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▶ ウーシー バイオロジクス アイルランド リミテッドの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-06-03
(54)【発明の名称】遺伝子的に改変されたＮＫ細胞およびその使用
(51)【国際特許分類】
C12N 5/10 20060101AFI20240527BHJP
A61K 35/17 20150101ALI20240527BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240527BHJP
A61P 35/02 20060101ALI20240527BHJP
A61P 9/10 20060101ALI20240527BHJP
A61P 3/10 20060101ALI20240527BHJP
A61P 1/16 20060101ALI20240527BHJP
A61P 19/02 20060101ALI20240527BHJP
A61K 47/68 20170101ALI20240527BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20240527BHJP
C12N 5/0783 20100101ALN20240527BHJP
C12N 15/12 20060101ALN20240527BHJP
C12N 15/13 20060101ALN20240527BHJP
C12N 15/62 20060101ALN20240527BHJP
C12N 15/09 20060101ALN20240527BHJP
【ＦＩ】
C12N5/10 ZNA
A61K35/17
A61P35/00
A61P35/02
A61P9/10 101
A61P3/10
A61P1/16
A61P19/02
A61K47/68
A61K39/395 H
C12N5/0783
C12N15/12
C12N15/13
C12N15/62 Z
C12N15/09 110
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023571468
(86)(22)【出願日】2022-05-19
(85)【翻訳文提出日】2024-01-16
(86)【国際出願番号】 CN2022093747
(87)【国際公開番号】W WO2022242700
(87)【国際公開日】2022-11-24
(31)【優先権主張番号】PCT/CN2021/094830
(32)【優先日】2021-05-20
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】518330176
【氏名又は名称】ウーシー バイオロジクス アイルランド リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100145403
【弁理士】
【氏名又は名称】山尾 憲人
(74)【代理人】
【識別番号】100122301
【弁理士】
【氏名又は名称】冨田 憲史
(74)【代理人】
【識別番号】100170520
【弁理士】
【氏名又は名称】笹倉 真奈美
(74)【代理人】
【識別番号】100221545
【弁理士】
【氏名又は名称】白江 雄介
(72)【発明者】
【氏名】ジェン，ヨン
(72)【発明者】
【氏名】ウー，チオン
(72)【発明者】
【氏名】ツァオ，ロイシウ
(72)【発明者】
【氏名】グゥ，ジージエ
【テーマコード（参考）】
4B065
4C076
4C085
4C087
【Ｆターム（参考）】
4B065AA90X
4B065AA90Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA01
4C076CC41
4C076CC50
4C076EE59
4C085AA14
4C085BB11
4C087AA01
4C087AA02
4C087BB65
4C087NA14
4C087ZA45
4C087ZA75
4C087ZA96
4C087ZB26
4C087ZB27
4C087ZC35
(57)【要約】
遺伝子的に改変されたＮＫ細胞とその使用を提供する。前記の改変されたＮＫ細胞は、癌のＣＡＲ－ＮＫ細胞の養子細胞療法に使用され得る。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＴＩＧＩＴ、ＮＫＧ２Ａ、およびＣＩＳＨのうちの二つまたは三つの機能的発現を損なうために改変される、単離された改変されたＮＫ細胞。
【請求項2】
ＴＩＧＩＴ、ＮＫＧ２Ａ、およびＣＩＳＨのうちの一つまたは二つまたは三つの機能的発現を損なうために改変される、ならびにキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をさらに含む、単離された改変されたＮＫ細胞。
【請求項3】
前記機能的発現が、遺伝子ノックアウト、遺伝子突然変異、遺伝子欠損、遺伝子サイレンシング、または前述のいずれかの組み合わせにより減少または除去される、請求項１または２に記載の改変されたＮＫ細胞。
【請求項4】
前記機能的発現が、ＣＲＩＳＰＲシステム、ＴＡＬＥＮシステム、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）システム、メガヌクレアーゼシステム、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、短ヘアピンＲＮＡ、または前述のいずれかの組み合わせを用いて減少または除去される、請求項１または２に記載の改変されたＮＫ細胞。
【請求項5】
前記機能的発現がＣＲＩＳＰＲシステムを使用して減少または除去される、および使用されるｓｇＲＮＡが、配列番号１～６、配列番号７～１８、および配列番号１９～２４から選択される、請求項１または２に記載の改変されたＮＫ細胞。
【請求項6】
機能的発現の損ないが、損ないが存在しない対応するＮＫ細胞と比較して、改変されたＮＫ細胞中の標的遺伝子の発現を少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％減少させる、請求項１または２に記載の改変されたＮＫ細胞。
【請求項7】
ＮＫ細胞が、脊椎動物の臍帯血、末梢血および／または胎盤（例えば、ヒトまたはげっ歯動物細胞）、および人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）からなる群から誘導されるものである、および／またはＮＫ細胞が自己または同種異系のものである、請求項１または２に記載の改変されたＮＫ細胞。
【請求項8】
ＣＡＲが（ｉ）抗原認識ドメイン、（ｉｉ）細胞外ヒンジ領域、（ｉｉｉ）膜貫通ドメイン、および（ｉｖ）細胞内シグナル伝達ドメイン、を含む、請求項２に記載の改変されたＮＫ細胞。
【請求項9】
抗原認識ドメインが、標的細胞上で発現するが、健康細胞上では発現しない抗原を標的とする抗体またはその抗原結合断片であり、例えば、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）として結合されたモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の可変領域、もしくは重鎖抗体（ＶＨＨ）の重鎖可変ドメインに由来する抗原認識ドメインである、ならびに／または抗原認識ドメインが、サイトカイン、自然免疫受容体、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー、成長因子、および／もしくは構造タンパク質などの天然リガンド／受容体ペアのメンバーである、請求項８に記載の改変されたＮＫ細胞。
【請求項10】
抗原認識ドメインが、以下：ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＨＥＲ２、ＢＣＭＡおよび／またはＥＧＦＲ－ＴＨＲ、ＣＤ１９、ＣＤ１２３、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ１７１、ＣＳ－１、ＣＬＬ－１、ＣＤ３３、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＧＤ２、ＧＤ３、ＢＣＭＡ、ＴｎＡｇ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＦＬＴ３、ＦＡＰ、ＴＡＧ７２、ＣＤ３８、ＣＤ４４ｖ６、ＣＥＡ、ＥＰＣＡＭ、Ｂ７Ｈ３、ＫＩＴ、ＩＬ－１３Ｒａ２、レチクル、ＩＬ－１１Ｒａ、ＰＳＣＡ、ＰＲＳＳ２１、ＶＥＧＦＲ２、ＬｅｗｉｓＹ、ＣＤ２４、ＰＤＧＦＲβ、ＳＳＥＡ－４、ＣＤ２Ｏ、葉酸受容体α、ＥＲＢＢ２（ＨＥＲ２／ｎｅｕ）、ＭＵＣ１、ＥＧＦＲ、ＮＣＡＭ、プロテアーゼ、ＰＡＰ、ＥＬＦ２Ｍ、ＥｐｈｒｉｎＢ２、ＩＧＦ－Ｉ受容体、ＣＡＩＸ、ＬＭＰ２、ｇｐ１００、ｂｃｒ－ａｂｌ、チロシナーゼ、ＥｐｈＡ２、フコシルＧＭ１、ｓＬｅ、ＧＭ３、ＴＧＳ５、ＨＭＷＭＡＡ、ｏ－アセチル－ＧＤ２、葉酸受容体β、ＴＥＭ１／ＣＤ２４８、ＴＥＭ７Ｒ、ＣＬＤＮ６、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＣＸＯＲＦ６１、ＣＤ９７、ＣＤ１７９ａ、ＡＬＫ、ポリシアル酸、ＰＬＡＣ１、ＧｌｏｂｏＨ、ＮＹＫ－ＢＲ－１、ＵＰＫ２、ＨＡＶＣＲ１、ＡＤＲＢ３、ＰＡＮＸ３、ＧＰＲ２Ｏ、ＬＹ６Ｋ、０Ｒ５１Ｅ２、ＴＡＲＰ、ＷＴ１、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＬＡＧＥｌａ、ＭＡＧＥ－Ａ１、レグマイン、ＨＰＶ Ｅ６、Ｅ７、ＭＡＧＥ Ａｌ、ＥＴＶ６－ＡＭＬ、精子タンパク質１７、ＸＡＧＥ１、Ｔｉｅ２、ＭＡＤ－ＣＴ－１、ＭＡＤＣＴ－２、Ｆｏｓ関連抗原１、ｐ５３、ｐ５３変異体、ｐｒｏｓｔｅｉｎ、サバイビンおよびテロメラーゼ、ＰＣＴＡ－１／Ｇａｌｅｃｔｉｎ８、ｍｅｌａｎＡＩ ＭＡＲＴ１、Ｒａｓ変異体、ｈＴＥＲＴ、肉腫転位断点（ｓａｒｃｏｍａ ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ ｂｒｅａｋｐｏｉｎｔｓ）、ＭＬ－ＩＡＰ、ＥＲＧ（ＴＭＰＲＳＳ２－ＥＴＳ融合遺伝子）、ＮＡ１７、ＰＡ１Ｘ３、アンドロゲン受容体、サイクリンＢ１、ＭＹＣＮ、ＲｈｏＣ、ＴＲＰ－２、ＣＹＰ１Ｂ１、ＢＯＲＩＳ、ＳＡＲＴ３、ＰＡＸ５、ＯＹ－ＴＥＳ１、ＬＣＫ、ＡＫＡＰ－４、ＳＳＸ２、ＲＡＧＥ－１、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＲＵ１、ＲＵ２、腸カルボキシルエステラーゼ、ｍｕｔ ｈｓｐ７０－２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ７２、ＬＡＩＲ１、ＦＣＡＲ、ＬＩＬＲＡ２、ＣＤ３００ＬＦ、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＢＳＴ２、ＥＭＲ２、ＬＹ７５、ＧＰＣ３、ＦＣＲ３ＭＬＳおよびＩＧＬＬ１、ならびにウロキナーゼ型プラスミノゲンアクチベータ受容体（ｕＰＡＲ）、からなる群より選択される１つまたは複数の抗原を標的とする、請求項８に記載の改変されたＮＫ細胞。
【請求項11】
ＣＡＲが、ＣＤ３ζエンドドメイン（例えば、配列番号３９のアミノ酸配列、または配列番号４０を含むヌクレオチド分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド）、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７、例えば配列番号３１のアミノ酸配列、または配列番号３２を含むヌクレオチド分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド）、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４Ｏ、ＰＤ－１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３、ＣＤ８３と特異的に結合するリガンド、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ－１、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８Ｏ（ＫＬＲＦ１）、ＣＤ１６Ｏ、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８α、ＣＤ８β、ＩＬ２Ｒβ、ＩＬ２Ｒγ、ＩＬ７Ｒα、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ－６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１Ｏ３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＢ７、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＣＤ１６Ｏ（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ－Ａ、Ｌｙ１Ｏ８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１ＳＯ、ＩＰＯ－３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＧＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ－７６、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６およびＮＫＧ２Ｄから選択される共刺激シグナル伝達ドメインを含む、請求項８に記載の改変されたＮＫ細胞。
