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▶ プレシジョン バイオロジックス、インコーポレイテッドの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-06-04
(54)【発明の名称】血液悪性腫瘍を治療するための方法及び組成物
(51)【国際特許分類】
A61K 39/395 20060101AFI20240528BHJP
G01N 33/574 20060101ALI20240528BHJP
G01N 33/577 20060101ALI20240528BHJP
A61K 35/17 20150101ALI20240528BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20240528BHJP
A61P 35/02 20060101ALI20240528BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240528BHJP
C07K 16/30 20060101ALI20240528BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20240528BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240528BHJP
C12N 15/62 20060101ALN20240528BHJP
C12N 15/63 20060101ALN20240528BHJP
【ＦＩ】
A61K39/395 T
G01N33/574 B ZNA
G01N33/574 E
G01N33/577 B
A61K35/17
A61K45/00
A61P35/02
A61P35/00
C07K16/30
C07K19/00
C12N5/10
C12N15/62 Z
C12N15/63 Z
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023571662
(86)(22)【出願日】2022-05-19
(85)【翻訳文提出日】2023-12-25
(86)【国際出願番号】 US2022030028
(87)【国際公開番号】W WO2022246066
(87)【国際公開日】2022-11-24
(31)【優先権主張番号】63/190,466
(32)【優先日】2021-05-19
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
２．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】520155136
【氏名又は名称】プレシジョン バイオロジックス、インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】110000855
【氏名又は名称】弁理士法人浅村特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】ツァン、クウォン、ワイ．
(72)【発明者】
【氏名】ファンティーニ、マッシモ
(72)【発明者】
【氏名】アーレン、フィリップ、エム．
【テーマコード（参考）】
4B065
4C084
4C085
4C087
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B065AA90X
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA24
4B065CA25
4B065CA44
4C084AA19
4C084MA02
4C084NA05
4C084NA14
4C084ZB261
4C084ZB262
4C084ZB271
4C084ZB272
4C084ZC75
4C085AA14
4C085BB02
4C085CC23
4C085EE01
4C085EE03
4C087AA01
4C087AA02
4C087BB37
4C087BB65
4C087CA04
4C087CA12
4C087MA02
4C087NA05
4C087NA14
4C087ZB26
4C087ZB27
4C087ZC75
4H045AA11
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045BA41
4H045CA40
4H045DA76
4H045EA20
4H045FA74
(57)【要約】
ＮＥＯ－２０１は、血液悪性腫瘍細胞、例えば、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、及び多発性骨髄腫に特異的に結合し、これらを死滅させることが示されている。ＮＥＯ－２０１を、任意選択で別の薬剤と組み合わせて使用する診断的方法、治療方法及び併用療法が、説明されている。
【選択図】図１Ａ
【選択図】図１Ａ
【特許請求の範囲】
【請求項1】
血液悪性腫瘍を治療または予防することを必要とする患者においてそれを行う方法であって、グリコシル化ＣＥＡＣＡＭ５及びＣＥＡＣＡＭ６に結合するが、アグリコシル化ＣＥＡＣＡＭ５またはアグリコシル化ＣＥＡＣＡＭ６には結合しない有効量の抗体または抗体断片を前記患者に投与することを含む、前記方法。
【請求項2】
前記抗体または抗体断片が、ＣＥＡＣＡＭ５のアミノ酸３１０～３１８の領域（ＲＴＴＶＴＴＩＴＶ）のスレオニン、ならびにＣＥＡＣＡＭ６のアミノ酸３１２～３２０の領域（ＴＶＴＭＩＴＶＳＧ）のスレオニン及びセリンに結合するＯ－グリコシル化エピトープを認識する、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
血液悪性腫瘍を治療または予防することを必要とする患者においてそれを行う方法であって、有効量のＮＥＯ－２０１またはその抗原結合断片を前記患者に投与することを含む、前記方法。
【請求項4】
前記血液悪性腫瘍が、図１１及び図１９のアレイに示される構造を有する０１、０２、０６、０２３、０２６、及び０３９ Ｏ－グリカンのうちの１つ以上から選択されるＯ－グリカンを発現するがん細胞を特徴とする、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項5】
前記血液悪性腫瘍が、図１１の前記アレイに示される前記構造及び図１９の構造を有する０６、０１または０２ Ｏ－グリカンを発現するがん細胞を特徴とする、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項6】
前記血液悪性腫瘍が、図１１及び図１９の前記アレイに示されるように、０６ Ｏ－グリカンを発現するがん細胞を特徴とする、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項7】
前記血液悪性腫瘍が、図５に示される構造を有するＴｎ抗原またはコア１、２、３、もしくは４ Ｏ－グリカンを発現するがん細胞を特徴とする、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項8】
前記血液悪性腫瘍が、白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫、または骨髄異形成症候群から選択される、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項9】
前記血液悪性腫瘍が、急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、バーキットリンパ腫（ＢＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、有毛細胞白血病（ＨＣＬ）、ホジキンリンパ腫（ＨＬ）、辺縁帯リンパ腫（ＭＺＬ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、骨髄腫、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、またはＴ細胞リンパ腫（ＴＣＬ）から選択される、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項10】
前記血液悪性腫瘍が白血病である、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項11】
前記血液悪性腫瘍が、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、任意選択で、急性前骨髄球性白血病（ＡＰＬ）である、請求項８に記載の方法。
【請求項12】
前記血液悪性腫瘍が、多発性骨髄腫である、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項13】
前記血液悪性腫瘍が、ＣＥＡＣＡＭ５及び／またはＣＥＡＣＡＭ６を発現する、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項14】
前記抗体を前記投与する前に、または前記投与する時に、（ｉ）前記血液悪性腫瘍が、ＣＥＡＣＡＭ５及び／またはＣＥＡＣＡＭ６陽性であることを決定することと、
（ｉｉ）前記血液悪性腫瘍が、（ｉ）図１１及び図１９の前記アレイに示される前記構造を有する０１、０２、０６、０２３、０２６及び０３９のうちの１つ以上から選択されるＯ－グリカン、
（ｉｉｉ）図１１及び図１９の前記アレイに示される前記構造を有する０６、０１もしくは０２ Ｏ－グリカン、
（ｉｖ）図１１及び図１９の前記アレイに示される前記構造を有する０６ Ｏ－グリカン、及び／または
（ｖ）図５に示される前記構造を有するＴｎ抗原またはコア１、２、３、もしくは４ Ｏ－グリカンを発現することを決定することと、を更に含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項15】
前記ＮＥＯ－２０１抗体が、（ｉ）配列番号２８及び配列番号２９に含まれたＶＨ及びＶＬ ＣＤＲ配列を含むか、
（ｉｉ）配列番号３８に対して少なくとも９０％の同一性を有する可変重鎖配列を含むか、
（ｉｉｉ）配列番号３９に対して少なくとも９０％の同一性を有する可変軽鎖配列を含むか、
（ｉｖ）配列番号３８に対して少なくとも９０％の同一性を有する可変重鎖配列、及び配列番号３９に対して少なくとも９０％の同一性を有する可変軽鎖配列を含むか、
（ｖ）配列番号３８に対して少なくとも９５％の同一性を有する可変重鎖配列、及び配列番号３９に対して少なくとも９５％の同一性を有する可変軽鎖配列を含むか、
（ｖｉ）配列番号３８と同一の可変重鎖配列、及び配列番号３９と同一の可変軽鎖配列を含むか、
（ｖｉｉ）配列番号２８のアミノ酸２０～４７０に対して少なくとも９０％の同一性を有する重鎖配列、及び配列番号２９のアミノ酸２０～２３３に対して少なくとも９０％の同一性を有する軽鎖配列を含むか、
（ｖｉｉｉ）配列番号２８のアミノ酸２０～４７０に対して少なくとも９５％の同一性を有する重鎖配列、及び配列番号２９のアミノ酸２０～２３３に対して少なくとも９５％の同一性を有する軽鎖配列を含むか、
（ｉｘ）配列番号２８のアミノ酸２０～４７０と同一の重鎖配列、及び配列番号２９のアミノ酸２０～２３３と同一の軽鎖配列を含むか、
（ｘ）配列番号２８のアミノ酸２０～４７０の重鎖配列、及び配列番号２９のアミノ酸２０～２３３の軽鎖配列からなるか、
（ｘｉ）ヒトＩｇＧ１定常ドメインを含むか、
（ｘｉｉ）ヒト化されているか、
（ｘｉｉｉ）別の部分にコンジュゲートされているか、
（ｘｉｖ）別の細胞毒性部分、標識、放射性部分、もしくは親和性タグにコンジュゲートされているか、または
（ｘｖ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）に含まれ、
（ｘｖｉ）前記抗体が、少なくとも１つの他の抗原、任意選択で別の腫瘍抗原または免疫細胞上に発現された抗原を標的とする多重特異性または二重特異性抗体であり、任意選択で前記他の抗原が、チェックポイント阻害剤またはサイトカインまたはホルモンまたは成長因子である、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項16】
前記抗体が、免疫細胞、任意選択でＴ細胞またはＮＫ細胞として投与され、その免疫細胞が、前記抗体を含むＣＡＲを発現する、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項17】
インビボで血液悪性腫瘍細胞を死滅させる方法であって、有効量のＮＥＯ－２０１抗体を患者に投与することを含む、前記方法。
【請求項18】
インビボで血液悪性腫瘍細胞を死滅させる方法であって、有効量のＮＥＯ－２０１抗体と、少なくとも１つの他の活性剤とを患者に投与することを含み、ＮＥＯ－２０１及び少なくとも１つの他の活性剤が、血液悪性腫瘍細胞を死滅させることにおいて相加的または相乗的効果を誘発する、前記方法。
【請求項19】
血液悪性腫瘍を治療もしくは予防するか、血液悪性腫瘍の負担を軽減するか、または血液悪性腫瘍の成長もしくは増殖速度を遅くする方法であって、有効量のＮＥＯ－２０１抗体を、それを必要とする患者に投与することを含む、前記方法。
【請求項20】
前記血液悪性腫瘍が、白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫、または骨髄異形成症候群から選択される、請求項１７～１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項21】
前記血液悪性腫瘍が、急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、バーキットリンパ腫（ＢＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、有毛細胞白血病（ＨＣＬ）、ホジキンリンパ腫（ＨＬ）、辺縁帯リンパ腫（ＭＺＬ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、骨髄腫、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、またはＴ細胞リンパ腫（ＴＣＬ）から選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項22】
前記血液悪性腫瘍が、ＡＭＬであり、Ｍ０（未分化急性骨髄芽球性白血病）、Ｍ１（最小成熟を伴う急性骨髄芽球性白血病）、Ｍ２（成熟を伴う急性骨髄芽球性白血病）、Ｍ３（急性前骨髄球性白血病（ＡＰＬ））、Ｍ４（急性骨髄単球性白血病）、Ｍ４ ｅｏｓ（好酸球増多症を伴う急性骨髄単球性白血病）、Ｍ５（急性単球性白血病）、Ｍ６（急性赤血球性白血病）、及びＭ７（急性巨核芽球性白血病）、特定の遺伝子異常（遺伝子または染色体変化）を有するＡＭＬ、染色体８と２１との間にトランスロケーションを有するＡＭＬ、染色体１６にトランスロケーションまたは逆位を有するＡＭＬ、ＰＭＬ－ＲＡＲＡ融合遺伝子を有するＡＰＬ、染色体９と１１との間にトランスロケーションを有するＡＭＬ、染色体６と９との間にトランスロケーションを有するＡＭＬ、染色体３にトランスロケーションまたは逆位を有するＡＭＬ、染色体１と２２との間にトランスロケーションを有するＡＭＬ（巨核芽球）、ＢＣＲ－ＡＢＬ１（ＢＣＲ－ＡＢＬ）融合遺伝子を有するＡＭＬ、ＮＰＭ１遺伝子の変異を伴うＡＭＬ、ＣＥＢＰＡ遺伝子の二対立遺伝子変異を伴うＡＭＬ（すなわち、遺伝子の両方のコピーの変異）、ＲＵＮＸ１遺伝子の変異を伴うＡＭＬ、骨髄異形成関連の変化を伴うＡＭＬ、以前の化学療法または放射線に関連するＡＭＬ、最小分化を伴うＡＭＬ（ＦＡＢ Ｍ０）、成熟していないＡＭＬ（ＦＡＢ Ｍ１）、成熟を伴うＡＭＬ（ＦＡＢ Ｍ２）、急性骨髄単球性白血病（ＦＡＢ Ｍ４）、急性単芽球性／単球性白血病（ＦＡＢ Ｍ５）、純血球性白血病（ＦＡＢ Ｍ６）、急性巨核芽球性白血病（ＦＡＢ Ｍ７）、急性好塩基球性白血病、線維症を伴う急性全髄症、骨髄性肉腫（顆粒球性肉腫または緑色腫としても知られる）、及びダウン症候群に関連する骨髄増殖を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項23】
前記血液悪性腫瘍が、ＡＭＬ様状態、例えば、未分化もしくは二表現型急性白血病または混合表現型急性白血病（ＭＰＡＬ）である、請求項２０に記載の方法。
【請求項24】
前記血液悪性腫瘍が、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、更に任意選択で急性前骨髄球性白血病である、請求項２０に記載の方法。
【請求項25】
前記血液悪性腫瘍が、骨髄腫である、請求項２０に記載の方法。
【請求項26】
前記血液悪性腫瘍が、（ｉ）ＣＥＡＣＡＭ５もしくはＣＥＡＣＡＭ６を発現し、
（ｉｉ）図１１及び図１９のアレイに示される構造を有する０１、０２、０６、０２３、０２６、及び０３９ Ｏ－グリカンのうちの１つ以上から選択されるＯ－グリカンを発現し、
（ｉｉｉ）図１１の前記アレイに示される前記構造及び図１９の構造を有する０６、０１もしくは０２ Ｏ－グリカンを発現し、
（ｉｖ）図１１及び図１９の前記アレイに示すように、０６ Ｏ－グリカンを発現し、及び／または
（ｖ）図５に示される構造を有するＴｎ抗原またはコア１、２、３、もしくは４ Ｏ－グリカンを発現する、請求項１７～２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項27】
前記投与する前または前記投与する時に、前記血液悪性腫瘍が、（ｉ）ＣＥＡＣＡＭ５もしくはＣＥＡＣＡＭ６を発現し、
（ｉｉ）図１１及び図１９の前記アレイに示される前記構造を有する０１、０２、０６、０２３、０２６、及び０３９ Ｏ－グリカンのうちの１つ以上から選択されるＯ－グリカンを発現し、
（ｉｉｉ）図１１の前記アレイに示される前記構造及び図１９の構造を有する０６、０１もしくは０２ Ｏ－グリカンを発現するか、または
（ｉｖ）図１１及び図１９の前記アレイに示すように、０６ Ｏ－グリカンを発現し、及び／または
（ｖ）図５に示される前記構造を有するＴｎ抗原またはコア１、２、３、もしくは４ Ｏ－グリカンを発現することを決定することを更に含む、請求項１７～２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項28】
請求項１７～２７のいずれか１項に記載の方法であって、（ｉ）配列番号２８及び配列番号２９に含まれたＶＨ及びＶＬ ＣＤＲ配列を含むか、
（ｉｉ）配列番号３８に対して少なくとも９０％の同一性を有する可変重鎖配列を含むか、
（ｉｉｉ）配列番号３９に対して少なくとも９０％の同一性を有する可変軽鎖配列を含むか、
（ｉｖ）配列番号３８に対して少なくとも９０％の同一性を有する可変重鎖配列、及び配列番号３９に対して少なくとも９０％の同一性を有する可変軽鎖配列を含むか、
（ｖ）配列番号３８に対して少なくとも９５％の同一性を有する可変重鎖配列、及び配列番号３９に対して少なくとも９５％の同一性を有する可変軽鎖配列を含むか、
（ｖｉ）配列番号３８と同一の可変重鎖配列、及び配列番号３９と同一の可変軽鎖配列を含むか、
（ｖｉｉ）配列番号２８のアミノ酸２０～４７０に対して少なくとも９０％の同一性を有する重鎖配列、及び配列番号２９のアミノ酸２０～２３３に対して少なくとも９０％の同一性を有する軽鎖配列を含むか、
（ｖｉｉｉ）配列番号２８のアミノ酸２０～４７０に対して少なくとも９５％の同一性を有する重鎖配列、及び配列番号２９のアミノ酸２０～２３３に対して少なくとも９５％の同一性を有する軽鎖配列を含むか、
（ｉｘ）配列番号２８のアミノ酸２０～４７０と同一の重鎖配列、及び配列番号２９のアミノ酸２０～２３３と同一の軽鎖配列を含むか、
（ｘ）配列番号２８のアミノ酸２０～４７０の重鎖配列、及び配列番号２９のアミノ酸２０～２３３の軽鎖配列からなるか、
（ｘｉ）ヒトＩｇＧ１定常ドメインを含むか、
（ｘｉｉ）ヒト化されているか、
（ｘｉｉｉ）別の部分にコンジュゲートされているか、
（ｘｉｖ）別の細胞毒性部分、標識、放射性部分、もしくは親和性タグにコンジュゲートされているか、
（ｘｖ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）に含まれるか、または
（ｘｖｉ）前記抗体が、少なくとも１つの他の抗原、任意選択で別の腫瘍抗原または免疫細胞上に発現された抗原を標的とする多重特異性または二重特異性抗体であり、任意選択で前記他の抗原が、チェックポイント阻害剤またはサイトカインまたはホルモンまたは成長因子である、前記方法。
【請求項29】
別の治療薬を前記患者に投与することを更に含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項30】
前記他の薬剤が、（ａ）微小管阻害剤、トポイソメラーゼ阻害剤、プラチン、アルキル化剤、及び代謝拮抗剤、（ｂ）ＭＫ－２２０６、ＯＮ ０１３１０５、ＲＴＡ ４０２、ＢＩ ２５３６、ソラフェニブ、ＩＳＩＳ－ＳＴＡＴ３Ｒｘ、微小管阻害剤、トポイソメラーゼ阻害剤、プラチン、アルキル化剤、代謝拮抗剤、パクリタキセル、ゲムシタビン、ドキソルビシン、ビンブラスチン、エトポシド、５－フルオロウラシル、カルボプラチン、アルトレタミン、アミノグルテチミド、アムサクリン、アナストロゾール、アザシチジン、ブレオマイシン、ブスルファン、カルムスチン、クロラムブシル、２－クロロデオキシアデノシン、シスプラチン、コルヒチン、シクロホスファミド、シタラビン、シトキサン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドセタキセル、リン酸エストラムスチン、フロクスウリジン、フルダラビン、ゲンツズマブ、ヘキサメチルメラミン、ヒドロキシ尿素、イフォスファミド、イマチニブ、インターフェロン、イリノテカン、ロムスチン、メクロレタミン、メルファレン、６－メルカプトプリン、メトトレキサート、マイトマイシン、ミトタン、ミトキサントロン、ペントスタチン、プロカルバジン、リツキシマブ、ストレプトゾシン、タモキシフェン、テモゾロミド、テニポシド、６－チオグアニン、トポテカン、トラスツズマブ、ビンクリスチン、ビンデシン、及び／またはビノレルビン、（ｃ）１－Ｄ－リボフラノシル－１，２，４－トリアゾール－３カルボキサミド、９－＞２－ヒドロキシ－エトキシメチルグアニン、アダマンタンアミン、５－ヨード－２’－デオキシウリジン、トリフルオロチミジン、インターフェロン、アデニンアラビノシド、プロテアーゼ阻害剤、チミジンキナーゼ阻害剤、糖または糖タンパク質合成阻害剤、構造タンパク質合成阻害剤、付着及び吸着阻害剤、ならびにアシクロビル、ペンシクロビル、バラシクロビル、及びガンシクロビルなどのヌクレオシド類似体、（ｄ）ＰＤ－１阻害剤または抗ＰＤ－１抗体、例えば、ＫＥＹＴＲＵＤＡ（登録商標）（ペンブロリズマブ）、ＯＰＤＩＶＯ（登録商標）（ニボルマブ）もしくはＬＩＢＴＡＹＯ（セミプリマブ）、（ｅ）ＰＤ－Ｌ１阻害剤または抗ＰＤ－Ｌ１抗体、例えば、ＴＥＣＥＮＴＲＩＱ（アテゾリズマブ）、ＩＭＦＩＮＺＩ（デュルバルマブ）もしくはＢＡＶＥＮＣＩＯ（アベルマブ）、あるいは（ｆ）ＣＴＬＡ－４阻害剤または抗ＣＴＬＡ－４抗体、例えば、ＹＥＲＶＯＹ（登録商標）イピリムマブから選択される、請求項２９に記載の方法。
【請求項31】
抗がんワクチンを前記患者に投与することを更に含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項32】
前記血液悪性腫瘍細胞が、ＣＤＣ及び／またはＡＤＣＣによって死滅する、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項33】
前記ＮＥＯ－２０１抗体が、細胞毒性部分に結合される、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項34】
インビトロで血液悪性腫瘍細胞を死滅させる方法であって、前記血液悪性腫瘍細胞をＮＥＯ－２０１抗体と接触させることを含む、前記方法。
【請求項35】
以下、（ｉ）前記血液悪性腫瘍細胞を補体と接触させること、または
