▶ プリビファーマ・コンサルティング・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツングの特許一覧 ▶ ツェー・エス・エル・ベーリング・アクチエンゲゼルシャフトの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-06-04
(54)【発明の名称】血漿画分からプラスミノーゲンを単離するための方法
(51)【国際特許分類】
C07K 14/745 20060101AFI20240528BHJP
C12N 9/68 20060101ALN20240528BHJP
【ＦＩ】
C07K14/745
C12N9/68
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023575540
(86)(22)【出願日】2022-06-07
(85)【翻訳文提出日】2023-12-27
(86)【国際出願番号】 EP2022065352
(87)【国際公開番号】W WO2022258590
(87)【国際公開日】2022-12-15
(31)【優先権主張番号】21178363.4
(32)【優先日】2021-06-08
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】519324329
【氏名又は名称】プリビファーマ・コンサルティング・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング
(71)【出願人】
【識別番号】501091604
【氏名又は名称】ツェー・エス・エル・ベーリング・アクチエンゲゼルシャフト
(74)【代理人】
【識別番号】100127926
【弁理士】
【氏名又は名称】結田 純次
(74)【代理人】
【識別番号】100140132
【弁理士】
【氏名又は名称】竹林 則幸
(74)【代理人】
【識別番号】100216105
【弁理士】
【氏名又は名称】守安 智
(72)【発明者】
【氏名】モーリス・マンダゴ
(72)【発明者】
【氏名】リカルダ・ヴェルツ
(72)【発明者】
【氏名】シュテファン・テー・キーシク
(72)【発明者】
【氏名】サイモン・ゲルバー
【テーマコード（参考）】
4H045
【Ｆターム（参考）】
4H045AA10
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045CA42
4H045DA89
4H045EA24
4H045GA01
4H045GA05
4H045GA10
4H045GA15
(57)【要約】
本発明は、血漿画分からプラスミノーゲンを単離するための方法であって、プラスミノーゲンを含有する血漿画分の沈殿物を塩基性水性緩衝液に分散すること、その固体部分を分離して他のタンパク質の少なくとも一部を除去すること、およびプラスミノーゲンを、酸性水性緩衝液を用いて抽出することを含む、方法に関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
血漿画分からプラスミノーゲンを単離するための方法であって、以下の工程：（ｉ）プラスミノーゲンを含む血漿画分の沈殿物をｐＨ７～１０の塩基性水性緩衝液に分散すること；
（ｉｉ）工程（ｉ）から得た分散液をインキュベートして、塩基性水性緩衝液に可溶なタンパク質および他の不純物の少なくとも一部を溶解させること；
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）のインキュベートした分散液の固体部分と液体部分とを互いに分離すること；
（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）から得た固体部分を、溶解したリジンおよび／または式（Ｉ）：
（Ｈ２Ｎ）ｎ－Ｒ－（Ａ）ｍ （Ｉ）、
（式中：
ｎは１または２の整数であり；
ｍは０、１または２の整数であり；
Ａは各出現において互いに独立してカルボキシル基またはアミノ基であり；
Ｒは、直鎖または分枝鎖Ｃ３～Ｃ１２－アルキレン、直鎖または分枝鎖Ｃ３～Ｃ１２－ヘテロアルキレン、１つもしくはそれ以上のハロゲンまたは１つもしくはそれ以上のＣ１～Ｃ４－（ヘテロ）アルキル残基で場合により置換されているＣ６～Ｃ１２－アリーレン、１つもしくはそれ以上のハロゲンまたは１つもしくはそれ以上のＣ１～Ｃ４－（ヘテロ）アルキル残基で場合により置換されているＣ３～Ｃ１２－ヘテロアリーレン、１つもしくはそれ以上のハロゲンまたは１つもしくはそれ以上のＣ１～Ｃ４－（ヘテロ）アルキル残基で場合により置換されているＣ３～Ｃ１２－アルキレン－Ｃ６～Ｃ１２－アリーレン、１つもしくはそれ以上のハロゲンまたは１つもしくはそれ以上のＣ１～Ｃ４－（ヘテロ）アルキル残基で場合により置換されているＣ３～Ｃ１２－アルキレン－Ｃ３～Ｃ１２－ヘテロアリーレンである）
の少なくとも１種の他の化合物もしくはその塩をさらに含むｐＨ２～６．６の酸性水性緩衝液と混合し、
場合により混合物をインキュベートしてプラスミノーゲンを溶解させ、場合により固体部分を除去すること；ならびに
（ｖ）工程（ｉｖ）からの単離されたプラスミノーゲンを含有する溶液を得ること
を含む、方法。
【請求項2】
プラスミノーゲンはＧｌｕ－プラスミノーゲンである、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
血漿画分は：（ａ）乏クリオプラズマ上清または乏クリオプラズマ沈殿物；
（ｂ）Ｃｏｈｎ法のペーストＩ、ＩＩもしくはＩＩＩのいずれかの画分、またはそのうちの２つもしくは全ての組合せ；
（ｃ）Ｋｉｓｔｌｅｒ－Ｎｉｔｓｃｈｍａｎｎ法のペーストＩ、ＩＩもしくはＩＩＩのいずれかの画分、またはそのうちの２つもしくは全ての組合せ；および
（ｄ）これらのうちの２つまたは全ての組合せ
からなる群から選択される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項4】
工程（ｉ）の塩基性水性緩衝液はｐＨ８．５～９．５のものである；および／または工程（ｉｖ）における酸性水性緩衝液は、ギ酸、酢酸もしくはクエン酸緩衝液であるか、ｐＨ４．５～ｐＨ５．５を有するか、もしくはその両方を特徴とする、
請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項5】
固体部分と液体部分とを互いに分離する工程（ｉｉｉ）は、デッドエンド濾過、タンジェンシャルフロー濾過、もしくはその組合せを含む濾過、透析、好ましくは沈降による相分離、および／または遠心分離からなる群から選択される手段によって得られる、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項6】
固体部分と液体部分とを互いに分離する工程（ｉｉｉ）は濾過によって得られ、ここで、工程（ｉｉｉ）の前に、少なくとも１種の濾過助剤が分散液に添加されており、好ましくは、濾過助剤は、ポリマー、好ましくは高分子量ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、セルロース、またはセルロース誘導体、珪藻土、パーライト、界面活性剤、およびこれらのうちの２つ以上の組合せからなる群から選択される、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項7】
工程（ｉ）～（ｉｉｉ）は、それぞれ１回行われるか、または２回以上繰り返される、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項8】
式（Ｉ）の化合物は、アミノヘキサン酸、アミノペンタン酸、アミノヘプタン酸、アミノオクタン酸、アミノノナン酸、１，６－ジアミノヘキサン、アミノデカン酸、オルニチン、アミノメチル安息香酸、およびオキサリジンからなる群から選択され、特に、少なくとも１種の式（Ｉ）の化合物は、６－アミノヘキサン酸、特にアミノヘキサン酸である、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項9】
工程（ｖ）において得た単離されたプラスミノーゲンを含有する溶液は：溶液を、リジン、式（Ｉ）の化合物、またはその両方の少なくとも一部と相互作用する、サイズ排除特性を有するかまたは有しない少なくとも１種のイオン交換体と接触させること；
溶液を、リジン、式（Ｉ）の化合物、またはその両方の少なくとも一部と相互作用する少なくとも１種のサイズ排除樹脂と接触させること；
溶液を、リジン、式（Ｉ）の化合物、またはその両方の少なくとも一部と相互作用する少なくとも１種の疎水性または混合モード相互作用クロマトグラフィー樹脂と接触させること；
溶液を、リジン、式（Ｉ）の化合物、またはその両方の少なくとも一部を除去するダイアフィルトレーションに供すこと；
溶液を少なくとも１回の沈殿－洗浄サイクルに供すこと；
固定化されたリジンおよび／または少なくとも１種の固定化された式（Ｉ）の化合物を含む固定相に基づくクロマトグラフィー；
プラスミノーゲンについて選択的なアフィニティークロマトグラフィー；
分子サイズクロマトグラフィー；
透析；
デッドエンド限外濾過、タンジェンシャルフロー限外濾過、またはその組合せを含む限外濾過；ならびに
これらのうちの２つ以上の組合せ
からなる群から選択される少なくとも１つのさらなる工程にさらに供される、請求項１～８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項10】
工程（ｖ）において得た単離されたプラスミノーゲンを含有する溶液は、少なくとも以下のさらなる工程：（ｖｉ）１つまたはそれ以上のアミノ基を含む化合物、特にリジン、式（Ｉ）の化合物、またはその両方の少なくとも一部を、工程（ｖ）において得た溶液から、好ましくは溶液を、リジン、式（Ｉ）の化合物、またはその両方の少なくとも一部と相互作用する少なくとも１種のクロマトグラフィー樹脂、特にイオン交換体と接触させることによって除去すること；ならびに
（ｖｉｉ）好ましくは第１にプラスミノーゲンと固定相との相互作用を可能にする緩衝液を使用し、続いて、プラスミノーゲンとプラスミノーゲンとの相互作用を低減させる緩衝液によってプラスミノーゲンを溶出する、固定化されたリジンおよび／または少なくとも１種の固定化された式（Ｉ）の化合物を含む固定相に基づくクロマトグラフィーを好ましくは実行することによって、プラスミノーゲンの純度および／または濃度を増加させること；ならびに
（ｖｉｉｉ）工程（ｖｉｉ）からの単離されたプラスミノーゲンを含有する溶液を得ること
にさらに供される、請求項１～９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項11】
以下の工程：（ｉ）プラスミノーゲンを含む血漿画分の沈殿物をｐＨ７～１０、好ましくはｐＨ８～１０、より好ましくはｐＨ８．５～９．５の塩基性水性緩衝液に分散すること；
（ｉｉ）工程（ｉ）から得た分散液をインキュベートして、塩基性水性緩衝液に可溶なタンパク質および他の不純物の少なくとも一部を溶解させること；
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）のインキュベートした分散液の固体部分と液体部分とを、デッドエンド濾過、タンジェンシャルフロー濾過、もしくはその組合せを含む濾過、透析、好ましくは沈降による相分離、および／または遠心分離によって互いに分離すること；
（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）から得た固体部分を、溶解したリジン、少なくとも１種の式（Ｉ）の化合物またはその塩もしくは組合せをさらに含むｐＨ２～６．６、好ましくはｐＨ４．５～ｐＨ５の酸性水性緩衝液と混合し、場合により、混合物をインキュベートしてプラスミノーゲンを溶解させ、固体部分を除去すること；ならびに
（ｖ）工程（ｉｖ）からの単離されたプラスミノーゲンを含有する溶液を得ること；
（ｖｉ）１つまたはそれ以上のアミノ基を含む化合物、特にリジン、式（Ｉ）の化合物、またはその両方の少なくとも一部を、工程（ｖ）において得た溶液から、好ましくは溶液を、リジン、式（Ｉ）の化合物、またはその両方の少なくとも一部と相互作用する少なくとも１種のクロマトグラフィー樹脂、特にイオン交換体と接触させることによって除去すること；ならびに
（ｖｉｉ）第１にプラスミノーゲンと固定相との相互作用を可能にする緩衝液を使用し、続いて、プラスミノーゲンとプラスミノーゲンとの相互作用を低減させる緩衝液によってプラスミノーゲンを溶出する、固定化されたリジンおよび／または少なくとも１種の固定化された式（Ｉ）の化合物を含む固定相に基づくクロマトグラフィーを実行することによって、プラスミノーゲンの純度および／または濃度を増加させること；ならびに
（ｖｉｉｉ）工程（ｖｉｉ）からの単離されたプラスミノーゲンを含有する溶液を得ること
を含む、請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項12】
工程（ｉｖ）および／または工程（ｖｉ）は、存在する限り、溶液を、沈殿剤、特にオクタン酸の少なくとも一部と相互作用する少なくとも１種の小孔性陰イオン交換樹脂と接触させることを含む、請求項１～１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項13】
（ａ）好ましくは１種もしくはそれ以上の免疫グロブリン、特に免疫グロブリンＧの１つもしくはそれ以上の画分を含む、工程（ｉｉ）において少なくとも部分的に溶解されるタンパク質は回収されるか；（ｂ）方法は、目的の画分のウイルス不活化工程をさらに含むか；
（ｃ）単離されたプラスミノーゲンを含有する溶液のｐＨは、場合により水性緩衝液を交換することによって所望の範囲にさらに調整されるか；または
（ｄ）方法は、プラスミノーゲンのフリーズドライもしくは乾燥をさらに含むか；
（ｅ）これらのうちの２つ以上の組合せである、
