特表 2024-521871 マイクロチップキャピラリー電気泳動アッセイ及び試薬

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-06-04

(54)【発明の名称】マイクロチップキャピラリー電気泳動アッセイ及び試薬

(51)【国際特許分類】

   G01N 27/447 20060101AFI20240528BHJP

【ＦＩ】

G01N27/447 301B

G01N27/447 331E

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023573618

(86)(22)【出願日】2022-06-01

(85)【翻訳文提出日】2024-01-16

(86)【国際出願番号】 US2022031738

(87)【国際公開番号】W WO2022256383

(87)【国際公開日】2022-12-08

(31)【優先権主張番号】17/368,377

(32)【優先日】2021-07-06

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】17/335,756

(32)【優先日】2021-06-01

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】597160510

【氏名又は名称】リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド

【氏名又は名称原語表記】ＲＥＧＥＮＥＲＯＮ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬＳ， ＩＮＣ．

(74)【代理人】

【識別番号】100083806

【弁理士】

【氏名又は名称】三好 秀和

(74)【代理人】

【識別番号】100111235

【弁理士】

【氏名又は名称】原 裕子

(74)【代理人】

【識別番号】100195257

【弁理士】

【氏名又は名称】大渕 一志

(72)【発明者】

【氏名】リールマン、 ティモシー

(72)【発明者】

【氏名】カロー、 ガブリエル

(72)【発明者】

【氏名】シュナイダーハインツェ、 ジェフリー

(72)【発明者】

【氏名】ノール、 ニコル、 エム．

(57)【要約】

タンパク質薬物製品試料の純度を評価し、タンパク質薬物製品試料中の不純物を同定するためのマイクロチップキャピラリー電気泳動（ＭＣＥ）アッセイ及び試薬が提供される。タンパク質薬物試料中の分析物を分析するための方法が提供される。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

水性電気泳動試料緩衝液であって、
１５５～２００ｍＭの２－ヨードアセトアミドと、
０．５０～１．５％のドデシル硫酸リチウムと、
６０～９５ｍＭのリン酸ナトリウムと、を含み、
前記水性電気泳動試料緩衝液は、８以下のｐＨを有する、水性電気泳動試料緩衝液。

【請求項2】

前記ｐＨは、６である、請求項１に記載の水性緩衝液。

【請求項3】

２００ｍＭの２－ヨードアセトアミドと、１．２％のドデシル硫酸リチウムと、６０ｍＭのリン酸ナトリウムと、を含む、請求項１に記載の水性緩衝液。

【請求項4】

水性電気泳動試料緩衝液であって、
１６５．９ｍＭの２－ヨードアセトアミドと、
０．８１％のドデシル硫酸リチウムと、
８１ｍＭのリン酸ナトリウムと、を含み、
前記水性電気泳動試料緩衝液は、６．０のｐＨを有する、水性電気泳動試料緩衝液。

【請求項5】

水性電気泳動試料緩衝液であって、
２００ｍＭの２－ヨードアセトアミドと、
１．２％のドデシル硫酸リチウムと、
６０ｍＭのリン酸ナトリウムと、を含み、
前記水性電気泳動試料緩衝液は、６．０のｐＨを有する、水性電気泳動試料緩衝液。

【請求項6】

水性電気泳動試料緩衝液であって、
２００ｍＭの２－ヨードアセトアミドと、
１．２％のドデシル硫酸リチウムと、
６０ｍＭのリン酸ナトリウムと、を含み、
前記水性電気泳動試料緩衝液は、８．０のｐＨを有する、水性電気泳動試料緩衝液。

【請求項7】

水性電気泳動試料緩衝液であって、
０．５０～１．５％のドデシル硫酸リチウムと、
４５～７５ｍＭのリン酸ナトリウムと、
８０～１５５ｍＭのジチオスレイトールと、を含み、
前記水性電気泳動試料緩衝液は、８以上のｐＨを有する、水性電気泳動試料緩衝液。

【請求項8】

前記ｐＨは、８である、請求項７に記載の水性緩衝液。

【請求項9】

前記ｐＨは、９である、請求項７に記載の水性緩衝液。

【請求項10】

８０ｍＭのジチオスレイトールを含む、請求項８に記載の水性緩衝液。

【請求項11】

１４２ｍＭのジチオスレイトールを含む、請求項８に記載の水性緩衝液。

【請求項12】

１．２％のドデシル硫酸リチウムと、６０ｍＭのリン酸ナトリウムと、を更に含む、請求項７に記載の水性緩衝液。

【請求項13】

水性電気泳動試料緩衝液であって、
０．６９％のドデシル硫酸リチウム、
６９ｍＭのリン酸ナトリウム、及び
８０～１５５ｍＭのジチオスレイトールからなり、
前記水性電気泳動試料緩衝液は、９．０のｐＨを有する、水性電気泳動試料緩衝液。

【請求項14】

水性電気泳動試料緩衝液であって、
１．２％のドデシル硫酸リチウム、
６０ｍＭのリン酸ナトリウム、及び
８０ｍＭのジチオスレイトールからなり、
前記水性電気泳動試料緩衝液は、８．０のｐＨを有する、水性電気泳動試料緩衝液。

【請求項15】

タンパク質薬物試料中の汚染物質又は不純物を同定するための方法であって、前記方法は、
前記タンパク質薬物試料を請求項１に記載の緩衝液に添加して、緩衝タンパク質薬物試料を形成するステップと、
前記緩衝タンパク質薬物試料を４５～７５℃に５～１５分間加熱して、変性緩衝タンパク質薬物試料を形成するステップと、
前記変性緩衝タンパク質薬物試料に検出可能な標識を添加し、それを３０～４０℃で１０～４０分間加熱して、変性標識タンパク質薬物試料を形成するステップと、
前記変性標識タンパク質薬物試料を希釈し、それをマイクロチップキャピラリー電気泳動システム上でＭＣＥに供して、希釈された前記タンパク質薬物試料を分離して、電気泳動図を生成するステップと、
前記タンパク質薬物、汚染物質、及び／又は不純物に対応する、前記電気泳動図中のピークを同定するステップと、を含む、方法。

【請求項16】

前記緩衝タンパク質薬物試料は、６０℃で１０分間加熱される、請求項１５に記載の方法。

【請求項17】

前記標識タンパク質薬物試料は、３５℃で１５分間加熱される、請求項１５に記載の方法。

【請求項18】

前記希釈されたタンパク質薬物試料は、３．６μｇ／ｍｌである、請求項１５に記載の方法。

【請求項19】

タンパク質薬物試料中の汚染物質又は不純物を同定するための方法であって、前記方法は、
タンパク質試料を請求項５に記載の緩衝液に添加して、緩衝タンパク質薬物試料を形成するステップと、
前記緩衝タンパク質薬物試料を４５～７５℃に５～１５分間加熱して、変性タンパク質薬物試料を形成するステップと、
前記変性タンパク質薬物試料に検出可能な標識を添加し、それを３０～４０℃で１０～４０分間加熱して、変性標識タンパク質薬物試料を形成するステップと、
前記変性標識タンパク質薬物試料を希釈し、それをマイクロチップキャピラリー電気泳動システム上でＭＣＥ分析に供して、電気泳動図を生成するステップと、
汚染物質又は不純物に対応する、前記電気泳動図中のピークを同定するステップと、を含む、方法。

【請求項20】

前記緩衝タンパク質薬物試料は、６０℃で１０分間加熱される、請求項１９に記載の方法。

【請求項21】

前記試料は、３５℃で１５分間加熱される、請求項１９に記載の方法。

【請求項22】

前記希釈されたタンパク質薬物試料は、３．６μｇ／ｍｌである、請求項１９に記載の方法。

【請求項23】

前記検出可能な標識は、ＤＹ－６３１ Ｎ－ヒドロキシスクシンイミジルエステルである、請求項１９に記載の方法。

【請求項24】

前記検出可能な標識は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）で再構成され、続いて２００ｍＭのリン酸ナトリウムｐＨ７．２緩衝液で希釈される、請求項２２に記載の方法。

【請求項25】

請求項１に記載の緩衝液と、
前記緩衝液中で電気泳動用の試料を調製するための説明書と、を備える、キット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年３月１９日に出願された米国仮特許出願第６２／６４４，９３３号の利益及び優先権を主張する、２０１９年３月１５日に出願された米国特許出願第１６／３５５，０５０号の一部継続出願である、２０２１年６月１日に出願された米国特許出願第１７／３３５，７５６号の一部継続出願である。本出願はまた、２０１８年３月１９日に出願された米国仮特許出願第６２／６４４，９３３号の利益及び優先権を主張する、２０１９年３月１５日に出願された米国特許出願第１６／３５５，０５０号の一部継続出願である。これらの出願の各々は、その全体が参考として援用される。

【0002】

本発明の態様は、概して、キャピラリー電気泳動の分野、特に、マイクロチップキャピラリー電気泳動を対象とする。

【背景技術】

【0003】

現在の品質管理（ＱＣ）検査室における生物学的製品の試験要求を満たすためには、堅牢で、再現性があり、ユーザフレンドリーな技術の実装が重要である。技術のアップグレードは、高品質の分析データを継続的に生成し、無効な検査結果及び機器関連の調査件数を最小限に抑えながら、生産量の増加を促進するために必要である。電気泳動は、生成物の純度及び断片化分析のためにＱＣにおいて歴史的に使用されてきたが、この手法は、ゲルベースからキャピラリーベースに、そしてより最近ではマイクロチップに移行している。マイクロチップキャピラリー電気泳動（ＭＣＥ）は、ＱＣ分析に必要とされる性能及び再現性の基準を維持しながら、試料分析時間の劇的な短縮を可能にする（Ｏｕｉｍｅｔ，Ｃ．，ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．，１２（２）：２１３－２２４（２０１７））。

