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特表2024-521815ＡＬＳ及び関連する疾患を治療するための多部位ニューロモデュレーション
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-06-04
(54)【発明の名称】ＡＬＳ及び関連する疾患を治療するための多部位ニューロモデュレーション
(51)【国際特許分類】
A61N 1/20 20060101AFI20240528BHJP
A61N 1/36 20060101ALI20240528BHJP
A61N 1/378 20060101ALI20240528BHJP
【ＦＩ】
A61N1/20
A61N1/36
A61N1/378
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023573133
(86)(22)【出願日】2022-05-24
(85)【翻訳文提出日】2024-01-26
(86)【国際出願番号】 US2022030655
(87)【国際公開番号】W WO2022251165
(87)【国際公開日】2022-12-01
(31)【優先権主張番号】17/331,142
(32)【優先日】2021-05-26
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
(71)【出願人】
【識別番号】507248826
【氏名又は名称】リサーチ ファウンデイション オブ ザ シティー ユニヴァーシティ オブ ニューヨーク
(74)【代理人】
【識別番号】100118902
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 修
(74)【代理人】
【識別番号】100106208
【弁理士】
【氏名又は名称】宮前 徹
(74)【代理人】
【識別番号】100196508
【弁理士】
【氏名又は名称】松尾 淳一
(74)【代理人】
【識別番号】100122644
【弁理士】
【氏名又は名称】寺地 拓己
(72)【発明者】
【氏名】アフメド，ザグルール
【テーマコード（参考）】
4C053
【Ｆターム（参考）】
4C053FF04
4C053GG01
4C053JJ06
4C053JJ13
4C053JJ14
4C053JJ24
(57)【要約】
多部位ニューロモデュレーションを用いたＡＬＳ及び関連する運動ニューロン疾患を治療する方法並びにシステムが開示される。
【選択図】図１６
【選択図】図１６
【特許請求の範囲】
【請求項1】
脊椎動物においてＡＬＳを治療するためのシステムであって、前記システムは、脊椎動物における筋力低下と関連する末梢神経の末梢直流刺激を供給するように構成された第１の刺激コンポーネントであって、前記第１の刺激コンポーネントは、前記末梢神経を刺激するように構成された神経刺激極を有する神経刺激回路を含む、第１の刺激コンポーネント、
前記末梢神経の制御と関連する脊髄の位置に脊髄直流刺激を供給するように構成された第２の刺激コンポーネントであって、前記第２の刺激コンポーネントは、活性脊髄刺激極及び脊髄参照極を有する脊髄刺激回路を規定し、前記脊髄刺激回路は、前記脊髄の位置を刺激するために前記脊髄刺激極と前記脊髄参照極の間に経脊髄直流刺激を供給するように構成され、前記活性脊髄刺激極は、前記脊髄の位置の比較的近位であり、前記脊髄参照極は、前記脊髄の位置の比較的遠位である、第２の刺激コンポーネント、並びに
前記活性脊髄極及び前記近位神経極が反対の極性を引き起こされ、結果として生じる分極回路を形成することを保証するように構成されたコントローラーコンポーネントであって、前記結果として生じる分極回路は、分極電流に従ってＡＬＳと関連する標的タンパク質の遺伝子発現及び／若しくはタンパク質発現の生物学的な活性又はレベルを変化させるために、前記反対の極性に従って前記活性脊髄極と前記近位神経極の間に分極電流を供給するように構成された、コントローラーコンポーネント、
を備え、
前記コントローラーコンポーネントがまた、末梢直流刺激及び脊髄直流刺激を所定の期間供給し、刺激を所定の日数に渡って所定の回数繰り返すように構成された、前記システム。
【請求項2】
前記コントローラーコンポーネントが、一定、連続的、パルス、断続的、変動、及び非変動の電流のうちの少なくとも１つを含む前記電流を供給するように構成された、請求項１に記載のシステム。
【請求項3】
前記コントローラーコンポーネントが、前記第１の刺激コンポーネント及び前記第２の刺激コンポーネントにより供給される電流の範囲を同時に制御するように更に構成された、請求項１に記載のシステム。
【請求項4】
前記第１の刺激コンポーネントが、前記末梢神経を刺激するために配置された刺激電極に刺激電流を供給するための正極及び負極を含み、前記正極及び前記負極が、１つの電極が前記正極に動作可能に接続され、別の電極が前記負極に動作可能に接続されるように配置された、請求項３に記載のシステム。
【請求項5】
前記第２の刺激コンポーネントが、前記脊髄の位置を渡って刺激を伝達するために配置された刺激電極に刺激電流を供給するための正極及び負極を含み、前記正極及び前記負極が、１つの電極が前記正極に動作可能に接続され、別の電極が前記負極に動作可能に接続されるように配置された、請求項３に記載のシステム。
【請求項6】
前記刺激電極のうちの少なくとも１つが移植されている、請求項４又は５に記載のシステム。
【請求項7】
前記コントローラーコンポーネント及び電源のうちの少なくとも１つがウェアラブルなハウジングに配置されている、請求項１に記載のシステム。
【請求項8】
前記所定の期間、前記所定の回数、及び前記所定の日数が、ＮＫＣＣ１、ＳＯＤ１、ｔａｕ、ＨＳＰ７０、若しくはＬＣ３Ｂの遺伝子発現及び／又はタンパク質発現の生物学的な活性又はレベルを変化させるように選択される、請求項１に記載のシステム。
【請求項9】
ＮＫＣＣ１、ＳＯＤ１、若しくはｔａｕの遺伝子発現及び／又はタンパク質発現の前記生物学的な活性又は前記レベルが低減される、請求項８に記載のシステム。
【請求項10】
ＨＳＰ７０若しくはＬＣ３Ｂの遺伝子発現及び／又はタンパク質発現の前記生物学的な活性又は前記レベルが増大される、請求項８に記載のシステム。
【請求項11】
脊髄、脳、又は末梢神経のうちの１つと関連する生物学的な活性を制御することにより運動ニューロン疾患を治療するための刺激装置であって、複数の端子を有する直流電源、
第１の電極を前記直流電源に接続するための第１の前記端子であって、前記第１の電極は脊椎動物の脊髄の背側面にあるか若しくは近接するか、脊椎動物の頭蓋にあるか、又は脊椎動物の末梢神経にあるか若しくは近接する、第１の前記端子、
第２の電極を前記直流電源に接続するための第２の前記端子であって、前記第２の電極は前記第１の電極から遠い場所に配置されている、第２の前記端子、ここで、前記第１の電極及び前記第２の電極は逆に帯電し、前記脊髄、前記頭蓋、又は前記末梢神経を刺激するための電流路を形成するように構成されている、及び
前記電流路を渡る前記電極の間の電流を制御するように構成されたコントローラーコンポーネントであって、前記コントローラーコンポーネントもまた、前記脊髄、前記頭蓋、又は前記末梢神経を渡る前記電流路を刺激するために前記直流を所定の期間供給し、刺激を所定の日数に渡って所定の回数繰り返すように構成された、コントローラーコンポーネント、
を備えた、前記刺激装置。
【請求項12】
前記運動ニューロン疾患が、筋萎縮性側索硬化症、原発性側索硬化症、進行性筋萎縮症、進行性球まひ、脊髄性筋萎縮症、及びポリオ後症候群からなる群より選択される疾患である、請求項１１に記載の刺激装置。
【請求項13】
前記コントローラーコンポーネントが、一定、連続的、パルス、断続的、変動、及び非変動の電流のうちの少なくとも１つを含めた前記電流を供給するように構成された、請求項１１に記載の刺激装置。
【請求項14】
前記第１の電極及び前記第２の電極のうちの少なくとも１つが移植されている、請求項１１又は１３に記載の刺激装置。
【請求項15】
前記コントローラーコンポーネント及び前記直流電源のうちの少なくとも１つがウェアラブルなハウジングに配置されている、請求項１１に記載の刺激装置。
【請求項16】
前記所定の期間、前記所定の回数、及び前記所定の日数が、ＮＫＣＣ１、ＳＯＤ１、ｔａｕ、ＨＳＰ７０、若しくはＬＣ３Ｂの遺伝子発現及び／又はタンパク質発現の生物学的な活性又はレベルを変化させるように選択される、請求項１１に記載の刺激装置。
【請求項17】
ＮＫＣＣ１、ＳＯＤ１、若しくはｔａｕの遺伝子発現及び／又はタンパク質発現の前記生物学的な活性又は前記レベルが低減される、請求項１６に記載の刺激装置。
【請求項18】
ＨＳＰ７０若しくはＬＣ３Ｂの遺伝子発現及び／又はタンパク質発現の前記生物学的な活性又は前記レベルが増大される、請求項１６に記載の刺激装置。
【請求項19】
脊椎動物においてＡＬＳを治療する方法であって、直流源のＡ電極とＢ電極の間に刺激を付与する工程であって、Ａ電極は脊椎動物の脊髄の背側面の第１の位置にあるか若しくは近接するか、又はＡ電極は脊椎動物の頭蓋の第１の位置にある、工程、並びに
ＡＬＳと関連する標的タンパク質の遺伝子発現及び／若しくはタンパク質発現の生物学的な活性又はレベルを調節するのに十分な強度で十分な期間、前記直流刺激を付与する工程、
を含み、
前記Ｂ電極は前記Ａ電極から遠い第１の場所に配置され、前記Ａ電極及び前記Ｂ電極は逆に帯電し、
前記直流は一定、連続的、パルス、断続的、変動、及び非変動のうちの少なくとも１つである、前記方法。
【請求項20】
前記Ａ電極を脊椎動物の脊髄の背側面の第２の位置又は脊椎動物の頭蓋の第２の位置に移動させる工程、任意に、前記Ｂ電極を前記Ａ電極から遠い第２の場所に配置させる工程、並びに
ＡＬＳと関連する標的タンパク質の遺伝子発現及び／若しくはタンパク質発現の生物学的な活性又はレベルを調節するのに十分な強度で十分な期間、前記直流刺激を付与する工程、
を更に含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項21】
前記工程を１回以上繰り返す工程を更に含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項22】
複数のＡ電極が前記脊髄の前記背側面に沿った複数の場所に配置されるか又は前記複数の場所に近接して配置され、複数のＢ電極が前記複数のＡ電極から遠い場所に配置される、請求項１９に記載の方法。
【請求項23】
複数のＡ電極が運動制御と関連する前記頭蓋の複数の場所に配置され、複数のＢ電極が前記複数のＡ電極から遠い場所に配置される、請求項１９に記載の方法。
【請求項24】
前記複数のＡ電極と前記複数のＢ電極の間に付与される前記刺激が同時に又は連続的に付与される、請求項２２又は２３に記載の方法。
【請求項25】
脊椎動物においてＡＬＳを治療する方法であって、直流源のＡ電極とＢ電極の間に第１の刺激を付与する工程であって、Ａ電極は脊椎動物の脊髄の背側面の第１の位置にあるか又は近接する、工程、
直流源のＣ電極とＤ電極の間に第２の刺激を付与する工程であって、Ｃ電極は脊椎動物の頭蓋の第１の位置にある、工程、並びに
ＡＬＳと関連する標的タンパク質の遺伝子発現及び／若しくはタンパク質発現の生物学的な活性又はレベルを調節するのに十分な強度で十分な期間、前記直流刺激を付与する工程、
を含み、
前記Ｂ電極は前記Ａ電極から遠い場所に配置され、前記Ａ電極及び前記Ｂ電極は逆に帯電し、前記Ｄ電極は前記Ｃ電極から遠い場所に配置され、前記Ｃ電極及び前記Ｄ電極は逆に帯電し、
前記直流は一定、連続的、パルス、断続的、変動、及び非変動のうちの少なくとも１つである、前記方法。
【請求項26】
前記第１及び第２の刺激が同時に又は連続的に付与される、請求項２５に記載の方法。
【請求項27】
前記Ａ電極を脊椎動物の脊髄の背側面の第２の位置に移動させる工程、任意に、前記Ｂ電極を前記Ａ電極から遠い第２の場所に配置させる工程、並びに
ＡＬＳと関連する標的タンパク質の遺伝子発現及び／若しくはタンパク質発現の生物学的な活性又はレベルを調節するのに十分な強度で十分な期間、前記直流刺激を付与する工程、
を更に含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項28】
前記Ｃ電極を脊椎動物の頭蓋の第２の位置に移動させる工程、任意に、前記Ｄ電極を前記Ｃ電極から遠い第２の場所に配置させる工程、並びに
ＡＬＳと関連する標的タンパク質の遺伝子発現及び／若しくはタンパク質発現の生物学的な活性又はレベルを調節するのに十分な強度で十分な期間、前記直流刺激を付与する工程、
を更に含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項29】
前記工程を１回以上繰り返す工程を更に含む、請求項２７又は２８に記載の方法。
【請求項30】
複数のＡ電極が前記脊髄の前記背側面に沿った複数の場所に配置されるか又は前記複数の場所に近接して配置され、複数のＢ電極が前記複数のＡ電極から遠い場所に配置される、請求項２８に記載の方法。
【請求項31】
複数のＣ電極が運動制御と関連する前記頭蓋の複数の場所に配置され、複数のＤ電極が前記複数のＣ電極から遠い場所に配置される、請求項２８に記載の方法。
【請求項32】
前記複数のＡ電極と前記複数のＢ電極の間及び前記複数のＣ電極と前記複数のＤ電極の間に付与される前記刺激が同時に又は連続的に付与される、請求項３０に記載の方法。
【請求項33】
直流源のＥ電極とＦ電極の間に第３の刺激を付与する工程であって、Ｅ電極が脊椎動物の第１の末梢神経の第１の位置にあるか又は近接する、工程を更に含み、前記Ｆ電極が前記Ｅ電極から遠い場所に配置され、前記Ｅ電極及び前記Ｆ電極が逆に帯電している、請求項２５に記載の方法。
【請求項34】
前記第１の刺激、前記第２の刺激、及び前記第３の刺激が同時に又は連続的に付与される、請求項３３に記載の方法。
【請求項35】
前記Ｅ電極を前記第１の末梢神経にあるか若しくは近接する第２の位置又は第２の末梢神経にあるか若しくは近接する位置に移動させる工程、任意に、前記Ｆ電極を前記Ｅ電極から遠い第２の場所に配置させる工程、並びに
ＡＬＳと関連する標的タンパク質の遺伝子発現及び／若しくはタンパク質発現の生物学的な活性又はレベルを調節するのに十分な強度で十分な期間、前記直流刺激を付与する工程、
を更に含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項36】
前記工程を１回以上繰り返す工程を更に含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項37】
複数のＥ電極が前記末梢神経に沿った複数の場所に配置されるか又は複数の末梢神経に配置されるか若しくは前記複数の末梢神経に近接して配置され、複数のＦ電極が前記複数のＥ電極から遠い場所に配置される、請求項３３に記載の方法。
【請求項38】
前記複数のＥ電極と前記複数のＦ電極の間に付与される前記刺激が同時に又は連続的に付与される、請求項３７に記載の方法。
【請求項39】
前記末梢神経が骨格筋を支配する、請求項３３に記載の方法。
【請求項40】
前記期間が１日以上の一連の刺激期間を含み、前記日が連続的又は非連続的である、請求項３３に記載の方法。
【請求項41】
ＮＫＣＣ１、ＳＯＤ１、ｔａｕ、ＨＳＰ７０、若しくはＬＣ３Ｂの遺伝子発現及び／又はタンパク質発現の生物学的な活性又はレベルを変化させるのに十分な強度で十分な期間、前記直流刺激を付与する工程を更に含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項42】
ＮＫＣＣ１、ＳＯＤ１、若しくはｔａｕの遺伝子発現及び／又はタンパク質発現の前記生物学的な活性又は前記レベルが低減される、請求項４１に記載の方法。
【請求項43】
ＨＳＰ７０若しくはＬＣ３Ｂの遺伝子発現及び／又はタンパク質発現の前記生物学的な活性又は前記レベルが増大される、請求項４１に記載の方法。
【請求項44】
脊椎動物においてＡＬＳを治療するためのシステムであって、前記システムが、脊椎動物における末梢神経に沿った複数の位置に末梢神経の末梢直流刺激を供給するか又は複数の末梢神経の末梢直流刺激を供給するように構成された複数のＡ刺激コンポーネントであって、前記Ａ刺激コンポーネントのそれぞれが、前記末梢神経又は前記複数の末梢神経を刺激するように構成された神経刺激極を有する神経刺激回路を含む、複数のＡ刺激コンポーネント、
前記末梢神経又は前記複数の末梢神経の制御と関連する複数の脊髄の位置に脊髄直流刺激を供給するように構成された複数のＢ刺激コンポーネントであって、前記Ｂ刺激コンポーネントのそれぞれが、活性脊髄刺激極及び脊髄参照極を有する脊髄刺激回路を規定し、前記脊髄刺激回路は、前記脊髄の位置を刺激するために前記脊髄刺激極と前記脊髄参照極の間に経脊髄直流刺激を供給するよう構成され、前記活性脊髄刺激極は、前記脊髄の位置の比較的近位であり、前記脊髄参照極は、前記脊髄の位置の比較的遠位である、複数のＢ刺激コンポーネント、並びに
前記活性脊髄極及び前記近位神経極が反対の極性を引き起こされ、結果として生じる分極回路を形成することを保証するように構成されたコントローラーコンポーネントであって、前記結果として生じる分極回路は、分極電流に従ってＡＬＳと関連する標的タンパク質の遺伝子発現及び／若しくはタンパク質発現の生物学的な活性又はレベルを変化させるために、前記反対の極性に従って前記活性脊髄極と前記近位神経極の間に分極電流を供給するように構成された、コントローラーコンポーネント、
を備え、
前記コントローラーコンポーネントはまた、末梢直流刺激及び脊髄直流刺激を所定の期間供給し、刺激を所定の日数に渡って所定の回数繰り返すように構成された、前記システム。
【請求項45】
前記コントローラーコンポーネントが、一定、連続的、パルス、断続的、変動、及び非変動の電流のうちの少なくとも１つを含めた前記電流を供給するように構成された、請求項４４に記載のシステム。
【請求項46】
前記コントローラーコンポーネントが、前記Ａ刺激コンポーネント及び前記Ｂ刺激コンポーネントにより供給される電流の範囲を同時に制御するように更に構成された、請求項４４に記載のシステム。
【請求項47】
前記Ａ刺激コンポーネントが、前記末梢神経の複数の位置又は前記複数の末梢神経を刺激するために配置された刺激電極に刺激電流を供給するための正極及び負極を含み、前記正極及び前記負極が、１つの電極が前記正極に動作可能に接続され、別の電極が前記負極に動作可能に接続されるように配置された、請求項４４に記載のシステム。
【請求項48】
前記Ｂ刺激コンポーネントが、前記複数の脊髄の位置を渡って刺激を伝達するために配置された刺激電極に刺激電流を供給するための正極及び負極を含み、前記正極及び前記負極が、１つの電極が前記正極に動作可能に接続され、別の電極が前記負極に動作可能に接続されるように配置された、請求項４６に記載のシステム。
【請求項49】
前記刺激電極のうちの少なくとも１つが移植されている、請求項４７に記載のシステム。
【請求項50】
前記コントローラーコンポーネント及び電源のうちの少なくとも１つがウェアラブルなハウジングに配置されている、請求項４４に記載のシステム。
【請求項51】
前記所定の期間、前記所定の回数、及び前記所定の日数が、神経細胞の寿命を引き延ばすため、並びに／あるいはＮＫＣＣ１、ＳＯＤ１、ｔａｕ、ＨＳＰ７０、若しくはＬＣ３Ｂの遺伝子発現及び／又はタンパク質発現の生物学的な活性又はレベルを変化させるために選択される、請求項４４に記載のシステム。
【請求項52】
ＮＫＣＣ１、ＳＯＤ１、若しくはｔａｕの遺伝子発現及び／又はタンパク質発現の前記生物学的な活性又は前記レベルが低減される、請求項５１に記載のシステム。
【請求項53】
ＨＳＰ７０若しくはＬＣ３Ｂの遺伝子発現及び／又はタンパク質発現の前記生物学的な活性又は前記レベルが増大される、請求項５１に記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
[001]本願は、米国非仮特許出願第１７／３３１，１４２号（２０２１年５月２６日出願）についての優先権を主張し、その内容は、すべての目的で本明細書に援用される。
[001]本願は、米国非仮特許出願第１７／３３１，１４２号（２０２１年５月２６日出願）についての優先権を主張し、その内容は、すべての目的で本明細書に援用される。
【0002】
技術分野
