(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-06-04
(54)【発明の名称】発熱活性が低い架橋性官能化ゼラチン
(51)【国際特許分類】
C07K 14/78 20060101AFI20240528BHJP
【ＦＩ】
C07K14/78
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023567109
(86)(22)【出願日】2022-06-09
(85)【翻訳文提出日】2023-12-08
(86)【国際出願番号】 EP2022065716
(87)【国際公開番号】W WO2022258763
(87)【国際公開日】2022-12-15
(31)【優先権主張番号】BE2021/5461
(32)【優先日】2021-06-10
(33)【優先権主張国・地域又は機関】BE
(31)【優先権主張番号】BE2021/5534
(32)【優先日】2021-07-09
(33)【優先権主張国・地域又は機関】BE
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
２．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】523411020
【氏名又は名称】ルースロ ビーヴイ
(74)【代理人】
【識別番号】110001519
【氏名又は名称】弁理士法人太陽国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】フェルガウウェン、ビョルン
【テーマコード（参考）】
4H045
【Ｆターム（参考）】
4H045AA10
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045CA40
4H045DA50
4H045EA20
4H045EA50
4H045FA50
4H045GA20
(57)【要約】
本発明は、アミド結合を介して置換架橋性カルボン酸部分Ｒ－（ＣＨ２）ｎ－ＣＯＯＨ（式中、ｎは１～１０の整数である）で官能化され、さらにリポ多糖含有量が１００ＥＵ／ｇ未満であるゼラチン、並びに前記置換架橋性カルボン酸のＮ－ヒドロキシスクシンイミドエステルを使用した前記ゼラチンの調製方法に関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
アミド結合を介してカルボン酸部分Ｒ－（ＣＨ２）ｎ－ＣＯＯＨで官能化されたゼラチンであって、ｎは１～１０の整数であり、さらにリポ多糖含有量が、１００ＥＵ／ｇ未満、好ましくは５０ＥＵ／ｇ未満、より好ましくは２０ＥＵ／ｇ未満、さらに好ましくは１０ＥＵ／ｇ未満、さらに好ましくは５ＥＵ／ｇ未満、さらに好ましくは２ＥＵ／ｇ未満、最も好ましくは１ＥＵ／ｇ未満であり、Ｒは４－フェノール、ノルボルネニル又はＳＨからなる群から選択される、ゼラチン。
【請求項2】
ｎが１～５、好ましくは２又は３である、請求項１に記載のゼラチン。
【請求項3】
前記カルボン酸部分が、３－（４－ヒドロキシフェニル）－プロピオン酸、３－（ＳＨ）－プロピオン酸、及び２－（５－ノルボルネニル）－酢酸のうちの１つ又は複数であり、好ましくは３－（４－ヒドロキシフェニル）－プロピオン酸である、請求項１又は請求項２に記載のゼラチン。
【請求項4】
前記官能化ゼラチンの、前記カルボン酸部分による修飾度が、５％～１００％、好ましくは２５％～１００％、より好ましくは５０％～１００％、さらに好ましくは７５～１００％である、請求項１～請求項３に記載のゼラチン。
【請求項5】
前記官能化ゼラチンが、１００ｐｐｍ未満、好ましくは５０ｐｐｍ未満、より好ましくは２０ｐｐｍ未満、さらに好ましくは１０ｐｐｍ未満、さらに好ましくは５ｐｐｍ未満、さらに好ましくは２ｐｐｍ未満、最も好ましくは１ｐｐｍ未満の量の遊離カルボン酸Ｒ－（ＣＨ２）ｎ－ＣＯＯＨを含有する、請求項１～請求項４に記載のゼラチン。
【請求項6】
前記官能化ゼラチンがＡ型ゼラチンである、請求項１～請求項５に記載のゼラチン。
【請求項7】
前記官能化ゼラチンが、さらに、（メタ）アクリレート基若しくは（メタ）アクリレート部分、アセチル基若しくはアセチル部分、フェノール基若しくはフェノール部分、チオール基若しくはチオール部分、ノルボルネン基若しくはノルボルネン部分、テトラジン基若しくはテトラジン部分、アジド基若しくはアジド部分、フラン基若しくはフラン部分、アリル基若しくはアリル部分、マレイミド基若しくはマレイミド部分、又はそれらの任意の組合せで修飾されている、請求項１～請求項６に記載のゼラチン。
【請求項8】
請求項１～請求項７のいずれか一項に記載の官能化ゼラチンを提供する方法であって、ａ．反応媒体中で、カルボン酸部分Ｒ－（ＣＨ２）ｎ－ＣＯＯＨ（式中、ｎは１～１０の整数である）のＮ－ヒドロキシスクシンイミドエステル（Ｒ－（ＣＨ２）ｎ－ＣＯＯ－ＮＨＳ）を含有する試薬とゼラチンとを反応させることによって、ゼラチンを修飾する工程と、
ｂ．前記反応媒体のｐＨを、２．０～４．０、好ましくは２．５～３．５、より好ましくは３．０～３．５の値に低下させる工程と、
ｃ．前記の酸性の反応媒体に、０．０１～１．５ｗ／ｗ％のミセル形成界面活性剤を添加する工程と、
ｄ．前記ミセル含有媒体を吸着剤に、好ましくは活性炭に接触させる工程と、
ｅ．前記吸着剤を前記媒体から分離する工程と、
ｆ．前記官能化ゼラチンを含む前記媒体を回収する工程と
を含み、
式中、Ｒは、４－フェノール、ノルボルネニル及びＳＨからなる群から選択される、
方法。
【請求項9】
請求項１～請求項７のいずれか一項に記載の官能化ゼラチンを調製する方法であって、ａ）反応媒体中で、カルボン酸部分Ｒ－（ＣＨ２）ｎ－ＣＯＯＨ（式中、ｎは１～１０の整数である）のＮ－ヒドロキシスクシンイミドエステル（Ｒ－（ＣＨ２）ｎ－ＣＯＯ－ＮＨＳ）を含有する試薬とゼラチンとを反応させることによって、ゼラチンを修飾する工程と、
ｂ１）反応媒体のｐＨを４．０～９．０、好ましくは４．０～６．０、より好ましくは４．０～６．０、さらに好ましくは４．５～５．５の値に低下させる工程と、
ｃ）前記反応媒体に、０．０１～１．５ｗ／ｗ％のミセル形成界面活性剤を添加する工程と、
ｂ２）前記反応媒体のｐＨを、２．０～４．０、好ましくは２．５～３．５、より好ましくは３．０～３．５の値に低下させる工程と、
ｄ）工程ｂ２）の媒体を固体吸着剤に接触させる工程と、
ｅ）工程ｄ）の固体吸着剤を前記媒体から分離する工程と、
ｆ）前記官能化ゼラチンを含む前記媒体を回収する工程と
を含み、
式中、Ｒは、４－フェノール、ノルボルネニル及びＳＨからなる群から選択される、
方法。
【請求項10】
ｎが１～５、好ましくは２又は３である、請求項８又は請求項９に記載の方法。
【請求項11】
前記カルボン酸部分Ｒ－（ＣＨ２）ｎ－ＣＯＯＨ（式中、ｎは１～１０の整数である）のＮ－ヒドロキシスクシンイミドエステルを含有する前記試薬が、Ｒ－（ＣＨ２）ｎ－ＣＯＯ－ＮＨＳである、請求項８～請求項１０に記載の方法。
【請求項12】
前記カルボン酸部分が、３－（４－ヒドロキシフェニル）－プロピオン酸、３－（ＳＨ）－プロピオン酸及び２－（５－ノルボルネニル）－酢酸のうちの１つ又は複数であり、好ましくは３－（４－ヒドロキシフェニル）－プロピオン酸である、請求項８～請求項１０に記載の方法。
【請求項13】
ゼラチンの第一級アミン基が前記カルボン酸部分で修飾されている、請求項８～請求項１２に記載の方法。
【請求項14】
前記官能化ゼラチンの第一級アミン基が、アミド結合を介して前記カルボン酸部分にカップリングされている、請求項８～請求項１３に記載の方法。
【請求項15】
透析工程を含まない、請求項８～請求項１４に記載の方法。
【請求項16】
前記ミセル形成界面活性剤が非イオン性界面活性剤を含み、好ましくは前記界面活性剤が、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００若しくはＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１０２、又はそれらの混合物である、請求項８～請求項１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項17】
前記官能化ゼラチンのリポ多糖含有量が、１００ＥＵ／ｇ未満、好ましくは５０ＥＵ／ｇ未満、より好ましくは２０ＥＵ／ｇ未満、さらに好ましくは１０ＥＵ／ｇ未満、さらに好ましくは５ＥＵ／ｇ未満、さらに好ましくは２ＥＵ／ｇ未満、最も好ましくは１ＥＵ／ｇ未満である、請求項８～請求項１６に記載の方法。
【請求項18】
前記官能化ゼラチンの、前記カルボン酸部分による修飾度が、５％～１００％、好ましくは２５％～１００％、より好ましくは５０％～１００％、さらに好ましくは７５～１００％である、請求項８～請求項１７に記載の方法。
【請求項19】
前記官能化ゼラチンに含まれる遊離カルボン酸Ｒ－（ＣＨ２）ｎ－ＣＯＯＨが、１００ｐｐｍ未満、好ましくは５０ｐｐｍ未満、より好ましくは２０ｐｐｍ未満、さらに好ましくは１０ｐｐｍ未満、さらに好ましくは５ｐｐｍ未満、さらに好ましくは２ｐｐｍ未満、最も好ましくは１ｐｐｍ未満である、請求項８～請求項１８に記載の方法。
【請求項20】
遊離カルボン酸の量が、ｐＨが９．５の５０ｍＭリン酸緩衝液に溶解した前記ゼラチンの試料で定量される、請求項８～請求項１９に記載の方法。
【請求項21】
前記官能化ゼラチンが、さらに、（メタ）アクリレート基若しくは（メタ）アクリレート部分、アセチル基若しくはアセチル部分、フェノール基若しくはフェノール部分、チオール基若しくはチオール部分、ノルボルネン基若しくはノルボルネン部分、テトラジン基若しくはテトラジン部分、アジド基若しくはアジド部分、フラン基若しくはフラン部分、アリル基若しくはアリル部分、マレイミド基若しくはマレイミド部分、又はそれらの任意の組合せで修飾される、請求項８～請求項２０に記載の方法。
【請求項22】
請求項１～請求項７のいずれかに記載の官能化ゼラチンと、架橋剤と、を含むヒドロゲル。
【請求項23】
請求項２２に記載のヒドロゲル又は請求項１～請求項７に記載の官能化ゼラチンを含む、フィルム。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本出願は、一般に、化学的に官能化されたゼラチン、特に架橋性の置換カルボン酸（cross-linkable, substituted carboxylic acid）で官能化されたゼラチンに関する。より詳細には、本発明は、発熱活性が低く（low pyrogenic activity）、特にリポ多糖含有量が低い架橋性置換カルボン酸官能化ゼラチン、架橋性置換カルボン酸官能化ゼラチンを含むヒドロゲル、架橋性置換カルボン酸官能化ゼラチンの調製方法、及びその使用に関する。
【背景技術】
【0002】
臨床、診断又は医薬の研究用の機能的な生体組織、生体インプラント、及び細胞ベースの多臓器モデルの再構築に、高い注目が集まっている。様々な組織工学用途の主要な候補として、天然の細胞外マトリックスと類似性があることから、ヒドロゲルが上がっている。
【0003】
ゼラチンヒドロゲルが、その生体適合性及び生分解性のために特に魅力的である。体内で最も豊富なタンパク質であり、細胞外マトリックスの最も一般的な分子であるコラーゲンが部分加水分解されることによって、ゼラチンは生成される。細胞認識配列であるアルギニン－グリシン－アスパラギン酸（ＲＧＤ）が豊富に存在することにより、ゼラチンには細胞が付着しやすく、その細胞の拡散と増殖が促進される。この細胞－マトリックス相互作用が、複雑な組織の構築にとって重要である。ゼラチンは、医薬品業界において信頼できる添加剤（excipient）として長い歴史があるため、安全性及び法令遵守の最高基準を満たしている。さらに、遊離アミノ基、ヒドロキシル基、及びカルボキシレート基が存在することにより、特定用途にむけた所望の特性を得るために化学修飾することが可能である。
【0004】
