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特表2024-521548主要な化合物としてＬＮＦＰ－Ｉ及び２’－ＦＬを有するＨＭＯブレンドプロファイルを生成する方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-06-03
(54)【発明の名称】主要な化合物としてＬＮＦＰ－Ｉ及び２’－ＦＬを有するＨＭＯブレンドプロファイルを生成する方法
(51)【国際特許分類】
C12P 19/18 20060101AFI20240527BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20240527BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20240527BHJP
C12N 15/54 20060101ALN20240527BHJP
C12N 15/69 20060101ALN20240527BHJP
C12N 15/67 20060101ALN20240527BHJP
C12N 15/31 20060101ALN20240527BHJP
【ＦＩ】
C12P19/18 ZNA
C12N1/21
C12N1/19
C12N15/54
C12N15/69 Z
C12N15/67 Z
C12N15/31
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023565527
(86)(22)【出願日】2022-05-17
(85)【翻訳文提出日】2023-12-22
(86)【国際出願番号】 EP2022063317
(87)【国際公開番号】W WO2022243314
(87)【国際公開日】2022-11-24
(31)【優先権主張番号】PA202170247
(32)【優先日】2021-05-17
(33)【優先権主張国・地域又は機関】DK
(31)【優先権主張番号】PA202170390
(32)【優先日】2021-07-20
(33)【優先権主張国・地域又は機関】DK
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】503220392
【氏名又は名称】ディーエスエム アイピー アセッツ ビー．ブイ．
【氏名又は名称原語表記】ＤＳＭ ＩＰ ＡＳＳＥＴＳ Ｂ．Ｖ．
【住所又は居所原語表記】Ｈｅｔ Ｏｖｅｒｌｏｏｎ １， ＮＬ－６４１１ ＴＥ Ｈｅｅｒｌｅｎ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ
(74)【代理人】
【識別番号】100107456
【弁理士】
【氏名又は名称】池田 成人
(74)【代理人】
【識別番号】100128381
【弁理士】
【氏名又は名称】清水 義憲
(74)【代理人】
【識別番号】100162352
【弁理士】
【氏名又は名称】酒巻 順一郎
(72)【発明者】
【氏名】パパダキス， マノス
(72)【発明者】
【氏名】ヨハンソン， テッド
(72)【発明者】
【氏名】ベッカー， ピーター
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B064AF04
4B064CA19
4B064CA21
4B064CC24
4B064DA10
4B065AA01Y
4B065AA19X
4B065AA24X
4B065AA26X
4B065AA30X
4B065AA77X
4B065AA80X
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA01
4B065CA21
4B065CA41
(57)【要約】
本開示は、主要なＨＭＯとしてＬＮＦＰ－Ｉ及び２’－ＦＬを有するヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）ブレンドを生成するための方法であって、方法が、遺伝的に操作された細胞を準備する工程であって、上記細胞が、異種β－１，３－Ｎ－アセチル－グルコサミニルトランスフェラーゼタンパク質、異種β－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼタンパク質、異種α－１，２－フコシルトランスフェラーゼタンパク質を含み、コラン酸遺伝子クラスターを機能的に発現し、タンパク質の発現を制御するための天然又は異種調節又はエピソーム要素を含み、任意選択的に異種糖トランスポータを発現する工程と、好適な細胞培養培地中で細胞を培養し、上記タンパク質を発現し、ＨＭＯブレンドを生成する工程と、を含む方法に関する。
【選択図】図１
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
主要なＨＭＯとして２’－ＦＬ及びＬＮＦＰ－Ｉを有するヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）ブレンドを生成するための方法であって、ａ．少なくとも２つのＨＭＯを産生することができる遺伝的に操作された細胞を準備する工程であって、前記細胞が、
ｉ．配列番号１、２、若しくは３で示される異種β－１，３－Ｎ－アセチル－グルコサミニルトランスフェラーゼタンパク質、又は配列番号１２若しくは３と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体を含み、
ｉｉ．配列番号４若しくは５で示される異種β－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼタンパク質、又は配列番号４若しくは５と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体を含み、且つ
ｉｉｉ．配列番号６及び７及び４９のいずれか１つで示される異種α－１，２－フコシルトランスフェラーゼタンパク質、又は配列番号６若しくは７若しくは４９のいずれか１つと少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体を含み、
ｉｖ．コラン酸遺伝子クラスターを機能的に発現し、且つ
ｖ．ｉ）～ｉｖ）のいずれか１つの前記発現を制御するための天然又は異種調節要素を含む工程と、
ｂ．好適な細胞培養培地で（ａ）に従って前記細胞を培養し、前記タンパク質を発現し、ＨＭＯブレンドを生成する工程と、
ｃ．工程（ｂ）で生成された前記ヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）ブレンドを収集する工程と、を含む方法。
【請求項2】
前記コラン酸遺伝子クラスターを、コピー数を増加させることによって、及び／又は前記発現を制御するための調節要素として適切な要素を選択することによって過剰発現する、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記異種β－１，３－Ｎ－アセチル－グルコサミニルトランスフェラーゼタンパク質が、配列番号１又は配列番号１と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項4】
前記異種β－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼタンパク質が、配列番号４又は配列番号４と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体である、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
ｉ）及びｉｉ）の前記発現を、前記コピー数を増加させることによって、並びに／又はｉ）及びｉｉ）に適切な調節要素を選択することによって過剰発現する、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
ｉ）及び／若しくはｉｉ）の前記発現が、単一コピーから得られる、並びに／又はｉ）及び／若しくはｉｉ）の発現のための前記調節要素が、低い又は中間の強度を有する、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
ｉ）及び／若しくはｉｉ）の前記発現が、２つ以上のコピーから得られる、並びに／又はｉ）及び／若しくはｉｉ）の発現のための前記調節要素が、高い強度を有する、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
前記調節要素が、配列番号１３（ＰｇｌｐＦ）、配列番号１２（ＰｇａｔＹ＿７０ＵＴＲ）、配列番号２７（Ｐｌａｃ）、配列番号９（ＰｍｇｌＢ＿７０ＵＴＲ）、配列番号１１（Ｐｓｃｒ）、又はこれらのバリアントからなる群から選択される、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
前記調節要素が、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ９（配列番号２３）、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ７（配列番号２１）、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ６（配列番号２０）、ＰｇｌｐＦ＿Ｂ２８（配列番号２４）、ＰｇｌｐＦ＿Ｂ２９（配列番号２５）、Ｐｓｃｒ（配列番号１１）、及びＰｌａｃ（配列番号２７）からなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項10】
前記調節要素が、ＰｇｌｐＦ（配列番号１３）、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ１０（配列番号１５）、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ８（配列番号２２）、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ５（配列番号１９）、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ４（配列番号１８）、ＰｇａｔＹ＿７０ＵＴＲ（配列番号１２）、ＰｍｇｌＢ＿７０ＵＴＲ（配列番号９）、及びＰｍｇｌＢ＿７０ＵＴＲ＿ＳＤ４（配列番号９）からなる群から選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項11】
ｖ）又はｖ）の上流の領域に結合し、ｉ）、ｉｉ）、ｉｉｉ）、又はｉｖ）のいずれか１つの前記発現を抑制する遺伝子産物が、前記細胞内で欠失しているか又は機能しない、請求項１～１０のいずれか一項の記載の方法。
【請求項12】
前記遺伝子産物が、ＤＮＡ結合転写リプレッサＧｌｐＲ（配列番号４８）である、請求項１１に記載の方法。
【請求項13】
ｉｉｉ）の前記異種α－１，２－フコシルトランスフェラーゼタンパク質が、ＦｕｔＣ（配列番号６）である、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項14】
前記細胞が、発現時に糖排出トランスポータとして機能する遺伝子産物をさらに含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項15】
前記糖排出トランスポータが、ｉ．配列番号２８、又は配列番号２８と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体、
ｉｉ．配列番号２９、又は配列番号２９と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体、
ｉｉｉ．配列番号３０、又は配列番号３０と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体、
ｉｖ．配列番号３１、又は配列番号３１と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体、
ｖ．配列番号３２、又は配列番号３２と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体、及び
ｖｉ．配列番号３３、又は配列番号３３と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体、
から選択されるアミノ酸配列からなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項16】
前記ＨＭＯブレンドが、前記全ＨＭＯのモル％の２５％～７０％の２’－ＦＬ、及び３０％～６０％のＬＮＦＰ－Ｉを有する、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項17】
工程（ｂ）の前記遺伝的に操作された細胞の培養中発酵温度が、３０～３２℃であり、２’－ＦＬのモル％が、前記生成されたＨＭＯブレンドの３０％～４０％である、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項18】
工程（ｂ）の前記遺伝的に操作された細胞の培養中のラクトースのレベルは、２０ｇ／Ｌ未満であり、２’－ＦＬのモル％が、前記生成されたＨＭＯブレンドの２５％～３５％である、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項19】
ｉｉ．配列番号１若しくは２若しくは３で示される異種β－１，３－Ｎ－アセチル－グルコサミニルトランスフェラーゼタンパク質、又は配列番号１、２、若しくは３と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体と、ｉｉｉ．配列番号４若しくは５で示される異種β－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼタンパク質、又は配列番号４若しくは５と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体と、
ｉｖ．配列番号６及び７のいずれか１つで示される異種α－１，２－フコシルトランスフェラーゼタンパク質、又は配列番号６若しくは７若しくは４９のいずれか１つと少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体と、
ｖ．コラン酸遺伝子クラスターと、
ｖｉ．ｉ）～ｉｖ）のいずれか１つの前記発現を制御するための天然若しくは異種調節又はエピソーム要素と、
ｖｉｉ．２’ＦＬ及び／又はＬＮＦＰ－Ｉを前記細胞外に輸送することができる糖排出トランスポータをコードする組換え核酸配列と、
をコードする組換え核酸配列を含む遺伝的に操作された細胞。
【請求項20】
コラン酸遺伝子クラスターを、前記コピー数を増加させることによって、及び／又は適切な調節要素を選択することによって過剰発現する、請求項１９に記載の遺伝的に操作された細胞。
【請求項21】
前記細胞が、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、Ｃ．グルタミクム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、Ｌ．ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、Ｓ．リビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）、Ｐ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）、及び出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）からなる群から選択される、請求項１９又は２０に記載の遺伝的に操作された細胞。
【請求項22】
１つ以上のＨＭＯの産生における、請求項１９又は２０に記載の遺伝的に操作された細胞の使用。
【請求項23】
前記１つ以上のＨＭＯが、主に、２’－ＦＬ及びＬＮＦＰ－Ｉのブレンドである、請求項２２に記載の使用。
【請求項24】
前記主要なＨＭＯブレンドが、全ＨＭＯのモル％の２５～７０％の２’－ＦＬ、及び全ＨＭＯのモル％の３０～６０％のＬＮＦＰ－Ｉを有する、請求項２２又は２３に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【0001】
［分野］
本開示は、主にＬＮＦＰ－Ｉ及び２’－ＦＬ、並びにあまり重要でない量のその他のＨＭＯからなる、固有のＨＭＯブレンドプロファイルを有する様々なヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）の混合物を生成する方法に関する。あまり豊富でないＨＭＯは、ＬＮＴ、ＬＮＴ－ＩＩ、又はＤＦＬである場合がある。特定のＨＭＯブレンドを達成するための戦略には、菌株操作及び発酵方法が含まれる。
本開示は、主にＬＮＦＰ－Ｉ及び２’－ＦＬ、並びにあまり重要でない量のその他のＨＭＯからなる、固有のＨＭＯブレンドプロファイルを有する様々なヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）の混合物を生成する方法に関する。あまり豊富でないＨＭＯは、ＬＮＴ、ＬＮＴ－ＩＩ、又はＤＦＬである場合がある。特定のＨＭＯブレンドを達成するための戦略には、菌株操作及び発酵方法が含まれる。
【0002】
［背景］
ヒト乳は、炭水化物、脂肪、タンパク質、ビタミン、ミネラル及び微量元素の複合混合物を表す。最も主要な画分は、炭水化物によって表され、炭水化物は更に、ラクトース及びより複合したオリゴ糖（ヒト乳オリゴ糖、ＨＭＯ）に更に分けることができる。ラクトースはエネルギー源として使用されるが、複合オリゴ糖は乳児によって代謝されない。複合オリゴ糖の画分は、炭水化物画分全体の最大１／１０を占め、おそらく１５０種を超える異なるオリゴ糖で構成されている。これらの複合オリゴ糖の発生及び濃度は、ヒトに特有であり、例えば家畜化された乳畜などの他の哺乳類の乳に大量に存在することはない。
ヒト乳は、炭水化物、脂肪、タンパク質、ビタミン、ミネラル及び微量元素の複合混合物を表す。最も主要な画分は、炭水化物によって表され、炭水化物は更に、ラクトース及びより複合したオリゴ糖（ヒト乳オリゴ糖、ＨＭＯ）に更に分けることができる。ラクトースはエネルギー源として使用されるが、複合オリゴ糖は乳児によって代謝されない。複合オリゴ糖の画分は、炭水化物画分全体の最大１／１０を占め、おそらく１５０種を超える異なるオリゴ糖で構成されている。これらの複合オリゴ糖の発生及び濃度は、ヒトに特有であり、例えば家畜化された乳畜などの他の哺乳類の乳に大量に存在することはない。
【0003】
現在まで、少なくとも１１５種のＨＭＯの構造が決定されており、ヒト乳中には、おそらくはるかにより多くのものが存在する。ＨＭＯは、ヒト発生における重要な機能性の発見により、過去１０年の間で非常に感心が高くなった。それらのプレバイオティクス特性の他に、ＨＭＯは、それらの適用分野を拡大する追加のプラスの効果と結び付けられている。ＨＭＯの健康上の利点は、乳児用調製粉乳及び乳児食などの食品における使用、並びに消費者用健康食品のためのそれらの承認を可能にした。
【0004】
ＨＭＯの化学合成と関連する欠点を回避するために、いくつかの酵素的方法及び発酵手法が開発されている。発酵に基づくプロセスは、伝統的に、２’－フコシルラクトース（２’－ＦＬ）、３－フコシルラクトース（３－ＦＬ）、ラクト－Ｎ－テトラオース（ＬＮＴ）、ラクト－Ｎ－ネオテトラオース（ＬＮｎＴ）、３’－シアリルラクトース（３’－ＳＬ）、及び６’－シアリルラクトース（６’－ＳＬ）などの個々のＨＭＯのために開発されている。発酵系プロセスでは、典型的には、組換え大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの遺伝的に操作された細菌株が利用される。
【0005】
発酵プロセスなどのＨＭＯの生物工学的生産は、費用効率良く且つ大規模でＨＭＯを製造するための有益なアプローチである。その方法は、所望のオリゴ糖の合成のために必要とされるグリコシルトランスフェラーゼを発現するように構築された遺伝子操作細菌に依存し、ＨＭＯ前駆体としてのヌクレオチド糖の細菌の固有のプールを利用する。現在、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＩ（ＬＮＦＰ－Ｉ）含有ブレンドの組成物を作成する方法、及び遺伝子工学又は発酵パラメータの調整のいずれかによって獲得したブレンドの様々なＨＭＯレベルを微調整する方法に関する知識は存在しない。なぜなら、ＨＭＯ製造のための商業的発酵プロセスパラメーターは通常秘密にされており、したがって、例えば発酵パラメータがＬＮＦＰ－Ｉブレンド組成物又は他のＨＭＯブレンドに及ぼす影響は記載されていないためである。
【0006】
国際公開第２０１９／００１１１３３号パンフレットは、ＬＮＴ又はＬＮｎＴをフコシル化して、ＬＮＦＰ－Ｉ、ＬＮＦＰ－ＩＩ、ＬＮＦＰ－ＩＩＩ、及びＬＮＦＰ－ＶＩを生成することができるフコシルトランスフェラーゼの同定について記載している。具体的には、ＬＮＦＰ－Ｉを生成するためのＦｕｃＴフコシルトランスフェラーゼの使用が記載されている。しかしながら、ＬＮＦＰ－Ｉと２’－ＦＬのブレンドを生成することができるフコシルトランスフェラーゼの開示はされていない。
【0007】
国際公開第２０１９／１２３３２４号パンフレットは、ＬＮＦＰ－Ｉの形成について記載しているが、形成されるＨＭＯの総量に含まれるＬＮＦＰ－Ｉ又は２’－ＦＬのモル％は示されていない。
【0008】
［概要］
本開示は、ＨＭＯブレンドの生物工学的生成を目的とし、一方で、通常、産業界の焦点は純粋なＨＭＯの生成にあり、即ち、典型的な関心は、ＨＭＯ副産物レベルを最小限に抑え、遠心分離などの下流プロセスで副産物を精製することである。
本開示は、ＨＭＯブレンドの生物工学的生成を目的とし、一方で、通常、産業界の焦点は純粋なＨＭＯの生成にあり、即ち、典型的な関心は、ＨＭＯ副産物レベルを最小限に抑え、遠心分離などの下流プロセスで副産物を精製することである。
【0009】
本開示は、多様な可能性のあるブレンド組成の中から、主要なＨＭＯとしてＬＮＦＰ－Ｉ及び２’－ＦＬを有する、遺伝的に操作された細胞から特定のＨＭＯブレンドを生成し、それらを特定の市場、顧客に合わせて調整し、特定の生物学的効果を達成する方法に関する詳細で深い知識を提供するが、特定のＨＭＯ及びＨＭＯ混合物の生物学的活性及び機能に関する知識は、急速に出現している。
【0010】
直接的な利点は、ブレンドが１つの産生菌株によって製造され、ＨＭＯの混合物として精製されるため、いくつかの産生菌株によって生成された個別に産生されたＨＭＯが混合されないことである。これにより、より持続可能な製造プロセスが実現し；貴重なＨＭＯが精製プロセス中に廃棄されないため、発酵における炭素源からＨＭＯ生成物への変換が、より高い全体収率で行われる。
【0011】
その最も広い態様において、本開示は、主要なＨＭＯとしてＬＮＦＰ－Ｉ及び／又は２’－ＦＬを有するヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）ブレンドを生成するための方法であって、生成される総ヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）の６０モル％超がＬＮＦＰ－Ｉであり、方法が：
ａ．ＨＭＯを産生することができる遺伝的に操作された細胞を準備する工程であって、上記細胞が、
ｉ．配列番号１［ｌｇｔＡ］若しくは２［ＰｍｎａｇＴ］若しくは３［ＨＤ０４６６］で示される異種β－１，３－Ｎ－アセチル－グルコサミニルトランスフェラーゼタンパク質、又は配列番号１、２、若しくは３と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体を含み；且つ
ｉｉ．配列番号４［ｇａｌＴＫ］若しくは５［ｃｖｂ３ｇａｌＴ］で示される異種β－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼタンパク質、又は配列番号４若しくは５と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体を含み；且つ
ｉｉｉ．配列番号６［ｆｕｔＣ］及び７［ｍｔｕｎ］及び４９［ＦｕｃＴ５４］のいずれか１つで示される異種α－１，２－フコシルトランスフェラーゼタンパク質、又は配列番号６及び７及び４９８と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有するその機能的相同体を含み；且つ
ｉｖ．コラン酸遺伝子クラスターを機能的に発現し、且つ
ｖ．ｉ）～ｉｖ）のいずれか１つの発現を制御するための天然又は異種調節要素を含む工程と、
ｂ．好適な細胞培養培地で（ａ）に従って細胞を培養し、上記タンパク質を発現し、ＨＭＯブレンドを生成する工程と、
ｃ．工程（ｂ）で生成されたヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）ブレンドを収集する工程と、を含む方法に関する。
ａ．ＨＭＯを産生することができる遺伝的に操作された細胞を準備する工程であって、上記細胞が、
ｉ．配列番号１［ｌｇｔＡ］若しくは２［ＰｍｎａｇＴ］若しくは３［ＨＤ０４６６］で示される異種β－１，３－Ｎ－アセチル－グルコサミニルトランスフェラーゼタンパク質、又は配列番号１、２、若しくは３と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体を含み；且つ
ｉｉ．配列番号４［ｇａｌＴＫ］若しくは５［ｃｖｂ３ｇａｌＴ］で示される異種β－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼタンパク質、又は配列番号４若しくは５と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体を含み；且つ
ｉｉｉ．配列番号６［ｆｕｔＣ］及び７［ｍｔｕｎ］及び４９［ＦｕｃＴ５４］のいずれか１つで示される異種α－１，２－フコシルトランスフェラーゼタンパク質、又は配列番号６及び７及び４９８と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有するその機能的相同体を含み；且つ
ｉｖ．コラン酸遺伝子クラスターを機能的に発現し、且つ
ｖ．ｉ）～ｉｖ）のいずれか１つの発現を制御するための天然又は異種調節要素を含む工程と、
ｂ．好適な細胞培養培地で（ａ）に従って細胞を培養し、上記タンパク質を発現し、ＨＭＯブレンドを生成する工程と、
ｃ．工程（ｂ）で生成されたヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）ブレンドを収集する工程と、を含む方法に関する。
【0012】
プロモータなどのｖ）の調節要素は、前述のグリコシルトランスフェラーゼ（ｉ～ｉｉｉ）及びコラン酸（ｃｏｌｏｎｉｃ ａｃｉｄ）遺伝子クラスター（ｉｖ）の発現を制御し、この調節要素は、構築体（プロモータ／調節要素＋コーディング配列）のｉ、ｉｉ、ｉｉｉ、及び／又はｉｖのコーディング配列に先行しなければならない。構築体は、ゲノム中に組み込まれ得るか、又は構築体は、プラスミド又は別のエピソーム要素の形で細胞に導入され得る。
【0013】
本明細書で開示される更なる態様は、
ｉ．配列番号１若しくは２若しくは３で示される異種β－１，３－Ｎ－アセチル－グルコサミニルトランスフェラーゼタンパク質、又は配列番号１、２、若しくは３と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体と；
ｉｉ．配列番号４若しくは５で示される異種β－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼタンパク質、又は配列番号４若しくは５と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体と；
ｉｉｉ．配列番号６若しくは７若しくは４９のいずれか１つで示される異種α－１，２－フコシルトランスフェラーゼタンパク質、又は配列番号６、７、若しくは４９のいずれか１つと少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体と；
ｉｖ．コラン酸遺伝子クラスターと、
ｖ．ｉ）～ｉｖ）のいずれか１つの発現を制御するための天然若しくは異種調節又はエピソーム要素と、
ｖｉ．２’ＦＬ及び／又はＬＮＦＰ－Ｉを細胞外に輸送することができる糖排出トランスポータをコードする組換え核酸配列と、
をコードする組換え核酸配列を含む遺伝的に操作された細胞に関する。
ｉ．配列番号１若しくは２若しくは３で示される異種β－１，３－Ｎ－アセチル－グルコサミニルトランスフェラーゼタンパク質、又は配列番号１、２、若しくは３と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体と；
ｉｉ．配列番号４若しくは５で示される異種β－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼタンパク質、又は配列番号４若しくは５と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体と；
ｉｉｉ．配列番号６若しくは７若しくは４９のいずれか１つで示される異種α－１，２－フコシルトランスフェラーゼタンパク質、又は配列番号６、７、若しくは４９のいずれか１つと少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体と；
ｉｖ．コラン酸遺伝子クラスターと、
ｖ．ｉ）～ｉｖ）のいずれか１つの発現を制御するための天然若しくは異種調節又はエピソーム要素と、
ｖｉ．２’ＦＬ及び／又はＬＮＦＰ－Ｉを細胞外に輸送することができる糖排出トランスポータをコードする組換え核酸配列と、
をコードする組換え核酸配列を含む遺伝的に操作された細胞に関する。
【0014】
更なる態様において、本開示は、
ｉ．配列番号１［ｌｇｔＡ］若しくは配列番号２［ＰｍｎａｇＴ］若しくは配列番号３［ＨＤＯ４６６］で示される異種β－１，３－Ｎ－アセチル－グルコサミニルトランスフェラーゼタンパク質、又は配列番号１、２、若しくは３と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体、及び
ｉｉ．配列番号４［ｇａｌＴＫ］若しくは配列番号５［ｃｖｂ３ｇａｌＴ］で示される異種β－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼタンパク質、又は配列番号４若しくは５と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体、及び
ｉｉｉ．配列番号６［ｆｕｔＣ］若しくは配列番号７［ｍｔｕｎ］若しくは配列番号４９［ｆｕｃＴ５４］のいずれか１つで示される異種α－１，２－フコシルトランスフェラーゼタンパク質、又は配列番号６、７、若しくは４９のいずれか１つと少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体
からなる群から選択されるタンパク質の１つ以上をコードする核酸配列を含む核酸構築体であって、
ｉｖ．コラン酸遺伝子クラスター（ｇｍｄ、ｗｃａＧ、ｗｃａＨ、ｗｃａＩ、ｍａｎＣ、ｍａｎＢ）を機能的に発現し、
上記核酸構築体が、核酸構築体中に存在する遺伝子の発現を制御するための天然若しくは異種の調節要素、即ちｉ）～ｉｖ）の１つ以上を更に含む、核酸構築体に関する。好ましくは、調節要素は、ｌａｃオペロン又はｇｌｐオペロンのプロモータ配列に由来する組換えプロモータ配列であり、ｉ）～ｉｖ）のコーディング配列のうちの１つ以上とプロモータ配列とが作動可能に連結している。
ｉ．配列番号１［ｌｇｔＡ］若しくは配列番号２［ＰｍｎａｇＴ］若しくは配列番号３［ＨＤＯ４６６］で示される異種β－１，３－Ｎ－アセチル－グルコサミニルトランスフェラーゼタンパク質、又は配列番号１、２、若しくは３と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体、及び
ｉｉ．配列番号４［ｇａｌＴＫ］若しくは配列番号５［ｃｖｂ３ｇａｌＴ］で示される異種β－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼタンパク質、又は配列番号４若しくは５と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体、及び
ｉｉｉ．配列番号６［ｆｕｔＣ］若しくは配列番号７［ｍｔｕｎ］若しくは配列番号４９［ｆｕｃＴ５４］のいずれか１つで示される異種α－１，２－フコシルトランスフェラーゼタンパク質、又は配列番号６、７、若しくは４９のいずれか１つと少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体
からなる群から選択されるタンパク質の１つ以上をコードする核酸配列を含む核酸構築体であって、
ｉｖ．コラン酸遺伝子クラスター（ｇｍｄ、ｗｃａＧ、ｗｃａＨ、ｗｃａＩ、ｍａｎＣ、ｍａｎＢ）を機能的に発現し、
上記核酸構築体が、核酸構築体中に存在する遺伝子の発現を制御するための天然若しくは異種の調節要素、即ちｉ）～ｉｖ）の１つ以上を更に含む、核酸構築体に関する。好ましくは、調節要素は、ｌａｃオペロン又はｇｌｐオペロンのプロモータ配列に由来する組換えプロモータ配列であり、ｉ）～ｉｖ）のコーディング配列のうちの１つ以上とプロモータ配列とが作動可能に連結している。
【0015】
別の態様において、本開示は、１つ以上のヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）、特に主要なＨＭＯとしてＬＮＦＰ－Ｉ及び２’－ＦＬを有するヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）ブレンドの生合成生成のための、本開示による遺伝的に操作された細胞又は核酸構築体の使用に関する。
【0016】
［詳細な説明］
種々の例示的な実施形態及び詳細は、関連する場合に図及び配列を参照して以降で説明される。図はまた、実施形態の説明を容易にすることのみを意図されることに留意するべきである。これらは、本開示の包括的な説明又は本開示の範囲に対する限定として意図されない。加えて、示される実施形態は、示される全ての態様又は利点を有する必要はない。特定の実施形態と併せて説明される態様又は利点は、その実施形態に必ずしも限定されず、そのように示されないか又はそのように明示的に説明されないとしても、他のあらゆる実施形態で実行され得る。
種々の例示的な実施形態及び詳細は、関連する場合に図及び配列を参照して以降で説明される。図はまた、実施形態の説明を容易にすることのみを意図されることに留意するべきである。これらは、本開示の包括的な説明又は本開示の範囲に対する限定として意図されない。加えて、示される実施形態は、示される全ての態様又は利点を有する必要はない。特定の実施形態と併せて説明される態様又は利点は、その実施形態に必ずしも限定されず、そのように示されないか又はそのように明示的に説明されないとしても、他のあらゆる実施形態で実行され得る。
【0017】
［例示的な方法］
本開示は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主細胞を、ＬＮＦＰ－Ｉ及び２’－ＦＬ生成のための遺伝的に操作された細胞ファクトリーに変換する。遺伝的に操作された細胞は、以下を目的とした応用合理的遺伝子操作プログラムの重点分野に該当する：
ａ）ＨＭＯ生成プロセスにおける重要な基質、即ち、ラクトース及びＬＮＴに対して明確な特異性を示す様々な野生型α－１，２－フコシルトランスフェラーゼをスクリーニングする、
ｂ）例えば、２’－ＦＬ及び／又はＬＮＦＰ－Ｉを細胞外に輸送できる主要ファシリテータースーパーファミリー（ＭＦＳ）の糖トランスポータを導入する、
ｃ）活性化糖ＧＤＰ－フコース、ＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃ、及びＵＤＰ－Ｇａｌ（糖供与体）の合成を含む、ＬＮＦＰ－Ｉ及び２’－ＦＬ生合成経路に直接関与する酵素をコードする遺伝子のコピー数及び／又は遺伝子の発現を増加させる、並びに
ｄ）ラクトース、ＬＮＴ－ＩＩ、及びＬＮＴ（糖受容体）を修飾して、それぞれＬＮＴ－ＩＩ、２’－ＦＬ、ＬＮＴ、及びＬＮＦＰ－Ｉを形成する。
本開示は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主細胞を、ＬＮＦＰ－Ｉ及び２’－ＦＬ生成のための遺伝的に操作された細胞ファクトリーに変換する。遺伝的に操作された細胞は、以下を目的とした応用合理的遺伝子操作プログラムの重点分野に該当する：
ａ）ＨＭＯ生成プロセスにおける重要な基質、即ち、ラクトース及びＬＮＴに対して明確な特異性を示す様々な野生型α－１，２－フコシルトランスフェラーゼをスクリーニングする、
ｂ）例えば、２’－ＦＬ及び／又はＬＮＦＰ－Ｉを細胞外に輸送できる主要ファシリテータースーパーファミリー（ＭＦＳ）の糖トランスポータを導入する、
ｃ）活性化糖ＧＤＰ－フコース、ＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃ、及びＵＤＰ－Ｇａｌ（糖供与体）の合成を含む、ＬＮＦＰ－Ｉ及び２’－ＦＬ生合成経路に直接関与する酵素をコードする遺伝子のコピー数及び／又は遺伝子の発現を増加させる、並びに
ｄ）ラクトース、ＬＮＴ－ＩＩ、及びＬＮＴ（糖受容体）を修飾して、それぞれＬＮＴ－ＩＩ、２’－ＦＬ、ＬＮＴ、及びＬＮＦＰ－Ｉを形成する。
【0018】
原則として、合理的なエンジニアリング戦略（ｃ）は複数の方法で適用することができる：
１）コラン酸遺伝子クラスター及び／又は２’－ＦＬ及び／又はＬＮＦＰ－Ｉの合成に関与する酵素をコードするグリコシルトランスフェラーゼ遺伝子のコピー数を変更して、これら２つのＨＭＯの比率を所望のレベルに微調整することができ、
２）これらの遺伝子の単一コピーの発現を転写レベル又は翻訳レベルで変化させることによって、同じ効果を達成できる。換言すれば、単一遺伝子コピーの発現を駆動するプロモータの強度及び／又は対応するｍＲＮＡのリボソーム結合を定義するシャイン・ダルガーノ配列の強度は、２’－ＦＬ及びＬＮＦＰ－Ｉの比率を望ましいレベルまで微調整するために様々な方法で変更することができ、
３）ＨＭＯ生成プロセスにおける重要な遺伝子の発現を抑制する制御因子の欠失は、最終産生細胞におけるＨＭＯ力価の改善、又は所与のブレンドの様々なＨＭＯの相対濃度の変更に向けた別の方法である。したがって、様々なＨＭＯの生合成における重要な工程を触媒する酵素のＰｇｌｐＦ駆動遺伝子発現のＧｌｐＲによる抑制が排除されると、それらのｍＲＮＡ及びおそらくそれらによってコードされる酵素のレベルが増加する可能性がある。後者は、最終的に全ＨＭＯ力価が高くなるだけでなく、ＬＮＦＰＩ－含有ＨＭＯブレンド中に存在する様々なＨＭＯの相対濃度の複数の変化も引き起こす可能性がある。
１）コラン酸遺伝子クラスター及び／又は２’－ＦＬ及び／又はＬＮＦＰ－Ｉの合成に関与する酵素をコードするグリコシルトランスフェラーゼ遺伝子のコピー数を変更して、これら２つのＨＭＯの比率を所望のレベルに微調整することができ、
２）これらの遺伝子の単一コピーの発現を転写レベル又は翻訳レベルで変化させることによって、同じ効果を達成できる。換言すれば、単一遺伝子コピーの発現を駆動するプロモータの強度及び／又は対応するｍＲＮＡのリボソーム結合を定義するシャイン・ダルガーノ配列の強度は、２’－ＦＬ及びＬＮＦＰ－Ｉの比率を望ましいレベルまで微調整するために様々な方法で変更することができ、
３）ＨＭＯ生成プロセスにおける重要な遺伝子の発現を抑制する制御因子の欠失は、最終産生細胞におけるＨＭＯ力価の改善、又は所与のブレンドの様々なＨＭＯの相対濃度の変更に向けた別の方法である。したがって、様々なＨＭＯの生合成における重要な工程を触媒する酵素のＰｇｌｐＦ駆動遺伝子発現のＧｌｐＲによる抑制が排除されると、それらのｍＲＮＡ及びおそらくそれらによってコードされる酵素のレベルが増加する可能性がある。後者は、最終的に全ＨＭＯ力価が高くなるだけでなく、ＬＮＦＰＩ－含有ＨＭＯブレンド中に存在する様々なＨＭＯの相対濃度の複数の変化も引き起こす可能性がある。
【0019】
したがって、主要なＨＭＯとしてＬＮＦＰ－Ｉ及び２’－ＦＬを有するヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）ブレンドを生成するための方法が開示される。好ましくは、ＨＭＯブレンドは、全ＨＭＯのモル％の２５％～７０％の２’－ＦＬ、及び３０％～６０％のＬＮＦＰ－Ｉを有する。
【0020】
方法は、ＨＭＯブレンドを産生することができる遺伝的に操作された細胞を準備することを含む。遺伝的に操作された細胞は、配列番号１［ｌｇｔＡ遺伝子］若しくは配列番号２［ＰｍｎａｇＴ］若しくは配列番号３［ＨＤ０４６６］で示される異種β－１，３－Ｎ－アセチル－グルコサミニルトランスフェラーゼタンパク質、又は配列番号１、２、若しくは３と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体を含んでもよい。
【0021】
遺伝的に操作された細胞は、配列番号４［ｇａｌＴＫ遺伝子］若しくは配列番号５［ｃｖｂ３ｇａｌＴ］で示される異種β－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼタンパク質、又は配列番号４若しくは５と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体を含んでもよい。
【0022】
遺伝的に操作された細胞は、配列番号６［ｆｕｔＣ］若しくは配列番号７［ｍｔｕｎ］若しくは配列番号４９［ｆｕｃＴ５４］若しくは配列番号８［ｓｍｏｂ］のいずれか１つで示される異種α－１，２－フコシルトランスフェラーゼタンパク質、又は配列番号６、７、４９、若しくは８のいずれか１つと少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体を含んでもよい。
全ＨＭＯのモル％の２５％～７０％の２’－ＦＬ及び３０％～６０％のＬＮＦＰ－Ｉを得るために、配列番号６［ＦｕｔＣ］の異種α－１，２－フコシルトランスフェラーゼ、又は少なくとも８０％であるアミノ酸配列を有するその機能的相同体を使用することが好ましい。
全ＨＭＯのモル％の２５％～７０％の２’－ＦＬ及び３０％～６０％のＬＮＦＰ－Ｉを得るために、配列番号６［ＦｕｔＣ］の異種α－１，２－フコシルトランスフェラーゼ、又は少なくとも８０％であるアミノ酸配列を有するその機能的相同体を使用することが好ましい。
【0023】
全ＨＭＯのモル％の４０％～５５％の２’－ＦＬ及び４０％～６０％のＬＮＦＰ－Ｉを得るために、配列番号７［ｍｔｕｎ］若しくは配列番号４９［ＦｕｃＴ５４］の異種α－１，２－フコシルトランスフェラーゼ、少なくとも８０％であるアミノ酸配列を有するその機能的相同体を使用することが好ましい。
【0024】
本開示の方法による遺伝的に操作された細胞は、更に、その天然ゲノム遺伝子座からのｇｍｄ、ｗｃａＧ、ｗｃａＨ、ｗｃａＩ、ｍａｎＣ、ｍａｎＢなどであるがこれらに限定されないコラン酸遺伝子クラスターを機能的に発現し得る。遺伝的に操作された細胞は、細胞の天然又は任意の他のゲノム遺伝子座からのコラン酸遺伝子クラスターの発現を制御するための天然又は異種調節要素を含み得る。
【0025】
遺伝的に操作された細胞を、好適な細胞培養培地中で培養し、上記タンパク質を発現し、主要なＨＭＯとしてＬＮＦＰ－Ｉ及び２’－ＦＬを有するＨＭＯブレンドを生成することができる。ＨＭＯブレンドは、ヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）生成の工業環境で適用される任意の手段によって収集することができる。
【0026】
［ｌｇｔＡ／ｇａｌＴＫ／ｍｔｕｎ］
１つ以上の例示的な方法において、方法は：
ａ．ＨＭＯを産生することができる遺伝的に操作された細胞を準備する工程であって、上記細胞が、
ｉ．配列番号１［ｌｇｔＡ］で示される異種β－１，３－Ｎ－アセチル－グルコサミニルトランスフェラーゼタンパク質、又は配列番号１と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体を含み；且つ
ｉｉ．配列番号４［ｇａｌＴＫ］で示される異種β－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼタンパク質、又は配列番号４と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体を含み；且つ
ｉｉｉ．配列番号７［ｍｔｕｎ］で示される異種α－１，２－フコシルトランスフェラーゼタンパク質、又は配列番号７と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体を含み；且つ
ｉｖ．コラン酸遺伝子クラスター（ｇｍｄ、ｗｃａＧ、ｗｃａＨ、ｗｃａＩ、ｍａｎＣ、ｍａｎＢ）を機能的に発現し、
ｖ．ｉ）～ｉｖ）の発現を制御するための天然又は異種調節要素を含む工程と、
ｂ．好適な細胞培養培地で（ａ）に従って細胞を培養し、上記タンパク質を発現し、ＨＭＯブレンドを生成する工程と、
ｃ．工程（ｂ）で生成されたヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）ブレンドを収集する工程と、を含む。
１つ以上の例示的な方法において、方法は：
ａ．ＨＭＯを産生することができる遺伝的に操作された細胞を準備する工程であって、上記細胞が、
ｉ．配列番号１［ｌｇｔＡ］で示される異種β－１，３－Ｎ－アセチル－グルコサミニルトランスフェラーゼタンパク質、又は配列番号１と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体を含み；且つ
ｉｉ．配列番号４［ｇａｌＴＫ］で示される異種β－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼタンパク質、又は配列番号４と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体を含み；且つ
ｉｉｉ．配列番号７［ｍｔｕｎ］で示される異種α－１，２－フコシルトランスフェラーゼタンパク質、又は配列番号７と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体を含み；且つ
ｉｖ．コラン酸遺伝子クラスター（ｇｍｄ、ｗｃａＧ、ｗｃａＨ、ｗｃａＩ、ｍａｎＣ、ｍａｎＢ）を機能的に発現し、
ｖ．ｉ）～ｉｖ）の発現を制御するための天然又は異種調節要素を含む工程と、
ｂ．好適な細胞培養培地で（ａ）に従って細胞を培養し、上記タンパク質を発現し、ＨＭＯブレンドを生成する工程と、
ｃ．工程（ｂ）で生成されたヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）ブレンドを収集する工程と、を含む。
【0027】
［ＰｍｎａｇＴ／ｇａｌＴＫ／ｍｔｕｎ］
１つ以上の例示的な方法において、方法は：
ａ．ＨＭＯを産生することができる遺伝的に操作された細胞を準備する工程であって、上記細胞が、
ｉ．配列番号２［ＰｍｎａｇＴ］で示される異種β－１，３－Ｎ－アセチル－グルコサミニルトランスフェラーゼタンパク質、又は配列番号２と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体を含み；且つ
ｉｉ．配列番号４［ｇａｌＴＫ］で示される異種β－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼタンパク質、又は配列番号４と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体を含み；且つ
ｉｉｉ．配列番号７［ｍｔｕｎ］で示される異種α－１，２－フコシルトランスフェラーゼタンパク質、又は配列番号７と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体を含み；且つ
ｉｖ．コラン酸遺伝子クラスター（ｇｍｄ、ｗｃａＧ、ｗｃａＨ、ｗｃａＩ、ｍａｎＣ、ｍａｎＢ）を機能的に発現し、
ｖ．ｉ）～ｉｖ）の発現を制御するための天然又は異種調節要素を含む工程と、
ｂ．好適な細胞培養培地で（ａ）に従って細胞を培養し、上記タンパク質を発現し、ＨＭＯブレンドを生成する工程と、
ｃ．工程（ｂ）で生成されたヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）ブレンドを収集する工程と、を含む。
１つ以上の例示的な方法において、方法は：
ａ．ＨＭＯを産生することができる遺伝的に操作された細胞を準備する工程であって、上記細胞が、
ｉ．配列番号２［ＰｍｎａｇＴ］で示される異種β－１，３－Ｎ－アセチル－グルコサミニルトランスフェラーゼタンパク質、又は配列番号２と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体を含み；且つ
ｉｉ．配列番号４［ｇａｌＴＫ］で示される異種β－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼタンパク質、又は配列番号４と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体を含み；且つ
ｉｉｉ．配列番号７［ｍｔｕｎ］で示される異種α－１，２－フコシルトランスフェラーゼタンパク質、又は配列番号７と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体を含み；且つ
ｉｖ．コラン酸遺伝子クラスター（ｇｍｄ、ｗｃａＧ、ｗｃａＨ、ｗｃａＩ、ｍａｎＣ、ｍａｎＢ）を機能的に発現し、
ｖ．ｉ）～ｉｖ）の発現を制御するための天然又は異種調節要素を含む工程と、
ｂ．好適な細胞培養培地で（ａ）に従って細胞を培養し、上記タンパク質を発現し、ＨＭＯブレンドを生成する工程と、
ｃ．工程（ｂ）で生成されたヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）ブレンドを収集する工程と、を含む。
【0028】
［ＨＤ０４６６／ｇａｌＴＫ／ｍｔｕｎ］
１つ以上の例示的な方法において、方法は：
ａ．ＨＭＯを産生することができる遺伝的に操作された細胞を準備する工程であって、上記細胞が、