【0004】

ＭＣＥは、バイオ医薬品の特性評価、品質管理、創薬のために医薬品業界で利用が拡大している有望な技術として登場したが、アッセイ干渉が起こりやすい場合がある。

【0005】

したがって、本発明の目的は、アッセイ干渉を減少させる改善されたＭＣＥアッセイ及び組成物を提供することである。

【0006】

本発明の別の目的は、タンパク質薬物製品中の不純物の検出を改善するためのＭＣＥアッセイ及び組成物を提供することである。

【発明の概要】

【0007】

純度を評価し、タンパク質薬物製品試料中の不純物を同定するためのＭＣＥアッセイ及び試薬が提供される。タンパク質薬物試料中の分析物を分析するための方法が提供される。好ましいタンパク質薬物としては、抗体及びその抗原結合フラグメントのような組換えタンパク質、並びに融合タンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。このアッセイは、ＭＣＥ技術を使用して、タンパク質製品及びタンパク質製品中の不純物を分離、同定、及び定量する。不純物には、タンパク質凝集体、タンパク質断片、タンパク質多量体、及びアッセイ混入物が含まれるが、これらに限定されない。還元緩衝液及び非還元緩衝液もまた提供される。一部の実施形態では、本明細書において提供されるＭＣＥアッセイ及び試薬は、ＲＥＧＥＮ－ＣＯＶ（商標）（ｃａｓｉｒｉｖｉｍａｂ及びｉｍｄｅｖｉｍａｂ）を含む治療用タンパク質製品などの抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２製品の分析及び精製試験において使用され得る。

【0008】

一実施形態は、２－ヨードアセトアミド（ＩＡＭ）、ヨード酢酸（ＩＡＡ）、又はＮ－エチルマレイミド（ＮＥＭ）などのアルキル化剤を含有する非還元性水性電気泳動試料緩衝液を提供する。一実施形態では、非還元性水性電気泳動試料緩衝液は、アルキル化剤、１５５～１７５ｍＭの２－ヨードアセトアミドと、０．５０～１．５％のドデシル硫酸リチウムと、６５～９５ｍＭのリン酸ナトリウムと、を含有し、水性電気泳動試料緩衝液は７未満のｐＨを有する。一実施形態では、緩衝液のｐＨは６である。別の実施形態では、水性緩衝液は、１６６ｍＭの２－ヨードアセトアミドと、０．８１％のドデシル硫酸リチウムと、８１ｍＭのリン酸ナトリウムと、を含有する。

【0009】

別の実施形態では、非還元性水性電気泳動試料緩衝液は、アルキル化剤、例えば、５０～２５０又は１５５～２００又は１５５～２５０ｍＭの２－ヨードアセトアミドと、０．５０～１．５％のドデシル硫酸リチウムと、４０～８０ｍＭ又は５０～７０ｍＭのリン酸ナトリウムと、を含有し、水性電気泳動試料緩衝液は、８以下のｐＨを有する。一実施形態では、緩衝液のｐＨは８である。更に別の実施形態では、水性緩衝液は、２００ｍＭの２－ヨードアセトアミドと、１．２％のドデシル硫酸リチウムと、６０ｍＭのリン酸ナトリウムと、を含有する。

【0010】

別の実施形態では、非還元性水性電気泳動試料緩衝液は、アルキル化剤、例えば、１５５～２００ｍＭの２－ヨードアセトアミドと、０．５０～１．５％のドデシル硫酸リチウムと、５０～７０ｍＭのリン酸ナトリウムと、を含有し、水性電気泳動試料緩衝液は、ｐＨ８以下を有する。一実施形態では、緩衝液のｐＨは６である。更に別の実施形態では、水性緩衝液は、２００ｍＭの２－ヨードアセトアミドと、１．２％のドデシル硫酸リチウムと、６０ｍＭのリン酸ナトリウムと、を含有する。

【0011】

還元緩衝液も提供される。一実施形態では、還元緩衝液は、０．５～１．５％のドデシル硫酸リチウムと、５５～８５ｍＭのリン酸ナトリウムと、還元剤と、を含有する水性電気泳動試料緩衝液であり、水性電気泳動試料緩衝液は、８を超えるｐＨを有する。一実施形態では、緩衝液のｐＨは９である。一実施形態では、還元緩衝液は、１３５～１５５ｍＭのジチオスレイトールを含有する。更に別の実施形態は、０．６９％のドデシル硫酸リチウムと、６９ｍＭのリン酸ナトリウムと、１４２ｍＭのジチオスレイトールと、を含有する還元緩衝液を提供する。

【0012】

別の実施形態では、還元緩衝液は、０．５～１．５％のドデシル硫酸リチウムと、４５～８５ｍＭのリン酸ナトリウムと、還元剤と、を含有する水性電気泳動試料緩衝液であり、水性電気泳動試料緩衝液は、８以上のｐＨを有する。一実施形態では、緩衝液のｐＨは８である。一実施形態では、還元緩衝液は、８０～１５５ｍＭのジチオスレイトールを含有する。更に別の実施形態は、１．２％のドデシル硫酸リチウムと、６０ｍＭのリン酸ナトリウムと、８０ｍＭのジチオスレイトールと、を含有する還元緩衝液を提供する。

【0013】

ＨＥＰＥＳベースの緩衝液もまた、開示される方法とともに使用され得る。一実施形態は、アルキル化剤、例えば５５～７５ｍＭの２－ヨードアセトアミドと、０．１～１．０％のドデシル硫酸リチウムと、５～８５ｍＭのＨＥＰＥＳと、５～１１５ｍＭの塩化ナトリウムと、を含有し、水性電気泳動試料緩衝液は、９未満のｐＨを有する、非還元ＨＥＰＥＳベースの水性電気泳動試料緩衝液を提供する。別の実施形態では、緩衝液のｐＨは８である。更に別の実施形態では、水性緩衝液は、６６．４ｍＭの２－ヨードアセトアミドと、０．３２％のドデシル硫酸リチウムと、１６．２ｍＭのＨＥＰＥＳと、４８．６ｍＭの塩化ナトリウムと、を含有する。

【0014】

別の実施形態は、０．０５～０．７５％のドデシル硫酸リチウムと、５ｍＭ～１１５ｍＭの塩化ナトリウムと、５ｍＭ～１１５ｍＭのＨＥＰＥＳと、還元剤と、を含有する、還元性ＨＥＰＥＳベースの水性電気泳動試料緩衝液を提供し、水性電気泳動試料緩衝液は、７を超えるｐＨを有する。一実施形態では、緩衝液のｐＨは８である。一実施形態では、還元緩衝液は、３５～５０ｍＭのジチオスレイトールを含有する。更に別の実施形態は、０．２８％のドデシル硫酸リチウムと、４１．５ｍＭ塩化ナトリウムと、１３．８ｍＭ ＨＥＰＥＳと、４２．５ｍＭのジチオスレイトールと、を含有する還元緩衝液を提供する。

【0015】

一実施形態は、タンパク質薬物試料中の汚染物質又は不純物を同定するための非還元ＭＣＥ法であって、タンパク質試料を上述の非還元緩衝液に添加して、緩衝タンパク質薬物試料を形成するステップを含む方法を提供する。緩衝タンパク質薬物試料を６５～８５℃で５～１５分間加熱して、変性緩衝タンパク質薬物試料を形成する。一実施形態では、緩衝タンパク質薬物試料は、７０℃で１０分間加熱される。

【0016】

別の実施形態では、タンパク質薬物試料中の汚染物質又は不純物を同定するための非還元ＭＣＥ法は、タンパク質試料を上述の非還元緩衝液に添加して、緩衝タンパク質薬物試料を形成するステップを含む。緩衝タンパク質薬物試料を５０～７２℃で５～１５分間加熱して、変性緩衝タンパク質薬物試料を形成する。あるいは、緩衝タンパク質薬物試料を４５～７５℃の間で５～１５分間加熱して、変性緩衝タンパク質薬物試料を形成する。一実施形態では、緩衝タンパク質薬物試料は、６０℃～６５℃で１０分間加熱される。別の実施形態では、緩衝タンパク質薬物試料は、６３℃で１０分間加熱される。別の実施形態では、緩衝タンパク質薬物試料は、６０℃で１０分間加熱される。

【0017】

一部の実施形態では、タンパク質薬物試料を検出可能な標識と混合し、３０～４０℃で２０～４０分間又は１０～４０分間加熱して、変性標識タンパク質薬物試料を形成する。他の実施形態では、タンパク質薬物試料を検出可能な標識と混合し、３０～４０℃で１５分間加熱して、変性標識タンパク質薬物試料を形成する。検出可能な標識としては、Ｄｙｏｍｉｃｓ ＤＹ－６３１ ＮＨＳエステルが挙げられるが、これに限定されない。一部の実施形態では、標識は、ＭｉｌｌｉＱ精製水によって希釈され、他の実施形態では、標識は、リン酸ナトリウム緩衝液中で希釈される。一部の例では、検出可能な標識は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）で再構成され、続いて２００ｍＭのリン酸ナトリウムｐＨ７．２緩衝液で希釈される。他の色素、フルオロフォア、発色団、質量タグ、量子ドットなど、及び米国特許第６，９２４，３７２号に開示されているものを含む、他の検出可能な標識を使用することができる。一実施形態では、標識が添加されたタンパク質薬物試料は、３５℃で３０分間加熱される。別の実施形態では、標識が添加されたタンパク質薬物試料は、３５℃で１５分間加熱される。過剰な標識は、必要に応じて、例えば、スピンフィルタを使用することによって、試料から除去される。更に別の実施形態では、過剰な標識はクエンチされない。更に別の実施形態では、過剰な標識は除去されない。

