特表 2024-521987 ジスルフィド結合した結合ポリペプチドのスクリーニング及び発現の方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-06-05

(54)【発明の名称】ジスルフィド結合した結合ポリペプチドのスクリーニング及び発現の方法

(51)【国際特許分類】

   C40B 40/08 20060101AFI20240529BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20240529BHJP

   C07K 16/00 20060101ALI20240529BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20240529BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20240529BHJP

   C12P 21/08 20060101ALI20240529BHJP

   C12P 21/02 20060101ALI20240529BHJP

   A61K 38/17 20060101ALI20240529BHJP

   C40B 30/04 20060101ALI20240529BHJP

   C12N 15/13 20060101ALN20240529BHJP

   C12N 15/62 20060101ALN20240529BHJP

   C12N 15/33 20060101ALN20240529BHJP

   C12N 1/15 20060101ALN20240529BHJP

   C12N 1/19 20060101ALN20240529BHJP

   C12N 1/21 20060101ALN20240529BHJP

   C40B 40/10 20060101ALN20240529BHJP

   C07K 14/195 20060101ALN20240529BHJP

   A61P 31/12 20060101ALN20240529BHJP

   A61K 39/395 20060101ALN20240529BHJP

【ＦＩ】

C40B40/08

C12N15/63 Z

C07K16/00

C07K19/00

C12N5/10

C12P21/08

C12P21/02 C

A61K38/17

C40B30/04

C12N15/13 ZNA

C12N15/62 Z

C12N15/33

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C40B40/10

C07K14/195

A61P31/12

A61K39/395 N

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023568539

(86)(22)【出願日】2022-05-11

(85)【翻訳文提出日】2023-12-27

(86)【国際出願番号】 US2022028864

(87)【国際公開番号】W WO2022241058

(87)【国際公開日】2022-11-17

(31)【優先権主張番号】63/187,931

(32)【優先日】2021-05-12

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/288,992

(32)【優先日】2021-12-13

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】523419211

【氏名又は名称】アプライド バイオメディカル サイエンス インスティチュート

(74)【代理人】

【識別番号】100092783

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 浩

(74)【代理人】

【識別番号】100120134

【弁理士】

【氏名又は名称】大森 規雄

(74)【代理人】

【識別番号】100126354

【弁理士】

【氏名又は名称】藤田 尚

(72)【発明者】

【氏名】マクレガー，ダンカン

(72)【発明者】

【氏名】ホアン，ルイチー

(72)【発明者】

【氏名】ワーナー ジェンキンス，ガブリエル

(72)【発明者】

【氏名】スマイダー，ボーン

【テーマコード（参考）】

4B064

4B065

4C084

4C085

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B064AG01

4B064AG27

4B064CA02

4B064CA19

4B064CC24

4B064DA01

4B065AA26X

4B065AA90Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA24

4B065CA25

4B065CA44

4C084AA06

4C084BA19

4C084BA20

4C084CA20

4C084MA55

4C084MA57

4C084MA59

4C084MA66

4C084NA14

4C084ZB331

4C084ZB332

4C085AA14

4C085EE01

4C085GG02

4C085GG03

4C085GG04

4C085GG10

4H045AA11

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA41

4H045CA40

4H045DA76

4H045EA22

4H045EA29

4H045FA74

(57)【要約】

本開示は、例えば、標的分子に特異的な結合ペプチドを同定するために、ジスルフィド結合した結合ポリペプチドのディスプレイライブラリーを産生及びスクリーニングする方法に関する。いくつかの実施形態において、結合ペプチドは超長ＣＤＲ３を含む。結合ペプチドは、超長ＣＤＲ３を含むウシ抗体に由来し得るか、又はそれらは合成若しくは半合成であり得る。また、本明細書では、ジスルフィド結合した結合ポリペプチドを含むディスプレイライブラリーも提供される。本開示はまた、例えば、好適な宿主細胞を使用して、可溶性のジスルフィド結合した結合ポリペプチドを産生又は発現する方法に関する。可溶性のジスルフィド結合した結合ポリペプチドを含む組成物も本明細書で提供される。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ウシ超長ＣＤＲ３抗体ディスプレイライブラリーを調製する方法であって、
（ａ）ウシ抗体ＶＨ鎖相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）鋳型ライブラリーからのＩｇＨＶ１－７ファミリーの複数の可変重（ＶＨ）領域をコードする配列を増幅することと、
（ｂ）前記複数のＶＨ領域のための複数の複製可能な発現ベクターを構築することであって、各複製可能な発現ベクターが、ＢＬＶ１Ｈ１２、ＢＬＶ５Ｄ３、ＢＬＶ８Ｃ１１、ＢＦ１Ｈ１、ＢＬＶ５Ｂ８、及びＦ１８のＶＬ領域からなる群から選択される可変ラムダ軽（ＶＬ）領域、又はそのヒト化バリアントに連結された増幅されたＶＨ領域を含む単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）をコードする核酸配列を含む、構築することと、
（ｃ）増幅されたディスプレイ粒子を産生するのに好適な条件下で、前記複数の複製可能な発現ベクターで好適な宿主細胞を形質転換することと、
（ｄ）前記増幅されたディスプレイ粒子を収集することであって、前記増幅されたディスプレイ粒子が、ｓｃＦｖを含む融合タンパク質をディスプレイするディスプレイ粒子を含む、収集することと、を含む、方法。

【請求項2】

前記ＶＬ領域が、ＢＬＶ１Ｈ１２ ＶＬ領域である、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

ウシ超長ＣＤＲ３抗体ディスプレイライブラリーを調製する方法であって、
（ａ）ウシ抗体ＶＨ鎖相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）鋳型ライブラリーからのＩｇＨＶ１－７ファミリーの複数の可変重（ＶＨ）領域をコードする配列を増幅することと、
（ｂ）前記複数のＶＨ領域のための複数の複製可能な発現ベクターを構築することであって、各複製可能な発現ベクターが、前記ＢＬＶ１Ｈ１２ラムダ可変軽（ＶＬ）領域又はそのヒト化バリアントに連結された増幅されたＶＨ領域を含む単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）をコードする核酸配列を含む、構築することと、
（ｃ）増幅されたディスプレイ粒子を産生するのに好適な条件下で、前記複数の複製可能な発現ベクターで好適な宿主細胞を形質転換することと、
（ｄ）前記増幅されたディスプレイ粒子を収集することであって、前記増幅されたディスプレイ粒子が、ｓｃＦｖを含む融合タンパク質をディスプレイするディスプレイ粒子を含む、収集することと、を含む、方法。

【請求項4】

前記ｃＤＮＡ鋳型ライブラリーが、免疫化ウシからの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から単離されたＲＮＡから調製される、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項5】

免疫化ウシからの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から単離されたＲＮＡから前記ｃＤＮＡ鋳型ライブラリーを調製することを更に含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項6】

前記ウシを標的抗原で免疫化することを更に含む、請求項４又は５に記載の方法。

【請求項7】

前記増幅されたディスプレイ粒子が、細菌ディスプレイ粒子、酵母ディスプレイ粒子、哺乳類ディスプレイ粒子、ファージディスプレイ粒子、ｍＲＮＡディスプレイ粒子、リボソームディスプレイ粒子、又はＤＮＡディスプレイ粒子を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項8】

前記増幅されたディスプレイ粒子が、ファージディスプレイ粒子である、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項9】

前記増幅されたディスプレイ粒子が、ファージミド粒子である、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項10】

前記核酸配列が、第１の核酸配列であり、各複製可能な発現ベクターが、ファージコートタンパク質の少なくとも一部をコードする第２の核酸配列を更に含み、前記方法が、前記ファージミド粒子を産生するのに十分な量の、前記ファージコートタンパク質をコードする遺伝子を有するヘルパーファージで、形質転換された前記宿主細胞を感染させることを更に含み、それによって、前記融合タンパク質が、前記ファージコートタンパク質の少なくとも一部を含む、請求項９に記載の方法。

【請求項11】

ウシ超長ＣＤＲ３抗体ファージディスプレイライブラリーを調製する方法であって、
（ａ）ウシを標的抗原で免疫化することと、
（ｂ）免疫化ウシからの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から単離されたＲＮＡから抗体可変重（ＶＨ）鎖相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）鋳型ライブラリーを調製することと、
（ｃ）前記ｃＤＮＡ鋳型ライブラリーからのＩｇＨＶ１－７ファミリーの複数のＶＨ領域をコードする配列を増幅することと、
（ｄ）前記複数のＶＨ領域のための複数の複製可能な発現ベクターを構築することであって、各複製可能な発現ベクターが、（１）ＢＬＶ１Ｈ１２ラムダ可変軽（ＶＬ）領域又はそのヒト化バリアントに連結された増幅されたＶＨ領域を含む単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）をコードする第１の核酸配列、及び（２）ファージコートタンパク質の少なくとも一部をコードする第２の核酸配列を含む、構築することと、
（ｅ）前記複数の複製可能な発現ベクターで好適な宿主細胞を形質転換することと、
（ｆ）増幅されたファージミド粒子を産生するのに十分な量の、前記ファージコートタンパク質をコードする遺伝子を有するヘルパーファージで、形質転換された前記宿主細胞を感染させることと、
（ｇ）前記増幅されたファージミド粒子を収集することであって、前記増幅されたファージミド粒子が、前記ファージコートタンパク質の少なくとも一部及びｓｃＦｖを含む融合タンパク質をディスプレイするファージミド粒子を含む、収集することと、を含む、方法。

【請求項12】

前記ＢＬＶ１Ｈ１２ラムダＶＬ領域が、配列番号２に示される、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項13】

前記ＢＬＶ１Ｈ１２ラムダＶＬ領域が、前記ＢＬＶ１Ｈ１２のラムダＶＬ領域のヒト化バリアントである、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項14】

前記ヒト化バリアントが、Ｋａｂａｔ番号付けに基づくアミノ酸置換Ｓ２Ａ、Ｔ５Ｎ、Ｐ８Ｓ、Ａ１２Ｇ、Ａ１３Ｓ、及びＰ１４Ｌ、ＣＤＲ１領域におけるアミノ酸置換Ｉ２９Ｖ及びＮ３２Ｇ、並びに／又はＣＤＲ２領域におけるＤＮＮからＧＤＴへのアミノ酸置換のうちの１つ以上を含む、請求項１３に記載の方法。

【請求項15】

前記ヒト化バリアントが、配列番号１０７に示される配列を含む、請求項１３又は１４に記載の方法。

【請求項16】

前記増幅されたＶＨ領域が、ペプチドリンカーを介して間接的に前記ＢＬＶ１Ｈ１２ラムダＶＬ領域に連結される、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項17】

前記ペプチドリンカーが、（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_３（配列番号９４）である、請求項１６に記載の方法。

【請求項18】

前記ｃＤＮＡ鋳型ライブラリーからの前記ＩｇＨＶ１－７ファミリーの前記複数のＶＨ領域が、配列番号８４に示される配列を含むフォワードプライマー及び配列番号８５に示される配列を含むリバースプライマーで増幅される、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項19】

前記構築の前に、前記方法が、複数の前記増幅されたＶＨ領域をコードする配列に対してサイズ分離を行って、超長ＣＤＲ３を有するＶＨ領域を富化することを更に含む、請求項１～１８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項20】

前記サイズ分離が、ゲル電気泳動によって行われる、請求項１９に記載の方法。

【請求項21】

前記ゲル電気泳動が、１．２％、１．５％、又は２％のアガロースゲルを使用して、任意選択で２％のアガロースゲルを使用して行われる、請求項２０に記載の方法。

【請求項22】

前記サイズ分離が、前記複数の増幅されたＶＨ領域をコードする配列から５５０塩基対長、約５５０塩基対長又は５５０塩基対長を超える配列を分離することを含み、前記５５０塩基対長、約５５０塩基対長又は５５０塩基対長を超える配列が、超長ＣＤＲ３を有するＶＨ領域をコードする配列を含む、請求項１９～２１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項23】

前記増幅された粒子の少なくとも又は少なくとも約２０％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、又は９５％が、超長ＣＤＲ３領域を含むＶＨ領域を含むｓｃＦｖをディスプレイする、請求項１～２２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項24】

前記増幅された粒子の少なくとも又は少なくとも約３０％が、超長ＣＤＲ３領域を含むＶＨ領域を含むｓｃＦｖをディスプレイする、請求項１～２３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項25】

前記増幅された粒子の少なくとも又は少なくとも約４０％が、超長ＣＤＲ３領域を含むＶＨ領域を含むｓｃＦｖをディスプレイする、請求項１～２４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項26】

前記増幅された粒子の少なくとも又は少なくとも約５０％が、超長ＣＤＲ３領域を含むＶＨ領域を含むｓｃＦｖをディスプレイする、請求項１～２５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項27】

前記超長ＣＤＲ３が、１～６つのジスルフィド結合を形成することができる２～１２のシステイン残基を含むシステインモチーフを含む、２５～７０個のアミノ酸のペプチド配列である、請求項１～２６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項28】

前記超長ＣＤＲ３が、４０～６０アミノ酸長である、請求項１～２７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項29】

前記超長ＣＤＲ３が、少なくとも４２アミノ酸長である、請求項１～２８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項30】

前記超長ＣＤＲ３が、４２アミノ酸長、４３アミノ酸長、４４アミノ酸長、４５アミノ酸長、４６アミノ酸長、４７アミノ酸長、４８アミノ酸長、４９アミノ酸長、５０アミノ酸長、５１アミノ酸長、５２アミノ酸長、５３アミノ酸長、５４アミノ酸長、５５アミノ酸長、５６アミノ酸長、５７アミノ酸長、５８アミノ酸長、５９アミノ酸長、又は６０アミノ酸長である、請求項１～２９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項31】

前記超長ＣＤＲ３が、少なくとも４つのシステイン残基を含む、請求項１～３０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項32】

前記超長ＣＤＲ３が、４つのシステイン残基を含む、請求項１～３１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項33】

前記超長ＣＤＲ３が、６、８、１０、又は１２のシステイン残基を含む、請求項１～３１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項34】

前記超長ＣＤＲ３が、少なくとも２つのジスルフィド結合を有する、請求項１～３３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項35】

前記超長ＣＤＲ３が、２つのジスルフィド結合を有する、請求項１～３４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項36】

前記超長ＣＤＲ３が、３、４、又は５つのジスルフィド結合を有する、請求項１～３４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項37】

前記方法が、ｓｃＦｖ配列中のＣＤＲ３－ノブ配列を同定することを更に含む、請求項１～３６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項38】

超長ＣＤＲ３－ノブディスプレイライブラリーを調製する方法であって、
（ａ）ウシ超長ＣＤＲ３領域の上昇ストークドメイン及び下降ストークドメインに特異的なフォワードプライマー及びリバースプライマーを用いて、ウシ抗体可変重（ＶＨ）鎖相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）鋳型ライブラリーから複数のＣＤＲ３－ノブのみの抗体をコードする配列を増幅することと、
（ｂ）前記複数のＣＤＲ３ノブのみの抗体のための複数の複製可能な発現ベクターを構築することであって、各複製可能な発現ベクターが、増幅されたＣＤＲ３ノブをコードする核酸配列を含む、構築することと、
（ｃ）増幅されたディスプレイ粒子を産生するのに好適な条件下で、前記複数の複製可能な発現ベクターで好適な宿主細胞を形質転換することと、
（ｄ）前記増幅されたディスプレイ粒子を収集することであって、前記増幅されたディスプレイ粒子が、増幅されたＣＤＲ３ノブを含む融合タンパク質をディスプレイするディスプレイ粒子を含む、収集することと、を含む、方法。

【請求項39】

前記ｃＤＮＡ鋳型ライブラリーが、免疫化ウシからの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から単離されたＲＮＡから調製される、請求項３８に記載の方法。

【請求項40】

免疫化ウシからの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から単離されたＲＮＡから前記ｃＤＮＡ鋳型ライブラリーを調製することを更に含む、請求項３８又は３９に記載の方法。

【請求項41】

前記ウシを標的抗原で免疫化することを更に含む、請求項３９又は４０に記載の方法。

【請求項42】

前記増幅されたディスプレイ粒子が、細菌ディスプレイ粒子、酵母ディスプレイ粒子、哺乳類ディスプレイ粒子、ファージディスプレイ粒子、ｍＲＮＡディスプレイ粒子、リボソームディスプレイ粒子、又はＤＮＡディスプレイ粒子を含む、請求項３８～４１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項43】

前記増幅されたディスプレイ粒子が、ファージディスプレイ粒子である、請求項３８～４２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項44】

前記増幅されたディスプレイ粒子が、ファージミド粒子である、請求項３８～４３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項45】

前記核酸配列が、第１の核酸配列であり、各複製可能な発現ベクターが、ファージコートタンパク質の少なくとも一部をコードする第２の核酸配列を更に含み、前記方法が、前記ファージミド粒子を産生するのに十分な量の、前記ファージコートタンパク質をコードする遺伝子を有するヘルパーファージで、形質転換された前記宿主細胞を感染させることを更に含み、それによって、前記融合タンパク質が、前記ファージコートタンパク質の少なくとも一部を含む、請求項４４に記載の方法。

【請求項46】

超長ＣＤＲ３－ノブファージディスプレイライブラリーを調製する方法であって、
（ａ）ウシを標的抗原で免疫化することと、
（ｂ）免疫化ウシからの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から単離されたＲＮＡから抗体可変重（ＶＨ）鎖相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）鋳型ライブラリーを調製することと、
（ｃ）ウシ超長ＣＤＲ３領域の上昇ストークドメイン及び下降ストークドメインに特異的なフォワードプライマー及びリバースプライマーを用いて、前記ｃＤＮＡ鋳型ライブラリーから複数のＣＤＲ３－ノブのみの抗体をコードする配列を増幅することと、
（ｄ）前記複数のＣＤＲ３－ノブのみの抗体のための複数の複製可能な発現ベクターを構築することであって、各複製可能な発現ベクターが、（１）増幅されたＣＤＲ３ノブをコードする第１の核酸配列、及び（２）ファージコートタンパク質の少なくとも一部をコードする第２の核酸配列を含む、構築することと、
（ｅ）前記複数の複製可能な発現ベクターで好適な宿主細胞を形質転換することと、
（ｆ）増幅されたファージミド粒子を産生するのに十分な量の、前記ファージコートタンパク質をコードする遺伝子を有するヘルパーファージで、形質転換された前記宿主細胞を感染させることと、
（ｇ）前記増幅されたファージミド粒子を収集することであって、前記増幅されたファージミド粒子が、前記ファージコートタンパク質の少なくとも一部及び増幅されたＣＤＲ３ノブを含む融合タンパク質をディスプレイするファージミド粒子を含む、収集することと、を含む、方法。

【請求項47】

前記プライマーが、配列番号７～１１及び１２１～１３０に示される配列のうちのいずれかを含むか又はそれらからなり、任意選択で、配列番号１２３、１２７、及び１２８に示される配列のうちのいずれかを含むか又はそれらからなる、請求項３８～４６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項48】

前記方法が、ウシ抗体可変重（ＶＨ）鎖鋳型配列から前記ＣＤＲ３－ノブを同定することを更に含む、請求項３８～４７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項49】

前記ＣＤＲ３－ノブが、
フレームワーク３中の保存されたシステイン及びフレームワーク４中の保存されたトリプトファンを同定すること、並びに
前記ＣＤＲ－３ノブの配列を決定することであって、
前記ＣＤＲ－３ノブが、アミノ酸配列長Ｋを有し、
前記配列が、位置Ｘ＋１で始まり、Ｘ＋Ｋで終わり、
Ｋ＝Ｌ－２Ｘ
（式中、Ｌは、フレームワーク３中の前記保存されたシステインから始まり、フレームワーク４中の前記保存されたトリプトファンで終わるアミノ酸配列中のアミノ酸の数であり、Ｘは、フレームワーク３中の最初のシステインからＣＤＲ Ｈ３中のＤ_Ｈ領域によってコードされる最初の保存されたシステインまでのアミノ酸の数である）である、前記ＣＤＲ－３ノブの配列を決定することを含むアルゴリズムによって抗体配列から同定される、請求項３７又は４８に記載の方法。

【請求項50】

前記抗体配列が、ウシ抗体である、請求項４９に記載の方法。

【請求項51】

同定された前記ＣＤＲ３－ノブが、同定された配列と比較して、Ｎ及び／又はＣ末端で１、２、３、４、又は５個のアミノ酸だけ伸長されている、請求項４９又は５０に記載の方法。

【請求項52】

前記複数のＣＤＲ３－ノブのみの抗体の各々が、１～６つのジスルフィド結合を形成することができる２～１２のシステイン残基を含むシステインモチーフを有する２５～７０個のアミノ酸のペプチド配列を含む、請求項３８～５１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項53】

前記ペプチド配列が、４０～６０アミノ酸長である、請求項５２に記載の方法。

【請求項54】

前記ペプチド配列が、少なくとも４２アミノ酸長である、請求項５２又は５３に記載の方法。

【請求項55】

前記ペプチド配列が、４２アミノ酸長、４３アミノ酸長、４４アミノ酸長、４５アミノ酸長、４６アミノ酸長、４７アミノ酸長、４８アミノ酸長、４９アミノ酸長、５０アミノ酸長、５１アミノ酸長、５２アミノ酸長、５３アミノ酸長、５４アミノ酸長、５５アミノ酸長、５６アミノ酸長、５７アミノ酸長、５８アミノ酸長、５９アミノ酸長、又は６０アミノ酸長である、請求項５２～５４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項56】

前記ペプチド配列が、少なくとも４つのシステイン残基を含む、請求項５２～５５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項57】

前記ペプチド配列が、４つのシステイン残基を含む、請求項５２～５６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項58】

前記ペプチド配列が、６、８、１０、又は１２のシステイン残基を含む、請求項５２～５６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項59】

前記ペプチド配列が、少なくとも２つのジスルフィド結合を有する、請求項５２～５８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項60】

前記ペプチド配列が、２つのジスルフィド結合を有する、請求項５２～５９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項61】

前記ペプチド配列が、３、４、又は５つのジスルフィド結合を有する、請求項５２～５９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項62】

前記標的抗原が、非病原性細菌、ウイルス、ウイルスタンパク質、免疫調節タンパク質、癌抗原、ヒトＩｇＧ、又はそれらの組換えタンパク質である、請求項６～３７及び４１～６１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項63】

前記ｃＤＮＡ鋳型ライブラリーが、配列番号４に示される配列を含むか又はそれからなるプライマー、配列番号５に示される配列を含むか又はそれからなるプライマー、配列番号３に示される配列を含むか又はそれからなるプライマー、及び配列番号６に示される配列を含むか又はそれからなるプライマーを含む、ＩｇＭ、ＩｇＡ、及びＩｇＧ特異的プライマーのプールを使用して合成された、請求項１～６２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項64】

超長ＣＤＲ３－ノブディスプレイライブラリーを調製する方法であって、
（ａ）複数のＣＤＲ３－ノブのみの抗体のための複数の複製可能な発現ベクターを構築することであって、各複製可能な発現ベクターが、１～６つのジスルフィド結合を形成することができる２～１２のシステイン残基を含むシステインモチーフを有する２５～７０個のアミノ酸のペプチド配列をコードする核酸配列を含む、構築することと、
（ｂ）増幅されたディスプレイ粒子を産生するのに好適な条件下で、前記複数の複製可能な発現ベクターで好適な宿主細胞を形質転換することと、
（ｃ）前記増幅されたディスプレイ粒子を収集することであって、前記増幅されたディスプレイ粒子が、ＣＤＲ３ノブを含む融合タンパク質をディスプレイするディスプレイ粒子を含む、収集することと、を含む、方法。

【請求項65】

前記増幅されたディスプレイ粒子が、細菌ディスプレイ粒子、酵母ディスプレイ粒子、哺乳類ディスプレイ粒子、ファージディスプレイ粒子、ｍＲＮＡディスプレイ粒子、リボソームディスプレイ粒子、又はＤＮＡディスプレイ粒子を含む、請求項６４に記載の方法。

【請求項66】

前記増幅されたディスプレイ粒子が、ファージディスプレイ粒子である、請求項６４又は６５に記載の方法。

【請求項67】

前記増幅されたディスプレイ粒子が、ファージミド粒子である、請求項６４～６６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項68】

前記核酸配列が、第１の核酸配列であり、各複製可能な発現ベクターが、ファージコートタンパク質の少なくとも一部をコードする第２の核酸配列を更に含み、前記方法が、前記ファージミド粒子を産生するのに十分な量の、前記ファージコートタンパク質をコードする遺伝子を有するヘルパーファージで、形質転換された前記宿主細胞を感染させることを更に含み、それによって、前記融合タンパク質が、前記ファージコートタンパク質の少なくとも一部を含む、請求項６７に記載の方法。

【請求項69】

超長ＣＤＲ３－ノブファージディスプレイライブラリーを調製する方法であって、
（ａ）複数のＣＤＲ３－ノブのみの抗体のための複数の複製可能な発現ベクターを構築することであって、各複製可能な発現ベクターが、（１）１～６つのジスルフィド結合を形成することができる２～１２のシステイン残基を含むシステインモチーフを有する２５～７０個のアミノ酸のペプチド配列をコードする第１の核酸配列、及び（２）ファージコートタンパク質の少なくとも一部をコードする第２の核酸配列を含む、構築することと、
（ｂ）複数の複製可能な発現ベクターで好適な宿主細胞を形質転換することと、
（ｃ）増幅されたファージミド粒子を産生するのに十分な前記ファージコートタンパク質をコードする遺伝子を有するヘルパーファージで、形質転換された前記宿主細胞を感染させることと、
（ｄ）前記増幅されたファージミド粒子を収集することであって、前記増幅されたファージミド粒子が、前記ファージコートタンパク質の少なくとも一部及びＣＤＲ３ノブを含む融合タンパク質をディスプレイするファージミド粒子を含む、収集することと、を含む、方法。

【請求項70】

前記複数のＣＤＲ３－ノブ抗体のうちの少なくとも１つが、
フレームワーク３中の保存されたシステイン及びフレームワーク４中の保存されたトリプトファンを同定すること、並びに
前記ＣＤＲ－３ノブの配列を決定することであって、
前記ＣＤＲ－３ノブが、アミノ酸配列長Ｋを有し、
前記配列が、位置Ｘ＋１で始まり、Ｘ＋Ｋで終わり、
Ｋ＝Ｌ－２Ｘ
（式中、Ｌは、フレームワーク３中の前記保存されたシステインから始まり、フレームワーク４中の前記保存されたトリプトファンで終わるアミノ酸配列中のアミノ酸の数であり、Ｘは、フレームワーク３中の最初のシステインからＣＤＲ Ｈ３中のＤ_Ｈ領域によってコードされる最初の保存されたシステインまでのアミノ酸の数である）である、前記ＣＤＲ－３ノブの配列を決定することを含むアルゴリズムによって抗体配列から同定される、請求項６４～６９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項71】

前記抗体配列が、ウシ抗体である、請求項７０に記載の方法。

【請求項72】

前記少なくとも１つのＣＤＲ３－ノブ抗体が、同定された配列と比較して、Ｎ及び／又はＣ末端で１、２、３、４、又は５個のアミノ酸だけ伸長されている配列を有する、請求項７０又は７１に記載の方法。

【請求項73】

前記ペプチド配列が、上昇ストークドメイン及び下降ストークドメインを含み、前記システインモチーフが、前記上昇ストークドメインと前記下降ストークドメインとの間にある、請求項２７～３７及び５２～７２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項74】

前記ペプチド配列が、標的抗原で免疫化されたウシからのＤＮＡから増幅される、請求項６４～７３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項75】

前記ペプチド配列が、ウシの超長ＣＤＲ３領域の前記ストークドメインのいずれかの側に特異的なプライマーを使用して、前記免疫化ウシからの可変重鎖ｃＤＮＡライブラリーから増幅される、請求項７４に記載の方法。

【請求項76】

前記ペプチド配列が、前記システインモチーフのＮ末端側に上昇ストークドメインを含まない、請求項２７～３７、５２～７２、７４、及び７５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項77】

前記ペプチド配列が、前記システインモチーフのＣ末端側に下降ストークドメインを含まない、請求項２７～３７、５２～７２、及び７４～７６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項78】

前記上昇ストークドメインが、配列ＣＸ_２ＴＶＸ_５Ｑを含み、配列中、Ｘ_２及びＸ_５は、任意のアミノ酸である、請求項７３～７５及び７７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項79】

Ｘ_２が、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、Ａｌａ、又はＰｒｏであり、Ｘ_５が、Ｈｉｓ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｍｅｔ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、又はＬｅｕである、請求項７８に記載の方法。

【請求項80】

Ｘ_２が、Ｓｅｒ、Ａｌａ、又はＴｈｒであり、Ｘ_５が、Ｈｉｓ又はＴｙｒである、請求項７８又は７９に記載の方法。

【請求項81】

前記ペプチド配列が、合成ＣＤＲ３－ノブである、請求項６４～７３及び７６～８０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項82】

前記ペプチド配列が、シクロチド又は修飾されたシクロチドである、請求項６４～７３及び７６～８１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項83】

前記ペプチド配列が、ウシＣＤＲ３－ノブに由来する半合成ＣＤＲ３－ノブである、請求項６４～７３及び７６～８１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項84】

前記ペプチド配列が、４０～６０アミノ酸長である、請求項６４～８３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項85】

前記ペプチド配列が、少なくとも４２アミノ酸長である、請求項６４～８４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項86】

前記ペプチド配列が、４２アミノ酸長、４３アミノ酸長、４４アミノ酸長、４５アミノ酸長、４６アミノ酸長、４７アミノ酸長、４８アミノ酸長、４９アミノ酸長、５０アミノ酸長、５１アミノ酸長、５２アミノ酸長、５３アミノ酸長、５４アミノ酸長、５５アミノ酸長、５６アミノ酸長、５７アミノ酸長、５８アミノ酸長、５９アミノ酸長、又は６０アミノ酸長である、請求項６４～８５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項87】

前記ペプチド配列が、少なくとも４つのシステイン残基を含む、請求項６４～８６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項88】

前記ペプチド配列が、４つのシステイン残基を含む、請求項６４～８７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項89】

前記ペプチド配列が、６、８、１０、又は１２のシステイン残基を含む、請求項６４～８７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項90】

前記ペプチド配列が、少なくとも２つのジスルフィド結合を有する、請求項６４～８９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項91】

前記ペプチド配列が、２つのジスルフィド結合を有する、請求項６４～９０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項92】

前記ペプチド配列が、３、４、又は５つのジスルフィド結合を有する、請求項６４～９０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項93】

前記複数のＣＤＲ３ノブが、前記ペプチド配列をコードする核酸配列内の１つ以上の選択された位置で変異され、前記複数の複製可能な発現ベクターが、変異ベクターのファミリーである、請求項６４～７３及び７６～９２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項94】

前記発現ベクターが、分泌シグナル配列を更に含む、請求項１～９３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項95】

前記分泌シグナル配列が、ｐｅｌＢシグナル配列である、請求項９４に記載の方法。

【請求項96】

前記好適な宿主細胞が、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞である、請求項１～９５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項97】

前記好適な宿主細胞が、ＴＧ１エレクトロコンピテント細胞である、請求項１～９６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項98】

前記ファージミド粒子が、Ｍ１３ファージに由来する、請求項９～３７、４４～６３、及び６７～９７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項99】

前記コートタンパク質が、Ｍ１３ファージ遺伝子ＩＩＩコートタンパク質（ｐＩＩＩ）である、請求項１０～３７、４５～６３、及び６８～９８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項100】

前記ヘルパーファージが、Ｍ１３Ｋ０７、Ｍ１３Ｒ４０８、Ｍ１３－ＶＣＳ、及びファイＸ１７４からなる群から選択される、請求項１０～３７、４５～６３、及び６８～９９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項101】

前記ヘルパーファージが、Ｍ１３Ｋ０７である、請求項１０～３７、４５～６３、及び６８～１００のいずれか一項に記載の方法。

【請求項102】

前記ディスプレイ粒子が、平均して、前記粒子の表面上に前記融合タンパク質の１つのコピーをディスプレイする、請求項１～１０１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項103】

請求項１～１０２のいずれか一項に記載の方法によって産生された、ディスプレイ粒子のライブラリー。

【請求項104】

複製可能な発現ベクターであって、ＢＬＶ１Ｈ１２、ＢＬＶ５Ｄ３、ＢＬＶ８Ｃ１１、ＢＦ１Ｈ１、ＢＬＶ５Ｂ８、及びＦ１８のＶＬ領域から選択される可変ラムダ軽（ＶＬ）領域、又はそのヒト化バリアントに連結された超長ＣＤＲ３を含むウシ可変重（ＶＨ）領域を含む単鎖可変断片をコードする核酸配列を含む融合タンパク質をコードする遺伝子融合物を含む、複製可能な発現ベクター。

【請求項105】

複製可能な発現ベクターであって、ＢＬＶ１Ｈ１２ラムダ可変軽（ＶＬ）領域、又はそのヒト化バリアントに連結された超長ＣＤＲ３を含むウシ可変重（ＶＨ）領域を含む単鎖可変断片をコードする核酸配列を含む融合タンパク質をコードする遺伝子融合物を含む、複製可能な発現ベクター。

【請求項106】

前記核酸配列が、第１の核酸配列であり、前記複製可能な発現が、ファージコートタンパク質の少なくとも一部をコードする第２の核酸配列を更に含む、請求項１０４又は１０５に記載の複製可能な発現ベクター。

【請求項107】

請求項１０４～１０６のいずれか一項に記載の複製可能な発現ベクターによってコードされる、ディスプレイ粒子。

【請求項108】

請求項１０７に記載の複数のディスプレイ粒子を含む、ディスプレイ粒子のライブラリー。

【請求項109】

前記ライブラリー中の前記ディスプレイ粒子の少なくとも又は少なくとも約２０％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、又は９５％が、超長ＣＤＲ３領域を含むＶＨ領域を含むｓｃＦｖを含む、請求項１０３又は１０８に記載のライブラリー。

【請求項110】

前記ライブラリー中の前記ディスプレイ粒子の少なくとも又は少なくとも約３０％が、超長ＣＤＲ３領域を含むＶＨ領域を含むｓｃＦｖを含む、請求項１０３、１０８、及び１０９のいずれか一項に記載のライブラリー。

【請求項111】

前記ライブラリー中の前記ディスプレイ粒子の少なくとも又は少なくとも約４０％が、超長ＣＤＲ３領域を含むＶＨ領域を含むｓｃＦｖを含む、請求項１０３及び１０８～１１０のいずれか一項に記載のライブラリー。

【請求項112】

前記ライブラリー中の前記ディスプレイ粒子の少なくとも又は少なくとも約５０％が、超長ＣＤＲ３領域を含むＶＨ領域を含むｓｃＦｖを含む、請求項１０３及び１０８～１１１のいずれか一項に記載のライブラリー。

【請求項113】

複製可能な発現ベクターであって、ジスルフィド結合を形成することができる２～１２のシステイン残基を含むシステインモチーフを有する２５～７０個のアミノ酸のペプチド配列をコードする核酸配列を含む融合タンパク質をコードする遺伝子融合物を含む、複製可能な発現ベクター。

【請求項114】

前記核酸配列が、第１の核酸配列であり、前記複製可能な発現ベクターが、ファージコートタンパク質の少なくとも一部をコードする第２の核酸配列を更に含む、請求項１１３に記載の複製可能な発現ベクター。

【請求項115】

請求項１１３又は１１４に記載の複製可能な発現ベクターによってコードされる、ディスプレイ粒子。

【請求項116】

請求項１１５に記載の複数のディスプレイ粒子を含む、ディスプレイ粒子のライブラリー。

【請求項117】

前記ディスプレイ粒子が、ファージディスプレイ粒子である、請求項１０３、１０８～１１２、及び１１６のいずれか一項に記載のライブラリー。

【請求項118】

前記ディスプレイ粒子が、ファージミド粒子である、請求項１０３、１０８～１１２、１１６、及び１１７のいずれか一項に記載のライブラリー。

【請求項119】

抗体結合タンパク質を選択するための方法であって、
（１）ディスプレイ粒子の標的分子への結合を可能にする条件下で、請求項１０３、１０８～１１２、及び１１６～１１８のいずれか一項に記載のディスプレイ粒子のライブラリーを前記標的分子と接触させることと、
（２）結合する前記ディスプレイ粒子を結合しないものから分離し、それによって、前記標的分子に結合する抗体結合タンパク質を含むディスプレイ粒子を選択することと、を含む、方法。

【請求項120】

前記ディスプレイ粒子が、ファージディスプレイ粒子である、請求項１１９に記載の方法。

【請求項121】

前記ディスプレイ粒子が、ファージミド粒子である、請求項１１９又は１２０に記載の方法。

【請求項122】

前記標的分子が、非病原性細菌、ウイルス、ウイルスタンパク質、免疫調節タンパク質、癌抗原、ヒトＩｇＧ、又はそれらの組換えタンパク質である、請求項１１９～１２１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項123】

前記標的分子が、コロナウイルス、コロナウイルス偽ウイルス、組換えコロナウイルススパイクタンパク質、又はコロナウイルススパイクタンパク質の受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）である、請求項１１９～１２２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項124】

前記コロナウイルスが、２２９Ｅ、ＮＬ６３、ＯＣ４３、ＨＫＵ１、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ２からなる群から選択される、請求項１２３に記載の方法。

【請求項125】

前記コロナウイルスが、Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ－１単離株、Ｂ．１．３５１南アフリカバリアント、又はＢ．１．１．７ ＵＫバリアントから選択されるＳＡＲＳ－ＣｏＶ２である、請求項１２３又は１２４に記載の方法。

【請求項126】

（ｉ）好適な宿主細胞に、（２）で結合する選択された前記ディスプレイ粒子をコードする複製可能な発現ベクターで感染させることと、
（ｉｉ）増幅されたディスプレイ粒子を収集することと、
（ｉｉｉ）前記増幅されたディスプレイ粒子を前記ディスプレイ粒子のライブラリーとして使用して、ステップ（１）及び（２）を繰り返すことと、を更に含む、請求項１１９～１２５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項127】

前記ディスプレイ粒子がファージミド粒子であり、前記方法が、増幅されたファージミド粒子を産生するのに十分な量の、前記ファージコートタンパク質をコードする遺伝子を有するヘルパーファージで、形質転換された宿主細胞を感染させることを更に含む、請求項１２６に記載の方法。

【請求項128】

前記ステップが、１回以上繰り返される、請求項１２６又は１２７に記載の方法。

【請求項129】

前記ステップが、同じ標的分子又は異なる標的分子を用いて繰り返される、請求項１２６～１２８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項130】

前記ステップが、異なる標的分子を用いて繰り返され、前記異なる標的分子が、前記標的分子に関連している、請求項１２９に記載の方法。

【請求項131】

前記異なる標的分子が、前記標的分子と同じタイプの病原体であるか、前記標的分子と同じ病原体群にあるか、又は前記標的分子のバリアントである、請求項１２９又は１３０に記載の方法。

【請求項132】

前記選択されたディスプレイ粒子中の融合遺伝子を配列決定して、前記抗体結合タンパク質を同定することを更に含む、請求項１１９～１３１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項133】

前記選択された抗体結合タンパク質から全長ＩｇＧ又はＦａｂを産生することを更に含む、請求項１３２に記載の方法。

【請求項134】

前記抗体結合タンパク質が、ｓｃＦｖであり、前記方法が、前記ｓｃＦｖのＶＨ領域を定常領域又はその一部と連結することを含む、重鎖又はその一部を構築することを含む、請求項１３２又は１３３に記載の方法。

【請求項135】

前記方法が、ヒト化ウシＶＨ領域の超長ＣＤＲ３領域のノブ領域を、選択された抗体結合タンパク質の超長ＣＤＲ３領域で置換することによってヒト化ＶＨ領域を構築することを含む、請求項１３２又は１３３に記載の方法。

【請求項136】

前記選択された抗体結合タンパク質の超長ＣＤＲ３領域が、ヒト化ウシＶＨ領域の上昇ストーク鎖と下降ストーク鎖との間で置換される、請求項１３５に記載の方法。

【請求項137】

前記ＶＨ領域が、式Ｖ１－Ｘ－Ｖ２を含み、前記重鎖のＶ１領域が、配列番号１１１に示される配列を含み、Ｘ領域が、選択された抗体結合タンパク質の超長ＣＤＲ３を含み、Ｖ２領域が、配列番号１１２に示される配列を含む、請求項１３６に記載の方法。

【請求項138】

前記方法が、前記ヒト化ＶＨ領域を定常領域又はその一部と連結することを含む、重鎖又はその一部を構築することを更に含む、請求項１３５～１３７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項139】

前記重鎖又は前記その一部が、ヒトＩｇＧ１重鎖又はその一部である、請求項１３４又は１３８に記載の方法。

【請求項140】

前記重鎖又はその一部を軽鎖と共発現させることを更に含む、請求項１３４、１３８、及び１３９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項141】

前記軽鎖が、ＢＬＶＨ１２、ＢＬＶ５Ｄ３、ＢＬＶ８Ｃ１１、ＢＦ１Ｈ１、ＢＬＶ５Ｂ８、若しくはＦ１８のウシ軽鎖であるか、又はそのヒト化バリアントである、請求項１４０に記載の方法。

【請求項142】

前記軽鎖が、配列番号１１３に示される配列を含むＢＬＶ１Ｈ１２軽鎖又はそのヒト化バリアントである、請求項１４０又は１４１に記載の方法。

【請求項143】

前記軽鎖が、配列番号１１４に示されるヒト化軽鎖である、請求項１４０～１４２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項144】

前記軽鎖が、配列番号１１５に示される配列を含むＢＬＶ５Ｂ８軽鎖又はそのヒト化バリアントである、請求項１４０又は１４１に記載の方法。

【請求項145】

前記軽鎖がヒト軽鎖である、請求項１４０に記載の方法。

【請求項146】

前記軽鎖が、ＶＬ１～４７、ＶＬ１～４０、ＶＬ１～５１、及びＶＬ２～１８からなる群から選択される、請求項１４０又は１４５に記載の方法。

【請求項147】

前記軽鎖が、配列番号１１６～１２０のうちのいずれか１つに示される、請求項１４０、１４５、及び１４６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項148】

可溶性超長ＣＤＲ３ノブを産生するための方法であって、
（ａ）切断可能なリンカーによって連結された超長ＣＤＲ３ノブ及び細菌シャペロンを含む融合タンパク質をコードする発現ベクターでＥ．ｃｏｌｉを形質転換することであって、前記超長ＣＤＲ３ノブが、１～６つのジスルフィド結合を形成することができる２～１２のシステイン残基を含むシステインモチーフを有する２５～７０個のアミノ酸のペプチド配列である、形質転換することと、
（ｂ）前記融合タンパク質の発現を許容する条件下で、細菌を培養することと、
（ｃ）細菌細胞溶解物の上清から前記融合タンパク質を単離することと、
（ｄ）前記融合タンパク質の前記切断可能なリンカーを切断し、それによって、前記細菌シャペロンを含まない１～６つのジスルフィド結合を含む可溶性超長ＣＤＲ３ノブを産生することと、を含む、方法。

【請求項149】

前記超長ＣＤＲ３ノブが、請求項１１９～１３２のいずれか一項に記載の方法によって選択された抗体結合タンパク質である、請求項１４８に記載の方法。

【請求項150】

前記融合タンパク質が、前記超長ＣＤＲ３ノブ単独と比較して増加した溶解度を有する、請求項１４８又は１４９に記載の方法。

【請求項151】

前記細菌シャペロンが、チオレドキシンＡ（ＴｒｘＡ）である、請求項１４８～１５０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項152】

前記切断可能なリンカーが、アミノ酸配列ＤＤＤＤＫ（配列番号１０６）を有するエンテロキナーゼ切断タグである、請求項１４８～１５１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項153】

前記切断可能なリンカーを切断することが、エンテロキナーゼを前記上清に添加することを含む、請求項１４８～１５２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項154】

前記可溶性超長ＣＤＲ３ノブが、化学的方法又は酵素的方法を介した前記可溶性超長ＣＤＲ３ノブの環化を可能にする更なるリンカーを含み、任意選択で、前記更なるリンカーが、ソルターゼ媒介環化を可能にする、請求項１４８～１５３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項155】

前記可溶性超長ＣＤＲ３ノブを環化することを更に含む、請求項１５４に記載の方法。

【請求項156】

（ｅ）前記可溶性超長ＣＤＲ３ノブを含む溶液から前記エンテロキナーゼ及び／又は前記細菌シャペロンを除去することを更に含む、請求項１４８～１５５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項157】

前記可溶性超長ＣＤＲ３ノブを含む前記溶液から前記可溶性超長ＣＤＲ３ノブを富化することを更に含み、任意選択で、前記富化することが、サイズ排除クロマトグラフィを含む、請求項１４８～１５６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項158】

前記可溶性超長ＣＤＲ３ノブを含む多重特異性結合分子を産生することを更に含む、請求項１４８～１５７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項159】

前記超長ＣＤＲ３ノブが、３～８ｋＤａ又は４～５ｋＤａのサイズである、請求項１４８～１５８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項160】

切断可能なリンカーによって連結された超長ＣＤＲ３ノブ及び細菌シャペロンを含む融合タンパク質であって、前記超長ＣＤＲ３ノブが、１～６つのジスルフィド結合を形成することができる２～１２のシステイン残基を含むシステインモチーフを有する２５～７０個のアミノ酸のペプチド配列である、融合タンパク質。

【請求項161】

前記細菌シャペロンが、チオレドキシンＡ（ＴｒｘＡ）である、請求項１６０に記載の融合タンパク質。

【請求項162】

前記切断可能なリンカーが、アミノ酸配列ＤＤＤＤＫ（配列番号１０６）を有するエンテロキナーゼ切断タグである、請求項１６０又は１６１に記載の融合タンパク質。

【請求項163】

前記超長ＣＤＲ３ノブが、１～６つのジスルフィド結合を含む、請求項１６０～１６２のいずれか一項に記載の融合タンパク質。

【請求項164】

請求項１６０～１６３のいずれか一項に記載の融合タンパク質を含む、組成物。

【請求項165】

抗体配列からＣＤＲ３ノブ配列を同定する方法であって、
フレームワーク３中の保存されたシステイン及びフレームワーク４中の保存されたトリプトファンを同定すること、並びに
前記ＣＤＲ－３ノブの配列を決定することであって、
前記ＣＤＲ－３ノブが、アミノ酸配列長Ｋを有し、
前記配列が、位置Ｘ＋１で始まり、Ｘ＋Ｋで終わり、
Ｋ＝Ｌ－２Ｘ
（式中、Ｌは、フレームワーク３中の前記保存されたシステインから始まり、フレームワーク４中の前記保存されたトリプトファンで終わるアミノ酸配列中のアミノ酸の数であり、Ｘは、フレームワーク３中の最初のシステインからＣＤＲ Ｈ３中のＤ_Ｈ領域によってコードされる最初の保存されたシステインまでのアミノ酸の数である）である、前記ＣＤＲ－３ノブの配列を決定することを含む、方法。

【請求項166】

前記抗体配列が、ウシ抗体である、請求項１６５に記載の方法。

【請求項167】

前記ＣＤＲ３－ノブ抗体が、同定された配列と比較して、Ｎ及び／又はＣ末端で１、２、３、４、又は５個のアミノ酸だけ伸長されている配列を有する、請求項１６５又は１６６に記載の方法。

【請求項168】

請求項１４８～１５９のいずれか一項に記載の方法によって産生される精製された可溶性超長ＣＤＲ３ノブであって、可溶性超長ＣＤＲ３が、２５～７５アミノ酸長であり、１～６つのジスルフィド結合を含む、精製された可溶性超長ＣＤＲ３ノブ。

【請求項169】

前記超長ＣＤＲ３ノブが、３～８ｋＤａのサイズである、請求項１６８に記載の精製された可溶性超長ＣＤＲ３ノブ。

【請求項170】

前記超長ＣＤＲ３ノブが、４～５ｋＤａのサイズである、請求項１６８又は１６９に記載の精製された可溶性超長ＣＤＲ３ノブ。

【請求項171】

前記ノブが、アミノ酸配列長Ｋを有し、
配列が、位置Ｘ＋１で始まり、Ｘ＋Ｋで終わり、
Ｋ＝Ｌ－２Ｘ
（式中、Ｌは、フレームワーク３中の保存されたシステインから始まり、フレームワーク４中の保存されたトリプトファンで終わる抗体のアミノ酸配列中のアミノ酸の数であり、Ｘは、フレームワーク３中の最初のシステインからＣＤＲ Ｈ３中のＤ_Ｈ領域によってコードされる最初の保存されたシステインまでのアミノ酸の数である）である、請求項１６８～１７０のいずれか一項に記載の精製された可溶性超長ＣＤＲ３ノブ。

【請求項172】

前記抗体配列が、ウシ抗体である、請求項１７１に記載の精製された可溶性超長ＣＤＲ３ノブ。

【請求項173】

前記ノブ配列が、Ｎ及び／又はＣ末端で１、２、３、４、又は５個のアミノ酸だけ更に伸長されている配列を有する、請求項１７１又は１７２に記載の精製された可溶性超長ＣＤＲ３ノブ。

【請求項174】

長さＫのペプチドノブ配列であって、
ノブが、アミノ酸配列長Ｋを有し、
前記配列が、位置Ｘ＋１で始まり、Ｘ＋Ｋで終わり、
Ｋ＝Ｌ－２Ｘ
（式中、Ｌは、フレームワーク３中の保存されたシステインから始まり、フレームワーク４中の保存されたトリプトファンで終わる抗体のアミノ酸配列中のアミノ酸の数であり、Ｘは、フレームワーク３中の最初のシステインからＣＤＲ Ｈ３中のＤ_Ｈ領域によってコードされる最初の保存されたシステインまでのアミノ酸の数である）である、ペプチドノブ配列。

【請求項175】

抗体配列が、ウシ抗体である、請求項１７４に記載のペプチドノブ配列。

【請求項176】

前記ノブ配列が、Ｎ及び／又はＣ末端で１、２、３、４、又は５個のアミノ酸だけ更に伸長されている配列を有する、請求項１７４又は１７５に記載のペプチドノブ配列。

【請求項177】

請求項１６８～１７３のいずれか一項に記載の精製された可溶性超長ＣＤＲ３を含む、組成物。

【請求項178】

薬学的に許容される担体を更に含む、請求項１７７に記載の組成物。

【請求項179】

非経口投与用に製剤化される、請求項１７７又は１７８に記載の組成物。

【請求項180】

静脈内、筋肉内、局所、耳、結膜、鼻、吸入、又は皮下投与用に製剤化される、請求項１７７～１７９のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項181】

吸入による投与用に製剤化される、請求項１７７～１８０のいずれか一項に記載の組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

（政府関心の声明）
本発明は、アメリカ国立衛生研究所により付与された助成金Ｒ０１ ＧＭ１０５８２６及びＲ０１ ＨＤ０８８４００の下で政府支援を受けて実施された。政府は本発明に一定の権利を有する。
（関連出願の相互参照）

【0002】

本出願は、２０２１年５月１２日に出願された米国特許仮出願第６３／１８７，９３１号、及び２０２１年１２月１３日に出願された米国特許仮出願第６３／２８８，９９２号の優先権を主張するものであり、これらのそれぞれの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0003】