請求項１～１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項14】
請求項１～１３のいずれか１項に記載の方法から取得可能なプラスミノーゲンを含む組成物であって、プラスミノーゲン、特にＧｌｕ－プラスミノーゲンが、総タンパク質含量の少なくとも７０％（ｗ／ｗ）を構成する、組成物。
【請求項15】
プラスミノーゲンを含む血漿画分の沈殿物からプラスミノーゲン以外のタンパク質を除去するための、ｐＨ８～１１の塩基性水性緩衝液の使用であって、好ましくは、請求項１～１３のいずれか１項に記載の方法を含む、使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、血漿画分からプラスミノーゲンを単離するための方法であって、プラスミノーゲンを含有する血漿画分の沈殿物を塩基性水性緩衝液に分散すること、その固体部分を分離して他のタンパク質の少なくとも一部を除去すること、およびプラスミノーゲンを、酸性水性緩衝液を用いて抽出することを含む、方法に関する。
【背景技術】
【0002】
血栓性事象は、重篤な健康上の問題を引き起こし得る。例えば、冠動脈梗塞、脳卒中および肺塞栓症は、先進国における主な死亡原因の一部である。血栓性事象の処置および予防は強く必要とされている。
【0003】
血栓性事象に関する多くの症例が知られている。血栓性事象の成立は、例えば、血管手術（例えば、冠動脈バイパス術）などの外科的介入、内部プロテーゼの存在（すなわち、異物／埋込剤または移植片、例えば血管／血管用内部プロテーゼの挿入）、または狭窄外傷性損傷（ｓｔｅｎｏｓｉｓ ｔｒａｕｍａｔｉｃ ｉｎｊｕｒｙ）において生じ得る。多様なさらなる原因が知られている。
【0004】
血栓性事象の処置は、通例、医薬品の投与に基づく。血栓の拡大を予防するために、抗凝固療法が求められる。ヘパリン調製物または第Ｘａ因子の阻害薬が使用される。フェンプロクモン、ワルファリンまたはビスクマ酢酸エチルなどの４－ヒドロキシクマリンが約３～６か月間使用される。クマリンは、血栓症を予防するが、出血傾向も増加するため、この薬物の使用は、典型的には、定期的な血液検査および特別な注意を必要とする。血栓塊の成長が停止すると、身体は損傷の浄化を開始することができる。身体は、典型的には、血塊を分解し、静脈の自由な流れを再び得ようとする（血行再建）。これには、典型的には数日、数週間、またはさらには数か月かかる。血栓塊の分解および静脈の再生において、血液の凝固性を高める物質が放出される場合がある。当技術分野で公知の大半の抗凝固薬は、大きな欠点を有し、多くの場合、重大な健康上のリスクを引き起こす。凝固に関する問題は、例えば、原因不明の肝不全または抗凝固薬の過剰投与によって引き起こされる可能性がある。線維素溶解部位は現時点では明らかになっていない。両側面の観察が処置の結果を改善するのに役立ち得る。処置の改善が所望されている。
【0005】
特許文献１および特許文献２に記載されているように、プラスミノーゲン、特にＧｌｕ－プラスミノーゲンは、患者における血栓性事象、特に微小血栓性事象を予防または処置するために効果的に使用できることが実験的に見出されている（特許文献１）。このことは、先天性または後天性プラスミノーゲン欠乏症に罹患している患者において特に関心のあるものであり得る。Ｇｌｕ－プラスミノーゲンは、ヒトプラズマにおける天然の循環前駆体である。Ｇｌｕ－プラスミノーゲンは、異なる単離および精製プロセスに起因してＬｙｓ－プラスミノーゲンに切断される場合がある。Ｌｙｓ－プラスミノーゲンを用いる処置は、出血などの望ましくない副作用をもたらし得る。Ｇｌｕ－プラスミノーゲンは、有意により長い半減期および十分に予測可能な活性を有する。したがって、Ｇｌｕ－プラスミノーゲンの精製が好ましい。
【0006】
プラスミノーゲン、特にＧｌｕ－プラスミノーゲンを良好な収率および純度で得ることには大きな関心が持たれている。プラスミノーゲンは血液中に天然に存在している。血液および血液画分も、プラスミノーゲンおよびその亜種の重要な供給源として役立つ。したがって、血液画分からプラスミノーゲン、特にＧｌｕ－プラスミノーゲンを単離するための方法が必要とされている。
【0007】
数十年の間、血液分画は、血中タンパク質、例えばアルブミン、免疫グロブリン画分、およびホルモン、ならびに血小板などの血液の他の成分を得るために使用されている。十分に確立された血液分画法は、Ｃｏｈｎ法またはＫｉｓｔｌｅｒ－Ｎｉｔｓｃｈｍａｎｎ法である。しかしながら、これらの方法は、典型的には、プラスミノーゲン、ましてや高い濃度および収率で提供するものではない。技術的および経済的理由のために、そのような確立された方法からプラスミノーゲン、特にＧｌｕ－プラスミノーゲンを取得可能となることは有益であり得る。
【0008】
特許文献３は、凍結Ｃｏｈｎ画分ＩＩＩまたはＩＩ／ＩＩＩペーストからのプラスミノーゲンの調製であって、解凍した材料を、１μＭ ｐ－ニトロフェニル－ｐ－グアニジノベンゾエートを含有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に懸濁し、続いて遠心分離および濾過工程を行い、その後、リジン－アガロース材料を介したクロマトグラフィーを行う、調製を記載している。カラムからの溶出は、ＰＢＳ中のアミノカプロン酸含量を増加することによって達成される。あるいは、特許文献３は、同様のプロセスをｐＨ８．０において行う方法に言及している。特許文献３の方法において、ｐＨの有意かつ意図的な変更は行われていないようである。
【0009】
特許文献４は、ｐＨ７．０の緩衝液と接触するプラズマの凍結クリオ沈殿物からプラスミンおよびプラスミノーゲンをクロマトグラフィー精製するためのいくつかの固定相を記載している。ここでは、アガロースに固定化されたトラネキサム酸（ＴＥＡ）が、プラスミン（プラスミノーゲン）およびフィブリノーゲンの同時単離も可能にする、使用に適したカラムであることが見出された。使用されるｐＨ範囲は中性から塩基性である。
【0010】
特許文献５は、プラズマからプラスミノーゲンを精製するために使用可能な特定のアフィニティークロマトグラフィー材料およびｐＨ７．５でのその使用を教示している。特許文献６は、約３～約１０のｐＨを有するプラスミノーゲン、ならびに浸透圧調整剤および安定化剤を含む医薬組成物を教示している。プラスミノーゲンは、中性ｐＨに類似しているｐＨでプラスミノーゲンを抽出することから得られる。
【0011】
特許文献７は、Ｃｏｈｎ画分ＩＩおよびＩＩＩから得られたカプリレート沈殿物を約３．５～約１０．５のｐＨの緩衝液と混合することを記載している。上述の特許のより具体的な例では、カプリレート沈殿物はｐＨ５を有する。抽出は、中性～ｐＨ１０．５の間で、さらにｐＨ７．５に調整されるｐＨで実行されることが教示されている。ｐＨ３．５での抽出は、特許文献７において使用された条件下では比較的効率的ではないことが示されている。さらに、リジンまたはイプシロンアミノカプロン酸のそのような混合物への添加、およびその後の陽イオン交換クロマトグラフィーも教示されている。最終プラスミノーゲンは、約２．５～約４のｐＨで溶出および緩衝される。
【0012】
特許文献１は、プラズマまたはプラズマ画分からＧｌｕ－プラスミノーゲンを単離するための方法であって、プラズマまたはプラズマ画分を陰イオン交換体と接触させること、および場合によりｐＨを所望の範囲に調整することを含む、方法を記載している。
【0013】
上記方法は、プラズマ画分からのプラスミノーゲンの単離を少なくとも部分的に可能にし、プラスミノーゲンの一部は高いＧｌｕ－プラスミノーゲン含量さえ有する。しかしながら、収率および純度をさらに改善すること、ならびにプラズマ画分からの、またはさらには慣例的なプラズマ分画法の副もしくは廃棄画分からの高品質プラスミノーゲンの取得を可能にする効率的な方法を提供することが所望されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0014】
【特許文献1】国際公開第２０１８／１６２７５４号
【特許文献2】国際公開第２０２０／１５２３２２号
【特許文献3】米国特許第５，２８８，４８９号
【特許文献4】国際公開第２００２／０９５０１９号
【特許文献5】欧州特許第１８８５４８５号
【特許文献6】国際公開第２０１６／０９５０１３号
【特許文献7】米国特許第８，２６８，７８２号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0015】
驚くべきことに、プラスミノーゲンを含む血漿画分の沈殿物を塩基性水性緩衝液に分散すること、その固体部分を分離すること、およびプラスミノーゲンを、好ましくは少なくとも１種の式（Ｉ）の化合物またはその塩もしくは組合せを含む酸性水性緩衝液を用いて抽出することを含む方法がプラスミノーゲンをもたらすことが見出された。
【課題を解決するための手段】
【0016】
本発明の第１の態様は、血漿画分からプラスミノーゲンを単離するための方法であって、以下の工程：
（ｉ）プラスミノーゲンを含む血漿画分の沈殿物をｐＨ７～１０の塩基性水性緩衝液に分散すること；
（ｉｉ）工程（ｉ）から得た分散液をインキュベートして、塩基性水性緩衝液に可溶なタンパク質および他の不純物の少なくとも一部を溶解させること；
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）のインキュベートした分散液の固体部分と液体部分とを互いに分離すること；
（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）から得た固体部分を、溶解したリジンおよび／または式（Ｉ）：
（Ｈ２Ｎ）ｎ－Ｒ－（Ａ）ｍ （Ｉ）、
（式中：
ｎは１または２の整数であり；
ｍは０、１または２の整数であり；
Ａは各出現において互いに独立してカルボキシル基またはアミノ基であり；
Ｒは、直鎖または分枝鎖Ｃ３～Ｃ１２－アルキレン、直鎖または分枝鎖Ｃ３～Ｃ１２－ヘテロアルキレン、１つもしくはそれ以上のハロゲンまたは１つもしくはそれ以上のＣ１～Ｃ４－（ヘテロ）アルキル残基で場合により置換されているＣ６～Ｃ１２－アリーレン、１つもしくはそれ以上のハロゲンまたは１つもしくはそれ以上のＣ１～Ｃ４－（ヘテロ）アルキル残基で場合により置換されているＣ３～Ｃ１２－ヘテロアリーレン、１つもしくはそれ以上のハロゲンまたは１つもしくはそれ以上のＣ１～Ｃ４－（ヘテロ）アルキル残基で場合により置換されているＣ３～Ｃ１２－アルキレン－Ｃ６～Ｃ１２－アリーレン、１つもしくはそれ以上のハロゲンまたは１つもしくはそれ以上のＣ１～Ｃ４－（ヘテロ）アルキル残基で場合により置換されているＣ３～Ｃ１２－アルキレン－Ｃ３～Ｃ１２－ヘテロアリーレンである）
の少なくとも１種の他の化合物もしくはその塩をさらに含むｐＨ２～６．６の酸性水性緩衝液と混合し、
場合により混合物をインキュベートしてプラスミノーゲンを溶解させ、場合により固体部分を除去すること；ならびに
（ｖ）工程（ｉｖ）からの単離されたプラスミノーゲンを含有する溶液を得ること
を含む、方法に関する。
（ｉ）プラスミノーゲンを含む血漿画分の沈殿物をｐＨ７～１０の塩基性水性緩衝液に分散すること；
（ｉｉ）工程（ｉ）から得た分散液をインキュベートして、塩基性水性緩衝液に可溶なタンパク質および他の不純物の少なくとも一部を溶解させること；
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）のインキュベートした分散液の固体部分と液体部分とを互いに分離すること；
（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）から得た固体部分を、溶解したリジンおよび／または式（Ｉ）：
（Ｈ２Ｎ）ｎ－Ｒ－（Ａ）ｍ （Ｉ）、
（式中：
ｎは１または２の整数であり；
ｍは０、１または２の整数であり；
Ａは各出現において互いに独立してカルボキシル基またはアミノ基であり；
Ｒは、直鎖または分枝鎖Ｃ３～Ｃ１２－アルキレン、直鎖または分枝鎖Ｃ３～Ｃ１２－ヘテロアルキレン、１つもしくはそれ以上のハロゲンまたは１つもしくはそれ以上のＣ１～Ｃ４－（ヘテロ）アルキル残基で場合により置換されているＣ６～Ｃ１２－アリーレン、１つもしくはそれ以上のハロゲンまたは１つもしくはそれ以上のＣ１～Ｃ４－（ヘテロ）アルキル残基で場合により置換されているＣ３～Ｃ１２－ヘテロアリーレン、１つもしくはそれ以上のハロゲンまたは１つもしくはそれ以上のＣ１～Ｃ４－（ヘテロ）アルキル残基で場合により置換されているＣ３～Ｃ１２－アルキレン－Ｃ６～Ｃ１２－アリーレン、１つもしくはそれ以上のハロゲンまたは１つもしくはそれ以上のＣ１～Ｃ４－（ヘテロ）アルキル残基で場合により置換されているＣ３～Ｃ１２－アルキレン－Ｃ３～Ｃ１２－ヘテロアリーレンである）
の少なくとも１種の他の化合物もしくはその塩をさらに含むｐＨ２～６．６の酸性水性緩衝液と混合し、
場合により混合物をインキュベートしてプラスミノーゲンを溶解させ、場合により固体部分を除去すること；ならびに
（ｖ）工程（ｉｖ）からの単離されたプラスミノーゲンを含有する溶液を得ること
を含む、方法に関する。
【0017】
特許請求される方法は、高純度のプラスミノーゲン、特にＧｌｕ－プラスミノーゲンの高い収率を実現することが驚くべきことに見出された。方法は、比較的少ない作業労力で行うことができる。したがって、本発明は技術的に有益である。
【発明を実施するための形態】
【0018】
本明細書で使用される場合、プラスミノーゲンは、任意のプラスミノーゲンまたはそのより多くの種類（例えば、Ｇｌｕ－プラスミノーゲン、Ｌｙｓ－プラスミノーゲンおよび／またはプラスミン）の誘導体もしくは組合せであり得る。そのようなタンパク質の構造およびプラスミノーゲン／プラスミン系の機能は、一般によく知られている。本発明の意味におけるプラスミノーゲンは、任意の目的の種のプラスミノーゲンであり得る。好ましくは、プラスミノーゲンはヒトまたは哺乳動物起源のものである。
