特表 2024-521602 光安定性が向上したインドール酢酸の農業用組成物、その製造方法および使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-06-04

(54)【発明の名称】光安定性が向上したインドール酢酸の農業用組成物、その製造方法および使用

(51)【国際特許分類】

   A01N 43/38 20060101AFI20240528BHJP

   A01N 61/00 20060101ALI20240528BHJP

   A01P 21/00 20060101ALI20240528BHJP

   A01G 7/06 20060101ALI20240528BHJP

   C12P 17/10 20060101ALN20240528BHJP

【ＦＩ】

A01N43/38

A01N61/00 D

A01P21/00

A01G7/06 A

C12P17/10

【審査請求】有

【予備審査請求】有

(21)【出願番号】P 2023526164

(86)(22)【出願日】2021-04-09

(85)【翻訳文提出日】2023-10-05

(86)【国際出願番号】 BR2021050145

(87)【国際公開番号】W WO2022213163

(87)【国際公開日】2022-10-13

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】523148285

【氏名又は名称】トタル・ビオテクノロジア・インドゥストゥリア・エ・コメルシオ・ソシエダージ／アノニマ

【氏名又は名称原語表記】ＴＯＴＡＬ ＢＩＯＴＥＣＮＯＬＯＧＩＡ ＩＮＤＵＳＴＲＩＡ Ｅ ＣＯＭＥＲＣＩＯ Ｓ／Ａ

(74)【代理人】

【識別番号】100145403

【弁理士】

【氏名又は名称】山尾 憲人

(74)【代理人】

【識別番号】100150500

【弁理士】

【氏名又は名称】森本 靖

(74)【代理人】

【識別番号】100176474

【弁理士】

【氏名又は名称】秋山 信彦

(72)【発明者】

【氏名】フカミ，ジョジアーニ

(72)【発明者】

【氏名】ゴメス，ドグラス ファビアーノ

(72)【発明者】

【氏名】マルコリーナ ゴメス，ジュリアーナ

(72)【発明者】

【氏名】ヒッポリート ジ アシス フィーリョ，ジョナス

【テーマコード（参考）】

2B022

4B064

4H011

【Ｆターム（参考）】

2B022EA01

2B022EB10

4B064AE48

4B064CA02

4B064CD13

4B064DA11

4H011AB03

4H011BA01

4H011BA04

4H011BB09

4H011BC19

4H011DA12

4H011DC05

4H011DD03

4H011DE15

4H011DG06

4H011DH15

(57)【要約】

本発明は、生物学的および／または合成起源のインドール酢酸（ＩＡＡ）と窒素源および還元糖とを含む混合物中の該ＩＡＡの光安定化を含む、農業用組成物の製造方法に関する。本発明による農業作物対象への適用のためのＩＡＡ植物ホルモンの光安定化は、前記混合物に高温を適用して、メイラード反応を介して前記窒素源および還元糖をメラノイジン型色素に変換させてＩＡＡ光分解を低減させることによって達成される。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＩＡＡとメラノイジン型色素との組み合わせを含むことを特徴とする、農業用組成物。

【請求項2】

ＩＡＡが合成物であることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。

【請求項3】

ＩＡＡが生物源由来であることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。

【請求項4】

ＩＡＡ産生細菌の発酵によって得られることを特徴とする、請求項３に記載の組成物。

【請求項5】

農業上許容される添加剤または担体をさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載の組成物。

【請求項6】

添加剤が、種子および播種溝を処理するための添加剤、噴霧タンク用の細胞保護剤、土壌改良剤、混合補助剤、種子コーティング用ポリマー、化学肥料または有機肥料の顆粒をコーティングするためのポリマー、葉物用製剤に使用される液体肥料、固形肥料、および内生胞子活性化剤、からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。

【請求項7】

農業用組成物を製造する方法であって、前記組成物中においてＩＡＡとメラノイジン型色素との組み合わせを処方化することを含むことを特徴とする、方法。

【請求項8】

インドール酢酸（ＩＡＡ）植物ホルモンおよび窒素源および還元糖を含む混合物を、メイラード反応を介した窒素源と還元糖のメラノイジン型色素への変換を促進する温度および圧力の条件に供することを含むことを特徴とする、請求項７に記載の農業用組成物の製造方法。

【請求項9】

ＩＡＡが合成物であることを特徴とする、請求項７に記載の農業用組成物の製造方法。

【請求項10】

ＩＡＡが、ＩＡＡ産生菌の発酵により得られることを特徴とする、請求項７に記載の農業用組成物の製造方法。

【請求項11】

請求項１０に記載の農業用組成物の製造方法であって、以下の工程：
（ａ）インドール酢酸（ＩＡＡ）の生合成のために、１つ以上のＩＡＡ産生細菌株およびトリプトファンを含む培養物を発酵させる工程；および、
（ｂ）メイラード反応を介した窒素源と還元糖のメラノイジン型色素への変換を促進する温度および圧力の条件下で安定化する工程、
を含むことを特徴とする、方法。