（ｉｉ）前記血液悪性腫瘍細胞を、エフェクター細胞、任意選択で、ナチュラルキラー細胞と接触させることのうちの１つ以上を更に含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項36】
血液悪性腫瘍細胞を検出する方法であって、前記血液悪性腫瘍細胞による前記ＮＥＯ－２０１抗原の発現を検出することを含み、任意選択で、血液または生検試料などの患者試料中の血液悪性腫瘍細胞のレベルを使用して、がんを診断するか、またはがんの予後を決定し、任意選択で、（ｉ）前記ＮＥＯ－２０１抗体が、標識に直接的または間接的に結合され、（ｉｉ）前記検出することが、細胞選別を含み、更に任意選択で、蛍光活性化細胞選別を含む、前記方法。
【請求項37】
血液悪性腫瘍細胞を染色する方法であって、細胞をＮＥＯ－２０１抗体と接触させることを含み、任意選択で、前記ＮＥＯ－２０１抗体が、標識に直接的または間接的に結合される、前記方法。
【請求項38】
血液悪性腫瘍細胞を単離する方法であって、ＮＥＯ－２０１抗原を発現する細胞を単離することを含み、任意選択で、血液悪性腫瘍細胞を含有する試料をＮＥＯ－２０１抗体と接触させることを含み、更に任意選択で、前記ＮＥＯ－２０１抗体が直接的または間接的に標識されている、前記方法。
【請求項39】
前記試料が、血液もしくは骨髄もしくは腫瘍生検試料であるか、または血液もしくは骨髄もしくは腫瘍生検試料を含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項40】
任意選択で、細胞選別によって、更に任意選択で、蛍光活性化細胞選別によって、ＮＥＯ－２０１陽性血液悪性腫瘍細胞をＮＥＯ－２０１陰性細胞から分離することを含む、請求項３８または３９に記載の方法。
【請求項41】
試料をＮＥＯ－２０１抗体を含む支持体と接触させることによって、前記血液悪性腫瘍細胞が単離され、それによって、前記血液悪性腫瘍細胞は前記支持体上に保持される、請求項３８または３９に記載の方法。
【請求項42】
前記ＮＥＯ－２０１抗体が、（ｉ）配列番号２８及び配列番号２９に含まれたＶＨ及びＶＬ ＣＤＲ配列を含むか、
（ｉｉ）配列番号３８に対して少なくとも９０％の同一性を有する可変重鎖配列を含むか、
（ｉｉｉ）配列番号３９に対して少なくとも９０％の同一性を有する可変軽鎖配列を含むか、
（ｉｖ）配列番号３８に対して少なくとも９０％の同一性を有する可変重鎖配列、及び配列番号３９に対して少なくとも９０％の同一性を有する可変軽鎖配列を含むか、
（ｖ）配列番号３８に対して少なくとも９５％の同一性を有する可変重鎖配列、及び配列番号３９に対して少なくとも９５％の同一性を有する可変軽鎖配列を含むか、
（ｖｉ）配列番号３８と同一の可変重鎖配列、及び配列番号３９と同一の可変軽鎖配列を含むか、
（ｖｉｉ）配列番号２８のアミノ酸２０～４７０に対して少なくとも９０％の同一性を有する重鎖配列、及び配列番号２９のアミノ酸２０～２３３に対して少なくとも９０％の同一性を有する軽鎖配列を含むか、
（ｖｉｉｉ）配列番号２８のアミノ酸２０～４７０に対して少なくとも９５％の同一性を有する重鎖配列、及び配列番号２９のアミノ酸２０～２３３に対して少なくとも９５％の同一性を有する軽鎖配列を含むか、
（ｉｘ）配列番号２８のアミノ酸２０～４７０と同一の重鎖配列、及び配列番号２９のアミノ酸２０～２３３と同一の軽鎖配列を含むか、
（ｘ）配列番号２８のアミノ酸２０～４７０の重鎖配列、及び配列番号２９のアミノ酸２０～２３３の軽鎖配列からなるか、
（ｘｉ）ヒトＩｇＧ１定常ドメインを含むか、
（ｘｉｉ）ヒト化されているか、
（ｘｉｉｉ）別の部分にコンジュゲートされているか、
（ｘｉｖ）別の細胞毒性部分、標識、放射性部分、もしくは親和性タグにコンジュゲートされているか、（ｘｖ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）に含まれるか、または
（ｘｖｉ）前記抗体が、少なくとも１つの他の抗原、任意選択で別の腫瘍抗原または免疫細胞上に発現された抗原を標的とする多重特異性または二重特異性抗体であり、任意選択で前記他の抗原が、チェックポイント阻害剤またはサイトカインまたはホルモンまたは成長因子である、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本ＰＣＴ出願は、２０２１年５月１９日に出願された米国仮出願第６３／１９０，４６６号に対する優先権を主張し、その内容は、参照によりそれらの全体が組み込まれる。
本ＰＣＴ出願は、２０２１年５月１９日に出願された米国仮出願第６３／１９０，４６６号に対する優先権を主張し、その内容は、参照によりそれらの全体が組み込まれる。
【0002】
配列表情報
本出願は、その開示の一部として、２０２１年５月１７日に作成された３２，４３２バイトのサイズをもつ「４３２８２ｏ４８００．ｔｘｔ」という名前のファイル内の生物学的配列表を含み、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本出願は、その開示の一部として、２０２１年５月１７日に作成された３２，４３２バイトのサイズをもつ「４３２８２ｏ４８００．ｔｘｔ」という名前のファイル内の生物学的配列表を含み、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【0003】
ヒトがん胎児性抗原（ＣＥＡ）ファミリーは、染色体１９ｑ１３．２上にタンデム状に配列された２９個の遺伝子で構成される。ヌクレオチド相同性に基づいて、これらの遺伝子は、２つの主要なサブファミリー、ＣＥＡＣＡＭ及び妊娠特異的糖タンパク質サブグループに分類される。ＣＥＡＣＡＭをコードするタンパク質には、ＣＥＡ（ＣＥＡＣＡＭ５）、ＣＥＡ関連の細胞接着分子（ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＥＡＣＡＭ３、ＣＥＡＣＡＭ４、ＣＥＡＣＡＭ６、ＣＥＡＣＡＭ７、ＣＥＡＣＡＭ８が含まれる。ＣＥＡＣＡＭファミリーは、Ｉｇスーパーファミリーに属する。構造的には、各ヒトＣＥＡＣＡＭには、１０８～１１０個のアミノ酸を含み、Ｉｇ可変ドメインと相同な１つのＮ末端ドメインが含まれ、その後に異なる数（０～６）のＩｇ Ｃ２タイプの定常様ドメインが続く。ＣＥＡＣＡＭタンパク質は、互いに同種親和性及び異好性相互作用することができる。ＣＥＡＣＡＭ１は、その細胞質ドメインにＩＴＩＭ（免疫受容体チロシンベースの抑制モチーフ）様ＰＤ－１が含まれているため、このファミリー内の独特なタンパク質である。この阻害効果は、ＩＴＩＭによるチロシン残基のリン酸化によって引き起こされ、その結果、Ｓｒｃホモロジー２ドメインを含むチロシンホスファターゼ－１及び－２が動員される。ＣＥＡＣＡＭ１タンパク質は、単球、顆粒球、活性化Ｔ細胞、Ｂ細胞、及びＮＫ細胞を含む様々な免疫細胞に発現する。ＣＥＡＣＡＭ１は、いくつかのアイソフォームとして発生し、２つの主要なものは、ＣＥＡＣＡＭ１－Ｌ及びＣＥＡＣＡＭ１－Ｓであり、それぞれ、長い（Ｌ）または短い（Ｓ）細胞質ドメインを有する。ＣＥＡＣＡＭ１－Ｓの発現は、ヒト白血球では完全に欠如している。ＣＥＡＣＡＭ１－Ｌは、ＣＤ１６は陰性であるがＣＤ５６は陽性である活性化ヒトＮＫ細胞の亜集団で発現する。腫瘍細胞上のＣＥＡとＮＫ細胞上のＣＥＡＣＡＭ１との間の異好性相互作用は、腫瘍細胞に対するＮＫ細胞の細胞毒性を阻害する。
【0004】
ＮＥＯ－２０１は、Ｈｏｌｌｉｎｓｈｅａｄ同種大腸癌ワクチンプラットフォームに対して生成されたヒト化ＩｇＧ１ ｍＡｂである（Ｈｏｌｌｉｎｓｈｅａｄ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ．１９７０；１（７６５８）：１１９１－１１９５、Ｈｏｌｌｉｎｓｈｅａｄ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９７２；１７７（４０５２）：８８７－８８９）。このワクチンの免疫原性成分は、７９人の結腸癌患者からの外科的に切除された検体からプールされた腫瘍膜画分に由来する腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）であった（Ｈｏｌｌｉｎｓｈｅａｄ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ．１９８５；５６（３）：４８０－４８９）。これらの膜画分は、半精製され、結腸癌患者対健常ボランティアの遅延型過敏症（ＤＴＨ）についてスクリーニングされ、難治性大腸癌患者における臨床試験で評価された（Ｈｏｌｌｉｎｓｈｅａｄ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ．１９８５；５６（３）：４８０－４８９、Ｈｏｌｌｉｎｓｈｅａｄ，ＵＳ４８１０７８１，１９８９、Ｂｒｉｓｔｏｌ ＆ Ｋａｎｔｏｒ，米国特許第７８２９６７８号，２０１０）。これらの試験は、ワクチンに対する細胞性応答に加えて持続的なＩｇＧ応答を発現した患者における抗腫瘍応答及び全生存の有意な延長の両方によって定義される臨床的利益を報告し、それによりワクチンは抗腫瘍抗体を生成することができる免疫原性成分を含んでいたことが示唆された（Ｈｏｌｌｉｎｓｈｅａｄ，Ｓｅｍｉｎ Ｓｕｒｇ Ｏｎｃｏｌ．１９９１ Ｊｕｌ－Ａｕｇ；７（４）：１９９－２１０）。
【0005】
本発明者及び他の者による以前の研究では、ＮＥＯ－２０１がＣＥＡＣＡＭファミリーメンバーの腫瘍関連バリアント、特にＣＥＡＣＡＭ５及びＣＥＡＣＡＭ６のがん関連バリアントに結合することが示されている（Ｚｅｌｉｇｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．Ｊｕｌｙ １ ２０１７（７７）（１３ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）３０２５）。ＮＥＯ－２０１は、特定のがんに対して反応性であるが、ほとんどの正常組織に対して反応性ではないことが実証されているＩｇＧ１ ｍＡｂである。機能分析は、ＮＥＯ－２０１が、ＡＤＣＣ及びＣＤＣなどの先天性免疫エフェクター機構に関与して、インビトロで腫瘍細胞を死滅させることができることを明らかにした（Ｆａｎｔｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１８，８，１８９９、Ｆａｎｔｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｔｈｅｒ Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍ．２０１９，３４，１４７－１５９、Ｚｅｌｉｇｓ ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ Ｏｎｃｏｌ．２０２０，１０，８０５）。更に、ＮＥＯ－２０１は、腫瘍細胞上のＣＥＡＣＡＭ５とＮＫ細胞上のＣＥＡＣＡＭ１との間の相互作用を遮断して、ＮＫ細胞毒性のＣＥＡＣＡＭ１依存性阻害を逆転させることができる（Ｆａｎｔｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｔｈｅｒ Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍ．２０２０，３５，１９０－１９８）。以前の研究では、ＮＥＯ－２０１は、マウスにおけるヒト膵臓腫瘍異種移植片の成長を減弱し、卵巣がんを有するマウスの生存を延長する能力も有することが示された（Ｆａｎｔｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１８，８，１８９９）。ＮＥＯ－２０１は、観察された唯一の有害作用である好中球の一時的な減少を伴う非ヒト霊長類における安全性／忍容性を示した（Ｚｅｌｉｇｓ ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ Ｏｎｃｏｌ．２０２０，１０，８０５）。更に、ＮＥＯ－２０１は、腫瘍関連ＣＥＡＣＡＭ－５及びＣＥＡＣＡＭ－６バリアントに特異的に結合するが、健康な組織上で発現されるものには結合しないことを実証した（Ｚｅｌｉｇｓ ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ Ｏｎｃｏｌ．２０２０，１０，８０５）。この点に関して、我々はまた、ＮＥＯ－２０１が、腫瘍細胞上で発現されたＣＥＡＣＡＭ－５とＮＫ細胞上で発現されたＣＥＡＣＡＭ－１との間の相互作用を遮断して、ＮＫ細胞毒性のＣＥＡＣＡＭ－１依存性阻害を逆転させることができることを実証した（Ｆａｎｔｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｔｈｅｒ Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍ．２０２０，３５，１９０－１９８）。更に、我々は、ＮＥＯ－２０１が、健康なドナー及びがん患者の両方で高分化で最も抑制的なＴｒｅｇ細胞に結合し、ＣＤＣインビトロによってそれらを排除できることを示した。標準治療後に進行した固形腫瘍を有する成人におけるモノクローナル抗体ＮＥＯ－２０１の安全性及び最大耐容用量を決定するためのオープンラベル、最初のヒト、第１相、用量漸増研究がＮＩＨ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒで完了した。
【0006】
出願者の以前の米国特許第５，６８８，６５７号、同第７，３１４，６２２号、同第７，４９１，８０１号、同第７，７６３，７２０号、同第７，８２９，６７８号、同第８，４７０，３２６号、同第８，５２４，４５６号、同第８，５３５，６６７号、同第８，８０２，０９０号、同第９，０３４，５８８号、同第９，０６８，０１４号、同第９，３７１，３７５号、同第９，５９２，２９０号、同第９，７１８，８６６号、及びＲＥ３９，７６０（これらのそれぞれは、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）は、様々な抗がん抗体、がん抗原、及び関連技術を開示している。特に、出願人の以前の特許の一部は、結腸癌及び膵臓癌の診断ならびに治療におけるＮＥＯ－２０１の使用を開示している。しかしながら、出願人の知る限り、血液悪性腫瘍の治療におけるＮＥＯ－２０１の使用は以前に記載されていない。
【発明の概要】
【0007】
本明細書の出願人は、ＮＥＯ－２０１が特定の血液細胞に結合し、血液悪性腫瘍に存在する細胞を死滅させることができることを初めて示す。ＮＥＯ－２０１抗原（ＣＥＡＣＡＭ５及びＣＥＡＣＡＭ６のがん関連グリコシル化バリアント）は、これらの細胞によって発現されることが以前に知られておらず、ＮＥＯ－２０１による血液細胞の死滅を可能にするのに十分な高い量ではるかに少ない発現であったため、これらの結果は予想外であった。本明細書の結果から、ＮＥＯ－２０１は、血液悪性腫瘍に存在する細胞に対して反応することができ、ＮＥＯ－２０１によって結合された抗原は、血液悪性腫瘍の検出及び／または治療を必要とする対象においてそれを行う方法において、診断マーカー及び治療標的の両方として使用することができると結論づける。
【図面の簡単な説明】
【0008】
【図1A】ＮＥＯ－２０１抗体によるＨＬ－６０細胞の染色。ＮＥＯ－２０１陽性細胞のパーセンテージを、対照未染色ＨＬ－６０細胞（左パネル）と比較してフローサイトメトリー（右パネル）によって決定した。
【図1B】ＮＥＯ－２０１抗体によるＨＬ－６０細胞の染色。ＮＥＯ－２０１陽性細胞のパーセンテージを、対照未染色ＨＬ－６０細胞（左パネル）と比較してフローサイトメトリー（右パネル）によって決定した。
【図1C】ＮＥＯ－２０１抗体によるＨＬ－６０細胞の染色。ＮＥＯ－２０１陽性細胞のパーセンテージを、対照未染色ＨＬ－６０細胞（左パネル）と比較してフローサイトメトリー（右パネル）によって決定した。
【図1D】ＮＥＯ－２０１抗体によるＨＬ－６０細胞の染色。ＮＥＯ－２０１陽性細胞のパーセンテージを、対照未染色ＨＬ－６０細胞（左パネル）と比較してフローサイトメトリー（右パネル）によって決定した。
【図2】ＮＥＯ－２０１は、ＰＢＭＣをエフェクター細胞として使用して、ＨＬ－６０（急性前骨髄球性白血病細胞株または急性骨髄性白血病細胞株）に対するＡＤＣＣを媒介する。各実験における３つの反復ウェルからの％特異的溶解±ＳＤ（標準偏差）の平均として結果を提示する。＊＊＊二元配置ＡＮＯＶＡによる統計的に有意な（ｐ＜０．００１）（ＮＥＯ－２０１＋ＰＢＭＣ対ＩｇＧ１＋ＰＢＭＣ）。エフェクター：標的細胞比は、標識した通り、５０：１または２５：１であった。
【図3】ＮＥＯ－２０１は、ＮＫ細胞をエフェクター細胞として使用して、ＨＬ－６０（急性前骨髄球性白血病細胞株）に対するＡＤＣＣを媒介する。各実験における３つの反復ウェルからの％特異的溶解±ＳＤ（標準偏差）の平均として結果を提示する。＊＊＊二元配置ＡＮＯＶＡによる統計的に有意な（ｐ＜０．００１）（ＮＥＯ－２０１＋ＮＫ細胞対ＩｇＧ１＋ＰＢＭＣ）。＊＊二元配置ＡＮＯＶＡによる統計的に有意な（ｐ＜０．０１）（ＮＥＯ－２０１＋ＮＫ細胞対ＩｇＧ１＋ＰＢＭＣ）。エフェクター：標的細胞比は、標識した通り、２０：１または１０：１であった。
【図4】血液腫瘍細胞株におけるＮＥＯ－２０１によって認識される細胞表面抗原の発現の分析。図では、データは、ＮＥＯ－２０１によって認識される抗原を発現する細胞のパーセンテージとして提示される。陽性率は、蛍光マイナス１対照を使用することによって決定した。
【図5】ムチン中に見出されるｏ－グリカンコアの構造。図の表では、Ｇａｌはガラクトースであり、ＧａｌＮＡｃはＮ－アセチルガラクトサミンであり、ＧｌｃＮＡｃはＮ－アセチルグルコサミンであり、Ｓｉａｌはシアル酸であり、Ｓｅｒはセリンであり、Ｔｈｒはスレオニンである。
【図6】ＣＦＰＡＣ－１細胞株によって発現されたＯ－グリカンプロファイル。
【図7A】ヒト好中球によって発現されたＯ－グリカンプロファイル。
【図7B】ヒト好中球によって発現されたＯ－グリカンプロファイル。
【図7C】ヒト好中球によって発現されたＯ－グリカンプロファイル。
【図8】Ｕ９３７、ＨＬ６０、及びＫ５６２細胞株によって発現されたＯ－グリカンプロファイル。
【図9】Ｏ－ＧａｌＮＡｃグリカンコアの構造。
【図10】哺乳動物対細菌ｒｈＣＥＡＣＡＭ６へのＮＥＯ－２０１結合を比較するＥＬＩＳＡ。
【図11】Ｏ－グリカンアレイ構造のアレイ。
【図12】ＣＥＡＣＡＭ６のアミノ酸配列。
【図13】異なる切断Ｃ末端ＣＥＡＣＡＭ６遺伝子構築物の構造。
【図14】ＣＥＡＣＡＭ５のアミノ酸配列。
【図15】異なる切断Ｃ末端ＣＥＡＣＡＭ５遺伝子構築物の構造。
【図16】抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ Ｃｙ３抗体検出方法を使用して、ＮＥＯ－２０１の結合親和性を異なるＯ－グリカンのアレイと比較した結合研究。示されるように、バックグラウンドシグナルは、アレイにわたって低く、抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ Ｃｙ３抗体検出方法との結合パターンは、ＮＥＯ－２０１がＯ－グリカン０１、０２、０６、２３、２６、及び３９ Ｏ－グリカンに特異的に結合することを示し、すなわち、これらのＯ－グリカンに対する抗ヒトＩｇＧ１抗体の検出された結合は、実際の結合事象であり、非特異的結合を表さない。ＮＥＯ－２０１（１００ｍｇ／ｍｌ）＋抗ｈｕ ＩｇＧ ＦｃＣｙ２（２０ｍｇ／ｍｌ）の結合親和性を示す。
【図17】抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ Ｃｙ３抗体検出方法を使用して、ＮＥＯ－２０１の結合親和性を異なるＯ－グリカンのアレイと比較した結合研究。示されるように、バックグラウンドシグナルは、アレイにわたって低く、抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ Ｃｙ３抗体検出方法との結合パターンは、ＮＥＯ－２０１がＯ－グリカン０１、０２、０６、２３、２６、及び３９ Ｏ－グリカンに特異的に結合することを示し、すなわち、これらのＯ－グリカンに対する抗ヒトＩｇＧ１抗体の検出された結合は、実際の結合事象であり、非特異的結合を表さない。ＮＥＯ－２０１（２０ｍｇ／ｍｌ）＋抗ｈｕ ＩｇＧ ＦｃＣｙ２（２０ｍｇ／ｍｌ）の結合親和性を示す。
【図18】抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ Ｃｙ３抗体検出方法を使用して、ＮＥＯ－２０１の結合親和性を異なるＯ－グリカンのアレイと比較した結合研究。示されるように、バックグラウンドシグナルは、アレイにわたって低く、抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ Ｃｙ３抗体検出方法との結合パターンは、ＮＥＯ－２０１がＯ－グリカン０１、０２、０６、２３、２６、及び３９ Ｏ－グリカンに特異的に結合することを示し、すなわち、これらのＯ－グリカンに対する抗ヒトＩｇＧ１抗体の検出された結合は、実際の結合事象であり、非特異的結合を表さない。ＮＥＯ－２０１（４ｍｇ／ｍｌ）＋抗ｈｕ ＩｇＧ ＦｃＣｙ２（２０ｍｇ／ｍｌ）の結合親和性を示す。
【図19】０１、０２、０６、０２３、０２６及び０３９ Ｏ－グリカンの構造。
【図20】ＣＦＰＡＣ－１についての注釈を伴うＯ－グリカンのＭＳスペクトル。
【図21】ヒト好中球についての注釈を伴うＯ－グリカンのＭＳスペクトル。
【図22】ＨＬ６０細胞株についての注釈を伴うＯ－グリカンのＭＳスペクトル。
【図23】Ｕ９３７細胞株についての注釈を伴うＯ－グリカンのＭＳスペクトル。
【図24】Ｋ５６２細胞株についての注釈を伴うＯ－グリカンのＭＳスペクトル。
【図25】哺乳動物（ＣＨＯ）発現系を使用して産生されたＣ末端切断ＣＥＡＣＡＭ６タンパク質に対するＮＥＯ－２０１結合親和性。実験では、発現されたＣＥＡＣＡＭ６バリアントを、抗ヒトカッパ鎖ＥＬＩＳＡによって正規化し、ＮＥＯ－２０１を使用して、２倍連続希釈されたＣＥＡＣＡＭ６バリアントコーティングウェルを検出した。示されるように、ＯＤ値は、３１８ストップの構築物から始まる同じ濃度で減少し、ＣＥＡＣＡＭ６ ３１０ストップの構築物で最も低い結合に達した。更に示されるように、構築物３２０ストップは、発現された全てのＣＥＡＣＡＭ６バリアントの同じ濃度において最も高いＯＤ値を有するＮＥＯ－２０１に対する完全な結合親和性を保持する。
【図26】哺乳動物（ＣＨＯ）発現系におけるＣ末端切断ＣＥＡＣＡＭ５タンパク質に対するＮＥＯ－２０１結合親和性。図は、ＥＬＩＳＡ結合アッセイにおける異なる切断ＣＥＡＣＡＭ５タンパク質の結合曲線を比較する。
【図27】異なるヒトがん細胞株にＮＥＯ－２０１が結合することを示すフローサイトメトリー実験。
【発明を実施するための形態】
【0009】
一態様では、本開示は、血液悪性腫瘍を治療または予防するか、血液悪性腫瘍の負担を軽減するか、または血液悪性腫瘍の成長もしくは増殖速度を遅くする方法であって、有効量のＮＥＯ－２０１抗体、またはＮＥＯ－２０１と同じエピトープに結合するか、またはＮＥＯ－２０１と同じエピトープに結合するためにＮＥＯ－２０１と競合する抗体を、それを必要とする患者に投与することを含む、方法を提供する。
【0010】
別の態様では、本開示は、血液悪性腫瘍に対する免疫応答を増強することを必要とする患者においてそれを行う方法であって、有効量のＮＥＯ－２０１抗体、またはＮＥＯ－２０１と同じエピトープに結合するか、またはＮＥＯ－２０１と同じエピトープに結合するためにＮＥＯ－２０１と競合する抗体を当該患者に投与することを含む、方法を提供する。
【0011】
別の態様では、本開示は、患者における血液悪性腫瘍の退行を刺激する方法であって、有効量のＮＥＯ－２０１抗体、またはＮＥＯ－２０１と同じエピトープに結合するか、またはＮＥＯ－２０１と同じエピトープに結合するためにＮＥＯ－２０１と競合する抗体を当該患者に投与し、それによって、当該患者における抗がん免疫を活性化、増強、または刺激することを含む、方法を提供する。
【0012】
