ホーム > 特許ランキング > シトリル ビー．ヴィ．
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-06-04
(54)【発明の名称】好酸球トラップの阻害
(51)【国際特許分類】
C12N 5/0787 20100101AFI20240528BHJP
A61P 17/00 20060101ALI20240528BHJP
A61P 11/00 20060101ALI20240528BHJP
A61P 1/00 20060101ALI20240528BHJP
A61P 37/08 20060101ALI20240528BHJP
A61P 31/00 20060101ALI20240528BHJP
A61P 11/06 20060101ALI20240528BHJP
A61P 11/02 20060101ALI20240528BHJP
A61P 1/04 20060101ALI20240528BHJP
A61P 27/16 20060101ALI20240528BHJP
A61P 9/00 20060101ALI20240528BHJP
A61P 9/10 20060101ALI20240528BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20240528BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20240528BHJP
A61K 31/56 20060101ALI20240528BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20240528BHJP
C07K 16/18 20060101ALN20240528BHJP
C12N 15/13 20060101ALN20240528BHJP
【ＦＩ】
C12N5/0787
A61P17/00
A61P11/00
A61P1/00
A61P37/08
A61P31/00
A61P11/06
A61P11/02
A61P1/04
A61P27/16
A61P9/00
A61P9/10 101
A61K39/395 N
A61P43/00 121
A61K31/56
A61P29/00
C07K16/18 ZNA
C12N15/13
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023568153
(86)(22)【出願日】2022-05-04
(85)【翻訳文提出日】2023-11-02
(86)【国際出願番号】 EP2022061970
(87)【国際公開番号】W WO2022233931
(87)【国際公開日】2022-11-10
(31)【優先権主張番号】21172160.0
(32)【優先日】2021-05-04
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(31)【優先権主張番号】2111541.5
(32)【優先日】2021-08-11
(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】521075309
【氏名又は名称】シトリル ビー．ヴィ．
(74)【代理人】
【識別番号】100136629
【弁理士】
【氏名又は名称】鎌田 光宜
(74)【代理人】
【識別番号】100080791
【弁理士】
【氏名又は名称】高島 一
(74)【代理人】
【識別番号】100125070
【弁理士】
【氏名又は名称】土井 京子
(74)【代理人】
【識別番号】100121212
【弁理士】
【氏名又は名称】田村 弥栄子
(74)【代理人】
【識別番号】100174296
【弁理士】
【氏名又は名称】當麻 博文
(74)【代理人】
【識別番号】100137729
【弁理士】
【氏名又は名称】赤井 厚子
(74)【代理人】
【識別番号】100152308
【弁理士】
【氏名又は名称】中 正道
(74)【代理人】
【識別番号】100201558
【弁理士】
【氏名又は名称】亀井 恵二郎
(72)【発明者】
【氏名】ヴァン エス、ヘルムス ヘンドリクス ジェラルドゥス
(72)【発明者】
【氏名】シリヴィ、レナート ジェラルドゥス シルヴァノ
(72)【発明者】
【氏名】モンティザーン、ダフネ
(72)【発明者】
【氏名】メルドラム、エリック チャールズ
【テーマコード（参考）】
4B065
4C085
4C086
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B065AA94X
4B065BC01
4B065BD39
4B065CA44
4C085AA13
4C085BB11
4C085BB36
4C085BB42
4C085CC21
4C085DD62
4C085EE01
4C085EE03
4C086AA01
4C086AA02
4C086DA08
4C086MA02
4C086MA04
4C086NA05
4C086ZA34
4C086ZA36
4C086ZA45
4C086ZA59
4C086ZA66
4C086ZA89
4C086ZB11
4C086ZB13
4C086ZB31
4C086ZC75
4H045AA11
4H045AA30
4H045BA10
4H045CA40
4H045DA76
4H045EA20
4H045FA74
(57)【要約】
本発明は、好酸球細胞外トラップ（ＥＥＴ）の形成を阻害する方法を提供する。具体的には、本発明は、ＥＥＴ形成を阻害又は検出する方法において使用するための、シトルリン含有エピトープに対する抗体又はその結合断片を提供する。方法は、ＥＥＴ関連病理を含む任意の疾患又は病態を診断、治療、又は予防するための方法であり得る。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
好酸球細胞外トラップ（ＥＥＴ）の形成を阻害する方法であって、脱イミノ化されたヒトのヒストン２Ａ及び／又はヒストン４におけるシトルリン化されたエピトープに特異的に結合する抗体又はその結合断片を、好酸球が存在するサンプル又は対象に投与することを含む方法。
【請求項2】
対象における疾患又は病態を予防又は治療するための方法であり、予防的又は治療的に有効な量の前記抗体又はその結合断片を前記対象に投与することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記疾患又は病態が、ＥＥＴ関連病理を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項4】
前記疾患又は病態が、好酸球性疾患又は病態である、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項5】
前記好酸球性疾患又は病態が、皮膚の好酸球性疾患若しくは病態；呼吸器の好酸球性疾患若しくは病態；胃腸の好酸球性疾患若しくは病態；アレルギー性疾患若しくは病態；又は蠕虫、真菌、ウイルス、若しくは細菌の感染症である、請求項４に記載の方法。
【請求項6】
前記疾患又は病態が、水疱性類天疱瘡、アトピー性皮膚炎、アレルギー性接触皮膚炎、好酸球性喘息、鼻茸を伴う慢性鼻副鼻腔炎（ＣＲＳｗＮＰ）、アレルギー性副鼻腔炎、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症、好酸球性慢性鼻副鼻腔炎、好酸球性食道炎（ＥｏＥ）、好酸球増加症候群（ＨＥＳ）、好酸球性多発血管炎性肉芽腫症（ＥＧＰＡ）、好酸球性中耳炎（ＥＯＭ）、並びに好酸球性及び全身性の症状を伴う薬物反応（ＤＲＥＳＳ）、動脈硬化、並びに血管炎から選択される、請求項２～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
前記疾患又は病態が、好酸球性喘息、鼻茸を伴う慢性鼻副鼻腔炎（ＣＲＳｗＮＰ）、好酸球性慢性鼻副鼻腔炎、好酸球性中耳炎（ＥＯＭ）、動脈硬化、及び血管炎から選択される、請求項２～６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
サンプル中のＥＥＴ形成をエクスビボで阻害又は検出するための方法であり、前記抗体又はその結合断片を前記サンプルに投与することと、結合が生じるのに好適な条件下でインキュベートすることを含み、任意で、前記サンプルが、血清又は血液等の対象から得られた体液のサンプルであり、任意で、前記サンプルが、例えば好酸球を単離するために処理される、請求項１に記載の方法。
【請求項9】
前記抗体又はその結合断片が、ａ）ＶＬのＣＤＲ１であって、ここで、前記ＣＤＲが、アミノ酸配列ＱＳＬ－Ｘ１－Ｄ－Ｘ２－Ｄ－Ｘ３－ＫＴＹ（式中、Ｘ１は、Ｖ又はＬであり、Ｘ２は、Ｔ、Ｓ、Ａ、又はＮであり、Ｘ３は、Ｇ又はＡである）を含むか又はからなり、好ましくは、前記アミノ酸配列が、ＱＳＬＬＤＳＤＧＫＴＹ（配列番号３６）でもＱＳＬＶＤＳＤＧＫＴＹ（配列番号３７）でもないＶＬのＣＤＲ１；及び
ｂ）配列番号１～５から選択される少なくとも１つのＣＤＲ、任意で少なくとも配列番号３及び配列番号５のＣＤＲ、好ましくは配列番号１～５の５つのＣＤＲ全て
を含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項10】
前記抗体又はその結合断片が、ａ）配列番号６、７、８、９、若しくは１０のＶＬ ＣＤＲ１；及び
ｂ）配列番号１～５のＣＤＲ；
又は
ａ）配列番号１３、１４、１５、１６、若しくは１７のいずれか１つのＶＬ ＣＤＲ；及び
ｂ）配列番号１１若しくは１２の重鎖可変ドメインアミノ酸配列
を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項11】
前記抗体又はその結合断片が、（Ｉ）
ａ）ＶＬ ＣＤＲ１であって、ここで、前記ＣＤＲが、アミノ酸配列ＱＳＬ－Ｘ１－Ｄ－Ｘ２－Ｄ－Ｘ３－ＫＴＹ（式中、Ｘ１は、Ｖ又はＬであり、Ｘ２は、Ｔ、Ｓ、Ａ、又はＮであり、Ｘ３は、Ｇ又はＡである）を含むか又はからなり、好ましくは、前記アミノ酸配列が、ＱＳＬＬＤＳＤＧＫＴＹ（配列番号３６）でもＱＳＬＶＤＳＤＧＫＴＹ（配列番号３７）でもなく、任意で、前記ＣＤＲ１が、配列番号６、７、８、９、又は１０から選択される、ＶＬ ＣＤＲ１；並びに
ｂ）配列番号４のＶＬ ＣＤＲ２及び配列番号５のＶＬ ＣＤＲ３のうちの少なくとも１つ、好ましくは両方；
を含む軽鎖可変領域と、
（ＩＩ）
ｃ）配列番号１１若しくは１２のアミノ酸配列；又は
ｄ）（ｃ）の少なくとも７アミノ酸の断片であって、前記抗体若しくはその結合断片が、脱イミノ化されたヒトのヒストン２Ａ及び／若しくはヒストン４におけるシトルリン化されたエピトープと特異的に反応する能力を保持している断片；又は
ｅ）（ｃ）の配列と少なくとも７０％のアミノ酸配列同一性を有する（ｃ）のバリアントであって、前記抗体又はその結合断片が、脱イミノ化されたヒトのヒストン２Ａ及び／若しくはヒストン４におけるシトルリン化されたエピトープと特異的に反応する能力を保持しているバリアント
を含む重鎖可変領域と
を含む、請求項９又は１０に記載の方法。
【請求項12】
前記抗体又はその結合断片が、ａ）配列番号１１の重鎖可変ドメインアミノ酸配列及び配列番号１３の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列；
ｂ）配列番号１１の重鎖可変ドメインアミノ酸配列及び配列番号１４の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列；
ｃ）配列番号１１の重鎖可変ドメインアミノ酸配列及び配列番号１５の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列；
ｄ）配列番号１１の重鎖可変ドメインアミノ酸配列及び配列番号１６の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列；
ｅ）配列番号１１の重鎖可変ドメインアミノ酸配列及び配列番号１７の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列；
ｆ）配列番号１２の重鎖可変ドメインアミノ酸配列及び配列番号１３の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列；
ｇ）配列番号１２の重鎖可変ドメインアミノ酸配列及び配列番号１４の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列；
ｈ）配列番号１２の重鎖可変ドメインアミノ酸配列及び配列番号１５の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列；
ｉ）配列番号１２の重鎖可変ドメインアミノ酸配列及び配列番号１６の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列；又は
ｊ）配列番号１２の重鎖可変ドメインアミノ酸配列及び配列番号１７の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列
を含む、請求項９～１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項13】
前記抗体又はその結合断片が、配列番号１８、１９、２０、２１、及び２２からなる群から選択されるペプチドに特異的に結合し、脱イミノ化されたヒトのヒストン２Ａ及び／又はヒストン４に、好ましくは少なくとも１ｎＭ以下の親和性で結合する、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項14】
（ｉ）前記抗体若しくはその結合断片が、組換え抗体、一本鎖抗体、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、可変断片（Ｆｖ）、断片抗原結合領域（Ｆａｂ）、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、ＶＨＨ抗体、ナノボディ、ラクダ由来のシングルドメイン抗体、サメＩｇＮＡＲ由来のシングルドメイン抗体断片（ＶＮＡＲ）、ダイアボディ、トリアボディ、アンチカリン、及びアプタマーからなる群から選択され、好ましくは完全長抗体である、並びに／又は（ｉｉ）前記抗体若しくはその結合断片が、追加の部分にコンジュゲートされている、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項15】
前記抗体又はその結合断片が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４領域等のＦｃ領域を含み、任意で、重鎖定常領域が、配列番号２３若しくは５６を含む及び／又は軽鎖定常領域が配列番号２４を含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項16】
前記抗体が、配列番号１１の重鎖可変ドメインアミノ酸配列、配列番号１６の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列、配列番号２３又は５６の重鎖定常領域アミノ酸配列、及び配列番号２４の軽鎖定常領域アミノ酸配列を含む、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項17】
好酸球細胞外トラップ（ＥＥＴ）及び好中球細胞外トラップ（ＮＥＴ）の形成を同時に阻害する、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項18】
肺障害を治療又は予防する方法であって、脱イミノ化されたヒトのヒストン２Ａ及び／又はヒストン４におけるシトルリン化されたエピトープに特異的に結合する抗体又はその結合断片を、前記肺障害を有する対象に投与することを含む方法。
【請求項19】
（ａ）前記病態が、炎症性肺障害である；（ｂ）前記肺障害が、前記対象の肺における好中球及び／若しくは好酸球のレベルの増加を特徴とする；
（ｃ）前記方法が、副腎皮質ステロイドを投与することを更に含む；並びに／又は
（ｄ）前記対象が、副腎皮質ステロイドには応答しない肺障害を有している、
請求項１８記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、好酸球細胞外トラップ（ＥＥＴ）の形成を阻害する方法を提供する。具体的には、本発明は、ＥＥＴ形成を阻害又は検出する方法において使用するための、シトルリン含有エピトープに対する抗体又はその結合断片を提供する。方法は、ＥＥＴ関連病理を含む任意の疾患又は病態を診断、治療、又は予防するための方法であり得る。本発明は更に、肺病態、特に炎症性肺病態を治療又は予防する方法において使用するための、シトルリン含有エピトープに対する抗体又はその結合断片を提供する。記載されるシトルリン含有エピトープに対する抗体又はその結合断片は、特に肺病態における好中球細胞外トラップ（ＮＥＴ）形成の阻害において使用することもできる。幾つかの実施形態では、好酸球細胞外トラップ（ＥＥＴ）の形成及び好中球細胞外トラップ（ＮＥＴ）の形成を両方阻害することができる。
【背景技術】
【0002】
好酸球は、循環白血球の一形態であり、通常、健常ヒトにおける白血球（ＷＢＣ）の約１～３％を占める。好酸球は、ホメオスタシス並びにアレルギー及び感染症を含む様々な疾患において多種多様な役割を担っている。特定の機序の活性細胞溶解性好酸球細胞死によって、好酸球細胞外トラップ（ＥＥＴ）及び全細胞内容物が放出されることが明らかになっている。これは、好酸球細胞外トラップ細胞死（ＥＥＴｏｓｉｓ）と呼ばれる。また、シャルコー－ライデン結晶（好酸球性炎症の古典的な病理学的マーカー）がＥＥＴｏｓｉｓに関連することも示されており、ＥＥＴｏｓｉｓ及びＥＥＴの存在が複数の疾患で報告されている。
【0003】
好中球細胞外トラップ（ＮＥＴ）の形成を特徴とする表面的には類似したプロセスが好中球で同定されており、ＮＥＴｏｓｉｓと呼ばれている。ＮＥＴは様々な病理と関連しており、治療としてのＮＥＴ阻害については、例えば、国際公開第２００９１４７２０１号、同第２０１１０７０１７２号、同第２０１６０９２０８２号、及び同第２０２００３８９６３号で論じられている。
【0004】
ＥＥＴｏｓｉｓ及びＮＥＴｏｓｉｓは、類似のＮＡＤＰＨ－オキシダーゼ依存性プロセス、並びに核の形態学的変化及び原形質／核膜の破裂等の共通する幾つかの特徴も有するが、多くの相違点もある。例えば、好中球及び好酸球は、顆粒の構造及び形成される細胞外トラップに違いがある。好中球がＮＥＴｏｓｉｓを受けると、顆粒が細胞内で崩壊して、顆粒タンパク質がＮＥＴに付着する。対照的に、好酸球における顆粒のほとんどはＥＥＴｏｓｉｓの過程で無傷であり、その結果、遊離細胞外顆粒と顆粒タンパク質を含まないＥＥＴとが生成される。ＮＥＴ及びＥＥＴはいずれもヒストン（すなわち、クロマチン構造）を保持しているが、ＥＥＴはクロマチンのプロテアーゼ修飾がそれほど広範ではないため、ＮＥＴよりも直径が大きい。ヒストンのシトルリン化（例えば、ＰＡＤ４という酵素が媒介する）がＮＥＴ形成において重要な役割を果たすことが知られているが、ＥＥＴ形成においても同様に重要な役割があるという証拠については不確定である。
【0005】
これら違いを考慮すると、ホメオスタシス及び疾患病因に果たす役割について詳細に理解するためには、ＥＥＴ／ＥＥＴｏｓｉｓ並びにＥＥＴ形成の機序及びそれを阻害できる方法に関する更なる研究が必要である。言い換えれば、ＥＥＴ関連病理を治療又は予防するための化合物が依然として必要とされている。
【0006】
好酸球及び好中球が肺病態の基礎病理において役割を果たしている場合が多いことを考えると、特にこのような病態における好酸球及び好中球の関与を標的とする方法も継続して必要とされている。
【発明の概要】
【0007】