【0018】

変性標識タンパク質薬物製品を希釈し、ＭＣＥに供して、マイクロチップキャピラリー電気泳動システム上で希釈されたタンパク質薬物試料を分離して、電気泳動図を得る。一実施形態では、０．５ｍｇ／ｍｌで開始し、次いでマイクロチップ上に注入される試料の最終濃度は、ＭＣＥに対して９μｇ／ｍｌである。別の実施形態では、０．２ｍｇ／ｍｌで開始し、次いでマイクロチップ上に注入される試料の最終濃度は、ＭＣＥに対して３．６μｇ／ｍｌである。電気泳動図は、タンパク質薬物製品及び不純物に対応するピークを含む。本方法は、タンパク質薬物製品、汚染物質、及び／又は不純物に対応する、電気泳動図中のピークを同定することによって終了する。

【0019】

別の実施形態は、タンパク質薬物試料中の汚染物質又は不純物を同定するための還元ＭＣＥ法を提供する。本方法は、タンパク質試料を上記の還元緩衝液のいずれか１つに添加して、緩衝タンパク質薬物試料を形成することによって開始する。緩衝タンパク質薬物試料を６５～８５℃、好ましくは７５℃で１０分間加熱することによって、緩衝タンパク質薬物試料を変性させて、変性タンパク質薬物試料を形成する。タンパク質薬物試料を検出可能な標識と混合し、３０～４０℃で２０～４０分間加熱して、変性標識タンパク質薬物試料を形成する。一実施形態では、標識が添加されたタンパク質薬物試料は、３５℃で３０分間加熱される。

【0020】

他の実施形態では、緩衝タンパク質薬物試料は、緩衝タンパク質薬物試料を５０～７２℃、好ましくは６０℃で１０分間加熱することによって変性されて、変性タンパク質薬物試料が形成される。例えば、タンパク質薬物試料を検出可能な標識と混合し、３０～４０℃で１５分間加熱して、変性標識タンパク質薬物試料を形成する。別の実施形態では、標識が添加されたタンパク質薬物試料は、３５℃で１５分間加熱される。

【0021】

過剰な標識は、必要に応じて、例えば、スピンフィルタを使用することによって、試料から除去される。更に別の実施形態では、過剰な標識はクエンチされない。更に別の実施形態では、過剰な標識は除去されない。例示的な検出可能な標識としては、Ｄｙｏｍｉｃｓ ＤＹ－６３１ ＮＨＳエステルが挙げられるが、これに限定されない。使用され得る他の検出可能な標識としては、他の色素、フルオロフォア、発色団、質量タグ、量子ドットなど、及び米国特許第６，９２４，３７２号に開示されるものが挙げられる。

【0022】

１つの実施形態では、試料濃度についての確立されたアッセイ範囲は、０．４ｍｇ／ｍｌ～０．６ｍｇ／ｍｌであり、これは、約７μｇ／ｍｌ～１１μｇ／ｍｌの分析される最終濃度に対応し、これは、マイクロチップキャピラリー電気泳動システムでのＭＣＥ分析に供されて、電気泳動図が生成される。別の実施形態では、試料濃度の確立されたアッセイ範囲は、約３．６μｇ／ｍｌ～１１μｇ／ｍｌの分析される最終濃度に対応する、０．２ｍｇ／ｍｌ～０．６ｍｇ／ｍｌである。本方法は、タンパク質薬物製品、汚染物質、及び／又は不純物に対応する、電気泳動図中のピークを同定することによって終了する。

【図面の簡単な説明】

【0023】

【図1A】典型的な非還元試料分析の電気泳動図を示す。

【0024】

【図1B】典型的な還元試料分析の電気泳動図を示す。Ｘ軸は時間（分）を表し、Ｙ軸は相対蛍光単位（ＲＦＵ）を表す。移動時間の増加は、タンパク質サイズの増加に対応する。

【発明を実施するための形態】

【0025】

Ｉ．定義
本発明を説明する文脈における（特に特許請求の範囲の文脈における）「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」という用語、及び類似の指示対象の使用は、本明細書において別段の指示がない限り、又は文脈によって明らかに矛盾しない限り、単数及び複数の両方を包含すると解釈されるべきである。

【0026】

本明細書中の値の範囲の列挙は、本明細書中で他に示されない限り、その範囲内に入る各別個の値を個々に言及する省略法として役立つことが単に意図され、そして各別個の値は、本明細書中に個々に列挙されたかのように本明細書中に援用される。

【0027】

「約」という用語の使用は、約＋／－１０％の範囲で記載された値の上又は下のいずれかの値を記載することが意図され、他の実施形態では、値は、約＋／－５％の範囲で記載された値の上又は下のいずれかの値の範囲であり得、他の実施形態では、値は、約＋／－２％の範囲で記載された値の上又は下のいずれかの値の範囲であり得、他の実施形態では、値は、約＋／－１％の範囲で記載された値の上又は下のいずれかの値の範囲であり得る。前述の範囲は、文脈によって明確にされることが意図され、更なる限定は暗示されない。本明細書に記載される全ての方法は、本明細書中で別段の指示がない限り、又は文脈によって明らかに矛盾しない限り、任意の好適な順序で実施され得る。本明細書中に提供される任意の及び全ての例、又は例示的な言語（例えば、「～など」）の使用は、単に本発明をより良く明らかにすることが意図され、そして他に特許請求されない限り、本発明の範囲に対して限定をもたらさない。本明細書中のいかなる言語も、特許請求されていない任意の要素が本発明の実施に必須であることを示すと解釈されるべきではない。

【0028】

「タンパク質」は、ペプチド結合によって互いに連結された２つ以上のアミノ酸残基を含む分子をいう。タンパク質には、ポリペプチド及びペプチドが含まれ、グリコシル化、脂質結合、硫酸化、グルタミン酸残基のγ－カルボキシル化、アルキル化、ヒドロキシル化及びＡＤＰリボシル化などの修飾も含まれ得る。タンパク質は、タンパク質ベースの薬物を含めて、科学的又は商業的対象であり得、タンパク質には、とりわけ、酵素、リガンド、受容体、抗体及びキメラ又は融合タンパク質が含まれる。タンパク質は、周知の細胞培養法を使用して種々のタイプの組換え細胞によって産生され、概して、遺伝子工学技術（例えば、キメラタンパク質をコードする配列、又はコドン最適化配列、イントロンを含まない配列など）によって細胞に導入され、ここで、タンパク質は、エピソームとして存在し得るか、又は細胞のゲノムに組み込まれ得る。

【0029】

「抗体」は、ジスルフィド結合によって相互接続された４つのポリペプチド鎖、２つの重（Ｈ）鎖及び２つの軽（Ｌ）鎖からなる免疫グロブリン分子を指す。各重鎖は、重鎖可変領域（ＨＣＶＲ又はＶＨ）及び重鎖定常領域を有する。重鎖定常領域は、３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３を含有する。各軽鎖は、軽鎖可変領域及び軽鎖定常領域を有する。軽鎖定常領域は、１つのドメイン（ＣＬ）からなる。ＶＨ及びＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と称されるより保存された領域に散在する、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される超可変性の領域に更に細分することができる。各ＶＨ及びＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端へ、以下の順序で配置された３つのＣＤＲ及び４つのＦＲで構成される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。「抗体」という用語は、任意のアイソタイプ又はサブクラスのグリコシル化及び非グリコシル化免疫グロブリンの両方への言及を含む。「抗体」という用語は、抗体を発現するようにトランスフェクトされた宿主細胞から単離された抗体などの、組換え手段によって調製、発現、作製又は単離された抗体分子を含む。抗体という用語はまた、２つ以上の異なるエピトープに結合することができるヘテロ四量体免疫グロブリンを含む二重特異性抗体も含む。二重特異性抗体は、概して、米国特許第８，５８６，７１３号に記載されている。

【0030】

「Ｆｃ融合タンパク質」は、２つ以上のタンパク質の一部又は全てを含み、これらのうちの１つは、免疫グロブリン分子のＦｃ部分であり、これらは、そうでなければ、天然に一緒に見出されない。抗体由来ポリペプチドの種々の部分（Ｆｃドメインを含む）に融合された特定の異種ポリペプチドを含む融合タンパク質の調製は、例えば、Ａｓｈｋｅｎａｚｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ，８８：１０５３５（１９９１）、Ｂｙｒｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３４４：６７７（１９９０）、及びＨｏｌｌｅｎｂａｕｇｈ ｅｔ ａｌ．，”Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｆｕｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ”，ｉｎ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌ．４，ｐａｇｅｓ １０．１９．１－１０．１９．１１（１９９２）に記載されている。「受容体Ｆｃ融合タンパク質」は、Ｆｃ部分に結合した受容体の１つ以上の細胞外ドメインを含み、一部の実施形態では、免疫グロブリンのＣＨ２及びＣＨ３ドメインが後に続くヒンジ領域を含む。一部の実施形態では、Ｆｃ融合タンパク質は、１つ以上のリガンドに結合する２つ又はそれ以上の別個の受容体鎖を含む。例えば、Ｆｃ融合タンパク質は、例えば、ＩＬ－１トラップ又はＶＥＧＦトラップなどのトラップである。