【請求項12】
ＣＡＲが、ベクター、例えばレンチウイルスベクターまたはレトロウイルスベクター（例えばγ－レトロウイルスベクター、ｐＭＳＣＶ ＳＦＦＶ）を介して、および／またはＣＲＩＳＰＲシステムを介してＮＫ細胞に形質導入される、請求項８に記載の改変されたＮＫ細胞。
【請求項13】
改変されたＮＫ細胞が、細胞集団、細胞培養物または製品中にある、請求項１または２に記載の改変されたＮＫ細胞。
【請求項14】
改変されたＮＫ細胞が、ＴＩＧＩＴ、ＮＫＧ２ＡおよびＣＩＳＨのうちの１つまたは複数の機能的発現を損なわないＮＫ細胞と比較して、以下：（ａ）ＴＩＧＩＴ、ＮＫＧ２ＡおよびＣＩＳＨのうちの１つまたは複数の機能的発現が減少または除去される；
（ｂ）インビトロおよび／またはインビボ細胞の増幅が増加される；
（ｃ）インビトロおよび／またはインビボ細胞の寿命が延長される；
（ｄ）インビボ細胞枯渇が改善される；
（ｅ）ＮＫ細胞の標的細胞に対する細胞毒性が高められる；および／または
（ｆ）ＮＫ細胞によって、サイトカイン、インターロイキンおよび／または成長因子の分泌が調節される、
のうちの１つまたは複数の特徴を有する、請求項１または２に記載の改変されたＮＫ細胞
【請求項15】
以下の工程：（ｉ）ＮＫ細胞を提供する工程；（ｉｉ）ＴＩＧＩＴ、ＮＫＧ２ＡおよびＣＩＳＨのうちの１つまたは複数の機能的発現を損なうようにＮＫ細胞を改変する工程；（ｉｉｉ）任意にはＮＫ細胞を改変して、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含むようにする工程；および（ｉｖ）任意には改変された細胞を増幅する工程、を含む、請求項１から１４のいずれか一項に記載の改変されたＮＫ細胞を製造する方法。
【請求項16】
工程（ｉｉ）は、工程（ｉｉｉ）の前、同時、または後に行われる；および／または工程（ｉｖ）は、工程（ｉ）～（ｉｉｉ）のうちの１つまたは複数の前または後に行われる、請求項１５に記載の方法。
【請求項17】
疾患を治療する製品の調製における、請求項１～１４のいずれか一項に記載の改変されたＮＫ細胞の使用。
【請求項18】
有効量の請求項１～１４のいずれか一項に記載の改変されたＮＫ細胞を投与することを含む、それを必要とする対象において疾患を治療する方法。
【請求項19】
疾患の治療における使用のための、請求項１～１４のいずれか一項に記載の改変されたＮＫ細胞。
【請求項20】
治療が養子細胞療法、好ましくはＣＡＲ－ＮＫ養子細胞療法である、請求項１７に記載の使用、または請求項１８に記載の方法、または疾患の治療における使用のための請求項１９に記載の改変されたＮＫ細胞。
【請求項21】
疾患が、癌、自己免疫性疾患、伝染病、移植拒絶反応および他の年齢関連疾患から選択される、請求項１７に記載の使用、または請求項１８に記載の方法、または疾患の治療における使用のための請求項１９に記載の改変されたＮＫ細胞。
【請求項22】
疾患が、癌腫、肉腫、メラノーマ、リンパ腫および白血病からなる群より選択される、ならびに／または、血液系、リンパ系、消化系、呼吸器系、生殖系、運動器系、および神経系の癌から選択される癌である、請求項１７に記載の使用、または請求項１８に記載の方法、または疾患の治療における使用のための請求項１９に記載の改変されたＮＫ細胞。
【請求項23】
疾患が、アテローム性動脈硬化症、糖尿病、肝線維症および変形性関節症からなる群より選択される、請求項１７に記載の使用、または請求項１８に記載の方法、または疾患の治療における使用のための請求項１９に記載の改変されたＮＫ細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
技術分野
本開示は、遺伝子工学と免疫療法に関する。特に、がんの養子細胞療法および／またはＣＡＲ－ＮＫ療法のような疾患の治療における遺伝子的に改変されたＮＫ細胞およびその使用に関する。
本開示は、遺伝子工学と免疫療法に関する。特に、がんの養子細胞療法および／またはＣＡＲ－ＮＫ療法のような疾患の治療における遺伝子的に改変されたＮＫ細胞およびその使用に関する。
【背景技術】
【0002】
背景
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞はヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の１５％を占め、腫瘍とウイルス感染を防ぐ上で重要な役割を果たしている細胞毒性リンパ細胞であり、現在、それは適応免疫系と自然免疫系をつなぐ重要な構成部分であることが知られている。
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞はヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の１５％を占め、腫瘍とウイルス感染を防ぐ上で重要な役割を果たしている細胞毒性リンパ細胞であり、現在、それは適応免疫系と自然免疫系をつなぐ重要な構成部分であることが知られている。
【0003】
ＮＫ細胞の活性は、標的細胞または抗原提示細胞上の対応するリガンドを認識する一連の共刺激（例えばＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ２２６）と共抑制表面受容体（例えばＰＤ－１、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ９６、ＴＩＭ－３、ＬＡＧ－３、ＮＫＧ２Ａ）によって調節される。共刺激と共抑制シグナルの統合は、ＮＫ細胞の反応性を決定する。
【0004】
ＮＫとＴ細胞に発現される膜貫通糖タンパク質受容体であるＴＩＧＩＴ（免疫グロブリンとＩＴＩＭドメインを有するＴ細胞免疫受容体）は、Ｔ細胞とＮＫ細胞の活性化を抑制する免疫チェックポイント分子である。ＩｇＶドメイン、膜貫通ドメイン、および免疫受容体抑制性チロシンモチーフ（ＩＴＩＭ， ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｒｏｓｉｎｅ－ｂａｓｅｄ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｍｏｔｉｆ）を含む。ＣＤ９６は、同じ免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーであり、類似の抑制作用を持つが、ＴＩＧＩＴに比べて、リガンドＣＤ１５５との結合親和性は低い。ＣＤ１５５（主に）とＣＤ１１２は、Ｔ細胞とＮＫ細胞が媒介する免疫を抑制するために、ＴＩＧＩＴとＣＤ９６が結合するリガンドとして作用する。ＣＤ１５５（ポリオウイルス受容体、ＰＶＲ）は正常な人体組織ではほとんど発現しないが、各種腫瘍細胞系と原発性悪性腫瘍では高くに発現する。臨床前および臨床証拠は、モノクローナル抗体によるＴＩＧＩＴ遮断が、ＮＫ細胞およびＴ細胞の抗腫瘍および抗ウイルス活性を増強することを証明した。
【0005】
ＮＫＧ２Ａ（ＮＫグループ２メンバーＡ）は、ＣＤ９４とヘテロ二量体を形成するＩＩ型膜受容体であるＮＫＧ２ファミリーのＮＫ細胞受容体である。ＮＫＧ２ＡはＣＤ９４と二量化し、Ｃ型凝集体と相関する、ＨＬＡ－Ｅを認識する抑制性受容体を形成する。これらの抑制性受容体は標的細胞上のＭＨＣ Ｉリガンドと相互作用し、それにより、細胞粒子の分極を完全に抑制し、細胞毒性粒子の放出を防止する。ＮＫＧ２Ａは、その細胞質尾部に、２つのＩＴＩＭを含む。これらのＩＴＩＭは、ＩＴＩＭ含有受容体と結合した後にリン酸化され、ＳＨ２ドメイン含有ホスファターゼ（ＳＨＰ）－１とＳＨＰ－２などのチロシンホスファターゼの募集を促進する。ＩＮＫ細胞中の大部の下流シグナルを遮断するため、ＩＴＩＭ含有受容体によるＳＨＰ－１の募集は、シグナル伝達の開始を抑制するように見える。血液腫瘍と実体腫瘍の腫瘍細胞には、ＨＬＡ－Ｅ発現のアップレギュレーションを示した。種々のがんにおいて、不良予後は、ＨＬＡ－Ｅのアップレギュレーションと関係がある。そして、抗体によるＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ受容体の遮断を、治療戦略とすることができる
【0006】
ＮＫ細胞における重要な負の細胞内免疫チェックポイントであるＣＩＳＨ（サイトカイン誘導ＳＨ２含有タンパク質）は、細胞内サイトカインシグナル伝達抑制因子（ＳＯＣＳ）ファミリーのメンバーであり、サイトカインと成長因子シグナル伝達経路の重要な調節因子である。他のメンバーと同様に、ＣＩＳＨは、中心ＳＨ２ドメインを有し、このドメインは、リン酸チロシン残基とユビキチン転移酵素系を募集するＳＯＸボックスモチーフと相互作用し、プロテアソームの分解を誘導することができる。ＣＩＳＨはＩＬ－１５に反応して急速に誘導されるが、ＣＩＳＨを欠損したＮＫ細胞は、ＩＬ－１５に対してより敏感であり、増殖、サイトカインの産生、腫瘍に対する細胞毒性が増強されることを特徴とする。
【0007】
遺伝子改変は、Ｔ細胞、樹状細胞、ＮＫ細胞を含む様々な細胞タイプの機能を再配向（ｒｅｄｉｒｅｃｔｉｎｇ）することが期待される。特に、さまざまな腫瘍抗原に対してＴ細胞を遺伝子的に再配向することについて、多くの研究がなされてきた。しかし、初代ＮＫ細胞の遺伝子的改変における困難は、この領域がＴ細胞にある程度遅れることをもたらす。いくつかの研究では、サイトカインの導入遺伝子（例えばＩＬ－２、ＩＬ－１２またはＩＬ－１５の導入遺伝子）を用いてＮＫ細胞を改変し、それにより細胞に必要なサイトカインを直接提供することにより、ＮＫ細胞機能を増強する。しかし、多くの研究では、キメラ受容体よるＮＫ細胞特異性の再配向が記述された。
【0008】
製造および使用中に、長期持続性があり、増強した抗腫瘍作用と減少した副作用を有するＮＫ細胞が依然として必要である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0009】
発明の概要
本明細書は、遺伝子的に改変されたＮＫ細胞およびその疾患治療における使用、例えばがんの養子細胞療法における使用を開示する。
本明細書は、遺伝子的に改変されたＮＫ細胞およびその疾患治療における使用、例えばがんの養子細胞療法における使用を開示する。
【0010】
本明細書の第１の態様として、ＴＩＧＩＴ、ＮＫＧ２ＡおよびＣＩＳＨのうちの１つまたは複数の機能的発現を損なうために改変された、単離された遺伝子的に改変されたＮＫ細胞を開示する。いくつかの実施形態によれば、ＮＫ細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をさらに含んでも良い。
【0011】
いくつかの実施形態では、単離された改変されたＮＫ細胞が提供される、ここでＮＫ細胞は改変されてＴＩＧＩＴ、ＮＫＧ２Ａ、およびＣＩＳＨのうちの少なくとも二つの機能的発現を損なう。
【0012】
いくつかの実施形態では、単離された改変されたＮＫ細胞が提供される、ここでＮＫ細胞は改変されて、ＴＩＧＩＴ、ＮＫＧ２Ａ、およびＣＩＳＨのうちの１つまたは複数の機能的発現を損なう、ならびにここでＮＫ細胞はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をさらに含む。
【0013】
本明細書の第２の態様として、本明細書に記載の改変されたＮＫ細胞を含む細胞集団または細胞培養物を開示する。
【0014】
本明細書の第３の態様として、本明細書に記載の改変されたＮＫ細胞、細胞集団または細胞培養物を含む製品を開示する。いくつかの実施形態では、製品は、医薬品、医薬組成物、またはキットである。
【0015】
本明細書の第４の態様として、本明細書に記載の改変されたＮＫ細胞を調製するための方法を開示する。
【0016】
本明細書の第５の態様として、疾患を治療する製品の調製における本明細書に記載の改変されたＮＫ細胞、細胞集団または細胞培養物の使用を開示する。
【0017】
本明細書の第６の態様として、必要とする対象における疾患を治療する方法を開示し、前記の方法は、有効量の本明細書に記載の改変されたＮＫ細胞、細胞集団、細胞培養物または製品を投与することを含む。
【0018】
本明細書の第７の態様として、疾患を治療するための、本明細書に記載の改変されたＮＫ細胞、細胞集団、細胞培養物または製品を開示する。
【0019】
本願の他の目的、特徴、利点、および態様は、以下の説明および添付の請求の範囲から当業者にとって明らかになる。しかしながら、以下の説明、添付の請求の範囲および具体的な実施例は、本願の好適な実施形態を示すが、例示的に説明として与えられることを理解すべきである。以下を読むことにより、開示された発明の要旨および範囲内の様々な変更および改変が当業者に容易に理解される。
【図面の簡単な説明】
【0020】
本発明の新規な特徴は、添付の請求の範囲に記載される。以下の詳細な説明を参照することにより、本発明の特徴と利点のより良い理解が得られ、この詳細な説明は、本発明の原理を利用した例示的な実施形態を説明する：
