特表 2024-521545 抗ＢＣＡＭ抗体又はその抗原結合フラグメント

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-06-03

(54)【発明の名称】抗ＢＣＡＭ抗体又はその抗原結合フラグメント

(51)【国際特許分類】

   C07K 16/28 20060101AFI20240527BHJP

   C07K 16/46 20060101ALI20240527BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20240527BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20240527BHJP

   C12N 15/62 20060101ALI20240527BHJP

   A61K 47/68 20170101ALI20240527BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240527BHJP

   A61P 35/02 20060101ALI20240527BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20240527BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20240527BHJP

【ＦＩ】

C07K16/28 ZNA

C07K16/46

C12N15/13

C12N15/63 Z

C12N15/62 Z

A61K47/68

A61P35/00

A61P35/02

A61K45/00

A61K39/395 T

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023565380

(86)(22)【出願日】2021-06-01

(85)【翻訳文提出日】2023-12-13

(86)【国際出願番号】 KR2021006816

(87)【国際公開番号】W WO2022244908

(87)【国際公開日】2022-11-24

(31)【優先権主張番号】10-2021-0065517

(32)【優先日】2021-05-21

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】520077986

【氏名又は名称】ゲノム アンド カンパニー

(74)【代理人】

【識別番号】100107456

【弁理士】

【氏名又は名称】池田 成人

(74)【代理人】

【識別番号】100162352

【弁理士】

【氏名又は名称】酒巻 順一郎

(74)【代理人】

【識別番号】100123995

【弁理士】

【氏名又は名称】野田 雅一

(72)【発明者】

【氏名】チャ， ミ ヤング

(72)【発明者】

【氏名】ユ， ヒョンキョン

(72)【発明者】

【氏名】チョン， ブ ナム

(72)【発明者】

【氏名】キム， ヒョヌク

【テーマコード（参考）】

4C076

4C084

4C085

4H045

【Ｆターム（参考）】

4C076AA95

4C076CC27

4C076CC41

4C076EE59

4C076FF70

4C084AA19

4C084NA05

4C084ZB261

4C084ZB262

4C084ZB271

4C084ZB272

4C084ZC752

4C085AA14

4C085AA16

4C085BB01

4C085CC23

4C085EE01

4C085EE03

4H045AA11

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA10

4H045BA41

4H045DA76

4H045EA20

4H045FA72

4H045FA74

(57)【要約】

本発明は、抗ＢＣＡＭ抗体又はその抗原結合フラグメント、及びその使用に関する。加えて、本発明による抗ＢＣＡＭ抗体又はその抗原結合フラグメントは、ＢＣＡＭを発現する細胞に関連する病態、例えば癌を予防又は治療するために使用することができる。
【選択図】 なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

配列番号７、９及び１１からなる群から選択されるいずれか１つのアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１と、
配列番号１３、１５及び１７からなる群から選択されるいずれか１つのアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２と、
配列番号１９、２１及び２３からなる群から選択されるいずれか１つのアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３と、
配列番号８、１０及び１２からなる群から選択されるいずれか１つのアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１と、
配列番号１４、１６及び１８からなる群から選択されるいずれか１つのアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２と、
配列番号２０、２２及び２４からなる群から選択されるいずれか１つのアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３と
を含む抗ＢＣＡＭ抗体又はその抗原結合フラグメント。

【請求項2】

（ａ）前記配列番号７のアミノ酸配列を含む前記重鎖ＣＤＲ１、
前記配列番号１３のアミノ酸配列を含む前記重鎖ＣＤＲ２、
前記配列番号１９のアミノ酸配列を含む前記重鎖ＣＤＲ３、
前記配列番号８のアミノ酸配列を含む前記軽鎖ＣＤＲ１、
前記配列番号１４のアミノ酸配列を含む前記軽鎖ＣＤＲ２、及び
前記配列番号２０のアミノ酸配列を含む前記軽鎖ＣＤＲ３、
（ｂ）前記配列番号９のアミノ酸配列を含む前記重鎖ＣＤＲ１、
前記配列番号１５のアミノ酸配列を含む前記重鎖ＣＤＲ２、
前記配列番号２１のアミノ酸配列を含む前記重鎖ＣＤＲ３、
前記配列番号１０のアミノ酸配列を含む前記軽鎖ＣＤＲ１、
前記配列番号１６のアミノ酸配列を含む前記軽鎖ＣＤＲ２、及び
前記配列番号２２のアミノ酸配列を含む前記軽鎖ＣＤＲ３、又は
（ｃ）前記配列番号１１のアミノ酸配列を含む前記重鎖ＣＤＲ１、
前記配列番号１７のアミノ酸配列を含む前記重鎖ＣＤＲ２、
前記配列番号２３のアミノ酸配列を含む前記重鎖ＣＤＲ３、
前記配列番号１２のアミノ酸配列を含む前記軽鎖ＣＤＲ１、
前記配列番号１８のアミノ酸配列を含む前記軽鎖ＣＤＲ２、及び
前記配列番号２４のアミノ酸配列を含む前記軽鎖ＣＤＲ３
を含む、請求項１に記載の抗ＢＣＡＭ抗体又はその抗原結合フラグメント。

【請求項3】

配列番号１、３及び５からなる群から選択されるいずれか１つの重鎖可変領域と、
配列番号２、４及び６からなる群から選択されるいずれか１つの軽鎖可変領域と
を含む、請求項１に記載の抗ＢＣＡＭ抗体又はその抗原結合フラグメント。

【請求項4】

（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
（ｂ）配列番号３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、又は
（ｃ）配列番号５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含む、請求項１に記載の抗ＢＣＡＭ抗体又はその抗原結合フラグメント。

【請求項5】

前記抗ＢＣＡＭ抗体が多重特異性抗体である、請求項１に記載の抗ＢＣＡＭ抗体又はその抗原結合フラグメント。

【請求項6】

前記抗原結合フラグメントが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆｖ、一本鎖抗体ｓｃＦｖ、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、ＶＬ、ＶＨ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ミニボディ（ｓｃＦＶ（ＣＨ３）２）、ＩｇＧ ｄｅｌｔａＣＨ２、ｓｃＦｖ－Ｆｃ、（ｓｃＦｖ）２－Ｆｃ、フィノマー、二重親和性再ターゲティング（ＤＡＲＴ）、又はＴＲＩＤＥＮＴである、請求項１に記載の抗ＢＣＡＭ抗体又はその抗原結合フラグメント。

【請求項7】

１×１０^－７Ｍ以下の結合解離平衡定数（Ｋ_Ｄ）でヒトＢＣＡＭタンパク質に結合する、請求項１に記載の抗ＢＣＡＭ抗体又はその抗原結合フラグメント。

【請求項8】

前記抗体がキメラ抗体、ヒト化抗体、又はヒト抗体である、請求項１に記載の抗ＢＣＡＭ抗体又はその抗原結合フラグメント。

【請求項9】

請求項１～８のいずれか一項に記載の抗ＢＣＡＭ抗体又はその抗原結合フラグメントを含む抗体薬物複合体。

【請求項10】

請求項１～８のいずれか一項に記載の抗ＢＣＡＭ抗体又はその抗原結合フラグメントをコードする核酸分子。

【請求項11】

請求項１０に記載の核酸分子を含む組換え発現ベクター。

【請求項12】

癌を予防又は治療する用の医薬組成物であって、請求項１～８のいずれか一項に記載の抗ＢＣＡＭ抗体又はその抗原結合フラグメントを含む医薬組成物。

【請求項13】

追加の抗癌剤をさらに含む、請求項１２に記載の医薬組成物。

【請求項14】

前記抗ＢＣＡＭ抗体又はその抗原結合フラグメント、及び前記追加の抗癌剤が、単一の製剤として同時に投与されるか、又は別々の製剤として同時若しくは逐次的に投与される、請求項１３に記載の医薬組成物。