[002]本発明は、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）及び関連する神経疾患を治療する多部位ニューロモデュレーションに基づく方法並びにシステムに関する。
[002]本発明は、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）及び関連する神経疾患を治療する多部位ニューロモデュレーションに基づく方法並びにシステムに関する。
【背景技術】
【0003】
[003]筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ、ルー・ゲーリック病、シャルコー病）は、多数のニューロンネットワークに影響を及ぼし、速やかに死をもたらす進行性の神経変性疾患である。その疾患は運動ニューロン系の体系的な分解の結果であり、臨床症状は、発症部位、前部前頭葉、上位及び下位運動ニューロンの分解プロセスの相対的親和性、並びにネットワーク内の疾患の広がりの速度に依存する（Ｒａｖｉｔｓら、「ＡＬＳ ｍｏｔｏｒ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ， ｆｏｃａｌｉｔｙ， ａｎｄ ｓｐｒｅａｄ：ｄｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇ ｍｏｔｏｒ ｎｅｕｒｏｎ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ」、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ、２００９）。ＡＬＳは、典型的には診断の２～５年以内に、筋力低下、痙性、まひ、及び最終的には死をもたらす。痙性は、脊髄運動ニューロンの過剰興奮性と関連する疼痛状態であり、ＡＬＳ患者の約８０％に見られ（Ｍｉｌｉｎｉｓら、「Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｐａｓｔｉｃｉｔｙ Ｉｎｄｅｘ－Ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ Ｌａｔｅｒａｌ Ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ」、Ａｃｔａ．Ｎｅｕｒｏｌ．Ｓｃａｎｄ．、２０１８）、注入ボツリヌス神経毒素又は経口バクロフェンにより主に治療される。診断されるのに十分なほど発現した後にＡＬＳを進行させるプロセスを対象とするメカニズム特異的な治療は、たかだか改善的な効果を有し得る（Ｍｉｌｌｅｒら、「Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｐａｒａｍｅｔｅｒ：ｔｈｅ ｃａｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ｐａｔｉｅｎｔ ｗｉｔｈ ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ ｌａｔｅｒａｌ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ （ａｎ ｅｖｉｄｅｎｃｅ－ｂａｓｅｄ ｒｅｖｉｅｗ）：ｒｅｐｏｒｔ ｏｆ ｔｈｅ Ｑｕａｌｉｔｙ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ Ｓｕｂｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ：ＡＬＳ Ｐｒａｃｔｉｃｅ Ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ Ｔａｓｋ Ｆｏｒｃｅ」、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ、１９９９）。疾患の広がりを停止する治療は、影響を受けた運動ニューロンのサルベージを試みるものよりも効果的であり得るが、そのような治療は未だ実現されていない。現在、ＡＬＳ治療の中心は疾患の臨床症状を対象とする適応治療からなる（Ｂｅｄｌａｃｋ及びＭｉｔｓｕｍｏｔｏ、「Ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ ｌａｔｅｒａｌ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ：ａ ｐａｔｉｅｎｔ ｃａｒｅ ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ ｃｌｉｎｉｃｉａｎｓ」、Ｄｅｍｏｓ Ｍｅｄｉｃａｌ、２０１２）。ＡＬＳを治療するためのＦＤＡに承認された薬物は３つのみ存在し、すべて非常に限定された有効性を有する。ＡＬＳの非侵襲的な治療について、この上なく大きな満たされていない医療ニーズがある。
【0004】
[004]ＡＬＳの大部分の症例（９０～９５％）は特発性であり、ＡＬＳの家族歴が知られていない患者に起こるが、症例の残りの５～１０％は家族性である。家族性ＡＬＳと関連付けられている少なくとも３１の異なる遺伝子変異があり（Ｍａｔｈｉｓら、「Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｏｆ ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ ｌａｔｅｒａｌ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ：ａ ｒｅｖｉｅｗ」、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌ．Ｓｃｉ．，２０１９）、家族性ＡＬＳの最も一般的な種類を表１に示す。
【0005】
【表1】
【0006】
[005]ＡＬＳの臨床所見は、線維束性攣縮、筋けいれん、反射亢進、及び痙性を含み、典型的には、息切れ、換気機能障害、及び最終的には呼吸不全に進行する。ＡＬＳ患者はＵＭＮ徴候及びＬＭＮ徴候の両方を示し得る。ＵＭＮ徴候は痙性、衰弱、及び反射の増大を含み、一方でＬＭＮ徴候は筋委縮、衰弱、線維束性攣縮、及び反射の低減を含む。ＡＬＳの患者は痛みを伴う筋けいれん、けいれん及び痙性を訴えることが多い。主要なＵＭＮ障害と関連する表現型である原発性側索硬化症（ＰＬＳ）の患者は、深刻な痙性を有し得る（Ｓｉｎｇｅｒら、「Ｐｒｉｍａｒｙ ｌａｔｅｒａｌ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ」、Ｍｕｓｃｌｅ Ｎｅｒｖｅ、２００７）。
【0007】
[006]近年の研究は、ＡＬＳと運動ニューロンの過剰興奮性の間の重要な関係性を証明した（Ｂａｅら、「Ｔｈｅ ｐｕｚｚｌｉｎｇ ｃａｓｅ ｏｆ ｈｙｐｅｒｅｘｃｉｔａｂｉｌｉｔｙ ｉｎ ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ ｌａｔｅｒａｌ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ」、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．、２０１３；ＥｌＢａｓｉｏｕｎｙら、「Ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔ ｉｎｗａｒｄ ｃｕｒｒｅｎｔｓ ｉｎ ｓｐｉｎａｌ ｍｏｔｏｎｅｕｒｏｎｓ：ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｆｏｒ ｎｏｒｍａｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｂｕｔ ｐｏｔｅｎｔｉａｌｌｙ ｈａｒｍｆｕｌ ａｆｔｅｒ ｓｐｉｎａｌ ｃｏｒｄ ｉｎｊｕｒｙ ａｎｄ ｉｎ ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ ｌａｔｅｒａｌ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ」、Ｃｌｉｎ．Ｎｅｕｒｏｐｈｙｓｉｏｌ．、２０１０；Ｋｉｅｒｎａｎら、「Ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ ｌａｔｅｒａｌ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ：ｏｒｉｇｉｎｓ ｔｒａｃｅｄ ｔｏ ｉｍｐａｉｒｅｄ ｂａｌａｎｃｅ ｂｅｔｗｅｅｎ ｎｅｕｒａｌ ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｎｅｏｎａｔａｌ ｐｅｒｉｏｄ」、Ｍｕｓｃｌｅ ａｎｄ Ｎｅｒｖｅ、２０１９；Ｍｏｄｏｌら、「Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ｏｆ ＮＫＣＣ１ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ａｖｏｉｄｓ ｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＫＣＣ２ ｉｎ ｃｅｎｔｒａｌ ｓｅｎｓｏｒｙ ｐａｔｈｗａｙｓ ａｎｄ ｒｅｄｕｃｅｓ ｎｅｕｒｏｐａｔｈｉｃ ｐａｉｎ ａｆｔｅｒ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｎｅｒｖｅ ｉｎｊｕｒｙ」、Ｐａｉｎ、２０１４；Ｐｉｅｒｉら、「Ａｌｔｅｒｅｄ ｅｘｃｉｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｍｏｔｏｒ ｎｅｕｒｏｎｓ ｉｎ ａ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｆａｍｉｌｉａｌ ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ ｌａｔｅｒａｌ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ」、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．、２００３；Ｗａｉｎｇｅｒら、「Ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｈｙｐｅｒｅｘｃｉｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ ｌａｔｅｒａｌ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ ｐａｔｉｅｎｔ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｍｏｔｏｒ ｎｅｕｒｏｎｓ」、Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．、２０１４）。過剰興奮した運動ニューロンは容易に脱分極し、疲労状態となり、最終的には死んで、それらの運動ニューロンにより支配される筋肉の衰弱及びまひを引き起こすことが前提となる。神経伝導試験を用いたヒトの神経生理学的な研究が、ＡＬＳの特発型及び家族型の両方において運動ニューロンの軸索過剰興奮性を実証し（Ｂｏｓｔｏｃｋら、「Ａｘｏｎａｌ ｉｏｎ ｃｈａｎｎｅｌ ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ ｌａｔｅｒａｌ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ」、Ｂｒａｉｎ、１９９５；Ｖｕｃｉｃ及びＫｉｅｒｎａｎ、「Ｕｐｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔ ｓｏｄｉｕｍ ｃｏｎｄｕｃｔａｎｃｅｓ ｉｎ ｆａｍｉｌｉａｌ ＡＬＳ」、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ、２０１０）、過剰興奮性が他のＡＬＳサブタイプにおいても報告され（Ｂｌａｉｒら、「ＦＵＳ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ ｌａｔｅｒａｌ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ：ｃｌｉｎｉｃａｌ， ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ， ｎｅｕｒｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ ｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ」、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ、２０１０；Ｗｉｌｌｉａｍｓら、「Ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｓｉｇｈｔｓ ｉｎｔｏ ＡＬＳ ｗｉｔｈ Ｃ９ＯＲＦ７２ ｅｘｐａｎｓｉｏｎｓ」、 Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ、２０１３）、これらは運動ニューロンの過剰興奮性が異なるＡＬＳの異型に渡って一貫して見られることを示唆する。皮質過剰興奮性もまたＡＬＳにおいて示され、筋力低下の発症に先行するＡＬＳの初期の特徴である（Ｖｕｃｉｃ及びＫｉｅｒｎａｎ、「Ａｘｏｎａｌ ｅｘｃｉｔａｂｉｌｉｔｙ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｉｎ ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ ｌａｔｅｒａｌ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ」、Ｃｌｉｎ．Ｎｅｕｒｏｐｈｙｓｉｏｌ．、２００６；Ｖｕｃｉｃら、「Ｃｏｒｔｉｃａｌ ｈｙｐｅｒｅｘｃｉｔａｂｉｌｉｔｙ ｍａｙ ｐｒｅｃｅｄｅ ｔｈｅ ｏｎｓｅｔ ｏｆ ｆａｍｉｌｉａｌ ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ ｌａｔｅｒａｌ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ」、Ｂｒａｉｎ、２００８）。
【0008】
[007]我々のグループは２０１９年に、特定のニューロン共輸送体の過剰発現と、運動ニューロンの過剰興奮性とやはり関連する状態である痙性の発生の間の最初の直接的な関係性を報告した（Ｍｅｋｈａｅｌら、「Ｒｅｐｅａｔｅｄ ａｎｏｄａｌ ｔｒａｎｓ－ｓｐｉｎａｌ ｄｉｒｅｃｔ ｃｕｒｒｅｎｔ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎ ｌｏｎｇ－ｔｅｒｍ ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｐａｓｔｉｃｉｔｙ ｉｎ ｍｉｃｅ ｗｉｔｈ ｓｐｉｎａｌ ｃｏｒｄ ｉｎｊｕｒｙ」、Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２０１９）。このＮａ－Ｋ－Ｃｌ共輸送体（ＮＫＣＣ１）は運動ニューロンにおいて見出され、塩化物イオン勾配の維持に関与する。我々は、脊髄損傷の動物モデルにおいてＮＫＣＣ１が損傷後に高くなり、ニューロンの過剰興奮性及び痙性の増大をもたらすことを報告した。我々は、我々の非侵襲性多部位ニューロモデュレーション技術による刺激がＮＫＣＣ１を抑制し、痙性を低減したことを報告した。
【0009】
[008]我々は本明細書において、ＳＯＤ１－Ｇ９３ＡマウスにおいてはＮＫＣＣ１が高くなり、我々の非侵襲性多部位ニューロモデュレーション技術による刺激が、高くなったＮＫＣＣ１レベルの低減をもたらし、それにより塩化物イオン勾配を正常化することでニューロンの過剰興奮性が低減することを記載する。我々は本明細書において、刺激後の脊髄運動ニューロンにおける更なる生化学的な変化、並びに刺激がＳＯＤ１－Ｇ９３Ａマウスにおいて震えの低減、疾患進行の遅延、運動機能の改善、脊髄運動ニューロンの維持の増大、及び生存の増加をもたらすという知見を更に記載する。
【発明の概要】
【0010】
[009]１つ以上の実施形態において、本発明は、直流（ＤＣ）源を、ヒト及び他の感覚のある生き物を含めた動物の神経軸に沿った多数の位置に付与することによって、筋萎縮性側索硬化症及び関連する疾患を治療する方法、装置、並びにシステムに関する。直流を付与する位置は、脊柱、末梢神経、及び頭蓋を含む。
【0011】
[010]我々の近年の研究は、ＡＬＳと運動ニューロンの過剰興奮性の間の重要な関係性を証明した。我々は、過剰興奮した脊髄運動ニューロンを抑制するため、非侵襲性ニューロモデュレーションの一形態である多部位ＤＣＳ（直流刺激）を用いた新たな非侵襲性アプローチを開発した。
【0012】
[011]２０１９年３月２２日に出願された国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０２３６７５（公開番号ＷＯ２０１９／１８３５３６）において、我々は、特定のニューロン共輸送体（ＮＫＣＣ１）の過剰発現と、運動ニューロンの過剰興奮性と関連する別の状態である痙性の発生の間の最初の直接的な関係性を開示している。このＮａ－Ｋ－Ｃｌ共輸送体（ＮＫＣＣ１）は運動ニューロンにおいて見出され、塩化物イオン勾配の維持に関与する。我々は、我々の非侵襲性の治療介入がＮＫＣＣ１レベルを抑制し、痙性を低減することを報告した。ＷＯ２０１９／１８３５３６の内容は、本明細書によって本願に援用される。
【0013】
[012]国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／１８１６７（公開番号ＷＯ２０１６／１３３９６０）において、我々は、ＡＬＳの治療に対する我々のＤＣＳに基づいた治療介入の出願を開示している。ＷＯ２０１６／１３３９６０の内容は、本明細書によって本願に援用される。
【0014】
[013]我々はまた、我々の非侵襲性多部位ＤＣＳアプローチを脳卒中における上肢痙性に適用する我々のヒトへのパイロット研究を公開し、５週間持続した痙性の著しい低減及び運動機能の改善を見出し、安全性を実証した。（Ｐａｇｅｔ－Ｂｌａｎｃ ２０１９）。
【0015】
[014]概して、本発明は、経脊髄直流刺激（ｔｓＤＣＳ）を組み込んだ多部位ＤＣＳの新たな付与を利用した、ＡＬＳ及び関連する疾患を治療するための新たな方法、装置、並びにシステムに関する。結果として、ニューロンの過剰興奮性を抑制し、ＡＬＳの臨床症状の進行を低減又は防止する。特に、我々は、運動ニューロンの過剰興奮性を抑制する様式での非侵襲性ニューロモデュレーションを用いた、ＡＬＳの進行を遅延させる全く新しいアプローチを見出した。
【0016】
[015]我々はＳＯＤ１－Ｇ９３Ａマウス群体を確立し、このトランスジェニックＡＬＳモデルを多部位ＤＣＳの効果を特徴付ける前臨床試験に利用した。我々の技術により非侵襲的に治療されたＳＯＤ１－Ｇ９３Ａマウスにおいて、我々は、震えの低減、疾患進行の遅延、運動機能の改善、脊髄運動ニューロンの維持の増大、及び生存の増加を示した。
【0017】
[016]我々は、ＳＯＤ１－Ｇ９３ＡモデルにおいてＮＫＣＣ１が過剰発現され、ＳＯＤ１が過剰発現され、ＨＳＰ７０が低減され、リン酸化ｔａｕが過剰発現されることを見出した。我々は、陽極多部位ＤＣＳによる刺激が介入部位でのＮＫＣＣ１の抑制をもたらすことを見出した。更に、我々は、陽極多部位ＤＣＳによる刺激が脊髄におけるＳＯＤ１の減少、ＨＳＰ７０の増加、ＬＣＢ３発現の上方調節、及びリン酸化ｔａｕの減少をもたらすことを見出した。我々の新たな発明は、ＡＬＳの痙性の低減だけではなくヒトにおけるＡＬＳの進行を遅延させるために好ましく適用される。
【0018】
[017]本開示は、好ましくは運動ニューロンの過剰興奮性を抑制する様式での非侵襲性多部位ニューロモデュレーションを用いた、ＡＬＳの進行を治療及び遅延させる全く新しいアプローチを教示する。
【0019】
[018]本開示の他の特徴及び利益は、その好ましい実施形態の以下の記載及び特許請求の範囲から明らかとなる。別に定義されなければ、本明細書で用いられるすべての技術的用語及び科学的用語は、本開示が属する分野の当業者により一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本開示の実施又は試験において本明細書に記載されたものと同様又は同等の方法及び材料を用いることができるが、適切な方法及び材料が以下に記載される。本明細書に記載されたすべての公開された外国特許及び外国特許出願が本明細書に援用される。本明細書に記載されたすべての他の公開された参考文献、文書、原稿、及び科学文献が本明細書に援用される。更に、材料、方法、及び実施例は例示にすぎず、限定するものであることを意図されない。