当該血液悪性腫瘍は、白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫、または骨髄異形成症候群を含み得る。例えば、当該血液悪性腫瘍は、急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、バーキットリンパ腫（ＢＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、有毛細胞白血病（ＨＣＬ）、ホジキンリンパ腫（ＨＬ）、辺縁帯リンパ腫（ＭＺＬ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、骨髄腫、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、またはＴ細胞リンパ腫（ＴＣＬ）から選択され得る。好ましい実施形態では、当該血液悪性腫瘍は、白血病、より好ましくは急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）を含み得る。特に好ましい実施形態では、当該血液悪性腫瘍は、急性前骨髄球性白血病である。
【0013】
別の態様では、本開示は、血液悪性腫瘍を治療または予防することを必要とする患者においてそれを行う方法であって、グリコシル化ＣＥＡＣＡＭ５及びＣＥＡＣＡＭ６には結合するが、アグリコシル化ＣＥＡＣＡＭ５またはアグリコシル化ＣＥＡＣＡＭ６には結合しない有効量の抗体または抗体断片を当該患者に投与することを含み、好ましくは、当該抗体または抗体断片は、ＣＥＡＣＡＭ５のアミノ酸３１０～３１８の領域（ＲＴＴＶＴＴＩＴＶ）のスレオニン、ならびにＣＥＡＣＡＭ６のアミノ酸３１２～３２０の領域（ＴＶＴＭＩＴＶＳＧ）のスレオニン及びセリンに結合するＯ－グリコシル化エピトープを認識する、方法を提供する。
【0014】
別の態様では、本開示は、血液悪性腫瘍を治療または予防することを必要とする患者においてそれを行う方法であって、有効量のＮＥＯ－２０１またはその抗原結合断片を当該患者に投与することを含み、任意選択で、上記血液悪性腫瘍は、図１１及び図１９のアレイに示される構造を有する０１、０２、０６、０２３、０２６、及び０３９ Ｏ－グリカンのうちの１つ以上から選択されるＯ－グリカンを発現するがん細胞を特徴とするか、または血液悪性腫瘍は、図１１のアレイに示される構造及び図１９の構造を有する０６、０１、または０２ Ｏ－グリカンを発現するがん細胞を特徴とするか、または血液悪性腫瘍は、図１１のアレイ及び図１９の構造に示される０６ Ｏ－グリカンを発現するがん細胞を特徴とするか、または血液悪性腫瘍は、図５に示される構造を有するＴｎ抗原またはコア１、２、４、もしくは４ Ｏ－グリカンを発現するがん細胞を特徴とする、方法を提供する。
【0015】
前述の方法のいずれにおいても、当該血液悪性腫瘍は、白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫、または骨髄異形成症候群を含み得る。
【0016】
前述の方法のいずれにおいても、当該血液悪性腫瘍は、更に任意選択で、急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、バーキットリンパ腫（ＢＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、有毛細胞白血病（ＨＣＬ）、ホジキンリンパ腫（ＨＬ）、辺縁帯リンパ腫（ＭＺＬ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、骨髄腫、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、またはＴ細胞リンパ腫（ＴＣＬ）から選択されてもよい。
【0017】
前述の方法のいずれにおいても、当該血液悪性腫瘍は、任意選択で白血病である。
【0018】
前述の方法のいずれにおいても、当該血液悪性腫瘍は、任意選択で、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、及び更に任意選択で、急性前骨髄球性白血病（ＡＰＬ）を含む。
【0019】
前述の方法のいずれにおいても、当該血液悪性腫瘍は、任意選択で、多発性骨髄腫である。
【0020】
前述の方法のいずれにおいても、当該血液悪性腫瘍は、任意選択で、ＣＥＡＣＡＭ５及び／またはＣＥＡＣＡＭ６を発現する。
【0021】
前述の方法のいずれにおいても、当該方法は、任意選択で、当該抗体を当該投与する前に、または当該投与する時に、以下のうちの１つ以上を更に含む：
（ｉ）当該血液悪性腫瘍が、ＣＥＡＣＡＭ５及び／またはＣＥＡＣＡＭ６陽性であることを決定すること、
（ｉｉ）当該血液悪性腫瘍が、（ｉ）図１１及び図１９のアレイに示される構造を有する０１、０２、０６、０２３、０２６及び０３９のうちの１つ以上から選択されるＯ－グリカン、
（ｉｉｉ）図１１及び図１９のアレイに示される構造を有する０６、０１もしくは０２ Ｏ－グリカンと、
（ｉｖ）図１１及び図１９のアレイに示される構造を有する０６ Ｏ－グリカン及び／または
（ｖ）図５に示される構造を有するＴｎ抗原またはコア１、２、３、もしくは４ Ｏ－グリカンを発現することを決定すること。
（ｉ）当該血液悪性腫瘍が、ＣＥＡＣＡＭ５及び／またはＣＥＡＣＡＭ６陽性であることを決定すること、
（ｉｉ）当該血液悪性腫瘍が、（ｉ）図１１及び図１９のアレイに示される構造を有する０１、０２、０６、０２３、０２６及び０３９のうちの１つ以上から選択されるＯ－グリカン、
（ｉｉｉ）図１１及び図１９のアレイに示される構造を有する０６、０１もしくは０２ Ｏ－グリカンと、
（ｉｖ）図１１及び図１９のアレイに示される構造を有する０６ Ｏ－グリカン及び／または
（ｖ）図５に示される構造を有するＴｎ抗原またはコア１、２、３、もしくは４ Ｏ－グリカンを発現することを決定すること。
【0022】
前述の方法のいずれにおいても、当該ＮＥＯ－２０１抗体は、以下のうちの１つ以上を含む：
（ｉ）配列番号２８及び配列番号２９に含まれたＶＨ及びＶＬ ＣＤＲ配列を含むか、
（ｉｉ）配列番号３８に対して少なくとも９０％の同一性を有する可変重鎖配列を含むか、
（ｉｉｉ）配列番号３９に対して少なくとも９０％の同一性を有する可変軽鎖配列を含むか、
（ｉｖ）配列番号３８に対して少なくとも９０％の同一性を有する可変重鎖配列、及び配列番号３９に対して少なくとも９０％の同一性を有する可変軽鎖配列を含むか、
（ｖ）配列番号３８に対して少なくとも９５％の同一性を有する可変重鎖配列、及び配列番号３９に対して少なくとも９５％の同一性を有する可変軽鎖配列を含むか、
（ｖｉ）配列番号３８と同一の可変重鎖配列、及び配列番号３９と同一の可変軽鎖配列を含むか、
（ｖｉｉ）配列番号２８のアミノ酸２０～４７０に対して少なくとも９０％の同一性を有する重鎖配列、及び配列番号２９のアミノ酸２０～２３３に対して少なくとも９０％の同一性を有する軽鎖配列を含むか、
（ｖｉｉｉ）配列番号２８のアミノ酸２０～４７０に対して少なくとも９５％の同一性を有する重鎖配列、及び配列番号２９のアミノ酸２０～２３３に対して少なくとも９５％の同一性を有する軽鎖配列を含むか、
（ｉｘ）配列番号２８のアミノ酸２０～４７０と同一の重鎖配列、及び配列番号２９のアミノ酸２０～２３３と同一の軽鎖配列を含むか、
（ｘ）配列番号２８のアミノ酸２０～４７０の重鎖配列、及び配列番号２９のアミノ酸２０～２３３の軽鎖配列からなるか、
（ｘｉ）ヒトＩｇＧ１定常ドメインを含むか、
（ｘｉｉ）ヒト化されているか、
（ｘｉｉｉ）別の部分にコンジュゲートされているか、
（ｘｉｖ）別の細胞毒性部分、標識、放射性部分、もしくは親和性タグにコンジュゲートされているか、または
（ｘｖ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）に含まれるか、
（ｘｖｉ）当該抗体が、少なくとも１つの他の抗原、任意選択で別の腫瘍抗原または免疫細胞上に発現された抗原を標的とする多重特異性または二重特異性抗体であり、任意選択で当該他の抗原が、チェックポイント阻害剤またはサイトカインまたはホルモンまたは成長因子である。
（ｉ）配列番号２８及び配列番号２９に含まれたＶＨ及びＶＬ ＣＤＲ配列を含むか、
（ｉｉ）配列番号３８に対して少なくとも９０％の同一性を有する可変重鎖配列を含むか、
（ｉｉｉ）配列番号３９に対して少なくとも９０％の同一性を有する可変軽鎖配列を含むか、
（ｉｖ）配列番号３８に対して少なくとも９０％の同一性を有する可変重鎖配列、及び配列番号３９に対して少なくとも９０％の同一性を有する可変軽鎖配列を含むか、
（ｖ）配列番号３８に対して少なくとも９５％の同一性を有する可変重鎖配列、及び配列番号３９に対して少なくとも９５％の同一性を有する可変軽鎖配列を含むか、
（ｖｉ）配列番号３８と同一の可変重鎖配列、及び配列番号３９と同一の可変軽鎖配列を含むか、
（ｖｉｉ）配列番号２８のアミノ酸２０～４７０に対して少なくとも９０％の同一性を有する重鎖配列、及び配列番号２９のアミノ酸２０～２３３に対して少なくとも９０％の同一性を有する軽鎖配列を含むか、
（ｖｉｉｉ）配列番号２８のアミノ酸２０～４７０に対して少なくとも９５％の同一性を有する重鎖配列、及び配列番号２９のアミノ酸２０～２３３に対して少なくとも９５％の同一性を有する軽鎖配列を含むか、
（ｉｘ）配列番号２８のアミノ酸２０～４７０と同一の重鎖配列、及び配列番号２９のアミノ酸２０～２３３と同一の軽鎖配列を含むか、
（ｘ）配列番号２８のアミノ酸２０～４７０の重鎖配列、及び配列番号２９のアミノ酸２０～２３３の軽鎖配列からなるか、
（ｘｉ）ヒトＩｇＧ１定常ドメインを含むか、
（ｘｉｉ）ヒト化されているか、
（ｘｉｉｉ）別の部分にコンジュゲートされているか、
（ｘｉｖ）別の細胞毒性部分、標識、放射性部分、もしくは親和性タグにコンジュゲートされているか、または
（ｘｖ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）に含まれるか、
（ｘｖｉ）当該抗体が、少なくとも１つの他の抗原、任意選択で別の腫瘍抗原または免疫細胞上に発現された抗原を標的とする多重特異性または二重特異性抗体であり、任意選択で当該他の抗原が、チェックポイント阻害剤またはサイトカインまたはホルモンまたは成長因子である。
【0023】
前述の方法のいずれにおいても、当該抗体が、任意選択で、免疫細胞、任意選択で、Ｔ細胞またはＮＫ細胞として投与され、免疫細胞は、当該抗体、融合タンパク質、または当該抗体を含むＣＡＲを発現する。
【0024】
別の態様では、本発明は、インビボで血液悪性腫瘍細胞を死滅させる方法であって、有効量のＮＥＯ－２０１抗体を患者に投与することを含む、方法を提供する。
【0025】
別の態様では、本発明は、インビボで血液悪性腫瘍細胞を死滅させる方法であって、有効量のＮＥＯ－２０１抗体と、少なくとも１つの他の活性剤とを患者に投与することを含み、ＮＥＯ－２０１及び少なくとも１つの他の活性剤が、血液悪性腫瘍細胞を死滅させることにおいて相加的または相乗的効果を誘発する、方法を提供する。
【0026】
別の態様では、本発明は、血液悪性腫瘍を治療もしくは予防する方法、血液悪性腫瘍の負荷を軽減する方法、または血液悪性腫瘍の成長もしくは増殖速度を遅くする方法を提供し、有効量のＮＥＯ－２０１抗体またはＮＥＯ－２０１と同じエピトープに結合するか、またはＮＥＯ－２０１と同じエピトープに結合するためにＮＥＯ－２０１と競合する抗体を、それを必要とする患者に投与することを含み、任意選択で、以前の方法のいずれかにおいて、当該血液悪性腫瘍は、白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫、または骨髄異形成症候群から選択され、更に任意選択で、当該血液悪性腫瘍は、急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、バーキットリンパ腫（ＢＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、有毛細胞白血病（ＨＣＬ）、ホジキンリンパ腫（ＨＬ）、境界帯リンパ腫（ＭＺＬ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、骨髄腫、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、またはＴ細胞リンパ腫（ＴＣＬ）から選択され、更に任意選択で白血病であり、任意選択で急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）であり、更に任意選択で急性前骨髄球性白血病または骨髄腫である。
【0027】
前述の方法のいずれにおいても、当該血液悪性腫瘍は、任意選択で、
（ｉ）ＣＥＡＣＡＭ５もしくはＣＥＡＣＡＭ６を発現し、
（ｉｉ）図１１及び図１９のアレイに示される構造を有する０１、０２、０６、０２３、０２６、及び０３９ Ｏ－グリカンのうちの１つ以上から選択されるＯ－グリカンを発現し、
（ｉｉｉ）図１１のアレイに示される構造及び図１９の構造を有する０６、０１もしくは０２ Ｏ－グリカンを発現するか、または
（ｉｖ）図１１及び図１９のアレイに示すように、０６ Ｏ－グリカンを発現し、及び／または
（ｖ）図５に示される構造を有するＴｎ抗原またはコア１、２、３、もしくは４ Ｏ－グリカンを発現する。
（ｉ）ＣＥＡＣＡＭ５もしくはＣＥＡＣＡＭ６を発現し、
（ｉｉ）図１１及び図１９のアレイに示される構造を有する０１、０２、０６、０２３、０２６、及び０３９ Ｏ－グリカンのうちの１つ以上から選択されるＯ－グリカンを発現し、
（ｉｉｉ）図１１のアレイに示される構造及び図１９の構造を有する０６、０１もしくは０２ Ｏ－グリカンを発現するか、または
（ｉｖ）図１１及び図１９のアレイに示すように、０６ Ｏ－グリカンを発現し、及び／または
（ｖ）図５に示される構造を有するＴｎ抗原またはコア１、２、３、もしくは４ Ｏ－グリカンを発現する。
【0028】
前述の方法のいずれにおいても、任意選択で、当該投与する前に、または当該投与する時に、当該血液悪性腫瘍が、
（ｉ）ＣＥＡＣＡＭ５もしくはＣＥＡＣＡＭ６を発現し、
（ｉｉ）図１１及び図１９のアレイに示される構造を有する０１、０２、０６、０２３、０２６、及び０３９ Ｏ－グリカンのうちの１つ以上から選択されるＯ－グリカンを発現し、
（ｉｉｉ）図１１のアレイに示される構造及び図１９の構造を有する０６、０１もしくは０２Ｏ－グリカンを発現するか、または
（ｉｖ）図１１及び図１９のアレイに示すように、０６ Ｏ－グリカンを発現し、及び／または
（ｖ）図５に示される構造を有するＴｎ抗原またはコア１、２、３、もしくは４ Ｏ－グリカンを発現するかどうかを決定する。
（ｉ）ＣＥＡＣＡＭ５もしくはＣＥＡＣＡＭ６を発現し、
（ｉｉ）図１１及び図１９のアレイに示される構造を有する０１、０２、０６、０２３、０２６、及び０３９ Ｏ－グリカンのうちの１つ以上から選択されるＯ－グリカンを発現し、
（ｉｉｉ）図１１のアレイに示される構造及び図１９の構造を有する０６、０１もしくは０２Ｏ－グリカンを発現するか、または
（ｉｖ）図１１及び図１９のアレイに示すように、０６ Ｏ－グリカンを発現し、及び／または
（ｖ）図５に示される構造を有するＴｎ抗原またはコア１、２、３、もしくは４ Ｏ－グリカンを発現するかどうかを決定する。
【0029】
前述の方法のいずれにおいても、ＮＥＯ－２０１抗体は、任意選択で、
（ｉ）配列番号２８及び配列番号２９に含まれたＶＨ及びＶＬ ＣＤＲ配列を含むか、
（ｉｉ）配列番号３８に対して少なくとも９０％の同一性を有する可変重鎖配列を含むか、
（ｉｉｉ）配列番号３９に対して少なくとも９０％の同一性を有する可変軽鎖配列を含むか、
（ｉｖ）配列番号３８に対して少なくとも９０％の同一性を有する可変重鎖配列、及び配列番号３９に対して少なくとも９０％の同一性を有する可変軽鎖配列を含むか、
（ｖ）配列番号３８に対して少なくとも９５％の同一性を有する可変重鎖配列、及び配列番号３９に対して少なくとも９５％の同一性を有する可変軽鎖配列を含むか、
（ｖｉ）配列番号３８と同一の可変重鎖配列、及び配列番号３９と同一の可変軽鎖配列を含むか、
（ｖｉｉ）配列番号２８のアミノ酸２０～４７０に対して少なくとも９０％の同一性を有する重鎖配列、及び配列番号２９のアミノ酸２０～２３３に対して少なくとも９０％の同一性を有する軽鎖配列を含むか、
（ｖｉｉｉ）配列番号２８のアミノ酸２０～４７０に対して少なくとも９５％の同一性を有する重鎖配列、及び配列番号２９のアミノ酸２０～２３３に対して少なくとも９５％の同一性を有する軽鎖配列を含むか、
（ｉｘ）配列番号２８のアミノ酸２０～４７０と同一の重鎖配列、及び配列番号２９のアミノ酸２０～２３３と同一の軽鎖配列を含むか、
（ｘ）配列番号２８のアミノ酸２０～４７０の重鎖配列、及び配列番号２９のアミノ酸２０～２３３の軽鎖配列からなるか、
（ｘｉ）ヒトＩｇＧ１定常ドメインを含むか、
（ｘｉｉ）ヒト化されているか、
（ｘｉｉｉ）別の部分にコンジュゲートされているか、
（ｘｉｖ）別の細胞毒性部分、標識、放射性部分、もしくは親和性タグにコンジュゲートされているか、
（ｘｖ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）に含まれるか、または
（ｘｖｉ）当該抗体が、少なくとも１つの他の抗原、任意選択で別の腫瘍抗原または免疫細胞上に発現された抗原を標的とする多重特異性または二重特異性抗体であり、任意選択で当該他の抗原が、チェックポイント阻害剤またはサイトカインまたはホルモンまたは成長因子である。
（ｉ）配列番号２８及び配列番号２９に含まれたＶＨ及びＶＬ ＣＤＲ配列を含むか、
（ｉｉ）配列番号３８に対して少なくとも９０％の同一性を有する可変重鎖配列を含むか、
（ｉｉｉ）配列番号３９に対して少なくとも９０％の同一性を有する可変軽鎖配列を含むか、
（ｉｖ）配列番号３８に対して少なくとも９０％の同一性を有する可変重鎖配列、及び配列番号３９に対して少なくとも９０％の同一性を有する可変軽鎖配列を含むか、
（ｖ）配列番号３８に対して少なくとも９５％の同一性を有する可変重鎖配列、及び配列番号３９に対して少なくとも９５％の同一性を有する可変軽鎖配列を含むか、
（ｖｉ）配列番号３８と同一の可変重鎖配列、及び配列番号３９と同一の可変軽鎖配列を含むか、
（ｖｉｉ）配列番号２８のアミノ酸２０～４７０に対して少なくとも９０％の同一性を有する重鎖配列、及び配列番号２９のアミノ酸２０～２３３に対して少なくとも９０％の同一性を有する軽鎖配列を含むか、
（ｖｉｉｉ）配列番号２８のアミノ酸２０～４７０に対して少なくとも９５％の同一性を有する重鎖配列、及び配列番号２９のアミノ酸２０～２３３に対して少なくとも９５％の同一性を有する軽鎖配列を含むか、
（ｉｘ）配列番号２８のアミノ酸２０～４７０と同一の重鎖配列、及び配列番号２９のアミノ酸２０～２３３と同一の軽鎖配列を含むか、
（ｘ）配列番号２８のアミノ酸２０～４７０の重鎖配列、及び配列番号２９のアミノ酸２０～２３３の軽鎖配列からなるか、
（ｘｉ）ヒトＩｇＧ１定常ドメインを含むか、
（ｘｉｉ）ヒト化されているか、
（ｘｉｉｉ）別の部分にコンジュゲートされているか、
（ｘｉｖ）別の細胞毒性部分、標識、放射性部分、もしくは親和性タグにコンジュゲートされているか、
（ｘｖ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）に含まれるか、または
（ｘｖｉ）当該抗体が、少なくとも１つの他の抗原、任意選択で別の腫瘍抗原または免疫細胞上に発現された抗原を標的とする多重特異性または二重特異性抗体であり、任意選択で当該他の抗原が、チェックポイント阻害剤またはサイトカインまたはホルモンまたは成長因子である。
【0030】
前述の方法のいずれにおいても、上記方法は更に、任意選択で、別の治療薬を当該患者に投与することを含み、更に任意選択で、当該他の治療薬は、（ａ）微小管阻害剤、トポイソメラーゼ阻害剤、プラチン、アルキル化剤、及び代謝拮抗剤、（ｂ）ＭＫ－２２０６、ＯＮ ０１３１０５、ＲＴＡ ４０２、ＢＩ ２５３６、ソラフェニブ、ＩＳＩＳ－ＳＴＡＴ３Ｒｘ、微小管阻害剤、トポイソメラーゼ阻害剤、プラチン、アルキル化剤、代謝拮抗剤、パクリタキセル、ゲムシタビン、ドキソルビシン、ビンブラスチン、エトポシド、５－フルオロウラシル、カルボプラチン、アルトレタミン、アミノグルテチミド、アムサクリン、アナストロゾール、アザシチジン、ブレオマイシン、ブスルファン、カルムスチン、クロラムブシル、２－クロロデオキシアデノシン、シスプラチン、コルヒチン、シクロホスファミド、シタラビン、シトキサン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドセタキセル、リン酸エストラムスチン、フロクスウリジン、フルダラビン、ゲンツズマブ、ヘキサメチルメラミン、ヒドロキシ尿素、イフォスファミド、イマチニブ、インターフェロン、イリノテカン、ロムスチン、メクロレタミン、メルファレン、６－メルカプトプリン、メトトレキサート、マイトマイシン、ミトタン、ミトキサントロン、ペントスタチン、プロカルバジン、リツキシマブ、ストレプトゾシン、タモキシフェン、テモゾロミド、テニポシド、６－チオグアニン、トポテカン、トラスツズマブ、ビンクリスチン、ビンデシン、及び／またはビノレルビン、（ｃ）１－Ｄ－リボフラノシル－１，２，４－トリアゾール－３カルボキサミド、９－＞２－ヒドロキシ－エトキシメチルグアニン、アダマンタンアミン、５－ヨード－２’－デオキシウリジン、トリフルオロチミジン、インターフェロン、アデニンアラビノシド、プロテアーゼ阻害剤、チミジンキナーゼ阻害剤、糖または糖タンパク質合成阻害剤、構造タンパク質合成阻害剤、付着及び吸着阻害剤、ならびにアシクロビル、ペンシクロビル、バラシクロビル、及びガンシクロビルなどのヌクレオシド類似体、（ｄ）ＰＤ－１阻害剤または抗ＰＤ－１抗体、例えば、ＫＥＹＴＲＵＤＡ（登録商標）（ペンブロリズマブ）、ＯＰＤＩＶＯ（登録商標）（ニボルマブ）もしくはＬＩＢＴＡＹＯ（セミプリマブ）、（ｅ）ＰＤ－Ｌ１阻害剤またはＰＤ－Ｌ１抗体、例えば、ＴＥＣＥＮＴＲＩＱ（アテゾリズマブ）、ＩＭＦＩＮＺＩ（デュルバルマブ）もしくはＢＡＶＥＮＣＩＯ（アベルマブ）、あるいは（ｆ）ＣＴＬＡ－４阻害剤または抗ＣＴＬＡ－４抗体、例えば、ＹＥＲＶＯＹ（登録商標）イピリムマブから選択される。
【0031】
前述の方法のいずれにおいても、任意選択で、抗がんワクチンも、当該患者に投与される。
【0032】
前述の方法のいずれにおいても、任意選択で、当該血液悪性腫瘍細胞は、ＣＤＣ及び／またはＡＤＣＣによって死滅する。
【0033】
前述の方法のいずれにおいても、任意選択で、当該ＮＥＯ－２０１抗体は、細胞毒性部分に結合される。
【0034】
別の態様では、本発明は、インビトロで血液悪性腫瘍細胞を死滅させる方法であって、当該血液悪性腫瘍細胞をＮＥＯ－２０１抗体と接触させることを含み、任意選択で、以下のうちの１つ以上を更に含む、方法を提供する：
（ｉ）当該血液悪性腫瘍細胞を補体と接触させること、及び／または
（ｉｉ）当該血液悪性腫瘍細胞を、エフェクター細胞、任意選択で、ナチュラルキラー細胞と接触させること。
（ｉ）当該血液悪性腫瘍細胞を補体と接触させること、及び／または
（ｉｉ）当該血液悪性腫瘍細胞を、エフェクター細胞、任意選択で、ナチュラルキラー細胞と接触させること。
【0035】
別の態様では、本発明は、血液悪性腫瘍細胞によるＮＥＯ－２０１抗原の発現を検出することを含み、任意選択で、血液または生検試料などの患者試料中の血液悪性腫瘍細胞のレベルを使用して、がんを診断するか、またはがんの予後を決定する、血液悪性腫瘍細胞を検出する方法を提供し、更に任意選択で、（ｉ）当該ＮＥＯ－２０１抗体は、標識に直接的または間接的に結合され、（ｉｉ）当該検出することは、細胞選別を含み、更に任意選択で、蛍光活性化細胞選別を含む。
【0036】
別の態様では、本発明は、インビボまたはインビトロ試料中の血液悪性腫瘍細胞を染色する方法であって、当該細胞をＮＥＯ－２０１抗体と接触させることを含み、任意選択で、当該ＮＥＯ－２０１抗体は、標識に直接的または間接的に結合され、更に任意選択で、当該試料は、腫瘍生検試料であるか、または血液もしくは骨髄を含む、方法を提供する。
【0037】
