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▶ クレ バイオテクノロジ （シャンハイ） カンパニー リミテッドの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-06-04
(54)【発明の名称】抗ＣＤ３抗体変異体、融合タンパク質および適用
(51)【国際特許分類】
C07K 16/28 20060101AFI20240528BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20240528BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20240528BHJP
C07K 14/54 20060101ALI20240528BHJP
C07K 14/715 20060101ALI20240528BHJP
C07K 16/30 20060101ALI20240528BHJP
C07K 14/47 20060101ALI20240528BHJP
C12N 15/24 20060101ALI20240528BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20240528BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20240528BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240528BHJP
A61P 35/02 20060101ALI20240528BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20240528BHJP
A61K 38/20 20060101ALI20240528BHJP
【ＦＩ】
C07K16/28 ZNA
C12N15/13
C07K19/00
C07K14/54
C07K14/715
C07K16/30
C07K14/47
C12N15/24
C12N15/12
C12N15/62 Z
A61P35/00
A61P35/02
A61K39/395 E
A61K38/20
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023574487
(86)(22)【出願日】2022-05-31
(85)【翻訳文提出日】2024-01-10
(86)【国際出願番号】 CN2022096501
(87)【国際公開番号】W WO2022253248
(87)【国際公開日】2022-12-08
(31)【優先権主張番号】202110628817.3
(32)【優先日】2021-06-02
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
(71)【出願人】
【識別番号】521501093
【氏名又は名称】クレ バイオテクノロジ （シャンハイ） カンパニー リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】110000578
【氏名又は名称】名古屋国際弁理士法人
(72)【発明者】
【氏名】チー シャンドン
(72)【発明者】
【氏名】パン チン
【テーマコード（参考）】
4C084
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C084AA02
4C084AA03
4C084BA01
4C084BA41
4C084DA12
4C084NA14
4C084ZB261
4C084ZB262
4C084ZB271
4C084ZB272
4C085AA14
4C085AA21
4C085BB01
4C085BB11
4H045AA11
4H045AA30
4H045BA10
4H045BA41
4H045CA40
4H045DA02
4H045DA50
4H045DA76
4H045EA20
4H045FA74
(57)【要約】
抗ＣＤ３抗体変異体、融合タンパク質および適用を提供する。抗ＣＤ３抗体に対して突然変異を行うことによって、その変異体を得られる。提供される融合タンパク質は、（１）抗腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）／抗ＣＤ３二重特異性抗体、（２）抗腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）、抗ＣＤ３およびＩＬ１５／ＩＬ１５Ｒａ含有多機能融合タンパク質、（３）抗腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）およびＩＬ１５／ＩＬ１５Ｒａ含有融合タンパク質を含む。抗体分子をコード核酸分子およびベクター、ならびに抗体分子の製薬用途をさらに提供する。
【選択図】図２
【選択図】図２
【特許請求の範囲】
【請求項1】
抗ＣＤ３抗体は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域は、ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２、ＶＨＣＤＲ３を含み、前記軽鎖可変領域は、ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２、ＶＬＣＤＲ３を含み、前記抗ＣＤ３抗体のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９～３４に示されるＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２、ＶＨＣＤＲ３、ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２およびＶＬＣＤＲ３を含む抗ＣＤ３抗体変異体であって、前記抗ＣＤ３抗体変異体の突然変異部位は、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０に示される配列の１０番目の部位、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１に示される配列の２番目の部位および７番目の部位、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３に示される配列の３番目の部位および４番目の部位、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４に示される配列の４番目の部位、５番目の部位、６番目の部位および７番目の部位のいずれか一つまたは二つ以上を含むことを特徴とする、前記抗ＣＤ３抗体変異体。
【請求項2】
前記突然変異とは、アミノ酸が置換されることを指すことを特徴とする請求項１に記載の抗ＣＤ３抗体変異体。
【請求項3】
変異体の突然変異部位は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０に示される配列における１０位のＡがＥに置換され、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１に示される配列における２位のＧがＳに置換され、７位のＳがＧに置換され、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３に示される配列における３位のＮがＷに置換され、４位のＫがＬに置換され、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４に示される配列における４位のＹがＮまたはＲに置換され、５位のＳがＫに置換され、６位のＮがＧに置換され、７位のＬがＧに置換される部位のいずれか一つまたは二つ以上を含むことを特徴とする
請求項１に記載の抗ＣＤ３抗体変異体。
【請求項4】
ＶＨＣＤＲ２のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５に示されたとおりであるか、または、ＶＨＣＤＲ３のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６に示されたとおりであるか、または、
ＶＬＣＤＲ２のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７または３８に示されたとおりであるか、または、
ＶＬＣＤＲ３のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９、４０または４１に示されたとおりであることを特徴とする
請求項１に記載の抗ＣＤ３抗体変異体。
【請求項5】
前記ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２、ＶＨＣＤＲ３、ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２およびＶＬＣＤＲ３のアミノ酸配列は、（１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９、３５、３１、３２、３７、３９、
（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９、３５、３６、３２、３７、４０、
（３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９、３５、３６、３２、３８、４１、のいずれかの一組の配列に示されたとおりであることを特徴とする
請求項１に記載の抗ＣＤ３抗体変異体。
【請求項6】
前記抗体変異体の重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、２または３に示される配列の重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域から選択されるか、またはそれと少なくとも９０％の配列同一性を有することを特徴とする請求項５に記載の抗ＣＤ３抗体変異体。
【請求項7】
前記重鎖可変領域と前記軽鎖可変領域との間には、ジスルフィド結合を形成するための突然変異があり、前記突然変異の部位は、次のいずれか一種または二種以上の組み合わせを含み、突然変異部位は、ＥＵに従って番号付けられ、前記重鎖可変領域は、ＶＨで表され、前記軽鎖可変領域は、ＶＬで表されることを特徴とする請求項１に記載の抗ＣＤ３抗体変異体。
【表1】
【請求項8】
前記抗ＣＤ３抗体変異体は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、もしくはＩｇＧ４またはその変異体から選択される重鎖定常領域、ならびにヒトκ鎖、λ鎖またはその変異体から選択される軽鎖定常領域をさらに含み、前記重鎖定常領域は、Ｆｃ断片またはその変異体を含むことを特徴とする請求項１に記載の抗ＣＤ３抗体変異体。
【請求項9】
前記抗体変異体は、重鎖可変領域、軽鎖可変領域、および前記重鎖可変領域と前記軽鎖可変領域とを連結する連結断片を含むｓｃＦｖであり、前記連結断片のアミノ酸配列は、好ましくは若干のＧＧＧＧＳリピート、より好ましくは３個のＧＧＧＧＳリピートであることを特徴とする請求項１に記載の抗ＣＤ３抗体変異体。
【請求項10】
癌を阻害または治療するための薬物の調製における、請求項１～９のいずれか１項に記載の抗ＣＤ３抗体変異体の適用。
【請求項11】
前記癌は、結腸直腸、乳房、卵巣、膵臓、胃、前立腺、腎臓、子宮頚、骨髄がん、リンパ腫、白血病、甲状腺、子宮内膜、子宮、膀胱、神経内分泌、頭頚部、肝臓、鼻咽頭、精巣、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、黒色腫、基底細胞皮膚がん、皮膚扁平上皮がん、隆起性皮膚線維肉腫、メルケル細胞がん、膠芽腫、神経膠腫、肉腫、中皮腫、および骨髄異形成症候群から選択されるか、または前記の部位で発生することを特徴とする請求項１０に記載の適用。
【請求項12】
核酸分子であって、請求項１～９のいずれか１項に記載の抗ＣＤ３抗体変異体をコードすることを特徴とする、前記核酸分子。
【請求項13】
発現ベクターであって、請求項１２に記載の核酸分子を含むことを特徴とする、前記発現ベクター。
【請求項14】
抗腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）／抗ＣＤ３のタンパク質分子であって、第１の単量体および第２の単量体を含むヘテロ二量体形態であり、
前記第１の単量体は、（ａ）Ｆｄ断片、（ｂ）軽鎖断片および第１のＦｃ鎖を含み、
前記第２の単量体は、（ａ）Ｆｄ断片、（ｂ）軽鎖断片、抗ＣＤ３抗体断片および第２のＦｃ鎖を含み、
前記軽鎖断片は、ＶＬドメインおよびＣＬドメインを含み、前記Ｆｄ断片は、ＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインを含み、前記第１の単量体または前記第２の単量体において、前記軽鎖断片は、前記Ｆｄ断片と対になって抗ＴＡＡのＦａｂドメインを形成し、ここで、前記第１の単量体の軽鎖断片は、前記第１のＦｃ鎖に融合され、前記抗ＣＤ３抗体断片のＮ末端は、前記第２の単量体の軽鎖断片に融合され、Ｃ末端は、前記第２のＦｃ鎖に融合され、
または、
前記第１の単量体は、（ａ）Ｆｄ断片、（ｂ）軽鎖断片、サイトカイン機能領域、第１のＦｃ鎖を含み、
前記第２の単量体は、（ａ）Ｆｄ断片、（ｂ）軽鎖断片、抗ＣＤ３抗体断片、および第２のＦｃ鎖を含み、
前記サイトカイン機能領域は、ＩＬ－１５およびＩＬ－１５Ｒａを含み、ここで、前記サイトカイン機能領域のＮ末端は、前記第１の単量体の軽鎖断片に融合され、Ｃ末端は、前記第１のＦｃ鎖に融合され、前記抗ＣＤ３抗体断片のＮ末端は、前記第２の単量体の軽鎖断片に融合され、Ｃ末端は、前記第２のＦｃ鎖に融合され、
または、
前記第１の単量体は、抗ＴＡＡ抗体断片、サイトカイン機能領域、第１のＦｃ鎖を含み、
前記第２の単量体は、抗ＴＡＡ抗体断片、抗ＣＤ３抗体断片、および第２のＦｃ鎖を含み、ここで、
前記サイトカイン機能領域のＮ末端は、前記第１の単量体の抗ＴＡＡ抗体断片に融合され、Ｃ末端は、前記第１のＦｃ鎖に融合され、前記抗ＣＤ３抗体断片のＮ末端は、前記第２の単量体の抗ＴＡＡ抗体断片に融合され、Ｃ末端は、前記第２のＦｃ鎖に融合され、
前記第１のＦｃ鎖と前記第２のＦｃ鎖とは、交換可能であることを特徴とする、前記抗腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）／抗ＣＤ３のタンパク質分子。
【請求項15】
前記抗ＴＡＡ抗体断片は、重鎖可変領域（ＶＨ）、軽鎖可変領域（ＶＬ）、および前記重鎖可変領域と前記軽鎖可変領域とを連結する連結断片を含むｓｃＦｖ形態であり、ペプチド鎖のＮ末端からＣ末端にかけて、前記抗ＴＡＡ抗体断片のアミノ酸融合順序は、「ＶＨ～ＶＬ」もしくは「ＶＬ～ＶＨ」であり、「～」は、連結断片を表わし、または、前記抗ＣＤ３抗体断片は、重鎖可変領域（ＶＨ）、軽鎖可変領域（ＶＬ）、および前記重鎖可変領域と前記軽鎖可変領域とを連結する連結断片を含むｓｃＦｖ形態であり、ペプチド鎖のＮ末端からＣ末端にかけて、前記抗ＣＤ３抗体断片のアミノ酸的融合順序は、「ＶＨ～ＶＬ」もしくは「ＶＬ～ＶＨ」であり、「～」は、連結断片を表わし、または、
ペプチド鎖のＮ末端からＣ末端にかけて、前記サイトカイン機能領域のアミノ酸断片の融合順序は、「ＩＬ－１５～ＩＬ－１５Ｒａ」または「ＩＬ－１５Ｒａ～ＩＬ－１５」であり、「～」は、連結断片を表わし、好ましくは、前記ＩＬ－１５～ＩＬ－１５Ｒａの配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２に示されたとおりであり、前記ＩＬ－１５Ｒａ～ＩＬ－１５の配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３に示されたとおりであることを特徴とする
請求項１４に記載の抗腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）／抗ＣＤ３のタンパク質分子。
【請求項16】
前記抗ＣＤ３抗体断片のアミノ酸配列は、ＣＤ３結合特異性抗体、抗体断片、単一ドメイン抗体またはそのヒト化形態から選択され、好ましくは、前記抗ＣＤ３抗体断片のアミノ酸配列は、ＳＰ３４、ＯＫＴ３、ＵＣＴＨ１またはその誘導体から選択されることを特徴とする請求項１４に記載の抗腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）／抗ＣＤ３のタンパク質分子。
【請求項17】
前記抗ＣＤ３抗体断片は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、前記抗ＣＤ３抗体断片の重鎖可変領域は、ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２、ＶＨＣＤＲ３を含み、前記抗ＣＤ３抗体断片の軽鎖可変領域は、ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２、ＶＬＣＤＲ３を含み、前記ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２、ＶＨＣＤＲ３、ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２およびＶＬＣＤＲ３のアミノ酸配列は、請求項５に記載の抗ＣＤ３抗体変異体のいずれか一組の配列に示されたとおりであることを特徴とする請求項１４に記載の抗腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）／抗ＣＤ３のタンパク質分子。
【請求項18】
ＩＬ－１５ＲａおよびＩＬ－１５は、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒａ複合体を形成し、ＩＬ－１５は、ＩＬ－１５、ＩＬ－１５Ｒａに結合できるその突然変異、切断および様々な誘導体を含み、ＩＬ－１５Ｒａは、ＩＬ－１５Ｒａ、ＩＬ－１５に結合できるその突然変異、切断および様々な誘導体を含み、好ましくは、前記ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒａ複合体は、次のいずれかの組み合わせに示される突然変異形態を含むが、これらに限定されず、カウント方法は、ＩＬ－１５またはＩＬ－１５Ｒａのアミノ酸配列の最初のアミノ酸に基づいてこれを１位としてカウントされ、好ましくは、前記ＩＬ－１５の親配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４に示されたとおりであり、前記ＩＬ－１５Ｒａの親配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５に示されたとおりであることを特徴とする請求項１４に記載の抗腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）／抗ＣＤ３のタンパク質分子。
【表2】
【請求項19】
前記ＩＬ－１５は、次のいずれかの組み合わせに示される突然変異形態を含むが、これらに限定されず、カウント方法は、ＩＬ－１５のアミノ酸配列の最初のアミノ酸に基づいてこれを１位としてカウントされ、好ましくは、前記ＩＬ－１５の親配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４に示されたとおりであることを特徴とする請求項１４に記載の抗腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）／抗ＣＤ３のタンパク質分子。
【表3】
【請求項20】
前記ＴＡＡは、ＣＤ２０、ＣＤ１９、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ５２、ｓｌａｍｆ７、ＧＤ２、ＣＤ２４、ＣＤ４７、ＣＤ１３３、ＣＤ２３９、ＣＤ２７６、ＰＤ－１、ＣＥＡ、Ｅｐｃａｍ、Ｔｒｏｐ２、ＴＡＧ７２、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ、ｆｏｌｒ１、ＣＬＤＮ１８．２、ＰＤＬ１、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲ ＶＩＩＩ、Ｃ－ＭＥＴ、ＨＥＲ２、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡ、ＥｐｈＡ２、ＡＤＡＭ１７、１７－Ａ１、ＮＫＧ２Ｄ ｌｉｇａｎｄｓ、ＭＣＳＰ、ＬＧＲ５、ＳＳＥＡ３、ＳＬＣ３４Ａ２、ＢＣＭＡ、ＧＰＮＭＢまたはＧｌｙｐｉｃａｎ－３から選択されることを特徴とする請求項１４に記載の抗腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）／抗ＣＤ３のタンパク質分子。
【請求項21】
前記第１のＦｃ鎖および前記第２のＦｃ鎖は、重合してＦｃセグメントを形成し、前記Ｆｃセグメントは、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ、ヒトＩｇＧ２ Ｆｃ、ヒトＩｇＧ３ Ｆｃ、ヒトＩｇＧ４ Ｆｃまたはその変異体から選択され、好ましくはＩｇＧ１ Ｆｃ、またはヒトＩｇＧ４ Ｆｃまたはその変異体から選択され、前記タンパク質分子は、Ｆｃヘテロ二量体形態であり、好ましくは、前記Ｆｃヘテロ二量体は、以下の突然変異の組み合わせを含むが、これらに限定されず、以下の突然変異は、ＥＵに従ってカウントされることを特徴とする請求項１４に記載の抗腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）／抗ＣＤ３のタンパク質分子。
【表4】
【請求項22】
前記タンパク質分子は、Ｆｃセグメントを含み、Ｆｃセグメントの選択により、以下の突然変異の組み合わせを含むが、これらに限定されない免疫エフェクター機能が排除され、以下の突然変異は、ＥＵに従ってカウントされることを特徴とする請求項１４に記載の抗腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）／抗ＣＤ３のタンパク質分子。
【表5】
【請求項23】
（１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：０５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：０６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：０７、（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：０８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：０６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：０７、
（３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：０９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：０６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：０７、
（４）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：０６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：０７、
（５）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：０５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：０７、
（６）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：０１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：０７、
（７）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：０７、
（８）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：０７、
（９）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１、
（１０）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１、
（１１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３、
（１２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３、
（１３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５、
（１４）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５、
（１５）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７、
（１６）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７、のいずれか一組の配列に示されるアミノ酸断片の融合によって得られることを特徴とする
請求項１４に記載の抗腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）／抗ＣＤ３のタンパク質分子。
【請求項24】
