特表 2024-522012 ＲＮＡに作用する内因性アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）による効率的および正確なＲＮＡ編集のためのアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-06-06

(54)【発明の名称】ＲＮＡに作用する内因性アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）による効率的および正確なＲＮＡ編集のためのアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/11 20060101AFI20240530BHJP

   A61P 3/00 20060101ALI20240530BHJP

   A61P 25/28 20060101ALI20240530BHJP

   A61P 27/02 20060101ALI20240530BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20240530BHJP

   A61K 31/712 20060101ALI20240530BHJP

   A61K 31/7125 20060101ALI20240530BHJP

【ＦＩ】

C12N15/11 Z ZNA

A61P3/00

A61P25/28

A61P27/02

A61K48/00

A61K31/712

A61K31/7125

【審査請求】未請求

【予備審査請求】有

(21)【出願番号】P 2023574225

(86)(22)【出願日】2022-05-31

(85)【翻訳文提出日】2024-01-30

(86)【国際出願番号】 EP2022064714

(87)【国際公開番号】W WO2022253810

(87)【国際公開日】2022-12-08

(31)【優先権主張番号】21177135.7

(32)【優先日】2021-06-01

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＲＩＴＯＮ

２．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】513008971

【氏名又は名称】エバーハルト カール ウニヴェルジテート テュービンゲン

【氏名又は名称原語表記】Ｅｂｅｒｈａｒｄ Ｋａｒｌｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｅｔ Ｔｕｅｂｉｎｇｅｎ

【住所又は居所原語表記】Ｇｅｓｃｈｗｉｓｔｅｒ－Ｓｃｈｏｌｌ－Ｐｌａｔｚ， ７２０７４ Ｔｕｅｂｉｎｇｅｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ

(74)【代理人】

【識別番号】110000338

【氏名又は名称】弁理士法人 ＨＡＲＡＫＥＮＺＯ ＷＯＲＬＤ ＰＡＴＥＮＴ ＆ ＴＲＡＤＥＭＡＲＫ

(72)【発明者】

【氏名】シュタッフォルスト，トルステン

(72)【発明者】

【氏名】マークル，トビアス

(72)【発明者】

【氏名】ヴェットエンゲル，ジャクリーン

【テーマコード（参考）】

4C084

4C086

【Ｆターム（参考）】

4C084AA13

4C084NA14

4C084ZA15

4C084ZA33

4C084ZC21

4C086AA01

4C086AA02

4C086EA16

4C086MA01

4C086MA04

4C086NA14

4C086ZA15

4C086ZA33

4C086ZC21

(57)【要約】

本発明は、内因性ＡＤＡＲによる、細胞内の標的ＲＮＡの部位特異的Ａ－ｔｏ－Ｉ編集に使用するための化学修飾オリゴリボヌクレオチドに関し、上記標的ＲＮＡ中の標的配列に結合可能である、２５～８０ヌクレオチドの長さの配列を含み、イノシンに編集される上記標的ＲＮＡ中の標的アデノシンと向かい合うセントラルヌクレオチドを有する、３個のヌクレオチドであるセントラル塩基トリプレットを含み、ａ）上記セントラル塩基トリプレットの外側のピリミジンヌクレオシドの少なくとも９０％は、糖部分の２’位で化学修飾されているか、デオキシリボヌクレオシドであるか、またはそれらの組み合わせであり、ｂ）連続した６個以上のヌクレオシドは、糖部分の２’位において２’－Ｏ－メチルによって化学修飾され、ｃ）上記セントラル塩基トリプレットの３つのヌクレオシドのうち少なくとも２つは、糖部分の２’位において化学修飾されているか、デオキシリボヌクレオシドである。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

内因性ＡＤＡＲによる、細胞内の標的ＲＮＡの部位特異的Ａ－ｔｏ－Ｉ編集に使用するための化学修飾オリゴリボヌクレオチドであって、
上記標的ＲＮＡ中の標的配列に結合可能である、２５～８０ヌクレオチドの長さの配列を含み、
イノシンに編集される上記標的ＲＮＡ中の標的アデノシンと向かい合うセントラルヌクレオチドを有する、３個のヌクレオチドであるセントラル塩基トリプレットを含み、
ａ）上記セントラル塩基トリプレットの外側のピリミジンヌクレオシドの少なくとも９０％は、糖部分の２’位で化学修飾されているか、デオキシリボヌクレオシドであるか、またはそれらの組み合わせであり、
ｂ）連続したわずか６個のヌクレオシドは、糖部分の２’位において２’－Ｏ－メチルによって化学修飾され、
ｃ）上記セントラル塩基トリプレットの３つのヌクレオシドのうち少なくとも２つは、糖部分の２’位において化学修飾されているか、デオキシリボヌクレオシドであるか、またはそれらの組み合わせであることを特徴とする、化学修飾オリゴリボヌクレオチド。

【請求項2】

上記標的ＲＮＡ中の編集される標的アデノシンと向かい合うヌクレオシドが、Ｎ－ヘテロ環塩基、より好ましくはピリジンまたはピリミジン塩基、好ましくはシトシン、ウラシル、チミンまたは５－メチルシトシンの群から選択されるヌクレオシド、最も好ましくはシトシンを有する、請求項１に記載の化学修飾オリゴリボヌクレオチド。

【請求項3】

ヌクレオシド間の連結の少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、最も好ましくは少なくとも６０％がホスホロチオエート連結である、先行する請求項のいずれかに記載の化学修飾オリゴリボヌクレオチド。

【請求項4】

上記オリゴリボヌクレオチドが、少なくとも５個、好ましくは少なくとも１０個、より好ましくは少なくとも１５個、最も好ましくは少なくとも２０個のホスホロチオエート連結を有するヌクレオシド間の連続したホスホロチオエート連結の少なくとも１つのヌクレオチドブロックを含む、先行する請求項のいずれかに記載の化学修飾オリゴリボヌクレオチド。

【請求項5】

上記セントラル塩基トリプレットの外側のピリミジンヌクレオシドの化学修飾が、２’－フルオロおよび２’－Ｏ－メチル置換基の組合せを構成し、それにより、化学修飾の少なくとも２０％、好ましくは３０～７０％、より好ましくは４０～６０％が２’－Ｏ－メチル置換基である、先行する請求項のいずれかに記載の化学修飾オリゴリボヌクレオチド。

【請求項6】

６個以下、より好ましくは５個以下、最も好ましくは４個以下の連続したヌクレオシドが２’－Ｏ－メチル修飾を含む、先行する請求項のいずれかに記載の化学修飾オリゴリボヌクレオチド。

【請求項7】

ピリミジンの１００％が、糖部分の２’位で修飾されているか、デオキシリボヌクレオシドであるか、またはそれらの組み合わせである、先行する請求項のいずれかに記載の化学修飾オリゴリボヌクレオチド。

【請求項8】

上記セントラル塩基トリプレット中の３つのヌクレオシドのそれぞれがデオキシリボヌクレオチドである、先行する請求項のいずれかに記載の化学修飾オリゴリボヌクレオチド。

【請求項9】

５’－ＣＡＮ配列コンテキスト（Ｎ＝Ｇ、Ａ、Ｕ、またはＣ）中のアデノシンを標的とするとき、上記セントラル塩基トリプレットの３’位のヌクレオシドがイノシンまたはその誘導体からなることによって、上記オリゴリボヌクレオチド中のイノシンが標的（ｍ）ＲＮＡ中のシトシン塩基と向かい合うように存在する、先行する請求項のいずれかに記載の化学修飾オリゴリボヌクレオチド。

【請求項10】

ヘアピン－ループ構造ＡＤＡＲリクルート部分が存在しない、先行する請求項のいずれかに記載の化学修飾オリゴリボヌクレオチド。

【請求項11】

上記セントラル塩基トリプレットに隣り合う２つのヌクレオチド配列が同じ長さを有する、先行する請求項のいずれかに記載の化学修飾オリゴリボヌクレオチド。

【請求項12】

上記セントラル塩基トリプレットに隣り合う２つのヌクレオチド配列が異なる長さを有し、それにより、３’末端の配列が少なくとも４個のヌクレオチド、好ましくは少なくとも９個のヌクレオチドであり、５’末端の配列が少なくとも１９個のヌクレオチド、好ましくは少なくとも２８個のヌクレオチド、より好ましくは少なくとも３３個のヌクレオチドである、先行する請求項のいずれかに記載の化学修飾オリゴリボヌクレオチド。

【請求項13】

３’末端および５’末端が、３個の連続した２’－Ｏ－メチルホスホロチオエートヌクレオチドまたは３個の２’－Ｏ－メトキシエチル（２’ＭＯＥ）ホスホロチオエートヌクレオチドのブロックでそれぞれ修飾されている、先行する請求項のいずれかに記載の化学修飾オリゴリボヌクレオチド。

【請求項14】

３’末端および５’末端の両方の末端が、少なくとも５個の連続したホスホロチオエート連結を含む、先行する請求項のいずれかに記載の化学修飾オリゴヌクレオチド。

【請求項15】

上記セントラル塩基トリプレットの外側のピリミジンヌクレオシドの化学修飾が、少なくとも１個、特に少なくとも５個の２’－フルオロ置換基を含む、先行する請求項のいずれかに記載の化学修飾オリゴヌクレオチド。

【請求項16】

上記セントラル塩基トリプレットの外側のピリミジンヌクレオシドの化学修飾が、２’－フルオロおよび２’－Ｏ－メチル置換基の組合せを構成し、それによって化学修飾の少なくとも２０％が２’－Ｆ置換基である、先行する請求項のいずれかに記載の化学修飾オリゴリボヌクレオチド。

【請求項17】

先行する請求項のいずれかに記載の少なくとも１つの化学修飾オリゴリボヌクレオチドを含むことを特徴とする、ヒトの障害または疾患、好ましくは遺伝的障害または疾患の処置または予防のための医薬。

【請求項18】

ヒトＳＥＲＰＩＮＡ１中の共通のＥ３４２Ｋ変異を標的とすることによるα１－アンチトリプシン欠損症の処置もしくは予防のための、または、
ヒトＬＲＲＫ２中の共通のＳ２０１９Ｇ変異を標的とすることによる神経変性疾患の処置もしくは予防のための、または、
ヒトＩＤＵＡ中の共通のＷ４０２Ｘ変異を標的とすることによるムコ多糖症の処置もしくは予防のための、または、
ヒトＰＤＥ６Ａ中のＶ６８５Ｍ変異を標的とすることによる網膜色素変性症の処置および予防のための、または、
ヒトＰＥＸ１遺伝子中のＧ８４３Ｄ変異を標的とすることによるツェルウェガースペクトラム障害の処置および予防のための、または、
ヒトＡＢＣＡ４中のＧ１９６１Ｅ変異を標的とすることによるスターガルト病もしくは加齢黄斑変性の処置もしくは予防のための、または、
ヒトＣＲＢ１中のＣ９４８Ｙ変異を標的とすることによる網膜色素変性症もしくはレーバー先天性黒内障等の網膜疾患の処置もしくは予防のための、請求項１～１６のいずれかに記載の化学修飾オリゴリボヌクレオチド。

【発明の詳細な説明】

【発明の詳細な説明】

【0001】

本発明は、標的ＲＮＡの部位特異的編集に使用する方法および化学修飾された核酸に関する。分子生物学の飛躍的な進歩により、細胞の遺伝情報を改変することが可能である。ＤＮＡの編集は通常、細胞の遺伝情報の安定した改変につながるが、ＤＮＡを変更するのではなく、（ｍ）ＲＮＡの遺伝情報を変更することが興味深い場合もある。（ｍ）ＲＮＡの編集がＤＮＡに勝る主要な利点は、一方では編集収率の用量依存性であり、他方では処理の可逆性である。標的ＲＮＡが編集される細胞内の化学修飾された核酸の濃度を調節することで、編集収率、ひいては標的ＲＮＡの翻訳後の修飾タンパク質の量に依存性を持たせることができる。一方、化学修飾された核酸が関連細胞内に存在しなくなると標的ＲＮＡの編集が停止し、編集されたＲＮＡは新たに転写された未編集のＲＮＡと置換されるため、この処理は可逆的である。

【0002】

本発明によるＲＮＡ分子の編集は、ＲＮＡに作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）のファミリーに属する酵素によって媒介される。ＡＤＡＲは、二本鎖ＲＮＡ中のアデノシン（Ａ）からイノシン（Ｉ）への脱アミノ化（Ａ－ｔｏ－Ｉ ＲＮＡ編集）を触媒する酵素ファミリーのメンバーである。この酵素触媒反応の過程で、アデノシンは水和中間体を経てイノシンに変化する。グアノシンは相補的塩基であるシチジンと３つの水素結合を形成できるが、イノシンはシチジンと２つの水素結合しか形成できない。翻訳機構はイノシンをグアノシンとして読み取る。したがって、ＡＤＡＲはＲＮＡレベルで機能的なアデノシンからグアノシンへの変異を導入する効果を有する。

【0003】

ＡＤＡＲファミリーに属するデアミナーゼがＲＮＡ、特にｍＲＮＡに作用できる要件は、二本鎖が形成されることである。したがって、ＡＤＡＲが作用できる二本鎖分子を形成できる相補的核酸（以下、オリゴヌクレオチドまたはオリゴリボヌクレオチド）を提供することが必要である。

【0004】

本発明は、アデノシン（Ａ）からグアノシン（Ｇ）への機能的変化を引き起こすことができる化学修飾された核酸を開示する。ＲＮＡの配列によっては、このような変異が劇的な影響をもたらすことがある。その変異は、ｍＲＮＡによってコードされるタンパク質に有害な影響を及ぼす点変異を直してもよく、または、他のアミノ酸が置換によって、翻訳されたタンパク質に組み込まれてもよい。しかしながら、停止コドン（ＵＡＡ、ＵＡＧ、ＵＧＡ）が編集されるまたはスプライス部位のときは、強い影響が観察され得る。

【0005】

本発明の化学修飾オリゴヌクレオチドの実質的な利点は、このようなオフターゲット編集が可逆的であり、壊滅的な副作用の危険が少ないことである。さらに、必要に応じて治療を中止し、元に戻すことができる。より優れた安全性プロファイルのために、ＲＮＡレベルでのヒト遺伝情報の一時的で限定的な操作が広く適用できるようになってもよく、ＤＮＡレベルでのゲノム編集が予測不可能で不可逆的な副作用のために危険である可能性がある医学的適応に拡大してもよい。

【0006】

ヒトの組織には、アデノシンからイノシンへの変換を可能にするいくつかのＡＤＡＲ酵素が発現しており、イノシンは順に翻訳時には生化学的にグアノシンとして読まれる。いくつかのＡＤＡＲが当技術分野で知られている。ＡＤＡＲはXenopus levisで見出され、ヒトおよびネズミの細胞でも見出されている。３つのヒトのＡＤＡＲはすべて共通のＣ末端デアミナーゼドメインを有するが、触媒活性を有することが明らかになったのはＡＤＡＲ１およびＡＤＡＲ２のみである。ＡＤＡＲは二本鎖ＲＮＡ結合ドメイン（ｄｓＲＢＤ）という共通の機能ドメインを共有する。ＡＤＡＲ１が３つのｄｓＲＢＤを含むのに対し、ＡＤＡＲ２およびＡＤＡＲ３は２つのｄｓＲＢＤしか共有しない。ＡＤＡＲ１について、２つのアイソフォームが知られている。構成的に発現する、短い１１０ｋＤａのＡＤＡＲ１はｐ１１０アイソフォームであるのに対し、長い１５０ｋＤａのＡＤＡＲ１はｐ１５０アイソフォームであり、これは別のインターフェロン誘導性プロモーターから発現する。現在の知見では、ＡＤＡＲ２は脳内のコード部位を主に編集する。ＡＤＡＲ１は非コード部位を編集する主要な酵素である。

