特表 2024-521928 Ｂ７Ｈ３モノクローナル抗体群及びその医薬用途

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-06-04

(54)【発明の名称】Ｂ７Ｈ３モノクローナル抗体群及びその医薬用途

(51)【国際特許分類】

   C07K 16/28 20060101AFI20240528BHJP

   C07K 16/46 20060101ALI20240528BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20240528BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20240528BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240528BHJP

   A61P 37/04 20060101ALI20240528BHJP

   A61K 47/68 20170101ALI20240528BHJP

   C12N 15/13 20060101ALN20240528BHJP

【ＦＩ】

C07K16/28 ZNA

C07K16/46

C12N15/63 Z

A61K39/395 N

A61P35/00

A61P37/04

A61K47/68

C12N15/13

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023574629

(86)(22)【出願日】2022-06-06

(85)【翻訳文提出日】2024-01-22

(86)【国際出願番号】 CN2022097193

(87)【国際公開番号】W WO2022257893

(87)【国際公開日】2022-12-15

(31)【優先権主張番号】202110639996.0

(32)【優先日】2021-06-09

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】523052085

【氏名又は名称】英諾湖医薬（杭州）有限公司

(74)【代理人】

【識別番号】110004163

【氏名又は名称】弁理士法人みなとみらい特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】邱均専

(72)【発明者】

【氏名】王振生

(72)【発明者】

【氏名】孫▲カイ▼

(72)【発明者】

【氏名】陳均勇

(72)【発明者】

【氏名】孫鍵

(72)【発明者】

【氏名】李忠良

(72)【発明者】

【氏名】夏明▲デ▼

(72)【発明者】

【氏名】陳如雷

【テーマコード（参考）】

4C076

4C085

4H045

【Ｆターム（参考）】

4C076AA95

4C076CC07

4C076CC27

4C076EE59

4C085AA14

4C085BB11

4C085CC02

4C085DD62

4C085DD63

4C085EE01

4H045AA11

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA10

4H045BA41

4H045DA76

4H045DA83

4H045DA89

4H045EA22

4H045FA72

4H045FA74

(57)【要約】

【課題】抗Ｂ７Ｈ３受容体のモノクローナル抗体群およびそのヒト化抗体群が提供される。
【解決手段】ハイブリドーマ技術により得られた抗体は、Ｂ７Ｈ３親和性、細胞エンドサイトーシス機能、抗体依存性細胞毒性を有するか、またはＢ７Ｈ３による免疫抑制作用を効果的にブロッキングすることができ、がん細胞の抑制、Ｂ７Ｈ３による作用やレベルに対する調節、および、生体免疫力の向上に用いられる関連薬物の調製に使用できる。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

重鎖ＣＤＲおよび軽鎖ＣＤＲを含み、前記重鎖ＣＤＲおよび前記軽鎖ＣＤＲは、ａ～ｎに示されるＣＤＲ組合せから選ばれた１つ以上の組を有する、Ｂ７Ｈ３モノクローナル抗体又はその抗原結合断片。

【表10】

【請求項2】

重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域および前記軽鎖可変領域は、Ａ～Ｎに示される可変領域組合せのうちの１つ以上の組から選ばれる、請求項１に記載のＢ７Ｈ３モノクローナル抗体又はその抗原結合断片。

【表11】

【請求項3】

前記重鎖可変領域および前記軽鎖可変領域はヒト化されたものである、請求項２に記載のＢ７Ｈ３モノクローナル抗体又はその抗原結合断片。

【請求項4】

ヒト化された前記重鎖可変領域および前記軽鎖可変領域は、１～６に示される可変領域組合せのうちの１つ以上の組から選ばれる、請求項３に記載のＢ７Ｈ３モノクローナル抗体又はその抗原結合断片。

【表12】

【請求項5】

ヒトＩｇＧ１の定常領域を有する、請求項４に記載のＢ７Ｈ３モノクローナル抗体又はその抗原結合断片。

【請求項6】

Ｂ７Ｈ３活性またはＢ７Ｈ３レベルを調節する薬物、顕著なエンドサイトーシス機能（腫瘍を毒素カップリングによって選択的に死滅または抑制することができる機能）を有し、又は、顕著な抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を有し、又は、Ｂ７Ｈ３の免疫抑制における作用をブロッキングすることによって生体免疫力を向上する薬物、Ｔリンパ球を促す薬物、又は、ＩＦＮ－γのようなＴリンパ球における細胞因子の産生を向上する薬物の調製における、請求項１～５のいずれか１項に記載のＢ７Ｈ３モノクローナル抗体又はその抗原結合断片の用途。

【請求項7】

モノクローナル抗体とカップリング部分を含むモノクローナル抗体カップリング剤であって、前記モノクローナル抗体は、請求項１～５のいずれか１項に記載のＢ７Ｈ３モノクローナル抗体又はその抗原結合断片であり、前記カップリング部分は、放射性核種、薬物、毒素、細胞因子、細胞因子受容体断片、酵素、フルオレセイン、及びビオチンのうちの１つ以上から選ばれる、モノクローナル抗体カップリング剤。

【請求項8】

Ｂ７Ｈ３活性またはＢ７Ｈ３レベルを調節する薬物、顕著なエンドサイトーシス機能（腫瘍を毒素カップリングによって選択的に死滅または抑制することができる機能）を有する薬物、顕著な抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を有する薬物、Ｂ７Ｈ３の免疫抑制における作用をブロッキングすることによって生体免疫力を向上する薬物、Ｔリンパ球を促す薬物、又は、ＩＦＮ－γのようなＴリンパ球における細胞因子の産生を向上する薬物の調製における、請求項７に記載のモノクローナル抗体カップリング剤の用途。

【請求項9】

腫瘍を予防及び／又は治療および／又は補助治療する薬物の調製における、請求項７に記載のモノクローナル抗体カップリング剤の用途。

【請求項10】

請求項１～５のいずれか１項に記載のＢ７Ｈ３モノクローナル抗体又はその抗原結合断片の核酸分子を含む、発現ベクター。

【請求項11】

請求項１～５のいずれか１項に記載のＢ７Ｈ３モノクローナル抗体又はその抗原結合断片と薬用ベクターとを含む、薬物組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本願は、２０２１年６月９日に中国特許局に提出された、出願番号が２０２１１０６３９９９６．０であって発明名称が「Ｂ７Ｈ３モノクローナル抗体群及びその医薬用途」である中国特許出願の優先権を主張しており、その全ての内容を引用により本願に取り込む。

【0002】

本発明は、腫瘍抗体治療及び分子免疫学治療の分野に属し、Ｂ７Ｈ３抗体及びその用途に関する。具体的には、本発明は、様々なＢ７Ｈ３モノクローナル抗体に関する。

【背景技術】

【0003】

Ｂ７Ｈ３は、ＣＤ２７６とも呼ばれ、Ｉ型膜貫通タンパク質である（ＣｈａｐｏｖａｌＡ．Ｉ．、ｅｔａｌ．、（２００１）、Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：２６９）。マウスでは、Ｂ７Ｈ３は９番染色体でコードされているが、ヒトでは、１５番染色体でコードされている。Ｂ７Ｈ３は、他のＢ７ファミリー配位子と２０％～２７％のアミノ酸相同性を有する（ＳｕｎＭ．、ｅｔａｌ．、（２００２）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６８：６２９４；ＬｏｏｓＭ．、（２０１０）、Ｃｌｉｎ．Ｄｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１０：６８３８７５）。タンパク質組成、構造の面では、マウスのＢ７Ｈ３は、２つのＩｇＧ７Ｈ３タイプ（細胞外のＩｇＶとＩｇＣの１ペアからなる）のみを有するが、ヒトのＢ７Ｈ３は、４つのＩｇＧ７Ｈ３タイプを有し、ほぼ完全に同じであるＩｇＶ－ＩｇＣ縦列反復である（ＳｕｎＭ．、ｅｔａｌ．、（２００２）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６８：６２９４；ＳｔｅｉｎｂｅｒｇｅｒＰ．、ｅｔａｌ．、（２００４）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７２：２３５２）。Ｂ７Ｈ３のｍＲＮＡは、幾つかの正常組織、例えば、肝臓、小腸、膵臓、精巣、心臓および結腸などの組織に存在するが、Ｂ７Ｈ３タンパク質は、正常組織においてめったに見られない（ＧｒｅｅｎｗａｌｄＲ．Ｊ．、ｅｔａｌ．、（２００５）、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３：５１５－４８）。Ｂ７Ｈ３のｍＲＮＡとタンパク質の間におけるそのような差異性は、転写後密着調節メカニズムの存在を反映したかもしれない（ＨｏｆｍｅｙｅｒＫ．Ａ．、ｅｔａｌ．、（２００８）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１０５：１０２７７；ＣａｌａｂｒｏＬ．、ｅｔａｌ．、（２０１１）、Ｊ．ＣｅｌｌＰｈｙｓｉｏｌ．２２６：２５９５）。全体的にみれば、Ｂ７Ｈ３は、幾つかの非免疫性線維芽細胞、内皮細胞及び骨芽細胞、および、例えば、Ｂ細胞、Ｔ細胞、単核球、樹状細胞又はＮＫ細胞のような幾つかの免疫細胞のみに存在するものである。Ｂ７Ｈ３の発現は、顆粒球－マクロファージのＣＳＦ又はリポ多糖刺激誘導によって産生され得る（ＳｕｈＷ．Ｋ．、ｅｔａｌ．、（２００３）、Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４：８９９；ＣｈａｐｏｖａｌＡ．Ｉ．、ｅｔａｌ．、（２００１）、Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：２６９；ＧｒｅｅｎｗａｌｄＲ．Ｊ．ｅｔａｌ．、（２００５）、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３：５１５）。

