特表 2024-521770 網膜血管症を治療する方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-06-04

(54)【発明の名称】網膜血管症を治療する方法

(51)【国際特許分類】

   A61K 45/00 20060101AFI20240528BHJP

   A61P 27/02 20060101ALI20240528BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20240528BHJP

   A61K 31/4184 20060101ALI20240528BHJP

   A61K 31/437 20060101ALI20240528BHJP

   A61K 31/519 20060101ALI20240528BHJP

【ＦＩ】

A61K45/00

A61P27/02

A61P43/00 111

A61K31/4184

A61K31/437

A61K31/519

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023572728

(86)(22)【出願日】2022-05-25

(85)【翻訳文提出日】2024-01-17

(86)【国際出願番号】 US2022030938

(87)【国際公開番号】W WO2022251370

(87)【国際公開日】2022-12-01

(31)【優先権主張番号】63/193,327

(32)【優先日】2021-05-26

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/220,771

(32)【優先日】2021-07-12

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＲＩＴＯＮ

２．ＰＬＵＲＯＮＩＣ

(71)【出願人】

【識別番号】517274752

【氏名又は名称】ユニティ バイオテクノロジー インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100102978

【弁理士】

【氏名又は名称】清水 初志

(74)【代理人】

【識別番号】100205707

【弁理士】

【氏名又は名称】小寺 秀紀

(74)【代理人】

【識別番号】100160923

【弁理士】

【氏名又は名称】山口 裕孝

(74)【代理人】

【識別番号】100119507

【弁理士】

【氏名又は名称】刑部 俊

(74)【代理人】

【識別番号】100142929

【弁理士】

【氏名又は名称】井上 隆一

(74)【代理人】

【識別番号】100148699

【弁理士】

【氏名又は名称】佐藤 利光

(74)【代理人】

【識別番号】100188433

【弁理士】

【氏名又は名称】梅村 幸輔

(74)【代理人】

【識別番号】100128048

【弁理士】

【氏名又は名称】新見 浩一

(74)【代理人】

【識別番号】100129506

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 智彦

(74)【代理人】

【識別番号】100114340

【弁理士】

【氏名又は名称】大関 雅人

(74)【代理人】

【識別番号】100214396

【弁理士】

【氏名又は名称】塩田 真紀

(74)【代理人】

【識別番号】100121072

【弁理士】

【氏名又は名称】川本 和弥

(74)【代理人】

【識別番号】100221741

【弁理士】

【氏名又は名称】酒井 直子

(74)【代理人】

【識別番号】100114926

【弁理士】

【氏名又は名称】枝松 義恵

(72)【発明者】

【氏名】ラベルジュ レミ－マルタン

(72)【発明者】

【氏名】キムラ スコット

(72)【発明者】

【氏名】サピエハ プルゼミスラフ

(72)【発明者】

【氏名】ツルダ パメラ

(72)【発明者】

【氏名】バス－クワック ピーター

(72)【発明者】

【氏名】ガシュワ ネイサン

(72)【発明者】

【氏名】チャウ ティアナ

【テーマコード（参考）】

4C084

4C086

【Ｆターム（参考）】

4C084AA17

4C084NA14

4C084ZA33

4C084ZC42

4C086AA01

4C086BC39

4C086CB05

4C086GA02

4C086GA07

4C086GA16

4C086MA01

4C086MA04

4C086NA14

4C086ZC42

(57)【要約】

本発明は、とりわけ、糖尿病性黄斑浮腫、糖尿病性網膜症、並びに乾燥型及び新生血管型の加齢性黄斑変性症などの特定の網膜血管症を治療する方法に関する。いくつかの事例では、この方法は、薬剤を患者に投与することによって、網膜血管症に罹患している患者を治療することを含む。薬剤は、本明細書に記載されるような薬剤のうちの１つ以上であり得る。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

罹患した眼における病原性血管新生を阻害する方法であって、ＧＰＸ４の阻害剤、ＧＬＳ１の阻害剤、ＰＡＰＰ－Ａの阻害剤、ｃＧＡＳの阻害剤、ＳＴＩＮＧの阻害剤、ｍＴＯＲの阻害剤、又はＧＣＮ２のアゴニストからなる群から選択される剤を投与することを含む、方法。

【請求項2】

罹患した眼における血管漏出を阻害する方法であって、ＧＰＸ４の阻害剤、ＧＬＳ１の阻害剤、ＰＡＰＰ－Ａの阻害剤、ｃＧＡＳの阻害剤、ＳＴＩＮＧの阻害剤、ｍＴＯＲの阻害剤、又はＧＣＮ２のアゴニストからなる群から選択される剤を投与することを含む、方法。

【請求項3】

前記罹患した眼が、老化内皮細胞の結果である、請求項１又は２に記載の方法。

【請求項4】

前記罹患した眼が、老化周細胞の結果である、請求項１又は２に記載の方法。

【請求項5】

前記罹患した眼が、糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）、糖尿病性網膜症（ＤＲ）、増殖性糖尿病性網膜症（ＰＤＲ）、乾燥型加齢性黄斑変性症（ｄＡＭＤ）、及び新生血管型加齢性黄斑変性症（ｎｖＡＭＤ）の結果である、請求項１又は２に記載の方法。

【請求項6】

老化内皮細胞を除去する方法であって、ＧＰＸ４の阻害剤、ＧＬＳ１の阻害剤、ＰＡＰＰ－Ａの阻害剤、ｃＧＡＳの阻害剤、ＳＴＩＮＧの阻害剤、ｍＴＯＲの阻害剤、又はＧＣＮ２のアゴニストと前記細胞を接触させることを含む、方法。

【請求項7】

老化周細胞を除去する方法であって、ＧＰＸ４の阻害剤、ＧＬＳ１の阻害剤、ＰＡＰＰ－Ａの阻害剤、ｃＧＡＳの阻害剤、ＳＴＩＮＧの阻害剤、ｍＴＯＲの阻害剤、又はＧＣＮ２のアゴニストと前記細胞を接触させることを含む、方法。

【請求項8】

網膜血管症に罹患している患者を治療する方法であって、ＧＰＸ４の阻害剤、ＧＬＳ１の阻害剤、ＰＡＰＰ－Ａの阻害剤、ｃＧＡＳの阻害剤、ＳＴＩＮＧの阻害剤、ｍＴＯＲの阻害剤、又はＧＣＮ２のアゴニストからなる群から選択される剤を前記患者に投与することを含む、方法。

【請求項9】

前記網膜血管症が、糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）、糖尿病性網膜症（ＤＲ）、増殖性糖尿病性網膜症（ＰＤＲ）、乾燥型加齢性黄斑変性症（ｄＡＭＤ）、及び新生血管型加齢性黄斑変性症（ｎｖＡＭＤ）である、請求項８に記載の方法。

【請求項10】

前記剤が、低分子、抗体、ポリペプチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、低分子干渉リボ核酸である、請求項１～５、８～９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項11】

前記阻害剤又はアゴニストが、低分子、抗体、ポリペプチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、低分子干渉リボ核酸である、請求項６又は７に記載の方法。

【請求項12】

前記ＧＰＸ４の阻害剤が、ＲＳＬ３、ＭＬ２１０、ＭＬ１６２、ＪＫＥ－１６７４、ＤＰＩ－７、ブチオニンスルホキシミン（ＢＳＯ）、ＦＩＮ５６、オーラノフィン、エラスチン、アルテミシニン、スルファサラジン、アルテスネート、ジヒドロアテミシン、化合物＃１９、化合物＃２５、ソラフェニブ、アルトレタミン、アルミトリン、アルテメーテル、アルテミゾン、ランペリゾンからなる群から選択される、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項13】

前記ＧＬＳ１の阻害剤が、６－ジアゾ－５－オキソ－Ｌ－ノルロイシン、ＧＫ９２１、ＵＰＧＬ００００４、テラグレナスタット、ＪＨＵ３９５、エチル２－（２－アミノ－４－メチルペンタンアミド）－ＤＯＮ、ＩＰＮ６００９０、及びＢＰＴＥＳである、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項14】

前記ＰＡＰＰ－Ａの阻害剤が、抗体である、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項15】

前記抗体が、ＰＡＣ－１ｓｃＦＶ、ＰＡＣ－１－Ｄ８ｓｃＦｖ、ＰＡＣ－２ｓｃＦｖ、ＰＡＣ－５ｓｃＦｖ、及びｍＡｂ－ＰＡ１／４１である、請求項１４に記載の方法。

【請求項16】

前記ＰＡＰＰ－Ａの阻害剤が、ポリペプチドである、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項17】

前記ポリペプチドが、ｐｒｏ－ＭＢＰ、スタンニオカルシン－１（ＳＴＣ１）、スタンニオカルシン－２（ＳＴＣ２）、及びビクニンである、請求項１６に記載の方法。

【請求項18】

前記ＰＡＰＰ－Ａの阻害剤が、アンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項19】

前記ｃＧＡＳの阻害剤が、３－（１－（６，７－ジクロロ－１Ｈ－ベンゾ［ｄ］イミダゾール－２－イル）－５－ヒドロキシ－３－メチル－１Ｈ－ピラゾール－４－イル）イソベンゾフラン－１（３Ｈ）－オン、１－（６，７－ジクロロ－９－（１－メチル－１Ｈ－ピラゾール－３－イル）－１，３，４，５－テトラヒドロ－２Ｈ－ピリド［４，３－ｂ］インドール－２－イル）－２ヒドロキシエタン－１－オン、１－［９－（６－アミノ－３－ピリジニル）－６，７－ジクロロ－１，３，４，５－テトラヒドロ－２Ｈ－ピリド［４，３ｂ］インドール－２－イル］－２－ヒドロキシ－エタノン、又は（１Ｒ，２Ｓ）－２－（７－オキソ－５－フェニル－４，７－ジヒドロピラゾロ［１，５－ａ］ピリミジン－３カルボキサミド）シクロヘキサン－１－カルボン酸である、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項20】

前記ＳＴＩＮＧの阻害剤が、Ｈ－１５１、Ｃ－１７８、Ｃ－１７６、及び化合物１８である、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項21】

前記ｍＴＯＲの阻害剤が、ラパマイシン、Ｐａｌｏｍｉｄ５２９、シロリムス、エベロリムス、テムシロリムス、リダフォロリムス、ウミロリムス、ゾタロリムス、及びＡＴＰ競合ｍＴＯＲキナーゼ阻害剤である、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項22】

前記ＧＣＮ２のアゴニストが、４－（２－アミノ－４－メチル－３－（２－メチルキノリン－６－イル）ベンゾイル）－１－メチル－２，５－ジフェニル－１Ｈ－ピラゾール－３（２Ｈ）－オン、１－（５－（４－アミノ－２，７－ジメチル－７Ｈ－ピロロ［２，３－ｄ］ピリミジン－５－イル）インドリン－１－イル）－２－（３－フルオロ－５－（トリフルオロメチル）フェニル）－エタノン、４－（２－アミノ－４－メチル－３－（２－（メチルアミノ）ベンゾ［ｄ］チアゾール－６－イル）ベンゾイル）－１－メチル－２，５－ジフェニル－１Ｈ－ピラゾール－３（２Ｈ）－オン、ロイセノール、ヒスチジノール、トレオニノール、ＳＢ－２０３２０７、ＳＢ－２１９３８３、ドビチニブ、ネラチニブ、スニチニブ、及びエロチニブ（elotinib）である、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年５月２６日に出願された米国仮特許出願第６３／１９３，３２７号、及び２０２１年７月１２日に出願された米国仮特許出願第６３／２２０，７７１号の利益を主張し、それらの各々の開示は、参照により本明細書に組み込まれる。

【0002】

発明の分野
本発明は、糖尿病性黄斑浮腫、糖尿病性網膜症及び加齢性黄斑変性症などの特定の網膜血管症を治療する方法に関する。

【背景技術】

【0003】

発明の背景
病理学的血管新生は、糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）、糖尿病性網膜症（ＤＲ）、及び加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）など、しばしば視力喪失及び失明につながる重篤な疾患である特定の網膜血管症の治療における主要な課題の１つのままである。

【0004】

ＤＭＥは、慢性的で制御不良な糖尿病に続く糖尿病性網膜症（ＤＲ）の合併症であり、糖尿病患者における視力を脅かす網膜症の最も一般的な形態である（Ｔａｎ ｅｔ ａｌ．２０１６，ＩＤＦ２０１９）。糖尿病患者の約１４人に１人は、ある程度のＤＭＥを有する（Ｃｏｎｅｙ２０１９）。網膜画像を使用した糖尿病患者におけるＤＲの全体的な有病率は３５％と推定され、視力を脅かすＤＲは１２％に存在した（ＷＨＯ２０１５）。有病率は、糖尿病のタイプ及び疾患の持続期間に依存する。糖尿病の両方のタイプ、１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）及び２型糖尿病（Ｔ２Ｄ）について、２５年の持続期間後、有病率は３０％に近い（Ｂｒｏｗｎｉｎｇ ｅｔ ａｌ．２０１８）。

【0005】

そのような眼疾患を有する患者の視力を安定させるための従来の標準的なケアには、レーザー光凝固療法、外科的硝子体切除術、及びベルテポルフィンによる光線力学療法が含まれていた。現在、抗血管内皮成長因子（抗ＶＥＧＦ）療法及びそのような眼血管疾患に罹患している患者の視力回復能力は、２００６年のＬｕｃｅｎｔｉｓ（登録商標）（ラニビズマブ）及び２０１１年のＥｙｌｅａ（登録商標）（アフリベルセプト）の承認以来、広く使用されている。ＶＥＧＦの機能を阻害する治療の最近の成功は、血管透過性及び成長に関与する成長因子の特異的標的化が、ＤＲ関連の血管機能障害、浮腫及び血管新生を治療する効果的な手段であることを実証している。

【0006】

しかしながら、そのような抗ＶＥＧＦ治療は、しばしば、健康な血管に対するオフターゲット効果をもたらした。したがって、健康な血管と病気の血管との間の分子的不一致を識別することは、生理学的組織機能に不可欠な血管を温存しながら、病理学的血管系を選択的に排除する標的治療を可能にするであろう。

【0007】

抗ＶＥＧＦ標準治療の別の欠点は、視力の向上を維持するために、頻繁な（例えば、毎月、更には月２回の硝子体内注射）及び長期投与を必要とすることである（Ｈｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ ２０１２；１１９：２５３７－４８；ｔｈｅ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ Ａｇｅ－Ｒｅｌａｔｅｄ Ｍａｃｕｌａｒ Ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ Ｔｒｉａｌｓ［ＣＡＴＴ］Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇｒｏｕｐ ２０１６ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ ２０１６；１２３：１７５１－６１）。これにより、この頻繁な治療レジメンに対する患者のコンプライアンスが低下した。

【0008】

また、一部の患者は、抗ＶＥＧＦ治療に対して最適ではない応答を経験していること、及び一部の患者は、抗ＶＥＧＦ治療にまったく応答しないことの証拠がある。Ｂｒｏｗｎ ＤＭ，ｅｔ ａｌ．，Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ．２０１３；１２０：２０１３－２０２２、及びＮｇｕｙｅｎ－Ｋｈｏａ ＢＡ，ｅｔ ａｌ．，ＢＭＣ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．２０１２；１２：１１を参照されたい。