ＥＥＴ形成におけるヒストンのシトルリン化の役割については、相反する証拠がある。驚くべきことに、本発明者らは、ヒストン２Ａ及び／又はヒストン４のアミノ末端におけるシトルリン化されたエピトープに結合する抗体がＥＥＴｏｓｉｓを阻害できること、ひいては、ＥＥＴ形成を阻害する方法において使用できることを見出した。方法は、ＥＥＴ関連病理を治療又は予防するための方法であってもよい。このような病理としては、皮膚の好酸球性疾患；呼吸器の好酸球性疾患；胃腸の好酸球性疾患；アレルギー性疾患；又は蠕虫、真菌、ウイルス、若しくは細菌の感染症を挙げることができる。更に、動脈硬化も治療又は予防することができる。別の実施形態では、血管炎を治療することもできる。
【0008】
ＥＥＴとＮＥＴとの違いを考慮すると、本発明者らは、予想外なことに、同じ条件下であることを含む、ヒストン２Ａ及び／又はヒストン４のアミノ末端におけるシトルリン化されたエピトープに結合する同じ抗体を用いてＥＥＴ及びＮＥＴの形成を両方阻害できることを更に見出した。本発明者らはまた、このような抗体を肺障害、特に喘息を含む炎症性肺障害を含む様々な病態の治療に使用できることも見出した。本発明者らはまた、このような抗体を浸潤性好中球数の増加を伴う病態の治療に使用できることも見出した。本発明者らは更に、このような抗体を浸潤性好酸球数の増加を伴う病態の治療に使用できることも見出した。
【0009】
本発明者らは更に、ヒストン２Ａ及び／又はヒストン４のアミノ末端におけるシトルリン化されたエピトープに結合する同じ抗体のアプローチが、場合によっては副腎皮質ステロイド及び／又は別のものよりも大きな効果をもたらす可能性があることを見出した。従って、本発明は、副腎皮質ステロイドに対して適切な応答を示さない個体の治療にも使用することができる。例えば、本発明を使用して副腎皮質ステロイドに対して耐性を有する個体を治療することができる。また、抗体及び副腎皮質ステロイドが互いを増強するようにこれら２つを併用することも可能であり、これは更に好ましい実施形態となり得る。一実施形態では、副腎皮質ステロイドは、デキサメタゾンである。
【0010】
代表的な脱イミノ化されたヒトのヒストン２Ａ及びヒストン４におけるシトルリン化されたエピトープに結合する抗体は、例えば、国際公開第２００９１４７２０１号、同第２０１１０７０１７２号、同第２０１６０９２０８２号、及び同第２０２００３８９６３号に記載されている。これら各文書及びそこに開示されている抗体（重鎖及び軽鎖の両方のＣＤＲ配列、可変領域配列、及び定常領域配列を全て含む）は、参照により本明細書に組み込まれる。特に、国際公開第２０１６０９２０８２号においてＲｈｍＡｂ２．１０２、ＲｈｍＡｂ２．１０８、ＲｈｍＡｂ２．１０９、ＲｈｍＡｂ２．１１０、ＲｈｍＡｂ２．１１１、ＲｈｍＡｂ２．１１２、ＭＱ２２．１０１、ＭＱ２２．１０２、及びＭＱ２２．１０１ｂ／ｄと命名されている抗体、並びにそれらの任意の抗原結合断片は、それぞれ参照により組み込まれる。同様に、国際公開第２０２００３８９６３号にｈＭＱ２２．１０１ｘ／ｙの形式の識別子で開示されている抗体及びその任意の抗原結合断片は、それぞれ参照により組み込まれる。国際公開第２０２００３８９６３号に開示されている抗体が特に好ましく、以下でより詳細に論じる。国際公開第２０２００３８９６３号においてｈＭＱ２２．１０１ｆ／ＬＣ４１と称されている抗体が最も好ましい。この抗体は、本明細書ではＣＩＴ－０１３と記載される場合もある。
【0011】
本発明は、好酸球細胞外トラップ（ＥＥＴ）の形成を阻害又は検出する方法であって、脱イミノ化されたヒトのヒストン２Ａ及び／又はヒストン４におけるシトルリン化されたエピトープに特異的に結合する抗体又はその結合断片をサンプル又は対象に投与することを含む方法を提供する。サンプル又は対象は、好ましくは、好酸球が存在するサンプル又は対象である。
【0012】
方法は、対象における疾患又は病態を予防又は治療するための方法であってもよく、従って、予防的又は治療的に有効な量の該抗体又はその結合断片を対象に投与することを含み得る。
【0013】
疾患又は病態は、典型的には、ＥＥＴ関連病理を含む。疾患又は病態は、好酸球性疾患又は病態であってよい。好酸球性疾患及び病態としては、皮膚の好酸球性疾患若しくは病態；呼吸器の好酸球性疾患若しくは病態；胃腸の好酸球性疾患若しくは病態；アレルギー性疾患若しくは病態；又は蠕虫、真菌、ウイルス、若しくは細菌の感染症を挙げることができる。
【0014】
また、上記方法、特に対象における疾患又は病態を予防又は治療するための上記方法において使用するための、脱イミノ化されたヒトのヒストン２Ａ及び／又はヒストン４におけるシトルリン化されたエピトープに特異的に結合する抗体又はその結合断片も提供される。また、対象における疾患又は病態を予防又は治療するための上記方法において使用するための医薬の製造において使用するための、脱イミノ化されたヒトのヒストン２Ａ及び／又はヒストン４におけるシトルリン化されたエピトープに特異的に結合する抗体又はその結合断片も提供される。一実施形態では、動脈硬化が治療される。別の実施形態では、血管炎が治療される。
【0015】
あるいは、方法は、サンプル中のＥＥＴ形成をエクスビボで阻害又は検出するための方法であってもよい。方法は、ＥＥＴ関連病理の存在を診断するために使用することもできる。
【0016】
方法は、幾つかの実施形態において、好酸球細胞外トラップ（ＥＥＴ）及び好中球細胞外トラップ（ＮＥＴ）の形成を阻害し得る。
【0017】
また、肺障害を治療又は予防する方法であって、脱イミノ化されたヒトのヒストン２Ａ及び／又はヒストン４におけるシトルリン化されたエピトープに特異的に結合する抗体又はその結合断片を、該肺障害を有する対象に投与することを含む方法が提供される。
【0018】
配列表の簡単な説明
抗体の用語
ＣＤＲ＝相補性決定領域。
ＶＨ＝重鎖可変ドメイン。
ＶＬ＝軽鎖可変ドメイン。
ＣＨ＝重鎖定常ドメイン。
ＣＬ＝軽鎖定常ドメイン。
ｍｓＶＨ２２．１０１＝治療用抗体のマウスＶＨ。
ｍｓＶＬ２２．１０１＝治療用抗体のマウスＶＬ。
ｈＶＨ２２．１０１ｘ＝治療用抗体のヒト化ＶＨ、「ｘ」は重鎖を指す。
ｈＶＬ２２．１０１ｙ＝治療用抗体のヒト化ＶＬ、「ｙ」は軽鎖を指す。
ｈＶＨ２２．１０１（ＨＣ）ｘ＝治療用抗体の最適化ヒト化ＶＨ、「（ＨＣ）ｘ」は重鎖を指す。
ｈＶＬ２２．１０１（ＬＣ）ｙ＝治療用抗体の最適化ヒト化ＶＬ、「（ＬＣ）ｙ」は軽鎖を指す。
ｈＭＱ２２．１０１ｘ／ｙ＝ヒト化治療用抗体、「ｘ」は重鎖を指し、「ｙ」は軽鎖を指す。
ｈＭＱ２２．１０１（ＨＣ）ｘ／（ＬＣ）ｙ＝本発明の最適化ヒト化治療用抗体、「（ＨＣ）ｘ」は重鎖を指し、「（ＬＣ）ｙ」は軽鎖を指す。
抗体の用語
ＣＤＲ＝相補性決定領域。
ＶＨ＝重鎖可変ドメイン。
ＶＬ＝軽鎖可変ドメイン。
ＣＨ＝重鎖定常ドメイン。
ＣＬ＝軽鎖定常ドメイン。
ｍｓＶＨ２２．１０１＝治療用抗体のマウスＶＨ。
ｍｓＶＬ２２．１０１＝治療用抗体のマウスＶＬ。
ｈＶＨ２２．１０１ｘ＝治療用抗体のヒト化ＶＨ、「ｘ」は重鎖を指す。
ｈＶＬ２２．１０１ｙ＝治療用抗体のヒト化ＶＬ、「ｙ」は軽鎖を指す。
ｈＶＨ２２．１０１（ＨＣ）ｘ＝治療用抗体の最適化ヒト化ＶＨ、「（ＨＣ）ｘ」は重鎖を指す。
ｈＶＬ２２．１０１（ＬＣ）ｙ＝治療用抗体の最適化ヒト化ＶＬ、「（ＬＣ）ｙ」は軽鎖を指す。
ｈＭＱ２２．１０１ｘ／ｙ＝ヒト化治療用抗体、「ｘ」は重鎖を指し、「ｙ」は軽鎖を指す。
ｈＭＱ２２．１０１（ＨＣ）ｘ／（ＬＣ）ｙ＝本発明の最適化ヒト化治療用抗体、「（ＨＣ）ｘ」は重鎖を指し、「（ＬＣ）ｙ」は軽鎖を指す。
【0019】
【表1-1】
【0020】
【表1-2】
【図面の簡単な説明】
【0021】
【図1-1】（ａ）抗体なし、ＣＩＴ－０１３、又はアイソタイプコントロールの存在下においてＡ２３１８７又はＰＭＡで刺激してＥＥＴを形成させた好酸球の代表的な画像。
【図1-2】（ｂ）パネル（ａ）と同じ条件で刺激した場合の、異なるドナー由来の好酸球サンプルにおけるＥＥＴ形成レベルのグラフ表示。
【図2-1】チリダニ（ＨＤＭ）アレルゲンによって誘導した気道炎症のモデルマウスに対するｔＡＣＰＡ抗体及びデキサメタゾンの影響。（ａ）気管支洗浄液中の好酸球レベル、（ｂ）気管支洗浄液中の好中球レベル、（ｃ）ＥＴのマーカーとしてのシトルリン化されたヒストン３のレベル、（ｄ）血管周囲の好中球増加のレベル。
【図2-2】チリダニ（ＨＤＭ）アレルゲンによって誘導した気道炎症のモデルマウスに対するｔＡＣＰＡ抗体及びデキサメタゾンの影響。（ｅ）血管周囲の単核球のレベル、及び（ｆ）細気管支の好中球増加のレベル。
【図3-1】気道炎症のモデルマウスに対するｔＡＣＰＡ抗体による治療の影響。（ａ）気管支洗浄液中のｄｓＤＮＡ濃度。
【図3-2】気道炎症のモデルマウスに対するｔＡＣＰＡ抗体による治療の影響。（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）それぞれ、パラフィンに包埋した肺組織中の細胞外ｃｉｔＨ３、細胞外ＭＰＯ、及びＮＥＴのレベル。
【図3-3】気道炎症のモデルマウスに対するｔＡＣＰＡ抗体による治療の影響。（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）それぞれ、パラフィンに包埋した肺組織中の好酸球、好中球、マクロファージの数。
【図3-4】気道炎症のモデルマウスに対するｔＡＣＰＡ抗体による治療の影響。（ｈ）パラフィンに包埋した肺組織中の貪食性マクロファージの割合。
【図4】ＣＩＴ－０１３は、免疫複合体によって誘導されたＥＥＴｏｓｉｓを阻害する。（ａ）未刺激の好酸球、免疫複合体で刺激した好酸球、ＣＩＴ－０１３の存在下において免疫複合体で刺激した好酸球、及びアイソタイプコントロール抗体の存在下において免疫複合体で刺激した好酸球におけるＥＥＴｏｓｉｓの代表的な画像。（ｂ）ＣＩＴ－０１３又はアイソタイプコントロール抗体の存在下におけるＥＥＴのレベル（細胞数の％として）を、２つの条件間の差（Δ）とともに示す（ｎ＝８ドナー）。
【発明を実施するための形態】
【0022】
開示される発明の様々な用途は、当技術分野における具体的なニーズに応じて調整できることを理解されたい。また、本明細書で使用される用語は、本発明の特定の実施形態を説明することのみを目的とし、限定を意図するものではないことも理解されたい。
【0023】
更に、本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用するとき、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、特に明確に指示しない限り、複数の指示対象を含む。従って、例えば、「抗体（ａｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ）」に対する言及は、「複数の抗体（ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）」等を含む。
【0024】
上記であろうと下記であろうと、本明細書に引用される全ての刊行物、特許、及び特許出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0025】
本発明の方法における使用に好適な抗体又はその結合断片の標的
シトルリンは、正常な翻訳中にはタンパク質に組み込まれることのないアミノ酸であるが、ペプチジルアルギニンデイミナーゼ（ＰＡＤ；ＥＣ３．５．３．１５）等の脱イミノ化酵素によるアルギニン残基の翻訳後修飾により生成される場合がある。哺乳動物（ヒト、マウス、及びラット）では、それぞれが異なる遺伝子によってコードされている５つのＰＡＤアイソタイプ（ＰＡＤ１～ＰＡＤ６；「ＰＡＤ４」及び「ＰＡＤ５」は同じアイソタイプに使用される）がこれまでに同定されている。従って、脱イミノ化及びシトルリン化という用語は、互換的に使用することができる。ヒトのヒストン２Ａ及び／又はヒストン４のシトルリン化は、典型的には、例えばＰＡＤ２及びＰＡＤ４によって行われ得る。これらヒストンのシトルリン化は、ＮＥＴの病理学的形成と関連しているが、本発明以前には、ＥＥＴの病理学的形成にも同等に関連するという決定的な証拠は存在しなかった。
シトルリンは、正常な翻訳中にはタンパク質に組み込まれることのないアミノ酸であるが、ペプチジルアルギニンデイミナーゼ（ＰＡＤ；ＥＣ３．５．３．１５）等の脱イミノ化酵素によるアルギニン残基の翻訳後修飾により生成される場合がある。哺乳動物（ヒト、マウス、及びラット）では、それぞれが異なる遺伝子によってコードされている５つのＰＡＤアイソタイプ（ＰＡＤ１～ＰＡＤ６；「ＰＡＤ４」及び「ＰＡＤ５」は同じアイソタイプに使用される）がこれまでに同定されている。従って、脱イミノ化及びシトルリン化という用語は、互換的に使用することができる。ヒトのヒストン２Ａ及び／又はヒストン４のシトルリン化は、典型的には、例えばＰＡＤ２及びＰＡＤ４によって行われ得る。これらヒストンのシトルリン化は、ＮＥＴの病理学的形成と関連しているが、本発明以前には、ＥＥＴの病理学的形成にも同等に関連するという決定的な証拠は存在しなかった。
【0026】
本発明の方法において使用するのに好適な本発明の抗体又はその結合断片は、脱イミノ化されたヒトのヒストン２Ａ及び／又はヒストン４におけるシトルリン化されたエピトープに特異的に結合する。また、抗体は、脱イミノ化されたヒトのヒストンＨ３におけるシトルリン化されたエピトープにも特異的に結合し得る。抗体又はその結合断片は、脱イミノ化されたヒトのヒストン２Ａ及び／又はヒストン４におけるシトルリン化されたエピトープに特異的に結合することができ、該エピトープは、配列番号１８、１９、２０、２１、及び２２からなる群から選択されるペプチドを含む。また、抗体又はその結合断片は、配列番号５３又は５４のペプチドを含むエピトープにも結合し得る。
【0027】
抗体又はその結合断片
用語「複数の抗体」、「抗体」、又は「その結合断片」とは、本明細書で使用するとき、「抗原」と呼ばれることの多い標的分子に特異的に結合することができる構造体、好ましくはタンパク質又はポリペプチドの構造体を指す。
用語「複数の抗体」、「抗体」、又は「その結合断片」とは、本明細書で使用するとき、「抗原」と呼ばれることの多い標的分子に特異的に結合することができる構造体、好ましくはタンパク質又はポリペプチドの構造体を指す。
【0028】
抗体分子とは、本明細書で使用するとき、抗体又はその結合断片を指す。用語「抗体」は、本明細書で使用するとき、一般に、インタクトな（全）抗体、すなわち、２本の重鎖及び２本の軽鎖の要素を含む抗体に関する。抗体は、例えば、国際公開第２００７／０２４７１５号に開示されている分子ＤＶＤ－Ｉｇ又は国際公開第２０１１／０３０１０７号に記載されているいわゆる（ＦａｂＦｖ）２Ｆｃのように、更なる追加の結合ドメインを含んでいてもよい。従って、「抗体」とは、本明細書で使用するとき、一価、二価、三価、又は四価の完全長抗体を含む。
【0029】
抗体の結合断片としては、一本鎖抗体（すなわち、完全長の重鎖及び軽鎖）；Ｆａｂ、改変Ｆａｂ、Ｆａｂ’、改変Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、Ｆａｂ－Ｆｖ、Ｆａｂ－ｄｓＦｖ、シングルドメイン抗体（例えば、ＶＨ又はＶＬ又はＶＨＨ）、ｓｃＦｖ、一価、二価、三価、又は四価の抗体、Ｂｉｓ－ｓｃＦｖ、ダイアボディ、トリボディ、トリアボディ、テトラボディ、及び上記のいずれかのエピトープ結合断片が挙げられる（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ Ｐ ａｎｄ Ｈｕｄｓｏｎ ＰＪ，２００５，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２３，：１１２６－１１３６；Ａｄａｉｒ ＪＲ ａｎｄ Ｌａｗｓｏｎ ＡＤＧ，２００５，Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ Ｒｅｖｉｅｗｓ－Ｏｎｌｉｎｅ，２，２０９－２１７を参照）。これら抗体断片を作製及び製造する方法は、当技術分野において周知である（例えば、Ｖｅｒｍａ Ｒ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，２１６，１６５－１８１を参照）。Ｆａｂ－Ｆｖフォーマットは、国際公開第２００９／０４０５６２号に最初に開示され、そのジスルフィド安定化バージョンであるＦａｂ－ｄｓＦｖは、国際公開第２０１０／０３５０１２号に最初に開示された。本発明において使用するための他の抗体断片としては、Ｆａｂ及びＦａｂ’断片が挙げられる。多価抗体は、多重特異性を有していてもよく、例えば二重特異的であってもよく、単一特異的であってもよい。
【0030】
抗体又はその結合断片は、一本鎖抗体、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、可変断片（Ｆｖ）、断片抗原結合領域（Ｆａｂ）、組換え抗体、モノクローナル抗体、ネイティブ抗体の抗原結合ドメイン又はアプタマーを含む融合タンパク質、ＶＨＨ抗体としても知られているシングルドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、ナノボディ（ラクダ由来のシングルドメイン抗体）、ＶＮＡＲと呼ばれるサメＩｇＮＡＲ由来のシングルドメイン抗体断片、ダイアボディ、トリアボディ、アンチカリン、アプタマー（ＤＮＡ又はＲＮＡ）、及びこれらの活性成分又は断片からなる群から選択され得る。
【0031】
ＩｇＧ１の重鎖及び軽鎖を有するＩｇＧ１（例えば、ＩｇＧ１／κ）抗体は、本発明において有利に使用することができる。しかしながら、κ又はλ軽鎖と組み合わせたＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＡｓｅｃ、ＩｇＤ、及びＩｇＥを含む他のヒト抗体アイソタイプも本発明に包含される。また、様々なアイソタイプの動物由来の抗体は全て、本発明において使用することができる。抗体は、フルサイズ抗体であってもよく、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、一本鎖Ｆｖ断片、又は単一ドメインＶＨＨ、ＶＨ又はＶＬ単一ドメインを含む抗体の抗原結合断片であってもよい。
【0032】
用語「シトルリンに特異的に結合する」又は「シトルリン化されたエピトープに特異的に結合する」とは、この状況では、抗体又はその結合断片が、シトルリン残基を含有するペプチド等の構造体には結合するが、該抗体又はその結合断片は、シトルリン残基の代わりにアルギニン残基を含有する同一構造体にはより弱くしか又は好ましくは全く結合しないことを意味する。ペプチドという用語は、本明細書に記載の抗体又はその結合断片との免疫反応性についての適正な状況において、好ましくはヒト又は動物の体内に存在するのと同じ状況において、好ましくはネイティブのポリペプチドの状況において、シトルリン残基を提示することができる構造体として解釈されるべきである。
【0033】
本発明の方法において使用するのに好適な抗体又はその結合断片は、脱イミノ化されたヒトのヒストン２Ａ及び／又はヒストン４におけるシトルリン化されたエピトープに特異的に結合する。脱イミノ化されたヒトのヒストン２Ａ及び／又はヒストン４におけるシトルリン化されたエピトープに抗体又はその結合断片が結合すると、ＥＥＴ形成がブロックされる。ヒストンのシトルリン化は、ＥＥＴの形成に関連している。
【0034】
ＥＥＴ形成のブロックは、全体的である場合も部分的である場合もある。例えば、抗体又はその結合断片は、ＥＥＴ形成を１０～５０％、少なくとも５０％、又は少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、若しくは９９％減少させることができる。ＥＥＴのブロックは、任意の好適な手段によって、例えば、インビトロでＥＥＴｏｓｉｓを測定することによって測定することができる（Ｆｕｋｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，“Ｈｏｗ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌ ＥＴｏｓｉｓ（ＥＥＴｏｓｉｓ）ａｎｄ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｔｒａｐｓ”；Ａｌｌｅｒｇｏｌｏｇｙ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｖｏｌｕｍｅ ７０，Ｉｓｓｕｅ １，２０２１，Ｐａｇｅｓ １９－２９）。