【0004】

Ｂ７Ｈ３は、重要な免疫チェックポイントタンパク質に該当する。初歩的な研究を経て、Ｂ７Ｈ３は、Ｔ細胞に対する刺激作用を有し、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖、Ｔリンパ球の細胞毒性の増強、及び、インターフェロン－γ（ＩＦＮ－γ）の産生への刺激をある程度促すことができ（ＣｈａｐｏｖａｌＡ．Ｉ．、ｅｔａｌ．、（２００１）、Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：２６９）、且つ、Ｂ７Ｈ３の欠失により、同種他家移植の慢性反発作用が軽減されることができる（ＷａｎｇＬ．ｅｔａｌ．、（２００５）、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３５：４２８）、という結論が示されていた。しかしながら、Ｂ７Ｈ３は、顕著な免疫抑制作用を有することが更に多くの研究により示されている。例えば、Ｂ７Ｈ３は、ＣＤ３抗体又は同種他家ＤＣ細胞のＴ細胞に対する活性化作用を顕著に抑制することができるが、Ｂ７Ｈ３ブロッキング抗体は、そのような抑制作用を効果的に逆転することができる（ＰｒａｓｓＤ．Ｖ．Ｒ．、ｅｔａｌ．、（２００４）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７３：２５００）。Ｂ７Ｈ３タンパク質の構造情報には、Ｂ７Ｈ３ＩｇＶドメインにおけるＦＧ環がＴ細胞の抑制に対して重要な役割を果たす可能性があることが示される（ＶｉｇｄｏｒｏｖｉｃｈＶ．、ｅｔａｌ．、（２０１３）、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ２１：７０７）。また、Ｔ細胞に加えて、Ｂ７Ｈ３は、天然殺傷細胞（ＮＫ）に対する抑制作用を有する可能性もある（ＣａｓｔｒｉｃｏｎｉＲ．、ｅｔａｌ．、（２００４）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１０１：１２６４０）。そういった可能性に関するメカニズムは、調節的Ｔ細胞（Ｔｒｅｇｓ）により、樹状細胞（ＤＣ）Ｂ７Ｈ３の発現を誘発することによって、ＤＣ細胞のＴリンパ球に対する刺激作用を抑制することに関連付けられる（ＭａｈｎｋｅＫ．、ｅｔａｌ．、（２００７）、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３７：２１１７）。マウスモデルにおいて、Ｂ７Ｈ３に乏しいマウスは、深刻な気道炎症が生じてしまい、実験的自己免疫ひずみ性脳脊髄炎などのような幾つかの自己免疫疾患もより早期的に発生してしまう（ＳｕｈＷ．Ｋ．、ｅｔａｌ．、（２００３）、Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４：８９９）。

【0005】

Ｂ７Ｈ３の発現レベルは、メラノーマ（ＷａｎｇＪ．、ｅｔａｌ．、（２０１３）、Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１３３：２０５０）、白血病（ＨｕＹ．、ｅｔａｌ．、（２０１５）、ヘムメロ２０：１８７；ＳｕｎＪ．、ｅｔａｌ．、（２０１４）、ＯｎｃｏＴａｒｇｅｔｓＴｈｅｒ．７：１９７９）、前立腺癌（ＺａｎｇＸ．、ｅｔａｌ．、（２００７）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１０４：１９４５８）、卵巣癌（ＺａｎｇＸ．、ｅｔａｌ．、（２０１０）、Ｍｏｄ．Ｐａｔｈｏｌ．２３：１１０４）および膵臓腺癌（ＣｈｅｎＹ．、ｅｔａｌ．、（２０１４）、Ｏｎｃｏ．Ｔａｒｇｅｔｓ Ｔｈｅｒ．７：１４６５－７２）などのような多くの悪性腫瘍では非常に高い。正常組織にも腫瘍組織にも、Ｂ７Ｈ３ｍＲＮＡが存在しているが、Ｂ７Ｈ３タンパク質は、腫瘍細胞のみにおいて高いレベルで現われている。このような差異は、ｍｉＲＮＡ－２９調節メカニズムに関連する可能性がある。例えば、正常組織または腫瘍組織やがん細胞系において、ｍｉＲＮＡ－２９とＢ７Ｈ３タンパク質のレベルは逆比関係にあることが判明された研究があった（Ｘｕ Ｈ．、ｅｔａｌ．、（２００９）、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６９：６２７５）。腫瘍患者において、Ｂ７Ｈ３の異常発現は、不良な予後、腫瘍の分画レベル及び転移度合いの増加、治療抵抗性、腫瘍患者全体の生存率の低下と密接に関わっている（ＰｉｃａｒｄａＥ．、ｅｔａｌ．、（２０１６）、Ｃｌｉｎ．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．２２：３４２５）。
Ｂ７Ｈ３のＴ細胞、ＮＫ細胞及びＤＣ細胞に対する抑制作用は、腫瘍細胞の免疫逃避の発生を著しく促す。また、Ｂ７Ｈ３は、腫瘍細胞の増殖、転移、侵襲、血管新生、上皮間葉転換（ＥＭＴ）、癌幹細胞性及びＷａｒｂｕｒｇ効果、並びに腫瘍細胞の薬物耐性等にも重要な役割を果たす。

【0006】

Ｂ７Ｈ３の増加は、Ｂｃｌ－２及びＢｃｌ－ｘｌの発現を促して、ＪＡＫ２－ＳＴＡＴ３シグナルルートの活性化により、腫瘍細胞抗アポトーシスの活性を増強することができる（ＺｈａｎｇＴ．、ｅｔａｌ．、（２０１５）、ＷｏｒｌｄＪ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．２１：１８０４）。同時に、ＡＫＴ、ＥＲＫ、及びＪＡＫ２／ＳＴＡＴ３ルートによる活性化では、腫瘍細胞の転移に関与するタンパク因子の発現（ＭＭＰ２、ＭＭＰ９およびＣＸＣＲ４等を含む）を誘導して、腫瘍細胞の転移力及び侵襲力を増強することができる（Ｔｅｋｌｅ Ｃ．、ｅｔａｌ．、（２０１３）、Ｉｎｔ．ＪＣａｎｃｅｒ１３０：２２８２；ＬｉＹ．、ｅｔａｌ．、（２０１７）、Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ８：７１７２５；ＷａｎｇＬ．、ｅｔａｌ．、（２０１３）、ＰＬｏＳＯｎｅ８：ｅ７０６８９；ＬｉｕＦ．、ｅｔａｌ．、（２０１５）、Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．Ｒｅｐ．１２：５４５５）。

【0007】

腫瘍内皮細胞のＢ７Ｈ３は、同様に、ＴＬＲ４依存性メカニズムによりＮＦ－κＢの活性化を誘導して、ＶＥＧＦ及びＩＬ－８の発現レベルを著しく増加させ（Ｔｅｋｌｅ Ｃ．、ｅｔａｌ．、（２０１２）、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ１３０：２２８２）、さらに、腫瘍の浸潤作用及び血管新生を促進することができるのが判明された研究は数多く存在する（ＦｅｒｒａｒａＮ．、ｅｔａｌ．、（２００２）、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ２：７９５）。一方、Ｂ７Ｈ３は、Ｅ－カルシトニンの低減及びＮ－カルシトニン、ボルクリン、ＣＤ１３３及びＣＤ４４の発現の増加により、腫瘍細胞ＥＭＴ及び腫瘍幹細胞活性を調節する機能を果たすこともできる（ＪｉａｎｇＢ．、ｅｔａｌ．、（２０１６）、Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ７３１７５５）。Ｂ７Ｈ３は、ＳＴＡＴ３シグナルの伝達を活性化させて、ヘキソキナーゼ２の発現を増加させることができる。そのため、Ｂ７Ｈ３は、同様に、腫瘍細胞の有酸素解糖を促進する役割を有する（ＳｈｉＴ．、ｅｔａｌ．、（２０１９）、ＣｅｌｌＤｅａｔｈＤｉｓ．１０：３０８）。同時に、Ｂ７Ｈ３は、転写因子ＮＲＦ２の活性を抑制することにより、活性酸素（ＲＯＳ）及びＨＩＦＩ１ａのレベルを上昇させて、腫瘍細胞の有酸素解糖作用をさらに増強し、腫瘍細胞の成長を促進する（ＬｉｍＳ．、ｅｔａｌ．、（２０１６）、ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．７６：２２３１）。また、Ｂ７Ｈ３の発現を抑制または低減することによって、例えば、ＤＮＡ複製を阻害する薬物（アルキル化薬を含む）や、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲとＲａｓ／Ｒａｆ／ＭＥＫシグナルタンパク質を阻害する薬物のような、幾つかの薬物に対する腫瘍細胞の反応を増加することができるのが判明された研究がますます多くなった（Ｆｌｅｍ－ＫａｒｌｓｅｎＫ．、ｅｔａｌ．、（２０１７）、ＰｉｇｍｅｎｔＣｅｌｌＭｅｌａｎｏｍａＲｅｓ．３０：４６７；ＫａｓｔｅｎＢ．Ｂ．、ｅｔａｌ．、（２０１７）、Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．４７：２３；ＬｉｕＨ．、ｅｔａｌ．、（２０１１）、Ｍｏｌ．ＣａｎｃｅｒＴｈｅｒ．１０：９６０）。