（シーケンスリスト参照による援用）
本出願は、電子フォーマットの配列表と共に出願されている。配列表は、２０２２年５月１０日に作成された１２８キロバイトのサイズの１６５７７２０００４４０ＳＥＱＬＩＳＴ．ｔｘｔという名称のファイルとして提供される。配列表の電子フォーマットの情報は、その全体が参照により組み込まれる。

【0004】

（発明の分野）
本開示は、例えば、標的分子に特異的な結合ペプチドを同定するために、ジスルフィド結合した結合ポリペプチドのディスプレイライブラリーを産生及びスクリーニングする方法に関する。いくつかの実施形態において、結合ペプチドは超長ＣＤＲ３を含む。結合ペプチドは、超長ＣＤＲ３を含むウシ抗体に由来し得るか、又はそれらは合成若しくは半合成であり得る。また、本明細書では、ジスルフィド結合した結合ポリペプチドを含むディスプレイライブラリーも提供される。本開示はまた、例えば、好適な宿主細胞を使用して、可溶性のジスルフィド結合した結合ポリペプチドを産生又は発現する方法に関する。可溶性のジスルフィド結合した結合ポリペプチドを含む組成物も本明細書で提供される。

【背景技術】

【0005】

抗体は、脊椎動物の免疫系が外来物質（抗原）に応答して、主に感染に対する防御のために形成する天然タンパク質である。抗体は、標的抗原への結合を媒介する相補性決定領域（complementarity determining region、ＣＤＲ）を含む。いくつかのウシ抗体は、他の脊椎動物と比較して異常に長い可変重（variable heavy、ＶＨ）ＣＤＲ３配列を有する。最大７０アミノ酸長であり得るこれらの長いＣＤＲ３は、抗体表面から突出する固有のドメインを形成することができ、それによって固有の抗体プラットフォームを可能にする。長いＣＤＲ３を含む抗体又はその部分をスクリーニング及び産生するため、並びに他のジスルフィド結合したポリペプチドをスクリーニング及び産生するための改善された方法が必要とされている。

【発明の概要】

【0006】

本明細書では、いくつかの実施形態において、ウシ超長ＣＤＲ３抗体ディスプレイライブラリーを調製する方法であって、（ａ）ウシ抗体ＶＨ鎖相補的ＤＮＡ（complementary DNA、ｃＤＮＡ）鋳型ライブラリーからのＩｇＨＶ１－７ファミリーの複数の可変重（ＶＨ）領域をコードする配列を増幅することと、（ｂ）複数のＶＨ領域のための複数の複製可能な発現ベクターを構築することであって、各複製可能な発現ベクターが、ＢＬＶ１Ｈ１２、ＢＬＶ５Ｄ３、ＢＬＶ８Ｃ１１、ＢＦ１Ｈ１、ＢＬＶ５Ｂ８、及びＦ１８のＶＬ領域からなる群から選択される可変ラムダ軽（ＶＬ）領域、又はそのヒト化バリアントに連結された増幅されたＶＨ領域を含む単鎖可変断片（single chain variable fragment、ｓｃＦｖ）をコードする第１の核酸配列を含む、構築することと、（ｃ）増幅されたディスプレイ粒子を産生するのに好適な条件下で、複数の複製可能な発現ベクターで好適な宿主細胞を形質転換することと、（ｄ）増幅されたディスプレイ粒子を収集することであって、増幅されたディスプレイ粒子が、ｓｃＦｖを含む融合タンパク質をディスプレイするディスプレイ粒子を含む、収集することと、を含む、方法が提供される。

【0007】

任意の実施形態のいくつかにおいて、ＶＬ領域は、ＢＬＶ１Ｈ１２ ＶＬ領域である。

【0008】

本明細書では、いくつかの実施形態において、ウシ超長ＣＤＲ３抗体ディスプレイライブラリーを調製する方法であって、（ａ）ウシ抗体ＶＨ鎖相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）鋳型ライブラリーからのＩｇＨＶ１－７ファミリーの複数の可変重（ＶＨ）領域をコードする配列を増幅することと、（ｂ）複数のＶＨ領域のための複数の複製可能な発現ベクターを構築することであって、各複製可能な発現ベクターが、ＢＬＶ１Ｈ１２ラムダ可変軽（variable light、ＶＬ）領域又はそのヒト化バリアントに連結された増幅されたＶＨ領域を含む単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）をコードする第１の核酸配列を含む、構築することと、（ｃ）増幅されたディスプレイ粒子を産生するのに好適な条件下で、複数の複製可能な発現ベクターで好適な宿主細胞を形質転換することと、（ｄ）増幅されたディスプレイ粒子を収集することであって、増幅されたディスプレイ粒子が、ｓｃＦｖを含む融合タンパク質をディスプレイするディスプレイ粒子を含む、収集することと、を含む、方法が提供される。

【0009】

任意の実施形態のいくつかにおいて、ｃＤＮＡ鋳型ライブラリーは、免疫化ウシからの末梢血単核細胞（peripheral blood mononuclear cell、ＰＢＭＣ）から単離されたＲＮＡから調製される。任意の実施形態のいくつかにおいて、方法は、免疫化ウシからの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から単離されたＲＮＡからｃＤＮＡ鋳型ライブラリーを調製することを更に含む。任意の実施形態のいくつかにおいて、方法は、ウシを標的抗原で免疫化することを更に含む。

【0010】

任意の実施形態のいくつかにおいて、増幅されたディスプレイ粒子は、細菌ディスプレイ粒子、酵母ディスプレイ粒子、哺乳類ディスプレイ粒子、ファージディスプレイ粒子、ｍＲＮＡディスプレイ粒子、リボソームディスプレイ粒子、又はＤＮＡディスプレイ粒子を含む。任意の実施形態のいくつかにおいて、増幅されたディスプレイ粒子は、ファージディスプレイ粒子である。任意の実施形態のいくつかにおいて、増幅されたディスプレイ粒子は、ファージミド粒子である。任意の実施形態のいくつかにおいて、各複製可能な発現ベクターは、ファージコートタンパク質の少なくとも一部をコードする第２の核酸配列を更に含み、方法は、ファージミド粒子を産生するのに十分な量の、ファージコートタンパク質をコードする遺伝子を有するヘルパーファージで、形質転換された宿主細胞を感染させることを更に含み、それによって、融合タンパク質は、ファージコートタンパク質の少なくとも一部を含む。

【0011】

本明細書では、いくつかの実施形態において、ウシ超長ＣＤＲ３抗体ファージディスプレイライブラリーを調製する方法であって、（ａ）ウシを標的抗原で免疫化することと、（ｂ）免疫化ウシからの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から単離されたＲＮＡから抗体可変重（ＶＨ）鎖相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）鋳型ライブラリーを調製することと、（ｃ）ｃＤＮＡ鋳型ライブラリーからのＩｇＨＶ１－７ファミリーの複数のＶＨ領域をコードする配列を増幅することと、（ｄ）複数のＶＨ領域のための複数の複製可能な発現ベクターを構築することであって、各複製可能な発現ベクターが、（１）ＢＬＶ１Ｈ１２ラムダ可変軽（ＶＬ）領域又はそのヒト化バリアントに連結された増幅されたＶＨ領域を含む単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）をコードする第１の核酸配列、及び（２）ファージコートタンパク質の少なくとも一部をコードする第２の核酸配列を含む、構築することと、（ｅ）複数の複製可能な発現ベクターで好適な宿主細胞を形質転換することと、（ｆ）増幅されたファージミド粒子を産生するのに十分な量の、ファージコートタンパク質をコードする遺伝子を有するヘルパーファージで、形質転換された宿主細胞を感染させることと、（ｇ）増幅されたファージミド粒子を収集することであって、増幅されたファージミド粒子が、ファージコートタンパク質の少なくとも一部及びｓｃＦｖを含む融合タンパク質をディスプレイするファージミド粒子を含む、収集することと、を含む、方法が提供される。

【0012】

任意の実施形態のいくつかにおいて、ＢＬＶ１Ｈ１２ラムダＶＬ領域は、配列番号２に示される。任意の実施形態のいくつかにおいて、ＢＬＶ１Ｈ１２ラムダＶＬ領域は、ＢＬＶ１Ｈ１２のラムダＶＬ領域のヒト化バリアントである。任意の実施形態のいくつかにおいて、ヒト化バリアントは、Ｋａｂａｔ番号付けに基づくアミノ酸置換Ｓ２Ａ、Ｔ５Ｎ、Ｐ８Ｓ、Ａ１２Ｇ、Ａ１３Ｓ、及びＰ１４Ｌ、ＣＤＲ１領域におけるアミノ酸置換Ｉ２９Ｖ及びＮ３２Ｇ、並びに／又はＣＤＲ２領域におけるＤＮＮからＧＤＴへのアミノ酸置換のうちの１つ以上を含む。任意の実施形態のいくつかにおいて、ヒト化バリアントは、配列番号１０７に示される配列を含む。

【0013】

任意の実施形態のいくつかにおいて、増幅されたＶＨ領域は、ペプチドリンカーを介して間接的にＢＬＶ１Ｈ１２ラムダＶＬ領域に連結される。任意の実施形態のいくつかにおいて、ペプチドリンカーは、（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_３（配列番号９４）である。

【0014】

任意の実施形態のいくつかにおいて、ｃＤＮＡ鋳型ライブラリーからのＩｇＨＶ１－７ファミリーの複数のＶＨ領域は、配列番号８４に示される配列を含むフォワードプライマー及び配列番号８５に示される配列を含むリバースプライマーで増幅される。

【0015】

任意の実施形態のいくつかにおいて、構築の前に、方法は、複数の増幅されたＶＨ領域をコードする配列に対してサイズ分離を行って、超長ＣＤＲ３を有するＶＨ領域を富化することを更に含む。任意の実施形態のいくつかにおいて、サイズ分離は、ゲル電気泳動によって行われる。任意の実施形態のいくつかにおいて、ゲル電気泳動は、１．２％、１．５％、又は２％のアガロースゲルを使用して、任意選択で２％のアガロースゲルを使用して行われる。任意の実施形態のいくつかにおいて、サイズ分離は、複数の増幅されたＶＨ領域をコードする配列から５５０塩基対長、約５５０塩基対長又は５５０塩基対長を超える配列を分離することを含み、５５０塩基対長、約５５０塩基対長又は５５０塩基対長を超える配列は、超長ＣＤＲ３を有するＶＨ領域をコードする配列を含む。

【0016】

任意の実施形態のいくつかにおいて、ゲル電気泳動は、２％のアガロースゲルを使用して行われる。

【0017】

任意の実施形態のいくつかにおいて、増幅された粒子の少なくとも又は少なくとも約２０％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、又は９５％は、超長ＣＤＲ３領域を含むＶＨ領域を含むｓｃＦｖをディスプレイする。任意の実施形態のいくつかにおいて、増幅された粒子の少なくとも又は少なくとも約３０％は、超長ＣＤＲ３領域を含むＶＨ領域を含むｓｃＦｖをディスプレイする。任意の実施形態のいくつかにおいて、増幅された粒子の少なくとも又は少なくとも約４０％は、超長ＣＤＲ３領域を含むＶＨ領域を含むｓｃＦｖをディスプレイする。任意の実施形態のいくつかにおいて、増幅された粒子の少なくとも又は少なくとも約５０％は、超長ＣＤＲ３領域を含むＶＨ領域を含むｓｃＦｖをディスプレイする。

【0018】

任意の実施形態のいくつかにおいて、超長ＣＤＲ３は、１～６つのジスルフィド結合を形成することができる２～１２のシステイン残基を含むシステインモチーフを含む、２５～７０個のアミノ酸のペプチド配列である。

【0019】

任意の実施形態のいくつかにおいて、超長ＣＤＲ３は、４０～６０アミノ酸長である。任意の実施形態のいくつかにおいて、超長ＣＤＲ３は、少なくとも４２アミノ酸長である。任意の実施形態のいくつかにおいて、超長ＣＤＲ３は、４２アミノ酸長、４３アミノ酸長、４４アミノ酸長、４５アミノ酸長、４６アミノ酸長、４７アミノ酸長、４８アミノ酸長、４９アミノ酸長、５０アミノ酸長、５１アミノ酸長、５２アミノ酸長、５３アミノ酸長、５４アミノ酸長、５５アミノ酸長、５６アミノ酸長、５７アミノ酸長、５８アミノ酸長、５９アミノ酸長、又は６０アミノ酸長である。

【0020】

任意の実施形態のいくつかにおいて、超長ＣＤＲ３は、少なくとも４つのシステイン残基を含む。任意の実施形態のいくつかにおいて、超長ＣＤＲ３は、４つのシステイン残基を含む。任意の実施形態のいくつかにおいて、超長ＣＤＲ３は、６、８、１０、又は１２のシステイン残基を含む。

【0021】

任意の実施形態のいくつかにおいて、超長ＣＤＲ３は、少なくとも２つのジスルフィド結合を有する。任意の実施形態のいくつかにおいて、超長ＣＤＲ３は、２つのジスルフィド結合を有する。任意の実施形態のいくつかにおいて、超長ＣＤＲ３は、３、４、又は５つのジスルフィド結合を有する。任意の実施形態のいくつかにおいて、方法は、ｓｃＦｖ配列中のＣＤＲ３－ノブ配列を同定することを更に含む。

【0022】

本明細書では、いくつかの実施形態において、超長ＣＤＲ３－ノブディスプレイライブラリーを調製する方法であって、（ａ）ウシ超長ＣＤＲ３領域の上昇ストークドメイン及び下降ストークドメインに特異的なフォワードプライマー及びリバースプライマーを用いて、ウシ抗体可変重（ＶＨ）鎖相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）鋳型ライブラリーから複数のＣＤＲ３－ノブのみの抗体をコードする配列を増幅することと、（ｂ）複数のＣＤＲ３ノブのみの抗体のための複数の複製可能な発現ベクターを構築することであって、各複製可能な発現ベクターが、増幅されたＣＤＲ３ノブをコードする第１の核酸配列を含む、構築することと、（ｃ）増幅されたディスプレイ粒子を産生するのに好適な条件下で、複数の複製可能な発現ベクターで好適な宿主細胞を形質転換することと、（ｄ）増幅されたディスプレイ粒子を収集することであって、増幅されたディスプレイ粒子が、増幅されたＣＤＲ３ノブを含む融合タンパク質をディスプレイするディスプレイ粒子を含む、収集することと、を含む、方法が提供される。

【0023】

任意の実施形態のいくつかにおいて、ｃＤＮＡ鋳型ライブラリーは、免疫化ウシからの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から単離されたＲＮＡから調製される。任意の実施形態のいくつかにおいて、方法は、免疫化ウシからの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から単離されたＲＮＡからｃＤＮＡ鋳型ライブラリーを調製することを更に含む。任意の実施形態のいくつかにおいて、方法は、ウシを標的抗原で免疫化することを更に含む。

【0024】

任意の実施形態のいくつかにおいて、増幅されたディスプレイ粒子は、細菌ディスプレイ粒子、酵母ディスプレイ粒子、哺乳類ディスプレイ粒子、ファージディスプレイ粒子、ｍＲＮＡディスプレイ粒子、リボソームディスプレイ粒子、又はＤＮＡディスプレイ粒子を含む。任意の実施形態のいくつかにおいて、増幅されたディスプレイ粒子は、ファージディスプレイ粒子である。任意の実施形態のいくつかにおいて、増幅されたディスプレイ粒子は、ファージミド粒子である。任意の実施形態のいくつかにおいて、各複製可能な発現ベクターは、ファージコートタンパク質の少なくとも一部をコードする第２の核酸配列を更に含み、方法は、ファージミド粒子を産生するのに十分な量の、ファージコートタンパク質をコードする遺伝子を有するヘルパーファージで、形質転換された宿主細胞を感染させることを更に含み、それによって、融合タンパク質は、ファージコートタンパク質の少なくとも一部を含む。

【0025】

本明細書では、いくつかの実施形態において、超長ＣＤＲ３ノブファージディスプレイライブラリーを調製する方法であって、（ａ）ウシを標的抗原で免疫化することと、（ｂ）免疫化ウシからの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から単離されたＲＮＡから抗体可変重（ＶＨ）鎖相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）鋳型ライブラリーを調製することと、（ｃ）ウシ超長ＣＤＲ３領域の上昇ストークドメイン及び下降ストークドメインに特異的なフォワードプライマー及びリバースプライマーを用いて、ｃＤＮＡ鋳型ライブラリーから複数のＣＤＲ３－ノブのみの抗体をコードする配列を増幅することと、（ｄ）複数のＣＤＲ３－ノブのみの抗体のための複数の複製可能な発現ベクターを構築することであって、各複製可能な発現ベクターが、（１）増幅されたＣＤＲ３ノブをコードする第１の核酸配列、及び（２）ファージコートタンパク質の少なくとも一部をコードする第２の核酸配列を含む、構築することと、（ｅ）複数の複製可能な発現ベクターで好適な宿主細胞を形質転換することと、（ｆ）増幅されたファージミド粒子を産生するのに十分な量の、ファージコートタンパク質をコードする遺伝子を有するヘルパーファージで、形質転換された宿主細胞を感染させることと、（ｇ）増幅されたファージミド粒子を収集することであって、増幅されたファージミド粒子が、ファージコートタンパク質の少なくとも一部及び増幅されたＣＤＲ３ノブを含む融合タンパク質をディスプレイするファージミド粒子を含む、収集することと、を含む、方法が提供される。

【0026】

任意の実施形態のいくつかにおいて、プライマーは、配列番号７～１１及び１２１～１３０に示される配列のうちのいずれかを含むか又はそれらからなる。

【0027】

任意の実施形態のいくつかにおいて、プライマーは、配列番号７～１１に示される配列のうちのいずれかを含むか又はそれらからなる。任意の実施形態のいくつかにおいて、プライマーは、配列番号８～１１に示される配列のうちのいずれかを含むか又はそれらからなる。任意の実施形態のいくつかにおいて、プライマーは、１２１～１３０に示される配列のうちのいずれかを含むか又はそれらからなる。任意の実施形態のいくつかにおいて、プライマーは、配列番号１２３、１２７及び１２８に示される配列のうちのいずれかを含むか又はそれらからなる。

【0028】

任意の実施形態のいくつかにおいて、プライマーは、配列番号７～１１及び１２１～１３０に示されるプライマーのうちの２つ以上を含む。任意の実施形態のいくつかにおいて、プライマーは、配列番号８～１１並びに１２３、１２７、及び１２８に示されるプライマーのうちの２つ以上を含む。任意の実施形態のいくつかにおいて、プライマーは、配列番号８～１１並びに１２３、１２７、及び１２８に示されるプライマーのうちの３つ以上を含む。任意の実施形態のいくつかにおいて、プライマーは、配列番号８～１１並びに１２３、１２７、及び１２８に示されるプライマーのうちの４つ以上を含む。

【0029】

任意の実施形態のいくつかにおいて、プライマーは、配列番号８に示される配列からなるプライマー、配列番号９に示される配列からなるプライマー、配列番号１０に示される配列からなるプライマー、及び配列番号１１に示される配列からなるプライマーを含む。

【0030】

任意の実施形態のいくつかにおいて、プライマーは、配列番号１２３に示される配列からなるプライマー、配列番号１２７に示される配列からなるプライマー、及び配列番号１２８に示される配列からなるプライマーを含む。

【0031】

任意の実施形態のいくつかにおいて、プライマーは、配列番号８に示される配列からなるプライマー、配列番号９に示される配列からなるプライマー、配列番号１０に示される配列からなるプライマー、配列番号１１に示される配列からなるプライマー、配列番号１２３に示される配列からなるプライマー、配列番号１２７に示される配列からなるプライマー、及び配列番号１２８に示される配列からなるプライマーを含む。

【0032】

任意の実施形態のいくつかにおいて、方法は、ウシ抗体可変重（ＶＨ）鎖鋳型配列からＣＤＲ３－ノブを同定することを更に含む。任意の実施形態のいくつかにおいて、ＣＤＲ３－ノブは、フレームワーク３中の保存されたシステイン及びフレームワーク４中の保存されたトリプトファンを同定すること、並びにＣＤＲ－３ノブが、アミノ酸配列長Ｋを有し、配列が、位置Ｘ＋１で始まり、Ｘ＋Ｋで終わり、Ｋ＝Ｌ－２Ｘ（式中、Ｌは、フレームワーク３中の保存されたシステインから始まり、フレームワーク４中の保存されたトリプトファンで終わるアミノ酸配列中のアミノ酸の数であり、Ｘは、フレームワーク３中の最初のシステインからＣＤＲ Ｈ３中のＤＨ領域によってコードされる最初の保存されたシステインまでのアミノ酸の数である）である、ＣＤＲ－３ノブの配列を決定することを含むアルゴリズムによって抗体配列から同定される。

【0033】

任意の実施形態のいくつかにおいて、抗体配列は、ウシ抗体である。任意の実施形態のいくつかにおいて、同定されたＣＤＲ３－ノブは、同定された配列と比較して、Ｎ及び／又はＣ末端で１、２、３、４、又は５個のアミノ酸だけ伸長されている。

【0034】

任意の実施形態のいくつかにおいて、複数のＣＤＲ３－ノブのみの抗体の各々は、１～６つのジスルフィド結合を形成することができる２～１２のシステイン残基を含むシステインモチーフを有する２５～７０個のアミノ酸のペプチド配列を含む。任意の実施形態のいくつかにおいて、ペプチド配列は、４０～６０アミノ酸長である。任意の実施形態のいくつかにおいて、ペプチド配列は、少なくとも４２アミノ酸長である。任意の実施形態のいくつかにおいて、ペプチド配列は、４２アミノ酸長、４３アミノ酸長、４４アミノ酸長、４５アミノ酸長、４６アミノ酸長、４７アミノ酸長、４８アミノ酸長、４９アミノ酸長、５０アミノ酸長、５１アミノ酸長、５２アミノ酸長、５３アミノ酸長、５４アミノ酸長、５５アミノ酸長、５６アミノ酸長、５７アミノ酸長、５８アミノ酸長、５９アミノ酸長、又は６０アミノ酸長である。

【0035】

任意の実施形態のいくつかにおいて、ペプチド配列は、少なくとも４つのシステイン残基を含む。任意の実施形態のいくつかにおいて、ペプチド配列は、４つのシステイン残基を含む。任意の実施形態のいくつかにおいて、ペプチド配列は、６、８、１０、又は１２のシステイン残基を含む。

【0036】

任意の実施形態のいくつかにおいて、ペプチド配列は、少なくとも２つのジスルフィド結合を有する。任意の実施形態のいくつかにおいて、ペプチド配列は、２つのジスルフィド結合を有する。任意の実施形態のいくつかにおいて、ペプチド配列は、３、４、又は５つのジスルフィド結合を有する。

【0037】

任意の実施形態のいくつかにおいて、標的抗原は、非病原性細菌、ウイルス、ウイルスタンパク質、免疫調節タンパク質（例えば、チェックポイント分子）、癌抗原、ヒトＩｇＧ、又はそれらの組換えタンパク質である。任意の実施形態のいくつかにおいて、免疫調節タンパク質は、チェックポイント分子である。

【0038】

任意の実施形態のいくつかにおいて、ｃＤＮＡ鋳型ライブラリーは、ＩｇＭ（配列番号４）、ＩｇＡ（配列番号５）、及びＩｇＧ特異的（配列番号３及び６）プライマーのプールを使用して合成された。任意の実施形態のいくつかにおいて、ｃＤＮＡ鋳型ライブラリーは、配列番号４に示される配列を含むか又はそれからなるプライマー、配列番号５に示される配列を含むか又はそれからなるプライマー、配列番号３に示される配列を含むか又はそれからなるプライマー、及び配列番号６に示される配列を含むか又はそれからなるプライマーを含む、ＩｇＭ、ＩｇＡ、及びＩｇＧ特異的プライマーのプールを使用して合成される。

【0039】

本明細書では、いくつかの実施形態において、超長ＣＤＲ３ノブファージディスプレイライブラリーを調製する方法であって、（ａ）複数のＣＤＲ３－ノブのみの抗体のための複数の複製可能な発現ベクターを構築することであって、各複製可能な発現ベクターが、１～６つのジスルフィド結合を形成することができる２～１２のシステイン残基を含むシステインモチーフを有する２５～７０個のアミノ酸のペプチド配列をコードする第１の核酸配列を含む、構築することと、（ｂ）増幅されたディスプレイ粒子を産生するのに好適な条件下で、複数の複製可能な発現ベクターで好適な宿主細胞を形質転換することと、（ｃ）増幅されたディスプレイ粒子を収集することであって、増幅されたディスプレイ粒子が、ＣＤＲ３ノブを含む融合タンパク質をディスプレイするディスプレイ粒子を含む、収集することと、を含む、方法が提供される。

【0040】

任意の実施形態のいくつかにおいて、増幅されたディスプレイ粒子は、細菌ディスプレイ粒子、酵母ディスプレイ粒子、哺乳類ディスプレイ粒子、ファージディスプレイ粒子、ｍＲＮＡディスプレイ粒子、リボソームディスプレイ粒子、又はＤＮＡディスプレイ粒子を含む。任意の実施形態のいくつかにおいて、増幅されたディスプレイ粒子は、ファージディスプレイ粒子である。任意の実施形態のいくつかにおいて、増幅されたディスプレイ粒子は、ファージミド粒子である。任意の実施形態のいくつかにおいて、各複製可能な発現ベクターは、ファージコートタンパク質の少なくとも一部をコードする第２の核酸配列を更に含み、方法は、ファージミド粒子を産生するのに十分な量の、ファージコートタンパク質をコードする遺伝子を有するヘルパーファージで、形質転換された宿主細胞を感染させることを更に含み、それによって、融合タンパク質は、ファージコートタンパク質の少なくとも一部を含む。

【0041】

本明細書では、いくつかの実施形態において、超長ＣＤＲ３ノブファージディスプレイライブラリーを調製する方法であって、（ａ）複数のＣＤＲ３－ノブのみの抗体のための複数の複製可能な発現ベクターを構築することであって、各複製可能な発現ベクターが、（１）１～６つのジスルフィド結合を形成することができる２～１２のシステイン残基を含むシステインモチーフを有する２５～７０個のアミノ酸のペプチド配列をコードする第１の核酸配列、及び（２）ファージコートタンパク質の少なくとも一部をコードする第２の核酸配列を含む、構築することと、（ｂ）複数の複製可能な発現ベクターで好適な宿主細胞を形質転換することと、（ｃ）増幅されたファージミド粒子を産生するのに十分なファージコートタンパク質をコードする遺伝子を有するヘルパーファージで、形質転換された宿主細胞を感染させることと、（ｄ）増幅されたファージミド粒子を収集することであって、増幅されたファージミド粒子が、ファージコートタンパク質の少なくとも一部及びＣＤＲ３ノブを含む融合タンパク質をディスプレイするファージミド粒子を含む、収集することと、を含む、方法が提供される。

【0042】

任意の実施形態のいくつかにおいて、複数のＣＤＲ３－ノブ抗体のうちの少なくとも１つは、フレームワーク３中の保存されたシステイン及びフレームワーク４中の保存されたトリプトファンを同定すること、並びにＣＤＲ－３ノブが、アミノ酸配列長Ｋを有し、配列が、位置Ｘ＋１で始まり、Ｘ＋Ｋで終わり、Ｋ＝Ｌ－２Ｘ（式中、Ｌは、フレームワーク３中の保存されたシステインから始まり、フレームワーク４中の保存されたトリプトファンで終わるアミノ酸配列中のアミノ酸の数であり、Ｘは、フレームワーク３中の最初のシステインからＣＤＲ Ｈ３中のＤＨ領域によってコードされる最初の保存されたシステインまでのアミノ酸の数である）であるＣＤＲ－３ノブの配列を決定することを含むアルゴリズムによって抗体配列から同定される。任意の実施形態のいくつかにおいて、抗体配列は、ウシ抗体である。任意の実施形態のいくつかにおいて、少なくとも１つのＣＤＲ３－ノブ抗体は、同定された配列と比較して、Ｎ及び／又はＣ末端で１、２、３、４、又は５個のアミノ酸だけ伸長されている配列を有する。

【0043】

任意の実施形態のいくつかにおいて、ペプチド配列は、上昇ストークドメイン及び下降ストークドメインを含み、システインモチーフは、上昇ストークドメインと下降ストークドメインとの間にある。

【0044】

任意の実施形態のいくつかにおいて、ペプチド配列は、標的抗原で免疫化されたウシからのＤＮＡから増幅される。任意の実施形態のいくつかにおいて、ペプチド配列は、ウシの超長ＣＤＲ３領域のストークドメインのいずれかの側に特異的なプライマーを使用して、免疫化ウシからの可変重鎖ｃＤＮＡライブラリーから増幅される。

【0045】

任意の実施形態のいくつかにおいて、ペプチド配列は、システインモチーフのＮ末端側に上昇ストークドメインを含まない。任意の実施形態のいくつかにおいて、ペプチド配列は、システインモチーフのＣ末端側に下降ストークドメインを含まない。

【0046】

任意の実施形態のいくつかにおいて、上昇ストークドメインは、配列ＣＸ_２ＴＶＸ_５Ｑを含み、配列中、Ｘ_２及びＸ_５は、任意のアミノ酸である。任意の実施形態のいくつかにおいて、Ｘ_２は、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、Ａｌａ、又はＰｒｏであり、Ｘ_５は、Ｈｉｓ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｍｅｔ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、又はＬｅｕである。任意の実施形態のいくつかにおいて、Ｘ_２は、Ｓｅｒ、Ａｌａ、又はＴｈｒであり、Ｘ_５は、Ｈｉｓ又はＴｙｒである。

【0047】

任意の実施形態のいくつかにおいて、ペプチド配列は、合成ＣＤＲ３－ノブである。任意の実施形態のいくつかにおいて、ペプチド配列は、シクロチド又は修飾されたシクロチドである。任意の実施形態のいくつかにおいて、ペプチド配列は、ウシＣＤＲ３－ノブに由来する半合成ＣＤＲ３－ノブである。

【0048】

任意の実施形態のいくつかにおいて、ペプチド配列は、４０～６０アミノ酸長である。任意の実施形態のいくつかにおいて、ペプチド配列は、少なくとも４２アミノ酸長である。任意の実施形態のいくつかにおいて、ペプチド配列は、４２アミノ酸長、４３アミノ酸長、４４アミノ酸長、４５アミノ酸長、４６アミノ酸長、４７アミノ酸長、４８アミノ酸長、４９アミノ酸長、５０アミノ酸長、５１アミノ酸長、５２アミノ酸長、５３アミノ酸長、５４アミノ酸長、５５アミノ酸長、５６アミノ酸長、５７アミノ酸長、５８アミノ酸長、５９アミノ酸長、又は６０アミノ酸長である。

【0049】

任意の実施形態のいくつかにおいて、ペプチド配列は、少なくとも４つのシステイン残基を含む。任意の実施形態のいくつかにおいて、ペプチド配列は、４つのシステイン残基を含む。任意の実施形態のいくつかにおいて、ペプチド配列は、６、８、１０、又は１２のシステイン残基を含む。

【0050】

任意の実施形態のいくつかにおいて、ペプチド配列は、少なくとも２つのジスルフィド結合を有する。任意の実施形態のいくつかにおいて、ペプチド配列は、２つのジスルフィド結合を有する。任意の実施形態のいくつかにおいて、ペプチド配列は、３、４、又は５つのジスルフィド結合を有する。

【0051】

任意の実施形態のいくつかにおいて、複数のＣＤＲ３ノブは、ペプチド配列をコードする核酸配列内の１つ以上の選択された位置で変異され、複数の複製可能な発現ベクターは、変異ベクターのファミリーである。

【0052】

任意の実施形態のいくつかにおいて、発現ベクターは、分泌シグナル配列を更に含む。任意の実施形態のいくつかにおいて、分泌シグナル配列は、ｐｅｌＢシグナル配列である。

【0053】

任意の実施形態のいくつかにおいて、好適な宿主細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞である。任意の実施形態のいくつかにおいて、好適な宿主細胞は、ＴＧ１エレクトロコンピテント細胞である。

【0054】

任意の実施形態のいくつかにおいて、ファージミド粒子は、Ｍ１３ファージに由来する。任意の実施形態のいくつかにおいて、コートタンパク質は、Ｍ１３ファージ遺伝子ＩＩＩコートタンパク質（ｐＩＩＩ）である。任意の実施形態のいくつかにおいて、ヘルパーファージは、Ｍ１３Ｋ０７、Ｍ１３Ｒ４０８、Ｍ１３－ＶＣＳ、及びファイＸ１７４からなる群から選択される。任意の実施形態のいくつかにおいて、ヘルパーファージは、Ｍ１３Ｋ０７である。

【0055】

任意の実施形態のいくつかにおいて、ディスプレイ粒子は、平均して、粒子の表面上に融合タンパク質の１つのコピーをディスプレイする。

【0056】

本明細書では、いくつかの実施形態において、提供される方法のうちのいずれかによって産生されるディスプレイ粒子のライブラリーが提供される。

【0057】

本明細書では、いくつかの実施形態において、複製可能な発現ベクターであって、ＢＬＶ１Ｈ１２、ＢＬＶ５Ｄ３、ＢＬＶ８Ｃ１１、ＢＦ１Ｈ１、ＢＬＶ５Ｂ８、及びＦ１８のＶＬ領域から選択される可変ラムダ軽（ＶＬ）領域、又はそのヒト化バリアントに連結された超長ＣＤＲ３を含むウシ可変重（ＶＨ）領域を含む単鎖可変断片をコードする第１の核酸配列を含む融合タンパク質をコードする遺伝子融合物を含む、複製可能な発現ベクターが提供される。

【0058】

本明細書では、いくつかの実施形態において、複製可能な発現ベクターであって、ＢＬＶ１Ｈ１２ラムダ可変軽（ＶＬ）領域、又はそのヒト化バリアントに連結された超長ＣＤＲ３を含むウシ可変重（ＶＨ）領域を含む単鎖可変断片をコードする第１の核酸配列を含む融合タンパク質をコードする遺伝子融合物を含む、複製可能な発現ベクターが提供される。

【0059】

任意の実施形態のいくつかにおいて、複製可能な発現ベクターは、ファージコートタンパク質の少なくとも一部をコードする第２の核酸配列を更に含む。

【0060】

本明細書では、いくつかの実施形態において、提供される複製可能な発現ベクターのうちのいずれかによってコードされるディスプレイ粒子が提供される。

【0061】

本明細書では、いくつかの実施形態において、複数の提供されるディスプレイ粒子のうちのいずれかを含むディスプレイ粒子のライブラリーが提供される。

【0062】

任意の実施形態のいくつかにおいて、ライブラリー中のディスプレイ粒子の少なくとも又は少なくとも約２０％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、又は９５％は、超長ＣＤＲ３領域を含むＶＨ領域を含むｓｃＦｖを含む。任意の実施形態のいくつかにおいて、ライブラリー中のディスプレイ粒子の少なくとも又は少なくとも約３０％は、超長ＣＤＲ３領域を含むＶＨ領域を含むｓｃＦｖを含む。任意の実施形態のいくつかにおいて、ライブラリー中のディスプレイ粒子の少なくとも又は少なくとも約４０％は、超長ＣＤＲ３領域を含むＶＨ領域を含むｓｃＦｖを含む。任意の実施形態のいくつかにおいて、ライブラリー中のディスプレイ粒子の少なくとも又は少なくとも約５０％は、超長ＣＤＲ３領域を含むＶＨ領域を含むｓｃＦｖを含む。

【0063】

本明細書では、いくつかの実施形態において、複製可能な発現ベクターであって、ジスルフィド結合を形成することができる２～１２のシステイン残基を含むシステインモチーフを有する２５～７０個のアミノ酸のペプチド配列をコードする第１の核酸配列を含む融合タンパク質をコードする遺伝子融合物を含む、複製可能な発現ベクターが提供される。

【0064】

任意の実施形態のいくつかにおいて、複製可能な発現ベクターは、ファージコートタンパク質の少なくとも一部をコードする第２の核酸配列を更に含む。

【0065】

本明細書では、いくつかの実施形態において、提供される複製可能な発現ベクターのうちのいずれかによってコードされるディスプレイ粒子が提供される。

【0066】

本明細書では、いくつかの実施形態において、複数の提供されるディスプレイ粒子のうちのいずれかを含むディスプレイ粒子のライブラリーが提供される。

【0067】

任意の実施形態のいくつかにおいて、ディスプレイ粒子は、ファージディスプレイ粒子である。任意の実施形態のいくつかにおいて、ディスプレイ粒子は、ファージミド粒子である。

【0068】

本明細書では、いくつかの実施形態において、抗体結合タンパク質を選択するための方法であって、（１）ディスプレイ粒子の標的分子への結合を可能にする条件下で、ディスプレイ粒子の提供されたライブラリーのうちのいずれかを標的分子と接触させることと、（２）結合するディスプレイ粒子を結合しないものから分離し、それによって、標的分子に結合する抗体結合タンパク質を含むディスプレイ粒子を選択することと、を含む、方法が提供される。

【0069】

任意の実施形態のいくつかにおいて、ディスプレイ粒子は、ファージディスプレイ粒子である。任意の実施形態のいくつかにおいて、ディスプレイ粒子は、ファージミド粒子である。

【0070】

任意の実施形態のいくつかにおいて、標的分子は、非病原性細菌、ウイルス、ウイルスタンパク質、免疫調節タンパク質（例えば、チェックポイント分子）、癌抗原、ヒトＩｇＧ、又はそれらの組換えタンパク質である。任意の実施形態のいくつかにおいて、標的分子は、コロナウイルス、コロナウイルス偽ウイルス、組換えコロナウイルススパイクタンパク質、又はコロナウイルススパイクタンパク質の受容体結合ドメイン（receptor-binding domain、ＲＢＤ）である。任意の実施形態のいくつかにおいて、コロナウイルスは、２２９Ｅ、ＮＬ６３、ＯＣ４３、ＨＫＵ１、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ２からなる群から選択される。任意の実施形態のいくつかにおいて、コロナウイルスは、Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ－１単離株、Ｂ．１．３５１南アフリカバリアント、又はＢ．１．１．７ ＵＫバリアントから選択されるＳＡＲＳ－ＣｏＶ２である。

【0071】

任意の実施形態のいくつかにおいて、方法は、（ｉ）好適な宿主細胞に、（２）で結合する選択されたディスプレイ粒子をコードする複製可能な発現ベクターで感染させることと、（ｉｉ）増幅されたディスプレイ粒子を収集することと、（ｉｉｉ）増幅されたディスプレイ粒子をディスプレイ粒子のライブラリーとして使用して、ステップ（１）及び（２）を繰り返すことと、を更に含む。任意の実施形態のいくつかにおいて、ディスプレイ粒子はファージミド粒子であり、方法は、増幅されたファージミド粒子を産生するのに十分な量の、ファージコートタンパク質をコードする遺伝子を有するヘルパーファージで、形質転換された宿主細胞を感染させることを更に含む。

【0072】

任意の実施形態のいくつかにおいて、ステップは１回以上繰り返される。任意の実施形態のいくつかにおいて、ステップは、同じ標的分子又は異なる標的分子を用いて繰り返される。任意の実施形態のいくつかにおいて、ステップは、異なる標的分子を用いて繰り返され、異なる標的分子は、標的分子に関連している。任意の実施形態のいくつかにおいて、異なる標的分子は、標的分子と同じタイプの病原体であるか、標的分子と同じ病原体群にあるか、又は標的分子のバリアントである。

【0073】

任意の実施形態のいくつかにおいて、方法は、選択されたディスプレイ粒子中の融合遺伝子を配列決定して、抗体結合タンパク質を同定することを更に含む。

【0074】

任意の実施形態のいくつかにおいて、方法は、選択された抗体結合タンパク質から全長ＩｇＧ又はＦａｂを産生することを更に含む。

【0075】

任意の実施形態のいくつかにおいて、抗体結合タンパク質は、ｓｃＦｖであり、方法は、ｓｃＦｖのＶＨ領域を定常領域又はその一部と連結することを含む、重鎖又はその一部を構築することを含む。任意の実施形態のいくつかにおいて、方法は、ヒト化ウシＶＨ領域の超長ＣＤＲ３領域のノブ領域を、選択された抗体結合タンパク質の超長ＣＤＲ３領域で置換することによってヒト化ＶＨ領域を構築することを含む。任意の実施形態のいくつかにおいて、選択された抗体結合タンパク質の超長ＣＤＲ３領域は、ヒト化ウシＶＨ領域の上昇ストーク鎖と下降ストーク鎖との間で置換される。任意の実施形態のいくつかにおいて、ＶＨ領域は、式Ｖ１－Ｘ－Ｖ２を含み、重鎖のＶ１領域は、配列番号１１１に示される配列を含み、Ｘ領域は、選択された抗体結合タンパク質の超長ＣＤＲ３を含み、Ｖ２領域は、配列番号１１２に示される配列を含む。任意の実施形態のいくつかにおいて、方法は、ヒト化ＶＨ領域を定常領域又はその一部と連結することを含む、重鎖又はその一部を構築することを更に含む。任意の実施形態のいくつかにおいて、重鎖又はその一部は、ヒトＩｇＧ１重鎖又はその一部である。

【0076】

任意の実施形態のいくつかにおいて、方法は、重鎖又はその一部を軽鎖と共発現させることを更に含む。任意の実施形態のいくつかにおいて、軽鎖は、ＢＬＶＨ１２、ＢＬＶ５Ｄ３、ＢＬＶ８Ｃ１１、ＢＦ１Ｈ１、ＢＬＶ５Ｂ８、若しくはＦ１８のウシ軽鎖であるか、又はそのヒト化バリアントである。任意の実施形態のいくつかにおいて、軽鎖は、ＢＬＶ１Ｈ１２軽鎖（配列番号１１３）又はそのヒト化バリアントである。任意の実施形態のいくつかにおいて、軽鎖は、配列番号１１４に示されるヒト化軽鎖である。任意の実施形態のいくつかにおいて、軽鎖は、ＢＬＶ５Ｂ８軽鎖（配列番号１１５）又はそのヒト化バリアントである。任意の実施形態のいくつかにおいて、軽鎖はヒト軽鎖である。任意の実施形態のいくつかにおいて、軽鎖は、ＶＬ１～４７、ＶＬ１～４０、ＶＬ１～５１、及びＶＬ２～１８からなる群から選択される。任意の実施形態のいくつかにおいて、軽鎖は、配列番号１１６～１２０のうちのいずれか１つに示される。

【0077】

任意の実施形態のいくつかにおいて、軽鎖は、配列番号１１３に示される配列を含むＢＬＶ１Ｈ１２軽鎖又はそのヒト化バリアントである。任意の実施形態のいくつかにおいて、軽鎖は、配列番号１１５に示される配列を含むＢＬＶ５Ｂ８軽鎖又はそのヒト化バリアントである。

【0078】

本明細書では、いくつかの実施形態において、可溶性超長ＣＤＲ３ノブを産生するための方法であって、（ａ）切断可能なリンカーによって連結された超長ＣＤＲ３ノブ及び細菌シャペロンを含む融合タンパク質をコードする発現ベクターでＥ．ｃｏｌｉを形質転換することであって、超長ＣＤＲ３ノブが、１～６つのジスルフィド結合を形成することができる２～１２のシステイン残基を含むシステインモチーフを有する２５～７０個のアミノ酸のペプチド配列である、形質転換することと、（ｂ）融合タンパク質の発現を許容する条件下で、細菌を培養することと、（ｃ）細菌細胞溶解物の上清から融合タンパク質を単離することと、（ｄ）融合タンパク質の切断可能なリンカーを切断し、それによって、細菌シャペロンを含まない１～６つのジスルフィド結合を含む可溶性超長ＣＤＲ３ノブを産生することと、を含む、方法が提供される。

【0079】

任意の実施形態のいくつかにおいて、超長ＣＤＲ３ノブは、提供される方法のうちのいずれかによって選択される抗体結合タンパク質である。

【0080】

任意の実施形態のいくつかにおいて、超長ＣＤＲ３ノブは、提供される方法のうちのいずれかによって同定される抗体結合タンパク質である。

【0081】

任意の実施形態のいくつかにおいて、融合タンパク質は、超長ＣＤＲ３ノブ単独と比較して増加した溶解度を有する。任意の実施形態のいくつかにおいて、細菌シャペロンは、チオレドキシンＡ（thioredoxin A、ＴｒｘＡ）である。

【0082】

任意の実施形態のいくつかにおいて、切断可能なリンカーは、アミノ酸配列ＤＤＤＤＫ（配列番号１０６）を有するエンテロキナーゼ切断タグである。任意の実施形態のいくつかにおいて、切断可能なリンカーを切断することは、エンテロキナーゼを上清に添加することを含む。

【0083】

任意の実施形態のいくつかにおいて、可溶性超長ＣＤＲ３ノブは、化学的方法又は酵素的方法を介した可溶性超長ＣＤＲ３ノブの環化を可能にする更なるリンカーを含む。任意の実施形態のいくつかにおいて、更なるリンカーは、ソルターゼ媒介環化を可能にする。任意の実施形態のいくつかにおいて、方法は、可溶性超長ＣＤＲ３ノブを環化することを更に含む。

【0084】

任意の実施形態のいくつかにおいて、方法は、（ｅ）可溶性超長ＣＤＲ３ノブを含む溶液からエンテロキナーゼ及び／又は細菌シャペロンを除去することを更に含む。

【0085】

任意の実施形態のいくつかにおいて、方法は、可溶性超長ＣＤＲ３ノブを含む溶液から可溶性超長ＣＤＲ３ノブを富化することを更に含む。任意の実施形態のいくつかにおいて、富化することは、サイズ排除クロマトグラフィを含む。

【0086】

任意の実施形態のいくつかにおいて、方法は、可溶性超長ＣＤＲ３ノブを含む多重特異性結合分子を産生することを更に含む。

【0087】

任意の実施形態のいくつかにおいて、超長ＣＤＲ３ノブは、３～８ｋＤａのサイズである。任意の実施形態のいくつかにおいて、超長ＣＤＲ３ノブは、４～５ｋＤａのサイズである。

【0088】

本明細書では、いくつかの実施形態において、切断可能なリンカーによって連結された超長ＣＤＲ３ノブ及び細菌シャペロンを含む融合タンパク質であって、超長ＣＤＲ３ノブが、１～６つのジスルフィド結合を形成することができる２～１２のシステイン残基を含むシステインモチーフを有する２５～７０個のアミノ酸のペプチド配列である、融合タンパク質が提供される。

【0089】

任意の実施形態のいくつかにおいて、細菌シャペロンは、チオレドキシンＡ（ＴｒｘＡ）である。

【0090】

任意の実施形態のいくつかにおいて、切断可能なリンカーは、アミノ酸配列ＤＤＤＤＫ（配列番号１０６）を有するエンテロキナーゼ切断タグである。

【0091】

任意の実施形態のいくつかにおいて、超長ＣＤＲ３ノブは、１～６つのジスルフィド結合を含む。

【0092】

本明細書では、いくつかの実施形態において、提供される融合タンパク質のうちのいずれかを含む組成物が提供される。

【0093】

本明細書では、ＣＤＲ３ノブ配列を抗体配列から同定する方法であって、フレームワーク３中の保存されたシステイン及びフレームワーク４中の保存されたトリプトファンを同定すること、並びにＣＤＲ－３ノブが、アミノ酸配列長Ｋを有し、配列が、位置Ｘ＋１で始まり、Ｘ＋Ｋで終わり、Ｋ＝Ｌ－２Ｘ（式中、Ｌは、フレームワーク３中の保存されたシステインから始まり、フレームワーク４中の保存されたトリプトファンで終わるアミノ酸配列中のアミノ酸の数であり、Ｘは、フレームワーク３中の最初のシステインからＣＤＲ Ｈ３中のＤＨ領域によってコードされる最初の保存されたシステインまでのアミノ酸の数である）であるＣＤＲ－３ノブの配列を決定することを含む、方法が提供される。任意の実施形態のいくつかにおいて、抗体配列は、ウシ抗体である。任意の実施形態のいくつかにおいて、ＣＤＲ３－ノブ抗体は、同定された配列と比較して、Ｎ及び／又はＣ末端で１、２、３、４、又は５個のアミノ酸だけ伸長されている配列を有する。

【0094】

本明細書では、いくつかの実施形態において、提供される方法のうちのいずれかによって産生される精製された可溶性超長ＣＤＲ３ノブであって、可溶性超長ＣＤＲ３が、２５～７５アミノ酸長であり、１～６つのジスルフィド結合を含む、精製された可溶性超長ＣＤＲ３ノブが提供される。

【0095】

任意の実施形態のいくつかにおいて、超長ＣＤＲ３ノブは、３～８ｋＤａのサイズである。任意の実施形態のいくつかにおいて、超長ＣＤＲ３ノブは、４～５ｋＤａのサイズである。

【0096】

いくつかの実施形態において、超長ＣＤＲ３ノブは、アミノ酸配列長Ｋを有し、配列は、位置Ｘ＋１で始まり、Ｘ＋Ｋで終わり、Ｋ＝Ｌ－２Ｘ（式中、Ｌは、フレームワーク３中の保存されたシステインから始まり、フレームワーク４中の保存されたトリプトファンで終わる抗体のアミノ酸配列中のアミノ酸の数であり、Ｘは、フレームワーク３中の最初のシステインから、ＣＤＲ Ｈ３中のＤＨ領域によってコードされる最初の保存されたシステインまでのアミノ酸の数である）である。いくつかの実施形態において、抗体配列は、ウシ抗体である。いくつかの態様において、ノブ配列は、Ｎ及び／又はＣ末端で１、２、３、４、又は５個のアミノ酸だけ更に伸長されている配列を有する。

【0097】

本明細書では、長さＫの配列を有するペプチドノブであって、ノブが、アミノ酸配列長Ｋを有し、配列は、位置Ｘ＋１で始まり、Ｘ＋Ｋで終わり、Ｋ＝Ｌ－２Ｘ（式中、Ｌは、フレームワーク３中の保存されたシステインから始まり、フレームワーク４中の保存されたトリプトファンで終わる抗体のアミノ酸配列中のアミノ酸の数であり、Ｘは、フレームワーク３中の最初のシステインから、ＣＤＲ Ｈ３中のＤＨ領域によってコードされる最初の保存されたシステインまでのアミノ酸の数である）である、ペプチドノブが提供される。いくつかの実施形態において、抗体配列は、ウシ抗体である。いくつかの態様において、ノブ配列は、Ｎ及び／又はＣ末端で１、２、３、４、又は５個のアミノ酸だけ更に伸長されている配列を有する。

【0098】

本明細書では、いくつかの実施形態において、提供される精製された可溶性超長ＣＤＲ３のうちのいずれかを含む組成物が提供される。

【0099】

任意の実施形態のいくつかにおいて、組成物は、薬学的に許容される担体を更に含む。

【0100】

任意の実施形態のいくつかにおいて、組成物は、非経口投与用に製剤化される。任意の実施形態のいくつかにおいて、組成物は、静脈内、筋肉内、局所、耳、結膜、鼻、吸入、又は皮下投与用に製剤化される。任意の実施形態のいくつかにおいて、組成物は、吸入による投与用に製剤化される。