【0019】
「タンパク質」、「ポリペプチド」および「ペプチド」という用語は、本発明全体にわたって最も広い意味で、主にアミノ酸残基から構成され、別のアミノ酸残基とアミド結合を介して連続的に連結している少なくとも２０アミノ酸残基を含む任意の化学実体として交換可能に理解される。本発明の意味におけるタンパク質は、１つもしくはそれ以上の翻訳後修飾に供されていても供されていなくてもよい、および／または１つもしくはそれ以上の非アミノ酸部分とコンジュゲートしていてもしていなくてもよいということが理解されるだろう。タンパク質の末端は、場合により、例えばアミド化、アセチル化、メチル化、アシル化などの当技術分野で公知の任意の手段によってキャッピングされることがある。
【0020】
翻訳後修飾は、当技術分野で周知であり、脂質化、リン酸化、硫酸化、グリコシル化、短縮化、酸化、還元、脱カルボキシル化、アセチル化、アミド化、脱アミド化、ジスルフィド結合形成、アミノ酸付加、補因子付加（例えば、ビオチン化、ヘム付加、エイコサノイド付加、ステロイド付加）、および金属イオン、非金属イオン、ペプチドまたは低分子の錯体化、および鉄－スルフィドクラスターの付加であり得るが、これらに限定しなくてもよい。さらに、場合により、補因子、特に環状グアノシン一リン酸（ｃＧＭＰ）、場合によりさらに、例えば、ＡＴＰ、ＡＤＰ、ＮＡＤ＋、ＮＡＤＨ＋Ｈ＋、ＮＡＤＰ＋、ＮＡＤＰＨ＋Ｈ＋、金属イオン、アニオン、脂質などのような補因子は、これらの補因子の生物学的影響と無関係にタンパク質に結合していてもよい。プラスミノーゲンの文脈では、特に、グリコシル化およびジスルフィド結合が生じ得る。
【0021】
好ましい実施形態では、本発明の文脈において、プラスミノーゲンはＧｌｕ－プラスミノーゲンである。したがって、本発明全体にわたって、プラスミノーゲンはＧｌｕ－プラスミノーゲンであると規定してもよい。本発明の方法の利点は、Ｇｌｕ－プラスミノーゲンの２つのグリコシル化パターンが、単離された生成物において観察可能であり得ることである。このことは、天然Ｇｌｕ－プラスミノーゲンを反映し得る。
【0022】
代替的な実施形態では、プラスミノーゲンはＬｙｓ－プラスミノーゲンである。代替的な実施形態では、プラスミノーゲンはＧｌｕ－プラスミノーゲンとＬｙｓ－プラスミノーゲンとの組合せである。ここにおいて、Ｌｙｓ－プラスミノーゲンとＧｌｕ－プラスミノーゲンとは、任意のバリエーションで組み合わせることができる（好ましくは、大部分がＧｌｕ－プラスミノーゲンである）。代替的な好ましい実施形態では、プラスミノーゲンは、Ｇｌｕ－プラスミノーゲンと、Ｌｙｓ－プラスミノーゲンと、１種またはそれ以上の他のプラスミノーゲン誘導体との組合せである。ここにおいて、Ｌｙｓ－プラスミノーゲンと、Ｇｌｕ－プラスミノーゲンと、１種またはそれ以上の他のプラスミノーゲン誘導体とは、任意のバリエーションで組み合わせることができる（好ましくは、大部分がＧｌｕ－プラスミノーゲンである）。
【0023】
Ｇｌｕ－プラスミノーゲンは、プラズマ由来の酵素前駆体である。Ｇｌｕ－プラスミノーゲンは（本質的に）タンパク質分解活性を有しないことが知られている。好ましくは、患者に投与されるプラスミノーゲン組成物（好ましくはＧｌｕ－プラスミノーゲンを含有する）は、（本質的に）タンパク質分解活性を有しない。そのような、タンパク質分解活性が（本質的に）存在しないことは、当業者によって一般に理解される最も広い意味で理解される。好ましくは、患者に投与されるＧｌｕ－プラスミノーゲンおよび／またはプラスミノーゲン組成物（好ましくはＧｌｕ－プラスミノーゲンを含有する）の酵素活性は、総タンパク質含量１．０ｇ／Ｌ当たり７０単位（Ｕ、すなわち、μｍｏｌ基質／分）未満、または総タンパク質含量１．０ｇ／Ｌ当たり５０Ｕ未満、２５Ｕ未満、１０Ｕ未満、９Ｕ未満、８Ｕ未満、７Ｕ未満、６Ｕ未満、５Ｕ未満、２Ｕ未満、１Ｕ未満、０．５Ｕ未満、０．１Ｕ未満、または０．０１Ｕ未満である。この文脈において、タンパク質分解活性は任意の手段によって決定することができる。例えば、それは、Ｓ－２２８８（Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ）タンパク質分解活性アッセイによって決定される活性であり得る。あるいは、それは、Ｄ－二量体の生成をもたらすフィブリンの分解として決定してもよい。プラスミンの特定の酵素活性は、フィブリンの分解からのＤ－二量体の生成を測定することによって決定することができる。好ましくは、患者に投与されるＧｌｕ－プラスミノーゲンおよび／またはプラスミノーゲン組成物（好ましくはＧｌｕ－プラスミノーゲンを含有する）のタンパク質分解活性は、アッセイの検出限界未満である。
【0024】
好ましい実施形態では、患者に投与されるプラスミノーゲン組成物は、プラスミノーゲン、特にＧｌｕ－プラスミノーゲンを、総タンパク質含量に基づいて少なくとも７５％（ｗ／ｗ）、少なくとも８０％（ｗ／ｗ）、少なくとも８５％（ｗ／ｗ）、少なくとも９０％（ｗ／ｗ）、少なくとも９５％（ｗ／ｗ）、少なくとも９６％（ｗ／ｗ）、少なくとも９７％（ｗ／ｗ）、少なくとも９８％（ｗ／ｗ）、または少なくとも９９％（ｗ／ｗ）の純度において含有する。
【0025】
好ましい実施形態では、得られるプラスミノーゲン組成物（好ましくはＧｌｕ－プラスミノーゲン組成物を含有する）は、内毒素を含有しないか、または１ＥＵ／ｍＬ未満、０．５ＥＵ／ｍＬ未満、０．１ＥＵ／ｍＬ未満、０．０５ＥＵ／ｍＬ未満、もしくは０．０１ＥＵ／ｍＬ未満（欧州薬局方（バージョン５．０）第２．６．１４章に記載のカブトガニ血球抽出物（ＬＡＬ）エンドセーフエンドクローム（ｅｎｄｏｓａｆｅ ｅｎｄｏｃｈｒｏｍｅ）アッセイにおいて決定される）の低い内毒素含量のみを含有する。
【0026】
好ましい実施形態では、患者に投与されるプラスミノーゲン組成物（好ましくはＧｌｕ－プラスミノーゲンを含有する）は、免疫グロブリンを含有しないか、または５ｇ／Ｌ未満、２ｇ／Ｌ未満、１ｇ／Ｌ未満、０．５ｇ／Ｌ未満、もしくは０．１ｇ／Ｌ未満の免疫グロブリン（比濁分析アッセイにおいて決定される）という低い免疫グロブリン含量のみを含有する。
【0027】
本明細書で使用される場合、塩基性水性緩衝液に可溶な他の不純物は、例えば、オクタン酸および／もしくは１種もしくはそれ以上の賦形剤などの１種もしくはそれ以上の低分子不純物などの任意の不純物であり得る、ならびに／または１種もしくはそれ以上の高分子量不純物であり得る。
【0028】
血漿（「プラズマ」、「プラズム」または「血液プラズム」などとも称される）は、任意の供給源から得ることができる。それは、例えば、細胞が除去された血液保存液から得ることができる。血漿はまた、様々な供給業者から市販されている。
【0029】
本発明の文脈において、「プラズマ画分」という用語は、最も広い意味で、Ｇｌｕ－プラスミノーゲンを含む、血漿から分離された任意の部分として理解される。血漿からプラズマ画分を調製するためのいくつかの方法が当業者に公知である。一般的に知られている一例は、凍結－解凍サイクル、および溶液中のエタノール濃度を漸進的に増加させることに基づくＣｏｈｎ法（Ｃｏｈｎの方法とも称される）である。
【0030】
本明細書で使用される血漿画分の沈殿物は、プラスミノーゲンを含む、血漿またはその任意の画分であり得る。好ましくは、血漿画分は、例えば、ＣｏｈｎまたはＫｉｓｔｌｅｒ－Ｎｉｔｓｃｈｍａｎｎ法などの十分に確立された血液分画法から得られる。好ましい実施形態では、血漿画分は：
（ａ）乏クリオプラズマ上清または乏クリオプラズマ沈殿物；
（ｂ）ＣｏｈｎもしくはＫｉｓｔｌｅｒ－Ｎｉｔｓｃｈｍａｎｎ法のペーストＩ、ＩＩもしくはＩＩＩのいずれかの画分、またはそのうちの２つもしくは全ての組合せ；
（ｃ）ＣｏｈｎもしくはＫｉｓｔｌｅｒ－Ｎｉｔｓｃｈｍａｎｎ法のペーストＩ、ＩＩもしくはＩＩＩのいずれかの画分、またはそのうちの２つもしくは全ての組合せ；および
（ｄ）これらのうちの２つまたは全ての組合せ
からなる群から選択される。
（ａ）乏クリオプラズマ上清または乏クリオプラズマ沈殿物；
（ｂ）ＣｏｈｎもしくはＫｉｓｔｌｅｒ－Ｎｉｔｓｃｈｍａｎｎ法のペーストＩ、ＩＩもしくはＩＩＩのいずれかの画分、またはそのうちの２つもしくは全ての組合せ；
（ｃ）ＣｏｈｎもしくはＫｉｓｔｌｅｒ－Ｎｉｔｓｃｈｍａｎｎ法のペーストＩ、ＩＩもしくはＩＩＩのいずれかの画分、またはそのうちの２つもしくは全ての組合せ；および
（ｄ）これらのうちの２つまたは全ての組合せ
からなる群から選択される。
【0031】
好ましい実施形態では、血漿画分は、Ｃｏｈｎ法のペーストＩの画分、Ｃｏｈｎ法のペーストＩＩの画分、Ｃｏｈｎ法のペーストＩＩＩの画分、Ｃｏｈｎ法のペーストＩおよびＩＩの画分、Ｃｏｈｎ法のペーストＩおよびＩＩＩの画分、Ｃｏｈｎ法のペーストＩＩおよびＩＩＩの画分、Ｃｏｈｎ法のペーストＩ、ＩＩおよびＩＩＩの画分からなる群から選択される。好ましい実施形態では、血漿画分は、Ｃｏｈｎ法のペーストＩの副または廃棄画分、Ｃｏｈｎ法のペーストＩＩの副または廃棄画分、Ｃｏｈｎ法のペーストＩＩＩの副または廃棄画分、Ｃｏｈｎ法のペーストＩおよびＩＩの副または廃棄画分、Ｃｏｈｎ法のペーストＩおよびＩＩＩの副または廃棄画分、Ｃｏｈｎ法のペーストＩＩおよびＩＩＩの副または廃棄画分、Ｃｏｈｎ法のペーストＩ、ＩＩおよびＩＩＩの副または廃棄画分からなる群から選択される。
【0032】
好ましい実施形態では、血漿画分は、Ｃｏｈｎ法のペーストＩＩおよびＩＩＩの画分である。好ましい実施形態では、血漿画分は、Ｃｏｈｎ法のペーストＩおよびＩＩの画分である。好ましい実施形態では、血漿画分は、Ｃｏｈｎ法のペーストＩＩおよびＩＩＩの副または廃棄画分である。好ましい実施形態では、血漿画分は、Ｃｏｈｎ法のペーストＩおよびＩＩの副または廃棄画分である。
【0033】
別の好ましい実施形態では、血漿画分は、Ｋｉｓｔｌｅｒ－Ｎｉｔｓｃｈｍａｎｎ法のペーストＩの画分、Ｋｉｓｔｌｅｒ－Ｎｉｔｓｃｈｍａｎｎ法のペーストＩＩの画分、Ｋｉｓｔｌｅｒ－Ｎｉｔｓｃｈｍａｎｎ法のペーストＩＩＩの画分、Ｋｉｓｔｌｅｒ－Ｎｉｔｓｃｈｍａｎｎ法のペーストＩおよびＩＩの画分、Ｋｉｓｔｌｅｒ－Ｎｉｔｓｃｈｍａｎｎ法のペーストＩおよびＩＩＩの画分、Ｋｉｓｔｌｅｒ－Ｎｉｔｓｃｈｍａｎｎ法のペーストＩＩおよびＩＩＩの画分、Ｋｉｓｔｌｅｒ－Ｎｉｔｓｃｈｍａｎｎ法のペーストＩ、ＩＩおよびＩＩＩの画分からなる群から選択される。別の好ましい実施形態では、血漿画分は、Ｋｉｓｔｌｅｒ－Ｎｉｔｓｃｈｍａｎｎ法のペーストＩの副または廃棄画分、Ｋｉｓｔｌｅｒ－Ｎｉｔｓｃｈｍａｎｎ法のペーストＩＩの副または廃棄画分、Ｋｉｓｔｌｅｒ－Ｎｉｔｓｃｈｍａｎｎ法のペーストＩＩＩの副または廃棄画分、Ｋｉｓｔｌｅｒ－Ｎｉｔｓｃｈｍａｎｎ法のペーストＩおよびＩＩの副または廃棄画分、Ｋｉｓｔｌｅｒ－Ｎｉｔｓｃｈｍａｎｎ法のペーストＩおよびＩＩＩの副または廃棄画分、Ｋｉｓｔｌｅｒ－Ｎｉｔｓｃｈｍａｎｎ法のペーストＩＩおよびＩＩＩの副または廃棄画分、Ｋｉｓｔｌｅｒ－Ｎｉｔｓｃｈｍａｎｎ法のペーストＩ、ＩＩおよびＩＩＩの副または廃棄画分からなる群から選択される。好ましい実施形態では、血漿画分は、Ｋｉｓｔｌｅｒ－Ｎｉｔｓｃｈｍａｎｎ沈殿物Ａ（ＰＰＴ－ＮＡ）である。
【0034】
好ましい実施形態では、血漿画分は、Ｋｉｓｔｌｅｒ－Ｎｉｔｓｃｈｍａｎｎ法のペーストＩＩおよびＩＩＩの画分である。好ましい実施形態では、血漿画分は、Ｋｉｓｔｌｅｒ－Ｎｉｔｓｃｈｍａｎｎ法のペーストＩおよびＩＩの画分である。好ましい実施形態では、血漿画分は、Ｋｉｓｔｌｅｒ－Ｎｉｔｓｃｈｍａｎｎ法のペーストＩＩおよびＩＩＩの副または廃棄画分である。好ましい実施形態では、血漿画分は、Ｋｉｓｔｌｅｒ－Ｎｉｔｓｃｈｍａｎｎ法のペーストＩおよびＩＩの副または廃棄画分である。
【0035】
別の好ましい実施形態では、血漿画分は、Ｃｏｈｎ法のペーストＩの画分、Ｃｏｈｎ法のペーストＩＩの画分、Ｃｏｈｎ法のペーストＩＩＩの画分、Ｃｏｈｎ法のペーストＩおよびＩＩの画分、Ｃｏｈｎ法のペーストＩおよびＩＩＩの画分、Ｃｏｈｎ法のペーストＩＩおよびＩＩＩの画分、Ｃｏｈｎ法のペーストＩ、ＩＩおよびＩＩＩの画分からなる群から選択される。
【0036】
好ましい実施形態では、血漿画分は、Ｃｏｈｎ法のペーストＩＩおよびＩＩＩの画分である。好ましい実施形態では、血漿画分は、Ｃｏｈｎ法のペーストＩおよびＩＩの画分である。
【0037】
別の好ましい実施形態では、血漿画分は、Ｋｉｓｔｌｅｒ－Ｎｉｔｓｃｈｍａｎｎ法のペーストＩの画分、Ｋｉｓｔｌｅｒ－Ｎｉｔｓｃｈｍａｎｎ法のペーストＩＩの画分、Ｋｉｓｔｌｅｒ－Ｎｉｔｓｃｈｍａｎｎ法のペーストＩＩＩの画分、Ｋｉｓｔｌｅｒ－Ｎｉｔｓｃｈｍａｎｎ法のペーストＩおよびＩＩの画分、Ｋｉｓｔｌｅｒ－Ｎｉｔｓｃｈｍａｎｎ法のペーストＩおよびＩＩＩの画分、Ｋｉｓｔｌｅｒ－Ｎｉｔｓｃｈｍａｎｎ法のペーストＩＩおよびＩＩＩの画分、Ｋｉｓｔｌｅｒ－Ｎｉｔｓｃｈｍａｎｎ法のペーストＩ、ＩＩおよびＩＩＩの画分からなる群から選択される。
【0038】
好ましい実施形態では、血漿画分は、Ｋｉｓｔｌｅｒ－Ｎｉｔｓｃｈｍａｎｎ法のペーストＩＩおよびＩＩＩの画分である。好ましい実施形態では、血漿画分は、Ｋｉｓｔｌｅｒ－Ｎｉｔｓｃｈｍａｎｎ法のペーストＩおよびＩＩの画分である。
【0039】
工程（ｉ）の沈殿物は、プラスミノーゲン、特にＧｌｕ－プラスミノーゲンを含有することが理解されるだろう。そのような沈殿物は、任意の手段によって取得可能であり得る（得ることができる）。好ましい実施形態では、沈殿物は、プラスミノーゲンを含む血液画分を有機溶媒（例えば、オクタン酸、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、ペンタノール、ヘキサノール、ヘプタノール、オクタノール、フェノール、アセトンなど）と接触させることから得られる。別の好ましい実施形態では、沈殿物は、プラスミノーゲンを含む血液画分をカオトロピック化合物（例えば、カオトロピック塩（例えば、バリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、塩素酸塩）、グアニジニウム塩酸塩、チオシアン酸グアニジニウムなどのチオシアン酸塩、過塩素酸塩、ヨウ化物、尿素、チオ尿素、高濃度の塩化ナトリウムなど）と接触させることから得られる。そのような有機溶媒またはカオトロピック塩は、沈殿剤と称すこともできる。別の好ましい実施形態では、沈殿物は、プラスミノーゲンを含む血液画分を冷却すること、または画分を凍結－解凍サイクルに供すことから得られる。