【請求項15】

抗体１１１ａ、１１１ｂ又は１１１ｃが結合するエピトープと同じエピトープに結合する、ヒトＢＣＡＭに特異的に結合する抗ＢＣＡＭ抗体又はその抗原結合フラグメント。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、抗ＢＣＡＭ抗体又はその抗原結合フラグメント、及びその使用に関する。さらに、本発明の抗ＢＣＡＭ抗体又はその抗原結合フラグメントは、ＢＣＡＭを発現する細胞に関連する病態、例えば癌の予防又は治療に使用することができる。

【背景技術】

【0002】

基底細胞接着分子（ＢＣＡＭ）は、Ｉｇスーパーファミリーの膜貫通タンパク質であり、ルーテル式血液型糖タンパク質（Ｌｕ）としても知られている。Ｌｕは当初、ルーテル式血液型の抗原として研究され、ＢＣＡＭは卵巣癌で発現上昇する抗原として同定された。Ｌｕ及びＢＣＡＭは同じ細胞外ドメインを有するが、細胞質尾部が異なる。詳細には、ＢＣＡＭは、Ｌｕ細胞質尾部に存在するＣＯＯＨ末端の４０アミノ酸を欠いている。さらに、Ｌｕ特異的細胞質領域にはＳＨ３結合モチーフ、ジロイシンモチーフ、及び潜在的なリン酸化部位を有する。Ｌｕ及びＢＣＡＭの細胞質尾部の共有領域はスペクトリン結合モチーフを含む。ＢＣＡＭ及びＬｕの構造は互いに重なり合っているため、実際の組織ではＬｕとＢＣＡＭとを区別することは難しく、ＬｕとＢＣＡＭとは互換的に呼ばれ、Ｌｕ／ＢＣＡＭと呼ばれたり、また、ＣＤ２３９とも呼ばれたりする。

【0003】

ＢＣＡＭの細胞外ドメインは、１つのＶ－セット、１つのＣ１－セット、及び３つのＩ－セット（Ｖ－Ｃ１－Ｉ－Ｉ－Ｉ）のドメインを含む。ＢＣＡＭは基底膜の主要成分であるラミニンα５に特異的に結合することから、ＢＣＡＭは基底膜への細胞接着に関与していると考えられている。ラミニンα５はβ鎖とγ鎖に結合してヘテロ三量体を形成し、これは正常組織や疾患組織の基底膜の多くに見られる。加えて、ＢＣＡＭは、α５、β１、γ１鎖から構成されるラミニン－５１１（ＬＭ－５１１）で肺癌細胞の遊走を促進する。さらに、ＬＭ－５１１での腫瘍細胞の遊走は、ＢＣＡＭに対する機能阻害抗体の存在下で阻害される。ＢＣＡＭの過剰発現は卵巣癌腫だけでなく、皮膚癌及び肝細胞癌腫でも観察されることが確認され、したがって、ＢＣＡＭは診断及び抗体医薬品の開発に有用な抗原として提唱されている。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0004】

【非特許文献1】Ｙａｍａｔｏ Ｋｉｋｋａｗａら、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔ、２０１８年４月２６日；８（１）：６６１２

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

本発明の目的は、ＢＣＡＭタンパク質に特異的に結合する抗ＢＣＡＭ抗体又はその抗原結合フラグメントを提供することである。

【0006】

さらに、本発明は、癌などのＢＣＡＭを発現する細胞に関連する病態を予防又は治療するための抗体又は抗原結合フラグメントの使用を提供する。

【課題を解決するための手段】

【0007】

本発明は、抗ＢＣＡＭ抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。

【0008】

本発明は、癌を予防又は治療する用の医薬組成物であって、抗ＢＣＡＭ抗体又はその抗原結合フラグメントを含む医薬組成物を提供する。加えて、本発明は、ＢＣＡＭ発現細胞を標的とするために阻害剤を選択的に送達できる抗体薬物複合体（ＡＤＣ）の形態の抗体又は抗原結合フラグメントを提供する。

【0009】

一実施形態では、本発明は、配列番号７、９及び１１からなる群から選択されるいずれか１つのアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号１３、１５及び１７からなる群から選択されるいずれか１つのアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、配列番号１９、２１及び２３からなる群から選択されるいずれか１つのアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、配列番号８、１０及び１２からなる群から選択されるいずれか１つのアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１４、１６及び１８からなる群から選択されるいずれか１つのアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、並びに配列番号２０、２２及び２４からなる群から選択されるいずれか１つのアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む抗ＢＣＡＭ抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。

【0010】

一実施形態では、本発明は、配列番号１、３及び５からなる群から選択されるいずれか１つの重鎖可変領域、並びに配列番号２、４及び６からなる群から選択されるいずれか１つの軽鎖可変領域を含む抗ＢＣＡＭ抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。

【0011】

一実施形態では、本発明の抗原結合フラグメントは、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆｖ、一本鎖抗体ｓｃＦｖ、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、ＶＬ、ＶＨ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ミニボディ（ｓｃＦＶ（ＣＨ３）２）、ＩｇＧ ｄｅｌｔａＣＨ２、ｓｃＦｖ－Ｆｃ、（ｓｃＦｖ）２－Ｆｃ、フィノマー、二重親和性再ターゲティング（ＤＡＲＴ）、又は本発明のＣＤＲ配列を含むＴＲＩＤＥＮＴであってもよい。本発明の抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体であってもよく、多重特異性抗体であってもよい。

【0012】

別の実施形態では、本発明は、抗体又はその抗原結合フラグメントをコードする核酸分子、及び該核酸分子を含む組換え発現ベクターを提供する。

【0013】

本発明はまた、癌を予防又は治療するための組成物であって、抗体又はその抗原結合フラグメントを有効成分として含む組成物を提供する。医薬組成物は、別の抗癌剤若しくは化学療法剤などの追加の抗癌剤と併用することができるか、又は放射線療法と併用することができる。

【0014】

本発明はまた、ＢＣＡＭタンパク質を分析又は検出するための組成物であって、抗体又はその抗原結合フラグメントを含む組成物を提供する。

【発明の効果】

【0015】

本発明の抗ＢＣＡＭ抗体又はその抗原結合フラグメントは、ヒトＢＣＡＭタンパク質に高親和性で結合する。その結果、本発明の抗ＢＣＡＭ抗体又はその抗原結合フラグメントは、癌の予防又は治療に効果的に使用することができる。

【図面の簡単な説明】

【0016】

【図1a】選択された抗体の重鎖可変領域（１ａ）のアミノ酸配列を示す図である。太字及び下線の配列は各領域のＣＤＲ配列を表す。

【図1b】選択された抗体の軽鎖可変領域（１ｂ）のアミノ酸配列を示す図である。太字及び下線の配列は各領域のＣＤＲ配列を表す。

【図2】ＥＬＩＳＡ分析による本発明の抗体のＢＣＡＭに対する結合能を示す図である。

【図3】ＦＡＣＳ分析による本発明の抗体のＢＣＡＭに対する結合能を示す図である（ＰＢＳとヒトＩｇＧの値は重なっていることを示す）。

【図4a】Ｏｃｔｅｔ分析による本発明の抗体のＢＣＡＭに対する結合能を示す図である。

【図4b】Ｏｃｔｅｔ分析による本発明の抗体のＢＣＡＭに対する結合能を示す図である。

【図4c】Ｏｃｔｅｔ分析による本発明の抗体のＢＣＡＭに対する結合能を示す図である。

【図5】共焦点レーザー走査型顕微鏡で観察した本発明の抗体の細胞内在化の程度を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0017】

抗ＢＣＡＭ抗体又はその抗原結合フラグメント
本発明は、ＢＣＡＭタンパク質に特異的に結合する抗ＢＣＡＭ抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。