【0009】

最近、個体における老化細胞の存在及び蓄積は、とりわけ、緑内障、白内障、糖尿病性膵臓及び変形性関節症などの加齢及び加齢関連の機能障害及び疾患に寄与し得る（ｖａｎ Ｄｅｕｒｓｅｎ ＪＭ．，Ｎａｔｕｒｅ．２０１４ Ｍａｙ ２２；５０９（７５０１）：４３９－４４６；Ｃｈｉｌｄｓ，Ｂ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｄ．２０１５ Ｄｅｃｅｍｂｅｒ；２１（１２）：１４２４－１４３５を参照されたい）。通常、有糸分裂細胞は、機能不全テロメア、ＤＮＡ損傷、強力な有糸分裂シグナル、及び破壊されたクロマチンを含む細胞ストレスに応答して、細胞周期から恒久的に離脱することができる。この応答は、細胞老化と称され、機能不全又は損傷した細胞の増殖の阻害、特にがん悪性腫瘍メカニズムの発達の抑制に重要であることが示されている（Ｃａｍｐｉｓｉ Ｊ．，Ｃｅｌｌ１２０：５１３－２２（２００５）；Ｃａｍｐｉｓｉ Ｊ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．２１：１０７－１２（２０１１）を参照されたい）。老化細胞は、有糸分裂刺激に対する不感受性、扁平な形態、増加した老化関連β－ガラクトシダーゼ活性（ＳＡ－β－ｇａｌ）、上昇したｐ１６発現、短縮されたテロメア、上昇したサイクリン依存性キナーゼ阻害剤発現、クロマチン構造の変化、広範囲のＤＮＡ損傷巣、アポトーシスに対する耐性、及び炎症誘発性老化関連分泌性表現型（ＳＡＳＰ）の活性化を含む、多数の細胞表現型を特徴とする（Ｃｏｐｐｅ，Ｊ－Ｐ，ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｐａｔｈｏｌ．２０１０；５：９９－１１８を参照されたい）。

【0010】

最近、網膜の病理学的血管系が選択的に細胞老化に関与することが示された（Ｃｒｅｓｐｏ－Ｇａｒｃｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ２０２１，３３，１－１５を参照されたい）。老化細胞が、加齢に関連する健康の低下の特定の態様に因果関係があり、がんを含む特定の加齢関連疾患に寄与する可能性が高いことを考慮して、効果的な治療法が研究開発されている。いくつかの場合では、患部内及びその周辺に蓄積された老化細胞を選択的に除去し、結果として生じる状態の有害な徴候及び症状を緩和する低分子化合物が特定されている。老化細胞において活性であるいくつかの細胞内経路は、とりわけ、ＭＤＭ２経路、Ｂｃｌ経路、Ａｋｔ経路、及びプロテアソーム経路など、標的化に適していることが示されている（ＷＯ／２０１５／１７１５９１：Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．、ＷＯ／２０１５／１１６７４０：Ｌａｂｅｒｇｅ ｅｔ ａｌ．、ＷＯ／２０１９／１３３９０４：Ｈｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．を参照されたい）。

【0011】

網膜における老化細胞を標的とすることとは別に、又はそれに加えて、網膜血管症においてＶＥＧＦ発現が増加し得る代替のメカニズムは、内皮小胞体（ＥＲ）ストレス及び活性化転写因子４（ＡＴＦ４）が関与する。ＡＴＦ４は、ストレスに対するアンフォールディングタンパク質応答（ＵＰＲ）の一部として活性化されるいくつかの転写因子のうちの１つである。ＡＴＦ４タンパク質へのＡＴＦ４ ｍＲＮＡの翻訳は、真核生物翻訳開始因子２（ｅＩＦ２）のリン酸化を介して一般的なタンパク質合成の阻害をもたらすいくつかのストレスに応答して誘導される（Ｂａｉｒｄ ＴＤ，ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖ Ｎｕｔｒ．２０１２；３：３０７－３２１を参照されたい）。これらのストレスには、栄養素欠乏、ＥＲストレス、酸化ストレス、及び低酸素が含まれる（Ａｂｃｏｕｗｅｒ，Ｓｔｅｖｅｎ Ｆ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ，；Ｓｕｐｐｌ１（１１）：１－１２，２０１３を参照されたい）。そのようなストレスに対する加齢に伴う適応反応及びホルメシスの低下は、このメカニズムを標的とする治療の機会を提供する。

【0012】

したがって、網膜血管症を治療するための代替方法を開発する必要性が存在する。

【発明の概要】

【0013】

本発明は、網膜血管症を治療する新規の方法を提供する。以下のものが、開示される発明の一部として具体的に企図される。

【0014】

実施形態１．罹患した眼における病原性血管新生を阻害する方法であって、ＧＰＸ４の阻害剤、ＧＬＳ１の阻害剤、ＰＡＰＰ－Ａの阻害剤、ｃＧＡＳの阻害剤、ＳＴＩＮＧの阻害剤、ｍＴＯＲの阻害剤、又はＧＣＮ２のアゴニストからなる群から選択される剤を投与することを含む、方法。

【0015】

実施形態２．罹患した眼における血管漏出を阻害する方法であって、ＧＰＸ４の阻害剤、ＧＬＳ１の阻害剤、ＰＡＰＰ－Ａの阻害剤、ｃＧＡＳの阻害剤、ＳＴＩＮＧの阻害剤、ｍＴＯＲの阻害剤、又はＧＣＮ２のアゴニストからなる群から選択される剤を投与することを含む、方法。

【0016】

実施形態３．前記罹患した眼が、老化内皮細胞の結果である、実施形態１又は２に記載の方法。

【0017】

実施形態４．前記罹患した眼が、老化周細胞の結果である、実施形態１又は２に記載の方法。

【0018】

実施形態５．前記罹患した眼が、糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）、糖尿病性網膜症（ＤＲ）、増殖性糖尿病性網膜症（ＰＤＲ）、乾燥型加齢性黄斑変性症（ｄＡＭＤ）、及び新生血管型加齢性黄斑変性症（ｎｖＡＭＤ）の結果である、実施形態１又は２に記載の方法。

【0019】

実施形態６．老化内皮細胞を除去する方法であって、ＧＰＸ４の阻害剤、ＧＬＳ１の阻害剤、ＰＡＰＰ－Ａの阻害剤、ｃＧＡＳの阻害剤、ＳＴＩＮＧの阻害剤、ｍＴＯＲの阻害剤、又はＧＣＮ２のアゴニストと前記細胞を接触させることを含む、方法。

【0020】

実施形態７．老化周細胞を除去する方法であって、ＧＰＸ４の阻害剤、ＧＬＳ１の阻害剤、ＰＡＰＰ－Ａの阻害剤、ｃＧＡＳの阻害剤、ＳＴＩＮＧの阻害剤、ｍＴＯＲの阻害剤、又はＧＣＮ２のアゴニストと前記細胞を接触させることを含む、方法。

【0021】

実施形態８．網膜血管症に罹患している患者を治療する方法であって、ＧＰＸ４の阻害剤、ＧＬＳ１の阻害剤、ＰＡＰＰ－Ａの阻害剤、ｃＧＡＳの阻害剤、ＳＴＩＮＧの阻害剤、ｍＴＯＲの阻害剤、又はＧＣＮ２のアゴニストからなる群から選択される剤を前記患者に投与することを含む、方法。

【0022】

実施形態９．前記網膜血管症が、糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）、糖尿病性網膜症（ＤＲ）、増殖性糖尿病性網膜症（ＰＤＲ）、乾燥型加齢性黄斑変性症（ｄＡＭＤ）、及び新生血管型加齢性黄斑変性症（ｎｖＡＭＤ）である、実施形態８に記載の方法。

【0023】

実施形態１０．前記剤が、低分子、抗体、ポリペプチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、低分子干渉リボ核酸である、実施形態１～５、８～９のいずれか１つに記載の方法。

【0024】

実施形態１１．前記阻害剤又はアゴニストが、低分子、抗体、ポリペプチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、低分子干渉リボ核酸である、実施形態６又は７に記載の方法。

【0025】

実施形態１２．前記ＧＰＸ４の阻害剤が、ＲＳＬ３、ＭＬ２１０、ＭＬ１６２、ＪＫＥ－１６７４、ＤＰＩ－７、ブチオニンスルホキシミン（ＢＳＯ）、ＦＩＮ５６、オーラノフィン、エラスチン、アルテミシニン、スルファサラジン、アルテスネート、ジヒドロアテミシン、化合物＃１９、化合物＃２５、ソラフェニブ、アルトレタミン、アルミトリン、アルテメーテル、アルテミゾン、ランペリゾンからなる群から選択される、実施形態１～１１のいずれか１つに記載の方法。

【0026】

実施形態１３．前記ＧＬＳ１の阻害剤が、６－ジアゾ－５－オキソ－Ｌ－ノルロイシン、ＧＫ９２１、ＵＰＧＬ００００４、テラグレナスタット、ＪＨＵ３９５、エチル２－（２－アミノ－４－メチルペンタンアミド）－ＤＯＮ、ＩＰＮ６００９０、及びＢＰＴＥＳである、実施形態１～１１のいずれか１つに記載の方法。

【0027】

実施形態１４．前記ＰＡＰＰ－Ａの阻害剤が、抗体である、実施形態１～１１のいずれか１つに記載の方法。

【0028】

実施形態１５．前記抗体が、ＰＡＣ－１ｓｃＦＶ、ＰＡＣ－１－Ｄ８ｓｃＦｖ、ＰＡＣ－２ｓｃＦｖ、ＰＡＣ－５ｓｃＦｖ、及びｍＡｂ－ＰＡ１／４１である、実施形態１４に記載の方法。

【0029】

実施形態１６．前記ＰＡＰＰ－Ａの阻害剤が、ポリペプチドである、実施形態１～１１のいずれか１つの方法。

【0030】

実施形態１７．前記ポリペプチドが、ｐｒｏ－ＭＢＰ、スタンニオカルシン－１（ＳＴＣ１）、スタンニオカルシン－２（ＳＴＣ２）、及びビクニンである、実施形態１６に記載の方法。

【0031】

実施形態１８．前記ＰＡＰＰ－Ａの阻害剤が、アンチセンスオリゴヌクレオチドである、実施形態１～１１のいずれか１つに記載の方法。

【0032】

実施形態１９．前記ｃＧＡＳの阻害剤が、３－（１－（６，７－ジクロロ－１Ｈ－ベンゾ［ｄ］イミダゾール－２－イル）－５－ヒドロキシ－３－メチル－１Ｈ－ピラゾール－４－イル）イソベンゾフラン－１（３Ｈ）－オン、１－（６，７－ジクロロ－９－（１－メチル－１Ｈ－ピラゾール－３－イル）－１，３，４，５－テトラヒドロ－２Ｈ－ピリド［４，３－ｂ］インドール－２－イル）－２ヒドロキシエタン－１－オン、１－［９－（６－アミノ－３－ピリジニル）－６，７－ジクロロ－１，３，４，５－テトラヒドロ－２Ｈ－ピリド［４，３ｂ］インドール－２－イル］－２－ヒドロキシ－エタノン、又は（１Ｒ，２Ｓ）－２－（７－オキソ－５－フェニル－４，７－ジヒドロピラゾロ［１，５－ａ］ピリミジン－３カルボキサミド）シクロヘキサン－１－カルボン酸である、実施形態１～１１のいずれか１つに記載の方法。

【0033】

実施形態２０．前記ＳＴＩＮＧの阻害剤が、Ｈ－１５１、Ｃ－１７８、Ｃ－１７６、及び化合物１８である、実施形態１～１１のいずれか１つに記載の方法。

【0034】

実施形態２１．前記ｍＴＯＲの阻害剤が、ラパマイシン、Ｐａｌｏｍｉｄ５２９、シロリムス、エベロリムス、テムシロリムス、リダフォロリムス、ウミロリムス、ゾタロリムス、及びＡＴＰ競合ｍＴＯＲキナーゼ阻害剤である、実施形態１～１１のいずれか１つに記載の方法。

【0035】

実施形態２２．前記ＧＣＮ２のアゴニストが、４－（２－アミノ－４－メチル－３－（２－メチルキノリン－６－イル）ベンゾイル）－１－メチル－２，５－ジフェニル－１Ｈ－ピラゾール－３（２Ｈ）－オン、１－（５－（４－アミノ－２，７－ジメチル－７Ｈ－ピロロ［２，３－ｄ］ピリミジン－５－イル）インドリン－１－イル）－２－（３－フルオロ－５－（トリフルオロメチル）フェニル）－エタノン、４－（２－アミノ－４－メチル－３－（２－（メチルアミノ）ベンゾ［ｄ］チアゾール－６－イル）ベンゾイル）－１－メチル－２，５－ジフェニル－１Ｈ－ピラゾール－３（２Ｈ）－オン、ロイセノール、ヒスチジノール、トレオニノール、ＳＢ－２０３２０７、ＳＢ－２１９３８３、ドビチニブ、ネラチニブ、スニチニブ、及びエロチニブ（elotinib）である、実施形態１～１１のいずれか１つに記載の方法。

【図面の簡単な説明】

【0036】

【図1】ＡＭＤ、ＤＲ／ＤＭＥ又はそのいずれでもない死前診断を有していた患者からの死後網膜ドナー組織における、正常と比較したｐ１６の免疫組織化学染色によって評価されるとおりの、ＡＭＤ及びＤＲ／ＤＭＥにおける老化細胞負荷の定量化を描画する。実施例２を参照されたい。

【図2】ＰＤＲ又はそのいずれでもない死前診断を有していた患者からの死後網膜ドナー組織における、正常と比較したｐ１６の免疫組織化学染色によって評価されるとおりの、ＰＤＲにおける老化細胞負荷の定量化を描画する。実施例２を参照されたい。

【図3A】図３Ａ～３Ｂは、用量依存的な非老化ＨＲＭＥＣ細胞に対する照射された老化ＨＲＭＥＣ細胞の選択的殺傷（図３Ａ）、及び用量依存的な非老化ＨＵＶＥＣ細胞に対する照射された老化ＨＵＶＥＣ細胞の選択的殺傷（図３Ｂ）を示すＧＰＸ４阻害剤、ＲＳＬ３を描画し、実施例１を参照されたい。

【図3B】図３Ａの説明を参照のこと。

【図4】用量依存的な非老化ＨＵＶＥＣ細胞に対する照射された老化ＨＵＶＥＣ細胞の選択的殺傷を示すＧＰＸ４阻害剤、ＪＫＥ－１６７４を描画し、実施例１を参照されたい。

【図5】用量依存的な非老化ＨＲＭＥＣ細胞に対する照射された老化ＨＲＭＥＣ細胞の選択的殺傷を示すＧＰＸ４阻害剤、ＭＬ２１０を描画し、実施例１を参照されたい。

【図6A】図６Ａ及び６Ｂは、用量依存的な非老化ＨＵＶＥＣ細胞に対する照射されたＨＵＶＥＣ細胞の選択的除去を示す２つのＧＰＸ４阻害剤、化合物＃１９（図６Ａ）及び化合物＃２５（図６Ｂ）を共に描画し、実施例１を参照されたい。