【0035】
用語「結合活性」及び「結合親和性」は、抗体分子が標的に結合する又は結合しない傾向を指すことを意図する。結合親和性は、抗体及びその標的についての解離定数（Ｋｄ）を求めることによって定量することができる。同様に、抗体のその標的への結合の特異性は、抗体及び別の非標的分子に関する解離定数と比較した、抗体のその標的に対する比較解離定数（Ｋｄ）の観点で定義され得る。
【0036】
典型的には、標的に対する抗体のＫｄは、環境中の無関係な物質又は共存する物質等の他の非標的分子に対するＫｄよりも２倍、好ましくは５倍、より好ましくは１０倍低い。より好ましくは、Ｋｄは、５０倍低い、更により好ましくは１００倍低い、更により好ましくは２００倍低い。
【0037】
この解離定数の値は、周知の方法によって直接求めることができ、複雑な混合物であっても、例えばＣａｃｅｃｉ ＭＳ ａｎｄ Ｃａｃｈｅｒｉｓ ＷＰ（１９８４，Ｂｙｔｅ，９，３４０－３６２）に記載されているもの等の方法によってコンピュータで計算することができる。例えば、Ｋｄは、Ｗｏｎｇ Ｉ ａｎｄ Ｌｏｈｍａｎ ＴＭ（１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，５４２８－５４３２）によって開示されているもの等のダブルフィルターニトロセルロースフィルター結合アッセイを用いて又は例えばＯｃｔｅｔ表面プラズモン共鳴を用いることによって確立され得る。
【0038】
脱イミノ化されたヒトのヒストン２Ａ及び／又はヒストン４についての結合親和性を評価する１つの方法は、ＥＬＩＳＡによる方法である。例えば、ウエスタンブロット、ＲＩＡ、及びフローサイトメトリー分析を含む、標的に対する抗体等のリガンドの結合能力を評価するための他の標準的なアッセイは、当技術分野において公知である。抗体の結合反応速度（例えば、結合親和性）は、例えばＢｉａｃｏｒｅ（商標）システム分析によって、表面プラズモン共鳴等の当技術分野において公知の標準的なアッセイによって評価することもできる。
【0039】
好ましくは、抗体は、脱イミノ化されたヒトのヒストン２Ａ及び／又はヒストン４について１ｎＭ以下の結合親和性を有する。好ましくは、本発明の抗体は、脱イミノ化されたヒトのヒストン２Ａ及び／若しくはヒストン４並びに／又は脱イミノ化されたヒトのヒストンＨ３について０．５ｎＭ以下、０．１ｎＭ以下、５０ｐＭ以下、１０ｐＭ以下、５ｐＭ以下、２ｐＭ以下、又は１ｐＭ以下の結合親和性を有する。
【0040】
また、抗体又はその結合断片は、ネイティブ抗体の抗原結合ドメインを含む融合タンパク質であってもよく、ＤＮＡ又はＲＮＡの形態のアプタマー等のアプタマーであってもよい。
【0041】
好ましくは、抗体は、モノクローナル抗体である。モノクローナル抗体は、互いに同一でありかつ特定のエピトープについて単一結合特異性及び親和性を有する免疫グロブリン分子である。本発明のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、従来のモノクローナル抗体方法論を含む様々な技術、例えば、“Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｍａｎｕａｌ ｏｆ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ”（Ｚｏｌａ Ｈ，１９８７，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ）及び“Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”（Ｈｕｒｒｅｌｌ ＪＧＲ，１９８２ ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ）に開示されているものによって生成することができる。
【0042】
本発明の方法で使用される抗体又はその結合断片は、結合ドメインを含む。結合ドメインは、一般に、重鎖から３つ及び軽鎖から３つの６つのＣＤＲ（ＶＨＨの場合は３個）を含む。一実施形態では、ＣＤＲはフレームワーク内にあり、一緒に可変領域又はドメインを形成する。従って、一実施形態では、抗体又は結合断片は、軽鎖可変領域又はドメイン及び重鎖可変領域又はドメインを含む抗原に特異的な結合ドメインを含む。
【0043】
抗体可変ドメインにおける残基は、従来、ＩＭＧＴ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ）に従って付番される。このシステムは、Ｌｅｆｒａｎｃ ＭＰ（１９９７，Ｊ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ，１８，５０９）に記載されている。本明細書では、特に指定のある場合を除き、この付番システムを使用する。
【0044】
ＩＭＧＴの残基指定は、必ずしもアミノ酸残基の線状付番に直接対応するものではない。実際の線状アミノ酸配列は、フレームワークであろうとＣＤＲであろうと、基本可変ドメイン構造の構造的構成要素の短縮又は該構造的構成要素への挿入に対応する厳密なＩＭＧＴ付番よりも少ないアミノ酸又は追加のアミノ酸を含有している場合がある。抗体の配列中の相同性の残基を「標準的な」ＩＭＧＴ付番された配列とアラインメントすることによって、所与の抗体について残基の正確なＩＭＧＴ付番を決定することができる。
【0045】
重鎖可変ドメインのＣＤＲは、ＩＭＧＴ付番システムに従って残基２７～３８（ＶＨのＣＤＲ１）、残基５６～６５（ＶＨのＣＤＲ２）、及び残基１０５～１１７（ＶＨのＣＤＲ３）に位置する。
【0046】
軽鎖可変ドメインのＣＤＲは、ＩＭＧＴ付番システムに従って残基２７～３８（ＶＬのＣＤＲ１）、残基５６～６５（ＶＬのＣＤＲ２）、及び残基１０５～１１７（ＶＬのＣＤＲ３）に位置する。
【0047】
好適な抗体又はその結合断片は、重鎖及び軽鎖のＣＤＲ、重鎖及び軽鎖の可変領域、及び／又は完全長の重鎖及び軽鎖の一次アミノ酸配列によって本明細書に開示され得る。
【0048】
本発明の方法において使用するための好ましい抗体又はその結合断片は、脱イミノ化されたヒトのヒストン２Ａ及び／又はヒストン４におけるシトルリン化されたエピトープに特異的に結合する抗体又はその結合断片の改変されたＶＬ ＣＤＲ１を含み、該改変されたＶＬ ＣＤＲ１は、該抗体又はその結合断片に、未改変バージョンのＶＬのＣＤＲ１を含む抗体又はその結合断片よりも改善された特性を提供する。未改変のＶＬ ＣＤＲ１は、アミノ酸配列ＱＳＬＬＤＳＤＧＫＴＹ（配列番号３６）又はＱＳＬＶＤＳＤＧＫＴＹ（配列番号３７）を含むか又はからなる。従って、本発明の方法において使用するための抗体又はその結合断片は、好ましくは配列番号３６又は３７のＶＬ ＣＤＲ１を含まないが、そのようなＶＬ ＣＤＲ１を含む抗体も依然としてそのような使用に好適である。
【0049】
抗体又はその結合断片のＶＬ鎖の改変されたＣＤＲ１は、アミノ酸配列ＱＳＬ－Ｘ１－Ｄ－Ｘ２－Ｄ－Ｘ３－ＫＴＹ（式中、Ｘ１は、Ｖ又はＬであり、Ｘ２は、Ｔ、Ｓ、Ａ、又はＮであり、Ｘ３は、Ｇ又はＡである）を含んでいてもよく又はからなっていてもよいが、但し、該アミノ酸配列は、ＱＳＬＬＤＳＤＧＫＴＹ（配列番号３６）でもＱＳＬＶＤＳＤＧＫＴＹ（配列番号３７）でもない。抗体又はその結合断片のＶＬ鎖の改変されたＣＤＲ１は、配列番号３６又は３７の未改変ＣＤＲ１と比較して異性化の減少を示すが、未改変ＣＤＲ１の結合特性は維持している。
【0050】
特定の抗体又はその結合断片のＶＨのＣＤＲのアミノ酸配列を配列番号１、２、及び３に示す。ＶＬのＣＤＲ２及び３を配列番号４及び５に示す。
【0051】
特定の抗体又はその結合断片のＶＨ及びＶＬのアミノ酸配列を配列番号１１及び１３に与える。ＶＨのＣＤＲを配列番号１、２、及び３に示す。ＶＬのＣＤＲを配列番号６、４、及び５に示す。
【0052】
別の抗体又はその結合断片のＶＨ及びＶＬのアミノ酸配列を配列番号１１及び１４に与える。ＶＨのＣＤＲを配列番号１、２、及び３に示す。ＶＬのＣＤＲを配列番号７、４、及び５に示す。
【0053】
別の抗体又はその結合断片のＶＨ及びＶＬのアミノ酸配列を配列番号１１及び１５に与える。ＶＨのＣＤＲを配列番号１、２、及び３に示す。ＶＬのＣＤＲを配列番号８、４、及び５に示す。
【0054】
別の抗体又はその結合断片のＶＨ及びＶＬのアミノ酸配列を配列番号１１及び１６に与える。ＶＨのＣＤＲを配列番号１、２、及び３に示す。ＶＬのＣＤＲを配列番号９、４、及び５に示す。
【0055】
別の抗体又はその結合断片のＶＨ及びＶＬのアミノ酸配列を配列番号１１及び１７に与える。ＶＨのＣＤＲを配列番号１、２、及び３に示す。ＶＬのＣＤＲを配列番号１０、４、及び５に示す。
【0056】
別の抗体又はその結合断片のＶＨ及びＶＬのアミノ酸配列を配列番号１２及び１３に与える。ＶＨのＣＤＲを配列番号１、２、及び３に示す。ＶＬのＣＤＲを配列番号６、４、及び５に示す。
【0057】
別の抗体又はその結合断片のＶＨ及びＶＬのアミノ酸配列を配列番号１２及び１４に与える。ＶＨのＣＤＲを配列番号１、２、及び３に示す。ＶＬのＣＤＲを配列番号７、４、及び５に示す。
【0058】
別の抗体又はその結合断片のＶＨ及びＶＬのアミノ酸配列を配列番号１２及び１５に与える。ＶＨのＣＤＲを配列番号１、２、及び３に示す。ＶＬ鎖のＣＤＲを配列番号８、４、及び５に示す。
【0059】
別の抗体又はその結合断片のＶＨ及びＶＬのアミノ酸配列を配列番号１２及び１６に与える。ＶＨのＣＤＲを配列番号１、２、及び３に示す。ＶＬのＣＤＲを配列番号９、４、及び５に示す。
【0060】
別の抗体又はその結合断片のＶＨ及びＶＬのアミノ酸配列を配列番号１２及び１７に与える。ＶＨのＣＤＲを配列番号１、２、及び３に示す。ＶＬのＣＤＲを配列番号１０、４、及び５に示す。
【0061】
抗体は、配列番号１１の重鎖可変ドメインアミノ酸配列、配列番号１６の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列、配列番号２３又は５６を含む重鎖定常領域アミノ酸配列、及び配列番号２４の軽鎖定常領域アミノ酸配列を含み得る。
【0062】
抗体は、配列番号１１の重鎖可変ドメインアミノ酸配列、配列番号１６の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列、配列番号２３又は５６の重鎖定常領域アミノ酸配列、及び配列番号２４の軽鎖定常領域アミノ酸配列を含み得る。
【0063】
抗体又はその結合断片は、ＶＬのＣＤＲ１が常にアミノ酸配列ＱＳＬ－Ｘ１－Ｄ－Ｘ２－Ｄ－Ｘ３－ＫＴＹ（式中、Ｘ１は、Ｖ又はＬであり、Ｘ２は、Ｔ、Ｓ、Ａ、又はＮであり、Ｘ３は、Ｇ又はＡである）を含むか若しくはからなるものとして存在するが、但し、該アミノ酸配列はＱＳＬＬＤＳＤＧＫＴＹ（配列番号３６）でもＱＳＬＶＤＳＤＧＫＴＹ（配列番号３７）でもないか、又は配列番号６、７、８、９、若しくは１０を含むか又はからなるものとして存在することを除いて、上記の特定の抗体のうちのいずれか１つのＣＤＲ配列のうちの１つ以上を含み得る。
【0064】
抗体又はその結合断片は、ＶＬ ＣＤＲ１に加えて、該特定の抗体の１つ以上のＶＨ ＣＤＲ配列、そして、代替的に又は追加的に１つ以上のＶＬ ＣＤＲ配列を含んでいてもよい。抗体又はその結合断片は、上記の特定の抗体又はその結合断片のＶＨ ＣＤＲ配列のうちの１つ、２つ、又は３つ全て、そして、代替的に又は追加的にＶＬ ＣＤＲ１を含む該特定の抗体又はその結合断片のＶＬ鎖のＣＤＲ配列のうちの１つ、２つ、又は３つ全てを含んでいてもよい。抗体又はその結合断片は、上記の特定の抗体又は結合断片の６つのＣＤＲ配列全てを含んでいてもよい。一例として、抗体は、配列番号６、７、８、９、又は１０のうちの１つと、配列番号１、２、３、４、及び５のうちの１つ以上とを含んでいてもよい。
【0065】
抗体又はその結合断片のＶＬ鎖の改変されたＣＤＲ１は、アミノ酸配列ＱＳＬ－Ｚ１－Ｚ２－Ｚ３－Ｚ４－Ｚ５－ＫＴＹ（式中、Ｚ１は、Ｖ又はＬであり、Ｚ２は、Ｄ又はＥであり、Ｚ３は、Ｔ、Ｓ、Ａ、又はＮであり、Ｚ４は、Ｄ、Ｅ、Ｓ、又はＡであり、Ｚ５は、Ｇ又はＡである）を含んでいてもよく又はからなっていてもよいが、但し、該アミノ酸配列はＱＳＬＬＤＳＤＧＫＴＹ（配列番号３６）でもＱＳＬＶＤＳＤＧＫＴＹ（配列番号３７）でもない。本発明の抗体又はその結合断片のＶＬ鎖の改変されたＣＤＲ１は、配列番号３６又は３７の未改変ＣＤＲ１と比較して異性化の減少を示すが、未改変ＣＤＲ１の結合特性は維持している。本発明の抗体又はその結合断片のＶＬ鎖の改変されたＣＤＲ１は、配列番号６、７、８、９、１０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、又は５２を含んでいてもよく又はからなっていてもよい。抗体は、配列番号６、７、８、９、１０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、又は５２のうちの１つと、配列番号１、２、３、４、及び５のうちの１つ以上とを含み得る。抗体は、配列番号６、７、８、９、１０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１又は５２のうちの１つと、配列番号１、２、３、４及び５の全てとを含み得る。
【0066】
本発明の方法において使用するのに好適な抗体又はその結合断片は、これら重鎖可変ドメイン又はＶＬのＣＤＲ２若しくは３におけるＣＤＲ配列のうちの１つのバリアントを代替的に含んでいてもよい。例えば、バリアントは、上記アミノ酸配列のいずれかの置換、欠失、又は付加バリアントであってよい。
【0067】
バリアント抗体は、上述の特定の配列及び断片から１個、２個、３個、４個、５個、１０個以下、２０個以下、３０個以下、又はそれ以上のアミノ酸の置換及び／又は欠失を含み得るが、本明細書に記載の抗体の活性は維持している。「欠失」バリアントは、例えば、１個、２個、３個、４個、若しくは５個の個々のアミノ酸、又は２個、３個、４個、若しくは５個のアミノ酸等の１つ以上のアミノ酸の小さな群の欠失を含んでいてよい。「アミノ酸の小さな群」とは、互いに連続しているか又は近接しているが連続してはいないものとして定義することができる。「置換」バリアントは、好ましくは、１つ以上のアミノ酸が同じ数のアミノ酸で置き換えられたもの及び保存的アミノ酸置換が行われたものを含む。例えば、アミノ酸を、類似の性質を有する別のアミノ酸、例えば、別の塩基性アミノ酸、別の酸性アミノ酸、別の中性アミノ酸、別の荷電アミノ酸、別の親水性アミノ酸、別の疎水性アミノ酸、別の極性アミノ酸、別の芳香族アミノ酸、別の脂肪族アミノ酸、別の極めて小さなアミノ酸、別の小さなアミノ酸、又は別の大きなアミノ酸で置換してよい。好適な置換基を選択するために使用することができる２０種の主なアミノ酸の幾つかの性質は、以下の通りである：
【0068】
【表2】
【0069】
好ましい「誘導体」又は「バリアント」は、配列中に存在するアミノ酸が、天然に存在するアミノ酸の代わりにその構造類似体であるものを含む。また、配列において使用されるアミノ酸は、抗体の機能が著しく悪影響を受けることのない限り、誘導体化又は修飾、例えば標識されていてもよい。
【0070】
上記の誘導体及びバリアントは、抗体の合成中に、又は生成後の修飾によって、又は抗体が組換え体の形態である場合は核酸の部位特異的変異誘発、ランダム変異誘発、又は酵素的切断及び／若しくはライゲーションの公知の技術を用いて調製することができる。
【0071】
好ましくは、バリアント抗体は、本明細書に開示される抗体のＶＬ及び／若しくはＶＨ又はその断片に対して６０％超、又は７０％超、例えば７５％又は８０％、好ましくは８５％超、例えば９０％超、９５％超、９６％超、９７％超、９８％超、又は９９％超のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を有する。このアミノ酸同一性のレベルは、関連する配列番号の配列の全長にわたって又は配列の一部にわたって、例えば、完全長ポリペプチドのサイズに応じて２０、３０、５０、７５、１００、１５０、２００、又はそれ以上のアミノ酸にわたってみられ得る。
【0072】
好ましくは、バリアント抗体は、本明細書に記載のＣＤＲ配列のうちの１つ以上を含む。
【0073】
アミノ酸配列に関連して、「配列同一性」とは、以下のパラメータでＣｌｕｓｔａｌＷ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ＪＤ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，２２，４６７３－４６８０）を用いて評価したときに指定の値を有する配列を指す：
ペアワイズアラインメントパラメータ－方法：緩徐／正確、マトリクス：ＰＡＭ、ギャップオープンペナルティ：１０．００、ギャップエクステンションペナルティ：０．１０；
マルチプルアライメントパラメータ－マトリクス：ＰＡＭ、ギャップオープンペナルティ：１０．００、遅延についての同一性％：３０、エンドギャップのペナルティ：オン、ギャップの分離距離：０、ネガティブマトリクス：なし、ギャップエクステンションペナルティ：０．２０、残基特異的ギャップペナルティ：オン、親水性ギャップペナルティ：オン、親水性残渣：Ｇ、Ｐ、Ｓ、Ｎ、Ｄ、Ｑ、Ｅ、Ｋ、Ｒ。特定の残基における配列同一性は、単に誘導体化されている同一の残基を含むことを意図する。
ペアワイズアラインメントパラメータ－方法：緩徐／正確、マトリクス：ＰＡＭ、ギャップオープンペナルティ：１０．００、ギャップエクステンションペナルティ：０．１０；
マルチプルアライメントパラメータ－マトリクス：ＰＡＭ、ギャップオープンペナルティ：１０．００、遅延についての同一性％：３０、エンドギャップのペナルティ：オン、ギャップの分離距離：０、ネガティブマトリクス：なし、ギャップエクステンションペナルティ：０．２０、残基特異的ギャップペナルティ：オン、親水性ギャップペナルティ：オン、親水性残渣：Ｇ、Ｐ、Ｓ、Ｎ、Ｄ、Ｑ、Ｅ、Ｋ、Ｒ。特定の残基における配列同一性は、単に誘導体化されている同一の残基を含むことを意図する。
【0074】
本発明の方法は、特定のＶＨ及びＶＬのアミノ酸配列並びにそのバリアント及び断片を有する抗体であって、これらＶＨ及びＶＬの機能又は活性を維持している抗体を使用し得る。
【0075】
従って、本発明の方法は、ヒトの脱イミノ化されたヒトのヒストン２Ａ及び／又はヒストン４におけるシトルリン化されたエピトープに特異的に結合する能力を保持しているＶＨのバリアントを含む抗体又はその結合断片を使用し得る。重鎖のバリアントは、未改変ＶＨと少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有し得る。ＶＨのバリアントは、ｈＶＨ２２．１０１ｆ若しくはｈＶＨ２２．１０１ＨＣ９（それぞれ配列番号１１及び１２）の少なくとも７アミノ酸の断片であって、抗体若しくはその結合断片が脱イミノ化されたヒトのヒストン２Ａ及び／若しくはヒストン４におけるシトルリン化されたエピトープと特異的に反応する能力を保持している断片；又はｈＶＨ２２．１０１ｆ若しくはｈＶＨ２２．１０１ＨＣ９（それぞれ配列番号１１及び１２）の配列と少なくとも７０％のアミノ酸配列同一性を有するｈＶＨ２２．１０１ｆ若しくはｈＶＨ２２．１０１ＨＣ９（それぞれ配列番号１１及び１２）のバリアントであって、抗体若しくはその結合断片が脱イミノ化されたヒトのヒストン２Ａ及び／若しくはヒストン４におけるシトルリン化されたエピトープと特異的に反応する能力を保持しているバリアントを含み得る。