【0007】

ＲＮＡを効率的に編集するためには、ＡＤＡＲがｍＲＮＡ転写産物上の特定の標的部位に誘導されることが必要である。先行技術におけるこれまでの試みは、ＡＤＡＲのデアミナーゼ活性を特定の部位に誘導し、それによってＡＤＡＲのデアミナーゼ活性を編集されるｍＲＮＡ分子上の正しい位置にもたらすために、天然のシス作用性ＡＤＡＲリクルート配列に由来する、特異的なループ－ヘアピン構造のＡＤＡＲリクルート部位を利用していた。部位特異的ＲＮＡ編集のためのこのような人工核酸は、ＷＯ２０２０／００１７９３に開示されている。先行技術に開示されている人工核酸は標的配列を含み、この配列は、標的ＲＮＡ中の標的配列に相補的または少なくとも部分的に相補的な核酸配列と、デアミナーゼをリクルートするためのリクルート部位とを含む。

【0008】

本発明の化学修飾された核酸は、特にデアミナーゼをリクルートするためのループ－ヘアピン構造のリクルート部分を有していない点で、先行技術に開示される核酸オリゴヌクレオチドとは異なる。本発明の化学修飾された核酸は、従来技術から知られているコンストラクトとは別の戦略を使用する。さまざまなＲＮＡ消化酵素、特にＲＮアーゼ（RNase）ＡおよびＲＮアーゼＨの偏在により、ＲＮＡが非常に不安定であることはよく知られている。先行技術によるＲＮＡ編集は、リクルート部位によってデアミナーゼをリクルートすることによってのみ達成する。リクルート部位は、所望の作用部位、すなわちイノシンに変換されるべき標的アデノシン、しかし機能的にはグアノシンに変換される、にデアミナーゼを誘導する。

【0009】

これに反して、本発明の化学修飾された核酸は、デアミナーゼのためのループ－ヘアピン構造のリクルート部位を必ずしも有していない。その代わりに、本発明の化学修飾された核酸は、ＡＤＡＲ酵素が付着するＲＮＡ二重鎖を形成し、それにより編集効率が向上する。後者は、その全長にわたって特定の最適な化学修飾パターンである化学修飾された核酸を使用することによって達成される。ＡＳＯの化学修飾がセントラルトリプレット（central triplet）に限定されず、セントラルトリプレットに隣接する側面にまで及ぶことが本発明の重要な特徴である。

【0010】

標的ＲＮＡ配列のセントラルトリプレットは、両側の１つのヌクレオチドによって隣接するアデノシンを含み、セントラル塩基トリプレット（Central Base Triplet）と称する。本発明の化学修飾オリゴヌクレオチド中のセントラル塩基トリプレットに相補的な配列は、その特異的な化学修飾に関して重要である。ｍＲＮＡ（編集）の翻訳レベルでの機能的変化を可能にするためには、本発明のオリゴヌクレオチドがｍＲＮＡの編集を可能にすることが必要である。本発明のオリゴヌクレオチドは、一方では、オリゴヌクレオチドの化学修飾、特にオリゴヌクレオチドの糖部分の修飾によって達成され得る分解（例えばＲＮアーゼによって引き起こされる）に対して十分に安定化されていることが必須である。

【0011】

他方では、化学修飾はＲＮＡ分子の編集を可能にしなければならない。オリゴヌクレオチドの化学修飾が広範囲に及ぶと、編集効率が許容できないレベルまで低下する。したがって、オリゴヌクレオチドの修飾は、最適な編集効率を得るために、本明細書に記載のガイドラインに従わなければならない。

【0012】

ＥＰ３５０７３６６は、ＡＤＡＲ酵素による標的アデノシンの脱アミノ化のための化学修飾一本鎖ＲＮＡ編集オリゴヌクレオチドを開示しており、これにより、３個の連続したヌクレオチドであるセントラル塩基トリプレットは、糖修飾および／または塩基修飾を含む。フランキング領域（flanking region）は、すべての実施形態（上記先行技術の図２）において、リボース単位における２’－Ｏ－メチル化のブロックと、少数の付加的な末端ホスホロチオエート連結とで一様に修飾されている。

【0013】

しかしながら、上記の先行技術で使用されている核酸の上記均一でブロック状の２’－Ｏ－メチル修飾は、内在性発現レベルの天然ＡＤＡＲ酵素による編集活性の強い損失につながることが見出された。これは、ｄｓＲＮＡ基質への二本鎖ＲＮＡ結合ドメインの結合に対する嵩高い２’－修飾の負の効果に従っている。具体的には、２’－Ｆおよび２’－Ｆと２’－ＯＭｅとの混合物が特によく受け入れられ、核酸上のすべてのピリミジン塩基に配置されるときにヌクレアーゼ消化に対してさらに良好な安定化効果を有することを本発明で記述している。したがって、本発明のオリゴヌクレオチドは、１分子あたり少なくとも１つの２’－Ｆ、好ましくは少なくとも５つ、より好ましくは少なくとも８つの２’－Ｆ修飾を含む。オリゴヌクレオチド中のすべてのピリミジン塩基における２’－Ｆ修飾は、２０％～６０％、好ましくは４５％～５５％の範囲である。

【0014】

しかしながら、セントラル塩基トリプレットの２’－Ｆ、特に２’－Ｏ－メチル化は、編集収率に強い悪影響を及ぼした。しかしながら、セントラル塩基トリプレットの３つの位置すべてにおいてデオキシリボースがよく許容され、ヌクレアーゼ消化に対して実質的な安定化を与えることを見出した。本発明の好ましい実施態様において、コントロールトリプレットに相補的なオリゴヌクレオチドの３つの糖単位はデオキシリボース単位である。

【0015】

化学修飾された核酸はさらに、標的ｍＲＮＡの部位特異的編集における使用に適していることを特徴とする。化学修飾された核酸は、標的アデノシンと向かい合うセントラル塩基トリプレットのセントラルヌクレオチドを除く、標的ｍＲＮＡ中の標的配列と完全に相補的な配列を含む。セントラル塩基トリプレットのセントラルヌクレオチドは、典型的にはシトシンまたはその誘導体であるが、核酸塩基アナログもあり得、典型的にはＮ－ヘテロ環化合物上に構築され、通常相補的なチミジンまたはウラシルを置換し、通常ＡＤＡＲによる編集部位の認識を向上させる。アデノシンデアミナーゼの作用により、標的アデノシンは転写後にグアノシンへ機能的に変化される。したがって、投与されたオリゴヌクレオチドが標的ＲＮＡとハイブリダイズするときに形成されるｄｓＲＮＡ内のＡＤＡＲによって標的とされるアデノシンの認識を向上させるために、上述の１つの例外を除いて、ヌクレオチドの配列はｍＲＮＡの標的領域と常に相補的である。さらに重要なことは、オリゴヌクレオチドの修飾、特に糖部分とその間の連結のパターンである。

【0016】

本発明の原理は、化学修飾された核酸がｍＲＮＡの編集を可能にするために十分な期間安定でなければならないという事実に基づいている。通常、ＲＮＡ分子は細胞内で非常に速く分解される。したがって、核酸は化学修飾されるが、化学修飾された核酸が細胞内で十分な時間存在し続け、同時に当該修飾がＡＤＡＲによる認識を妨げない程度に当該修飾を行われなければならない。オリゴヌクレオチドの修飾には、ヌクレオチドの糖部分が関係する。ＲＮＡ塩基は修飾されていない部分である。オリゴヌクレオチドを安定化させる好ましい修飾は、デオキシリボース部分、またはリボース部分に２’－Ｏ－メチルおよび／または２’－Ｆ修飾を有するＲＮＡ塩基である。別の修飾は、糖部分間のリン酸結合をホスホロチオエート結合で置き換えることである。

【0017】

本発明の過程において、人工核酸（オリゴヌクレオチド）は１５～８０ヌクレオチド、好ましくは２５～６５ヌクレオチド、より好ましくは３０～６０ヌクレオチドの長さを有することが見出された。このような長さの核酸を、本出願ではオリゴヌクレオチドと称する。

【0018】

本発明の化学修飾された核酸（オリゴヌクレオチド）は、標的ｍＲＮＡ中の対応する配列とほぼ１００％の相補性で相補的な配列を有する。いくつかの実施形態において、標的ｍＲＮＡ中の対応する配列に対する化学修飾オリゴヌクレオチドの相補性は、少なくとも８５％の相補性である。完全な相補性はハイブリダイゼーションプロセスにとって最適である一方、天然のＡＤＡＲ基質はしばしば少数のミスマッチおよび／またはバルジを含み、二本鎖ＲＮＡ結合ドメインによる基質認識またはデアミナーゼの活性部位内部での基質認識を向上させるために二本鎖基質の構造的摂動を可能にすることによって編集を補助する。

【0019】

本発明の化学修飾された核酸（オリゴヌクレオチド）では、ピリミジンヌクレオシドの少なくとも９０％、好ましくは９５％、さらに好ましくは１００％が２’－位で化学修飾されている。セントラル塩基トリプレットの外側では、修飾は好ましくは２’－アルキル、より好ましくは２’－Ｏ－メチル、または２’－Ｏ－エチル、２’－アミノ、または２’－ハロ、より好ましくは２’－フルオロ修飾である。セントラル塩基トリプレットの内側では、少なくとも２つ、より好ましくはすべての核酸塩基、ピリミジンおよびプリンが、２’－ＯＭｅ、または２’－Ｆ、より好ましくは２’－デオキシで修飾されている。本発明の一実施形態において、両末端（５’／３’）に末端ブロックが存在し、好ましくは両末端に３個の２’－ＯＭｅ／ＰＳヌクレオチドまたは２’－ＭＯＥ／ＰＳが存在する。

【0020】

特に好ましい実施形態において、セントラル塩基トリプレットの外側のピリミジンヌクレオシドは、任意の化学量論で、好ましくは２０：８０～８０：２０、より好ましくは７０：３０～３０：７０、さらにより好ましくは６０：４０～４０：６０の２’－フルオロと２’－Ｏ－メチル置換基との混合物で修飾されている。２’－Ｆおよび２’－Ｏ－メチル修飾が混合される場合、６個以下、好ましくは５個以下、さらに好ましくは４個以下の２’－Ｏ－メチル修飾が１つのブロックに結合されるべきである。このような混合物において、少なくとも１つのピリミジンヌクレオシド、好ましくは少なくとも５つ、より好ましくは少なくとも８つのピリミジンヌクレオシドが２’－フルオロ置換基で修飾されている。

【0021】

本発明の実施形態の化学修飾された核酸のセントラル塩基トリプレットには、Ｎ－ヘテロ環塩基、ピリジンまたはピリミジン誘導体、より好ましくはシトシンヌクレオシドまたはその誘導体を有するヌクレオシドが存在し、これは標的（ｍ）ＲＮＡ中の標的アデノシンと向かい合う。特に好ましい実施態様において、このヌクレオシドならびに５’および３’－特異的隣接ヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾ヌクレオシド、より好ましくは２つの修飾ヌクレオシド、さらにより好ましくは３つの修飾ヌクレオシドを含み、２’炭素原子に置換基を有し、この置換基は２’－フルオロもしくは２’－Ｏ－メチル、またはさらにより好ましくは２’－デオキシのいずれかである。

【0022】

標的（ｍ）ＲＮＡにおいて、

【化1】

コドン（標的とされるＡに下線を付し、Ｎ＝任意の核酸塩基である）が標的とされるとき、本発明の化学修飾された核酸のセントラル塩基トリプレットは、２’－デオキシ－イノシンまたはヒポキサンチン核酸塩基もしくはその誘導体を有する任意のヌクレオチドを含み、これは標的とされるアデノシンに５’－隣接するシトシン塩基と対をなす。好ましくは、２’－デオキシ－イノシンは、２つ、より好ましくは３つの２’－デオキシヌクレオチドを含むセントラル塩基トリプレットに配置される。

【0023】

本発明の化学修飾された核酸は、分解に対する安定性が向上し、ＡＤＡＲと結合するのに最適な化学修飾パターンを示すので、本発明の核酸は、デアミナーゼを引き付ける特異的なループ－ヘアピン構造のリクルート部分を有していないことが好ましい。

【0024】

本発明の一実施態様において、化学修飾された核酸は対称的であり、これはセントラル塩基トリプレットに隣接する２つのヌクレオチド配列が同じ長さを有することを意味する。オリゴヌクレオチドが例えば５９ヌクレオチドを有するとき、セントラル塩基トリプレットの両側に２８ヌクレオチドが存在する。本発明の対称的な実施形態の概略構造を図１Ｂに示す。

【0025】

別の実施形態において、本発明の核酸は対称的ではなく、これはセントラル塩基トリプレットに隣接する２つの配列の長さが異なることを意味する。非対称設計は、標的周辺の配列空間をより柔軟に使用することを可能にする。さらに、非対称設計は、核酸が正しい末端で短縮されることを条件として、対称設計と比較して、核酸の短い配列、例えば４５ｎｔの編集収率を高めることができることが見出された。好ましくは、セントラル塩基トリプレットに対するフランキング配列（flanking sequence）５’は、非対称実施形態におけるフランキング配列３’よりも長い。好ましい実施形態は、３’フランキング配列において少なくとも４ｎｔ、より好ましくは少なくとも９ｎｔを含み、５’フランキング配列において少なくとも１９ｎｔ、より好ましくは少なくとも２８ｎｔ、最も好ましくは少なくとも３３ｎｔを含む。本発明の非対称実施形態の概略構造を図１Ａに示す。

【0026】

好ましい実施形態において、本発明の核酸は、少なくとも３０％、より好ましくは４０％、さらに好ましくは５０％、最も好ましくは６０％超の割合でホスホロチオエート連結を介して連結される。好ましくは、少なくとも１０、より好ましくは少なくとも１５、最も好ましくは２０以上のヌクレオシド連結が、核酸の末端（５’または３’）から出発して、ほとんど不連続になることなく、より好ましくは一切不連続になることなく配置される。本発明の別の実施態様において、好ましくは連続的なホスホロチオエート連結の上記ブロックは、核酸の両末端（５’および３’）から出発して核酸の両側面に配置される。

【0027】

別の好ましい実施形態において、糖部分の修飾はホスホロチオエート連結と組み合わされる。

【0028】

本発明の化学修飾された核酸は、ＲＮアーゼによる通常もたらされる分解に対して実質的により安定であり、その結果、（ｍ）ＲＮＡが編集されるべき細胞内でより長く存在することができる。理論に束縛されることを望むものではないが、化学修飾された核酸の寿命は細胞の環境中で増加するので、二本鎖による安定性の長期化によってｍＲＮＡにＡＤＡＲが作用することができるため、デアミナーゼをリクルートするためのリクルート部位は必要ない。

【0029】

生物学的反応は時間依存的であることが多い。脊椎動物の細胞内には多種多様なＲＮＡ分子が存在し、それらは恒常的で迅速に入れ替わる。ＲＮＡ分子は様々なＲＮアーゼによって頻繁に分解される。したがって、治療目的でのＲＮＡ分子の使用は、ＲＮＡ分子の急速な分解によって制限されることが多い。通常、ｉｎ ｖｉｖｏの状態は、細胞培養による試験系を使用するｉｎ ｖｉｔｒｏの状態とは異なるため、治療目的で使用される分子の安定性は、処置の成功にとって決定的な意味を有する可能性がある。

【0030】

本発明の化学修飾された核酸分子は、編集能力と細胞内での十分な安定性との良好なバランスを提供し、それによりエンドソーム内の状態さえも許容し得る。本発明の化学修飾オリゴヌクレオチドは、さらにジムノティックの取り込み（gymnotic uptake）が可能であり、許容できる編集効率を示す。

