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特表2024-521745レンチウイルスによって特定の遺伝子が挿入されたボツリヌス毒素に敏感な細胞
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-06-04
(54)【発明の名称】レンチウイルスによって特定の遺伝子が挿入されたボツリヌス毒素に敏感な細胞
(51)【国際特許分類】
C12N 5/079 20100101AFI20240528BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240528BHJP
C12Q 1/02 20060101ALI20240528BHJP
G01N 33/543 20060101ALI20240528BHJP
C12N 15/12 20060101ALN20240528BHJP
【ＦＩ】
C12N5/079
C12N5/10 ZNA
C12Q1/02
G01N33/543 545A
C12N15/12
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023572228
(86)(22)【出願日】2022-05-24
(85)【翻訳文提出日】2023-11-21
(86)【国際出願番号】 KR2022007323
(87)【国際公開番号】W WO2022250405
(87)【国際公開日】2022-12-01
(31)【優先権主張番号】10-2021-0066040
(32)【優先日】2021-05-24
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(31)【優先権主張番号】10-2022-0063008
(32)【優先日】2022-05-23
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
(71)【出願人】
【識別番号】516359207
【氏名又は名称】エーティージーシー カンパニー、リミテッド
【氏名又は名称原語表記】ＡＴＧＣ ＣＯ．， ＬＴＤ．
(74)【代理人】
【識別番号】110000729
【氏名又は名称】弁理士法人ユニアス国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】チャン、ソン ス
(72)【発明者】
【氏名】イム、イル ホ
(72)【発明者】
【氏名】イ、ハク ソプ
(72)【発明者】
【氏名】アン、ヨン シク
(72)【発明者】
【氏名】チェ、ドゥ ジン
【テーマコード（参考）】
4B063
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B063QA01
4B063QQ08
4B063QQ79
4B063QR48
4B063QR77
4B063QR80
4B063QS33
4B063QS35
4B065AA90X
4B065AA90Y
4B065AA93X
4B065AA93Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065CA24
4B065CA46
(57)【要約】
本発明は、ＳＥＰＴＩＮ２またはＴｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ（ＴＸＮ）を過剰発現するボツリヌス毒素活性測定用細胞、及び前記ボツリヌス毒素活性測定用細胞にボツリヌス毒素を処理して培養する段階、前記培養された細胞を溶解させて細胞溶解液を収集する段階、及び前記細胞溶解液内のＳＮＡＰ－２５切断生成物の量を測定する段階を含むボツリヌス毒素活性測定方法に関する。
【選択図】図１５
【選択図】図１５
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＳＥＰＴＩＮ２またはＴｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ（ＴＸＮ）を過剰発現する、ボツリヌス毒素活性測定用細胞。
【請求項2】
前記細胞は、ＳＥＰＴＩＮ２またはＴＸＮ遺伝子が形質導入（ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）されて過剰発現されることを特徴とする、請求項１に記載のボツリヌス毒素活性測定用細胞。
【請求項3】
前記細胞は、ボツリヌス毒素中毒（ｉｎｔｏｘｉｃａｔｉｏｎ）に対する感受性が増加したことを特徴とする、請求項１に記載のボツリヌス毒素活性測定用細胞。
【請求項4】
前記細胞は、ＳｉＭａ細胞、ＬＡＮ－２細胞、ＰＣ１２細胞、Ｎｅｕｒｏ－２ａ細胞、ＬＡ１－５５ｎ細胞、Ｎ１８細胞、ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞、Ｋｅｌｌｙ細胞、ＮＢ６９細胞、Ｎ１Ｅ－１１５細胞、ＢＥ（２）－Ｍ１７細胞、及びＳＫ－Ｎ－ＢＥ（２）細胞からなる群から選ばれるいずれかであることを特徴とする、請求項１に記載のボツリヌス毒素活性測定用細胞。
【請求項5】
前記ボツリヌス毒素は、ボツリヌスセロタイプ（ｓｅｒｏｔｙｐｅ）Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ及びＧからなる群から選ばれるいずれかであることを特徴とする、請求項１に記載のボツリヌス毒素活性測定用細胞。
【請求項6】
ａ）請求項１～５のいずれか一項に記載のボツリヌス毒素活性測定用細胞にボツリヌス毒素を処理して培養する段階と、ｂ）前記培養された細胞を溶解させて細胞溶解液を収集する段階と、
ｃ）前記細胞溶解液内のＳＮＡＰ－２５切断生成物の量を測定する段階と、を含む、ボツリヌス毒素活性測定方法。
【請求項7】
前記ＳＮＡＰ－２５切断生成物の量は、サンドイッチ免疫検定法（ＥＬＩＳＡ）またはウェスタンブロット（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ）を用いて測定することを特徴とする、請求項６に記載のボツリヌス毒素活性測定方法。
【請求項8】
請求項１～５のいずれか一項に記載のボツリヌス毒素活性測定用細胞を有効成分として含む、ボツリヌス毒素活性測定用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ボツリヌス毒素活性測定用細胞及びこれを用いたボツリヌス毒素活性測定方法などに関する。
【背景技術】
【0002】
ボツリヌス毒素（ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ ｔｏｘｉｎ）は、腐った缶詰や腐った肉で育つグラム陽性嫌気性バクテリアであるクロストリジウム・ボツリヌス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）が作り出す神経毒素である。これは８つの神経毒素に分類され、このうち７種（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ）は、神経の麻痺を引き起こすことがある。サイズは約１５０ｋＤａで、ボツリヌス毒素タンパク質以外に非毒素タンパク質（ｎｏｎ－ｔｏｘｉｎ）の複合体から構成され、各複合体のサイズは、神経毒素の種類に応じて最大９００ｋＤａまで生成される。ボツリヌス毒素型によって作用形態と対象、活性期間などが異なるが、そのうちボツリヌス毒素Ａ型の場合、致命的な生物学的作用剤の１つとして知られている。このようなボツリヌス毒素は、筋肉の痙攣や収縮を誘発する信号を遮断して麻痺を引き起こす作用をするが、これらの機能に基づく生物学的作用剤として１９８９年に米国ＦＤＡの承認を受けてから、治療や美容目的で幅広く使用されている。治療目的としては、斜視（ｓｔｒａｂｉｓｍｕｓ）、斜頸（ｔｏｒｔｉｃｏｌｌｉｓ）、顔面痙攣（ｂｌｅｐｈａｒｏｓｐａｓｍ）、弛緩不能、歯並び、腰痛などのような疾患に、美容目的としては、しわ、しかめっ面のしわの除去、四角あご治療、多汗症（ｈｙｐｅｒｈｉｄｒｏｓｉｓ）などの治療に使用されている。
【0003】
ボツリヌス毒素を治療及び美容に使用するために、使用前の生物学的検証が必要であり、そのような検証は一般にマウスを用いたマウスＬＤ５０、すなわち、致死性試験（ｌｅｔｈａｌｉｔｙ ｔｅｓｔ）を通じて確認される。実質的に、薬剤学的製剤のラベル上のユニットは、マウスＬＤ５０ユニットである。しかし、統計学的に有用なマウスＬＤ５０データを提供するためには必要とするマウスの数が非常に多いだけでなく、検査のための費用が大きく、ボツリヌス毒素のセロタイプによる差が見えにくいという点などの限界点を持っている（韓国公開特許１０－２０１２－０１３４１５４）。
【0004】
したがって、このような短所を克服するためには、動物を使用せずにボツリヌス毒素吸収に必要な一切のすべての段階を評価できる、簡単でありながら敏感度は高い新しい方式のボツリヌス毒素活性測定方法が必要なのが実状である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
本発明は、前記のような従来技術上の問題点を解決するために案出されたもので、ボツリヌス毒素活性測定用細胞及びそれを用いたボツリヌス毒素活性測定方法などを提供することをその目的とする。前記細胞は、ＳＥＰＴＩＮ２またはＴｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ（ＴＸＮ）遺伝子を過剰発現する細胞であり、ボツリヌス毒素の結合、細胞吸収、細胞質内への転位及びプロテアーゼ活性をすべて評価できるだけでなく、ボツリヌス毒素に対する敏感度が著しく向上したため、低い容量のボツリヌス毒素も高い精度で検証できる。また、原料医薬品及び完製医薬品状態のボツリヌス毒素薬学的組成物の活性も測定しうる。
【0006】
しかし、本発明が解決しようとする技術的課題は、以上で言及した課題に制限されず、言及されていないさらに他の課題は、以下の記載から本発明が属する技術分野の通常の知識を有する者が明確に理解できるだろう。
【課題を解決するための手段】
【0007】
本発明は、ＳＥＰＴＩＮ２またはＴｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ（ＴＸＮ）を過剰発現するボツリヌス毒素活性測定用細胞を提供する。
【0008】
本発明の一具体例において、前記細胞は、ＳＥＰＴＩＮ２またはＴＸＮ遺伝子が好ましくは、形質導入（ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）、形質移入（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）などの方法で細胞内に挿入されて前記遺伝子が過剰発現されてもよいが、一般に知られている細胞内に遺伝子を挿入する方式であれば、これに制限されるものではない。前記ＳＥＰＴＩＮ２は、好ましくは、ヒトのＳＥＰＴＩＮ２遺伝子であり、より好ましくは、ＮＣＢＩのａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ ＮＭ＿００１００８４９１．２の３，７２６ｂｐのｍＲＮＡ配列を発現する遺伝子であるが、その変異体も本発明の範囲に含まれる。具体的には、ＮＭ＿００１００８４９１．２のｍＲＮＡ配列と９０％以上、より好ましくは、９５％以上、最も好ましくは、９８％以上の配列相同性を有する配列を含んでもよい。「配列相同性の％」は、最適に配列された配列と比較領域を比較することによって確認され、比較領域においてヌクレオチド配列の一部は、配列の最適配列に対する参照配列（追加または削除を含まない）に比べて追加または削除（すなわち、ギャップ）を含んでもよい。次に、前記ＴＸＮは、好ましくは、ヒトのＴＸＮ遺伝子であり、より好ましくは、ＮＣＢＩのａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ ＮＭ＿００３３２９．４の７３７ｂｐのｍＲＮＡ配列を発現する遺伝子であるが、その変異体も本発明の範囲に含まれる。具体的には、ＮＭ＿００３３２９．４のｍＲＮＡ配列と９０％以上、より好ましくは、９５％以上、最も好ましくは、９８％以上の配列相同性を有する配列を含んでもよい。「配列相同性の％」は、最適に配列された配列と比較領域を比較することによって確認され、比較領域においてヌクレオチド配列の一部は、配列の最適配列に対する参考配列（追加または削除を含まない）に比べて追加または削除（すなわち、ギャップ）を含んでもよい。