ゼラチンヒドロゲルは、その側基を事前に修飾せずに、又は、その側基を官能化した後に、ゼラチンポリマーを架橋することによって作製される。ゼラチン骨格への官能基の付加とは、ヒドロゲルの設計及び特性に対する高度な制御を伴う架橋戦略である。ゼラチンを架橋するために最も広く使用され研究されている修飾は、メタクリロイル化である。ＭＡ修飾ゼラチンは、一般にゲルＭＡと呼ばれる。十分に確立されているメタクリロイルゼラチンの代替としては、アクリロイルゼラチン（Ｂｉｌｌｉｅｔ ｅｔ ａｌ．２０１３「Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒａｓｔｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｐｈｏｔｏｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ａｎｄ Ｍｅｔｈａｃｒｙｌａｍｉｄｅ－Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ Ｇｅｌａｔｉｎ Ｈｙｄｒｏｇｅｌ Ｂｕｉｌｄｉｎｇ Ｂｌｏｃｋｓ」Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ １３：１５３１－４５）がある。
【0005】
他の官能化ゼラチンとしては、例えばチラミン官能化ゼラチン（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．３１（６）：１１４８－５７）がある。Ｗａｎｇらは、３－（４－ヒドロキシフェニル）－プロピオン酸（３－（４－ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）－ｐｒｏｐｉｏｎｉｃ ａｃｉｄ：ＨＰＡ）、過剰のＮ－ヒドロキシスクシンイミド（Ｎ－ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ：ＮＨＳ）、及び１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）－カルボジイミド塩酸塩（１－ｅｔｈｙｌ－３－（３－ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）－ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ：ＥＤＣ）の組合せを用いた修飾によるゼラチンの官能化について開示している。国際公開第２００６／０１００６６号には、チラミンのゼラチンへのカルボジイミド媒介カップリングを用いたゼラチンの修飾が開示されている。他の関連刊行物としては国際公開第２０２０／０５０７７９号があり、チラミン又はヒドロキシフェニルプロピオン酸ベースの架橋剤に基づく調整可能な特性を有するヒドロゲルが開示されている。化合物３－（４－ヒドロキシフェニル）プロパン酸（３－（４－ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）ｐｒｏｐａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）（ＨＯＣ６Ｈ４（ＣＨ２）２ＣＯ２Ｈは、ＨＰＡと略されることもあり、またフロレト酸又はデスアミノチロシン（ｄｅｓａｍｉｎｏｔｙｒｏｓｉｎｅ）（ＤＡＴと略されることもある）としても知られている。これらの表記は、互換的に使用されうる。
【0006】
Ｅｌｖｉｎ ｅｔ ａｌ．２０１０，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．３１（６）：８３２３－８３３１には、遊離アミンと３－（４－ヒドロキシフェニル）プロパン酸とのカップリングにより、ゼラチンの結合性部分、パラ－ヒドロキシルフェニル（チロシン様）の含有量が増加することに基づいて、光重合性ゼラチンベースの材料を作製することが記載されている。ＤＡＴ含有量は、ゼラチンとボルトンハンター試薬（Ｎ－スクシンイミジル－３－［４－ヒドロキシフェニル］プロピオナート）との反応によって増加した。これが、カルボン酸官能化ゼラチンの例である。
【0007】
ゼラチンベースのヒドロゲルは、官能化度及びポリマー濃度に応じて、その物理的特性（架橋密度、膨潤性、及び剛性）を調整することができ、このことにより、この材料が様々な組織工学用途のための汎用基盤となっている。架橋は、様々な方法で開始され得る。これらの方法の１つに、使用される光開始剤に応じてＵＶ又は可視光によって発生するラジカルによるものがある。あるいは、チオール－エン光クリックケミストリ、チオール－マイケル付加、逆電子要求ディールス・アルダー反応、ディールス・アルダークリック反応、ジスルフィド架橋形成、シッフ／の塩基、π－π環化付加、光酸化、及び／又は酵素的架橋を介するものがある。
【0008】
（生体）医療用途のゼラチンベースのヒドロゲルの主な欠点の１つは、従来法で製造されたゼラチン中に、エンドトキシン（本明細書ではリポ多糖とも呼ばれる）が存在することである。エンドトキシンは、高度に免疫原性である大きな分子であり、グラム陰性菌の外膜の主成分である。エンドトキシンは耐熱性が高いため、不活性化しにくい。エンドトキシンは、免疫系に曝露されると免疫応答を開始し、このことが組織の炎症、他のアレルゲンに対する感受性の増加、及び致命的ショックのリスクをもたらす可能性がある。ほとんどの研究は、現在、エンドトキシンレベルが高いゼラチンに基づく架橋官能化ゼラチンについて行われている。
【0009】
従来法で製造されたゼラチンはまた、エンドトキシン以外の微生物成分によって汚染される可能性があり、その一部は、エンドトキシンのように、ヒトで有害な免疫応答を引き起こす可能性がある。非エンドトキシン発熱物質としては、例えば、グラム陽性菌に由来するリポテイコ酸（ｌｉｐｏｔｅｉｃｈｏｉｃ ａｃｉｄ：ＬＴＡ）、並びにその他、真菌、酵母、ウイルス、細菌及び寄生虫に由来する化合物などの物質が挙げられる（Ｈａｓｉｗａ ｅｔ ａｌ．（２０１３）「Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｎｏｎｅｎｄｏｔｏｘｉｎ ｐｙｒｏｇｅｎｓ ｂｙ ｔｈｅ ｗｈｏｌｅ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｃｙｔｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｔｅｓｔ．ＡＬＴＥＸ ３０：１６９－２０８）。これらの非エンドトキシン発熱物質、及び、好ましくは一般的な発熱物質又は病原体関連分子パターン（Ｐａｔｈｏｇｅｎ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐａｔｔｅｒｎ：ＰＡＭＰ）はまた、自然免疫受容体が活性化した際の不必要な副作用を防ぐために、ゼラチンベースのヒドロゲルの（生体）医療用途では、最小限にとどめられるべきである。
【0010】
また、ゼラチンを官能化及び架橋してゼラチンヒドロゲルにする間に、複数の試薬が使用される。試薬及び反応生成物の残存物が、官能化ゼラチン中に存在する可能性がある。例えば、Ｅｌｖｉｎら（上記を参照されたい）によって記載されているように、ゼラチンをＮ－スクシンイミジル－３－［４－ヒドロキシフェニル］プロピオナートと反応させると、３－［４－ヒドロキシ］プロピオン酸（ＨＰＡ、フロレト酸）などの加水分解生成物、及び、Ｎ－スクシンイミジル－３－［４－ヒドロキシフェニル］プロピオナートなどの未反応試薬が、官能化ゼラチン組成物中に存在する可能性がある。これらの残留物は望ましくないと考えられる。化学修飾したゼラチンを用いて解決すべき他の問題は、化学プロセスが、ゼラチンの劣化若しくは加水分解（Ｍｗの低下）、又は望ましくない架橋（分子量の増加）をもたらす場合があることである。したがって、化学修飾により、結果的に、官能化の前後でＭｗがほぼ同じであるゼラチンが得られることが望ましい。
【0011】
従来の手順は、蒸留水に対する透析によって反応混合物を精製することに依拠している。通常、透析は１週間かけて行われる。したがって、この時間のかかる工程は、官能化ゼラチンを大規模生産するのに効率的ではない。さらに、この透析の期間に、微生物汚染及びゼラチン分解のリスクが増加する。ゼラチンベースのヒドロゲルの（生体）医療用途では、所望の機械的特性（例えば、強度及び弾性）を有するヒドロゲルを調整することが可能な生体適合性の（例えば、生体組織に対して非毒性であり、非免疫原性である）官能化ゼラチンが必要とされている。工業規模での生産を可能にする効率的なプロセスによってかかるゼラチンを製造する需要もある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0012】
本発明は、従来技術の上記問題の１つ又は複数を解決する。特に、発熱物質含有量が低く、特にエンドトキシン含有量が低く、かつ、試薬、副生成物及び加水分解生成物の汚染が少ないカルボン酸修飾ゼラチン（置換カルボン酸で官能化された第一級アミンを含む修飾ゼラチン）が提供される。カルボン酸官能化ゼラチンは、発熱物質含有量が低く、特にエンドトキシン含有量が低いため、生体適合性が向上している。本発明のカルボン酸官能化ゼラチンは、架橋プロセスを妨害することが知られている反応物による汚染が少ないため、特に架橋に有用である。また有利なことに、カルボン酸官能化ゼラチンは、長時間の透析工程を必要としない単純な製造プロセスによって調製することができる。
【課題を解決するための手段】
【0013】
本発明は、特に、以下の番号付けした態様及び実施形態（ｉ）～（ｘｖ）のうちのいずれか１つ又は１つ若しくは複数の組合せのいずれかによって表現される。
（ｉ）アミド結合を介しカルボン酸部分Ｒ－（ＣＨ２）ｎ－ＣＯＯＨ（式中、ｎは１～１０の整数である）で官能化されたゼラチンであって、さらに、リポ多糖含有量が、１００ＥＵ／ｇ未満、１００ＥＵ／ｇ、好ましくは５０ＥＵ／ｇ未満、より好ましくは２０ＥＵ／ｇ未満、さらに好ましくは１０ＥＵ／ｇ未満、さらに好ましくは５ＥＵ／ｇ未満、さらに好ましくは２ＥＵ／ｇ未満、最も好ましくは１ＥＵ／ｇ未満である、ゼラチン。
（ｉｉ）含んでいる反応物及び試薬、好ましくは遊離の置換カルボン酸が１００ｐｐｍ未満である、（ｉ）に記載のゼラチン。
（ｉｉｉ）グラム陽性細菌由来の発熱物質、鞭毛細菌由来の発熱物質、一本鎖ウイルスＲＮＡ、及び非メチル化ＣｐＧモチーフに富む細菌ＤＮＡの含有量が低い、好ましくはグラム陽性細菌由来及び鞭毛細菌由来の発熱物質の含有量が低い、より好ましくはグラム陽性細菌由来の発熱物質の含有量が低い、（ｉ）又は（ｉｉ）に記載のゼラチン。
（ｉｖ）前記ゼラチンがＡ型ゼラチンである、（ｉ）～（ｉｉｉ）のいずれか１つに記載のゼラチン。
（ｖ）カルボン酸置換度が、５％～１００％、好ましくは２５％～１００％、より好ましくは５０～１００％、さらに好ましくは８０％～１００％である、（ｉ）～（ｉｖ）のいずれか１つに記載のゼラチン。
（ｖｉ）前記ゼラチンが、（メタ）アクリロイル基若しくは（メタ）アクリロイル部分、アセチル基若しくはアセチル部分、フェノール基若しくはフェノール部分、チオール基若しくはチオール部分、ノルボルネン基若しくはノルボルネン部分、テトラジン基若しくはテトラジン部分、アジド基若しくはアジド部分、フラン基若しくはフラン部分、アリル基若しくはアリル部分、マレイミド基若しくはマレイミド部分、又はそれらの任意の組合せでさらに修飾されている、（ｉ）～（ｖ）のいずれか１つに記載のゼラチン。
（ｖｉｉ）（ｉ）～（ｖｉ）のいずれか１つに記載のカルボン酸で修飾されたゼラチンと、架橋剤とを含むヒドロゲル。
（ｖｉｉｉ）（ｖｉｉ）に記載のヒドロゲル又は（ｉ）～（ｖｉ）のいずれか１つに記載のゼラチンを含むフィルム。
（ｉｘ）（ｉ）～（ｖｉ）のいずれか１つに記載の官能化ゼラチンを提供する方法であって、
ａ．反応媒体中で、カルボン酸部分Ｒ－（ＣＨ２）ｎ－ＣＯＯＨ（式中、ｎは１～１０の整数である）のＮ－ヒドロキシスクシンイミドエステル（好ましくはＲ－（ＣＨ２）ｎ－ＣＯＯ－ＮＨＳ）を含有する試薬とゼラチンとを反応させることによって、ゼラチンを修飾する工程と、
ｂ．前記反応媒体のｐＨを、２．０～４．０、好ましくは２．５～３．５、より好ましくは３．０～３．５の値に、低下させる工程と、
ｃ．０．０１～１．５ｗ／ｗ％のミセル形成界面活性剤を、前記の酸性の反応媒体に添加する工程と、