【0040】
沈殿物は、当技術分野で公知の任意の手段によって得ることができる。好ましい実施形態では、プラスミノーゲンを含む血漿画分の沈殿物は、血漿もしくはその画分の凍結および解凍（さらには、血漿もしくはその画分を凍結－解凍サイクルに供すこと）、温度の変化、ｐＨの変化、少なくとも１種の沈殿剤の添加、またはこれらのうちの２つ以上の組合せから得られる。好ましい実施形態では、沈殿剤は、オクタン酸、エタノール、塩、もしくはポリエチレングリコール、または血漿画分に対するこれらのうちの２つ以上の組合せからなる群から選択される。
【0041】
好ましい実施形態では、プラスミノーゲンを含む血漿画分の沈殿物は、オクタン酸の血漿画分への添加から得られる。「オクタン酸」という用語は、本明細書で使用される場合、最も広い意味で、オクタン酸アニオン（すなわち、遊離酸を含む）およびその塩を含む任意の化合物として理解されることが理解されるだろう。
【0042】
好ましい実施形態では、プラスミノーゲンを含む血漿画分の沈殿物は：
（ａ）乏クリオプラズマ上清または乏クリオプラズマ沈殿物；
（ｂ）ＣｏｈｎもしくはＫｉｓｔｌｅｒ－Ｎｉｔｓｃｈｍａｎｎ法のペーストＩ、ＩＩもしくはＩＩＩのいずれかの副もしくは廃棄画分、またはそのうちの２つもしくは全ての組合せ；
（ｃ）ＣｏｈｎもしくはＫｉｓｔｌｅｒ－Ｎｉｔｓｃｈｍａｎｎ法のペーストＩ、ＩＩもしくはＩＩＩのいずれかの画分、またはそのうちの２つもしくは全ての組合せ；および
（ｄ）これらのうちの２つまたは全ての組合せ
からなる群から選択される血漿画分へのオクタン酸の添加から得られる。
（ａ）乏クリオプラズマ上清または乏クリオプラズマ沈殿物；
（ｂ）ＣｏｈｎもしくはＫｉｓｔｌｅｒ－Ｎｉｔｓｃｈｍａｎｎ法のペーストＩ、ＩＩもしくはＩＩＩのいずれかの副もしくは廃棄画分、またはそのうちの２つもしくは全ての組合せ；
（ｃ）ＣｏｈｎもしくはＫｉｓｔｌｅｒ－Ｎｉｔｓｃｈｍａｎｎ法のペーストＩ、ＩＩもしくはＩＩＩのいずれかの画分、またはそのうちの２つもしくは全ての組合せ；および
（ｄ）これらのうちの２つまたは全ての組合せ
からなる群から選択される血漿画分へのオクタン酸の添加から得られる。
【0043】
沈殿物は、任意の形態で提供することができる。好ましい実施形態では、工程（ｉ）の沈殿物は、濾過、好ましくはデッドエンド濾過によって得られる。この場合、沈殿物は濾過ケーキと称すこともできる。好ましい実施形態では、沈殿物は、オクタン酸（ＯＡ）濾過ケーキ、すなわち、プラスミノーゲンを含む血液画分をオクタン酸と接触させ、その後、濾過することによって得られた沈殿物である。あるいは、工程（ｉ）の沈殿物は、遠心分離によって得られる。
【0044】
プラズマ分画法から取得可能な沈殿物は、プラズマ分画法から得た場合に直接使用しても、保存してもよい。場合により、本発明の方法は、プラズマ分画法と組み合わせ、手順フロー（オンラインとしても設計可能）の一部として行ってもよい。あるいは、保存された沈殿物を本発明の方法のために使用してもよい。そのような保存された沈殿物は、場合により冷却されているか、または凍結され、本発明の方法を行う際に解凍することができる。
【0045】
分散は、任意の手段によって実施することができる。例えば、分散は、塩基性水性緩衝液の添加と、振盪、混合（手動で、またはスターラー、ミキサーもしくはブレンダーを介して）、またはその組合せとによって実行することができる。
【0046】
本明細書で使用される場合、「水性緩衝液」という用語は、最も広い意味で、主に（すなわち、５０重量％超の）水を含む任意の緩衝溶液として理解される。
【0047】
好ましい実施形態では、塩基性水性緩衝溶液は、溶解したリジンも、少なくとも１種の式（Ｉ）の化合物も、その塩または組合せも含まない。
【0048】
工程（ｉ）の分散液は、任意の（沈殿物）：（塩基性水性緩衝液）比から得ることができる。好ましい実施形態では、（沈殿物）：（塩基性水性緩衝液）重量比は、２０：１～１：２０、１０：１～１：１０、２：１～１：２０、１：１～１：２０、１：２～１：１０、１：３～１：７、１：４～１：６の範囲、またはおよそ１：５の範囲である。
【0049】
工程（ｉ）は、沈殿物を塩基性水性緩衝液に分散するのに好適な任意の条件で実施することができる。好ましくは、この工程は、０℃～３０℃の間の範囲、好ましくは４℃～２５℃の間、４℃～１０℃の間、または１７℃～２２℃の間の範囲の温度で実施される。
【0050】
上述のように、工程（ｉ）の塩基性水性緩衝液は、ｐＨ７～１０の範囲のｐＨを有し得る。好ましい実施形態では、工程（ｉ）の塩基性水性緩衝液は、ｐＨ８～１０、ｐＨ８．１～９．９、ｐＨ８．２～９．８、ｐＨ８．３～９．７、ｐＨ８．４～９．６、ｐＨ８．５～９．５、ｐＨ８．６～９．４、ｐＨ８．７～９．３、ｐＨ８．８～９．２、ｐＨ８．９～９．１、またはｐＨ９のものである。
【0051】
上述のように、工程（ｉｖ）における酸性水性緩衝液は、ｐＨ２～６．６の範囲のｐＨを有し得る。好ましい実施形態では、工程（ｉｖ）における酸性水性緩衝液は、ｐＨ２～６、ｐＨ２．５～５．９、ｐＨ３～５．７、ｐＨ３．５～５．６、ｐＨ４～６、ｐＨ４．５～５．５、ｐＨ４．６～５．４、ｐＨ４．７～５．３、ｐＨ４．８～５．２、ｐＨ４．９～５．１、またはｐＨ５のものである。好ましくは、工程（ｉｖ）における酸性水性緩衝液のｐＨは、ｐＨ６．６、すなわちＧｌｕ－プラスミノーゲンの等電点以下、より好ましくはそれ未満である。
【0052】
好ましい実施形態では、工程（ｉ）の塩基性水性緩衝液は、ｐＨ８．１～９．９、ｐＨ８．２～９．８、ｐＨ８．３～９．７、ｐＨ８．４～９．６、ｐＨ８．５～９．５、ｐＨ８．６～９．４、ｐＨ８．７～９．３、ｐＨ８．８～９．２、ｐＨ８．９～９．１、またはｐＨ９のものであり；
工程（ｉｖ）における酸性水性緩衝液は、ｐＨ２．５～５．９、ｐＨ３～５．７、ｐＨ３．５～５．６、ｐＨ４～６、ｐＨ４．５～５．５、ｐＨ４．６～５．４、ｐＨ４．７～５．３、ｐＨ４．８～５．２、ｐＨ４．９～５．１、またはｐＨ５のものである。
工程（ｉｖ）における酸性水性緩衝液は、ｐＨ２．５～５．９、ｐＨ３～５．７、ｐＨ３．５～５．６、ｐＨ４～６、ｐＨ４．５～５．５、ｐＨ４．６～５．４、ｐＨ４．７～５．３、ｐＨ４．８～５．２、ｐＨ４．９～５．１、またはｐＨ５のものである。
【0053】
好ましい実施形態では、工程（ｉ）の塩基性水性緩衝液と工程（ｉｖ）における水性緩衝液とのｐＨ差は、少なくとも０．５、少なくとも１、少なくとも１．２５、少なくとも１．５、少なくとも１．７５、少なくとも２、少なくとも２．２５、少なくとも２．５、少なくとも２．７５、少なくとも３、少なくとも３．２５、少なくとも３．５、少なくとも３．７５、または少なくとも４である。好ましい実施形態では、工程（ｉ）の塩基性水性緩衝液と工程（ｉｖ）における水性緩衝液とのｐＨ差は、０．５～１０の間、１～９の間、２～８の間、２．５～７の間、３～６の間、３．５～５の間、または３．５～４．５の間である。
【0054】
本明細書に教示される数値は、最も広い意味で、その後の小数を包含する丸められた値として一般に理解されるように理解されることが理解されるだろう。例えば、ｐＨ５は、一般に理解されるように、ｐＨ４．５～５．４の値を含む。
【0055】
インキュベートする工程（ｉｉ）は、塩基性水性緩衝液に可溶なタンパク質の少なくとも一部を溶解させる任意の条件で実施することができる。好ましくは、この工程は、０℃～３０℃の間の範囲、好ましくは４℃～２５℃の間、４℃～１０℃の間、または１７℃～２２℃の間の範囲の温度で実施される。温度はまた、場合により経時的に変化させてもよい。
【0056】
工程（ｉｉ）のインキュベーション時間は、塩基性水性緩衝液に可溶なタンパク質の少なくとも一部を溶解させ、かつ目的のプラスミノーゲンを本質的に破壊しない任意の範囲であり得る。好ましい実施形態では、工程（ｉｉ）のインキュベーションは、１分～４８時間、５分～２４時間、１０分～１２時間、１５分～６時間、２０分～２時間、２５分～１時間、２５分～４５分、またはおよそ３０分の時間範囲にわたって行われる。
【0057】
工程（ｉｉ）のインキュベーションが完了したら、工程（ｉｉ）のインキュベートした分散液の固体部分と液体部分とを互いに分離する。これは、任意の手段によって実行することができる。好ましい実施形態では、固体部分と液体部分とを互いに分離する工程（ｉｉｉ）は、デッドエンド濾過、タンジェンシャルフロー濾過、もしくはその組合せを含む濾過、透析、好ましくは沈降による相分離、および／または遠心分離からなる群から選択される手段によって得られる。好ましい実施形態では、工程（ｉｉｉ）の分離は、濾過、好ましくはデッドエンド濾過によって達成される。この場合、得られた分離された固体部分は、濾過ケーキと称すこともできる。
【0058】
好ましい実施形態では、固体部分と液体部分とを互いに分離する工程（ｉｉｉ）は濾過によって得られ、ここで、工程（ｉｉｉ）の前に、少なくとも１種の濾過助剤が分散液に添加されている。濾過助剤は、当技術分野で公知の任意の濾過助剤であり得る。好ましい実施形態では、濾過助剤は、ポリマー、好ましくは高分子量ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、セルロース、またはセルロース誘導体、珪藻土、パーライト、界面活性剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ－２０）、およびこれらのうちの２つ以上の組合せからなる群から選択される。２つ以上の濾過助剤の組合せも使用できることが理解されるだろう。
【0059】
工程（ｉｉｉ）は、この目的に好適な任意の条件で実施することができる。好ましくは、この工程は、０℃～３０℃の間の範囲、好ましくは４℃～２５℃の間、４℃～１０℃の間、または１７℃～２２℃の間の範囲の温度で実施される。
【0060】
工程（ｉ）～（ｉｉｉ）は、それぞれ１回行っても、２回以上繰り返してもよい。
【0061】
工程（ｉｉｉ）から得た固体部分を酸性水性緩衝液と混合する工程（ｉｖ）は、任意の手段によって行うことができる。例えば、混合は、酸性水性緩衝液の添加と、振盪、混合（手動で、またはスターラー、ミキサーもしくはブレンダーを介して）、またはその組合せとによって実行することができる。
【0062】
本明細書で使用される緩衝液のいずれかにおいて使用される１種またはそれ以上の緩衝剤は、任意の化学的性質のものであり得る。好ましくは、緩衝剤は薬学的に許容される緩衝剤である。好ましい実施形態では、酸性水性緩衝液は、ギ酸、アセテート、カーボネート、ハイドロゲンカーボネート、および／またはシトレート、好ましくはギ酸ナトリウム、酢酸ナトリウムまたはクエン酸ナトリウム、特に酢酸ナトリウムを含む。好ましい実施形態では、酸性水性緩衝液は、酢酸緩衝液、特に酢酸ナトリウム緩衝液である。例えば、本明細書で使用される酸性水性緩衝液は、酢酸ナトリウム／グリシン緩衝系を含み得る。
【0063】
酸性水性緩衝液は、場合により１つまたはそれ以上のさらなる成分も含み得ることが理解されるだろう。好ましい実施形態では、それは、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの、好ましくは２００～３５０００Ｄａ、１０００～１０００００Ｄａ、２００～１０００Ｄａ、５００～５０００Ｄａ、１０００～１００００Ｄａ、５０００～５００００Ｄａ、または１００００～１０００００Ｄａの平均分子量（サイズ排除クロマトグラフィーによって決定可能）を有する水溶性または乳化性ポリマーを含む。
【0064】
工程（ｉｖ）の混合物は、任意の（固体部分）：（酸性水性緩衝液）比から得ることができる。好ましい実施形態では、（固体部分）：（酸性水性緩衝液）重量比は、２０：１～１：２０、１０：１～１：１０、２：１～１：２０、１：１～１：２０、１：１～１：１０、１：２～１：７、１：２～１：５の範囲、またはおよそ１：３の範囲である。
【0065】
工程（ｉｖ）は、この目的に好適な任意の条件で実施することができる。好ましくは、この工程は、０℃～３０℃の間の範囲、好ましくは４℃～２５℃の間、４℃～１０℃の間、または１７℃～２２℃の間の範囲の温度で実施される。
【0066】
好ましい実施形態では、少なくとも１種の式（Ｉ）の化合物は、アミノヘキサン酸、アミノペンタン酸、アミノヘプタン酸、アミノオクタン酸、アミノノナン酸、６－ジアミノヘキサン、アミノデカン酸、オルニチン、アミノメチル安息香酸、およびオキサリジンからなる群から選択され、特に、少なくとも１種の式（Ｉ）の化合物は、６－アミノヘキサン酸、特にアミノヘキサン酸である。
【0067】
好ましい実施形態では、工程（ｉｖ）の酸性水性緩衝液はリジン、特にＬ－リジンを含む。
【0068】
好ましい実施形態では、工程（ｉｖ）の酸性水性緩衝液は６－アミノヘキサン酸を含む。
【0069】
場合により、工程（ｉｖ）の混合物は１つまたはそれ以上のさらなる成分を含む。場合により、１つまたはそれ以上の種類の陰イオン交換樹脂を工程（ｉｖ）の混合物に添加してもよい。
【0070】
場合により、工程（ｉｖ）は、混合物をインキュベートしてプラスミノーゲンを溶解させ、場合により固体部分を除去することを含む。
【0071】