【0009】
本発明の他の具体例において、前記細胞は、ＳＥＰＴＩＮ２またはＴＸＮ遺伝子が過剰発現されることにより、野生型（ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ）細胞に比べてボツリヌス毒素中毒（ｉｎｔｏｘｉｃａｔｉｏｎ）に対する感受性が増加したことを特徴とする。
【0010】
本発明のさらに他の具体例において、前記細胞は好ましくは、ＳｉＭａ細胞、ＬＡＮ－２細胞、ＰＣ１２細胞、Ｎｅｕｒｏ－２ａ細胞、ＬＡ１－５５ｎ細胞、Ｎ１８細胞、ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞、Ｋｅｌｌｙ細胞、ＮＢ６９細胞、Ｎ１Ｅ－１１５細胞、ＢＥ（２）－Ｍ１７細胞、ＳＫ－Ｎ－ＢＥ（２）細胞などであってもよいが、一般にボツリヌス毒素活性を測定するのに使用できることが知られている細胞株であれば、これに制限されるものではない。
【0011】
本発明のさらに他の具体例において、前記ボツリヌス毒素は、ボツリヌスセロタイプ（ｓｅｒｏｔｙｐｅ）Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ及びＧからなる群から選ばれてもよい。
【0012】
また、本発明は、ａ）前記ボツリヌス毒素活性測定用細胞にボツリヌス毒素を処理して培養する段階、ｂ）前記培養された細胞を溶解させ、細胞溶解液を収集する段階、及びｃ）前記細胞溶解液内のＳＮＡＰ－２５切断生成物の量を測定する段階を含む、ボツリヌス毒素活性測定方法を提供する。
【0013】
本発明の一具体例において、前記ＳＮＡＰ－２５切断生成物の量は、サンドイッチ免疫検定法（ＥＬＩＳＡ）、ウェスタンブロット（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ）などを用いて測定することを特徴とするが、タンパク質を検出するのに使用する方法として知られている方法であれば、これに制限されるものではない。
【0014】
また、本発明は、前記ボツリヌス毒素活性測定用細胞を有効成分として含む、ボツリヌス毒素活性測定用キットを提供する。
【0015】
また、本発明は、前記ボツリヌス毒素活性測定用細胞のボツリヌス毒素活性測定のための用途を提供する。
【発明の効果】
【0016】
本発明によるボツリヌス毒素活性測定用細胞は、ＳＥＰＴＩＮ２またはＴｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎを過剰発現することにより、ボツリヌス毒素に対する敏感度が著しく向上したため、低用量のボツリヌス毒素も高精度で検証できるだけでなく、ボツリヌス毒素の結合、細胞吸収、細胞質内への電位及びプロテアーゼ活性をすべて評価できるため、多数の動物実験に代わることが期待される。また、ボツリヌス毒素だけでなく、原料医薬品及び完製医薬品状態のボツリヌス毒素薬学的組成物の活性も測定できるため、ボツリヌス毒素を用いる様々な分野の産業に容易に適用できるものと期待される。
【図面の簡単な説明】
【0017】
【発明を実施するための形態】
【0018】
本発明者らは、ボツリヌス毒素活性測定方法について鋭意研究した結果、ボツリヌス毒素活性を測定できる敏感度が向上した細胞株を作製し、これを用いて安定的にボツリヌス毒素の活性を測定できることを確認して本発明を完成した。
【0019】
本明細書において、「ボツリヌス毒素」は、細菌によって産生されるか、または組換え技法によって産生されてもよいが、任意の公知の種類のボツリヌス毒素及び操作された変異体または融合タンパク質を含む、続いて発見できる種類のボツリヌス毒素を意味する。
ボツリヌス毒素８つの神経毒素に区分され、ボツリヌス毒素のセロタイプ（ｓｅｒｏｔｙｐｅ）であるＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ及びＧの７種は、神経麻痺を誘発することがある。このタンパク質は、複合体を含むタンパク質と含まないタンパク質に分けられ、純粋な毒素タンパク質の分子量は、１５０ｋＤａであり、複合体の形成の有無に応じて３００ｋＤａ、５００ｋＤａ及び９００ｋＤａで多様にタンパク質が生成される。本発明のボツリヌス毒素は、代案的にボツリヌス毒素誘導体、すなわち、ボツリヌス毒素活性を有するが、天然または組換えの原型ボツリヌス毒素に比べて１つ以上の化学的変形または機能的変形を含む化合物であってもよい。例えば、ボツリヌス毒素は、変形された神経毒素（例えば、原型の、または組換えによって生成された神経毒素、その誘導体または断片に比べて１つ以上のアミノ酸の欠失、修飾または置換を有する神経毒素）であってもよい。例えば、ボツリヌス毒素は、その特性を強化するか、またはその望ましくない副作用を減少させるが、依然として望ましいボツリヌス毒素の活性を保有する方式で変形されたボツリヌス毒素であってもよい。代案的に、ボツリヌス毒素は組換えまたは合成化学技法を用いて製造された毒素であってもよい（例えば、異なるボツリヌス毒素のセロタイプのサブユニットまたはドメインから製造された、組換えペプチド、融合タンパク質、またはハイブリッド神経毒素（例えば、米国特許第６，４４４，２０９号参照）。ボツリヌス毒素は、また、必要なボツリヌス毒素活性を有することが実証された全分子の一部分であってもよく、そのような場合には、それ自体または組み合わせまたはコンジュゲート（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）分子、例えば、融合タンパク質の一部として用いられてもよい。また、ボツリヌス毒素は、それ自体で非毒性でありうるボツリヌス毒素の前駆体、例えば、タンパク質加水分解による分解時に毒性となり得る無毒性亜鉛プロテアーゼ（ｚｉｎｃ ｐｒｏｔｅａｓｅ）の形態であってもよい。
ボツリヌス毒素８つの神経毒素に区分され、ボツリヌス毒素のセロタイプ（ｓｅｒｏｔｙｐｅ）であるＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ及びＧの７種は、神経麻痺を誘発することがある。このタンパク質は、複合体を含むタンパク質と含まないタンパク質に分けられ、純粋な毒素タンパク質の分子量は、１５０ｋＤａであり、複合体の形成の有無に応じて３００ｋＤａ、５００ｋＤａ及び９００ｋＤａで多様にタンパク質が生成される。本発明のボツリヌス毒素は、代案的にボツリヌス毒素誘導体、すなわち、ボツリヌス毒素活性を有するが、天然または組換えの原型ボツリヌス毒素に比べて１つ以上の化学的変形または機能的変形を含む化合物であってもよい。例えば、ボツリヌス毒素は、変形された神経毒素（例えば、原型の、または組換えによって生成された神経毒素、その誘導体または断片に比べて１つ以上のアミノ酸の欠失、修飾または置換を有する神経毒素）であってもよい。例えば、ボツリヌス毒素は、その特性を強化するか、またはその望ましくない副作用を減少させるが、依然として望ましいボツリヌス毒素の活性を保有する方式で変形されたボツリヌス毒素であってもよい。代案的に、ボツリヌス毒素は組換えまたは合成化学技法を用いて製造された毒素であってもよい（例えば、異なるボツリヌス毒素のセロタイプのサブユニットまたはドメインから製造された、組換えペプチド、融合タンパク質、またはハイブリッド神経毒素（例えば、米国特許第６，４４４，２０９号参照）。ボツリヌス毒素は、また、必要なボツリヌス毒素活性を有することが実証された全分子の一部分であってもよく、そのような場合には、それ自体または組み合わせまたはコンジュゲート（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）分子、例えば、融合タンパク質の一部として用いられてもよい。また、ボツリヌス毒素は、それ自体で非毒性でありうるボツリヌス毒素の前駆体、例えば、タンパク質加水分解による分解時に毒性となり得る無毒性亜鉛プロテアーゼ（ｚｉｎｃ ｐｒｏｔｅａｓｅ）の形態であってもよい。
【0020】
本明細書において、「細胞」とは、ボツリヌス毒素によるボツリヌス毒素中毒に脆弱なすべての真核細胞、またはボツリヌス毒素を吸収できるすべての真核細胞を意味する。真核細胞は、例えば、マウス、ラット、ブタ、ウシ、ヒツジ、ウマ、霊長類及びヒトなどの様々な哺乳類に由来する細胞を意味する。本明細書において、「作製された細胞株」とは、確立された細胞株、不滅の細胞株、または形質転換細胞株と同義語であり、無限増殖のために選択された細胞を意味する。本明細書に開示された形質転換細胞株は、複数の細胞継代に対してボツリヌス毒素活性に対する一貫した敏感度を示し、「ボツリヌス毒素活性に対する敏感度」とは、非－処理対照群または背景（ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ）信号によって検出された信号を一貫して測定できる最低のボツリヌス毒素濃度を意味する。
【0021】
本明細書において、「ベクター」または「プラスミド」とは、細胞内に伝達されるＤＮＡ断片、核酸分子などを意味し、前記ベクターは、ＤＮＡを複製させ、宿主細胞から独立して再製造されてもよい。用語の「伝達体」と互換して使用されてもよい。「発現ベクター」とは、目的のコード配列と、特定の宿主生物において作動可能に連結されたコード配列を発現するのに必須的な滴定核酸配列を含む組換えＤＮＡ分子を意味する。また、本発明の組換えベクターまたはプラスミドは、ＳＥＰＴＩＮ２またはＴｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎをコードする遺伝子が含まれており、細胞内でＳＥＰＴＩＮ２またはＴｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎを過剰発現させることができるすべてのベクターを総称する。
【0022】
本明細書において、「キット」とは、本発明のボツリヌス毒素活性測定用細胞を含むことにより、ボツリヌス毒素の活性を測定できる機器を意味し、ボツリヌス毒素そのもの、ボツリヌス毒素の原料医薬品、ボツリヌス毒素の完製医薬品などのボツリヌス毒素の活性を測定するのに使用されてもよく、本発明のキットには、本発明のボツリヌス毒素活性測定用細胞以外に細胞を溶解させるための細胞溶解剤、ＥＬＩＳＡ用抗体及び試薬、マニュアルなどをさらに含んでもよいが、本発明のボツリヌス毒素活性測定方法に使用できるものであればさらに含んでもよい。
【0023】
以下、本発明の理解を助けるために好ましい実施例を提示する。しかし、以下の実施例は、本発明をより容易に理解するために提供されるものであり、以下の実施例によって本発明の内容が限定されるものではない。
【0024】
［実施例］
実施例１：レンチウイルス産生用細胞株２９３ＦＴの培養
レンチウイルス産生に一般的に用いられる細胞株である２９３ＦＴは、２９３Ｆ細胞株から由来したもので、ｐＣＭＶＳＰＯＲＴ６ＴＡｇ．ｎｅｏ ｐｌａｓｍｉｄを通じてＳＶ４０ ｌａｒｇｅ Ｔ ａｎｔｉｇｅｎを安定的に発現する細胞株で、レンチウイルスの産生に使用される代表的な細胞株である。２９３ＦＴ細胞株は、前記ｐｌａｓｍｉｄ内にネオマイシン耐性遺伝子を暗号化しているため、細胞解凍を除くすべての細胞の培養時にはネオマイシン類似体であるｇｅｎｅｔｉｃｉｎを含む培地を用いて培養した。より詳細には、２９３ＦＴ ｃｅｌｌ ｓｔｏｃｋ（Ｔｈｅｒｍｏ，Ｒ７００－０７）を１０％ ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ），１Ｘ ＮＥＡＡ（Ｇｉｂｃｏ），２ｍＭ Ｌ－ｇｌｕｔａｍｉｎｅ（Ｇｉｂｃｏ）及び１％ ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ－ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（Ｇｉｂｃｏ）が添加されたＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）培地に懸濁し、２００ｘｇで３分間遠心分離して上澄み液を除去し、細胞を得た。得られた細胞は培養培地を用いて再懸濁した後、１００ｍｍ細胞培養皿に分注して３７℃、５％ＣＯ２培養器で２４時間培養した。その後、培養培地をすべて除去し、１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）、１Ｘ ＮＥＡＡ（Ｇｉｂｃｏ）、２ｍＭ Ｌ－ｇｌｕｔａｍｉｎｅ（Ｇｉｂｃｏ）、１％ ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ－ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（Ｇｉｂｃｏ）及び５００ μｇ／ｍＬ ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ（Ｇｉｂｃｏ）が添加されたＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）培地に交換した後、培養した。次に、細胞飽和度（ｃｅｌｌ ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｙ）が９０％以上に増加すれば、再び継代培養を行った。継代培養は、まず従来の培養培地を除去し、ＤＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）を培養体積（ｃｕｌｔｕｒｅ ｖｏｌｕｍｅ）の５０％である５ｍＬを添加して水洗いした。次に、ＤＰＢＳを除去し、ＴｒｙｐＬＥ（Ｇｉｂｃｏ）を培養体積の２０％である２ｍＬを添加し、３７℃、５％ＣＯ２培養器で２分間反応させた。反応が完了した後、培養培地をさらに添加した後、８００ｘｇ、４℃で２分間遠心分離して上澄み液を除去した。次に、培養培地を用いて再懸濁した後、Ｔｒｙｐａｎ ｂｌｕｅ（Ｇｉｂｃｏ）とヘモサイトメーターを用いて細胞数を測定し、１００ｍｍの細胞培養皿に２×１０６個の細胞を１０ｍＬの培養培地とともに分注して継代培養し、継代培養は、３～４日ごとに前記と同じ方法で行った。