【0020】
[019]適用可能な場合又は明確には放棄されていない場合、本明細書に記載された実施形態のうちのいずれか１つは、実施形態が本開示の異なる態様の下に記載されるとしても、いずれかの他の１つ以上の実施形態と組み合わせることができるものと考えられる。
【0021】
[020]これら及び他の実施形態が、以下の詳細な説明により開示及び／又は包含される。
[021]例として与えられるものの本開示を記載された特定の実施形態のみに限定することを意図されない以下の詳細な記載は、添付の図面とあわせて最も良く理解される。
[021]例として与えられるものの本開示を記載された特定の実施形態のみに限定することを意図されない以下の詳細な記載は、添付の図面とあわせて最も良く理解される。
【図面の簡単な説明】
【0022】
【図1】[022]図１Ａ～１Ｃは、マウスにおける多部位ＤＣＳ刺激の設定を示す。図１Ａは、マウスが脊柱に沿って配置された３つの電極、２つの座骨神経電極、及び腹部の戻り電極を有する、刺激の設定を記載する。この電極の配列の背後にある根拠は、脊髄を渡って、及び下肢を下って電流を送ることである。図１Ｂは、同等の電気回路を示す。図１Ｃは、筋肉抵抗及びＥＭＧの記録を可能にしながらマウスが刺激を受けることができるようにする、マウスホルダーを示す。
【図2】[023]図２Ａ～２Ｂは、ＳＯＤ１－Ｇ９３Ａマウスにおける伸展反射の筋肉抵抗及びＥＭＧ反応に対する陽極ＤＣＳの３セッションの効果を示す。図２Ａはマウスホルダーの動物を示す。図２Ｂ（上）は、陽極多部位ＤＣＳによる刺激前に記録された筋肉抵抗及びＥＭＧ出力を示す。図２Ｂ（下）は、１日当たり５０分間付与された陽極多部位ＤＣＳの３セッション後に記録された筋肉抵抗及びＥＭＧ出力を示す。
【図3】[024]図３Ａ～３Ｂは、症状の発現後のＳＯＤ１－Ｇ９３Ａマウスにおける伸展へのＥＭＧ反応に対する陽極多部位ＤＣＳの即時及び持続的な効果を示す。図３Ａは、陽極多部位ＤＣＳ（陽極で１．５ｍＡ、Ｔ９～Ｌ６に配置。ＥＭＧは後肢の下腿三頭筋から記録された）による刺激の前及び間に得られた２乗平均平方根の（緑）及び加工していない（ピンク）ＥＭＧ出力を示す。疾患発症後のＥＭＧ出力において筋活動の増大が見られる。高いレベルの活動は刺激開始すぐに抑制され、スパイク振幅が低減される。図３Ｂは、それぞれの毎日のセッションが５０分持続する陽極多部位ＤＣＳによる刺激の３日後に得られた２乗平均平方根の（緑）及び加工していない（ピンク）ＥＭＧ出力を示す。ＥＭＧスパイクの振幅及び振動数は刺激が付与されない場合でも低減され、治療の持続的な効果を示している。
【図4】[025]図４は、ＳＯＤ１－Ｇ９３Ａマウスの後肢の震えに対する陽極多部位ＤＣＳの即時の効果を示す。ＡＬＳマウスは、症状の発現後に震え及びけいれんを示す。これらの震えは、マイクロゴニオメーター又は力変換器のいずれかを用いて測定することができる。図４（上）は、マイクロゴニオメーターを用いて記録された左後足の震えを示す。図４（中）は、力変換器を用いて記録された右後足の震えを示す。図４（下）は、右後肢の下腿三頭筋の震えのＥＭＧ出力を示す。すべての３つのプロットにおいて、斜線部分は陽極多部位ＤＣＳの付与前に対応する。震え及びけいれんは、両側で刺激開始直後に抑制される。この強化はすべての測定方法を用いて見ることができる。
【図5】[026]図５は、症状の発現後のＳＯＤ１－Ｇ９３Ａマウスにおける無意識の筋収縮及び震えに対する陽極多部位ＤＣＳの持続的な効果を示す。上から下まで、図は、刺激前、刺激の間、刺激の２日後及び刺激の３日後に測定された（青の）ＥＭＧ出力及び（力変換器により記録された黒の）力測定を示す。震えは刺激の間にすぐに抑制される。刺激の２日後に測定された活性は、震えの更なる低減を示す。刺激の３日後、震え及び筋けいれんは刺激なしでも更に低減される。
【図6】[027]図６は、陽極多部位ＤＣＳ後のＳＯＤ１－Ｇ９３Ａマウスにおける運動機能の改善を示す。刺激されたキャリアマウス及び刺激なしのキャリアマウス並びに非キャリアマウスにおいて、０～６のスコア基準（６は完全なスコアであり、手足の掌の中央部が横木に配置されて動物の全重量を負う）を有する改良された水平梯子スコアシステムを用いて運動機能を評価した。マウスを下からビデオ録画し、ビデオを保管してマウスの治療を知らない調査者により分析した。マウスは１週間当たり２日間、１日当たり１時間の刺激を受け、１．５ｍＡが脊髄陽極により送られた。刺激は、この群において平均で１０６日の年齢の疾患発症後に開始した。刺激なしのＡＬＳマウスのグリッドウォーキングスコアは、非キャリアコントロール（黒）と比較して疾患発症後にすぐに低下する（青）。刺激されたキャリアマウス（赤）では、グリッドウォーキングスコアは刺激なしのキャリアマウスのスコアよりも顕著に高く、刺激後の運動機能の保護の高まりを反映している。Ｎ＝２の非キャリア、４の刺激されたキャリア、２の刺激なしのキャリア。データは平均±ＳＥＭとして示される。
【図7】[028]図７Ａ～７Ｆは、ＳＯＤ１－Ｇ９３Ａマウスにおける陽極多部位ＤＣＳ後の脊髄運動ニューロンにおけるＮＫＣＣ１発現を示す。ＮＫＣＣ１は、塩化物イオン勾配の維持に関与するニューロンの塩化物イオン共輸送体である。ＮＫＣＣ１の過剰発現は、運動ニューロンの過剰興奮性をもたらす。非キャリアマウス（図７Ａ）、刺激なしのキャリアマウス（図７Ｂ）、刺激されたキャリアマウス（図７Ｃ）並びに同じ動物の腰部及び頸部の運動ニューロン（図７Ｄ及び７Ｅ）において、免疫化学検査を用いてＮＫＣＣ１発現を評価した。（緑の）ＮＫＣＣ１発現は、非キャリアコントロールマウスと比較して刺激なしのＡＬＳマウスにおいて増大され、多部位陽極ＤＣＳにより低減される。刺激を受ける動物では、ＮＫＣＣ１発現は、電極の部位（腰部）の下部で低減される。図７Ｆは、３つの群に渡るＮＫＣＣ１の相対発現レベルを示す。
【図8】[029]図８Ａ～８Ｆは、陽極多部位ＤＣＳにより治療されたＳＯＤ１－Ｇ９３Ａマウスにおける低減されたＳＯＤ１発現を示す。ＡＬＳマウスは変異ＳＯＤ１（ｍＳＯＤ１）タンパク質を過剰発現し、病理学的な凝集をもたらす。図８Ａ～８Ｅは、治療された動物及び治療されていない動物の脊髄の顕微鏡写真である。図８Ｆは、刺激なしのキャリアと比較した刺激されたキャリア動物における顕著に低いｍＳＯＤ１発現を示す。Ｎ＝コントロール：４匹の動物から８枚の薄片；刺激：５匹の動物から５枚の薄片。
【図9】[030]図９は、ＨＳＰ７０発現が非キャリア動物と比較してキャリア動物において低減され、ＳＯＤ１－Ｇ９３Ａマウスにおける陽極多部位ＤＣＳによる刺激後にキャリア動物において増大されることを示す。ＨＳＰ７０は、分解経路により基質の流れを促進することが知られているシャペロンタンパク質である。ＩｍａｇＪを用いて単一の脊髄運動ニューロンのＨＳＰ７０免疫蛍光強度を計算した。脊髄におけるＨＳＰ７０レベルは、コントロールマウス（左上）と比較して刺激なしのキャリアマウス（左下）において顕著に低減されるが、刺激後のキャリアマウス（右上）において顕著に増大される。これらの知見を棒グラフに要約する（右下；Ｎ＝刺激：４匹の動物から２７の運動ニューロン；コントロール：３匹の動物から１９の運動ニューロン）。
【図10】[031]図１０は、リン酸化ｔａｕタンパク質（ｐｈＴａｕ）レベルに対する陽極多部位ＤＣＳの効果を示す。ＡＬＳにおいてはリン酸化ｔａｕの増加が報告されてきた（Ｓｔｅｖｅｎｓら、「Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｔａｕ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｍｏｔｏｒ ｎｅｕｒｏｎｓ ｆｒｏｍ ｃｌｉｎｉｃａｌｌｙ ｐｕｒｅ ｓｐｏｒａｄｉｃ ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ ｌａｔｅｒａｌ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ ｐａｔｉｅｎｔｓ」、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．、２０１９）。非キャリアと比較して、刺激なしのキャリアマウスにおいてより多くのｐｈＴａｕが見られる。陽極多部位ＤＣＳによる治療が、キャリアマウスにおけるｐｈＴａｕレベルを低減させた。
【図11】[032]図１１は、ＳＯＤ１－Ｇ９３ＡマウスにおけるＬＣ３Ｂの発現に対する陽極多部位ＤＣＳの効果を示す。ＬＣ３Ｂは、自食作用活性のタンパク質マーカーである。自食作用の異常調節がＡＬＳと関連しており、ＬＣ３Ｂの減少は、毒性タンパク質の異常な蓄積後の運動ニューロンの分解の加速をもたらし得る。ＬＣ３Ｂ発現は、刺激なしのキャリアマウス（コントロール）と比較して刺激後のキャリアマウスにおいて増大される。
【図12】[033]図１２は、ＳＯＤ１－Ｇ９３Ａマウスの脊髄運動ニューロンの生存に対する陽極多部位ＤＣＳの効果を示す。同胞ＳＯＤ１－Ｇ９３Ａマウスを刺激される群及び刺激なしの群に分けた。刺激されたマウスは、疾患発症後に５連続の毎日の６０分の治療を受けた。疾患発症後１０日目にマウスを犠牲にした。マウス当たり２枚の薄片を摘出した後、運動ニューロンをカウントした。顕微鏡写真は、それぞれの例のマウスの同じ薄片の４つの部分を示す。刺激は、刺激なしのキャリアと比較して、刺激後、より大きなアルファ運動ニューロンの保護、及び全体で３４．８％の運動ニューロンのカウントの増加をもたらした。
【図13】[034]図１３は、症状の発現直後に治療が始まる（治療的刺激の枠組み）場合のＳＯＤ１－Ｇ９３Ａマウスの生存に対する陽極多部位ＤＣＳの効果を示すＫａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒプロットである。症状の発現は、グリッドウォーキング試験における８０以下のスコアとして定義された。刺激されたキャリアマウスは平均で２０．５日（±２．１日）間生存し、一方で刺激なしのキャリアマウスは平均で１１．１日（±１．２日）間生存し、刺激されたマウスの疾患発症後の平均生存時間が８４％の増大となった。Ｎ＝１９の刺激されたマウス；２３の刺激なしのマウス。Ｌｏｇ Ｒａｎｋ（Ｍａｎｔｅｌ－Ｃｏｘ）、カイ２乗＝１３．８６、ｐ＝０．０００２；Ｂｒｅｓｌｏｗ（一般化Ｗｉｌｃｏｘｏｎ）カイ２乗＝１２．２５、ｐ＝０．０００５；Ｔａｒｏｎｅ－Ｗａｒｅ、カイ２乗＝１３．１２、ｐ＝０．０００３。
【図14】[035]図１４は、多部位ＤＣＳを付与する制御ユニット並びに脊柱及び四肢の末梢神経に沿って適用される皮膚表面電極からなる、ＡＬＳの治療のための新たな過剰興奮性抑制アプローチの実施形態を説明する。
【発明を実施するための形態】
【0023】
[038]これらの教示の範囲は添付の特許請求の範囲により定義されるのが最も良いことから、説明は限定的な意味で理解されるものではなく、単にこれらの教示の一般原則を説明する目的のためになされる。
【0024】
[039]上記の説明及び更なる実施形態が、具体的に番号付けされたコンポーネントが記載されており、従って本開示のすべての図に記載されていると理解される、以下の図面とあわせて以下に記載される。
【0025】
[040]本明細書で用いられる場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」及び「その（ｔｈｅ）」は、その内容が明らかに他のものを示さない限り、複数の言及を含む。
【0026】
[041]本明細書で用いられる場合、用語「刺激」とは、上方調節又は下方調節とも呼ばれる、神経線維の興奮又は抑制のいずれかを言う。
[042]本明細書で用いられる場合、用語「電気刺激」とは、電圧をかけることによるか磁気的に電流を誘導することによるかにかかわらず、脊髄神経、ニューロン、回路又は経路への電流の生成又は導入を言う。
[042]本明細書で用いられる場合、用語「電気刺激」とは、電圧をかけることによるか磁気的に電流を誘導することによるかにかかわらず、脊髄神経、ニューロン、回路又は経路への電流の生成又は導入を言う。
【0027】
[043]直流刺激（ＤＣＳ）は、哺乳動物における疾患及び障害、特に脊椎動物の神経系に影響を及ぼす疾患及び障害を治療するために直流を用いることを包含する、非侵襲性ニューロモデュレーション方法論である。ＤＣＳは、経脊髄直流刺激（ｔｓＤＣＳ）、経頭蓋直流刺激（ｔｃＤＣＳ）、及び経末梢神経直流刺激（ｔｐｎＤＣＳ）を含む。
【0028】
[044]経脊髄直流刺激（ｔｓＤＣＳ）は、脊髄ニューロン及び脊髄路を調節するために直流を用いる非侵襲性ニューロモデュレーション方法論である。ｔｓＤＣＳは、脊髄ニューロン内の特定のタンパク質の発現を誘導又は抑制することができる。特定のタンパク質の発現を調節することで、疾患の症状、例えば痙性、筋緊張亢進、及びジストニアに影響を与えることができ、ニューロンの過剰興奮性と関連する疾患の進行に影響を与えることができる。
【0029】
[045]本発明の実施形態によれば、ｔｓＤＣＳは、標的とする脊髄の位置の刺激を含む。刺激は、標的とする脊髄の位置を含む規定された電流路に沿って直流を付与することを含む。１つの例示的実施形態では、刺激が、閾値下レベルで実質的に連続的で非変動である。別の例示的実施形態では、刺激が全体的に又は部分的に変動する。別の例示的実施形態では、刺激が、変動する刺激及び非変動の刺激の組み合わせを含む。別の例示的実施形態では、刺激が、刺激のパルスを含む。更に別の例示的実施形態では、刺激が、電流が単一方向ではない連続的な電流刺激のパルスを含む。
【0030】
[046]経頭蓋直流刺激（ｔｃＤＣＳ）は、脳及び皮質経路のニューロン及びグリア細胞を調節するために直流を用いる非侵襲性ニューロモデュレーション方法論である。ｔｃＤＣＳは、脳のニューロン内及び他の細胞内の特定のタンパク質の発現を誘導又は抑制することができる。特定のタンパク質の発現を調節することは、ＡＬＳ、他の運動ニューロン疾患及びアルツハイマー病を含む、ＣＮＳの一定の神経疾患及び神経障害を治療するために回復効果があり得る。
【0031】
[047]本発明の実施形態によれば、ｔｃＤＣＳは、標的とする頭蓋の位置の刺激を含む。刺激は、標的とする頭蓋の位置を含む規定された電流路に沿って直流を付与することを含む。１つの例示的実施形態では、刺激が、閾値下レベルで実質的に連続的で非変動である。別の例示的実施形態では、刺激が全体的に又は部分的に変動する。別の例示的実施形態では、刺激が、変動する刺激及び非変動の刺激の組み合わせを含む。別の例示的実施形態では、刺激が、刺激のパルスを含む。更に別の例示的実施形態では、刺激が、電流が単一方向ではない連続的な電流刺激のパルスを含む。
【0032】
[048]末梢直流刺激（ｐＤＣＳ）は、末梢神経を調節するために直流を用いる非侵襲性ニューロモデュレーション方法論である。ｐＤＣＳは、末梢神経内及び周辺細胞内の特定のタンパク質の発現を誘導又は抑制することができ、その神経の下行信号及び上行信号を伝える能力に影響を及ぼすことができる。特定のタンパク質の発現を調節することは、ＡＬＳ及び他の運動ニューロン疾患を含めた一定の神経障害の治療に用いることができる。
【0033】
[049]本発明の実施形態によれば、ｐＤＣＳは、標的とする末梢神経の位置の刺激を含む。刺激は、標的とする末梢神経の位置を含む規定された電流路に沿って直流を付与することを含む。１つの例示的実施形態では、刺激が、閾値下レベルで実質的に連続的で非変動である。別の例示的実施形態では、刺激が全体的に又は部分的に変動する。別の例示的実施形態では、刺激が、変動する刺激及び非変動の刺激の組み合わせを含む。別の例示的実施形態では、刺激が、刺激のパルスを含む。更に別の例示的実施形態では、刺激が、電流が単一方向ではない連続的な電流刺激のパルスを含む。
【0034】
[050]「多部位ＤＣＳ」とは、神経軸に沿った多数の部位への同時の直流刺激の付与を言い、ｔｓＤＣＳ、ｔｃＤＣＳ、及びｐＤＣＳを含むことができる。
[051]本発明を行う際には、電極又は電極の配列が直流源に接続され、目的とする領域に、例えば、脊髄の背側面に渡って直接若しくはその近く、頭蓋、又は末梢神経若しくはその近くのいずれかに配置される。戻りの電極又は電極の配列は、そこから遠くに配置されて電流路を規定し、目的とする領域に配置された電極と正反対の身体の腹側面に実際はあり得るが、必ずしもそうではない。機能及び望まれる刺激に応じて、直流が、陽極又は陰極のいずれかとして目的とする領域に配置された治療電極に付与される。
[051]本発明を行う際には、電極又は電極の配列が直流源に接続され、目的とする領域に、例えば、脊髄の背側面に渡って直接若しくはその近く、頭蓋、又は末梢神経若しくはその近くのいずれかに配置される。戻りの電極又は電極の配列は、そこから遠くに配置されて電流路を規定し、目的とする領域に配置された電極と正反対の身体の腹側面に実際はあり得るが、必ずしもそうではない。機能及び望まれる刺激に応じて、直流が、陽極又は陰極のいずれかとして目的とする領域に配置された治療電極に付与される。
【0035】
[052]以下の用語は、本明細書で提供された発明の実施形態の非限定的な記載による様々な説明において、少なくとも以下の定義を有することが理解され得る。
[053]「陰極刺激」とは、陰極が治療のための目的とする望ましい領域に配置されているＤＣＳを言う。
[053]「陰極刺激」とは、陰極が治療のための目的とする望ましい領域に配置されているＤＣＳを言う。
【0036】
[054]「陽極刺激」とは、陽極が治療のための目的とする望ましい領域に配置されているＤＣＳを言う。
[055]「痙性」は、伸展反射の速度依存的な活動亢進として定義される。従って、痙性とは、一定の筋肉が連続的又は散発的に収縮している症状を言う。この収縮は筋肉の凝り又は緊張を引き起こし、正常な動作、会話及び歩行を妨げ得るものであり、痛みを伴うものとなり得る。痙性は通常、脳又は脊髄の領域への損傷により引き起こされる。損傷が神経系と筋肉の間の信号の均衡の変化を引き起こす。この不均衡が筋肉の活動の増大をもたらす。
[055]「痙性」は、伸展反射の速度依存的な活動亢進として定義される。従って、痙性とは、一定の筋肉が連続的又は散発的に収縮している症状を言う。この収縮は筋肉の凝り又は緊張を引き起こし、正常な動作、会話及び歩行を妨げ得るものであり、痛みを伴うものとなり得る。痙性は通常、脳又は脊髄の領域への損傷により引き起こされる。損傷が神経系と筋肉の間の信号の均衡の変化を引き起こす。この不均衡が筋肉の活動の増大をもたらす。
【0037】
[056]「筋緊張亢進」とは、秩序のない脊髄反射、筋紡錘の興奮性の増大、及びシナプス抑制の低減を生じさせる、損傷した運動ニューロンの下行経路を制御する正常に機能しない能力を言う。これらの結果は、症状を示す筋肉の筋緊張の異常な増大をもたらす。筋緊張亢進は、伸展反射活動亢進のない筋緊張の増大を示す患者を含み、これにより、痙性と筋緊張亢進を区別する。
【0038】
[057]「タンパク質発現」とは、細胞若しくは組織に含まれるか又は細胞若しくは組織により生成された、タンパク質若しくはペプチド（例えば分泌されたタンパク質若しくはペプチド）のレベル又は量を言う。「発現差異」、「タンパク質発現差異」、及び「異なって発現された」とは、細胞若しくは組織に含まれるか又は細胞若しくは組織により生成された、タンパク質若しくはペプチドのレベル又は量の変化を言う。タンパク質発現の変化は、特定の外部信号、例えば化学的信号、機械的信号、又は直流刺激に反応して起こり得る。そのような発現の変化は、細胞若しくは組織に含まれるか又は細胞若しくは組織により生成された、タンパク質若しくはペプチドのレベル又は量の増加であっても減少であってもよい。タンパク質若しくはペプチドのレベル又は量の増加はまた「上方調節」とも呼ばれ、タンパク質若しくはペプチドのレベル又は量の減少はまた「下方調節」とも呼ばれる。
【0039】
[058]「メッセンジャーＲＮＡ発現」（「ｍＲＮＡ発現」）とは、細胞若しくは組織に含まれるｍＲＮＡのレベル又は量を言う。「発現差異」、「ｍＲＮＡ発現差異」、「遺伝子発現差異」、及び「異なって発現された」とは、細胞若しくは組織に含まれるｍＲＮＡのレベル又は量の変化を言う。ｍＲＮＡ又は遺伝子発現の変化は、特定の外部信号、例えば化学的信号、機械的信号、又は直流刺激に反応して起こり得る。そのような発現の変化は、細胞若しくは組織に含まれるｍＲＮＡのレベル又は量の増加であっても減少であってもよい。ｍＲＮＡのレベル又は量の増加はまた「上方調節」とも呼ばれ、ｍＲＮＡのレベル又は量の減少はまた「下方調節」とも呼ばれる。用語「ｍＲＮＡ発現」及び「遺伝子発現」は、本開示を通して交換可能に用いられる。
