特表 2024-521683 生体試料を分析するためのマーカー、方法および装置

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-06-04

(54)【発明の名称】生体試料を分析するためのマーカー、方法および装置

(51)【国際特許分類】

   G01N 21/64 20060101AFI20240528BHJP

   G01N 21/78 20060101ALI20240528BHJP

   G01N 33/53 20060101ALI20240528BHJP

   G01N 33/536 20060101ALI20240528BHJP

   G02B 21/00 20060101ALI20240528BHJP

   C12Q 1/6806 20180101ALI20240528BHJP

   C12M 1/00 20060101ALI20240528BHJP

   C12M 1/34 20060101ALI20240528BHJP

【ＦＩ】

G01N21/64 F

G01N21/78 C

G01N33/53 M

G01N33/536 D

G02B21/00

C12Q1/6806 Z

C12M1/00 A

C12M1/34 A

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023571595

(86)(22)【出願日】2021-12-23

(85)【翻訳文提出日】2023-12-26

(86)【国際出願番号】 EP2021087558

(87)【国際公開番号】W WO2022242896

(87)【国際公開日】2022-11-24

(31)【優先権主張番号】PCT/EP2021/063310

(32)【優先日】2021-05-19

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(31)【優先権主張番号】PCT/EP2021/066645

(32)【優先日】2021-06-18

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(31)【優先権主張番号】PCT/EP2021/073819

(32)【優先日】2021-08-28

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】511079735

【氏名又は名称】ライカ マイクロシステムズ シーエムエス ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング

【氏名又は名称原語表記】Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ ＣＭＳ ＧｍｂＨ

【住所又は居所原語表記】Ｅｒｎｓｔ－Ｌｅｉｔｚ－Ｓｔｒａｓｓｅ １７－３７， Ｄ－３５５７８ Ｗｅｔｚｌａｒ， Ｇｅｒｍａｎｙ

(74)【代理人】

【識別番号】100114890

【弁理士】

【氏名又は名称】アインゼル・フェリックス＝ラインハルト

(74)【代理人】

【識別番号】100098501

【弁理士】

【氏名又は名称】森田 拓

(74)【代理人】

【識別番号】100116403

【弁理士】

【氏名又は名称】前川 純一

(74)【代理人】

【識別番号】100134315

【弁理士】

【氏名又は名称】永島 秀郎

(74)【代理人】

【識別番号】100162880

【弁理士】

【氏名又は名称】上島 類

(72)【発明者】

【氏名】ゼーレン アルスハイマー

(72)【発明者】

【氏名】カイ ヴァルター

(72)【発明者】

【氏名】ヨアヒム ブラドル

【テーマコード（参考）】

2G043

2H052

4B029

4B063

【Ｆターム（参考）】

2G043AA03

2G043BA16

2G043EA01

2G043FA02

2H052AA08

2H052AA09

2H052AC04

2H052AC14

2H052AC15

2H052AC27

2H052AE07

2H052AF01

2H052AF14

4B029AA07

4B029BB01

4B029FA01

4B029FA15

4B063QA01

4B063QA05

4B063QQ05

4B063QR14

4B063QR32

4B063QR35

4B063QS28

4B063QS36

4B063QS39

4B063QX02

(57)【要約】

生体試料（７０２）中の所定の構造体（１０２）をマーキングするためのマーカー（１００）は、マーカーベース（１０４）を含む。マーカーベース（１０４）は、試料（７０２）の所定の構造体（１０２）に付着するように構成されたアフィニティ試薬（１０６）と、少なくとも２つの付着部位（１１０ａ，１１０ｂ，１１０ｃ）を有する、アフィニティ試薬（１０６）に連結された付着構造体（１０８）と、を有する。付着構造体（１０８）は、付着部位（１１０ａ，１１０ｂ，１１０ｃ）同士の間に配置された少なくとも１つの開裂部位（１１２ａ，１１２ｂ）を含む。マーカーベース（１０４）から少なくとも１つの付着部位（１１０ａ，１１０ｂ，１１０ｃ）を切り離すために、付着構造体（１０８）を、少なくとも１つの開裂部位（１１２ａ，１１２ｂ）において開裂剤によって切断することができる。マーカー（１００）は、少なくとも２つのレポーター（１１４ａ，１１４ｂ，１１４ｃ）をさらに含み、各レポーター（１１４ａ，１１４ｂ，１１４ｃ）は、付着部位（１１０ａ，１１０ｂ，１１０ｃ）のうちの１つに付着するように構成された相補的付着部位（１１８ａ，１１８ｂ，１１８ｃ）を有するリンカー構造体（１１６）と、リンカー構造体（１１６）に配置された少なくとも２つの異なる蛍光色素（１２０ａ～１２０ｅ）の組み合わせと、を含む。色素の組み合わせは、各レポーター（１１４ａ，１１４ｂ，１１４ｃ）にとって一義的である。相補的付着部位（１１８ａ，１１８ｂ，１１８ｃ）は、各レポーター（１１４ａ，１１４ｂ，１１４ｃ）にとって一義的であり、かつ各レポーター（１１４ａ，１１４ｂ，１１４ｃ）がマーカーベース（１０４）のそれぞれ異なる付着部位（１１０ａ，１１０ｂ，１１０ｃ）に付着するように構成されている。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

生体試料（７０２）中の所定の構造体（１０２）をマーキングするためのマーカー（１００）であって、
前記マーカー（１００）は、マーカーベース（１０４）および少なくとも２つのレポーター（１１４ａ，１１４ｂ，１１４ｃ）を含み、
前記マーカーベース（１０４）は、
前記試料（７０２）の前記所定の構造体（１０２）に付着するように構成されたアフィニティ試薬（１０６）と、
少なくとも２つの付着部位（１１０ａ，１１０ｂ，１１０ｃ）を有する、前記アフィニティ試薬（１０６）に連結された付着構造体（１０８）と、
を有し、
前記付着構造体（１０８）は、前記付着部位（１１０ａ，１１０ｂ，１１０ｃ）同士の間に配置された少なくとも１つの開裂部位（１１２ａ，１１２ｂ）を含み、
前記マーカーベース（１０４）から少なくとも１つの付着部位（１１０ａ，１１０ｂ，１１０ｃ）を切り離すために、前記付着構造体（１０８）は、前記少なくとも１つの開裂部位（１１２ａ，１１２ｂ）において開裂剤によって切断可能であり、
各レポーター（１１４ａ，１１４ｂ，１１４ｃ）は、
前記付着部位（１１０ａ，１１０ｂ，１１０ｃ）のうちの１つに付着するように構成された相補的付着部位（１１８ａ，１１８ｂ，１１８ｃ）を有するリンカー構造体（１１６）と、
前記リンカー構造体（１１６）に配置された少なくとも２つの異なる蛍光色素（１２０ａ～１２０ｅ）の組み合わせと、
を含み、
前記蛍光色素の組み合わせは、各レポーター（１１４ａ，１１４ｂ，１１４ｃ）にとって一義的であり、
前記相補的付着部位（１１８ａ，１１８ｂ，１１８ｃ）は、各レポーター（１１４ａ，１１４ｂ，１１４ｃ）にとって一義的であり、各レポーター（１１４ａ，１１４ｂ，１１４ｃ）が前記マーカーベース（１０４）のそれぞれ異なる付着部位（１１０ａ，１１０ｂ，１１０ｃ）に付着するように構成されている、
マーカー（１００）。