【0018】

一実施形態では、本発明の抗ＢＣＡＭ抗体又はその抗原結合フラグメントは、以下を含む：
配列番号７、９及び１１からなる群から選択されるいずれか１つのアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号１３、１５及び１７からなる群から選択されるいずれか１つのアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、
配列番号１９、２１及び２３からなる群から選択されるいずれか１つのアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、
配列番号８、１０及び１２からなる群から選択されるいずれか１つのアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号１４、１６及び１８からなる群から選択されるいずれか１つのアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、並びに
配列番号２０、２２及び２４からなる群から選択されるいずれか１つのアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３。

【0019】

具体的な実施形態では、本発明の抗ＢＣＡＭ抗体又はその抗原結合フラグメントは、以下を含む：
（ａ）配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号１３のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、
配列番号１９のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、
配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号１４のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号２０のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３、
（ｂ）配列番号９のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号１５のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、
配列番号２１のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、
配列番号１０のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号１６のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号２２のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３、又は
（ｃ）配列番号１１のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号１７のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、
配列番号２３のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、
配列番号１２のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号１８のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号２４のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３。

【0020】

本明細書で使用される場合、各鎖又はその可変領域が特定のアミノ酸配列を含むとは、鎖又は可変領域がアミノ酸配列全体を含むか、アミノ酸配列全体を有するか、又はアミノ酸配列からなることを意味する。

【0021】

一例では、抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号７のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号１３のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、配列番号１９のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３、配列番号８のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１４のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２０のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を含む。

【0022】

別の一例では、抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号７のアミノ酸配列から本質的になる重鎖ＣＤＲ１、配列番号１３のアミノ酸配列から本質的になる重鎖ＣＤＲ２、配列番号１９のアミノ酸配列から本質的になる重鎖ＣＤＲ３、配列番号８のアミノ酸配列から本質的になる軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１４のアミノ酸配列から本質的になる軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２０のアミノ酸配列から本質的になる軽鎖ＣＤＲ３を含む。

【0023】

別の一例では、抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号７のアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１、配列番号１３のアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２、配列番号１９のアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３、配列番号８のアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１４のアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２０のアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３を含む。

【0024】

本明細書で使用される場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という用語、又はその変形語は、オープンな意味を指す。一例として、列挙されているアミノ酸配列を含む抗体又はその抗原結合フラグメントは、必須か否かにかかわらず、列挙されていない追加のアミノ酸配列を含むことができる。

【0025】

本明細書で使用される場合、「から本質的になる」という用語又はその変形語句は、言及された要素のいずれかを含み、実施形態の基本的かつ新規な特性又は機能的特性に実質的に影響を与えない要素の存在を許容する。一例として、列挙されているアミノ酸配列から本質的になる抗体又はその抗原結合フラグメントは、抗体又はそのフラグメントの特性に実質的に影響を与えない１つ又は複数のアミノ酸残基の置換を含むことができる。

【0026】

本明細書で使用される場合、「からなる」という用語又はその変形語句は、本明細書に記載されるそれぞれの構成要素が、実施形態のその説明に記載又は列挙されていないいずれの要素も許可しない場合を指す。

【0027】

本明細書で定義される別の抗体又はその抗原結合フラグメントの各鎖又は変異領域は、上記の例のようなアミノ酸配列を含む、有する、又はそれからなることもできる。

【0028】

「相補性決定領域」（ＣＤＲ；ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）という用語は、抗原結合に必要な抗体可変領域内のアミノ酸残基を指す。各可変領域は、通常、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３と特定される３つのＣＤＲ領域を有する。

【0029】

別の実施形態では、本発明の抗ＢＣＡＭ抗体又はその抗原結合フラグメントは、以下を含む：
配列番号１、３及び５からなる群から選択されるいずれか１つの重鎖可変領域、並びに
配列番号２、４及び６からなる群から選択されるいずれか１つの軽鎖可変領域。

【0030】

具体的な実施形態では、本発明の抗ＢＣＡＭ抗体又はその抗原結合フラグメントは、以下を含む：
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
（ｂ）配列番号３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、又は
（ｃ）配列番号５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域。

【0031】

抗体可変領域とは、ＣＤＲ及びフレームワーク領域（ＦＲ）のアミノ酸配列を含む抗体分子の軽鎖部分及び重鎖部分を指す。

【0032】

本明細書で使用される場合「抗体」という用語は、免疫グロブリン分子の可変領域に位置する少なくとも１つの抗原認識部位を介して、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、ポリペプチド、タンパク質などの標的に特異的に結合することができる免疫グロブリン分子を指す。本明細書での「抗体」という用語は、最も広い意味で使用され、したがって、インタクトなポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体のみならず、二量体、多量体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、その抗原結合フラグメント、その抗体フラグメント、抗原認識部位（例えば、可変領域）を含む免疫グロブリン分子の他の任意の改変された構成を含む融合タンパク質、合成抗体（例えば、「抗体模倣物」）、「ＦｙｎｏｍＡｂ」などを広範に包含する。

【0033】

抗体には、免疫グロブリン（Ｉｇ）Ｍ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、及びＩｇＥの５つのクラスがあり、それぞれ重鎖定常領域遺伝子μ、δ、γ、α、及びεから作られる重鎖を含む。抗体の軽鎖及び重鎖は、抗体ごとに異なるアミノ酸配列を有する可変領域と同じアミノ酸配列を有する定常領域とに分けられ、重鎖定常領域はＣＨ１、Ｈ（ヒンジ）、ＣＨ２、ＣＨ３ドメインを含む。各ドメインは２つのβシートからなり、その間に分子内ジスルフィド結合が連結されている。

【0034】

本明細書で、配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む抗体を「１１１ａ」と呼び、配列番号３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む抗体を「１１１ｂ」と呼び、配列番号５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む抗体を「１１１ｃ」と呼ぶ。

【0035】

本発明の抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体、又はヒト抗体であってもよい。

【0036】

本明細書で使用される場合、「キメラ抗体」という用語は、ある種に可変領域配列が由来し、別の種に定常領域配列が由来する抗体、例えば可変領域配列がマウス抗体に由来し、定常領域配列がヒト抗体に由来する抗体を指す。キメラ抗体の作製方法は当技術分野で公知である。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：１２０２（１９８５）などを参照されたい。

【0037】

本明細書で使用される場合、「ヒト化抗体」という用語は、別の哺乳動物種、例えばマウス又はニワトリなどの非ヒト種の生殖細胞系列に由来する１つ又は複数のＣＤＲ配列が、ヒト免疫グロブリン分子のフレームワーク配列に移植された抗体を指す。フレームワーク配列は、例えば変異によってさらに改変されることがある。ヒトＩｇ配列は、例えばＮＣＢＩ Ｄａｔａｂａｓｅ（Ｅｎｔｅｚ Ｇｅｎｅ）などに参考として開示されることがある。適切な配列を使用して、抗体の免疫原性を低下させたり、又は結合、親和性、ｏｎ－ｒａｔｅ、ｏｆｆ－ｒａｔｅ、結合活性、特異性、半減期、若しくは他の適切な特性を低下、増強、又は修正したりすることができる。

【0038】

本明細書で使用される場合、「ヒト抗体」という用語は、フレームワーク領域とＣＤＲ領域の両方がヒト免疫グロブリン配列に由来する可変領域を含む抗体を指す。抗体の定常領域もヒト免疫グロブリン配列に由来する。