【0031】

本発明の化学修飾された核酸による最良の結果は、オリゴヌクレオチドにおいて以下の特徴のうち好ましくはいくつか、より好ましくは少なくとも２つ、さらに好ましくは少なくとも３つの特徴が実現されたときに達成され得る：
セントラル塩基トリプレットに隣接する領域に配置されているホスホロチオエートの含有量が高い（少なくとも３０％）；
少なくとも１つのＤＮＡ糖ヌクレオシドが、脱アミノ化されるアデノシンと向かい合うセントラル塩基トリプレットに存在する；
ほぼ等しい化学量論でのヌクレオシドリボース部分の２’－Ｆまたは２’－ＯＭｅ修飾による、セントラル塩基トリプレットの外側のピリミジン塩基の安定化であり、それによって２’－ＯＭｅのブロックを避けるパターンが好ましい；
両末端は、二重修飾、すなわち糖部分の２’－ＯＭｅ修飾およびホスホロチオエート連結を有する３つのヌクレオチドのブロックによって安定化されている。

【0032】

本発明の化学修飾された核酸分子（オリゴヌクレオチド）は、分子が脊椎動物の生体中で十分に安定であるという利点を有することによって、所望の効果が達成され得る。本発明の分子は、種々のＲＮアーゼの分解に対して十分な期間安定であることによって、効果が発揮され得る。

【0033】

本発明の化学修飾された核酸の別の利点は、特定のベクターまたは特定のトランスフェクション法等の他の助力機構なしに、標的細胞に直接もたらすことができることである。本発明の化学修飾された核酸はジムノシス（gymnosis）を介して作用することができ、これはベクターまたは他の担体等の補助手段なしに標的細胞に直接適用できることを意味する。

【0034】

本発明の化学修飾された核酸の別の利点は、臨床的に関連する標的において編集効率が高いことである。修飾核酸はジムノシスを介して標的細胞に導入することができ、標的細胞における翻訳レベルに対して比較的高い効果を達成し得る。

【0035】

本発明の化学修飾された核酸の別の利点は、ＡからＩへの編集が、５’ＵＡＧ等の比較的編集しやすい標的だけでなく、５’ＣＡＡ等のより困難なトリプレットでも達成し得ることである。

【0036】

本発明およびその好ましい実施形態は、実施例および図によって説明されるが、これらは限定的なものではない。

【0037】

図には、本発明の好ましい実施形態が特に示されている。

【0038】

図１は、本発明の２つの好ましい実施形態の基本構造および用語を示す。図１Ａ）は非対称修飾オリゴヌクレオチドを示し、図１Ｂ）は対称設計を示す。

【0039】

図１Ａは、標的とされるＲＮＡに結合する、セントラル塩基トリプレット（ＮＮＮ）の３’－隣接する４以下のヌクレオチドおよび５’－隣接する１９以下のヌクレオチドを含む、本発明の非対称実施形態である。標的とされるアデノシン（Ａ^＊）は、セントラル塩基トリプレットのセントラルヌクレオチドと向かい合っている。

【0040】

図１Ｂは、標的とされるＲＮＡに結合する、セントラル塩基トリプレットに５’－および３’－隣接する少なくとも１１個のヌクレオチドを含む、本発明の対称的な実施形態である。標的とされるアデノシンは、セントラル塩基トリプレットのセントラルヌクレオチドと向かい合っている。

【0041】

図２は、実施例１で実施した実験の結果を示す。ＧＡＰＤＨオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の編集の程度は、異なるオリゴヌクレオチドについてパーセントで示され、その配列は表中に提供される。実験は、インターフェロン－αの存在下（＋ＩＦＮ）および非存在下で行った。

【0042】

図２Ｅは、ガイドＲＮＡの長さが編集効率に及ぼす影響を示している。少なくとも２５ヌクレオチドの長さまでは、編集効率は少なくとも許容範囲内であることが分かる。編集効率が約５０％以上であるため、好ましくは、下限は３０ヌクレオチドである。

【0043】

図３は、リードオリゴヌクレオチドＶ１２０．２およびＶ１１７．１９、ならびに、ＧＡＰＤＨの編集を示し、これによる実験は実施例２でより詳細に記載されている。２つの修飾オリゴヌクレオチドを図３Ａ）（非対称）および図３Ｂ）（対称）に模式的に示す。編集は、ＨｅＬａ、Ｕ２ＯＳ、ＳＨ－ＳＹ５Ｙ、ＳＫ－Ｎ－ＢＥ、Ｈｕｈ７、ＨｅｐＧ２、Ａ５４９、ＴＨＰ－１等の種々の細胞株で試験した。実験はインターフェロン－αの存在下（＋ＩＦＮ）および非存在下で行った。

【0044】

図４は、好ましいＧＡＤＰＨコンストラクトへのさらなる化学修飾の導入を示す。図４Ａ）およびＢ）のより詳細な説明および詳細は、実施例３で見出すことができる。図４Ｃ）は安定性を実証し、図４Ｄ）は実施例４に開示されている編集効率を示す。

【0045】

図４Ｄ）およびＥ）に示したグラフの詳細は、実施例５で見出すことができる。

【0046】

図４Ｆは、セントラル塩基トリプレットの外側のピリミジンヌクレオシドの２’－フルオロおよび２’－Ｏ－メチル置換基の組み合わせを有する、「Ｖ１２０．２１」および「Ｖ１２０．２３」と命名された本発明の２つのオリゴヌクレオチドの編集効率の比較である。これらのオリゴヌクレオチドを、ＷＯ２０１９／１５８４７５の図３Ｃ（ＡＤＡＲ １０２－２）、図７（ＡＤＡＲ １０３－８）および図７（ＡＤＡＲ １０２－７）で開示されたコンストラクトと比較した。本発明のコンストラクトの優れた編集効率は、図４Ｆから明確に見出される。

【0047】

図５は、ＨｅＬａ細胞における安定な化学修飾ＧＡＤＰＨ標的コンストラクトによるジムノシスを示す。実験概要は実施例６でより詳細に説明する。

【0048】

図６は、実施例７（図６Ａ））および実施例８（図６Ｂ）で得られた結果を示す。データは、ＳＴＡＴ１ Ｙ７０１編集および安定性データに関する。

【0049】

図７は、ＭｅＣＰ２ Ｗ１０４Ｘの編集および安定性データに関する。図７Ａ）に示した結果の詳細は実施例９で見出すことができ、図７Ｂ）のより詳細な説明は実施例１０で見出すことができ、図７Ｃ）のより詳細な説明は実施例１１で見出すことができる。

【0050】

図８は、ｈＩＤＵＡ Ｗ４０２Ｘの編集、α－Ｌ－イズロニダーゼアッセイ、および実験詳細の安定性データを示す。８Ａ）については実施例１２を、８Ｂ）については実施例１３を、８Ｃ）については実施例１４を参照されたい。

【0051】

図９はｍＩＤＵＡ Ｗ３９２Ｘの編集および安定性データに関する。図９Ａ）は実施例１５の結果、図９Ｂ）は実施例１６の結果、図９Ｃ）は実施例１７の結果を示す。

【0052】

図１０は、ＰＤＥ６Ａ Ｖ６８５Ｍ編集および対応する安定性データに関する。実施例１８の結果を図１０Ａ）に、実施例１９の結果を図１０Ｂ）に、実施例２０の結果を図１０Ｃ）に示す。

【0053】

図１１は、ＳＥＲＰＩＮＡ１ ＰｉＺＺ編集およびＡ１ＡＴ ＥＬＩＳＡおよび安定性データに関する結果を示す。図１１Ａ）の詳細については実施例２１を、図１１Ｂ）については実施例２２を、図１１Ｃ）については実施例２３を参照されたい。

【0054】

図１２は、ＬＲＲＫ２ Ｇ２０１９Ｓ標的について実施例２４で得られた結果を実証する。驚くべきことに、本発明である、修飾を有するオリゴヌクレオチド（Ｖ１１７．１９およびＶ１２０．２）は、非常に高い編集収率を示す。先行技術の教示に従った化学修飾ピリミジンヌクレオチドを導入することにより（Ｖ１１７．２０およびＶ１２０．３）、コンストラクトの編集活性は約半分に減少する。

【0055】

〔実施例１〕ヒトハウスキーピングＧＡＰＤＨ遺伝子のＯＲＦ中のＬ１５７部位および３’ＵＴＲ部位におけるコンストラクトのＲＮＡ編集活性の最適化（図２を参照）

【0056】

実施例１の結果を図２に示す。２×５～２×２５の連結の範囲であるホスホロチオエート（ＰＳ）連結の長いブロックは編集の改善をもたらすことが示されている。図２Ｂ）は、ホスホロチオエート連結なしでは編集が達成できないことを示している（コンストラクトＶ１１７．１）。図２Ｃ）および２Ｄ）は、オリゴヌクレオチドの長さの影響を証明している。非対称デザインを選択した場合、長さは４０ヌクレオチドまで短縮できる。図２Ｅ）に示すように、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の外側、例えば３’ＵＴＲ領域の編集部位について、非対称デザインはオリゴヌクレオチドの長さを２５ｎｔまでも短縮できる。さらに、インターフェロン－αを加えても、編集効率の向上にはつながらないことも興味深い。

【0057】

本発明の好ましい実施形態におけるホスホロチオエート連結の導入の効果、ならびに、最も好ましいコンストラクトの長さおよびセントラル塩基トリプレットの位置決めを調べた。内因性ＡＤＡＲをリクルートすることによって、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）における５’ＵＡＧコンテキストのアデノシンを編集するための内因性ハウスキーピング転写産物（ＧＡＰＤＨ）を標的とするために、本発明の修飾オリゴヌクレオチドを使用した。概して、「ＩＦＮ」として表されるインターフェロンの実験環境への追加は、コンストラクトの編集活性に大きな影響を与えなかった。コンストラクト配列の詳細を表１Ａおよび１Ｂに示す。

【0058】

結果を得るために、ＨｅＬａ細胞（Cat.No.：ATCC CCL-2）をＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋Ｐ／Ｓ（１００Ｕ／ｍＬのペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン）で培養した。１００μＬのＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ（＋６００ユニットのＩＦＮ－α，Merck，カタログ番号ＩＦ００７，ロット番号２９３７８５８）中の５×１０^４細胞を、９６ウェルフォーマット中の０．５μＬのリポフェクタミン２０００と５ｐｍｏｌのコンストラクト／ウェルとのトランスフェクションミックスに加えた。２４時間後にＲＮＡの単離および配列決定のために細胞を回収した。実験から以下の結論が導き出された。

【0059】

Ａ）ホスホロチオエート（ＰＳ）連結の導入量が増えるにつれて、コンストラクトの編集活性は向上する。セントラル塩基トリプレットの両側にホスホチオエート連結が５つしかないコンストラクトＶ１１７．１６（配列番号２）は、両側にＰＳ連結が２５個あるコンストラクトＶ１１７．１９（配列番号５）と比較して、編集活性が著しく低下している。

【0060】

Ｂ）ホスホロチオエート連結を全く含まないコンストラクトは、連続したブロックに配置されたＰＳ連結を付加的に含む実施形態（Ｖ１１７．１９，配列番号５；および、Ｖ１１９．４，配列番号８）とは対照的に、検出可能な編集を示さない。好ましい実施形態において、オリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド間に連続したホスホロチオエート連結の少なくとも１つのヌクレオチドブロックを含む。コンストラクトにおけるホスホロチオエート連結の欠如（Ｖ１１７．１，配列番号１；および、Ｖ１１９．１，配列番号７）は、編集活性に対して壊滅的である。

【0061】

Ｃ）本発明の好ましい実施形態の編集活性は、オリゴリボヌクレオチドの長さに依存する。最小の長さは、編集部位がＯＲＦ内にあるかまたはＯＲＦの外側にあるかに依存して変化し得る。セントラル塩基トリプレットと隣り合うオリゴリボヌクレオチドアームを短くすること、例えば、全長５９ｎｔから４７ｎｔへの短縮（Ｖ１１７．１９，配列番号５；およびＶ１１８．３，配列番号６）は、対称性の実施形態では編集活性に不利である。非対称性の実施形態（Ｖ１１９．４，配列番号８；Ｖ１２０．２、配列番号９；Ｖ１２１．１，配列番号１０；およびＶ１２２．１，配列番号１１）について、対称性の実施形態と比較して、全体としてより短いオリゴリボヌクレオチドは、高い編集効率を得るのに十分であり、例えば、４０ｎｔまで短縮すること（Ｖ１２１．１，配列番号１０）は可能であり、一方、３５ｎｔまで短縮すると、ＯＲＦ内の編集部位に対する編集活性がなくなる（Ｖ１２２．１，配列番号１１）。ＯＲＦの外側の編集部位のオリゴヌクレオチド長に関しては、以下のコンストラクトを検討した：４５ヌクレオチドを有するＶ１２０．２（配列番号６３）；４０ヌクレオチドを有するＶ１２１．２（配列番号６４）；３５ヌクレオチドを有するＶ１２１．３（配列番号６５）；３０ヌクレオチドを有するＶ１２１．４（配列番号６６）；および、２５ヌクレオチドを有するＶ１２１．５（配列番号６７）について、編集効率を検討した。コンストラクトＶ１２１．２（配列番号６４）は、非対称性コンストラクトの３’末端を４ヌクレオチドまで短縮できることも示している。結果を図２Ｅに示す。すべての特徴により、本発明の全オリゴヌクレオチド長の下限は２５ヌクレオチドであると思われる。

【0062】

Ｄ）同じオリゴリボヌクレオチド長のコンストラクトにおけるセントラル塩基トリプレットの好ましい位置は重要である。より長いコンストラクト、例えば本実施例では５９ヌクレオチド（Ｖ１１７．１９，配列番号５；およびＶ１１９．４，配列番号８）は、セントラル塩基トリプレットの明確な好ましい位置を示さない。しかし、より短いコンストラクト、例えば４７ヌクレオチド長（Ｖ１１８．３，配列番号６）または４５ヌクレオチド長（Ｖ１２０．２，配列番号９）は、Ｖ１２０．２（配列番号９）と同様に、セントラル塩基トリプレットをコンストラクトの３’末端側に配置する強い優先性を示し、その結果、セントラル塩基トリプレットに５’－隣接する長いヌクレオチド配列を有する本発明の非対称性の実施形態が得られる。

【0063】

【表1】

【0064】

【表2】

【0065】

〔実施例２〕種々の腫瘍細胞株での、内因性ＡＤＡＲによるＬ１５７部位におけるヒトＧＡＰＤＨ転写産物の編集

【0066】

異なる組織由来の細胞株における本発明のコンストラクトの適用性を調べるために、次の本発明の特に好ましい２つの実施形態を使用して細胞株スクリーニングを実施した：長く、対称性であるデザイン（Ｖ１１７．１９，配列番号５、図３Ｂ）および短く、非対称性であるデザイン（Ｖ１２０．２，配列番号９、図３Ａ）。修飾を示すコンストラクトのリストを表２に示す。

【0067】

種々の腫瘍細胞株は、ＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳで培養したＴＨＰ－１を除き、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋Ｐ／Ｓで培養した。１×１０^５細胞／ウェル（ＨｅＬａ細胞（cat. no. ATCC CCL-2）、U2OS-Flp-In T-REx32（Elmar Schiebelからの親切な寄付）、Ｈｕｈ７（CLS GmbH, Heidelberg, cat. no. 300156）、ＨｅｐＧ２（DSMZ, Braunschweig, Germany, cat. no. ACC180）およびＡ５４９（European Collection of Authenticated Cell Cultures ECACC 86012804））を２４ウェルプレートに播種した。ＳＫ－ＮＢＥ（２）（cat. no. ATCC CRL-2271）およびＳＨ－ＳＹ５Ｙ（cat. no. ATCC CRL-2266）細胞株については、２４ウェルあたり２．５×１０^５細胞を播種した。２４時間後に培地を交換し（ＩＦＮ処理細胞には３，０００Ｕ／ウェルのＩＦＮ－αを補充）、５０μＬのＯｐｔｉＭＥＭ中の２５ｐｍｏｌのＡＳＯ／ウェルと５０μＬのＯｐｔｉＭＥＭ中の１．５μｌ／ウェルのリポフェクタミンＲＮＡｉＭＡＸ試薬（ThermoFisher Scientific）とのトランスフェクションミックスで細胞をフォワードトランスフェクトした。５分間のインキュベーション後、両方の溶液を合わせ、さらに２０分間インキュベートした後、トランスフェクションミックスを１つのウェルに均等に分配した。２４時間後に、ＲＮＡの単離および配列決定のために細胞を回収した。