核酸分子であって、請求項１４～２３のいずれか１項に記載の抗腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）／抗ＣＤ３のタンパク質分子をコードすることを特徴とする、前記核酸分子。
【請求項25】
癌を阻害または治療するための薬物の調製における、請求項１４～２３のいずれか１項に記載の抗腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）／抗ＣＤ３のタンパク質分子の適用であって、前記癌は、結腸直腸、乳房、卵巣、膵臓、胃、前立腺、腎臓、子宮頚、骨髄がん、リンパ腫、白血病、甲状腺、子宮内膜、子宮、膀胱、神経内分泌、頭頚部、肝臓、鼻咽頭、精巣、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、黒色腫、基底細胞皮膚がん、皮膚扁平上皮がん、隆起性皮膚線維肉腫、メルケル細胞がん、膠芽腫、神経膠腫、肉腫、中皮腫、および骨髄異形成症候群から選択される癌を含むか、または前記の部位で発生することを特徴とする、前記癌を阻害または治療するための薬物の調製における、請求項１４～２３のいずれか１項に記載の抗腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）／抗ＣＤ３のタンパク質分子の適用。
【請求項26】
抗腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）、およびＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒａ含有融合タンパク質であって、二つのポリペプチド鎖を含み、いずれか一つのポリペプチド鎖は、抗ＴＡＡ抗体断片、サイトカイン機能領域、Ｆｃ断片を含み、前記抗ＴＡＡ抗体断片は、ｓｃＦｖ形態であり、前記サイトカイン機能領域は、ＩＬ－１５およびＩＬ－１５Ｒａを含み、前記サイトカイン機能領域のＮ末端は、前記抗ＴＡＡ抗体断片に融合され、Ｃ末端は、前記Ｆｃ断片と融合することを特徴とする、前記抗腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）、およびＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒａ含有融合タンパク質。
【請求項27】
ＩＬ－１５ＲａおよびＩＬ－１５は、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒａ複合体を形成し、ＩＬ－１５は、ＩＬ－１５、ＩＬ－１５Ｒａに結合できるその突然変異、切断および様々な誘導体を含み、ＩＬ－１５Ｒａは、ＩＬ－１５Ｒａ、ＩＬ－１５に結合できるその突然変異、切断および様々な誘導体を含み、好ましくは、前記ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒａ複合体は、次のいずれかの組み合わせに示される突然変異形態を含むが、これらに限定されず、カウント方法は、ＩＬ－１５またはＩＬ－１５Ｒａのアミノ酸配列の最初のアミノ酸に基づいてこれを１位としてカウントされ、好ましくは、前記ＩＬ－１５の親配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４に示されたとおりであり、前記ＩＬ－１５Ｒａの親配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５に示されたとおりであることを特徴とする請求項２６に記載の抗腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）、およびＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒａ含有融合タンパク質。
【表6】
【請求項28】
前記ＩＬ－１５は、次のいずれかの組み合わせに示される突然変異形態を含むが、これらに限定されず、カウント方法は、ＩＬ－１５のアミノ酸配列の最初のアミノ酸に基づいてこれを１位としてカウントされ、好ましくは、前記ＩＬ－１５の親配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４に示されたとおりであることを特徴とする請求項２６に記載の抗腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）、およびＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒａ含有融合タンパク質。
【表7】
【請求項29】
前記融合タンパク質は、Ｆｃセグメントを含み、Ｆｃセグメントの選択により、以下の突然変異の組み合わせを含むが、これらに限定されない免疫エフェクター機能が排除され、以下の突然変異は、ＥＵに従ってカウントされることを特徴とする請求項２６に記載の抗腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）、およびＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒａ含有融合タンパク質。
【表8】
【請求項30】
前記融合タンパク質のいずれか一つのポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８に示されたとおりであるか、またはそれと少なくとも９０％の配列同一性を有することを特徴とする請求項２６に記載の抗腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）、およびＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒａ含有融合タンパク質。
【請求項31】
核酸分子であって、請求項２６～３０のいずれか１項に記載の抗腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）、およびＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒａ含有融合タンパク質をコードすることを特徴とする、前記核酸分子。
【請求項32】
癌を阻害または治療するための薬物の調製における、請求項２６～３０のいずれか１項に記載の抗腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）、およびＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒａ含有融合タンパク質の適用であって、前記癌は、結腸直腸、乳房、卵巣、膵臓、胃、前立腺、腎臓、子宮頚、骨髄がん、リンパ腫、白血病、甲状腺、子宮内膜、子宮、膀胱、神経内分泌、頭頚部、肝臓、鼻咽頭、精巣、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、黒色腫、基底細胞皮膚がん、皮膚扁平上皮がん、隆起性皮膚線維肉腫、メルケル細胞がん、膠芽腫、神経膠腫、肉腫、中皮腫、以及骨髄異形成症候群から選択される癌を含むか、または前記の部位で発生することを特徴とする、前記癌を阻害または治療するための薬物の調製における、請求項２６～３０のいずれか１項に記載の抗腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）、およびＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒａ含有融合タンパク質の適用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、生物医学技術の分野に関し、具体的には、抗ＣＤ３抗体変異体、融合タンパク質および適用に関する。
【背景技術】
【0002】
Ｔ細胞と呼ばれるＴリンパ球（Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ）は、骨髄由来のリンパ系幹細胞であり、胸腺で分化、成熟した後、リンパおよび血液循環を通じて、全身の免疫器官および組織に分布し、免疫機能を発揮する。Ｔ細胞は、ウイルス感染細胞および癌細胞を迅速に排除できる非常に効率的な殺傷細胞である。Ｔ細胞の殺傷効果には、免疫シナプスの形成が必要であるが、このプロセスは、抗原提示細胞の表面ＭＨＣ分子と提示された抗原ペプチドによって形成される複合体とのＴＣＲ識別に大きく依存する。活性化された免疫シナプスは、細胞毒素およびサイトカインを放出して殺傷効果を果たす。免疫シナプスの形成プロセスにおいて、Ｔ細胞と標的細胞との間の距離によって制限され、二重特異的または多重特異性抗体指向性Ｔ細胞は、免疫シナプスの形成をシミュレートする必要があり、一端は、ＣＤ３を標的とすることでＴ細胞のＴＣＲ受容体への架橋を達成し、他端は、標的細胞表面抗原を標的とすることによって標的細胞への架橋を達成する。ＣＤ３分子は、すべての成熟Ｔ細胞の表面に発現され、ＴＣＲと非共有結合して、完全なＴＣＲ－ＣＤ３複合体を形成し、抗原刺激に対する免疫応答に共同に関与し、現在、二重特異性抗体において適用が最も多く、且つ最も成功している免疫エフェクター細胞表面のトリガー分子である。ＣＤ３を標的とする二重特異性抗体は、Ｔ細胞表面のＣＤ３および腫瘍細胞表面の抗原にそれぞれ結合することで、細胞傷害性Ｔ細胞（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ ｃｅｌｌ、ＴｃまたはＣＴＬ）と腫瘍細胞との距離を縮め、従来のＴ細胞の二重活性化シグナルに依存するのではなく、Ｔ細胞を直接活性化し、Ｔ細胞が癌細胞を直接殺傷するように誘導する。
【0003】
開示されたＣＤ３抗体において、ＯＫＴ３は、画期的な影響力を有する抗体であり、最初に市販された治療用抗体として、疾患の治療におけるモノクローナル抗体の使用の先駆的抗体となる。ＳＰ３４は、現在、サルと反応することができる少ないＣＤ３抗体の一つである。近年、科学界は、二重抗体の分野で新たな進歩を遂げ、それによって、様々な種類の新規ＣＤ３二重抗体（ＣＤ３－ＢｓＡｂ）を開発した。現在、異なる構造を有する１００を超えるＣＤ３－ＢｓＡｂの開発に成功した。多数の形態により、半減期、免疫原性、治療効果の反応種類、固形腫瘍への浸透能力等の抗体の多くの特性を決定する。アムジェン（Ａｍｇｅｎ）のブリナツモマブ（Ｂｌｉｎａｔｕｍｏｍａｂ）（ＢｉＴＥ形式のＣＤ１９ｘＣＤ３）は、２０１４年にＦＤＡによって承認され、現在最も成功しているＣＤ３－ＢｓＡｂ二重抗体である。当該薬物は、再発性または難治性急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）患者の治療に使用される。標準的な化学療法と比較して、ブリナツモマブで治療された患者の４０％異常が、完全または部分奏効（ＣＲ／ＰＲ）を達成でき、全生存期間の中央値は、数か月改善されることができる。ブリナツモマブに加えて、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３８、ＢＣＭＡ、ＣＤ３３およびＣＤ１２３等の現在臨床試験が行われている他のＣＤ３－ＢｓＡｂが多数ある。さらに、１／２期臨床試験において、急性骨髓性白血病（ＡＭＬ）に患う患者は、ＭａｃｒｏＧｅｎｉｃｓ会社のＦｌｏｔｅｔｕｚｕｍａｂ（ＣＤ１２３ｘＣＤ３－ＢｓＡｂ）で治療され、その全奏効率（ＯＲＲ）は、３０％である。Ａｂｂｖｉｅ／Ｇｅｎｍａｂ会社のＥｐｃｏｒｉｔａｍａｂ（ＣＤ２０ｘＣＤ３－ＢｓＡｂ）の別の１／２期臨床試験において、びまん性リンパ性大細胞型Ｂ細胞腫瘍（ＤＬＢＣＬ）の患者は、４４％の完全奏効（ＣＲ）および１１％の部分奏効（ＰＲ）が示され、濾胞性リンパ腫の患者では１００％の奏効（ＰＲ）が示される。他のいくつかのＣＤ２０ｘＣＤ３二重抗体も同様の優れた結果を取得し、例えば、ＮＳＧマウスにおいて、Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ会社のＲＥＧＮ１９７９（ＣＤ２０ｘＣＤ３－ＢｓＡｂ）は、ＲｏｃｈｅのＲｉｔｕｘｉｍａｂ （ＣＤ２０モノクローナル抗体）よりも腫瘍成長を制御でき、ＣＤ３二重抗体薬の治療効果をさらに証明する。再発または難治性（Ｒ／Ｒ）びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）患者の治療におけるＲｏｃｈｅのＣＤ２０ｘＣＤ３ Ｔ細胞結合二重特異性抗体グロフィタマブ（ｇｌｏｆｉｔａｍａｂ）（ＣＤ２０－ＴＣＢ）に関する最新データによると、当該延長研究には、過剰前治療を受けた高難治性ＤＬＢＣＬ患者が含まれており、５８．３％の患者がその初期治療に反応せず、約３分の一（３３．１％）の患者は、以前にＣＡＲ－Ｔ細胞治療を受けていた。独立審査委員会（ＩＲＣ）の評価によると、追跡期間中央値１２．６ヶ月で、患者（６１／１５５）の３９．４％がＣＲ（主な治療効果項目）を達成し、患者（５１．６％、８０／１５５）の半数は、全奏効（部分奏効［ＰＲ］＋完全奏効［ＣＲ］の患者比率、二次治療効果項目）を達成し、安全性の観点から、サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）は、最も一般的な有害事象であり、６３．０％の患者で発生する。ＣＲＳ事象は、予測可能であり、一般に低悪性度（主にグレード１［４７．４％］またはグレード２［１１．７％］）であり、初回投与時に発生し、ＣＲＳのためにグロフィタマブ治療を中止した患者は１名のみである。グレード３以上のＣＲＳの発生率は、低く（３．９％）、グレード５の事象はない。グロフィタマブは、ＣＤ２０を標的とする二つのＦａｂ領域、およびＣＤ３を標的とする一つのＦａｂ領域を含む、新規「２：１」構造パターンを有する。
【0004】
アムジェン会社のブリナツモマブは、臨床試験でサイトカインストーム（ＣＲＳ）が最も重要な毒性副作用の一つであることを示す。ＣＤ１９発現腫瘍細胞が多数の健康なＢ細胞およびＴ細胞と同じ環境にある場合、ＣＤ３－ＢｓＡｂを介したＴ細胞の活性化は、突然起こり、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－６およびＴＮＦ－α等の炎症性サイトカインを過剰に放出し、最終的には、発熱から多臓器不全に至るまでの症状を引き起こす。しかしながら、ＣＲＳは、ブリナツモマブに特有の毒性副作用ではない。事実上、ＣＲＳは、ほとんどのＣＤ３－ＢｓＡｂおよびＣＡＲ－Ｔの治療で頻繁に発生する。ヒト化マウスモデルでは、ＣＤ３－ＢｓＡｂ誘導ＣＲＳの主な媒介物は、活性化Ｔ細胞によって産生されるＴＮＦ－αであり、単球による炎症性サイトカインの大量分泌を引き起こすことが示される。研究によると、上流ＴＮＦ－αおよびその下流のＩＬ－１βまたはＩＬ－６を遮断すると、ＣＲＳを効果的に軽減できることがわかる。さらに、マウスおよびサルモデルで行われたいくつかの前臨床研究によると、ＣＤ３の親和性（即ち、「より弱い」ＣＤ３を使用する）を低下させることによって、サイトカインストームの程度を軽減できることがわかる。
【0005】
インターロイキン－１５（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－１５、ＩＬ－１５）は、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞およびメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞の機能にとって非常に重要な長さ１４～１５ｋＤａのサイトカインである。ＩＬ－１５は、その受容体ＩＬ－１５Ｒαに結合して、きわめて高い生物学的効力を有する複合体ＩＬ－１５スーパーアゴニスト（ＩＬ－１５ ＳＡ）を生成した後に、一緒に標的細胞に形質導入され、輸送される。ＩＬ－１５ ＳＡは、ＩＬ－１５Ｒに応答および発現する細胞、特にＮＫ細胞／Ｔ細胞を強力に活性化し、それによって抗腫瘍および抗ウイルス機能を促進する。ＩＬ－１５は、幅広い免疫調節効果を有し、Ｔ細胞、特にＮＫ細胞、メモリーＣＤ８＋Ｔ細胞の生存、増殖および機能の調節に関与することができる。ＩＬ－１５は、ＩＬ－２構造と非常に似ており、スパイラルサイトカインファミリーに属する。ＩＬ－１５のヘテロ三量体受容体は、ＩＬ－２受容体とＩＬ－２Ｒ／ＩＬ－１５ Ｒβ（ＣＤ１２２）および共通のγｃ鎖（ＣＤ１３２）を共有し、これらの共通の受容体成分および共有のＪＡＫ １／ＪＡＫ ３／ＳＴＡＴ ５シグナル伝達経路により、ＩＬ－１５は、Ｔ細胞増殖の刺激、細胞傷害性Ｔリンパ球の産生、Ｂ細胞の免疫グロブリン合成の刺激、ならびにＮＫ細胞の産生および持続的生存等を含む、ＩＬ－２と同じ機能を有する。多くの適応性免疫応答において、ＩＬ－２およびＩＬ－１５は、独特で、且つしばしば競合性の効果を有する。主に次のような四つのポイントがある。１．ＩＬ－２は、Ｔｒｅｇｓ細胞の活性化を調節できるが、ＩＬ－１５は、調節できない。２．ＩＬ－２は、誘導されたＣＤ８＋エフェクターＴ細胞の細胞死を活性化することによって、Ｔ細胞応答を阻害する。３．ＩＬ－１５は、ＮＫ、エフェクター細胞ＣＤ８＋および記憶表現型ＣＤ８＋Ｔ細胞の分化において必ず必要とする役割を果たす。４．臨床研究によると、ＩＬ－１５毒性は、ＩＬ－２の毒性と異なり、ＩＬ－２と比較して、ＩＬ－１５は、血管毛細管漏出がほとんど観察されないことを示す。これらの要因により、ＩＬ－１５は、腫瘍免疫策略においてより潜在的なサイトカインとなる。現在、複数のＩＬ－１５標的製品は、依存として臨床試験段階にあり、ここで、最も注目されるのは、ＩＬ－１５タンパク質Ｎ７２Ｄを突然変異させた後ＩＬ－１５ＲａおよびＩｇＧ１Ｆｃに共同発現および結合した融合タンパク質であるＩＬ－１５スーパーアゴニストＮ－８０３であり、２０２２年５月２３日、ＩｍｍｕｎｉｔｙＢｉｏは、ＩＬ－１５スーパーアゴニストＮ－８０３の販売申請をＦＤＡに提出し、ＢＣＧワクチン（ＢＣＧ）と併用してＢＣＧワクチンに応答しない非筋層浸潤癌（ＮＭＩＢＣ）の治療に使用される。２０２１年に発表された臨床データでは、Ｎ－８０３＋ＢＣＧの併用治療効果が顕著で、ＣＲ率は７１％（５９／８３）に達し、平均ＣＲ維持期間は、２４．１か月であることを示す。１期臨床試験によると、転移性非小細胞肺がんの治療においてニボルマブ（Ｎｉｖｏｌｕｍａｂ）（ＰＤ－１抗体、Ｏｐｄｉｖｏ）トＮ－８０３を併用すると、患者の長期生存を大幅に延長できることを示す。Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ会社は、Ｘｅｎｃｏｒ会社と協力してＩＬ－１５サイトカインＸｍＡｂ（登録商標）２４３０６を開発し、現在Ｔｅｃｅｎｔｒｉｑと併用したＸｍＡｂ（登録商標）２４３０６の臨床研究を実施している。Ｈｅｎｇｒｕｉ会社のＳＨＲ－１５０１（ＩＬ－１５融合タンパク質）は、２０１９年５月１４日にＳＨＲ－１５０１臨床試験の実施が承認された。さらに、治療が奏功しなかった進行性悪性腫瘍患者に対しては、ＳＨＲ－１３１６（ＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体薬）とＳＨＲ－１５０１とを併用する予定である。
【0006】
現在、治療のためのＣＤ３二重特異性抗体の開発の必要性は依然として満たされておらず、固形腫瘍において直面する課題を解決し、ＣＤ３－ＢｓＡｂ二重抗体の安全性を向上させるには、持続的な開発研究が必要である。
【発明の概要】
【0007】
【課題を解決するための手段】
【0008】
本発明の第１の目的は、抗ＣＤ３抗体が、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域が、ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２、ＶＨＣＤＲ３を含み、前記軽鎖可変領域が、ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２、ＶＬＣＤＲ３を含み、前記抗ＣＤ３抗体のアミノ酸配列が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９～３４に示されるＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２、ＶＨＣＤＲ３、ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２およびＶＬＣＤＲ３を含む抗ＣＤ３抗体変異体を提供し、前記抗ＣＤ３抗体変異体の突然変異部位は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０に示される配列の１０番目の部位、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１に示される配列の２番目の部位および７番目の部位、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３に示される配列の３番目の部位および４番目の部位、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４に示される配列の４番目の部位、５番目の部位、６番目の部位および７番目の部位のいずれか一つまたは二つ以上を含む。
【0009】
好ましくは、前記突然変異とは、アミノ酸が置換されることを指す。
好ましくは、変異体の突然変異部位は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０に示される配列における１０位のＡがＥに置換され、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１に示される配列における２位のＧがＳに置換され、７位のＳがＧに置換され、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３に示される配列における３位のＮがＷに置換され、４位のＫがＬに置換され、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４に示される配列における４位のＹがＮまたはＲに置換され、５位のＳがＫに置換され、６位のＮがＧに置換され、７位のＬがＧに置換される等の部位のいずれか一つまたは二つ以上を含む。
好ましくは、変異体の突然変異部位は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０に示される配列における１０位のＡがＥに置換され、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１に示される配列における２位のＧがＳに置換され、７位のＳがＧに置換され、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３に示される配列における３位のＮがＷに置換され、４位のＫがＬに置換され、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４に示される配列における４位のＹがＮまたはＲに置換され、５位のＳがＫに置換され、６位のＮがＧに置換され、７位のＬがＧに置換される等の部位のいずれか一つまたは二つ以上を含む。
【0010】
好ましくは、ＶＨＣＤＲ２のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５に示されたとおりであるか、または、ＶＨＣＤＲ３のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６に示されたとおりであるか、または、ＶＬＣＤＲ２のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７または３８に示されたとおりであるか、または、ＶＬＣＤＲ３のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９、４０または４１に示されたとおりである。
【0011】
好ましくは、前記ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２、ＶＨＣＤＲ３、ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２およびＶＬＣＤＲ３のアミノ酸配列は、
（１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９、３５、３１、３２、３７、３９、
（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９、３５、３６、３２、３７、４０、
（３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９、３５、３６、３２、３８、４１のいずれかの一組の配列に示されたとおりである。
（１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９、３５、３１、３２、３７、３９、
（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９、３５、３６、３２、３７、４０、
（３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９、３５、３６、３２、３８、４１のいずれかの一組の配列に示されたとおりである。
【0012】
好ましくは、前記抗体変異体の重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、２または３に示される配列の重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域から選択されるか、またはそれと少なくとも９０％の配列同一性を有する。
【0013】
好ましくは、前記重鎖可変領域と前記軽鎖可変領域との間には、ジスルフィド結合を形成するための突然変異があり、前記突然変異の部位は、次のいずれか一種または二種以上の組み合わせを含み、突然変異部位は、ＥＵに従って番号付けられ、前記重鎖可変領域は、ＶＨで表され、前記軽鎖可変領域は、ＶＬで表され、
