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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-06-11
(54)【発明の名称】エピレギュリンを標的とする化合物及び方法
(51)【国際特許分類】
C07K 16/28 20060101AFI20240604BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240604BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20240604BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20240604BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20240604BHJP
A61P 29/02 20060101ALI20240604BHJP
A61P 25/04 20060101ALI20240604BHJP
G01N 33/53 20060101ALI20240604BHJP
【ＦＩ】
C07K16/28 ZNA
C12N5/10
C12N15/63 Z
C12N15/13
A61K39/395 N
A61P29/02
A61P25/04
G01N33/53 D
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023571606
(86)(22)【出願日】2022-05-19
(85)【翻訳文提出日】2023-11-17
(86)【国際出願番号】 US2022030058
(87)【国際公開番号】W WO2022246078
(87)【国際公開日】2022-11-24
(31)【優先権主張番号】63/191,496
(32)【優先日】2021-05-21
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
２．ＴＲＩＴＯＮ
(71)【出願人】
【識別番号】594197872
【氏名又は名称】イーライ リリー アンド カンパニー
(74)【代理人】
【識別番号】100092783
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 浩
(74)【代理人】
【識別番号】100095360
【弁理士】
【氏名又は名称】片山 英二
(74)【代理人】
【識別番号】100103182
【弁理士】
【氏名又は名称】日野 真美
(74)【代理人】
【識別番号】100139310
【弁理士】
【氏名又は名称】吉光 真紀
(72)【発明者】
【氏名】バイドラー，キャサリン ブラウティガム
(72)【発明者】
【氏名】ボイルズ，ジェフリー ストリートマン
(72)【発明者】
【氏名】ギラルド，ダニエル スコット
(72)【発明者】
【氏名】ハーラン，シャノン マリー
(72)【発明者】
【氏名】ジョンソン，マイケル パーヴィン
【テーマコード（参考）】
4B065
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B065AA90X
4B065AA90Y
4C085AA14
4C085BB11
4C085CC03
4C085CC05
4C085CC31
4C085DD62
4C085EE01
4C085GG04
4H045AA11
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA70
4H045DA76
4H045EA20
4H045FA74
4H045GA26
(57)【要約】
本発明は、エピレギュリン抗体、それらを含む組成物、並びに慢性変形性関節症疼痛又は慢性糖尿病性末梢神経障害疼痛又は慢性腰痛症などの慢性疼痛障害のための抗体及び／又はその組成物を作製及び／又は使用する方法に関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ヒトエピレギュリンに結合する抗体であって、前記抗体が、重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、前記ＶＨが、重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み、前記ＶＬが、軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含み、前記ＨＣＤＲ１が、配列番号５を含み、
前記ＨＣＤＲ２が、配列番号６を含み、
前記ＨＣＤＲ３が、配列番号７を含み、
前記ＬＣＤＲ１が、配列番号８を含み、
前記ＬＣＤＲ２が、配列番号９を含み、
前記ＬＣＤＲ３が、配列番号１０を含む、抗体。
【請求項2】
前記ＶＨが、配列番号３を含み、前記ＶＬが、配列番号４を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項3】
前記抗体が、配列番号１を含む重鎖（ＨＣ）及び配列番号２を含む軽鎖（ＬＣ）を含む、請求項１又は２に記載の抗体。
【請求項4】
配列番号１１又は１２の配列を含む、核酸。
【請求項5】
請求項４に記載の核酸を含む、ベクター。
【請求項6】
前記ベクターが、配列番号１１の第１の核酸配列及び配列番号１２の第２の核酸配列を含む、請求項５に記載のベクター。
【請求項7】
配列番号１１の核酸配列を含む第１のベクター及び配列番号１２の核酸配列を含む第２のベクターを含む、組成物。
【請求項8】
請求項５又は６に記載のベクターを含む、細胞。
【請求項9】
配列番号１１の核酸配列を含む第１のベクター及び配列番号１２の核酸配列を含む第２のベクターを含む、細胞。
【請求項10】
前記細胞が、哺乳動物細胞である、請求項８又は９に記載の細胞。
【請求項11】
抗体を産生するプロセスであって、前記抗体が発現するような条件下で、請求項８～１０のいずれか一項に記載の細胞を培養することと、発現した前記抗体を培養培地から回収することと、を含む、プロセス。
【請求項12】
請求項１１に記載のプロセスによって産生される、抗体。
【請求項13】
請求項１～３又は１２のいずれか一項に記載の抗体と、薬学的に許容される賦形剤、希釈剤又は担体と、を含む、医薬組成物。
【請求項14】
疼痛障害の治療を必要とする患者において、疼痛障害を治療する方法であって、前記対象に、治療有効量の請求項１～３若しくは１２のいずれか一項に記載の抗体又は請求項１３に記載の医薬組成物を投与することを含む、方法。
【請求項15】
前記疼痛障害が、変形性関節症疼痛、糖尿病性末梢神経障害疼痛及び慢性腰痛症からなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項16】
前記疼痛障害が、変形性関節症疼痛である、請求項１５に記載の方法。
【請求項17】
前記疼痛障害が、糖尿病性末梢神経障害疼痛である、請求項１５に記載の方法。
【請求項18】
前記疼痛障害が、慢性腰痛症である、請求項１５に記載の方法。
【請求項19】
前記疼痛障害が、療法抵抗性である、請求項１５に記載の方法。
【請求項20】
療法に使用するための、請求項１～３又は１２のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項21】
疼痛障害の治療に使用するための、請求項１～３若しくは１２のいずれか一項に記載の抗体又は請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項22】
前記疼痛障害が、変形性関節症疼痛、糖尿病性末梢神経障害疼痛及び慢性腰痛症からなる群から選択される、請求項２１に記載の抗体又は医薬組成物。
【請求項23】
前記疼痛障害が、変形性関節症疼痛である、請求項２１に記載の抗体又は医薬組成物。
【請求項24】
前記疼痛障害が、糖尿病性末梢神経障害疼痛である、請求項２１に記載の抗体又は医薬組成物。
【請求項25】
前記疼痛障害が、慢性腰痛症である、請求項２１に記載の抗体又は医薬組成物。
【請求項26】
疼痛障害の治療のための医薬品の製造における、請求項１～３又は１２のいずれか一項に記載の抗体の使用。
【請求項27】
前記疼痛障害が、変形性関節症疼痛、糖尿病性末梢神経障害疼痛及び慢性腰痛症からなる群から選択される、請求項２６に記載の使用。
【請求項28】
体液試料中のヒトエピレギュリンレベルを決定する方法であって、（ａ）前記体液試料を、請求項１～３のいずれか一項に記載の抗ヒトエピレギュリン診断用モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントと接触させることと、
（ｂ）任意選択で、非特異的に結合したあらゆるモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントを除去することと、
（ｃ）ヒトエピレギュリンに特異的に結合するモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントの量を検出及び／又は定量化することと、を含む、方法。
【請求項29】
前記体液試料が、血液、血清若しくは血漿試料、又は脳脊髄液試料であり、前記接触させることが、エクスビボで生じる、請求項２８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、侵害受容性、神経障害性及び混合性疼痛を含む疼痛の治療、並びに特に変形性関節症（osteoarthritis、ＯＡ）疼痛又は糖尿病性末梢神経障害疼痛（diabetic peripheral neuropathy pain、ＤＰＮＰ）又は慢性腰痛症（chronic low back pain、ＣＬＢＰ）の治療における、ヒトエピレギュリンに対して指向された抗体を含む化合物、医薬組成物及び方法、並びにそれらの使用に関する。
【背景技術】
【0002】
慢性疼痛は、その機序に基づいて、侵害受容性、神経障害性及び混合性の異なるカテゴリに分類される。侵害受容性疼痛は、神経細胞以外の組織に損傷を与える可能性がある、又は実際に損傷を引き起こす刺激によって引き起こされる。これにより、末梢感覚系の侵害受容性受容器が活性化される。変形性関節症による疼痛は、体性侵害受容性疼痛の典型的な一例である。神経障害性疼痛は、中枢神経系又は末梢神経系の損傷又は疾患によって引き起こされ、感覚神経系の不適応過敏症を導く。糖尿病性末梢神経障害による疼痛は、末梢神経障害性疼痛の典型的な一例である。慢性腰痛症などの、侵害受容性疼痛及び神経障害性疼痛の両方の特徴を示す状態は、混合性疼痛に分類される。
【0003】
慢性疼痛は、非常に広まっている状態であり、社会に大きな影響を及ぼす。２０１６年には、米国の成人人口の推定２０．４％が、国民健康調査のデータに基づいて、過去６か月間のほとんどの日又は毎日の疼痛として定義される慢性疼痛を経験していた。人口の推定８％が、過去６か月間、ほぼ毎日、又は毎日、生活又は仕事の活動を制限する慢性疼痛を有していた。その結果、慢性疼痛は医療費の主な原因となっており、２０１０年の米国における慢性疼痛管理の年間費用は約６，３５０億ドルと推定された。高い疾患負荷及び社会的影響にもかかわらず、慢性疼痛の管理は現在満足のいくものではない。非薬物療法だけでは、疼痛緩和又は機能改善に十分とは言えず、利用可能な薬物療法は多様であり、提供される利益はわずかで、重大な安全上のリスクがある。現在、最も一般的なタイプの慢性疼痛を軽減するために最も頻繁に使用されている薬物は、アセトアミノフェン、非ステロイド系抗炎症薬及びオピオイドである。ガバペンチノイド、その他の抗けいれん薬（ジバルプロ酸ナトリウム、カルバマゼピン、又はラモトリギンなど）、及び一部の抗うつ薬（三環系薬又はデュロキセチンなど）は、特定の疼痛障害に使用できる。現在の薬理学的医療設備は、典型的には、低レベルの有効性を提供し、耐容性の問題及び／又は有害な副作用を有する。オピオイドは急性疼痛には効果的であるが、乱用のリスクが高く、重篤な有害反応の可能性があるため、慢性疼痛の治療選択肢は制限されている。患者及び社会に対する慢性疼痛の身体的、感情的及び経済的影響は、効果的かつ耐容可能な治療選択肢の欠如と相まって、満たされていない重大な医療ニーズとなっている。
【0004】
エピレギュリンは、７つのリガンド：ＴＧＦ－α（ＴＧＦＡ）、エピレギュリン（ＥＲＥＧ）、ＥＧＦ、ヘパリン結合ＥＧＦ（Heparin-Binding EGF、ＨＢ－ＥＧＦ）、エピゲン（ＥＰＧＮ）、アンフィレグリン（ＡＲＥＧ）及びベータセルリン（ＢＴＣ）を含むリガンドの上皮成長因子受容体（epidermal growth factor receptor、ＥＧＦＲ）ファミリーのメンバーである（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ ＭＲ，Ｗｏｌｆ Ｅ．Ｔｈｅ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｌｉｇａｎｄｓ ａｔ ａ ｇｌａｎｃｅ．Ｊ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．２００９；２１８（３）：４６０－４６６）。ＥＧＦＲ（ＥｒｂＢ１）に加えて、受容体のこのファミリー内に３つの追加の受容体（ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３及びＥｒｂＢ４）があり、このうちＥｒｂＢ３及びＥｒｂＢ４は、リガンドのニューレグリンファミリー並びにリガンドのＥＧＦＲファミリーの選択メンバー（エピレギュリン、ベータセルリン及びＨＢ－ＥＧＦ）に結合することができる。これらのリガンドは、パラクリン又はオートクリン様式で作用して、様々な生物学的プロセスを調節し得る可溶性リガンドを産生するようにタンパク質分解的に切断される、膜貫通タンパク質として合成される。エピレギュリンは、ＥＧＦＲ及びＥｒｂＢ４の両方に結合して、ＥｒｂＢ２又はＥｒｂＢ３とのホモ二量体化又はリガンド誘導性ヘテロ二量体化を介してシグナリングを誘導することができる。
【0005】
エピレギュリンシグナリングは、炎症、創傷治癒及び血管新生などの広範囲の生理学的状態に寄与する（Ｒｉｅｓｅ ｅｔ ａｌ．Ｅｐｉｒｅｇｕｌｉｎ：Ｒｏｌｅｓ ｉｎ Ｎｏｒｍａｌ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ，Ｓｅｍｉｎ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ．２０１４，０：４９－５６）。ＥＧＦＲ受容体ホモ又はヘテロ二量体ペアを介したエピレギュリンシグナリングにより、ＥＲＫ、ＭＡＰＫ、ＡＰ１、ＰＩ３Ｋ、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ及びＮＦＫＢなどの多数の下流シグナリング経路の活性化の可能性が得られる。ＪＡＫ／ＳＴＡＴ及びＮＦＫＢなどの経路の活性化は、炎症の駆動において十分に実証されているが、ＡＰ１シグナリングの活性化は、神経活性化のマーカーであるｃ－ＦＯＳ及びｃ－ＪＵＮ活性化を駆動する。前臨床モデルにおける最近公開されたデータは、エピレギュリンの役割を、ニューロン炎症及びニューロン活性化を特徴とする慢性疼痛の調節と関連付けており、慢性疼痛障害における可能性のある機序としての炎症及びニューロン活性化を調節するエピレギュリンシグナリング経路の役割を示唆している。報告によると、ＥＧＦＲ経路が神経障害性疼痛の病因に関与していることが示されている（Ｋｅｒｓｔｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ（ＥＧＦＲ－Ｉ）ｉｎ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｎｅｕｒｏｐａｔｈｉｃ ｐａｉｎ．Ｂｒ Ｊ Ａｎａｅｓｔｈ．２０１５；１１５（５）：７６１－７６７）。しかしながら、受容体をＥＧＦＲ抗体又はＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤で標的とすることは、胃腸（gastrointestinal、ＧＩ）及び皮膚有害反応の高い発生率に関連することが見出されており、これにより、慢性疼痛障害におけるそれらの可能性のある使用が制限されている。
【0006】
ＴＧＦα及びエピレギュリンの両方に結合する抗体は、糖尿病性腎症の治療方法とともに、国際公開第２０１２／１３８５１０号に開示されている。ＬＹ３０１６８５９は、エピレギュリン及び形質転換成長因子α（transforming growth factor α、ＴＧＦ－α）に結合するモノクローナル抗体であり、これは、第１相臨床試験において試験され、健康な対象及び糖尿病性腎症を有する患者における安全性、薬物動態、薬力学及び有効性について評価された（Ｓｌｏａｎ－Ｌａｎｃａｓｔｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｓａｆｅｔｙ，Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ，Ｐｈａｒｍａｃｏｄｙｎａｍｉｃｓ，ａｎｄ Ｅｆｆｉｃａｃｙ Ａｆｔｅｒ Ｓｉｎｇｌｅ ａｎｄ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｄｏｓｉｎｇｓ ｏｆ ＬＹ３０１６８５９ ｉｎ Ｈｅａｌｔｈｙ Ｓｕｂｊｅｃｔｓ ａｎｄ Ｐａｔｉｅｎｔｓ Ｗｉｔｈ Ｄｉａｂｅｔｉｃ Ｎｅｐｈｒｏｐａｔｈｙ，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ２０１８，７（７）７５９－７７２を参照されたい）。Ｓｌｏａｎ－Ｌａｎｃａｓｔｅｒらは、ＬＹ３０１６８５９がエピレギュリンよりもＴＧＦαに対して高い親和性を有すること、更にＬＹ３０１６８５９投与が腎症疾患関連バイオマーカーに対していかなる明らかな効果ももたらさなかったことを記載している（Ｂｅｉｄｌｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，２０１４，３４９（２）：３３０－３４３もまた参照されたい）。標的介在性薬物処分を示唆する非線形動態が見られ、高レベルの可溶性標的会合には高用量が必要であった。注目すべきことに、報告された両方の研究において高頻度の抗ＬＹ３０１６８５９抗体が観察されたが、薬物耐容性アッセイにおいて測定される循環エピレギュリンの用量及び時間依存的増加によって示されるような薬物動態又は標的会合に対する明確な影響はなかった。慢性疼痛適応症の治療のために、エピレギュリンに対してより選択的であり、より高い親和性を有し、かつ抗薬物抗体応答を誘導する可能性がより低い抗体が、満たされていない重要な治療ニーズとなっている。侵害受容性、神経障害性及び混合性疼痛を含む慢性疼痛障害、並びに特に変形性関節症若しくは糖尿病性末梢神経障害若しくは慢性腰痛症の治療、並びに／又は療法抵抗性疼痛の治療のための、代替及び／又は改善された治療に対する満たされていないニーズが残っている。
【発明の概要】
【0007】
本開示の実施形態は、新規抗ヒトエピレギュリン抗体、それらの医薬組成物、並びに疼痛及び慢性疼痛障害の治療においてこれらの抗体及び組成物を使用する方法を提供する。いくつかの実施形態によれば、本発明は、軽鎖可変領域（light chain variable region、ＬＣＶＲ）及び重鎖可変領域（heavy chain variable region、ＨＣＶＲ）を含む抗体を提供し、ＬＣＶＲは、相補性決定領域（complementarity determining region、ＣＤＲ）、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含み、ＨＣＶＲは、ＣＤＲ、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み、これらは、表１に提供されるＣＤＲの組み合わせの群から選択される。本明細書で使用される配列識別子は、表１に列挙され、配列は、本明細書に提供されるアミノ酸及びヌクレオチド配列表に提供される。抗体１は、高親和性完全ヒト免疫グロブリンＧ４（immunoglobulin G4、ＩｇＧ４）モノクローナル抗体であり、ヒトエピレギュリンのＣ末端領域の残基に結合し、ヒトエピレギュリンのＥＧＦＲへの結合及びＥＧＦＲの活性化を予防する。抗体１は、ヒト療法のための改善された抗エピレギュリン抗体となっており、これは、増強された親和性、選択性、オフターゲット及び望ましくない活性のリスクの低下、免疫原性のリスクの低下、高い効力及び長い作用期間、並びに他の望ましい特性を含む有利な特性の組み合わせを有し、エピレギュリンを遮断し、疼痛及び慢性疼痛障害を治療するための改善された手段を提供する。
【0008】
【表1】
【0009】
したがって、本開示の実施形態はまた、ＬＣＶＲが、配列番号４のアミノ酸配列を有し、ＨＣＶＲが、配列番号３のアミノ酸配列を有する、ＬＣＶＲ及びＨＣＶＲを含む抗体も提供する。
【0010】
他の実施形態によれば、本開示はまた、ＬＣＶＲが、配列番号４のアミノ酸配列を有し、ＨＣＶＲが、配列番号３のアミノ酸配列を有し、ヒンジ領域及びＦｃ領域が、配列番号５１及び配列番号５２から選択される、ＬＣＶＲ及びＨＣＶＲを含む抗体も提供する。
【0011】
別の実施形態では、本開示はまた、配列番号２のアミノ酸配列を有するＬＣ及び配列番号１のアミノ酸配列を有するＨＣを含む抗体も提供する。他の実施形態によれば、本開示はまた、配列番号２のアミノ酸配列を有するＬＣ及び配列番号１のアミノ酸配列を有するＨＣのアミノ酸配列と少なくとも９５％の相同性を有するアミノ酸配列を有する、ＬＣ及びＨＣを含む抗体も提供する。
【0012】
本明細書で使用される場合、「抗体１」は、配列番号５のＨＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号６のＨＣＤＲ２アミノ酸配列、配列番号７のＨＣＤＲ３アミノ酸配列、配列番号８のＬＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号９のＬＣＤＲ２アミノ酸配列、配列番号１０のＬＣＤＲ３アミノ酸配列、配列番号３のＨＣＶＲアミノ酸配列、配列番号４のＬＣＶＲアミノ酸配列、配列番号１のＨＣアミノ酸配列、配列番号２のＬＣアミノ酸配列を有するか、又は配列番号１１のＨＣ ＤＮＡ配列によってコードされるか、又は配列番号１２のＬＣ ＤＮＡ配列によってコードされる抗体を指す。本明細書で配列が示される抗体の各々におけるフレームワーク及びＣＤＲ配列は、特に指定がない限り、Ｎｏｒｔｈ，ｅｔ ａｌ．．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０１１：４０６：２２８－２５６の方法と一致する注釈規則を使用して注釈が付けられている。
【0013】
