ホーム > 特許ランキング > ザ ジェイ． デビッド グラッドストーン インスティテューツ、 ア テスタメンタリー トラスト エスタブリッシュド アンダー ザ ウィル オブ ジェイ． デビッド グラッドストーン
▶ ザ ジェイ． デビッド グラッドストーン インスティテューツ、 ア テスタメンタリー トラスト エスタブリッシュド アンダー ザ ウィル オブ ジェイ． デビッド グラッドストーンの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-06-04
(54)【発明の名称】外因性阻害のアッセイ
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/02 20060101AFI20240528BHJP
G01N 33/53 20060101ALI20240528BHJP
C12N 5/0797 20100101ALN20240528BHJP
C12N 5/0735 20100101ALN20240528BHJP
C12N 5/0775 20100101ALN20240528BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/02 ZNA
G01N33/53 Y
G01N33/53 D
C12N5/0797
C12N5/0735
C12N5/0775
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023574545
(86)(22)【出願日】2022-06-03
(85)【翻訳文提出日】2024-01-29
(86)【国際出願番号】 US2022032172
(87)【国際公開番号】W WO2022256664
(87)【国際公開日】2022-12-08
(31)【優先権主張番号】63/197,242
(32)【優先日】2021-06-04
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＰＹＴＨＯＮ
(71)【出願人】
【識別番号】517352418
【氏名又は名称】ザ ジェイ． デビッド グラッドストーン インスティテューツ、 ア テスタメンタリー トラスト エスタブリッシュド アンダー ザ ウィル オブ ジェイ． デビッド グラッドストーン
(74)【代理人】
【識別番号】100105957
【弁理士】
【氏名又は名称】恩田 誠
(74)【代理人】
【識別番号】100068755
【弁理士】
【氏名又は名称】恩田 博宣
(74)【代理人】
【識別番号】100142907
【弁理士】
【氏名又は名称】本田 淳
(74)【代理人】
【識別番号】100152489
【弁理士】
【氏名又は名称】中村 美樹
(72)【発明者】
【氏名】アカソグルー、カテリーナ
(72)【発明者】
【氏名】ピーターセン、マーク
(72)【発明者】
【氏名】マイヤー－フランケ、アンケ
【テーマコード（参考）】
4B063
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B063QA01
4B063QA18
4B063QQ08
4B063QR77
4B063QS33
4B065AA90X
4B065CA24
4B065CA46
(57)【要約】
外因性阻害物質による再ミエリン化阻害を克服する薬剤をスクリーニングするためのハイスループット、ハイコンテントアッセイ。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
外因性阻害物質による再ミエリン化阻害を克服する薬剤をスクリーニングするためのハイスループット、ハイコンテントアッセイであって、ａ）オリゴデンドロサイト前駆細胞（ＯＰＣ）を外因性阻害物質及び試験薬剤と接触させること、及び
ｂ）単一アッセイで２つの読み取り値を取得することにより、１）ＭＢＰ＋ミエリン形成オリゴデンドロサイト（ＯＬ）、及び２）ＧＦＡＰ＋アストロサイトの存在を検出／定量すること
を含み、前記外因性阻害物質のみと接触させた対照ＯＰＣと比較したＯＬの増加及びＧＦＡＰ＋アストロサイトの減少は、この薬剤が外因性阻害物質による再ミエリン化の阻害を克服したことを示す、アッセイ。
【請求項2】
前記外因性阻害物質は、抗体、化合物、小分子、ペプチド、及び核酸のうちの少なくとも１つである、請求項１に記載のアッセイ。
【請求項3】
前記外因性阻害物質は炎症性分子である、請求項１又は２に記載のアッセイ。
【請求項4】
前記外因性阻害物質はフィブリノーゲンである、請求項１～３のいずれか一項に記載のアッセイ。
【請求項5】
フィブリノーゲンは生理学的レベルで存在する、請求項４に記載のアッセイ。
【請求項6】
フィブリノーゲンは、少なくとも２．５ｍｇ／ｍｌの濃度で添加される、請求項４に記載のアッセイ。
【請求項7】
前記ＯＰＣは初代ＯＰＣである、請求項１～６のいずれか一項に記載のアッセイ。
【請求項8】
前記初代ＯＰＣは、ａ）の前に増殖培地中で１～６日間培養される、請求項７に記載のアッセイ。
【請求項9】
前記増殖培地はＰＤＧＦ－ＡＡ及びＮＴ３を含む、請求項８に記載のアッセイ。
【請求項10】
前記ＯＰＣは、タンパク質分解及び／又はコラーゲン分解によって培養皿から分離され、その後、新鮮な培養皿に播種される、請求項８又は９に記載のアッセイ。
【請求項11】
前記ＯＰＣは、ａ）の前に、９６ウェルプレートの１ウェルあたり５×１０３細胞で、又は３８４ウェルプレートの１ウェルあたり１×１０３細胞で播種される、請求項１０に記載のアッセイ。
【請求項12】
前記播種されたＯＰＣは、ａ）の前に最大２４時間培養される、請求項１１に記載のアッセイ。
【請求項13】
前記ＯＰＣは、ｂ）の前に前記ＯＰＣが分化できるように、ステップａ）において１～６日間培養される、請求項１～１２のいずれか一項に記載のアッセイ。
【請求項14】
前記ＯＰＣは３日間培養される、請求項１３に記載のアッセイ。
【請求項15】
前記分化培地はＣＮＴＦトリヨードチロニン（Ｔ３）及びＰＤＧＦ－ＡＡを含む、請求項１３又は１４に記載のアッセイ。
【請求項16】
ａ）の後、前記細胞をＭＢＰに対する抗体（オリゴデンドロサイト）及びＧＦＡＰに対する抗体（アストロサイト）と接触させる、請求項１～１５のいずれか一項に記載のアッセイ。
【請求項17】
前記抗体は検出可能な標識で直接的又は間接的に標識され、標識を有する前記細胞の画像が取得される、請求項１６に記載のアッセイ。
【請求項18】
自動化画像が取得される、請求項１７に記載のアッセイ。
【請求項19】
培養容器（例えば、ウェル）の少なくとも約８０％が画像化される、請求項１７又は１８に記載のアッセイ。
【請求項20】
ＭＢＰ＋及びＧＦＡＰ＋の自動定量化が使用される、請求項１～１９のいずれか一項に記載のアッセイ。
【請求項21】
外因性阻害物質の阻害を克服する薬剤をスクリーニングするためのハイスループット、ハイコンテントアッセイであって、ａ）細胞を外因性阻害物質及び試験薬剤と接触させること、及び
ｂ）前記試験薬剤に対する細胞応答を検出及び／又は定量すること
を含み、前記細胞を前記外因性阻害物質のみと接触させた対照と比較して異なる細胞応答は、薬剤が前記外因性阻害物質を克服できたことを示す。
【請求項22】
前記外因性阻害物質は、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン、ヒアルロナン、フィブロネクチン凝集体、ミエリンデブリ、炎症性サイトカイン（例えば、可溶性ＴＮＦ－α又はインターフェロン－γ）、骨形成タンパク質、エンドセリン－１、セマフォリン、環境毒素及びアルコール、タバコ、違法薬物又は娯楽用薬物からなる群から選択される、請求項２１に記載のアッセイ。
【請求項23】
前記細胞は、神経幹細胞及び／又は前駆細胞（成人及び／又は胎児／新生児）、放射状グリア細胞（成人及び／又は胎児／新生児）、小脳顆粒ニューロン前駆細胞、神経堤幹／前駆細胞、血管／内皮の幹／前駆細胞、臓器幹／前駆細胞（例えば、心臓、肝臓、肺、腎臓、骨格筋、皮膚、骨、網膜）、間葉系幹／前駆細胞、胎盤幹／前駆細胞、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞（又はＥＳＣ／ｉＰＳＣ由来の細胞）、及びがん／腫瘍関連細胞／幹細胞を含む幹細胞又は前駆細胞からなる群から選択される、請求項２１又は２２に記載のアッセイ。
【請求項24】
前記神経前駆細胞はオリゴデンドロサイト前駆細胞（ＯＰＣ）である、請求項２３に記載のアッセイ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
テキストファイルとして提供される配列表の参照による組み込み
配列表は、２０２２年６月２日に作成され、サイズが６９３バイトのテキストファイル「２２４４００２．ｔｘｔ」として本明細書に提供される。テキストファイルの内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
配列表は、２０２２年６月２日に作成され、サイズが６９３バイトのテキストファイル「２２４４００２．ｔｘｔ」として本明細書に提供される。テキストファイルの内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0002】
政府の資金援助
本発明は、ＡＲＭＹ／ＭＲＭＣによって与えられたＷ８１ＸＷＨ－１７－１－０２１１に基づく政府支援及び国立衛生研究所によって与えられたＲ３５ ＮＳ０９７９７６に基づく政府支援によって行われた。政府は本発明に関して一定の権利を有する。
本発明は、ＡＲＭＹ／ＭＲＭＣによって与えられたＷ８１ＸＷＨ－１７－１－０２１１に基づく政府支援及び国立衛生研究所によって与えられたＲ３５ ＮＳ０９７９７６に基づく政府支援によって行われた。政府は本発明に関して一定の権利を有する。
【背景技術】
【0003】
発明の背景
血液脳関門（ＢＢＢ）破壊部位及び神経血管損傷部位における外因性阻害物質は、神経疾患における再ミエリン化不全の一因となる。しかし、再ミエリン化の外因性阻害を克服する治療法は広く利用可能ではなく、神経血管機能不全部位におけるグリア前駆細胞ニッチリモデリングの動態はほとんど知られていない。
血液脳関門（ＢＢＢ）破壊部位及び神経血管損傷部位における外因性阻害物質は、神経疾患における再ミエリン化不全の一因となる。しかし、再ミエリン化の外因性阻害を克服する治療法は広く利用可能ではなく、神経血管機能不全部位におけるグリア前駆細胞ニッチリモデリングの動態はほとんど知られていない。
【発明の概要】
【0004】
本明細書では、ミエリン化促進薬がフィブリノーゲンによる再ミエリン化の外因性阻害をレスキューしないことが示されたため、外因性阻害物質の存在下で再ミエリン化を促進する化合物を同定するためのアッセイ／スクリーニング（ＯＰＣ－Ｘと名付けた）を提供する。
【0005】
一実施形態は、外因性阻害物質による再ミエリン化阻害を克服する薬剤をスクリーニングするためのハイスループット、ハイコンテントアッセイを提供し、このアッセイは、ａ）オリゴデンドロサイト前駆細胞（ＯＰＣ）を外因性阻害物質及び試験薬剤と接触させること、及びｂ）単一アッセイで２つの読み取り値を取得することにより、１）ＭＢＰ＋ミエリン形成オリゴデンドロサイト（ＯＬ）、及び２）ＧＦＡＰ＋アストロサイトの存在を検出／定量することを含み、外因性阻害物質のみと接触させた対照ＯＰＣと比較したＯＬの増加及びＧＦＡＰ＋アストロサイトの減少は、この薬剤が外因性阻害物質による再ミエリン化の阻害を克服したことを示す。
【0006】
一実施形態では、外因性阻害物質は、抗体、化合物、小分子、ペプチド及び／又は核酸である。別の実施形態では、外因性阻害物質は炎症性分子である。一実施形態では、外因性阻害物質はフィブリノーゲンである。一実施形態では、フィブリノーゲンは生理学的レベルで存在する。別の実施形態では、フィブリノーゲンは、少なくとも２．５ｍｇ／ｍｌの濃度で添加される。
【0007】
一実施形態では、ＯＰＣは初代ＯＰＣである。一実施形態では、初代ＯＰＣは、ａ）の前に増殖培地中で１～６日間培養される。別の実施形態では、増殖培地はＰＤＧＦ－ＡＡ及びＮＴ３を含む。一実施形態では、ＯＰＣは、タンパク質分解及び／又はコラーゲン分解によって培養皿から分離され、その後、新鮮な培養皿に播種される。別の実施形態では、ＯＰＣは、ａ）の前に、９６ウェルプレートの１ウェルあたり５×１０３細胞で、又は３８４ウェルプレートの１ウェルあたり１×１０３細胞で播種される。一実施形態では、播種されたＯＰＣは、ａ）の前に最大２４時間培養される。別の実施形態では、ＯＰＣは、ｂ）の前にＯＰＣが分化できるように、ステップａ）において１、２、３、４、５又は６日間を含む１～６日間培養される。
【0008】
一実施形態では、ａ）の後、細胞を、ＭＢＰに対する抗体（オリゴデンドロサイト）及びＧＦＡＰに対する抗体（アストロサイト）と接触させる。一実施形態では、抗体は、検出可能な標識で直接的又は間接的に標識され、自動化画像などの、標識を有する細胞の画像が取得される。一実施形態では、培養容器（例えば、ウェル）の少なくとも約８０％が画像化される。別の実施形態では、ＭＢＰ＋及びＧＦＡＰ＋の自動定量化が使用される。
【0009】
一実施形態は、外因性阻害物質の阻害を克服する薬剤をスクリーニングするためのハイスループット、ハイコンテントアッセイを提供し、このアッセイは、ａ）細胞を外因性阻害物質及び試験薬剤と接触させること、及びｂ）試験薬剤に対する細胞応答を検出及び／又は定量することを含み、細胞を外因性阻害物質のみと接触させた対照と比較して異なる細胞応答は、薬剤が外因性阻害物質を克服できたことを示す。一実施形態では、外因性阻害物質は、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン、ヒアルロナン、フィブロネクチン凝集体、ミエリンデブリ、炎症性サイトカイン（例えば、可溶性ＴＮＦ－α又はインターフェロン－γ）、骨形成タンパク質、エンドセリン－１、セマフォリン、環境毒素及びアルコール、タバコ、違法薬物又は娯楽用薬物からなる群から選択される。別の実施形態では、細胞は、幹細胞又は前駆細胞、例えば、神経幹細胞及び／又は前駆細胞（成人及び／又は胎児／新生児）、放射状グリア細胞（成人及び／又は胎児／新生児）、小脳顆粒ニューロン前駆細胞、神経堤幹／前駆細胞、血管／内皮の幹／前駆細胞、臓器幹／前駆細胞（例えば、心臓、肝臓、肺、腎臓、骨格筋、皮膚、骨、網膜）、間葉系幹／前駆細胞、胎盤幹／前駆細胞、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞（又はＥＳＣ／ｉＰＳＣ由来の細胞）、及びがん／腫瘍関連細胞／幹細胞からなる群から選択される。一実施形態では、神経前駆細胞はオリゴデンドロサイト前駆細胞（ＯＰＣ）である。
【図面の簡単な説明】
【0010】
【図1-B】同上。
【図1-C】同上。
【図1-D】同上。
【図1A】ＮＧ２細胞は、慢性神経炎症におけるフィブリノーゲン沈着部位及び限られた再ミエリン化部位で血管周囲にクラスター化する。Ａ、ＮＧ２－ＣｒｅＥＲＴＭ：ＲｏｓａｔｄＴｏｍａｔｏ／＋：Ｃｘ３ｃｒ１ＧＦＰ／＋年齢を一致させた健康な対照マウスにおけるミクログリア（緑）、ＮＧ２細胞（赤）及び血管系（青、７０ｋＤａオレゴングリーンデキストラン）のｉｎ ｖｉｖｏ ２Ｐ最大値投影画像、臨床徴候のピーク時（ピークＥＡＥ、平均スコア３）及び慢性ＥＡＥ時（平均臨床スコア２．１）。示されている画像は、ＥＡＥ誘発後１７日目（ピーク）及び３５日目（慢性）のマウスのものである。対照条件のＮＧ２ｔｄＴｏｍａｔｏ／＋周皮細胞は白い矢印で示されている。スケールバー、５０μｍ。対照（ｎ＝４マウス）、ピーク（ｎ＝５マウス）、及び慢性（ｎ＝６マウス）ＥＡＥにおけるＮＧ２細胞及びミクログリアクラスターの定量化。値は平均値±標準誤差、＊ｐ＜０．０５、ｎ．ｓ．は有意差なし、（ボンフェローニの多重比較検定による二元配置分散分析）。
【図1B】ＮＧ２細胞は、慢性神経炎症におけるフィブリノーゲン沈着部位及び限られた再ミエリン化部位で血管周囲にクラスター化する。Ｂ、免疫されていない健康なマウス（対照）、及び疾患のピーク期及び慢性期のＭＯＧ３５－５５－ＥＡＥマウスからの脊髄切片をフィブリノーゲンについて免疫染色（緑色）した顕微鏡写真。核は４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ、青）で染色される。スケールバー、１００μｍ。免疫されていない健康なマウス（対照）（ｎ＝４マウス）、及び疾患のピーク期（ｎ＝５マウス）及び慢性期（ｎ＝６マウス）の、ＭＯＧ３５－５５－ＥＡＥマウスの脊髄におけるデキストラン漏出の定量化。値は平均値±標準誤差、＊ｐ＜０．０５（テューキーの多重比較検定による一元配置分散分析）。免疫されていない健康なマウス（対照）、及び疾患のピーク期及び慢性期のＭＯＧ３５－５５－ＥＡＥマウス（１群あたりｎ＝３マウス）の脊髄におけるフィブリノーゲン免疫反応性の定量化。値は平均±標準誤差、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１（テューキーの多重比較検定による一元配置分散分析）。
【図1C】ＮＧ２細胞は、慢性神経炎症におけるフィブリノーゲン沈着部位及び限られた再ミエリン化部位で血管周囲にクラスター化する。Ｃ、フィブリノーゲンについて免疫染色（緑色）した慢性ＥＡＥのＮＧ２－ＣｒｅＥＲＴＭ：ＲｏｓａｔｄＴｏｍａｔｏ／＋：Ｃｘ３ｃｒ１ＧＦＰ／＋マウスの腹側脊髄切片の顕微鏡写真。スケールバー、５０μｍ。ＮＧ２クラスター領域及びクラスターのない領域（ｎ＝５マウス）におけるフィブリノーゲン免疫陽性の定量化。値は平均値±標準誤差、＊＊ｐ＜０．０１（両側マン－ホイットニー検定）。
【図1D】ＮＧ２細胞は、慢性神経炎症におけるフィブリノーゲン沈着部位及び限られた再ミエリン化部位で血管周囲にクラスター化する。Ｄ、ＮＧ２クラスターの領域及びクラスターのない領域における慢性ＥＡＥのＮＧ２－ＣｒｅＥＲＴＭ：ＲｏｓａｔｄＴｏｍａｔｏ／＋：Ｃｘ３ｃｒ１ＧＦＰ／＋マウスのミエリン（緑色）のｉｎ ｖｉｖｏ ２Ｐ最大値投影画像。枠で囲んだ領域は、ミエリン標識のみを示すために右上の挿入図に示されている。スケールバー、２０μｍ。ＮＧ２クラスターの領域及びクラスターのない領域（ｎ＝５マウス）における慢性ＥＡＥのミエリンの円形度の定量化。値は平均値±標準誤差、＊＊ｐ＜０．０１（両側マン－ホイットニー検定）。１．０の値は完全な円を示す（縦断面の変性ミエリンに見られるように）。値が０．０に近づくほど非円形で直線的な形状（正常な有髄線維の縦断面）になることを示す。
【図1E】ＮＧ２細胞は、慢性神経炎症におけるフィブリノーゲン沈着部位及び限られた再ミエリン化部位で血管周囲にクラスター化する。Ｅ、２Ｐ体積及びＳＢＥＭ体積の同期（ｃｏ－ｒｅｇｉｓｔｒａｔｉｏｎ）のためのＲＯＩ追跡ワークフロー。
【図1F】ＮＧ２細胞は、慢性神経炎症におけるフィブリノーゲン沈着部位及び限られた再ミエリン化部位で血管周囲にクラスター化する。Ｆ～Ｇ、２匹の異なるマウスからのｎ＝３ ＲＯＩからの代表的な相関ＳＢＥＭ画像。Ｆｉ、ＮＧ２クラスター領域のＣＮＳ柔組織は、活性化した内皮細胞（緑色のアスタリスク）、内皮への白血球の付着（黒色の矢印）、及び優勢な脱髄（赤い枠で囲んだ領域）及びまばらな再ミエリン化（青い枠で囲んだ領域）を伴う血管周囲病変を伴う炎症を起こした脊髄血管を示している。スケールバー、２０μｍ。Ｆｉｉ、赤い枠で囲んだ領域を高倍率で示す。赤い矢印は脱髄した軸索を示している。スケールバー、１０μｍ。Ｆｉｉｉ、青い枠で囲んだ領域を高倍率で示す。青い矢印は再ミエリン化された軸索を示している。スケールバー、１０μｍ。Ｆｉｖ．ＮＧ２クラスターのない領域におけるＣＮＳ柔組織内の相関ＳＢＥＭ。黒い矢印は正常な有髄軸索を示している。スケールバー、１０μｍ。
【図1G】ＮＧ２細胞は、慢性神経炎症におけるフィブリノーゲン沈着部位及び限られた再ミエリン化部位で血管周囲にクラスター化する。Ｆ～Ｇ、２匹の異なるマウスからのｎ＝３ ＲＯＩからの代表的な相関ＳＢＥＭ画像。Ｇｉ、ＮＧ２クラスターの領域内の別のＲＯＩからの代表的なＳＢＥＭは、血管周囲の脱髄、神経膠症（赤い点線の領域）及び一部の限られた再ミエリン化（青い枠で囲んだ領域）を伴う静脈を示す。神経膠症の領域は浸潤マクロファージ（Ｍ）及びアストロサイト（Ａ）を含む。遠位領域は、黒い矢印で示された正常な有髄軸索を有する。スケールバー、１０μｍ。Ｇｉｉ、青い枠で囲んだ領域を高倍率で示す。青い矢印は再ミエリン化された軸索を示している。黒い矢印はＮＧ２細胞を示している。スケールバー、５μｍ。
【図2A】図２Ａ～２Ｆ。ＥＡＥにおけるＮＧ２細胞のＲＮＡ－ｓｅｑ分析により、抗凝固経路の抑制が明らかになった。データは、１群あたりｎ＝３のマウスからのものである（Ａ～Ｄ）。Ａ、ＭＯＧ３５－５５－ＥＡＥ又は健康なマウスのＮＧ２系統細胞のＲＮＡ－ｓｅｑ解析からのＤＥＧのボルケーノプロット。円は、健康なマウスと比較して、ＥＡＥにおいて有意に下方制御された遺伝子（青、ｌｏｇ２倍率変化＜－１、ＦＤＲ＜０．０５）又は上方制御された遺伝子（赤、ｌｏｇ２倍率変化＞１、ＦＤＲ＜０．０５）を示している。
【図2B】Ａからのデータのヒートマップ。遺伝子はＨＯＰＡＣＨ教師なしクラスタリング分析によってクラスター化された（クラスター１～９）。発現値を対数正規化し、行をセンタリングし、Ｚスコアとして表示した。重要なＧＯタームと遺伝子の例がクラスターごとに示されている。ＦＤＲ＜０．０５；Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ－Ｈｏｃｈｂｅｒｇの修正。
【図2C】健康なマウスと比較した、ＥＡＥからのＮＧ２細胞において下方制御された（青いノード）又は上方制御された（赤いノード）共発現ＧＯタームネットワークの視覚化。遺伝子セットサイズと共発現の重複（キー）をＧＳＥＡによって決定した（ｐ＜０．０５）。