【0014】
【表1】
【0015】
好ましくは、前記抗ＣＤ３抗体変異体は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、もしくはＩｇＧ４またはその変異体から選択される重鎖定常領域、ならびにヒトκ鎖、λ鎖またはその変異体から選択される軽鎖定常領域をさらに含み、前記重鎖定常領域は、Ｆｃ断片またはその変異体を含む。
【0016】
好ましくは、前記抗体変異体は、重鎖可変領域、軽鎖可変領域、および前記重鎖可変領域と前記軽鎖可変領域とを連結する連結断片を含むｓｃＦｖであり、前記連結断片のアミノ酸配列は、好ましくは若干のＧＧＧＧＳリピート、より好ましくは３個のＧＧＧＧＳリピートである。
【0017】
本発明の別の目的は、癌を阻害または治療するための薬物の調製における、前記抗ＣＤ３抗体変異体の適用を提供する。
好ましくは、前記癌は、結腸直腸、乳房、卵巣、膵臓、胃、前立腺、腎臓、子宮頚、骨髄がん、リンパ腫、白血病、甲状腺、子宮内膜、子宮、膀胱、神経内分泌、頭頚部、肝臓、鼻咽頭、精巣、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、黒色腫、基底細胞皮膚がん、皮膚扁平上皮がん、隆起性皮膚線維肉腫、メルケル細胞がん、膠芽腫、神経膠腫、肉腫、中皮腫、および骨髄異形成症候群の癌から選択されるか、または前記の部位で発生する。
好ましくは、前記癌は、結腸直腸、乳房、卵巣、膵臓、胃、前立腺、腎臓、子宮頚、骨髄がん、リンパ腫、白血病、甲状腺、子宮内膜、子宮、膀胱、神経内分泌、頭頚部、肝臓、鼻咽頭、精巣、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、黒色腫、基底細胞皮膚がん、皮膚扁平上皮がん、隆起性皮膚線維肉腫、メルケル細胞がん、膠芽腫、神経膠腫、肉腫、中皮腫、および骨髄異形成症候群の癌から選択されるか、または前記の部位で発生する。
【0018】
本発明の別の目的は、前記抗ＣＤ３抗体変異体をコードする核酸分子を提供する。
本発明の別の目的は、上記の核酸分子を含む発現ベクターを提供する。
本発明の別の目的は、上記の核酸分子を含む発現ベクターを提供する。
【0019】
本発明の別の目的は、抗腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）／抗ＣＤ３のタンパク質分子を提供し、それは、第１の単量体および第２の単量体を含むヘテロ二量体形態であり、
前記第１の単量体は、（ａ）Ｆｄ断片、（ｂ）軽鎖断片および第１のＦｃ鎖を含み、前記第２の単量体は、（ａ）Ｆｄ断片、（ｂ）軽鎖断片、抗ＣＤ３抗体断片および第２のＦｃ鎖を含み、前記軽鎖断片は、ＶＬドメインおよびＣＬドメインを含み、前記Ｆｄ断片は、ＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインを含み、前記第１の単量体または前記第２の単量体において、前記軽鎖断片は、前記Ｆｄ断片と対になって抗ＴＡＡのＦａｂドメインを形成し、ここで、前記第１の単量体の軽鎖断片は、前記第１のＦｃ鎖に融合され、前記抗ＣＤ３抗体断片のＮ末端は、前記第２の単量体の軽鎖断片に融合され、Ｃ末端は、前記第２のＦｃ鎖に融合され、
または、前記第１の単量体は、（ａ）Ｆｄ断片、（ｂ）軽鎖断片、サイトカイン機能領域、第１のＦｃ鎖を含み、前記第２の単量体は、（ａ）Ｆｄ断片、（ｂ）軽鎖断片、抗ＣＤ３抗体断片、および第２のＦｃ鎖を含み、前記サイトカイン機能領域は、ＩＬ－１５およびＩＬ－１５Ｒａを含み、ここで、前記サイトカイン機能領域のＮ末端は、前記第１の単量体の軽鎖断片に融合され、Ｃ末端は、前記第１のＦｃ鎖に融合され、前記抗ＣＤ３抗体断片のＮ末端は、前記第２の単量体の軽鎖断片に融合され、Ｃ末端は、前記第２のＦｃ鎖に融合され、
または、前記第１の単量体は、抗ＴＡＡ抗体断片、サイトカイン機能領域、第１のＦｃ鎖を含み、前記第２の単量体は、抗ＴＡＡ抗体断片、抗ＣＤ３抗体断片、および第２のＦｃ鎖を含み、ここで、前記サイトカイン機能領域のＮ末端は、前記第１の単量体の抗ＴＡＡ抗体断片に融合され、Ｃ末端は、前記第１のＦｃ鎖に融合され、前記抗ＣＤ３抗体断片のＮ末端は、前記第２の単量体の抗ＴＡＡ抗体断片に融合され、Ｃ末端は、前記第２のＦｃ鎖に融合され、
前記第１のＦｃ鎖と前記第２のＦｃ鎖とは、交換可能である。
前記第１の単量体は、（ａ）Ｆｄ断片、（ｂ）軽鎖断片および第１のＦｃ鎖を含み、前記第２の単量体は、（ａ）Ｆｄ断片、（ｂ）軽鎖断片、抗ＣＤ３抗体断片および第２のＦｃ鎖を含み、前記軽鎖断片は、ＶＬドメインおよびＣＬドメインを含み、前記Ｆｄ断片は、ＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインを含み、前記第１の単量体または前記第２の単量体において、前記軽鎖断片は、前記Ｆｄ断片と対になって抗ＴＡＡのＦａｂドメインを形成し、ここで、前記第１の単量体の軽鎖断片は、前記第１のＦｃ鎖に融合され、前記抗ＣＤ３抗体断片のＮ末端は、前記第２の単量体の軽鎖断片に融合され、Ｃ末端は、前記第２のＦｃ鎖に融合され、
または、前記第１の単量体は、（ａ）Ｆｄ断片、（ｂ）軽鎖断片、サイトカイン機能領域、第１のＦｃ鎖を含み、前記第２の単量体は、（ａ）Ｆｄ断片、（ｂ）軽鎖断片、抗ＣＤ３抗体断片、および第２のＦｃ鎖を含み、前記サイトカイン機能領域は、ＩＬ－１５およびＩＬ－１５Ｒａを含み、ここで、前記サイトカイン機能領域のＮ末端は、前記第１の単量体の軽鎖断片に融合され、Ｃ末端は、前記第１のＦｃ鎖に融合され、前記抗ＣＤ３抗体断片のＮ末端は、前記第２の単量体の軽鎖断片に融合され、Ｃ末端は、前記第２のＦｃ鎖に融合され、
または、前記第１の単量体は、抗ＴＡＡ抗体断片、サイトカイン機能領域、第１のＦｃ鎖を含み、前記第２の単量体は、抗ＴＡＡ抗体断片、抗ＣＤ３抗体断片、および第２のＦｃ鎖を含み、ここで、前記サイトカイン機能領域のＮ末端は、前記第１の単量体の抗ＴＡＡ抗体断片に融合され、Ｃ末端は、前記第１のＦｃ鎖に融合され、前記抗ＣＤ３抗体断片のＮ末端は、前記第２の単量体の抗ＴＡＡ抗体断片に融合され、Ｃ末端は、前記第２のＦｃ鎖に融合され、
前記第１のＦｃ鎖と前記第２のＦｃ鎖とは、交換可能である。
【0020】
好ましくは、前記抗ＴＡＡ抗体断片は、重鎖可変領域（ＶＨ）、軽鎖可変領域（ＶＬ）、および前記重鎖可変領域と前記軽鎖可変領域とを連結する連結断片を含むｓｃＦｖ形態であり、ペプチド鎖のＮ末端からＣ末端にかけて、前記抗ＴＡＡ抗体断片のアミノ酸融合順序は、「ＶＨ～ＶＬ」もしくは「ＶＬ～ＶＨ」であり、「～」は、連結断片を表わし、または、前記抗ＣＤ３抗体断片は、重鎖可変領域（ＶＨ）、軽鎖可変領域（ＶＬ）、および前記重鎖可変領域と前記軽鎖可変領域とを連結する連結断片を含むｓｃＦｖ形態であり、ペプチド鎖のＮ末端からＣ末端にかけて、前記抗ＣＤ３抗体断片のアミノ酸的融合順序は、「ＶＨ～ＶＬ」もしくは「ＶＬ～ＶＨ」であり、「～」は、連結断片を表わし、または、ペプチド鎖のＮ末端からＣ末端にかけて、前記サイトカイン機能領域のアミノ酸断片の融合順序は、「ＩＬ－１５～ＩＬ－１５Ｒａ」または「ＩＬ－１５Ｒａ～ＩＬ－１５」であり、「～」は、連結断片を表わし、好ましくは、前記ＩＬ－１５～ＩＬ－１５Ｒａの配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２に示されたとおりであり、前記ＩＬ－１５Ｒａ～ＩＬ－１５の配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３に示されたとおりである。
好ましくは、前記抗ＣＤ３抗体断片のアミノ酸配列は、ＣＤ３結合特異性抗体、抗体断片、単一ドメイン抗体またはそのヒト化形態から選択され、好ましくは、前記抗ＣＤ３抗体断片のアミノ酸配列は、ＳＰ３４、ＯＫＴ３、ＵＣＴＨ１またはその誘導体から選択される。
好ましくは、前記抗ＣＤ３抗体断片のアミノ酸配列は、ＣＤ３結合特異性抗体、抗体断片、単一ドメイン抗体またはそのヒト化形態から選択され、好ましくは、前記抗ＣＤ３抗体断片のアミノ酸配列は、ＳＰ３４、ＯＫＴ３、ＵＣＴＨ１またはその誘導体から選択される。
【0021】
好ましくは、前記抗ＣＤ３抗体断片は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、前記抗ＣＤ３抗体断片の重鎖可変領域は、ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２、ＶＨＣＤＲ３を含み、前記抗ＣＤ３抗体断片の軽鎖可変領域は、ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２、ＶＬＣＤＲ３を含み、前記ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２、ＶＨＣＤＲ３、ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２およびＶＬＣＤＲ３のアミノ酸配列は、請求項５に記載の抗ＣＤ３抗体変異体のいずれか一組の配列に示されたとおりである。
【0022】
好ましくは、ＩＬ－１５ＲａおよびＩＬ－１５は、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒａ複合体を形成し、ＩＬ－１５は、ＩＬ－１５、ＩＬ－１５Ｒａに結合できるその突然変異、切断および様々な誘導体を含み、ＩＬ－１５Ｒａは、ＩＬ－１５Ｒａ、ＩＬ－１５に結合できるその突然変異、切断および様々な誘導体を含み、好ましくは、前記ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒａ複合体は、次のいずれかの組み合わせに示される突然変異形態を含むが、これらに限定されず、カウント方法は、ＩＬ－１５またはＩＬ－１５Ｒａのアミノ酸配列の最初のアミノ酸に基づいてこれを１位としてカウントされ、好ましくは、前記ＩＬ－１５の親配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４に示されたとおりであり、前記ＩＬ－１５Ｒａの親配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５に示されたとおりである。
【0023】
【表2】
【0024】
好ましくは、前記ＩＬ－１５は、次のいずれかの組み合わせに示される突然変異形態を含むが、これらに限定されず、カウント方法は、ＩＬ－１５のアミノ酸配列の最初のアミノ酸に基づいてこれを１位としてカウントされ、好ましくは、前記ＩＬ－１５の親配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４に示されたとおりである。
【0025】
【表3】
【0026】
好ましくは、前記ＴＡＡは、ＣＤ２０、ＣＤ１９、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ５２、ｓｌａｍｆ７、ＧＤ２、ＣＤ２４、ＣＤ４７、ＣＤ１３３、ＣＤ２３９、ＣＤ２７６、ＰＤ－１、ＣＥＡ、Ｅｐｃａｍ、Ｔｒｏｐ２、ＴＡＧ７２、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ、ｆｏｌｒ１、ＣＬＤＮ１８．２、ＰＤＬ１、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲ ＶＩＩＩ、Ｃ－ＭＥＴ、ＨＥＲ２、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡ、ＥｐｈＡ２、ＡＤＡＭ１７、１７－Ａ１、ＮＫＧ２Ｄ ｌｉｇａｎｄｓ、ＭＣＳＰ、ＬＧＲ５、ＳＳＥＡ３、ＳＬＣ３４Ａ２、ＢＣＭＡ、ＧＰＮＭＢまたはＧｌｙｐｉｃａｎ－３から選択される。
【0027】
好ましくは、前記第１のＦｃ鎖および前記第２のＦｃ鎖は、重合してＦｃセグメントを形成し、前記Ｆｃセグメントは、ヒト（Ｈｕｍａｎ）ＩｇＧ１ Ｆｃ、ヒトＩｇＧ２ Ｆｃ、ヒトＩｇＧ３ Ｆｃ、ヒトＩｇＧ４ Ｆｃまたはその変異体から選択され、好ましくはＩｇＧ１ Ｆｃ、またはヒトＩｇＧ４ Ｆｃまたはその変異体から選択され、前記タンパク質分子は、Ｆｃヘテロ二量体形態であり、好ましくは、前記Ｆｃヘテロ二量体は、以下の突然変異の組み合わせを含むが、これらに限定されず、以下の突然変異は、ＥＵに従ってカウントされる。
【0028】
【表4】
【0029】
好ましくは、前記タンパク質分子は、Ｆｃセグメントを含み、Ｆｃセグメントの選択により、以下の突然変異の組み合わせを含むが、これらに限定されない免疫エフェクター機能が排除され、以下の突然変異は、ＥＵに従ってカウントされる。
【0030】
【表5】
【0031】
好ましくは、前記抗腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）／抗ＣＤ３のタンパク質分子は、
（１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：０５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：０６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：０７、
（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：０８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：０６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：０７、
（３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：０９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：０６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：０７、
（４）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：０６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：０７、
（５）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：０５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：０７、
（６）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：０１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：０７、
（７）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：０７、
（８）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：０７、
（９）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１、
（１０）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１、
（１１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３、
（１２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３、
（１３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５、
（１４）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５、
（１５）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７、
（１６）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７、のいずれか一組の配列に示されるアミノ酸断片の融合によって得られる。
（１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：０５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：０６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：０７、
（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：０８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：０６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：０７、
（３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：０９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：０６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：０７、
（４）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：０６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：０７、
（５）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：０５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：０７、
（６）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：０１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：０７、
（７）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：０７、
（８）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：０７、
（９）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１、
（１０）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１、
（１１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３、
（１２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３、
（１３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５、
（１４）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５、
（１５）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７、
（１６）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７、のいずれか一組の配列に示されるアミノ酸断片の融合によって得られる。
【0032】
本発明の別の目的は、前記抗腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）／抗ＣＤ３のタンパク質分子をコードする核酸分子を提供する。
本発明の別の目的は、癌を阻害または治療するための薬物の調製における、前記抗腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）／抗ＣＤ３のタンパク質分子の適用を提供し、前記癌は、結腸直腸、乳房、卵巣、膵臓、胃、前立腺、腎臓、子宮頚、骨髄がん、リンパ腫、白血病、甲状腺、子宮内膜、子宮、膀胱、神経内分泌、頭頚部、肝臓、鼻咽頭、精巣、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、黒色腫、基底細胞皮膚がん、皮膚扁平上皮がん、隆起性皮膚線維肉腫、メルケル細胞がん、膠芽腫、神経膠腫、肉腫、中皮腫、および骨髄異形成症候群から選択される癌を含むか、または前記の部位で発生する。
本発明の別の目的は、癌を阻害または治療するための薬物の調製における、前記抗腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）／抗ＣＤ３のタンパク質分子の適用を提供し、前記癌は、結腸直腸、乳房、卵巣、膵臓、胃、前立腺、腎臓、子宮頚、骨髄がん、リンパ腫、白血病、甲状腺、子宮内膜、子宮、膀胱、神経内分泌、頭頚部、肝臓、鼻咽頭、精巣、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、黒色腫、基底細胞皮膚がん、皮膚扁平上皮がん、隆起性皮膚線維肉腫、メルケル細胞がん、膠芽腫、神経膠腫、肉腫、中皮腫、および骨髄異形成症候群から選択される癌を含むか、または前記の部位で発生する。
【0033】
本発明の別の目的は、抗腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）、およびＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒａ含有融合タンパク質を提供し、それは、二つのポリペプチド鎖を含み、いずれか一つのポリペプチド鎖は、抗ＴＡＡ抗体断片、サイトカイン機能領域、Ｆｃ断片を含み、前記抗ＴＡＡ抗体断片は、ｓｃＦｖ形態であり、前記サイトカイン機能領域は、ＩＬ－１５およびＩＬ－１５Ｒａを含み、前記サイトカイン機能領域のＮ末端は、前記抗ＴＡＡ抗体断片に融合され、Ｃ末端は、前記Ｆｃ断片と融合する。
【0034】
好ましくは、前記抗腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）、およびＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒａ含有融合タンパク質において、そのＩＬ－１５ＲａおよびＩＬ－１５は、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒａ複合体を形成し、ＩＬ－１５は、ＩＬ－１５、ＩＬ－１５Ｒａに結合できるその突然変異、切断および様々な誘導体を含み、ＩＬ－１５Ｒａは、ＩＬ－１５Ｒａ、ＩＬ－１５に結合できるその突然変異、切断および様々な誘導体を含み、好ましくは、前記ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒａ複合体は、次のいずれかの組み合わせに示される突然変異形態を含むが、これらに限定されず、カウント方法は、ＩＬ－１５またはＩＬ－１５Ｒａのアミノ酸配列の最初のアミノ酸に基づいてこれを１位としてカウントされ、好ましくは、前記ＩＬ－１５の親配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４に示されたとおりであり、前記ＩＬ－１５Ｒａの親配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５に示されたとおりである。
【0035】
【表6】
【0036】
好ましくは、前記抗腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）、およびＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒａ含有融合タンパク質において、そのＩＬ－１５は、次のいずれかの組み合わせに示される突然変異形態を含むが、これらに限定されず、カウント方法は、ＩＬ－１５のアミノ酸配列の最初のアミノ酸に基づいてこれを１位としてカウントされ、好ましくは、前記ＩＬ－１５の親配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４に示されたとおりである。
【0037】
【表7】
【0038】
好ましくは、前記抗腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）、およびＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒａ含有融合タンパク質において、それは、Ｆｃセグメントを含み、Ｆｃセグメントの選択により、以下の突然変異の組み合わせを含むが、これらに限定されない免疫エフェクター機能が排除され、以下の突然変異は、ＥＵに従ってカウントされる。
【0039】
【表8】
【0040】
好ましくは、前記抗腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）、およびＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒａ含有融合タンパク質において、そのいずれか一つのポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８に示されたとおりであるか、またはそれと少なくとも９０％の配列同一性を有する。
【0041】
本発明の別の目的は、前記抗腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）、およびＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒａ含有融合タンパク質をコードする核酸分子を提供する。