好ましい実施形態では、工程（ｉｖ）において得られる固体部分は、溶解したプラスミノーゲンを主に含む液体画分から分離される。これは、任意の手段によって実行することができる。好ましい実施形態では、工程（ｉｖ）は、固体部分と液体部分とを、デッドエンド濾過、タンジェンシャルフロー濾過、もしくはその組合せを含む濾過、透析、好ましくは沈降による相分離、および／または遠心分離からなる群から選択される手段によって互いに分離することを含む。好ましい実施形態では、工程（ｉｖ）の場合による分離は、濾過、好ましくはデッドエンド濾過によって達成される。この場合、得られた分離された固体部分は、濾過ケーキと称すこともできる。場合により、洗浄された固体部分は、酸性水性緩衝液を用いてさらに洗浄される。例えば、その前の混合に使用される容量の半分を使用してもよい。これは１回またはそれ以上行ってもよい。得られた複数の溶液は合わせてもよい（プールとしても設計可能）。
【0072】
上記手順工程から、単離されたプラスミノーゲンを含有する溶液を得ることができる。そのようなプラスミノーゲンは、特に高い収率および純度などの特に有益な技術的特性をすでに有している。にもかかわらず、方法は、さらなる工程を追加することによってさらに一層改善することができる。
【0073】
好ましい実施形態では、工程（ｖ）は、溶液に溶解した沈殿剤の濃度を減少させる１つまたはそれ以上の手段をさらに含む。これは、多相分離を含む任意の手段によって実行することができる。
【0074】
好ましい実施形態では、工程（ｖ）は、溶液を、沈殿剤、特にオクタン酸アニオンの少なくとも一部と相互作用する少なくとも１種のクロマトグラフィー樹脂と接触させる、溶液に溶解した沈殿剤の濃度を減少させる１つまたはそれ以上の手段をさらに含み、ここで、より好ましくは、前記クロマトグラフィー樹脂はイオン交換体、特に陰イオン交換体である。好ましい実施形態では、オクタン酸アニオンの少なくとも一部と相互作用する少なくとも１種の陰イオン交換体からの分散液を接触させること。
【0075】
好ましい実施形態では、工程（ｖ）において得た単離されたプラスミノーゲンを含有する溶液は、
溶液を、リジン、式（Ｉ）の化合物、またはその両方の少なくとも一部と相互作用する、サイズ排除特性を有するかまたは有しない少なくとも１種のイオン交換体（例えば、陰イオン交換体または陽イオン交換体）と接触させること；
溶液を、リジン、式（Ｉ）の化合物、またはその両方の少なくとも一部と相互作用する少なくとも１種のサイズ排除樹脂と接触させること；
溶液を、リジン、式（Ｉ）の化合物、またはその両方の少なくとも一部と相互作用する少なくとも１種の疎水性または混合モード相互作用クロマトグラフィー樹脂と接触させること；
溶液を、リジン、式（Ｉ）の化合物、またはその両方の少なくとも一部を除去するダイアフィルトレーションに供すこと；
溶液を少なくとも１回の沈殿－洗浄サイクルに供すこと；
固定化されたリジンおよび／または少なくとも１種の固定化された式（Ｉ）の化合物を含む固定相に基づくクロマトグラフィー；
プラスミノーゲンについて選択的なアフィニティークロマトグラフィー；
分子サイズクロマトグラフィー（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｉｚｅ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）；
透析；
デッドエンド限外濾過、タンジェンシャルフロー限外濾過、またはその組合せを含む限外濾過；ならびに
これらのうちの２つ以上の組合せ
からなる群から選択される少なくとも１つのさらなる工程にさらに供される。
溶液を、リジン、式（Ｉ）の化合物、またはその両方の少なくとも一部と相互作用する、サイズ排除特性を有するかまたは有しない少なくとも１種のイオン交換体（例えば、陰イオン交換体または陽イオン交換体）と接触させること；
溶液を、リジン、式（Ｉ）の化合物、またはその両方の少なくとも一部と相互作用する少なくとも１種のサイズ排除樹脂と接触させること；
溶液を、リジン、式（Ｉ）の化合物、またはその両方の少なくとも一部と相互作用する少なくとも１種の疎水性または混合モード相互作用クロマトグラフィー樹脂と接触させること；
溶液を、リジン、式（Ｉ）の化合物、またはその両方の少なくとも一部を除去するダイアフィルトレーションに供すこと；
溶液を少なくとも１回の沈殿－洗浄サイクルに供すこと；
固定化されたリジンおよび／または少なくとも１種の固定化された式（Ｉ）の化合物を含む固定相に基づくクロマトグラフィー；
プラスミノーゲンについて選択的なアフィニティークロマトグラフィー；
分子サイズクロマトグラフィー（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｉｚｅ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）；
透析；
デッドエンド限外濾過、タンジェンシャルフロー限外濾過、またはその組合せを含む限外濾過；ならびに
これらのうちの２つ以上の組合せ
からなる群から選択される少なくとも１つのさらなる工程にさらに供される。
【0076】
好ましい実施形態では、工程（ｖ）において得た単離されたプラスミノーゲンを含有する溶液は、少なくとも以下のさらなる工程：
（ｖｉ）１つまたはそれ以上のアミノ基を含む化合物、特にリジン、式（Ｉ）の化合物、またはその両方の少なくとも一部を、工程（ｖ）において得た溶液から、好ましくは溶液を、リジン、式（Ｉ）の化合物、またはその両方の少なくとも一部と相互作用する少なくとも１種のクロマトグラフィー樹脂、特にイオン交換体（例えば、陰イオン交換体または陽イオン交換体、特に陰イオン交換体）と接触させることによって除去すること；ならびに
（ｖｉｉ）好ましくは第１にプラスミノーゲンと固定相との相互作用を可能にする緩衝液を使用し、続いて、プラスミノーゲンとプラスミノーゲンとの相互作用を低減させる緩衝液によってプラスミノーゲンを溶出する、固定化されたリジンおよび／または少なくとも１種の固定化された式（Ｉ）の化合物を含む固定相に基づくクロマトグラフィーを好ましくは実行することによって、プラスミノーゲンの純度および／または濃度を増加させること；ならびに
（ｖｉｉｉ）工程（ｖｉｉ）からの単離されたプラスミノーゲンを含有する溶液を得ること
にさらに供される。
（ｖｉ）１つまたはそれ以上のアミノ基を含む化合物、特にリジン、式（Ｉ）の化合物、またはその両方の少なくとも一部を、工程（ｖ）において得た溶液から、好ましくは溶液を、リジン、式（Ｉ）の化合物、またはその両方の少なくとも一部と相互作用する少なくとも１種のクロマトグラフィー樹脂、特にイオン交換体（例えば、陰イオン交換体または陽イオン交換体、特に陰イオン交換体）と接触させることによって除去すること；ならびに
（ｖｉｉ）好ましくは第１にプラスミノーゲンと固定相との相互作用を可能にする緩衝液を使用し、続いて、プラスミノーゲンとプラスミノーゲンとの相互作用を低減させる緩衝液によってプラスミノーゲンを溶出する、固定化されたリジンおよび／または少なくとも１種の固定化された式（Ｉ）の化合物を含む固定相に基づくクロマトグラフィーを好ましくは実行することによって、プラスミノーゲンの純度および／または濃度を増加させること；ならびに
（ｖｉｉｉ）工程（ｖｉｉ）からの単離されたプラスミノーゲンを含有する溶液を得ること
にさらに供される。
【0077】
工程（ｖｉ）および（ｖｉｉ）は、この目的のために使用可能な任意の緩衝液および任意の温度で行うことができる。
【0078】
好ましくは、工程（ｖｉ）において使用可能な緩衝液は酸性水性緩衝液である。例えば、そのような酸性水性緩衝液は、ｐＨ２．５～５．９、ｐＨ３～５．７、ｐＨ３．５～５．６、ｐＨ４～６、ｐＨ４．５～５．５、ｐＨ４．６～５．４、ｐＨ４．７～５．３、ｐＨ４．８～５．２、ｐＨ４．９～５．１、またはｐＨ５のものであり得る。好ましくは、この工程（ｖｉ）は、０℃～３０℃の間の範囲、好ましくは４℃～２５℃の間、４℃～１０℃の間、または１７℃～２２℃の間の範囲の温度で実施される。カラムからの溶出は、例えばおよそ１Ｍなどの０．５～２Ｍの間のモル濃度の塩化ナトリウムなどの塩を有するような高塩緩衝液を使用することによって実行することができる。
【0079】
好ましくは、工程（ｖｉｉ）において使用可能な緩衝液は酸性水性緩衝液である。例えば、そのような酸性水性緩衝液は、ｐＨ２．５～５．９、ｐＨ３～５．７、ｐＨ３．５～５．６、ｐＨ４～６、ｐＨ４．５～５．５、ｐＨ４．６～５．４、ｐＨ４．７～５．３、ｐＨ４．８～５．２、ｐＨ４．９～５．１、ｐＨ３、またはｐＨ４、またはｐＨ５のものであり得る。好ましくは、この工程（ｖｉｉ）は、０℃～３０℃の間の範囲、好ましくは４℃～２５℃の間、４℃～１０℃の間、または１７℃～２２℃の間の範囲の温度で実施される。工程（ｖｉｉ）の固定相は、例えばリジンコンジュゲートセファロースであり得る。
【0080】
場合により、ｐＨは、溶出時にかなり低く、例えばｐＨ２～ｐＨ５の間のｐＨ範囲に維持されることがある。これは、望ましくない分解に対してプラスミノーゲン、特にＧｌｕ－プラスミノーゲンを安定化することができ、その有効期間を増加させることができる。
【0081】
好ましい実施形態では、本発明の方法は、以下の工程：
（ｉ）プラスミノーゲンを含む血漿画分の沈殿物をｐＨ７～１０、好ましくは８～１０、より好ましくはｐＨ８．５～９．５の塩基性水性緩衝液に分散すること；
（ｉｉ）工程（ｉ）から得た分散液をインキュベートして、塩基性水性緩衝液に可溶なタンパク質の少なくとも一部を溶解させること；
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）のインキュベートした分散液の固体部分と液体部分とを、デッドエンド濾過、タンジェンシャルフロー濾過、もしくはその組合せを含む濾過、透析、好ましくは沈降による相分離、および／または遠心分離によって互いに分離すること；
（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）から得た固体部分を、溶解したリジン、少なくとも１種の式（Ｉ）の化合物またはその塩もしくは組合せをさらに含むｐＨ２～６．６、好ましくはｐＨ４．５～ｐＨ５の酸性水性緩衝液と混合し、場合により、混合物をインキュベートしてプラスミノーゲンを溶解させ、固体部分を除去すること；ならびに
（ｖ）工程（ｉｖ）からの単離されたプラスミノーゲンを含有する溶液を得ること；
（ｖｉ）１つまたはそれ以上のアミノ基を含む化合物、特にリジン、式（Ｉ）の化合物、またはその両方の少なくとも一部を、工程（ｖ）において得た溶液から、好ましくは溶液を、リジン、式（Ｉ）の化合物、またはその両方の少なくとも一部と相互作用する少なくとも１種のクロマトグラフィー樹脂、特にイオン交換体と接触させることによって除去すること；ならびに
（ｖｉｉ）第１にプラスミノーゲンと固定相との相互作用を可能にする緩衝液を使用し、続いて、プラスミノーゲンとプラスミノーゲンとの相互作用を低減させる緩衝液によってプラスミノーゲンを溶出する、固定化されたリジンおよび／または少なくとも１種の式（Ｉ）の固定化された化合物を含む固定相に基づくクロマトグラフィーを実行することによって、プラスミノーゲンの純度および／または濃度を増加させること；ならびに
（ｖｉｉｉ）工程（ｖｉｉ）からの単離されたプラスミノーゲンを含有する溶液を得ること
を含む。
（ｉ）プラスミノーゲンを含む血漿画分の沈殿物をｐＨ７～１０、好ましくは８～１０、より好ましくはｐＨ８．５～９．５の塩基性水性緩衝液に分散すること；
（ｉｉ）工程（ｉ）から得た分散液をインキュベートして、塩基性水性緩衝液に可溶なタンパク質の少なくとも一部を溶解させること；
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）のインキュベートした分散液の固体部分と液体部分とを、デッドエンド濾過、タンジェンシャルフロー濾過、もしくはその組合せを含む濾過、透析、好ましくは沈降による相分離、および／または遠心分離によって互いに分離すること；
（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）から得た固体部分を、溶解したリジン、少なくとも１種の式（Ｉ）の化合物またはその塩もしくは組合せをさらに含むｐＨ２～６．６、好ましくはｐＨ４．５～ｐＨ５の酸性水性緩衝液と混合し、場合により、混合物をインキュベートしてプラスミノーゲンを溶解させ、固体部分を除去すること；ならびに
（ｖ）工程（ｉｖ）からの単離されたプラスミノーゲンを含有する溶液を得ること；
（ｖｉ）１つまたはそれ以上のアミノ基を含む化合物、特にリジン、式（Ｉ）の化合物、またはその両方の少なくとも一部を、工程（ｖ）において得た溶液から、好ましくは溶液を、リジン、式（Ｉ）の化合物、またはその両方の少なくとも一部と相互作用する少なくとも１種のクロマトグラフィー樹脂、特にイオン交換体と接触させることによって除去すること；ならびに
（ｖｉｉ）第１にプラスミノーゲンと固定相との相互作用を可能にする緩衝液を使用し、続いて、プラスミノーゲンとプラスミノーゲンとの相互作用を低減させる緩衝液によってプラスミノーゲンを溶出する、固定化されたリジンおよび／または少なくとも１種の式（Ｉ）の固定化された化合物を含む固定相に基づくクロマトグラフィーを実行することによって、プラスミノーゲンの純度および／または濃度を増加させること；ならびに
（ｖｉｉｉ）工程（ｖｉｉ）からの単離されたプラスミノーゲンを含有する溶液を得ること
を含む。
【0082】
得られたプラスミノーゲン、特にＧｌｕ－プラスミノーゲンは、場合により製剤化、保存することができるか、または任意の目的のために直接使用することができる。
【0083】
好ましい実施形態では、工程（ｉｖ）および／または工程（ｖｉ）は、存在する限り、溶液を、沈殿剤、特にオクタン酸の少なくとも一部と相互作用する少なくとも１種の小孔性陰イオン交換樹脂（ｓｍａｌｌ ｐｏｒｅ ａｎｉｏｎ ｅｘｃｈａｎｇｅ ｒｅｓｉｎ）と接触させることを含む。
【0084】