【0040】
[059]運動ニューロン疾患とは、運動ニューロンに影響を及ぼす一定の神経疾患を言い、筋萎縮性側索硬化症、原発性側索硬化症、進行性筋萎縮症、進行性球まひ、脊髄性筋萎縮症、及びポリオ後症候群を含む。
【0041】
[060]本発明は、多部位ＤＣＳの付与が、疾患の症状を治療すること及び疾患の進行を遅延させることの両方により、ＡＬＳ及び他の運動ニューロン疾患の患者において有益であり得るという仮説を支持する。
【0042】
[061]Ｎａ－Ｋ－Ｃｌ共輸送体アイソフォーム１（ＮＫＣＣ１）及びＫ－Ｃｌ共輸送体アイソフォーム２（ＫＣＣ２）は、神経細胞膜を横切る塩化物イオン（Ｃｌ－）濃度勾配の確立及び維持に関与する（Ｍｉｓｇｅｌｄら、「Ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｃｈｌｏｒｉｄｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｉｎ ｐｏｓｔｓｙｎａｐｔｉｃ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ ｎｅｕｒｏｎｓ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９８６）。ＧＡＢＡ－Ａ及びグリシン受容体により仲介される抑制強度の決定においては電気学的なＣｌ－勾配が重要であるため、ＮＫＣＣ１及びＫＣＣ２のタンパク質レベル又は活性の不均衡は、過剰興奮性及び筋肉の機能不全、特に痙性を引き起こすことが予測された（Ｂｏｕｌｅｎｇｕｅｚら、「Ｄｏｗｎ－ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｐｏｔａｓｓｉｕｍ－ｃｈｌｏｒｉｄｅ ｃｏｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ ＫＣＣ２ ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｓ ｔｏ ｓｐａｓｔｉｃｉｔｙ ａｆｔｅｒ ｓｐｉｎａｌ ｃｏｒｄ ｉｎｊｕｒｙ」、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．、２０１０；Ｍｏｄｏｌら、「Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ｏｆ ＮＫＣＣ１ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ａｖｏｉｄｓ ｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＫＣＣ２ ｉｎ ｃｅｎｔｒａｌ ｓｅｎｓｏｒｙ ｐａｔｈｗａｙｓ ａｎｄ ｒｅｄｕｃｅｓ ｎｅｕｒｏｐａｔｈｉｃ ｐａｉｎ ａｆｔｅｒ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｎｅｒｖｅ ｉｎｊｕｒｙ」、Ｐａｉｎ、２０１４）。脊髄又は脳の興奮性への直流刺激の長期的効果の基礎となる作用のメカニズムは、ほとんど知られていない。ｔｓＤＣＳが脊髄回路の興奮性の長期的な変化を引き起こし得ることが提案されてきた（Ａｈｍｅｄ、「Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｐｉｎｏ－ｓｃｉａｔｉｃ ａｎｄ ｃｏｒｔｉｃｏ－ｓｃｉａｔｉｃ ａｓｓｏｃｉａｔｉｖｅ ｐｌａｓｔｉｃｉｔｙ：ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｂｙ ｔｒａｎｓ－ｓｐｉｎａｌ ｄｉｒｅｃｔ ｃｕｒｒｅｎｔ ａｎｄ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｎ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ａｆｔｅｒ ｓｐｉｎａｌ ｃｏｒｄ ｉｎｊｕｒｙ ｉｎ ｍｉｃｅ」、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、２０１３；Ａｈｍｅｄ、「Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｃａｔｈｏｄａｌ ｔｒａｎｓ－ｓｐｉｎａｌ ｄｉｒｅｃｔ ｃｕｒｒｅｎｔ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｎ ｌｏｗｅｒ ｕｒｉｎａｒｙ ｔｒａｃｔ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ｎｏｒｍａｌ ａｎｄ ｓｐｉｎａｌ ｃｏｒｄ ｉｎｊｕｒｙ ｍｉｃｅ ｗｉｔｈ ｏｖｅｒａｃｔｉｖｅ ｂｌａｄｄｅｒ」、Ｊ．Ｎｅｕｒａｌ．Ｅｎｇ．、２０１７；Ｂｏｌｚｏｎｉ及びＪａｎｋｏｗｓｋａ、「Ｐｒｅｓｙｎａｐｔｉｃ ａｎｄ ｐｏｓｔｓｙｎａｐｔｉｃ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｌｏｃａｌ ｃａｔｈｏｄａｌ ＤＣ ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈｉｎ ｔｈｅ ｓｐｉｎａｌ ｃｏｒｄ ｉｎ ａｎａｅｓｔｈｅｔｉｚｅｄ ａｎｉｍａｌ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ」、Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．、２０１５；Ｓａｍａｄｄａｒら、「Ｔｒａｎｓｓｐｉｎａｌ ｄｉｒｅｃｔ ｃｕｒｒｅｎｔ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｍｏｄｕｌａｔｅｓ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｄｕｌｔ ｎｅｗｌｙ ｂｏｒｎ ｓｐｉｎａｌ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｍｉｃｅ」、Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．、２０１６；Ｓｏｎｇら、「Ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｍｏｔｏｒ ｃｏｒｔｅｘ ａｎｄ ｓｐｉｎａｌ ｃｏｒｄ ｎｅｕｒｏｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｃｏｒｔｉｃｏｓｐｉｎａｌ ｓｙｓｔｅｍ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｎｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｐｌａｓｔｉｃｉｔｙ ａｎｄ ｍｏｔｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｆｔｅｒ ｉｎｊｕｒｙ」、Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．、２０１６；Ｗｉｅｒａｓｚｋｏ及びＡｈｍｅｄ、「Ｄｉｒｅｃｔ ｃｕｒｒｅｎｔ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｃａｌｃｉｕｍ ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｎｅｕｒｏｎａｌ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ」、Ｎｅｕｒａｌ．Ｐｌａｓｔ．、２０１６）。我々の近年の知見は、直流刺激が一定のタンパク質の発現レベルを調節し得ることを示す。従って、本発明は、脊髄におけるＮＫＣＣ１、ＳＯＤ１、ＨＳＰ７０、ＬＣＢ３、ｔａｕのタンパク質発現の変化へのｔｓＤＣＳを含む多部位ＤＣＳの効果の研究、並びに筋肉ＥＭＧ、震え、運動機能、運動ニューロンの生存、及び動物の生存への多部位ＤＣＳの効果の研究を行った。
【0043】
[062]ＳＯＤ１－Ｇ９３Ａマウスへの多部位ＤＣＳの影響を明らかにするため、電気生理学、自発運動分析、及び生存研究の組合せが用いられた。更に、マウス由来の刺激された脊髄組織におけるＮＫＣＣ１、ＳＯＤ１、ｔａｕ、ＨＳＰ７０、及びＬＣ３Ｂのタンパク質発現並びに／又は遺伝子発現の変化を同定するため、定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）、ウエスタンブロッティング、及び免疫組織化学検査が行われた。
【0044】
[063]本発明の例示的実施形態は、運動ニューロンの疾患若しくは障害を治療することを含むか、又はＮＫＣＣ１、ＳＯＤ１、若しくはｔａｕの高度な発現に関連付けられている。そのような疾患及び障害の代表例は、筋萎縮性側索硬化症、原発性側索硬化症、進行性筋萎縮症、進行性球まひ、脊髄性筋萎縮症、ポリオ後症候群、パーキンソン病、及びアルツハイマー病を含む。
【0045】
[064]本発明の例示的実施形態は、ＮＫＣＣ１の遺伝子発現レベル及び／若しくはタンパク質発現レベルを低減させるか、ＳＯＤ１の遺伝子発現レベル及び／若しくはタンパク質発現レベルを低減させるか、ｔａｕの遺伝子発現レベル及び／若しくはタンパク質発現レベルを低減させるか、又はＨＳＰ７０の遺伝子発現レベル及び／若しくはタンパク質発現レベルを増大させる様式で非侵襲性ニューロモデュレーションを与える工程を含む、ＡＬＳ及び他の運動ニューロン疾患を治療する方法を含む。
【0046】
[065]本発明の例示的実施形態は、脊椎動物において疾患を治療する方法であって、直流源の第１の電極と第２の電極の間に刺激を付与する工程であって、第１の電極は脊椎動物の脊髄の背側面にあるか若しくは近接するか又は第１の電極が脊椎動物の頭蓋にある工程、並びにＮＫＣＣ１、ＳＯＤ１、ｔａｕ、ＨＳＰ７０、若しくはＬＣ３Ｂの遺伝子発現及び／又はタンパク質発現の生物学的な活性又はレベルを変化させるのに十分な強度で十分な期間、直流刺激を付与する工程を含み、第２の電極は第１の電極から遠い場所に配置され、第１の電極及び第２の電極は逆に帯電し、直流は一定、連続的、パルス、断続的、変動、及び非変動のうちの少なくとも１つである、方法を含む。
【0047】
[066]本発明の例示的実施形態は、二重刺激法である脊椎動物において疾患を治療する方法であって、直流源の第１の電極と第２の電極の間に第１の刺激を付与する工程であって、第１の電極は脊椎動物の脊髄の背側面にあるか又は近接する工程、直流源の第３の電極と第４の電極の間に第２の刺激を付与する工程であって、第３の電極のうちの１つは脊椎動物の末梢神経にあるか又は近接する工程、並びにＮＫＣＣ１、ＳＯＤ１、ＨＳＰ７０、ｔａｕ、若しくはＬＣ３Ｂの遺伝子発現及び／又はタンパク質発現の生物学的な活性又はレベルを変化させるのに十分な強度で十分な期間、直流刺激を付与する工程を含み、第２の電極は第１の電極から遠い場所に配置され、第１の電極及び第２の電極は逆に帯電し、第４の電極は第３の電極から遠い場所に配置され、第３の電極及び第４の電極は逆に帯電し、直流は一定、連続的、パルス、断続的、変動、及び非変動のうちの少なくとも１つである、方法を含む。
【0048】
[067]二重刺激法のいくつかの実施形態では、第１の刺激及び第２の刺激が同時に又は連続的に付与される。
[068]本発明の例示的実施形態は、三重刺激法である脊椎動物において疾患を治療する方法であって、直流源の第１の電極と第２の電極の間に第１の刺激を付与する工程であって、第１の電極は脊椎動物の脊髄の背側面にあるか又は近接する工程、直流源の第３の電極と第４の電極の間に第２の刺激を付与する工程であって、第３の電極のうちの１つは脊椎動物の末梢神経にあるか又は近接する工程、並びにＮＫＣＣ１、ＳＯＤ１、ＨＳＰ７０、ｔａｕ、若しくはＬＣ３Ｂの遺伝子発現及び／又はタンパク質発現の生物学的な活性又はレベルを変化させるのに十分な強度で十分な期間、直流刺激を付与する工程を含み、第２の電極は第１の電極から遠い場所に配置され、第１の電極及び第２の電極は逆に帯電し、第４の電極は第３の電極から遠い場所に配置され、第３の電極及び第４の電極は逆に帯電し、直流は一定、連続的、パルス、断続的、変動、及び非変動のうちの少なくとも１つである方法を含み、該方法は、直流源の第５の電極と第６の電極の間に第３の刺激を付与する工程であって、第５の電極が脊椎動物の頭蓋にある工程を更に含み、第６の電極が第５の電極から遠い場所に配置され、第５の電極及び第６の電極が逆に帯電している、方法を含む。
[068]本発明の例示的実施形態は、三重刺激法である脊椎動物において疾患を治療する方法であって、直流源の第１の電極と第２の電極の間に第１の刺激を付与する工程であって、第１の電極は脊椎動物の脊髄の背側面にあるか又は近接する工程、直流源の第３の電極と第４の電極の間に第２の刺激を付与する工程であって、第３の電極のうちの１つは脊椎動物の末梢神経にあるか又は近接する工程、並びにＮＫＣＣ１、ＳＯＤ１、ＨＳＰ７０、ｔａｕ、若しくはＬＣ３Ｂの遺伝子発現及び／又はタンパク質発現の生物学的な活性又はレベルを変化させるのに十分な強度で十分な期間、直流刺激を付与する工程を含み、第２の電極は第１の電極から遠い場所に配置され、第１の電極及び第２の電極は逆に帯電し、第４の電極は第３の電極から遠い場所に配置され、第３の電極及び第４の電極は逆に帯電し、直流は一定、連続的、パルス、断続的、変動、及び非変動のうちの少なくとも１つである方法を含み、該方法は、直流源の第５の電極と第６の電極の間に第３の刺激を付与する工程であって、第５の電極が脊椎動物の頭蓋にある工程を更に含み、第６の電極が第５の電極から遠い場所に配置され、第５の電極及び第６の電極が逆に帯電している、方法を含む。
【0049】
[069]三重刺激法のいくつかの実施形態では、第１の刺激、第２の刺激、及び第３の刺激が同時に又は連続的に付与される。
[070]末梢神経が刺激される本発明の例示的な例では、末梢神経が骨格筋を支配する。いくつかの末梢神経の代表例は、脚の神経又は腕の神経を含み、これらに限定されないが、座骨神経、腓骨神経、底側指神経、大腿神経、伏在神経、腓腹神経、脛骨神経、正中神経、筋皮神経、掌側指神経、橈骨神経、及び尺骨神経を含む。
[070]末梢神経が刺激される本発明の例示的な例では、末梢神経が骨格筋を支配する。いくつかの末梢神経の代表例は、脚の神経又は腕の神経を含み、これらに限定されないが、座骨神経、腓骨神経、底側指神経、大腿神経、伏在神経、腓腹神経、脛骨神経、正中神経、筋皮神経、掌側指神経、橈骨神経、及び尺骨神経を含む。
【0050】
[071]単一刺激法、二重刺激法、及び三重刺激法のいくつかの実施形態では、刺激が１日以上の日の一連の刺激期間を含む期間に渡って行われ、その日が連続的又は非連続的である。
【0051】
[072]単一刺激法、二重刺激法、及び三重刺激法のいくつかの実施形態では、治療される疾患が筋緊張疾患、例えば痙性、脊髄損傷後の痙性、筋緊張亢進、及びジストニアである。
【0052】
[073]単一刺激法、二重刺激法、及び三重刺激法のいくつかの実施形態では、ＮＫＣＣ１の遺伝子発現及び／若しくはタンパク質発現の生物学的な活性又はレベルが低減されるか、ＳＯＤ１の遺伝子発現及び／若しくはタンパク質発現の生物学的な活性又はレベルが低減されるか、ｔａｕの遺伝子発現及び／若しくはタンパク質発現の生物学的な活性又はレベルが低減されるか、ＨＳＰ７０の遺伝子発現及び／若しくはタンパク質発現の生物学的な活性又はレベルが増大されるか、あるいはＬＣ３Ｂの遺伝子発現及び／若しくはタンパク質発現の生物学的な活性又はレベルが低減される。
【0053】
[074]本発明の例示的実施形態は、脊椎動物においてＡＬＳを治療する方法を含む。本明細書に記載された非侵襲性電気刺激法は、運動ニューロン及び皮質ニューロンが死ぬことを防ぐことによりＡＬＳの進行を停止させるように設計されており、即ち、本明細書に記載された方法は、神経細胞の寿命を引き延ばすか又は少なくとも運動ニューロン及び皮質ニューロンの細胞死の速度を遅らせる。理論により束縛されることを意図しないが、脊髄ニューロン及び皮質ニューロンにおいてＮＫＣＣ、ＳＯＤ１、若しくはｔａｕの発現及び／又は活性を抑制すること、又はＨＳＰ７０若しくはＬＣ３Ｂの発現及び／又は活性を高めることのいずれかが、運動ニューロン細胞及び皮質ニューロン細胞の寿命を引き延ばすことによりＡＬＳの進行の停止を引き起こすと考えられる。
【0054】
[075]いくつかの実施形態では、ＡＬＳを治療する方法は、直流源のＡ電極とＢ電極の間に刺激を付与する工程であって、Ａ電極は脊椎動物の脊髄の背側面にあるか若しくは近接するか又はＡ電極は脊椎動物の頭蓋にある工程、及びＡＬＳ病態と関連する神経細胞の寿命を引き延ばすのに十分な強度で十分な期間、直流刺激を付与する工程を含み、Ｂ電極はＡ電極から遠い場所に配置され、Ａ電極及びＢ電極は逆に帯電し、直流は一定、連続的、パルス、断続的、変動、及び非変動のうちの少なくとも１つである。
【0055】
[076]ＡＬＳ患者を治療する場合、多数の位置で神経細胞の寿命を引き延ばすために、脊髄の長さに沿った多数の脊髄の位置が治療されることが考えられる。従って、いくつかの実施形態では、ＡＬＳを治療する方法は、脊髄の背側面に沿った複数の場所に配置されているか又はそれら複数の場所に近接して配置されている複数のＡ電極、及び複数のＡ電極から遠い場所に配置された複数のＢ電極を含む。他の実施形態では、一組のＡ電極及びＢ電極が用いられ、電極が一連の治療において脊髄の長さに沿った異なる位置に移動させられる。
【0056】
[077]ＡＬＳ患者を治療する場合、運動皮質（一次運動野としても知られる６野及び４野）、基底核、及び小脳を含めた運動制御と関連する脳の多数の領域が治療されることもまた考えられる。従って、いくつかの実施形態では、ＡＬＳを治療する方法は、運動制御と関連する頭蓋の複数の場所に配置された複数のＡ電極を含み、複数のＢ電極が、複数のＡ電極から遠い場所に配置される。他の実施形態では、一組のＡ電極及びＢ電極が用いられ、電極が一連の治療において運動制御と関連する異なる頭蓋の場所に移動させられる。
【0057】
[078]ＡＬＳを治療する方法のいくつかの実施形態では、複数のＡ電極と複数のＢ電極の間に付与される刺激が同時に又は連続的に付与される。
[079]いくつかの実施形態では、ＡＬＳ患者を治療する方法は、直流源のＡ電極とＢ電極の間に第１の刺激を付与する工程であって、Ａ電極が脊椎動物の脊髄の背側面にあるか又は近接する工程、直流源のＣ電極とＤ電極の間に第２の刺激を付与する工程であって、Ｃ電極が脊椎動物の頭蓋にある工程、及び神経細胞の寿命を引き延ばすのに十分な強度で十分な期間、直流刺激を付与する工程を含み、Ｂ電極はＡ電極から遠い場所に配置され、Ａ電極及びＢ電極は逆に帯電し、Ｄ電極はＣ電極から遠い場所に配置され、Ｃ電極及びＤ電極は逆に帯電し、直流は一定又はパルスである。いくつかの実施形態では、第１及び第２の刺激が同時に又は連続的に付与される。
[079]いくつかの実施形態では、ＡＬＳ患者を治療する方法は、直流源のＡ電極とＢ電極の間に第１の刺激を付与する工程であって、Ａ電極が脊椎動物の脊髄の背側面にあるか又は近接する工程、直流源のＣ電極とＤ電極の間に第２の刺激を付与する工程であって、Ｃ電極が脊椎動物の頭蓋にある工程、及び神経細胞の寿命を引き延ばすのに十分な強度で十分な期間、直流刺激を付与する工程を含み、Ｂ電極はＡ電極から遠い場所に配置され、Ａ電極及びＢ電極は逆に帯電し、Ｄ電極はＣ電極から遠い場所に配置され、Ｃ電極及びＤ電極は逆に帯電し、直流は一定又はパルスである。いくつかの実施形態では、第１及び第２の刺激が同時に又は連続的に付与される。
【0058】
[080]いくつかの実施形態では、ＡＬＳを治療する方法が、脊髄の背側面に沿った複数の場所に配置されているか又はそれら複数の場所に近接して配置されている複数のＡ電極、及び複数のＡ電極から遠い場所に配置された複数のＢ電極を含む。他の実施形態では、一組のＡ電極及びＢ電極が用いられ、電極が一連の治療において脊髄の長さに沿った異なる位置に移動させられる。
【0059】