ｄ．前記ミセル含有媒体を吸着剤に、好ましくは固体吸着剤に、好ましくは固体吸着剤に、好ましくは活性炭に、接触させる工程と、
ｅ．前記吸着剤を前記媒体から分離する工程と、
ｆ．前記官能化ゼラチンを含む前記媒体を回収する工程と
を含む、方法。
（ｘ）前記ミセル形成界面活性剤が非イオン性界面活性剤を含み、好ましくは前記界面活性剤が、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００若しくはＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１０２、又はそれらの混合物である、（ｉｘ）に記載の方法。
（ｘｉ）前記固体吸着剤が疎水性吸着剤、好ましくは活性炭である、（ｉｘ）又は（ｘ）に記載の方法。
（ｘｉｉ）前記カルボン酸修飾ゼラチンを含む前記媒体を乾燥させる工程をさらに含む、（ｉｘ）～（ｘｉ）のいずれか１つに記載の方法。
（ｘｉｉｉ）医薬に使用するための、（ｉ）～（ｖｉ）のいずれか１つに記載のゼラチン、又は（ｖｉｉ）に記載のヒドロゲル。
（ｘｉｖ）組織若しくは器官、又はそれらの一部、コーティング、足場、又は制御放出剤形などの生物学的構築物を製造するための、（ｉ）～（ｖｉ）のいずれかに１つに記載のゼラチン、又は（ｖｉｉ）に記載のヒドロゲルの、インビトロ又はエクスビボの使用。
（ｘｖ）（ｉ）～（ｖｉ）のいずれか１つに記載のゼラチン、又は（ｖｉｉ）に記載のヒドロゲルの、バイオインク又はバイオ樹脂としての使用。
（ｉ）アミド結合を介しカルボン酸部分Ｒ－（ＣＨ２）ｎ－ＣＯＯＨ（式中、ｎは１～１０の整数である）で官能化されたゼラチンであって、さらに、リポ多糖含有量が、１００ＥＵ／ｇ未満、１００ＥＵ／ｇ、好ましくは５０ＥＵ／ｇ未満、より好ましくは２０ＥＵ／ｇ未満、さらに好ましくは１０ＥＵ／ｇ未満、さらに好ましくは５ＥＵ／ｇ未満、さらに好ましくは２ＥＵ／ｇ未満、最も好ましくは１ＥＵ／ｇ未満である、ゼラチン。
（ｉｉ）含んでいる反応物及び試薬、好ましくは遊離の置換カルボン酸が１００ｐｐｍ未満である、（ｉ）に記載のゼラチン。
（ｉｉｉ）グラム陽性細菌由来の発熱物質、鞭毛細菌由来の発熱物質、一本鎖ウイルスＲＮＡ、及び非メチル化ＣｐＧモチーフに富む細菌ＤＮＡの含有量が低い、好ましくはグラム陽性細菌由来及び鞭毛細菌由来の発熱物質の含有量が低い、より好ましくはグラム陽性細菌由来の発熱物質の含有量が低い、（ｉ）又は（ｉｉ）に記載のゼラチン。
（ｉｖ）前記ゼラチンがＡ型ゼラチンである、（ｉ）～（ｉｉｉ）のいずれか１つに記載のゼラチン。
（ｖ）カルボン酸置換度が、５％～１００％、好ましくは２５％～１００％、より好ましくは５０～１００％、さらに好ましくは８０％～１００％である、（ｉ）～（ｉｖ）のいずれか１つに記載のゼラチン。
（ｖｉ）前記ゼラチンが、（メタ）アクリロイル基若しくは（メタ）アクリロイル部分、アセチル基若しくはアセチル部分、フェノール基若しくはフェノール部分、チオール基若しくはチオール部分、ノルボルネン基若しくはノルボルネン部分、テトラジン基若しくはテトラジン部分、アジド基若しくはアジド部分、フラン基若しくはフラン部分、アリル基若しくはアリル部分、マレイミド基若しくはマレイミド部分、又はそれらの任意の組合せでさらに修飾されている、（ｉ）～（ｖ）のいずれか１つに記載のゼラチン。
（ｖｉｉ）（ｉ）～（ｖｉ）のいずれか１つに記載のカルボン酸で修飾されたゼラチンと、架橋剤とを含むヒドロゲル。
（ｖｉｉｉ）（ｖｉｉ）に記載のヒドロゲル又は（ｉ）～（ｖｉ）のいずれか１つに記載のゼラチンを含むフィルム。
（ｉｘ）（ｉ）～（ｖｉ）のいずれか１つに記載の官能化ゼラチンを提供する方法であって、
ａ．反応媒体中で、カルボン酸部分Ｒ－（ＣＨ２）ｎ－ＣＯＯＨ（式中、ｎは１～１０の整数である）のＮ－ヒドロキシスクシンイミドエステル（好ましくはＲ－（ＣＨ２）ｎ－ＣＯＯ－ＮＨＳ）を含有する試薬とゼラチンとを反応させることによって、ゼラチンを修飾する工程と、
ｂ．前記反応媒体のｐＨを、２．０～４．０、好ましくは２．５～３．５、より好ましくは３．０～３．５の値に、低下させる工程と、
ｃ．０．０１～１．５ｗ／ｗ％のミセル形成界面活性剤を、前記の酸性の反応媒体に添加する工程と、
ｄ．前記ミセル含有媒体を吸着剤に、好ましくは固体吸着剤に、好ましくは固体吸着剤に、好ましくは活性炭に、接触させる工程と、
ｅ．前記吸着剤を前記媒体から分離する工程と、
ｆ．前記官能化ゼラチンを含む前記媒体を回収する工程と
を含む、方法。
（ｘ）前記ミセル形成界面活性剤が非イオン性界面活性剤を含み、好ましくは前記界面活性剤が、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００若しくはＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１０２、又はそれらの混合物である、（ｉｘ）に記載の方法。
（ｘｉ）前記固体吸着剤が疎水性吸着剤、好ましくは活性炭である、（ｉｘ）又は（ｘ）に記載の方法。
（ｘｉｉ）前記カルボン酸修飾ゼラチンを含む前記媒体を乾燥させる工程をさらに含む、（ｉｘ）～（ｘｉ）のいずれか１つに記載の方法。
（ｘｉｉｉ）医薬に使用するための、（ｉ）～（ｖｉ）のいずれか１つに記載のゼラチン、又は（ｖｉｉ）に記載のヒドロゲル。
（ｘｉｖ）組織若しくは器官、又はそれらの一部、コーティング、足場、又は制御放出剤形などの生物学的構築物を製造するための、（ｉ）～（ｖｉ）のいずれかに１つに記載のゼラチン、又は（ｖｉｉ）に記載のヒドロゲルの、インビトロ又はエクスビボの使用。
（ｘｖ）（ｉ）～（ｖｉ）のいずれか１つに記載のゼラチン、又は（ｖｉｉ）に記載のヒドロゲルの、バイオインク又はバイオ樹脂としての使用。
【図面の簡単な説明】
【0014】
【図4A】図４は出発ゼラチンのＭＷ分布（１）、並びに、ＮＨＳ、ＨＰＡ及びＥＤＣのin situ混合物を使用する経路を介した修飾と、それに続いて１段階透析を用いて精製を行った結果のＭＷ分布（２）、及び、２段階透析を用いて精製を行った結果のＭＷ分布（３）を示した図である。
【図4B】同じ出発ゼラチン（１）のＭＷ分布、及びＥＤＣが本質的に存在しない状態でＮＨＳ－ＨＰＡを使用する経路を介した修飾と、それに続いてミセル形成に基づく精製を用いた２段階精製を行った結果のＭＷ分布を示す。
【発明を実施するための形態】
【0015】
他に定義されない限り、技術用語及び科学用語を含み、本発明の開示に使用されるすべての用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解される意味を有する。さらなる指針によって、本発明の教示をよりよく理解するために用語の定義が含まれる。本明細書で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「前記（ｔｈｅ）」には、文脈により他に明確に指示されない限り、単数の指示物及び複数の指示物の両方が含まれる。
【0016】
本明細書で使用される「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ、ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、及び「構成される（ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ ｏｆ）」という用語は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ、ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ、ｃｏｎｔａｉｎｓ）」と同義であり、包括的又は無制限であり、列挙されていない追加の構成物、要素、又は方法の工程を排除しない。ある要素又は工程を含む実施形態について言及する場合、この言及には、列挙された要素又は工程から本質的になる実施形態も包含される。端点により列挙される数値範囲には、それぞれの範囲内に包含されるすべての数及び分数、並びに列挙された端点が含まれる。パラメータ、量、持続時間などの測定可能な値に言及する場合に本明細書で使用される「約」という用語は、開示する発明で実行するのに以下のばらつきが適切である場合に限り、特定の値の＋／－１０％以下、好ましくは＋／－５％以下、より好ましくは＋／－１％以下、さらに好ましくは＋／－０．１％以下のばらつきを包含することを意味する。「約」という修飾語が指す値は、それ自体も具体的でありかつ好ましく、開示されていることを理解されたい。本明細書で引用されるすべての文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0017】
本出願は、一般に、例えばゼラチンベースのヒドロゲル及びフィルムを調製する目的でゼラチンを架橋するための官能化ゼラチンに関する。より詳細には、本出願は、カルボン酸官能化ゼラチンに関する。
【0018】
ゼラチンは、コラーゲンに由来する水溶性タンパク質の混合物である。ゼラチンは、例えば、当技術分野で既知のように、例えばウシ、ブタ、家禽又は魚の、皮膚、腱、靭帯、骨などを、酸又はアルカリ条件下で水性抽出することによって得られるコラーゲンの部分加水分解又は酵素加水分解によって得られる。酸処理によって得られるゼラチンは「Ａ型ゼラチン」と呼ばれ、「Ｂ型ゼラチン」はアルカリベースのプロセスに由来する。Ｂ型ゼラチンではアスパラギン及びグルタミンの脱アミノ化がより多く生じるため、Ａ型ゼラチン及びＢ型ゼラチンの等電点（ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ ｐｏｉｎｔ：ＩＥＰ）はそれぞれ、ｐＨ７．０～９．０及びｐＨ４．９～５．１にあり、このことにより、中性の生理学的ｐＨでは、それらのゼラチンが正及び負に帯電することが可能である。好ましい実施形態では、本発明はＡ型ゼラチンに関する。
【0019】
ゼラチンは、均一なタンパク質分子を構成しているのではなく、長さが不定のタンパク質分子を不定の量含んでいる。好ましくは、本明細書で使用されるゼラチンは、平均分子量が、１５００Ｄａ～３００ｋＤａの範囲内、好ましくは２０００Ｄａ～３００ｋＤａ、４０００Ｄａ～３００ｋＤａ、５０００Ｄａ～３００ｋＤａ、１０ｋＤａ～３００ｋＤａ、又は２０ｋＤａ～３００ｋＤａ、より好ましくは５０ｋＤａ～３００ｋＤａ、最も好ましくは１００ｋＤａ～３００ｋＤａ、例えば１００ｋＤａ～２７５ｋＤａ又は１００ｋＤａ～２５０ｋＤａである。ゼラチンの分子量分布は、通常、サイズ排除高速液体クロマトグラフィー（ｈｉｇｈ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：ＨＰＬＣ）技術によって測定され、溶出画分はＵＶ吸着によって検出され、測定データは適切なソフトウェアによって評価される。すべての技術は当技術分野で既知であり、Ｏｌｉｊｖｅ ｅｔ．ａｌ．（２０００．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｌｌｏｉｄ ａｎｄ Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４３：４７６－４８２）を参照されたい。
【0020】
本明細書で使用される場合、「ゼラチン」という用語は、化学修飾ゼラチンを含む「ゼラチン誘導体」も包含する。本明細書で使用される「化学基又は化学部分（例えば、カルボン酸基又はカルボン酸部分、チラミン基又はチラミン部分、メタクリロイル基又はメタクリロイル部分、アクリロイル基又はアクリロイル部分、アセチル基又はアセチル部分、フェノール基又はフェノール部分など）で修飾されたゼラチン」という表現は、例えばゼラチンの少なくとも１つのアミン基、少なくとも１つのヒドロキシル基、少なくとも１つのカルボキシル基、及び／又は少なくとも１つのフェノール基に結合した前記化学基又は化学部分（例えば、カルボン酸基、チラミン基又はチラミン部分、メタクリロイル基又はアクリロイル基、アセチル基又はアセチル部分、フェノール基又はフェノール部分など）を含むゼラチンを表す。
【0021】