【請求項12】

ＩＡＡ産生細菌が、１つ以上のアゾスピリルム・ブラシレンセ（Azospirillum brasilense）株を含むことを特徴とする、請求項１１に記載の農業用組成物の製造方法。

【請求項13】

１つ以上のアゾスピリルム・ブラシレンセ（A. brasilense）株が、Ａｂ－Ｖ５およびＡｂ－Ｖ６からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１２に記載の農業用組成物の製造方法。

【請求項14】

メイラード反応が、発酵槽環境内で起こることを特徴とする、請求項１１に記載の農業用組成物の製造方法。

【請求項15】

発酵が、バッチ培養または流加培養であることを特徴とする、請求項１１に記載の農業用組成物の製造方法。

【請求項16】

前記生成物の安定化のプロセスが、約１５分～約１２０分間行われることを特徴とする、請求項７に記載の農業用組成物の製造方法。

【請求項17】

前記生成物の安定化のプロセスが、約１００℃～約１３０℃の温度で行われることを特徴とする、請求項８に記載の農業用組成物の製造方法。

【請求項18】

前記生成物の安定化のプロセスが、約０．５～２．０Ｋｇｆ／ｃｍ^２の圧力で行われることを特徴とする、請求項８に記載の農業用組成物の製造方法。

【請求項19】

発酵培養物の植菌のためのアゾスピリルム・ブラシレンセ（A. brasilense）培養物の逐次の拡大をさらに含むことを特徴とする、請求項１１に記載の農業用組成物の製造方法。

【請求項20】

アゾスピリルム・ブラシレンセ（A. brasilense）Ａｂ－Ｖ５株とＡｂ－Ｖ６株が、別々に植菌されることを特徴とする、請求項１９に記載の農業用組成物の製造方法。

【請求項21】

逐次の拡大が、約１００ｍＬから約１０Ｌ、約１８０Ｌから約２０００Ｌの体積で行われることを特徴とする、請求項１９に記載の農業用組成物の製造方法。

【請求項22】

アゾスピリルム・ブラシレンセ（A. brasilense）株を、オービタルシェーカー上で約８０ｒｐｍ～約１５０ｒｐｍでインキュベートすることにより増殖させることを特徴とする、請求項２１に記載の農業用組成物の製造方法。

【請求項23】

アゾスピリルム・ブラシレンセ（A. brasilense）株を、約１８時間～約９６時間インキュベートすることにより増殖させることを特徴とする、請求項２２に記載の農業用組成物の製造方法。

【請求項24】

アゾスピリルム・ブラシレンセ（A. brasilense）株を、約１０Ｌの培地を含むステンレス鋼丸型フラスコ内で増殖させることを特徴とする、請求項２３に記載の農業用組成物の製造方法。

【請求項25】

前記菌株を、約１８～約９６時間インキュベートすることを特徴とする、請求項２４に記載の農業用組成物の製造方法。

【請求項26】

前記菌株を、約０．２５Ｎｍ^３／ｈ～約１．０Ｎｍ^３／ｈ（＝０．４１～１．６６ｖｖｍ）の空気流量でインキュベートすることを特徴とする、請求項２５に記載の農業用組成物の製造方法。

【請求項27】

約１０Ｌの２つのステンレス鋼製丸型フラスコ内で前記菌株を分離培養した後、前記２つのフラスコを、約１８０Ｌの培地が入ったタンクに植菌させることを特徴とする、請求項２４～２６のいずれか１項に記載の農業用組成物の製造方法。

【請求項28】

前記菌株を、約１８～約９６時間インキュベートすることを特徴とする、請求項２７に記載の農業用組成物の製造方法。

【請求項29】

前記菌株を、約１．２５～約３．０Ｎｍ^３／ｈ（＝０．１～０．２５ｖｖｍ）の空気流量でインキュベートすることを特徴とする、請求項２７に記載の農業用組成物の製造方法。

【請求項30】

インキュベートの温度が、約２２℃～約３８℃であることを特徴とする、請求項８～２９のいずれか１項に記載の農業用組成物の製造方法。

【請求項31】

発酵工程が、約０．５～約１．２ｋｇｆ／ｃｍ^３の圧力で行われることを特徴とする、請求項８に記載の農業用組成物の製造方法。

【請求項32】

発酵工程が、約４０ｈｚ～約４５ｈｚの撹拌下で行われることを特徴とする、請求項１１に記載の農業用組成物の製造方法。

【請求項33】

発酵工程が、約２２℃～約３８℃の温度で行われることを特徴とする、請求項１１に記載の農業用組成物の製造方法。

【請求項34】

発酵工程が、約１．０Ｎｍ^３／ｈ～約２．５Ｎｍ^３／ｈ（＝０．００８５～０．０２１ｖｖｍ）の空気流量で行われることを特徴とする、請求項１１に記載の農業用組成物の製造方法。