実施例１：レンチウイルス産生用細胞株２９３ＦＴの培養
レンチウイルス産生に一般的に用いられる細胞株である２９３ＦＴは、２９３Ｆ細胞株から由来したもので、ｐＣＭＶＳＰＯＲＴ６ＴＡｇ．ｎｅｏ ｐｌａｓｍｉｄを通じてＳＶ４０ ｌａｒｇｅ Ｔ ａｎｔｉｇｅｎを安定的に発現する細胞株で、レンチウイルスの産生に使用される代表的な細胞株である。２９３ＦＴ細胞株は、前記ｐｌａｓｍｉｄ内にネオマイシン耐性遺伝子を暗号化しているため、細胞解凍を除くすべての細胞の培養時にはネオマイシン類似体であるｇｅｎｅｔｉｃｉｎを含む培地を用いて培養した。より詳細には、２９３ＦＴ ｃｅｌｌ ｓｔｏｃｋ（Ｔｈｅｒｍｏ，Ｒ７００－０７）を１０％ ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ），１Ｘ ＮＥＡＡ（Ｇｉｂｃｏ），２ｍＭ Ｌ－ｇｌｕｔａｍｉｎｅ（Ｇｉｂｃｏ）及び１％ ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ－ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（Ｇｉｂｃｏ）が添加されたＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）培地に懸濁し、２００ｘｇで３分間遠心分離して上澄み液を除去し、細胞を得た。得られた細胞は培養培地を用いて再懸濁した後、１００ｍｍ細胞培養皿に分注して３７℃、５％ＣＯ２培養器で２４時間培養した。その後、培養培地をすべて除去し、１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）、１Ｘ ＮＥＡＡ（Ｇｉｂｃｏ）、２ｍＭ Ｌ－ｇｌｕｔａｍｉｎｅ（Ｇｉｂｃｏ）、１％ ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ－ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（Ｇｉｂｃｏ）及び５００ μｇ／ｍＬ ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ（Ｇｉｂｃｏ）が添加されたＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）培地に交換した後、培養した。次に、細胞飽和度（ｃｅｌｌ ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｙ）が９０％以上に増加すれば、再び継代培養を行った。継代培養は、まず従来の培養培地を除去し、ＤＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）を培養体積（ｃｕｌｔｕｒｅ ｖｏｌｕｍｅ）の５０％である５ｍＬを添加して水洗いした。次に、ＤＰＢＳを除去し、ＴｒｙｐＬＥ（Ｇｉｂｃｏ）を培養体積の２０％である２ｍＬを添加し、３７℃、５％ＣＯ２培養器で２分間反応させた。反応が完了した後、培養培地をさらに添加した後、８００ｘｇ、４℃で２分間遠心分離して上澄み液を除去した。次に、培養培地を用いて再懸濁した後、Ｔｒｙｐａｎ ｂｌｕｅ（Ｇｉｂｃｏ）とヘモサイトメーターを用いて細胞数を測定し、１００ｍｍの細胞培養皿に２×１０６個の細胞を１０ｍＬの培養培地とともに分注して継代培養し、継代培養は、３～４日ごとに前記と同じ方法で行った。
【0025】
実施例２：ＢｏＮＴ／Ａ中毒に脆弱な細胞株の作製のための遺伝子選定及び暗号化プラスミドの作製
図１に示すように、ＳＥＰＴＩＮ２（ＳＥＰＴ２）は、ＢｏＮＴ／Ａが細胞内で分解されることから保護する役割を果たし、Ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ（ＴＸＮ）は、ＢｏＮＴ／Ａの重鎖と軽鎖間の二硫化結合を分離するのに作用することが知られている。前記２つのタンパク質を細胞内で過剰発現させるために、ｐＬｅｎｔｉ－Ｃ－Ｍｙｃ－ＤＤＫ－Ｐ２Ａ－Ｐｕｒｏベクター内にそれぞれのタンパク質をコードする遺伝子が挿入されたｐＬｅｎｔｉ－ＯＲＦプラスミド（ＳＥＰＴＩＮ２：ＲＣ２２４８６４Ｌ３、ＴＸＮ：ＲＣ２０８８７６Ｌ３）をＯｒｉｇｅｎｅ社に依頼して作製した。ＳＥＰＴＩＮ２作製のためには、配列番号９のアミノ酸配列（ＤＮＡ配列：配列番号１０）を利用し、Ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ作製のためには、配列番号１１のアミノ酸配列（ＤＮＡ配列：配列番号１２）を利用した。ｐＬｅｎｔｉ－Ｃ－Ｍｙｃ－ＤＤＫ－Ｐ２Ａ－Ｐｕｒｏベクターマップを図２に示した。凍結乾燥したｐＬｅｎｔｉ－ＯＲＦプラスミドが入ったチューブを５０００ｘｇで３分間遠心分離した後、蒸留水１００μＬを添加し、ピペッティングした後、－２０℃の冷凍庫で使用前まで保管した。
図１に示すように、ＳＥＰＴＩＮ２（ＳＥＰＴ２）は、ＢｏＮＴ／Ａが細胞内で分解されることから保護する役割を果たし、Ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ（ＴＸＮ）は、ＢｏＮＴ／Ａの重鎖と軽鎖間の二硫化結合を分離するのに作用することが知られている。前記２つのタンパク質を細胞内で過剰発現させるために、ｐＬｅｎｔｉ－Ｃ－Ｍｙｃ－ＤＤＫ－Ｐ２Ａ－Ｐｕｒｏベクター内にそれぞれのタンパク質をコードする遺伝子が挿入されたｐＬｅｎｔｉ－ＯＲＦプラスミド（ＳＥＰＴＩＮ２：ＲＣ２２４８６４Ｌ３、ＴＸＮ：ＲＣ２０８８７６Ｌ３）をＯｒｉｇｅｎｅ社に依頼して作製した。ＳＥＰＴＩＮ２作製のためには、配列番号９のアミノ酸配列（ＤＮＡ配列：配列番号１０）を利用し、Ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ作製のためには、配列番号１１のアミノ酸配列（ＤＮＡ配列：配列番号１２）を利用した。ｐＬｅｎｔｉ－Ｃ－Ｍｙｃ－ＤＤＫ－Ｐ２Ａ－Ｐｕｒｏベクターマップを図２に示した。凍結乾燥したｐＬｅｎｔｉ－ＯＲＦプラスミドが入ったチューブを５０００ｘｇで３分間遠心分離した後、蒸留水１００μＬを添加し、ピペッティングした後、－２０℃の冷凍庫で使用前まで保管した。
【0026】
ｐＬｅｎｔｉ－ＯＲＦプラスミドに形質転換された菌株を作製するために、プラスミドを常温で解凍し、水溶性細胞（ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｃｅｌｌ，ＲＢＣ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）は、１００μＬを４℃で解凍した。次に、解凍されたプラスミド２μＬを水溶性細胞に処理した後、４℃で１０分間反応させた後、３７℃で１分間熱ショック（ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ）を加えた後、ＬＢ ｂｒｏｔｈ７００μＬを添加し、３７℃振とう培養器で１５分間培養した。培養が完了した後、３４μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールが添加されたＬＢ寒天平板（ａｇａｒ ｐｌａｔｅ）に培養液２０μＬを添加し、スプレッダーで均一に広げた。菌を処理した寒天平板は、３７℃培養器で１６時間培養した。次に、寒天平板上に生成された群体（ｃｏｌｏｎｙ）をそれぞれクロラムフェニコールが添加されたＬＢ ｂｒｏｔｈ１．５ｍＬに接種し、３７℃培養器で１６時間振とう培養した。培養が完了した後、培養液を１３，０００ｒｐｍで１分間遠心分離して上澄み液を除去し、残ったペレットは、ＤＮＡ－ｓｐｉｎ Ｐｌａｓｍｉｄ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ｉＮｔＲＯＮ）を用いて提供されたプロトコルに従ってプラスミドの精製に使用した。次に、精製されたプラスミドの塩基配列は、コスモジンテックに依頼して分析した。塩基配列分析に用いたプライマー配列を表１に示した。塩基配列分析の結果、ＳＥＰＴＩＮ２は、ＮＣＢＩのａｃｃｅｓｓ ｎｕｍｂｅｒ ＮＭ＿００１００８４９１．２と、ＴＸＮは、ＮＭ＿００３３２９．４と正確に一致することを確認し、これにより、ＳＥＰＴＩＮ２またはＴＸＮ、すなわち、ターゲット遺伝子が正常に挿入されたプラスミドが作製されたことを確認した。
【0027】
【表1】
【0028】
ｐＬｅｎｔｉ－ＯＲＦプラスミドを大量生産するために、プラスミドに形質転換された菌株培養液５００μＬを、３４μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールが添加された１００ｍＬのＬＢ ｂｒｏｔｈに接種した後、３７℃で１６時間振とう培養した。次に、培養液を５００ｍＬ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ ｂｏｔｔｌｅ（Ｎａｌｇｅｎｅ）に移した後、６０００ｘｇ、４℃で１５分間遠心分離し、上澄み液を除去した。次に、ＨｉＳｐｅｅｄ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｄｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてペレットからプラスミドを精製した。精製されたプラスミドは、Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ＵＶ／ｖｉｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ ＤＵ ７３０（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いて定量した。その結果を表２に示した。
【0029】
【表2】
【0030】
実施例３：２９３ＦＴ細胞株内の形質移入によるレンチウイルスの作製
レンチウイルス生産効率の高い細胞株である２９３ＦＴ細胞株を前記実施例１と同じ方法で継代培養された２．５ｘ１０６個の細胞を１００ｍｍ細胞培養皿に分注した。次に、細胞飽和度が４０～５０％に達することを顕微鏡で確認した。その結果を図３に示した。次に、形質移入（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）のために１．５ｍＬのチューブにｏｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）１．５ｍＬとｐＬｅｎｔｉ－ＯＲＦプラスミド５μｇを添加して混合した。次に、蒸留水に含まれている０．５μｇ／μＬのｐａｃｋａｇｉｎｇ ｐｌａｓｍｉｄ（Ｏｒｉｇｅｎｅ）を６μｇ添加して混合した後、ＴｕｒｂｏＦｅｃｔｉｎ（Ｏｒｉｇｅｎｅ）３３μＬをさらに添加して混合した。混合溶液を常温で１５分間反応させた後、細胞培養皿にすべて処理し、２日間培養した。次に、ウイルスが含まれている培地上澄み液を回収して４℃で保管し、新しい培地を添加して再び１日間培養した。次に、再び培地上澄み液を回収し、前日回収した培地と混合した後、０．４５μｍシリンジフィルター（ｓｙｒｉｎｇｅ ｆｉｌｔｅｒ，Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を用いてフィルタリングした後、使用前まで４℃で保管した。