[081]いくつかの実施形態では、ＡＬＳを治療する方法が、運動制御と関連する頭蓋の複数の場所に配置された複数のＣ電極、及び複数のＣ電極から遠い場所に配置された複数のＤ電極を含む。他の実施形態では、一組のＣ電極及びＤ電極が用いられ、電極が一連の治療において運動制御と関連する異なる頭蓋の場所に移動させられる。
【0060】
[082]いくつかの実施形態では、複数のＡ電極と複数のＢ電極の間及び複数のＣ電極と複数のＤ電極の間に付与される刺激が同時に又は連続的に付与される。
[083]いくつかの実施形態では、ＡＬＳを治療する方法が、直流源のＥ電極とＦ電極の間に第３の刺激を付与する工程をであって、Ｅ電極が脊椎動物の末梢神経にあるか又は近接する工程を更に含み、Ｆ電極がＥ電極から遠い場所に配置され、Ｅ電極及びＦ電極が逆に帯電している。いくつかの実施形態では、第１の刺激、第２の刺激、及び第３の刺激が同時に又は連続的に付与される。
[083]いくつかの実施形態では、ＡＬＳを治療する方法が、直流源のＥ電極とＦ電極の間に第３の刺激を付与する工程をであって、Ｅ電極が脊椎動物の末梢神経にあるか又は近接する工程を更に含み、Ｆ電極がＥ電極から遠い場所に配置され、Ｅ電極及びＦ電極が逆に帯電している。いくつかの実施形態では、第１の刺激、第２の刺激、及び第３の刺激が同時に又は連続的に付与される。
【0061】
[084]いくつかの実施形態では、ＡＬＳを治療する方法は、末梢神経に沿った複数の場所に配置されているか若しくはそれら複数の場所に近接して配置されているか又は複数の末梢神経に配置されているか若しくはそれら複数の末梢神経に近接して配置されている複数のＥ電極を含み、複数のＦ電極が、複数のＥ電極から遠い場所に配置されている。他の実施形態では、一組のＣ電極及びＤ電極が用いられ、電極が末梢神経に沿った異なる場所に移動させられるか又は異なる末梢神経に移動させられる。いくつかの実施形態では、複数のＥ電極と複数のＦ電極の間に付与される刺激が同時に又は連続的に付与される。末梢神経が刺激されるいくつかの実施形態では、末梢神経が骨格筋を支配する。いくつかの末梢神経の代表例が上記に開示される。
【0062】
[085]ＡＬＳを治療する方法のいくつかの実施形態では、期間が１日以上の一連の刺激期間を含み、その日が連続的又は非連続的である。
[086]ＡＬＳを治療する方法のいくつかの実施形態では、方法は、ＮＫＣＣ１、ＳＯＤ１、ｔａｕ、ＨＳＰ７０、若しくはＬＣ３Ｂの遺伝子発現及び／又はタンパク質発現の生物学的な活性又はレベルを変化させるのに十分な強度で十分な期間、直流刺激を付与する工程を更に含む。いくつかの実施形態では、ＮＫＣＣ１、ＳＯＤ１、若しくはｔａｕの遺伝子発現及び／又はタンパク質発現の生物学的な活性又はレベルが低減され、一方で他の実施形態では、ＨＳＰ７０若しくはＬＣ３Ｂの遺伝子発現及び／又はタンパク質発現の生物学的な活性又はレベルが増大される。
[086]ＡＬＳを治療する方法のいくつかの実施形態では、方法は、ＮＫＣＣ１、ＳＯＤ１、ｔａｕ、ＨＳＰ７０、若しくはＬＣ３Ｂの遺伝子発現及び／又はタンパク質発現の生物学的な活性又はレベルを変化させるのに十分な強度で十分な期間、直流刺激を付与する工程を更に含む。いくつかの実施形態では、ＮＫＣＣ１、ＳＯＤ１、若しくはｔａｕの遺伝子発現及び／又はタンパク質発現の生物学的な活性又はレベルが低減され、一方で他の実施形態では、ＨＳＰ７０若しくはＬＣ３Ｂの遺伝子発現及び／又はタンパク質発現の生物学的な活性又はレベルが増大される。
【0063】
[087]いくつかの実施形態では、それぞれがそれ自身の定電流源を有する、多数の脊髄電極（例えば陽極）を用いる。これは電流を分割し、１つの大きな長方形の脊髄電極と比較してより均一な刺激を伝達する。
【0064】
[088]他の実施形態では、それぞれがそれ自身の定電流源を有する多数の脊髄電極（例えば陽極）が、更なる定電流源を用いることにより両側末梢刺激の機能と組み合わせられる。
【0065】
[089]別の実施形態では、同時に起こる皮質刺激も含む。
[090]本発明の実施形態を行う際には、頸部及び腰部の刺激治療が別の日に行われ、例えばある日には上肢、翌日には下肢である。
[090]本発明の実施形態を行う際には、頸部及び腰部の刺激治療が別の日に行われ、例えばある日には上肢、翌日には下肢である。
【0066】
[091]動物、特にヒトを含めた哺乳動物が、本明細書で議論されるＤＣＳ治療の対象である。例示的かつ非限定的な実施形態では、本発明の実施におけるヒトの治療は、例えば、通常１ｍＡを超えて６ｍＡより下の範囲内、より具体的には約３．５～４ｍＡの範囲内のＤＣＳの付与を含むことができ、約２０～６０分／日の間付与され得る。他の例示的かつ非限定的な実施形態では、本発明の実施におけるヒトの治療は、経頭蓋ＤＣＳ（ｔｃＤＣＳ）又は末梢ＤＣＳ（ｐＤＣＳ）の付与を含むことができる。ＤＣＳ治療は、予定日に指示されるたびごとであっても隔日であってもよく、修復又は回復に影響を及ぼすことが意図されたあらゆる他の治療制度であってもよい。
【0067】
[092]本明細書に開示された本発明の方法を行う際には、以下のシステム又は装置が用いられる。
[093]本発明の例示的実施形態は、脊椎動物におけるＡＬＳ又は他の運動ニューロン疾患の治療のためのシステムであって、該システムは、脊椎動物における運動ニューロン疾患と関連する末梢神経の末梢直流刺激を供給するように構成された第１の刺激コンポーネントであって、その第１の刺激コンポーネントは、その末梢神経を刺激するように構成された神経刺激極を有する神経刺激回路を含む、第１の刺激コンポーネント、末梢神経の制御と関連する脊髄の位置に脊髄直流刺激を供給するように構成された第２の刺激コンポーネントであって、その第２の刺激コンポーネントは、活性脊髄刺激極及び脊髄参照極を有する脊髄刺激回路を規定し、その脊髄刺激回路は、その脊髄の位置を刺激するためにその脊髄刺激極とその脊髄参照極の間に定電流経脊髄直流刺激を供給するように構成され、活性脊髄刺激極は、その脊髄の位置の比較的近位であり、脊髄参照極は、その脊髄の位置の比較的遠位である、第２の刺激コンポーネント、並びにその活性脊髄極及びその近位神経極が反対の極性を引き起こされ、結果として生じる分極回路を形成することを保証するように構成されたコントローラーコンポーネントであって、その結果として生じる分極回路は、分極電流に従って標的タンパク質の遺伝子発現及び／若しくはタンパク質発現の生物学的な活性又はレベルを変化させるために、その反対の極性に従ってその活性脊髄極とその近位神経極の間に分極電流を供給するように構成された、コントローラーコンポーネントを備え、そのコントローラーコンポーネントはまた、末梢直流刺激及び脊髄直流刺激を所定の期間供給し、刺激を所定の日数に渡って所定の回数繰り返すように構成された、システムを含む。
[093]本発明の例示的実施形態は、脊椎動物におけるＡＬＳ又は他の運動ニューロン疾患の治療のためのシステムであって、該システムは、脊椎動物における運動ニューロン疾患と関連する末梢神経の末梢直流刺激を供給するように構成された第１の刺激コンポーネントであって、その第１の刺激コンポーネントは、その末梢神経を刺激するように構成された神経刺激極を有する神経刺激回路を含む、第１の刺激コンポーネント、末梢神経の制御と関連する脊髄の位置に脊髄直流刺激を供給するように構成された第２の刺激コンポーネントであって、その第２の刺激コンポーネントは、活性脊髄刺激極及び脊髄参照極を有する脊髄刺激回路を規定し、その脊髄刺激回路は、その脊髄の位置を刺激するためにその脊髄刺激極とその脊髄参照極の間に定電流経脊髄直流刺激を供給するように構成され、活性脊髄刺激極は、その脊髄の位置の比較的近位であり、脊髄参照極は、その脊髄の位置の比較的遠位である、第２の刺激コンポーネント、並びにその活性脊髄極及びその近位神経極が反対の極性を引き起こされ、結果として生じる分極回路を形成することを保証するように構成されたコントローラーコンポーネントであって、その結果として生じる分極回路は、分極電流に従って標的タンパク質の遺伝子発現及び／若しくはタンパク質発現の生物学的な活性又はレベルを変化させるために、その反対の極性に従ってその活性脊髄極とその近位神経極の間に分極電流を供給するように構成された、コントローラーコンポーネントを備え、そのコントローラーコンポーネントはまた、末梢直流刺激及び脊髄直流刺激を所定の期間供給し、刺激を所定の日数に渡って所定の回数繰り返すように構成された、システムを含む。
【0068】
[094]システムのいくつかの実施形態では、コントローラーコンポーネントが、一定、連続的、パルス、断続的、変動、及び非変動の電流のうちの少なくとも１つを含む電流を供給するように構成される。
【0069】
[095]システムのいくつかの実施形態では、コントローラーコンポーネントが、第１の刺激コンポーネント及び第２の刺激コンポーネントにより供給された電流の範囲を同時に制御するように更に構成される。
【0070】
[096]システムのいくつかの実施形態では、第１の刺激コンポーネントが、末梢神経を刺激するために配置された刺激電極に刺激電流を供給するための正極及び負極を含み、その正極及び負極は、１つの電極が正極に動作可能に接続され、別の電極が負極に動作可能に接続されるように配置される。システムのいくつかの実施形態では、第２の刺激コンポーネントが、脊髄の位置を渡って刺激を伝達するために配置された刺激電極に刺激電流を供給するための正極及び負極を含み、その正極及び負極が、１つの電極が正極に動作可能に接続され、別の電極が負極に動作可能に接続されるように配置される。
【0071】
[097]システムのいくつかの実施形態では、刺激電極のうちの少なくとも１つが移植されている。
[098]システムの更なる他の実施形態では、コントローラーコンポーネント及び電源のうちの少なくとも１つがウェアラブルなハウジングに配置される。
[098]システムの更なる他の実施形態では、コントローラーコンポーネント及び電源のうちの少なくとも１つがウェアラブルなハウジングに配置される。
【0072】
[099]システムのいくつかの実施形態では、ＮＫＣＣ１、ＳＯＤ１、ｔａｕ、ＨＳＰ７０、若しくはＬＣ３Ｂの遺伝子発現及び／又はタンパク質発現の生物学的な活性又はレベルを変化させるように、所定の期間、所定の回数、及び所定の日数が選択される。システムの一定の実施形態では、ＮＫＣＣ１、ＳＯＤ１、若しくはｔａｕの遺伝子発現及び／又はタンパク質発現の生物学的な活性又はレベルが低減され、一方で他の実施形態では、ＨＳＰ７０若しくはＬＣ３Ｂの遺伝子発現及び／又はタンパク質発現の生物学的な活性又はレベルが増大される。
【0073】
[0100]本発明の例示的実施形態は、脊髄又は脳のうちの１つと関連する生物学的な活性を制御するための刺激装置であって、複数の端子を有する直流電源、第１の電極を直流電源に接続するための第１の端子であって、第１の電極は脊椎動物の脊髄の背側面のうちの１つ又は脊椎動物の頭蓋にある第１の端子、第２の電極を直流電源に接続するための第２の端子であって、第２の電極は第１の電極から遠い場所に配置されており、第１の電極及び第２の電極は逆に帯電している、第２の端子、並びに電極の間の電流を制御するように構成されたコントローラーコンポーネントであって、コントローラーコンポーネントはまた、直流刺激を所定の期間供給し、刺激を所定の日数に渡って所定の回数繰り返すように構成された、コントローラーコンポーネントを備えた刺激装置を含む。
【0074】
[0101]刺激装置のいくつかの実施形態では、コントローラーコンポーネントが、一定、連続的、パルス、断続的、変動、及び非変動の電流のうちの少なくとも１つを含む電流を供給するように構成される。
【0075】
[0102]刺激装置のいくつかの実施形態では、第１の電極及び第２の電極のうちの少なくとも１つが移植されている。
[0103]刺激装置の更なる他の実施形態では、コントローラーコンポーネント及び直流電源のうちの少なくとも１つがウェアラブルなハウジングに配置される。
[0103]刺激装置の更なる他の実施形態では、コントローラーコンポーネント及び直流電源のうちの少なくとも１つがウェアラブルなハウジングに配置される。
【0076】
[0104]刺激装置のいくつかの実施形態では、所定の期間、所定の回数、及び所定の日数が、ＮＫＣＣ１、ＳＯＤ１、ｔａｕ、ＨＳＰ７０、若しくはＬＣ３Ｂの遺伝子発現及び／又はタンパク質発現の生物学的な活性又はレベルを変化させるために選択される。
【0077】
[0105]本発明の例示的実施形態は、脊椎動物においてＡＬＳを治療するためのシステムであって、該システムは、脊椎動物における末梢神経に沿った複数の位置に末梢神経の末梢直流刺激を供給するか又は複数の末梢神経の末梢直流刺激を供給するように構成された複数のＡ刺激コンポーネントであって、そのＡ刺激コンポーネントのそれぞれは、その末梢神経又は複数の末梢神経を刺激するように構成された神経刺激極を有する神経刺激回路を含む複数のＡ刺激コンポーネント、その末梢神経又は複数の末梢神経の制御と関連する複数の脊髄の位置に脊髄直流刺激を供給するように構成された複数のＢ刺激コンポーネントであって、そのＢ刺激コンポーネントのそれぞれは、活性脊髄刺激極及び脊髄参照極を有する脊髄刺激回路を規定し、その脊髄刺激回路は、その脊髄の位置を刺激するためにその脊髄刺激極とその脊髄参照極の間に定電流経脊髄直流刺激を供給するよう構成され、活性脊髄刺激極は、その脊髄の位置の比較的近位であり、脊髄参照極は、その脊髄の位置の比較的遠位である複数のＢ刺激コンポーネント、並びにその活性脊髄極及びその近位神経極が反対の極性を引き起こされ、結果として生じる分極回路を形成することを保証するように構成されたコントローラーコンポーネントであって、その結果として生じる分極回路は、分極電流に従って標的分子の遺伝子発現及び／若しくはタンパク質発現の生物学的な活性又はレベルを変化させるために、その反対の極性に従ってその活性脊髄極とその近位神経極の間に分極電流を供給するように構成されたコントローラーコンポーネントを備え、そのコントローラーコンポーネントはまた、末梢直流刺激及び脊髄直流刺激を所定の期間供給し、刺激を所定の日数に渡って所定の回数繰り返すように構成された、システムを含む。
【0078】
[0106]システムのいくつかの実施形態では、コントローラーコンポーネントが、一定、連続的、パルス、断続的、変動、及び非変動の電流のうちの少なくとも１つを含む電流を供給するように構成される。
【0079】
[0107]システムのいくつかの実施形態では、コントローラーコンポーネントが、Ａ刺激コンポーネント及びＢ刺激コンポーネントにより供給された電流の範囲を同時に制御するように更に構成される。
【0080】
[0108]システムのいくつかの実施形態では、Ａ刺激コンポーネントが、末梢神経の複数の位置又は複数の末梢神経を刺激するために配置された刺激電極に刺激電流を供給するための正極及び負極を含み、その正極及び負極が、１つの電極が正極に動作可能に接続され、別の電極が負極に動作可能に接続されるように配置される。
【0081】
[0109]システムのいくつかの実施形態では、Ｂ刺激コンポーネントが、複数の脊髄の位置を渡って刺激を伝達するために配置された刺激電極に刺激電流を供給するための正極及び負極を含み、その正極及び負極が、１つの電極が正極に動作可能に接続され、別の電極が負極に動作可能に接続されるように配置される。
【0082】
[0110]システムのいくつかの実施形態では、刺激電極のうちの少なくとも１つが移植されている。
[0111]システムの更なる他の実施形態では、コントローラーコンポーネント及び電源のうちの少なくとも１つがウェアラブルなハウジングに配置される。
[0111]システムの更なる他の実施形態では、コントローラーコンポーネント及び電源のうちの少なくとも１つがウェアラブルなハウジングに配置される。
【0083】
[0112]システムのいくつかの実施形態では、ＮＫＣＣ１、ＳＯＤ１、ｔａｕ、ＨＳＰ７０、若しくはＬＣ３Ｂの遺伝子発現及び／又はタンパク質発現の生物学的な活性又はレベルを変化させるために、所定の期間、所定の回数、及び所定の日数が選択される。システムの一定の実施形態では、ＮＫＣＣ１、ＳＯＤ１、若しくはｔａｕの遺伝子発現及び／又はタンパク質発現の生物学的な活性又はレベルが低減される。システムの一定の実施形態では、ＨＳＰ７０若しくはＬＣ３Ｂの遺伝子発現及び／又はタンパク質発現の生物学的な活性又はレベルが増大される。
【0084】
[0113]本発明の例示的実施形態は、ＡＬＳを治療するための刺激装置であって、複数の端子を有する直流電源、複数のＡ電極を直流電源に接続するための複数のＡ端子であって、複数のＡ電極は脊椎動物の脊髄の背側面の複数の位置又は脊椎動物の頭蓋の複数の位置にある複数のＡ端子、複数のＢ電極を直流電源に接続するための複数のＢ端子であって、複数のＢ電極は複数のＡ電極から遠い場所に配置されており、Ａ電極及びＢ電極は逆に帯電している複数のＢ端子、並びに電極の間の電流を制御するように構成されたコントローラーコンポーネントであって、コントローラーコンポーネントはまた、直流刺激を所定の期間供給し、刺激を所定の日数に渡って所定の回数繰り返すように構成された、コントローラーコンポーネントを備えた刺激装置を含む。
【0085】
[0114]刺激装置のいくつかの実施形態では、コントローラーコンポーネントが、一定、連続的、パルス、断続的、変動、及び非変動の電流のうちの少なくとも１つを含む電流を供給するように構成される。
【0086】
[0115]刺激装置のいくつかの実施形態では、Ａ電極及びＢ電極のうちの少なくとも１つが移植されている。
[0116]刺激装置の更なる他の実施形態では、コントローラーコンポーネント及び直流電源のうちの少なくとも１つがウェアラブルなハウジングに配置される。
[0116]刺激装置の更なる他の実施形態では、コントローラーコンポーネント及び直流電源のうちの少なくとも１つがウェアラブルなハウジングに配置される。
【0087】
[0117]刺激装置のいくつかの実施形態では、ＮＫＣＣ１、ＳＯＤ１、ｔａｕ、ＨＳＰ７０、若しくはＬＣ３Ｂの遺伝子発現及び／又はタンパク質発現の生物学的な活性又はレベルを変化させるために、所定の期間、所定の回数、及び所定の日数が選択される。刺激装置のいくつかの実施形態では、ＮＫＣＣ１、ＳＯＤ１、若しくはｔａｕの遺伝子発現及び／又はタンパク質発現の生物学的な活性又はレベルが低減される。刺激装置のいくつかの実施形態では、ＨＳＰ７０若しくはＬＣ３Ｂの遺伝子発現及び／又はタンパク質発現の生物学的な活性又はレベルが増大される。
【0088】
[0118]本発明のシステム及び刺激装置は、図面を参照して以下に更に記載される。
[0119]上述した実施形態は、それぞれの刺激コンポーネントにより適用される一組の電極を説明するが、１つの刺激コンポーネントにより複数の組の電極が適用される実施形態もまた、これらの教示の範囲内である。例えば、いくつかの実施形態では、複数の組の電極が第１の刺激コンポーネントにより適用され、それぞれの組の電極のうちの１つが、異なる脊髄又は頭蓋の位置に適用される。
[0119]上述した実施形態は、それぞれの刺激コンポーネントにより適用される一組の電極を説明するが、１つの刺激コンポーネントにより複数の組の電極が適用される実施形態もまた、これらの教示の範囲内である。例えば、いくつかの実施形態では、複数の組の電極が第１の刺激コンポーネントにより適用され、それぞれの組の電極のうちの１つが、異なる脊髄又は頭蓋の位置に適用される。
【0089】
[0120]これらの教示は特定の実施形態の観点から記載されたが、上述の記載を考慮して、多数の代替、改変、及びバリエーションが当業者にとって明らかであることが明白である。従って、これらの教示は、本教示及び以下の特許請求の範囲の範囲及び精神の内にあるすべのそのような代替、改変及びバリエーションを包含することが意図される。
【実施例】
【0090】
実施例１： 材料及び方法
動物