各ＨＣのカルボキシ末端部分は、エフェクター機能を主に担う定常領域を定義し、本発明のいくつかの実施形態では、抗体は、エフェクター機能を低下させる各ＨＣの定常領域に１つ以上の改変を有する。好ましくは、本発明の実施形態は、ＩｇＧ４抗体であり、したがって、ＩｇＧ４ Ｆｃ領域、又はヒトＩｇＧ４由来のＦｃ領域、例えば改変ＩｇＧ４ Ｆｃ領域を含有する。
【0014】
いくつかの実施形態によれば、エフェクター機能を低下させる両方のＨＣの定常領域における改変、及びアミノ酸置換が、ＩｇＧ４ヒンジ及びＦｃ領域に導入される。したがって、いくつかの実施形態は、残基２２９及び２３０（ＥＵインデックス２３４～２３５位）の両方にアミノ酸アラニンを含む両方のＨＣの定常領域における改変（抗体１のＨＣに例示され、配列番号５２に示される）、並びに残基２２３（ＥＵインデックス２２８位）にアミノ酸プロリンを含む安定性を促進する両方のＨＣの定常領域における更なる改変（抗体１のＨＣに例示され、配列番号５１に示される）、並びに残基４４２（ＥＵインデックス４４７位）のアミノ酸リジンの欠失（配列番号１のＨＣに例示される）を有する。
【0015】
本発明の抗体は、以下の特性：１）高い結合親和性並びに望ましい会合及び解離速度、２）疼痛緩和応答及びインビボ有効性を達成するためのヒトエピレギュリンの中和における効力、３）疼痛障害の治療及び／若しくは予防のための単剤療法として十分に強力であること、４）持続的な作用持続時間、５）十分に制限された注射部位反応、６）許容可能な低い免疫原性（すなわち、ヒトにおいて十分に非免疫原性）、７）不都合な皮膚発疹反応の低減、並びに／又は８）疼痛障害、例えば、侵害受容性、神経障害性及び混合性疼痛を含む慢性疼痛の治療、並びに特に慢性変形性関節症疼痛若しくは慢性糖尿病性末梢神経障害疼痛若しくは慢性腰痛症の治療における開発及び／若しくは使用に許容される、熱安定性、溶解性、低い自己会合及び薬物動態特徴を含むがこれらに限定されない、望ましいインビボ安定性、物理的及び化学的安定性のうちの１つ以上を含むがこれらに限定されない、先行技術の抗エピレギュリン抗体よりも特に有利な特性の組み合わせを有すると考えられる。
【0016】
本発明の実施形態は、ヒトエピレギュリンに対する抗体、それらの組成物、及び本明細書に記載の実施形態に提供される薬理学的に有利な抗ヒトエピレギュリン抗体を使用する、エピレギュリン中和を介した、疼痛障害の治療、下方制御又は寛解において有用な方法を提供することによって、先行技術に対して有意な進歩を提供する。本発明の抗ヒトエピレギュリン抗体は、好ましくは、特に慢性疼痛障害及び疼痛状態における疼痛応答の阻害を介して、疼痛症状を緩和し、疼痛病態生理を改善することができる。そのような抗体の臨床的な使用は、治療される疼痛関連障害の長期的な緩和につながる可能性がある。
【0017】
更に、ヒトエピレギュリンに特異的であり、改善された結合親和性を有し、かつヒトエピレギュリン決定において増強した感度を実証する、診断用抗ヒトエピレギュリン抗体、並びに最小限の干渉及び広い希釈直線性をもたらす改善された酵素結合免疫吸着アッセイ（enzyme-linked immunosorbent assay、ＥＬＩＳＡ）アッセイ条件に対する必要性が存在する。本開示のいくつかの態様によれば、配列番号２１によって与えられるヒトエピレギュリンに結合する、ヒトエピレギュリン中和抗体を含む抗ヒトエピレギュリン抗体が提供される。「エピレギュリン」又は「ヒトエピレギュリン」は、ヒトエピレギュリンタンパク質を指す。本明細書で使用される場合、エピレギュリンは、成熟エピレギュリンペプチドを指す。エピレギュリン（ＥＲＥＧ、ＥＰＲとしても知られる）は、ペプチドホルモンの上皮成長因子（ＥＧＦ）ファミリーに属する４６アミノ酸のタンパク質である。エピレギュリンは、１６２アミノ酸の膜貫通エピレギュリン前駆体として産生され、これは切断されて、以下の配列：
「ＶＳＩＴＫＣＳＳＤＭＮＧＹＣＬＨＧＱＣＩＹＬＶＤＭＳＱＮＹＣＲＣＥＶＧＹＴＧＶＲＣＥＨＦＦＬ」（配列番号２１）の４６アミノ酸の成熟ペプチドを放出する（例えば、Ｔｏｙｏｄａ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ｍｏｕｓｅ ｅｐｉｒｅｇｕｌｉｎ，ａ ｎｏｖｅｌ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ－ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ，ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｅａｒｌｙ ｓｔａｇｅ ｏｆ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．１９９５；３７７：４０３－７を参照されたい）。実施例２に記載され、調製されるようなヒトエピレギュリン（配列番号２２）は、例えば、本明細書に記載のインビトロ実験において使用することができる。本明細書に記載の抗体が、ヒトエピレギュリンタンパク質に結合する能力及び／又はそれを中和する能力への言及は、インビトロ実験においてヒトエピレギュリンに結合し、それを中和するそれらの能力にも言及する。
「ＶＳＩＴＫＣＳＳＤＭＮＧＹＣＬＨＧＱＣＩＹＬＶＤＭＳＱＮＹＣＲＣＥＶＧＹＴＧＶＲＣＥＨＦＦＬ」（配列番号２１）の４６アミノ酸の成熟ペプチドを放出する（例えば、Ｔｏｙｏｄａ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ｍｏｕｓｅ ｅｐｉｒｅｇｕｌｉｎ，ａ ｎｏｖｅｌ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ－ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ，ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｅａｒｌｙ ｓｔａｇｅ ｏｆ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．１９９５；３７７：４０３－７を参照されたい）。実施例２に記載され、調製されるようなヒトエピレギュリン（配列番号２２）は、例えば、本明細書に記載のインビトロ実験において使用することができる。本明細書に記載の抗体が、ヒトエピレギュリンタンパク質に結合する能力及び／又はそれを中和する能力への言及は、インビトロ実験においてヒトエピレギュリンに結合し、それを中和するそれらの能力にも言及する。
【0018】
本明細書で使用される場合、「ヒト抗エピレギュリン抗体」又は「抗ヒトエピレギュリン抗体」は、ヒトエピレギュリンに結合し、インビトロ又はインビボ投与された場合に、少なくとも１つの有意に減少した活性などのエピレギュリン活性中和及び／又は遮断応答をもたらす抗体を指す。例えば、エピレギュリン応答性分子又は細胞エンドポイントの変化によって証明される、エピレギュリンシグナリングの所望の低減。本明細書で使用される場合、「シグナリング」及び「シグナル伝達」及び「エピレギュリン介在性」という用語は、エピレギュリンに関連する場合、エピレギュリンの活性に起因する細胞及び／又は細胞間反応を指す。
【0019】
本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、抗原に結合する免疫グロブリン分子を指す。抗体の実施形態には、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、又はコンジュゲート抗体が含まれる。抗体は、任意のクラス（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ）、及び任意のサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）のものであってもよい。例示的な抗体は、４つのポリペプチド鎖：鎖間ジスルフィド結合を介して架橋される２つの重鎖（heavy chain、ＨＣ）及び２つの軽鎖（light chain、ＬＣ）から構成された免疫グロブリンＧ（immunoglobulin G、ＩｇＧ）型抗体である。ＬＣは、カッパ又はラムダとして分類され、これらは各々、特定の定常領域を特徴とする。本発明の実施形態は、ＩｇＧ１又はＩｇＧ４抗体を含み得、カッパ軽鎖又はラムダ軽鎖を更に含み得る。好ましくは、本発明の抗体は、カッパ定常領域である軽鎖定常領域を含む。
【0020】
ＨＣは、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタ又はイプシロンとして分類され、それぞれ抗体のアイソタイプをＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ又はＩｇＥとして定義する。４つのポリペプチド鎖の各々のアミノ末端部分は、抗原認識に主に関与する約１００～１２５個以上のアミノ酸の可変領域を含む。４つのポリペプチド鎖の各々のカルボキシ末端部分は、主にエフェクター機能に関与する定常領域を含有する。各重鎖は、重鎖可変領域（ＶＨ）及び重鎖定常領域から構成される。重鎖の定常領域は、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含有する。ＣＨ１は、ＨＣＶＲの後にあり、ＣＨ１及びＨＣＶＲは、抗原に結合する抗体の一部である抗原結合（Ｆａｂ）フラグメントの重鎖部分を形成する。ＣＨ２は、ヒンジ領域の後にあり、ＣＨ３の前にある。ＣＨ３は、ＣＨ２の後にあり、重鎖のカルボキシ末端にある。軽鎖の定常領域は、１つのドメインＣＬを含有する。ＣＬは、ＬＣＶＲの後にあり、ＣＬ及びＬＣＶＲは、Ｆａｂの軽鎖部分を形成する。
【0021】
本発明の抗体は、サブクラス、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４に更に分類することができるＩｇＧ ＨＣを含み、本開示の実施形態は、例えば、エフェクター機能を増強又は低減する、各ＨＣの定常領域に１つ以上の改変を含み得る。本明細書で使用される「Ｆｃ領域」という用語は、抗体重鎖のＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含む抗体の領域を指す。任意選択で、Ｆｃ領域は、抗体重鎖のヒンジ領域の一部分又はヒンジ領域全体を含み得る。ＩｇＧ１は、抗体依存性細胞傷害性（antibody-dependent cell cytotoxicity、ＡＤＣＣ）及び補体依存性細胞傷害性（complement-dependent cytotoxicity、ＣＤＣ）を誘導することが既知であり、本明細書に記載のＦｃ変異は、凝集を低減し、ＡＤＣＣ若しくはＣＤＣ活性（若しくは他の機能）を低減若しくは増強し、かつ／又は抗体の薬物動態を改変し得る。本明細書に記載の抗ヒトＥＲＥＧ抗体の実施形態は、ＦｃγＲ及びＣ１ｑ受容体への結合が低減しており、それにより、野生型ＩｇＧ Ｆｃ領域を有する抗体によって誘導され得る細胞傷害性を低減又は除去する。したがって、いくつかの実施形態によれば、変異は、本明細書に記載の位置でＦｃ領域に導入される。改変Ｆｃ領域を含むそのような抗ヒトＥＲＥＧ抗体のエフェクター機能を十分に低減又は除去することにより、患者の安全性を改善することができ、本明細書に記載の他の特性と組み合わせて、望ましくない活性を回避しながら有用な活性の改善されたプロファイルを有する治療薬を提供することができる。
【0022】
特定の生物学的系において発現する場合、抗体は、Ｆｃ領域においてグリコシル化される。典型的には、グリコシル化は、高度に保存されたＮ－グリコシル化部位の抗体のＦｃ領域に生じる。Ｎ－グリカンは、典型的には、アスパラギンに結合する。抗体は、他の位置でもグリコシル化され得る。本開示の抗体は、モノクローナル抗体である。モノクローナル抗体は、単一のコピー又はクローン（例えば、任意の真核生物、原核生物、又はファージクローンを含む）に由来する抗体であり、それが産生される方法により定義されるものではない。モノクローナル抗体は、例えば、ハイブリドーマ技術、組換え技術、ファージ提示技術、合成技術、例えば、ＣＤＲ移植、又はそのような技術若しくは当該技術分野で既知の他の技術の組み合わせにより産生することができる。本開示は、本発明の抗体がヒト又はヒト化抗体であることを企図する。モノクローナル抗体の文脈において、「ヒト」及び「ヒト化」という用語は、当業者に周知である（Ｗｅｉｎｅｒ ＬＪ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２００６；２９：１－９、Ｍａｌｌｂｒｉｓ Ｌ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ａｅｓｔｈｅｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．２０１６；９：１３－１５）。本開示の抗体の例示的な実施形態はまた、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖフラグメント、ｓｃＦｖ抗体フラグメント、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、Ｆｄフラグメント及び線状抗体などの、抗原と特異的に相互作用する能力を保持する抗体の少なくとも一部分を含む、抗体フラグメント又は抗原結合フラグメントを含む。
【0023】
各ＬＣ及びＨＣのアミノ末端部分は、その中に含有されるＣＤＲを介した抗原認識を主に担う約１００～１２０アミノ酸の可変領域を含む。ＶＨ及びＶＬ領域は、フレームワーク領域（framework regions、ＦＲ）と呼ばれる、より保存されている領域が散在する、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる、超可変領域に更に細分され得る。ＣＤＲはタンパク質の表面上に露出しており、抗原結合特異性のための抗体の重要な領域である。各ＶＨ及びＶＬは、３つのＣＤＲ及び４つのＦＲから構成されており、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順序でアミノ末端からカルボキシ末端へと配置される。本明細書では、重鎖の３つのＣＤＲを「ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３」と称し、軽鎖の３つのＣＤＲを「ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３」と称する。ＣＤＲは、抗原との特異的相互作用を形成する残基の大部分を含有する。抗体が特定の抗原に結合する機能的能力は、６つのＣＤＲによって大きく影響される。アミノ酸残基のＣＤＲへの割り当ては、Ｋａｂａｔ（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１））、Ｃｈｏｔｈｉａ（Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，「Ｃａｎｏｎｉｃａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ」，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９６，９０１－９１７（１９８７）、Ａｌ－Ｌａｚｉｋａｎｉ ｅｔ ａｌ．，「Ｓｔａｎｄａｒｄ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｃａｎｏｎｉｃａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ」，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２７３，９２７－９４８（１９９７））、Ｎｏｒｔｈ（Ｎｏｒｔｈ ｅｔ ａｌ．，「Ａ Ｎｅｗ Ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ＣＤＲ Ｌｏｏｐ Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ」，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，４０６，２２８－２５６（２０１１））、又はＩＭＧＴ（ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ ｄａｔａｂａｓｅ、ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇで利用可能、Ｌｅｆｒａｎｃ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９９；２７：２０９－２１２を参照されたい）に記載されるものを含む、周知のスキームによって実施され得る。
【0024】
本開示の目的のために、別段の指定がない限り、本明細書に記載の抗エピレギュリン抗体、並びにＬＣＶＲ領域及びＨＣＶＲ領域内のＣＤＲドメインへのアミノ酸の割り当てには、ＮｏｒｔｈのＣＤＲ定義が使用される。以下の表２は、ＳＡｂＰｒｅｄ／ＡＮＡＲＣＩライブラリー（Ｄｕｎｂａｒ ａｎｄ Ｄｅａｎｅ，「ＡＮＡＲＣＩ：ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ ａｎｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ」，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，３２，２９８－３００（２０１６））を使用して生成された、それぞれＮｏｒｔｈ、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ及び／又はＩＭＧＴの規約に基づく、抗体１及び／又は本開示の抗体のＣＤＲ配列を提供する。
【0025】
【表2】
【0026】
本開示の抗体の実施形態は、いくつかの薬理学的に有用かつ重要な活性の組み合わせを有し、ある点では、ヒトエピレギュリンに高い親和性で、及びヒトエピレギュリンに高い特異性で結合することができ、かつ他の有用な特性を有する。本明細書で使用される「結合する」という用語は、特に示されない限り、別のタンパク質又は分子との引力相互作用を形成するタンパク質又は分子の能力を意味することを意図するが、これは、当該技術分野で既知である一般的な方法によって決定される、２つのタンパク質又は分子の近接をもたらす。本明細書で使用される場合、「特異的に結合する」という語句は、ヒトエピレギュリンに対する抗エピレギュリン抗体の親和性を指し、特に示されない限り、本明細書に記載のＭＳＤ－ＳＥＴ（溶液平衡滴定）の使用を含む当該技術分野で既知である一般的な方法によって約ｐＨ７．４で決定される、約２×１０－９Ｍ未満、好ましくは約２×１０－１１Ｍ未満、更により好ましくは約２×１０－１１Ｍ～約２×１０－１２ＭのＫＤを意味することを意図する。「特異的に結合する」という語句はまた、他の抗原、及び特にＥＧＦＲリガンドＴＧＦαと比較した場合の、ヒトエピレギュリンに対する抗エピレギュリン抗体の相対的親和性も示し、ヒトエピレギュリンに対する親和性は、ヒトエピレギュリンの特異的認識及び試験される他のＥＧＦＲリガンドへの結合の欠如をもたらす。
【0027】
本開示の抗体の実施形態は、本実施形態の配列を含む構築物から、当技術分野で知られている様々な技術によって発現及び産生され得る。「核酸」又は「ポリヌクレオチド」という用語は、本明細書で互換的に使用される場合、天然ヌクレオチド、改変ヌクレオチド及び／又はヌクレオチドの類似体を組み込んだＤＮＡ、ｃＤＮＡ及びＲＮＡ分子などの一本鎖及び／又は二本鎖ヌクレオチド含有分子を含む、ヌクレオチドのポリマーを指す。本開示のポリヌクレオチドはまた、例えば、ＤＮＡ若しくはＲＮＡポリメラーゼ又は合成反応によってその中に組み込まれた基質も含み得る。本開示のＤＮＡ分子は、本発明の抗体中のポリペプチド（例えば、重鎖、軽鎖、可変重鎖及び可変軽鎖）のうちの少なくとも１つのアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする天然に存在しないポリヌクレオチド配列を含む、ＤＮＡ分子である。
【0028】
ＨＣＶＲ又はＬＣＶＲ領域をコードする単離ＤＮＡは、それぞれＨＣＶＲ又はＬＣＶＲをコードするＤＮＡを、重鎖又は軽鎖定常領域をコードする別のＤＮＡ分子に作動可能に連結して、それぞれ重鎖又は軽鎖を形成することによって、完全長重鎖遺伝子に変換され得る。ヒト及び他の哺乳動物の重鎖定常領域遺伝子の配列は、当該技術分野において既知である。これらの領域を包含するＤＮＡフラグメントは、例えば、標準的なＰＣＲ増幅によって得ることができる。
【0029】
本開示のポリヌクレオチドは、配列が発現制御配列に作動可能に連結された後に宿主細胞において発現し得る。発現ベクターは、典型的には、エピソームとして、又は宿主染色体ＤＮＡの一体化した部分としてのいずれかで、宿主生物中で複製可能である。一般に、発現ベクターは、所望のＤＮＡ配列で形質転換されたそれらの細胞の検出を可能にするために、選択マーカー、例えば、テトラサイクリン、ネオマイシン及びジヒドロ葉酸レダクターゼを含有する。目的のポリヌクレオチド配列（例えば、抗体のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド及び発現制御配列）を含有するベクターは、細胞宿主のタイプに応じて変動する周知の方法によって宿主細胞に導入され得る。
【0030】
本開示の抗体は、哺乳動物細胞において容易に産生することができ、この非限定的な例には、ＣＨＯ、ＮＳ０、ＨＥＫ２９３又はＣＯＳ細胞が含まれる。宿主細胞は、当該技術分野において周知の技術を使用して培養される。哺乳動物の抗体発現は、典型的にグリコシル化をもたらす。抗体のグリコシル化は、典型的には、Ｎ結合又はＯ結合のいずれかである。Ｎ結合グリコシル化とは、アスパラギン残基の側鎖への炭水化物部分の結合を指す。Ｏ結合グリコシル化とは、ヒドロキシアミノ酸への糖、例えばＮ－アセチルガラクトサミン、ガラクトース、又はキシロースの結合を指す。典型的には、グリコシル化は、高度に保存されたＮ－グリコシル化部位（例えば、ＩＭＧＴ又はＥＵインデックスナンバリングによると、ＩｇＧ１における２９７位）での抗体のＦｃ領域に生じる。グリコシル化部位は、グリコシル化を変更するために改変することができる（例えば、グリコシル化を遮断若しくは低減するか、又はアミノ酸配列を変更して追加若しくは多様なグリコシル化を生成する）。
【0031】
ＩｇＧサブクラスからの哺乳動物での抗体の発現は、一方又は両方の重鎖からのＣ末端アミノ酸のクリッピングをもたらす可能性があり、例えば、ＩｇＧ１抗体の場合、１つ又は２つのＣ末端アミノ酸が除去され得る。ＩｇＧ１抗体の場合、Ｃ末端リジンが存在する場合、発現中に重鎖から切り詰められるか、又は切り取られ得る。追加的に、最後から２番目のグリシンも、同様に重鎖から切り詰められるか、切り取られ得る。
【0032】
哺乳動物での抗体の発現はまた、Ｎ末端アミノ酸の改変ももたらし得る。例えば、重鎖又は軽鎖の最もＮ末端のアミノ酸がグルタミンである場合、ピログルタミン酸に改変され得る。