【0008】

腫瘍細胞をＢ７Ｈ３欠失のマウスに移植させ、または、腫瘍マウスに対してＢ７Ｈ３抗体処理を行うことによって、腫瘍の成長は明らかに抑制されるようになる（ＣａｉＤ．、ｅｔａｌ．、（２０２０）、Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７：２２７；ＬｅｅＹ．Ｈ．、ｅｔａｌ．、（２０１７）、ＣｅｌｌＲｅｓ．２７：１０３４）ため、Ｂ７Ｈ３を遮断するシグナル伝達は、腫瘍治療に用いられてもよいことが示されている。また、抗ＰＤ－１抗体との併用により、Ｂ７Ｈ３およびＰＤ－１に対する二重ブロッキング機能を果たして、相乗的な抗腫瘍効果が生じる（ＬｅｅＹ．Ｈ．、ｅｔａｌ．、（２０１７）、ＣｅｌｌＲｅｓ．２７：１０３４）。正常組織と腫瘍組織におけるＢ７Ｈ３の発現レベルの有意差により、Ｂ７Ｈ３抗体のＡＤＣＣ効果又は毒素カップリングにより、腫瘍細胞を効果的に殺すことができ、正常組織に対してもあまり大きな影響を与えない（ＫｏｅｎｉｇＳ．、ｅｔａｌ．、（２０１４）、Ｍｅｄｉｃｏｇｒａｐｈｉａ３６：２８５）。要するに、現在の研究情報を踏まえて、Ｂ７Ｈ３は、がん治療上の有望な標的とされている。

【発明の概要】

【0009】

本発明は、ハイブリドーマ技術により、抗Ｂ７Ｈ３モノクローナル抗体群が得られ、それらの抗体は、Ｂ７Ｈ３に対する親和力が高く、エンドサイトーシス機能が顕著に現われ（腫瘍を毒素カップリングによって選択的に死滅または抑制することができる）、抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）が著しく、又は、Ｂ７Ｈ３に起因した免疫抑制作用を効果的にブロッキングすることができる。本発明は、その中の６つの抗体候補のヒト化に成功しました。上述した抗体は、がん細胞の抑制、Ｂ７Ｈ３による作用やレベルに対する調節、および、生体免疫力の向上に用いられる薬物の調製、特に、がんの治療に関する薬物の調製の面では、多様な適用範囲を有するものとして有望とされている。

【0010】

本発明が提供するマウス化またはヒト化されたＢ７Ｈ３抗体または機能性断片は、重鎖シーケンス及び軽鎖シーケンスを含む。抗ヒトＢ７Ｈ３マウス抗体、重鎖可変領域、軽鎖可変領域におけるアミノ酸配列情報は以下の通りである。７Ｆ５重鎖可変領域、軽鎖可変領域におけるアミノ酸配列は、それぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、２であり、９Ｃ８重鎖可変領域、軽鎖可変領域におけるアミノ酸配列は、それぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、４であり、５Ｂ６重鎖可変領域、軽鎖可変領域におけるアミノ酸配列は、それぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５、６であり、７Ｃ９重鎖可変領域、軽鎖可変領域におけるアミノ酸配列は、それぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７、８であり、２Ａ９重鎖可変領域、軽鎖可変領域におけるアミノ酸配列は、それぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９、１０であり、４Ｆ１１重鎖可変領域、軽鎖可変領域におけるアミノ酸配列は、それぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１、１２であり、１５Ａ２重鎖可変領域、軽鎖可変領域におけるアミノ酸配列は、それぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３、１４であり、７Ｂ７重鎖可変領域、軽鎖可変領域におけるアミノ酸配列は、それぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５、１６であり、７Ｅ６重鎖可変領域、軽鎖可変領域におけるアミノ酸配列は、それぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７、１８であり、２Ｅ１０重鎖可変領域、軽鎖可変領域におけるアミノ酸配列は、それぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９、２０であり、２Ｆ１２重鎖可変領域、軽鎖可変領域におけるアミノ酸配列は、それぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１、２２であり、２Ｆ７重鎖可変領域、軽鎖可変領域におけるアミノ酸配列は、それぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３、２４であり、１３Ａ２重鎖可変領域、軽鎖可変領域におけるアミノ酸配列は、それぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５、２６であり、１４Ｂ３重鎖可変領域、軽鎖可変領域におけるアミノ酸配列は、それぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７、２８である。

【0011】

上記抗体における重鎖、軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３のアミノ酸配列情報は以下の通りである。７Ｆ５重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９、３０、３１で、その軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２、３３、３４であり、９Ｃ８重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５、３６、３７で、その軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８、３９、４０であり、５Ｂ６重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１、４２、４３で、その軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４、４５、４６であり、７Ｃ９重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７、４８、４９で、その軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０、５１、５２であり、２Ａ９重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５３、５４、５５で、その軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５６、５７、５８であり、４Ｆ１１重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９、６０、６１で、その軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６２、６３、６４であり、１５Ａ２重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６５、６６、６７で、その軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６８、６９、７０であり、７Ｂ７重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７１、７２、７３で、その軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７４、７５、７６であり、７Ｅ６重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７７、７８、７９で、その軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８０、８１、８２であり、２Ｅ１０重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８３、８４、８５で、その軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８６、８７、８８であり、２Ｆ１２重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８９、９０、９１で、その軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９２、９３、９４であり、２Ｆ７重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９５、９６、９７で、その軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９８、９９、１００であり、１３Ａ２重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０１、１０２、１０３で、その軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０４、１０５、１０６である。１４Ｂ３重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０７、１０８、１０９で、その軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１０、１１１、１１２である。

【0012】

さらに、抗ヒトＢ７Ｈ３抗体又は断片は、形質転換を進行されると、ヒト化された抗体となる。

【0013】

抗ヒトＢ２Ｈ３ヒト化された抗体の２Ａ９重鎖可変領域におけるアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１３で、その軽鎖可変領域におけるアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１４であり、ヒト化された抗体の４Ｆ１１重鎖可変領域におけるアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１５で、その軽鎖可変領域におけるアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１６であり、ヒト化された抗体の９Ｃ８重鎖可変領域におけるアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１７で、その軽鎖可変領域におけるアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１８であり、ヒト化された抗体の１５Ａ２重鎖可変領域におけるアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１９で、その軽鎖可変領域におけるアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２０であり、ヒト化された抗体の５Ｂ６重鎖可変領域におけるアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２１で、その軽鎖可変領域におけるアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２２であり、ヒト化された抗体の７Ｂ７重鎖可変領域におけるアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２３で、その軽鎖可変領域におけるアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２４である。

【0014】

発現ベクターは、上記抗体の核酸分子を含む。

【0015】

薬物組成物は、上記抗体又はその機能断片と、薬用ベクターと、を含む。
上記抗体又はその機能的断片、核酸分子、発現ベクター、宿主細胞、薬物組成物は、Ｂ７Ｈ３免疫機能的薬物の調製のための用途で用いられる。

【0016】

本件特許では、哺乳動物細胞発現系を用いて、組換えＢ７Ｈ３受容体タンパク質を抗原として調製し、マウスを免疫した後、マウス脾臓細胞を骨髄腫細胞と融合してハイブリドーマ細胞を取得する。大量のハイブリドーマ細胞を複数回もクローニングしたり、スクリーニングしたりすることにより、複数のモノクローナル抗体ドーマ細胞株を取得する。それらのハイブリドーマ細胞株は、Ｂ７Ｈ３受容体に特異的に結合するモノクローナル抗体を分泌して産生することができる（図１、図２）。これらのモノクローナル抗体のうち、一部は明らかな細胞によるエンドサイトーシス機能を有し（図３、図４）、一部はヒト免疫細胞による細胞因子、例えば、ＩＦＮ－γの分泌を促進する機能を有し（図５）、一部は明らかなＡＤＣＣ関与機能を有し（図６、図７、図８）、ここで、一部のモノクローナル抗体は、将来のＡＤＣ、ＡＤＣＣ及びＢ７Ｈ３アンタゴニストの開発に用いられてもよい。さらに、ＲＴ－ＰＣＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ－Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応）によって、抗体における軽鎖可変領域及び重鎖可変領域の遺伝子をクローニングしてコーディングし、相補性決定クラスター接木法（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙａｒｉｔｙ－ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇｒｅｇｉｏｎｇｒａｆｔ、ＣＤＲ－ｇｒａｆｔ）を用いて、ヒト化された抗体を構築する。体外機能実験により、ヒト化されたＢ７Ｈ３抗体は、Ｂ７Ｈ３受容体タンパク質と特異的に結合することができる（図９、図１０）とともに、明らかな細胞によるエンドサイトーシス機能を保っており（図１１）、ＭＭＡＥ毒素をカップリングした後、Ｃａｌｕ－６腫瘍細胞に対して、明らかな毒殺機能（図１２）、ＡＤＣＣ関与機能（図１３）、ＮＫ９２ＭＩ－ｈＣＤ１６細胞を介したＪｕｒｋａｔ－Ｂ７Ｈ３及びＰＣ９細胞に対するＡＤＣＣ毒殺機能（図１４）、及び、ヒト免疫細胞による細胞因子、例えば、ＩＦＮ－γの産生及び分泌を促進する機能（図１５）を有することが判明された。本件特許で用いられる陽性対照抗体は、特許ＵＳ８８０２０９１及びＷＯ２０１７１８０８１３Ａｌに由来する。

【図面の簡単な説明】

【0017】

本発明における具体的な実施形態または従来技術の技術案をより明確に説明するために、以下は、具体的な実施形態または従来技術の説明に必要な添付図面を簡単に紹介する。明らかなことに、以下で説明している添付図面は、本発明の幾つかの実施例に過ぎず、当業者にとって、創造的な労力を払わずに、これらの添付図面を基にして他の添付図面を得ることが可能である。