本明細書で使用される場合、「カルボン酸基で修飾されたゼラチン」又は「架橋性置換カルボン酸基で修飾されたゼラチン」は、本明細書では、「カルボン酸修飾ゼラチン」、「カルボン酸置換ゼラチン」又は「カルボン酸－ゼラチン」又は「ゼラチンカルボン酸」とも呼ばれ、好ましくはアミド結合を介して、少なくとも１つのカルボン酸基で置換された遊離アミンを有するゼラチンとして定義される。ゼラチンはアミノ酸を含み、その一部は、末端アミン（例えば、リシン、アルギニン、アスパラギン、グルタミン）を含有する側鎖を有し、又は、ヒドロキシル（例えば、セリン、トレオニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、チロシン、ヒドロキシプロリン）を含有する側鎖を有する。さらに、ゼラチンは、Ｎ末端アミンも含有する。これらの末端アミンのすべてをカルボン酸基で置換して、カルボン酸基を含む官能化ゼラチンを生成することができる。アミド結合を形成するために、カルボン酸でＮ末端アミンを置換することが好ましい。
【0022】
本発明のゼラチンの官能化に使用されるカルボン酸は、式Ｒ－（ＣＨ２）ｎ－ＣＯＯＨ（式中、ｎは１～１０の整数である）を有するカルボン酸である。
【0023】
実施形態では、ゼラチンの官能化に使用されるカルボン酸において、Ｒは、４－フェノール、ノルボルネニル、又はＳＨからなる群から選択される。実施形態では、ｎは１～５、好ましくは２又は３である。好ましい実施形態では、ゼラチンの官能化に使用されるカルボン酸において、カルボン酸部分は、３－（４－ヒドロキシフェニル）－プロピオン酸、３－（ＳＨ）－プロピオン酸、及び２－（５－ノルボルネニル）－酢酸のうちの１つ又は複数であり、好ましくは３－（４－ヒドロキシフェニル）－プロピオン酸である。
【0024】
ゼラチンの「官能化度（ｄｅｇｒｅｅ ｏｆ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚａｔｉｏｎ：ＤｏＦ）」は、一般に、全第一級アミン基に対する官能化された第一級アミン基の割合を指す。本明細書で使用される場合、「カルボン酸置換度」は、カルボン酸基で置換された、ゼラチン中の遊離アミン基の割合を指す。
ゼラチンのカルボン酸置換度などの官能化度は、それ自体既知の方法によって定量することができる。
ゼラチンのカルボン酸置換度などの官能化度は、それ自体既知の方法によって定量することができる。
【0025】
例えば、Ｆｅ（ＩＩＩ）－アセトヒドロキサム酸法は、ヒドロキシル基での置換の定量に用いることができる。Ｈａｂｅｅｂ法（（メタ）アクリルアミドのトリニトロベンゼンスルホン酸（ｔｒｉｎｉｔｒｏｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ：ＴＮＢＳ）ベースの分光光度定量、Ｈａｂｅｅｂ １９９６．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１４：３２８－３３６）、１Ｈ－ＮＭＲ及びフルオロアルデヒドアッセイ（遊離アミンのｏ－フタルジアルデヒド（ｏ－Ｐｈｔｈａｌｄｉａｌｄｅｈｙｄｅ：ＯＰＡ）ベースの蛍光定量としても知られている）は、アミン基におけるカルボン酸置換の定量に用いることができる。アミン基変換を定量化するためのフルオロアルデヒドアッセイと、ヒドロキシル基を定量化するためのＦｅ（ＩＩＩ）－アセトヒドロキサム酸法との組合せなど、前述の方法の組合せを用いることもできる。実施形態では、遊離アミンを定量することによるカルボン酸置換度の定量に、フルオロアルデヒドアッセイが用いられる。
【0026】
本明細書に開示するカルボン酸官能化ゼラチンでは、好ましくは遊離アミン基で、カルボン酸官能化が生じる。実施形態では、カルボン酸官能化ゼラチンは、カルボン酸置換度が２０％～１００％、好ましくは５０％～１００％、より好ましくは８０％～１００％、例えば８５％～１００％、９０％～１００又は９５％～１００％である。実施形態では、カルボン酸官能化ゼラチンは、カルボン酸置換度が２０％未満、好ましくは１０％未満、９％、８％、７％又は６％、より好ましくは５％未満、４％、３％、２％又は１％である。
【0027】
本明細書に開示するカルボン酸官能化ゼラチンは、さらに修飾及び／又は官能化されてもよい。実施形態では、カルボン酸－ゼラチンは、（メタ）アクリロイル基若しくは（メタ）アクリロイル部分、アセチル基若しくはアセチル部分、フェノール基若しくはフェノール部分、チオール基若しくはチオール部分、ノルボルネン基若しくはノルボルネン部分、テトラジン基若しくはテトラジン部分、アジド基若しくはアジド部分、フラン基若しくはフラン部分、アリル基若しくはアリル部分、マレイミド基若しくはマレイミド部分、又はそれらの任意の組合せ、好ましくはアセチル基で、さらに修飾される。二重化学官能化ゼラチンは、Ｈｏｃｈ ｅｔ ａｌ．（２０１２．Ｃｈｅｍｉｃａｌ ｔａｉｌｏｒｉｎｇ ｏｆ ｇｅｌａｔｉｎ ｔｏ ａｄｊｕｓｔ ｉｔｓ ｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ ｐｈｙｓｉｃａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｆｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｂｉｏｐｒｉｎｔｉｎｇ．Ｊ．Ｍａｔｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｂ １：５６７５）に記載されているように生成されてもよい。
【0028】
本明細書に開示するカルボン酸－ゼラチンは、発熱活性が低い。発熱活性は、当技術分野で既知の単球活性化試験（Ｍｏｎｏｃｙｔｅ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ Ｔｅｓｔ：ＭＡＴ）アッセイを用いて測定することができる。ＭＡＴアッセイにより、エンドトキシン及び非エンドトキシンである発熱物質レベルの両方の定量化が可能であるが、ＰＡＭＰ汚染の型は区別されない。種々のＰＡＭＰ、また種々の非エンドトキシンを検出及び定量化するために、Ｆｒａｕｎｈｏｆｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｉｎｔｅｒｆａｃｉａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＩＧＢによって、細胞ベースの発熱物質検出アッセイ（ＰＡＭＰアッセイ）が開発された。この細胞ベースの試験システムでは、ヒトＴｏｌｌ様受容体（Ｔｏｌｌ－ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ＴＬＲ）を使用してＰＡＭＰを検出する（Ｂｕｒｇｅｒ－Ｋｅｎｔｉｓｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ａ ｎｅｗ ｃｅｌｌ－ｂａｓｅｄ ｉｎｎａｔｅ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｔｈｅ ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ，ｌｉｇａｎｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ，ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｙｒｏｇｅｎｓ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，３５８：９３－１０３）。より詳細には、細胞、例えばＮＩＨ３Ｔ３細胞は、種々のＰＡＭＰの検出を可能にする種々のＴＬＲの組合せを発現する。例えば、受容体の組合せＴＬＲ１／２、ＴＬＲ２／６、ＴＬＲ４／ＣＤ１４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ７、及びＴＬＲ９を有する細胞株により、グラム陽性細菌由来の発熱物質（ＴＬＲ１／２、ＴＬＲ２／６）、鞭毛細菌由来の発熱物質（ＴＬＲ５）、一本鎖ウイルスＲＮＡ（ＴＬＲ７）の検出が可能であり、細胞株ＴＬＲ４／ＣＤ１４はグラム陰性細菌由来のエンドトキシンの検出が可能であり、ＴＬＲ９細胞株により非メチル化ＣｐＧモチーフに富む細菌ＤＮＡが検出される。実施形態では、本明細書に開示するＨＰＡ－ゼラチンは、グラム陽性細菌由来の発熱物質、鞭毛細菌由来の発熱物質、一本鎖ウイルスＲＮＡ、グラム陰性細菌由来のエンドトキシン、及び非メチル化ＣｐＧモチーフに富む細菌ＤＮＡの含有量が低い。
【0029】
特定の実施形態では、カルボン酸－ゼラチンは、グラム陽性細菌由来及び鞭毛細菌由来の発熱物質の含有量が低く、とりわけグラム陽性細菌由来の発熱物質の含有量が低い。特定の実施形態では、本明細書に開示するカルボン酸－ゼラチンは、エンドトキシン又はリポ多糖（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ：ＬＰＳ）の含有量が低く、特に、ＬＰＳ含有量が、１００ＥＵ／ｇ未満、より好ましくは５０ＥＵ／ｇ未満、さらに好ましくは２０ＥＵ／ｇ未満、さらに好ましくは１０ＥＵ／ｇ未満、さらに好ましくは５ＥＵ／ｇ未満、さらに好ましくは２ＥＵ／ｇ未満５、最も好ましくは１ＥＵ／ｇ未満であることを特徴とする。さらに特定の実施形態では、本明細書に開示するカルボン酸－ゼラチンは、Ａ型ゼラチン（由来）であり、ＬＰＳ含有量が、１００ＥＵ／ｇ未満、より好ましくは５０ＥＵ／ｇ未満、さらに好ましくは２０ＥＵ／ｇ未満、さらに好ましくは１０ＥＵ／ｇ未満、さらに好ましくは５ＥＵ／ｇ未満、さらに好ましくは２ＥＵ／ｇ未満、最も好ましくは１ＥＵ／ｇ未満であることを特徴とする。さらなる特定の他の実施形態では、本明細書に開示するカルボン酸－ゼラチンは、Ｂ型ゼラチン（由来）であり、ＬＰＳ含有量が、２０ＥＵ／ｇ未満未満、好ましくは１０ＥＵ／ｇ未満、より好ましくは５ＥＵ／ｇ未満、さらに好ましくは２ＥＵ／ｇ未満、最も好ましくは１ＥＵ／ｇ未満であることを特徴とする。ＥＵという用語は当技術分野で既知であり、「エンドトキシン単位」を表す。１ＥＵは、約１０４～１０５個の細菌に存在する量である１００ｐｇの大腸菌リポ多糖にほぼ等しい。本明細書において、ＥＵ／ｇという用語は、カルボン酸官能化ゼラチンの乾燥重量当たりのＥＵ数を表す。リムルスアッセイ（ＬＡＬ）は、サブピコグラム量までのＬＰＳを測定するための当技術分野で周知のバイオアッセイである。リムルス試薬（Ｌｉｍｕｌｕｓ ａｍｅｂｏｃｙｔｅ ｌｙｓａｔｅ：ＬＡＬ）は、アメリカカブトガニ、リムルス・ポリフェムス（Ｌｉｍｕｌｕｓ ｐｏｌｙｐｈｅｍｕｓ）由来の血球（アメボサイト）の水性抽出物である。ＬＡＬは、細菌エンドトキシン又はリポ多糖と反応する。この反応がＬＡＬ試験の基礎であり、そして、細菌エンドトキシンの検出及び定量化に用いられる。例えば、ＬＰＳレベルを定量化するための適切なＬＡＬ法としては、例えば米国Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ社の発色エンドセイフ法がある。許容され推奨される他の方法としては、Ｈｙｇｌｏｓ ＧｍｂＨ社（ドイツ）のエンドザイム・リコンビナントＣ因子法がある。前記のいずれの方法でも同様又は同一の測定値が得られるため、両方法は互換的に用いることができる。
【0030】