【請求項2】

前記リンカー構造体（１１６）は、オリゴヌクレオチドまたはペプチドによって形成されている、
請求項１記載のマーカー（１００）。

【請求項3】

前記開裂部位（１１２ａ，１１２ｂ）は、酵素開裂部位（１１２ａ，１１２ｂ）であり、前記付着構造体（１０８）を、前記開裂部位（１１２ａ，１１２ｂ）において酵素開裂剤によって切断することができる、
請求項１または２記載のマーカー（１００）。

【請求項4】

前記酵素開裂部位（１１２ａ，１１２ｂ）は、制限酵素の標的部位、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ標的、リコンビナーゼ標的部位、特にｌｏｘＰ部位もしくはフリッパーゼ標的部位、またはカスパーゼ標的部位である、
請求項３記載のマーカー（１００）。

【請求項5】

前記開裂部位（１１２ａ，１１２ｂ）は、光開裂部位（１１２ａ，１１２ｂ）であり、前記付着構造体（１０８）を、前記開裂部位（１１２ａ，１１２ｂ）において光分解、特にＵＶ光によって切断することができる、
請求項１または２記載のマーカー（１００）。

【請求項6】

前記付着部位（１１０ａ，１１０ｂ，１１０ｃ）および／または前記相補的付着部位（１１８ａ，１１８ｂ，１１８ｃ）は、オリゴヌクレオチドである、
請求項１から５までのいずれか１項記載のマーカー（１００）。

【請求項7】

生体試料（７０２）を分析するための方法であって、前記方法は、次のステップ、すなわち、
ａ）請求項１から６までのいずれか１項記載の少なくとも１つのマーカー（１００）を提供するステップと、
ｂ）マーカーベース（１０４）および第１のレポーター（１１４ａ，１１４ｂ，１１４ｃ）を前記試料（７０２）内に導入するステップと、
ｃ）前記第１のレポーター（１１４ａ，１１４ｂ，１１４ｃ）の蛍光色素（１２０ａ～１２０ｅ）を励起するために、少なくとも１つの第１の励起光を前記試料（７０２）に向けるステップと、
ｄ）前記試料（７０２）の読み出された体積体内に位置する、励起された蛍光色素（１２０ａ～１２０ｅ）によって放出された蛍光光から、少なくとも１つの第１の読み出しを生成するステップと、
ｅ）前記マーカーベース（１０４）から前記第１のレポーター（１１４ａ，１１４ｂ，１１４ｃ）を切り離すために、少なくとも１つの開裂剤を前記試料（７０２）内に導入するステップと、
ｆ）第２のレポーター（１１４ａ，１１４ｂ，１１４ｃ）を前記試料（７０２）内に導入するステップと、
ｇ）前記第２のレポーター（１１４ａ，１１４ｂ，１１４ｃ）の蛍光色素（１２０ａ～１２０ｅ）を励起するために、少なくとも１つの第２の励起光を前記試料（７０２）に向けるステップと、
ｈ）前記試料（７０２）の読み出された体積体内に位置する、励起された蛍光色素（１２０ａ～１２０ｅ）によって放出された蛍光光から、少なくとも１つの第２の読み出しを生成するステップと、
ｉ）前記第１の読み出しと前記第２の読み出しとに基づいて、前記読み出された体積体内に前記マーカー（１００）が存在するか否かを決定するステップと、
を含む方法。

【請求項8】

前記方法は、前記マーカー（１００）の前記アフィニティ試薬（１０６）を、架橋剤によって前記所定の構造体（１０２）に架橋するさらなるステップを含む、
請求項７記載の方法。

【請求項9】

前記第１の読み出しおよび／または前記第２の読み出しを生成するステップは、励起された前記蛍光色素（１２０ａ～１２０ｅ）によって放出された前記蛍光光を、複数の検出チャネルに分けることを含み、
前記検出チャネルは、前記蛍光色素（１２０ａ～１２０ｅ）の少なくとも１つの発光特性に対応し、
前記発光特性は、発光スペクトル、蛍光強度および蛍光寿命のうちの１つである、
請求項７または８記載の方法。

【請求項10】

前記マーカー（１００）は、前記第１のレポーターおよび第２のレポーター（１１４ａ，１１４ｂ，１１４ｃ）の各蛍光色素がそれぞれ前記第１の読み出しおよび前記第２の読み出しの１つの検出チャネルに対応するように提供される、
請求項９記載の方法。

【請求項11】

前記レポーター（１１４ａ，１１４ｂ，１１４ｃ）のすべての蛍光色素（１２０ａ～１２０ｅ）は、色素の複数の集合に分割され、
同じ集合内の各蛍光色素は、実質的に１つの波長スペクトルまたは同じ波長スペクトルによって励起可能であり、
ステップｃ）およびステップｇ）において、各前記集合の前記蛍光色素（１２０ａ～１２０ｅ）を励起するために、色素の集合ごとに少なくとも１つの励起光が前記試料（７０２）に向けられ、
ステップｄ）およびステップｈ）において、前記試料（７０２）の前記読み出された体積体内に位置する、励起された前記蛍光色素（１２０ａ～１２０ｅ）によって放出された蛍光光から、色素の集合ごとに少なくとも１つの読み出しが生成される、
請求項７から１０までのいずれか１項記載の方法。

【請求項12】

ステップｃ）およびステップｄ）において、前記励起光は、互いに時間的に追従するシーケンスで前記試料（７０２）に向けられる、
請求項１１記載の方法。

【請求項13】

前記第１のレポーター（１１４ａ，１１４ｂ，１１４ｃ）は、前記第２の励起光が前記試料（７０２）に向けられる前に、前記試料（７０２）から洗い流される、
請求項７から１２までのいずれか１項記載の方法。

【請求項14】

前記第１の読み出しおよび／または前記第２の読み出しは、前記読み出された体積体の少なくとも１つの画像、または前記読み出された体積体の読み出された画像データストリームを含んでいる、
請求項７から１３までのいずれか１項記載の方法。

【請求項15】

前記第１の読み出しおよび／または前記第２の読み出しを生成するために、前記試料（７０２）のハイパースペクトル画像を捕捉するさらなるステップを含む、
請求項７から１４までのいずれか１項記載の方法。