【請求項35】

発酵工程が、約１８時間～約９６時間行われることを特徴とする、請求項１１に記載の農業用組成物の製造方法。

【請求項36】

請求項８～３５のいずれか１項に記載の方法によって得られ、任意に１つ以上の農業上許容される添加剤および／または担体をさらに含んでもよいことを特徴とする、農業用組成物。

【請求項37】

農作物に適用するためのものであることを特徴とする、請求項１または３６に記載の農業用組成物の使用。

【請求項38】

種子、植栽溝、灌漑または葉面施用に適用するためのものであることを特徴とする、請求項３７に記載の使用。

【請求項39】

請求項１または３６に記載の組成物でコーティングされていることを特徴とする、植物、植物部分および／または種子。

【請求項40】

本特許出願において最初に開示、記載または説明されている主題に包含される、その実施形態のいずれかまたは該当する請求項カテゴリー、例えば、製品、方法または使用、によって特徴付けられる、発明。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、光安定性が向上した生物由来および／または合成由来のインドール酢酸（ＩＡＡ）を含む、植物の成長を促進するための農業用組成物、ならびにその製造方法および使用に関する。

【背景技術】

【0002】

細菌による植物ホルモンの産生は、植物の成長促進をつかさどる主な要因の１つである。植物ホルモン（オーキシン、サイトカイニン、ジベレリン、エチレン、およびアブシジン酸）は、植物の成長を調節する役割を果たす有機物質である（Raven et al., 2001）。天然に存在する主なオーキシンはインドール酢酸（ＩＡＡ）であり、植物の成長調節剤としての使用に大きな可能性を秘めている。土壌中のおよび／または植物に関連する細菌や真菌などのいくつかの微生物は、インドール酢酸（ＩＡＡ）を含む、植物で見られるものと同じ成長ホルモンを合成する。したがって、ＩＡＡなどの植物ホルモンを含む農業用組成物の使用は、作物の成長を促進するために望ましい。

【0003】

植物において、微生物のＩＡＡは、アゾスピリルム属（Azospirillum spp.）、アルカリゲネス・フェカリス属（Alcaligenes faecalis）、クレブシエラ属（Klebsiella sp.）、エンテロバクター属（Enterobacter sp.）、ザントモナス属（Xanthomonas sp.）、シュードモナス属（Pseudomonas spp.）、バチルス属（Bacillus spp.）、ハーバスピリルム・セロペディカエ属（Herbaspirillum seropedicae）、リゾビウム属（Rhizobium spp.）、およびブラディリゾビウム属（Bradyrhizobium spp.）の細菌によって産生され、これは、植物の成長刺激と関連付けられている（Patten and Glick, 1996; Idris et al., 2007; Kochar et al., 2011; Shao et al., 2015）。

【0004】

微生物は、環境に応じて、利用可能ないくつかのＩＡＡ生合成経路の中から特定のＩＡＡ生合成経路を選択できると考えられている。また、多くの細菌において、ＩＡＡ合成経路は複数あり、そのほとんどがトリプトファン依存性経路であることも報告されている（Patten and Glick, 1996）。トリプトファン依存性経路を介したＩＡＡ生合成の誘導はよく知られており、研究されている（Tullio et al., 2019; Iamada et al., 2017）。アゾスピリルムの発酵によるインドール酢酸の生成は、例えばＣＮ１０４９７５０５２に記載されている。ＩＡＡ分子は、培地の温度やｐＨなどの物理的要因に対して比較的安定性が高いが（Hiratsuka et al., 1989）、植物ホルモンの光分解は、ＩＡＡを含む農業用組成物の使用に関する主要な障害の１つである（Dunlap and Robacker, 1988; Stasinopoulos and Hangarter, 1990 and Hiratsuka et al., 1989）。光分解は、波長と強度に応じて、合成されたＩＡＡの最大９０％減少させる。

【0005】

したがって、当技術分野において、商業規模で植物作物に組成物を適用した後、化合物が長期間安定で活性を維持できるように、光安定性が向上したＩＡＡ植物ホルモンを含有する農業用組成物が求められている。

【0006】

［図面の簡単な説明］
［図１］特定の温度および圧力の条件下で安定化プロセスを受けた、ＵＶ光へのさまざまな曝露時間における合成ＩＡＡと生物学的ＩＡＡの濃度を示している。化合物の光安定性におけるメラノイジンの関与の証拠となる。
［図２］さまざまな安定化時間とＵＶ光への曝露下での生物学的ＩＡＡの濃度を示している。

【発明の概要】

【0007】

驚くべきことに、本発明は、インドール酢酸（ＩＡＡ）を含む組成物において、ＩＡＡ（indoleacetic acid）をメラノイジン型色素（melanoidin type pigment）と組み合わせることにより、光安定性が向上した農業用途向けのＩＡＡ含有組成物を達成できることを教示する。本発明の組成物および方法で使用されるＩＡＡは、生物学的および／または合成起源のものであり得る。