【図12】図１２Ａ－１２Ｂは、Ｒａｊｉ－ｌｕｃ標的細胞に対するｍＣＤ１９ ＣＡＲ－ＮＫ細胞の細胞毒性試験の結果を示す。統計データは二元配置分散分析によって分析される。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。
【発明を実施するための形態】
【0021】
発明の詳細な説明
以下の説明および実施例は、本発明の実施形態を詳細に説明する。本発明は、本明細書に記載の特定の実施形態に限定されるものではないので、変更することができることを理解すべきである。当業者であれば、本発明には多くの変更および修正が存在し、これらの変更および修正は本発明の範囲内に含まれることを認識すべきである。
以下の説明および実施例は、本発明の実施形態を詳細に説明する。本発明は、本明細書に記載の特定の実施形態に限定されるものではないので、変更することができることを理解すべきである。当業者であれば、本発明には多くの変更および修正が存在し、これらの変更および修正は本発明の範囲内に含まれることを認識すべきである。
【0022】
本開示は、主に、ＮＫ細胞中のＴＩＧＩＴ、ＮＫＧ２Ａおよび／またはＣＩＳＨの機能的発現を損なうことにより、遺伝子的に改変されたＮＫ細胞の細胞毒性を著しく改善し、ＮＫ細胞のインビトロまたはインビボ寿命を延長することができるという予期しない知見に基づく。この知見に基づいて、本開示は、遺伝子的に改変されたＮＫ細胞およびその製造方法を提供する、ここでＮＫ細胞のＴＩＧＩＴ、ＮＫＧ２Ａおよび／またはＣＩＳＨのうちの少なくとも１つが損なわれ、およびここでＮＫ細胞は、キメラ抗原受容体をさらに含んでも良いか、またはキメラ抗原受容体と結合しても良い。本明細書では、本開示のＮＫ細胞を含む細胞集団、細胞培養物または製品、ならびに癌、自己免疫性疾患、伝染病、移植拒絶反応および他の年齢関連疾患の治療におけるそれらの使用をさらに提供する。
【0023】
特に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術および科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者が一般に理解するものと同じ意味を有する。本開示は、本開示に記載のものと同様または同等の任意の方法および材料を用いて実施または試験することができるが、好ましい方法および材料が記載される。
【0024】
本明細書で使用する場合、用語「一つ」または「一個」は、文書文法オブジェクトの「１つまたは複数」（すなわち、少なくとも１つ）を表すことを意図する。文脈に別の定義がない限り、単数表現には複数の表現が含まれる。例えば、「一つの要素」は、一つの要素または複数の要素を意味する。
【0025】
「約」は、基準の数、レベル、値、回数、頻度、百分率、寸法、サイズ、量、重量、または長さに対して、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１％で変化する数、レベル、値、回数、頻度、百分率、寸法、サイズ、量、重量、または長さを意味する。
【0026】
特に指示がない限り、「または」の使用は、「および／または」を意味する。
【0027】
本明細書で使用する場合、特に説明がない限り、用語「含む」、「含有」、および「含んで」は、記載された工程もしくは要素、または工程もしくは要素の群を含むと理解すべきであり、任意の他の工程もしくは要素または工程もしくは要素の群を排除するものではない。
【0028】
フレーズ「からなる」は、「からなる」というフレーズの後の内容を含み、且つそれらに限定することを意味する。したがって、「からなる」というフレーズは、列挙された要素が必要または強制的であり、かつ他の要素が存在する可能性があることを意味する。
【0029】
「単離」という用語は、天然状態において通常に付随する成分を実質的にまたは本質的に含まない材料を意味する。前記の材料は、細胞または、タンパク質または核酸などの高分子であってもよい。例えば、本明細書で用いられる「単離された細胞」とは、自然存在状態の細胞から精製された細胞を指す。
【0030】
用語「ＮＫ細胞」または「ナチュラルキラー細胞」は、自然免疫系にとって重要な細胞毒性リンパ球を指す。ＮＫ細胞は、抗腫瘍と抗ウイルス反応を媒介するため、良好な臨床応用の将来性がある。本開示のＮＫ細胞は、血液（例えば、自己または同種異系ＰＢＭＣ）、ＮＫ細胞系（例えばＮＫ－９２、ＮＫＧ、ＹＴ、ＮＫ－ＹＳ、ＨＡＮＫ－１、ＹＴＳ、ＮＫＬなど）または分化幹細胞（例えばｉＰＳＣ）から由来しても良い。
【0031】
ＴＩＧＩＴ、ＮＫＧ２Ａおよび／またはＣＩＳＨ
本明細書で使用する場合、用語「ＴＩＧＩＴ」または「ＴＩＧＩＴ遺伝子」は、Ｔ細胞およびＮＫ細胞の活性化を抑制する免疫チェックポイント分子である免疫グロブリンおよびＩＴＩＭドメインを有するＴ細胞免疫受容体（ＴＩＧＩＴ）をコードするヌクレオチド分子を指す。
本明細書で使用する場合、用語「ＴＩＧＩＴ」または「ＴＩＧＩＴ遺伝子」は、Ｔ細胞およびＮＫ細胞の活性化を抑制する免疫チェックポイント分子である免疫グロブリンおよびＩＴＩＭドメインを有するＴ細胞免疫受容体（ＴＩＧＩＴ）をコードするヌクレオチド分子を指す。
【0032】
ＴＩＧＩＴ遺伝子は、配列番号２５に記載された配列を有するＴＩＧＩＴポリペプチドなどのＴＩＧＩＴポリペプチド、または上記ＴＩＧＩＴポリペプチドまたは当分野で知られている任意のＴＩＧＩＴポリペプチドと高い同一性（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．８％の同一性）を有し、同じ免疫チェックポイント機能を有するＴＩＧＩＴポリペプチドをコードする遺伝子である。
【0033】
例えば、ＴＩＧＩＴ遺伝子は、以下であっても良いが、これらに限定されない：配列番号２６に記載された配列を有する核酸分子；上記のＴＩＧＩＴ遺伝子または当分野で知られている任意のＴＩＧＩＴ遺伝子と高い同一性（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．８％の同一性）を有し、かつ同様に機能性ＴＩＧＩＴポリペプチドをコード・発現するＴＩＧＩＴポリペプチドコード配列。
【0034】
本明細書で使用する場合、用語「ＮＫＧ２Ａ」または「ＮＫＧ２Ａ遺伝子」は、ＣＤ９４とヘテロ二量体を形成し、ＨＬＡ－Ｅと相互作用することで細胞粒子の分極を抑制し、細胞毒性粒子の放出を防止するＩＩ型膜受容体であるＮＫグループ２メンバーＡ（ＮＫＧ２Ａ）をコードするヌクレオチド分子を指す。
【0035】
ＮＫＧ２Ａ遺伝子は、配列番号２７に記載された配列を有するＴＩＧＩＴポリペプチドなどのＮＫＧ２Ａポリペプチド、または上記ＮＫＧ２Ａポリペプチドまたは当分野で知られている任意のＮＫＧ２Ａポリペプチドと高い同一性（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．８％の同一性）を有し、同じ免疫チェックポイント機能を有するＮＫＧ２Ａポリペプチドをコードする遺伝子である。
【0036】
例えば、ＮＫＧ２Ａ遺伝子は、以下であっても良いが、これらに限定されない：配列番号２８に記載された配列を有する核酸分子；上記のＮＫＧ２Ａ遺伝子または当分野で知られている任意のＮＫＧ２Ａ遺伝子と高い同一性（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．８％の同一性）を有し、かつ同様に機能性ＮＫＧ２Ａポリペプチドをコードおよび発現するＮＫＧ２Ａポリペプチドコード配列。
【0037】
本明細書で使用する場合、用語「ＣＩＳＨ」または「ＣＩＳＨ遺伝子」は、サイトカイン誘導ＳＨ２含有タンパク質（ＣＩＳＨ）をコードするヌクレオチド分子を指し、ＮＫ細胞における重要な負の細胞内免疫チェックポイントであるＣＩＳＨ（サイトカイン誘導ＳＨ２含有タンパク質）は、細胞内サイトカインシグナル伝達抑制因子（ＳＯＣＳ）ファミリーのメンバーであり、サイトカインと成長因子シグナル伝達経路の重要な調節因子である。
【0038】
ＣＩＳＨ遺伝子は、配列番号２９に記載された配列を有するＴＩＧＩＴポリペプチドなどのＣＩＳＨポリペプチド、または上記ＣＩＳＨポリペプチドまたは当分野で知られている任意のＣＩＳＨポリペプチドと高い同一性（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．８％の同一性）を有し、同じ免疫チェックポイント機能を有するＣＩＳＨポリペプチドをコードする遺伝子である。
【0039】
例えば、ＣＩＳＨ遺伝子は、以下であっても良いが、これらに限定されない：配列番号３０に記載された配列を有する核酸分子；上記のＣＩＳＨ遺伝子または当分野で知られている任意のＣＩＳＨ遺伝子と高い同一性（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．８％の同一性）を有し、かつ同様に機能性ＣＩＳＨポリペプチドをコードおよび発現するＣＩＳＨポリペプチドコード配列。
【0040】
用語「発現を損なう／抑制する」は、遺伝子またはタンパク質の発現を抑制、減少、または除去することを意味する。遺伝子（すなわちＴＩＧＩＴ、ＮＫＧ２ＡまたはＣＩＳＨをコードする遺伝子）の発現を抑制または減少または除去するために、遺伝子の配列および／または構造は、遺伝子が転写されない（ＤＮＡに対して）または翻訳されない（ＲＮＡに対して）、または機能性タンパク質（例えば転写因子）を生成するために転写または翻訳されることがないように改変しても良い。
【0041】
本明細書では、遺伝子発現を抑制、減少、または除去するための当技術分野で知られている様々な方法を説明する。いくつかの方法は、核酸置換、付加、および／または欠失を野生型遺伝子に導入することができる。いくつかの方法は、遺伝子に単鎖または二重鎖の断裂を導入することもできる。上述のように、タンパク質の発現を抑制または減少または除去するために、タンパク質をコードする遺伝子またはポリヌクレオチドの発現を抑制、減少または除去することができる。
【0042】
本明細書で使用する場合、用語「損なう」または「抑制」の表現は、参照対照レベルに比べて少なくとも１０％、例えば少なくとも約２０％、または少なくとも約３０％、または少なくとも約４０％、または少なくとも約５０％、または少なくとも約６０％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％、または最大１００％（すなわち、参照サンプルと比較して存在しないレベルに）減少することを意味する。
【0043】
本明細書で使用する場合、用語「不活性化」は、遺伝子によってコードされるポリペプチド産物の発現を阻止することを意味する。不活性化は、遺伝子発現の任意の段階またはプロセス（転写、翻訳、タンパク質発現を含むがこれらに限定されない）で発生することができ、かつ、任意の遺伝子または遺伝子産物（ＤＮＡ、ＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ）、およびポリペプチドを含むがこれらに限定されない）に影響を与えることができる。
【0044】
いくつかの実施形態では、遺伝子の欠損により、遺伝子を抑制または不活性化する。本明細書で使用される場合、「遺伝子の欠損」とは、ＤＮＡ配列の少なくとも一部を遺伝子からまたは遺伝子の近傍で除去することを意味する。いくつかの実施形態では、遺伝子の欠損を経った配列は、遺伝子のエキソン配列を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子の欠損を経った配列は、遺伝子のプロモーター配列を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子の欠損を経った配列は、遺伝子のフランキング配列を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子から、遺伝子配列の一部を除去する。いくつかの実施形態では、染色体から、完全な遺伝子配列を除去する。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、本明細書のいずれかの実施形態に記載の遺伝子の欠損を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子配列中の少なくとも１つのヌクレオチドまたはヌクレオチド塩基対の欠失により、遺伝子を抑制または不活性化し、非機能性遺伝子産物をもたらす。いくつかの実施形態では、遺伝子は遺伝子の欠損により不活化され、ここで遺伝子配列中の少なくとも１つのヌクレオチドの欠失により、もはや元の遺伝子産物の機能または活性を有さない遺伝子産物、または機能不全の遺伝子産物がもたらされる。
【0045】
いくつかの実施形態では、遺伝子の付加または置換により、遺伝子を抑制または不活性化し、ただし、遺伝子配列に少なくとも１つのヌクレオチドまたはヌクレオチド塩基対を付加または置換することにより、遺伝子を抑制または不活性化する。いくつかの実施形態では、遺伝子は遺伝子不活性化により不活性化され、ここで遺伝子配列中の少なくとも１つのヌクレオチドの組み込みまたは置換より、もはや元の遺伝子産物の機能または活性を有さない遺伝子産物、または機能不全の遺伝子産物がもたらされる。いくつかの実施形態では、遺伝子は付加または置換により不活性化され、ここで遺伝子配列への少なくとも１つのヌクレオチドの組み込みまたは置換より、機能不全の遺伝子産物がもたらされる。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、本明細書のいずれかの実施形態に記載の遺伝子の付加または置換を含む。