別の態様では、本発明は、血液悪性腫瘍細胞を単離する方法であって、ＮＥＯ－２０１標的抗原を発現する細胞を単離することを含み、任意選択で、血液悪性腫瘍細胞を含有する試料をＮＥＯ－２０１抗体と接触させることを含み、更に任意選択で、当該ＮＥＯ－２０１抗体が直接的または間接的に標識されており、任意選択で、当該試料が血液もしくは骨髄であるか、または血液もしくは骨髄を含み、更に任意選択で、ＮＥＯ－２０１陽性血液悪性腫瘍細胞をＮＥＯ－２０１陰性細胞から分離し、更に任意選択で、細胞選別によって、更に任意選択で、蛍光活性化細胞選別によって分離することを含む、方法を提供する。
【0038】
別の態様では、本発明は、試料をＮＥＯ－２０１抗体を含む支持体と接触させることによって、血液悪性腫瘍細胞を単離する方法であって、それによって、当該血液悪性腫瘍細胞は当該支持体上に保持される、方法を提供する。
【0039】
前述の方法のいずれにおいても、当該ＮＥＯ－２０１抗体は、好ましくは、
（ｉ）配列番号２８及び配列番号２９に含まれたＶＨ及びＶＬ ＣＤＲ配列を含むか、
（ｉｉ）配列番号３８に対して少なくとも９０％の同一性を有する可変重鎖配列を含むか、
（ｉｉｉ）配列番号３９に対して少なくとも９０％の同一性を有する可変軽鎖配列を含むか、
（ｉｖ）配列番号３８に対して少なくとも９０％の同一性を有する可変重鎖配列、及び配列番号３９に対して少なくとも９０％の同一性を有する可変軽鎖配列を含むか、
（ｖ）配列番号３８に対して少なくとも９５％の同一性を有する可変重鎖配列、及び配列番号３９に対して少なくとも９５％の同一性を有する可変軽鎖配列を含むか、
（ｖｉ）配列番号３８と同一の可変重鎖配列、及び配列番号３９と同一の可変軽鎖配列を含むか、
（ｖｉｉ）配列番号２８のアミノ酸２０～４７０に対して少なくとも９０％の同一性を有する重鎖配列、及び配列番号２９のアミノ酸２０～２３３に対して少なくとも９０％の同一性を有する軽鎖配列を含むか、
（ｖｉｉｉ）配列番号２８のアミノ酸２０～４７０に対して少なくとも９５％の同一性を有する重鎖配列、及び配列番号２９のアミノ酸２０～２３３に対して少なくとも９５％の同一性を有する軽鎖配列を含むか、
（ｉｘ）配列番号２８のアミノ酸２０～４７０と同一の重鎖配列、及び配列番号２９のアミノ酸２０～２３３と同一の軽鎖配列を含むか、
（ｘ）配列番号２８のアミノ酸２０～４７０の重鎖配列、及び配列番号２９のアミノ酸２０～２３３の軽鎖配列からなるか、
（ｘｉ）ヒトＩｇＧ１定常ドメインを含むか、
（ｘｉｉ）ヒト化されているか、
（ｘｉｉｉ）別の部分にコンジュゲートされているか、
（ｘｉｖ）別の細胞毒性部分、標識、放射性部分、もしくは親和性タグにコンジュゲートされているか、
（ｘｖ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）に含まれるか、または
（ｘｖｉ）当該抗体が、少なくとも１つの他の抗原、任意選択で別の腫瘍抗原または免疫細胞上に発現された抗原を標的とする多重特異性または二重特異性抗体であり、任意選択で当該他の抗原が、チェックポイント阻害剤またはサイトカインまたはホルモンまたは成長因子である。
（ｉ）配列番号２８及び配列番号２９に含まれたＶＨ及びＶＬ ＣＤＲ配列を含むか、
（ｉｉ）配列番号３８に対して少なくとも９０％の同一性を有する可変重鎖配列を含むか、
（ｉｉｉ）配列番号３９に対して少なくとも９０％の同一性を有する可変軽鎖配列を含むか、
（ｉｖ）配列番号３８に対して少なくとも９０％の同一性を有する可変重鎖配列、及び配列番号３９に対して少なくとも９０％の同一性を有する可変軽鎖配列を含むか、
（ｖ）配列番号３８に対して少なくとも９５％の同一性を有する可変重鎖配列、及び配列番号３９に対して少なくとも９５％の同一性を有する可変軽鎖配列を含むか、
（ｖｉ）配列番号３８と同一の可変重鎖配列、及び配列番号３９と同一の可変軽鎖配列を含むか、
（ｖｉｉ）配列番号２８のアミノ酸２０～４７０に対して少なくとも９０％の同一性を有する重鎖配列、及び配列番号２９のアミノ酸２０～２３３に対して少なくとも９０％の同一性を有する軽鎖配列を含むか、
（ｖｉｉｉ）配列番号２８のアミノ酸２０～４７０に対して少なくとも９５％の同一性を有する重鎖配列、及び配列番号２９のアミノ酸２０～２３３に対して少なくとも９５％の同一性を有する軽鎖配列を含むか、
（ｉｘ）配列番号２８のアミノ酸２０～４７０と同一の重鎖配列、及び配列番号２９のアミノ酸２０～２３３と同一の軽鎖配列を含むか、
（ｘ）配列番号２８のアミノ酸２０～４７０の重鎖配列、及び配列番号２９のアミノ酸２０～２３３の軽鎖配列からなるか、
（ｘｉ）ヒトＩｇＧ１定常ドメインを含むか、
（ｘｉｉ）ヒト化されているか、
（ｘｉｉｉ）別の部分にコンジュゲートされているか、
（ｘｉｖ）別の細胞毒性部分、標識、放射性部分、もしくは親和性タグにコンジュゲートされているか、
（ｘｖ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）に含まれるか、または
（ｘｖｉ）当該抗体が、少なくとも１つの他の抗原、任意選択で別の腫瘍抗原または免疫細胞上に発現された抗原を標的とする多重特異性または二重特異性抗体であり、任意選択で当該他の抗原が、チェックポイント阻害剤またはサイトカインまたはホルモンまたは成長因子である。
【0040】
更に、上記または下記の方法のいずれかにおいて、当該ＮＥＯ－２０１抗体は、ＮＥＯ－２０１抗原への結合に関して、配列番号２８の重鎖及び配列番号２９の軽鎖を含む抗体と競合し得る。
【0041】
定義
別途定義されない限り、本明細書で用いる全ての技術的及び科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を表す。本明細書に記載されるものと同様または同等の方法及び材料は、本発明または本発明の試験で使用され得るが、適切な方法及び材料が本明細書に記載される。材料、方法、及び実施例は単なる例示であり、限定することを意図するものではない。
別途定義されない限り、本明細書で用いる全ての技術的及び科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を表す。本明細書に記載されるものと同様または同等の方法及び材料は、本発明または本発明の試験で使用され得るが、適切な方法及び材料が本明細書に記載される。材料、方法、及び実施例は単なる例示であり、限定することを意図するものではない。
【0042】
本明細書の説明において、及び下記特許請求の範囲にわたって用いられる場合、文脈が別途明確に指示しない限り、「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」の意味は、複数の指示対象を含む。
【0043】
本明細書における「急性骨髄性白血病」または「ＡＭＬ」は、全てのタイプのＡＭＬを含む。例えば、ＡＭＬの仏米英（ＦＡＢ）分類によれば、本明細書におけるＡＭＬは、ＡＭＬサブタイプ、Ｍ０～Ｍ７、すなわち、Ｍ０（未分化急性骨髄芽球性白血病）、Ｍ１（最小成熟を伴う急性骨髄芽球性白血病）、Ｍ２（成熟を伴う急性骨髄芽球性白血病）、Ｍ３（急性前骨髄球性白血病（ＡＰＬ））、Ｍ４（急性骨髄単球性白血病）、Ｍ４ ｅｏｓ（好酸球増多症を伴う急性骨髄単球性白血病）、Ｍ５（急性単球性白血病）、Ｍ６（急性赤血球性白血病）及びＭ７（急性巨核芽球性白血病）を具体的に含む。ＡＭＬのＷＨＯシステム分類によれば、本明細書におけるＡＭＬは、特定の遺伝子異常（遺伝子または染色体変化）を有するＡＭＬ、例えば、染色体８と２１との間にトランスロケーションを有するＡＭＬ、染色体１６にトランスロケーションまたは逆位を有するＡＭＬ、ＰＭＬ－ＲＡＲＡ融合遺伝子を有するＡＰＬ、染色体９と１１との間にトランスロケーションを有するＡＭＬ、染色体６と９との間にトランスロケーションを有するＡＭＬ、染色体３にトランスロケーションまたは逆位を有するＡＭＬ、染色体１と２２との間にトランスロケーションを有するＡＭＬ（巨核芽球）、ＢＣＲ－ＡＢＬ１（ＢＣＲ－ＡＢＬ）融合遺伝子を有するＡＭＬ、ＮＰＭ１遺伝子の変異を伴うＡＭＬ、ＣＥＢＰＡ遺伝子の二対立遺伝子変異を伴うＡＭＬ（すなわち、遺伝子の両方のコピーの変異）、ＲＵＮＸ１遺伝子の変異を伴うＡＭＬ、骨髄異形成関連の変化を伴うＡＭＬ、以前の化学療法または放射線に関連するＡＭＬ、最小分化を伴うＡＭＬ（ＦＡＢ Ｍ０）、成熟していないＡＭＬ（ＦＡＢ Ｍ１）、成熟を伴うＡＭＬ（ＦＡＢ Ｍ２）、急性骨髄単球性白血病（ＦＡＢ Ｍ４）、急性単芽球性／単球性白血病（ＦＡＢ Ｍ５）、純血球性白血病（ＦＡＢ Ｍ６）、急性巨核芽球性白血病（ＦＡＢ Ｍ７）、急性好塩基球性白血病、線維症を伴う急性全髄症、骨髄性肉腫（顆粒球性肉腫または緑色腫としても知られる）、及びダウン症候群に関連する骨髄増殖を具体的に含む。また、本明細書におけるＡＭＬは、ＡＭＬ様状態、すなわち、厳密にはＡＭＬではないが、混合表現型急性白血病（ＭＰＡＬ）と称されることがあるリンパ球性及び骨髄性特徴の両方を有する白血病である未分化及び二表現型急性白血病を含む。
【0044】
本明細書で使用される「アミノ酸」という用語は、天然アミノ酸、合成アミノ酸、ならびに天然アミノ酸と同様の形で機能するアミノ酸類似体及びアミノ酸模倣体を指す。天然アミノ酸は、遺伝暗号によってコードされるもの、ならびにそれらのアミノ酸が後で修飾されたもの、例えば、ヒドロキシプロリン、γ－カルボキシグルタメート及びＯ－ホスホセリンである。アミノ酸類似体とは、天然アミノ酸と同じ基本化学構造、すなわち、水素、カルボキシル基、アミノ基、及びＲ基に結合している炭素を有する化合物、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムを指す。このような類似体は、修飾されたＲ基を有するか（例えばノルロイシン）または修飾されたペプチド主鎖を有するが、天然アミノ酸と同じ基本化学構造を保持している。アミノ酸模倣体とは、アミノ酸の一般的な化学構造とは異なる構造を有するが、天然アミノ酸と同様の形で機能する化学化合物を指す。
【0045】
本明細書で使用される「ＮＫ枯渇」または「ナチュラルキラー枯渇」という用語は、正常範囲と比較して低いナチュラルキラー（ＮＫ）細胞レベルを有する患者を指す。ＮＫ細胞は、細胞毒性自然免疫リンパ球である。典型的には、ＮＫ細胞は、健康な個体における末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の５～２０％を含む。ＰＭＢＣの５％未満を含むＮＫ細胞を有する患者は、ＮＫ枯渇と呼ばれる。加えて、ＮＫ細胞が３％未満のＰＭＢＣを含む場合、この患者は、重度のＮＫ細胞枯渇と称される。加えて、正常な個人では、最大９０％のＰＢＭＣ ＮＫ細胞が、ＣＤ５６ｄｉｍＣＤ１６＋ＮＫ細胞であり、これらは最も細胞毒性のサブセットとみなされる。７０％未満のＰＢＭＣ ＮＫ細胞がＣＤ５６ｄｉｍＣＤ１６＋ＮＫ細胞である場合、この患者は、ＮＫ枯渇と称される。加えて、５０％未満のＰＢＭＣ ＮＫ細胞がＣＤ５６ｄｉｍＣＤ１６＋ＮＫ細胞である場合、この患者は、重度のＮＫ枯渇と称される。所定の患者は、これらの個々の基準のいずれかまたは両方を満たすことに基づいて、ＮＫ枯渇または重度のＮＫ枯渇と称され得る。一般的に言えば、ＮＫ枯渇または重度のＮＫ枯渇としての患者の状態は、患者から採取された試料、例えば、血液試料、例えば、１週間または２週間前に得られ、試験された試料を試験することによって決定される。ＮＫ枯渇または重度のＮＫ枯渇としての患者の状態は、疾患の診断及び／またはこのようなＮＫ細胞の枯渇に関連する一連の治療からも推定され得る。
【0046】
「抗体」は、本明細書で用いられる場合、エピトープに適合し、それを認識する特定形状を有する任意のポリペプチド鎖含有分子構造を広く指し、１つ以上の非共有結合相互作用は、分子構造とエピトープとの間の複合体を安定化する。典型的な抗体分子は、免疫グロブリンであり、全ての源、例えば、ヒト、齧歯類、ウサギ、ウシ、ヒツジ、ブタ、イヌ、ニワトリからのあらゆる種類の免疫グロブリン、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤが「抗体」であると考えられる。抗体としては、キメラ抗体、ヒト抗体、及び他の非ヒト哺乳動物抗体、ヒト化抗体、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、ラクダ抗体、ナノボディ、ＩｇＮＡＲ（サメに由来する一本鎖抗体）、小モジュール免疫薬（ＳＭＩＰ）、ならびに抗体断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及び他の抗体断片）が挙げられるが、これらに限定されない。多数の抗体コード配列が記載されており、他のものは、当該技術分野で周知の方法によって引き起こされ得る。Ｓｔｒｅｌｔｓｏｖ，ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．１４（１１）：２９０１－９、Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ，ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｎａｔｕｒｅ ３７４（６５１８）：１６８－１７３、Ｎｕｔｔａｌｌ，ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．３８（４）：３１３－２６、Ｈａｍｅｒｓ－Ｃａｓｔｅｒｍａｎ，ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ ３６３（６４２８）：４４６－８、Ｇｉｌｌ，ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７（６）：６５３－８を参照されたい。
【0047】
「ＮＥＯ－２０１抗体」とは、配列番号２８及び配列番号２９の重鎖及び軽鎖、または任意選択で、その中に含まれる定常領域と一緒に可変領域、ならびにそれらの断片及びバリアントを含む抗体を指す。そのようなバリアントには、配列番号２８及び配列番号２９に含まれたＣＤＲ配列の１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたは好ましくは６つ全てを含む配列、すなわち、配列番号３２の重鎖ＣＤＲ１、配列番号３３の重鎖ＣＤＲ２、配列番号３４の重鎖ＣＤＲ３、配列番号３５の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号３６の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３７の軽鎖ＣＤＲ３が含まれる。そのようなバリアントはまた、ＮＥＯ－２０１抗原への結合に関して、ＮＥＯ－２０１と競合する抗体も含む。当該抗体は、ヒト化され得る。当該抗体は、１つ以上のリーダー配列を含んで発現され得、発現中及び／または抗体の処理及び分泌に除去され得る。当該抗体は、当該ＮＥＯ－２０１抗体配列及び異なる抗体の結合断片を含む二特異的または多特異的抗体を含むが、これらに限定されない、一価、二価、またはより多価の形式で提示され得る。典型的には、当該抗体は、がん細胞に特異的に結合し、がん細胞への結合に関して、配列番号３８の可変重鎖及び配列番号３９の可変軽鎖を含むか、または配列番号２８の重鎖及び配列番号２９の軽鎖を含む抗体と競合する。配列番号２８及び／または配列番号２９に含まれたＣＤＲ配列のうちの１つ以上は、バリアント配列、例えば、配列番号１もしくは４の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２もしくは５の軽鎖ＣＤＲ２、配列番号３もしくは６の軽鎖ＣＤＲ３、配列番号７の重鎖ＣＤＲ１、配列番号８、１０、３０、もしくは３１の重鎖ＣＤＲ２、配列番号９もしくは１１または配列番号３０～３１の重鎖ＣＤＲ３と置換され得る。軽鎖は、配列番号１４、１６、１７、１８、１９、２０、２１、または２９の軽鎖配列に含まれるＣＤＲを含み得る。重鎖は、配列番号１５、２２、２３、２４、２５、２６、２７、または２９の重鎖配列に含まれるＣＤＲを含み得る。当該抗体は、配列番号３８に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有する可変重鎖配列、及び／または配列番号３９に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有する可変軽鎖配列を含み得、任意選択で、当該重鎖配列及び／または軽鎖配列は、配列番号２８及び配列番号２９に含まれたＣＤＲ配列の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または好ましくは６つ全て、すなわち、配列番号３２の重鎖ＣＤＲ１、配列番号３３の重鎖ＣＤＲ２、配列番号３４の重鎖ＣＤＲ３、配列番号３５の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号３６の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３７の軽鎖ＣＤＲ３を含む。当該抗体は、細胞毒性部分、放射性部分、標識、または精製タグなどの別の部分にコンジュゲートされ得る。
【0048】
本明細書で使用される「抗原」は、動物がその抗原のエピトープに結合することができる抗体を産生するように更に誘導することができる抗体が結合することができる分子または分子の一部を広く指す。抗原は、１つのエピトープを有していても、１つを超えるエピトープを有していてもよい。本明細書で言及される特定の反応は、抗原が、非常に選択的な方法で、その対応する抗体と反応し、他の抗原によって誘発され得る多数の他の抗体とは反応しないことを示す。抗原は、腫瘍特異的であり得る（例えば、膵臓及び結腸癌の腫瘍細胞によって発現される）。
【0049】
本明細書で使用される「がん」は、悪性の成長または腫瘍を引き起こす異常で制御されない細胞分裂を特徴とする任意の腫瘍性疾患（侵襲性または転移性のいずれであっても）を広く指す。
【0050】
本明細書で使用される「がんワクチン」は、がん細胞に対する免疫応答を誘発するか、または誘発することを目的とする免疫原性組成物を指す。
【0051】
本明細書で使用される「キメラ抗体」は、定常領域またはその一部分が、変更、代替、または交換されているため、抗原結合部位（可変領域）が異なるまたは変更されたクラス、エフェクター機能及び／または種の定常領域、またはキメラ抗体に新しい特性を付与する完全に異なる分子、例えば、酵素、毒素、ホルモン、成長因子、薬物などに結合され、または、可変領域またはその一部分は、異なるまたは変更された抗原特異性を有する可変領域で変更、代替、または交換されている、抗体分子を広く指す。
【0052】
本明細書で使用される「保存的に改変されたバリアント」は、アミノ酸及び核酸配列の両方に適用され、特定の核酸配列に関して、保存的に改変されたバリアントを広く指し、同一または本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸を指すか、または、核酸がアミノ酸配列をコードしない場合、本質的に同一の配列を指す。遺伝暗号の縮重のために、多数の機能的に同一の核酸が、任意の所与のタンパク質をコードする。このような核酸変動は「サイレント変動」であり、保存的に改変された変動の１つの種である。ポリペプチドをコードする本明細書中の全ての核酸配列はまた、核酸の可能なあらゆるサイレント変動を表す。当業者ならば、核酸における各コドンを、機能的に同一の分子を生じるために改変することができると理解できるであろう（ただし、通常メチオニンの唯一のコドンであるＡＵＧ、及び通常トリプトファンの唯一のコドンであるＴＧＧは除く）。
【0053】
本明細書で使用される「相補性決定領域」、「超可変領域」、または「ＣＤＲ」は、抗体の軽または重鎖の可変領域に見出される１つ以上の超可変領域または相補性決定領域（ＣＤＲ）を広く指す。Ｋａｂａｔ，ｅｔ ａｌ．（１９８７）“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ”Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤを参照されたい。これらの表現には、Ｋａｂａｔ，ｅｔ ａｌ．（１９８３）“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ”Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓに定義される「相補性決定領域」または「抗体の３次元構造における超可変ループ」（Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ（１９８７）Ｊ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１：９１７）が含まれる。各鎖内のＣＤＲは、フレームワーク領域によって極めて近接して保持され、他の鎖のＣＤＲとともに、抗原結合部位の形成に寄与する。ＣＤＲ内で、抗体抗原相互作用において、ＣＤＲによって使用される必須の接触残基を表す選択性決定領域（ＳＤＲ）として説明される選択アミノ酸が存在する。Ｋａｓｈｍｉｒｉ（２００５）Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６：２５－３４。
【0054】
本明細書で使用される「対照量」は、マーカーの試験量に対して比較される任意の量または量の範囲であり得るマーカーを広く指す。例えば、マーカーの対照量は、特定の疾患または状態を有する患者またはそのような疾患または状態を有さない人におけるマーカーの量であり得る。対照量は、絶対量（例えば、マイクログラム／ｍｌ）または相対量（例えば、シグナルの相対強度）のいずれかであり得る。
【0055】
本明細書で使用される「差次的に存在する」とは、疾患の１つを有さない患者から採取された同等の試料と比較して疾患または状態を有する患者から採取された試料中に存在するマーカーの量または質における、差異を広く指す。例えばハイブリダイゼーション及び／またはＮＡＴベースのアッセイによって測定されるように、例えば、ある試料中の核酸断片の量が、もう一方の試料中の核酸断片の量と著しく異なる場合、核酸断片は、任意選択で２つの試料間に差次的に存在し得る。ある試料中のポリペプチドの量が、もう一方の試料中のポリペプチドの量と著しく異なる場合、ポリペプチドは、２つの試料間で差次的に存在する。マーカーが一方の試料で検出可能であるが、もう一方の試料で検出可能でない場合、そのようなマーカーは差次的に存在するとみなすことができることに注意すべきである。任意に、比較的少量の上方調節が、マーカーとして役立ち得る。
【0056】
本明細書で使用される「診断的」は、病態の存在または性質を特定することを広く指す。診断的方法は、それらの感度及び特異性において異なる。診断的アッセイの「感度」は、検査で陽性を示す罹患した個体のパーセンテージである（「真の陽性」のパーセント）。アッセイによって検出されない罹患した個体は、「偽の陰性」である。罹患していない、かつアッセイにおいて検査で陰性を示す対象は、「真の陰性」と呼ばれる。診断的アッセイの「特異性」は、１－偽の陽性率であり、「偽の陽性」率は、検査で陽性を示す疾患のない者の割合として定義される。特定の診断的方法は、状態の確定診断を提供しないことがあるが、この方法が診断を補助する陽性表示を提供することをもって足りる。
【0057】
本明細書で使用される「診断する」は、疾患または症状を分類することと、疾患の重症度を決定することと、疾患の進行を監視することと、疾患の転帰及び／または回復の見通しを予測することと、を広く指す。「検出する」という用語も、前述のいずれかを任意に包含し得る。本発明に従う疾患の診断は、いくつかの実施形態において、対象から得られた生物試料中の本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドのレベルを決定することによって影響されることがあり、決定されるレベルは、疾患に対する素因、または疾患の存在もしくは非存在と相関し得る。「対象から得られた生物試料」は、対象から物理的に除去されていない試料も任意に含み得ることに留意すべきである。
【0058】