【0033】
本開示の抗体、又はそれを含む医薬組成物は、非経口経路によって投与されることができ、この非限定的な例は、皮下投与及び静脈内投与である。本開示の抗体は、薬学的に許容される担体、希釈剤、又は賦形剤とともに単回投与又は複数回投与で患者に投与され得る。本開示の医薬組成物は、当該技術分野において周知の方法（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２２ｎｄ ｅｄ．（２０１２），Ａ．Ｌｏｙｄ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ）によって調製することができ、本明細書に開示される抗体、及び１つ以上の薬学的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤を含む。
【0034】
本開示の抗体実施形態の使用：
いくつかの実施形態によれば、本開示の抗エピレギュリン抗体は、疼痛障害の治療に有用である。本明細書中で使用される場合、「疼痛障害」という用語は、過剰及び／又は慢性的な疼痛状態から生じる望ましくない状態を指し、ここで、エピレギュリン阻害は、より恒常性でより病理学的ではない疼痛状態をもたらす。本明細書に記載の本開示の抗体による治療が企図される例示的な疼痛障害には、侵害受容性、神経障害性及び混合性疼痛を含む慢性疼痛、並びに特に、変形性関節症疼痛又は糖尿病性末梢神経障害疼痛又は腰痛症、並びに特に慢性疼痛状態における化学療法剤誘発末梢神経障害の治療が含まれる。
いくつかの実施形態によれば、本開示の抗エピレギュリン抗体は、疼痛障害の治療に有用である。本明細書中で使用される場合、「疼痛障害」という用語は、過剰及び／又は慢性的な疼痛状態から生じる望ましくない状態を指し、ここで、エピレギュリン阻害は、より恒常性でより病理学的ではない疼痛状態をもたらす。本明細書に記載の本開示の抗体による治療が企図される例示的な疼痛障害には、侵害受容性、神経障害性及び混合性疼痛を含む慢性疼痛、並びに特に、変形性関節症疼痛又は糖尿病性末梢神経障害疼痛又は腰痛症、並びに特に慢性疼痛状態における化学療法剤誘発末梢神経障害の治療が含まれる。
【0035】
本発明の他の実施形態によれば、抗エピレギュリン抗体は、エピレギュリン介在性疼痛障害の診断用途に有用である。いくつかの実施形態では、疼痛障害は、変形性関節症（ＯＡ）疼痛又は糖尿病性末梢神経障害疼痛（ＤＰＮＰ）又は慢性腰痛症（ＣＬＢＰ）のうちの少なくとも１つである。いくつかのより具体的な実施形態では、疼痛障害は、変形性関節症（ＯＡ）である。
【0036】
本開示は、本開示の抗エピレギュリン抗体、及び１つ以上の薬学的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤を含む、医薬組成物を更に提供する。更に、本開示は、変形性関節症疼痛又は糖尿病性末梢神経障害疼痛又は慢性腰痛症などの疼痛障害を治療する方法であって、本開示の医薬組成物を、それを必要とする患者に投与することを含む方法を提供する。
【0037】
加えて、本開示は、エピレギュリン介在性疾患を治療する方法を提供する。より具体的には、本発明は、変形性関節症疼痛又は糖尿病性末梢神経障害疼痛又は慢性腰痛症などの慢性疼痛障害を治療する方法であって、有効量の本開示の抗エピレギュリン抗体を、それを必要とする患者に投与することを含む方法を提供する。
【0038】
本開示はまた、療法に使用するための本開示の抗エピレギュリン抗体も提供する。より具体的には、本開示は、変形性関節症疼痛又は糖尿病性末梢神経障害疼痛又は慢性腰痛症などの慢性疼痛障害の治療に使用するための本開示の抗エピレギュリン抗体を提供する。
【0039】
特定の実施形態では、本開示は、変形性関節症疼痛又は糖尿病性末梢神経障害疼痛又は慢性腰痛症などの１つ以上の慢性疼痛障害の治療のための医薬品の製造における、本開示の抗エピレギュリン抗体又はその組成物の使用を提供する。
【0040】
本開示の抗体は、エピレギュリンが障害の病因に寄与する可能性がある慢性疼痛障害の同定に有用である。更なる実施形態では、本開示は、患者における慢性疼痛障害を治療する方法を提供する。そのような方法は、患者試料を抗エピレギュリン抗体と接触させ、患者試料中のヒトエピレギュリンと抗体との間の結合を検出するステップと、患者試料中のエピレギュリンの存在が、罹患していない個体において観察される基準値を超えて検出される場合、患者がエピレギュリン介在性障害を有する、そのリスクがある、その治療が必要である、かつ／又はそれに関連する症状のリスクがあると診断するステップとを含む。本明細書に提供される治療方法のいくつかのより具体的な実施形態によれば、そのような方法は、対照標準を、患者試料と接触させる際に使用されるものと同じエピレギュリンの第１のエピトープ領域に結合する第１の抗体と接触させる更なるステップを含む、基準値を決定するステップと、対照標準を、検出可能な標識を有し、患者試料と接触させる際に使用されるものと同じエピレギュリンの第２のエピトープ領域に結合する第２の抗体と接触させるステップと、検出可能なシグナルによって提供されるシグナルを検出するステップとを更に含む。いくつかの具体的な実施形態では、抗エピレギュリン抗体は、表１に提供されるＬＣ及びＨＣ ＣＤＲの組み合わせを含む。更なる実施形態では、第２の抗体は、表１に提供されるＬＣＶＲ及びＨＣＶＲの組み合わせを含む。特定の実施形態では、慢性疼痛障害は、変形性関節症疼痛又は糖尿病性末梢神経障害疼痛又は慢性腰痛症のうちの１つである。いくつかの実施形態では、患者試料は、ＣＳＦ、血液、血清、組織ライセート、又は血漿のうちの１つである。いくつかの実施形態によれば、本方法は、患者試料を、エピレギュリンの第２のエピトープ領域に結合し、検出可能な標識を有する第２の抗エピレギュリン抗体と接触させるステップと、検出可能なシグナルによって提供されるシグナルを検出するステップとを更に含む。更なる実施形態では、第２の抗体は、表１に提供されるＬＣ及びＨＣ ＣＤＲの組み合わせを含む。更なる実施形態では、第２の抗体は、表１に提供されるＬＣＶＲ及びＨＣＶＲの組み合わせを含む。特定の実施形態によれば、第１及び第２の抗エピレギュリン抗体は、一緒にビンに入れられない。
【0041】
いくつかの実施形態によれば、本開示は、患者試料中のエピレギュリンを検出する方法であって、患者試料を、エピレギュリンの第１のエピトープ領域に結合する第１の抗体と接触させるステップと、患者試料を、エピレギュリンの第２のエピトープ領域に結合し、検出可能な標識を有する第２の抗体と接触させるステップと、当該検出可能な標識によって提供されるシグナルを検出するステップとを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、患者試料は、血液、血清、組織ライセート又は血漿のうちの１つである。いくつかのより具体的な実施形態によれば、エピレギュリンの第１のエピトープ領域は、エピレギュリンの第２のエピトープ領域と部分的に重複する。更に、いくつかの実施形態では、第１及び第２の抗体と接触させる当該ステップは、同時に生じる。いくつかの具体的な実施形態では、第１の抗体は、表１に提供されるＬＣ及びＨＣ ＣＤＲの組み合わせを含む。更なる実施形態では、第１の抗体は、表１に提供されるＬＣＶＲ及びＨＣＶＲの組み合わせを含む。
【0042】
本開示のいくつかの実施形態によれば、患者試料中のエピレギュリンを定量化する方法が提供される。そのような方法は、患者試料を、エピレギュリンの第１のエピトープ領域に結合する第１の抗体と接触させるステップと、患者試料を、エピレギュリンの第２のエピトープ領域に結合し、検出可能な標識を有する第２の抗体と接触させるステップと、当該検出可能な標識によって提供されるシグナルを検出するステップと、対照標準を、（患者試料を接触させる際に使用されるものと）同じエピレギュリンの第１のエピトープ領域に結合する第１の抗体と接触させるステップと、対照標準を、（患者試料を接触させる際に使用されるものと）同じエピレギュリンの第２のエピトープ領域に結合し、検出可能な標識を有する第２の抗体と接触させるステップと、当該検出可能なシグナルによって提供されるシグナルを検出するステップとを含む。いくつかの実施形態では、患者試料は、血液、血清若しくは血漿、又は組織ライセートのうちの１つである。いくつかのより具体的な実施形態によれば、エピレギュリンの第１のエピトープ領域は、エピレギュリンの第２のエピトープ領域と部分的に重複する。更に、いくつかの実施形態では、第１及び第２の抗体と接触させる当該ステップは、同時に生じる。いくつかの具体的な実施形態では、第１の抗体は、表１に提供されるＬＣ及びＨＣ ＣＤＲの組み合わせを含む。更なる実施形態では、第１の抗体は、表１に提供されるＬＣＶＲ及びＨＣＶＲの組み合わせを含む。いくつかの具体的な実施形態では、第２の抗体は、表１に提供されるＬＣ及びＨＣ ＣＤＲの組み合わせを含む。更なる実施形態では、第２の抗体は、表１に提供されるＬＣＶＲ及びＨＣＶＲの組み合わせを含む。
【0043】
いくつかの実施形態によれば、エピレギュリン介在性疾患又は障害を診断する方法が提供される。そのような方法は、患者試料を抗エピレギュリン抗体と接触させるステップと、患者試料中のエピレギュリンと抗体との間の結合を検出するステップとを含む。いくつかの特定の実施形態によれば、診断する方法は、患者試料中のエピレギュリンの存在が基準値を超えて検出される場合、患者がエピレギュリン介在性障害を有する、そのリスクがある、その治療が必要である、かつ／又はそれに関連する症状のリスクがあると診断することを含む。いくつかのより具体的な実施形態によれば、そのような方法は、対照標準を、患者試料と接触させる際に使用されるものと同じエピレギュリンの第１のエピトープ領域に結合する第１の抗体と接触させるステップを含む、基準値を決定するステップと、対照標準を、検出可能な標識を有し、患者試料と接触させる際に使用されるものと同じエピレギュリンの第２のエピトープ領域に結合する第２の抗体と接触させるステップと、検出可能なシグナルによって提供されるシグナルを検出するステップとを更に含む。いくつかの実施形態では、第１の抗体は、表１に提供されるＬＣ及びＨＣ ＣＤＲの組み合わせを含む。更なる実施形態では、抗体は、表１に提供されるＬＣＶＲ及びＨＣＶＲの組み合わせを含む。本明細書に提供される、エピレギュリン介在性疾患を診断する方法のいくつかの実施形態は、患者試料を、エピレギュリンの第２のエピトープ領域に結合し、検出可能な標識を有する第２の抗エピレギュリン抗体と接触させるステップと、検出可能な標識によって提供されるシグナルを検出するステップとを更に含む。いくつかの具体的な実施形態では、抗エピレギュリン抗体は、表１に提供されるＬＣ及びＨＣ ＣＤＲの組み合わせを含む。更なる実施形態では、抗体は、表１に提供されるＬＣＶＲ及びＨＣＶＲの組み合わせを含む。具体的な実施形態によれば、エピレギュリンの第１のエピトープ領域は、エピレギュリンの第２のエピトープ領域と部分的に重複する。特定の実施形態によれば、第１及び第２の抗体は、一緒にビンに入れられない。更なる実施形態によれば、基準値は、健康なボランティアの血漿、体液若しくは組織ライセートから確立される、かつ／又は適切な基準群及び試料源について当業者によって決定されるとおりである。更なる実施形態では、疼痛障害は、変形性関節症疼痛又は糖尿病性末梢神経障害疼痛又は慢性腰痛症のうちの１つである。
【0044】
一実施形態では、本開示は、体液試料中のヒトエピレギュリンレベルを決定する方法であって、（ａ）体液試料を、配列番号２１にあるようなアミノ酸配列を含むヒトエピレギュリンに特異的に結合する、抗ヒトエピレギュリン診断用モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントと接触させることであって、抗体又はその抗原結合フラグメントが、アミノ酸配列、配列番号８、配列番号９及び配列番号１０をそれぞれ含む軽鎖相補性決定領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３、並びにアミノ酸配列、配列番号５、配列番号６及び配列番号７をそれぞれ含む重鎖相補性決定領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含む、接触させることと、（ｂ）任意選択で、非特異的に結合したあらゆるモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントを除去することと、（ｃ）ヒトエピレギュリンに特異的に結合するモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントの量を検出及び／又は定量化することとを含む方法を提供する。好ましくは、当該体液試料は、血液、血清若しくは血漿試料、又は脳脊髄液試料であり、当該の接触させることは、エクスビボで生じる。
【0045】
本開示の実施形態では、患者は、本明細書に記載の抗体による治療を必要とする、本明細書に記載の疾患又は障害のうちの１つなどの医学的リスク、状態又は障害を有することが診断されたヒトである。本発明の方法によって治療され得る障害が、変形性関節症疼痛又は糖尿病性末梢神経障害疼痛又は慢性腰痛症などの、確立され、受け入れられた分類によって既知である場合、それらの分類は、様々な周知の医学書に見出され得る。例えば、Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ａｎｄ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｍｅｎｔａｌ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓの第５版（ＤＳＭ－５）又は類似の書物は、本明細書に記載の特定の障害を同定するための診断用ツールを提供する（例えば、Ｓｃｈｏｌｚ，ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ ＩＡＳＰ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｈｒｏｎｉｃ ｐａｉｎ ｆｏｒ ＩＣＤ－１１：ｃｈｒｏｎｉｃ ｎｅｕｒｏｐａｔｈｉｃ ｐａｉｎ．Ｐａｉｎ．２０１９ Ｊａｎｕａｒｙ；１６０（１）：５３－５９、及びＴｒｅｅｄｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｒｏｎｉｃ ｐａｉｎ ａｓ ａ ｓｙｍｐｔｏｍ ｏｒ ａ ｄｉｓｅａｓｅ：ｔｈｅ ＩＡＳＰ Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｈｒｏｎｉｃ Ｐａｉｎ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｄｉｓｅａｓｅｓ（ＩＣＤ－１１），ＰＡＩＮ：２０１９ Ｊａｎｕａｒｙ １６０：１９－２７）もまた参照されたい）。また、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｄｉｓｅａｓｅｓ第１０版（ＩＣＤ－１０）は、本明細書に記載の特定の障害についての分類を提供する。当業者は、ＤＳＭ－５、及びＩＣＤ－１０又はＩＣＤ－１１に記載のものを含む、本明細書に記載の疾患及び障害についての代替の命名法、疾病分類学及び分類システムがあり、用語及び分類システムが医科学の進歩とともに進化することを認識するであろう。
【0046】
したがって、「治療すること」（又は「治療する」又は「治療」）という用語は、本明細書に記載の既存の症状、障害、状態又は疾患の進行又は重症度が遅延、中断、抑止、制御、軽減、停止、低減又は逆転し得る、全てのプロセスを指すことが意図されるが、必ずしも全ての障害又は疾患症状の完全な除去を示すとは限らないことを意図している。治療は、患者、特にヒトにおける疾患、障害又は状態の治療のためのタンパク質又は核酸又はベクター又は組成物の投与を含む。治療は、エピレギュリン活性の低減から利益を得るヒトにおける疾患又は障害の治療のための本開示の抗体の投与を含み、当該治療は、（ａ）疾患の更なる進行を阻害すること、すなわち、その発症を抑止すること、（ｂ）疾患を緩和すること、すなわち、疾患若しくは障害の退行を引き起こすこと、又はその症状若しくは合併症を軽減すること、及び／あるいは（ｃ）症状の疾患の発症を予防することを提供することを含む。本明細書で定義され使用される治療は、疼痛の発生率の低減、疼痛又は疼痛の１つ以上の症状の寛解、疼痛又は疼痛の１つ以上の症状の緩和、疼痛の発症の遅延を明確に含む。いくつかの状況では、治療にはまた、疼痛の治療も含まれるが、必ずしも疼痛を引き起こす基礎疾患又は状態を改変しない。本明細書で使用される場合、「療法抵抗性疼痛」は、２つ以上の従来の単剤療法及び／又は二重療法治療レジメンに不応性である疼痛として定義される。
【0047】
本明細書で使用される疼痛の「発生率を低減すること」は、疼痛の持続時間及び／又は頻度を低減することのいずれかを意味する（例えば、個体における疼痛症状までの時間を遅延させるか、又は増加させることを含む）。当業者によって理解されるように、個体は、治療に対するそれらの応答に関して変動し得る。疼痛の治療にはまた、疼痛の重症度を低減すること、並びにこの状態に一般的に使用される他の薬物及び／又は療法（例えば、アヘン剤を含む）の必要性及び／又は量（例えば、それへの曝露）を低減することも含まれる。（変形性関節症疼痛などの）疼痛又は疼痛の１つ以上の症状を「寛解させること」とは、本開示の抗体又は組成物を投与しない場合と比較した場合の、疼痛の１つ以上の症状の減少又は改善を意味する。「寛解させること」には、症状の持続時間の短縮又は低減も含まれる。（変形性関節症疼痛などの）疼痛又は疼痛の１つ以上の症状を「緩和すること」とは、本開示による抗体又は組成物で治療された個体又は個体の集団における疼痛の１つ以上の望ましくない臨床徴候の程度を減少させることを意味する。本明細書で使用される場合、疼痛の発症を「遅延させること」とは、変形性関節症疼痛などの疼痛の進行を先送り、妨害、遅延、減速、安定化及び／又は延期することを意味する。この遅延は、病歴及び／又は治療される個体に応じて、様々な長さの時間であり得る。当業者に明らかであるように、十分又は有意な遅延は、個体が疼痛を発症しないという点で、事実上、予防を包含し得る。症状の発症を「遅延させる」方法は、方法を使用しない場合と比較して、所与の時間枠において症状が発症する可能性を低減し、かつ／又は所与の時間枠において症状の程度を低減する方法であり得る。そのような比較は、典型的には、統計的に有意な数の対象を使用した臨床研究に基づく。
【0048】
「有効量」とは、治療する医療関係者によって求められている、組織、系又はヒトの生物学的若しくは医学的応答、又はそれに対する所望の治療効果を誘発するであろう本開示の抗ヒトエピレギュリン抗体、又はそのような抗体を含む医薬組成物の量を意味する。本明細書で使用される場合、患者の「有効応答」、又は治療に対する患者の応答性という用語は、本開示の抗体投与時に患者に付与される臨床上又は治療上の利益を指す。抗体の有効量は、個体の病状、年齢、性別及び体重、並びに個体において所望の応答を誘発する抗体の能力などの因子に応じて変動し得る。そのような所望の応答には、慢性疼痛のレベルの低下又は疼痛障害の徴候若しくは症状の改善のうちのいずれか１つ以上が含まれる。有効量は、既知技術の使用によって、及び同様の状況下で得られた結果を観察することによって、当業者により容易に決定されることができる。本開示の抗ヒトエピレギュリン抗体の有効量は、単回用量又は複数回用量で投与され得る。更に、本発明の抗体の有効量は、一度だけ投与される場合、有効量未満である量の複数回用量で投与され得る。患者に対する有効量を決定する際に、患者の大きさ（例えば、体重又は質量）、体表面積、年齢及び一般的な健康状態、関与する特定の疾患又は障害、疾患又は障害の程度又は関与又は重症度、個々の患者の応答、投与される特定の化合物、投与様式、投与される製剤のバイオアベイラビリティ特徴、選択される投与レジメン、併用薬の使用、並びに担当医師に既知である他の関連する状況を含むがこれらに限定されない、いくつかの因子が、担当医師によって考慮される。（皮下、筋肉内及び／又は静脈内を含むがこれらに限定されない）用量は、約０．５ｍｇ／ｋｇ～約５０ｍｇ／ｋｇであり得る。しかしながら、特に当業者に既知である、かつ／又は本明細書に記載される投薬量の考慮事項を考慮して、本明細書に言及されている用量よりも少ない又は多い用量もまた想定される。治療中の患者の進行は定期的な評価によって監視され得、必要に応じて用量がそれに応じて調整される。
【0049】
本明細書に開示される方法の可能性のある利点は、慢性疼痛障害に罹患している患者において、又は耐容性、毒性、及び／若しくは抗薬物抗体応答を含む有害事象を含む許容される安全性プロファイルで、著しい及び／又は長期の緩和をもたらし、したがって患者が全体的な治療方法から利益を得る可能性である。より具体的には、本開示の抗体は、皮膚発疹（Ｌｉ Ｔ，Ｐｅｒｅｚ－Ｓｏｌｅｒ Ｒ．Ｓｋｉｎ ｔｏｘｉｃｉｔｉｅｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ．Ｔａｒｇｅｔ Ｏｎｃｏｌ．２００９ Ａｐｒ；４（２）：１０７－１９）、及び／又は抗薬物抗体応答などの臨床的に望ましくない有害事象を回避しながら有効な治療を提供する。本開示の治療の有効性は、様々な疼痛障害の治療を評価する際に一般的に使用される様々なエンドポイントによって測定することができる。例えば、当業者に既知の評価を含む、本開示の任意の特定の療法の有効性を決定するための他のアプローチを任意選択で採用してもよい。
【図面の簡単な説明】
【0050】
【図1】抗体１（パネルＡ）及びＬＹ３０１６８５９（パネルＢ）のリガンド選択性ＥＬＩＳＡ結果を示し、実施例２に記載のリガンド特異性ＥＬＩＳＡにおいて決定されるように、ヒトエピレギュリンに対する抗体１の選択性を示すが、他のＥＧＦファミリーリガンド（エピゲン、アンフィレグリン、ベータセルリン、ＥＧＦ、ＨＢ－ＥＧＦ及びＴＧＦα（ＴＧＦＡ））に対しては明らかな結合がないことを実証する。比較すると、ＬＹ３０１６８５９は、エピレギュリン及びＴＧＦαの両方に結合する。
【図2】対照ｈＩｇＧ抗体（黒四角）と比較した場合の、抗体１（黒丸）の投与の３日後のインビボでの膜エピレギュリンの結合。
【図3】対照ｈＩｇＧ抗体（白四角）と比較した場合の、抗体１（黒四角）の１０ｍｇ／ｋｇの皮下用量後のインビボでの膜エピレギュリンの前処理時間に依存した結合。
【図4】エピレギュリン結合の効力が５０分の１未満である比較抗体（白丸）と比較した場合の、抗体１（黒四角）の投与の３日後のインビボでの膜エピレギュリンの結合。
【図5】エピレギュリンの示される変異に対する抗体１のＦａｂ結合のＥＬＩＳＡ評価。
【図6】抗体１についてのヒトＥＧＦＲリガンドエピトープ（ＥＧＦ様ドメイン）のアラインメント。リガンド配列は、アミノ酸及びヌクレオチド配列の配列表に提供される。
【実施例】