レンチウイルス生産効率の高い細胞株である２９３ＦＴ細胞株を前記実施例１と同じ方法で継代培養された２．５ｘ１０６個の細胞を１００ｍｍ細胞培養皿に分注した。次に、細胞飽和度が４０～５０％に達することを顕微鏡で確認した。その結果を図３に示した。次に、形質移入（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）のために１．５ｍＬのチューブにｏｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）１．５ｍＬとｐＬｅｎｔｉ－ＯＲＦプラスミド５μｇを添加して混合した。次に、蒸留水に含まれている０．５μｇ／μＬのｐａｃｋａｇｉｎｇ ｐｌａｓｍｉｄ（Ｏｒｉｇｅｎｅ）を６μｇ添加して混合した後、ＴｕｒｂｏＦｅｃｔｉｎ（Ｏｒｉｇｅｎｅ）３３μＬをさらに添加して混合した。混合溶液を常温で１５分間反応させた後、細胞培養皿にすべて処理し、２日間培養した。次に、ウイルスが含まれている培地上澄み液を回収して４℃で保管し、新しい培地を添加して再び１日間培養した。次に、再び培地上澄み液を回収し、前日回収した培地と混合した後、０．４５μｍシリンジフィルター（ｓｙｒｉｎｇｅ ｆｉｌｔｅｒ，Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を用いてフィルタリングした後、使用前まで４℃で保管した。
【0031】
実施例４：レンチウイルスを用いた形質導入細胞株の作製
実施例１と同じ方法で継代培養した４ｘ１０６個のＳｉＭａ（ＤＳＭＺ，ＡＣＣ１６４）細胞株１０％ＦＢＳ，２ｍＭ Ｌ－ｇｌｕｔａｍｉｎｅ（Ｇｉｂｃｏ）及び１％ ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ－ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（Ｇｉｂｃｏ）が添加されたＲＰＭＩ１６４０（Ｇｉｂｃｏ）培養培地４ｍＬが添加された６０ｍｍ細胞培養皿に分注し、１６時間培養した。次に、培養液を除去した後、実施例３と同じ方法で得られたレンチウイルス溶液１ｍＬと新しい培地３ｍＬを混合して添加し、ポリブレン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を最終濃度が８μｇ／ｍＬとなるように添加して培養した。翌日、培養液を除去し、新しい培地を添加した後、再び１日間培養し、１μｇ／ｍＬのピューロマイシン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）が添加された新しい培養培地に交換した。その後、３～４日間隔でピューロマイシンが含まれた培地に交換しながら、形質導入されたピューロマイシン薬剤耐性細胞のみを選別した。レンチウイルスを用いて形質導入された細胞株を作製する方法を図４に簡略に示した。
実施例１と同じ方法で継代培養した４ｘ１０６個のＳｉＭａ（ＤＳＭＺ，ＡＣＣ１６４）細胞株１０％ＦＢＳ，２ｍＭ Ｌ－ｇｌｕｔａｍｉｎｅ（Ｇｉｂｃｏ）及び１％ ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ－ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（Ｇｉｂｃｏ）が添加されたＲＰＭＩ１６４０（Ｇｉｂｃｏ）培養培地４ｍＬが添加された６０ｍｍ細胞培養皿に分注し、１６時間培養した。次に、培養液を除去した後、実施例３と同じ方法で得られたレンチウイルス溶液１ｍＬと新しい培地３ｍＬを混合して添加し、ポリブレン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を最終濃度が８μｇ／ｍＬとなるように添加して培養した。翌日、培養液を除去し、新しい培地を添加した後、再び１日間培養し、１μｇ／ｍＬのピューロマイシン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）が添加された新しい培養培地に交換した。その後、３～４日間隔でピューロマイシンが含まれた培地に交換しながら、形質導入されたピューロマイシン薬剤耐性細胞のみを選別した。レンチウイルスを用いて形質導入された細胞株を作製する方法を図４に簡略に示した。
【0032】
次に、培養された細胞株をそれぞれの群体に分離するために、図５に示すように、クローニングシリンダー（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて物理的に培養皿内に空間を区画した。より詳しくは、培養に使用した培地を除去し、ＤＰＢＳ３ｍＬを処理して細胞を水洗いした後にそれぞれの群体にクローニングシリンダーを取り付け、シリンダー内のＤＰＢＳのみを別々に除去した。次に、クローニングシリンダー内にｔｒｙｐＬＥ５０μＬをそれぞれ処理し、３７℃、５％ＣＯ２培養器で３分間反応させた。その後、ｔｒｙｐＬＥ及び細胞混合液をピペッティングして混合した後、１μｇ／ｍＬのピューロマイシンが添加された１５０μＬの培養培地が含まれている９６ウェルプレートにそれぞれ分注した。次に、分注された順序で細胞株の名前を命名した。その後、細胞の成長に応じてスケールアップして培養した。
【0033】
実施例５：形質導入された細胞株の確認
５．１．導入されたタンパク質の発現有無の検証
実施例４と同じ方法で作製された形質導入細胞株を確認するために、１次的に発現されるタンパク質をウェスタンブロッティングを用いて確認した。より詳しくは、スケールアップして培養した１００ｍｍ細胞培養皿の培地を除去し、４℃のＤＰＢＳ ５ｍＬを用いて水洗いした。次に、ＤＰＢＳを除去した後、ｃＯｍｐｌｅｔｅＴＭ及びＥＤＴＡ－ｆｒｅｅ Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｃｏｃｋｔａｉｌ（Ｒｏｃｈｅ）が添加されているＲＩＰＡ溶解緩衝液（ｉＮｔＲＯＮ）２００μＬを細胞に処理した。Ｃｅｌｌ ｌｉｆｔｅｒ（ＳＰＬ）を用いて細胞溶解液を１．５ｍＬ ｔｕｂｅに移した後、４℃で２０分間動かさずに反応させた。次に、１７，０００ｒｐｍ、４℃の条件で３０分間遠心分離した後、上澄み液を新しい１．５ｍＬのチューブに移した。ｐｉｅｒｃｅＴＭＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いて上澄み液内のタンパク質量を定量し、４Ｘ Ｌａｅｍｍｌｉ Ｓａｍｐｌｅ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）でサンプリングした後、１００℃で１０分間加熱してウェスタンブロッティング用の試料を用意した。次に、１５％ポリアクリルアミドゲルを用いてウェスタンブロッティングを行った。電気泳動により試料内のタンパク質をサイズに応じて分離し、１００Ｖ、１時間条件でＩｍｍｏｂｉｌｏｎ－Ｐ ＰＶＤＦ Ｍｅｍｂｒａｎｅ（Ｍｅｒｃｋ）に移動させた。タンパク質の移動が完了したｍｅｍｂｒａｎｅは、Ｐｏｎｃｅａｕ Ｓ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）で染色してタンパク質発現パターンを確認した。Ｍｅｍｂｒａｎｅを０．１％ ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ ２０ ｉｎ ＰＢＳ（ＰＢＳＴ）に浸して５分ずつ４回Ｄｉｇｉｔａｌ Ｏｒｂｉｔａｌ Ｓｈａｋｅｒ（ＤＡＩＨＡＮ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて水洗いしてＰｏｎｃｅａｕ Ｓを除去し、ブロッキング緩衝液（５％ ＢＳＡ ＰＢＳＴ）を添加し、常温で１時間、Ｄｉｇｉｔａｌ Ｏｒｂｉｔａｌ Ｓｈａｋｅｒを用いてブロッキングさせた。ｐＬｅｎｔｉ－Ｃ－Ｍｙｃ－ＤＤＫ－Ｐ２Ａ－Ｐｕｒｏベクター内のターゲット遺伝子、すなわち、挿入された遺伝子が発現されると、発現されるタンパク質のＣ末端にはＭｙｃとＤＤＫ－ＴＡＧが一緒に発現される。したがって、ブロッキングが完了したｍｅｍｂｒａｎｅにＭｙｃタグに特異的に結合する１次抗体（Ｍｙｃ－ｔａｇ，Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２２７８Ｓ，１：１０００ ｖ／ｖ ｉｎ ２％ＢＳＡ ＰＢＳＴ）を処理し、４℃でＤｉｇｉｔａｌ Ｏｒｂｉｔａｌ Ｓｈａｋｅｒを用いて１６時間反応させた。反応が完了したｍｅｍｂｒａｎｅは、ＰＢＳＴに浸して５分ずつ４回、Ｄｉｇｉｔａｌ Ｏｒｂｉｔａｌ Ｓｈａｋｅｒを用いて洗浄した後、２次抗体（Ａｎｔｉ－Ｒａｂｂｉｔ ＨＲＰ，ａｂｃａｍ，ａｂ６７２１，１：１００００ｖ／ｖ ｉｎ ＰＢＳＴ）を処理し、常温で１時間反応させた。その後、ＰＢＳＴにｍｅｍｂｒａｎｅを浸して５分ずつ４回、Ｄｉｇｉｔａｌ Ｏｒｂｉｔａｌ Ｓｈａｋｅｒを用いて洗浄し、Ｐｉｅｒｃｅ ＥＣＬ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を処理した後、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ ＬＡＳ ５００（Ｃｙｔｉｖａ）でタンパク質を検出した。その結果を図６に示した。
５．１．導入されたタンパク質の発現有無の検証
実施例４と同じ方法で作製された形質導入細胞株を確認するために、１次的に発現されるタンパク質をウェスタンブロッティングを用いて確認した。より詳しくは、スケールアップして培養した１００ｍｍ細胞培養皿の培地を除去し、４℃のＤＰＢＳ ５ｍＬを用いて水洗いした。次に、ＤＰＢＳを除去した後、ｃＯｍｐｌｅｔｅＴＭ及びＥＤＴＡ－ｆｒｅｅ Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｃｏｃｋｔａｉｌ（Ｒｏｃｈｅ）が添加されているＲＩＰＡ溶解緩衝液（ｉＮｔＲＯＮ）２００μＬを細胞に処理した。Ｃｅｌｌ ｌｉｆｔｅｒ（ＳＰＬ）を用いて細胞溶解液を１．５ｍＬ ｔｕｂｅに移した後、４℃で２０分間動かさずに反応させた。次に、１７，０００ｒｐｍ、４℃の条件で３０分間遠心分離した後、上澄み液を新しい１．５ｍＬのチューブに移した。ｐｉｅｒｃｅＴＭＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いて上澄み液内のタンパク質量を定量し、４Ｘ Ｌａｅｍｍｌｉ Ｓａｍｐｌｅ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）でサンプリングした後、１００℃で１０分間加熱してウェスタンブロッティング用の試料を用意した。次に、１５％ポリアクリルアミドゲルを用いてウェスタンブロッティングを行った。電気泳動により試料内のタンパク質をサイズに応じて分離し、１００Ｖ、１時間条件でＩｍｍｏｂｉｌｏｎ－Ｐ ＰＶＤＦ Ｍｅｍｂｒａｎｅ（Ｍｅｒｃｋ）に移動させた。タンパク質の移動が完了したｍｅｍｂｒａｎｅは、Ｐｏｎｃｅａｕ Ｓ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）で染色してタンパク質発現パターンを確認した。Ｍｅｍｂｒａｎｅを０．１％ ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ ２０ ｉｎ ＰＢＳ（ＰＢＳＴ）に浸して５分ずつ４回Ｄｉｇｉｔａｌ Ｏｒｂｉｔａｌ Ｓｈａｋｅｒ（ＤＡＩＨＡＮ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて水洗いしてＰｏｎｃｅａｕ Ｓを除去し、ブロッキング緩衝液（５％ ＢＳＡ ＰＢＳＴ）を添加し、常温で１時間、Ｄｉｇｉｔａｌ Ｏｒｂｉｔａｌ Ｓｈａｋｅｒを用いてブロッキングさせた。ｐＬｅｎｔｉ－Ｃ－Ｍｙｃ－ＤＤＫ－Ｐ２Ａ－Ｐｕｒｏベクター内のターゲット遺伝子、すなわち、挿入された遺伝子が発現されると、発現されるタンパク質のＣ末端にはＭｙｃとＤＤＫ－ＴＡＧが一緒に発現される。したがって、ブロッキングが完了したｍｅｍｂｒａｎｅにＭｙｃタグに特異的に結合する１次抗体（Ｍｙｃ－ｔａｇ，Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２２７８Ｓ，１：１０００ ｖ／ｖ ｉｎ ２％ＢＳＡ ＰＢＳＴ）を処理し、４℃でＤｉｇｉｔａｌ Ｏｒｂｉｔａｌ Ｓｈａｋｅｒを用いて１６時間反応させた。反応が完了したｍｅｍｂｒａｎｅは、ＰＢＳＴに浸して５分ずつ４回、Ｄｉｇｉｔａｌ Ｏｒｂｉｔａｌ Ｓｈａｋｅｒを用いて洗浄した後、２次抗体（Ａｎｔｉ－Ｒａｂｂｉｔ ＨＲＰ，ａｂｃａｍ，ａｂ６７２１，１：１００００ｖ／ｖ ｉｎ ＰＢＳＴ）を処理し、常温で１時間反応させた。その後、ＰＢＳＴにｍｅｍｂｒａｎｅを浸して５分ずつ４回、Ｄｉｇｉｔａｌ Ｏｒｂｉｔａｌ Ｓｈａｋｅｒを用いて洗浄し、Ｐｉｅｒｃｅ ＥＣＬ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を処理した後、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ ＬＡＳ ５００（Ｃｙｔｉｖａ）でタンパク質を検出した。その結果を図６に示した。