【請求項16】

前記方法は、特に、カプセル化、ポリマーマトリクス埋め込み、および共結晶化のうちの少なくとも１つによって遮蔽された環境内に前記蛍光色素を配置することによって、少なくとも１つの蛍光色素の蛍光寿命を安定化させるさらなるステップを含む、
請求項７から１５までのいずれか１項記載の方法。

【請求項17】

請求項７から１６までのいずれか１項記載の方法を実施するように適合させられた、生体試料（７０２）を分析するための装置（７００）。

【請求項18】

前記装置（７００）は、第１の読み出しおよび第２の読み出しを生成するように構成された、顕微鏡、プレートリーダー、細胞測定器、イメージング細胞測定器または蛍光活性化細胞選別機を備える、
請求項１７記載の装置（７００）。

【請求項19】

前記装置（７００）は、前記蛍光色素（１２０ａ～１２０ｅ）の蛍光発光強度、蛍光寿命、蛍光寿命を表す値、発光スペクトル、励起指紋および蛍光異方性のうちの少なくとも１つを決定するように構成されている、
請求項１７または１８記載の装置（７００）。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、生体試料内の所定の構造体をマーキングするためのマーカーに関する。本発明はまた、生体試料を分析するための方法に関する。本発明はさらに、生体試料を分析するための装置に関する。

【背景技術】

【0002】

生命科学の分野における重要な問題に取り組むために、生体試料、例えば組織試料または細胞培養内の特定の構造体を正確に識別しかつその位置を特定することが重要である。マーカーを、特定の構造体、例えば特定の生体分子に結合している試料内に導入することによってこれを行うことができる。これらのマーカーは、概して、対象の構造体に付着するアフィニティ試薬と、アフィニティ試薬に直接的に結合されているか、または他の手段、例えば、二次アフィニティ試薬によってアフィニティ試薬に付着するか、のいずれかである１つまたは複数の蛍光色素と、を備える。

【0003】

蛍光顕微鏡法は、例えば、高い空間分解能での試料のイメージングを可能にするのに、概して１個～５個の少ない数の異なる蛍光色素しか必要としない。利用可能な色素は、同じ実験において、細胞の種類を識別するために使用されるすべてのマーカー、関心対象のタンパク質などの機能マーカー、および一般的な形態マーカーに分配されなければならない。このことは、多くのイメージング実験において、細胞の種類の識別が単に不十分であることを意味している。例えば、遺伝子制御ネットワーク（ＧＲＮ）の分析に基づいて、より信頼性が高く、堅牢な、細胞の種類の識別を可能にするアプローチが近年は存在しているが、これらのアプローチは、試料から読み出される、極めて多くの数の異なるマーカーを必要とする。

【0004】

文献ＰＣＴ／ＥＰ２０２１／０６３３１０およびＰＣＴ／ＥＰ２０２１／０７３８１９は、それぞれ、１回の蛍光顕微鏡法実験において使用可能なマーカーの数を増やすためのマーカーおよび方法を提案している。各マーカーは、原則的に、各マーカーを識別するコードを形成する色素の一義的な組み合わせを含んでいる。しかし、特に、多数のマーカーが互いに近接している場合には、ある程度の曖昧さが残る。これらの曖昧さを解消するために、これらのマーカーを切り離し、マーカーの種々異なる集合での画像取得を繰り返す必要がある。このプロセスには、時間および費用がかかる。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

したがって、低いコストおよび時間消費で、多数の所定の構造体の確実な識別を可能にする、生体試料中の所定の構造体をマーキングするためのマーカー、生体試料を分析するための方法、および生体試料を分析するための装置を提供することが課題である。

【課題を解決するための手段】

【0006】

上述の課題は、独立請求項の主題によって解決される。有利な実施形態は、従属請求項および以降の説明において規定されている。

【0007】

生体試料中の所定の構造体をマーキングするための提案されるマーカーは、マーカーベースを含む。マーカーベースは、試料の所定の構造体に付着するように構成されたアフィニティ試薬と、少なくとも２つの付着部位を有する、アフィニティ試薬に連結された付着構造体と、を有する。付着構造体は、付着部位同士の間に配置された少なくとも１つの開裂部位を含む。マーカーベースから少なくとも１つの付着部位を切り離すために、付着構造体を、少なくとも１つの開裂部位において開裂剤によって切断することができる。マーカーは、少なくとも２つのレポーターをさらに含み、各レポーターは、付着部位のうちの１つに付着するように構成された相補的付着部位を有するリンカー構造体と、リンカー構造体に配置された少なくとも２つの異なる蛍光色素の組み合わせと、を含む。色素の組み合わせは、各レポーターにとって一義的である。相補的付着部位は、各レポーターにとって一義的であり、かつ各レポーターがマーカーベースのそれぞれ異なる付着部位に付着するように構成されている。

【0008】

アフィニティ試薬は、特に、抗体、単分域抗体（ナノボディとしても知られる）、少なくとも２つの単分域抗体の組み合わせ、アプタマー、オリゴヌクレオチド、モルホリノ、所定のＲＮＡに相補的なＰＮＡ、ＤＮＡ標的シーケンス、リガンド（例えば薬剤または薬剤様分子）、または毒素、例えば、ファロイジン、アクチンフィラメントに結合する毒素であり得る。所定の構造体は、特定の生体分子、例えば、タンパク質、ＲＮＡシーケンス、ペプチド、ＤＮＡシーケンス、代謝産物、ホルモン、神経伝達物質、ビタミンまたは微量栄養素であってよい。所定の構造体は、１つの分析物、例えば、金属イオン、特に重金属イオン、Ｃｄ（ＩＩ）、Ｃｏ（ＩＩ）、Ｐｂ（ＩＩ）、Ｈｇ（ＩＩ）またはＵ（ＶＩ）などであってもよい。

【0009】

マーカーベースのアフィニティ試薬は、試料内に導入される際に、所定の構造体に自身を付着させる。所定の構造体は、分析物または標的または標的分子とも称される。アフィニティ試薬は、付着構造体に連結されているので、付着構造体も同様に、所定の構造体に連結されることとなる。これによって、マーカーベースは、種々異なるレポーターが所定の構造体に付着することを可能にする。各レポーターは、複数の色素の一義的な組み合わせを含み、この一義的な組み合わせが、各レポーターを識別するコードを形成する。これによって、所定の構造体が蛍光イメージングのために可視化される。

【0010】

開裂部位は、リンカー構造体に沿って付着部位同士の間に配置されている。開裂部位において付着構造体を切断することによって、付着部位のうちの１つが付着構造体から切り離される。切り離された付着部位にレポーターのうちの１つが連結されている場合には、そのレポーターも同様に切り離される。つまり、切り離されたレポーターは、もはや所定の構造体には連結されておらず、試料から洗い流すことができる。切り離されたレポーターが洗い流された後、残っている付着部位に自身を付着させる別のレポーターを試料内に導入することができる。したがって、マーカーによって、所定の構造体をサイクル式にまたはラウンドに基づいた方式で順次にマーキングまたはエンコードすることが可能になる。これによって、第１のラウンドのマーキングにおいて生じる曖昧さを、以降のラウンドのマーキングにおいて、アフィニティ試薬の切り離しまたは再導入を必要とせずに解消することができる。これによって、結果として、多数のマーカー、すなわち識別されるべき多数の所定の構造体を伴う実験のコストおよび時間の浪費が減る。