ｉ．配列番号３［ＨＤ０４６６］で示される異種β－１，３－Ｎ－アセチル－グルコサミニルトランスフェラーゼタンパク質、又は配列番号３と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体を含み；且つ
ｉｉ．配列番号４［ｇａｌＴＫ］で示される異種β－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼタンパク質、又は配列番号４と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体を含み；且つ
ｉｉｉ．配列番号７［ｍｔｕｎ］で示される異種α－１，２－フコシルトランスフェラーゼタンパク質、又は配列番号７と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体を含み；且つ
ｉｖ．コラン酸遺伝子クラスター（ｇｍｄ、ｗｃａＧ、ｗｃａＨ、ｗｃａＩ、ｍａｎＣ、ｍａｎＢ）を機能的に発現し、
ｖ．ｉ）～ｉｖ）の発現を制御するための天然又は異種調節要素を含む工程と、
ｂ．好適な細胞培養培地で（ａ）に従って細胞を培養し、上記タンパク質を発現し、ＨＭＯブレンドを生成する工程と、
ｃ．工程（ｂ）で生成されたヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）ブレンドを収集する工程と、を含む。
１つ以上の例示的な方法において、方法は：
ａ．ＨＭＯを産生することができる遺伝的に操作された細胞を準備する工程であって、上記細胞が、
ｉ．配列番号３［ＨＤ０４６６］で示される異種β－１，３－Ｎ－アセチル－グルコサミニルトランスフェラーゼタンパク質、又は配列番号３と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体を含み；且つ
ｉｉ．配列番号４［ｇａｌＴＫ］で示される異種β－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼタンパク質、又は配列番号４と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体を含み；且つ
ｉｉｉ．配列番号７［ｍｔｕｎ］で示される異種α－１，２－フコシルトランスフェラーゼタンパク質、又は配列番号７と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体を含み；且つ
ｉｖ．コラン酸遺伝子クラスター（ｇｍｄ、ｗｃａＧ、ｗｃａＨ、ｗｃａＩ、ｍａｎＣ、ｍａｎＢ）を機能的に発現し、
ｖ．ｉ）～ｉｖ）の発現を制御するための天然又は異種調節要素を含む工程と、
ｂ．好適な細胞培養培地で（ａ）に従って細胞を培養し、上記タンパク質を発現し、ＨＭＯブレンドを生成する工程と、
ｃ．工程（ｂ）で生成されたヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）ブレンドを収集する工程と、を含む。
【0029】
［ＨＤ０４６６／ｃｖｂ３ｇａｌＴ／ｍｔｕｎ］
１つ以上の例示的な方法において、方法は：
ａ．ＨＭＯを産生することができる遺伝的に操作された細胞を準備する工程であって、上記細胞が、
ｉ．配列番号３［ＨＤ０４６６］で示される異種β－１，３－Ｎ－アセチル－グルコサミニルトランスフェラーゼタンパク質、又は配列番号３と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体を含み；且つ
ｉｉ．配列番号５［ｃｖｂ３ｇａｌＴ］で示される異種β－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼタンパク質、又は配列番号５と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体を含み；且つ
ｉｉｉ．配列番号７［ｍｔｕｎ］で示される異種α－１，２－フコシルトランスフェラーゼタンパク質、又は配列番号７と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体を含み；且つ
ｉｖ．コラン酸遺伝子クラスター（ｇｍｄ、ｗｃａＧ、ｗｃａＨ、ｗｃａＩ、ｍａｎＣ、ｍａｎＢ）を機能的に発現し、
ｖ．ｉ）～ｉｖ）の発現を制御するための天然又は異種調節要素を含む工程と、
ｂ．好適な細胞培養培地で（ａ）に従って細胞を培養し、上記タンパク質を発現し、ＨＭＯブレンドを生成する工程と、
ｃ．工程（ｂ）で生成されたヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）ブレンドを収集する工程と、を含む。
１つ以上の例示的な方法において、方法は：
ａ．ＨＭＯを産生することができる遺伝的に操作された細胞を準備する工程であって、上記細胞が、
ｉ．配列番号３［ＨＤ０４６６］で示される異種β－１，３－Ｎ－アセチル－グルコサミニルトランスフェラーゼタンパク質、又は配列番号３と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体を含み；且つ
ｉｉ．配列番号５［ｃｖｂ３ｇａｌＴ］で示される異種β－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼタンパク質、又は配列番号５と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体を含み；且つ
ｉｉｉ．配列番号７［ｍｔｕｎ］で示される異種α－１，２－フコシルトランスフェラーゼタンパク質、又は配列番号７と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体を含み；且つ
ｉｖ．コラン酸遺伝子クラスター（ｇｍｄ、ｗｃａＧ、ｗｃａＨ、ｗｃａＩ、ｍａｎＣ、ｍａｎＢ）を機能的に発現し、
ｖ．ｉ）～ｉｖ）の発現を制御するための天然又は異種調節要素を含む工程と、
ｂ．好適な細胞培養培地で（ａ）に従って細胞を培養し、上記タンパク質を発現し、ＨＭＯブレンドを生成する工程と、
ｃ．工程（ｂ）で生成されたヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）ブレンドを収集する工程と、を含む。
【0030】
［ＰｍｎａｇＴ／ｃｖｂ３ｇａｌＴ／ｍｔｕｎ］
１つ以上の例示的な方法において、方法は：
ａ．ＨＭＯを産生することができる遺伝的に操作された細胞を準備する工程であって、上記細胞が、
ｉ．配列番号２［ＰｍｎａｇＴ］で示される異種β－１，３－Ｎ－アセチル－グルコサミニルトランスフェラーゼタンパク質、又は配列番号２と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体を含み；且つ
ｉｉ．配列番号５［ｃｖｂ３ｇａｌＴ］で示される異種β－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼタンパク質、又は配列番号５と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体を含み；且つ
ｉｉｉ．配列番号７［ｍｔｕｎ］で示される異種α－１，２－フコシルトランスフェラーゼタンパク質、又は配列番号７と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体を含み；且つ
ｉｖ．コラン酸遺伝子クラスター（ｇｍｄ、ｗｃａＧ、ｗｃａＨ、ｗｃａＩ、ｍａｎＣ、ｍａｎＢ）を機能的に発現し、
ｖ．ｉ）～ｉｖ）の発現を制御するための天然又は異種調節要素を含む工程と、
ｂ．好適な細胞培養培地で（ａ）に従って細胞を培養し、上記タンパク質を発現し、ＨＭＯブレンドを生成する工程と、
ｃ．工程（ｂ）で生成されたヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）ブレンドを収集する工程と、を含む。
１つ以上の例示的な方法において、方法は：
ａ．ＨＭＯを産生することができる遺伝的に操作された細胞を準備する工程であって、上記細胞が、
ｉ．配列番号２［ＰｍｎａｇＴ］で示される異種β－１，３－Ｎ－アセチル－グルコサミニルトランスフェラーゼタンパク質、又は配列番号２と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体を含み；且つ
ｉｉ．配列番号５［ｃｖｂ３ｇａｌＴ］で示される異種β－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼタンパク質、又は配列番号５と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体を含み；且つ
ｉｉｉ．配列番号７［ｍｔｕｎ］で示される異種α－１，２－フコシルトランスフェラーゼタンパク質、又は配列番号７と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体を含み；且つ
ｉｖ．コラン酸遺伝子クラスター（ｇｍｄ、ｗｃａＧ、ｗｃａＨ、ｗｃａＩ、ｍａｎＣ、ｍａｎＢ）を機能的に発現し、
ｖ．ｉ）～ｉｖ）の発現を制御するための天然又は異種調節要素を含む工程と、
ｂ．好適な細胞培養培地で（ａ）に従って細胞を培養し、上記タンパク質を発現し、ＨＭＯブレンドを生成する工程と、
ｃ．工程（ｂ）で生成されたヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）ブレンドを収集する工程と、を含む。
【0031】
［ｌｇｔＡ／ｃｖｂ３ｇａｌＴ／ｍｔｕｎ］
１つ以上の例示的な方法において、方法は：
ａ．ＨＭＯを産生することができる遺伝的に操作された細胞を準備する工程であって、上記細胞が、
ｉ．配列番号１［ｌｇｔＡ］で示される異種β－１，３－Ｎ－アセチル－グルコサミニルトランスフェラーゼタンパク質、又は配列番号１と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体を含み；且つ
ｉｉ．配列番号５［ｃｖｂ３ｇａｌＴ］で示される異種β－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼタンパク質、又は配列番号５と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体を含み；且つ
ｉｉｉ．配列番号７［ｍｔｕｎ］で示される異種α－１，２－フコシルトランスフェラーゼタンパク質、又は配列番号７と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体を含み；且つ
ｉｖ．コラン酸遺伝子クラスター（ｇｍｄ、ｗｃａＧ、ｗｃａＨ、ｗｃａＩ、ｍａｎＣ、ｍａｎＢ）を機能的に発現し、
ｖ．ｉ）～ｉｖ）の発現を制御するための天然又は異種調節要素を含む工程と、
ｂ．好適な細胞培養培地で（ａ）に従って細胞を培養し、上記タンパク質を発現し、ＨＭＯブレンドを生成する工程と、
ｃ．工程（ｂ）で生成されたヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）ブレンドを収集する工程と、を含む。
１つ以上の例示的な方法において、方法は：
ａ．ＨＭＯを産生することができる遺伝的に操作された細胞を準備する工程であって、上記細胞が、
ｉ．配列番号１［ｌｇｔＡ］で示される異種β－１，３－Ｎ－アセチル－グルコサミニルトランスフェラーゼタンパク質、又は配列番号１と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体を含み；且つ
ｉｉ．配列番号５［ｃｖｂ３ｇａｌＴ］で示される異種β－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼタンパク質、又は配列番号５と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体を含み；且つ
ｉｉｉ．配列番号７［ｍｔｕｎ］で示される異種α－１，２－フコシルトランスフェラーゼタンパク質、又は配列番号７と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体を含み；且つ
ｉｖ．コラン酸遺伝子クラスター（ｇｍｄ、ｗｃａＧ、ｗｃａＨ、ｗｃａＩ、ｍａｎＣ、ｍａｎＢ）を機能的に発現し、
ｖ．ｉ）～ｉｖ）の発現を制御するための天然又は異種調節要素を含む工程と、
ｂ．好適な細胞培養培地で（ａ）に従って細胞を培養し、上記タンパク質を発現し、ＨＭＯブレンドを生成する工程と、
ｃ．工程（ｂ）で生成されたヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）ブレンドを収集する工程と、を含む。
【0032】
［ｌｇｔＡ／ｇａｌＴＫ／ｆｕｔＣ］
１つ以上の例示的な方法において、方法は：
ａ．ＨＭＯを産生することができる遺伝的に操作された細胞を準備する工程であって、上記細胞が、
ｉ．配列番号１［ｌｇｔＡ］で示される異種β－１，３－Ｎ－アセチル－グルコサミニルトランスフェラーゼタンパク質、又は配列番号１と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体を含み；且つ
ｉｉ．配列番号４［ｇａｌＴＫ］で示される異種β－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼタンパク質、又は配列番号４と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体を含み；且つ
ｉｉｉ．配列番号６［ｆｕｔＣ］で示される異種α－１，２－フコシルトランスフェラーゼタンパク質、又は配列番号６と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体を含み；且つ
ｉｖ．コラン酸遺伝子クラスター（ｇｍｄ、ｗｃａＧ、ｗｃａＨ、ｗｃａＩ、ｍａｎＣ、ｍａｎＢ）を機能的に発現し、
ｖ．ｉ）～ｉｖ）の発現を制御するための天然又は異種調節要素を含む工程と、
ｂ．好適な細胞培養培地で（ａ）に従って細胞を培養し、上記タンパク質を発現し、ＨＭＯブレンドを生成する工程と、
ｃ．工程（ｂ）で生成されたヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）ブレンドを収集する工程と、を含む。
１つ以上の例示的な方法において、方法は：
ａ．ＨＭＯを産生することができる遺伝的に操作された細胞を準備する工程であって、上記細胞が、
ｉ．配列番号１［ｌｇｔＡ］で示される異種β－１，３－Ｎ－アセチル－グルコサミニルトランスフェラーゼタンパク質、又は配列番号１と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体を含み；且つ
ｉｉ．配列番号４［ｇａｌＴＫ］で示される異種β－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼタンパク質、又は配列番号４と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体を含み；且つ
ｉｉｉ．配列番号６［ｆｕｔＣ］で示される異種α－１，２－フコシルトランスフェラーゼタンパク質、又は配列番号６と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体を含み；且つ
ｉｖ．コラン酸遺伝子クラスター（ｇｍｄ、ｗｃａＧ、ｗｃａＨ、ｗｃａＩ、ｍａｎＣ、ｍａｎＢ）を機能的に発現し、
ｖ．ｉ）～ｉｖ）の発現を制御するための天然又は異種調節要素を含む工程と、
ｂ．好適な細胞培養培地で（ａ）に従って細胞を培養し、上記タンパク質を発現し、ＨＭＯブレンドを生成する工程と、
ｃ．工程（ｂ）で生成されたヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）ブレンドを収集する工程と、を含む。
【0033】
［ＰｍｎａｇＴ／ｇａｌＴＫ／ｆｕｔＣ］
１つ以上の例示的な方法において、方法は：
ａ．ＨＭＯを産生することができる遺伝的に操作された細胞を準備する工程であって、上記細胞が、
ｉ．配列番号２［ＰｍｎａｇＴ］で示される異種β－１，３－Ｎ－アセチル－グルコサミニルトランスフェラーゼタンパク質、又は配列番号２と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体を含み；且つ
ｉｉ．配列番号４［ｇａｌＴＫ］で示される異種β－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼタンパク質、又は配列番号４と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体を含み；且つ
ｉｉｉ．配列番号６［ｆｕｔＣ］で示される異種α－１，２－フコシルトランスフェラーゼタンパク質、又は配列番号６と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体を含み；且つ
ｉｖ．コラン酸遺伝子クラスター（ｇｍｄ、ｗｃａＧ、ｗｃａＨ、ｗｃａＩ、ｍａｎＣ、ｍａｎＢ）を機能的に発現し、
ｖ．ｉ）～ｉｖ）の発現を制御するための天然又は異種調節要素を含む工程と、
ｂ．好適な細胞培養培地で（ａ）に従って細胞を培養し、上記タンパク質を発現し、ＨＭＯブレンドを生成する工程と、
ｃ．工程（ｂ）で生成されたヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）ブレンドを収集する工程と、を含む。
１つ以上の例示的な方法において、方法は：
ａ．ＨＭＯを産生することができる遺伝的に操作された細胞を準備する工程であって、上記細胞が、
ｉ．配列番号２［ＰｍｎａｇＴ］で示される異種β－１，３－Ｎ－アセチル－グルコサミニルトランスフェラーゼタンパク質、又は配列番号２と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体を含み；且つ
ｉｉ．配列番号４［ｇａｌＴＫ］で示される異種β－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼタンパク質、又は配列番号４と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体を含み；且つ
ｉｉｉ．配列番号６［ｆｕｔＣ］で示される異種α－１，２－フコシルトランスフェラーゼタンパク質、又は配列番号６と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体を含み；且つ
ｉｖ．コラン酸遺伝子クラスター（ｇｍｄ、ｗｃａＧ、ｗｃａＨ、ｗｃａＩ、ｍａｎＣ、ｍａｎＢ）を機能的に発現し、
ｖ．ｉ）～ｉｖ）の発現を制御するための天然又は異種調節要素を含む工程と、
ｂ．好適な細胞培養培地で（ａ）に従って細胞を培養し、上記タンパク質を発現し、ＨＭＯブレンドを生成する工程と、
ｃ．工程（ｂ）で生成されたヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）ブレンドを収集する工程と、を含む。
【0034】
［ＨＤ０４６６／ｇａｌＴＫ／ｆｕｔＣ］
１つ以上の例示的な方法において、方法は：
ａ．ＨＭＯを産生することができる遺伝的に操作された細胞を準備する工程であって、上記細胞が、
ｉ．配列番号３［ＨＤ０４６６］で示される異種β－１，３－Ｎ－アセチル－グルコサミニルトランスフェラーゼタンパク質、又は配列番号３と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体を含み；且つ
ｉｉ．配列番号４［ｇａｌＴＫ］で示される異種β－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼタンパク質、又は配列番号４と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体を含み；且つ
ｉｉｉ．配列番号６［ｆｕｔＣ］で示される異種α－１，２－フコシルトランスフェラーゼタンパク質、又は配列番号６と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体を含み；且つ
ｉｖ．コラン酸遺伝子クラスター（ｇｍｄ、ｗｃａＧ、ｗｃａＨ、ｗｃａＩ、ｍａｎＣ、ｍａｎＢ）を機能的に発現し、
ｖ．ｉ）～ｉｖ）の発現を制御するための天然又は異種調節要素を含む工程と、
ｂ．好適な細胞培養培地で（ａ）に従って細胞を培養し、上記タンパク質を発現し、ＨＭＯブレンドを生成する工程と、
ｃ．工程（ｂ）で生成されたヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）ブレンドを収集する工程と、を含む。
１つ以上の例示的な方法において、方法は：
ａ．ＨＭＯを産生することができる遺伝的に操作された細胞を準備する工程であって、上記細胞が、
ｉ．配列番号３［ＨＤ０４６６］で示される異種β－１，３－Ｎ－アセチル－グルコサミニルトランスフェラーゼタンパク質、又は配列番号３と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体を含み；且つ
ｉｉ．配列番号４［ｇａｌＴＫ］で示される異種β－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼタンパク質、又は配列番号４と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体を含み；且つ
ｉｉｉ．配列番号６［ｆｕｔＣ］で示される異種α－１，２－フコシルトランスフェラーゼタンパク質、又は配列番号６と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体を含み；且つ
ｉｖ．コラン酸遺伝子クラスター（ｇｍｄ、ｗｃａＧ、ｗｃａＨ、ｗｃａＩ、ｍａｎＣ、ｍａｎＢ）を機能的に発現し、
ｖ．ｉ）～ｉｖ）の発現を制御するための天然又は異種調節要素を含む工程と、
ｂ．好適な細胞培養培地で（ａ）に従って細胞を培養し、上記タンパク質を発現し、ＨＭＯブレンドを生成する工程と、
ｃ．工程（ｂ）で生成されたヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）ブレンドを収集する工程と、を含む。
【0035】
［ＨＤ０４６６／ｃｖｂ３ｇａｌＴ／ｆｕｔＣ］
１つ以上の例示的な方法において、方法は：
ａ．ＨＭＯを産生することができる遺伝的に操作された細胞を準備する工程であって、上記細胞が、
ｉ．配列番号３［ＨＤ０４６６］で示される異種β－１，３－Ｎ－アセチル－グルコサミニルトランスフェラーゼタンパク質、又は配列番号３と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体を含み；且つ
ｉｉ．配列番号５［ｃｖｂ３ｇａｌＴ］で示される異種β－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼ００００００００タンパク質、又は配列番号５と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体を含み；且つ
ｉｉｉ．配列番号６［ｆｕｔＣ］で示される異種α－１，２－フコシルトランスフェラーゼタンパク質、又は配列番号６と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体を含み；且つ
ｉｖ．コラン酸遺伝子クラスター（ｇｍｄ、ｗｃａＧ、ｗｃａＨ、ｗｃａＩ、ｍａｎＣ、ｍａｎＢ）を機能的に発現し、
ｖ．ｉ）～ｉｖ）の発現を制御するための天然又は異種調節要素を含む工程と、
ｂ．好適な細胞培養培地で（ａ）に従って細胞を培養し、上記タンパク質を発現し、ＨＭＯブレンドを生成する工程と、
ｃ．工程（ｂ）で生成されたヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）ブレンドを収集する工程と、を含む。
１つ以上の例示的な方法において、方法は：
ａ．ＨＭＯを産生することができる遺伝的に操作された細胞を準備する工程であって、上記細胞が、
ｉ．配列番号３［ＨＤ０４６６］で示される異種β－１，３－Ｎ－アセチル－グルコサミニルトランスフェラーゼタンパク質、又は配列番号３と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体を含み；且つ
ｉｉ．配列番号５［ｃｖｂ３ｇａｌＴ］で示される異種β－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼ００００００００タンパク質、又は配列番号５と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体を含み；且つ
ｉｉｉ．配列番号６［ｆｕｔＣ］で示される異種α－１，２－フコシルトランスフェラーゼタンパク質、又は配列番号６と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体を含み；且つ
ｉｖ．コラン酸遺伝子クラスター（ｇｍｄ、ｗｃａＧ、ｗｃａＨ、ｗｃａＩ、ｍａｎＣ、ｍａｎＢ）を機能的に発現し、
ｖ．ｉ）～ｉｖ）の発現を制御するための天然又は異種調節要素を含む工程と、
ｂ．好適な細胞培養培地で（ａ）に従って細胞を培養し、上記タンパク質を発現し、ＨＭＯブレンドを生成する工程と、
ｃ．工程（ｂ）で生成されたヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）ブレンドを収集する工程と、を含む。
【0036】
［ＰｍｎａｇＴ／ｃｖｂ３ｇａｌＴ／ｆｕｔＣ］
１つ以上の例示的な方法において、方法は：
ａ．ＨＭＯを産生することができる遺伝的に操作された細胞を準備する工程であって、上記細胞が、
ｉ．配列番号２［ＰｍｎａｇＴ］で示される異種β－１，３－Ｎ－アセチル－グルコサミニルトランスフェラーゼタンパク質、又は配列番号２と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体を含み；且つ
ｉｉ．配列番号５［ｃｖｂ３ｇａｌＴ］で示される異種β－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼタンパク質、又は配列番号５と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体を含み；且つ
ｉｉｉ．配列番号６［ｆｕｔＣ］で示される異種α－１，２－フコシルトランスフェラーゼタンパク質、又は配列番号６と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体を含み；且つ
ｉｖ．コラン酸遺伝子クラスター（ｇｍｄ、ｗｃａＧ、ｗｃａＨ、ｗｃａＩ、ｍａｎＣ、ｍａｎＢ）を機能的に発現し、
ｖ．ｉ）～ｉｖ）の発現を制御するための天然又は異種調節要素を含む工程と、
ｂ．好適な細胞培養培地で（ａ）に従って細胞を培養し、上記タンパク質を発現し、ＨＭＯブレンドを生成する工程と、
ｃ．工程（ｂ）で生成されたヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）ブレンドを収集する工程と、を含む。
１つ以上の例示的な方法において、方法は：
ａ．ＨＭＯを産生することができる遺伝的に操作された細胞を準備する工程であって、上記細胞が、
ｉ．配列番号２［ＰｍｎａｇＴ］で示される異種β－１，３－Ｎ－アセチル－グルコサミニルトランスフェラーゼタンパク質、又は配列番号２と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体を含み；且つ
ｉｉ．配列番号５［ｃｖｂ３ｇａｌＴ］で示される異種β－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼタンパク質、又は配列番号５と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体を含み；且つ
ｉｉｉ．配列番号６［ｆｕｔＣ］で示される異種α－１，２－フコシルトランスフェラーゼタンパク質、又は配列番号６と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体を含み；且つ
ｉｖ．コラン酸遺伝子クラスター（ｇｍｄ、ｗｃａＧ、ｗｃａＨ、ｗｃａＩ、ｍａｎＣ、ｍａｎＢ）を機能的に発現し、
ｖ．ｉ）～ｉｖ）の発現を制御するための天然又は異種調節要素を含む工程と、
ｂ．好適な細胞培養培地で（ａ）に従って細胞を培養し、上記タンパク質を発現し、ＨＭＯブレンドを生成する工程と、
ｃ．工程（ｂ）で生成されたヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）ブレンドを収集する工程と、を含む。
【0037】
［ｌｇｔＡ／ｃｖｂ３ｇａｌＴ／ｆｕｔＣ］
１つ以上の例示的な方法において、方法は：
ａ．ＨＭＯを産生することができる遺伝的に操作された細胞を準備する工程であって、上記細胞が、
ｉ．配列番号１［ｌｇｔＡ］で示される異種β－１，３－Ｎ－アセチル－グルコサミニルトランスフェラーゼタンパク質、又は配列番号１と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体を含み；且つ
ｉｉ．配列番号５［ｃｖｂ３ｇａｌＴ］で示される異種β－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼタンパク質、又は配列番号５と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体を含み；且つ
ｉｉｉ．配列番号６［ｆｕｔＣ］で示される異種α－１，２－フコシルトランスフェラーゼタンパク質、又は配列番号６と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体を含み；且つ
ｉｖ．コラン酸遺伝子クラスター（ｇｍｄ、ｗｃａＧ、ｗｃａＨ、ｗｃａＩ、ｍａｎＣ、ｍａｎＢ）を機能的に発現し、
ｖ．ｉ）～ｉｖ）の発現を制御するための天然又は異種調節要素を含む工程と、
ｂ．好適な細胞培養培地で（ａ）に従って細胞を培養し、上記タンパク質を発現し、ＨＭＯブレンドを生成する工程と、
ｃ．工程（ｂ）で生成されたヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）ブレンドを収集する工程と、を含む。
１つ以上の例示的な方法において、方法は：
ａ．ＨＭＯを産生することができる遺伝的に操作された細胞を準備する工程であって、上記細胞が、
ｉ．配列番号１［ｌｇｔＡ］で示される異種β－１，３－Ｎ－アセチル－グルコサミニルトランスフェラーゼタンパク質、又は配列番号１と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体を含み；且つ
ｉｉ．配列番号５［ｃｖｂ３ｇａｌＴ］で示される異種β－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼタンパク質、又は配列番号５と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体を含み；且つ
ｉｉｉ．配列番号６［ｆｕｔＣ］で示される異種α－１，２－フコシルトランスフェラーゼタンパク質、又は配列番号６と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体を含み；且つ
ｉｖ．コラン酸遺伝子クラスター（ｇｍｄ、ｗｃａＧ、ｗｃａＨ、ｗｃａＩ、ｍａｎＣ、ｍａｎＢ）を機能的に発現し、
ｖ．ｉ）～ｉｖ）の発現を制御するための天然又は異種調節要素を含む工程と、
ｂ．好適な細胞培養培地で（ａ）に従って細胞を培養し、上記タンパク質を発現し、ＨＭＯブレンドを生成する工程と、
ｃ．工程（ｂ）で生成されたヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）ブレンドを収集する工程と、を含む。
【0038】
［ｌｇｔＡ／ｇａｌＴＫ／ｆｕｔＣ／ｓｍｏｂ］
１つ以上の例示的な方法において、方法は：
ａ．ＨＭＯを産生することができる遺伝的に操作された細胞を準備する工程であって、上記細胞が、
ｉ．配列番号１［ｌｇｔＡ］で示される異種β－１，３－Ｎ－アセチル－グルコサミニルトランスフェラーゼタンパク質、又は配列番号１と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体を含み；且つ
ｉｉ．配列番号４［ｇａｌＴＫ］で示される異種β－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼタンパク質、又は配列番号４と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体を含み；且つ
ｉｉｉ．配列番号６［ｆｕｔＣ］及び配列番号８［ｓｍｏｂ］で示される２つの異種α－１，２－フコシルトランスフェラーゼタンパク質、又は独立して、配列番号６若しくは配列番号８と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体を含み；且つ
ｉｖ．コラン酸遺伝子クラスター（ｇｍｄ、ｗｃａＧ、ｗｃａＨ、ｗｃａＩ、ｍａｎＣ、ｍａｎＢ）を機能的に発現し、
ｖ．ｉ）～ｉｖ）の発現を制御するための天然又は異種調節要素を含む工程と、
ｂ．好適な細胞培養培地で（ａ）に従って細胞を培養し、上記タンパク質を発現し、ＨＭＯブレンドを生成する工程と、
ｃ．工程（ｂ）で生成されたヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）ブレンドを収集する工程と、を含む。
１つ以上の例示的な方法において、方法は：
ａ．ＨＭＯを産生することができる遺伝的に操作された細胞を準備する工程であって、上記細胞が、
ｉ．配列番号１［ｌｇｔＡ］で示される異種β－１，３－Ｎ－アセチル－グルコサミニルトランスフェラーゼタンパク質、又は配列番号１と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体を含み；且つ
ｉｉ．配列番号４［ｇａｌＴＫ］で示される異種β－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼタンパク質、又は配列番号４と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体を含み；且つ
ｉｉｉ．配列番号６［ｆｕｔＣ］及び配列番号８［ｓｍｏｂ］で示される２つの異種α－１，２－フコシルトランスフェラーゼタンパク質、又は独立して、配列番号６若しくは配列番号８と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体を含み；且つ
ｉｖ．コラン酸遺伝子クラスター（ｇｍｄ、ｗｃａＧ、ｗｃａＨ、ｗｃａＩ、ｍａｎＣ、ｍａｎＢ）を機能的に発現し、
ｖ．ｉ）～ｉｖ）の発現を制御するための天然又は異種調節要素を含む工程と、
ｂ．好適な細胞培養培地で（ａ）に従って細胞を培養し、上記タンパク質を発現し、ＨＭＯブレンドを生成する工程と、
ｃ．工程（ｂ）で生成されたヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）ブレンドを収集する工程と、を含む。
【0039】
［ＰｍｎａｇＴ／ｇａｌＴＫ／ｆｕｃＴ５４］
１つ以上の例示的な方法において、方法は：
ａ．ＨＭＯを産生することができる遺伝的に操作された細胞を準備する工程であって、上記細胞が、
ｉ．配列番号２［ＰｍｎａｇＴ］で示される異種β－１，３－Ｎ－アセチル－グルコサミニルトランスフェラーゼタンパク質、又は配列番号２と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体を含み；且つ
ｉｉ．配列番号４［ｇａｌＴＫ］で示される異種β－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼタンパク質、又は配列番号４と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体を含み；且つ
ｉｉｉ．配列番号４９［ｆｕｃＴ５４］で示される異種α－１，２－フコシルトランスフェラーゼタンパク質、又は配列番号４９と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体を含み；且つ
ｉｖ．コラン酸遺伝子クラスター（ｇｍｄ、ｗｃａＧ、ｗｃａＨ、ｗｃａＩ、ｍａｎＣ、ｍａｎＢ）を機能的に発現し、
ｖ．ｉ）～ｉｖ）の発現を制御するための天然又は異種調節要素を含む工程と、
ｂ．好適な細胞培養培地で（ａ）に従って細胞を培養し、上記タンパク質を発現し、ＨＭＯブレンドを生成する工程と、
ｃ．工程（ｂ）で生成されたヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）ブレンドを収集する工程と、を含む。
１つ以上の例示的な方法において、方法は：
ａ．ＨＭＯを産生することができる遺伝的に操作された細胞を準備する工程であって、上記細胞が、
ｉ．配列番号２［ＰｍｎａｇＴ］で示される異種β－１，３－Ｎ－アセチル－グルコサミニルトランスフェラーゼタンパク質、又は配列番号２と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体を含み；且つ
ｉｉ．配列番号４［ｇａｌＴＫ］で示される異種β－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼタンパク質、又は配列番号４と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体を含み；且つ
ｉｉｉ．配列番号４９［ｆｕｃＴ５４］で示される異種α－１，２－フコシルトランスフェラーゼタンパク質、又は配列番号４９と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体を含み；且つ
ｉｖ．コラン酸遺伝子クラスター（ｇｍｄ、ｗｃａＧ、ｗｃａＨ、ｗｃａＩ、ｍａｎＣ、ｍａｎＢ）を機能的に発現し、
ｖ．ｉ）～ｉｖ）の発現を制御するための天然又は異種調節要素を含む工程と、
ｂ．好適な細胞培養培地で（ａ）に従って細胞を培養し、上記タンパク質を発現し、ＨＭＯブレンドを生成する工程と、
ｃ．工程（ｂ）で生成されたヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）ブレンドを収集する工程と、を含む。
【0040】
［ＨＤ０４４９４９／ｇａｌＴＫ／ｆｕｃＴ５４］
１つ以上の例示的な方法において、方法は：
ａ．ＨＭＯを産生することができる遺伝的に操作された細胞を準備する工程であって、上記細胞が、
ｉ．配列番号３［ＨＤ０４４９４９］で示される異種β－１，３－Ｎ－アセチル－グルコサミニルトランスフェラーゼタンパク質、又は配列番号３と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体を含み；且つ
ｉｉ．配列番号４［ｇａｌＴＫ］で示される異種β－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼタンパク質、又は配列番号４と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体を含み；且つ
ｉｉｉ．配列番号４９［ｆｕｃＴ５４］で示される異種α－１，２－フコシルトランスフェラーゼタンパク質、又は配列番号４９と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体を含み；且つ
ｉｖ．コラン酸遺伝子クラスター（ｇｍｄ、ｗｃａＧ、ｗｃａＨ、ｗｃａＩ、ｍａｎＣ、ｍａｎＢ）を機能的に発現し、
ｖ．ｉ）～ｉｖ）の発現を制御するための天然又は異種調節要素を含む工程と、
ｂ．好適な細胞培養培地で（ａ）に従って細胞を培養し、上記タンパク質を発現し、ＨＭＯブレンドを生成する工程と、
ｃ．工程（ｂ）で生成されたヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）ブレンドを収集する工程と、を含む。
１つ以上の例示的な方法において、方法は：
ａ．ＨＭＯを産生することができる遺伝的に操作された細胞を準備する工程であって、上記細胞が、
ｉ．配列番号３［ＨＤ０４４９４９］で示される異種β－１，３－Ｎ－アセチル－グルコサミニルトランスフェラーゼタンパク質、又は配列番号３と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体を含み；且つ
ｉｉ．配列番号４［ｇａｌＴＫ］で示される異種β－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼタンパク質、又は配列番号４と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体を含み；且つ
ｉｉｉ．配列番号４９［ｆｕｃＴ５４］で示される異種α－１，２－フコシルトランスフェラーゼタンパク質、又は配列番号４９と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体を含み；且つ
ｉｖ．コラン酸遺伝子クラスター（ｇｍｄ、ｗｃａＧ、ｗｃａＨ、ｗｃａＩ、ｍａｎＣ、ｍａｎＢ）を機能的に発現し、
ｖ．ｉ）～ｉｖ）の発現を制御するための天然又は異種調節要素を含む工程と、
ｂ．好適な細胞培養培地で（ａ）に従って細胞を培養し、上記タンパク質を発現し、ＨＭＯブレンドを生成する工程と、
ｃ．工程（ｂ）で生成されたヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）ブレンドを収集する工程と、を含む。
【0041】
［ＨＤ０４４９４９／ｃｖｂ３ｇａｌＴ／ｆｕｃＴ５４］
１つ以上の例示的な方法において、方法は：
ａ．ＨＭＯを産生することができる遺伝的に操作された細胞を準備する工程であって、上記細胞が、
ｉ．配列番号３［ＨＤ０４４９４９］で示される異種β－１，３－Ｎ－アセチル－グルコサミニルトランスフェラーゼタンパク質、又は配列番号３と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体を含み；且つ
ｉｉ．配列番号５［ｃｖｂ３ｇａｌＴ］で示される異種β－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼ００００００００タンパク質、又は配列番号５と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体を含み；且つ
ｉｉｉ．配列番号４９［ｆｕｃＴ５４］で示される異種α－１，２－フコシルトランスフェラーゼタンパク質、又は配列番号４９と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体を含み；且つ
ｉｖ．コラン酸遺伝子クラスター（ｇｍｄ、ｗｃａＧ、ｗｃａＨ、ｗｃａＩ、ｍａｎＣ、ｍａｎＢ）を機能的に発現し、
ｖ．ｉ）～ｉｖ）の発現を制御するための天然又は異種調節要素を含む工程と、
ｂ．好適な細胞培養培地で（ａ）に従って細胞を培養し、上記タンパク質を発現し、ＨＭＯブレンドを生成する工程と、
ｃ．工程（ｂ）で生成されたヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）ブレンドを収集する工程と、を含む。
１つ以上の例示的な方法において、方法は：
ａ．ＨＭＯを産生することができる遺伝的に操作された細胞を準備する工程であって、上記細胞が、
ｉ．配列番号３［ＨＤ０４４９４９］で示される異種β－１，３－Ｎ－アセチル－グルコサミニルトランスフェラーゼタンパク質、又は配列番号３と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体を含み；且つ
ｉｉ．配列番号５［ｃｖｂ３ｇａｌＴ］で示される異種β－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼ００００００００タンパク質、又は配列番号５と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体を含み；且つ
ｉｉｉ．配列番号４９［ｆｕｃＴ５４］で示される異種α－１，２－フコシルトランスフェラーゼタンパク質、又は配列番号４９と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体を含み；且つ
ｉｖ．コラン酸遺伝子クラスター（ｇｍｄ、ｗｃａＧ、ｗｃａＨ、ｗｃａＩ、ｍａｎＣ、ｍａｎＢ）を機能的に発現し、
ｖ．ｉ）～ｉｖ）の発現を制御するための天然又は異種調節要素を含む工程と、
ｂ．好適な細胞培養培地で（ａ）に従って細胞を培養し、上記タンパク質を発現し、ＨＭＯブレンドを生成する工程と、
ｃ．工程（ｂ）で生成されたヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）ブレンドを収集する工程と、を含む。
【0042】
［ＰｍｎａｇＴ／ｃｖｂ３ｇａｌＴ／ｆｕｃＴ５４］
１つ以上の例示的な方法において、方法は：
ａ．ＨＭＯを産生することができる遺伝的に操作された細胞を準備する工程であって、上記細胞が、
ｉ．配列番号２［ＰｍｎａｇＴ］で示される異種β－１，３－Ｎ－アセチル－グルコサミニルトランスフェラーゼタンパク質、又は配列番号２と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体を含み；且つ
ｉｉ．配列番号５［ｃｖｂ３ｇａｌＴ］で示される異種β－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼタンパク質、又は配列番号５と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体を含み；且つ
ｉｉｉ．配列番号４９［ｆｕｃＴ５４］で示される異種α－１，２－フコシルトランスフェラーゼタンパク質、又は配列番号４９と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体を含み；且つ
ｉｖ．コラン酸遺伝子クラスター（ｇｍｄ、ｗｃａＧ、ｗｃａＨ、ｗｃａＩ、ｍａｎＣ、ｍａｎＢ）を機能的に発現し、
ｖ．ｉ）～ｉｖ）の発現を制御するための天然又は異種調節要素を含む工程と、
ｂ．好適な細胞培養培地で（ａ）に従って細胞を培養し、上記タンパク質を発現し、ＨＭＯブレンドを生成する工程と、
ｃ．工程（ｂ）で生成されたヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）ブレンドを収集する工程と、を含む。
１つ以上の例示的な方法において、方法は：
ａ．ＨＭＯを産生することができる遺伝的に操作された細胞を準備する工程であって、上記細胞が、
ｉ．配列番号２［ＰｍｎａｇＴ］で示される異種β－１，３－Ｎ－アセチル－グルコサミニルトランスフェラーゼタンパク質、又は配列番号２と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体を含み；且つ
ｉｉ．配列番号５［ｃｖｂ３ｇａｌＴ］で示される異種β－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼタンパク質、又は配列番号５と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体を含み；且つ
ｉｉｉ．配列番号４９［ｆｕｃＴ５４］で示される異種α－１，２－フコシルトランスフェラーゼタンパク質、又は配列番号４９と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体を含み；且つ
ｉｖ．コラン酸遺伝子クラスター（ｇｍｄ、ｗｃａＧ、ｗｃａＨ、ｗｃａＩ、ｍａｎＣ、ｍａｎＢ）を機能的に発現し、
ｖ．ｉ）～ｉｖ）の発現を制御するための天然又は異種調節要素を含む工程と、
ｂ．好適な細胞培養培地で（ａ）に従って細胞を培養し、上記タンパク質を発現し、ＨＭＯブレンドを生成する工程と、
ｃ．工程（ｂ）で生成されたヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）ブレンドを収集する工程と、を含む。
【0043】
［ｌｇｔＡ／ｃｖｂ３ｇａｌＴ／ｆｕｃＴ５４］
１つ以上の例示的な方法において、方法は：
ａ．ＨＭＯを産生することができる遺伝的に操作された細胞を準備する工程であって、上記細胞が、
ｉ．配列番号１［ｌｇｔＡ］で示される異種β－１，３－Ｎ－アセチル－グルコサミニルトランスフェラーゼタンパク質、又は配列番号１と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体を含み；且つ
ｉｉ．配列番号５［ｃｖｂ３ｇａｌＴ］で示される異種β－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼタンパク質、又は配列番号５と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体を含み；且つ
ｉｉｉ．配列番号４９［ｆｕｃＴ５４］で示される異種α－１，２－フコシルトランスフェラーゼタンパク質、又は配列番号４９と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体を含み；且つ
ｉｖ．コラン酸遺伝子クラスター（ｇｍｄ、ｗｃａＧ、ｗｃａＨ、ｗｃａＩ、ｍａｎＣ、ｍａｎＢ）を機能的に発現し、
ｖ．ｉ）～ｉｖ）の発現を制御するための天然又は異種調節要素を含む工程と、
ｂ．好適な細胞培養培地で（ａ）に従って細胞を培養し、上記タンパク質を発現し、ＨＭＯブレンドを生成する工程と、
ｃ．工程（ｂ）で生成されたヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）ブレンドを収集する工程と、を含む。
１つ以上の例示的な方法において、方法は：
ａ．ＨＭＯを産生することができる遺伝的に操作された細胞を準備する工程であって、上記細胞が、
ｉ．配列番号１［ｌｇｔＡ］で示される異種β－１，３－Ｎ－アセチル－グルコサミニルトランスフェラーゼタンパク質、又は配列番号１と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体を含み；且つ
ｉｉ．配列番号５［ｃｖｂ３ｇａｌＴ］で示される異種β－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼタンパク質、又は配列番号５と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体を含み；且つ