【0039】

本明細書で使用される場合、「抗原結合フラグメント」又は「抗体フラグメント」という用語は通常、少なくとも親抗体の抗原結合ドメイン又は可変領域の少なくとも一部（例えば、１つ又は複数のＣＤＲ）を含むことを指す。抗体フラグメントは、親抗体の結合特異性の少なくとも一部を保持している。本明細書で使用することができる抗原結合フラグメントの例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆｖ、一本鎖抗体ｓｃＦｖ、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、ＶＬ、ＶＨ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ミニボディ（（ｓｃＦＶ－ＣＨ３）２）、ＩｇＧ ｄｅｌｔａＣＨ２、ｓｃＦｖ－Ｆｃ、（ｓｃＦｖ）２－Ｆｃ、フィノマー、二重親和性再ターゲティング（ＤＡＲＴ）、アンチカリン、ＦＮ３モノボディ、ＤＡＲＰｉｎ、アフィボディ、アフィリン、アフィマー、アフィティン、アルファボディ、アビマー、Ｉｍ７、ＶＬＲ、ＶＮＡＲ、Ｔｒｉｍａｂ、ＣｒｏｓｓＭａｂ、ＴＲＩＤＥＮＴ、ナノボディ、バイノボディ、又はｄｉ－ｓｄＦｖが挙げられるが、これらに限定されない。

【0040】

具体的には、Ｆａｂフラグメントは、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ、及びＣＨ１ドメインから構成される一価のフラグメントを指す。

【0041】

Ｆａｂ’フラグメントがＦａｂフラグメントと異なる点は、抗体ヒンジ領域から少なくとも１つのシステインを含むＣＨ１ドメインのカルボキシル末端にいくつかの残基が付加されている点である。

【0042】

Ｆａｂ’－ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基が遊離のチオール基を有するＦａｂ’を指す。

【0043】

Ｆ（ａｂ’）２抗体フラグメントは、Ｆａｂ’フラグメント間のヒンジシステインを介して一対のＦａｂ’フラグメントとして生成される。

【0044】

Ｆｖは、抗原認識部位及び抗原結合部位を完全に含む最小限の抗体フラグメントである。このフラグメントは、１つの重鎖可変領域と１つの軽鎖可変領域が非共有結合で緊密に結合した二量体からなる。この２つの領域の折りたたみから、６つの超可変ループ（重鎖と軽鎖からそれぞれ３つのループ）が生じ、抗原結合のためのアミノ酸残基をもたらし、抗体に抗原結合特異性を与える。しかしながら、単一の可変領域であっても、結合部位全体よりは低い親和性ではあるが、抗原を認識し結合する能力がある。

【0045】

一本鎖抗体ｓｃＦｖは、一本のポリペプチド鎖に連結されたＶＨ抗体ドメイン及びＶＬ抗体ドメインを含む抗体フラグメントである。好ましくは、ｓｃＦｖポリペプチドは、ｓｃＦｖが抗原結合のために所望の構造を形成することを可能にする、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間のポリペプチドリンカーをさらに含む。本明細書においてｓｃＦｖポリペプチドは、ｓｃＦｖ抗体フラグメント、抗原結合フラグメントｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ抗体、抗体ｓｃＦｖ、又は単にｓｃＦｖとも呼ばれる。

【0046】

ダイアボディとは、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間に短いリンカー（約５～１０残基）を使用してｓｃＦｖフラグメントを構築することにより調製される小さな抗体フラグメントを指し、Ｖドメインの鎖間対合は達成されるが鎖内対合は達成されず、その結果、二価のフラグメント、すなわち２つの抗原結合部位を有するフラグメントが得られる。二重特異性ダイアボディは、２つの抗体のＶＨドメインとＶＬドメインが異なるポリペプチド鎖上に存在する２つの「クロスオーバー」ｓｃＦｖフラグメントからなるヘテロダイマーである。同様に、トリアボディ及びテトラボディは、それぞれ３つのポリペプチド鎖及び４つのポリペプチド鎖を含み、それぞれ３つの抗原結合部位及び４つの抗原結合部位を形成するが、これらは互いに同じであってもよく、又は異なっていてもよい。

【0047】

フィノマーとは、ヒトＦｙｎ ＳＨ３ドメインに由来する非免疫グロブリン由来の結合ポリペプチドを指す。Ｆｙｎ ＳＨ３由来ポリペプチドは当技術分野で公知であり、例えば、Ｇｒａｂｕｌｏｖｓｋｉら（２００７）ＪＢＣ、２８２、３１９６～３２０４頁、国際公開第２００８／０２２７５９号などに開示されている。フィノマーは別の分子（例えば抗体）と遺伝的に融合して、「ＦｙｎｏｍＡｂ」、すなわち二重特異性を有するように工学操作し得る形態を生成することができる。

【0048】

二重親和性再ターゲティング（ＤＡＲＴ）及びＴＲＩＤＥＮＴは、２つ以上の標的に同時に結合するように設計されたものを指す。ＤＡＲＴは、共有結合で連結された二重特異性ダイアボディ、例えばＣ末端ジスルフィド架橋を介して連結されたダイアボディを指し、その構造及び定義などは、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（２０１０）３９９、４３６～４４９などに開示されている。

【0049】

本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントは、ヒトＢＣＡＭタンパク質などのＢＣＡＭタンパク質に特異的に結合することができる。

【0050】

具体的な一実施形態では、本発明は、抗体１１１ａ、１１１ｂ又は１１１ｃが結合するエピトープと同じエピトープに結合する、ヒトＢＣＡＭに特異的に結合する抗ＢＣＡＭ抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖及び軽鎖の各々のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３は、抗体１１１ａ、１１１ｂ又は１１１ｃの重鎖及び軽鎖の各々のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、特に好ましくは１００％の相同性を有する。同様に、抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖及び軽鎖の各々は、抗体１１１ａ、１１１ｂ又は１１１ｃの重鎖及び軽鎖の各々と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、特に好ましくは１００％の相同性を有する。

【0051】

本明細書で使用される場合、「ＢＣＡＭ」という用語は基底細胞接着分子を指し、細胞外マトリックスタンパク質であるラミニンの受容体として作用する表面糖タンパク質である。「ＢＣＡＭ」は、ルーテル式血液型糖タンパク質（Ｌｕ）又はＣＤ２３９としても知られており、本明細書において、「ＢＣＡＭ」、「Ｌｕ」、「Ｌｕ／ＢＣＡＭ」及び「ＣＤ２３９」は、同じタンパク質を指し、互換的に使用することができる。

【0052】

本明細書で使用される場合、「特異的に結合する」又は「特異的な」という用語は、標的と抗体との間の結合などの測定可能で再現可能な相互作用を指し、これは、生物学的分子を含む不均一な分子集団の存在下で標的の存在を決定するものである。例えば、特定の標的（例えば、エピトープ）に特異的に結合する抗体とは、他の標的に結合するよりも、より高い親和性、結合活性、より容易に、及び／又はより長い期間、この標的に結合する抗体である。

【0053】

本明細書で使用される場合、「ヒトＢＣＡＭタンパク質に特異的に結合する」という用語は、１×１０^－７Ｍ以下、又は好ましくは５×１０^－８Ｍ以下の結合解離平衡定数（Ｋ_Ｄ）でヒトＢＣＡＭタンパク質に結合する抗体を指すことができる。したがって、本発明の抗ＢＣＡＭ抗体又はその抗原結合フラグメントは、１×１０^－７Ｍ以下の結合解離平衡定数（Ｋ_Ｄ）、好ましくは５×１０^－８Ｍ以下のＫ_ＤでヒトＢＣＡＭタンパク質に結合することができる。

【0054】

本明細書で使用される場合、「Ｋ_Ｄ」という用語は、特定の抗体－抗原相互作用の結合解離平衡定数を指し、式Ｋ_Ｄ＝Ｋ_ｄ／Ｋ_ａ（式中、Ｋ_ａは結合速度定数であり、Ｋｄは解離速度定数である）から算出され、定数Ｋ_Ｄの単位はＭである。抗体のＫ_Ｄ値は、当技術分野で広く確立された方法を使用して決定することができる。抗体のＫ_Ｄ値を測定するための好ましい方法は、表面プラズモン共鳴（ＳＲＰ）、好ましくはビアコア（Ｂｉａｃｏｒｅ）（登録商標）システムなどのバイオセンサーシステム、又はオクテット（Ｏｃｔｅｔ）（登録商標）システムなどのバイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）を使用することである。具体的な一例として、本明細書に記載されるＫ_Ｄは、オクテット（登録商標）システムを使用したＢＬＩによって得られる値であってもよい。