【0034】
図６に示すように、形質導入されたＳｉＭａ細胞株においてＴｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎタンパク質またはＳｅｐｔｉｎ－２タンパク質が発現することを確認した。ただし、ＳＥＰＴＩＮ２－１細胞株では、Ｓｅｐｔｉｎ－２の他に未確認バンドが検出された。
【0035】
５．２．遺伝子導入可否の検証
実施例４と同じ方法で作製された形質導入細胞株においてターゲット遺伝子の導入を確認するために、細胞株から遺伝子ＤＮＡを分離した後、導入遺伝子部分をＰＣＲを用いて増幅させた。ＰＣＲのためのプライマーは、形質導入された遺伝子と内在性（ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ）遺伝子を区別するために、形質導入された遺伝子のみを有する３’末端の配列を用いてプライマーをデザインした後、コスモジンテックに依頼して作製した。ＰＣＲに用いたプライマー配列を表３に示した。図７に示すように、ＴＸＮまたはＳＥＰＴＩＮ２遺伝子の増幅のための順方向プライマー（ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ）はそれぞれの遺伝子の５’末端配列に結合するようにデザインし、２つの遺伝子共通の逆方向プライマー（ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ）はＤＤＫ－ｔａｇ配列に結合するようにデザインした。次に、ベータグロビン（β－ｇｌｏｂｉｎ）遺伝子を増幅させることができるプライマー（ＧＨ２０及びＧＨ２１）を陽性対照群として用いた。
実施例４と同じ方法で作製された形質導入細胞株においてターゲット遺伝子の導入を確認するために、細胞株から遺伝子ＤＮＡを分離した後、導入遺伝子部分をＰＣＲを用いて増幅させた。ＰＣＲのためのプライマーは、形質導入された遺伝子と内在性（ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ）遺伝子を区別するために、形質導入された遺伝子のみを有する３’末端の配列を用いてプライマーをデザインした後、コスモジンテックに依頼して作製した。ＰＣＲに用いたプライマー配列を表３に示した。図７に示すように、ＴＸＮまたはＳＥＰＴＩＮ２遺伝子の増幅のための順方向プライマー（ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ）はそれぞれの遺伝子の５’末端配列に結合するようにデザインし、２つの遺伝子共通の逆方向プライマー（ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ）はＤＤＫ－ｔａｇ配列に結合するようにデザインした。次に、ベータグロビン（β－ｇｌｏｂｉｎ）遺伝子を増幅させることができるプライマー（ＧＨ２０及びＧＨ２１）を陽性対照群として用いた。
【0036】
【表3】
【0037】
ＰＣＲのために、形質導入されたＳｉＭａ－ＴＸＮ－３、ＳｉＭａ－ＳＥＰＴＩＮ２－１、ＳｉＭａ－ＳＥＰＴＩＮ２－２、及びＳｉＭａ－ＳＥＰＴＩＮ２－３細胞株をそれぞれ１μｇ／ｍＬのピューロマイシンが添加された培養培地が入った１００ｍｍ細胞培養皿に分注し、細胞飽和度が約８０％に達したとき、Ｗｉｚａｒｄ（登録商標） Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて提供されるプロトコルに従って各細胞株の誘電体ＤＮＡを抽出し、抽出された誘電体ＤＮＡは、Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ＵＶ／Ｖｉｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ ＤＵ ７３０（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いて定量した。その結果を表４に示した。
【0038】
【表4】
【0039】
次に、誘電体ＤＮＡ５０ｎｇ、２Ｘ Ｐｌａｔｉｎｕｍ ＳｕｐｅｒＦｉ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ ２５μＬ、１０μＭのｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒとｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒをそれぞれ２．５μＬずつ混合し、最終的に５０μＬとなるように蒸留水を添加してＰＣＲ試料を準備した後にＰＣＲを行った。ＰＣＲ条件は、表５に示した。
【0040】
【表5】
【0041】
ＰＣＲが完了した後、０．０１％（ｖ／ｖ）ＥｃｏＤｙｅＴＭＮｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｂｉｏｆａｃｔ）が混合された１．５％（ｗ／ｖ）ＤＮＡアガロースゲルと電気泳動キットであるＭｕｐｉｄ－Ｏｎｅ（Ａｄｖａｎｃｅ）を用いて電気泳動した。電気泳動は、１００Ｖで３５分間行っており、Ｇｅｌ Ｄｏｃｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ ＬＳＧ１０００（ｉＮｔＲＯＮ）を用いてイメージングした。その結果を図８に示した。
【0042】
図８に示すように、ＳｉＭａ－ＴＸＮ－３細胞株において陽性対照群に該当するベータグロビン遺伝子と、形質導入されたＤＤＫ－ｔａｇを含むＴＸＮ遺伝子がすべて正常に増幅されたことを確認した。また、ＳｉＭａ－ＳＥＰＴＩＮ２－１、ＳｉＭａ－ＳＥＰＴＩＮ２－２、ＳｉＭａ－ＳＥＰＴＩＮ２－３、それぞれの細胞株においても形質導入されたＤＤＫ－ｔａｇを含むＳＥＰＴＩＮ２遺伝子がすべて増幅されたことを確認した。前記結果を通じて、形質導入された遺伝子を過剰発現する形質導入細胞株が正常に製造されたことが確認できた。
【0043】
実施例６：サンドイッチＥＬＩＳＡによるＢｏＮＴ／Ａ生物学的活性の検証
６．１．ＢｏＮＴ／Ａを処理したＳｉＭａ－ＳＥＰＴＩＮ２－３細胞の細胞溶解液の製造
細胞ベースのボツリヌス毒素の生物学的活性検証システムを確認するために、１次的にボツリヌス毒素が処理された細胞の細胞溶解液を製造した。ボツリヌス毒素を処理するために、対照群としてはＳｉＭａ細胞株を１０％ＦＢＳ、２ｍＭ Ｌ－ｇｌｕｔａｍｉｎｅ及び１％ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ－ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎが添加されたＲＰＭＩ１６４０培地が入った９６ウェルプレートに１．２×１０５ｃｅｌｌｓ／１００μＬ／ｗｅｌｌの濃度で、実験群としては、ＳｉＭａ－ＳＥＰＴＩＮ２－３細胞株を１０％ＦＢＳ、２ｍＭ Ｌ－ｇｌｕｔａｍｉｎｅ及び１％ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ－ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ及び１μｇ／ｍＬピューロマイシンが添加されたＲＰＭＩ１６４０培地が入った９６ウェルプレートに１．２×１０５ｃｅｌｌｓ／１００μＬ／ｗｅｌｌの濃度でそれぞれ分注した。各細胞株を分注し、２日間培養した後に培地を除去し、１Ｘ Ｂ－２７ＴＭ Ｐｌｕｓ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｇｉｂｃｏ）、１Ｘ Ｎ－２ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｇｉｂｃｏ）、２ｍＭ Ｌ－ｇｌｕｔａｍｉｎｅ及び２５μｇ／ｍＬ Ｔｒｉｓｉａｌｏｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅ ＧＴ１Ｂ（Ｍａｔｒｅｙａ）が添加されている１００μＬの分化培地を処理し、２日間培養して分化を誘導した。分化２日後に培地を除去し、１Ｘ Ｂ－２７ＴＭ Ｐｌｕｓ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ及び１Ｘ Ｎ－２ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ及び０．２５％ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｕｍ Ａｌｂｕｍｉｎ（ミドリ十字）が添加されているＲＰＭＩ１６４０にＢｏＮＴ／Ａ複合体を１．３５倍ずつ連続希釈（ｓｅｒｉａｌ ｄｉｌｕｔｉｏｎ）し、最終的に１００μＬとなるように各ウェルに添加した。ボツリヌス毒素を処理し、４日間培養した後に培地を除去し、ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｏｃｋｔａｉｌが添加された溶解緩衝液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ ７．４）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ，１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２及び１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００）１１０μＬを各ウェルに処理して細胞を溶解させた。次に、細胞溶解液を１．５ｍＬのチューブに移し、１７，０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離して上澄み液を得て、サンドイッチＥＬＩＳＡに用いる細胞溶解液を製造した。
６．１．ＢｏＮＴ／Ａを処理したＳｉＭａ－ＳＥＰＴＩＮ２－３細胞の細胞溶解液の製造