ｉｉｉ．配列番号４９［ｆｕｃＴ５４］で示される異種α－１，２－フコシルトランスフェラーゼタンパク質、又は配列番号４９と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体を含み；且つ
ｉｖ．コラン酸遺伝子クラスター（ｇｍｄ、ｗｃａＧ、ｗｃａＨ、ｗｃａＩ、ｍａｎＣ、ｍａｎＢ）を機能的に発現し、
ｖ．ｉ）～ｉｖ）の発現を制御するための天然又は異種調節要素を含む工程と、
ｂ．好適な細胞培養培地で（ａ）に従って細胞を培養し、上記タンパク質を発現し、ＨＭＯブレンドを生成する工程と、
ｃ．工程（ｂ）で生成されたヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）ブレンドを収集する工程と、を含む。
【0044】
本開示は、主に２’－ＦＬ及びＬＮＦＰ－ＩからなるＨＭＯブレンドを生成するためのいくつかの菌株操作ツール及び発酵プロセスの調整を提供する。本明細書で提示されるアプローチは、２’－ＦＬ及びＬＮＦＰ－Ｉが獲得したブレンドの主要なＨＭＯであることを保証するだけでなく、各々が独自の方法で２つのＨＭＯのいずれかの合成を促進する。
【0045】
例えば、主にＬＮＦＰ－Ｉ及び２’－ＦＬからなり、ＬＮＦＰ－Ｉが最も豊富なＨＭＯであるブレンドの合成は、スルフリフレクサス・モビリス（Ｓｕｌｆｕｒｉｆｌｅｘｕｓ ｍｏｂｉｌｉｓ）（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ：ＷＰ＿１２６４５５３９２．１）由来のＳｍｏｂ酵素などの適切なα－１，２－フコシルトランスフェラーゼを選択することによってのみ達成できる。その代わりに、主にＬＮＦＰ－Ｉ及び２’－ＦＬからなり、２’－ＦＬが最も豊富なＨＭＯであるブレンドが望まれる場合は、そのとき対応する産生株が、本明細書に開示されるトランスポータタンパク質の群から選択される異種ＭＦＳトランスポータとともに、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ：ＷＰ＿０８０４７３８６５．１）由来のＦｕｔＣ酵素を発現する必要がある。
【0046】
更に、コラン酸（ｃｏｌｏｎｉｃ ａｃｉｄ）遺伝子クラスターの発現レベルは、産生菌株によって発現されるグリコシルトランスフェラーゼに関係なく、ブレンド中のＨＭＯ、２’－ＦＬ、又はＬＮＦＰ－Ｉのいずれかの普及を可能にする高度な方法で調整できる。例えば、その天然遺伝子座からのコラン酸（ｃｏｌｏｎｉｃ ａｃｉｄ）遺伝子クラスターの発現を駆動するプロモータの強度を変更することは、細胞内ＧＤＰ－フコースのレベルを制御し、その後内在化したラクトースと新たに形成されたＬＮＴの両方のフコシル化の程度を制御するための固有のツールであり、これは、産生菌株で発現されるグリコシルトランスフェラーゼ又は他の異種タンパク質に特徴的な方法で、２’－ＦＬ及びＬＮＦＰ－Ｉの比率に影響を与える。
【0047】
［ヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）］
本開示の文脈において、用語「オリゴ糖」は、いくつかの単糖単位を含有する糖ポリマーを意味する。単糖単位の数は、３～１５の範囲、例えば３～１０の範囲、例えば３～６の範囲、例えば３～５の範囲である。いくつかの実施形態において、好ましいオリゴ糖は、３又は４単糖単位、即ち三糖、四糖、五糖、又は六糖からなる糖ポリマーである。本開示の好ましいオリゴ糖は、ヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）である。
本開示の文脈において、用語「オリゴ糖」は、いくつかの単糖単位を含有する糖ポリマーを意味する。単糖単位の数は、３～１５の範囲、例えば３～１０の範囲、例えば３～６の範囲、例えば３～５の範囲である。いくつかの実施形態において、好ましいオリゴ糖は、３又は４単糖単位、即ち三糖、四糖、五糖、又は六糖からなる糖ポリマーである。本開示の好ましいオリゴ糖は、ヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）である。
【0048】
本文脈において、用語「ヒトミルクオリゴ糖」又は「ＨＭＯ」は、ヒト母乳中に見出される複合糖質を意味する。ＨＭＯは、１つ以上のベータ－Ｎ－アセチル－ラクトサミニル及び／又は１つ以上のベータ－ラクト－Ｎ－ビオシル単位によって伸長され得る還元末端にラクトース単位を含むコア構造を有し、このコア構造は、アルファ－Ｌ－フコピラノシル及び／又はアルファ－Ｎ－アセチル－ノイラミニル（シアリル）部分によって置換され得る。
【0049】
この点に関して、非酸性（又は中性）ＨＭＯは、シアリル残基を欠き、酸性ＨＭＯは、それらの構造に少なくとも１つのシアリル残基を有する。非酸性（又は中性）ＨＭＯは、フコシル化されても又はされなくてもよい。このような中性の非フコシル化ＨＭＯの例としては、ラクト－Ｎ－トリオース２（ＬＮＴ－２）ラクト－Ｎ－テトラオース（ＬＮＴ）、ラクト－Ｎ－ネオテトラオース（ＬＮｎＴ）、ラクト－Ｎ－ネオヘキサオース（ＬＮｎＨ）、パラ－ラクト－Ｎ－ネオヘキサオース（ｐＬＮｎＨ）、パラ－ラクト－Ｎ－ヘキサオース（ｐＬＮＨ）及びラクト－Ｎ－ヘキサオース（ＬＮＨ）が挙げられる。中性フコシル化ＨＭＯの例としては、２’－フコシルラクトース（２’－ＦＬ）、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＩ（ＬＮＦＰ－Ｉ）、ラクト－Ｎ－ジフコヘキサオースＩ（ＬＮＤＦＨ－Ｉ）、３－フコシルラクトース（３’－ＦＬ）、ジフコシルラクトース（ＤＦＬ）、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＩＩ（ＬＮＦＰ－ＩＩ）、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＩＩＩ（ＬＮＦＰ－ＩＩＩ）、ラクト－Ｎ－ジフコヘキサオースＩＩＩ（ＬＮＤＦＨ－ＩＩＩ）、フコシル－ラクト－Ｎ－ヘキサオースＩＩ（ＦＬＮＨ－ＩＩ）、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＶ（ＬＮＦＰ－Ｖ）、ラクト－Ｎ－ジフコヘキサオースＩＩ（ＬＮＤＦＨ－ＩＩ）、フコシル－ラクト－Ｎ－ヘキサオースＩ（ＦＬＮＨ－Ｉ）、フコシル－パラ－ラクト－Ｎ－ヘキサオースＩ（ＦｐＬＮＨ－Ｉ）、フコシル－パラ－ラクト－Ｎ－ネオヘキサオースＩＩ（Ｆ－ｐＬＮｎＨ ＩＩ）及びフコシル－ラクト－Ｎ－ネオヘキサオース（ＦＬＮｎＨ）が挙げられる。酸性ＨＭＯの例としては、３’－シアリルラクトース（３’－ＳＬ）、６’－シアリルラクトース（６’－ＳＬ）、３－フコシル－３’－シアリルラクトース（ＦＳＬ）、３’－Ｏ－シアリルラクト－Ｎ－テトラオースａ（ＬＳＴ ａ）、フコシル－ＬＳＴ ａ（ＦＬＳＴ ａ）、６’－Ｏ－シアリルラクト－Ｎ－テトラオースｂ（ＬＳＴ ｂ）、フコシル－ＬＳＴ ｂ（ＦＬＳＴ ｂ）、６’－Ｏ－シアリルラクト－Ｎ－ネオテトラオース（ＬＳＴ ｃ）、フコシル－ＬＳＴ ｃ（ＦＬＳＴ ｃ）、３’－Ｏ－シアリルラクト－Ｎ－ネオテトラオース（ＬＳＴ ｄ）、フコシル－ＬＳＴ ｄ（ＦＬＳＴ ｄ）、シアリル－ラクト－Ｎ－ヘキサオース（ＳＬＮＨ）、シアリル－ラクト－Ｎ－ネオヘキサオースＩ（ＳＬＮＨ－Ｉ）、シアリル－ラクト－Ｎ－ネオヘキサオースＩＩ（ＳＬＮＨ－ＩＩ）及びジシアリル－ラクト－Ｎ－テトラオース（ＤＳＬＮＴ）が挙げられる。
【0050】
本開示の文脈において、ラクトースは、ＨＭＯ種であるとみなされない。
【0051】
［ヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）ブレンド］
用語「ブレンド」又は「ＨＭＯブレンド」は、ＬＮＴ、ＬＮｎＴ、ＬＮＨ、ＬＮＴ－ＩＩ、ＬＮｎＨ、ｐａｒａ－ＬＮＨ、ｐａｒａ－ＬＮｎＨ、２’－ＦＬ、３ＦＬ、ＤＦＬ、ＬＮＦＰ Ｉ、ＬＮＤＦＨ－Ｉ、ＬＮＦＰ ＩＩ、ＬＮＦＰ ＩＩＩ、ＬＮＦＰ Ｖ、Ｆ－ＬＮｎＨ、ＤＦ－ＬＮＨ Ｉ、ＤＦ－ＬＮＨ ＩＩ、ＤＦ－ＬＮＨ Ｉ、ＤＦ－ｐａｒａ－ＬＮＨ、ＤＦ－ｐａｒａ－ＬＮｎＨ、３’－ＳＬ、６’－ＳＬ、ＦＳＬ、Ｆ－ＬＳＴ ａ、Ｆ－ＬＳＴ ｂ、Ｆ－ＬＳＴ ｃ、ＬＳＴ ａ、ＬＳＴ ｂ、ＬＳＴ ｃ、及びＤＳ－ＬＮＴから選択されるＨＭＯが挙げられるがこれらに限定されないものなどの、２つ以上のＨＭＯ及び／又はＨＭＯ前駆体の混合物を指す。本明細書で記載されるＨＭＯブレンドは、精製されたＨＭＯ又は異なる発酵バッチで生成されたＨＭＯを混合することによってではなく、発酵終了時に得られる。ＨＭＯブレンドは発酵中又は発酵終了時に生成されるＨＭＯの組成であり、発酵終了時のＨＭＯブレンドは最終ＨＭＯブレンドとも呼ばれる。ＨＭＯのブレンドは下流で精製される場合があるが、その目的は、発酵後に得られるＨＭＯブレンドと同様の比率のＨＭＯブレンドを維持することである。精製後のブレンドに更なるＨＭＯは添加されないと考えられる。
用語「ブレンド」又は「ＨＭＯブレンド」は、ＬＮＴ、ＬＮｎＴ、ＬＮＨ、ＬＮＴ－ＩＩ、ＬＮｎＨ、ｐａｒａ－ＬＮＨ、ｐａｒａ－ＬＮｎＨ、２’－ＦＬ、３ＦＬ、ＤＦＬ、ＬＮＦＰ Ｉ、ＬＮＤＦＨ－Ｉ、ＬＮＦＰ ＩＩ、ＬＮＦＰ ＩＩＩ、ＬＮＦＰ Ｖ、Ｆ－ＬＮｎＨ、ＤＦ－ＬＮＨ Ｉ、ＤＦ－ＬＮＨ ＩＩ、ＤＦ－ＬＮＨ Ｉ、ＤＦ－ｐａｒａ－ＬＮＨ、ＤＦ－ｐａｒａ－ＬＮｎＨ、３’－ＳＬ、６’－ＳＬ、ＦＳＬ、Ｆ－ＬＳＴ ａ、Ｆ－ＬＳＴ ｂ、Ｆ－ＬＳＴ ｃ、ＬＳＴ ａ、ＬＳＴ ｂ、ＬＳＴ ｃ、及びＤＳ－ＬＮＴから選択されるＨＭＯが挙げられるがこれらに限定されないものなどの、２つ以上のＨＭＯ及び／又はＨＭＯ前駆体の混合物を指す。本明細書で記載されるＨＭＯブレンドは、精製されたＨＭＯ又は異なる発酵バッチで生成されたＨＭＯを混合することによってではなく、発酵終了時に得られる。ＨＭＯブレンドは発酵中又は発酵終了時に生成されるＨＭＯの組成であり、発酵終了時のＨＭＯブレンドは最終ＨＭＯブレンドとも呼ばれる。ＨＭＯのブレンドは下流で精製される場合があるが、その目的は、発酵後に得られるＨＭＯブレンドと同様の比率のＨＭＯブレンドを維持することである。精製後のブレンドに更なるＨＭＯは添加されないと考えられる。
【0052】
１つ以上の例示的な実施形態において、本明細書で言及される「ＨＭＯブレンド」は、ＬＮＴ、ＬＮＴ－ＩＩ、ＬＮｎＨ、ｐａｒａ－ＬＮＨ、２’－ＦＬ、ＤＦＬ、及びＬＮＦＰ Ｉからなる群から選択される２つ以上のＨＭＯ及び／又はＨＭＯ前駆体の混合物に関する。好ましくは、ＨＭＯブレンド又はＨＭＯブレンドの主要成分は、単一の産生菌株から産生される。
【0053】
［主要なＨＭＯとしてＬＮＦＰ－Ｉ及び２’－ＦＬを有するブレンド］
本開示は、主要なＨＭＯとしてＬＮＦＰ－Ｉ及び２’－ＦＬを有するＨＭＯの固有且つ多様なブレンドを達成する２つの主要な方法、即ち菌株操作戦略及び発酵プロセス戦略を強調する。本目的を達成するための菌株操作戦略は、ＨＭＯ産生細胞の以下の遺伝形質の操作を含む。
１．導入されるα－１，２－フコシルトランスフェラーゼの選択
２．コラン酸遺伝子クラスターの発現の程度
３．β－１，３－Ｎ－アセチル－グルコサミニルトランスフェラーゼの発現の程度又はコピー数
４．主要ファシリテータースーパーファミリー（ＭＦＳ）の糖トランスポータの導入
５．細胞の規制状況の変化 例えばｇｌｐＲ調節因子の欠失
本開示は、主要なＨＭＯとしてＬＮＦＰ－Ｉ及び２’－ＦＬを有するＨＭＯの固有且つ多様なブレンドを達成する２つの主要な方法、即ち菌株操作戦略及び発酵プロセス戦略を強調する。本目的を達成するための菌株操作戦略は、ＨＭＯ産生細胞の以下の遺伝形質の操作を含む。
１．導入されるα－１，２－フコシルトランスフェラーゼの選択
２．コラン酸遺伝子クラスターの発現の程度
３．β－１，３－Ｎ－アセチル－グルコサミニルトランスフェラーゼの発現の程度又はコピー数
４．主要ファシリテータースーパーファミリー（ＭＦＳ）の糖トランスポータの導入
５．細胞の規制状況の変化 例えばｇｌｐＲ調節因子の欠失
【0054】
本開示における発酵プロセス戦略は、非常に予測可能な方法で、菌株操作から誘導される所与の菌株との特定のＨＭＯブレンドプロファイルを達成するために、発酵温度及び／又は発酵ブロス中のラクトースレベルの調整が含まれる。
【0055】
［ブレンド比］
本明細書で開示される方法によって生成されるＨＭＯ生成物は、また、それらの比によって説明することもできる。本明細書で記載される「比」は、ＨＭＯの２つの量の間の比として理解され、例えば、一方の量を他方の量で割ったもの、又は一方の量を総量で割ったものなどであるが、これらに限定されない。
本明細書で開示される方法によって生成されるＨＭＯ生成物は、また、それらの比によって説明することもできる。本明細書で記載される「比」は、ＨＭＯの２つの量の間の比として理解され、例えば、一方の量を他方の量で割ったもの、又は一方の量を総量で割ったものなどであるが、これらに限定されない。
【0056】
本発明の一実施形態において、本明細書に記載の菌株による発酵後、ＨＭＯブレンドは、９０～３０％のモル％のＬＮＦＰ－１及び７０～１０％のモル％の２’－ＦＬ、例えば、９０～４０％のモル％のＬＮＦＰ－１及び６０～１０％のモル％の２’－ＦＬ、例えば、全ＨＭＯの２５％～７０％のモル％の２’－ＦＬ及び３０％～６０％のモル％のＬＮＦＰ－Ｉを有する。
【0057】
実施例からの発酵データ（温度調節）によって裏付けられたモル％ブレンド比は、以下のような例示的なＨＭＯブレンド組成範囲を示す：全てのＨＭＯの合計に対するＬＮＦＰ－Ｉ［４７～６３］、２’－ＦＬ［３１～５１］、及びＬＮＴ［１～５］、又は６３／３１／５～４７／５１／１（全てモル％）のＬＮＦＰ－Ｉ／２’－ＦＬ／ＬＮＴの組み合わせ、例えば温度を調節する場合、ＬＮＦＰ－Ｉのモル％は８０～３０％、２’－ＦＬは７０～２０％などであるが、これらに限定されない。
【0058】
発明のいくつかの実施形態において、発酵は２５～３４℃、好ましくは３０～３２℃で行われ、ブレンド中の主なＨＭＯのモル％は、ＬＮＦＰ－Ｉが３０～６０％、２’－ＦＬが４０～７０％である。
【0059】
発明のいくつかの実施形態において、発酵は２５～２８℃で行われ、ブレンド中の主なＨＭＯのモル％は、ＬＮＦＰ－Ｉが４５～５５％、２’－ＦＬが４５～５５％である。
【0060】
発明のいくつかの実施形態において、発酵は２８～３４℃で行われ、ブレンド中の主なＨＭＯのモル％は、ＬＮＦＰ－Ｉが３０～４５％、２’－ＦＬが５５～７０％である。
【0061】
実施例からのラクトース調節については、高ラクトースプロセスについてのモル％の例示的な以下の範囲を示す：ＬＮＦＰ－Ｉ／ＨＭＯ［６０～６８］、ＬＮＴ／ＨＭＯ［２１～２７］、ＬＮＴ－ＩＩ／ＨＭＯ［６～９］、２’－ＦＬ／ＨＭＯ［４～６］。また、低ラクトースプロセスについては、モル％で以下の範囲が見つかった：ＬＮＦＰ－Ｉ／ＨＭＯ［６６～７０］、２’－ＦＬ／ＨＭＯ［２５～３０］、ＬＮＴ／ＨＭＯ［３～４］、ＬＮＴ－ＩＩ／ＨＭＯ［１～１．５］。
【0062】
本明細書において、例えば、低ラクトースプロセスは、２つの最も豊富なＨＭＯであるＬＮＦＰ－Ｉ及び２’－ＦＬを有するブレンドを支持する。
【0063】
従って、１つ以上の例示的な実施形態において、ラクトースを調節する場合、ＬＮＦＰ－Ｉのモル％は９０～４０％、２’－ＦＬは６０～１０％であり得る。
【0064】
従って、１つ以上の例示的な実施形態において、ラクトースを調節する場合、ＬＮＦＰ－Ｉのモル％は９０～３０％、２’－ＦＬは７０～１０％であり得る。
【0065】
いくつかの実施形態において、発酵中のラクトースは低く、例えば２０ｇ／Ｌ未満、好ましくは１５ｇ／Ｌ未満、例えば０．５～１５ｇ／Ｌ、好ましくは１０ｇ／Ｌ未満、例えば１～１０ｇ／Ｌであり、２’－ＦＬのモル％は、ブレンド中の全ＨＭＯの２０％超、好ましくは３０％超である。
【0066】
１つ以上の例示的な実施形態において、ＬＮＦＰ－Ｉ／２’－ＦＬ／ＬＮＴ間の比は、１５：８：２、１５：７：２、１５：６：２、又は１５：５：２であり得る。
【0067】
以下の比は、規制バッチで製造された材料、従ってモル比ではなく質量比に基づく。
【0068】
１つ以上の例示的な実施形態において、ＬＮＦＰ－Ｉ／２’－ＦＬ／ＬＮＴ間の質量比は、６０：３０：１、４０：２０：１、３０：１５：１、１０：５：１、８：４：１、６：３：１であり得る。
【0069】
本明細書では、ＬＮＦＰ－Ｉ／２’－ＦＬ／ＬＮＴ間の質量比は、８０：４０：１、８０：３０：１、８０：２０：１、８０：１５：１、８０：１０：１、８０：５：１、８０：４：１であり得ることが記載されている。
【0070】
１つ以上の例示的な実施形態において、ＬＮＦＰ－Ｉ／２’－ＦＬ／ＬＮＴ間の質量比は、６０：３０：１、６０：３０：２、６０：３０：３、６０：３０：４、６０：３０：５であり得る。
【0071】
１つ以上の例示的な実施形態において、ＬＮＦＰ－Ｉ／２’－ＦＬ／ＬＮＴ間の質量比は、６０：１５：１、６０：１５：２、６０：１５：３、６０：１５：４、６０：１５：５であり得る。
【0072】
１つ以上の例示的な実施形態において、ＬＮＦＰ－Ｉ／２’－ＦＬ／ＬＮＴ間の質量比は、以下［８０～５０］：［２５～１５］：［０～５］の範囲内であり得る。
【0073】
１つ以上の例示的な実施形態において、（ＬＮＦＰ－Ｉ＋２’－ＦＬ）／ＬＮＴ間の質量比は、以下の範囲［９５～７５］：［０～５］の範囲内であり得る。
【0074】
［機能的酵素］
コラン酸遺伝子クラスターを過剰発現し、異種β－１，３－Ｎ－アセチル－グルコサミニルトランスフェラーゼ、β－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼ、及びα－１，２－フコシルトランスフェラーゼからなる群から選択される機能的酵素を発現する細胞によって産生される様々なＨＭＯの存在量を変化させるために、いくつかの遺伝子工学的アプローチが適用されている。
コラン酸遺伝子クラスターを過剰発現し、異種β－１，３－Ｎ－アセチル－グルコサミニルトランスフェラーゼ、β－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼ、及びα－１，２－フコシルトランスフェラーゼからなる群から選択される機能的酵素を発現する細胞によって産生される様々なＨＭＯの存在量を変化させるために、いくつかの遺伝子工学的アプローチが適用されている。
【0075】
一般的に、以下の実施例で明らかなように、本発明者らは、ほとんどの遺伝子操作がＬＮＦＰ－Ｉ及び２’－ＦＬの比率に影響を与え、程度は低いが、最終ＨＭＯブレンド中のＬＮＴ及びＬＮＴ－ＩＩなどの前駆体糖の相対存在量にも影響を与えることを観察した。最終ＨＭＯブレンドは、発酵の終了時に遺伝子改変細胞によって産生されるＨＭＯの混合物として理解される。
【0076】
獲得した最終ＨＭＯブレンドのＬＮＦＰ－Ｉと２’－ＦＬの比率の有意差は、様々な細菌種からの異なる異種α－１，２－フコシルトランスフェラーゼを導入するだけで最初に得られた。
【0077】
このタイプの様々なグリコシルトランスフェラーゼを試験した結果、様々な最終ＨＭＯブレンドが得られ、ここでＬＮＦＰ－Ｉ及び２’－ＦＬが主なＨＭＯであった。ラクトース及びＬＮＴに対する異種α－１，２－フコシルトランスフェラーゼの特異性は、主に、ＬＮＦＰ－Ｉ又は２’－ＦＬがブレンド内で最も豊富なＨＭＯであるかどうかを決定した。
【0078】
［導入された機能的酵素の選択］
例えば、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ：ＷＰ＿０８０４７３８６５．１、ただし、Ｃ末端に２つの追加アミノ酸（ＬＧ）を有する又は配列番号６）からのα－１，２－フコシルトランスフェラーゼＦｕｔＣのラクトースに対するより高い特異性は、２’－ＦＬが最も豊富なＨＭＯであるＨＭＯブレンドをもたらした。
例えば、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ：ＷＰ＿０８０４７３８６５．１、ただし、Ｃ末端に２つの追加アミノ酸（ＬＧ）を有する又は配列番号６）からのα－１，２－フコシルトランスフェラーゼＦｕｔＣのラクトースに対するより高い特異性は、２’－ＦＬが最も豊富なＨＭＯであるＨＭＯブレンドをもたらした。
【0079】
これに対して、スルフリフレクサス・モビリス（Ｓｕｌｆｕｒｉｆｌｅｘｕｓ ｍｏｂｉｌｉｓ）（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ：ＷＰ＿１２６４５５３９２．１又は配列番号８）からのα－１，２－フコシルトランスフェラーゼＳｍｏｂ酵素により、ブレンドが得られ、ここでのＬＮＦＰ－Ｉが主なＨＭＯであり、２’－ＦＬが２番目に豊富なＨＭＯであり、ＬＮＴ－ＩＩが限られた量でのみ形成されていた。
【0080】
ほぼ等モル濃度のＬＮＦＰ－Ｉ及び２’－ＦＬを含むＨＭＯブレンドをもたらす酵素もあり、これは、いずれかの重要な基質、即ち、ＬＮＴ及びラクトースに対するそれらの特異性がほぼ均等であることを示している。
【0081】
このような酵素の例は、シデロキシダンス・リソトロフィカス（Ｓｉｄｅｒｏｘｙｄａｎｓ ｌｉｔｈｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ）ＥＳ－１１（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ：ＷＰ＿０１３０３１０１０．１又は配列番号４９）からのα－１，２－フコシルトランスフェラーゼＦｕｃＴ５４及びメチロバクター・ツンドリパルダム（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｔｕｎｄｒｉｐａｌｕｄｕｍ）（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ：ＷＰ＿０３１４３７１９８．１又は配列番号７）からのＭｔｕｎである。
【0082】
α－１，２－フコシルトランスフェラーゼの選択とは別に、ＦｕｔＣを発現する細胞の他のいくつかのタイプの遺伝子改変は、ＬＮＦＰ－Ｉ及び２’－ＦＬの比率に特異的に影響を与える可能性がある。
【0083】
したがって、ｆｕｔＣ発現細胞における特定の遺伝的変化は、ＬＮＦＰ－Ｉ又は２’－ＦＬのいずれかが最も豊富なＨＭＯであり、２’－ＦＬ又はＬＮＦＰ－Ｉがそれぞれ２番目に豊富なＨＭＯである所与のＨＭＯブレンドに関連付けられている可能性がある。
【0084】
ＨＭＯブレンドを合成することができるように、組換え細胞は、グリコシルトランスフェラーゼ活性を備える機能的酵素をコードする少なくとも１つの組換え核酸を含む。グリコシル化活性は、内在化した単糖又は二糖から連続的なグリコシル化工程を経てオリゴ糖を合成するために必要な酵素活性として理解されるべきであり、内在化したアクセプタ、例えばラクトースは、第１のグリコシル化工程で三糖にグリコシル化され、次いでその三糖が第２のグリコシル化工程で四糖にグリコシル化されるなどである。グリコシル化工程は、それぞれのグリコシルトランスフェラーゼによって媒介される。
【0085】
この関連で、語句「活性化された糖ヌクレオチドのグリコシル残基を、上記アクセプタから上記オリゴ糖への生合成経路の中間体に転移させることができるグリコシルトランスフェラーゼ」又は「活性化された糖ヌクレオチドのグリコシル残基を、上記アクセプタから上記オリゴ糖への生合成経路の中間体に転移させることができるグリコシルトランスフェラーゼ」は、第２、第３などのグリコシル化工程を指す。オリゴ糖、より具体的にはＨＭＯに関して、用語「生合成経路の中間体」は、所望のオリゴ糖又はＨＭＯを生成するために必要な反応工程における中間体オリゴ糖又はＨＭＯとして理解されるべきである。
【0086】
例えば、ラクト－Ｎ－テトラオースはラクトースから調製され、第１のグリコシルトランスフェラーゼ（β－１，３－Ｎ－アセチル－グルコサミニルトランスフェラーゼ）は、ＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃのＧｌｃＮＡｃを内在化したラクトースに転移し、ラクト－Ｎ－トリオースＩＩ（ＬＮＴ－ＩＩ）を形成し、次いで第２のグリコシルトランスフェラーゼ（β－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼ）は、ＵＤＰ－ＧａｌのＧａｌを先に形成したＬＮＴ－ＩＩに転移し、ラクト－Ｎ－テトラオース（ＬＮＴ）を形成し、第３のグリコシルトランスフェラーゼ（α－１，２－フコシルトランスフェラーゼ）は、ＧＤＰ－ＦｕｃのＦｕｃを先に形成したＬＮＴに転移し、従ってラクト－Ｎ－フコペンタオースＩ（ＬＮＦＰ－Ｉ）を形成する。この関連で、ＬＮＴ－ＩＩ及びＬＮＴは、ラクトースからＬＮＦＰ－Ｉへの生合成経路の中間体であると考えられる（図１２も参照されたい）。同じ又は第２のグリコシルフコシルトランスフェラーゼは、ＧＤＰ－ＦｕｃのＦｕｃをＬＮＦＰ－Ｉに転移して、ラクト－Ｎ－ジフコヘキサオースＩ（ＬＮＤＦＨ－Ｉ）を形成することができる。
【0087】
グリコシルトランスフェラーゼ遺伝子は、遺伝的に操作された細胞のゲノムに（染色体組み込みによって）組み込まれる場合があるか、又はあるいは、それは、遺伝的に操作された細胞のゲノムに組み込まれるか、若しくはプラスミドＤＮＡに挿入され、プラスミド保有（ｐｌａｓｍｉｄ－ｂｏｒｎｅ）グリコシルトランスフェラーゼとして発現され得る構築体に含まれる場合がある。
【0088】
ＨＭＯブレンド、例えば２’－ＦＬ又はＬＮＦＰ－Ｉの生成に２つ以上のグリコシルトランスフェラーゼが必要な場合、グリコシルトランスフェラーゼ活性を有する異なる酵素をコードする２つ以上の組換え核酸は、ゲノムに組み込まれる、構築体に含まれる、及び／又はプラスミドから発現され得る（例えば、２’－ＦＬ及び／又はＬＮＦＰ－Ｉを生成するためにβ－１，３－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ（第２のグリコシルトランスフェラーゼをコードする第２の組換え核酸）及びβ－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼ（第３のグリコシルトランスフェラーゼをコードする第３の組換え核酸）と潜在的に組み合わされたα－１，２－フコシルトランスフェラーゼ（第１のグリコシルトランスフェラーゼをコードする第１の組換え核酸）であって、第１、第２、及び第３の組換え核酸は、互いに独立して、染色体に、又は１つ以上の構築体及び／若しくはプラスミドに組み込むことができる）。
【0089】
１つ以上の例示的な実施形態において、第１、第２、及び第３の組換え核酸は両方とも、遺伝的に操作された細胞の染色体に安定して組み込まれる。組み込みは、宿主細胞のゲノム内の１つ以上の部位で行うことができる。宿主細胞の１つのゲノム部位に組み込まれた場合、組換え核酸は、オペロンを形成する単一の調節要素の制御下にあるか、又は個々の調節要素の制御下のいずれかにあることができる。あるいは、組換え核酸は、個々の調節要素の制御下で宿主細胞のゲノム内のいくつかの場所に組み込まれ得る。
【0090】
現在の例示的な別の実施形態において、第１、第２、及び第３のグリコシルトランスフェラーゼの少なくとも１つは、プラスミド保有である。
【0091】
［異種発現］
本開示において、異種という用語は、タンパク質をコードする核酸が、通常はそのタンパク質を産生（即ち発現）しない細胞に導入され、その細胞がタンパク質を発現できるようになり、遺伝子改変細胞と呼ばれることを意味する。従って、異種とは、発現されたタンパク質が最初にレシピエント／宿主細胞とは異なる細胞型又は種からクローニングされた、又はそれに由来するという事実を指す。所望のタンパク質をコードする核酸は、レシピエント細胞がｃＤＮＡをタンパク質として発現することを促進する形式でなければならない（即ち、それは発現ベクターに入れられる）。外来遺伝物質をレシピエント細胞に転移する方法には、トランスフェクションと形質導入、並びにクリスパー／ｃａｓが含まれる。レシピエント細胞の種類の選択は、タンパク質の機能を詳細に調べる実験の必要性に基づいて行われることが多く、異種発現系として知られる最も一般的なレシピエントは、通常、ＤＮＡを転移しやすいため、又はタンパク質の機能をより簡単に評価できるという理由で選択される。
本開示において、異種という用語は、タンパク質をコードする核酸が、通常はそのタンパク質を産生（即ち発現）しない細胞に導入され、その細胞がタンパク質を発現できるようになり、遺伝子改変細胞と呼ばれることを意味する。従って、異種とは、発現されたタンパク質が最初にレシピエント／宿主細胞とは異なる細胞型又は種からクローニングされた、又はそれに由来するという事実を指す。所望のタンパク質をコードする核酸は、レシピエント細胞がｃＤＮＡをタンパク質として発現することを促進する形式でなければならない（即ち、それは発現ベクターに入れられる）。外来遺伝物質をレシピエント細胞に転移する方法には、トランスフェクションと形質導入、並びにクリスパー／ｃａｓが含まれる。レシピエント細胞の種類の選択は、タンパク質の機能を詳細に調べる実験の必要性に基づいて行われることが多く、異種発現系として知られる最も一般的なレシピエントは、通常、ＤＮＡを転移しやすいため、又はタンパク質の機能をより簡単に評価できるという理由で選択される。
【0092】
実施例で示すように、最終ブレンドにおける１番目と２番目に豊富なＨＭＯの存在量の順序は、２’－ＦＬ＞ＬＮＦＰ－ＩからＬＮＦＰ－Ｉ＞２’－ＦＬに逆転する可能性があり、これは、ｆｕｔＣ発現細胞におけるｌｇｔＡ（β－１，３－Ｎ－アセチル－グルコサミニルトランスフェラーゼをコードする）及びｇａｌＴＫ（β－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼをコードする）遺伝子のコピー数を同時に増加させることによって達成される。
【0093】
［異種β－１，３－Ｎ－アセチル－グルコサミニルトランスフェラーゼ］
異種β－１，３－Ｎ－アセチル－グルコサミニルトランスフェラーゼは、ＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃのＧｌｃＮＡｃをラクトースに転移する能力を含む任意のタンパク質である。本明細書で使用されるβ－１，３－Ｎ－アセチル－グルコサミニルトランスフェラーゼは、遺伝的に操作された細胞の種に起源を持たない、即ち、β－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子は、異種起源のものである。異種β－１，３－Ｎ－アセチル－グルコサミニルトランスフェラーゼの例は、それぞれ、配列番号１、２、及び３で例示されるＬｇｔＡ、ＰｍｎａｇＴ、及びＨＤ０４６６である。
異種β－１，３－Ｎ－アセチル－グルコサミニルトランスフェラーゼは、ＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃのＧｌｃＮＡｃをラクトースに転移する能力を含む任意のタンパク質である。本明細書で使用されるβ－１，３－Ｎ－アセチル－グルコサミニルトランスフェラーゼは、遺伝的に操作された細胞の種に起源を持たない、即ち、β－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子は、異種起源のものである。異種β－１，３－Ｎ－アセチル－グルコサミニルトランスフェラーゼの例は、それぞれ、配列番号１、２、及び３で例示されるＬｇｔＡ、ＰｍｎａｇＴ、及びＨＤ０４６６である。
【0094】
［ｌｇｔＡ］
ｌｇｔＡ遺伝子は、β－１，３－Ｎ－アセチル－グルコサミニル－トランスフェラーゼをコードする遺伝子であり、遺伝子の相同体はいくつかの細菌種で見出されており、ここで遺伝子は細菌のリポオリゴ糖のラクト－Ｎ－ネオ－テトラオース構造要素の合成に関与している。
ｌｇｔＡ遺伝子は、β－１，３－Ｎ－アセチル－グルコサミニル－トランスフェラーゼをコードする遺伝子であり、遺伝子の相同体はいくつかの細菌種で見出されており、ここで遺伝子は細菌のリポオリゴ糖のラクト－Ｎ－ネオ－テトラオース構造要素の合成に関与している。
【0095】
１つ以上の例示的な実施形態において、ｌｇｔＡ遺伝子は、配列番号４０で示されるとおりであるか、又は配列番号４０と少なくとも７０％同一、例えば、配列番号４０と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、若しくは１００％同一の核酸配列を有するその機能的相同体である。
【0096】
１つ以上の例示的な実施形態において、ｌｇｔＡ遺伝子は、配列番号１のタンパク質、又は配列番号１と少なくとも７０％同一、例えば、配列番号１と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、若しくは１００％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体をコードする。
【0097】
［ＰｍｎａｇＴ］
１つ以上の例示的な実施形態において、ＰｍｎａｇＴ遺伝子は、配列番号４１で示されるとおりであるか、又は配列番号４１と少なくとも７０％同一、例えば、配列番号４１と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、若しくは１００％同一の核酸配列を有するその機能的相同体である。
１つ以上の例示的な実施形態において、ＰｍｎａｇＴ遺伝子は、配列番号４１で示されるとおりであるか、又は配列番号４１と少なくとも７０％同一、例えば、配列番号４１と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、若しくは１００％同一の核酸配列を有するその機能的相同体である。
【0098】
１つ以上の例示的な実施形態において、ＰｍｎａｇＴ遺伝子は、配列番号２のタンパク質、又は配列番号２と少なくとも７０％同一、例えば、配列番号２と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、若しくは１００％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体をコードする。
【0099】
［ＨＤＯ４６６］
１つ以上の例示的な実施形態において、ＨＤ０４６６遺伝子は、配列番号４２で示されるとおりであるか、又は配列番号４２と少なくとも７０％同一、例えば、配列番号４２と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、若しくは１００％同一の核酸配列を有するその機能的相同体である。
１つ以上の例示的な実施形態において、ＨＤ０４６６遺伝子は、配列番号４２で示されるとおりであるか、又は配列番号４２と少なくとも７０％同一、例えば、配列番号４２と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、若しくは１００％同一の核酸配列を有するその機能的相同体である。
【0100】
１つ以上の例示的な実施形態において、ＨＤ０４６６遺伝子は、配列番号３のタンパク質、又は配列番号３と少なくとも７０％同一、例えば、配列番号３と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、若しくは１００％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体をコードする。
【0101】
１つ以上の例示的な実施形態において、これらの酵素を使用して生成され得る異種β－１，３－Ｎ－アセチル－グルコサミニルトランスフェラーゼ及びＨＭＯブレンドを、以下のマトリクスに示す。
【0102】
【表1】
【0103】
［異種β－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼ］
異種β－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼは、ＵＤＰ－ＧａｌのＧａｌをＧｌｃＮＡｃ部分に転移する能力を含む任意のタンパク質である。本明細書で使用されるβ－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼは、遺伝的に操作された細胞の種に起源を持たない、即ち、β－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子は、異種起源のものである。
異種β－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼは、ＵＤＰ－ＧａｌのＧａｌをＧｌｃＮＡｃ部分に転移する能力を含む任意のタンパク質である。本明細書で使用されるβ－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼは、遺伝的に操作された細胞の種に起源を持たない、即ち、β－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子は、異種起源のものである。
【0104】
異種β－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼの例は、ＧａｌＴＫ及びＣｖｂ３ｇａｌＴであり、それぞれ、配列番号４及び５で例示される。
【0105】
［ｇａｌＴＫ］
１つ以上の例示的な実施形態において、ｇａｌＴＫ遺伝子は、配列番号４３で示されるとおりであるか、又は配列番号４３と少なくとも７０％同一、例えば、配列番号４３と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、若しくは１００％同一の核酸配列を有するその機能的相同体である。
１つ以上の例示的な実施形態において、ｇａｌＴＫ遺伝子は、配列番号４３で示されるとおりであるか、又は配列番号４３と少なくとも７０％同一、例えば、配列番号４３と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、若しくは１００％同一の核酸配列を有するその機能的相同体である。
【0106】
１つ以上の例示的な実施形態において、ｇａｌＴＫ遺伝子は、配列番号４のタンパク質、又は配列番号４と少なくとも７０％同一、例えば、配列番号４と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、若しくは１００％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体をコードする。
【0107】
［ｃｖｂ３ｇａｌＴ］
１つ以上の例示的な実施形態において、ｃｖｂ３ｇａｌＴ遺伝子は、配列番号４４で示されるとおりであるか、又は配列番号４４と少なくとも７０％同一、例えば、配列番号４４と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、若しくは１００％同一の核酸配列を有するその機能的相同体である。
１つ以上の例示的な実施形態において、ｃｖｂ３ｇａｌＴ遺伝子は、配列番号４４で示されるとおりであるか、又は配列番号４４と少なくとも７０％同一、例えば、配列番号４４と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、若しくは１００％同一の核酸配列を有するその機能的相同体である。
【0108】
１つ以上の例示的な実施形態において、ｃｖｂ３ｇａｌＴ遺伝子は、配列番号５のタンパク質、又は配列番号５と少なくとも７０％同一、例えば、配列番号５と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、若しくは１００％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体をコードする。
【0109】
異種β－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼのいくつかの非限定的な実施形態を、以下のマトリクスに示す。
【0110】
【表2】
【0111】
［異種α－１，２－フコシルトランスフェラーゼ］
α－１，２－フコシロシルトランスフェラーゼは、α－１，２結合を介してＯ抗原反復単位のガラクトース残基にフコースを付加する役割を果たす。１つ以上の例示的な実施形態において、異種α－１，２－フコシルトランスフェラーゼタンパク質は、配列番号６若しくは７若しくは８のいずれか１つであるか、又は配列番号６、７、若しくは８のいずれか１つと少なくとも８０％同一、例えば、少なくとも番号６、７、若しくは８と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、若しくは１００％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体である。
α－１，２－フコシロシルトランスフェラーゼは、α－１，２結合を介してＯ抗原反復単位のガラクトース残基にフコースを付加する役割を果たす。１つ以上の例示的な実施形態において、異種α－１，２－フコシルトランスフェラーゼタンパク質は、配列番号６若しくは７若しくは８のいずれか１つであるか、又は配列番号６、７、若しくは８のいずれか１つと少なくとも８０％同一、例えば、少なくとも番号６、７、若しくは８と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、若しくは１００％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体である。
【0112】
好適な異種α－１，２－フコシルトランスフェラーゼの例及びＨＭＯブレンドに対するそれらの効果を以下のマトリクスに示す。
【0113】
【表3】
【0114】
［ｆｕｔＣ］
１つ以上の例示的な実施形態において、ｆｕｔＣ遺伝子は、配列番号４５で示されるとおりであるか、又は配列番号４５と少なくとも７０％同一、例えば、配列番号４５と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、若しくは１００％同一の核酸配列を有するその機能的相同体である。
１つ以上の例示的な実施形態において、ｆｕｔＣ遺伝子は、配列番号４５で示されるとおりであるか、又は配列番号４５と少なくとも７０％同一、例えば、配列番号４５と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、若しくは１００％同一の核酸配列を有するその機能的相同体である。
【0115】
１つ以上の例示的な実施形態において、ｆｕｔＣ遺伝子は、配列番号６のタンパク質、又は配列番号６と少なくとも７０％同一、例えば、配列番号６と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、若しくは１００％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体をコードする。
【0116】
［Ｍｔｕｎ］
１つ以上の例示的な実施形態において、Ｍｔｕｎ遺伝子は、配列番号４６で示されるとおりであるか、又は配列番号４６と少なくとも７０％同一、例えば、配列番号４６と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、若しくは１００％同一の核酸配列を有するその機能的相同体である。
１つ以上の例示的な実施形態において、Ｍｔｕｎ遺伝子は、配列番号４６で示されるとおりであるか、又は配列番号４６と少なくとも７０％同一、例えば、配列番号４６と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、若しくは１００％同一の核酸配列を有するその機能的相同体である。
【0117】
１つ以上の例示的な実施形態において、Ｍｔｕｎ遺伝子は、配列番号７のタンパク質、又は配列番号７と少なくとも７０％同一、例えば、配列番号７と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、若しくは１００％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体をコードする。
【0118】
［ＦｕｃＴ５４］
１つ以上の例示的な実施形態において、ＦｕｃＴ５４遺伝子は、配列番号４９のタンパク質、又は配列番号４９と少なくとも７０％同一、例えば、配列番号４９と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、若しくは１００％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体をコードする。国際公開第２０１９／００８１３３号パンフレットにおいて、ＦｕｃＴ５４はいくつかのＬＮＦＰ－Ｉを生成することが示されているが、２’－ＦＬを生成する能力は調査されていない。
１つ以上の例示的な実施形態において、ＦｕｃＴ５４遺伝子は、配列番号４９のタンパク質、又は配列番号４９と少なくとも７０％同一、例えば、配列番号４９と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、若しくは１００％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体をコードする。国際公開第２０１９／００８１３３号パンフレットにおいて、ＦｕｃＴ５４はいくつかのＬＮＦＰ－Ｉを生成することが示されているが、２’－ＦＬを生成する能力は調査されていない。
【0119】
［ｓｍｏｂ］
ｓｍｏｂ遺伝子は、配列番号４７で示されるとおりであるか、又は配列番号４７と少なくとも７０％同一、例えば、配列番号４７と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、若しくは１００％同一の核酸配列を有するその機能的相同体である。
ｓｍｏｂ遺伝子は、配列番号４７で示されるとおりであるか、又は配列番号４７と少なくとも７０％同一、例えば、配列番号４７と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、若しくは１００％同一の核酸配列を有するその機能的相同体である。
【0120】
ｓｍｏｂ遺伝子は、配列番号８のタンパク質、又は配列番号８と少なくとも７０％同一、例えば、配列番号８と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、若しくは１００％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体をコードする。
【0121】
異種α－１，２－フコシルトランスフェラーゼタンパク質は、配列番号８［ｓｍｏｂ］である。これは、より高いレベルのＬＮＦＰ－Ｉが望まれる場合に特に有用であり、細胞は最適には糖トランスポータとして作用する遺伝子産物を任意選択的に更に含み得る。
【0122】
１つ以上の例示的な実施形態において、異種α－１，２－フコシルトランスフェラーゼタンパク質は、配列番号７［ｍｔｕｎ］又は配列番号４９［ｆｕｃＴ５４］である。これらは、等モル濃度のＬＮＦＰ－Ｉ及び２’－ＦＬが望ましい場合に特に有用なＨＭＯブレンドである。
【0123】
１つ以上の例示的な実施形態において、異種α－１，２－フコシルトランスフェラーゼタンパク質は、配列番号６［ｆｕｔＣ］である。これは、より高いレベルの２’ＦＬが望まれる場合に特に有用であり細胞は糖トランスポータとして作用する遺伝子産物を更に含む。
【0124】
［コラン酸遺伝子クラスター］
大腸菌（ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｋ－１２のコラン酸遺伝子クラスターは、細菌の細胞壁の主要なオリゴ糖である細胞外多糖類コラン酸の産生に関与している。コラン酸（ｃｏｌｏｎｉｃ ａｃｉｄ）（ＣＡ）遺伝子クラスターは、次の遺伝子、ｇｍｄ、ｗｃａＧ、ｗｃａＨ、ｗｃａｌ、ｍａｎＢ、及びｍａｎＣで構成されており、これは、ＧＤＰ－フコース生合成経路にも寄与し、これは、ＧＤＰ－フコースはＨＭＯのグリコシル単位のフコシル化の供与体として機能するため、ＨＭＯの生成において重要である。ＣＡ遺伝子クラスターの例は、配列番号５２に示す。
大腸菌（ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｋ－１２のコラン酸遺伝子クラスターは、細菌の細胞壁の主要なオリゴ糖である細胞外多糖類コラン酸の産生に関与している。コラン酸（ｃｏｌｏｎｉｃ ａｃｉｄ）（ＣＡ）遺伝子クラスターは、次の遺伝子、ｇｍｄ、ｗｃａＧ、ｗｃａＨ、ｗｃａｌ、ｍａｎＢ、及びｍａｎＣで構成されており、これは、ＧＤＰ－フコース生合成経路にも寄与し、これは、ＧＤＰ－フコースはＨＭＯのグリコシル単位のフコシル化の供与体として機能するため、ＨＭＯの生成において重要である。ＣＡ遺伝子クラスターの例は、配列番号５２に示す。
【0125】
コラン酸遺伝子クラスター並びにβ－１，３－Ｎ－アセチル－グルコサミニルトランスフェラーゼ、β－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼ、及びα－１，２－フコシルトランスフェラーゼをコードする異種遺伝子は、本明細書で使用される遺伝子改変細胞にＰｇｌｐＦ駆動発現カセットの形で導入されたため、ｇｌｐＲ遺伝子（ＤＮＡ結合転写リプレッサＧｌｐＲをコードする）の欠失は、細胞内の全てのＰｇｌｐＦプロモータからＧｌｐＲによって課される転写抑制を排除し、この方法で全てのＰｇｌｐＦベースの遺伝子発現を増強する可能性がある。従って、最終ブレンドのＨＭＯ含有量は様々な形で影響を受ける可能性がある。本開示の枠組みにおいて、ｆｕｔＣ発現細胞の遺伝的バックグラウンドからｇｌｐＲ遺伝子を欠失させると、最終ＨＭＯブレンドにおけるＬＮＦＰ－Ｉ対２’－ＦＬの比率が増加し得ることが観察された。
【0126】
１つ以上の例示的な実施形態において、コラン酸遺伝子クラスターは、その天然のゲノム遺伝子座から発現されて、遺伝子クラスターによってコードされる機能的タンパク質を生成し、それによってＧＤＰフコース生合成経路に寄与する可能性がある。発現は積極的に調節され得る。発現は、天然プロモータを目的のプロモータと交換すること、及び／又は別のゲノム遺伝子座から遺伝子クラスターを発現することにより上記タンパク質をコードするコラン酸遺伝子のコピー数を増加させること、若しくはコラン酸遺伝子クラスターをエピソーム的に発現することにより調節することができる。実施例に示すように、このような手段は、例えば異種α－１，２－フコシルトランスフェラーゼタンパク質の機能を改善する（実施例２を参照）。
【0127】
従って、１つ以上の例示的な実施形態において、ｉｖ）のコラン酸遺伝子クラスターの発現は、天然プロモータを目的のプロモータと交換すること、及び／又は別のゲノム遺伝子座から遺伝子クラスターを発現することにより上記タンパク質をコードするコラン酸遺伝子のコピー数を増加させること、若しくはコラン酸遺伝子クラスターをエピソーム的に発現することにより調節される。