【図6B】図６Ａの説明を参照のこと。

【図7】細胞株又は組織におけるＧＰＸ４の阻害を検出するために使用されるＧＰＸ４競合標的係合ゲルシフトアッセイの概略図であり、実施例７を参照されたい。

【図8A】図８Ａ～８Ｃは、成体マウス網膜におけるＧＰＸ４阻害剤、ＲＳＬ３の標的係合を描画する。ゲルシフトアッセイを行い、各レーンは、ゲルシフトのために、ＲＳＬ３及びストレプトアビジンで標識された２０μＬの網膜溶解物を含有した（図８Ａ）。品質管理のために、等量のビヒクル処理された網膜溶解物を組み合わせ、１００μＭのＲＳＬ３又はＤＭＳＯで処理した（図８Ｂ）。標的係合を、統合バンド密度測定（ＩｍａｇｅＪ（登録商標））に基づいて定量化した（図８Ｃ）。実施例７を参照されたい。

【図8B】図８Ａの説明を参照のこと。

【図8C】図８Ａの説明を参照のこと。

【図9A】図９Ａ～９Ｂは、老化ＨＵＶＥＣ細胞と共に６時間インキュベートすることによるＧＰＸ４阻害剤化合物＃１９（図９Ａ）及び＃２５（図９Ｂ）の標的係合を描画する。実施例７を参照されたい。

【図9B】図９Ａの説明を参照のこと。

【図10A】図１０Ａ～１０Ｄは、Ｈ２１２２細胞におけるレポーター遺伝子ＡＴＦ４（図１０Ａ及び図１０Ｂ）並びにＤＤＩＴ３（図１０Ｃ及び図１０Ｄ）を使用したＧＣＮ２経路活性化を描画する。実施例８を参照されたい。

【図10B】図１０Ａの説明を参照のこと。

【図10C】図１０Ａの説明を参照のこと。

【図10D】図１０Ａの説明を参照のこと。

【図11A】図１１Ａ～１１Ｃは、ＧＣＮ２活性化因子、化合物３９の全身投与が、網膜におけるＧＣＮ２を活性化することを描画する。図１１Ａ及び図１１Ｂは、化合物３９が、正常酸素及び酸素誘導性網膜症（ＯＩＲ）マウスの両方において、様々な用量及び時点で網膜内のレポーター遺伝子ＡＴＦ４及びＤＤＩＴ３を活性化したことを示す。図１１Ｃは、腹腔内投与された化合物３９が、マウス網膜において３０及び６０ｍｐｋでＡＴＦ４タンパク質発現を活性化したことを示す。実施例９を参照されたい。

【図11B】図１１Ａの説明を参照のこと。

【図11C】図１１Ａの説明を参照のこと。

【図12】図１２Ａ及び１２Ｂは、ＧＣＮ２活性化因子である化合物３９が、酸化還元因子であるＳｌｃ７ａ１１（図１２Ａ）及び抗血管新生因子であるＳｅｒｐｉｎｆ１（図１２Ｂ）の両方の発現を、正常酸素マウス及びＯＩＲ新生児マウスの両方において様々な用量及び時点で腹腔内投与後に活性化することによって、疾患関連遺伝子発現を調節することを示す。実施例１０を参照されたい。

【図13】３０ｍｐｋでＧＣＮ２活性化因子である化合物３９を腹腔内投与したことで、ＯＩＲ新生児からの網膜において、早ければ処理後４時間でＡＴＦ４タンパク質発現が活性化され、蛍光体－ｅＩＦ２αレベルが増加し、ＨＩＦ１αタンパク質発現が下方制御されたことを示す。実施例１０を参照されたい。

【図14】図１４Ａ～１４Ｂは、ＧＣＮ２の活性化が、ＯＩＲマウスモデルにおける網膜血管系を改善することを示す。具体的には、ＧＣＮ２活性化因子である化合物３９は、全身投与されると、処置されたＯＩＲマウスの網膜における新血管形成を改善することができる（図１４Ａ）が、無血管領域を改善することはできない（図１４Ｂ）。実施例１１を参照されたい。

【図15】図１５Ａ～１５Ｂは、ＧＣＮ２の活性化が、ＯＩＲマウスモデルにおける血管新生を改善することを示す。化合物３９は、ビヒクル対照（図１５Ａ）と比較して、処置されたＯＩＲマウスの網膜における血管新生を改善することができる（図１５Ｂ）。実施例１１を参照されたい。

【発明を実施するための形態】

【0037】

発明の詳細な説明
Ｉ．定義
本明細書で使用される場合、「約」という用語は、当業者に容易に知られるそれぞれの値の通常の誤差範囲を指す。本明細書における「約」を伴う値又はパラメータへの言及は、その値又はパラメータ自体を対象とする実施形態を含む（及び説明する）。

【0038】

本明細書で使用される場合、「投与すること」は、本明細書の網膜血管症に罹患している患者に、化合物－メグルミンの投薬量を投与する方法を意味する。本明細書に記載の方法で利用される組成物は、例えば、硝子体内（例えば、硝子体内注射によって）、経眼（例えば、経眼注射によって）、又は眼内（例えば、眼内注射によって）投与され得る。投与方法は、様々な要因（例えば、投与される化合物又は組成物、及び治療される状態、疾患、又は障害の重症度）に応じて変化し得る。

【0039】

「抗体」という用語は、最も広い意味で本明細書で使用され、それらが望ましい抗原結合活性を示す限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、及び抗体断片を含むがこれらに限定されない、様々な抗体構造を包含する。

【0040】

本明細書で使用される場合、「抗ＶＥＧＦ治療」又は「抗ＶＥＧＦ療法」という用語は、網膜血管症を治療するために示される任意の現在承認されている抗ＶＥＧＦ薬物を意味する。そのような承認された薬物としては、例えば、Ｌｕｃｅｎｔｉｓ（登録商標）（ラニビズマブ）又はＥｙｌｅａ（登録商標）（アフリベルセプト）、及びラニビズマブ又はアフリベルセプトに対する任意の承認されたバイオ後続薬物が挙げられる。

【0041】

「アゴニスト」又は「活性化因子」又は「活性化」剤は、それが結合する標的又は抗原の生物学的又はシグナル伝達活性を活性化させるか、刺激するか、又は増加させるものである。いくつかの状況では、アゴニスト剤は、リガンドがその同族受容体と係合し、それを活性化させる様式と同様に作用可能であることが企図される。

【0042】

本明細書で使用される場合、「フェロプトーシス」は、鉄によって媒介される反応性酸素種の生成を伴い、部分的には脂質過酸化を特徴とする、当該技術分野で理解される細胞死の形態を指す。「フェロプトーシス誘導剤」又は「フェロプトーシス活性化因子」は、フェロプトーシスを誘導、促進又は活性化する剤を指す。

【0043】

本明細書で使用される場合、「網膜血管症」は、例えば、糖尿病性黄斑浮腫、糖尿病性網膜症、及び乾燥型又は新生血管（又は湿潤）型加齢性黄斑変性症などの病原性血管新生を伴う眼疾患を指す。他の眼疾患としては、例えば、地図状萎縮が挙げられ得る。

【0044】

「老化細胞」は、一般に、典型的には複製するが、細胞状態の変化を引き起こす老化又は他の事象の結果として、もはや複製しない細胞型に由来すると考えられる。換言すれば、老化細胞は、細胞増殖の不可逆的な停止に入る細胞である。老化細胞はまた、アポトーシスに耐性になり、したがって、対象に持続し、対象の加齢に伴い蓄積し得る。更に、老化細胞は、多面的な分泌表現型又は老化関連分泌表現型（ＳＡＳＰ）を示し、これは、老化関連がんの初期提示又は進行中の病理学において役割を果たし得る病理学的可溶性因子であると考えられている。本発明の態様を実践する目的で、老化細胞は、例えば、ｐ１６、又はｐ１６、老化関連βガラクトシダーゼ、若しくはｐ２１から選択される少なくとも１つのマーカーを発現するものとして特定され得る。老化細胞はまた、これらに限定されないが、炎症因子（例えば、これらに限定されないが、ＭＭＰ１、ＭＭＰ３、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１β、プロスタグランジンなど）、及び／又は線維化促進因子（例えば、これらに限定されないが、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＣＴＧＦ、ＴＩＭＰ－１、ＭＣＰ－１など）及び／又は成長因子（例えば、これらに限定されないが、ＶＥＧＦ－α、ＩＬ－６、ＩＬ－８、Ｐａｉ－１など）などのＳＡＳＰ因子を分泌するものとして特定され得る。

【0045】

候補剤阻害剤又はアゴニストは、同じ組織型の複製細胞、又はＳＡＳＰマーカーを欠く静止細胞と比較して、より選択的に老化細胞を排除する場合、典型的には「セノリティック」と称される。一態様では、非老化細胞上の老化細胞の除去のために、約２～１０倍の選択性、又は約１０～１０００倍の選択性、又は約１００～２０００倍の選択性、又は約１０～２０００倍の選択性、又は約１０００～２０００倍の選択性、又は１０００倍を超える選択性を達成することが、本発明の方法の一部として企図される。代替的に、又は追加的に、本発明の方法は、病態の最初の提示又は進行中の病理学において役割を果たす、又はその解消を阻害する老化関連分泌表現型（ＳＡＳＰ）の一部として、病理学的可溶性因子又はメディエーターの放出を減少させる場合、効果的に使用され得る。この点で、「セノリティック」という用語は、本発明の化合物及び方法が、老化細胞（老化細胞阻害剤）を除去するのではなく、選択的に阻害することによって主に機能し得ることを理解した上で、例示的であり、そのようなものは、その後の利益を伴って本発明の方法で使用することができる。

【0046】

本明細書で使用される場合、「治療」（及び「治療する）」又は「治療すること」）は、治療される個体の自然経過を改変する試みにおける臨床介入を指し、予防のために、又は臨床病理の経過中に実行され得る。本明細書で特許請求される治療方法の望ましい効果には、これらに限定されないが、ＤＭＥ、ＤＲ又はＡＭＤの発生又は再発の予防、ＤＭＥ、ＤＲ又はＡＭＤの症状の緩和、ＤＭＥ、ＤＲ又はＡＭＤの任意の直接的又は間接的な病理学的帰結の減少、ＤＭＥ、ＤＲ又はＡＭＤにおける疾患の進行速度の低減、ＤＭＥ、ＤＲ又はＡＭＤにおける疾患の状態の改善又は緩和、及びＤＭＥ、ＤＲ又はＡＭＤに対する寛解又は予後の改善が含まれる。

【0047】

特に明記又は要求されない限り、本明細書で使用される他の用語は、それらの通常の意味を有する。

【0048】

組成物及び方法
本発明は、糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）、糖尿病性網膜症（ＤＲ）、及び加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）などの特定の網膜血管症を治療するための方法を提供する。

【0049】

ＤＭＥは、慢性的で制御不良な糖尿病に続く糖尿病性網膜症（ＤＲ）の合併症であり、糖尿病患者における視力を脅かす網膜症の最も一般的な形態である。糖尿病患者の約１４人に１人は、ある程度のＤＭＥを有する。世界保健機関（ＷＨＯ）は２０１５年に、網膜画像を使用した糖尿病患者におけるＤＲの全体的な有病率は３５％と推定され、視力を脅かすＤＲは１２％に存在することを報告した。有病率は、糖尿病のタイプ及び疾患の持続期間に依存する。糖尿病の両方のタイプ、１型糖尿病及び２型糖尿病について、２５年の持続期間後、有病率は３０％に近い。米国では、４０歳超の少なくとも５５０万人がＤＭＥがない状態でＤＲを有すると推定され、更に８０万人～１００万人の患者がＤＭＥを有する。いくつかの推定によると、それらのうち４０％のみが診断及び治療され、約５％が診断及び観察されている。

【0050】

糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）は、糖尿病性網膜症（ＤＲ）に続発する黄斑肥厚であり、血管漏出及び体液蓄積につながる血液網膜関門の欠陥に起因する。Ｂｈａｇａｔ Ｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｕｒｖ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．２００９；５４：１－３２を参照されたい。ＤＭＥは、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、細胞間接着分子－１（ＩＣＡＭ－１）、インターロイキン－６（ＩＬ－６）、単球走化性タンパク質－１（ＭＣＰ－１）、及び白血球停滞を含むいくつかの炎症因子の発現に関連している。Ｆｕｎａｔｓｕ Ｈ，ｅｔ ａｌ．，Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ．２００９；１１６：７３－７９、及びＭｉｙａｍｏｔｏ Ｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．１９９９；９６：１０８３６－１０８４１を参照されたい。更に、これらの因子の発現は、網膜の血管透過性及び疾患の重症度の両方に関連しており、したがってそれらの重要な病原学的役割を裏付けている。

【0051】

ＤＲ：糖尿病性網膜症の有病率は年齢と共に増加し、５０歳を超える人々における失明の最も一般的な原因である。これは多因子障害であり、高血糖は、糖尿病性眼疾患の多くの側面に関与する細胞及び炎症性サイトカインに毒性作用を及ぼす。糖尿病性網膜症は、毛細血管基底膜の肥厚を伴い、周細胞が毛細血管の内皮細胞に接触するのを防止する。周細胞の喪失は、毛細血管の漏出を増加させ、血液網膜関門の崩壊につながる可能性がある。毛細血管が弱くなると、動脈瘤が形成され、更に漏出する可能性がある。高血糖の期間及び重症度は、糖尿病性網膜症の発症に関連する要因である。高血糖のこれらの効果はまた、網膜の神経機能を損なう可能性がある。これは、非増殖性糖尿病性網膜症（ＮＰＤＲ）と呼称される糖尿病性網膜症の初期段階である。

【0052】

糖尿病性網膜症はまた、臨床的血管疾患の発症前の神経機能の変化に関連する、神経網膜の変性疾患である。網膜の毛細血管は、網膜の虚血領域を引き起こす糖尿病において閉塞する可能性がある。非灌流組織は、既存の血管から新しい血管の成長（すなわち、血管新生）を誘発することによって応答する。新しい血管は壊れやすく、眼に血液が漏れる傾向があるため、これらの新しい血管はまた、増殖性糖尿病性網膜症（ＰＤＲ）と呼ばれる状態である視力喪失を引き起こす可能性がある。進行性増殖性糖尿病性網膜症では、網膜血管新生を伴う血管新生ＶＥＧＦ媒介性応答が続き、眼は、硝子体出血又は牽引網膜剥離の発症に起因する重篤な視力喪失の更なるリスクにさらされる。治療しないと不可逆的な血管又は神経損傷となり得、早期介入の必要性を強調している。

【0053】

ＡＭＤ：加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）は、視覚障害及び重度の視力喪失の主要な原因である。視覚障害の世界的な原因の中で３番目にランクされ、失明率は８．７％である。

【0054】

ＡＭＤは、網膜の中心部分の悪化によって引き起こされ、その病因に関与する補体、脂質、血管新生、炎症性、及び細胞外マトリックス経路の調節不全を伴う多因子障害である。ＡＭＤの病理学は、黄斑の網膜色素上皮と、時間の経過と共に網膜を損傷すると考えられているその下の脈絡膜との間の、ドルーゼン（例えば、細胞外タンパク質及び脂質の蓄積）と呼ばれる特徴的な黄色の沈着物の進行性の蓄積を特徴とする。