【図2D】ＥＡＥ又は健康なマウスからのＮＧ２細胞のＲＮＡ－ｓｅｑデータのＧＳＥＡによって決定された遺伝子セット「凝固の負の制御」及び「細胞接合アセンブリの制御」のエンリッチメントプロット。Ｘ軸はデータセット内の遺伝子のランクを示す。ＮＥＳ、正規化エンリッチメントスコア。
【図2E】Ｅ～Ｆ、健康マウス及びＥＡＥマウスからのＰＤＧＦＲα＋ＯＰＣ（Ｅ）又はＰＤＧＦＲβ＋周皮細胞（Ｆ）集団における表面標識ＴＦＰＩの代表的なヒストグラム及びＴＦＰＩ＋細胞の定量化。データは１群あたりｎ＝５からのものである（平均値±標準誤差）＊＊ｐ＜０．０１、ｎ．ｓ．有意差なし（両側マンホイットニー検定）。
【図2F】同上。
【図3A】図３Ａ～３Ｇ。ミエリン化促進化合物は、ＯＰＣ分化のフィブリノーゲン外因性阻害を克服しない。Ａ、ミディアムスループットの、フィブリノーゲンの存在下でのミエリン化促進薬のＯＰＣ－Ｘスクリーニングのワークフロー。
【図3B】Ｂ～Ｃ、示されるように、フィブリノーゲン及びミエリン促進薬又はビヒクル対照（ジメチルスルホキシド、ＤＭＳＯ）で処理された初代ラットＯＰＣにおけるＭＢＰ（緑）及びＧＦＡＰ（赤）の免疫蛍光。核はヘキスト色素（青）で染色される。ｎ＝３の独立した実験からの代表的な画像。スケールバー、１００μｍ。
【図3C】同上。
【図3D】Ｄ～Ｅ、自動画像取得及び定量化からの総細胞ＭＢＰ＋又はＧＦＡＰ＋のパーセンテージの定量化。データはｎ＝３の独立した実験からの平均値±標準誤差である。＊＊＊＊ｐ＜０．０００１（ダネットの多重比較検定による一元配置分散分析）。
【図3E】同上。
【図3F】ＤＭＨ１又はクレマスチンの存在下での対照又はフィブリノーゲン処理初代ラットＯＰＣにおけるホスホ－ＳＭＡＤ１／５（Ｐ－ＳＭＡＤ１／５）及びＩＤ２タンパク質レベル。値は、ｎ＝３の独立した実験の平均である。
【図3G】フィブリノーゲン及びＬＤＮ－２１２８５４（０．１８μＭ）又はビヒクル対照（ＤＭＳＯ）で３日間処理した初代ラットＯＰＣにおけるＭＢＰ（緑）及びＧＦＡＰ（赤）の免疫蛍光。核はヘキスト色素（青）で染色される。ｎ＝３の独立した実験からの代表的な画像。スケールバー、１００μｍ。Ｈ、自動画像取得及び定量化からの総ＭＢＰ＋又はＧＦＡＰ＋細胞のパーセンテージの定量化。データはｎ＝３の独立した実験からの平均値±標準誤差である。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１（ダネットの多重比較検定による一致した一元配置分散分析）。
【図4A】４Ａ～４Ｅ。慢性神経炎症におけるＩ型ＢＭＰ受容体阻害の治療効果。Ａ、疾患のピークから開始して１４日間ＬＤＮ－２１２８５４又は生理食塩水（キー）で処理したＭＯＧ３５－５５－ＥＡＥマウスの臨床スコア。データはｎ＝６マウス（ＥＡＥ＋ＬＤＮ－２１２８５４）及びｎ＝５マウス（ＥＡＥ＋生理食塩水）からの平均±標準誤差である。＊ｐ＜０．０５、（両側順列検定）。
【図4B】生理食塩水（左のパネル）又はＬＤＮ－２１２８５４（右のパネル）で処理したＭＯＧ３５－５５－ＥＡＥマウスの脊髄切片をＭＢＰについて免疫染色することで、ミエリン（緑）及びフィブリノーゲン（赤）を視覚化した顕微鏡写真。破線は脱髄した白質の境界を示す。スケールバー、５０μｍ。データは１群あたりｎ＝５のマウスからの平均±標準誤差である。＊＊ｐ＜０．０１（両側マン－ホイットニー検定）。
【図4C】ＬＤＮ－２１２８５４又は生理食塩水（キー）で３０日間処理したＮＯＤ－ＭＯＧ３５－５５ＥＡＥマウスの臨床スコア。データは、ｎ＝８マウス（ＥＡＥ＋ＬＤＮ－２１２８５４）及びｎ＝７マウス（ＥＡＥ＋生理食塩水）の平均±標準誤差である。＊ｐ＜０．０５、（最大スコアのグループ平均を比較するウェルチ２サンプルｔ検定、生理食塩水＝２．３６、ＬＤＮ－２１２８５４＝１．７５）。
【図4D】生理食塩水（左のパネル）又はＬＤＮ－２１２８５４（右のパネル）で処理したＮＯＤ－ＭＯＧ３５－５５ＥＡＥマウスの脊髄切片の顕微鏡写真。暗視野顕微鏡を使用してミエリン（緑）を視覚化し、フィブリノーゲン（赤）について免疫染色した。破線は脱髄した白質の境界を示す。スケールバー、１００μｍ。データは１群あたりｎ＝６マウスからの平均±標準誤差である。＊ｐ＜０．０５ ＊＊ｐ＜０．０１（両側マン－ホイットニー検定）。
【図4E】生理食塩水（左のパネル）及びＬＤＮ－２１２８５４（右のパネル）で処理した慢性ＥＡＥのＮＧ２－ＣｒｅＥＲＴＭ：ＲｏｓａｔｄＴｏｍａｔｏ／＋マウスにおけるＮＧ２細胞（赤）及び血管系（青、７０ｋＤａオレゴングリーンデキストラン）のｉｎ ｖｉｖｏ ２Ｐ最大値投影画像。スケールバー、５０μｍ。データは、ｎ＝６（ＥＡＥ＋ＬＤＮ－２１２８５４）及びｎ＝５（ＥＡＥ＋生理食塩水）からの平均±標準誤差である。＊ｐ＜０．０５（対応のない両側ｔ検定）。Ｆ、生理食塩水（左のパネル）及びＬＤＮ－２１２８５４（右のパネル）で処理した慢性ＥＡＥのＮＧ２－ＣｒｅＥＲＴＭ：ＲｏｓａｔｄＴｏｍａｔｏ／＋マウスにおけるＮＧ２細胞（赤）及びミエリン（緑、ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ）のｉｎ ｖｉｖｏ ２Ｐ最大値投影画像。スケールバー、２０μｍ。データは、ｎ＝５（ＥＡＥ＋ＬＤＮ－２１２８５４）及びｎ＝４（ＥＡＥ＋生理食塩水）からの平均±標準誤差である。＊ｐ＜０．０５（両側マン－ホイットニー検定）。ミエリン損傷はミエリン円形度で定量化され、１．０の値は完全な円を示し、値が０．０に近づくほど非円形の形状、直線的な形状になることを示す。Ｇ、生理食塩水（左のパネル）又はＬＤＮ－２１２８５４（右のパネル）で１４日間処理した後のＮＧ２－ＣｒｅＥＲＴＭ：ＲｏｓａｔｄＴｏｍａｔｏ／＋ＭＯＧ３５－５５－ＥＡＥマウスからの脊髄切片の顕微鏡写真。ＮＧ２細胞（赤）とＩＤ２の免疫染色（緑）。核は４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ、青）で染色される。スケールバー、２５μｍ。データは、ｎ＝６（ＥＡＥ＋ＬＤＮ－２１２８５４）及びｎ＝５（ＥＡＥ＋生理食塩水）からの平均±標準誤差である。＊＊ｐ＜０．０１（両側マンホイットニー検定）。Ｈ、ＬＤＮ－２１２８５４又は生理食塩水で１４日間処理したＮＧ２－ＣｒｅＥＲＴＭ：ＲｏｓａｔｄＴｏｍａｔｏ／＋ＭＯＧ３５－５５－ＥＡＥマウスの脊髄切片の顕微鏡写真を使用したｔｄＴｏｍａｔｏ＋ＯＰＣ由来細胞の運命マッピング。ＮＧ２ｔｄＴｏｍａｔｏ＋細胞（赤）及び成熟ＯＬマーカーＧＳＴ－ｐｉ（緑、上のパネル）又はアストロサイトマーカーＧＦＡＰ（緑、下のパネル）の免疫染色。スケールバー、５０μｍ（上のパネル）及び２０μｍ（下のパネル）。データは、ｎ＝６（ＥＡＥ＋ＬＤＮ－２１２８５４）及びｎ＝５（ＥＡＥ＋生理食塩水）からの平均±標準誤差。＊＊ｐ＜０．０１（両側マン－ホイットニー検定）。
【図5】補足図１。ＭＯＧ３５－５５－ＥＡＥのＮＧ２ｃｒｅＥＲＴＭ：ＲｏｓａｔｄＴｏｍａｔｏ／＋：Ｃｘ３ｃｒ１ＧＦＰ／＋マウスにおけるＮＧ２系統細胞及びミクログリアのｉｎ ｖｉｖｏ ２Ｐイメージング及びバルクＲＮＡ－ｓｅｑ解析のワークフロー。
【図6】補足図２Ａ～２Ｃ。ＥＡＥの様々な段階における神経血管界面のＮＧ２細胞及びミクログリアのｉｎ ｖｉｖｏ ２Ｐイメージング。ＮＧ２ｃｒｅＥＲＴＭ：ＲｏｓａｔｄＴｏｍａｔｏ／＋：Ｃｘ３ｃｒ１ＧＦＰ／＋年齢を一致させた健康な対照マウスのＮＧ２細胞（赤、上のパネル）、ミクログリア（緑、下のパネル）、及び血管系（青、７０ｋＤａオレゴングリーンデキストラン）のｉｎ ｖｉｖｏ ２Ｐ最大値投影画像、臨床徴候のピーク時（ピークＥＡＥ、平均スコア３）及び慢性ＥＡＥ時（平均臨床スコア２．１）。スケールバー、１００μｍ。ピーク時（ｎ＝５マウス）及び慢性（ｎ＝６マウス）ＥＡＥにおけるＮＧ２クラスターとミクログリアクラスターの共局在の定量化。値は平均値±標準誤差、＊＊ｐ＜０．０１（両側マン－ホイットニー検定）。
【図7】補足図２Ｂ、ＮＧ２ｃｒｅＥＲＴＭ：ＲｏｓａｔｄＴｏｍａｔｏ／＋：Ｃｘ３ｃｒ１ＧＦＰ／＋年齢を一致させた健康な対照マウスのＮＧ２細胞（赤）及び血管系（青、７０ｋＤａオレゴングリーンデキストラン）のｉｎ ｖｉｖｏ ２Ｐ最大値投影画像、臨床徴候のピーク時（ピークＥＡＥ、平均スコア３）及び慢性ＥＡＥ時（平均臨床スコア２．１）。スケールバー、５０μｍ。慢性ＥＡＥにおける最も近い血管からのＮＧ２クラスターの距離の定量化（６匹のマウスの４５個のクラスターからのデータ）。対照条件のＮＧ２ｔｄＴｏｍａｔｏ＋周皮細胞は白い矢印で示されている。
【図8】補足図２Ｃ、ＮＧ２－ＣｒｅＥＲＴＭ：ＲｏｓａｔｄＴｏｍａｔｏ／＋：Ｃｘ３ｃｒ１ＧＦＰ／＋マウスの脊髄実質内の血管系（青、７０ｋＤａオレゴングリーンデキストラン）に関連したｔｄＴｏｍａｔｏ＋（赤）周皮細胞（左のパネル）及びＯＬ系統細胞のｉｎ ｖｉｖｏ ２Ｐ最大値投影。スケールバー、２０μｍ。
【図9】補足図３Ａ～３Ｃ。ＥＡＥの様々な段階での内皮活性化。Ａ、ＶＣＡＭ－１について免疫染色した対照、ピークＥＡＥ及び慢性ＥＡＥのＮＧ２－ＣｒｅＥＲＴＭ：ＲｏｓａｔｄＴｏｍａｔｏ／＋マウスの腹側脊髄切片の顕微鏡写真。赤い矢印は血管のＶＣＡＭ－１発現を示す。赤いアステリスクはびまん性ＶＣＡＭ－１陽性を示す。対照、ピークＥＡＥ及び慢性ＥＡＥの腹側脊髄におけるＶＣＡＭ－１免疫反応性の定量化。スケールバー、５０μｍ。値は平均±標準誤差、＊＊ｐ＜０．０５（ダネットの多重比較検定による一元配置分散分析）。
【図10】補足図３Ｂ、対照のＮＧ２－ＣｒｅＥＲＴＭ：ＲｏｓａｔｄＴｏｍａｔｏ／＋マウスの腹側脊髄切片の顕微鏡写真、ＰＬＶＡＰについて免疫染色したピークＥＡＥ及び慢性ＥＡＥ。赤い矢印は血管のＰＬＶＡＰ発現を示す。赤いアステリスクはびまん性ＰＬＶＡＰ陽性を示す。スケールバー、５０μｍ。対照、ピークＥＡＥ及び慢性ＥＡＥにおける腹側脊髄のＰＬＶＡＰ＋血管の定量化。値は平均±標準誤差、＊ｐ＜０．０５（テューキーの多重比較検定による一元配置分散分析）。
【図11】補足図３Ｃ、ＮＧ２クラスター領域のＣＮＳ柔組織には、活性化した内皮細胞を有する炎症を起こした脊髄血管が見られる。ここに示されているのは、正常なＢＢＢ血管の非常に薄い内皮と比較して厚い、活性化した内皮（黒い矢印）である。これらの活性化した内皮は小さい突起（赤い矢印）を形成し、これは血管内の白血球（黒い矢印）と接触する。
【図12】補足図４Ａ～４Ｂ。慢性ＥＡＥにおけるフィブリノーゲンの沈着及びミエリン破壊に関連するＮＧ２細胞クラスター。Ａ、フィブリノーゲンについて免疫染色した（緑色）慢性ＥＡＥのＮＧ２－ＣｒｅＥＲＴＭ：ＲｏｓａｔｄＴｏｍａｔｏ／＋：Ｃｘ３ｃｒ１ＧＦＰ／＋マウスの腹側脊髄切片の顕微鏡写真。ＮＧ２ｔｄＴｏｍａｔｏ＋細胞（赤色）は、フィブリノーゲン沈着部位にクラスター化する。ここでは、マージチャネル内に黄色のＲＯＩ（白色の矢印）で示されている。スケールバー、５０μｍ。
【図13】補足図４Ｂ、ＮＧ２細胞クラスターの領域及びクラスターのない領域における慢性ＥＡＥのＮＧ２－ＣｒｅＥＲＴＭ：ＲｏｓａｔｄＴｏｍａｔｏ／＋：Ｃｘ３ｃｒ１ＧＦＰ／＋マウスのＮＧ２ｔｄＴｏｍａｔｏ＋細胞（赤）及びミエリン（緑）のｉｎ ｖｉｖｏ ２Ｐ最大値投影画像。注目すべき重要な点は、ミエリン鞘は、ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ Ｄｅｅｐ Ｒｅｄ遠赤色蛍光色素（ａｂｓ／ｅｍ約６４４／６６５ｎｍ）で標識されており、ここでは緑色で擬似的に着色されていることである。ここでは、破壊されたミエリン又はミエリン小胞はＮＧ２細胞クラスター領域において白い矢印で示され、正常に見えるミエリンは非クラスター領域において白い矢印で示されている。スケールバー、２０μｍ。
【図14】補足図５Ａ～５Ｃ。ＮＧ２細胞のＦＡＣＳ分離。Ａ、バルクＲＮＡ配列に対するＥＡＥ（ｎ＝３）及び健康な対照マウス（ｎ＝３）の脊髄からのＮＧ２ｔｄＴｏｍａｔｏ＋細胞のゲーティング戦略の代表的なフローサイトメトリープロット。
【図16】補足図５Ｃ、代表的なフローサイトメトリー等高線プロット及び生存ＰＤＧＦＲα＋細胞の表面ＭＨＣＩＩの定量化。データは１群あたりｎ＝５からのものである（平均±標準誤差）＊＊ｐ＜０．０１、（両側マンホイットニー検定）。細胞集団のパーセントはゲート（Ａ～Ｃ）の上にリストされている。
【図17】補足図６Ａ～６Ｃ。対照及びピークＥＡＥにおけるＮＧ２ｔｄＴｏｍａｔｏ＋細胞間のオリゴデンドログリア系列細胞と周皮細胞の比率。Ａ、対照及びピークＥＡＥのＮＧ２－ＣｒｅＥＲＴＭ：ＲｏｓａｔｄＴｏｍａｔｏ／＋マウスの腹側脊髄切片の顕微鏡写真。ＮＧ２ｔｄＴｏｍａｔｏ＋細胞（赤）をＯＬＩＧ２（緑）及びＰＤＧＦＲβ（遠赤チャンネルで染色、ここでは青で擬似着色）について免疫染色した。ＮＧ２ｔｄＴｏｍａｔｏ＋ＯＬＩＧ２＋細胞は白い矢印で示されている。ＮＧ２ｔｄＴｏｍａｔｏ＋ＰＤＧＦＲβ＋細胞は白いアステリスクで示されている。ＮＧ２ｔｄＴｏｍａｔｏ＋ＯＬＩＧ２－ＰＤＧＦＲβ－細胞は白い矢印で示されている。スケールバー、２０μｍ。
【図19】同上。
【発明を実施するための形態】
【0011】
発明の詳細な説明
本明細書に記載される方法及び組成物の実施は、別段の指示がない限り、医薬化学、薬剤製剤技術、投与計画、分子生物学及び生化学の従来の技術を使用することができ、これらのすべては当業者の技術の範囲内である。適切な技術の具体的な例は、本明細書の実施例を参照することによって得ることができる。
本明細書に記載される方法及び組成物の実施は、別段の指示がない限り、医薬化学、薬剤製剤技術、投与計画、分子生物学及び生化学の従来の技術を使用することができ、これらのすべては当業者の技術の範囲内である。適切な技術の具体的な例は、本明細書の実施例を参照することによって得ることができる。
【0012】
以下の説明では、本発明のより完全な理解を提供するために、多くの具体的な詳細が記載される。しかしながら、当業者には、本発明はこれらの特定の詳細の１つ以上がなくても実施できることが明らかであろう。他の場合には、本発明を分かりにくくすることを避けるために、当業者によく知られている／利用可能な特徴及び手順については説明していない。
【0013】
略語
２Ｐ＝２光子；ＢＢＢ＝血液脳関門；ＢＭＰ＝骨形成タンパク質；ＣＳＰＧ＝コンドロイチン硫酸プロテオグリカン；ＤＥＧ＝差次的発現遺伝子；ＥＡＥ＝実験的自己免疫性脳脊髄炎；ＧＳＥＡ＝遺伝子セットエンリッチメント解析；ＧＯ＝遺伝子オントロジー；ＧＳＴ－ｐｉ＝グルタチオンｓ－トランスフェラーゼ－ｐｉ；ＭＨＣＩＩ＝主要組織適合遺伝子複合体クラスＩＩ；ＭＯＧ＝ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質；ＮＯＤ＝非肥満糖尿病；ＯＬ＝オリゴデンドロサイト；ＯＰＣ＝オリゴデンドロサイト前駆細胞；ＲＮＡ－ｓｅｑ＝ＲＮＡシーケンス；ＳＢＥＭ＝シリアルブロックフェイス電子顕微鏡法；ＴＦＰＩ＝組織因子経路阻害物質；ＴＧＦ－β＝トランスフォーミング増殖因子ベータ。
２Ｐ＝２光子；ＢＢＢ＝血液脳関門；ＢＭＰ＝骨形成タンパク質；ＣＳＰＧ＝コンドロイチン硫酸プロテオグリカン；ＤＥＧ＝差次的発現遺伝子；ＥＡＥ＝実験的自己免疫性脳脊髄炎；ＧＳＥＡ＝遺伝子セットエンリッチメント解析；ＧＯ＝遺伝子オントロジー；ＧＳＴ－ｐｉ＝グルタチオンｓ－トランスフェラーゼ－ｐｉ；ＭＨＣＩＩ＝主要組織適合遺伝子複合体クラスＩＩ；ＭＯＧ＝ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質；ＮＯＤ＝非肥満糖尿病；ＯＬ＝オリゴデンドロサイト；ＯＰＣ＝オリゴデンドロサイト前駆細胞；ＲＮＡ－ｓｅｑ＝ＲＮＡシーケンス；ＳＢＥＭ＝シリアルブロックフェイス電子顕微鏡法；ＴＦＰＩ＝組織因子経路阻害物質；ＴＧＦ－β＝トランスフォーミング増殖因子ベータ。
【0014】
説明
ＭＢＰ＋オリゴデンドロサイトの単一読み取りによるＯＰＣからなる再ミエリン化アッセイは、病変環境に存在する再ミエリン化の外因性阻害物質のスクリーニングにも、ＧＦＡＰ＋アストロサイトへの細胞運命スイッチのスクリーニングにも適していない。
ＭＢＰ＋オリゴデンドロサイトの単一読み取りによるＯＰＣからなる再ミエリン化アッセイは、病変環境に存在する再ミエリン化の外因性阻害物質のスクリーニングにも、ＧＦＡＰ＋アストロサイトへの細胞運命スイッチのスクリーニングにも適していない。
【0015】
外因性阻害物質の存在下で再ミエリン化を促進する化合物を同定するスクリーニング（ＯＰＣ－Ｘ）を開発することにより、ミエリン化促進薬がフィブリノーゲンによる再ミエリン化の外因性阻害をレスキューしないことが示された。対照的に、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）受容体遮断は、多発性硬化症の慢性モデルにおいて強力な治療効果をもたらし、アストロサイトの細胞運命を抑制しながら、ミエリン形成オリゴデンドロサイトを促進することによって阻害性フィブリノーゲン効果をレスキューし、ミエリン化促進前駆ニッチを回復させた。したがって、フィブリノーゲンによる不完全なＯＰＣ分化は、既知のミエリン化促進化合物に対して抵抗性であり、これは、ＢＭＰシグナル伝達経路の遮断により、血管損傷を伴う神経炎症性病変における外因性阻害を克服することで再ミエリン化効果を高める可能性があることを示唆している。
【0016】
このアッセイは、ａ）フィブリン／フィブリノーゲンによる再ミエリン化の阻害を克服する、ｂ）炎症性分子、サイトカインなどの他の外因性阻害物質による再ミエリン化の阻害を克服する、ｃ）線維性アストロサイトの生成を阻害する、及びｄ）オリゴデンドロサイト前駆細胞（ＯＰＣ）又は神経前駆細胞（ＮＰＣ）などの他の幹細胞のアストロサイトへの細胞運命スイッチを阻害する、抗体、化合物、小分子、ペプチドなどのスクリーニングを含む、多くの目的に使用することができる。
【0017】
本明細書で提供されるアッセイは、以下を含むいくつかの利点を提供する。１）疾患に関連した再ミエリン化阻害をレスキューできる薬剤のスクリーニング及び発見；２）疾患関連外因性阻害物質としてのフィブリン／フィブリノーゲン用に最適化されている；３）フィブリン／フィブリノーゲンに加えて、又はフィブリン／フィブリノーゲンの代わりに他の外因性阻害物質との使用に適合させることができる；４）単一のアッセイでミエリン形成細胞とアストロサイトの両方の検査が可能になる。
【0018】
フィブリン／フィブリノーゲンに加えて、又はその代わりに、他の外因性阻害物質としては、限定するものではないが、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（Ｋｅｏｕｇｈ ｅｔ ａｌ．，２０１６）、ヒアルロナン（Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ ｅｔ ａｌ．，２０１８）、フィブロネクチン凝集体（Ｓｔｏｆｆｅｌｓ ｅｔ ａｌ．，２０１３）、ミエリンデブリ（Ｋｏｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．、２００６）、炎症性サイトカイン（例えば、可溶性ＴＮＦ－α（Ｋａｒａｍｉｔａ ｅｔ ａｌ．，２０１７）、インターフェロン－ガンマ（Ｋｉｒｂｙ ｅｔ ａｌ．，２０１９））、骨形成タンパク質（Ｍａｂｉｅ ｅｔ ａｌ．，１９９７）、エンドセリン－１（Ｈａｍｍｏｎｄ ｅｔ ａｌ．，２０１４）、セマフォリン（Ｓｙｅｄ ｅｔ ａｌ．，２０１１）、環境毒素及びアルコール／タバコ／違法薬物及び／又は娯楽用薬物（Ｆｏｒｂｅｓ ａｎｄ Ｇａｌｌｏ，２０１７）が挙げられる。
【0019】
本明細書に記載のアッセイ／スクリーニングに使用する細胞としては、限定するものではないが、神経幹／前駆細胞（成人及び胎児／新生児）、放射状グリア細胞（成人及び胎児／新生児）、小脳顆粒ニューロン前駆細胞、神経堤幹／前駆細胞、血管／内皮の幹／前駆細胞、臓器幹／前駆細胞（心臓、肝臓、肺、腎臓、骨格筋、皮膚、骨、網膜）、間葉系幹／前駆細胞、胎盤幹／前駆細胞、胚性幹細胞及び／又は人工多能性幹細胞（及びＥＳＣ／ｉＰＳＣ由来の細胞）及びがん／腫瘍関連幹細胞が挙げられる。
【0020】
そのようなスクリーニング／アッセイは、ＢＢＢ破壊やフィブリン沈着などを伴う神経疾患（Ｐｅｔｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１８）、アルツハイマー病、加齢に伴う認知症、外傷性脳及び脊髄損傷、新生児及び早産児の脳損傷、くも膜下／脳室内出血、脳卒中、感染症、筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン病、ハンチントン病、ＨＩＶ脳炎、統合失調症や双極性疾患などの精神神経疾患、がん、アテローム性動脈硬化症／心血管疾患、網膜症／黄斑変性症、慢性肺疾患、末梢自己免疫疾患（例えば、関節リウマチ、大腸炎、狼瘡）、上皮間葉移行（ＥＭＴ）及び多発性硬化症（ＭＳ；例えば、フィブリノーゲンが豊富な抑制性のＭＳ病変環境を克服する薬剤は、ＭＳに切実に必要とされている代替治療手段を提供し得る）を含むがこれらに限定されない多くの状態／疾患の治療のための治療薬／分子を同定するために使用することができる
試験薬剤の使用
本発明のアッセイは、外因性阻害を阻害する候補治療薬を同定するために使用される。これには、新しい薬剤の試験と、既知の化合物（合成、組換え、又は天然化合物を含む）の効果を試験するアッセイが含まれる。
試験薬剤の使用
本発明のアッセイは、外因性阻害を阻害する候補治療薬を同定するために使用される。これには、新しい薬剤の試験と、既知の化合物（合成、組換え、又は天然化合物を含む）の効果を試験するアッセイが含まれる。
【0021】
薬学分野では、標的に対する結合親和性と有効性が必ずしも相関するわけではないこと、及び、試験薬剤によってもたらされる細胞ベースの活性変化の同定は、単に親和性（例えば、ミクログリア受容体への薬剤の結合）によって同定される薬剤と比較して、治療活性の改善された機能的予測因子であることが知られている。
【0022】