好ましい実施形態では、沈殿剤の少なくとも一部と相互作用するそのような少なくとも１種の小孔性陰イオン交換樹脂は、例えば、０．１～１０ｎｍ、１～１００ｎｍ、０．１～１０μｍ、または１～１００μｍの範囲の孔などの微多孔構造を有する樹脂である。好ましい実施形態では、沈殿剤の少なくとも一部と相互作用するそのような少なくとも１種の小孔性陰イオン交換樹脂は、１種またはそれ以上のスチレン系（コ）ポリマーに基づく樹脂であり、第四級アンモニウム基および／またはスルホン酸基を含有し得る。
【0085】
好ましい実施形態では、沈殿剤の少なくとも一部と相互作用するそのような少なくとも１種の小孔性陰イオン交換樹脂は、Ｄｏｗｅｘ樹脂、特に５０～１００メッシュ（０．１５～０．３ｍｍの平均粒径）、１００～２００メッシュ（０．０８～０．１５ｍｍの平均粒径）、または２００～４００メッシュ（０．０４～０．０８ｍｍの平均粒径）を有するＤｏｗｅｘ １×８である。
【0086】
例えば、それは治療上の使用のために使用することができる。この場合、プラスミノーゲン、特にＧｌｕ－プラスミノーゲンは、１つまたはそれ以上の血栓性事象を処置または予防するための方法における使用のために、個体に投与することができる。この場合、好ましくは、溶液のｐＨは、投与前に所望の範囲に変更される。場合により、１つまたはそれ以上のさらなる薬学的に許容される成分を追加してもよい。プラスミノーゲン、特にＧｌｕ－プラスミノーゲンの薬学的および医学的使用は、国際公開第２０１８／１６２７５４号および国際公開第２０２０／１５２３２２号に詳細に記載されている。
【0087】
保存が所望される場合、得られたプラスミノーゲン、特にＧｌｕ－プラスミノーゲンは、場合により凍結乾燥（フリーズドライ）または凍結してもよい。
【0088】
本発明の方法は、プラスミノーゲンの調製だけでなく、望ましい副生成物としての１つまたはそれ以上のさらなる構成成分の調製も可能にすることが理解されるだろう。
【0089】
好ましい実施形態では、本発明の方法は、
（ａ）好ましくは、場合により単離されることがある、１種もしくはそれ以上の免疫グロブリン、特に免疫グロブリンＧの１つもしくはそれ以上の画分を含む、工程（ｉｉ）において少なくとも部分的に溶解されるタンパク質が回収されること；
（ｂ）方法が、目的の画分のウイルス不活化工程をさらに含むこと；
（ｃ）単離されたプラスミノーゲンを含有する溶液のｐＨが、場合により水性緩衝液を交換することによって所望の範囲にさらに調整されること；または
（ｄ）方法が、プラスミノーゲンのフリーズドライもしくは乾燥をさらに含むこと；
（ｅ）これらのうちの２つ以上の組合せ
をさらに特徴とする。
（ａ）好ましくは、場合により単離されることがある、１種もしくはそれ以上の免疫グロブリン、特に免疫グロブリンＧの１つもしくはそれ以上の画分を含む、工程（ｉｉ）において少なくとも部分的に溶解されるタンパク質が回収されること；
（ｂ）方法が、目的の画分のウイルス不活化工程をさらに含むこと；
（ｃ）単離されたプラスミノーゲンを含有する溶液のｐＨが、場合により水性緩衝液を交換することによって所望の範囲にさらに調整されること；または
（ｄ）方法が、プラスミノーゲンのフリーズドライもしくは乾燥をさらに含むこと；
（ｅ）これらのうちの２つ以上の組合せ
をさらに特徴とする。
【0090】
前述のように、本発明の方法によって取得可能な（得られる）プラスミノーゲン、特にＧｌｕ－プラスミノーゲンは、特に高い純度および場合により手順工程において使用される薬剤の微量の残留物などの特別な構造的特徴をそれ自体として有する。
【0091】
したがって、本発明のさらなる態様は、本発明の方法から取得可能なプラスミノーゲンを含む組成物であって、プラスミノーゲン、特にＧｌｕ－プラスミノーゲンが、総タンパク質含量の少なくとも７０％（ｗ／ｗ）を構成する、組成物に関する。
【0092】
上記の方法の文脈において説明された実施形態および定義は、それから取得可能なプラスミノーゲンに準用して適用されることが理解されるだろう。
【0093】
好ましい実施形態では、プラスミノーゲン、特にＧｌｕ－プラスミノーゲンは、総タンパク質含量の少なくとも７５％（ｗ／ｗ）、少なくとも８０％（ｗ／ｗ）、少なくとも８５％（ｗ／ｗ）、少なくとも９０％（ｗ／ｗ）、または少なくとも９５％（ｗ／ｗ）を構成する。
【0094】
本発明の一実施形態では、本発明の方法から取得可能な（または得られる）（Ｇｌｕ－）プラスミノーゲンは医薬組成物において提供される。したがって、それは、１種またはそれ以上の薬学的に許容される担体と混和してもよい。したがって、本発明のさらなる態様は、本発明の方法から取得可能な（または得られる）（Ｇｌｕ－）プラスミノーゲンと１種またはそれ以上の薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物に言及する。
【0095】
「医薬組成物」および「医薬製剤」という用語は交換可能に理解される。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」、「薬学的に許容される賦形剤」、「担体」および「賦形剤」という用語は、最も広い意味で、それぞれプラスミノーゲンおよび少なくとも１種のプラスミノーゲン活性化因子の薬理学的忍容性を支持し得る任意の物質として交換可能に理解される。そのような医薬組成物は、既製であってもよく、好ましくは液体製剤、特に注射用ポーションであり得る。
【0096】
保存形態は、液体であってもよいが、乾燥形態（例えば粉末、例えば乾燥またはフリーズドライしたプラスミノーゲンおよび少なくとも１種のプラスミノーゲン活性化因子をそれぞれ含む粉末）であってもよく、ペーストまたはシロップなどであってもよい。場合により、乾燥形態、ペーストまたはシロップは、患者に投与される前に溶解または乳化されることがある。
【0097】
薬学的に許容される担体は、水性緩衝液、生理食塩水、水、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、エタノール、植物油、パラフィン油、またはこれらのうちの２つ以上の組合せからなるリストから例示的に選択することができる。さらに、薬学的に許容される担体は、場合により、１種もしくはそれ以上の界面活性剤、１種もしくはそれ以上のフォーム剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＬＳ）、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ））、１種もしくはそれ以上の着色剤（例えば、食品着色料）、１種もしくはそれ以上のビタミン、１種もしくはそれ以上の塩（例えば、ナトリウム、カリウム、カルシウム、亜鉛塩）、１種もしくはそれ以上の湿潤剤（例えば、ソルビトール、グリセロール、マンニトール、プロピレングリコール、ポリデキストロース）、１種もしくはそれ以上の酵素、１種もしくはそれ以上の保存剤（例えば、安息香酸、メチルパラベン）、１種もしくはそれ以上の抗酸化剤、１種もしくはそれ以上のハーブおよび植物抽出物、１種もしくはそれ以上の安定化剤、１種もしくはそれ以上のキレート剤（例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ））、ならびに／または１種もしくはそれ以上の取込みメディエータ（例えば、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）、タンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）、抗菌ペプチドなど）を含有し得る。
【0098】
本発明はまた、本発明の処置または予防の文脈において使用可能な医薬組成物の投薬単位に関する。例示的には、本発明は、単回用量容器または複数回用剤形に言及し得る。
【0099】
本発明はまた、医薬としての使用のための、本発明のプラスミノーゲン、特にＧｌｕ－プラスミノーゲン、または本発明の医薬組成物に関する。
【0100】
本発明はまた、血栓性事象を処置または予防するための方法における使用のための、本発明のプラスミノーゲン、特にＧｌｕ－プラスミノーゲン、または本発明の医薬組成物に関する。プラスミノーゲン、特にＧｌｕ－プラスミノーゲンを用いるそのような処置は、国際公開第２０１８／１６２７５４号および国際公開第２０２０／１５２３２２号に詳細に記載されている。
【0101】
前述のように、プラスミノーゲンを精製する前に塩基性水性緩衝液を使用することは、取得可能なプラスミノーゲンの純度に特に有益であることが見出された。
【0102】
したがって、本発明のさらなる態様は、プラスミノーゲンを含む血漿画分の沈殿物からプラスミノーゲン以外のタンパク質を除去するための、ｐＨ８～１１の塩基性水性緩衝液の使用であって、好ましくは、本発明の方法を含む、使用に関する。
【0103】
上記の方法の文脈において説明された実施形態および定義は、この使用に準用して適用されることが理解されるだろう。
【0104】
以下の実施例および図は、ここに記載および特許請求される本発明の例示的な実施形態を提供することが意図されている。これらの実施例は、本発明の主題の範囲に対する限定を提供することを意図するものではない。以下の図、実施例および特許請求の範囲は本発明をさらに例示する。
【図面の簡単な説明】
【0105】
【図1】本発明の手順の一例のフローチャートを示す。プラスミノーゲンを含む血漿画分の沈殿物（例えば、オクタン酸沈殿物（ＯＡ－ＰＰＴ））は、濾過ケーキとして提供することができ、再懸濁工程（Ａ）に供すことができる。これは、濾過ケーキ（４）の酸性水性緩衝液への再懸濁を提供し得る。得られた溶液は、この目的に好適なカラム（７）（例えば、Ｅｓｈｍｕｎｏ ＣＰＸ、Ｍｅｒｃｋ、Ｇｅｒｍａｎｙ）における陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）工程（Ｂ）に供すことができる。さらに、アフィニティークロマトグラフィー工程（Ｃ）が適用される。この目的のために、固定化されたリジンおよび／または少なくとも１種の固定化されたリジン類似体を含む固定相に基づく（例えば、リジンコンジュゲートセファロースに基づく）クロマトグラフィーカラム（１１）を使用することができる。プラスミノーゲン製剤溶液（１２）を得ることができる。
【図2】本発明の手順の別の例の概要を示す図である。ここにおいて、プラスミノーゲンを含む血漿画分（例えば、オクタン酸沈殿物（ＯＡ－ＰＰＴ）再懸濁液）の沈殿物（１）は、塩基性水性緩衝液（２）に分散することができる。例えば、（１）：（２）の重量比は、１：５であってもよく、ｐＨはｐＨ９（例えば、ｐＨ９．０）に設定してもよい。分散液は、インキュベートおよび濾過することができる。これにより、主要な不純物を含む濾液（総タンパク質濃度は、例えば３～６ｇ／Ｌであり得る）が沈殿物から分離される。残りの濾過ケーキ（４）は、ｐＨ５（例えば、ｐＨ５．０）を有する、リジンおよび／またはリジン類似体（例えば、０．２Ｍ ６－アミノヘキサン酸（ＡＨＡ）を含有する０．２Ｍ酢酸ナトリウム）を含む酸性水性緩衝液に１：３の濾過ケーキ：緩衝液重量比で溶解することができる。得られた溶液（５）は、可溶化したプラスミノーゲンを含み、１ｇ／Ｌ未満の総タンパク質含量を有し得る。この溶液（５）は、（例えば、ｐＨ５（例えば、ｐＨ５．０）の、１０ｍＭ酢酸ナトリウムおよび５０ｍＭグリシンを含む緩衝液などの酸性緩衝液を用いて１：３の比に）さらに希釈することができる。得られた溶液（６）は、陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）カラム（７）（例えば、Ｅｓｈｍｕｎｏ ＣＰＸ、Ｍｅｒｃｋ、Ｇｅｒｍａｎｙ）に供すことができる。それによって、リジンおよび／またはリジン類似体（８）（例えば、６－アミノヘキサン酸）を溶液から効果的に除去することができる。これにより、目的のプラスミノーゲンを含む溶液（９）を得ることができる。ここにおいて、高塩緩衝液を、溶出のために使用される溶出緩衝液（例えば、５０ｍＭ酢酸ナトリウム、５０ｍＭグリシンおよび１Ｍ塩化ナトリウムを含む、ｐＨ５（例えば、５．０））として使用することができる。溶液（９）は、さらなる、好ましくは酸性の緩衝液（１０）（例えば、５０ｍＭ酢酸ナトリウム、５０ｍＭグリシンを含む、ｐＨ５（例えば、５．０））に希釈することができる。得られた溶液は、固定化されたリジンおよび／または少なくとも１種の固定化されたリジン類似体を含む固定相に基づく（例えば、リジンコンジュゲートセファロースに基づく）クロマトグラフィーカラム（１１）に供すことができる。目的のプラスミノーゲンが結合し得る。溶出液（１３）は、好ましくは検出可能なプラスミノーゲン含量を含有しない。プラスミノーゲン製剤溶液（１２）を、例えば、ｐＨ３（例えば、ｐＨ３．０）の、５０ｍＭクエン酸塩および５０ｍＭグリシンを含む溶出緩衝液によって得ることができる。
【図3】２．５μｇ／ウェルの総タンパク質負荷を用いた非還元条件下でのＳＤＳ－ＰＡＧＥを示す図である。レーンＡは、Ｇｌｕ－プラスミノーゲンの標準品（０．６μｇ／ウェル）を示す。レーンＢは、Ａｌｌ Ｂｌｕｅ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｓｔａｎｄａｒｄを示す。レーンＣは、Ｌｙｓ－プラスミノーゲンの標準品（０．６μｇ／ウェル）を示す。レーンＤは、Ｌｙｓ－プラスミンの標準品（０．６μｇ／ウェル）を示す。レーンＥは、リジンコンジュゲートセファロースカラムからの溶出液を示す。
【図4】以下の実験セクションにおいて説明される、樹脂Ｅｓｈｕｍｕｎｏ ＣＰＸ（Ｍｅｒｃｋ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて行った陽イオン交換（ＣＥＸ）クロマトグラフィーのクロマトグラムを示す。ピークＡ／１の前に有意なピークは存在しなかった。
【図5】溶出が、以下の実験セクションにおいて説明される、固定化されたリジンに基づくカラムを用いて行ったアフィニティークロマトグラフィーのクロマトグラムを示すことを示す。２つのピークＡ／１およびＢ／１が存在する。