【0055】

ＡＭＤには、「乾燥」及び「湿潤」の２つの基本的なタイプがある（新生血管性ＡＭＤ又はｎｖＡＭＤとしても知られている）。ＡＭＤの症例の約８５％～９０％が「乾燥」（萎縮）型であり、１０～１５％が「湿潤」（滲出）型である。乾燥型ＡＭＤ（ｄＡＭＤ）は、黄斑における網膜色素上皮（ＲＰＥ）及び光受容体細胞の漸進的喪失によって定義される。乾燥型ＡＭＤに罹患する患者は、光受容体細胞及びそれらの密接に関連する網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞の死に起因して、中心視力の漸進的喪失を有し、ドルーゼンの沈着を伴う。湿潤ＡＭＤは、黄斑上皮の下に異常な血管が増殖することを特徴とする。湿潤ＡＭＤは、Ｂｒｕｃｈ膜を介した脈絡毛細血管の異常な血管増殖（例えば、脈絡膜新生血管）による視力喪失をもたらす。臨床的には、早期（中程度のドルーゼン及び網膜色素変化）から後期（新生血管型ＡＭＤ及び萎縮型ＡＭＤ）に分類される。

【0056】

セノリティックアッセイ：本発明の候補剤はまた、老化細胞を選択的に死滅させる能力について評価され得る。培養細胞が剤と接触され、細胞毒性又は細胞の阻害の程度が決定される。老化細胞を死滅させる又は阻害する剤の能力は、低密度で自由に分裂している正常細胞、及び高密度で静止状態にある正常細胞に対する剤の効果と比較され得る。非限定的な例として、実施例１は、本発明の候補剤を試験及び定量化するために、ヒト内皮ＨＵＶＥＣ細胞株及びヒトＲＰＥ細胞株において照射誘発老化を使用する細胞ベースのアッセイの例示を提供する。同様のプロトコルが既知であり、候補となるセノリティック化合物が他の老化細胞型を死滅させる能力を試験するために開発又は最適化され得る。

【0057】

経路：本明細書に記載され、特許請求される本発明は、ある特定された生物学的経路の阻害剤又はアゴニストを使用して網膜血管症を治療することを企図する。本明細書に記載され、特許請求される本発明はまた、ある特定された生物学的経路の阻害剤又はアゴニストを使用して、網膜血管症を治療するために、老化内皮細胞及び／又は老化周細胞などの老化細胞を除去することを企図する。企図される生物学的経路は以下のとおりである。

【0058】

グルタチオンペルオキシダーゼ４（ＧＰＸ４）経路：酸化ストレス及び酸化還元系の調節は、発がん及びがんの進行において重要な役割を果たしており、このため、がん治療標的の領域として多くの注目を集めている。グルタチオンペルオキシダーゼ４（ＧＰＸ４）は、８つの既知の哺乳類アイソザイム（ＧＰＸ１～８）からなるグルタチオンペルオキシダーゼのファミリーに属し、そのメンバーは、過酸化水素、有機ヒドロペルオキシド及び脂質ヒドロペルオキシドの還元を触媒し、それによって細胞を酸化ストレスから保護し、膜リン脂質の過酸化を抑制することによって細胞死をシグナル伝達する。ＧＰＸ４活性が損なわれると、脂質過酸化は、非アポトーシス細胞死の酸化的鉄依存性形態であるフェロプトーシスを引き起こし得る。外因性剤によって誘導されるフェロプトーシスは、ＧＰＸ４修復活性に中毒性の腫瘍細胞に対して選択的に致死的であり、これは、フェロプトーシスの誘導がいくつかのがんを治療するための有益なアプローチであり得ることを示唆している。Ｓｔｏｃｋｗｅｌｌ ＢＲ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ．２０１７；１７１：２７３－２８５を参照されたい。

【0059】

例示的なＧＰＸ４阻害剤：当該技術分野で現在知られている、又は開発される任意のＧＰＸ４阻害剤は、本発明に従って、老化関連疾患及び／又は加齢関連疾患の治療のために、老化活性について試験し、開発することができる。特に、本発明の方法で利用することができるＧＰＸ４阻害剤としては、例えば、ＲＳＬ３、ＭＬ２１０、ＭＬ１６２、ＪＫＥ－１６７４、ＤＰＩ－７、ブチオニンスルホキシミン（ＢＳＯ）、ＦＩＮ５６、オーラノフィン、エラスチン、アルテミシニン、スルファサラジン、アルテスネート、ジヒドロアテミシン、ソラフェニブ、アルトレタミン、アルミトリン、アルテメーテル、アルテミゾン、又はランペリゾンが挙げられるが、これらに限定されない。他の非限定的な例示的ＧＰＸ４阻害剤は、ＷＯ２０１９／１６８９９９開示され特許請求される化合物１～２７３、ＷＯ２０２０／１７６７５７に開示され特許請求される化合物１～１０２、及びＷＯ２０２１／０４１５３６開示され特許請求される化合物１～１２及び化合物Ａ－１～Ａ－１９であり得、これらは各々、参照によりそれらの全体の各々が組み込まれる。

【0060】

ＧＰＸ４生物学的アッセイ：研究は、フェロスタチンなどの親油性抗酸化物質が、ＧＰＸ４阻害誘発性フェロプトーシスから細胞を救うことができることを示している。例えば、間葉系状態ＧＰＸ４ノックアウト細胞は、フェロスタチンの存在下で生存することができるが、フェロスタチンの供給が終了すると、これらの細胞はフェロプトーシスを受ける（例えば、Ｖｉｓｗａｎａｔｈａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ５４７：４５３－７，２０１７を参照されたい）。また、ＧＰＸ４ｉは、脂質ＲＯＳスカベンジャー（フェロスタチン、リプロキシスタチン）、リポキシゲナーゼ阻害剤、鉄キレート剤、及びカスパーゼ阻害剤などの、アポトーシス阻害剤が救出しないフェロプトーシス経路の他の構成要素をブロックすることによって救出され得ることが実験的に決定されている。これらの所見は、非アポトーシス鉄依存性酸化性細胞死（すなわち、フェロプトーシス）を示唆している。したがって、フェロプトーシスがん細胞死を誘導する分子の能力、及びそのような能力がフェロスタチンの添加によって警告されることは、その分子がＧＰＸ４阻害剤であることを明確に示している。候補剤ＧＰＸ４阻害剤の阻害可能性を試験するために使用される例示的なアッセイは、以下のとおりである。ＧＰＸ４ウェスタンブロットアッセイの移動度シフトを使用して、候補ＧＰＸ４阻害剤とのインキュベーション後の細胞ベースのアッセイにおいて標的係合を直接評価することができる。移動度シフトは、ＧＰＸ４不可逆的阻害剤の薬力学的マーカーとして使用することができる。更に、候補ＧＰＸ４阻害剤は、ＧＰＸ４の細胞ベースのウェスタンブロット分析において評価することができる。

【0061】

グルタミナーゼ阻害剤１（ＧＬＳ１）経路：グルタミンは、最も豊富な血漿アミノ酸であり、多くの成長促進経路に関与する。特に、グルタミンは、ＴＣＡサイクルにおける酸化及び細胞の酸化還元平衡の維持に関与し、また、ヌクレオチド及びアミノ酸合成のための窒素も提供する（Ｃｕｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．２００７，１２，３４４－５７；ＤｅＢｅｒａｒｄｉｎｉｓ ａｎｄ Ｃｈｅｎｇ，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２０１０，３１３－３２４）。グルタミナーゼは、グルタミンからグルタミン酸を生成するミトコンドリアアミドヒドロラーゼ酵素である。これは、ＲＯＳの解毒に関与している。

【0062】

例示的ＧＬＳ１阻害剤：当該技術分野で現在知られている、又は開発される任意のＧＬＳ１阻害剤が、本発明に従って開示される網膜血管症の治療のために試験及び開発され得る。特に、本発明の方法で利用することができるＧＬＳ１阻害剤としては、限定されないが以下を含む：例えば、６－ジアゾ－５－オキソ－Ｌ－ノルロイシン（ジアゾオキソノルロイシン、Ｌ－６－ジアゾ－５－オキソノルロイシン、ＤＯＮ）、ストレプトマイセスから単離された抗生物質は、ｃＫＧＡ（腎臓型グルタミナーゼ）に対するＩＣ５０が約１ｍＭであるグルタミナーゼアンタゴニストであり、ＧＫ９２１は、修飾されたアッセイ条件下でＩＣ５０が８．９３μＭであるトランスグルタミナーゼ２（ＴＧａｓｅ２）阻害剤であり、ＵＰＧＬ００００４は、ＧＬＳ２に勝るＧＡＣに対する高い選択性を示す、ＩＣ５０が２９ｎＭである強力なグルタミナーゼＣ（ＧＡＣ）であり、ビス－２－（５－フェニルアセタミド－１、２、４－チアジアゾール－２－イル）エチルスルフィド３（ＢＰＴＥＳ）は、ＩＣ５０が０．１６μＭである強力かつ選択的グルタミナーゼＧＬＳ１阻害剤であり、テラグレナスタット（ＣＢ－８３９）は、組換えヒトＧＡＣに対するＩＣ５０が２４ｎＭである強力で選択的かつ経口的に生物学的に利用可能なグルタミナーゼ阻害剤であり、ＪＨＵ３９５は、血漿中で不活性に循環するが、浸透して標的組織内で活性ＧＡを放出するように設計された経口的に生物学的に利用可能なＧＡ（グルタミン拮抗剤）プロドラッグであり、ＪＨＵ－０８３（エチル２－（２－アミノ－４－メチルペンタンアミド）－ＤＯＮ）は、ＤＯＮの新規プロドラッグであり、グルタミナーゼ活性を選択的に遮断し、ＩＰＮ－６００９０二塩酸塩（ＩＡＣＳ－６２７４としても知られる）は、ＧＬＳ－２に対して活性が観察されない、グルタミナーゼ１の経口活性及び高選択的阻害剤（ＧＬＳ１；ＩＣ５０＝３１ｎＭ）である。

【0063】

ＧＬＳ１生物学的アッセイ：候補剤ＧＬＳ１阻害剤の阻害可能性を試験するために使用される例示的なアッセイは、以下のとおりである。グルタミン酸オキシダーゼ／ＡｍｐｌｅｘＲｅｄ（登録商標）結合アッセイを使用して、ＧＬＳ１阻害剤化合物がインビトロで、精製された組換え６Ｈｉｓタグ化ＧＬＳ１に結合し、その活性を阻害する能力を測定することができる。結合反応は、試薬６－（２－ブロモエチニル）－２，３－ジメチル－キナゾリン－４－オン、Ａｍｐｌｅｘ Ｒｅｄ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、及びグルタミン酸オキシダーゼをＴＲＩＳ緩衝液中に添加することによって停止させることができる。反応は、５３５／５９０ｎｍ光学フィルタを使用してＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ＥｎＶｉｓｉｏｎ（登録商標）で読み取ることができ、生データは、Ｇｅｎｅｄａｔａ（登録商標）を使用して分析してＩＣ５０値を生成することができる。使用することができる別のアッセイは、ＡｍｐｌｅｘＲｅｄを使用して細胞グルタミン酸枯渇を測定するＰＣ３細胞結合アッセイである。ＰＣ３細胞は、候補剤阻害剤を含有するマルチウェルプレートに播種することができる。インキュベーション後、プレートは、５３５／５９０ｎｍの光学フィルタを使用してＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ＥｎＶｉｓｉｏｎ（登録商標）で読み取り、独自のソフトウェアを使用して生データを分析してＩＣ５０値を生成することができる。

【0064】

妊娠関連血漿タンパク質－Ａ（ＰＡＰＰ－Ａ）又はパパリシン－１経路：亜鉛メタロプロテイナーゼであるＰＡＰＰ－Ａは、表面グリコアミノグリカン（ＧＡＧ）に結合し、ＩＧＦＢＰ－２、－４、及び－５を切断して、局所シグナル伝達のためにＩＧＦ１又はＩＧＦ２を放出する。妊娠血清中のＰＡＰＰ－Ａは、好酸球主要塩基性タンパク質（ｐｒｏＭＢＰ）のプロフォームにジスルフィド結合を介して連結され、ＰＡＰＰ－Ａ／ｐｒｏＭＢＰと表される約５００ｋＤａの２：２の複合体を形成する。ＰＡＰＰ－Ａの血清形態は、推定２２残基シグナルペプチド、５８残基のｐｒｏ－ｐａｒｔ、及び１５４７残基循環成熟ポリペプチドを含有するプレプロタンパク質に由来する。アミノ酸配列は、任意の既知のタンパク質との全体的な類似性を示さないが、メチンシンに共通する２つの配列モチーフ、メタロプロテアーゼのスーパーファミリー、ノッチタンパク質スーパーファミリーから知られている３つのＬｉｎ－１２／Ｎｏｔｃｈ反復、及び補体系の構成要素から知られている５つの短いコンセンサス反復を含有する。ＰＡＰＰ－Ａのトランスジェクノックアウトは、おそらく循環ＩＧＦ－Ｉレベルを低下させることによって、マウスの寿命延長をもたらし得る（Ｈｏｔｚｅｎｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（２００２）Ｄｅｃ４及びＣｏｎｏｖｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１３１（５）：１１８７－１１９４（２００４）を参照されたい）。

【0065】

例示的ＰＡＰＰ－Ａ阻害剤：当該技術分野で現在知られている、又は開発される任意のＰＡＰＰ－Ａ阻害剤が、本発明に従って開示される網膜血管症の治療のために試験及び開発され得る。特に、本発明の方法で利用され得るＰＡＰＰ－Ａ阻害剤としては、例えば、限定されないが、ＰＡＰＰ－Ａに特異的に結合する抗体が挙げられる。これらには、例えば、ＷＯ２０２０／１９８１６６、米国特許第８，６５３，０２０号、Ｍｉｋｋｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ５，１０１４－１０２５（２０１４）、Ｍｉｋｋｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８３，１６７７２－１６７８０（２００８）、及びＭｏｈｒｉｎ ｅｔ ａｌ．，ｂｉｏＲｘｉｖ，ｄｏｉ：ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１０１／２０２０．０２．０５．９３６３１０（このバージョンは、２０２０年２月６日に掲載された）において開示されるように、ＰＡＣ－１ｓｃＦＶ、ＰＡＣ－１－Ｄ８ｓｃＦｖ、ＰＡＣ－２ｓｃＦｖ、ＰＡＣ－５ｓｃＦｖが含まれ得、これらは全て、参照によりそれらの全体の各々が本明細書に全て組み込まれる。本発明の方法で利用され得る他のＰＡＰＰ－Ａ阻害剤としては、例えば、限定されないが、ＰＡＰＰ－Ａの機能を阻害することができるポリペプチドが挙げられる。これらには、例えば、プロ－ＭＢＰ、スタニオカルシン－１（ＳＴＣ１）、又はスタニオカルシン－２（ＳＴＣ２）が含まれ得る。本発明の方法で利用され得る更に他のＰＡＰＰ－Ａ阻害剤としては、例えば、限定されないが、５’－ＧＣＣＣＡＡＣＴＣＣＴＧＣＴＧＧＡＡ－３’（ＡＳ－ＰＡＰＰ－Ａ）のアンチセンス配列からなるヒトＰＡＰＰ－Ａ ｍＲＮＡに対応する１８塩基ホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドなどのＰＡＰＰ－Ａを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドが挙げられる（Ｔａｎａｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ Ｊａｎ ２００４を参照されたい）。本発明の方法で利用され得る更に他のＰＡＰＰ－Ａ阻害剤としては、限定されないが、クニッツ型プロテアーゼ阻害剤ビクニンが挙げられる。