【0046】
宿主細胞中の遺伝子機能発現を損なう方法および技術としては、規則的な間隔をもってクラスター化された短鎖反復回文配列（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ， ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ，ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔｓ、ＣＲＩＳＰＲ）、転写活性因子様エフェクターヌクレアーゼ（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ－ｌｉｋｅ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｎｕｃｌｅａｓｅ、ＴＡＬＥＮ）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ｚｉｎｃ－ｆｉｎｇｅｒ ｎｕｃｌｅａｓｅ、ＺＦＮ）、相同組換え、非相同末端結合、メガヌクレアーゼ、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ；短ヘアピンＲＮＡともいう）を含むが、これらに限定されない。
【0047】
いくつかの実施形態では、ＴＩＧＩＴは、配列番号３、２、または６などの配列番号１～６から選ばれるｇＲＮＡを含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムによって損なってもよい。いくつかの実施形態では、ＮＫＧ２Ａは、配列番号１８、７、または１０などの配列番号７～１８から選ばれるｇＲＮＡを含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムによって損なってもよい。いくつかの実施形態では、ＣＩＳＨは、配列番号２１、１９、または２４などの配列番号１９～２４から選ばれるｇＲＮＡを含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムによって損なってもよい。
【0048】
いくつかの実施形態では、デュアルノックアウトまたはトリプルノックアウトは、ＴＩＧＩＴ、ＮＫＧ２Ａ、およびＣＩＳＨのうちの２つまたは３つに対するｇＲＮＡ、例えば配列番号１～６から選ばれるｇＲＮＡ、配列番号７～１８から選ばれるｇＲＮＡ、および配列番号１９～２４から選ばれるｇＲＮＡからなる群から選ばれる２つ以上のｇＲＮＡを含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムで行ってもよい。例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムは、配列番号３、１８および／または２１のｇＲＮＡを含んでもよい。
【0049】
本願の開示によれば、ＴＩＧＩＴ、ＮＫＧ２Ａおよび／またはＣＩＳＨのうちの１つまたは複数の損ない（ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔ）は、インビトロおよび／またはインビボ細胞増幅を増加させ、インビトロおよび／またはインビボ細胞の寿命を延長し、インビボ細胞の枯渇を改善し、ＮＫ細胞の標的細胞に対する細胞毒性を増加させ、および／またはＮＫ細胞からのサイトカイン、インターロイキンおよび／または成長因子の分泌を調節することができる。
【0050】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）
本願の改変されたＮＫ細胞は、エンジニアリングされた抗原受容体、例えば、活性化または刺激性ＣＡＲ、共刺激性ＣＡＲ（ＷＯ２０１４／０５５６６８参照）、および／または阻害性ＣＡＲ（ｉＣＡＲ、Ｆｅｄｏｒｏｖら、Ｓｃｉ． Ｔｒａｎｓｌ． Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、５（２１５）（２０１３年１２月）参照）を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）などをさらに含んでも良い。
本願の改変されたＮＫ細胞は、エンジニアリングされた抗原受容体、例えば、活性化または刺激性ＣＡＲ、共刺激性ＣＡＲ（ＷＯ２０１４／０５５６６８参照）、および／または阻害性ＣＡＲ（ｉＣＡＲ、Ｆｅｄｏｒｏｖら、Ｓｃｉ． Ｔｒａｎｓｌ． Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、５（２１５）（２０１３年１２月）参照）を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）などをさらに含んでも良い。
【0051】
ＣＡＲは、通常に、１種以上の細胞内シグナル伝達成分と結合する細胞外抗原（またはリガンド）結合ドメインを含み、いくつかの態様では、こんな結合は、リンカーおよび／または膜貫通ドメインを介する。この分子は通常、天然抗原受容体を通過するシグナル、共刺激受容体と組み合わされる前記受容体を通過するシグナル、および／または単独で共刺激受容体を通過するシグナルをシミュレーションまたは模倣する。
【0052】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、特定の抗原（またはマーカーまたはリガンド）に特異的に構築され、当該抗原は、例えば、養子療法によって標的化された特定の細胞型で発現される抗原、例えば癌マーカーであり、および／または、阻害反応を誘導することを目的とする抗原、例えば正常または非罹患細胞型に発現する抗原である。したがって、ＣＡＲは、通常に、その細胞外部分に、１つまたは複数の抗原結合断片、ドメイン、または部分である１つまたは複数の抗原結合分子、あるいは１つまたは複数の抗体可変ドメイン、および／または抗体分子を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、抗体分子の一つまたは複数の抗原結合部分を含み、例えば、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の可変重鎖（ＶＨ）および可変軽鎖（ＶＬ）から誘導される単鎖抗体断片（ｓｃＦｖ）を含む。
【0053】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、例えば、癌マーカーまたは標的となる細胞または疾患（例えば、腫瘍細胞や癌細胞）の細胞表面抗原、例えば、本明細書に記載されるまたは当技術分野で知られる任意の標的抗原などの抗原と特異的に結合する抗体重鎖ドメインを含む。
【0054】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲの標的としては、ＢＣＭＡ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＰＳＭＡ、ＡＣＥ２、ＣＤ７、ＣＳ１、ＥＧＦＲ／ＥＧＦＲＶＩＩＩ、ＥｒＢｂ２／ＨＥＲ２、ＣＤ３、ＣＤ１３８、とＮＫＧ２Ｄが挙げられるが、これらに限定されない。
【0055】
抗体断片は、完全抗体のタンパク質加水分解消化および組換え宿主細胞の製造を含むがこれらに限定されない、種々の技術によって製造することができる。いくつかの実施形態では、抗体は、組換えによって産生される断片であり、例えば、不自然に発生する配置を含む断片であり、例えば、合成リンカー（例えばペプチドリンカー）によって結合された２つ以上の抗体領域または鎖を有するものであり、および／または天然に存在する完全抗体の酵素消化によって生成された断片ではなくても良い。いくつかの態様では、抗体断片はｓｃＦｖである。
【0056】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、細胞表面上で発現する抗原（例えば、完全抗原）を特異的に認識する抗体または抗原結合断片（例えば、ｓｃＦｖ）を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、抗ＢＣＭＡ ＶＨＨを含む。
【0057】
いくつかの態様では、抗原特異的結合または認識成分は、１つまたは複数の膜貫通および細胞内シグナルドメインと接続する。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ＣＡＲの細胞外ドメインと融合した膜貫通ドメインを含む。１つの実施形態では、ＣＡＲの１つのドメインと天然に結合された膜貫通ドメインを使用する。場合によっては、アミノ酸置換により、膜貫通ドメインを選択または改変し、これらのドメインが同じまたは異なる表面膜タンパク質の膜貫通ドメインと結合することを避け、それによって受容体複合体の他のメンバーとの相互作用を最小化する。
【0058】
いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、天然由来または合成由来から誘導される。由来が天然である場合、このドメインは、いくつかの態様では、任意の膜結合または膜貫通タンパク質に由来する。膜貫通領域は、Ｔ細胞受容体のα、βまたはζ鎖、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＣＤ３ε、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４の膜貫通領域から誘導される（すなわち、膜貫通領域を少なくとも含む）ものを含む。あるいは、いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、合成される。いくつかの態様では、合成的な膜貫通ドメインは、主にロイシンおよびバリンなどの疎水性残基を含む。いくつかの態様では、合成的な膜貫通ドメインの各端に、フェニルアラニン、トリプトファン、およびバリンのトリプレットが見出される。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ８ヒンジおよび膜貫通領域を含む。
【0059】
いくつかの実施形態では、短いオリゴマーまたはポリペプチドリンカー（例えば、長さが２～１０アミノ酸のリンカー、例えばグリシンとセリンを含むリンカー（例えばグリシン－セリンダブレット））が存在し、ＣＡＲの膜貫通ドメインと細胞質シグナル伝達ドメインとの間に接続が形成される。
【0060】
ＣＡＲは、通常に、少なくとも１つ以上の細胞内シグナル伝達成分を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ＴＣＲ複合体の細胞内成分、例えばＴ細胞活性化および細胞毒性を媒介するＴＣＲ ＣＤ３＋鎖、例えばＣＤ３ζ鎖を含む。したがって、いくつかの態様では、抗原結合分子は、１つまたは複数の細胞シグナル伝達モジュールと接続する。いくつかの実施形態では、細胞シグナル伝達モジュールは、ＣＤ３膜貫通ドメイン、ＣＤ３細胞内シグナル伝達ドメイン、および／または他のＣＤ膜貫通ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、Ｆｃ受容体γ、ＣＤ８、ＣＤ４、ＣＤ２５、またはＣＤ１６などの１つまたは複数の他の分子の一部をさらに含む。例えば、いくつかの態様では、ＣＡＲは、ＣＤ３ζ（ＣＤ３－ζ）またはＦｃ受容体γとＣＤ８、ＣＤ４、ＣＤ２５またはＣＤ１６との間のキメラ分子を含む。
【0061】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲを接続する際に、ＣＡＲの細胞質ドメインまたは細胞内シグナル伝達ドメインは、ＮＫ細胞の正常なエフェクター機能または応答のうちの少なくとも１つを活性化する。
【0062】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＤＡＰ１０、ＩＣＯＳなどの共刺激受容体のシグナル伝達ドメインおよび／または膜貫通部分を含む。いくつかの態様では、同じＣＡＲは、活性化成分と共刺激成分を含み、他の態様では、活性化ドメインは、１つのＣＡＲによって提供され、共刺激成分は、別の抗原を認識する別のＣＡＲによって提供される。
【0063】
特定の実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３（例えばＣＤ３－ζ）細胞内ドメインに接続されたＣＤ２８膜貫通およびシグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζ細胞内ドメインに接続されたＣＤ２８とＣＤ１３７（４－１ＢＢ、ＴＮＦＲＳＦ９）とのキメラ共刺激ドメインを含む。
【0064】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、細胞質部分中の活性化ドメイン（例えば、プライマリ－活性化ドメイン（ｐｒｉｍａｒｙ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｄｏｍａｉｎ））と組み合わせた２つ以上の共刺激ドメインを含む。一つの例としては、ＣＤ３－ζ、ＣＤ２８および４－１ＢＢの細胞内成分を含む受容体である。