【0011】

好ましい実施形態では、リンカー構造体は、オリゴヌクレオチドまたはペプチドによって形成されている。リンカー構造体は、蛍光色素を保持し、これらの蛍光色素を付着部位に連結することを可能にする。蛍光色素は、直接的に、すなわち共有的に、または間接的に、例えばアフィニティタグ－アフィニティリガンドの組み合わせによって、リンカー構造体に結合されていてよい。リンカー構造体自体は、１つまたは複数のオリゴヌクレオチド、例えばＤＮＡ、ＲＮＡ、ＬＮＡ、ＰＮＡ、モルホリノまたは別の人工オリゴヌクレオチドを含んでいてよい。リンカー構造体は、ペプチドまたは他のＤＮＡ類似体もしくはＲＮＡ類似体も含んでいてよい。オリゴヌクレオチドとペプチドとが同様に、標準化された方法によって特定のニーズに適合するように合成されてよい。したがって、レポーターは簡単かつコスト効率よく製造され得る。

【0012】

別の好ましい実施形態では、開裂部位は、酵素開裂部位であり、付着構造体を、開裂部位において酵素開裂剤によって切断することができる。好ましくは、酵素開裂部位は、制限酵素の標的部位、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ標的、リコンビナーゼ標的部位、特にｌｏｘＰ部位もしくはフリッパーゼ標的部位、またはカスパーゼ標的部位である。１つまたは複数のレポーターをマーカーから切り離すために、酵素開裂剤が試料内に導入される。酵素開裂剤が開裂部位において付着構造体を切断した後、付着構造体のうちの切断された部分と、付着構造体のこの部分に連結されているレポーターと、を試料から洗い流すことができる。酵素的開裂には、開裂部位のみを標的とし、これによって他の構造体への損傷を減らすという利点がある。

【0013】

別の好ましい実施形態では、開裂部位は、光開裂部位であり、付着構造体を、開裂部位において光分解、特にＵＶ光によって切断することができる。光分解によって付着構造体を切断することは、非常に効率的であり、自動化が容易である。

【0014】

別の好ましい実施形態では、付着部位および／または相補的付着部位は、オリゴヌクレオチドである。オリゴヌクレオチドは、容易に、一義的なバーコード状の構造体にすることができる。したがって、特定のレポーターだけが特定の付着部位に自身を付着させるように、各付着部位とそれらの各相補的付着部位とを構成することができる。

【0015】

本発明はまた、生体試料を分析するための方法であって、この方法は、次のステップ、すなわち、ａ）上述のような少なくとも１つのマーカーを提供するステップと、ｂ）マーカーベースおよび第１のレポーターを試料内に導入するステップと、ｃ）第１のレポーターの蛍光色素を励起するために、少なくとも１つの第１の励起光を試料に向けるステップと、ｄ）試料の読み出された体積体内に位置する、励起された蛍光色素によって放出された蛍光光から、少なくとも１つの第１の読み出しを生成するステップと、ｅ）マーカーベースから第１のレポーターを切り離すために、少なくとも１つの開裂剤を試料内に導入するステップと、ｆ）第２のレポーターを試料内に導入するステップと、ｇ）第２のレポーターの蛍光色素を励起するために、少なくとも１つの第２の励起光を試料に向けるステップと、ｈ）試料の読み出された体積体内に位置する、励起された蛍光色素によって放出された蛍光光から、少なくとも１つの第２の読み出しを生成するステップと、ｉ）第１の読み出しと第２の読み出しとに基づいて、読み出された体積体内にマーカーが存在するか否かを決定するステップと、を含む方法にも関する。

【0016】

マーカーを試料内に導入する際には、第１のレポーターがマーカーベースの付着構造体に既に付着させられていてよい。択一的に、マーカーベースと第１のレポーターとは、試料内に別々に導入される。第１の励起光は、第１のレポーターの特定の蛍光色素に関連する１つの波長または波長スペクトルの光を含み得る。２つ以上の第１の励起光、例えば種々異なる光源によって放出される光が同時にまたは順次に使用されてよい。開裂剤は、開裂部位が前述した酵素開裂剤にとっての標的である場合には、酵素開裂剤であってよい。択一的に、開裂剤は、開裂部位が光分解によって切断可能である場合には、光、特にＵＶ光であってよい。

【0017】

特に、生体試料を分析するための方法が適用される際には、請求項１記載のマーカーは、好ましくは少なくとも１つのレポーターを含み、この少なくとも１つのレポーターは、この少なくとも１つのレポーターにとって一義的であって、かつ付着部位のうちの１つに付着するように構成された相補的付着部位を有するリンカー構造体と、リンカー構造体に配置された少なくとも２つの異なる蛍光色素の組み合わせと、を含み、色素の組み合わせは、この少なくとも１つのレポーターにとって一義的である、ということが留意される。その後、好ましくは上述した方法のステップａ）～ｅ）が適用された後には、マーカーは、少なくとも１つのさらなる（例えば、第２の）レポーターを含み、この少なくとも１つのさらなる（例えば、第２の）レポーターは、この少なくとも１つのさらなる（例えば、第２の）レポーターにとって一義的であって、かつ別の異なる付着部位に付着するように構成された相補的付着部位と、リンカー構造体に配置された少なくとも２つの異なる蛍光色素の組み合わせと、を有し、この少なくとも１つのさらなるレポーターは、別の異なる付着部位に付着させられるように適合させられている。したがって、マーカーを少なくとも２つの部分から構成することが適している場合があり、第１の部分は、アフィニティ試薬を有するマーカーベースと、少なくとも２つの付着部位を有する、アフィニティ試薬に連結された付着構造体と、を含み、付着構造体は、付着部位と少なくとも１つのレポーターとの間に配置される少なくとも１つの開裂部位を含む。マーカーの第２の（および任意のさらなる）部分は、少なくとも１つのさらなる（例えば、第２の）レポーターを含むことができ、この少なくとも１つのさらなる（例えば、第２の）レポーターは、この少なくとも１つのさらなる（例えば、第２の）レポーターにとって一義的であって、かつ別の異なる付着部位に付着するように構成された相補的付着部位と、リンカー構造体に配置された少なくとも２つの異なる蛍光色素の組み合わせと、を有し、この少なくとも１つのさらなるレポーターは、別の異なる付着部位に付着させられるように適合させられている。