【発明を実施するための形態】

【0008】

本明細書で示されるように、メラノイジン型色素とＩＡＡを組み合わせることによる安定化は、生物学的供給源および／または合成供給源からのＩＡＡに光保護を提供する。

【0009】

一実施形態において、本発明は、ＩＡＡとメラノイジン型色素との組み合わせを含む組成物を提供する。本発明の組成物は、任意に、添加剤または農業上許容される担体、例えば、種子および播種溝を処理するための添加剤、噴霧タンク用の細胞保護剤、土壌改良剤、グラウト補助剤、種子コーティング用ポリマー、化学肥料または有機肥料の顆粒をコーティングするためのポリマー、葉物産物用の製剤に使用される液体肥料、固形肥料、内生胞子活性化剤（endospore activators）、その他の目的のものを含有してもよい。

【0010】

本発明の組成物は、当技術分野で知られている適切な包装方法（パッケージング）によって包装することができる。好ましくは、最終製品の酸素交換を必要としないバッグおよび／またはプラスチックボトルを使用することができる。本発明の製品の包装は、光安定性があるため、遮光の必要性が除去される。好ましくは、包装の体積は約１～２０Ｌであり、冷蔵環境または約１０～３５℃の範囲の室温で保存できる。

【0011】

本発明はさらに、ＩＡＡをメラノイジンと組み合わせることによって光安定性が向上したＩＡＡ農業用組成物を製造する方法を提供する。本発明の特定の実施形態において、ＩＡＡとメラノイジン型色素との組み合わせは、ＩＡＡおよび窒素源および還元糖を含む混合物を、メイラード反応を介した窒素源および還元糖のメラノイジン型色素への変換を促進する温度および圧力の条件に供することによって行われる。別の実施形態において、ＩＡＡおよびメラノイジン型色素は、メイラード反応による前記色素の形成後に組み合わされる。

【0012】

「窒素源」という用語には、これに限定されるものではないが、当技術分野で公知の生物学的または合成起源の、アミノ酸、ペプチドおよびタンパク質、ならびにそれらを含む混合物または生物学的抽出物が含まれる。

【0013】

「還元糖」という用語には、これに限定されるものではないが、当技術分野で公知の遊離アルデヒド基または遊離ケトン基を有するため還元剤として作用することができる任意の糖、およびそれらを含む混合物または生物学的抽出物が含まれる。

【0014】

本発明の好ましい実施形態において、前記ＩＡＡ、および窒素源および還元糖を含む混合物は、ＩＡＡ産生細菌をトリプトファン含有培地中で発酵させることによって得られる。発酵から得られるブロス（培養液）は、細菌によって生成されるＩＡＡ、および発酵した培地からの還元糖および窒素源を含む。前記発酵後、ブロスは、メイラード反応を介して窒素源および還元糖のメラノイジン型色素への変換を促進する温度および圧力の条件に供され、それにより、メラノイジン型色素が組成物のＩＡＡに光保護を与える。

【0015】

「ＩＡＡ産生細菌」という用語には、これに限定されるものではないが、アゾスピリルム属（Azospirillum spp.）、アルカリゲネス・フェカリス属（Alcaligenes faecalis）、クレブシエラ属（Klebsiella sp.）、エンテロバクター属（Enterobacter sp.）、ザントモナス属（Xanthomonas sp.）、ハーバスピリルム・セロペディカエ属（Herbaspirillum seropedicae）、リゾビウム属（Rhizobium spp.）、およびブラディリゾビウム属（Bradyrhizobium spp.）の細菌が含まれる（PattenとGlick, 1996）。好ましくは、ＩＡＡ産生細菌は、アゾスピリルム・ブラシレンセ（Azospirillum brasilense）である。

【0016】

したがって、本発明の好ましい特定の実施形態には、農業用組成物の工業的な製造方法であって、インドール酢酸（ＩＡＡ）の生合成のために、１つ以上のＩＡＡ産生細菌株およびトリプトファンを含む培養物を発酵させる工程；および、メイラード反応を介した窒素源と還元糖のメラノイジン型色素への変換を促進する温度および圧力の条件下で安定化する工程、を含む方法が含まれる。

【0017】

本発明はさらに、本発明の方法によって製造される組成物、およびその使用を提供する。

【0018】

有利なことに、好ましい実施形態において、本発明は、合成成分を含まず、生物学的経路のみによって得られる、光安定性が向上したＩＡＡ農業用組成物を提供する。

【0019】

本発明はさらに、圧力、温度、酸素化（空気量および撹拌）、およびＩＡＡ産生細菌の発酵のための培地パラメータなどの、ＩＡＡ農業用組成物を工業的に製造する方法の追加パラメータを含む、高濃度のＩＡＡ濃縮物を生成するための、好ましい実施形態を提供する。