特定の態様では、本発明のアッセイは、活性化フィブリンを介したシグナル伝達のｉｎ ｖｉｖｏ調節と相関する。本発明で使用するための細胞ベースのアッセイの例としては、限定するものではないが、ハイスループット結合スクリーニング；細胞の活性化、増殖、分化、壊死及び／又はアポトーシスを測定するアッセイ；フローサイトメトリーアッセイ；標識又はターンオーバーを測定する代謝アッセイ；位相差及び蛍光顕微鏡法；受容体リン酸化及び／又はターンオーバー；細胞シグナル伝達アッセイ；免疫組織化学研究；レポーター遺伝子アッセイ、及び細胞内分画と局在化が挙げられる。
【0023】
生化学的アッセイを使用して、本発明の細胞ベースのアッセイ法において結合と有効性を相関させることもできる。これらには、限定するものではないが、分光測光アッセイ、蛍光アッセイ、熱量測定アッセイ、化学発光アッセイ、放射分析、クロマトグラフィーアッセイ、比色アッセイ、及び基質特異性阻害剤キナーゼアッセイが挙げられる。具体的な例としては、ルシフェラーゼアッセイ（ホタルルシフェラーゼタンパク質がルシフェリンの酸化を触媒し、その反応で光が発生する。これはプロモーター活性やトランスフェクション効率を測定するためのレポーター遺伝子として頻繁に使用される）；電気泳動；気液クロマトグラフィー；及びフォースター共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）がある。
【0024】
試験薬剤の機能的活性を確認するために、本発明の試験薬剤の治療有効量を対象（神経学的病状の動物モデルを含む）に投与して、本発明のアッセイにおける同定後、そのｉｎ ｖｉｖｏ活性を確認することができる。「治療有効用量又は量」又は「有効量」とは、投与された場合に陽性の治療反応をもたらす試験薬剤の量を意味する。本発明のいくつかの実施形態では、治療有効用量は、約０．１．ｍｕ．ｇ／ｋｇ～約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約０．００１ｍｇ／ｋｇ～約５０ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約３０ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ～約２５ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ～約２０ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ～約１５ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ～約１２ｍｇ／ｋｇ、約７ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、又はその中の任意の値の範囲内である。治療方法は、治療有効用量の単回投与又は治療有効用量の複数回投与を含み得ることが認識される。
【0025】
試験薬剤は、所望の治療反応を促進するための所望の治療用量を供給するために投与される。「所望の治療反応」とは、状態又は状態に関連する症状の改善を意味する。投与経路の例には、静脈内、動脈内、冠動脈内、非経口、皮下、真皮下、皮下、腹腔内、心室／脳室内注入、注入カテーテル、バルーンカテーテル、ボーラス注射、手術中の組織表面への直接適用、又は他の好都合な経路が含まれる。
【0026】
試験薬剤は、薬学的に許容される担体と組み合わせて、溶液、懸濁液、又は乳濁液などの単位用量で製剤化することができる。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」は、薬剤投与に適合するあらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤などを含むことを意図している。適切な担体は、この分野の標準的な参考文献であるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓの最新版に記載されており、この文献は参照により本明細書に組み込まれる。そのような担体又は希釈剤の好ましい例としては、限定するものではないが、水、生理食塩水、リンゲル液、ブドウ糖溶液、及び５％ヒト血清アルブミンが挙げられる。細胞を送達するためのそのような媒体及び薬剤の使用は、当技術分野でよく知られている。従来の媒体又は薬剤が本明細書で提供される細胞又はポリペプチドと不適合である場合を除き、組成物中でのそれらの使用が想定される。補助的な活性化合物を試験薬剤に組み込むこともできる。
【0027】
そのような投与に使用される溶液又は懸濁液には、希釈用の水、生理食塩水、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール又は他の合成溶媒などの滅菌希釈剤；ベンジルアルコールやメチルパラベンなどの抗菌剤；アスコルビン酸や亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸などのキレート剤；酢酸塩、クエン酸塩、リン酸塩などの緩衝剤、及び塩化ナトリウムやブドウ糖などの張度調整剤などの他の成分が含まれ得る。ｐＨは、塩酸や水酸化ナトリウムなどの酸又は塩基で調整できる。組成物は、ガラス又はプラスチック製のアンプル、使い捨て注射器、又は複数回投与用バイアルに封入することができる。
【0028】
注射用に適した試験薬剤には、滅菌水溶液（水溶性の場合）又は分散液、及び滅菌注射用溶液又は分散液を即時調製するための滅菌粉末が含まれる。静脈内投与の場合、適切な担体には生理食塩水、静菌水、又はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が含まれる。いずれの場合も、組成物は無菌でなければならず、可能な限り流体である必要がある。それは製造及び保管の条件下で安定していなければならず、細菌や真菌などの微生物の汚染作用から保存されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなど）、及びそれらの適切な混合物を含む溶媒又は分散媒であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用、分散液の場合には必要な粒径の維持、及び界面活性剤の使用によって維持することができる。微生物の作用の抑制は、様々な抗菌剤や抗真菌剤によって達成できる。
【0029】
注射可能な組成物の持続的な吸収は、吸収を遅らせる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを組成物中に含めることによってもたらされ得る。無菌の注射用溶液は、選択された成分の組み合わせを含む適切な溶媒に必要な量の活性薬剤を組み込み、その後フィルター滅菌することによって調製できる。通常、分散液は、基本的な分散媒及び上に列挙したものからの必要な他の成分を含有する滅菌ビヒクルに活性薬剤を組み込むことによって調製される。無菌注射用溶液を調製するための無菌粉末の場合、調製方法は真空乾燥及び凍結乾燥であり、事前に滅菌濾過した溶液から有効成分と任意の追加の所望の成分の粉末を得る。多くの場合、等張剤を含めることが好ましいであろう。
【0030】
試験薬剤を送達するために様々な送達方法を使用することができ、部分的には薬剤及びその生物学的利用能に依存する。例えば、生物学的に利用可能な小分子又は他の薬剤は経口投与され得るが、タンパク質ベースの薬剤は通常（ただし必ずではない）、非経口投与される。特定の薬剤は全身的に投与され得るが、他の薬剤は局所送達の方がより有益である場合がある。送達方法は、本明細書を読めば当業者には明らかであり、試験薬剤の特定の特性を考慮して決定することができる。
【0031】
試験薬剤の有効量は、所望の効果の性質、治療の頻度、任意の同時治療、健康状態、レシピエントの体重などに応じて様々であり得ることが理解される。例えば、Ｂｅｒｋｏｗら編、Ｍｅｒｃｋ Ｍａｎｕａｌ、第１６版、Ｍｅｒｃｋ ａｎｄ Ｃｏ．、ニュージャージー州ラーウェイ（１９９２）；Ｇｏｏｄｍａｎら編、Ｇｏｏｄｍａｎ ａｎｄ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、第８版、Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、ニューヨーク州エルムズフォード（１９９０）；Ａｖｅｒｙ‘ｓ Ｄｒｕｇ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、第３版、ＡＤＩＳ Ｐｒｅｓｓ，ＬＴＤ．，Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ、メリーランド州ボルチモア（１９８７）、Ｅｂａｄｉ，Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，Ｌｉｔｔｌｅ，Ｂｒｏｗｎ ａｎｄ Ｃｏ．、ボストン（１９８５）、Ｋａｔｚｕｎｇ，Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，Ａｐｐｌｅｔｏｎ ａｎｄ Ｌａｎｇｅ、コネチカット州ノーウォーク（１９９２）を参照されたい。これらの参考文献及びこれらの中で引用されている参考文献は、参照により全体が本明細書に組み込まれる。
【0032】
定義
説明を明確にし、簡潔にするために、本明細書では、特徴を同じ又は別の実施形態の一部として説明する場合がある。しかしながら、本発明の範囲には、記載された特徴のすべて又は一部の組み合わせを有する実施形態が含まれ得ることが理解されるであろう。
説明を明確にし、簡潔にするために、本明細書では、特徴を同じ又は別の実施形態の一部として説明する場合がある。しかしながら、本発明の範囲には、記載された特徴のすべて又は一部の組み合わせを有する実施形態が含まれ得ることが理解されるであろう。
【0033】
本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的としており、本発明を限定することを意図したものではない。別様に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。以下の定義は、読み手が本発明を理解するのを助けることを意図しているが、特に指定されない限り、そのような用語の意味を変更したり制限したりすることを意図したものではない。
【0034】
本明細書で使用される不定冠詞「１つ」、「その」、及び「前記」は、文脈上明らかにそうでないことを示していない限り、複数の参照を含むものと理解されるべきである。したがって、例えば、「１つの阻害物質」への言及は、標的分子を阻害する能力を有する１つ又は複数の薬剤を指し、「前記方法」への言及は、当業者に知られている同等の複数のステップ及び複数の方法への言及を含む。
【0035】
本明細書で使用される「及び／又は」という語句は、その語句で結合された要素の「いずれか又は両方」、例えば、ある場合には結合的に存在し、他の場合には分離的に存在する要素を意味すると理解されるべきである。
【0036】
本明細書で使用される「又は」は、上で定義された「及び／又は」と同じ意味を有すると理解されるべきである。例えば、項目のリストを区切る場合、「及び／又は」又は「又は」は包括的である、例えば、多数の項目のうちの少なくとも１つを含むが、複数の項目も含み、任意選択で、追加の未掲載の項目も含むと解釈されるものとする。反対のことが明確に示されている用語、例えば「のうちの１つのみ」や「のうちの正確に１つ」など、あるいは特許請求の範囲で使用される場合は、「からなる」のみ、複数の要素又は要素のリストのうちの１つの要素だけが含まれることを指す。通常、本明細書で使用される「又は」という用語は、「いずれか」、「のうちの１つ」、「のうちの１つのみ」、又は「正確に１つ」などの排他的な用語が前に付いている場合のみ、排他的な選択肢（つまり、「一方又は他方であって両方ではない」）を示すものとして解釈されるものとする。
【0037】
本明細書で使用される場合、「約」という用語は、示された値のプラス又はマイナス１０％を意味する。例えば、約１００は９０～１１０を意味する。
値の範囲が提供される場合、その範囲の上限と下限との間の各中間値と、他の記載された値又は記載された範囲内の中間値が本発明に包含されることが理解される。これらのより小さい範囲の上限及び下限は、独立してより小さい範囲に含まれてもよく、記載された範囲内で特に除外される制限を受ける場合も含め、本発明の範囲内にも包含される。記載された範囲に上限・下限の一方又は両方が含まれる場合、これらの含まれる上限・下限の両方のうちいずれかを除く範囲も本発明に含まれる。
値の範囲が提供される場合、その範囲の上限と下限との間の各中間値と、他の記載された値又は記載された範囲内の中間値が本発明に包含されることが理解される。これらのより小さい範囲の上限及び下限は、独立してより小さい範囲に含まれてもよく、記載された範囲内で特に除外される制限を受ける場合も含め、本発明の範囲内にも包含される。記載された範囲に上限・下限の一方又は両方が含まれる場合、これらの含まれる上限・下限の両方のうちいずれかを除く範囲も本発明に含まれる。
【0038】
「小分子」という用語は、医薬品で一般に使用される有機分子に匹敵するサイズの分子を指す。この用語には、生体高分子（例えば、タンパク質、核酸など）は含まれない。有機小分子には、最大約５０００Ｄａまで、最大２０００Ｄａまで、及び最大約１０００Ｄａまでのサイズ範囲のものが含まれる。
【0039】
本明細書で使用される「試験薬剤」は、疾患又はその症状を治療するための候補である任意の薬剤を指す。そのような薬剤には、限定するものではないが、ペプチド；タンパク質（誘導体化又は標識されたタンパク質を含む）；抗体又はその断片；小分子；アプタマー；炭水化物及び／又は他の非タンパク質結合部分；天然に存在する結合パートナーの誘導体及び断片；ペプチド模倣薬；及びファーマコフォアが含まれる。
【0040】
「ファーマコフォア」という用語は、本明細書では慣例にとらわれない方法で使用される。この用語は通常、化合物のクラス又は集合の幾何学的及び／又は化学的記述を意味するが、本明細書で使用される場合、この用語は、化合物の三次元物理的形状及び化合物を構成する原子の電気化学的性質によって与えられる特定の生化学的活性又は結合特性を有する化合物を意味する。したがって、本明細書で使用される「ファーマコフォア」という用語は化合物であり、定義された特性を有する化合物の集合を表すものではない。具体的には、「ファーマコフォア」とは、これらの特性を備えた化合物である。
【0041】
実施例
以下の実施例は、当業者に本発明の製造方法及び使用方法の完全な開示及び説明を提供するために提示されるものであり、発明者らが発明とみなすものの範囲を限定することを意図するものではないし、実施例は以下の実験が実施されたすべての又は唯一の実験であることを表し又は暗示することを意図するものでもない。当業者であれば、広い範囲で説明した本発明の趣旨又は範囲から逸脱することなく、特定の態様として示した本発明に多くの変形及び／又は修正を加え得ることが理解されよう。したがって、本態様はあらゆる点で例示的なものであり、限定的なものではないとみなされるべきである。
以下の実施例は、当業者に本発明の製造方法及び使用方法の完全な開示及び説明を提供するために提示されるものであり、発明者らが発明とみなすものの範囲を限定することを意図するものではないし、実施例は以下の実験が実施されたすべての又は唯一の実験であることを表し又は暗示することを意図するものでもない。当業者であれば、広い範囲で説明した本発明の趣旨又は範囲から逸脱することなく、特定の態様として示した本発明に多くの変形及び／又は修正を加え得ることが理解されよう。したがって、本態様はあらゆる点で例示的なものであり、限定的なものではないとみなされるべきである。
【0042】
使用される数値（例えば、量、温度など）の正確性を確保するために努力がはらわれている。しかし、ある程度の実験誤差や偏差は考慮する必要がある。特に指定のない限り、部は重量部であり、分子量は重量平均分子量であり、温度は摂氏度であり、圧力は大気圧又は大気圧付近である。
【0043】
実施例１
再ミエリン化を促進する化合物を発見するためのアッセイ
序論
多発性硬化症（ＭＳ）における治療の進歩への障壁は、疾患の進行段階での再ミエリン化の失敗と軸索喪失の一因となる抑制性病変環境を克服できないことである（１）。血液タンパク質のフィブリノーゲンは、血管損傷後にＣＮＳに沈着する、抑制性病変環境の構成要素である（１）。フィブリノーゲンは、ＣＮＳの炎症、脱髄、及び軸索損傷を促進し、オリゴデンドロサイト前駆細胞（ＯＰＣ）が成熟ミエリン形成オリゴデンドロサイト（ＯＬ）に分化するのをブロックする（２～５）。次に、血管周囲のＯＰＣクラスターは、慢性ＭＳ病変における持続的な血液脳関門（ＢＢＢ）の破壊とフィブリノーゲンの蓄積に寄与し得る（６）。
再ミエリン化を促進する化合物を発見するためのアッセイ
序論
多発性硬化症（ＭＳ）における治療の進歩への障壁は、疾患の進行段階での再ミエリン化の失敗と軸索喪失の一因となる抑制性病変環境を克服できないことである（１）。血液タンパク質のフィブリノーゲンは、血管損傷後にＣＮＳに沈着する、抑制性病変環境の構成要素である（１）。フィブリノーゲンは、ＣＮＳの炎症、脱髄、及び軸索損傷を促進し、オリゴデンドロサイト前駆細胞（ＯＰＣ）が成熟ミエリン形成オリゴデンドロサイト（ＯＬ）に分化するのをブロックする（２～５）。次に、血管周囲のＯＰＣクラスターは、慢性ＭＳ病変における持続的な血液脳関門（ＢＢＢ）の破壊とフィブリノーゲンの蓄積に寄与し得る（６）。
【0044】
フィブリノーゲンが豊富な抑制性のＭＳ病変環境を克服する薬剤の発見は、切実に必要とされているＭＳの代替治療手段を提供するであろう。フィブリノーゲンの治療的枯渇は、脱髄動物モデルにおける再ミエリン化を促進することができるが、出血性合併症の可能性があるため、その臨床使用が制限される可能性がある（２）。最近、ＯＰＣの分化を促進する化合物が、網羅的薬物スクリーニングで同定された。しかし、これらのミエリン促進化合物が、炎症性脱髄におけるミエリン修復に対するフィブリノーゲンの阻害効果を克服できるかどうかは不明である（７～１０）。
【0045】
ここでは、新しいミディアムスループットのフィブリノーゲンＯＰＣ阻害アッセイの開発について説明する。このアッセイでは、最近発見されたミエリン促進化合物のいずれもＯＰＣに対するフィブリノーゲンの影響をレスキューできないことが示されている。ＢＭＰ Ｉ型受容体阻害剤のみが、フィブリノーゲンの存在下でＯＰＣの成熟ＯＬへの分化を回復する。データは、既知のミエリン促進化合物がＭＳ病変環境においてフィブリノーゲンなどの外因性阻害物質を克服できない可能性があること、及びフィブリノーゲン誘導性のＢＭＰシグナル伝達を標的とすることがＭＳの機能回復を促進する代替の治療手段となり得ることを示している。本明細書に記載の新規アッセイは、フィブリノーゲンによるＯＰＣ成熟及び再ミエリン化の阻害を克服する化合物をスクリーニングするために使用することができる。
【0046】
材料及び方法／結果／考察
Ａ．ミディアムスループットのフィブリノーゲン－ＯＰＣ阻害アッセイの開発
アッセイを９６ウェルプレート形式に小型化するために、まずＯＰＣ密度、フィブリノーゲン濃度、染色手順、及び画像解析に使用するプロトコルを最適化した（図１’Ａ）。最適化されたプロトコルでは、初代ラットＯ４＋ＯＰＣをイムノパニングによって単離する。１０ｃｍディッシュあたり約５×１０５個の細胞を播種し、ＯＰＣを増殖させるために３日間インキュベートした。次いで、細胞をＡｃｃｕｔａｓｅを使用して継代し、９６ウェルプレートに５×１０３細胞／ウェルで再播種し、実験前に１日間回復させた。対照条件とフィブリノーゲン条件との間の最適な差異を達成するには、フィブリノーゲンを少なくとも２．５ｍｇ／ｍＬの濃度で添加する必要があった。ＯＰＣを３日間分化させてから、固定とその後の染色手順を行った。ＯＰＣをヘキスト色素（核）、及びＭＢＰ（オリゴデンドロサイト）及びＧＦＡＰ（アストロサイト）に対する抗体で染色した。画像を、Ａｒｒａｙｓｃａｎ ＸＴＩ機器を使用して取得した。ウェル間のばらつきを抑えるために、ウェル表面積の約８０％をカバーする２５枚の画像を１０×対物レンズで撮影した。画像を、ＨＣＳ Ｓｔｕｄｉｏソフトウェアを使用して分析した。総細胞数を、ヘキスト＋核の数に基づいて計算した。ＭＢＰ又はＧＦＡＰのいずれかに対して陽性の全細胞のパーセンテージを定量化するために、細胞体を含むように核マスク（ヘキスト色素）からリングを拡張した。ＭＢＰの場合、核の周囲に十分な大きさのリングを拡張した。緑色蛍光細胞体（ＭＢＰ＋４８８ｎｍ）を伴う核を、総細胞数に対するＭＢＰ＋細胞のパーセンテージとして計算し、赤色細胞体（ＧＦＡＰ＋、５４９又は６４７ｎｍ）を伴う核をＧＦＡＰ＋細胞のパーセンテージとして計算した。
Ａ．ミディアムスループットのフィブリノーゲン－ＯＰＣ阻害アッセイの開発
アッセイを９６ウェルプレート形式に小型化するために、まずＯＰＣ密度、フィブリノーゲン濃度、染色手順、及び画像解析に使用するプロトコルを最適化した（図１’Ａ）。最適化されたプロトコルでは、初代ラットＯ４＋ＯＰＣをイムノパニングによって単離する。１０ｃｍディッシュあたり約５×１０５個の細胞を播種し、ＯＰＣを増殖させるために３日間インキュベートした。次いで、細胞をＡｃｃｕｔａｓｅを使用して継代し、９６ウェルプレートに５×１０３細胞／ウェルで再播種し、実験前に１日間回復させた。対照条件とフィブリノーゲン条件との間の最適な差異を達成するには、フィブリノーゲンを少なくとも２．５ｍｇ／ｍＬの濃度で添加する必要があった。ＯＰＣを３日間分化させてから、固定とその後の染色手順を行った。ＯＰＣをヘキスト色素（核）、及びＭＢＰ（オリゴデンドロサイト）及びＧＦＡＰ（アストロサイト）に対する抗体で染色した。画像を、Ａｒｒａｙｓｃａｎ ＸＴＩ機器を使用して取得した。ウェル間のばらつきを抑えるために、ウェル表面積の約８０％をカバーする２５枚の画像を１０×対物レンズで撮影した。画像を、ＨＣＳ Ｓｔｕｄｉｏソフトウェアを使用して分析した。総細胞数を、ヘキスト＋核の数に基づいて計算した。ＭＢＰ又はＧＦＡＰのいずれかに対して陽性の全細胞のパーセンテージを定量化するために、細胞体を含むように核マスク（ヘキスト色素）からリングを拡張した。ＭＢＰの場合、核の周囲に十分な大きさのリングを拡張した。緑色蛍光細胞体（ＭＢＰ＋４８８ｎｍ）を伴う核を、総細胞数に対するＭＢＰ＋細胞のパーセンテージとして計算し、赤色細胞体（ＧＦＡＰ＋、５４９又は６４７ｎｍ）を伴う核をＧＦＡＰ＋細胞のパーセンテージとして計算した。