【図面の簡単な説明】

【0101】

【図1】４～６ｋＤａのサイズを有する「ノブ」ペプチドを含む、例示的な超長ＣＤＲ３ウシ抗体の概略図を示す。

【図2A】ＥＬＩＳＡによるＳＡＲＳ ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質のＲＢＤドメインに対する免疫化ウシ血清の結合を示す。

【図2B】ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２偽ウイルスに対する血清ＩｇＧの中和活性を示す。

【図3A】各ディスプレイライブラリー（すなわち、ｓｃＦｖ及び「ノブ」ディスプレイ）におけるｐＩＩＩファージ融合構築物を示す。

【図3B】ＮｃｏＩ－ＮｏｔＩ断片としてのウシＣＤＲ３ノブＤＮＡ断片の直接クローニングに使用されるｐＴＡＵ１ファージベクター多重クローニング部位の概略図を示す。

【図3C】ＢＬＶ１Ｈ１２ Ｖ－ラムダＤＮＡとインフレームでＮｃｏＩ－ＸｈｏＩ断片としてウシＶＨ ＤＮＡ断片をクローニングするために使用されるｐＴＡＵ１－ＢＬＶ１Ｈ１２（－ＶＨ）ファージｓｃＦｖベクター多重クローニング部位の概略図を示す。

【図3D】アガロースゲル上の超長ＶＨ断片と超長ＣＤＲ３領域を含まないより短いＶＨ断片との間の分離を示す。

【図4】例示的な超長抗体Ｒ２Ｃ１（ＳＫＤ、配列番号６８）、Ｒ２Ｃ３（ＳＫＭ、配列番号６９）、Ｒ４Ｃ１（配列番号７０）、Ｒ５Ｃ１（配列番号７１）、ＳＲ３Ａ３（配列番号７２）、ＲＲ２Ｆ１２（配列番号７３）、及びＲＲ２Ｇ３（配列番号７４）の配列アラインメントを示す。生殖系列配列も示されている（配列番号７５）。

【図5A】例示的なキメラウシ－ヒトＩｇＧ１抗体のスパイクタンパク質への結合を示す。

【図5B】ＲＢＤへの結合も示す。

【図5C】いくつかのＳＡＲＳ ＣｏＶ株に由来する組換え安定化スパイクタンパク質へのＩｇＧ抗体のＥＬＩＳＡ結合を示す。

【図5D】オミクロンバリアントＲＢＤ（左）又は組換え安定化スパイク三量体（右）に対する選択ＩｇＧ抗体のＥＬＩＳＡ結合曲線を示す。

【図5E】ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１と比較したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対するＲ４Ｃ１及びＲ２Ｄ９の例示的なＥＬＩＳＡデータを反映する。

【図5F】ＷＴ（Ｗｕｈａｎ）ＳＡＲＳ ＣｏＶ－２スパイクタンパク質に対する３つの異なる例示的な抗体ノブ候補についてのＥＬＩＳＡ結合活性を示す。

【図5G】ＳＤＳを使用し、ビオチン化ＲＢＤで検出した改変ウエスタンブロットを示す。

【図6A】ｔｒｘＡ－ＣＤＲ３－ノブ融合及びＣＤＲ３－ノブ発現に使用されるｐＥＴ３２ｂベクタークローニング部位の概略図を示す。

【図6B】細菌溶解物からの精製プロセスの概略図を示す。

【図6C】Ｅ．ｃｏｌｉ溶解物からの可溶性ＣＤＲ３－ノブの効率的な精製を示すＣＤＲ３－ノブＳＤＳ－ＰＡＧＥを示す。

【図6D】いくつかの精製された超長ＣＤＲ Ｈ３ノブペプチドの例示的なＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルを示す。

【図7A】ＩＭＡＣ精製されたｔｒｘＡ融合物の連続希釈を使用した、Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ－１スパイクタンパク質捕捉ＥＬＩＳＡの結果を示す。

【図7B】ＴｒｘＡ－Ｒ２Ｇ３融合タンパク質の結合も示す。

【図8A】例示的な精製されたＲ２－Ｇ３ ＣＤＲ３－ノブへの可溶性ビオチン化ＲＢＤ結合のバックグラウンド除去ＥＬＩＳＡを示す。

【図8B】参照抗スパイク抗体（ＣＲ３０２２）と比較した可溶性Ｒ２Ｇ３ノブ結合を示す。

【図8C】例示的な切断されたＲ２Ｇ３変異体のアミノ酸配列を示す。例示的な切断されたＲ２Ｇ３変異体としては、Ｒ２Ｇ３ ＴＲＵＮＣ１（配列番号８７）、Ｒ２Ｇ３ ＴＲＵＮＣ２（配列番号８８）、Ｒ２Ｇ３ ＴＲＵＮＣ３（配列番号８９）、Ｒ２Ｇ３ ＴＲＵＮＣ３Ａ（配列番号９０）、Ｒ２Ｇ３ ＴＲＵＮＣ３Ｂ（配列番号９１）、Ｒ２Ｇ３ ＴＲＵＮＣ４（配列番号９２）、及びＲ２Ｇ３ ＴＲＵＮＣ５（配列番号９３）が挙げられる。例示的な切断された変異体が由来する親Ｒ２Ｇ３バリアントもまた示される（配列番号８６）。

【図8D】細菌発現及び精製後のＲ２Ｇ３切断物のＳＤＳ－ＰＡＧＥを示す。

【図8E】コーティングされたＣＤＲ３－ノブ切断によるビオチン化ＲＢＤのＥＬＩＳＡ結合の結果を示す。

【図9A】精製されたＲ４Ｃ１ノブについてのサイズ排除クロマトグラフを示す。

【図9B】２つの画分（Ａ４及びＡ７）のゲル電気泳動ゲルを示す。

【図9C】精製されたＲ２Ｇ３ノブについてのサイズ排除クロマトグラフを示す。

【図9D】画分（Ａ６）のゲル電気泳動ゲルを示す。

【図10A】野生型（図１０Ａ）、「ＵＫ」バリアント（図１０Ｂ）、「４８４Ｋ」バリアント（図１０Ｃ）、及び「ＳＡ」バリアント（図１０Ｄ）ＳＡＲＳ ＣｏＶ－２スパイクタンパク質発現ウイルスに対する４つの例示的な超長ＣＤＲ３抗体（Ｆ１２、Ｇ３、ＳＫＤ、及びＳＫＭ）についての偽ウイルスルシフェラーゼアッセイの結果を示す。

【図10B】野生型（図１０Ａ）、「ＵＫ」バリアント（図１０Ｂ）、「４８４Ｋ」バリアント（図１０Ｃ）、及び「ＳＡ」バリアント（図１０Ｄ）ＳＡＲＳ ＣｏＶ－２スパイクタンパク質発現ウイルスに対する４つの例示的な超長ＣＤＲ３抗体（Ｆ１２、Ｇ３、ＳＫＤ、及びＳＫＭ）についての偽ウイルスルシフェラーゼアッセイの結果を示す。

【図10C】野生型（図１０Ａ）、「ＵＫ」バリアント（図１０Ｂ）、「４８４Ｋ」バリアント（図１０Ｃ）、及び「ＳＡ」バリアント（図１０Ｄ）ＳＡＲＳ ＣｏＶ－２スパイクタンパク質発現ウイルスに対する４つの例示的な超長ＣＤＲ３抗体（Ｆ１２、Ｇ３、ＳＫＤ、及びＳＫＭ）についての偽ウイルスルシフェラーゼアッセイの結果を示す。

【図10D】野生型（図１０Ａ）、「ＵＫ」バリアント（図１０Ｂ）、「４８４Ｋ」バリアント（図１０Ｃ）、及び「ＳＡ」バリアント（図１０Ｄ）ＳＡＲＳ ＣｏＶ－２スパイクタンパク質発現ウイルスに対する４つの例示的な超長ＣＤＲ３抗体（Ｆ１２、Ｇ３、ＳＫＤ、及びＳＫＭ）についての偽ウイルスルシフェラーゼアッセイの結果を示す。

【図11A】様々なコロナウイルス株からの偽ウイルスに対する異なるＩｇＧ抗体のＩＣ５０値を示す。

【図11B】野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２偽ウイルスの中和におけるＲ２Ｇ３ ＩｇＧ、Ｆａｂ、及びノブの比較を示す。

【図12】多重特異性ノブペプチド組成物及びフォーマットの図である。複数のパラトープノブペプチドを、ホモ二量体又はヘテロ二量体として含む免疫グロブリンに結合させて、多重特異性結合ポリペプチドを提供することができる。複数のパラトープノブペプチドはまた、例えばリンカーを介して直列に直接連結されてもよい。複数のノブペプチドを混合物又はカクテルとして組み合わせて、組み合わせたポリクローナル組成物を提供することもできる。

【図13A】ＢＬＶ１Ｈ１２ Ｆａｂ（ＰＤＢ ４ｋ３ｄ）の結晶構造を示す。

【図13B】フレームワーク３システイン、ノブ位置１システイン、及びフレームワーク４トリプトファン側鎖を有するストーク及びノブ領域の拡大図が示される。

【図14】１２の例示的な抗体についてのストーク及びノブ領域の配列アラインメントを示す。ノブ領域は、黒色で強調された白色文字で示される上昇ストーク領域及び下降ストーク領域に隣接する。

【図15】ＣＤＲ Ｈ３に加えてＮ末端に３つの残基を含むストーク及びノブドメイン（Ｌ）の概略図である。

【図16A】ＥＬＩＳＡを介して評価した、コーティングされたＣＤＲ３－ノブ切断によるビオチン化ＲＢＤの結合を示す。

【図16B】細菌発現及び精製後のＲ２Ｇ３切断物の例示的なＳＤＳ－ＰＡＧＥを示す。

【図17A】コーティングされたＣＤＲ３－ノブＮ末端切断によるビオチン化ＲＢＤのＥＬＩＳＡ結合を示す。

【図17B】細菌発現及び精製後のＲ２Ｇ３ Ｎ末端切断の例示的なＳＤＳ－ＰＡＧＥを示す。

【図18A】ウシ超長ＣＤＲ３領域の上昇ストークドメイン及び下降ストークドメインに特異的なプライマーの配列アラインメントを示す。

【図18B】プライマーを使用した増幅によって得られたＰＣＲ産物を示す。

【発明を実施するための形態】

【0102】

本明細書では、いくつかの実施形態において、ウシ又は合成超長ＣＤＲ３ディスプレイライブラリー又はシクロチドディスプレイライブラリーを含むディスプレイライブラリーを調製する方法、並びに標的分子に特異的な結合分子について当該ライブラリーをスクリーニングする方法が提供される。いくつかの実施形態において、ディスプレイライブラリーは、例えば、超長ＣＤＲ３をコードする配列を富化又は選択するために、免疫化ウシのｃＤＮＡから選択的に増幅された配列に由来する。本明細書ではまた、いくつかの実施形態において、可溶性ペプチドを産生する方法、場合によっては可溶性超長ＣＤＲ３ノブを産生する方法も提供される。産生される可溶性超長ＣＤＲ３ノブは、ウシ又は合成であり得る。提供される方法により産生される可溶性ペプチドはまた、シクロチドを含む。

【0103】

いくつかの態様において、提供される方法は、独立した結合単位として提供される方法により独立して発現及び産生され得る、超長ＣＤＲ３を含むウシ抗体に由来するものを含む、ジスルフィド結合したノブペプチドのスクリーニング及び産生を可能にする。いくつかの態様において、提供される方法は、単純な免疫化に基づくディスカバリープラットフォームを提供する。このプラットフォームは、インビトロディスプレイベースのプラットフォームのペプチド構造多様性よりも大きいペプチド構造多様性を提供し、スクリーニング及び産生された各ノブペプチドは、潜在的にそれ自体の新規ジスルフィド結合構造を有する。このプラットフォームはまた、標的分子に対する迅速なヒットディスカバリーを可能にする。

【0104】

本明細書に記載されるように、ウシ抗体は、異常な構造を有するサブドメインが、２つの１２残基の逆平行β鎖（上昇鎖及び下降鎖）から構成される「ストーク」、及び標準抗体パラトープから離れてストークの上に位置するより長い、例えば３９残基のジスルフィド豊富「ノブ」から形成される構造を形成する超長ＣＤＲ３配列を含む独特な構造を有する。超長ＣＤＲ３のノブ領域は、抗原結合を付与する。ヒト及びマウスなどの他の種からの抗体とは異なり、ウシ又はウシ由来の抗体のＣＤＲ領域Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｈ１、及びＨ２は、それらの配列多様性のほとんどがＣＤＲ Ｈ３にあるため、より少ない配列多様性を示す（Ｓｔａｎｆｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ．２０１６ Ｓｃｉ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１（１）：ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｉｍｍｕｎｏｌ．ａａｆ７９６２）。したがって、ウシ又はウシ由来の抗体では、抗原結合は主にＣＤＲ Ｈ３を介して、又はそれのみを介してであり、他のＣＤＲは抗原結合に寄与しない。

【0105】

独特な超長ＣＤＲ Ｈ３構造の分析及び活用の利用可能な方法は、完全に満足できるものではない。多くの場合、方法は、単離されたノブドメインの切除及び精製を必要とする（Ｍａｃｐｈｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．２０２０ ＰＬＯＳ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１８（９）：ｅ３００００８２１）。そのような方法は、治療用分子を生成するための良好な製造実施に容易に従うことができず、また、産生され得るノブタンパク質の量に関して非効率的である。更に、ノブの切除のための酵素の使用も、単離されたタンパク質の完全性を損ない得る。

【0106】

注目すべきことに、ウシ抗体の超長ＣＤＲ－Ｈ３に由来するジスルフィド結合したノブペプチドは、独立して発現され得、独立した結合単位として提供される方法により産生され得、標的分子（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２）に対するピコモル濃度の結合親和性及び中和活性を保持することが本明細書において見出される。このノブペプチドは、およそ４～５ｋＤａ、例えば約４．４ｋＤａのサイズしかなく、最小の独立した抗原結合ドメインを表す。これは、より大きな抗体と同様に、高い親和性及びエピトープ被覆度を示す。その小さなサイズは、小分子のサイズに近づき、それによって、新しい新規の治療薬としての抗原結合ドメインの有用性を開く。例えば、その小さいサイズは、より良好な組織浸透を可能にし、肺胞送達も可能にする。更に、提供されるノブペプチドは、それらの強固なジスルフィド結合した小ドメインにより安定である。この安定な構造は、ナノボディ及び他の免疫グロブリンドメインベースの断片において見られる凝集を回避する。また、本明細書で実証されるように、知見はまた、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて提供される方法により高収率で産生され得、ノブペプチドを治療用分子として非常に開発可能なものにすることを示す。提供される方法により生成されるペプチドは、ｍＡｂ又はノブのいずれかとして、既知のウイルス又はウイルスクラスを標的とすることができる。いくつかの態様において、ｍＡｂ及びノブは、パンデミック発生の場合に迅速な発見及び産生の準備ができており、疾患の新しい株の場合に迅速に旋回させることができる。いくつかの態様において、提供される方法によるｍＡｂ及びノブ産生は、ＧＭＰ標準に迅速に移行することができる。いくつかの態様において、ノブは、治療レジメンの「カクテル」のために使用することができる。

【0107】

提供される方法によりスクリーニング及び産生されたノブペプチドのうちのいずれかを含む組成物も本明細書において提供される。いくつかの実施形態において、組成物は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２などの所望の抗原に結合するための単一パラトープを提供する単一ノブペプチドを提供するモノクローナルであり得る。他の実施形態において、提供される組成物はポリクローナルであり、抗原の異なるエピトープ又は異なる抗原に対する異なるノブペプチドの混合物又はカクテルを含む（図１２）。

【0108】

更に、小さく独特なサイズのノブペプチドを活用する多重特異性結合フォーマットも本明細書において提供される（図１２）。例えば、異なるノブパラトープを、Ｆｃの二量体化が二価又は多価フォーマットを提供するヒト又はヒト化超長ＣＤＲ－Ｈ３全長抗体の骨格に操作することができる。場合によっては、「ノブ・イントゥ・ホール（knobs into hole）」Ｆｃ操作戦略を使用して、各々がＳＡＲＳ－ＣｏＶ２のスパイクタンパク質などの所望の抗原に結合するための異なるパラトープを提供する２、３、４つ以上の異なるノブペプチドを含むヘテロ二量体二重特異性又は多重特異性フォーマットを産生することができる。

【0109】

本明細書ではまた、抗体又は抗原結合断片又はノブポリペプチドを含む提供される結合ポリペプチド、及びその組成物の治療方法及び使用も提供される。

【0110】

Ｉ．定義
別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語、表記法、並びに他の専門用語及び科学用語又は用語法は、本特許請求の主題が属する当業者に一般に理解される意味と同じ意味を有する。場合によっては、一般的に理解される意味を有する用語は、明確さのために、及び／又は容易な参照のために本明細書において定義され、本明細書におけるそのような定義の包含は、必ずしも、当該技術分野において一般的に理解されるものに対する実質的な差異を表すと解釈されるべきではない。

【0111】

本明細書で使用される場合、冠詞「ａ」及び「ａｎ」は、冠詞の文法上の目的語の１つ又は１つより多いこと（すなわち、少なくとも１つ）を指す。例として、「要素（an element）」は、１つの要素又は２つ以上の要素を意味する。

【0112】

本開示全体を通して、特許請求される主題の様々な態様が範囲フォーマットで表される。範囲フォーマットでの記載は、単に便宜上及び簡潔さのためであり、特許請求される主題の範囲に対する柔軟性のない限定として解釈されるべきではないことを理解されたい。したがって、範囲の記載は、具体的に開示された全ての可能な部分範囲並びにその範囲内の個々の数値を有すると考えられるべきである。例えば、値の範囲が提供される場合、その範囲の上限と下限との間の各介在値、及びその記載される範囲内の任意の他の記載値又は介在値が、特許請求される主題内に包含されることが理解される。これらのより小さい範囲の上限及び下限は、独立して、より小さな範囲に含めることができ、また、特許請求される主題の範囲内に包含され、記載された範囲内で特に除外された制限を受ける。記載される範囲が限度の一方又は両方を含む場合、それらの含まれる限度のいずれか又は両方を除く範囲もまた、特許請求される主題に含まれる。これは、範囲の幅に関係なく適用される。

【0113】

本明細書で使用される場合、「約」という用語は、当業者によって理解され、それが使用される文脈である程度変動する。本明細書で使用される場合、「約」は、測定可能な値、例えば、量、持続時間などに言及する場合、特定の値から±２０％又は±１０％、より好ましくは±５％、更により好ましくは±１％、なおより好ましくは±０．１％の変動を包含することを意味し、そのような変動は、開示される方法を行うのに適切である。

【0114】

本明細書において交換可能に使用される「超長ＣＤＲ３」又は「超長ＣＤＲ３配列」は、ヒト抗体配列に由来しないＣＤＲ３又はＣＤＲ３配列を含む。超長ＣＤＲ３は、３５アミノ酸長以上、例えば、４０アミノ酸長以上、４５アミノ酸長以上、５０アミノ酸長以上、５５アミノ酸長以上、又は６０アミノ酸長以上であってもよい。いくつかの実施形態において、超長ＣＤＲ３は、２５～７０アミノ酸長、例えば４０～７０アミノ酸長である。典型的には、超長ＣＤＲ３は、重鎖ＣＤＲ３（ＣＤＲ－Ｈ３又はＣＤＲＨ３）である。超長ＣＤＲ３Ｈ３は、反芻動物（例えば、ウシ）配列のＣＤＲＨ３の特徴を示す。超長ＣＤＲ３の構造は、上昇鎖及び下降鎖（例えば、各々約１２アミノ酸長）から構成される「ストーク」と、ストークの上に位置するジスルフィド豊富「ノブ」とを含む。超長ＣＤＲ３の独特な「ストーク及びノブ」構造は、ミニ抗原結合ドメインを形成するために抗体表面から突出するジスルフィド結合したノブを支持する２つの逆平行β鎖（上昇ストーク鎖及び下降ストーク鎖）をもたらす。いくつかの実施形態において、超長ＣＤＲ３抗体は、順に、上昇ストーク領域、ノブ領域、及び下降ストーク領域を含む。

【0115】

本明細書で使用される場合、交換可能に使用される「ＣＤＲ３－ノブ」又は「ノブ」は、４０～７０アミノ酸長のペプチド配列である超長ＣＤＲ３の一部を指し、当該ＣＤＲ３－ノブは、少なくとも４つの非標準Ｃｙｓ残基、例えば６、８、１０又は最大１２の非標準システイン残基を有し、２～６つのジスルフィド結合を形成する。典型的には、ノブは、アミノ酸モチーフシステイン－プロリン（cysteine-proline、ＣＰ）を有する最初のシステイン残基を含む。場合によっては、ＣＤＲ３－ノブは、超長ＣＤＲ３を含む抗体又は抗原結合断片中の上昇ストーク（ストークＡ）又は下降ストーク（ストークＢ）の間に位置してもよく、ＣＤＲ３－ノブは、抗体界面から突出して、抗原との抗原結合部位を形成する。他の場合において、ＣＤＲ３－ノブは、独立して、本明細書に記載される「ノブ」ペプチドとして産生され得る。

【0116】

本明細書で使用される場合、交換可能に使用される用語である「ノブペプチド」、「ＣＤＲ３－ノブペプチド」、又は「ノブのみのペプチド」は、４０～７０アミノ酸長であり、少なくとも４つの非標準Ｃｙｓ残基、例えば６、８、１０、又は最大１２の非標準システイン残基によって形成される２～６つのジスルフィド結合を含む、独立して産生される直鎖状ジスルフィド結合ペプチドを指す。ノブペプチドは、超長ＣＤＲ３に由来し得るか、又は合成的に産生され得る。典型的には、ペプチド配列の最初のシステインは、アミノ酸モチーフシステイン－プロリン（ＣＰ）を有する最初のシステイン残基を含む。ノブペプチドは、環状分子を形成する環化を受けることができない直鎖状分子である。

【0117】

「実質的に類似する」又は「実質的に同じ」は、当業者が、２つの値間の差異が、当該値（例えば、Ｋｄ値）によって測定される生物学的特徴の文脈内で生物学的及び／又は統計的有意性がほとんど又は全くないと考えるように、２つの数値間（一般に、一方は本明細書に開示される抗体に関連し、他方は参照／比較抗体に関連する）の十分に高い程度の類似性を指す。当該２つの値の間の差は、参照／比較抗体についての値の関数として、好ましくは約５０％未満、好ましくは約４０％未満、好ましくは約３０％未満、好ましくは約２０％未満、好ましくは約１０％未満である。

【0118】

「結合親和性」とは、一般的に、分子（例えば、抗体）の単一の結合部位とその結合パートナー（例えば、抗原）との間の非共有結合相互作用の合計の強度を指す。別段の指示がない限り、「結合親和性」は、結合対のメンバー（例えば、抗体及び抗原）間の１：１相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。分子ＸのそのパートナーＹに対する親和性は、一般的に、解離定数によって表すことができる。低親和性抗体は、一般的に、抗原にゆっくりと結合し、容易に解離する傾向があるのに対して、高親和性抗体は、一般的に、抗原により速く結合し、より長く結合したままである傾向がある。結合親和性を測定する様々な方法が当該技術分野で既知であり、そのいずれも本開示の目的のために使用することができる。

【0119】

ペプチド又はポリペプチド配列に関する「アミノ酸配列同一性パーセント（％）」は、配列を整列させ、最大配列同一性パーセントを達成するために、必要であればギャップを導入した後、配列同一性の一部としていかなる保存的置換も考慮しない、特定のペプチド又はポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージを指す。アミノ酸配列同一性パーセントを決定する目的のためのアラインメントは、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮ、又はＭｅｇＡｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの公的に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用して、当該技術分野の技術の範囲内である様々な方法で達成することができる。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大アラインメントを達成するために必要とされる任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。

【0120】

「ポリペプチド」、「ペプチド」、「タンパク質」、及び「タンパク質断片」は、アミノ酸残基のポリマーを指すために交換可能に使用され得る。これらの用語は、１つ以上のアミノ酸残基が対応する天然に存在するアミノ酸の人工化学模倣物であるアミノ酸ポリマー、並びに天然に存在するアミノ酸ポリマー及び天然に存在しないアミノ酸ポリマーに適用される。

【0121】

「アミノ酸」とは、天然に存在するアミノ酸及び合成アミノ酸、並びに天然に存在するアミノ酸と同様に機能するアミノ酸類似体及びアミノ酸模倣物を指す。天然に存在するアミノ酸は、遺伝子コードによってコードされるアミノ酸、並びに後に修飾されるアミノ酸、例えば、ヒドロキシプロリン、ガンマ－カルボキシグルタミン酸、及びＯ－ホスホセリンである。アミノ酸類似体は、水素、カルボキシル基、アミノ基、及びＲ基（例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウム）に結合する天然に存在するアミノ酸、例えばアルファ炭素と同じ基本化学構造を有する化合物を指す。そのような類似体は、修飾されたＲ基（例えば、ノルロイシン）又は修飾されたペプチド骨格を有し得るが、天然に存在するアミノ酸と同じ基本化学構造を保持する。アミノ酸模倣物は、アミノ酸の一般的な化学構造とは異なる構造を有するが、天然に存在するアミノ酸と同様に機能する化学化合物を指す。

【0122】

「保存的に修飾されたバリアント」は、アミノ酸配列及び核酸配列の両方に適用される。「アミノ酸バリアント」は、アミノ酸配列を指す。特定の核酸配列に関して、保存的に修飾されたバリアントとは、同一若しくは本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸を指すか、又は核酸がアミノ酸配列をコードしない場合、本質的に同一若しくは関連する（例えば、天然に隣接している）配列を指す。遺伝子コードの縮重により、多数の機能的に同一の核酸がほとんどのタンパク質をコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ、及びＧＣＵは全て、アミノ酸アラニンをコードする。したがって、アラニンがコドンによって特定される全ての位置において、コドンは、コードされるポリペプチドを変更することなく、記載される対応するコドンの別のものに変更され得る。このような核酸変異は、保存的に修飾された変異の１種である「サイレント変異」である。ポリペプチドをコードする本明細書の全ての核酸配列はまた、核酸のサイレント変異を記載する。当業者は、ある特定の状況において、核酸中の各コドン（通常、メチオニンに対する唯一のコドンであるＡＵＧ、及び通常、トリプトファンに対する唯一のコドンであるＴＧＧを除く）が、機能的に同一の分子を生じるように修飾され得ることを認識する。したがって、ポリペプチドをコードする核酸のサイレント変異は、発現産物に関しては記載の配列に潜在しているが、実際のプローブ配列に関しては潜在していない。アミノ酸配列に関して、当業者は、コードされた配列中の単一のアミノ酸又はわずかな割合のアミノ酸を変更、付加、又は欠失する核酸、ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質配列に対する個々の置換、欠失、又は付加が、変更が化学的に類似したアミノ酸でのアミノ酸の置換を生じる場合を含む、「保存的に修飾されたバリアント」であることを認識する。機能的に類似したアミノ酸を提供する保存的置換表は、当該技術分野で周知である。そのような保存的に修飾されたバリアントは、本明細書に開示される多型バリアント、種間ホモログ、及び対立遺伝子に追加され、これらを除外しない。典型的な保存的置換としては、以下が挙げられる：１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）、５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）、６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）、７）セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、及び８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（１９８４）を参照されたい）。

【0123】

非ヒト（例えば、ウシ）抗体の「ヒト化」又は「ヒト操作」形態は、例えば、最小配列が非ヒト免疫グロブリンに由来するものを含む、ヒト免疫グロブリン配列において表されるアミノ酸を含むキメラ抗体である。例えば、ヒト化抗体又はヒト操作抗体は、いくつかの残基がヒト抗体において類似部位からの残基によって置換されている非ヒト（例えば、ウシ）抗体であり得る（例えば、米国特許第５，７６６，８８６号を参照されたい）。ヒト化抗体はまた、任意選択で、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部、典型的にはヒト免疫グロブリンのものを含み得る。更なる詳細については、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２－５２５（１９８６）、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３－３２９（１９８８）、及びＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３－５９６（１９９２）を参照されたい。以下の総説及びそこで引用されている参考文献も参照されたい：Ｖａｓｗａｎｉ ａｎｄ Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ａｎｎ．Ａｌｌｅｒｇｙ，Ａｓｔｈｍａ ＆ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１：１０５－１１５（１９９８）、Ｈａｒｒｉｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ ２３：１０３５－１０３８（１９９５）、Ｈｕｒｌｅ ａｎｄ Ｇｒｏｓｓ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．５：４２８－４３３（１９９４）。

【0124】

抗体に関する「可変ドメイン」は、異なる抗体間で変動するアミノ酸の配列を含む抗体重鎖又は軽鎖の特異的Ｉｇドメインを指す。各軽鎖及び各重鎖は、１つの可変領域ドメイン（ＶＬ及びＶＨ）を有する。可変ドメインは抗原特異性を提供し、したがって抗原認識に関与する。各可変領域は、抗原結合部位ドメイン及びフレームワーク領域（framework region、ＦＲ）の一部であるＣＤＲを含有する。

【0125】

「定常領域ドメイン」は、可変領域ドメインよりも抗体間で比較的より保存されているアミノ酸の配列を含む抗体重鎖又は軽鎖中のドメインを指す。各軽鎖は、単一の軽鎖定常領域（ＣＬ）ドメインを有し、各重鎖は、１つ以上の重鎖定常領域（ＣＨ）ドメインを含み、これは、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、及び場合によってはＣＨ４を含む。全長ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＧアイソタイプは、ＣＨ１、ＣＨ２ ＣＨ３、及びヒンジ領域を含むが、ＩｇＥ及びＩｇＭは、ＣＨ１、ＣＨ２ ＣＨ３、及びＣＨ４を含む。ＣＨ１及びＣＬドメインは、抗体分子のＦａｂアームを伸長し、したがって、抗原との相互作用及び抗体アームの回転に寄与する。抗体定常領域は、例えば、様々な細胞、生体分子、及び組織との相互作用を介して、抗体が特異的に結合する抗原、病原体、及び毒素のクリアランスなどであるがこれらに限定されないエフェクター機能を果たすことができる。

【0126】

「超可変領域」又は「ＨＶＲ」と同義である「相補性決定領域」及び「ＣＤＲ」という用語は、抗原特異性及び／又は結合親和性を付与する抗体可変領域内のアミノ酸の非隣接配列を指すことが当該技術分野で既知である。一般に、各重鎖可変領域には３つのＣＤＲ（ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３）があり、各軽鎖可変領域には３つのＣＤＲ（ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、ＣＤＲ－Ｌ３）がある。「フレームワーク領域」及び「ＦＲ」は、重鎖及び軽鎖の可変領域の非ＣＤＲ部分を指すことが当該技術分野で既知である。一般に、各全長重鎖可変領域に４つのＦＲ（ＦＲ－Ｈ１、ＦＲ－Ｈ２、ＦＲ－Ｈ３、及びＦＲ－Ｈ４）が存在し、各全長軽鎖可変領域に４つのＦＲ（ＦＲ－Ｌ１、ＦＲ－Ｌ２、ＦＲ－Ｌ３、及びＦＲ－Ｌ４）が存在する。

【0127】

所与のＣＤＲ又はＦＲの正確なアミノ酸配列の境界は、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．（１９９１），「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，」５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（「Ｋａｂａｔ」番号付けスキーム）、Ａｌ－Ｌａｚｉｋａｎｉ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）ＪＭＢ ２７３，９２７－９４８（「Ｃｈｏｔｈｉａ」番号付けスキーム）、ＭａｃＣａｌｌｕｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６２：７３２－７４５（１９９６），「Ａｎｔｉｂｏｄｙ－ａｎｔｉｇｅｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ：Ｃｏｎｔａｃｔ ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ ｔｏｐｏｇｒａｐｈｙ，」Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６２，７３２－７４５．」（「Ｃｏｎｔａｃｔ」番号付けスキーム）、Ｌｅｆｒａｎｃ ＭＰ ｅｔ ａｌ．，「ＩＭＧＴ ｕｎｉｑｕｅ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ ｆｏｒ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ａｎｄ Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎｓ ａｎｄ Ｉｇ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ Ｖ－ｌｉｋｅ ｄｏｍａｉｎｓ，」Ｄｅｖ Ｃｏｍｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００３ Ｊａｎ；２７（１）：５５－７７（「ＩＭＧＴ」番号付けスキーム）、Ｈｏｎｅｇｇｅｒ Ａ ａｎｄ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ Ａ，「Ｙｅｔ ａｎｏｔｈｅｒ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ ｓｃｈｅｍｅ ｆｏｒ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎｓ：ａｎ ａｕｔｏｍａｔｉｃ ｍｏｄｅｌｉｎｇ ａｎｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ｔｏｏｌ，」Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ，２００１ Ｊｕｎ ８；３０９（３）：６５７－７０（「Ａｈｏ」番号付けスキーム）、及びＭａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，「Ｍｏｄｅｌｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ ｌｏｏｐｓ：ａ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ，」ＰＮＡＳ，１９８９，８６（２３）：９２６８－９２７２（「ＡｂＭ」番号付けスキーム）に記載のものを含む、いくつかの周知のスキームのうちのいずれかを使用して容易に決定することができる。

【0128】

所与のＣＤＲ又はＦＲの境界は、同定に使用されるスキームに依存して変化し得る。例えば、Ｋａｂａｔスキームは構造アラインメントに基づくが、Ｃｈｏｔｈｉａスキームは構造情報に基づく。Ｋａｂａｔ及びＣｈｏｔｈｉａスキームの両方の番号付けは、最も一般的な抗体領域配列長に基づき、挿入は、挿入文字、例えば、「３０ａ」によって対処され、欠失は、いくつかの抗体に現れる。２つのスキームは、異なる位置にある特定の挿入及び欠失（「インデル」）を配置し、異なる番号付けをもたらす。Ｃｏｎｔａｃｔスキームは、複雑な結晶構造の分析に基づき、多くの点でＣｈｏｔｈｉａ番号付けスキームに類似している。ＡｂＭスキームは、Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ’ｓ ＡｂＭ抗体モデリングソフトウェアによって使用されるものに基づくＫａｂａｔ定義とＣｈｏｔｈｉａ定義との間の折衷である。

【0129】

以下の表１は、それぞれＫａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＡｂＭ、及びＣｏｎｔａｃｔスキームによって同定されるＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、ＣＤＲ－Ｌ３、及びＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３の例示的な位置境界を列挙する。ＣＤＲ－Ｈ１について、残基番号付けは、Ｋａｂａｔ及びＣｈｏｔｈｉａ番号付けスキームの両方を使用して列挙される。ＦＲは、ＣＤＲ間に位置し、例えば、ＦＲ－Ｌ１はＣＤＲ－Ｌ１の前に位置し、ＦＲ－Ｌ２はＣＤＲ－Ｌ１とＣＤＲ－Ｌ２との間に位置し、ＦＲ－Ｌ３はＣＤＲ－Ｌ２とＣＤＲ－Ｌ３との間に位置するなどである。示されるＫａｂａｔ番号付けスキームは、Ｈ３５Ａ及びＨ３５Ｂに挿入を配置するため、示されるＫａｂａｔ番号付け規則を使用して番号付けされる場合、Ｃｈｏｔｈｉａ ＣＤＲ－Ｈ１ループの末端は、ループの長さにより、Ｈ３２とＨ３４との間で変化することに留意されたい。

【0130】

【表1】

１－Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．（１９９１），「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，」５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ
２－Ａｌ－Ｌａｚｉｋａｎｉ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）ＪＭＢ ２７３，９２７－９４８

【0131】

したがって、別段の指定がない限り、所与の抗体又はその可変領域などのその領域の「ＣＤＲ」若しくは「相補性決定領域」、又は個々の指定されたＣＤＲ（例えば、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３）は、前述のスキームのいずれかによって定義された、ある（又は特定の）相補性決定領域を包含すると理解されるべきである。例えば、特定のＣＤＲ（例えば、ＣＤＲ－Ｈ３）が、所与のＶ_Ｈ又はＶ_Ｌ領域アミノ酸配列中に対応するＣＤＲのアミノ酸配列を含むと述べられる場合、そのようなＣＤＲは、前述のスキームのうちのいずれかによって定義されるように、可変領域内に対応するＣＤＲ（例えば、ＣＤＲ－Ｈ３）の配列を有することが理解される。いくつかの実施形態において、特定のＣＤＲ配列が特定される。提供される抗体の例示的なＣＤＲ配列は、様々な番号付けスキームを使用して記載されているが、提供される抗体は、他の前述の番号付けスキーム又は当業者に既知の他の番号付けスキームのいずれかによって記載されるＣＤＲを含み得ることが理解される。

【0132】

同様に、別段の指定がない限り、所与の抗体又はその可変領域などのその領域のＦＲ又は個々の指定されたＦＲ（例えば、ＦＲ－Ｈ１、ＦＲ－Ｈ２、ＦＲ－Ｈ３、ＦＲ－Ｈ４）は、既知のスキームのいずれかによって定義された、ある（又は特定の）フレームワーク領域を包含すると理解されるべきである。場合によっては、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＡｂＭ、又はＣｏｎｔａｃｔ法によって定義されるＣＤＲなど、特定のＣＤＲ、ＦＲ、又はＦＲ若しくはＣＤＲを同定するためのスキームが指定される。他の場合には、ＣＤＲ又はＦＲの特定のアミノ酸配列が与えられる。

【0133】

超長ＣＤＲ３を含む抗体は、超長ＣＤＲ３を有する可変重（ＶＨ）鎖を含む抗体である。抗体は、ＶＨ鎖と可変軽（ＶＬ）鎖との対合を更に含み得る。いくつかの実施形態において、抗体又は抗原結合断片は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む。したがって、抗体という用語は、全長抗体及び抗体断片を含むその部分を含み、そのようなものは、重鎖若しくはその部分及び／又は軽鎖若しくはその部分を含む。抗体は、２つの重鎖（Ｈ及びＨ’と表すことができる）及び２つの軽鎖（Ｌ及びＬ’と表すことができる）を含み得、各Ｌ鎖は、共有ジスルフィド結合によってＨ鎖に連結されており、２つのＨ鎖は、ジスルフィド結合によって互いに連結されている。「全長抗体」又は「インタクトな抗体」という用語は、抗体断片とは対照的に、その実質的にインタクトな形態の抗体を指すために交換可能に使用される。全長抗体は、典型的には、２つの全長重鎖（例えば、ＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３又はＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３－ＣＨ４）及び２つの全長軽鎖（ＶＬ－ＣＬ）並びにヒンジ領域を有する抗体である。

【0134】

本明細書において「抗体」という用語は、最も広い意味で使用され、ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を含み、断片抗原結合（fragment antigen binding、Ｆａｂ）断片、Ｆ（ａｂ’）_２断片、Ｆａｂ’断片、Ｆｖ断片、組換えＩｇＧ（recombinant IgG、ｒＩｇＧ）断片、特異的に結合することができる重鎖可変（Ｖ_Ｈ）領域、及び単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む、インタクトな抗体及び機能的（抗原結合）抗体断片を含む。

【0135】

「抗体断片」は、インタクトな抗体の一部、インタクトな抗体の抗原結合及び／又は可変領域を含む。抗体断片としては、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）_２断片、Ｆｖ断片、ジスルフィド結合Ｆｖ（disulfide-linked Fv、ｄｓＦｖ）、Ｆｄ断片、Ｆｄ’断片、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）又は単鎖Ｆａｂ（single-chain Fab、ｓｃＦａｂ）を含む単鎖抗体分子、上記のうちのいずれかの抗原結合断、及び抗体断片からの多重特異性抗体が挙げられるが、これらに限定されない。

【0136】

「Ｆａｂ断片」は、パパインによる全長免疫グロブリンの消化から生じる抗体断片、又は合成的に、例えば、組換え法によって産生される同じ構造を有する断片である。Ｆａｂ断片は、軽鎖（Ｖ_Ｌ及びＣ_Ｌを含む）、並びに重鎖の可変ドメイン（Ｖ_Ｈ）及び重鎖の１つの定常領域ドメイン（Ｃ_Ｈ１）を含む別の鎖を含む。

【0137】

「ｓｃＦｖ断片」は、任意の順序でポリペプチドリンカーによって共有結合された可変軽鎖（Ｖ_Ｌ）及び可変重鎖（Ｖ_Ｈ）を含む抗体断片を指す。リンカーは、２つの可変ドメインが実質的な干渉なしに架橋されるような長さのものである。例示的なリンカーは、いくつかのＧｌｕ又はＬｙｓ残基が溶解度を増加させるために全体に分散された、（Ｇｌｙ－Ｓｅｒ）_ｎ残基である。

【0138】

ヌクレオチド又はアミノ酸位置が配列表に示されるような開示された配列中のヌクレオチド又はアミノ酸位置「に対応する」という記載のように、タンパク質の位置に関して「に対応する」という用語は、構造的配列アラインメントに基づいて、又はＧＡＰアルゴリズムなどの標準的なアラインメントアルゴリズムを使用して、開示された配列とのアラインメントの際に同定されたヌクレオチド又はアミノ酸位置を指す。例えば、類似配列（例えば、断片又は種バリアント）の対応する残基は、構造アラインメント法による参照配列に対するアラインメントによって決定することができる。配列を整列させることによって、当業者は、例えば、ガイドとして保存されたアミノ酸残基及び同一のアミノ酸残基を使用して、対応する残基を同定することができる。

【0139】

「有効量」又は「治療有効量」という用語は、本明細書で使用される場合、治療される症状及び／又は状態を顕著にかつ前向きに修正する（例えば、前向きな臨床応答を提供する）のに十分な医薬組成物の量を意味する。医薬組成物における使用のための活性成分の有効量は、治療される特定の状態、状態の重症度、治療の期間、併用療法の性質、用いられる特定の活性成分、利用される特定の薬学的に許容される賦形剤及び／又は担体、並びに主治医の知識及び専門知識を有する同様の要因によって変化する。

【0140】

本明細書において使用される場合、「薬学的に許容される」という用語は、化合物の生物学的活性又は特性を抑止せず、比較的非毒性である、担体又は希釈剤などの材料を指し、すなわち、材料は、望ましくない生物学的効果を引き起こすことなく、又は材料が含まれる組成物の構成要素のいずれかと有害な様式で相互作用することなく、個体に投与することができる。

【0141】

本明細書で使用される場合、組成物は、細胞を含む、２つ以上の産物、物質、又は化合物の任意の混合物を指す。これは、溶液、懸濁液、液体、粉末、ペースト、水性、非水性、又はそれらの任意の組み合わせであり得る。

【0142】

本明細書で使用される場合、「医薬組成物」という用語は、本発明の少なくとも１つの化合物と、担体、安定剤、希釈剤、分散剤、懸濁剤、増粘剤、及び／又は賦形剤などの他の化学構成要素との混合物を指す。医薬組成物は、生物への化合物の投与を容易にする。静脈内、経口、エアロゾル、非経口、眼、肺、及び局所投与、並びに吸入による投与を含むがこれらに限定されない、化合物を投与する複数の技法が当該技術分野に存在する。

【0143】

本明細書で使用される場合、「疾患又は障害」は、原因又は状態（感染、後天的状態、遺伝的状態が挙げられるが、これらに限定されない）から生じる生物における病的状態を指し、同定可能な症状を特徴とする。

【0144】

本明細書で使用される場合、「治療する」、「治療すること」、又は「治療」という用語は、疾患又は障害を改善すること、例えば、疾患又は障害、例えば、障害の根本原因又はその臨床症状のうちの少なくとも１つの発症を遅延又は停止又は低減することを指す。

【0145】

本明細書で使用される場合、「対象」という用語は、ヒトなどの哺乳動物を含む動物を指す。対象及び患者という用語は、交換可能に使用することができる。

【0146】

本明細書で使用される場合、「任意選択の」又は「任意選択で」は、その後に記載される事象又は状況が起こる又は起こらないこと、並びにその記載が、当該事象又は状況が起こる場合及び起こらない場合を含むことを意味する。例えば、任意選択で置換されている基は、その基が非置換であるか、又は置換されていることを意味する。

【0147】

ＩＩ．ディスプレイライブラリー及び選択方法
本明細書では、いくつかの態様において、超長ＣＤＲ３抗体ディスプレイライブラリーを調製する方法が提供される。本明細書ではまた、いくつかの態様において、超長ＣＤＲ３－ノブディスプレイライブラリーを調製する方法が提供される。いくつかの実施形態において、ディスプレイライブラリーは、ファージディスプレイライブラリーである。いくつかの実施形態において、超長ＣＤＲ３抗体又はノブは、ウシ抗体に由来し、例えば、標的抗原で免疫化されたウシによって産生される抗体に基づく。いくつかの実施形態において、超長ＣＤＲ３抗体又はノブは合成である。いくつかの実施形態において、超長ＣＤＲ３抗体又はノブは、例えば、外因性ペプチド配列を含むシクロチド又は修飾されたシクロチドを含む。

【0148】

Ａ．ライブラリー産生方法
核酸を操作するための技法、例えば、配列中に変異を生成する、サブクローニング、標識、プロービング、配列決定、ハイブリダイゼーションなどのための技法は、科学刊行物及び特許文献に詳細に記載される。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ，Ｒｕｓｓｅｌｌ ＤＷ（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ ｅｄ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｄ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９７）、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｐａｒｔ Ｉ，Ｔｈｅｏｒｙ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ，Ｔｉｊｓｓｅｎ ｅｄ．，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．（１９９３）を参照されたい。

【0149】

変異ポリヌクレオチド及び／又はポリペプチドを含むライブラリーを生成するための任意の既知の方法を、提供される方法及びベクターと共に使用して、ディスプレイライブラリー、例えば、ファージディスプレイライブラリーを生成し、ライブラリーから結合タンパク質を選択することができる。ライブラリーは、例えば、任意のウイルス、細菌、他の病原体、免疫調節タンパク質（例えば、チェックポイント分子）、又は癌抗原を含む、任意の抗原についてライブラリーから結合タンパク質を選択するためのスクリーニングアッセイにおいて使用することができる。スクリーニングを容易にするために、抗体ライブラリーは、典型的には、ライブラリーの個々の分子（表現型）とそれらをコードする遺伝情報（遺伝子型）との間に物理的リンクが存在するように、ディスプレイ技法を使用してスクリーニングされる。これらの方法としては、細菌ディスプレイ、酵母ディスプレイ、哺乳類ディスプレイ、ファージディスプレイ（Ｓｍｉｔｈ，Ｇ．Ｐ．（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２８：１３１５－１３１７）、ｍＲＮＡディスプレイ、リボソームディスプレイ、及びＤＮＡディスプレイを含む細胞ディスプレイが挙げられるが、これに限定されない。

【0150】

いくつかの実施形態において、提供されるライブラリーは、ファージディスプレイライブラリーである。いくつかの実施形態において、ディスプレイライブラリーは、ファージディスプレイライブラリーである。いくつかの実施形態において、ファージディスプレイライブラリーは、ディスプレイのためのポリペプチドをコードすることに加えて、ファージコートタンパク質の少なくとも一部をコードするファージミドの使用を介して産生される。いくつかの実施形態において、ファージミド粒子は、Ｍ１３ファージに由来する。いくつかの実施形態において、コートタンパク質は、Ｍ１３ファージ遺伝子ＩＩＩコートタンパク質（ｐＩＩＩ）である。

【0151】

いくつかの実施形態において、ファージディスプレイライブラリーは、超長ＣＤＲ３ ｓｃＦｖ抗体断片又は超長ＣＤＲ３ノブペプチドなどの本明細書に記載される候補結合ポリペプチドと、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉのＦ特異的繊維状ファージの遺伝子ＩＩＩマイナーコートタンパク質（Ｆｆ：ｆ１、Ｍ１３、又はｆｄ）との融合によって産生される。あるいは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓを含む他の細菌種を使用して、ファージディスプレイライブラリーを産生することができる。いくつかの実施形態において、遺伝子ＩＩＩは、Ｍ１３ファージのマイナーコートタンパク質（ｐＩＩＩとも呼ばれる）である。遺伝子ＩＩＩマイナーコートタンパク質（ビリオンの一端に約５コピー存在する）は、適切なファージアセンブリに関与し、Ｅ．ｃｏｌｉの線毛への付着による感染のためである。ファージディスプレイの方法は既知である。

【0152】

いくつかの実施形態において、超長ＣＤＲ３ ｓｃＦｖ抗体断片又は超長ＣＤＲ３ノブペプチドなどの本明細書に記載される候補結合ポリペプチドをコードする核酸は、複製可能な発現ベクターに挿入されるか、又はその一部として構築され、核酸は、ｐＩＩＩなどのファージコートタンパク質の少なくとも一部をコードする核酸に融合される。いくつかの実施形態において、超長ＣＤＲ３ ｓｃＦｖ抗体断片又は超長ＣＤＲ３ノブペプチドなどの本明細書に記載の候補結合ポリペプチドをコードする核酸は、ｐＩＩＩに融合される。

【0153】

いくつかの実施形態において、複製可能な発現ベクターは、プロモーター、シグナル配列、表現型選択遺伝子、複製起点部位、及び当業者に既知の他の必要な構成要素を含む様々な構成要素を一般的に含むプラスミドベクターである。原核生物ベクターにおいて最も一般的に使用されるプロモーターとしては、ｌａｃ Ｚプロモーター系、アルカリホスファターゼｐｈｏ Ａプロモーター、バクテリオファージλＰＬプロモーター（温度感受性プロモーター）、ｔａｃプロモーター（ｌａｃリプレッサーによって調節されるハイブリッドｔｒｐ－ｌａｃプロモーター）、トリプトファンプロモーター、バクテリオファージＴ７プロモーター、又は他の好適な微生物プロモーターが挙げられる。プロモーター系の例としては、Ｌａｃ Ｚ、λＰＬ、ＴＡＣ、Ｔ ７ポリメラーゼ、トリプトファン、及びアルカリホスファターゼプロモーター、並びにそれらの組み合わせが挙げられる。好適な原核生物シグナル配列は、例えば、ＬａｍＢ若しくはＯｍｐＦ（Ｗｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ，６８：１９３ １９８３）、ＭａｌＥ、ＰｈｏＡ、Ｅ．ｃｏｌｉ熱安定性エンテロトキシンＩＩ（ＳＴＩＩ）シグナル配列、又はＰｅｌ Ｂ分泌シグナル配列をコードする遺伝子から得ることができる。いくつかの実施形態において、発現ベクターは、ポリペプチドをコードする核酸に動作可能に融合された分泌シグナル配列を更に含む。いくつかの実施形態において、分泌配列は、Ｐｅｌ Ｂ分泌シグナル配列である。いくつかの実施形態において、複製可能な発現ベクターはまた、表現型選択遺伝子を含み得る。典型的な表現型選択遺伝子は、宿主細胞に抗生物質耐性を付与するタンパク質をコードするものである。例として、アンピシリン耐性遺伝子（ａｍｐ）、テトラサイクリン耐性遺伝子（ｔｅｔ）、又はカルベニシレン耐性遺伝子が使用され得る。