【0065】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ヒトＣＤ８ヒンジおよび膜貫通領域、細胞質ドメイン４－１ＢＢおよびＣＤ３ζを有する抗ＢＣＭＡ ＶＨＨを含む。
【0066】
いくつかの実施形態において、ＣＡＲまたは他の抗原受容体は、受容体を発現するために細胞の形質導入またはエンジニアリングを確認するためのマーカー、例えば細胞表面受容体の切断型、例えば切断されたＥＧＦＲ（ｔＥＧＦＲ）をさらに含む。
【0067】
場合によっては、ＣＡＲは、第１世代、第２世代、および／または第３世代ＣＡＲと呼ばれる。いくつかの態様では、第１世代ＣＡＲは、抗原結合時にＣＤ３鎖の誘導シグナルのみを提供するＣＡＲである；いくつかの態様では、第２世代ＣＡＲは、このようなシグナルおよび共刺激シグナルを提供するＣＡＲであり、例えば、ＣＤ２８またはＣＤ１３７のような共刺激受容体からの細胞内シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲである；いくつかの態様では、第３世代ＣＡＲは、いくつかの態様では、異なる共刺激受容体の複数の共刺激ドメインを含むＣＡＲである。
【0068】
いくつかの態様では、ＣＡＲまたは他の抗原受容体は、抑制性ＣＡＲ（例えば、ｉＣＡＲ）であり、細胞中のＩＴＡＭおよび／または共刺激促進反応などの免疫反応などの反応を阻害または抑制する細胞内成分を含む。このような細胞内シグナル伝達成分の例は、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ３、ＢＴＬＡ、ＯＸ２Ｒ、ＴＩＭ－３、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ－１、ＰＧＥ２受容体、ＥＰ２／４アデノシン受容体（Ａ２ＡＲを含む）免疫チェックポイント分子上で発見されたものである。いくつかの態様では、エンジニアリングされた細胞は、そのような抑制性分子のシグナル伝達ドメインを含む抑制性ＣＡＲ、またはそのような抑制性分子から誘導される抑制性ＣＡＲを含み、そして、細胞の反応、例えば活性化および／または共刺激ＣＡＲによって誘導される反応を抑制する。例えば、活性化受容体によって認識される抗原（例えばＣＡＲ）も正常細胞の表面上で発現するか、あるいは正常細胞の表面上でも発現する可能性がある場合、このＣＡＲはオフターゲット効果の可能性を低減するために使用される。いくつかの態様では、正常細胞特異性のマーカーを認識するｉＣＡＲなどの抑制性受容体を導入する。
【0069】
いくつかの例示的な実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ８シグナルペプチド（例えば、配列番号３１を含むか、または配列番号３２にコードされるもの）、抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖ ＦＭＣ ６３（例えば、配列番号３３を含むか、または配列番号３４にコードされるもの）、ヒトＣＤ８ヒンジおよび膜貫通領域（例えば配列番号３５を含むか、または配列番号３６にコードされるもの）、細胞質ドメイン４－１ＢＢ（例えば、配列番号３７を含むか、または配列番号３８にコードされるもの）、および／またはＣＤ３ζ（例えば、配列番号３９を含むか、または配列番号４０にコードされるもの）を含むように設計される。
【0070】
細胞集団、細胞培養物または製品
本明細書は、本明細書で開示された改変されたＮＫ細胞を含む細胞集団、細胞培養物または製品も提供する。
本明細書は、本明細書で開示された改変されたＮＫ細胞を含む細胞集団、細胞培養物または製品も提供する。
【0071】
本開示のいくつかの実施形態において、細胞集団、細胞培養物または製品のうちの少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．８％または１００％の細胞は、本出願の改変されたＮＫ細胞である。いくつかの実施形態では、細胞集団、細胞培養物または製品は、他の細胞を含まない。
【0072】
いくつかの実施形態では、細胞集団、細胞培養物または製品は、例えば医薬組成物および製剤として、疾患の治療に使用することができる。医薬組成物および製剤は、一般に、任意に薬学的に許容される１つ以上の担体または賦形剤を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、少なくとも１つの追加の治療剤を含む。
【0073】
「薬物製剤」という用語は、製剤の形態が、それに含まれる活性成分の生物活性を有効にすることを可能にし、製剤を投与された対象に対して許容できない毒性を有する追加成分を含まないことを意味する。
【0074】
「薬学的に許容される担体」とは、活性成分を除いて、薬物製剤中の対象に対して無毒な成分を意味する。薬学的に許容される担体としては、緩衝剤、賦形剤、安定剤、または防腐剤が挙げられるが、これらに限定されない。
【0075】
いくつかの実施形態では、担体の選択は、部分的に、特定の細胞、結合分子、および／または抗体および／または投与方法によって決定される。そのため、さまざまな適切な配合がある。担体は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １６ ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｏｓｏｌ、Ａ．Ｅｄ．（１９８０）によって記述される。薬学的に許容される担体は、使用される用量および濃度において、通常に、受容者に対して無毒である。
【0076】
製剤または組成物は、結合分子または細胞を用いて治療される特定の適応症、疾患または障害のために使用されることができる１種以上の活性成分を含んでも良く、結合分子または細胞と相補的な活性を有するものが好ましく、それぞれの活性は互いに悪影響を与えない。そのような活性成分は、意図する目的に有効な量で組み合わせて適切に存在する。したがって、いくつかの実施形態では、医薬組成物は、さらに、アスパラギナーゼ、ブスルファン、カルボプラチン、シスプラチン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシウレア、メトトレキサート、パクリタキセル、リツキシマブ、ビンブラスチン、ビンクリスチンなどの化学療法剤などの他の医薬活性剤または医薬品を含む。
【0077】
いくつかの実施形態では、遺伝子工学細胞の場合、対象に約１００万～約１０００億個の細胞、例えば１００万～約５００億個の細胞（例えば、約５００万個の細胞、約２５００万個の細胞、約５億個の細胞、約１０億個の細胞、約５０億個の細胞、約２００億個の細胞、約３００億個の細胞、約４００億個の細胞、または上記の値のいずれかによって定義される範囲）、例えば、約１０００万～約１０００億個の細胞（例えば、約２０００万個の細胞、約３０００万個の細胞、約４０００万個の細胞、約６０００万個の細胞、約７０００万個の細胞、約８０００万個の細胞、約９０００万個の細胞、約１００億個の細胞、約２５０億個の細胞、約５００億個の細胞、約７５０億個の細胞、約９００億個の細胞、または上記の値のいずれかで定義される範囲）、かつ場合によっては、約１億個の細胞～約５００億個の細胞（例えば、約１億２０００万個の細胞、約２億５０００万個の細胞、約３億５０００万個の細胞、約４億５０００万個の細胞、約６億５０００万個の細胞、約８億個の細胞、約９億個の細胞、約３０億個の細胞、約３００億個の細胞、約４５０億個の細胞）またはこれらの範囲の任意の値、および／または対象の体重１ｋｇ当たりの細胞数を投与する。
【0078】
本開示の医薬品は、標準的な投与技術、製剤、および／または装置を用いて投与することができる。組成物の貯蔵および投与のための製剤および装置、例えば注射器およびバイアルが提供される。細胞の投与は、自己または異種であってもよい。例えば、免疫応答細胞または祖先細胞は、１つの対象から獲得し、同じ対象または異なる適合な対象に投与することができる。末梢血由来の免疫応答細胞またはその子孫は、カテーテル投与、全身注射、局所注射、静脈注射、または非経口投与を含む局所注射によって投与することができる。治療組成物（例えば、遺伝子改変免疫応答細胞を含む医薬組成物）を投与する場合、通常、これは単位用量当たりの注射可能な形態（溶液、懸濁液、エマルジョン）に製剤化される。
【0079】
製剤は、経口、静脈内、腹腔内、皮下、肺、経皮、筋肉内、鼻内、口腔、舌下または座薬で投与する製剤を含む。いくつかの実施形態では、細胞集団は、非経口投与される。本明細書で使用される「非経口」という用語は、静脈内、筋肉内、皮下、直腸、膣および腹膜内投与を含む。いくつかの実施形態では、細胞集団は、静脈内、腹腔内または皮下注射による外周全身送達で対象に投与される。
【0080】
治療方法と使用
本開示のエンジニアリングされた細胞、細胞集団、細胞培養物、製品の治療方法および使用も提供する。方法および使用は、ＮＫ細胞によって治療可能な疾患、病状、または障害を有する対象に細胞または細胞を含む組成物を投与することに関する。
本開示のエンジニアリングされた細胞、細胞集団、細胞培養物、製品の治療方法および使用も提供する。方法および使用は、ＮＫ細胞によって治療可能な疾患、病状、または障害を有する対象に細胞または細胞を含む組成物を投与することに関する。
【0081】
本明細書で使用する場合、「治療」（およびその文法的変形、例えば「処置」または「療法」）は、疾患、病状または障害、またはそれに関連する症状、副作用または結果または表現型の完全または部分的な改善または減少を指す。所望の治療効果としては、疾患の発生または再発の予防、症状の軽減、疾患の直接的または間接的な病理的結果の軽減、転移の防止、疾患進行速度の低下、疾患状態の改善または軽減、および予後の緩和または改善が挙げられるが、これらに限定されない。
【0082】
本明細書で使用する場合、「有効量」という用語は、投与の場合、治療結果などの所望の結果を達成するために必要な用量／量および期間内に有効な量を意味する。薬剤（例えば、薬物製剤）の「治療有効量」とは、必要な治療結果、例えば、疾患、病状または障害の治療、および／または治療のための薬物動態学的または薬効学的効果を達成するために必要な投与量および期間内に有効な量を意味する。治療有効量は、対象の疾患状態、年齢、性別、体重、および投与される細胞集団などの要因に応じて変化することができる。
【0083】
本明細書で使用する場合、「対象」は脊椎動物、例えば哺乳動物、例えばヒトまたは他の動物であり、通常ヒトである。いくつかの実施形態では、対象は、例えば、化学療法、放射線療法、および／または造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）、例えば同種異系ＨＳＣＴを含む他の療法による治療の後、持続性または再発性疾患に罹患する。いくつかの実施形態では、対象は再発しなかったが、再発のリスクがある（例えば再発のリスクが高い）と判断され、したがって、再発の可能性を低減する、または再発を予防するなどの化合物または組成物を予防的に投与する。
【0084】
疾患や障害は、癌を含む。どの癌も、本明細書に記載の遺伝子改変されたＴ細胞を用いて治療することができる。いくつかの実施形態では、癌は血液がんである。いくつかの実施形態では、癌は、癌腫または肉腫である。いくつかの実施形態では、癌は、急性リンパ球白血病、急性骨髄性白血病、Ｂｕｒｋｉｔｔリンパ腫、中枢神経系リンパ腫、慢性リンパ球白血病、慢性骨髄性白血病、有毛細胞白血病、慢性骨髄増殖性障害、骨髄増殖異常症候群、成人急性骨髄増殖性障害、多発性骨髄腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫または非ホジキンリンパ腫である。いくつかの実施形態では、癌は、乳癌、前立腺癌、睾丸癌、腎細胞癌、膀胱癌、肝臓癌、卵巣癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、肺癌、結腸直腸癌、肛門癌、膵臓癌、胃癌、食道がん、肝細胞癌、腎臓癌、頭頚部癌、神経膠芽腫、中皮腫、黒色腫、軟骨肉腫または骨または軟組織肉腫である。いくつかの実施形態では、癌は、副腎皮質癌、肛門癌、虫垂癌、星細胞腫、基底細胞癌、胆管癌、骨腫瘍、脳幹神経膠腫、脳癌、小脳星細胞腫、脳星細胞癌、室管膜腫、髄母細胞腫、幕上原始神経外胚葉腫、視覚通路および下視床神経膠腫または気管支腺腫である。いくつかの実施形態では、癌は結合促進組織増殖性小円球腫、室管膜腫、上皮様血管内皮腫（ＥＨＥ）、Ｅｗｉｎｇ肉腫、頭蓋外生殖細胞腫、性腺外生殖細胞腫、肝外胆管癌、眼内黒色腫、網膜芽細胞腫、胆嚢癌、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、生殖細胞腫瘍、妊娠性絨毛腫瘍（ｇｅｓｔａｔｉｏｎａｌ ｔｒｏｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ ｔｕｍｏｒ）、胃カルチノイド、心臓癌、下咽頭癌、視床下部と視覚通路神経膠腫、小児眼内黒色腫、膵島細胞癌、カポジ肉腫、喉頭癌、唇口癌、脂質肉腫、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、巨球蛋白血症、男性乳癌、骨悪性繊維組織細胞腫、髄母細胞腫、メラノーマ、メルケル細胞癌、中皮腫、転移性頸部扁平上皮癌、口癌、多発性内分泌腫症候群、菌状息肉症（ｍｙｃｏｓｉｓ ｆｕｎｇｏｉｄｅｓ）、慢性粘液腫、鼻腔癌および副鼻腔癌、鼻咽頭癌、神経母細胞腫、少突起膠質腫、口腔癌、中咽頭癌、骨肉腫、卵巣上皮癌、卵巣生殖細胞腫、卵巣低悪性潜在腫瘍、副鼻腔癌および鼻腔癌、副甲状腺癌、陰茎癌、咽頭癌、好クロム細胞腫、松果体星形細胞腫、松果腺生殖細胞腫、松果体芽腫、幕上原始神経外胚葉腫、下垂体腫、形質細胞腫、胸膜肺母細胞腫、原発性中枢神経系リンパ腫、腎細胞癌、網膜母細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺癌、子宮肉腫、Ｓｅｚａｒｙ症候群、非粘液腫皮膚癌、メラノーマ、Ｍｅｒｋｅｌ細胞皮膚癌、小腸癌、扁平上皮癌、頸部扁平上皮癌、のどの癌、胸腺腫、甲状腺癌、腎盂（Ｒｅｎａｌ ｐｅｌｖｉｓ）および尿管移行細胞癌、絨毛性腫瘍、妊娠期、尿道癌、子宮癌、膣癌、外陰癌、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症またはウィルムス腫瘍である。