【0018】

この方法は、試料を分析するために上述の１つまたは複数のマーカーを使用する。マーカーは、試料中の所定の構造体を標的にして、これらの所定の構造体を視認可能かつ識別可能とするために使用される。個々のマーカーは、自身に付着させられたレポーターによって、放出された蛍光光に関する情報、特に蛍光色素の発光スペクトル、蛍光発光強度、または蛍光寿命、または励起指紋を含む第１の読み出しおよび第２の読み出しによって識別される。少なくとも２つの異なる読み出しが生成され、かつ各読み出しを生成するためにそれぞれ異なるレポーターが使用されるので、第１の読み出しの捕捉の間に生じる曖昧さを、後続の読み出しにおいて解消することができる。これによって、識別されるべき多数のマーカー、ひいては多数の所定の構造体を確実に識別すること、および分けることが可能になる。

【0019】

好ましい一実施形態では、この方法は、マーカーのアフィニティ試薬を、架橋剤によって所定の構造体に架橋するさらなるステップを含む。架橋剤、例えばグルタルアルデヒドは、アフィニティ試薬と所定の構造体との間の相互作用を安定化させる。これによって、レポーターを導入して切り離すサイクルを、アフィニティ試薬と所定の構造体との結合が破壊されることなくより多くの回数、実施することが可能になる。

【0020】

別の好ましい実施形態では、第１の読み出しおよび／または第２の読み出しを生成することは、励起された蛍光色素によって放出された蛍光光を、複数の検出チャネルに分けることを含む。検出チャネルは、蛍光色素の少なくとも１つの発光特性に対応する。発光特性は、発光スペクトル、蛍光強度および蛍光寿命のうちの１つである。好ましくは、マーカーは、第１のレポーターおよび第２のレポーターの各蛍光色素がそれぞれ第１の読み出しおよび第２の読み出しの１つの検出チャネルに対応するように提供される。これらのチャネルは、１回の読み出しに対する種々異なる蛍光色素の寄与を分けるために生成される。チャネルの生成は、スペクトルアンミキシング、蛍光寿命の決定、および蛍光色素の励起指紋の決定のうちの少なくとも１つを含み得る。スペクトルアンミキシング（スペクトルイメージングおよびリニアアンミキシングまたはチャネルアンミキシングとも称される）は、リニアアンミキシング、主成分分析、スペクトルの教師なし学習手段、サポートベクターマシン、ニューラルネットワーク、（スペクトル）フェーザーアプローチ、およびモンテカルロアンミキシングアルゴリズムを含むさまざまな様式で実行され得るが、これらに限定されない。種々異なるマーカーに関連する蛍光色素間のクロストークを減らすために、これらの技術のうちのいくつかが使用されてよい。種々異なる蛍光色素からの寄与、すなわち、例えば読み出しの１つの画素における、オーバラップする発光スペクトルに起因するクロストークを分けるためにアンミキシング技術を使用することもできる。これらの技術を用いることによって、ノイズの低減に起因して、この方法の感度を大幅に上げることができる。さらに、蛍光色素、ひいてはレポーターを正確に識別するために、蛍光色素の蛍光寿命および励起指紋を使用することができる。これは、読み出しごとに、マーカーのより多くの集合を使用するために使用可能である。結果として、これは、１回の実験において使用することができるマーカーの総数を大幅に増やす。

【0021】

別の好ましい実施形態では、レポーターのすべての蛍光色素は、色素の複数の集合に分割される。同じ集合内の各蛍光色素は、実質的に１つの波長スペクトルまたは同じ波長スペクトルによって励起可能である。ステップｃ）およびステップｇ）において、各集合の蛍光色素を励起するために、色素の集合ごとに少なくとも１つの励起光が試料に向けられる。ステップｄ）およびステップｈ）において、試料の読み出された体積体内に位置する、励起された蛍光色素によって放出された蛍光光から、色素の集合ごとに少なくとも１つの読み出しが生成される。蛍光色素の各集合は、種々異なる励起光によって独立して励起され得るので、各集合によって放出される蛍光光を独立して検出することもできる。これは、それぞれが種々異なる集合によって放出された蛍光光を捕捉する複数の読み出しを生成するために使用される。各読み出しにおいて、種々異なる蛍光色素が励起され、これによって、種々異なる色素のより堅牢な識別、ひいてはレポーターと、試料の関連する所定の構造体と、のより堅牢な識別が可能になる。

【0022】

別の好ましい実施形態では、ステップｃ）およびステップｄ）において、励起光は、互いに時間的に追従するシーケンスで試料に向けられる。好ましくは、異なる励起光の適用の間の時間は、蛍光色素の蛍光寿命よりも長い。これによって、異なる蛍光色素間のクロストークを減らすことができ、さらにこの方法の感度が向上する。

【0023】

別の好ましい実施形態では、第１のレポーターは、第２の励起光が試料に向けられる前に、試料から洗い流される。結合されていないレポーターを洗い流すことによって、確実に、自身の関連する所定の構造体に実際に付着させられたマーカーのみが検出される。したがって、結合されていないレポーターを洗い流すことによって、試料中の構造体の誤識別が防止され、この方法はより信頼性のあるものとなる。

【0024】

別の好ましい実施形態では、第１の読み出しおよび／または第２の読み出しは、読み出された体積体の少なくとも１つの画像、または読み出された体積体の読み出された画像データストリームを含んでいる。特に、この方法は、第１の読み出しおよび／または第２の読み出しを生成するために、試料のハイパースペクトル画像を捕捉するさらなるステップを含む。限られた数の波長帯域、典型的には１０未満または１０前後の波長帯域を捕捉するマルチスペクトルイメージングとは対照的に、ハイパースペクトルイメーシングは、１ピクセル当たり数十または数百の波長帯域を捕捉する。換言すれば、ハイパースペクトルイメージングは、非常に高いスペクトル分解能を有する。これによって、蛍光色素の発光スペクトルに基づいて、蛍光色素をより微細に区別することが可能になり、これによって、この方法の感度および信頼性が向上する。

【0025】

別の好ましい実施形態では、この方法は、特に、カプセル化、ポリマーマトリクス埋め込み、および共結晶化のうちの少なくとも１つによって遮蔽された環境内に蛍光色素を配置することによって、少なくとも１つの蛍光色素の蛍光寿命を安定させるさらなるステップを含む。蛍光寿命の安定化によって、安定した蛍光色素の寿命に基づいて、安定した蛍光色素の識別の信頼性を大幅に高めることができる。他の点では等しい蛍光色素のうちのいくつかの蛍光色素の蛍光寿命を延ばすためにこの方法を使用することもでき、これは、さらなる区別化特徴を提供し、これによって、１回の実験で使用することができる蛍光色素の数が増える。