【0066】

ＰＡＰＰ－Ａ生物学的アッセイ：候補剤ＰＡＰＰ－Ａ阻害剤の阻害可能性を試験するために使用される例示的なアッセイは、以下のとおりである。ＩＧＦＢＰ－４タンパク質がＩＧＦ１と混合され、３７℃で３０分間インキュベートされる細胞ｐＡＫＴアッセイを用いることができる。ＰＡＰＰ－Ａタンパク質をＩＧＦＢＰ－４／ＩＧＦ１混合物に添加し、３７℃で４～５時間インキュベートする。ＨＥＫ２９３細胞を血清なしでＥＭＥＭ培地中に入れ、一晩接着させることができる。ＩＧＦ１／ＩＧＦＢＰ－４／ＰＡＰＰ－Ａ混合物を、最終希釈１：３０で細胞に添加し、３７℃で２０分間インキュベートする。細胞をＭＳＤトリス溶解緩衝液中に溶解し、製造業者のプロトコルに従って、Ｐｈｏｓｐｈｏ（Ｓｅｒ４７３）／Ｔｏｔａｌ Ａｋｔ Ｗｈｏｌｅ Ｃｅｌｌ Ｌｙｓａｔｅキット（ＭＳＤ、Ｋ１５１００Ｄ）によって分析する。抗ＰＡＰＰ Ａ抗体の中和効力を評価するために、ＩＧＦ１／ＩＧＦＢＰ－４混合物に添加する前に、ＰＡＰＰ－Ａタンパク質を様々な濃度の抗ＰＡＰＰ－Ａ抗体とプレインキュベートすることができる。

【0067】

使用され得る別のＰＡＰＰ－Ａ生物学的アッセイは、ＩＧＦ結合タンパク質のインビトロＰＡＰＰ－Ａ酵素切断である。アッセイ等において、Ｃ末端Ｃ－ｍｙｃ及びＦｌａｇタグを有するヒト及びマウスＰＡＰＰ－Ａタンパク質は、安定的に形質導入されたＨＥＫ２９３細胞株によって発現され、ヘパリンカラムクロマトグラフィーによって精製される。ヒト及びマウスＩＧＦＢＰ－２、ＩＧＦＢＰ－４及びＩＧＦＢＰ－５タンパク質は、Ｎ末端（ヒトタンパク質について）又はＣ末端（マウスタンパク質について）６Ｈｉｓタグを有するＨＥＫ２９３細胞における一過性発現によって組換え的に産生され、Ｎｉ－セファロースカラムクロマトグラフィーによって精製される。酵素切断反応のために、ＩＧＦＢＰ－２及びＩＧＦＢＰ－４タンパク質を、適切な種（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ヒト用２９１－Ｇ１－２００及びマウス用７９１－ＭＧ－０５０）のＩＧＦ１と３０分間３７℃で予備インキュベートする。次いで、ＩＧＦＢＰ２／ＩＧＦ１、ＩＧＦＢＰ－４／ＩＧＦ１又はＩＧＦＢＰ－５タンパク質を様々な濃度のＰＡＰＰ－Ａと混合し、３７℃で２～４時間インキュベートする。切断反応における最終濃度は、ＩＧＦＢＰでは９０ｎＭ、ＩＧＦ１では８５０ｎＭであり得る。次いで、タンパク質を、キャピラリカートリッジキット（ＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅ、カタログ番号ＳＭ－Ｗ００２－１）を使用してＷｅｓ機器（ＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅ）でキャピラリ電気泳動により溶解し、ＴＨＥ ＨｉｓＴａｇ抗体（ＧｅｎｅＳｃｒｉｐｔ、カタログ番号Ａ００１８６）でプローブし、抗マウス検出モジュール（ＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅ、カタログ番号ＤＭ－００２）で可視化する。抗ＰＡＰＰ Ａ抗体の中和効力を評価するために、ＩＧＦ１／ＩＧＦＢＰ－４混合物に添加する前に、ＰＡＰＰ－Ａタンパク質を様々な濃度の抗ＰＡＰＰ－Ａ抗体とプレインキュベートすることができる。これらのアッセイにおけるＰＡＰＰ－Ａ濃度は、ＩＧＦＢＰ－４については０．４ｎＭ、ＩＧＦＢＰ－２については３．５ｎＭ、及びＩＧＦＢＰ－５切断については０．０８ｎＭに固定することができる。

【0068】

ｃＧＡＳ－ＳＴＩＮＧ経路：微生物核酸の認識は、免疫系が病原体を検出する主要なメカニズムである。環状ＧＭＰ－ＡＭＰ（ｃＧＡＭＰ）合成酵素（ｃＧＡＳ）は、インターフェロン遺伝子又はＳＴＩＮＧのアダプター刺激因子を活性化する第２のメッセンジャーｃＧＡＭＰの産生によって先天性免疫応答を活性化する細胞質ＤＮＡセンサーである。次いで、ＳＴＩＮＧは、ＴＡＮＫ結合キナーゼ１（ＴＢＫ１）及びＩκＢキナーゼを動員して、それぞれ、ＩＦＮ調節因子３（ＩＲＦ３）及びＮＦ－κＢを活性化し、Ｉ型インターフェロン及び炎症性サイトカインの産生をもたらし、これもまた、自己免疫及び炎症性疾患につながり得る。ｃＧＡＳはまた、細胞老化に関与することが報告されており、ｃＧａｓ－／－マウス由来のマウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）は、ＷＴマウス由来のＭＥＦと比較して、老化の徴候の低減を示し、より速い自発的不死化を生じた（Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ Ｊｕｎｅ ２０１７を参照されたい）。

【0069】

例示的ｃＧＡＳ阻害剤：当該技術分野で現在知られている、又は開発される任意のｃＧＡＳ阻害剤が、本発明に従って開示される網膜血管症の治療のために試験及び開発され得る。特に、本発明の方法で利用され得るｃＧＡＳ阻害剤としては、例えば、限定されないが、３－（１－（６，７－ジクロロ－１Ｈ－ベンゾ［ｄ］イミダゾール－２－イル）－５－ヒドロキシ－３－メチル－１Ｈ－ピラゾール－４－イル）イソベンゾフラン－１（３Ｈ）－オンであるＲＵ．５２１（Ｖｉｎｃｅｎｔ Ｊ．ｅｔ ａｌ．，２０１７．Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ．２８（１）：７５０を参照されたい）、又は１－（６，７－ジクロロ－９－（１－メチル－１Ｈ－ピラゾール－３－イル）－１，３，４，５－テトラヒドロ－２Ｈ－ピリド［４，３－ｂ］インドール－２－イル）－２ヒドロキシエタン－１－オンであるＧ１４０、若しくは１－［９－（６－アミノ－３－ピリジニル）－６，７－ジクロロ－１，３，４，５－テトラヒドロ－２Ｈ－ピリド［４，３ｂ］インドール－２－イル］－２－ヒドロキシ－エタノンであるＧ１５０（Ｇ１４０及びＧ１５０の両方について、Ｌ．ｅｔ ａｌ．２０１９．Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ．１０，２２６１を参照されたい）、又は（１Ｒ，２Ｓ）－２－（７－オキソ－５－フェニル－４，７－ジヒドロピラゾロ［１，５－ａ］ピリミジン－３カルボキサミド）シクロヘキサン－１－カルボン酸であるＰＦ－０６９２８２１５（Ｈａｌｌ ｅｔ ａｌ．，ＰＬＯＳ ＯＮＥ ２０１７，１２，ｅ０１８４８４３を参照されたい）が挙げられる。

【0070】

例示的ＳＴＩＮＧ阻害剤：当該技術分野で現在知られている、又は開発される任意のＳＴＩＮＧ阻害剤が、本発明に従って開示される網膜血管症の治療のために試験及び開発され得る。特に、本発明の方法で利用され得るＳＴＩＮＧ阻害剤としては、例えば、限定されないが、ＣＡＳ Ｎｏ．９４１９８７－６０－６であるＨ－１５１、又はＣＡＳ Ｎｏ．３２９１９８－８７－０であるＣ－１７８、又はＣＡＳ Ｎｏ．３１４０５４－００－７であるＣ－１７６（Ｈ－１５１、Ｃ－１７８、及びＣ－１７６について、Ｈａａｇ Ｓ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，２０１８．Ｎａｔｕｒｅ ５５９：２６９－７３を参照されたい）が挙げられる。他のＳＴＩＮＧアンタゴニストは、化合物１８又はＣ１８である（Ｓｉｕ，ｅｔ ａｌ．ＡＣＳ Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，１０（１）（２０１９），ｐｐ．９２－９７を参照されたい）。

【0071】

ｃＧＡＳ又はＳＴＩＮＧ生物学的アッセイ：ＣＧＡＳ及び／又はＳＴＩＮＧの候補剤の阻害可能性を試験するために使用される例示的なアッセイは、以下のとおりである。ｃＧＡＳ阻害剤は、ＡＴＰ、ＧＴＰ、二本鎖ＤＮＡ、及びＣＧＡＳとの反応によって、質量分析アッセイを使用してｃＧＡＳ活性について測定することができる。他のｃＧＡＳ活性アッセイとしては、候補ｃＧＡＳ阻害剤がＡＴＰ若しくはＧＴＰ、又は二本鎖ＤＮＡ及びｃＧＡＳと反応するＣｙ５－ｃＧＡＭＰ蛍光分極アッセイが挙げられる。Ｃｙ５標識ｃＧＡＭＰ及びｃＧＡＭＰ抗体を添加し、反応をＥｎｖｉｓｉｏｎプレートリーダーで６２０ｎｍで読み取り、Ｋｉを決定する（Ｈａｌｌ ｅｔ ａｌ．，ＰＬＯＳ ＯＮＥ ２０１７，１２，ｅ０１８４８４３を参照されたい）。利用され得る他のアッセイは、候補ｃＧＡＳ阻害剤がヒトｓＡＣｔタンパク質とインキュベートされ、次いでＡＴＰが添加される、可溶性アデニリルシクラーゼ（ｓＡＣ）阻害アッセイである。ｃＡＭＰの形成及びＡＴＰの消費を、ＲＦ－ＭＳを使用する標準と比較し、ＩＣ５０を計算する。

【0072】

ｍＴＯＲ経路：ラパマイシン（ｍＴＯＲ）のメカニズム的標的は、栄養素、成長因子、細胞エネルギー、及びストレスに応答して細胞の成長及び代謝を制御する、高度に保存されたセリン／トレオニンキナーゼである。

【0073】

例示的ｍＴＯＲ阻害剤：当該技術分野で現在知られている、又は開発される任意のｍＴＯＲ阻害剤が、本発明に従って開示される網膜血管症の治療のために試験及び開発され得る。特に、本発明の方法で利用され得るＳＴＩＮＧ阻害剤としては、例えば、限定されないが、ラパマイシン、Ｐａｌｏｍｉｄ５２９、シロリムス、エベロリムス、テムシロリムス、リダフォロリムス、ウミロリムス、ゾタロリムス、及びＡＴＰ競合ｍＴＯＲキナーゼ阻害剤が挙げられる。

【0074】

一般制御非抑制２（ＧＣＮ２）経路：細胞が育つためには、周囲を感知して適応することができる必要がある。低栄養環境に適応するための鍵は、統合ストレス応答（ＩＳＲ）であり、これは、細胞が細胞の恒常性を回復するか、又はストレスの期間中にアポトーシスを促進することを可能にする経路である。ＩＳＲの中心は、セリン／スレオニンプロテインキナーゼＧＣＮ２であり、これは、飢餓を感知することに関与する。アミノ酸が欠乏するとＧＣＮ２は活性化されて、翻訳開始因子ｅＩＦ２αをリン酸化し、タンパク質翻訳を停止させ、転写因子ＡＴＦ４を活性化することによってＩＳＲを開始し、転写因子ＡＴＦ４は次いで、自己貪食及び生合成経路を上方制御する。

【0075】

例示的ＧＣＮ２活性化因子：当該技術分野で現在知られている、又は開発される任意のＧＣＮ２活性化因子が、本発明に従って開示される網膜血管症の治療のために試験及び開発され得る。特に、本発明の方法で利用され得るＧＣＮ２のアゴニストとしては、限定されないが、例えば、４－（２－アミノ－４－メチル－３－（２－メチルキノリン－６－イル）ベンゾイル）－１－メチル－２，５－ジフェニル－１Ｈ－ピラゾール－３（２Ｈ）－オン塩酸塩又は化合物４４、１－（５－（４－アミノ－２，７－ジメチル－７Ｈ－ピロロ［２，３－ｄ］ピリミジン－５－イル）インドリン－１－イル）－２－（３－フルオロ－５－（トリフルオロメチル）フェニル）－エタノン又は化合物５２、４－（２－アミノ－４－メチル－３－（２－（メチルアミノ）ベンゾ［ｄ］チアゾール－６－イル）ベンゾイル）－１－メチル－２，５－ジフェニル－１Ｈ－ピラゾール－３（２Ｈ）－オン又は化合物３９（化合物３９、４４及び５２に関してＳｍｉｔｈ，Ａｄｒｉａｎ Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ ｏｆ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ．２０１５ Ｆｅｂ １２：５８（３）：１４２６－４１を参照されたい）、ロイセノール、ヒスチジノール、スレオニノール、ＳＢ－２０３２０７、ＳＢ－２１９３８３（Ｃａｖｅｎｅｒ，Ｄ．，ｅｔ ａｌ．，ＷＯ２００８／０８５９２１を参照されたい）、ドビチニブ、ネラチニブ、スニチニブ、及びエロチニブが挙げられる。

【0076】

ＧＣＮ２生物学的アッセイ：ＧＣＮ２の候補剤の活性化可能性を試験するために使用される例示的なアッセイは、限定されないが、以下のとおりであってもよい。そのようなアッセイの１つは、ＧＣＮ２、ｅＩＦ２ａ及び候補ＧＣＮ２活性化剤を組み合わせた反応がＡＴＰの添加時に行われる、ｅＩＦ２ａリン酸化アッセイである。反応をクエンチし、次いで沸騰によって変性させ、次いでタンパク質ゲル上で泳動させ、ニトロセルロース又はＰＶＤＦ膜に移し、ブロックし、蛍光体－ｅＩＦ２ａに対する抗体と共にインキュベートし、次いで化学発光基質とのインキュベーション後に可視化する。候補ＧＣＮ２活性化剤を試験するために使用され得る細胞アッセイは、例えば、ホタルルシフェラーゼ（ＦＬｕｃ）に融合されたＡＴＦ４レポーターでトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞などの安定した細胞株を使用して、組換えレトロウイルスを産生することである。そのような細胞を播種し、次いで適切な量の候補ＧＣＮ２活性化因子で一定期間処理する。発光を測定し、ＥＣ５０として表す。

【0077】

網膜血管症のモニタリング及び診断方法：当該技術分野で既知の標準化された眼科検査技術には、例えば、瞼、眼付属器、まつ毛、角膜表面、前房、瞳孔、水晶体、硝子体空洞、並びに視神経及び黄斑を含む中心網膜解剖学的構造の評価を可能にする詳細なスリットランプ生体顕微鏡評価が含まれる。別の方法は、前房角度の詳細な検査を可能にする隅角鏡検査である。間接眼科検査は、硝子体及び末梢網膜障害のモニタリングにおいて重要な網膜周辺部の評価を可能にする。