【0068】

ＴＨＰ－１は、２４ウェルプレートの３×１０^５細胞／ウェルをＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳ＋ＰＭＡ（２００ｎＭ）中で３日間分化させ、その後ＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳで５日間培養した後、同様にトランスフェクトした。

【0069】

図Ｃに示すように、両方のコンストラクトとも試験したすべての細胞株で編集活性を示した。注目すべきことに、編集活性は、先行技術（ＷＯ２０２０／００１７９３に開示される）の場合のようには、インターフェロンの添加（「＋ＩＦＮ」）によって著しく改善されることはなかった。

【0070】

【表3】

【0071】

〔実施例３〕内因性ＡＤＡＲによる、内因性ヒトＧＡＰＤＨ転写産物のＬ１５７部位を標的とするコンストラクトへの化学修飾パターンの導入

【0072】

本実施例の結果を図４Ａ）およびＢ）に示す。例えばコンストラクトＶ１２０．７（配列番号１３）で使用される大きな２’－Ｏ－メチルブロックの使用は、編集の実質的な減少をもたらす（図４Ａ）。図４Ｂ）は、ピリミジンヌクレオシドの修飾に関して、２’Ｆ修飾はよく受け入れられ、２’－Ｏ－メチル修飾は多かれ少なかれ受け入れられるが、２’－ＭＯＥ［２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）］は受け入れられないことを示している。

【0073】

修飾は、合成オリゴヌクレオチドが、非自己オリゴヌクレオチドに対する複数の防御線が存在する治療環境において無傷であるために不可欠であることが証明されている。これらの修飾は、ヌクレオシドの糖部分、例えば２’－ヒドロキシ基（２’ＯＨ）の代わりに２’－Ｏ－メチル、２’－フルオロ（２’Ｆ）、２’－ＭＯＥまたは２’－デオキシ基（２’Ｈ）等であるが、これらに限定されるものではない。異なる種類の修飾に加えて、コンストラクト中の修飾ヌクレオシドの位置も重要な点である。修飾の種類だけでなく、修飾ヌクレオシドの位置もコンストラクトの編集活性に強い影響を与える。試験した配列およびその修飾のリストを表３Ａおよび３Ｂに示す。

【0074】

ＨｅＬａ細胞を培養し、実施例２に記載したようにフォワードトランスフェクトした。簡単に説明すると、２４ウェルあたり１×１０^５細胞を播種し、２４時間後にそれぞれのコンストラクトを２５ｐｍｏｌでフォワードトランスフェクトした。トランスフェクションしてから２４時間後、ＲＮＡ単離およびサンガー配列決定のために細胞を回収した。

【0075】

図４Ａに示すように、先行技術（例えば、ＥＰ３５０７３６６）の特徴である２’－Ｏ－メチル修飾の長いブロック（Ｖ１２０．７，配列番号１３）の導入は、編集活性に壊滅的な影響を及ぼす。しかしながら、他の繰り返しパターンの修飾、例えば２’Ｆ／２’Ｆ／リボ（Ｖ１２０．１３，配列番号１４）、２’－Ｏ－メチル／２’Ｆ（Ｖ１２０．１４，配列番号１５）、２’－Ｏ－メチル／２’Ｆ／２’Ｆ（Ｖ１２０．１５，配列番号１６）、または２’－デオキシ／２’Ｆ／２’Ｆ（Ｖ１２０．１６，配列番号１７）もそれぞれ、編集効率にかなり強い影響を与えた。対照的に、コンストラクト中の多数の選択されたヌクレオチドの化学修飾はよく受け入れられた（図４Ｂ）。これらの実施形態では、セントラル塩基トリプレットの内側のピリミジン塩基を２’－デソキシで修飾し、セントラル塩基トリプレットの外側のすべてのピリミジンヌクレオシドで他の修飾と組み合わせた。特に、２’－Ｆ修飾は非常によく受け入れられたが（Ｖ１２０．１７，配列番号１８およびＶ１１７．２８，配列番号２３）、一方、２’－Ｏ－メチル修飾単独では、コンストラクトの設計によっては編集収率が低下した（Ｖ１２０．１８，配列番号１９およびＶ１１７．２７，配列番号２２）。よく知られている修飾である２’－ＭＯＥは、すべてのピリミジン上に置かれた場合には受け入れられなかった（Ｖ１２０．１９，配列番号２０）。

【0076】

さらに、本発明によるコンストラクトの比較を、先行技術から公知の類似の構造と実施した。ＷＯ２０１９／１５８４７５は、塩基編集のための化学修飾ガイドＲＮＡを開示している。図３Ｃにおいて、Ｗ３９２Ｘ変異マウスＩＤＵＡ部位を標的とする２’－ＭＯＥ修飾ガイドＲＮＡが、「ＡＤＡＲ １０２－２」という名称で開示されている。このコンストラクトは３９ヌクレオチドを有する。図７には、「ＡＤＡＲ １０３－８」および「ＡＤＡＲ １０２－７」と称された、Ｗ３９２ＸマウスＩＤＵＡ部位を標的とする他の２’－ＭＯＥ修飾ガイドＲＮＡも示されている。

【0077】

上述したように、先行技術から公知の３つのコンストラクトであるＡＤＡＲ １０２－２（配列番号６８）、ＡＤＡＲ １０３－８（配列番号６９）およびＡＤＡＲ １０２－７（配列番号７０）による編集効率を測定する比較例を、本発明のコンストラクトであるＶ１２０．２１（配列番号４１）およびＶ１２０．２３（配列番号４２）と比較して実施した。コントロールは、オリゴヌクレオチドを添加しなかった（ＡＳＯなし）。

【0078】

編集効率を図４Ｆに示す。明らかに、本発明によるオリゴヌクレオチドは、先行技術に開示されたコンストラクトの編集効率よりも約２０倍高い優れた編集効率を示した。この改良された編集効率は主に、セントラル塩基トリプレットの外側のピリミジンヌクレオシドの２’－フルオロ置換基と２’－Ｏ－メチル置換基との組み合わせによるものと推測される。

【0079】

全体として、化学修飾の性質およびオリゴリボヌクレオチド内の配置部位が、ＲＮＡ編集収率に明確な影響を及ぼすことが示された。

【0080】

【表4-1】

【0081】

【表4-2】

【0082】

【表5】

【0083】

〔実施例４〕内因性ＡＤＡＲによる、内因性Ｌ１５７ ＧＡＰＤＨ遺伝子を標的とするコンストラクトの安定化

【0084】

図４Ｃ）および図４Ｄ）は、１０％ＦＢＳ中でのヌクレアーゼに対する安定性に関する修飾の効果を示している（図４Ｃ））。図４Ｄ）は、改良されたオリゴヌクレオチドが十分に安定で、比較的短く、それにもかかわらず有効性が高いことを示している。

【0085】

本発明の治療可能性を評価するためには、ＲＮアーゼ等の非自己オリゴヌクレオチドに対する内因性防御機構に対する本発明のコンストラクトの安定性を決定することが非常に重要である。コンストラクトへの化学修飾ヌクレオシドの導入は、ＲＮアーゼに対する安定性を改善することができる。これを決定するために、本発明の４つの好ましい実施形態である、糖部分の２’－ヒドロキシル基に化学修飾を有する２つの実施形態（Ｖ１１７．２９，配列番号２４およびＶ１２０．２０，配列番号２１）ならびに化学修飾がない２つの実施形態（Ｖ１１７．１９，配列番号５およびＶ１２０．２，配列番号９）を、ウシ胎児血清中で７日間にわたって安定性を試験した。配列および修飾を表４に示す。

【0086】

コンストラクトを１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）中でインキュベートした。オリゴヌクレオチドの分解は変性尿素ＰＡＧＥで可視化した。実験では、１５ｐｍｏｌのそれぞれのＡＳＯを１０μｌのＰＢＳ＋１０％ＦＢＳで希釈した。モック（mock）サンプルはＰＢＳのみで希釈した１５ｐｍｏｌのＡＳＯを含んでいた。すべてのサンプルを３７℃で所定の時間インキュベートした後、液体Ｎ_２で凍結させ、直ちに－８０℃で保存した。サンプルの変性は、それぞれ７μｌのＲＮＡローディング色素（Rotiphorese（登録商標）シークエンスゲル希釈液において、Rotiphorese（登録商標）シークエンスゲルバッファ濃縮液の１：１０希釈液、Carl Roth）を加え、７０℃で２分間インキュベートすることで達成した。変性したサンプルを尿素（７Ｍ）ポリアクリルアミド（１５％）電気泳動（ＰＡＧＥ）ゲルにロードし、１×ＴＢＥバッファー中、１２００Ｖで４～６時間泳動した。製造元の指示に従ってSYBR（商標）Gold Nucleic Acid Gel Stain（Thermo Fisher Scientific）を使用してバンドを可視化し、Fujifilm FLA-5100蛍光画像解析装置を使用して、励起波長λ_ｅｘ＝４７３ｎｍでスキャンした。

【0087】

コンストラクトの設計、例えばオリゴリボヌクレオチドの長さまたはセントラル塩基トリプレットの位置に関係なく、ヌクレオシド糖部分の２’－ヒドロキシル基の化学修飾を欠く２つのコンストラクト（すなわち、Ｖ１１７．１９，配列番号５およびＶ１２０．２，配列番号９）は直ちに分解された。対照的に、ピリミジンヌクレオシドの２’－ヒドロキシル基に化学修飾を有する２つのコンストラクト（Ｖ１１７．２９，配列番号２４およびＶ１２０．２０，配列番号２１）は、１０％ウシ胎児血清に７日間を超えて耐えることができた。したがって、選択したヌクレオシドの糖部分に化学修飾を加えることで、ＲＮアーゼ分解に対する耐久性が増し、その結果、血清中でのコンストラクトの寿命が長くなる。

【0088】

さらに、内因性ＨｅＬａ ＡＤＡＲをリクルートすることによる内因性ＧＡＰＤＨ転写産物の編集について、化学的に安定化された実施形態（Ｖ１２０．１７，配列番号１８およびＶ１１７．２９，配列番号２４）を、先行技術のオリゴリボヌクレオチド設計（Ｖ２５．１，配列番号１２、ＷＯ２０２０／００１７９３に開示）と並べて評価した（図４Ｄ）。具体的には、化学的に安定化された実施形態の両方が、編集効率によって先行技術のオリゴヌクレオチドＶ２５．１（配列番号１２）を明らかに凌駕することが見出された。このことは、先行技術のオリゴリボヌクレオチドによる編集効率がＩＦＮ－α処理によって押し上げられたとき（「＋ＩＦＮ」）にも当てはまった。

【0089】

【表6】

【0090】

〔実施例５〕種々の細胞の種類における、内因性ＡＤＡＲによるヒトＧＡＰＤＨ転写産物のＬ１５７部位の編集（図５ＤおよびＥを参照）。

【0091】

図４Ｅ）は、ヒト初代細胞で実験を実施した実施例５の結果である。これらの実験は、後の商業的使用に直結する細胞株で本発明が機能することを示すので、非常に重要である。

【0092】

ＨｅＬａ細胞（図４Ｄ）および種々の組織由来の初代細胞（図４Ｅ）における本発明のコンストラクトの適用性を調べるために、合計４つの本発明の特に好ましい実施形態を使用した：化学修飾ピリミジンヌクレオシドがない実施形態（Ｖ１１７．１９，配列番号５、および、Ｖ１２０．２，配列番号９）、または化学修飾ピリミジンヌクレオシドを有する実施形態（Ｖ１１７．２９，配列番号２４、および、Ｖ１２０．１７，配列番号１８）。使用したコンストラクトおよび対応する配列のリストは以下の表（表５）に示す。

【0093】

正常ヒトアストロサイト（NHA、Lonza cat. No.CC-2565）は、ABM Basal Medium（Lonza cat. No.CC-3187）にAGM SingleQuot Kit Supplementary & Growth Factors（Lonza cat. No.CC-4123）を添加した培地で培養した。ヒト網膜色素上皮細胞（H-RPE, Lonza cat.00194987）は、RtEBM Basal Medium（Lonza cat. No.00195407）に、RtEGM Retinal Epithelial Cell Growth Medium SingleQuots Supplements and Growth Factors（Lonza cat. No.00195407）を添加した一方、ＦＢＳを添加しなかった培地で培養した（播種のために、ＦＢＳを添加し、２４時間後にＦＢＳを含まない培地に培地を交換した）。正常ヒト気管支上皮細胞（NHBE、Lonza cat. No.CC-2540）は、BEGM Bronchial Epithelial Cell Growth Basal Medium(Lonza cat. no CC-3171）に、BEGM Bronchial Epithelial Cell Growth Medium SingleQuots Supplements and Growth Factors（CC-4175）を添加した培地で培養した。トランスフェクション手順は、１×１０^５細胞／ウェルを播種し、２５ｐｍｏｌのＡＳＯをトランスフェクションして、Ｈｅｌａ細胞について実施例３に記載したように行った。ＩＦＮ処理細胞（「＋ＩＦＮ」）には、コンストラクトのトランスフェクションの前に１５，０００Ｕ／ウェルのＩＦＮ－αを補充した。２４時間後、ＲＮＡ単離およびサンガー配列決定のために細胞を回収した。

【0094】

ＨｅＬａ細胞を処理し、実施例３で既に記載したように、フォワードトランスフェクトした。１×１０^５細胞／ウェルを播種し、２５ｐｍｏｌのＡＳＯをトランスフェクトし、対応するウェルを初代細胞について記載したようにＩＦＮで処理した。

【0095】

図ＤおよびＥに示すように、両方のコンストラクトは、試験したすべての細胞の種類（ＨｅＬａ、ＮＨＡ、ＮＨＢＥおよびＲＰＥ細胞）において効率的な編集活性を示した。ピリミジンヌクレオシドにさらなる化学修飾を加えることは、ほとんどの場合において良好に受け入れられた。しかしながら、化学修飾ヌクレオシドを有するコンストラクト（Ｖ１１７．２９，配列番号２４およびＶ１２０．１７，配列番号１８）は、化学修飾ヌクレオシドがない対応するコンストラクト（Ｖ１１７．１９，配列番号５およびＶ１２０．２，配列番号９）と比較して、編集活性の低下を示した。注目すべきことに、本発明のすべての実施形態の編集活性は、ＷＯ２０２０／００１７９３に開示された先行技術（Ｖ２５．１，配列番号１２）と比較して著しく改善された。このことは、インターフェロン－α（「＋ＩＦＮ」）を添加したＶ２５．１オリゴリボヌクレオチドによる編集を押し上げた後でも同様であった。

【0096】

【表7】

【0097】

〔実施例６〕内因性ＡＤＡＲによる、内因性ヒトＧＡＰＤＨ転写産物のＬ１５７部位を編集するためのコンストラクトのジムノティックの取り込み

【0098】

本実施例の結果を図５に示す。本発明のコンストラクトは、いわゆる「裸の取り込み（naked uptake）」を可能にすることが示された。これは、オリゴヌクレオチドががん細胞株およびヒト初代細胞において、補助的な手段なしに標的部位に到達することを意味する。ピリミジンヌクレオシドに修飾がなければ、裸の取り込みはあまり効果的ではないことに留意すべきである。

【0099】

本発明の好ましい実施形態について、トランスフェクション剤（ジムノシス）による補助なしで、ヒトハウスキーピング遺伝子（ＧＡＰＤＨ）を編集する能力についても試験した。本実施例に使用したコンストラクトを表６に示す。