【0026】

本発明はさらに、生体試料を分析するための装置に関する。装置は、上述の方法を実施するように適合させられている。

【0027】

装置は、上述の方法と同じ利点を有し、方法に関する従属請求項の特徴を利用して補足され得る。

【0028】

好ましい実施形態では、装置は、第１の読み出しおよび第２の読み出しを生成するように構成された、顕微鏡、プレートリーダー、細胞測定器、イメージング細胞測定器または蛍光活性化細胞選別機を備える。好ましくは、顕微鏡は、レンズレス顕微鏡、ライトフィールド顕微鏡、ワイドフィールド顕微鏡、蛍光ワイドフィールド顕微鏡、ライトシート顕微鏡、走査型顕微鏡、スピニングディスク顕微鏡、または共焦点走査型顕微鏡である。

【0029】

別の好ましい実施形態では、装置は、蛍光色素の蛍光発光強度、蛍光寿命、蛍光寿命を表す値、発光スペクトル、励起指紋および蛍光異方性のうちの少なくとも１つを決定するように構成されている。

【0030】

以降では、特定の実施形態について図面を参照しながら説明する。

【図面の簡単な説明】

【0031】

【図1】一実施形態による、生体試料内の所定の構造体をマーキングするためのマーカーの概略図を示す図である。

【図2】第１の開裂剤を導入した後の、図１によるマーカーの概略図を示す図である。

【図3】第２のレポーターを導入した後の、図１および図２によるマーカーの概略図を示す図である。

【図4】第２の開裂剤を導入した後の、図１～図３によるマーカーの概略図を示す図である。

【図5】第３のレポーターを導入した後の、図１～図４によるマーカーの概略図を示す図である。

【図6】図１～図５を参照して上述したマーカーを利用して生体試料を分析するための方法のフローチャートを示す図である。

【図7】生体試料を分析するための装置の概略図を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0032】

図１は、一実施形態による、生体試料内の所定の構造体１０２をマーキングするためのマーカー１００の概略図である。

【0033】

所定の構造体１０２は、試料７０２（図７を参照）内に位置する、特定の生体分子、または１つの分析物、例えば金属イオンであり得る。図１では、所定の構造体１０２は、五角形として示されている。

【0034】

マーカー１００は、マーカーベース１０４を有し、マーカーベース１０４は、アフィニティ試薬１０６と、アフィニティ試薬１０６に連結された付着構造体１０８と、を含む。アフィニティ試薬１０６は、所定の構造体１０２に自身を付着させ、これによって、付着構造体１０８を所定の構造体１０２に連結するように構成されている。架橋剤、例えばグルタルアルデヒドを、アフィニティ試薬１０６と所定の構造体１０２との間の結合を強化するために使用することができる。付着構造体１０８は、長鎖として例示的に形成されており、この長鎖に沿って３つの付着部位１１０ａ，１１０ｂ，１１０ｃが形成されている。各付着部位１１０ａ，１１０ｂ，１１０ｃは、各付着部位１１０ａ，１１０ｂ，１１０ｃにとって一義的であるそれぞれ異なる分子を含む。例えば、付着部位１１０ａ，１１０ｂ，１１０ｃは、ヌクレオチドの一義的なシーケンスを含むオリゴヌクレオチドなどのオリゴマーによって形成されてよい。３つの付着部位１１０ａ，１１０ｂ，１１０ｃの間には、２つの開裂部位１１２ａ，１１２ｂが配置されている。付着構造体１０８を、２つの開裂部位１１２ａ，１１２ｂにおいて、開裂剤２００，４００（図２および図４を参照）によって、付着部位１１０ａ，１１０ｂ，１１０ｃを付着構造体１０８から切り離すために切断することができる。第１の開裂剤２００によって第１の開裂部位１１２ａが切断されると、第１の付着部位１１０ａが切り離される。第２の開裂剤４００によって第２の開裂部位１１２ｂが切断されると、第２の付着部位１１０ｂが切り離され、第３の付着部位１１０ｃだけがマーカーベース１０４に連結されたまま残る。付着構造体１０８の切断を、図２および図４を参照して、以降でより詳細に説明する。

【0035】

マーカー１００は、レポーター１１４ａ，１１４ｂ，１１４ｃをさらに含み、図１には、これらのレポーター１１４ａ，１１４ｂ，１１４ｃのうちの１つが示されている。レポーター１１４ａ，１１４ｂ，１１４ｃは、長鎖として例示的に形成されたリンカー構造体１１６を含む。リンカー構造体１１６は、付着構造体１０８の第１の付着部位１１０ａに付着するように構成された相補的付着部位１１８ａを含む。相補的付着部位１１８ａは、関連する付着部位１１０ａの分子に対して相補的な分子を含む。リンカー構造体１１６に沿って、蛍光色素１２０ａ，１２０ｂ，１２０ｃ，１２０ｄ，１２０ｅが配置されている。この実施形態では、蛍光色素１２０ａ，１２０ｂ，１２０ｃ，１２０ｄ，１２０ｅは、二次構造体を介してリンカー構造体１１６に間接的に結合されている。図１では、蛍光色素１２０ａ，１２０ｂ，１２０ｃ，１２０ｄ，１２０ｅは、オリゴヌクレオチドシーケンスに結合されており、このオリゴヌクレオチドシーケンスは、リンカー構造体１１６上に配置された相補的なオリゴヌクレオチドシーケンスに付着させられている。しかし、蛍光色素１２０ａ，１２０ｂ，１２０ｃ，１２０ｄ，１２０ｅが、リンカー構造体１１６に直接的に、すなわち共有的に結合されてもよい。これらのレポーター１１４ａ，１１４ｂ，１１４ｃの各々の蛍光色素１２０ａ，１２０ｂ，１２０ｃ，１２０ｄ，１２０ｅの組み合わせは、各レポーター１１４ａ，１１４ｂ，１１４ｃにとって一義的である。これによって、レポーター１１４ａ，１１４ｂ，１１４ｃを一義的に識別することができる。１つの色素の代わりに蛍光色素１２０ａ，１２０ｂ，１２０ｃ，１２０ｄ，１２０ｅの組み合わせを用いることによって、一義的に識別可能なレポーター１１４ａ，１１４ｂ，１１４ｃの数が大幅に増える。例えば、１０個の異なる蛍光色素が使用される。２つの色素の一義的な組み合わせは、４５通りあり、５つの色素の一義的な組み合わせは、２５２通りある。つまり、２５２個までの異なる所定の構造体１０２がマーキング可能であり、かつ１０個の蛍光色素のみによって一義的に識別可能である。

【0036】

図２は、第１の開裂剤２００を導入した後の、図１によるマーカー１００の概略図である。

【0037】

この実施形態では、開裂剤２００，４００は、酵素開裂剤である。択一的に、開裂剤は、光分解によって開裂部位１１２ａ，１１２ｂにおいて付着構造体１０８を切断する光、特にＵＶ光であってもよい。図２では、付着構造体１０８は、第１の開裂剤２００によって第１の付着部位１１０ａと第２の付着部位１１０ｂとの間で切断される。これによって、第１の付着部位１１０ａおよび第１のレポーター１１４ａがマーカー１００から切り離される。次いで、切り離されたレポーター１１４ａが、試料７０２から洗い流されてよい。次のステップでは、第２のレポーター１１４ｂ（図３を参照）を試料７０２内に導入することができる。これについては、図３を参照しながら以降で説明する。