【0154】

所望のポリペプチドをコードする核酸を含む好適なベクターの構築は、標準的な組換えＤＮＡ手順を使用して調製される。ベクターを形成するために組み合わされる単離されたＤＮＡ断片は、切断され、調整され、所望のベクターを生成するために特定の順序及び配向で一緒にライゲートされる。いくつかの実施形態において、ＤＮＡは、好適な緩衝液中で適切な制限酵素（複数可）を使用して切断される。適切な緩衝液、ＤＮＡ濃度、並びにインキュベーション時間及び温度は、制限酵素の製造業者によって指定される。一般的に、３７℃で約１時間又は２時間のインキュベーション時間が適切であるが、いくつかの酵素はより高い温度を必要とする。インキュベーション後、酵素及び他の夾雑物を、フェノール及びクロロホルムの混合物での消化溶液の抽出によって除去し、ＤＮＡを、エタノールでの沈殿によって水性画分から回収する。

【0155】

ＤＮＡ断片を一緒にライゲートして機能的ベクターを形成するために、ＤＮＡ断片の末端は、互いに適合性がなくてはならない。場合によって、末端は、エンドヌクレアーゼ消化後に直接適合性である。しかしながら、まず、エンドヌクレアーゼ消化によって一般的に産生される粘着末端を平滑末端に変換して、それらをライゲーションに適合させることが必要であり得る。末端を平滑化するために、ＤＮＡを、４つのデオキシヌクレオチド三リン酸の存在下で、１０単位のＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片（クレノウ）を用いて、１５℃で少なくとも１５分間、好適な緩衝液中で処理する。次いで、ＤＮＡをフェノール－クロロホルム抽出及びエタノール沈殿により精製する。

【0156】

一緒にライゲートされるＤＮＡ断片（ライゲートされる各断片の末端が適合性であるように、適切な制限酵素で予め消化されている）を溶液に入れる。いくつかの実施形態において、ＤＮＡ断片は、ほぼ等モル量で提供される。いくつかの実施形態において、溶液はまた、ＡＴＰ、リガーゼ緩衝液、及びリガーゼ、例えば、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを、例えば、０．５μｇのＤＮＡ当たり１０単位又は約１０単位で含む。ＤＮＡ断片がベクターにライゲートされる場合、ベクターは、適切な制限エンドヌクレアーゼで切断することによって最初に線状化される。次に、線状化ベクターをアルカリホスファターゼ又は仔ウシ腸ホスファターゼで処理する。ホスファターゼ処理は、ライゲーションステップ中のベクターの自己ライゲーションを防止する。

【0157】

いくつかの実施形態において、複数の構築された複製可能な発現ベクターは、好適な宿主細胞に形質転換される。好適な宿主細胞には、原核生物宿主細胞が含まれる。いくつかの実施形態において、ディスプレイライブラリーを発現又は産生するために使用される宿主細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞である。好適な原核生物宿主細胞には、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＪＭ１０１、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２株２９４（ＡＴＣＣ番号３１，４４６）、Ｅ．ｃｏｌｉ株Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ番号２７，３２５）、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ番号３１，５３７）、Ｅ．ｃｏｌｉ ＸＬ－１Ｂｌｕｅ（ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、及びＥ．ｃｏｌｉ Ｂが含まれる。しかしながら、Ｅ．ｃｏｌｉの多くの他の株、例えば、ＨＢ１０１、ＮＭ５２２、ＮＭ５３８、ＮＭ５３９、並びに原核生物の多くの他の種及び属が、同様に使用され得る。上記に列挙したＥ．ｃｏｌｉ株に加えて、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓなどの桿菌、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ又はＳｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓａｎｓなどの他の腸内細菌科、及び様々なＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種が、全て宿主として使用され得る。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉのプロテアーゼ欠損株である。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、ＴＧ１エレクトロコンピテント細胞である。

【0158】

原核生物細胞の形質転換は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（上記）のセクション１．８２に記載される塩化カルシウム法を使用して容易に達成される。あるいは、エレクトロポレーション（Ｎｅｕｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．，１：８４１ １９８２）を使用して、これらの細胞を形質転換してもよい。いくつかの実施形態において、方法は、形質転換された宿主細胞を、ファージコートタンパク質をコードする遺伝子を有するヘルパーファージに感染させることを更に含む。いくつかの実施形態において、方法は、ファージミド粒子の十分な発現を促進するためにヘルパーファージの使用を更に含む。いくつかの実施形態において、ヘルパーファージは、Ｍ１３Ｋ０７、Ｍ１３Ｒ４０８、Ｍ１３－ＶＣＳ、及びファイＸ１７４からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、ヘルパーファージは、Ｍ１３Ｋ０７である。次いで、形質転換された感染宿主細胞は、プラスミドの少なくとも一部を含み、宿主を形質転換することができる組換えファージミド粒子を形成するのに好適な条件下で培養される。形質転換された細胞は、抗生物質、例えば、テトラサイクリン（tetracycline、ｔｅｔ）若しくはアンピシリン（ampicillin、ａｍｐ）、カルベニシリン、又は特定の発現ベクターに依存する他の抗生物質上で成長させることにより選択され、ベクター上の耐性遺伝子の存在により耐性にされる。

【0159】

形質転換された細胞の選択後、これらの細胞を培養物中で成長させ、次いでプラスミドＤＮＡ（又は外来遺伝子が挿入された他のベクター）を単離する。プラスミドＤＮＡは、当該技術分野で既知の方法を使用して単離され得る。単離されたＤＮＡは、当該技術分野で既知の方法により精製され得る。次いで、この精製されたプラスミドＤＮＡを、制限マッピング及び／又はＤＮＡ配列決定により分析する。

【0160】

１．ディスプレイのためのポリペプチド
いくつかの実施形態において、ディスプレイのためのポリペプチドは、超長ＣＤＲ３を含む。ウシ抗体では、超長ＣＤＲ３配列は、異常な構造を有するサブドメインが、２つの１２残基の逆平行β鎖（上昇鎖及び下降鎖）から構成される「ストーク」、及び標準抗体パラトープから離れてストークの上に位置するより長い、例えば３９残基のジスルフィド豊富「ノブ」から形成される構造を形成する。長い逆平行βリボンは、ノブドメインを主要抗体足場と連結するための架橋として機能する。超長ＣＤＲ３の独特な「ストーク及びノブ」構造は、ミニ抗原結合ドメインを形成するために抗体表面から突出するジスルフィド結合したノブを支持する２つの逆平行β鎖（上昇ストーク鎖及び下降ストーク鎖）をもたらす。いくつかの実施形態において、超長ＣＤＲ３抗体は、順に、上昇ストーク領域、ノブ領域、及び下降ストーク領域を含む。

【0161】

いくつかの実施形態において、超長ＣＤＲ－Ｈ３は、上昇ストークドメイン（ストークＡ）、ジスルフィド豊富ノブ領域、及び下降ストークドメイン（ストークＢ）を含み、ノブ領域は上昇ストークドメインと下降ストークドメインとの間に位置する。いくつかの実施形態において、超長ＣＤＲ－Ｈ３の配列は、ジスルフィド豊富ノブ領域が抗体の先端に位置する、抗体から突出する逆平行β鎖の構造を提供する（図１）。ストークＡは、主に疎水性側鎖、及び上昇鎖を開始する塩基に比較的保存されたモチーフを含む。この保存されたモチーフは、典型的には、様々なウシ（bovine）又はウシ（cow）配列の可変領域配列の最初のシステイン残基の後に見出される。いくつかの実施形態において、ストークＡの塩基は、ＣＤＲ－Ｈ１の残基と相互作用することによって塩基を安定化する残基ＣＴＴＶＨＱ（配列番号９８）、ＣＡＴＶＨＱ（配列番号９９）、ＣＡＩＶＱＱ（配列番号１００）、又はＣＡＴＶＤＱ（配列番号１０１）を含む。ストークＡは、ジスルフィド結合したノブ領域の一部を形成する最初の保存されたシステイン残基の前に、可変数の残基、例えば、２～８つのアミノ酸残基によって接続される。いくつかの実施形態において、ノブ領域は、最初のシステイン残基がノブ内の別のシステイン残基と第１のジスルフィド結合を形成する、第１の保存されたアミノ酸モチーフＣｙｓ－Ｐｒｏ（ＣＰ）を含む。ノブは、２～６つのジスルフィド結合を形成することができる２～１２のシステイン残基を含み得る。ストークは、可変長であり得、ストークＢは、スタッキング相互作用を介してラダーを形成する交互芳香族を含み得、これは、長い溶媒曝露された２本鎖βリボンの安定性に寄与し得る（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ．２０１３，１５３（６）：１３７９－１３９３）。いくつかの実施形態において、ストークＢは、ノブ構造を支持する交互チロシンの保存されたパターンを含み、モチーフＹＸ_１ＹＸ_２Ｙ（配列番号１０２）を有することもある。

【0162】

いくつかの実施形態において、超長ＣＤＲ３は、２５～７０個のアミノ酸のペプチド配列を含むか、又はそれである。いくつかの実施形態において、超長ＣＤＲ３は、３５～７０アミノ酸長、４０～７０アミノ酸長、４５～７０アミノ酸長、５０～７０アミノ酸長、５５～７０アミノ酸長、若しくは６０～７０アミノ酸長、又は約３５～７０アミノ酸長、４０～７０アミノ酸長、４５～７０アミノ酸長、５０～７０アミノ酸長、５５～７０アミノ酸長、若しくは６０～７０アミノ酸長であるペプチド配列である。

【0163】

いくつかの実施形態において、超長ＣＤＲ３はシステインモチーフを含む。いくつかの実施形態において、システインモチーフは、２～２０のシステイン残基、例えば、２～１８、２～１６、２～１４、２～１２、２～１０、２～８、２～６、２～４、４～２０、４～１８、４～１６、４～１４、４～１２、４～１０、４～８、４～６、６～２０、６～１８、６～１６、６～１４、６～１２、６～１０、６～８、８～２０、８～１８、８～１６、８～１４、８～１２、８～１０、１０～２０、１０～１８、１０～１６、１０～１４、１０～１２、１２～２０、１２～１８、１２～１６、１２～１４、１４～２０、１４～１８、１４～１６、１６～２０、１６～１８、若しくは１８～２０、又は約２～１８、２～１６、２～１４、２～１２、２～１０、２～８、２～６、２～４、４～２０、４～１８、４～１６、４～１４、４～１２、４～１０、４～８、４～６、６～２０、６～１８、６～１６、６～１４、６～１２、６～１０、６～８、８～２０、８～１８、８～１６、８～１４、８～１２、８～１０、１０～２０、１０～１８、１０～１６、１０～１４、１０～１２、１２～２０、１２～１８、１２～１６、１２～１４、１４～２０、１４～１８、１４～１６、１６～２０、１６～１８、若しくは１８～２０のシステイン残基（各々境界値を含む）を含む。いくつかの実施形態において、システインモチーフは、２～１２のシステイン残基を含む。

【0164】

いくつかの実施形態において、超長ＣＤＲ３ノブは、１～１０個のジスルフィド結合、例えば、１～９、１～８、１～７、１～６、１～５、１～４、１～３、１～２、２～１０、２～９、２～８、２～７、２～６、２～５、２～４、２～３、３～１０、３～９、３～８、３～７、３～６、３～５、３～４、４～１０、４～９、４～８、４～７、４～６、４～５、５～１０、５～９、５～８、５～７、５～６、６～１０、６～９、６～８、６～７、７～１０、７～９、７～８、８～１０、８～９、若しくは９～１０個、又は約１～９、１～８、１～７、１～６、１～５、１～４、１～３、１～２、２～１０、２～９、２～８、２～７、２～６、２～５、２～４、２～３、３～１０、３～９、３～８、３～７、３～６、３～５、３～４、４～１０、４～９、４～８、４～７、４～６、４～５、５～１０、５～９、５～８、５～７、５～６、６～１０、６～９、６～８、６～７、７～１０、７～９、７～８、８～１０、８～９、若しくは９～１０個のジスルフィド結合（各々境界値を含む）を含む。いくつかの実施形態において、超長ＣＤＲ３ノブは、１～６つのジスルフィド結合を含む。

【0165】

いくつかの実施形態において、超長ＣＤＲ３は、上昇ストークドメインを含む。いくつかの実施形態において、超長ＣＤＲ３は、下降ストークドメインを含む。いくつかの実施形態において、システインモチーフは、上昇ストークドメインと下降ストークドメインとの間にある。いくつかの実施形態において、上昇ストークドメインは、配列ＣＸ_２ＴＶＸ_５Ｑ（配列番号１０３）を含み、配列中、Ｘ_２及びＸ_５は、任意のアミノ酸である。いくつかの実施形態において、Ｘ_２は、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、Ａｌａ、又はＰｒｏであり、Ｘ_５は、Ｈｉｓ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｍｅｔ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、又はＬｅｕ（配列番号１０４）である。いくつかの実施形態において、Ｘ_２は、Ｓｅｒ、Ａｌａ、又はＴｈｒであり、Ｘ_５は、Ｈｉｓ又はＴｙｒ（配列番号１０５）である。

【0166】

他の実施形態において、超長ＣＤＲ３は、システインモチーフのＮ末端側に上昇ストークドメインを含まない。いくつかの実施形態において、超長ＣＤＲ３は、システインモチーフのＣ末端側に下降ストークドメインを含まない。

【0167】

いくつかの実施形態において、ディスプレイのためのポリペプチド、例えば、超長ＣＤＲ３を含むポリペプチドは、ウシ抗体に由来する。いくつかの実施形態において、ディスプレイのためのポリペプチドは、ウシ相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）ライブラリーからの配列を増幅することによって産生される。いくつかの実施形態において、ｃＤＮＡ鋳型ライブラリーは、ウシからの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から単離されたＲＮＡから調製される。いくつかの実施形態において、ｃＤＮＡ鋳型ライブラリーは、免疫グロブリン特異的プライマーのプールを使用して合成される。いくつかの実施形態において、ｃＤＮＡ鋳型ライブラリーは、ＩｇＭ、ＩｇＡ、及びＩｇＧ特異的プライマーのプールを使用して合成される。使用のための例示的なプライマーとしては、配列番号３（ＩｇＧ）、配列番号４（ＩｇＭ）、配列番号５（ＩｇＡ）、及び配列番号６（ＩｇＧ）に示される配列を有するものが挙げられる。

【0168】

いくつかの実施形態において、ウシは標的抗原で免疫化される。いくつかの実施形態において、標的抗原は、非病原性細菌、ウイルス、ウイルスタンパク質、免疫調節タンパク質（例えば、チェックポイント分子）、癌抗原、ヒトＩｇＧ、又はそれらの組換えタンパク質である。いくつかの実施形態において、標的抗原は、ウイルスタンパク質である。いくつかの実施形態において、ウシは、複数の標的抗原、例えば、異なるウイルス抗原で免疫化される。いくつかの実施形態において、異なるウイルス抗原は、ウイルスの異なるバリアント、クレード、又は株に関連するタンパク質である。

【0169】

いくつかの実施形態において、標的抗原は、コロナウイルス、コロナウイルス偽ウイルス、又はそのようなウイルスの抗原、例えば、組換えコロナウイルススパイクタンパク質、又はコロナウイルススパイクタンパク質の受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）である。コロナウイルスは、コロナウイルス科、ニドウイルス目、及びリボウィリア域の２つの亜科のうちの１つであるオルトコロナウイルス亜科からであり得る。４つの属：アルファコロナウイルス、ベータコロナウイルス、ガンマコロナウイルス、及びデルタコロナウイルスが存在する。ＳＡＲＳ ＣｏＶ２は、サルベコウイルス亜属に属するベータコロナウイルスである。いくつかの実施形態において、コロナウイルスは、２２９Ｅ、ＮＬ６３、ＯＣ４３、ＨＫＵ１、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ２からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、コロナウイルスは、Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ－１単離株、Ｂ．１．３５１南アフリカバリアント、又はＢ．１．１．７ ＵＫバリアントから選択されるＳＡＲＳ－ＣｏＶ２である。いくつかの実施形態において、ＳＡＲＳ ＣｏＶ－２特異的抗原は、Ｓ三量体ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態において、ＳＡＲＳ ＣｏＶ－２特異的抗原は、Ｓ単量体ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態において、ＳＡＲＳ ＣｏＶ－２特異的抗原は、Ｓ三量体又は単量体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、ウシは、コロナウイルス２２９Ｅ、ＮＬ６３、ＯＣ４３、ＨＫＵ１、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ２の任意の組み合わせに関連する複数の標的抗原で免疫化される。いくつかの実施形態において、ウシは、Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ－１単離株、Ｂ．１．３５１南アフリカバリアント、又はＢ．１．１．７ ＵＫバリアントから選択されるＳＡＲＳ－ＣｏＶ２バリアントの任意の組み合わせに関連する複数の標的抗原で免疫化される。

【0170】

いくつかの実施形態において、抗原は、癌抗原である。いくつかの実施形態において、抗原は、ＡＣＴＨＲ、内皮細胞Ａｎｘａ－１、アミノペチダーゼＮ、抗ＩＬ－６Ｒ、アルファ－４－インテグリン、アルファ－５－ベータ－３インテグリン、アルファ－５－ベータ－５インテグリン、アルファ－フェトプロテイン（alpha-fetoprotein、ＡＦＰ）、ＡＮＰＡ、ＡＮＰＢ、ＡＰＡ、ＡＰＮ、ＡＰＰ、１ＡＲ、２ＡＲ、ＡＴ１、Ｂ１、Ｂ２、ＢＡＧＥ１、ＢＡＧＥ２、Ｂ細胞受容体ＢＢ１、ＢＢ２、ＢＢ４、カルシトニン受容体、癌抗原１２５（cancer antigen 125、ＣＡ１２５）、ＣＣＫ１、ＣＣＫ２、ＣＤ５、ＣＤ１０、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４５、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ６８、ＣＤ９０、ＣＤ１３３、ＣＤ７、ＣＤ１５、ＣＤ３４、ＣＤ４４、ＣＤ２０６、ＣＤ２７１、ＣＥＡ（癌胎児性抗原）、ＣＧＲＰ、ケモカイン受容体、細胞表面アネキシン－１、細胞表面プレクチン－１、Ｃｒｉｐｔｏ－１、ＣＲＬＲ、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ４、ＤＣＣ、ＤＬＬ３、Ｅ２グリコプロテイン、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＭＲ１、エンドシアリン、ＥＰ２、ＥＰ４、ＥｐＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、ＥＴ受容体、フィブロネクチン、フィブロネクチンＥＤ－Ｂ、ＦＧＦＲ、ｆｒｉｚｚｌｅｄ受容体、ＧＡＧＥ１、ＧＡＧＥ２、ＧＡＧＥ３、ＧＡＧＥ４、ＧＡＧＥ５、ＧＡＧＥ６、ＧＬＰ－１受容体、ファミリーＡのＧタンパク質結合受容体（ロドプシン様）、ファミリーＢのＧタンパク質結合受容体（セクレチン受容体様）、ファミリーＣのＧタンパク質結合受容体（代謝型グルタミン酸受容体様）、ＧＤ２、ＧＰ１００、ＧＰ１２０、グリピカン－３、ヘマグルチニン、ヘパラン硫酸、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、ＨＭＦＧ、ＨＰＶ １６／１８及びＥ６／Ｅ７抗原、ｈＴＥＲＴ、ＩＬ１１－Ｒ、ＩＬ－１３Ｒ、ＩＴＧＡＭ、カリクレイン－９、Ｌｅｗｉｓ Ｙ、ＬＨ受容体、ＬＨＲＨ－Ｒ、ＬＰＡ１、ＭＡＣ－１、ＭＡＧＥ １、ＭＡＧＥ ２、ＭＡＧＥ ３、ＭＡＧＥ ４、ＭＡＲＴ１、ＭＣ１Ｒ、メソテリン、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、Ｎｅｕ（細胞表面ヌクレオリン）、ネプリライシン、ニューロピリン－１、ニューロピリン－２、ＮＧ２、ＮＫ１、ＮＫ２、ＮＫ３、ＮＭＢ－Ｒ、Ｎｏｔｃｈ－１、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＯＴ－Ｒ、変異ｐ５３、ｐ９７メラノーマ抗原、ＮＴＲ２、ＮＴＲ３、ｐ３２（ｐ３２／ｇＣ１ｑ－Ｒ／ＨＡＢＰ１）、ｐ７５、ＰＡＣ１、ＰＡＲ１、Ｐａｔｃｈｅｄ（ＰＴＣＨ）、ＰＤＧＦＲ、ＰＤＦＧ受容体、ＰＤＴ、プロテアーゼ切断コラーゲンＩＶ、プロテイナーゼ３、プロヒビチン、プロテインチロシンキナーゼ７、ＰＳＡ、ＰＳＭＡ、プリン作動性Ｐ２Ｘファミリー（例えば、Ｐ２Ｘ１－５）、変異Ｒａｓ、ＲＡＭＰ１、ＲＡＭＰ２、ＲＡＭＰ３ ｐａｔｃｈｅｄ、ＲＥＴ受容体、プレキシン、平滑化、ｓｓｔ１、ｓｓｔ２Ａ、ｓｓｔ２Ｂ、ｓｓｔ３、ｓｓｔ４、ｓｓｔ５、物質Ｐ、ＴＥＭ、Ｔ細胞ＣＤ３受容体、ＴＡＧ７２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、Ｔｉｅ－１、Ｔｉｅ－２、Ｔｒｋ－Ａ、Ｔｒｋ－Ｂ、Ｔｒｋ－Ｃ、ＴＲ１、ＴＲＰＡ、ＴＲＰＣ、ＴＲＰＶ、ＴＲＰＭ、ＴＲＰＭＬ、ＴＲＰＰ（例えば、ＴＲＰＶ１－６、ＴＲＰＡ１、ＴＲＰＣ１－７、ＴＲＰＭ１－８、ＴＲＰＰ１－５、ＴＲＰＭＬ１－３）、ＴＳＨ受容体、ＶＥＧＦ受容体（ＶＥＧＦＲ１又はＦｌｔ－１、ＶＥＧＦＲ２又はＦＬＫ－１／ＫＤＲ、及びＶＥＧＦ－３又はＦＬＴ－４）、電位開口型イオンチャネル、ＶＰＡＣ１、ＶＰＡＣ２、ウイルムス腫瘍１、Ｙ１、Ｙ２、Ｙ４、及びＹ５の中から選択される。

【0171】

いくつかの実施形態において、抗原は、ＨＥＲ１／ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２／ＥＲＢＢ２、ＣＤ２０、ＣＤ２５（ＩＬ－２Ｒα受容体）、ＣＤ３３、ＣＤ５２、ＣＤ１３３、ＣＤ２０６、ＣＥＡ、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＥＡＣＡＭ３、ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＥＡＣＡＭ６、癌抗原１２５（ＣＡ１２５）、アルファ－フェトプロテイン（ＡＦＰ）、Ｌｅｗｉｓ Ｙ、ＴＡＧ７２、Ｃａｐｒｉｎ－１、メソテリン、ＰＤＧＦ受容体、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４、ＩＬ－２受容体、血管内皮成長因子（vascular endothelial growth factor、ＶＥＧＦ）、ＣＤ３０、ＥｐＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、グリピカン－３、ｇｐＡ３３、ムチン、ＣＡＩＸ、ＰＳＭＡ、葉酸結合タンパク質、ガングリオシド（ＧＤ２、ＧＤ３、ＧＭ１、及びＧＭ２など）、ＶＥＧＦ受容体（VEGF receptor、ＶＥＧＦＲ）、インテグリンαＶβ３、インテグリンα５β１、ＥＲＢＢ３、ＭＥＴ、ＩＧＦ１Ｒ、ＥＰＨＡ３、ＴＲＡＩＬＲ１、ＴＲＡＩＬＲ２、ＲＡＮＫＬ、ＦＡＰ、テネイシン、ＡＦＰ、ＢＣＲ複合体、ＣＤ３、ＣＤ１８、ＣＤ４４、ＣＴＬＡ－４、ｇｐ７２、ＨＬＡ－ＤＲ １０β、ＨＬＡ－ＤＲ抗原、ＩｇＥ、ＭＵＣ－１、ｎｕＣ２４２、ＰＥＭ抗原、メタロプロテイナーゼ、エフリン受容体、エフリンリガンド、ＨＧＦ受容体、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ４、ボンベシン受容体、及びＳＫ－１抗原である。

【0172】

いくつかの実施形態において、抗原は、ＣＤ２５、ＰＤ－１（ＣＤ２７９）、ＰＤ－Ｌ１（ＣＤ２７４、Ｂ７－Ｈ１）、ＰＤ－Ｌ２（ＣＤ２７３、Ｂ７－ＤＣ）、ＣＴＬＡ－４、ＬＡＧ３（ＣＤ２２３）、ＴＩＭ３（ＨＡＶＣＲ２）、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７、ＴＮＦＲＳＦ９）、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ４（ＣＤ１８４）、ＣＤ２７、ＣＥＡＣＡＭ１、ガレクチン９、ＢＴＬＡ、ＣＤ１６０、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ１ホモログ）、Ｂ７－Ｈ４（ＶＣＴＮ１）、ＣＤ８０（Ｂ７－１）、ＣＤ８６（Ｂ７－２）、ＣＤ２８、ＨＨＬＡ２（Ｂ７－Ｈ７）、ＣＤ２８Ｈ、ＣＤ１５５、ＣＤ２２６、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ９６、ガレクチン３、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ７０、ＬＩＧＨＴ（ＴＮＦＳＦ１４）、ＨＶＥＭ（ＴＮＦＲＳＦ１４）、Ｂ７－Ｈ３（ＣＤ２７６）、Ｏｘ４０Ｌ（ＴＮＦＳＦ４）、ＣＤ１３７Ｌ（ＴＮＦＳＦ９、ＧＩＴＲＬ）、Ｂ７ＲＰ１、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、ＩＣＯＳＬ、ＫＩＲ、ＧＡＬ９、ＮＫＧ２Ａ（ＣＤ９４）、ＧＡＲＰ、ＴＬ１Ａ、ＴＮＦＲＳＦ２５、ＴＭＩＧＤ２、ＢＴＮＬ２、ブチロフィリンファミリー、ＣＤ４８、ＣＤ２４４、Ｓｉｇｌｅｃファミリー、ＣＤ３０、ＣＳＦ１Ｒ、ＭＩＣＡ（ＭＨＣクラスＩポリペプチド関連配列Ａ）、ＭＩＣＢ（ＭＨＣクラスＩポリペプチド関連配列Ｂ）、ＮＫＧ２Ｄ、ＫＩＲファミリー（キラー細胞免疫グロブリン様受容体、ＬＩＬＲファミリー（白血球免疫グロブリン様受容体、ＣＤ８５、ＩＬＴ、ＬＩＲ）、ＳＩＲＰＡ（シグナル調節タンパク質アルファ）、ＣＤ４７（ＩＡＰ）、ニューロピリン１（Neuropilin 1、ＮＲＰ－１）、ＶＥＧＦＲ、及びＶＥＧＦである。

【0173】

いくつかの実施形態において、抗原は、免疫調節タンパク質（例えば、チェックポイント分子）である。いくつかの実施形態において、抗原は、免疫チェックポイント受容体リガンドである。遮断又は阻害の標的となり得る例示的な免疫チェックポイント分子としては、ＰＤ１（ＣＤ２７９）、ＰＤＬ１（ＣＤ２７４、Ｂ７－Ｈ１）、ＰＤＬ２（ＣＤ２７３、Ｂ７－ＤＣ）、ＣＴＬＡ－４、ＬＡＧ３（ＣＤ２２３）、ＴＩＭ３、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、４－１ＢＢＬ（ＣＤ１３７Ｌ）、ＧＩＴＲ（ＴＮＦＲＳＦ１８、ＡＩＴＲ）、ＣＤ４０、Ｏｘ４０（ＣＤ１３４、ＴＮＦＲＳＦ４）、ＣＸＣＲ２、腫瘍関連抗原（tumor associated antigen、ＴＡＡ）、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＨＶＥＭ、ＧＡＬ９、Ｂ７Ｈ３、Ｂ７Ｈ４、ＶＩＳＴＡ、ＫＩＲ、２Ｂ４（ＣＤ２ファミリーの分子に属し、全てのＮＫ、γδ、及びメモリーＣＤ８＋（αβ）Ｔ細胞上で発現される）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５とも呼ばれる）、及びＣＧＥＮ－１５０４９が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、免疫チェックポイント分子は、ＣＤ２５、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＣＴＬＡ－４、ＬＡＧ－３、ＴＩＭ－３、４－１ＢＢ、ＧＩＴＲ、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＯＸ４０、ＯＸ４０Ｌ、ＣＸＣＲ２、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＨＶＥＭ、ＣＤ２８、及びＶＩＳＴＡである。

【0174】

いくつかの実施形態において、ディスプレイのためのポリペプチドは合成である。いくつかの実施形態において、合成ポリペプチドは、ウシ抗体の全て又は一部、例えば、超長ＣＤＲ３ノブを含む。いくつかの実施形態において、合成ポリペプチドは、修飾されたシクロチドである。いくつかの実施形態において、修飾されたシクロチドは、例えば、ウシの超長ＣＤＲ３ノブ配列を含む。

【0175】

いくつかの実施形態において、ディスプレイのためのポリペプチドは、超長ＣＤＲ－Ｈ３を含む可変重領域及び可変軽領域を含む。特定のフォーマットには、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）などの単鎖フォーマットが含まれる。他の実施形態において、ディスプレイのためのポリペプチドは、２５～７０アミノ酸長、例えば４０～７０アミノ酸長のより小さいペプチド、すなわちノブペプチドである。ディスプレイ及びディスプレイライブラリーのための例示的な分子が記載される。

【0176】

ａ．ディスプレイのためのｓｃＦｖペプチド
いくつかの実施形態において、ディスプレイのためのポリペプチドは、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である。いくつかの実施形態において、ｓｃＦｖは、ウシ超長ＣＤＲ３を有するＶＨ領域を含む。いくつかの実施形態において、ＶＨ領域は、ウシｃＤＮＡ鋳型ライブラリー、例えば、免疫化ウシからの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から単離されたＲＮＡから調製されたものから増幅された配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、増幅は、超長ＣＤＲ３を含むことが知られているか、又はその疑いがあるウシ抗体ファミリーのＶＨ領域をコードする配列を増幅することによる。いくつかの実施形態において、ＩｇＨＶ１－７ファミリーのＶＨ領域の配列を増幅して、ｓｃＦｖのＶＨ領域をコードする配列を産生する。いくつかの実施形態において、ＩｇＨＶ１－７ファミリーのＶＨ領域は、配列番号８４に示される配列を含むフォワードプライマー及び配列番号８５に示される配列を含むリバースプライマーを用いて増幅される。いくつかの実施形態において、フォワードプライマー及び／又はリバースプライマーは、クローニングを容易にするために、制限酵素部位に特異的な配列を更に含む。いくつかの実施形態において、ＩｇＨＶ１－７ファミリーのＶＨ領域は、配列番号１２に示されるフォワードプライマー及び配列番号１３に示されるリバースプライマーを用いて増幅される。

【0177】

いくつかの実施形態において、ディスプレイのためのポリペプチドのＶＨ領域の配列の調製はまた、サイズ分離ステップを含む。いくつかの実施形態において、ウシｃＤＮＡ鋳型ライブラリーなどからの、例えば、ＩｇＨＶ１－７ファミリーのＶＨ領域配列の増幅後、超長ＣＤＲ３を有するＶＨ領域をコードする配列は、超長ＣＤＲ３を有さないＶＨ領域をコードするより短い配列から分離される。いくつかの実施形態において、サイズ分離ステップは、超長ＣＤＲ３を有するＶＨ領域をコードする増幅された配列を更に富化する。

【0178】

いくつかの実施形態において、サイズ分離ステップは、複数の増幅されたＶＨ領域をコードする配列から、４２５、４５０、４７５、５００、５２５、若しくは５５０塩基対長の配列、約４２５、４５０、４７５、５００、５２５、若しくは５５０塩基対長の配列、又は４２５、４５０、４７５、５００、５２５、若しくは５５０塩基対長を超える配列を分離することを含み、４２５、４５０、４７５、５００、５２５、若しくは５５０塩基対長の配列、約４２５、４５０、４７５、５００、５２５、若しくは５５０塩基対長の配列、又は４２５、４５０、４７５、５００、５２５、若しくは５５０塩基対長を超える配列は、超長ＣＤＲ３を有するＶＨ領域をコードする配列を含む。いくつかの実施形態において、５５０塩基対長、約５５０塩基対長の配列、又は５５０塩基対長を超える配列は、残りの配列から分離される。

【0179】

いくつかの実施形態において、サイズ分離は、アガロースゲル電気泳動によって行われる。いくつかの実施形態において、１．２％、１．５％、又は２％のアガロースゲルが使用される。いくつかの実施形態において、２％のアガロースゲルが使用される。

【0180】

いくつかの実施形態において、ｓｃＦｖは、ディスプレイライブラリーのポリペプチドにわたって固定されているＶＬ領域を含む。いくつかの態様において、固定ＶＬ領域の使用は、超長ＣＤＲ３を有するＶＨ領域を含むｓｃＦｖの選択及び／又はスクリーニングを改善する。いくつかの実施形態において、ＶＬ領域は、ＢＬＶ１Ｈ１２、ＢＬＶ５Ｄ３、ＢＬＶ８Ｃ１１、ＢＦ１Ｈ１、ＢＬＶ５Ｂ８、及びＦ１８からなる群より選択される可変ラムダ軽（ＶＬ）領域であるか、又はそのヒト化バリアントである。いくつかの実施形態において、ＶＬ領域は、ＢＬＶ５Ｂ８ラムダＶＬ領域（配列番号１１０）又はそのヒト化バリアントである。いくつかの実施形態において、ＶＬ領域は、ＢＬＶ１Ｈ１２ラムダＶＬ領域又はそのヒト化バリアントである。いくつかの実施形態において、ＢＬＶ１Ｈ１２ ＶＬ領域は、配列番号２に示される。いくつかの実施形態において、ヒト化バリアントは、Ｋａｂａｔ番号付けに基づくアミノ酸置換Ｓ２Ａ、Ｔ５Ｎ、Ｐ８Ｓ、Ａ１２Ｇ、Ａ１３Ｓ、及びＰ１４Ｌ、ＣＤＲ１領域におけるアミノ酸置換Ｉ２９Ｖ及びＮ３２Ｇ、並びに／又はＣＤＲ２領域におけるＤＮＮからＧＤＴへのアミノ酸置換のうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態において、ＢＬＶ１Ｈ１２のヒト化バリアントは、配列番号１０７に示される配列を含む。

【0181】

いくつかの実施形態において、ディスプレイされたｓｃＦｖの少なくとも又は少なくとも約２０％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、又は９５％は、超長ＣＤＲ３領域を含むＶＨ領域を含む。いくつかの実施形態において、ディスプレイされたｓｃＦｖの少なくとも又は少なくとも約３０％は、超長ＣＤＲ３領域を含むＶＨ領域を含む。いくつかの実施形態において、ディスプレイされたｓｃＦｖの少なくとも又は少なくとも約４０％は、超長ＣＤＲ３領域を含むＶＨ領域を含む。いくつかの実施形態において、ディスプレイされたｓｃＦｖの少なくとも又は少なくとも約５０％は、超長ＣＤＲ３領域を含むＶＨ領域を含む。いくつかの実施形態において、ディスプレイされたｓｃＦｖの少なくとも又は少なくとも約６０％は、超長ＣＤＲ３領域を含むＶＨ領域を含む。いくつかの実施形態において、ディスプレイされたｓｃＦｖの少なくとも又は少なくとも約７０％は、超長ＣＤＲ３領域を含むＶＨ領域を含む。いくつかの実施形態において、ディスプレイされたｓｃＦｖの少なくとも又は少なくとも約８０％は、超長ＣＤＲ３領域を含むＶＨ領域を含む。いくつかの実施形態において、ディスプレイされたｓｃＦｖの少なくとも又は少なくとも約９０％は、超長ＣＤＲ３領域を含むＶＨ領域を含む。いくつかの実施形態において、ディスプレイされたｓｃＦｖの少なくとも又は少なくとも約９５％は、超長ＣＤＲ３領域を含むＶＨ領域を含む。

【0182】

いくつかの実施形態において、ｓｃＦｖのＶＨ及びＶＬ領域は、直接連結される。いくつかの実施形態において、ｓｃＦｖのＶＨ及びＶＬ領域は、例えば、ペプチドリンカーを介して間接的に連結される。いくつかの実施形態において、リンカーは、可動性リンカーである。いくつかの実施形態において、ペプチドリンカーは、（Ｇｌｙ４ Ｓｅｒ）３（配列番号９４）である。

【0183】

ｂ．ディスプレイのためのノブペプチド
いくつかの実施形態において、ディスプレイのためのポリペプチドは、超長ＣＤＲ３ノブ、例えば、ウシ超長ＣＤＲ３である。いくつかの実施形態において、超長ＣＤＲ３ノブは、ウシｃＤＮＡ鋳型ライブラリー、例えば、免疫化ウシからの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から単離されたＲＮＡから調製されたものから増幅された配列によってコードされる。

【0184】

いくつかの実施形態において、増幅は、超長ＣＤＲ３ノブをコードする配列を増幅することによる。いくつかの実施形態において、ウシの超長ＣＤＲ３領域の上昇ストークドメイン及び下降ストークドメインに特異的なプライマーを使用して、超長ＣＤＲ３ノブをコードする配列を増幅する。いくつかの実施形態において、超長ＣＤＲ３ノブは、１、２、３、４、５、又は６個のアミノ酸などの上昇ストークドメインの一部を含む。いくつかの実施形態において、超長ＣＤＲ３ノブは、１、２、３、４、５、６、７、８、又は９個のアミノ酸などの下降ストークドメインの一部を含む。いくつかの実施形態において、上昇ストークドメインは、配列ＣＸ_２ＴＶＸ_５Ｑを含み、配列中、Ｘ_２及びＸ_５は、任意のアミノ酸である。いくつかの実施形態において、Ｘ_２は、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、Ａｌａ、又はＰｒｏであり、Ｘ_５は、Ｈｉｓ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｍｅｔ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、又はＬｅｕである。いくつかの実施形態において、Ｘ_２は、Ｓｅｒ、Ａｌａ、又はＴｈｒであり、Ｘ_５は、Ｈｉｓ又はＴｙｒである。いくつかの実施形態において、増幅に使用されるプライマーは、配列番号７～１１に示される配列を含むか又はそれらからなる。いくつかの実施形態において、増幅に使用されるプライマーは、配列番号８～１１に示される配列を含むか又はそれらからなる。いくつかの実施形態において、増幅に使用されるプライマーは、配列番号１２１～１３０に示される配列を含むか又はそれらからなる。いくつかの実施形態において、増幅に使用されるプライマーは、配列番号１２３、１２７、及び１２８に示される配列を含むか又はそれらからなる。

【0185】

いくつかの実施形態において、増幅に使用されるプライマーは、上昇ストークドメイン及び下降ストークドメインに特異的な異なるプライマーのプールである。いくつかの実施形態において、プライマーのプールは、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０の異なるプライマーを含む。いくつかの実施形態において、プライマーのプールは、配列番号７～１１及び１２１～１３０に示されるプライマーとは少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０の異なるプライマーを含む。いくつかの実施形態において、プライマーのプールは、配列番号８～１１、１２３、１２７、及び１２８に示されるプライマーから少なくとも２、３、４、５、６、又は７つの異なるプライマーを含む。いくつかの実施形態において、プライマーのプールは、配列番号８～１１に示されるプライマーを含む。いくつかの実施形態において、プライマーのプールは、配列番号１２３、１２７、及び１２８に示されるプライマーを含む。いくつかの実施形態において、プライマーのプールは、配列番号８～１１、２３、２７、及び２８に示されるプライマーを含む。

【0186】

いくつかの実施形態において、ノブペプチドは、セクションＩＩ．Ｃに記載される方法を使用して同定されるペプチドである。同定されたら、ノブペプチド配列は、当業者に既知の方法を使用して増幅され得る。他の実施形態において、ノブペプチドは、合成的に生成され得る。組換え法、化学合成、又はそれらの組み合わせを含む様々な技法を用いることができる。いくつかの実施形態において、化学合成法は、ホスホラミダイト法などの既知の化学合成技法を含み得る。場合によっては、組換え又は合成核酸は、ポリメラーゼ連鎖反応（polymerase chain reaction、ＰＣＲ）によって生成され得る。

【0187】

ｃ．ディスプレイのための合成ペプチド
いくつかの実施形態において、ディスプレイのためのポリペプチドは、合成ペプチドである。いくつかの実施形態において、合成ペプチドは、本明細書に記載されるシステインモチーフ及びジスルフィド結合を有する、例えば、２～２０のシステイン残基及び１～１０のジスルフィド結合を有するランダム配列ポリペプチドである。いくつかの実施形態において、合成ペプチドは、本明細書に記載されるシステインモチーフ及びジスルフィド結合を有することについて、例えば、２～２０のシステイン残基及び１～１０のジスルフィド結合を有することについて、ランダム配列ライブラリーから選択されている。ランダム配列ライブラリーを産生する方法は既知である。

【0188】

いくつかの実施形態において、ディスプレイのためのポリペプチドは、半合成超長ＣＤＲ３ノブである。いくつかの実施形態において、半合成超長ＣＤＲ３ノブは、修飾のための足場として使用されているウシ超長ＣＤＲ３ノブに由来する。いくつかの実施形態において、ウシ超長ＣＤＲ３ノブは、例えば、半合成超長ＣＤＲ３ノブが依然として２～２０のシステイン残基及び１～１０のジスルフィド結合を含むように、例えば、本明細書に記載されるシステインモチーフ及びジスルフィド結合構造を保存しながら、ランダム変異を含むように修飾されている。いくつかの実施形態において、ウシ超長ＣＤＲ３ノブは、外因性ペプチド配列を含むように修飾されている。いくつかの実施形態において、ウシ超長ＣＤＲ３ノブは、例えば、半合成超長ＣＤＲ３ノブが依然として２～２０のシステイン残基及び１～１０のジスルフィド結合を含むように、例えば、本明細書に記載されるシステインモチーフ及びジスルフィド結合構造を保存しながら、その中の１つ以上のペプチド配列を欠失させるように修飾されている。

【0189】

いくつかの実施形態において、ディスプレイのためのポリペプチドは、シクロチドである。いくつかの実施形態において、ディスプレイのためのポリペプチドは、例えば、外因性ペプチド配列を含むように修飾されている修飾されたシクロチドである。いくつかの実施形態において、修飾されたシクロチドは、本明細書に記載されるか又は提供される方法により同定される任意のものを含む、超長ＣＤＲ３ノブ配列又はその一部を含む。

【0190】

システイン－ノットマイクロタンパク質（シクロチド）は、様々な植物種において見出されるシステイン－ノットマイクロタンパク質又はシクロチドの天然に存在するファミリーを含む。システイン－ノットマイクロタンパク質（シクロチド）は、典型的には、約３０～４０個のアミノ酸からなる小ペプチドであり、環状又は直鎖状形態として天然に見出すことができ、環状形態は、遊離Ｎ末端又はＣ末端のアミノ又はカルボキシル末端も有さない。それらは、３つの分子内ジスルフィド結合及び小さな三本鎖βシートに基づく明確な構造を有する（Ｃｒａｉｋ ｅｔ ａｌ．，２００１；Ｔｏｘｉｃｏｎ ３９，４３－６０）。環状タンパク質は、本明細書において「システインノット」と呼ばれる構造を明確にする保存されたシステイン残基を示す。このファミリーは、天然に存在する環状分子及びそれらの直鎖状誘導体の両方、並びに環化を受けた直鎖状分子を含む。これらの分子は、あまり構造化されていないペプチドよりも高い安定性を有する分子フレームワーク構造として有用である。（Ｃｏｌｇｒａｖｅ ａｎｄ Ｃｒａｉｋ，２００４；Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４３，５９６５－５９７５）。

【0191】

主なシクロチドの特徴は、システインノットによる顕著な安定性、化学合成に容易に利用できるようにする小さなサイズ、及び配列変異に対する優れた耐性である。シクロチド足場は、ほぼ３０の異なるタンパク質ファミリーにおいて見出され、その中で、コノトキシン、クモ毒、カボチャ属阻害剤、アグーチ関連タンパク質、及び植物シクロチドが、最も多く存在するファミリーである。Ｒｕｂｉａｃｅａｅ科及びＶｉｏｌａｃｅａｅ科の植物からのシクロチドは、大部分が頭－尾環状ペプチドであることが見出されている（Ｃｒａｉｋ ｅｔ ａｌ．２０１０．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．６７：９－１６）。しかしながら、シクロチドのカボチャ属阻害剤ファミリー内では、環状及び直鎖状の両方のシクロチドは、Ｍｏｍｏｒｄｉｃａ ｃｏｃｈｉｎｃｈｉｎｅｎｓｉｓから同定されている：環状トリプシン阻害剤（ＭＣｏＴＩ）－Ｉ及び－ＩＩ、並びにそれらの直鎖状対応物ＭＣｏＴＩ－ＩＩＩ（Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ ｅｔ ａｌ．２０００．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３９，５７２２－５７３０）。現在、環状及び直鎖状バリアントの両方が異なるシクロチドファミリーに存在し得ることが明らかであるが、環化の影響はあまり理解されていない。環状ペプチドは、それらの直鎖状対応物と比較した場合、改善された安定性、プロテアーゼに対するより良好な耐性、及び低減された可動性を示すことが予想され、望ましくは、増強された生物学的活性をもたらす。しかしながら、直鎖状シクロチドは、他のペプチド又はタンパク質により容易に結合することができるという利点を有する。

【0192】

例えば、シクロチドは、植物において一般的に見出される。提供される実施形態の態様において、シクロチドは、Ｍｏｍｏｒｄｉｃａｅ、Ｒｕｂｉａｃｅａｅ、及びＶｉｏｌａｃｅａｅの植物種のシクロチドの直鎖状又は環状形態に由来する。好ましい態様において、本発明のシクロチドは、カボチャ属セリンプロテアーゼ阻害剤ファミリーを含むＭｏｍｏｒｄｉｃａｅ種のシクロチドの直鎖状又は環状形態に由来し（Ｏｔｌｅｗｓｋｉ ＆ Ｋｏｒｏｗａｒｓｃｈ Ａｃｔａ Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｐｏｌ．１９９６；４３（３）：４３１－４４）、より好ましい態様において、以下のＭｏｍｏｒｄｉｃａ ｃｏｃｈｉｎｃｈｉｎｅｎｓｉｓトリプシン阻害剤ＭＣｏＴＩ－Ｉ［配列番号９５］及び－ＩＩ［配列番号９６］（天然に環状）、並びにＭＣｏＴＩ－ＩＩＩ（天然に直鎖状）［配列番号９７］に由来する。
Ｍｃｏｔｉ－Ｉ ＧＧＶＣＰＫＩＬＱＲＣＲＲＤＳＤＳＰＧＡＣＩＣＲＧＮＧＹＣＧＳＧＳＤ［配列番号９５］
Ｍｃｏｔｉ－ＩＩ ＧＧＶＣＰＫＩＬＫＫＣＲＲＤＳＤＳＰＧＡＣＩＣＲＧＮＧＹＣＧＳＧＳＤ［配列番号９６］
Ｍｃｏｔｉ－ＩＩＩ ＥＲＡＣＰＲＩＬＫＫＣＲＲＤＳＤＳＰＧＡＣＩＣＲＧＮＧＹＣＧ［配列番号９７］

【0193】

いくつかの実施形態において、シクロチド分子フレームワークは、システイン－ノット骨格を形成するアミノ酸又はその類似体の配列を含み、当該システイン－ノット骨格は、当該システイン－ノット骨格の三次元構造にノットトポロジーを付与するのに十分なジスルフィド結合又はその化学的等価物を含み、１つ以上のベータターン上及び／又は１つ以上のループ内などの少なくとも１つの露出したアミノ酸残基が、天然に存在するアミノ酸配列と比較して挿入又は置換されている（置き換えられている）。いくつかの実施形態において、シクロチドは、外因性ペプチド配列の挿入又は外因性ペプチド配列による置換によって修飾される。したがって、本明細書に記載のシクロチドは、天然又は野生型非修飾シクロチドと比較して修飾されたシクロチドであり、修飾されたシクロチドは、１つ以上のアミノ酸配列、例えば、外因性ペプチド配列によって挿入又は置換された１つ以上のループを有する。提供される実施形態の態様において、修飾されたシクロチドは、高い酵素安定性を提供するのに十分なアミノ酸構造を組み込む。

【0194】

いくつかの実施形態において、修飾されたシクロチド配列は、システインノット骨格部分及び外因性ペプチド配列を有するものとして定義されてもよく、当該修飾されたシクロチドは、ｉ）外因性ペプチド配列であって、当該配列が約２～５０のアミノ酸残基である外因性ペプチド配列と、ｉｉ）ステップｉ）の当該配列にグラフトされたシステインノット骨格であって、当該システインノット骨格が、構造（Ｉ）：

【化1】

【0195】

（式中、Ｃ_１～Ｃ_６は、システイン残基であり、Ｃ_１及びＣ_４、Ｃ_２及びＣ_５、並びにＣ_３及びＣ_６の各々は、ジスルフィド結合によって連結されてシステインノットを形成し、各Ｘは、ループ内のアミノ酸残基を表し、当該アミノ酸残基は、同じであるか又は異なり、ｄは、約１～２であり、ループ１、２、３、５、又は６のうちの１つ以上は、節ｉ）の配列を含むアミノ酸配列を有し、節ｉ）の当該配列を含む任意のループは、２～約５０個のアミノ酸を含み、節ｉ）の当該配列を含まないループ１、２、３、５、又は６のうちのいずれかについて、ａ、ｂ、ｃ、ｅ、及びｆは、同じであるか又は異なり、各々３～１０の任意の数であり、ｂ、ｃ、ｅ、及びｆは、各々１～２０の任意の数である）を含むシステインノット骨格と、を含む。

【0196】

いくつかの実施形態において、修飾されたシクロチド配列は、直鎖状又は環状のいずれかであり得る。

【0197】

いくつかの実施形態において、修飾されたシクロチドは、Ｍｏｍｏｒｄｉｃａｅ、Ｒｕｂｉａｃｅａｅ、及びＶｉｏｌａｃｅａｅの植物種のシクロチドの直鎖状又は環状形態に由来する。いくつかの実施形態において、修飾されたシクロチドは、カボチャ属セリンプロテアーゼ阻害剤ファミリーを含むＭｏｍｏｒｄｉｃａｅ種のシクロチドの直鎖状又は環状形態に由来する（Ｏｔｌｅｗｓｋｉ ＆ Ｋｏｒｏｗａｒｓｃｈ Ａｃｔａ Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｐｏｌ．１９９６；４３（３）：４３１－４４）。いくつかの実施形態において、修飾されたシクロチドは、以下のＭｏｍｏｒｄｉｃａ ｃｏｃｈｉｎｃｈｉｎｅｎｓｉｓトリプシン阻害剤ＭＣｏＴＩ－Ｉ［配列番号９５］及び－ＩＩ［配列番号９６］（天然に環状）、並びにＭＣｏＴＩ－ＩＩＩ（天然に直鎖状）［配列番号９７］に由来する。
Ｍｃｏｔｉ－Ｉ ＧＧＶＣＰＫＩＬＱＲＣＲＲＤＳＤＳＰＧＡＣＩＣＲＧＮＧＹＣＧＳＧＳＤ［配列番号９５］
Ｍｃｏｔｉ－ＩＩ ＧＧＶＣＰＫＩＬＫＫＣＲＲＤＳＤＳＰＧＡＣＩＣＲＧＮＧＹＣＧＳＧＳＤ［配列番号９６］
Ｍｃｏｔｉ－ＩＩＩ ＥＲＡＣＰＲＩＬＫＫＣＲＲＤＳＤＳＰＧＡＣＩＣＲＧＮＧＹＣＧ［配列番号９７］