【0047】
Ｂ．３８４ウェルフォーマットでのハイコンテントフィブリノーゲン－ＯＰＣ阻害アッセイの開発
我々は、９６ウェルアッセイで確立したアッセイパラメータを使用して、自動化可能な３８４ウェルハイコンテントスクリーニングアッセイを開発した。ＯＰＣを取得し、上記のように培養した。アッセイを３８４ウェルフォーマットに適合させるために、ウェルあたりの様々な細胞密度を試験した。１×１０３細胞／ウェルを最適な細胞数として決定した。細胞をマルチチャンネルピペットを使用して手作業で播種した。Ａｇｉｌｅｎｔ ＢＲＡＶＯリキッドハンドラーを使用して以下のステップを実施した。２４時間の培養後、増殖培地を各ウェルから取り出し、グルコースとピルビン酸ナトリウムを含むＤＰＢＳを加えて簡単に洗浄することで、すべての増殖因子を確実に除去した。ＤＰＢＳ溶液を除去した後、２倍濃度の分化因子＋化合物を含む５０μＬの培地を、予備希釈ポリプロピレンプレートから加えた。１時間のインキュベーション後、２倍濃度のフィブリノーゲンを含む５０μＬの通常培地を、マルチチャンネルピペットを使用して手作業で添加し、溶液を加熱プラットフォーム上に維持した。３日間のインキュベーション後、９６ウェルプレートフォーマットについて記載したのと同じプロトコルに従って細胞を染色するが、プロトコルのすべてのステップでＢｉｏＴｅｋＥＬ４０６リキッドハンドラーを使用する。画像の取得と分析を、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｒｒａｙｓｃａｎ ＸＴＩを使用して上記のように行った。
我々は、９６ウェルアッセイで確立したアッセイパラメータを使用して、自動化可能な３８４ウェルハイコンテントスクリーニングアッセイを開発した。ＯＰＣを取得し、上記のように培養した。アッセイを３８４ウェルフォーマットに適合させるために、ウェルあたりの様々な細胞密度を試験した。１×１０３細胞／ウェルを最適な細胞数として決定した。細胞をマルチチャンネルピペットを使用して手作業で播種した。Ａｇｉｌｅｎｔ ＢＲＡＶＯリキッドハンドラーを使用して以下のステップを実施した。２４時間の培養後、増殖培地を各ウェルから取り出し、グルコースとピルビン酸ナトリウムを含むＤＰＢＳを加えて簡単に洗浄することで、すべての増殖因子を確実に除去した。ＤＰＢＳ溶液を除去した後、２倍濃度の分化因子＋化合物を含む５０μＬの培地を、予備希釈ポリプロピレンプレートから加えた。１時間のインキュベーション後、２倍濃度のフィブリノーゲンを含む５０μＬの通常培地を、マルチチャンネルピペットを使用して手作業で添加し、溶液を加熱プラットフォーム上に維持した。３日間のインキュベーション後、９６ウェルプレートフォーマットについて記載したのと同じプロトコルに従って細胞を染色するが、プロトコルのすべてのステップでＢｉｏＴｅｋＥＬ４０６リキッドハンドラーを使用する。画像の取得と分析を、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｒｒａｙｓｃａｎ ＸＴＩを使用して上記のように行った。
【0048】
考察
分離ごとに利用可能なＯＰＣの数をスケールアップし、増殖後の収量を調製物あたり１５０万細胞から調製物あたり５００万細胞に増やした。増殖は、ＰＤＧＦ－ＡＡ及びＮＴ３を含むＯＰＣ培地において１０ｃｍプレートで３～４日間行うことができる。３７°で約５分間のインキュベーションで細胞の継代を助けるためにＡＣＣＵＴＡＳＥ（商標）を使用することができる。再播種は、９６ウェル又は３８４ウェルプレートに行うことができる。例えば、９６ウェルプレート＝ウェルあたり５０００個の細胞；３８４ウェルプレート＝ウェルあたり１０００個の細胞。再現可能なＯＰＣ分化のため、分化培地中で一定期間（例えば、約３日間）。ＭＢＰ＋細胞へのＯＰＣ分化を阻害し、ＧＦＡＰ＋細胞へのＯＰＣ分化を最大化するために、フィブリノーゲンは、少なくとも約２．５ｍｇ／ｍｌの濃度で使用され得る。
分離ごとに利用可能なＯＰＣの数をスケールアップし、増殖後の収量を調製物あたり１５０万細胞から調製物あたり５００万細胞に増やした。増殖は、ＰＤＧＦ－ＡＡ及びＮＴ３を含むＯＰＣ培地において１０ｃｍプレートで３～４日間行うことができる。３７°で約５分間のインキュベーションで細胞の継代を助けるためにＡＣＣＵＴＡＳＥ（商標）を使用することができる。再播種は、９６ウェル又は３８４ウェルプレートに行うことができる。例えば、９６ウェルプレート＝ウェルあたり５０００個の細胞；３８４ウェルプレート＝ウェルあたり１０００個の細胞。再現可能なＯＰＣ分化のため、分化培地中で一定期間（例えば、約３日間）。ＭＢＰ＋細胞へのＯＰＣ分化を阻害し、ＧＦＡＰ＋細胞へのＯＰＣ分化を最大化するために、フィブリノーゲンは、少なくとも約２．５ｍｇ／ｍｌの濃度で使用され得る。
【0049】
同じプレートで多くの化合物を同時に試験するために、ワークフローを開発した。例えば、２×化合物とそれに続く２×フィブリノーゲンのマルチチャンネル投与を使用すると、インキュベーターの外で化合物とフィブリノーゲンを投与するのに必要な時間を短縮できる。プログラミング及び３８４ウェルフォーマット用のＡｇｉｌｅｎｔ ＢＲＡＶＯリキッドハンドラーを使用すると、培地を移す間の細胞の脱落を最小限に抑えることができる。ＢｉｏＴｅｋＥＬ４０６リキッドハンドラーは、３８４ウェルフォーマットでの免疫染色手順に使用できる。
【0050】
対象とする細胞／細胞成分／タンパク質を、例えば、ＭＢＰ（１：２５０）及びＧＦＡＰ（１：５００）一次抗体、二次蛍光抗体（１：５００）、ヘキスト核色素（２μｇ／ｍＬ）で標識／染色することができ、自動検出に使用することができる。Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｒｒａｙｓｃａｎ ＸＴＩを使用して自動画像取得を実行できる。例えば、１０倍で２５枚の画像を取得することで、各ウェルの定量化される領域を最大化する（９６ウェルプレートウェルのウェル表面積の約８０％をカバー）。一部の領域では細胞が密集する傾向があるため、広い領域が必要である。そのため、ウェル全体の画像化は治療効果をより正確に捉え、定量化におけるウェル間のばらつきを低減する。ＭＢＰ＋細胞やＧＦＡＰ＋細胞などの染色及び標識は、自動定量化できる（定量化方法は、ＨＣＳ Ｓｔｕｄｉｏソフトウェア（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して設計できる）。一例として、ＧＦＡＰ陽性の全細胞の割合を定量化するために、核マスク（ヘキスト色素）から細胞体を含むようにリングを拡張した。ＭＢＰ＋細胞の場合、細胞体を超えて細胞突起を含むようにリングを拡張することで、成熟ＯＬのみが分析に含まれるようにした。リング内で測定された蛍光強度が、二次抗体のみの対照で生成された蛍光強度に対して設定された閾値を超えた場合、細胞はソフトウェアによって陽性と判定された。全体として、この技術によりバイアスが排除され、定量におけるウェル間及びプレート間のばらつきが軽減される。
【0051】
さらに、ここで説明するすべてのステップにより、結果が得られる速度が向上する。９６ウェルプレートの手動画像取得と定量化には１～２週間かかるが、自動画像取得と定量化は１日で実行できる。
【0052】
参考文献
【0053】
【表1-1】
【0054】
【表1-2】
【0055】
実施例２
ＢＭＰ受容体の遮断は再ミエリン化の外因性阻害を克服し、神経血管の恒常性を回復する
序論
ＣＮＳミエリンの再生は、多発性硬化症、新生児脳損傷、脳卒中などのいくつかの神経疾患で失敗する（Ｆｒａｎｋｌｉｎ ａｎｄ Ｆｆｒｅｎｃｈ－Ｃｏｎｓｔａｎｔ，２０１７）。これらの条件では、微小環境における細胞外的合図（ｃｅｌｌ－ｅｘｔｒｉｎｓｉｃ ｃｕｅｓ）は、多能性ＯＰＣが成熟したミエリン産生オリゴデンドロサイト（ＯＬ）に分化するのをブロックすることにより、再ミエリン化を阻害する（Ｆｏｒｂｅｓ ａｎｄ Ｇａｌｌｏ，２０１７）。多発性硬化症のような慢性脱髄疾患における治療の進歩に対する重大な障壁は、この抑制性病変環境を克服して疾患の進行を止めることができないことである（Ｒｅｉｃｈ ｅｔ ａｌ．，２０１８）。ＯＰＣの分化及び再ミエリン化の内因性経路を強化する小分子は、薬物スクリーニングで同定されている（Ｆａｎｃｙ ｅｔ ａｌ．，２０１１；Ｄｅｓｈｍｕｋｈ ｅｔ ａｌ．，２０１３；Ｍｅｉ ｅｔ ａｌ．，２０１４；Ｎａｊｍ ｅｔ ａｌ．，２０１５；Ｍｅｉ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。しかし、これらの薬物は、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＣＳＰＧ）や炎症性サイトカインなどの疾患に関連するＯＰＣ分化の外因性阻害物質を克服できず、高齢のＯＰＣや炎症環境にある多発性硬化症患者のＯＰＣにおけるＯＬ分化を促進することもできなかった（Ｋｅｏｕｇｈ ｅｔ ａｌ．，２０１６；Ｎｅｕｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，２０１９；Ｓｔａｒｏｓｔ ｅｔ ａｌ．，２０２０）。ミエリン化促進化合物が血管透過性が増加した部位の阻害性微小環境を克服できるかどうかは不明のままである。
ＢＭＰ受容体の遮断は再ミエリン化の外因性阻害を克服し、神経血管の恒常性を回復する
序論
ＣＮＳミエリンの再生は、多発性硬化症、新生児脳損傷、脳卒中などのいくつかの神経疾患で失敗する（Ｆｒａｎｋｌｉｎ ａｎｄ Ｆｆｒｅｎｃｈ－Ｃｏｎｓｔａｎｔ，２０１７）。これらの条件では、微小環境における細胞外的合図（ｃｅｌｌ－ｅｘｔｒｉｎｓｉｃ ｃｕｅｓ）は、多能性ＯＰＣが成熟したミエリン産生オリゴデンドロサイト（ＯＬ）に分化するのをブロックすることにより、再ミエリン化を阻害する（Ｆｏｒｂｅｓ ａｎｄ Ｇａｌｌｏ，２０１７）。多発性硬化症のような慢性脱髄疾患における治療の進歩に対する重大な障壁は、この抑制性病変環境を克服して疾患の進行を止めることができないことである（Ｒｅｉｃｈ ｅｔ ａｌ．，２０１８）。ＯＰＣの分化及び再ミエリン化の内因性経路を強化する小分子は、薬物スクリーニングで同定されている（Ｆａｎｃｙ ｅｔ ａｌ．，２０１１；Ｄｅｓｈｍｕｋｈ ｅｔ ａｌ．，２０１３；Ｍｅｉ ｅｔ ａｌ．，２０１４；Ｎａｊｍ ｅｔ ａｌ．，２０１５；Ｍｅｉ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。しかし、これらの薬物は、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＣＳＰＧ）や炎症性サイトカインなどの疾患に関連するＯＰＣ分化の外因性阻害物質を克服できず、高齢のＯＰＣや炎症環境にある多発性硬化症患者のＯＰＣにおけるＯＬ分化を促進することもできなかった（Ｋｅｏｕｇｈ ｅｔ ａｌ．，２０１６；Ｎｅｕｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，２０１９；Ｓｔａｒｏｓｔ ｅｔ ａｌ．，２０２０）。ミエリン化促進化合物が血管透過性が増加した部位の阻害性微小環境を克服できるかどうかは不明のままである。
【0056】
多発性硬化症では、血液脳関門（ＢＢＢ）の破壊により、血液凝固因子フィブリノーゲンがＣＮＳに入ることが可能になる（Ｐｅｔｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１８）。フィブリノーゲン沈着は、多発性硬化症の発症における最も初期の事象の１つであり、慢性脱髄病変では持続するが、再ミエリン化病変では最小限であり、正常な白質には存在しない（Ｖｏｓ ｅｔ ａｌ．，２００５；Ｐｅｔｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１７；Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，２０１８）。進行性多発性硬化症では、フィブリノーゲンは皮質及び脳脊髄液で検出され、神経細胞及び皮質の喪失と相関している（Ｙａｔｅｓ ｅｔ ａｌ．，２０１７；Ｍａｇｌｉｏｚｚｉ ｅｔ ａｌ．，２０１９）。脱髄損傷モデルでは、フィブリノーゲンの遺伝的又は薬理学的枯渇は、ＣＮＳ及び末梢神経系における再ミエリン化を促進する（Ａｋａｓｓｏｇｌｏｕ ｅｔ ａｌ．，２００２；Ｐｅｔｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１７）。フィブリノーゲンは、ＯＰＣ及び神経前駆細胞におけるＢＭＰ受容体シグナル伝達を活性化することで、それぞれ再ミエリン化及び神経形成を阻害する（Ｐｅｔｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１７；Ｐｏｕｓ ｅｔ ａｌ．，２０２０）。フィブリノーゲンは、ＢＭＰ受容体活性化を介してＮＧ２＋（ＣＳＰＧ－４によってコードされる）ＯＰＣのアストロサイトへの細胞運命スイッチを誘導する（Ｐｅｔｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１７）。これは、神経血管ニッチにおけるＯＰＣ誘導性アストロサイト形成の誘導による再ミエリン化の外因性阻害におけるフィブリノーゲンの役割を示唆している。さらに、フィブリノーゲンがフィブリンに変換されると、ミクログリア及びマクロファージの酸化ストレスと炎症促進性分極化が誘発され（Ｒｙｕ ｅｔ ａｌ．，２０１５；Ｍｅｎｄｉｏｌａ ｅｔ ａｌ．，２０２０）、これはＯＰＣにとって有毒であり、再ミエリン化不全の一因となる（Ｂａｃｋ ｅｔ ａｌ．，１９９８；Ｍｉｒｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。これは、慢性神経疾患における抑制性微小環境の維持における血管透過性の増加とフィブリノーゲン沈着の役割を示唆している。しかし、ＢＢＢ破壊部位における神経血管ニッチのリモデリング、及びそれと再ミエリン化不全との関係は依然として十分に理解されていない。
【0057】
ここでは、クレマスチンなどの既知のミエリン化促進化合物では克服できなかったＯＰＣのシグナル伝達経路が、フィブリノーゲンによる再ミエリン化の外因性阻害により活性化されることが示されている。対照的に、ＢＭＰシグナル伝達の阻害は、慢性ＥＡＥモデルにおいてＯＰＣの細胞運命を成熟ＯＬに治療効果とともに回復させることにより、再ミエリン化に対するフィブリノーゲンの阻害効果をレスキューした。トランスクリプトミクスと、慢性神経炎症性病変における電子顕微鏡法と同期させたｉｎ ｖｉｖｏ２光子（２Ｐ）イメージングを統合することにより、ＯＰＣは、活性なＢＭＰシグナル伝達及び制限された再ミエリン化を伴うフィブリノーゲン沈着部位に蓄積することが示されている。したがって、既知のミエリン化促進化合物は、フィブリノーゲンによるＢＭＰ受容体活性化及び不完全なＯＰＣ分化を克服できず、これはＢＭＰ経路阻害が脳血管損傷部位におけるミエリン化促進前駆ニッチの再生能力を高める可能性があることを示唆している。
【0058】
材料及び方法
動物
Ｃ５７ＢＬ／６、ＮＯＤ、Ｂ６．Ｃｇ－Ｔｇ（Ｃｓｐｇ４－ｃｒｅ／Ｅｓｒ１＊）ＢＡｋｉｋ／Ｊ（ＮＧ２－ＣｒｅＥＲＴＭ）１、Ｂ６．Ｃｇ－Ｇｔ（ＲＯＳＡ）２６Ｓｏｒｔｍ１４（ＣＡＧ－ｔｄＴｏｍａｔｏ）Ｈｚｅ／Ｊ（ＲｏｓａｔｄＴｏｍａｔｏ）２、及びＢ６．１２９Ｐ－Ｃｘ３ｃｒ１ｔｍ１Ｌｉｔｔ／Ｊ（ＣＸ３ＣＲ１ＧＦＰ）３マウスを、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入した。マウスを１ケージあたり５匹のグループで、標準的な飼育条件と１２時間の明暗サイクル下で飼育した。同腹子を持つＳｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙ雌ラットをＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒから購入し、Ｐ１～Ｐ７雄及び雌ラットをＯＰＣ分離に使用した。すべての動物プロトコルは、カリフォルニア大学サンフランシスコ校の動物研究委員会によって承認され、国立衛生研究所及びＡＲＲＩＶＥガイドラインに従った。
動物
Ｃ５７ＢＬ／６、ＮＯＤ、Ｂ６．Ｃｇ－Ｔｇ（Ｃｓｐｇ４－ｃｒｅ／Ｅｓｒ１＊）ＢＡｋｉｋ／Ｊ（ＮＧ２－ＣｒｅＥＲＴＭ）１、Ｂ６．Ｃｇ－Ｇｔ（ＲＯＳＡ）２６Ｓｏｒｔｍ１４（ＣＡＧ－ｔｄＴｏｍａｔｏ）Ｈｚｅ／Ｊ（ＲｏｓａｔｄＴｏｍａｔｏ）２、及びＢ６．１２９Ｐ－Ｃｘ３ｃｒ１ｔｍ１Ｌｉｔｔ／Ｊ（ＣＸ３ＣＲ１ＧＦＰ）３マウスを、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入した。マウスを１ケージあたり５匹のグループで、標準的な飼育条件と１２時間の明暗サイクル下で飼育した。同腹子を持つＳｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙ雌ラットをＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒから購入し、Ｐ１～Ｐ７雄及び雌ラットをＯＰＣ分離に使用した。すべての動物プロトコルは、カリフォルニア大学サンフランシスコ校の動物研究委員会によって承認され、国立衛生研究所及びＡＲＲＩＶＥガイドラインに従った。
【0059】
ＥＡＥの誘発と臨床スコアリング
活性型ＥＡＥを、９～１０週齢のＮＧ２－ＣｒｅＥＲＴＭ：ＲｏｓａｔｄＴｏｍａｔｏ／＋：Ｃｘ３ｃｒ１ＧＦＰ／＋雌マウスで、最後のタモキシフェン注射から３５～４０日後に、４００μｇの熱不活化結核菌Ｈ３７Ｒａ（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を添加した不完全フロイントアジュバント（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）中７５μｇのＭＯＧ３５－５５ペプチド（ＭＥＶＧＷＹＲＳＰＦＳＲＶＶＨＬＹＲＮＧＫ（配列番号１）；Ａｕｓｐｅｐ）での皮下免疫によって誘発した。免疫化後０日目及び２日目に、マウスに２００ｎｇの百日咳毒素（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を腹腔内注射した。慢性ＮＯＤ ＥＡＥモデルでは、１０～１２週齢のＮＯＤマウスを１５０μｇのＭＯＧ３５－５５ペプチドで免疫し、続いて記載のように０日目と２日目に２００ｎｇの百日咳毒素を投与した４。
活性型ＥＡＥを、９～１０週齢のＮＧ２－ＣｒｅＥＲＴＭ：ＲｏｓａｔｄＴｏｍａｔｏ／＋：Ｃｘ３ｃｒ１ＧＦＰ／＋雌マウスで、最後のタモキシフェン注射から３５～４０日後に、４００μｇの熱不活化結核菌Ｈ３７Ｒａ（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を添加した不完全フロイントアジュバント（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）中７５μｇのＭＯＧ３５－５５ペプチド（ＭＥＶＧＷＹＲＳＰＦＳＲＶＶＨＬＹＲＮＧＫ（配列番号１）；Ａｕｓｐｅｐ）での皮下免疫によって誘発した。免疫化後０日目及び２日目に、マウスに２００ｎｇの百日咳毒素（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を腹腔内注射した。慢性ＮＯＤ ＥＡＥモデルでは、１０～１２週齢のＮＯＤマウスを１５０μｇのＭＯＧ３５－５５ペプチドで免疫し、続いて記載のように０日目と２日目に２００ｎｇの百日咳毒素を投与した４。
【0060】
治療的処置のために、ピーク＋２ｄでマウスに６ｍｇ／ｋｇのＬＤＮ－２１２８５４（Ａｘｏｎ Ｍｅｄｃｈｅｍ＃２２０１）又は生理食塩水を１日２回（１０～１４時間間隔で）１４日間投与した。マウスを無作為に治療群に割り当て、スコアを付け、盲検法で薬物治療を行った。実験者のバイアスが導入されないように、実験グループは実験終了時に治療割り当てについて非盲検にした。ＥＡＥの症状を発現しなかったマウスは、治療及び分析から除外した。マウスの体重を測定し、毎日スコアリングした。神経障害を、治療を知らされていない観察者によって５段階のスケールで評価した：０、症状なし；１、尾の緊張の喪失；２、運動失調；３、後肢麻痺；４、後肢及び前肢の麻痺；５、瀕死。スコア＞２．５をＥＡＥピークと定義した。
【0061】
ＮＧ２細胞の蛍光活性化セルソーティング