【0018】

【図1】ＥＬＩＳＡ法により、Ｂ７Ｈ３ハイブリドーマモノクローナル抗体とＢ７Ｈ３－ｈＦｃタンパク質との結合特性を測定することを示す。

【図2】ＦＡＣＳ法により、Ｂ７Ｈ３ハイブリドーマモノクローナル抗体とＰＣ９細胞との結合特性を測定することを示す。

【図3】ＦＡＣＳ法により、Ｂ７Ｈ３ハイブリドーマ抗体のＪｕｒｋａｔ－Ｂ７Ｈ３細胞によってエンドサイトーシスされる活性を測定することを示す。

【図4】ＦＡＣＳ法により、Ｂ７Ｈ３ハイブリドーマ抗体のＰＣ９細胞によってエンドサイトーシスされる活性を測定することを示す。

【図5】Ｂ７Ｈ３ハイブリドーマ抗体によるヒトのＰＢＭＳ細胞ＩＦＮ－γの分泌への促進作用を示す。

【図6】レポーター遺伝子法により、Ｂ７Ｈ３ハイブリドーマ又はキメラ抗体が関与するＪｕｒｋａｔ－Ｂ７Ｈ３細胞に対するＡＤＣＣ機能を測定することを示す。

【図7】レポーター遺伝子法により、幾つかのＢ７Ｈ３キメラ抗体が関与するＰＣ９腫瘍細胞に対するＡＤＣＣ機能を測定することを示す。

【図8】レポーター遺伝子法により、幾つかのＢ７Ｈ３キメラ抗体が関与するＤＬＤ１腫瘍細胞に対するＡＤＣＣ機能を測定することを示す。

【図9】ＥＬＩＳＡ法により、ヒト化されたＢ７Ｈ３モノクローナル抗体とＢ７Ｈ３－Ｈｉｓタンパク質との結合特性を測定することを示す。

【図10】ＦＡＣＳ法により、ヒト化されたＢ７Ｈ３モノクローナル抗体とＰＣ９細胞におけるＢ７Ｈ３タンパク質との結合特性を測定することを示す。

【図11】ＦＡＣＳ法により、ヒト化されたＢ７Ｈ３モノクローナル抗体がＰＣ９細胞によってエンドサイトーシスされることを測定することを示す。

【図12】ヒト化されたＢ７Ｈ３抗体ＡＤＣによるＣａｌｕ－６腫瘍細胞に対する毒殺機能を示す。

【図13】レポーター遺伝子法により、ヒト化されたＢ７Ｈ３抗体によるＪｕｒｋａｔ－Ｂ７Ｈ３細胞およびＰＣ９細胞に対するＡＤＣＣ機能を測定することを示す。

【図14】ヒト化されたＢ７Ｈ３抗体が関与するＮＫ９２ＭＩ－ｈＣＤ１６細胞によるＪｕｒｋａｔ－Ｂ７Ｈ３細胞およびＰＣ９細胞に対するＡＤＣＣ毒殺機能とを示す。

【図15】ヒト化されたＢ７Ｈ３モノクローナル抗体によるヒトのＰＢＭＳ細胞ＩＦＮ－γの産出および分泌への促進作用を示す。

【具体的な実施形態】

【0019】

本文で用いられる用語の「抗体」は、最も広い意味で使われ、抗原と特異的に結合する１つ以上の抗原結合ドメインを含む免疫グロブリンまたは他の類別の分子を含み、特定の抗原に対して結合特異性を示すタンパク質またはポリペプチドである。抗体の具体的な実例として、完全抗体（例えば、従来の四鎖抗体分子）、一本鎖抗体、単一ドメイン抗体、二重特異性抗体、多重特異性抗体などが挙げられる。従来の抗体分子は、通常、同一の２重鎖および同一の２軽鎖をジスルフィド結合で互いに連結してなるテトラマーである。アミノ酸配列の保存的差異により、重鎖と軽鎖は、アミノ基端に位置する可変領域（Ｖ）と、カルボキシル末端に位置する定常領域（Ｃ）とに分けられる。可変領域は、抗原に対する識別や結合を行うためのものであり、定常領域（例えば、Ｆｃ断片）は、抗体依存性細胞関与の細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）のような下流効果を機能させるためのものである。重鎖可変領域及び軽鎖可変領域において、それぞれ３つの局所領域のアミノ酸組成があり、配列順序が更に高い変異度合いを有し、抗体と抗原の結合にとっての重要な位置となる。そのため、相補性決定領域（ＣＤＲ）とも呼ばれる。ＣＤＲのアミノ酸配列は、当業界で公認された番号の方案、例えば、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＩＭＧＴ、ＡｂＭ又はＣｏｎｔａｃｔにより、容易に特定されることが可能である。

【0020】

抗体の「抗原結合断片」とは、抗体分子における抗原との特異的結合に関与するアミノ酸断片のことを指し、例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ及びｓｃＦｖのうちの１つであってもよい。

【0021】

ＥＣ５０（ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｆｏｒ ５０％ ｏｆ ｍａｘｉｍａｌ ｅｆｆｅｃｔ）とは、最大効果５０％をもたらす濃度のことを指す。酵素結合免疫吸着測定（ＥＬＩＳＡ）では、抗体分子と対応する抗原との結合能力を表す場合、最大検出シグナル（例えば、測色強度又は蛍光強度）の半分を産生するときの抗体分子濃度のことを指してもよい。ＥＣ５０値が低いほど、抗原との結合親和力が大きくなる。

【0022】

本発明は、Ｂ７Ｈ３モノクローナル抗体又はその抗原結合断片に関し、重鎖および軽鎖を含み、前記重鎖のＣＤＲ１アミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９、３５、４１、４７、５３、５９、６５、７１、７７、８３、８９、９５、１０１、１０７のうちの１つから選ばれ、前記重鎖のＣＤＲ２アミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０、３６、４２、４８、５４、６０、６６、７２、７８、８４、９０、９６、１０２、１０８のうちの１つから選ばれ、前記重鎖のＣＤＲ３アミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１、３７、４３、４９、５５、６１、６７、７３、７９、８５、９１、９７、１０３、１０９のうちの１つから選ばれ、前記軽鎖のＣＤＲ１アミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２、３８、４４、５０、５６、６２、６８、７４、８０、８６、９２、９８、１０４、１１０のうちの１つから選ばれ、前記軽鎖のＣＤＲ２アミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３、３９、４５、５１、５７、６３、６９、７５、８１、８７、９３、９９、１０５、１１１のうちの１つから選ばれ、前記軽鎖のＣＤＲ３アミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４、４０、４６、５２、５８、６４、７０、７６、８２、８８、９４、１００、１０６、１１２のうちの１つから選ばれ、ここで、前記抗原結合断片における重鎖と軽鎖は、それぞれ前記抗体の重鎖と軽鎖のＣＤＲ１～ＣＤＲ３にわたるアミノ酸配列を含む。
本発明が提供するＢ７Ｈ３抗体又はその抗原結合断片は、重鎖ＣＤＲおよび軽鎖ＣＤＲを含み、前記重鎖ＣＤＲおよび前記軽鎖ＣＤＲは、ａ～ｎに示されるＣＤＲ組合せから選ばれた１つ以上の組を有する。

【0023】

【表10】

【0024】

幾つかの実施形態では、前記重鎖可変領域におけるアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７のうちの１つから選ばれ、前記軽鎖可変領域におけるアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８のうちの１つから選ばれる。

【0025】

幾つかの実施形態では、前記Ｂ７Ｈ３モノクローナル抗体又はその抗原結合断片は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域および前記軽鎖可変領域は、Ａ～Ｎに示される可変領域組合せのうちの１つ以上の組から選ばれる。

【0026】

【表11】

【0027】

一般的に当業者が理解できるように、抗体又はその抗原結合断片の機能的変異体も本発明の範囲内にあり、本文に用いられる用語「機能的変異体」とは、母体タンパク質分子（例えば、天然タンパク質分子）を基にして１つ以上のアミノ酸を挿入、欠失又は置換するように導入して得られた変異体分子のことを指し、依然として、母体タンパク質分子の少なくとも一部の機能（特に注目されている機能、例えば、対応する抗原との結合能力）を保留したものである。
ＣＤＲ領域について、本発明における機能的変異体は、重鎖相補性決定領域と軽鎖相補性決定領域を含み、ａ～ｎに示される相補性決定領域の組合せのいずれか１つと比べて、それぞれ、最多で３つのアミノ酸の変異（例えば、１つ、２つまたは３つのアミノ酸の置換、欠失又は追加、又はそのうちの任意の組合せ）を含む。好ましくは、前記変異は、保存的変異である。

【0028】

可変領域について、幾つかの実施形態では、本発明における機能的変異体は、重鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域におけるアミノ酸配列は、組み合せＡ～Ｎに示される重鎖可変領域配列のうちのいずれかとは、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する配列を含む。幾つかの実施形態では、本発明における機能的変異体は、軽鎖可変領域を含み、前記軽鎖可変領域におけるアミノ酸配列は、組み合せＡ～Ｎに示される軽鎖可変領域配列のうちのいずれかとは、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する配列を含む。「同一性」という用語は、２つのアミノ酸又はヌクレオチド配列同士間（例えば、クエリ配列と基準配列の間）の一致性の度合を指し、一般的に百分率で表される。通常、２つのアミノ酸又はヌクレオチド配列同士間の一致率（百分率）を計算する前に、配列アライメント（ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）をまず行い、（ギャップがあれば）そのギャップ（ｇａｐ）を導入する。或る比較位置にて、２つの配列におけるアミノ酸残基又は塩基が同じであれば、その２つの配列が当該位置において一致し、又は、マッチングしたと考えられる。２つの配列におけるアミノ酸残基又は塩基が異なるものであれば、両者が当該位置において一致しない、又はマッチングしないと考えられる。幾つかのアルゴリズムでは、配列の一致性は、マッチングした位置の数量を照合窓における位置の総数で除算することによって得られる。他の幾つかのアルゴリズムでは、ギャップの数量及び／又はギャップの長さも考慮されている。汎用的な配列比較アルゴリズムまたはソフトウェアとして、ＤＡＮＭＡＮ、ＣＬＵＳＴＡＬＷ、ＭＡＦＦＴ、ＢＬＡＳＴ、ＭＵＬＣＬＥなどが含まれる。本発明の目的からすると、公開された比較ソフトウェアＢＬＡＳＴ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／より得られる）が用いられ、デフォルトの設定を行うことにより、最適な配列比較が得られるとともに、２つのアミノ酸またはヌクレオチド配列同士間の配列一致性を算出してもよい。