【0078】

視力の機能試験は、当該技術分野で既知であり、例えば、最善の補正された視力、対比視力、及び低輝度の視力、色覚（石原試験及びファルンスワース・マンセル試験を含む）及び視野評価（ハンフリー自動周囲測定及び微小周囲測定を含む）、涙液産生（シルマー試験）、並びに眼内圧（ＩＯＰ）を測定するための眼圧測定が含まれる。これらは、例えば、前部及び後部セグメント写真、角膜厚さ測定、超音波、超音波生体顕微鏡検査、光学コヒーレンス断層撮影（ＯＣＴ）、光学コヒーレンス断層撮影血管撮影（ＯＣＴＡ）、蛍光血管撮影（ＦＡ）、静脈内蛍光血管撮影（ＩＶＦＡ）、及び眼底自己蛍光（ＦＡＦ）を含む構造試験と併せて使用される。コンピュータ断層撮影（ＣＴ）又は磁気共鳴画像（ＭＲＩ）スキャンなどの画像撮影は、眼、眼球周囲及び眼窩構造、並びに脳内の視神経、視覚経路及び視覚野の頭蓋内部分を評価するために利用される。これらの試験は、眼及び周囲の構造の層の構造的完全性及び厚さの視覚化、並びに血流及び循環の評価を可能にする。全視野及び多焦点網膜検査、視覚誘発電位及び微小周囲測定などの電気生理学的試験を含む、網膜、視神経及び視覚経路／皮質の高度な機能試験もまた、疾患の進行及び治療の影響を診断及びモニタリングするために使用される。当業者は、本明細書に記載される網膜血管症を診断、測定、及びモニタリングするために、当該技術分野で既知の適切な方法論を展開することができるであろう。

【0079】

患者：特許請求される本発明のいくつかの実施形態では、ＤＭＥに罹患している患者を治療するために使用される本発明の候補剤阻害剤又はアゴニストは、ＤＭＥだけでなく、糖尿病性網膜症（ＤＲ）に罹患している患者に投与される。他の実施形態では、ＤＭＥ患者は、ＤＭＥだけでなく、非増殖性ＤＲにも罹患している。他の実施形態では、ＤＭＥ患者はまた、増殖性ＤＲにも罹患している。本発明の他の実施形態では、患者は、加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）に罹患している。他の実施形態では、ＡＭＤに罹患している患者は、新生血管性ＡＭＤに罹患している。

【0080】

投与：硝子体内（ＩＶＴ）は、硝子体液ゲルと呼ばれるゼリー状の流体で満たされた硝子体腔と呼ばれる眼の後部の空間に薬物を直接配置する手順において、本明細書に記載され、特許請求される剤の１つの例示的な投与経路である。この手順は、通常、オフィス環境で、訓練を受けた網膜専門家によって実行される。本明細書に記載され、特許請求される剤の別の投与経路は、眼房内（ＩＣ）である。眼房内注射は、通常、眼球の前房への注射である。本明細書に記載され、特許請求される剤の他の投与経路は、静脈内、筋肉内、経口、非経口、局所、及び皮下であり得る。

【実施例】

【0081】

以下は、本発明の方法及び組成物の例である。上記の一般的な説明を考慮すると、様々な他の実施形態が実践され得ることが理解される。

【0082】

実施例１：老化網膜血管細胞又は上皮細胞又は内皮細胞における候補剤の試験
老化網膜血管内皮細胞又は老化網膜色素上皮細胞を除去する候補剤の能力は、以下のアッセイで直接測定することができる。ヒト網膜微小血管内皮細胞（ＨＲＭＥＣ）は、ＨＥＣ０９又はＣｅｌｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ ＡＣＢＲＩ１８１の名称でＮｅｕｒｏｍｉｃｓ（登録商標）から入手することができる。ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）は、ＣＣ－２５１９の名称でＬｏｎｚａ（登録商標）から入手することができる。細胞は、３％のＯ_２、１０％のＣＯ_２、及び約９５％の湿度で、ＥＮＤＯ－Ｇｒｏｗｔｈ（登録商標）培地（Ｎｅｕｒｏｍｉｃｓ（登録商標）、Ｅｄｉｎａ ＭＮ）中７５％未満のコンフルエンシーで維持及び増殖させることができる。ヒト網膜色素上皮細胞（ＲＰＥ）は、１９４９８７の名称でＬｏｎｚａ（登録商標）から得ることができる。ＲＰＥ細胞は、３％のＯ_２、１０％のＣＯ_２、及び約９５％の湿度の雰囲気中で、５％のＦＢＳ及びＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐを含む２００９年にＳｏｎｏｄａらによって定義されたＲＰＥ培地中７５％未満のコンフルエンシーで維持及び増殖させることができる。

【0083】

細胞は、照射細胞（使用前に照射後７日間培養）、増殖正常細胞（使用前に低密度で１日間培養）、及び静止細胞（４日間にわたってコンフルエンシーまで培養）の３つの群に分けることができる。

【0084】

０日目に、照射ＨＲＭＥＣ又はＲＰＥ又はＨＵＶＥＣ細胞を、細胞が集まりプレートから分離し始めるまで、ＴｒｙｐＬＥトリプシン含有試薬（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ（登録商標）Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、マサチューセッツ）とインキュベートすることができる。次いで、細胞を分散させ、カウントし、１ｍＬ当たり１００，０００個の細胞の濃度で培地中で調製することができる。この細胞懸濁液を、１ｍＬ当たり１００，０００個の細胞の密度でＴ１７５フラスコに配置し、１０～１５Ｇｙで照射することができる。照射後、細胞を９６ウェルプレート中で１００μＬで播種することができる。１日目、３日目、４日目、又は６日目に、各ウェル中の培地を吸引し、新鮮な培地と置き換えることができる。３日目に、静止した健康な非老化ＨＲＭＥＣ又はＲＰＥ細胞を、上述のように培養フラスコからトリプシン化することができ、細胞を分散させ、カウントし、１ｍＬ当たり８０，０００個の細胞の濃度で培地中で調製することができる。９６ウェルプレートの各ウェルに１００μＬの細胞を播種することができ、培地は１日目、３日目、６日目及び１０日目に交換することができる。

【0085】

１０日目に、候補剤を所望の濃度に適切に希釈し、次いで、培地から吸引した後、細胞と組み合わせることができる。候補剤は、細胞と共に、例えば、３～７日間などの適切日数の間培養することができる。アッセイシステムは、熱安定性ルシフェラーゼの特性を使用して、細胞溶解中に放出される内因性ＡＴＰａｓｅを同時に阻害しながら、安定した発光シグナルを生成する反応条件を可能にし得る。培養期間の終了時に、プレートをインキュベータから取り出し、室温で２０分間平衡化させ、次いで１００μＬのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ（登録商標）Ｃｏｒｐ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）を各ウェルに加えることができる。細胞プレートをオービタルシェーカー上に３０秒間置き、次いで室温で１０分間放置してから、例えば、ＥｎＶｉｓｉｏｎ（登録商標）プレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用して発光を測定することができる。発光読み取り値を正規化して、％細胞生存／成長を決定し、候補剤濃度及び対照に対してプロットすることができ、効力（ＩＣ５０値）をＧｒａｐｈｐａｄ（登録商標）Ｐｒｉｓｍで非線形曲線フィッティングによって決定することができる。

【0086】

この実験は、ＧＰＸ４阻害剤であるＲＳＬ３（（１Ｓ，３Ｒ）－メチル２－（２－クロロアセチル）－１－（４－（メトキシカルボニル）フェニル）－２，３，４，９－テトラヒドロ－１Ｈ－ピリド［３，４－ｂ］インドール－３－カルボキシレート；ＣＡＳ Ｎｏ．１２１９８１０－１６－８）を試験して行ったが、これは、ＤＭＳＯの１～３希釈シリーズで２００倍で調製し、次いで培地中で最終濃度の１．５倍に希釈し、照射された老化ＨＲＭＥＣ細胞及び対照としての非老化ＨＲＭＥＣ細胞に適用し、図３Ａを参照されたい。データは、ＲＳＬ３が、非老化ＨＲＭＥＣと比較して、老化ＨＲＭＥＣ細胞に対して選択的にセノリティックであることを示している。同様に、ＲＳＬ３は、照射された老化ＨＵＶＥＣ細胞及び対照としての非老化ＨＵＶＥＣ細胞に適用され、図３Ｂを参照されたい。データは、ＲＳＬ３が、非老化ＨＵＶＥＣと比較して、老化ＨＵＶＥＣ細胞に対して選択的にセノリティックであることを示している。

【0087】

この実験はまた、異なるＧＰＸ４阻害剤であるＪＫＥ－１６７４（（Ｅ）－１－（４－（ビス（４－クロロフェニル）メチル）ピペラジン－１－イル）－２－（ヒドロキシイミノ）－３－ニトロプロパン－１－オン；ＣＡＳ Ｎｏ．２４２１１１９－６０－８）を試験して行ったが、これは、ＤＭＳＯ中の１～３希釈シリーズで２００倍で調製し、次いで培地中で最終濃度の１．５倍に希釈し、照射された老化ＨＵＶＥＣ細胞及び対象としての非老化ＨＵＶＥＣ細胞に適用し、図４を参照されたい。データは、ＪＫＥ－１６７４が、非老化ＨＵＶＥＣと比較して、老化ＨＵＶＥＣ細胞に対して選択的にセノリティックであることを示している。

【0088】

この実験はまた、更に別のＧＰＸ４阻害剤であるＭＬ２１０（Ｅａｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，ＢｉｏＲｘｉｖ，Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ ５，２０１８を参照されたい；ＣＡＳ Ｎｏ．１３６０７０５－９６－９）を試験して行ったが、これはＤＭＳＯ中の１～３希釈シリーズで２００倍で調製し、次いで培地中で最終濃度の１．５倍に希釈し、照射された老化ＨＲＭＥＣ細胞及び対照としての非老化ＨＲＭＥＣ細胞に適用し、図５を参照されたい。データは、ＭＬ２１０が、非老化ＨＲＭＥＣと比較して、老化ＨＲＭＥＣ細胞に対して選択的にセノリティックであることを示している。

【0089】

同様の実験を、２つの他の候補ＧＰＸ４阻害剤である化合物＃１９（ＵＳ２０１９／０２６３８０２に記載の化合物２８を参照されたい）及び＃２５（ＵＳ２０１９／０２６３８０２に記載の化合物１５６を参照されたい）を試験して行ったが、これは、ＤＭＳＯ中の１～３希釈シリーズで２００倍で調製し、次いで培地中で最終濃度の１．５倍に希釈し、照射された老化ＨＵＶＥＣ細胞及び対照としての非老化ＨＵＶＥＣ細胞に適用し、図６Ａ及び図６Ｂを参照されたい。データは、化合物＃１９（図６Ａ）及び＃２５（図６Ｂ）の両方が、非老化ＨＵＶＥＣと比較して、老化ＨＵＶＥＣ細胞に対して選択的にセノリティックであることを示している。

【0090】

実施例２：ＡＭＤ、ＤＲ／ＤＭＥ及びＰＤＲ組織における老化細胞の証拠
罹患した患者からのＡＭＤ、ＤＲ／ＤＭＥ、及びＰＤＲ組織試料における老化細胞の存在の証拠を得るために、ｐ１６について染色した。

【0091】

ヒトの死後全ドナー眼球は、様々な眼組織バンクからプロスペクティブに調達された。患者の診断は、患者の履歴を使用して確認した。摘出後、眼球を直ちにデビッドソンの試薬に入れ、少なくとも４８時間固定した。固定後、溶液を７０％エタノールと交換した。次いで、組織を組織学的カセットに入れし、パラフィン浸潤及び包埋のために処理した。パラフィンブロックをミクロトーム上に取り付け、５～９μｍの厚さに切片化した。４ｍｍの矢状切片で切断した組織切片を４５℃の水浴に入れ、Ｓｕｐｅｒｆｒｏｓｔ（登録商標）Ｐｌｕｓ顕微鏡スライドを使用して切片を拾い、Ｋｉｍｗｉｐｅ（登録商標）で余分な水分を除去した。次いで、スライドを直立させて室温で３０分間乾燥させ、続いて３７℃のインキュベータで一晩インキュベートした。スライドを６０℃で１５～２０分間焼成し、次いで室温まで冷却した。スライドを、キシレン又はキシレン代替物（例えば、Ｈｉｓｔｏｃｌｅａｒ（登録商標））を使用して４分間脱ろうし、合計３回インキュベーションを繰り返した。次いで、スライドを、次のように、低減濃度のエタノール中で連続的にインキュベーションすることにより再水和させた。１００％エタノール中で各５分間を２回、９０％エタノール中で各２分間を２回、７５％エタノール中で各２分間を２回、５０％エタノール中で各２分間を２回、次いで水で４分間洗浄した。

【0092】

抗原回収は、スチーマー又は圧力加熱器を使用して、酸性クエン酸ナトリウム緩衝液中で１２０℃で３分間（又は９５℃で２０分間）インキュベートすることによって行った。スライドを室温まで１５分間冷却し、その後、０．１％のＴｒｉｔｏｎ－Ｘ１００（ＴＢＳＴ）を補充したＴｒｉｓ緩衝生理食塩水で２回、各々２分間洗浄した。スライドをＴＢＳＴで各々５分間再度２回洗浄した後、使用する二次抗体の起源の種からの５％の正常血清を含有するＴＢＳＴ中で室温で１時間ブロックした。ブロック後、スライドを、ＴＢＳＴ中で１：２に希釈したｐ１６一次マウス抗ヒトｐ１６^{ＩＮＫ４ａ}抗体（ＣＩＮｔｅｃクローンＥ６Ｈ４、Ｒｏｃｈｅ、カタログ番号７０５－４７９３）と共に、４℃で一晩（又は室温で２時間）インキュベートした。Ｐ１６を、Ｒｏｃｈｅ Ｖｅｎｔａｎａ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｐｌａｔｆｏｒｍ上でジエチルアミノクマリンＤＣＣ蛍光染色アッセイを使用して視覚化した。Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏｓｃａｎ（登録商標）顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ（登録商標）、Ｏｂｅｒｋｏｃｈｅｎ、ドイツ）を使用したフルスライド走査後、ｐ１６ＩＮＫ４ａ陽性細胞の数をＶｉｓｉｏｐｈａｒｍ画像解析ソフトウェア（Ｖｉｓｉｏｐｈａｒｍ（登録商標）、Ｈｏｅｒｓｈｏｌｍ、デンマーク）を使用して定量し、全細胞を全ＤＡＰＩ染色核から定量化した。ここで、正常に対するｐ＜０．０００１は、Ｄｕｎｎの多重比較試験を用いたＫｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓによる。

【0093】

図１及び２は、ｐ１６^{ＩＮＫ４ａ}陽性細胞の定量化を示し、対照網膜と比較した場合の、ＡＭＤ、ＤＲ／ＤＭＥ及びＰＤＲの患者の網膜における増加を示す。

【0094】

実施例３：ブレオマイシン誘発性緑内障モデルにおける候補剤の有効性
この実施例は、原発性開放隅角緑内障（ＰＯＡＧ）のマウスモデルにおける本発明の候補剤の試験を示す。８～１０週齢の雄Ｃ５７Ｂｌ６／Ｊマウスを、イソフルオランチャンバ内で３分間鎮静化し、次いでノーズコーン内の手術台上に配置して、一定のイソフルオラン麻酔を維持することができる。２．５％フェニレフリン－トロピカミドの１滴を、拡張のために眼に滴下する。ベースライン眼内圧（ＩＯＰ）の測定は、手術前にＴｏｎｏｌａｂ（商標）を使用して両眼で行うことができる。ＩＯＰ値は、６つの測定値の平均として報告される。緑内障様表現型を誘導するために、２μＬのブレオマイシン（０．２５Ｕ／ｋｇ）又はＰＢＳ（対照）を右眼に眼房内注射することができる。