【0085】
疾患や病状は、自己免疫性疾患や炎症性疾患を含む。例示的な疾患および病状は、多発性硬化症、リウマチ性関節炎、および全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）を含む。
【0086】
がんのほか、他の疾患や病状は年齢関連疾患も含む。例示的な疾患および病状は、アテローム性動脈硬化症、糖尿病、肝線維化および変形性関節症（ｏｓｔａｒｔｈｒｉｔｉｓ）を含む。
【0087】
いくつかの実施形態では、方法は、本開示の遺伝子工学細胞を対象に投与するための養子細胞療法を含む。このような投与は、疾患または病状の細胞が標的的に破壊されるように、細胞の活性化（例えば、ＮＫ細胞活性化）を標的的に促進することができる。
【0088】
養子細胞療法は、癌免疫療法の新しいモデルを代表するが、それは転移Ｔ／ＮＫ細胞の持続性と機能差に制限される可能性がある。ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、異種移植が可能であり、既有の製品になる可能性があり、ＮＫ細胞またはＣＡＲ－ＮＫ細胞の養子細胞療法に普遍性を持たせる。
【0089】
例えば、我々が、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９変異誘発スクリーニング方法を用いて、ＴＩＧＩＴ、ＮＫＧ２Ａおよび／またはＣＩＳＨを標的とすることで、ＮＫ細胞を、腫瘍中に広く蓄積し、より優れた持続性と強力のエフェクター機能を有する長寿命エフェクター細胞に再プログラムする；また、ＣＡＲをさらに含む改変されたＮＫ細胞は、改善された抗腫瘍効果を産生する。それにより、我々が、腫瘍などの疾患の養子細胞療法に有望な改変されたＮＫ細胞を提供する。
【0090】
提供される方法および使用は、養子細胞療法の方法および使用を含む。いくつかの実施形態において、方法は、細胞または細胞を含む組成物を対象、組織または細胞、例えば、疾患、病状または障害に罹患している、疾患、病状または障害のリスクがある、または疾患、病状または障害が疑われるものに投与することを含む。いくつかの実施形態では、細胞、集団および組成物は、例えば、養子ＮＫ細胞療法またはＣＡＲ－ＮＫ細胞療法などの養子細胞療法で治療しようとする特定の疾患または障害を有する対象に投与される。いくつかの実施形態では、細胞または組成物は、例えば、疾患または障害に罹患している、または疾患または障害のリスクがある対象に投与される。いくつかの態様では、以上のことにより、この方法は、例えば腫瘍の負担を軽減することによって、疾患または障害の１つまたは複数の症状を治療（例えば改善）する。
【0091】
養子細胞療法のための細胞投与方法は既知であり、提供される方法および組成物と組み合わせて使用することができる。いくつかの実施形態では、細胞療法、例えば養子細胞療法、例えば養子Ｔ細胞療法は、自己移植によって行われ、ここで、細胞は、細胞療法を受ける対象から、またはそのような対象から誘導されるサンプルから単離および／または他の方法で調製される。したがって、いくつかの態様では、細胞は、治療を必要とする対象、例えば患者に由来し、細胞の単離と処理後に、同じ対象に投与する。
【0092】
いくつかの実施形態では、細胞療法、例えば養子細胞療法、例えば養子ＮＫまたはＣＡＲ－ＮＫ細胞療法は、異種移植によって行われ、ここで、細胞を、細胞療法を受けるかまたは最終的に受ける対象（例えば、第１の対象）以外の対象から単離および／または他の方法で調製される。そのような実施形態では、次いで、細胞を同じ種の異なる対象、例えば第２の対象に投与する。いくつかの実施形態では、第１および第２の対象は、遺伝子的に同じである。いくつかの実施形態では、第１および第２の対象は、遺伝子的に類似している。いくつかの実施形態では、第２の対象は、第１の対象と同じＨＬＡクラスまたはスーパータイプを発現する。
【0093】
疾患の種類および重症度に応じて、細胞または医薬組成物の投与量は、約１μｇ／ｋｇ～１５ｍｇ／ｋｇ（例えば、０．１ｍｇ／ｋｇ～１０ｍｇ／ｋｇ）、約１μｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／ｋｇ以上、約０．０５ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、４．０ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇを含むことができる。複数の用量、例えば、週１回または３週間に１回間欠的に投与することができる。投与は、最初のより高負荷使用量、その後の一回以上の低使用量で行っても良い。
【0094】
哺乳動物（例えばヒト）に細胞を投与した後、エンジニアリングされた細胞集団および／または医薬組成物の生物活性は、任意の公知の方法により測定することができる。評価されたパラメータには、エンジニアリングされたＮＫ細胞と抗原のインビボ（例えばイメージング）またはエクスビボ（ｅｘ ｖｉｖｏ）（例えばＥＬＩＳＡまたはフローサイトメトリー）での特異的結合が含まれる。特定の実施形態では、エンジニアリングされた細胞が標的細胞を破壊する能力は、当技術分野で知られている任意の適切な方法、例えば細胞毒性アッセイを用いて測定することができる。特定の実施形態では、細胞の生物活性は、また、特定のサイトカインの発現および／または分泌を測定することによって測定することができる。いくつかの態様では、腫瘍量または負荷の減少などの臨床結果を評価することによって、生物活性を測定する。
【0095】
いくつかの実施形態では、細胞または医薬組成物は、併用治療の一部として投与され、例えば、別の治療介入（例えば、別のエンジニアリングされた細胞または受容体または試薬、例えば細胞毒性剤または治療剤）と同時にまたは順番に任意の順序で投与する。
【0096】
本明細書で参照された出版物とその参照された材料は、参照によってすべて本明細書に組み込まれる。特に記載がない限り、すべての試薬は商業的に入手されている。特に記載がない限り、すべての部とパーセンテージは重量に基づく。特に説明がない限り、結果の平均値が与えられる。特に定義がない限り、ここで使用される略語は一般的な略語である。
【実施例】
【0097】
実施例
実施例１ Ｋ５６２フィーダ細胞によるＮＫ細胞の体外増幅
Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙ トランスフェクションシステム（Ａｄｄｇｅｎｅ）を用いて全長４－１ＢＢＬと膜結合型ＩＬ－２１（ｍＢＩＬ－２１）を発現するＫ５６２細胞を構築した。ｍＢＩＬ－２１および４－１ＢＢＬをコードする遺伝子配列を、ｐＳＢｂｉ－ＲＢプラスミド（Ａｄｄｄｇｅｎｅ－６０５２２）にクローニングした。ｐＳＢｂｉ－ＲＢ－ｍＢＩＬ ２１－４－１ＢＢＬプラスミドは、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙ トランスポザーゼ（ＳＢ １００ Ｘ、ＣＡＴ＃Ａｄｇｅｎｅ－１２７９０９）と共に、３：１の割合でインキュベートすることによりＫ５６２細胞に形質転換された。エンジニアリングされたＫ５６２細胞は、ブラストサイジンの圧力下で数週間選択され、ｍＢＩＬ－２１および４－１ＢＢＬの発現を確認した後、ＮＫフィーダとして使用され、体外でＮＫ細胞を十分に培養した。
実施例１ Ｋ５６２フィーダ細胞によるＮＫ細胞の体外増幅
Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙ トランスフェクションシステム（Ａｄｄｇｅｎｅ）を用いて全長４－１ＢＢＬと膜結合型ＩＬ－２１（ｍＢＩＬ－２１）を発現するＫ５６２細胞を構築した。ｍＢＩＬ－２１および４－１ＢＢＬをコードする遺伝子配列を、ｐＳＢｂｉ－ＲＢプラスミド（Ａｄｄｄｇｅｎｅ－６０５２２）にクローニングした。ｐＳＢｂｉ－ＲＢ－ｍＢＩＬ ２１－４－１ＢＢＬプラスミドは、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙ トランスポザーゼ（ＳＢ １００ Ｘ、ＣＡＴ＃Ａｄｇｅｎｅ－１２７９０９）と共に、３：１の割合でインキュベートすることによりＫ５６２細胞に形質転換された。エンジニアリングされたＫ５６２細胞は、ブラストサイジンの圧力下で数週間選択され、ｍＢＩＬ－２１および４－１ＢＢＬの発現を確認した後、ＮＫフィーダとして使用され、体外でＮＫ細胞を十分に培養した。
【0098】
健康ドナーからの新鮮なＰＢＭＣは、ＳａｉｌｙＢｉｏ（中国上海）とＡｌｌＣｅｌｌｓ（中国上海、中国）が提供した。Ｋ５６２フィーダ細胞の細胞増殖を停止するために、５０μｇ／ｍＬのマイトマイシンＣ（Ｓｉｇｍａ－Ｍ４２８７）で３７℃、５％ＣＯ２で１時間前処理した。ＰＢＭＣと不活化されたＫ５６２フィーダ細胞を、１０％ＦＢＳと２００ Ｕ／ｍＬ（Ｒ＆Ｄ－２０２－ＩＬ）ヒトＩＬ－２を含むＲＰＭＩ－１６４０培地中で３７℃、５％ＣＯ２で１：１の割合で共培養した。培地は２日または３日ごとに交換される。
【0099】
実施例２ 増幅されたＮＫ細胞の純度測定
１４日目に、増幅されたＮＫ細胞（１×１０５細胞／ウェル）を、ＡＰＣ－抗－ＣＤ３（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ－３００４３９）およびＰＥ－抗－ＣＤ５６抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ－３１８０５）と共に、４℃で１時間インキュベートした。１％ＢＳＡ／ＰＢＳで洗浄した後、細胞をさらに洗浄し、１％ＢＳＡ－ＰＢＳ（ｗ／ｖ）に再懸濁して、フローサイトメトリーに使用し、ＦｌｏｗＪｏによりデータを分析した。
１４日目に、増幅されたＮＫ細胞（１×１０５細胞／ウェル）を、ＡＰＣ－抗－ＣＤ３（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ－３００４３９）およびＰＥ－抗－ＣＤ５６抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ－３１８０５）と共に、４℃で１時間インキュベートした。１％ＢＳＡ／ＰＢＳで洗浄した後、細胞をさらに洗浄し、１％ＢＳＡ－ＰＢＳ（ｗ／ｖ）に再懸濁して、フローサイトメトリーに使用し、ＦｌｏｗＪｏによりデータを分析した。
【0100】
ＮＫ細胞集団（ＣＤ３－ＣＤ５６＋を特徴とする）の純度を、図１と表１に示す。
表１ ６つのドナーからの増幅されたＮＫ細胞の純度
その結果、ＮＫ細胞は首尾よく新鮮なＰＢＭＣから高純度で増殖された。
表１ ６つのドナーからの増幅されたＮＫ細胞の純度
【表1】
【0101】
実施例３ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９によるＴＩＧＩＴ、ＮＫＧ２Ａおよび／またはＣＩＳＨのシングルノックアウトまたはダブルノックアウト
３．１ ｓｇＲＮＡ配列
ＴＩＧＩＴ、ＮＫＧ２Ａ、またはＣＩＳＨの低分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）配列は、ＣＲＩＳＰＯＲウェブサイト上で設計されて（ｈｔｔｐ：／／ｃｒｉｓｐｏｒ．ｔｅｆｏｒ．ｎｅｔ／）、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（中国南京）で合成された。ｓｇＲＮＡの配列を表２に示す。
表２ ＴＩＧＩＴ、ＮＫＧ２Ａ、およびＣＩＳＨのｓｇＲＮＡ配列
３．１ ｓｇＲＮＡ配列
ＴＩＧＩＴ、ＮＫＧ２Ａ、またはＣＩＳＨの低分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）配列は、ＣＲＩＳＰＯＲウェブサイト上で設計されて（ｈｔｔｐ：／／ｃｒｉｓｐｏｒ．ｔｅｆｏｒ．ｎｅｔ／）、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（中国南京）で合成された。ｓｇＲＮＡの配列を表２に示す。
表２ ＴＩＧＩＴ、ＮＫＧ２Ａ、およびＣＩＳＨのｓｇＲＮＡ配列
【表2】
【0102】
３．２ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９によってＴＩＧＩＴ、ＮＫＧ２ＡおよびＣＩＳＨのノックアウト
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体は、４ Ｄ－ＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒＴＭシステム（４Ｄ－Ｎｕｃｌｅｆｅｃｔｏｒ Ｃｏｒｅ Ｕｎｉｔ、Ｌｏｎｚａ）を介して、増幅されたＮＫ細胞に送達された。