細胞ベースのボツリヌス毒素の生物学的活性検証システムを確認するために、１次的にボツリヌス毒素が処理された細胞の細胞溶解液を製造した。ボツリヌス毒素を処理するために、対照群としてはＳｉＭａ細胞株を１０％ＦＢＳ、２ｍＭ Ｌ－ｇｌｕｔａｍｉｎｅ及び１％ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ－ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎが添加されたＲＰＭＩ１６４０培地が入った９６ウェルプレートに１．２×１０５ｃｅｌｌｓ／１００μＬ／ｗｅｌｌの濃度で、実験群としては、ＳｉＭａ－ＳＥＰＴＩＮ２－３細胞株を１０％ＦＢＳ、２ｍＭ Ｌ－ｇｌｕｔａｍｉｎｅ及び１％ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ－ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ及び１μｇ／ｍＬピューロマイシンが添加されたＲＰＭＩ１６４０培地が入った９６ウェルプレートに１．２×１０５ｃｅｌｌｓ／１００μＬ／ｗｅｌｌの濃度でそれぞれ分注した。各細胞株を分注し、２日間培養した後に培地を除去し、１Ｘ Ｂ－２７ＴＭ Ｐｌｕｓ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｇｉｂｃｏ）、１Ｘ Ｎ－２ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｇｉｂｃｏ）、２ｍＭ Ｌ－ｇｌｕｔａｍｉｎｅ及び２５μｇ／ｍＬ Ｔｒｉｓｉａｌｏｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅ ＧＴ１Ｂ（Ｍａｔｒｅｙａ）が添加されている１００μＬの分化培地を処理し、２日間培養して分化を誘導した。分化２日後に培地を除去し、１Ｘ Ｂ－２７ＴＭ Ｐｌｕｓ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ及び１Ｘ Ｎ－２ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ及び０．２５％ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｕｍ Ａｌｂｕｍｉｎ（ミドリ十字）が添加されているＲＰＭＩ１６４０にＢｏＮＴ／Ａ複合体を１．３５倍ずつ連続希釈（ｓｅｒｉａｌ ｄｉｌｕｔｉｏｎ）し、最終的に１００μＬとなるように各ウェルに添加した。ボツリヌス毒素を処理し、４日間培養した後に培地を除去し、ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｏｃｋｔａｉｌが添加された溶解緩衝液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ ７．４）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ，１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２及び１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００）１１０μＬを各ウェルに処理して細胞を溶解させた。次に、細胞溶解液を１．５ｍＬのチューブに移し、１７，０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離して上澄み液を得て、サンドイッチＥＬＩＳＡに用いる細胞溶解液を製造した。
【0044】
６．２．サンドイッチＥＬＩＳＡを用いたＥＣ５０の確認
ボツリヌス毒素セロタイプＡ（ＢｏＮＴ／Ａ）は、神経筋接合部（ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌａｒ ｊｕｎｃｔｉｏｎ）の前シナプス（ｐｒｅｓｙｎａｐｓｅ）に作用し、前シナプス細胞膜に結合しているＳｙｎａｐｔｏｓｏｍａｌ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ，２５ｋＤａ（ＳＮＡＰ－２５）分子の切断を引き起こすことが知られているため、この原理を適用して切断されたＳＮＡＰ－２５（ｃｌｅａｖｅｄ ＳＮＡＰ－２５）、及び完全なＳＮＡＰ－２５を認識できるそれぞれの抗体を用いたサンドイッチＥｎｚｙｍｅ－Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ）試験法をデザインした。その原理は、図９に簡略に示した。
ボツリヌス毒素セロタイプＡ（ＢｏＮＴ／Ａ）は、神経筋接合部（ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌａｒ ｊｕｎｃｔｉｏｎ）の前シナプス（ｐｒｅｓｙｎａｐｓｅ）に作用し、前シナプス細胞膜に結合しているＳｙｎａｐｔｏｓｏｍａｌ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ，２５ｋＤａ（ＳＮＡＰ－２５）分子の切断を引き起こすことが知られているため、この原理を適用して切断されたＳＮＡＰ－２５（ｃｌｅａｖｅｄ ＳＮＡＰ－２５）、及び完全なＳＮＡＰ－２５を認識できるそれぞれの抗体を用いたサンドイッチＥｎｚｙｍｅ－Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ）試験法をデザインした。その原理は、図９に簡略に示した。
【0045】
切断されたＳＮＡＰ－２５に特異的に結合する捕捉抗体（ｃａｐｔｕｒｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ）であるＭｏｕｓｅ Ｓｙｎａｐｔｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ ２５ｋＤａ（ＳＮＡＰ－２５，ａ．ａ．１８３－１９７）ｃｌｅａｖｅｄ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｍｙｂｉｏｓｏｕｒｃｅ，ＭＢＳ３１２５９７）を０．１Ｍのｓｏｄｉｕｍ ｃａｒｂｏｎａｔｅコーティング緩衝液（ｃｏａｔｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ， ｐＨ ９．６）を用いて０．２％（ｖ／ｖ）の濃度に希釈した後に１００μＬをＣｌｅａｒ Ｆｌａｔ－Ｂｏｔｔｏｍ Ｉｍｍｕｎｏ Ｎｏｎｓｔｅｒｉｌｅ ９６－Ｗｅｌｌ Ｐｌａｔｅ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）の各ウェルに処理し、４℃で１６時間動かさずに反応させた。その後、ウェルに結合していない抗体を除去し、０．１％ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ ２０ ｉｎ ＰＢＳ（ＰＢＳＴ）２００μＬを用いて３回洗浄した。次に、ブロッキング緩衝液（５％ＢＳＡ ＰＢＳＴ）２００μＬを各ウェルに処理し、常温で７５ｒｐｍの条件で１時間ｓｈａｋｅｒに置いた。１時間後にブロッキング緩衝液を除去し、ＰＢＳＴ ２００μＬを用いて３回洗浄し、実施例６．１と同じ方法で得た細胞溶解液 ９０μＬを添加し、常温で７５ｒｐｍの条件でｓｈａｋｅｒで２時間反応させた。次に、細胞溶解液を除去し、ＰＢＳＴ ２００μＬで３回洗浄した。その後、検出抗体（ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ）であるＡｎｔｉ－ＳＮＡＰ－２５ ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓ９６８４）をブロッキング緩衝液を用いて０．１％（ｖ／ｖ）の濃度に希釈した後、１００μＬを各ウェルに処理し、常温で７５ｒｐｍの条件でｓｈａｋｅｒで１時間反応させた。その後、ＰＢＳＴ ２００μＬを用いて３回洗浄して結合していない抗体をすべて除去し、２次抗体であるＡｎｔｉ－Ｒａｂｂｉｔ ＨＲＰ（ａｂｃａｍ，ａｂ６７２１）をブロッキング緩衝液を用いて０．０１％（ｖ／ｖ）に希釈し、希釈した抗体溶液１００μＬを各ウェルに処理し、常温で７５ｒｐｍの条件でｓｈａｋｅｒで１時間反応させた。次に、ＰＢＳＴ ２００μＬを用いて３回洗浄した後、ＴＭＢ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ＥＩＡ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｋｉｔ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）のＴＭＢ溶液と過酸化水素溶液を９：１で混合し、各ウェルに５０μＬを処理した後、３７℃の培養器で３０分間反応させた。その後、２Ｎの硫酸（ｓｕｌｆｕｒｉｃ ａｃｉｄ）５０μＬを各ウェルに処理した後、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｐｌｕｓ ３８４ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて４５０ｎｍ波長帯の吸光度（ＯＤ４５０）を測定した。得られたローデータ（ｒａｗ ｄａｔａ）は、 ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ Ｖｅｒｓｉｏｎ ７．００（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．）を用いて用量反応曲線（ｆｏｕｒ ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ）を作成し、自社のマウス力価試験結果（ｕｎｉｔ）を基準にＥＣ５０値を算出した。その後、すべての実験を少なくとも３回以上繰り返し、結果を平均値±標準偏差で示した。その結果を図１０に示した。
【0046】
図１０に示すように、対照群であるＳｉＭａ細胞株のＥＣ５０は７．３５Ｕ／ｍＬ（０．４９ｐＭ）、ＳＥＰＴＩＮ２－３形質導入細胞株のＥＣ５０は、５．３８Ｕ／ｍＬ（０．３６ｐＭ）の値を示すことを確認した。これにより、ＳＥＰＴＩＮ２を過剰発現させることにより、敏感度を向上させることができることが確認できた。
【0047】
また、より詳細に細胞株間の敏感度の差を比較するために、ＳｉＭａ細胞株各グループのＯＤ４５０ｎｍ値をＳＥＰＴＩＮ２－３細胞株各グループのＯＤ４５０ｎｍ値で割って、同じボツリヌス毒素処理に対する細胞株の反応程度を比較した。その結果を図１１に示した。
【0048】
図１１に示すように、毒素を処理しないＯＤ４５０ＳＥＰＴＩＮ２／ＯＤ４５０ＷＴ値は１であるのに対し、毒素を処理したときは約１．７程度までその値が上昇し、細胞株間の毒素に対する感度の差を示すことを確認した。これを通じて、ＳＥＰＴＩＮ２遺伝子を過剰発現する形質導入細胞株は、対照群（ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ）に比べてボツリヌス毒素に対する敏感度が増加したことが確認できた。
【0049】
６．３．ＢｏＮＴ／Ａを処理したＳｉＭａ－Ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ細胞の細胞溶解液の製造
細胞ベースのボツリヌス毒素の生物学的活性検証システムを確認するために、１次的にボツリヌス毒素が処理された細胞の細胞溶解液を製造した。ボツリヌス毒素を処理するために、対照群としてはＳｉＭａ細胞株を１０％ＦＢＳ、２ｍＭ Ｌ－ｇｌｕｔａｍｉｎｅ及び１％ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ－ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎが添加されたＲＰＭＩ１６４０培地が入った９６ウェルプレートに８×１０４ｃｅｌｌｓ／１００μＬ／ｗｅｌｌの濃度で、実験群としてはＳｉＭａ－ＴＸＮ３細胞株を１０％ＦＢＳ、２ｍＭ Ｌ－ｇｌｕｔａｍｉｎｅ及び１％ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ－ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ及び１μｇ／ｍＬピューロマイシンが添加されたＲＰＭＩ１６４０培地が入った９６ウェルプレートに、８×１０４ｃｅｌｌｓ／１００μＬ／ｗｅｌｌの濃度でそれぞれ分注した。各細胞株を分注し、２日間培養した後、培地を除去し、１Ｘ Ｂ－２７ＴＭ Ｐｌｕｓ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｇｉｂｃｏ）、１Ｘ Ｎ－２ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｇｉｂｃｏ）、２ｍＭ Ｌ－ｇｌｕｔａｍｉｎｅ及び２５μｇ／ｍＬ Ｔｒｉｓｉａｌｏｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅ ＧＴ１Ｂ（Ｍａｔｒｅｙａ）が添加されている１００μＬの分化培地を処理し、２日間培養して分化を誘導した。分化２日後に培地を除去し、ＲＰＭＩ１６４０にＢｏＮＴ／Ａ複合体を０、１、５、１０、５０、１００、５００、１０００、２０００（ｐＭ）濃度で調製し、最終的に１００μＬずつ各ウェルに添加した。ボツリヌス毒素を処理し、４日間培養した後に培地を除去し、ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｏｃｋｔａｉｌが添加された溶解緩衝液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ ７．４）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２及び１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００）１１０μＬを各ウェルに処理して細胞を溶解させた。次に、細胞溶解液を１．５ｍＬのチューブに移し、１７，０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離して上澄み液を得て、サンドイッチＥＬＩＳＡに用いる細胞溶解液を製造した。