ＮＧ２細胞を選別するために、以前に説明されたように灌流したメスのマウスから脊髄組織を収集した５。成体脳解離（ＡＢＤ）キットの製造元（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）の説明書に修正を加えた方法で、脊髄全体から単細胞懸濁液を調製した。簡単に説明すると、細かく刻んだ組織を、１５μＭアクチノマイシンＤ（ＡｃｔＤ；Ｓｉｇｍａ）６を含むＡＢＤ Ｍｉｘ１とともに３４℃で１５分間、個別にインキュベートし、次にその溶液にＡＢＤ Ｍｉｘ２を３４℃で１０分間加えた。組織を穏やかに粉砕し、３４℃で１０分間インキュベートした。ホモジナイズした組織溶液を７０μｍスマートストレーナー（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）に通し、冷ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、４℃、４５０×ｇで７分間遠心分離した。ＡＢＤキットのデブリ除去ステップの指示に従って組織デブリを除去し、３０μｍスマートストレーナー（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）に通し、４５０×ｇ、４℃で７分間遠心分離した。上記のすべてのステップは、３μＭ ＡｃｔＤの存在下で行った。単一細胞懸濁液を１μＭ Ｓｙｔｏｘ ｂｌｕｅ生／死染色液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）とともに４℃で５分間インキュベートしてから、ＢＤ ＦＡＣＳＤｉｖａ（商標）ｖ８ソフトウェアを備えたＦＡＣＳＡＲＩＡ ＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でセルソーティングを行った。ＳＳＣ－Ａ及びＦＳＣ－Ａのサイズに基づいてすべての細胞をゲーティングし、ＦＳＣ－Ｈ及びＦＳＣ－Ｗパラメータによってダブレットの識別を実行した。Ｓｙｔｏｘ ｂｌｕｅ－ＮＧ２ｔｄｔｏｍａｔｏ＋細胞を、１％の２－メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ）及び０．２５％の試薬ＤＸ（Ｑｉａｇｅｎ）を添加したＲＬＴプラス溶解バッファー（Ｑｉａｇｅｎ）を含むチューブの中へ直接選別した。細胞溶解物をドライアイス上で凍結し、使用するまで直ちに－８０℃で保存した。ＴＦＰＩ及びＭＨＣクラスＩＩの発現を測定するために、Ｃ５７ＢＬ／６脊髄組織の単一細胞懸濁液を、ＡｃｔＤを添加せずに上記のように調製した。細胞をＦｃ Ｂｌｏｃｋ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）とともに氷上で１５分間インキュベートし、続いてＦＡＣＳ染色バッファー（ＢＤ）中で蛍光結合Ａｂｓ及び抗ＴＦＰＩとともに氷上で３０分間インキュベートした。次いで、細胞を、氷上でＰＢＳ中の蛍光結合二次抗体とともにアクア生／死染色キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で３０分間染色した。試料を直ちにＢＤ ＦＡＣＳＤｉｖａ（商標）ｖ８ソフトウェアを使用してＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）にかけた。すべてのＦＡＣＳプロットはＦｌｏｗｊｏで生成された。以下の抗体を使用した：ＡＰＣ／Ｃｙ７抗マウスＣＤ１１ｂ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、＃１０１２２５、１：２００）、ＰＥ抗マウスＣＤ３（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、＃１００２０６、１：２００）、ＰＥ／Ｃｙ７抗マウスＰＤＧＦＲＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、＃２５－１４０１－８２、１：５０）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８抗マウスＰＤＧＦＲＢ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、５３－１４０２－８２、１：５０）、ＢＶ６５０抗マウスＭＨＣＩＩ（ＢＤ、＃７４３８７３、１：２００）、ウサギ抗－マウスＴＦＰＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＰＡ５－３４５７８、１：１００）、ＢＶ４２１ロバ抗ウサギＩｇＧ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、４０６４１０、１：２００）、及びＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（商標）固定可能なアクア死細胞染色キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｌ３４９５７、１：５００）。
ＮＧ２細胞を選別するために、以前に説明されたように灌流したメスのマウスから脊髄組織を収集した５。成体脳解離（ＡＢＤ）キットの製造元（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）の説明書に修正を加えた方法で、脊髄全体から単細胞懸濁液を調製した。簡単に説明すると、細かく刻んだ組織を、１５μＭアクチノマイシンＤ（ＡｃｔＤ；Ｓｉｇｍａ）６を含むＡＢＤ Ｍｉｘ１とともに３４℃で１５分間、個別にインキュベートし、次にその溶液にＡＢＤ Ｍｉｘ２を３４℃で１０分間加えた。組織を穏やかに粉砕し、３４℃で１０分間インキュベートした。ホモジナイズした組織溶液を７０μｍスマートストレーナー（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）に通し、冷ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、４℃、４５０×ｇで７分間遠心分離した。ＡＢＤキットのデブリ除去ステップの指示に従って組織デブリを除去し、３０μｍスマートストレーナー（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）に通し、４５０×ｇ、４℃で７分間遠心分離した。上記のすべてのステップは、３μＭ ＡｃｔＤの存在下で行った。単一細胞懸濁液を１μＭ Ｓｙｔｏｘ ｂｌｕｅ生／死染色液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）とともに４℃で５分間インキュベートしてから、ＢＤ ＦＡＣＳＤｉｖａ（商標）ｖ８ソフトウェアを備えたＦＡＣＳＡＲＩＡ ＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でセルソーティングを行った。ＳＳＣ－Ａ及びＦＳＣ－Ａのサイズに基づいてすべての細胞をゲーティングし、ＦＳＣ－Ｈ及びＦＳＣ－Ｗパラメータによってダブレットの識別を実行した。Ｓｙｔｏｘ ｂｌｕｅ－ＮＧ２ｔｄｔｏｍａｔｏ＋細胞を、１％の２－メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ）及び０．２５％の試薬ＤＸ（Ｑｉａｇｅｎ）を添加したＲＬＴプラス溶解バッファー（Ｑｉａｇｅｎ）を含むチューブの中へ直接選別した。細胞溶解物をドライアイス上で凍結し、使用するまで直ちに－８０℃で保存した。ＴＦＰＩ及びＭＨＣクラスＩＩの発現を測定するために、Ｃ５７ＢＬ／６脊髄組織の単一細胞懸濁液を、ＡｃｔＤを添加せずに上記のように調製した。細胞をＦｃ Ｂｌｏｃｋ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）とともに氷上で１５分間インキュベートし、続いてＦＡＣＳ染色バッファー（ＢＤ）中で蛍光結合Ａｂｓ及び抗ＴＦＰＩとともに氷上で３０分間インキュベートした。次いで、細胞を、氷上でＰＢＳ中の蛍光結合二次抗体とともにアクア生／死染色キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で３０分間染色した。試料を直ちにＢＤ ＦＡＣＳＤｉｖａ（商標）ｖ８ソフトウェアを使用してＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）にかけた。すべてのＦＡＣＳプロットはＦｌｏｗｊｏで生成された。以下の抗体を使用した：ＡＰＣ／Ｃｙ７抗マウスＣＤ１１ｂ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、＃１０１２２５、１：２００）、ＰＥ抗マウスＣＤ３（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、＃１００２０６、１：２００）、ＰＥ／Ｃｙ７抗マウスＰＤＧＦＲＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、＃２５－１４０１－８２、１：５０）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８抗マウスＰＤＧＦＲＢ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、５３－１４０２－８２、１：５０）、ＢＶ６５０抗マウスＭＨＣＩＩ（ＢＤ、＃７４３８７３、１：２００）、ウサギ抗－マウスＴＦＰＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＰＡ５－３４５７８、１：１００）、ＢＶ４２１ロバ抗ウサギＩｇＧ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、４０６４１０、１：２００）、及びＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（商標）固定可能なアクア死細胞染色キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｌ３４９５７、１：５００）。
【0062】
バルクＲＮＡシーケンス
ＲＬＴバッファー中の凍結ＮＧ２細胞溶解物を２４℃で解凍し、メーカーの指示に従ってＱＩＡｓｈｒｅｄｄｅｒ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して溶解させた。ＲＮＡｅａｓｙマイクロキット（Ｑｉａｇｅｎ）をそのまま使用して細胞溶解物から全ＲＮＡを単離した。ＲＮＡの質と量をＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒピコチップ分析（Ａｇｉｌｅｎｔ）によって決定し、ＲＮＡ完全性数＞８のすべての試料をＲＮＡ－ｓｅｑライブラリの調製に使用した。ｃＤＮＡライブラリを、Ｏｖａｔｉｏｎ ＲＮＡ－ｓｅｑ Ｓｙｓｔｅｍ Ｖ２（ＮｕＧＥＮ）を使用して全ＲＮＡから生成した。ライブラリを、それぞれＫＡＰＡ ｑＰＣＲ（Ｒｏｃｈｅ）及びＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒ ＤＮＡチップ分析（Ａｇｉｌｅｎｔ）によって定量及び品質チェックした。ライブラリをプールし、ペアエンド７５塩基対のリード長を８レーンにわたってＮｅｘｔｓｅｑ５００（Ｉｌｌｕｍｎｉａ）で配列決定した。ライブラリごとのシーケンシング深度は４，０００万リードを超えた。ＦＡＳＴＱファイルを、メーカーのガイドライン（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）に従ってＢｉｏｓｐａｃｅで生成した。
ＲＬＴバッファー中の凍結ＮＧ２細胞溶解物を２４℃で解凍し、メーカーの指示に従ってＱＩＡｓｈｒｅｄｄｅｒ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して溶解させた。ＲＮＡｅａｓｙマイクロキット（Ｑｉａｇｅｎ）をそのまま使用して細胞溶解物から全ＲＮＡを単離した。ＲＮＡの質と量をＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒピコチップ分析（Ａｇｉｌｅｎｔ）によって決定し、ＲＮＡ完全性数＞８のすべての試料をＲＮＡ－ｓｅｑライブラリの調製に使用した。ｃＤＮＡライブラリを、Ｏｖａｔｉｏｎ ＲＮＡ－ｓｅｑ Ｓｙｓｔｅｍ Ｖ２（ＮｕＧＥＮ）を使用して全ＲＮＡから生成した。ライブラリを、それぞれＫＡＰＡ ｑＰＣＲ（Ｒｏｃｈｅ）及びＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒ ＤＮＡチップ分析（Ａｇｉｌｅｎｔ）によって定量及び品質チェックした。ライブラリをプールし、ペアエンド７５塩基対のリード長を８レーンにわたってＮｅｘｔｓｅｑ５００（Ｉｌｌｕｍｎｉａ）で配列決定した。ライブラリごとのシーケンシング深度は４，０００万リードを超えた。ＦＡＳＴＱファイルを、メーカーのガイドライン（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）に従ってＢｉｏｓｐａｃｅで生成した。
【0063】
バルクＲＮＡシーケンスの解析
各試料について、リード１とリード２のＦＡＳＴＱファイルを別々に連結し、Ｉｌｌｕｍｎｉａアダプターをトリミングし、ＦＡＳＴＱＣを使用してＦＡＳＴＱファイルの品質をチェックした。次に、配列決定リードをＳＴＡＲを使用してマウス参照ゲノムｍｍ１０対してアライメントし、遺伝子ごとのカウントを以前に説明されたようにｆｅａｔｕｒｅＣｏｕｎｔｓによって定量した５。ＥｄｇｅＲ（バージョン３．２４．３）によってＤＥＧを識別した７。１超又は－１未満のｌｏｇ２倍率変化のカットオフを使用し、誤検出率（ＦＤＲ）ｐ値は０．０５未満とした。Ｒ（バージョン３．５．０）、Ｋ－ｍｅａｎｓＨＯＰＡＣＨ（バージョン２．４２．０）を使用して、ＤＥＧのクラスタリング分析を、ｐｈｅａｔｍａｐパッケージ（バージョン１．０．１２）を使用して視覚化し、ボルケーノプロットをｇｇｐｌｏｔ２パッケージ（バージョン３．２．１）で生成した。
各試料について、リード１とリード２のＦＡＳＴＱファイルを別々に連結し、Ｉｌｌｕｍｎｉａアダプターをトリミングし、ＦＡＳＴＱＣを使用してＦＡＳＴＱファイルの品質をチェックした。次に、配列決定リードをＳＴＡＲを使用してマウス参照ゲノムｍｍ１０対してアライメントし、遺伝子ごとのカウントを以前に説明されたようにｆｅａｔｕｒｅＣｏｕｎｔｓによって定量した５。ＥｄｇｅＲ（バージョン３．２４．３）によってＤＥＧを識別した７。１超又は－１未満のｌｏｇ２倍率変化のカットオフを使用し、誤検出率（ＦＤＲ）ｐ値は０．０５未満とした。Ｒ（バージョン３．５．０）、Ｋ－ｍｅａｎｓＨＯＰＡＣＨ（バージョン２．４２．０）を使用して、ＤＥＧのクラスタリング分析を、ｐｈｅａｔｍａｐパッケージ（バージョン１．０．１２）を使用して視覚化し、ボルケーノプロットをｇｇｐｌｏｔ２パッケージ（バージョン３．２．１）で生成した。
【0064】
機能的エンリッチメント及び遺伝子ネットワーク解析
ＨＯＰＡＣＨによってクラスター化されたＤＥＧの機能的エンリッチメント解析を、デフォルトのパラメータを使用してＭｅｔａｓｃａｐｅで実行し８、重要な遺伝子オントロジー（ＧＯ）タームをＦＤＲｐ値＜０．０５によって特定した。１００万データセットあたりのＲＮＡ－ｓｅｑ正規化カウントを使用し、デフォルト設定を使用して、ＧＯの分子シグネチャデータベース生物学的プロセス（Ｃ５．ｂｐ．ｖ７．１ｓｙｍｂｏｌｓ．ｇｍｔ）を使用してＧＳＥＡで遺伝子ネットワーク解析を実行した９、１０。ｐ値＜０．１０のＧＯタームは、Ｃｙｔｏｓｃａｐｅ（バージョン３．７．２）１１を使用したエンリッチメントマップの視覚化に使用され、デフォルト設定のプラグインＡｕｔｏＡｎｎｏｔａｔｅ（バージョン１．３．２）を使用して公平にクラスター化された。
ＨＯＰＡＣＨによってクラスター化されたＤＥＧの機能的エンリッチメント解析を、デフォルトのパラメータを使用してＭｅｔａｓｃａｐｅで実行し８、重要な遺伝子オントロジー（ＧＯ）タームをＦＤＲｐ値＜０．０５によって特定した。１００万データセットあたりのＲＮＡ－ｓｅｑ正規化カウントを使用し、デフォルト設定を使用して、ＧＯの分子シグネチャデータベース生物学的プロセス（Ｃ５．ｂｐ．ｖ７．１ｓｙｍｂｏｌｓ．ｇｍｔ）を使用してＧＳＥＡで遺伝子ネットワーク解析を実行した９、１０。ｐ値＜０．１０のＧＯタームは、Ｃｙｔｏｓｃａｐｅ（バージョン３．７．２）１１を使用したエンリッチメントマップの視覚化に使用され、デフォルト設定のプラグインＡｕｔｏＡｎｎｏｔａｔｅ（バージョン１．３．２）を使用して公平にクラスター化された。
【0065】
ｉｎ ｖｉｖｏ多光子顕微鏡法
Ｍａｉ Ｔａｉ ｅＨＰ ＤｅｅｐＳｅｅ及びＩｎｓｉｇｈｔＸ３ Ｔｉ：サファイアフェムト秒レーザー（パルス幅＜１２０ｆｓ、調整範囲６９０～１０４０ｎｍ（Ｍａｉ Ｔａｉ）及び６８０～１３００ｎｍ（ＩｎｓｉｇｈｔＸ３）、繰り返し速度８０ＭＨｚ、Ｓｐｅｃｔｒａ－Ｐｈｙｓｉｃｓ／Ｎｅｗｐｏｒｔ）を備えたＵｌｔｉｍａ ＩＶ ２Ｐ顕微鏡（Ｐｒａｉｒｉｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ／Ｂｒｕｋｅｒ）を使用した。レーザーを、蛍光色素に応じて９１０～１１５０ｎｍの励起波長に調整した。画像化は、硬膜の下約８０～１２０μｍで、１．６ズームのＯｌｙｍｐｕｓ２５×１．０５ＮＡ、又は１．０～１．５μｍ又は３～４μｍのいずれかのｚ－ステップを備えるＮｉｋｏｎ１０×０．４ＮＡ水浸レンズ、それぞれ４０×又は１０×倍率を使用して行った。すべての画像化実験中、対物レンズから出射される最大レーザー出力は４０ｍＷ未満であった。ＩＲブロッキングフィルターと５６０ｎｍの二色性光を、デスキャンされていない検出器の前の一次放射ビーム経路に配置した。６６０ｎｍの二色性及び６９２／２４ｎｍ＋６０７／４５ｎｍのバンドパスフィルターを使用して、Ｍｉｔｏ Ｔｒａｃｋｅｒ Ｒｅｄ／遠赤とｔｄＴｏｍａｔｏ／ローダミンの蛍光発光をそれぞれ分離した。５２０ｎｍの二色性及び５４２／２７ｎｍ＋４９４／４１ｎｍバンドパスフィルターを使用して、それぞれＹＦＰとＧＦＰの蛍光発光を分離した。
Ｍａｉ Ｔａｉ ｅＨＰ ＤｅｅｐＳｅｅ及びＩｎｓｉｇｈｔＸ３ Ｔｉ：サファイアフェムト秒レーザー（パルス幅＜１２０ｆｓ、調整範囲６９０～１０４０ｎｍ（Ｍａｉ Ｔａｉ）及び６８０～１３００ｎｍ（ＩｎｓｉｇｈｔＸ３）、繰り返し速度８０ＭＨｚ、Ｓｐｅｃｔｒａ－Ｐｈｙｓｉｃｓ／Ｎｅｗｐｏｒｔ）を備えたＵｌｔｉｍａ ＩＶ ２Ｐ顕微鏡（Ｐｒａｉｒｉｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ／Ｂｒｕｋｅｒ）を使用した。レーザーを、蛍光色素に応じて９１０～１１５０ｎｍの励起波長に調整した。画像化は、硬膜の下約８０～１２０μｍで、１．６ズームのＯｌｙｍｐｕｓ２５×１．０５ＮＡ、又は１．０～１．５μｍ又は３～４μｍのいずれかのｚ－ステップを備えるＮｉｋｏｎ１０×０．４ＮＡ水浸レンズ、それぞれ４０×又は１０×倍率を使用して行った。すべての画像化実験中、対物レンズから出射される最大レーザー出力は４０ｍＷ未満であった。ＩＲブロッキングフィルターと５６０ｎｍの二色性光を、デスキャンされていない検出器の前の一次放射ビーム経路に配置した。６６０ｎｍの二色性及び６９２／２４ｎｍ＋６０７／４５ｎｍのバンドパスフィルターを使用して、Ｍｉｔｏ Ｔｒａｃｋｅｒ Ｒｅｄ／遠赤とｔｄＴｏｍａｔｏ／ローダミンの蛍光発光をそれぞれ分離した。５２０ｎｍの二色性及び５４２／２７ｎｍ＋４９４／４１ｎｍバンドパスフィルターを使用して、それぞれＹＦＰとＧＦＰの蛍光発光を分離した。
【0066】
ｉｎ ｖｉｖｏ脊髄イメージング
ｉｎ ｖｉｖｏ脊髄イメージングを以前に説明されたように行った１２。簡単に説明すると、脊髄を１回の椎弓切除術によって所望のレベル（Ｔ１１）で露出させ、マウスを脊椎安定化装置上に配置した。Ｆｌｏｗ－Ｉｔ（商標）ＡＬＣ（Ｐｅｎｔｒｏｎ）を使用して、露出した脊髄の周囲にウェルを作成し、予め温めておいた（３７℃）人工脳脊髄液（ＡＣＳＦ、ＨＥＰＥＳベース、ｍＭ単位で：１２５ ＮａＣｌ、１０ グルコース、１０ ＨＥＰＥＳ、３．１ ＣａＣｌ２、２．７ ＫＣｌ、及び１．３ ＭｇＣｌ２；ｐＨ７．４）を一滴適用した後、予め温めておいたＡＣＳＦで硬膜を穏やかに洗い流すことで、潜在的な硬膜出血を洗浄及び除去した。椎弓切除術中に偶発的な損傷を負ったマウス、及び硬膜（下）出血の兆候があるマウスについては、これらの事象は実験計画とは関係のない炎症反応やその他の神経変性反応を引き起こす可能性があるため、そのマウスを研究から除外した。ＡＣＳＦ中３％の７０ｋＤａオレゴングリーン結合デキストラン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の溶液１００μｌを眼窩後方に注射して血管系を標識し、その後マウスを２Ｐ画像顕微鏡の下に置いた。ｉｎ ｖｉｖｏミエリンイメージングでは、皮下注射針を使用して髄膜（硬膜及びクモ膜）を慎重に除去し、その下にある露出した脊髄を、ＡＣＳＦ中８μＭの濃度で溶解させたＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ Ｄｅｅｐ Ｒｅｄ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に３０分間浸した１３。次に、画像化セッションの前に、脊髄を予め温めておいたＡＣＳＦで４～５回慎重に洗浄した。
ｉｎ ｖｉｖｏ脊髄イメージングを以前に説明されたように行った１２。簡単に説明すると、脊髄を１回の椎弓切除術によって所望のレベル（Ｔ１１）で露出させ、マウスを脊椎安定化装置上に配置した。Ｆｌｏｗ－Ｉｔ（商標）ＡＬＣ（Ｐｅｎｔｒｏｎ）を使用して、露出した脊髄の周囲にウェルを作成し、予め温めておいた（３７℃）人工脳脊髄液（ＡＣＳＦ、ＨＥＰＥＳベース、ｍＭ単位で：１２５ ＮａＣｌ、１０ グルコース、１０ ＨＥＰＥＳ、３．１ ＣａＣｌ２、２．７ ＫＣｌ、及び１．３ ＭｇＣｌ２；ｐＨ７．４）を一滴適用した後、予め温めておいたＡＣＳＦで硬膜を穏やかに洗い流すことで、潜在的な硬膜出血を洗浄及び除去した。椎弓切除術中に偶発的な損傷を負ったマウス、及び硬膜（下）出血の兆候があるマウスについては、これらの事象は実験計画とは関係のない炎症反応やその他の神経変性反応を引き起こす可能性があるため、そのマウスを研究から除外した。ＡＣＳＦ中３％の７０ｋＤａオレゴングリーン結合デキストラン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の溶液１００μｌを眼窩後方に注射して血管系を標識し、その後マウスを２Ｐ画像顕微鏡の下に置いた。ｉｎ ｖｉｖｏミエリンイメージングでは、皮下注射針を使用して髄膜（硬膜及びクモ膜）を慎重に除去し、その下にある露出した脊髄を、ＡＣＳＦ中８μＭの濃度で溶解させたＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ Ｄｅｅｐ Ｒｅｄ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に３０分間浸した１３。次に、画像化セッションの前に、脊髄を予め温めておいたＡＣＳＦで４～５回慎重に洗浄した。