また有利には、本明細書に開示するカルボン酸－ゼラチンには、試薬及び反応生成物が実質的に含まれない。実施形態では、本明細書に開示するカルボン酸－ゼラチンに含まれる遊離カルボン酸、すなわちゼラチンに結合していないカルボン酸は低レベルであり、含まれるのは１５０ｐｐｍ未満のカルボン酸、又は１００ｐｐｍ未満のカルボン酸、又は５０ｐｐｍ未満のカルボン酸、好ましくは３０ｐｐｍ未満のカルボン酸、より好ましくは２５ｐｐｍ未満のカルボン酸、さらに好ましくは２０ｐｐｍ未満のカルボン酸である。実施形態では、本明細書に開示するカルボン酸－ゼラチンに含まれるのは、１５０ｐｐｍ未満のカルボン酸、例えば１４０ｐｐｍ未満のカルボン酸、１３０ｐｐｍ未満のカルボン酸、１２０ｐｐｍ未満のカルボン酸、又は１１０ｐｐｍ未満のカルボン酸、好ましくは１００ｐｐｍ未満のカルボン酸、例えば、９０ｐｐｍ未満のカルボン酸、８０ｐｐｍ未満のカルボン酸、７０ｐｐｍ未満又は６０ｐｐｍ未満のカルボン酸であり、ここで好ましくは、カルボン酸含有量は、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ９．５）に溶解したカルボン酸－ゼラチンの試料で定量される。実施例に詳述されているように、特に、カルボン酸－ゼラチンの試料を、水、又は５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ９．５）に溶解し、溶解した試料の限外濾過（例えば、１０ｋＤａアミコンウルトラ遠心式フィルタを使用）、及び濾液のＨＰＬＣ分析によって、カルボン酸を測定することができる。カルボン酸官能化ゼラチン中のカルボン酸の残基により、カルボン酸官能化ゼラチン分子の架橋が妨害される可能性がある。したがって、本明細書に開示するカルボン酸官能化ゼラチンは、そのカルボン酸含有量が低いため、ヒドロゲル又はフィルムを形成するための架橋に特に適している。それゆえに、さらなる態様は、架橋カルボン酸－ゼラチン又は本明細書に開示する架橋カルボン酸－ゼラチンを含むヒドロゲルに関する。本明細書ではさらに、前記ヒドロゲルから誘導されるフィルム、生体接着剤などの製品を開示する。本明細書で使用される「ヒドロゲル」という用語は、ゲルを形成する架橋カルボン酸－ゼラチンなどの親水性ポリマー鎖のネットワークを指す。「ゲル」という用語は、定常状態にある場合に、流れを示さない実質的に希薄な架橋系を表す。
【0031】
カルボン酸－ゼラチンの架橋プロセスは、当技術分野で周知である。通常、光開始剤の存在下での光への曝露により、１つのゼラチン分子のカルボン酸基が、別のゼラチン分子のカルボン酸基と反応して、カルボン酸－ゼラチンを架橋することができる。
【0032】
本明細書で使用される「光開始剤」という用語は、光、例えば紫外線（ＵＶ）又は可視光（ＶＩＳ）に曝露されるとフリーラジカルに分解する任意の化学化合物、又は化合物の混合物を指す。紫外線光開始剤の非限定的な例としては、１－［４－（２－ヒドロキシエトキシ）－フェニル］－２－ヒドロキシ－２－メチル－１－プロパン－１－オン（イルガキュア（Ｉｒｇａｃｕｒｅ、登録商標）２９５９の商品名でも知られる）、及びリチウムフェニル－２，４，６－トリメチルベンゾイルホスフィナート（ＬＡＰ）が挙げられる。可視光光開始剤（visible light photoinitiators）は、可視光に曝露されるとフリーラジカルを生成する。可視光光開始剤を励起するのに有用な可視光の例示的な範囲には、緑色、青色、藍色、及び紫色が含まれる。好ましくは、可視光は、４５０～５５０ｎｍの範囲内の波長を有する。可視光光開始剤の非限定的な例としては、エオシンＹ、リボフラビン／トリエタノールアミン、ビニルカプロラクタム、ｄｌ－２，３－ジケト－１，７，７－トリメチルノルカンファン（ＣＱ）、１－フェニル－１，２－プロパジオン（ＰＰＤ）、２，４，６－トリメチルベンゾイル－ジフェニルホスフィンオキシド（ＴＰＯ）、ビス（２，６－ジクロロベンゾイル）－（４－プロピルフェニル）ホスフィンオキシド（Ｉｒ８１９）、４，４’－ビス（ジメチルアミノ）ベンゾフェノン、４，４’－ビス（ジエチルアミノ）ベンゾフェノン、２－クロロチオキサンテン－９－オン、４－（ジメチルアミノ）ベンゾフェノン、フェナントレンキノン、フェロセン、ジフェニル１（２，４，６トリメチルベンゾイル）ホスフィンオキシド／２－ヒドロキシ－２－メチルプロピオフェノン（５０／５０ブレンド）、ジベンゾスベレノン、（ベンゼン）トリカルボニルクロム、レサズリン、レゾルフィン、５ベンゾイルトリメチルゲルマン（イボセリン（Ｉｖｏｃｅｒｉｎ、登録商標））、それらの誘導体、及びそれらの任意の組合せが挙げられる。
【0033】
光照射時間は、ポリマーの架橋が可能な任意の適切な時間であってよい。例えば、照射時間は、１０秒～２０分、好ましくは１分～２０分、より好ましくは２～１５分の範囲（例えば、２分、３分、４分、５分、６分、７分、８分、９分、１０分、１１分、１２分、１３分、１４分又は１５分）であってもよい。
【0034】
ゼラチンベースのヒドロゲルの機械的特性は、例えば、使用するゼラチンの分子量によって、ＨＰＡ置換度、カルボン酸－ゼラチン濃度、光開始剤の量、及び光曝露時間を変えることによって、様々な用途に合わせて調整することができる。
【0035】
本明細書で使用される場合、カルボン酸置換ゼラチンの濃度は、カルボン酸置換ゼラチンの重量を溶媒の体積で割ったもの（ｗ／ｖ）として定義され、パーセンテージで表される。溶媒は、医薬的に許容されるキャリアであってもよい。ヒドロゲルの実施形態では、カルボン酸置換ゼラチンは、５％～２５％（ｗ／ｖ）、１７％～２５％（ｗ／ｖ）、１７％～２３％（ｗ／ｖ）、又は約２０％（ｗ／ｖ）の濃度で存在する。いくつかの実施形態では、カルボン酸置換ゼラチンは、５％～１５％（ｗ／ｖ）、８％～１２％（ｗ／ｖ）、又は約１０％（ｗ／ｖ）の濃度で存在する。いくつかの実施形態では、カルボン酸置換ゼラチンは、１０％～４０％（ｗ／ｖ）、１５％～３５％（ｗ／ｖ）、２０％～３０％（ｗ／ｖ）、又は約５％、１０％、１５％、２０％、若しくは２５％（ｗ／ｖ）の濃度で存在する。
【0036】
本発明による化学修飾ゼラチン、特にカルボン酸－ゼラチン、及びヒドロゲルは、様々な用途に使用されてもよく、例としては、以下に限定されないが、ヒト又は非ヒト動物の組織（例えば、軟骨、軟組織）の製造又は修復、及び生物学的構築物の３次元バイオファブリケーション又は３次元バイオプリンティングのためのバイオインク又はバイオ樹脂としての使用が挙げられる。生物学的構築物は、例えば多孔質又は非多孔質であってもよい細胞含有の足場が挙げられるバイオファブリケーション技術又はバイオプリンティング技術を用いて製造することができる、任意の動物の組織若しくは器官又はその一部であってもよい。
【0037】
「バイオインク」という用語は、３Ｄ印刷、３Ｄプロット、又は加工を施して、特定の形状又は構築物にすることができる細胞適合性のヒドロゲルを指す。ヒドロゲルは、生細胞及び／又は成長因子などを組み込んでも組み込まなくてもよい。「バイオ樹脂」という用語は、レーザー又は光投射ベースの光ステレオリソグラフィ、又は同様のリソグラフィ技術を用い、３Ｄ印刷又は加工を施して特定の形状又は構築物にすることができる細胞適合性のヒドロゲルを表す。ヒドロゲルは、生細胞、薬物、及び／又は成長因子などを組み込んでも組み込まなくてもよい。
【0038】
カルボン酸Ａ関連の態様は、組織若しくは器官又はそれらの一部を製造するための、本明細書に開示するカルボン酸－ゼラチン、又は本明細書に開示するカルボン酸－ゼラチンを含むヒドロゲルの、インビトロ又はエクスビボの使用に関する。実施形態では、組織又は器官は、骨組織、軟骨、及び血管組織から選択される。本明細書に開示するカルボン酸－ゼラチン、又は本明細書に開示するカルボン酸－ゼラチンを含むヒドロゲルを含み、組織工学的に設計された組織若しくは器官又はそれらの一部も、本明細書に開示する。
【0039】
別の態様は、徐放性投薬剤又は生物学的構築物を製造するための、本明細書に開示するカルボン酸－ゼラチン、又は本明細書に開示するカルボン酸－ゼラチンを含むヒドロゲルの、インビトロ又はエクスビボの使用に関する。生物学的構築物は、例えば、細胞の接着及び増殖に適した（固体）支持体のコーティング、又は、細胞若しくは薬物及び／若しくは媒介物を含有するのに適した足場であり得る。
【0040】
またさらなる態様は、本明細書に開示するカルボン酸－ゼラチン、又は本明細書に開示するカルボン酸－ゼラチンを含むヒドロゲルの、バイオインク又はバイオ樹脂としての使用に関する。
【0041】
さらなる実施形態では、バイオインク又はバイオ樹脂は、生物学的構築物の３次元バイオファブリケーション又は３次元バイオプリンティングに使用される。生物学的構築物は、動物の組織若しくは器官、又はそれらの一部であり得る。生物学的構築物はまた、細胞を含有するのに適した足場、又は、例えば薬物及び／又は媒介物（例えば薬物送達／遺伝子治療の用途）を含有するのに適した足場であり得る。生物学的構築物はまた、生体吸収性スクリュー、又は他の生体材料（例えば生体接着剤）であり得る。実施形態では、生物学的構築物は、細胞を含有するのに適した足場である。実施形態では、生物学的構築物はコーティングである。本明細書に開示するカルボン酸－ゼラチンを含む生物学的構築物、又は本明細書に開示するカルボン酸－ゼラチンを含むヒドロゲルを含む生物学的構築物もまた、本明細書で開示する。またさらなる態様は、本明細書に開示するカルボン酸－ゼラチンの調製方法に関する。本発明者らは、驚くべきことに、国際公開第２０１６／０８５３４５号に記載されている方法の改変版に従ってカルボン酸－ゼラチンの水性反応媒体を精製すると、その媒体からリポ多糖が除去されるだけでなく、他の発熱物質、並びに、ゼラチン反応のカルボン酸官能化の間に形成されるか又はゼラチン反応のカルボン酸官能化の後に残る遊離カルボン酸及び他の反応物質も、除去されることを見出した。したがって、反応媒体の透析が必要ではなく、その結果、本明細書の他の箇所で明記したように、ＬＰＳ含有量が低く、発熱物質含有量が低く、かつカルボン酸含有量が低いカルボン酸－ゼラチンを提供するプロセスが、より速いものとなる。
【0042】
それゆえに、さらなる態様では、本発明は、本明細書に開示するカルボン酸－ゼラチンを調製する方法であって、前記方法は、以下の工程、すなわち、
ａ．反応媒体中で、カルボン酸部分Ｒ－（ＣＨ２）ｎ－ＣＯＯＨ（式中、ｎは１～１０の整数である）のＮ－ヒドロキシスクシンイミドエステル（Ｒ－（ＣＨ２）ｎ－ＣＯＯ－ＮＨＳ）を含有する試薬とゼラチンとを反応させることによって、ゼラチンを修飾する工程と、
ｂ．前記反応媒体のｐＨを、２．０～４．０、好ましくは２．５～３．５、より好ましくは３．０～３．５の値に低下させる工程と、
ｃ．前記の酸性の反応媒体に、０．０１～１．５ｗ／ｗ％のミセル形成界面活性剤を添加する工程と、
ｄ．前記ミセル含有媒体を吸着剤に、好ましくは活性炭に接触させる工程と、
ｅ．前記吸着剤を前記媒体から分離する工程と、
ｆ．官能化ゼラチンを含む前記媒体を回収する工程と、
ｇ．所望により、工程ｆ）の官能化ゼラチンを含む前記媒体を乾燥させる工程と
を含む、方法に関する。
ａ．反応媒体中で、カルボン酸部分Ｒ－（ＣＨ２）ｎ－ＣＯＯＨ（式中、ｎは１～１０の整数である）のＮ－ヒドロキシスクシンイミドエステル（Ｒ－（ＣＨ２）ｎ－ＣＯＯ－ＮＨＳ）を含有する試薬とゼラチンとを反応させることによって、ゼラチンを修飾する工程と、
ｂ．前記反応媒体のｐＨを、２．０～４．０、好ましくは２．５～３．５、より好ましくは３．０～３．５の値に低下させる工程と、
ｃ．前記の酸性の反応媒体に、０．０１～１．５ｗ／ｗ％のミセル形成界面活性剤を添加する工程と、
ｄ．前記ミセル含有媒体を吸着剤に、好ましくは活性炭に接触させる工程と、
ｅ．前記吸着剤を前記媒体から分離する工程と、
ｆ．官能化ゼラチンを含む前記媒体を回収する工程と、
ｇ．所望により、工程ｆ）の官能化ゼラチンを含む前記媒体を乾燥させる工程と
を含む、方法に関する。
【0043】
本明細書に開示するカルボン酸官能化ゼラチン－ゼラチンを調製する代替方法は、以下の工程、すなわち、
ａ）反応媒体中で、カルボン酸部分Ｒ－（ＣＨ２）ｎ－ＣＯＯＨ（式中、ｎは１～１０の整数である）のＮ－ヒドロキシスクシンイミドエステル（Ｒ－（ＣＨ２）ｎ－ＣＯＯ－ＮＨＳ）を含有する試薬とゼラチンとを反応させることによって、ゼラチンを修飾する工程と、
ｂ１）前記反応媒体のｐＨを、４．０～９．０、好ましくは４．０～６．０、より好ましくは４．０～６．０、さらに好ましくは４．５～５．５の値に低下させる工程と、
ｃ）前記反応媒体に、０．０１～１．５ｗ／ｗ％のミセル形成界面活性剤を添加する工程と、
ｂ２）前記反応媒体のｐＨを、２．０～４．０、好ましくは２．５～３．５、より好ましくは３．０～３．５の値に低下させる工程と、
ｄ）工程ｂ２）の媒体を固体吸着剤に接触させる工程と、
ｅ）工程ｄ）の固体吸着剤を前記媒体から分離する工程と、
ｆ）官能化ゼラチンを含む前記媒体を回収する工程と、
ｇ）所望により、工程ｆ）のカルボン酸官能化ゼラチン－ゼラチンを含む前記媒体を乾燥させる工程と
を含む。