【0020】

当業者に理解されるように、さまざまなＩＡＡ産生細菌株、好ましくは、アゾスピリルム・ブラシレンセ（Azospirillum brasilense）を使用することができ、またさまざまな培養パラメータおよび発酵パラメータを、本発明と組み合わせることができる。

【0021】

好ましい実施形態において、本発明は、以下の工程：
（ａ）インドール酢酸（ＩＡＡ）の生合成のために、１つ以上のＩＡＡ産生細菌株およびトリプトファンを含む培養物を発酵させる工程；および、
（ｂ）メイラード反応を介した窒素源と還元糖のメラノイジン型色素への変換を促進する温度および圧力の条件下で安定化する工程、
を含む、農業用組成物の製造方法を提供する。

【0022】

驚くべきことに、本発明の組成物におけるＩＡＡ光安定性は、メラノイジンとの組み合わせによって達成され、それは、光による分解のため農業においてバイオプロダクトの使用ができなくなることがなくなる。上述の色素は、最終製品に当たる光をフィルタリングして、ＩＡＡ植物ホルモンを保護することができ、それは、トリプトファン誘導経路で生合成されたものであっても、合成起源のものであってもよい。

【0023】

本発明の好ましい実施形態において、メラノイジン色素は、メイラード反応として知られるプロセスから得られる。この反応には強度に応じて３段階があり、最も進行した段階では、アミノ化合物と糖断片との重合（ポリメリゼーション）が起こり、茶色の色素であるメラノイジンが生成する（Van Boekel, 1998）。ＩＡＡ産生細菌を発酵させることによって得られるブロスからなる混合物の使用を含む実施形態において、この反応は、前記発酵後に、発酵プロセス中に挿入された窒素源および還元糖を、ＩＡＡの安定性をもたらす色素に変換することによって、起こる。これにより、最終製品中の高い植物ホルモンレベルは、光照射条件下でも、製品が保管および販売されるパッケージ内でも、または、種子、植栽溝、灌漑、または葉への農業用途においても、また、ＵＶ波長の強い照射下の環境においても、農業上の効率を損なうことなく、非常に安定して維持される。

【0024】

特定の実施形態において、ＩＡＡ産生細菌は、アゾスピリルム属（Azospirillum sp.）、より好ましくは、アゾスピリルム・ブラシレンセ（Azospirillum brasilense）である。好ましい実施形態において、１つ以上のアゾスピリルム・ブラシレンセ（A. brasilense）株は、Ａｂ－Ｖ５、Ａｂ－Ｖ６、Ｓｐ６、Ｓｐ７、Ｓｐ２４５、Ｃｄ、８－Ｉ、Ａｚ３９からなる群から選択される。より好ましい実施形態において、Ａｂ－Ｖ５株およびＡｂ－Ｖ６株の両方が使用される。

【0025】

好ましい実施形態において、植物ホルモンの安定化は、発酵槽環境内で行われる。好ましくは、安定化のプロセスは、約１００℃～約１３０℃の温度で、約１５分～１２０分間行われる。好ましくは、生成物の安定化は、約０．５～２．０ｋｇｆ／ｃｍ^２の圧力で行われる。

【0026】

本発明の好ましい実施形態において、アゾスピリルム・ブラシレンセ培養物のバッチ発酵または流加発酵（フェッドバッチ発酵）は、約１８～９６時間行われる。

【0027】

好ましい実施形態において、本発明の方法は、発酵培養物の植菌のためのアゾスピリルム・ブラシレンセ（A. brasilense）培養物の逐次の拡大（アップスケーリング）を含む。好ましくは、逐次の拡大は、約１０Ｌのための植菌物として機能する１００ｍＬの体積で開始する。次に、これらを約１８０Ｌに植菌し、次いで、最終的に約２，０００Ｌの反応器に移す。

【0028】

好ましい実施形態において、アゾスピリルム・ブラシレンセ（A. brasilense）株培養物は、約１００ｍＬのフラスコ内で、オービタルシェーカー上で約８０ｒｐｍないし約１５０ｒｐｍでインキュベートすることにより、増殖される。インキュベーション時間は、好ましくは、約１８時間～約９６時間である。好ましくは、次いで、アゾスピリルム・ブラシレンセ株を、約１０Ｌの培地を含むステンレス鋼丸型フラスコ内で増殖させる。インキュベーション時間は、好ましくは、約０．２５Ｎｍ^３／ｈ～約１．０Ｎｍ^３／ｈ（＝０．４１～１．６６ｖｖｍ）の空気流量で、約８～約９６時間である。