【0051】
以下の実施例は、特許請求された本発明を説明するために提供され、これを限定するものではない。以下のアッセイの結果は、本開示の例示されるモノクローナル抗体及び／又はそれらの抗原結合フラグメントが、ヒトエピレギュリンに結合する、かつ／又はそれを中和し、したがって、本明細書に記載のエピレギュリン介在性障害の治療に使用され得ることを実証する。
【0052】
実施例１：抗体の生成、発現及び精製
ヒト抗エピレギュリン抗体のパネルを、組換えＥＲＥＧ（ヒト及びカニクイザル）でヒト化マウスを免疫化して、エピレギュリンシグナリングの中和に有効であり得る抗体を同定することによって得る。変異を各抗体の個々の相補性決定領域（ＣＤＲ）に体系的に導入し、抗原濃度を低下させ、抗原会合までの時間を低下させ、かつ／又は解離期間を増加させながら、得られたライブラリーを複数ラウンドの選択に供して、親和性が改善されたクローンを単離する。個々のバリアントの配列を決定し、使用して、コンビナトリアルライブラリーを構築し、それを、ストリンジェンシーを高めながら追加ラウンドの選択に供して、個々のＣＤＲ領域間の相加的又は相乗的な変異のペアリングを特定する。個々のコンビナトリアルクローンを、配列決定し、結合特徴を決定する。このスクリーニングを、ヒト又はマウスエピレギュリンに対して行って、１つ以上の選択された種に対する親和性を増加させることができる（例えば、ヒトエピレギュリンに対する抗体１）。操作後の選択性を維持するために、他のＥＧＦＲリガンドに対してカウンタースクリーニングを行ってもよい。選択した抗体を変異誘発して、エピレギュリンに対する結合親和性を維持しながら、メチオニン酸化などの翻訳後改変を修復することもできる。追加的に、免疫原性リスクの可能性を低減するために、フレームワーク（framework、ＦＷ）及びＣＤＲ置換を抗体に対して行って、これらの配列をそれらの生殖系列状態に戻すことができる。
ヒト抗エピレギュリン抗体のパネルを、組換えＥＲＥＧ（ヒト及びカニクイザル）でヒト化マウスを免疫化して、エピレギュリンシグナリングの中和に有効であり得る抗体を同定することによって得る。変異を各抗体の個々の相補性決定領域（ＣＤＲ）に体系的に導入し、抗原濃度を低下させ、抗原会合までの時間を低下させ、かつ／又は解離期間を増加させながら、得られたライブラリーを複数ラウンドの選択に供して、親和性が改善されたクローンを単離する。個々のバリアントの配列を決定し、使用して、コンビナトリアルライブラリーを構築し、それを、ストリンジェンシーを高めながら追加ラウンドの選択に供して、個々のＣＤＲ領域間の相加的又は相乗的な変異のペアリングを特定する。個々のコンビナトリアルクローンを、配列決定し、結合特徴を決定する。このスクリーニングを、ヒト又はマウスエピレギュリンに対して行って、１つ以上の選択された種に対する親和性を増加させることができる（例えば、ヒトエピレギュリンに対する抗体１）。操作後の選択性を維持するために、他のＥＧＦＲリガンドに対してカウンタースクリーニングを行ってもよい。選択した抗体を変異誘発して、エピレギュリンに対する結合親和性を維持しながら、メチオニン酸化などの翻訳後改変を修復することもできる。追加的に、免疫原性リスクの可能性を低減するために、フレームワーク（framework、ＦＷ）及びＣＤＲ置換を抗体に対して行って、これらの配列をそれらの生殖系列状態に戻すことができる。
【0053】
本明細書で抗体１と称される、操作及び／又は最適化された抗エピレギュリン抗体が得られ、これは、重鎖及び軽鎖の可変領域のアミノ酸配列、完全な重鎖及び軽鎖アミノ酸配列、並びに以下の「アミノ酸及びヌクレオチド配列の配列表」と題するセクションに列挙されているものと同じものをコードするヌクレオチド配列を有する。これらの配列に対応する配列番号、並びに軽鎖及び重鎖のＣＤＲアミノ酸配列を表１に示す。
【0054】
発現及び精製：
本開示の例示される抗エピレギュリン抗体は、本質的に以下のとおりに発現及び精製することができる。抗体１を、ＨＥＫ２９３又はＣＨＯなどの適切な宿主細胞において発現させ、当該細胞は、最適な所定のＨＣ：ＬＣベクター比を使用して抗体１を分泌するための発現系、又はＨＣ及びＬＣの両方をコードする単一のベクター系で、一過性に又は安定的にのいずれかでトランスフェクトする。発現プラスミドは、抗体１のＬＣ及びＨＣ遺伝子のｃＤＮＡバージョン（例えば、表１に提示される例示される抗体１のＨＣをコードする配列番号１１のＤＮＡ配列、及び表１によるＬＣアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列、例えば、表１に提示される例示される抗体１のＬＣをコードする配列番号１２のＤＮＡ配列）を含有し、ヒトサイトメガロウイルスの主な前初期プロモータに基づくものなどの一般的に使用され、かつこの目的に好適な構築物から発現される。
本開示の例示される抗エピレギュリン抗体は、本質的に以下のとおりに発現及び精製することができる。抗体１を、ＨＥＫ２９３又はＣＨＯなどの適切な宿主細胞において発現させ、当該細胞は、最適な所定のＨＣ：ＬＣベクター比を使用して抗体１を分泌するための発現系、又はＨＣ及びＬＣの両方をコードする単一のベクター系で、一過性に又は安定的にのいずれかでトランスフェクトする。発現プラスミドは、抗体１のＬＣ及びＨＣ遺伝子のｃＤＮＡバージョン（例えば、表１に提示される例示される抗体１のＨＣをコードする配列番号１１のＤＮＡ配列、及び表１によるＬＣアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列、例えば、表１に提示される例示される抗体１のＬＣをコードする配列番号１２のＤＮＡ配列）を含有し、ヒトサイトメガロウイルスの主な前初期プロモータに基づくものなどの一般的に使用され、かつこの目的に好適な構築物から発現される。
【0055】
本発明の抗体が分泌された培地は、イオン交換及び疎水性相互作用クロマトグラフィーの混合様式方法などの従来の技術によって精製することができる。例えば、培地は、従来の方法を使用して、プロテインＡ又はプロテインＧカラムに適用され、そこから溶離することができ、イオン交換及び疎水性相互作用クロマトグラフィーの混合様式方法もまた、使用することができる。可溶性凝集体及び多量体を、サイズ排除、疎水性相互作用、イオン交換、又はヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを含む一般的な技術によって効果的に除去し得る。生成物は、例えば、－７０℃で直ちに凍結させても、冷蔵しても、又は凍結乾燥させてもよい。タンパク質精製の様々な方法が採用され得、そのような方法は、当該技術分野において既知であり、例えば、Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８２：８３－８９（１９９０）、及びＳｃｏｐｅｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，ＮＹ（１９９４）に記載される。抗体１は、－７０℃で直ちに凍結させても、又は２～８℃で数か月間貯蔵しても、又は凍結乾燥させても、又は直ちに使用するために４℃で保存してもよい。本発明の例示されるヒト抗体のアミノ酸配列番号を、表１に示す。
【0056】
実施例２：抗エピレギュリン抗体の特徴付け
エピレギュリン試薬を、融合タンパク質として作製し、切断及び精製する。切断されたエピレギュリンは、天然型と比較して余分なアミノ酸を含む成熟可溶型であり、これをインビトロ結合及び中和アッセイに使用する（配列番号２２～２５）。ヒトエピレギュリン（ＥＲＥＧ）融合物（配列番号２７）もまた、結合アッセイ（捕捉試薬）に使用し、脱落を減少させる単一の変異を有する完全長エピレギュリン配列（配列番号２６）を細胞ベースの結合及びエフェクター機能アッセイに使用する。
エピレギュリン試薬を、融合タンパク質として作製し、切断及び精製する。切断されたエピレギュリンは、天然型と比較して余分なアミノ酸を含む成熟可溶型であり、これをインビトロ結合及び中和アッセイに使用する（配列番号２２～２５）。ヒトエピレギュリン（ＥＲＥＧ）融合物（配列番号２７）もまた、結合アッセイ（捕捉試薬）に使用し、脱落を減少させる単一の変異を有する完全長エピレギュリン配列（配列番号２６）を細胞ベースの結合及びエフェクター機能アッセイに使用する。
【0057】
成熟可溶性エピレギュリンを、一過性にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞培養において、単量体ヒトＩｇＧ４ Ｆｃ（Ｆ４０５Ｑ／Ｙ４０７Ｅ）（配列番号２７）上のＨＲＶ３Ｃプロテアーゼ切断可能Ｃ末端融合物として発現させる。融合タンパク質をプロテインＡ親和性カラムで捕捉し、サイズ排除クロマトグラフィーによって更に精製する。融合物をＨＲＶ３Ｃプロテアーゼで切断し、プロテインＡ親和性カラムに流して、単量体Ｆｃを除去し、サイズ排除クロマトグラフィーによって更に精製して、成熟可溶性エピレギュリンを得る。
【0058】
抗原の配列：
切断されたヒトエピレギュリン（配列番号２２）
ＧＰＧＶＳＩＴＫＣＳＳＤＭＮＧＹＣＬＨＧＱＣＩＹＬＶＤＭＳＱＮＹＣＲＣＥＶＧＹＴＧＶＲＣＥＨＦＦＬＧ
切断されたヒトエピレギュリン（配列番号２２）
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【0059】
切断されたカニクイザルエピレギュリン（配列番号２３）
ＧＰＧＶＳＩＴＫＣＮＳＤＭＮＧＹＣＬＨＧＱＣＩＹＬＶＤＭＳＱＮＹＣＲＣＥＶＧＹＴＧＶＲＣＥＨＦＹＬＧ
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【0060】
切断されたラットエピレギュリン（配列番号２４）
ＧＰＧＶＬＩＴＫＣＳＳＤＭＤＧＹＣＬＨＧＨＣＩＹＬＶＤＭＳＥＫＹＣＲＣＥＶＧＹＴＧＬＲＣＥＨＦＦＬＧ
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【0061】
切断されたウサギエピレギュリン（配列番号２５）
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【0062】
完全長ヒトエピレギュリン（Ｔ１１１Ｐ変異と結合した膜）（配列番号２６）
ＭＴＡＧＲＲＭＥＭＬＣＡＧＲＶＰＡＬＬＬＣＬＧＦＨＬＬＱＡＶＬＳＴＴＶＩＰＳＣＩＰＧＥＳＳＤＮＣＴＡＬＶＱＴＥＤＮＰＲＶＡＱＶＳＩＴＫＣＳＳＤＭＮＧＹＣＬＨＧＱＣＩＹＬＶＤＭＳＱＮＹＣＲＣＥＶＧＹＴＧＶＲＣＥＨＦＦＬＴＶＰＱＰＬＳＫＥＹＶＡＬＴＶＩＬＩＩＬＦＬＩＴＶＶＧＳＴＹＹＦＣＲＷＹＲＮＲＫＳＫＥＰＫＫＥＹＥＲＶＴＳＧＤＰＥＬＰＱＶ
ＭＴＡＧＲＲＭＥＭＬＣＡＧＲＶＰＡＬＬＬＣＬＧＦＨＬＬＱＡＶＬＳＴＴＶＩＰＳＣＩＰＧＥＳＳＤＮＣＴＡＬＶＱＴＥＤＮＰＲＶＡＱＶＳＩＴＫＣＳＳＤＭＮＧＹＣＬＨＧＱＣＩＹＬＶＤＭＳＱＮＹＣＲＣＥＶＧＹＴＧＶＲＣＥＨＦＦＬＴＶＰＱＰＬＳＫＥＹＶＡＬＴＶＩＬＩＩＬＦＬＩＴＶＶＧＳＴＹＹＦＣＲＷＹＲＮＲＫＳＫＥＰＫＫＥＹＥＲＶＴＳＧＤＰＥＬＰＱＶ
【0063】
単量体Ｆｃヒトエピレギュリン（配列番号２７）
ＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＱＬＥＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＬＥＶＬＦＱＧＰＧＶＳＩＴＫＣＳＳＤＭＮＧＹＣＬＨＧＱＣＩＹＬＶＤＭＳＱＮＹＣＲＣＥＶＧＹＴＧＶＲＣＥＨＦＦＬＧ
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【0064】
様々な種からの成熟エピレギュリンの配列は、当該技術分野において一般的に既知であり、参照配列は、例えば以下のとおりである：成熟可溶性ヒトエピレギュリン参照配列（ＮＰ＿００１４２３．１ ６３－１０８）、成熟可溶性カニクイザル（本明細書においてｃｙｎｏとも称される）エピレギュリン参照配列（ＸＰ＿００５５５５１２０．１ ６３－１０８）、成熟可溶性ラットエピレギュリン参照配列（ＮＰ＿０６７７２１．１ ５６－１０１）及び成熟可溶性ウサギエピレギュリン参照配列（ＸＰ＿００８２６５９６８．１ ５７－１０２）。他のヒトＥＧＦＲリガンド参照配列番号は、以下のとおりである：ヒトＴＧＦα（ＮＰ＿００３２２７．１）、ＥＲＥＧ（ＮＰ＿００１４２３．１）、ＥＰＧＮ（ＮＰ＿００１２５７９１８．１）、ＡＲＥＧ（ＮＰ＿００１６４８．１）、ＢＴＣ（ＮＰ＿００１７２０．１）、ＥＧＦ（ＮＰ＿００１９５４．２）、ＨＢ－ＥＧＦ（ＮＰ＿００１９３６．１）。
【0065】
ヒトエピレギュリンに対する結合親和性
ヒト（配列番号２２）、カニクイザル（配列番号２３）、ラット（配列番号２４）及びウサギ（配列番号２５）エピレギュリンに対する抗体１の溶液相平衡結合親和性を、ＭＳＤ溶液平衡滴定（MSD solution equilibrium titration、ＭＳＤ－ＳＥＴ）アッセイによって３７℃で測定する。（例えば、Ｄａｒｌｉｎｇ ＲＪ，Ｂｒａｕｌｔ Ｐ－Ａ（２００５）Ｋｉｎｅｔｉｃ Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ Ａｓｓａｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ．Ａｓｓａｙ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ２：６４７－６５７を参照されたい。）
ヒト（配列番号２２）、カニクイザル（配列番号２３）、ラット（配列番号２４）及びウサギ（配列番号２５）エピレギュリンに対する抗体１の溶液相平衡結合親和性を、ＭＳＤ溶液平衡滴定（MSD solution equilibrium titration、ＭＳＤ－ＳＥＴ）アッセイによって３７℃で測定する。（例えば、Ｄａｒｌｉｎｇ ＲＪ，Ｂｒａｕｌｔ Ｐ－Ａ（２００５）Ｋｉｎｅｔｉｃ Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ Ａｓｓａｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ．Ａｓｓａｙ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ２：６４７－６５７を参照されたい。）
【0066】
ＭＳＤ ＳＩ６０００機器（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を使用してＭＳＤプレートを読み取る。ＭＳＤアッセイプレートを、以下のように調製する。マルチアレイ９６ウェルプレート（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、Ｐ／Ｎ Ｌ１５ＸＡ－３）を、ＰＢＳ中の単量体Ｆｃ－ヒトエピレギュリン融合物の１μｇ／ｍｌ溶液３０μｌで、２～８℃で一晩コーティングする。コーティング後、プレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、次いで３％ブロッカーＡ（５％ブロッカーＡ（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、Ｐ／Ｎ Ｒ９３ＡＡ－１）からＰＢＳ中で希釈）中で振盪しながら室温で１時間ブロッキングする。
【0067】
ＳＥＴ試料を、ｐＨ６．０及びｐＨ７．４の１％ブロッカーＡ中で調製する。抗体を、２０及び２００ｐＭ（ｐＨ７．４）又は２００ｐＭ及び２ｎＭ（ｐＨ６．０）のいずれかに希釈する。エピレギュリンを、抗体濃度の２倍付近を中心とした合計１２回の希釈で連続希釈する。これは、１０及び１００ｎＭ（ｐＨ７．４）又は１００ｎＭ及び１０００ｎＭ（ｐＨ６．０）の開始濃度を使用することによって達成し、次いでこれを、１回１０倍希釈し、９回２倍連続希釈し、次いで最終希釈のために１０倍希釈する。エピレギュリン滴定及び固定濃度抗体溶液を、１：１で合わせて、ＳＥＴ溶液を調製する。ＳＥＴ溶液を、３７℃で約９６時間インキュベートして、結合を平衡に到達させる。
【0068】
１００μｌのＳＥＴ溶液を、調製したＭＳＤプレートの二連の列に移し、室温で１０分間インキュベートして、遊離抗体を捕捉する。インキュベーション後、プレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、次いで１００μｌの１％ブロッカーＡ中の１μｇ／ｍｌビオチン化ヤギ抗ヒトカッパ一次抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ、カタログ２０６０－０８）を全てのウェルに添加する。これを室温で６０分間、プレートシェーカー上でインキュベートする。次いで、プレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、次いで１％ブロッカーＡ中の１μｇ／ｍｌ ＳＵＬＦＯストレプトアビジン（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、Ｐ／Ｎ Ｒ３２ＡＤ－１）１００μｌを全てのウェルに添加する。これを室温で３０分間、プレートシェーカー上でインキュベートする。次いで、プレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、次いで１００μｌの１Ｘ Ｒｅａｄ Ｂｕｆｆｅｒ Ｔ（４Ｘ Ｒｅａｄ Ｂｕｆｆｅｒ Ｔ（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、Ｐ／Ｎ Ｒ９３ＡＡ－１）から水に希釈）を添加した後、プレートを読み取る。未知の活性抗原画分を説明するための解離定数（ＫＤ）及び最小公倍数（least common multiplier、ＬＣＭ）リガンド補正係数を、非線形回帰を使用して、ＭＳＤ－ＳＥＴデータから平衡結合方程式に全体的に当てはめる。これを、所与のｐＨで固定抗体濃度の各ペアについて行う。
【0069】
ｐＨ７．４で、抗体１は、ヒトエピレギュリンに１４．９ｐＭの親和性（ＫＤ）で結合し、カニクイザルエピレギュリンに２６．８ｐＭのＫＤで結合し、ラットエピレギュリンに３０．２ｐＭのＫＤで結合し、ウサギエピレギュリンに２４．０ｐＭのＫＤで結合する。ｐＨ６．０で、抗体１は、ヒトエピレギュリンに１９５ｐＭのＫＤで結合し、カニクイザルエピレギュリンに３２８ｐＭのＫＤで結合し、ラットエピレギュリンに２８６ｐＭのＫＤで結合し、ウサギエピレギュリンに３３０ｐＭのＫＤで結合する。抗体１のｐＨ選択性（ｐＨ６．０のＫＤ／ｐＨ７．４のＫＤ）は、ヒトエピレギュリンが１３．０、カニクイザルエピレギュリンが１２．２、ラットエピレギュリンが９．５、ウサギエピレギュリンが１３．７である。ｐＨ依存性抗原結合は、薬物動態及び標的中和の持続時間の両方の改善を提供することができ（Ｖｉｎｃｅｎｔ，Ｋ．Ｊ．ａｎｄ Ｍ．Ｚｕｒｉｎｉ（２０１２）．「Ｃｕｒｒｅｎｔ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｆｃ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎｄ ｐＨ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｎｔｉｇｅｎ ｂｉｎｄｉｎｇ，ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ．」Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｊ ７（１２）：１４４４－１４５０を参照されたい）、抗体１及び／又は本開示の抗体は、有用な薬物動態及びエピレギュリン中和特性を提供すると考えられる、エピレギュリン結合に対する有利なｐＨ選択性を示す。
【0070】
【表3】
【0071】
結果を、３つの独立した複製からのＫＤの平均として報告する。誤差推定値は、独立した複製の標準偏差として計算する。ｐＨ７．４でのヒトＥＲＥＧに対する抗体１の親和性は、ＬＹ３０１６８５９と比較して、親和性において約７０倍の改善となっており、これは、インビボで同等のＥＲＥＧ中和の達成に必要とされる抗体１の有意により低い用量をもたらし得る。より低い用量の抗体１を使用する能力は、必要な阻害がより少ない抗体で達成され得ることを意味し、結果として、この薬物製品は、静脈内投薬を必要とする抗体と比較して、到達性、耐容性、コンプライアンスのために臨床的に重要である皮下投与に受け入れられ得る。これは、本明細書に記載の慢性疼痛適応症に必要とされるような慢性投薬の文脈において特に有利である。
【0072】
抗体１のリガンド特異性：
ＥＧＦファミリーリガンドへの抗体結合の特異性は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）及び／又は当業者に周知の他の一般的な方法によって試験することができる。
ＥＧＦファミリーリガンドへの抗体結合の特異性は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）及び／又は当業者に周知の他の一般的な方法によって試験することができる。
【0073】
ＥＬＩＳＡ試薬の調製は、以下のように行うことができる。試験したリガンドは、ヒトエピゲン（Ｒ＆Ｄ ６６２９－ＥＰ－０２５／ＣＦ）、エピレギュリン（本明細書の実施例２に記載のように、及び／又は当技術分野で既知の方法によって調製及び精製（配列番号２２））、アンフィレグリン（Ｒ＆Ｄ ２６２－ＡＲ－１００／ＣＦ）、ベータセルリン（Ｒ＆Ｄ ２６１－ＣＥ－０１０／ＣＦ）、ＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ ２３６－ＥＧ－２００）、ＨＢ－ＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ ２５９－ＨＥ－０５０／ＣＦ）並びにＴＧＦα（Ｒ＆Ｄ ２３９－Ａ－１００）である。リガンドを、Ｔｈｅｒｍｏ Ｐｉｅｒｃｅ Ｓｕｌｆｏ－ＮＨＳ－ＬＣ－ビオチン（Ａ３９２５７）を使用して、１０倍過剰のビオチンで氷上で２時間ビオチン化し、次いで個別使用のための少量のアリコートで－８０℃で凍結させる。
【0074】