ａ）反応媒体中で、カルボン酸部分Ｒ－（ＣＨ２）ｎ－ＣＯＯＨ（式中、ｎは１～１０の整数である）のＮ－ヒドロキシスクシンイミドエステル（Ｒ－（ＣＨ２）ｎ－ＣＯＯ－ＮＨＳ）を含有する試薬とゼラチンとを反応させることによって、ゼラチンを修飾する工程と、
ｂ１）前記反応媒体のｐＨを、４．０～９．０、好ましくは４．０～６．０、より好ましくは４．０～６．０、さらに好ましくは４．５～５．５の値に低下させる工程と、
ｃ）前記反応媒体に、０．０１～１．５ｗ／ｗ％のミセル形成界面活性剤を添加する工程と、
ｂ２）前記反応媒体のｐＨを、２．０～４．０、好ましくは２．５～３．５、より好ましくは３．０～３．５の値に低下させる工程と、
ｄ）工程ｂ２）の媒体を固体吸着剤に接触させる工程と、
ｅ）工程ｄ）の固体吸着剤を前記媒体から分離する工程と、
ｆ）官能化ゼラチンを含む前記媒体を回収する工程と、
ｇ）所望により、工程ｆ）のカルボン酸官能化ゼラチン－ゼラチンを含む前記媒体を乾燥させる工程と
を含む。
【0044】
本明細書に記載の方法においては、任意の種類のゼラチン、例えばウシ、ブタ、家禽又は魚が起源の、例えばＡ型ゼラチン又はＢ型ゼラチンを使用することができる。実施形態では、Ａ型ゼラチンが使用される。他の実施形態では、Ｂ型ゼラチンが使用される。
【0045】
Ｎ－ヒドロキシ－スクシンイミジル活性化カルボン酸を用いたゼラチンのカルボン酸官能化は、適切な緩衝液、例えばｐＨ９．０の炭酸塩緩衝液又はリン酸緩衝生理食塩水（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ－ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ：ＰＢＳ）において、５０℃の温度で６０～１８０分間、例えば６０分間又は１２０～１８０分間、それぞれのＮ－ヒドロキシ－スクシンイミジル活性化カルボン酸とゼラチンとを反応させることによって行うことができる。ゼラチンのカルボン酸官能化度は、Ｓｈｉｒａｈａｍａ ｅｔ ａｌ．（２０１６）に記載されているように、Ｎ－ヒドロキシ－スクシンイミジル活性化カルボン酸試薬とゼラチンとの比を変えることによって調整することができる。反応中、カルボン酸－ゼラチンと共に遊離カルボン酸が形成される。
【0046】
実施形態では、本発明のゼラチンの官能化に使用されるＮ－ヒドロキシ－スクシンイミジル活性化カルボン酸は、好ましくは本質的に１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）－カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）がない状態において、式Ｒ－（ＣＨ２）ｎ－ＣＯＯ－ＮＨＳ（式中、ｎは１～１０の整数である）を有するＮ－ヒドロキシ－スクシンイミジル－（ＮＨＳ）活性化カルボン酸である。
【0047】
実施形態では、ゼラチンの官能化に使用されるＮ－ヒドロキシ－スクシンイミジル－（ＮＨＳ）－活性化カルボン酸において、Ｒは、４－フェノール、５－ノルボルネニル、又はＳＨからなる群から選択される。実施形態では、ｎは、１～１０、好ましくは１～５、好ましくは２又は３である。好ましい実施形態では、ゼラチンの官能化に使用されるＮ－ヒドロキシ－スクシンイミジル－（ＮＨＳ）－活性化カルボン酸において、カルボン酸部分は、３－（４－ヒドロキシフェニル）－プロピオン酸、３－（ＳＨ）－プロピオン酸、及び２－（５－ノルボルネニル）－酢酸のうちの１つ又は複数であり、好ましくは３－（４－ヒドロキシフェニル）－プロピオン酸である。好ましい実施形態では、ゼラチンの官能化に使用されるＮ－ヒドロキシ－スクシンイミジル－（ＮＨＳ）活性化カルボン酸は、Ｎ－ヒドロキシ－スクシンイミジル－３－（４－ヒドロキシフェニル）－プロピオナート、Ｎ－ヒドロキシ－スクシンイミジル－３－（ＳＨ）－プロピオナート、及びＮ－ヒドロキシ－スクシンイミジル－２－（５－ノルボルネニル）－アセチルからなる群から選択され、好ましくはＮ－ヒドロキシ－スクシンイミジル－３－（４－ヒドロキシフェニル）－プロピオナートである。
【0048】
反応媒体のｐＨは、ミセル形成界面活性剤を添加する前に、２．０～５．０の値、好ましくは２．０～４．０、より好ましくは３．０～４．０、例えば約３．５又は２．０～３．５の値、例えば約３．０の値、さらに好ましくは３．０～３．５に低下させうる（本明細書に記載の方法における工程ｂ））。あるいは、反応媒体のｐＨは、ミセル形成界面活性剤を添加する前に、４．０～９．０の値、好ましくは４．０～６．０、より好ましくは４．０～６．０、さらに好ましくは４．５～５．５に低下させてもよく（本明細書に記載の方法における工程ｂ１））、ミセル形成界面活性剤を添加した後、媒体を固体吸着剤と接触させる前に、２．０～４．０の値、より好ましくは３．０～４．０、例えば約３．５又は２．０～３．５の値、例えば約３．０の値、さらに好ましくは３．０～３．５にさらに低下させてもよい（本明細書に記載の方法における工程ｂ２））。有利には、低いｐＨで次の方法の工程を行うと、ＬＰＳ、発熱物質、及びカルボン酸がより効率的に除去される。
【0049】
本明細書に記載の方法では、ミセル形成界面活性剤を反応媒体に添加する。ミセル形成界面活性剤は、溶液中でミセル（可溶性凝集体）を形成することができる。ミセル形成界面活性剤は、当技術分野で既知である。ミセル形成界面活性剤は、カチオン性又はアニオン性の界面活性剤などのイオン性界面活性剤であり得る。好ましくは、界面活性剤は非イオン性界面活性剤であり、そのような界面活性剤は、イオン性界面活性剤と比較して、より低い濃度でミセルを形成する傾向がある。さらに、イオン性界面活性剤は、イオン結合によってゼラチンと相互作用する可能性があり、除去がより困難である。
【0050】
好ましくは、ミセル形成非イオン性界面活性剤は、エトキシル化界面活性剤、好ましくはアルキルフェノールエトキシレートであり、好ましくは式ＣｘＨ２ｘ－１－Ｃ６Ｈ４－Ｏ－（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ｎＨで表されるアルキルフェノールエトキシレートであって、式中、ｘは４～１２であり、ｎは７．５～１４であり、Ｘは好ましくは８であり、ｎは好ましくは８～１３、より好ましくは８．５～１２．５、最も好ましくは９～１２であるアルキルフェノールエトキシレートであり、特にＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１０２、又はそれらの混合物である。Ｔｒｉｔｏｎ Ｘシリーズの非イオン性界面活性剤は、オクチルフェノールとエチレンオキシドとの反応によって調製される。その生成物は、通常、アルキルアリールポリエーテルアルコールとして記載される種類のものであり、Ｃ８Ｈ１７ Ｃ６Ｈ５（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）９．７（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００）、及びＣ９Ｈ１９ Ｃ６Ｈ５（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）１２．３（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１０２）の構造式を有する。適切な他の非イオン性界面活性剤は、ノニルフェノキシポリエトキシエタノールＣ１５Ｈ２４Ｏ（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ｎであって、ｎは３～４０であり、例えばノノキシノール－４、ノノキシノール－１５、及びノノキシノール－３０であるノニルフェノキシポリエトキシエタノール、又は、Ｃ１２－Ｃ１８脂肪酸のポリエチレングリコールソルビタンモノエステル、例えばＴＷＥＥＮを含む。ＣＨＡＰＳＯ（３－（［３－コラミドプロピル］ジメチルアンモニオ）－２－ヒドロキシル－１－プロパンスルホナートは、適切な別の非イオン性界面活性剤である。
【0051】
ミセル形成界面活性剤を添加した結果、ＬＰＳはモノマー化され、前記モノマーは界面活性剤と相互作用し、界面活性剤及びＬＰＳを含むミセル複合体を形成すると考えられる。ＬＰＳと、好ましくはまた他の発熱物質、特にグラム陽性細菌由来の発熱物質及び鞭毛細菌由来の発熱物質、とりわけグラム陽性細菌由来の発熱物質との効率的な除去を可能にするために、ゼラチン、特にカルボン酸－ゼラチンと、添加される界面活性剤、特に非イオン性界面活性剤との重量比は、好ましくは２０００：１以下、より好ましくは５００：１以下、さらに好ましくは２５０：１以下、最も好ましくは５０：１以下である。実際、より高い重量比では、すなわち比較的多くのゼラチンが存在する場合は、すべてのＬＰＳが界面活性剤によって結合されるわけではない。好ましくは、界面活性剤は、０．０１～１．５ｗ／ｗ％、好ましくは０．０１５～１．０ｗ／ｗ％、より好ましくは０．０２０～０．５０ｗ／ｗ％の濃度で反応媒体に添加される。
【0052】
本明細書に記載の方法の工程ｄ）において、界面活性剤、ＬＰＳ及びそのモノマー、並びに／又は他の発熱物質、特にグラム陽性細菌由来の発熱物質及び鞭毛細菌由来の発熱物質、とりわけグラム陽性細菌由来の発熱物質を含む可溶性凝集体を含有し得る工程ｃ）の媒体又は工程ｂ２）の媒体を、（固体）吸着剤と接触させる。吸着剤はまた、界面活性剤と結合すること、好ましくはＬＰＳとも結合することに加えて、好ましくは他の発熱物質、特にグラム陽性細菌由来の発熱物質、鞭毛細菌由来の発熱物質、一本鎖ウイルスＲＮＡ、並びに非メチル化ＣｐＧモチーフに富む細菌ＤＮＡ、及びＨＰＡとも結合する。
【0053】
固体吸着剤は、界面活性剤と結合することが可能な、好ましくはＬＰＳ、他の発熱物質及びカルボン酸とも結合することが可能な吸着剤であって、疎水性吸着剤などの当業者に既知の適切な任意の吸着剤であり得る。吸着剤は、好ましくは不溶性であり、適切な吸着剤は、粘土、例としては（活性）珪藻土又は粘土、フィロケイ酸塩、例としてはフィロケイ酸アルミニウム、スメクタイト鉱物及び疎水性吸着剤、例としては活性炭、例えばノーリットＳＸプラス若しくはノーリットＲＯＸ ０．８（オランダ、Ｃａｂｏｔ社）、又は３Ｍゼータカーボン・フィルタ・カートリッジ、例としてはタイプＲ５５Ｓ若しくはＲ３０Ｌ３Ｓ（米国、３Ｍ社）を含む。また、１つ又は複数の吸着剤の混合物も適用することができる。好ましい実施形態では、固体吸着剤は活性炭である。
【0054】
媒体と固体吸着剤との接触は、例えば、粒子状吸着剤を媒体に添加することによって、又は、前記吸着剤を含むフィルタエレメントに媒体を通すことによって、又は、吸着剤を積層したカラムに通すことによって、又は、その外面に吸着剤が存在する担体と共に媒体をインキュベートすることによって行うことができる。
【0055】
固体吸着剤は、界面活性剤に対する重量比が、少なくとも２．５：１、より好ましくは少なくとも３．０：１、最も好ましくは少なくとも３．５：１で、好ましくは媒体に添加される。固体吸着剤は、濃度が０．１～３ｗ／ｗ％、好ましくは０．５～１ｗ／ｗ％で、好ましくは媒体に添加される。フィルタエレメント又はフィルタシステムが使用される場合、フィルタシステムにおいて同様の量の吸着剤を使用することが好ましい可能性がある。
【0056】
接触工程を十分な時間をかけて行うことにより界面活性剤が適切に吸着され、その結果、界面活性剤と、界面活性剤に結合しているＬＰＳ並びに／又は他の発熱物質、特にグラム陽性細菌由来の発熱物質及び鞭毛細菌由来の発熱物質、とりわけグラム陽性細菌由来の発熱物質とが除去され、好ましくはまた、吸着剤に結合するＨＰＡ、ＬＰＳ並びに他の発熱物質、特にグラム陽性細菌由来の発熱物質、鞭毛細菌由来の発熱物質、一本鎖ウイルスＲＮＡ、及び非メチル化ＣｐＧモチーフに富む細菌ＤＮＡ、及びメタクリル酸が吸着される。好ましくは、吸着剤を（水性）媒体と５分～１時間、より好ましくは１０～３０分間接触させる。
【0057】