[0121]行われた動物実験のすべてに、ＣＵＮＹ／ＣＳＩで確立された繁殖コロニーに由来するトランスジェニックＳＯＤ１－Ｇ９３Ａマウスを用いた。トランスジェニックＳＯＤ１－Ｇ９３Ａマウスは、最も広く用いられているＡＬＳのマウスモデルであり、ヒトＣｕ／Ｚｎ活性酸素分解酵素１（ＳＯＤ１）の変異型を過剰発現するように操作されている。そのマウスは筋肉の震え、まひ、若すぎる死を発現し、運動ニューロン損失を示す。マウスは、６０日齢で（発症前）遺伝子型決定及びコピー数に基づいて特定の群に割り当てられる。キャリア動物においてコピー数を定量するためにｑＰＣＲが用いられる。雌群及び雄群が含まれることは、雌のマウス及び雄のマウス（Ｇ９３Ａ）が異なる生存率を有することを見出した刊行物に基づく。治療的刺激実験のために、キャリア動物は２つの群に分けられた：１）陽極多部位ＤＣＳ治療群；及び２）刺激なしのキャリア群。治療は、疾患及び運動機能障害の徴候を確認した第１日に開始する（初期段階）。これはグリッドウォーキング試験を用いて確認される。動物は３０歩、歩行させられ、下側からビデオ録画される。ビデオは、知らされていない調査者により分析される。我々は、グリッドウォーキングを定量化するために６点のフットフォールトスコアシステムを用いた。グリッドウォーキングは脊髄又は皮質の機能障害に非常に敏感であることから（Ｒｕｅｇｓｅｇｇｅｒ、「Ａｂｅｒｒａｎｔ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｓｆｏｌｄｅｄ ＳＯＤ１ ｗｉｔｈ Ｎａ＋／Ｋ＋ ＡＴＰａｓｅ－α３ ｉｍｐａｉｒｓ ｉｔｓ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｓ ｔｏ ｍｏｔｏｒ ｎｅｕｒｏｎ ｖｕｌｎｅｒａｂｉｌｉｔｙ ｉｎ ＡＬＳ」、Ａｃｔａ．Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．、２０１６）、このシステムは、マウスの疾患の初期段階を検出するのに非常に正確であることが見出された（予備データ）。研究プロトコールのすべてが、カレッジオブスタテンアイランドＩＡＣＵＣ委員会の承認済みである。
動物
[0121]行われた動物実験のすべてに、ＣＵＮＹ／ＣＳＩで確立された繁殖コロニーに由来するトランスジェニックＳＯＤ１－Ｇ９３Ａマウスを用いた。トランスジェニックＳＯＤ１－Ｇ９３Ａマウスは、最も広く用いられているＡＬＳのマウスモデルであり、ヒトＣｕ／Ｚｎ活性酸素分解酵素１（ＳＯＤ１）の変異型を過剰発現するように操作されている。そのマウスは筋肉の震え、まひ、若すぎる死を発現し、運動ニューロン損失を示す。マウスは、６０日齢で（発症前）遺伝子型決定及びコピー数に基づいて特定の群に割り当てられる。キャリア動物においてコピー数を定量するためにｑＰＣＲが用いられる。雌群及び雄群が含まれることは、雌のマウス及び雄のマウス（Ｇ９３Ａ）が異なる生存率を有することを見出した刊行物に基づく。治療的刺激実験のために、キャリア動物は２つの群に分けられた：１）陽極多部位ＤＣＳ治療群；及び２）刺激なしのキャリア群。治療は、疾患及び運動機能障害の徴候を確認した第１日に開始する（初期段階）。これはグリッドウォーキング試験を用いて確認される。動物は３０歩、歩行させられ、下側からビデオ録画される。ビデオは、知らされていない調査者により分析される。我々は、グリッドウォーキングを定量化するために６点のフットフォールトスコアシステムを用いた。グリッドウォーキングは脊髄又は皮質の機能障害に非常に敏感であることから（Ｒｕｅｇｓｅｇｇｅｒ、「Ａｂｅｒｒａｎｔ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｓｆｏｌｄｅｄ ＳＯＤ１ ｗｉｔｈ Ｎａ＋／Ｋ＋ ＡＴＰａｓｅ－α３ ｉｍｐａｉｒｓ ｉｔｓ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｓ ｔｏ ｍｏｔｏｒ ｎｅｕｒｏｎ ｖｕｌｎｅｒａｂｉｌｉｔｙ ｉｎ ＡＬＳ」、Ａｃｔａ．Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．、２０１６）、このシステムは、マウスの疾患の初期段階を検出するのに非常に正確であることが見出された（予備データ）。研究プロトコールのすべてが、カレッジオブスタテンアイランドＩＡＣＵＣ委員会の承認済みである。
【0091】
[0122]回路及び電源
[0123]電流を末梢神経に通過させることが、運動ニューロンの過剰興奮性を減衰及び調節するために必要とされる（Ａｈｍｅｄ、「Ｔｒａｎｓ－ｓｐｉｎａｌ ｄｉｒｅｃｔ ｃｕｒｒｅｎｔ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｍｏｄｉｆｉｅｓ ｓｐｉｎａｌ ｃｏｒｄ ｅｘｃｉｔａｂｉｌｉｔｙ ｔｈｒｏｕｇｈ ｓｙｎａｐｔｉｃ ａｎｄ ａｘｏｎａｌ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ」、Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｐ．、２０１４）。更に、この電流の方向及び分布は制御され得る（Ａｈｍｅｄ、「Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｃａｔｈｏｄａｌ ｔｒａｎｓ－ｓｐｉｎａｌ ｄｉｒｅｃｔ ｃｕｒｒｅｎｔ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｎ ｌｏｗｅｒ ｕｒｉｎａｒｙ ｔｒａｃｔ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ｎｏｒｍａｌ ａｎｄ ｓｐｉｎａｌ ｃｏｒｄ ｉｎｊｕｒｙ ｍｉｃｅ ｗｉｔｈ ｏｖｅｒａｃｔｉｖｅ ｂｌａｄｄｅｒ」、Ｊ．Ｎｅｕｒａｌ．Ｅｎｇ．、２０１７）。本研究の多部位ＤＣＳプロトコールは、麻酔動物とともに用いられるために我々の研究所で元々設計された経脊髄回路を改良する必要があった（Ａｈｍｅｄ、「Ｔｒａｎｓ－ｓｐｉｎａｌ ｄｉｒｅｃｔ ｃｕｒｒｅｎｔ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ａｌｔｅｒｓ ｍｕｓｃｌｅ ｔｏｎｅ ｉｎ ｍｉｃｅ ｗｉｔｈ ａｎｄ ｗｉｔｈｏｕｔ ｓｐｉｎａｌ ｃｏｒｄ ｉｎｊｕｒｙ ｗｉｔｈ ｓｐａｓｔｉｃｉｔｙ」、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、２０１４）。簡潔には、回路は、図１Ａに示すように皮膚の上の電極を用いることにより罹患した手足の脊髄及び座骨神経に電流（ＤＣ）を非侵襲的に通すように改良された。参照電流源が、３つの脊髄電極により分けられた脊髄電流を供給した。神経活動を呼び起こすことを防ぐために、脊髄電極から座骨神経電極を通る電流は、脊髄電流を３つの枝に分けることにより減衰させた。第１の枝は腹部電極に直接接続し、減衰されていない電流を運び、一方で第２及び第３の枝は、３００ｋΩの抵抗器を通過し、座骨神経への電流を減衰させた。回路の概略を図１Ｂに示す。電流は、専用のＤＣユニットのあるＧＲＡＳＳ刺激器（Ｓ８８、ＧＲＡＳＳ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ／ＮＡＴＵＳ）により供給された。電流パラメーターのモニタリング及びＤＣ減衰の確認が、卓上デジタルマルチメーター（３４４０１Ａ、Ａｇｉｌｅｎｔ／Ｋｅｙｓｉｇｈｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＣＡ ＵＳＡ）を用いることにより、それぞれの実験の初め、間及び完了時に行われた。
[0123]電流を末梢神経に通過させることが、運動ニューロンの過剰興奮性を減衰及び調節するために必要とされる（Ａｈｍｅｄ、「Ｔｒａｎｓ－ｓｐｉｎａｌ ｄｉｒｅｃｔ ｃｕｒｒｅｎｔ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｍｏｄｉｆｉｅｓ ｓｐｉｎａｌ ｃｏｒｄ ｅｘｃｉｔａｂｉｌｉｔｙ ｔｈｒｏｕｇｈ ｓｙｎａｐｔｉｃ ａｎｄ ａｘｏｎａｌ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ」、Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｐ．、２０１４）。更に、この電流の方向及び分布は制御され得る（Ａｈｍｅｄ、「Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｃａｔｈｏｄａｌ ｔｒａｎｓ－ｓｐｉｎａｌ ｄｉｒｅｃｔ ｃｕｒｒｅｎｔ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｎ ｌｏｗｅｒ ｕｒｉｎａｒｙ ｔｒａｃｔ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ｎｏｒｍａｌ ａｎｄ ｓｐｉｎａｌ ｃｏｒｄ ｉｎｊｕｒｙ ｍｉｃｅ ｗｉｔｈ ｏｖｅｒａｃｔｉｖｅ ｂｌａｄｄｅｒ」、Ｊ．Ｎｅｕｒａｌ．Ｅｎｇ．、２０１７）。本研究の多部位ＤＣＳプロトコールは、麻酔動物とともに用いられるために我々の研究所で元々設計された経脊髄回路を改良する必要があった（Ａｈｍｅｄ、「Ｔｒａｎｓ－ｓｐｉｎａｌ ｄｉｒｅｃｔ ｃｕｒｒｅｎｔ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ａｌｔｅｒｓ ｍｕｓｃｌｅ ｔｏｎｅ ｉｎ ｍｉｃｅ ｗｉｔｈ ａｎｄ ｗｉｔｈｏｕｔ ｓｐｉｎａｌ ｃｏｒｄ ｉｎｊｕｒｙ ｗｉｔｈ ｓｐａｓｔｉｃｉｔｙ」、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、２０１４）。簡潔には、回路は、図１Ａに示すように皮膚の上の電極を用いることにより罹患した手足の脊髄及び座骨神経に電流（ＤＣ）を非侵襲的に通すように改良された。参照電流源が、３つの脊髄電極により分けられた脊髄電流を供給した。神経活動を呼び起こすことを防ぐために、脊髄電極から座骨神経電極を通る電流は、脊髄電流を３つの枝に分けることにより減衰させた。第１の枝は腹部電極に直接接続し、減衰されていない電流を運び、一方で第２及び第３の枝は、３００ｋΩの抵抗器を通過し、座骨神経への電流を減衰させた。回路の概略を図１Ｂに示す。電流は、専用のＤＣユニットのあるＧＲＡＳＳ刺激器（Ｓ８８、ＧＲＡＳＳ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ／ＮＡＴＵＳ）により供給された。電流パラメーターのモニタリング及びＤＣ減衰の確認が、卓上デジタルマルチメーター（３４４０１Ａ、Ａｇｉｌｅｎｔ／Ｋｅｙｓｉｇｈｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＣＡ ＵＳＡ）を用いることにより、それぞれの実験の初め、間及び完了時に行われた。
【0092】
[0124]マウスホルダー
[0125]マウスを動かないようにするシステムを、３つのコンポーネントから我々の研究所で組み立てた（図１Ｃ）。１）マウス保持チャンバーとして機能する透明プレキシグラスアクリル管。２）透明なアクリル凹形固定プレートからなる内部調節可能な支持システム。プレートの位置は、管の長さ全体を走る切り抜きから突き出たハンドルにより、チャンバーの長さに沿って直線的に調節することができた。更に、プレートの凹面を動物の背面に合うように設計し、従ってそれを背部に固定した。この表面はまた、様々な大きさのマウスに合わせるために外部から調節することができた。３）それぞれ芯が覆われた１ｃｍ×１．５ｃｍのステンレス鋼プレートから構成される、４つの皮膚の上の刺激電極。電極のうちの１つは、（腹部参照電極として）保持チャンバーの床面に取り外せないように固定され、一方で第２の電極は、（背面活性脊髄電極として）固定プレートの中央に取り外せないように固定され、このプレートの位置は調節することができた。残りの２つの電極は、固定プレートの長い側面に存在する切り抜きに沿ってそれらを滑らかに動かすことにより直線的に調節することができ、これらはそれぞれ左及び右の座骨神経導体として機能した。保持チャンバーの腹部表面は、動物の後肢それぞれのためのものである２つの開口部を有していた。それぞれの開口部には、試験中に完全な膝の伸展を確保するために膝固定パッドが備えられた。試験前に、中央に開口部を有するキャップが、呼吸及びイソフルラン投与のために保持チャンバーの前端に配置された。伸展の間、後肢の動きを足首関節に限定するため、別のアクリル台を作って下腿遠位部を固定した。その台は、ｘ軸、ｙ軸、及びｚ軸に動かすことができ、押さえにより足の適切な整列を達成し、伸展前の動物の臀部の角度を調節する、調節可能なステンレス鋼の足首固定材締め具を有していた。
[0125]マウスを動かないようにするシステムを、３つのコンポーネントから我々の研究所で組み立てた（図１Ｃ）。１）マウス保持チャンバーとして機能する透明プレキシグラスアクリル管。２）透明なアクリル凹形固定プレートからなる内部調節可能な支持システム。プレートの位置は、管の長さ全体を走る切り抜きから突き出たハンドルにより、チャンバーの長さに沿って直線的に調節することができた。更に、プレートの凹面を動物の背面に合うように設計し、従ってそれを背部に固定した。この表面はまた、様々な大きさのマウスに合わせるために外部から調節することができた。３）それぞれ芯が覆われた１ｃｍ×１．５ｃｍのステンレス鋼プレートから構成される、４つの皮膚の上の刺激電極。電極のうちの１つは、（腹部参照電極として）保持チャンバーの床面に取り外せないように固定され、一方で第２の電極は、（背面活性脊髄電極として）固定プレートの中央に取り外せないように固定され、このプレートの位置は調節することができた。残りの２つの電極は、固定プレートの長い側面に存在する切り抜きに沿ってそれらを滑らかに動かすことにより直線的に調節することができ、これらはそれぞれ左及び右の座骨神経導体として機能した。保持チャンバーの腹部表面は、動物の後肢それぞれのためのものである２つの開口部を有していた。それぞれの開口部には、試験中に完全な膝の伸展を確保するために膝固定パッドが備えられた。試験前に、中央に開口部を有するキャップが、呼吸及びイソフルラン投与のために保持チャンバーの前端に配置された。伸展の間、後肢の動きを足首関節に限定するため、別のアクリル台を作って下腿遠位部を固定した。その台は、ｘ軸、ｙ軸、及びｚ軸に動かすことができ、押さえにより足の適切な整列を達成し、伸展前の動物の臀部の角度を調節する、調節可能なステンレス鋼の足首固定材締め具を有していた。
【0093】
[0126]
実施例２： 陽極多部位ＤＣＳはＥＭＧ活性の抑制をもたらす
[0127]症状の発現後のＳＯＤ１－Ｇ９３Ａマウスにおける伸展へのＥＭＧ反応に対する陽極多部位ＤＣＳの即時及び持続的な効果を、図２Ａ～２Ｂ及び３Ａ～３Ｂに示す。図２Ａ～２Ｂは、ＳＯＤ１－Ｇ９３Ａマウスにおける伸展反射の筋肉抵抗及びＥＭＧ反応に対する陽極ＤＣＳの３セッションの効果を示す。図２Ａはマウスホルダーの動物を示す。図２Ｂ（上）は、陽極多部位ＤＣＳ（１．５ｍＡ）による刺激前に記録された筋肉抵抗及びＥＭＧ出力を示す。図２Ｂ（下）は、１日当たり５０分間付与された陽極多部位ＤＣＳの３セッション後に記録された筋肉抵抗及びＥＭＧ出力を示す。図３Ａは、陽極多部位ＤＣＳ（陽極で１．５ｍＡ、Ｔ９～Ｌ６に配置。ＥＭＧは後肢の下腿三頭筋から記録された）による刺激の前及び間に得られた２乗平均平方根の（緑）及び加工していない（ピンク）ＥＭＧ出力を示す。疾患発症後のＥＭＧ出力において筋活動の増大が見られる。高いレベルの活動は刺激開始すぐに抑制され、スパイク振幅が低減される。図３Ｂは、それぞれの毎日のセッションが５０分持続する陽極多部位ＤＣＳによる刺激の３日後に得られた２乗平均平方根の（緑）及び加工していない（ピンク）ＥＭＧ出力を示す。ＥＭＧスパイクの振幅及び振動数は刺激が付与されない場合でも低減され、治療の持続的な効果を示している。
実施例２： 陽極多部位ＤＣＳはＥＭＧ活性の抑制をもたらす
[0127]症状の発現後のＳＯＤ１－Ｇ９３Ａマウスにおける伸展へのＥＭＧ反応に対する陽極多部位ＤＣＳの即時及び持続的な効果を、図２Ａ～２Ｂ及び３Ａ～３Ｂに示す。図２Ａ～２Ｂは、ＳＯＤ１－Ｇ９３Ａマウスにおける伸展反射の筋肉抵抗及びＥＭＧ反応に対する陽極ＤＣＳの３セッションの効果を示す。図２Ａはマウスホルダーの動物を示す。図２Ｂ（上）は、陽極多部位ＤＣＳ（１．５ｍＡ）による刺激前に記録された筋肉抵抗及びＥＭＧ出力を示す。図２Ｂ（下）は、１日当たり５０分間付与された陽極多部位ＤＣＳの３セッション後に記録された筋肉抵抗及びＥＭＧ出力を示す。図３Ａは、陽極多部位ＤＣＳ（陽極で１．５ｍＡ、Ｔ９～Ｌ６に配置。ＥＭＧは後肢の下腿三頭筋から記録された）による刺激の前及び間に得られた２乗平均平方根の（緑）及び加工していない（ピンク）ＥＭＧ出力を示す。疾患発症後のＥＭＧ出力において筋活動の増大が見られる。高いレベルの活動は刺激開始すぐに抑制され、スパイク振幅が低減される。図３Ｂは、それぞれの毎日のセッションが５０分持続する陽極多部位ＤＣＳによる刺激の３日後に得られた２乗平均平方根の（緑）及び加工していない（ピンク）ＥＭＧ出力を示す。ＥＭＧスパイクの振幅及び振動数は刺激が付与されない場合でも低減され、治療の持続的な効果を示している。
【0094】
[0128]
実施例３： 陽極多部位ＤＣＳは震えの抑制をもたらす
[0129]ＡＬＳマウスは、症状の発現後に震え及びけいれんを示す。これらの震えは、マイクロゴニオメーター又は力変換器のいずれかを用いて測定することができる。図４は、ＳＯＤ１－Ｇ９３Ａマウスの後肢の震えに対する陽極多部位ＤＣＳの即時の効果を示す。図４（上）は、マイクロゴニオメーターを用いて記録された左後足の震えを示す。図４（中）は、力変換器を用いて記録された右後足の震えを示す。図４（下）は、右後肢の下腿三頭筋の震えのＥＭＧ出力を示す。すべての３つのプロットにおいて、斜線部分は陽極多部位ＤＣＳの付与前に対応する。震え及びけいれんは、両側で刺激開始直後に抑制される。この強化はすべての測定方法を用いて見ることができる。図５は、症状の発現後のＳＯＤ１－Ｇ９３Ａマウスにおける無意識の筋収縮及び震えに対する陽極多部位ＤＣＳの持続的な効果を示す。上から下まで、図は、刺激前、刺激の間、刺激の２日後及び刺激の３日後に測定された（青の）ＥＭＧ出力及び（力変換器により記録された黒の）力測定を示す。震えは刺激の間にすぐに抑制される。刺激の２日後に測定された活性は、震えの更なる低減を示す。刺激の３日後、震え及び筋けいれんは刺激なしでも更に低減される。
実施例３： 陽極多部位ＤＣＳは震えの抑制をもたらす
[0129]ＡＬＳマウスは、症状の発現後に震え及びけいれんを示す。これらの震えは、マイクロゴニオメーター又は力変換器のいずれかを用いて測定することができる。図４は、ＳＯＤ１－Ｇ９３Ａマウスの後肢の震えに対する陽極多部位ＤＣＳの即時の効果を示す。図４（上）は、マイクロゴニオメーターを用いて記録された左後足の震えを示す。図４（中）は、力変換器を用いて記録された右後足の震えを示す。図４（下）は、右後肢の下腿三頭筋の震えのＥＭＧ出力を示す。すべての３つのプロットにおいて、斜線部分は陽極多部位ＤＣＳの付与前に対応する。震え及びけいれんは、両側で刺激開始直後に抑制される。この強化はすべての測定方法を用いて見ることができる。図５は、症状の発現後のＳＯＤ１－Ｇ９３Ａマウスにおける無意識の筋収縮及び震えに対する陽極多部位ＤＣＳの持続的な効果を示す。上から下まで、図は、刺激前、刺激の間、刺激の２日後及び刺激の３日後に測定された（青の）ＥＭＧ出力及び（力変換器により記録された黒の）力測定を示す。震えは刺激の間にすぐに抑制される。刺激の２日後に測定された活性は、震えの更なる低減を示す。刺激の３日後、震え及び筋けいれんは刺激なしでも更に低減される。
【0095】
[0130]
実施例４： 陽極多部位ＤＣＳは運動機能の改善をもたらす
[0131]刺激されたキャリアマウス及び刺激なしのキャリアマウス並びに非キャリアマウスにおいて、０～６のスコア基準（６は完全なスコアであり、マウスの手足の掌の中央部が横木に配置されて動物の全重量を負う）を有する改良された水平梯子スコアシステムを用いて運動機能を評価した。マウスを下からビデオ録画し、ビデオを保管してマウスの治療を知らない調査者により分析した。図６は、陽極多部位ＤＣＳ後のＳＯＤ１－Ｇ９３Ａマウスにおける運動機能の改善を示す。マウスは１週間当たり２日間、１日当たり１時間の刺激を受け、１．５ｍＡが脊髄陽極により送られた。刺激は、この群において平均で１０６日の年齢の疾患発症後に開始した。刺激なしのＡＬＳマウスのグリッドウォーキングスコアは、非キャリアコントロール（黒）と比較して疾患発症後にすぐに低下する（青）。刺激されたキャリアマウス（赤）では、グリッドウォーキングスコアは刺激なしのキャリアマウスのスコアよりも顕著に高く、刺激後の運動機能の保護の高まりを反映している。Ｎ＝２の非キャリア、４の刺激されたキャリア、２の刺激なしのキャリア。データは平均±ＳＥＭとして示される。
実施例４： 陽極多部位ＤＣＳは運動機能の改善をもたらす