【0031】

「ＭＣＥ」又は「マイクロチップキャピラリー電気泳動」という用語は、分析物のマイクロチップベースのキャピラリー電気泳動（ＣＥ）分離をいう。

【0032】

ＩＩ．ＭＣＥアッセイ及び緩衝液
タンパク質薬物試料中の分析物を分析するための方法が提供される。タンパク質薬物としては、抗体及びその抗原結合フラグメント、融合タンパク質、並びに組換えタンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。このアッセイは、ＭＣＥ技術を使用して、タンパク質製品及びタンパク質製品中の不純物を分離、同定、及び定量する。不純物には、タンパク質凝集体、タンパク質断片、タンパク質多量体、及びアッセイ混入物が含まれるが、これらに限定されない。還元緩衝液及び非還元緩衝液もまた提供される。

【0033】

マイクロチップキャピラリー電気泳動（ＭＣＥ）は、インプロセス試験、ロットリリース、及び安定性指標に好適なタンパク質純度及び不純物の分析を提供する。ｃａｓｉｒｉｖｉｍａｂ及びｉｍｄｅｖｉｍａｂのようなタンパク質試料は、試料を加熱し、アルキル化試薬（非還元）又は還元試薬（還元）のいずれかとともにドデシル硫酸リチウム（ＬＤＳ）を添加することにより変性させて調製した。理論に束縛されることを意図しないが、これは、線状の負に荷電したタンパク質－ＬＤＳポリペプチド鎖を生成し、次いで、これをアミンエステル色素とともにインキュベートして、任意の遊離アミン基を共有結合的に標識する。標識された試料は、マイクロチップ上に注入され得、ここで、電流の適用は、質量電荷比に従って試料成分を分離する。検出は、電気泳動図を生成するレーザ誘起蛍光によって行うことができる。電気泳動図の分析は、存在する不純物と比較した試料の相対的純度を提供する。

【0034】

Ａ．緩衝液
１．非還元緩衝液
一実施形態は、１５５～２００ｍＭのアルキル化剤、例えば２－ヨードアセトアミドと、０．５０～１．５％のドデシル硫酸リチウムと、６０～９５ｍＭのリン酸ナトリウムと、を含有する非還元性水性電気泳動試料緩衝液を提供し、水性電気泳動試料緩衝液は、７未満のｐＨを有する。一実施形態では、緩衝液のｐＨは６である。別の実施形態では、水性緩衝液は、１６６ｍＭの２－ヨードアセトアミドと、０．８１％のドデシル硫酸リチウムと、８１ｍＭのリン酸ナトリウムと、を含有する。

【0035】

別の実施形態は、１５５～２００ｍＭのアルキル化剤と、０．５０～１．５％のドデシル硫酸リチウムと、６０～９５ｍＭのリン酸ナトリウムと、を含有し、８以下のｐＨを有する、非還元性水性電気泳動試料緩衝液を提供する。別の実施形態では、緩衝液のｐＨは８である。別の実施形態では、水性緩衝液は、２００ｍＭの２－ヨードアセトアミドと、１．２％のドデシル硫酸リチウムと、６０ｍＭのリン酸ナトリウムと、を含有する。

【0036】

別の実施形態は、１５５～２００ｍＭのアルキル化剤と、０．５０～１．５％のドデシル硫酸リチウムと、６０～９５ｍＭのリン酸ナトリウムと、を含有し、８未満のｐＨを有する、非還元性水性電気泳動試料緩衝液を提供する。別の実施形態では、緩衝液のｐＨは６である。別の実施形態では、水性緩衝液は、２００ｍＭの２－ヨードアセトアミドと、１．２％のドデシル硫酸リチウムと、６０ｍＭのリン酸ナトリウムと、を含有する。

【0037】

２．還元緩衝液
還元緩衝液も提供される。一実施形態では、還元緩衝液は、０．５～１．５％のドデシル硫酸リチウムと、６５～９５ｍＭのリン酸ナトリウムと、還元剤と、を含有する水性電気泳動試料緩衝液であり、水性電気泳動試料緩衝液は、８を超えるｐＨを有する。別の実施形態では、上記還元緩衝液は、０．５～１．５％のドデシル硫酸リチウムと、４５～９５ｍＭのリン酸ナトリウムと、還元剤と、を含有し、水性電気泳動試料緩衝液は、８以上のｐＨを有する。一実施形態では、緩衝液のｐＨは９である。別の実施形態では、緩衝液のｐＨは８である。

【0038】

還元剤は当技術分野で公知である。例示的な還元剤としては、ジチオスレイトール（ＤＴＴ、ＣＡＳ ３４８３－１２－３）、β－メルカプトエタノール（ＢＭＥ、２ ＢＭＥ、２－ＭＥ、ｂ－ｍｅｒ、ＣＡＳ ６０－２４－２）、２－アミノエタンチオール（２－ＭＥＡ－ＨＣｌ、システアミン－ＨＣｌとも称される、ＣＡＳ １５６－５７－０）、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ、ＣＡＳ ５９６１－８５－３）、システイン塩酸塩（Ｃｙｓ－ＨＣｌ、ＣＡＳ ５２－８９－１）、又は２－メルカプトエタンスルホン酸ナトリウム塩（ＭＥＳＮＡ）が挙げられるが、これらに限定されない。ペプチド及びタンパク質ジスルフィド結合の固相還元を可能にするためにチオールベースの還元剤が固定化された樹脂を含有する固定化還元剤カラムなどの、タンパク質結合を還元するための他の方法が当技術分野で公知である。ジスルフィド結合を切断するのに好適な更なる還元剤もまた想定される。

【0039】

一実施形態では、還元緩衝液は、１３５～１５５ｍＭのジチオスレイトールを含有する。別の実施形態では、還元緩衝液は、８０～１５５ｍＭのジチオスレイトールを含有する。

【0040】

更に別の実施形態は、０．６９％のドデシル硫酸リチウムと、６９ｍＭのリン酸ナトリウムと、１４２ｍＭのジチオスレイトール、又は１．２％のドデシル硫酸リチウムと、６０ｍＭのリン酸ナトリウムと、８０ｍＭのジチオスレイトールと、を含有する還元緩衝液を提供する。

【0041】

３．ＨＥＰＥＳベースの非還元緩衝液
ＨＥＰＥＳベースの緩衝液もまた、開示される方法とともに使用され得る。一実施形態は、アルキル化剤、例えば５５～７５ｍＭの２－ヨードアセトアミドと、０．１～１．０％のドデシル硫酸リチウムと、５～８５ｍＭのＨＥＰＥＳと、５～１１５ｍＭの塩化ナトリウムと、を含有し、９未満のｐＨを有する、非還元ＨＥＰＥＳベースの水性電気泳動試料緩衝液を提供する。一実施形態では、緩衝液のｐＨは８である。別の実施形態では、水性緩衝液は、６６．４ｍＭの２－ヨードアセトアミドと、０．３２％のドデシル硫酸リチウムと、１６．２ｍＭのＨＥＰＥＳと、４８．６ｍＭの塩化ナトリウムと、を含有する。

【0042】

４．ＨＥＰＥＳベースの還元緩衝液
別の実施形態は、０．０５～０．７５％のドデシル硫酸リチウムと、５ｍＭ～１１５ｍＭの塩化ナトリウムと、５ｍＭ～１１５ｍＭのＨＥＰＥＳと、還元剤と、を含有する、還元性ＨＥＰＥＳベースの水性電気泳動試料緩衝液を提供し、水性電気泳動試料緩衝液は、７を超えるｐＨを有する。一実施形態では、緩衝液のｐＨは８である。一実施形態では、還元緩衝液は、３５～５０ｍＭのジチオスレイトールを含有する。更に別の実施形態は、０．２８％のドデシル硫酸リチウムと、４１．５ｍＭ塩化ナトリウムと、１３．８ｍＭ ＨＥＰＥＳと、４２．５ｍＭのジチオスレイトールと、を含有する還元緩衝液を提供する。

【0043】

Ｂ．アッセイ
１．非還元アッセイ
一実施形態は、タンパク質薬物試料中の汚染物質又は不純物を同定するための非還元ＭＣＥ法を提供し、本方法は、タンパク質試料を上述の非還元緩衝液に添加して、緩衝タンパク質薬物試料を形成するステップを含む。緩衝タンパク質薬物試料を５０～８５℃で５～１５分間加熱して、変性緩衝タンパク質薬物試料を形成する。一実施形態では、緩衝タンパク質薬物試料は、７５℃で１０分間加熱される。別の実施形態では、緩衝タンパク質薬物試料は、４５～７５℃の間で５～１５分間加熱されて、変性緩衝タンパク質薬物試料が形成される。別の好ましい実施形態では、緩衝タンパク質薬物試料は、６０℃で１０分間加熱される。更に別の好ましい実施形態では、緩衝タンパク質薬物試料は、６３℃で１０分間加熱される。