【0076】
代表的な脱イミノ化したヒトのヒストン２Ａ及びヒストン４におけるシトルリン化されたエピトープに結合する抗体は、例えば国際公開第２００９１４７２０１号、同第２０１１０７０１７２号、同第２０１６０９２０８２号、及び同第２０２００３８９６３号に記載されている。これら各文書及びそこに開示されている抗体（重鎖及び軽鎖の両方のＣＤＲ配列、可変領域配列、及び定常領域配列を全て含む）は、参照により本明細書に組み込まれる。具体的には、国際公開第２０１６０９２０８２号においてＲｈｍＡｂ２．１０２、ＲｈｍＡｂ２．１０８、ＲｈｍＡｂ２．１０９、ＲｈｍＡｂ２．１１０、ＲｈｍＡｂ２．１１１、ＲｈｍＡｂ２．１１２、ＭＱ２２．１０１、ＭＱ２２．１０２、及びＭＱ２２．１０１ｂ／ｄと命名されている抗体並びにそれらの任意の抗原結合断片は、それぞれ参照により組み込まれる。同様に、国際公開第２０２００３８９６３号にｈＭＱ２２．１０１ｘ／ｙの形式の識別子で開示されている抗体及びその任意の抗原結合断片は、それぞれ参照により組み込まれる。国際公開第２０２００３８９６３号に開示されている抗体が特に好ましく、以下でより詳細に論じる。国際公開第２０２００３８９６３号においてｈＭＱ２２．１０１ｆ／ＬＣ４１と称されている抗体が最も好ましい。この抗体は、本明細書ではＣＩＴ－０１３と記載される場合もある。
【0077】
ポリヌクレオチド、ベクター、及び宿主細胞
本発明はまた、本明細書に記載の抗体又はその結合断片をコードしているポリヌクレオチド、ベクター、及び発現ベクターを包含する。
本発明はまた、本明細書に記載の抗体又はその結合断片をコードしているポリヌクレオチド、ベクター、及び発現ベクターを包含する。
【0078】
本発明はまた、本明細書に記載の任意の抗体又は断片をコードしているポリヌクレオチドに関する。用語「核酸分子」及び「ポリヌクレオチド」は、本明細書では互換的に使用され、デオキシリボヌクレオチド若しくはリボヌクレオチド又はこれらの類似体のいずれかである、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。ポリヌクレオチドの非限定的な例は、遺伝子、遺伝子断片、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、組み換えポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたＤＮＡ、任意の配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブ、及びプライマーを含む。ポリヌクレオチドは、単離又は精製された形態で提供され得る。
【0079】
選択されたポリヌクレオチドを「コードしている」核酸配列は、適切な調節配列の制御下におかれたときにインビボでポリペプチドに転写（ＤＮＡの場合）及び翻訳（ｍＲＮＡの場合）される核酸分子である。コード配列の境界は、５’（アミノ）末端における開始コドン及び３’（カルボキシ）末端における翻訳終止コドンによって決定される。本開示の目的のために、このような核酸配列は、ウイルス由来のｃＤＮＡ、原核生物又は真核生物のｍＲＮＡ、ウイルス又は原核生物のＤＮＡ又はＲＮＡ由来のゲノム配列、及び更には合成ＤＮＡ配列を含んでいてよいが、これらに限定されない。転写終結配列は、コード配列の３’側に位置していてよい。一実施形態では、ポリヌクレオチドは、上記のＶＨ又はＶＬのアミノ酸配列をコードしている配列を含む。ポリヌクレオチドは、本明細書に開示される特定の抗体又はその結合断片のＶＨ又はＶＬの配列をコードしていてよい。
【0080】
従って、抗体又はその結合断片は、それをコードしておりかつそれを発現することができるポリヌクレオチドから生成されてもよく、又は該ポリヌクレオチドの形態で送達されてもよい。抗体が２本以上の鎖を含む場合、ポリヌクレオチドは、１本以上の抗体鎖をコードし得る。例えば、ポリヌクレオチドは、抗体軽鎖、抗体重鎖、又は両方をコードし得る。一方が抗体軽鎖をコードし、他方が対応する抗体重鎖をコードしている２つのポリヌクレオチドが提供されてもよい。このようなポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド対は、抗体が生成されるように一緒に発現し得る。
【0081】
ポリヌクレオチドは、一例としてＳａｍｂｒｏｏｋ Ｊ ｅｔ ａｌ．（１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）に記載されている通り、当技術分野において周知の方法に従って合成することができる。
【0082】
本発明の核酸分子は、挿入された配列に動作可能に連結され、それによって、インビボで本発明の抗体を発現させることができる制御配列を含む、発現カセットの形態で提供され得る。次に、これら発現カセットは、典型的には、ベクター（例えば、プラスミド又は組み換えウイルスベクター）内に提供される。このような発現カセットを宿主対象に直接投与してもよい。あるいは、ポリヌクレオチドを含むベクターを宿主対象に投与してもよい。好ましくは、遺伝子ベクターを使用してポリヌクレオチドを調製及び／又は投与する。好適なベクターは、十分な量の遺伝情報を保有し、上に定義した抗体又はその結合断片等のポリペプチドを発現させることができる任意のベクターであってよい。
【0083】
また、このようなポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターも開示される。このような発現ベクターは、分子生物学の技術分野においてルーチン的に構築され、例えば、本発明のペプチドを発現させるために、プラスミドＤＮＡ並びに適切なイニシエータ、プロモータ、エンハンサ、及び他のエレメント、例えば必要になる場合がありかつ正確な配向で配置されたポリアデニル化シグナルの使用を伴っていてよい。他の好適なベクターは、当業者には明らかであろう。これに関する更なる例として、Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ ｅｔ ａｌ．（１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）を参照する。
【0084】
当業者であれば、本明細書に記載の配列を使用して、例えば以下の実施例に記載されるｃＤＮＡ又はゲノム配列をクローニング又は生成することができる。ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のような適切な真核生物発現ベクター又はその誘導体にこれら配列をクローニングし、その後、適切な軽鎖及び重鎖含有ベクターの組み合わせで（ＣＨＯ細胞のような）哺乳動物細胞をトランスフェクションした結果、本明細書に記載の抗体が発現及び分泌される。
【0085】
当業者はまた、抗体配列の特異的結合ドメインを使用することによって本明細書に記載の抗体又はその結合断片の類似体を作製し、融合タンパク質等のポリペプチド等の異なる状況で発現させることができる。これは、当技術分野において周知である。
【0086】
また、抗体を発現するように改変された細胞も開示される。このような細胞としては、哺乳動物細胞若しくは昆虫細胞等の一過性又は好ましくは安定性の高等真核細胞株、酵母等の下等真核細胞、又は細菌細胞等の原核細胞が挙げられる。本発明の抗体をコードしているベクター又は発現カセットの挿入により改変され得る細胞の具体例としては、哺乳動物のＨＥＫ２９３、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＮＳ０、及びＣＯＳの細胞が挙げられる。好ましくは、選択される細胞株は、安定しているだけでなく、成熟グリコシル化を可能にするものである。
【0087】
このような細胞株は、抗体若しくはその結合断片を生成するためにルーチンな方法を用いて培養してもよく、又は抗体若しくはその結合断片を対象に送達するために治療的若しくは予防的に使用してもよい。あるいは、本発明のポリヌクレオチド、発現カセット、又はベクターをエクスビボで対象由来の細胞に投与し、次いで、細胞を対象の体内に戻してもよい。
【0088】
脱イミノ化されたヒトのヒストン２Ａ及び／又はヒストン４におけるシトルリン化されたエピトープに特異的に結合する抗体又はその結合断片を生成するプロセスであって、本明細書に記載の宿主細胞を培養することと、該細胞から該抗体又はその結合断片を単離することとを含むプロセスが本明細書に開示される。
【0089】
医薬組成物
本発明の方法において使用する場合、上に定義した抗体又は結合断片は、該抗体又はその結合断片を含む医薬組成物として提供することができる。従って、本発明は、本発明の方法において使用するための、抗体又はその結合断片と薬学的に許容し得る担体とを含む医薬組成物を包含する。
本発明の方法において使用する場合、上に定義した抗体又は結合断片は、該抗体又はその結合断片を含む医薬組成物として提供することができる。従って、本発明は、本発明の方法において使用するための、抗体又はその結合断片と薬学的に許容し得る担体とを含む医薬組成物を包含する。
【0090】
本明細書で使用するとき、「薬学的に許容し得る担体」は、生理学的に適合する任意の及び全ての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌及び抗真菌剤、等張及び吸収遅延剤等を含む。好ましくは、担体は、非経口的、例えば静脈内、眼内、筋肉内、皮下、皮内、又は腹腔内への投与（例えば、注射又は注入による）に好適である。特定の実施形態では、薬学的に許容し得る担体は、共溶媒溶液、リポソーム、ミセル、液晶、ナノ結晶、ナノ粒子、エマルジョン、微粒子、ミクロスフェア、ナノスフィア、ナノカプセル、ポリマー又はポリマー担体、界面活性剤、懸濁剤、シクロデキストリン等の錯化剤、又はアルブミン等の吸着分子、表面活性粒子、及びキレート剤からなる群から選択される少なくとも１つの担体を含む。更なる実施形態では、多糖類は、ヒアルロン酸及びその誘導体、デキストラン及びその誘導体、セルロース及びその誘導体（例えば、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、酢酸フタル酸セルロース、酢酸コハク酸セルロース、酢酸酪酸セルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート）、キトサン及びその誘導体、［β］－グルカン、アラビノキシラン、カラギーナン、ペクチン、グリコーゲン、フコイダン、コンドロチン、デルマタン、ヘパラン、ヘパリン、ペントサン、ケラタン、アルギネート、シクロデキストリン、並びにこれらのエステル及び硫酸塩を含む塩及び誘導体を含む。
【0091】
好ましい薬学的に許容し得る担体は、水性担体又は希釈剤を含む。本発明の医薬組成物において使用することができる好適な水性担体の例としては、水、緩衝水、及び生理食塩水が挙げられる。他の担体の例としては、エタノール、ポリオール（グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等）、及びこれらの好適な混合物、オリーブオイル等の植物油、並びにオレイン酸エチル等の注射可能な有機エステルが挙げられる。例えば、レシチン等のコーティング材料を使用することによって、分散液の場合は必要な粒径を維持することによって、及び界面活性剤を使用することによって適切な流動性を維持することができる。多くの場合、組成物中に等張剤、例えば糖、マンニトール、ソルビトール等のポリアルコール、又は塩化ナトリウムを含むことが好ましい。
【0092】
医薬組成物は、薬学的に許容し得る酸化防止剤を含んでいてもよい。これら組成物はまた、防腐剤、湿潤剤、乳化剤、及び分散剤等のアジュバントを含有していてもよい。上記の滅菌手順によっても、様々な抗菌及び抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸等を含めることによっても、微生物の存在を確実に防ぐことができる。また、糖類、塩化ナトリウム等の等張化剤を組成物に含めることが望ましい場合もある。更に、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチン等の吸収を遅延させる剤を含めることによって、注射可能な医薬形態の持続性吸収を実現することもできる。
【0093】
治療組成物は、典型的には、無菌でなければならず、製造及び保管の条件下で安定でなければならない。医薬組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、リポソーム、又は高薬物濃度に好適な他の秩序構造として製剤化することができる。
【0094】
滅菌注射液は、必要に応じて上に列挙した成分のうちの１つ又は組み合わせと共に適切な溶媒中に必要量の活性剤（例えば、抗体）を配合し、続いて、滅菌精密濾過することによって調製され得る。一般的に、分散液は、塩基性分散媒と上に列挙したもののうちの必要な他の成分とを含有する滅菌ビヒクルに活性剤を配合することによって調製される。滅菌注射液を調製するための滅菌粉末の場合、調製の好ましい方法は真空乾燥及びフリーズドライ（凍結乾燥）であり、これにより、その予め滅菌濾過された溶液から活性剤の粉末に加えて任意の更なる所望の成分が得られる。
【0095】
医薬組成物は、上に定義した抗体に加えて追加の活性成分を含んでいてもよい。上述したように、本発明の組成物は１つ以上の抗体を含んでいてもよい。また、該組成物は、追加の治療又は予防用の活性剤を含んでいてもよい。
【0096】
投与経路に応じて、抗体を不活化又は変性させる可能性のある酸及び他の自然条件の作用から該抗体を保護するための材料で、抗体又はその結合断片をコーティングしてもよい。
【0097】
好ましい実施形態では、本発明に係る医薬組成物は、水溶液、ゲル、ヒドロゲル、フィルム、ペースト、クリーム、スプレー、軟膏、又はラップからなる群から選択される形態である。
【0098】
更なる実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物は、静脈内、皮下、眼内、筋肉内、関節内、皮内、腹膜内、脊髄等の経路によって又は他の非経口的な投与経路、例えば注射若しくは注入によって投与することができる。投与は、直腸、経口、眼、外用、表皮、又は粘膜の経路で行うことができる。投与は、吸入によるものを含む局所的なものであってもよい。好ましい実施形態では、医薬組成物は、静脈内又は皮下に投与される。一実施形態では、医薬組成物は、吸入により投与してよい。一実施形態では、医薬組成物を含む定量投与装置が使用される。
【0099】
本発明の一実施形態では、対象は、本発明の抗体又は結合断片及び副腎皮質ステロイドの両方で治療される。一実施形態では、副腎皮質ステロイドは、デキサメタゾンである。一実施形態では、抗体又は結合断片及び副腎皮質ステロイドは、同時に、別々に、又は逐次投与される。一実施形態では、２つは同じ組成物で与えられる。別の実施形態では、そうではない。一実施形態では、副腎皮質ステロイドは、吸入を介して与えられる。
【0100】
また、本発明の抗体又は他の組成物と使用説明書とを含むキットも本明細書に開示される。キットは、本明細書で論じる追加の治療又は予防用の剤等の１つ以上の追加の試薬を更に含有していてもよい。
【0101】
疾患を予防及び治療する方法
本発明は、好酸球細胞外トラップ（ＥＥＴ）の形成を阻害する方法であって、脱イミノ化されたヒトのヒストン２Ａ及び／又はヒストン４におけるシトルリン化されたエピトープに特異的に結合する抗体又はその結合断片を、好酸球が存在するサンプル又は対象に投与することを含む方法を提供する。本発明はまた、好中球細胞外トラップ（ＮＥＴ）の形成を阻害するための、特に肺病態を治療又は予防するためのこのような抗体又は結合断片を提供する。好ましい一実施形態では、肺病態は、好中球及び好酸球の数の増加を特徴とするものである。従って、好ましい一実施形態では、本発明はＥＥＴ及びＮＥＴの両方を阻害するために使用される。
本発明は、好酸球細胞外トラップ（ＥＥＴ）の形成を阻害する方法であって、脱イミノ化されたヒトのヒストン２Ａ及び／又はヒストン４におけるシトルリン化されたエピトープに特異的に結合する抗体又はその結合断片を、好酸球が存在するサンプル又は対象に投与することを含む方法を提供する。本発明はまた、好中球細胞外トラップ（ＮＥＴ）の形成を阻害するための、特に肺病態を治療又は予防するためのこのような抗体又は結合断片を提供する。好ましい一実施形態では、肺病態は、好中球及び好酸球の数の増加を特徴とするものである。従って、好ましい一実施形態では、本発明はＥＥＴ及びＮＥＴの両方を阻害するために使用される。
【0102】
方法は、対象における疾患又は病態を予防又は治療するための方法であってよく、その場合、該方法は、予防的又は治療的に有効な量の該抗体又はその結合断片を対象に投与することを含む。また、対象における疾患又は病態を予防又は治療するための該方法において使用するための、脱イミノ化されたヒトのヒストン２Ａ及び／又はヒストン４におけるシトルリン化されたエピトープに特異的に結合する抗体又はその結合断片も提供される。また、対象における疾患又は病態を予防又は治療するための該方法において使用するための医薬の製造において使用するための、脱イミノ化されたヒトのヒストン２Ａ及び／又はヒストン４におけるシトルリン化されたエピトープに特異的に結合する抗体又はその結合断片も提供される。
【0103】
治療用途では、既に障害又は病態に罹患している対象に、病態又はその症状のうちの１つ以上を治癒、緩和、又は部分的に停止させるのに十分な量の抗体又は組成物を投与する。このような治療的処置の結果、疾患の症状の重症度が低下し得る又は無症状期間の頻度若しくは持続期間が増加し得る。これを達成するのに適切な量を「治療上有効な量」と定義する。所与の目的のための有効な量は、疾患又は傷害の重症度並びに対象の体重及び全身状態に依存する。予防用途では、未だ障害又は病態の症状を呈していない対象に、症状の発生を防止又は遅延させるのに十分な量のポリペプチド又は組成物を投与する。このような量を「予防上有効な量」と定義する。本明細書で使用するとき、用語「対象」は、任意の脊椎動物、典型的にはヒト又はウマ等の任意の哺乳動物を含む。対象は、好ましくはヒトである。
【0104】
特定の実施形態では、抗体又はその結合断片は、別の部分に（直接的又は間接的に）連結されていてもよい。他の部分は、薬物等の治療剤であってよい。他の部分は、検出可能な標識であってもよい。他の部分は、治療標的に特異的な抗体又はポリペプチドの結合ドメイン等の結合部分であってもよい。本発明の抗体又はその結合断片は、二重特異的抗体であってもよい。
【0105】
治療剤又は検出可能な標識は、例えば化学的コンジュゲーションによって本発明の抗体又はその結合断片に直接結合し得る。抗体に剤又は標識をコンジュゲートさせる方法は、当技術分野において公知である。例えば、カルボジイミドコンジュゲーション（Ｂａｕｍｉｎｇｅｒ Ｓ ａｎｄ Ｗｉｌｃｈｅｋ Ｍ，１９８０，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，７０，１５１－１５９）を使用してドキソルビシンを含む様々な剤を抗体又はペプチドにコンジュゲートさせることができる。水溶性カルボジイミドである１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）は、機能性部分を結合部分にコンジュゲートさせるのに特に有用である。
【0106】
部分を抗体にコンジュゲートさせるために他の方法を使用することもできる。例えば、グルタルアルデヒドの架橋と同様に、適切な反応物質の過ヨウ素酸ナトリウム酸化に続く還元的アルキル化を使用してもよい。しかしながら、本発明のコンジュゲートの生成にどの方法を選択するかにかかわらず、抗体がそのターゲティング能力を維持し、機能性部分がその関連機能を維持していると確認されなければならないことが認識される。