【0128】
１つ以上の例示的な実施形態において、ｉｖ）のコラン酸遺伝子クラスターは、機能的に発現され得る。
【0129】
［機能的に発現する］
本文脈において、コラン酸遺伝子クラスターに関する用語「機能的に発現する」は、次のように理解しなければならない：コラン酸遺伝子クラスターの発現は、機能的なＧＤＰ－フコース生合成経路に必要な酵素を提供しなければならない。
本文脈において、コラン酸遺伝子クラスターに関する用語「機能的に発現する」は、次のように理解しなければならない：コラン酸遺伝子クラスターの発現は、機能的なＧＤＰ－フコース生合成経路に必要な酵素を提供しなければならない。
【0130】
発現は、天然プロモータを目的のプロモータと交換することによって調節することができる。発現はまた、上記タンパク質をコードするコラン酸遺伝子のコピー数を増加させることによって調節することもできる。コラン酸遺伝子クラスターのエピソーム発現も発現に影響を与える。
【0131】
従って、１つ以上の例示的な実施形態において、ｖ）のコラン酸遺伝子クラスターの発現は、天然プロモータを目的のプロモータと交換すること、及び／又は上記タンパク質をコードするコラン酸遺伝子のコピー数を増加させること、若しくはコラン酸遺伝子クラスターをエピソーム的に発現することにより調節される。
【0132】
１つ以上の例示的な実施形態において、コラン酸遺伝子クラスターの発現の制御は、天然プロモータを目的のプロモータと交換すること、及び／又は染色体上の異なる遺伝子座からクラスターを発現すること若しくはコラン酸遺伝子クラスターをエピソーム的に発現することにより上記タンパク質をコードするコラン酸遺伝子のコピー数を増加させることによって調節される。
ＣＡ遺伝子クラスター内の個々の遺伝子については以下に記載される。
ＣＡ遺伝子クラスター内の個々の遺伝子については以下に記載される。
【0133】
［Ｇｍｄ］
ｇｍｄ遺伝子は、ＧＤＰ－Ｄ－マンノースのＧＤＰ－４－デヒドロ－６－デオキシ－Ｄ－マンノースへの変換を触媒するタンパク質ＧＤＰ－マンノース－４，６－デヒドラターゼ（ＵｎｉＰｒｏｔ 受入番号 Ｐ０ＡＣ８８）をコードする。このタンパク質は、ＧＤＰ－α－Ｄ－マンノースからＧＤＰ－Ｌ－フコースを合成する反応に関与する。１つ以上の例示的な実施形態において、ｇｍｄ遺伝子は、過剰発現する。
ｇｍｄ遺伝子は、ＧＤＰ－Ｄ－マンノースのＧＤＰ－４－デヒドロ－６－デオキシ－Ｄ－マンノースへの変換を触媒するタンパク質ＧＤＰ－マンノース－４，６－デヒドラターゼ（ＵｎｉＰｒｏｔ 受入番号 Ｐ０ＡＣ８８）をコードする。このタンパク質は、ＧＤＰ－α－Ｄ－マンノースからＧＤＰ－Ｌ－フコースを合成する反応に関与する。１つ以上の例示的な実施形態において、ｇｍｄ遺伝子は、過剰発現する。
【0134】
［ｗｃａＧ］
ｆｃｌとしても知られるｗｃａＧ遺伝子は、ＧＤＰ－４－デヒドロ－６－デオキシ－Ｄ－マンノースのＧＤＰ－フコースへの２段階のＮＡＤＰ依存性変換を触媒するタンパク質ＧＤＰ－Ｌ－フコースシンターゼ（ＥＣ １．１．１．２７１、（ＵｎｉＰｒｏｔ 受入番号 Ｐ３２０５５））をコードする。１つ以上の例示的な実施形態において、ｗｃａＧ遺伝子は、過剰発現する。
ｆｃｌとしても知られるｗｃａＧ遺伝子は、ＧＤＰ－４－デヒドロ－６－デオキシ－Ｄ－マンノースのＧＤＰ－フコースへの２段階のＮＡＤＰ依存性変換を触媒するタンパク質ＧＤＰ－Ｌ－フコースシンターゼ（ＥＣ １．１．１．２７１、（ＵｎｉＰｒｏｔ 受入番号 Ｐ３２０５５））をコードする。１つ以上の例示的な実施形態において、ｗｃａＧ遺伝子は、過剰発現する。
【0135】
［ｗｃａＨ］
ｗｃａＨ遺伝子は、ＧＤＰ－マンノースとＧＤＰ－グルコースの両方を加水分解するタンパク質ＧＤＰ－マンノースマンノシルヒドロラーゼ（ＥＣ ３．６．１．－、（ＵｎｉＰｒｏｔ アクセッション番号 Ｐ３２０５６））をコードする。１つ以上の例示的な実施形態において、ｗｃａＨ遺伝子は、過剰発現する。
ｗｃａＨ遺伝子は、ＧＤＰ－マンノースとＧＤＰ－グルコースの両方を加水分解するタンパク質ＧＤＰ－マンノースマンノシルヒドロラーゼ（ＥＣ ３．６．１．－、（ＵｎｉＰｒｏｔ アクセッション番号 Ｐ３２０５６））をコードする。１つ以上の例示的な実施形態において、ｗｃａＨ遺伝子は、過剰発現する。
【0136】
［ｗｃａＩ］
ｗｃａＩ遺伝子はコラン酸生合成グリコシルトランスフェラーゼＷｃａＩ（ＵｎｉＰｒｏｔ アクセッション番号 Ｐ３２０５７）をコードしており、未修飾フコースのＵＰＰ－Ｇｌｃ（α－Ｄ－グルコピラノシル－ジホスホウンデカプレノール－グルコース）への転移を触媒する。１つ以上の例示的な実施形態において、ｗｃａｌ遺伝子は、過剰発現する。
ｗｃａＩ遺伝子はコラン酸生合成グリコシルトランスフェラーゼＷｃａＩ（ＵｎｉＰｒｏｔ アクセッション番号 Ｐ３２０５７）をコードしており、未修飾フコースのＵＰＰ－Ｇｌｃ（α－Ｄ－グルコピラノシル－ジホスホウンデカプレノール－グルコース）への転移を触媒する。１つ以上の例示的な実施形態において、ｗｃａｌ遺伝子は、過剰発現する。
【0137】
［ｍａｎＢ］
ｍａｎＢ遺伝子は、α－Ｄ－マンノース－１－ホスフェートのＤ－マンノース－６－ホスフェートへの変換を触媒することにより、ＧＤＰマンノースの生合成に関与するタンパク質ホスホマンノムターゼ（ＥＣ ５．４．２．８、（ＵｎｉＰｒｏｔ アクセッション番号 Ｐ２４１７５））をコードする。従って、ｍａｎＢの発現レベルは、ＧＤＰ－マンノースの形成を調節する。１つ以上の例示的な実施形態において、ｍａｎＢ遺伝子は、過剰発現する。
ｍａｎＢ遺伝子は、α－Ｄ－マンノース－１－ホスフェートのＤ－マンノース－６－ホスフェートへの変換を触媒することにより、ＧＤＰマンノースの生合成に関与するタンパク質ホスホマンノムターゼ（ＥＣ ５．４．２．８、（ＵｎｉＰｒｏｔ アクセッション番号 Ｐ２４１７５））をコードする。従って、ｍａｎＢの発現レベルは、ＧＤＰ－マンノースの形成を調節する。１つ以上の例示的な実施形態において、ｍａｎＢ遺伝子は、過剰発現する。
【0138】
［ｍａｎＣ］
ｍａｎＣ遺伝子は、タンパク質マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ（ＥＣ：２．７．７．１３、（ＵｎｉＰｒｏｔ アクセッション番号 Ｐ２４１７４））をコードし、これは、ＧＴＰ及びα－Ｄ－マンノース－１－ホスフェートからのＧＤＰ－マンノースの合成を介してＧＤＰ－マンノースの生合成に関与する。
ｍａｎＣ遺伝子は、タンパク質マンノース－１－ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ（ＥＣ：２．７．７．１３、（ＵｎｉＰｒｏｔ アクセッション番号 Ｐ２４１７４））をコードし、これは、ＧＴＰ及びα－Ｄ－マンノース－１－ホスフェートからのＧＤＰ－マンノースの合成を介してＧＤＰ－マンノースの生合成に関与する。
【0139】
１つ以上の例示的な実施形態において、ｍａｎＣ遺伝子は、過剰発現する。
【0140】
［天然のゲノム遺伝子座］
本開示に関連して、コラン酸遺伝子クラスターに関して用語「天然のゲノム遺伝子座」は、遺伝的に操作された細胞のゲノムにおける遺伝子クラスターの元の自然な位置に関する。
本開示に関連して、コラン酸遺伝子クラスターに関して用語「天然のゲノム遺伝子座」は、遺伝的に操作された細胞のゲノムにおける遺伝子クラスターの元の自然な位置に関する。
【0141】
［配列同一性］
２つ以上の核酸又はアミノ酸配列の文脈において、用語「［特定の］％の配列同一性」は、２つ以上の配列が、核酸又はアミノ酸の比較ウィンドウ又は指定された配列にわたって最大一致について比較及び整列されたとき、所与のパーセントで共通する核酸又はアミノ酸残基を有することを意味する（即ち、配列は、少なくとも９０パーセント（％）の同一性を有する）。核酸配列又はアミノ酸配列の同一性パーセントは、デフォルトパラメーターを用いるＢＬＡＳＴ ２．０配列比較アルゴリズムを使用して、又は手動によるアラインメント及び視覚的検査によって測定することができる（例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／を参照されたい）。この定義は、欠失及び／又は付加を有する試験配列の補体及び配列並びに置換を有する補体及び配列にも適用される。同一性パーセント、配列類似性の決定に、またアラインメントに好適なアルゴリズムの例は、ＢＬＡＳＴ ２．２．２０＋アルゴリズムであり、これは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５－３３８９（１９９７）に記載されているＢＬＡＳＴ ２．２．２０＋アルゴリズムである。ＢＬＡＳＴ ２．２．２０＋は、本開示の核酸及びタンパク質に対する配列同一性パーセントを決定するために使用される。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウエアは、国立バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を通して公的に入手可能である。一般的に使用されている配列アラインメントアルゴリズムの例は、
ＣＬＵＳＴＡＬ Ｏｍｅｇａ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｍｓａ／ｃｌｕｓｔａｌｏ／）、
ＥＭＢＯＳＳ Ｎｅｅｄｌｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｐｓａ／ｅｍｂｏｓｓ＿ｎｅｅｄｌｅ／）、
ＭＡＦＦＴ（ｈｔｔｐ：／／ｍａｆｆｔ．ｃｂｒｃ．ｊｐ／ａｌｉｇｎｍｅｎｔ／ｓｅｒｖｅｒ／）又は
ＭＵＳＣＬＥ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｍｓａ／ｍｕｓｃｌｅ／）である。
２つ以上の核酸又はアミノ酸配列の文脈において、用語「［特定の］％の配列同一性」は、２つ以上の配列が、核酸又はアミノ酸の比較ウィンドウ又は指定された配列にわたって最大一致について比較及び整列されたとき、所与のパーセントで共通する核酸又はアミノ酸残基を有することを意味する（即ち、配列は、少なくとも９０パーセント（％）の同一性を有する）。核酸配列又はアミノ酸配列の同一性パーセントは、デフォルトパラメーターを用いるＢＬＡＳＴ ２．０配列比較アルゴリズムを使用して、又は手動によるアラインメント及び視覚的検査によって測定することができる（例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／を参照されたい）。この定義は、欠失及び／又は付加を有する試験配列の補体及び配列並びに置換を有する補体及び配列にも適用される。同一性パーセント、配列類似性の決定に、またアラインメントに好適なアルゴリズムの例は、ＢＬＡＳＴ ２．２．２０＋アルゴリズムであり、これは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５－３３８９（１９９７）に記載されているＢＬＡＳＴ ２．２．２０＋アルゴリズムである。ＢＬＡＳＴ ２．２．２０＋は、本開示の核酸及びタンパク質に対する配列同一性パーセントを決定するために使用される。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウエアは、国立バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を通して公的に入手可能である。一般的に使用されている配列アラインメントアルゴリズムの例は、
ＣＬＵＳＴＡＬ Ｏｍｅｇａ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｍｓａ／ｃｌｕｓｔａｌｏ／）、
ＥＭＢＯＳＳ Ｎｅｅｄｌｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｐｓａ／ｅｍｂｏｓｓ＿ｎｅｅｄｌｅ／）、
ＭＡＦＦＴ（ｈｔｔｐ：／／ｍａｆｆｔ．ｃｂｒｃ．ｊｐ／ａｌｉｇｎｍｅｎｔ／ｓｅｒｖｅｒ／）又は
ＭＵＳＣＬＥ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｍｓａ／ｍｕｓｃｌｅ／）である。
【0142】
好ましくは、２つのアミノ酸配列間の配列同一性は、好ましくはバージョン５．０．０以降のＥＭＢＯＳＳパッケージ（ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｏｐｅｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｓｕｉｔｅ，Ｒｉｃｅ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．１６：２７６－２７７）のＮｅｅｄｌｅプログラムにおいて実装されている、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏ／．Ｂｉｏｌ．４８：４４３－４５３）を用いて決定され、これはＥＭＢＯＳＳパッケージ（ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｏｐｅｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｓｕｉｔｅ，Ｒｉｃｅ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．１６：２７６－２７７，）、好ましくはバージョン５．０．０以後のＮｅｅｄｌｅプログラム（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｐｓａ／ｅｍｂｏｓｓ ｎｅｅｄｌｅ／で入手可能）により実行される。用いられるパラメータは、１０のギャップオープンペナルティ、０．５のギャップエクステンションペナルティ及びＥＢＬＯＳＵＭ６２（３０ ＢＬＯＳＵＭ６２のＥＭＢＯＳＳバージョン）置換マトリクスである。Ｎｅｅｄｌｅ標識「最長同一性」（－ｎｏｂｒｉｅｆオプションを用いて得られる）の出力が同一性パーセントとして用いられ、以下のように算出される：（同一の残基×１００）／（アラインメントの長さ－アラインメント内のギャップの総数）。
【0143】
好ましくは、２つのヌクレオチド配列間の配列同一性は、１０、好ましくは、バージョン５．０．０以降のＥＭＢＯＳＳパッケージ（ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｏｐｅｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｓｕｉｔｅ，Ｒｉｃｅ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．１６：２７６－２７７）、１０好ましくはバージョン５．０．０以後のＮｅｅｄｌｅプログラムにより実行される。用いられるパラメータは、１０のギャップオープンペナルティ、０．５のギャップエクステンションペナルティ及びＤＮＡＦＵＬＬ（ＮＣＢＩ ＮＵＣ４．４のＥＭＢＯＳＳバージョン）置換マトリクスである。Ｎｅｅｄｌｅ標識「最長同一性」（－ｎｏｂｒｉｅｆオプションを用いて得られる）の出力が同一性パーセントとして用いられ、以下のように算出される：（同一のデオキシリボヌクレオチド×１００）／（アラインメントの長さ－アラインメント内のギャップの総数）。
【0144】
［機能的相同体］
本明細書中に記載されるタンパク質／核酸配列の機能的相同体は、その元々の機能性を保持する、変更を遺伝コード内に有するタンパク質／核酸配列である。機能的相同体は、変異誘発によって得られ得る。機能的相同体は、タンパク質／核酸配列の機能性と比較して、少なくとも５０％、例えば６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％の存続する機能性を有しなければならない。
本明細書中に記載されるタンパク質／核酸配列の機能的相同体は、その元々の機能性を保持する、変更を遺伝コード内に有するタンパク質／核酸配列である。機能的相同体は、変異誘発によって得られ得る。機能的相同体は、タンパク質／核酸配列の機能性と比較して、少なくとも５０％、例えば６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％の存続する機能性を有しなければならない。
【0145】
開示されるアミノ酸又は核酸配列のいずれか１つの機能的相同体は、より高い機能性も有し得る。配列番号１～４７のいずれか１つの機能的相同体は、ＨＭＯ収率、純度、バイオマス形成の引下げ、遺伝的に操作された細胞の生存能力、本開示に従う遺伝的に操作された細胞のロバスト性又は消耗品の引下げに関してＨＭＯの産生に関与することができなければならない。
【0146】
［発現の制御］
本文脈において、用語「発現の制御」は、遺伝子のｍＲＮＡへの転写とその後のタンパク質への翻訳が制御される遺伝子発現に関連する。遺伝子発現は主に転写レベルで制御され、主に調節要素など（ただしこれに限定されない）ＤＮＡ上の特定の部位へのタンパク質の結合の結果として発生する。
本文脈において、用語「発現の制御」は、遺伝子のｍＲＮＡへの転写とその後のタンパク質への翻訳が制御される遺伝子発現に関連する。遺伝子発現は主に転写レベルで制御され、主に調節要素など（ただしこれに限定されない）ＤＮＡ上の特定の部位へのタンパク質の結合の結果として発生する。
【0147】
上記のように、エンジニアリング戦略は、次のように複数の方法で適用できる：
１）コピー数
２）これらの遺伝子の任意のコピーの発現を転写レベル又は翻訳レベルで制御すること
３）ＨＭＯ生成プロセスにおける重要な遺伝子の発現を抑制する調節因子の欠失
４）ＨＭＯ生成プロセスにおける重要な遺伝子の活性化及び／又は増強する調節因子の過剰発現。
１）コピー数
２）これらの遺伝子の任意のコピーの発現を転写レベル又は翻訳レベルで制御すること
３）ＨＭＯ生成プロセスにおける重要な遺伝子の発現を抑制する調節因子の欠失
４）ＨＭＯ生成プロセスにおける重要な遺伝子の活性化及び／又は増強する調節因子の過剰発現。
【0148】
ＬＮＦＰ－Ｉ及び２’－ＦＬ生合成経路に直接関与する酵素をコードする遺伝子のコピー数及び／又は遺伝子の発現を増加させ、活性化糖であるＧＤＰ－フコース、ＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃ、及びＵＤＰ－Ｇａｌ（糖供与体）を合成し、ラクトース、ＬＮＴ－ＩＩ、ＬＮＴ、及びＬＮＦＰ－Ｉ（糖受容体）を修飾して、それぞれ、ＬＮＴ－ＩＩ、２’－ＦＬ、ＬＮＴ、ＬＮＦＰ－Ｉ、及びＬＮＤＦＨ－Ｉを形成することが望ましい。
【0149】
［過剰発現］
様々な分子機構により、適用される生成プロセスに関連した条件下で遺伝子が適切なレベルで発現されることが保証される。例えば、転写の調節は次のような影響経路にまとめることができる：遺伝的（制御因子と目的の遺伝子との直接相互作用）、制御因子と転写機構との調節及び／又は相互作用、並びにエピジェネティック（転写に影響を与えるＤＮＡ構造の非配列変化）。
様々な分子機構により、適用される生成プロセスに関連した条件下で遺伝子が適切なレベルで発現されることが保証される。例えば、転写の調節は次のような影響経路にまとめることができる：遺伝的（制御因子と目的の遺伝子との直接相互作用）、制御因子と転写機構との調節及び／又は相互作用、並びにエピジェネティック（転写に影響を与えるＤＮＡ構造の非配列変化）。
【0150】
遺伝子発現が任意の遺伝子についての臨界閾値を下回ると、突然変異表現型が生じるが、その理由は、そのような欠損は本質的に標的遺伝子の機能の部分的又は完全な喪失を模倣するのに対し、天然遺伝子の発現増加は細胞又は生物にとって有益又は破壊的である可能性があるからであることが知られている。
【0151】
遺伝子の過剰発現は、重要な遺伝子調節配列に結合して転写を促進する転写アクチベータ、又は転写にプラスの影響を与える配列要素（以下に記載するように調節要素とも呼ばれる）を構成するエンハンサによって直接達成され得る。同様に、遺伝子の直接の過剰発現は、単にゲノム内のコピー数を増加させるか、又は天然プロモータをより強力なプロモータに置き換えるか、又は更には対応するｍＲＮＡのリボソームへの結合を制御する配列、つまり遺伝子のコード配列の上流に存在するシャイン・ダルガーノ配列を改変することによっても達成することができる。
【0152】
更に、遺伝子の過剰発現はまた、通常は目的の遺伝子のコーディング配列周囲の重要な調節配列に結合し、それによってその転写を阻害する転写リプレッサの部分的又は完全な不活化によって間接的に達成され得る。
【0153】
従って、１つ以上の例示的な実施形態において、本明細書に記載される方法の工程ｉ）、ｉｉ）、及びｉｉｉ）の異種β－１，３－Ｎ－アセチル－グルコサミニルトランスフェラーゼ、β－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼ、及びα－１，２－フコシルトランスフェラーゼタンパク質の過剰発現は、上記タンパク質をコードする遺伝子のコピー数を増加させることによって、及び／又はこれらの遺伝子の発現を制御するため適切な要素を選択することによって、及び／又は上記タンパク質をコードする遺伝子のコーディング配列周囲の調節要素に結合するリプレッサを不活性化することによって提供される。
【0154】
［コピー数の増加］
コピー数変動は構造変動の一種である：具体的には、これはかなりの数の塩基対の一種の乗算であり、タンパク質をコードする遺伝子を表す場合、同じタンパク質をコードする遺伝子の数が増加することになる。このような変動は、多くの種で自然に発生する可能性があるが、宿主細胞を遺伝的に改変することによって導入することもできる。
コピー数変動は構造変動の一種である：具体的には、これはかなりの数の塩基対の一種の乗算であり、タンパク質をコードする遺伝子を表す場合、同じタンパク質をコードする遺伝子の数が増加することになる。このような変動は、多くの種で自然に発生する可能性があるが、宿主細胞を遺伝的に改変することによって導入することもできる。
【0155】
１つ以上の例示的な実施形態において、発現は、所望の遺伝子のコピー数を増加させることにより制御される。コピー数は、細胞内に高いコピー数を有するプラスミドを導入することによって、又は宿主細胞のゲノムに遺伝子の追加のコピーを導入することによって増加させることができる。
【0156】
例えば、最終ブレンドは、ｆｕｔＣ発現細胞におけるｌｇｔＡ（β－１，３－Ｎ－アセチル－グルコサミニルトランスフェラーゼをコードする）及びｇａｌＴＫ（β－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼをコードする）遺伝子のコピー数を同時に増加させることにより、２’－ＦＬ＞ＬＮＦＰ－ＩからＬＮＦＰ－Ｉ＞２’－ＦＬへ逆転させることができる（実施例３参照）。
【0157】
従って、１つ以上の例示的な実施形態において、目的は、配列番号６［ＦｕｔＣ］若しくは配列番号７［ｍｔｕｎ］若しくは配列番号４９［ＦｕｃＴ５４］のα－１，２－フコシロシル－トランスフェラーゼ又はそれらの相同体と組み合わされた、例えばｌｇｔＡ及びｇａｌＴＫにより例示されるβ－１，３－Ｎ－アセチル－グルコサミニルトランスフェラーゼ及びβ－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子のコピー数を増加させることである。
【0158】
［調節要素］
本明細書に記載される方法による遺伝的に操作された細胞は、内因性若しくは異種性及び／又は合成核酸配列の制御された過剰発現を可能にする調節要素を含み得る。
本明細書に記載される方法による遺伝的に操作された細胞は、内因性若しくは異種性及び／又は合成核酸配列の制御された過剰発現を可能にする調節要素を含み得る。
【0159】
用語「調節要素」は、プロモータ配列、シグナル配列、及び／又は調節要素に作動可能に連結された核酸配列の転写及び／又は翻訳に影響を与える転写因子結合部位のアレイを含む。
【0160】
調節要素は、転写レベル及び転写後レベルで発見され、さらにそれらのレベルでの分子の網状組織を可能にする。例えば、転写後レベルでは、ｍＲＮＡの安定性、翻訳、細胞内局在を制御する生化学シグナルが調節要素によって処理される。ＲＮＡ結合タンパク質は、別の種類の転写後調節要素であり、配列要素又は構造要素として更に分類される。調節要素として機能する可能性のある特定の配列モチーフも、ｍＲＮＡ修飾に関連している。様々なＤＮＡ調節要素が遺伝子発現の調節に関与しており、ＤＮＡ、クロマチンを構成する細胞タンパク質、遺伝子アクチベータ及びリプレッサ、並びに転写因子が関与する生化学的相互作用に依存する。
【0161】
一般に、転写及び翻訳調節配列としては、プロモータ配列、リボソーム結合部位、転写開始及び終結配列、翻訳開始及び終結配列、遺伝子調節因子ための結合部位、並びにエンハンサ配列が挙げられるが、これらに限定されない。
【0162】
プロモータ及びエンハンサは遺伝子発現の主要なゲノム調節要素である。プロモータは、遺伝子の転写開始部位（ＴＳＳ）の１～２キロベース（ｋｂ）内のＤＮＡ領域であり；それらには、ＲＮＡポリメラーゼの転写機構を組み立てるのに必要な短い調節要素（ＤＮＡモチーフ）が含まれている。細菌及び古細菌の種では、プロモータの下流、典型的には開始コドンから約８塩基にシャイン・ダルガーノ配列があるのが一般的である。加えて、ＴＳＳのより遠位に位置するＤＮＡ調節要素は、転写に大きく寄与する可能性がある。このような領域はエンハンサと呼ばれることが多く、位置に依存しないＤＮＡ調節要素は、部位特異的な転写因子と相互作用して細胞型の同一性を確立し、遺伝子発現を調節する。エンハンサは、その配列状況とは独立して、ルーピングとして知られるプロセスを通じて、標的遺伝子から数ｋｂ～数百ｋｂの距離で作用し得る。これらの特徴のため、好適なエンハンサを同定し、ＤＮＡ配列のみに基づいてそれらを標的遺伝子に結び付けることは困難である。
【0163】
プロモータは、他の転写及び翻訳調節核酸配列（「制御配列」とも呼ばれる）と一緒に、所与の遺伝子又は遺伝子の群（１つのオペロン）を発現するために必要である。
【0164】
目的の特定の遺伝子の発現を促進する好適なプロモータ配列の同定は、多くの場合、困難な努力を必要とする面倒な作業である。本開示に関連して、調節要素は、翻訳後調節因子であっても、若しくはなくてもよく、又は翻訳調節因子であっても、若しくはなくてもよい。
【0165】
適切な調節要素（例えば、プロモータ、エンハンサ、及び／又はシャイン・ダルガーノ配列）を選択することにより、異種遺伝子の発現に影響を与える可能性がある。プロモータ又はシャイン・ダルガーノ配列など調節要素の強度は、β－ガラクトシダーゼ活性が、以前に説明されるようにアッセイされるｌａｃＺ酵素アッセイを用いて評価することができる（例えば、Ｍｉｌｌｅｒ Ｊ．Ｈ．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｃｏｌｄ ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，１９７２を参照されたい）。簡潔には、細胞は、Ｚ－バッファ中に希釈されて、ドデシル硫酸ナトリウム（０．１％）及びクロロホルムにより浸透性にされる。アッセイは、３０℃で実施される。試料が予熱されて、アッセイは、２００μｌオルト－ニトロ－フェニル－β－ガラクトシダーゼ（４ｍｇ／ｍＬ）の添加によって開始されて、試料が僅かに黄色に変わった場合に５００μｌの１Ｍ Ｎａ２ＣＯ３の添加によって止められる。オルトニトロフェノールの放出は、その後、４２０ｎｍでの光学濃度の変化として判定される。特定の活性は、ミラーユニット（ＭＵ）［Ａ４２０／（ｍｉｎ＊ｍＬ＊Ａ６００）］で報告される。活性が１０，０００ＭＵを超える調節要素は、強いとみなされ、活性が３，０００ＭＵ未満の調節要素は、弱いとみなされ、その間にあるものは、中間の強度を有する。強い調節要素の例は、およそ１４．０００ＭＵの活性を有するＰｇｌｐＦプロモータであり、弱いプロモータの例は、ＩＰＴＧにより誘導された場合におよそ２３００ＭＵの活性を有するＰｌａｃである。
【0166】
従って、本発明の一実施形態において、調節要素は、本発明による１つ以上の異種核酸配列の発現、即ち過剰発現を増強することができる１つ以上の要素を含む。特に、β－１，３－Ｎ－アセチル－グルコサミニルトランスフェラーゼ及び／又はβ－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼの発現レベルの調節は、２’－ＦＬの形成に影響を与え得る。一実施形態において、１０，０００ＭＵ超、例えば１２，０００ＭＵ超、例えば１５，０００ＭＵ超の調節要素が、１，３－Ｎ－アセチル－グルコサミニルトランスフェラーゼ及び／又はβ－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼの発現を制限している。１，３－Ｎ－アセチル－グルコサミニルトランスフェラーゼ及び／又はβ－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼの発現を制御するための強いプロモータの使用により、ＬＮＦＰ－Ｉへの経路が促進されるため、２’－ＦＬに対するＬＮＦＰ－Ｉの比率が増加する（図１２を参照）。
【0167】
本発明の別の実施形態において、調節要素は、本発明による１つ以上の異種核酸配列の発現の適切な制御を可能にする１つ以上の要素を含む。特に、β－１，３－Ｎ－アセチル－グルコサミニルトランスフェラーゼ及び／又はβ－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼの発現レベルの調節は、２’－ＦＬの形成に影響を与え得る。一実施形態において、１０，０００ＭＵ未満、例えば８，０００ＭＵ未満、未満、例えば６，０００ＭＵ未満、例えば４，０００ＭＵ未満、例えば２，０００ＭＵ未満の調節要素が、１，３－Ｎ－アセチル－グルコサミニルトランスフェラーゼ及び／又はβ－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼの発現を制御している。１，３－Ｎ－アセチル－グルコサミニルトランスフェラーゼ及び／又はβ－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼの発現を制御するための中程度又は弱い強度のプロモータを使用することにより、中間生成物ＬＮＴ－ＩＩ及びＬＮＴが生成される速度が低下し、その結果系内に存在するラクトースからより多くの２’－ＦＬが生成されるようになるため、ＬＮＦＰ－Ｉ対２’－ＦＬの比率が減少する（図１２を参照）。
【0168】
それに関して、本発明による１つ以上のグリコシルトランスフェラーゼ及び／又はスクロース加水分解酵素、及び／又はＰＴＳ依存性スクロース利用系、及び／又は１つ以上の天然若しくは異種ＭＦＳトランスポータタンパク質をコードする核酸配列及び／又は遺伝子の発現を調節する調節要素は、プロモータ配列であり得る。
【0169】
本明細書で開示される方法の実行において、異なる又は同一のプロモータ配列を使用して、宿主細胞のゲノムに統合されたか又はエピソームＤＮＡの異なる目的の遺伝子の転写を促進してもよい。
【0170】
［天然］
本開示に関連して、用語「天然」は、本発明の方法に従って遺伝的に操作された元の細胞のゲノムに由来するが、任意の遺伝子改変前の核酸配列を指す。それに関して、核酸配列は、遺伝的に操作された細胞に関して、それが大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ－１２株に由来し、異種起源のものではなく、組み換えられた核酸配列ではない場合、天然のものとみなされ得る。
本開示に関連して、用語「天然」は、本発明の方法に従って遺伝的に操作された元の細胞のゲノムに由来するが、任意の遺伝子改変前の核酸配列を指す。それに関して、核酸配列は、遺伝的に操作された細胞に関して、それが大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ－１２株に由来し、異種起源のものではなく、組み換えられた核酸配列ではない場合、天然のものとみなされ得る。
【0171】
［異種調節要素］
調節要素は、内因性又は異種の及び／又は組換え及び／又は合成の核酸配列であり得る。本文脈において、用語「異種調節要素」は、本明細書に記載される元の遺伝的に操作された細胞に対して内因性ではない調節要素として理解されるべきである。異種調節要素はまた、組換え調節要素であってもよく、ここで２つ以上の作動可能に結合していない天然調節要素が、異種及び／又は合成調節要素に組み換えられる。異種調節要素は、当業者に公知の方法を使用して遺伝的に操作された細胞に導入され得る。
調節要素は、内因性又は異種の及び／又は組換え及び／又は合成の核酸配列であり得る。本文脈において、用語「異種調節要素」は、本明細書に記載される元の遺伝的に操作された細胞に対して内因性ではない調節要素として理解されるべきである。異種調節要素はまた、組換え調節要素であってもよく、ここで２つ以上の作動可能に結合していない天然調節要素が、異種及び／又は合成調節要素に組み換えられる。異種調節要素は、当業者に公知の方法を使用して遺伝的に操作された細胞に導入され得る。
【0172】
［プロモータ配列］
遺伝子及び／又は核酸配列の発現を調節する調節要素又は要素は、１つ以上のプロモータ配列を含んでいてもよく、ここでプロモータ配列は、目的の遺伝子の核酸配列の発現を調節するという意味で、目的の遺伝子の核酸配列に作動可能に連結される。
遺伝子及び／又は核酸配列の発現を調節する調節要素又は要素は、１つ以上のプロモータ配列を含んでいてもよく、ここでプロモータ配列は、目的の遺伝子の核酸配列の発現を調節するという意味で、目的の遺伝子の核酸配列に作動可能に連結される。
【0173】
１つ以上の例示的な実施形態において、異種調節要素は、プロモータ配列である。
【0174】
一般的には、プロモータは、天然、異種、及び／又は合成核酸配列を含んでもよく、２つ以上の核酸配列又は上記の同じ若しくは異なる起源を組み換えた、組換え核酸配列であってもよく、それにより、同種、異種、若しくは合成の核酸プロモータ配列、及び／又は同種、異種、若しくは合成の核酸調節要素を生成する。
【0175】
１つ以上の例示的な実施形態において、遺伝的に操作された細胞の遺伝子及び／又は異種核酸配列の調節要素は、２つ以上の天然又は異種プロモータ配列を含む。
【0176】
１つ以上の例示的な実施形態において、遺伝的に操作された細胞の調節要素は、単一のプロモータ配列を含む。
【0177】
１つ以上の例示的な実施形態において、遺伝的に操作された細胞の遺伝子及び／又は異種核酸配列の調節要素は、同一のプロモータ配列を有する２つ以上の調節要素を含む。
【0178】
１つ以上の例示的な実施形態において、遺伝的に操作された細胞の遺伝子及び／又は異種核酸配列の調節要素は、同一でないプロモータ配列を有する２つ以上の調節要素を含む。
【0179】
調節構造、即ち、転写因子結合部位の遺伝子ごと（ｇｅｎｅ－ｂｙ－ｇｅｎｅ）の分布、及びそれらの部位に結合する転写因子の正体は、複数の異なる増殖条件を使用でき、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ゲノム全体から１００を超える遺伝子があり、これらは調節要素として機能する。従って、本明細書に記載の１つ以上のタンパク質をコードする１つ以上の異種又は天然の核酸配列の転写及び／又は転写レベルの調節を可能にする任意のプロモータ配列が好適であり得る。
【0180】
１つ以上の例示的な実施形態において、調節要素は、ＰＢＡＤ、Ｐｘｙｌ、ＰｓａｃＢ、ＰｘｙｌＡ、ＰｒｐＲ、ＰｎｉｔＡ、ＰＴ７、Ｐｔａｃ、ＰＬ、ＰＲ、ＰｎｉｓＡ、Ｐｂ、Ｐｓｃｒ、ＰｇａｔＹ＿７０ＵＴＲ、ＰｇｌｐＦ、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ１、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ１０、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ２、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ３、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ４、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ５、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ６、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ７、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ８、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ９、ＰｇｌｐＦ＿Ｂ２８、ＰｇｌｐＦ＿Ｂ２９、Ｐｌａｃ＿１６ＵＴＲ、Ｐｌａｃ、ＰｍｇｌＢ＿７０ＵＴＲ、及びＰｍｇｌＢ＿７０ＵＴＲ＿ＳＤ４からなる群から選択される。
【0181】
ＰｇｌｐＦ、ＰｌｇｐＡ、ＰｌｇｐＴ、ＰｇａｔＹ、ＰｍｇｌＢ、及びＰｌａｃプロモータ系から誘導されるプロモータ配列の幅広い選択は、国際公開第２０１９１２３３２４号パンフレット及び同第２０２０２５５０５４号パンフレット（参照により本明細書に組み込まれる）に詳細に記載されている。
【0182】
１つ以上の例示的な実施形態において、調節要素は、配列番号１３（ＰｇｌｐＦ）、配列番号１２（ＰｇａｔＹ＿７０ＵＴＲ）、配列番号２７（Ｐｌａｃ）、配列番号９（ＰｍｇｌＢ＿７０ＵＴＲ）、配列番号１１（Ｐｓｃｒ）、又はこれらのバリアントからなる群から選択されるプロモータである。特に、国際公開第２０１９１２３３２４号パンフレットに記載されているＰｇｌｐＦ若しくはＰｌａｃのバリアント、又は国際公開第２０２０２５５０５４号パンフレットに記載されているＰｍｇｌＢ＿７０ＵＴＲのバリアントが望ましい。
【0183】
１つ以上の例示的な実施形態において、異種β－１，３－Ｎ－アセチル－グルコサミニルトランスフェラーゼ及び／又は異種β－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼの発現は、単一コピーから得られ、且つ／又は異種β－１，３－Ｎ－アセチル－グルコサミニルトランスフェラーゼ及び／又は異種β－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼの発現のための調節要素は、低い又は中間の強度を有する。中強度及び低強度を有する調節要素は、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ９（配列番号２３）、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ７（配列番号２１）、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ６（配列番号２０）、ＰｇｌｐＦ＿Ｂ２８（配列番号２４）、ＰｇｌｐＦ＿Ｂ２９（配列番号２５）、Ｐｓｃｒ（配列番号１１）、及びＰｌａｃ（配列番号２７）からなる群から選択することができる。
【0184】
１つ以上の例示的な実施形態において、ｉ）及び／若しくはｉｉ）の発現は、２つ以上のコピーから得られる、並びに／又はｉ）及び／若しくはｉｉ）の発現のための調節要素は、高い強度を有する。高強度を有する調節要素は、ＰｇｌｐＦ（配列番号１３）、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ１０（配列番号１５）、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ８（配列番号２２）、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ５（配列番号１９）、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ４（配列番号１８）、ＰｇａｔＹ＿７０ＵＴＲ（配列番号１２）、ＰｍｇｌＢ＿７０ＵＴＲ（配列番号９）、及びＰｍｇｌＢ＿７０ＵＴＲ＿ＳＤ４（配列番号９）からなる群から選択することができる。
【0185】
１つ以上の例示的な実施形態において、調節要素は、Ｐｓｃｒ、ＰｇａｔＹ＿７０ＵＴＲ、ＰｇｌｐＦ、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ１、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ２、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ３、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ４、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ５、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ６、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ７、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ８、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ９、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ１０、ＰｇｌｐＦ＿Ｂ２８、ＰｇｌｐＦ＿Ｂ２９、Ｐｌａｃ、及びＰｌａｃ＿１６ＵＴＲからなる群から選択される。１つ以上の例示的な実施形態において、調節要素は、ＰｇｌｐＦ、Ｐｓｃｒ、Ｐｌａｃ、ＰｇｌｐＦ＿Ｂ２９、及びＰｇｌｐＦ＿Ｂ２８からなる群から選択される。
【0186】
本発明の好ましい例示的な実施形態において、遺伝的に操作された細胞の遺伝子及び／又は異種核酸配列の発現を調節するための調節要素に含まれるプロモータ配列は、ｇｌｐＦＫＸオペロンプロモータ配列、ＰｇｌｐＦを包含する。
【0187】
１つ以上の例示的な実施形態において、調節要素は、ＰｇｌｐＦ（配列番号１３）、又はＰｇｌｐＦ＿ＳＤ１０（配列番号１５）、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ９（配列番号２３）、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ８（配列番号２２）、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ７（配列番号２１）、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ６（配列番号２０）、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ５（配列番号１９）、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ４（配列番号１８）、ＰｇｌｐＦ＿Ｂ２８（配列番号２４）、及びＰｇｌｐＦ＿Ｂ２９（配列番号２５）から選択されるそのバリアントからなる群から選択される。
【0188】
１つ以上の例示的な実施形態において、遺伝的に操作された細胞の遺伝子及び／又は異種核酸配列の発現を調節するための調節要素に含まれるのプロモータ配列は、ｌａｃオペロンプロモータ配列、Ｐｌａｃを包含する。
【0189】
１つ以上の例示的な実施形態において、遺伝的に操作された細胞は、ＭＤＯ株（「材料及び方法」を参照）に由来し、天然コラン酸遺伝子座の前の単純なプロモータ交換及び／又は異なるゲノム遺伝子座［Ｐｌａｃ（ＣＡ）：：
ＰｇｌｐＦ＿Ｂ２８（ＣＡ）］にあるこの遺伝子クラスターの第２のコピーの導入によって、コラン酸遺伝子クラスターをコードする核酸を過剰発現する。
ＰｇｌｐＦ＿Ｂ２８（ＣＡ）］にあるこの遺伝子クラスターの第２のコピーの導入によって、コラン酸遺伝子クラスターをコードする核酸を過剰発現する。
【0190】
１つ以上の例示的な実施形態において、本開示の構築体に含まれる組換え遺伝子の発現を調節するための調節要素は、ｍｇｌＢＡＣであり；ガラクトース／メチル－ガラクトシドＡＢＣトランスポータ周辺質結合タンパク質プロモータＰｍｇｌＢ又は配列番号９のＰｍｇｌＢ＿７０ＵＴＲ又は配列番号１０のＰｍｇｌＢ＿７０ＵＴＲ＿ＳＤ４等のそのバリアントであるが、これらに限定されない。更なるＰｍｇｌＢバリアントは、国際公開第２０２０２５５０５４号パンフレットに記載されているように記載される。
【0191】
１つ以上の例示的な実施形態において、本開示の構築体に含まれる組換え遺伝子の発現を調節するための調節要素は、ｇａｔＹＺＡＢＣＤであり；テガトース－１，６－ビスＰアルドラーゼプロモータＰｇａｔＹ又はそのバリアントである。
【0192】
［Ｐｓｃｒ］
１つ以上の例示的な実施形態において、異種調節要素は、Ｐｓｃｒ又は配列番号１１などであるがこれに限定されないそのバリアントである。
１つ以上の例示的な実施形態において、異種調節要素は、Ｐｓｃｒ又は配列番号１１などであるがこれに限定されないそのバリアントである。
【0193】
［ＰｇａｔＹ＿７０ＵＴＲ］
１つ以上の例示的な実施形態において、異種調節要素は、ＰｇａｔＹ＿７０ＵＴＲ又は配列番号１２などであるがこれに限定されないそのバリアントである。
１つ以上の例示的な実施形態において、異種調節要素は、ＰｇａｔＹ＿７０ＵＴＲ又は配列番号１２などであるがこれに限定されないそのバリアントである。
【0194】
［ＰｇｌｐＦ］
１つ以上の例示的な実施形態において、異種調節要素は、ＰｇｌｐＦ又は配列番号１３などであるがこれに限定されないそのバリアントである。
１つ以上の例示的な実施形態において、異種調節要素は、ＰｇｌｐＦ又は配列番号１３などであるがこれに限定されないそのバリアントである。
【0195】
［ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ１］
１つ以上の例示的な実施形態において、異種調節要素は、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ１又は配列番号１４などであるがこれに限定されないそのバリアントである。
１つ以上の例示的な実施形態において、異種調節要素は、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ１又は配列番号１４などであるがこれに限定されないそのバリアントである。
【0196】
［ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ１０］
１つ以上の例示的な実施形態において、異種調節要素は、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ１０又は配列番号１５などであるがこれに限定されないそのバリアントである。
１つ以上の例示的な実施形態において、異種調節要素は、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ１０又は配列番号１５などであるがこれに限定されないそのバリアントである。
【0197】
［ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ２］
１つ以上の例示的な実施形態において、異種調節要素は、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ２又は配列番号１６などであるがこれに限定されないそのバリアントである。
１つ以上の例示的な実施形態において、異種調節要素は、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ２又は配列番号１６などであるがこれに限定されないそのバリアントである。
【0198】
［ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ３］
１つ以上の例示的な実施形態において、異種調節要素は、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ３又は配列番号１７などであるがこれに限定されないそのバリアントである。
１つ以上の例示的な実施形態において、異種調節要素は、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ３又は配列番号１７などであるがこれに限定されないそのバリアントである。
【0199】
［ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ４］
１つ以上の例示的な実施形態において、異種調節要素は、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ４又は配列番号１８などであるがこれに限定されないそのバリアントである。
１つ以上の例示的な実施形態において、異種調節要素は、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ４又は配列番号１８などであるがこれに限定されないそのバリアントである。
【0200】
［ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ５］
１つ以上の例示的な実施形態において、異種調節要素は、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ５又は配列番号１９などであるがこれに限定されないそのバリアントである。
１つ以上の例示的な実施形態において、異種調節要素は、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ５又は配列番号１９などであるがこれに限定されないそのバリアントである。
【0201】
［ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ６］
１つ以上の例示的な実施形態において、異種調節要素は、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ６又は配列番号２０などであるがこれに限定されないそのバリアントである。