【0029】

機能的変異体は、Ｂ７Ｈ３に特異的に結合する能力を備えている。当業者であれば、公知の技術を用いて、本明細書に記載されている抗原結合分子の適切な変異体を確定することができるはずである。幾つかの実施形態では、当業者は、活性化された適切な領域を破壊することなく、抗体またはその抗原結合断片のうち、Ｂ７Ｈ３に特異的に結合するための活性に対して重要ではない領域を同定することができる。

【0030】

幾つかの実施形態では、前記Ｂ７Ｈ３モノクローナル抗体又はその抗原結合断片は、マウス化またはヒト化されたものである。
幾つかの実施形態では、前記重鎖可変領域および前記軽鎖可変領域はヒト化されたものである。

【0031】

幾つかの実施形態では、前記重鎖および前記軽鎖はヒト化されたものである。
用語の「ヒト化された抗体（ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ）」は、ＣＤＲ移植抗体（ＣＤＲ－ｇｒａｆｔｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ）とも呼ばれ、第１の動物由来のＣＤＲ配列をヒトの抗体可変領域フレームワークに移植し、すなわち異なるタイプのヒト系抗体骨格配列に移植して産生された抗体のことを指す。キメラ抗体はマウスタンパク質成分を大量に含むことにより、異種反応を誘導してしまうことを回避することができる。このようなアーキテクチャ配列は、種別系抗体遺伝子配列を含む共通ＤＮＡデータベースまたは公開された参考文献から得られる。ヒト重鎖・軽鎖可変領域遺伝子のような種別系ＤＮＡ配列は、「ＶＢａｓｅ」人種系配列データベース（ｗｗｗ．ｍｒｃｃｐｅ．ｃｏｍ．ａｃ．ｕｋ／ｖｂａｓｅ）から得られ、また、Ｋａｂａｔ、Ｅ．Ａ．らよる『Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ』（１９９１年、第５版）から見つけることが可能である。免疫原性の低下と同時に引き起こされた活性の低下を回避するために、上述したヒト抗体可変領域フレームワーク配列に対して、最小逆方向異変又は復帰変異を実行することにより、活性を保持してもよい。本発明におけるヒト化された抗体は、さらに、ファージディスプレイにより、ＣＤＲを親和性成熟させたヒト化された抗体も含む。本発明における好適な一実施形態では、第１の動物由来はマウス由来である。

【0032】

幾つかの実施形態では、前記重鎖および前記軽鎖はヒト化されたものであり、ヒト化された前記重鎖可変領域におけるアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３のうちの１つから選ばれ、ヒト化された前記軽鎖可変領域におけるアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４のうちの１つから選ばれる。

【0033】

幾つかの実施形態では、ヒト化された前記重鎖可変領域および前記軽鎖可変領域は、１～６に示される可変領域組合せのうちの１つ以上の組から選ばれる。

【0034】

【表12】

【0035】

幾つかの実施形態では、前記重鎖および前記軽鎖はヒト化されたものであり、ヒト化された前記重鎖可変領域におけるアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１３であり、ヒト化された前記軽鎖可変領域におけるアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１４である。

【0036】

幾つかの実施形態では、前記Ｂ７Ｈ３モノクローナル抗体又はその抗原結合断片は、ヒトＩｇＧ１の定常領域を有する。

【0037】

本発明は、Ｂ７Ｈ３活性またはＢ７Ｈ３レベルを調節する薬物、顕著なエンドサイトーシス機能（腫瘍を毒素カップリングによって選択的に死滅または抑制することができる機能）を有し、又は、顕著な抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を有し、又は、Ｂ７Ｈ３の免疫抑制における作用をブロッキングすることによって生体免疫力を向上する薬物、Ｔリンパ球を促す薬物、又は、ＩＦＮ－γのようなＴリンパ球における細胞因子の産生を向上する薬物の調製における、Ｂ７Ｈ３モノクローナル抗体又はその抗原結合断片の用途にも関する。
本発明は、モノクローナル抗体とカップリング部分を含み、前記モノクローナル抗体は、上述したような１組のＢ７Ｈ３モノクローナル抗体又はその抗原結合断片であり、前記カップリング部分は、放射性核種、薬物、毒素、細胞因子、細胞因子受容体断片、酵素、フルオレセイン、及びビオチンのうちの１つ以上から選ばれる、モノクローナル抗体カップリング剤にも関する。

【0038】

本発明は、Ｂ７Ｈ３活性またはＢ７Ｈ３レベルを調節する薬物、顕著なエンドサイトーシス機能（腫瘍を毒素カップリングによって選択的に死滅または抑制することができる機能）を有する薬物、顕著な抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を有する薬物、Ｂ７Ｈ３の免疫抑制における作用をブロッキングすることによって生体免疫力を向上する薬物、Ｔリンパ球を促す薬物、又は、ＩＦＮ－γのようなＴリンパ球における細胞因子の産生を向上する薬物の調製における、上述したようなモノクローナル抗体カップリング剤の用途にも関する。

【0039】

本発明は、腫瘍を予防及び／又は治療および／又は補助治療する薬物の調製における、上述したようなモノクローナル抗体カップリング剤の用途にも関する。

【0040】

本発明は、上記抗体の核酸分子を含む発現ベクターにも関する。
本発明は、上記Ｂ７Ｈ３モノクローナル抗体又はその抗原結合断片を含む発現ベクターにも関する。

【0041】

「ベクター（ｖｅｃｔｏｒ）」との用語は、ポリヌクレオチドが挿入されてもよい核酸搬送ツールのことを指す。ベクターは、挿入されたポリヌクレオチドによりコーディングされたタンパク質を発現させることができる場合、発現ベクターと呼ばれる。ベクターは、形質転換、形質導入又は形質転換により宿主細胞に導入されて、担持された遺伝物質素子を宿主細胞に発現させることができる。ベクターは、当業者により公知されたものであり、プラスミド、ファージミド、コスミド、人工染色体（例えば、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）又はＰ１由来の人工染色体（ＰＡＣ））、ファージ（例えば、λファージ又はＭ１３ファージ）、及び、動物ウイルス等を含むが、それらに限定されない。ベクターとして用いられてもよい動物ウイルスは、逆転写酵素ウイルス（レンチウイルスを含む）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス）、ワクシニアウイルス、バキュロウイルス、パピローマウイルス、パピローマウイルス（例えばＳＶ４０）を含むが、それらに限定されない。幾つかの実施形態では、本発明に記載のベクターは、遺伝子工学における汎用的な調節因子、例えば、エンハンサー、プロモーター、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）及びその他の発現制御要素（例えば、転写終了シグナル、又はポリアデニル酸化シグナルやポリヌクレオチド配列等）を含む。

【0042】

本発明では、ベクターは、組成物であってもよく、例えば、複数のプラスミドの混合物であってもよいし、異なるプラスミド負荷抗体又はその抗原結合断片の一部であってもよい。

【0043】

本発明は、上記抗体又はその機能断片（のうちの少なくとも１つ）と、薬用ベクターと、を含む薬物組成物にも関する。

【0044】

本明細書で使用される場合、「薬用ベクター」は、活性成分と組み合わせられるときに、上記成分が生物学的活性を保持するとともに、被験者の免疫系と反応しない任意の材料を含む。実例として、標準的な薬用ベクター（例えば、リン酸緩衝塩水溶液、水、エマルジョン（油／水エマルジョン等）および各種の湿潤剤のいずれかが含まれるが、それらに限らない。そのようなベクターを含む組成物は、公知された一般的な方法により調製される（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１８版、Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏより編集、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｅａｓｏｎ、ＰＡ、１９９０、および、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ、Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ、第２１版、ＭａｃｋＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、２００５を参照）。

【0045】

本発明は、上記抗体又はその機能的断片、核酸分子、発現ベクター、宿主細胞、薬物組成物は、Ｂ７Ｈ３免疫機能的薬物の調製のための用途で用いられることにも関する。

【0046】

以下は、実施例を結び付けながら、本発明の実施形態を詳しく説明する。

【実施例】

【0047】

抗Ｂ７Ｈ３抗体を産生するマウス免疫及び細胞融合
ヒト化されたＢ７Ｈ３（ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＮＭ＿００１０２４７３６．２）の 細胞外領域およびｍＦｃ融合タンパク質（Ｂ７Ｈ３－ＥＣＤ－ｍＦｃ）を抗原として、等体完全フロイントアジュバント（Ｓｉｇｍａ、Ｃａｔ．Ｎｏ．：Ｆ５５８１）と十分に乳化した後、６～８週齢のＢａｌｂ／ｃマウス（ジョーエン（蘇州）新薬研究センター有限公司から購入）に対して皮下による免疫を実行し、抗原免疫量が５０μｇ／匹である。その後、２週間おきに、同じ用量の抗原を不完全フロイントアジュバント（Ｓｉｇｍａ、Ｃａｔ．Ｎｏ．：Ｆ５５０６）と十分に乳化させた後、マウスに対して皮下による免疫を３回実行する。３回の免疫を行った後、マウスの血清価を測定し、融合よりも前の３日間は、１回の補強免疫を腹腔注射により行う。ＰＥＧ Ｈｙｂｒｉ－Ｍａｘ（Ｓｉｇｍａ、Ｃａｔ．Ｎｏ．：７１８１）を融合剤とし、マウスの脾臓細胞をＳＰ２／０細胞と４：１の割合で混合し、融合した細胞を９６ウェルプレートに入れ（１×１０^５個／ウェル）、１ウェルあたりに、０．１ｍＬの１×ＨＡＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｔ．Ｎｏ．：２１０６０－０１７）培地を含有する。３日目に、０．１ｍＬのＨＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｔ．Ｎｏ．：１１０６７－０３０）培地を入れ、７日目に９６ウェルプレートにおける培地を吸い取り、新鮮なＨＴ培地を０．２ｍＬ追加する。９日目に、上澄み液を採取して各種のスクリーニングやテストを行う。