細胞ベースのボツリヌス毒素の生物学的活性検証システムを確認するために、１次的にボツリヌス毒素が処理された細胞の細胞溶解液を製造した。ボツリヌス毒素を処理するために、対照群としてはＳｉＭａ細胞株を１０％ＦＢＳ、２ｍＭ Ｌ－ｇｌｕｔａｍｉｎｅ及び１％ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ－ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎが添加されたＲＰＭＩ１６４０培地が入った９６ウェルプレートに８×１０４ｃｅｌｌｓ／１００μＬ／ｗｅｌｌの濃度で、実験群としてはＳｉＭａ－ＴＸＮ３細胞株を１０％ＦＢＳ、２ｍＭ Ｌ－ｇｌｕｔａｍｉｎｅ及び１％ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ－ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ及び１μｇ／ｍＬピューロマイシンが添加されたＲＰＭＩ１６４０培地が入った９６ウェルプレートに、８×１０４ｃｅｌｌｓ／１００μＬ／ｗｅｌｌの濃度でそれぞれ分注した。各細胞株を分注し、２日間培養した後、培地を除去し、１Ｘ Ｂ－２７ＴＭ Ｐｌｕｓ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｇｉｂｃｏ）、１Ｘ Ｎ－２ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｇｉｂｃｏ）、２ｍＭ Ｌ－ｇｌｕｔａｍｉｎｅ及び２５μｇ／ｍＬ Ｔｒｉｓｉａｌｏｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅ ＧＴ１Ｂ（Ｍａｔｒｅｙａ）が添加されている１００μＬの分化培地を処理し、２日間培養して分化を誘導した。分化２日後に培地を除去し、ＲＰＭＩ１６４０にＢｏＮＴ／Ａ複合体を０、１、５、１０、５０、１００、５００、１０００、２０００（ｐＭ）濃度で調製し、最終的に１００μＬずつ各ウェルに添加した。ボツリヌス毒素を処理し、４日間培養した後に培地を除去し、ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｏｃｋｔａｉｌが添加された溶解緩衝液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ ７．４）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２及び１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００）１１０μＬを各ウェルに処理して細胞を溶解させた。次に、細胞溶解液を１．５ｍＬのチューブに移し、１７，０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離して上澄み液を得て、サンドイッチＥＬＩＳＡに用いる細胞溶解液を製造した。
【0050】
６．４．サンドイッチＥＬＩＳＡを用いたＥＣ５０の確認
実施例６．２と同じ方法でＴＸＮ遺伝子を過剰発現する形質導入細胞株に対するボツリヌス毒素敏感度を実施例６．３の細胞溶解液を用いて確認した。その結果を図１２に示した。
実施例６．２と同じ方法でＴＸＮ遺伝子を過剰発現する形質導入細胞株に対するボツリヌス毒素敏感度を実施例６．３の細胞溶解液を用いて確認した。その結果を図１２に示した。
【0051】
図１２に示すように、Ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ遺伝子を過剰発現する形質導入細胞株は、対照群（ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ）に比べてボツリヌス毒素に対する敏感度が増加したことが確認できた。
【0052】
実施例７：サンドイッチＥＬＩＳＡによるＢｏＮＴ／Ａ薬学的組成物（原料医薬品）の生物学的活性の検証
細胞ベースのボツリヌス毒素の生物学的活性検証システムがボツリヌス毒素薬学的組成物（原料医薬品）にも適用が可能かどうかを確認するために、ＳｉＭａ－ＳＥＰＴＩＮ２－３細胞株を用いてサンドイッチＥＬＩＳＡを行った。より詳しくは、ＳｉＭａ－ＳＥＰＴＩＮ２－３細胞株を１０％ＦＢＳ、２ｍＭ Ｌ－ｇｌｕｔａｍｉｎｅ、１％ ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ－ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ及び１μｇ／ｍＬピューロマイシンが添加されたＲＰＭＩ１６４０培地が入った９６ウェルプレートに、１．２×１０５ｃｅｌｌｓ／１００μＬ／ｗｅｌｌの濃度で分注した。次に、２日間培養した後に培地を除去し、１Ｘ Ｂ－２７ＴＭ Ｐｌｕｓ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、１Ｘ Ｎ－２ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、２ｍＭ Ｌ－ｇｌｕｔａｍｉｎｅ及び２５μｇ／ｍｌ Ｔｒｉｓｉａｌｏｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅ ＧＴ１Ｂが添加されている１００μＬの分化培地を処理し、２日間培養して分化を誘導した。分化２日後に培地を除去し、１Ｘ Ｂ－２７ＴＭ Ｐｌｕｓ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、１Ｘ Ｎ－２ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔが添加されているＲＰＭＩ１６４０にＢｏＮＴ／Ａ複合体（ＡＴＧＣ－１００から保存溶液などの他の物質が除去された原料医薬品であるボツリヌス毒素）を１．５５倍ずつ連続希釈（ｓｅｒｉａｌ ｄｉｌｕｔｉｏｎ）して細胞に濃度別に処理した。ボツリヌス毒素を処理し、４日間培養した後に培地を除去し、ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｏｃｋｔａｉｌが添加された溶解緩衝液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２及び１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００）１１０μＬを各ウェルに処理して細胞を溶解させた。次に、細胞溶解液を１．５ｍＬのチューブに移し、１７，０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離して上澄み液を得て、サンドイッチＥＬＩＳＡに用いる細胞溶解液を製造した。
細胞ベースのボツリヌス毒素の生物学的活性検証システムがボツリヌス毒素薬学的組成物（原料医薬品）にも適用が可能かどうかを確認するために、ＳｉＭａ－ＳＥＰＴＩＮ２－３細胞株を用いてサンドイッチＥＬＩＳＡを行った。より詳しくは、ＳｉＭａ－ＳＥＰＴＩＮ２－３細胞株を１０％ＦＢＳ、２ｍＭ Ｌ－ｇｌｕｔａｍｉｎｅ、１％ ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ－ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ及び１μｇ／ｍＬピューロマイシンが添加されたＲＰＭＩ１６４０培地が入った９６ウェルプレートに、１．２×１０５ｃｅｌｌｓ／１００μＬ／ｗｅｌｌの濃度で分注した。次に、２日間培養した後に培地を除去し、１Ｘ Ｂ－２７ＴＭ Ｐｌｕｓ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、１Ｘ Ｎ－２ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、２ｍＭ Ｌ－ｇｌｕｔａｍｉｎｅ及び２５μｇ／ｍｌ Ｔｒｉｓｉａｌｏｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅ ＧＴ１Ｂが添加されている１００μＬの分化培地を処理し、２日間培養して分化を誘導した。分化２日後に培地を除去し、１Ｘ Ｂ－２７ＴＭ Ｐｌｕｓ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、１Ｘ Ｎ－２ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔが添加されているＲＰＭＩ１６４０にＢｏＮＴ／Ａ複合体（ＡＴＧＣ－１００から保存溶液などの他の物質が除去された原料医薬品であるボツリヌス毒素）を１．５５倍ずつ連続希釈（ｓｅｒｉａｌ ｄｉｌｕｔｉｏｎ）して細胞に濃度別に処理した。ボツリヌス毒素を処理し、４日間培養した後に培地を除去し、ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｏｃｋｔａｉｌが添加された溶解緩衝液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２及び１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００）１１０μＬを各ウェルに処理して細胞を溶解させた。次に、細胞溶解液を１．５ｍＬのチューブに移し、１７，０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離して上澄み液を得て、サンドイッチＥＬＩＳＡに用いる細胞溶解液を製造した。
【0053】
次に、切断されたＳＮＡＰ－２５に特異的に結合する捕捉抗体（ｃａｐｔｕｒｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ）であるＭｏｕｓｅ Ｓｙｎａｐｔｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ ２５ｋＤａ（ＳＮＡＰ－２５，ａ．ａ．１８３－１９７）ｃｌｅａｖｅｄ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｍｙｂｉｏｓｏｕｒｃｅ）を０．１Ｍのｓｏｄｉｕｍ ｃａｒｂｏｎａｔｅコーティング緩衝液（ｃｏａｔｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ，ｐＨ９．６）を用いて０．８％（ｖ／ｖ）の濃度に希釈した後、１００μＬをＣｌｅａｒ Ｆｌａｔ－Ｂｏｔｔｏｍ Ｉｍｍｕｎｏ Ｎｏｎｓｔｅｒｉｌｅ ９６－Ｗｅｌｌ Ｐｌａｔｅ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）の各ウェルに処理し、４℃で１６時間動かさずに反応させた。その後、ウェルに結合していない抗体を除去し、０．１％ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ ２０ ｉｎ ＰＢＳ（ＰＢＳＴ）２００μＬを用いて３回洗浄した。次に、ブロッキング緩衝液（５％ＢＳＡ ＰＢＳＴ）２００μＬを各ウェルに処理し、常温で７５ｒｐｍの条件で２時間ｓｈａｋｅｒに置いた。２時間後にブロッキング緩衝液を除去し、得られた細胞溶解液９０μＬを添加し、常温で７５ｒｐｍの条件でｓｈａｋｅｒで２時間処理した。その後、細胞溶解液を除去し、ＰＢＳＴ ２００μＬで３回洗浄した。その後、検出抗体（ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ）であるＡｎｔｉ－ＳＮＡＰ－２５ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓ９６８４）をブロッキング緩衝液をを用いて０．１％（ｖ／ｖ）の濃度に希釈した後、１００μＬを各ウェルに処理し、常温で７５ｒｐｍの条件でｓｈａｋｅｒで１時間反応させた。その後、ＰＢＳＴ ２００μＬを用いて３回洗浄して結合していない抗体をすべて除去し、２次抗体であるＡｎｔｉ－Ｒａｂｂｉｔ ＨＲＰ（ａｂｃａｍ，ａｂ６７２１）をブロッキング緩衝液を用いて０．０１％（ｖ／ｖ）に希釈し、希釈した抗体溶液１００μＬを各ウェルに処理し、常温で７５ｒｐｍの条件でｓｈａｋｅｒで１時間処理した。次に、ＰＢＳＴ ２００μＬを用いて３回洗浄した後、ＴＭＢ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，３４０２８）溶液を各ウェルに１００μＬ処理した後、常温で１５分間反応させた。その後、２Ｎの硫酸（ｓｕｌｆｕｒｉｃ ａｃｉｄ）１００μＬを各ウェルに処理した後、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｐｌｕｓ ３８４ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて４５０ｎｍ波長帯の吸光度（ＯＤ４５０）を測定した。得られたローデータ（ｒａｗ ｄａｔａ）は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ Ｖｅｒｓｉｏｎ ７．００（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．）を用いて用量反応曲線（ｆｏｕｒ ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ）を作成し、自社のマウス力価試験結果（ｕｎｉｔ）を基準にＥＣ５０値を算出した。その結果を図１３に示した