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体は、４ Ｄ－ＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒＴＭシステム（４Ｄ－Ｎｕｃｌｅｆｅｃｔｏｒ Ｃｏｒｅ Ｕｎｉｔ、Ｌｏｎｚａ）を介して、増幅されたＮＫ細胞に送達された。
【0103】
培地（１０％ＦＢＳと２００Ｕ／ｍＬヒトＩＬ－２を含むＲＰＭＩ－１６４０）を、細胞培養プレート中で３７℃で３０分間予熱し、ＮＫ細胞をヌクレオフェクション（ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎ）用に収穫した。Ｃａｓ９（１００ｐｍｏｌ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ－Ａ ３６４９８）とｓｇＲＮＡ（２００ｐｍｏｌ）のＲＮＰ（リボ核タンパク質）複合体を混合し、室温で２０分間インキュベートした。室温で、各反応につき１×１０６個の増幅されたＮＫ細胞とｓｇＲＮＡ含有ＲＮＰ複合体を１００μＬ Ｐ３一次核トランスフェクション溶液（Ｌｏｎｚａ－Ｖ ４ ＸＰ－３０２４）中で軽く混合し、その後、混合物をＮｕｃｌｅｏｃｕｖｅｔｔｅ容器に移した。Ｌｏｎｚａ ４ Ｄ Ｎｕｃｌｅｆｅｃｔｏｒに容器を挿入し、プログラムＣＭ－１３７を用いて核トランスフェクションを行った。容器を取り出した後、すぐに予熱した培地を各カセットウェルに加えた。培地／細胞／ＲＮＰ混合物を、６ウェルプレート中の予熱ＲＰＭＩ－１６４０培地に移し、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。３日目に、次いで、ノックアウト効率を、フローサイトメトリーまたはウェスタンブロットにより決定した。
【0104】
シングルプロテインノックアウトにおいて顕著な効果を有するｓｇＲＮＡ－３（ＴＩＧＩＴに対して）、ｓｇＲＮＡ－１８（ＮＫＧ２Ａに対して）、およびｓｇＲＮＡ２１（ＣＩＳＨに対して）を用いて、デュアルノックアウト（ＤＫＯ）を行った。
【0105】
３．３ フローサイトメトリーによるノックアウト効率の測定
フローサイトメトリーによる細胞表面タンパク質ＴＩＧＩＴとＮＫＧ２Ａのシングルノックアウト効率およびデュアルノックアウト効率を測定した。
フローサイトメトリーによる細胞表面タンパク質ＴＩＧＩＴとＮＫＧ２Ａのシングルノックアウト効率およびデュアルノックアウト効率を測定した。
【0106】
ＮＫ細胞（１×１０５細胞／ウェル）をＡＰＣ－抗－ＴＩＧＩＴ抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ－１７－９００－４２）と４℃で１時間インキュベートした。１％ＢＳＡ／ＰＢＳで洗浄した後、細胞を洗浄し、１％ＢＳＡ－ＰＢＳ（ｗ／ｖ）に再懸濁して、フローサイトメトリーに使用し、ＦｌｏｗＪｏによりデータを分析した。
【0107】
ＴＩＧＩＴ、ＮＫＧ２Ａおよびデュアルノックアウトの効率を、それぞれ図２－４および表３－５に示す。
表３ ＴＩＧＩＴのノックアウト効率
表４ ＮＫＧ２Ａのノックアウト効率
表５ ＴＩＧＩＴとＮＫＧ２Ａのデュアルノックアウトの効率
結果は、少なくともいくつかのｓｇＲＮＡが、ＴＩＧＩＴおよび／またはＮＫＧ２Ａをノックアウトするのに有効であることを示している。
表３ ＴＩＧＩＴのノックアウト効率
【表3】
【表4】
【表5】
【0108】
３．４ ウェスタンブロットによるノックアウト効率の測定
細胞内タンパク質ＣＩＳＨの単独の効率をウェスタンブロットにより測定した。
細胞内タンパク質ＣＩＳＨの単独の効率をウェスタンブロットにより測定した。
【0109】
ＮＫ細胞（１×１０７細胞）を収集し、冷たいＰＢＳで洗浄し、細胞溶解緩衝液（ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ－９８０３）中で溶解した。等量のタンパク質を含む細胞溶解物を、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）により分離し、ポリフッ化ビニリデン膜上に移した。０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴｒｉｓ緩衝塩水中の５％脱脂乳中でブロッキングした後、膜をウサギ抗ＣＩＳＨ抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ－８７３１）と４℃で一晩インキュベートし、次いで、室温でＨＲＰヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ－７０７０ Ｓ）に２時間暴露した。免疫反応性タンパク質を、増強化学発光システム（ＣｈｅｍｉＤｏｃＭＦ，Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用いて観察した。ストリップをＴＢＳＴで洗浄し、次いで、マウス抗ＧＡＰＤＨ抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ－９７１６６）と４℃で一晩インキュベートした。第２の抗体インキュベーション（ＨＲＰヤギ抗マウスＩｇＧ（ＣＡＴ＃Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ－Ａ ９０－２３１ Ｐ）後、化学発光シグナルを再捕捉した。
【0110】
データを図５に示す。結果は、いくつかのｓｇＲＮＡがＣＩＳＨノックアウトに有効であることを示している。
【0111】
実施例４ 改変されたＮＫ細胞の細胞毒性
細胞表面に内因性ＣＤ１５５を発現し、ＩＦＮ－γ誘導後にＨＬＡ－Ｅの発現を上昇するヒト線維肉腫細胞系ＨＴ１０８０（ＥＣＡＣＣ－ｎｏ．８５１１５０５）を、改変されたＮＫ細胞の細胞毒性の評価に用いた。ＺｓＧｒｅｅｎを発現するレンチウイルスは、Ｓａｎｇｏｎ（中国上海）で合成されたレンチウイルススシャトルベクターと包装プラスミドＰｓＰＡＸ．２（Ａｄｄｇｅｎｅ－１２６０）とＰＭＤ ２．Ｇ（Ａｄｄｇｅｎｅ－１２５９）で包装された。０．５μｇ／ｍＬ ＩＦＮ－γの存在下、ＺｓＧｒｅｅｎレンチウイルスでトランスフェクションしたＨＴ１０８０細胞を、９６ウェルプレートに２４時間プレ接種し、培養プレートの平底に接着させた。
細胞表面に内因性ＣＤ１５５を発現し、ＩＦＮ－γ誘導後にＨＬＡ－Ｅの発現を上昇するヒト線維肉腫細胞系ＨＴ１０８０（ＥＣＡＣＣ－ｎｏ．８５１１５０５）を、改変されたＮＫ細胞の細胞毒性の評価に用いた。ＺｓＧｒｅｅｎを発現するレンチウイルスは、Ｓａｎｇｏｎ（中国上海）で合成されたレンチウイルススシャトルベクターと包装プラスミドＰｓＰＡＸ．２（Ａｄｄｇｅｎｅ－１２６０）とＰＭＤ ２．Ｇ（Ａｄｄｇｅｎｅ－１２５９）で包装された。０．５μｇ／ｍＬ ＩＦＮ－γの存在下、ＺｓＧｒｅｅｎレンチウイルスでトランスフェクションしたＨＴ１０８０細胞を、９６ウェルプレートに２４時間プレ接種し、培養プレートの平底に接着させた。
【0112】
ＣＤ１５５およびＨＬＡ－Ｅ発現レベルは、ＰＥ－抗－ＣＤ１５５抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ－１２－１５５０－４１）およびＡＰＣ－抗－ＨＬＡ－Ｅ抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ－３４２６０６）を用いて、フローサイトメトリーにより決定した。図６は、ＨＴ１０８０細胞におけるＣＤ１５５（ＴＩＧＩＴのリガンド）とＨＬＡ－Ｅ（ＮＫＧ２Ａのリガンド）の高い発現レベルを示す。
【0113】
その後、改変されたＮＫ細胞を、３：１０の割合で各ウェルに添加した。ＩｎｃｕＣｉｔｅ ＺＯＯＭ（Ｅｓｓｅｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）自動生細胞イメージングシステムにより監視された緑色蛍光シグナルにより、生細胞の数を評価した。
【0114】
図７のデータは、ＮＫ／腫瘍細胞の割合が３：１０の場合、ＴＩＧＩＴ、ＮＫＧ２Ａおよび／またはＣＩＳＨノックアウトされたＮＫ細胞の細胞毒性が増強されることを示し、その中で、ＴＩＧＩＴ／ＮＫＧ２Ａ、ＴＩＧＩＴ／ＣＩＳＨとＮＫＧ２Ａ／ＣＩＳＨのデュアルノックアウトは、良好な抗腫瘍活性を示し、ＴＩＧＩＴ＋ＣＩＳＨデュアルノックアウトは、すべての試験群の中で最も良い効果を示した。
【0115】
実施例５ エンジニアリングされたＮＫのインビボ研究
６～８週齢の雌ＮＳＧ（Ｂｉｏｃｙｔｏｇｅｎ、中国）マウスを、特定病原体除去条件下に、配置して処理し、高圧滅菌された食料と水を提供した。研究における動物の処理、看護、治療に関するすべての手順は、実験室動物看護評価と認証協会（ＡＡＡＬＡＣ）の指導の下で行われた。０日目に、４ｘ１０６個のＡ５４９細胞を、１００ｍＬ ＰＢＳ中で、ＮＳＧマウスの右腹部に皮下注射した。腫瘍が５０～１００ｍｍ３に達した場合、マウスを４群（ビヒクルＰＢＳ、未改変ＮＫ、ＴＩＧＩＴ／ＣＩＳＨノックアウトＮＫ、ＮＫＧ２Ａ／ＣＩＳＨノックアウトＮＫ、ｎ＝６）に分け、０日目、３日目、６日目に、１ｘ１０７個のＮＫ細胞を静脈内で投与した。腫瘍体積とマウス体重を３日ごとに測定した。３日ごとにカリパスを用いて腫瘍体積を測定し、次の方程式を用いて計算した：Ｖ＝０．５ａｂ２、ａとｂは、それぞれ腫瘍の長径と短径である。
６～８週齢の雌ＮＳＧ（Ｂｉｏｃｙｔｏｇｅｎ、中国）マウスを、特定病原体除去条件下に、配置して処理し、高圧滅菌された食料と水を提供した。研究における動物の処理、看護、治療に関するすべての手順は、実験室動物看護評価と認証協会（ＡＡＡＬＡＣ）の指導の下で行われた。０日目に、４ｘ１０６個のＡ５４９細胞を、１００ｍＬ ＰＢＳ中で、ＮＳＧマウスの右腹部に皮下注射した。腫瘍が５０～１００ｍｍ３に達した場合、マウスを４群（ビヒクルＰＢＳ、未改変ＮＫ、ＴＩＧＩＴ／ＣＩＳＨノックアウトＮＫ、ＮＫＧ２Ａ／ＣＩＳＨノックアウトＮＫ、ｎ＝６）に分け、０日目、３日目、６日目に、１ｘ１０７個のＮＫ細胞を静脈内で投与した。腫瘍体積とマウス体重を３日ごとに測定した。３日ごとにカリパスを用いて腫瘍体積を測定し、次の方程式を用いて計算した：Ｖ＝０．５ａｂ２、ａとｂは、それぞれ腫瘍の長径と短径である。
【0116】
【0117】
図８Ａの結果は、ＴＩＧＩＴ／ＣＩＳＨノックアウトまたはＮＫＧ２Ａ／ＣＩＳＨノックアウトを有するＮＫ細胞が、マウスにおけるＨＴ１０８０腫瘍成長の除去に優れた効果を有することを示している。また、図８（ｂ）に示すように有意差は認められず、ＮＫ治療の安全性が示唆された。
【0118】
実施例６ ＣＡＲ－ＮＫおよび改変されたＣＡＲ－ＮＫ製剤
６．１抗ＣＤ１９ ＣＡＲプラスミドとレトロウイルスベクターの構築
設計されたＣＤ１９標的ＣＡＲは、ＣＤ８シグナルペプチド（配列番号３１のアミノ酸配列、配列番号３２のコード配列）、抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖ ＦＭＣ６３（配列番号３３のアミノ酸配列、配列番号３４のコード配列）、ヒトＣＤ８ヒンジと膜貫通領域（配列番号３５のアミノ酸配列、配列番号３６のコード配列）、細胞質ドメイン４－１ＢＢ（配列番号３７のアミノ酸配列、配列番号３８のコード配列）およびＣＤ３ζ（配列番号３９のアミノ酸配列、配列番号４０のコード配列）を含む。ＣＡＲ ｃＤＮＡ構築物を、レトロウイルスシャトルベクターｐＭＳＣＶ ＳＦＶのマルチクローニングサイトに合成した。
６．１抗ＣＤ１９ ＣＡＲプラスミドとレトロウイルスベクターの構築
設計されたＣＤ１９標的ＣＡＲは、ＣＤ８シグナルペプチド（配列番号３１のアミノ酸配列、配列番号３２のコード配列）、抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖ ＦＭＣ６３（配列番号３３のアミノ酸配列、配列番号３４のコード配列）、ヒトＣＤ８ヒンジと膜貫通領域（配列番号３５のアミノ酸配列、配列番号３６のコード配列）、細胞質ドメイン４－１ＢＢ（配列番号３７のアミノ酸配列、配列番号３８のコード配列）およびＣＤ３ζ（配列番号３９のアミノ酸配列、配列番号４０のコード配列）を含む。ＣＡＲ ｃＤＮＡ構築物を、レトロウイルスシャトルベクターｐＭＳＣＶ ＳＦＶのマルチクローニングサイトに合成した。
【0119】
０日目に、１×１０７個の２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ－ＣＲＬ－３２１６）を１５０ｍｍシャーレに播種した。翌日、ＣＤ１９ ＣＡＲとベクターは、レトロウイルス包装プラスミド、ｐＣＭＶ ｇａｇ－ｐｏｌ、ＰＭＤ ２．ＢａＥＶ（配列番号４１のアミノ酸配列、配列番号４２のコード配列）と一緒に、２９３Ｔ細胞に共トランスフェクションした。２日目に、トランスフェクションされた２９３Ｔ細胞の培地を、新鮮な培地に置換した。３日目に、トランスフェクションされた２９３Ｔ細胞から、レトロウイルス上清を収集し、０．４５μｍポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）膜フィルターで濾過した。必要に応じて、レトロウイルス上清を超遠心分離（Ｂｅｃｋｍａｎ）により濃縮した。
【0120】