【0038】

図３は、第２のレポーター１１４ｂを導入した後の、図１および図２によるマーカー１００の概略図である。

【0039】

第２のレポーター１１４ｂは、第１のレポーター１１４ａとは異なる、蛍光色素１２０ａ’，１２０ｂ’，１２０ｃ’，１２０ｄ’，１２０ｅ’の組み合わせを含む。第２のレポーター１１４ｂの相補的付着部位１１８ｂは、付着構造体１０８の第２の付着部位１１０ｂに自身を付着させるように構成されている。したがって、第２のレポーター１１４ｂは、図３では第２の付着部位１１０ｂに付着させられている。

【0040】

図４は、第２の開裂剤４００を導入した後の、図１～図３によるマーカー１００の概略図である。

【0041】

図４では、付着構造体１０８は、第２の開裂剤４００によって再切断される。この切断は、第２の付着部位１１０ｂと第３の付着部位１１０ｃとの間で行われ、これによって、第２の付着部位１１０ｂおよび第２のレポーター１１４ｂがマーカーベース１０４から切り離される。次いで、切り離された第２のレポーター１１４ｂが、試料７０２から洗い流されてよい。次のステップでは、第３のレポーター１１４ｃ（図５を参照）を試料７０２内に導入することができる。これについては、図５を参照しながら以降で説明する。

【0042】

図５は、第３のレポーター１１４ｃを導入した後の、図１～図４によるマーカー１００の概略図である。

【0043】

第３のレポーター１１４ｃは、第１のレポーター１１４ａおよび第２のレポーター１１４ｂとはさらに異なる、蛍光色素１２０ａ’’，１２０ｂ’’，１２０ｃ’’，１２０ｄ’’，１２０ｅ’’の別の組み合わせを含む。第３のレポーター１１４ｃの相補的付着部位１１８ｃは、付着構造体１０８の第３の付着部位１１０ｃに自身を付着させるように構成されている。したがって、第３のレポーター１１４ｃは、図５では第３の付着部位１１０ｃに付着させられている。

【0044】

図１～図５には、生体試料７０２を分析するためにマーカー１００を使用する方法が示されており、この方法では、所定の構造体１０２をサイクル式にまたはラウンドに基づいた方式でマーキングするために、３つの異なるレポーター１１４ａ，１１４ｂ，１１４ｃが使用される。この方法を、図６を参照して以降で説明する。この方法を、図７を参照して以降で説明する装置によって実施することができる。

【0045】

図６は、図１～図５を参照して上述したマーカー１００を利用して生体試料７０２を分析するための方法のフローチャートである。

【0046】

ステップＳ６００において、プロセスが開始される。ステップＳ６０２において、上述のような少なくとも１つのマーカー１００が提供される。マーカー１００は、例えば、溶液または凍結乾燥固体で提供されてよい。特に、マーカーベース１０４と種々異なるレポーター１１４ａ，１１４ｂ，１１４ｃとは、別々に提供されている。

【0047】

ステップＳ６０４において、マーカーベース１０４が試料７０２内に導入される。マーカーベース１０４を試料７０２内に導入する際には、第１のレポーター１１４ａがマーカーベース１０４の付着構造体１０８に既に付着させられていてよい。択一的に、マーカーベース１０４と第１のレポーター１１４ａとは、試料７０２内に別々に導入される。マーカーベース１０４が、自身の各所定の構造体１０２に自身を付着させる時間を有し、第１のレポーター１１４ａが、自身の各マーカーベース１０４に自身を付着させる時間を有した後、結合されていないマーカーベース１０４およびレポーター１１４ａ，１１４ｂ，１１４ｃは、任意のステップＳ６０６において試料７０２から洗い流される。マーカー１００が自身を付着させるはずの特定の所定の構造体１０２が、試料７０２内に存在しない場合がある。したがって、結合されていないマーカーベース１０４およびレポーター１１４ａ，１１４ｂ，１１４ｃを洗い流すことによって、以降において、自身の関連する所定の構造体１０２に実際に付着させられたマーカー１００のみが確実に検出される。また、すべてのマーカーベース１０４が、自身の関連する所定の構造体１０２に結合するというわけではない場合、またはすべてのレポーター１１４ａが、自身の関連する付着部位１１０ａ，１１０ｂ，１１０ｃに結合するというわけではない場合もある。この場合には、結合されていないマーカーベース１０４およびレポーター１１４ａ，１１４ｂ，１１４ｃを洗い流すことによって、試料７０２中の構造体の誤識別が防止される。

【0048】

ステップＳ６０８において、第１のレポーター１１４ａの蛍光色素１２０ａ，１２０ｂ，１２０ｃ，１２０ｄ，１２０ｅを励起するために、少なくとも１つの第１の励起光が試料７０２に向けられる。第１の励起光は、第１のレポーター１１４ａの特定の蛍光色素１２０ａ，１２０ｂ，１２０ｃ，１２０ｄ，１２０ｅに関連する１つの波長または波長スペクトルの光を含み得る。２つ以上の第１の励起光、例えば種々異なる光源によって放出される光が同時にまたは順次に使用されてよい。励起された蛍光色素１２０ａ，１２０ｂ，１２０ｃ，１２０ｄ，１２０ｅは、蛍光光を放出し、この蛍光光は、ステップＳ６１０において、少なくとも１つの第１の読み出しを生成するために使用される。第１の読み出しは、蛍光光に関する情報、特に、蛍光色素１２０ａ，１２０ｂ，１２０ｃ，１２０ｄ，１２０ｅの発光スペクトル、蛍光発光強度または蛍光寿命を含む。第１の読み出しからの情報は、ステップＳ６１２において、第１のレポーター１１４ａ，１１４ｂ，１１４ｃの蛍光色素１２０ａ，１２０ｂ，１２０ｃ，１２０ｄ，１２０ｅ、したがって、試料７０２の読み出された体積体内に存在するマーカー１００を識別するために使用される。ステップＳ６０４～Ｓ６１２は、試料７０２を染色してイメージングする第１のサイクルまたはラウンドに対応する。

【0049】

任意選択的に、試料７０２内のすべてのマーカー１００が、第１の読み出しのみから、少なくとも所定の確実性で識別された場合、プロセスは、ステップＳ６１２の後に終了してよい。択一的に、プロセスは、ステップＳ６１４において継続される。