１つ以上の例示的な実施形態において、異種調節要素は、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ６又は配列番号２０などであるがこれに限定されないそのバリアントである。
【0202】
［ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ７］
１つ以上の例示的な実施形態において、異種調節要素は、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ７又は配列番号２１などであるがこれに限定されないそのバリアントである。
１つ以上の例示的な実施形態において、異種調節要素は、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ７又は配列番号２１などであるがこれに限定されないそのバリアントである。
【0203】
［ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ８］
１つ以上の例示的な実施形態において、異種調節要素は、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ８又は配列番号２２などであるがこれに限定されないそのバリアントである。
１つ以上の例示的な実施形態において、異種調節要素は、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ８又は配列番号２２などであるがこれに限定されないそのバリアントである。
【0204】
［ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ９］
１つ以上の例示的な実施形態において、異種調節要素は、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ９又は配列番号２３などであるがこれに限定されないそのバリアントである。
１つ以上の例示的な実施形態において、異種調節要素は、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ９又は配列番号２３などであるがこれに限定されないそのバリアントである。
【0205】
［ＰｇｌｐＦ＿Ｂ２８］
１つ以上の例示的な実施形態において、異種調節要素は、ＰｇｌｐＦ＿Ｂ２８又は配列番号２４などであるがこれに限定されないそのバリアントである。
１つ以上の例示的な実施形態において、異種調節要素は、ＰｇｌｐＦ＿Ｂ２８又は配列番号２４などであるがこれに限定されないそのバリアントである。
【0206】
［ＰｇｌｐＦ＿Ｂ２９］
１つ以上の例示的な実施形態において、異種調節要素は、ＰｇｌｐＦ＿Ｂ２９又は配列番号２５などであるがこれに限定されないそのバリアントである。
１つ以上の例示的な実施形態において、異種調節要素は、ＰｇｌｐＦ＿Ｂ２９又は配列番号２５などであるがこれに限定されないそのバリアントである。
【0207】
［Ｐｌａｃ＿１６ＵＴＲ］
１つ以上の例示的な実施形態において、異種調節要素は、Ｐｌａｃ＿１６ＵＴＲ又は配列番号２６などであるがこれに限定されないそのバリアントである。
１つ以上の例示的な実施形態において、異種調節要素は、Ｐｌａｃ＿１６ＵＴＲ又は配列番号２６などであるがこれに限定されないそのバリアントである。
【0208】
［Ｐｌａｃ］
１つ以上の例示的な実施形態において、異種調節要素は、Ｐｌａｃ又は配列番号２７などであるがこれに限定されないそのバリアントである。
１つ以上の例示的な実施形態において、異種調節要素は、Ｐｌａｃ又は配列番号２７などであるがこれに限定されないそのバリアントである。
【0209】
［ＰｍｇｌＢ＿７０ＵＴＲ］
１つ以上の例示的な実施形態において、異種調節要素は、ＰｍｇｌＢ＿７０ＵＴＲ又は配列番号９などであるがこれに限定されないそのバリアントである。
１つ以上の例示的な実施形態において、異種調節要素は、ＰｍｇｌＢ＿７０ＵＴＲ又は配列番号９などであるがこれに限定されないそのバリアントである。
【0210】
［ＰｍｇｌＢ＿７０ＵＴＲ＿ＳＤ４］
１つ以上の例示的な実施形態において、異種調節要素は、ＰｍｇｌＢ＿７０ＵＴＲ＿ＳＤ４又は配列番号１０などであるがこれに限定されないそのバリアントである。
１つ以上の例示的な実施形態において、異種調節要素は、ＰｍｇｌＢ＿７０ＵＴＲ＿ＳＤ４又は配列番号１０などであるがこれに限定されないそのバリアントである。
【0211】
［エピソーム要素］
用語「エピソーム要素」は、染色体外核酸配列を指し、自律的に複製するか、又は遺伝的に操作された細胞のゲノムに組み込むことができる。従って、エピソーム核酸配列は、遺伝的に操作された細胞の染色体に組み込むことができるプラスミドである場合があり、即ち、全てのプラスミドがエピソーム要素であるわけではない。
用語「エピソーム要素」は、染色体外核酸配列を指し、自律的に複製するか、又は遺伝的に操作された細胞のゲノムに組み込むことができる。従って、エピソーム核酸配列は、遺伝的に操作された細胞の染色体に組み込むことができるプラスミドである場合があり、即ち、全てのプラスミドがエピソーム要素であるわけではない。
【0212】
１つ以上の例示的な実施形態において、エピソーム核酸配列は、染色体に組み込まれていないプラスミドであってもよい。これらの実施形態において、エピソーム要素は、目的の発現カセットを運ぶプラスミドＤＮＡ配列を指し、そのカセットはプロモータ配列、目的の遺伝子のコーディング配列、及びターミネータ配列から構成される。
【0213】
１つ以上の例示的な実施形態において、エピソーム核酸配列は、一部のみが染色体に組み込まれたプラスミドであってもよい。これらの実施形態において、発現カセットは、上記のものに似ているが、目的の遺伝子が組み込まれる遺伝子座の上流及び下流のＤＮＡ領域に相同な２つのＤＮＡ断片を更に含む。
【0214】
［アクチベータ］
１つ以上の例示的な実施形態において、本明細書に開示される遺伝的に操作された細胞は、ＬＮＦＰ－Ｉ、２’－ＦＬ、ＬＮＴ ＩＩ、及びＬＮＴなどであるがこれらに限定されないヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）の生成を促進するのに必要な酵素をコードする遺伝子の発現を増強する過剰発現された遺伝子産物を含む。
１つ以上の例示的な実施形態において、本明細書に開示される遺伝的に操作された細胞は、ＬＮＦＰ－Ｉ、２’－ＦＬ、ＬＮＴ ＩＩ、及びＬＮＴなどであるがこれらに限定されないヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）の生成を促進するのに必要な酵素をコードする遺伝子の発現を増強する過剰発現された遺伝子産物を含む。
【0215】
１つ以上の例示的な実施形態において、本開示の細胞は、ｖ）の調節要素又はｖ）の調節要素の上流の領域に結合し、ｉ）～ｉｉｉ）のタンパク質又はｉｖ）のコラン酸（ｃｏｌｏｎｉｃ ａｃｉｄ）遺伝子クラスターの発現を増強する、過剰発現された遺伝子産物を含み得る。
【0216】
１つ以上の例示的な実施形態において、本開示の細胞は、ｖ）の調節要素又はｖ）の調節要素の上流の領域に結合し、ｉ）～ｉｉｉ）のタンパク質又はｉｖ）のコラン酸（ｃｏｌｏｎｉｃ ａｃｉｄ）遺伝子クラスターの発現を増強する、過剰発現された遺伝子産物を含み得、ここで異種α－１，２－フコシルトランスフェラーゼタンパク質は、配列番号６である。
【0217】
［ＣＲＰ］
１つ以上の例示的な実施形態において、上記遺伝子産物は、ｃＡＭＰ ＤＮＡ結合転写二重制御因子ＣＲＰである。
１つ以上の例示的な実施形態において、上記遺伝子産物は、ｃＡＭＰ ＤＮＡ結合転写二重制御因子ＣＲＰである。
【0218】
ＣＲＰは、転写因子のＣＲＰ－ＦＮＲスーパーファミリーに属する。ＣＲＰはいくつかの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）遺伝子の発現を制御し、その多くは二次炭素源の異化に関与している。環状ＡＭＰ（ｃＡＭＰ）により活性化すると、ＣＲＰは特定のプロモータ配列に直接結合し、その結合により直接相互作用を通じてＲＮＡポリメラーゼが動員され、プロモータ配列に続く核酸配列の転写が活性化され、目的の遺伝子の発現が引き起こされる。従って、ＣＲＰの過剰発現は、目的の遺伝子／核酸配列の発現の増強につながる可能性がある。他の機能の中では、ＣＲＰはＰｇｌｐＦプロモータにその機能を発揮し、リプレッサＧｌｐＲとは逆にＰｇｌｐＦファミリーのプロモータ配列を活性化する。このようにして、本開示の遺伝的に操作された細胞のＣＲＰの過剰発現は、ＰｇｌｐＦファミリーのプロモータによって調節される遺伝子の発現を促進する。
【0219】
従って、１つ以上の例示的な実施形態において、ｃｒｐ遺伝子は、過剰発現する。ｃｒｐ遺伝子は、ＧｅｎＢａｎｋ受入ＩＤ ＮＰ＿４１７８１６を有するアミノ酸配列と１００％同一のタンパク質又はＧｅｎＢａｎｋ受入ＩＤ ＮＰ＿４１７８１６と少なくとも７０％同一、例えば８０％、例えば９０％、例えば９５％、例えば９８％同一のその機能的相同体をコードし得る。
【0220】
２’－ＦＬ産生株における本開示で示唆されるＧｌｐＲ及び／又はＣＲＰの遺伝的操作は、これらの株による２’－ＦＬの全体的な産生にとって有益である。
【0221】
［リプレッサ］
実施例５で示すように、ＤＮＡ結合転写リプレッサＧｌｐＲをコードするｇｌｐＲ遺伝子の欠失は、ＬＮＦＰ－Ｉ、２’－ＦＬ、ＬＮＴ ＩＩ、及びＬＮＴ（豊富な順）を含む最大４つのＨＭＯを含むＨＭＯ混合物の特定の標的組成を獲得するための遺伝的ツールとして使用される。
実施例５で示すように、ＤＮＡ結合転写リプレッサＧｌｐＲをコードするｇｌｐＲ遺伝子の欠失は、ＬＮＦＰ－Ｉ、２’－ＦＬ、ＬＮＴ ＩＩ、及びＬＮＴ（豊富な順）を含む最大４つのＨＭＯを含むＨＭＯ混合物の特定の標的組成を獲得するための遺伝的ツールとして使用される。
【0222】
１つ以上の例示的な実施形態において、本開示による方法は、ｖ）の調節要素又はｖ）の調節要素の上流の領域に結合し、ｉ）～ｉｉｉ）のタンパク質又はｉｖ）のコラン酸（ｃｏｌｏｎｉｃ ａｃｉｄ）遺伝子クラスターの発現を抑制する、機能しない（又は存在しない）遺伝子産物を更に含む細胞を含む。
【0223】
１つ以上の例示的な実施形態において、本開示による方法は、細胞を含み、ここでｖ）の調節要素又はｖ）の調節要素の上流の領域に結合し、ｉ）、ｉｉ）、若しくはｉｉｉ）のタンパク質のいずれか１つ、又はｖ）のコラン酸（ｃｏｌｏｎｉｃ ａｃｉｄ）遺伝子クラスターの発現を抑制する遺伝子産物は、欠失しているか又は機能しない。
【0224】
１つ以上の例示的な好ましい実施形態において、本開示による方法は、ｖ）の調節要素又はｖ）の調節要素の上流の領域に結合し、ｉ）～ｉｉｉ）のタンパク質又はｉｖ）のコラン酸（ｃｏｌｏｎｉｃ ａｃｉｄ）遺伝子クラスターの発現を抑制する、機能しない（又は存在しない）遺伝子産物を更に含む細胞を含み、ここで異種α－１，２－フコシルトランスフェラーゼタンパク質は、配列番号６である。
【0225】
１つ以上の例示的な実施形態において、上記遺伝子産物は、ＤＮＡ結合転写リプレッサＧｌｐＲである。
【0226】
［ＧｌｐＲ］
ＧｌｐＲは転写調節因子のＤｅｏＲファミリーに属し、異なるオペロンで構成されているグリセロール－３－ホスフェートレギュロン（ｒｅｇｕｌｏｎ）のリプレッサとして機能する。この調節因子はｇｌｐＥＧＲオペロンの一部であるが、独立した（ｇｌｐＲ）転写単位として構成的に発現することもできる。加えて、調節されるオペロンは、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）が誘導物質、グリセロール、又はグリセロール－３－リン酸（Ｇ３Ｐ）の存在下、及びグルコースの非存在下で増殖する場合に誘導される。誘導物質の非存在下で、このリプレッサは、２０核酸長のＤＮＡ標的部位からなる逆方向反復配列にタンデムに結合する。
ＧｌｐＲは転写調節因子のＤｅｏＲファミリーに属し、異なるオペロンで構成されているグリセロール－３－ホスフェートレギュロン（ｒｅｇｕｌｏｎ）のリプレッサとして機能する。この調節因子はｇｌｐＥＧＲオペロンの一部であるが、独立した（ｇｌｐＲ）転写単位として構成的に発現することもできる。加えて、調節されるオペロンは、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）が誘導物質、グリセロール、又はグリセロール－３－リン酸（Ｇ３Ｐ）の存在下、及びグルコースの非存在下で増殖する場合に誘導される。誘導物質の非存在下で、このリプレッサは、２０核酸長のＤＮＡ標的部位からなる逆方向反復配列にタンデムに結合する。
【0227】
ｇｌｐＲ遺伝子に関する用語「機能しない又は存在しない」は、細菌ゲノムからの対応する核酸配列（例えば、配列番号４８又はｇｌｐＦ由来プロモータを下方制御することができるｇｌｐＲをコードするそのバリアント）の完全又は部分的欠失によるｇｌｐＲ遺伝子の不活化を指す。ｇｌｐＲ遺伝子は、調節要素へのＤＮＡ結合に影響を与える終止コドン、フレームシフト、又はアミノ酸変異を導入するコーディング配列に変異を導入することによって、機能しなくすることもできる。ｇｌｐＲ遺伝子は、ＤＮＡ結合転写リプレッサＧｌｐＲをコードする。この方法では、ＰｇｌｐＦファミリーのプロモータ配列は、遺伝的に操作された細胞において、さもなければＰｇｌｐＦプロモータを下方制御するリプレッサ遺伝子が欠失しているため、上方制御される。
【0228】
１つ以上の例示的な実施形態において、ｇｌｐＲ遺伝子は欠失している。
【0229】
［糖排出トランスポータ］
過去１０年間、いくつかの新しい効果的な糖排出トランスポータタンパク質が同定されており、それぞれ組換えにより生成された様々なＨＭＯに対する特異性を有し、上記タンパク質を発現する組換え細胞の開発は、高い規模の産業的ＨＭＯ製造に有利である。糖輸送は、限定されるものではないが、オリゴ糖などの糖の輸送に関する。
過去１０年間、いくつかの新しい効果的な糖排出トランスポータタンパク質が同定されており、それぞれ組換えにより生成された様々なＨＭＯに対する特異性を有し、上記タンパク質を発現する組換え細胞の開発は、高い規模の産業的ＨＭＯ製造に有利である。糖輸送は、限定されるものではないが、オリゴ糖などの糖の輸送に関する。
【0230】
例えば、いくつかの選択された糖排出トランスポータタンパク質のうちの１つを導入することによってｆｕｔＣ発現細胞を操作すること、並びにコラン酸遺伝子クラスターの発現レベルを増加させることは、最終ＨＭＯブレンドの１番目と２番目に豊富なＨＭＯの存在量の順序を、ＬＮＦＰ－Ｉ＞２’－ＦＬから２’－ＦＬ＞ＬＮＦＰ－Ｉへと著しく逆転させることができる２つの効率的な遺伝子改変であることが判明した。
【0231】
従って、本明細書に記載される遺伝的に操作された細胞は、糖排出トランスポータをコードする組換え核酸も含み得る。糖排出トランスポータは、例えば、本明細書に記載の方法でＨＭＯのレベルを増加させる。
【0232】
本明細書に記載の遺伝的に操作された細胞の細胞質又は周辺質から産生培地へ、及び／又は産生培地から細胞質若しくは周辺質への、１つ以上のＨＭＯの流入及び／又は流出輸送が開示される。
【0233】
本明細書に開示される遺伝的に操作された細胞の細胞質若しくは周辺質から産生培地及び／又は産生培地から遺伝的に操作された細胞の細胞質若しくは周辺質に１つ以上のＨＭＯを輸送できる本明細書に開示される遺伝的に操作された細胞において発現されるポリペプチドは、糖輸送が可能なポリペプチドである。
【0234】
したがって、本文脈において、糖輸送は、ＨＭＯなどであるがこれに限定されない糖の流出及び／又は流入輸送を意味し得る。
【0235】
したがって、１つ以上の例示的な実施形態において、本明細書中に記載される方法に従う遺伝的に操作された細胞は、糖排出トランスポータとしての機能を果たす遺伝子産物を更に含む。糖排出トランスポータとしての機能を果たす遺伝子産物は、遺伝的に操作された細胞内で発現される組換え核酸配列によってコードされ得る。糖排出トランスポータをコードする組換え核酸配列は、遺伝的に操作された細胞のゲノム中に組み込まれ得る。それはプラスミドによってもたらされる場合もあれば、エピソーム発現要素の一部である場合もある。
【0236】
［ＭＦＳトランスポータ］
例示的な糖排出トランスポータは、主要ファシリテータースーパーファミリータンパク質の亜種である。ＭＦＳトランスポータは、オリゴ糖などの糖などの分子（ただしこれに限定されない）の細胞膜を通過する輸送を促進する。
例示的な糖排出トランスポータは、主要ファシリテータースーパーファミリータンパク質の亜種である。ＭＦＳトランスポータは、オリゴ糖などの糖などの分子（ただしこれに限定されない）の細胞膜を通過する輸送を促進する。
【0237】
「主要ファシリテータースーパーファミリー（ＭＦＳ）」という用語は、二次活性トランスポータクラスの大きくて非常に多様なファミリーを意味し、糖、薬物、疎水性分子、ペプチド、有機イオンなどを含む様々な基質の範囲の輸送を担う。
【0238】
本文脈において「ＭＦＳトランスポータ」は、細胞膜を通したオリゴ糖、好ましくはＨＭＯの輸送、好ましくは本明細書に記載の遺伝的に操作された細胞によって合成されたＨＭＯ／オリゴ糖の細胞サイトゾルから細胞培地への輸送を促進するタンパク質を意味する。加えて、又はあるいは、ＭＦＳトランスポータは、ラクトース、グルコース、細胞代謝産物、及び／又は毒素などのＨＭＯ又はオリゴ糖とみなされない分子の排出も促進し得る。
【0239】
実施例４において、ｆｕｔＣ発現細胞の遺伝的バックグラウンドに糖排出トランスポータタンパク質をコードする選択された異種遺伝子を導入すると、最終ＨＭＯブレンドの１番目と２番目に豊富なＨＭＯの存在量の順序を、ＬＮＦＰ－Ｉ＞２’－ＦＬから２’－ＦＬ＞ＬＮＦＰ－Ｉへと著しく逆転させることができるのかが実証されている。表４に示すように、これらの菌株間の唯一の違いは、宿主の選択されたゲノム遺伝子座に組み込まれるトランスポータ遺伝子である。このような異種遺伝子の過剰発現は、細胞内部から細胞外環境への２’－ＦＬ及び／又はＬＮＦＰ－Ｉの輸送を強化し、それによってＨＭＯ産生にさまざまな形で影響を与えると考えられている。
【0240】
１つ以上の例示的な実施形態において、遺伝的に操作された細胞は、表５で示されるような１つ以上の糖トランスポートタンパク質をコードする組換え核酸を更に含む。
【0241】
１つ以上の例示的な実施形態において、糖排出トランスポータ及び／又はＭＦＳトランスポートタンパク質は、Ｂａｄ、Ｎｅｃ、ＹｂｅｒＣ、Ｆｒｅｄ、Ｖａｇ、及びＭａｒｃからなる群から選択される。
【0242】
１つ以上の例示的な好ましい実施形態において、糖排出トランスポータは、Ｎｅｃ又はＹｂｅｒＣである。
【0243】
［Ｂａｄ］
「Ｂａｄタンパク質」又は「Ｂａｄトランスポータ」又は「Ｂａｄ」として互換的に本明細書で特定されるＭＦＳトランスポータタンパク質は、配列番号２８のアミノ酸配列を有し；配列番号２８として本明細書で特定されるアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受入ＩＤ ＷＰ＿０１７４８９９１４．１を有するアミノ酸配列と１００％同一のアミノ酸配列である。
「Ｂａｄタンパク質」又は「Ｂａｄトランスポータ」又は「Ｂａｄ」として互換的に本明細書で特定されるＭＦＳトランスポータタンパク質は、配列番号２８のアミノ酸配列を有し；配列番号２８として本明細書で特定されるアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受入ＩＤ ＷＰ＿０１７４８９９１４．１を有するアミノ酸配列と１００％同一のアミノ酸配列である。
【0244】
１つ以上の例示的な実施形態において、糖排出トランスポータ及び／又はＭＦＳトランスポートタンパク質は、Ｂａｄである。更なる実施形態において、糖排出トランスポータは、配列番号２８のアミノ酸配列を有するか、又は配列番号２８と少なくとも７０％同一、例えば少なくとも８０％同一、例えば少なくとも８５％同一、例えば少なくとも９０％同一、例えば少なくとも９５％同一、若しくは例えば少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を有する機能的相同体である。
【0245】
［Ｎｅｃ］
配列番号２９のアミノ酸配列を有するＭＦＳトランスポータタンパク質は、「Ｎｅｃタンパク質」又は「Ｎｅｃトランスポータ」又は「Ｎｅｃ」として互換的に本明細書で特定され；Ｎｅｃタンパク質をコードする核酸配列は、「Ｎｅｃコーディング核酸／ＤＮＡ」又は「ｎｅｃ遺伝子」又は「ｎｅｃ」として本明細書で特定され；配列番号２９として本明細書で特定されるアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受入ＩＤ ＷＰ＿０９２６７２０８１．１を有するアミノ酸配列と１００％同一のアミノ酸配列である。
配列番号２９のアミノ酸配列を有するＭＦＳトランスポータタンパク質は、「Ｎｅｃタンパク質」又は「Ｎｅｃトランスポータ」又は「Ｎｅｃ」として互換的に本明細書で特定され；Ｎｅｃタンパク質をコードする核酸配列は、「Ｎｅｃコーディング核酸／ＤＮＡ」又は「ｎｅｃ遺伝子」又は「ｎｅｃ」として本明細書で特定され；配列番号２９として本明細書で特定されるアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受入ＩＤ ＷＰ＿０９２６７２０８１．１を有するアミノ酸配列と１００％同一のアミノ酸配列である。
【0246】
１つ以上の例示的な実施形態において、糖排出トランスポータ及び／又はＭＦＳトランスポートタンパク質は、Ｎｅｃである。更なる実施形態において、糖排出トランスポータは、配列番号２９のアミノ酸配列を有するか、又は配列番号２９と少なくとも７０％同一、例えば少なくとも８０％同一、例えば少なくとも８５％同一、例えば少なくとも９０％同一、例えば少なくとも９５％同一、若しくは例えば少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を有する機能的相同体である。
【0247】
［ＹｂｅｒＣ］
配列番号３０のアミノ酸配列を有するＭＦＳトランスポータタンパク質は、「ＹｂｅｒＣタンパク質」又は「ＹｂｅｒＣトランスポータ」又は「ＹｂｅｒＣ」として互換的に本明細書で特定され；ＹｂｅｒＣタンパク質をコードする核酸配列は、「ＹｂｅｒＣコーディング核酸／ＤＮＡ」又は「ｙｂｅｒＣ遺伝子」又は「ｙｂｅｒＣ」として本明細書で特定され；配列番号３０として本明細書で特定されるアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受入ＩＤ ＥＥＱ０８２９８．１を有するアミノ酸配列と１００％同一のアミノ酸配列である。
配列番号３０のアミノ酸配列を有するＭＦＳトランスポータタンパク質は、「ＹｂｅｒＣタンパク質」又は「ＹｂｅｒＣトランスポータ」又は「ＹｂｅｒＣ」として互換的に本明細書で特定され；ＹｂｅｒＣタンパク質をコードする核酸配列は、「ＹｂｅｒＣコーディング核酸／ＤＮＡ」又は「ｙｂｅｒＣ遺伝子」又は「ｙｂｅｒＣ」として本明細書で特定され；配列番号３０として本明細書で特定されるアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受入ＩＤ ＥＥＱ０８２９８．１を有するアミノ酸配列と１００％同一のアミノ酸配列である。
【0248】
１つ以上の例示的な実施形態において、糖排出トランスポータ及び／又はＭＦＳトランスポートタンパク質は、ＹｂｅｒＣである。更なる実施形態において、糖排出トランスポータは、配列番号３０のアミノ酸配列を有するか、又は配列番号３０と少なくとも７０％同一、例えば少なくとも８０％同一、例えば少なくとも８５％同一、例えば少なくとも９０％同一、例えば少なくとも９５％同一、若しくは例えば少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を有する機能的相同体である。
【0249】
［Ｆｒｅｄ］
配列番号３１のアミノ酸配列を有するＭＦＳトランスポータタンパク質は、「Ｆｒｅｄタンパク質」又は「Ｆｒｅｄトランスポータ」又は「Ｆｒｅｄ」として互換的に本明細書で特定され；Ｆｒｅｄタンパク質をコードする核酸配列は、「Ｆｒｅｄコーディング核酸／ＤＮＡ」又は「ｆｒｅｄ遺伝子」又は「ｆｒｅｄ」として本明細書で特定され；配列番号３１として本明細書で特定されるアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受入ＩＤ ＷＰ＿０８７８１７５５６．１を有するアミノ酸配列と１００％同一のアミノ酸配列である。
配列番号３１のアミノ酸配列を有するＭＦＳトランスポータタンパク質は、「Ｆｒｅｄタンパク質」又は「Ｆｒｅｄトランスポータ」又は「Ｆｒｅｄ」として互換的に本明細書で特定され；Ｆｒｅｄタンパク質をコードする核酸配列は、「Ｆｒｅｄコーディング核酸／ＤＮＡ」又は「ｆｒｅｄ遺伝子」又は「ｆｒｅｄ」として本明細書で特定され；配列番号３１として本明細書で特定されるアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受入ＩＤ ＷＰ＿０８７８１７５５６．１を有するアミノ酸配列と１００％同一のアミノ酸配列である。
【0250】
１つ以上の例示的な実施形態において、糖排出トランスポータ及び／又はＭＦＳトランスポートタンパク質は、Ｆｒｅｄである。更なる実施形態において、糖排出トランスポータは、配列番号３１のアミノ酸配列を有するか、又は配列番号３１と少なくとも７０％同一、例えば少なくとも８０％同一、例えば少なくとも８５％同一、例えば少なくとも９０％同一、例えば少なくとも９５％同一、若しくは例えば少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を有する機能的相同体である。
【0251】
［Ｖａｇ］
配列番号３２のアミノ酸配列を有するＭＦＳトランスポータタンパク質は、「Ｖａｇタンパク質」又は「Ｖａｇトランスポータ」又は「Ｖａｇ」として互換的に本明細書で特定され；Ｖａｇタンパク質をコードする核酸配列は、「Ｖａｇコーディング核酸／ＤＮＡ」又は「ｖａｇ遺伝子」又は「ｖａｇ」として本明細書で特定され；配列番号３２として本明細書で特定されるアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受入ＩＤ ＷＰ＿０４８７８５１３９．１を有するアミノ酸配列と１００％同一のアミノ酸配列である。
配列番号３２のアミノ酸配列を有するＭＦＳトランスポータタンパク質は、「Ｖａｇタンパク質」又は「Ｖａｇトランスポータ」又は「Ｖａｇ」として互換的に本明細書で特定され；Ｖａｇタンパク質をコードする核酸配列は、「Ｖａｇコーディング核酸／ＤＮＡ」又は「ｖａｇ遺伝子」又は「ｖａｇ」として本明細書で特定され；配列番号３２として本明細書で特定されるアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受入ＩＤ ＷＰ＿０４８７８５１３９．１を有するアミノ酸配列と１００％同一のアミノ酸配列である。
【0252】
１つ以上の例示的な実施形態において、糖排出トランスポータ及び／又はＭＦＳトランスポートタンパク質は、Ｖａｇである。更なる実施形態において、糖排出トランスポータは、配列番号３２のアミノ酸配列を有するか、又は配列番号３２と少なくとも７０％同一、例えば少なくとも８０％同一、例えば少なくとも８５％同一、例えば少なくとも９０％同一、例えば少なくとも９５％同一、若しくは例えば少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を有する機能的相同体である。
【0253】
［Ｍａｒｃ］
配列番号３３のアミノ酸配列を有するＭＦＳトランスポータタンパク質は、「Ｍａｒｃタンパク質」又は「Ｍａｒｃトランスポータ」又は「Ｍａｒｃ」として互換的に本明細書で特定され；Ｍａｒｃタンパク質をコードする核酸配列は、「Ｍａｒｃコーディング核酸／ＤＮＡ」又は「ｍａｒｃ遺伝子」又は「Ｍａｒｃ」として本明細書で特定され；配列番号３３として本明細書で特定されるアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受入ＩＤ ＷＰ＿０６０４４８１６９．１を有するアミノ酸配列と１００％同一のアミノ酸配列である。
配列番号３３のアミノ酸配列を有するＭＦＳトランスポータタンパク質は、「Ｍａｒｃタンパク質」又は「Ｍａｒｃトランスポータ」又は「Ｍａｒｃ」として互換的に本明細書で特定され；Ｍａｒｃタンパク質をコードする核酸配列は、「Ｍａｒｃコーディング核酸／ＤＮＡ」又は「ｍａｒｃ遺伝子」又は「Ｍａｒｃ」として本明細書で特定され；配列番号３３として本明細書で特定されるアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受入ＩＤ ＷＰ＿０６０４４８１６９．１を有するアミノ酸配列と１００％同一のアミノ酸配列である。
【0254】
１つ以上の例示的な実施形態において、糖排出トランスポータ及び／又はＭＦＳトランスポートタンパク質は、Ｍａｒｃである。更なる実施形態において、糖排出トランスポータは、配列番号３３のアミノ酸配列を有するか、又は配列番号３３と少なくとも７０％同一、例えば少なくとも８０％同一、例えば少なくとも８５％同一、例えば少なくとも９０％同一、例えば少なくとも９５％同一、若しくは例えば少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を有する機能的相同体である。
【0255】
１つ以上の例示的な実施形態において、Ｂａｄ、Ｎｅｃ、ＹｂｅｒＣ、Ｆｒｅｄ、Ｖａｇ、及びＭａｒｃからなる群から選択される糖排出トランスポータ及び／又はＭＦＳトランスポートタンパク質は、機能的相同体であってもよい。
【0256】
１つ以上の例示的な実施形態において、糖排出トランスポータ機能的相同体は、配列番号２８、２９、３０、３１、３２、又は３３のうちのいずれか１つ少なくとも７０％同一、例えば少なくとも８０％同一、例えば少なくとも８５％同一、例えば少なくとも９０％同一、例えば少なくとも９５％同一、又は例えば少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を有する。
【0257】
［培養］
本文脈において、培養は、一般に自然環境の外で、制御された条件下で細胞を増殖させるプロセスを指し、したがって、多数の細胞を培養、増殖、及び成長させるために使用される方法を指す。
本文脈において、培養は、一般に自然環境の外で、制御された条件下で細胞を増殖させるプロセスを指し、したがって、多数の細胞を培養、増殖、及び成長させるために使用される方法を指す。
【0258】
［細胞培養培地］
本文脈において、成長培地又は培養培地は、微生物、細胞、又は小さな植物の成長をサポートするように設計された液体又はゲルである。培地は、適切なエネルギー源を構成し、細胞周期を調節する化合物を含み得る。培養培地は、半規定、即ち複合培地化合物（例えば、酵母抽出物、大豆ペプトン、カザミノ酸など）を含有するものであっても、複合化合物を含まない化学的に規定されたものであってもよい。成長培地、培養培地、及び産生培地は、互換的に使用される。定時的な好適な培地は、実験例で提供される。
本文脈において、成長培地又は培養培地は、微生物、細胞、又は小さな植物の成長をサポートするように設計された液体又はゲルである。培地は、適切なエネルギー源を構成し、細胞周期を調節する化合物を含み得る。培養培地は、半規定、即ち複合培地化合物（例えば、酵母抽出物、大豆ペプトン、カザミノ酸など）を含有するものであっても、複合化合物を含まない化学的に規定されたものであってもよい。成長培地、培養培地、及び産生培地は、互換的に使用される。定時的な好適な培地は、実験例で提供される。
【0259】
１つ以上の例示的な実施形態において、培養培地は、最小培地である。
【0260】
１つ以上の例示的な実施形態において、培養培地は、グリセロール、スクロース、グルコース、及びフルクトースを含有する群から選択される１つ以上のエネルギー炭素源が補充される。
【0261】
１つ以上の例示的な実施形態において、培養培地は、グリセロール、スクロース、及びグルコースを含有する群から選択される１つ以上のエネルギー炭素源が補充される。
【0262】
１つ以上の例示的な実施形態において、培養培地は、グリセロール、スクロース、及び／又はグルコースが補充される。
【0263】
１つ以上の例示的な実施形態において、培養培地は、グリセロール及び／又はグルコースが補充される。
【0264】
１つ以上の例示的な実施形態において、培養培地は、スクロース及び／又はグルコースが補充される。
【0265】
１つ以上の例示的な実施形態において、培養培地は、グリセロール及び／又はスクロースが補充される。
【0266】
１つ以上の例示的な実施形態において、培養培地は、スクロースのみが補充される。
【0267】
１つ以上の例示的な実施形態において、培地は、唯一の炭素エネルギー源としてスクロースを含有する。
【0268】
［発酵温度］
実施例６は、どのように発酵温度を有利に使用して株ＭＰ２１によって生成されるＨＭＯブレンドの組成を調節することができるかについての開示と、特定の菌株、つまりＭＰ２１が、このブレンド中の最も豊富な２つのＨＭＯのモル比が例えばＬＮＦＰ－Ｉ：２’－ＦＬについて１．５：１～２：１で変化しながら、３番目に豊富なＨＭＯ、つまりＬＮＴは、同じ温度間隔で全ＨＭＯ混合物のモル比で約５％～１％で変化することの開示と、を扱っている。
実施例６は、どのように発酵温度を有利に使用して株ＭＰ２１によって生成されるＨＭＯブレンドの組成を調節することができるかについての開示と、特定の菌株、つまりＭＰ２１が、このブレンド中の最も豊富な２つのＨＭＯのモル比が例えばＬＮＦＰ－Ｉ：２’－ＦＬについて１．５：１～２：１で変化しながら、３番目に豊富なＨＭＯ、つまりＬＮＴは、同じ温度間隔で全ＨＭＯ混合物のモル比で約５％～１％で変化することの開示と、を扱っている。
【0269】
１つ以上の例示的な実施形態において、上記の例示的な方法の工程（ｂ）の遺伝的に操作された細胞の培養中発酵温度は、２０℃、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃、２５℃、２６℃、２７℃、２８℃、２９℃、３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃、３７℃、３８℃、３９℃、又は４０℃に固定してもよい。
【0270】
本明細書に記載される発酵プロセスはまた、非常に予測可能な方法で、菌株操作から得られた特定の菌株とのＨＭＯブレンドプロファイルを達成するために、発酵温度及び／又は発酵ブロス中のラクトースレベルの調節が含まれる。従って、例えば２５～３４℃、例えば２５～３２℃などの発酵温度の変動は、ＬＮＦＰ－Ｉ／２’－ＦＬ／ＬＮＴブレンドの組成を調節することができる。
【0271】
従って、１つ以上の例示的な実施形態において、上記の例示的な方法の工程（ｂ）の遺伝的に操作された細胞の培養中発酵温度は、調節される。遺伝的に操作された細胞の培養中の温度調節は、２０～４０℃、例えば２０～３９℃、２０～３８℃、２０～３７℃、２０～３６℃、２０～３５℃、２０～３４℃、２０～３３℃、２０～３２℃、２０～３１℃、２０～３０℃、２１～４０℃、２２～４０℃、２３～４０℃、２４～４０℃、２５～４０℃、２６～４０℃、２７～４０℃、２８～４０℃、２９～４０℃、３０～４０℃、２１～３９℃、２２～３８℃、２３～３７℃、２４～３６℃、２５～３５℃、２５～３４℃、２５～３３℃、２５～３２℃、２５～３１℃、２５～３０℃、２６～３０℃、２７～３０℃、２８～３０℃、及び２９～３０℃であってもよい。
【0272】
実施例６に示されるように、グルコース供給開始後１５分で、表８及び９に示すように、発酵温度設定値を３３℃から調査中のそれぞれの設定値まで下げた。これらの温度低下は、３時間にわたる直線傾斜で実行された。発酵の終了は、ＨＭＯミックスとラクトースの標的組成に達したときに、およそ９５～９８時間であった。図６は、異なる産生温度での発酵で株ＭＰ２１によって産生される３つの主要なＨＭＯ、つまりＬＮＦＰ－Ｉ、２’－ＦＬ、及びＬＮＴの発生、並びにアクセプタラクトースの発生を示している。ＬＮＦＰ－Ｉ／ＨＭＯＬ比は、全ての場合で約６０％に増加し、２’－ＦＬ及びＬＮＴは温度に大きく依存する挙動を示し、ＨＭＯＬはＨＭＯ及びラクトースの合計である。従って、発酵終了時、２’－ＦＬ／ＨＭＯＬ比は１５％～３５％の範囲であり、ＬＮＴ／ＨＭＯＬ比は１％～４％の範囲である。更に、２’－ＦＬ／ＨＭＯＬは、調査範囲（２５～３２℃）で温度に比例して増加する一方、ＬＮＴ／ＨＭＯＬは温度に反比例して動作する、つまり、産生温度が低いほど、ＬＮＴ／ＨＭＯＬ比は高くなる。
【0273】
２’－ＦＬ及び２’－ＦＬ／ＤＦＬ生成物のプロセス開発研究中に、本発明者らは、２’－ＦＬ産生株のＤＦＬ形成に対する発酵温度とラクトースレベル（及び炭素源の種類）の影響を観察した。
【0274】
この場合、低温及び低ラクトースレベルは、より低いＤＦＬ形成を支持するとともに、本明細書ではＬＮＦＰ－Ｉ産生株のこれらのパラメータをより詳しく調べている。一方では、ＬＮＦＰ－Ｉ産生株の状況は、３つの異なるグリコシルトランスフェラーゼにより更に複雑になり、２’－ＦＬ株では１つのグリコシルトランスフェラーゼ及び糖ヌクレオチド経路のみと比較して、ＬＮＦＰ－Ｉの生合成に必要な糖ヌクレオチド経路を比較した。更に、おそらくＬＮＦＰ－Ｉ株及び２’－ＦＬ株は、同じα－１，２－フソシルトランスフェラーゼ（ａｌｐｈａ－１，２－ｆｕｓｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）を共有しているため、観察された効果のいくつかが観察された。
【0275】
従って、１つ以上の例示的な実施形態において、２’－ＦＬ／ＨＭＯＬの比率は温度に比例して増加する。
【0276】
従って、１つ以上の例示的な実施形態において、ＬＮＴ／ＨＭＯＬの比率は温度に比例して減少する。
【0277】
［ラクトースのレベル］
実施例７に示されるように、発酵中のラクトースのレベルは、ＬＮＦＰ－Ｉ産生株の１つの特定のファミリーの４－ＨＭＯブレンドの組成に非常に大きな影響を与えることを示した。従って、１つ以上の例示的な実施形態において、上記の例示的な方法の工程（ｂ）の遺伝的に操作された細胞の培養中のラクトースのラクトースレベルは、調節される。
実施例７に示されるように、発酵中のラクトースのレベルは、ＬＮＦＰ－Ｉ産生株の１つの特定のファミリーの４－ＨＭＯブレンドの組成に非常に大きな影響を与えることを示した。従って、１つ以上の例示的な実施形態において、上記の例示的な方法の工程（ｂ）の遺伝的に操作された細胞の培養中のラクトースのラクトースレベルは、調節される。
【0278】
低レベルのラクトースは、発酵中のラクトースが２０ｇ／Ｌ未満、好ましくは１５ｇ／Ｌ未満、例えば０．５～１５ｇ／Ｌ、好ましくは１０ｇ／Ｌ未満、例えば１～１０ｇ／Ｌである場合である。
【0279】
高レベルのラクトースは、発酵の最初の４０時間で３０～８０ｇ／Ｌであり、その後、所望の場合は、発酵の終了時にラクトースレベルを低下させるためにラクトースを枯渇させ、それによってラクトースを含まない生成物を提供するための下流の精製の必要性を減らす。
【0280】
図７に示すように、さもなければ、２つの発酵プロセスは、培地組成、グルコース供給プロファイル、並びに温度、ｐＨ及び溶存酸素などの発酵プロセスパラメーターに関して同一である。しかしながら、２番目と３番目に豊富なＨＭＯの存在量の順序が、２’－ＦＬ＞＞ＬＮＴからＬＮＴ＞＞２’－ＦＬへと著しく逆転させるには、ラクトースレベルを低（０．５～２０ｇ／Ｌ）から高（３０～８０ｇ／Ｌ）まで変化させることによってのみ可能であった。
【0281】
高ラクトースレベルのＨＭＯ生成物プロファイルは、ＬＮＦＰ－Ｉ＞２’－ＦＬ＞ＬＮＴ＞ＬＮＴ－ＩＩである。
従って、１つ以上の例示的な実施形態において、遺伝的に操作された細胞の培養中のラクトースレベルは、低から高へ調節される。
従って、１つ以上の例示的な実施形態において、遺伝的に操作された細胞の培養中のラクトースレベルは、低から高へ調節される。
【0282】
従って、１つ以上の例示的な実施形態において、遺伝的に操作された細胞の培養中のラクトースレベルは、低から高へ調節される。
【0283】
１つ以上の例示的な実施形態において、高レベルのラクトースレベルは、３０～８０ｇ／Ｌ、例えば３０～４０ｇ／Ｌ、３０～５０ｇ／Ｌ、３０～６０ｇ／Ｌ、３０～７０ｇ／Ｌ、４０～５０ｇ／Ｌ、４０～６０ｇ／Ｌ、４０～７０ｇ／Ｌ、４０～８０ｇ／Ｌ、５０～６０ｇ／Ｌ、５０～７０ｇ／Ｌ、５０～８０ｇ／Ｌ、６０～７０ｇ／Ｌ、６０～８０ｇ／Ｌ、３５～５０ｇ／Ｌ、３５～６０ｇ／Ｌ、３５～７０ｇ／Ｌ、３５～７５ｇ／Ｌ、３５～８０ｇ／Ｌ、４５～５５ｇ／Ｌ、４５～７５ｇ／Ｌ、５５～６５ｇ／Ｌ、５５～７５ｇ／Ｌ、５５～８０ｇ／Ｌ、６５～７５ｇ／Ｌ、又は６５～８０ｇ／Ｌに関連するがこれらに限定されない。
【0284】
従って、１つ以上の例示的な実施形態において、低レベルのラクトースレベルは、０～１５ｇ／Ｌ、例えば０～５ｇ／Ｌ、０～７．５ｇ／Ｌ、０～１０ｇ／Ｌ、０～１２．５ｇ／Ｌ、２．５～５ｇ／Ｌ、２．５～７．５ｇ／Ｌ、２．５～１０ｇ／Ｌ、２．５～１２．５ｇ／Ｌ、２．５～１５ｇ／Ｌ、５～７．５ｇ／Ｌ、５～１０ｇ／Ｌ、５～１２．５ｇ／Ｌ、５～１５ｇ／Ｌ、７．５～１０ｇ／Ｌ、７．５～１２．５ｇ／Ｌ、７．５～１５ｇ／Ｌ、１０～１２．５ｇ／Ｌ、１０～１５ｇ／Ｌ、又は１２．５～１５ｇ／Ｌに関連するがこれらに限定されない。
【0285】
温度及びラクトース濃度以外の他の発酵パラメータは、ＬＮＦＰ－Ｉ産生株のＨＭＯブレンド組成にこれほど大きな影響を与えることは見出されなかった。
【0286】
上記の菌株操作戦略によって導かれた多くのＬＮＦＰ－Ｉ産生株の場合、驚くべきことに、２つの主要な発酵パラメータは、予想可能且つ固有の方法で得られるＨＭＯブレンドプロファイルの組成に大きな影響を与えることが判明し、ブレンドに含まれるＨＭＯの各々について狭い範囲内で事前に決定された組成を有するプロファイルの提供が可能になった。
【0287】
従って、２５～３２℃の発酵温度の変動により、ＬＮＦＰ－Ｉ／２’－ＦＬ／ＬＮＴブレンドの組成を調節することができる。特定の株（実施例６を参照）、つまりＭＰ２１を使用した１つの研究では、このブレンドに含まれる２つの最も豊富なＨＭＯのモル比が、ＬＮＦＰ－Ｉ：２’－ＦＬについて１．５：１～２：１で変化しながら、３番目に豊富なＨＭＯ、つまりＬＮＴは、同じ温度間隔で全ＨＭＯ混合物のモル比で約５％～１％で変化するこが示される。
【0288】
［スクロース発酵］
１つ以上の例示的な実施形態において、遺伝的に操作された細胞は、ＰＴＳ依存性スクロース利用輸送系並びに／又はスクロースをフルクトース及びグルコースに加水分解することができる異種ポリペプチドをコードする組換え核酸配列を含み得る。
１つ以上の例示的な実施形態において、遺伝的に操作された細胞は、ＰＴＳ依存性スクロース利用輸送系並びに／又はスクロースをフルクトース及びグルコースに加水分解することができる異種ポリペプチドをコードする組換え核酸配列を含み得る。
【0289】
このような細胞は、炭素エネルギー源としてスクロースを利用することができる。例えば、本明細書に開示される方法の工程ｂ）による培養工程は、２段階のスクロース供給を含み、第２の供給段階では、細胞増殖を遅らせ、高細胞密度培養で産生される生成物の含有量を増加させるために、第１の供給段階で連続的に添加される量よりも少ない量のスクロースを培養物に連続的に添加する。
【0290】
第２の供給段階中に細胞培養物に連続的に添加されるスクロースの供給速度は、第１の供給段階中に連続的に添加されるスクロースの供給速度よりも約３０～４０％低い場合がある。
【0291】
どちらの供給段階中でも、ラクトースは、好ましくは同じ供給溶液中のスクロースとともに連続的に、又は順次添加することができる。
【0292】
任意選択的には、第２段階の後に細胞外画分にかなりの量の未使用のアクセプタが残った場合は、培養は、第３の供給段階を更に含む。
【0293】
次いで、スクロースの添加は、アクセプタを添加せずに、好ましくは第２の供給段階に設定されたほぼ同じ供給速度で、アクセプタが消費されるまで継続する。
【0294】
１つ以上の例示的な実施形態において、遺伝的に操作された細胞は、１つ以上の異種ポリペプチドをコードする１つ以上の異種核酸配列を含んでもよく、これは、前記遺伝的に操作された細胞の唯一の炭素エネルギー源としてのスクロースの利用を可能にする。
【0295】
１つ以上の例示的な実施形態において、遺伝的に操作された細胞は、ｓｃｒＹＡオペロン及びｓｃｒＢＲオペロンを更に含むＰＴＳ依存性スクロース利用システムを含む。
【0296】
１つ以上の例示的な実施形態において、ｓｃｒＹＡオペロンによるコードされるポリペプチドは、配列番号３４若しくは配列番号３５［それぞれ、ｓｃｒＹ及びｓｃｒＡ］に従うアミノ酸配列を有するポリペプチドであるか、又は配列番号３４若しくは配列番号３５［それぞれ、ｓｃｒＹ及びｓｃｒＡ］のいずれか１つと少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有する配列番号３４若しくは配列番号３５［それぞれ、ｓｃｒＹ及びｓｃｒＡ］のいずれか１つの機能的相同体である。
【0297】
１つ以上の例示的な実施形態において、ｓｃｒＢＲオペロンによるコードされるポリペプチドは、配列番号３６若しくは配列番号３７［それぞれ、ｓｃｒＢ及びｓｃｒＲ］に従うアミノ酸配列を有するポリペプチドであるか、又は配列番号３６若しくは配列番号３７［それぞれ、ｓｃｒＢ及びｓｃｒＲ］のいずれか１つと少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有する配列番号３６若しくは配列番号３７［それぞれ、ｓｃｒＢ及びｓｃｒＲ］のいずれか１つの機能的相同体である。国際公開第２０１５／１９７０８２号パンフレット（参考として本明細書に組み込まれる）では、ＰＴＳ依存性スクロース利用系が更に詳細に開示されている。
【0298】
１つ以上の例示的な実施形態において、スクロースをフルクトース及びグルコースへ加水分解することができるポリペプチドは、配列番号３８若しくは配列番号３９［それぞれ、ＳａｃＣ＿Ａｇａｌ及びＢｆｆ］からなる群から選択されるか、又は配列番号３８若しくは配列番号３９［それぞれ、ＳａｃＣ＿Ａｇａｌ及びＢｆｆ］のいずれか１つと少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有する配列番号３８若しくは配列番号３９［それぞれ、ＳａｃＣ＿Ａｇａｌ及びＢｆｆ］のいずれか１つの機能的相同体である。
【0299】
［収集］
文脈における用語「収集」は、発酵の終了に続いて産生されたＨＭＯを回収することに関する。１つ以上の例示的な実施形態において、これは、バイオマス（即ち宿主細胞）及び培地の両方に含まれる、即ちバイオマスからの発酵ブロスの分離前に／分離をせずにＨＭＯを回収することを含み得る。他の実施形態では、産生されたＨＭＯは、バイオマス及び発酵ブロスから個別に、即ち培養培地（即ち発酵ブロス）からのバイオマスの分離後／分離に続いて回収され得る。
文脈における用語「収集」は、発酵の終了に続いて産生されたＨＭＯを回収することに関する。１つ以上の例示的な実施形態において、これは、バイオマス（即ち宿主細胞）及び培地の両方に含まれる、即ちバイオマスからの発酵ブロスの分離前に／分離をせずにＨＭＯを回収することを含み得る。他の実施形態では、産生されたＨＭＯは、バイオマス及び発酵ブロスから個別に、即ち培養培地（即ち発酵ブロス）からのバイオマスの分離後／分離に続いて回収され得る。
【0300】
培地からの細胞の分離は、当業者に周知の方法のいずれか、例えば、任意の好適な種類の遠心分離又は濾過により実行することができる。培地からの細胞の分離は、発酵ブロスの収集直後に続けるか、又は適切な条件で発酵ブロスを貯蔵した後の段階で実行することができる。残留しているバイオマス（又は全発酵）からの産生されたＨＭＯの回収には、バイオマス（即ち、産生細胞）からの抽出が含まれる。
【0301】
発酵からの回収後、ＨＭＯは、更なる加工処理及び精製に利用可能である。
【0302】
［遺伝的に操作された細胞］
本明細書で記載される遺伝的に操作された細胞は、上記で記載される異種β－１，３－Ｎ－アセチル－グルコサミニルトランスフェラーゼ、β－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼ、及びα－１，２－フコシルトランスフェラーゼであり、実施例で示されるとおりである。いくつかの実施形態において、異種β－１，３－Ｎ－アセチル－グルコサミニルトランスフェラーゼ、β－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼ、及びα－１，２－フコシルトランスフェラーゼのうちの１つ以上は、過剰発現する。
本明細書で記載される遺伝的に操作された細胞は、上記で記載される異種β－１，３－Ｎ－アセチル－グルコサミニルトランスフェラーゼ、β－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼ、及びα－１，２－フコシルトランスフェラーゼであり、実施例で示されるとおりである。いくつかの実施形態において、異種β－１，３－Ｎ－アセチル－グルコサミニルトランスフェラーゼ、β－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼ、及びα－１，２－フコシルトランスフェラーゼのうちの１つ以上は、過剰発現する。
【0303】
本開示は、オリゴ糖を生成するための方法において使用するための遺伝的に操作された細胞について記載している。上記遺伝的に操作された細胞は、遺伝的に操作され、
ｉ．配列番号１若しくは配列番号２若しくは配列番号３で示される異種β－１，３－Ｎ－アセチル－グルコサミニルトランスフェラーゼタンパク質、又は配列番号１、２、若しくは３と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体と、
ｉｉ．配列番号４若しくは配列番号５で示される異種β－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼタンパク質、又は配列番号４若しくは５と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体と、