本発明の別の目的は、癌を阻害または治療するための薬物の調製における、前記抗腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）、およびＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒａ含有融合タンパク質の適用を提供し、前記癌は、結腸直腸、乳房、卵巣、膵臓、胃、前立腺、腎臓、子宮頚、骨髄がん、リンパ腫、白血病、甲状腺、子宮内膜、子宮、膀胱、神経内分泌、頭頚部、肝臓、鼻咽頭、精巣、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、黒色腫、基底細胞皮膚がん、皮膚扁平上皮がん、隆起性皮膚線維肉腫、メルケル細胞がん、膠芽腫、神経膠腫、肉腫、中皮腫、および骨髄異形成症候群から選択される癌を含むか、または前記の部位で発生する。
本発明の別の目的は、癌を阻害または治療するための薬物の調製における、前記抗腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）、およびＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒａ含有融合タンパク質の適用を提供し、前記癌は、結腸直腸、乳房、卵巣、膵臓、胃、前立腺、腎臓、子宮頚、骨髄がん、リンパ腫、白血病、甲状腺、子宮内膜、子宮、膀胱、神経内分泌、頭頚部、肝臓、鼻咽頭、精巣、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、黒色腫、基底細胞皮膚がん、皮膚扁平上皮がん、隆起性皮膚線維肉腫、メルケル細胞がん、膠芽腫、神経膠腫、肉腫、中皮腫、および骨髄異形成症候群から選択される癌を含むか、または前記の部位で発生する。
【発明の効果】
【0042】
既存の技術と比較して、本発明は、次のような有益な効果を有する。
（１）本発明は、既存の抗ＣＤ３抗体を突然変異させて、新たな抗ＣＤ３抗体の変異体を取得する。
（１）本発明は、既存の抗ＣＤ３抗体を突然変異させて、新たな抗ＣＤ３抗体の変異体を取得する。
【0043】
（２）本発明は、より優れた生物学的活性を有する、新規構造を有する抗体分子を提供する。
【図面の簡単な説明】
【0044】
【図1】ＣＤ３抗体ＳＰ３４およびその突然変異体のＪｕｒｋａｔ細胞への結合のＦＡＣＳ検出を示すグラフである。
【図2】抗ＴＡＡ（腫瘍関連抗原）および抗ＣＤ３に対する二重特異性抗体の分子形態の設計図である。
【図3】ＱＰ３７２３３７２４１４６１の分子設計図である。
【図4】ＱＰ３７４４３７４８１４６１の分子設計図である。
【図5】ＣＬＤＮ１８．２／ＣＤ３二重抗体等の分子のＣＬＤＮ１８．２への結合のＦＡＣＳ検出の結果図である。
【図6】ＣＬＤＮ１８．２／ＣＤ３二重抗体等の分子のＣＬＤＮ１８．２への結合のＦＡＣＳ検出の結果図である。
【図7】ＣＬＤＮ１８．２／ＣＤ３二重抗体等の分子のＣＤ３への結合のＦＡＣＳ検出の結果図である。
【図8】ＣＬＤＮ１８．２／ＣＤ３二重抗体等の分子のＣＤ３への結合のＦＡＣＳ検出の結果図である。
【図9】ＣＬＤＮ１８．２／ＣＤ３抗体等の分子によって媒介されたＰＢＭＣによるヒト胃がん細胞ＮＵＧＣ４－ＣＬＤＮ１８．２細胞の殺傷の結果図である。
【図10】ＣＬＤＮ１８．２／ＣＤ３抗体等の分子によって媒介されたＰＢＭＣによるヒト胃がん細胞ＮＵＧＣ４－ＣＬＤＮ１８．２細胞の殺傷の結果図である。
【図11】ＣＬＤＮ１８．２／ＣＤ３抗体等の分子によって媒介されたＰＢＭＣによるヒト肺がん細胞ＨＣＣ８２７－ＣＬＤＮ１８．２細胞の殺傷の結果図である。
【図12】ＣＤ３ＥＧＤ ＨｕＧＥＭＭマウスへの結腸直腸がん細胞ＭＣ３８－ｈＣＬＤＮ１８．２の皮下移植のインビボ動物モデルにおけるＣＬＤＮ１８．２／ＣＤ３二重抗体分子による腫瘍成長の阻害の曲線図である。
【図13】ＣＤ３ＥＧＤ ＨｕＧＥＭＭマウスへの結腸直腸がん細胞ＭＣ３８－ｈＣＬＤＮ１８．２の皮下移植のインビボ動物モデルに投与した後各群のマウス体重変化の曲線図である。
【図14】ＰＢＭＣヒト化ＮＯＧマウスＸ－ＣＬＤＮ１８．２ ／ＭＩＡ ＰａＣａ－２皮下移植腫瘍モデルにおけるＣＬＤＮ１８．２／ＣＤ３二重抗体分子による腫瘍成長の阻害の曲線図である。
【図15】ＰＢＭＣヒト化ＮＯＧマウスＸ－ＣＬＤＮ１８．２ ／ＭＩＡ ＰａＣａ－２皮下移植腫瘍モデルにおけるＣＬＤＮ１８．２／ＣＤ３二重抗体分子による腫瘍成長の阻害の曲線図である。
【図16】一種類の抗ＴＡＡ／ＣＤ３およびＩＬ１５／ＩＬ１５Ｒａ含有多機能融合タンパク質の構造形態の設計図である。
【図17】一種類の抗ＴＡＡ／ＣＤ３およびＩＬ１５／ＩＬ１５Ｒａ含有多機能融合タンパク質の構造形態の設計図である。
【図18】一種類の抗ＴＡＡ／ＣＤ３およびＩＬ１５／ＩＬ１５Ｒａ含有多機能融合タンパク質の構造形態の設計図である。
【図19】一種類の抗ＴＡＡ／ＣＤ３およびＩＬ１５／ＩＬ１５Ｒａ含有多機能融合タンパク質の構造形態の設計図である。
【図20】別の種類の抗ＴＡＡ／ＣＤ３およびＩＬ１５／ＩＬ１５Ｒａ含有多機能融合タンパク質の構造形態の設計図である。
【図21】別の種類の抗ＴＡＡ／ＣＤ３およびＩＬ１５／ＩＬ１５Ｒａ含有多機能融合タンパク質の構造形態の設計図である。
【図22】別の種類の抗ＴＡＡ／ＣＤ３およびＩＬ１５／ＩＬ１５Ｒａ含有多機能融合タンパク質の構造形態の設計図である。
【図23】別の種類の抗ＴＡＡ／ＣＤ３およびＩＬ１５／ＩＬ１５Ｒａ含有多機能融合タンパク質の構造形態の設計図である。
【図24】別の種類の抗ＴＡＡ／ＣＤ３およびＩＬ１５／ＩＬ１５Ｒａ含有多機能融合タンパク質の構造形態の設計図である。
【図25】別の種類の抗ＴＡＡ／ＣＤ３およびＩＬ１５／ＩＬ１５Ｒａ含有多機能融合タンパク質の構造形態の設計図である。
【図26】別の種類の抗ＴＡＡ／ＣＤ３およびＩＬ１５／ＩＬ１５Ｒａ含有多機能融合タンパク質の構造形態の設計図である。
【図27】別の種類の抗ＴＡＡ／ＣＤ３およびＩＬ１５／ＩＬ１５Ｒａ含有多機能融合タンパク質の構造形態の設計図である。
【図28】腫瘍標的Ｔ細胞／ＮＫ細胞活性化のためのＴＡＡ／ＩＬ１５二機能性融合タンパク質の構造形態図である。
【図29】ＣＬＤＮ１８．２／ＣＤ３／ＩＬ１５多機能融合タンパク質のＣＬＤＮ１８．２への結合のＦＡＣＳ検出の結果図である。
【図30】ＣＬＤＮ１８．２／ＣＤ３／ＩＬ１５およびＣＬＤＮ１８．２／ＩＬ１５融合タンパク質のＣＬＤＮ１８．２への結合のＦＡＣＳ検出の結果図である。
【図31】ＣＬＤＮ１８．２／ＣＤ３／ＩＬ１５多機能融合タンパク質のＣＤ３への結合のＦＡＣＳ検出の結果図である。
【図32】ＣＬＤＮ１８．２／ＣＤ３／ＩＬ１５およびＣＬＤＮ１８．２／ＩＬ１５融合タンパク質のＣＤ３への結合のＦＡＣＳ検出の結果図である。
【図33】多機能融合タンパク質ＩＬ１５の活性を検出するためのＭｏ７ｅ細胞増殖実験の結果図である。
【図34】多機能融合タンパク質ＩＬ１５の活性を検出するためのＭｏ７ｅ細胞増殖実験の結果図である。
【図35】多機能融合タンパク質ＩＬ１５の活性を検出するためのＭｏ７ｅ細胞増殖実験の結果図である。
【図36】ＣＬＤＮ１８．２／ＣＤ３／ＩＬ１５によって媒介されたＰＢＭＣによるヒト胃がん細胞ＮＵＧＣ４－ＣＬＤＮ１８．２細胞の殺傷の結果図である。
【図37】ＣＬＤＮ１８．２／ＣＤ３／ＩＬ１５によって媒介されたＰＢＭＣによるヒト胃がん細胞ＮＵＧＣ４－ＣＬＤＮ１８．２細胞の殺傷の結果図である。
【図38】ＣＬＤＮ１８．２／ＣＤ３／ＩＬ１５によって媒介されたＰＢＭＣによるヒト肺がん細胞ＨＣＣ８２７－ＣＬＤＮ１８．２細胞の殺傷の結果図である。
【発明を実施するための形態】
【0045】
以下、添付の図面および実施例を合わせて、本発明の技術的解決策をさらに説明する。
本実験において具体的な条件を定めていない実験方法については、通常、従来の条件に従うか、または原料もしくは商品メーカーが提示する条件に従う。具体的な出所が示されていない試薬は、市場で購入された従来の試薬である。
本実験において具体的な条件を定めていない実験方法については、通常、従来の条件に従うか、または原料もしくは商品メーカーが提示する条件に従う。具体的な出所が示されていない試薬は、市場で購入された従来の試薬である。
【0046】
本明細書において、「／」とは、「および」を指す。例えば、抗腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）／抗ＣＤ３二重特異性抗体とは、ＴＡＡとＣＤ３とを同時に標的とする抗体を指す。
【0047】
「融合」という用語は、ペプチド結合による構成要素の直接連結、連結断片を介した構成要素の連結、または分子間相互作用による融合を指す。単一のペプチド鎖において、融合とは、ペプチド結合による直接連結、または連結断片を介した連結を指す。「多機能融合タンパク質」とは、二つまたはそれ以上の異なるエピトープ（例えば、二つ、三つまたはそれ以上の異なるエピトープ）に結合できる、二つまたはそれ以上の抗原結合ドメインを含むタンパク質を指し、多機能融合タンパク質は、サイトカイン（例えば、ＩＬ－１５、ＩＬ－１５Ｒａ）等を含むこともできる。「融合位置」とは、ペプチド鎖における機能的領域またはドメインの位置を指し、当該ペプチド鎖上の各機能的断片の連結順序を示す。
【0048】
「ポリペプチド」という用語は、タンパク質およびその断片を含む、任意の長さのアミノ酸鎖を指す。本発明は、アミノ酸残基の配列としてのポリペプチドを開示する。あれらの配列は、アミノ基末端からカルボキシ基末端への方向に左から右に書かれている。標準命名法に従って、アミノ酸残基配列は、アラニン（Ａｌａ、Ａ）、アルギニン（Ａｒｇ、Ｒ）、アスパラギン（（Ａｓｎ、Ｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ、Ｄ）、シメシン（Ｃｙｓ、Ｃ）、グルタミン（Ｇｌｎ、Ｑ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ、Ｅ）、グリシン（Ｇｌｙ、Ｇ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ、Ｈ）、イソロイシン（Ｉ１ｅ，Ｉ）、ロイシン（Ｌｅｕ、Ｌ）、リジン（Ｌｙｓ、Ｋ）、メチオニン（Ｍｅｔ、Ｍ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ、Ｆ）、プロリン（Ｐｒｏ、Ｐ）、セリン（Ｓｅｒ、Ｓ）、スレオニン（Ｔｈｒ、Ｔ）、トリプトファン（Ｔｒｐ、Ｗ）、チロシン（Ｔｙｒ、Ｙ）およびバリン（Ｖａｌ、Ｖ）のように３文字または１文字のコードで命名される。
【0049】
「単鎖」という用語は、ペプチド結合によって線形的に連結したアミノ酸を含む分子を指す。
「変異体」または「突然変異体」という用語は、含まれたアミノ酸またはヌクレオチドとは異なるが、基本的な特性を保持しているポリペプチドまたはポリヌクレオチドを指す。通常、変異体間または変異体と親抗体との間の違いは、限られており、アミノ酸配列は、一般に非常に類似している。本明細書において、変異前の抗体または抗体断片を親抗体と呼び、変異後の抗体または抗体断片を変異体と呼ぶ。変異体は、依然として抗原結合活性を有する。
「変異体」または「突然変異体」という用語は、含まれたアミノ酸またはヌクレオチドとは異なるが、基本的な特性を保持しているポリペプチドまたはポリヌクレオチドを指す。通常、変異体間または変異体と親抗体との間の違いは、限られており、アミノ酸配列は、一般に非常に類似している。本明細書において、変異前の抗体または抗体断片を親抗体と呼び、変異後の抗体または抗体断片を変異体と呼ぶ。変異体は、依然として抗原結合活性を有する。
【0050】
「抗体」（ａｎｔｉｂｏｄｙ、Ａｂ）という用語は、少なくとも一つの抗原結合部位を含み、且つ抗原に特異的に結合できる免疫グロブリン分子（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ、Ｉｇ）を指す。
【0051】
「抗原」という用語は、体内で免疫応答を誘導でき、且つ抗体に特異的に結合する物質である。抗原への抗体の結合は、水素結合、ファンデルワールス力、イオン結合、および疎水結合を含む両者間に形成される相互作用によって媒介された。抗原表面上で抗体に結合する領域を「抗原決定基」または「エピトープ」と呼び、一般に、各抗原には、複数の決定基がある。
【0052】
本発明で言及される「抗体」という用語は、最も広い意味で理解され、モノクローナル抗体（全長モノクローナル抗体）、ポリクローナル抗体、抗体断片、少なくとも二つの異なる抗原結合ドメインを含む多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）を含む。抗体は、マウス抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、ヒト抗体、および他に由来する抗体をさらに含む。本発明の抗体は、ヒト、非ヒト霊長類動物、マウス、ラット、ウシ、ウマ、ニワトリ、ラクダ、アルパカ等の免疫グロブリンを含むがこれらに限定されない、任意の動物に由来することができる。抗体は、非天然アミノ酸、Ｆｃエフェクター機能の突然変異およびグリコシル化部位の突然変異のような別の修飾を含むことができる。抗体は、抗体が所望の生物学的活性を示す限り、翻訳後修飾された抗体、抗体の抗原決定基を含む融合タンパク質、ならびに抗原識別部位に対する任意の他の修飾を含む免疫グロブリン分子をさらに含む。言い換えれば、抗体は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫活性断片、即ち、少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む分子を含む。
【0053】
抗体の基本構造は、２本の完全に同一の重鎖（ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ、Ｈ）および２本の完全に同一の軽鎖（ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ、Ｌ）がジスルフィド結合によって連結されるＹ字型の単量体である。各鎖は、それぞれ２～５個の約１１０個のアミノ酸を含み、配列が類似しているが機能が異なるドメイン（機能領域とも呼ばれる）で構成される。抗体分子において、軽鎖および重鎖がＮ末端に近接するアミノ酸配列は、大きく変化しており、形成されたドメインを可変領域（ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ、Ｖ領域）と呼ばれ、Ｃ末端に近接するアミノ酸配列が相対的に一定な領域は、定常領域（ｃｏｎｓｔａｎｔ ｒｅｇｉｏｎ、Ｃ領域）と呼ばれる。
【0054】
重鎖および軽鎖のＶ領域は、それぞれＶＨおよびＶＬと呼ばれ、ＶＨおよびＶＬは、それぞれ三つの領域のアミノ酸組成を有し、配列順序が非常に変化しやすく、超可変領域（ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ、ＨＶＲ）と呼ばれ、当該領域は、抗原エピトープに相補的な空間構造を形成し、相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ、ＣＤＲ）とも呼ばれる。ＶＨの３个ＣＤＲは、それぞれＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２、ＶＨＣＤＲ３で表され、ＶＬの三つのＣＤＲは、それぞれＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２、ＶＬＣＤＲ３で表される。ＶＨおよびＶＬの合計六つのＣＤＲが、一緒に抗原結合部位（ａｎｔｉｇｅｎ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ）を形成する。ＣＤＲ領域のアミノ酸の多様性は、抗体が多数の異なる抗原に特異的に結合する分子基盤である。Ｖ領域のＣＤＲの外側のアミノ酸組成および排列順序は、比較的に変化が少なく、フレームワーク領域（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｒｅｇｉｏｎ、ＦＲ）と呼ばれる。ＶＨおよびＶＬは、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４で表される四つのフレームワーク領域（フレームワーク領域と呼ばれる）を有する。ＶＨおよびＶＬは、それぞれ三つのＣＤＲおよび四つのＦＲで構成され、アミノ基端からカルボキシ基に向かう配列の順序は、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４である。
【0055】
抗体重鎖の定常領域のアミノ酸配列に従って、ヒト免疫グロブリンをＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥの五つのカテゴリーに分類できる。それは、異なるサブタイプ（アイソタイプ）に分けることができ、例えば、ヒトＩｇＧは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４に分けることができ、ＩｇＡは、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２に分けることができる。ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥのサブタイプは、発見されていない。軽鎖アミノ酸配列に基づいて、軽鎖をκ鎖およびλ鎖に分類できる。本発明の抗体は、任意の種類（例えば、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ）またはサブタイプ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２）であり得る。
【0056】
重鎖および軽鎖の定常領域は、それぞれＣＨおよびＣＬと呼ばれる。ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤの重鎖定常領域は、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３の三つのドメインを有し、ＩｇＭ、ＩｇＥの重鎖定常領域は、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、ＣＨ４の四つのドメインを有する。
【0057】
ヒンジ領域（ｈｉｎｇｅ ｒｅｇｉｏｎ）は、ＣＨ１とＣＨ２との間に位置し、豊富なプロリンを含むため、伸ばしたり曲げたりしやすく、Ｙ字型の二つのアーム間の距離を変えることができ、二つのアームを同時に抗原エピトープに結合するのに有利する。
【0058】
「Ｆａｂ断片」という用語は、抗原結合断片（ｆｒａｇｍｅｎｔ ｏｆ ａｎｔｉｇｅｎ ｂｉｎｄｉｎｇ、Ｆａｂ）であり、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインと構成される抗体断片を表わし、単一の抗原エピトープ（一価）に結合する。当業者は、一定条件下で、抗体分子鎖の特定の部分がタンパク質加水分解酵素によって容易に様々な断片に加水分解されることを知っている。パパインは、ヒンジ領域のＮ末端から抗体分子を二つの完全に同一の抗原結合断片（Ｆａｂ）および結晶化可能な断片（Ｆｃ）に加水分解される。
【0059】
「Ｆｄ断片」という用語は、ＶＨおよびＣＨ１ドメインで構成される抗体断片を指す。
「Ｆｃ」、「Ｆｃセグメント」、「Ｆｃ断片」、「Ｆｃドメイン」という用語は、抗原結合活性を有しない結晶化可能な断片（ｆｒａｇｍｅｎｔ ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｂｌｅ）を指し、抗体がエフェクター分子または細胞表面Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）に相互作用する部位である。Ｆｃ断片は、表面に対応するＦｃ受容体を有する細胞に結合し、異なる生物学的効果を生み出す。ＡＤＣＣ効果（抗体依存性細胞媒介性細胞毒性効果、ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）において、抗体のＦａｂセグメントは、ウイルス感染細胞または腫瘍細胞の抗原エピトープに結合し、そのＦｃセグメントは、殺傷細胞（ＮＫ細胞、巨噬細胞等）表面のＦｃＲに結合し、殺傷細胞を媒介して標的細胞を直接殺傷する。Ｆｃ断片は、重鎖定常領域ＣＨ１を除く抗体の定常領域ポリペプチド、即ち、ヒト免疫グロブリンＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＧ重鎖定常領域のカルボキシ基末端の二つの定常領域ドメインＣＨ２およびＣＨ３、ならびにヒト免疫グロブリンＩｇＥおよびＩｇＭ重鎖定常領域のカルボキシ基末端の三つの定常領域ドメインＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ４を含む。Ｆｃ断片は、多くの場合、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ、ヒトＩｇＧ２ Ｆｃ、ヒトＩｇＧ３ Ｆｃ、ヒトＩｇＧ４ Ｆｃまたはその変異体から選択され、好ましくはＩｇＧ１ Ｆｃ、またはヒトＩｇＧ４ Ｆｃまたはその変異体から選択される。
「Ｆｃ」、「Ｆｃセグメント」、「Ｆｃ断片」、「Ｆｃドメイン」という用語は、抗原結合活性を有しない結晶化可能な断片（ｆｒａｇｍｅｎｔ ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｂｌｅ）を指し、抗体がエフェクター分子または細胞表面Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）に相互作用する部位である。Ｆｃ断片は、表面に対応するＦｃ受容体を有する細胞に結合し、異なる生物学的効果を生み出す。ＡＤＣＣ効果（抗体依存性細胞媒介性細胞毒性効果、ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）において、抗体のＦａｂセグメントは、ウイルス感染細胞または腫瘍細胞の抗原エピトープに結合し、そのＦｃセグメントは、殺傷細胞（ＮＫ細胞、巨噬細胞等）表面のＦｃＲに結合し、殺傷細胞を媒介して標的細胞を直接殺傷する。Ｆｃ断片は、重鎖定常領域ＣＨ１を除く抗体の定常領域ポリペプチド、即ち、ヒト免疫グロブリンＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＧ重鎖定常領域のカルボキシ基末端の二つの定常領域ドメインＣＨ２およびＣＨ３、ならびにヒト免疫グロブリンＩｇＥおよびＩｇＭ重鎖定常領域のカルボキシ基末端の三つの定常領域ドメインＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ４を含む。Ｆｃ断片は、多くの場合、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ、ヒトＩｇＧ２ Ｆｃ、ヒトＩｇＧ３ Ｆｃ、ヒトＩｇＧ４ Ｆｃまたはその変異体から選択され、好ましくはＩｇＧ１ Ｆｃ、またはヒトＩｇＧ４ Ｆｃまたはその変異体から選択される。
【0060】
Ｆｃは、２本の鎖から構成されることができ、本明細書において、Ｆｃ断片の２本の鎖を第１のＦｃ鎖および第２のＦｃ鎖と記載し、第１のＦｃ鎖および第２のＦｃ鎖は、それぞれ突然変異されることができ、本発明は、特定に限定されない。Ｆｃ断片は、Ｆｃドメイン内の単一のポリペプチド鎖を指すこともできる。抗体のＦｃセグメントは、免疫エフェクター機能を排除するように選択でき、次のような突然変異の組み合わせ（ＥＵによってカウントされる）を含むが、これらに限定されない。
【0061】
【表9】
【0062】
突然変異によって設計されたＦｃ変異体の間は、空間充填効果、静電ステアリング、水素結合作用、疏水作用等を形成することができる。Ｆｃ変異体間の相互作用は、安定なヘテロ二量体の形成に有利する。好ましい突然変異設計は、「Ｋｎｏｂ－ｉｎ－ｈｏｌｅ」形態の突然変異設計である。
【0063】
ｓｃＦｖ（ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｒａｇｍｅｎｔ）、または単鎖抗体は、リンカー（ｌｉｎｋｅｒ）を介して連結された抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域で構成される。「連結断片」は、ＩＬ－１５をＩＬ－１５Ｒａに連結し、ＣＤ３抗体のＶＨをＶＬに連結することができ、タンパク質の正しいフォールディングおよびペプチド安定性を確保する。「連結断片」は、好ましくは（ＧＧＧＧＳ）ｎであり、ここで、ｎは、０、１、２、３、４、５またはそれ以上であり得る。連結断片配列が短すぎる場合、二つのタンパク質の高次構造のフォールディングに影響を及ぼし、相互に干渉する可能性があり、連結ペプチド配列が長すぎる場合、連結ペプチド配列自体が新しい抗原となるため、免疫原性の問題が生じる。
【0064】
腫瘍関連抗原（ｔｕｍｏｒ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ａｎｔｉｇｅｎ、ＴＡＡ）とは、胚性タンパク質、糖タンパク質抗原、扁平上皮抗原等を含む、腫瘍細胞または正常細胞に存在する抗原分子を指し、臨床腫瘍の診断に一般的に使用される。腫瘍関連抗原は、腫瘍細胞の固有のものではなく、正常細胞でも微量合成されることができるが、腫瘍細胞が増殖すると高度に発現するため、「関連抗原」と呼ばれる。腫瘍関連抗原は、例えば、ＣＤ２０、ＣＤ１９、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ５２、ｓｌａｍｆ７、ＧＤ２、ＣＤ２４、ＣＤ４７、ＣＤ１３３、ＣＤ２３９、ＣＤ２７６、ＰＤ－１、ＣＥＡ、Ｅｐｃａｍ、Ｔｒｏｐ２、ＴＡＧ７２、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ、ｆｏｌｒ１、ＣＬＤＮ１８．２、ＰＤＬ１、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲ ＶＩＩＩ、Ｃ－ＭＥＴ、ＨＥＲ２、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡ、ＥｐｈＡ２、ＡＤＡＭ１７、１７－Ａ１、ＮＫＧ２Ｄ ｌｉｇａｎｄｓ、ＭＣＳＰ、ＬＧＲ５、ＳＳＥＡ３、ＳＬＣ３４Ａ２、ＢＣＭＡ、ＧＰＮＭＢまたはＧｌｙｐｉｃａｎ－３であり得る。