【実施例】

【0048】

ハイブリドーマ抗体による抗原結合力及びサブクローニング
ハイブリドーマ抗体による結合力のテストには、ＥＬＩＳＡと、ＦＡＣＳと、有限希釈法を用いたサブクローニングとが含まれる。

【0049】

１）ＥＬＩＳＡにより、Ｂ７Ｈ３結合陽性クローンをスクリーニングする。５０μＬのＢ７Ｈ３－ｈＦｃ（最終濃度：２μｇ／ｍＬ）を用いて、９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ｃａｔ．Ｎｏ．：９０１８）を包んで、室温で終夜放置する。洗浄緩衝液（ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で３回も洗浄した後、ブロッキング緩衝液（ＰＢＳ＋２％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ、Ｃａｔ．Ｎｏ．：Ｖ９００９３））を加えて室温で１時間インキュベートし、洗浄緩衝液でＥＬＩＳＡプレートを３回洗浄する。ハイブリドーマ上澄み液を加えて、室温で１時間インキュベートし、３回も洗浄する。各ウェルには、１００μＬの１００００倍希釈したＨＲＰカップリングヤギ抗マウスＩｇＧ二次抗体（Ｔｈｅｒｍｏ、Ｃａｔ．Ｎｏ．：３１４３２）を加えて、室温で１時間光遮蔽でインキュベートし、３回洗浄する。各ウェルには、１００μＬ ＴＭＢ（北京百奥賽博、Ｃａｔ．Ｎｏ．：ＥＳ－００２）を加えて、室温で２分間インキュベートして発色させ、１００μＬ／ウェルの終止液（２ＮＨ２ＳＯ４）を加えて発色反応を終了させ、マイクロプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ Ｓｐａｒｋ）で各ウェルのＯＤ４５０数値を読み取る。

【0050】

２）ＦＡＣＳにより、Ｂ７Ｈ３結合陽性クローンをスクリーニングする。上述した検出において陽性であるハイブリドーマ上澄み液又は精製したハイブリドーマ抗体を５０μＬ取ってから、５０μＬの２９３Ｔ－Ｂ７Ｈ３細胞と混合し（２×１０^５個／ウェル）、９６ウェルＵ底細胞プレートに添加して４ｏＣで１時間インキュベートし、ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ＋３％ＦＣＳ）で２回も洗浄して遠心分離させ、４００倍希釈したＰＥ標識のヤギ抗マウス抗（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、Ｃａｔ．Ｎｏ．：４０５３０７）を加えて、４ｏＣで３０分間光遮蔽でインキュベートし、ＦＡＣＳ緩衝液で２回も洗浄して遠心分離させてから、ＢＤＡｃｃｕｉＣ６のフローサイトメーターでＰＥパスにおける細胞のシグナル値を検出する。

【0051】

３）サブクローニングする。有限希釈法により、サブクローニングする。即ち、上述したＥＬＩＳＡおよびＦＡＣＳによる検出において陽性であるポリクローナルハイブリドーマ細胞に対してサブクローニングを行い、その後、ＥＬＩＳＡおよびＦＡＣＳの方法による検出スクリーニングを繰り返して、陽性ハイブリドーマモノクローンを取得する。

【0052】

抗体の精製、濃度の測定及びエンドトキシンの測定
陽性であるモノクローナルハイブリドーマ細胞を５０ｍＬの無血清培地に置いて（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｔ．Ｎｏ．：１２０４５－０７６）、８～９日間培養した後、遠心分離して上澄み液を回収する。Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａアフィニティークロマトグラフィーにより、モノクローナル抗体を精製し、精製した抗体サンプルに対して、限外濾過遠心チューブ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｃａｔ．Ｎｏ．：ＡＣＳ５０００２４）による液交換および濃縮を行い、その後、ＢＣＡ法により、タンパク質濃度を測定し、カブトガニ試薬（厦門リムルス試薬生物科学株式有限公司）を用いて、精製した抗体サンプルのエンドトキシンの含有量を検出する。

【0053】

精製した抗体サンプルのＢ７Ｈ３との結合能力をＥＬＩＳＡおよびＦＡＣＳにより検出し、その結果を図１（ａ～ｂ）、図２（ａ～ｂ）および表１に示す。選択されたハイブリドーマ抗体は、いずれも高い親和力を有するものである。

【0054】

表１ Ｂ７Ｈ３ハイブリドーマモノクローナル抗体とＢ７Ｈ３抗原の結合力ＥＣ_５０の値

【表1】

【実施例】

【0055】

ハイブリドーマモノクローナル抗体のエンドサイトーシス機能及びＢ７Ｈ３ブロッキング機能のテスト
抗体のエンドサイトーシス機能に対する分析：９６ウェルプレートにおいて、各ウェルに５０μＬの２×１０^６／ｍｌＰＣ９細胞及び５０μＬの標識されたＢ７Ｈ３抗体を加え、９６ウェル細胞培養プレートを４℃で１時間インキュベートし、ＦＡＣＳ ｂｕｆｆｅｒで２回洗浄した後、ＰＨ依存性蛍光染料であるＣｙｐＨｅｒ５Ｅ（ＧＥ、Ｃａｔ．Ｎｏ．：ＰＡ１５４０１）により標識されたＧｏａｔ ａｎｔｉ－ｍＦｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ、Ｃａｔ．Ｎｏ．：１１５－００５－０７１）二次抗体を加えてから、４℃で０．５時間インキュベートし、２回洗浄した後、培地（１６４０＋１０％ＦＢＳ）に入れ、インキュベーターで３時間放置してから、培地を遠心分離して除去し、ＰＨ９．０のＰＢＳにおいて再懸濁し、ＢＤ Ｃ６フローサイトメーターでＰＣ９細胞のＣｙｐＨｅｒ５Ｅシグナルを検出し、Ｂ７Ｈ３抗体が細胞内部に入る効率を算出する。図３（ａ～ｄ）及び図４（ａ～ｄ）に示されるように、Ｊｕｒｋａｔ－Ｂ７Ｈ３及びＰＣ９細胞は、Ｂ７Ｈ３抗体（１５Ａ２、５Ｂ６、７Ｃ９、２Ｆ７、７Ｂ７、２Ｅ１０、４Ｆ１１等を含む）に対して、顕著なエンドサイトーシス活性を有するものである。

【0056】

ヒトＰＢＭＣ細胞による細胞因子の分泌に対するＢ７Ｈ３ハイブリドーマ抗体の影響へのテスト：９６ウェル（Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ｃａｔ．Ｎｏ．：３７９９）において、完全培地（ＲＰＭＩ１６４０＋１０％ＦＣＳ）で再懸濁したＰＢＭＣ細胞（ＴＰＣＳ、Ｃａｔ．Ｎｏ．：ＰＢ０２５Ｃ）を加えてから、さらに４０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ３（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｃａｔ．Ｎｏ．：１６－００３７－８５）を加え、３７℃で７２時間インキュベートする。活性化されたＰＢＭＣ細胞をカウントした後、完全培地で再懸濁する（２．５×１０^５細胞／ｍＬ）。９６ウェルプレートにおいて、各ウェルにＰＢＭＣ細胞を１００μＬ、異なる濃度のＢ７Ｈ３抗体（開始濃度が２０μｇ／ｍＬで、１０倍系希釈したもの）を５０μＬ加えて、９６ウェル細胞培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ｃａｔ．Ｎｏ．：３５９９）を３７℃で、５％のＣＯ_２インキュベーターで４８時間インキュベートし、上澄み液を回収する。細胞因子の濃度をＩＦＮ－γ ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃａｔ．Ｎｏ．：ＤＹ２８５）で検出する。図５に示されるように、Ｂ７Ｈ３抗体は、５Ｂ６、２Ｆ１２、２Ｆ７、１５Ａ２、１３Ａ２、１４Ｂ３、４Ｆ１１、２Ａ９などを含み、ＰＢＭＣ細胞によるＩＦＮ－γの分泌を著しく促すことができる。

【実施例】

【0057】

Ｂ７Ｈ３抗体の可変領域遺伝子クローニング及び配列測定
Ｂ７Ｈ３モノクローナルハイブリドーマ細胞株をＴＲＩｚｏｎ（Ｃｗｂｉｏｔｅｃｈ、Ｃａｔ．Ｎｏ．：ＣＷ０５８０）で分解し、ハイブリドーマ細胞の全ＲＮＡを抽出する。ハイブリドーマ細胞のＲＮＡをＨｉＦｉ Ｓｃｒｉｐｔ ｃＤＮＡ合成キット（Ｃｗｂｉｏｔｅｃｈ、Ｃａｔ．Ｎｏ．：ＣＷ２５６９）でｃＤＮＡに逆転写する。ｃＤＮＡをテンプレートとして、簡便なプライマーを用いて、ＰＣＲ法（Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈｅｔａｌ．、（１９９３）、ＥｕｒＪＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ２３：２０６－２１１；Ｓｔｒｅｂｅ、ｅｔａｌ．、（２０１０）、ＡｎｔｉｂｏｄｙＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ１：３－１４）により、 抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域遺伝子を増幅する。ＰＣＲ増幅産物をＴ／Ａベクターに接続した後、ＤＨ５ａコンピテントセルを転化し、塗板して３７℃で一晩培養する。培養プレートからモノクローンをピックアップして、拡大して培養した後、プラスミドを抽出し、抗体の遺伝子配列を測定する。抗体の遺伝子配列に基づいて、その相補性決定クラスター（ＣＤＲ）及びスケルトン領域を解析する。Ｂ７Ｈ３抗体の配列番号を表２に示し、具体的な配列情報について、配列表を参照されたい。