【0055】

別の実施形態では、本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントは、薬物複合形態、すなわち抗体薬物複合体（ＡＤＣ）を形成することができる。本明細書で使用される場合、「抗体薬物複合体」又は「ＡＤＣ」という用語は、式Ｍ－［Ｌ－Ｄ］_ｎで表すことができ、式中、Ｍは抗体分子、すなわち本発明の抗ＢＣＡＭ抗体又はその抗原結合フラグメントを表し、Ｌは任意のリンカー又はリンカーユニットであり、Ｄは適切な薬物又はプロドラッグであり、ｎは約１～約２０の整数である。ＡＤＣに含まれる薬物は、本発明の抗体の特異的結合を妨害しない薬物である限り、治療又は診断の用途に応じて適宜選択することができる。一実施形態では、薬物としては、細胞毒性剤（例えば、化学療法剤）、プロドラッグ変換酵素、放射性同位元素若しくは化合物、又は毒素が挙げられるが、これらに限定されない。ＡＤＣに含まれ得る薬物及びリンカー、並びにその調製方法は、当技術分野で公知の方法に従うことができる。したがって、本発明は、抗ＢＣＡＭ抗体又はその抗原結合フラグメントを含む抗体薬物複合体を提供する。

【0056】

別の実施形態では、本発明の抗ＢＣＡＭ抗体又はその抗原結合フラグメントは、ＥＬＩＳＡアッセイによって決定されるように、１５０ｎＭ以下、例えば１３０ｎＭ以下、１００ｎＭ以下、５０ｎＭ以下、２０ｎＭ以下、又は１０ｎＭ以下のＥＣ５０でＢＣＡＭタンパク質に結合する。

【0057】

本明細書で使用される場合、「ＥＣ５０」という用語は、抗体を用いたインビトロ又はインビボアッセイに関する用語であり、最大応答の５０％、すなわち最大応答とベースラインとの間の中間の応答を誘導する抗体の濃度を指す。

【0058】

核酸分子及びベクター
本発明の別の態様は、本発明の抗ＢＣＡＭ抗体又はその抗原結合フラグメントをコードする核酸分子に関する。

【0059】

核酸は、細胞全体、細胞溶解物中、又は特異的に精製された形態若しくは実質的に純粋な形態で存在することができる。核酸は、アルカリ／ＳＤＳ処理、ＣｓＣｌバンディング、カラムクロマトグラフィ、アガロースゲル電気泳動及び当技術分野で周知の他の方法を含む標準的な技術によって、他の細胞成分又は他の汚染物質、例えば他の細胞核酸又はタンパク質から離れて精製された場合、「単離された」又は「実質的に純粋になった」ことになる。

【0060】

本発明の核酸は、例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡであってもよく、イントロン配列を含んでも含まなくてもよい。好ましい実施形態では、核酸はｃＤＮＡ分子である。

【0061】

一実施形態では、本発明の核酸分子は、本発明の抗ＢＣＡＭ抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖領域、重鎖領域、又は軽鎖及び重鎖の両方の領域をコードし、好ましくは、軽鎖可変領域、重鎖可変領域、又は軽鎖及び重鎖の両方の可変領域をコードする。

【0062】

ＶＬ及び／又はＶＨ領域をコードするＤＮＡフラグメントが得られると、そのようなＤＮＡフラグメントを標準的な組換えＤＮＡ技術によってさらに操作することができ、例えば、可変領域遺伝子を完全長抗体鎖遺伝子、Ｆａｂフラグメント遺伝子、又はｓｃＦｖ遺伝子に変換することができる。これらの操作では、ＶＬ又はＶＨをコードするＤＮＡフラグメントが、別のタンパク質、例えば抗体定常領域又はフレキシブルリンカーをコードする別のＤＮＡフラグメントに作動可能に連結される。本明細書で使用される場合、「作動可能に連結される」という用語は、２つのＤＮＡフラグメントによってコードされるアミノ酸配列がインフレームのままであるように、２つのＤＮＡフラグメントが接合されることを意味する。

【0063】

ＶＨ領域をコードする単離されたＤＮＡは、ＶＨをコードするＤＮＡを、重鎖定常領域（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）をコードする別のＤＮＡ分子に作動可能に結合させることにより、完全長の重鎖遺伝子に変換することができる。重鎖定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、又はＩｇＤ定常領域であってもよい。

【0064】

Ｆａｂフラグメント重鎖遺伝子の場合、ＶＨをコードするＤＮＡは、重鎖ＣＨ１定常領域のみをコードする別のＤＮＡ分子と作動可能に連結することができる。

【0065】

ｓｃＦｖ遺伝子を作製するには、ＶＬ及びＶＨをコードするＤＮＡフラグメントを、フレキシブルリンカーをコードする別のフラグメント、例えばアミノ酸配列（Ｇｌｙ４－Ｓｅｒ）３をコードする別のフラグメントと作動可能に連結されることにより、ＶＬ及びＶＨ領域がフレキシブルリンカーによって接合されて、ＶＬ及びＶＨ配列が連続した一本鎖タンパク質として発現できる。

【0066】

ＲＮＡ又はＤＮＡなどの本発明の核酸配列は、種々の供給源から単離され、遺伝子工学的に操作され、増幅され、及び／又は組換え的に発現することができる。任意の組換え発現系を使用することができ、これには細菌に加えて、例えば酵母、昆虫又は哺乳動物系が挙げられる。例えば、発現ベクターへのサブクローニング、プローブの標識、配列決定、及びハイブリダイゼーションなどの核酸の操作は、当技術分野で公知のように行うことができる。

【0067】

したがって、本発明は、核酸分子を含む組換え発現ベクターを提供する。

【0068】

本明細書で使用される場合、「ベクター」という用語は、原核細胞及び／又は真核細胞において自己複製が可能なＤＮＡ分子を指し、遺伝子又はＤＮＡフラグメントを細胞などに送達するための担体として一般的に使用される組換えベクター、クローニングベクター、又は発現ベクターと互換的に使用される。ベクターは一般に、原核細胞及び／又は真核細胞で複製可能な複製起点、抗生物質分解酵素などの特定の条件／物質に対する耐性を付与することができる選択マーカー遺伝子、真核細胞又は原核細胞で遺伝子を転写可能なプロモーター、及び翻訳可能配列を含むが、これらに限定されない。

【0069】

ベクターの一種に「プラスミド」があるが、これは環状の二本鎖ＤＮＡループで、そこに追加のＤＮＡセグメントをライゲートできるものを指す。別の一種のベクターはウイルスベクターであり、このベクターではウイルスゲノムに追加のＤＮＡセグメントをライゲートし得る。ある種のベクターは、導入された宿主細胞内で自律複製が可能である（例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクター及びエピソーム型哺乳動物ベクター）。

【0070】

抗体又はその抗原結合フラグメントの調製
本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントは、従来公知の方法に従って調製することができる。

【0071】

一実施形態では、本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントは、ファージディスプレイ技術などの抗体ディスプレイ技術を使用して調製することができる。