【0095】

ＩＯＰ測定は、損傷後７日目（治療前）、１４日目、及び２１日目に行うことができる。治療は、ブレオマイシン傷害の７日後に行うことができる。マウスをイソフルオランチャンバ内で３分間鎮静化し、次いでノーズコーン内の手術台上に配置して、一定のイソフルオラン麻酔を維持することができる。２．５％フェニレフリン－トロピカミドの１滴を、拡張のために眼に滴下することができる。組み合わせた、又はビヒクル中の好適な濃度の候補剤のマイクロリットル体積を、片目に眼房内注射することができる。

【0096】

眼試料は、ブレオマイシン傷害の１４日後及び２１日後に採取することができる。小柱網を収集し、液体窒素中で迅速に凍結することができる。試料の保存は、ＲＮＡ抽出まで－８０℃であってもよい。ＲＮＡ抽出は、クロロホルム抽出、続いてＤｉｒｅｃｔ－Ｚｏｌ Ｍｉｃｒｏｐｒｅｐ（商標）ＲＮＡ抽出キット（ＶＷＲ（登録商標））を使用して実行することができる。Ｈｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（商標）キット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ（登録商標））を使用して、５００ナノグラムのＲＮＡを用いてｃＤＮＡを調製することができる。ｃＤＮＡの１０分の１は、ＰｅｒｆｅＣＴａ ｑＰＣＲ ＴｏｕｇｈＭｉｘ Ｌｏｗ Ｒｏｘ（商標）及びＴａｑｍａｎ（商標）プライマー／プローブ（ＱｕａｎｔａＢｉｏ（商標））を使用してＲＮＡ発現測定のレベルに使用することができる。

【0097】

実施例４：糖尿病誘発性網膜症モデルにおける候補剤の有効性
ストレプトゾトシン（ＳＴＺ）げっ歯類モデル（Ｆｅｉｔ－Ｌｅｉｃｈｍａｎ ｅｔ ａｌ，ＩＯＶＳ４６：４２８１－８７，２００５）は、膵臓β細胞に対するＳＴＺの直接細胞毒性作用を介した高血糖の誘導を通じて、糖尿病性網膜症及び糖尿病性黄斑浮腫の特徴を再現する。高血糖症は、ＳＴＺ投与後数日以内に生じ、糖尿病性網膜症の表現型態様は、数週間以内に生じ、血管漏出、及びこれらのげっ歯類において示される視力及びコントラスト感度の低下を伴う。したがって、このモデルは、糖尿病性眼疾患における治療薬の評価に広く使用されている。

【0098】

６～７週のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの重量を測定し、それらのベースライン血糖を測定する（Ａｃｃｕ－Ｃｈｅｋ（登録商標）、Ｒｏｃｈｅ）。マウスに、ＳＴＺ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｅｒｉｃｈ（登録商標）、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を５日間連続して、５５ｍｇ／Ｋｇで腹腔内注射することができる。週齢が一致した対照には、緩衝剤のみを注射することができる。最後のＳＴＺ注射の１週間後に再度血糖を測定することができ、非絶食性血糖が１７ｍＭ（３００ｍｇ／ｄＬ）よりも高い場合、マウスは糖尿病であるとみなされる。ＳＴＺで処理された糖尿病Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに、ＳＴＺ投与の８及び９週間後に、候補剤のマイクロリットル体積を硝子体内注射することができる。網膜血管透過性は、以下のように、ＳＴＺ処理１０週後にエバンスブルー透過アッセイによって測定することができる。

【0099】

マウスを麻酔し、生理食塩水に溶解したエバンスブルー色素を尾静脈注射する。尾静脈注射の２時間後、マウスをケタミン及びキシラジンで麻酔し、生理食塩水を使用して左心室を通して灌流させることができる。灌流後、網膜を解剖し、重量を測定し、７０℃で１８時間ホルムアミド中に入れ、エバンス青色染料を抽出する。翌日、網膜を４５分間遠心分離し、ホルムアミドから取り出す。エバンスブルーの血管外漏出を、Ａ６２０でプレートリーダーを使用して測定する。標準曲線を使用して、ｎｇエバンス青色／湿潤組織重量の単位に換算する。

【0100】

実施例５：レーザー誘導脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）マウスモデルにおける候補剤の有効性
レーザー誘発性ＣＮＶモデルは、Ｂｒｕｃｈの膜の破裂を伴い、炎症性／創傷治癒応答及びそれに伴うＣＮＶをもたらし、それによって湿潤ＡＭＤ又は新生血管ＡＭＤを模倣する。脈絡膜毛細血管は、新生血管応答に明示的に関与しており、このモデルは、湿潤又は新生血管ＡＭＤと同様の血管造影外観を生成する。

【0101】

雄のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（６～８週間）を、レーザー処置の前にケタミン／キシラジンカクテルで麻酔することができる。ＣＮＶ病変は、ダイオードレーザー（ＩＲＩＤＥＸ（登録商標）、Ｏｃｕｌｉｇｈｔ（登録商標）ＧＬ）及びスリットランプ（Ｚｅｉｓｓ（登録商標））を使用したレーザー光凝固によって誘導され、スポットサイズは５０ｕｍ、電力は１８０ｍＷ、曝露時間は１００ミリ秒である。典型的には、４つのレーザー熱傷が、各眼の視神経盤の周りの３、６、９、及び１２時の位置で誘導される。候補剤及び適切な対照を、レーザー誘導の１日前に腹腔内に注射し、３日ごとに合計３回注射することができる。レーザー誘導の９日後、マウスに、尾静脈を介してＦＩＴＣ－レクチン又はＴＲＩＴＣ－デキストランを灌流させることができる。灌流の後、眼を摘出し、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で１５分間固定する。

【0102】

脈絡膜－強膜複合体及び網膜を分離することができ、抗ＣＤ３１免疫蛍光（ＩＦ）を行って、網膜及び脈絡膜組織の両方の全マウント染色によって血管系を証明することができる。ＣＤ３１ＩＦについて、ラット抗マウス抗体ＢＤ５５０２７４を１：１００で希釈し、４℃で一晩インキュベートした。二次抗ラット抗体（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（登録商標）、Ａ１１００６）との４時間のインキュベーション後、全マウントを４８８ｎｍで画像化することができる。病変部における血管新生及び網膜における血管密度の定量化は、米国国立衛生研究所によって開発されたオープンソースソフトウェアであるＩｍａｇｅＪによって実施することができる。ｐ値は、スチューデントｔ検定によって評価することができる（有意な変化、ｐ＜０．０５）。

【0103】

実施例６：酸素誘導性網膜症（ＯＩＲ）マウスモデルにおける候補剤の有効性
ＯＩＲモデルは、マウスの子の網膜血管系がまだ発達している段階での高酸素への曝露に基づいている。これは、毛細血管枯渇をもたらし、室内空気に戻ると、網膜虚血及び網膜血管系における増殖性血管疾患又は酸素誘発性網膜症をもたらす。

【0104】

Ｃ５７ＢＬ／６Ｊの子を、出生後７日目（Ｐ７）に高酸素チャンバ（７５％Ｏ２）内に５日間収容し（ケージごとにｎ＝１０）、網膜の中心部の血管退縮をもたらす。ＣＤ－１養育母体を、チャンバに入る前及び入ってから２～３日後に回転させる。Ｐ１２において、子を室内空気に戻し、そこでは相対的な低酸素により異常な血管新生が誘発され、次いで、適切な量の対照及び候補剤を腹腔内投与する。Ｐ１７において、ナイーブＯＩＲマウスを含む全ての群を安楽死させることができる。眼を摘出し、４％パラホルムアルデヒドに１時間固定する。

【0105】

網膜を解剖し、Ｂａｎｄｅｉｒａｅａ ｓｉｍｐｌｉｃｉｆｏｌｉａ（Ｇｒｉｆｆｏｎｉａ ｓｉｍｐｌｉｃｉｆｏｌｉａ）からのローダミン標識レクチン（１：１００）と共に、ＰＢＳ中の１ｍＭ ＣａＣｌ_２中で一晩インキュベートして、血管消失（ＶＯ）領域又は血管新生（ＮＶ）領域を可視化する。染色された網膜を、スライド上に平らに取り付け、Ｚｅｉｓｓ（登録商標）ＡｘｉｏＳｃａｎ上で画像化する。Ｖｉｓｉｏｐｈａｒｍ（登録商標）上で画像を分析して、全網膜の％ＶＯ又は％ＮＶを決定することができる。

【0106】

実施例７：ＧＰＸ４競合標的係合ゲルシフトアッセイ
ＧＰＸ４阻害剤のインビトロ細胞株又はインビボ組織標的係合（ＴＥ）のいずれかの検出のために、ゲルシフトアッセイを開発した。アッセイの概略図については、図７を参照されたい。

【0107】

インビトロ標識化プロトコル：２つの凍結マウス網膜を、セラミックビーズを有する０．５ｍＬのＰｒｅｃｅｌｌｙｓ（登録商標）チューブ、及び１×Ｒｏｃｈｅ ＥＤＴＡ不含プロテアーゼ阻害剤及び５ｍＭのＴＣＥＰを有する２００μＬの低温ｍＰＥＲに直接加えた。網膜組織を、４℃で４５００ＲＰＭで単一の１５ｓバーストを使用して均質化した。発泡体を除去するために、チューブを５ｋ×ｇで５分間、４℃で回転させた、次いで全ての液体を１．５ｍＬのＥｐｐｅｎｄｏｒｆｓ（登録商標）に移した。試料を２０ｋ×ｇで４℃で１０分間回転させ、清澄化した溶解物を正常なチューブに移した。２７．５μＬの各ビヒクル対照を１つのチューブに組み合わせて、標識標準試料を提供した。

【0108】

標識対照については、５０μＬの試料を１μＬの５ｍＭ ＲＳＬ３に添加し、別の５０μＬの試料を対照としてＤＭＳＯに添加した。試料を混合し、室温（ＲＴ）で１時間インキュベートした。この１μＬの５ｍＭ ＧＰＸ４ビオチンプローブを各試料に添加した後、次いで短時間ボルテックスし、室温で更に１時間２０分間インキュベートした。インキュベーション終了時に－２０℃のアセトン３００μＬを添加し、試料を－２０℃で保存した。他の全ての試料については、５０μＬの溶解物を１μＬの５ｍＭ ＧＰＸ４ビオチンプローブに添加し、混合した。反応を室温で２時間進めてから、上記のようにアセトン沈殿させた。

【0109】

試料を解凍し、４℃で２０，０００ｘｇで１０分間回転させた。上清を吸引し、廃棄した。５００μＬの氷冷アセトンを各チューブに添加し、バスソニケーターで短時間超音波処理を行ってペレットを破砕した。続いて、チューブを２０，０００ｘｇ及び４℃で５分間回転させ、１８０度回転させ、更に５分間回転させた。上清を吸引し、ペレットを約１０分間空気乾燥させた。

【0110】

１０μＬのＳＤＳ溶液（０．５％のＳＤＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＴｒｉｓ７．４、５ｍＭのＴＣＥＰ、１×Ｒｏｃｈｅプロテアーゼ阻害剤）を各チューブに加え、室温で１時間放置した。次いで、チューブをバスソニケーターの焦点で個々に超音波処理し、次いでボルテックスし、短時間回転させて、チューブの底部で試料を統合した。４０μＬのＮＰ４０溶液（１．２５％のＮＰ－４０、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＴｒｉｓ７．４、５ｍＭのＴＣＥＰ、１ｘＲｏｃｈｅプロテアーゼ阻害剤）を添加し、試料を再び短時間超音波処理し、ボルテックスし、チューブの底部に収集した。

【0111】

ストレプトアビジン結合反応のために、２０μＬの試料を５μＬの５ｍｇ／ｍＬのストレプトアビジン（Ｐｒｏｍｅｇａ（登録商標））に添加した。各反応の第２の２０μＬを、５μＬの１５０ｍＭのＮａＣｌを含有する「モック」チューブに加えた。これら２つの２５μＬの試料を、４℃、５５０ＲＰＭで一晩振盪させた。

【0112】

ウェスタンブロット分析：試料を２５μＬの２×ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）試料緩衝液（４×ｗ ｄＨ_２Ｏから希釈）で希釈し、４～１２％のＮｕＰＡＧＥ Ｍｉｄｉ、１ｍｍ、１２＋２ウェルのＢｉｓ／Ｔｒｉｓゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に充填した。ゲルを１５０Ｖで１時間１５分間溶出させ、次いでｉＢｌｏｔ（登録商標）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して、７分間プログラム３設定を使用してニトロセルロース膜に移した。

【0113】

ブロットをＴＢＳＴ中５％のミルクで１時間ブロックした。ＴＢＳＴで洗浄した後、ＴＢＳＴ中５％のＢＳＡ中で１：２０００で希釈した抗ＧＰＸ４抗体（Ａｂｃａｍ＃ａｂ１２５０６６）を添加し、ブロットを振盪しながら４℃で一晩インキュベートした。抗ウサギＨＲＰを、ＴＢＳＴ中５％のミルク中で１：５０００で約１時間室温で使用し、Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｐｉｃｏ（登録商標）ＥＣＬ試薬を使用してシグナルを検出した。全ての分析は、Ａｚｕｒｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（登録商標）ｃ５００からの５分間の曝露を使用して行った。ＩｍａｇｅＪ（登録商標）（米国国立衛生研究所）を使用して、＋／－ストレプトアビジンのバンドの統合密度を定量化した。

【0114】

この実験は、成体マウス網膜におけるＲＳＬ３の用量依存性ＧＰＸ４ ＴＥを実証した。図８Ａ～８Ｃを参照されたい。

【0115】

この実験はまた、ＧＰＸ４阻害剤の化合物＃１９及び＃２５（それぞれ、図９Ａ及び図９Ｂを参照されたい）を使用して、老化ＨＵＶＥＣ細胞と共に６時間インキュベートすることによって行った。データは、インビトロＴＥにおける強力なサブマイクロモルを示した。

【0116】

このゲルシフトアッセイは、上記のＯＩＲモデルと並行して使用して、インビボ状況で候補ＧＰＸ４阻害剤のＴＥを試験することができる。具体的には、異常な新生血管がマウスの子で引き起こされると、適切な量のビヒクル対照又は候補ＧＰＸ４阻害剤を、例えば、硝子体内（ＩＶＴ）に投薬することができる。一定期間後、マウスを安楽死させ、眼を収集し、本明細書に記載のゲルシフトアッセイで処理することができる。