【0065】
「ベクター」という用語は、それが連結している別のポリヌクレオチドを輸送できるポリヌクレオチド分子を指す。ベクターの一つの種類は、「プラスミド」であり、これは、環状の二本鎖ＤＮＡ環を指し、ここで、追加のＤＮＡセグメントに連結されることができる。ベクターの別の種類は、ウイルスベクターであり、ここで、追加のＤＮＡセグメントは、ウイルスゲノムに連結されることができる。特定のベクターは、それらが導入された宿主細胞内で自律複製することができる（例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーマル哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーマル哺乳動物ベクター）は、宿主細胞に導入された後に宿主細胞のゲノムに組み込まれ、それによって宿主ゲノムとともに複製されることができる。さらに、特定のベクターは、それらが作動可能に連結される遺伝子の発現を指示することができる。通常、組換えＤＮＡ技術で有用である発現ベクターは、通常、プラスミドの形態である
「ＩＬ－１５」、「ＩＬ－１５Ｒａ」という用語は、その突然変異体または断片であり得る。
「ＩＬ－１５」、「ＩＬ－１５Ｒａ」という用語は、その突然変異体または断片であり得る。
【0066】
「第１の」、「第２の」という用語は、説明の目的でのみ使用され、その重要性の程度を示したり暗示したりするものではない。
本発明は、既存のＣＤ３抗体ＳＰ３４を親抗体として用い、その可変領域を突然変異させて、ＣＤ３抗体変異体を取得する。本発明は、異なる標的を標的とし、異なる構成を有するいくつかのタンパク質分子もさらに提供する。
本発明は、既存のＣＤ３抗体ＳＰ３４を親抗体として用い、その可変領域を突然変異させて、ＣＤ３抗体変異体を取得する。本発明は、異なる標的を標的とし、異なる構成を有するいくつかのタンパク質分子もさらに提供する。
【0067】
「ＩＬ－１５～ＩＬ１５Ｒａ」は、次のような配列を使用することができる。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２
【0068】
【化1】
【0069】
「ＩＬ１５Ｒａ～ＩＬ－１５」は、次のような配列を使用することができる。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３
【0070】
【化2】
【0071】
一．抗ＣＤ３抗体変異体の取得、および抗ＴＡＡ（腫瘍関連抗原）／ＣＤ３二重特異性抗体形態の設計
実施例１：抗ＣＤ３抗体変異体の取得、分子クローニング、一過性発現、およびタンパク質の精製
１．分子クローニング：ヒト化抗ＣＤ３抗体ＳＰ３４（Ｗｉｌｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．、１９９０；ＵＳ ８２３６３０８）を親抗体として使用し、そのＣＤＲを突然変異させ、安定性の高い抗体をスクリーニングして、三つの変異体を取得する。ＣＤ３親抗体ＳＰ３４およびその変異体の軽鎖および重鎖可変領域を、連結配列を介して単鎖抗体ＶＨ－ＶＬに構築し、且つそのＣ末端にヒトＩｇＧ１のＦＣセグメントが融合され、分子クローニングによって、真核発現ベクターｐＱＤを構築してロードする。クローン番号およびタンパク質の配列番号は、次の表に示されたとおりである。
実施例１：抗ＣＤ３抗体変異体の取得、分子クローニング、一過性発現、およびタンパク質の精製
１．分子クローニング：ヒト化抗ＣＤ３抗体ＳＰ３４（Ｗｉｌｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．、１９９０；ＵＳ ８２３６３０８）を親抗体として使用し、そのＣＤＲを突然変異させ、安定性の高い抗体をスクリーニングして、三つの変異体を取得する。ＣＤ３親抗体ＳＰ３４およびその変異体の軽鎖および重鎖可変領域を、連結配列を介して単鎖抗体ＶＨ－ＶＬに構築し、且つそのＣ末端にヒトＩｇＧ１のＦＣセグメントが融合され、分子クローニングによって、真核発現ベクターｐＱＤを構築してロードする。クローン番号およびタンパク質の配列番号は、次の表に示されたとおりである。
【0072】
【表10】
【0073】
アミノ酸配列は、次のように示されたとおりである。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：０１ ＱＤ３６８５
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：０１ ＱＤ３６８５
【0074】
【化3】
【0075】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：０２ ＱＤ３６８９
【0076】
【化4】
【0077】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：０３ ＱＤ３６９０
【0078】
【化5】
【0079】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：０４ ＱＤ３６７９（ｈＳＰ３４ ＶＨ－ＶＬ－ＦＣ）
【0080】
【化6】
【0081】
注：下線付き部分のアミノ酸は、抗体の重鎖可変領域であり、波線部分は、軽鎖可変領域であり、重鎖可変領域および軽鎖可変領域の間の斜体部分は、連結配列である。可変領域のアミノ酸順序は、ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４であり、太字部分且つ下部太線部分は、それぞれＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ３、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３を示す。親抗体とその突然変異体ＣＤＲ配列との比較は、次の表に示されたとおりである。
【0082】
【表11】
【0083】
２．タンパク質発現：２９３Ｅ細胞の細胞密度を１×１０６／ｍｌに調整する。プラスミドおよびトランスフェクション試薬ＰＥＩを準備し、トランスフェクションに必要なプラスミドの量は、１００μｇ／１００ｍｌ細胞であり、ＰＥＩとプラスミドとの質量比は、２：１である。プラスミドおよびＰＥＩを均等に混合し、１５分間放置する。プラスミドとＰＥＩとの混合物を２９３Ｅの細胞にゆっくりと加え、８％ＣＯ２、１２０ｒｐｍ、３７℃のシェーカー内に入れて培養する。トランスフェクションの５～６日目に、水平遠心分離機で４７００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、細胞上清を収集して精製する。
【0084】
３．タンパク質精製：
タンパク質アフィニティークロマトグラフィー：細胞培養液を高速遠心分離した後に上清を採取し、ＧＥのプロテインＡクロマトグラフィーカラムを使用してアフィニティークロマトグラフィーを実行する。クロマトグラフィーに使用される平衡緩衝液は、１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）であり、細胞上清をローディングして結合した後、紫外線がベースラインに戻るまでＰＢＳで洗浄し、次いで溶出緩衝液０．１Ｍグリシン（ｐＨ３．０）を使用して目的タンパク質を溶出し、Ｔｒｉｓを使用してｐＨを中性に調節して保存し、タンパク質体積排除クロマトグラフィー：イオン交換によって得られた生成物を限外ろ過によって濃縮した後に体積排除クロマトグラフィーを実行し、例えば、ＧＥのＳｕｐｅｒｄｅｘ２００ゲルを使用して分離して、可能性のある凝集体および他の成分を除去して、高純度の目的生成物を取得する。得られたタンパク質の純度分析は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及ＳＥＣ－ＨＰＬＣ検出によって分析されることができる。タンパク質濃度は、ＵＶ分光光度法によって測定される。
タンパク質アフィニティークロマトグラフィー：細胞培養液を高速遠心分離した後に上清を採取し、ＧＥのプロテインＡクロマトグラフィーカラムを使用してアフィニティークロマトグラフィーを実行する。クロマトグラフィーに使用される平衡緩衝液は、１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）であり、細胞上清をローディングして結合した後、紫外線がベースラインに戻るまでＰＢＳで洗浄し、次いで溶出緩衝液０．１Ｍグリシン（ｐＨ３．０）を使用して目的タンパク質を溶出し、Ｔｒｉｓを使用してｐＨを中性に調節して保存し、タンパク質体積排除クロマトグラフィー：イオン交換によって得られた生成物を限外ろ過によって濃縮した後に体積排除クロマトグラフィーを実行し、例えば、ＧＥのＳｕｐｅｒｄｅｘ２００ゲルを使用して分離して、可能性のある凝集体および他の成分を除去して、高純度の目的生成物を取得する。得られたタンパク質の純度分析は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及ＳＥＣ－ＨＰＬＣ検出によって分析されることができる。タンパク質濃度は、ＵＶ分光光度法によって測定される。
【0085】
細胞発現タンパク質の収量および純度は、次の表に示されたとおりであり、ＱＰ３６７９、即ち親ヒト化抗ＣＤ３抗体ＳＰ３４の収量は、６８．６４ｍｇ／Ｌであり、抗ＣＤ３抗体突然変異体は、すべて親抗体ＱＰ３６７９よりも高い発現収率を示し、これは、突然変異体の収量がより高く、タンパク質がより安定的であり得ることを示し、同時にＳＥＣ－ＨＰＬＣによってタンパク質の純度は、すべて非常に良好である。
【0086】
【表12】
【0087】
実施例２：ＣＤ３を天然に発現するＪｕｒｋａｔ細胞に結合する抗ＣＤ３抗体変異体のＦＡＣＳ検出
抗ＣＤ３抗体結合活性のＦＡＣＳ検出：ヒトリンパ球性白血病細胞（Ｊｕｒｋａｔ細胞）は、天然ＣＤ３を発現し、ＦＡＣＳ（フローサイトメトリー、ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｅｒ）によって抗ＣＤ３抗体およびその突然変異体のＪｕｒｋａｔ細胞への結合を検出する。１Ｅ５／ウェルＪｕｒｋａｔ細胞をＵ字型９６ウェルプレートに播種し、氷ＰＢＳで１回洗浄し、１２００ｒｐｍで３分間遠心分離し、洗浄完了後、２００μＬ／ウェルに従って３％ＦＢＳ／ＰＢＳブロッキング溶液を加え、氷上で１時間インキュベートする。ブロッキング完了後、１２００ｒｐｍで３分間遠心分離した後、上清を振り捨て、様々な濃度のサンプルをインキュベートし、氷上で２時間インキュベートし、氷ＰＢＳで３回洗浄し、ＰＥ－抗ヒトＦＣ抗体を１：２００の希釈率、５０μｌ／ウェルでインキュベートし、充分に混合し、氷上で１時間置き、氷ＰＢＳで３回洗浄する。２００μｌ／ウェルのＰＢＳに細胞を再懸濁し、ＦＡＣＳ機器で平均蛍光値を読み取り、ｇｒａｐｈｐａｄ ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して結果を分析する。
抗ＣＤ３抗体結合活性のＦＡＣＳ検出：ヒトリンパ球性白血病細胞（Ｊｕｒｋａｔ細胞）は、天然ＣＤ３を発現し、ＦＡＣＳ（フローサイトメトリー、ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｅｒ）によって抗ＣＤ３抗体およびその突然変異体のＪｕｒｋａｔ細胞への結合を検出する。１Ｅ５／ウェルＪｕｒｋａｔ細胞をＵ字型９６ウェルプレートに播種し、氷ＰＢＳで１回洗浄し、１２００ｒｐｍで３分間遠心分離し、洗浄完了後、２００μＬ／ウェルに従って３％ＦＢＳ／ＰＢＳブロッキング溶液を加え、氷上で１時間インキュベートする。ブロッキング完了後、１２００ｒｐｍで３分間遠心分離した後、上清を振り捨て、様々な濃度のサンプルをインキュベートし、氷上で２時間インキュベートし、氷ＰＢＳで３回洗浄し、ＰＥ－抗ヒトＦＣ抗体を１：２００の希釈率、５０μｌ／ウェルでインキュベートし、充分に混合し、氷上で１時間置き、氷ＰＢＳで３回洗浄する。２００μｌ／ウェルのＰＢＳに細胞を再懸濁し、ＦＡＣＳ機器で平均蛍光値を読み取り、ｇｒａｐｈｐａｄ ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して結果を分析する。
【0088】
図１に示されるように、結果は、抗ＣＤ３抗体ＳＰ３４およびその突然変異体ＱＰ３６８５、ＱＰ３６８９、ＱＰ３６９０は、すべてｊｕｒｋａｔ結合活性を維持することを示す。
【0089】
実施例３．抗ＴＡＡ（腫瘍関連抗原）および抗ＣＤ３を含む二重特異性抗体形態の設計
ＣＤ３二重抗体は、治療的効果を果たし、主に、腫瘍細胞上に発現される腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）およびＴ細胞上のＣＤ３標的に同時に結合することにより、これら二つの細胞を架橋結合させて免疫シナプスを形成し、Ｔ細胞が活性化され、それによって腫瘍細胞を殺傷する。多価ＴＡＡ抗体は、特に標的の特異性が十分でない場合に、標的の選択性を向上させることができる。ＣＤ３二重抗体の安全性を向上させる主な方向性は、ＴＡＡの選択性を向上させ、同時に適切なＣＤ３抗体親和性を選択することで独副作用を軽減しながら有効性を維持することができ、それによって腫瘍の選択性を向上させ、健康な細胞の標的を減少させる。
ＣＤ３二重抗体は、治療的効果を果たし、主に、腫瘍細胞上に発現される腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）およびＴ細胞上のＣＤ３標的に同時に結合することにより、これら二つの細胞を架橋結合させて免疫シナプスを形成し、Ｔ細胞が活性化され、それによって腫瘍細胞を殺傷する。多価ＴＡＡ抗体は、特に標的の特異性が十分でない場合に、標的の選択性を向上させることができる。ＣＤ３二重抗体の安全性を向上させる主な方向性は、ＴＡＡの選択性を向上させ、同時に適切なＣＤ３抗体親和性を選択することで独副作用を軽減しながら有効性を維持することができ、それによって腫瘍の選択性を向上させ、健康な細胞の標的を減少させる。
【0090】
本発明によって提供される抗ＴＡＡ（腫瘍関連抗原）および抗ＣＤ３の二重特異性抗体分子形態の設計は、図２に示されたとおりである。
図２に示される抗ＴＡＡおよび抗ＣＤ３の二重特異性抗体分子は、第１の単量体（図２の左側部分）および第２の単量体（図２の右側部分）を含む。第１の単量体は、Ｆｄ断片（ＶＨおよびＣＨ１を含む）を有する鎖１、ならびに軽鎖断片（ＶＬおよびＣＬを含む）および第１のＦｃ鎖を有する鎖２等の二つの鎖を含む。第２の単量体も、Ｆｄ断片（ＶＨおよびＣＨ１を含む）を有する鎖１、ならびに軽鎖断片（ＶＬおよびＣＬを含む）、抗ＣＤ３抗体断片（図２におけるＣＤ３抗体、これは、ｓｃＦｖ形態である）、および第２のＦｃ鎖を有する鎖２の二つの鎖を含む。第１の単量体または第２の単量体において、軽鎖断片およびＦｄ断片は、それぞれ対になって抗ＴＡＡのＦａｂドメインを形成する（図２におけるＴＡＡ抗体の機能を実現するために）。従来の抗体とは異なり、第１の単量体の軽鎖断片は、第１のＦｃ鎖に融合され、同時に抗ＣＤ３抗体断片のＮ末端は、第２の単量体の軽鎖断片に融合され、抗ＣＤ３抗体断片のＣ末端は、第２のＦｃ鎖と融合する。第１のＦｃ鎖および前記第２のＦｃ鎖は、重合してＦｃドメインを形成する。Ｆｃドメインは、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ、ヒトＩｇＧ２ Ｆｃ、ヒトＩｇＧ３ Ｆｃ、ヒトＩｇＧ４ Ｆｃまたはその変異体を形成することができる。
図２に示される抗ＴＡＡおよび抗ＣＤ３の二重特異性抗体分子は、第１の単量体（図２の左側部分）および第２の単量体（図２の右側部分）を含む。第１の単量体は、Ｆｄ断片（ＶＨおよびＣＨ１を含む）を有する鎖１、ならびに軽鎖断片（ＶＬおよびＣＬを含む）および第１のＦｃ鎖を有する鎖２等の二つの鎖を含む。第２の単量体も、Ｆｄ断片（ＶＨおよびＣＨ１を含む）を有する鎖１、ならびに軽鎖断片（ＶＬおよびＣＬを含む）、抗ＣＤ３抗体断片（図２におけるＣＤ３抗体、これは、ｓｃＦｖ形態である）、および第２のＦｃ鎖を有する鎖２の二つの鎖を含む。第１の単量体または第２の単量体において、軽鎖断片およびＦｄ断片は、それぞれ対になって抗ＴＡＡのＦａｂドメインを形成する（図２におけるＴＡＡ抗体の機能を実現するために）。従来の抗体とは異なり、第１の単量体の軽鎖断片は、第１のＦｃ鎖に融合され、同時に抗ＣＤ３抗体断片のＮ末端は、第２の単量体の軽鎖断片に融合され、抗ＣＤ３抗体断片のＣ末端は、第２のＦｃ鎖と融合する。第１のＦｃ鎖および前記第２のＦｃ鎖は、重合してＦｃドメインを形成する。Ｆｃドメインは、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ、ヒトＩｇＧ２ Ｆｃ、ヒトＩｇＧ３ Ｆｃ、ヒトＩｇＧ４ Ｆｃまたはその変異体を形成することができる。
【0091】
二重特異性抗体の分子クローニング、一過性発現、およびタンパク質精製：
１．分子クローニング：
図２に示されるように、ＴＡＡは、ＣＬＤＮ１８．２を選択し、抗ＣＬＤＮ１８．２／ＣＤ３二重特異性抗体を設計し、ここで、ＣＬＤＮ１８．２抗体配列については、特許文献ＣＮ２０２０１０３４４６７６．８の抗体ＱＰ１４６１１４６３の配列を参照することができ、抗ＣＤ３抗体は、それぞれＳＰ３４配列およびその変異体ＱＰ３６８５、ＱＰ３６８９、ＱＰ３６９０の抗体軽鎖重鎖配列を使用する。ＱＰ３７４５３７４９３７４６の抗ＣＤ３抗体配列は、ＳＰ３４から選択され、ＱＰ０９０８３７４９３７４６、ＱＰ０９０９３７４９３７４６、ＱＰ０９１０３７４９３７４６の抗ＣＤ３抗体配列は、ＱＰ３６８５、ＱＰ３６８９、ＱＰ３６９０から選択される。タンパク質の発現および配列番号は、次の表に示されたとおりである。
１．分子クローニング：
図２に示されるように、ＴＡＡは、ＣＬＤＮ１８．２を選択し、抗ＣＬＤＮ１８．２／ＣＤ３二重特異性抗体を設計し、ここで、ＣＬＤＮ１８．２抗体配列については、特許文献ＣＮ２０２０１０３４４６７６．８の抗体ＱＰ１４６１１４６３の配列を参照することができ、抗ＣＤ３抗体は、それぞれＳＰ３４配列およびその変異体ＱＰ３６８５、ＱＰ３６８９、ＱＰ３６９０の抗体軽鎖重鎖配列を使用する。ＱＰ３７４５３７４９３７４６の抗ＣＤ３抗体配列は、ＳＰ３４から選択され、ＱＰ０９０８３７４９３７４６、ＱＰ０９０９３７４９３７４６、ＱＰ０９１０３７４９３７４６の抗ＣＤ３抗体配列は、ＱＰ３６８５、ＱＰ３６８９、ＱＰ３６９０から選択される。タンパク質の発現および配列番号は、次の表に示されたとおりである。
【0092】
【表13】
【0093】
同時に比較するために、他の２種類の形態ＣＬＤＮ１８．２／ＣＤ３二重抗体分子ＱＰ３７２３３７２４１４６１およびＱＰ３７４４３７４８１４６１を構築し、特許ＵＳ２０２０００５５９３２Ａ１に基づいて、アムジェン会社のＣＬＤＮ１８．２／ＣＤ３二重抗体分子ＡＭＧ９１０を構築し、ＡＭＧ９１０タンパク質をＱＰ３６９３と番号付ける。タンパク質の発現および配列番号は、次の表に示されたとおりである。
【0094】
【表14】
【0095】
ＱＰ３７２３３７２４１４６１の分子設計は、図３に示されたとおりである。ＱＰ３７４４３７４８１４６１の分子設計は、図４に示されたとおりである。
２．クローン構築方法：
表４および表５に示されるようにクローンを設計し、全長発現ベクターを構築する。プライマー設計：オンラインソフトウェアＤＮＡＷｏｒｋｓ（ｖ３．２．４）（ｈｔｔｐ：／／ｈｅｌｉｘｗｅｂ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｄｎａｗｏｒｋｓ／）を使用して、組換えに必要な遺伝子断片を合成するための複数のプライマーを設計する。断片スプライシング：ＴａＫａＲａ会社Ｐｒｉｍｅｒ ＳＴＡＲ ＧＸＬ ＤＮＡポリメラーゼの取扱説明書に従って、上記で設計した複数のプライマーを用いて、ＰＣＲ増幅により組換えに必要な遺伝子断片を得る。第１段階ＰＣＲ：５０μＬのＰＣＲ反応系は、１０μＬのＰｒｉｍｅｒＳＴＡＲ ＧＸＬ Ｂｕｆｆｅｒ（５×）、４μＬのｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ（２．５ｍｍｏｌ・Ｌ－１）、１μＬの上記に示されるような各プライマー、１μＬのＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＧＸＬ ＤＮＡポリメラーゼを含む。ＰＣＲ反応条件は、９８℃で２分間、９８℃で２０秒間、５５℃で１５秒間、６８℃で３０秒間を３０サイクルとし、６８℃で５分間である。第２段階ＰＣＲ：第１段階のＰＣＲ生成物をテンプレートとして使用し、最初および最後のプライマーを用いて、第１段階と同じ条件でＰＣＲ増幅を実行する。ＰＣＲは、目的断片を増幅するために構築する。発現ベクターｐＱＤの構築および酵素消化：識別配列と酵素消化部位とが異なる特性を有するＢｓｍＢＩ等のいくつかの特殊な限制エンドヌクレアーゼを使用して、発現ベクターｐＱＤ（シグナルペプチドを有する）を設計および構築し、ＢｓｍＢＩ酵素でベクターを消化し、ゲルを備蓄のために回収する。発現ベクターの組換え構築：組換え標的遺伝子断片およびＢｓｍＢＩで酵素消化した発現ベクターｐＱＤ（シグナルペプチド断片を有する）を回收し、３：１の比率でそれぞれＤＨ５α感受性細胞に加え、０℃で３０分間氷浴し、４２℃で９０秒間ヒートショックし、，５倍量のＬＢ ｍｅｄｉｕｍを加え、３７℃で４５分間インキュベートし、ＬＢ－Ａｍｐ平プレートを塗布し、３７℃で一晩培養して、単一クローンを選択し、シーケンシングによって、それそれそれぞれの目的のクローンを取得する。
２．クローン構築方法：
表４および表５に示されるようにクローンを設計し、全長発現ベクターを構築する。プライマー設計：オンラインソフトウェアＤＮＡＷｏｒｋｓ（ｖ３．２．４）（ｈｔｔｐ：／／ｈｅｌｉｘｗｅｂ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｄｎａｗｏｒｋｓ／）を使用して、組換えに必要な遺伝子断片を合成するための複数のプライマーを設計する。断片スプライシング：ＴａＫａＲａ会社Ｐｒｉｍｅｒ ＳＴＡＲ ＧＸＬ ＤＮＡポリメラーゼの取扱説明書に従って、上記で設計した複数のプライマーを用いて、ＰＣＲ増幅により組換えに必要な遺伝子断片を得る。第１段階ＰＣＲ：５０μＬのＰＣＲ反応系は、１０μＬのＰｒｉｍｅｒＳＴＡＲ ＧＸＬ Ｂｕｆｆｅｒ（５×）、４μＬのｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ（２．５ｍｍｏｌ・Ｌ－１）、１μＬの上記に示されるような各プライマー、１μＬのＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＧＸＬ ＤＮＡポリメラーゼを含む。ＰＣＲ反応条件は、９８℃で２分間、９８℃で２０秒間、５５℃で１５秒間、６８℃で３０秒間を３０サイクルとし、６８℃で５分間である。第２段階ＰＣＲ：第１段階のＰＣＲ生成物をテンプレートとして使用し、最初および最後のプライマーを用いて、第１段階と同じ条件でＰＣＲ増幅を実行する。ＰＣＲは、目的断片を増幅するために構築する。発現ベクターｐＱＤの構築および酵素消化：識別配列と酵素消化部位とが異なる特性を有するＢｓｍＢＩ等のいくつかの特殊な限制エンドヌクレアーゼを使用して、発現ベクターｐＱＤ（シグナルペプチドを有する）を設計および構築し、ＢｓｍＢＩ酵素でベクターを消化し、ゲルを備蓄のために回収する。発現ベクターの組換え構築：組換え標的遺伝子断片およびＢｓｍＢＩで酵素消化した発現ベクターｐＱＤ（シグナルペプチド断片を有する）を回收し、３：１の比率でそれぞれＤＨ５α感受性細胞に加え、０℃で３０分間氷浴し、４２℃で９０秒間ヒートショックし、，５倍量のＬＢ ｍｅｄｉｕｍを加え、３７℃で４５分間インキュベートし、ＬＢ－Ａｍｐ平プレートを塗布し、３７℃で一晩培養して、単一クローンを選択し、シーケンシングによって、それそれそれぞれの目的のクローンを取得する。
【0096】
３．タンパク質発現：
２９３Ｅ細胞の細胞密度を１×１０６／ｍｌに調整する。プラスミドおよびトランスフェクション試薬ＰＥＩを準備し、トランスフェクションに必要なプラスミドの量は、１００μｇ／１００ｍｌ細胞であり、ＰＥＩとプラスミドとの質量比は、２：１である。プラスミドおよびＰＥＩを均等に混合し、１５分間放置する。プラスミドとＰＥＩとの混合物を２９３Ｅの細胞にゆっくりと加え、８％ＣＯ２、１２０ｒｐｍ、３７℃のシェーカーに入れて培養する。トランスフェクションの５～６日目に、水平遠心分離機で４７００ｒｐｍで２０分間遠心分離して、細胞上清を収集して精製する。
２９３Ｅ細胞の細胞密度を１×１０６／ｍｌに調整する。プラスミドおよびトランスフェクション試薬ＰＥＩを準備し、トランスフェクションに必要なプラスミドの量は、１００μｇ／１００ｍｌ細胞であり、ＰＥＩとプラスミドとの質量比は、２：１である。プラスミドおよびＰＥＩを均等に混合し、１５分間放置する。プラスミドとＰＥＩとの混合物を２９３Ｅの細胞にゆっくりと加え、８％ＣＯ２、１２０ｒｐｍ、３７℃のシェーカーに入れて培養する。トランスフェクションの５～６日目に、水平遠心分離機で４７００ｒｐｍで２０分間遠心分離して、細胞上清を収集して精製する。
【0097】
４．タンパク質精製：