【0072】

抗体のファージライブラリーを、ヒト抗体の重鎖及び軽鎖可変領域遺伝子をファージ表面タンパク質（ｐＩＩＩ）に融合させた形態でファージミドベクターにクローニングし、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で発現させた後、Ｍ１３ヘルパーファージを感染させ、重鎖及び軽鎖可変領域の様々な組合せの配列を有する抗体フラグメント（ｓｃＦｖ又はＦａｂ）がファージ表面に提示された抗体ライブラリーを調製する。このライブラリーから、特定の抗原に結合する抗体のフラグメントをパニング法で単離し、単離された抗体フラグメントを特性決定した後、全ＩｇＧ型に変換して動物細胞で大量発現させることにより、特異的ヒトモノクローナル抗体を産生する。

【0073】

ライブラリーとしては、ヒト体内に既に存在する抗体遺伝子を使用したナイーブ抗体ライブラリーを使用することができ、或いは、抗体のＣＤＲにランダム合成配列を付加することによって多様性を高めた合成抗体ライブラリーを使用することができる。

【0074】

本明細書で使用される場合、「ファージミドベクター」という用語は、ファージ複製起点を有するプラスミドＤＮＡを指し、通常、選択マーカーとして抗生物質耐性遺伝子を有する。

【0075】

ファージディスプレイに使用されるファージミドベクターは、Ｍ１３ファージのｇＩＩＩ遺伝子又はその一部を含み、ＳｃＦｖ遺伝子はｇＩＩＩ遺伝子の５’末端にライゲートされて、形質転換体を通して発現される。

【0076】

「ヘルパーファージ」とは、ファージミドがファージ粒子にパッケージされるために必要な遺伝情報を提供するファージである。ファージミドにはファージのｇＩＩＩ遺伝子又はその一部が含まれているため、ファージミドで形質転換した宿主細胞（形質転換体）をヘルパーファージに感染させ、残りのファージ遺伝子をもたらす。ヘルパーファージには、Ｍ１３Ｋ０７又はＶＣＳＭ１３が含まれ、ヘルパーファージに感染した形質転換体を選択することができるように、カナマイシン耐性遺伝子などの抗生物質耐性遺伝子を含むものがほとんどである。加えて、パッケージングシグナルが欠損しているため、ヘルパーファージ遺伝子ではなくファージミド遺伝子が選択的にファージ粒子にパッケージングされる。

【0077】

別の実施形態では、本発明の抗体は、例えばモノクローナル抗体の形態で、当技術分野で公知の方法に従って試験用被験体（例えばマウス）にＢＣＡＭ抗原を注射し、次いで目的の配列又は機能的特性を有する抗体を発現するハイブリドーマを単離することによって調製することができる。

【0078】

モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順（例えば、モノクローナル抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用して）で容易に単離され、配列決定される。ハイブリドーマ細胞は、そのようなＤＮＡの好ましい供給源として提供される。単離されると、ＤＮＡは発現ベクターに入れられ、大腸菌細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、又は骨髄腫細胞など、免疫グロブリンタンパク質を産生しない宿主細胞にトランスフェクトされ、組換え宿主細胞でのモノクローナル抗体の合成が得られる。

【0079】

使用及び方法
本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントは、ＢＣＡＭに特異的に結合し、癌を予防又は治療する。

【0080】

したがって、一実施形態では、本発明は、癌を予防、改善、又は治療するための方法であって、被験体に、有効量の抗ＢＣＡＭ抗体又はその抗原結合フラグメントを投与することを含む方法を提供する。

【0081】

別の実施形態では、本発明は、癌を予防、改善、又は治療するための抗ＢＣＡＭ抗体又はその抗原結合フラグメントの使用を提供する。

【0082】

別の実施形態では、本発明は、癌を予防、改善、又は治療するための医薬組成物であって、抗ＢＣＡＭ抗体又はその抗原結合フラグメントを含む医薬組成物を提供する。抗ＢＣＡＭ抗体又はその抗原結合フラグメントは、医薬組成物中に有効量含有させることができる。

【0083】

本明細書で使用される場合、「被験体」という用語は、ヒト及び非ヒト動物の両方を含むことを意味する。非ヒト動物としては、全ての脊椎動物、例えば、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ニワトリ、両生類、及び爬虫類を含む哺乳類及び非哺乳類が挙げられるが、例えば、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマが好ましい。好ましい被験体は、癌の予防又は治療を必要とするヒトである。

【0084】

好ましくは、本発明の抗ＢＣＡＭ抗体又はその抗原結合フラグメントは、ＢＣＡＭタンパク質に特異的に結合し、それにより、ＢＣＡＭを発現している癌細胞に効果的に結合し、インビボでの癌細胞の増殖を阻害することが可能であり、癌の予防、改善又は治療に有効に使用することができる。ＢＣＡＭは腫瘍の遊走に関連し、さらに、その過剰発現が皮膚癌、卵巣癌、膵臓癌、乳癌などで特に見られることが知られている（Ｆ．Ｒ．Ｍ．Ｌａｔｉｎｉら、Ｂｌｏｏｄ Ｃｅｌｌｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ａｎｄ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ５０（２０１３）１６１～１６５などを参照されたい）。したがって、本発明の抗ＢＣＡＭ抗体は、腫瘍の遊走が観察される全ての癌、例えば転移性癌に使用することができ、その過剰発現が観察される特定の癌腫にも使用することができる。

【0085】

本発明の抗体を使用した場合に増殖が阻害され得る癌の例としては、黒色腫（例えば、転移性悪性黒色腫）、腎臓癌（例えば、明細胞癌腫）、前立腺癌（例えば、ホルモン不応性前立腺腺癌腫）、乳癌、結腸直腸癌、直腸癌、結腸癌、及び肺癌（例えば、非小細胞肺癌）、骨癌、膵臓癌、肝臓癌、皮膚癌、頭頸部癌、子宮癌、卵巣癌、直腸癌、肛門部癌、胃癌、精巣癌、卵管癌腫、子宮内膜癌腫、子宮頸癌腫、膣癌腫、外陰癌腫、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、食道癌、小腸癌、内分泌系癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟部肉腫、尿道癌、陰茎癌、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ性白血病を含む慢性又は急性の白血病、小児期の固形腫瘍、リンパ球性リンパ腫、膀胱癌、尿管癌、腎盂癌腫、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、原発性ＣＮＳリンパ腫、腫瘍血管新生、脊髄軸腫瘍、脳幹神経膠腫、下垂体腺腫、カポジ肉腫、類表皮癌、扁平上皮癌、Ｔ細胞リンパ腫、アスベストにより誘導されるものを含む環境誘発癌などが挙げられるが、これらに限定されない。

【0086】

一実施形態では、本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントを使用して、ＢＣＡＭタンパク質に特異的に結合して抗体薬物複合体（ＡＤＣ）を形成することにより、癌を予防又は治療することができる。したがって、一実施形態では、本発明は、薬剤と複合した形態の抗ＢＣＡＭ抗体又は抗原結合フラグメントを提供する。一実施形態では、薬物としては、細胞毒性剤（例えば、化学療法剤）、プロドラッグ変換酵素、放射性同位元素若しくは化合物、又は毒素が挙げられるが、これらに限定されない。ＡＤＣに含まれ得る薬物及びリンカー、並びにその調製方法は、当技術分野で公知の方法に従うことができる。

【0087】

本発明の抗体又は抗原結合フラグメントは、単独で使用することができるか、又は他の抗癌治療と併用することができる。他の抗癌治療としては、例えば、標準的な癌治療（例えば、化学療法、放射線療法、又は手術）、又は細胞毒性剤、細胞分裂阻害剤、抗ホルモン剤、血管新生阻害剤若しくは代謝拮抗剤、標的化剤、免疫刺激剤若しくは免疫調節剤、免疫チェックポイント阻害剤、又は細胞毒性剤、細胞分裂阻害剤、及び他の毒性剤と複合した抗体などの他の抗癌剤を挙げることができる。