【0198】

例えば、未修飾又は野生型シクロチドは、配列番号９５～９７のいずれか１つに示されるシクロチドであり、その１つ以上のループが１つ以上のアミノ酸配列（例えば、外因性ペプチド配列）によって挿入又は置換されているシクロチドであり得る。特定の実施形態において、修飾されたシクロチドは、Ｍｃｏｔｉ－ＩＩ（配列番号９６）に基づくループ置換ライブラリーに由来する。

【0199】

いくつかの実施形態において、外因性ペプチド配列が挿入又は置換されるループは、ループ１である。いくつかの実施形態において、外因性ペプチド配列が挿入又は置換されるループは、ループ５である。いくつかの実施形態において、外因性ペプチド配列が挿入又は置換されるループは、環化を受けて形成されるようなループ６である。

【0200】

いくつかの実施形態において、未修飾シクロチド、例えば、シクロチドＭｃｏｔｉ－ＩＩ（配列番号９６）に挿入又は置き換えられる外因性ペプチド配列は、２～５０のアミノ酸残基である。いくつかの実施形態において、外因性ペプチド配列は、２～４０個のアミノ酸、２～３０個のアミノ酸、２～２５個のアミノ酸、２～２０個のアミノ酸、２～１５個のアミノ酸、２～１０個のアミノ酸、２～５個のアミノ酸、５～５０個のアミノ酸、５～４０個のアミノ酸、５～３０個のアミノ酸、５～２５個のアミノ酸、５～２０個のアミノ酸、５～１５個のアミノ酸、５～１０個のアミノ酸、１０～５０個のアミノ酸、１０～４０個のアミノ酸、１０～３０個のアミノ酸、１０～２５個のアミノ酸、１０～１５個のアミノ酸、１５～５０個のアミノ酸、１５～４０個のアミノ酸、１５～３０個のアミノ酸、１５～２５個のアミノ酸、１５～２０個のアミノ酸、２０～５０個のアミノ酸、２０～４０個のアミノ酸、２０～３０個のアミノ酸、２０～２５個のアミノ酸、２５～５０個のアミノ酸、２５～４０個のアミノ酸、２５～３０個のアミノ酸、３０～５０個のアミノ酸、３０～４０個のアミノ酸、又は４０～５０個のアミノ酸である。いくつかの実施形態において、外因性ペプチド配列は、２～３０個のアミノ酸、例えば、２～２４個のアミノ酸、２～１８個のアミノ酸、２～１２個のアミノ酸、２～６個のアミノ酸、６～３０個のアミノ酸、６～２４個のアミノ酸、６～１８個のアミノ酸、６～１２個のアミノ酸、１２～３０個のアミノ酸、１２～２４個のアミノ酸、１２～１８個のアミノ酸、１８～３０個のアミノ酸、１８～２４個のアミノ酸、又は２４～３０個のアミノ酸である。

【0201】

Ｂ．ディスプレイライブラリー
本明細書ではまた、任意の提供される方法によって産生される任意のものを含む、ディスプレイ粒子、例えばファージミド粒子のライブラリーも提供される。

【0202】

本明細書ではまた、ＢＬＶ１Ｈ１２、ＢＬＶ５Ｄ３、ＢＬＶ８Ｃ１１、ＢＦ１Ｈ１、ＢＬＶ５Ｂ８、及びＦ１８からなる群から選択される可変ラムダ軽（ＶＬ）領域、又はそのヒト化バリアントに連結された超長ＣＤＲ３を含むウシ可変重（ＶＨ）領域を有する単鎖可変断片をコードする第１の核酸配列と、ファージコートタンパク質の少なくとも一部をコードする第２の核酸配列とを含む融合タンパク質をコードする遺伝子融合物を含む、複製可能な発現ベクターを含むか、又は複製可能な発現ベクターであるファージミドも提供される。いくつかの実施形態において、ＶＬ領域は、ＢＬＶ１Ｈ１２のＶＬ領域である。

【0203】

本明細書ではまた、ウシ超長ＣＤＲ３ノブをコードする第１の核酸配列と、ファージコートタンパク質の少なくとも一部をコードする第２の核酸配列とを含む融合タンパク質をコードする遺伝子融合物を含む、複製可能な発現ベクターを含むか、又は複製可能な発現ベクターであるファージミドも提供される。

【0204】

本明細書ではまた、連結されたジスルフィド結合を形成することができる２～１２のシステイン残基を含むシステインモチーフを有する２５～７０個のアミノ酸のペプチド配列をコードする第１の核酸配列と、ファージコートタンパク質の少なくとも一部をコードする第２の核酸配列とを含む融合タンパク質をコードする遺伝子融合物を含む、複製可能な発現ベクターを含むか、又は複製可能な発現ベクターであるファージミドも提供される。

【0205】

いくつかの実施形態において、ディスプレイ粒子、例えば、本明細書に記載のファージミドのうちのいずれかによってコードされるファージミド粒子のライブラリーも本明細書において提供される。

【0206】

いくつかの実施形態において、ディスプレイ粒子は、超長ＣＤＲ３ノブ、例えば、本明細書に記載のいずれかを含む。

【0207】

いくつかの実施形態において、ディスプレイ粒子は、合成又は半合成の超長ＣＤＲ３ノブ、例えば、本明細書に記載のいずれかを含む。

【0208】

いくつかの実施形態において、ディスプレイ粒子は、シクロチド、例えば、本明細書に記載のいずれかを含む。

【0209】

いくつかの実施形態において、ディスプレイ粒子は、修飾されたシクロチド、例えば、本明細書に記載のいずれかを含む。

【0210】

いくつかの実施形態において、ディスプレイ粒子は、超長ＣＤＲ３領域を含むＶＨを有するｓｃＦｖを含む。いくつかの実施形態において、ライブラリー中のディスプレイ粒子、例えば、ファージミド粒子の少なくとも又は少なくとも約２０％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、又は９５％は、超長ＣＤＲ３領域を有するＶＨ領域を含むｓｃＦｖを含む。いくつかの実施形態において、ライブラリー中のディスプレイ粒子、例えば、ファージミド粒子の少なくとも又は少なくとも約３０％は、超長ＣＤＲ３領域を有するＶＨ領域を含むｓｃＦｖを含む。いくつかの実施形態において、ライブラリー中のディスプレイ粒子、例えば、ファージミド粒子の少なくとも又は少なくとも約３５％は、超長ＣＤＲ３領域を有するＶＨ領域を含むｓｃＦｖを含む。いくつかの実施形態において、ライブラリー中のディスプレイ粒子、例えば、ファージミド粒子の少なくとも又は少なくとも約４０％は、超長ＣＤＲ３領域を有するＶＨ領域を含むｓｃＦｖを含む。いくつかの実施形態において、ライブラリー中のディスプレイ粒子、例えば、ファージミド粒子の少なくとも又は少なくとも約４５％は、超長ＣＤＲ３領域を有するＶＨ領域を含むｓｃＦｖを含む。いくつかの実施形態において、ライブラリー中のディスプレイ粒子、例えば、ファージミド粒子の少なくとも又は少なくとも約５０％は、超長ＣＤＲ３領域を有するＶＨ領域を含むｓｃＦｖを含む。いくつかの実施形態において、ライブラリー中のディスプレイ粒子、例えば、ファージミド粒子の少なくとも又は少なくとも約６０％は、超長ＣＤＲ３領域を有するＶＨ領域を含むｓｃＦｖを含む。いくつかの実施形態において、ライブラリー中のディスプレイ粒子、例えば、ファージミド粒子の少なくとも又は少なくとも約７０％は、超長ＣＤＲ３領域を有するＶＨ領域を含むｓｃＦｖを含む。いくつかの実施形態において、ライブラリー中のディスプレイ粒子、例えば、ファージミド粒子の少なくとも又は少なくとも約８０％は、超長ＣＤＲ３領域を有するＶＨ領域を含むｓｃＦｖを含む。いくつかの実施形態において、ライブラリー中のディスプレイ粒子、例えば、ファージミド粒子の少なくとも又は少なくとも約９０％は、超長ＣＤＲ３領域を有するＶＨ領域を含むｓｃＦｖを含む。いくつかの実施形態において、ライブラリー中のディスプレイ粒子、例えば、ファージミド粒子の少なくとも又は少なくとも約９５％は、超長ＣＤＲ３領域を有するＶＨ領域を含むｓｃＦｖを含む。

【0211】

Ｃ．細胞選択方法
本明細書ではまた、本明細書に記載のディスプレイライブラリーのうちのいずれかから、標的分子に特異的な抗体結合タンパク質を選択するための方法も提供される。次いで、これらのディスプレイライブラリーを、標的分子と接触させ、標的に対して最も高い親和性を有するライブラリーのメンバーを、より低い親和性のメンバーから分離する。次いで、これらのディスプレイライブラリーを、標的分子と接触させ、標的に対して最も高い親和性を有するライブラリーのメンバーを、より低い親和性のメンバーから分離する。次いで、高親和性結合物は、任意の適切な系によって増幅される。このプロセスは、所望の親和性のポリペプチドが得られるまで繰り返される。

【0212】

例えば、ディスプレイライブラリーは、超長ＣＤＲ３ ｓｃＦｖポリペプチド又はＣＤＲ３－ノブペプチドがファージコートタンパク質に融合され、そのポリペプチドをコードするＤＮＡを含むファージミド粒子の表面上に、通常は平均して各関連ポリペプチドの単一コピーとしてディスプレイされる、本明細書に記載されるファージディスプレイライブラリーである。次いで、これらのファージミド粒子を、標的分子と接触させ、標的に対して最も高い親和性を有する粒子を、より低い親和性の粒子から分離する。次いで、高親和性結合物は、細菌宿主の感染によって増幅され、競合的結合ステップが繰り返される。このプロセスは、所望の親和性のポリペプチドが得られるまで繰り返される。

【0213】

いくつかの実施形態において、提供される方法は、ディスプレイ粒子、例えばファージミド粒子の、標的分子への結合を可能にする条件下で、本明細書において提供されるディスプレイライブラリーのうちのいずれかを標的分子と接触させることを含む。いくつかの実施形態において、方法は、結合するディスプレイ粒子、例えば、ファージミド粒子を結合しないものから分離し、それによって、標的分子に結合する抗体結合タンパク質を含むディスプレイ粒子、例えば、ファージミド粒子を選択することを更に含む。いくつかの実施形態において、方法は、選択された粒子中の融合遺伝子を配列決定して、抗体結合タンパク質を同定することを含む。

【0214】

標的分子は、天然の供給源から単離され得るか、又は当該技術分野で既知の手順による組換え方法によって調製され得る。精製された標的分子は、好適なマトリックス、例えば、アガロースビーズ、アクリルアミドビーズ、ガラスビーズ、セルロース、様々なアクリルコポリマー、ヒドロキシアルキルメタクリレートゲル、ポリアクリル及びポリメタクリルコポリマー、ナイロン、中性及びイオン性担体などに結合され得る。マトリックスへの標的タンパク質の結合は、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，４４ １９７６に記載される方法によって、又は当該技術分野で既知の他の手段によって達成され得る。

【0215】

マトリックスへの標的分子の結合後、固定化された標的は、ディスプレイ粒子の少なくとも一部と固定化された標的分子との結合に好適な条件下で、ディスプレイ粒子、例えば、ファージミド粒子のライブラリーと接触させることができる。通常、ｐＨ、イオン強度、温度などを含む条件は、生理学的条件を模倣する。例示的な「接触」条件は、４℃～３７℃、例えば室温で、１５分～４時間、例えば、１時間インキュベートすることを含み得る。しかしながら、これらは、相互作用する結合パートナーなどの性質に応じて適宜変化してもよい。混合物を、穏やかな揺動、混合、又は回転に供することができる。加えて、他の適切な試薬、例えば、非特異的結合を低減するための遮断剤が添加され得る。例えば、１～４％のＢＳＡ又は他の好適な遮断剤（例えば、乳汁）を使用することができる。しかしながら、接触条件は、スクリーニング方法の目的に応じて当業者によって変更及び適応され得ることが理解されるであろう。例えば、インキュベーション温度が、例えば、室温又は３７℃である場合、これは、これらの条件下で安定である（例えば、３７℃でのインキュベーションの場合、ヒト身体において見出される条件下で安定である）結合剤を同定する可能性を増加させ得る。そのような特性は、結合パートナーの一方又は両方が、ある種の治療用途、例えば抗体において使用される候補である場合、非常に有利であり得る。再び、条件に対するそのような適応は、当業者の範囲内である。

【0216】

固定化された標的分子に対して高い親和性を有する結合したディスプレイ粒子（「結合剤」）は、洗浄により低い親和性を有する（したがって標的に結合しない）ものから分離することができる。結合剤は、様々な方法によって固定化された標的分子から解離され得る。これらの方法には、野生型リガンドを使用する競合的解離、ｐＨ、及び／又はイオン強度の変更、並びに当該技術分野で既知の方法が含まれる。

【0217】

いくつかの実施形態において、標的分子は、非病原性細菌、ウイルス、ウイルスタンパク質、癌抗原、ヒトＩｇＧ、又はその組換えタンパク質である。いくつかの実施形態において、標的分子は、ウイルスタンパク質である。いくつかの実施形態において、標的分子は、コロナウイルス、コロナウイルス偽ウイルス、組換えコロナウイルススパイクタンパク質、又はコロナウイルススパイクタンパク質の受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）である。いくつかの実施形態において、コロナウイルスは、２２９Ｅ、ＮＬ６３、ＯＣ４３、ＨＫＵ１、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ２からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、コロナウイルスは、Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ－１単離株、Ｂ．１．３５１南アフリカバリアント、又はＢ．１．１．７ ＵＫバリアントから選択されるＳＡＲＳ－ＣｏＶ２である。

【0218】

いくつかの実施形態において、方法は、以前に選択されたディスプレイ粒子が再発現され、同じ又は異なる標的分子を用いることを含む更なる選択ステップに供されるステップを含む。いくつかの実施形態において、選択ステップは、１回以上繰り返される。いくつかの実施形態において、更なる選択ステップは、好適な宿主細胞を、以前に選択されたディスプレイ粒子をコードする複製可能な発現ベクターに感染させることと、追加の増幅されたディスプレイ粒子を収集することと、追加の増幅されたディスプレイ粒子を同じ又は異なる標的抗原と接触させることと、を含む。いくつかの実施形態において、異なる標的分子は、標的分子に関連し、同じ種類の病原体、同じ群の病原体、又は標的分子のバリアントである。いくつかの実施形態において、標的分子及び異なる標的分子は、コロナウイルス２２９Ｅ、ＮＬ６３、ＯＣ４３、ＨＫＵ１、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ２の任意の組み合わせに関連する。いくつかの実施形態において、標的分子及び異なる標的分子は、Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ－１単離株、Ｂ．１．３５１南アフリカバリアント、及びＢ．１．１．７ ＵＫバリアントから選択されるＳＡＲＳ－ＣｏＶ２バリアントの任意の組み合わせに関連する。

【0219】

提供される方法により結合剤のうちの１つ以上のセットが選択又は単離されたら、これらを更なる分析に供することができる。いくつかの実施形態において、更なる分析は、増幅ステップとしての細菌の感染による結合剤の単離、ファージ又はファージミドＤＮＡの単離、及び当該ファージ又はファージミドＤＮＡに含まれる候補結合剤をコードするＤＮＡ配列の好適な発現ベクターへのクローニングを伴う。そのような感染ステップはまた、結合剤の増幅を可能にし得る。あるいは、結合剤は、他の適切な方法によって、例えば、当該結合剤をコードする核酸のＰＣＲ又は当該核酸の適切な宿主細胞への形質転換（好適な発現ベクターの状況において）によって、この段階で増幅され得る。

【0220】

結合剤をコードするＤＮＡが好適な発現ベクターにクローニングされると、結合剤をコードするＤＮＡを配列決定することができるか、又はタンパク質を可溶性形態で発現させることができ（例えば、本明細書において提供される方法によるものを含む）、適切な結合研究に供して、タンパク質レベルで候補を更に特徴付けることができる。適切な結合研究は、結合剤の性質に依存し、ＥＬＩＳＡ、フィルタースクリーニングアッセイ、ＦＡＣＳ、若しくは免疫蛍光アッセイ、ＢｉａＣｏｒｅ親和性測定、又は結合定数を定量するための他の方法、組織スライド若しくは細胞の染色、及び他の免疫組織化学法を含むが、これらに限定されない。これらの結合研究のうちの１つ以上を使用して、結合剤を分析することができる。

【0221】

本明細書ではまた、配列ライブラリーからのものを含む、アミノ酸配列によってウシＣＤＲ Ｈ３ノブなどの超長ＣＤＲ Ｈ３ノブを同定するための方法も提供される。いくつかの態様において、超長ＣＤＲ Ｈ３ノブを同定するための方法は、例えば、本明細書に記載される、例えば以下に示される式を参照することなどによって、ノブドメインの領域を定義することを含む。

【0222】

いくつかの実施形態において、超長ＣＤＲ Ｈ３ノブを同定するための方法は、ノブ領域Ｎ末端境界を「ＣＰＤＧ」モチーフ中の第１のＤ_Ｈシステインとして定義することを含む。いくつかの実施形態において、方法は、フレームワーク４トリプトファン位置から上昇ストーク残基の数を減算することによって位置付けられる位置としてＣ末端境界を定義することを更に含む。いくつかの態様において、方法は、任意の抗体配列から超長ＣＤＲ Ｈ３ノブを同定するために使用することができる。特定の実施形態において、抗体配列は、本明細書に記載の抗体のうちのいずれかなどのウシ抗体である。

【0223】

方法のこの実施形態の表現を以下に示す。

【0224】

ノブ境界位置（Ｃ末端）＝保存されたフレームワーク４トリプトファン－Ｘの位置；式中、Ｘ＝上昇ストークを定義するフレームワーク３標準システインから始まり、「ＣＰＤＧ」モチーフ中の保存された最初のＤ領域システインの前のアミノ酸で終わる、アミノ酸の数。

【0225】

ノブ中の残基の数（Ｋ）＝Ｌ－２Ｘ；式中、Ｌ＝標準フレームワーク３システインで始まり、標準フレームワーク４トリプトファンで終わる、ストークドメイン及びノブドメインを包含するアミノ酸の数。
Ｋ位置＝（Ｘ＋１）～（Ｘ＋Ｋ）

【0226】

ＩＩＩ．可溶性ペプチドの発現
本明細書ではまた、いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法のいずれかによって同定された抗体結合タンパク質（結合剤とも呼ばれる）のいずれかを産生する方法を含む、可溶性ジスルフィド結合含有ペプチドを産生する方法も提供される。提供される方法によって産生される可溶性ペプチドは、ジスルフィド結合した可溶性タンパク質を産生することが望ましい２つ以上のシステイン残基を含むペプチド（例えば、２５～７０アミノ酸長）である。いくつかの実施形態において、提供される方法は、宿主細胞、例えばＥ．ｃｏｌｉを、可溶性ペプチドをコードする発現ベクターで形質転換することを含む。いくつかの実施形態において、発現ベクターは、可溶性ペプチド及びシャペロン、例えば細菌シャペロンを含む融合タンパク質をコードする。いくつかの実施形態において、可溶性ペプチド及びシャペロン、例えば細菌シャペロンは、リンカーによって連結されている。いくつかの実施形態において、リンカーは切断可能なリンカーである。

【0227】

核酸を操作するための技法、例えば、配列中に変異を生成する、サブクローニング、標識、プロービング、配列決定、ハイブリダイゼーションなどのための技法は、科学刊行物及び特許文献に詳細に記載される。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ，Ｒｕｓｓｅｌｌ ＤＷ（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ ｅｄ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｄ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９７）、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｐａｒｔ Ｉ，Ｔｈｅｏｒｙ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ，Ｔｉｊｓｓｅｎ ｅｄ．，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．（１９９３）を参照されたい。

【0228】

いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、可溶性タンパク質単独と比較して増加した溶解度を有する。いくつかの態様において、この増加した溶解度は、シャペロン、例えば細菌シャペロンの包含によって少なくとも部分的に付与される。いくつかの態様において、シャペロン、例えば細菌シャペロンの包含は、融合タンパク質の可溶性を促進する一方で、ジスルフィド結合形成を促進するように操作又は修飾された宿主細胞環境を含む可溶性ペプチドにおけるジスルフィド結合形成を可能にする。いくつかの実施形態において、シャペロン、例えば細菌シャペロンは、チオレドキシンＡ（ＴｒｘＡ）である。

【0229】

いくつかの実施形態において、提供される方法は、宿主細胞、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉなどの細菌を、融合タンパク質の発現を許容する条件下で培養することを更に含む。いくつかの実施形態において、提供される方法は、培養後に、発現された融合タンパク質を宿主細胞、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉなどの細菌の溶解物の上清から単離することを更に含む。いくつかの実施形態において、提供される方法は、切断可能なリンカーを切断し、それによって細菌シャペロンを含まない可溶性ペプチドを産生することを更に含む。

【0230】

いくつかの実施形態において、切断可能なリンカーは、エンテロキナーゼ切断タグである。いくつかの実施形態において、切断可能なリンカーは、アミノ酸配列ＤＤＤＤＫ（配列番号１０６）を含む。いくつかの実施形態において、切断可能なリンカーの切断は、エンテロキナーゼを添加することを含む。いくつかの実施形態において、エンテロキナーゼは、宿主細胞溶解物の上清に添加される。いくつかの実施形態において、提供される方法は、切断可能なリンカーを切断した後に、可溶性ペプチドを含む溶液からエンテロキナーゼ及び／又は細菌シャペロンを除去することを更に含む。

【0231】

いくつかの実施形態において、可溶性ペプチドは、最大７０アミノ酸長である。いくつかの実施形態において、可溶性ペプチドは、４０～６０アミノ酸長である。いくつかの実施形態において、可溶性ペプチドは、少なくとも４２アミノ酸長である。いくつかの実施形態において、可溶性ペプチドは、４２アミノ酸長、４３アミノ酸長、４４アミノ酸長、４５アミノ酸長、４６アミノ酸長、４７アミノ酸長、４８アミノ酸長、４９アミノ酸長、５０アミノ酸長、５１アミノ酸長、５２アミノ酸長、５３アミノ酸長、５４アミノ酸長、５５アミノ酸長、５６アミノ酸長、５７アミノ酸長、５８アミノ酸長、５９アミノ酸長、又は６０アミノ酸長である。

【0232】

いくつかの実施形態において、可溶性ペプチドは、２５～７０個のアミノ酸である。例えば、いくつかの実施形態において、可溶性ペプチドは、３５アミノ酸長以上、４０アミノ酸長以上、４５アミノ酸長以上、５０アミノ酸長以上、５５アミノ酸長以上、又は６０アミノ酸長以上である。いくつかの実施形態において、可溶性ペプチドは、３５～７０アミノ酸長、４０～７０アミノ酸長、４５～７０アミノ酸長、５０～７０アミノ酸長、５５～７０アミノ酸長、若しくは６０～７０アミノ酸長、又は約３５～７０アミノ酸長、４０～７０アミノ酸長、４５～７０アミノ酸長、５０～７０アミノ酸長、５５～７０アミノ酸長、若しくは６０～７０アミノ酸長である。

【0233】

いくつかの実施形態において、可溶性ペプチドは、６～５０個のアミノ酸、６～４０個のアミノ酸、６～３０個のアミノ酸、６～２５個のアミノ酸、６～２０個のアミノ酸、６～１５個のアミノ酸、６～１０個のアミノ酸、１０～５０個のアミノ酸、１０～４０個のアミノ酸、１０～３０個のアミノ酸、１０～２５個のアミノ酸、１０～１５個のアミノ酸、１５～５０個のアミノ酸、１５～４０個のアミノ酸、１５～３０個のアミノ酸、１５～２５個のアミノ酸、１５～２０個のアミノ酸、２０～５０個のアミノ酸、２０～４０個のアミノ酸、２０～３０個のアミノ酸、２０～２５個のアミノ酸、２５～５０個のアミノ酸、２５～４０個のアミノ酸、２５～３０個のアミノ酸、３０～５０個のアミノ酸、３０～４０個のアミノ酸、又は４０～５０個のアミノ酸である。いくつかの実施形態において、可溶性ペプチドは、６～３０個のアミノ酸、６～２４個のアミノ酸、６～１８個のアミノ酸、６～１２個のアミノ酸、１２～３０個のアミノ酸、１２～２４個のアミノ酸、１２～１８個のアミノ酸、１８～３０個のアミノ酸、１８～２４個のアミノ酸、又は２４～３０個のアミノ酸である。

【0234】

いくつかの実施形態において、可溶性ペプチドは、ジスルフィド結合を形成することができるシステインモチーフを含む。いくつかの実施形態において、システインモチーフは、２～２０のシステイン残基、例えば、２～１８、２～１６、２～１４、２～１２、２～１０、２～８、２～６、２～４、４～２０、４～１８、４～１６、４～１４、４～１２、４～１０、４～８、４～６、６～２０、６～１８、６～１６、６～１４、６～１２、６～１０、６～８、８～２０、８～１８、８～１６、８～１４、８～１２、８～１０、１０～２０、１０～１８、１０～１６、１０～１４、１０～１２、１２～２０、１２～１８、１２～１６、１２～１４、１４～２０、１４～１８、１４～１６、１６～２０、１６～１８、若しくは１８～２０、又は約２～１８、２～１６、２～１４、２～１２、２～１０、２～８、２～６、２～４、４～２０、４～１８、４～１６、４～１４、４～１２、４～１０、４～８、４～６、６～２０、６～１８、６～１６、６～１４、６～１２、６～１０、６～８、８～２０、８～１８、８～１６、８～１４、８～１２、８～１０、１０～２０、１０～１８、１０～１６、１０～１４、１０～１２、１２～２０、１２～１８、１２～１６、１２～１４、１４～２０、１４～１８、１４～１６、１６～２０、１６～１８、若しくは１８～２０のシステイン残基（各々境界値を含む）を含む。いくつかの実施形態において、システインモチーフは、２～１２のシステイン残基を含む。いくつかの実施形態において、可溶性ペプチドは、少なくとも４つのＣｙｓ残基を含む。いくつかの実施形態において、可溶性ペプチドは、４つのＣｙｓ残基を含む。いくつかの実施形態において、可溶性ペプチドは、６、８、１０、又は１２のＣｙｓ残基を含む。

【0235】

いくつかの実施形態において、可溶性ペプチドは、１～１０のジスルフィド結合、例えば、１～９、１～８、１～７、１～６、１～５、１～４、１～３、１～２、２～１０、２～９、２～８、２～７、２～６、２～５、２～４、２～３、３～１０、３～９、３～８、３～７、３～６、３～５、３～４、４～１０、４～９、４～８、４～７、４～６、４～５、５～１０、５～９、５～８、５～７、５～６、６～１０、６～９、６～８、６～７、７～１０、７～９、７～８、８～１０、８～９、若しくは９～１０、又は約１～９、１～８、１～７、１～６、１～５、１～４、１～３、１～２、２～１０、２～９、２～８、２～７、２～６、２～５、２～４、２～３、３～１０、３～９、３～８、３～７、３～６、３～５、３～４、４～１０、４～９、４～８、４～７、４～６、４～５、５～１０、５～９、５～８、５～７、５～６、６～１０、６～９、６～８、６～７、７～１０、７～９、７～８、８～１０、８～９、若しくは９～１０のジスルフィド結合（各々境界値を含む）を含む。いくつかの実施形態において、可溶性ペプチドは、１～６つのジスルフィド結合を含む。いくつかの実施形態において、可溶性ペプチドは、２～６つのジスルフィド結合を含む。いくつかの実施形態において、可溶性ペプチドは、少なくとも２つのジスルフィド結合を有する。いくつかの実施形態において、可溶性ペプチドは、２つのジスルフィド結合を有する。いくつかの実施形態において、可溶性ペプチドは、３、４、又は５つのジスルフィド結合を有する。

【0236】

いくつかの実施形態において、可溶性ペプチドは、可溶性ペプチド中に存在する最もＮ末端のシステイン残基の前に３～６個のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態において、可溶性ペプチドは、可溶性ペプチド中に存在する最もＮ末端のシステイン残基の前に、３、４、５、又は６個のアミノ酸を含む。

【0237】

いくつかの実施形態において、可溶性ペプチドは、可溶性ペプチド中に存在する最もＣ末端のシステイン残基の後に少なくとも６個のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態において、可溶性ペプチドは、可溶性ペプチド中に存在する最もＣ末端のシステイン残基の後に６～９個のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態において、可溶性ペプチドは、可溶性ペプチド中に存在する最もＣ末端のシステイン残基の後に、６、７、８、又は９個のアミノ酸を含む。

【0238】

いくつかの実施形態において、可溶性ペプチドは、可動性リンカーを含む。いくつかの実施形態において、可動性リンカーは、可溶性ペプチドのＮ末端に含まれる。いくつかの実施形態において、可動性リンカーは、可溶性ペプチド中に存在する最もＮ末端のシステイン残基の前の３～６個のアミノ酸に付加される。いくつかの実施形態において、可動性リンカーは、可溶性ペプチド中に存在する最もＮ末端側のシステイン残基の前の３～６個のアミノ酸に含まれる。いくつかの実施形態において、可動性リンカーは、可溶性ペプチドのＣ末端に含まれる。いくつかの実施形態において、可動性リンカーは、可溶性ペプチドに存在する最もＣ末端のシステイン残基の後の少なくとも６個のアミノ酸に付加される。いくつかの実施形態において、可動性リンカーは、可溶性ペプチド中に存在する最もＣ末端側のシステイン残基の後の少なくとも６個のアミノ酸に含まれる。

【0239】

いくつかの実施形態において、可動性リンカーは、ＧＧＧＧＡＭＧＳ（配列番号１０８）である。いくつかの実施形態において、可動性リンカーは、ＧＧＳ（配列番号１０９）である。いくつかの実施形態において、可動性リンカー（例えば、ＧＧＧＧＡＭＧＳ、配列番号１０８）は、可溶性ペプチドの環化を可能にする。いくつかの実施形態において、環化は、化学的方法又は酵素的方法を介する。いくつかの実施形態において、可動性リンカー（例えば、ＧＧＧＧＡＭＧＳ、配列番号１０８）は、可溶性ペプチドのソルターゼ媒介環化を可能にする。いくつかの実施形態において、提供される方法は、例えば、化学的方法又は酵素的方法を介して、可溶性ペプチドを環化するステップを更に含む。

【0240】

いくつかの実施形態において、提供される方法は、可溶性ペプチドを富化するステップを更に含む。いくつかの実施形態において、提供される方法は、可溶性ペプチドの可溶性凝集体を含む、溶液中に存在する任意の可溶性凝集体から可溶性ペプチドを分離することを更に含む。いくつかの実施形態において、分離は、活性な可溶性ペプチドを、そのより大きい、不活性な、又はあまり活性でない可溶性凝集体から分離することを伴う。いくつかの実施形態において、分離は、クロマトグラフィ法を使用して達成される。いくつかの実施形態において、富化又は分離は、サイズ排除クロマトグラフィによる。いくつかの実施形態において、分離は、可溶性ペプチドを含むが、その可溶性凝集体を含まない１つ以上の溶出画分を収集し、それによって可溶性ペプチドの富化又は精製された組成物を産生することを伴う。

【0241】

いくつかの実施形態において、提供される方法は、可溶性ペプチドを含む多重特異性結合分子を産生することを更に含む。いくつかの実施形態において、多重特異性結合分子は、可溶性ペプチドの複数のコピーを含む。いくつかの実施形態において、多重特異性結合分子は、異なる可溶性ペプチドを含む。いくつかの実施形態において、多重特異性結合分子は、可溶性ペプチド間（例えば、一方の可溶性ペプチドコピーのＣ末端と他方の可溶性ペプチドコピーのＮ末端との間）に可動性リンカー（例えば、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ）を含む。いくつかの実施形態において、１つの可溶性ペプチドは、ＩｇＧとして軽鎖と共に発現されるＶＨ領域に存在し、第２の可溶性ペプチドは、重鎖定常領域に融合される。いくつかの実施形態において、多重特異性結合分子は、同じ可溶性ペプチドを有する２つのＶＨ領域を含む。いくつかの実施形態において、多重特異性結合分子は、例えば、異種重鎖のみが互いに効果的に対合して二量体を形成するような定常領域変異を有する重鎖を使用して、異なる可溶性ペプチドを含むＶＨ領域を含む。いくつかの実施形態において、これらの変異は、ＦｃのＣＨ３ドメインにおける一方の鎖上のＴ２２Ｙ及び他方の鎖上のＹ８６Ｔなどの「ノブ・イントゥ・ホール」変異である。

【0242】

いくつかの実施形態において、発現ベクターは、融合タンパク質の発現を制御するための誘導性プロモーター配列を更に含む。本明細書で使用される場合、「プロモーター配列」という用語は、一般的にＤＮＡポリマー中に存在する遺伝子の上流に位置し、当該遺伝子のｍＲＮＡへの転写の開始部位を提供するＤＮＡ配列を指す。本発明における使用に好適なプロモーター配列は、ウイルス、バクテリオファージ、原核生物細胞又は真核生物細胞に由来してもよく、構成的プロモーター又は誘導性プロモーターであってもよい。

【0243】

いくつかの実施形態において、誘導性プロモーター配列は、融合タンパク質をコードする配列に作動可能に連結される。本明細書で使用される場合、「作動可能に連結された」という用語は、第１の配列が第２の配列の制御下で第２の配列又は領域に影響を及ぼすことができるように、第１の配列が第２の配列に十分に近接して配置されていることを意味する。例えば、プロモーター配列は、遺伝子配列に作動可能に連結されてもよく、通常、遺伝子配列の発現がプロモーター配列の制御下にあるように、遺伝子配列の５’末端に位置する。加えて、調節配列は、転写を促進する際にプロモーター配列の能力を増強するように、プロモーター配列に作動可能に連結され得る。このような場合、調節配列は、一般的に、プロモーター配列の５’末端に位置する。

【0244】

本発明における使用に好適なプロモーター配列は、好ましくは、以下のうちのいずれか１つに由来する：ウイルス、細菌細胞、酵母細胞、真菌細胞、藻類細胞、植物細胞、昆虫細胞、動物細胞、及びヒト細胞。例えば、細菌細胞において有用なプロモーターとしては、ｔａｃプロモーター、Ｔ７プロモーター、Ｔ７ Ａ１プロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ａｒａＢＡＤプロモーター、及びλＰＲＰＬプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。植物細胞において有用なプロモーターとしては、例えば、３５Ｓ ＣａＭＶプロモーター、アクチンプロモーター、ユビキチンプロモーターなどが挙げられる。哺乳動物細胞における使用に好適な調節エレメントとしては、ＣＭＶ－ＨＳＶチミジンキナーゼプロモーター、ＳＶ４０、ＲＳＶプロモーター、ＣＭＶエンハンサー、又はＳＶ４０エンハンサーが挙げられる。

【0245】

本発明における使用に好適なベクターとしては、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ウイルス、又はレトロウイルスなどの遺伝子工学技術において一般的に使用されるものが挙げられる。

【0246】

本発明における使用に好適なベクターは、転写開始部位、転写終結部位、リボソーム結合部位、ＲＮＡスプライシング部位、ポリアデニル化部位、翻訳終結部位などの他の発現制御エレメントを含んでもよい。本発明における使用に好適なベクターは、転写／翻訳エンハンサー配列などの更なる調節エレメント、及び好適な条件下でベクターのスクリーニングを可能にする少なくともマーカー遺伝子又はレポーター遺伝子を更に含んでもよい。本発明における使用に好適なマーカー遺伝子としては、例えば、真核生物細胞培養において有用なジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子及びＧ４１８又はネオマイシン耐性遺伝子、並びにＥ．ｃｏｌｉ及び他の細菌培養において有用なアンピシリン、ストレプトマイシン、テトラサイクリン、又はカナマイシン耐性遺伝子が挙げられる。本発明における使用に好適なベクターは、分泌シグナルをコードする核酸配列を更に含み得る。これらの配列は当業者に周知である。

【0247】

使用されるベクター及び宿主細胞系に依存して、本発明により産生される組換え遺伝子産物（タンパク質）は、組換え細胞内に残存するか、培養培地中に分泌されるか、周辺質中に分泌されるか、又は細胞膜の外表面上に保持されるかのいずれかであり得る。本発明の方法によって産生される組換え遺伝子産物（タンパク質）は、様々な標準的なタンパク質精製技術（アフィニティークロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィ、ゲル濾過、電気泳動、逆相クロマトグラフィ、等電点電気泳動などが挙げられるが、これらに限定されない）を使用することによって精製され得る。本発明の方法によって産生される組換え遺伝子産物（タンパク質）は、好ましくは、「実質的に純粋な」形態で回収される。本明細書で使用される場合、「実質的に純粋」という用語は、市販製品としての精製されたタンパク質の有効な使用を可能にする当該精製されたタンパク質の純度を指す。

【0248】

Ａ．宿主細胞
「宿主細胞」という用語は、核酸配列で形質転換、トランスフェクト、若しくは感染させた細胞、又は核酸配列で形質転換、トランスフェクト、若しくは感染させ、次いで目的のタンパク質を組換え産生するために目的の選択された遺伝子を発現することができる細胞を指すために使用される。この用語は、選択された遺伝子又は遺伝子修飾が存在する限り、子孫が形態又は遺伝的構成において元の親と同一であるか否かにかかわらず、親細胞の子孫を含む。

【0249】

可溶性ペプチド又は可溶性ペプチド及びシャペロン、例えば細菌シャペロンを含む融合タンパク質を産生するための提供される方法は、異種ポリペプチドを発現することができ、かつ遺伝子修飾することができる任意の宿主生物を使用して行うことができる。宿主生物は、好ましくは単細胞宿主生物であるが、生物が本明細書に記載されるように修飾され得、目的のポリペプチドがその中で発現され得る限り、多細胞生物の使用もまた、提供される方法によって包含される。明確にする目的のために、「宿主細胞」という用語は、本明細書全体を通して使用されるが、技術的理由のために実行不可能でない限り、宿主生物が宿主細胞の代わりに用いられ得ることが理解されるべきである。

【0250】

いくつかの実施形態において、宿主細胞は、細菌細胞などの原核生物細胞である。宿主細胞は、Ｂａｃｉｌｌｕｓなどのグラム陽性細菌細胞又はＥ．ｃｏｌｉなどのグラム陰性細菌であり得る。宿主生物は、好気性生物又は嫌気性生物であり得る。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、他の細胞型よりも少ないプロテアーゼを有する宿主細胞など、ポリペプチドを発現するのに好ましい特徴を有するものである。この目的に好適な細菌には、古細菌及び真正細菌、例えば、腸内細菌科が含まれる。有用な細菌の他の例としては、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ、Ｅｒｗｉｎｉａ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｐｒｏｔｅｕｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｒｈｉｚｏｂｉａ、Ｖｉｔｒｅｏｓｃｉｌｌａ、及びＰａｒａｃｏｃｃｕｓが挙げられる。有用な細菌の更なる例としては、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、及びＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐｅｃｉｅｓ、特に、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓが挙げられる。好適なＥ．ｃｏｌｉ宿主としては、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨＢ４、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ－２１（両方のｌｏｎが欠損している（Ｐｈｉｌｌｉｐｓ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５９：２８３，１９８４）及びｏｍｐＴプロテアーゼ）、Ｅ．ｃｏｌｉ ＡＤ４９４、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ ２７，３２５）、Ｅ．ｃｏｌｉ ２９４（ＡＴＣＣ ３１，４４６）、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｂ、及びＥ．ｃｏｌｉ Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ ３１，５３７）が挙げられる。他の株としては、メチオニン欠損であり、したがって、^３５ Ｓ－メチオニン又はセレノメチオニンによる標的タンパク質の高特異的活性標識を可能にするＥ．ｃｏｌｉ Ｂ８３４が挙げられる（Ｌｅａｈｙ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５８：９８７，１９９２）。更に他の目的の株としては、ＢＬＲ株、並びにＫ－１２株ＨＭＳ１７４及びＮｏｖａＢｌｕｅが挙げられ、これらは、プラスミド単量体収率を改善し、反復配列を含む標的プラスミドを安定化するのに役立ち得るｒｅｃＡ誘導体である。

【0251】

いくつかの実施形態において、提供される方法において使用されるＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉサイトゾルにおけるジスルフィド結合したタンパク質の可溶性発現を改善するように操作又は修飾される。いくつかの実施形態において、細胞質チオール－レドックス平衡環境は、チオレドキシンレダクターゼなどの還元経路における変化を介して変更される。いくつかの実施形態において、Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞は、ジスルフィド結合形成を許容する酸化細胞質を有する。グルタチオンレダクターゼΔｇｏｒ、チオレドキシンレダクターゼ、及び／又はグルタチオン生合成経路を欠く、ＳＨｕｆｆｌｅ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）及びＯｒｉｇａｍｉ（商標）（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を含む様々な種類の変異株が市販されている。いくつかの実施形態において、提供される方法の一部として形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ株は、Ｏｒｉｇａｍｉ（商標）（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）変異株である。

【0252】

好適なＢａｃｉｌｌｕｓ株としては、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｚｙｌｏｌｉｇｕｅｌａｃｉｅｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｌｃａｌｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｌａｕｓｅｉｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ、又はＢａｃｉｌｌｕｓ ｈａｌｏｄｕｒａｎｓが挙げられる。グラム陽性細菌Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓは、バイオテクノロジー産業における分泌タンパク質産生のための好ましい生物である。その需要は、主に、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓが、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉなどのグラム陰性細菌の周辺質において多くのタンパク質を保持する外膜を欠くという事実に基づいている。したがって、細胞質膜を横切って輸送されるＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓタンパク質の大部分は、成長培地中で直接終わる。加えて、外膜の欠如は、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓで産生されたタンパク質がリポ多糖（エンドトキシン）を含まないことを意味する。タンパク質産生宿主としてＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓを使用する他の利点は、その高い遺伝的従順性、約４１００個の遺伝子のほぼ全てにおいて変異を有する株の利用可能性、遺伝子発現のための株及びベクターを有するツールボックス、並びにこの細菌が一般的に安全であると認識されているという事実である（Ｂｒａｕｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１０：３７６－３８１，１９９９、Ｋｏｂａｙａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ １００：４６７８－４６８３，２００３、Ｋｕｎｓｔ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ３９０：２４９－２５６，１９９７、Ｚｅｉｇｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎ Ｅ．Ｇｏｌｄｍａｎ ａｎｄ Ｌ．Ｇｒｅｅｎ（ｅｄ．），Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，Ｆｌａ．，２００８）。

【0253】

別の実施形態において、宿主細胞は、酵母細胞又は哺乳類細胞などの真核生物細胞である。哺乳類細胞の例としては、チャイニーズハムスター卵巣細胞（Chinese hamster ovary cell、ＣＨＯ）（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ６１）、ＣＨＯ ＤＨＦＲ細胞（Ｕｒｌａｕｂ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９７：４２１６－４２２０（１９８０））、ヒト胎児腎臓（human embryonic kidney、ＨＥＫ）２９３若しくは２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１５７３）、又は３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ９２）が挙げられる。好適な哺乳類宿主細胞の選択、並びに形質転換、培養、増幅、スクリーニング、及び産物産生及び精製のための方法は、当該技術分野で既知である。他の好適な哺乳類細胞株は、サルＣＯＳ－１細胞株（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１６５０）及びＣＯＳ－７細胞株（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１６５１）、並びにＣＶ－１細胞株（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ７０）である。更なる例示的な哺乳類宿主細胞としては、霊長類細胞株及びげっ歯類細胞株（形質転換細胞株を含む）が挙げられる。正常な二倍体細胞、初代組織のインビトロ培養に由来する細胞株、並びに初代外植片もまた好適である。候補細胞は、選択遺伝子が遺伝子型的に欠損していても、優性に作用する選択遺伝子を含んでいてもよい。他の好適な哺乳類細胞株としては、マウス神経芽細胞腫Ｎ２Ａ細胞、ＨｅＬａ、マウスＬ－９２９細胞、Ｓｗｉｓｓ、Ｂａｌｂ－ｃ、又はＮＩＨマウスに由来する３Ｔ３株、ＢＨＫ又はＨａＫハムスター細胞株（これらは、ＡＴＣＣから入手可能である）が挙げられるが、これらに限定されない。これらの細胞株の各々は、タンパク質発現の当業者に既知であり、利用可能である。

【0254】

当業者に既知の酵母細胞の多くの株もまた、本明細書に記載のポリペプチドの発現のための宿主細胞として利用可能である。例示的な酵母細胞としては、例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｉｖｉｓａｅ及びＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓが挙げられる。Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｍなどの真菌もまた、本明細書に記載のポリペプチドの発現のための宿主細胞として利用可能である。

【0255】

加えて、所望される場合、昆虫細胞系が、提供される方法において利用され得る。そのような系は、例えば、Ｋｉｔｔｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１４：８１０－８１７（１９９３）、Ｌｕｃｋｌｏｗ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，４：５６４－５７２（１９９３）、及びＬｕｃｋｌｏｗ ｅｔ ａｌ．（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６７：４５６６－４５７９（１９９３）に記載されている。例示的な昆虫細胞は、Ｓｆ－９及びＨｉ５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ．）である。

【0256】

Ｂ．可溶性ペプチド
いくつかの実施形態において、提供される方法において産生される可溶性ペプチドは、可溶性超長ＣＤＲ３ノブである。いくつかの実施形態において、提供される方法において産生される可溶性ペプチドは、可溶性の合成又は半合成ペプチドである。いくつかの実施形態において、提供される方法において産生される可溶性ペプチドは、シクロチドである。いくつかの実施形態において、提供される方法において産生される可溶性ペプチドは、修飾されたシクロチドである。いくつかの実施形態において、提供される方法において産生される可溶性ペプチドは、半合成又は修飾された超長ＣＤＲ３ノブである。

【0257】

１．可溶性ウシ超長ＣＤＲ３ノブ
いくつかの実施形態において、提供される方法において産生される可溶性ペプチドは、可溶性超長ＣＤＲ３ノブである。いくつかの実施形態において、可溶性超長ＣＤＲ３ノブは、ウシ超長ＣＤＲ３である。いくつかの実施形態において、可溶性超長ＣＤＲ３ノブは、ウシｃＤＮＡ鋳型ライブラリー、例えば、免疫化ウシからの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から単離されたＲＮＡから調製されたものから増幅された配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、可溶性超長ＣＤＲ３ノブは、本明細書で提供される方法（例えば、セクションＩＩ－Ａ－１－ａ及びＩＩ－Ａ－１－ｂを参照されたい）のいずれかによりウシｃＤＮＡ鋳型ライブラリーから増幅された配列の全て又は一部を含む。いくつかの実施形態において、可溶性超長ＣＤＲ３ノブは、標的分子の結合剤として同定又は選択された任意のものである。いくつかの実施形態において、可溶性超長ＣＤＲ３ノブは、本明細書に提供される方法（例えば、セクションＩＩ～Ｃを参照されたい）のいずれかにより標的分子の結合剤として同定又は選択された任意の超長ＣＤＲ３ノブであるか、又はその一部である。

【0258】

２．可溶性合成ペプチド
いくつかの実施形態において、提供される方法において産生される可溶性ペプチドは、可溶性の合成又は半合成ペプチドである。いくつかの実施形態において、提供される方法において産生される可溶性ペプチドは、半合成又は修飾された超長ＣＤＲ３ノブである。いくつかの実施形態において、提供される方法において産生される可溶性ペプチドは、シクロチドである。いくつかの実施形態において、提供される方法において産生される可溶性ペプチドは、修飾されたシクロチドである。

【0259】

ａ．可溶性合成超長ＣＤＲ３ノブ
いくつかの実施形態において、可溶性ペプチドは、半合成超長ＣＤＲ３ノブである。いくつかの実施形態において、半合成超長ＣＤＲ３ノブは、修飾のための足場として使用されているウシ超長ＣＤＲ３ノブに由来する。いくつかの実施形態において、ウシ超長ＣＤＲ３ノブは、ウシｃＤＮＡ鋳型ライブラリー、例えば、免疫化ウシからの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から単離されたＲＮＡから調製されたものから増幅された配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、ウシ超長ＣＤＲ３ノブは、本明細書で提供される方法（例えば、セクションＩＩ－Ａ－１－ａ及びＩＩ－Ａ－１－ｂを参照されたい）のいずれかによりウシｃＤＮＡ鋳型ライブラリーから増幅された配列の全て又は一部を含む。いくつかの実施形態において、ウシ超長ＣＤＲ３ノブは、標的分子の結合剤として同定又は選択された任意のものである。いくつかの実施形態において、ウシ超長ＣＤＲ３ノブは、本明細書に提供される方法（例えば、セクションＩＩ～Ｃを参照されたい）のいずれかにより標的分子の結合剤として同定又は選択された任意の超長ＣＤＲ３ノブであるか、又はその一部である。

【0260】

いくつかの実施形態において、ウシ超長ＣＤＲ３ノブは、例えば、半合成超長ＣＤＲ３ノブが依然として２～２０のシステイン残基及び１～１０のジスルフィド結合を含むように、例えば、本明細書に記載されるシステインモチーフ及びジスルフィド結合構造を保存しながら、ランダム変異を含むように修飾されている。いくつかの実施形態において、ウシ超長ＣＤＲ３ノブは、外因性ペプチド配列を含むように修飾されている。いくつかの実施形態において、ウシ超長ＣＤＲ３ノブは、例えば、半合成超長ＣＤＲ３ノブが依然として２～２０のシステイン残基及び１～１０のジスルフィド結合を含むように、例えば、本明細書に記載されるシステインモチーフ及びジスルフィド結合構造を保存しながら、その中の１つ以上のペプチド配列を欠失させるように修飾されている。

【0261】

ｂ．可溶性シクロチド
いくつかの実施形態において、提供される方法において産生される可溶性ペプチドは、可溶性シクロチドである。いくつかの実施形態において、シクロチドは、外因性ペプチド配列を含むように修飾されたシクロチドである。