ＥＬＩＳＡアッセイは、以下のように実行することができる。Ｇｒｅｉｎｅｒ９６ウェル高結合プレート（６５００６１）を、ＰＢＳ中１μｇ／ｍｌの５０μｌ／ウェルのニュートラアビジン（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｐｉｅｒｃｅ ３１０００）で、４℃で一晩コーティングする。コーティング溶液を翌日除去し、１００μｌ／ウェルのＰｉｅｒｃｅ Ｂｌｏｃｋｅｒ Ｃａｓｅｉｎ（３７５２８）を添加し、室温で３０分間以上インキュベートして、プレートをブロッキングする。ブロッキング後、プレートをＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄して、残留ブロッキング緩衝液を除去する。ビオチン化リガンドを、リガンド当たり１２ウェルにわたって２０ｎＭの一定濃度のＰｉｅｒｃｅ Ｃａｓｅｉｎ Ｂｌｏｃｋｅｒ中、別個のＰＣＲプレート（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ９５１０２０４４３）において希釈し、最後の列には抗原対照は入れない。リガンドを、ブロッキングしたアッセイプレートに移し、室温で１時間インキュベートする。アッセイプレートを、ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄する。試験される抗体を、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃａｓｅｉｎ Ｂｌｏｃｋｅｒ中、５μｇ／ｍＬ（ＬＹ３０１６８５９）又は１０μｇ／ｍｌ（抗体１）で開始して、プレート（１２ウェル）にわたって１：３希釈で連続希釈し、最終体積は５０μｌ／ウェルとし、室温で１時間インキュベートする。アッセイプレートを、ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄する。抗ヒトカッパ－ＡＰ二次抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ ２０６０－０４）を、ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０中、１：２０００希釈で５０μｌ／ウェルで添加し、室温で１時間インキュベートする。アッセイプレートを、ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄する。最後に、５０μｌのｐＮＰＰ基質（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｎ２７６５）を添加し、十分な色が存在するまで発色させ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＤｅｖｉｃｅｓによるＳｐｅｃｔｒａｍａｘ Ｐｌｕｓ ３８４プレートリーダーで４０５ｎｍで読み取る。
【0075】
図１は、抗体１のリガンド選択性のＥＬＩＳＡ結果を示す。抗体１は、上記のリガンド特異性ＥＬＩＳＡにおいて決定されるように、ヒトエピレギュリンへの結合に対する選択性を実証するが、他のＥＧＦファミリーリガンドエピゲン、アンフィレグリン、ベータセルリン、ＥＧＦ、ＨＢ－ＥＧＦ及びＴＧＦαへの明らかな結合は実証しない。他のＥＧＦファミリーリガンドではなく、エピレギュリンへの選択的かつ特異的な結合は、抗体１が、ＴＧＦα又は他のものなどの他のＥＧＦファミリーリガンドに結合することの臨床的に望ましくない効果を回避しながら、エピレギュリンシグナリングを遮断する所望の効果を達成し得ることを示す。ＴＧＦαへの結合の欠如は、エピレギュリンを効果的に阻害するために必要とされる用量を低減し得る。この選択性は、汎ＥＧＦＲ阻害剤について観察されてきた皮膚発疹などの望ましくない臨床的有害事象を回避し得る。
【0076】
物理化学的属性：
化学的安定性、溶解性及び粘度を含む、治療用抗体製品属性に関して、抗体１は、ヒト治療薬として使用するための物理化学的属性の望ましい組み合わせを示す。
化学的安定性、溶解性及び粘度を含む、治療用抗体製品属性に関して、抗体１は、ヒト治療薬として使用するための物理化学的属性の望ましい組み合わせを示す。
【0077】
安定性：
抗体１の安定性を、５ｍＭヒスチジン（ｐＨ６．０）＋２８０ｍＭマンニトール＋０．０５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート－８０中に製剤化した高濃度（約１００ｍｇ／ｍｌ）で評価する。濃縮試料を、５℃及び３５℃で４週間の期間にわたってインキュベートする。インキュベーション後、試料を、サイズ排除クロマトグラフィー（size exclusion chromatography、ＳＥＣ）により高分子量の割合（percent high molecular weight、ＨＭＷ％）について、キャピラリー電気泳動（ＣＥ－ＳＤＳ）によりフラグメンテーションについて、及びＬＣ－ＭＳペプチドマッピングにより化学修飾（例えば、脱アミド化、異性化又は酸化）について分析する。３５℃で４週間後、抗体１は、０．４％のΔＨＭＷ％（高分子量のパーセンテージにおける変化）、０．６％のΔフラグメント％（フラグメントのパーセンテージにおける変化）を示し、０．５％を超えるＣＤＲ化学修飾は示さなかった。
抗体１の安定性を、５ｍＭヒスチジン（ｐＨ６．０）＋２８０ｍＭマンニトール＋０．０５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート－８０中に製剤化した高濃度（約１００ｍｇ／ｍｌ）で評価する。濃縮試料を、５℃及び３５℃で４週間の期間にわたってインキュベートする。インキュベーション後、試料を、サイズ排除クロマトグラフィー（size exclusion chromatography、ＳＥＣ）により高分子量の割合（percent high molecular weight、ＨＭＷ％）について、キャピラリー電気泳動（ＣＥ－ＳＤＳ）によりフラグメンテーションについて、及びＬＣ－ＭＳペプチドマッピングにより化学修飾（例えば、脱アミド化、異性化又は酸化）について分析する。３５℃で４週間後、抗体１は、０．４％のΔＨＭＷ％（高分子量のパーセンテージにおける変化）、０．６％のΔフラグメント％（フラグメントのパーセンテージにおける変化）を示し、０．５％を超えるＣＤＲ化学修飾は示さなかった。
【0078】
同じ製剤化条件下での光安定性を、２５℃で４０ワット時／ｍ２ＵＶ光及び２４０ｋｌｕｘ時可視光の合わせた合計曝露によって評価する。インキュベーション後、試料を、ＳＥＣによってＨＭＷ％について、及びＬＣ－ＭＳペプチドマッピングによって化学修飾について分析する。抗体１は、曝露されていない対照と比較して、ＳＥＣによって測定される６．１％のΔＨＭＷ％を示し、０．７％を超えるＣＤＲ化学修飾は示さなかった。
【0079】
同じ製剤化条件下での凍結／解凍安定性を、－７０℃に置かれた大量のバルク原薬の凍結／解凍条件を模倣する、３回繰り返される、緩慢な制御された温度サイクルを使用して評価する。抗体１は、３回の凍結解凍サイクル後に１．０％のＳＥＣによって測定されるΔＨＭＷ％を示した。
【0080】
これらの結果は、抗体１が、溶液製剤の開発及び治療薬としての使用を容易にするのに十分な、有利な物理的及び化学的安定性を有することを示す。
【0081】
溶解性：
溶解性は、１００ｍｇの抗体１を３０ｋＤａの分子量カットオフ遠心フィルター（例えば、Ａｍｉｃｏｎ Ｕ．Ｃ．フィルター、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ番号ＵＦＣ９０３０２４）で約０．５ｍｌの体積に濃縮することによって評価する。Ｓｏｌｏ ＶＰＥ分光光度計（Ｃ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ）を使用して、２８０ｎｍでのＵＶ吸光度によって、試料の最終濃度を測定した。
溶解性は、１００ｍｇの抗体１を３０ｋＤａの分子量カットオフ遠心フィルター（例えば、Ａｍｉｃｏｎ Ｕ．Ｃ．フィルター、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ番号ＵＦＣ９０３０２４）で約０．５ｍｌの体積に濃縮することによって評価する。Ｓｏｌｏ ＶＰＥ分光光度計（Ｃ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ）を使用して、２８０ｎｍでのＵＶ吸光度によって、試料の最終濃度を測定した。
【0082】
抗体１は、５ｍＭヒスチジンｐＨ６緩衝液中で１７５ｍｇ／ｍｌ以上、ＰＢＳ ｐＨ７．４中で１６８ｍｇ／ｍｌ以上の溶解性を示す。５℃又は－５℃で１週間貯蔵した後も、相分離又は寒冷沈降は観察されない。これらの結果は、抗体１が、高濃度投薬を可能にするのに十分な溶解性を示すことを示す。
【0083】
粘度
抗体１及びＬＹ３０１６８５９の粘度を、ＶＲＯＣ Ｉｎｉｔｉｕｍ（ＲｈｅｏＳｅｎｓｅ）を使用して、約１２５ｍｇ／ｍｌの濃度で、１５℃で分析する。抗体１は、ｐＨ６の５ｍＭヒスチジン＋２８０ｍＭマンニトール中１３３ｍｇ／ｍｌで６．４ｃＰの粘度を示し、ＬＹ３０１６８５９は、ｐＨ６の５ｍＭヒスチジン＋２８０ｍＭマンニトール中１３２ｍｇ／ｍＬで１２．２ｃＰの粘度を示した。これらの結果は、抗体１が、ＬＹ３０１６８５９と比較して低減した粘度、及び高濃度投薬を可能にするのに十分に低い粘度を示すことを示す。より高い濃度の抗体１を使用する能力は、より低い用量の必要性と組み合わせて、必要な有効用量が送達のためのより小さい体積で達成され得ることを意味し、それは、薬物製品が、皮下投与に受け入れられ得ることを意味し、これは、静脈内投薬を必要とする抗体でなければならない薬剤と比較して、到達性、耐容性、コンプライアンスのために臨床的に重要である。
抗体１及びＬＹ３０１６８５９の粘度を、ＶＲＯＣ Ｉｎｉｔｉｕｍ（ＲｈｅｏＳｅｎｓｅ）を使用して、約１２５ｍｇ／ｍｌの濃度で、１５℃で分析する。抗体１は、ｐＨ６の５ｍＭヒスチジン＋２８０ｍＭマンニトール中１３３ｍｇ／ｍｌで６．４ｃＰの粘度を示し、ＬＹ３０１６８５９は、ｐＨ６の５ｍＭヒスチジン＋２８０ｍＭマンニトール中１３２ｍｇ／ｍＬで１２．２ｃＰの粘度を示した。これらの結果は、抗体１が、ＬＹ３０１６８５９と比較して低減した粘度、及び高濃度投薬を可能にするのに十分に低い粘度を示すことを示す。より高い濃度の抗体１を使用する能力は、より低い用量の必要性と組み合わせて、必要な有効用量が送達のためのより小さい体積で達成され得ることを意味し、それは、薬物製品が、皮下投与に受け入れられ得ることを意味し、これは、静脈内投薬を必要とする抗体でなければならない薬剤と比較して、到達性、耐容性、コンプライアンスのために臨床的に重要である。
【0084】
実施例３：抗エピレギュリン抗体のインビトロでの機能的特徴付け
インビトロでのエピレギュリンの中和：
抗体１などの本開示の抗体によるエピレギュリン活性の中和は、以下に記載されるようなエピレギュリン誘導性細胞ベースの応答アッセイのうちの１つ以上によって評価することができる。
インビトロでのエピレギュリンの中和：
抗体１などの本開示の抗体によるエピレギュリン活性の中和は、以下に記載されるようなエピレギュリン誘導性細胞ベースの応答アッセイのうちの１つ以上によって評価することができる。
【0085】
本開示の抗体を、２つの独立した機能アッセイにおいてエピレギュリン活性を中和する能力について試験する。本開示の抗体１によるエピレギュリン活性の中和は、以下に記載されるような受容体のＥＧＦＲファミリーの下流シグナリング経路を利用する１つ以上の細胞ベースの活性アッセイによって評価することができる。中和アッセイ（Ｃ１６６－ＡＰ１－Ｌｕｃ及びＴＧＷ－ｐＥＲＫ）の平均半最大阻害濃度（ＩＣ５０）の決定は、ＳｉｇｍａＰｌｏｔ又はＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍで計算する。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍにおいて、ＩＣ５０は、Ｌｏｇ１０形質転換抗体濃度の非線形回帰分析を実行することによって計算する。１つのプレートにわたって二連又は三連でのみ実行されるアッセイについて、ＩＣ５０及び標準偏差（standard deviation、ＳＤ）は、各複製のＩＣ５０及び複製の平均ＩＣ５０からのＳＤを計算することによって決定する。二連又は三連での様々なプレートにわたる化合物の分析のために、各プレートについてＩＣ５０を計算し、プレートにわたってＳＤを決定する。
【0086】
Ｃ１６６－ＡＰ１－ルシフェラーゼ機能アッセイにおけるエピレギュリン誘導性応答の阻害：
ヒトエピレギュリン誘導性ルシフェラーゼレポーター活性を中和する本開示の抗体の能力は、ＡＰ１活性化によって駆動されるルシフェラーゼレポーターを過剰発現するＣ１６６細胞（Ｃ１６６－ＡＰ１－Ｌｕｃ）において評価することができる。Ｃ１６６細胞は、最高レベルでＥＧＦＲ発現を有する受容体の４つのＥＧＦＲファミリー全てを発現する内皮由来細胞株である。抗体１活性を試験するために、Ｃ１６６－ＡＰ１－Ｌｕｃ細胞を成長培地［ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ １２４３０－０４７）、１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ １００８２１４７）、Ａｎｔｉ／Ａｎｔｉ（Ｇｉｂｃｏ １５２４００６２）及び２μｇ／ｍｌ Ｐｕｒｏ（１０００Ｘ ２ｍｇ／ｍｌピューロマイシン塩酸塩（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、カタログ番号５４０４１１）］中で成長させ、０．０５％トリプシン－ＰＢＳ中で解離させ、無血清培地（ＦＢＳを有しない成長培地）中、ウェル当たり５０μｌで組織培養処理９６ウェルプレートに１ｍｌ当たり５０，０００細胞で播種する。細胞を、５０μｌの１００ｎｇ／ｍｌ（１６～１８．５ｎＭ）最終濃度のエピレギュリン（本明細書に上記されるような、ヒト（配列番号２２）、カニクイザル（配列番号２３）、ラット（配列番号２４）及びウサギ（配列番号２５））並びに抗体１の濃度の連続希釈物で６時間処理する。インキュベーション後、細胞を、１００μｌ Ｐｒｏｍｅｇａ（商標）Ｏｎｅ－Ｇｌｏ（商標）Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ溶液（Ｐｒｏｍｅｇａ（商標）、カタログ番号Ｅ６１２０）で３分間溶解する。発光を、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｗａｌｌａｃｅ １４２０ Ｖｉｃｔｏｒ２（商標）マイクロプレートリーダーで読み取る。以下の表４に示す相対蛍光単位（relative fluorescence unit、ＲＦＵ）の低減は、ヒト（配列番号２２）、カニクイザル（配列番号２３）、ラット（配列番号２４）及びウサギ（配列番号２５）を含む、試験した様々な関連する種のエピレギュリン活性を中和する抗体１の能力を反映している。ヒトエピレギュリンの中和における抗体１のＩＣ５０値は、８．７ｎＭ、ＳＤ２．３、ｎ＝５プレート、２～３複製／プレートである（表４）。関連する種にわたる中和は、カニクイザル（ＩＣ５０ ２．１ｎＭ、ＳＤ０．０８、ｎ＝３複製）、ラット（ＩＣ５０ ２．５ｎＭ、ＳＤ０．２７、ｎ＝３複製）、ウサギ（ＩＣ５０ ３．６ｎＭ、ＳＤ０．１４、ｎ＝３複製）に対する試験によって実証される。ＬＹ３０１６８５９（国際公開第２０１２／１３８５１０号の抗体１）と比較した場合の抗体１のアッセイ検証及び低減したＩＣ５０を、ＬＹ３０１６８５９を用いたこのアッセイにおけるヒトエピレギュリンの中和と比較し、確認した（表４）。これらの研究で使用したヒト、ウサギ、カニクイザル及びウサギエピレギュリンは、本明細書に上記されるように生成した。ＬＹ３０１６８９５は、ヒトエピレギュリンを２５．９ｎＭのＩＣ５０、ＳＤ１１．７、ｎ＝８プレート、２～３複製／プレートで、カニクイザル（ＩＣ５０ ８．６ｎＭ、ＳＤ０．２７、ｎ＝２プレート、２～３複製／プレート）、ラット（ＩＣ５０ ７２０ｎＭ、ＳＤ１０、ｎ＝２プレート、２～３複製／プレート）及びウサギ（ＩＣ５０ １１．０ｎＭ、ＳＤ１．１５、ｎ＝２プレート、２～３複製／プレート）を中和することが実証された。エピレギュリン誘導性Ｃ１６６－ＡＰ１－Ｌｕｃアッセイの統計的検証により、ＭＳＲは１．２４、９５％ＣＩのＭＳＲ（ＭＳＲ＝最小有意比）は１．１５、１．４３、抗体１の効力分析は８．４＋／－１．３と決定した。このアッセイは、抗体１によるエピレギュリン誘導性機能的細胞応答のインビトロ中和、及び様々な種由来のエピレギュリンの活性を阻害する能力、及びインビボでのエピレギュリンに対する抗体１の中和効果の可能性を実証する。
ヒトエピレギュリン誘導性ルシフェラーゼレポーター活性を中和する本開示の抗体の能力は、ＡＰ１活性化によって駆動されるルシフェラーゼレポーターを過剰発現するＣ１６６細胞（Ｃ１６６－ＡＰ１－Ｌｕｃ）において評価することができる。Ｃ１６６細胞は、最高レベルでＥＧＦＲ発現を有する受容体の４つのＥＧＦＲファミリー全てを発現する内皮由来細胞株である。抗体１活性を試験するために、Ｃ１６６－ＡＰ１－Ｌｕｃ細胞を成長培地［ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ １２４３０－０４７）、１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ １００８２１４７）、Ａｎｔｉ／Ａｎｔｉ（Ｇｉｂｃｏ １５２４００６２）及び２μｇ／ｍｌ Ｐｕｒｏ（１０００Ｘ ２ｍｇ／ｍｌピューロマイシン塩酸塩（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、カタログ番号５４０４１１）］中で成長させ、０．０５％トリプシン－ＰＢＳ中で解離させ、無血清培地（ＦＢＳを有しない成長培地）中、ウェル当たり５０μｌで組織培養処理９６ウェルプレートに１ｍｌ当たり５０，０００細胞で播種する。細胞を、５０μｌの１００ｎｇ／ｍｌ（１６～１８．５ｎＭ）最終濃度のエピレギュリン（本明細書に上記されるような、ヒト（配列番号２２）、カニクイザル（配列番号２３）、ラット（配列番号２４）及びウサギ（配列番号２５））並びに抗体１の濃度の連続希釈物で６時間処理する。インキュベーション後、細胞を、１００μｌ Ｐｒｏｍｅｇａ（商標）Ｏｎｅ－Ｇｌｏ（商標）Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ溶液（Ｐｒｏｍｅｇａ（商標）、カタログ番号Ｅ６１２０）で３分間溶解する。発光を、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｗａｌｌａｃｅ １４２０ Ｖｉｃｔｏｒ２（商標）マイクロプレートリーダーで読み取る。以下の表４に示す相対蛍光単位（relative fluorescence unit、ＲＦＵ）の低減は、ヒト（配列番号２２）、カニクイザル（配列番号２３）、ラット（配列番号２４）及びウサギ（配列番号２５）を含む、試験した様々な関連する種のエピレギュリン活性を中和する抗体１の能力を反映している。ヒトエピレギュリンの中和における抗体１のＩＣ５０値は、８．７ｎＭ、ＳＤ２．３、ｎ＝５プレート、２～３複製／プレートである（表４）。関連する種にわたる中和は、カニクイザル（ＩＣ５０ ２．１ｎＭ、ＳＤ０．０８、ｎ＝３複製）、ラット（ＩＣ５０ ２．５ｎＭ、ＳＤ０．２７、ｎ＝３複製）、ウサギ（ＩＣ５０ ３．６ｎＭ、ＳＤ０．１４、ｎ＝３複製）に対する試験によって実証される。ＬＹ３０１６８５９（国際公開第２０１２／１３８５１０号の抗体１）と比較した場合の抗体１のアッセイ検証及び低減したＩＣ５０を、ＬＹ３０１６８５９を用いたこのアッセイにおけるヒトエピレギュリンの中和と比較し、確認した（表４）。これらの研究で使用したヒト、ウサギ、カニクイザル及びウサギエピレギュリンは、本明細書に上記されるように生成した。ＬＹ３０１６８９５は、ヒトエピレギュリンを２５．９ｎＭのＩＣ５０、ＳＤ１１．７、ｎ＝８プレート、２～３複製／プレートで、カニクイザル（ＩＣ５０ ８．６ｎＭ、ＳＤ０．２７、ｎ＝２プレート、２～３複製／プレート）、ラット（ＩＣ５０ ７２０ｎＭ、ＳＤ１０、ｎ＝２プレート、２～３複製／プレート）及びウサギ（ＩＣ５０ １１．０ｎＭ、ＳＤ１．１５、ｎ＝２プレート、２～３複製／プレート）を中和することが実証された。エピレギュリン誘導性Ｃ１６６－ＡＰ１－Ｌｕｃアッセイの統計的検証により、ＭＳＲは１．２４、９５％ＣＩのＭＳＲ（ＭＳＲ＝最小有意比）は１．１５、１．４３、抗体１の効力分析は８．４＋／－１．３と決定した。このアッセイは、抗体１によるエピレギュリン誘導性機能的細胞応答のインビトロ中和、及び様々な種由来のエピレギュリンの活性を阻害する能力、及びインビボでのエピレギュリンに対する抗体１の中和効果の可能性を実証する。
【0087】
【表4】
【0088】
ヒトエピレギュリンに対する中和については、抗体１については５枚のプレート、及びＬＹ３０１６８５９については８枚のプレートにわたる複製からのＩＣ５０を平均することによって、平均及びＳＤを決定した。ラット、カニクイザル及びウサギエピレギュリンに対する中和については、各種について１つのプレートから三連のＩＣ５０を平均し、抗体１のＳＤを決定した。ラット、カニクイザル及びウサギエピレギュリンに対する中和については、ＬＹ３０１６８５９の２つの異なるプレートにわたる二連のＩＣ５０を平均することから、ＩＣ５０を生成した。
【0089】
表４のデータは、抗体１が、上記のＣ１６６－ＡＰ１－Ｌｕｃ細胞ベースのアッセイにおいて、ヒトエピレギュリン誘導性ルシフェラーゼレポーター活性を効果的に中和することができ（ＩＣ５０＝８．７ｎＭ）、ＬＹ３０１６８９５（ＩＣ５０＝２５．９ｎＭ）よりもＩＣ５０が約３倍低いことを実証する。エピレギュリンの関連する種に対する交差反応性を、ラット（ＩＣ５０＝２．５ｎＭ）、カニクイザル（ＩＣ５０＝２．１ｎＭ）及びウサギ（ＩＣ５０＝３．６ｎＭ）エピレギュリンに対する中和を試験することによって確認した。これらのデータは、ヒトエピレギュリン介在性シグナリングを中和し、エピレギュリン介在性シグナリングが疼痛障害、並びに特にＯＡ、ＤＰＮＰ及びＣＬＢＰなどの病因に寄与するヒト疾患を治療する、抗体１の能力を支持する。
【0090】
Ｃ１６６－ＡＰ１－Ｌｕｃアッセイにおけるエピレギュリン中和に対する抗体１の選択性：
エピレギュリンの中和に対する抗体１の選択性は、Ｃ１６６－ＡＰ１－Ｌｕｃアッセイにおいて７つのＥＧＦＲリガンド（エピゲン、ＴＧＦα、ＢＴＣ、ＥＧＦ、ＨＢ－ＥＧＦ、エピレギュリン及びアンフィレグリン）全ての活性を試験することによって、更に実証することができる（リガンドは、例えば、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓから、エピレギュリン番号１１９５－ＥＰ－ＣＦ、ベータセルリン番号２６１－ＣＥ－ＣＦ、ＥＧＦ番号２３６－ＥＧ－ＣＦ、ＴＧＦα番号２３９－Ａ－ＣＦ、ＨＢ－ＥＧＦ番号２５９－ＨＥ－ＣＦ、エピゲン番号６６２９－ＥＰ－ＣＦ及びアンフィレグリン番号２６２－ＡＲ－ＣＦで購入することができる）。これらの７つのＥＧＦＲリガンドは、リガンドに応じてルシフェラーゼ活性の２～５倍の増加を伴うＡＰ１活性化を実証する。ＥＧＦＲリガンドのＥＣ５０は、本明細書に上記されるように、Ｃ１６６－ＡＰ１－Ｌｕｃ細胞株において各リガンドの用量応答を実行することによって決定する。刺激のためのリガンド濃度を、各リガンドのＥＣ５０－ＥＣ８０を使用することによって決定する（ベータセルリン０．８ｎＭ、ＥＧＦ １．３ｎＭ、ＴＧＦα ２．５ｎＭ、ＨＢ－ＥＧＦ ０．５２ｎＭ、エピレギュリン１６ｎＭ、エピゲン３３３ｎＭ及びアンフィレグリン１８１ｎＭ、エピゲン及びアンフィレグリンは、曲線上のプラトーの欠如のために推定上のＥＣ５０であった）。抗体１は、８．７ｎＭのＩＣ５０でＣ１６６－ＡＰ１－Ｌｕｃ細胞においてエピレギュリン誘導性ルシフェラーゼ活性を中和する能力を実証し、対照的に、Ｃ１６６－ＡＰ１－Ｌｕｃアッセイにおいてベータセルイン、ＥＧＦ、ＴＧＦα、ＨＢ－ＥＧＦ、エピゲン又はアンフィレグリン誘導性ルシフェラーゼ活性の阻害は実証しない（以下の表５を参照されたい）。表５のデータはまた、エピレギュリンの活性は特異的に中和するが、他のファミリーメンバーであるベータセルリン、ＥＧＦ、ＴＧＦα、ＨＢ－ＥＧＦ、エピゲン及びアンフィレグリンの活性は中和しないという、抗体１の薬理学的選択性も支持する。この選択性は、抗体１が、エピレギュリン応答に選択的に介入し、したがって、他のＥＧＦＲリガンドを遮断し得るＬＹ３０１６８５９などの特異性がより低い薬剤によって生じ得る有害作用の可能性を回避すると予想されるという点で重要である。