【0029】

好ましい実施形態において、本発明によるアゾスピリルム・ブラシレンセ株の培養増殖のための培養温度は、約２２℃～約３８℃である。

【0030】

好ましい実施形態において、本発明について記載した１８０Ｌの培養物からのアップスケーリングプロセスにおいて、アゾスピリルム・ブラシレンセＡｂ－Ｖ５株およびＡｂ－Ｖ６株を一緒に植菌する。この目的のために、好ましい態様では、約１０Ｌの２つのステンレス鋼丸型フラスコ中でそれらの菌株を増殖させた後、前記フラスコを、約１８０Ｌの培地が入ったタンクに植菌し、約１８～約９６時間インキュベートする。空気流量は、好ましくは、約１．２５～約３．０Ｎｍ^３／ｈ（＝０．１～０．２５ｖｖｍ）である。

【0031】

好ましい実施形態において、発酵工程は、約２２℃～約３８℃の温度で行われる。空気流量は、好ましくは、約１．０Ｎｍ^３／ｈ～約２．５Ｎｍ^３／ｈ（＝０．００８５～０．０２１ｖｖｍ）である。圧力は、好ましくは、約０．５～約１．２ｋｇｆ／ｃｍ^３である。撹拌は、好ましくは、約４０ｈｚ～約４５ｈｚである。発酵工程は、好ましくは、約１８時間～約９６時間行われる。

【0032】

好ましい実施形態において、１００ｍＬスケールのためのアゾスピリルム・ブラシレンセ（A. brasilense）の培養および／または発酵をスケールアップするために使用される培地は、ＮＦｂ培地である（Dobereiner, 1995）。他の生産スケール、すなわち、１０Ｌ、１８０Ｌ、および２０００Ｌの場合、好ましい態様では、表１に記載の培地が使用される。

【0033】

別の実施形態において、本発明は、上述の本発明による方法によって得ることができる、光安定性が向上した、ＩＡＡ農業用組成物を提供する。

【0034】

別の実施形態において、本発明はさらに、植物成長促進剤または生化学物質として農作物に適用するための、本発明の農業用組成物の使用を提供する。好ましくは、その使用は、種子、植栽溝、灌漑、または葉面施用に噴霧により適用するためのものである。

【0035】

別の実施形態において、本発明は、農作物の成長を最適化し、および／または農作物の収量を増加させるための農業用組成物を製造するための、本発明の光安定化ＩＡＡ植物ホルモンの使用を提供する。

【0036】

別の実施形態において、本発明は、本発明により得られる組成物でコーティングされた、植物、植物部分および／または種子を提供する。

【実施例】

【0037】

実施例１：培養のスケールアップ
アゾスピリルム・ブラシレンセ（Azospirillum brasilense）Ａｂ－Ｖ５株およびＡｂ－Ｖ６株を、１００ｍＬのＮＦｂ培地（Dobereiner, 1995）を含むフラスコに別々に植菌し、オービタルシェーカーにおいて、８０～１５０ｒｐｍ、２２～３８℃で、約１８～９６時間インキュベートする。次のスケールアップステップは、１０Ｌの培地（表１）が入ったステンレス鋼丸型フラスコに植菌し、この中で菌株を別々に増殖させ、空気流量０．２５～１．０Ｎｍ^３／ｈ（＝０．４１～１．６６ｖｖｍ）、温度約２２～３７℃で、約１８～９６時間インキュベートすることにより構成される。その後、各培養物を１８０Ｌの培地を含むタンクに植菌し、空気流量０．２５～３．０Ｎｍ^３／ｈ（＝０．１～０．２５ｖｖｍ）、温度２２～３８℃の範囲で、約１８～９６時間インキュベートする。

【0038】

【表1】

【0039】

【表2】

【0040】

実施例２：バイオリアクターでの発酵
２，０００Ｌ発酵槽での増殖には、表１に示すアミノ酸トリプトファンを含む培地を使用する。２，０００Ｌ発酵槽でのアゾスピリルム・ブラシレンセの増殖パラメータは次のとおりである：圧力０．５～１．２ｋｇｆ／ｃｍ^３、振盪範囲４０～４５ｈｚ、温度２２～３８℃、空気流量１．０～２．５Ｎｍ^３／ｈ（＝０．００８５～０．０２１ｖｖｍ）、１８～９６時間。

【0041】

実施例３：安定化
１８～９６時間の発酵後、微生物を含む培地を、１００～１３０℃、０．５～２．０ｋｇｆ／ｃｍ^２の圧力で、約１５～１２０分間滅菌することにより、代謝産物を安定化させるプロセスが実施される。

【0042】

実施例４：光安定性
インドール酢酸植物ホルモンの光安定性をもたらす配合物を検証するために、２つの手順を実施した。第１のアッセイでは、以下を比較した：ｉ）水を用いた合成ＩＡＡ（メラノイジンによる保護なし）；ｉｉ）本発明の生物学的ＩＡＡ製造プロセスで使用されるのと同じ培地を用いた合成ＩＡＡ、および、ｉｉｉ）生物学的ＩＡＡ；メイラード反応によるメラノイジンの生成によるインドール化合物の安定化を目的として、すべてのサンプルは１２１℃で約１時間の滅菌プロセスに供されている。安定化に必要な時間が経過した後、ＧｌｉｃｋｍａｎｎとＤｅｓｓａｕｘ（１９９４）によって提案された方法に従って、Ｓａｋｗｏｌｓｋｉ試薬を使用して、ＩＡＡ濃度を評価した。