本明細書で使用される「有効量」は、所望の結果を達成する化合物、抗体、抗原、または細胞の量を広く指す。「有効量」は、疾患を治療するために患者に投与された時に、その疾患についてそのような治療を行うのに十分である。有効量は、予防に有効な量、及び／または防止に有効な量であり得る。有効量は、兆候／症状の発生を低減するために有効な量、防止するために有効な量、兆候／症状の発生の重症度を低減するため、兆候／症状の発生を排除するため、兆候／症状の発生の発達を遅延させるため、兆候／症状の発生の発達を防止するため、及び／または兆候／症状の発生の予防をもたらすために有効な量であり得る。「有効量」は、疾患及びその重症度、ならびに治療される患者の年齢、体重、病歴、感受性、及び既存状態に応じて異なり得る。「有効量」という用語は、本開示の目的で「治療上有効な量」と同義である。
【0059】
本明細書で使用される「発現ベクター」は、本開示の核酸配列を、インビトロまたはインビボで原核生物、酵母、真菌、植物、昆虫、または哺乳動物の細胞を含むいずれかの細胞において、構成的または誘導的に発現させる目的での、いずれの組換え発現系を広く指す。この用語には、線状または環状の発現系が含まれる。この用語には、エピソームのままであるかまたは宿主細胞のゲノムに組み込まれた発現系が含まれる。この発現系は、自己複製能力を有することも有しないこともでき、すなわち、細胞内で一過性の発現のみを駆動することもできる。この用語には、組換え核酸の転写に必要な最低限の要素のみを含む組換え発現カセットが含まれる。
【0060】
本明細書で使用される「フレームワーク領域」または「ＦＲ」は、抗体の軽鎖及び重鎖の可変領域内の１つ以上のフレームワーク領域を広く指す。Ｋａｂａｔ，ｅｔ ａｌ．（１９８７）“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ”Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤを参照されたい。これらの表現は、抗体の軽鎖及び重鎖の可変領域内で、ＣＤＲの間に挿入されるアミノ酸配列領域を含む。
【0061】
「血液悪性腫瘍」は、骨髄などの造血組織、または免疫系の細胞で始まるがんの形態を指す。血液悪性腫瘍の例としては、白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫、及び骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）が挙げられる。血液悪性腫瘍のより具体的な例としては、辺縁帯リンパ腫（ＭＺＬ）（脾辺縁帯リンパ腫（ＳＭＺＬ）を含む）、バーキットリンパ腫（ＢＬ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）（形質細胞白血病（ＰＣＬ）及び骨髄腫性髄外疾患（ＥＭＤ）を含む）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）（Ｂ細胞ＡＭＬを含む）、急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、Ｔ細胞リンパ腫（ＴＣＬ）（未分化大細胞リンパ腫（ＡＬＣＬ）及びセザリー症候群を含む）、ならびにホジキンリンパ腫（ＨＬ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【0062】
「急性骨髄性白血病」または「ＡＭＬ」は、全てのタイプのＡＭＬを含む。ＡＭＬの仏米英（ＦＡＢ）分類によれば、本明細書におけるＡＭＬは、ＡＭＬサブタイプ、Ｍ０～Ｍ７、すなわち、Ｍ０（未分化急性骨髄芽球性白血病）、Ｍ１（最小成熟を伴う急性骨髄芽球性白血病）、Ｍ２（成熟を伴う急性骨髄芽球性白血病）、Ｍ３（急性前骨髄球性白血病（ＡＰＬ））、Ｍ４（急性骨髄単球性白血病）、Ｍ４ ｅｏｓ（好酸球増多症を伴う急性骨髄単球性白血病）、Ｍ５（急性単球性白血病）、Ｍ６（急性赤血球性白血病）及びＭ７（急性巨核芽球性白血病）を具体的に含む。
【0063】
ＡＭＬのＷＨＯシステム分類によれば、本明細書におけるＡＭＬは、特定の遺伝子異常（遺伝子または染色体変化）を有するＡＭＬ、例えば、染色体８と２１との間にトランスロケーションを有するＡＭＬ、染色体１６にトランスロケーションまたは逆位を有するＡＭＬ、ＰＭＬ－ＲＡＲＡ融合遺伝子を有するＡＰＬ、染色体９と１１との間にトランスロケーションを有するＡＭＬ、染色体６と９との間にトランスロケーションを有するＡＭＬ、染色体３にトランスロケーションまたは逆位を有するＡＭＬ、染色体１と２２との間にトランスロケーションを有するＡＭＬ（巨核芽球）、ＢＣＲ－ＡＢＬ１（ＢＣＲ－ＡＢＬ）融合遺伝子を有するＡＭＬ、ＮＰＭ１遺伝子の変異を伴うＡＭＬ、ＣＥＢＰＡ遺伝子の二対立遺伝子変異を伴うＡＭＬ（すなわち、遺伝子の両方のコピーの変異）、ＲＵＮＸ１遺伝子の変異を伴うＡＭＬ、骨髄異形成関連の変化を伴うＡＭＬ、以前の化学療法または放射線に関連するＡＭＬ、最小分化を伴うＡＭＬ（ＦＡＢ Ｍ０）、成熟していないＡＭＬ（ＦＡＢ Ｍ１）、成熟を伴うＡＭＬ（ＦＡＢ Ｍ２）、急性骨髄単球性白血病（ＦＡＢ Ｍ４）、急性単芽球性／単球性白血病（ＦＡＢ Ｍ５）、純血球性白血病（ＦＡＢ Ｍ６）、急性巨核芽球性白血病（ＦＡＢ Ｍ７）、急性好塩基球性白血病、線維症を伴う急性全髄症、骨髄性肉腫（顆粒球性肉腫または緑色腫としても知られる）、及びダウン症候群に関連する骨髄増殖を具体的に含む。また、本明細書におけるＡＭＬは、ＡＭＬ様状態、すなわち、厳密にはＡＭＬではないが、混合表現型急性白血病（ＭＰＡＬ）と称されることがあるリンパ球性及び骨髄性特徴の両方を有する白血病である未分化及び二表現型急性白血病を含む。
【0064】
本明細書で使用される「異種」は、核酸が、自然では互いに同一の関係では見出されない２つ以上の部分配列を含むことを示す核酸の一部を広く指す。例えば、核酸は、典型的には、組換えにより生成され、新しい機能的核酸を作製するように配置された無関係の遺伝子由来の２つ以上の配列を有し、例えばある供給源からのプロモーター及び他の供給源からのコード領域を有する。同様に、異種タンパク質は、タンパク質が自然では互いに同一の関係では見出されない２つ以上の部分配列を含むこと（例えば、融合タンパク質）を示す。
【0065】
本明細書で使用される「高親和性」とは、標的抗原に対して少なくとも１０－８Ｍ、より好ましくは少なくとも１０－９Ｍ、更により好ましくは少なくとも１０－１０ＭのＫＤを有する抗体を広く指す。しかしながら、「高親和性」結合は、他の抗体アイソタイプに対して変動し得る。例えば、ＩｇＭアイソタイプに対する「高親和性」結合は、少なくとも１０－７Ｍ、より好ましくは少なくとも１０－８ＭのＫＤを有する抗体を指す。
【0066】
本明細書で使用される「相同性」は、核酸配列と参照核酸配列との間、またはポリペプチド配列と参照ポリペプチド配列との間の類似性の程度を広く指す。相同性は、部分的または完全なものであり得る。完全相同性は、核酸配列またはアミノ酸配列が同一であることを示す。部分的に相同な核酸またはアミノ酸配列は、参照核酸またはアミノ酸配列と同一ではないものである。相同性の程度は、配列比較によって決定することができる。「配列同一性」という用語は、「相同性」と互換的に使用され得る。
【0067】
本明細書で使用される「宿主細胞」は、発現ベクターを含み、かつ発現ベクターの複製または発現を支持する細胞を広く指す。宿主細胞は、原核細胞、例えばＥ．ｃｏｌｉ、または真核細胞、例えば酵母、昆虫（例えば、ＳＦ９）、両生類または哺乳動物の細胞、例えばＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＨＥＫ－２９３、例えば、培養細胞、外植片及びインビボでの細胞であり得る。
【0068】
本明細書で使用される「ハイブリダイゼーション」は、鎖が互いに逆平行に配置された時の相補的ヌクレオチド間の水素結合の形成による相補的（部分的相補を含む）ポリヌクレオチド鎖の物理的相互作用を広く指す。
【0069】
本明細書で使用される「Ｋ－ａｓｓｏｃ」または「Ｋａ」は、特定の抗体抗原相互作用の会合速度を広く指し、一方、本明細書で使用される「Ｋｄｉｓｓ」または「Ｋｄ」という用語は、特定の抗体抗原相互作用の解離速度を指す。本明細書で使用される「ＫＤ」という用語は、Ｋｄ対Ｋａの比（すなわち、Ｋｄ／Ｋａ）から得られ、モル濃度（Ｍ）として表される解離速度を指す。抗体に対するＫＤ値は、当該技術分野で十分に確立されている方法を使用して決定することができる。
【0070】
本明細書で使用される「イムノアッセイ」は、抗体を使用して抗原に特異的に結合させるアッセイを広く指す。イムノアッセイは、抗原を単離、標的、及び／または定量する特定の抗体の特異的結合特性の使用を特徴とし得る。
【0071】
本明細書で使用される「単離された」は、それが天然に存在するその元の環境から除去され、したがってその天然環境からヒトの手によって改変された材料を広く指す。単離された材料は、例えば、ベクター系に含まれる外因性核酸、宿主細胞内に含有される外因性核酸、またはその元の環境から除去され、したがってヒトの手によって改変された任意の材料（例えば、「単離された抗体」）であり得る。
【0072】
本明細書で使用される「標識」または「検出可能な部分」は、顕微鏡的、光化学的、生化学的、免疫化学的、化学的、または他の物理的手段によって検出可能な組成物を広く指す。
【0073】
本明細書で使用される「低ストリンジェンシー」、「中ストリンジェンシー」、「高ストリンジェンシー」、または「非常に高ストリンジェンシーの条件」は、核酸ハイブリダイゼーション及び洗浄についての条件を広く指す。ハイブリダイゼーション反応を行うための手引きは、Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（５ｔｈ Ｅｄ．）Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ＮＹに見出すことができる。例示的な特定のハイブリダイゼーション条件には、（１）低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件：約４５℃で、６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中、次いで少なくとも５０℃で０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で２回洗浄（低ストリンジェンシー条件では、洗浄温度は５５℃まで上昇させることができる）、（２）中ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件：約４５℃で、６×ＳＳＣ、次いで６０℃、０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で１回以上洗浄、（３）高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件：約４５℃で、６×ＳＳＣ中、次いで、６５℃で、０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で１回以上洗浄、及び（４）非常に高いストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件：６５℃で、０．５Ｍリン酸ナトリウム、７％ＳＤＳ、次いで、６５℃で、０．２×ＳＳＣ、１％ＳＤＳで１回以上洗浄が含まれるが、これらに限定されない。
【0074】
ＣＤ１２７などのマーカーに関して使用される「低レベル」または「低」という用語は、当該技術分野でよく知られており、対象となる細胞マーカー（例えば、ＣＤ１２７）の発現レベルを指し、細胞マーカーの発現レベルは全体として分析されている細胞集団における他の細胞におけるその細胞マーカーの発現レベルと比較して低い。より具体的には、「低」という用語は、１つ以上の他の別個の細胞集団よりも低いレベルで細胞マーカーを発現する別個の細胞集団を指す。したがって、ＣＤ１２７低は、例えば、ＣＤ１２７－亜集団よりも高いがＣＤ１２７＋亜集団よりも低いレベルで、標識されたＣＤ１２７抗体と接触した時にわずかにまたはぼんやりと染色する種類の細胞を指す。
【0075】
「哺乳動物」は、本明細書で用いられる場合、皮膚の体毛被覆、及び雌において、子を育てるための乳汁産生乳腺を特徴とする、ヒトを含む哺乳類クラスの任意かつ全ての温血脊椎動物を広く指す。哺乳動物の例には、アルパカ、アルマジロ、カピバラ、ネコ、ラクダ、チンパンジー、チンチラ、ウシ、イヌ、ヤギ、ゴリラ、ハムスター、ウマ、ヒト、キツネザル、ラマ、マウス、非ヒト霊長類、ブタ、ラット、ヒツジ、トガリネズミ、リス、及びバクが含まれるが、これらに限定されない。哺乳動物には、ウシ科、イヌ科、ウマ科、ネコ科、ネズミ科、ヒツジ科、ブタ科、霊長類、及び齧歯類が含まれるが、これらに限定されない。哺乳動物には、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ ＤＣにあるＳｍｉｔｈｓｏｎｉａｎ自然史博物館によって維持される世界の哺乳類に列挙される任意かつ全てのものも含まれる。
【0076】
本明細書で使用される「核酸」または「核酸配列」は、一本鎖または二本鎖のいずれかの形態のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドオリゴヌクレオチドを広く指す。この用語は、天然ヌクレオチドの既知の類似体を含む核酸、すなわちオリゴヌクレオチドを包含する。この用語はまた、合成骨格を有する核酸様構造も包含する。他に示されない限り、特定の核酸配列はまた、保存的に改変されたそのバリアント（例えば、縮重コドン置換）及び相補的配列、ならびに明確に示された配列を暗に包含する。核酸という用語は、遺伝子、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、及びポリヌクレオチドと互換的に使用される。
【0077】
本明細書で使用される「作動可能に連結された」とは、２つのＤＮＡ断片によってコードされるアミノ酸配列がインフレームに維持されるように２つのＤＮＡ断片が結合される時を広く指す。
【0078】
本明細書で使用される場合、「パラトープ」は、抗原を認識する抗体の部分（例えば、抗体の抗原結合部位）を広く指す。パラトープは、抗体のＦｖ領域の小さな領域（例えば、１５～２２個のアミノ酸）であってもよく、抗体の重鎖及び軽鎖の一部を含有してもよい。Ｇｏｌｄｓｂｙ，ｅｔ ａｌ．Ａｎｔｉｇｅｎｓ（Ｃｈａｐｔｅｒ ３）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（５ｔｈ Ｅｄ．）Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，ｐａｇｅｓ ５７－７５を参照されたい。
【0079】
「患者」は、本明細書で用いられる場合、疾患状態を軽減するか、または疾患状態の発生もしくは再発を防止するかのいずれかのために治療を必要とする任意の動物を広く指す。また、本明細書で使用される「患者」は、危険因子、病歴、感受性、症状、兆候を有し、疾患が以前に診断されたか、疾患の危険性があるか、または疾患の患者集団の一員である、任意の動物を広く指す。患者は、ヒトなどの臨床患者、または随伴動物、家畜動物、畜産動物、珍しい動物、または動物園動物などの獣医学的患者であり得る。「対象」という用語は、「患者」という用語と互換的に使用され得る。本明細書に開示される本発明の好ましい実施形態において、患者は、ヒトである。
【0080】
「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」という用語は、互換的に使用され、アミノ酸残基のポリマーを広く指す。これらの用語は、１つ以上のアミノ酸残基が、対応する天然アミノ酸の類似体または模倣体であるアミノ酸ポリマーと、天然アミノ酸ポリマーに適用される。これらの用語は、１つ以上のアミノ酸残基が、対応する天然アミノ酸の人工的な化学的模倣体であるアミノ酸ポリマーと、天然アミノ酸ポリマーと、非天然アミノ酸ポリマーに適用される。ポリペプチドは、例えば、糖タンパク質を形成するための炭水化物残基の添加によって改変され得る。「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」という用語には、糖タンパク質、ならびに非糖タンパク質が含まれる。
【0081】
本明細書で使用される「プロモーター」は、核酸の転写を支配する一連の核酸配列を広く指す。本明細書で使用される場合、プロモーターは、ポリメラーゼＩＩ型プロモーターの場合においては、ＴＡＴＡ要素などの、転写の開始部位の近くで必要な核酸配列を含む。プロモーターはまた、任意に、転写の開始部位から数千塩基も離れて位置することができる遠位エンハンサーまたはリプレッサーエレメントを含むことができる。「構成性」プロモーターは、ほとんどの環境及び発達条件下で活性であるプロモーターである。「誘導性」プロモーターは、環境及び発達制御下で活性であるプロモーターである。
【0082】
本明細書で使用される「予防的有効量」は、疾患の予防または疾患の再発の防止のために患者に投与された時に、その疾患または再発についてそのような予防をもたらすのに十分である化合物の量を広く指す。予防的有効量は、兆候及び／または症状の発生を防止するのに有効な量であり得る。「予防的有効量」は、疾患及びその重症度、ならびに治療される患者の年齢、体重、病歴、状態になりやすい傾向、先行する状態に応じて異なり得る。
【0083】
本明細書で使用される「予防」は、兆候及び／または症状が患者に存在しない、寛解期であり、または患者において以前に存在していた、一連の治療を広く指す。予防は、患者において疾患の治療の後で疾患が起こることを防止することを含む。更に、防止は、疾患を潜在的に発症し得る患者、特に、疾患に影響されやすい患者（例えば、患者集団のメンバー、危険因子を有する、または疾患を発生する危険性のあるもの）を治療することを含む。
【0084】
本明細書で使用される「組換え」は、産物、例えば、細胞、または核酸、タンパク質、またはベクターに関して広く指し、細胞、核酸、タンパク質、またはベクターが、異種核酸もしくはタンパク質、または天然の核酸もしくはタンパク質の導入、または細胞がそのように改変された細胞に由来することを示す。したがって、例えば、組換え細胞は、細胞の天然（非組換え）形態内に見出されない遺伝子を発現するか、さもなければ異常に発現され、発現が不十分または全く発現されない天然遺伝子を発現する。
【0085】
本明細書で使用される、抗体に「特異的に（または選択的に）結合する」または「特異的に（または選択的に）免疫反応する」または「特異的に相互作用するまたは結合する」は、タンパク質またはペプチド（または他のエピトープ）を広く指し、いくつかの実施形態において、タンパク質及び他の生物製剤の不均一な集団におけるタンパク質の存在を決定する結合反応を指す。例えば、指定されたイムノアッセイ条件下で、特定された抗体は、バックグラウンド（非特異的シグナル）よりも少なくとも２倍多い特定のタンパク質に結合し、試料に存在する他のタンパク質に有意な量で実質的に結合しない。典型的に、特異的または選択的反応は、少なくとも２倍のバックグラウンド信号またはノイズであり、より典型的には約１０～１００倍超のバックグラウンドである。
【0086】
本明細書で使用される「特異的にハイブリダイズ可能」及び「相補的」とは、核酸が、従来のワトソンクリックまたは他の従来とは異なる種類のいずれかによって別の核酸配列と水素結合（複数可）を形成することができることを広く指す。核酸分子とその相補的配列の結合自由エネルギーは、核酸の関連する機能、例えばＲＮＡｉ活性が進むことを可能にするのに十分である。核酸分子のための結合自由エネルギーの決定は、当該技術分野で周知である。例えば、Ｔｕｒｎｅｒ，ｅｔ ａｌ．（１９８７）ＣＳＨ Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．ＬＩＩ：１２３－３３、Ｆｒｉｅｒ，ｅｔ ａｌ．（１９８６）ＰＮＡＳ ８３：９３７３－７７、Ｔｕｒｎｅｒ，ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０９：３７８３－８５を参照されたい。相補性パーセントは、第２の核酸配列と水素結合（例えば、ワトソンクリック型塩基対合）を形成することができる核酸分子中の連続する残基の割合を示す（例えば、１０個のうち少なくとも約５、６、７、８、９、１０個が少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、及び１００％の相補性を有する）。「完全に相補的」または１００％の相補性とは、第２の核酸配列中の同じ数の連続する残基と水素結合する核酸配列の連続する残基の全てを広く指す。「実質的な相補的」とは、非相補的であるように選択されたオーバーハングなどのポリヌクレオチド鎖の領域を除いて、少なくとも約９０％の相補性を示すポリヌクレオチド鎖を指す。特異的結合は、特異的結合が望まれる条件下で、すなわちインビボアッセイまたは治療的処置の場合には生理学的条件下で、またはインビトロアッセイの場合にはアッセイが行われる条件下で、非標的配列へのオリゴマー化合物の非特異的結合を回避するのに十分な程度の相補性を必要とする。非標的配列は、典型的には、少なくとも５ヌクレオチドが異なり得る。
【0087】
本明細書で使用される疾患の「兆候」は、患者の検査で発見可能な、疾患を示す任意の異常、疾患を示す主観である兆候とは対照的に、疾患を示す目的を広く指す。
【0088】
本明細書で使用される「固体支持体」、「支持体」、及び「基板」は、平滑な支持体（例えば、金属、ガラス、プラスチック、シリコン、及びセラミックの表面）、ならびに、凹凸がある、及び多孔質の材料を含むが、これらに限定されない、別の材料が連結され得る固体または半固体構造を提供する任意の材料を広く指す。例示的な固体支持体には、活性化ビーズ、磁気応答性ビーズ、または蛍光標識ビーズなどのビーズが含まれる。
【0089】
本明細書で使用される「対象」は、本明細書に開示される本発明に従って治療されるのに適した者を広く指し、限定されないが鳥類及び哺乳動物対象を含み、好ましくは哺乳動物である。本開示される本発明の文脈における哺乳動物には、イヌ科、ネコ科、ウシ科、ヤギ科、ウマ科、ヒツジ科、ブタ科、齧歯類（例えば、ラット及びマウス）、ウサギ科、霊長類、ヒトが含まれるが、これらに限定されない。本明細書に開示される本発明に従って治療されることを必要とする任意の哺乳動物対象が適している。両性別及び任意の発達段階（すなわち、新生児、幼児、若年、青年、成人）のヒト対象を、本発明に従って治療することができる。本発明は、獣医目的で、ならびに薬物スクリーニング及び薬物開発の目的で、動物対象、特にマウス、ラット、イヌ、ネコ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、及びウマなどの哺乳動物対象で実行されてもよい。「対象」は、「患者」と互換的に使用される。開示される本発明の好ましい実施形態において、対象は、ヒトである。
【0090】
本明細書で使用される疾患の「症状」は、患者によって経験され、疾患を示す任意の病的現象または構造、機能、もしくは感覚の正常からの離脱を広く指す。
【0091】
本明細書で使用される「治療法」、「治療的」、「治療する」、または「治療」は、疾患を治療すること、疾患もしくはその臨床症状の発達を停止もしくは低減すること、及び／または疾患を緩和し、疾患もしくはその臨床症状の退行を引き起こすことを広く指す。治療法は、疾患、疾患の兆候、及び／または症状の予防、治療、修復、低減、軽減、及び／または緩和の提供を包含する。治療法は、進行中の疾患の兆候及び／または症状（例えば、腫瘍の成長、転移）を有する患者における兆候及び／または症状の軽減を包含する。治療法は、「予防」も包含する。「低減された」という用語は、治療の目的で、兆候及び／または症状の臨床的に有意な低減を広く指す。治療法は、再燃または再発性の兆候及び／または症状の兆候（例えば、腫瘍の成長、転移）を治療することを含む。治療法は、兆候及び／または症状をいつでも除外すること、ならびに既存の兆候及び／または症状を低減すること、及び既存の兆候及び／または症状を排除することを包含するが、これらに限定されない。治療法は、慢性疾患（「維持」）及び急性疾患を治療することを含む。例えば、治療は、兆候及び／または症状（例えば、腫瘍の成長、転移）の再燃または再発を治療または予防することを含む。