エピレギュリンの中和に対する抗体１の選択性は、Ｃ１６６－ＡＰ１－Ｌｕｃアッセイにおいて７つのＥＧＦＲリガンド（エピゲン、ＴＧＦα、ＢＴＣ、ＥＧＦ、ＨＢ－ＥＧＦ、エピレギュリン及びアンフィレグリン）全ての活性を試験することによって、更に実証することができる（リガンドは、例えば、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓから、エピレギュリン番号１１９５－ＥＰ－ＣＦ、ベータセルリン番号２６１－ＣＥ－ＣＦ、ＥＧＦ番号２３６－ＥＧ－ＣＦ、ＴＧＦα番号２３９－Ａ－ＣＦ、ＨＢ－ＥＧＦ番号２５９－ＨＥ－ＣＦ、エピゲン番号６６２９－ＥＰ－ＣＦ及びアンフィレグリン番号２６２－ＡＲ－ＣＦで購入することができる）。これらの７つのＥＧＦＲリガンドは、リガンドに応じてルシフェラーゼ活性の２～５倍の増加を伴うＡＰ１活性化を実証する。ＥＧＦＲリガンドのＥＣ５０は、本明細書に上記されるように、Ｃ１６６－ＡＰ１－Ｌｕｃ細胞株において各リガンドの用量応答を実行することによって決定する。刺激のためのリガンド濃度を、各リガンドのＥＣ５０－ＥＣ８０を使用することによって決定する（ベータセルリン０．８ｎＭ、ＥＧＦ １．３ｎＭ、ＴＧＦα ２．５ｎＭ、ＨＢ－ＥＧＦ ０．５２ｎＭ、エピレギュリン１６ｎＭ、エピゲン３３３ｎＭ及びアンフィレグリン１８１ｎＭ、エピゲン及びアンフィレグリンは、曲線上のプラトーの欠如のために推定上のＥＣ５０であった）。抗体１は、８．７ｎＭのＩＣ５０でＣ１６６－ＡＰ１－Ｌｕｃ細胞においてエピレギュリン誘導性ルシフェラーゼ活性を中和する能力を実証し、対照的に、Ｃ１６６－ＡＰ１－Ｌｕｃアッセイにおいてベータセルイン、ＥＧＦ、ＴＧＦα、ＨＢ－ＥＧＦ、エピゲン又はアンフィレグリン誘導性ルシフェラーゼ活性の阻害は実証しない（以下の表５を参照されたい）。表５のデータはまた、エピレギュリンの活性は特異的に中和するが、他のファミリーメンバーであるベータセルリン、ＥＧＦ、ＴＧＦα、ＨＢ－ＥＧＦ、エピゲン及びアンフィレグリンの活性は中和しないという、抗体１の薬理学的選択性も支持する。この選択性は、抗体１が、エピレギュリン応答に選択的に介入し、したがって、他のＥＧＦＲリガンドを遮断し得るＬＹ３０１６８５９などの特異性がより低い薬剤によって生じ得る有害作用の可能性を回避すると予想されるという点で重要である。
【0091】
【表5】
【0092】
ＴＧＷ神経芽細胞腫細胞株においてエピレギュリン誘導性応答を中和する抗体１の能力：
エピレギュリン中和を、ＴＧＷ神経芽細胞腫細胞株におけるエピレギュリン誘導性ＥＲＫリン酸化を測定することによって更に評価する。ＴＧＷ細胞は、受容体のＥＧＦＲファミリーの４つ全てを発現し、ＥＧＦＲ発現は、最高レベルである。このアッセイにおいて、ＴＧＷ細胞を、成長培地［ＮＡＰＹＲ（Ｇｉｂｃｏ番号１１９９５－０６５）、１Ｘ ＮＥＡＡ（Ｇｉｂｃｏ番号１１１４０－０５０）、Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｇｉｂｃｏ番号３５０５０－０６１）及び１Ｘ Ａｎｔｉ－Ａｎｔｉ（Ｇｉｂｃｏ番号１５２４０－０６２）を有するＤＭＥＭ高グルコース］中、コラーゲン１コーティングプレート上で成長させる。細胞を、０．０５％トリプシン－ＰＢＳ中で解離させ、９６ウェルのコラーゲン１コーティング９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ番号３５４４０７）中、１００，０００細胞／１００μｌで無血清培地（ＦＢＳを０．１％ＢＳＡで置換した成長培地）に播種する。ＴＧＷ細胞において、エピレギュリン処理（８０ｎｇ／ｍｌで５分間）は、非刺激細胞と比較して、ＥＲＫ（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，ＬＬＣ、Ｐｈｏｓｐｈｏ－ＥＲＫ１／２ Ｗｈｏｌｅ Ｃｅｌｌ Ｌｙｓａｔｅ Ｋｉｔ＃Ｋ１５１ＤＷＤ）の５倍を超えるリン酸化の増加を誘導する。ホスホ－ＥＲＫ活性化を、化学発光誘導によって決定し、相対蛍光単位（ＲＦＵ）として示す。抗体１の中和は、細胞の刺激前に２０分間連続希釈した抗体１とともにヒトエピレギュリンをインキュベートすることによって決定する。Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＳＥＣＴＯＲ Ｉｍａｇｅｒ上でプレートを読み取ることによって、データを得る。抗体１処理によるエピレギュリン誘導性ホスホル－ＥＲＫ１／２シグナルの低減を、表６に示し、これは、抗体１がヒトエピレギュリンを中和する能力を反映している。ＴＧＷ細胞におけるヒトエピレギュリン誘導性ｐＥＲＫ誘導の中和における抗体１のＩＣ５０値は、３．４ｎＭ、ＳＤ０．７（ｎ＝２複製）であることが観察され、これは、ＩＣ５０が１４．６ｎＭ、ＳＤ０．７（ｎ＝２複製）であるＬＹ３０１６８５９よりも低い。表６のデータは、抗体１が、ＴＧＷ細胞におけるヒトエピレギュリン誘導性ホスホル－ＥＲＫ１／２活性化を遮断する能力の証拠を提供する。このデータは、独立した読み出しを有する２つの異なる細胞株を利用して、本開示の抗体、及び特に抗体１がヒトエピレギュリンを中和する能力を実証し、慢性疼痛障害などのエピレギュリン介在性障害の治療におけるこれらの抗体の治療用途を支持する。
エピレギュリン中和を、ＴＧＷ神経芽細胞腫細胞株におけるエピレギュリン誘導性ＥＲＫリン酸化を測定することによって更に評価する。ＴＧＷ細胞は、受容体のＥＧＦＲファミリーの４つ全てを発現し、ＥＧＦＲ発現は、最高レベルである。このアッセイにおいて、ＴＧＷ細胞を、成長培地［ＮＡＰＹＲ（Ｇｉｂｃｏ番号１１９９５－０６５）、１Ｘ ＮＥＡＡ（Ｇｉｂｃｏ番号１１１４０－０５０）、Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｇｉｂｃｏ番号３５０５０－０６１）及び１Ｘ Ａｎｔｉ－Ａｎｔｉ（Ｇｉｂｃｏ番号１５２４０－０６２）を有するＤＭＥＭ高グルコース］中、コラーゲン１コーティングプレート上で成長させる。細胞を、０．０５％トリプシン－ＰＢＳ中で解離させ、９６ウェルのコラーゲン１コーティング９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ番号３５４４０７）中、１００，０００細胞／１００μｌで無血清培地（ＦＢＳを０．１％ＢＳＡで置換した成長培地）に播種する。ＴＧＷ細胞において、エピレギュリン処理（８０ｎｇ／ｍｌで５分間）は、非刺激細胞と比較して、ＥＲＫ（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，ＬＬＣ、Ｐｈｏｓｐｈｏ－ＥＲＫ１／２ Ｗｈｏｌｅ Ｃｅｌｌ Ｌｙｓａｔｅ Ｋｉｔ＃Ｋ１５１ＤＷＤ）の５倍を超えるリン酸化の増加を誘導する。ホスホ－ＥＲＫ活性化を、化学発光誘導によって決定し、相対蛍光単位（ＲＦＵ）として示す。抗体１の中和は、細胞の刺激前に２０分間連続希釈した抗体１とともにヒトエピレギュリンをインキュベートすることによって決定する。Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＳＥＣＴＯＲ Ｉｍａｇｅｒ上でプレートを読み取ることによって、データを得る。抗体１処理によるエピレギュリン誘導性ホスホル－ＥＲＫ１／２シグナルの低減を、表６に示し、これは、抗体１がヒトエピレギュリンを中和する能力を反映している。ＴＧＷ細胞におけるヒトエピレギュリン誘導性ｐＥＲＫ誘導の中和における抗体１のＩＣ５０値は、３．４ｎＭ、ＳＤ０．７（ｎ＝２複製）であることが観察され、これは、ＩＣ５０が１４．６ｎＭ、ＳＤ０．７（ｎ＝２複製）であるＬＹ３０１６８５９よりも低い。表６のデータは、抗体１が、ＴＧＷ細胞におけるヒトエピレギュリン誘導性ホスホル－ＥＲＫ１／２活性化を遮断する能力の証拠を提供する。このデータは、独立した読み出しを有する２つの異なる細胞株を利用して、本開示の抗体、及び特に抗体１がヒトエピレギュリンを中和する能力を実証し、慢性疼痛障害などのエピレギュリン介在性障害の治療におけるこれらの抗体の治療用途を支持する。
【0093】
【表6】
【0094】
実施例４：ＣＤ－１マウスにおいて誘発された接触性アロディニアにおけるエピレギュリンのインビボ機能的特徴付け
生物学的に活性な分子であるエピレギュリン及びＴＧＦαが接触性アロディニアを誘導する能力は、足底内注射後の雄ＣＤ－１マウスにおいて評価することができる。マウスを、温度及び光が制御された動物施設において、実験前の少なくとも７日間、水及び食物を自由に与えて順応させる。試験日に、動物を試験室に運び、ホームケージで２０分間順応させた後、高架金属メッシュ床上の透明プラスチックチャンバーに入れ、１時間順応させる。機械的刺激に対する足引っ込め応答は、金属メッシュ床の開口部を介してケージの下から、後足の足底表面に適用した較正済みｖｏｎ Ｆｒｅｙフィラメントを使用することによって決定する。測定は、上げ下げ試験パラダイムにおいてｖｏｎ Ｆｒｅｙフィラメントを使用して達成する。８つの段階的なフィラメントの力の範囲は、０．０４ｇ～６ｇである。足引っ込め閾値を測定し、計算する。足引っ込め閾値のベースライン値に基づいて、動物を投薬群に無作為化し、これらは、ＰＢＳ、エピレギュリン３０ｎｇ、エピレギュリン３００ｎｇ、ＴＧＦα ３０ｎｇ又はＴＧＦα ３００ｎｇであり、（マウスエピレギュリン（配列番号２８）及びマウスＴＧＦα（配列番号２９）試薬は、本明細書に記載のように調製したもの、又はＴＧＦαについてはＨｉｓタグ付き及び標準的なクロマトグラフィー技術（固定化金属イオン親和性クロマトグラフィー若しくはＩＭＡＣ、続いてサイズ排除クロマトグラフィー又はＳＥＣ）によって精製したものとして調製したものである。次いで、動物は、ＰＢＳの２０μｌ溶液、又は新鮮な希釈エピレギュリン若しくはＴＧＦαの後足の足底内注射を受ける。足引っ込め閾値を、注射後２時間及び４時間の時点で評価する。データを以下の表７に示す。
生物学的に活性な分子であるエピレギュリン及びＴＧＦαが接触性アロディニアを誘導する能力は、足底内注射後の雄ＣＤ－１マウスにおいて評価することができる。マウスを、温度及び光が制御された動物施設において、実験前の少なくとも７日間、水及び食物を自由に与えて順応させる。試験日に、動物を試験室に運び、ホームケージで２０分間順応させた後、高架金属メッシュ床上の透明プラスチックチャンバーに入れ、１時間順応させる。機械的刺激に対する足引っ込め応答は、金属メッシュ床の開口部を介してケージの下から、後足の足底表面に適用した較正済みｖｏｎ Ｆｒｅｙフィラメントを使用することによって決定する。測定は、上げ下げ試験パラダイムにおいてｖｏｎ Ｆｒｅｙフィラメントを使用して達成する。８つの段階的なフィラメントの力の範囲は、０．０４ｇ～６ｇである。足引っ込め閾値を測定し、計算する。足引っ込め閾値のベースライン値に基づいて、動物を投薬群に無作為化し、これらは、ＰＢＳ、エピレギュリン３０ｎｇ、エピレギュリン３００ｎｇ、ＴＧＦα ３０ｎｇ又はＴＧＦα ３００ｎｇであり、（マウスエピレギュリン（配列番号２８）及びマウスＴＧＦα（配列番号２９）試薬は、本明細書に記載のように調製したもの、又はＴＧＦαについてはＨｉｓタグ付き及び標準的なクロマトグラフィー技術（固定化金属イオン親和性クロマトグラフィー若しくはＩＭＡＣ、続いてサイズ排除クロマトグラフィー又はＳＥＣ）によって精製したものとして調製したものである。次いで、動物は、ＰＢＳの２０μｌ溶液、又は新鮮な希釈エピレギュリン若しくはＴＧＦαの後足の足底内注射を受ける。足引っ込め閾値を、注射後２時間及び４時間の時点で評価する。データを以下の表７に示す。
【0095】
【表7】
【0096】
ＴＧＦαと比較した場合のエピレギュリンの効果を上記の表７に示し、この疼痛モデルにおいて、エピレギュリンは引っ込め閾値の低減によって示されるような疼痛応答を誘導するが、ＴＧＦαは誘導しないことを示す。抗体１は、エピレギュリン及びＴＧＦαの両方を認識するＬＹ３０１６８５９と比較して、より選択的かつ特異的な疼痛治療薬を具体化すると考えられ、本開示の抗体１によるＴＧＦαへの結合の欠如は、オフターゲット効果の回避、免疫原性の低減、及び治療用途に必要とされ得る用量の改善又は低下に関して有利であると考えられる。
【0097】
実施例５：抗体１の免疫原性の可能性の特徴付け
抗体１は、以下の知見によって支持されるように、ヒトエピレギュリンに対する増強された親和性、他のＥＧＦＲリガンドと比較した場合のエピレギュリンに対する改善された特異性、及びＬＹ３０１６８５９と比較して改善された生物物理学的特性、及び完全ヒト配列（これらのうちの後者は、低減した免疫原性の可能性を提供すると考えられる）を含む、いくつかの組み合わされた点において改善された治療用抗体となっている。
抗体１は、以下の知見によって支持されるように、ヒトエピレギュリンに対する増強された親和性、他のＥＧＦＲリガンドと比較した場合のエピレギュリンに対する改善された特異性、及びＬＹ３０１６８５９と比較して改善された生物物理学的特性、及び完全ヒト配列（これらのうちの後者は、低減した免疫原性の可能性を提供すると考えられる）を含む、いくつかの組み合わされた点において改善された治療用抗体となっている。
【0098】
樹状細胞（Dendritic Cell、ＤＣ）内在化アッセイ
単球由来ＤＣ培養（Monocyte-derived DC Culturing、ＭＤＤＣ）
標準プロトコルに従って、ＣＤ１４＋単球を末梢血単核細胞（periphery blood mononuclear cell、ＰＢＭＣ）から単離させ、培養し、ＤＣに分化させる。手短に言うと、ＬＲＳ－ＷＢＣからＦｉｃｏｌｌ（＃１７－１４４０－０２、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）及びＳｅｐｍａｔｅ ５０（＃１５４５０、ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）による密度勾配遠心分離を使用してＰＢＭＣを単離する。製造元のマニュアルに従って、ＣＤ１４＋マイクロビーズキット（＃１３０－０５０－２０１、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）による陽性選択を使用してＣＤ１４＋単球を単離する。次いで、１０００単位／ｍｌのＧＭ－ＣＳＦ及び６００単位／ｍｌのＩＬ－４とともに、細胞を１００万／ｍｌで６日間培養して、Ｌ－グルタミン及び２５ｍＭのＨＥＰＥＳを添加し、１０％ＦＢＳ、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、１×ペニシリン－ストレプトマイシン、１×非必須アミノ酸、及び５５μＭの２－メルカプトエタノールを補充したＲＰＭＩ培地（以下、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入した完全ＲＰＭＩ培地又は培地と呼ぶ）中で未成熟樹状細胞（ＭＤＤＣ）に誘導する。培地を２日目及び５日目の２回変える。６日目に、セルスクレーパーで細胞を静かに収集し、実験に使用する。ＭＤＤＣを、顕微鏡による樹状形態、及びフローサイトメトリーによるＣＤ１４、ＣＤ１１ｃ、及びＨＬＡ－ＤＲの発現について視覚的に特徴付ける。ＬＰＳ処理に応答する能力は、フローサイトメトリーを使用してＣＤ８０、ＣＤ８３、及びＣＤ８６の増加を測定することによって確認される。
単球由来ＤＣ培養（Monocyte-derived DC Culturing、ＭＤＤＣ）
標準プロトコルに従って、ＣＤ１４＋単球を末梢血単核細胞（periphery blood mononuclear cell、ＰＢＭＣ）から単離させ、培養し、ＤＣに分化させる。手短に言うと、ＬＲＳ－ＷＢＣからＦｉｃｏｌｌ（＃１７－１４４０－０２、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）及びＳｅｐｍａｔｅ ５０（＃１５４５０、ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）による密度勾配遠心分離を使用してＰＢＭＣを単離する。製造元のマニュアルに従って、ＣＤ１４＋マイクロビーズキット（＃１３０－０５０－２０１、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）による陽性選択を使用してＣＤ１４＋単球を単離する。次いで、１０００単位／ｍｌのＧＭ－ＣＳＦ及び６００単位／ｍｌのＩＬ－４とともに、細胞を１００万／ｍｌで６日間培養して、Ｌ－グルタミン及び２５ｍＭのＨＥＰＥＳを添加し、１０％ＦＢＳ、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、１×ペニシリン－ストレプトマイシン、１×非必須アミノ酸、及び５５μＭの２－メルカプトエタノールを補充したＲＰＭＩ培地（以下、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入した完全ＲＰＭＩ培地又は培地と呼ぶ）中で未成熟樹状細胞（ＭＤＤＣ）に誘導する。培地を２日目及び５日目の２回変える。６日目に、セルスクレーパーで細胞を静かに収集し、実験に使用する。ＭＤＤＣを、顕微鏡による樹状形態、及びフローサイトメトリーによるＣＤ１４、ＣＤ１１ｃ、及びＨＬＡ－ＤＲの発現について視覚的に特徴付ける。ＬＰＳ処理に応答する能力は、フローサイトメトリーを使用してＣＤ８０、ＣＤ８３、及びＣＤ８６の増加を測定することによって確認される。
【0099】
Ｆａｂ－ＴＡＭＲＡ－ＱＳＹ７の結合
Ｆ（ａｂ’）２フラグメントヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）をＱＳＹ７－ＮＨＳ及びＴＡＭＲＡ－ＳＥ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）で二重標識して、試験物質の内在化を追跡するためのユニバーサルプローブとして使用するＦａｂ－ＴＡＭＲＡ－ＱＳＹ７を得る。Ｆ（ａｂ’）２（１．３ｍｇ／ｍｌで約１ｍｌ）の各バイアルを、Ａｍｉｃｏ Ｕｌｔｒａ－０．５遠心フィルター装置（＃ＵＦＣ５０１０９６、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して１４，０００ｒｃｆで２分間遠心分離することにより、約２ｍｇ／ｍｌに濃縮する。ｐＨを１０％（ｖ／ｖ）１Ｍ重炭酸ナトリウムで塩基性（＞ｐＨ８）に調整し、ＤＭＳＯ中１０ｍＭのＱＳＹ－ＮＨＳ保存液６．８μｌを添加し、混合する。反応バイアルを室温で３０分間暗所に保つ。中間生成物であるＦａｂ－ＱＳＹ７を、Ｚｅｂａ Ｓｐｉｎ脱塩カラム（＃８９８９０、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、相対遠心力（relative centrifugal force、ＲＣＦ）１０００で２分間遠心分離することにより精製する。ＮａｎｏＤｒｏｐ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で２８０ｎｍ及び５６０ｎｍの吸光度を測定することにより、濃度及び標識度（degree of labeling、ＤＯＬ）を計算する。次いで、再びＡｍｉｃｏ Ｕｌｔｒａ－０．５遠心フィルター装置を用いて１４，０００ｒｃｆで２分間遠心分離することにより、Ｆａｂ－ＱＳＹ７を約２ｍｇ／ｍｌに濃縮する。１０％（ｖ／ｖ）１Ｍ重炭酸ナトリウムでｐＨを調整した後、ＤＭＳＯ中の１５ｍＭのＴＡＭＲＡ－ＳＥ保存液４．３μｌを添加して混合する。室温の暗所で３０分の後、最終生成物Ｆａｂ－ＴＡＭＲＡ－ＱＳＹ７を精製し、１０００ｒｃｆで２分間遠心分離することによりＺｅｂａ Ｓｐｉｎ脱塩カラムを使用して収集する。ＮａｎｏＤｒｏｐ分光光度計で２８０ｎｍ、５５５ｎｍ、及び５６０ｎｍの吸光度を読み取ることにより、濃度及びＤＯＬを再度定量化する。このプロトコルを使用すると、Ｆ（ａｂ’）２当たり約２つのＱＳＹ７と２つのＴＡＭＲＡと、を含む約１．５ｍｇ／ｍｌのＦａｂ－ＴＡＭＲＡ－ＱＳＹ７を約３００μｌが得られる。
Ｆ（ａｂ’）２フラグメントヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）をＱＳＹ７－ＮＨＳ及びＴＡＭＲＡ－ＳＥ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）で二重標識して、試験物質の内在化を追跡するためのユニバーサルプローブとして使用するＦａｂ－ＴＡＭＲＡ－ＱＳＹ７を得る。Ｆ（ａｂ’）２（１．３ｍｇ／ｍｌで約１ｍｌ）の各バイアルを、Ａｍｉｃｏ Ｕｌｔｒａ－０．５遠心フィルター装置（＃ＵＦＣ５０１０９６、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して１４，０００ｒｃｆで２分間遠心分離することにより、約２ｍｇ／ｍｌに濃縮する。ｐＨを１０％（ｖ／ｖ）１Ｍ重炭酸ナトリウムで塩基性（＞ｐＨ８）に調整し、ＤＭＳＯ中１０ｍＭのＱＳＹ－ＮＨＳ保存液６．８μｌを添加し、混合する。反応バイアルを室温で３０分間暗所に保つ。中間生成物であるＦａｂ－ＱＳＹ７を、Ｚｅｂａ Ｓｐｉｎ脱塩カラム（＃８９８９０、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、相対遠心力（relative centrifugal force、ＲＣＦ）１０００で２分間遠心分離することにより精製する。ＮａｎｏＤｒｏｐ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で２８０ｎｍ及び５６０ｎｍの吸光度を測定することにより、濃度及び標識度（degree of labeling、ＤＯＬ）を計算する。次いで、再びＡｍｉｃｏ Ｕｌｔｒａ－０．５遠心フィルター装置を用いて１４，０００ｒｃｆで２分間遠心分離することにより、Ｆａｂ－ＱＳＹ７を約２ｍｇ／ｍｌに濃縮する。１０％（ｖ／ｖ）１Ｍ重炭酸ナトリウムでｐＨを調整した後、ＤＭＳＯ中の１５ｍＭのＴＡＭＲＡ－ＳＥ保存液４．３μｌを添加して混合する。室温の暗所で３０分の後、最終生成物Ｆａｂ－ＴＡＭＲＡ－ＱＳＹ７を精製し、１０００ｒｃｆで２分間遠心分離することによりＺｅｂａ Ｓｐｉｎ脱塩カラムを使用して収集する。ＮａｎｏＤｒｏｐ分光光度計で２８０ｎｍ、５５５ｎｍ、及び５６０ｎｍの吸光度を読み取ることにより、濃度及びＤＯＬを再度定量化する。このプロトコルを使用すると、Ｆ（ａｂ’）２当たり約２つのＱＳＹ７と２つのＴＡＭＲＡと、を含む約１．５ｍｇ／ｍｌのＦａｂ－ＴＡＭＲＡ－ＱＳＹ７を約３００μｌが得られる。