【0117】

実施例８：ＧＣＮ２インビトロ活性の決定
元々、オフターゲットＧＣＮ２阻害剤活性を有するＰＥＲＫ阻害剤として説明された（Ｓｍｉｔｈ，Ａｄｒｉａｎ Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ ｏｆ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ．２０１５ Ｆｅｂ １２：５８（３）：１４２６－４１）特定の化合物である化合物３９を試験して、様々なインビトロアッセイを使用してＧＣＮ２活性化活性を有するかどうかを判定した。あらゆる制限なしに、そのようなアッセイを使用して、ＧＣＮ２経路活性化のための他の化合物を試験することができる。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１２ａ技術及びＨｉＢｉＴタグを担持する一本鎖オリゴＤＮＡヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）テンプレートを使用したノックインアプローチを通して、高親和性ルシフェラーゼ相補性断片（ＨｉＢｉＴ）によってＨ２１２２細胞（ＣＲＬ－５９８５（商標））において活性化転写因子４（ＡＴＦ４）をＣ末端タグ付けした。レポーター細胞株生成後（Ｈ２１２２ ＡＴＦ４－ＨｉＢｉＴ）、細胞を９６ウェルプレートにほぼコンフルエンシーで播種し、翌日、化合物３９で５時間処理した。開始濃度として１０μＭを使用して、４分の１対数希釈を使用して用量応答を生成した。Ｎａｎｏ－Ｇｌｏ（登録商標）ＨｉＢｉＴ溶解検出（Ｐｒｏｍｅｇａ（登録商標））試薬を５時間後に添加し、添加－混合－読出しアッセイフォーマットを使用して、細胞ＡＴＦ４タンパク質のプレートベースの生物発光定量化を可能にした。ＡＴＦ４発現のピーク活性化は、化合物３９の約２５０ｎＭで検出された。図１０Ａを参照されたい。

【0118】

次いで、マウス胚性線維芽（ＭＥＦ）細胞をほぼコンフルエンシーまで培養し、固定濃度（２５０ｎＭ）の化合物３９で５時間処理した。細胞をＬＳＤ溶解緩衝液中で採取し、ホモジネートをＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分離した。Ｐ－ｅＩＦ２ａ（クローンＤ９Ｇ８）、ＡＴＦ４（クローンＤ４Ｂ８）、及びＤＮＡ損傷誘導性転写産物３（ＤＤＩＴ３）（クローン９Ｃ８）を標的とする抗体を使用して、免疫ブロッティングを一晩行った。化合物３９の処理は、ホスホ－ｅＩＦ２ａ（ｐ－ｅＩＦ２ａ）、並びにＡＴＦ４及びＤＤＩＴ３（ＣＨＯＰ）のレベルを増加させる。図１０Ｂを参照されたい。

【0119】

初代ヒト網膜微小血管内皮細胞（ＨＲＭＥＣ－Ｃｅｌｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ（商標）Ｃｏｒｐ．、ＡＣＢＲＩ１８１、ロット＃１８１．０４．０２．０２．０２）を、Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｋｉｔ－ＶＥＧＦ（ＡＴＣＣロット８０７２０２０１）を用いて血管細胞基底培地（ＡＴＣＣ（登録商標）ロット９０９０９２７７）で培養し、追加のＦＢＳを５％ＦＢＳの最終濃度に添加した。細胞を、９６ウェルプレートにほぼコンフルエンシーで播種し、翌日、化合物３９で５時間処理した。開始濃度として１０μＭを使用して、４分の１対数希釈を使用して用量応答を生成した。処理後、ＲＮＡをＲＮｅａｓｙ（登録商標）９６－Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ（登録商標））を使用して抽出し、次にＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（商標）ＩＶ ＶＩＬＯ（商標）Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ（登録商標））を使用してｃＤＮＡを生成した。標準ＴａｑＭａｎ（登録商標）試薬及び条件を使用して、ｑＰＣＲを行った。プライマーＨｓ００３５８７９６＿ｇ１を使用してＤＤＴＩ３遺伝子発現を検出し、プライマー（Ｈｓ９９９９９９１０＿ｍ１）を使用してＴｂｐを対照遺伝子として使用した。ＤＤＩＴ３発現のピーク活性化は、約２５０ｎＭの化合物３９で検出された。図１０Ｃを参照されたい。

【0120】

化合物３９によるＤＤＩＴ３活性化が、ＰＥＲＫではなくＧＣＮ２活性化に依存するかどうかを決定するために、以下の実験を行った。ＧＣＮ２ノックアウト細胞（ＣＲＬ－２９７８（商標））、ＰＥＲＫノックアウト細胞（ＣＲＬ－２９７６（商標））、又はＷＴ対照細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－２９７７（商標））をほぼコンフルエンシーまで培養し、固定濃度（２５０ｎＭ）の化合物３９で５時間処理した。処理後、ＲＮＡをＲＮｅａｓｙ（登録商標）９６－Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して抽出し、次にＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（商標）ＩＶ ＶＩＬＯ（商標）Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ（登録商標））を使用してｃＤＮＡを生成した。標準ＴａｑＭａｎ試薬及び条件を使用して、ｑＰＣＲを行った。プライマーＨｓ００３５８７９６＿ｇ１を使用してＤＤＩＴ３遺伝子発現を検出し、プライマー（Ｈｓ９９９９９９１０＿ｍ１）を使用してＴｂｐを対照遺伝子として使用した。ノックアウト細胞株は、化合物３９によるＤＤＩＴ３誘導がＧＣＮ２に依存するが、ＰＥＲＫには依存しないことを示した。図１０Ｄを参照されたい。

【0121】

実施例９：ＧＣＮ２インビボ活性の決定
化合物３９を、ヒト虚血性網膜症、酸素誘導性網膜症（ＯＩＲ）新生児マウスと多くの特徴を共有する動物モデルにおいて試験した。化合物３９の薬力学的効果を調べるために、それを１０、３０、又は９０ｍｐｋのいずれかで腹腔内（ＩＰ）投与した。投薬製剤は、１％のＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ－６８／１％のＨＰＭＣ、１５％のカプチゾールを含むビヒクルに基づいた。正常酸素及びＯＩＲ新生児の両方をＰ１２（高酸素症の終了）で処理し、４時間後、又は２４時間後のＰ１３で取り出した。網膜を解剖し、完全自動化されたスピンカラムベースの核酸抽出機器（Ｑｉａｃｕｂｅ Ｃｏｎｎｅｃｔ（商標））を使用してＲＮＡを抽出した。ｑＰＣＲは、標準のＴａｑＭａｎ（登録商標）試薬及び条件を使用して行った。Ａｔｆ４、Ｄｄｉｔ３、及びＴｂｐ（対照）遺伝子発現を、それぞれ、プライマー：Ｍｍ００５１５３２４＿ｍ１、Ｍｍ００４９２０９７＿ｍ１、及びＭｍ０１２７７０４２＿ｍ１を使用して決定した。化合物３９は、ＩＰ投与後、ＡＴＦ４（図１１Ａ）及びＤＤＩＴ３（図１１Ｂ）の両方について、用量依存的な遺伝子発現の誘導を有することが示された。

【0122】

腹腔内投与された化合物３９は、３０及び６０ｍｐｋでＡＴＦ４タンパク質発現を活性化した。化合物３９投与の４時間後に成体の眼網膜を解剖し、採取した試料を氷上に維持し、Ｐｒｅｃｅｌｌｙｓ（商標）（５００μＬチューブ）組織ホモジナイザを使用して、Ｐｉｅｒｃｅ Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｍｉｎｉ錠（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標）Ａ３２９６３）を含有する３００ｕＬ ＭＳＤ Ｔｒｉｓ溶解緩衝液中で均質化した。次いで、均質化された試料を遠心分離して、破片から上清を分離した。溶解物をＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分離し、ＡＴＦ４（Ｄ４Ｂ８）及び対照タンパク質アクチニン（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、ｃａｔ．３１３４Ｓ）について免疫ブロットした。図１１Ｃを参照されたい。結果は、化合物３９がＡＴＦ４のレベルを増加させたが、制御タンパク質アクチニンを増加させなかったことを実証している。

【0123】

実施例１０：ＧＣＮ２アゴニストを使用した網膜疾患との関連性を有するストレス応答遺伝子の調節
化合物３９の薬力学的効果を調べるために、それを正常酸素及びＯＩＲ新生児マウスの両方において１０、３０、又は９０ｍｐｋのいずれかで腹腔内投与した。投薬製剤は、１％のＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ－６８／１％のＨＰＭＣ、１５％のカプチゾールを含むビヒクルに基づいた。正常酸素及びＯＩＲ新生児の両方をＰ１２（高酸素症の終了）で処理し、４時間後、又は２４時間後のＰ１３で取り出した。網膜を解剖し、完全自動化されたスピンカラムベースの核酸抽出機器（Ｑｉａｃｕｂｅ Ｃｏｎｎｅｃｔ（商標））を使用してＲＮＡを抽出した。ｑＰＣＲは、標準のＴａｑＭａｎ試薬及び条件を使用して行った。Ｓｌｃ７ａ１１、Ｓｅｒｐｉｎｆ１、及びＴｂｐ（対照）遺伝子発現を、それぞれ、プライマーＭｍ００４４２５３０＿ｍ１、Ｍｍ００４４１２７０＿ｍ１、及びＭｍ０１２７７０４２＿ｍ１を使用して決定した。網膜Ｓｌｃ７ａ１１（図１２Ａ）及び網膜Ｓｅｒｐｉｎｆ１（図１２Ｂ）の両方について、化合物３９による遺伝子発現の用量依存的誘導を検出した。

【0124】

正常酸素及びＯＩＲ眼網膜を、化合物３９投与の４時間後に解剖し、採取した試料を氷上に維持し、Ｐｒｅｃｅｌｌｙｓ（５００μＬチューブ）組織ホモジナイザを使用して、３００μＬのＬＳＤ試料／溶解緩衝液中で均質化した。次いで、均質化された試料を遠心分離して、破片から上清を分離した。溶解物をＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分離し、ＡＴＦ４（Ｄ４Ｂ８）、ｐ－ｅＩＦ２ａ（Ｄ９Ｇ８）、及びＨＩＦ１α（Ｎｏｖｕｓ（商標）、ｃａｔ．ＮＢ１００－４４９）及び対照タンパク質アクチニン（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ（商標）、ｃａｔ．３１３４Ｓ）について免疫ブロットした。図１３を参照されたい。化合物３９の処置は、ＡＴＦ４及びホスホ－ｅＩＦ２αのレベルの増加、並びに低酸素ストレスシグナル伝達の低減を示すＨＩＦ１αタンパク質レベルの下方調節を特徴とする薬力学的応答をもたらした。

【0125】

実施例１１：ＧＣＮ２アゴニストを使用した網膜血管系の改善
化合物３９の有効性を、マウスＯＩＲモデルで研究した。高酸素環境への幼若マウスの曝露は、網膜血管系の閉塞をもたらし、その後、周囲の空気に戻ると病理学的血管新生（血管新生）をもたらす。化合物３９を、示された時点（モデルのＰ１２及びＰ１４）で２回腹腔内投与（９０ｍｐｋ）、又は１回のみ（Ｐ１２で、続いてＰ１４でｂｔビヒクル対照）のいずれかで投与した。

【0126】

無血管領域及び新生血管領域を、モデルのＰ１７における網膜平面標本の採取及び染色後に定量化した。化合物３９の２回の９０ｍｐｋの腹腔内投与を受けたＯＩＲの子は、Ｐ１７において、新血管形成の有意な拮抗（図１４Ａ）を示したが、血管遮断（図１４Ｂ）は示さなかった。これらの結果は、全身投与された化合物３９が、ＯＩＲ疾患モデルにおいて病原性血管新生を機能的に阻害し得ることを示している。

【0127】

ＯＩＲの子を、Ｐ１２で９０ｍｐｋの化合物３９の腹腔内注射で処理し、次いでこれらの子を、授乳中の母親と共に室内空気中に移し、Ｐ１４で投与を繰り返し、Ｐ１７で屠殺した。Ｐ１７で眼を摘出し、血管染色のために網膜を解剖した。無血管又は新生血管領域を決定するために、網膜を平面にマウントし、蛍光顕微鏡検査のためにイソレクチンＢ４（ＩＢ４）で染色した。イソレクチン染色した平面標本は、ビヒクルで処理した子（図１５Ａ）と比較して、化合物３９で処理した子（図１５Ｂ）における網膜血管の保存を示している。ビヒクルで処理された子は、化合物３９で反復処置された子と比較して、虚血性後部網膜を有し、９０ｍｐｋの化合物３９の２回の腹腔内投与が新生血管を有意に抑制したことを示している。

【0128】

前述の本発明は、理解を明確にする目的のために、解説及び例によってある程度詳細に説明されているが、説明及び例は、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。本明細書で引用される全ての特許及び科学文献の開示は、参照によりそれらの全体が明示的に組み込まれる。

【図1】

【図2】

【図3A】

【図3B】

【図4】

【図5】

【図6A】

【図6B】

【図7】

【図8A】

【図8B】

【図8C】

【図9A】

【図9B】

【図10A】

【図10B】

【図10C】

【図10D】

【図11A】

【図11B】

【図11C】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【手続補正書】

【提出日】2024-03-18

【手続補正1】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００６５

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0065】

例示的ＰＡＰＰ－Ａ阻害剤：当該技術分野で現在知られている、又は開発される任意のＰＡＰＰ－Ａ阻害剤が、本発明に従って開示される網膜血管症の治療のために試験及び開発され得る。特に、本発明の方法で利用され得るＰＡＰＰ－Ａ阻害剤としては、例えば、限定されないが、ＰＡＰＰ－Ａに特異的に結合する抗体が挙げられる。これらには、例えば、ＷＯ２０２０／１９８１６６、米国特許第８，６５３，０２０号、Ｍｉｋｋｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ５，１０１４－１０２５（２０１４）、Ｍｉｋｋｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８３，１６７７２－１６７８０（２００８）、及びＭｏｈｒｉｎ ｅｔ ａｌ．，ｂｉｏＲｘｉｖ，ｄｏｉ：ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１０１／２０２０．０２．０５．９３６３１０（このバージョンは、２０２０年２月６日に掲載された）において開示されるように、ＰＡＣ－１ｓｃＦＶ、ＰＡＣ－１－Ｄ８ｓｃＦｖ、ＰＡＣ－２ｓｃＦｖ、ＰＡＣ－５ｓｃＦｖが含まれ得、これらは全て、参照によりそれらの全体の各々が本明細書に全て組み込まれる。本発明の方法で利用され得る他のＰＡＰＰ－Ａ阻害剤としては、例えば、限定されないが、ＰＡＰＰ－Ａの機能を阻害することができるポリペプチドが挙げられる。これらには、例えば、プロ－ＭＢＰ、スタニオカルシン－１（ＳＴＣ１）、又はスタニオカルシン－２（ＳＴＣ２）が含まれ得る。本発明の方法で利用され得る更に他のＰＡＰＰ－Ａ阻害剤としては、例えば、限定されないが、５’－ＧＣＣＣＡＡＣＴＣＣＴＧＣＴＧＧＡＡ－３’（SEQ ID NO: 1）（ＡＳ－ＰＡＰＰ－Ａ）のアンチセンス配列からなるヒトＰＡＰＰ－Ａ ｍＲＮＡに対応する１８塩基ホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドなどのＰＡＰＰ－Ａを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドが挙げられる（Ｔａｎａｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ Ｊａｎ ２００４を参照されたい）。本発明の方法で利用され得る更に他のＰＡＰＰ－Ａ阻害剤としては、限定されないが、クニッツ型プロテアーゼ阻害剤ビクニンが挙げられる。

【手続補正2】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】配列表

【補正方法】追加

【補正の内容】

【配列表】

2024521770000001.app

【国際調査報告】