【0058】

表２ Ｂ７Ｈ３抗体の配列番号の説明

【表2-1】

【表2-2】

【表2-3】

【表2-4】

【表2-5】

【表2-6】

【表2-7】

【実施例】

【0059】

ハイブリドーマモノクローナル抗体のＡＤＣＣ活性テスト
レポーター（Ｒｅｐｏｒｔｅｒ）遺伝子法により、抗体のＡＤＣＣ活性をテストする。２９３Ｔ－Ｂ７Ｈ３、ＰＣ９又はＤＬＤ１腫瘍細胞を標的細胞とし、Ｊｕｒｋａｔ－ｍＣＤ１６．２－ＮＦ－ｋＢ又はＪｕｒｋａｔ－ｈＣＤ１６－ＮＦ－ｋＢ細胞をエフェクター細胞とし、ｍＣＤ１６．２又はｈＣＤ１６に介入された転写因子ＮＦ－ｋＢの活性化シグナルを用いて、ＡＤＣＣ陽性クローンをスクリーニングする。上述したＥＬＩＳＡ及びＦＡＣＳによる検出において陽性であるハイブリドーマ抗体を５０μＬ取って、２５μＬの２９３Ｔ－Ｂ７Ｈ３、ＰＣ９又はＤＬＤ１腫瘍細胞（７．５×１０^４個／ウェル）と混合し、９６ウェルプレートに加えてから、さらに２５μＬのＪｕｒｋａｔ－ｍＣＤ６．２－ＮＦ－ｋＢ細胞（２．５×１０^４個／ウェル）を加え、均一に混合し、３７℃でのインキュベーターに置いて４時間インキュベートする。各ウェルに、予熱したＢｒｉｇｈｔ－Ｇｌｏ溶液（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｃａｔ．Ｎｏ．：Ｅ２６２０）を２５μＬ入れて、室温で光遮蔽で３分間静置し、マイクロプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ Ｓｐａｒｋ）により、各サンプルのコールド発光（Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）シグナル値を測定する。

【0060】

ハイブリドーマ抗体において、マウスのＩｇＧ１抗体はＡＤＣＣ活性を有しない。そのため、遺伝子配列測定により、１４個のハイブリドーマ抗体のうち、９個はマウスＩｇＧ１をベースとし、５個はＩｇＧ２ｂまたはＩｇＧ２ａをベースとすることが判明された（表３を参照）。図６ａには、ハイブリドーマ抗体のＪｕｒｋａｔ－Ｂ７Ｈ３を標的細胞としたＡＤＣＣレポーター遺伝子のテスト結果が表示される。予期通り、ＩｇＧ２ｂまたはＩｇＧ２ａをベースとした５個のハイブリドーマ抗体はＡＤＣＣ活性を有するが、マウスＩｇＧ１をベースとした９個のハイブリドーマ抗体は活性を有しない。そのため、マウスＩｇＧ１をベースとした９個のハイブリドーマ抗体について、Ｆｃの置換を行い、図６ｂに示されるように、それらの抗体を、ヒトＩｇＧ１をベースとしたキメラ抗体とした。図７と図８には、ＰＣ９又はＤＬＤ１腫瘍細胞を標的細胞としたＡＤＣＣレポーター遺伝子のテスト結果が示され、抗体の形態がヒトＩｇＧ１をベースとしたキメラ抗体である。ＡＤＣＣレポーター遺伝子のテスト結果を総括的にみると、ＡＤＣＣ活性が相対的に強いものとして、９Ｃ８、５Ｂ６、７Ｃ９、Ｆ５、７Ｅ６、２Ａ９、４Ｆ１１などが含まれる。

【0061】

表３ Ｂ７Ｈ３ハイブリドーマ抗体のＦｃタイプ

【表3】

【実施例】

【0062】

ヒト化されたＢ７Ｈ３抗体２Ａ９、４Ｆ１１、９Ｃ８、１５Ａ２、５Ｂ６及び７Ｂ７
ハイブリドーマ抗体の各面での特性を総合的に考察したところ、２Ａ９、４Ｆ１１、９Ｃ８、１５Ａ２、５Ｂ６及び７Ｂ７を含む６個のＢ７Ｈ３抗体を選択して、ヒト化形質転換を進行させる。

【0063】

相補決定クラスターグラフト法により、Ｂ７Ｈ３抗体に対するヒト化形質転換を進行する。まず、ＩＭＧＴデータベースにおいて、マウス２Ａ９、４Ｆ１１、９Ｃ８、１５Ａ２、５Ｂ６および７Ｂ７抗体の軽鎖可変領域配列、重鎖可変領域配列との相同性が最も高いヒト胚系抗体（ｇｅｒｍｌｉｎｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ）配列をそれぞれ調べる。２Ａ９抗体の軽鎖可変領域に対するヒト化には、胚系ＩＧＫＶ３－１１＊０１が選択され、重鎖可変領域に対するヒト化には、胚系ＩＧＨＶ１－２＊０２が選択される。４Ｆ１１抗体の軽鎖可変領域に対するヒト化には、胚系ＩＧＫＶ３－１１＊０１が選択され、重鎖可変領域に対するヒト化には、胚系ＩＧＨＶ１－２＊０２が選択される。９Ｃ８抗体の軽鎖可変領域に対するヒト化には、胚系ＩＧＫＶ３－１１＊０１が選択され、重鎖可変領域に対するヒト化には、胚系ＩＧＨＶ１－４６＊０１が選択される。１５Ａ２抗体の軽鎖可変領域に対するヒト化には、胚系ＩＧＫＶ３－１１＊０１が選択され、重鎖可変領域に対するヒト化には、胚系ＩＧＨＶ１－８＊０１が選択される。５Ｂ６抗体の軽鎖可変領域に対するヒト化には、胚系ＩＧＫＶ３－３９＊０１が選択され、重鎖可変領域に対するヒト化には、胚系ＩＧＨＶ１－６９＊０２が選択される。７Ｂ７抗体の軽鎖可変領域に対するヒト化には、胚系ＩＧＫＶ３－３９＊０１が選択され、重鎖可変領域に対するヒト化には、胚系ＩＧＨＶ１－２１＊０１が選択される。マウス抗体のＣＤＲ領域を残し、マウス抗体のフレームワーク領域（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ）配列をヒト胚性抗体のフレームワーク領域配列で置き換える。マウス抗体の構造モデルを確立し、ヒト化された抗体と、相応なマウス抗体フレームワーク領域における各部位とのアミノ酸を１つずつ比較する。フレームワーク領域におけるある部位には、ヒトのアミノ酸配列が用いられても、ＣＤＲ領域の空間構造が破壊されたり、変化したりすることがない場合、当該部位に対して、ヒトのアミノ酸配列を適用するが、さもなければ、当該部位に対して、対応するマウス配列を適用する（即ち、復帰変異がマウス配列である）。

【0064】

構造シミュレーションでは、２Ａ９抗体のヒト化された重鎖における２４番目のＡｌａをＴｈｒに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６７番目のＶａｌをＡｌａに、６９番目のＭｅｔをＬｅｕに、７１番目のＡｒｇをＶａｌに、７３番目のＴｈｒをＬｙｓにそれぞれ復帰変異する。２Ａ９抗体のヒト化された軽鎖における４６番目のＬｅｕをＡｒｇに、４７番目のＬｅｕをＴｒｐに、４８番目のＩｌｅをＶａｌに、７１番目のＰｈｅをＴｙｒに復帰変異する。４Ｆ１１抗体のヒト化された重鎖における２４番目のＡｌａをＴｈｒに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６７番目のＶａｌをＡｌａに、６９番目のＭｅｔをＬｅｕに、７１番目のＡｒｇをＶａｌに、７３番目のＴｈｒをＬｙｓにそれぞれ復帰変異する。４Ｆ１１抗体のヒト化された軽鎖における４６番目のＬｅｕをＡｒｇに、４７番目のＬｅｕをＴｒｐに、４８番目のＩｌｅをＶａｌに、７１番目のＰｈｅをＴｙｒに復帰変異する。９Ｃ８抗体のヒト化された重鎖における４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６７番目のＶａｌをＡｌａに、６９番目のＭｅｔをＬｅｕに、７１番目のＡｒｇをＶａｌに、７３番目のＴｈｒをＬｙｓにそれぞれ復帰変異する。９Ｃ８抗体のヒト化された軽鎖における２番目のＩｌｅをＴｈｒに、４６番目のＬｅｕをＡｒｇに、４７番目のＬｅｕをＴｒｐに、７１番目のＰｈｅをＴｙｒにそれぞれ復帰変異する。１５Ａ２抗体のヒト化された重鎖における４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６７番目のＶａｌをＡｌａに、６９番目のＭｅｔをＬｅｕに、７１番目のＡｒｇをＡｌａに、７３番目のＴｈｒをＬｙｓにそれぞれ復帰変異する。１５Ａ２抗体のヒト化された軽鎖における３６番目のＴｙｒをＰｈｅに、４７番目のＬｅｕをＴｒｐに、４９番目のＴｙｒをＨｉｓに、５８番目のＩｌｅをＰｈｅに、７１番目のＰｈｅをＴｙｒにそれぞれ復帰変異する。５Ｂ６抗体のヒト化された重鎖における２７番目のＧｌｙをＴｙｒに、３０番目のＳｅｒをＩｌｅに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６７番目のＶａｌをＡｌａに、６９番目のＩｌｅをＬｅｕにそれぞれ復帰変異する。５Ｂ６抗体のヒト化された軽鎖における４６番目のＬｅｕをＡｒｇに、４７番目のＬｅｕをＰｒｏに、６６番目のＧｌｙをＡｌａに、７１番目のＰｈｅをＴｙｒに、９８番目のＰｈｅをＩｌｅにそれぞれ復帰変異する。７Ｂ７抗体のヒト化された重鎖における４９番目のＳｅｒをＡｌａに復帰変異する。７Ｂ７抗体のヒト化された軽鎖における２番目のＩｌｅをＳｅｒに、４８番目のＩｌｅをＶａｌにそれぞれ、復帰変異する。