【0054】
図１３に示すように、ボツリヌス毒素用量依存的にＳＮＡＰ－２５切断量が増加することを確認した。次に、ＥＣ５０値は１６．９８Ｕ／ｍＬであることを確認した。
【0055】
実施例８：サンドイッチＥＬＩＳＡによるＢｏＮＴ／Ａ薬学的組成物（完製医薬品）の生物学的活性の検証
細胞ベースのボツリヌス毒素の生物学的活性検証システムがさらに他のボツリヌス毒素薬学的組成物（完製医薬品）にも適用可能かどうかを確認するために、ＳｉＭａ－ＳＥＰＴＩＮ２－３細胞株を用いてサンドイッチＥＬＩＳＡを行った。より詳しくは、ＳｉＭａ－ＳＥＰＴＩＮ２－３細胞株を１０％ＦＢＳ、２ｍＭ Ｌ－ｇｌｕｔａｍｉｎｅ、１％ ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ－ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ及び１μｇ／ｍＬピューロマイシンが添加されたＲＰＭＩ１６４０培地が入った９６ウェルプレートに１．２×１０５ｃｅｌｌｓ／１００μＬ／ｗｅｌｌの濃度で分注した。次に、２日間培養した後に培地を除去し、１Ｘ Ｂ－２７ＴＭ Ｐｌｕｓ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、１Ｘ Ｎ－２ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、２ｍＭ Ｌ－ｇｌｕｔａｍｉｎｅ及び２５μｇ／ｍｌ Ｔｒｉｓｉａｌｏｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅ ＧＴ１Ｂが添加されている１００μＬの分化培地を処理し、２日間培養して分化を誘導した。分化２日後に培地を除去し、１Ｘ Ｂ－２７ＴＭ Ｐｌｕｓ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、１Ｘ Ｎ－２ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔが添加されているＲＰＭＩ１６４０にＢｏＮＴ／Ａ完製医薬品（ＡＴＧＣ－１００）を１．４倍ずつ連続希釈（ｓｅｒｉａｌ ｄｉｌｕｔｉｏｎ）して細胞に濃度別に処理した。ボツリヌス毒素を処理し、４日間培養した後に培地を除去し、ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｏｃｋｔａｉｌが添加された溶解緩衝液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２及び１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００）１１０μＬを各ウェルに処理して細胞を溶解させた。次に、細胞溶解液を１．５ｍＬのチューブに移し、１７，０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離して上澄み液を得て、サンドイッチＥＬＩＳＡに用いる細胞溶解液を製造した。
細胞ベースのボツリヌス毒素の生物学的活性検証システムがさらに他のボツリヌス毒素薬学的組成物（完製医薬品）にも適用可能かどうかを確認するために、ＳｉＭａ－ＳＥＰＴＩＮ２－３細胞株を用いてサンドイッチＥＬＩＳＡを行った。より詳しくは、ＳｉＭａ－ＳＥＰＴＩＮ２－３細胞株を１０％ＦＢＳ、２ｍＭ Ｌ－ｇｌｕｔａｍｉｎｅ、１％ ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ－ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ及び１μｇ／ｍＬピューロマイシンが添加されたＲＰＭＩ１６４０培地が入った９６ウェルプレートに１．２×１０５ｃｅｌｌｓ／１００μＬ／ｗｅｌｌの濃度で分注した。次に、２日間培養した後に培地を除去し、１Ｘ Ｂ－２７ＴＭ Ｐｌｕｓ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、１Ｘ Ｎ－２ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、２ｍＭ Ｌ－ｇｌｕｔａｍｉｎｅ及び２５μｇ／ｍｌ Ｔｒｉｓｉａｌｏｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅ ＧＴ１Ｂが添加されている１００μＬの分化培地を処理し、２日間培養して分化を誘導した。分化２日後に培地を除去し、１Ｘ Ｂ－２７ＴＭ Ｐｌｕｓ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、１Ｘ Ｎ－２ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔが添加されているＲＰＭＩ１６４０にＢｏＮＴ／Ａ完製医薬品（ＡＴＧＣ－１００）を１．４倍ずつ連続希釈（ｓｅｒｉａｌ ｄｉｌｕｔｉｏｎ）して細胞に濃度別に処理した。ボツリヌス毒素を処理し、４日間培養した後に培地を除去し、ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｏｃｋｔａｉｌが添加された溶解緩衝液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２及び１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００）１１０μＬを各ウェルに処理して細胞を溶解させた。次に、細胞溶解液を１．５ｍＬのチューブに移し、１７，０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離して上澄み液を得て、サンドイッチＥＬＩＳＡに用いる細胞溶解液を製造した。
【0056】
次に、切断されたＳＮＡＰ－２５に特異的に結合する捕捉抗体（ｃａｐｔｕｒｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ）であるＭｏｕｓｅ Ｓｙｎａｐｔｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ ２５ｋＤａ（ＳＮＡＰ－２５，ａ．ａ．１８３－１９７）ｃｌｅａｖｅｄ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｍｙｂｉｏｓｏｕｒｃｅ）を０．１Ｍのｓｏｄｉｕｍ ｃａｒｂｏｎａｔｅコーティング緩衝液（ｃｏａｔｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ，ｐＨ９．６）を用いて０．８％（ｖ／ｖ）の濃度に希釈した後、１００μＬをＣｌｅａｒ Ｆｌａｔ－Ｂｏｔｔｏｍ Ｉｍｍｕｎｏ Ｎｏｎｓｔｅｒｉｌｅ ９６－Ｗｅｌｌ Ｐｌａｔｅ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）の各ウェルに処理し、４℃で１６時間動かさずに反応させた。その後、ウェルに結合していない抗体を除去し、０．１％ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ ２０ ｉｎ ＰＢＳ（ＰＢＳＴ）２００μＬを用いて３回洗浄した。次に、ブロッキング緩衝液（５％ＢＳＡ ＰＢＳＴ）２００μＬを各ウェルに処理し、常温で７５ｒｐｍの条件で２時間ｓｈａｋｅｒに置いた。２時間後にブロッキング緩衝液を除去して得た細胞溶解液９０μＬを添加し、常温で７５ｒｐｍの条件でｓｈａｋｅｒで２時間処理した。次に、細胞溶解液を除去し、ＰＢＳＴ ２００μＬで３回手洗いした。その後、検出抗体（ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ）であるＡｎｔｉ－ＳＮＡＰ－２５ ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓ９６８４）をブロッキング緩衝液を用いて０．１％（ｖ／ｖ）の濃度に希釈した後、１００μＬを各ウェルに処理し、常温で７５ｒｐｍの条件でｓｈａｋｅｒで１時間反応させた。その後、ＰＢＳＴ ２００μＬを用いて３回洗浄して結合していない抗体をすべて除去し、２次抗体であるＡｎｔｉ－Ｒａｂｂｉｔ ＨＲＰ（ａｂｃａｍ，ａｂ６７２１）をブロッキング緩衝液を用いて０．０１％（ｖ／ｖ）に希釈し、希釈した抗体溶液１００μＬを各ウェルに処理し、常温で７５ｒｐｍの条件でｓｈａｋｅｒで１時間処理した。次に、ＰＢＳＴ ２００μＬを用いて３回洗浄した後、ＴＭＢ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，３４０２８）溶液を各ウェルに１００μＬを処理した後、常温で１５分間反応させた。その後、２Ｎの硫酸（ｓｕｌｆｕｒｉｃ ａｃｉｄ）１００μＬを各ウェルに処理した後、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｐｌｕｓ ３８４ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて４５０ｎｍ波長帯の吸光度（ＯＤ４５０）を測定した。得られたローデータ（ｒａｗ ｄａｔａ）は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ Ｖｅｒｓｉｏｎ ７．００（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．）を用いて用量反応曲線（ｆｏｕｒ ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ）を作成し、自社のマウス力価試験結果（ｕｎｉｔ）を基準にＥＣ５０値を算出した。その結果を図１４に示した
【0057】
図１４に示すように、ボツリヌス毒素用量依存的にＳＮＡＰ－２５切断量が増加することを確認した。次に、ＥＣ５０値は５．４２Ｕ／ｍＬであることを確認した。
【0058】
前記結果を通じて、図１５に示すように、本発明のレンチウイルスを用いてＳＥＰＴＩＮ２またはＴＸＮ遺伝子を過剰発現する細胞株を用いることにより、ボツリヌス毒素だけでなく、ボツリヌス毒素薬学的組成物、すなわち、原料医薬品及び完製医薬品の力価を細胞ベースで容易に測定することができ、その敏感度を著しく向上させることができることが確認できた。したがって、本発明の細胞株をボツリヌス毒素を用いる様々な産業分野に適用できるものと期待される。
【0059】
前述した本発明の説明は例示のためのものであり、本発明が属する技術分野の通常の知識を有する者は、本発明の技術的思想や必須的な特徴を変更することなく、他の具体的な形態に容易に変形が可能であることが理解できるだろう。したがって、前述した実施例は、すべての面で例示的なものであり、限定的なものではないと理解しなければならない。
【産業上の利用可能性】
【0060】
本発明のボツリヌス毒素活性測定用細胞は、ボツリヌス毒素に対する敏感性が著しく向上したため、多数の動物実験に代わって、ボツリヌス毒素だけでなく、原料医薬品または完製医薬品状態のボツリヌス毒素薬学的組成物の活性を測定する様々な産業分野に広く用いることができる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【配列表】
【国際調査報告】