ｉｉｉ．配列番号６若しくは配列番号７若しくは配列番号４９若しくは配列番号８のいずれか１つで示される異種α－１，２－フコシルトランスフェラーゼタンパク質、又は配列番号６、７、４９、若しくは８のいずれか１つと少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体と、
ｉｖ．コラン酸遺伝子クラスターと、
ｖ．ｉ）、ｉｉ）、及びｉｉｉ）のタンパク質の発現を制御するための天然又は異種調節要素又はｉｖ）のコラン酸遺伝子クラスターと、を発現する。
ｉ．配列番号１若しくは配列番号２若しくは配列番号３で示される異種β－１，３－Ｎ－アセチル－グルコサミニルトランスフェラーゼタンパク質、又は配列番号１、２、若しくは３と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体と、
ｉｉ．配列番号４若しくは配列番号５で示される異種β－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼタンパク質、又は配列番号４若しくは５と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体と、
ｉｉｉ．配列番号６若しくは配列番号７若しくは配列番号４９若しくは配列番号８のいずれか１つで示される異種α－１，２－フコシルトランスフェラーゼタンパク質、又は配列番号６、７、４９、若しくは８のいずれか１つと少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体と、
ｉｖ．コラン酸遺伝子クラスターと、
ｖ．ｉ）、ｉｉ）、及びｉｉｉ）のタンパク質の発現を制御するための天然又は異種調節要素又はｉｖ）のコラン酸遺伝子クラスターと、を発現する。
【0304】
本発明の一態様は、
ｉ．配列番号１若しくは２若しくは３で示される異種β－１，３－Ｎ－アセチル－グルコサミニルトランスフェラーゼタンパク質、又は配列番号１、２、若しくは３と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体と、
ｉｉ．配列番号４若しくは５で示される異種β－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼタンパク質、又は配列番号４若しくは５と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体と、
ｉｉｉ．配列番号６若しくは配列番号７若しくは配列番号４９のいずれか１つで示される異種α－１，２－フコシルトランスフェラーゼタンパク質、又は配列番号６、７、若しくは４９のいずれか１つと少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体と、
ｉｖ．コラン酸遺伝子クラスターと、
ｖ．ｉ）～ｉｖ）のいずれか１つの発現を制御するための天然又は異種調節要素と、
をコードする組換え核酸配列を含む、遺伝的に操作された細胞に関する。
ｉ．配列番号１若しくは２若しくは３で示される異種β－１，３－Ｎ－アセチル－グルコサミニルトランスフェラーゼタンパク質、又は配列番号１、２、若しくは３と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体と、
ｉｉ．配列番号４若しくは５で示される異種β－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼタンパク質、又は配列番号４若しくは５と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体と、
ｉｉｉ．配列番号６若しくは配列番号７若しくは配列番号４９のいずれか１つで示される異種α－１，２－フコシルトランスフェラーゼタンパク質、又は配列番号６、７、若しくは４９のいずれか１つと少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体と、
ｉｖ．コラン酸遺伝子クラスターと、
ｖ．ｉ）～ｉｖ）のいずれか１つの発現を制御するための天然又は異種調節要素と、
をコードする組換え核酸配列を含む、遺伝的に操作された細胞に関する。
【0305】
好ましくは、遺伝的に操作された細胞は、２’ＦＬ及び／又はＬＮＦＰ－Ｉを細胞外に輸送することができる糖排出トランスポータをコードする組換え核酸配列を更に含む。
【0306】
糖排出トランスポータをコードする組換え核酸配列は：
ａ．配列番号２８をコードする核酸配列、又は配列番号２８と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体、
ｂ．配列番号２９をコードする核酸配列、又は配列番号２９と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体、
ｃ．配列番号３０をコードする核酸配列、又は配列番号３０と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体、
ｄ．配列番号３１をコードする核酸配列、又は配列番号３１と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体、
ｅ．配列番号３２をコードする核酸配列、又は配列番号３２と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体、及び
ｆ．配列番号３３をコードする核酸配列、又は配列番号３３と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体からなる群から選択することができる。
ａ．配列番号２８をコードする核酸配列、又は配列番号２８と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体、
ｂ．配列番号２９をコードする核酸配列、又は配列番号２９と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体、
ｃ．配列番号３０をコードする核酸配列、又は配列番号３０と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体、
ｄ．配列番号３１をコードする核酸配列、又は配列番号３１と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体、
ｅ．配列番号３２をコードする核酸配列、又は配列番号３２と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体、及び
ｆ．配列番号３３をコードする核酸配列、又は配列番号３３と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体からなる群から選択することができる。
【0307】
好ましくは、遺伝的に操作された細胞は、コピー数を増加させることによって、及び／又は適切な調節要素を選択することによってコラン酸遺伝子クラスターを過剰発現する。
【0308】
「遺伝的に改変された」又は「遺伝的に操作された」細胞は、本明細書で互換的に使用され、遺伝子材料が遺伝子工学技術を使用して人間の介入によって改変されている細胞として理解され、そのような技術は、例えば、以下に限定されないが、例えば、異種ポリヌクレオチド配列、Ｃｒｉｓｐｅｒ／Ｃａｓ編集及び／又はランダム変異誘発による形質転換又は形質移入である。本発明の文脈において、用語「遺伝子改変細胞」及び「宿主細胞」は、互換的に使用される。
【0309】
本発明において、「遺伝子改変細胞」は、好ましくは、外来ポリヌクレオチド配列によって形質転換又は形質移入されている宿主細胞である。
【0310】
１つ以上の例示的な実施形態において、細胞は、２’－ＦＬ、ＬＮＴ－ＩＩ、ＬＮＴ、ＬＮＦＰ－Ｉ、及びＤＦＬからなる群から選択される１つ以上のＨＭＯを産生することができる。
【0311】
１つ以上の例示的な実施形態において、遺伝的に操作された細胞は、２’－ＦＬ、ＬＮＴ－ＩＩ、ＬＮＴ、及びＬＮＦＰ－Ｉからなる群から選択される１つ以上のＨＭＯを産生することができる。
【0312】
１つ以上の例示的な実施形態において、遺伝的に操作された細胞により産生される主要なＨＭＯは、ＬＮＦＰ－Ｉ及び／又は２’－ＦＬである。いくつかの実施形態において、ＨＭＯ生成総量のうちのＬＮＦＰ－Ｉ及び／又は２’－ＦＬ画分は、少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９８％である。
【0313】
１つ以上の例示的な実施形態において、ＨＭＯブレンドは、細胞によって産生される全ＨＭＯの２５～７０％の２’－ＦＬのモル％及び３０％～６０％のＬＮＦＰ－Ｉのモル％を含む。
【0314】
遺伝的に操作された細胞は、哺乳動物細胞株を含む、ＨＭＯ産生に有用な任意の細胞であり得る。好ましくは、宿主細胞は、真核生物又は原核生物起源の単細胞微生物である。
【0315】
宿主細胞として機能し得る適切な微生物細胞としては、酵母細胞、細菌細胞、古細菌細胞、藻類細胞、及び真菌細胞が挙げられる。
【0316】
遺伝的に操作された細胞（宿主細胞）は、例えば、細菌細胞又は酵母細胞であり得る。好ましい一実施形態において、遺伝的に操作された細胞は、好ましくは、細菌細胞などの原核細胞である。
【0317】
［宿主細胞］
細菌宿主細胞に関して、原則として、限定されないが、それらは、目的の遺伝子又は調節要素を挿入するための遺伝的操作を可能にする限り、真正細菌（グラム陽性又はグラム陰性）又は古細菌であってもよく、製造規模で培養することができる。好ましくは、宿主細胞は、高細胞密度への培養を可能にする特性を有する。
細菌宿主細胞に関して、原則として、限定されないが、それらは、目的の遺伝子又は調節要素を挿入するための遺伝的操作を可能にする限り、真正細菌（グラム陽性又はグラム陰性）又は古細菌であってもよく、製造規模で培養することができる。好ましくは、宿主細胞は、高細胞密度への培養を可能にする特性を有する。
【0318】
本発明によるＨＭＯの工業的組換え産生のために好適である細菌宿主細胞の非限定的例は、エルウィニア・ヘルビコラ（Ｅｒｗｉｎｉａ ｈｅｒｂｉｃｏｌａ）（パントエア・アグロメランス（Ｐａｎｔｏｅａ ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ））、シトロバクター・フロインジイ（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉ）、パントエア・シトレア（Ｐａｎｔｏｅａ ｃｉｔｒｅａ）、ペクトバクテリウム・カロトボルム（Ｐｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｒｏｔｏｖｏｒｕｍ）又はキサントモナス・カンペストリス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）であり得る。枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・コアギュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バチルス・サーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・ラテロスポルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ）、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチルス・ミコイデス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｙｃｏｉｄｅｓ）、バチルス・プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ）、バチルス・レンツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｅｎｔｕｓ）、バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）、及びバチルス・サーキュサンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）を含むバチルス属（ｇｅｎｕｓ Ｂａｃｉｌｌｕｓ）の細菌も使用され得る。同様に、ラクトバチルス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、ラクトバチルス・サリバリウス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ラクトバチルス・ヘルベチクス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）、ラクトバチルス・デルブリュッキイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）、ラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、ラクトバチルス・ブルガリクス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）、ラクトバチルス・クリスパツス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）、ラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ）、ラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ）、ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）、ラクトバチルス・ジェンセニイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｅｎｓｅｎｉｉ）及びラクトバチルス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）含むが、これらに限定されないラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）及びラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）の細菌は、本発明の方法を使用して操作され得る。ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ）及びプロピオニバクテリウム・フロイデンライシイ（Ｐｒｏｐｒｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ）も、本明細書に記載した本発明のための好適な細菌種である。本発明の一部として挙げられるのは、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）属（例えば、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）及びエンテロコッカス・サーモフィルス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ））、ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属（例えば、ビフィドバクテリウム・ロングム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ）、ビフィドバクテリウム・インファンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ）及びビフィドバクテリウム・ビフィドゥム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ））、スポロラクトバチルス（Ｓｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属種、ミクロモモスポラ（Ｍｉｃｒｏｍｏｍｏｓｐｏｒａ）属種、ミクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）属種、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属種及びシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属（例えば、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）及び緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ））由来の、本明細書中に記載されるように操作された菌株でもある。
【0319】
本発明によるＨＭＯの産業的組換え生成に好適な真菌宿主細胞の非限定的な例として、例えば、酵母細胞、例えばコマガタエラ・ファフィ（Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ ｐｈａｆｆｉｉ）、クルイベロマイセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）及び出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）又は糸状菌、例えばアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属種、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属種若しくはトリコデルマ（Ｔｒｉｃｏｄｅｒｍａ）属種があり、例示的な種として、クロコウジカビ（Ａ．ｎｉｇｅｒ）、Ａ．ニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）、ニホンコウジカビ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）、Ｆ．ソラニイ（Ｆ．ｓｏｌａｎｉ）、赤かび病（Ｆ．ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）及びＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）であり得る。
【0320】
１つ以上の例示的な実施形態において、遺伝的に操作された細胞は、出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）又はＰ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）である。
【0321】
１つ以上の例示的な実施形態において、遺伝的に操作された細胞は、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）である。
【0322】
１つ以上の例示的な実施形態において、遺伝的に操作された細胞は、出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である。
【0323】
１つ以上の例示的な実施形態において、遺伝的に操作された細胞は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、Ｃ．グルタミクム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、Ｌ．ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、Ｓ．リビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）、Ｐ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）、及び出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）からなる群から選択される。
【0324】
１つ以上の例示的な実施形態において、遺伝的に操作された細胞は、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、及び大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）からなる群から選択される。
【0325】
１つ以上の例示的な実施形態において、遺伝的に操作された細胞は、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）である。
【0326】
１つ以上の例示的な実施形態において、遺伝的に操作された細胞は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）である。
【0327】
１つ以上の例示的な実施形態において、本発明は、遺伝的に操作された細胞に関し、その細胞は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ－１２又はＤＥ３株に由来する。
【0328】
［核酸構築体］
本開示は、
ｉ．配列番号１若しくは配列番号２若しくは配列番号３で示される異種β－１，３－Ｎ－アセチル－グルコサミニルトランスフェラーゼタンパク質、又は配列番号１、２、若しくは３と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体、及び
ｉｉ．配列番号４若しくは配列番号５で示される異種β－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼタンパク質、又は配列番号４若しくは５と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体、及び
ｉｉｉ．配列番号６若しくは配列番号７若しくは配列番号８のいずれか１つで示される異種α－１，２－フコシルトランスフェラーゼタンパク質、又は配列番号６、７、若しくは８のいずれか１つと少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体、及び
ｉｖ．コラン酸遺伝子クラスター、
からなる群から選択される１つ以上のタンパク質をコードする組換え核酸配列を含む核酸構築体であって、
上記核酸構築体が、核酸構築体中に存在する遺伝子の発現を制御するための少なくとも１つの天然若しくは異種調節要素、即ちｉ）～ｉｖ）の１つ以上を更に含む、核酸構築体の提供について記載する。
本開示は、
ｉ．配列番号１若しくは配列番号２若しくは配列番号３で示される異種β－１，３－Ｎ－アセチル－グルコサミニルトランスフェラーゼタンパク質、又は配列番号１、２、若しくは３と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体、及び
ｉｉ．配列番号４若しくは配列番号５で示される異種β－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼタンパク質、又は配列番号４若しくは５と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体、及び
ｉｉｉ．配列番号６若しくは配列番号７若しくは配列番号８のいずれか１つで示される異種α－１，２－フコシルトランスフェラーゼタンパク質、又は配列番号６、７、若しくは８のいずれか１つと少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体、及び
ｉｖ．コラン酸遺伝子クラスター、
からなる群から選択される１つ以上のタンパク質をコードする組換え核酸配列を含む核酸構築体であって、
上記核酸構築体が、核酸構築体中に存在する遺伝子の発現を制御するための少なくとも１つの天然若しくは異種調節要素、即ちｉ）～ｉｖ）の１つ以上を更に含む、核酸構築体の提供について記載する。
【0329】
本開示の態様において、核酸構築体は、
ｉ．配列番号１若しくは配列番号２若しくは配列番号３で示される異種β－１，３－Ｎ－アセチル－グルコサミニルトランスフェラーゼタンパク質、又は配列番号１、２、若しくは３と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体と；
ｉｉ．配列番号４若しくは配列番号５で示される異種β－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼタンパク質、又は配列番号４若しくは５と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体と；
ｉｉｉ．配列番号６、７、若しくは４９で示される異種α－１，２－フコシルトランスフェラーゼタンパク質、又は配列番号６、７、若しくは４９のいずれか１つと少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体と；
ｉｖ．コラン酸遺伝子クラスターと、
ｖ．ｉ）～ｉｖ）のいずれか１つの発現を制御するための天然又は異種調節要素と、
をコードする組換え核酸配列を含む。
ｉ．配列番号１若しくは配列番号２若しくは配列番号３で示される異種β－１，３－Ｎ－アセチル－グルコサミニルトランスフェラーゼタンパク質、又は配列番号１、２、若しくは３と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体と；
ｉｉ．配列番号４若しくは配列番号５で示される異種β－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼタンパク質、又は配列番号４若しくは５と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体と；
ｉｉｉ．配列番号６、７、若しくは４９で示される異種α－１，２－フコシルトランスフェラーゼタンパク質、又は配列番号６、７、若しくは４９のいずれか１つと少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体と；
ｉｖ．コラン酸遺伝子クラスターと、
ｖ．ｉ）～ｉｖ）のいずれか１つの発現を制御するための天然又は異種調節要素と、
をコードする組換え核酸配列を含む。
【0330】
核酸構築体は、その天然のゲノム遺伝子座からのコラン酸遺伝子クラスターの機能的発現を促進する少なくとも１つの調節要素を含み得る。具体的には、コラン酸遺伝子クラスターは、コピー数を増加させることによって、及び／又は適切な調節要素を選択することによって過剰発現し得る。
【0331】
一実施形態では、調節要素は、ｌａｃオペロン又はｇｌｐオペロンのプロモータ配列に由来する組換えプロモータ配列であり、ｉ）～ｉｖ）のコーディング配列のうちの１つ以上とプロモータ配列とが作動可能に連結している。
【0332】
本発明の一実施形態は、
ｉ．配列番号１で示される異種β－１，３－Ｎ－アセチル－グルコサミニルトランスフェラーゼタンパク質、又は配列番号１少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体
ｉｉ．配列番号４で示される異種β－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼタンパク質、又は配列番号４と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体、及び
ｉｉｉ．配列番号８のいずれか１つで示される異種α－１，２－フコシルトランスフェラーゼタンパク質、又は配列番号８のいずれか１つと少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体
ｉｖ．コラン酸遺伝子クラスター
からなる群から選択される１つ以上のタンパク質をコードする組換え核酸配列を含む核酸構築体であって、
核酸構築体が、核酸構築体中に存在するｉ）～ｉｖ）の１つ以上をコードする遺伝子の発現を制御するための天然又は異種調節又はエピソーム要素を更に含む、核酸構築体である。
ｉ．配列番号１で示される異種β－１，３－Ｎ－アセチル－グルコサミニルトランスフェラーゼタンパク質、又は配列番号１少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体
ｉｉ．配列番号４で示される異種β－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼタンパク質、又は配列番号４と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体、及び
ｉｉｉ．配列番号８のいずれか１つで示される異種α－１，２－フコシルトランスフェラーゼタンパク質、又は配列番号８のいずれか１つと少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体
ｉｖ．コラン酸遺伝子クラスター
からなる群から選択される１つ以上のタンパク質をコードする組換え核酸配列を含む核酸構築体であって、
核酸構築体が、核酸構築体中に存在するｉ）～ｉｖ）の１つ以上をコードする遺伝子の発現を制御するための天然又は異種調節又はエピソーム要素を更に含む、核酸構築体である。
【0333】
核酸構築体は、組換え核酸配列であり得る。用語「組換え核酸配列」、「組換え遺伝子／核酸／ＤＮＡコーディング」、又は「コーディング核酸配列」は、互換的に使用され、適切な制御配列、即ち、プロモータ配列の制御下にある場合、ｍＲＮＡ内に転写されてタンパク質に翻訳される一連の連続的非重複トリプレット（コドン）を含む、人工的（即ち、核酸配列を作製するために標準的な実験室方法を使用してインビトロで生成される）核酸配列を意味する。
【0334】
コーディング配列の境界は、一般に、ｍＲＮＡの５’末端、翻訳開始コドン（ＡＵＧ、ＧＵＧ又はＵＵＧ）及び翻訳終止コドン（ＵＡＡ、ＵＧＡ又はＵＡＧ）でのオープンリーディングフレームのすぐ上流に配置されるリボソーム結合部位によって決定される。コーディング配列として、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成及び組換え核酸配列が挙げられ得るが、これらに限定されない。
【0335】
用語「核酸」には、ＲＮＡ、ＤＮＡ及びｃＤＮＡ分子が含まれる。遺伝コードの縮重の結果として、所与のタンパク質をコードする多数の核酸配列が生成され得ることが理解される。
【0336】
［組換え核酸配列］
組換え核酸配列は、コーディングＤＮＡ配列、例えば、遺伝子、又は非コーディングＤＮＡ配列、例えば、プロモータ配列などの調節ＤＮＡであり得る。
組換え核酸配列は、コーディングＤＮＡ配列、例えば、遺伝子、又は非コーディングＤＮＡ配列、例えば、プロモータ配列などの調節ＤＮＡであり得る。
【0337】
したがって、１つの例示された実施形態において、本発明は、核酸構築体であって、コーディング核酸配列、即ち、目的の遺伝子の組換えＤＮＡ配列、例えばフコシルトランスフェラーゼ遺伝子、及び非コーディング調節ＤＮＡ配列、例えばプロモータＤＮＡ配列、例えばｌａｃオペロン若しくはｇｌｐオペロンのプロモータに由来する組換えプロモータ配列、又は別のゲノムプロモータＤＮＡ配列に由来するプロモータ配列、或いは合成プロモータ配列を含む核酸構築体に関し、ここで、コーディング配列及びプロモータ配列は、作動可能に連結している。
【0338】
用語「作動可能に連結した」は、２つ以上の核酸（例えば、ＤＮＡ）断片間の機能的関係を指す。「作動可能に連結した」は、転写調節配列の転写配列との機能的関係を指す。例えば、プロモータ配列は、これが適切な宿主細胞又は他の発現系におけるコーディング配列の転写を刺激又は調節する場合、コーディング配列と作動可能に連結している。
【0339】
一般に、転写配列に作動可能に連結しているプロモータ配列は、転写配列に物理的に隣接しており、即ち、それらは、シス作用性である。
【0340】
１つの例示された実施形態において、本発明の核酸構築体は、ベクターＤＮＡの一部であり得、別の実施形態において、構築体は、宿主細胞のゲノム内に組み込まれている発現カセット／カートリッジである。
【0341】
したがって、用語「核酸構築体」は、ゲノムの遺伝子の発現を修飾するか、又は構築体中に含まれ得る遺伝子／コーディングＤＮＡ配列を発現させるために標的細胞、例えば細菌細胞中に「移植」されることが意図される、核酸の人工的に構築された断片、特にＤＮＡ断片を意味する。
【0342】
構築体（発現カセット）内に含まれる対象の核酸構築体の細菌ゲノム中への組込みは、従来の方法により、例えばａｔｔＴｎ７部位について記載されている、染色体上の特異的部位に相同であるフランキング配列を含有する直線状カートリッジを用いることにより（Ｗａｄｄｅｌｌ Ｃ．Ｓ．ａｎｄ Ｃｒａｉｇ Ｎ．Ｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．（１９８８）Ｆｅｂ；２（２）：１３７－４９．）；組換えがファージλのＲｅｄリコンビナーゼ機能又はＲａｃプロファージのＲｅｃＥ／ＲｅｃＴリコンビナーゼ機能によって媒介される核酸配列のゲノム組込み方法により（Ｍｕｒｐｈｙ，Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（１９９８）；１８０（８）：２０６３－７；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（１９９８）２０：１２３－１２８ Ｍｕｙｒｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｒｅｐ．（２０００）１（３）：２３９－２４３）；Ｒｅｄ／ＥＴ組換えに基づく方法により（Ｗｅｎｚｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ．（２００５），１２（３）：３４９－５６．；Ｖｅｔｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（２００５）；７１（４）：１８２９－３５）；又は陽性クローン、即ち例えばマーカー遺伝子若しくは遺伝子機能の損失若しくは獲得によって選択され得る発現カセットを有するクローンにより達成され得る。
【0343】
［遺伝的に操作された細胞の使用］
本開示は、本明細書に記載される遺伝的に操作された細胞又は核酸構築体のあらゆる商用利用にも関する。
本開示は、本明細書に記載される遺伝的に操作された細胞又は核酸構築体のあらゆる商用利用にも関する。
【0344】
したがって、１つ以上の例示的な実施形態において、本発明に従う遺伝的に操作された細胞又は核酸構築体は、１つ以上のＨＭＯの製造で使用される。１つ以上のＨＭＯは、２’－ＦＬ、ＬＮＴ－ＩＩ、ＬＮＴ、ＬＮＦＰ－Ｉ、及びＤＦＬからなる群から選択することができる。好ましい本実施形態において、１つ以上のＨＭＯは、２’－ＦＬ、ＬＮＴ－ＩＩ、ＬＮＴ、及びＬＮＦＰ－Ｉからなる群から選択される。
【0345】
１つ以上の例示的な実施形態において、遺伝的に操作された細胞及び／又は核酸構築体は、２つ以上のＨＭＯの製造で使用され、１つ以上のＨＭＯは、２’－ＦＬ、ＬＮＴ、及びＬＮＦＰ－Ｉからなる群から選択される。
【0346】
別の例示された実施形態において、本開示に従う遺伝的に操作された細胞及び／又は核酸構築体は、２つ以上ＨＭＯの製造で使用され、ＨＭＯは、２’－ＦＬ及びＬＮＦＰ－Ｉである。
【0347】
別の例示された実施形態において、本発明に従う遺伝的に操作された細胞及び／又は核酸構築体は、２つ以上ＨＭＯの製造で使用され、主要なＨＭＯブレンドは、生成される全ＨＭＯの２’－ＦＬのモル％が２５～７０％、ＬＮＦＰ－Ｉのモル％が３０％～６０％である。
【0348】
［ＨＭＯの製造］
１つ以上のＨＭＯを産生させるために、本明細書に記載の遺伝的に操作された細胞は、当該技術分野において公知の手法に従って、好適な炭素源、例えばグルコース、グリセロール、ラクトースなどの存在下で培養され、産生されたＨＭＯは、培養培地及び培養プロセス中に形成される微生物バイオマスから収集される。その後、ＨＭＯは、当該技術分野において公知の手法、例えば国際公開第２０１５／１８８８３４号パンフレット、国際公開第２０１７／１８２９６５号パンフレット又は国際公開第２０１７／１５２９１８号パンフレットに記載されるものなどの手法に従って精製され、精製されたＨＭＯは、栄養補助食品、医薬品として又は例えば研究用などの任意の他の目的に使用される。
１つ以上のＨＭＯを産生させるために、本明細書に記載の遺伝的に操作された細胞は、当該技術分野において公知の手法に従って、好適な炭素源、例えばグルコース、グリセロール、ラクトースなどの存在下で培養され、産生されたＨＭＯは、培養培地及び培養プロセス中に形成される微生物バイオマスから収集される。その後、ＨＭＯは、当該技術分野において公知の手法、例えば国際公開第２０１５／１８８８３４号パンフレット、国際公開第２０１７／１８２９６５号パンフレット又は国際公開第２０１７／１５２９１８号パンフレットに記載されるものなどの手法に従って精製され、精製されたＨＭＯは、栄養補助食品、医薬品として又は例えば研究用などの任意の他の目的に使用される。
【0349】
ＨＭＯの製造は通常、大量で培養を実施することによって行われる。本発明の意味における用語「製造する工程」及び「製造規模」は、最小体積が５Ｌの培養ブロスを用いた発酵を規定する。通常、「製造規模」プロセスは、目的の生成物を含有する大量の調製物を処理することができ、例えば、治療用化合物又は組成物の場合、臨床試験及び市場供給の需要を満たす量の目的のタンパク質を産生することができることによって規定される。大量であることに加えて、製造規模の方法は、振盪フラスコによる培養のような単純な実験室規模の方法とは対照的に、撹拌、通気、栄養素供給、プロセスパラメーター（ｐＨ、温度、溶存酸素圧、背圧など）のモニタリング及び制御のための機器を装備しているバイオリアクター（発酵槽）の技術システムの使用を特徴とする。大体において、本開示の実施例に記載される振盪フラスコ、卓上バイオリアクター又はディープウエルフォーマット等のラボスケールの方法における発現系の挙動は、バイオリアクターの複雑な環境におけるそのシステムの挙動を予測することを可能にする。
【0350】
発酵プロセスに使用される好適な細胞培地に関して、制限はない。培地は、半規定、即ち複雑な培地化合物（例えば、酵母抽出物、大豆ペプトン、カザミノ酸等）であり得るか、又はそれは、いかなる複雑な化合物も含めずに化学的に規定され得る。スクロースが炭素エネルギー源として使用される場合、最小培地の方が好ましい場合がある。
【0351】
［製造された生成物］
遺伝的に操作された細胞又は核酸構築体の使用に従う用語「製造された生成物」は、１つ以上の生成物ＨＭＯとして意図される１つ以上のＨＭＯを指す。種々の生成物は、先に記載されている。
遺伝的に操作された細胞又は核酸構築体の使用に従う用語「製造された生成物」は、１つ以上の生成物ＨＭＯとして意図される１つ以上のＨＭＯを指す。種々の生成物は、先に記載されている。
【0352】
有利には、本明細書中に開示される方法は、副生成物対生成物の比率の低下及び生成物の全収量（及び／又は総計でのＨＭＯ）の増大の両方を実現する。この生成物形成と比較して少ない副生成物形成は、生成物産生の増加を促進し、産生及び生成物回収プロセスの両方の効率を上昇させ、ＨＭＯの優れた製造手法を提供する。
【0353】
製造される生成物は、１つ以上のＨＭＯを含む粉末、組成、懸濁液又はゲルであり得る。
【0354】
［表］
【0355】
【表4】
【0356】
【表5】
【0357】
【表6】
【0358】
【表7】
【0359】
【表8】
【0360】
【表9】
【0361】
【表10】
【0362】
【表11】
【0363】
【表12】
【0364】
【表13】
【0365】
【表14】
【0366】
【表15】
【0367】
［全般］
本開示による化合物と関連させて上で論じられたいずれかの特徴及び／又は態様は、本明細書に記載される方法に類似して適用されることが理解されるべきである。
本開示による化合物と関連させて上で論じられたいずれかの特徴及び／又は態様は、本明細書に記載される方法に類似して適用されることが理解されるべきである。
【0368】
ラクト－Ｎ－トリオース、ＬＮＴ－ＩＩ、ＬＮＴ ＩＩ、ＬＮＴ２、及びＬＮＴ ２という用語は、互換的に使用される。
【0369】
以下の図面及び例は、本開示を説明するために以下に提供される。それらは、例示を意図したものであり、決して限定するものとして解釈されるべきではない。
【図面の簡単な説明】
【0370】
【図1】様々なα－１，２－フコシルトランスフェラーゼを発現する株により生成されたブレンド：（ａ）ブレンドのＨＭＯ含有量（％ｍＭ）、（ｂ）全ＨＭＯ形成（ｍＭ）。
【図2】（ａ）ｓｍｏｂ発現細胞及び（ｂ）ｆｕｔＣ発現細胞におけるコラン酸遺伝子クラスターの発現レベルを変化させたブレンドのＨＭＯ含有量（％ｍＭ）の変化、並びに対応するブレンドにおける全ＨＭＯ形成（ｍＭ）（ｃ）。
【図3】ＬＮＴ合成に必要なグリコシルトランスフェラーゼのコピー数の、株（ａ）ＭＰ１０及び（ｂ）ＭＰ１１により生成される最終ブレンドのＨＭＯ含有量（％ｍＭ）への影響
【図4】様々な異種ＭＦＳトランスポータを発現する株によって生成された最終ブレンドの全ＨＭＯ、ＬＮＦＰ－Ｉ、及び２’－ＦＬ含有量（％ｍＭ）の、そのようなトランスポータを有さない株と比較した相対変化。
【図5】ｇｌｐＲ＋／－表現型の、株（ａ）ＭＰ１９及び（ｂ）ＭＰ２０により生成される最終ブレンドのＨＭＯ含有量（％ｍＭ）への影響。
【図6】ａ～ｄ ２５℃～３２℃の６つの異なる温度における、発酵実施全体にわたる全ブロス試料中のＨＭＯブレンド組成の時間プロファイル。ＨＭＯＬ＝ＬＮＦＰ－Ｉ、２’－ＦＬ、ＬＮＴ、ＬＮＴ－ＩＩ、ＤＦＬ、及びラクトースを含むＨＭＯの合計。ＤＦＬ及びＬＮＴ－ＩＩは、ＬＮＴを下回り、典型的には、＜１ｇ／Ｌであるが示されていない。
【図7】２つの株ＭＰ１９及びＭＰ２２を用いて、高ラクトース（プロセスＬ２Ｆ２０）又は低ラクトース（プロセスＬ２Ｆ２１）のいずれかの条件の４回の試験を通した、発酵ブロス中のラクトース一水和物濃度の時間プロファイル。
【図8】２つの株ＭＰ１９及びＭＰ２２を用いて、高ラクトース（プロセスＬ２Ｆ２０）又は低ラクトース（プロセスＬ２Ｆ２１）のいずれかの条件の４回の試験を通した、発酵ブロス中のＬＮＦＰ－Ｉ／ＨＭＯ比の時間プロファイル。ＨＭＯ＝ＬＮＦＰ－Ｉ、２’－ＦＬ、ＬＮＴ、ＬＮＴ－ＩＩ、及びＤＦＬを含むＨＭＯの合計。ＤＦＬは＜０．３ｇ／Ｌである。
【図9】ａ～ｃ ２つの株ＭＰ１９及びＭＰ２２を用いて、高ラクトース（プロセスＬ２Ｆ２０）又は低ラクトース（プロセスＬ２Ｆ２１）のいずれかの条件の４回の試験を通した、発酵ブロス中の比率２’－ＦＬ／ＨＭＯ、ＬＮＴ／ＨＭＯ、及びＬＮＴ－ＩＩ／ＨＭＯの時間プロファイル。ＨＭＯ＝ＬＮＦＰ－Ｉ、２’－ＦＬ、ＬＮＴ、ＬＮＴ－ＩＩ、及びＤＦＬを含むＨＭＯの合計。ＤＦＬは＜０．３ｇ／Ｌである。
【図10】ＭＦＳトランスポータを発現しないｓｍｏｂ発現細胞（ＭＰ８株）及びｎｅｃ（ＭＰ２３及びＭＰ２５株）又はｙｂｅｒＣ（ＭＰ２４株）遺伝子のゲノムコピーを有するｓｍｏｂ発現細胞の培養上清で検出されたＬＮＦＰ－Ｉ画分（全ＬＮＦＰ－Ｉの％）。
【図11】ＭＦＳトランスポータを発現しないｓｍｏｂ発現細胞（ＭＰ８株）及びｎｅｃ（ＭＰ２３及びＭＰ２５株）又はｙｂｅｒＣ（ＭＰ２４株）遺伝子のゲノムコピーを発現する細胞についての最終ＨＭＯブレンドにおけるＬＮＦＰ－Ｉ対２’－ＦＬの比率。
【図12】ラクトースから、それぞれ、ＬＮＦＰ－Ｉ及び２’－ＦＬを産生するための経路。２’ＦＬは、ラクトースにフコースを付加する酵素α－１，２－フコシルトランスフェラーゼ（α－１，２－ｆｔ）の存在下でラクトースから単一工程で産生される。ＬＮＦＰ－Ｉの産生は、３工程プロセスであり、そこではβ－１，３－Ｎ－アセチル－グルコサミニルトランスフェラーゼ（β－１，３－ＧｌｃＮａｃＴ）がＮ－アセチルグルコサミンをラクトースに付加してＬＮＴ－ＩＩを形成し、そこにβ－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼ（β－１，３－ＧａｌＴ）はガラクトースを付加してＬＮＴを形成し、その上にα－１，２－フコシルトランスフェラーゼ（α－１，２－ｆｔ）はフコースを付加してＬＮＦＰ－Ｉを形成する。実施例１で示すように、様々なα－１，２－フコシルトランスフェラーゼは、異なる基質特異性を有していてもよく、つまり、ＦｕｔＣはラクトースに対してより高い特異性を有していても良く、そこでｓｍｏｂは基質としてのＬＮＴに対してより高い特異性を有するようである。
【0371】
［配列番号］
本出願は、テキスト形式及び電子形式の配列表を含み、優先権出願ＤＫ ＰＡ ２０２１ ７０２４７の修正配列リストに列挙されている配列と同様に、参照により本明細書に組み込まれる。以下に配列をまとめる。
本出願は、テキスト形式及び電子形式の配列表を含み、優先権出願ＤＫ ＰＡ ２０２１ ７０２４７の修正配列リストに列挙されている配列と同様に、参照により本明細書に組み込まれる。以下に配列をまとめる。
【0372】
配列番号１［ｌｇｔＡタンパク質－β－１，３－Ｎ－アセチル－グルコサミニルトランスフェラーゼ］
配列番号２［ＰｍｎａｇＴタンパク質－β－１，３－Ｎ－アセチル－グルコサミニルトランスフェラーゼ］
配列番号３［ＨＤ０４６６－β－１，３－Ｎ－アセチル－グルコサミニルトランスフェラーゼ］
配列番号４［ｇａｌＴＫ－β－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼ］
配列番号５［ｃｖｂ３ｇａｌＴ－β－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼ］
配列番号６［ｆｕｔＣ－α－１，２－フコシルトランスフェラーゼ］
配列番号７［ｍｔｕｎ－ α－１，２－フコシルトランスフェラーゼ］
配列番号８［ｓｍｏｂ－ α－１，２－フコシルトランスフェラーゼ］
配列番号９［ｐｍｇｌＢ＿７０ＵＴＲ］
配列番号１０［ｐｍｇｌＢ＿７０ＵＴＲ＿ＳＤ４］
配列番号１１［Ｐｓｃｒ］
配列番号１２［ＰｇａｔＹ＿７０ＵＴＲ］
配列番号１３［ＰｇｌｐＦ］
配列番号１４［ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ１］
配列番号１５［ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ１０］
配列番号１６［ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ２］
配列番号１７［ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ３］
配列番号１８［ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ４］
配列番号１９［ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ５］
配列番号２０［ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ６］
配列番号２１［ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ７］
配列番号２２［ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ８］
配列番号２３［ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ９］
配列番号２４［ＰｇｌｐＦ＿Ｂ２８］
配列番号２５［ＰｇｌｐＦ＿Ｂ２９］
配列番号２６［Ｐｌａｃ＿１６ＵＴＲ］
配列番号２７［Ｐｌａｃ］
配列番号２８［Ｂａｄ］
配列番号２９［Ｎｅｃ］
配列番号３０［ＹｂｅｒＣ］
配列番号３１［Ｆｒｅｄ］
配列番号３２［Ｖａｇ］
配列番号３３［Ｍａｒｃ］
配列番号３４［ＳｃｒＹ］
配列番号３５［ＳｃｒＡ］
配列番号３６［ＳｃｒＢ ＣＡＡ４７９７４．１］
配列番号３７［ＳｃｒＲ］
配列番号３８［ＳａｃＣ＿ＡｇａＩ］
配列番号３９［Ｂｆｆ］
配列番号４０［ｌｇｔａ遺伝子］
配列番号４１［ＰｍｎａｇＴ遺伝子］
配列番号４２［ＨＤ０４６６遺伝子］
配列番号４３［ｇａｌｔｋ遺伝子］
配列番号４４［ｃｖｂ３ｇａｌＴ］
配列番号４５［α－１，２－フコシルトランスフェラーゼをコードするｆｕｔＣ遺伝子］
配列番号４６［α－１，２－フコシルトランスフェラーゼをコードするｍｔｕｎ遺伝子］
配列番号４７［α－１，２－フコシルトランスフェラーゼをコードするｓｍｏｂ遺伝子］
配列番号４８［ＤＮＡ結合転写リプレッサＧｌｐＲ］
配列番号４９［ｆｕｃＴ５４ α－１，２－フコシルトランスフェラーゼ］
配列番号５０オリゴＯ４８、ｇａｌＫ．ｆｏｒ
配列番号５１オリゴＯ４９、ｇａｌＫ．ｒｅｖ
配列番号５２ ＣＡ遺伝子クラスター
配列番号２［ＰｍｎａｇＴタンパク質－β－１，３－Ｎ－アセチル－グルコサミニルトランスフェラーゼ］
配列番号３［ＨＤ０４６６－β－１，３－Ｎ－アセチル－グルコサミニルトランスフェラーゼ］
配列番号４［ｇａｌＴＫ－β－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼ］
配列番号５［ｃｖｂ３ｇａｌＴ－β－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼ］
配列番号６［ｆｕｔＣ－α－１，２－フコシルトランスフェラーゼ］
配列番号７［ｍｔｕｎ－ α－１，２－フコシルトランスフェラーゼ］
配列番号８［ｓｍｏｂ－ α－１，２－フコシルトランスフェラーゼ］
配列番号９［ｐｍｇｌＢ＿７０ＵＴＲ］
配列番号１０［ｐｍｇｌＢ＿７０ＵＴＲ＿ＳＤ４］
配列番号１１［Ｐｓｃｒ］
配列番号１２［ＰｇａｔＹ＿７０ＵＴＲ］
配列番号１３［ＰｇｌｐＦ］
配列番号１４［ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ１］
配列番号１５［ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ１０］
配列番号１６［ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ２］
配列番号１７［ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ３］
配列番号１８［ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ４］
配列番号１９［ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ５］