タンパク質アフィニティークロマトグラフィー法：細胞培養液を高速遠心分離した後に上清を採取し、ＧＥのプロテインＡクロマトグラフィーカラムを使用してアフィニティークロマトグラフィーを実行する。クロマトグラフィーに使用する平衡緩衝液は、１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）であり、細胞上清をローディングして結合した後、紫外線がベースラインに戻るまでＰＢＳで洗浄し、次いで溶出緩衝液０．１Ｍグリシン（ｐＨ３．０）を使用して目的タンパク質を溶出し、Ｔｒｉｓを使用してｐＨを中性に調節して保存し、タンパク質体積排除クロマトグラフィー：イオン交換によって得られた生成物を限外ろ過によって濃縮した後に体積排除クロマトグラフィーを実行し、例えば、ＧＥのＳｕｐｅｒｄｅｘ２００ゲルを使用して分離して、可能性のある凝集体および他の成分を除去して、高純度の目的生成物を取得する。得られたタンパク質の純度分析は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及ＳＥＣ－ＨＰＬＣ検出によって分析されることができる。タンパク質濃度は、ＵＶ分光光度法によって測定される。精製プロセス全体でエンドトキシンが厳密に管理され、精製タンパク質のエンドトキシン含有量は、１ＥＵ／ｍｇ未満である。
タンパク質アフィニティークロマトグラフィー法：細胞培養液を高速遠心分離した後に上清を採取し、ＧＥのプロテインＡクロマトグラフィーカラムを使用してアフィニティークロマトグラフィーを実行する。クロマトグラフィーに使用する平衡緩衝液は、１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）であり、細胞上清をローディングして結合した後、紫外線がベースラインに戻るまでＰＢＳで洗浄し、次いで溶出緩衝液０．１Ｍグリシン（ｐＨ３．０）を使用して目的タンパク質を溶出し、Ｔｒｉｓを使用してｐＨを中性に調節して保存し、タンパク質体積排除クロマトグラフィー：イオン交換によって得られた生成物を限外ろ過によって濃縮した後に体積排除クロマトグラフィーを実行し、例えば、ＧＥのＳｕｐｅｒｄｅｘ２００ゲルを使用して分離して、可能性のある凝集体および他の成分を除去して、高純度の目的生成物を取得する。得られたタンパク質の純度分析は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及ＳＥＣ－ＨＰＬＣ検出によって分析されることができる。タンパク質濃度は、ＵＶ分光光度法によって測定される。精製プロセス全体でエンドトキシンが厳密に管理され、精製タンパク質のエンドトキシン含有量は、１ＥＵ／ｍｇ未満である。
【0098】
結果は、ＣＬＤＮ１８．２／ＣＤ３二重特異性抗体ＱＰ３７４５３７４９３７４６、ＱＰ０９０８３７４９３７４６、ＱＰ０９０９３７４９３７４６およびＱＰ０９１０３７４９３７４６の細胞発現収率が高く、ＨＰＬＣ－ＳＥＣ純度が９５％を超え、生産可能であることを示す。
【0099】
実施例４：二重特異性抗体とＣＬＤＮ１８．２との結合活性のＦＡＣＳ検出
実験段階：
ＣＬＤＮ１８．２を安定的に発現する細胞株ＣＨＯＳ－ＣＬＤＮ１８．２を採取し、１Ｅ５／ウェル細胞ＣＨＯＳ－ＣＬＤＮ１８．２をＵ字型９６ウェルプレートに播種し、氷ＰＢＳで１回洗浄し、１２００ｒｐｍで３分間遠心分離し、洗浄完了後、２００μＬ／ウェルに従って３％ＦＢＳ／ＰＢＳブロッキング溶液を加え、氷上で１時間インキュベートする。ブロッキング完了後、１２００ｒｐｍで３分間遠心分離した後、上清を振り捨て、様々な濃度のサンプルをインキュベートし、氷上で２時間インキュベートし、氷ＰＢＳで３回洗浄し、ＰＥ－抗ヒトＦＣ抗体を１：２００の希釈率、５０μｌ／ウェルでインキュベートし、充分に混合し、氷上で１時間置き、氷ＰＢＳで３回洗浄する。２００μｌ／ウェルのＰＢＳに細胞を再懸濁し、ＦＡＣＳ機器で平均蛍光値を読み取り、ｇｒａｐｈｐａｄ ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して結果を分析する。
実験段階：
ＣＬＤＮ１８．２を安定的に発現する細胞株ＣＨＯＳ－ＣＬＤＮ１８．２を採取し、１Ｅ５／ウェル細胞ＣＨＯＳ－ＣＬＤＮ１８．２をＵ字型９６ウェルプレートに播種し、氷ＰＢＳで１回洗浄し、１２００ｒｐｍで３分間遠心分離し、洗浄完了後、２００μＬ／ウェルに従って３％ＦＢＳ／ＰＢＳブロッキング溶液を加え、氷上で１時間インキュベートする。ブロッキング完了後、１２００ｒｐｍで３分間遠心分離した後、上清を振り捨て、様々な濃度のサンプルをインキュベートし、氷上で２時間インキュベートし、氷ＰＢＳで３回洗浄し、ＰＥ－抗ヒトＦＣ抗体を１：２００の希釈率、５０μｌ／ウェルでインキュベートし、充分に混合し、氷上で１時間置き、氷ＰＢＳで３回洗浄する。２００μｌ／ウェルのＰＢＳに細胞を再懸濁し、ＦＡＣＳ機器で平均蛍光値を読み取り、ｇｒａｐｈｐａｄ ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して結果を分析する。
【0100】
図５および図６に示されるように、結果は、ＣＬＤＮ１８．２／ＣＤ３二重特異性抗体ＱＰ３７４５３７４９３７４６、ＱＰ０９０８３７４９３７４６、ＱＰ０９０９３７４９３７４６およびＱＰ０９１０３７４９３７４６は、すべてＣＬＤＮ１８．２に結合することを示す。図５に示されるように、ＴＡＡ標的ＣＬＤＮ１８．２に対する本発明の図２の二重抗体ＱＰ３７４５３７４９３７４６、ＱＰ０９０８３７４９３７４６、ＱＰ０９０９３７４９３７４６およびＱＰ０９１０３７４９３７４６の結合親和性は、抗ＣＬＤＮ１８．２抗体ＩｇＧ形態ＱＰ１４６１１４６３の結合親和性と相当であり、設計の予想どおりに対照抗体ＡＭＧ９１０（１：１形態）ＱＰ３６９３よりも顕著に強力である。
【0101】
実施例５：二重特異性抗体とＣＤ３との結合活性のＦＡＣＳ検出
ヒトリンパ球性白血病細胞（Ｊｕｒｋａｔ細胞）は、天然ＣＤ３を発現し、ＦＡＣＳ検出によって抗ＣＤ３抗体およびその突然変異体のＪｕｒｋａｔ細胞への結合を検出する。１Ｅ５／ウェルＪｕｒｋａｔ細胞をＵ字型９６ウェルプレートに播種し、氷ＰＢＳで１回洗浄し、１２００ｒｐｍで３分間遠心分離し、洗浄完了後、２００μＬ／ウェルに従って３％ＦＢＳ／ＰＢＳブロッキング溶液を加え、氷上で１時間インキュベートする。ブロッキング完了後、１２００ｒｐｍで３分間遠心分離した後、上清を振り捨て、様々な濃度のサンプルをインキュベートし、氷上で２時間インキュベートし、氷ＰＢＳで３回洗浄し、ＰＥ－抗ヒトＦＣ抗体を１：２００の希釈率、５０μｌ／ウェルでインキュベートし、充分に混合し、氷上で１時間置き、氷ＰＢＳで３回洗浄する。２００μｌ／ウェルのＰＢＳに細胞を再懸濁し、ＦＡＣＳ機器で平均蛍光値を読み取り、ｇｒａｐｈｐａｄ ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して結果を分析する。
ヒトリンパ球性白血病細胞（Ｊｕｒｋａｔ細胞）は、天然ＣＤ３を発現し、ＦＡＣＳ検出によって抗ＣＤ３抗体およびその突然変異体のＪｕｒｋａｔ細胞への結合を検出する。１Ｅ５／ウェルＪｕｒｋａｔ細胞をＵ字型９６ウェルプレートに播種し、氷ＰＢＳで１回洗浄し、１２００ｒｐｍで３分間遠心分離し、洗浄完了後、２００μＬ／ウェルに従って３％ＦＢＳ／ＰＢＳブロッキング溶液を加え、氷上で１時間インキュベートする。ブロッキング完了後、１２００ｒｐｍで３分間遠心分離した後、上清を振り捨て、様々な濃度のサンプルをインキュベートし、氷上で２時間インキュベートし、氷ＰＢＳで３回洗浄し、ＰＥ－抗ヒトＦＣ抗体を１：２００の希釈率、５０μｌ／ウェルでインキュベートし、充分に混合し、氷上で１時間置き、氷ＰＢＳで３回洗浄する。２００μｌ／ウェルのＰＢＳに細胞を再懸濁し、ＦＡＣＳ機器で平均蛍光値を読み取り、ｇｒａｐｈｐａｄ ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して結果を分析する。
【0102】
図７および図８に示されるように、結果は、ＣＬＤＮ１８．２／ＣＤ３二重特異性抗体ＱＰ３７４５３７４９３７４６、ＱＰ０９０８３７４９３７４６、ＱＰ０９０９３７４９３７４６およびＱＰ０９１０３７４９３７４６は、すべてＣＤ３に結合することを示す。図７に示されるように、本発明の図２の二重抗体ＱＰ３７４５３７４９３７４６、ＱＰ０９０８３７４９３７４６、ＱＰ０９０９３７４９３７４６およびＱＰ０９１０３７４９３７４６は、結合ＣＤ３親和性によって二つのカテゴリーに分類され、ここで、ＱＰ３７４５３７４９３７４６、ＱＰ０９０８３７４９３７４６は、ＣＤ３に対する結合親和性が弱く、ＱＰ０９０９３７４９３７４６およびＱＰ０９１０３７４９３７４６は、親和性が強いが、これら二つの分子のＣＤ３に対する結合親和性は、すべて対照抗体ＡＭＧ９１０（１：１形態）ＱＰ３６９３よりも顕著に弱く、これは、ＣＤ３二重抗体の安全性を向上させるためにＣＤ３抗体親和性を低下させるという我々の予想と一致している。
【0103】
実施例６：ＣＬＤＮ１８．２／ＣＤ３二重特異性抗体によって媒介されたヒト胃がん細胞のＴ細胞殺傷
実験方法：選択された標的細胞は、ＣＬＤＮ１８．２を安定的に発現するヒト胃がん細胞株ＮＵＧＣ４－ＣＬＤＮ１８．２である。エフェクター細胞は、ヒトＰＢＭＣである。Ｅ：Ｔ比１０：１に従って、様々な濃度の抗体を加え、３７℃、５％ＣＯ２で４８時間培養し、ＣｙｔｏＴｏｘ ９６（登録商標）Ｎｏｎ－Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｇ１７８０－１０００ ａｓｓａｙｓ）を使用して、細胞培養上清中のＬＤＨを検出し、細胞毒性％を定量する。標的細胞の最大溶解率（１００％）は、１％であり、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００で標的細胞を処理して細胞を溶解し、すべてのＬＤＨを放出する。標的細胞自発、エフェクター細胞自発、標的細胞＋エフェクター細胞自発等の対照ウェルを設定する。式％細胞毒性（Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）＝［（実験（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ）－エフェクター自発（Ｅｆｆｅｃｔｏｒ Ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ）－標的自発（Ｔａｒｇｅｔ Ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ））／（標的の最大値（Ｔａｒｇｅｔ Ｍａｘｉｍｕｍ）－標的自発（Ｔａｒｇｅｔ Ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ））］×１００に従ってデータを分析する。
実験方法：選択された標的細胞は、ＣＬＤＮ１８．２を安定的に発現するヒト胃がん細胞株ＮＵＧＣ４－ＣＬＤＮ１８．２である。エフェクター細胞は、ヒトＰＢＭＣである。Ｅ：Ｔ比１０：１に従って、様々な濃度の抗体を加え、３７℃、５％ＣＯ２で４８時間培養し、ＣｙｔｏＴｏｘ ９６（登録商標）Ｎｏｎ－Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｇ１７８０－１０００ ａｓｓａｙｓ）を使用して、細胞培養上清中のＬＤＨを検出し、細胞毒性％を定量する。標的細胞の最大溶解率（１００％）は、１％であり、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００で標的細胞を処理して細胞を溶解し、すべてのＬＤＨを放出する。標的細胞自発、エフェクター細胞自発、標的細胞＋エフェクター細胞自発等の対照ウェルを設定する。式％細胞毒性（Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）＝［（実験（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ）－エフェクター自発（Ｅｆｆｅｃｔｏｒ Ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ）－標的自発（Ｔａｒｇｅｔ Ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ））／（標的の最大値（Ｔａｒｇｅｔ Ｍａｘｉｍｕｍ）－標的自発（Ｔａｒｇｅｔ Ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ））］×１００に従ってデータを分析する。
【0104】
図９および図１０に示されるように、結果は、ＱＰ３７４５３７４９３７４６、ＱＰ０９０８３７４９３７４６、ＱＰ０９０９３７４９３７４６およびＱＰ０９１０３７４９３７４６は、すべてＰＢＭＣを媒介してヒト胃がん細胞ＮＵＧＣ４－ＣＬＤＮ１８．２細胞を殺傷することができることを示す。図９に示されるように、本発明の図２の二重抗体ＱＰ３７４５３７４９３７４６、ＱＰ０９０８３７４９３７４６、ＱＰ０９０９３７４９３７４６およびＱＰ０９１０３７４９３７４６によって媒介されたヒト胃がん細胞ＮＵＧＣ４－ＣＬＤＮ１８．２細胞のＰＢＭＣ殺傷活性は、すべて対照分子ＱＰ３６９３（ＡＭＧ９１０）よりも強い。本発明で選択されたＣＤ３抗体のＣＤ３への結合親和性は、すべてＡＭＧ９１０分子のＣＤ３抗体（図７を参照する）の親和性よりも弱いが、標的細胞に対する殺傷能力には影響を及ぼさない。
【0105】
実施例７：ＣＬＤＮ１８．２／ＣＤ３二重特異性抗体によって媒介されたヒト肺がん細胞のＴ細胞殺傷
実験方法：選択された標的細胞は、ＣＬＤＮ１８．２を安定的に発現するヒト肺がん細胞株ＨＣＣ８２７－ＣＬＤＮ１８．２である。エフェクター細胞は、ヒトＰＢＭＣである。Ｅ：Ｔ比１０：１に従って、様々な濃度の抗体を加え、３７℃、５％ＣＯ２で４８時間培養し、ＣｙｔｏＴｏｘ ９６（登録商標）Ｎｏｎ－Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｇ１７８０－１０００ ａｓｓａｙｓ）を使用して、細胞培養上清中のＬＤＨを検出し、細胞毒性％を定量する。標的細胞の最大溶解率（１００％）は、１％であり、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００で標的細胞を処理して細胞を溶解し、すべてのＬＤＨを放出する。標的細胞自発、エフェクター細胞自発、標的細胞＋エフェクター細胞自発等の対照ウェルを設定する。式％細胞毒性（Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）＝［（実験（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ）－エフェクター自発（Ｅｆｆｅｃｔｏｒ Ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ）－標的自発（Ｔａｒｇｅｔ Ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ））／（標的の最大値（Ｔａｒｇｅｔ Ｍａｘｉｍｕｍ）－標的自発（Ｔａｒｇｅｔ Ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ））］×１００に従ってデータを分析する。
実験方法：選択された標的細胞は、ＣＬＤＮ１８．２を安定的に発現するヒト肺がん細胞株ＨＣＣ８２７－ＣＬＤＮ１８．２である。エフェクター細胞は、ヒトＰＢＭＣである。Ｅ：Ｔ比１０：１に従って、様々な濃度の抗体を加え、３７℃、５％ＣＯ２で４８時間培養し、ＣｙｔｏＴｏｘ ９６（登録商標）Ｎｏｎ－Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｇ１７８０－１０００ ａｓｓａｙｓ）を使用して、細胞培養上清中のＬＤＨを検出し、細胞毒性％を定量する。標的細胞の最大溶解率（１００％）は、１％であり、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００で標的細胞を処理して細胞を溶解し、すべてのＬＤＨを放出する。標的細胞自発、エフェクター細胞自発、標的細胞＋エフェクター細胞自発等の対照ウェルを設定する。式％細胞毒性（Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）＝［（実験（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ）－エフェクター自発（Ｅｆｆｅｃｔｏｒ Ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ）－標的自発（Ｔａｒｇｅｔ Ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ））／（標的の最大値（Ｔａｒｇｅｔ Ｍａｘｉｍｕｍ）－標的自発（Ｔａｒｇｅｔ Ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ））］×１００に従ってデータを分析する。
【0106】
図１１に示されるように、結果は、ＣＤ３二重抗体分子ＱＰ３７４５３７４９３７４６、ＱＰ０９０８３７４９３７４６、ＱＰ０９０９３７４９３７４６およびＱＰ０９１０３７４９３７４６は、ＰＢＭＣを介してヒト肺がん細胞ＨＣＣ８２７－ＣＬＤＮ１８．２細胞を殺傷させることができることを示す。本発明の図２の二重抗体ＱＰ３７４５３７４９３７４６、ＱＰ０９０８３７４９３７４６、ＱＰ０９０９３７４９３７４６およびＱＰ０９１０３７４９３７４６によって媒介されたヒト肺がん細胞ＨＣＣ８２７－ＣＬＤＮ１８．２細胞のＰＢＭＣ殺傷活性は、すべて対照分子ＱＰ３６９３（ＡＭＧ９１０）よりも強い。ＨＣＣ８２７－ＣＬＤＮ１８．２細胞ではＮＵＧＣ４－ＣＬＤＮ１８．２の結果を再現する（図９を参照する）。
【0107】
実施例８：ＣＤ３ヒト化マウスモデルの動物薬効
腫瘍成長に対する抗ＣＬＤＮ１８．２／ＣＤ３二重抗体分子の効果をＣＤ３ヒト化マウス（ＣＤ３ＥＤＧ ＨｕＧＥＭＭ）モデルで評価する。指数増殖期の結腸直腸がん細胞ＭＣ３８－ｈＣＬＤＮ１８．２細胞を収集し、播種に適した濃度になるまでＰＢＳに再懸濁する。各実験マウスの右背中に５×１０６のＭＣ３８－ｈＣＬＤＮ１８．２細胞を皮下接種し、腫瘍の成長状況を定期的に観察し、腫瘍が平均体積約１００ｍｍ３まで成長すると、腫瘍の大きさおよびマウス体重に基づいて、ランダムにグループ分けて投与する。投与方案は、次のとおりである。
腫瘍成長に対する抗ＣＬＤＮ１８．２／ＣＤ３二重抗体分子の効果をＣＤ３ヒト化マウス（ＣＤ３ＥＤＧ ＨｕＧＥＭＭ）モデルで評価する。指数増殖期の結腸直腸がん細胞ＭＣ３８－ｈＣＬＤＮ１８．２細胞を収集し、播種に適した濃度になるまでＰＢＳに再懸濁する。各実験マウスの右背中に５×１０６のＭＣ３８－ｈＣＬＤＮ１８．２細胞を皮下接種し、腫瘍の成長状況を定期的に観察し、腫瘍が平均体積約１００ｍｍ３まで成長すると、腫瘍の大きさおよびマウス体重に基づいて、ランダムにグループ分けて投与する。投与方案は、次のとおりである。
【0108】
【表15】
【0109】
上記の表に示される方案に従って、６回投与し、週２回腫瘍を測定し、腫瘍阻害率は、表７に示され、腫瘍阻害曲線は、図１２に示され、結果によると、投与後２１日目に、０．６ｍｐｋの低用量群におけるＱＰ３７４５３７４９３７４６の腫瘍阻害率（ＴＧＩ）は、８９．２９％に達し、０．７ｍｐｋ群（０．７ｍｐｋのＡＭＧ９１０群のモル濃度は、１．２ｍｐｋのＱＰ３７４５３７４９３７４６に相当する）における対照抗体ＡＭＧ９１０の腫瘍阻害率（ＴＧＩ＝８６．５％）よりも優れるか、または同等であり、即ち、ＱＰ３７４５３７４９３７４６は、半分の用量で対照抗体ＡＭＧ９１０と同じ腫瘍阻害効果を達成することができることを示す。図１３は、投与後の各群のマウスの体重変化であり、結果によると、投与群のマウスの体重は、基本的に変化がなく、成長が良好であり、薬物の安全性が良好であることを確認できることを示す。
【0110】
【表16】
【0111】
実施例９：ヒト化ＮＯＧマウスモデルの動物薬効
実験目的：ＰＢＭＣヒト化ＮＯＧマウスＸ－ＣＬＤＮ１８．２／ＭＩＡ ＰａＣａ－２皮下移植腫瘍モデルにおける被験物のインビボ薬効を評価する。細胞培養：Ｘ－ＣＬＤＮ１８．２／ＭＩＡ ＰａＣａ－２細胞をインビトロで培養し、培養条件は、１０％ウシ胎児血清を加えた培地、３７℃、５％ＣＯ２である。週に２回一般の継代を実行する。細胞が指数増値期に維持する場合、細胞生存率が９５％を超える場合、細胞を收取し、生存細胞パーセンテージをカウントし、接種する。動物：ＮＯＧマウス、メス、６～８週齢、体重１８～２０Ｇ。実験に合計３６匹（２４ｐｌｕｓ５０％）が必要である。動物は、資格を有するサプライヤーから提供される。腫瘍接種： ５＊１０６個のＸ－ＣＬＤＮ１８．２／ＭＩＡ ＰａＣａ－２および２＊１０６個のＰＢＭＣ細胞を混合して各マウスの右首および背中に接種する。接種と同時に実験動物には耳標を付け、後続の実験の唯一の確認マークとなる。腫瘍が成長するのを待ち、腫瘍平均体積が約６０～１００ｍｍ３に達する時点でランダムにグループ分けて投与する。実験のグループ分けおよび投与方案は、表８を参照する。
実験目的：ＰＢＭＣヒト化ＮＯＧマウスＸ－ＣＬＤＮ１８．２／ＭＩＡ ＰａＣａ－２皮下移植腫瘍モデルにおける被験物のインビボ薬効を評価する。細胞培養：Ｘ－ＣＬＤＮ１８．２／ＭＩＡ ＰａＣａ－２細胞をインビトロで培養し、培養条件は、１０％ウシ胎児血清を加えた培地、３７℃、５％ＣＯ２である。週に２回一般の継代を実行する。細胞が指数増値期に維持する場合、細胞生存率が９５％を超える場合、細胞を收取し、生存細胞パーセンテージをカウントし、接種する。動物：ＮＯＧマウス、メス、６～８週齢、体重１８～２０Ｇ。実験に合計３６匹（２４ｐｌｕｓ５０％）が必要である。動物は、資格を有するサプライヤーから提供される。腫瘍接種： ５＊１０６個のＸ－ＣＬＤＮ１８．２／ＭＩＡ ＰａＣａ－２および２＊１０６個のＰＢＭＣ細胞を混合して各マウスの右首および背中に接種する。接種と同時に実験動物には耳標を付け、後続の実験の唯一の確認マークとなる。腫瘍が成長するのを待ち、腫瘍平均体積が約６０～１００ｍｍ３に達する時点でランダムにグループ分けて投与する。実験のグループ分けおよび投与方案は、表８を参照する。
【0112】
【表17】
【0113】
上記の表に示される方案に従って、５回投与投与し、週２回腫瘍を測定し、腫瘍阻害率は、表９を参照し、腫瘍阻害曲線は、図１４を参照し、投与後１５日目の結果によると、低用量群４ｍｐｋにおけるＱＰ３７４５３７４９３７４６の腫瘍阻害率（ＴＧＩ）は、９２．３％に達し、高用量群８ｍｐｋにおけるＱＰ３７４５３７４９３７４６の腫瘍阻害率（ＴＧＩ）は、９９．８％に達し、いずれも５ｍｐｋ群（ＡＭＧ９１０ ５ｍｐｋ群のモル濃度は、ＱＰ３７４５３７４９３７４６高用量群８ｍｐｋに相当する）における対照抗体ＡＭＧ９１０の腫瘍阻害率（ＴＧＩ＝６９．３％）よりも有意に良好であることを示す。図１５は、投与後の各群のマウスの体重変化を示し、結果は、投与群のマウスの体重がほぼ変化せず、成長が良好で、良好な薬物の安全性を証明することを示す。
【0114】
【表18】
【0115】
二：抗ＴＡＡ（腫瘍関連抗原）、抗ＣＤ３抗体、およびサイトカインＩＬ１５／ＩＬ１５Ｒａ含有多機能融合タンパク質形態の設計
ＣＤ３二重抗体は、血液腫瘍において大きな可能性を示しているが、ＣＤ３二重抗体は、固形腫瘍の治療において依然としていくつかの課題に直面する。ＣＤ３二重抗体療法は、固形腫瘍組織におけるＴ細胞浸潤および免疫阻害に関連し、浸潤Ｔ細胞が少ない場合、ＣＤ３二重抗体治療に対する耐性が生じやすくなる。ＩＬ１５は、Ｔ細胞およびＮＫ細胞を活性化し、これらの細胞の増殖および生存を媒介する可溶性サイトカインである。本発明は、そのサイトカインＩＬ１５成分がＴ細胞を含む免疫細胞の増殖を刺激し、腫瘍の免疫微小環境を変化せることができることを期待する、ＴＡＡ／ＣＤ３／ＩＬ１５多機能融合タンパク質を設計する。
ＣＤ３二重抗体は、血液腫瘍において大きな可能性を示しているが、ＣＤ３二重抗体は、固形腫瘍の治療において依然としていくつかの課題に直面する。ＣＤ３二重抗体療法は、固形腫瘍組織におけるＴ細胞浸潤および免疫阻害に関連し、浸潤Ｔ細胞が少ない場合、ＣＤ３二重抗体治療に対する耐性が生じやすくなる。ＩＬ１５は、Ｔ細胞およびＮＫ細胞を活性化し、これらの細胞の増殖および生存を媒介する可溶性サイトカインである。本発明は、そのサイトカインＩＬ１５成分がＴ細胞を含む免疫細胞の増殖を刺激し、腫瘍の免疫微小環境を変化せることができることを期待する、ＴＡＡ／ＣＤ３／ＩＬ１５多機能融合タンパク質を設計する。
【0116】
実施例１０：抗ＴＡＡ（腫瘍関連抗原）、抗ＣＤ３、およびＩＬ１５／ＩＬ１５Ｒａ含有多機能融合タンパク質形態の設計
本発明は、様々な抗ＴＡＡ（腫瘍関連抗原）、抗ＣＤ３、およびＩＬ１５／ＩＬ１５Ｒａ含有多機能融合タンパク質を提供する。
本発明は、様々な抗ＴＡＡ（腫瘍関連抗原）、抗ＣＤ３、およびＩＬ１５／ＩＬ１５Ｒａ含有多機能融合タンパク質を提供する。
【0117】
１．第１の種類の多機能融合タンパク質は、図１６～図１９を参照することができ、融合タンパク質分子は、第１の単量体（図の左側部分）および第２の単量体（図の右側部分）を含む。第１の単量体は、Ｆｄ断片（ＶＨおよびＣＨ１を含む）を有する鎖１、ならびに軽鎖断片（ＶＬおよびＣＬを含む）、サイトカイン機能領域（ＩＬ１５およびＩＬ１５Ｒａを含む）、第１のＦｃ鎖を有する鎖２等の二つの鎖を含む。第２の単量体は、Ｆｄ断片（ＶＨおよびＣＨ１を含む）を有する鎖１、ならびに軽鎖断片（ＶＬおよびＣＬを含む）、抗ＣＤ３抗体断片（図におけるＣＤ３抗体、これは、ｓｃＦｖ形態である）、および第２のＦｃ鎖を有する鎖２等の二つの鎖を含む。第１の単量体または第２の単量体において、軽鎖断片およびＦｄ断片は、それぞれ対になって抗ＴＡＡのＦａｂドメインを形成する（図における抗－ＴＡＡ抗体の機能を実現するために）。サイトカイン機能領域のＮ末端は、第１の単量体の軽鎖断片に融合され、Ｃ末端は、第１のＦｃ鎖に融合され、抗ＣＤ３抗体断片のＮ末端は、第２の単量体の軽鎖断片に融合され、Ｃ末端は、第２のＦｃ鎖と融合する。第１のＦｃ鎖および第２のＦｃ鎖は、重合してＦｃドメインを形成する。