【0100】

ＨｅＬａ細胞はＤＭＥＭ＋３％ＦＢＳで培養した。５００μｌ培地／ウェルに２４ウェルあたり１０^４のＨｅｌａ細胞を播種し、２４時間インキュベートした。２４時間後、培地を５μＭ、１μＭ、０．２μＭおよび０μＭのＡＳＯを含む培地に交換した。各ウェルに３００μｌのコンストラクト含有培地を含ませ、５日後に交換した。ＨｅＬａ細胞はさらに５日後に剥離し、５０％ずつ分割した。３日後、５日後、７日後および１０日後にＲＮＡ単離およびサンガー配列決定のために細胞を回収した。

【0101】

初代細胞については、１０^４細胞／ウェルのＲＰＥ、ＮＢＥおよびＮＨＡを、それぞれの培地中の２４ウェルプレートに播種し、２４時間後に培地を２５０μＬの培地に交換し、ＯｐｔｉＭＥＭ中の５０μＬのＡＳＯを最終ＡＳＯ濃度が５μＭとなるように添加した。オリゴヌクレオチド添加後３日または５日後に、ＲＮＡ単離のために細胞を回収した。

【0102】

図５Ａに示すように、コンストラクトｖ１１７．２９（配列番号２４）は処理したＨｅＬａ細胞に容易に取り込まれ、トランスフェクション剤を加えなくても高い編集活性を示した。最良の結果が得られたのは、ＨｅＬａ細胞を１μＭのコンストラクトで１０日間処理したときであった。編集効率は、培地中のＶ１１７．２９濃度（５μＭまたは０．２μＭ）の変動によって示されるように、用量依存的であった。注目すべきことに、Ｖ１１７．２９と比較してさらなる安定的な化学修飾を欠き、血清中で速やかに分解され（実施例４参照）、１μＭのコンストラクトＶ１１７．１９（配列番号５）の添加は、７日間および１０日間の処理後、ＨｅＬａ細胞においてほとんど編集活性を示さなかったが、Ｖ１１７．２９はこれらの条件下で最も良好な結果を示した。このことは、本発明で開示する化学修飾パターンが、オリゴヌクレオチドのジムノティックの取り込みのもとで編集を達成することが可能であり、当該達成に必要であることを明確に示している。

【0103】

処理した初代細胞（ＲＰＥ、ＮＨＡ、ＮＨＢＥ細胞、図５Ｂに示す）も、トランスフェクション試薬による補助なしで、編集を達成するのに十分な量のコンストラクトＶ１１７．２９が取り込まれることを示している。ＨｅＬａ細胞における１μＭの条件と同様に、３日間の処理と比較して５日後には編集効率が増大する。結論として、安定化されたコンストラクトのジムノティックの取り込みは細胞株および初代細胞の両方で可能であり、内因性ＡＤＡＲを利用することで内因性転写産物の編集を達成するのに十分効率的である。

【0104】

【表8】

【0105】

〔実施例７〕内因性ＡＤＡＲによる、内因性ヒトＳＴＡＴ１転写産物のＹ７０１部位の編集

【0106】

実施例７の結果を図６に示す。明らかな安定化が認められ、先行技術（ｖ２５．１）と比較して編集収率が大幅に向上している。初代細胞において、編集収率は約１０倍向上している。オリゴヌクレオチドの化学的安定化により、高い編集収率が得られると結論づけられる。

【0107】

実施例２において内因性ヒトＧＡＰＤＨのＬ１５７部位を標的とするコンストラクトについて実施したように、内因性ヒトＳＴＡＴ１転写産物のリン酸化部位Ｙ７０１を標的とする本発明の３つの好ましいコンストラクトを、２つの異なる細胞株（Ｈｕｈ７およびＨｅＬａ細胞）および３つの異なる初代細胞（ＮＨＡ、ＮＨＢＥおよびＲＰＥ細胞）において試験した。本コンストラクトは、化学的に安定化されたもの（Ｖ１１７．２８，配列番号２７）および化学的に安定化されていないもの（Ｖ１２０．２，配列番号２５およびＶ１１７．１９，配列番号２６）の両方のバージョンがあった。本実施例に使用したコンストラクトの配列を表７に示す。

【0108】

腫瘍細胞株は実施例２に記載したように処理した一方、初代細胞は実施例５に記載したように処理した。簡単に説明すると、２４ウェルあたり１×１０^５の細胞を２５ｐｍｏｌのコンストラクトでフォワードトランスフェクトし、２４時間後にＲＮＡを単離し、サンガー配列決定を行った。

【0109】

図６Ａに示すように、Ｖ１１７．１９は試験したすべての細胞の種類において編集活性が高かった。コンストラクトＶ１１７．２８のピリミジンヌクレオシドにさらなる安定化化学修飾を加えても、対応する安定性の低いコンストラクトＶ１１７．１９と比較して編集活性を損なうことはなかった（図６Ｂ参照）。Ｖ１１７．１９はより短く、より化学的に安定化されているにもかかわらず、両方の対称性コンストラクトの編集活性は、ＨｅＬａ細胞において先行技術であるＶ２５．１（配列番号２８）と比較してほぼ３倍改善され、ＲＰＥ細胞において８倍超改善された。非対称の実施形態であるＶ１２０．２も編集活性を示したが、Ｖ１１７．１９およびＶ１１７．２８の両方に比べて低かった。いずれの新規コンストラクトも、先行技術であるＶ２５．１（ＷＯ２０２０／００１７９３に開示）の場合のように、インターフェロン－α（「＋ＩＦＮ」）の添加によって編集活性を押し上げることはできなかった。全体として、本発明は、ＩＦＮ処理とは無関係に、先行技術の解決策よりも短いものによって、明らかに優れた編集収率を与えた。

【0110】

【表9】

【0111】

〔実施例８〕内因性ＡＤＡＲによる、ヒトＳＴＡＴ１遺伝子の内因性Ｙ７０１部位を標的とするコンストラクトの安定化（図６Ｂ参照）

【0112】

実施例４で上述したように、ＲＮアーゼ等の内因性環境における防御機構に対するコンストラクトの安定化は、本発明の治療的観点を可能にするために不可欠である。このために、本発明の好ましい実施形態である、ある場合（Ｖ１１７．２８，配列番号２７）およびない場合（Ｖ１１７．１９，配列番号２６）について、７日間にわたって１０％ウシ胎児血清中でその安定性について試験した。配列および修飾は表７に示す。結果は実施例４で既に記載した結果が得られた。

【0113】

図６Ｂに示すように、コンストラクトに修飾ピリミジンヌクレオシドを含めると（Ｖ１１７．２８）、化学修飾ヌクレオシドを欠くコンストラクト（Ｖ１１７．１９）と比較して、１０％ＦＢＳ中での寿命が強く改善される。Ｖ２５．１（配列番号２８、ＷＯ２０２０／００１７９３に開示）と比較した実施例７のコンストラクトの優れた編集活性と合わせて、これらのコンストラクトは先行技術に対して明らかな改善である。

【0114】

〔実施例９〕内因性ＡＤＡＲによる、マウスＭＥＣＰ２転写産物の疾患を引き起こすＷ１０４Ｘ変異の編集

【0115】

図７は、疾患関連モデル系における高い編集効率を示している。図７は、特にＦＢＳアッセイで示されるように、安定化後も良好な収率を示す（図７Ｃ））。図７Ｂ）は、Ｖ１２０．２対Ｖ１２０．２２の比較によって示されるように、非対称の実施形態においても好ましい非対称構造が存在することを示している。

【0116】

マウスＭＥＣＰ２遺伝子の疾患原因となるＷ１０４Ｘ変異を標的とするコンストラクトは、２つの異なるアプローチで試験された：プラスミド上の標的ｃＤＮＡをトランスフェクトしたＨｅＬａ細胞、または、piggyBacトランスポザーゼ系を介して疾患原因となるＭＥＣＰ２ Ｗ１０４Ｘ変異ｃＤＮＡをそのゲノムに安定に組み込まれたＨｅＬａ細胞。コンストラクトは、不安定なもの（Ｖ１２０．２，配列番号２９）、または、修飾を加えて化学的に安定化したもの（Ｖ１２０．２１，配列番号３０）であった。本実施例に使用したコンストラクトの配列を表８に示す。

【0117】

プラスミドトランスフェクションによるアプローチ（「プラスミド」）では、５×１０^４のＨｅＬａ細胞を２４ウェルプレートに播種した。２４時間後、細胞をマウスＭＥＣＰ２ Ｗ１０４Ｘ ｃＤＮＡ遺伝子を含むプラスミドでフォワードトランスフェクトした。３００ｎｇのプラスミドおよび０．９μｌのＦｕＧＥＮＥ（登録商標）６（Promega）をそれぞれ５０μｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭで希釈し、５分間インキュベートした後、それらを合わせてさらに２０分間インキュベートした。培地を交換し（ＩＦＮ処理細胞には１５，０００Ｕ／ウェルのＩＦＮ－αを補充）、トランスフェクションミックスを１ウェルに均等に分注した。プラスミドトランスフェクションの２４時間後、細胞を２５ｐｍｏｌのコンストラクト／ウェルおよび１．５μｌ／ウェルのリポフェクタミンＲＮＡｉＭＡＸ試薬（ThermoFisher Scientific）によってフォワードトランスフェクトした。２４時間後、ＲＮＡ単離および配列決定のために細胞を回収した。

【0118】

piggyBacによるアプローチ（「PiggyBac」）では、piggyBacトランスポザーゼ系を介してゲノムに安定に組み込まれたマウスＭＥＣＰ２ Ｗ１０４Ｘ ｃＤＮＡ遺伝子を含む１×１０^５のＨｅＬａ細胞を２４ウェルプレートに播種した。２４時間後、２５ｐｍｏｌのコンストラクト／ウェルおよび１．５μｌ／ウェルのリポフェクタミンＲＮＡｉＭＡＸ試薬（ThermoFisher Scientific）によって、プラスミドによるアプローチの説明と同様に細胞をフォワードトランスフェクトした。ＩＦＮ処理した細胞には、コンストラクトのトランスフェクションの前に３，０００Ｕ／ウェルのＩＦＮ－αを補充した。２４時間後、ＲＮＡ単離および配列決定のために細胞を回収した。

【0119】

図７Ａに示すように、不安定なコンストラクトであるＶ１２０．２、および、化学修飾したピリミジンヌクレオシドで安定化したコンストラクトであるＶ１２０．２１の両方で、同等レベルの効率的な編集活性が可能であった。プラスミドを介したアプローチでは両方のコンストラクトも同じようにうまくいったが、piggyBacによるアプローチではＶ１２０．２よりもＶ１２０．２１の方が、わずかに活性が低下した。上述の実施例からも分かるように、両方のコンストラクトともにインターフェロン添加後（「＋ＩＦＮ」）、編集活性に著しい差がなかった。

【0120】

【表10】

【0121】

〔実施例１０〕内因性ＡＤＡＲによる、マウスＭＥＣＰ２転写産物の疾患原因となるＷ１０４Ｘ変異の編集収率に対する非対称性の一般コンストラクト設計の逆位の効果（図７Ｂ参照）

【0122】

非対称性コンストラクトについて、セントラル塩基トリプレットを短いコンストラクトの３’末端側に配置すると、同じ長さの対称性コンストラクトに比べて編集活性が向上することが既に示されている。非対称性コンストラクト、特に実施例３ＡのＶ１２０．２（配列番号２９）の基本設計を反転させ、通常コンストラクトの３’末端に配置されるセントラル塩基トリプレットをコンストラクトの５’末端に配置した（Ｖ１２０．２２、配列番号３１）。本実施例に使用したコンストラクトの配列を表８に示す。ＨｅＬａ細胞は、実施例９のプラスミドトランスフェクトアプローチについて上述したように処理した。

【0123】

図７Ｂに示すように、セントラル塩基トリプレットの通常の位置（Ｖ１２０．２、配列番号２９）を向かい合う部位（Ｖ１２０．２２、配列番号３１）に反転させると、編集活性に有害な影響を及ぼし、ほぼ半分に減少する。したがって、非対称な実施形態におけるセントラル塩基トリプレットの位置は、オリゴヌクレオチドの３’末端側にあることが好ましいことは明らかである。

【0124】

〔実施例１１〕内因性ＡＤＡＲによる、マウスＭＥＣＰ２転写産物の疾患を引き起こすＷ１０４Ｘ変異を標的とするコンストラクトの安定化（図７Ｃ参照）

【0125】

実施例４で既に議論したように、ＲＮアーゼなどの内因性環境における防御機構に対するコンストラクトの安定化は、本発明の治療的観点を可能にするために不可欠である。このために、本発明の好ましい実施形態である、化学修飾されたピリミジンヌクレオシドを有する実施形態（Ｖ１２０．２１、配列番号３０）、および有さない実施形態（Ｖ１２０．２、配列番号２９）を、７日間にわたって１０％ウシ胎児血清中でその安定性について試験した。配列および修飾を表８に示す。結果は実施例４で既に説明した結果が得られた。

【0126】

図７Ｃに示すように、修飾ピリミジンヌクレオシドをコンストラクトに含めることで（Ｖ１２０．２１）、コンストラクトは１０％ＦＢＳ中で７日間にわたって耐えることができるが、不安定なコンストラクト（Ｖ１２０．２）はほとんど直ちに分解される。

【0127】

〔実施例１２〕内因性ＡＤＡＲによる、Hurler症候群患者線維芽細胞におけるヒトＩＤＵＡ転写産物の疾患原因となるＷ４０２Ｘ変異の編集（図８Ａ）

【0128】

図８は疾患関連試験系での結果を示している。標的ＲＮＡは患者の線維芽細胞で内因性に発現している。安定化は達成されているが、編集効率に関しては不利である。

【0129】

ＩＤＵＡ遺伝子の生殖細胞系列変異は、ＩＤＵＡ遺伝子がコードする酵素であるα－Ｌ－イズロニダーゼが欠損し、多糖類の分解に関与できないライソゾーム病であるムコ多糖症Ｉ型の頻度の高い原因である。このため、リソソーム内にグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）が蓄積し、その重症度は様々である：軽症のScheie症候群（患者は軽度の健康問題を抱え、寿命は正常である）から、重症のHurler症候群（患者は重度の健康問題を抱え、小児期には致死的となる）までに及ぶ。ＩＤＵＡ遺伝子のホモ接合性Ｗ４０２Ｘ変異は、重篤なHurler症候群の根本的な原因の一つであり、本実施例では、病気にさせるＲＮＡを編集し、酵素機能を回復させることを試みた、対応するコンストラクトの望ましい標的である（実施例１３参照）。対応するコンストラクトの配列は表９で見出すことができる。

【0130】

軽症のScheie症候群患者（「Scheie」、ＧＭ０１３２３）、重症のHurler症候群患者（ＧＭ０６２１４）、および健康なドナー（「健康」、ＧＭ０５６５９）由来の線維芽細胞は、Coriell Institute for Medical Research（米国）から購入した。線維芽細胞は、１５％ＦＢＳを含むＤＭＥＭで培養した。２．５ｍｌのＤＭＥＭ＋１５％ＦＢＳ中の２．５×１０^５細胞／ウェルを６ウェルプレートに播種した。播種２４時間後に、１２５ｐｍｏｌのコンストラクトおよび７．５μｌのリポフェクタミンＲＮＡｉＭＡＸ試薬（それぞれ２５０μｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭで希釈）を使用してフォワードトランスフェクションを実施した。５分間のインキュベーション後、両方の溶液を合わせ、さらに２０分間インキュベートした後、トランスフェクションミックスを１つのウェルに均等に分配した。Scheie症候群および健常線維芽細胞は、コンストラクトを加えずにトランスフェクションミックスで処理した。トランスフェクションの２４時間後に培地を交換した。トランスフェクションの４８時間後に、ＲＮＡ単離および配列決定のために線維芽細胞を回収した。