配列番号２０［ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ６］
配列番号２１［ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ７］
配列番号２２［ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ８］
配列番号２３［ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ９］
配列番号２４［ＰｇｌｐＦ＿Ｂ２８］
配列番号２５［ＰｇｌｐＦ＿Ｂ２９］
配列番号２６［Ｐｌａｃ＿１６ＵＴＲ］
配列番号２７［Ｐｌａｃ］
配列番号２８［Ｂａｄ］
配列番号２９［Ｎｅｃ］
配列番号３０［ＹｂｅｒＣ］
配列番号３１［Ｆｒｅｄ］
配列番号３２［Ｖａｇ］
配列番号３３［Ｍａｒｃ］
配列番号３４［ＳｃｒＹ］
配列番号３５［ＳｃｒＡ］
配列番号３６［ＳｃｒＢ ＣＡＡ４７９７４．１］
配列番号３７［ＳｃｒＲ］
配列番号３８［ＳａｃＣ＿ＡｇａＩ］
配列番号３９［Ｂｆｆ］
配列番号４０［ｌｇｔａ遺伝子］
配列番号４１［ＰｍｎａｇＴ遺伝子］
配列番号４２［ＨＤ０４６６遺伝子］
配列番号４３［ｇａｌｔｋ遺伝子］
配列番号４４［ｃｖｂ３ｇａｌＴ］
配列番号４５［α－１，２－フコシルトランスフェラーゼをコードするｆｕｔＣ遺伝子］
配列番号４６［α－１，２－フコシルトランスフェラーゼをコードするｍｔｕｎ遺伝子］
配列番号４７［α－１，２－フコシルトランスフェラーゼをコードするｓｍｏｂ遺伝子］
配列番号４８［ＤＮＡ結合転写リプレッサＧｌｐＲ］
配列番号４９［ｆｕｃＴ５４ α－１，２－フコシルトランスフェラーゼ］
配列番号５０オリゴＯ４８、ｇａｌＫ．ｆｏｒ
配列番号５１オリゴＯ４９、ｇａｌＫ．ｒｅｖ
配列番号５２ ＣＡ遺伝子クラスター
【0373】
［項目］
１．主要なＨＭＯとしてＬＮＦＰ－Ｉ及び２’－ＦＬを有するヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）ブレンドを生成するための方法であって、
ａ）ＨＭＯを産生することができる遺伝的に操作された細胞を準備する工程であって、上記細胞が、
ｉ）配列番号１若しくは２若しくは３で示される異種β－１，３－Ｎ－アセチル－グルコサミニルトランスフェラーゼタンパク質、又は配列番号１若しくは２若しくは３と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体を含み；且つ
ｉｉ）配列番号４若しくは５で示される異種β－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼタンパク質、又は配列番号４若しくは５と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体を含み；且つ
ｉｉｉ）配列番号６若しくは７若しくは４９若しくは８のいずれか１つで示される異種α－１，２－フコシルトランスフェラーゼタンパク質、又は配列番号６若しくは７若しくは４９若しくは８のいずれか１つと少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有するその機能的相同体を含み；且つ
ｉｖ）コラン酸遺伝子クラスターを機能的に発現し、且つ
ｖ）ｉ）～ｉｖ）のいずれか１つの発現を制御するための天然又は異種調節要素を含む工程と、
ｂ）好適な細胞培養培地で（ａ）に従って細胞を培養し、上記タンパク質を発現し、ＨＭＯブレンドを生成する工程と、
ｃ）工程（ｂ）で生成されたヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）ブレンドを収集する工程と、を含む方法。
１．主要なＨＭＯとしてＬＮＦＰ－Ｉ及び２’－ＦＬを有するヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）ブレンドを生成するための方法であって、
ａ）ＨＭＯを産生することができる遺伝的に操作された細胞を準備する工程であって、上記細胞が、
ｉ）配列番号１若しくは２若しくは３で示される異種β－１，３－Ｎ－アセチル－グルコサミニルトランスフェラーゼタンパク質、又は配列番号１若しくは２若しくは３と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体を含み；且つ
ｉｉ）配列番号４若しくは５で示される異種β－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼタンパク質、又は配列番号４若しくは５と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体を含み；且つ
ｉｉｉ）配列番号６若しくは７若しくは４９若しくは８のいずれか１つで示される異種α－１，２－フコシルトランスフェラーゼタンパク質、又は配列番号６若しくは７若しくは４９若しくは８のいずれか１つと少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有するその機能的相同体を含み；且つ
ｉｖ）コラン酸遺伝子クラスターを機能的に発現し、且つ
ｖ）ｉ）～ｉｖ）のいずれか１つの発現を制御するための天然又は異種調節要素を含む工程と、
ｂ）好適な細胞培養培地で（ａ）に従って細胞を培養し、上記タンパク質を発現し、ＨＭＯブレンドを生成する工程と、
ｃ）工程（ｂ）で生成されたヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）ブレンドを収集する工程と、を含む方法。
【0374】
２．ｉ）、ｉｉ）、及びｉｉｉ）のタンパク質の過剰発現が、上記タンパク質をコードする遺伝子のコピー数を増加させることによって、及び／又はｉｖ）のコラン酸（ｃｏｌｏｎｉｃ ａｃｉｄ）遺伝子クラスターに適切な調節要素を選択することによって提供される、項目１に記載の方法。
【0375】
３．ｉｖ）のコラン酸遺伝子クラスターの発現が、天然プロモータを目的のプロモータと交換すること、及び／又は別のゲノム遺伝子座から遺伝子クラスターを発現することにより上記タンパク質をコードするコラン酸遺伝子のコピー数を増加させること、又はコラン酸遺伝子クラスターをエピソーム的に発現することにより調節される、項目１又は２に記載の方法。
【0376】
４．異種調節要素が、配列番号１３（ＰｇｌｐＦ）、配列番号１２（ＰｇａｔＹ＿７０ＵＴＲ）、配列番号２７（Ｐｌａｃ）、配列番号９（ＰｍｇｌＢ＿７０ＵＴＲ）、配列番号１１（Ｐｓｃｒ）、又はこれらのバリアントからなるプロモータの群から選択される、項目１～３のいずれか１つに記載の方法。
【0377】
５．異種調節要素が、ＰＢＡＤ、Ｐｘｙｌ、ＰｓａｃＢ、ＰｘｙｌＡ、ＰｒｐＲ、ＰｎｉｔＡ、ＰＴ７、Ｐｔａｃ、ＰＬ、ＰＲ、ＰｎｉｓＡ、Ｐｂ、Ｐｓｃｒ、ＰｇａｔＹ＿７０ＵＴＲ、ＰｇｌｐＦ、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ１、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ１０、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ２、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ３、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ４、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ５、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ６、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ７、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ８、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ９、ＰｇｌｐＦ＿Ｂ２８、Ｐｌａｃ＿１６ＵＴＲ、Ｐｌａｃ、ＰｍｇｌＢ＿７０ＵＴＲ、及びＰｍｇｌＢ＿７０ＵＴＲ＿ＳＤ４からなる群から選択される、項目１～４のいずれか１つに記載の方法。
【0378】
６．異種調節要素が、ＰｇｌｐＦ、Ｐｓｃｒ、Ｐｌａｃ、ＰｇｌｐＦ＿Ｂ２９、及びＰｇｌｐＦ＿Ｂ２８からなる群から選択される、項目１～５のいずれか１つに記載の方法。
【0379】
７．ｉ）及びｉｉ）の発現が、単一コピーから得られる、並びに／又はｉ）及びｉｉ）の発現のための調節要素が、低い又は中間の強度を有する、項目１～６のいずれか１つに記載の方法。
【0380】
８．調節要素が、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ９（配列番号２３）、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ７（配列番号２１）、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ６（配列番号２０）、ＰｇｌｐＦ＿Ｂ２８（配列番号２４）、ＰｇｌｐＦ＿Ｂ２９（配列番号２５）、Ｐｓｃｒ（配列番号１１）、及びＰｌａｃ（配列番号２７）からなる群から選択される、項目７に記載の方法。
【0381】
９．調節要素が、強い調節要素である、項目１～８のいずれか１つに記載の方法。
【0382】
１０．調節要素が、ＰｇｌｐＦ（配列番号１３）、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ１０（配列番号１５）、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ８（配列番号２２）、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ５（配列番号１９）、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ４（配列番号１８）、ＰｇａｔＹ＿７０ＵＴＲ（配列番号１２）、ＰｍｇｌＢ＿７０ＵＴＲ（配列番号９）、及びＰｍｇｌＢ＿７０ＵＴＲ＿ＳＤ４（配列番号９）からなる群から選択される、項目９に記載の方法。
【0383】
１１．異種β－１，３－Ｎ－アセチル－グルコサミニルトランスフェラーゼタンパク質が、配列番号１又は配列番号１と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体である、項目１～１０のいずれか１つに記載の方法。
【0384】
１２．異種β－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼタンパク質が、配列番号４又は配列番号４と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体である、項目１～１１のいずれか１つに記載の方法。
【0385】
１３．ｉｖ）のコラン酸（ｃｏｌｏｎｉｃ ａｃｉｄ）遺伝子クラスターの発現が、天然プロモータを目的のプロモータと交換すること、及び／又は別の遺伝子座からの遺伝子クラスターを発現すること若しくはコラン酸（ｃｏｌｏｎｉｃ ａｃｉｄ）遺伝子クラスターをエピソーム的に発現することにより上記タンパク質をコードするコラン酸遺伝子のコピー数を増加させることによって調節され、異種α－１，２－フコシルトランスフェラーゼタンパク質が、配列番号６若しくは８又は配列番号６若しくは８のいずれか１つと少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体である、項目１～１２のいずれか１つに記載の方法。
【0386】
１４．ｉ）及びｉｉ）のタンパク質の過剰発現が、上記タンパク質をコードする遺伝子のコピー数の同時増加によって提供され、異種α－１，２－フコシルトランスフェラーゼタンパク質が、配列番号６又は配列番号６のいずれか１つと少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体である、項目１～１３のいずれか１つに記載の方法。
【0387】
１５．ＨＭＯブレンドが、モル％で２５％～７０％の２’－ＦＬ、及び３０％～６０％のＬＮＦＰ－Ｉを有する、項目１～１４のいずれか１つに記載の方法。
【0388】
１６．生成されたＨＭＯブレンド中の２’－ＦＬのモル％が、３０％～７０％、例えば４０％～５５％、例えば５０％～７０％である、項目１３又は１４に記載の方法。
【0389】
１７．ＬＮＦＰ－Ｉのモル％が、３０％～６０％、例えば４０％～５５％、例えば３０％～４５％である、項目１３又は１４に記載の方法。
【0390】
１８．異種α－１，２－フコシルトランスフェラーゼタンパク質が、配列番号７若しくは４９又は配列番号７若しくは４９のいずれか１つと少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体である、項目１～１２のいずれか１つに記載の方法。
【0391】
１９．生成されたＨＭＯブレンド中の２’－ＦＬのモル％が、４０％～６０％、例えば４５％～５５％である、項目１８に記載の方法。
【0392】
２０．ＬＮＦＰ－Ｉのモル％が、４０％～６０％、例えば４０％～５５％である、項目１８に記載の方法。
【0393】
２１．ｖ）又はｖ）の上流の領域に結合し、ｉ）～ｉｖ）のいずれか１つの発現を抑制する遺伝子産物が、細胞において欠失しているか又は機能せず、異種α－１，２－フコシルトランスフェラーゼタンパク質が、配列番号６である、項目１～２０のいずれか１つの記載の方法。
【0394】
２２．上記遺伝子産物が、ＤＮＡ結合転写リプレッサＧｌｐＲである、項目２１に記載の方法。
【0395】
２３．細胞が、糖排出トランスポータとして機能する遺伝子産物を更に含む、項目１～２２のいずれか１つに記載の方法。
【0396】
２４．糖排出トランスポータが、Ｂａｄ、Ｎｅｃ、ＹｂｅｒＣ、Ｆｒｅｄ、Ｖａｇ、及びＭａｒｃからなる群から選択される、項目２３に記載の方法。
【0397】
２５．糖排出トランスポータが、
ｉ）配列番号２８又は配列番号２８と少なくとも７０％同一、例えば少なくとも８０％同一、例えば少なくとも８５％同一、例えば少なくとも９０％同一、例えば少なくとも９５％同一、若しくは例えば少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を有する機能的相同体
ｉｉ）配列番号２９又は配列番号２９と少なくとも７０％同一、例えば少なくとも８０％同一、例えば少なくとも８５％同一、例えば少なくとも９０％同一、例えば少なくとも９５％同一、若しくは例えば少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を有する機能的相同体
ｉｉｉ）配列番号３０又は配列番号３０と少なくとも７０％同一、例えば少なくとも８０％同一、例えば少なくとも８５％同一、例えば少なくとも９０％同一、例えば少なくとも９５％同一、若しくは例えば少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を有する機能的相同体
ｉｖ）配列番号３１又は配列番号３１と少なくとも７０％同一、例えば少なくとも８０％同一、例えば少なくとも８５％同一、例えば少なくとも９０％同一、例えば少なくとも９５％同一、若しくは例えば少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を有する機能的相同体
ｖ）配列番号３２又は配列番号３２と少なくとも７０％同一、例えば少なくとも８０％同一、例えば少なくとも８５％同一、例えば少なくとも９０％同一、例えば少なくとも９５％同一、若しくは例えば少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を有する機能的相同体、及び
ｖｉ）配列番号３３又は配列番号３３と少なくとも７０％同一、例えば少なくとも８０％同一、例えば少なくとも８５％同一、例えば少なくとも９０％同一、例えば少なくとも９５％同一、若しくは例えば少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を有する機能的相同体
から選択されるアミノ酸配列からなる群から選択される、項目２４に記載の方法。
ｉ）配列番号２８又は配列番号２８と少なくとも７０％同一、例えば少なくとも８０％同一、例えば少なくとも８５％同一、例えば少なくとも９０％同一、例えば少なくとも９５％同一、若しくは例えば少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を有する機能的相同体
ｉｉ）配列番号２９又は配列番号２９と少なくとも７０％同一、例えば少なくとも８０％同一、例えば少なくとも８５％同一、例えば少なくとも９０％同一、例えば少なくとも９５％同一、若しくは例えば少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を有する機能的相同体
ｉｉｉ）配列番号３０又は配列番号３０と少なくとも７０％同一、例えば少なくとも８０％同一、例えば少なくとも８５％同一、例えば少なくとも９０％同一、例えば少なくとも９５％同一、若しくは例えば少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を有する機能的相同体
ｉｖ）配列番号３１又は配列番号３１と少なくとも７０％同一、例えば少なくとも８０％同一、例えば少なくとも８５％同一、例えば少なくとも９０％同一、例えば少なくとも９５％同一、若しくは例えば少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を有する機能的相同体
ｖ）配列番号３２又は配列番号３２と少なくとも７０％同一、例えば少なくとも８０％同一、例えば少なくとも８５％同一、例えば少なくとも９０％同一、例えば少なくとも９５％同一、若しくは例えば少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を有する機能的相同体、及び
ｖｉ）配列番号３３又は配列番号３３と少なくとも７０％同一、例えば少なくとも８０％同一、例えば少なくとも８５％同一、例えば少なくとも９０％同一、例えば少なくとも９５％同一、若しくは例えば少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を有する機能的相同体
から選択されるアミノ酸配列からなる群から選択される、項目２４に記載の方法。
【0398】
２６．糖排出トランスポータが、好ましくは、Ｎｅｃ又はＹｂｅｒＣである、項目２４又は２５に記載の方法。
【0399】
２７．異種α－１，２－フコシルトランスフェラーゼタンパク質が、配列番号６［ｆｕｔＣ］若しくは配列番号７［ｍｔｕｎ］若しくは配列番号４９［ＦｕｃＴ５４］又は配列番号６、７、若しくは４８のいずれか１つと少なくとも８０％のアミノ酸配列を有する機能的相同体である、項目２６に記載の方法。
【0400】
２８．生成されたＨＭＯブレンド中の２’－ＦＬのモル％が、３０％～７０％、例えば４０％～５５％、例えば５０％～６０％である、項目２７に記載の方法。
【0401】
２９．工程（ｂ）で遺伝的に操作された細胞の培養中発酵温度が、調節されている、項目１～２８のいずれか１つに記載の方法。
【0402】
３０．２’－ＦＬ／ＨＭＯＬ比が、発酵温度の上昇に比例して増加し、発酵温度が、２５～３４℃、好ましくは３０～３２℃である、項目２９に記載の方法。
【0403】
３１．工程（ｂ）で遺伝的に操作された細胞の培養中発酵温度が、２５～３４℃であり、２’－ＦＬのモル％が、生成されたＨＭＯブレンドの１５％～４０％である、項目２９に記載の方法。
【0404】
３２．異種α－１，２－フコシルトランスフェラーゼタンパク質が、配列番号６［ｆｕｔＣ］である、項目３０に記載の方法。
【0405】
３３．ＬＮＴ／ＨＭＯＬ比が、発酵温度の上昇に比例して減少する、項目２９又は３０に記載の方法。
【0406】
３４．工程（ｂ）で遺伝的に操作された細胞の培養中ラクトースレベルが、調節されている、項目１～３３のいずれか１つに記載の方法。
【0407】
３５．低ラクトースレベル、例えば２０ｇ／Ｌ未満、好ましくは１５ｇ／Ｌ未満、例えば０．５～１５ｇ／Ｌ、好ましくは１０ｇ／Ｌ未満、例えば１～１０ｇ／ＬのＨＭＯ生成物プロファイルが、ＬＮＦＰ－Ｉ＞２’－ＦＬ＞ＬＮＴ＞ＬＮＴ－ＩＩである、項目３４に記載の方法。
【0408】
３６．高ラクトースレベル、例えば発酵の最初の４０時間で３０～８０ｇ／ＬのＨＭＯ生成物プロファイルが、ＬＮＦＰ－Ｉ＞ＬＮＴ＞ＬＮＴ－ＩＩ＞２’－ＦＬである、項目３４に記載の方法。
【0409】
３７．上記遺伝的に操作された細胞が、１つ以上の異種ポリペプチドをコードする１つ以上の異種核酸配列を含み、これが、上記遺伝的に操作された細胞の唯一の炭素エネルギー源としてのスクロースの利用を可能にする、項目１～３６のいずれか１つに記載の方法。
【0410】
３８．スクロース利用系が、配列番号３８［ＳａｃＣ＿Ａｇａｌ、グリコシドヒドロラーゼファミリー３２タンパク質、ＷＰ＿１０３８５３２１０．１９Ｑ ＩＤ ＮＯ：及び３９［Ｂｆｆ、β－フルクトフラノシダーゼタンパク質、ＢＡＤ１８１２１．１］、又は配列番号３８若しくは３９のいずれか１つと少なくとも８０％のアミノ酸配列を有する配列番号１１及び１２のいずれか１つの機能的相同体からなる群から選択される、スクロースをフルクトース及びグルコースへ加水分解することができるポリペプチドである、項目３７に記載の方法。
【0411】
３９．遺伝的に操作された細胞であって、
ｉ）配列番号１若しくは２若しくは３で示される異種β－１，３－Ｎ－アセチル－グルコサミニルトランスフェラーゼタンパク質、又は配列番号１～３と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体と、
ｉｉ）配列番号４若しくは５で示される異種β－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼタンパク質、又は配列番号４～５と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体と、
ｉｉｉ）配列番号６若しくは７若しくは８のいずれか１つで示される異種α－１，２－フコシルトランスフェラーゼタンパク質、又は配列番号６～８のいずれか１つと少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有するその機能的相同体と、
ｉｖ）コラン酸遺伝子クラスターと、
ｖ）ｉ）～ｉｖ）のいずれか１つの発現を制御するための天然又は異種調節要素と、
をコードする組換え核酸配列を含む、遺伝的に操作された細胞。
ｉ）配列番号１若しくは２若しくは３で示される異種β－１，３－Ｎ－アセチル－グルコサミニルトランスフェラーゼタンパク質、又は配列番号１～３と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体と、
ｉｉ）配列番号４若しくは５で示される異種β－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼタンパク質、又は配列番号４～５と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体と、
ｉｉｉ）配列番号６若しくは７若しくは８のいずれか１つで示される異種α－１，２－フコシルトランスフェラーゼタンパク質、又は配列番号６～８のいずれか１つと少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有するその機能的相同体と、
ｉｖ）コラン酸遺伝子クラスターと、
ｖ）ｉ）～ｉｖ）のいずれか１つの発現を制御するための天然又は異種調節要素と、
をコードする組換え核酸配列を含む、遺伝的に操作された細胞。
【0412】
４０．２’ＦＬ及び／又はＬＮＦＰ－Ｉを細胞外に輸送することができる糖排出トランスポータをコードする組換え核酸配列を更に含む、項目３９に記載の遺伝的に操作された細胞。
【0413】
４１．糖排出トランスポータをコードする組換え核酸配列が
ｉ）配列番号２８をコードする核酸配列又は配列番号２８と少なくとも７０％同一、例えば少なくとも８０％同一、例えば少なくとも８５％同一、例えば少なくとも９０％同一、例えば少なくとも９５％同一、若しくは例えば少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を有する機能的相同体、
ｉｉ）配列番号２９をコードする核酸配列又は配列番号２９と少なくとも７０％同一、例えば少なくとも８０％同一、例えば少なくとも８５％同一、例えば少なくとも９０％同一、例えば少なくとも９５％同一、若しくは例えば少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を有する機能的相同体、
ｉｉｉ）配列番号３０をコードする核酸配列又は配列番号３０と少なくとも７０％同一、例えば少なくとも８０％同一、例えば少なくとも８５％同一、例えば少なくとも９０％同一、例えば少なくとも９５％同一、若しくは例えば少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を有する機能的相同体、
ｉｖ）配列番号３１をコードする核酸配列又は配列番号３１と少なくとも７０％同一、例えば少なくとも８０％同一、例えば少なくとも８５％同一、例えば少なくとも９０％同一、例えば少なくとも９５％同一、若しくは例えば少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を有する機能的相同体、
ｖ）配列番号３２をコードする核酸配列又は配列番号３２と少なくとも７０％同一、例えば少なくとも８０％同一、例えば少なくとも８５％同一、例えば少なくとも９０％同一、例えば少なくとも９５％同一、若しくは例えば少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を有する機能的相同体、及び
ｖｉ）配列番号３３をコードする核酸配列又は配列番号３３と少なくとも７０％同一、例えば少なくとも８０％同一、例えば少なくとも８５％同一、例えば少なくとも９０％同一、例えば少なくとも９５％同一、若しくは例えば少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を有する機能的相同体
からなる群から選択される、項目４０に記載の遺伝的に操作された細胞。
ｉ）配列番号２８をコードする核酸配列又は配列番号２８と少なくとも７０％同一、例えば少なくとも８０％同一、例えば少なくとも８５％同一、例えば少なくとも９０％同一、例えば少なくとも９５％同一、若しくは例えば少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を有する機能的相同体、
ｉｉ）配列番号２９をコードする核酸配列又は配列番号２９と少なくとも７０％同一、例えば少なくとも８０％同一、例えば少なくとも８５％同一、例えば少なくとも９０％同一、例えば少なくとも９５％同一、若しくは例えば少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を有する機能的相同体、
ｉｉｉ）配列番号３０をコードする核酸配列又は配列番号３０と少なくとも７０％同一、例えば少なくとも８０％同一、例えば少なくとも８５％同一、例えば少なくとも９０％同一、例えば少なくとも９５％同一、若しくは例えば少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を有する機能的相同体、
ｉｖ）配列番号３１をコードする核酸配列又は配列番号３１と少なくとも７０％同一、例えば少なくとも８０％同一、例えば少なくとも８５％同一、例えば少なくとも９０％同一、例えば少なくとも９５％同一、若しくは例えば少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を有する機能的相同体、
ｖ）配列番号３２をコードする核酸配列又は配列番号３２と少なくとも７０％同一、例えば少なくとも８０％同一、例えば少なくとも８５％同一、例えば少なくとも９０％同一、例えば少なくとも９５％同一、若しくは例えば少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を有する機能的相同体、及び
ｖｉ）配列番号３３をコードする核酸配列又は配列番号３３と少なくとも７０％同一、例えば少なくとも８０％同一、例えば少なくとも８５％同一、例えば少なくとも９０％同一、例えば少なくとも９５％同一、若しくは例えば少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を有する機能的相同体
からなる群から選択される、項目４０に記載の遺伝的に操作された細胞。
【0414】
４２．コラン酸遺伝子クラスターが、コピー数を増加させることによって、及び／又は適切な調節要素を選択することによって過剰発現される、項目３９～４１のいずれか１つに記載の遺伝的に操作された細胞。
【0415】
４３．異種β－１，３－Ｎ－アセチル－グルコサミニルトランスフェラーゼタンパク質が、配列番号１又は配列番号１と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体である、項目３９又は４０に記載の遺伝的に操作された細胞。
【0416】
４４．異種β－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼタンパク質が、配列番号４又は配列番号４と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体である、項目３９～４３のいずれか１つに記載の遺伝的に操作された細胞。
【0417】
４５．異種α－１，２－フコシルトランスフェラーゼタンパク質が、配列番号６又は配列番号６と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体である、項目３９～４４のいずれか１つに記載の遺伝的に操作された細胞。
【0418】
４６．異種α－１，２－フコシルトランスフェラーゼタンパク質が、配列番号７若しくは４９、又は配列番号７若しくは４９と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体である、項目３９～４４のいずれか１つに記載の遺伝的に操作された細胞。
【0419】
４７．
ｉ）配列番号１若しくは２若しくは３で示される異種β－１，３－Ｎ－アセチル－グルコサミニルトランスフェラーゼタンパク質、又は配列番号１～３と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体、及び
ｉｉ）配列番号４若しくは５で示される異種β－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼタンパク質、又は配列番号４～５と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体、及び
ｉｉｉ）配列番号６若しくは７若しくは８のいずれか１つで示される異種α－１，２－フコシルトランスフェラーゼタンパク質、又は配列番号６～８のいずれか１つと少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体、及び
ｉｖ）コラン酸遺伝子クラスター
からなる群から選択される、タンパク質の１つ以上をコードする組換え核酸配列を含む核酸構築体であって、
上記核酸構築体が、核酸構築体中に存在する遺伝子の発現を制御するための少なくとも１つの天然若しくは異種調節要素又はエピソーム要素、即ちｉ）～ｉｖ）の１つ以上を更に含む、核酸構築体。
ｉ）配列番号１若しくは２若しくは３で示される異種β－１，３－Ｎ－アセチル－グルコサミニルトランスフェラーゼタンパク質、又は配列番号１～３と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体、及び
ｉｉ）配列番号４若しくは５で示される異種β－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼタンパク質、又は配列番号４～５と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体、及び
ｉｉｉ）配列番号６若しくは７若しくは８のいずれか１つで示される異種α－１，２－フコシルトランスフェラーゼタンパク質、又は配列番号６～８のいずれか１つと少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するその機能的相同体、及び
ｉｖ）コラン酸遺伝子クラスター
からなる群から選択される、タンパク質の１つ以上をコードする組換え核酸配列を含む核酸構築体であって、
上記核酸構築体が、核酸構築体中に存在する遺伝子の発現を制御するための少なくとも１つの天然若しくは異種調節要素又はエピソーム要素、即ちｉ）～ｉｖ）の１つ以上を更に含む、核酸構築体。
【0420】
４８．調節要素が、ｌａｃオペロン又はｇｌｐオペロンのプロモータ配列に由来する組換えプロモータ配列であり、ｉ）～ｉｖ）のコーディング配列のうちの１つ以上とプロモータ配列とが作動可能に連結している、項目４７に記載の核酸構築体。
【0421】
４９．ＨＭＯブレンドの生成における、項目４０若しくは４１に記載の遺伝的に操作された細胞、又は項目４７若しくは４８に記載の核酸構築体の使用。
【0422】
５０．ＨＭＯブレンドが、２’－ＦＬ、ＬＮＴ－ＩＩ、ＬＮＴ、ＬＮＦＰ－Ｉ、及びＤＦＬからなる群から選択されるＨＭＯを含む、項目４９に記載の使用。
【0423】
５１．ＨＭＯブレンドが、２’－ＦＬ及びＬＮＦＰ－Ｉを含有する、項目４９又は５０に記載の使用。
【0424】
５２．ＨＭＯブレンドが、全ＨＭＯのモル％の３０～６０％のＬＮＦＰ－Ｉ、及び３０～７０％の２’－ＦＬを有する、項目４９～５１のいずれか１つに記載の使用。
【0425】
［実施例］
［材料及び方法］
［株の構築］
以下の実施例で使用される株のバックグラウンド株として、細菌株ＭＤＯを使用した。ＭＤＯは、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｋ－１２ ＤＨ１からの構築体である。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ－１２ ＤＨ１の遺伝子型は、Ｆ－、λ－、ｇｙｒＡ９６、ｒｅｃＡ１、ｒｅｌＡ１、ｅｎｄＡ１、ｔｈｉ－１、ｈｓｄＲ１７、ｓｕｐＥ４４である。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ－１２ ＤＨ１に加えて、遺伝子型ＭＤＯは、以下の改変：ｌａｃＺ：１．５ｋｂｐの欠失、ｌａｃＡ：０．５ｋｂｐの欠失、ｎａｎＫＥＴＡ：３．３ｋｂｐの欠失、ｍｅｌＡ：０．９ｋｂｐの欠失、ｗｃａＪ：０．５ｋｂｐの欠失、ｍｄｏＨ：０．５ｋｂｐの欠失、及びｇｍｄ遺伝子の上流へのＰｌａｃプロモータの挿入を有する。
［材料及び方法］
［株の構築］
以下の実施例で使用される株のバックグラウンド株として、細菌株ＭＤＯを使用した。ＭＤＯは、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｋ－１２ ＤＨ１からの構築体である。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ－１２ ＤＨ１の遺伝子型は、Ｆ－、λ－、ｇｙｒＡ９６、ｒｅｃＡ１、ｒｅｌＡ１、ｅｎｄＡ１、ｔｈｉ－１、ｈｓｄＲ１７、ｓｕｐＥ４４である。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ－１２ ＤＨ１に加えて、遺伝子型ＭＤＯは、以下の改変：ｌａｃＺ：１．５ｋｂｐの欠失、ｌａｃＡ：０．５ｋｂｐの欠失、ｎａｎＫＥＴＡ：３．３ｋｂｐの欠失、ｍｅｌＡ：０．９ｋｂｐの欠失、ｗｃａＪ：０．５ｋｂｐの欠失、ｍｄｏＨ：０．５ｋｂｐの欠失、及びｇｍｄ遺伝子の上流へのＰｌａｃプロモータの挿入を有する。
【0426】
対象の遺伝子を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のゲノム中に挿入する方法は、当業者に周知である。本出願で使用される株の遺伝子型を、表１、２、３、４、６、７、１０、及び１２で示す。
【0427】
例として、ＧａｌＫ遺伝子座を置換することによるＭＦＳトランスポータのゲノム挿入が記載されている。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ－１２ ＤＨ１ ＭＤＯの染色体ＤＮＡにおけるｆｒｅｄ遺伝子及びＴ１転写終結配列に連結されたプロモータを含有する発現カセットは、基本的に、Ｈｅｒｒｉｎｇ ｅｔ ａｌ．（Ｈｅｒｒｉｎｇ ｅｔ ａｌ ２００３．Ｇｅｎｅ ３１１：１５３－１６３）により記載される遺伝子ゴージング（Ｇｅｎｅ Ｇｏｒｇｉｎｇ）により実施された。簡潔に述べると、ドナープラスミド及びヘルパープラスミドを、ＭＤＯに同時形質転換させ、０．２％のグルコース、アンピシリン（１００μｇ／ｍＬ）又はカナマイシン（５０ｍｇ／ｍＬ）及びクロラムフェニコール（２０μｇ／ｍＬ）を含有するＬＢプレート上で選択した。単一コロニーを、クロラムフェニコール（２０μｇ／ｍＬ）及び１０μＬの２０％のＬ－アラビノースを含有する１ｍＬのＬＢ中に播種し、７～８時間にわたり振盪しながら３７℃でインキュベートした。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のｇａｌＫ遺伝子座内への統合のために、次に、細胞をＭ９－ＤＯＧプレート上にプレーティングし、３７℃で４８時間インキュベートした。ＭＭ－ＤＯＧプレート上で形成される単一コロニーを、０．２％グルコースを含有するＬＢプレート上で再びストリークし、３７℃で２４時間インキュベートした。ＭｃａＣｏｎｋｅｙ－ガラクトース寒天プレート上で白色に見え、アンピシリン及びクロラムフェニコールの両方に感受性であったコロニーは、ドナー及びヘルパープラスミドを消失しており、ｇａｌＫ遺伝子座における挿入物を含有すると予測された。ｇａｌＫ部位での挿入を、プライマーＯ４８（配列番号５０）及びＯ４９（配列番号５１）を使用するコロニーＰＣＲによって同定し、挿入されたＤＮＡを、シーケンシング（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって検証した。
【0428】
遺伝子ゴージング（例えば、Ｈｅｒｒｉｎｇ ａｎｄ Ｂｌａｔｔｎｅｒ ２００４ Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８６：２６７３－８１及びＷａｒｍｉｎｇｅｔ ａｌ ２００５ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３３（４）：ｅ３６）を様々な選択マーカー遺伝子及び様々なスクリーニング方法に用いて、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）染色体ＤＮＡ中の他の遺伝子座で遺伝的カセットの挿入を行うことができる。
【0429】
［株の特性評価のためのディープウェルアッセイプロトコル］
本実施例に開示される株は、４日間プロトコルを用いて９６ディープウェルプレート内でスクリーニングされた。最初の２４時間中、前培養物を高密度に増殖させてから、遺伝子発現の誘導及び生成物形成を可能にする培地に移した。より詳細には、１日目中、硫酸マグネシウム、チアミン及びグルコースを補充した基礎最少培地を用いてフレッシュな前培養物を調製した。前培養物を３４℃、１０００ｒｐｍの振盪で２４時間インキュベートし、その後、更に新しい基本最少培地（ＢＭＭ、ｐＨ７，５）に移してメインの培養を開始した。新しいＢＭＭに硫酸マグネシウム、チアミン、２０％グルコース溶液のボーラス（１００ｍＬ当たり５０μＬ）及び１０％ラクトース溶液のボーラス（１００ｍＬ当たり５ｍＬ）を補充した。更に、グルコースがＣ制限増殖に適した速度で放出されるようなスクロースヒドロラーゼ（インベルターゼ）の添加を伴って、５０％スクロース溶液を炭素源として提供した。メインの培養物を２８℃、１０００ｒｐｍの振盪で７２時間インキュベートした。
本実施例に開示される株は、４日間プロトコルを用いて９６ディープウェルプレート内でスクリーニングされた。最初の２４時間中、前培養物を高密度に増殖させてから、遺伝子発現の誘導及び生成物形成を可能にする培地に移した。より詳細には、１日目中、硫酸マグネシウム、チアミン及びグルコースを補充した基礎最少培地を用いてフレッシュな前培養物を調製した。前培養物を３４℃、１０００ｒｐｍの振盪で２４時間インキュベートし、その後、更に新しい基本最少培地（ＢＭＭ、ｐＨ７，５）に移してメインの培養を開始した。新しいＢＭＭに硫酸マグネシウム、チアミン、２０％グルコース溶液のボーラス（１００ｍＬ当たり５０μＬ）及び１０％ラクトース溶液のボーラス（１００ｍＬ当たり５ｍＬ）を補充した。更に、グルコースがＣ制限増殖に適した速度で放出されるようなスクロースヒドロラーゼ（インベルターゼ）の添加を伴って、５０％スクロース溶液を炭素源として提供した。メインの培養物を２８℃、１０００ｒｐｍの振盪で７２時間インキュベートした。
【0430】
全ブロスの分析の場合、９６ウェルプレートを１００℃で煮沸し、その後遠心分離にかけ、最後に上清をＨＰＬＣにより分析した。上清試料の場合、マイクロタイタープレートの初期遠心分離に続いて、ＨＰＬＣによる直接分析用に０．１ｍＬの上清を除去した。ペレット試料の場合、細胞を最初に洗浄して、次に脱イオン水に溶解させ、遠心分離した。遠心分離に続いて、再懸濁、煮沸、遠心分離、及び最終上清の分析後に、ペレットの細胞内部のＨＭＯ含有量を分析した。
【0431】
各試料中の検出されたＨＭＯのミリモル含有量（ｍＭ）は、報告された分析データに基づいて計算され、最終ブレンド中の各ＨＭＯのｍＭパーセンテージ（％）は、各菌株によって産生されたＨＭＯブレンドの定量的な違いを簡単に比較するために、ブレンド中の全ＨＭＯ（ｍＭ）濃度との関係で計算した。
【0432】
［実施例１－様々な野生型α－１，２－フコシルトランスフェラーゼを試験することによる、ＬＮＦＰ－Ｉ、２’－ＦＬ、及びＬＮＴのＨＭＯブレンドのバリエーションの生成］
［ディープウェルアッセイで試験された株ＭＰ１、ＭＰ２、ＭＰ３、及びＭＰ４の遺伝子型の説明］
以前に報告されたプラットフォームの株（「ＭＤＯ」）に基づいて、表１にまとめた改変は、この研究で使用したＬＮＦＰ－Ｉ産生株ＭＰ１、ＭＰ２、ＭＰ３、及びＭＰ４を得るために行われたものであり、全て完全に染色体株であった。菌株は、四糖類ＨＭＯであるＬＮＴ、及びフコシレートＬＮＴを産生して、更に五糖類ＨＭＯであるＬＮＦＰ－Ｉを産生ことができる。この反応に使用できるフコシルトランスフェラーゼ酵素は数多くあるが、本開示の枠組みにおいて、本発明者らは、ラクトース及びＬＮＴをフコシル化する能力を試験するために、様々な細菌種からα－１，２－フコシルトランスフェラーゼの小さなサブセットを選択した。選択された酵素は、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ：ＷＰ＿０８０４７３８６５．１、ただし、Ｃ末端に２つの追加アミノ酸（ＬＧ）を有する、配列番号６）からのＦｕｔＣ、スルフリフレクサス・モビリス（Ｓｕｌｆｕｒｉｆｌｅｘｕｓ ｍｏｂｉｌｉｓ）（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ：ＷＰ＿１２６４５５３９２．１、配列番号８）からのＳｍｏｂ、シデロキシダンス・リソトロフィカス（Ｓｉｄｅｒｏｘｙｄａｎｓ ｌｉｔｈｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ）ＥＳ－１１（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ：ＷＰ＿０１３０３１０１０．１、配列番号４９）からのＦｕｃＴ５４、及びメチロバクター・ツンドリパルダム（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｔｕｎｄｒｉｐａｌｕｄｕｍ）（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ：ＷＰ＿０３１４３７１９８．１、配列番号７）からのＭｔｕｎを含む。
［ディープウェルアッセイで試験された株ＭＰ１、ＭＰ２、ＭＰ３、及びＭＰ４の遺伝子型の説明］
以前に報告されたプラットフォームの株（「ＭＤＯ」）に基づいて、表１にまとめた改変は、この研究で使用したＬＮＦＰ－Ｉ産生株ＭＰ１、ＭＰ２、ＭＰ３、及びＭＰ４を得るために行われたものであり、全て完全に染色体株であった。菌株は、四糖類ＨＭＯであるＬＮＴ、及びフコシレートＬＮＴを産生して、更に五糖類ＨＭＯであるＬＮＦＰ－Ｉを産生ことができる。この反応に使用できるフコシルトランスフェラーゼ酵素は数多くあるが、本開示の枠組みにおいて、本発明者らは、ラクトース及びＬＮＴをフコシル化する能力を試験するために、様々な細菌種からα－１，２－フコシルトランスフェラーゼの小さなサブセットを選択した。選択された酵素は、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ：ＷＰ＿０８０４７３８６５．１、ただし、Ｃ末端に２つの追加アミノ酸（ＬＧ）を有する、配列番号６）からのＦｕｔＣ、スルフリフレクサス・モビリス（Ｓｕｌｆｕｒｉｆｌｅｘｕｓ ｍｏｂｉｌｉｓ）（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ：ＷＰ＿１２６４５５３９２．１、配列番号８）からのＳｍｏｂ、シデロキシダンス・リソトロフィカス（Ｓｉｄｅｒｏｘｙｄａｎｓ ｌｉｔｈｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ）ＥＳ－１１（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ：ＷＰ＿０１３０３１０１０．１、配列番号４９）からのＦｕｃＴ５４、及びメチロバクター・ツンドリパルダム（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｔｕｎｄｒｉｐａｌｕｄｕｍ）（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ：ＷＰ＿０３１４３７１９８．１、配列番号７）からのＭｔｕｎを含む。
【0433】
本実施例において、α－１，２－フコシルトランスフェラーゼの選択が、ほぼＬＮＦＰ－Ｉと２’－ＦＬだけからなるＨＭＯブレンドの明確で多様な標的組成を得る遺伝的ツールとしてどのように使用できるかが実証された。本開示は、α－１，２－フコシルトランスフェラーゼの選択が、株ＭＰ１、ＭＰ２、ＭＰ３、及びＭＰ４により産生されるＨＭＯブレンドの組成調節にどのように有利に利用できるかを実証している。表１に示すように、これらの株間の唯一の違いは、ＨＭＯ、又はその前駆体である糖の合成のためのラクトース及びＬＮＴのｉｎ ｖｉｖｏでの修飾を駆動するために宿主の選択されたゲノム遺伝子座に導入されたα－１，２－フコシルトランスフェラーゼ遺伝子である。異なる酵素はラクトース及びＬＮＴに対して異なる特異性を示し、これは獲得した最終ＨＭＯブレンド中のＬＮＦＰ－Ｉ及び２’－ＦＬの相対存在量に明確に反映された。
【0434】
［ディープウェルアッセイの結果］
「材料及び方法選択」で記載されたように、菌株をディープウェルアッセイで特性評価した。図１ａで示すように、α－１，２－フコシルトランスフェラーゼの選択により、最終ブレンドのＨＭＯ存在量に顕著な違いが生じた。他の酵素と比較して、ＦｕｔＣはＬＮＴよりもラクトースに対する特異性が高いようで、この事実が２’－ＦＬが最も豊富なＨＭＯとなったＨＭＯブレンドをもたらした。これに対して、ＬＮＦＰ－Ｉが主なＨＭＯであり、２’－ＦＬが２番目に豊富な糖であるのに対し、ＬＮＴ－ＩＩは限られた量でしか形成されないブレンドが、Ｓｍｏｂにより得られた。Ｓｍｏｂは驚くべき特異性でＬＮＴをフコシル化することができるが、ラクトースに対する特異性は一見非常に低いようである。最終的に、ＦｕｃＴ５４及びＭｔｕｎは、ほぼ等モル濃度のＬＮＦＰ－Ｉ及び２’－ＦＬを有するＨＭＯブレンドをもたらし、これは、ＬＮＴ及びラクトースに対するそれらの特異性がほぼ均等であることを示している（図１ａ）。
「材料及び方法選択」で記載されたように、菌株をディープウェルアッセイで特性評価した。図１ａで示すように、α－１，２－フコシルトランスフェラーゼの選択により、最終ブレンドのＨＭＯ存在量に顕著な違いが生じた。他の酵素と比較して、ＦｕｔＣはＬＮＴよりもラクトースに対する特異性が高いようで、この事実が２’－ＦＬが最も豊富なＨＭＯとなったＨＭＯブレンドをもたらした。これに対して、ＬＮＦＰ－Ｉが主なＨＭＯであり、２’－ＦＬが２番目に豊富な糖であるのに対し、ＬＮＴ－ＩＩは限られた量でしか形成されないブレンドが、Ｓｍｏｂにより得られた。Ｓｍｏｂは驚くべき特異性でＬＮＴをフコシル化することができるが、ラクトースに対する特異性は一見非常に低いようである。最終的に、ＦｕｃＴ５４及びＭｔｕｎは、ほぼ等モル濃度のＬＮＦＰ－Ｉ及び２’－ＦＬを有するＨＭＯブレンドをもたらし、これは、ＬＮＴ及びラクトースに対するそれらの特異性がほぼ均等であることを示している（図１ａ）。
【0435】
議論中の菌株によって産生されたブレンド中の全ＨＭＯ濃度は大きく異なった。高２’－ＦＬ濃度と全ＨＭＯ濃度との間には強い相関関係が存在するが、最終ＨＭＯブレンド中のＬＮＦＰ－Ｉ含有量が高いほど、全ＨＭＯ濃度は低くなる（図１ｂ）。
【0436】
結論として、ＬＮＦＰ－Ｉを産生するためにＬＮＴ産生株の遺伝的バックグラウンドに導入できるα－１，２－フコシルトランスフェラーゼの選択は、最終ブレンドが、ほぼ独占的にＬＮＦＰ－Ｉ（ＭＰ２、Ｓｍｏｂ）、又は大部分が２’－ＦＬ（ＭＰ１、ＦｕｔＣ）、又は１：１に近い比率のＬＮＦＰ－Ｉ及び２’－ＦＬ（ＭＰ３、ＦｕｃＴ５４及びＭＰ４、Ｍｔｕｎ）のいずれかからなるような方法で、混合物の相対ＨＭＯ存在量を有意に変化させることができる。
【0437】
［実施例２－コラン酸遺伝子クラスターの発現レベルを増加させることによる、ＬＮＦＰ－Ｉ、２’－ＦＬ、及びＬＮＴのＨＭＯブレンドのバリエーションの生成］
［ディープウェルアッセイで試験された株ＭＰ５、ＭＰ６、ＭＰ７、ＭＰ８、及びＭＰ９の遺伝子型の説明］