【0262】

システイン－ノットマイクロタンパク質（シクロチド）は、様々な植物種において見出されるシステイン－ノットマイクロタンパク質又はシクロチドの天然に存在するファミリーを含む。システイン－ノットマイクロタンパク質（シクロチド）は、典型的には、約３０～４０個のアミノ酸からなる小ペプチドであり、環状又は直鎖状形態として天然に見出すことができ、環状形態は、遊離Ｎ末端又はＣ末端のアミノ又はカルボキシル末端も有さない。それらは、３つの分子内ジスルフィド結合及び小さな三本鎖βシートに基づく明確な構造を有する（Ｃｒａｉｋ ｅｔ ａｌ．，２００１；Ｔｏｘｉｃｏｎ ３９，４３－６０）。環状タンパク質は、本明細書において「システインノット」と呼ばれる構造を明確にする保存されたシステイン残基を示す。このファミリーは、天然に存在する環状分子及びそれらの直鎖状誘導体の両方、並びに環化を受けた直鎖状分子を含む。これらの分子は、あまり構造化されていないペプチドよりも高い安定性を有する分子フレームワーク構造として有用である。（Ｃｏｌｇｒａｖｅ ａｎｄ Ｃｒａｉｋ，２００４；Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４３，５９６５－５９７５）。

【0263】

主なシクロチドの特徴は、システインノットによる顕著な安定性、化学合成に容易に利用できるようにする小さなサイズ、及び配列変異に対する優れた耐性である。シクロチド足場は、ほぼ３０の異なるタンパク質ファミリーにおいて見出され、その中で、コノトキシン、クモ毒、カボチャ属阻害剤、アグーチ関連タンパク質、及び植物シクロチドが、最も多く存在するファミリーである。Ｒｕｂｉａｃｅａｅ科及びＶｉｏｌａｃｅａｅ科の植物からのシクロチドは、大部分が頭－尾環状ペプチドであることが見出されている（Ｃｒａｉｋ ｅｔ ａｌ．２０１０．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．６７：９－１６）。しかしながら、シクロチドのカボチャ属阻害剤ファミリー内では、環状及び直鎖状の両方のシクロチドは、Ｍｏｍｏｒｄｉｃａ ｃｏｃｈｉｎｃｈｉｎｅｎｓｉｓから同定されている：環状トリプシン阻害剤（ＭＣｏＴＩ）－Ｉ及び－ＩＩ、並びにそれらの直鎖状対応物ＭＣｏＴＩ－ＩＩＩ（Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ ｅｔ ａｌ．２０００．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３９，５７２２－５７３０）。現在、環状及び直鎖状バリアントの両方が異なるシクロチドファミリーに存在し得ることが明らかであるが、環化の影響はあまり理解されていない。環状ペプチドは、それらの直鎖状対応物と比較した場合、改善された安定性、プロテアーゼに対するより良好な耐性、及び低減された可動性を示すことが予想され、望ましくは、増強された生物学的活性をもたらす。しかしながら、直鎖状シクロチドは、他のペプチド又はタンパク質により容易に結合することができるという利点を有する。

【0264】

例えば、シクロチドは、植物において一般的に見出される。提供される実施形態の態様において、シクロチドは、Ｍｏｍｏｒｄｉｃａｅ、Ｒｕｂｉａｃｅａｅ、及びＶｉｏｌａｃｅａｅの植物種のシクロチドの直鎖状又は環状形態に由来する。好ましい態様において、本発明のシクロチドは、カボチャ属セリンプロテアーゼ阻害剤ファミリーを含むＭｏｍｏｒｄｉｃａｅ種のシクロチドの直鎖状又は環状形態に由来し（Ｏｔｌｅｗｓｋｉ ＆ Ｋｏｒｏｗａｒｓｃｈ Ａｃｔａ Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｐｏｌ．１９９６；４３（３）：４３１－４４）、より好ましい態様において、以下のＭｏｍｏｒｄｉｃａ ｃｏｃｈｉｎｃｈｉｎｅｎｓｉｓトリプシン阻害剤ＭＣｏＴＩ－Ｉ［配列番号９５］及び－ＩＩ［配列番号９６］（天然に環状）、並びにＭＣｏＴＩ－ＩＩＩ（天然に直鎖状）［配列番号９７］に由来する。
Ｍｃｏｔｉ－Ｉ ＧＧＶＣＰＫＩＬＱＲＣＲＲＤＳＤＳＰＧＡＣＩＣＲＧＮＧＹＣＧＳＧＳＤ［配列番号９５］
Ｍｃｏｔｉ－ＩＩ ＧＧＶＣＰＫＩＬＫＫＣＲＲＤＳＤＳＰＧＡＣＩＣＲＧＮＧＹＣＧＳＧＳＤ［配列番号９６］
Ｍｃｏｔｉ－ＩＩＩ ＥＲＡＣＰＲＩＬＫＫＣＲＲＤＳＤＳＰＧＡＣＩＣＲＧＮＧＹＣＧ［配列番号９７］

【0265】

いくつかの実施形態において、シクロチド分子フレームワークは、システイン－ノット骨格を形成するアミノ酸又はその類似体の配列を含み、当該システイン－ノット骨格は、当該システイン－ノット骨格の三次元構造にノットトポロジーを付与するのに十分なジスルフィド結合又はその化学的等価物を含み、１つ以上のベータターン上及び／又は１つ以上のループ内などの少なくとも１つの露出したアミノ酸残基が、天然に存在するアミノ酸配列と比較して挿入又は置換されている（置き換えられている）。いくつかの実施形態において、シクロチドは、外因性ペプチド配列の挿入又は外因性ペプチド配列による置換によって修飾される。したがって、本明細書に記載のシクロチドは、天然又は野生型非修飾シクロチドと比較して修飾されたシクロチドであり、修飾されたシクロチドは、１つ以上のアミノ酸配列、例えば、外因性ペプチド配列によって挿入又は置換された１つ以上のループを有する。提供される実施形態の態様において、修飾されたシクロチドは、高い酵素安定性を提供するのに十分なアミノ酸構造を組み込む。

【0266】

いくつかの実施形態において、修飾されたシクロチド配列は、システインノット骨格部分及び外因性ペプチド配列を有するものとして定義されてもよく、当該修飾されたシクロチドは、ｉ）外因性ペプチド配列であって、当該配列が約２～５０のアミノ酸残基である外因性ペプチド配列と、ｉｉ）ステップｉ）の当該配列にグラフトされたシステインノット骨格であって、当該システインノット骨格が、構造（Ｉ）：

【化2】

【0267】

（式中、Ｃ_１～Ｃ_６は、システイン残基であり、Ｃ_１及びＣ_４、Ｃ_２及びＣ_５、並びにＣ_３及びＣ_６の各々は、ジスルフィド結合によって連結されてシステインノットを形成し、各Ｘは、ループ内のアミノ酸残基を表し、当該アミノ酸残基は、同じであるか又は異なり、ｄは、約１～２であり、ループ１、２、３、５、又は６のうちの１つ以上は、節ｉ）の配列を含むアミノ酸配列を有し、節ｉ）の当該配列を含む任意のループは、２～約５０個のアミノ酸を含み、節ｉ）の当該配列を含まないループ１、２、３、５、又は６のうちのいずれかについて、ａ、ｂ、ｃ、ｅ、及びｆは、同じであるか又は異なり、各々３～１０の任意の数であり、ｂ、ｃ、ｅ、及びｆは、各々１～２０の任意の数である）を含むシステインノット骨格と、を含む。

【0268】

いくつかの実施形態において、修飾されたシクロチド配列は、直鎖状又は環状のいずれかであり得る。

【0269】

いくつかの実施形態において、修飾されたシクロチドは、Ｍｏｍｏｒｄｉｃａｅ、Ｒｕｂｉａｃｅａｅ、及びＶｉｏｌａｃｅａｅの植物種のシクロチドの直鎖状又は環状形態に由来する。いくつかの実施形態において、修飾されたシクロチドは、カボチャ属セリンプロテアーゼ阻害剤ファミリーを含むＭｏｍｏｒｄｉｃａｅ種のシクロチドの直鎖状又は環状形態に由来する（Ｏｔｌｅｗｓｋｉ ＆ Ｋｏｒｏｗａｒｓｃｈ Ａｃｔａ Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｐｏｌ．１９９６；４３（３）：４３１－４４）。いくつかの実施形態において、修飾されたシクロチドは、以下のＭｏｍｏｒｄｉｃａ ｃｏｃｈｉｎｃｈｉｎｅｎｓｉｓトリプシン阻害剤ＭＣｏＴＩ－Ｉ［配列番号９５］及び－ＩＩ［配列番号９６］（天然に環状）、並びにＭＣｏＴＩ－ＩＩＩ（天然に直鎖状）［配列番号９７］に由来する。
Ｍｃｏｔｉ－Ｉ ＧＧＶＣＰＫＩＬＱＲＣＲＲＤＳＤＳＰＧＡＣＩＣＲＧＮＧＹＣＧＳＧＳＤ［配列番号９５］
Ｍｃｏｔｉ－ＩＩ ＧＧＶＣＰＫＩＬＫＫＣＲＲＤＳＤＳＰＧＡＣＩＣＲＧＮＧＹＣＧＳＧＳＤ［配列番号９６］
Ｍｃｏｔｉ－ＩＩＩ ＥＲＡＣＰＲＩＬＫＫＣＲＲＤＳＤＳＰＧＡＣＩＣＲＧＮＧＹＣＧ［配列番号９７］

【0270】

例えば、未修飾又は野生型シクロチドは、配列番号９５～９７のいずれか１つに示されるシクロチドであり、その１つ以上のループが１つ以上のアミノ酸配列（例えば、外因性ペプチド配列）によって挿入又は置換されているシクロチドであり得る。特定の実施形態において、修飾されたシクロチドは、Ｍｃｏｔｉ－ＩＩ（配列番号９６）に基づくループ置換ライブラリーに由来する。

【0271】

いくつかの実施形態において、外因性ペプチド配列が挿入又は置換されるループは、ループ１である。いくつかの実施形態において、外因性ペプチド配列が挿入又は置換されるループは、ループ５である。いくつかの実施形態において、外因性ペプチド配列が挿入又は置換されるループは、環化を受けて形成されるようなループ６である。

【0272】

ＩＶ．ペプチドを含む抗体
また、本明細書では、いくつかの実施形態において、全長ＩｇＧ又はＦａｂを産生することを含む方法も提供される。いくつかの実施形態において、全長ＩｇＧ又はＦａｂは、本明細書で提供される方法のいずれかにより選択される抗体結合タンパク質又はペプチドから産生される。いくつかの実施形態において、全長ＩｇＧ又はＦａｂは、本明細書に提供される方法のいずれかにより産生される可溶性ペプチドから産生される。

【0273】

いくつかの実施形態において、抗体結合タンパク質はｓｃＦｖであり、方法は、ｓｃＦｖのＶＨ領域を定常領域又はその一部と連結することを含む、重鎖又はその一部を構築することを含む。

【0274】

いくつかの実施形態において、方法は、ヒト化ウシＶＨ領域の超長ＣＤＲ３領域のノブ領域を、選択された抗体結合タンパク質の超長ＣＤＲ３領域で置換することによってヒト化ＶＨ領域を構築することを含む。いくつかの実施形態において、選択された抗体結合タンパク質の超長ＣＤＲ３領域は、ヒト化ウシＶＨ領域の上昇ストーク鎖と下降ストーク鎖との間で置換される。いくつかの実施形態において、ＶＨ領域は式Ｖ１－Ｘ－Ｖ２を含み、重鎖のＶ１領域は、配列番号１１１に示される配列を含み、Ｘ領域は、選択された抗体の超長ＣＤＲ３を含み、Ｖ２領域は、配列番号１１２に示される配列を含む。

【0275】

いくつかの実施形態において、方法は、ヒト化ＶＨ領域を定常領域又はその一部と連結することを含む、重鎖又はその一部を構築することを更に含む。いくつかの実施形態ｉにおいて、重鎖又はその一部は、ヒトＩｇＧ１重鎖又はその一部である。いくつかの実施形態において、方法は、重鎖又はその一部を軽鎖と共発現させることを更に含む。

【0276】

いくつかの実施形態において、軽鎖は、ＢＬＶＨ１２、ＢＬＶ５Ｄ３、ＢＬＶ８Ｃ１１、ＢＦ１Ｈ１、ＢＬＶ５Ｂ８、若しくはＦ１８のウシ軽鎖であるか、又はそのヒト化バリアントである。いくつかの実施形態において、軽鎖は、ＢＬＶ１Ｈ１２軽鎖（配列番号１１３）又はそのヒト化バリアントである。いくつかの実施形態において、軽鎖は、配列番号１１４に示されるヒト化軽鎖である。いくつかの実施形態において、軽鎖は、ＢＬＶ５Ｂ８軽鎖（配列番号１１５）又はそのヒト化バリアントである。いくつかの実施形態において、軽鎖はヒト軽鎖である。いくつかの実施形態において、軽鎖は、ＶＬ１～４７、ＶＬ１～４０、ＶＬ１～５１、及びＶＬ２～１８からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、軽鎖は、配列番号１１６～１２０のうちのいずれか１つに示される。

【0277】

いくつかの実施形態において、方法によって選択又は産生される抗体結合タンパク質又はペプチドは、複数の提供されるペプチド（例えば、ノブペプチド）のうちのいずれかを含む多重特異性結合タンパク質としてフォーマットされる。いくつかの実施形態において、ノブペプチドなどの複数のペプチドは、パラトープである。いくつかの実施形態において、ノブペプチドなどの複数のペプチドは、２、３、又は４つのペプチドである。多重特異性ポリペプチドを生成するための例示的なフォーマットを図１２に示す。

【0278】

いくつかの実施形態において、ノブペプチドなどの１つ以上のペプチドは、可動性リンカー（例えば、ＧＧＧＳ又は他の類似の可動性リンカー、（ＧＧＧＳ）ｎ（式中、ｎは１～３である）のより長いリンカーを含む）で分離された単一ポリペプチド鎖中で直列に連結される。いくつかの実施形態において、直列単一ポリペプチドは、二価、三価、四価、又は他の多価分子を産生するために、２、３、４つ以上のペプチド、例えばノブペプチドを含んでもよい。

【0279】

いくつかの実施形態において、ノブペプチドなどのペプチドは、本明細書に記載のヒト化超長重鎖分子のうちのいずれかを含む超長ＣＤＲ－Ｈ３足場のノブ領域の置換によって再フォーマットされる。重鎖は、本明細書に記載の軽鎖分子のうちのいずれかなどの軽鎖と複合体化され得る。いくつかの実施形態において、細胞において産生される場合、２本鎖ポリペプチドは、２つの重鎖分子間のジスルフィド形成から生じる二量体化によって形成される。いくつかの実施形態において、ノブペプチドなどのペプチドを含む修飾された免疫グロブリンは、ペプチド、例えばノブペプチドを含むホモ二量体である。他の実施形態において、２つの異なる重鎖は、各々異なるペプチド（例えば、ノブペプチド）を保有する２つの異なる重鎖が相互作用して、ヘテロ二量体を形成し得るヘテロ二量体を産生するために、ノブ・イントゥ・ホール（knobs-into-hole）操作戦略又は他の戦略を使用して細胞において共発現され得る。いくつかの実施形態において、定常鎖の残基は、ヘテロ二量体形成を促進するためにアミノ酸置換によって修飾される。任意の実施形態のいくつかでは、１つ以上のアミノ酸修飾は、電荷反発による自己会合を低減又は防止するために、ノブ・イントゥ・ホール修飾及び電荷変異から選択される。ヘテロ二量体は、第１のポリペプチドサブユニットをコードする第１の核酸分子及び第２の異なるポリペプチドサブユニットをコードする第２の核酸分子の両方を細胞に形質転換することによって形成され得る。いくつかの態様において、ヘテロ二量体は、二量体の形成を媒介するための２つのポリペプチドサブユニットの残基間の共有結合又は非共有結合相互作用の結果として、細胞からの発現及び分泌の際に産生される。そのようなプロセスにおいて、一般的に、ホモ二量体及びヘテロ二量体を含む二量体分子の混合物が形成される。ヘテロ二量体の生成のために、精製のための更なるステップが必要であり得る。例えば、第１及び第２のポリペプチドは、金属キレート又は他のエピトープを有するタグを含むように操作することができ、タグは異なる。タグ付けされたドメインは、ウエスタンブロット、免疫沈降、又はバイオアッセイにおける活性枯渇／遮断による検出を可能にするために、金属キレートクロマトグラフィ及び／又は抗体による迅速な精製のために使用され得る。方法としては、米国特許第１０，９９５，１２７号に記載されるものが挙げられる。いくつかの実施形態において、ヒトＩｇＧ１は、ＣＨ３ドメインにＴ２２Ｙアミノ酸置換を含み、第２のＩｇＧ１重鎖は、重鎖にＹ８６Ｔアミノ酸置換を含む。

【0280】

Ｖ．免疫化
いくつかの実施形態において、提供される方法は、免疫化ウシから単離されたＲＮＡから調製されるｃＤＮＡ鋳型ライブラリーの使用又はそれからの増幅を含む。いくつかの実施形態において、方法は、ウシを標的抗原で免疫化することを更に含む。

【0281】

いくつかの実施形態において、標的抗原は、非病原性細菌、ウイルス、ウイルスタンパク質、癌抗原、ヒトＩｇＧ、又はその組換えタンパク質である。いくつかの実施形態において、標的抗原は、例えばコロナウイルス、例えばＳＡＲＳ ＣｏＶ－２に関連するウイルス又はウイルスタンパク質である。

【0282】

いくつかの実施形態において、ウシは、標的抗原又は関連する標的抗原の群、例えばウイルスのバリアントに関連する抗原を含む抗原組成物の少なくとも１用量を投与することによって免疫化される。いくつかの実施形態において、抗原組成物は、アジュバントを更に含む。当業者は、多くの潜在的に有用なアジュバント、例えば、フロイント完全アジュバント、ミョウバン、及びスクアレンに精通している。例えば、米国特許出願公開第２０１５／０３６１１６０号を参照されたく、これは、全ての目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。本発明の組成物中で使用され得るアジュバントとしては、油型エマルジョン組成物（水中油型エマルジョン及び油中水型エマルジョン）、完全フロイントアジュバント（complete Freund's adjuvant、ＣＦＡ）、及び不完全フロイントアジュバント（incomplete Freund's adjuvant、ＩＦＡ）が挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態において、アジュバントは、ＲＩＢＩ、Ｉｓｃｏｍａｔｒｉｘ、又はＥＮＡＢＬ Ｃｌ（ＶａｘＬｉａｎｔ）を含む。本発明における使用に好適なアジュバントには、腸内細菌性リポ多糖（lipopolysaccharide、ＬＰＳ）の誘導体、リピドＡ誘導体、免疫刺激性オリゴヌクレオチド、及びＡＤＰ－リボシル化毒素、並びにそれらの無毒化誘導体などの細菌又は微生物誘導体が含まれる。

【0283】

ウシ（cattle）などのウシ（bovine）を免疫化して、例えば、高力価の初乳、乳汁、血清、又は免疫組織（例えば、ＰＢＭＣ）を産生するための方法は、当該技術分野において既知である。そのような方法は、例えば、米国特許出願公開第２００７／００５３９１７号及び第２０１３／００２２６１９号に開示されており、これらの各々は、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0284】

いくつかの実施形態において、免疫化は、抗原組成物の初回刺激用量及び少なくとも１回の追加免疫用量を投与することを含む。いくつかの実施形態において、免疫化は、抗原組成物の２回以上の追加免疫用量を投与することを含む。一実施形態において、初回刺激用量及び少なくとも１回の追加免疫用量は、同じ抗原組成物を含む。いくつかの実施形態において、２回以上の追加免疫用量は、同じ抗原組成物を含む。動物は、数日、数週間、又は数ヶ月の期間にわたって間隔を置いて免疫原組成物を投与され得る。免疫化レジメンの終わりに、血液、乳汁、又は初乳などの過免疫材料を採取する。一実施形態において、過免疫材料は、初回刺激用量を投与してから２ヶ月未満、３ヶ月未満、４ヶ月未満、５ヶ月未満、６ヶ月未満、９ヶ月未満、又は１２ヶ月未満後に収集される。一実施形態において、過免疫材料は、初回刺激用量を投与してから約３ヶ月～約６ヶ月後に収集される。一実施形態において、過免疫材料は、初回刺激用量を投与してから約３ヶ月～約９ヶ月後に収集される。いくつか実施形態において、過免疫材料は、初回刺激用量を投与してから約３ヶ月～約１２ヶ月後に収集される。一実施形態において、過免疫材料は、初回刺激用量を投与してから約６ヶ月～約１２ヶ月後に収集される。

【0285】

いくつかの実施形態において、方法は、ウシから生物学的試料を単離することを更に含む。いくつかの実施形態において、生物学的試料は、乳汁、血液、血清、初乳、又は末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）である。一実施形態において、生物学的試料は、初回刺激用量を投与してから２ヶ月未満、３ヶ月未満、４ヶ月未満、５ヶ月未満、６ヶ月未満、９ヶ月未満、又は１２ヶ月未満後に収集される。一実施形態において、生物学的試料は、初回刺激用量を投与してから約３ヶ月～約６ヶ月後に収集される。いくつか実施形態において、生物学的試料は、初回刺激用量を投与してから約３ヶ月～約９ヶ月後に収集される。いくつか実施形態において、生物学的試料は、初回刺激用量を投与してから約３ヶ月～約１２ヶ月後に収集される。いくつかの実施形態において、生物学的試料は、初回刺激用量を投与してから約６ヶ月～約１２ヶ月後に収集される。

【0286】

いくつかの実施形態において、方法は、ウシから末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離することと、例えば、超長ＣＤＲ３を含む候補結合ペプチドをコードするポリヌクレオチドをクローニングすることとを更に含む。一実施形態において、ポリヌクレオチドをクローニングすることは、単一細胞ＲＴ－ＰＣＲ増幅を行うことを含む。

【0287】

ＶＩ．組成物及び製剤
医薬組成物及び製剤を含む、本明細書に記載の抗体若しくは抗原結合断片又はノブペプチドなどの結合ポリペプチドを含む組成物も提供される。一実施形態において、組成物は、本明細書に記載されるように産生される可溶性ペプチドを含む。一実施形態において、組成物は、本明細書に記載されるように産生される可溶性ペプチドを含む融合タンパク質を含む。一実施形態において、組成物は、標的分子への結合能力について同定された、例えば、本明細書に記載されるように同定された可溶性ペプチドを含む。いくつかの実施形態において、組成物は、超長ＣＤＲ３を含むノブポリペプチド又は合成ペプチドを含む。医薬組成物及び製剤は、一般的に、１つ以上の任意の薬学的に許容される担体又は賦形剤を含む。

【0288】

「医薬製剤」という用語は、その中に含まれる活性成分の生物学的活性が有効であることを可能にするような形態であり、製剤が投与される対象にとって許容できないほど毒性である追加の構成要素を含まない調製物を指す。

【0289】

「薬学的に許容される担体」は、対象に非毒性である、活性成分以外の医薬製剤中の成分を指す。薬学的に許容される担体としては、緩衝剤、賦形剤、安定剤、又は保存剤が挙げられるが、これらに限定されない。

【0290】

いくつかの態様において、担体の選択は、特定の細胞、結合分子、及び／若しくは抗体によって、並びに／又は投与方法によって部分的に決定される。したがって、様々な好適な製剤が存在する。例えば、医薬組成物は保存剤を含むことができる。好適な保存剤としては、例えば、メチルパラベン、プロピルパラベン、安息香酸ナトリウム、及び塩化ベンザルコニウムが挙げられ得る。いくつかの態様において、２つ以上の保存剤の混合物が使用される。防腐剤又はその混合物は、典型的には、全組成物の約０．０００１重量％～約２重量％の量で存在する。担体は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １６ ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０）に記載されている。薬学的に許容される担体は、一般的に、用いられる投薬量及び濃度でレシピエントに非毒性であり、緩衝液、例えば、リン酸、クエン酸、及び他の有機酸；アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤；防腐剤（例えば、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド、塩化ヘキサメソニウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、ブチル、又はベンジルアルコール、アルキルパラベン、例えば、メチル又はプロピルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、３－ペンタノール、及びｍ－クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、若しくは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、若しくはリジンなどのアミノ酸；グルコース、マンノース、若しくはデキストリンを含む、単糖類、二糖類、及び他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロース、若しくはソルビトールなどの糖類；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ－タンパク質錯体）；並びに／又はポリエチレングリコール（polyethylene glycol、ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤が挙げられるが、これらに限定されない。

【0291】

いくつかの態様において、緩衝剤が組成物に含まれる。好適な緩衝剤としては、例えば、クエン酸、クエン酸ナトリウム、リン酸、リン酸カリウム、並びに様々な他の酸及び塩が挙げられる。いくつかの態様において、２つ以上の緩衝剤の混合物が使用される。緩衝剤又はその混合物は、典型的には、全組成物の約０．００１重量％～約４重量％の量で存在する。投与可能な医薬組成物を調製するための方法は既知である。例示的な方法は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ；２１ｓｔ ｅｄ．（Ｍａｙ １，２００５）により詳細に記載されている。

【0292】

本明細書に記載の抗体の製剤は、凍結乾燥製剤及び水溶液を含み得る。

【0293】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗体は、薬学的に許容される希釈剤、担体、又は賦形剤内で、単位用量形態で投与され得る。ＳＡＲＳ ＣｏＶ－２感染の治療を受ける個体に投与するための好適な製剤又は組成物を提供するために、従来の薬務を用いることができる。いくつかの実施形態において、投与は、予防的である。任意の適切な投与経路が用いられてもよく、例えば、投与は、非経口、静脈内、動脈内、皮下、筋肉内、腹腔内、鼻腔内、エアロゾル、坐剤、経口投与、又は吸入によるものであってもよい。

【0294】

製剤には、経口、静脈内、腹腔内、皮下、肺、経皮、筋肉内、鼻腔内、頬側、舌下、又は坐剤投与用のものが含まれる。いくつかの実施形態において、細胞集団は、非経口的に投与される。本明細書で使用される場合、「非経口」という用語は、静脈内、筋肉内、皮下、直腸、膣、頭蓋内、胸腔内、及び腹腔内投与を含む。

【0295】

いくつかの実施形態において、組成物は、滅菌液体調製物、例えば、等張水溶液、懸濁液、エマルジョン、分散液、又は粘性組成物として提供され、これらは、いくつかの態様において、選択されたｐＨに緩衝化され得る。液体調製物は、通常、ゲル、他の粘性組成物、及び固体組成物よりも調製が容易である。加えて、液体組成物は、特に注射によって投与するのに幾分より便利である。一方、粘性組成物は、特定の組織とのより長い接触期間を提供するために、適切な粘度範囲内で製剤化され得る。液体又は粘性組成物は担体を含むことができ、担体は、例えば、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール）、及びそれらの好適な混合物を含む溶媒又は分散媒であり得る。

【0296】

滅菌注射溶液は、結合分子を溶媒中に、例えば、無菌水、生理学的生理食塩水、グルコース、デキストロースなどの好適な担体、希釈剤、又は賦形剤と混合して組み込むことによって調製することができる。組成物はまた、凍結乾燥され得る。組成物は、投与経路及び所望の調製物に応じて、補助物質、例えば、湿潤剤、分散剤、又は乳化剤（例えば、メチルセルロース）、ｐＨ緩衝剤、ゲル化若しくは粘度増強添加剤、保存剤、香味剤、着色剤などを含むことができる。いくつかの態様において、好適な調製物を調製するために標準的な教科書を参考にすることができる。

【0297】

抗菌性保存剤、抗酸化剤、キレート剤、及び緩衝剤を含む、組成物の安定性及び無菌性を増強する様々な添加剤を添加することができる。微生物の作用の防止は、様々な抗菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸などによって確実にすることができる。注射可能な医薬形態の長期吸収は、吸収を遅らせる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンの使用によってもたらすことができる。

【0298】

本発明による医薬組成物は、例えば、アンプル、バイアル、坐剤、錠剤、丸剤、又はカプセル剤の形態などの単位用量形態であってもよい。製剤は、治療有効量又は予防有効量（例えば、病的状態を予防、排除、又は低減する量）でヒト個体に投与して、疾患又は状態のための療法を提供することができる。投与される治療剤の好ましい投薬量は、障害の種類及びｉ程度、特定の患者の全体的な健康状態、複合賦形剤の製剤化、並びにその投与経路などの変数に依存する可能性がある。

【0299】

ある特定の実施形態において、本明細書に記載の組成物は、肺（pneumonal）投与用に製剤化することができ、ある特定の実施形態において、組成物は、吸入（例えば、気管支内、鼻腔内、又は経口吸入、鼻腔内点滴薬）による投与用に製剤化される。組成物は、ネブライザー、吸入器、アトマイザー、エアロゾル化装置、ミスター、乾燥粉末吸入器、定量吸入器、定量噴霧器、定量ミスター、定量アトマイザー、又は他の好適な送達装置を使用して投与することができる。

【0300】

いくつかの実施形態において、組成物は、凍結乾燥させた組成物である。いくつかの実施形態において、組成物はエアロゾル投与用に製剤化され、ある特定の実施形態において、組成物は経口投与又は吸入による投与用に製剤化される。

【0301】

本明細書に記載の医薬組成物は、それ自体既知の方法で、例えば、従来の溶解、凍結乾燥、混合、造粒、又は糖衣化プロセスによって調製される。医薬組成物は、従来の薬務（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ（２１ｓｔ ｅｄ．），ｅｄ．Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，２００５，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ及びＥｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｅｄｓ．Ｊ．Ｓｗａｒｂｒｉｃｋ ａｎｄ Ｊ．Ｃ．Ｂｏｙｌａｎ，２０１３，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ）に従い製剤化され得る。

【0302】

エアロゾル投与が適切である場合、スクアラミン又はその誘導体は、標準的な手順を使用してエアロゾルとして製剤化され得る。「エアロゾル」という用語は、細気管支又は鼻腔に吸入することができるスクアラミン又はその誘導体の任意のガス中懸濁相を含み、乾燥粉末及び水性エアロゾル並びに肺及び鼻エアロゾルを含む。具体的には、エアロゾルは、定量吸入器若しくはネブライザー、又はミスト噴霧器においてもたらされ得るように、スクアラミン又はその誘導体の液滴のガス中懸濁液を含む。エアロゾルはまた、空気又は他のキャリアガス中に懸濁された本発明の化合物の乾燥粉末組成物を含み、これは、例えば、吸入器デバイスからの吹送によって送達され得る。Ｇａｎｄｅｒｔｏｎ ＆ Ｊｏｎｅｓ，Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｔｏ ｔｈｅ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｔｒａｃｔ（Ｅｌｌｉｓ Ｈｏｒｗｏｏｄ，１９８７）、Ｇｏｎｄａ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，６：２７３－３１３（１９９０）、及びＲａｅｂｕｒｎ ｅｔ ａｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，２７：１４３－１５９（１９９２）を参照されたい。

【0303】

インビボ投与に使用される製剤は、一般的に無菌である。注射用組成物は、無菌条件下で通常の方法で調製される。同じことが、組成物をアンプル又はバイアルに導入し、容器を密封することにも当てはまる。無菌性は、例えば、無菌濾過膜を通した濾過によって容易に達成され得る。

【0304】

いくつかの態様において、医薬組成物は、組成物の送達が、治療されるべき部位の感作の前に、かつ感作を引き起こすのに十分な時間で生じるように、時間放出送達系、遅延放出送達系、及び持続放出送達系を用いることができる。多くの種類の放出送達系が利用可能であり、既知である。そのような系は、組成物の反復投与を回避することができ、それによって対象及び医師に対する利便性が増大される。

【0305】

いくつかの実施形態において、医薬組成物は、抗体又は抗原結合断片などの結合ポリペプチドを、疾患又は状態を治療又は予防するのに有効な量、例えば、治療有効量又は予防有効量で含む。いくつかの実施形態において、治療的又は予防的有効性は、治療された対象の定期的な評価によってモニタリングされる。数日以上にわたる反復投与の場合、状態に応じて、疾患症状の所望の抑制が生じるまで治療を繰り返す。しかしながら、他の投薬レジメンが有用であり得、決定され得る。所望の投薬量は、組成物の単回ボーラス投与によって、組成物の複数回ボーラス投与によって、又は組成物の連続注入投与によって送達することができる。

【0306】

ＶＩＩ．使用方法
本明細書において、対象における疾患又は状態を治療するための治療方法及び使用が提供される。いくつかの実施形態において、方法及び使用は、提供される結合ポリペプチド、例えば、抗体若しくは抗原結合断片又はノブペプチドを対象（例えば、ヒト）に投与することを含む。いくつかの実施形態において、結合ポリペプチド又はそれを含む組成物は、非経口投与によって対象に投与される。いくつかの実施形態において、結合ポリペプチド又はそれを含む組成物は、筋肉内、皮下、静脈内、局所、経口、又は吸入によって投与される。特定の実施形態において、特にノブペプチドの送達のために、投与は吸入による。いくつかの実施形態において、提供される結合ポリペプチド、例えば、ノブペプチドは、エアロゾル投与によって、例えば、吸入器若しくはネブライザー又はミスト噴霧器を使用する送達によって投与され得る。

【0307】

いくつかの実施形態において、提供される実施形態は、対象における癌又は増殖性疾患を治療又は予防するための方法に関する。いくつかの実施形態において、提供される実施形態は、対象におけるコロナウイルス感染を治療又は予防するための方法に関する。いくつかの実施形態において、方法は、ウイルス感染のリスクがある対象におけるウイルス感染の予防的治療のためのものである。いくつかの実施形態において、方法は、ウイルス感染を有することが既知であるか又は疑われる対象を治療するためのものである。いくつかの実施形態において、方法は、対象におけるコロナウイルス感染症などのウイルス感染を予防し得る。いくつかの実施形態において、方法は、１つ以上の徴候又は症状の存在又は重症度を緩和するなど、対象におけるコロナウイルス感染症の症状の徴候を低減することができる。いくつかの実施形態において、抗体若しくは抗原結合断片又はノブペプチドなどの結合分子は、感染の治療をもたらすのに有効な量で対象に投与される。本明細書ではまた、そのような方法及び治療における、並びにそのような治療方法を実行するための医薬の調製における、抗体若しくは抗原結合断片又はノブペプチドなどの結合ポリペプチドの使用も提供される。いくつかの実施形態において、方法は、結合ポリペプチド又はそれを含む組成物を、疾患又は状態を有する、有していた、又は有することが疑われる対象に投与することによって実施される。いくつかの実施形態において、方法は、それによって、対象における疾患若しくは状態又は障害を治療する。本明細書ではまた、例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に起因するコロナウイルス感染に関連する疾患又は障害の治療のための、本明細書で提供される医薬組成物などの組成物のうちのいずれかの使用も提供される。

【0308】

いくつかの実施形態において、提供される結合ポリペプチド、例えば、抗体若しくは抗原結合断片又はノブペプチドは、有効量又は治療有効量で対象に投与される。ウイルス感染を治療又は予防するための、提供される結合ポリペプチド、例えば、抗体若しくは抗原結合断片又はノブペプチドの有効用量又は治療有効用量は、治療される対象における感染の１つ以上の徴候及び／又は症状を、そのような徴候及び／又は症状の退行又は排除を誘導することによるか、あるいはそのような徴候及び／又は症状の進行を阻害することによるかにかかわらず、緩和するのに十分な量である。投与量は、投与される対象の年齢及びサイズ、標的疾患、状態、投与経路などに応じて変化し得る。実施形態において、例えば、成人ヒト対象におけるウイルス感染を治療又は予防するための、提供される結合ポリペプチド、例えば、抗体若しくはその抗原結合断片又はノブペプチドの有効用量又は治療有効用量は、約０．００１ｍｇ／ｋｇ～約２００ｍｇ／ｋｇ、例えば、０．０１ｍｇ／ｋｇ～２００ｍｇ／ｋｇ又は０．１ｍｇ／ｋｇ～２００ｍｇ／ｋｇである。感染の重症度に応じて、治療の頻度及び期間を調整することができる。

【0309】

提供される方法及び使用は、対象におけるウイルス感染を治療するための方法及び使用を含む。例えば、治療方法は、提供される結合ポリペプチド、例えば、抗体若しくは抗原結合断片又はノブペプチドを、疾患又は感染、例えばウイルス感染の１つ以上の徴候又は症状を有する対象に、有効な又は治療的に有効な量又は用量で投与することを含む。

【0310】

いくつかの実施形態において、提供される方法及び使用は、予防的方法及び使用を含む。いくつかの実施形態において、本明細書において、提供される結合ポリペプチド、例えば、抗体若しくは抗原結合断片又はノブペプチドを、ウイルス感染のリスクがある対象に予防的に投与して、そのような感染を予防するための方法が提供される。いくつかの実施形態において、投与される量は、有効な又は治療的に有効な量又は用量である。いくつかの実施形態において、提供される方法及び使用は、対象におけるウイルス感染を予防する。いくつかの実施形態において、提供される方法によるウイルス感染の予防は、提供される結合ポリペプチド、例えば、抗体若しくは抗原結合断片又はノブペプチドなどを対象に投与して、対象の体内での疾患又は感染（例えば、ウイルス感染）の兆候を阻害することを伴う。いくつかの実施形態において、方法は、ウイルス感染の１つ以上の徴候又は症状を低減する。

【0311】

ＶＩＩＩ．例示的な実施形態
提供される実施形態には以下のものがある。
１．ウシ超長ＣＤＲ３抗体ディスプレイライブラリーを調製する方法であって、
（ａ）ウシ抗体ＶＨ鎖相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）鋳型ライブラリーからのＩｇＨＶ１－７ファミリーの複数の可変重（ＶＨ）領域をコードする配列を増幅することと、
（ｂ）複数のＶＨ領域のための複数の複製可能な発現ベクターを構築することであって、各複製可能な発現ベクターが、ＢＬＶ１Ｈ１２、ＢＬＶ５Ｄ３、ＢＬＶ８Ｃ１１、ＢＦ１Ｈ１、ＢＬＶ５Ｂ８、及びＦ１８のＶＬ領域からなる群から選択される可変ラムダ軽（ＶＬ）領域又はそのヒト化バリアントに連結された増幅されたＶＨ領域を含む単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）をコードする第１の核酸配列を含む、構築することと、
（ｃ）増幅されたディスプレイ粒子を産生するのに好適な条件下で、複数の複製可能な発現ベクターで好適な宿主細胞を形質転換することと、
（ｄ）増幅されたディスプレイ粒子を収集することであって、増幅されたディスプレイ粒子が、ｓｃＦｖを含む融合タンパク質をディスプレイするディスプレイ粒子を含む、収集することと、を含む、方法。
２．ＶＬ領域が、ＢＬＶ１Ｈ１２ ＶＬ領域である、実施形態１に記載の方法。
３．ウシ超長ＣＤＲ３抗体ディスプレイライブラリーを調製する方法であって、
（ａ）ウシ抗体ＶＨ鎖相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）鋳型ライブラリーからのＩｇＨＶ１－７ファミリーの複数の可変重（ＶＨ）領域をコードする配列を増幅することと、
（ｂ）複数のＶＨ領域のための複数の複製可能な発現ベクターを構築することであって、各複製可能な発現ベクターが、ＢＬＶ１Ｈ１２ラムダ可変軽（ＶＬ）領域又はそのヒト化バリアントに連結された増幅されたＶＨ領域を含む単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）をコードする第１の核酸配列を含む、構築することと、
（ｃ）増幅されたディスプレイ粒子を産生するのに好適な条件下で、複数の複製可能な発現ベクターで好適な宿主細胞を形質転換することと、
（ｄ）増幅されたディスプレイ粒子を収集することであって、増幅されたディスプレイ粒子が、ｓｃＦｖを含む融合タンパク質をディスプレイするディスプレイ粒子を含む、収集することと、を含む、方法。
４．ｃＤＮＡ鋳型ライブラリーが、免疫化ウシからの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から単離されたＲＮＡから調製される、実施形態１～３のいずれか１つに記載の方法。
５．免疫化ウシからの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から単離されたＲＮＡからｃＤＮＡ鋳型ライブラリーを調製することを更に含む、実施形態１～３のいずれか１つに記載の方法。
６．ウシを標的抗原で免疫化することを更に含む、実施形態４又は５に記載の方法。
７．増幅されたディスプレイ粒子が、細菌ディスプレイ粒子、酵母ディスプレイ粒子、哺乳類ディスプレイ粒子、ファージディスプレイ粒子、ｍＲＮＡディスプレイ粒子、リボソームディスプレイ粒子、又はＤＮＡディスプレイ粒子を含む、実施形態１～６のいずれか１つに記載の方法。
８．増幅されたディスプレイ粒子が、ファージディスプレイ粒子である、実施形態１～７のいずれか１つに記載の方法。
９．増幅されたディスプレイ粒子が、ファージミド粒子である、実施形態１～８のいずれか１つに記載の方法。
１０．各複製可能な発現ベクターが、ファージコートタンパク質の少なくとも一部をコードする第２の核酸を更に含み、方法が、ファージミド粒子を産生するのに十分な量の、ファージコートタンパク質をコードする遺伝子を有するヘルパーファージで、形質転換された宿主細胞を感染させることを更に含み、それによって、融合タンパク質が、ファージコートタンパク質の少なくとも一部を含む、実施形態９に記載の方法。
１１．ウシ超長ＣＤＲ３抗体ファージディスプレイライブラリーを調製する方法であって、
（ａ）ウシを標的抗原で免疫化することと、
（ｂ）免疫化ウシからの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から単離されたＲＮＡから抗体可変重（ＶＨ）鎖相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）鋳型ライブラリーを調製することと、
（ｃ）ｃＤＮＡ鋳型ライブラリーからのＩｇＨＶ１－７ファミリーの複数のＶＨ領域をコードする配列を増幅することと、
（ｄ）複数のＶＨ領域のための複数の複製可能な発現ベクターを構築することであって、各複製可能な発現ベクターが、（１）ＢＬＶ１Ｈ１２ラムダ可変軽（ＶＬ）領域又はそのヒト化バリアントに連結された増幅されたＶＨ領域を含む単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）をコードする第１の核酸配列、及び（２）ファージコートタンパク質の少なくとも一部をコードする第２の核酸を含む、構築することと、
（ｅ）複数の複製可能な発現ベクターで好適な宿主細胞を形質転換することと、
（ｆ）増幅されたファージミド粒子を産生するのに十分な量の、ファージコートタンパク質をコードする遺伝子を有するヘルパーファージで、形質転換された宿主細胞を感染させることと、
（ｇ）増幅されたファージミド粒子を収集することであって、増幅されたファージミド粒子が、ファージコートタンパク質の少なくとも一部及びｓｃＦｖを含む融合タンパク質をディスプレイするファージミド粒子を含む、収集することと、を含む、方法。
１２．ＢＬＶ１Ｈ１２ラムダＶＬ領域が、配列番号２に示される、実施形態１～１１のいずれか１つに記載の方法。
１３．ＢＬＶ１Ｈ１２ラムダＶＬ領域が、ＢＬＶ１Ｈ１２のラムダＶＬ領域のヒト化バリアントである、実施形態１～１１のいずれか１つに記載の方法。
１４．ヒト化バリアントが、Ｋａｂａｔ番号付けに基づくアミノ酸置換Ｓ２Ａ、Ｔ５Ｎ、Ｐ８Ｓ、Ａ１２Ｇ、Ａ１３Ｓ、及びＰ１４Ｌ、ＣＤＲ１領域におけるアミノ酸置換Ｉ２９Ｖ及びＮ３２Ｇ、並びに／又はＣＤＲ２領域におけるＤＮＮからＧＤＴへのアミノ酸置換のうちの１つ以上を含む、実施形態１３に記載の方法。
１５．ヒト化バリアントが、配列番号１０７に示される配列を含む、実施形態１３又は１４に記載の方法。
１６．増幅されたＶＨ領域が、ペプチドリンカーを介して間接的にＢＬＶ１Ｈ１２ラムダＶＬ領域に連結される、実施形態２～１５のいずれか１つに記載の方法。
１７．ペプチドリンカーが、（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_３（配列番号９４）である、実施形態１６に記載の方法。
１８．ｃＤＮＡ鋳型ライブラリーからのＩｇＨＶ１－７ファミリーの複数のＶＨ領域が、配列番号８４に示される配列を含むフォワードプライマー及び配列番号８５に示される配列を含むリバースプライマーで増幅される、実施形態１～１７のいずれか１つに記載の方法。
１９．構築の前に、方法が、複数の増幅されたＶＨ領域をコードする配列に対してサイズ分離を行って、超長ＣＤＲ３を有するＶＨ領域を富化することを更に含む、実施形態１～１８のいずれか１つに記載の方法。