【0131】

図８Ａに示すように、標的アデノシンを取り囲むイントロン配列を標的とする対称的な実施形態（Ｖ１１７．１９イントロン，配列番号３５；およびＶ１１７．２８イントロン，配列番号３６）は、低い編集活性しか示さなかった。対照的に、標的アデノシン周辺の成熟ｍＲＮＡ配列を標的としたコンストラクト（Ｖ１１７．１９エクソン，配列番号３２）は非常に高い編集活性を示し、Scheie症候群線維芽細胞で見出されたものと比較して、補正されたｍＲＮＡ比を上回る。しかしながら、安定化修飾をコンストラクトに加えると（Ｖ１１７．２０エクソン，配列番号３３およびＶ１１７．２１エクソン，配列番号３４）、安定性が低い対応するｖ１１７．１９エクソンと比較して編集収率は低下した。最後に、非対称実施形態のＶ１２０．２（配列番号３７）も良好な編集活性を示し、Scheie症候群線維芽細胞で見出されたレベルに近いレベルに達した。非対称な実施形態について、コンストラクトにピリミジンヌクレオシドで安定化修飾を加えることで（Ｖ１２０．１７、配列番号３８）、編集効率もある程度低下する。

【0132】

【表11】

【0133】

〔実施例１３〕ヒトＩＤＵＡ転写産物の疾患原因となるＷ４０２Ｘ変異を標的とするコンストラクトで処理したHurler症候群患者線維芽細胞由来の細胞溶解物のα－Ｌ－イズロニダーゼアッセイ（図８Ｂ）

【0134】

Ｗ４０２Ｘ変異α－Ｌ－イズロニダーゼのタンパク質機能を、コンストラクトによるＲＮＡ編集によって回復させる試みとして（実施例１２に記載）、異なるコンストラクトで処理した線維芽細胞の溶解物を使用してα－Ｌ－イズロニダーゼアッセイを行った。対応するコンストラクトの配列は表９に見出すことができる。

【0135】

患者の線維芽細胞を、実施例１２に記載したように処理、播種およびトランスフェクトした。各試験コンストラクトについて、２つの６ウェルを使用した。トランスフェクションの４８時間後、線維芽細胞を剥離し、ＰＢＳで１回洗浄した。４０μｌのＰＢＳ中の０．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を細胞ペレットに加え、氷上で３０分間インキュベートし、α－Ｌ－イズロニダーゼ酵素アッセイを行った。４－メチルウンベリフェロンの標準希釈系列を調製した（０～１６０μＭ）。標準希釈系列の各濃度について、標準溶液２５μｌを９６ウェルプレート中の２５μｌの０．４Ｍギ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３．５）に添加した。線維芽細胞サンプルについては、各溶液２５μｌを９６ウェルに加え、基質溶液２５μｌ（０．４Ｍギ酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ３．５中、１８０μＭ ４－メチルアンベリフェリル α－Ｌ－イズノニド（4-methylumbelliferyl α-L-iduronide））と混合した。反応物を３７℃で９０分間インキュベートした後、ウェルに２００μｌのグリシン炭酸バター（ｐＨ１０．４）を加えて酵素活性を停止させた。４－メチルウンベリフェロンの蛍光は、Tecan Spark 10Mプレートリーダーを使用して、励起波長λ_ｅｘ＝３５５ｎｍ、発光波長λ_ｅｍ＝４６０ｎｍで測定した。算出された酵素活性は、タンパク質量（ＢＣＡアッセイにより決定）を基準とし、Scheie溶解物の酵素活性に標準化した。

【0136】

図８Ｂで分かるように、結果はScheie症候群線維芽細胞の溶解物中のα－Ｌ－イズロニダーゼの酵素活性（１００％に設定）に標準化され、これはまた、タンパク質の回復（protein restoration）に必要な最低の治療閾値を決定する。参考として、未処理のHurler症候群線維芽細胞（「ＡＳＯなし」）は約３倍低いα－Ｌ－イズロニダーゼ活性を示したが、健常線維芽細胞（「健康」）はScheie症候群線維芽細胞で観察された活性の約７００倍高いα－Ｌ－イズロニダーゼ活性を示した。

【0137】

イントロンＩＤＵＡ ｍＲＮＡを標的としたコンストラクト（Ｖ１１７．１９イントロン，配列番号３５およびＶ１１７．２８イントロン，配列番号３６）はいずれも、対応する編集活性と同様に、とても効率的なタンパク質の回復は達成できず、α－Ｌ－イズロニダーゼ活性レベルはScheie症候群線維芽細胞の半分から４分の３に達した。

【0138】

非対称性コンストラクト（Ｖ１２０．２，配列番号３７；およびＶ１２０．１７，配列番号３８）および安定化対称性コンストラクト（Ｖ１１７．２０エクソン，配列番号３３；およびＶ１１７．２１エクソン，配列番号３４）はすべて、Scheie症候群線維芽細胞で見出されたものと同程度か、わずかに上回るα－Ｌ－イズロニダーゼ活性レベルを示す。最後に、成熟ｍＲＮＡ、Ｖ１１７．１９エクソンを標的とする不安定な対称性コンストラクト（配列番号３２）は、Scheie症候群線維芽細胞レベルを６倍上回るα－Ｌ－イズロニダーゼ活性レベルを示す。全体として、このことは、本発明が治療効果を約束するレベルまでタンパク質機能を回復できることを示している。これは、編集効率に影響を及ぼしたとはいえ、完全な安定化化学修飾パターンを有するいくつかの実施形態にも当てはまった。

【0139】

〔実施例１４〕内因性ＡＤＡＲによる、ヒトＩＤＵＡ転写産物の疾患原因となるＷ４０２Ｘ変異を標的とするコンストラクトの安定化（図８Ｃ参照）

【0140】

実施例４で議論したように、ＲＮアーゼ等の内因性環境における防御機構に対するコンストラクトの安定化は、本発明の治療的観点を可能にするために必須である。このために、本発明の好ましい実施形態である、ピリミジンヌクレオシドに化学修飾を導入して安定化させた実施形態（Ｖ１２０．１７，配列番号３８；Ｖ１１７．２０エクソン，配列番号３３；Ｖ１１７．２１エクソン，配列番号３４およびＶ１１７．２８イントロン，配列番号３６）ならびに安定化させていない実施形態（Ｖ１２０．２，配列番号３７；Ｖ１１７．１９イントロン，配列番号３５；および、Ｖ１１７．１９エクソン，配列番号３２）について、７日間にわたり１０％ウシ胎児血清中での安定性を試験した。配列および修飾を表９に示す。結果は実施例４で上述した結果が得られた。

【0141】

図８Ｃに示すように、修飾ピリミジンヌクレオシドをコンストラクトに含めることで（Ｖ１２０．１７，配列番号３８；Ｖ１１７．２０エクソン，配列番号３３；Ｖ１１７．２１エクソン，配列番号３４およびＶ１１７．２８イントロン，配列番号３６）、コンストラクトは１０％ＦＢＳ中で７日間にわたって耐えることができるが、不安定なコンストラクト（Ｖ１２０．２，配列番号３７；Ｖ１１７．１９イントロン，配列番号３５；および、Ｖ１１７．１９エクソン，配列番号３２）はほとんど直ちに分解される。全体として、これは導入した化学修飾の安定化効果を明確に実証している。

【0142】

〔実施例１５〕内因性ＡＤＡＲによる、マウスＩＤＵＡ転写産物の疾患原因となるＷ３９２Ｘ変異の編集

【0143】

図９は実施例１５（図９Ａ））、実施例１６（図９Ｂ））および実施例１７（図９Ｃ））の結果を示す。

【0144】

マウスＩＤＵＡ転写産物のＷ３９２Ｘ変異は、実施例１２で簡単に説明したヒトＩＤＵＡ遺伝子のＷ４０２Ｘ変異に相当する。マウスの疾患を引き起こす変異体を標的とするコンストラクトを、その編集活性およびタンパク質の回復について試験した（実施例１６参照）。コンストラクトの配列を表１０に示す。

【0145】

５×１０^４のＨｅＬａ細胞を２４ウェルプレートに播種した。２４時間後、細胞をマウスＷ３９２Ｘ変異ＩＤＵＡ ｃＤＮＡを含むプラスミドでフォワードトランスフェクトした。３００ｎｇプラスミドおよび０．９μｌのＦｕＧＥＮＥ（登録商標）６（Promega）をそれぞれ５０μｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭで希釈し、５分間インキュベートし、それらを合わせて、さらに２０分間インキュベートした。培地を交換し、トランスフェクションミックスを１つのウェルに均等に分配した。プラスミドトランスフェクションの２４時間後、細胞を２５ｐｍｏｌのＡＳＯ／ウェルおよび１．５μｌ／ウェルのリポフェクタミンＲＮＡｉＭＡＸ試薬（ThermoFisher Scientific）でフォワードトランスフェクトした。２４時間後、ＲＮＡ単離および配列決定のために細胞を回収した。

【0146】

図９Ａに示すように、不安定なコンストラクトであるＶ１２０．２（配列番号４０）では比較的良好な編集活性が得られる。安定化修飾を有するコンストラクト（Ｖ１２０．２１，配列番号４１；およびＶ１２０．２３，配列番号４２）はいずれも、Ｖ１２０．２と比較して編集活性の一部を失う。ピリミジンヌクレオシドの糖部分に２’－フルオロ修飾および２’－Ｏ－メチル修飾の交互の混合物を有するコンストラクトＶ１２０．２３は、２’－フルオロ修飾のみを有するＶ１２０．２１と比較してわずかに高い編集活性を示し、２’－Ｆおよび２’－Ｏ－メチルの混合が編集効率をサポートできることを示している。

【0147】

【表12】

【0148】

〔実施例１６〕マウスＩＤＵＡ転写産物の疾患原因となるＷ３９２Ｘ変異を標的とするコンストラクトで処理したＨｅＬａ細胞由来の細胞溶解物のα－Ｌ－イズロニダーゼアッセイ（図９Ｂ）

【0149】

編集されたＩＤＵＡ ＲＮＡの、回復されたα－Ｌ－イズロニダーゼタンパク質への移行を決定するために、α－Ｌ－イズロニダーゼ酵素アッセイを行った。絶対活性の結果は、マウスＩＤＵＡ野生型ｃＤＮＡを含むプラスミドでトランスフェクトしたＨｅＬａ細胞からのα－Ｌ－イズロニダーゼ活性と相対化した。コンストラクトの配列は表１０に示す。

【0150】

ＨｅＬａ細胞を、実施例１５に記載したように、２４ウェルあたり５×１０^４細胞、３００ｎｇプラスミドおよび２５ｐｍｏｌコンストラクトで処理、播種、トランスフェクトした。野生型参照データを提供するために、マウスＩＤＵＡ野生型ｃＤＮＡを含むプラスミドでＨｅＬａ細胞をトランスフェクトした。各設定について、１つの２４ウェルを使用した。コンストラクトのトランスフェクションから２４時間後、α－Ｌ－イズロニダーゼ酵素アッセイ用に、細胞を１００μｌのＭ－ＰＥＲバッファー（Thermo Scientific）で溶解した。サンプルのさらなる処理は、ブラッドフォードアッセイによるタンパク質量の測定を除き、実施例１３に記載したように行った。

【0151】

図９Ｂで分かるように、α－Ｌ－イズロニダーゼアッセイの結果は、図９Ａ（実施例１５）の編集データから既に明らかなことを描写している。安定化修飾を有する両コンストラクト（Ｖ１２０．２１，配列番号４１；およびＶ１２０．２３，配列番号４２）は、Ｖ１２０．２（配列番号４０）と比較してα－Ｌ－イズロニダーゼ活性が部分的に低下している。しかしながら、編集結果と比較すると、コンストラクトＶ１２０．２３（ピリミジンヌクレオシドに２’－フルオロ修飾および２’－Ｏ－メチル修飾の交互のパターンを有する）は、ピリミジンヌクレオシドに２’－フルオロ修飾のみを有するＶ１２０．２１と比較して、明らかに高い編集活性を示し、２’－Ｆと２’－Ｏ－メチルの混合が編集効率をサポートすることを示している。

【0152】

〔実施例１７〕内因性ＡＤＡＲによる、マウスＩＤＵＡ転写産物の疾患原因となるＷ３９２Ｘ変異を標的とするコンストラクトの安定化（図９Ｃ）

【0153】

実施例４で議論したように、例えば血清中に見出されるＲＮアーゼに対するコンストラクトの安定化は、本発明の治療的観点を可能にするために必須である。このために、本発明の好ましい実施形態である、ピリミジンヌクレオシドにおける化学修飾の導入により安定化された実施形態（Ｖ１２０．２１，配列番号４１）および安定化されていない実施形態（Ｖ１２０．２，配列番号４０）を、７日間にわたる１０％ウシ胎児血清中での安定性について試験した。コンストラクトの配列を表１０に示す。結果は実施例４に記載した結果が得られた。

【0154】

図９Ｃに示すように、修飾ピリミジンヌクレオシドをコンストラクト（Ｖ１２０．２１）に含めることで、コンストラクトは１０％ＦＢＳ中で７日間にわたって耐えることができるが、不安定なコンストラクト（Ｖ１２０．２）はほとんどすぐに分解され、安定化効果が得られたことが再び示された。

【0155】

〔実施例１８〕内因性ＡＤＡＲによる、マウスＰＤＥ６Ａ転写産物の疾患原因となるＶ６８５Ｍ変異の編集（図１０Ａ）

【0156】

２つの好ましい実施形態Ｖ１１７．１９およびＶ１２０．２は、複数の他の標的について以前に試験された（図３ＡおよびＢに示したスキーム）。網膜色素変性症によって徐々に失明を引き起こし、５’－ＵＡＵ－３’コンテキストのアデノシンによって引き起こされる、マウスＰＤＥ６Ａ遺伝子の疾患原因となるＶ６８５Ｍ変異部位に対して設計されたコンストラクトの編集活性を調べた。コンストラクトのリストを表１１に示す。

【0157】

５×１０^４のＨｅＬａ細胞を２４ウェルプレートに播種した。２４時間後、細胞は疾患原因となるマウスＰＤＥ６Ａ Ｖ６８５Ｍ ｃＤＮＡを含むプラスミドでフォワードトランスフェクトされた。３００ｎｇのプラスミドおよび０．９μｌのＦｕＧＥＮＥ（登録商標）６（Promega）をそれぞれ５０μｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭで希釈し、５分間インキュベート後、それらを合わせ、さらに２０分間インキュベートした。培地を交換し、トランスフェクションミックスを１つのウェルに均等に分配した。プラスミドトランスフェクションの２４時間後、細胞を２５ｐｍｏｌのＡＳＯ／ウェルおよび１．５μｌ／ウェルのリポフェクタミンＲＮＡｉＭＡＸ試薬（ThermoFisher Scientific）でフォワードトランスフェクトした。２４時間後、ＲＮＡ単離および配列決定のために細胞を回収した。

【0158】

図１０Ａに示すように、不安定な対称性コンストラクト（Ｖ１１７．１９，配列番号４３）が最も高い編集活性を示す。しかしながら、コンストラクトが安定化修飾を有すると（Ｖ１１７．２０，配列番号４４；およびＶ１１７．２１，配列番号４５）、ヒトＩＤＵＡ遺伝子のＷ４０２Ｘ部位を標的とする対称性コンストラクト（配列番号３２～３６）について、実施例１２で分かることと同様に、コンストラクトの編集活性は低下する。

【0159】

非対称性コンストラクトについては、正反対のことが観察される。不安定なコンストラクトＶ１２０．２（配列番号４６）は、安定化されたコンストラクトＶ１２０．３（配列番号４７）に比べて編集活性がわずかに低い。対称性コンストラクトのような安定化による編集活性の低下は観察されない。