【0107】
抗体に連結された治療剤は、治療上有益なポリペプチド又はポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを含んでいてよい。このようなポリペプチドの例としては、抗増殖性又は抗炎症性のサイトカインが挙げられる。
【0108】
抗体は、検出可能な標識に連結されてもよい。「検出可能な標識」とは、抗体を患者に投与した後に標的部分に位置しているときに、典型的には体外及び標的が位置している部位から非侵襲的に検出することができる部分に抗体が連結されていることを意味する。従って、抗体は、イメージング及び診断において有用であり得る。
【0109】
典型的には、標識は、イメージングにおいて有用な放射性原子であるか又はそれを含む。好適な放射性原子としては、シンチグラフィー研究のための９９ｍＴｃ及び１２３Ｉが挙げられる。他の標識としては、例えば、再び１２３Ｉ、１３１Ｉ、１１１Ｉｎ、１９Ｆ、１３Ｃ、１５Ｎ、１７Ｏ、ガドリニウム、マンガン、又は鉄等の磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）用のスピン標識が挙げられる。明らかに、分子を容易に検出できるようにするためには、十分な量の適切な原子同位体が抗体に連結されていなければならない。
【0110】
放射標識又は他の標識は、公知の方法で組み込むことができる。例えば、抗体又はその断片は、生合成されてもよく、又は例えばフッ素１９を含む好適なアミノ酸前駆体を水素の代わりに用いる化学的アミノ酸合成によって合成されてもよい。９９ｍＴｃ、１２３Ｉ、１８６Ｒｈ、１８８Ｒｈ、及び１１１Ｉｎ等の標識は、例えば、ポリペプチドにおけるシステイン残基を介して結合することができる。イットリウム－９０は、リジン残基を介して結合することができる。好ましくは、検出可能な標識は、例えば、テクネチウム－９９ｍ又はヨウ素－１２３等の放射性原子を含む。あるいは、検出可能な標識は、ヨウ素－１２３；ヨウ素－１３１；インジウム－１１１；フッ素－１９；炭素－１３；窒素－１５；酸素－１７；ガドリニウム；マンガン；鉄を含む群から選択され得る。
【0111】
一実施形態では、本発明の抗体は、直接又は間接的に細胞傷害性部分又は検出可能な標識に選択的に結合することができる。従って、この実施形態では、抗体は、細胞傷害性であるか又は容易に検出可能な更なる化合物又は成分に選択的に結合する部分に連結される。
【0112】
抗体若しくは結合断片、又は該抗体若しくは断片を含む組成物は、当該技術分野において公知の様々な方法のうちの１つ以上の方法を用いて１つ以上の投与経路を介して投与してよい。当業者には理解される通り、投与経路及び／又は投与モードは所望の結果に応じて変化する。本発明の抗体又は組成物の好ましい投与経路としては、静脈内、皮下、眼内、筋肉内、皮内、腹腔内、脊髄、又は他の非経口的な投与経路、例えば注射又は注入が挙げられる。「非経口投与」という表現は、本明細書で使用するとき、経腸投与及び外用投与以外の投与モードを意味し、通常は注射による。投与は、直腸、経口、眼、外用、表皮、又は粘膜の経路で行うことができる。投与は、腫瘍周囲、腫瘍近傍、腫瘍内、腫瘍の切除縁へ、病巣内、病巣周囲、腔内注入による、小胞内投与、又は吸入によるものを含む局所的なものであってもよい。好ましい実施形態では、医薬組成物は、静脈内又は皮下に投与される。
【0113】
抗体又はその結合断片の好適な投与量は、熟練の医師によって決定され得る。本発明の医薬組成物中の活性成分の実際の投与量レベルは、患者にとって毒性であることなく、特定の患者、組成物、及び投与モードについて所望の治療応答を達成するのに有効な活性成分の量が得られるように変化させてよい。選択される投与量レベルは、使用される特定の抗体の活性、投与経路、投与時間、抗体の排泄速度、治療期間、使用される特定の組成物と併用される他の薬物、化合物、及び／又は材料、治療される患者の年齢、性別、体重、状態、全身健康、及び前病歴、並びに医学分野で周知である類似の要因を含む様々な薬物動態学的要因に依存する。
【0114】
抗体又はその結合断片の好適な用量は、例えば、約０．１μｇ／ｋｇ（治療される患者の体重）～約１００ｍｇ／ｋｇの範囲であり得る。例えば、好適な投与量は、１週間あたり約１μｇ／ｋｇ（体重）～約５０ｍｇ／ｋｇ、１週間あたり約１００μｇ／ｋｇ（体重）～約２５ｍｇ／ｋｇ、又は１週間あたり約１０μｇ／ｋｇ（体重）～約１２．５ｍｇ／ｋｇであってよい。
【0115】
好適な投与量は、１日あたり約１μｇ／ｋｇ（体重）～約５０ｍｇ／ｋｇ、１日あたり約１００μｇ／ｋｇ（体重）～約２５ｍｇ／ｋｇ、又は１日あたり約１０μｇ／ｋｇ（体重）～約１２．５ｍｇ／ｋｇであってよい。
【0116】
投与レジメンは、最適な所望の応答（例えば、治療応答）を提供するように調整してよい。例えば、単回ボーラス投与してもよく、経時的に何回かに分けて投与してもよく、治療状況の緊急性によって適応があれば用量を比例的に減少させたり、増加させたりしてもよい。投与を容易にし、投与量を均一にするために、非経口組成物を単位剤形に製剤化することが特に有利である。単位剤形とは、本明細書で使用するとき、治療される対象のための単位投与量として適している物理的に別々の単位を指し、各単位が、必要な医薬担体と共同して所望の治療効果を生じさせるように計算された所定の量の活性化合物を含有する。
【0117】
抗体は、単回投与又は複数回投与で投与してよい。複数回投与では、同一又は異なる経路を介して同一又は異なる位置に投与してよい。あるいは、抗体を徐放性製剤として投与してもよく、この場合には、必要な投与頻度がより少なくなる。投与量及び頻度は、患者における抗体の半減期及び所望の治療期間に応じて変化し得る。また、投与量及び投与頻度は、処置が予防的なものであるか治療的なものであるかによっても変化し得る。予防的用途では、比較的低投与量を長期間にわたって比較的広い間隔で投与してよい。治療的用途では、比較的高投与量を、例えば、患者が疾患の症状の部分的又は完全な寛解を示すまで投与してよい。
【0118】
２つ以上の剤の併用投与は、多数の異なる方法で達成され得る。一実施形態では、抗体又はその結合断片と他の剤とを、単一の組成物で一緒に投与してよい。別の実施形態では、抗体と他の剤とを、併用療法の一部として別々の組成物で投与してもよい。例えば、抗体又はその結合断片を、他の剤の前に、後に、又は同時に投与してよい。
【0119】
診断、治療、又は予防される疾患
本明細書に開示される方法は、ＥＥＴ関連病理を含む任意の疾患又は病態を診断、治療、又は予防するための方法であり得る。ＥＥＴ関連病理とは、典型的には、ＥＥＴの形成によって全て又は一部が媒介される病理を意味する。このような病理は、典型的には、好酸球によって全て若しくは一部が媒介される又は好ましくは主に媒介される任意の疾患又は病態に存在する。このような疾患又は病態は、本明細書では好酸球性又は好酸球関連と記載される場合がある。従って、言い換えれば、本明細書に開示される方法は、好酸球性疾患又は病態を診断、治療、又は予防するための方法であってよい。
本明細書に開示される方法は、ＥＥＴ関連病理を含む任意の疾患又は病態を診断、治療、又は予防するための方法であり得る。ＥＥＴ関連病理とは、典型的には、ＥＥＴの形成によって全て又は一部が媒介される病理を意味する。このような病理は、典型的には、好酸球によって全て若しくは一部が媒介される又は好ましくは主に媒介される任意の疾患又は病態に存在する。このような疾患又は病態は、本明細書では好酸球性又は好酸球関連と記載される場合がある。従って、言い換えれば、本明細書に開示される方法は、好酸球性疾患又は病態を診断、治療、又は予防するための方法であってよい。
【0120】
好酸球性疾患又は病態は、罹患した組織又は器官において、健常個体における同じ組織又は器官と比べてより多数の好酸球が存在する疾患又は病態として定義され得る。好酸球性疾患及び病態としては、皮膚の好酸球性疾患若しくは病態；呼吸器の好酸球性疾患若しくは病態；胃腸の好酸球性疾患若しくは病態；アレルギー性疾患若しくは病態；又は蠕虫、真菌、ウイルス、若しくは細菌の感染症を挙げることができる。
【0121】
皮膚の好酸球性疾患又は病態としては、水疱性類天疱瘡（ＰＢ）、アトピー性皮膚炎（ＡＤ）及び慢性自然発生じんま疹（ＣＳＵ）、アレルギー性接触皮膚炎、及び好酸球性蜂巣炎（ウェルズ症候群とも呼ばれる）が挙げられる。
【0122】
呼吸器の好酸球性疾患又は病態としては、好酸球性喘息、鼻ポリープ、鼻茸を伴う慢性鼻副鼻腔炎（ＣＲＳｗＮＰ）、アレルギー性副鼻腔炎、アレルギー性鼻炎、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症（真菌感染症）、好酸球性慢性鼻副鼻腔炎、熱帯性肺好酸球症（典型的には、呼吸器蠕虫感染症）が挙げられる。
【0123】
胃腸の好酸球性疾患又は病態としては、好酸球性食道炎（ＥｏＥ）、好酸球性胃炎（胃－ＥＧ）、好酸球性胃腸炎（胃及び小腸－ＥＧＥ）、好酸球性腸炎（小腸）、好酸球性大腸炎（大腸－ＥＣ）、及び回虫症又は旋毛虫症等の胃腸蠕虫感染症が挙げられる。
【0124】
他の好酸球性疾患又は病態としては、好酸球増加症候群（ＨＥＳ－血液及び様々な器官で発症）、好酸球性多発血管炎性肉芽腫症（ＥＧＰＡ－血管を含む様々な器官で発症）、及び好酸球性中耳炎（ＥＯＭ－中耳で発症）、並びに好酸球性及び全身性の症状を伴う薬物反応（ＤＲＥＳＳ－様々な器官で発症）が挙げられる。
【0125】
好ましい一実施形態では、治療又は予防される疾患は、動脈硬化である。別の実施形態では、血管炎が治療される。
【0126】
本明細書に開示される方法は、上記の好酸球性疾患又は病態のいずれかを診断、治療、又は予防のための方法であり得る。特に好ましい好酸球性疾患又は病態としては、ＥＥＴの存在が直接確認されているものが挙げられる。このような疾患及び病態としては、水疱性類天疱瘡、アトピー性皮膚炎、アレルギー性接触皮膚炎、好酸球性喘息、鼻茸を伴う慢性鼻副鼻腔炎（ＣＲＳｗＮＰ）、アレルギー性副鼻腔炎、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症、好酸球性慢性鼻副鼻腔炎、好酸球性食道炎（ＥｏＥ）、好酸球増加症候群（ＨＥＳ）、好酸球性多発血管炎性肉芽腫症（ＥＧＰＡ）、好酸球性中耳炎（ＥＯＭ）、並びに好酸球性及び全身性の症状を伴う薬物反応（ＤＲＥＳＳ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【0127】
最も好ましい好酸球性疾患又は病態は、ＥＥＴと疾患の発生率及び／又は重症度との相関が直接観察されているものである。このような疾患及び病態としては、好酸球性喘息、鼻茸を伴う慢性鼻副鼻腔炎（ＣＲＳｗＮＰ）、好酸球性慢性鼻副鼻腔炎、及び好酸球性中耳炎（ＥＯＭ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【0128】
上述したもの等の疾患におけるＥＥＴの存在及び／又は好酸球の役割は、当技術分野において十分に確立されている。例えば、Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｔ．Ｌ ｅｔ ａｌ．（２０２０）．“ＮＥＴｓ ａｎｄ ＥＥＴｓ，ａ Ｗｈｏｌｅ Ｗｅｂ ｏｆ Ｍｅｓｓ”．Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ，８（１２），１９２５及びＭｕｋｈｅｒｊｅｅ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．（２０１８）．Ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌ Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔｒａｐｓ ａｎｄ Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｅｓ－Ｕｎｔａｎｇｌｉｎｇ ｔｈｅ Ｗｅｂ！．Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，９，２７６３を参照。本発明は、参照により組み込まれるこれら文献に列挙されている任意の疾患の治療、予防、又は診断に好適である。
【0129】
本明細書に開示される方法はまた、好酸球には部分的にしか媒介されない疾患又は病態におけるＥＥＴ関連病理を診断、治療、又は予防するための方法であってもよい。例えば、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、クローン病、潰瘍性大腸炎、疱疹状皮膚炎、血栓症、及びアテローム性動脈硬化症等の疾患は、複数の細胞型によって引き起こされる複数の病理を示すことがあるため、「好酸球性」とは定義されないことがある。しかし、それにもかかわらずＥＥＴ関連病理を示すことがあるので、本明細書に開示される方法で診断、治療、又は予防することができる。
【0130】
別の方法
本発明は、好酸球細胞外トラップ（ＥＥＴ）の形成を阻害又は検出する方法であって、脱イミノ化されたヒトのヒストン２Ａ及び／又はヒストン４におけるシトルリン化されたエピトープに特異的に結合する抗体又はその結合断片を、好酸球が存在するサンプル又は対象に投与することを含む方法を提供する。この方法は、サンプル中のＥＥＴ形成をエクスビボで阻害又は検出するための方法であってもよく、その場合、該方法は、該抗体又はその結合断片をサンプルに投与し、結合が生じるのに好適な条件下でインキュベートすることを含む。言い換えれば、抗体－標的複合体の形成を可能にする条件である。この方法は、任意で、該複合体が形成されたかどうかを判定することを含んでいてもよい。
本発明は、好酸球細胞外トラップ（ＥＥＴ）の形成を阻害又は検出する方法であって、脱イミノ化されたヒトのヒストン２Ａ及び／又はヒストン４におけるシトルリン化されたエピトープに特異的に結合する抗体又はその結合断片を、好酸球が存在するサンプル又は対象に投与することを含む方法を提供する。この方法は、サンプル中のＥＥＴ形成をエクスビボで阻害又は検出するための方法であってもよく、その場合、該方法は、該抗体又はその結合断片をサンプルに投与し、結合が生じるのに好適な条件下でインキュベートすることを含む。言い換えれば、抗体－標的複合体の形成を可能にする条件である。この方法は、任意で、該複合体が形成されたかどうかを判定することを含んでいてもよい。
【0131】
このような方法では、結合が生じるのに好適な条件下でサンプルを好適な抗体又は断片と接触させる。好適な条件は、少なくとも１分間、２分間、３分間、４分間、５分間、６分間、７分間、８分間、９分間、１０分間、又はそれ以上インキュベートすることを含む。インキュベートは、好ましくは室温で、より好ましくは約２０℃、２５℃、３０℃、３５℃、４０℃、又は４５℃、最も好ましくは約３７℃で行われる。上記方法は、任意の好適なｐＨ下で実施してよいが、典型的にはおおよそｐＨ６．５～７．５で実施される。方法は、トリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）又はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）等の任意の好適なバッファ中で実施してよい。
【0132】
結合したかどうかを判定するためのサンプルの検出又は分析は、例えば、質量分析、ＨＰＬＣ、アフィニティクロマトグラフィ、ゲル電気泳動、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、ＥＬＩＳＡ、レクチンブロッティング、分光分析、キャピラリー電気泳動、フローサイトメトリー、顕微鏡観察、及び分析のための他の標準的な検査技術等であるがこれらに限定されない、任意の好適な分析方法によって評価してよい。
【0133】
抗体又はその結合断片は、固体支持体に結合していてもよく、その検出を支援するために、上記の通り標識されていても又は別の化学基若しくは分子にコンジュゲートされていてもよい。例えば、典型的な化学基としては、フルオレセインアナート（ＦＩＴＣ）若しくはフィコエリトリン（ＰＥ）等の蛍光標識、又はビオチン等のタグが挙げられる。
【0134】
サンプルは、典型的には、血清又は血液等の対象から得られた体液のサンプルである。この方法は、例えば好酸球を単離するために、抗体又は断片を投与する前にサンプルを処理することを含んでいてもよい。サンプルは、対象、好ましくはＥＥＴ関連病理の存在が確認され得るか又は疑われ得るヒト対象から採取したサンプルであってよい。得られた結果は、例えば前節で述べた疾患のいずれかを含む、対象におけるＥＥＴ関連病理の存在を検出又は確認するため等の診断目的に使用することができる。このような使用は、対象から得られた結果を健常対照から得られたサンプルを使用して得られた結果と比較することを含んでいてよい。対象におけるＥＥＴ関連病理の存在は、本明細書に記載される任意の好酸球性疾患を含む好酸球性疾患の１つ以上の症状の存在により確認され得る又は疑われ得る。
【0135】
肺障害
好ましい一実施形態では、本発明は、肺障害を治療するために用いられる。特に、本発明は、肺障害を治療又は予防する方法であって、脱イミノ化されたヒトのヒストン２Ａ及び／又はヒストン４におけるシトルリン化されたエピトープに特異的に結合する抗体又はその結合断片を、該肺障害に罹患しているか又はリスクを有する対象に投与することを含む方法を提供する。一実施形態では、抗体又は結合断片は、本明細書に記載されているもののいずれかである。好ましい実施形態では、肺障害は、炎症性肺障害であり得る。一実施形態では、肺障害は、障害を有しない健常対象と比較して、炎症性細胞の肺への流入を特徴とするものである。例えば、一実施形態では、白血球の肺への流入を特徴とする病態であり得る。一実施形態では、肺障害は、顆粒球の肺への流入、特に好酸球及び／又は好中球の肺への流入を特徴とする。
好ましい一実施形態では、本発明は、肺障害を治療するために用いられる。特に、本発明は、肺障害を治療又は予防する方法であって、脱イミノ化されたヒトのヒストン２Ａ及び／又はヒストン４におけるシトルリン化されたエピトープに特異的に結合する抗体又はその結合断片を、該肺障害に罹患しているか又はリスクを有する対象に投与することを含む方法を提供する。一実施形態では、抗体又は結合断片は、本明細書に記載されているもののいずれかである。好ましい実施形態では、肺障害は、炎症性肺障害であり得る。一実施形態では、肺障害は、障害を有しない健常対象と比較して、炎症性細胞の肺への流入を特徴とするものである。例えば、一実施形態では、白血球の肺への流入を特徴とする病態であり得る。一実施形態では、肺障害は、顆粒球の肺への流入、特に好酸球及び／又は好中球の肺への流入を特徴とする。
【0136】
本発明者らは、脱イミノ化されたヒトのヒストン２Ａ及び／又はヒストン４におけるシトルリン化されたエピトープに特異的に結合する抗体又はその結合断片が、副腎皮質ステロイドよりも肺障害の治療において有効である可能性があることを見出した。従って、一実施形態では、肺病態は、対象の副腎皮質ステロイドに対する症状応答性が乏しいことを特徴とする。特に、一実施形態では、提供されるアプローチは、デキサメタゾンに対する応答性が乏しい肺病態を有する対象を治療するために使用される。別の実施形態では、対象は、脱イミノ化されたヒトのヒストン２Ａ及び／又はヒストン４におけるシトルリン化されたエピトープに特異的に結合する抗体又はその結合断片及び副腎皮質ステロイドの両方で治療される。一実施形態では、対象は、抗体（又は結合断片）及びデキサメタゾンの両方で治療される。一実施形態では、この２つを組み合わせることで、副腎皮質ステロイドの効果を増強するのに役立ち得る。
【0137】
一実施形態では、肺障害を治療又は予防する方法は、ＮＥＴの存在を減少させる。別の実施形態では、方法は、ＥＥＴの存在を減少させる。好ましい実施形態では、方法は、対象の肺におけるＮＥＴ及びＥＥＴの両方を減少させ得る。一実施形態では、方法は、ＮＥＴ及び／又はＥＥＴの形成を減少させる。