【0088】

好ましくは、本発明の抗体又は抗原結合フラグメントは、免疫チェックポイント阻害剤、化学療法剤、放射線療法剤などの他の抗癌剤と併用することができる。

【0089】

免疫チェックポイント阻害剤は、例えば、抗ＣＴＬＡ－４抗体（例えば、イピリムマブ）、抗ＰＤ－１抗体（例えば、ペムブロリズマブ、ニボルマブ）、又は抗ＰＤ－Ｌ１抗体（例えば、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ）であってもよい。化学療法剤としては、アルキル化剤、代謝拮抗剤、キナーゼ阻害剤、紡錘体毒植物性アルカロイド、細胞毒性／抗腫瘍性抗生物質、トポイソメラーゼ阻害剤、光増感剤、抗エストロゲン及び選択的エストロゲン受容体モジュレーター（ＳＥＲＭ）、抗プロゲステロン、エストロゲン受容体ダウンレギュレーター（ＥＲＤ）、エストロゲン受容体拮抗剤、黄体形成ホルモン放出ホルモン作動剤、抗アンドロゲン、アロマターゼ阻害剤、ＥＧＦＲ阻害剤、ＶＥＧＦ阻害剤、異常な細胞増殖又は腫瘍増殖に関与する遺伝子の発現を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチドが挙げられるが、これらに限定されない。本発明の化学療法剤の具体例としては、ゲムシタビン、ビノレルビン、エトポシド（ＶＰ－１６）、シスプラチン又はカルボプラチンなどの白金アナログ、パクリタキセル、アルブミン結合パクリタキセル、及びドキセタキセルなどのタキソイドなどが挙げられる。

【0090】

本発明の抗体又は抗原結合フラグメントを他の抗癌剤と併用する場合、別々に投与してもよく、又は複数の有効成分が単一の医薬製剤中に存在する複合医薬品の形態で適用してもよい。別々の製剤として投与する場合、２つの製剤を逐次的に投与してもよく、又は同時に投与してもよい。同時投与の場合は、一緒に患者に与えられる。逐次的投与の場合、長くない時間間隔で投与することができ、例えば、製剤は１２時間以内、又は６時間以内の期間に患者に投与することができる。

【0091】

一実施形態では、本発明は、癌を予防、改善、又は治療するための方法であって、被験体に、有効量の抗体又はその抗原結合フラグメントを、追加の抗癌剤と併用して投与することを含む方法を提供する。本実施形態は、抗ＢＣＡＭ抗体又は抗原結合フラグメントを含む単一の組成物を、追加の抗癌剤と共に、投与を必要とする患者に同時に投与することだけでなく、抗ＢＣＡＭ抗体又は抗原結合フラグメント及び追加の抗癌剤をそれぞれ別々に含む組成物を、投与を必要とする患者に同時又は逐次的に投与することも含む。

【0092】

別の実施形態では、本発明は、癌を予防、改善、又は治療するために追加の抗癌剤と併用するための抗ＢＣＡＭ抗体又はその抗原結合フラグメントの使用を提供する。

【0093】

別の実施形態では、本発明は、癌を予防、改善、又は治療するための医薬組成物又は組合せであって、抗ＢＣＡＭ抗体又はその抗原結合フラグメント、及び追加の抗癌剤を含む医薬組成物又は組合せを提供する。本明細書において、抗ＢＣＡＭ抗体又はその抗原結合フラグメント、及び追加の抗癌剤を含む医薬組成物又は組合せは、２つの構成成分が物理的に単一の製剤の形態で一緒に存在する場合だけでなく、２つの構成成分が別々の製剤で同時又は逐次的に投与される場合も含み、この場合、２つの薬物は別々に提供されてもよいし、単一のキットで一緒に提供されてもよい。したがって、本発明は、癌を予防、改善、又は治療するためのキットであって、抗ＢＣＡＭ抗体又はその抗原結合フラグメント、及び追加の抗癌剤を含むキットを提供する。

【0094】

医薬組成物
本発明は、抗ＢＣＡＭ抗体又はその抗原結合フラグメントを含む医薬組成物を提供する。組成物は不活性成分、すなわち薬学的に許容できる賦形剤（Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓなどを参照）を含有していてもよい。治療用製剤及び診断用製剤の組成物は、製剤を生理学的に許容できる担体、賦形剤、又は安定剤と混合することにより、例えば凍結乾燥粉末、スラリー、水溶液、又は懸濁液の形態で調製することができる。

【0095】

適切な投与経路としては、筋肉内投与、静脈内投与、又は皮下投与などの非経口投与が挙げられる。本発明の医薬組成物に使用される、又は本発明の方法を実施するために使用される抗体の投与は、局所適用、又は皮内、皮下、腹腔内、非経口、動脈内、若しくは静脈内注射などの様々な従来の方法によって実施することができる。一実施形態では、本発明の抗体は静脈内又は皮下投与される。

【実施例】

【0096】

以下、実施例を参照して本発明をより詳細に説明する。これらの実施例は、本発明をより詳細に説明することを意図しているに過ぎず、本発明の範囲は、本発明の主題に従って、これらの実施例によって限定されないことは、当業者には明らかであろう。

【0097】

実施例１：ファージディスプレイによるＢＣＡＭ特異的抗体の調製
１．１ ファージディスプレイによるｓｃＦｖ抗体ライブラリーの調製及び選択
本発明の抗体をファージディスプレイ法によって調製した。

【0098】

ヒト血液又は骨髄から得た抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域のｍＲＮＡをＰＣＲで増幅し、ｃＤＮＡを合成した。制限酵素を使用してファージミドベクターでクローニングを行い、エレクトロポレーションにより大腸菌で発現させた。続いて、ヘルパーファージで感染を行い、ｓｃＦｖの形態でヒトライブラリーを調製した。

【0099】

ライブラリーは、バイオパニングにより標的抗原ＢＣＡＭに高親和性で結合する抗体をスクリーニングした。ＢＣＡＭに結合する陽性クローンを選択し、配列決定によってＢＣＡＭに対してユニークなｓｃＦｖ配列を選択した。

【0100】

１．２ 抗ＢＣＡＭ ＩｇＧ４抗体１１１ａ～１１１ｃの調製
ヒトＩｇＧ４の形態の抗体を産生するために、実施例１．１で選択したｓｃＦｖの軽鎖領域及び重鎖領域を発現ベクターにクローニングした。ＤＮＡを一過性にトランスフェクトし、培養して抗体を発現させ、培養培地をκ領域捕捉体に結合させて抗体を溶出させ、３種類の抗ＢＣＡＭヒトＩｇＧ４抗体（１１１ａ、１１１ｂ、及び１１１ｃ）を調製した。

【0101】

各ＩｇＧ４抗体の軽鎖及び重鎖可変領域のアミノ酸配列、並びに各可変領域のＣＤＲのアミノ酸配列を、それぞれ図１ａ及び１ｂ、並びに表１及び２に示す（図１ａ及び１ｂ並びに表１中の太字及び下線の配列は、各ＣＤＲを表す）。