以前に報告されたプラットフォームの株（「ＭＤＯ」）に基づいて、表２にまとめた改変は、この研究で使用したＬＮＦＰ－Ｉ産生株ＭＰ５、ＭＰ６、ＭＰ７、ＭＰ８、及びＭＰ９を得るために行われたものであり、全て完全に染色体株であった。菌株は、四糖類ＨＭＯであるＬＮＴ、及びフコシレートＬＮＴを産生して、更に五糖類ＨＭＯであるＬＮＦＰ－Ｉを得ることができる。この反応に使用したフコシルトランスフェラーゼ酵素は、Ｓｍｏｂ（ＭＰ８及びＭＰ９）又はＦｕｔＣ（ＭＰ５、ＭＰ６、及びＭＰ７）のいずれかであった。実施例１で議論されているとおり、２つの酵素は、ラクトース及びＬＮＴに対して異なる特異性を示し、最終ブレンドでは主なＨＭＯとしてＬＮＦＰ－Ｉ又は２’－ＦＬが得られる。同様に、ＬＮＴ及びＬＮＴ－ＩＩなどの他のＨＭＯが、このようなＨＭＯブレンドに存在するが、濃度は低くなる。
［ディープウェルアッセイで試験された株ＭＰ５、ＭＰ６、ＭＰ７、ＭＰ８、及びＭＰ９の遺伝子型の説明］
以前に報告されたプラットフォームの株（「ＭＤＯ」）に基づいて、表２にまとめた改変は、この研究で使用したＬＮＦＰ－Ｉ産生株ＭＰ５、ＭＰ６、ＭＰ７、ＭＰ８、及びＭＰ９を得るために行われたものであり、全て完全に染色体株であった。菌株は、四糖類ＨＭＯであるＬＮＴ、及びフコシレートＬＮＴを産生して、更に五糖類ＨＭＯであるＬＮＦＰ－Ｉを得ることができる。この反応に使用したフコシルトランスフェラーゼ酵素は、Ｓｍｏｂ（ＭＰ８及びＭＰ９）又はＦｕｔＣ（ＭＰ５、ＭＰ６、及びＭＰ７）のいずれかであった。実施例１で議論されているとおり、２つの酵素は、ラクトース及びＬＮＴに対して異なる特異性を示し、最終ブレンドでは主なＨＭＯとしてＬＮＦＰ－Ｉ又は２’－ＦＬが得られる。同様に、ＬＮＴ及びＬＮＴ－ＩＩなどの他のＨＭＯが、このようなＨＭＯブレンドに存在するが、濃度は低くなる。
【0438】
本実施例において、コラン酸遺伝子クラスターの発現レベルの増加が、ｓｍｏｂ発現細胞におけるＬＮＦＰ－Ｉ及び２’－ＦＬの比率を増加させるため、又はｆｕｔＣ発現細胞における最終ＨＭＯブレンドの１番目と２番目に豊富なＨＭＯの存在量の順序をＬＮＦＰ－Ｉ＞２’－ＦＬから２’－ＦＬ＞ＬＮＦＰ－Ｉに逆転させるための遺伝的ツールとしてどのように使用できるかが実証された。本開示は、コラン酸遺伝子の発現の微調整は、ｓｍｏｂ及びｆｕｔＣ発現細胞によって産生されるＨＭＯブレンドの組成を調節するために有利に使用することができることを実証している。
【0439】
［ディープウェルアッセイの結果］
「材料及び方法選択」で記載されたように、菌株をディープウェルアッセイで特性評価した。
「材料及び方法選択」で記載されたように、菌株をディープウェルアッセイで特性評価した。
【0440】
図２ａ～ｃにて示すように、単一の遺伝子改変、即ちコラン酸遺伝子クラスターの発現レベルの増加は、ｓｍｏｂ及びｆｕｔＣ発現細胞によって獲得されるＨＭＯブレンドに劇的な変化をもたらした。具体的には、ｓｍｏｂ発現細胞におけるコラン酸遺伝子の発現を駆動するプロモータの強度を高めること（即ち、ＰｇｌｐＦ＿Ｂ２９をＰｇｌｐＦプロモータと置き換えること）は、ＨＭＯブレンドのＬＮＦＰ－Ｉ画分をほぼ２５％増加させ、同時にＬＮＴ ＩＩ＋ＬＮＴ画分をほぼ３０％減少させ得る（図２ａ）。従って、天然のコラン酸遺伝子座の前でこの単一の単純なプロモータを交換することにより、大部分がＬＮＦＰ－Ｉ（８５％）からなり、２’－ＦＬが２番目に豊富なＨＭＯであってブレンドの全ＨＭＯ含有量の１０％のみを構成し得るＨＭＯブレンドの前に生成をもたらすことができる。しかしながら、コラン酸遺伝子クラスターを差次的に発現するｓｍｏｂ発現細胞によって産生されるブレンド中の全ＨＭＯ濃度が著しく異なることは注目に値する。具体的には、コラン酸遺伝子クラスターの高レベルの発現は、全ＨＭＯ形成の減少に関連しているようである（図２ｃ）：株ＭＰ９はほぼ５ｍＭのＨＭＯを産生するが、株ＭＰ８はわずか４ｍＭの総量の糖を産生する。
【0441】
更に、図２ｂにて示すように、ｆｕｔＣ発現細胞におけるコラン酸遺伝子クラスターのプロモータ強度及び／又はコピー数の漸進的増加（即ち、ＰｇｌｐＦ＿Ｂ２９＜ＰｇｌｐＦ＿Ｂ２８＜ＰｇｌｐＦ＋ＰｇｌｐＦ＿Ｂ２８）は、ＨＭＯブレンドの２’－ＦＬ画分を最大２５％まで徐々に増加させ、同時にブレンドのＬＮＦＰ－Ｉ画分を同様のパーセンテージで徐々に減少させ得る（図２ｂ）。詳細には、天然のコラン酸遺伝子座の前の単純なプロモータ交換及び異なるゲノム遺伝子座にあるこの遺伝子クラスターの第２のコピーの導入（即ち、ＰｇｌｐＦ＿Ｂ２９→ＰｇｌｐＦ＿Ｂ２８＋ＰｇｌｐＦ）によって、ｆｕｔＣ発現細胞において、最終ＨＭＯブレンドの１番目と２番目に豊富なＨＭＯの存在量の順序をＬＮＦＰ－Ｉ＞２’－ＦＬから２’－ＦＬ＞ＬＮＦＰ－Ｉに逆転させることができる。議論中の遺伝子改変、即ちＰｇｌｐＦ＿Ｂ２９→ＰｇｌｐＦ＿Ｂ２８＋ＰｇｌｐＦはまた、最終ブレンド中の全ＨＭＯ濃度も大幅に向上させたことは注目に値する。具体的には、株ＭＰ５における遺伝子改変（ＰｇｌｐＦ＋ＰｇｌｐＦ＿Ｂ２８）は、株ＭＰ７（ＰｇｌｐＦ＿Ｂ２９）と比較して、全ＨＭＯ含有量がほぼ３５％高くなる。
【0442】
結論として、コラン酸遺伝子クラスターの発現レベルの増加は、ｓｍｏｂ発現細胞においてＬＮＦＰ－Ｉ及び２’－ＦＬの比率を増加させ、又はｆｕｔＣ発現細胞において最終ＨＭＯブレンドの１番目と２番目に豊富なＨＭＯの存在量の順序をＬＮＦＰ－Ｉ＞２’－ＦＬから２’－ＦＬ＞ＬＮＦＰ－Ｉに逆転させることができる遺伝的ツールである。
【0443】
［実施例３－ＬＮＴ形成に関与するグリコシルトランスフェラーゼのコピー数を増加させることによる、ＬＮＦＰ－Ｉ、２’－ＦＬ、及びＬＮＴのＨＭＯブレンドのバリエーションの生成］
［ディープウェルアッセイで試験された株ＭＰ１０及びＭＰ１１の遺伝子型の説明］
以前に報告されたプラットフォームの株（「ＭＤＯ」）に基づいて、表３にまとめた改変は、この研究で使用したＬＮＦＰ－Ｉ産生株ＭＰ１０及びＭＰ１１を得るために行われたものであり、どちらも完全に染色体株であった。菌株は、四糖類ＨＭＯである、ＬＮＴ、及びフコシレートＬＮＴを産生して、更に五糖類ＨＭＯである、ＬＮＦＰ－Ｉを得ることができる。この反応に使用したフコシルトランスフェラーゼ酵素は、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ：ＷＰ＿０８０４７３８６５．１、ただし、Ｃ末端に２つの追加アミノ酸（ＬＧ）を有する、配列番号６）からのＦｕｔＣ酵素であった。
［ディープウェルアッセイで試験された株ＭＰ１０及びＭＰ１１の遺伝子型の説明］
以前に報告されたプラットフォームの株（「ＭＤＯ」）に基づいて、表３にまとめた改変は、この研究で使用したＬＮＦＰ－Ｉ産生株ＭＰ１０及びＭＰ１１を得るために行われたものであり、どちらも完全に染色体株であった。菌株は、四糖類ＨＭＯである、ＬＮＴ、及びフコシレートＬＮＴを産生して、更に五糖類ＨＭＯである、ＬＮＦＰ－Ｉを得ることができる。この反応に使用したフコシルトランスフェラーゼ酵素は、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ：ＷＰ＿０８０４７３８６５．１、ただし、Ｃ末端に２つの追加アミノ酸（ＬＧ）を有する、配列番号６）からのＦｕｔＣ酵素であった。
【0444】
本実施例において、ＬＮＴ生合成に関与するグリコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子のコピー数の微調整が、ｆｕｔＣ発現細胞において、獲得したブレンドの１番目と２番目に豊富なＨＭＯの存在量の順序を２’－ＦＬ＞ＬＮＦＰ－ＩからＬＮＦＰ－Ｉ＞２－ＦＬに逆転させる遺伝的ツールとしてどのように使用できるかが実証された。本開示は、ｆｕｔＣ発現細胞におけるｌｇｔＡ（β－１，３－Ｎ－アセチル－グルコサミニルトランスフェラーゼをコードする）及びｇａｌＴＫ（β－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼをコードする）遺伝子のコピー数の同時増加が、株ＭＰ１０及びＭＰ１１によって産生されるＨＭＯブレンドの組成を調節する手段としてどのように有利に使用するできるかを実証している。表３で示すように、２つの株の唯一の違いは、株ＭＰ１０のバックグラウンドと比較して株ＭＰ１１の遺伝的バックグラウンドに追加のｌｇｔＡ及びｇａｌＴＫコピーが存在することである。ＭＰ１１におけるｌｇｔＡ及びｇａｌＴＫ遺伝子の追加のコピーは、ＬＮＴ産生を促進し、それによってＬＮＦＰ－Ｉ及び／又は全体的なＨＭＯ産生を増加させると考えられている。
【0445】
［ディープウェルアッセイの結果］
「材料及び方法選択」で記載されたように、菌株をディープウェルで特性評価した。
「材料及び方法選択」で記載されたように、菌株をディープウェルで特性評価した。
【0446】
図３で示すように、株ＭＰ１１を産生するためのＬＮＦＰ－Ｉ産生株ＭＰ１０におけるｌｇｔＡ及びｇａｌＴＫコピー数の同時増加は、獲得されたＨＭＯブレンドに顕著な変化をもたらした。具体的には、この改変により、最終ブレンドの２番目に主要なＨＭＯの存在量の順序をＬＮＦＰ－Ｉから２’－ＦＬに逆転させることができる。より低い遺伝子コピー数を有する株であるＭＰ１０は、５８％の２’－ＦＬ及び４０％のＬＮＦＰ－Ｉからなるブレンドを産生するとともに、より高い遺伝子コピー数を有する株であるＭＰ１１は、４０％の２’－ＦＬ及び５５％ＬＮＦＰ－Ｉという逆転したＨＭＯプロファイルを有するブレンドをもたらした。これらの株によって生成された最終ＨＭＯブレンドの全ＨＭＯ濃度は大きく異なり、株ＭＰ１０（各遺伝子の１つのコピー）は、株ＭＰ１１（各遺伝子の２つのコピー）によって産生されたものと比較して、全ＨＭＯ含有量が１５％高いブレンドを産生した。従って、議論中の遺伝子改変は、最終ＨＭＯブレンドのＬＮＦＰ－Ｉ及び２’－ＦＬ画分の両方だけでなく、得られる全ＨＭＯ濃度にも変化をもたらす（データは示されていない）。
【0447】
結論として、ＬＮＴ生合成に関与するグリコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子のコピー数の同時増加は、ｆｕｔＣ発現細胞において、獲得したブレンドの１番目と２番目に豊富なＨＭＯの存在量の順序を２’－ＦＬ＞ＬＮＦＰ－ＩからＬＮＦＰ－Ｉ＞２－ＦＬに逆転させる効果的なツールである。
【0448】
［実施例４－主要ファシリテータースーパーファミリー（ＭＦＳ）の糖排出トランスポータを導入することによる、ＬＮＦＰ－Ｉ、２’－ＦＬ、及びＬＮＴのＨＭＯブレンドのバリエーションの生成］
［ディープウェルアッセイで試験された株ＭＰ１２、ＭＰ１３、ＭＰ１４、ＭＰ１５、ＭＰ１６、ＭＰ１７、及びＭＰ１８の遺伝子型の説明］
以前に報告されたプラットフォームの株（「ＭＤＯ」）に基づいて、表４にまとめた改変は、この研究で使用したＬＮＦＰ－Ｉ産生株ＭＰ１２、ＭＰ１３、ＭＰ１４、ＭＰ１５、ＭＰ１６、ＭＰ１７、及びＭＰ１８を得るために行われたものであり、全て完全に染色体株であった。菌株は、四糖類ＨＭＯである、ＬＮＴ、及びフコシレートＬＮＴを産生して、更に五糖類ＨＭＯである、ＬＮＦＰ－Ｉを得ることができる。この反応に使用したフコシルトランスフェラーゼ酵素は、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ：ＷＰ＿０８０４７３８６５．１、ただし、Ｃ末端に２つの追加アミノ酸（ＬＧ）を有する、配列番号６）からのＦｕｔＣ酵素であった。特に、ＬＮＴ及びＬＮＴ ＩＩなどの他のＨＭＯは、上記の株によって産生された最終ＨＭＯブレンド中に存在したが、その濃度は最小限であった。
［ディープウェルアッセイで試験された株ＭＰ１２、ＭＰ１３、ＭＰ１４、ＭＰ１５、ＭＰ１６、ＭＰ１７、及びＭＰ１８の遺伝子型の説明］
以前に報告されたプラットフォームの株（「ＭＤＯ」）に基づいて、表４にまとめた改変は、この研究で使用したＬＮＦＰ－Ｉ産生株ＭＰ１２、ＭＰ１３、ＭＰ１４、ＭＰ１５、ＭＰ１６、ＭＰ１７、及びＭＰ１８を得るために行われたものであり、全て完全に染色体株であった。菌株は、四糖類ＨＭＯである、ＬＮＴ、及びフコシレートＬＮＴを産生して、更に五糖類ＨＭＯである、ＬＮＦＰ－Ｉを得ることができる。この反応に使用したフコシルトランスフェラーゼ酵素は、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ：ＷＰ＿０８０４７３８６５．１、ただし、Ｃ末端に２つの追加アミノ酸（ＬＧ）を有する、配列番号６）からのＦｕｔＣ酵素であった。特に、ＬＮＴ及びＬＮＴ ＩＩなどの他のＨＭＯは、上記の株によって産生された最終ＨＭＯブレンド中に存在したが、その濃度は最小限であった。
【0449】
本実施例において、ｆｕｔＣ発現細胞における遺伝的バックグラウンドに糖排出トランスポータタンパク質（表５）をコードする選択された異種遺伝子の導入が、最終ＨＭＯブレンドの１番目と２番目に豊富なＨＭＯの存在量の順序を、ＬＮＦＰ－Ｉ＞２’－ＦＬから２’－ＦＬ＞ＬＮＦＰ－Ｉへとどのように著しく逆転させることができるのかが実証されている。この関連で、本明細書で提示される遺伝的ツールは、上記実施例２の記載されているものと同等であり、ここでｆｕｔＣ発現細胞におけるコラン酸遺伝子クラスターの発現の増加は、ブレンド中の２つの最も豊富なＨＭＯのプロファイルがＬＮＦＰ－Ｉ＞２’－ＦＬから２’－ＦＬ＞ＬＮＦＰ－Ｉへ逆転することも示された。本明細書で議論される開示は、選択された異種糖排出トランスポータタンパク質をコードする遺伝子の導入が、株ＭＰ１２、ＭＰ１３、ＭＰ１４、ＭＰ１５、ＭＰ１６、ＭＰ１７、及びＭＰ１８によって産生されるＨＭＯブレンドの組成を調節するために、どのようにして有利に使用できるかを実証している。これらの菌株間の唯一の違いは、表４に示すように、宿主の選択されたゲノム遺伝子座に組み込まれるトランスポータ遺伝子である。このような異種遺伝子の過剰発現は、細胞内部から細胞外環境への２’－ＦＬ及び／又はＬＮＦＰ－Ｉの輸送を強化し、それによってＨＭＯ産生にさまざまな形で影響を与えると考えられている。
【0450】
［ディープウェルアッセイの結果］
「材料及び方法選択」で記載されたように、菌株をディープウェルアッセイで特性評価した。
「材料及び方法選択」で記載されたように、菌株をディープウェルアッセイで特性評価した。
【0451】
図４で示すように、ｆｕｔＣ発現細胞の遺伝的バックグラウンドに糖排出トランスポータタンパク質（表５）をコードする選択された異種遺伝子を導入すると、獲得したＨＭＯブレンドに劇的な変化が生じた。これらのトランスポータ遺伝子を有するカセットの発現を駆動するために選択されたプロモータは、Ｐｌａｃ又はＰｇｌｐＦのいずれかであったことに注意する。しかしながら、本実施例において、各トランスポータのＰｌａｃベース又はＰｇｌｐＦベースの構築体のみのデータが表示される。詳細には、各トランスポータに対して最も顕著な効果をもたらした構築体は、図４に示されているデータに含まれた。
【0452】
一般的には、図４に示すように、選択されたＭＦＳトランスポータ遺伝子のいずれかを導入すると、おそらく、トランスポータを介した２’－ＦＬ（ＬＮＦＰ－Ｉではない）の細胞外への効率的な輸送によって、ＬＮＦＰ－Ｉの形成が明らかに減少し、２’－ＦＬ形成が大幅に増加した。トランスポータ発現細胞における２’－ＦＬ画分の大幅な増加は、得られたブレンドの全ＨＭＯ濃度に反映され、対応するブレンドは、ＭＦＳトランスポータを有さない宿主株（ＭＰ１２）のブレンドと比較して３５～７０％高いＨＭＯ含有量を示した（図４）。
【0453】
産生宿主の遺伝的バックグラウンドに導入されたトランスポータ遺伝子に応じて、得られたブレンド中のＬＮＦＰ－Ｉ濃度は、対照（宿主）株と比較して有意に異なり、異種ＭＦＳトランスポータをコードしない宿主細胞内で形成されたＬＮＦＰ－Ｉの９０％、７０％、６０％、５０％、又はわずか３０％を占めた。最終ブレンド中のＬＮＦＰ－Ｉ濃度の最大の減少（７０％）は、ＰｇｌｐＦ－ｙｂｅｒＣ構築体の導入により観察されたが、最終ブレンドのＬＮＦＰ－Ｉ含有量のわずかな損失（１０％）は、Ｐｌａｃ－ｎｅｃ構築体の導入により観察された。
【0454】
これに対して、産生宿主へのトランスポータ構築体の導入から生じるブレンドは、異種トランスポータを欠く細胞により産生されるブレンドと比較して、２’－ＦＬ濃度が２．５～３．５倍増加したことを示した。ブレンドの２’－ＦＬ濃度の最も高い相対的な増加は、ＰｇｌｐＦ－ｆｒｅｄ構築体の導入で得られたが、最も低い相対的な増加は、ＰｇｌｐＦ－ｖａｇ構築体の導入で得られた（図４）。
【0455】
前述のように、異種糖排出トランスポータを発現する株により産生されるＨＭＯブレンドの全ＨＭＯ濃度は、宿主株のブレンドと比較して３５～７０％高いＨＭＯ含有量を示した。宿主と比較してＨＭＯ含有量の最も高い増加は、Ｐｌａｃ－ｎｅｃ及びＰｇｌｐＦ－ｆｒｅｄ構築体の導入で観察され、これは、同様に、２’－ＦＬ濃度の最も高い相対的増加のいくつかをもたらした（図４）。
【0456】
結論として、ｆｕｔＣ発現細胞の遺伝的バックグラウンドにＭＦＳスーパーファミリーの糖排出トランスポータタンパク質をコードする選択された異種遺伝子を導入すると、最終ＨＭＯブレンドの１番目と２番目に豊富なＨＭＯの存在量の順序を、ＬＮＦＰ－Ｉ＞２’－ＦＬから２’－ＦＬ＞ＬＮＦＰ－Ｉへと激しく逆転させることができる。このような遺伝子改変は、最終ブレンドで得られる全ＨＭＯ濃度に大きな変化をもたらす可能性もあり、ＬＮＦＰ－Ｉ産生宿主に導入されたトランスポータ構築体に応じて、トランスポータ発現細胞では全ＨＭＯ含量が最大７０％増加する。
【0457】
［実施例５－ＰｇｌｐＦ駆動遺伝子発現を抑制するｇｌｐＲ遺伝子を欠失させることによる、ＬＮＦＰ－Ｉ、２’－ＦＬ、及びＬＮＴのＨＭＯブレンドのバリエーションの生成］
［ディープウェルアッセイで試験された株ＭＰ１９及びＭＰ２０の遺伝子型の説明］
以前に報告されたプラットフォームの株（「ＭＤＯ」）に基づいて、表６にまとめた改変は、この研究で使用したＬＮＦＰ－Ｉ産生株ＭＰ１９及びＭＰ２０を得るために行われたものであり、どちらも完全に染色体株であった。菌株は、四糖類ＨＭＯであるＬＮＴ、及びフコシレートＬＮＴを産生して、更に五糖類ＨＭＯであるＬＮＦＰ－Ｉを得ることができる。この反応に使用した、フコシルトランスフェラーゼ酵素は、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ：ＷＰ＿０８０４７３８６５．１、ただし、Ｃ末端に２つの追加アミノ酸（ＬＧ）を有する、配列番号６）からのＦｕｔＣ酵素であった。特に、ＬＮＴ及びＬＮＴ ＩＩなどの他のＨＭＯは、上記の株によって産生された最終ＨＭＯブレンド中に存在したが、低濃度であった。
［ディープウェルアッセイで試験された株ＭＰ１９及びＭＰ２０の遺伝子型の説明］
以前に報告されたプラットフォームの株（「ＭＤＯ」）に基づいて、表６にまとめた改変は、この研究で使用したＬＮＦＰ－Ｉ産生株ＭＰ１９及びＭＰ２０を得るために行われたものであり、どちらも完全に染色体株であった。菌株は、四糖類ＨＭＯであるＬＮＴ、及びフコシレートＬＮＴを産生して、更に五糖類ＨＭＯであるＬＮＦＰ－Ｉを得ることができる。この反応に使用した、フコシルトランスフェラーゼ酵素は、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ：ＷＰ＿０８０４７３８６５．１、ただし、Ｃ末端に２つの追加アミノ酸（ＬＧ）を有する、配列番号６）からのＦｕｔＣ酵素であった。特に、ＬＮＴ及びＬＮＴ ＩＩなどの他のＨＭＯは、上記の株によって産生された最終ＨＭＯブレンド中に存在したが、低濃度であった。
【0458】
本実施例において、ｇｌｐＲ遺伝子の欠失が、ＬＮＦＰ－Ｉ、２’－ＦＬ、ＬＮＴ ＩＩ、及びＬＮＴ（豊富な順）を含む最大４つのＨＭＯを含むＨＭＯ混合物の特定の標的組成を獲得するためにどのように遺伝的ツールとして使用されるかが実証された。本開示は、ｇｌｐＲ遺伝子の欠失が、株ＭＰ１９及びＭＰ２０により産生されるＨＭＯブレンドの組成調節にどのように有利に利用できるかを実証している。表６に示すように、２つの株間の唯一の違いは、ｇｌｐＲ遺伝子のノックアウトである。ｇｌｐＲの遺伝子産物は、ＤＮＡ結合転写リプレッサＧｌｐＲであり、これは、異なるオペロンで構成されているグリセロール－３－ホスフェートレギュロン（ｒｅｇｕｌｏｎ）のリプレッサとして機能する。その標的の１つは、ＰｇｌｐＦプロモータであり、これは、元々グリセロール促進因子ＧｌｐＦをコードする天然大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）遺伝子ｇｌｐＦの前に見つけられる。コラン酸遺伝子クラスター及びＭＦＳトランスポータ又はＨＭＯ合成のためのグリコシルトランスフェラーゼをコードする異種遺伝子はＰｇｌｐＦプロモータの制御下にあるため、ｇｌｐＲ遺伝子の欠失により、細胞内の全てのＰｇｌｐＦプロモータからのＧｌｐＲによる転写抑制が排除され、この方法で宿主のゲノムに存在する全てのＰｇｌｐＦベースのカセットからの遺伝子発現が増強され、それにより、複数の方法で全体的なＨＭＯ産生に影響を与え得る。
【0459】
［ディープウェルアッセイの結果］
「材料及び方法選択」で記載されたように、菌株をディープウェルアッセイで特性評価した。
「材料及び方法選択」で記載されたように、菌株をディープウェルアッセイで特性評価した。
【0460】
図５に示すように、単一の遺伝子改変、即ちｇｌｐＲ遺伝子の欠失により、得られたＨＭＯブレンドのＨＭＯの分布に顕著な変化が生じた。ｇｌｐＲ遺伝子の欠失により、２’－ＦＬ、ＬＮＴ及びＬＮＴ－ＩＩの形成が著しく変化したが、ＬＮＦＰ－Ｉの形成はわずかな影響であった。具体的には、ｇｌｐＲ＋株であるＭＰ１９は、５０％のＬＮＦＰ－Ｉ及び４４％の２’－ＦＬからなるブレンドを産生したが、ｇｌｐＲ－株であるＭＰ２０は、ＭＰ１９と比べて１５％少ない２’－ＦＬ及び５％だけ多いＬＮＦＰ－Ｉを含むブレンドを提供した。更に、ｇｌｐＲの欠失は、最終ＨＭＯブレンドにおけるより高いＬＮＴ及びＬＮＴ－ＩＩ画分と関連しているようである（図５）。
【0461】
ｇｌｐＲ遺伝子の欠失により、株ＭＰ１９によって産生されたブレンドと比較して、株ＭＰ２０によって獲得されたブレンド中の全ＨＭＯ濃度（７％）がわずかに減少した、即ち株ＭＰ１９は５．７ｍＭの総量の糖を産生したが、株ＭＰ２０は５．３ｍＭのＨＭＯを産生した（データは示さず）。
【0462】
結論として、ｇｌｐＲ遺伝子の欠失により、得られたブレンド中の個々のＨＭＯ存在量が変化し、ＬＮＦＰ－Ｉ対２’－ＦＬの比率がｇｌｐＲ＋細胞のブレンド（ＭＰ１９）よりも高くなった（ＭＰ２０）。この遺伝子改変により、得られたブレンド中のＬＮＴ ＩＩ及びＬＮＴの存在量も増加したが、どちらも最終ブレンドでは最も少ない存在量の糖のままであった。
【0463】
［実施例６－発酵温度調節による、ＬＮＦＰ－Ｉ、２’－ＦＬ、及びＬＮＴのＨＭＯブレンドのバリエーションの生成］
［発酵で使用される菌株の遺伝子型の説明］
以前に報告されたプラットフォームの株（「ＭＤＯ」）に基づいて、表７にまとめた改変は、この研究で使用したＬＮＦＰ－Ｉ産生株を得るために行われたものであり、即ち完全染色体株ＭＰ２１であった。菌株は、四糖類ＨＭＯであるＬＮＴ、及びフコシレートＬＮＴを産生して、更に五糖類ＨＭＯであるＬＮＦＰ－Ｉを得ることができる。この反応に使用した、フコシルトランスフェラーゼ酵素、つまりヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ：ＷＰ＿０８０４７３８６５．１、ただし、Ｃ末端に２つの追加アミノ酸（ＬＧ）を有する、配列番号６）から誘導されるＦｕｔＣ酵素であるα－１，２－フコシロシル－トランスフェラーゼは、基質としてＬＮＴだけでなくラクトースの両方をフコシル化できるだけでなく、この菌株の主な産物として、それぞれＬＮＦＰ－Ｉ及び２’－ＦＬを産生できることが判明した。ＬＮＴも蓄積するが、程度は低く、ＬＮＦＰ－Ｉ、２’－ＦＬ、及びＬＮＴで構成されるＨＭＯブレンドが残る。さらに程度は低いが、ＤＦＬ（＝２’，３－ジフコシルラクトース）も２’－ＦＬのフコシル化から得られるが、ラクトースの利用可能性が限られている場合にのみ、かなりの量が得られる（実施例７も参照されたい）。
［発酵で使用される菌株の遺伝子型の説明］
以前に報告されたプラットフォームの株（「ＭＤＯ」）に基づいて、表７にまとめた改変は、この研究で使用したＬＮＦＰ－Ｉ産生株を得るために行われたものであり、即ち完全染色体株ＭＰ２１であった。菌株は、四糖類ＨＭＯであるＬＮＴ、及びフコシレートＬＮＴを産生して、更に五糖類ＨＭＯであるＬＮＦＰ－Ｉを得ることができる。この反応に使用した、フコシルトランスフェラーゼ酵素、つまりヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ：ＷＰ＿０８０４７３８６５．１、ただし、Ｃ末端に２つの追加アミノ酸（ＬＧ）を有する、配列番号６）から誘導されるＦｕｔＣ酵素であるα－１，２－フコシロシル－トランスフェラーゼは、基質としてＬＮＴだけでなくラクトースの両方をフコシル化できるだけでなく、この菌株の主な産物として、それぞれＬＮＦＰ－Ｉ及び２’－ＦＬを産生できることが判明した。ＬＮＴも蓄積するが、程度は低く、ＬＮＦＰ－Ｉ、２’－ＦＬ、及びＬＮＴで構成されるＨＭＯブレンドが残る。さらに程度は低いが、ＤＦＬ（＝２’，３－ジフコシルラクトース）も２’－ＦＬのフコシル化から得られるが、ラクトースの利用可能性が限られている場合にのみ、かなりの量が得られる（実施例７も参照されたい）。
【0464】
［発酵プロセスの説明］
発酵は、２Ｌの発酵槽バイオリアクター（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、Ｂｉｏｓｔａｔ Ｂ）で実施し、３０ｇ／ｋｇの炭素源（グルコース）、ＭｇＳＯ４×７Ｈ２Ｏ、ＫＯＨ、Ｈ３ＰＯ４、微量元素溶液、クエン酸、消泡剤、及びチアミンからなる９００ｍＬの規定ミネラル培地から開始した。微量金属溶液（ＴＭＳ）は、Ｍｎ、Ｃｕ、Ｆｅ、硫酸塩としてＺｎ及びクエン酸を含有した。規定の最小培地中で増殖させた２％（ｖ／ｖ）の前培養物を接種することによって発酵を開始した。バッチ培地中に含まれる炭素源を枯渇させた後、グルコース、ＭｇＳＯ４×７Ｈ２Ｏ、ＴＭＳ、及びＨ３ＰＯ４を含有する滅菌供給溶液を、所定の非線形プロファイルを用いて、炭素制限方式で連続的に供給した。７５ｇ／ｋｇのラクトース一水和物を、グルコース供給開始の１時間後から開始して３０分以内に添加した。２８％のＮＨ４ＯＨ溶液で滴定することにより、発酵中のｐＨを６．８に制御した。エアレーションは、大気を使用して１ｖｖｍであり、溶存酸素は、３０％超の空気飽和で制御された。グルコース供給開始後１５分で、表８及び９に示すように、発酵温度設定値を３３℃から調査中のそれぞれの設定値まで下げた。これらの温度低下は、３時間にわたる直線傾斜で実行された。発酵の終了は、ＨＭＯミックスとラクトースの標的組成に達したときに、およそ９５～９８時間であった。
発酵は、２Ｌの発酵槽バイオリアクター（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、Ｂｉｏｓｔａｔ Ｂ）で実施し、３０ｇ／ｋｇの炭素源（グルコース）、ＭｇＳＯ４×７Ｈ２Ｏ、ＫＯＨ、Ｈ３ＰＯ４、微量元素溶液、クエン酸、消泡剤、及びチアミンからなる９００ｍＬの規定ミネラル培地から開始した。微量金属溶液（ＴＭＳ）は、Ｍｎ、Ｃｕ、Ｆｅ、硫酸塩としてＺｎ及びクエン酸を含有した。規定の最小培地中で増殖させた２％（ｖ／ｖ）の前培養物を接種することによって発酵を開始した。バッチ培地中に含まれる炭素源を枯渇させた後、グルコース、ＭｇＳＯ４×７Ｈ２Ｏ、ＴＭＳ、及びＨ３ＰＯ４を含有する滅菌供給溶液を、所定の非線形プロファイルを用いて、炭素制限方式で連続的に供給した。７５ｇ／ｋｇのラクトース一水和物を、グルコース供給開始の１時間後から開始して３０分以内に添加した。２８％のＮＨ４ＯＨ溶液で滴定することにより、発酵中のｐＨを６．８に制御した。エアレーションは、大気を使用して１ｖｖｍであり、溶存酸素は、３０％超の空気飽和で制御された。グルコース供給開始後１５分で、表８及び９に示すように、発酵温度設定値を３３℃から調査中のそれぞれの設定値まで下げた。これらの温度低下は、３時間にわたる直線傾斜で実行された。発酵の終了は、ＨＭＯミックスとラクトースの標的組成に達したときに、およそ９５～９８時間であった。
【0465】
発酵を通して、ＨＰＬＣを用いてＬＮＦＰ－Ｉ、２’－ＦＬ、ＬＮＴ、ＬＮＴ ＩＩ、ＤＦＬ、ラクトース、及び他の副生成物の濃度を決定するために試料を採取した。全ブロス試料を脱イオン水で３倍に希釈し、２０分間煮沸した。これに続いて、１７０００ｇで３分間遠心分離を行い、その後、得られた上清をＨＰＬＣで分析した。上記の測定値は、ラクトースを含むＨＭＯ（「ＨＭＯＬ」）及びラクトースを含まないＨＭＯ（「ＨＭＯ」）の合計に対する各ＨＭＯの比率を正確に計算するために使用された。
【0466】
［発酵実施の結果］
図６は、異なる産生温度での発酵で株ＭＰ２１によって産生される３つの主要なＨＭＯ、つまりＬＮＦＰ－Ｉ、２’－ＦＬ、及びＬＮＴの発生、並びにアクセプタラクトースの発生を示している。グラフは、各個々の化合物のモル比を全てのＨＭＯ及びラクトースの合計（「ＨＭＯＬ」）で割ったものを示す。驚くべきことに、ＬＮＦＰ－Ｉ／ＨＭＯＬモル比は全ての場合で約４５％に増加するが、２’－ＦＬ及びＬＮＴは温度に大きく依存する挙動を示す。従って、発酵終了時、２’－ＦＬ／ＨＭＯＬのモル比は２０％～５０％の範囲であり、ＬＮＴ／ＨＭＯＬのモル比は１％のわずか下～３．５４％の範囲である。更に、２’－ＦＬ／ＨＭＯＬは、調査範囲（２５～３２℃）で温度に比例して増加する一方、ＬＮＴ／ＨＭＯＬは温度に反比例した挙動を示す、つまり、産生温度が低いほど、ＬＮＴ／ＨＭＯＬのモル比は高くなる。すべての発酵終点モル比を表８に示す。発酵終了時のラクトースはＨＭＯＬに対して約３３％に達する可能性があり、これより低いレベルであってもＨＭＯ／ＨＭＯＬ比が突然変化することはないため、最終発酵試料中のラクトースの残留レベルが非常に低く、望ましい組成を確保するために、発酵プロセスを適切に制御することができると考えられる。可能な限り低い残留ラクトースレベルで終了する改良された発酵プロセスの他に、ラクトース濃度を選択的に下げることに加えて、膜プロセスなどのＤＳＰ操作を適用することもできる。従って、表９で示される組成範囲を有する最終生成物を得ることが実現可能である。従って、生成物の範囲は以下のとおりであり得る：全てのＨＭＯの合計に対してＬＮＦＰ－Ｉ［４７～６３］、２’－ＦＬ［３１～５１］、及びＬＮＴ［１～５］、又はＬＮＦＰ－Ｉ／２’－ＦＬ／ＬＮＴが６３／３１／５～４７／５１／１（全てモル％）である組み合わせ。
図６は、異なる産生温度での発酵で株ＭＰ２１によって産生される３つの主要なＨＭＯ、つまりＬＮＦＰ－Ｉ、２’－ＦＬ、及びＬＮＴの発生、並びにアクセプタラクトースの発生を示している。グラフは、各個々の化合物のモル比を全てのＨＭＯ及びラクトースの合計（「ＨＭＯＬ」）で割ったものを示す。驚くべきことに、ＬＮＦＰ－Ｉ／ＨＭＯＬモル比は全ての場合で約４５％に増加するが、２’－ＦＬ及びＬＮＴは温度に大きく依存する挙動を示す。従って、発酵終了時、２’－ＦＬ／ＨＭＯＬのモル比は２０％～５０％の範囲であり、ＬＮＴ／ＨＭＯＬのモル比は１％のわずか下～３．５４％の範囲である。更に、２’－ＦＬ／ＨＭＯＬは、調査範囲（２５～３２℃）で温度に比例して増加する一方、ＬＮＴ／ＨＭＯＬは温度に反比例した挙動を示す、つまり、産生温度が低いほど、ＬＮＴ／ＨＭＯＬのモル比は高くなる。すべての発酵終点モル比を表８に示す。発酵終了時のラクトースはＨＭＯＬに対して約３３％に達する可能性があり、これより低いレベルであってもＨＭＯ／ＨＭＯＬ比が突然変化することはないため、最終発酵試料中のラクトースの残留レベルが非常に低く、望ましい組成を確保するために、発酵プロセスを適切に制御することができると考えられる。可能な限り低い残留ラクトースレベルで終了する改良された発酵プロセスの他に、ラクトース濃度を選択的に下げることに加えて、膜プロセスなどのＤＳＰ操作を適用することもできる。従って、表９で示される組成範囲を有する最終生成物を得ることが実現可能である。従って、生成物の範囲は以下のとおりであり得る：全てのＨＭＯの合計に対してＬＮＦＰ－Ｉ［４７～６３］、２’－ＦＬ［３１～５１］、及びＬＮＴ［１～５］、又はＬＮＦＰ－Ｉ／２’－ＦＬ／ＬＮＴが６３／３１／５～４７／５１／１（全てモル％）である組み合わせ。
【0467】
［実施例７－発酵中のラクトース濃度調節による、ＬＮＦＰ－Ｉ、２’－ＦＬ、及びＬＮＴのＨＭＯブレンドのバリエーションの生成］
［高又は低ラクトースプロセスによる発酵で試験された株ＭＰ１９及びＭＰ２２の遺伝子型の説明］
以前に報告されたプラットフォームの株（「ＭＤＯ」）に基づいて、表１０にまとめた改変は、この研究で使用したＬＮＦＰ－Ｉ産生株ＭＰ１９及びＭＰ２２を得るために行われたものであり、どちらも完全に染色体株であった。菌株は、四糖類ＨＭＯであるＬＮＴ、及びフコシレートＬＮＴを産生して、更に五糖類ＨＭＯであるＬＮＦＰ－Ｉを得ることができる。この反応に使用した、フコシルトランスフェラーゼ酵素、つまりヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ：ＷＰ＿０８０４７３８６５．１、ただし、Ｃ末端に２つの追加アミノ酸（ＬＧ）を有する、配列番号６）から誘導されるＦｕｔＣ酵素であるα－１，２－フコシロシル－トランスフェラーゼは、ＬＮＴをフコシル化して、これらの菌株の主な産物としてＬＮＦＰ－Ｉを産生できることが判明した。同様に、他のＨＭＯは、発酵中の増殖条件、特に発酵中のアクセプタラクトースの濃度に依存して、主な副生成物である２’－ＦＬ、ＬＮＴ、及びＬＮＴ－ＩＩを様々な濃度で産生されている。実施例６において、発酵中のラクトースレベルの調節が、顕著な量のＬＮＦＰ－Ｉ、２’－ＦＬ、ＬＮＴ、及びＬＮＴ－ＩＩの最大４つのＨＭＯを含むＨＭＯ混合物の特定の標的組成を得るためにどのように使用されるかが実証された。従って、本開示は、発酵中のラクトースの添加が、株ＭＰ１９及びＭＰ２２により産生されるＨＭＯブレンドの組成調節にどのように有利に利用できるかを取り扱っている。２つの菌株の唯一の違いは、異種グリコシルトランスフェラーゼの組み込みのために選択されたゲノム遺伝子座にある。
［高又は低ラクトースプロセスによる発酵で試験された株ＭＰ１９及びＭＰ２２の遺伝子型の説明］
以前に報告されたプラットフォームの株（「ＭＤＯ」）に基づいて、表１０にまとめた改変は、この研究で使用したＬＮＦＰ－Ｉ産生株ＭＰ１９及びＭＰ２２を得るために行われたものであり、どちらも完全に染色体株であった。菌株は、四糖類ＨＭＯであるＬＮＴ、及びフコシレートＬＮＴを産生して、更に五糖類ＨＭＯであるＬＮＦＰ－Ｉを得ることができる。この反応に使用した、フコシルトランスフェラーゼ酵素、つまりヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ：ＷＰ＿０８０４７３８６５．１、ただし、Ｃ末端に２つの追加アミノ酸（ＬＧ）を有する、配列番号６）から誘導されるＦｕｔＣ酵素であるα－１，２－フコシロシル－トランスフェラーゼは、ＬＮＴをフコシル化して、これらの菌株の主な産物としてＬＮＦＰ－Ｉを産生できることが判明した。同様に、他のＨＭＯは、発酵中の増殖条件、特に発酵中のアクセプタラクトースの濃度に依存して、主な副生成物である２’－ＦＬ、ＬＮＴ、及びＬＮＴ－ＩＩを様々な濃度で産生されている。実施例６において、発酵中のラクトースレベルの調節が、顕著な量のＬＮＦＰ－Ｉ、２’－ＦＬ、ＬＮＴ、及びＬＮＴ－ＩＩの最大４つのＨＭＯを含むＨＭＯ混合物の特定の標的組成を得るためにどのように使用されるかが実証された。従って、本開示は、発酵中のラクトースの添加が、株ＭＰ１９及びＭＰ２２により産生されるＨＭＯブレンドの組成調節にどのように有利に利用できるかを取り扱っている。２つの菌株の唯一の違いは、異種グリコシルトランスフェラーゼの組み込みのために選択されたゲノム遺伝子座にある。
【0468】
［高及び低ラクトースレベルによる発酵プロセスの説明］
発酵は、２００ｍＬのＤａｓＢｏｘバイオリアクター（（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で実施し、３０ｇ／ｋｇの炭素源（グルコース）、ＭｇＳＯ４×７Ｈ２Ｏ、ＫＯＨ、ＮａＯＨ、ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４、ＫＨ２ＰＯ４、微量元素溶液、クエン酸、消泡剤、及びチアミンからなる１００ｍＬの規定ミネラル培地から開始した。微量金属溶液（ＴＭＳ）は、Ｍｎ、Ｃｕ、Ｆｅ、硫酸塩としてＺｎ及びクエン酸を含有した。規定の最小培地中で増殖させた２％（ｖ／ｖ）の前培養物を接種することによって発酵を開始した。バッチ培地中に含まれる炭素源を枯渇させた後、グルコース、ＭｇＳＯ４×７Ｈ２Ｏ、ＴＭＳ、及びＨ３ＰＯ４を含有する滅菌供給溶液を、所定の線形プロファイルを用いて、炭素制限方式で連続的に供給した。
発酵は、２００ｍＬのＤａｓＢｏｘバイオリアクター（（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で実施し、３０ｇ／ｋｇの炭素源（グルコース）、ＭｇＳＯ４×７Ｈ２Ｏ、ＫＯＨ、ＮａＯＨ、ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４、ＫＨ２ＰＯ４、微量元素溶液、クエン酸、消泡剤、及びチアミンからなる１００ｍＬの規定ミネラル培地から開始した。微量金属溶液（ＴＭＳ）は、Ｍｎ、Ｃｕ、Ｆｅ、硫酸塩としてＺｎ及びクエン酸を含有した。規定の最小培地中で増殖させた２％（ｖ／ｖ）の前培養物を接種することによって発酵を開始した。バッチ培地中に含まれる炭素源を枯渇させた後、グルコース、ＭｇＳＯ４×７Ｈ２Ｏ、ＴＭＳ、及びＨ３ＰＯ４を含有する滅菌供給溶液を、所定の線形プロファイルを用いて、炭素制限方式で連続的に供給した。
【0469】
ラクトース添加は、高又は低ラクトースプロセスを選択するかどうかに依存して、２つの異なる方法で実施された。高ラクトースプロセス（「Ｌ２Ｆ２０」）において、ラクトース一水和物溶液を２回のボーラス添加により添加し、１回目は供給開始からおよそ１０時間後、２回目は約７０時間ＥＦＴで添加した。低ラクトースプロセス（「Ｌ２Ｆ２１」）において、ラクトースをグルコース供給溶液の一部として連続的に供給した。図７で示すように、これにより、以下のラクトース濃度範囲が得られた：高ラクトースプロセス３０～８０ｇ／Ｌ、低ラクトースプロセス０～１５ｇ／Ｌ。
【0470】
１４％ＮＨ４ＯＨ溶液で滴定することにより、発酵中のｐＨを６．８に制御した。エアレーションは空気を用いて１ｖｖｍに制御し、溶存酸素は撹拌速度によって制御し、空気飽和の２３％以上に維持した。グルコースの供給開始から１５分後に、発酵温度設定値を３３℃から２５℃に下げた。この温度降下は、瞬時に、傾斜なく行った。過剰な泡立ちに関する不安定性が観察されるまで発酵を操作した。
【0471】
発酵を通して、ＨＰＬＣを用いてＬＮＦＰ－Ｉ、２’－ＦＬ、ＬＮＴ、ＬＮＴ－ＩＩ、ＤＦＬ、ラクトース、及び他の副生成物の濃度を決定するために試料を採取した。全ブロス試料を脱イオン水で３倍に希釈し、２０分間煮沸した。これに続いて、１７０００ｇで３分間遠心分離を行い、その後、得られた上清をＨＰＬＣで分析した。上記の測定値は、ＨＭＯの合計（「ＨＭＯ」）に対する各ＨＭＯの比率を正確に計算するために使用された。
【0472】
［発酵実施の結果］
４回の発酵は少なくとも６８．７時間安定して実行された。３つの例では、発酵後期に過剰な泡立ちが発生したが、ＧＤＦ１７２６５は１３８．３時間非常に安定して実行された。比較の理由としては、表１１は、６８．７時間の時点での発酵試料中のＨＭＯ組成を示す。数字は、ＤＦＬを含むこれら４つのＨＭＯの合計（「ＨＭＯ」）に対する、個々のＨＭＯであるＬＮＦＰ－Ｉ、２’－ＦＬ、ＬＮＴ、及びＬＮＴ－ＩＩの比率をモル％で表す。このＨＭＯは最大０．３ｇ／Ｌという微量しか現れないため、ＤＦＬ数値は示されていない。図７に示すように、２つのプロセスは、高ラクトースプロセスであるＬ２Ｆ２０では３０～８０ｇ／Ｌのラクトースレベル、及び低ラクトースプロセスであるＬ２Ｆ２１では０～１５ｇ／Ｌを維持することができる。さもなければ、２つの発酵プロセスは、培地組成、グルコース供給プロファイル、並びに温度、ｐＨ及び溶存酸素などの発酵プロセスパラメーターに関して同一である。
４回の発酵は少なくとも６８．７時間安定して実行された。３つの例では、発酵後期に過剰な泡立ちが発生したが、ＧＤＦ１７２６５は１３８．３時間非常に安定して実行された。比較の理由としては、表１１は、６８．７時間の時点での発酵試料中のＨＭＯ組成を示す。数字は、ＤＦＬを含むこれら４つのＨＭＯの合計（「ＨＭＯ」）に対する、個々のＨＭＯであるＬＮＦＰ－Ｉ、２’－ＦＬ、ＬＮＴ、及びＬＮＴ－ＩＩの比率をモル％で表す。このＨＭＯは最大０．３ｇ／Ｌという微量しか現れないため、ＤＦＬ数値は示されていない。図７に示すように、２つのプロセスは、高ラクトースプロセスであるＬ２Ｆ２０では３０～８０ｇ／Ｌのラクトースレベル、及び低ラクトースプロセスであるＬ２Ｆ２１では０～１５ｇ／Ｌを維持することができる。さもなければ、２つの発酵プロセスは、培地組成、グルコース供給プロファイル、並びに温度、ｐＨ及び溶存酸素などの発酵プロセスパラメーターに関して同一である。
【0473】
更に、図８に示すように、全ての発酵における主要なＨＭＯ生成物は、産生される全ＨＭＯの６５％～８０％の範囲のＬＮＦＰ－Ｉである。このレベルは発酵の早い段階、つまり約４０時間からすでに到達しており、全体を通して実質的に変化しない。更に、ＬＮＦＰ－Ｉ／ＨＭＯ比は、ラクトースレベルとはほぼ無関係であり、即ち、試験した両方の菌株の低ラクトースプロセスでわずかに高くなるだけである。
【0474】
最終的には、図９ａ～ｃは、４回の実施全体にわたる発酵ブロス中の３つの生成物比２’－ＦＬ／ＨＭＯ、ＬＮＴ／ＨＭＯ、及びＬＮＴ ＩＩ／ＨＭＯの時間プロファイルを示す。データは、ラクトース濃度に大きく依存する２つの主要な生成物組成を明らかにしている。高ラクトースプロセス（Ｌ２Ｆ２０）において、ＨＭＯ生成物プロファイルは、（降順で）ＬＮＦＰ－Ｉ＞２’－ＦＬ＞ＬＮＴ＞ＬＮＴ ＩＩである。低ラクトースプロセス（Ｌ２Ｆ２１）において、ＨＭＯ生成物プロファイルは、ＬＮＦＰ－Ｉ＞ＬＮＴ＞ＬＮＴ－ＩＩ＞＝２’－ＦＬである。これは、調査した両方の株に等しく当てはまる。従って、表１１に示すように、高ラクトースプロセスについては、モル％で以下の範囲を見出すことができる：全てのＨＭＯの合計に対してＬＮＦＰ－Ｉ［４７～６３］、２’－ＦＬ［３１～５１］、及びＬＮＴ［１～５］、又はＬＮＦＰ－Ｉ／２’－ＦＬ／ＬＮＴが６３／３１／５～４７／５１／１（全てモル％）である組み合わせ。また、低ラクトースプロセスについては、モル％で以下の範囲が見つかった：ＬＮＦＰ－Ｉ／ＨＭＯ［６６～７０］、２’－ＦＬ／ＨＭＯ［２５～３０］、ＬＮＴ／ＨＭＯ［３～４］、ＬＮＴ－ＩＩ／ＨＭＯ［１～１．５］。
【0475】
従って、ラクトース濃度は、主にＬＮＦＰ－Ｉを含むＨＭＯブレンドの産生中に、３～４種類の主なＨＭＯの所定の望ましいプロファイルを達成するための強力な制御ツールとなり得る。
【0476】
［実施例８－Ｓｍｏｂ酵素である異種ＭＦＳトランスポータＮｅｃ又はＹｂｅｒＣの同時発現により、ＬＮＦＰ－Ｉ形成が増加する］
本実施例は、最適化された菌株操作アプローチにより、ＬＮＦＰ－Ｉ対２’－ＦＬの比率が高く、生成物のかなりの画分が培養上清中に見出される株を構築する。
本実施例は、最適化された菌株操作アプローチにより、ＬＮＦＰ－Ｉ対２’－ＦＬの比率が高く、生成物のかなりの画分が培養上清中に見出される株を構築する。
【0477】
［株ＭＰ８、ＭＰ２３、ＭＰ２４、及びＭＰ２５の遺伝子型の説明］
以前に報告されたプラットフォームの株（「ＭＤＯ」）に基づいて、表１２にまとめた改変は、完全染色体株ＭＰ８、ＭＰ２３、ＭＰ２４、及びＭＰ２５を得るために行われたものであった。菌株は、五糖類ＨＭＯであるＬＮＦＰ－Ｉを産生することができる。グリコシルトランスフェラーゼ酵素である、Ｎ．メニンギティディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）からのＬｇｔＡ（β－１，３－Ｎ－アセチルグルコサミントランスフェラーゼ）、Ｈ．ピロリ（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）からのＧａｌＴＫ（β－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼ）、及びＳ．モビリス（Ｓ．Ｍｏｂｉｌｉｓ）からのＳｍｏｂ（α－１，２－フコシルトランスフェラーゼ）は、４つの株全てに存在する。更に、株ＭＰ６は、エルシニア・ベルコビエリ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｂｅｒｃｏｖｉｅｒｉ）からの主要ファシリテータースーパーファミリー（ＭＦＳ）であるＹｂｅｒＣの異種トランスポータを発現する一方で、株ＭＰ５及びＭＰ７は、ローゼンベルギエラ・ネクタレア（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇｉｅｌｌａ ｎｅｃｔａｒｅａ）からの異種ＭＦＳトランスポータであるＮｅｃを発現する。後者の２つの菌株の唯一の違いは、ｎｅｃ遺伝子の発現を駆動するプロモータの強度にある、つまり、株ＭＰ５にはＰｇｌｐＦ駆動ｎｅｃコピーが存在するが、株ＭＰ７は、Ｐｌａｃプロモータの制御下でｎｅｃ遺伝子を発現する。
以前に報告されたプラットフォームの株（「ＭＤＯ」）に基づいて、表１２にまとめた改変は、完全染色体株ＭＰ８、ＭＰ２３、ＭＰ２４、及びＭＰ２５を得るために行われたものであった。菌株は、五糖類ＨＭＯであるＬＮＦＰ－Ｉを産生することができる。グリコシルトランスフェラーゼ酵素である、Ｎ．メニンギティディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）からのＬｇｔＡ（β－１，３－Ｎ－アセチルグルコサミントランスフェラーゼ）、Ｈ．ピロリ（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）からのＧａｌＴＫ（β－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼ）、及びＳ．モビリス（Ｓ．Ｍｏｂｉｌｉｓ）からのＳｍｏｂ（α－１，２－フコシルトランスフェラーゼ）は、４つの株全てに存在する。更に、株ＭＰ６は、エルシニア・ベルコビエリ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｂｅｒｃｏｖｉｅｒｉ）からの主要ファシリテータースーパーファミリー（ＭＦＳ）であるＹｂｅｒＣの異種トランスポータを発現する一方で、株ＭＰ５及びＭＰ７は、ローゼンベルギエラ・ネクタレア（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇｉｅｌｌａ ｎｅｃｔａｒｅａ）からの異種ＭＦＳトランスポータであるＮｅｃを発現する。後者の２つの菌株の唯一の違いは、ｎｅｃ遺伝子の発現を駆動するプロモータの強度にある、つまり、株ＭＰ５にはＰｇｌｐＦ駆動ｎｅｃコピーが存在するが、株ＭＰ７は、Ｐｌａｃプロモータの制御下でｎｅｃ遺伝子を発現する。
【0478】
［ディープウェルアッセイの結果］
「材料及び方法選択」で記載されたように、菌株をディープウェルアッセイで特性評価した（ただし、２０％ラクトース溶液（１０ｍＬ又は７５ｍＬ）を使用した）。各試料で検出されたＨＭＯの濃度を使用して、試験した株のＨＭＯ含有量における定量的差異の％を計算した、即ち、異種トランスポータを発現しない細胞のＨＭＯ含有量に対するｎｅｃ及びｙｂｅｒＣ発現細胞のＨＭＯ含有量％。
「材料及び方法選択」で記載されたように、菌株をディープウェルアッセイで特性評価した（ただし、２０％ラクトース溶液（１０ｍＬ又は７５ｍＬ）を使用した）。各試料で検出されたＨＭＯの濃度を使用して、試験した株のＨＭＯ含有量における定量的差異の％を計算した、即ち、異種トランスポータを発現しない細胞のＨＭＯ含有量に対するｎｅｃ及びｙｂｅｒＣ発現細胞のＨＭＯ含有量％。
【0479】
新しく形成された目的のＨＭＯは、ＨＭＯによって課される浸透圧ストレスから細胞を緩和するために細胞外に輸送される必要がある。糖エクスポータの特定及びその発現の微妙なバランスが、このような産生システムの成功の鍵となり得る。ただし、選択した糖エクスポータによって結合及び輸送されなければならないのは、その前駆体又は伸長バージョンではなく、目的のＨＭＯのみであるため、この作業は困難になり得る。
【0480】
本実施例において、Ｎｅｃ及びＹｂｅｒＣ糖トランスポータは、ＬＮＦＰ－Ｉ生成物を細胞外に輸送できることが示されている。詳細には、ＭＦＳトランスポータを発現しない細胞（株ＭＰ８）の上清では、全ＬＮＦＰ－Ｉの２４％のみが検出されたが、合成されたＬＮＦＰ－Ｉの約３８％が、Ｎｅｃトランスポータを発現する細胞の培養上清中で検出された（図１０）。
【0481】
更に、ｎｅｃ又はＹｂｅｒＣ糖エクスポータを株に導入すると、細胞によって産生されるＨＭＯブレンドにおけるＬＮＦＰ－Ｉ対２’－ＦＬの比率の変化が誘導される。具体的には、ＭＦＳトランスポータを有する株において、糖トランスポータを発現しない株（株ＭＰ８）と比較した場合、この比は６．７から約７．８に増加する（図１１）。
【0482】
本明細書で記載されるアプローチによれば、ＬＮＦＰ－Ｉ以外のＨＭＯは、操作された細胞によって送達される全ＨＭＯブレンドのごく一部にすぎない。本実施例の枠組みにおいて、異種遺伝子である、ｓｍｏｂ及びｎｅｃ又はｙｂｅｒＣを、すでにＬＮＴを産生している大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ１ Ｋ１２株のゲノムに導入することにより、ＩｇｔＡ遺伝子の高コピー数を有利に使用して、上記の有益な形質を有する効率的なＬＮＦＰ－Ｉ細胞ファクトリーを送達することができる。
【0483】
結論として、β－１，３－Ｎ－アセチルグルコサミントランスフェラーゼＬｇｔＡ、β－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼＧａｌＴＫ、α－１，２－フコシルトランスフェラーゼＳｍｏｂ、及びＭＦＳトランスポータＮｅｃ又はＹｂｅｒＣのいずれかのバランスの取れた発現が、ＬＮＦＰ－Ｉ対２’ＦＬの比率がより高いＨＭＯブレンドを産生するための効果的な菌株操作戦略を構成する。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【配列表】
【国際調査報告】