【0050】

ステップＳ６１４において、第１の開裂剤２００が試料７０２内に導入される。開裂剤２００，４００は、開裂部位１１２ａ，１１２ｂが前述した酵素開裂剤にとっての標的である場合には、酵素開裂剤であってよい。択一的に、開裂剤２００，４００は、開裂部位１１２ａ，１１２ｂが光分解によって切断可能である場合には、光、特にＵＶ光であってよい。第１の付着部位１１０ａと第２の付着部位１１０ｂとの間で付着構造体１０８が切断された後、ステップＳ６１６において、切り離された第１のレポーター１１４ａが洗い流される。ステップＳ６１８において、第２のレポーター１１４ｂが試料７０２内に導入される。ステップＳ６２０において、第２のレポーター１１４ｂの蛍光色素１２０ａ’，１２０ｂ’，１２０ｃ’，１２０ｄ’，１２０ｅ’を励起するために、第２の励起光が試料７０２に向けられる。第２の励起光も、第２のレポーター１１４ｂの特定の蛍光色素１２０ａ’，１２０ｂ’，１２０ｃ’，１２０ｄ’，１２０ｅ’に関連する１つの波長または波長スペクトルの光を含み得る。同様に、２つ以上の第２の励起光が使用されてよい。ステップＳ６２２において、試料７０２の読み出された体積体内に位置する、励起された蛍光色素１２０ａ’，１２０ｂ’，１２０ｃ’，１２０ｄ’，１２０ｅ’によって放出された蛍光光から、少なくとも１つの第２の読み出しが生成される。ステップＳ６２４において、第２の第１のレポーター１１４ａ，１１４ｂの蛍光色素１２０ａ，１２０ｂ，１２０ｃ，１２０ｄ，１２０ｅ，１２０ａ’，１２０ｂ’，１２０ｃ’，１２０ｄ’，１２０ｅ’、ひいては試料７０２内に存在するマーカー１００を識別するために、第２の読み出しからの情報が使用される。ステップＳ６１４～Ｓ６２４は、試料７０２を染色してイメージングする第２のサイクルまたはラウンドに対応する。

【0051】

第１の読み出しおよび第２の読み出しから、試料７０２内のすべてのマーカー１００が、少なくとも所定の確実性で識別された場合、プロセスはステップＳ６２６において終了する。択一的に、ステップＳ６１４～Ｓ６２４が、第３のレポーター１１４ｃに関して、試料７０２を染色してイメージングする第３のサイクルまたはラウンドにおいて繰り返される。

【0052】

図７は、生体試料７０２を分析するための装置７００の概略図を示している。

【0053】

特に、装置７００は、図１～図５を参照して上述したマーカー１００を利用して、図６を参照して上述した生体試料７０２を分析するための方法を実施することができる。図では、装置７００は、顕微鏡システム７０４の一部として例示的に示されている。

【0054】

装置７００は、試料７０２内にマーカー１００を導入するための染色ユニット７０６を備える。この目的のために、染色ユニット７０６は、自動化されていてもよいし、自動化されていなくてもよい１つまたは複数のピペットを備えていてよい。また、装置７００は、種々異なるレポーター１１４ａ，１１４ｂ，１１４ｃの蛍光色素１２０ａ，１２０ｂ，１２０ｃ，１２０ｄ，１２０ｅを励起するための励起ユニット７０８を備える。励起ユニット７０８は、少なくとも１つの光源、好ましくはコヒーレント光源を備える。少なくとも１つの光源は、レポーター１１４ａ，１１４ｂ，１１４ｃの蛍光色素１２０ａ，１２０ｂ，１２０ｃ，１２０ｄ，１２０ｅを励起するために用いられる励起光を放出するように構成されている。種々異なる波長または波長スペクトルの励起光を放出するために、光源は、調整可能な光源であってよい。択一的に、装置７００は、種々異なる波長または波長スペクトルの光を放出する２つ以上の光源を備えていてよい。図７に示されている実施形態では、励起ユニット７０８によって放出された励起光は、ビーム分割ユニット７１０によって試料７０２に向けられる。

【0055】

装置７００のイメージングユニット７１２は、励起された色素によって放出された蛍光光から画像を生成するように構成されている。画像は、この実施形態における読み出しである。イメージングユニットは、蛍光光を捕捉するために試料７０２に向けて配向された対物レンズ７１４を備える。捕捉された蛍光光は、続いて、ビーム分割ユニット７１０によって検出ユニット７１６に向けられる。検出ユニット７１６は、少なくとも１つの検出要素と、蛍光光を種々異なる検出チャネルに分割するための回折要素と、を備える。

【0056】

読み出しを生成した後、レポーター１１４ａ，１１４ｂ，１１４ｃを、自身の各マーカー１００および試料７０２から切り離す必要がある。これは、開裂剤２００，４００によって行われる。開裂剤２００，４００は、酵素開裂剤であってよく、酵素開裂剤は、染色ユニット７０６によって試料７０２内に導入可能である。択一的に、光分解によって付着構造体１０８を切断するために、励起ユニット７０８の光源または付加的な光源が使用されてよい。

【0057】

装置７００は、染色ユニット７０６、励起ユニット７０８および検出ユニット７１６に連結されたプロセッサ７１８をさらに備える。プロセッサ７１８は、生体試料７０２を分析するための方法を実施する目的で、装置７００の各要素をコントロールするように構成されている。特に、プロセッサ７１８は、少なくとも１つのユーザ入力に基づいてこの方法を実施するように構成されている。

【0058】

同一または類似に作用する要素は、すべての図において同じ参照符号で示されている。本明細書で使用されるように、用語「および／または（かつ／または）」は、関連する記載項目のうちの１つまたは複数の項目のあらゆるすべての組み合わせを含んでおり、「／」として略記されることがある。

【0059】

いくつかの態様を装置の文脈において説明してきたが、これらの態様が、対応する方法の説明も表していることが明らかであり、ここではブロックまたは装置がステップまたはステップの特徴に対応している。同様に、ステップの文脈において説明された態様は、対応する装置の対応するブロックまたは項目または特徴の説明も表している。

【符号の説明】

【0060】

１００ マーカー
１０２ 所定の構造体
１０４ マーカーベース
１０６ アフィニティ試薬
１０８ 付着構造体
１１０ａ，１１０ｂ，１１０ｃ 付着部位
１１２ａ，１１２ｂ 開裂部位
１１４ａ，１１４ｂ，１１４ｃ レポーター
１１６ リンカー構造体
１１８ａ，１１８ｂ，１１８ｃ 相補的付着部位
１２０ａ，１２０ｂ，１２０ｃ，１２０ｄ，１２０ｅ，１２０ａ’，１２０ｂ’，１２０ｃ’，１２０ｄ’，１２０ｅ’，１２０ａ’’，１２０ｂ’’，１２０ｃ’’，１２０ｄ’’，１２０ｅ’’ 蛍光色素
２００ 開裂剤
４００ 開裂剤
７００ 装置
７０２ 試料
７０４ 顕微鏡システム
７０６ 染色ユニット
７０８ 励起ユニット
７１０ ビーム分割ユニット
７１２ イメージングユニット
７１４ 対物レンズ
７１６ 検出ユニット
７１８ プロセッサ

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【国際調査報告】