本明細書に記載の方法の次の工程（ｅ））において、固体吸着剤を媒体から除去する。水性媒体を固体吸着剤と接触させ、その吸着剤を媒体から分離する適切な方法については、当業者であれば承知している。前記分離には、例えば、吸着剤が微粒子として媒体に添加される場合には遠心又は濾過を含めることができ、工業上の利用可能性の観点から濾過が好ましい。例えば、固体吸着剤を（工程ｃ）又は工程ｂ２の）媒体に添加し、界面活性剤を吸着剤に結合させ、好ましくはＬＰＳ、他の発熱物質及びカルボン酸も吸着剤に結合させた後、吸着剤を、例えば濾過、沈降、又は遠心などによって除去することができる。別の実施例では、固体吸着剤をフィルタ内に存在させることができ、（本明細書に記載の方法の工程ｃ）又は工程ｂ２）の）媒体を、前記フィルタ、又は一連のそのようなフィルタを通過させ、同時に、濾液の収率を最大限にするために、所望によりそのフィルタを洗浄することができる。このようにして、本明細書に記載の方法の工程ｄ）、工程ｅ）及び工程ｆ）は、単一の濾過工程で組み合わせることができる。固体吸着剤の分離に続いて、カルボン酸－ゼラチンを含む媒体が回収される。
【0058】
好ましくは、本明細書に記載の方法の工程ｃ）～工程ｆ）は、使用される界面活性剤の曇点より低い温度で行われる。本明細書で使用される場合、「曇点」という用語は、界面活性剤が媒体中で不溶性凝集体を形成する温度を指す。前記温度は、塩濃度など、媒体の条件によって異なる。特定の条件が与えられない場合、曇点は、本明細書において、１ｗ／ｗ％水溶液が不溶性凝集体を形成する温度として定義される。したがって、温度が界面活性剤の曇点より低いと記載されている場合、前記温度は６８～６９℃（すなわち、１ｗ／ｗ％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００溶液について）であるが、１６～２５ｗ／ｗ％ＮａＣｌ溶液の場合、前記曇点は室温である。曇点は、界面活性剤を添加せずに６２０ｎｍでの溶液の吸光度を測定し、想定量の界面活性剤を添加した時に吸光度が増加するかどうかを確認することによって、所与の状況下で簡便に決定することができる。吸光度は、曇点より上で増加する。
【0059】
実施形態では、工程ｃ）～工程ｆ）は、温度が６５℃以下、より好ましくは６２℃以下、さらに好ましくは６０℃以下で行われる。実施形態では、工程ｃ）～工程ｆ）は、温度が３０℃～６５℃、好ましくは３０℃～６０℃、より好ましくは３０℃～５０℃又は３０℃～４０℃、さらに好ましくは３０℃～３５℃で行われる。
【0060】
いくつかの実施形態では、媒体のｐＨは、当該方法の工程ｃ）～工程ｆ）を通じて、２．０～５．０、好ましくは２．０～４．０、より好ましくは３．０～４．０、例えば約３．５、又は２．０～３．５、例えば約３．０、さらに好ましくは３．０～３．５である。そのようなｐＨでは、温度は、好ましくは３５℃より低く、より好ましくは３０℃～３５℃、例えば約３０℃である。
【0061】
他の実施形態では、媒体のｐＨは、当該方法の工程ｄ）～工程ｆ）を通じて、２．０～５．０、好ましくは２．０～４．０、より好ましくは３．０～４．０、例えば約３．５、又は２．０～３．５、例えば約３．０、さらに好ましくは３．０～３．５である。そのようなｐＨでは、温度は、好ましくは３５℃より低く、より好ましくは３０℃～３５℃、例えば約３０℃である。
【0062】
カルボン酸－ゼラチンを含む媒体の回収に続いて、当該方法は、媒体のｐＨを３．５～９．０、好ましくは４．０～８．０、より好ましくは５．０～７．０に上昇させる工程をさらに含んでもよい。前述のように、本明細書に記載の方法により、ＬＰＳ含有量が、特に１００ＥＵ／ｇ未満、より好ましくは５０ＥＵ／ｇ未満、さらに好ましくは２０ＥＵ／ｇ未満、さらに好ましくは１０ＥＵ／ｇ未満、さらに好ましくは５ＥＵ／ｇ未満、さらに好ましくは２ＥＵ／ｇ未満、最も好ましくは１ＥＵ／ｇ未満の、ＬＰＳ含有量が低いカルボン酸－ゼラチンが得られる。特に、カルボン酸－ゼラチン－ゼラチンは、工程ａ）の出発材料として使用されるゼラチンのＬＰＳ含有量と比較して、含まれるＬＰＳが５０分の１以下、好ましくは１００分の１以下、より好ましくは１５０分の１以下、さらに好ましくは２００分の１以下、最も好ましくは２５０分の１以下である。ＬＰＳ数（LPS count）は、例えば、本明細書の他の箇所に記載のＬＡＬアッセイを用いて、回収された媒体で定量することができる。
【0063】
得られるカルボン酸－ゼラチンはさらに、非エンドトキシン発熱物質の含有量が低いこと、特にグラム陽性細菌由来の発熱物質、鞭毛細菌由来の発熱物質、一本鎖ウイルスＲＮＡ、グラム陰性細菌由来のエンドトキシン、及び非メチル化ＣｐＧモチーフに富む細菌ＤＮＡの含有量が低いこと、とりわけグラム陽性細菌由来及び鞭毛細菌由来の発熱物質の含有量が低いこと、さらにとりわけグラム陽性細菌由来の発熱物質の含有量が低いことを特徴とする。特に、カルボン酸－ゼラチンは、工程ａ）の出発材料として使用されるゼラチンのグラム陽性細菌由来の発熱物質の含有量と比較して、含まれるグラム陽性細菌由来の発熱物質が１０分の１以下、好ましくは２０分の１以下、より好ましくは５０分の１以下、さらに好ましくは１００分の１以下、１５０分の１以下、２００分の１以下、又は２５０分の１以下である。特に、カルボン酸－ゼラチンは、工程ａ）の出発材料として使用されるゼラチンの鞭毛細菌由来の発熱物質の含有量と比較して、含まれる鞭毛細菌由来の発熱物質が１０分の１以下、好ましくは２０分の１以下、より好ましくは５０分の１以下、さらに好ましくは１００分の１以下、１５０分の１以下、２００分の１以下、又は２５０分の１以下である。特に、カルボン酸－ゼラチンは、工程ａ）の出発物質として使用されるゼラチンの非メチル化ＣｐＧモチーフに富む少ない細菌ＤＮＡの含有量と比較して、含まれる非メチル化ＣｐＧモチーフに富む細菌ＤＮＡが１０分の１以下、好ましくは２０分の１以下、より好ましくは５０分の１以下、さらに好ましくは１００分の１以下、１５０分の１以下、２００分の１以下、又は２５０分の１以下である。少ない一本鎖ウイルスＲＮＡ。
【0064】
さらに、本明細書に記載の方法により、遊離（非ゼラチン結合）カルボン酸含有量が低く、特に、カルボン酸が１００ｐｐｍ未満、好ましくは５０ｐｐｍ未満、より好ましくは３０ｐｐｍ未満であるカルボン酸修飾ゼラチンが得られる。遊離（非ゼラチン結合）３－（４－ヒドロキシフェニル）－プロピオン酸含有量を定量するために、カルボン酸が少ない官能化ゼラチンを、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ９．５）に溶解した。
【0065】
好ましくは、水に溶解したカルボン酸－ゼラチンの試料で定量したように、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ９．５）に溶解したカルボン酸－ゼラチンの試料で定量した場合、カルボン酸は１５０ｐｐｍ未満、好ましくは１００ｐｐｍ未満である。
【0066】
したがって、当該方法により、上記の（６工程又は７工程の）工程ａ）～工程ｆ）を１回行うことで、精製カルボン酸－ゼラチンが提供される。
【0067】
本明細書に記載の方法により、透析工程を必要とせずにカルボン酸含有量が低いカルボン酸－ゼラチンが得られるので、当該方法は、好ましくは透析工程を含まない。そのような透析工程は一般に時間がかかるので、本発明の方法は、精製カルボン酸－ゼラチンを特に大規模生産するのにより効率的である。
【0068】
実施形態では、当該方法は、カルボン酸－ゼラチンを含む回収媒体を、所望により前記媒体のｐＨを上昇させた後に、例えば白色多孔質発泡体に凍結乾燥することにより（Ｖａｎ Ｄｅｎ Ｂｕｌｃｋｅ ｅｔ ａｌ．，２０００．，Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，１：３１－３８）乾燥させる工程をさらに含む。
【0069】
次に、本発明を、以下の非限定的な実施例によってさらに説明する。
【実施例】
【0070】
実施例１：３－（４－ヒドロキシフェニル）－プロピオナート官能化ゼラチンの調製方法及び３－（４－ヒドロキシフェニル）－プロピオナート官能化ゼラチンの特性
材料及び方法
１５～２０％ゼラチン（ブタの皮膚、Ａ型、ブルーム２００）をｐＨ９．０の１．２５Ｍ炭酸塩緩衝液に溶かした溶液を、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド－３－（４－ヒドロキシフェニル）－プロピオナートと、ゼラチン中の全有効アミノ基に対して１：１の比で、５０℃で１２０～１８０分間反応させた。反応の間に、３－（４－ヒドロキシフェニル）－プロピオン酸（ＰＡ）が形成された。反応媒体のｐＨをｐＨ３．５に低下させた。ＨＣｌを使用して炭酸塩を除去した。１．１２％（ゼラチンの重量に対して）のＴｒｉｔｏｎ Ｘ１００を前記媒体に添加し、媒体を１時間撹拌しながら維持した。次いで、前記媒体を、活性炭を充填したカラムで濾過した。カルボン酸の他のＮ－ヒドロキシスクシンイミドエステルを同様に反応させた。
材料及び方法
１５～２０％ゼラチン（ブタの皮膚、Ａ型、ブルーム２００）をｐＨ９．０の１．２５Ｍ炭酸塩緩衝液に溶かした溶液を、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド－３－（４－ヒドロキシフェニル）－プロピオナートと、ゼラチン中の全有効アミノ基に対して１：１の比で、５０℃で１２０～１８０分間反応させた。反応の間に、３－（４－ヒドロキシフェニル）－プロピオン酸（ＰＡ）が形成された。反応媒体のｐＨをｐＨ３．５に低下させた。ＨＣｌを使用して炭酸塩を除去した。１．１２％（ゼラチンの重量に対して）のＴｒｉｔｏｎ Ｘ１００を前記媒体に添加し、媒体を１時間撹拌しながら維持した。次いで、前記媒体を、活性炭を充填したカラムで濾過した。カルボン酸の他のＮ－ヒドロキシスクシンイミドエステルを同様に反応させた。
【0071】
ＬＰＳ含有量の定量
エンドザイムＩＩアッセイキット（Ｈｙｇｌｏｓ社）を製造業者の説明書に従って使用し、ＬＰＳ含有量を定量した。簡潔に述べると、官能化ゼラチンの超純水溶液を、想定されるＬＰＳ含有量に応じて２．５０％（ｗ／ｗ）、及び１０倍、２０倍、５０倍、１００倍などの希釈で調製した。各試料１００μＬをマルチウェルプレートのウェルに添加し、製造業者の説明書に従って調製したアッセイ試薬１００μＬと混合した。得られた混合物の蛍光強度を、マイクロプレート蛍光リーダ（ＢｏｐＴｅｋ社、励起／発光＝３８０ｎｍ／４５５ｎｍ）でモニタした。エンドトキシンを含まない水で再構成した５０ＥＵ／ｍＬのエンドトキシン標準液（大腸菌０５５：Ｂ５）の希釈系列を較正標準液として使用し、官能化ゼラチン（ＧｅｌＤＡＴ）試料の４－ヒドロキシフェニル－プロピオン酸含有量８％（ｗ／ｗ）の水溶液又は５０ｍＭリン酸緩衝溶液（ｐＨ９．５）の空試験として、エンドトキシンを含まない水を使用した。室温で１５分かけて試料を膨潤させ、次いで試料が外観上、完全に溶解するまで５０℃で３０分間置いた。試料溶液０．５ｍＬを１０ｋＤａアミコンウルトラ遠心式フィルタ（ミリポア）に添加し、５０℃（オーブン）に１０分間置き、その後、１２０００ｘｇ、４０℃で３０分間遠心した。その後、ＨＰＬＣ分析のために濾液を採取した。１％（ｗ／ｗ）の４－ヒドロキシフェニル－プロピオン酸の水溶液又は５０ｍＭリン酸緩衝溶液（ｐＨ９．５）を調製し、水又は５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ９．５）で２倍希釈を行うことによって、０．１ｐｐｍ～１００ｐｐｍの範囲の４－ヒドロキシフェニル－プロピオン酸の希釈系列を作製し、標準液として使用した。