【0100】
ＦＡＣＳによる標準化内在化試験
個々の試験分子をＰＢＳで１ｍｇ／ｍｌに正規化し、次いで完全ＲＰＭＩ培地で更に８μｇ／ｍｌに希釈する。Ｆａｂ－ＴＡＭＲＡ－ＱＳＹ７を完全ＲＰＭＩ培地で５．３３μｇ／ｍｌに希釈する。抗体とＦａｂ－ＴＡＭＲＡ－ＱＳＹ７とを等量で混合し、複合体形成のために暗所で、４℃で３０分間インキュベートする。ＭＤＤＣを完全ＲＰＭＩ培地に４００万／ｍｌで再懸濁し、抗体／プローブ複合体５０μｌを添加した９６ウェル丸底プレートにウェル当たり５０μｌで播種する。細胞をＣＯ２インキュベーターで、３７℃で２４時間インキュベートする。細胞を２％ＦＢＳ ＰＢＳで洗浄し、Ｃｙｔｏｘ Ｇｒｅｅｎの生／死色素を含む１００μｌの２％ＦＢＳ ＰＢＳに再懸濁する。ＢＤ ＬＳＲ Ｆｏｒｔｅｓｓａ Ｘ－２０でデータを収集し、ＦｌｏｗＪｏで分析する。生単一細胞をゲーティングし、ＴＡＭＲＡ蛍光陽性細胞の割合を読み出しとして記録する。
個々の試験分子をＰＢＳで１ｍｇ／ｍｌに正規化し、次いで完全ＲＰＭＩ培地で更に８μｇ／ｍｌに希釈する。Ｆａｂ－ＴＡＭＲＡ－ＱＳＹ７を完全ＲＰＭＩ培地で５．３３μｇ／ｍｌに希釈する。抗体とＦａｂ－ＴＡＭＲＡ－ＱＳＹ７とを等量で混合し、複合体形成のために暗所で、４℃で３０分間インキュベートする。ＭＤＤＣを完全ＲＰＭＩ培地に４００万／ｍｌで再懸濁し、抗体／プローブ複合体５０μｌを添加した９６ウェル丸底プレートにウェル当たり５０μｌで播種する。細胞をＣＯ２インキュベーターで、３７℃で２４時間インキュベートする。細胞を２％ＦＢＳ ＰＢＳで洗浄し、Ｃｙｔｏｘ Ｇｒｅｅｎの生／死色素を含む１００μｌの２％ＦＢＳ ＰＢＳに再懸濁する。ＢＤ ＬＳＲ Ｆｏｒｔｅｓｓａ Ｘ－２０でデータを収集し、ＦｌｏｗＪｏで分析する。生単一細胞をゲーティングし、ＴＡＭＲＡ蛍光陽性細胞の割合を読み出しとして記録する。
【0101】
データ表示及び統計分析
分子は、二連又は三連で、３人以上のドナーに対して試験する。各ドナーについて、ＴＡＭＲＡ陽性集団の割合を考慮する。異なるドナーから生成されたデータを有する分子の比較を可能にするために、正規化された内在化指数（ＮＩＩ）が使用される。内在化シグナルは、次の式を使用してＩｇＧ１アイソタイプ（ＮＩＩ＝０）及び内部陽性対照ＰＣ（ＮＩＩ＝１００）に対して正規化する。
分子は、二連又は三連で、３人以上のドナーに対して試験する。各ドナーについて、ＴＡＭＲＡ陽性集団の割合を考慮する。異なるドナーから生成されたデータを有する分子の比較を可能にするために、正規化された内在化指数（ＮＩＩ）が使用される。内在化シグナルは、次の式を使用してＩｇＧ１アイソタイプ（ＮＩＩ＝０）及び内部陽性対照ＰＣ（ＮＩＩ＝１００）に対して正規化する。
【0102】
【数1】
ここで、ＸＴＡＭＲＡ、ＩｇＧ１アイソタイプＴＡＭＲＡ、及びＰＣＴＡＭＲＡは、それぞれ試験分子Ｘ、ＩｇＧ１アイソタイプ、及びＰＣのＴＡＭＲＡ陽性集団の割合である。データは、ＪＭＰ（登録商標）１４．１．０又はＧｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ８．１．２で分析する。ＴＡＭＲＡ陽性集団の割合の平均及びＮＩＩを計算し、報告する。ＤＣなどの抗原提示細胞における内在化の増加は、免疫原性のリスクの増加と関連している。表９の結果は、ＬＹ３０１６８５９と比較した場合の抗体１のＤＣ内在化の低下、したがって、免疫原性リスクの低下を実証する。
【0103】
【表8】
【0104】
（例えば、Ｗｅｎ，Ｙ．，Ｃａｈｙａ，Ｓ．，Ｚｅｎｇ，Ｗ．ｅｔ ａｌ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ ＦＲＥＴ－Ｂａｓｅｄ Ａｓｓａｙ ｆｏｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｍＡｂｓ Ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｂｙ Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ Ｃｅｌｌｓ ｉｎ Ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ Ｒｉｓｋ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ．ＡＡＰＳ Ｊ ２２，６８（２０２０）を参照されたい）
【0105】
ＭＡＰＰアッセイ（ＭＨＣ関連ペプチドプロテオミクス）方法：
１０人の正常なヒトドナーからの初代ヒト樹状細胞を、記載のように、ＣＤ－１４陽性細胞の単離によってバフィーコートから調製し、５％血清置換物（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号Ａ２５９６１０１）を含有する完全ＲＰＭＩ培地中で２０ｎｇ／ｍｌ ＩＬ－４及び４０ｎｇ／ｍｌ ＧＭ－ＣＳＦとともに、３７℃、５％ＣＯ２で３日間インキュベートすることによって、未成熟樹状細胞に分化させた（Ｋｎｉｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，「Ｔｈｅ Ｈｕｍａｎ Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｃｌａｓｓ ＩＩ Ｉｍｍｕｎｏｐｅｐｔｉｄｏｍｅ ｏｆ ｔｈｅ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓｐｉｋｅ Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ」，Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ，３３，１０８４５４（２０２０））。４日目に３マイクロモルの試験抗体を約５×１０６細胞に添加し、細胞を成熟樹状細胞に形質転換するために、５ｍｇ／ｍｌのＬＰＳを含有する新鮮な培地を５時間のインキュベーション後に交換する。翌日、成熟細胞をプロテアーゼ阻害剤及びＤＮＡｓｅを含む１ｍｌのＲＩＰＡ緩衝液中で溶解する。ライセートを、試料分析まで－８０℃で貯蔵する。
１０人の正常なヒトドナーからの初代ヒト樹状細胞を、記載のように、ＣＤ－１４陽性細胞の単離によってバフィーコートから調製し、５％血清置換物（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号Ａ２５９６１０１）を含有する完全ＲＰＭＩ培地中で２０ｎｇ／ｍｌ ＩＬ－４及び４０ｎｇ／ｍｌ ＧＭ－ＣＳＦとともに、３７℃、５％ＣＯ２で３日間インキュベートすることによって、未成熟樹状細胞に分化させた（Ｋｎｉｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，「Ｔｈｅ Ｈｕｍａｎ Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｃｌａｓｓ ＩＩ Ｉｍｍｕｎｏｐｅｐｔｉｄｏｍｅ ｏｆ ｔｈｅ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓｐｉｋｅ Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ」，Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ，３３，１０８４５４（２０２０））。４日目に３マイクロモルの試験抗体を約５×１０６細胞に添加し、細胞を成熟樹状細胞に形質転換するために、５ｍｇ／ｍｌのＬＰＳを含有する新鮮な培地を５時間のインキュベーション後に交換する。翌日、成熟細胞をプロテアーゼ阻害剤及びＤＮＡｓｅを含む１ｍｌのＲＩＰＡ緩衝液中で溶解する。ライセートを、試料分析まで－８０℃で貯蔵する。
【0106】
自動液体処理システムを使用して、ビオチン化抗汎ＨＬＡクラスＩＩ抗体（クローンＴｕ３９）を使用し、解凍したライセートからＨＬＡ－ＩＩ分子を単離する。結合した受容体－ペプチド複合体を、５％酢酸、０．１％ＴＦＡで溶出する。溶出したＭＨＣ－ＩＩペプチドを、高分子量タンパク質を除去するために、事前に洗浄した１０ｋ ＭＷＣＯフィルターに通す。単離ＭＨＣ－ＩＩペプチドは、Ｔｈｅｒｍｏ ＬＵＭＯＳ質量分析計を備えたＴｈｅｒｍｏ ｅａｓｙ １２００ ｎＬＣ－ＨＰＬＣシステムを使用して、ナノＬＣ／ＭＳによって分析する。この分離では、７５μｍ×７ｃｍのＹＭＣ－ＯＤＳ Ｃ１８カラムを使用し、流速２５０ｎＬ／分、並びにＡ溶媒として０．１％ギ酸水溶液、及びＢ溶媒として０．１％ギ酸を有する８０％アセトニトリルで、６５分間の勾配を行った。質量分析は、解像度２４０，０００のフルスキャン様式で実行し、続いてＨＣＤ及びＥＴｈｃＤフラグメンテーションによるイオントラップ型ラピッドスキャンで構成される３秒のデータ依存型ＭＳ／ＭＳサイクルを実行する。
【0107】
ペプチドの同定は、試験抗体配列を含有するウシ／ヒトデータベースに対する酵素検索パラメータのない複数の検索アルゴリズムを使用して、内部プロテオミクスパイプライン（Ｈｉｇｇｓ ｅｔ ａｌ．，「Ｌａｂｅｌ－ｆｒｅｅ ＬＣ－ＭＳ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ」，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，４２８，２０９－２３０（２００８））によって生成する。ＫＮＩＭＥワークフローを使用して、試料の同定ファイルを処理する。試験物質から同定されたペプチドを、親配列に対して整列させる。非生殖系列残基を提示するドナーの割合、非生殖系列残基を有するペプチドを提示する異なる領域の数、及び非生殖系列残基を有する各領域でのペプチド提示の深さを注釈する全てのドナーの要約を作成する。非生殖系列ペプチドの提示の程度の増加は、免疫原性のリスクの増加と関連している。表８の結果は、ＬＹ３０１６８５９と比較した場合の、抗体１に対する非生殖系列ペプチドの提示の低下、したがって抗体１に対する免疫原性のリスクの低下を示す。
【0108】
【表9】
【0109】
実施例６．ラットにおける投薬後のインビボでの膜エピレギュリンへの結合の実証。
エピレギュリンは、膜結合型、及びＡＤＡＭ（A disintegrin and metalloprotease、Ａディスインテグリン及びメタロプロテアーゼ）プロテアーゼによる膜型の切断で生じる可溶型の両方で存在する。本開示の抗体が、例えば、皮下注射による末梢投薬後にインビボで膜型のエピレギュリンに結合する能力は、エクスビボで組織を単離し、続いて本明細書に記載に記載の及び／又は当業者に既知の標準的な免疫蛍光染色法を適用することによって評価することができる。ラット舌の上皮層の陽性及び特異的免疫蛍光標識は、抗体１を用いて実証することができる。
エピレギュリンは、膜結合型、及びＡＤＡＭ（A disintegrin and metalloprotease、Ａディスインテグリン及びメタロプロテアーゼ）プロテアーゼによる膜型の切断で生じる可溶型の両方で存在する。本開示の抗体が、例えば、皮下注射による末梢投薬後にインビボで膜型のエピレギュリンに結合する能力は、エクスビボで組織を単離し、続いて本明細書に記載に記載の及び／又は当業者に既知の標準的な免疫蛍光染色法を適用することによって評価することができる。ラット舌の上皮層の陽性及び特異的免疫蛍光標識は、抗体１を用いて実証することができる。
【0110】
ラット舌は、安楽死させた雄Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラット（体重１４０～２１５グラム）から、抗体１を含む試験される抗体、又は対照若しくは比較抗体の様々な用量（０．１～１００ｍｇ／ｋｇ、皮下）の後、投薬後の様々な時間（投薬後３～２８日）に得、ドライアイス上で急速冷凍することができる。舌組織の凍結冠状２０ミクロン切片を解凍し、ＰＢＳ中で３分間洗浄し、４％パラホルムアルデヒド中で１０分間固定する。スライドをＳｕｐｅｒ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ（ＨＫ５８３－５Ｋ、Ｂｉｏｇｅｎｅｘ）中で洗浄し、次いでＰｏｗｅｒ ｂｌｏｃｋ（ＨＫ０６５－５Ｋ、Ｂｉｏｇｅｎｅｘ）＋０．１％Ｔｒｉｔｏｎ ｘ－１００で１０分間ブロッキングする。次いで、スライドを洗浄し、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ａ１１０１３、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、１３．３μｇ／ｍｌ）、並びに抗体１の可変領域（配列番号３及び４）及びマウス定常領域（ＤｙＬｉｇｈｔ ６５０標識）を有する、本明細書で「抗体１ ＶＲキメラ」（配列番号６４及び６５）と称される標識ヒト／マウスＩｇＧ１キメラとともに、室温で１５分間インキュベートする。スライドを３回洗浄し、Ｐｒｏｌｏｎｇ金退色防止試薬をカバーガラスの前に適用する。各動物からの４８８及び６５０ｎｍ波長での蛍光画像を、Ｋｅｙｅｎｃｅ ＢＺ８００を利用して、全ての画像について同じ露光設定を使用して撮影する。陽性に染色された上皮層内の緑色又は赤色シグナルを、ＩｍａｇｅＪ－Ｗｉｎ６４ソフトウェアを利用して、４つの無作為な対象領域を取ることによって平均強度について定量化する。緑色シグナルは、結合した抗体１、又は対照抗体、又は参照比較抗体（インビボで投薬）から生じ、赤色シグナルは、未結合のエピレギュリンであり、検出抗体は、結合した薬物と競合し、未結合の遊離エピレギュリンのみを染色する。得られたデータを、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ヤギ抗ヒトＩｇＧシグナル（緑色）の、残りの抗体１ ＶＲキメラシグナル（赤色）に対する比を利用することによって正規化する。
【0111】
図２は、抗体１を１ｍｇ／ｋｇ以上の用量で投薬した３日後に、膜エピレギュリンの結合の有意な用量依存的増加がインビボで観察されることを示す。図３は、１０ｍｇ／ｋｇの抗体１の単回投与後、少なくとも１４日間、インビボで膜エピレギュリンの持続的な結合があることを示す。
【0112】
図４は、抗体１について、エピレギュリン結合の効力が５０分の１未満である比較抗体と比較して、インビボでの結合した膜エピレギュリンの程度がより高いことを実証する。図４は、抗体１の親和性の改善はまた、インビボでの膜結合エピレギュリンリガンド結合の改善にもつながることを示す。
【0113】
実施例７：抗体１のエピトープマッピング
抗体１は、他のＥＧＦＲリガンドファミリーメンバーに関して高い親和性及び選択性、並びに有利なエピレギュリン中和活性及び薬物動態特性で、ＥＧＦＲリガンドファミリーメンバーエピレギュリン（ＥＲＥＧ）に選択的に結合し、それを中和するヒトＩｇＧ４抗体である。これらの特性は、本明細書に記載の追加の安定性及び粘度及び溶解性特性とともに、改善された属性と、ＥＲＥＧ活性を中和する有利な治療薬との組み合わせを有する抗体をもたらす。エピトープマッピング研究を実施して、抗体１の結合及び特異性に必要なヒトＥＲＥＧ中の特定のアミノ酸を決定した。重要なアミノ酸を、抗体１ Ｆａｂ／ＥＲＥＧ複合体の結晶構造から同定し、これらのアミノ酸の寄与を、変異誘発及び結合研究を介して更に特徴付けた。これらのアミノ酸の寄与は、他のＥＧＦＲリガンドファミリーメンバーと比較して、ＥＲＥＧに対する抗体１の特異性の構造基盤を提供する。これらの結果により、関連する前臨床種における交差反応性及び選択性についての情報が得られる。
抗体１は、他のＥＧＦＲリガンドファミリーメンバーに関して高い親和性及び選択性、並びに有利なエピレギュリン中和活性及び薬物動態特性で、ＥＧＦＲリガンドファミリーメンバーエピレギュリン（ＥＲＥＧ）に選択的に結合し、それを中和するヒトＩｇＧ４抗体である。これらの特性は、本明細書に記載の追加の安定性及び粘度及び溶解性特性とともに、改善された属性と、ＥＲＥＧ活性を中和する有利な治療薬との組み合わせを有する抗体をもたらす。エピトープマッピング研究を実施して、抗体１の結合及び特異性に必要なヒトＥＲＥＧ中の特定のアミノ酸を決定した。重要なアミノ酸を、抗体１ Ｆａｂ／ＥＲＥＧ複合体の結晶構造から同定し、これらのアミノ酸の寄与を、変異誘発及び結合研究を介して更に特徴付けた。これらのアミノ酸の寄与は、他のＥＧＦＲリガンドファミリーメンバーと比較して、ＥＲＥＧに対する抗体１の特異性の構造基盤を提供する。これらの結果により、関連する前臨床種における交差反応性及び選択性についての情報が得られる。
【0114】
試験物質の配列を、アミノ酸及びヌクレオチド配列の配列表に提供し、以下のように相互参照する：ヒトＥＲＥＧ（配列番号２１）、抗体１ Ｆａｂ ＨＣ（配列番号６２）、抗体１ Ｆａｂ ＬＣ（配列番号６３）、モノＦｃヒトＥＲＥＧ（配列番号２７）、モノＦｃヒトＥＲＥＧ Ｅ９５Ｈ（配列番号５７）、モノＦｃヒトＥＲＥＧ Ｅ９５Ａ（配列番号５６）、モノＦｃヒトＥＲＥＧ Ｈ７８Ｎ（配列番号５５）、モノＦｃヒトＥＲＥＧ Ｈ７８Ａ（配列番号５４）、モノＦｃヒトＥＲＥＧ Ｆ１０６Ｋ（配列番号６１）、モノＦｃヒトＥＲＥＧ Ｆ１０６Ａ（配列番号６０）、モノＦｃヒトＥＲＥＧ Ｙ９８Ａ（配列番号５８）、モノＦｃヒトＥＲＥＧ Ｌ７７Ｆ（配列番号５３）、モノＦｃヒトＥＲＥＧ Ｒ１０２Ａ（配列番号５９）。
【0115】
抗体１ Ｆａｂフラグメント及びヒトＥＲＥＧの両方を、一過性ＣＨＯ発現において産生し、標準的な技術によって精製した。３０％モル過剰のＥＲＥＧを抗体１ Ｆａｂに添加することによって複合体を調製し、次いでサイズ排除クロマトグラフィーによって精製して、過剰な遊離ＥＲＥＧを除去した。ＥＲＥＧに対する抗体１ Ｆａｂ結合を、まずウェスタンブロット分析によってプローブし、抗体１ Ｆａｂが、このアッセイにおいて、変性、非還元ＥＲＥＧは認識できるが、変性、還元ＥＲＥＧは認識できないことを示した。これは、ＥＲＥＧジスルフィド結合に依存する立体構造エピトープを強く示唆する。
【0116】
ヒトエピレギュリンに結合した抗体１のＦａｂフラグメントの結晶構造
ヒトエピレギュリンに結合した抗体１のＦａｂフラグメントの結晶構造を解析した。複合体を結晶化させ、１．８Å構造を、Ｐｈａｓｅｒ ２．８．３を使用して分子置換によって解析し、その後、Ｒｅｆｍａｃ ５．８．０２５８で精密化した。結晶において、抗体１ Ｆａｂ’は、エピレギュリン二量体の反対面に結合する。エピレギュリンＬｅｕ７７及びＨｉｓ７８側鎖は、エピトープの中心にあり、Ｌｅｕ７７は、疎水性ポケットに埋もれており、Ｈｉｓ７８側鎖は、水素結合のネットワークの中心にある。抗体１重鎖Ａｒｇ５０側鎖は、重鎖Ｔｙｒ５２側鎖ヒドロキシルに対する水素結合供与体であり、重鎖Ｔｙｒ５２側鎖ヒドロキシルは、脱プロトン化Ｈｉｓ７８側鎖Ｎδ１水素結合受容体に対する水素結合供与体であり、プロトン化Ｈｉｓ７８側鎖Ｎε２は、水分子に対する水素結合供与体であり、この水分子は、重鎖Ｌｅｕ１０９及び軽鎖Ｔｙｒ１０７骨格カルボニルに対する水素供与体である。抗体１残基は、ＩＭＧＴ規約によって番号付けする。追加の同定されたエピトープ接触には、Ｇｌｕ９５、Ｔｙｒ９８、Ａｒｇ１０２及びＰｈｅ１０６側鎖、並びにＬｅｕ７７、Ｖａｌ９６及びＧｌｕ１０４骨格が含まれる。構造は、抗体１エピトープが立体構造的であり、線状ではないことを明確に実証し、上記のウェスタンの結果を確認する。
ヒトエピレギュリンに結合した抗体１のＦａｂフラグメントの結晶構造を解析した。複合体を結晶化させ、１．８Å構造を、Ｐｈａｓｅｒ ２．８．３を使用して分子置換によって解析し、その後、Ｒｅｆｍａｃ ５．８．０２５８で精密化した。結晶において、抗体１ Ｆａｂ’は、エピレギュリン二量体の反対面に結合する。エピレギュリンＬｅｕ７７及びＨｉｓ７８側鎖は、エピトープの中心にあり、Ｌｅｕ７７は、疎水性ポケットに埋もれており、Ｈｉｓ７８側鎖は、水素結合のネットワークの中心にある。抗体１重鎖Ａｒｇ５０側鎖は、重鎖Ｔｙｒ５２側鎖ヒドロキシルに対する水素結合供与体であり、重鎖Ｔｙｒ５２側鎖ヒドロキシルは、脱プロトン化Ｈｉｓ７８側鎖Ｎδ１水素結合受容体に対する水素結合供与体であり、プロトン化Ｈｉｓ７８側鎖Ｎε２は、水分子に対する水素結合供与体であり、この水分子は、重鎖Ｌｅｕ１０９及び軽鎖Ｔｙｒ１０７骨格カルボニルに対する水素供与体である。抗体１残基は、ＩＭＧＴ規約によって番号付けする。追加の同定されたエピトープ接触には、Ｇｌｕ９５、Ｔｙｒ９８、Ａｒｇ１０２及びＰｈｅ１０６側鎖、並びにＬｅｕ７７、Ｖａｌ９６及びＧｌｕ１０４骨格が含まれる。構造は、抗体１エピトープが立体構造的であり、線状ではないことを明確に実証し、上記のウェスタンの結果を確認する。
【0117】
抗体１ Ｆａｂを用いた変異体エピレギュリンＥＬＩＳＡ
結合及び選択性の両方に対するそれらの相対的寄与を理解するために、重要なエピトープ残基を点変異誘発によって更に特徴付けた。モノＦｃ ＥＲＥＧ融合物（上記を参照されたい）をＰＢＳ中で１μｇ／ｍＬに希釈し、１００μＬを各ウェルに添加して、ＥＬＩＳＡプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒカタログ番号６５５０６１）を５℃で一晩コーティングした。バリアントをプレート上のカラムによってグループ分けし、野生型を３つの複製カラムにコーティングし、点変異体を単一の複製カラムにコーティングした。コーティング後、プレートを、２００μＬのＰＢＳＴでウェル当たり３回洗浄し、次いでカゼインブロッキング緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏカタログ番号３７５２８）を使用してプレートシェーカー上、室温で１時間ブロッキングした。ブロッキング後、プレートを前回と同様に洗浄した。抗体１ Ｆａｂフラグメントを、カゼインブロッキング緩衝液中で１μｇ／ｍＬに希釈し、次いでブロッキング緩衝液中で３倍連続希釈して、合計７つの濃度とし、ブロッキング緩衝液をブランクとした。Ｆａｂ希釈系列を、調製したＥＬＩＳＡプレートにウェル当たり１００μＬで添加し、プレートシェーカー上で室温で１時間インキュベートした。プレートを前回と同様に洗浄し、次いでブロッキング緩衝液中で１：８，０００に希釈した１００μＬのヤギ抗ヒトカッパＨＲＰ二次抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈカタログ番号２０６０－０５）を各ウェルに添加した。プレートを、二次抗体とともに室温で１時間プレートシェーカー上でインキュベートし、次いで前回と同様に洗浄した。ＴＭＢ基質を調製し（カタログ番号３４０２１）、１００μＬを全てのウェルに添加した。プレートを室温で３～５分間静的にインキュベートし、次いで１００μＬの１Ｎ ＨＣｌを全てのウェルに添加して、反応を停止させた。プレートを、プレートリーダーで４５０ｎｍで読み取った。ブランクについて減算したＥＬＩＳＡデータを、抗体濃度をＸ軸及びＯＤ４５０をＹ軸として、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ９にプロットした。非線形回帰を使用して、データを「Ｓ字形、４ＰＬ、Ｘは濃度である」モデルに当てはめることによって、曲線を生成した。