【図6】以下の実験セクションに記載されるように提供されるＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルを示す図であり、レーンは以下の通りである：（１）再懸濁工程の第１の濾液、２．５μｇ／ウェル；（２）再懸濁工程の第１の洗浄工程からの濾液、２．５μｇ／ウェル；（３）再懸濁工程の第２の洗浄工程からの濾液、２．５μｇ／ウェル；（４）再懸濁の第２の洗浄工程からの濾液、本来の濃度；（５）Ｇｌｕ－プラスミノーゲン標準品、６μｇ／ウェル；（６）Ａｌｌ Ｂｌｕｅ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｎｄａｒｄ；（７）Ｌｙｓ－プラスミノーゲン標準品、６μｇ／ウェル；（８）Ｌｙｓ－プラスミン標準品、０．６μｇ／ウェル；（９）カラムの充填前のＣＥＸクロマトグラフィーのフィード、１：３に希釈した第２の再懸濁濾液；（１０）カラムの充填後のＣＥＸクロマトグラフィーのフィード、１：３に希釈した第２の再懸濁濾液；（１１）カラムの充填前のアフィニティークロマトグラフィーのフィード、１：２に希釈したＣＥＸ溶出液、２．５μｇ／ウェル；（１２）カラムの充填後のアフィニティークロマトグラフィーのフィード、１：２に希釈したＣＥＸ溶出液、２．５μｇ／ウェル；（１３）アフィニティークロマトグラフィーの溶出液、２．５μｇ／ウェル；および（１４）アフィニティークロマトグラフィーのフロースルー、２．５μｇ／ウェル。
【図7】以下の実験セクションに記載されるように提供されるウェスタンブロットゲルを示す図であり、レーンは以下の通りである：（１）再懸濁工程の第１の濾液、１μｇ／ウェル；（２）再懸濁工程の第１の洗浄工程からの濾液、１μｇ／ウェル；（３）再懸濁工程の第２の洗浄工程からの濾液、１μｇ／ウェル；（４）再懸濁の第２の洗浄工程からの濾液、１μｇ／ウェル；（５）Ｇｌｕ－プラスミノーゲン標準品、０．０９μｇ／ウェル；（６）Ａｌｌ Ｂｌｕｅ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｎｄａｒｄ；（７）Ｌｙｓ－プラスミノーゲン標準品、６μｇ／ウェル；（８）Ｌｙｓ－プラスミン標準品、０．９μｇ／ウェル；（９）カラムの充填前のＣＥＸクロマトグラフィーのフィード、１：３に希釈した第２の再懸濁濾液、１μｇ／ウェル；（１０）カラムの充填後のＣＥＸクロマトグラフィーのフィード、１：３に希釈した第２の再懸濁濾液、１μｇ／ウェル；（１１）カラムの充填前のアフィニティークロマトグラフィーのフィード、１：２に希釈したＣＥＸ溶出液、１μｇ／ウェル；（１２）カラムの充填後のアフィニティークロマトグラフィーのフィード、１：２に希釈したＣＥＸ溶出液、１μｇ／ウェル；（１３）アフィニティークロマトグラフィーの溶出液、０．１５μｇ／ウェル；および（１４）アフィニティークロマトグラフィーのフロースルー、１μｇ／ウェル。
【図8】非還元性条件下（Ａ）および還元性条件下（Ｂ）における、Ｌｙｓ－プラスミノーゲンと比較したＧｌｕ－プラスミノーゲンを示すＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルのバンドを示す図である。Ｌｙｓ－プラスミノーゲンがよりはっきりと視認できることが明らかである。
【実施例】
【0106】
血漿画分から（Ｇｌｕ－）プラスミノーゲンを単離するための方法の例
Ｉ）材料および方法
オクタン酸（ＯＡ）を用いたＧｌｕ－プラスミノーゲンを含有する血漿画分の沈殿から得た沈殿物（ＯＡ－沈殿物、ＯＡ－ＰＰＴ）を、標準的な血液分画法から得た。この目的のために、Ｋｉｓｔｌｅｒ－Ｎｉｔｓｃｈｍａｎｎ法からのＯＡ－ＰＰＴ（Ｋｉｓｔｌｅｒ－Ｎｉｔｓｃｈｍａｎｎ沈殿物Ａ、ＰＰＴ－ＮＡ）を使用した。
Ｉ）材料および方法
オクタン酸（ＯＡ）を用いたＧｌｕ－プラスミノーゲンを含有する血漿画分の沈殿から得た沈殿物（ＯＡ－沈殿物、ＯＡ－ＰＰＴ）を、標準的な血液分画法から得た。この目的のために、Ｋｉｓｔｌｅｒ－Ｎｉｔｓｃｈｍａｎｎ法からのＯＡ－ＰＰＴ（Ｋｉｓｔｌｅｒ－Ｎｉｔｓｃｈｍａｎｎ沈殿物Ａ、ＰＰＴ－ＮＡ）を使用した。
【0107】
さらなる比較例では、Ｋｉｓｔｌｅｒ－Ｃｏｈｎ法（Ｋｉｓｔｌｅｒ－Ｃｏｈｎ画分Ｉ＋ＩＩ＋ＩＩＩ）からのＯＡ－沈殿物を使用し、これは同等の結果をもたらした。ＯＡ－沈殿物１８０ｇの濾過ケーキを使用した。さらなる比較例では、ＯＡ－沈殿物３６０ｇを使用し、これは同等の結果をもたらした。
【0108】
ａ）沈殿物の塩基性水性緩衝液への分散
ＯＡ－沈殿物の濾過ケーキを塩基性水性緩衝液（０．２Ｍ酢酸ナトリウムおよび３．５％（ｗ／ｖ）のＰＥＧ２０００を含有する）に、１：５の好ましい範囲（１：１から少なくとも１：１０までの範囲も代替例において例示的に使用した）の濾過ケーキ：緩衝液の質量比で分散した（生成された懸濁液は９．０のｐＨに調整した）。
ＯＡ－沈殿物の濾過ケーキを塩基性水性緩衝液（０．２Ｍ酢酸ナトリウムおよび３．５％（ｗ／ｖ）のＰＥＧ２０００を含有する）に、１：５の好ましい範囲（１：１から少なくとも１：１０までの範囲も代替例において例示的に使用した）の濾過ケーキ：緩衝液の質量比で分散した（生成された懸濁液は９．０のｐＨに調整した）。
【0109】
ｂ）分散液のインキュベーション
分散液を中程度の冷却条件（テンパリング装置、Ｌａｕｄａ、Ｇｅｒｍａｎｙ）下で１時間インキュベートおよび撹拌した。濾過助剤（５ｇ／ｋｇのＨａｒｂｏｒｌｉｔｅ９００、Ｉｍｅｒｙｓ Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ Ｆｒａｎｃｅ Ｓ．Ａ．Ｓ．）を添加し、室温で３０分間さらにインキュベートおよび撹拌した。
分散液を中程度の冷却条件（テンパリング装置、Ｌａｕｄａ、Ｇｅｒｍａｎｙ）下で１時間インキュベートおよび撹拌した。濾過助剤（５ｇ／ｋｇのＨａｒｂｏｒｌｉｔｅ９００、Ｉｍｅｒｙｓ Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ Ｆｒａｎｃｅ Ｓ．Ａ．Ｓ．）を添加し、室温で３０分間さらにインキュベートおよび撹拌した。
【0110】
ｃ）インキュベートした分散液の液体部分からの固体部分の分離
濾過助剤を含有する分散液を標準的なフィルタ（ＰｕｒａＦｉｘ ＣＨ ９Ｐ、Ｆｉｌｔｒｏｘ ＡＧ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）によって濾過した。濾過ケーキを、沈殿物を分散するために使用した容量の最大半分の緩衝液を用いて洗浄した。濾過時間は個々の実験に合わせて調整した。それは、濾過が完了するまで求められた。典型的には、それは７３ｋｇ／ｍ３でおよそ２２分の範囲であった。
濾過助剤を含有する分散液を標準的なフィルタ（ＰｕｒａＦｉｘ ＣＨ ９Ｐ、Ｆｉｌｔｒｏｘ ＡＧ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）によって濾過した。濾過ケーキを、沈殿物を分散するために使用した容量の最大半分の緩衝液を用いて洗浄した。濾過時間は個々の実験に合わせて調整した。それは、濾過が完了するまで求められた。典型的には、それは７３ｋｇ／ｍ３でおよそ２２分の範囲であった。
【0111】
驚くべきことに、沈殿物を分散するための塩基性水性緩衝液の使用とそれに続く濾過とが、例えば、（Ｇｌｕ－）プラスミノーゲン以外の多数のタンパク質、脂肪酸、ＰＥＧ２０００、およびオクタン酸の残留物などの不純物の効率的かつ本質的な除去を可能にしたことが見出された。不純物は濾液中に除去することができた。残りの濾過ケーキは（Ｇｌｕ－）プラスミノーゲンを含有した。
【0112】
ｄ）（Ｇｌｕ－）プラスミノーゲンの可溶化
（Ｇｌｕ－）プラスミノーゲンを含有する濾過ケーキを酸性水性緩衝液（０．２Ｍ酢酸ナトリウムおよび０．２Ｍリジン類似体６－アミノヘキサン酸を含有、ｐＨ５．０に調整）と、１：３の好ましい範囲（１：１から少なくとも１：１０までの範囲も代替例において例示的に使用した）の濾過ケーキ：緩衝液の質量比で混合した。ＯＡ－沈殿物１８０ｇ当たり、Ｄｏｗｅｘ １×８（ＤｕＰｏｎｔ Ｄｏｗ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、ＵＳＡ）３０ｇを添加した。
（Ｇｌｕ－）プラスミノーゲンを含有する濾過ケーキを酸性水性緩衝液（０．２Ｍ酢酸ナトリウムおよび０．２Ｍリジン類似体６－アミノヘキサン酸を含有、ｐＨ５．０に調整）と、１：３の好ましい範囲（１：１から少なくとも１：１０までの範囲も代替例において例示的に使用した）の濾過ケーキ：緩衝液の質量比で混合した。ＯＡ－沈殿物１８０ｇ当たり、Ｄｏｗｅｘ １×８（ＤｕＰｏｎｔ Ｄｏｗ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、ＵＳＡ）３０ｇを添加した。
【0113】
混合物を中程度の冷却条件（テンパリング装置、Ｌａｕｄａ、Ｇｅｒｍａｎｙ）下で１．５時間インキュベートした。次いで、残留物を標準的なフィルタ（ＰｕｒａＦｉｘ ＣＨ ９Ｐ、Ｆｉｌｔｒｏｘ ＡＧ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）による濾過によって除去した。濾過時間は個々の実験に合わせて調整した。それは、濾過が完了するまで求められた。典型的には、それはおよそ６分の範囲であったが、濾過量に合わせて変更された。濾過ケーキを洗浄して、残留物溶解画分を除去した。（Ｇｌｕ－）プラスミノーゲンは溶液中に本質的に残っていた。収率を改善するために、濾過残渣を、可溶化のために使用した容量の最大半分の酸性水性緩衝液を用いて洗浄した。その後、２つの溶液を合わせ、次いでさらに処理した。
【0114】
ｅ）陽イオン交換（ＣＥＸ）クロマトグラフィー
上記から得た（Ｇｌｕ－）プラスミノーゲンを含有する溶液を、酸性水性緩衝液（１０ｍＭ酢酸ナトリウム、５０ｍＭグリシン、ｐＨ５．０に調整）に、１：３の容量比（さらなる比較実験では、より広い範囲を使用した）に希釈した。
上記から得た（Ｇｌｕ－）プラスミノーゲンを含有する溶液を、酸性水性緩衝液（１０ｍＭ酢酸ナトリウム、５０ｍＭグリシン、ｐＨ５．０に調整）に、１：３の容量比（さらなる比較実験では、より広い範囲を使用した）に希釈した。
【0115】
強陽イオン交換（ＣＥＸ）クロマトグラフィー樹脂Ｅｓｈｕｍｕｎｏ ＣＰＸ（Ｍｅｒｃｋ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を固定相として使用した。これは、２．４ｍＬ／分（５分の接触時間）のフロースルーを使用する１２ｍＬクロマトグラフィーカラム（１２６×１１ｍｍ）を備えるＮＧＣクロマトグラフィーシステム（ＢｉｏＲａｄ、ＵＳＡ）において使用した。このカラムは、平衡化緩衝液（２００ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．０に調整）によって平衡化した。（Ｇｌｕ－）プラスミノーゲンを含有する希釈溶液を充填した。次いで、カラムを、洗浄緩衝液（５０ｍＭ酢酸ナトリウム、５０ｍＭグリシン、ｐＨ５．０に調整）を用いて洗浄した。最後に、（Ｇｌｕ－）プラスミノーゲンを含有する画分を、溶出高塩緩衝液（５０ｍＭ酢酸ナトリウム、５０ｍＭグリシン、１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ５．０に調整）によって溶出した。
【0116】
リジン類似体６－アミノヘキサン酸を溶液から効果的に除去できたことが見出された。
【0117】
ｆ）リジンコンジュゲートセファロースを用いるクロマトグラフィー
上記から得た（Ｇｌｕ－）プラスミノーゲンを含有する溶液を、酸性水性緩衝液（５０ｍＭ酢酸ナトリウム、５０ｍＭグリシン、ｐＨ５．０に調整）に、１：２の容量比（さらなる比較実験では、より広い範囲を使用した）に希釈した。
上記から得た（Ｇｌｕ－）プラスミノーゲンを含有する溶液を、酸性水性緩衝液（５０ｍＭ酢酸ナトリウム、５０ｍＭグリシン、ｐＨ５．０に調整）に、１：２の容量比（さらなる比較実験では、より広い範囲を使用した）に希釈した。
【0118】
ＥＣＨ－Ｌｙｓｉｎｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ Ｆａｓｔ－Ｆｌｏｗ（４％架橋アガロースに基づく、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ／Ｃｙｔｉｖａ、ＵＳＡ）を固定相として使用した。これは、１．２ｍＬ／分（１０分の接触時間）のフロースルーを使用する１２ｍＬクロマトグラフィーカラム（１２６×１１ｍｍ）または０．６ｍＬ／分（１０分の接触時間）のフロースルーを使用する６ｍＬクロマトグラフィーカラム（６３×１１ｍｍ）を備えるＮＧＣクロマトグラフィーシステム（ＢｉｏＲａｄ、ＵＳＡ）において使用した。カラムは、ｐＨ５．０の５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液によって平衡化した。（Ｇｌｕ－）プラスミノーゲンを含有する溶液を充填した。カラムを、第１の洗浄緩衝液（５０ｍＭ酢酸ナトリウム、５０ｍＭグリシン、１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ５．０に調整）を用いて洗浄した。次いで、カラムを、第２の洗浄緩衝液（１０ｍＭ酢酸ナトリウム、５０ｍＭグリシン、ｐＨ５．０に調整）を用いて洗浄した。最後に、Ｇｌｕ－プラスミノーゲンを含有する画分を、クエン酸塩含有溶出塩緩衝液（５０ｍＭクエン酸塩、５０ｍＭグリシン、ｐＨ３．０に調整）によって溶出した。
【0119】
ｇ）ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット
ＳＤＳ－ＰＡＧＥを、Ｍｉｎｉ－ＰＲＯＴＥＡＮテトラセルシステム（ＢｉｏＲａｄ、ＵＳＡ）および１０％プレキャストポリアクリルアミドゲルを使用して実行した。非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥについては、試料を、Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液（非還元）を用いて１：４に希釈し、次いでゲルに充填した。還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥについては、タンパク質試料を、１０％ジチオトレイトール（ＤＴＴ）を含有するＬａｅｍｍｌｉ緩衝液に１：４に希釈し、９５℃で５分間インキュベートした。ＳＤＳ－ＰＡＧＥについては、レーンに、ウェル１つ当たりタンパク質３μｇを充填し、ウェスタンブロットについては、ウェル１つ当たりタンパク質１．２～２．４μｇを使用した。各ゲルは、Ｇｌｕ－プラスミノーゲン、Ｌｙｓ－プラスミノーゲン、Ｌｙｓ－プラスミン、およびＰｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｐｌｕｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｌｌ Ｂｌｕｅ Ｐｒｅ－Ｓｔａｉｎｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ標準品（ＢｉｏＲａｄ、ＵＳＡ）の４つの標準品レーンを備えていた。電気泳動を、４℃の冷蔵庫において約１時間、１×泳動用緩衝液を用いて８０～２００Ｖで実施した。ニトロセルロース膜への転写は、Ｍｉｎｉ Ｔｒａｎｓ－Ｂｌｏｔ（登録商標）電気泳動転写システム（ＢｉｏＲａｄ、ＵＳＡ）を３５０ｍＡで１時間使用する１×転写緩衝液（２０％（ｖ／ｖ）メタノールを用いて１：１０に希釈した１０×緩衝液）中でのウェット式ブロッティングによって実行した。転写システムは冷蔵庫の外で準備したため、密封アイスユニットを緩衝液タンクに付加して、システムを冷却し、オーバーヒートおよび温度変動を予防した。次いで、転写膜をＴＢＳＴ緩衝液中５％（ｗ／ｖ）脱脂粉乳において１時間ブロッキングし、ＴＢＳＴ緩衝液（Ｔｗｅｅｎ－２０を含有するトリス緩衝生理食塩水）中５％（ｗ／ｖ）脱脂粉乳において、一次抗体（１：７００）と共に４℃で一晩インキュベートした。ＴＢＳＴ緩衝液を使用した洗浄工程（３×５分）後、膜を、西洋ワサビペルオキシダーゼにコンジュゲートした二次抗体（１：２０００）と共に（ＴＢＳＴ緩衝液中５％（ｗ／ｖ）脱脂粉乳において）室温で１時間インキュベートした。タンパク質バンドを、ＳｅｒａｍｕｎＢｌａｕ ｐｒｅｃ（登録商標）膜基質（Ｓｅｒａｍｕｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ ＧｍｂＨ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して検出した。
ＳＤＳ－ＰＡＧＥを、Ｍｉｎｉ－ＰＲＯＴＥＡＮテトラセルシステム（ＢｉｏＲａｄ、ＵＳＡ）および１０％プレキャストポリアクリルアミドゲルを使用して実行した。非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥについては、試料を、Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液（非還元）を用いて１：４に希釈し、次いでゲルに充填した。還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥについては、タンパク質試料を、１０％ジチオトレイトール（ＤＴＴ）を含有するＬａｅｍｍｌｉ緩衝液に１：４に希釈し、９５℃で５分間インキュベートした。ＳＤＳ－ＰＡＧＥについては、レーンに、ウェル１つ当たりタンパク質３μｇを充填し、ウェスタンブロットについては、ウェル１つ当たりタンパク質１．２～２．４μｇを使用した。各ゲルは、Ｇｌｕ－プラスミノーゲン、Ｌｙｓ－プラスミノーゲン、Ｌｙｓ－プラスミン、およびＰｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｐｌｕｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｌｌ Ｂｌｕｅ Ｐｒｅ－Ｓｔａｉｎｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ標準品（ＢｉｏＲａｄ、ＵＳＡ）の４つの標準品レーンを備えていた。電気泳動を、４℃の冷蔵庫において約１時間、１×泳動用緩衝液を用いて８０～２００Ｖで実施した。ニトロセルロース膜への転写は、Ｍｉｎｉ Ｔｒａｎｓ－Ｂｌｏｔ（登録商標）電気泳動転写システム（ＢｉｏＲａｄ、ＵＳＡ）を３５０ｍＡで１時間使用する１×転写緩衝液（２０％（ｖ／ｖ）メタノールを用いて１：１０に希釈した１０×緩衝液）中でのウェット式ブロッティングによって実行した。転写システムは冷蔵庫の外で準備したため、密封アイスユニットを緩衝液タンクに付加して、システムを冷却し、オーバーヒートおよび温度変動を予防した。次いで、転写膜をＴＢＳＴ緩衝液中５％（ｗ／ｖ）脱脂粉乳において１時間ブロッキングし、ＴＢＳＴ緩衝液（Ｔｗｅｅｎ－２０を含有するトリス緩衝生理食塩水）中５％（ｗ／ｖ）脱脂粉乳において、一次抗体（１：７００）と共に４℃で一晩インキュベートした。ＴＢＳＴ緩衝液を使用した洗浄工程（３×５分）後、膜を、西洋ワサビペルオキシダーゼにコンジュゲートした二次抗体（１：２０００）と共に（ＴＢＳＴ緩衝液中５％（ｗ／ｖ）脱脂粉乳において）室温で１時間インキュベートした。タンパク質バンドを、ＳｅｒａｍｕｎＢｌａｕ ｐｒｅｃ（登録商標）膜基質（Ｓｅｒａｍｕｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ ＧｍｂＨ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して検出した。
【0120】
ｈ）タンパク質分解活性の決定
総タンパク質分解活性：
発色基質Ｓ－２２８８と混合した試料（１００μＬ＋１００μＬ試料）の４５０ｎｍにおける吸収動態を、分光光度計を使用して３７℃で１～３分間モニタリングすることによって、タンパク質分解活性（ＰＡ）を評価した。７～９のｐＨ範囲の試料を、ＰＡアッセイ緩衝液Ｉ（０．１Ｍトリス－ＨＣｌ、０．１０６Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ８．７）を用いて１：４に予め希釈した。７未満のｐＨを有する酸性再懸濁液試料については、試料を、ＰＡアッセイ緩衝液Ｉを用いて１：８に予め希釈して、プロテアーゼが再び活性となるｐＨ値を達成した。アッセイの線形範囲を満たすために、ＰＡアッセイ緩衝液Ｉを用いた少なくとも１：２の希釈比を使用した。使用した全ての緩衝液を、ＰＡ緩衝液Ｉを用いた必要とされる希釈比に関して評価して、総タンパク質分解活性に適切な８．４の標的ｐＨを達成した。
総タンパク質分解活性：
発色基質Ｓ－２２８８と混合した試料（１００μＬ＋１００μＬ試料）の４５０ｎｍにおける吸収動態を、分光光度計を使用して３７℃で１～３分間モニタリングすることによって、タンパク質分解活性（ＰＡ）を評価した。７～９のｐＨ範囲の試料を、ＰＡアッセイ緩衝液Ｉ（０．１Ｍトリス－ＨＣｌ、０．１０６Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ８．７）を用いて１：４に予め希釈した。７未満のｐＨを有する酸性再懸濁液試料については、試料を、ＰＡアッセイ緩衝液Ｉを用いて１：８に予め希釈して、プロテアーゼが再び活性となるｐＨ値を達成した。アッセイの線形範囲を満たすために、ＰＡアッセイ緩衝液Ｉを用いた少なくとも１：２の希釈比を使用した。使用した全ての緩衝液を、ＰＡ緩衝液Ｉを用いた必要とされる希釈比に関して評価して、総タンパク質分解活性に適切な８．４の標的ｐＨを達成した。
【0121】
優勢な（ｐｒｅｖａｌｅｎｔ）タンパク質分解活性：
酸性試料の、再懸濁液環境における優勢なタンパク質分解活性を評価するために、代替的なプロトコルを使用した。試料をＰＡアッセイ緩衝液ＩＩ（０．０２５Ｍトリス－ＨＣｌ、０．０２６Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ８．７）と１：２で混合した。次いで、混合物を発色基質Ｓ－２２８８と１：２で混合し、４５０ｎｍにおける吸収動態を、分光光度計を使用して３７℃で１～３分間測定した。
酸性試料の、再懸濁液環境における優勢なタンパク質分解活性を評価するために、代替的なプロトコルを使用した。試料をＰＡアッセイ緩衝液ＩＩ（０．０２５Ｍトリス－ＨＣｌ、０．０２６Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ８．７）と１：２で混合した。次いで、混合物を発色基質Ｓ－２２８８と１：２で混合し、４５０ｎｍにおける吸収動態を、分光光度計を使用して３７℃で１～３分間測定した。
【0122】
ＩＩ）結果
驚くべきことに、非常に高い純度のＧｌｕ－プラスミノーゲンを高収率で取得可能であることが見出された。
驚くべきことに、非常に高い純度のＧｌｕ－プラスミノーゲンを高収率で取得可能であることが見出された。
【0123】
一例では、第１の分散および濾過後の可溶化タンパク質含量（濾液および洗浄）は１７．６ｇであり、第１の濾液の総タンパク質分解活性は３８ＩＵ／ｇ、および第１の洗浄後の総タンパク質分解活性は６２ＩＵ／ｇであった。
【0124】
この例において、酸性緩衝液を用いた可溶化後の可溶化タンパク質含量（濾液）は１５３ｍｇであった。これはＧｌｕ－プラスミノーゲン１９．２ｍｇを含有した。濾液における総タンパク質分解活性は５９ＩＵ／ｇであり、優勢なタンパク質分解活性は検出レベル未満であった。この文脈において、優勢なタンパク質分解活性は、現時点では活性であるが低い処理ｐＨでは抑制されるプロテアーゼを測定するための変換された基質の測定値を記載する。総タンパク質分解活性のために、試料ｐＨを、基質変換および生成物を害し得る存在する全てのプロテアーゼの評価に最適な値に戻すように調整した。
【0125】
陽イオン交換（ＣＥＸ）クロマトグラフィーの回収率は８１％であった（さらなる比較実験では、より広い範囲を使用した）。総タンパク質分解活性は、ＣＥＸ前の５９ＩＵ／ｇからＣＥＸ後の３７ＩＵ／ｇに低下した。生成組成物（Ｇｌｕ／Ｌｙｓ－プラスミノーゲン）において観察可能な変化は存在しなかった。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ／ウェスタンブロット（ＷＢ）に関して、上側の２つのバンドはＧｌｕ形態（２つの異なるグリコシル化）を示し、下側のバンドは２つの異なるグリコシル化を有するＬｙｓ形態を示す。Ｇｌｕ形態の下側のバンドとＬｙｓ形態の上側のバンドとは重なっているため、３つのバンドのみが視認できる。ウェスタンブロットでは、ＣｏａＣｈｒｏｍ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ ＧｍｂＨ（Ａｕｓｔｒｉａ）から得た市販の抗プラスミノーゲン抗体「ヒツジ抗ヒトプラスミノーゲン（Ｐｇ）」（「ＳＡＰＧ－ＩＧ」）を融合した。抗ヒツジＩｇＧ抗体を二次抗体として使用した。
【0126】
【表1】
【0127】
この実験では、より高いタンパク質濃度において、値のある程度の変化が観察された。単一の実験、すなわちＢｒａｄｆｏｒｄアッセイまたはＥＬＩＳＡにおける異なる桁の試料の比較に焦点を当てた。
【0128】
リジンコンジュゲートセファロースを用いたクロマトグラフィー後の溶出液は、プラスミノーゲン６０１μｇ／ｍＬを含有し、このうち５８７μｇ／ｍＬがＧｌｕ－プラスミノーゲンであった。これは、プラスミノーゲン含量において９７％（ｗ／ｗ）超の純度である。プラスミノーゲンの発色活性は１６４％であった。総タンパク質分解活性は１４５ＩＵ／ｇであり、優勢なタンパク質分解活性は検出レベル未満であった。
【0129】
ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル（図６を参照のこと）およびウェスタンブロット（図７を参照のこと）において、プラスミノーゲンは、溶出前の洗浄緩衝液のフロースルー中に検出されなかった（それぞれ、レーン（１）および（２）を参照されたい）。
【0130】
アフィニティークロマトグラフィーの溶出液（図６および７のレーン（１３）を参照されたい）において、有意な量の純粋な（Ｇｌｕ－）プラスミノーゲンが得られた。同一性はウェスタンブロットによって示され、純度はＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルにおいて示されている。全ての視認できる不純物を本質的に除去した。分子量は、Ｇｌｕ－プラスミノーゲン標準品の質量を満たした（レーン（５）を参照されたい）。
【0131】
注目すべきことに、アフィニティークロマトグラフィーのフロースルーは、検出可能な量の（Ｇｌｕ－）プラスミノーゲンを示していない（図６および７のレーン（１４）を参照されたい）。このことは、アフィニティークロマトグラフィー工程が得られた収率を有意には低下させなかったことを示す。
【0132】
プラスミノーゲンの溶出液純度は、ピークが９０．７８％であることを示した。検出される可能性のある不純物は、０．７％（ｗ／ｗ）のアルブミン、１．０％（ｗ／ｗ）の免疫グロブリンＩｇＧ、０．８％（ｗ／ｗ）の免疫グロブリンＩｇＧ、および１．１％（ｗ／ｗ）の免疫グロブリンＩｇＭである。
【0133】
【表2】
【0134】
試料に６－アミノヘキサン酸（６－ＡＨＡ）を加えた、すなわち、同等の含量の６－ＡＨＡを添加して、試料同士の比較性を改善した。
【0135】
したがって、本発明の方法は、異なる供給源のオクタン酸（ＯＡ）を用いて使用可能であり、確実性の高い高純度のＧｌｕ－プラスミノーゲンを提供する。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【国際調査報告】