エンドザイムＩＩアッセイキット（Ｈｙｇｌｏｓ社）を製造業者の説明書に従って使用し、ＬＰＳ含有量を定量した。簡潔に述べると、官能化ゼラチンの超純水溶液を、想定されるＬＰＳ含有量に応じて２．５０％（ｗ／ｗ）、及び１０倍、２０倍、５０倍、１００倍などの希釈で調製した。各試料１００μＬをマルチウェルプレートのウェルに添加し、製造業者の説明書に従って調製したアッセイ試薬１００μＬと混合した。得られた混合物の蛍光強度を、マイクロプレート蛍光リーダ（ＢｏｐＴｅｋ社、励起／発光＝３８０ｎｍ／４５５ｎｍ）でモニタした。エンドトキシンを含まない水で再構成した５０ＥＵ／ｍＬのエンドトキシン標準液（大腸菌０５５：Ｂ５）の希釈系列を較正標準液として使用し、官能化ゼラチン（ＧｅｌＤＡＴ）試料の４－ヒドロキシフェニル－プロピオン酸含有量８％（ｗ／ｗ）の水溶液又は５０ｍＭリン酸緩衝溶液（ｐＨ９．５）の空試験として、エンドトキシンを含まない水を使用した。室温で１５分かけて試料を膨潤させ、次いで試料が外観上、完全に溶解するまで５０℃で３０分間置いた。試料溶液０．５ｍＬを１０ｋＤａアミコンウルトラ遠心式フィルタ（ミリポア）に添加し、５０℃（オーブン）に１０分間置き、その後、１２０００ｘｇ、４０℃で３０分間遠心した。その後、ＨＰＬＣ分析のために濾液を採取した。１％（ｗ／ｗ）の４－ヒドロキシフェニル－プロピオン酸の水溶液又は５０ｍＭリン酸緩衝溶液（ｐＨ９．５）を調製し、水又は５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ９．５）で２倍希釈を行うことによって、０．１ｐｐｍ～１００ｐｐｍの範囲の４－ヒドロキシフェニル－プロピオン酸の希釈系列を作製し、標準液として使用した。
【0072】
ＤＮＡ含有量の定量
ＴＥ緩衝液（１ｍＭのＥＤＴＡを含む１０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ水溶液、ｐＨ＝８）で、ストック濃度が０．１ｍｇ／ｍＬのサケ精巣ｄｓＤＮＡ標準液を調製し、ストック濃度１０μｇ／ｍＬにさらに希釈した。ＴＥ緩衝液中１０μｇ／ｍｌ～０μｇ／ｍｌの範囲の定量標準液とした。１０％（ｗ／ｗ）ゼラチン試料をＴＥ緩衝液で調製し、試料を３０分かけて膨潤させ、水浴を使用して４０℃で溶解した。黒色ウェル蛍光９６ウェルプレートのウェルに、ＴＥ緩衝液９４μＬ及びサイバーグリーン１μＬを含有するマスターミックス（１００倍）９５μｌと、試料又は標準液５μｌとを添加し、吸入及び吐出のピペッティングにより混合した。前記９６ウェルプレートを覆い、３７℃、７００ｒｐｍで３０分間インキュベートした。シナジー（Ｓｙｎｅｒｇｙ、商標）Ｍｘ蛍光光度計（ＢｉｏＴｅｋ社）を使用して、製造業者の説明書に従い、２５℃、Ｅｘ５３５ｎｍ／Ｅｍ６１７ｎｍで蛍光を測定した。
ＴＥ緩衝液（１ｍＭのＥＤＴＡを含む１０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ水溶液、ｐＨ＝８）で、ストック濃度が０．１ｍｇ／ｍＬのサケ精巣ｄｓＤＮＡ標準液を調製し、ストック濃度１０μｇ／ｍＬにさらに希釈した。ＴＥ緩衝液中１０μｇ／ｍｌ～０μｇ／ｍｌの範囲の定量標準液とした。１０％（ｗ／ｗ）ゼラチン試料をＴＥ緩衝液で調製し、試料を３０分かけて膨潤させ、水浴を使用して４０℃で溶解した。黒色ウェル蛍光９６ウェルプレートのウェルに、ＴＥ緩衝液９４μＬ及びサイバーグリーン１μＬを含有するマスターミックス（１００倍）９５μｌと、試料又は標準液５μｌとを添加し、吸入及び吐出のピペッティングにより混合した。前記９６ウェルプレートを覆い、３７℃、７００ｒｐｍで３０分間インキュベートした。シナジー（Ｓｙｎｅｒｇｙ、商標）Ｍｘ蛍光光度計（ＢｉｏＴｅｋ社）を使用して、製造業者の説明書に従い、２５℃、Ｅｘ５３５ｎｍ／Ｅｍ６１７ｎｍで蛍光を測定した。
【0073】
実施例２：本発明の実施形態による方法で調製された官能化ゼラチンと、透析に基づく方法で調製された官能化ゼラチンとの比較。
材料及び方法
ゼラチンを本明細書に記載の方法に従って修飾した。出発ゼラチンを、ゼラチン（Ｈｙｇｌｏｓエンドザイム）１グラム当たり２２２９エンドトキシン単位（ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ ｕｎｉｔ：ＥＵ）で汚染した。３－（４－ヒドロキシフェニル）－プロピオン酸残基及びＬＰＳ汚染をそれぞれ、ｐｐｍ及びゼラチン１グラム当たりのＥＵで、実施例１に記載したように測定した。３－（４－ヒドロキシフェニル）－プロピオン酸含有量を定量するために、官能化ゼラチンを５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ９．５）に溶解した。比較方法例では、超純水（ミリＱ、Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）に対する透析によって、官能化ゼラチン溶液から３－（４－ヒドロキシフェニル）－プロピオン酸副生成物を除去した。３－（４－ヒドロキシフェニル）－プロピオン酸溶液の２０ミリリットルのアリコートを５本の透析チューブ（透析チュービングセルロース膜、ＭＷＣＯ １４ｋＤａ、カタログ番号：Ｄ９５２７－１００ＦＴ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）に移し、透析チューブのそれぞれを２．５リットルの水に浸した。透析を４０℃で進め、水を２４時間ごとに交換した。Ｔ１＝１日目、Ｔ２＝２日目、Ｔ３＝３日目、Ｔ４＝４日目、及びＴ５＝７日目に、１本ずつチューブを取り出し、３－（４－ヒドロキシフェニル）－プロピオン酸及びＬＰＳの含有量を、実施例１に記載したように測定した。３－（４－ヒドロキシフェニル）－プロピオン酸含有量を定量するために、官能化ゼラチンを５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ９．５）に溶解した。本発明の一実施形態による方法では、官能化ゼラチン溶液の４０ｍｌアリコート５つに、希釈ＨＣｌを添加することによって、ｐＨを２．０、２．５、３．０、３．５及び４．０に調整し（すべて４０℃で測定）、（ゼラチン含有量に対して）０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ１００を各アリコートに添加した。次いで、各アリコートを２つに分け、これらのうちの１つを、メタクリル酸含有量及びＬＰＳ汚染へのｐＨ低下及びＴｒｉｔｏｎ Ｘ１００添加の影響に関しての陰性対照として用いた。ノーリット活性炭粉末（Ｓ２６８、活性炭ノーリットＳＸプラス８０１３－１）５グラムを実験用チューブのそれぞれに添加し、これらのチューブを、回転振とう機にて４０℃で１時間インキュベートした。次に、これらのチューブを２０００ｒｐｍで３０分間遠心し、上清を濾過し（０．４５μｍ）、実施例１に記載したように、３－（４－ヒドロキシフェニル）－プロピオン酸及びＬＰＳの含有量について分析した。遊離（非ゼラチン結合）３－（４－ヒドロキシフェニル）－プロピオン酸の含有量を定量するために、官能化ゼラチンを５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ９．５）に溶解した。
材料及び方法
ゼラチンを本明細書に記載の方法に従って修飾した。出発ゼラチンを、ゼラチン（Ｈｙｇｌｏｓエンドザイム）１グラム当たり２２２９エンドトキシン単位（ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ ｕｎｉｔ：ＥＵ）で汚染した。３－（４－ヒドロキシフェニル）－プロピオン酸残基及びＬＰＳ汚染をそれぞれ、ｐｐｍ及びゼラチン１グラム当たりのＥＵで、実施例１に記載したように測定した。３－（４－ヒドロキシフェニル）－プロピオン酸含有量を定量するために、官能化ゼラチンを５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ９．５）に溶解した。比較方法例では、超純水（ミリＱ、Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）に対する透析によって、官能化ゼラチン溶液から３－（４－ヒドロキシフェニル）－プロピオン酸副生成物を除去した。３－（４－ヒドロキシフェニル）－プロピオン酸溶液の２０ミリリットルのアリコートを５本の透析チューブ（透析チュービングセルロース膜、ＭＷＣＯ １４ｋＤａ、カタログ番号：Ｄ９５２７－１００ＦＴ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）に移し、透析チューブのそれぞれを２．５リットルの水に浸した。透析を４０℃で進め、水を２４時間ごとに交換した。Ｔ１＝１日目、Ｔ２＝２日目、Ｔ３＝３日目、Ｔ４＝４日目、及びＴ５＝７日目に、１本ずつチューブを取り出し、３－（４－ヒドロキシフェニル）－プロピオン酸及びＬＰＳの含有量を、実施例１に記載したように測定した。３－（４－ヒドロキシフェニル）－プロピオン酸含有量を定量するために、官能化ゼラチンを５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ９．５）に溶解した。本発明の一実施形態による方法では、官能化ゼラチン溶液の４０ｍｌアリコート５つに、希釈ＨＣｌを添加することによって、ｐＨを２．０、２．５、３．０、３．５及び４．０に調整し（すべて４０℃で測定）、（ゼラチン含有量に対して）０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ１００を各アリコートに添加した。次いで、各アリコートを２つに分け、これらのうちの１つを、メタクリル酸含有量及びＬＰＳ汚染へのｐＨ低下及びＴｒｉｔｏｎ Ｘ１００添加の影響に関しての陰性対照として用いた。ノーリット活性炭粉末（Ｓ２６８、活性炭ノーリットＳＸプラス８０１３－１）５グラムを実験用チューブのそれぞれに添加し、これらのチューブを、回転振とう機にて４０℃で１時間インキュベートした。次に、これらのチューブを２０００ｒｐｍで３０分間遠心し、上清を濾過し（０．４５μｍ）、実施例１に記載したように、３－（４－ヒドロキシフェニル）－プロピオン酸及びＬＰＳの含有量について分析した。遊離（非ゼラチン結合）３－（４－ヒドロキシフェニル）－プロピオン酸の含有量を定量するために、官能化ゼラチンを５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ９．５）に溶解した。
【0074】
結果
表１に、本明細書の他の箇所に開示する方法によって得られた精製官能化ゼラチンの３－（４－ヒドロキシフェニル）－プロピオン酸（ＰＡ）含有量（ｐｐｍ）及びＬＰＳ含有量（ＥＵ／ｇ）を示す。図１は、グラフで表したものである。
表１に、本明細書の他の箇所に開示する方法によって得られた精製官能化ゼラチンの３－（４－ヒドロキシフェニル）－プロピオン酸（ＰＡ）含有量（ｐｐｍ）及びＬＰＳ含有量（ＥＵ／ｇ）を示す。図１は、グラフで表したものである。
【0075】
【表1】
【0076】
ミセル形成及び濾過を介した精製
表２に、透析に基づく方法又は本発明の実施形態による方法によって得られた精製官能化ゼラチンの３－（４－ヒドロキシフェニル）－プロピオン酸含有量（ＰＡ、ｐｐｍ）及びＬＰＳ含有量（ＥＵ／ｇ）を示す。図２は、グラフで表したものである。図３に、ＨＰＬＣを示す。
表２に、透析に基づく方法又は本発明の実施形態による方法によって得られた精製官能化ゼラチンの３－（４－ヒドロキシフェニル）－プロピオン酸含有量（ＰＡ、ｐｐｍ）及びＬＰＳ含有量（ＥＵ／ｇ）を示す。図２は、グラフで表したものである。図３に、ＨＰＬＣを示す。
【0077】
【表2】
【0078】
図４は、図４Ａにおいて、出発ゼラチンのＭＷ分布（１）、並びに、ＮＨＳ、ＨＰＡ及びＥＤＣのin situ混合物を使用する経路を介した修飾と、それに続いて１段階透析を用いて精製を行った結果のＭＷ分布（２）、及び、２段階透析を用いて精製を行った結果のＭＷ分布（３）を示す。修飾ゼラチンは、出発ゼラチンと比較してＭｗ分布がより広く、望ましくない架橋のあることが示されている。
【0079】
図４Ｂは、図４Ａにおいて、同じ出発ゼラチンのＭＷ分布（１）、及び、ＥＤＣが本質的に存在しない状態でＮＨＳ－ＨＰＡを使用する経路を介した修飾と、それに続いてミセル形成に基づく精製を用いて精製を行った結果のＭＷ分布を示す。修飾ゼラチンは出発ゼラチンとほぼ同一のＭｗ分布を有しており、望ましくない架橋が本質的に存在しない状態で誘導体化が成功したことが示されている。
【0080】
ＥＤＣがない状態でＮＨＳ－ＨＰＡを用いて誘導体化すると、ＮＨＳ、ＨＰＡ及びＥＤＣの混合物を用いた誘導体化と比較して、元のゼラチンにより近く、異なるＭｗプロファイルを有する生成物になる。ミセル形成を介した精製によって、ＬＰＳが少なく、かつＨＰＡが少ない生成物になり、品質が向上している。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4A】
【図4B】
【国際調査報告】