【0138】
方法は、任意の好適な肺障害、特に炎症性肺障害を治療するために使用することができる。一実施形態では、肺障害は、ＣＯＰＤ、気管支炎、肺気腫、嚢胞性線維症、線維症及び特発性肺線維症、並びに喘息から選択される。好ましい実施形態では、病態は喘息である。対象が重度の喘息を有していてもよい。特に好ましい一実施形態では、肺障害は、アレルギー性喘息であり得る。好ましい一実施形態では、肺障害は、チリダニアレルギーが関与するアレルギー性喘息である。一実施形態では、肺障害は、好酸球及び／又は好中球の数の増加を特徴とする喘息である。一実施形態では、本発明の方法を使用して、浸潤性好酸球の数が増加した肺病態を治療することができる。別の実施形態では、本発明の方法を使用して、浸潤性好中球の数が増加した肺病態を治療することができる。別の実施形態では、対象の浸潤性好酸球及び好中球の数が増加している。一実施形態では、対象は、好中球性喘息を有していてよい。別の実施形態では、対象は、好酸球性喘息を有していてよい。一実施形態では、対象は、２型喘息を有していてよい。別の実施形態では、対象は、非２型喘息を有していてよい。
【0139】
一実施形態では、肺における炎症性細胞の存在を評価する方法として気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）を用いることができる。一実施形態では、気管支肺胞腔内の総白血球数を測定する方法としてＢＡＬを用いることができる。一実施形態では、気管支肺胞腔内の好中球及び／又は好酸球の数を測定する方法としてＢＡＬを用いることができる。一実施形態では、本発明の方法により、対象由来のＢＡＬ中の好中球数が治療前の数と比べて減少する。別の実施形態では、治療により、対象由来のＢＡＬ中の好酸球数が治療前又は治療期間中の数と比べて減少する。一実施形態では、好酸球数及び好中球数の両方が減少する。一実施形態では、治療の結果、ＢＡＬ中の総顆粒球数が減少する。一実施形態では、本発明は、血管周囲浸潤性好中球、血管周囲単核細胞、及び／又は細気管支浸潤性好中球を減少させ得る。本明細書に記載の抗体又はその結合断片による治療はまた、例えばＢＡＬ中で測定したときのシトルリン化されたヒストン、特にＢＡＬ中のシトルリン化されたヒストン３も減少させ得る。
【0140】
本発明は、以下の実施例によって更に例示されるが、これらは、更なる限定であると解釈されるべきではない。本出願全体を通して引用される全ての図面並びに全ての参照文献、特許及び公開特許出願の内容は、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。
【実施例】
【0141】
実施例１：Ａ２３１８７又はＰＭＡで刺激した際のＣＩＴ－０１３抗体による好酸球からの細胞外ＤＮＡ放出の阻害。
Ｆｉｃｏｌｌ勾配遠心分離の後、赤血球をＡＣＫ溶解し、その後、製造業者のプロトコールに従って磁気ビーズと共に好酸球単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を用いてネガティブセレクションを行うことにより、健常ドナーの血液２０ｍＬから好酸球を単離した。単離した好酸球（フローサイトメトリーで測定したＣＤ１６－Ｓｉｇｌｅｃ－８＋の発現に基づく純度約９０％）を、ＣＩＴ－０１３又はアイソタイプコントロール抗体（２５μｇ／ｍＬ）の非存在下又は存在下において２μＭ Ａ２３１８７又は１００ｎＭ ホルボール１２－ミリステート１３－アセテート（ＰＭＡ）で刺激した。ネガティブコントロールとして、刺激も抗体曝露も行わずに細胞を播種した（未処理）。ＤＮＡを可視化するために、全てのウェルに細胞不透過性色素であるＳｙｔｏｘ Ｇｒｅｅｎを存在させた。Ｉｎｃｕｃｙｔｅライブセルイメージング及び解析システムＳＸ１（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を用いて、位相差及びＳｙｔｏｘ Ｇｒｅｅｎの画像を３０分間ごとに１ウェルあたり４枚撮影した。ａ）種々の条件について４時間刺激した後に撮影した代表的な画像を示す。Ｓｙｔｏｘ ｇｒｅｅｎのシグナルをグレースケールで描く。スケールバー：１００μｍ ｂ）細胞外トラップのためのＩｎｃｕｃｙｔｅ ＳＸ１ソフトウェアを用いてデータを解析した。これら細胞外トラップは、ＤＮＡの拡散に起因して平均強度が比較的低く（１８～８０）かつ平均細胞面積よりも大きな面積（３１５μｍ２～４０００μｍ２の面積－実験から無作為に選択された例の画像の測定に基づく）を有するＳｙｔｏｘ Ｇｒｅｅｎシグナルとして決定された。実験開始時の細胞数は、位相差画像において７０μｍ２を超える面積（この値も特定の実験の評価に基づく）を有する事象として決定された。結果は、開始時の細胞数と比較した細胞外トラップの相対数として表す。グラフでは、各ドナー由来の好酸球（ｎ＝３）について条件ごとに３ウェルの平均及び標準偏差を経時的に描く。グラフは、アイソタイプコントロール抗体と比較して、ＣＩＴ－０１３の存在下では好酸球性細胞外トラップの割合が明らかに減少することを示す。
Ｆｉｃｏｌｌ勾配遠心分離の後、赤血球をＡＣＫ溶解し、その後、製造業者のプロトコールに従って磁気ビーズと共に好酸球単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を用いてネガティブセレクションを行うことにより、健常ドナーの血液２０ｍＬから好酸球を単離した。単離した好酸球（フローサイトメトリーで測定したＣＤ１６－Ｓｉｇｌｅｃ－８＋の発現に基づく純度約９０％）を、ＣＩＴ－０１３又はアイソタイプコントロール抗体（２５μｇ／ｍＬ）の非存在下又は存在下において２μＭ Ａ２３１８７又は１００ｎＭ ホルボール１２－ミリステート１３－アセテート（ＰＭＡ）で刺激した。ネガティブコントロールとして、刺激も抗体曝露も行わずに細胞を播種した（未処理）。ＤＮＡを可視化するために、全てのウェルに細胞不透過性色素であるＳｙｔｏｘ Ｇｒｅｅｎを存在させた。Ｉｎｃｕｃｙｔｅライブセルイメージング及び解析システムＳＸ１（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を用いて、位相差及びＳｙｔｏｘ Ｇｒｅｅｎの画像を３０分間ごとに１ウェルあたり４枚撮影した。ａ）種々の条件について４時間刺激した後に撮影した代表的な画像を示す。Ｓｙｔｏｘ ｇｒｅｅｎのシグナルをグレースケールで描く。スケールバー：１００μｍ ｂ）細胞外トラップのためのＩｎｃｕｃｙｔｅ ＳＸ１ソフトウェアを用いてデータを解析した。これら細胞外トラップは、ＤＮＡの拡散に起因して平均強度が比較的低く（１８～８０）かつ平均細胞面積よりも大きな面積（３１５μｍ２～４０００μｍ２の面積－実験から無作為に選択された例の画像の測定に基づく）を有するＳｙｔｏｘ Ｇｒｅｅｎシグナルとして決定された。実験開始時の細胞数は、位相差画像において７０μｍ２を超える面積（この値も特定の実験の評価に基づく）を有する事象として決定された。結果は、開始時の細胞数と比較した細胞外トラップの相対数として表す。グラフでは、各ドナー由来の好酸球（ｎ＝３）について条件ごとに３ウェルの平均及び標準偏差を経時的に描く。グラフは、アイソタイプコントロール抗体と比較して、ＣＩＴ－０１３の存在下では好酸球性細胞外トラップの割合が明らかに減少することを示す。
【0142】
実施例２：気道炎症のモデルマウスに対するｔＡＣＰＡ抗体による治療の影響。
雌Ｂａｌｂ／ｃマウス（８週齢）を０日目にチリダニ（ＨＤＭ）及び完全フロイントアジュバントで皮下（ｓ．ｃ．）感作した。ＨＤＭは、Ｓｔａｌｌｅｒｇｅｎｅｓ Ｇｒｅｅｒから入手した（バッチ番号ＸＰＢ８２Ｄ３Ａ２．５）。１４日後、マウスをＨＤＭに鼻内曝露（ｉ．ｎ．）するか又はビヒクルを投与した（Ｓｈａｍマウス）。曝露の１時間前に、マウスに１ｍｇ／ｋｇのデキサメタゾンを経口投与（ｐ．ｏ．）、２０ｍｇ／ｋｇのＣＩＴ－０１３抗体のマウス前駆体（ｔＡＣＰＡ；ＭＱ２２．１０１）を静脈内投与（ｉ．ｖ）、又は２０ｍｇ／ｋｇのアイソタイプコントロール抗体をｉ．ｖ投与した。未処理マウスにはビヒクルをｐ．ｏ．又はｉ．ｖ．投与した。１５日目に、マウスの肺を０．４ｍＬのＰＢＳ溶液（Ｍｇ２＋及びＣａ２＋を含まない）で３回洗浄した。気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）を４００×ｇ及び４℃で５分間遠心分離して、細胞を無細胞ＢＡＬＦ画分から分離した。
雌Ｂａｌｂ／ｃマウス（８週齢）を０日目にチリダニ（ＨＤＭ）及び完全フロイントアジュバントで皮下（ｓ．ｃ．）感作した。ＨＤＭは、Ｓｔａｌｌｅｒｇｅｎｅｓ Ｇｒｅｅｒから入手した（バッチ番号ＸＰＢ８２Ｄ３Ａ２．５）。１４日後、マウスをＨＤＭに鼻内曝露（ｉ．ｎ．）するか又はビヒクルを投与した（Ｓｈａｍマウス）。曝露の１時間前に、マウスに１ｍｇ／ｋｇのデキサメタゾンを経口投与（ｐ．ｏ．）、２０ｍｇ／ｋｇのＣＩＴ－０１３抗体のマウス前駆体（ｔＡＣＰＡ；ＭＱ２２．１０１）を静脈内投与（ｉ．ｖ）、又は２０ｍｇ／ｋｇのアイソタイプコントロール抗体をｉ．ｖ投与した。未処理マウスにはビヒクルをｐ．ｏ．又はｉ．ｖ．投与した。１５日目に、マウスの肺を０．４ｍＬのＰＢＳ溶液（Ｍｇ２＋及びＣａ２＋を含まない）で３回洗浄した。気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）を４００×ｇ及び４℃で５分間遠心分離して、細胞を無細胞ＢＡＬＦ画分から分離した。
【0143】
細胞ペレットをＰＢＳに再懸濁させた後、細胞をカウントし、その結果を図２のパネルａ）及びｂ）に提示した。具体的には、気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）中の好酸球（図２のパネルａ）及び好中球（図２のパネルｂ）の数を、自動セルカウンターＤＡＳＩＴ Ｓｙｓｍｅｘ ＸＴ－２０００Ｉｖでカウントした。データは、図２のパネルａ）及びｂ）に、マウス１頭あたりの細胞数として１群あたり（７～８頭／群）の平均及び平均の標準誤差（ＳＥＭ）と共に示す。グラブスの検定によって求められた外れ値は除外した。一元配置分散分析に続いてダネットの多重比較検定を行い、対応する投与経路のＨＤＭ曝露群に対して統計解析を行った。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。図２のパネルａ）及びｂ）の結果は、ｔＡＣＰＡ抗体及びデキサメタゾンの両方が、ＨＤＭを投与したマウスのＢＡＬＦ中の好中球及び好酸球の数を減少させたことを示す。
【0144】
次いで、ＢＡＬＦの無細胞画分を、更に使用するまで－８０℃で保存し、製造業者のプロトコールに従ってシトルリン化されたヒストンＨ３（クローン１１Ｄ３）ＥＬＩＳＡキット（Ｓａｎｂｉｏ；５０１６２０）を用いて、シトルリン化されたヒストンＨ３（ｃｉｔＨ３）の濃度を求めた（Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｉｔｒｕｌｌｉｎａｔｅｄ Ｈｉｓｔｏｎｅ Ｈ３－Ｃｌｏｎｅ １１Ｄ３－ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ－品番５０１６２０も参照、情報はｗｗｗ．ｃａｙｍａｎｃｈｅｍ．ｃｏｍから入手可能）。得られた結果を図２のパネルｃ）に示す。グラブスの検定によって求められた外れ値は除外した。クラスカル・ワリス検定に続いてダネットの多重比較検定を行い、対応する投与経路のＨＤＭ曝露群に対して統計解析を行った。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。図２のパネルｃ）から分かるように、ｔＡＣＰＡ抗体及びデキサメタゾンの両方が、ＨＤＭを投与したマウスのシトルリン化されたヒストンＨ３を、ビヒクルを投与しただけのコントロールマウスでみられるレベルに戻るまで又はそれに近いレベルまで減少させた。
【0145】
洗浄後、肺組織を回収し、１０％リン酸緩衝ホルマリンで固定し、パラフィンに包埋した。５μｍの縦方向切片を３０μｍ間隔で２枚作製し、ヘマトキシリン・エオジンで染色した。治療群について盲検化された独立した病理医によって切片を段階分けした。Ｏｌｙｍｐｕｓ ＢＸ５０顕微鏡を用い、８０倍又は１６０倍の倍率で左右の肺を別々に採点した。まず８０倍の倍率で全体的な評価を行い、１６０倍の倍率を用いて詳細な検査を行って重症度を確認した。得られた結果を図２のパネルｄ）～ｆ）に示す。パネルｄ）は血管周囲の好中球増加の結果、パネルｅ）は血管周囲の単核球浸潤の結果、ｆ）は細気管支の好中球増加の結果である。結果を、正常を０点、最小限局性浸潤を１点、最小多病巣性浸潤を２点、中等度の浸潤を３点、顕著な浸潤を４点に割り当てた。データは、２枚の切片のマウス１頭あたりの平均スコアとして、１群あたり（８頭／群）の平均＋ＳＥＭと共に図２のパネルｄ）～ｆ）に示す。クラスカル・ワリス検定に続いてダネットの多重比較検定を行い、対応する投与経路のＨＤＭ曝露群に対して統計解析を行った。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。
【0146】
より詳細には、肺の病理検査に用いた評点は以下の通りであった：１．全ての切片を品質について事前にスクリーニングした。一般的な不合格の理由は、切片の傷又は破れ、切片の浮き、染色の質の悪さであった。２．死の過程の変化を記録した。３．以下の組織学的帰結を採点した：血管周囲の好中球浸潤；血管周囲の単核球浸潤（定義：血管内腔から血管壁への炎症性細胞の浸潤－外弾性板における細胞を含む）；細気管支の好中球浸潤
【0147】
図２のパネルｄ）～ｆ）の結果は、ｔＡＣＰＡ抗体及びデキサメタゾンの両方が、血管周囲の好中球増加（パネルｄ）、血管周囲の単核球（パネルｅ）、及び細気管支の好中球浸潤（パネルｆ）を減少させたことを示しており、ｔＡＣＰＡ抗体の結果は、デキサメタゾンでみられた結果に比べていずれの場合もより顕著であった。
【0148】
実施例３：気道炎症のモデルマウスに対するｔＡＣＰＡ抗体による治療の影響。
雌Ｂａｌｂ／ｃマウス（８週齢）を０日目に１００μｇのチリダニ（ＨＤＭ）及び２５μｇの完全フロイントアジュバントで皮下（ｓ．ｃ．）感作した。ＨＤＭは、Ｓｔａｌｌｅｒｇｅｎｅｓ Ｇｒｅｅｒから入手した（バッチ番号ＸＰＢ８２Ｄ３Ａ２．５）。１４日後、マウスを１００μｇのＨＤＭに鼻内曝露（ｉ．ｎ．）するか又はビヒクルを投与した（Ｓｈａｍマウス）。曝露の１時間前に、マウスに１ｍｇ／ｋｇのデキサメタゾン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を経口投与（ｐ．ｏ．）、２０ｍｇ／ｋｇのＣＩＴ－０１３抗体のマウス前駆体（ｔＡＣＰＡ；ＭＱ２２．１０１）を静脈内投与（ｉ．ｖ）、又は２０ｍｇ／ｋｇのアイソタイプコントロール抗体（Ｃｏｎ．Ａｂ；抗鶏卵リゾチーム抗体；ＣｒｏｗｎＢｉｏ、品番：Ｃ０００５）をｉ．ｖ．投与した。未処理マウスにはビヒクルをｐ．ｏ．又はｉ．ｖ．投与した。１５日目に、マウスの肺を０．４ｍＬのＰＢＳ溶液（Ｍｇ２＋及びＣａ２＋を含まない）で３回洗浄した。気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）を４００×ｇ及び４℃で５分間遠心分離して、細胞を無細胞ＢＡＬＦ画分から分離した。ＢＡＬＦの無細胞画分は、更に使用するまで－８０℃で保存した。洗浄後、肺組織を回収し、１０％リン酸緩衝ホルマリンで２４時間固定し、組織病理学的検査のためにパラフィンに包埋した。
雌Ｂａｌｂ／ｃマウス（８週齢）を０日目に１００μｇのチリダニ（ＨＤＭ）及び２５μｇの完全フロイントアジュバントで皮下（ｓ．ｃ．）感作した。ＨＤＭは、Ｓｔａｌｌｅｒｇｅｎｅｓ Ｇｒｅｅｒから入手した（バッチ番号ＸＰＢ８２Ｄ３Ａ２．５）。１４日後、マウスを１００μｇのＨＤＭに鼻内曝露（ｉ．ｎ．）するか又はビヒクルを投与した（Ｓｈａｍマウス）。曝露の１時間前に、マウスに１ｍｇ／ｋｇのデキサメタゾン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を経口投与（ｐ．ｏ．）、２０ｍｇ／ｋｇのＣＩＴ－０１３抗体のマウス前駆体（ｔＡＣＰＡ；ＭＱ２２．１０１）を静脈内投与（ｉ．ｖ）、又は２０ｍｇ／ｋｇのアイソタイプコントロール抗体（Ｃｏｎ．Ａｂ；抗鶏卵リゾチーム抗体；ＣｒｏｗｎＢｉｏ、品番：Ｃ０００５）をｉ．ｖ．投与した。未処理マウスにはビヒクルをｐ．ｏ．又はｉ．ｖ．投与した。１５日目に、マウスの肺を０．４ｍＬのＰＢＳ溶液（Ｍｇ２＋及びＣａ２＋を含まない）で３回洗浄した。気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）を４００×ｇ及び４℃で５分間遠心分離して、細胞を無細胞ＢＡＬＦ画分から分離した。ＢＡＬＦの無細胞画分は、更に使用するまで－８０℃で保存した。洗浄後、肺組織を回収し、１０％リン酸緩衝ホルマリンで２４時間固定し、組織病理学的検査のためにパラフィンに包埋した。
【0149】
保存したＢＡＬＦを用いて、製造業者のプロトコールに従ってＱｕａｎｔ－ｉＴ ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ ｄｓＤＮＡ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔｓ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；Ｐ１１４９６）を用いて二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）の濃度を求めた（Ｑｕａｎｔ－ｉＴ（商標）ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（商標）ｄｓＤＮＡ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔｓ －品番Ｐ１１４９６も参照、情報はｗｗｗ．ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ．ｃｏｍから入手可能）。簡単に説明すると、サンプルをＴＥバッファで５倍希釈し、ＴＥバッファで２００倍に希釈したＰｉｃｏＧｒｅｅｎと１：１で混合した。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ ｉＤ５（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）又はＣＬＡＲＩＯｓｔａｒ（ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ）で蛍光を測定した。得られた結果を図３のパネルＡ）に示す。
【0150】