【0044】

検出可能な標識は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中で供給業者の推奨に従って調製される。その後の希釈物を、ＭｉｌｌｉＱ中で供給業者の推奨に従って調製する。他の実施形態では、標識は、２００ｍＭのリン酸ナトリウムｐＨ７．２中での希釈によって調製される。一部の実施形態では、標識は、５μＭ溶液に希釈される。他の実施形態では、標識は１６μＭ溶液に希釈される。次いで、希釈した標識を変性緩衝タンパク質薬物試料に添加し、３０～４０℃で１０～４０分間加熱して、変性標識タンパク質薬物試料を形成する。別の実施形態では、次いで、検出可能な標識を変性緩衝タンパク質薬物試料に添加し、３０～４０℃で１５分間加熱して、変性標識タンパク質薬物試料を形成する。一実施形態では、標識が添加された変性タンパク質薬物試料は、３５℃で３０分間加熱される。別の好ましい実施形態では、標識が添加された変性タンパク質薬物試料は、３５℃で１５分間加熱される。過剰な標識は、必要に応じて、例えば、スピンフィルタを使用することによって、試料から除去される。更に別の実施形態では、過剰な標識はクエンチされない。更に別の実施形態では、過剰な標識は除去されない。

【0045】

好ましい検出可能な標識としては、Ｄｙｏｍｉｃｓ ＤＹ－６３１ ＮＨＳエステルが挙げられるが、これに限定されない。使用され得る他の検出可能な標識としては、他の色素、フルオロフォア、発色団、質量タグ、量子ドットなど、及び米国特許第６，９２４，３７２号に開示されるものが挙げられる。

【0046】

変性標識タンパク質薬物製品を希釈し、ＭＣＥに供して、マイクロチップキャピラリー電気泳動システム上で希釈されたタンパク質薬物試料を分離して、電気泳動図を得る。一実施形態では、０．５ｍｇ／ｍｌで開始し、次いでマイクロチップ上に注入される試料の最終濃度は、ＭＣＥに対して９μｇ／ｍｌである。別の実施形態では、試料開始濃度は、０．２ｍｇ／ｍｌである。電気泳動図は、タンパク質薬物製品及び不純物に対応するピークを含む。本方法は、汚染物質又は不純物に対応する、電気泳動図中のピークを同定することによって終了する。

【0047】

２．還元アッセイ
別の実施形態は、タンパク質薬物試料中の汚染物質又は不純物を同定するための還元ＭＣＥ法を提供する。本方法は、タンパク質薬物試料を上記の還元緩衝液のいずれか１つに添加して、緩衝タンパク質薬物試料を形成することによって開始される。緩衝タンパク質薬物試料を６５～８５℃、好ましくは７５℃で１０分間加熱することによって、緩衝タンパク質薬物試料を変性させて、変性タンパク質薬物試料を形成する。別の実施形態では、緩衝タンパク質薬物試料は、緩衝タンパク質薬物試料を５０～７２℃、又は４５～７５℃、又は好ましくは６０℃で１０分間加熱することによって変性されて、変性タンパク質薬物試料が形成される。更に別の好ましい実施形態では、緩衝タンパク質薬物試料は、６３℃で１０分間加熱される。標的タンパク質薬物試料を変性させるのに必要な温度は、標的タンパク質薬物試料の構造に応じて変化させることができる。

【0048】

次いで、標識を添加したタンパク質薬物試料を３０～４０℃で２０～４０分間又は１０～２０分間又は１０～４０分間加熱して、変性標識タンパク質薬物試料を形成する。一実施形態では、標識が添加されたタンパク質薬物製品試料は、３５℃で３０分間加熱される。別の好ましい実施形態では、標識が添加されたタンパク質薬物製品試料は、３５℃で１５分間加熱される。過剰な標識は、必要に応じて、例えば、スピンフィルタを使用することによって、試料から除去される。更に別の実施形態では、過剰な標識はクエンチされない。更に別の実施形態では、過剰な標識は除去されない。好ましい検出可能な標識としては、Ｄｙｏｍｉｃｓ ＤＹ－６３１ ＮＨＳエステルが挙げられるが、これに限定されない。使用され得る他の検出可能な標識としては、他の色素、フルオロフォア、発色団、質量タグ、量子ドットなど、及び米国特許第６，９２４，３７２号に開示されるものが挙げられる。

【0049】

１つの実施形態では、試料濃度についての確立されたアッセイ範囲は、０．４ｍｇ／ｍｌ～０．６ｍｇ／ｍｌであり、これは、約７μｇ／ｍｌ～１１μｇ／ｍｌの分析される最終濃度に対応し、これは、マイクロチップキャピラリー電気泳動システムでのＭＣＥ分析に供されて、電気泳動図が生成される。別の実施形態では、試料濃度についての確立されたアッセイ範囲は、０．２ｍｇ／ｍｌ～０．６ｍｇ／ｍｌであり、これは、約３．６μｇ／ｍｌ～１１μｇ／ｍｌの分析される最終濃度に対応し、これは、マイクロチップキャピラリー電気泳動システムでのＭＣＥ分析に供されて、電気泳動図が生成される。本方法は、タンパク質薬物製品、汚染物質、及び／又は不純物に対応する、電気泳動図中のピークを同定することによって終了する。

【0050】

Ｃ．計器類
開示されたＭＣＥアッセイを実施するための計器類は市販されている。一実施形態では、開示されるＭＣＥアッセイは、ＬａｂＣｈｉｐ ＧＸＩＩ又はＬａｂＣｈｉｐ ＧＸＩＩ Ｔｏｕｃｈ ＨＴ及びＬａｂＣｈｉｐ（登録商標）ＨＴ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｃｈｉｐを使用して実施される。

【0051】

ＩＩＩ．対象のタンパク質
開示されるＭＣＥアッセイ及び試薬を用いてアッセイされる対象のタンパク質、例えば、タンパク質薬物製品は、原核細胞又は真核細胞における発現に好適な任意の対象のタンパク質であり得、提供される操作された宿主細胞系において使用され得る。例えば、対象のタンパク質としては、抗体若しくはその抗原結合フラグメント、キメラ抗体若しくはその抗原結合フラグメント、ＳｃＦｖ若しくはそのフラグメント、Ｆｃ融合タンパク質若しくはそのフラグメント、増殖因子若しくはそのフラグメント、サイトカイン若しくはそのフラグメント、又は細胞表面レセプターの細胞外ドメイン若しくはそのフラグメントが挙げられるが、これらに限定されない。対象のタンパク質は、単一のサブユニットからなる単純なポリペプチド、又は２つ以上のサブユニットを含む複雑なマルチサブユニットタンパク質であり得る。対象のタンパク質は、バイオ医薬品製品、食品添加物若しくは保存剤、又は精製及び品質基準に供される任意のタンパク質薬物製品であり得る。

【0052】

一部の実施形態では、タンパク質薬物製品（対象のタンパク質）は、抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、モノクローナル抗体、多重特異性抗体、二重特異性抗体、抗原結合抗体断片、一本鎖抗体、ダイアボディ、トリアボディ、又はテトラボディ、Ｆａｂ断片又はＦ（ａｂ’）２断片、ＩｇＤ抗体、ＩｇＥ抗体、ＩｇＭ抗体、ＩｇＧ抗体、ＩｇＧ１抗体、ＩｇＧ２抗体、ＩｇＧ３抗体、又はＩｇＧ４抗体である。一実施形態では、抗体はＩｇＧ１抗体である。一実施形態では、抗体はＩｇＧ２抗体である。一実施形態では、抗体はＩｇＧ４抗体である。一実施形態では、抗体はキメラＩｇＧ２／ＩｇＧ４抗体である。一実施形態では、抗体はキメラＩｇＧ２／ＩｇＧ１抗体である。一実施形態では、抗体はキメラＩｇＧ２／ＩｇＧ１／ＩｇＧ４抗体である。