【0067】
ｉｎ ｖｉｖｏ画像データの処理
図用の画像を生成するために、ＩｍａｇｅＪ（ＮＩＨ）総和値投影アルゴリズムを使用してＺスタックをＺ軸に沿って強度投影し、画像化されたボリュームの２次元表現を再作成した。ＩｍａｇｅＪで背景の減算、外れ値の削除、アンシャープマスクアルゴリズムを使用して、画像の明るさ／コントラスト、背景ノイズ、及びシャープネスを調整した。ＩｍａｇｅＪのスペクトル分離アルゴリズムを使用してＧＦＰ信号とＹＦＰ信号を分離し、その後、それらに擬似カラーを付けた。
図用の画像を生成するために、ＩｍａｇｅＪ（ＮＩＨ）総和値投影アルゴリズムを使用してＺスタックをＺ軸に沿って強度投影し、画像化されたボリュームの２次元表現を再作成した。ＩｍａｇｅＪで背景の減算、外れ値の削除、アンシャープマスクアルゴリズムを使用して、画像の明るさ／コントラスト、背景ノイズ、及びシャープネスを調整した。ＩｍａｇｅＪのスペクトル分離アルゴリズムを使用してＧＦＰ信号とＹＦＰ信号を分離し、その後、それらに擬似カラーを付けた。
【0068】
細胞クラスターの定量化
ＮＧ２－ＣｒｅＥＲＴＭ：ＲｏｓａｔｄＴｏｍａｔｏ／＋：Ｃｘ３ｃｒ１ＧＦＰ／＋健康対照マウス又はＥＡＥチャレンジマウスからの画像のＺスタックをＺ投影し、実験間の信号強度の違いを考慮するために自動的に閾値処理した（ＩｍａｇｅＪのデフォルトアルゴリズム）。ＮＧ２及びミクログリアクラスターを、４つ以上の細胞体が互いに接触しており、細胞密度が健康に見える脊髄よりも少なくとも２倍高い領域として定義した。ＩｍａｇｅＪを用いて、クラスター数、及び最も近い血管までの距離を計測した。
ＮＧ２－ＣｒｅＥＲＴＭ：ＲｏｓａｔｄＴｏｍａｔｏ／＋：Ｃｘ３ｃｒ１ＧＦＰ／＋健康対照マウス又はＥＡＥチャレンジマウスからの画像のＺスタックをＺ投影し、実験間の信号強度の違いを考慮するために自動的に閾値処理した（ＩｍａｇｅＪのデフォルトアルゴリズム）。ＮＧ２及びミクログリアクラスターを、４つ以上の細胞体が互いに接触しており、細胞密度が健康に見える脊髄よりも少なくとも２倍高い領域として定義した。ＩｍａｇｅＪを用いて、クラスター数、及び最も近い血管までの距離を計測した。
【0069】
ミエリンの円形度
ミエリンの損傷を、ミエリンの円形度で定量した。１．０の値は完全な円を示し（変性ミエリンの縦断面で見られるように）、値が０．０に近づくほど非円形で直線的な形状（正常な有髄線維の縦断面）になることを示す。
ミエリンの損傷を、ミエリンの円形度で定量した。１．０の値は完全な円を示し（変性ミエリンの縦断面で見られるように）、値が０．０に近づくほど非円形で直線的な形状（正常な有髄線維の縦断面）になることを示す。
【0070】
電子顕微鏡法
ＳＢＥＭのための組織の調製。ｔｄＴｏｍａｔｏ＋ＮＧ２系列細胞、ミクログリア、及びデキストランで可視化した血管系を明らかにするために、ＮＧ２－ＣｒｅＥＲＴＭ：ＲｏｓａｔｄＴｏｍａｔｏ／＋：Ｃｘ３ｃｒ１ＧＦＰ／＋マウスのｉｎ ｖｉｖｏ ２Ｐイメージングを慢性ＥＡＥで実施した。画像化セッションの後、動物をリンゲル液で灌流し、続いてカコジル酸中の０．５％グルタルアルデヒド／２％ＰＦＡで灌流した。画像ウィンドウの下で脊髄領域を灌流脊髄から切り出し、冷カコジル酸中０．５％グルタルアルデヒド／２％ＰＦＡで２時間固定した。次いで、標本を冷カコジル酸中４％ＰＦＡで一晩固定した。脊髄の背面側を厚さ１５０μｍの水平ビブラトーム切片に切断した。切片を、冷カコジル酸中２％グルタルアルデヒドで一晩固定した。切片を以前に説明されたように染色した１４。簡単に説明すると、組織を０．１５Ｍカコジル酸中２％四酸化オスミウム（Ｔｅｄ Ｐｅｌｌａ）、０．５％チオカルボヒドラジド（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）水溶液、２％四酸化オスミウム水溶液、２％酢酸ウラニル（Ｔｅｄ Ｐｅｌｌａ）水溶液、及びアスパラギン酸鉛で染色した１５。各染色液の間に水で徹底的に洗浄した。次いで、切片をエタノール及びアセトンを通して脱水し、次いで、Ｄｕｒｃｕｐａｎ ＡＣＭ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ）に浸透した。切片を、離型剤（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、ペンシルベニア州ハットフィールド）でコーティングしたスライドガラスの間に平らに埋め込み、６０℃で７２時間硬化させた。
ＳＢＥＭのための組織の調製。ｔｄＴｏｍａｔｏ＋ＮＧ２系列細胞、ミクログリア、及びデキストランで可視化した血管系を明らかにするために、ＮＧ２－ＣｒｅＥＲＴＭ：ＲｏｓａｔｄＴｏｍａｔｏ／＋：Ｃｘ３ｃｒ１ＧＦＰ／＋マウスのｉｎ ｖｉｖｏ ２Ｐイメージングを慢性ＥＡＥで実施した。画像化セッションの後、動物をリンゲル液で灌流し、続いてカコジル酸中の０．５％グルタルアルデヒド／２％ＰＦＡで灌流した。画像ウィンドウの下で脊髄領域を灌流脊髄から切り出し、冷カコジル酸中０．５％グルタルアルデヒド／２％ＰＦＡで２時間固定した。次いで、標本を冷カコジル酸中４％ＰＦＡで一晩固定した。脊髄の背面側を厚さ１５０μｍの水平ビブラトーム切片に切断した。切片を、冷カコジル酸中２％グルタルアルデヒドで一晩固定した。切片を以前に説明されたように染色した１４。簡単に説明すると、組織を０．１５Ｍカコジル酸中２％四酸化オスミウム（Ｔｅｄ Ｐｅｌｌａ）、０．５％チオカルボヒドラジド（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）水溶液、２％四酸化オスミウム水溶液、２％酢酸ウラニル（Ｔｅｄ Ｐｅｌｌａ）水溶液、及びアスパラギン酸鉛で染色した１５。各染色液の間に水で徹底的に洗浄した。次いで、切片をエタノール及びアセトンを通して脱水し、次いで、Ｄｕｒｃｕｐａｎ ＡＣＭ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ）に浸透した。切片を、離型剤（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、ペンシルベニア州ハットフィールド）でコーティングしたスライドガラスの間に平らに埋め込み、６０℃で７２時間硬化させた。
【0071】
Ｘ線顕微鏡法とＳＢＥＭのＲＯＩターゲティング。ＳＢＥＭイメージング用のＲＯＩを見つけて方向を定めるために、標本をＸＲＭで画像化した１６。標本をＺｅｉｓｓ Ｖｅｒｓａ ５１０でスキャンした。ビブラトーム切片全体の最初のスキャンを、０．４×対物レンズ、８０ｋＶ、ピクセルサイズ約５μｍで収集した。ＸＲＭで観察された血管系と２光子ボリュームを比較した後、ＲＯＩを特定し、カミソリの刃を使用して切り取った。標本をＡＣＬＡＲ（Ｔｅｄ Ｐｅｌｌａ）上に接着し、これ自体をシアノアクリレート接着剤を使用してダミーブロックに接着した。このとき、ビブラトーム切片の腹側を上にした。ＸＲＭボリュームをガイダンスとして使用し、Ｌｅｉｃａ ＥＭ ＵＣ６ウルトラミクロトーム上でガラスブレードを使用して標本にアプローチし、切断面がＳＢＥＭにおける目的の最終切断面と平行になるようにした。余分なエポキシを除去し、組織が露出したら、標本をダミーブロックから取り出し、導電性銀エポキシ（Ｔｅｄ Ｐｅｌｌａ）を使用して、今度は背側を上にしてＡ３ ＳＢＥＭ標本ピン（ＲＭＣ Ｂｏｅｃｋｌｅｒ）に取り付けた。Ａ３ピンをＡ３標本ホルダーに置き、４×対物レンズを使用して８０ｋＶ、約１．５μｍのピクセルサイズでＸＲＭでスキャンした。このＸＲＭボリュームを、標本ブロックの傾きを正確に調整し、ブロックの背面から余分な樹脂を除去し、ＳＢＥＭイメージング用のＲＯＩ位置を特定するために使用した。
【0072】
ＳＢＥＭイメージング。標本を、フォーカルチャージ補償（ｆｏｃａｌ ｃｈａｒｇｅ ｃｏｍｐｅｎｓａｔｉｏｎ）システムとＧａｔａｎ ２ＸＰ ３Ｖｉｅｗシステムを備えたＺｅｉｓｓ Ｇｅｍｉｎｉ ３００ ＶＰ ＳＥＭで画像化した。ボリュームを、１μ秒の滞留時間、１０ｎｍピクセル、５０ｎｍステップサイズ、及び窒素ガスをオンにした焦点ガス注入により２．５ｋＶで収集した。スコープは分析モードと高電流モードで実行された。結果として得られた画像のスタックを、ＩＭＯＤプログラムを使用したカスタムＰｙｔｈｏｎスクリプトを使用して並べた１７。
【0073】
ＯＰＣ－Ｘスクリーニング
初代ラットＯ４＋ＯＰＣを、以前に説明されたように、パパイン解離皮質細胞懸濁液を、ＲＡＮ－２（ネガティブ選択）、Ｏ１（ネガティブ選択）、Ｏ４（ポジティブ選択）の３つの皿で順次イムノパニングすることにより単離した１８。Ｏ４＋ＯＰＣを、プレートあたり５×１０５細胞の初期密度でポリエチレンイミン（ＰＥＩ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）をコーティングした１０ｃｍ培養プレート上に播種し、３７℃の５％ＣＯ２インキュベーター内で３日間増殖培地中で増殖させた。次に、細胞をＡｃｃｕｔａｓｅを使用して継代し、ＰＥＩをコーティングしたμＣｌｅａｒ（商標）９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ－Ｏｎｅ）にウェルあたり５×１０３細胞で再播種した。分化培地中で実験的処理を行う前に、細胞を増殖培地中で１日間インキュベートした。化学的に定義されたベース培地は、ＤＭＥＭ（４．５ｇ／Ｌグルコース、＋ピルビン酸、＋グルタミン；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、１×Ｂ２７（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、１×Ｎ２（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、１％ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、及び５０ｎｇ ｍｌ－１ＮＴ３（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）であった。増殖培地は、２０ｎｇ ｍｌ－１ＰＤＧＦ－ＡＡ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を添加した基本培地から構成された。分化培地は、２０ｎｇ ｍｌ－１ＣＮＴＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）及び４０ｎｇ ｍｌ－１トリヨードチロニン（Ｔ３、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加した、ＰＤＧＦ－ＡＡを含まない基本培地から構成された。「遅い」分化培地（ＮＴ３も追加の成長因子も含まず、Ｔ３も含まない基本培地）をクレマスチンの用量反応研究で使用して、以前の報告の条件を再現した１９。
初代ラットＯ４＋ＯＰＣを、以前に説明されたように、パパイン解離皮質細胞懸濁液を、ＲＡＮ－２（ネガティブ選択）、Ｏ１（ネガティブ選択）、Ｏ４（ポジティブ選択）の３つの皿で順次イムノパニングすることにより単離した１８。Ｏ４＋ＯＰＣを、プレートあたり５×１０５細胞の初期密度でポリエチレンイミン（ＰＥＩ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）をコーティングした１０ｃｍ培養プレート上に播種し、３７℃の５％ＣＯ２インキュベーター内で３日間増殖培地中で増殖させた。次に、細胞をＡｃｃｕｔａｓｅを使用して継代し、ＰＥＩをコーティングしたμＣｌｅａｒ（商標）９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ－Ｏｎｅ）にウェルあたり５×１０３細胞で再播種した。分化培地中で実験的処理を行う前に、細胞を増殖培地中で１日間インキュベートした。化学的に定義されたベース培地は、ＤＭＥＭ（４．５ｇ／Ｌグルコース、＋ピルビン酸、＋グルタミン；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、１×Ｂ２７（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、１×Ｎ２（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、１％ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、及び５０ｎｇ ｍｌ－１ＮＴ３（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）であった。増殖培地は、２０ｎｇ ｍｌ－１ＰＤＧＦ－ＡＡ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を添加した基本培地から構成された。分化培地は、２０ｎｇ ｍｌ－１ＣＮＴＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）及び４０ｎｇ ｍｌ－１トリヨードチロニン（Ｔ３、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加した、ＰＤＧＦ－ＡＡを含まない基本培地から構成された。「遅い」分化培地（ＮＴ３も追加の成長因子も含まず、Ｔ３も含まない基本培地）をクレマスチンの用量反応研究で使用して、以前の報告の条件を再現した１９。
【0074】
阻害性病変環境を模倣するために、フィブリノーゲン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ）を、ミエリン促進化合物のスクリーニング用には１．５ｍｇ ｍｌ－１の濃度で、他のすべてのｉｎ ｖｉｔｒｏ研究用には２．５ｍｇ ｍｌ－１の濃度で分化培地に添加した。これらは成熟ＯＬへのＯＰＣ分化を阻害することが知られている生理学的血漿濃度である１８。ミエリン促進化合物をＤＭＳＯに溶解させ、フィブリノーゲン処理の１時間前に、ＯＬへのＯＰＣ分化を促進することが以前に示されている濃度で４つのウェルに添加した。最終化合物濃度は、ベンズトロピン１μＭ１９、クレマスチン１μＭ１９、クエチアピン１μＭ１９、ミコナゾール１μＭ２０、クロベタゾール５μＭ２０、（±）Ｕ－５０４８８ １μＭ２１、及びＸＡＶ－９３９ ０．１μＭ２２であった。ＤＭＨ１（１μＭ）１８は、すべてのアッセイプレートにおいて陽性対照として機能した。細胞を最大０．１％のＤＭＳＯ濃度に曝露し、対照には同濃度のＤＭＳＯを含めた。すべての条件を４つのウェルで試験し、Ｎ＝３の生物学的複製のために３つの独立した実験で繰り返した。用量反応曲線については、フィブリノーゲン処理の１時間前に、ＬＤＮ－２１２８５４及びクレマスチンを３倍連続希釈（５μＭ～２ｎＭ）で４つのウェルに添加した。用量反応実験を２つ又は３つの独立した実験で繰り返した。細胞を３日間分化させた後、固定、染色、及び定量を行った。ＢＭＰ受容体阻害剤と別のミエリン化促進化合物の組み合わせを試験するために、３つの独立した実験で、ＬＤＮ－２１２８５４（０．１μＭ）とクレマスチン（０．５μＭ）を、フィブリノーゲン処理の１時間前に、４つのウェルに単独で又は一緒に添加した。細胞を２日間分化させた後、固定、染色、及び定量を行った。
【0075】
ＯＰＣを４％パラホルムアルデヒドで固定し、５％正常ヤギ血清／０．１％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）－Ｘ１００でブロッキング及び透過処理し、２μｇ／ｍＬヘキスト核色素（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、抗ＭＢＰ抗体（Ａｂｅａｍ ａｂ９２４０６又はＡｂｅａｍ ａｂ７３４９）、及び抗ＧＦＡＰ抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ＃１２３８９）、続いてヤギ二次抗体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で染色した。画像を、１０×対物レンズ、ヘキスト色素検出用の３８６／２３フィルター、ＭＢＰ／Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ－４８８検出用の４８５／２０フィルター、及びＧＦＡＰ／Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ－５４６蛍光検出用の５４９／１８フィルターを使用して、ＡｒｒａｙｓｃａｎＸＴＩ機器（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で取得した。ウェル間のばらつきを減らすために、ウェル表面積の約８０％をカバーする２５枚の画像を撮影した。画像を、ＨＣＳ Ｓｔｕｄｉｏソフトウェア（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して分析した。総細胞数をヘキスト＋核の数に基づいて計算した。ＭＢＰ又はＧＦＡＰのいずれかに対して陽性の全細胞のパーセンテージを定量するために、細胞体（ＧＦＡＰ＋細胞）を含むように核マスク（ヘキスト色素）からリングを拡張した。ＭＢＰ＋細胞の場合、細胞体を超えてＯＬ突起を含むようにリングを拡張することで、成熟ＯＬのみが分析に含まれるようにした。ＨＣＳ Ｓｔｕｄｉｏソフトウェアを使用して、ＭＢＰ＋及びＧＦＡＰ＋細胞の割合を、細胞の総数あたりのＭＢＰ＋及びＧＦＡＰ＋細胞の数に基づいて計算した。リング内で測定された蛍光強度が、二次抗体のみの対照で生成された蛍光強度に対して設定された閾値を超えた場合、細胞はソフトウェアによって陽性と判定された。
【0076】
免疫組織化学
深いアベルチン又はケタミン／キシラジン麻酔下で、マウスに経心的に４％ＰＦＡを灌流した。組織を取り出し、４％ＰＦＡで一晩固定し、３０％スクロース／ＰＢＳで凍結保護し、Ｎｅｇ－５０培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で凍結させ、１０～１２μｍの切片に凍結切片化し、Ｔｉｓｓｕｅ Ｔａｃｋ顕微鏡スライド（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ）上に置いた。切片を０．１～０．３％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００中で透過処理し、５％ＢＳＡ又は５％正常ロバ血清でブロッキングし、一次抗体とともに４℃で一晩インキュベートし、次に蛍光二次抗体とともに室温で１～２時間インキュベートした。スライドに、ＤＡＰＩ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を含むＰｒｏｌｏｎｇ Ｇｏｌｄ又はＳｌｏｗＦａｄｅ Ｇｏｌｄ退色防止剤のカバースリップをかけた。
深いアベルチン又はケタミン／キシラジン麻酔下で、マウスに経心的に４％ＰＦＡを灌流した。組織を取り出し、４％ＰＦＡで一晩固定し、３０％スクロース／ＰＢＳで凍結保護し、Ｎｅｇ－５０培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で凍結させ、１０～１２μｍの切片に凍結切片化し、Ｔｉｓｓｕｅ Ｔａｃｋ顕微鏡スライド（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ）上に置いた。切片を０．１～０．３％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００中で透過処理し、５％ＢＳＡ又は５％正常ロバ血清でブロッキングし、一次抗体とともに４℃で一晩インキュベートし、次に蛍光二次抗体とともに室温で１～２時間インキュベートした。スライドに、ＤＡＰＩ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を含むＰｒｏｌｏｎｇ Ｇｏｌｄ又はＳｌｏｗＦａｄｅ Ｇｏｌｄ退色防止剤のカバースリップをかけた。
【0077】
以下の一次抗体を使用した：フィブリノーゲン（マウスＩＨＣ：１：１０００、ウサギポリクローナル、Ｊ．Ｄｅｇｅｎ、シンシナティから贈呈）；ＧＦＡＰ（１：２００、ラットモノクローナル、＃１３－０３００、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）；ＧＳＴ－ｐｉ（１：２００、ウサギポリクローナル、＃３１２、ＭＢＬ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）、ＩＤ２（１：２０００、ウサギモノクローナル、＃Ｍ２１３、ＣａｌＢｉｏｒｅａｇｅｎｔｓ）；ＭＢＰ（１：５００、＃ａｂ７３４９、Ａｂｅａｍ）、ＯＬＩＧ－２（１：２００、ウサギポリクローナル、＃ａｂ９６１０、ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、ＰＤＧＦＲβ（１：１００、ヤギポリクローナル、＃ＡＦ１０４２、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ＰＬＶＡＰ（１：１００、ラットモノクローナル、＃５５３８４９、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、ＶＣＡＭ－１（１：５０、ラットモノクローナル、＃５５０５４７、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）。
【0078】