[0131]刺激されたキャリアマウス及び刺激なしのキャリアマウス並びに非キャリアマウスにおいて、０～６のスコア基準（６は完全なスコアであり、マウスの手足の掌の中央部が横木に配置されて動物の全重量を負う）を有する改良された水平梯子スコアシステムを用いて運動機能を評価した。マウスを下からビデオ録画し、ビデオを保管してマウスの治療を知らない調査者により分析した。図６は、陽極多部位ＤＣＳ後のＳＯＤ１－Ｇ９３Ａマウスにおける運動機能の改善を示す。マウスは１週間当たり２日間、１日当たり１時間の刺激を受け、１．５ｍＡが脊髄陽極により送られた。刺激は、この群において平均で１０６日の年齢の疾患発症後に開始した。刺激なしのＡＬＳマウスのグリッドウォーキングスコアは、非キャリアコントロール（黒）と比較して疾患発症後にすぐに低下する（青）。刺激されたキャリアマウス（赤）では、グリッドウォーキングスコアは刺激なしのキャリアマウスのスコアよりも顕著に高く、刺激後の運動機能の保護の高まりを反映している。Ｎ＝２の非キャリア、４の刺激されたキャリア、２の刺激なしのキャリア。データは平均±ＳＥＭとして示される。
【0096】
[0132]
実施例５： 陽極多部位ＤＣＳはＮＫＣＣ１の発現を低減させる
[0133]ＮＫＣＣ１は、塩化物イオン勾配の維持に関与するニューロンの塩化物イオン共輸送体である。ＮＫＣＣ１の過剰発現は、運動ニューロンの過剰興奮性をもたらす。図７Ａ～７Ｆは、ＳＯＤ１－Ｇ９３Ａマウスにおける陽極多部位ＤＣＳ後の脊髄運動ニューロンにおけるＮＫＣＣ１発現を示す。非キャリアマウス（図７Ａ）、刺激なしのキャリアマウス（図７Ｂ）、刺激されたキャリアマウス（図７Ｃ）並びに同じ動物の腰部及び頸部の運動ニューロン（図７Ｄ及び７Ｅ）において、免疫化学検査を用いてＮＫＣＣ１発現を評価した。（緑の）ＮＫＣＣ１発現は、非キャリアコントロールマウスと比較して刺激なしのＡＬＳマウスにおいて増大され、多部位陽極ＤＣＳにより低減される。刺激を受ける動物では、ＮＫＣＣ１発現は、電極の部位（腰部）の下部で低減される。図７Ｆは、３つの群に渡るＮＫＣＣ１の相対発現レベルを示す。
実施例５： 陽極多部位ＤＣＳはＮＫＣＣ１の発現を低減させる
[0133]ＮＫＣＣ１は、塩化物イオン勾配の維持に関与するニューロンの塩化物イオン共輸送体である。ＮＫＣＣ１の過剰発現は、運動ニューロンの過剰興奮性をもたらす。図７Ａ～７Ｆは、ＳＯＤ１－Ｇ９３Ａマウスにおける陽極多部位ＤＣＳ後の脊髄運動ニューロンにおけるＮＫＣＣ１発現を示す。非キャリアマウス（図７Ａ）、刺激なしのキャリアマウス（図７Ｂ）、刺激されたキャリアマウス（図７Ｃ）並びに同じ動物の腰部及び頸部の運動ニューロン（図７Ｄ及び７Ｅ）において、免疫化学検査を用いてＮＫＣＣ１発現を評価した。（緑の）ＮＫＣＣ１発現は、非キャリアコントロールマウスと比較して刺激なしのＡＬＳマウスにおいて増大され、多部位陽極ＤＣＳにより低減される。刺激を受ける動物では、ＮＫＣＣ１発現は、電極の部位（腰部）の下部で低減される。図７Ｆは、３つの群に渡るＮＫＣＣ１の相対発現レベルを示す。
【0097】
[0134]ウエスタンブロット
[0135]脊髄組織を回収し、すぐにドライアイスに置いた。続いて、サンプルを、プロテアーゼ阻害剤カクテル（ＳＣ－２９１３１、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｄａｌｌａｓ Ｔｅｘａｓ、Ｕ．Ｓ．Ａ．）、ホスファターゼ阻害剤カクテル１１（カタログ番号：ＢＰ－ ４８０、Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）、１００ｍＭのＰＭＳＦ（カタログ番号：ＢＰ－４８１、Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）及び５００ｍＭのＥＤＴＡを含むＲＩＰＡ緩衝液（カタログ番号：ＢＰ－１１５、Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ａｓｈｌａｎｄ、ＭＡ、ＵＳＡ）中で均質化した。それぞれのサンプル（１００ｍｇ／ｍｌ）へのＲＩＰＡカクテルの添加後、溶解物を１５分間氷上でインキュベートし、Ｓｏｎｉｃ Ｄｉｓｍｅｍｂｒａｔｏｒ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｓｐｒｉｎｇｆｉｅｌｄ Ｔｏｗｎｓｈｉｐ、ＮＪ ＵＳＡ）を用いて０．５～１分間超音波で分解して完全な均質化を達成した。次いで、サンプルを３０分間Ｓｏｒｖａｌｌ Ｌｅｇｅｎｄ Ｍｉｃｒｏ ２１Ｒ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅにおいて１３０００ｒｐｍで遠心分離し、それぞれのサンプルの上清画分を回収した。ｉＭａｒｋＴＭマイクロプレート吸光度リーダー（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ ＣＡ）を用いて総タンパク質濃度を決定した。２０μｇのそれぞれのサンプルを等容積の２×サンプル緩衝液と混合し、１０％ＳＤＳポリアクリルアミドゲルにおいて電気泳動させた。分離されたタンパク質をＰＶＤＦ膜（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）に移動させた後、膜を５％スキムミルク緩衝液中で２時間ブロッキングし、次いで、適切な一次抗体とともに一晩４℃でインキュベートした。用いた一次抗体は、ウサギポリクローナル熱ショックタンパク質７０（ＨＳＰ７０）／ＨＳＣ－７０（Ｈ－３００）抗体（１：１０００；ＳＣ－３３５７５、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、マウスモノクローナルＮＫＣＣ１（Ａ－６）抗体（１：１０００；ＳＣ－５１４７７４、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、及びウサギポリクローナル抗ホスホＮＫＣＣ１ Ｔｈｒ２１２／Ｔｈｒ２１７抗体（１：１０００；ＡＢＳ １００４、ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ、ＵＳＡ）を含んでいた。続いて、膜を１×ＴＴＢＳで３回洗浄し、ブロッキング緩衝液中で適切な二次抗体とともにインキュベートした。二次抗体は、ヤギ抗ウサギＩｇＧ西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）抗体（１：５０００；ＳＣ－２００４、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）及びヤギ抗マウスＩｇＧ－ＨＲＰ抗体（１：５０００；ＳＣ－２００５、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を含んでいた。室温で１時間後、膜を１×ＴＴＢＳで３回洗浄した。結合した抗体をＨＲＰに基づく化学発光基質であるルミノール／酸化溶液（Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏ Ｐｒｏｄｕｃｔ）により可視化し、Ｉｍａｇｅ Ｊソフトウェア（ＩｍａｇｅＪ、Ｕ．Ｓ．Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ．Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍａｒｙｌａｎｄ、ＵＳＡ）により定量化した。続いて、ブロットを１×ストリッピング緩衝液、１×リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）及び１×ＴＴＢＳとともに３０分間インキュベートし、次いで、ブロッキング緩衝液中で１時間インキュベートした。ブロッキング緩衝液中での１時間のマウスモノクローナルＩｇＧ（ｉ－アクチン（Ｃ４）ＨＲＰ抗体（１：２５００；ＳＣ－４７７７８、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）との更なるインキュベーションの後、ブロットを１×ＴＴＢＳで３回洗浄し、次いで、ルミナール／酸化溶液（Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏ Ｐｒｏｄｕｃｔ）で画像化した。バンドをＩｍａｇｅ Ｊソフトウェアで定量化した。
[0135]脊髄組織を回収し、すぐにドライアイスに置いた。続いて、サンプルを、プロテアーゼ阻害剤カクテル（ＳＣ－２９１３１、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｄａｌｌａｓ Ｔｅｘａｓ、Ｕ．Ｓ．Ａ．）、ホスファターゼ阻害剤カクテル１１（カタログ番号：ＢＰ－ ４８０、Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）、１００ｍＭのＰＭＳＦ（カタログ番号：ＢＰ－４８１、Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）及び５００ｍＭのＥＤＴＡを含むＲＩＰＡ緩衝液（カタログ番号：ＢＰ－１１５、Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ａｓｈｌａｎｄ、ＭＡ、ＵＳＡ）中で均質化した。それぞれのサンプル（１００ｍｇ／ｍｌ）へのＲＩＰＡカクテルの添加後、溶解物を１５分間氷上でインキュベートし、Ｓｏｎｉｃ Ｄｉｓｍｅｍｂｒａｔｏｒ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｓｐｒｉｎｇｆｉｅｌｄ Ｔｏｗｎｓｈｉｐ、ＮＪ ＵＳＡ）を用いて０．５～１分間超音波で分解して完全な均質化を達成した。次いで、サンプルを３０分間Ｓｏｒｖａｌｌ Ｌｅｇｅｎｄ Ｍｉｃｒｏ ２１Ｒ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅにおいて１３０００ｒｐｍで遠心分離し、それぞれのサンプルの上清画分を回収した。ｉＭａｒｋＴＭマイクロプレート吸光度リーダー（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ ＣＡ）を用いて総タンパク質濃度を決定した。２０μｇのそれぞれのサンプルを等容積の２×サンプル緩衝液と混合し、１０％ＳＤＳポリアクリルアミドゲルにおいて電気泳動させた。分離されたタンパク質をＰＶＤＦ膜（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）に移動させた後、膜を５％スキムミルク緩衝液中で２時間ブロッキングし、次いで、適切な一次抗体とともに一晩４℃でインキュベートした。用いた一次抗体は、ウサギポリクローナル熱ショックタンパク質７０（ＨＳＰ７０）／ＨＳＣ－７０（Ｈ－３００）抗体（１：１０００；ＳＣ－３３５７５、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、マウスモノクローナルＮＫＣＣ１（Ａ－６）抗体（１：１０００；ＳＣ－５１４７７４、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、及びウサギポリクローナル抗ホスホＮＫＣＣ１ Ｔｈｒ２１２／Ｔｈｒ２１７抗体（１：１０００；ＡＢＳ １００４、ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ、ＵＳＡ）を含んでいた。続いて、膜を１×ＴＴＢＳで３回洗浄し、ブロッキング緩衝液中で適切な二次抗体とともにインキュベートした。二次抗体は、ヤギ抗ウサギＩｇＧ西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）抗体（１：５０００；ＳＣ－２００４、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）及びヤギ抗マウスＩｇＧ－ＨＲＰ抗体（１：５０００；ＳＣ－２００５、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を含んでいた。室温で１時間後、膜を１×ＴＴＢＳで３回洗浄した。結合した抗体をＨＲＰに基づく化学発光基質であるルミノール／酸化溶液（Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏ Ｐｒｏｄｕｃｔ）により可視化し、Ｉｍａｇｅ Ｊソフトウェア（ＩｍａｇｅＪ、Ｕ．Ｓ．Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ．Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍａｒｙｌａｎｄ、ＵＳＡ）により定量化した。続いて、ブロットを１×ストリッピング緩衝液、１×リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）及び１×ＴＴＢＳとともに３０分間インキュベートし、次いで、ブロッキング緩衝液中で１時間インキュベートした。ブロッキング緩衝液中での１時間のマウスモノクローナルＩｇＧ（ｉ－アクチン（Ｃ４）ＨＲＰ抗体（１：２５００；ＳＣ－４７７７８、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）との更なるインキュベーションの後、ブロットを１×ＴＴＢＳで３回洗浄し、次いで、ルミナール／酸化溶液（Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏ Ｐｒｏｄｕｃｔ）で画像化した。バンドをＩｍａｇｅ Ｊソフトウェアで定量化した。
【0098】
[0136]
実施例６： 陽極多部位ＤＣＳはＳＯＤ１タンパク質の発現を低減させる
[0137]ＳＯＤ１の凝集は家族性ＡＬＳの部分集合の病理学的特徴であり（Ｐａｒｅら、「Ｍｉｓｆｏｌｄｅｄ ＳＯＤ１ ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ｉｎ ｓｐｏｒａｄｉｃ ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ ｌａｔｅｒａｌ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ」、Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．、２０１８）、トランスジェニックＳＯＤ１－Ｇ９３Ａマウスモデルは変異ＳＯＤ１（ｍＳＯＤ１）タンパク質を過剰発現し、病理学的な凝集をもたらす。図８Ａ～８Ｆは、陽極多部位ＤＣＳにより治療されたＳＯＤ１－Ｇ９３Ａマウスにおける低減されたＳＯＤ１発現を示す。図８Ａ～８Ｅは、治療された動物及び治療されていない動物の脊髄の顕微鏡写真である。図８Ｆは、刺激なしのキャリアと比較した刺激されたキャリア動物における顕著に低いｍＳＯＤ１発現を示す。Ｎ＝コントロール：４匹の動物から８枚の薄片；刺激：５匹の動物から５枚の薄片。
実施例６： 陽極多部位ＤＣＳはＳＯＤ１タンパク質の発現を低減させる
[0137]ＳＯＤ１の凝集は家族性ＡＬＳの部分集合の病理学的特徴であり（Ｐａｒｅら、「Ｍｉｓｆｏｌｄｅｄ ＳＯＤ１ ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ｉｎ ｓｐｏｒａｄｉｃ ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ ｌａｔｅｒａｌ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ」、Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．、２０１８）、トランスジェニックＳＯＤ１－Ｇ９３Ａマウスモデルは変異ＳＯＤ１（ｍＳＯＤ１）タンパク質を過剰発現し、病理学的な凝集をもたらす。図８Ａ～８Ｆは、陽極多部位ＤＣＳにより治療されたＳＯＤ１－Ｇ９３Ａマウスにおける低減されたＳＯＤ１発現を示す。図８Ａ～８Ｅは、治療された動物及び治療されていない動物の脊髄の顕微鏡写真である。図８Ｆは、刺激なしのキャリアと比較した刺激されたキャリア動物における顕著に低いｍＳＯＤ１発現を示す。Ｎ＝コントロール：４匹の動物から８枚の薄片；刺激：５匹の動物から５枚の薄片。
【0099】
[0138]
実施例７： 陽極多部位ＤＣＳはＨＳＰ７０の反応を誘導する
[0139]ＨＳＰ７０は、分解経路により基質の流れを促進することが知られているシャペロンタンパク質である。図９は、ＨＳＰ７０発現が非キャリア動物と比較してキャリア動物において低減され、ＳＯＤ１－Ｇ９３Ａマウスにおける陽極多部位ＤＣＳによる刺激後にキャリア動物において増大されることを示す。ＩｍａｇＪを用いて単一の脊髄運動ニューロンのＨＳＰ７０免疫蛍光強度を計算した。脊髄におけるＨＳＰ７０レベルは、コントロールマウス（左上）と比較して刺激なしのキャリアマウス（左下）において顕著に低減されるが、刺激後のキャリアマウス（右上）において顕著に増大される。これらの知見を棒グラフに要約する（右下；Ｎ＝刺激：４匹の動物から２７の運動ニューロン；コントロール：３匹の動物から１９の運動ニューロン）。
実施例７： 陽極多部位ＤＣＳはＨＳＰ７０の反応を誘導する
[0139]ＨＳＰ７０は、分解経路により基質の流れを促進することが知られているシャペロンタンパク質である。図９は、ＨＳＰ７０発現が非キャリア動物と比較してキャリア動物において低減され、ＳＯＤ１－Ｇ９３Ａマウスにおける陽極多部位ＤＣＳによる刺激後にキャリア動物において増大されることを示す。ＩｍａｇＪを用いて単一の脊髄運動ニューロンのＨＳＰ７０免疫蛍光強度を計算した。脊髄におけるＨＳＰ７０レベルは、コントロールマウス（左上）と比較して刺激なしのキャリアマウス（左下）において顕著に低減されるが、刺激後のキャリアマウス（右上）において顕著に増大される。これらの知見を棒グラフに要約する（右下；Ｎ＝刺激：４匹の動物から２７の運動ニューロン；コントロール：３匹の動物から１９の運動ニューロン）。
【0100】
[0140]免疫組織化学検査
[0141]ＨＳＰ７０免疫組織化学検査：多部位ＤＣＳによる刺激後の運動ニューロンにおけるＨＳＰ７０発現を調べるため、動物をケタミン／キシラジン溶液で麻酔し、次いで、室温でＰＢＳ、その後４％パラホルムアルデヒドによりかん流させた。切断した脊髄部分を同じ固定剤中で一晩、後固定し、次いで、凍結防止のために３０％スクロースに移動させた。脊髄部分をドライアイスで凍結させ、薄片にし、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に回収した。Ｔｒｉｓ Ａ緩衝液における３回の洗浄後、切片を１５分間、Ｔｒｉｓ Ｂで１回洗浄し、次いで、Ｔｒｉｓ Ｂ中に希釈された１０％正常ヤギ血清（ＮＧＳ）中でブロッキングした。１時間後、一次マウスモノクローナルＨＳＰ７０（Ｆ－３）抗体を添加し（１：５００、ｓｃ－３７３８６７、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、切片を４℃で撹拌器において一晩インキュベートした。翌日、切片を３回洗浄し、次いで、ビオチン化ヤギ抗マウス抗体（１：５００：ＢＡ－９２００、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ ＵＳＡ）とともにインキュベートした。１時間後、ＤｙＬｉｇｈｔ ４８８（１：２０００：ＳＡ－５４８８、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を添加した。更に３０分後、切片をＴｒｉｓ Ａで２回洗浄し、薄片をＤＡＰＩ（Ｈ－１２００：Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を含む培地で標本にした。