【0160】

【表13】

【0161】

〔実施例１９〕内因性ＡＤＡＲによる、ヒトＰＤＥ６Ａ転写産物の疾患原因となるＶ６８５Ｍ変異の編集（図１０Ｂ）

【0162】

実施形態Ｖ１１７．１９およびＶ１２０．２は、既に示した多数の他の標的に対して強く好ましい。実施例１８について上述したように、ＰＤＥ６Ａ遺伝子のＶ６８５Ｍ変異－今回はヒト－は、本発明が適用できる別の潜在的部位である。マウス遺伝子とは対照的に、ヒト遺伝子の標的アデノシンは５’－ＣＡＵ－３’コンテキストの一部である。コンストラクトのリストを表１２に示す。

【0163】

結果は実施例１８について記述した結果と同様に得られた。しかしながら、マウスＰＤＥ６Ａ遺伝子を含むプラスミドでＨｅＬａ細胞をトランスフェクトする代わりに、変異ヒトＰＤＥ６Ａ Ｖ６８５Ｍ ｃＤＮＡを含むプラスミドをトランスフェクトした。

【0164】

全体的な編集収率が実施例１８のマウスコンテキストほど高くないことは明らかであるが、図１０Ｂに示されるコンストラクトの編集活性もまた、選択された設定および遺伝子に対する本発明の適用性を証明することは明らかである。全体的に低い編集活性は、マウス遺伝子においてより好ましいコンテキスト（５’－ＵＡＵ）と比較して、ヒト遺伝子（５’－ＣＡＵ）においてＡＤＡＲが標的アデノシンを検出するためにあまり好ましくない編集コンテキストが原因である可能性がある。

【0165】

Ｖ１１７．１９（配列番号４８）が最も高い全体的な編集活性を示す。興味深いことに、実施例１８のマウス遺伝子で既に分かるように、安定な非対称性コンストラクトＶ１２０．１７（配列番号５０）は、対応する不安定コンストラクトＶ１２０．２（配列番号４９）よりもわずかに高い編集活性を示す。

【0166】

【表14】

【0167】

〔実施例２０〕内因性ＡＤＡＲによる、マウスＰＤＥ６Ａ転写産物の疾患原因となるＶ６８５Ｍ変異を標的とするコンストラクトの安定化（図１０Ｃ）

【0168】

実施例４で議論したように、血清中に見出されるＲＮアーゼ等の内因性防御機構に対して安定なコンストラクトが、本発明の治療的観点からは好ましい。このために、実施例１８で使用した好ましい実施形態である、ピリミジンヌクレオシドにおける化学修飾の導入により安定化された実施形態（Ｖ１１７．２０，配列番号４４）および安定化されていない実施形態（Ｖ１１７．１９，配列番号４３）を、７日間にわたる１０％ウシ胎児血清中での安定性について試験した。コンストラクトの配列を表１１に示す。結果は実施例４に記載した結果が得られた。

【0169】

図１０Ｃに示すように、修飾ピリミジンヌクレオシドをコンストラクト（Ｖ１１７．２０，配列番号４４）に含めると、コンストラクトは１０％ＦＢＳ中で７日間にわたって耐えることができるが、不安定なコンストラクト（Ｖ１１７．１９，配列番号４３）はほとんどすぐに分解される。

【0170】

〔実施例２１〕内因性ＡＤＡＲによる、ヒトＳＥＲＰＩＮＡ１転写産物の疾患原因となるＥ３４２Ｋ変異の編集（図１１Ａ）

【0171】

ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子はα－１－アンチトリプシン（Ａ１ＡＴ）タンパク質をコードし、肝臓で合成され、特に薄い組織を自己消化から守る重要なプロテアーゼ阻害剤である。肝臓から最終的に血流に分泌され、全身に広がる。ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の生殖細胞系列変異は、様々な重症度のＡ１ＡＴの機能障害を引き起こす可能性がある。重篤なＥ３４２Ｋ変異はＡ１ＡＴタンパク質のミスフォールディングを引き起こし、それによりＡ１ＡＴタンパク質は血流中に適切に分泌されなくなる。これにより、Ａ１ＡＴの過剰蓄積による肝疾患およびＡ１ＡＴの不足による肺疾患が引き起こされる。Ｅ３４２Ｋ変異の根底にある標的アデノシンは５’－ＣＡＡ－３’にある。

【0172】

ヒトＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の疾患原因となるＥ３４２Ｋ変異を標的とするコンストラクトは、２つの異なるアプローチで試験された。すなわち、プラスミド上の標的ｃＤＮＡをトランスフェクトしたＨｅＬａ細胞、または疾患原因となるＥ３４２Ｋ ＳＥＲＰＩＮＡ１変異ｃＤＮＡを、piggyBacトランスポザーゼシステムを介してゲノムに安定的に組み込んだＨｅＬａ細胞である。このコンストラクトは不安定であるか（Ｖ１１７．１９，配列番号５１；およびＶ１２０．２，配列番号５５）、修飾ピリミジンヌクレオシドで化学的に安定化されていた（Ｖ１１７．２４，配列番号５２；Ｖ１１７．２５，配列番号５２；Ｖ１１７．２５，配列番号５３；Ｖ１１７．２６，配列番号５４；およびＶ１２０．１０，配列番号５６）。本実施例で使用したコンストラクトの配列を表１３に示す。

【0173】

プラスミドトランスフェクションによるアプローチ（「プラスミド」）では、２．５×１０^４のＨｅＬａ細胞を２４ウェルプレートに播種した。２４時間後、細胞をヒトＳＥＲＰＩＮＡ１ Ｅ３４２Ｋ変異ｃＤＮＡまたはＳＥＲＰＩＮＡ１健常ｃＤＮＡ（「野生型」）を含むプラスミドでフォワードトランスフェクトした。３００ｎｇプラスミドおよび０．９μｌ ＦｕＧＥＮＥ（登録商標）６（Promega）をそれぞれ５０μｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭで希釈し、５分間インキュベートした後、それらを合わせてさらに２０分間インキュベートした。培地を交換し、トランスフェクションミックスを１つのウェルに均等に分配した。プラスミドトランスフェクションの２４時間後、細胞を５ｐｍｏｌのコンストラクト／ウェルおよび１．５μｌ／ウェルのリポフェクタミンＲＮＡｉＭＡＸ試薬（ThermoFisher Scientific）でフォワードトランスフェクトした。２４時間後、培地を交換した。トランスフェクションから４８時間後、ＲＮＡ単離および配列決定のために細胞を回収した。

【0174】

piggyBacトランスポザーゼによるアプローチ（「PiggyBac」）について、piggyBacトランスポザーゼシステムを介してゲノムに安定的に組み込まれたヒトＳＥＲＰＩＮＡ１ Ｅ３４２Ｋ変異ｃＤＮＡ遺伝子またはＳＥＲＰＩＮＡ１野生型遺伝子（「野生型」）を含む１×１０^５のＨｅＬａ細胞を２４ウェルプレートに播種した。２４時間後、細胞を２５ｐｍｏｌのコンストラクト／ウェルおよび１．５μｌ／ウェルのリポフェクタミンＲＮＡｉＭＡＸ試薬（ThermoFisher Scientific）でフォワードトランスフェクトした。２４時間後、ＲＮＡ単離および配列決定のために細胞を回収した。

【0175】

図１１Ａに示すように、不安定な対称性コンストラクトＶ１１７．１９（配列番号５１）およびＶ１１７．２４（配列番号５２）、ならびに安定なおよび不安定な非対称性コンストラクトＶ１２０．２（配列番号５５）およびＶ１２０．１０（配列番号５６）の編集活性は、piggyBacおよびプラスミドアプローチのいずれにおいても中程度である。しかしながら、グアノシン塩基の代わりにイノシン塩基をセントラル塩基トリプレットの最末端３’－部位に導入すると、コンストラクト（Ｖ１１７．２５，配列番号５３；および特にＶ１１７．２６，配列番号５４）の編集活性は強い増加を示すが、両コンストラクトは安定化修飾を有し、通常、対応する不安定なコンストラクトと比較して編集活性の低下を引き起こしている。ここでも、実施例１６（図９）で既に分かるように、ピリミジンヌクレオシドにおいて２’－Ｆのみではなく、２’－Ｆと２’－Ｏ－メチルの混合物（Ｖ１１７．２５対１１７．２６）は編集収率を改善した。

【0176】

【表15】

【0177】

〔実施例２２〕ヒトＳＥＲＰＩＮＡ１転写産物のＥ３４２Ｋ変異部位を標的とするコンストラクトで処理した細胞の細胞上清による、サンドイッチＥＬＩＳＡで測定したα－１－アンチトリプシンの回復（図１１Ｂ）

【0178】

Ａ１ＡＴは分泌タンパク質であるため、ＲＮＡ編集の成功がタンパク質の回復に及ぼす影響は、未処理の細胞と比較して、編集コンストラクトで処理した細胞から分泌されるＡ１ＡＴの量を測定することによって試験することができる。これはプラスミドをトランスフェクトしたアプローチで行われた。本実施例で使用したコンストラクトの配列を表１３に示す。

【0179】

ＨｅＬａ細胞は、２４ウェルあたり２．５×１０^４の細胞、３００ｎｇプラスミドおよび５ｐｍｏｌコンストラクトで、プラスミドをトランスフェクトしたアプローチの記載のように処理した。コンストラクトのトランスフェクションから４８時間後、細胞から３００μｌの上清を除去し、３００×ｇで５分間遠心した。上清を希釈バッファー（１×ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０＋２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ））で１：３０に希釈し、ウサギ抗ヒトα－１－アンチトリプシン抗体（A0012, Dako Denmark ApS）をコートしたGreiner Microlon（登録商標）High Binding ９６ウェルプレートの９６ウェルに１００μｌをアプライし、洗浄バッファー（１×ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０）で洗浄し、１×ＰＢＳ中の５％ミルクでブロッキングした。サンプルは３連で測定し、ヒトＡ１ＡＴ標準物質（SRP6312, Sigma-Aldrich）とともにロードし、ＲＴで８０分間インキュベートした。その後、プレートを洗浄バッファーで洗浄し、ワサビペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトＡ１ＡＴ抗体（Biomol, A56-122P）１００μｌを、１×ＰＢＳ中１：１０，０００希釈で各ウェルにアプライし、ＲＴで１時間インキュベートした。プレートを洗浄バッファーで再度洗浄し、１００μｌのＯＰＤ基質（９ｍｌのミリポア水、１ｍｌのStable Peroxide Substrate Buffer 10x（34062, Thermo Scientific）および1x OPD Tablet（34006, Thermo Scientific））を各ウェルにアプライし、暗所、ＲＴで３０分間インキュベートした。反応を５０μｌの２．５ＭのＨ_２ＳＯ_４で停止し、直ちにTecan Spark（登録商標）１０ＭプレートリーダーでＯＤ値をλ＝４９０ｎｍで読み取った。タンパク質濃度は標準物質から計算し、野生型細胞上清および非標的ネガティブコントロールコンストラクト（「ＧＡＰＤＨ Ｖ１１７．１９」、配列番号５）をトランスフェクトした変異細胞由来の上清の値に対して標準化した。

【0180】

図１１Ｂに示すように、処理細胞から分泌されたＡ１ＡＴ量は、実施例２１で見出された編集活性を反映している。低い編集活性を示した不安定なコンストラクト、Ｖ１１７．２４（配列番号５２）もまた、コントロールと比較してＡ１ＡＴ分泌を示さない。しかしながら、セントラル塩基トリプレットにイノシンヌクレオシドを導入した安定型（Ｖ１１７．２５、配列番号５３；およびＶ１１７．２６、配列番号５４）は、野生型陽性コントロールの半分に近いＡ１ＡＴ分泌量を示した。ここでも、実施例１５／１６（図９）および実施例２１で既に分かるように、ピリミジンヌクレオシドの２’－Ｆのみではなく、２’－Ｆと２’－Ｏ－メチルの混合物（Ｖ１１７．２５対１１７．２６）がタンパク質の修復を改善した。

【0181】

〔実施例２３〕内因性ＡＤＡＲによる、ヒトＳＥＲＰＩＮＡ１転写産物の疾患原因となるＥ３４２Ｋ変異を標的とするコンストラクトの安定化（図１１Ｃ）

【0182】

実施例４で議論したように、血清中に見出されるＲＮアーゼ等の内因性防御機構に対して安定なコンストラクトが、本発明の治療的観点からは好ましい。このために、実施例２２で使用した好ましい実施形態である、ピリミジンヌクレオシドにおける化学修飾の導入により安定化された実施形態（Ｖ１１７．２５，配列番号５３；およびＶ１１７．２６，配列番号５４）、および安定化されていない実施形態（Ｖ１１７．２４，配列番号５２）を、７日間にわたる１０％ウシ胎児血清中での安定性について試験した。コンストラクトの配列を表１３に示す。結果は実施例４に記載した結果が得られた。

【0183】

図１１Ｃに示すように、また以前の標的についても、Ｖ１１７．２５およびＶ１１７．２６のようにコンストラクト内のピリミジンヌクレオシドを修飾することにより、コンストラクトは１０％ＦＢＳ中で７日間以上耐えることができるのに対し、不安定なコンストラクトＶ１１７．２４は直ちに分解される。全体として、実施例２１～２３は、治療への応用に関して本発明の有望な特性を示している。

【0184】

先行技術から本発明を識別するために、ＷＯ２０１８／０４１９７３に開示された２つのオリゴヌクレオチド、ＡＤＡＲ６０－６（ここでは配列番号５７）およびＡＤＡＲ６０－１０（ここでは配列番号５８）が、同じ条件下で編集活性およびタンパク質回復を比較するために選択された。両オリゴヌクレオチドは、修飾の種類、密度および位置が比較的類似していることから選ばれた。両オリゴヌクレオチドは３１ヌクレオチドから構成され、そのセントラル塩基トリプレットに相当する部分は、本発明の好ましい実施形態であるｖ１１７．１９（図３Ｂ）と同様に、全体構造内に対称的に配置された。両末端に連続した４個のホスホロチオエート連結から構成される先行技術のオリゴヌクレオチド骨格は、したがって、各末端に連続した２５個のホスホロチオエート連結を含む、本実施例の実施形態Ｖ１１７．２５（配列番号５３）およびＶ１１７．２６（配列番号５４）に示されるように、より少ないホスホロチオエート連結を含んでいた。最後に、ＡＤＡＲ６０－６はＤＮＡヌクレオシドで完全に構成されたセントラル塩基トリプレットを有するが、ＡＤＡＲ６０－１０は、標的とされるアデノシンと向かい合う塩基に３’－隣接するイノシンヌクレオシドを含むセントラル塩基トリプレットを有する。組み合わせて、２つのオリゴヌクレオチドＡＤＡＲ６０－６（配列番号５７）およびＡＤＡＲ６０－１０（配列番号５８）は、本発明で提示した好ましい実施形態Ｖ１１７．２５（配列番号５３）およびＶ１１７．２６（配列番号５４）と同様の修飾を示し、したがって、先行技術との比較に適していると考えられた。しかしながら、それらは、オリゴヌクレオチドの長さ、低いホスホロチオエート含有量、および２’－Ｏ－メチル化塩基の大きなブロックの使用において、本発明とは異なる。それらの正確な配列は表１３に開示されている。

【0185】

図１１Ａ）に示すように、ＡＤＡＲ６０－６およびＡＤＡＲ６０－１０は、前項で記載した実施例２１～２３で提示した実施形態と比較して類似していたが、いずれのオリゴヌクレオチドについても、試験された条件下で追跡可能な編集活性は検出されなかった（実施例２１および図１１Ａ参照）。さらに、ＡＤＡＲ６０－６およびＡＤＡＲ６０－１０は、Ａ１ＡＴサンドイッチＥＬＩＳＡを介して示されるように、Ａ１ＡＴタンパク質を回復させることができなかった（実施例２２および図１１Ｂを参照）が、本発明のＥ３４２Ｋ変異ＳＥＲＰＩＮＡ１標的を標的とする優れたコンストラクトであるＶ１１７．２６（配列番号５４）は、野生型Ａ１ＡＴコントロールの平均４２％を回復させた。先行技術の解決策では、内因性ＡＤＡＲを使用した顕著な編集を達成することはできなかった。このデータは、検出可能な編集を達成するためにＡＤＡＲ２の過剰発現および細胞溶解物中での編集実験の高度に人為的な実施を必要とする、元の特許ＷＯ２０１８／０４１９７３（図３）に提示されたデータに適合する。