【0092】
本明細書で使用される「可変領域」または「ＶＲ」は、抗体の抗原への結合に直接関与する抗体の軽鎖及び重鎖の各ペア内のドメインを広く指す。各重鎖は、一方の端に可変ドメイン（ＶＨ）を有し、続いて、いくつかの定常ドメインを有する。各軽鎖は、一方の端に可変ドメイン（ＶＬ）を有し、その他方の端に定常ドメインを有し、軽鎖の定常ドメインは、重鎖の第１の定常ドメインと整列し、軽鎖の可変ドメインは、重鎖の可変ドメインと整列している。
【0093】
本明細書で使用される「ベクター」は、宿主細胞内で自発的に複製することができ、１つまたは少数の制限エンドヌクレアーゼ認識部位を特徴とするプラスミド、コスミド、ファージミド、ファージＤＮＡ、または他のＤＮＡ分子を広く指し、そのようなＤＮＡ配列がベクターの本質的な生物学的機能を失うことなく決定可能な方法で切断され得、その複製及びクローニングを生じさせるためにＤＮＡが挿入され得る。ベクターは更に、ベクターで形質転換された細胞の同定に使用するのに適したマーカーを含んでもよい。
【0094】
技術及び手順は一般に、当該技術分野において周知である従来の方法に従って、かつ本明細書全体を通して引用され、考察される、一般的かつより具体的な様々な参考文献に記載されるように実行される。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｍｏｌｅｃ．Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ｌａｂ．Ｍａｎｕａｌ［３ｒｄ Ｅｄ］Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓを参照されたい。組換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチド合成、ならびに組織培養及び形質転換（例えば、電気穿孔、リポフェクション）には、標準技術が使用され得る。酵素反応及び精製技術は、製造業者の仕様書に従って、または当該技術分野において一般的に達成されるように、または本明細書に記載されるように実行され得る。本明細書に記載される分析化学、合成有機化学、及び医薬及び薬学的化学と関連して利用される命名法、ならびに実験室の手順及び技術は、当該技術分野で周知であり、一般的に使用される。標準的な技術は、化学合成、化学分析、薬学的調製、製剤、及び送達、ならびに患者の治療に使用され得る。
【実施例】
【0095】
ここで一般に説明される本発明は、単に本発明のある特定の態様及び実施形態の説明の目的で含まれ、本発明を限定するものではない次の実施例を参照することによって、より容易に理解されるであろう。
【0096】
実施例１：ＮＥＯ－２０１による血液腫瘍細胞株の結合及び溶解を検出するアッセイ
方法
腫瘍細胞株
急性前骨髄球性白血病細胞株［ＨＬ－６０］（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ－２４０（商標））は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ，ＵＳＡ）から入手した。細胞株を、マイコプラズマを含まない低継代数で使用し、増殖及び維持のために提供者によって指定された培地中で３７℃／５％ＣＯ２で培養した。
方法
腫瘍細胞株
急性前骨髄球性白血病細胞株［ＨＬ－６０］（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ－２４０（商標））は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ，ＵＳＡ）から入手した。細胞株を、マイコプラズマを含まない低継代数で使用し、増殖及び維持のために提供者によって指定された培地中で３７℃／５％ＣＯ２で培養した。
【0097】
ヒト健康ドナーＰＢＭＣ
健康なヒトドナー由来の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、適切なＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ｂｏａｒｄの承認及びインフォームドコンセントの下、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ Ｂｌｏｏｄ Ｂａｎｋ（ＮＣＴ００００１８４６）から入手した。
健康なヒトドナー由来の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、適切なＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ｂｏａｒｄの承認及びインフォームドコンセントの下、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ Ｂｌｏｏｄ Ｂａｎｋ（ＮＣＴ００００１８４６）から入手した。
【0098】
ＰＢＭＣを、完全培地中の３７℃／５％ＣＯ２で一晩インキュベートしてから、ＡＤＣＣアッセイでエフェクター細胞として使用した。完全な培地は、１０％の胎児ウシ血清１０％米国産、熱不活性化ＨｙＣｌｏｎｅウシ胎児血清定義（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｓｓａｑｕａｈ，ＷＡ，ＵＳＡ）を含有するＲＰＭＩ－１６４０培地（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ，ＵＳＡ）、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ，ＵＳＡ）によって構成される。
【0099】
ＮＫ細胞の精製
ＮＫエフェクター細胞を、製造業者のプロトコルに従って、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｈｕｍａｎ ＮＫ細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｃｏｌｏｇｎｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から単離した。健康なドナーから単離されたＮＫ細胞を、ＡＤＣＣアッセイでエフェクター細胞として使用する前に、完全な培地中の３７℃／５％ＣＯ２で一晩インキュベートした。
ＮＫエフェクター細胞を、製造業者のプロトコルに従って、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｈｕｍａｎ ＮＫ細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｃｏｌｏｇｎｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から単離した。健康なドナーから単離されたＮＫ細胞を、ＡＤＣＣアッセイでエフェクター細胞として使用する前に、完全な培地中の３７℃／５％ＣＯ２で一晩インキュベートした。
【0100】
抗体
本研究で使用したモノクローナル抗体ＮＥＯ－２０１は、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ，Ｉｎｃ．によって提供された。ヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡによって購入された。
本研究で使用したモノクローナル抗体ＮＥＯ－２０１は、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ，Ｉｎｃ．によって提供された。ヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡによって購入された。
【0101】
フローサイトメトリー
ＨＬ－６０細胞株におけるＮＥＯ－２０１によって認識される細胞表面抗原の発現の分析をフローサイトメトリーによって行った。細胞を採取し、カウントして、（１．０×１０６）の濃度を得た。次いで、細胞を遠心分離し、冷たいＰＢＳで２回洗浄し、次いで、１×ＰＢＳ＋１％ＢＳＡ（Ｔｅｋｎｏｖａ，Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ，ＣＡ，ＵＳＡ）中の１０μｇ／ｍＬのＦＩＴＣコンジュゲートＮＥＯ－２０１抗体で４℃で３０分間染色した。
ＨＬ－６０細胞株におけるＮＥＯ－２０１によって認識される細胞表面抗原の発現の分析をフローサイトメトリーによって行った。細胞を採取し、カウントして、（１．０×１０６）の濃度を得た。次いで、細胞を遠心分離し、冷たいＰＢＳで２回洗浄し、次いで、１×ＰＢＳ＋１％ＢＳＡ（Ｔｅｋｎｏｖａ，Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ，ＣＡ，ＵＳＡ）中の１０μｇ／ｍＬのＦＩＴＣコンジュゲートＮＥＯ－２０１抗体で４℃で３０分間染色した。
【0102】
染色後、細胞を冷たいＰＢＳで２回洗浄し、ＦＡＣＳ ＣＡＮＴＯ ＩＩフローサイトメーター（ＢＤ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して検査した。細胞蛍光の分析は、ＦＣＳ Ｅｘｐｒｅｓｓソフトウェアを使用して行った。ＦＩＴＣコンジュゲートＮＥＯ－２０１抗体で染色された細胞を有する未染色細胞に直面して陽性を決定した。染色値が１０％を超える陽性とみなされ、ＮＥＯ－２０１発現が陽性とみなされた。
【0103】
インビトロＡＤＣＣアッセイ
４時間１１１Ｉｎリリースアッセイを使用して、ＮＥＯ－２０１によって媒介されるＡＤＣＣを評価した。急性前骨髄球性白血病細胞株ＨＬ－６０を標的として使用し、ＰＢＭＣまたは単離されたＮＫ細胞をＮＥＯ－２０１またはＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体の存在下で、または単独でエフェクターとして使用した。標的細胞を採取し、カウントした。１×１０６個の標的細胞を完全培地に懸濁させ、２０μＣｉ１１１Ｉｎ－オキシキノリン（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｓｉｌｖｅｒ Ｓｐｒｉｎｇ，ＭＤ）で標識し、３７℃／５％ＣＯ２で２０分間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を完全培地で２回洗浄し、次いで９６ウェル丸底培養プレートに３０００細胞／ウェルで播種した。続いて、ＮＥＯ－２０１またはＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体を１０μｇ／ｍＬの濃度で標的細胞に添加した。次いで、エフェクターをプレートに添加した。エフェクターとしてＰＢＭＣを用いて行ったＡＤＣＣアッセイについて、ＰＢＭＣを、５０：１及び２５：１のエフェクター細胞：標的細胞（Ｅ：Ｔ）比で９６ウェルの丸底培養プレートに添加した。エフェクターとしてＮＫ細胞を用いて行ったＡＤＣＣアッセイについて、ＮＫ細胞を、２０：１及び１０：１のエフェクター細胞：標的細胞（Ｅ：Ｔ）比で９６ウェルの丸底培養プレートに添加した。
４時間１１１Ｉｎリリースアッセイを使用して、ＮＥＯ－２０１によって媒介されるＡＤＣＣを評価した。急性前骨髄球性白血病細胞株ＨＬ－６０を標的として使用し、ＰＢＭＣまたは単離されたＮＫ細胞をＮＥＯ－２０１またはＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体の存在下で、または単独でエフェクターとして使用した。標的細胞を採取し、カウントした。１×１０６個の標的細胞を完全培地に懸濁させ、２０μＣｉ１１１Ｉｎ－オキシキノリン（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｓｉｌｖｅｒ Ｓｐｒｉｎｇ，ＭＤ）で標識し、３７℃／５％ＣＯ２で２０分間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を完全培地で２回洗浄し、次いで９６ウェル丸底培養プレートに３０００細胞／ウェルで播種した。続いて、ＮＥＯ－２０１またはＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体を１０μｇ／ｍＬの濃度で標的細胞に添加した。次いで、エフェクターをプレートに添加した。エフェクターとしてＰＢＭＣを用いて行ったＡＤＣＣアッセイについて、ＰＢＭＣを、５０：１及び２５：１のエフェクター細胞：標的細胞（Ｅ：Ｔ）比で９６ウェルの丸底培養プレートに添加した。エフェクターとしてＮＫ細胞を用いて行ったＡＤＣＣアッセイについて、ＮＫ細胞を、２０：１及び１０：１のエフェクター細胞：標的細胞（Ｅ：Ｔ）比で９６ウェルの丸底培養プレートに添加した。
【0104】
標的細胞もまた、自発放出を計算するために完全培地単独で、または完全溶解を計算するために０．０５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００でインキュベートした。
【0105】
次いで、プレートを３７℃／５％ＣＯ２で４時間インキュベートした。
【0106】
インキュベーション後、プレート内のウェルから培地を回収し、自発放出、完全溶解及び特異的溶解をガンマカウンターでカウントした。
【0107】
特異的ＡＤＣＣ溶解の割合は、以下の方程式を使用して決定された：
特異的溶解率＝（実験溶解－自発放出）／（完全溶解－自発放出）×１００
特異的溶解率＝（実験溶解－自発放出）／（完全溶解－自発放出）×１００
【0108】
実施例２：血液悪性腫瘍細胞によるＮＥＯ－２０１発現の検出
ＮＥＯ－２０１が血液新生物に結合する能力を、フローサイトメトリーによって解析した。ヒトＨＬ－６０細胞（急性前骨髄球性白血病細胞株）を標的として使用した。
ＮＥＯ－２０１が血液新生物に結合する能力を、フローサイトメトリーによって解析した。ヒトＨＬ－６０細胞（急性前骨髄球性白血病細胞株）を標的として使用した。
【0109】
データは、ＮＥＯ－２０１によって認識される抗原を発現する細胞のパーセンテージとして提示される。ＮＥＯ－２０１との反応性を、染色されていない細胞（図１Ａ～１Ｄ、左パネル）を、１０μｇ／ｍＬのＦＩＴＣコンジュゲートＮＥＯ－２０１（図１、右パネル）で染色された細胞と比較することによって決定した。陽性率は、≧１０％の陽性細胞の％として定義した。結果は、４つの独立した反復について示される（各々、図１Ａ～１Ｄ）。
【0110】
２つの独立した実験の結果は、ＨＬ－６０細胞の５４．８８％、５３．００％、４５．６４％、及び６１．８２％がＮＥＯ－２０１陽性としてスコアリングされたことを示し（それぞれ、図１Ａ～１Ｄ、右パネル）、対照（非染色ＨＬ－６０細胞、図１Ａ～１Ｄ、左パネル）の０．３７％、０．４０％、１．５１％、及び１．０６％と比較した。
【0111】
実施例３：ＮＥＯ－２０１はインビトロで血液悪性腫瘍細胞を死滅させることができる
ＨＬ－６０細胞株を標的として使用し、ＰＢＭＣまたは精製ＮＫ細胞をエフェクター細胞として使用したインビトロＡＤＣＣアッセイにおいて、ＮＥＯ－２０１によって媒介されるＡＤＣＣを評価した。細胞を、１０μｇ／ｍＬのＮＥＯ－２０１またはヒトＩｇＧ１（陰性対照）とともにインキュベートした。
ＨＬ－６０細胞株を標的として使用し、ＰＢＭＣまたは精製ＮＫ細胞をエフェクター細胞として使用したインビトロＡＤＣＣアッセイにおいて、ＮＥＯ－２０１によって媒介されるＡＤＣＣを評価した。細胞を、１０μｇ／ｍＬのＮＥＯ－２０１またはヒトＩｇＧ１（陰性対照）とともにインキュベートした。
【0112】
示されるように、２つの独立した実験において、１人の健康なドナー由来のＰＢＭＣを、５０：１または２５：１のＥ：Ｔ比でエフェクター細胞として使用した。各実験における３つの反復ウェルからのパーセンテージ特異的溶解±ＳＤ（標準偏差）の平均として結果を提示する。エフェクター細胞としてのＰＢＭＣを使用するインビトロ細胞毒性アッセイの結果を以下の表１に示し、図２にグラフで示す。
【表1】
【0113】
表１．エフェクター細胞としてＰＢＭＣを使用したインビトロ細胞毒性アッセイの結果＊二元配置ＡＮＯＶＡにより統計的に有意（ｐ＜０．００１）（ＮＥＯ－２０１＋ＰＢＭＣ対ＩｇＧ１＋ＰＢＭＣ、５０：１のＥ：Ｔ比）＆二元配置ＡＮＯＶＡにより統計的に有意（ｐ＜０．００１）（ＮＥＯ－２０１＋ＰＢＭＣ対ＩｇＧ１＋ＰＢＭＣ、２５：１のＥ：Ｔ比）。
【0114】
細胞毒性アッセイも、ＮＫ細胞をエフェクター細胞として使用して行った。細胞を、１０μｇ／ｍＬのＮＥＯ－２０１またはヒトＩｇＧ１（陰性対照）とともにインキュベートした。２つの独立した実験において、２人の健康なドナー由来のＮＫ細胞を、示されたＥ：Ｔ比でエフェクター細胞として使用した。各実験における３つの反復ウェルからの％特異的溶解±ＳＤ（標準偏差）の平均として結果を提示する。精製されたＮＫ細胞をエフェクター細胞として使用したインビトロ細胞毒性アッセイの結果を以下の表２に示し、図３にグラフで示す。
【表2】
【0115】
表２．精製したＮＫ細胞をエフェクター細胞として使用したインビトロ細胞毒性アッセイの結果＊二元配置ＡＮＯＶＡにより統計的に有意（ｐ＜０．００１）（ＮＥＯ－２０１＋ＮＫ細胞対ＩｇＧ１＋ＮＫ細胞、２０：１のＥ：Ｔ比）であり、＃二元配置ＡＮＯＶＡにより統計的に有意（ｐ＜０．０１）（ＮＥＯ－２０１＋ＰＢＭＣ対ＩｇＧ１＋ＰＢＭＣ、１０：１のＥ：Ｔ比）であり、＆二元配置ＡＮＯＶＡにより統計的に有意（ｐ＜０．００１）（ＮＥＯ－２０１＋ＰＢＭＣ対ＩｇＧ１＋ＰＢＭＣ、１０：１のＥ：Ｔ比）である。
【0116】
結果は、ＮＥＯ－２０１が、エフェクター細胞として、ＰＢＭＣまたは精製されたＮＫ細胞を用いて、インビトロで効果的にＨＬ－６０細胞を死滅させたことを示している。
【0117】
実施例４：インビトロでの血液腫瘍細胞株へのＮＥＯ－２０１の結合
背景
我々は、固形腫瘍に加えて、以下を以前に実証した：（Ｆａｎｔｉｎｉ Ｍ，ｅｔ ａｌ．“Ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｎｏｖｅｌ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ＮＥＯ－２０１ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ”，Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１７；８：１８９９－３）、Ｆａｎｔｉｎｉ Ｍ，ｅｔ ａｌ．，“Ａｎ ＩＬ－１５ Ｓｕｐｅｒａｇｏｎｉｓｔ，ＡＬＴ－８０３，Ｅｎｈａｎｃｅｓ Ａｎｔｉｂｏｄｙ－Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｃｅｌｌ－Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ Ｅｌｉｃｉｔｅｄ ｂｙ ｔｈｅ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ＮＥＯ－２０１ Ａｇａｉｎｓｔ Ｈｕｍａｎ Ｃａｒｃｉｎｏｍａ Ｃｅｌｌｓ”，Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｔｈｅｒ Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍ．２０１９；３４（３）：１４７－５９、Ｚｅｌｉｇｓ ＫＰ，ｅｔ ａｌ．，“Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ａｎｔｉ－Ｔｕｍｏｒ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ＮＥＯ－２０１ ｉｎ Ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ Ｏｖａｒｉａｎ Ｃａｎｃｅｒ”，Ｆｒｏｎｔ Ｏｎｃｏｌ．２０２０；１０：８０５）、ＮＥＯ－２０１によって認識される抗原は、ヒト造血細胞の特定のサブセットによっても発現されること（Ｆａｎｔｉｎｉ Ｍ，ｅｔ ａｌ．，“Ｔｈｅ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ＮＥＯ－２０１ Ｅｎｈａｎｃｅｓ Ｎａｔｕｒａｌ Ｋｉｌｌｅｒ Ｃｅｌｌ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ Ａｇａｉｎｓｔ Ｔｕｍｏｒ Ｃｅｌｌｓ Ｔｈｒｏｕｇｈ Ｂｌｏｃｋａｄｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ＣＥＡＣＡＭ５／ＣＥＡＣＡＭ１ Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ Ｐａｔｈｗａｙ”，Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｔｈｅｒ Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍ．２０２０；３５（３）：１９０－８）。この点で、ＣＤ１５＋顆粒球の９８．９％及びＣＤ４＋Ｔ細胞の約４．６％がＮＥＯ－２０１染色に対して陽性であったことが観察された。逆に、ＮＥＯ－２０１は、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、単球、ＣＤ８＋Ｔ細胞、及びＣＤ４＋Ｔ細胞の大部分に結合しなかった（Ｆａｎｔｉｎｉ Ｍ，ｅｔ ａｌ．，“Ｔｈｅ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ＮＥＯ－２０１ Ｅｎｈａｎｃｅｓ Ｎａｔｕｒａｌ Ｋｉｌｌｅｒ Ｃｅｌｌ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ Ａｇａｉｎｓｔ Ｔｕｍｏｒ Ｃｅｌｌｓ Ｔｈｒｏｕｇｈ Ｂｌｏｃｋａｄｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ＣＥＡＣＡＭ５／ＣＥＡＣＡＭ１ Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ Ｐａｔｈｗａｙ”，Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｔｈｅｒ Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍ．２０２０；３５（３）：１９０－８）。
背景