【0118】
図１６～図１９において、ｓｃＦｖ形態の抗ＣＤ３抗体断片は、重鎖可変領域（ＶＨ）、軽鎖可変領域（ＶＬ）、ならびに重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを連結する連結断片を含むことができる。ペプチド鎖のＮ末端からＣ末端にかけて、抗ＣＤ３抗体断片のアミノ酸の融合順序は、「ＶＨ（ＣＤ３）～ＶＬ（ＣＤ３）」、または「ＶＬ（ＣＤ３）～ＶＨ（ＣＤ３）」であり得、「～」は、連結断片を表わす。サイトカイン機能領域のアミノ酸断片の融合順序は、「ＩＬ－１５～ＩＬ－１５Ｒａ」、または「ＩＬ－１５Ｒａ～ＩＬ－１５」であり得る。
【0119】
【化7】
【0120】
【化8】
【0121】
【化9】
【0122】
【化10】
【0123】
２．第２の種類の多機能融合タンパク質は、図２０～図２７を参照することができ、タンパク質分子は、第１の単量体（図の左側部分）および第２の単量体（図の右側部分）を含む。第１の単量体は、抗ＴＡＡ抗体断片（ＶＨおよびＶＬドメインを含むｓｃＦｖ形態である）、サイトカイン機能領域（ＩＬ１５およびＩＬ１５Ｒａを含む）、第１のＦｃ鎖を含み、第２の単量体は、抗ＴＡＡ抗体断片（ＶＨおよびＶＬドメインを含むｓｃＦｖ形態である）、抗ＣＤ３抗体断片（図におけるＣＤ３抗体は、ｓｃＦｖ形態である）、ならびに第２のＦｃ鎖を含む。サイトカイン機能領域のＮ末端は、第１の単量体の抗ＴＡＡ抗体断片に融合され、Ｃ末端は、第１のＦｃ鎖に融合され、抗ＣＤ３抗体断片のＮ末端は、第２の単量体の抗ＴＡＡ抗体断片に融合され、Ｃ末端は、第２のＦｃ鎖と融合する。第１のＦｃ鎖および第２のＦｃ鎖は、重合してＦｃドメインを形成する。
【0124】
第１の種類の多機能融合タンパク質と同様に、ｓｃＦｖ形態の抗ＣＤ３抗体断片は、重鎖可変領域（ＶＨ）、軽鎖可変領域（ＶＬ）、ならびに重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを連結する連結断片を含むことができる。ペプチド鎖のＮ末端からＣ末端にかけて、抗ＣＤ３抗体断片のアミノ酸の融合順序は、「ＶＨ（ＣＤ３）～ＶＬ（ＣＤ３）」、または「ＶＬ（ＣＤ３）～ＶＨ（ＣＤ３）」であり得、「～」は、連結断片を表わす。サイトカイン機能領域のアミノ酸断片の融合順序は、「ＩＬ－１５～ＩＬ－１５Ｒａ」、または「ＩＬ－１５Ｒａ～ＩＬ－１５」であり得る。さらに、ｓｃＦｖ形態の抗ＴＡＡ抗体断片は、重鎖可変領域（ＶＨ）、軽鎖可変領域（ＶＬ）、ならびに前記重鎖可変領域と前記軽鎖可変領域とを連結する連結断片を含み、ペプチド鎖のＮ末端からＣ末端にかけて、抗ＴＡＡ抗体断片のアミノ酸の融合順序は、「ＶＨ（ＴＡＡ）～ＶＬ（ＴＡＡ）」、または「ＶＬ（ＴＡＡ）～ＶＨ（ＴＡＡ）」であり得、「～」は、連結断片を表わす。
【0125】
図２０～図２７に示される抗体分子の各ドメインは、同じアミノ酸配列を使用し、違いは、融合順序または構成にある。図２０を例として挙げると、融合タンパク質に対する二つのポリペプチド鎖は、（１）第１のポリペプチド鎖：ＶＬ（ＴＡＡ）－ＶＨ（ＴＡＡ）－ＩＬ１５－ＩＬ１５Ｒａ－第１のＦｃ鎖、（２）第２のポリペプチド鎖：ＶＬ（ＴＡＡ）－ＶＨ（ＴＡＡ）－ ＶＨ（ＣＤ３）－ＶＬ（ＣＤ３）－第２のＦｃ鎖のように説明される。
【0126】
３．本発明は、腫瘍標的Ｔ細胞／ＮＫ細胞活性化のためのＴＡＡ／ＩＬ１５二機能性融合タンパク質を提供し、その構造形態は、図２８を参照することができ、第２の種類の多機能融合タンパク質と比較して、違いは、抗ＣＤ３抗体断片をサイトカイン機能領域（ＩＬ１５およびＩＬ１５Ｒａを含む）に置き換えることである。図２８において、タンパク質分子は、対称的な構造形態を有する。
【0127】
実施例１１：ＣＬＤＮ１８．２／ＣＤ３／ＩＬ１５多機能融合タンパク質の分子クローニング、一過性発現、およびタンパク質精製
１．分子クローニング：
実施例１０に従って、ＣＬＤＮ１８．２／ＣＤ３／ＩＬ１５またはＣＬＤＮ１８．２／ＩＬ１５多機能融合タンパク質を設計し、ここで、ＣＬＤＮ１８．２抗体は、特許文献ＣＮ２０２０１０３４４６７６．８の抗体ＱＰ１４６１１４６３配列を参照することができ、抗ＣＤ３抗体は、ＳＰ３４軽鎖、重鎖配列を使用し、タンパク質の発現および配列番号は、次の表に示されたとおりである。
１．分子クローニング：
実施例１０に従って、ＣＬＤＮ１８．２／ＣＤ３／ＩＬ１５またはＣＬＤＮ１８．２／ＩＬ１５多機能融合タンパク質を設計し、ここで、ＣＬＤＮ１８．２抗体は、特許文献ＣＮ２０２０１０３４４６７６．８の抗体ＱＰ１４６１１４６３配列を参照することができ、抗ＣＤ３抗体は、ＳＰ３４軽鎖、重鎖配列を使用し、タンパク質の発現および配列番号は、次の表に示されたとおりである。
【0128】
【表19】
【0129】
同時に、Ｈｅｎｇｒｕｉ会社のＩＬ１５／ＩＬ１５Ｒａ－ＦＣを対照として構築し、ＩＬ１５／ＩＬ１５Ｒａ－ＦＣタンパク質をＱＰ３３１２３３１３と番号付ける。
【0130】
表１０に示されるようにクローンを設計し、全長発現ベクターを構築する。クローン構築、タンパク質発現およびタンパク質精製方法ついては、実施例３を参照することができる。
【0131】
実施例１２：ＣＬＤＮ１８．２／ＣＤ３／ＩＬ１５多機能融合タンパク質とＣＬＤＮ１８．２との結合活性のＦＡＣＳ検出
実験段階：ＣＬＤＮ１８．２を安定的に発現する細胞株ＣＨＯＳ－ＣＬＤＮ１８．２を採取し、１Ｅ５／ウェル細胞ＣＨＯＳ－ＣＬＤＮ１８．２をＵ字型９６ウェルプレートに播種し、氷ＰＢＳで１回洗浄し、１２００ｒｐｍで３分間遠心分離し、洗浄完了後、２００μＬ／ウェルに従って３％ＦＢＳ／ＰＢＳブロッキング溶液を加え、氷上で１時間インキュベートする。ブロッキング完了後、１２００ｒｐｍで３分間遠心分離した後、上清を振り捨て、様々な濃度のサンプルをインキュベートし、氷上で２時間インキュベートし、氷ＰＢＳで３回洗浄し、ＰＥ－抗ヒトＦＣ抗体を１：２００希釈率、５０μｌ／ウェルでインキュベートし、充分に混合し、氷上で１時間置き、氷ＰＢＳで３回洗浄する。２００μｌ／ウェルのＰＢＳに細胞を再懸濁し、ＦＡＣＳ機器で平均蛍光値を読み取り、ｇｒａｐｈｐａｄ ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して結果を分析する。図２９および図３０に示されるように、結果は、ＣＬＤＮ１８．２／ＣＤ３／ＩＬ１５およびＣＬＤＮ１８．２／ＩＬ１５多機能融合タンパク質が、すべてＴＡＡ標的ＣＬＤＮ１８．２に結合し、親和性が、ＡＭＧ９１０類似体（１：１形態）ＱＰ３６９３よりも強いことを示し、これは、予想と一致している。
実験段階：ＣＬＤＮ１８．２を安定的に発現する細胞株ＣＨＯＳ－ＣＬＤＮ１８．２を採取し、１Ｅ５／ウェル細胞ＣＨＯＳ－ＣＬＤＮ１８．２をＵ字型９６ウェルプレートに播種し、氷ＰＢＳで１回洗浄し、１２００ｒｐｍで３分間遠心分離し、洗浄完了後、２００μＬ／ウェルに従って３％ＦＢＳ／ＰＢＳブロッキング溶液を加え、氷上で１時間インキュベートする。ブロッキング完了後、１２００ｒｐｍで３分間遠心分離した後、上清を振り捨て、様々な濃度のサンプルをインキュベートし、氷上で２時間インキュベートし、氷ＰＢＳで３回洗浄し、ＰＥ－抗ヒトＦＣ抗体を１：２００希釈率、５０μｌ／ウェルでインキュベートし、充分に混合し、氷上で１時間置き、氷ＰＢＳで３回洗浄する。２００μｌ／ウェルのＰＢＳに細胞を再懸濁し、ＦＡＣＳ機器で平均蛍光値を読み取り、ｇｒａｐｈｐａｄ ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して結果を分析する。図２９および図３０に示されるように、結果は、ＣＬＤＮ１８．２／ＣＤ３／ＩＬ１５およびＣＬＤＮ１８．２／ＩＬ１５多機能融合タンパク質が、すべてＴＡＡ標的ＣＬＤＮ１８．２に結合し、親和性が、ＡＭＧ９１０類似体（１：１形態）ＱＰ３６９３よりも強いことを示し、これは、予想と一致している。
【0132】
実施例１３：ＣＬＤＮ１８．２／ＣＤ３／ＩＬ１５多機能融合タンパク質とＣＤ３との結合活性のＦＡＣＳ検出
リンパ球性白血病細胞（Ｊｕｒｋａｔ細胞）は、天然ＣＤ３を発現し、ＦＡＣＳ検出によって抗ＣＤ３抗体およびその突然変異体のＪｕｒｋａｔ細胞への結合を検出する。１Ｅ５／ウェルＪｕｒｋａｔ細胞をＵ字型９６ウェルプレートに播種し、氷ＰＢＳで１回洗浄し、１２００ｒｐｍで３分間遠心分離し、洗浄完了後、２００μＬ／ウェルに従って３％ＦＢＳ／ＰＢＳブロッキング溶液を加え、氷上で１時間インキュベートする。ブロッキング完了後、１２００ｒｐｍで３分間遠心分離した後、上清を振り捨て、様々な濃度のサンプルをインキュベートし、氷上で２時間インキュベートし、氷ＰＢＳで３回洗浄し、ＰＥ－抗ヒトＦＣ抗体を１：２００の希釈率、５０μｌ／ウェルでインキュベートし、充分に混合し、氷上で１時間置き、氷ＰＢＳで３回洗浄する。２００μｌ／ウェルのＰＢＳに細胞を再懸濁し、ＦＡＣＳ機器で平均蛍光値を読み取り、ｇｒａｐｈｐａｄ ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して結果を分析する。図３１および図３２に示されるように、結果は、ＣＬＤＮ１８．２／ＣＤ３／ＩＬ１５多機能融合タンパク質が、すべてＣＤ３に結合し、親和性は、対照分子ＡＭＧ９１０（ＱＰ３６９３）よりも弱いことを示し、これは、ＣＤ３抗体親和性の低下によりＣＤ３二重抗体の安全性を向上させるという本発明者らの予想と一致している。
リンパ球性白血病細胞（Ｊｕｒｋａｔ細胞）は、天然ＣＤ３を発現し、ＦＡＣＳ検出によって抗ＣＤ３抗体およびその突然変異体のＪｕｒｋａｔ細胞への結合を検出する。１Ｅ５／ウェルＪｕｒｋａｔ細胞をＵ字型９６ウェルプレートに播種し、氷ＰＢＳで１回洗浄し、１２００ｒｐｍで３分間遠心分離し、洗浄完了後、２００μＬ／ウェルに従って３％ＦＢＳ／ＰＢＳブロッキング溶液を加え、氷上で１時間インキュベートする。ブロッキング完了後、１２００ｒｐｍで３分間遠心分離した後、上清を振り捨て、様々な濃度のサンプルをインキュベートし、氷上で２時間インキュベートし、氷ＰＢＳで３回洗浄し、ＰＥ－抗ヒトＦＣ抗体を１：２００の希釈率、５０μｌ／ウェルでインキュベートし、充分に混合し、氷上で１時間置き、氷ＰＢＳで３回洗浄する。２００μｌ／ウェルのＰＢＳに細胞を再懸濁し、ＦＡＣＳ機器で平均蛍光値を読み取り、ｇｒａｐｈｐａｄ ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して結果を分析する。図３１および図３２に示されるように、結果は、ＣＬＤＮ１８．２／ＣＤ３／ＩＬ１５多機能融合タンパク質が、すべてＣＤ３に結合し、親和性は、対照分子ＡＭＧ９１０（ＱＰ３６９３）よりも弱いことを示し、これは、ＣＤ３抗体親和性の低下によりＣＤ３二重抗体の安全性を向上させるという本発明者らの予想と一致している。
【0133】
実施例１４：多機能融合タンパク質ＩＬ１５の活性を評価するためのＭｏ７ｅ細胞増殖実験
Ｍｏ７ｅ（ヒト巨細胞性白血病細胞株）細胞は、ＩＬ－１５Ｒβγを発現し、サイトカイン増殖依存性細胞である。研究によると、休止期ＮＫ細胞およびナイーブＴ細胞は、中程度の親和性ＩＬ－１５Ｒβγ表現型を発現し、サイトカインＩＬ１５／ＩＬ１５Ｒａを用いたＭｏ７ｅ（ＩＬ－１５Ｒβγ）細胞増殖実験の結果は、刺激されていないＰＢＭＣの増殖実験の結果と一致する（Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ、１１（６） Ｊｕｎｅ ２０１２）。本発明は、Ｍｏ７ｅ細胞増殖実験を使用して、多機能融合タンパク質ＩＬ１５の活性を評価し、方法および結果は、次のとおりである。
Ｍｏ７ｅ（ヒト巨細胞性白血病細胞株）細胞は、ＩＬ－１５Ｒβγを発現し、サイトカイン増殖依存性細胞である。研究によると、休止期ＮＫ細胞およびナイーブＴ細胞は、中程度の親和性ＩＬ－１５Ｒβγ表現型を発現し、サイトカインＩＬ１５／ＩＬ１５Ｒａを用いたＭｏ７ｅ（ＩＬ－１５Ｒβγ）細胞増殖実験の結果は、刺激されていないＰＢＭＣの増殖実験の結果と一致する（Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ、１１（６） Ｊｕｎｅ ２０１２）。本発明は、Ｍｏ７ｅ細胞増殖実験を使用して、多機能融合タンパク質ＩＬ１５の活性を評価し、方法および結果は、次のとおりである。
【0134】
実験試薬：Ｍｏ７ｅ細胞（ヒト巨細胞性白血病細胞株）は、中国医学アカデミー基礎医学研究所の再オブリソースセンターから購入され、細胞増殖および毒性検出キット（ＣＣＫ－８）は、ＭｅｉｌｕｎＢｉｏから購入され、製品番号は、ＭＡ０２１８であり、組換えヒトＧＭ－ＣＳＦは、ｐｅｒｐｒｏｔｅｃｈから購入され、製品番号は、３００－０３であり、ヒトＩｇＧは、Ｓｉｇｍａから購入され、製品番号は、Ｉ４５０６であり、他の抗体は、内部で調製される。
【0135】
実験方法：Ｍｏ７ｅ細胞は、１０％ＦＢＳ、２ｍＭのＬ－グルタミンおよび８ｎｇ／ｍｌのＧＭ－ＣＳＦを含むＲＰＭＩ１６４０培地を使用して、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで培養され、Ｍｏ７ｅ細胞を収集し、８００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を捨て、ＧＭ－ＣＳＦを含まないＲＰＭＩ１６４０培地で細胞を２回洗浄し、ＧＭ－ＣＳＦを含まないＲＰＭＩ１６４０培地で細胞を再懸濁し、且つカウントし、８０μｌ／ウェルで２×１０４個の細胞を９６ウェルプレートに接種し、３７℃、５％ ＣＯ２インキュベーターで１時間培養し、試験される各薬用培地を４倍勾配で希釈した後、２０μｌ／ウェルを細胞懸濁液と均一に混合し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで３日間培養し、１０μｌ／ウェルのＣＣＫ－８試薬を試験される９６ウェルプレートに加え、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで４時間インキュベートし、９６ウェルプレートを取り出し、マイクロプレートリーダーで波長４５０ｎｍの吸光度を検出する。
【0136】
図３３、図３４および図３５に示されるように、実験結果は、異なる設計形態のＣＬＤＮ１８．２／ＣＤ３／ＩＬ１５およびＣＬＤＮ１８．２／ＩＬ１５多機能融合タンパク質が、すべてＩＬ１５活性を有し、分子設計に応じて活性が強いか弱いかが異なることを示す。異なる構築形態は、ＩＬ１５活性が異なる分子を産生指し、これは、最適な治療ウィンドウを選択する機会を提供する。
【0137】
実施例１５：ＣＬＤＮ１８．２／ＣＤ３／ＩＬ１５多機能融合タンパク質によって媒介されたヒト胃がん細胞のＴ細胞殺傷
実験方法：選択された標的細胞は、ＣＬＤＮ１８．２を安定的に発現するヒト胃がん細胞株ＮＵＧＣ４－ＣＬＤＮ１８．２である。エフェクター細胞は、ヒトＰＢＭＣである。Ｅ：Ｔ比１０：１に従って、様々な濃度の抗体を加え、３７℃、５％ＣＯ２で４８時間培養し、ＣｙｔｏＴｏｘ ９６（登録商標）Ｎｏｎ－Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｇ１７８０－１０００ ａｓｓａｙｓ）を使用して、細胞培養上清中のＬＤＨを検出し、細胞毒性％を定量する。標的細胞の最大溶解率（１００％）は、１％であり、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００で標的細胞を処理して細胞を溶解し、すべてのＬＤＨを放出する。標的細胞自発、エフェクター細胞自発、標的細胞＋エフェクター細胞自発等の対照ウェルを設定する。式％細胞毒性（Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）＝［（実験（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ）－エフェクター自発（Ｅｆｆｅｃｔｏｒ Ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ）－標的自発（Ｔａｒｇｅｔ Ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ））／（標的の最大値（Ｔａｒｇｅｔ Ｍａｘｉｍｕｍ）－標的自発（Ｔａｒｇｅｔ Ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ））］×１００に従ってデータを分析する。図３６および図３７に示されるように、結果は、ＱＰ３７４５０８９９３７４６、ＱＰ０９０１０９００３７４６、ＱＰ０９０２３６８８、ＱＰ３６６７０９０３、ＱＰ０９０４０９０５、ＱＰ０９０６０９０５、ＱＰ０９０４０９０７およびＱＰ０９０６０９０７が、すべてＰＢＭＣを媒介してヒト胃がん細胞ＮＵＧＣ４－ＣＬＤＮ１８．２細胞を殺傷することができることを示す。ここで、ＱＰ３７４５０８９９３７４６、ＱＰ０９０１０９００３７４６がＰＢＭＣを媒介してヒト肺がん細胞ＮＵＧＣ４－ＣＬＤＮ１８．２細胞を殺傷する活性は、対照分子ＡＭＧ９１０の活性よりも有意に優れる。他の分子によって媒介されるヒト肺がん細胞ＮＵＧＣ４－ＣＬＤＮ１８．２細胞のＰＢＭＣ殺傷活性は、対照分子ＡＭＧ９１０に相当する。
実験方法：選択された標的細胞は、ＣＬＤＮ１８．２を安定的に発現するヒト胃がん細胞株ＮＵＧＣ４－ＣＬＤＮ１８．２である。エフェクター細胞は、ヒトＰＢＭＣである。Ｅ：Ｔ比１０：１に従って、様々な濃度の抗体を加え、３７℃、５％ＣＯ２で４８時間培養し、ＣｙｔｏＴｏｘ ９６（登録商標）Ｎｏｎ－Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｇ１７８０－１０００ ａｓｓａｙｓ）を使用して、細胞培養上清中のＬＤＨを検出し、細胞毒性％を定量する。標的細胞の最大溶解率（１００％）は、１％であり、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００で標的細胞を処理して細胞を溶解し、すべてのＬＤＨを放出する。標的細胞自発、エフェクター細胞自発、標的細胞＋エフェクター細胞自発等の対照ウェルを設定する。式％細胞毒性（Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）＝［（実験（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ）－エフェクター自発（Ｅｆｆｅｃｔｏｒ Ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ）－標的自発（Ｔａｒｇｅｔ Ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ））／（標的の最大値（Ｔａｒｇｅｔ Ｍａｘｉｍｕｍ）－標的自発（Ｔａｒｇｅｔ Ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ））］×１００に従ってデータを分析する。図３６および図３７に示されるように、結果は、ＱＰ３７４５０８９９３７４６、ＱＰ０９０１０９００３７４６、ＱＰ０９０２３６８８、ＱＰ３６６７０９０３、ＱＰ０９０４０９０５、ＱＰ０９０６０９０５、ＱＰ０９０４０９０７およびＱＰ０９０６０９０７が、すべてＰＢＭＣを媒介してヒト胃がん細胞ＮＵＧＣ４－ＣＬＤＮ１８．２細胞を殺傷することができることを示す。ここで、ＱＰ３７４５０８９９３７４６、ＱＰ０９０１０９００３７４６がＰＢＭＣを媒介してヒト肺がん細胞ＮＵＧＣ４－ＣＬＤＮ１８．２細胞を殺傷する活性は、対照分子ＡＭＧ９１０の活性よりも有意に優れる。他の分子によって媒介されるヒト肺がん細胞ＮＵＧＣ４－ＣＬＤＮ１８．２細胞のＰＢＭＣ殺傷活性は、対照分子ＡＭＧ９１０に相当する。
【0138】
実施例１６：ＣＬＤＮ１８．２／ＣＤ３／ＩＬ１５多機能融合タンパク質によって媒介されたヒト肺がん細胞のＴ細胞殺傷
実験方法：選択された標的細胞は、ＣＬＤＮ１８．２を安定的に発現するヒト肺がん細胞株ＨＣＣ８２７－ＣＬＤＮ１８．２である。エフェクター細胞は、ヒトＰＢＭＣである。Ｅ：Ｔ比１０：１に従って、様々な濃度の抗体を加え、３７℃、５％ＣＯ２で４８時間培養し、ＣｙｔｏＴｏｘ ９６（登録商標）Ｎｏｎ－Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｇ１７８０－１０００ ａｓｓａｙｓ）を使用して、細胞培養上清中のＬＤＨを検出し、細胞毒性％を定量する。標的細胞の最大溶解率（１００％）は、１％であり、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００で標的細胞を処理して細胞を溶解し、すべてのＬＤＨを放出する。標的細胞自発、エフェクター細胞自発、標的細胞＋エフェクター細胞自発等の対照ウェルを設定する。式％細胞毒性（Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）＝［（実験（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ）－エフェクター自発（Ｅｆｆｅｃｔｏｒ Ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ）－標的自発（Ｔａｒｇｅｔ Ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ））／（標的の最大値（Ｔａｒｇｅｔ Ｍａｘｉｍｕｍ）－標的自発（Ｔａｒｇｅｔ Ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ））］×１００に従ってデータを分析する。図３８に示されるように、結果は、ＱＰ０９０１０９００３７４６、ＱＰ３６６７０９０３、ＱＰ０９０４０９０５、ＱＰ０９０６０９０５およびＱＰ０９０４０９０７が、すべてＰＢＭＣを媒介してヒト肺がん細胞ＨＣＣ８２７－ＣＬＤＮ１８．２細胞活性を殺傷することができることを示す。ここで、ＱＰ０９０１０９００３７４６によって媒介されたヒト肺がん細胞ＨＣＣ８２７－ＣＬＤＮ１８．２細胞のＰＢＭＣ殺傷活性は、対照分子ＡＭＧ９１０よりも有意に優れる。他の分子によって媒介されたヒト肺がん細胞ＨＣＣ８２７－ＣＬＤＮ１８．２細胞のＰＢＭＣ殺傷活性は、対照分子ＡＭＧ９１０に相当する。
実験方法：選択された標的細胞は、ＣＬＤＮ１８．２を安定的に発現するヒト肺がん細胞株ＨＣＣ８２７－ＣＬＤＮ１８．２である。エフェクター細胞は、ヒトＰＢＭＣである。Ｅ：Ｔ比１０：１に従って、様々な濃度の抗体を加え、３７℃、５％ＣＯ２で４８時間培養し、ＣｙｔｏＴｏｘ ９６（登録商標）Ｎｏｎ－Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｇ１７８０－１０００ ａｓｓａｙｓ）を使用して、細胞培養上清中のＬＤＨを検出し、細胞毒性％を定量する。標的細胞の最大溶解率（１００％）は、１％であり、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００で標的細胞を処理して細胞を溶解し、すべてのＬＤＨを放出する。標的細胞自発、エフェクター細胞自発、標的細胞＋エフェクター細胞自発等の対照ウェルを設定する。式％細胞毒性（Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）＝［（実験（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ）－エフェクター自発（Ｅｆｆｅｃｔｏｒ Ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ）－標的自発（Ｔａｒｇｅｔ Ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ））／（標的の最大値（Ｔａｒｇｅｔ Ｍａｘｉｍｕｍ）－標的自発（Ｔａｒｇｅｔ Ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ））］×１００に従ってデータを分析する。図３８に示されるように、結果は、ＱＰ０９０１０９００３７４６、ＱＰ３６６７０９０３、ＱＰ０９０４０９０５、ＱＰ０９０６０９０５およびＱＰ０９０４０９０７が、すべてＰＢＭＣを媒介してヒト肺がん細胞ＨＣＣ８２７－ＣＬＤＮ１８．２細胞活性を殺傷することができることを示す。ここで、ＱＰ０９０１０９００３７４６によって媒介されたヒト肺がん細胞ＨＣＣ８２７－ＣＬＤＮ１８．２細胞のＰＢＭＣ殺傷活性は、対照分子ＡＭＧ９１０よりも有意に優れる。他の分子によって媒介されたヒト肺がん細胞ＨＣＣ８２７－ＣＬＤＮ１８．２細胞のＰＢＭＣ殺傷活性は、対照分子ＡＭＧ９１０に相当する。
【0139】
さらに、いくつかの他の実施例において、抗ＣＤ３抗体断片は、それぞれＳＰ３４変異体ＱＰ３６８５、ＱＰ３６８９、ＱＰ３６９０の抗体軽鎖、重鎖配列から選択され、実施例１１の表１０に示されるように、クローンを設計し、且つタンパク質を発現および精製する。結果は、ＱＰ３６８５、ＱＰ３６８９、ＱＰ３６９０の抗体軽鎖、重鎖配列を使用して構築された分子も、ＣＬＤＮ１８．２結合活性およびＩＬ１５活性を有し、抗ＣＤ３分子は、ＣＤ３結合活性も融資、Ｔ細胞を媒介してヒト胃がん細胞または肺がん細胞を殺傷する効果もあることを示す。
【0140】
本発明の内容を上記の好ましい実施形態を通じて詳細に説明したが、本発明は上記の説明に限定されるものでないことを理解されたい。当業者であれば、上記の内容を読めば、本発明に対する様々な修正および変更が明らかとなるであろう。従って、本発明の保護範囲は、添付の特許請求の範囲によって限定されるべきである。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【図28】
【図29】
【図30】
【図31】
【図32】
【図33】
【図34】
【図35】
【図36】
【図37】
【図38】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2024-01-18