[0141]ＨＳＰ７０免疫組織化学検査：多部位ＤＣＳによる刺激後の運動ニューロンにおけるＨＳＰ７０発現を調べるため、動物をケタミン／キシラジン溶液で麻酔し、次いで、室温でＰＢＳ、その後４％パラホルムアルデヒドによりかん流させた。切断した脊髄部分を同じ固定剤中で一晩、後固定し、次いで、凍結防止のために３０％スクロースに移動させた。脊髄部分をドライアイスで凍結させ、薄片にし、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に回収した。Ｔｒｉｓ Ａ緩衝液における３回の洗浄後、切片を１５分間、Ｔｒｉｓ Ｂで１回洗浄し、次いで、Ｔｒｉｓ Ｂ中に希釈された１０％正常ヤギ血清（ＮＧＳ）中でブロッキングした。１時間後、一次マウスモノクローナルＨＳＰ７０（Ｆ－３）抗体を添加し（１：５００、ｓｃ－３７３８６７、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、切片を４℃で撹拌器において一晩インキュベートした。翌日、切片を３回洗浄し、次いで、ビオチン化ヤギ抗マウス抗体（１：５００：ＢＡ－９２００、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ ＵＳＡ）とともにインキュベートした。１時間後、ＤｙＬｉｇｈｔ ４８８（１：２０００：ＳＡ－５４８８、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を添加した。更に３０分後、切片をＴｒｉｓ Ａで２回洗浄し、薄片をＤＡＰＩ（Ｈ－１２００：Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を含む培地で標本にした。
【0101】
[0142]コリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣｈＡＴ）免疫組織化学検査：脊髄の切片をＰＢＳで３回洗浄し、室温で１時間、１０％ウサギ血清／０．１’Ｙ° Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００／０．１Ｍ ＰＢＳとともにインキュベートした。次いで、切片を４℃で４８～７２時間、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００／０．１Ｍ ＰＢＳ中の抗ＣｈＡＴ一次抗体（１：５００、ＡＢ１４４Ｐ、ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐ．）とともにインキュベートした。切片をＰＢＳで３回十分に洗浄し、次いで、室温で１時間、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００／０．１Ｍ ＰＢＳ中のウサギ抗ヤギ５６８ｎｍ抗体（１：５００）とともにインキュベートした。ＰＢＳで更に３回洗浄後、切片をＤＡＰＩ（Ｈ－１２００；Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を含む培地で標本にした。
【0102】
[0143]ｑ－ＰＣＲ
[0144]Ｔｒｉｚｏｌに基づく方法（Ｒｉｏら、２０１０）を用いてＲＮＡを脊髄サンプルから単離し、続いて、クロロホルム及びイソプロピルアルコールによる抽出を行った。簡潔には、それぞれのＲＮＡサンプルをジエチルジカーボネート（ＤＥＰＣ）水に溶解し、次いで、製造業者の指示に従ってＱｉａｇｅｎ ＲＮＡｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ Ｇｅｒｍａｎｙ）により精製した。Ｎａｎｏｄｒｏｐ ２０００ｃ機器（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）を用いてＲＮＡ濃度を測定した。総ＲＮＡをｉＳｃｒｉｐｔＴ” Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）により相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に変換した。それぞれの反応について、２ｐｇの総ＲＮＡを遺伝子特異的プライマー（ＰｒｉｍｅＰＣＲ Ａｓｓａｙ Ｓｌｃ１２ａ２）と合わせた。刺激された動物及び刺激されていない動物から得られたサンプルを常に同じプレートで分析した。それぞれのサンプルについて、それぞれの転写産物についての増幅産物の差を、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ化学に基づく検出を用いることにより３回の反復から測定した。β－アクチン（ＡＣＴＢ）、ＴＡＴＡボックス結合タンパク質（ＴＢＰ）及びヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ１（ＨＰＲＴ１）を内在性参照遺伝子として用い、これらの遺伝子の増幅に用いたプライマーは、それぞれＰｒｉｍｅＰＣＲ Ａｓｓａｙ ＡＣＴＢ、ＰｒｉｍｅＰＣＲ Ａｓｓａｙ ＴＢＰ及びＰｒｉｍｅＰＣＲ Ａｓｓａｙ ＨＰＲＴ１であった。中枢神経系においてそれらが安定的に発現した以前の実証（Ｖａｌｅｎｔｅら、２０１４；Ｗａｌｄｅｒら、２０１４）に基づく分析のために、得られた３つの転写産物を選択した。総反応容積は１０μｌであり、それは５μｌのｓｕｐｅｒｍｉｘ、プライマー、ｃＤＮＡ鋳型、及びヌクレアーゼを含まない水を含んでいた。３８４ウェルプレートにおいてＣＦＸ３８４ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）及びＳｓｏＡＤＶＡＮＣＥＤ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）によりｑＰＣＲ反応を行った。ＣＦＸ管理ソフトウェア（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＵＳＡ）を用い、自動ベースライン及び閾値検出オプションを選択した。得られたデータをＭｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌに移し、規格化因子としての内在性参照遺伝子に対する相対的な正規化した発現量を、３回の幾何平均を用いることによりそれぞれのサンプルについて計算した。
[0144]Ｔｒｉｚｏｌに基づく方法（Ｒｉｏら、２０１０）を用いてＲＮＡを脊髄サンプルから単離し、続いて、クロロホルム及びイソプロピルアルコールによる抽出を行った。簡潔には、それぞれのＲＮＡサンプルをジエチルジカーボネート（ＤＥＰＣ）水に溶解し、次いで、製造業者の指示に従ってＱｉａｇｅｎ ＲＮＡｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ Ｇｅｒｍａｎｙ）により精製した。Ｎａｎｏｄｒｏｐ ２０００ｃ機器（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）を用いてＲＮＡ濃度を測定した。総ＲＮＡをｉＳｃｒｉｐｔＴ” Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）により相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に変換した。それぞれの反応について、２ｐｇの総ＲＮＡを遺伝子特異的プライマー（ＰｒｉｍｅＰＣＲ Ａｓｓａｙ Ｓｌｃ１２ａ２）と合わせた。刺激された動物及び刺激されていない動物から得られたサンプルを常に同じプレートで分析した。それぞれのサンプルについて、それぞれの転写産物についての増幅産物の差を、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ化学に基づく検出を用いることにより３回の反復から測定した。β－アクチン（ＡＣＴＢ）、ＴＡＴＡボックス結合タンパク質（ＴＢＰ）及びヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ１（ＨＰＲＴ１）を内在性参照遺伝子として用い、これらの遺伝子の増幅に用いたプライマーは、それぞれＰｒｉｍｅＰＣＲ Ａｓｓａｙ ＡＣＴＢ、ＰｒｉｍｅＰＣＲ Ａｓｓａｙ ＴＢＰ及びＰｒｉｍｅＰＣＲ Ａｓｓａｙ ＨＰＲＴ１であった。中枢神経系においてそれらが安定的に発現した以前の実証（Ｖａｌｅｎｔｅら、２０１４；Ｗａｌｄｅｒら、２０１４）に基づく分析のために、得られた３つの転写産物を選択した。総反応容積は１０μｌであり、それは５μｌのｓｕｐｅｒｍｉｘ、プライマー、ｃＤＮＡ鋳型、及びヌクレアーゼを含まない水を含んでいた。３８４ウェルプレートにおいてＣＦＸ３８４ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）及びＳｓｏＡＤＶＡＮＣＥＤ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）によりｑＰＣＲ反応を行った。ＣＦＸ管理ソフトウェア（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＵＳＡ）を用い、自動ベースライン及び閾値検出オプションを選択した。得られたデータをＭｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌに移し、規格化因子としての内在性参照遺伝子に対する相対的な正規化した発現量を、３回の幾何平均を用いることによりそれぞれのサンプルについて計算した。
【0103】
[0145]
実施例８： 陽極多部位ＤＣＳはリン酸化ｔａｕの発現を低減させる
[0146]ＡＬＳにおいてはリン酸化ｔａｕタンパク質（ｐｈＴａｕ）の増加が報告されてきた（Ｓｔｅｖｅｎｓら、「Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｔａｕ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｍｏｔｏｒ ｎｅｕｒｏｎｓ ｆｒｏｍ ｃｌｉｎｉｃａｌｌｙ ｐｕｒｅ ｓｐｏｒａｄｉｃ ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ ｌａｔｅｒａｌ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ ｐａｔｉｅｎｔｓ」、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．、２０１９）。図１０は、リン酸化ｔａｕタンパク質（ｐｈＴａｕ）レベルに対する陽極多部位ＤＣＳの効果を示す。非キャリアと比較して、刺激なしのキャリアマウスにおいてより高いレベルのｐｈＴａｕが見られる。陽極多部位ＤＣＳによる治療が、キャリアマウスにおけるｐｈＴａｕレベルを低減させた。
実施例８： 陽極多部位ＤＣＳはリン酸化ｔａｕの発現を低減させる
[0146]ＡＬＳにおいてはリン酸化ｔａｕタンパク質（ｐｈＴａｕ）の増加が報告されてきた（Ｓｔｅｖｅｎｓら、「Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｔａｕ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｍｏｔｏｒ ｎｅｕｒｏｎｓ ｆｒｏｍ ｃｌｉｎｉｃａｌｌｙ ｐｕｒｅ ｓｐｏｒａｄｉｃ ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ ｌａｔｅｒａｌ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ ｐａｔｉｅｎｔｓ」、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．、２０１９）。図１０は、リン酸化ｔａｕタンパク質（ｐｈＴａｕ）レベルに対する陽極多部位ＤＣＳの効果を示す。非キャリアと比較して、刺激なしのキャリアマウスにおいてより高いレベルのｐｈＴａｕが見られる。陽極多部位ＤＣＳによる治療が、キャリアマウスにおけるｐｈＴａｕレベルを低減させた。
【0104】
[0147]
実施例９： 陽極多部位ＤＣＳはＬＣ３Ｂの発現の増大を誘導する
[0148]我々は、ＳＯＤ１－Ｇ９３ＡマウスにおけるＬＣ３Ｂ（微小管結合タンパク質－１軽鎖３β）の発現を調査した。ＬＣ３Ｂは、自食作用活性のタンパク質マーカーである。自食作用の異常調節がＡＬＳと関連しており、ＬＣ３Ｂの減少は、毒性タンパク質の異常な蓄積後の運動ニューロンの分解の加速をもたらし得る。図１１は、ＳＯＤ１－Ｇ９３ＡマウスにおけるＬＣ３Ｂの発現に対する陽極多部位ＤＣＳの効果を示す。ＬＣ３Ｂは、自食作用活性のタンパク質マーカーである。ＬＣ３Ｂ発現は、刺激なしのキャリアマウス（コントロール）と比較して刺激後のキャリアマウスにおいて増大される。
実施例９： 陽極多部位ＤＣＳはＬＣ３Ｂの発現の増大を誘導する
[0148]我々は、ＳＯＤ１－Ｇ９３ＡマウスにおけるＬＣ３Ｂ（微小管結合タンパク質－１軽鎖３β）の発現を調査した。ＬＣ３Ｂは、自食作用活性のタンパク質マーカーである。自食作用の異常調節がＡＬＳと関連しており、ＬＣ３Ｂの減少は、毒性タンパク質の異常な蓄積後の運動ニューロンの分解の加速をもたらし得る。図１１は、ＳＯＤ１－Ｇ９３ＡマウスにおけるＬＣ３Ｂの発現に対する陽極多部位ＤＣＳの効果を示す。ＬＣ３Ｂは、自食作用活性のタンパク質マーカーである。ＬＣ３Ｂ発現は、刺激なしのキャリアマウス（コントロール）と比較して刺激後のキャリアマウスにおいて増大される。
【0105】
[0149]
実施例１０： 陽極多部位ＤＣＳは脊髄運動ニューロンの生存を増加させる
[0150]ＡＬＳでは、運動ニューロンの過剰興奮性が最終的には運動ニューロン死をもたらす。我々は、運動ニューロンの生存に対する多部位ＤＣＳの効果を試験した。図１２は、ＳＯＤ１－Ｇ９３Ａマウスの脊髄運動ニューロンの生存に対する陽極多部位ＤＣＳの効果を示す。同胞ＳＯＤ１－Ｇ９３Ａマウスを刺激される群及び刺激なしの群に分けた。刺激されたマウスは、疾患発症後に５連続の毎日の６０分の治療を受けた。疾患発症後１０日目にマウスを犠牲にした。マウス当たり２枚の薄片を摘出した後、運動ニューロンをカウントした。顕微鏡写真は、それぞれの例のマウスの同じ薄片の４つの部分を示す。刺激は、刺激なしのキャリアと比較して、刺激後、より大きなα運動ニューロンの保護、及び全体で３４．８％の運動ニューロンのカウントの増加をもたらした。
実施例１０： 陽極多部位ＤＣＳは脊髄運動ニューロンの生存を増加させる
[0150]ＡＬＳでは、運動ニューロンの過剰興奮性が最終的には運動ニューロン死をもたらす。我々は、運動ニューロンの生存に対する多部位ＤＣＳの効果を試験した。図１２は、ＳＯＤ１－Ｇ９３Ａマウスの脊髄運動ニューロンの生存に対する陽極多部位ＤＣＳの効果を示す。同胞ＳＯＤ１－Ｇ９３Ａマウスを刺激される群及び刺激なしの群に分けた。刺激されたマウスは、疾患発症後に５連続の毎日の６０分の治療を受けた。疾患発症後１０日目にマウスを犠牲にした。マウス当たり２枚の薄片を摘出した後、運動ニューロンをカウントした。顕微鏡写真は、それぞれの例のマウスの同じ薄片の４つの部分を示す。刺激は、刺激なしのキャリアと比較して、刺激後、より大きなα運動ニューロンの保護、及び全体で３４．８％の運動ニューロンのカウントの増加をもたらした。
【0106】
[0151]
実施例１１： 陽極多部位ＤＣＳはＳＯＤ１－Ｇ９３Ａマウスの生存を増加させる
[0152]多部位ＤＣＳは過剰興奮した脊髄運動ニューロンを抑制することができることから、それは運動機能を超える効果を有し得るというのが我々の前提である。（疾患発症時に開始する）ＳＯＤ１－Ｇ９３Ａマウスにおける治療的刺激の枠組み（５日／週、３．３Ａ／ｍ２の電流密度）を用いて、我々は（群の間で性別を均衡化した）コントロールマウスに対する刺激されたマウスの生存を評価した。図１３は、症状の発現直後に治療が始まる場合のＳＯＤ１－Ｇ９３Ａマウスの生存に対する陽極多部位ＤＣＳの効果を示すＫａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒプロットである。症状の発現は、グリッドウォーキング試験における８０以下のスコアとして定義された。刺激されたキャリアマウスは平均で２０．５日（±２．１日）間生存し、一方で刺激なしのキャリアマウスは平均で１１．１日（±１．２日）間生存し、刺激されたマウスの疾患発症後の平均生存時間が８４％の増大となった。Ｎ＝１９の刺激されたマウス；２３の刺激なしのマウス。Ｌｏｇ Ｒａｎｋ（Ｍａｎｔｅｌ－Ｃｏｘ）、χ２＝１３．８６、ｐ＝０．０００２；Ｂｒｅｓｌｏｗ（一般化Ｗｉｌｃｏｘｏｎ）、χ２＝１２．２５、ｐ＝０．０００５；Ｔａｒｏｎｅ－Ｗａｒｅ、χ２＝１３．１２、ｐ＝０．０００３。
実施例１１： 陽極多部位ＤＣＳはＳＯＤ１－Ｇ９３Ａマウスの生存を増加させる
[0152]多部位ＤＣＳは過剰興奮した脊髄運動ニューロンを抑制することができることから、それは運動機能を超える効果を有し得るというのが我々の前提である。（疾患発症時に開始する）ＳＯＤ１－Ｇ９３Ａマウスにおける治療的刺激の枠組み（５日／週、３．３Ａ／ｍ２の電流密度）を用いて、我々は（群の間で性別を均衡化した）コントロールマウスに対する刺激されたマウスの生存を評価した。図１３は、症状の発現直後に治療が始まる場合のＳＯＤ１－Ｇ９３Ａマウスの生存に対する陽極多部位ＤＣＳの効果を示すＫａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒプロットである。症状の発現は、グリッドウォーキング試験における８０以下のスコアとして定義された。刺激されたキャリアマウスは平均で２０．５日（±２．１日）間生存し、一方で刺激なしのキャリアマウスは平均で１１．１日（±１．２日）間生存し、刺激されたマウスの疾患発症後の平均生存時間が８４％の増大となった。Ｎ＝１９の刺激されたマウス；２３の刺激なしのマウス。Ｌｏｇ Ｒａｎｋ（Ｍａｎｔｅｌ－Ｃｏｘ）、χ２＝１３．８６、ｐ＝０．０００２；Ｂｒｅｓｌｏｗ（一般化Ｗｉｌｃｏｘｏｎ）、χ２＝１２．２５、ｐ＝０．０００５；Ｔａｒｏｎｅ－Ｗａｒｅ、χ２＝１３．１２、ｐ＝０．０００３。
【0107】
[0153]
実施例１２： ＡＬＳを有するヒトにおける過剰興奮性抑制アプローチの実施形態
[0154]図１４は、多部位ＤＣＳを付与する制御ユニット並びに脊柱及び四肢の末梢神経に沿って適用される皮膚表面電極からなる、ＡＬＳの治療のための新たな過剰興奮性抑制アプローチの実施形態を説明する。陽極は脊柱に沿って配置され、戻りの電極は前腸骨稜に配置される。末梢電極はそれぞれの手足に配置され、陰極は陽極よりも近位に配置される。脊髄陽極からの電流は、脊髄を渡って（戻りの電極へ）及び手足を下って（末梢陰極へ）それらの両方に流れる。図１５は、痙性を低減し、疾患の進行を遅延させるために頸椎から腰椎にＡＬＳ患者を連続的に治療するために用いられる多チャンネルユニットの実施形態を示す。それぞれのチャンネルは５ｍＡ ＤＣ以下を供給するように制限され、最も小さい電極について最大電流密度０．５６ｍＡ／ｃｍ２である（適用規格により規定された安全限度より低い）。図１６は、同じ多部位ＤＣＳ技術を用いて皮質ニューロンを保護するための二つの半球皮質刺激を用いる実施形態を説明する。電流は皮質の陽極から脊髄の陰極に流れる。
実施例１２： ＡＬＳを有するヒトにおける過剰興奮性抑制アプローチの実施形態
[0154]図１４は、多部位ＤＣＳを付与する制御ユニット並びに脊柱及び四肢の末梢神経に沿って適用される皮膚表面電極からなる、ＡＬＳの治療のための新たな過剰興奮性抑制アプローチの実施形態を説明する。陽極は脊柱に沿って配置され、戻りの電極は前腸骨稜に配置される。末梢電極はそれぞれの手足に配置され、陰極は陽極よりも近位に配置される。脊髄陽極からの電流は、脊髄を渡って（戻りの電極へ）及び手足を下って（末梢陰極へ）それらの両方に流れる。図１５は、痙性を低減し、疾患の進行を遅延させるために頸椎から腰椎にＡＬＳ患者を連続的に治療するために用いられる多チャンネルユニットの実施形態を示す。それぞれのチャンネルは５ｍＡ ＤＣ以下を供給するように制限され、最も小さい電極について最大電流密度０．５６ｍＡ／ｃｍ２である（適用規格により規定された安全限度より低い）。図１６は、同じ多部位ＤＣＳ技術を用いて皮質ニューロンを保護するための二つの半球皮質刺激を用いる実施形態を説明する。電流は皮質の陽極から脊髄の陰極に流れる。
【0108】
[0155]要約すると、本結果は、陽極多部位ＤＣＳが（ａ）長期的にニューロンの脊髄の興奮性を低減し、（ｂ）筋力低下の進行を遅延させ、（ｃ）刺激されたＳＯＤ１－Ｇ９３Ａマウスの生存期間を８４％まで著しく増加させることを実証する。更に、我々は、陽極多部位ＤＣＳによる治療が（ａ）変異ＳＯＤ１タンパク質の発現を低減し、（ｂ）高くなったＮＫＣＣ１の発現を低減し、（ｃ）高くなったｔａｕの発現を低減し、（ｄ）ＨＳＰ７０の発現を増大させ、（ｅ）ＬＣ３Ｂの発現を増大させることを見出した。あわせると、これらのデータは、陽極多部位ＤＣＳが自食作用及びプロテアソームのタンパク質分解系を調節することにより異常に折り畳まれたタンパク質のクリアランスを促進するという証拠を提供する。脊髄の興奮性を低減し、毒性タンパク質を脊髄細胞から除去することにより、多部位ＤＣＳはＡＬＳに対する病態修飾治療介入となることができる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【国際調査報告】