【0312】

２０．サイズ分離が、ゲル電気泳動によって行われる、実施形態１９に記載の方法。
２１．ゲル電気泳動が、１．２％、１．５％、又は２％のアガロースゲルを使用して、任意選択で２％のアガロースゲルを使用して行われる、実施形態２０に記載の方法。
２２．サイズ分離が、複数の増幅されたＶＨ領域をコードする配列から５５０塩基対長、約５５０塩基対長又は５５０塩基対長を超える配列を分離することを含み、５５０塩基対長、約５５０塩基対長又は５５０塩基対長を超える配列が、超長ＣＤＲ３を有するＶＨ領域をコードする配列を含む、実施形態１９～２１のいずれか１つに記載の方法。
２３．増幅された粒子の少なくとも又は少なくとも約２０％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、又は９５％が、超長ＣＤＲ３領域を含むＶＨ領域を含むｓｃＦｖをディスプレイする、実施形態１～２２のいずれか１つに記載の方法。
２４．増幅された粒子の少なくとも又は少なくとも約３０％が、超長ＣＤＲ３領域を含むＶＨ領域を含むｓｃＦｖをディスプレイする、実施形態１～２３のいずれか１つに記載の方法。
２５．増幅された粒子の少なくとも又は少なくとも約４０％が、超長ＣＤＲ３領域を含むＶＨ領域を含むｓｃＦｖをディスプレイする、実施形態１～２４のいずれか１つに記載の方法。
２６．増幅された粒子の少なくとも又は少なくとも約５０％が、超長ＣＤＲ３領域を含むＶＨ領域を含むｓｃＦｖをディスプレイする、実施形態１～２５のいずれか１つに記載の方法。
２７．超長ＣＤＲ３が、１～６つのジスルフィド結合を形成することができる２～１２のシステイン残基を含むシステインモチーフを含む、２５～７０個のアミノ酸のペプチド配列である、実施形態１～２６のいずれか１つに記載の方法。
２８．超長ＣＤＲ３が、４０～６０アミノ酸長である、実施形態１～２７のいずれか１つに記載の方法。
２９．超長ＣＤＲ３が、少なくとも４２アミノ酸長である、実施形態１～２８のいずれか１つに記載の方法。
３０．超長ＣＤＲ３が、４２アミノ酸長、４３アミノ酸長、４４アミノ酸長、４５アミノ酸長、４６アミノ酸長、４７アミノ酸長、４８アミノ酸長、４９アミノ酸長、５０アミノ酸長、５１アミノ酸長、５２アミノ酸長、５３アミノ酸長、５４アミノ酸長、５５アミノ酸長、５６アミノ酸長、５７アミノ酸長、５８アミノ酸長、５９アミノ酸長、又は６０アミノ酸長である、実施形態１～２９のいずれか１つに記載の方法。
３１．超長ＣＤＲ３が、少なくとも４つのシステイン残基を含む、実施形態１～３０のいずれか１つに記載の方法。
３２．超長ＣＤＲ３が、４つのシステイン残基を含む、実施形態１～３１のいずれか１つに記載の方法。
３３．超長ＣＤＲ３が、６、８、１０、又は１２のシステイン残基を含む、実施形態１～３１のいずれか１つに記載の方法。
３４．超長ＣＤＲ３が、少なくとも２つのジスルフィド結合を有する、実施形態１～３３のいずれか１つに記載の方法。
３５．超長ＣＤＲ３が、２つのジスルフィド結合を有する、実施形態１～３４のいずれか１つに記載の方法。
３６．超長ＣＤＲ３が、３、４、又は５つのジスルフィド結合を有する、実施形態１～３４のいずれか１つに記載の方法。
３７．超長ＣＤＲ３－ノブディスプレイライブラリーを調製する方法であって、
（ａ）ウシ超長ＣＤＲ３領域の上昇ストークドメイン及び下降ストークドメインに特異的なフォワードプライマー及びリバースプライマーを用いて、ウシ抗体可変重（ＶＨ）鎖相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）鋳型ライブラリーから複数のＣＤＲ３－ノブのみの抗体をコードする配列を増幅することと、
（ｂ）複数のＣＤＲ３ノブのみの抗体のための複数の複製可能な発現ベクターを構築することであって、各複製可能な発現ベクターが、増幅されたＣＤＲ３ノブをコードする第１の核酸配列を含む、構築することと、
（ｃ）増幅されたディスプレイ粒子を産生するのに好適な条件下で、複数の複製可能な発現ベクターで好適な宿主細胞を形質転換することと、
（ｄ）増幅されたディスプレイ粒子を収集することであって、増幅されたディスプレイ粒子が、増幅されたＣＤＲ３ノブを含む融合タンパク質をディスプレイするディスプレイ粒子を含む、収集することと、を含む、方法。
３８．ｃＤＮＡ鋳型ライブラリーが、免疫化ウシからの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から単離されたＲＮＡから調製される、実施形態３７に記載の方法。
３９．免疫化ウシからの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から単離されたＲＮＡからｃＤＮＡ鋳型ライブラリーを調製することを更に含む、実施形態３７に記載の方法。
４０．ウシを標的抗原で免疫化することを更に含む、実施形態３８又は３９に記載の方法。
４１．増幅されたディスプレイ粒子が、細菌ディスプレイ粒子、酵母ディスプレイ粒子、哺乳類ディスプレイ粒子、ファージディスプレイ粒子、ｍＲＮＡディスプレイ粒子、リボソームディスプレイ粒子、又はＤＮＡディスプレイ粒子を含む、実施形態３７～４０のいずれか１つに記載の方法。
４２ 増幅されたディスプレイ粒子が、ファージディスプレイ粒子である、実施形態３７～４１のいずれか１つに記載の方法。
４３．増幅されたディスプレイ粒子が、ファージミド粒子である、実施形態３７～４２のいずれか１つに記載の方法。
４４．各複製可能な発現ベクターが、ファージコートタンパク質の少なくとも一部をコードする第２の核酸を更に含み、方法が、ファージミド粒子を産生するのに十分な量の、ファージコートタンパク質をコードする遺伝子を有するヘルパーファージで、形質転換された宿主細胞を感染させることを更に含み、それによって、融合タンパク質が、ファージコートタンパク質の少なくとも一部を含む、実施形態４３に記載の方法。
４５．超長ＣＤＲ３－ノブファージディスプレイライブラリーを調製する方法であって、
（ａ）ウシを標的抗原で免疫化することと、
（ｂ）免疫化ウシからの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から単離されたＲＮＡから抗体可変重（ＶＨ）鎖相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）鋳型ライブラリーを調製することと、
（ｃ）ウシ超長ＣＤＲ３領域の上昇ストークドメイン及び下降ストークドメインに特異的なフォワードプライマー及びリバースプライマーを用いて、ｃＤＮＡ鋳型ライブラリーから複数のＣＤＲ３－ノブのみの抗体をコードする配列を増幅することと、
（ｄ）複数のＣＤＲ３－ノブのみの抗体のための複数の複製可能な発現ベクターを構築することであって、各複製可能な発現ベクターが、（１）増幅されたＣＤＲ３ノブをコードする第１の核酸配列、及び（２）ファージコートタンパク質の少なくとも一部をコードする第２の核酸を含む、構築することと、
（ｅ）複数の複製可能な発現ベクターで好適な宿主細胞を形質転換することと、
（ｆ）増幅されたファージミド粒子を産生するのに十分な量の、ファージコートタンパク質をコードする遺伝子を有するヘルパーファージで、形質転換された宿主細胞を感染させることと、
（ｇ）増幅されたファージミド粒子を収集することであって、増幅されたファージミド粒子が、ファージコートタンパク質の少なくとも一部及び増幅されたＣＤＲ３ノブを含む融合タンパク質をディスプレイするファージミド粒子を含む、収集することと、を含む、方法。
４６．プライマーが、配列番号７～１１に示される配列のうちのいずれかを含むか又はそれらからなる、実施形態３７～４５のいずれか１つに記載の方法。
４７．複数のＣＤＲ３－ノブのみの抗体の各々が、１～６つのジスルフィド結合を形成することができる２～１２のシステイン残基を含むシステインモチーフを有する２５～７０個のアミノ酸のペプチド配列を含む、実施形態３７～４６のいずれか１つに記載の方法。
４８．ペプチド配列が、４０～６０アミノ酸長である、実施形態４７に記載の方法。
４９．ペプチド配列が、少なくとも４２アミノ酸長である、実施形態４７又は４８に記載の方法。
５０．ペプチド配列が、４２アミノ酸長、４３アミノ酸長、４４アミノ酸長、４５アミノ酸長、４６アミノ酸長、４７アミノ酸長、４８アミノ酸長、４９アミノ酸長、５０アミノ酸長、５１アミノ酸長、５２アミノ酸長、５３アミノ酸長、５４アミノ酸長、５５アミノ酸長、５６アミノ酸長、５７アミノ酸長、５８アミノ酸長、５９アミノ酸長、又は６０アミノ酸長である、実施形態４７～４９のいずれか１つに記載の方法。
５１．ペプチド配列が、少なくとも４つのシステイン残基を含む、実施形態４７～５０のいずれか１つに記載の方法。
５２．ペプチド配列が、４つのシステイン残基を含む、実施形態４７～５１のいずれか１つに記載の方法。
５３．ペプチド配列が、６、８、１０、又は１２のシステイン残基を含む、実施形態４７～５１のいずれか１つに記載の方法。
５４．ペプチド配列が、少なくとも２つのジスルフィド結合を有する、実施形態４７～５３のいずれか１つに記載の方法。
５５．ペプチド配列が、２つのジスルフィド結合を有する、実施形態４７～５４のいずれか１つに記載の方法。
５６．ペプチド配列が、３、４、又は５つのジスルフィド結合を有する、実施形態４７～５４のいずれか１つに記載の方法。
５７．標的抗原が、非病原性細菌、ウイルス、ウイルスタンパク質、免疫調節タンパク質、癌抗原、ヒトＩｇＧ、又はそれらの組換えタンパク質である、実施形態６～３６及び４０～５６のいずれか１つに記載の方法。
５８．ｃＤＮＡ鋳型ライブラリーが、ＩｇＭ（配列番号４）、ＩｇＡ（配列番号５）、及びＩｇＧ特異的（配列番号３及び６）プライマーのプールを使用して合成された、実施形態１～５７のいずれか１つに記載の方法。
５９．超長ＣＤＲ３－ノブディスプレイライブラリーを調製する方法であって、
（ａ）複数のＣＤＲ３－ノブのみの抗体のための複数の複製可能な発現ベクターを構築することであって、各複製可能な発現ベクターが、１～６つのジスルフィド結合を形成することができる２～１２のシステイン残基を含むシステインモチーフを有する２５～７０個のアミノ酸のペプチド配列をコードする第１の核酸配列を含む、構築することと、
（ｂ）増幅されたディスプレイ粒子を産生するのに好適な条件下で、複数の複製可能な発現ベクターで好適な宿主細胞を形質転換することと、
（ｃ）増幅されたディスプレイ粒子を収集することであって、増幅されたディスプレイ粒子が、ＣＤＲ３ノブを含む融合タンパク質をディスプレイするディスプレイ粒子を含む、収集することと、を含む、方法。
６０．増幅されたディスプレイ粒子が、細菌ディスプレイ粒子、酵母ディスプレイ粒子、哺乳類ディスプレイ粒子、ファージディスプレイ粒子、ｍＲＮＡディスプレイ粒子、リボソームディスプレイ粒子、又はＤＮＡディスプレイ粒子を含む、実施形態５９に記載の方法。
６１．増幅されたディスプレイ粒子が、ファージディスプレイ粒子である、実施形態５９又は６０に記載の方法。
６２．増幅されたディスプレイ粒子が、ファージミド粒子である、実施形態５９～６１のいずれか１つに記載の方法。
６３．各複製可能な発現ベクターが、ファージコートタンパク質の少なくとも一部をコードする第２の核酸を更に含み、方法が、ファージミド粒子を産生するのに十分な量の、ファージコートタンパク質をコードする遺伝子を有するヘルパーファージで、形質転換された宿主細胞を感染させることを更に含み、それによって、融合タンパク質が、ファージコートタンパク質の少なくとも一部を含む、実施形態６２に記載の方法。
６４．超長ＣＤＲ３－ノブファージディスプレイライブラリーを調製する方法であって、
（ａ）複数のＣＤＲ３－ノブのみの抗体のための複数の複製可能な発現ベクターを構築することであって、各複製可能な発現ベクターが、（１）１～６つのジスルフィド結合を形成することができる２～１２のシステイン残基を含むシステインモチーフを有する２５～７０個のアミノ酸のペプチド配列をコードする第１の核酸配列、及び（２）ファージコートタンパク質の少なくとも一部をコードする第２の核酸を含む、構築することと、
（ｂ）複数の複製可能な発現ベクターで好適な宿主細胞を形質転換することと、
（ｃ）増幅されたファージミド粒子を産生するのに十分なファージコートタンパク質をコードする遺伝子を有するヘルパーファージで、形質転換された宿主細胞を感染させることと、
（ｄ）増幅されたファージミド粒子を収集することであって、増幅されたファージミド粒子が、ファージコートタンパク質の少なくとも一部及びＣＤＲ３ノブを含む融合タンパク質をディスプレイするファージミド粒子を含む、収集することと、を含む、方法。
６５．ペプチド配列が、上昇ストークドメイン及び下降ストークドメインを含み、システインモチーフが、上昇ストークドメインと下降ストークドメインとの間にある、実施形態２７～３６及び４７～６４のいずれか１つに記載の方法。
６６．ペプチド配列が、標的抗原で免疫化されたウシからのＤＮＡから増幅される、実施形態６４又は６５に記載の方法。
６７．ペプチド配列が、ウシの超長ＣＤＲ３領域のストークドメインのいずれかの側に特異的なプライマーを使用して、免疫化ウシからの可変重鎖ｃＤＮＡライブラリーから増幅される、実施形態６６に記載の方法。
６８．ペプチド配列が、システインモチーフのＮ末端側に上昇ストークドメインを含まない、実施形態２７～３６、４７～６４、６６、及び６７のいずれか１つに記載の方法。
６９．ペプチド配列が、システインモチーフのＣ末端側に下降ストークドメインを含まない、実施形態２７～３６、４７～６４、及び６６～６８のいずれか１つに記載の方法。
７０．上昇ストークドメインが、配列ＣＸ_２ＴＶＸ_５Ｑを含み、配列中、Ｘ_２及びＸ_５は、任意のアミノ酸である、実施形態６５～６７及び６９のいずれか１つに記載の方法。
７１．Ｘ_２が、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、Ａｌａ、又はＰｒｏであり、Ｘ_５が、Ｈｉｓ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｍｅｔ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、又はＬｅｕである、実施形態７０に記載の方法。
７２．Ｘ_２が、Ｓｅｒ、Ａｌａ、又はＴｈｒであり、Ｘ_５が、Ｈｉｓ又はＴｙｒである、実施形態７０又は７１に記載の方法。
７３．ペプチド配列が、合成ＣＤＲ３－ノブである、実施形態６４、６５、及び６８～７２のいずれか１つに記載の方法。
７４．ペプチド配列が、シクロチド又は修飾されたシクロチドである、実施形態６４、６５、及び６８～７３のいずれか１つに記載の方法。
７５．ペプチド配列が、ウシＣＤＲ３－ノブに由来する半合成ＣＤＲ３－ノブである、実施形態６４、６５、及び６８～７３のいずれか１つに記載の方法。
７６．ペプチド配列が、４０～６０アミノ酸長である、請求項６４～７５のいずれか１つに記載の方法。
７７．ペプチド配列が、少なくとも４２アミノ酸長である、実施形態６４～７６のいずれか１つに記載の方法。
７８．ペプチド配列が、４２アミノ酸長、４３アミノ酸長、４４アミノ酸長、４５アミノ酸長、４６アミノ酸長、４７アミノ酸長、４８アミノ酸長、４９アミノ酸長、５０アミノ酸長、５１アミノ酸長、５２アミノ酸長、５３アミノ酸長、５４アミノ酸長、５５アミノ酸長、５６アミノ酸長、５７アミノ酸長、５８アミノ酸長、５９アミノ酸長、又は６０アミノ酸長である、実施形態６４～７７のいずれか１つに記載の方法。
７９．ペプチド配列が、少なくとも４つのシステイン残基を含む、実施形態６４～７８のいずれか１つに記載の方法。
８０．ペプチド配列が、４つのシステイン残基を含む、実施形態６４～７９のいずれか１つに記載の方法。
８１．ペプチド配列が、６、８、１０、又は１２のシステイン残基を含む、実施形態６４～７９のいずれか１つに記載の方法。
８２．ペプチド配列が、少なくとも２つのジスルフィド結合を有する、実施形態６４～８１のいずれか１つに記載の方法。
８３．ペプチド配列が、２つのジスルフィド結合を有する、実施形態６４～８２のいずれか１つに記載の方法。
８４．ペプチド配列が、３、４、又は５つのジスルフィド結合を有する、実施形態６４～８２のいずれか１つに記載の方法。
８５．複数のＣＤＲ３ノブが、ペプチド配列をコードする核酸配列内の１つ以上の選択された位置で変異され、複数の複製可能な発現ベクターが、変異ベクターのファミリーである、実施形態６４、６５、及び６８～８４のいずれか１つに記載の方法。
８６．発現ベクターが、分泌シグナル配列を更に含む、実施形態１～８５のいずれか１つに記載の方法。
８７．分泌シグナル配列が、ｐｅｌＢシグナル配列である、実施形態８６記載の方法。
８８．好適な宿主細胞が、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞である、実施形態１～８７のいずれか１つに記載の方法。
８９．好適な宿主細胞が、ＴＧ１エレクトロコンピテント細胞である、実施形態１～８８のいずれか１つに記載の方法。
９０．ファージミド粒子が、Ｍ１３ファージに由来する、実施形態９～３６、４３～５８、及び６２～８９のいずれか１つに記載の方法。
９１．コートタンパク質が、Ｍ１３ファージ遺伝子ＩＩＩコートタンパク質（ｐＩＩＩ）である、実施形態１０～３６、４４～５８、及び６３～９０のいずれか１つに記載の方法。
９２．ヘルパーファージが、Ｍ１３Ｋ０７、Ｍ１３Ｒ４０８、Ｍ１３－ＶＣＳ、及びファイＸ１７４からなる群から選択される、実施形態１０～３６、４４～５８、及び６３～９１のいずれか１つに記載の方法。
９３．ヘルパーファージが、Ｍ１３Ｋ０７である、実施形態１０～３６、４４～５８、及び６３～９２のいずれか１つに記載の方法。
９４．ディスプレイ粒子が、平均して、粒子の表面上に融合タンパク質の１つのコピーをディスプレイする、実施形態１～９３のいずれか１つに記載の方法。
９５．実施形態１～９４のいずれか１つに記載の方法によって産生された、ディスプレイ粒子のライブラリー。
９６．複製可能な発現ベクターであって、ＢＬＶ１Ｈ１２、ＢＬＶ５Ｄ３、ＢＬＶ８Ｃ１１、ＢＦ１Ｈ１、ＢＬＶ５Ｂ８、及びＦ１８のＶＬ領域から選択される可変ラムダ軽（ＶＬ）領域、又はそのヒト化バリアントに連結された超長ＣＤＲ３を含むウシ可変重（ＶＨ）領域を含む単鎖可変断片をコードする第１の核酸配列を含む融合タンパク質をコードする遺伝子融合物を含む、複製可能な発現ベクター。
９７．複製可能な発現ベクターであって、ＢＬＶ１Ｈ１２ラムダ可変軽（ＶＬ）領域、又はそのヒト化バリアントに連結された超長ＣＤＲ３を含むウシ可変重（ＶＨ）領域を含む単鎖可変断片をコードする第１の核酸配列を含む融合タンパク質をコードする遺伝子融合物を含む、複製可能な発現ベクター。
９８．ファージコートタンパク質の少なくとも一部をコードする第２の核酸配列を更に含む、実施形態９６又は９７に記載の複製可能な発現ベクター。
９９．実施形態９６～９８のいずれか１つに記載の複製可能な発現ベクターによってコードされる、ディスプレイ粒子。
１００．実施形態９５又は９９に記載の複数のディスプレイ粒子を含む、ディスプレイ粒子のライブラリー。
１０１．ライブラリー中のディスプレイ粒子の少なくとも又は少なくとも約２０％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、又は９５％が、超長ＣＤＲ３領域を含むＶＨ領域を含むｓｃＦｖを含む、実施形態１００に記載のライブラリー。
１０２．ライブラリー中のディスプレイ粒子の少なくとも又は少なくとも約３０％が、超長ＣＤＲ３領域を含むＶＨ領域を含むｓｃＦｖを含む、実施形態１００又は１０１に記載のライブラリー。
１０３．ライブラリー中のディスプレイ粒子の少なくとも又は少なくとも約４０％が、超長ＣＤＲ３領域を含むＶＨ領域を含むｓｃＦｖを含む、実施形態１００～１０２のいずれか１つに記載のライブラリー。
１０４．ライブラリー中のディスプレイ粒子の少なくとも又は少なくとも約５０％が、超長ＣＤＲ３領域を含むＶＨ領域を含むｓｃＦｖを含む、実施形態１００～１０３のいずれか１つに記載のライブラリー。
１０５．複製可能な発現ベクターであって、ジスルフィド結合を形成することができる２～１２のシステイン残基を含むシステインモチーフを有する２５～７０個のアミノ酸のペプチド配列をコードする第１の核酸配列を含む融合タンパク質をコードする遺伝子融合物を含む、複製可能な発現ベクター。
１０６．ファージコートタンパク質の少なくとも一部をコードする第２の核酸配列を更に含む、実施形態１０５に記載の複製可能な発現ベクター。
１０７．実施形態１０５又は１０６に記載の複製可能な発現ベクターによってコードされる、ディスプレイ粒子。
１０８．実施形態１０７に記載の複数のディスプレイ粒子を含む、ディスプレイ粒子のライブラリー。
１０９．ディスプレイ粒子が、ファージディスプレイ粒子である、実施形態９５、１００～１０４、及び１０８のいずれか１つに記載のライブラリー。
１１０．ディスプレイ粒子が、ファージミド粒子である、実施形態９５、１００～１０４、１０８、及び１０９のいずれか１つに記載のライブラリー。
１１１．抗体結合タンパク質を選択するための方法であって、
（１）ディスプレイ粒子の標的分子への結合を可能にする条件下で、実施形態９５、１００～１０４、及び１０８～１１０のいずれか１つに記載のディスプレイ粒子のライブラリーを標的分子と接触させることと、
（２）結合するディスプレイ粒子を結合しないものから分離し、それによって、標的分子に結合する抗体結合タンパク質を含むディスプレイ粒子を選択することと、を含む、方法。
１１２．ディスプレイ粒子が、ファージディスプレイ粒子である、実施形態１１１に記載の方法。
１１３．ディスプレイ粒子が、ファージミド粒子である、実施形態１１１又は１１２に記載の方法。
１１４．標的分子が、非病原性細菌、ウイルス、ウイルスタンパク質、免疫調節タンパク質、癌抗原、ヒトＩｇＧ、又はそれらの組換えタンパク質である、実施形態１１１～１１３のいずれか１つに記載の方法。
１１５．標的分子が、コロナウイルス、コロナウイルス偽ウイルス、組換えコロナウイルススパイクタンパク質、又はコロナウイルススパイクタンパク質の受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）である、実施形態１１１～１１４のいずれか１つに記載の方法。
１１６．コロナウイルスが、２２９Ｅ、ＮＬ６３、ＯＣ４３、ＨＫＵ１、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ２からなる群から選択される、実施形態１１５に記載の方法。
１１７．コロナウイルスが、Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ－１単離株、Ｂ．１．３５１南アフリカバリアント、又はＢ．１．１．７ ＵＫバリアントから選択されるＳＡＲＳ－ＣｏＶ２である、実施形態１１５又は１１６に記載の方法。
１１８．
（ｉ）好適な宿主細胞に、（２）で結合する選択されたディスプレイ粒子をコードする複製可能な発現ベクターで感染させることと、
（ｉｉ）増幅されたディスプレイ粒子を収集することと、
（ｉｉｉ）増幅されたディスプレイ粒子をディスプレイ粒子のライブラリーとして使用して、ステップ（１）及び（２）を繰り返すことと、を更に含む、実施形態１１１～１１７のいずれか１つに記載の方法。
１１９．ディスプレイ粒子がファージミド粒子であり、方法が、増幅されたファージミド粒子を産生するのに十分な量の、ファージコートタンパク質をコードする遺伝子を有するヘルパーファージで、形質転換された宿主細胞を感染させることを更に含む、実施形態１１８に記載の方法。
１２０．ステップが、１回以上繰り返される、実施形態１１８又は１１９に記載の方法。
１２１．ステップが、同じ標的分子又は異なる標的分子を用いて繰り返される、実施形態１１８～１２０のいずれか１つに記載の方法。
１２２．ステップが、異なる標的分子を用いて繰り返され、異なる標的分子が、標的分子に関連している、実施形態１２１に記載の方法。
１２３．異なる標的分子が、標的分子と同じタイプの病原体であるか、標的分子と同じ病原体群であるか、又は標的分子のバリアントである、実施形態１２１又は１２２に記載の方法。
１２４．選択されたディスプレイ粒子中の融合遺伝子を配列決定して、抗体結合タンパク質を同定することを更に含む、実施形態１１１～１２３のいずれか１つに記載の方法。
１２５．選択された抗体結合タンパク質から全長ＩｇＧ又はＦａｂを産生することを更に含む、実施形態１２４に記載の方法。
１２６．抗体結合タンパク質が、ｓｃＦｖであり、方法が、ｓｃＦｖのＶＨ領域を定常領域又はその一部と連結することを含む、重鎖又はその一部を構築することを含む、実施形態１２４又は１２５に記載の方法。
１２７．方法が、ヒト化ウシＶＨ領域の超長ＣＤＲ３領域のノブ領域を、選択された抗体結合タンパク質の超長ＣＤＲ３領域で置換することによってヒト化ＶＨ領域を構築することを含む、実施形態１２４又は１２５に記載の方法。
１２８．選択された抗体結合タンパク質の超長ＣＤＲ３領域が、ヒト化ウシＶＨ領域の上昇ストーク鎖と下降ストーク鎖との間で置換される、実施形態１２７に記載の方法。
１２９．ＶＨ領域が、式Ｖ１－Ｘ－Ｖ２を含み、重鎖のＶ１領域が、配列番号１１１に示される配列を含み、Ｘ領域が、選択された抗体の超長ＣＤＲ３を含み、Ｖ２領域が、配列番号１１２に示される配列を含む、実施形態１２８に記載の方法。
１３０．方法が、ヒト化ＶＨ領域を定常領域又はその一部と連結することを含む、重鎖又はその一部を構築することを更に含む、実施形態１２７～１２９のいずれか１つに記載の方法。
１３１．重鎖又はその一部が、ヒトＩｇＧ１重鎖又はその一部である、実施形態１２６又は１３０に記載の方法。
１３２．重鎖又はその一部を軽鎖と共発現させることを更に含む、実施形態１２６、１３０、及び１３１のいずれか１つに記載の方法。
１３３．軽鎖が、ＢＬＶＨ１２、ＢＬＶ５Ｄ３、ＢＬＶ８Ｃ１１、ＢＦ１Ｈ１、ＢＬＶ５Ｂ８、若しくはＦ１８のウシ軽鎖であるか、又はそのヒト化バリアントである、実施形態１３２に記載の方法。
１３４．軽鎖が、ＢＬＶ１Ｈ１２軽鎖（配列番号１１３）又はそのヒト化バリアントである、実施形態１３２又は１３３に記載の方法。
１３５．軽鎖が、配列番号１１４に示されるヒト化軽鎖である、実施形態１３１～１３４のいずれか１つに記載の方法。
１３６．軽鎖が、ＢＬＶ５Ｂ８軽鎖（配列番号１１５）又はそのヒト化バリアントである、実施形態１３２又は１３３に記載の方法。
１３７．軽鎖がヒト軽鎖である、実施形態１３２に記載の方法。
１３８．軽鎖が、ＶＬ１～４７、ＶＬ１～４０、ＶＬ１～５１、及びＶＬ２～１８からなる群から選択される、実施形態１３２又は１３７に記載の方法。
１３９．軽鎖が、配列番号１１６～１２０のうちのいずれか１つに示される、実施形態１３２、１３７、及び１３８のいずれか１つに記載の方法。
１４０．可溶性超長ＣＤＲ３ノブを産生するための方法であって、
（ａ）切断可能なリンカーによって連結された超長ＣＤＲ３ノブ及び細菌シャペロンを含む融合タンパク質をコードする発現ベクターでＥ．ｃｏｌｉを形質転換することであって、超長ＣＤＲ３ノブが、１～６つのジスルフィド結合を形成することができる２～１２のシステイン残基を含むシステインモチーフを有する２５～７０個のアミノ酸のペプチド配列である、形質転換することと、
（ｂ）融合タンパク質の発現を許容する条件下で、細菌を培養することと、
（ｃ）細菌細胞溶解物の上清から融合タンパク質を単離することと、
（ｄ）融合タンパク質の切断可能なリンカーを切断し、それによって、細菌シャペロンを含まない１～６つのジスルフィド結合を含む可溶性超長ＣＤＲ３ノブを産生することと、を含む、方法。
１４１．超長ＣＤＲ３ノブが、実施形態１１１～１２４のいずれか１つに記載の方法によって同定された抗体結合タンパク質である、実施形態１４０に記載の方法。
１４２．融合タンパク質が、超長ＣＤＲ３ノブ単独と比較して増加した溶解度を有する、実施形態１４０又は１４１に記載の方法。
１４３．細菌シャペロンが、チオレドキシンＡ（ＴｒｘＡ）である、実施形態１４０～１４２のいずれか１つに記載の方法。
１４４．切断可能なリンカーが、アミノ酸配列ＤＤＤＤＫ（配列番号１０６）を有するエンテロキナーゼ切断タグである、実施形態１４０～１４３のいずれか１つに記載の方法。
１４５．切断可能なリンカーを切断することが、エンテロキナーゼを上清に添加することを含む、実施形態１４０～１４４のいずれか１つに記載の方法。
１４６．可溶性超長ＣＤＲ３ノブが、化学的方法又は酵素的方法を介した可溶性超長ＣＤＲ３ノブの環化を可能にする更なるリンカーを含み、任意選択で、更なるリンカーが、ソルターゼ媒介環化を可能にする、実施形態１４０～１４５のいずれか１つに記載の方法。
１４７．可溶性超長ＣＤＲ３ノブを環化することを更に含む、実施形態１４６に記載の方法。
１４８．（ｅ）可溶性超長ＣＤＲ３ノブを含む溶液からエンテロキナーゼ及び／又は細菌シャペロンを除去することを更に含む、実施形態１４０～１４７のいずれか１つに記載の方法。
１４９．可溶性超長ＣＤＲ３ノブを含む溶液から可溶性超長ＣＤＲ３ノブを富化することを更に含み、任意選択で、富化することが、サイズ排除クロマトグラフィを含む、実施形態１４０～１４８のいずれか１つに記載の方法。
１５０．可溶性超長ＣＤＲ３ノブを含む多重特異性結合分子を産生することを更に含む、実施形態１４０～１４９のいずれか１つに記載の方法。
１５１．超長ＣＤＲ３ノブが、３～８ｋＤａ又は４～５ｋＤａのサイズである、実施形態１４０～１５０のいずれか１つに記載の方法。
１５２．切断可能なリンカーによって連結された超長ＣＤＲ３ノブ及び細菌シャペロンを含む融合タンパク質であって、超長ＣＤＲ３ノブが、１～６つのジスルフィド結合を形成することができる２～１２のシステイン残基を含むシステインモチーフを有する２５～７０個のアミノ酸のペプチド配列である、融合タンパク質。
１５３．細菌シャペロンが、チオレドキシンＡ（ＴｒｘＡ）である、実施形態１５２に記載の融合タンパク質。
１５４．切断可能なリンカーが、アミノ酸配列ＤＤＤＤＫ（配列番号１０６）を有するエンテロキナーゼ切断タグである、実施形態１５２又は１５３に記載の融合タンパク質。
１５５．超長ＣＤＲ３ノブが、１～６つのジスルフィド結合を含む、実施形態１５２～１５４のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
１５６．実施形態１５２～１５５のいずれか１つに記載の融合タンパク質を含む、組成物。
１５７．実施形態１４０～１５１のいずれか１つに記載の方法によって産生される精製された可溶性超長ＣＤＲ３ノブであって、可溶性超長ＣＤＲ３が、２５～７５アミノ酸長であり、１～６つのジスルフィド結合を含む、精製された可溶性超長ＣＤＲ３ノブ。
１５８．超長ＣＤＲ３ノブが、３～８ｋＤａのサイズである、実施形態１５７に記載の精製された可溶性超長ＣＤＲ３ノブ。
１５９．超長ＣＤＲ３ノブが、４～５ｋＤａのサイズである、実施形態１５７又は１５８に記載の精製された可溶性超長ＣＤＲ３ノブ。
１６０．実施形態１５７～１５９のいずれか１つに記載の精製された可溶性超長ＣＤＲ３を含む、組成物。
１６１．薬学的に許容される担体を更に含む、実施形態１６０に記載の組成物。
１６２．非経口投与用に製剤化される、実施形態１６０又は１６１に記載の組成物。
１６３．静脈内、筋肉内、局所、耳、結膜、鼻、吸入、又は皮下投与用に製剤化される、実施形態１６０～１６２のいずれか１つに記載の組成物。
１６４．吸入による投与用に製剤化される、実施形態１６０～１６３のいずれか１つに記載の組成物。

【実施例】

【0313】

以下の実施例は、単に例示目的のために含まれており、決して本発明の範囲を限定することを意図するものではない。

【0314】

実施例１：抗ＳＡＲＳ ＣｏＶ－２抗体の生成
ウシをＳＡＲＳ ＣｏＶ－２スパイクタンパク質又はその受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）部分で免疫化し、血清を収集して結合活性を評価した。

【0315】

Ａ．スパイクタンパク質及び受容体結合ドメインの発現及び精製
親Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ－１単離株（ＮＣＢＩ ＹＰ＿００９７２４３９０．１）又は変異Ｅ４８４Ｋ（並びにＫ４１７Ｎ及びＮ５０１Ｙ）を有するＢ．１．３５１「南アフリカ」バリアントからのＳＡＲＳ ＣｏＶ－２スパイク三量体タンパク質、又は親受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）タンパク質（スパイクタンパク質のアミノ酸３１９～５４１）を、ＨＥＫ２９３細胞のトランスフェクションにより産生した。２９３ｆｅｃｔｉｎを有する約１２０×１０^６個のＨＥＫ２９３ Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、（１）フューリン切断部位が除去され、Ｋ９８６Ｐ及びＶ９８７Ｐ安定化変異、Ｔ４－フィブリチン三量体化ドメイン、並びにｃ末端６ｘ Ｈｉｓタグを有するスパイクタンパク質の細胞外ドメインをコードする配列、又は（２）ｃ末端６ｘ Ｈｉｓタグを有するスパイクＲＢＤドメイン（スパイクタンパク質のアミノ酸３１９～５４１）を含む、１２０μｇのｐＣＡＧＧＳベースのベクターと組み合わせた。

【0316】

細胞を３７℃で４日間、８％ＣＯ２で振盪し、１５０μｌのＴＣＭ－ＰｒｏｔｅａｓｅＡｒｒｅｓｔ組織培養プロテアーゼ阻害剤（Ｇ－Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を３日目に添加した。分泌されたスパイク又はＲＢＤタンパク質を含む上清を、４０００ ＲＰＭで５分間遠心分離し、続いて０．４５μｍのＰＥＳフィルターを通して濾過することによって上清から清澄化した。上清を濃縮し、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ Ｆｉｌｔｅｒユニット（Ｓタンパク質調製物についてはＭＷＣＯ＝５０，０００、ＲＢＤタンパク質については１０，０００）（ＥＭＤ－Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を４℃で使用してＰＢＳに緩衝液交換した。次いで、濃縮した上清を、５０ｍＭ、１００ｍＭ、２００ｍＭ、３００ｍＭ、及び４００ｍＭのイミダゾール勾配溶出画分（各々１カラム容積）を収集したことを除いて、製造業者のプロトコルに従って、ＴＡＬＯＮコバルト金属親和性樹脂（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ）を使用して精製した。各溶出画分を、ＩｎｓｔａｎｔＢｌｕｅ Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｉｎ（Ａｂｃａｍ）で染色したＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル上で分離した。単一のスパイクタンパク質バンド又は単一のＲＢＤバンドを含む画分をプールし、上述のようにＰＢＳに緩衝液交換し、タンパク質の濃度を、Ｎａｎｏｄｒｏｐ Ｏｎｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、それぞれ、スパイク又はＲＢＤタンパク質の吸光係数及び分子量に基づいて定量した。

【0317】

Ｂ．免疫化プロトコル
２頭の仔ウシを、精製されたＷｕｈａｎ－Ｈｕ－１スパイクタンパク質又はＲＢＤタンパク質バリアントを用いて、２００μｇ／用量を５つの首位置に広げて免疫化し、公開された方法に従って追加免疫した（Ｓｏｋ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ２０１７，５４８（７６６５１０８－１１１、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ ２０１３，１５３（６）：１３７９－１３９３）。血清を収集し、１：１００～１：１０，０００の血清希釈範囲で、ＲＢＤ免疫化仔ウシからの血清に対して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクのＲＢＤドメインに対してＩｇＧ ＥＬＩＳＡを行った。スパイクタンパク質反応性は、免疫化の７～２１日後に観察された。図２Ａに示すように、ＲＢＤドメインに対する結合活性は、最初の免疫化後に顕著であった。

【0318】

また血清ＩｇＧを、プラーク低減及び中和試験（plaque reduction and neutralization test、ＰＲＮＴ）を使用して、スパイクタンパク質及びウイルスの中和について評価した。このインビトロアッセイにおいて、ウイルス及び血清ＩｇＧは、抗体によって首尾よく結合されたウイルスがもはや細胞に浸透することができず、かつ／又はもはや感染を更に伝播することができないように、許容細胞に同時に適用される前に、一緒にプレインキュベートされる。結果として、感染の病巣及び「プラーク」と呼ばれる細胞損傷は、細胞単層が染色される場合、サイズ及び／又は数がより小さいようである。

【0319】

ＳＡＲＳ ＣｏＶ－２スパイクタンパク質を発現する偽ウイルスを、モデルウイルスとして使用して、Ｖｅｒｏ６細胞における親スパイクタンパク質及びＲＢＤ免疫化ウシの両方からの血清ＩｇＧの中和率をアッセイした。天然ウイルスと比較して、偽ウイルスを、高力価でＢＳＬ－２を考慮して取り扱うことができ、１回のラウンドで細胞に感染させるだけである。図２Ｂに示されるように、免疫化プロトコルのいずれかにおいてウシから得られたＩｇＧは、用量依存的に偽ウイルスを首尾よく中和することができた。より高い濃度では、ＲＢＤ単独で免疫化したウシからの血清ＩｇＧ（ｎｇ／ｍＬ）は、偽ウイルスの１００％を中和することが観察された。

【0320】

総合すると、これらの結果は、免疫化ウシ血清及びそれに含まれる抗体がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を中和することができることを支持する。

【0321】

実施例２：抗体発見のための超長ＣＤＲ３ ｓｃＦｖ抗体又はＣＤＲ３－ノブのみのファージディスプレイライブラリーの生成
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、実施例１に記載される免疫化ウシから収集し、ＲＮＡを抽出して、以下に記載される２つのファージディスプレイライブラリーを生成するために使用した。具体的には、免疫化の１４～６４日後に約１～５×１０^７個のＰＢＭＣを収集し、ＲＮＡ抽出及びｃＤＮＡ合成の前に保存した。

【0322】

可変重鎖（ＶＨ）断片及び可変軽鎖（ＶＬ）断片が可動性リンカーペプチド（（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_３１５アミノ酸リンカー、配列番号９４）によって連結されたｓｃＦｖフォーマットの抗体を使用するか、又は独立したＣＤＲ３－ノブを使用するかのいずれかの２つのライブラリー戦略を用いた。両方のアプローチにおいて、ｓｃＦｖ又はＣＤＲ３－ノブを、可動性Ｇｌｙ４Ｓｅｒリンカーを介してｐＩＩＩに融合した。図３Ａは、各ディスプレイライブラリーにおけるｐＩＩＩ融合構築物を示す。ディスプレイライブラリーの生成を以下に要約する。

【0323】

Ａ．ｓｃＦｖライブラリー構築
第１の戦略では、免疫ウシ由来のＶＨ ＤＮＡ断片を、固定軽鎖ＢＬＶ１Ｈ１２と組み合わせた（Ｓｔａｎｆｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２０１６，１（１）：ａａｆ７９６２．）。ＲＢＤ及び全長スパイクタンパク質免疫ライブラリーを、異なる免疫化時点について構築した。

【0324】

ＲＮＡを、ＲＮＡｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、５×１０^６～１０^７個のウシＰＢＭＣから単離した。Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＶ Ｆｉｒｓｔ－Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ合成キット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、＃１８０９１０５０）を使用して、５μｇの全ＲＮＡからのｃＤＮＡ合成、続いてＰＣＲ増幅を行うことによって、免疫ウシ抗体ＶＨレパートリーを得た。ＶＨ鋳型ライブラリーを生成するために、ＶＨのためのｃＤＮＡ鋳型は、ＩｇＭ（配列番号４）、ＩｇＡ（配列番号５）、及びＩｇＧ特異的（配列番号３及び６）プライマーのプールを使用して合成された。

【0325】

これらのハイブリッドライブラリーにおいて、全長ドナー超長ＶＨを、ＶＨファミリー特異的プライマー対を用いてＶＨ鋳型ライブラリーから増幅した。具体的には、超長ＣＤＲ３領域を有するＶＨ領域を富化するために、ウシＩｇＨＶ１－７ファミリーに特異的なＦＲ１及びＦＲ４プライマー（それぞれ配列番号１２及び１３）を用いて、両方のＶＨ領域を増幅した。増幅した産物を、予めクローニングされたｐＴＡＵ１ ｐＩＩＩ融合ファージディスプレイベクター（ｐＴＡＵ１－ＢＬＶ１Ｈ１２（－ＶＨ）にクローニングすることによって、リンカー－ＢＬＶ１Ｈ１２ラムダ軽鎖可変領域（配列番号２に示され、１に示されるＤＮＡ配列によってコードされるＢＬＶ１Ｈ１２軽鎖）と組み合わせた（図３Ｃを参照されたい）。増幅した産物を、ＮｃｏＩ及びＸｈｏＩ（ＮＥＢ）で２時間消化し、可動性リンカーペプチド（（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_３、配列番号９４）によるＶＨ及びＶＬの分離のためにＮｃｏＩ－ＸｈｏＩ断片としてｐＴＡＵ１－ＢＬＶ１Ｈ１２（－ＶＨ）にサブクローニングした。更なるステップにおいて、いくつかの超長ＶＨ断片を、ＮｃｏＩ及びＸｈｏＩ制限酵素で消化する前に、アガロースゲル電気泳動を使用してより短いＶＨ断片から分離することによって更に富化した。図３Ｄに示されるように、２％のアガロースゲルは、超長ＶＨ断片（約５５０塩基対長）と超長ＣＤＲ３領域を有さないより短いＶＨ断片（約４００塩基対長）との間で最も多くの分離を達成した。

【0326】

次に、これをＴ４ ＤＮＡリガーゼを用いて、１６℃で一晩ライゲートした。最終ライブラリーは、精製されたライゲーション産物を用いたエレクトロコンピテントＴＧ１細胞（Ｌｕｃｉｇｅｎ）のエレクトロポレーションにより得た。各ライブラリーは、＞９０％がインサートである最小１０^７のクローンであった。

【0327】

Ｂ．ＣＤＲ３－ノブライブラリー構築
第２の戦略において、ＶＨ鋳型のライブラリーを、実質的に第１の戦略に記載されるように生成した。次いで、超長ＶＨのみの免疫ウシ由来ＣＲＤ３－ノブ（「ＣＤＲ３－ノブのみ」とも呼ばれる）ライブラリーを、保存されたプライマーを使用してＶＨ鋳型ライブラリーからストーク－ノブＣＤＲを増幅し、ｐＩＩＩ融合物としてｐＴＡＵ１ファージディスプレイｐＩＩＩ融合ベクターにクローニングすることにより構築した。

【0328】

具体的には、ＲＮＡを、ＲＮＡｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、５×１０^６～１０^７個のウシＰＢＭＣから単離した。Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＶ Ｆｉｒｓｔ－Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ合成キット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して、５μｇの全ＲＮＡからのｃＤＮＡ合成、続いてＰＣＲ増幅を行うことによって、免疫ウシ抗体ＣＤＲ３－ノブレパートリーを得た。ＶＨ鋳型ライブラリーを生成するために、ＣＤＲ３－ノブのためのｃＤＮＡ鋳型は、ＩｇＭ（配列番号４）、ＩｇＡ（配列番号５）、及びＩｇＧ特異的（配列番号３及び６）プライマーのプールを使用して合成された。

【0329】

一次ストーク－ノブＣＤＲ３を、ＣＤＲ３領域（配列番号７～１１）のストークドメインのいずれかの側に特異的なＩｇＨＶ１－７ファミリー特異的プライマーを用いて、第１の鎖ｃＤＮＡから増幅した。次いで、これらを、ＮｃｏＩ及びＮｏｔＩ（ＮＥＢ）で２時間消化した後にＮｃｏＩ－ＮｏｔＩ断片としてｐＴＡＵ１ファージベクターにクローニングし、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを用いて、１６℃で一晩ライゲートした（図３Ｂを参照されたい）。最終ライブラリーは、精製されたライゲーション産物を用いたエレクトロコンピテントＴＧ１細胞（Ｌｕｃｉｇｅｎ）のエレクトロポレーションにより得た。各ライブラリーは、＞９０％がインサートである最小１０^７のクローンであった。

【0330】

実施例３：ファージディスプレイライブラリーのスクリーニング及びＳＡＲＳ Ｃｏｖ－２に対する超長ＶＨ又はＣＤＲ３－ノブドメインの選択
実施例２に記載されるように生成されたＶＨ超長ＣＤＲ３ ｓｃＦｖ抗体又はＣＤＲ－ノブのみのライブラリーを、ＳＡＲＳ ＣｏＶ－２標的タンパク質（親Ｗｕｈａｎ Ｈｕ－１又は「南アフリカ」Ｂ．１．３５１バリアントスパイクタンパク質又は親Ｗｕｈａｎ Ｈｕ－１ ＲＢＤの両方）に対する２～５ラウンドのファージディスプレイ選択に供した。ウイルス単離株又は親ＲＢＤのいずれかからのスパイクタンパク質を、４℃で一晩、ＰＢＳ中１ｍＬの１０μｇ／ｍＬの標的タンパク質を含むＮＵＮＣイムノチューブ上にコーティングした。次いで、チューブを、ＰＢＳ中に溶解した３～４ｍＬの２％の粉乳を用いて血液ミキサーで室温で１時間遮断し、ＰＢＳで３回洗浄した。

【0331】

各選択について、実施例２に記載されるように生成された異なる免疫化ｓｃＦｖ又はＣＤＲ３ノブライブラリーからの約１０^１２のファージ粒子を、ＰＢＳに溶解した１ｍＬの４％の粉乳に添加し、ＰＢＳで最大総容量２ｍＬとし、次いで、標的タンパク質を含むチューブに添加し、室温で２時間、血液ミキサーでインキュベートした。次いで、チューブを１０ｘＰＢＳ／０．１％のＴｗｅｅｎ２０及び１０×ＰＢＳで洗浄した。

【0332】

結合したファージを、血液ミキサーで１０分間、１ｍＬの新鮮な０．１Ｍのトリエチルアミンで回収し、氷上で０．５ｍＬの１Ｍのトリス（ｐＨ７．０）で中和した。対数期ＴＧ１ Ｐｈａｇｅ－Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ（商標）細胞を、３７℃／２００ｒｐｍで１時間、溶出されたファージに感染させ、次いで２％のグルコース／５０μｇ／ｍＬのカルベニシリンを補充した２ｘＴＹ寒天上で一晩３０℃で成長させた。

【0333】

上述の各ラウンドの選択後、ＴＧ１細菌をマスタープレートから、２０％のグリセロール／２％のグルコース／５０μｇ／ｍＬのカルベニシリンを補充した２０ｍＬの２ｘＴＹ培地中にこすり落とした。約４～５ｍＬのこの溶液を、１００μｌのＭ１３Ｋ０７ヘルパーファージ（ＭＯＩ＝１０）を含む２％のグルコース／５０μｇ／ｍＬのカルベニシリンを補充した２０ｍＬの２ｘＴＹ培地に添加した。この懸濁液を、３７℃／２００ｒｐｍで１時間インキュベートし、２００ｍＬの２ｘＴＹ／０．２Ｍのスクロース／５０μｇ／ｍＬのカルベニシリン／２５μｇ／ｍＬのカナマイシン／２０μｍのＩＰＴＧに添加した後、３０℃／２００ｒｐｍで一晩インキュベートした。増幅したファージを、氷上で１時間インキュベートした後、２５０ｍＬのＯａｋｒｉｄｇｅ遠心チューブ中で、１／５容積の２．５ＭのＮａＣｌ、２０％のＰＥＧ ８０００を用いて、清澄化した培養上清から沈殿させた。ファージ含有物質をＳｏｒｖａｌｌ遠心機で２０分間１４，０００ｇでペレット化し、２ｍＬのＰＢＳに再懸濁し、１ｍＬを次の選択ラウンドで使用するために保存した。各ライブラリーについて２～５ラウンドの選択を行い、ラウンド２から各ラウンドについてファージＥＬＩＳＡを行った。

【0334】

各選択から、個々のコロニーを、９６ディープウェル培養プレート中の５０μｇ／ｍＬのカルベニシリン及び２％のｗ／ｖグルコースを補充した６００μＬの２ｘＴＹ培地に採取し、２００ｒｐｍで、一晩３７℃で（振盪しながら）インキュベートした。各培養物について、５０μＬを、２００μＬ／ウェルの同じ培地を含む新しい９６ディープウェルプレートに移し、３時間成長させた。Ｍ１３Ｋ０７カナマイシン耐性ヘルパーファージのおよそ１０^８のカナマイシン耐性単位（kanamycin resistance unit、ｋ．ｒ．ｕ．）を各ウェルに添加し、プレートを３７℃で１時間インキュベートした。発現培地（０．２Ｍのスクロース、１００μｇ／ｍＬのカルベニシリン、２５μｇ／ｍＬのカナマイシン、及び２０μＭのＩＰＴＧを補充した８００μＬ／ウェルの２ｘＴＹ培地）を各ウェルに添加し、増幅を３０℃で一晩継続した。

【0335】

培養プレートを２０００ｇで１０分間、４℃で遠心分離し、ウェル当たり２５μＬの培養上清をＥＬＩＳＡに使用した。ハーフエリアＣｏｓｔａｒ ＥＬＩＳＡプレートを、５０μＬ／ウェルのＲＢＤ又はＰＢＳ中１μｇ／ｍＬのスパイク標的タンパク質を用いて、４℃で一晩コーティングし、ＰＢＳに溶解した１００μＬ／ウェルの２％の粉乳を用いて室温で１時間遮断し、次いで２×１００μＬ／ウェルのＰＢＳで洗浄した。ウェル当たり約２５μＬのファージ培養上清を、２５μＬ／ウェルの４％の粉乳／ＰＢＳを含む各標的プレート又は陰性対照プレートに添加し、室温で１時間結合させた。各プレートを、０．１％のＴｗｅｅｎ２０を含む２００μＬ／ウェルのＰＢＳで２回、次いで２００μＬ／ウェルのＰＢＳで２回洗浄した。結合したファージを、５０μＬ：／ウェル、２％の粉乳／ＰＢＳ中１：５０００希釈した抗Ｍ１３－ＨＲＰコンジュゲート（Ｓｉｎｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）を用いて、室温で１時間検出した。プレートを洗浄し、５０μＬ／ウェルのＴＭＢ（３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン）基質緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）を用いて室温で５～１０分間展開させた。製造プロトコルに従って１００μＬ／ウェルの０．５ＮのＨ_２ＳＯ_４で反応を停止させ、光学密度を４５０ｎｍで読み取った。

【0336】

ｓｃＦｖライブラリーのスクリーニングからの陽性クローンを配列決定し、哺乳類ＨＥＫ２９３細胞におけるキメラＢＬＶ１Ｈ１２ラムダ軽鎖－ヒトラムダ軽鎖定常領域との共発現のために、短いＶＨ配列及び超長ＶＨ配列の両方をｐＦＵＳＥヒトＩｇＧ１ Ｆｃ重鎖発現ベクターに移した。ノブ－ＣＤＲ３のみのライブラリーのスクリーニングからの陽性クローンを、完全ＶＨ遺伝子断片として合成し、ｐＦＵＳＥヒトＩｇＧ１ Ｆｃベクターにクローニングし、上述のようにキメラＢＬＶ１Ｈ１２ラムダ軽鎖と共に同様に発現させた。具体的には、各Ｖ_Ｈを、２Ｘ Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＩＩ Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）並びにＶ_Ｈフレームワーク１（フォワード）及びＪ_Ｈフレームワーク４（リバース）に特異的なプライマーを用いた５０μＬ反応において、１０ｎｇのファージプラスミドミニプレップ（Ｑｉａｇｅｎ）からＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ生成されたインサートを、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ遺伝子の５’末端上の５’ＥｃｏＲＩ及び３’ＮｈｅＩ部位でｐＦＵＳＥ哺乳類発現ベクターにクローニングした。これを、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞へのトランスフェクションのために、ウシＶ_Ｌ（ＢＬＶ１Ｈ１２）及びヒトλＣ_Ｌ配列を含む第２のｐＦＵＳＥプラスミドと対合した。細胞を、３０～６０ｍＬのＦｒｅｅｓｔｙｌｅ ２９３ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｇｉｂｃｏ）中１×１０^６細胞／ｍＬの密度で播種し、次いで、３７℃及び８％のＣＯ_２の加湿環境でインキュベートした。重鎖及び軽鎖プラスミドを、１：１で組み合わせて、２９３Ｆ培養物１ｍＬ当たり１μｇのＤＮＡの総量とし、次いで、Ｏｐｔｉ ＭＥＭ Ｉ培地（Ｇｉｂｃｏ）中で希釈して、２９３Ｆ培養物３０ｍＬ当たり１ｍＬの最終体積とした。各３０ｍＬの２９３Ｆ培養物について、約６０μＬの２９３ｆｅｃｔｉｎトランスフェクション試薬（Ｇｉｂｃｏ）及び９４０μＬのＯｐｔｉ ＭＥＭ Ｉを合わせ、次いで穏やかに混合し、室温で５分間インキュベートした後、希釈したＤＮＡに添加した。この混合物を室温で３０分間インキュベートし、次いで、２９３Ｆ培養物に移した。

【0337】

トランスフェクションの５日後に培地を採取し、発現されたキメラウシヒトＩｇＧ１抗体を固定化されたＰｒｏｔｅｉｎ Ａ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Ｃｙｔｉｖａ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）クロマトグラフィにより精製し、次いで、生ウイルス及び偽ウイルスの抗原結合及び中和について試験した。

【0338】

ライブラリースクリーニングからの選択された候補抗体を同定し、配列決定した（表Ｅ１）。いくつかの選択された抗体は、超長ＣＤＲ３ドメインを含んでいた。したがって、超長ＣＤＲ３抗体は、天然に存在するウシ抗体の約１０％しか示さないにもかかわらず、上記のファージディスプレイアプローチによって生成及びスクリーニングされた実施例１に記載の免疫化からの候補抗体は、超長ＣＤＲ３を有するウシ抗体について高度に富化された（すなわち、候補の４０％超が少なくとも５０個のアミノ酸のＣＤＲ３を特徴とする）。

【0339】

例示的な抗体ＳＡ－Ｒ２Ｃ３及びＳＡ－Ｒ２Ｄ９抗体は、超長ｓｃＦｖライブラリー（親Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ１ Ｓタンパク質による免疫化）に由来し、南アフリカバリアントスパイクタンパク質に対する選択を伴うスクリーニングによって同定された。例示的なＳＫＭ及びＳＫＤ抗体を、記載されるＣＤＲ３－ノブライブラリーから直接誘導されたファージライブラリーからのスクリーニングから同定した。

【0340】

例示的な超長抗体ＳＫＤ（配列番号６８）、ＳＫＭ（配列番号６９）、Ｒ４Ｃ１（配列番号７０）、Ｒ５Ｃ１（配列番号７１）、ＳＲ３Ａ３（配列番号７２）、Ｒ２Ｆ１２（配列番号７３）、及びＲ２Ｇ３（配列番号７４）の配列アラインメントを、生殖系列参照配列（配列番号７５）と共に図４に示す。ＣＤＲ３の長さ及びシステイン残基の数も各々について示す。

【0341】

【表2】

【0342】

実施例４：スパイクタンパク質及びＲＢＤへの結合評価
次いで、実施例３に記載されるキメラウシ－ヒトＩｇＧ１抗体として発現及び精製された選択されたクローンを、ＲＢＤ及びスパイクタンパク質に結合するそれらの能力についてアッセイした。