画像を、乾式Ｐｌａｎ－Ｎｅｏｆｌｕａｒ対物レンズ（１０×０．３ＮＡ、２０×０．５ＮＡ、又は４０×０．７５ＮＡ）、Ａｘｉｏｃａｍ ＨＲｃ ＣＣＤカメラ、及びＡｘｉｏｖｉｓｉｏｎ画像解析ソフトウェアを備えたＡｘｉｏｐｌａｎ ＩＩ落射蛍光顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ）；Ｎｉｋｏｎ ＣＦＩ ６０シリーズ無限光学システムとＫｅｙｅｎｃｅイメージングソフトウェアを備えたＢＩＯＲＥＶＯ ＢＺ－９０００倒立蛍光顕微鏡（Ｋｅｙｅｎｃｅ）；又は２０×ＮＡ１．０対物レンズを備えたＯｌｙｍｐｕｓ Ｆｌｕｏｖｉｅｗ共焦点顕微鏡で取得した。すべての画像をＩｍａｇｅＪで処理及び分析した。染色に応じて、マウス治療グループを知らされていない研究者によって、閾値処理されたバイナリ画像又は細胞の計数に対して定量を行った。
【0079】
イムノブロット
細胞又は組織を、プロテアーゼ／ホスファターゼ阻害剤カクテル（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を添加したＲＩＰＡ溶解バッファー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に溶解させ、４℃、１３，０００×ｇで１５分間遠心分離することによって溶解物を除去した。等量のタンパク質を４％～１２％のビストリスゲル（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にロードし、ウェスタンブロッティングによって分析した。バンドを、ＨＲＰ結合二次抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）で視覚化した。ＩｍａｇｅＪソフトウェア（ＮＩＨ）を使用して濃度測定を行い、各バンドの値を同じ膜からのＧＡＰＤＨローディングコントロールに対して正規化した。一次抗体は次のとおりであった：Ｉｄ２（１：１０００、ウサギモノクローナル、＃Ｍ２１３、ＣａｌＢｉｏｒｅａｇｅｎｔｓ）；ホスホ－Ｓｍａｄｌ／５（１：１０００、ウサギモノクローナル、＃９５１６、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）；ＧＡＰＤＨ（１：１０００、ウサギモノクローナル、＃２１１８、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）。
細胞又は組織を、プロテアーゼ／ホスファターゼ阻害剤カクテル（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を添加したＲＩＰＡ溶解バッファー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に溶解させ、４℃、１３，０００×ｇで１５分間遠心分離することによって溶解物を除去した。等量のタンパク質を４％～１２％のビストリスゲル（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にロードし、ウェスタンブロッティングによって分析した。バンドを、ＨＲＰ結合二次抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）で視覚化した。ＩｍａｇｅＪソフトウェア（ＮＩＨ）を使用して濃度測定を行い、各バンドの値を同じ膜からのＧＡＰＤＨローディングコントロールに対して正規化した。一次抗体は次のとおりであった：Ｉｄ２（１：１０００、ウサギモノクローナル、＃Ｍ２１３、ＣａｌＢｉｏｒｅａｇｅｎｔｓ）；ホスホ－Ｓｍａｄｌ／５（１：１０００、ウサギモノクローナル、＃９５１６、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）；ＧＡＰＤＨ（１：１０００、ウサギモノクローナル、＃２１１８、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）。
【0080】
統計分析
ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（バージョン８）を使用して統計分析を行った。データは平均値±標準誤差として表示される。サンプルサイズを事前に決定するための統計的手法は使用していないが、サンプルサイズは以前に報告されたものと同様である。統計的有意性は、図の説明文に示されているように、スチューデントのｔ検定（両側、対応なし）、又はマン－ホイットニー検定（両側）、又は一元配置又は二元配置の分散分析（ＡＮＯＶＡ）に続いて、多重比較のためのダネット又はテューキーの事後検定を使用して決定した。Ｐ値≦０．０５を有意であるとみなした。同様のＥＡＥスコア（スコアの差≦０．５）を有するマウスを実験グループにランダムに割り当て、交絡因子を最小限に抑えるために各ケージに各治療群の動物を入れた。ＥＡＥ臨床スコアリング、組織病理学的分析、定量化を盲検法で行った。ＥＡＥの臨床スコアを比較するために、ＥＡＥ実験の毎日の平均臨床スコアの変化の統計的有意性を順列検定を使用して推定した２３。対応するＰ値を１０００の順列を使用して推定した。各順列では、マウスをランダムに並べ替えた。ＮＯＤ－ＥＡＥモデルでは、最後の２０日間の処理からの最大スコアの平均を、ウェルチの２サンプルｔ検定を使用して各群間で比較した。
ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（バージョン８）を使用して統計分析を行った。データは平均値±標準誤差として表示される。サンプルサイズを事前に決定するための統計的手法は使用していないが、サンプルサイズは以前に報告されたものと同様である。統計的有意性は、図の説明文に示されているように、スチューデントのｔ検定（両側、対応なし）、又はマン－ホイットニー検定（両側）、又は一元配置又は二元配置の分散分析（ＡＮＯＶＡ）に続いて、多重比較のためのダネット又はテューキーの事後検定を使用して決定した。Ｐ値≦０．０５を有意であるとみなした。同様のＥＡＥスコア（スコアの差≦０．５）を有するマウスを実験グループにランダムに割り当て、交絡因子を最小限に抑えるために各ケージに各治療群の動物を入れた。ＥＡＥ臨床スコアリング、組織病理学的分析、定量化を盲検法で行った。ＥＡＥの臨床スコアを比較するために、ＥＡＥ実験の毎日の平均臨床スコアの変化の統計的有意性を順列検定を使用して推定した２３。対応するＰ値を１０００の順列を使用して推定した。各順列では、マウスをランダムに並べ替えた。ＮＯＤ－ＥＡＥモデルでは、最後の２０日間の処理からの最大スコアの平均を、ウェルチの２サンプルｔ検定を使用して各群間で比較した。
【0081】
参考文献
【0082】
【表2-1】
【0083】
【表2-2】
【0084】
結果
ＮＧ２細胞は慢性神経炎症において限定的な再ミエリン化を伴って、フィブリノーゲン沈着部位で血管周囲にクラスター化する。
ＮＧ２細胞は慢性神経炎症において限定的な再ミエリン化を伴って、フィブリノーゲン沈着部位で血管周囲にクラスター化する。
【0085】
ＯＰＣとも呼ばれるＮＧ２細胞は、血管系と密接に関連する成体ＣＮＳの前駆細胞であり、再ミエリン化を促進する独特の能力を持っている（Ｄｉｍｏｕ ａｎｄ Ｇａｌｌｏ，２０１５）。神経炎症におけるＮＧ２細胞と神経血管機能障害を研究するために、ＮＧ２－ＣｒｅＥＲＴＭ：ＲｏｓａｔｄＴｏｍａｔｏ／＋：Ｃｘ３ｃｒ１ＧＦＰ／＋マウスを作成した。ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）のアミノ酸３５～５５のエピトープ（「ＭＯＧ３５－５５ＥＡＥ」）によって誘発される慢性実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）中のＮＧ２細胞及びミクログリアのｉｎ ｖｉｖｏ ２Ｐイメージング及びトランスクリプトームプロファイリングを行った（補足図１）。７０キロダルトンのオレゴングリーンデキストランの血管外漏出を、急性ＢＢＢ漏出のマーカーとして使用し、フィブリノーゲン免疫組織学を慢性ＢＢＢ漏出及び局所凝固のマーカーとして使用した。ＥＡＥのピークでは、血管周囲クラスターは主にミクログリアから構成され、ＮＧ２細胞は脊髄実質内に均一に分布していた（図１Ａ、補足図２Ａ）。しかし、慢性ＥＡＥでは、血管周囲クラスターもＮＧ２細胞から構成され、ＮＧ２細胞クラスターの約８０％以上が血管に、又は血管から３０μｍ以内に位置していた（図１Ａ、補足図２Ｂ）。クラスター内のＮＧ２ｔｄＴｏｍａｔｏ＋細胞は、脊髄実質内の複数の分岐突起を特徴とするグリア様形態を有しており、血管壁に沿って細長い突起を有するＮＧ２ｔｄＴｏｍａｔｏ＋周皮細胞とは区別できた（補足図２Ｃ）。内皮活性化のマーカーであるＶＣＡＭ１（Ｌｅｎｇｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，２０１７）、及び漏出性ＣＮＳ血管の有窓内皮細胞のマーカーであるＰＬＶＡＰ（Ｎｉｕ ｅｔ ａｌ．，２０１９）は、ピーク及び慢性ＥＡＥ白質で増加した（補足図３Ａ、Ｂ）。これは、神経血管恒常性の破壊を示唆している。フィブリノーゲンの沈着は、ＥＡＥにおける神経血管病理の顕著な特徴であり、疾患の発症に必要である（Ａｄａｍｓ ｅｔ ａｌ．，２００７；Ｄａｖａｌｏｓ ｅｔ ａｌ．，２０１２；Ｒｙｕ ｅｔ ａｌ．，２０１８）。急性デキストラン漏出はＥＡＥのピーク時に最も高かったが、フィブリノーゲンの沈着は時間の経過とともに増加し、慢性ＥＡＥ中に最も高かった（図１Ｂ）。これは、活動的なＢＢＢ破壊が減少した場合でも持続的なフィブリノーゲン沈着を示唆している。慢性ＥＡＥでは、ＮＧ２クラスターはフィブリノーゲン沈着部位でのみ血管周囲に凝集し（図１Ｃ、補足図４Ａ）、多くの場合、ミクログリアクラスターと共局在した（図１Ａ、補足図２Ａ）。これらの結果は、神経炎症中のフィブリノーゲン沈着部位における神経血管界面の動的グリアリモデリングを示唆している。
【0086】
ｉｎ ｖｉｖｏ ２Ｐイメージングを使用して血管周囲ＮＧ２クラスター内のミエリンを評価するために、高濃度で使用するとミエリンも標識するミトコンドリア色素であるＭｉｔｏ Ｔｒａｃｋｅｒ Ｄｅｅｐ Ｒｅｄ（Ｒｏｍａｎｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．，２０１３）を適用した。ミエリン鞘の水泡形成を特徴とする重大なミエリン破壊がＮＧ２クラスターの近くに存在したが、クラスターのない部位では正常に見えるミエリン鞘が現れた（図１Ｄ、補足図４Ｂ）。ミエリンの超微細構造を研究するために、マイクロコンピューター断層撮影法を使用して、２Ｐで画像化されたボリュームと３次元シリアルブロックフェイス電子顕微鏡法（ＳＢＥＭ）を関連付けるための同期（ｃｏ－ｒｅｇｉｓｔｒａｔｉｏｎ）技術が開発された（図１Ｅ）。この技術を使用して、ｉｎ ｖｉｖｏ ２Ｐ顕微鏡法で画像化されたＥＡＥマウスの血管周囲ＮＧ２クラスターのまったく同じ領域でＳＢＥＭ画像を収集した。内皮の活性化、内皮表面での白血球の付着、血管周囲のアストログリオーシス、及び炎症を、部分的にデブリを含むマクロファージを伴う炎症を起こした静脈が観察された（図１Ｆｉ、Ｇｉ、補足図３Ｃ）。実質病変では、２つの異なるパターンを発見した。１つ目は、低細胞密度の細長い細胞の細胞浸潤を特徴とし、その一部にはオスミウム親和性分解産物が含まれていた。これらの領域では、大部分の軸索が脱髄しており、再ミエリン化はまばらであった（図１Ｆｉｉ、Ｇｉ）。他の領域では、いくらかのミトコンドリアを含むが、ＮＧ２細胞を彷彿とさせる他の細胞小器官をほとんど含まない核周囲細胞質の小さな縁を有する小細胞のより高密度のクラスターが存在した（図１Ｇｉｉ）。再ミエリン化した軸索はこれらの細胞クラスターに密接に隣接していたが、クラスターから離れた領域では軸索は脱髄していた（図１Ｆｉｉｉ、Ｇｉｉ）。血管周囲のＮＧ２細胞から離れたところでは、正常に見える血管周囲のＣＮＳ組織、アストロサイトのグリア境界膜、及び正常なミエリン厚さの軸索が観察された（図１Ｆｉｖ）。これらの結果は、血管周囲のＮＧ２クラスターが炎症、神経膠症、明らかな脱髄及び限定的な再ミエリン化に関連していることを示唆している。ＥＡＥにおけるＮＧ２細胞のトランスクリプトームプロファイリングは、血管恒常性と抗凝固経路の抑制を明らかにする。
【0087】
慢性ＥＡＥにおけるＮＧ２細胞のトランスクリプトーム変化を研究するために、ＭＯＧ３５－５５ＥＡＥマウス又は健康な対照の脊髄から収集したＮＧ２ｔｄＴｏｍａｔｏ＋細胞でＲＮＡ－ｓｅｑを行った（補足図３Ａ）。対照と比較して、慢性ＥＡＥの設定において合計１，２４１個の発現変動遺伝子（ＤＥＧ）（ＦＤＲ＜０．０５；±１ｌｏｇ２倍率変化）を同定し、そのうち７３８個（６０％）が下方制御され、５０３個（４０％）が上方制御されていた（図２Ａ）。教師なし遺伝子クラスタリング分析により、９個の異なる遺伝子クラスターが特定された（図２Ｂ）。遺伝子オントロジー（ＧＯ）分析により、慢性ＥＡＥは、ＧＯ経路タームである「急性炎症反応の正の制御」、「Ｔ細胞媒介細胞毒性の正の制御」、「抗原プロセシングと提示」、及び「インターフェロンベータに対する細胞反応」を含むクラスター１～４では炎症遺伝子及び抗原提示遺伝子を活性化することが明らかになった（図２Ｂ）。Ｃｄ７４、Ｈ２－ｄｍａ、Ｂ２ｍなどの標準抗原提示遺伝子は、ＥＡＥにおいて有意に上方制御された（図２Ｂ）。これは、疾患におけるＯＬ系統細胞の免疫様機能を示唆する報告と一致している（Ｆａｌｃａｏ ｅｔ ａｌ．，２０１８；Ｋｉｒｂｙ ｅｔ ａｌ．，２０１９）。興味深いことに、下方制御された遺伝子クラスター５～９のＧＯ解析により、「血管新生」、「Ｗｎｔシグナル伝達経路の制御」、「脈管形成」、「血管発達」、「細胞接合組織化」など、血管及びＢＢＢの恒常性に関連する経路が明らかになった（図２Ｂ）。これに応じて、ＥＡＥでは、血管の維持、創傷治癒と凝固、及び密着結合に関与する遺伝子ネットワークが全体的に抑制されていた（図２Ｃ）。ＤＥＧの遺伝子セットエンリッチメント解析（ＧＳＥＡ）により、下方制御された上位２つの遺伝子セットを「細胞接合アセンブリの制御」（正規化エンリッチメントスコア（ＮＥＳ）１．７、ｐ＜０．０１）及び「凝固の負の制御」（ＮＥＳ１．７、ｐ＜０．０１）として特定した（図２Ｄ）。血液凝固及びフィブリン形成の主要なインヒビターである組織因子経路インヒビター（Ｔｆｐｉ）の発現（Ｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ．，２０１４）は、ＥＡＥのＮＧ２細胞で大幅に減少した。ＮＧ２ｔｄＴｏｍａｔｏ＋集団はＯＰＣ及び周皮細胞系統を含んでいるため、我々はＭＯＧ３５－５５－ＥＡＥマウス又は健康な対照の脊髄からＰＤＧＦＲα＋ＯＰＣ及びＰＤＧＦＲβ＋周皮細胞を単離し（補足図３Ｂ）、抗原提示及び抗凝固経路をそれぞれ評価するために、細胞表面の主要組織適合性複合体クラスＩＩ（ＭＨＣＩＩ）及びＴＦＰＩを標識した。我々のバルクＲＮＡｓｅｑ及び以前の研究（Ｋｉｒｂｙ ｅｔ ａｌ．，２０１９）と一致して、ＥＡＥのＰＤＧＦＲα＋ＯＰＣでＭＨＣＩＩが増加した（補足図３Ｃ）。ＴＦＰＩはＯＰＣによって発現されたが、健康な対照では周皮細胞では発現されず、ＥＡＥでは有意に抑制された（図２Ｅ、Ｆ）。全体として、これらの結果は、慢性神経炎症におけるＯＰＣにおける抗原提示、凝固、及び血管恒常性経路の調節不全を特定する。
【0088】
ミエリン化促進化合物は、ＯＰＣ分化のフィブリノーゲン外因性阻害を克服しない
ＯＰＣは、多発性硬化症病変に見られるフィブリノーゲンやＢＭＰなどの外因性シグナルに応答して、ミエリン形成ＯＬ又はアストロサイト様細胞に分化することができる（Ｍａｂｉｅ ｅｔ ａｌ．，１９９７；Ｐｅｔｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１７；Ｈａｃｋｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，２０１８）。我々は、外因性阻害物質の存在下でＯＰＣの成熟ＭＢＰ＋ＯＬへの分化を促進し、ＧＦＡＰ＋アストロサイトへのＯＰＣ運命スイッチを減少させる化合物を同定するため、ミディアムスループットかつハイコンテントイメージングアッセイであるＯＰＣ－Ｘスクリーニングを開発した（図３Ａ）。ＯＰＣ－Ｘアッセイでは、フィブリノーゲンは対照と比較して、ＭＢＰ＋成熟ＯＬを減少させ、ＧＦＡＰ＋アストロサイト様細胞を約６０％増加させた（図３Ｂ～Ｄ）。７種類の化合物、すなわちベンズトロピン、クレマスチン、クエチアピン、ミコナゾール、クロベタゾール、（±）Ｕ－５０４８８、及びＸＡＶ－９３９は、ＯＰＣ分化の内因性経路を促進することが以前に確認されている（Ｆａｎｃｙ ｅｔ ａｌ．，２０１１；Ｍｅｉ ｅｔ ａｌ．，２０１４；Ｎａｊｍ ｅｔ ａｌ．，２０１５；Ｍｅｉ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。しかし、これらのミエリン化促進化合物は、フィブリノーゲンによるＯＰＣ分化の外因性阻害を克服しなかった（図３Ｂ～Ｄ）。対照的に、ＢＭＰ受容体インヒビターのＤＭＨ１（Ｈａｏ ｅｔ ａｌ．，２０１０）は、フィブリノーゲンの阻害効果をレスキューし、成熟ＯＬへのＯＰＣ分化を対照レベルまで回復させた（図３Ｂ～Ｄ）。フィブリノーゲンによるＯＰＣからＧＦＡＰ＋細胞への細胞運命スイッチも、ＤＭＨ１によって無効になった（図３Ｄ）。ムスカリン受容体アンタゴニストであるクレマスチンは、ＯＰＣの再ミエリン化能力を促進し、現在多発性硬化症の臨床試験中である（Ｍｅｉ ｅｔ ａｌ．，２０１４；Ｇｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１７）。クレマスチンは予想どおり対照条件でＭＢＰ＋細胞の数を増加させたが、フィブリノーゲンの存在下では成熟ＯＬへのＯＰＣの分化を促進しなかった（補足図４）。クレマスチンは、フィブリノーゲンによって誘発されるＢＭＰシグナルトランスデューサーＳＭＡＤ１／５のリン酸化やＢＭＰ標的タンパク質ＩＤ２の発現をブロックしなかった（図３Ｅ）。対照的に、ＤＭＨ１は、フィブリノーゲンによって誘発されるＳＭＡＤ１／５のリン酸化とＩＤ２発現をブロックした（図３Ｅ）。したがって、ＯＰＣ分化を促進するこれまでに同定された化合物は、血管損傷部位における外因性阻害シグナル伝達経路を克服できない可能性がある。
ＯＰＣは、多発性硬化症病変に見られるフィブリノーゲンやＢＭＰなどの外因性シグナルに応答して、ミエリン形成ＯＬ又はアストロサイト様細胞に分化することができる（Ｍａｂｉｅ ｅｔ ａｌ．，１９９７；Ｐｅｔｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１７；Ｈａｃｋｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，２０１８）。我々は、外因性阻害物質の存在下でＯＰＣの成熟ＭＢＰ＋ＯＬへの分化を促進し、ＧＦＡＰ＋アストロサイトへのＯＰＣ運命スイッチを減少させる化合物を同定するため、ミディアムスループットかつハイコンテントイメージングアッセイであるＯＰＣ－Ｘスクリーニングを開発した（図３Ａ）。ＯＰＣ－Ｘアッセイでは、フィブリノーゲンは対照と比較して、ＭＢＰ＋成熟ＯＬを減少させ、ＧＦＡＰ＋アストロサイト様細胞を約６０％増加させた（図３Ｂ～Ｄ）。７種類の化合物、すなわちベンズトロピン、クレマスチン、クエチアピン、ミコナゾール、クロベタゾール、（±）Ｕ－５０４８８、及びＸＡＶ－９３９は、ＯＰＣ分化の内因性経路を促進することが以前に確認されている（Ｆａｎｃｙ ｅｔ ａｌ．，２０１１；Ｍｅｉ ｅｔ ａｌ．，２０１４；Ｎａｊｍ ｅｔ ａｌ．，２０１５；Ｍｅｉ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。しかし、これらのミエリン化促進化合物は、フィブリノーゲンによるＯＰＣ分化の外因性阻害を克服しなかった（図３Ｂ～Ｄ）。対照的に、ＢＭＰ受容体インヒビターのＤＭＨ１（Ｈａｏ ｅｔ ａｌ．，２０１０）は、フィブリノーゲンの阻害効果をレスキューし、成熟ＯＬへのＯＰＣ分化を対照レベルまで回復させた（図３Ｂ～Ｄ）。フィブリノーゲンによるＯＰＣからＧＦＡＰ＋細胞への細胞運命スイッチも、ＤＭＨ１によって無効になった（図３Ｄ）。ムスカリン受容体アンタゴニストであるクレマスチンは、ＯＰＣの再ミエリン化能力を促進し、現在多発性硬化症の臨床試験中である（Ｍｅｉ ｅｔ ａｌ．，２０１４；Ｇｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１７）。クレマスチンは予想どおり対照条件でＭＢＰ＋細胞の数を増加させたが、フィブリノーゲンの存在下では成熟ＯＬへのＯＰＣの分化を促進しなかった（補足図４）。クレマスチンは、フィブリノーゲンによって誘発されるＢＭＰシグナルトランスデューサーＳＭＡＤ１／５のリン酸化やＢＭＰ標的タンパク質ＩＤ２の発現をブロックしなかった（図３Ｅ）。対照的に、ＤＭＨ１は、フィブリノーゲンによって誘発されるＳＭＡＤ１／５のリン酸化とＩＤ２発現をブロックした（図３Ｅ）。したがって、ＯＰＣ分化を促進するこれまでに同定された化合物は、血管損傷部位における外因性阻害シグナル伝達経路を克服できない可能性がある。
【0089】
神経炎症におけるＩ型ＢＭＰ受容体阻害の治療効果
ＢＭＰ発現及び下流の受容体シグナル伝達は、ヒト多発性硬化症病変において増加する（Ｃｏｓｔａ ｅｔ ａｌ．，２０１９；Ｈａｒｎｉｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，２０１９）。ＢＭＰ標的タンパク質ＩＤ２も、広範なフィブリノーゲン沈着を伴う病変では増加する（Ｐｅｔｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１７）。ＤＭＨ１がｉｎ ｖｉｔｒｏでフィブリノーゲンによって誘発されるＢＭＰ受容体活性化を効果的にブロックし、ＯＰＣ分化を回復したという発見（図３）は、ＢＭＰシグナル伝達を標的とすることが神経炎症の修復を促進する可能性があることを示唆した。しかし、ＤＭＨ１は水溶性ではないため、生体内での使用は制限される。したがって、我々は、水溶性アクチビンＡ受容体Ｉ型（ＡＣＶＲ１）にバイアスされたＩ型ＢＭＰ受容体阻害剤である、ＤＭＨ１に類似した分子構造を有する（Ｍｏｈｅｄａｓ ｅｔ ａｌ．，２０１３）ＬＤＮ－２１２８５４をＯＰＣ－Ｘスクリーニングで試験した。ＬＤＮ－２１２８５４は成熟ＯＬ分化を回復し、フィブリノーゲン処理したＯＰＣからのＧＦＡＰ＋アストロサイトの形成を用量依存的にブロックした（図３Ｆ、Ｇ）。