【0102】

【表1】

【0103】

【表2】

【0104】

実施例２：抗ＢＣＡＭ ＩｇＧ４抗体の結合活性の確認
２．１ ＥＬＩＳＡによる抗原タンパク質との結合能の確認
実施例１で調製した各抗体の抗原タンパク質（ＢＣＡＭタンパク質）に対する結合能を確認するため、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着測定法（Ｅｎｚｙｍｅ－Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ））試験を行った。抗原タンパク質をＰＢＳ緩衝液で希釈し、１５ｎＭの濃度に調製した。９６ウェルハーフプレート（Ｃｏｓｔａｒ、カタログ番号３６９０）の各ウェルに５０μＬの抗原タンパク質をコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。翌日、プレート内の溶液を全て除去した後、ブロッキング緩衝液（ＰＢＳ中３％ＢＳＡ）を各ウェルに添加し、３７℃で１時間インキュベートした。３種類の抗体サンプル（１１１ａ、１１１ｂ、及び１１１ｃ）をブロッキング緩衝液で１μＭから７点（１ｐＭ）まで１０倍の希釈比で順次希釈した。ブロッキング工程終了後、ウェルから緩衝液を除去し、希釈により調製した抗体を各ウェルに５０μＬずつ添加し、３７℃で２時間インキュベートした。インキュベートしたウェルを０．１％ＰＢＳＴ（ＰＢＳ中０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）で洗浄し、抗体検出用の二次抗体であるＨＲＰ複合抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ抗体（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号３１４２３）で３７℃、１時間処理した後、０．１％ＰＢＳＴで再度洗浄した。ＡＢＴＳ溶液（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号００－２０２４）を着色のために各ウェルに５０μＬずつ添加し、室温で１０分間反応させ、４０５ｎｍの光学濃度（ＯＤ_４０５）を測定した。抗体の濃度に応じたＯＤ_４０５値を図２及び表３に示す。各抗体の抗原に対する結合活性の程度を比較するため、各抗体のＥＣ５０濃度を算出し、結果を表４に示す。

【0105】

その結果、ＥＬＩＳＡ実験により試験した抗体１１１ａ、１１１ｂ、及び１１１ｃは、ＢＣＡＭに対して優れた結合能を有することが確認された。

【0106】

【表3】

【0107】

【表4】

【0108】

２．２ 蛍光標識細胞分取（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｓｏｒｔｉｎｇ）（ＦＡＣＳ、フローサイトメトリー）による抗原タンパク質への結合能の確認
実施例１で調製した３種類の抗体についてＦＡＣＳ試験を行った。

【0109】

ヒトＢＣＡＭ抗原は、トランスフェクション（２９３ＦＴ／ＢＣＡＭ１プラスミドを使用）によりＨＥＫ２９３ＦＴ細胞で発現させた。トランスフェクトしたＨＥＫ２９３ＦＴ細胞（１ｘ１０^５細胞）をＰＢＳに懸濁し、その５０μＬをプレートに播種した。

【0110】

これとは別に、実施例１の抗ＢＣＡＭ抗体とアイソタイプ対照（ヒトＩｇＧ）抗体の各々を、ＰＢＳを使用して４５μｇ／ｍＬの濃度で初期希釈し、３倍希釈で１２回希釈し、適切な時間、適切な温度でプレートをインキュベートした。陰性対照として、ＰＢＳ緩衝液を使用した。

【0111】

次いで、洗浄後、アレクサフルーア（ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ）（登録商標）６４７ ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（ｍｉｎ Ｘ Ｂｏｖ，Ｈｒｓ，Ｍｓ Ｓｒ Ｐｒｏｔ）（Ｊａｃｋｓｏｎ）（１μｇ／ｍＬ）を添加し、プレートを再度インキュベートし、ＰＢＳで再度洗浄し、フローサイトメータで抗原抗体結合度を解析した。

【0112】

結果を表５及び図３に示す。

【0113】

【表5】

【0114】

２．３ バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）による抗原タンパク質への結合能の確認
実施例１で調製した３種類の抗体について、オクテット（オクテットＱＫ、ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を使用してＢＬＩによる結合能確認試験を行った。

【0115】

具体的には、アミンカップリングを使用してヒトＢＣＡＭ（抗原）を結合させるため、Ｒｅａｃｔｉｖｅ ２ｎｄ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ（ＡＲ２Ｇ）バイオセンサー（カタログ番号１８－５０９４、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）をマウントし、ＡＥ２Ｇ試薬キット（カタログ番号１８－５０９５）を使用して活性化した。その後、バイオセンサーを抗原溶液に１０分間入れてヒトＢＣＡＭを結合させ、エタノールアミン溶液に５分間入れて反応を終了させた。ヒトＢＣＡＭが結合したバイオセンサーを、調製した３種類の抗体１１１ａ、１１１ｂ、及び１１１ｃを含む緩衝液に入れ、結合反応を５分間モニターした後、解離反応を１５分間行った。この時、抗体溶液を順次希釈し、濃度の違いによる会合及び解離速度を検証した。結合速度定数（Ｋａ）及び解離速度定数（Ｋｄ）は、カーブフィッティングソフトウェアを使用して１：１結合モデルに当てはめることにより決定した。結合解離平衡定数（ＫＤ）は、ＫＤ＝Ｋｄ／Ｋａで算出した。結合ダイナミクスデータを以下の表６に、結合センサーグラムを図４ａ、４ｂ、及び４ｃに示す。

【0116】

【表6】

【0117】

このことから、本発明の抗体はヒトＢＣＡＭタンパク質に高い親和性で結合することが確認された。

【0118】

実施例３：共焦点レーザー顕微鏡による抗体の細胞内在化の確認
実施例１で調製した３種類の抗体を使用して、抗体の細胞内在化を確認する実験を行った。

【0119】

５×１０^４個のＭＫＮ－１（ヒト胃癌細胞株、ＫＣＬＢ）細胞を細胞培養スライド（ＳＰＬ、韓国）に播種した。翌日、細胞がプレートに接着していることを確認し、既存の細胞培養培地を除去した後、実施例１で調製した抗体１１１ａ、１１１ｂ、及び１１１ｃをＰＢＳで希釈して１０μｇ／ｍＬ又は４０μｇ／ｍＬを調製し、各ウェルを抗体５００μＬで処理した。抗体を４℃で１時間反応させた後、残った抗体を除去し、細胞スライドをＰＢＳで３回洗浄した。細胞スライドを２つのグループに分け、一方のグループを細胞内在化の陰性対照とし、もう一方のグループを細胞内在化誘導グループとして使用した。陰性対照として使用する細胞スライドは、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ、Ｓｉｇｍａ、米国）を使用して固定（室温で１０分間処理）し、細胞内在化誘導グループとして使用する細胞スライドは、３７℃のインキュベータに移して１時間インキュベートした後、陰性対照と同様に４％ＰＦＡを使用して固定した。固定した各細胞スライドをＰＢＳで洗浄してＰＦＡを完全に除去した後、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ１００を用いて１５分間室温で処理し、二次抗体の透過を可能にする準備をした。細胞スライドをＰＢＳ洗浄及びブロッキング工程（３％ＢＳＡで室温２０分処理）に供した後、細胞スライドを蛍光複合化二次抗体（１０μｇ／ｍＬのアレクサ４８８複合化ヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国）を用いて４℃で１時間処理した。二次抗体処理に供した細胞スライドは、核染色のためにそれぞれヘキスト３３３４２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国）を用いて室温で３分間処理し、ＰＢＳで洗浄し、マウント液（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、米国）で処理し、カバーガラスで覆ってスライドサンプルを完成させた。抗体の細胞内在化の程度は、ＬＳＭ７１０共焦点レーザー顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ、ドイツ）を使用して４００倍の倍率で観察した。

【0120】

結果を図５に示す。陰性対照グループ（細胞内在化を誘導しなかった４℃及び１時間の抗体処理条件、図５の上段写真）の場合では、３種類の抗体はそれぞれ癌細胞表面に結合していたが、細胞内在化誘導条件である３７℃及び１時間の抗体処理条件（図５の下段写真）の場合では、各抗体は細胞内に内在化し、細胞表面の蛍光シグナルは減少したが、細胞内の蛍光シグナルは増加したことが確認された（核染色部分の蛍光シグナルをアスタリスクで示し、各抗体染色部分の蛍光シグナルを三角で示す）。これらの結果は、本発明の抗体が細胞内在化を通じて細胞毒性薬物を細胞内に送達する可能性を有すること、すなわち、該抗体は、将来的に薬物と複合したＡＤＣの形態で使用され得ることを示している。

【図1a】

【図1b】

【図2】

【図3】

【図4a】

【図4b】

【図4c】

【図5】

【配列表】

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【国際調査報告】