その後、パラフィン包埋肺組織を用いて、Ｖｅｎｔａｎａ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｕｌｔｒａ自動染色プラットフォーム（Ｖｅｎｔａｎａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ）で染色するための厚さ５μｍの縦方向切片を調製した。切片を脱パラフィンし、水和し、Ｃｅｌｌ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ １ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｖｅｎｔａｎａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ）中において９３℃で３２分間インキュベートして、抗原を回収した。２０μｇ／ｍＬのシトルリン化されたヒストン３（ｃｉｔＨ３）に対するウサギ抗体（Ａｂｃａｍ、カタログ番号ａｂ５１０３）及び２μｇ／ｍＬのミエロイドペルオキシダーゼに対するヤギ抗体（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号：ＡＦ３６６７）で６０分間切片を染色した。洗浄後、二次抗体である４μｇ／ｍＬのＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８にコンジュゲートしたロバ抗ウサギ（Ａｂｃａｍ、品番：ａｂ１５００７３）及び４μｇ／ｍＬのＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５にコンジュゲートしたロバ抗ヤギ（Ａｂｃａｍ、品番：１５０１３４）と共に切片を３７℃で３２分間インキュベートした。次に、切片を洗浄し、３００ｎＭのＤＡＰＩと共に室温で３０分間インキュベートしてＤＮＡを染色した。染色した切片をＺｅｉｓｓ Ａｘｉｏ Ｓｃａｎ Ｚ１（Ｚｅｉｓｓ）を用いてデジタルスキャンし、治療群について盲検化された独立した病理医によって評価した。切片の質をスクリーニングしたところ、ｃｉｔＨ３のＦＩＴＣチャンネルに非特異的な自家蛍光が認められた。シトルリン化されたヒストン３陽性シグナル（ｃｉｔＨ３＋）の数及びＭＰＯ陽性シグナル（ＭＰＯ＋）の数をカウントし、形状に基づいて自家蛍光シグナルと区別した。シグナルは、形状に基づいて又は最も近い核から３核半径超離れている場合に細胞外であるとみなした。好中球細胞外トラップ（ＮＥＴ）を、細胞外のｃｉｔＨ３及びＭＰＯの両シグナルを含む構造体として可視化し、ＮＥＴの発生率を０～３（陰性、軽度、中等度、及び重度）で採点した。カウントは解剖学的領域ごとに行った。血管（周囲）領域は、直径３００μｍ未満の血管の外膜の端までの血管壁からなっていた。血管外膜の端が不明確な場合は、最大壁厚の３倍の横断面に設定した。細気管支（周囲）領域は、最大直径６００μｍの細気管支の外部結合組織の端までの粘膜を含んでいた。端が識別できない場合、外部結合組織の端は最大粘膜厚の２倍に設定した。大血管（直径２００μｍ超）及び細気管支のない視野で肺胞面積の評価を行った。５箇所の血管（周囲）又は細気管支（周囲）領域及び１０箇所の肺胞領域でカウントを行い、算術平均として表した。細胞外ｃｉｔＨ３、細胞外ＭＰＯ、及びＮＥＴについて得られた結果を、それぞれ図３のパネルｂ）、ｃ）、及びｄ）に提示する。
【0151】
パラフィン包埋肺組織から１０μｍ間隔で縦方向切片を２枚切り出し、ヘマトキシリン・エオジンで染色した。切片の質を評価し、破れていたり、浮き上がっていたり、染色の質が悪かったりした場合は不合格とした。血管（周囲）、細細気管支（周囲）、又は肺胞領域における好酸球数、好中球数、マクロファージ数、及び貪食性マクロファージ数を、治療群について盲検化された病理医がカウントした。
【0152】
より詳細には：肺切片のランダムな座標で解剖学的領域ごとにカウントを行った。血管（周囲）領域における細胞は、血管内腔から血管壁に浸潤し、直径３００μｍ未満の血管の外弾性板内に存在する場合を含んでいた。細細気管支（周囲）領域の細胞は、直径６００μｍ未満の細気管支の粘膜、筋層、又は外弾性板に浸潤した場合を含んでいた。肺胞領域の細胞は、太い細気管支及び血管（直径１００μｍ超）が存在しない肺胞領域の視野でカウントした。肺領域ごとに１０視野でカウントし、算術平均として表した。
【0153】
好酸球は、明らかなエオシン陽性細胞質空胞を伴う典型的な好酸球核形態を示す細胞として定義され、細胞数はパネルｅ）に示される。好中球は、杆状球を除いた典型的な好中球核形態によって定義され、細胞数はパネルｆ）に提示される。古典的なマクロファージ形態を有する細胞をマクロファージとしてカウントし、データをパネルｇ）に提示する。細胞膜に融合した空胞を含む、透明で豊富に存在する細胞質空胞を有するマクロファージを、貪食性マクロファージとして記録した。貪食性マクロファージ数÷総マクロファージ数×１００％によって貪食性マクロファージの割合を算出し、パネルｈ）のグラフに示した。
【0154】
図３のデータは、群ごと（８頭／群）の中央値を示すパネルｄ）の半定量的ＮＥＴスコアを除いて、群ごとの平均±平均の標準誤差（ＳＥＭ）として提示する。Ｐｒｉｓｍ ９を用いてクラスカル・ワリス検定に続いてＤｕｎｎの多重比較検定を行うことによって投与群ごとに統計解析を実施した。ｎｓ ｐ＞０．０５、＃又は＊ｐ＜０．０５、＃＃又は＊＊ｐ＜０．０１、＃＃＃又は＊＊＊ｐ＜０．００１、＃＃＃＃又は＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。
【0155】
図３のパネルａ）のグラフは、デキサメタゾン及びｔＡＣＰＡ抗体の両方が、ＨＤＭに曝露したマウスのＢＡＬＦ中のｄｓＤＮＡレベルを低下させたことを示す。図３のパネルｂ）の結果は、曝露時の３つの異なる肺領域、血管（周囲）、細気管支（周囲）、及び肺胞における細胞外トラップのマーカーとしてのｃｉｔＨ３の存在を示す。３つの肺領域全てにおいて有意ではなかったが、デキサメタゾン又はマウスｔＡＣＰＡ処理により、ｃｉｔＨ３数の明らかな減少が観察された。同様の傾向は、図３パネルｃ）及びｄ）に示す細胞外ＭＰＯ（ＮＥＴの構成要素）及びびまん性細胞外ＮＥＴでも観察される。
【0156】
図３のパネルｅ）及びｆ）は、ほとんどの場合統計学的に有意ではなかったが、デキサメタゾン又はｔＡＣＰＡで処理した際に好酸球数及び好中球数がわずかに減少したことを示しており、細気管支（周囲）及び肺胞の領域における好中球数の減少は、デキサメタゾン処理と比較してｔＡＣＰＡでより顕著であった。図３のパネルｇ）及びｈ）のグラフは、マクロファージの総数が曝露され、デキサメタゾンで処理された動物と同程度のままであったのに対し、ｔＡＣＰＡで処理した際には貪食性マクロファージの割合だけが増加したことを示す。
【0157】
実施例４：ＣＩＴ－０１３は、免疫複合体によって誘導されたＥＥＴｏｓｉｓを阻害する。
健常ボランティアの血液から好酸球を単離した。まず、Ｆｉｃｏｌｌ勾配遠心分離の後、ＡＣＫ溶解バッファを用いて赤血球を溶解することによって、血液から顆粒球を単離した。その後、製造業者のプロトコールに従ってＭｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ製の好酸球単離キット（カタログ番号：１３０－０９２－０１０）を用いて磁気ビーズによるネガティブセレクションによって顆粒球画分から好酸球を単離した。フローサイトメトリーによって測定したＳｉｇｌｅｃ－８及びＣＤ１６の発現に基づいて、好酸球画分の純度を確認した。単一の生存ＣＤ４５＋白血球から８５％を超える好酸球（Ｓｉｇｌｅｃ－８＋ＣＤ１６－）を含有し、１０％未満の好中球（Ｓｉｇｌｅｃ－８－及びＣＤ１６＋）を含有する好酸球分画のデータが含まれていた。
健常ボランティアの血液から好酸球を単離した。まず、Ｆｉｃｏｌｌ勾配遠心分離の後、ＡＣＫ溶解バッファを用いて赤血球を溶解することによって、血液から顆粒球を単離した。その後、製造業者のプロトコールに従ってＭｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ製の好酸球単離キット（カタログ番号：１３０－０９２－０１０）を用いて磁気ビーズによるネガティブセレクションによって顆粒球画分から好酸球を単離した。フローサイトメトリーによって測定したＳｉｇｌｅｃ－８及びＣＤ１６の発現に基づいて、好酸球画分の純度を確認した。単一の生存ＣＤ４５＋白血球から８５％を超える好酸球（Ｓｉｇｌｅｃ－８＋ＣＤ１６－）を含有し、１０％未満の好中球（Ｓｉｇｌｅｃ－８－及びＣＤ１６＋）を含有する好酸球分画のデータが含まれていた。
【0158】
４℃で一晩９６ウェルＮｕｎｃ ＭａｘｉＳｏｒｐプレート（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を１０μｇ／ｍＬのヒト血清アルブミン（ＨＳＡ；Ｓｅｑｅｎｓ ＩＶＤ）でコーティングすることにより、コーティングされた免疫複合体（ｃＩＣ）を作製した。未結合のＨＳＡを除去するために、洗浄バッファ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０を含有するＰＢＳ）を使用した。３回洗浄した後、１ウェル当たり１０μｇ／ｍＬの濃度のウサギ抗アルブミン抗体（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）５０μＬと共に、プレートを振盪しながら室温で１時間インキュベートした。ウェルを洗浄バッファで３回、ＤＰＢＳで３回洗浄した。その後、１％ペニシリン及びストレプトマイシン、０．１％ＢＳＡ、並びに１０ｍＭ ＨＥＰＥＳを含有する、Ｌ－グルタミンを含み、フェノールレッドを含まないＲＰＭＩ１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ）に、１ウェルあたり２０，０００細胞の濃度で好酸球を播種した。無刺激コントロールとして、ＨＳＡでコーティングしただけのウェルを用いた。細胞膜不透過性ＤＮＡ色素であるＳｙｔｏｘ Ｇｒｅｅｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を最終濃度２０ｍＭになるようにウェルに添加した。２５μｇ／ｍＬのＣＩＴ－０１３又はアイソタイプコントロール抗体（アイソタイプ；抗鶏卵リゾチーム、ＣｒｏｗｎＢｉｏ、品番Ｃ０００１）の存在下又は非存在下で細胞を刺激した。ＩｎｃｕＣｙｔｅライブセルイメージングシステムＳＸ１（Ｓａｔｏｒｉｕｓ）を用いて画像を６０分間ごとに撮影した。ＩｎｃｕＣｙｔｅ ＳＸ１解析ソフトウェアを用いて、Ｓｙｔｏｘ Ｇｒｅｅｎシグナルに基づいて細胞外トラップの形成を解析した。細胞よりも大きな面積を有し、ＤＮＡの脱凝縮に起因して平均強度の低いＳｙｔｏｘ Ｇｒｅｅｎシグナルを細胞外トラップとみなした。ＥＥＴを放出する細胞の割合を評価するために、ＩｎｃｕＣｙｔｅ ＳＸ１解析ソフトウェアを用いて、早い時点で撮影した位相差画像における細胞数を求めた。４時間目のＳｙｔｏｘ Ｇｒｅｅｎシグナルの代表的な画像を、５０μｍのスケールバーと共に図４のパネルａ）に示す（ｎ＝８ドナー）。各ドナーについて、ＣＩＴ－０１３又はアイソタイプコントロール抗体の存在下における４時間目のＥＥＴ量を、２つの条件間のＥＥＴの差（Δ）と共に図４のパネルｂ）に示す（ｎ＝８ドナー）。Ｐｒｉｓｍを用いて対応のあるサンプルについてフリードマン検定によって統計解析を行った、＊＊＊ｐ＜０．００１。図４の両パネルは、アイソタイプコントロール抗体と比較して、ＣＩＴ－０１３によってＥＥＴ放出が阻害されることを示す。
【0159】
配列表
配列番号１－ｍｓＶＨ２２．１０１及びｈＶＨ２２．１０１（ＨＣ）ｘのＣＤＲ１
ＧＹＴＦＴＮＹＧ
配列番号２－ｍｓＶＨ２２．１０１及びｈＶＨ２２．１０１（ＨＣ）ｘのＣＤＲ２
ＩＮＴＹＳＧＥＡ
配列番号３－ｍｓＶＨ２２．１０１及びｈＶＨ２２．１０１（ＨＣ）ｘのＣＤＲ３
ＬＲＧＹＴＹＱＳＦＤＥＧＧＤＹ
配列番号４－ｍｓＶＬ２２．１０１及びｈＶＬ２２．１０１（ＬＣ）ｙのＣＤＲ２
ＬＶＳ
配列番号５－ｍｓＶＬ２２．１０１及びｈＶＬ２２．１０１（ＬＣ）ｙのＣＤＲ３
ＷＱＧＴＨＦＰＹＴ
配列番号６－ｈＶＬ２２．１０１ＬＣ１７のＣＤＲ１
ＱＳＬＬＤＴＤＧＫＴＹ
配列番号７－ｈＶＬ２２．１０１ＬＣ２１のＣＤＲ１
ＱＳＬＬＤＳＤＡＫＴＹ
配列番号８－ｈＶＬ２２．１０１ＬＣ２７のＣＤＲ１
ＱＳＬＬＤＴＤＡＫＴＹ
配列番号９－ｈＶＬ２２．１０１ＬＣ４１のＣＤＲ１
ＱＳＬＬＤＡＤＧＫＴＹ
配列番号１０－ｈＶＬ２２．１０１ＬＣ４２のＣＤＲ１
ＱＳＬＬＤＮＤＧＫＴＹ
配列番号１１－ｈＶＨ２２．１０１ｆ
ＲＩＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＮＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＮＴＹＳＧＥＡＴＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＭＴＲＤＴＳＩＳＴＡＹＭＥＬＳＲＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＬＲＧＹＴＹＱＳＦＤＥＧＧＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号１２－ｈＶＨ２２．１０１ＨＣ９
ＲＩＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＮＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＮＴＹＳＧＥＡＴＹＶＤＤＦＱＧＲＶＴＭＴＲＤＴＳＩＳＴＡＹＭＥＬＳＲＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＬＲＧＹＴＹＱＳＦＤＥＧＧＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号１３－ｈＶＬ２２．１０１ＬＣ１７
ＤＶＶＭＴＱＳＰＬＳＬＰＶＴＬＧＱＰＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＬＤＴＤＧＫＴＹＬＮＷＦＱＱＲＰＧＱＳＰＲＲＬＩＹＬＶＳＫＬＤＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＷＱＧＴＨＦＰＹＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ
配列番号１４－ｈＶＬ２２．１０１ＬＣ２１
ＤＶＶＭＴＱＳＰＬＳＬＰＶＴＬＧＱＰＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＬＤＳＤＡＫＴＹＬＮＷＦＱＱＲＰＧＱＳＰＲＲＬＩＹＬＶＳＫＬＤＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＷＱＧＴＨＦＰＹＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ
配列番号１５－ｈＶＬ２２．１０１ＬＣ２７
ＤＶＶＭＴＱＳＰＬＳＬＰＶＴＬＧＱＰＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＬＤＴＤＡＫＴＹＬＮＷＦＱＱＲＰＧＱＳＰＲＲＬＩＹＬＶＳＫＬＤＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＷＱＧＴＨＦＰＹＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ
配列番号１６－ｈＶＬ２２．１０１ＬＣ４１
ＤＶＶＭＴＱＳＰＬＳＬＰＶＴＬＧＱＰＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＬＤＡＤＧＫＴＹＬＮＷＦＱＱＲＰＧＱＳＰＲＲＬＩＹＬＶＳＫＬＤＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＷＱＧＴＨＦＰＹＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ
配列番号１７－ｈＶＬ２２．１０１ＬＣ４２
ＤＶＶＭＴＱＳＰＬＳＬＰＶＴＬＧＱＰＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＬＤＮＤＧＫＴＹＬＮＷＦＱＱＲＰＧＱＳＰＲＲＬＩＹＬＶＳＫＬＤＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＷＱＧＴＨＦＰＹＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ
配列番号配列番号１８－ヒストン２Ａ由来の国際公開第２０１６０９２０８２号の配列番号１（実施例１／７で使用）
ＳＧＸＧＫＱＧＧＫＡＲＡ
（式中、Ｘは、シトルリンである）
配列番号配列番号１９－ヒストン４由来の国際公開第２０１６０９２０８２号の配列番号２（実施例７で使用）
ＳＧＸＧＫＧＧＫＧＬＧＫＧＧＡＫＲＨＲＫＶＬＲ
（式中、Ｘは、シトルリンである）
配列番号配列番号２０－ヒストン４由来の国際公開第２０１６０９２０８２号の短縮形配列番号２（実施例７で使用）
ＳＧＸＧＫＧＧＫＧＬＧＫ
（式中、Ｘは、シトルリンである）
配列番号２１－ペプチド番号４（ヒトのヒストン２Ａ）（国際公開第２０１１０７０１７２号の配列番号２４）
ＱＦＰＶＧＸＶＨＲＬＬＲ
（式中、Ｘは、シトルリンである）
配列番号２２－ペプチド番号６（ヒトのヒストン２Ａ）（国際公開第２０１１０７０１７２号の配列番号２６）
ＶＨＲＬＬＸＫＧＮＹＳＥ
（式中、Ｘは、シトルリンである）
配列番号２３－ＩｇＧ１のヒト重鎖定常ドメイン
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ
配列番号２４－ヒトκ鎖定常ドメイン
ＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
配列番号２５－ｍｓＶＨ２２．１０１
ＲＩＱＬＶＱＳＧＰＥＬＫＫＰＧＥＡＶＫＩＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＮＹＧＭＨＷＭＫＱＴＰＧＫＤＦＲＷＭＧＷＩＮＴＹＳＧＥＡＴＹＶＤＤＦＫＧＲＦＡＦＳＬＧＴＳＡＳＴＡＹＬＱＩＮＮＬＫＮＤＤＴＡＴＹＦＣＬＲＧＹＴＹＱＳＦＤＥＧＧＤＹＷＧＱＧＴＡＬＴＶＳＳ
配列番号２６－ｈＶＨ２２．１０１ｊ
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＮＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＮＴＹＳＧＥＡＴＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＭＴＲＤＴＳＩＳＴＡＹＭＥＬＳＲＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＬＲＧＹＴＹＱＳＦＤＥＧＧＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号２７－ｈＶＨ２２．１０１ＨＣ７
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＮＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＮＴＹＳＧＥＡＴＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＩＴＡＤＥＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＬＲＧＹＴＹＱＳＦＤＥＧＧＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号２８－ｈＶＨ２２．１０１ＨＣ８
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＮＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＮＴＹＳＧＥＡＴＹＶＤＤＦＱＧＲＶＴＩＴＡＤＥＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＬＲＧＹＴＹＱＳＦＤＥＧＧＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号２９－ｈＶＨ２２．１０１ＨＣ１０
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＮＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＮＴＹＳＧＥＡＴＹＶＤＤＦＱＧＲＶＴＭＴＲＤＴＳＩＳＴＡＹＭＥＬＳＲＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＬＲＧＹＴＹＱＳＦＤＥＧＧＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号３０－ｍｓＶＬ２２．１０１