【0186】

全体として、本データは、生細胞内の内因性ＡＤＡＲによるＲＮＡ編集収率およびタンパク質の回復という点で、本発明が先行技術よりも優れていることを示している。

【0187】

〔実施例２４〕内因性ＡＤＡＲによる、ヒトＬＲＲＫ２転写産物における疾患原因となるＧ２０１９Ｓ変異の編集（図１２）

【0188】

神経系の重要なキナーゼであるＬＲＲＫ２遺伝子の変異は、神経変性疾患と関連している。病原性変異の１つであるＧ２０１９Ｓは、パーキンソン病の発症リスクを高める。Ｇ２０１９Ｓ変異の根底にある標的アデノシンは５’－ＣＡＧコンテキストにある。したがって、本発明の標的として適している。コンストラクトの配列を表１４に示す。

【0189】

５×１０^４のＨｅＬａ細胞を２４ウェルプレートに播種した。２４時間後、細胞を、Ｇ２０１９Ｓ変異を有するヒトＬＲＲＫ２ ｃＤＮＡを含むプラスミドでフォワードトランスフェクトした。３００ｎｇのプラスミドおよび０．９μｌのＦｕＧＥＮＥ（登録商標）６（Ｐｒｏｍｅｇａ）をそれぞれ５０μｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭで希釈し、５分間インキュベートした後、それらを合わせてさらに２０分間インキュベートした。培地を交換し、トランスフェクションミックスを１つのウェルに均等に分配した。プラスミドトランスフェクションの２４時間後、細胞を２５ｐｍｏｌのＡＳＯ／ウェルおよび１．５μｌ／ウェルのリポフェクタミンＲＮＡｉＭＡＸ試薬（ThermoFisher Scientific）でフォワードトランスフェクトした。２４時間後、ＲＮＡ単離および配列決定のために細胞を回収した。

【0190】

図１２に示すように、化学修飾ピリミジンヌクレオシドを含まないコンストラクト（Ｖ１１７．１９，配列番号５９；およびＶ１２０．２，配列番号６１）で得られた編集収率は非常に高く、６０～８０％の範囲である。化学修飾されたピリミジンヌクレオシドを導入すると、すなわちＶ１１７．２０（配列番号６０）およびＶ１２０．３（配列番号６２）は、コンストラクトの編集活性が約半分に低下する。ピリミジンヌクレオシドに化学修飾を導入すると、このように編集活性が低下することは、上述の実施例で既に注目されていた傾向である。ＳＥＲＰＩＮＡ１標的とともに、ここで示した５’－ＣＡＧのように、ＡＤＡＲによってあまり好まれないコンテキストのアデノシンを標的とすることにも、先の発明が有用であることが証明できる。

【0191】

【表16】

【0192】

本出願に記載のヌクレオチド配列は、添付の配列表にも要約されている。しかしながら、配列表はヌクレオチドの配列を示すものであり、配列の修飾は複雑であるため配列表には反映されていない。ヌクレオチド配列が標的配列と一致しなければならないのに対して、修飾は明細書に明確に示されており、修飾パターンは本発明にとって重要である。

【図面の簡単な説明】

【0193】

【図1】本発明の２つの好ましい実施形態の基本構造および用語を示す。

【図2】実施例１で実施した実験の結果を示す。

【図3】リードオリゴヌクレオチドＶ１２０．２およびＶ１１７．１９、ならびに、ＧＡＰＤＨの編集を示す。

【図4-1】好ましいＧＡＤＰＨコンストラクトへのさらなる化学修飾の導入を示す。

【図4-2】好ましいＧＡＤＰＨコンストラクトへのさらなる化学修飾の導入を示す。

【図5】ＨｅＬａ細胞における安定な化学修飾ＧＡＤＰＨ標的コンストラクトによるジムノシスを示す。

【図6】実施例７（図６Ａ））および実施例８（図６Ｂ）で得られた結果を示す。

【図7】ＭｅＣＰ２ Ｗ１０４Ｘの編集および安定性データに関する。

【図8】ｈＩＤＵＡ Ｗ４０２Ｘの編集、α－Ｌ－イズロニダーゼアッセイ、および実験詳細の安定性データを示す。

【図9】ｍＩＤＵＡ Ｗ３９２Ｘの編集および安定性データに関する。

【図10】ＰＤＥ６Ａ Ｖ６８５Ｍ編集および対応する安定性データに関する。

【図11】ＳＥＲＰＩＮＡ１ ＰｉＺＺ編集およびＡ１ＡＴ ＥＬＩＳＡおよび安定性データに関する結果を示す。

【図12】ＬＲＲＫ２ Ｇ２０１９Ｓ標的について実施例２４で得られた結果を実証する。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4-1】

【図4-2】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【配列表】

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【手続補正書】

【提出日】2023-08-14

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【請求項1】

内因性ＡＤＡＲによる、細胞内の標的ＲＮＡの部位特異的Ａ－ｔｏ－Ｉ編集に使用するための化学修飾オリゴリボヌクレオチドであって、
上記標的ＲＮＡ中の標的配列に結合可能である、２５～８０ヌクレオチドの長さの配列を含み、
イノシンに編集される上記標的ＲＮＡ中の標的アデノシンと向かい合うセントラルヌクレオチドを有する、３個のヌクレオチドであるセントラル塩基トリプレット（ＣＢＴ）を含み、
ａ）上記ＣＢＴの外側のピリミジンヌクレオシドの少なくとも９０％は、糖部分の２’位で化学修飾されているか、デオキシリボヌクレオシドであるか、またはそれらの組み合わせであり、
ｂ）連続したわずか６個のヌクレオシドは、糖部分の２’位において２’－Ｏ－メチルによって化学修飾され、および、
ｃ）上記ＣＢＴの３つのヌクレオシドのうち少なくとも２つは、糖部分の２’位において化学修飾されているか、デオキシリボヌクレオシドであるか、またはそれらの組み合わせであり、ヌクレオシド間の連結の少なくとも３０％はホスホロチオエート（ＰＳ）連結であることを特徴とする、化学修飾オリゴリボヌクレオチド。

【請求項2】

内因性ＡＤＡＲによる、細胞内の標的ＲＮＡの部位特異的Ａ－ｔｏ－Ｉ編集に使用するための化学修飾オリゴリボヌクレオチドであって、
上記標的ＲＮＡ中の標的配列に結合可能である、２５～８０ヌクレオチドの長さの配列を含み、
イノシンに編集される上記標的ＲＮＡ中の標的アデノシンと向かい合うセントラルヌクレオチドを有する、３個のヌクレオチドであるセントラル塩基トリプレット（ＣＢＴ）を含み、
ａ）上記ＣＢＴの外側のピリミジンヌクレオシドの少なくとも９０％は、２’－フルオロおよび２’－Ｏ－メチル修飾の混合物によって糖部分の２’位が化学修飾されており、
ｂ）連続したわずか６個のヌクレオシドは、糖部分の２’位において２’－Ｏ－メチルによって化学修飾され、および、
ｃ）上記ＣＢＴの３つのヌクレオシドのうち少なくとも２つは、糖部分の２’位において化学修飾されているか、デオキシリボヌクレオシドであるか、またはそれらの組み合わせであることを特徴とし、および
ヌクレオシド間の連結の少なくとも３０％はホスホロチオエート（ＰＳ）連結である、化学修飾オリゴリボヌクレオチド。

【請求項3】

上記ＣＢＴの外側の化学修飾の少なくとも２０％、好ましくは３０～７０％、より好ましくは４０～６０％が２’－Ｏ－メチル置換基である、請求項２に記載の化学修飾オリゴリボヌクレオチド。

【請求項4】

上記ＣＢＴの外側の化学修飾の少なくとも２０％が２’－Ｆ置換基である、請求項２または３に記載の化学修飾オリゴリボヌクレオチド。

【請求項5】

内因性ＡＤＡＲによる、細胞内の標的ＲＮＡの部位特異的Ａ－ｔｏ－Ｉ編集に使用するための化学修飾オリゴリボヌクレオチドであって、
上記標的ＲＮＡ中の標的配列に結合可能である、２５～８０ヌクレオチドの長さの配列を含み、
イノシンに編集される上記標的ＲＮＡ中の標的アデノシンと向かい合うセントラルヌクレオチドを有する、３個のヌクレオチドであるセントラル塩基トリプレット（ＣＢＴ）を含み、
ａ）上記ＣＢＴの外側のピリミジンヌクレオシドの少なくとも９０％は、糖部分の２’位で化学修飾されているか、デオキシリボヌクレオシドであるか、またはそれらの組み合わせであり、
ｂ）連続したわずか６個のヌクレオシドは、糖部分の２’位において２’－Ｏ－メチルによって化学修飾され、
ｃ）上記ＣＢＴの３つのヌクレオシドのうち少なくとも２つは、糖部分の２’位において化学修飾されているか、デオキシリボヌクレオシドであるか、またはそれらの組み合わせであり、および、
ｄ）上記ピリミジンヌクレオシドは、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－ＭＯＥ）修飾は含まず、および、
ヌクレオシド間の連結の少なくとも３０％はホスホロチオエート（ＰＳ）連結であることを特徴とする、化学修飾オリゴリボヌクレオチド。

【請求項6】

ヌクレオシド間の連結の少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％がホスホロチオエート（ＰＳ）連結である、請求項１～５のいずれか１項に記載の化学修飾オリゴリボヌクレオチド。

【請求項7】

ヌクレオシド間の連結の少なくとも６０％がホスホロチオエート（ＰＳ）連結である、請求項１～５のいずれか１項に記載の化学修飾オリゴリボヌクレオチド。

【請求項8】

上記標的ＲＮＡ中の編集される標的アデノシンと向かい合うヌクレオシドが、Ｎ－ヘテロ環塩基、任意でピリジンまたはピリミジン塩基、好ましくはシトシン、ウラシル、チミンまたは５－メチルシトシンの群から選択されるヌクレオシド、最も好ましくはシトシンを有する、請求項１～７のいずれか１項に記載の化学修飾オリゴリボヌクレオチド。

【請求項9】

上記オリゴリボヌクレオチドが、少なくとも５個、好ましくは少なくとも１０個、より好ましくは少なくとも１５個、最も好ましくは少なくとも２０個のＰＳ連結を有するヌクレオシド間の連続したＰＳ連結の少なくとも１つのヌクレオチドブロックを含む、請求項１～８のいずれか１項に記載の化学修飾オリゴリボヌクレオチド。

【請求項10】

上記ＣＢＴの外側のピリミジンヌクレオシドの化学修飾が、２’－フルオロおよび２’－Ｏ－メチル置換基の組合せを構成し、それにより、化学修飾の少なくとも２０％、好ましくは３０～７０％、より好ましくは４０～６０％が２’－Ｏ－メチル置換基である、請求項４～９のいずれか１項に記載の化学修飾オリゴリボヌクレオチド。

【請求項11】

５個以下、好ましくは４個以下の連続したヌクレオシドが、上記糖部分の２’位において２’－Ｏ－メチル修飾を含む、請求項１～１０のいずれか１項に記載の化学修飾オリゴリボヌクレオチド。

【請求項12】

ピリミジンの１００％が、糖部分の２’位で修飾されているか、デオキシリボヌクレオシドであるか、またはそれらの組み合わせである、請求項１～１１のいずれかに記載の化学修飾オリゴリボヌクレオチド。

【請求項13】

上記ＣＢＴ中の３つのヌクレオシドのそれぞれがデオキシリボヌクレオチドである、請求項１２に記載の化学修飾オリゴリボヌクレオチド。

【請求項14】

５’－ＣＡＮ配列コンテキスト（Ｎ＝Ｇ、Ａ、Ｕ、またはＣ）中のアデノシンを標的とするとき、上記ＣＢＴの３’位のヌクレオシドがイノシンまたはその誘導体からなることによって、上記オリゴリボヌクレオチド中のイノシンが標的（ｍ）ＲＮＡ中のシトシン塩基と向かい合うように存在する、請求項１～１３のいずれか１項に記載の化学修飾オリゴリボヌクレオチド。

【請求項15】

ヘアピン－ループ構造ＡＤＡＲリクルート部分が存在しない、請求項１～１４のいずれか１項に記載の化学修飾オリゴリボヌクレオチド。

【請求項16】

上記ＣＢＴに隣り合う２つのヌクレオチド配列が同じ長さを有する、請求項１～１５のいずれか１項に記載の化学修飾オリゴリボヌクレオチド。

【請求項17】

上記ＣＢＴに隣り合う２つのヌクレオチド配列が異なる長さを有し、それにより、３’末端の配列が少なくとも４個のヌクレオチド、好ましくは少なくとも９個のヌクレオチドであり、５’末端の配列が少なくとも１９個のヌクレオチド、好ましくは少なくとも２８個のヌクレオチド、より好ましくは少なくとも３３個のヌクレオチドである、請求項１～１６のいずれか１項に記載の化学修飾オリゴリボヌクレオチド。

【請求項18】

３’末端および５’末端が、３個の連続した２’－Ｏ－メチルＰＳヌクレオチドのブロックでそれぞれ修飾されている、請求項１～１７のいずれか１項に記載の化学修飾オリゴリボヌクレオチド。

【請求項19】

３’末端および５’末端が、３個の２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－ＭＯＥ）ＰＳヌクレオチドのブロックでそれぞれ修飾されている、請求項１～４および６～１７のいずれか１項に記載の化学修飾オリゴリボヌクレオチド。

【請求項20】

３’末端および５’末端の両方の末端が、少なくとも５個の連続したＰＳ連結を含む、請求項１～１８のいずれか１項に記載の化学修飾オリゴヌクレオチド。

【請求項21】

上記ＣＢＴの外側のピリミジンヌクレオシドの化学修飾が、少なくとも１個、好ましくは少なくとも５個、より好ましくは少なくとも８個の２’－フルオロ置換基を含む、請求項２０に記載の化学修飾オリゴリボヌクレオチド。

【請求項22】

上記ＣＢＴの外側のピリミジンヌクレオシドの化学修飾が、２’－フルオロおよび２’－Ｏ－メチル置換基の組合せを構成し、それによって化学修飾の少なくとも２０％が２’－Ｆ置換基である、請求項４～２１のいずれか１項に記載の化学修飾オリゴリボヌクレオチド。

【請求項23】

請求項１～２２のいずれか１項に記載の少なくとも１つの化学修飾オリゴリボヌクレオチドを含むことを特徴とする、ヒトの障害または疾患、好ましくは遺伝的障害または疾患の処置または予防のための医薬。

【請求項24】

（ｉ）ヒトＳＥＲＰＩＮＡ１中の共通のＥ３４２Ｋ変異を標的とすることによるα１－アンチトリプシン欠損症、
（ii）ヒトＬＲＲＫ２中の共通のＳ２０１９Ｇ変異を標的とすることによる神経変性疾患、
（iii）ヒトＩＤＵＡ中の共通のＷ４０２Ｘ変異を標的とすることによるムコ多糖症、
（iv）ヒトＰＤＥ６Ａ中のＶ６８５Ｍ変異を標的とすることによる網膜色素変性症、
（v）ヒトＰＥＸ１遺伝子中のＧ８４３Ｄ変異を標的とすることによるツェルウェガースペクトラム障害、
（vi）ヒトＡＢＣＡ４中のＧ１９６１Ｅ変異を標的とすることによるスターガルト病または加齢黄斑変性、または
（vii）ヒトＣＲＢ１中のＣ９４８Ｙ変異を標的とすることによる網膜色素変性症またはレーバー先天性黒内障等の網膜疾患
の処置または予防のための、請求項１～２２のいずれかに記載の化学修飾オリゴリボヌクレオチドまたは請求項２３に記載の医薬。

【国際調査報告】