ＢＭＰ発現及び下流の受容体シグナル伝達は、ヒト多発性硬化症病変において増加する（Ｃｏｓｔａ ｅｔ ａｌ．，２０１９；Ｈａｒｎｉｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，２０１９）。ＢＭＰ標的タンパク質ＩＤ２も、広範なフィブリノーゲン沈着を伴う病変では増加する（Ｐｅｔｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１７）。ＤＭＨ１がｉｎ ｖｉｔｒｏでフィブリノーゲンによって誘発されるＢＭＰ受容体活性化を効果的にブロックし、ＯＰＣ分化を回復したという発見（図３）は、ＢＭＰシグナル伝達を標的とすることが神経炎症の修復を促進する可能性があることを示唆した。しかし、ＤＭＨ１は水溶性ではないため、生体内での使用は制限される。したがって、我々は、水溶性アクチビンＡ受容体Ｉ型（ＡＣＶＲ１）にバイアスされたＩ型ＢＭＰ受容体阻害剤である、ＤＭＨ１に類似した分子構造を有する（Ｍｏｈｅｄａｓ ｅｔ ａｌ．，２０１３）ＬＤＮ－２１２８５４をＯＰＣ－Ｘスクリーニングで試験した。ＬＤＮ－２１２８５４は成熟ＯＬ分化を回復し、フィブリノーゲン処理したＯＰＣからのＧＦＡＰ＋アストロサイトの形成を用量依存的にブロックした（図３Ｆ、Ｇ）。
【0090】
ＬＤＮ－２１２８５４の治療可能性を決定するために、ＥＡＥの２つのモデル：ＮＧ２－ＣｒｅＥＲＴＭ：ＲｏｓａｔｄＴｏｍａｔｏ／＋マウスで誘発される慢性ＭＯＧ３５－５５ＥＡＥと、ＭＯＧのアミノ酸３５～５５のエピトープによって非肥満糖尿病（ＮＯＤ）マウスで誘発される進行性ＥＡＥ（「ＮＯＤ－ＭＯＧ３５－５５ＥＡＥ」）（Ｍａｙｏ ｅｔ ａｌ．，２０１４）を選択した。ＬＤＮ－２１２８５４の治療的投与により、臨床スコアが大幅に改善され（図４Ａ～Ｄ）、両方のモデルでフィブリノーゲンの沈着と脱髄が減少した（図４Ａ～Ｄ）。また、ＬＤＮ－２１２８５４は、ｉｎ ｖｉｖｏ２Ｐイメージングによって明らかになったように、ＭＯＧ３５－５５ＥＡＥにおける血管周囲のＮＧ２クラスターとミエリン損傷を著しく減少させた（図４Ｅ、Ｆ）。さらに、ＬＤＮ－２１２８５４は、ＥＡＥ白質でＮＧ２細胞におけるＩＤ２発現を減少させた（図４Ｇ）。これは、ＮＧ２細胞系統におけるＢＭＰシグナル伝達の阻害と一致している。
【0091】
フィブリノーゲン及びＢＭＰ受容体シグナル伝達の重要な機構は、ＯＰＣからアストロサイトへの細胞運命スイッチであるため（Ｍａｂｉｅ ｅｔ ａｌ．，１９９７；Ｐｅｔｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１７）、我々は、ＬＤＮ－２１２８５４がＭＯＧ３５－５５ＥＡＥにおいてミエリン化細胞へのＯＰＣ分化を促進するかどうかを試験した。ｉｎ ｖｉｖｏでのＯＰＣの細胞運命を追跡するために、ＮＧ２－ＣｒｅＥＲＴＭ：ＲｏｓａｔｄＴｏｍａｔｏ／＋マウスでＥＡＥを誘導し、ＮＧ２＋ＯＰＣとその子孫におけるｔｄＴｏｍａｔｏのタモキシフェン誘導発現を可能にした（Ｐｅｔｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１７；Ｈａｃｋｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，２０１８）。グルタチオンｓ－トランスフェラーゼ－ｐｉ（ＧＳＴ－ｐｉ）は成熟ＯＬを標識し、ＧＦＡＰは遺伝子標識されたｔｄＴｏｍａｔｏ＋ＮＧ２＋ＯＰＣに由来するアストロサイトを標識した。ＬＤＮ－２１２８５４の治療的投与により、対照と比較してＧＳＴ－ｐｉ＋成熟ＯＬに分化したＮＧ２ｔｄＴｏｍａｔｏ＋ＯＰＣの割合が増加し、ＮＧ２－ＣｒｅＥＲＴＭ：ＲｏｓａｔｄＴｏｍａｔｏ／＋ＭＯＧ３５－５５ＥＡＥマウスにおけるＯＰＣ由来のＧＦＡＰ＋アストロサイトの形成が消失した（図４Ｈ）。まとめると、これらの結果は、Ｉ型ＢＭＰ受容体阻害によりＯＰＣの成熟ＯＬへの細胞運命が回復し、フィブリノーゲンの沈着と活性なＢＭＰシグナル伝達を伴う神経炎症性疾患の治療可能性を有することを示唆する。
【0092】
考察
本明細書で提供されるデータは、神経炎症におけるＢＢＢ機能不全部位での神経血管ニッチの動的な細胞リモデリングを明らかにし、ミエリン修復を促進するための創薬標的となり得る経路を特定する。おそらく神経炎症では、血管周囲のＮＧ２＋ＯＰＣクラスターが凝固促進環境に寄与し、過剰なフィブリノーゲンの沈着、ＯＰＣにおけるＢＭＰ受容体シグナル伝達の活性化、及び血管損傷部位での再ミエリン化の外因性阻害を引き起こす。このモデルは、血管周囲ＯＰＣクラスターが活動性病変境界に局在する、フィブリノーゲン沈着、線維素溶解障害、ＢＭＰ経路活性化、及び神経膠症を伴う慢性脱髄性多発性硬化症病変と一致している（Ｐｅｔｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１７；Ｙａｔｅｓ ｅｔ ａｌ．，２０１７）；Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，２０１８；Ｎｉｕ ｅｔ ａｌ．，２０１９）。ＯＰＣ－Ｘスクリーニングを通じて、我々は、多くのミエリン化促進薬の治療能力が血管損傷及びフィブリノーゲン沈着の部位に限定されている可能性があることを発見し、慢性脱髄を伴う疾患における外因性阻害を克服するための治療戦略に対するまだ満たされていない臨床ニーズを浮き彫りにした。本明細書では、ＢＭＰ経路の活性化を阻害すると、神経血管機能不全部位におけるＯＰＣ分化の失敗を克服することによってミエリン修復を促進できるという概念が提供される。したがって、ＢＭＰ阻害剤はミエリン化促進薬のツールボックスを拡張し、ＢＢＢ破壊及び白質病理を患う患者に追加の治療オプションを提供することができる。
本明細書で提供されるデータは、神経炎症におけるＢＢＢ機能不全部位での神経血管ニッチの動的な細胞リモデリングを明らかにし、ミエリン修復を促進するための創薬標的となり得る経路を特定する。おそらく神経炎症では、血管周囲のＮＧ２＋ＯＰＣクラスターが凝固促進環境に寄与し、過剰なフィブリノーゲンの沈着、ＯＰＣにおけるＢＭＰ受容体シグナル伝達の活性化、及び血管損傷部位での再ミエリン化の外因性阻害を引き起こす。このモデルは、血管周囲ＯＰＣクラスターが活動性病変境界に局在する、フィブリノーゲン沈着、線維素溶解障害、ＢＭＰ経路活性化、及び神経膠症を伴う慢性脱髄性多発性硬化症病変と一致している（Ｐｅｔｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１７；Ｙａｔｅｓ ｅｔ ａｌ．，２０１７）；Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，２０１８；Ｎｉｕ ｅｔ ａｌ．，２０１９）。ＯＰＣ－Ｘスクリーニングを通じて、我々は、多くのミエリン化促進薬の治療能力が血管損傷及びフィブリノーゲン沈着の部位に限定されている可能性があることを発見し、慢性脱髄を伴う疾患における外因性阻害を克服するための治療戦略に対するまだ満たされていない臨床ニーズを浮き彫りにした。本明細書では、ＢＭＰ経路の活性化を阻害すると、神経血管機能不全部位におけるＯＰＣ分化の失敗を克服することによってミエリン修復を促進できるという概念が提供される。したがって、ＢＭＰ阻害剤はミエリン化促進薬のツールボックスを拡張し、ＢＢＢ破壊及び白質病理を患う患者に追加の治療オプションを提供することができる。
【0093】
ｉｎ ｖｉｖｏ ２Ｐイメージングを使用して、我々は疾患のピークにおけるミクログリアと脱髄に関連する血管周囲グリア細胞組成の顕著な変化と、それに続く慢性神経炎症における再ミエリン化が制限された血管周囲ＮＧ２クラスターの形成を発見した。フィブリノーゲン沈着部位におけるＮＧ２細胞のクラスター化は、ＯＰＣの移動又は接着が血管損傷部位で変化する可能性があること、又はＯＰＣ自体がＢＢＢ破壊又は局所凝固に寄与する可能性があることを示唆している。この研究は、凝固を調節する遺伝子の発現におけるこれまで知られていなかったＯＰＣの機能を示唆している。凝固因子Ｘ及び組織因子媒介凝固の強力なインヒビターであるＴＦＰＩ（Ｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ．，２０１４）はＯＰＣで発現され、慢性神経炎症によって抑制された。興味深いことに、多発性硬化症患者ではＴＦＰＩを含む止血バイオマーカーが変化しており（Ｚｉｌｉｏｔｔｏ ｅｔ ａｌ．，２０１９）、これは神経炎症性疾患における抗凝固経路と凝固促進経路の不均衡を示唆している。酸化促進性ミクログリアは、凝固因子Ｘなどの凝固タンパク質の発現を通じて、病変微小環境における凝固促進性環境にも寄与している可能性がある（Ｍｅｎｄｉｏｌａ ｅｔ ａｌ．，２０２０）。したがって、神経血管界面での転写変化は、多くの神経疾患で観察されるフィブリンの過剰又は持続的な沈着に寄与する局所凝固促進環境を確立する可能性がある（Ｐｅｔｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１８）。ＮＧ２細胞－血管－フィブリノーゲン軸又は下流のフィブリノーゲンシグナル伝達を標的とする治療戦略は、神経炎症性病変環境における外因性阻害を克服する治療手段を提供することができる。
【0094】
この研究は、ミエリン化促進薬が病変環境において外因性阻害物質によって活性化されるシグナル伝達経路を違った形で抑制することを示唆している。実際、クレマスチンは、ＢＭＰ受容体活性化の下流の重要な経路であるＳＭＡＤ１／５リン酸化を阻害することも、アストロサイトへのＯＰＣ細胞運命スイッチをレスキューすることもなかった。フィブリノーゲンは、ＯＰＣにおけるＢＭＰ受容体シグナル伝達の活性化に加えて、アストロサイトからのＣＳＰＧ産生を刺激し、トランスフォーミング増殖因子ベータ（ＴＧＦ－β）のキャリアである（Ｓｃｈａｃｈｔｒｕｐ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。ＣＳＰＧは、ＯＰＣにおけるプロテインチロシンホスファターゼシグマ受容体の活性化を通じて部分的に再ミエリン化を阻害する（Ｐｅｎｄｌｅｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。加齢に伴うＯＰＣ機能の喪失は、ＴＧＦ－βシグナル伝達又はＯＰＣニッチの剛性の増加に応答して発生し、その後機械応答性イオンチャネルＰｉｅｚｏｌを介したシグナル伝達が起こる可能性がある（Ｂａｒｏｒ ｅｔ ａｌ．，２０１９；Ｓｅｇｅｌ ｅｔ ａｌ．，２０１９）。したがって、神経膠症、血管損傷、ＢＢＢ破壊を伴う炎症性病変において再ミエリン化を増加させる薬剤の選択を改善するには、抑制性病変環境と下流のシグナル伝達をよりよく再現するアッセイが必要である。さらに、臨床におけるミエリン化促進薬の選択では、脱髄性神経疾患患者の外因性抑制環境におけるその有効性を考慮する必要があるかもしれない。薬物の組み合わせで複数の阻害経路を標的にすることは、再ミエリン化に対して相加効果又は相乗効果をもたらす可能性があり、阻害性病変環境においてミエリン化促進化合物の治療効果を最大化する手段を提供する可能性がある。
【0095】
抗凝固剤による治療的フィブリノーゲン枯渇は神経炎症を抑制し、ミエリン再生を促進することができるが（Ａｋａｓｓｏｇｌｏｕ ｅｔ ａｌ．，２００２；Ｐｅｔｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１７）、出血性合併症によりこのアプローチの臨床的有用性が制限される可能性がある。本研究により、ＡＣＶＲ１にバイアスされたＢＭＰ受容体阻害剤であるＬＤＮ－２１２８５４が、慢性神経炎症の潜在的な治療薬として特定された。損傷した血管周囲ニッチにおけるフィブリノーゲン及びＢＭＰシグナル伝達の活性化は、ＯＰＣ細胞運命をＯＬの再ミエリン化ではなくアストロサイトに導き（Ｐｅｔｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１７；Ｂａｒｏｒ ｅｔ ａｌ．，２０１９）、これが血管損傷部位における病的神経膠症の一因となる可能性がある。ＬＤＮ－２１２８５４は、ミエリン形成ＯＬを増加させ、アストロサイトへのＯＰＣ分化を排除した。ＬＤＮ－２１２８５４は研究で使用された用量で良好な忍容性を示したが、ヒトの毒性データは限られている。ＡＣＶＲ１選択的ＢＭＰ阻害剤の臨床使用は、異所性骨化及びミエリン異常を引き起こす過剰なＢＭＰシグナル伝達を伴う稀な疾患である進行性骨化性線維異形成症の治療において最近注目を集めている（Ｋａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。ＬＤＮ－２１２８５４及び他の安全なＡＣＶＲ１選択的阻害剤は、多発性硬化症、アルツハイマー病、新生児脳損傷、及び外傷性脳損傷を含む、ＢＢＢ破壊及びミエリン異常を伴う神経疾患の治療選択肢となる可能性がある。
【0096】
参考文献
【0097】
【表3-1】
【0098】
【表3-2】
【0099】
【表3-3】
【0100】
【表3-4】
【0101】
【表3-5】
【0102】
すべての刊行物、受託番号によって特定されるヌクレオチド及びアミノ酸配列、特許及び特許出願は、参照により本明細書に組み込まれる。上記の詳述では、本発明をその特定の実施形態に関連して説明し、多くの詳細を説明の目的で記載したが、当業者には、本発明は追加の実施形態が可能性であり、本明細書に記載されている詳細の一部は、本発明の基本原理から逸脱することなく大幅に変更され得ることが明らかであろう。
【0103】
本明細書に記載される特定の方法及び組成物は、実施形態の代表的なものであり、例示であり、本発明の範囲を限定するものではない。他の目的、態様、及び実施形態は、本明細書を検討すれば当業者に想起され、これらは特許請求の範囲によって定義される本発明の趣旨の範囲内に包含される。本発明の範囲及び趣旨から逸脱することなく、本明細書に開示された本発明に対して様々な置換及び修正を行うことができることは、当業者には容易に明らかであろう。本明細書に例示的に記載される本発明は、本明細書において必須であるとして具体的に開示されていないいかなる要素又は限定も存在しない状態で適切に実施することができる。本明細書に例示的に記載される方法及びプロセスは、異なるステップの順序で適切に実施することができ、本方法及びプロセスは、本明細書又は特許請求の範囲に示されるステップの順序に必ずしも限定されない。
【0104】
いかなる状況においても、特許は、本明細書に具体的に開示された特定の例、実施形態、又は方法に限定されると解釈されてはならない。いかなる状況においても、特許は、特許商標庁の審査官、その他の役人や従業員によってなされた声明によって限定されるものと解釈されてはならない。ただし、そのような声明が出願人による返答書面で具体的かつ無資格又は留保なしに明示的に採用されている場合を除く。
【0105】
使用されている用語及び表現は説明の用語として使用されており、限定するものではない。そのような用語及び表現の使用には、示され説明されている特徴又はその一部と同等のものを除外する意図はない。特許請求の範囲に記載された本発明の範囲内で、様々な変更が可能であることを理解されたい。したがって、本発明は実施形態及び任意選択の特徴によって具体的に開示されたが、当業者であれば、本明細書に開示された概念の修正及び変更に頼ることができ、そのような修正及び変更は、添付の特許請求の範囲及び本発明の記述によって定義される本発明の範囲内にあるとみなされることが理解されるであろう。
【図1-A】
【図1-B】
【図1-C】
【図1-D】
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図1D】
【図1E】
【図1F】
【図1G】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図2D】
【図2E】
【図2F】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図3D】
【図3E】
【図3F】
【図3G】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図4D】
【図4E】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2024-02-14
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
外因性阻害物質による再ミエリン化阻害を克服する薬剤をスクリーニングするためのハイスループット、ハイコンテントアッセイであって、ａ）オリゴデンドロサイト前駆細胞（ＯＰＣ）を外因性阻害物質及び試験薬剤と接触させること、及び
ｂ）単一アッセイで２つの読み取り値を取得することにより、１）ＭＢＰ＋ミエリン形成オリゴデンドロサイト（ＯＬ）、及び２）ＧＦＡＰ＋アストロサイトの存在を検出／定量すること
を含み、前記外因性阻害物質のみと接触させた対照ＯＰＣと比較したＯＬの増加及びＧＦＡＰ＋アストロサイトの減少は、この薬剤が外因性阻害物質による再ミエリン化の阻害を克服したことを示す、アッセイ。
【請求項2】
前記外因性阻害物質は、抗体、化合物、小分子、ペプチド、及び核酸のうちの少なくとも１つである、請求項１に記載のアッセイ。
【請求項3】
前記外因性阻害物質は炎症性分子である、請求項１に記載のアッセイ。
【請求項4】
前記外因性阻害物質はフィブリノーゲンである、請求項１に記載のアッセイ。
【請求項5】
フィブリノーゲンは生理学的レベルで存在する、請求項４に記載のアッセイ。
【請求項6】
フィブリノーゲンは、少なくとも２．５ｍｇ／ｍｌの濃度で添加される、請求項４に記載のアッセイ。
【請求項7】
前記ＯＰＣは初代ＯＰＣである、請求項１に記載のアッセイ。
【請求項8】
前記初代ＯＰＣは、ａ）の前に増殖培地中で１～６日間培養される、請求項７に記載のアッセイ。
【請求項9】
前記増殖培地はＰＤＧＦ－ＡＡ及びＮＴ３を含む、請求項８に記載のアッセイ。
【請求項10】
前記ＯＰＣは、タンパク質分解及び／又はコラーゲン分解によって培養皿から分離され、その後、新鮮な培養皿に播種される、請求項８に記載のアッセイ。
【請求項11】
前記ＯＰＣは、ａ）の前に、９６ウェルプレートの１ウェルあたり５×１０３細胞で、又は３８４ウェルプレートの１ウェルあたり１×１０３細胞で播種される、請求項１０に記載のアッセイ。
【請求項12】
前記播種されたＯＰＣは、ａ）の前に最大２４時間培養される、請求項１１に記載のアッセイ。
【請求項13】
前記ＯＰＣは、ｂ）の前に前記ＯＰＣが分化できるように、ステップａ）において１～６日間培養される、請求項１に記載のアッセイ。
【請求項14】
前記ＯＰＣは３日間培養される、請求項１３に記載のアッセイ。
【請求項15】
分化培地はＣＮＴＦトリヨードチロニン（Ｔ３）及びＰＤＧＦ－ＡＡを含む、請求項１３に記載のアッセイ。
【請求項16】
ａ）の後、前記細胞をＭＢＰに対する抗体（オリゴデンドロサイト）及びＧＦＡＰに対する抗体（アストロサイト）と接触させる、請求項１に記載のアッセイ。
【請求項17】
前記抗体は検出可能な標識で直接的又は間接的に標識され、標識を有する前記細胞の画像が取得される、請求項１６に記載のアッセイ。
【請求項18】
自動化画像が取得される、請求項１７に記載のアッセイ。
【請求項19】
培養容器（例えば、ウェル）の少なくとも約８０％が画像化される、請求項１７に記載のアッセイ。
【請求項20】
ＭＢＰ＋及びＧＦＡＰ＋の自動定量化が使用される、請求項１～１９のいずれか一項に記載のアッセイ。
【請求項21】
外因性阻害物質の阻害を克服する薬剤をスクリーニングするためのハイスループット、ハイコンテントアッセイであって、ａ）細胞を外因性阻害物質及び試験薬剤と接触させること、及び
ｂ）前記試験薬剤に対する細胞応答を検出及び／又は定量すること
を含み、前記細胞を前記外因性阻害物質のみと接触させた対照と比較して異なる細胞応答は、薬剤が前記外因性阻害物質を克服できたことを示す、アッセイ。
【請求項22】
前記外因性阻害物質は、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン、ヒアルロナン、フィブロネクチン凝集体、ミエリンデブリ、炎症性サイトカイン（例えば、可溶性ＴＮＦ－α又はインターフェロン－γ）、骨形成タンパク質、エンドセリン－１、セマフォリン、環境毒素及びアルコール、タバコ、違法薬物又は娯楽用薬物からなる群から選択される、請求項２１に記載のアッセイ。
【請求項23】
前記細胞は、神経幹細胞及び／又は前駆細胞（成人及び／又は胎児／新生児）、放射状グリア細胞（成人及び／又は胎児／新生児）、小脳顆粒ニューロン前駆細胞、神経堤幹／前駆細胞、血管／内皮の幹／前駆細胞、臓器幹／前駆細胞（例えば、心臓、肝臓、肺、腎臓、骨格筋、皮膚、骨、網膜）、間葉系幹／前駆細胞、胎盤幹／前駆細胞、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞（又はＥＳＣ／ｉＰＳＣ由来の細胞）、及びがん／腫瘍関連細胞／幹細胞を含む幹細胞又は前駆細胞からなる群から選択される、請求項２１又は２２に記載のアッセイ。
【請求項24】
前記神経前駆細胞はオリゴデンドロサイト前駆細胞（ＯＰＣ）である、請求項２３に記載のアッセイ。
【国際調査報告】