【0343】

Ａ．ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２
キメラウシ－ヒトＩｇＧ１抗体のＲＢＤ及びスパイク結合をＥＬＩＳＡによって評価した。ＰＢＳ中１μｇ／ｍＬのＲＢＤ又はスパイクタンパク質約５０μＬをハーフエリアＣｏｓｔａｒ ＥＬＩＳＡプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）の各ウェルに添加し、４℃で一晩コーティングした。プレートを、１８０μＬ／ウェルの２％の粉乳／ＴＢＳ／０．１％のＴｗｅｅｎ２０で室温で２時間遮断した。精製したキメラウシ－ヒトＩｇＧ１抗体を、２％の粉乳／ＴＢＳ／０．１％のＴｗｅｅｎ２０中で２０ｎＭ～０．００１２９ｎＭに５倍希釈し、５０μＬ／ウェルの各希釈物をコーティングされた／コーティングされていないウェルに２つ組で添加した。プレートを、室温で１時間インキュベートし、次いで１８０μＬのＴＢＳ／０．１％のＴｗｅｅｎ２０で４回洗浄し、結合したＩｇＧを、２％の粉乳／ＴＢＳ／０．１％のＴｗｅｅｎ２０中で１：５０００に希釈した５０μＬ／ウェルの抗ヒトＦｃ－ＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を用いて室温で３０分間検出した。次いで、プレートを１８０μＬのＴＢＳ／０．１％のＴｗｅｅｎ２０で５回洗浄した後、５０μＬ／ウェルのＴＭＢ（３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン）基質緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を添加した。室温で１～２分後、５０μＬ／ウェルの１ＮのＨ_２ＳＯ_４で反応を停止させ、ＯＤ ４５０ｎｍ値を記録した。

【0344】

試験した３つのクローンの代表的な結果を、図５Ａ及び図５Ｂに示す。図５Ａに示されるように、精製されたキメラウシ－ヒトＩｇＧ１抗体（Ｒ２Ｇ３、Ｒ２Ｆ１２、及びＲ４Ｃ１）の各々は、スパイクタンパク質への結合を示した。非関連ウシ－ヒトＩｇＧ１（１３６Ｓ ＩｇＧ）は、スパイクタンパク質への結合を示さなかった。図５Ｂに示されるように、クローンＲ２Ｇ３及びＲ２Ｆ１２のＶ_Ｈを有する精製されたキメラウシ－ヒトＩｇＧ１抗体は、ＲＢＤへの結合を示した。非関連ウシ－ヒトＩｇＧ１（１３６Ｓ ＩｇＧ）、並びにクローンＲ４Ｃ１のＶ_Ｈを有するキメラ抗体は、ＲＢＤタンパク質への結合を示さなかった。これらの結果は、抗体Ｒ４Ｃ１はスパイクタンパク質中の非ＲＢＤエピトープに結合するが、Ｒ２Ｇ３及びＲ２Ｆ１２はＲＢＤエピトープに結合するという知見と一致する。

【0345】

【表3】

【0346】

Ｂ．ＳＡＲＳ ＣｏＶ－２バリアント
キメラウシ－ヒトＩｇＧ１抗体のＲＢＤ及びスパイク結合を、ＳＡＲＳ ＣｏＶ－２の更なる単離株（ベータ、デルタ、及びオミクロン系統からのバリアント、並びにＳＡＲＳ ＣｏＶ－１ウイルスを含む）に対してＥＬＩＳＡにより評価した。実施例４に記載されるように、ＰＢＳ中１μｇ／ｍｌのＲＢＤ又はスパイクタンパク質約５０μＬを各ウェルに添加し、４℃で一晩コーティングした。プレートを、室温で２時間遮断した。精製されたキメラウシ－ヒトＩｇＧ１抗体を、２０ｎＭ～０．００１２９ｎＭの５倍に希釈し、５０μＬ／ウェルの各希釈物をコーティングされた／コーティングされていないウェルに２つ組で添加した。プレートを室温で１時間インキュベートし、次いで４回洗浄し、結合したＩｇＧを抗ヒトＦｃ－ＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）で検出した。次いで、プレートを５回洗浄した後、ＴＭＢ基質緩衝液を添加した。室温で１～２分後、Ｈ２ＳＯ４で反応を停止させ、ＯＤ ４５０ｎｍ値を記録した。

【0347】

図５Ｃは、野生型（wild-type、ＷＴ）Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ－１株、ベータ株（以前は南アフリカ株と記載された）、又はデルタ株に由来する組換え安定化スパイクタンパク質へのＩｇＧ抗体のＥＬＩＳＡ結合を示す。例示的な抗体ＳＫＤ及びＳＫＭは、ベータへの検出可能な結合を失うが、ＷＴ及びデルタＳＡＲＳ ＣｏＶ－２への結合を維持するようであることが観察された。他の抗体は、各Ｓタンパク質について試験した濃度範囲にわたって結合することが示されている。

【0348】

ＲＢＤを用いて実施された実験の相補的セットにおいて、図５Ｄは、オミクロンバリアントＲＢＤ（左）又は組換え安定化スパイク三量体（右）に対する選択ＩｇＧ抗体のＥＬＩＳＡ結合曲線を示す。試験した例示的なＲＢＤ結合物のうち、Ｒ２Ｄ９のみが、オミクロンバリアントスパイクＲＢＤへの結合を維持することが観察された。Ｒ４Ｃ１、Ｒ５Ｃ１、及びＲ２Ｄ９はまた、ナノモル以下の範囲のＥＣ５０で全長オミクロンスパイクに結合することが観察された。

【0349】

図５Ｅは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１と比較したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対するＲ４Ｃ１及びＲ２Ｄ９の例示的なＥＬＩＳＡデータを反映する。ＮＣ－Ｃｏｗｌとしても知られるＰ１Ｂ４を陰性対照として使用した。Ｓｏｋ，ｅｔ．ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ２０１７を参照されたい。これらのデータは、Ｒ４Ｃ１がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１に対する完全な結合活性を維持するのに対して、代替的な例示的な抗体Ｒ２Ｄ９は＞１０倍の結合を失うことを示す。しかしながら、Ｒ２Ｄ９は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１に対して低ナノモル範囲でいくらかの結合活性を依然として維持することが観察された。

【0350】

最後に、図５Ｆは、ＷＴ（Ｗｕｈａｎ）ＳＡＲＳ ＣｏＶ－２スパイクタンパク質に対する３つの異なる例示的な抗体ノブ候補についてのＥＬＩＳＡ結合活性（上）を示す。この実験では、各例示的なノブをＤＯ１エピトープタグと共に発現させ、これをＸ軸に反映された抗ＤＯ１抗体で検出した。図５Ｇは、改変されたウエスタンブロットを更に示す。ここで、示された例示的な抗体ノブを、ＳＤＳの存在下で７０℃に加熱し、次いでＳＤＳ－ＰＡＧＥにより分離した後、ニトロセルロース膜に移し、ビオチン化ＲＢＤで検出した。ＥＺ－Ｌｉｎｋ ＮＨＳ－ＬＣ－ＬＣ－ビオチン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して、ＲＢＤをビオチン化した。ＮＨＳ－ＬＣ－ＬＣ－ビオチンをＤＭＦ中で再構成し、１：５（ＲＢＤ：ビオチン）モル比で精製されたＲＢＤと混合し、次いで室温で３０分間インキュベートした。次いで、反応物を、ＰＢＳ中で平衡化したＰｉｅｒｃｅポリアクリルアミドスピン脱塩カラム７Ｋ ＭＷＣＯに適用した。アプロチニンを同様のサイズ対照として選択した。Ｒ２Ｇ３ノブは、熱及びＳＤＳ処理にもかかわらず、ＲＢＤへの結合を維持することが観察された。

【0351】

実施例５：ウイルス中和
いくつかの態様において、ウイルス抗原タンパク質への抗体の結合は、細胞侵入又は感染伝播を軽減するのに不十分である。一方、中和抗体として知られるいくつかの抗体は、インビトロ及び／又はインビボでウイルスを阻害する能力を有し、したがって、治療用途により関連すると考えられる。したがって、上述される候補抗体を、候補抗体の中和能力をアッセイするためのモデルウイルスであるＳＡＲＳ ＣｏＶ－３偽ウイルスによる細胞の感染を中和するそれらの能力について試験した。ＳＡＲＳウイルスの天然に存在する単離株と比較して、偽ウイルスは、高力価でＢＳＬ－２を考慮して取り扱うことができ、したがって、偽ウイルスルシフェラーゼアッセイ（pseudovirus luciferase assay、ＰＶＬＡ）などにおけるスクリーニングに適している。

【0352】

親Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ－１スパイクタンパク質配列のＳＡＲＳ ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質をそのウイルスエンベロープにおいて発現する偽ウイルスを、ルシフェラーゼ発現のための遺伝子がそのカーゴとして運ばれるように操作した。細胞への浸透が成功すると、ルシフェラーゼは、偽ウイルス中和阻害率が相対光単位（relative light unit、ＲＬＵ）として表されるルシフェラーゼ活性に反比例するように発現される。これらの偽型ウイルスを、ＣＲＦＫ－ｈＡＣＥ２細胞において行われる中和アッセイにおいて使用した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２侵入のための受容体として、ＡＣＥ２過剰発現は、「高い感染力」を示す細胞株を産生することができる機構と考えられる。逆に、最小又はより低いＡＣＥ２発現を有する細胞系は、「低感染力」を示すと考えることができる。

【0353】

具体的には、模擬培地又は連続希釈（５倍）抗体Ｆａｂを、同量のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２野生型（ＷＴ）を保有する偽型ウイルスと混合し、３７℃で１時間インキュベートした。次いで、混合物を、ポリブレン（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡ）（１０μｇ／ｍＬ）の存在下でＣＲＦＫ－ｈＡＣＥ又はＣＲＦＫ－ｈＤＤＰ４細胞に形質導入した。形質導入細胞を３７℃で４８時間インキュベートした後、溶解緩衝液を添加し、ＲＬＵを測定した。

【0354】

同定された抗体の偽ウイルス中和の概要を表Ｅ３に示す。ウシ超長ＣＤＲ３抗体は非常に強力であり、変異株を中和し、いくつかの抗体について１～５ｎｇ／ｍＬ未満の濃度で半最大阻害を有する。一般に、超長ＣＤＲ３抗体は、標準的なＣＤＲ３長を有する抗体よりも強力な中和を示した。

【0355】

【表4】

【0356】

実施例６：ＣＤＲ３－ノブのみの抗体の細菌発現及び精製
上述の超長ＣＤＲ３ウシ抗体に由来する１～６つのジスルフィド結合を有する２５～５０個のアミノ酸の小ペプチド配列であるＣＤＲ３－ノブを発現及び精製するための系を開発した。発現系は、細菌シャペロンＴｒｘＡとの融合を含んだ。ＣＤＲ３－ノブ並びにｔｒｘＡ－ＣＤＲ－ノブ融合物を、スパイク及びＲＢＤ結合について試験した。

【0357】

Ａ．ＴｒｘＡ－ＣＤＲ３－ノブ融合物並びにＣＤＲ３－ノブの発現及び精製
実施例２～５に記載される候補超長ＣＤＲ３抗体からのＣＤＲ３－ノブを、ＫｐｎＩ－ＸｈｏＩ（又は適切な場合にはＮｃｏＩ－ＸｈｏＩ）断片としてｐＥＴ３２ｂベクター（ＥＭＤ－Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）にクローニングし（図６Ａ）、Ｏｒｉｇａｍｉ ２ ＤＥ３細菌に形質転換し、以下に記載されるように発現させた。これらのＣＤＲ３－ノブは、それぞれ、配列番号６０～６７に示される配列を有し、配列番号５２～６０に示されるＤＮＡ配列によってコードされた。

【0358】

ｔｒｘＡ－ＣＤＲ３－ノブ融合クローンを、２０ｍＬの２ｘＴＹ／５０μｇ／ｍＬのカルベニシリン／１０μｇ／ｍＬのテトラサイクリン／２％のグルコース中で、３７℃で一晩成長させ、２００ｍＬの同じ培地に移し、ＯＤ６００ｎｍが約１．０になるまで３７℃で成長させ、その後、細菌を遠沈し、２００ｍＬの２ｘＴＹ／５０μｇ／ｍＬのカルベニシリン／０．５ｍＭのＩＰＴＧに再懸濁し、２２℃で一晩成長させた。細菌を再びペレット化し、１０ｍＬのＢｕｇｂｕｓｔｅｒ ＨＴ（ＥＭＤ－Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に再懸濁し、室温で３０分間回転させ、デブリを１４，０００ｇで、４℃で２０分間ペレット化した。上清を平衡化したＴａｌｏｎ樹脂カラム（１ｍＬ樹脂ＴａＫａＲａ）に添加し、４℃で２時間回転させ、５カラム容積の洗浄緩衝液（５ｍＭのイミダゾール）、次いで１カラム容積の洗浄緩衝液（１０ｍＭのイミダゾール）で洗浄し、２．５ｍＬの３００ｍＭのイミダゾール溶出緩衝液で溶出し、次いでＰＤ１０スピンカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて緩衝液をＰＢＳ／生理食塩水に交換した。ｔｒｘＡ－ＣＤＲ３－ノブを、５０ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、及び２．５ｍＭのＣａＣｌ２（１×エンテロキナーゼ（enterokinase、ＥＫ）反応緩衝液）に調整し、４００ｕ組換えｈｉｓタグ付けされたエンテロキナーゼ（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ）を添加し、室温で一晩インキュベートした。消化されたｔｒｘＡ及びエンテロキナーゼを、新鮮な平衡化Ｔａｌｏｎ樹脂カラム（１．２ｍＬの樹脂）上で、４℃で２時間インキュベーションすることによって除去し、精製されたＣＤＲ－ノブをフロースルー中に収集した。再び、試料を生理食塩水／ＰＢＳに緩衝液交換した。場合によっては、エンドトキシン除去が、使用又は試験（例えば、ウイルス中和アッセイにおける試験）の前に、陰イオン交換クロマトグラフィによって行われてもよい。独立したドメインとしてＥ．ｃｏｌｉにおいてクローニング及び発現されたＣＤＲ３－ノブは、配列番号６０～６７に示される。

【0359】

段階的精製を図６Ｂに示す。図６Ｃに示されるように、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによってモニタリングされる段階的精製は、Ｅ．ｃｏｌｉ溶解物からｔｒｘＡ－ＣＤＲ３－ノブ融合タンパク質及び可溶性ＣＤＲ３－ノブの両方を効率的に精製した。図６Ｄは、いくつかの精製された超長ＣＤＲ Ｈ３ノブペプチドの例示的なＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルを示す。試料を還元剤ＤＴＴで処理したが、これはいくつかの態様において、ジスルフィド結合を破壊するのに十分である。同様のサイズのタンパク質アプロチニンをサイズ対照として含めた。

【0360】

ＩＭＡＣ精製されたｔｒｘＡ－ＣＤＲ３－ノブ融合スパイク又はＲＢＤ結合
ｔｒｘＡ融合物としてＣＤＲ３－ノブ結合を評価するために、ｔｒｘＡからのエンテロキナーゼ切断の前に、ハーフエリアＣｏｓｔａｒ ＥＬＩＳＡプレートを、５０μｌ／ウェルＰＢＳ中の２５μＬのｔｒｘＡ融合物からのＩＭＡＣ精製されたｔｒｘＡ－ノブ融合物の連続希釈物で４℃で一晩コーティングした。ＲＢＤ結合クローンＲ２Ｇ３、Ｒ２Ｆ１２、ＳＫＭ、及びＳＫＤ（それぞれ配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、及び配列番号５７に示される核酸配列、並びにそれぞれ配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、及び配列番号６５に示されるアミノ酸配列）、並びにスパイク結合クローンＲ４Ｃ１（配列番号５５に示される核酸配列、及び配列番号６３に示されるアミノ酸配列）を試験した。

【0361】

次いで、プレートを、１００μＬ／ウェルの２％の粉乳／ＰＢＳで室温で１時間遮断し、次いで１００μＬ／ウェルのＰＢＳで２回洗浄した。約５０μＬ／ウェルの２％の粉乳／ＰＢＳ中１μｇ／ｍＬのＷｕｈａｎ－Ｈｕ－１スパイクタンパク質を１時間インキュベートし、次いで、ウェルを１００μｌ／ウェルのＰＢＳで３回洗浄した。結合したスパイクタンパク質を検出するために、１μｇ／ｍＬの全長ＩｇＧキメラ超長ＣＤＲ３を、２％の粉乳／ＰＢＳ中の抗ＲＢＤ Ｒ２Ｇ３ ＩｇＧ１（Ｒ４Ｃ１の場合）又は抗Ｒ４Ｃ１ ＩｇＧ１抗体（Ｒ２Ｆ１２、Ｒ２Ｇ３、ＳＫＤ、及びＳＫＭ融合物の場合）のいずれかに添加し、１時間インキュベートし、次いで、ウェルを１００μＬ／ウェルのＰＢＳで３回洗浄した。次いで、結合したＩｇＧを、２％の粉乳／ＰＢＳ中の１：５０００希釈抗ヒトＩｇＧ－Ｆｃ－ＨＲＰコンジュゲートと共に１時間インキュベートすることにより検出し、次いで、ウェルを１００μＬ／ウェルのＰＢＳで３回洗浄した。次いで、プレートを洗浄し、５０μＬ／ウェルのＴＭＢ（３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン）基質緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）を用いて室温で５～１０分間展開させた。１００μＬ／ウェルの０．５ＮのＨ_２ＳＯ_４で反応を停止させ、４５０ｎｍで読み取った。

【0362】

図７Ａに示されるように（Ｒ２Ｆ１２は「Ｆ１２」として示され、Ｒ２Ｇ３は「Ｇ３」として示される）、試験したｔｒｘＡ－ノブ融合タンパク質は、スパイクタンパク質結合を示した。融合タンパク質Ｒ３Ｃ１及びＲ２Ｇ３をスパイクタンパク質の不在下でインキュベートした対照条件（「Ｒ３Ｃ１ ＮＯスパイク」及び「Ｇ３ ＮＯスパイク」と示される）は、結合を示さなかった。ＴｒｘＡ－Ｒ２Ｇ３融合タンパク質についての結合も、コーティングされていないプレートと比較して、図７Ｂにおいて別々に示される。

【0363】

Ｂ．精製されたＲ２Ｇ３ ＣＤＲ３－ノブのＷｕｈａｎ－Ｈｕ－１ ＲＢＤへの結合
精製されたＲ２Ｇ３ ＣＤＲ３－ノブ（上述のｔｒｘＡからのエンテロキナーゼ切断後）のＲＢＤへの結合を、ＥＬＩＳＡにより評価した。Ｒ２Ｇ３ ＣＤＲ３－ノブをコードする核酸配列を配列番号５２に示し、アミノ酸配列を配列番号６０に示す。

【0364】

ハーフエリアＣｏｓｔａｒ ＥＬＩＳＡプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）のウェルを、ＰＢＳ中５０μＬ／ウェルの８４～０．０８２０３１ｎＭから２倍希釈した精製されたＣＤＲ３－ノブで、２つ組でコーティングした。プレートを、３７℃で１時間インキュベートし、次いで、１８０μＬ／ウェルの２％の粉乳／ＴＢＳ／０．１％のＴｗｅｅｎ２０で室温で２時間遮断した。次いで、ビオチン化ＲＢＤを、２％の乳汁／ＴＢＳ／０．１％のＴｗｅｅｎ２０中で０．５ｎｇ／μＬに希釈し、５０μＬ／ウェルをコーティングされた／コーティングされていないウェルに添加した。室温で１時間後、ウェルを１８０μＬ／ウェルのＴＢＳ／０．１％のＴｗｅｅｎ２０で４回洗浄し、結合したビオチン化ＲＢＤを、２％の乳汁／ＴＢＳ／０．１％のＴｗｅｅｎ２０中で１：５０００に希釈した５０μＬ／ウェルのストレプトアビジン－ＨＲＰ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて室温で３０分間検出した。次いで、ウェルを１８０μＬ／ウェルのＴＢＳ／０．１％のＴｗｅｅｎ２０で５回洗浄した後、５０μＬ／ウェルのＴＭＢ（３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン）基質緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を添加した。室温で１～２分後、５０μＬ／ウェルの１ＮのＨ_２ＳＯ_４で反応を停止させ、ＯＤ ４５０ｎｍ値を記録した。コーティングされていないウェルの平均ＯＤ４５０を、コーティングされた各ウェルのＯＤ４５０から差し引いた。バックグラウンドを差し引いたＯＤ４５０値を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ＬＬＣ）においてＬｏｇ（ＣＤＲ３－ノブｎＭ）に対してプロットした。

【0365】

図８Ａに示すように、可溶性Ｒ２Ｇ３ノブは、ＲＢＤへの結合を示した。図８Ｂに示されるように、可溶性Ｒ２Ｇ３ノブ結合は、参照抗スパイクタンパク質抗体ＣＲ３０２２の結合と比較して増加した。

【0366】

Ｃ．切断されたＲ２Ｇ３ ＣＤＲ３－ノブのＷｕｈａｎ－Ｈｕ－１ ＲＢＤへの結合
切断されたＲ２Ｇ３ ＣＤＲ３－ノブをクローニングし、Ｒ２Ｇ３切断された変異体、続いてエンテロキナーゼ切断部位をコードするｐＥＴ３２ｂベクターを使用して上述のように産生した。切断されたＲ２Ｇ３変異体のアミノ酸配列を図８Ｃに示す。図８Ｄに示すように、切断物１～３は、エンテロキナーゼ切断及びゲル電気泳動後にコンパクトなバンドを示した（レーン当たり０．７５μｇの切断されたノブタンパク質、２５０ｍＭ ＤＴＴ）。

【0367】

切断されたＲ２Ｇ３ ＣＤＲ３－ノブも、上述のようにＲＢＤ結合について試験した。図８Ｅに示すように、切断物１～３はＲＢＤ結合能力を保持したが、切断物４及び５はＲＢＤ結合を欠いていた。

【0368】

Ｄ．最小ＣＤＲ３－ノブＣ末端要件の定義
原型ＣＤＲ３－ノブのＣ末端要件（すなわち、Ｃ末端最小配列）を定義するために、一連のＲ２Ｇ３切断物を、上記実施例６に記載されるようにｐＥＴ３２ｂにクローニングし、発現させ、精製した。これらの切断物は、以下の表Ｅ４に示されるとおりであった。

【0369】

【表5】

【0370】

発現させた材料の質を、上記の実施例６Ｄに記載されるように、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びＲＢＤ ＥＬＩＳＡにより評価した。切断物４（Ｇ３ ＴＲＵＮＣ４）及び５（Ｇ３ ＴＲＵＮＣ５）だけが、ＲＢＤ結合能力を示さないことが観察された。切断物３Ａ（Ｇ３ ＴＲＵＮＣ３Ａ）及び３Ｂ（Ｇ３ ＴＲＵＮＣ３Ｂ）は、図８Ａに示されるように、ＥＬＩＳＡにおける結合の低減及びＳＤＳ－ＰＡＧＥにおけるバンド拡散性の増加を実証した。切断物１～３を用いて実施したＥＬＩＳＡでは、図８Ｂに示されるように、親Ｒ２Ｇ３ ＣＤＲ３－ノブと比較して、結合活性の喪失が観察されなかった。これらのデータは、Ｒ２Ｇ３結合のために最後の非標準Ｃｙｓ残基の後に最低少なくとも９個のアミノ酸が必要であることを支持する。

【0371】

Ｅ．サイズ排除クロマトグラフィによるＣＤＲ３－ノブ精製
サイズ排除クロマトグラフィ（size exclusion chromatography、ＳＥＣ）を使用して、細菌発現後に精製された可溶性ＣＤＲ３－ノブが複数の形態で存在するかどうかを解明した。可溶性Ｒ４Ｃ１及びＲ２Ｇ３ノブを上述のように産生し、ＳＥＣに供した。

【0372】

図９Ａに示されるように、ＳＥＣは、精製されたＲ４Ｃ１ノブについて少なくとも２つの別個の溶出画分（画分Ａ４及びＡ７）を明らかにし、精製されたＲ４Ｃ１ノブが細菌発現後に複数の形態で存在したことを示した。画分Ａ４及びＡ７についてゲル電気泳動を行った。図９Ｂに示されるように、画分Ａ４は、より大きな可溶性凝集体及びより小さい活性の可溶性ＣＤＲ３－ノブを含んだ。画分Ａ７は、より小さい活性の可溶性ＣＤＲ３－ノブのみを含んだ。

【0373】

図９Ｃに示されるように、ＳＥＣは、精製されたＲ２Ｇ３ノブ（画分Ａ６）について１つの明確な溶出画分（画分Ａ６）のみを明らかにした。この結果は、画分Ａ６に対して行ったゲル電気泳動により確証された（図９Ｄ）。

【0374】

実施例７：キメラＦａｂ超長ＣＤＲ３及びＣＤＲ３－ノブのＳＡＲＳ－ＣｏＶ ２ウイルス中和の比較
ＣＤＲ３－ノブのみの抗体のウイルス中和を評価するために、偽ウイルス又は生ＷＴ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ウイルスの中和を評価するアッセイを行った。この実施例において、精製されたＲ２Ｇ３ ＣＤＲ３－ノブ（「Ｇ３－ノブ」）若しくはキメラＲ２Ｇ３超長ＣＤＲ３抗体のＦａｂ（「Ｇ３－Ｆａｂ」）、又は全長ＩｇＧキメラＲ２Ｇ３超長ＣＤＲ３抗体（「Ｇ３」）を、示されるように試験した。

【0375】

実質的に実施例５に記載される偽ウイルスルシフェラーゼアッセイ（ＰＬＳＡ）を行った。ウイルス中和を、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ－１）野生型（ＷＴ）スパイクタンパク質、又はＳバリアント（Ｅ４８４Ｋ／Ｎ５０７Ｙ；Ｂ．１．１．７又は「ＵＫ」バリアント及びＫ４１７Ｎ／Ｅ４８４Ｋ／Ｎ５０１Ｙ；Ｂ．１．３５１又は「ＳＡ」バリアント）を保有する偽型ウイルスに対して評価した。模擬培地又は連続希釈（５倍）抗体Ｇ３－ノブ、Ｇ３－Ｆａｂ、又はＧ３を、同量のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２野生型（ＷＴ）、Ｓバリアント（４８４Ｋ、Ｂ．１．１．７、及びＢ．１．３５１）を保有する偽型ウイルスと混合し、３７℃で１時間インキュベートした。次いで、混合物を、ポリブレン（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡ）（１０μｇ／ｍＬ）の存在下でＣＲＦＫ－ｈＡＣＥ又はＣＲＦＫ－ｈＤＤＰ４細胞に形質導入した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２侵入のための受容体として、ＡＣＥ２過剰発現は、「高い感染力」を示す細胞株を産生することができる機構と考えられる。逆に、最小又はより低いＡＣＥ２発現を有する細胞系は、「低感染力」を示すと考えることができる。

【0376】

形質導入細胞を３７℃で４８時間インキュベートした後、溶解緩衝液を添加し、ＲＬＵを測定した。模擬処理に対する各抗体、Ｇ３－Ｆａｂ又はＧ３－ノブの連続希釈の阻害曲線を生成し、５０％有効濃度（ＥＣ５０）値を、可変勾配を使用してＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）により決定した。結果を表Ｅ５に要約した。

【0377】

生ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する中和活性を評価するために、Ｇ３、Ｇ３－Ｆａｂ、又はＧ３－ノブの選択された抗体を、Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、又はＢ．１．１７若しくはＢ．１．３５１バリアントの複製に対するそれらの中和活性について調査した。簡単に説明すると、５０～１００のプラーク形成単位のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｈＣｏＶ／ＵＳＡ－ＷＡ１／２０２０（野生型）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｈＣｏＶ－１９／英国／２０４８２０４６４／２０２０（Ｂ．１．１．７バリアント）、又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｈＣｏＶ－１９／南アフリカ／ＫＲＩＳＰ－ＥＣ－Ｋ００５３２１／２０２０（Ｂ．１．３５１バリアント）を模擬培地又は連続希釈（５倍）Ｇ３－Ｆａｂ又はＧ３－ノブと混合した。３７℃で１時間インキュベートした後、混合物を２４ウェルプレート中のコンフルエントなＶｅｒｏ Ｅ６細胞に播種した。２時間のインキュベーション後、寒天（最終濃度１％）及びニュートラルレッドを含む培地を細胞に添加した。４８～７２時間後、各ウェル中のプラークを計数した。ＥＣ５０値を上述のように決定し、以下の表Ｅ５に示した。

【0378】

総合すると、表Ｅ５に示される結果は、標準ＩｇＧ Ｆａｂフォーマット又はＣＤＲ３－ノブのみのフォーマットのいずれかの例示的なウシ超長ＣＤＲ３ Ｒ２Ｇ３が、ＷＴ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２並びに試験されたバリアントに対して強力な中和活性を示したことを実証する。ウシ超長ＣＤＲ３抗体は非常に強力であり、変異株を中和し、抗体フォーマットにより１～５ｎｇ／ｍＬ未満の濃度で半最大阻害を有する。注目すべきことに、わずか５１アミノ酸長の短い配列であるにもかかわらず、ＣＤＲ３－ノブのみの抗体は、ナノモル以下の効力を保持した。ＣＤＲ３－ノブ抗体のサイズが小さいため、本実施例は、他のウイルス、細菌、他の感染症、喘息、又は肺癌を含む呼吸器標的用の吸入製剤のための新規治療用抗体候補としてのＣＤＲ３－ノブ抗体の有用性を支持する。

【0379】

【表6】

【0380】

Ａ．ＳＡＲＳ ＣｏＶ－２バリアント
超長ＣＤＲ３抗体のウイルス中和の更なる評価において、生ＷＴ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ウイルス又はいくつかのバリアントＳＡＲＳ ＣｏＶ－２ウイルスの中和を評価するための更なるアッセイを行った。本実施例において、全長ＩｇＧキメラ超長ＣＤＲ３抗体Ｆ１２、Ｇ３、ＳＫＤ、及びＳＫＭを、示されるように試験した。

【0381】

実質的に実施例５に記載される偽ウイルスルシフェラーゼアッセイ（ＰＬＳＡ）を行った。ウイルス中和を、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ－１）野生型（ＷＴ）スパイクタンパク質、Ｓバリアント（Ｅ４８４Ｋ／Ｎ５０７Ｙ；Ｂ．１．１．７又は「ＵＫ」バリアント及びＫ４１７Ｎ／Ｅ４８４Ｋ／Ｎ５０１Ｙ；Ｂ．１．３５１又は「ＳＡ」バリアント）、又は４８４Ｋを保有する偽型ウイルスに対して評価した。模擬培地又は連続希釈（５倍）抗体を、同量のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２野生型（ＷＴ）、Ｓバリアント（４８４Ｋ、Ｂ．１．１．７、及びＢ．１．３５１）を保有する偽型ウイルスと混合し、３７℃で１時間インキュベートした。次いで、混合物を、ポリブレン（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡ）（１０μｇ／ｍＬ）の存在下で、Ｖｅｒｏ、ＣＲＦＫ－ｈＡＣＥ、又はＣＲＦＫ－ｈＤＤＰ４細胞に形質導入した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２侵入のための受容体として、ＡＣＥ２過剰発現は、「高い感染力」を示す細胞株を産生することができる機構と考えられる。逆に、最小又はより低いＡＣＥ２発現を有する細胞系は、「低感染力」を示すと考えることができる。

【0382】

形質導入細胞を３７℃で４８時間インキュベートした後、溶解緩衝液を添加し、ＲＬＵを測定した。図１０Ａ～１０Ｄに示されるように、各例示的な超長ＣＤＲ３抗体は、２つ以上のバリアントＳＡＲＳ ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質に対する活性を示した。模擬処理に対する各抗体の連続希釈の阻害曲線を生成し、５０％有効濃度（ＥＣ５０）値を、可変勾配を使用してＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）により決定した。結果を表Ｅ６に要約した。

【0383】

【表7】

【0384】

総合すると、表Ｅ５に示される結果は、例示的なウシ超長ＣＤＲ３抗体、Ｆ１２、Ｇ３、ＳＫＤ、及びＳＫＭが、ＷＴ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２並びに試験されたバリアントに対して強力な中和活性を示したことを実証する。ウシ超長ＣＤＲ３抗体は非常に強力であり、変異株を中和し、抗体フォーマットにより１～５ｎｇ／ｍＬ未満の濃度で半最大阻害を有する。注目すべきことに、わずか５１アミノ酸長の短い配列であるにもかかわらず、ＣＤＲ３－ノブのみの抗体は、ナノモル以下の効力を保持した。ＣＤＲ３－ノブ抗体のサイズが小さいため、本実施例は、他のウイルス、細菌、他の感染症、喘息、又は肺癌を含む呼吸器標的用の吸入製剤のための新規治療用抗体候補としてのＣＤＲ３－ノブ抗体の有用性を支持する。

【0385】

実施例８：ＳＡＲＳ ＣｏＶ－１交差反応性
例示的な超長ＣＤＲ３抗体の可能な交差反応性及び広範な中和を評価するために、偽ウイルスの中和を評価するアッセイを実施した。本実施例において、例示的なＲ４Ｃ１及びＲ２Ｄ９超長ＣＤＲ３抗体を、示されるように試験した。

【0386】

実質的に実施例５に記載される偽ウイルスルシフェラーゼアッセイ（ＰＬＳＡ）を行った。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ－１）野生型（ＷＴ）スパイクタンパク質、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１ウイルスのＳタンパク質、又はＶＳＶ－Ｇ対照を保有する偽型ウイルスに対するウイルス中和を評価した。模擬培地又は連続希釈（５倍）抗体Ｇ３－ノブ、Ｇ３－Ｆａｂ、又はＧ３を、同量のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２野生型（ＷＴ）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１野生型、又はＶＳＶ－Ｇを保有する偽型ウイルスと混合し、３７℃で１時間インキュベートした。次いで、混合物をポリブレン（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡ）（１０μｇ／ｍＬ）の存在下で細胞に形質導入した。

【0387】

形質導入細胞を３７℃で４８時間インキュベートした後、溶解緩衝液を添加し、中和パーセントを測定した。模擬処理に対する各抗体の連続希釈の阻害曲線を生成し、最大中和パーセント（maximum percent neutralization、ＭＰＮ）、すなわち中和されたウイルスについて中和曲線がプラトーになるパーセントを、可変勾配を使用してＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）により決定した。

【0388】

図１１Ａは、様々なコロナウイルス株からの偽ウイルスに対する異なるＩｇＧ抗体のＩＣ５０値を示す。Ｒ４Ｃ１及びＲ２Ｄ９は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のオミクロンバリアントに対する活性を維持することに留意されたい。全ての抗体はナノモル以下の効力を示し、いくつかは低ピコモル範囲にある。

【0389】

実施例９：生変異ウイルスの中和
例示的な抗体の更なる交差反応性及び潜在的な広範な中和を評価するために、生ウイルスに加えて偽ウイルスの中和を評価するアッセイを実施した。本実施例において、上述の例示的なＳＫＭ、ＳＫＤ、Ｒ４Ｃ１（ＩｇＧ、Ｆａｂ、及びノブ）、Ｇ３（ＩｇＧ、Ｆａｂ、及びノブ）、並びにＲ２Ｄ９（ＩｇＧ及びノブ）を、示されるように試験した。

【0390】

実質的に実施例５に記載される偽ウイルスルシフェラーゼアッセイ（ＰＬＳＡ）を行った。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ－１）野生型（ＷＴ）スパイクタンパク質、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ベータ系統ウイルスのＳタンパク質、又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２デルタ系統ウイルスを保有する偽型ウイルスに対するウイルス中和を評価した。模擬培地又は連続希釈（５倍）抗体、ノブ、若しくはｆａｂを、同量のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質を保有する偽型ウイルスと混合し、３７℃で１時間インキュベートした。次いで、混合物をポリブレン（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡ）（１０μｇ／ｍｌ）の存在下で細胞に形質導入した。形質導入細胞を３７℃で４８時間インキュベートした後、溶解緩衝液を添加し、ＲＬＵを測定した。

【0391】

中和はまた、ＢＳＬ－３条件下で生ウイルスを使用してアッセイされた。上述と同様に、連続希釈（５倍）抗体、ノブ、又はｆａｂを、同量の野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス（Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ－１）、又はアルファ（英国）若しくはベータ（南アフリカ）系統バリアントのいずれかと混合し、３７℃で１時間インキュベートした。細胞を洗浄し、次いで、細胞を３７℃で４８時間インキュベートした後、プラーク形成単位（plaque forming unit、ＰＦＵ）を測定した。

【0392】

偽ウイルス又は生ウイルスを用いた実験において、中和パーセントを測定した。模擬処理に対する各抗体の連続希釈の阻害曲線を生成し、最大中和パーセント（ＭＰＮ）、すなわち中和されたウイルスについて中和曲線がプラトーになるパーセントを、可変勾配を使用してＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）により決定した。例えば、例示的な候補Ｒ２Ｇ３（ＩｇＧ、Ｆａｂ、及びノブ）についての結果を図１１Ｂに示す。結果をｎｇ／ｍＬで表Ｅ７に要約し、３つの独立した複製の標準偏差を右側に示す。

【0393】

【表8】

【0394】

実施例１０：超長ＣＤＲ３を有する二重特異性及び多重特異性抗体
ウシ超長ＣＤＲＨ３抗体に由来するノブは、融合タンパク質として、又は二量体若しくは多量体分子の一部として発現され、二価、二重特異性、多価、又は多重特異性タンパク質を作製する（図１２）。２つ以上のノブは、例えば、１つのノブのＣ末端と別のノブのＮ末端との間に可動性リンカー（例えば、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒなど）を有する融合タンパク質として発現される。加えて、一方のノブがウシ又はヒト化ウシのＶＨ領域としてのその野生型立体構造であり、ＩｇＧとして軽鎖と共に発現され、第２のノブが重鎖定常領域のＣ末端に融合されている二重特異性分子が作製される。この状況において、２つのＶＨ領域は同一であり、ノブ１の特異性を有するが、Ｃ末端はノブ２によって決定される新しい特異性を有する。

【0395】

別のアプローチでは、２つの重鎖が共発現される「ノブ・イントゥ・ホール（knobs into holes）」技術が用いられ、ここで、一方の重鎖は、そのＣＤＲＨ３内に１つのノブ（ノブ１）を有するＶＨ領域を含み、第２の重鎖は、そのＣＤＲＨ３内に第２のノブ（ノブ２）を有するＶＨ領域を有する。２つの重鎖はまた、異種重鎖のみが互いに効果的に対合して二量体を形成するような定常領域変異を有することによっても異なる。この場合、ホモ二量体は、認識できる程度には形成されない。そのような「ノブ・イントゥ・ホール」変異は、ＦｃのＣＨ３ドメインにＴ２２Ｙ（一方の鎖上）及びＹ８６Ｔ（他方の鎖上）を含む。

【0396】

そのような分子をコードするＤＮＡベクターは、標準的な分子生物学技術によって生成され、前の実施例に上述されるように発現及び精製される。加えて、個々のノブは、ヘテロ二官能性又はヘテロ多官能性リンカー（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ）を含む、小分子リンカー又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）リンカーを使用して一緒に化学的に共有結合される。この場合、個々のノブを発現させ、精製し、次いで、リンカー及び適切な反応条件の存在下で一緒に加えて、リンカーをノブタンパク質に共有結合させる。アミン、カルボキシル、マレイミド、ＮＨＳエステル、及びヒドラジド化学が、これらの架橋アプローチにおいて一般的に使用される。更に、ノブは、ナノ粒子に特異性又は活性を提供するためにナノ粒子との関連で使用される。これに関して、ナノ粒子は、ウイルスタンパク質、アルブミンナノ粒子などから形成される粒子を含む、タンパク質ベースのナノ粒子であり得る。ナノ粒子はまた、脂質（例えば、リポ粒子（lipoparticles））、炭水化物などを含む非タンパク質分子に由来し得る。

【0397】

実施例１１：ウシ超長ＣＤＲ Ｈ３ノブドメイン末端のバイオインフォマティクスによる同定
アミノ酸配列によってウシ超長ＣＤＲ Ｈ３ノブドメインの境界を同定するためのアルゴリズムを開発した。配列によって、ウシ超長ＣＤＲ Ｈ３領域は、「フレームワーク３中の保存されたシステインに続く３番目の残基からフレームワーク４中の保存されたトリプトファンの直前の残基」に及ぶ（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ ２０１３，１５３（６）：１３７９－１３９３）。構造的には、ノブドメインは、逆平行β－リボンストークドメインの遠位端に位置する小さなジスルフィド豊富ドメインとして定義される（図１３Ａ及び１３Ｂ）。

【0398】

例示的なウシ超長抗体の結晶構造（表Ｅ８）を配列（図１４）と併せて分析して、配列及び構造の両方によるノブ境界の正確な定義を定式化した。分析において、ノブドメインの最初の残基は、保存された「ＰＤＧ」モチーフの前の最初の保存されたＤ_Ｈシステイン、又はＡ０１などの稀な例外ではこの位置の他の残基として定義された。最後のノブドメイン残基の位置を特定する目的で、ストークドメインも定義した。結晶構造分析により、上昇及び下降ストークβ－リボン鎖の長さに対称性が観察された。最初のＣＤＲ Ｈ３残基に３アミノ酸位置だけ前の保存されたフレームワーク３システイン（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．２０１３）は、上昇ストーク鎖の塩基の近位に位置し、最後のＣＤＲ Ｈ３残基の１残基下流である保存されたフレームワーク４トリプトファンの真向かいに位置する（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．２０１３）。分析において、最初の上昇ストーク残基を保存されたフレームワーク３システインと定義し、最後の下降ストーク残基を保存されたフレームワーク４トリプトファンと定義した。Ｃ末端ノブ境界位置は、フレームワーク４トリプトファン位置から上昇ストーク残基の数を差し引くことによって位置を特定した（表Ｅ８）。

【0399】

要約すると、本発明者らのアルゴリズム（以下）は、ノブ領域Ｎ末端境界を、「ＣＰＤＧ」モチーフ中の最初のＤ_Ｈシステインとして定義し、Ｃ末端境界を、フレームワーク４トリプトファン位置から上昇ストーク残基の数を差し引くことによって位置を特定した位置として定義する（図１５）。アルゴリズムは、ウシ超長ＣＤＲ Ｈ３抗体配列に適用することができる一般的な規則として機能する。

【0400】

要約すると、本発明者らのアルゴリズム（以下）は、ノブ領域Ｎ末端境界を、「ＣＰＤＧ」モチーフ中の最初のＤ_Ｈシステインとして定義し、Ｃ末端境界を、フレームワーク４トリプトファン位置から上昇ストーク残基の数を差し引くことによって位置を特定した位置として定義する（図１５）。アルゴリズムは、ウシ超長ＣＤＲ Ｈ３抗体配列に適用することができる一般的な規則として機能する。

【0401】

アルゴリズムは以下のように記載される：Ｌ＝標準フレームワーク３システインで始まり、標準フレームワーク４トリプトファンで終わる、ストークドメイン及びノブドメインを包含するアミノ酸の数。Ｘ＝上昇ストークを定義するフレームワーク３標準システインから始まり、「ＣＰＤＧ」モチーフ中の保存された最初のＤ領域システインの前のアミノ酸で終わる、アミノ酸の数。

【0402】

保存されたフレームワーク４トリプトファン－Ｘの位置＝ノブ境界位置（Ｃ末端）；ノブ中の残基の数（Ｋ）＝Ｌ－２Ｘ；Ｋ位置＝（Ｘ＋１）～（Ｘ＋Ｋ）

【0403】

【表9】

分析した公表された結晶構造を有するウシ超長抗体は、上昇鎖及び下降鎖にＸ個のアミノ酸を有する。各抗体のストークドメイン及びノブドメイン（Ｌ）、並びにノブドメイン単独（Ｋ）を含むアミノ酸の総数も記載する。

【0404】

実施例１２：最小ＣＤＲ３－ノブＣ末端及び最小ＣＤＲ３－ノブＮ末端を定義する
実施例１１に記載のアルゴリズムは、未知の構造を有する抗体からのストーク及びノブ領域のＣ末端切断（以下のサブセクションＡ）及びＮ末端切断（以下のサブセクションＢ）を発現させ、試験することによって実験的に検証された。場合によっては、発現又は安定性を改善するために、１、２、３、４、又は５個のアミノ酸をノブ末端に付加してもよい。

【0405】

Ａ．最小ＣＤＲ３－ノブＣ末端の定義
原型ＣＤＲ３－ノブのＣ末端要件を定義するために、上記の実施例６に記載されるように、一連のＲ２Ｇ３切断物をｐＥＴ３２ｂにクローニングし、発現させた。発現させた材料の質を、同様に実施例６に記載されるように、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びＲＢＤ ＥＬＩＳＡにより評価した。例示的な試験したＲ２Ｇ３切断物は、以下の表Ｅ９に示され、各切断は、低減された末端リンカーを用いて行われた。

【0406】

【表10】

【0407】

図１６Ａに示されるように、切断物４及び５のみが、観察されたＲＢＤ結合をもたらさなかった。切断物３Ａ及び３Ｂは、ＥＬＩＳＡにおける結合の低減及びＳＤＳ－ＰＡＧＥにおけるバンド拡散性の増加を実証した（図１６Ｂ）。切断物１～３は、親Ｒ２Ｇ３ ＣＤＲ３－ノブと比較して結合活性の喪失を有さなかった。まとめると、これらの結果は、Ｒ２Ｇ３結合のための最後の非標準Ｃｙｓ残基の後の最低９個のアミノ酸を支持する。

【0408】

Ｂ．最小ＣＤＲ３－ノブＮ末端の定義
実施例１１に記載したのと同様に、一連のＲ２Ｇ３切断物をｐＥＴ３２ｂにクローニングして、原型ＣＤＲ３－ノブのＮ末端要件を定義し、上記の実施例６に記載されるように発現させた。発現させた材料の質を、実施例６に記載されるように、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びＲＢＤ ＥＬＩＳＡにより評価した。例示的な試験したＲ２Ｇ３切断物を以下の表Ｅ１０に示す。

【0409】

【表11】

【0410】

試験した例示的なＮ末端切断物の各々は、ＥＬＩＳＡによるビオチン化ＲＢＤに対する同様の結合プロファイル及びＳＤＳ－ＰＡＧＥにおけるバンド拡散性を示すことが観察された（それぞれ図１７Ａ及び１７Ｂ）。切断物５は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥを介して２つのバンドをもたらしたが、これは結合活性のいかなる低減とも相関しなかったことが注目された。これらの結果は、これらの例示的な切断されたＲ２Ｇ３配列において欠失されたアミノ酸のいずれも、ノブドメインの一部ではないことを示唆する。

【0411】

実施例１３：超長ＣＤＲ３－ノブドメインの選択的増幅
超長ＣＤＲ３－ノブドメインを、ウシＶＨ鋳型ライブラリーから選択的に増幅した。ウシＶＨ鋳型ライブラリーを、実質的に実施例２に記載されるように調製した。

【0412】

具体的には、ＲＮＡを、ＲＮＡｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、５×１０^６～１０^７個のウシＰＢＭＣから単離した。Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＶ Ｆｉｒｓｔ－Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ合成キット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して、５μｇの全ＲＮＡからのｃＤＮＡ合成、続いてＰＣＲ増幅を行うことによって、免疫ウシ抗体ＣＤＲ３－ノブレパートリーを得た。ＶＨ鋳型ライブラリーを生成するために、ＣＤＲ３－ノブのためのｃＤＮＡ鋳型は、ＩｇＭ（配列番号４）、ＩｇＡ（配列番号５）、及びＩｇＧ特異的（配列番号３及び６）プライマーのプールを使用して合成された。

【0413】

一次ストーク－ノブＣＤＲ３を、ＣＤＲ３領域のストークドメインのいずれかの側に特異的なＩｇＨＶ１－７ファミリー特異的プライマーを用いて、第１の鎖ｃＤＮＡから増幅した。一次ストーク－ノブＣＤＲ３を、配列番号８～１１に示されるプライマーの全て並びに配列番号１２２～１３０に示されるプライマーのうちの１つを含むプライマーのプールを使用して増幅した。次いで、増幅した配列を、２％のアガロースゲルでのゲル電気泳動を使用して、超長ＣＤＲ３－ノブドメインの優勢について分析した。

【0414】

配列番号１２２～１３０に示されるプライマー（プライマーｐ１～ｐ９）の、例示的な標準的な短いＣＤＲ３抗体（抗体０２８～０３０）及び超長ＣＤＲ３抗体（抗体０１～０２６）の配列に対するアラインメントを図１８Ａに示す。図１８Ａに示される配列の配列識別子（配列番号）を表Ｅ１１に示す。

【0415】

【表12】

【0416】

ゲル電気泳動の結果は、配列番号１２３、１２７、及び１２８に示されるプライマーを含むプライマーのプールによる増幅が、特に６５～６８℃のアニーリングで、超長ＣＤＲ３－ノブドメインの富化をもたらすことを示した（図１８Ｂ）。具体的には、いくつかのプライマーを使用して得られたＰＣＲ産物について２つのバンドが明らかであり、標準的な短いＣＤＲ３－ノブドメイン及び超長ＣＤＲ３－ノブドメインの増幅を示したが、配列番号１２３、１２７、及び１２８に示されるプライマーを使用して、超長ＣＤＲ３－ノブドメインの配列に対応する１つのバンドのみ（約３００～３５０ｂｐの予想されるＰＣＲ産物サイズ）が得られた。

【0417】

ストーク－ノブＣＤＲ３ライブラリーを、配列番号８～１１、１２３、１２７、及び１２８に示されるプライマーを使用して増幅されたＤＮＡから構築した。ライブラリーを実質的に実施例２に記載されるように構築し、実施例３に記載されるように２ラウンドの選択のためにスパイクタンパク質に対して選択した。スクリーニングしたクローンの９０％超がスパイク結合クローンであり、全ての結合クローンが超長ＣＤＲ３抗体であった。

【0418】

これらの結果は、超長ＣＤＲ３－ノブドメインが、ＣＤＲ３領域のストークドメインに特異的な特定のプライマーを使用して、ＶＨ鋳型ライブラリーから選択的に増幅され得ることを示す。

【0419】

本発明は、例えば、本発明の様々な態様を例示するために提供される特定の開示された実施形態に範囲を限定することを意図していない。記載の組成物及び方法に対する様々な修正は、本明細書における記載及び教示から明らかになるであろう。そのような変形は、本開示の真の範囲及び趣旨から逸脱することなく実施され得、本開示の範囲内に入ることが意図される。

【0420】

【表13-1】

【0421】

【表13-2】

【0422】

【表13-3】

【0423】

【表13-4】

【0424】

【表13-5】

【0425】

【表13-6】

【0426】

【表13-7】

【0427】

【表13-8】

【0428】

【表13-9】

【0429】

【表13-10】

【0430】

【表13-11】

【0431】

【表13-12】

【0432】

【表13-13】

【図1】

【図2A】

【図2B】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図3D】

【図4】

【図5A】

【図5B】

【図5C】

【図5D】

【図5E】

【図5F】

【図5G】

【図6A】

【図6B】

【図6C】

【図6D】

【図7A】

【図7B】

【図8A】

【図8B】

【図8C】

【図8D】

【図8E】

【図9A】

【図9B】

【図9C】

【図9D】

【図10A】

【図10B】

【図10C】

【図10D】

【図11A】

【図11B】

【図12】

【図13A】

【図13B】

【図14】

【図15】

【図16A】

【図16B】

【図17A】

【図17B】

【図18A】

【図18B】

【配列表】

2024521987000001.app

【国際調査報告】