【0053】

実施形態は、任意の公知の治療用抗体治療薬とともに使用することができる。一部の実施形態では、抗体は、抗プログラム細胞死１抗体（例えば、米国特許出願公開第２０１５／０２０３５７９Ａ１号に記載される抗ＰＤ１抗体）、抗プログラム細胞死リガンド－１（例えば、米国特許出願公開第２０１５／０２０３５８０Ａ１号に記載される抗ＰＤ－Ｌ１抗体）、抗Ｄｌｌ４抗体、抗アンジオポエチン－２抗体（例えば、米国特許第９，４０２，８９８号に記載される抗ＡＮＧ２抗体）、抗アンジオポエチン様３抗体（例えば、米国特許第９，０１８，３５６号に記載されている抗Ａｎｇｐｔｌ３抗体）、抗血小板誘導増殖因子受容体抗体（例えば、米国特許第９，２６５，８２７号に記載されている抗ＰＤＧＦＲ抗体）、抗Ｅｒｂ３抗体、抗プロラクチン受容体抗体（例えば、米国特許第９，３０２，０１５号に記載される抗ＰＲＬｒ抗体）、抗補体５抗体（例えば、米国特許出願公開第２０１５／０３１３１９４Ａ１号に記載される抗Ｃ５抗体）、抗ＴＮＦ抗体、抗上皮成長因子受容体抗体（例えば、米国特許第９，１３２，１９２号に記載されている抗ＥＧＦＲ抗体又は米国特許出願公開第２０１５／０２５９４２３Ａ１号に記載されている抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体）、抗プロタンパク質転換酵素ズブチリシンケキシン－９抗体（例えば、米国特許第８，０６２，６４０号又は米国特許第９，５４０，４４９号に記載される抗ＰＣＳＫ９抗体）、抗増殖分化因子－８抗体（例えば、米国特許第８，８７１，２０９号又は同第９，２６０，５１５号に記載されるような、抗ミオスタチン抗体としても公知の抗ＧＤＦ８抗体）、抗グルカゴン受容体（例えば、米国特許出願公開第２０１５／０３３７０４５Ａ１号又は同第２０１６／００７５７７８Ａ１号に記載されている抗ＧＣＧＲ抗体）、抗ＶＥＧＦ抗体、抗ＩＬ１Ｒ抗体、インターロイキン４受容体抗体（例えば、米国特許出願公開第２０１４／０２７１６８１Ａ１号又は米国特許第８，７３５，０９５号若しくは同第８，９４５，５５９号に記載されている抗ＩＬ４Ｒ抗体）、抗インターロイキン６受容体抗体（例えば、米国特許第７，５８２，２９８号、同第８，０４３，６１７号又は同第９，１７３，８８０号に記載されている抗ＩＬ６Ｒ抗体）、抗ＩＬ１抗体、抗ＩＬ２抗体、抗ＩＬ３抗体、抗ＩＬ４抗体、抗ＩＬ５抗体、抗ＩＬ６抗体、抗ＩＬ７抗体、抗インターロイキン３３（例えば、米国特許第９，４５３，０７２号又は同第９，６３７，５３５号に記載される抗ＩＬ３３抗体）、抗呼吸器合胞体ウイルス抗体（例えば、米国特許出願公開第９，４４７，１７３号に記載されている抗ＲＳＶ抗体）、抗分化抗原群３（例えば、米国特許第９，４４７，１７３号及び同第９，４４７，１７３号、並びに米国特許出願第６２／２２２，６０５号に記載される抗ＣＤ３抗体）、抗分化抗原群２０（例えば、米国特許第９，６５７，１０２号及びＵＳ２０１５／０２６６９６６Ａ１、並びに米国特許第７，８７９，９８４号に記載されている抗ＣＤ２０抗体）、抗ＣＤ１９抗体、抗ＣＤ２８抗体、抗分化抗原群－４８（例えば、米国特許第９，２２８，０１４号に記載の抗ＣＤ４８抗体）、抗Ｆｅｌ ｄ１抗体（例えば、米国特許第９，０７９，９４８号に記載されている）、抗中東呼吸症候群ウイルス（例えば、米国特許出願公開第２０１５／０３３７０２９Ａ１号に記載される抗ＭＥＲＳ抗体）、抗エボラウイルス抗体（例えば、米国特許出願公開第２０１６／０２１５０４０号に記載されている）、抗ジカウイルス抗体、抗リンパ球活性化遺伝子３抗体（例えば、抗ＬＡＧ３抗体、又は抗ＣＤ２２３抗体）、抗神経成長因子抗体（例えば、米国特許出願公開第２０１６／００１７０２９号並びに米国特許第８，３０９，０８８号及び同第９，３５３，１７６号に記載されている抗ＮＧＦ抗体）及び抗タンパク質Ｙ抗体からなる群から選択され得る。一部の実施形態では、二重特異性抗体は、抗ＣＤ３×抗ＣＤ２０二重特異性抗体（米国特許出願公開第２０１４／００８８２９５Ａ１号及び同第２０１５／０２６６９６６Ａ１号に記載されている）、抗ＣＤ３×抗ムチン１６二重特異性抗体（例えば、抗ＣＤ３×抗Ｍｕｃ１６二重特異性抗体）、及び抗ＣＤ３×抗前立腺特異的膜抗原二重特異性抗体（例えば、抗ＣＤ３×抗ＰＳＭＡ二重特異性抗体）からなる群から選択され得る。一部の実施形態では、対象のタンパク質は、ｃａｓｉｒｉｖｉｍａｂ、ｉｍｄｅｖｉｍａｂ、ｒａｖｕｌｉｚｕｍａｂ－ｃｗｖｚ、ａｂｃｉｘｉｍａｂ、ａｄａｌｉｍｕｍａｂ、ａｄａｌｉｍｕｍａｂ－ａｔｔｏ、ａｄｏ－ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ、ａｌｅｍｔｕｚｕｍａｂ、ａｌｉｒｏｃｕｍａｂ、ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ、ａｖｅｌｕｍａｂ、ｂａｓｉｌｉｘｉｍａｂ、ｂｅｌｉｍｕｍａｂ、ｂｅｎｒａｌｉｚｕｍａｂ、ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ、ｂｅｚｌｏｔｏｘｕｍａｂ、ｂｌｉｎａｔｕｍｏｍａｂ、ｂｒｅｎｔｕｘｉｍａｂ ｖｅｄｏｔｉｎ、ｂｒｏｄａｌｕｍａｂ、ｃａｎａｋｉｎｕｍａｂ、ｃａｐｒｏｍａｂ ｐｅｎｄｅｔｉｄｅ、ｃｅｒｔｏｌｉｚｕｍａｂ ｐｅｇｏｌ、ｃｅｍｉｐｌｉｍａｂ、ｃｅｔｕｘｉｍａｂ、ｄｅｎｏｓｕｍａｂ、ｄｉｎｕｔｕｘｉｍａｂ、ｄｕｐｉｌｕｍａｂ、ｄｕｒｖａｌｕｍａｂ、ｅｃｕｌｉｚｕｍａｂ、ｅｌｏｔｕｚｕｍａｂ、ｅｍｉｃｉｚｕｍａｂ－ｋｘｗｈ、ｅｍｔａｎｓｉｎｅａｌｉｒｏｃｕｍａｂ、ｅｖｉｎａｃｕｍａｂ、ｅｖｏｌｏｃｕｍａｂ、ｆａｓｉｎｕｍａｂ、ｇｏｌｉｍｕｍａｂ、ｇｕｓｅｌｋｕｍａｂ、ｉｂｒｉｔｕｍｏｍａｂ ｔｉｕｘｅｔａｎ、ｉｄａｒｕｃｉｚｕｍａｂ、ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ、ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ－ａｂｄａ、ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ－ｄｙｙｂ、ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ、ｉｘｅｋｉｚｕｍａｂ、ｍｅｐｏｌｉｚｕｍａｂ、ｎｅｃｉｔｕｍｕｍａｂ、ｎｅｓｖａｃｕｍａｂ、ｎｉｖｏｌｕｍａｂ、ｏｂｉｌｔｏｘａｘｉｍａｂ、ｏｂｉｎｕｔｕｚｕｍａｂ、ｏｃｒｅｌｉｚｕｍａｂ、ｏｆａｔｕｍｕｍａｂ、ｏｌａｒａｔｕｍａｂ、ｏｍａｌｉｚｕｍａｂ、ｐａｎｉｔｕｍｕｍａｂ、ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ、ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ、ｒａｍｕｃｉｒｕｍａｂ、ｒａｎｉｂｉｚｕｍａｂ、ｒａｘｉｂａｃｕｍａｂ、ｒｅｓｌｉｚｕｍａｂ、ｒｉｎｕｃｕｍａｂ、ｒｉｔｕｘｉｍａｂ、ｓａｒｉｌｕｍａｂ、ｓｅｃｕｋｉｎｕｍａｂ、ｓｉｌｔｕｘｉｍａｂ、ｔｏｃｉｌｉｚｕｍａｂ、ｔｏｃｉｌｉｚｕｍａｂ、ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ、ｔｒｅｖｏｇｒｕｍａｂ、ｕｓｔｅｋｉｎｕｍａｂ、及びｖｅｄｏｌｉｚｕｍａｂからなる群から選択することができる。

【0054】

一部の実施形態では、対象のタンパク質は、Ｆｃ部分及び別のドメインを含有する組換えタンパク質（例えば、Ｆｃ融合タンパク質）である。一部の実施形態では、Ｆｃ融合タンパク質は、Ｆｃ部分にカップリングされた受容体の１つ以上の細胞外ドメインを含有する受容体Ｆｃ融合タンパク質である。一部の実施形態では、Ｆｃ部分は、ヒンジ領域、続いてＩｇＧのＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含む。一部の実施形態では、受容体Ｆｃ融合タンパク質は、単一のリガンド又は複数のリガンドのいずれかに結合する２つ以上の異なる受容体鎖を含有する。例えば、Ｆｃ融合タンパク質は、ＩＬ－１トラップ（例えば、ｈＩｇＧ１のＦｃに融合されたＩｌ－１Ｒ１細胞外領域に融合されたＩＬ－１ＲＡｃＰリガンド結合領域を含有するリロナセプト、米国特許第６，９２７，０４４号を参照）、又はＶＥＧＦトラップ（例えば、ｈＩｇＧ１のＦｃに融合されたＶＥＧＦレセプターＦｌｋ１のＩｇドメイン３に融合されたＶＥＧＦレセプターＦｌｔ１のＩｇドメイン２を含むアフリベルセプト又はｚｉｖ－アフリベルセプト、米国特許第７，０８７，４１１号及び同第７，２７９，１５９号を参照）のようなＴＲＡＰタンパク質である。他の実施形態では、Ｆｃ融合タンパク質は、ｓｃＦｖ－Ｆｃ融合タンパク質であり、これは、Ｆｃ部分に結合された抗体の１つ以上の抗原結合ドメイン（例えば、可変重鎖フラグメント及び可変軽鎖フラグメント）のうちの１つ以上を含有する。