【0043】

グラフ１に示す結果は、本クレームの安定化プロセスを有さない合成ＩＡＡは、ＵＶ光に４時間暴露した後に完全に分解されることを示している。暴露後最初の１時間以内に、光分解はすでに７４．５％に達する。しかしながら、アゾスピリルム・ブラシレンセ（Azospirillum brasilense）によって生物学的に生成されたＩＡＡを評価すると、特に１、２、および４時間のＵＶ光の曝露後に、それぞれ、０．７％、１７．２％、および２９．１％の分解しかなく、安定化なし（水で希釈）のＩＡＡと比較して、濃度の減少が少なかったため、より高い安定性が確認された。同様に、技術解決手段に示されている配合物に合成ＩＡＡを添加し、続いて安定化の工程を行うと、ＵＶ光に対する光保護の同じ挙動が得られた。これは、メイラード反応によって生成される色素であるメラノイジンが、生物学的および合成起源の植物ホルモンであるインドール酢酸を光分解から保護するという驚くべき能力を示している。Ｌｅａｓｕｒｅら（２０１３）は、インドール酢酸は光分解速度が高いため、植物での使用が難しいことを報告しており、これは、持続可能なアグリビジネスに貢献することができる天然由来の強力な植物成長促進剤であるＩＡＡを商業的規模で農業利用できるようにするため、本クレームの実用的な解決手段の重要性を証明している。

【0044】

第２の手順（グラフ２）では、光保護におけるメラノイジン濃度の役割を評価するために、生物学的ＩＡＡを用いた製剤を安定化するプロセスを異なる時間にして、１５分、１時間、１時間３０分の範囲で評価した。

【0045】

第１のアッセイと同様に、ＩＡＡ植物ホルモンの安定化が効果的であり、ＵＶ光照射に対する化合物の安定性が向上した。また、インドール化合物を異なる安定化時間に曝露すると、正比例の比率で光保護が生じること、すなわち、プロセスの時間が長いほど、より大きな安定性が得られること、特に生物学的ＩＡＡ安定化の処理時間が１時間３０分である場合に、アゾスピリルム・ブラシレンセによって合成されるＩＡＡの高い安定性が提供すされることも注目される。ＩＡＡ安定性の向上の驚くべき効果は、スコット・ノット平均検定（ｐ≦０．０５）を適用することによって、本アッセイで試験された紫外線への曝露のすべての時間において有意差があったことにより、確認された。安定化のプロセスを実施しない場合、生物学的ＩＡＡの光分解が５４．８５％で発生するが、生物学的ＩＡＡの部分的な保護は微生物の増殖前の培地の滅菌によるものであることを指摘することが重要である。

【0046】

得られた結果は、光照射を受けたＩＡＡ植物ホルモンの安定性を向上する技術解決手段によって示された、安定化プロセス中に生成される色素であるメラノイジンの有効性を実証している。この解決手段は、植物成長促進化合物の応用にいくつかの可能性をもたらし、環境に優しいと同時に重要な作物に改良をもたらす革新的で応用可能な解決手段によってプラスの影響を受けた、社会環境バランスに不可欠な農業の持続可能性に貢献するものである。

【手続補正書】

【提出日】2024-02-22

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【請求項1】

インドール酢酸（ＩＡＡ）とメラノイジン型色素との組み合わせを含む農業用組成物であって、メラノイジンを含まないＩＡＡ組成物と比べて光安定性が向上している、農業用組成物。

【請求項2】

ＩＡＡが合成物である、請求項１に記載の組成物。

【請求項3】

ＩＡＡが生物源由来であり、好適には、ＩＡＡがＩＡＡ産生細菌の発酵によって得られる、請求項１に記載の組成物。

【請求項4】

農業上許容される添加剤または担体をさらに含み、好適には、添加剤が、種子および播種溝を処理するための添加剤、噴霧タンク用の細胞保護剤、土壌改良剤、混合補助剤、種子コーティング用ポリマー、化学肥料または有機肥料の顆粒をコーティングするためのポリマー、葉物用製剤に使用される液体肥料、固形肥料、および内生胞子活性化剤、からなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。

【請求項5】

光安定性が向上したＩＡＡ農業用組成物を製造する方法であって、前記組成物中においてＩＡＡとメラノイジン型色素との組み合わせを処方化することを含み、前記組成物がメラノイジンを含まないＩＡＡ組成物と比べて向上した光安定性を示す、方法。