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
抗ＣＤ３抗体は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域は、ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２、ＶＨＣＤＲ３を含み、前記軽鎖可変領域は、ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２、ＶＬＣＤＲ３を含み、前記抗ＣＤ３抗体のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９～３４に示されるＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２、ＶＨＣＤＲ３、ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２およびＶＬＣＤＲ３を含む抗ＣＤ３抗体変異体であって、前記抗ＣＤ３抗体変異体の突然変異部位は、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０に示される配列の１０番目の部位、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１に示される配列の２番目の部位および７番目の部位、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３に示される配列の３番目の部位および４番目の部位、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４に示される配列の４番目の部位、５番目の部位、６番目の部位および７番目の部位のいずれか一つまたは二つ以上を含むことを特徴とし、
好ましくは、前記突然変異とは、アミノ酸が置換されることを指すことを特徴とする、抗ＣＤ３抗体変異体。
【請求項2】
変異体の突然変異部位は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０に示される配列における１０位のＡがＥに置換され、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１に示される配列における２位のＧがＳに置換され、７位のＳがＧに置換され、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３に示される配列における３位のＮがＷに置換され、４位のＫがＬに置換され、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４に示される配列における４位のＹがＮまたはＲに置換され、５位のＳがＫに置換され、６位のＮがＧに置換され、７位のＬがＧに置換される部位のいずれか一つまたは二つ以上を含むことを特徴とする
請求項１に記載の抗ＣＤ３抗体変異体。
【請求項3】
ＶＨＣＤＲ２のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５に示されたとおりであるか、または、ＶＨＣＤＲ３のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６に示されたとおりであるか、または、
ＶＬＣＤＲ２のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７または３８に示されたとおりであるか、または、
ＶＬＣＤＲ３のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９、４０または４１に示されたとおりであることを特徴とする
請求項１に記載の抗ＣＤ３抗体変異体。
【請求項4】
前記ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２、ＶＨＣＤＲ３、ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２およびＶＬＣＤＲ３のアミノ酸配列は、（１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９、３５、３１、３２、３７、３９、
（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９、３５、３６、３２、３７、４０、
（３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９、３５、３６、３２、３８、４１のいずれかの一組の配列に示されたとおりであることを特徴とする
請求項１に記載の抗ＣＤ３抗体変異体。
【請求項5】
前記抗体変異体の重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、２または３に示される配列の重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域から選択されるか、またはそれと少なくとも９０％の配列同一性を有することを特徴とする請求項４に記載の抗ＣＤ３抗体変異体。
【請求項6】
前記重鎖可変領域と前記軽鎖可変領域との間には、ジスルフィド結合を形成するための突然変異があり、前記突然変異の部位は、次のいずれか一種または二種以上の組み合わせを含み、突然変異部位は、ＥＵに従って番号付けられ、前記重鎖可変領域は、ＶＨで表され、前記軽鎖可変領域は、ＶＬで表されることを特徴とする請求項１に記載の抗ＣＤ３抗体変異体。
【表1】
【請求項7】
前記抗ＣＤ３抗体変異体は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、もしくはＩｇＧ４またはその変異体から選択される重鎖定常領域、ならびにヒトκ鎖、λ鎖またはその変異体から選択される軽鎖定常領域をさらに含み、前記重鎖定常領域は、Ｆｃ断片またはその変異体を含むことを特徴とする請求項１に記載の抗ＣＤ３抗体変異体。
【請求項8】
前記抗体変異体は、重鎖可変領域、軽鎖可変領域、および前記重鎖可変領域と前記軽鎖可変領域とを連結する連結断片を含むｓｃＦｖであり、前記連結断片のアミノ酸配列は、好ましくは若干のＧＧＧＧＳリピート、より好ましくは３個のＧＧＧＧＳリピートであることを特徴とする請求項１に記載の抗ＣＤ３抗体変異体。
【請求項9】
癌を阻害または治療するための薬物の調製における、請求項１に記載の抗ＣＤ３抗体変異体の適用であって、
前記癌は、結腸直腸、乳房、卵巣、膵臓、胃、前立腺、腎臓、子宮頚、骨髄がん、リンパ腫、白血病、甲状腺、子宮内膜、子宮、膀胱、神経内分泌、頭頚部、肝臓、鼻咽頭、精巣、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、黒色腫、基底細胞皮膚がん、皮膚扁平上皮がん、隆起性皮膚線維肉腫、メルケル細胞がん、膠芽腫、神経膠腫、肉腫、中皮腫、および骨髄異形成症候群から選択されるか、または前記の部位で発生することを特徴とする
抗ＣＤ３抗体変異体の適用。
【請求項10】
核酸分子であって、請求項１に記載の抗ＣＤ３抗体変異体をコードすることを特徴とする、前記核酸分子。
【請求項11】
抗腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）／抗ＣＤ３のタンパク質分子であって、第１の単量体および第２の単量体を含むヘテロ二量体形態であり、
前記第１の単量体は、（ａ）Ｆｄ断片、（ｂ）軽鎖断片および第１のＦｃ鎖を含み、
前記第２の単量体は、（ａ）Ｆｄ断片、（ｂ）軽鎖断片、抗ＣＤ３抗体断片および第２のＦｃ鎖を含み、
前記軽鎖断片は、ＶＬドメインおよびＣＬドメインを含み、前記Ｆｄ断片は、ＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインを含み、前記第１の単量体または前記第２の単量体において、前記軽鎖断片は、前記Ｆｄ断片と対になって抗ＴＡＡのＦａｂドメインを形成し、ここで、前記第１の単量体の軽鎖断片は、前記第１のＦｃ鎖に融合され、前記抗ＣＤ３抗体断片のＮ末端は、前記第２の単量体の軽鎖断片に融合され、Ｃ末端は、前記第２のＦｃ鎖に融合され、
または、
前記第１の単量体は、（ａ）Ｆｄ断片、（ｂ）軽鎖断片、サイトカイン機能領域、第１のＦｃ鎖を含み、
前記第２の単量体は、（ａ）Ｆｄ断片、（ｂ）軽鎖断片、抗ＣＤ３抗体断片、および第２のＦｃ鎖を含み、
前記サイトカイン機能領域は、ＩＬ－１５およびＩＬ－１５Ｒａを含み、ここで、前記サイトカイン機能領域のＮ末端は、前記第１の単量体の軽鎖断片に融合され、Ｃ末端は、前記第１のＦｃ鎖に融合され、前記抗ＣＤ３抗体断片のＮ末端は、前記第２の単量体の軽鎖断片に融合され、Ｃ末端は、前記第２のＦｃ鎖に融合され、
または、
前記第１の単量体は、抗ＴＡＡ抗体断片、サイトカイン機能領域、第１のＦｃ鎖を含み、
前記第２の単量体は、抗ＴＡＡ抗体断片、抗ＣＤ３抗体断片、および第２のＦｃ鎖を含み、ここで、
前記サイトカイン機能領域のＮ末端は、前記第１の単量体の抗ＴＡＡ抗体断片に融合され、Ｃ末端は、前記第１のＦｃ鎖に融合され、前記抗ＣＤ３抗体断片のＮ末端は、前記第２の単量体の抗ＴＡＡ抗体断片に融合され、Ｃ末端は、前記第２のＦｃ鎖に融合され、
前記第１のＦｃ鎖と前記第２のＦｃ鎖とは、交換可能であることを特徴とし、
好ましくは、前記抗ＣＤ３抗体断片のアミノ酸配列は、ＣＤ３結合特異性抗体、抗体断片、単一ドメイン抗体またはそのヒト化形態から選択され、好ましくは、前記抗ＣＤ３抗体断片のアミノ酸配列は、ＳＰ３４、ＯＫＴ３、ＵＣＴＨ１またはその誘導体から選択されることを特徴とする、
前記抗腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）／抗ＣＤ３のタンパク質分子。
【請求項12】
前記抗ＴＡＡ抗体断片は、重鎖可変領域（ＶＨ）、軽鎖可変領域（ＶＬ）、および前記重鎖可変領域と前記軽鎖可変領域とを連結する連結断片を含むｓｃＦｖ形態であり、ペプチド鎖のＮ末端からＣ末端にかけて、前記抗ＴＡＡ抗体断片のアミノ酸融合順序は、「ＶＨ～ＶＬ」もしくは「ＶＬ～ＶＨ」であり、「～」は、連結断片を表わし、または、前記抗ＣＤ３抗体断片は、重鎖可変領域（ＶＨ）、軽鎖可変領域（ＶＬ）、および前記重鎖可変領域と前記軽鎖可変領域とを連結する連結断片を含むｓｃＦｖ形態であり、ペプチド鎖のＮ末端からＣ末端にかけて、前記抗ＣＤ３抗体断片のアミノ酸的融合順序は、「ＶＨ～ＶＬ」もしくは「ＶＬ～ＶＨ」であり、「～」は、連結断片を表わし、または、
ペプチド鎖のＮ末端からＣ末端にかけて、前記サイトカイン機能領域のアミノ酸断片の融合順序は、「ＩＬ－１５～ＩＬ－１５Ｒａ」または「ＩＬ－１５Ｒａ～ＩＬ－１５」であり、「～」は、連結断片を表わし、好ましくは、前記ＩＬ－１５～ＩＬ－１５Ｒａの配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２に示されたとおりであり、前記ＩＬ－１５Ｒａ～ＩＬ－１５の配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３に示されたとおりであることを特徴とする
請求項１１に記載の抗腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）／抗ＣＤ３のタンパク質分子。
【請求項13】
前記抗ＣＤ３抗体断片は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、前記抗ＣＤ３抗体断片の重鎖可変領域は、ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２、ＶＨＣＤＲ３を含み、前記抗ＣＤ３抗体断片の軽鎖可変領域は、ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２、ＶＬＣＤＲ３を含み、前記ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２、ＶＨＣＤＲ３、ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２およびＶＬＣＤＲ３のアミノ酸配列は、（１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９，３５，３１，３２，３７，３９； （２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９，３５，３６，３２，３７，４０； （３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９，３５，３６、３２，３８，４１のいずれか一組の配列に示されたとおりであることを特徴とする請求項１１に記載の抗腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）／抗ＣＤ３のタンパク質分子。
【請求項14】
ＩＬ－１５ＲａおよびＩＬ－１５は、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒａ複合体を形成し、ＩＬ－１５は、ＩＬ－１５、ＩＬ－１５Ｒａに結合できるその突然変異、切断および様々な誘導体を含み、ＩＬ－１５Ｒａは、ＩＬ－１５Ｒａ、ＩＬ－１５に結合できるその突然変異、切断および様々な誘導体を含み、前記ＩＬ－１５は、次のいずれかの組み合わせに示される突然変異形態を含むが、これらに限定されず、カウント方法は、ＩＬ－１５のアミノ酸配列の最初のアミノ酸に基づいてこれを１位としてカウントされ、好ましくは、前記ＩＬ－１５の親配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４に示されたとおりであることを特徴とし、
【表2】
請求項１１に記載の抗腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）／抗ＣＤ３のタンパク質分子。
【表3】
【請求項15】
前記ＴＡＡは、ＣＤ２０、ＣＤ１９、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ５２、ｓｌａｍｆ７、ＧＤ２、ＣＤ２４、ＣＤ４７、ＣＤ１３３、ＣＤ２３９、ＣＤ２７６、ＰＤ－１、ＣＥＡ、Ｅｐｃａｍ、Ｔｒｏｐ２、ＴＡＧ７２、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ、ｆｏｌｒ１、ＣＬＤＮ１８．２、ＰＤＬ１、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲ ＶＩＩＩ、Ｃ－ＭＥＴ、ＨＥＲ２、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡ、ＥｐｈＡ２、ＡＤＡＭ１７、１７－Ａ１、ＮＫＧ２Ｄ ｌｉｇａｎｄｓ、ＭＣＳＰ、ＬＧＲ５、ＳＳＥＡ３、ＳＬＣ３４Ａ２、ＢＣＭＡ、ＧＰＮＭＢまたはＧｌｙｐｉｃａｎ－３から選択されることを特徴とする請求項１１に記載の抗腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）／抗ＣＤ３のタンパク質分子。
【請求項16】
前記第１のＦｃ鎖および前記第２のＦｃ鎖は、重合してＦｃセグメントを形成し、前記Ｆｃセグメントは、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ、ヒトＩｇＧ２ Ｆｃ、ヒトＩｇＧ３ Ｆｃ、ヒトＩｇＧ４ Ｆｃまたはその変異体から選択され、好ましくはＩｇＧ１ Ｆｃ、またはヒトＩｇＧ４ Ｆｃまたはその変異体から選択され、前記タンパク質分子は、Ｆｃヘテロ二量体形態であり、好ましくは、前記Ｆｃヘテロ二量体は、以下の突然変異の組み合わせを含むが、これらに限定されず、以下の突然変異は、ＥＵに従ってカウントされることを特徴とする請求項１１に記載の抗腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）／抗ＣＤ３のタンパク質分子。
【表4】
【請求項17】
前記タンパク質分子は、Ｆｃセグメントを含み、Ｆｃセグメントの選択により、以下の突然変異の組み合わせを含むが、これらに限定されない免疫エフェクター機能が排除され、以下の突然変異は、ＥＵに従ってカウントされることを特徴とする請求項１１に記載の抗腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）／抗ＣＤ３のタンパク質分子。
【表5】
【請求項18】
（１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：０５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：０６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：０７、（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：０８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：０６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：０７、
（３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：０９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：０６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：０７、
（４）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：０６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：０７、
（５）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：０５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：０７、
（６）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：０１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：０７、
（７）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：０７、
（８）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：０７、
（９）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１、
（１０）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１、
（１１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３、
（１２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３、
（１３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５、
（１４）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５、
（１５）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７、
（１６）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７のいずれか一組の配列に示されるアミノ酸断片の融合によって得られることを特徴とする
請求項１１に記載の抗腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）／抗ＣＤ３のタンパク質分子。
【請求項19】
核酸分子であって、請求項１１に記載の抗腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）／抗ＣＤ３のタンパク質分子をコードすることを特徴とする、前記核酸分子。
【請求項20】
癌を阻害または治療するための薬物の調製における、請求項１１に記載の抗腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）／抗ＣＤ３のタンパク質分子の適用であって、前記癌は、結腸直腸、乳房、卵巣、膵臓、胃、前立腺、腎臓、子宮頚、骨髄がん、リンパ腫、白血病、甲状腺、子宮内膜、子宮、膀胱、神経内分泌、頭頚部、肝臓、鼻咽頭、精巣、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、黒色腫、基底細胞皮膚がん、皮膚扁平上皮がん、隆起性皮膚線維肉腫、メルケル細胞がん、膠芽腫、神経膠腫、肉腫、中皮腫、および骨髄異形成症候群から選択される癌を含むか、または前記の部位で発生することを特徴とする、前記癌を阻害または治療するための薬物の調製における、請求項１１に記載の抗腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）／抗ＣＤ３のタンパク質分子の適用。
【請求項21】
抗腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）、およびＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒａ含有融合タンパク質であって、二つのポリペプチド鎖を含み、いずれか一つのポリペプチド鎖は、抗ＴＡＡ抗体断片、サイトカイン機能領域、Ｆｃ断片を含み、前記抗ＴＡＡ抗体断片は、ｓｃＦｖ形態であり、前記サイトカイン機能領域は、ＩＬ－１５およびＩＬ－１５Ｒａを含み、前記サイトカイン機能領域のＮ末端は、前記抗ＴＡＡ抗体断片に融合され、Ｃ末端は、前記Ｆｃ断片と融合することを特徴とする、前記抗腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）、およびＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒａ含有融合タンパク質。
【請求項22】
ＩＬ－１５ＲａおよびＩＬ－１５は、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒａ複合体を形成し、ＩＬ－１５は、ＩＬ－１５、ＩＬ－１５Ｒａに結合できるその突然変異、切断および様々な誘導体を含み、ＩＬ－１５Ｒａは、ＩＬ－１５Ｒａ、ＩＬ－１５に結合できるその突然変異、切断および様々な誘導体を含み、前記ＩＬ－１５は、次のいずれかの組み合わせに示される突然変異形態を含むが、これらに限定されず、カウント方法は、ＩＬ－１５のアミノ酸配列の最初のアミノ酸に基づいてこれを１位としてカウントされ、好ましくは、前記ＩＬ－１５の親配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４に示されたとおりであることを特徴とし、
【表6】
請求項２１に記載の抗腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）、およびＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒａ含有融合タンパク質。
【表7】
【請求項23】
前記融合タンパク質のいずれか一つのポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８に示されたとおりであるか、またはそれと少なくとも９０％の配列同一性を有することを特徴とする請求項２１に記載の抗腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）、およびＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒａ含有融合タンパク質。
【請求項24】
核酸分子であって、請求項２１に記載の抗腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）、およびＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒａ含有融合タンパク質をコードすることを特徴とする、前記核酸分子。
【請求項25】
癌を阻害または治療するための薬物の調製における、請求項２１に記載の抗腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）、およびＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒａ含有融合タンパク質の適用であって、前記癌は、結腸直腸、乳房、卵巣、膵臓、胃、前立腺、腎臓、子宮頚、骨髄がん、リンパ腫、白血病、甲状腺、子宮内膜、子宮、膀胱、神経内分泌、頭頚部、肝臓、鼻咽頭、精巣、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、黒色腫、基底細胞皮膚がん、皮膚扁平上皮がん、隆起性皮膚線維肉腫、メルケル細胞がん、膠芽腫、神経膠腫、肉腫、中皮腫、以及骨髄異形成症候群から選択される癌を含むか、または前記の部位で発生することを特徴とする、前記癌を阻害または治療するための薬物の調製における、請求項２１に記載の抗腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）、およびＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒａ含有融合タンパク質の適用。
【国際調査報告】