【0055】

ＩＶ．細胞培養
開示されるＭＣＥアッセイ及び試薬を用いてアッセイされるタンパク質薬物製品は、産生された細胞培養物である。細胞培養は、バッチ培養を指す「流加細胞培養」又は「流加培養」であり得、ここで、細胞及び培養培地は、最初に培養容器に供給され、追加の培養栄養素は、培養の終了前に定期的な細胞及び／又は生成物の回収を伴って又は伴わずに、培養中に培養物に別個の増分でゆっくりと供給される。流加培養は、周期的に培養物全体（細胞及び培地を含み得る）が除去され、新鮮な培地によって置き換えられる「半連続流加培養」を含む。流加培養は、単純な「バッチ培養」とは区別されるが、細胞培養のための全ての成分（動物細胞及び全ての培養栄養素を含む）は、バッチ培養における培養プロセスの開始時に培養容器に供給される。流加培養は、標準的な流加プロセスの間に培養容器から上清が除去されない限り、「灌流培養」とは異なり得るが、灌流培養では、細胞は、例えば、濾過によって培養物中に拘束され、培養培地は、連続的又は断続的に導入され、培養容器から除去される。しかしながら、流加細胞培養中の試験対象のための試料の除去が企図される。流加プロセスは、最大作業体積及び／又はタンパク質製品に達したことが決定されるまで継続し、その後、タンパク質が採取される。

【0056】

細胞培養は、通常は特定の増殖期に細胞を継続的に増殖させるために使用される技術である「連続細胞培養」であり得る。例えば、細胞の一定の供給が必要とされる場合、又は対象の特定のタンパク質の産生が必要とされる場合、細胞培養は、特定の増殖期における維持を必要とし得る。したがって、細胞をその特定の相に維持するためには、条件を継続的に監視し、それに応じて調整しなければならない。

【0057】

細胞は、細胞培養培地中で培養される。「細胞培養培地」及び「培養培地」という用語は、哺乳動物細胞を増殖させるために使用される栄養溶液であって、典型的には、細胞の増殖を増強するために必要な栄養素、例えば、糖質エネルギー源、必須アミノ酸（例えば、フェニルアラニン、バリン、スレオニン、トリプトファン、メチオニン、ロイシン、イソロイシン、リジン、及びヒスチジン）及び非必須アミノ酸（例えば、アラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、プロリン、セリン、及びチロシン）、微量元素、エネルギー源、脂質、ビタミンなどを提供する栄養溶液を指す。細胞培養培地は、細胞増殖を支持する原材料を供給する抽出物、例えば、血清又はペプトン（加水分解物）を含有し得る。培地は、動物由来抽出物の代わりに、酵母由来又は大豆抽出物を含有してもよい。化学的に規定された培地とは、全ての化学成分が公知である（すなわち、公知の化学構造を有する）細胞培養培地をいう。化学的に定義された培地は、血清又は動物由来ペプトンなどの動物由来成分を完全に含まない。一実施形態では、培地は化学的に定義された培地である。

【0058】

この溶液はまた、ホルモン及び増殖因子を含む、最小速度を超えて増殖及び／又は生存を増強する成分を含有し得る。この溶液は、培養される特定の細胞の生存及び増殖に最適なｐＨ及び塩濃度に処方され得る。

【0059】

「細胞株」とは、細胞の連続継代又は継代培養を介して特定の系統に由来する細胞（単数又は複数）をいう。「細胞」という用語は、「細胞集団」と交換可能に使用される。

【0060】

「細胞」という用語は、組換え核酸配列を発現するのに好適な任意の細胞を含む。細胞には、細菌細胞、哺乳動物細胞、ヒト細胞、非ヒト動物細胞、鳥類細胞、昆虫細胞、酵母細胞、又は例えばハイブリドーマ若しくはクアドローマなどの細胞融合物などの、原核生物及び真核生物の細胞が含まれる。ある特定の実施形態では、細胞は、ヒト、サル、類人猿、ハムスター、ラット又はマウス細胞である。他の実施形態では、細胞は、以下の細胞、すなわち、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）（例えば、ＣＨＯ Ｋ１、ＤＸＢ－１１ ＣＨＯ、Ｖｅｇｇｉｅ－ＣＨＯ）、ＣＯＳ（例えば、ＣＯＳ－７）、網膜細胞、Ｖｅｒｏ、ＣＶ１、腎臓（例えば、ＨＥＫ２９３、２９３ ＥＢＮＡ、ＭＳＲ ２９３、ＭＤＣＫ、ＨａＫ、ＢＨＫ２１）、ＨｅＬａ、ＨｅｐＧ２、ＷＩ３８、ＭＲＣ ５、Ｃｏｌｏ２５、ＨＢ ８０６５、ＨＬ－６０、リンパ球、例えば、Ｊｕｒｋａｔ（Ｔリンパ球）又はＤａｕｄｉ（Ｂリンパ球）、Ａ４３１（表皮）、Ｕ９３７、３Ｔ３、Ｌ細胞、Ｃ１２７細胞、ＳＰ２／０、ＮＳ－０、ＭＭＴ細胞、幹細胞、腫瘍細胞、及び前述の細胞に由来する細胞株から選択することができる。一部の実施形態では、細胞は、１つ以上のウイルス遺伝子、例えば、ウイルス遺伝子を発現する網膜細胞（例えば、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞）を含む。一部の実施形態では、細胞はＣＨＯ細胞である。他の実施形態では、細胞はＣＨＯ Ｋ１細胞である。

【0061】

Ｖ．キット
一実施形態は、開示される緩衝液又は開示される緩衝液を作製するための成分のうちの１つ以上を含むキットを提供する。キットは、緩衝液又は成分のための容器を含むことができる。緩衝液は、溶液又は凍結乾燥形態であり得る。このキットはまた、必要に応じて、凍結乾燥された処方物のための希釈剤又は再構成溶液を含む第２の容器、及び必要に応じて、溶液の使用又は再構成及び／又は凍結乾燥された緩衝液若しくは粉末化された成分の使用のための説明書を備える。

【0062】

キットは、緩衝液、希釈剤、及びフィルタのうちの１つ以上を含む、開示されるＭＣＥアッセイを実施するために必要とされる追加の試薬を更に含み得る。緩衝液及び試薬は、ボトル、バイアル、又は試験管中に存在し得る。

【0063】

以下の実施例は、本発明者らがその発明とみなすものの範囲を限定することを意図するものではない。

【実施例】

【0064】

実施例１：治療用タンパク質の純度及び不純物分析のためのＭＣＥアッセイ。
方法及び材料：
材料：
ＬａｂＣｈｉｐ ＧＸＩＩ又はＬａｂＣｈｉｐ ＧＸＩＩ Ｔｏｕｃｈ ＨＴ及びＬａｂＣｈｉｐ（登録商標）ＨＴ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｃｈｉｐを、キャピラリー電気泳動分離及びデータ収集のために使用した（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）。上記に開示した非還元及び還元変性緩衝液をＭＣＥアッセイに使用した。

【0065】

方法：
マイクロチップキャピラリー電気泳動（ＭＣＥ）は、インプロセス試験、ロットリリース、及び安定性指標に好適なタンパク質純度及び不純物の分析を提供する。ｃａｓｉｒｉｖｉｍａｂ及びｉｍｄｅｖｉｍａｂのタンパク質試料は、加熱及びアルキル化剤（非還元）又は還元剤（還元）のいずれかとともにドデシル硫酸リチウム（ＬＤＳ）を添加することによって試料を変性させることによって調製した。次いで、得られた試料をアミンエステル色素とともにインキュベートして、任意の遊離アミン基を共有結合的に標識した。標識された試料をマイクロチップ上に注入し、そこで電流を印加して試料成分をサイズ（低分子量から高分子量）に従って分離した。レーザ誘起蛍光によって検出を行い、電気泳動図を作成した。電気泳動図の分析は、存在する不純物と比較した試料の相対的純度を提供した。

【0066】

表１は、第１のＭＣＥアッセイのための試料を調製するためのワークフロー手順を示す。簡単に述べると、タンパク質試料を０．５ｍｇ／ｍｌに希釈した。１μｌの非還元（ＮＲ）又は還元（Ｒ）変性緩衝液のいずれか及び４μｌの希釈試料を９６ウェルプレートに添加した。試料を混合し、遠心分離し、製品について指定された温度、典型的には７５℃で１０分間加熱した。次いで、試料を５μＭの市販の色素（例えば、Ｄｙｏｍｉｃｓ ＤＹ－６３１ ＮＨＳ Ｅｓｔｅｒ、ＰＩＣＯ色素とも称される）で標識した。試料を混合し、遠心分離し、次いで３５℃で３０分間加熱した。次いで、標識された試料を１０５μｌの希釈停止溶液で希釈した。ＬａｂＣｈｉｐ ＧＸＩＩ又はＬａｂＣｈｉｐ ＧＸＩＩ Ｔｏｕｃｈ ＨＴを使用して試料を分離した。