我々は、固形腫瘍に加えて、以下を以前に実証した：（Ｆａｎｔｉｎｉ Ｍ，ｅｔ ａｌ．“Ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｎｏｖｅｌ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ＮＥＯ－２０１ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ”，Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１７；８：１８９９－３）、Ｆａｎｔｉｎｉ Ｍ，ｅｔ ａｌ．，“Ａｎ ＩＬ－１５ Ｓｕｐｅｒａｇｏｎｉｓｔ，ＡＬＴ－８０３，Ｅｎｈａｎｃｅｓ Ａｎｔｉｂｏｄｙ－Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｃｅｌｌ－Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ Ｅｌｉｃｉｔｅｄ ｂｙ ｔｈｅ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ＮＥＯ－２０１ Ａｇａｉｎｓｔ Ｈｕｍａｎ Ｃａｒｃｉｎｏｍａ Ｃｅｌｌｓ”，Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｔｈｅｒ Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍ．２０１９；３４（３）：１４７－５９、Ｚｅｌｉｇｓ ＫＰ，ｅｔ ａｌ．，“Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ａｎｔｉ－Ｔｕｍｏｒ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ＮＥＯ－２０１ ｉｎ Ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ Ｏｖａｒｉａｎ Ｃａｎｃｅｒ”，Ｆｒｏｎｔ Ｏｎｃｏｌ．２０２０；１０：８０５）、ＮＥＯ－２０１によって認識される抗原は、ヒト造血細胞の特定のサブセットによっても発現されること（Ｆａｎｔｉｎｉ Ｍ，ｅｔ ａｌ．，“Ｔｈｅ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ＮＥＯ－２０１ Ｅｎｈａｎｃｅｓ Ｎａｔｕｒａｌ Ｋｉｌｌｅｒ Ｃｅｌｌ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ Ａｇａｉｎｓｔ Ｔｕｍｏｒ Ｃｅｌｌｓ Ｔｈｒｏｕｇｈ Ｂｌｏｃｋａｄｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ＣＥＡＣＡＭ５／ＣＥＡＣＡＭ１ Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ Ｐａｔｈｗａｙ”，Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｔｈｅｒ Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍ．２０２０；３５（３）：１９０－８）。この点で、ＣＤ１５＋顆粒球の９８．９％及びＣＤ４＋Ｔ細胞の約４．６％がＮＥＯ－２０１染色に対して陽性であったことが観察された。逆に、ＮＥＯ－２０１は、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、単球、ＣＤ８＋Ｔ細胞、及びＣＤ４＋Ｔ細胞の大部分に結合しなかった（Ｆａｎｔｉｎｉ Ｍ，ｅｔ ａｌ．，“Ｔｈｅ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ＮＥＯ－２０１ Ｅｎｈａｎｃｅｓ Ｎａｔｕｒａｌ Ｋｉｌｌｅｒ Ｃｅｌｌ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ Ａｇａｉｎｓｔ Ｔｕｍｏｒ Ｃｅｌｌｓ Ｔｈｒｏｕｇｈ Ｂｌｏｃｋａｄｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ＣＥＡＣＡＭ５／ＣＥＡＣＡＭ１ Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ Ｐａｔｈｗａｙ”，Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｔｈｅｒ Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍ．２０２０；３５（３）：１９０－８）。
【0118】
これらの観察から始まり、我々は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、マンテル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）細胞などの血液腫瘍細胞株に対するインビトロでのＮＥＯ－２０１の反応性を評価した。
【0119】
材料及び方法
細胞株
使用した細胞株は、６つのＡＭＬ（ＨＬ６０、Ｕ９３７、ＭＯＬＭ１３、ＡＭＬ２、ＩＭＳ－Ｍ２及びＯＣＬ－ＡＭＬ３）、２つのＭＭ（ＯＰＭ２、ＭＭ１．Ｓ）、２つのＡＬＬ（ＳＵＰ－Ｂ１５、ＲＰＭＩ８４０２）、及び４つのＭＣＬ（Ｊｅｋｏ－１、Ｚ１３８、ＪＶＭ２及びＪＶＭ１３）であった。
細胞株
使用した細胞株は、６つのＡＭＬ（ＨＬ６０、Ｕ９３７、ＭＯＬＭ１３、ＡＭＬ２、ＩＭＳ－Ｍ２及びＯＣＬ－ＡＭＬ３）、２つのＭＭ（ＯＰＭ２、ＭＭ１．Ｓ）、２つのＡＬＬ（ＳＵＰ－Ｂ１５、ＲＰＭＩ８４０２）、及び４つのＭＣＬ（Ｊｅｋｏ－１、Ｚ１３８、ＪＶＭ２及びＪＶＭ１３）であった。
【0120】
細胞株を、マイコプラズマを含まない低継代数で使用し、増殖及び維持のために提供者によって指定された培地中で３７℃／５％ＣＯ２で培養した。
【0121】
フローサイトメトリー
血液腫瘍細胞株におけるＮＥＯ－２０１によって認識される細胞表面抗原の発現の解析を、フローサイトメトリーによって行った。細胞を採取し、カウントして、（１．０×１０６）の濃度を得た。次いで、細胞を遠心分離し、冷たいＰＢＳで２回洗浄し、次いで、１×ＰＢＳ＋１％ＢＳＡで、室温で暗所で２０分間、以下のモノクローナル抗体で染色した：ＣＤ１５、ＣＤ４５、ＣＤ３８、ＣＤ１３８、ＣＤ１４、ＣＤ１９、及びＮＥＯ－２０１。
血液腫瘍細胞株におけるＮＥＯ－２０１によって認識される細胞表面抗原の発現の解析を、フローサイトメトリーによって行った。細胞を採取し、カウントして、（１．０×１０６）の濃度を得た。次いで、細胞を遠心分離し、冷たいＰＢＳで２回洗浄し、次いで、１×ＰＢＳ＋１％ＢＳＡで、室温で暗所で２０分間、以下のモノクローナル抗体で染色した：ＣＤ１５、ＣＤ４５、ＣＤ３８、ＣＤ１３８、ＣＤ１４、ＣＤ１９、及びＮＥＯ－２０１。
【0122】
染色後、細胞を冷たいＰＢＳで２回洗浄し、Ｎａｖｉｏｓフローサイトメーターを使用して検査した。Ｋａｌｕｚａソフトウェア（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して、細胞蛍光の分析を行った。陽性率は、蛍光マイナス１対照を使用することによって決定した。ＮＥＯ－２０１について１０％以上陽性の染色値は、ＮＥＯ－２０１によって認識される抗原の発現について陽性であると考えられた。
【0123】
結果
ＮＥＯ－２０１は、ＡＭＬ及びＭＭ細胞株と反応することが見出された。試験した６つのＡＭＬ細胞株のうち５つがＮＥＯ－２０１に結合し、陽性細胞の％はそれぞれ、ＨＬ６０、Ｕ９３７、ＭＯＬＭ１３、ＡＭＬ２及びＩＭＳ－Ｍ２について４７％、９９．５％、１００％、１００％及び９７．８％であった。２つのＭＭ細胞株における陽性細胞の％は、ＯＰＭ２及びＭＭ１．Ｓについてそれぞれ、９９％及び１８％であった。ＮＥＯ－２０１は、試験した２つのＡＬＬ及び４つのＭＣＬ細胞株に対して反応しなかった（表３及び図４）。
ＮＥＯ－２０１は、ＡＭＬ及びＭＭ細胞株と反応することが見出された。試験した６つのＡＭＬ細胞株のうち５つがＮＥＯ－２０１に結合し、陽性細胞の％はそれぞれ、ＨＬ６０、Ｕ９３７、ＭＯＬＭ１３、ＡＭＬ２及びＩＭＳ－Ｍ２について４７％、９９．５％、１００％、１００％及び９７．８％であった。２つのＭＭ細胞株における陽性細胞の％は、ＯＰＭ２及びＭＭ１．Ｓについてそれぞれ、９９％及び１８％であった。ＮＥＯ－２０１は、試験した２つのＡＬＬ及び４つのＭＣＬ細胞株に対して反応しなかった（表３及び図４）。
【0124】
図４は、血液腫瘍細胞株におけるＮＥＯ－２０１によって認識される細胞表面抗原の発現の分析を含む。データは、ＮＥＯ－２０１によって認識される抗原を発現する細胞のパーセンテージとして提示される。陽性率は、蛍光マイナス１対照を使用することによって決定した。ＮＥＯ－２０１染色について１０％以上陽性の染色値は、ＮＥＯ－２０１によって認識される抗原の発現について陽性であると考えられた。
【0125】
表３は、血液腫瘍細胞株におけるＮＥＯ－２０１によって認識される細胞表面抗原の発現の分析の概要を提供する。ＮＥＯ－２０１陽性細胞株は太字で表示され、ＮＥＯ－２０１陽性率は陽性％≧１０％と定義された。
【表3】
【0126】
実施例５：ｍＡｂ ＮＥＯ－２０１結合Ｏ－グリカンエピトープの同定
序論
がん細胞表面における異常なＯ－グリカン発現は、膜結合Ｎ－アセチルガラクトサミン（Ｏ－ＧａｌＮＡｃ）糖タンパク質（Ｔ及びＴｎ抗原）ならびに糖脂質（Ｌｅｗｉｓ ａ及びＬｅｗｉｓ ｘ）の糖成分として生じる。グリカン鎖の糖のシアリル化は、がん細胞によって発現されるＯ－グリカンレパートリーに追加の多様性を導入する。グリコシル化は、タンパク質及び脂質の重要な翻訳後修飾であり、がん発生によって強く影響される。これらの異常なＯ－グリカンは全て、腫瘍の診断及び治療を改善し、それらの特異的認識のための分子プローブを提供する潜在的な標的として機能し得る。Ｔｎ及びＴ抗原を特異的に認識するモノクローナル抗体は、悪性細胞を検出するために広く使用されている。
序論
がん細胞表面における異常なＯ－グリカン発現は、膜結合Ｎ－アセチルガラクトサミン（Ｏ－ＧａｌＮＡｃ）糖タンパク質（Ｔ及びＴｎ抗原）ならびに糖脂質（Ｌｅｗｉｓ ａ及びＬｅｗｉｓ ｘ）の糖成分として生じる。グリカン鎖の糖のシアリル化は、がん細胞によって発現されるＯ－グリカンレパートリーに追加の多様性を導入する。グリコシル化は、タンパク質及び脂質の重要な翻訳後修飾であり、がん発生によって強く影響される。これらの異常なＯ－グリカンは全て、腫瘍の診断及び治療を改善し、それらの特異的認識のための分子プローブを提供する潜在的な標的として機能し得る。Ｔｎ及びＴ抗原を特異的に認識するモノクローナル抗体は、悪性細胞を検出するために広く使用されている。
【0127】
Ｏ－グリコシル化経路は、単一のＮ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）をセリンまたはスレオニン残基に添加することから始まり、したがって、Ｔｎ抗原エピトープを形成する。Ｔｎ抗原は、ガラクトースで更に延長して、コア１（Ｔｈｏｍｓｅｎ－Ｆｒｉｅｄｅｎｒｅｉｃｈ抗原）としても知られるＴ抗原を形成するか、またはＮ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）で更に延長して、コア３（図９）を形成することができる。健康な細胞におけるコア１ Ｏ－グリカンは、一般に、２つのＧＬｃＮＡｃを有するＧｌｃＮＡｃまたはＴｎを有する複合分枝コア２に更に拡張されて、コア４構造を形成する。コア３及びコア４構造は、腸管にのみ存在する。コア構造５～８は非常に限られた発生である（図９及び図８）。コア５を有するムチンは、ヒトメコニウム及び腸腺癌組織で報告されているが、コア６構造は、ヒト腸ムチン及び卵巣嚢胞ムチンで見出される。コア８は、ヒト呼吸器ムチンにおいて報告されている。ウシ顎下腺ムチンは、コア７構造を含有することが示された。図８は、ムチン中に見出されるＯ－グリカンコアの構造を示す。腫瘍細胞は、細胞表面上のＴｎ抗原及びＴ抗原などの切断型Ｏ－グリカンの発現を特徴とする。これらの切断構造は、ジシアリル－Ｔ（ｓＴ）のシアリル－Ｔｎ（ｓＴｎ）及びシアリル－を形成し、シアリル化することができ、これは、グリカン構造の更なる延長を防止する。コア１～４は、拡張された複合Ｏ－グリカンとして生じることが示されている。Ｔｎ及びＴ抗原ならびにそれらのシアリル化構造、ｓＴｎ及びｓＴ抗原は、複数の腫瘍タイプ、特に乳癌、卵巣癌、胃癌、及び結腸癌などの上皮起源のものによって発現される。切断されたＯ－グリカンは、一般に腫瘍の進行を支持し、それらの存在は予後不良と強く相関している。
【0128】
ＮＥＯ－２０１は、ＮＥＯ－２０１標的抗原を発現する多くの異なるヒトがんに対して反応性であるが、ほとんどの正常上皮組織に対して反応性ではないＩｇＧ１ ｍＡｂである。ＮＥＯ－２０１は、抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）、補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）、及びＣＥＡＣＡＭ５／ＣＥＡＣＡＭ１免疫チェックポイント阻害経路の遮断などの複数の機構を介して、腫瘍細胞に対する抗腫瘍活性を媒介することができる。固形腫瘍に加えて、本明細書では、ＮＥＯ－２０１標的がヒト造血細胞にも見られることを示す。フローサイトメトリー解析により、ＣＤ１５＋顆粒球の９８．９％及びＣＤ４＋Ｔ細胞の約４．６％がＮＥＯ－２０１染色に対して陽性であったことが実証された。Ｂ細胞、ＮＫ細胞、単球、ＣＤ８＋Ｔ細胞、及びＣＤ４＋Ｔ細胞の大部分に関して、ＮＥＯ－２０１との結合は観察されなかった。我々はまた、ＮＥＯ－２０１が、哺乳動物発現のｒｈＣＥＡＣＡＭ６に結合するが、細菌発現のｒｈＣＥＡＣＭＡ６には結合しないことを実証した（図１０）。これらの観察に基づいて、我々は、ＮＥＯ－２０１が、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、及びマンテル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）細胞株などの血液腫瘍細胞株に対してインビトロで潜在的に反応性であるかどうかを評価した。
【0129】
材料及び方法
Ｏ－グリカンアレイを使用したＮＥＯ－２０１に結合するＯ－グリカンの同定
図１１の実験では、当社のＧｌｙｃａｎ Ａｒｒａｙ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒを使用して、グリカンアレイを３０分間遮断した。次いで、当社のＧｌｙｃａｎ Ａｒｒａｙ Ａｓｓａｙ Ｂｕｆｆｅｒ（ＧＡＡＢ）（これはＴＢＳ－Ｔに基づく）を用いて３回洗浄した。試料をＧＡＡＢで所望の濃度に希釈し、次いで、グリカンアレイに直接適用した。アレイを覆い、室温で１時間、８０ｒｐｍで振盪した。次いで、アレイをＧＡＡＢで３回再洗浄し、次いで、検出抗体をＧＡＡＢ中で希釈し、アレイに適用した。光に当たらないように覆い、室温で１時間、８０ｒｐｍで振盪し、次いでＧＡＡＢで３回、ＭｉｌｌｉＱ水で２回洗浄した。高出力レーザーを使用したＩｎｎｏｐｓｙｓ ＩｎｎｏＳｃａｎ ７１０ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ｓｃａｎｎｅｒを使用して５ＰＭＴで読み取った。ソフトウェアを使用して、アレイ上の各スポットを検出し、各スポットのＲＦＵ強度を計算した。バックグラウンドＲＦＵを各スポットのＲＦＵ値から差し引いた。各グリカンスポットの中央値を決定し、グラフ化した。
Ｏ－グリカンアレイを使用したＮＥＯ－２０１に結合するＯ－グリカンの同定
図１１の実験では、当社のＧｌｙｃａｎ Ａｒｒａｙ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒを使用して、グリカンアレイを３０分間遮断した。次いで、当社のＧｌｙｃａｎ Ａｒｒａｙ Ａｓｓａｙ Ｂｕｆｆｅｒ（ＧＡＡＢ）（これはＴＢＳ－Ｔに基づく）を用いて３回洗浄した。試料をＧＡＡＢで所望の濃度に希釈し、次いで、グリカンアレイに直接適用した。アレイを覆い、室温で１時間、８０ｒｐｍで振盪した。次いで、アレイをＧＡＡＢで３回再洗浄し、次いで、検出抗体をＧＡＡＢ中で希釈し、アレイに適用した。光に当たらないように覆い、室温で１時間、８０ｒｐｍで振盪し、次いでＧＡＡＢで３回、ＭｉｌｌｉＱ水で２回洗浄した。高出力レーザーを使用したＩｎｎｏｐｓｙｓ ＩｎｎｏＳｃａｎ ７１０ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ｓｃａｎｎｅｒを使用して５ＰＭＴで読み取った。ソフトウェアを使用して、アレイ上の各スポットを検出し、各スポットのＲＦＵ強度を計算した。バックグラウンドＲＦＵを各スポットのＲＦＵ値から差し引いた。各グリカンスポットの中央値を決定し、グラフ化した。
【0130】
Ｏ－グリカンアレイレイアウト：
ＰＣ１：Ｂ１－ＰＥＧ－ＮＨ２；ＰＣ２：ヒトＩｇＧ；ＰＣ３：マウスＩｇＧ；ＰＣ４：ウサギＩｇＧ
ＮＥＯ－２０１を３つの濃度（１００μｇ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌ、及び４μｇ／ｍｌ）で使用して、Ｏ－グリカンアレイとともに室温で１時間インキュベートした。次いで、アレイを洗浄し、室温で１時間、２０μｇ／ｍｌの濃度の抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ Ｃｙ３でインキュベートした。アレイを、ＧＡＡＢで３回、及びＭｉｌｌｉＱ水で２回洗浄した。高出力レーザーを使用したＩｎｎｏｐｓｙｓ ＩｎｎｏＳｃａｎ ７１０ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ｓｃａｎｎｅｒを使用して５ＰＭＴで読み取った。ソフトウェアを使用して、アレイ上の各スポットを検出し、各スポットのＲＦＵ強度を計算した。バックグラウンドＲＦＵを各スポットのＲＦＵ値から差し引いた。
ＰＣ１：Ｂ１－ＰＥＧ－ＮＨ２；ＰＣ２：ヒトＩｇＧ；ＰＣ３：マウスＩｇＧ；ＰＣ４：ウサギＩｇＧ
ＮＥＯ－２０１を３つの濃度（１００μｇ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌ、及び４μｇ／ｍｌ）で使用して、Ｏ－グリカンアレイとともに室温で１時間インキュベートした。次いで、アレイを洗浄し、室温で１時間、２０μｇ／ｍｌの濃度の抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ Ｃｙ３でインキュベートした。アレイを、ＧＡＡＢで３回、及びＭｉｌｌｉＱ水で２回洗浄した。高出力レーザーを使用したＩｎｎｏｐｓｙｓ ＩｎｎｏＳｃａｎ ７１０ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ｓｃａｎｎｅｒを使用して５ＰＭＴで読み取った。ソフトウェアを使用して、アレイ上の各スポットを検出し、各スポットのＲＦＵ強度を計算した。バックグラウンドＲＦＵを各スポットのＲＦＵ値から差し引いた。
【0131】
腫瘍細胞株のＯ－グリカンプロファイルを解明し、検出された各グリカンの相対的存在量を推定する
ガラス製品及びガラスチューブは、ＭｉｌｌｉＱ水で洗浄し、事前に乾燥させる。
ガラス製品及びガラスチューブは、ＭｉｌｌｉＱ水で洗浄し、事前に乾燥させる。
【0132】
試薬は、事前にＭｉｌｌｉＱ水で洗浄された器具でアルミホイルに重み付けされる。可能な限り、液体試薬は使い捨てのガラス製ピペットで取り扱う。溶媒は、ＨＰＬＣグレード以上である。
【0133】
Ｎ－グリカンの除去：
１．ＰＢＳで３回洗浄した後、細胞ペレットを１ｍｌの溶解緩衝液（２５ｍＭのＴＲＩＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡ、０．５％ｗ／ｖのＣＨＡＰＳ、ｐＨ７．４）に再懸濁し、超音波処理した（１０秒の５パルス）。次いで、溶解した試料を５０ｍＭの重炭酸アンモニウムに対して４℃で２４時間透析し、透析緩衝液を３回変更した。
１．ＰＢＳで３回洗浄した後、細胞ペレットを１ｍｌの溶解緩衝液（２５ｍＭのＴＲＩＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡ、０．５％ｗ／ｖのＣＨＡＰＳ、ｐＨ７．４）に再懸濁し、超音波処理した（１０秒の５パルス）。次いで、溶解した試料を５０ｍＭの重炭酸アンモニウムに対して４℃で２４時間透析し、透析緩衝液を３回変更した。
【0134】
２．凍結乾燥後、透析した材料を、１ｍｌの２ｍｇ／ｍｌのＤＴＴ（１，４－ジチオスレイトール）溶液に再懸濁し、５０℃で９０分間インキュベートした。
【0135】
３．０．６ＭのＴＲＩＳ緩衝液ｐＨ８．５中の新鮮な１２ｍｇ／ｍｌのヨードアセトアミド溶液を調製する。ＤＴＴで処理した試料に０．５ｍｌのＩＡＡ溶液を添加し、暗所で９０分間室温でインキュベートする。
【0136】
４．４℃で１６時間～２４時間、５０ｍＭの重炭酸アンモニウムに対して試料を透析し、緩衝液を３回交換する。分子カットオフは１～５ｋＤａでなければならない。透析後、試料を１５ｍｌのチューブに移し、試料を凍結乾燥する。
【0137】
５．５０ｍＭの重炭酸アンモニウム中の５０μｇ／ｍｌのＴＰＣＫ処理トリプシン溶液０．５ｍｌに乾燥試料を再懸濁し、３７℃で一晩（１２～１６時間）インキュベーションする。２滴の５％酢酸を添加して反応を停止する。
【0138】
６．Ｃ１８ Ｓｐｅ－Ｐａｋ（５０ｍｇ）カラムを、メタノール、５％酢酸、１－プロパノール、及び５％酢酸で調節する。トリプシン消化された試料をＣ１８カラム上に装填する。
【0139】
７．カラムを４ｍｌの５％酢酸で洗浄し、Ｃ１８カラムからペプチドを２ｍｌの２０％１－プロパノール、次に２ｍｌの４０％１－プロパノール、最後に２ｍｌの１００％１－プロパノールで溶出する。全ての溶出画分をプールし、試料を凍結乾燥した。
【0140】
８．乾燥した材料を２００μｌの５０ｍＭの重炭酸アンモニウムで慎重に再懸濁し、２μｌのＰＮＧａｓｅＦ Ｉｎｃｕｂａｔｅを３７℃で４時間添加する。次に、３７℃で一晩（１２～１６時間）インキュベートするために、更に３μｌのＰＮＧａｓｅＦを添加する。２滴の５％酢酸を添加して反応を停止する。
【0141】
９．Ｃ１８ Ｓｐｅ－Ｐａｋ（５０ｍｇ）カラムを、メタノール、５％酢酸、１－プロパノール、及び５％酢酸で調節する。ＰＮＧａｓｅＦ消化試料をＣ１８カラム上に装填する。フロースルーを破棄する。
【0142】
Ｏ－グリカンの調製：
１．カラムに結合した材料（ペプチド及び潜在的にＯ－グリコペプチドを含有する）を、１ｍｌの２０％１－プロパノール、１ｍｌの４０％１－プロパノール、及び１ｍｌの１００％１－プロパノールで連続的に溶出することによって回収する。溶出された画分を凍結乾燥させる。
１．カラムに結合した材料（ペプチド及び潜在的にＯ－グリコペプチドを含有する）を、１ｍｌの２０％１－プロパノール、１ｍｌの４０％１－プロパノール、及び１ｍｌの１００％１－プロパノールで連続的に溶出することによって回収する。溶出された画分を凍結乾燥させる。
【0143】
２．０．１ＭのＮａＯＨ溶液中の５５ｍｇ／ｍｌのＮａＢＨ４（水素化ホウ素ナトリウム）４００μｌを試料に添加する。一晩４５℃でインキュベートする。
【0144】
３．発泡が止まるまで、３～４滴の純粋な（１００％）酢酸を添加して反応を停止する。
【0145】
４．１０ｍｌの５％酢酸でカラムを洗浄して、Ｄｏｗｅｘ（５０Ｗ Ｘ８、メッシュサイズ２００～４００）イオン交換樹脂カラムを調製し、調節する。
【0146】
５．酢酸中和された試料をカラムに装填し、３ｍｌの５％酢酸で洗浄する。フロースルーを回収してプールし、洗浄する。回収した材料を凍結乾燥する。
【0147】
６．凍結乾燥した試料に、酢酸：メタノール溶液（１：９；ｖ／ｖ＝１０％）１ｍｌを添加する。徹底的にボルテックスし、窒素の流れの下で乾燥する。この共蒸発ステップをもう３回繰り返す。
【0148】
７．Ｃ１８カラムを調節する。
【0149】
８．共蒸発させた乾燥試料を２００μｌの５０％メタノール中に再懸濁し、調節したＣ１８カラムに充填する。カラムを４ｍｌの５％酢酸で洗浄する。フロースルーを回収してプールし、洗浄し、試料を凍結乾燥し、過メチル化に進む。
【0150】
過メチル化：
スラリーＮａＯＨ／ＤＭＳＯ溶液の調製は、毎回新鮮にされる。乳鉢、乳棒、及びガラス管は、ＭｉｌｌｉＱ水で洗浄し、事前に乾燥させる。可能な限り、液体試薬は使い捨てのガラス製ピペットで取り扱う。溶媒は、ＨＰＬＣグレード以上である。
スラリーＮａＯＨ／ＤＭＳＯ溶液の調製は、毎回新鮮にされる。乳鉢、乳棒、及びガラス管は、ＭｉｌｌｉＱ水で洗浄し、事前に乾燥させる。可能な限り、液体試薬は使い捨てのガラス製ピペットで取り扱う。溶媒は、ＨＰＬＣグレード以上である。
【0151】
１．清潔で乾燥した乳鉢及び乳棒を使用して、３ｍｌのＤＭＳＯ中の７個のＮａＯＨのペレットを粉砕する。スクリューキャップでガラスチューブ内の試料を乾燥させるために、このスラリー溶液１ｍｌを添加する。
【0152】
２．５００μｌのヨードメタンを添加し、蓋をしっかり閉じ、試料を室温で約３０分間振る。混合物は白くなり、完了に達すると固体になることさえある。
【0153】
３．ガスの圧力が上昇するにつれて、キャップをゆっくりと開く。１ｍｌのＭｉｌｌｉＱ水を添加して反応を停止し、全ての固体が溶解するまでチューブをボルテックスする。
【0154】
４．クロロホルム１ｍｌ及び追加のＭｉｌｌｉＱ水３ｍｌを添加し、チューブを完全にボルテックスし、両方の相を混合し、短時間で遠心分離して、クロロホルム及び水相を分離する（約５０００ｒｐｍ、２０秒未満）。
【0155】
５．水性の上層を廃棄し、３ｍｌのＭｉｌｌｉＱ水を添加して更に２回洗浄を繰り返す。
【0156】
６．クロロホルム画分をＳｐｅｅｄＶａｃで乾燥させる（約２０～３０分）。
【0157】