ＤＶＶＭＴＱＴＰＬＴＬＳＶＴＴＧＱＰＡＳＩＳＣＫＳＳＱＳＬＬＤＳＤＧＫＴＹＬＮＷＬＦＱＲＰＧＱＳＰＫＲＬＩＹＬＶＳＫＬＤＳＧＶＰＤＲＦＴＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＬＧＩＹＹＣＷＱＧＴＨＦＰＹＴＦＧＧＧＴＮＬＥＩＫ
配列番号３１－ｈＶＬ２２．１０１ｅ
ＤＶＶＭＴＱＳＰＬＳＬＰＶＴＬＧＱＰＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＶＤＳＤＧＫＴＹＬＮＷＦＱＱＲＰＧＱＳＰＲＲＬＩＹＬＶＳＫＬＤＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＷＱＧＴＨＦＰＹＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ
配列番号３２－ｈＶＬ２２．１０１ｇ
ＤＶＶＭＴＱＳＰＬＳＬＰＶＴＬＧＱＰＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＬＤＳＤＧＫＴＹＬＮＷＦＱＱＲＰＧＱＳＰＲＲＬＩＹＬＶＳＫＬＤＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＷＱＧＴＨＦＰＹＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ
配列番号３３－ｈＶＬ２２．１０１ｈ
ＤＶＶＭＴＱＳＰＬＳＬＰＶＴＬＧＱＰＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＶＡＳＤＧＫＴＹＬＮＷＦＱＱＲＰＧＱＳＰＲＲＬＩＹＬＶＳＫＬＤＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＷＱＧＴＨＦＰＹＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ
配列番号３４－ｈＶＬ２２．１０１ｉ
ＤＶＶＭＴＱＳＰＬＳＬＰＶＴＬＧＱＰＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＶＥＳＤＧＫＴＹＬＮＷＦＱＱＲＰＧＱＳＰＲＲＬＩＹＬＶＳＫＬＤＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＷＱＧＴＨＦＰＹＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ
配列番号３５－ｈＶＬ２２．１０１ｊ
ＤＶＶＭＴＱＳＰＬＳＬＰＶＴＬＧＱＰＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＶＳＳＤＧＫＴＹＬＮＷＦＱＱＲＰＧＱＳＰＲＲＬＩＹＬＶＳＫＬＤＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＷＱＧＴＨＦＰＹＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ
配列番号３６－ｍｓＶＬ２２．１０１及びｈＶＬ２２．１０１ｇのＣＤＲ１
ＱＳＬＬＤＳＤＧＫＴＹ
配列番号３７－ｈＶＬ２２．１０１ｅのＣＤＲ１
ＱＳＬＶＤＳＤＧＫＴＹ
配列番号３８－ｈＶＬ２２．１０１ｈのＣＤＲ１
ＱＳＬＶＡＳＤＧＫＴＹ
配列番号３９－ｈＶＬ２２．１０１ｉのＣＤＲ１
ＱＳＬＶＥＳＤＧＫＴＹ
配列番号４０－ｈＶＬ２２．１０１ｊのＣＤＲ１
ＱＳＬＶＳＳＤＧＫＴＹ
配列番号４１－ｈＶＬ２２．１０１ＬＣ１６のＣＤＲ１
ＱＳＬＬＥＳＤＧＫＴＹ
配列番号４２－ｈＶＬ２２．１０１ＬＣ１９のＣＤＲ１
ＱＳＬＬＤＳＥＧＫＴＹ
配列番号４３－ｈＶＬ２２．１０１ＬＣ２０のＣＤＲ１
ＱＳＬＬＤＳＳＧＫＴＹ
配列番号４４－ｈＶＬ２２．１０１ＬＣ２２のＣＤＲ１
ＱＳＬＬＥＳＥＧＫＴＹ
配列番号４５－ｈＶＬ２２．１０１ＬＣ２３のＣＤＲ１
ＱＳＬＬＥＳＳＧＫＴＹ
配列番号４６－ｈＶＬ２２．１０１ＬＣ２４のＣＤＲ１
ＱＳＬＬＥＳＤＡＫＴＹ
配列番号４７－ｈＶＬ２２．１０１ＬＣ２５のＣＤＲ１
ＱＳＬＬＤＴＥＧＫＴＹ
配列番号４８－ｈＶＬ２２．１０１ＬＣ２６のＣＤＲ１
ＱＳＬＬＤＴＳＧＫＴＹ
配列番号４９－ｈＶＬ２２．１０１ＬＣ３７のＣＤＲ１
ＱＳＬＬＤＳＡＧＫＴＹ
配列番号５０－ｈＶＬ２２．１０１ＬＣ３８のＣＤＲ１
ＱＳＬＬＥＳＡＧＫＴＹ
配列番号５１－ｈＶＬ２２．１０１ＬＣ３９のＣＤＲ１
ＱＳＬＬＤＡＥＧＫＴＹ
配列番号５２－ｈＶＬ２２．１０１ＬＣ４０のＣＤＲ１
ＱＳＬＬＤＮＥＧＫＴＹ
配列番号５３－ｍｓＦｉｂβ ＸＧ（国際公開第２０１１０７０１７２号の配列番号３７）
ＥＰＴＤＳＬＤＡＸＧＨＲＰＶＤＲＲ
（式中、Ｘは、シトルリンである）
配列番号５４－ｍｓＶｉｍ ＸＳ／ＸＬ（国際公開第２０１１０７０１７２号の配列番号３８）
ＹＶＴＸＳＳＡＶＸＬＸＳＳＶＰ
（式中、Ｘは、シトルリンである）
配列番号５５－ｍｓＶＬ２２．１０１及びｈＶＬ２２．１０１（ＬＣ）ｙのＣＤＲ２周辺領域
ＬＶＳＫＬＤＳ
配列番号５６－ｈＣＨ２２．１０１ｆの重鎖定常ドメイン
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
配列番号１－ｍｓＶＨ２２．１０１及びｈＶＨ２２．１０１（ＨＣ）ｘのＣＤＲ１
ＧＹＴＦＴＮＹＧ
配列番号２－ｍｓＶＨ２２．１０１及びｈＶＨ２２．１０１（ＨＣ）ｘのＣＤＲ２
ＩＮＴＹＳＧＥＡ
配列番号３－ｍｓＶＨ２２．１０１及びｈＶＨ２２．１０１（ＨＣ）ｘのＣＤＲ３
ＬＲＧＹＴＹＱＳＦＤＥＧＧＤＹ
配列番号４－ｍｓＶＬ２２．１０１及びｈＶＬ２２．１０１（ＬＣ）ｙのＣＤＲ２
ＬＶＳ
配列番号５－ｍｓＶＬ２２．１０１及びｈＶＬ２２．１０１（ＬＣ）ｙのＣＤＲ３
ＷＱＧＴＨＦＰＹＴ
配列番号６－ｈＶＬ２２．１０１ＬＣ１７のＣＤＲ１
ＱＳＬＬＤＴＤＧＫＴＹ
配列番号７－ｈＶＬ２２．１０１ＬＣ２１のＣＤＲ１
ＱＳＬＬＤＳＤＡＫＴＹ
配列番号８－ｈＶＬ２２．１０１ＬＣ２７のＣＤＲ１
ＱＳＬＬＤＴＤＡＫＴＹ
配列番号９－ｈＶＬ２２．１０１ＬＣ４１のＣＤＲ１
ＱＳＬＬＤＡＤＧＫＴＹ
配列番号１０－ｈＶＬ２２．１０１ＬＣ４２のＣＤＲ１
ＱＳＬＬＤＮＤＧＫＴＹ
配列番号１１－ｈＶＨ２２．１０１ｆ
ＲＩＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＮＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＮＴＹＳＧＥＡＴＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＭＴＲＤＴＳＩＳＴＡＹＭＥＬＳＲＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＬＲＧＹＴＹＱＳＦＤＥＧＧＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号１２－ｈＶＨ２２．１０１ＨＣ９
ＲＩＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＮＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＮＴＹＳＧＥＡＴＹＶＤＤＦＱＧＲＶＴＭＴＲＤＴＳＩＳＴＡＹＭＥＬＳＲＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＬＲＧＹＴＹＱＳＦＤＥＧＧＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号１３－ｈＶＬ２２．１０１ＬＣ１７
ＤＶＶＭＴＱＳＰＬＳＬＰＶＴＬＧＱＰＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＬＤＴＤＧＫＴＹＬＮＷＦＱＱＲＰＧＱＳＰＲＲＬＩＹＬＶＳＫＬＤＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＷＱＧＴＨＦＰＹＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ
配列番号１４－ｈＶＬ２２．１０１ＬＣ２１
ＤＶＶＭＴＱＳＰＬＳＬＰＶＴＬＧＱＰＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＬＤＳＤＡＫＴＹＬＮＷＦＱＱＲＰＧＱＳＰＲＲＬＩＹＬＶＳＫＬＤＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＷＱＧＴＨＦＰＹＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ
配列番号１５－ｈＶＬ２２．１０１ＬＣ２７
ＤＶＶＭＴＱＳＰＬＳＬＰＶＴＬＧＱＰＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＬＤＴＤＡＫＴＹＬＮＷＦＱＱＲＰＧＱＳＰＲＲＬＩＹＬＶＳＫＬＤＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＷＱＧＴＨＦＰＹＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ
配列番号１６－ｈＶＬ２２．１０１ＬＣ４１
ＤＶＶＭＴＱＳＰＬＳＬＰＶＴＬＧＱＰＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＬＤＡＤＧＫＴＹＬＮＷＦＱＱＲＰＧＱＳＰＲＲＬＩＹＬＶＳＫＬＤＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＷＱＧＴＨＦＰＹＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ
配列番号１７－ｈＶＬ２２．１０１ＬＣ４２
ＤＶＶＭＴＱＳＰＬＳＬＰＶＴＬＧＱＰＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＬＤＮＤＧＫＴＹＬＮＷＦＱＱＲＰＧＱＳＰＲＲＬＩＹＬＶＳＫＬＤＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＷＱＧＴＨＦＰＹＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ
配列番号配列番号１８－ヒストン２Ａ由来の国際公開第２０１６０９２０８２号の配列番号１（実施例１／７で使用）
ＳＧＸＧＫＱＧＧＫＡＲＡ
（式中、Ｘは、シトルリンである）
配列番号配列番号１９－ヒストン４由来の国際公開第２０１６０９２０８２号の配列番号２（実施例７で使用）
ＳＧＸＧＫＧＧＫＧＬＧＫＧＧＡＫＲＨＲＫＶＬＲ
（式中、Ｘは、シトルリンである）
配列番号配列番号２０－ヒストン４由来の国際公開第２０１６０９２０８２号の短縮形配列番号２（実施例７で使用）
ＳＧＸＧＫＧＧＫＧＬＧＫ
（式中、Ｘは、シトルリンである）
配列番号２１－ペプチド番号４（ヒトのヒストン２Ａ）（国際公開第２０１１０７０１７２号の配列番号２４）
ＱＦＰＶＧＸＶＨＲＬＬＲ
（式中、Ｘは、シトルリンである）
配列番号２２－ペプチド番号６（ヒトのヒストン２Ａ）（国際公開第２０１１０７０１７２号の配列番号２６）
ＶＨＲＬＬＸＫＧＮＹＳＥ
（式中、Ｘは、シトルリンである）
配列番号２３－ＩｇＧ１のヒト重鎖定常ドメイン
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ
配列番号２４－ヒトκ鎖定常ドメイン
ＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
配列番号２５－ｍｓＶＨ２２．１０１
ＲＩＱＬＶＱＳＧＰＥＬＫＫＰＧＥＡＶＫＩＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＮＹＧＭＨＷＭＫＱＴＰＧＫＤＦＲＷＭＧＷＩＮＴＹＳＧＥＡＴＹＶＤＤＦＫＧＲＦＡＦＳＬＧＴＳＡＳＴＡＹＬＱＩＮＮＬＫＮＤＤＴＡＴＹＦＣＬＲＧＹＴＹＱＳＦＤＥＧＧＤＹＷＧＱＧＴＡＬＴＶＳＳ
配列番号２６－ｈＶＨ２２．１０１ｊ
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＮＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＮＴＹＳＧＥＡＴＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＭＴＲＤＴＳＩＳＴＡＹＭＥＬＳＲＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＬＲＧＹＴＹＱＳＦＤＥＧＧＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号２７－ｈＶＨ２２．１０１ＨＣ７
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＮＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＮＴＹＳＧＥＡＴＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＩＴＡＤＥＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＬＲＧＹＴＹＱＳＦＤＥＧＧＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号２８－ｈＶＨ２２．１０１ＨＣ８
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＮＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＮＴＹＳＧＥＡＴＹＶＤＤＦＱＧＲＶＴＩＴＡＤＥＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＬＲＧＹＴＹＱＳＦＤＥＧＧＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号２９－ｈＶＨ２２．１０１ＨＣ１０
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＮＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＮＴＹＳＧＥＡＴＹＶＤＤＦＱＧＲＶＴＭＴＲＤＴＳＩＳＴＡＹＭＥＬＳＲＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＬＲＧＹＴＹＱＳＦＤＥＧＧＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号３０－ｍｓＶＬ２２．１０１
ＤＶＶＭＴＱＴＰＬＴＬＳＶＴＴＧＱＰＡＳＩＳＣＫＳＳＱＳＬＬＤＳＤＧＫＴＹＬＮＷＬＦＱＲＰＧＱＳＰＫＲＬＩＹＬＶＳＫＬＤＳＧＶＰＤＲＦＴＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＬＧＩＹＹＣＷＱＧＴＨＦＰＹＴＦＧＧＧＴＮＬＥＩＫ
配列番号３１－ｈＶＬ２２．１０１ｅ
ＤＶＶＭＴＱＳＰＬＳＬＰＶＴＬＧＱＰＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＶＤＳＤＧＫＴＹＬＮＷＦＱＱＲＰＧＱＳＰＲＲＬＩＹＬＶＳＫＬＤＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＷＱＧＴＨＦＰＹＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ
配列番号３２－ｈＶＬ２２．１０１ｇ
ＤＶＶＭＴＱＳＰＬＳＬＰＶＴＬＧＱＰＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＬＤＳＤＧＫＴＹＬＮＷＦＱＱＲＰＧＱＳＰＲＲＬＩＹＬＶＳＫＬＤＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＷＱＧＴＨＦＰＹＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ
配列番号３３－ｈＶＬ２２．１０１ｈ
ＤＶＶＭＴＱＳＰＬＳＬＰＶＴＬＧＱＰＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＶＡＳＤＧＫＴＹＬＮＷＦＱＱＲＰＧＱＳＰＲＲＬＩＹＬＶＳＫＬＤＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＷＱＧＴＨＦＰＹＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ
配列番号３４－ｈＶＬ２２．１０１ｉ
ＤＶＶＭＴＱＳＰＬＳＬＰＶＴＬＧＱＰＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＶＥＳＤＧＫＴＹＬＮＷＦＱＱＲＰＧＱＳＰＲＲＬＩＹＬＶＳＫＬＤＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＷＱＧＴＨＦＰＹＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ
配列番号３５－ｈＶＬ２２．１０１ｊ
ＤＶＶＭＴＱＳＰＬＳＬＰＶＴＬＧＱＰＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＶＳＳＤＧＫＴＹＬＮＷＦＱＱＲＰＧＱＳＰＲＲＬＩＹＬＶＳＫＬＤＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＷＱＧＴＨＦＰＹＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ
配列番号３６－ｍｓＶＬ２２．１０１及びｈＶＬ２２．１０１ｇのＣＤＲ１
ＱＳＬＬＤＳＤＧＫＴＹ
配列番号３７－ｈＶＬ２２．１０１ｅのＣＤＲ１
ＱＳＬＶＤＳＤＧＫＴＹ
配列番号３８－ｈＶＬ２２．１０１ｈのＣＤＲ１
ＱＳＬＶＡＳＤＧＫＴＹ
配列番号３９－ｈＶＬ２２．１０１ｉのＣＤＲ１
ＱＳＬＶＥＳＤＧＫＴＹ
配列番号４０－ｈＶＬ２２．１０１ｊのＣＤＲ１
ＱＳＬＶＳＳＤＧＫＴＹ
配列番号４１－ｈＶＬ２２．１０１ＬＣ１６のＣＤＲ１
ＱＳＬＬＥＳＤＧＫＴＹ
配列番号４２－ｈＶＬ２２．１０１ＬＣ１９のＣＤＲ１
ＱＳＬＬＤＳＥＧＫＴＹ
配列番号４３－ｈＶＬ２２．１０１ＬＣ２０のＣＤＲ１
ＱＳＬＬＤＳＳＧＫＴＹ
配列番号４４－ｈＶＬ２２．１０１ＬＣ２２のＣＤＲ１
ＱＳＬＬＥＳＥＧＫＴＹ
配列番号４５－ｈＶＬ２２．１０１ＬＣ２３のＣＤＲ１
ＱＳＬＬＥＳＳＧＫＴＹ
配列番号４６－ｈＶＬ２２．１０１ＬＣ２４のＣＤＲ１
ＱＳＬＬＥＳＤＡＫＴＹ
配列番号４７－ｈＶＬ２２．１０１ＬＣ２５のＣＤＲ１
ＱＳＬＬＤＴＥＧＫＴＹ
配列番号４８－ｈＶＬ２２．１０１ＬＣ２６のＣＤＲ１
ＱＳＬＬＤＴＳＧＫＴＹ
配列番号４９－ｈＶＬ２２．１０１ＬＣ３７のＣＤＲ１
ＱＳＬＬＤＳＡＧＫＴＹ
配列番号５０－ｈＶＬ２２．１０１ＬＣ３８のＣＤＲ１
ＱＳＬＬＥＳＡＧＫＴＹ
配列番号５１－ｈＶＬ２２．１０１ＬＣ３９のＣＤＲ１
ＱＳＬＬＤＡＥＧＫＴＹ
配列番号５２－ｈＶＬ２２．１０１ＬＣ４０のＣＤＲ１
ＱＳＬＬＤＮＥＧＫＴＹ
配列番号５３－ｍｓＦｉｂβ ＸＧ（国際公開第２０１１０７０１７２号の配列番号３７）
ＥＰＴＤＳＬＤＡＸＧＨＲＰＶＤＲＲ
（式中、Ｘは、シトルリンである）
配列番号５４－ｍｓＶｉｍ ＸＳ／ＸＬ（国際公開第２０１１０７０１７２号の配列番号３８）
ＹＶＴＸＳＳＡＶＸＬＸＳＳＶＰ
（式中、Ｘは、シトルリンである）
配列番号５５－ｍｓＶＬ２２．１０１及びｈＶＬ２２．１０１（ＬＣ）ｙのＣＤＲ２周辺領域
ＬＶＳＫＬＤＳ
配列番号５６－ｈＣＨ２２．１０１ｆの重鎖定常ドメイン
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
【図1-1】
【図1-2】
【図2-1】
【図2-2】
【図3-1】
【図3-2】
【図3-3】
【図3-4】
【図4】
【配列表】
【国際調査報告】