【0065】

ヒト化された抗体の重鎖可変領域と軽鎖可変領域におけるアミノ酸配列番号は、それぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１３とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１４である。４Ｆ１１ヒト化された抗体の重鎖可変領域と軽鎖可変領域におけるアミノ酸配列番号は、それぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１５とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１６である。９Ｃ８ヒト化された抗体の重鎖可変領域と軽鎖可変領域におけるアミノ酸配列番号は、それぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１７とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１８である。１５Ａ２ヒト化された抗体の重鎖可変領域と軽鎖可変領域におけるアミノ酸配列番号は、それぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１９とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２０である。５Ｂ６ヒト化された抗体の重鎖可変領域と軽鎖可変領域におけるアミノ酸配列番号は、それぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２１とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２２である。７Ｂ７ヒト化された抗体の重鎖可変領域と軽鎖可変領域におけるアミノ酸配列番号は、それぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２３とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２４である。以上のヒト化された抗体をＩｇＧ１サブタイプとして構築する。ヒト化された抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域におけるアミノ酸配列情報を表４に示す。

【0066】

番号が２Ａ９、４Ｆ１１、９Ｃ８、１５Ａ２、５Ｂ６及び７Ｂ７であるヒト化された抗体の軽鎖及び重鎖における核酸配列を合成して、発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１に挿入する。０．１ｍｇの抗体軽鎖と０．１ｍｇの抗体重鎖の発現プラスミドを用いて、２００ｍＬの２９３細胞（細胞密度が１×１０^６／ｍＬ）を共形質転換し、３７ｏＣシェーカーで６日間培養してから、遠心分離して上澄み液を回収し、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａでヒト化された抗体を精製し、精製したヒト化された抗体に対する活性の検出を行う。

【0067】

表４ Ｂ７Ｈ３ヒト化された抗体の配列表

【表4】

【実施例】

【0068】

ヒト化されたＢ７Ｈ３抗体とＢ７Ｈ３との結合作用
ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳにより、ヒト化されたＢ７Ｈ３抗体サンプルとＢ７Ｈ３タンパク質との結合活性を検出し、具体的な方法について、実施例２を参照されたい。ヒト化された抗体ｈｕ２Ａ９、ｈｕ４Ｆ１１、ｈｕ５Ｂ６、ｈｕ９Ｃ８、ｈｕ１５Ａ２及びｈｕ７Ｂ７に対する測定の結果を表５～６及び図９～１０に示す。全体的にみると、本発明における抗体は、ヒト化された後、ヒト化される前の高抗原親和力の作用を保持することができる。特に、ｈｕ１５Ａ２、ｈｕ７Ｂ７及びｈｕ５Ｂ６が挙げられる。

【0069】

表５ ＥＬＳＩＡによるヒト化されたＢ７Ｈ３抗体とＢ７Ｈ３－ｍＦｃタンパク質との結合作用への検出

【表5】

【0070】

表６ ＦＡＣＳによるヒト化されたＢ７Ｈ３抗体と細胞表面Ｂ７Ｈ３との結合作用への測定

【表6】

【実施例】

【0071】

ヒト化されたＢ７Ｈ３抗体のエンドサイトーシス機能への検出
具体的な測定方法について、実施例３を参照されたい。その結果として、表７及び図１１に示されるように、ＰＣ９細胞は、ヒト化されたＢ７Ｈ３抗体に対して顕著なエンドサイトーシス機能を有することが判明された。陽性対照（ＭａｃｒｏＧｅｎｉｃｓによるＭＧＡ０１８とＭＳＫＣＣの８Ｈ９）と照らして、本発明における抗体のエンドサイトーシス機能は、８Ｈ９よりもはるかに高い。また、ｈｕ１５Ａ２及びｈｕ７Ｂ７は、同様にＭＧＣ０１８よりも高い。

【0072】

表７ ＰＣ９腫瘍細胞によるヒト化されたＢ７Ｈ３抗体へのエンドサイトーシス機能

【表7】

【実施例】

【0073】

毒素とカップリングされるヒト化されたＢ７Ｈ３抗体（Ｂ７Ｈ３－ＡＤＣ）によるＣａｌｕ－６腫瘍細胞への毒殺機能
化学的なカップリング法により、Ｖｃ－ＭＭＡＥをＢ７Ｈ３抗体にカップリングさせる。３：１モル比で、Ｂ７Ｈ３抗体をＴＣＥＰで還元し、３７℃で４５分間インキュベートし、限外ろ過によりＴＣＥＰを除去する。抗体を０．５ｍｌのＰＢＳで再懸濁し、Ｂ７Ｈ３抗体よりも６倍モル数のＶｃ－ＭＭＡＥを加えて、４℃で１２０分間インキュベートし、限外濾過によりカップリングされていないＶｃ－ＭＭＡＥを除去し、使用に備えて抗体濃度を検出する。９６ウェルプレートに、１００μｌのＰＣ９（各ウェルに５０００細胞）および１００μｌの勾配的に希釈したＢ７Ｈ３－ＡＤＣを加える。３７℃で５日間インキュベートした後、各ウェルにＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏをｘμｌ添加し、蛍光強度を検出し、抗体が腫瘍細胞の増殖を抑制する能力を計算する。その結果、図１２及び表８に示されるように、ヒト化されたＢ７Ｈ３抗体は、ＭＭＡＥ毒素にカップリングした後、Ｃａｌｕ－６腫瘍細胞に対して顕著な毒殺機能を有し、ＭａｃｒｏＧｅｎｅの陽性対照（ＭＧＣ０１８－ＭＭＡＥ）よりも強い活性を有することが判明された。

【0074】

表８ ヒト化されたＢ７Ｈ３抗体とＭＭＡＥのカップリング剤によるＣａｌｕ－６腫瘍細胞に対する毒殺機能

【表8】

【実施例】

【0075】

ヒト化されたＢ７Ｈ３抗体によるＡＤＣＣ機能への検出
具体的な測定方法について、実施例５を参照されたい。その結果、表９および図１３に示されるように、ヒト化されたＢ７Ｈ３抗体は、顕著なＡＤＣＣ活性を有することが明らかになった。ＭＧＡ２７１（ＭＧ－Ａｂ）がＭａｃｒｏｇｅｎｉｃｓの抗体であり、それと比べて、ヒト化された９Ｃ８、５Ｂ６、２Ａ９及び４Ｆ１１抗体は、より小さいＥＣ５０値相を有し、より良いＡＤＣＣ活性を呈している。

【0076】

表９ ヒト化されたＢ７Ｈ３抗体によるＡＤＣＣ機能

【表9】

【実施例】

【0077】

ヒト化されたＢ７Ｈ３抗体介入ＮＫ９２ＭＩ－ｈＣＤ１６細胞によるＪｕｒｋａｔ－Ｂ７Ｈ３及びＰＣ９細胞に対するＡＤＣＣ毒殺機能
ＮＫ９２ＭＩ－ｈＣＤ１６を用いてＮＫ細胞を模擬することで、Ｂ７Ｈ３抗体の殺傷腫瘍活性を評価する。２５μｌのＣＦＳＥで染色されたＰＣ９（各ウェルに０．５×１０^５細胞）と、２５μｌのＮＫ９２ＭＩ－ｈＣＤ１６（各ウェルに１×１０^５細胞）とを混合し、勾配的に希釈されたＢ７Ｈ３抗体を５０μｌ添加する。３７℃で４時間インキュベートした後、各ウェルに７－ＡＡＤを５μｌ添加し、室温で１０分間インキュベートし、９６ウェルプレートを遠心分離して上澄み液を再懸濁し、その後、フローサイトメーターを用いて、ＣＦＳＥ陽性細胞におけるＣＦＳＥおよび７－ＡＡＤ二重陽性の細胞の割合を検出し、Ｂ７Ｈ３抗体介入のＮＫ細胞殺傷活性が得られる。その結果、図１４に示されるように、ヒト化されたＢ７Ｈ３抗体９Ｃ８、５Ｂ６、２Ａ９及び４Ｆ１１は、明らかに、ＮＫ９２ＭＩ－ｈＣＤ１６細胞のＰＣ９腫瘍細胞に対するＡＤＣＣ殺傷機能を引き起こすことができる。

【実施例】

【0078】

ヒトＰＢＭＣ細胞による細胞因子の分泌に対するヒト化されたＢ７Ｈ３抗体の促進機能
具体的な測定方法について、実施例３を参照されたい。その結果、図１５に示されるように、ヒト化されたＢ７Ｈ３抗体５Ｂ６、２Ａ９及び４Ｆ１１は、ヒトＰＢＭＣ細胞によるＩＦＮ－γの分泌を顕著に促進する機能を有する。
以上は、本発明の好適な実施例に過ぎず、本発明の保護範囲を限定するものではない。即ち、本発明の特許請求の範囲及び実用新案に基づく簡単な等価変化及び補正であれば、本発明の特許出願の保護範囲に入っているものである。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【国際調査報告】