７．Ｃ１８ Ｓｐｅ－Ｐａｋ（２００ｍｇ）カラムを、メタノール、ＭｉｌｉＱ水、アセトニトリル及びＭｉｌｌｉＱ水で調節する。乾燥試料を２００μｌの５０％メタノールで再懸濁し、カラム上に充填する。チューブを１ｍｌの１５％アセトニトリルで洗浄し、カラム上に充填する。カラムを２ｍｌの１５％アセトニトリルで洗浄する。
【0158】
８．３ｍｌの５０％アセトニトリルで清潔なガラスチューブにカラムを溶出させる。ＭＳ分析のために溶出画分を凍結乾燥した。
【0159】
ＭＳ ＭＡＬＤＩ分析：
ＭＳデータは、Ｂｒｕｋｅｒ ＵｌｔｒａＦｌｅｘ ＩＩ ＭＡＬ ＤＩ－ＴＯＦ質量分析計機器上で得た。反射陽性モードが使用され、データは通常、Ｏ－グリカンについて５００ｍ／ｚから４０００ｍ／ｚの間で記録される。
ＭＳデータは、Ｂｒｕｋｅｒ ＵｌｔｒａＦｌｅｘ ＩＩ ＭＡＬ ＤＩ－ＴＯＦ質量分析計機器上で得た。反射陽性モードが使用され、データは通常、Ｏ－グリカンについて５００ｍ／ｚから４０００ｍ／ｚの間で記録される。
【0160】
各ＭＳ Ｏ－グリカンプロファイルについて、データ抽出のために２０，０００個以上のレーザーショットの凝集を考慮した。少なくとも２のシグナル／ノイズ比の質量シグナルを考慮し、更なる解析及び注釈付けのために、Ｏ－グリカン組成物と一致するＭＳシグナルのみを考慮した。その後のＭＳデータ取得後の分析は、ｍＭａｓｓ（Ｓｔｒｏｈａｌｍ，Ｍ．，Ｋａｖａｎ，Ｄ．，Ｎｏｖａｋ，Ｐ．，Ｖｏｌｎｙ，Ｍ．，ａｎｄ Ｈａｖｌｉｃｅｋ，Ｖ．（２０１０），“ｍＭａｓｓ ３：ａ ｃｒｏｓｓ－ｐｌａｔｆｏｒｍ ｓｏｆｔｗａｒｅ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ ｆｏｒ ｐｒｅｃｉｓｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｉｃ ｄａｔａ”，Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ ８２，４６４８－４６５１）を使用して行った。
【0161】
この分析で使用した腫瘍細胞株及びヒト好中球：
ＮＥＯ－２０１抗原陽性細胞株（ＣＦＰＡＣ－１：膵臓癌、正常ドナーからのヒト好中球、ＨＬ－６０：ＡＭＬ、Ｕ９３７：ＡＭＬ及びＫ５６２：ＣＭＬ）。
ＮＥＯ－２０１抗原陽性細胞株（ＣＦＰＡＣ－１：膵臓癌、正常ドナーからのヒト好中球、ＨＬ－６０：ＡＭＬ、Ｕ９３７：ＡＭＬ及びＫ５６２：ＣＭＬ）。
【0162】
ＣＥＡＣＡＭ６及びＣＥＡＣＡＭ５Ｃ末端におけるＮＥＯ－２０１結合領域の同定
ＣＥＡＣＡＭ６及びＣＥＡＣＡＭ５の発現について、ＣＥＡＣＡＭ６及びＣＥＡＣＡＭ５のＰＣＲ断片を、制限部位Ｎｈｅ１及びＨｉｎｄ１１１を介してＤＨＦＲベクターに構築した。ＣＥＡＣＡＭ６ ｃＤＮＡは、ＣＦＰＡＣ－１ ｍＲＮＡ抽出物を鋳型として、ＲＴ－ＰＣＲによって得られ、ＣＥＡＣＡＭ５ ｃＤＮＡは、ＡＴＣＣ（＃ＭＧＣ－３４２１２）からもたらされた。配列をプライマーＢＧＨ－ＲＥＶ（ＣＴＡＧＡＡＧＧＣＡＣＡＧＴＣＧＡＧＧＣ）及びＣＭＶ－Ｆｏｒ（ＣＧＣＡＡＡＴＧＧＧＣＧＧＴＡＧＧＣＧＴＧ）によって検証した。４μｇのプラスミドを、６ウェルプレートに播種した１×１０６個の哺乳動物ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（９０％コンフルエンシー）に一過性にトランスフェクトし、４８～７２時間培養した。
ＣＥＡＣＡＭ６及びＣＥＡＣＡＭ５の発現について、ＣＥＡＣＡＭ６及びＣＥＡＣＡＭ５のＰＣＲ断片を、制限部位Ｎｈｅ１及びＨｉｎｄ１１１を介してＤＨＦＲベクターに構築した。ＣＥＡＣＡＭ６ ｃＤＮＡは、ＣＦＰＡＣ－１ ｍＲＮＡ抽出物を鋳型として、ＲＴ－ＰＣＲによって得られ、ＣＥＡＣＡＭ５ ｃＤＮＡは、ＡＴＣＣ（＃ＭＧＣ－３４２１２）からもたらされた。配列をプライマーＢＧＨ－ＲＥＶ（ＣＴＡＧＡＡＧＧＣＡＣＡＧＴＣＧＡＧＧＣ）及びＣＭＶ－Ｆｏｒ（ＣＧＣＡＡＡＴＧＧＧＣＧＧＴＡＧＧＣＧＴＧ）によって検証した。４μｇのプラスミドを、６ウェルプレートに播種した１×１０６個の哺乳動物ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（９０％コンフルエンシー）に一過性にトランスフェクトし、４８～７２時間培養した。
【0163】
図１２はＣＥＡＣＡＭ６のアミノ酸配列を示す。図１３に示されるように、異なる切断Ｃ末端ＣＥＡＣＡＭ６遺伝子構築物を設計した。切断研究は、ＣＥＡＣＡＭ６のＣ末端のＮＥＯ－２０１結合領域を特定することである。図１４はＣＥＡＣＡＭ５のアミノ酸配列を示す。図１５に示すように、異なる切断Ｃ末端ＣＥＡＣＡＭ５遺伝子構築物を設計した。切断されたＣ末端構築物の発現の手順は、上記の方法と同じであった。全ての欠失をＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトし、４８～７２時間後に細胞ペレット及び／または上清を採取した。上清結合活性をＥＬＩＳＡによって定量した。切断研究は、ＣＥＡＣＡＭ５のＣ末端のＮＥＯ－２０１結合領域を同定することである。
【0164】
ＮＥＯ－２０１は、哺乳動物発現ｒｈＣＥＡＣＡＭ６に結合するが、細菌発現ｒｈＣＥＡＣＭＡ６には結合しない
上記のように、ＣＥＡＣＡＭ６コード配列を含むＤＮＡプラスミドを、細菌（Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１）及び哺乳動物ＨＥＫ２９３Ｔ細胞において発現させた。発現されたタンパク質を、ＥＬＩＳＡにおいてＮＥＯ－２０１ｍＡｂによって検出される能力について試験して、ＮＥＯ－２０１の結合エピトープ（複数可）が炭水化物を含むことを確認した。
上記のように、ＣＥＡＣＡＭ６コード配列を含むＤＮＡプラスミドを、細菌（Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１）及び哺乳動物ＨＥＫ２９３Ｔ細胞において発現させた。発現されたタンパク質を、ＥＬＩＳＡにおいてＮＥＯ－２０１ｍＡｂによって検出される能力について試験して、ＮＥＯ－２０１の結合エピトープ（複数可）が炭水化物を含むことを確認した。
【0165】
簡潔に述べると、９６ウェルプレートを、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１またはＨＥＫ２９３Ｔ細胞で発現された１００μＬ／ウェルの４００ｎｇ／ｍＬの組換えヒトＣＥＡＣＡＭ６で、最初に４℃で一晩コーティングした。次いで、プレートを１ＸＴｒｉｓ緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０で洗浄し、次いで、１ＸＴＢＳ中５％乳２００μＬ／ウェルで、３７℃で１時間遮断した。次いでプレートを洗浄し、次いで１００μＬ／ウェルのＮＥＯ－２０１抗体を１０ｎｇ／ｍＬから０．０７８ｎｇ／ｍＬまで２倍の段階希釈で添加し、３７℃で１時間インキュベートした。プレートを洗浄し、１００μＬ／ウェルの抗ヒトＩｇＧ抗体ペルオキシダーゼコンジュゲートをプレートに添加し、３７℃で１時間インキュベートした。プレートを洗浄し、１００μＬ／ウェルのテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質溶液を暗所で室温で添加した。Ｈ２ＳＯ４を添加することによって反応を停止させ、プレートリーダーを使用して４５０ｎｍでの吸収を読み取った。
【0166】
ヒトがん細胞株へのＮＥＯ－２０１結合のフローサイトメトリー
慢性骨髄性白血病細胞株［Ｋ５６２］（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ－２４３（商標））及び膵臓細胞株［ＣＦＰＡＣ－１］（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－１９１８（商標））は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ，ＵＳＡ）から入手した。細胞株を、マイコプラズマを含まない低継代数で使用し、増殖及び維持のために提供者によって指定された培地中で３７℃／５％ＣＯ２で培養した。
慢性骨髄性白血病細胞株［Ｋ５６２］（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ－２４３（商標））及び膵臓細胞株［ＣＦＰＡＣ－１］（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－１９１８（商標））は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ，ＵＳＡ）から入手した。細胞株を、マイコプラズマを含まない低継代数で使用し、増殖及び維持のために提供者によって指定された培地中で３７℃／５％ＣＯ２で培養した。
【0167】
ＮＥＯ－２０１によって認識される細胞表面抗原の発現の分析をフローサイトメトリーによって行った。細胞を採取し、カウントして、（１．０×１０６）の濃度を得た。次いで、細胞を遠心分離し、冷たいＰＢＳで２回洗浄し、次いで、１×ＰＢＳ＋１％のＢＳＡ（Ｔｅｋｎｏｖａ，Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ，ＣＡ，ＵＳＡ）中の１０μｇ／ｍＬのＰａｃｉｆｉｃ ＢｌｕｅをコンジュゲートしたＮＥＯ－２０１抗体で３０分間、４℃で染色した。染色後、細胞を冷たいＰＢＳで２回洗浄し、ＦＡＣＳＶｅｒｓｅフローサイトメーター（ＢＤ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して検査した。細胞蛍光の分析は、ＢＤ ＦＡＣＳｕｉｔｅソフトウェアを使用して行った。陽性率は、Ｐａｃｉｆｉｃ ＢｌｕｅをコンジュゲートしたＮＥＯ－２０１抗体で染色された細胞を有する未染色細胞に直面して決定された。染色値＞１０％陽性とみなされ、ＮＥＯ－２０１抗原発現が陽性とみなされた。
【0168】
結果
ＮＥＯ－２０１は、哺乳動物発現ｒｈＣＥＡＣＡＭ６に結合するが、細菌発現ｒｈＣＥＡＣＭＡ６には結合しない
図１０に示すように、ＥＬＩＳＡ結果は、ＮＥＯ－２０１が哺乳動物発現ｒｈＣＥＡＣＡＭ６に結合するが、細菌発現ｒｈＣＥＡＣＭＡ６に結合しないことを明らかにした。
ＮＥＯ－２０１は、哺乳動物発現ｒｈＣＥＡＣＡＭ６に結合するが、細菌発現ｒｈＣＥＡＣＭＡ６には結合しない
図１０に示すように、ＥＬＩＳＡ結果は、ＮＥＯ－２０１が哺乳動物発現ｒｈＣＥＡＣＡＭ６に結合するが、細菌発現ｒｈＣＥＡＣＭＡ６に結合しないことを明らかにした。
【0169】
Ｏ－グリカンアレイに対するＮＥＯ－２０１の結合親和性
バックグラウンド信号はアレイ全体で低い。結合パターンは、抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ Ｃｙ３抗体検出方法で明確である。この方法は、抗ヒトＩｇＧ１抗体方法で見られるＯ－グリカン０１、２、６、２３、２６、及び３９との結合事象が、実際の結合事象であり得、非特異的結合ではないことを示す（図１６、１７、１８、１９）。
バックグラウンド信号はアレイ全体で低い。結合パターンは、抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ Ｃｙ３抗体検出方法で明確である。この方法は、抗ヒトＩｇＧ１抗体方法で見られるＯ－グリカン０１、２、６、２３、２６、及び３９との結合事象が、実際の結合事象であり得、非特異的結合ではないことを示す（図１６、１７、１８、１９）。
【0170】
これらの結果は、ＮＥＯ－２０１がＯ－グリカンアレイのＯ－グリカン０１、０２、０６、０２３、０２６、及び０３９と相互作用することを示している。Ｏ６結合相互作用は、観察されたものの中で最も強かった。０１及び０２は、Ｔｎ抗原である。０６は、コア１であり、０２３は、コア２であり、０２６は、コア３であり、０３９は、コア４ Ｏ－グリカンである。
【0171】
腫瘍細胞系及びヒト好中球のＯ－グリカンプロファイル
ヒト膵臓癌細胞株（ＣＦＰＡＣ－１）：
ＣＦＰＡＣ－１ Ｏ－グリカンプロファイルは、主にシアリル化Ｏ－グリカンの見事な配列を示す。この試料について最大１０個のＯ－グリカンを同定した。以下の表は、ｍ／ｚ、組成物、提案された構造、及び相対的存在量を含む、ＣＦＰＡＣ－１についてプロファイリングされたＯ－グリカンをまとめている（図２０及び図５）。ＣＦＰＡＣ－１は、主にコア１プロファイルを示す。
ヒト膵臓癌細胞株（ＣＦＰＡＣ－１）：
ＣＦＰＡＣ－１ Ｏ－グリカンプロファイルは、主にシアリル化Ｏ－グリカンの見事な配列を示す。この試料について最大１０個のＯ－グリカンを同定した。以下の表は、ｍ／ｚ、組成物、提案された構造、及び相対的存在量を含む、ＣＦＰＡＣ－１についてプロファイリングされたＯ－グリカンをまとめている（図２０及び図５）。ＣＦＰＡＣ－１は、主にコア１プロファイルを示す。
【0172】
【0173】
ヒト血液腫瘍細胞：ＡＭＬ（ＨＬ６０及びＵ９３７）及びＣＭＬ（Ｋ５６２）
図２２、図２３、図２４及び図７は、各々、ＡＭＬ細胞株ＨＬ６０及びＵ９３７ならびにＣＭＬ細胞株Ｋ５６２のＯ－グリカンプロファイルを示す。ＨＬ６０は主に拡張コア１プロファイルを示し、Ｕ９３７は主に拡張コア１及びコア２プロファイルを示し、Ｋ５６２は主に拡張コア２プロファイルを示していることがわかる。
図２２、図２３、図２４及び図７は、各々、ＡＭＬ細胞株ＨＬ６０及びＵ９３７ならびにＣＭＬ細胞株Ｋ５６２のＯ－グリカンプロファイルを示す。ＨＬ６０は主に拡張コア１プロファイルを示し、Ｕ９３７は主に拡張コア１及びコア２プロファイルを示し、Ｋ５６２は主に拡張コア２プロファイルを示していることがわかる。
【0174】
哺乳動物発現系におけるＣ末端切断ＣＥＡＣＡＭ６タンパク質に対するＮＥＯ－２０１結合親和性
２９３Ｔ細胞株の４８～７２時間のトランスフェクション後の上清を回収し、上清中の分泌ＣＥＡＣＡＭ６を、定量化のために抗ヒトカッパ鎖抗体を使用してＥＬＩＳＡによって測定した。ＮＥＯ－２０１とＣＥＡＣＡＭ６切断バリアントとの結合活性を図２５に示す。ＣＥＡＣＡＭ６のＣ末端の切断に伴い、ＮＥＯ－２０１の結合の親和性が徐々に低下していることがわかる。これらの結果は、ＮＥＯ－２０１への完全な結合親和性を保持する最短のＣＥＡＣＡＭ６配列が、ＣＥＡＣＡＭ６Ｃ末端（３２０Ｇストップ構築物）の３１９Ｓで終わることを実証する。結合は、ＣＥＡＣＡＭＣ末端の３１２Ｔで検出されなかった（３１２Ｔｓｔｏｐ構築物）。ＣＥＡＣＡＭ６の３１２～３２０にまたがるアミノ酸残基は、ＴＶＴＭＩＴＶＳＧである。３１２位、３１４位、及び３１７位の各々にスレオニン残基、ならびに３１９位にセリン残基が存在するため、ＧａｌＮＡｃ残基をこれらのスレオニン及びセリン残基のうちの１つ以上に潜在的に添加して、Ｏ－グリカンを形成することができる。この結果は、ＮＥＯ－２０１がＣＥＡＣＡＭ６のエピトープを含むＯ－グリカンに結合するという我々の所見と一致する。
２９３Ｔ細胞株の４８～７２時間のトランスフェクション後の上清を回収し、上清中の分泌ＣＥＡＣＡＭ６を、定量化のために抗ヒトカッパ鎖抗体を使用してＥＬＩＳＡによって測定した。ＮＥＯ－２０１とＣＥＡＣＡＭ６切断バリアントとの結合活性を図２５に示す。ＣＥＡＣＡＭ６のＣ末端の切断に伴い、ＮＥＯ－２０１の結合の親和性が徐々に低下していることがわかる。これらの結果は、ＮＥＯ－２０１への完全な結合親和性を保持する最短のＣＥＡＣＡＭ６配列が、ＣＥＡＣＡＭ６Ｃ末端（３２０Ｇストップ構築物）の３１９Ｓで終わることを実証する。結合は、ＣＥＡＣＡＭＣ末端の３１２Ｔで検出されなかった（３１２Ｔｓｔｏｐ構築物）。ＣＥＡＣＡＭ６の３１２～３２０にまたがるアミノ酸残基は、ＴＶＴＭＩＴＶＳＧである。３１２位、３１４位、及び３１７位の各々にスレオニン残基、ならびに３１９位にセリン残基が存在するため、ＧａｌＮＡｃ残基をこれらのスレオニン及びセリン残基のうちの１つ以上に潜在的に添加して、Ｏ－グリカンを形成することができる。この結果は、ＮＥＯ－２０１がＣＥＡＣＡＭ６のエピトープを含むＯ－グリカンに結合するという我々の所見と一致する。
【0175】
哺乳動物発現系におけるＣ末端切断ＣＥＡＣＡＭ５タンパク質に対するＮＥＯ－２０１結合親和性
切断された構築物ＣＥＡＣＡＭ５－Ｄ２－３２０＊、ＣＥＡＣＡＭ５－Ｄ２－３１８＊、ＣＥＡＣＡＭ５－Ｄ２－３１６＊、ＣＥＡＣＡＭ５－Ｄ２－３１４＊及びＣＥＡＣＡＭ５－Ｄ２－３１２＊からの結合曲線は、ＣＥＡＣＡＭ５－Ｄ２－３２０＊タンパク質がＮＥＯ－２０１に特異的に結合する能力を保持することを示す。図２６の結果からわかるように、結合活性は、ＣＥＡＣＡＭ５のＣ末端におけるアミノ酸のより多くの切断とともに徐々に減少し、アミノ酸残基３１１～６８５を欠失した後に検出される結合活性はない（ＣＥＡＣＡＭ５－Ｄ２－３１２＊）。これらの結果は、残基３１０～３１８にまたがるＣＥＡＣＡＭ５の領域が、ＮＥＯ－２０１のＣＥＡＣＡＭ５への結合に不可欠であることを実証する。ＣＥＡＣＡＭ５の残基３１０～３１８を含むアミノ酸は、ＲＴＴＶＴＴＩＴＶである。３１１位、３１２位、３１４位、３１５位、及び３１７位のそれぞれにスレオニン残基が存在するので、ＧａｌＮＡｃ残基をこれらのスレオニン残基のうちの１つ以上に潜在的に添加して、Ｏ－グリカンを形成することができる。この結果は、ＮＥＯ－２０１がＣＥＡＣＡＭ５上のエピトープを含むＯ－グリカンに結合するという私たちの発見を裏付ける。
切断された構築物ＣＥＡＣＡＭ５－Ｄ２－３２０＊、ＣＥＡＣＡＭ５－Ｄ２－３１８＊、ＣＥＡＣＡＭ５－Ｄ２－３１６＊、ＣＥＡＣＡＭ５－Ｄ２－３１４＊及びＣＥＡＣＡＭ５－Ｄ２－３１２＊からの結合曲線は、ＣＥＡＣＡＭ５－Ｄ２－３２０＊タンパク質がＮＥＯ－２０１に特異的に結合する能力を保持することを示す。図２６の結果からわかるように、結合活性は、ＣＥＡＣＡＭ５のＣ末端におけるアミノ酸のより多くの切断とともに徐々に減少し、アミノ酸残基３１１～６８５を欠失した後に検出される結合活性はない（ＣＥＡＣＡＭ５－Ｄ２－３１２＊）。これらの結果は、残基３１０～３１８にまたがるＣＥＡＣＡＭ５の領域が、ＮＥＯ－２０１のＣＥＡＣＡＭ５への結合に不可欠であることを実証する。ＣＥＡＣＡＭ５の残基３１０～３１８を含むアミノ酸は、ＲＴＴＶＴＴＩＴＶである。３１１位、３１２位、３１４位、３１５位、及び３１７位のそれぞれにスレオニン残基が存在するので、ＧａｌＮＡｃ残基をこれらのスレオニン残基のうちの１つ以上に潜在的に添加して、Ｏ－グリカンを形成することができる。この結果は、ＮＥＯ－２０１がＣＥＡＣＡＭ５上のエピトープを含むＯ－グリカンに結合するという私たちの発見を裏付ける。
【0176】
フローサイトメトリーによるＫ５６２（ＣＭＬ細胞株）とＣＦＰＡＣ－１（膵臓細胞株）との間のＮＥＯ－２０１反応性差
Ｏ－グリカンアレイは、ＮＥＯ－２０１が０１、０２、０６、０２３、０２６及び０３９ Ｏ－グリカンと相互作用し、Ｏ６（コア１）結合相互作用が観察されたものの中で最も強いことを示した。
Ｏ－グリカンアレイは、ＮＥＯ－２０１が０１、０２、０６、０２３、０２６及び０３９ Ｏ－グリカンと相互作用し、Ｏ６（コア１）結合相互作用が観察されたものの中で最も強いことを示した。
【0177】
コア１グリカンが、ＮＥＯ－２０１に対して最も強い反応性を有するＯ－グリカンを表すことを確認するために、フローサイトメトリーによって、ＣＦＰＡＣ－１（図５に示す高レベルのコア１グリカンを発現する膵臓細胞株）とＫ５６２（図８に示すコア２グリカンのみを発現する慢性骨髄性白血病細胞株）との間のＮＥＯ－２０１反応性を比較した。
【0178】
図２７に示すように、ＮＥＯ－２０１はＫ５６２細胞と反応しなかった。逆に、ＣＦＰＡＣ－１細胞のほぼ１００％が、ＮＥＯ－２０１について陽性染色された。
【0179】
結論
がん細胞表面における異常なＯ－グリカン発現は、タンパク質及び脂質の重要な翻訳後修飾であり、がん発生によって強く影響される。これらの異常なＯ－グリカンは全て、腫瘍の診断及び治療を改善するための潜在的な標的として機能し得る。Ｔｎ及びＴ抗原を特異的に認識するモノクローナル抗体は、悪性細胞を検出するために広く使用されている。
がん細胞表面における異常なＯ－グリカン発現は、タンパク質及び脂質の重要な翻訳後修飾であり、がん発生によって強く影響される。これらの異常なＯ－グリカンは全て、腫瘍の診断及び治療を改善するための潜在的な標的として機能し得る。Ｔｎ及びＴ抗原を特異的に認識するモノクローナル抗体は、悪性細胞を検出するために広く使用されている。
【0180】
我々の結果は、ＮＥＯ－２０１がＯ－グリカン０１、０２、０６、０２３、０２６及び０３９ Ｏ－グリカンと相互作用し、最も強い結合がＴｎ抗原である０６、０１及び０２で観察されたことを示す。０６はコア１、０２３はコア２、０２６はコア３、０３９はコア４である。
【0181】
ＣＦＰＡＣ－１、ヒト好中球、ヒト血液腫瘍細胞ＨＬ６０、Ｕ９３７などのＮＥＯ－２０１反応性細胞は、コア１及びコア２ Ｏ－グリカン及び／または拡張コア１及びコア２ Ｏ－グリカンプロファイルの発現を示す。
【0182】
コア１グリカンがＮＥＯ－２０１への最も強い結合を示すという観察を確認するために、フローサイトメトリーによって、ＣＦＰＡＣ－１細胞（表面に高発現のコア１グリカン）に対するＮＥＯ－２０１反応性をＫ５６２細胞（コア２グリカンのみ発現）と比較した。
【0183】
示されているように、ＮＥＯ－２０１はＫ５６２細胞に反応せず、拡張コア２グリカンのみを発現することが観察された。一方、高レベルのコア１（特に０６）及び拡張コア１を発現したＣＦＰＡＣ－１は、フローサイトメトリーにおいて高い割合のＮＥＯ－２０１陽性細胞を示した。この観察は、ＮＥＯ－２０１がコア１及び／または拡張コア１グリカンに強く結合することを示唆している。これらの結果はまた、哺乳動物発現ｒｈＣＥＡＣＡＭ６が細菌発現ｒｈＣＥＡＣＭＡ６に存在しないＯ－グリカンを発現するため、ＮＥＯ－２０１が哺乳動物発現ｒｈＣＥＡＣＡＭ６に結合するが、細菌発現ｒｈＣＥＡＣＭＡ６には結合しないという我々の発見を確認する（図６）。
【0184】
我々は、切断研究からＣＥＡＣＡＭ６及びＣＥＡＣＡＭ５のＮＥＯ－２０１結合領域を同定した。これらの結果は、ＣＥＡＣＡＭ６における３１２～３２０（ＴＶＴＭＩＴＶＳＧ）のアミノ酸配列及びＣＥＡＣＡＭ５における３１０～３１８（ＲＴＴＶＴＴＩＴＶ）のアミノ酸配列の面積が、ＮＥＯ－２０１への結合に不可欠であることを示す。これらの領域は、スレオニン及びセリン残基からなり、ＧａｌＮＡｃ残基をスレオニンに添加してＯ－グリカンを形成することができることが知られている。これらの結果は、ＮＥＯ－２０１反応性細胞からのＯ－グリカンアレイ及びＯ－グリカンプロファイリングの結果とともに、ＮＥＯ－２０１がタンパク質配列のこれらの領域でコア１、コア２、及び／または拡張コア１及びコア２に結合することを強く示唆しているが、コア１及び／または拡張コア１は、ＮＥＯ－２０１への結合が最も高いグリカンである可能性が非常に高い。
【0185】
ヒト化ＮＥＯ－２０１モノクローナル抗体
これらの実施例で使用されたＮＥＯ－２０１抗体配列は、以下の図に含まれている。
これらの実施例で使用されたＮＥＯ－２０１抗体配列は、以下の図に含まれている。
【化1】
【0186】
発現リーダー配列、可変領域、及び定常領域の間の境界は、各配列中のフォワードスラッシュ（「／」）で区切られ、ＣＤＲ配列は、太字の下線付きテキストで示されている。使用された抗体配列は、示されている可変及び定常領域を含んだ。これらには、配列番号３２の重鎖ＣＤＲ１、配列番号３３の重鎖ＣＤＲ２、配列番号３４の重鎖ＣＤＲ３、配列番号３５の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号３６の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３７の軽鎖ＣＤＲ３が含まれる。
【0187】
本明細書で引用される各文書は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図1D】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7A】
【図7B】
【図7C】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【配列表】
【国際調査報告】