【請求項6】

インドール酢酸（ＩＡＡ）植物ホルモンおよび窒素源および還元糖を含む混合物を、メイラード反応を介した窒素源と還元糖のメラノイジン型色素への変換を促進する温度および圧力の条件に供することを含む、請求項５に記載の方法。

【請求項7】

ＩＡＡが合成物である、請求項５に記載の方法。

【請求項8】

ＩＡＡが生物源由来であり、好適には、ＩＡＡがＩＡＡ産生菌の発酵により得られる、請求項５に記載の方法。

【請求項9】

請求項８に記載の方法であって、以下の工程：
（ａ）インドール酢酸（ＩＡＡ）の生合成のために、１つ以上のＩＡＡ産生細菌株およびトリプトファンを含む培養物を発酵させる工程；および、
（ｂ）メイラード反応を介した窒素源と還元糖のメラノイジン型色素への変換を促進する温度および圧力の条件下で安定化する工程、
を含む、方法。

【請求項10】

ＩＡＡ産生細菌が、１つ以上のアゾスピリルム・ブラシレンセ（Azospirillum brasilense）株を含み、好適には、１つ以上のアゾスピリルム・ブラシレンセ株が、Ａｂ－Ｖ５およびＡｂ－Ｖ６からなる群から選択される、請求項９に記載の方法。

【請求項11】

メイラード反応が、発酵槽環境内で起こる、請求項９に記載の方法。

【請求項12】

発酵が、バッチ培養または流加培養である、請求項９に記載の方法。

【請求項13】

前記生成物の安定化のプロセスが、
（ｉ）約１５分～約１２０分間；
（ｉｉ）約１００℃～約１３０℃の温度で；および／または
（ｉｉｉ）約０．５～２．０Ｋｇｆ／ｃｍ^２の圧力で、
行われる、請求項５に記載の方法。

【請求項14】

発酵培養物の植菌のためのアゾスピリルム・ブラシレンセ（A. brasilense）培養物の逐次の拡大をさらに含み、好適には、アゾスピリルム・ブラシレンセＡｂ－Ｖ５株とＡｂ－Ｖ６株が、別々に植菌される、請求項９に記載の方法。

【請求項15】

逐次の拡大が、約１００ｍＬから約１０Ｌ、約１８０Ｌから約２０００Ｌの体積で行われ、好適には、アゾスピリルム・ブラシレンセ（A. brasilense）株を、オービタルシェーカー上で約８０ｒｐｍ～約１５０ｒｐｍでインキュベートすることにより増殖させ、より好適には、アゾスピリルム・ブラシレンセ株を、約１８時間～約９６時間インキュベートすることにより増殖させ、さらに好適には、アゾスピリルム・ブラシレンセ株を、約１０Ｌの培地を含むステンレス鋼丸型フラスコ内で増殖させる、請求項１４に記載の方法。

【請求項16】

前記菌株を、約１８～約９６時間インキュベートし、好適には、前記菌株を、約０．２５Ｎｍ^３／ｈ～約１．０Ｎｍ^３／ｈ（＝０．４１～１．６６ｖｖｍ）の空気流量でインキュベートし、より好適には、約１０Ｌの２つのステンレス鋼製丸型フラスコ内で前記菌株を分離培養した後、前記２つのフラスコを、約１８０Ｌの培地が入ったタンクに植菌させ、さらに好適には、前記菌株を、約１．２５～約３．０Ｎｍ^３／ｈ（＝０．１～０．２５ｖｖｍ）の空気流量で約１８～約９６時間インキュベートする、請求項１５に記載の方法。

【請求項17】

インキュベートの温度が、約２２℃～約３８℃である、請求項８～１６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項18】

発酵工程が、約０．５～約１．２ｋｇｆ／ｃｍ^３の圧力で行われる、請求項６に記載の方法。

【請求項19】

発酵工程が、
（ｉ）約４０ｈｚ～約４５ｈｚの撹拌下で；
（ｉｉ）約２２℃～約３８℃の温度で；
（ｉｉｉ）約１．０Ｎｍ^３／ｈ～約２．５Ｎｍ^３／ｈ（＝０．００８５～０．０２１ｖｖｍ）の空気流量で；および／または
（ｉｖ）約１８時間～約９６時間、
行われる、請求項９に記載の方法。

【請求項20】

請求項５～１９のいずれか１項に記載の方法によって得られる光安定性が向上したＩＡＡ農業用組成物であって、該組成物がメラノイジンを含まないＩＡＡ組成物と比べて向上した光安定性を示し、任意に１つ以上の農業上許容される添加剤および／または担体をさらに含んでもよい、組成物。

【請求項21】

請求項１または２０に記載の農業用組成物の使用であって、農作物に適用するためのものであり、好適には、該組成物が、種子、植栽溝、灌漑または葉面施用に適用するためのものである、該組成物の使用。

【請求項22】

請求項１または２０のいずれかに記載の組成物でコーティングされている、植物、植物部分および／または種子。

【国際調査報告】