ＨＴ１０８０（ＥＣＡＣＣ、番号８５１１１５０５）感染法を用いて、レトロウイルスの力価を測定した。簡単に言えば、ＨＴ１０８０細胞を９６ウェルプレートに１０，０００／ウェルの密度で一晩播種した。完全ＤＭＥＭ培地で５倍連続希釈したレトロウイルスを、ＨＴ１０８０細胞に添加し、軽く混合した。培養プレートを３７℃のインキュベーターに入れて７２時間培養した。フローサイトメトリーを用いて、ＨＴ１０８０細胞中のＣＡＲ発現を蛍光により特徴づけた。レトロウイルスの力価は以下のように計算される：
レトロウイルスの力価（ＴＵ／ｍＬ）＝（形質転換された細胞数×蛍光陽性％）／（ウイルス体積）。
レトロウイルスの力価（ＴＵ／ｍＬ）＝（形質転換された細胞数×蛍光陽性％）／（ウイルス体積）。
【0121】
６．２抗ＣＤ１９ ＣＡＲ－ＮＫ細胞の産生
増幅されたＮＫ細胞を、ＭＯＩが４であるレトロウイルス粒子、およびＮＫ細胞のレトロウイルス形質導入効率を高めるものとして知られているポリブレン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ－ＴＲ－１００３－Ｇ、４μＧ／ｍＬ）と混合した。その後、細胞を６ウェルプレート中で９０分間遠心分離し（３２℃で１５００ｒｐｍ）、次いで３７℃の完全ＲＰＭＩ １６４０培地中で１８時間インキュベートした。その後、遠心分離により形質導入混合物を除去し、ＩＬ－２（２００Ｕ／ｍＬ）およびＩＬ－１５（１４０Ｕ／ｍＬ）が存在する新鮮な完全ＲＰＭＩ １６４０培地で置換した。
増幅されたＮＫ細胞を、ＭＯＩが４であるレトロウイルス粒子、およびＮＫ細胞のレトロウイルス形質導入効率を高めるものとして知られているポリブレン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ－ＴＲ－１００３－Ｇ、４μＧ／ｍＬ）と混合した。その後、細胞を６ウェルプレート中で９０分間遠心分離し（３２℃で１５００ｒｐｍ）、次いで３７℃の完全ＲＰＭＩ １６４０培地中で１８時間インキュベートした。その後、遠心分離により形質導入混合物を除去し、ＩＬ－２（２００Ｕ／ｍＬ）およびＩＬ－１５（１４０Ｕ／ｍＬ）が存在する新鮮な完全ＲＰＭＩ １６４０培地で置換した。
【0122】
６．３改変されたＣＡＲ－ＮＫ細胞の産生
トランスフェクション後４日目に、ＴＩＧＩＴとＣＩＳＨのデュアルノックアウトにより、抗ＣＤ１９ ＣＡＲ－ＮＫから改変された抗ＣＤ１９ ＣＡＲ－ＮＫ（ｍＣＤ１９ ＣＡＲ－ＮＫ）が得られた。ＴＩＧＩＴとＣＩＳＨ－ＲＮＰ複合体を有するＣＡＲ－ＮＫの電気穿孔プロセスは、実施例３．２に記載されている。次いで、ＩＬ－２（２００Ｕ／ｍＬ）およびＩＬ－１５（１４０Ｕ／ｍＬ）が存在する完全１６４０培地中で、ｍＣＤ１９ ＣＡＲ－ＮＫ細胞を、マイトマイシンＣで処理したＫ５６２フィーダ細胞（実施例１の処理と同じ）と共培養した。
トランスフェクション後４日目に、ＴＩＧＩＴとＣＩＳＨのデュアルノックアウトにより、抗ＣＤ１９ ＣＡＲ－ＮＫから改変された抗ＣＤ１９ ＣＡＲ－ＮＫ（ｍＣＤ１９ ＣＡＲ－ＮＫ）が得られた。ＴＩＧＩＴとＣＩＳＨ－ＲＮＰ複合体を有するＣＡＲ－ＮＫの電気穿孔プロセスは、実施例３．２に記載されている。次いで、ＩＬ－２（２００Ｕ／ｍＬ）およびＩＬ－１５（１４０Ｕ／ｍＬ）が存在する完全１６４０培地中で、ｍＣＤ１９ ＣＡＲ－ＮＫ細胞を、マイトマイシンＣで処理したＫ５６２フィーダ細胞（実施例１の処理と同じ）と共培養した。
【0123】
６．４ ＣＤ１９ ＣＡＲ－ＮＫの形質導入効率測定
ＣＤ１９ ＣＡＲおよびｍＣＤ１９ ＣＡＲ－ＮＫ細胞の形質導入効率は、トランスフェクション後８日目（すなわちＫ５６２フィーダ細胞との５日間の共培養後）に、フローサイトメトリーにより評価した。簡単に言えば、ＣＡＲ－ＮＫとｍＣＡＲ ＮＫ細胞を収穫し、ＰＥラベルされたＣＤ１９抗原（Ａｃｒｏ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＣＤ９－ＨＰ２Ｈ３、希釈度１：１００）と、４℃で１時間インキュベートした。１％ＢＳＡ／ＰＢＳで洗浄した後、細胞を洗浄し、１％ＢＳＡ－ＰＢＳに再懸濁して、フローサイトメトリーに使用し、ＦｌｏｗＪｏによりデータを分析した。
ＣＤ１９ ＣＡＲおよびｍＣＤ１９ ＣＡＲ－ＮＫ細胞の形質導入効率は、トランスフェクション後８日目（すなわちＫ５６２フィーダ細胞との５日間の共培養後）に、フローサイトメトリーにより評価した。簡単に言えば、ＣＡＲ－ＮＫとｍＣＡＲ ＮＫ細胞を収穫し、ＰＥラベルされたＣＤ１９抗原（Ａｃｒｏ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＣＤ９－ＨＰ２Ｈ３、希釈度１：１００）と、４℃で１時間インキュベートした。１％ＢＳＡ／ＰＢＳで洗浄した後、細胞を洗浄し、１％ＢＳＡ－ＰＢＳに再懸濁して、フローサイトメトリーに使用し、ＦｌｏｗＪｏによりデータを分析した。
【0124】
図９Ａおよび９Ｂの結果は、抗ＣＤ１９ ＣＡＲ－ＮＫ細胞が高い形質導入効率で効果的に産生されることを示している。
【0125】
６．５ ＦＡＣＳとウェスタンブロットによるノックアウト効率の測定
ｍＣＤ１９ ＣＡＲ ＮＫ細胞のＴＩＧＩＴとＣＩＳＨノックアウト効率を、フローサイトメトリーとウェスタンブロットによりそれぞれ測定した。図１０Ａ、１０Ｂ、１１Ａ、１１Ｂに示す結果は、ｍＣＤ１９ ＣＡＲ ＮＫ細胞におけるＴＩＧＩＴとＣＩＳＨの高いノックアウト効率を証明している。
ｍＣＤ１９ ＣＡＲ ＮＫ細胞のＴＩＧＩＴとＣＩＳＨノックアウト効率を、フローサイトメトリーとウェスタンブロットによりそれぞれ測定した。図１０Ａ、１０Ｂ、１１Ａ、１１Ｂに示す結果は、ｍＣＤ１９ ＣＡＲ ＮＫ細胞におけるＴＩＧＩＴとＣＩＳＨの高いノックアウト効率を証明している。
【0126】
実施例７ ＣＡＲ－ＮＫの体外特性付け
ＣＡＲ－ＮＫ細胞は、腫瘍細胞の殺傷能力試験およびトランスフェクション後１４日目のサイトカインの放出によって、特徴付けられた。
ＣＡＲ－ＮＫ細胞は、腫瘍細胞の殺傷能力試験およびトランスフェクション後１４日目のサイトカインの放出によって、特徴付けられた。
【0127】
７．１ 細胞毒性測定
ルシフェラーゼを発現する標的細胞を産生するために、レンチウイルスルシフェラーゼをＲａｊｉ細胞に形質転換した。３：１および１：１の割合で、ＣＤ１９ ＣＡＲ－ＮＫとｍＣＤ１９ ＣＡＲ－ＮＫ細胞を、２００００個のルシフェラーゼを発現するＲａｊｉ（Ｒａｊｉ－ｌｕｃ、ＡＴＣＣ－ＣＬ８６）細胞と２４時間共培養した。各ウェルに、Ｏｎｅ－Ｇｌｏルシフェラーゼ測定試薬（ＣＡＴ＃Ｐｒｏｍｅｇａ Ｅ６１２０）を添加した。プレートを室温で５分間揺らした後、ＥｎＶｉｓｉｏｎリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いて発光を検出した。上清を集め、ＩＦＮ－γ放出のために－８０℃で凍結した。細胞毒性は以下の式により計算される：細胞毒性＝ＲＬＵ試験群／ＲＬＵ対照群Ｘ１００％。
ルシフェラーゼを発現する標的細胞を産生するために、レンチウイルスルシフェラーゼをＲａｊｉ細胞に形質転換した。３：１および１：１の割合で、ＣＤ１９ ＣＡＲ－ＮＫとｍＣＤ１９ ＣＡＲ－ＮＫ細胞を、２００００個のルシフェラーゼを発現するＲａｊｉ（Ｒａｊｉ－ｌｕｃ、ＡＴＣＣ－ＣＬ８６）細胞と２４時間共培養した。各ウェルに、Ｏｎｅ－Ｇｌｏルシフェラーゼ測定試薬（ＣＡＴ＃Ｐｒｏｍｅｇａ Ｅ６１２０）を添加した。プレートを室温で５分間揺らした後、ＥｎＶｉｓｉｏｎリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いて発光を検出した。上清を集め、ＩＦＮ－γ放出のために－８０℃で凍結した。細胞毒性は以下の式により計算される：細胞毒性＝ＲＬＵ試験群／ＲＬＵ対照群Ｘ１００％。
【0128】
図１２Ａおよび１２Ｂの結果は、未改変ＣＤ１９ ＣＡＲ－ＮＫ細胞に比べて、ｍＣＤ１９ ＣＡＲ－ＮＫ細胞の癌細胞に対する毒性が顕著に増加したことを示しており、改変されたＣＡＲ－ＮＫ細胞が癌の治療においてより有効であることが示唆された。
【0129】
７．２連続殺傷試験
連続殺傷試験を用いてｍＣＤ１９ ＣＡＲ－ＮＫの細胞毒性をさらに検討した。３：１および１：１の割合で、ＣＤ１９ ＣＡＲ－ＮＫとｍＣＤ１９ ＣＡＲ－ＮＫ細胞を、２００００個のＲａｊｉ－ｌｕｃ細胞と２４時間共培養し、そして、同じ量の新しいＲａｊｉ－ｌｕｃ細胞を添加した。２４時間後、１００μＬの上清を回収し、ＩＦＮ－γ放出のために－８０℃で凍結した。各ウェルに、Ｏｎｅ－Ｇｌｏルシフェラーゼ測定試薬（ＣＡＴ＃Ｐｒｏｍｅｇａ Ｅ６１２０）を添加した。プレートを室温で５分間揺らした後、ＥｎＶｉｓｉｏｎリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いて発光を検出した。
連続殺傷試験を用いてｍＣＤ１９ ＣＡＲ－ＮＫの細胞毒性をさらに検討した。３：１および１：１の割合で、ＣＤ１９ ＣＡＲ－ＮＫとｍＣＤ１９ ＣＡＲ－ＮＫ細胞を、２００００個のＲａｊｉ－ｌｕｃ細胞と２４時間共培養し、そして、同じ量の新しいＲａｊｉ－ｌｕｃ細胞を添加した。２４時間後、１００μＬの上清を回収し、ＩＦＮ－γ放出のために－８０℃で凍結した。各ウェルに、Ｏｎｅ－Ｇｌｏルシフェラーゼ測定試薬（ＣＡＴ＃Ｐｒｏｍｅｇａ Ｅ６１２０）を添加した。プレートを室温で５分間揺らした後、ＥｎＶｉｓｉｏｎリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いて発光を検出した。
【0130】
図１３Ａと１３Ｂの結果は、連続殺傷試験において、ｍＣＤ１９ ＣＡＲ－ＮＫ細胞の癌細胞に対する細胞毒性が増加したことを示しており、改変されたＣＡＲ－ＮＫ細胞が癌の治療においてより有効である可能性があることが示唆された。
【0131】
７．３ サイトカイン放出検査
実施例７．１および７．２に記載したように収集した上清を解凍し、整合した抗体ペアを用いて、酵素結合免疫吸着試験（ＥＬＩＳＡ）によるＩＦＮ－γ定量を行った。
標準品として、組換えヒトＩＦＮ－γ（ｃａｔ＃ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ－３００－０２）を使用した。ヒトＩＦＮ－γ特異的捕捉抗体（ｃａｔ＃Ｐｉｅｒｃｅ－Ｍ７００Ａ）を用いて、プレートをプレコートした。ブロッキングした後、１００μＬ標準品またはサンプルを各ウェルに移し、周囲温度で２時間インキュベートした。未結合物質を除去した後、ＩＦＮ－γに特異的なビオチン結合検出抗体（ｃａｔ＃Ｐｉｅｒｃｅ－Ｍ７０１Ｂ）をウェルに添加し、１時間インキュベートした。次いで、ストレプトアビジンが結合されたホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）（ｃａｔ＃Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ－ＳＮ１００４）をウェルに添加し、周囲温度で３０分間インキュベートした。ＴＭＢマトリックス１００μｌを割り当てて発色させ、次に２Ｎ ＨＣｌ １００μｌで発色を停止した。マイクロプレート分光光度計を用いて４５０ ｎＭで吸光度を読み取った。
実施例７．１および７．２に記載したように収集した上清を解凍し、整合した抗体ペアを用いて、酵素結合免疫吸着試験（ＥＬＩＳＡ）によるＩＦＮ－γ定量を行った。
標準品として、組換えヒトＩＦＮ－γ（ｃａｔ＃ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ－３００－０２）を使用した。ヒトＩＦＮ－γ特異的捕捉抗体（ｃａｔ＃Ｐｉｅｒｃｅ－Ｍ７００Ａ）を用いて、プレートをプレコートした。ブロッキングした後、１００μＬ標準品またはサンプルを各ウェルに移し、周囲温度で２時間インキュベートした。未結合物質を除去した後、ＩＦＮ－γに特異的なビオチン結合検出抗体（ｃａｔ＃Ｐｉｅｒｃｅ－Ｍ７０１Ｂ）をウェルに添加し、１時間インキュベートした。次いで、ストレプトアビジンが結合されたホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）（ｃａｔ＃Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ－ＳＮ１００４）をウェルに添加し、周囲温度で３０分間インキュベートした。ＴＭＢマトリックス１００μｌを割り当てて発色させ、次に２Ｎ ＨＣｌ １００μｌで発色を停止した。マイクロプレート分光光度計を用いて４５０ ｎＭで吸光度を読み取った。
【0132】
図１４Ａ、１４Ｂ、１５Ａ、１５Ｂの結果は、ｍＣＤ１９ ＣＡＲ－ＮＫ細胞のヒトＩＦＮ－γ放出がＣＤ１９ ＣＡＲ－ＮＫよりはるかに高いことを示している。
【0133】
本発明の範囲は、本明細書に開示された実施形態に限定されるものではなく、これらの実施形態は、本発明の様々な態様の単一の図示として意図され、いかなる機能的に同等の実施形態も本発明の範囲内にある。本明細書に記載されているものに加えて、本発明の組成物および方法の様々な変更は、当業者にとって前述の説明および教示から明らかになり、同様に本発明の範囲内に入ることが意図される。このような修正または他の実施形態は、本発明の真の範囲および要旨から逸脱することなく実施することができる。
【0134】
付録。配列情報
【表6】
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【配列表】
【国際調査報告】