【表1】

【0067】

表２は、第２のＭＣＥアッセイのための試料を調製するためのワークフロー手順を示す。手短に言えば、タンパク質試料を０．５又は２ｍｇ／ｍｌに希釈した。１０μｌの非還元（ＮＲ）又は還元（Ｒ）変性緩衝液のいずれか、及び４０μｌの希釈試料を９６ウェルプレートに添加した。試料を混合し、遠心分離し、製品について指定された温度、典型的には６０℃で１０分間加熱した。次いで、試料を１６μＭの市販の色素（例えば、Ｄｙｏｍｉｃｓ ＤＹ－６３１ ＮＨＳエステル）で標識した。試料を混合し、遠心分離し、次いで３５℃で１５分間加熱した。次いで、標識された試料を、１０５μｌの希釈停止溶液又は希釈溶液で希釈した。ＬａｂＣｈｉｐ ＧＸＩＩ又はＬａｂＣｈｉｐ ＧＸＩＩ Ｔｏｕｃｈ ＨＴを使用して試料を分離した。

【0068】

実施例１Ａ：非還元性緩衝液
試料調製ステップにおいて、１６６ｍＭの２－ヨードアセトアミドと、０．８１％のドデシル硫酸リチウムと、８１ｍＭのリン酸ナトリウムと、を含有し、ｐＨ６の非還元性水性電気泳動試料緩衝液を使用して、表１に示される一般的な調製に続いた。試料を７５_℃で１０分間加熱した。試料標識ステップは、５μＭ色素溶液を使用した。最終希釈ステップは、１０５μＬの希釈停止溶液を使用した。

【0069】

実施例１Ｂ：還元緩衝液
試料調製ステップにおいて、０．６９％のドデシル硫酸リチウムと、６９ｍＭのリン酸ナトリウムと、１４２ｍＭのジチオスレイトールと、を含有し、ｐＨ９の還元水性電気泳動試料緩衝液を使用して、表１に示される一般的な調製に続いた。試料を７５℃で１０分間加熱した。試料標識ステップは、５μＭ色素溶液を使用した。最終希釈ステップは、１０５μＬの希釈停止溶液を使用した。

【表2】

【0070】

緩衝液
２００ｍＭのリン酸ナトリウム一塩基性一水和物、２００ｍＭのリン酸ナトリウム二塩基性七水和物、及び１０％のドデシル硫酸リチウム（ＬＤＳ）のストック溶液を調製した。あるいは、商業的に調製されたｐＨ８のリン酸ナトリウム緩衝液を用いた。

【0071】

ストック溶液及びＭｉｌｌｉ－Ｑ（登録商標）水を使用して、１００ｍＭのリン酸ナトリウム１％ＬＤＳ ｐＨ６及び１００ｍＭのリン酸ナトリウム１％ＬＤＳ ｐＨ９の溶液を調製した。

【0072】

ストック溶液及びＭｉｌｌｉ－Ｑ水を使用して、１００ｍＭのリン酸ナトリウム２％ＬＤＳ ｐＨ６及び１００ｍＭのリン酸ナトリウム２％ＬＤＳ ｐＨ８の溶液を含む代替の緩衝液を作製した。

【0073】

３４μＬの１Ｍヨードアセトアミド（ＩＡＭ）（Ｍｉｌｌｉ－Ｑ（登録商標）水中で新たに調製）＋１００ｍＭのリン酸ナトリウム１％ＬＤＳ ｐＨ６ １６６μＬ＋Ｍｉｌｌｉ－Ｑ（登録商標）水の５μＬを添加することによって、非還元緩衝液を調製した。最終濃度は、１６６ｍＭの２－ヨードアセトアミド、０．８１％のドデシル硫酸リチウム、及び８１ｍＭのリン酸ナトリウムであった。

【0074】

８００μＬの１Ｍヨードアセトアミド（ＩＡＭ）（Ｍｉｌｌｉ－Ｑ（登録商標）水中で新たに調製した）＋１２００μＬの１００ｍＭのリン酸ナトリウム２％ＬＤＳ ｐＨ８を添加することによって、代替の非還元緩衝液を調製した。最終濃度は、２００ｍＭの２－ヨードアセトアミド、１．２％のドデシル硫酸リチウム、及び６０ｍＭのリン酸ナトリウムであった。

【0075】

更に別の非還元緩衝液を、８００μＬの１Ｍヨードアセトアミド（ＩＡＭ）（Ｍｉｌｌｉ－Ｑ（登録商標）水中で新たに調製した）＋１２００μＬの１００ｍＭのリン酸ナトリウム２％ＬＤＳ ｐＨ６を添加することによって調製した。最終濃度は、２００ｍＭの２－ヨードアセトアミド、１．２％のドデシル硫酸リチウム、及び６０ｍＭのリン酸ナトリウムであった。

【0076】

６８μＬの１０×還元剤（５００ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）＋１６６μＬの１００ｍＭのリン酸ナトリウム１％ＬＤＳ ｐＨ９＋６μＬのＭｉｌｌｉ－Ｑ（登録商標）水）を添加することによって、還元緩衝液を調製した。最終濃度は、０．６９％のドデシル硫酸リチウム、６９ｍＭのリン酸ナトリウム、及び１４２ｍＭジチオスレイトールであった。

【0077】

３２０μＬの１０×還元剤（５００ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）＋１２００μＬの１００ｍＭのリン酸ナトリウム２％ＬＤＳ ｐＨ８＋４８０μＬのＭｉｌｌｉ－Ｑ（登録商標）水）を添加することによって、代替の還元緩衝液を調製した。最終濃度は、１．２％のドデシル硫酸リチウム、６０ｍＭのリン酸ナトリウム、及び８０ｍＭジチオスレイトールであった。

【0078】

実施例２Ａ：非還元性緩衝液
試料調製ステップにおいて、２００ｍＭの２－ヨードアセトアミドと、１．２％のドデシル硫酸リチウムと、６０ｍＭのリン酸ナトリウムと、を含有し、ｐＨ８の非還元性水性電気泳動試料緩衝液を使用して、表２に示される一般的な調製に続いた。試料を６０℃で１０分間加熱した。試料標識ステップは、１６μＭの色素溶液を使用した。最終希釈ステップは、１０５μＬの希釈停止溶液を使用した。

【0079】

実施例２Ｂ：還元緩衝液
試料調製ステップにおいて、１．２％のドデシル硫酸リチウムと、６０ｍＭのリン酸ナトリウムと、８０ｍＭのジチオスレイトールと、を含有し、ｐＨ８の還元水性電気泳動試料緩衝液を使用して、表２に示される一般的な調製に続いた。試料を６０℃で１０分間加熱した。試料標識ステップは、１６μＭの色素溶液を使用した。最終希釈ステップは、１０５μＬの希釈停止溶液を使用した。

【0080】

実施例２Ｃ：非還元緩衝液、非クエンチング
試料調製ステップにおいて、２００ｍＭの２－ヨードアセトアミドと、１．２％のドデシル硫酸リチウムと、６０ｍＭのリン酸ナトリウムと、を含有し、ｐＨ６の非還元性水性電気泳動試料緩衝液を使用して、表２に示される一般的な調製に続いた。試料を６３℃で１０分間加熱した。試料標識ステップは、１６μＭの色素溶液を使用した。最終希釈ステップは、１０５μＬの希釈溶液を使用した。

【0081】

実施例２Ｄ：還元緩衝液、非クエンチング
試料調製ステップにおいて、１．２％のドデシル硫酸リチウムと、６０ｍＭのリン酸ナトリウムと、８０ｍＭのジチオスレイトールと、を含有し、ｐＨ８の還元水性電気泳動試料緩衝液を使用して、表２に示される一般的な調製に続いた。試料を６３℃で１０分間加熱した。試料標識ステップは、１６μＭの色素溶液を使用した。最終希釈ステップは、１０５μＬの希釈溶液を使用した。

【0082】

結果：
マイクロチップキャピラリー電気泳動（ＭＣＥ）は、ＱＣ分析に必要とされる性能及び再現性の基準を維持しながら、劇的に短縮された試料分析時間を可能にする。本明細書中に開示される非還元及び還元変性緩衝液を使用して、ＭＣＥアッセイを開発した。図１Ａ～図１Ｂは、第１のＭＣＥアッセイからの非還元試料及び還元試料中のタンパク質の代表的な電気泳動図を示す。図１Ａは、非還元分析電気泳動図を示す。０．４２６の主ピーク（ＭＰ）は主抗体に対応し、標識された低分子量（ＬＭＷ）ピークは抗体断片に対応する。この実施例には存在しないが、場合によっては、１つ以上の高分子量フラグメントに対応するピークが存在する。図ＩＢは、還元分析電気泳動図を示す。軽鎖（ＬＣ）、重鎖、及び非グリコシル化重鎖（ＮＧＨＣ）、低分子量（ＬＭＷ）、及び高分子量（ＨＭＷ）抗体断片に対応するピークは、それに応じて標識される。異なる製品は、生成される電気泳動図においてバリエーションを有し得、したがって、異なる標識慣例を有し得ることに留意すべきである。

【0083】

前述の明細書において、本発明は、その特定の実施形態に関連して記載されており、多くの詳細が例示の対象のために示されているが、本発明が更なる実施形態を受け入れることができること、及び本明細書中に記載される特定の詳細が、本発明の基本的な原理から逸脱することなくかなり変更され得ることは、当業者に明らかである。

【0084】

本発明は、その趣旨又は本質的な属性から逸脱することなく、他の特定の形態で具現化されてもよく、したがって、本発明の範囲を示すものとして、前述の明細書ではなく、添付の特許請求の範囲が参照されるべきである。

【図1A】

【図1B】

【国際調査報告】