結合及び選択性の両方に対するそれらの相対的寄与を理解するために、重要なエピトープ残基を点変異誘発によって更に特徴付けた。モノＦｃ ＥＲＥＧ融合物（上記を参照されたい）をＰＢＳ中で１μｇ／ｍＬに希釈し、１００μＬを各ウェルに添加して、ＥＬＩＳＡプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒカタログ番号６５５０６１）を５℃で一晩コーティングした。バリアントをプレート上のカラムによってグループ分けし、野生型を３つの複製カラムにコーティングし、点変異体を単一の複製カラムにコーティングした。コーティング後、プレートを、２００μＬのＰＢＳＴでウェル当たり３回洗浄し、次いでカゼインブロッキング緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏカタログ番号３７５２８）を使用してプレートシェーカー上、室温で１時間ブロッキングした。ブロッキング後、プレートを前回と同様に洗浄した。抗体１ Ｆａｂフラグメントを、カゼインブロッキング緩衝液中で１μｇ／ｍＬに希釈し、次いでブロッキング緩衝液中で３倍連続希釈して、合計７つの濃度とし、ブロッキング緩衝液をブランクとした。Ｆａｂ希釈系列を、調製したＥＬＩＳＡプレートにウェル当たり１００μＬで添加し、プレートシェーカー上で室温で１時間インキュベートした。プレートを前回と同様に洗浄し、次いでブロッキング緩衝液中で１：８，０００に希釈した１００μＬのヤギ抗ヒトカッパＨＲＰ二次抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈカタログ番号２０６０－０５）を各ウェルに添加した。プレートを、二次抗体とともに室温で１時間プレートシェーカー上でインキュベートし、次いで前回と同様に洗浄した。ＴＭＢ基質を調製し（カタログ番号３４０２１）、１００μＬを全てのウェルに添加した。プレートを室温で３～５分間静的にインキュベートし、次いで１００μＬの１Ｎ ＨＣｌを全てのウェルに添加して、反応を停止させた。プレートを、プレートリーダーで４５０ｎｍで読み取った。ブランクについて減算したＥＬＩＳＡデータを、抗体濃度をＸ軸及びＯＤ４５０をＹ軸として、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ９にプロットした。非線形回帰を使用して、データを「Ｓ字形、４ＰＬ、Ｘは濃度である」モデルに当てはめることによって、曲線を生成した。
【0118】
点変異体を、プレート上にコーティングされたエピレギュリン変異体を用いたＥＬＩＳＡによって評価し、抗体１ Ｆａｂ希釈系列を添加し、シグナルを、抗カッパ二次体によって測定した（図５を参照されたい）。Ｙ９８Ａを除いて、全ての変異体は、減少した結合を示した。Ｈ７８Ａは、結合をほぼノックアウトし、Ｙ９８Ａは、試験した濃度で検出可能な結合を示さなかった。
【0119】
モノＦｃヒトＥＲＥＧ変異体に対する抗体１ Ｆａｂフラグメント結合のＳＰＲ分析
Ｂｉａｃｏｒｅ ８Ｋ機器及び試薬（Ｃｙｔｉｖａ）を使用して、両方のモノＦｃヒトＥＲＥＧ変異体に結合する抗体１ ＦａｂフラグメントのＳＰＲ分析を行った。低レベルのモノＦｃヒトＥＲＥＧ変異体を、アミンカップリングキット（Ｃｙｔｉｖａ Ｐ／Ｎ ＢＲ１０００５０）及びＢｉａｃｏｒｅ ８Ｋ制御ソフトウェアにおける「低レベルＣＭ５カップリング」法を使用して、ＣＭ５ Ｓシリーズセンサーチップ（Ｃｙｔｉｖａ Ｐ／Ｎ ＢＲ１００５３０）の試料フローセル（Ｆｃ２）中に固定化した。泳動緩衝液は、１Ｘ ＨＢＳ－ＥＰ＋ｐＨ７．４（２０Ｘ ＨＢＳ－ＥＰ＋、Ｔｅｋｎｏｖａ Ｐ／Ｎ Ｈ８０２２から調製）又は１Ｘ ＭＢＳ－ＥＰ＋ｐＨ６．０（１０ｍＭ ＭＥＳ＋１５０ｍＭ ＮａＣｌ＋３ｍＭ ＥＤＴＡ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）であり、泳動温度は３７℃であった。Ｂｉａｃｏｒｅ実験を、３つの独立した実験において、各独立した実験内の各希釈物の単一の複製を用いて実施した。Ｂｉａｃｏｒｅ Ｉｎｓｉｇｈｔ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｖｅｒｓｉｏｎ ３．０（Ｃｙｔｉｖａ）を用いて、「１：１結合」動態モデル（ＥＲＥＧバリアント）又は「定常状態親和性」モデルのいずれかを使用して、参照について減算し、ブランクについて減算したＳＰＲデータを分析して、ＫＤ値を決定した。
Ｂｉａｃｏｒｅ ８Ｋ機器及び試薬（Ｃｙｔｉｖａ）を使用して、両方のモノＦｃヒトＥＲＥＧ変異体に結合する抗体１ ＦａｂフラグメントのＳＰＲ分析を行った。低レベルのモノＦｃヒトＥＲＥＧ変異体を、アミンカップリングキット（Ｃｙｔｉｖａ Ｐ／Ｎ ＢＲ１０００５０）及びＢｉａｃｏｒｅ ８Ｋ制御ソフトウェアにおける「低レベルＣＭ５カップリング」法を使用して、ＣＭ５ Ｓシリーズセンサーチップ（Ｃｙｔｉｖａ Ｐ／Ｎ ＢＲ１００５３０）の試料フローセル（Ｆｃ２）中に固定化した。泳動緩衝液は、１Ｘ ＨＢＳ－ＥＰ＋ｐＨ７．４（２０Ｘ ＨＢＳ－ＥＰ＋、Ｔｅｋｎｏｖａ Ｐ／Ｎ Ｈ８０２２から調製）又は１Ｘ ＭＢＳ－ＥＰ＋ｐＨ６．０（１０ｍＭ ＭＥＳ＋１５０ｍＭ ＮａＣｌ＋３ｍＭ ＥＤＴＡ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）であり、泳動温度は３７℃であった。Ｂｉａｃｏｒｅ実験を、３つの独立した実験において、各独立した実験内の各希釈物の単一の複製を用いて実施した。Ｂｉａｃｏｒｅ Ｉｎｓｉｇｈｔ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｖｅｒｓｉｏｎ ３．０（Ｃｙｔｉｖａ）を用いて、「１：１結合」動態モデル（ＥＲＥＧバリアント）又は「定常状態親和性」モデルのいずれかを使用して、参照について減算し、ブランクについて減算したＳＰＲデータを分析して、ＫＤ値を決定した。
【0120】
抗体１ Ｆａｂを泳動緩衝液中で３００ｎＭ（ｐＨ７．４）又は９００ｎＭ（ｐＨ６．０）に希釈し、次いで３倍連続希釈して、合計７つの希釈とした。Ｆａｂを全てのフローセルに２４０秒間注入し、続いて５０μＬ／分の流速で１８００秒間の解離を行った。チップ表面を、７Ｍグアニジンを１００μＬ／分で２×３０秒注入して再生した。参照について減算したデータを、８つのチャネルの各々において、試料フローセルマイナス参照フローセル（Ｆｃ２－Ｆｃ１）として収集し、次いで参照について減算したデータを緩衝液ブランクについて減算した。
【0121】
変異体のサブセットの結合親和性を、３７℃でＢｉａｃｏｒｅによって測定した。結果を、３つの独立した複製測定の平均±標準偏差として表９に報告する。「ｒｅｌ」は、野生型（wild type、ｗｔ）に対する相対値を示す。
【0122】
【表10】
【0123】
表９の結果は、ｐＨ７．４で、Ｒ１０２Ａに対する３倍から、Ｆ１０６Ｋに対する１０００倍超までの、変異体に対する様々なより弱い親和性を示す。
【0124】
ヒトＥＧＦＲリガンドエピトープアラインメント
ＥＧＦＲリガンド配列アラインメント（図６）の文脈において、このデータは、Ｅ９５及びＦ１０６が、ＥＲＥＧ選択性にとって重要なエピトープ位置であることを示す。１００％保存されたＹ９８及びＲ１０２位は、結合には重要であるが、選択性には寄与していない。Ｌ７７及びＨ７８もまた、結合にとって重要であり、選択性に影響を与えるが、それらは、ＥＧＦＲリガンドにわたって高度に保存されており、したがってＥＲＥＧ特異的ではない。これらの結果により、ＥＲＥＧに対する抗体１の結合及び優れた選択性についての構造基盤が実証されるだけでなく、エピトープマッピング研究からのリガンド及び種選択性についての情報も得られる。
ＥＧＦＲリガンド配列アラインメント（図６）の文脈において、このデータは、Ｅ９５及びＦ１０６が、ＥＲＥＧ選択性にとって重要なエピトープ位置であることを示す。１００％保存されたＹ９８及びＲ１０２位は、結合には重要であるが、選択性には寄与していない。Ｌ７７及びＨ７８もまた、結合にとって重要であり、選択性に影響を与えるが、それらは、ＥＧＦＲリガンドにわたって高度に保存されており、したがってＥＲＥＧ特異的ではない。これらの結果により、ＥＲＥＧに対する抗体１の結合及び優れた選択性についての構造基盤が実証されるだけでなく、エピトープマッピング研究からのリガンド及び種選択性についての情報も得られる。
【0125】
アミノ酸及びヌクレオチド配列の配列表
抗体１の重鎖（配列番号１）
ＱＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＥＴＬＳＬＴＣＴＶＳＧＧＳＩＳＳＹＹＷＳＷＩＲＱＰＡＧＫＧＬＥＷＩＧＲＩＹＰＳＧＮＴＮＹＮＰＳＬＫＳＲＶＴＩＳＶＤＴＳＫＮＱＦＳＬＫＬＳＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＧＬＶＭＤＶＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧ
抗体１の重鎖（配列番号１）
ＱＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＥＴＬＳＬＴＣＴＶＳＧＧＳＩＳＳＹＹＷＳＷＩＲＱＰＡＧＫＧＬＥＷＩＧＲＩＹＰＳＧＮＴＮＹＮＰＳＬＫＳＲＶＴＩＳＶＤＴＳＫＮＱＦＳＬＫＬＳＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＧＬＶＭＤＶＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧ
【0126】
抗体１の軽鎖（配列番号２）
ＥＩＶＬＴＱＳＰＧＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＥＦＳＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＧＡＳＳＲＡＴＧＩＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＲＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＨＱＹＧＴＮＰＦＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
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【0127】
抗体１のＨＣＶＲ（配列番号３）
ＱＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＥＴＬＳＬＴＣＴＶＳＧＧＳＩＳＳＹＹＷＳＷＩＲＱＰＡＧＫＧＬＥＷＩＧＲＩＹＰＳＧＮＴＮＹＮＰＳＬＫＳＲＶＴＩＳＶＤＴＳＫＮＱＦＳＬＫＬＳＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＧＬＶＭＤＶＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
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【0128】
抗体１のＬＣＶＲ（配列番号４）
ＥＩＶＬＴＱＳＰＧＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＥＦＳＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＧＡＳＳＲＡＴＧＩＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＲＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＨＱＹＧＴＮＰＦＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ
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【0129】
抗体１のＨＣＤＲ１（配列番号５）
ＴＶＳＧＧＳＩＳＳＹＹＷＳ
ＴＶＳＧＧＳＩＳＳＹＹＷＳ
【0130】
抗体１のＨＣＤＲ２（配列番号６）
ＲＩＹＰＳＧＮＴＮ
ＲＩＹＰＳＧＮＴＮ
【0131】
抗体１のＨＣＤＲ３（配列番号７）
ＡＲＧＧＬＶＭＤＶ
ＡＲＧＧＬＶＭＤＶ
【0132】
抗体１のＬＣＤＲ１（配列番号８）
ＲＡＳＱＳＶＥＦＳＹＬＡ
ＲＡＳＱＳＶＥＦＳＹＬＡ
【0133】
抗体１のＬＣＤＲ２（配列番号９）
ＹＧＡＳＳＲＡＴ
ＹＧＡＳＳＲＡＴ
【0134】
抗体１のＬＣＤＲ３（配列番号１０）
ＨＱＹＧＴＮＰＦＴ
ＨＱＹＧＴＮＰＦＴ
【0135】
抗体１の重鎖をコードするＤＮＡ（配列番号１１）
ＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＣＡＧＧＡＧＴＣＧＧＧＴＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＴＧＡＡＧＣＣＴＴＣＧＧＡＧＡＣＣＣＴＧＴＣＣＣＴＣＡＣＣＴＧＣＡＣＴＧＴＣＴＣＴＧＧＴＧＧＣＴＣＣＡＴＣＡＧＴＴＣＧＴＡＣＴＡＣＴＧＧＡＧＣＴＧＧＡＴＴＣＧＧＣＡＧＣＣＣＧＣＡＧＧＧＡＡＧＧＧＡＣＴＧＧＡＧＴＧＧＡＴＴＧＧＧＡＧＧＡＴＣＴＡＴＣＣＧＡＧＴＧＧＧＡＡＣＡＣＣＡＡＣＴＡＣＡＡＣＣＣＣＴＣＣＣＴＣＡＡＧＡＧＴＣＧＡＧＴＣＡＣＣＡＴＡＴＣＡＧＴＡＧＡＣＡＣＧＴＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＴＴＣＴＣＣＣＴＧＡＡＧＣＴＧＡＧＣＴＣＴＧＴＧＡＣＣＧＣＴＧＣＧＧＡＣＡＣＧＧＣＣＧＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＡＧＡＧＧＡＧＧＡＣＴＧＧＴＧＡＴＧＧＡＣＧＴＧＴＧＧＧＧＡＣＡＧＧＧＡＡＣＡＣＴＡＧＴＧＡＣＣＧＴＧＡＧＴＡＧＣＧＣＣＴＣＣＡＣＣＡＡＧＧＧＣＣＣＡＴＣＧＧＴＣＴＴＣＣＣＧＣＴＡＧＣＧＣＣＣＴＧＣＴＣＣＡＧＧＡＧＣＡＣＣＴＣＣＧＡＧＡＧＣＡＣＡＧＣＣＧＣＣＣＴＧＧＧＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＧＧＡＣＴＡＣＴＴＣＣＣＣＧＡＡＣＣＧＧＴＧＡＣＧＧＴＧＴＣＧＴＧＧＡＡＣＴＣＡＧＧＣＧＣＣＣＴＧＡＣＣＡＧＣＧＧＣＧＴＧＣＡＣＡＣＣＴＴＣＣＣＧＧＣＴＧＴＣＣＴＡＣＡＧＴＣＣＴＣＡＧＧＡＣＴＣＴＡＣＴＣＣＣＴＣＡＧＣＡＧＣＧＴＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＣＣＣＴＣＣＡＧＣＡＧＣＴＴＧＧＧＣＡＣＧＡＡＧＡＣＣＴＡＣＡＣＣＴＧＣＡＡＣＧＴＡＧＡＴＣＡＣＡＡＧＣＣＣＡＧＣＡＡＣＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＡＧＴＴＧＡＧＴＣＣＡＡＡＴＡＴＧＧＴＣＣＣＣＣＡＴＧＣＣＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＡＧＣＡＣＣＴＧＡＧＧＣＣＧＣＣＧＧＧＧＧＡＣＣＡＴＣＡＧＴＣＴＴＣＣＴＧＴＴＣＣＣＣＣＣＡＡＡＡＣＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＴＣＴＣＡＴＧＡＴＣＴＣＣＣＧＧＡＣＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＣＧＴＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＣＧＴＧＡＧＣＣＡＧＧＡＡＧＡＣＣＣＣＧＡＧＧＴＣＣＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＴＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＴＡＡＴＧＣＣＡＡＧＡＣＡＡＡＧＣＣＧＣＧＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＴＣＡＡＣＡＧＣＡＣＧＴＡＣＣＧＴＧＴＧＧＴＣＡＧＣＧＴＣＣＴＣＡＣＣＧＴＣＣＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＣＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＧＧＴＣＴＣＣＡＡＣＡＡＡＧＧＣＣＴＣＣＣＧＴＣＣＴＣＣＡＴＣＧＡＧＡＡＡＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＡＧＣＣＡＡＡＧＧＧＣＡＧＣＣＣＣＧＡＧＡＧＣＣＡＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＡＴＣＣＣＡＧＧＡＧＧＡＧＡＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＡＧＧＣＴＴＣＴＡＣＣＣＣＡＧＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＡＡＧＣＡＡＴＧＧＧＣＡＧＣＣＧＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＧＣＣＴＣＣＣＧＴＧＣＴＧＧＡＣＴＣＣＧＡＣＧＧＣＴＣＣＴＴＣＴＴＣＣＴＣＴＡＣＡＧＣＡＧＧＣＴＡＡＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＧＧＴＧＧＣＡＧＧＡＧＧＧＧＡＡＴＧＴＣＴＴＣＴＣＡＴＧＣＴＣＣＧＴＧＡＴＧＣＡＴＧＡＧＧＣＴＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＡＣＡＧＡＡＧＡＧＣＣＴＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＣＴＧＧＧＴ
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【0136】
抗体１の軽鎖をコードするＤＮＡ（配列番号１２）
ＧＡＡＡＴＴＧＴＧＴＴＧＡＣＧＣＡＧＴＣＴＣＣＡＧＧＣＡＣＣＣＴＧＴＣＴＴＴＧＴＣＴＣＣＡＧＧＧＧＡＡＡＧＡＧＣＣＡＣＣＣＴＣＴＣＣＴＧＣＡＧＧＧＣＣＡＧＴＣＡＧＴＣＴＧＴＧＧＡＡＴＴＣＡＧＣＴＡＣＴＴＡＧＣＣＴＡＴＧＧＴＧＣＡＴＣＣＡＧＣＡＧＧＧＣＣＡＣＴＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＡＡＡＣＣＴＧＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＣＡＧＧＣＴＣＣＴＣＡＴＣＴＡＴＧＧＴＧＣＡＴＣＣＡＧＣＡＧＧＧＣＣＡＣＴＧＧＣＡＴＣＣＣＡＧＡＣＡＧＧＴＴＣＡＧＴＧＧＣＡＧＴＧＧＧＴＣＴＧＧＧＡＣＡＧＡＣＴＴＣＡＣＴＣＴＣＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＧＡＣＴＧＧＡＧＣＣＴＧＡＡＧＡＴＴＴＴＧＣＡＧＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＴＣＡＣＣＡＧＴＡＣＧＧＡＡＣＡＡＡＣＣＣＧＴＴＣＡＣＡＴＴＣＧＧＧＣＡＧＧＧＡＡＣＣＡＡＧＧＴＴＧＡＡＡＴＡＡＡＧＣＧＡＡＣＴＧＴＧＧＣＴＧＣＡＣＣＡＴＣＴＧＴＣＴＴＣＡＴＣＴＴＣＣＣＧＣＣＡＴＣＴＧＡＴＧＡＧＣＡＧＴＴＧＡＡＡＴＣＴＧＧＡＡＣＴＧＣＣＴＣＴＧＴＴＧＴＧＴＧＣＣＴＧＣＴＧＡＡＴＡＡＣＴＴＣＴＡＴＣＣＣＡＧＡＧＡＧＧＣＣＡＡＡＧＴＡＣＡＧＴＧＧＡＡＧＧＴＧＧＡＴＡＡＣＧＣＣＣＴＣＣＡＡＴＣＧＧＧＴＡＡＣＴＣＣＣＡＧＧＡＧＡＧＴＧＴＣＡＣＡＧＡＧＣＡＧＧＡＣＡＧＣＡＡＧＧＡＣＡＧＣＡＣＣＴＡＣＡＧＣＣＴＣＡＧＣＡＧＣＡＣＣＣＴＧＡＣＧＣＴＧＡＧＣＡＡＡＧＣＡＧＡＣＴＡＣＧＡＧＡＡＡＣＡＣＡＡＡＧＴＣＴＡＣＧＣＣＴＧＣＧＡＡＧＴＣＡＣＣＣＡＴＣＡＧＧＧＣＣＴＧＡＧＣＴＣＧＣＣＣＧＴＣＡＣＡＡＡＧＡＧＣＴＴＣＡＡＣＡＧＧＧＧＡＧＡＧＴＧＣ
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【0137】
ヒトエピレギュリン（配列番号２１）
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【0138】
ヒトエピレギュリン構築物（配列番号２２）
ＧＰＧＶＳＩＴＫＣＳＳＤＭＮＧＹＣＬＨＧＱＣＩＹＬＶＤＭＳＱＮＹＣＲＣＥＶＧＹＴＧＶＲＣＥＨＦＦＬＧ
ＧＰＧＶＳＩＴＫＣＳＳＤＭＮＧＹＣＬＨＧＱＣＩＹＬＶＤＭＳＱＮＹＣＲＣＥＶＧＹＴＧＶＲＣＥＨＦＦＬＧ
【0139】
カニクイザルエピレギュリン（配列番号２３）
ＶＳＩＴＫＣＮＳＤＭＮＧＹＣＬＨＧＱＣＩＹＬＶＤＭＳＱＮＹＣＲＣＥＶＧＹＴＧＶＲＣＥＨＦＹＬ
ＶＳＩＴＫＣＮＳＤＭＮＧＹＣＬＨＧＱＣＩＹＬＶＤＭＳＱＮＹＣＲＣＥＶＧＹＴＧＶＲＣＥＨＦＹＬ
【0140】
ラットエピレギュリン（配列番号２４）
ＶＬＩＴＫＣＳＳＤＭＤＧＹＣＬＨＧＨＣＩＹＬＶＤＭＳＥＫＹＣＲＣＥＶＧＹＴＧＬＲＣＥＨＦＦＬ
ＶＬＩＴＫＣＳＳＤＭＤＧＹＣＬＨＧＨＣＩＹＬＶＤＭＳＥＫＹＣＲＣＥＶＧＹＴＧＬＲＣＥＨＦＦＬ
【0141】
ウサギエピレギュリン（配列番号２５）
ＶＳＩＴＫＣＧＳＤＭＮＧＹＣＬＨＧＱＣＩＹＬＶＤＭＳＥＮＹＣＲＣＥＶＧＹＴＧＶＲＣＥＨＦＦＬ
ＶＳＩＴＫＣＧＳＤＭＮＧＹＣＬＨＧＱＣＩＹＬＶＤＭＳＥＮＹＣＲＣＥＶＧＹＴＧＶＲＣＥＨＦＦＬ
【0142】
完全長ヒトエピレギュリン（膜結合、Ｔ１１１Ｐ変異あり）（配列番号２６）
ＭＴＡＧＲＲＭＥＭＬＣＡＧＲＶＰＡＬＬＬＣＬＧＦＨＬＬＱＡＶＬＳＴＴＶＩＰＳＣＩＰＧＥＳＳＤＮＣＴＡＬＶＱＴＥＤＮＰＲＶＡＱＶＳＩＴＫＣＳＳＤＭＮＧＹＣＬＨＧＱＣＩＹＬＶＤＭＳＱＮＹＣＲＣＥＶＧＹＴＧＶＲＣＥＨＦＦＬＴＶＰＱＰＬＳＫＥＹＶＡＬＴＶＩＬＩＩＬＦＬＩＴＶＶＧＳＴＹＹＦＣＲＷＹＲＮＲＫＳＫＥＰＫＫＥＹＥＲＶＴＳＧＤＰＥＬＰＱＶ
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【0143】
単量体Ｆｃヒトエピレギュリン（配列番号２７）
ＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＱＬＥＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＬＥＶＬＦＱＧＰＧＶＳＩＴＫＣＳＳＤＭＮＧＹＣＬＨＧＱＣＩＹＬＶＤＭＳＱＮＹＣＲＣＥＶＧＹＴＧＶＲＣＥＨＦＦＬＧ
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【0144】
切断されたマウスＥＲＥＧ（配列番号２８）
ＧＰＧＶＱＩＴＫＣＳＳＤＭＤＧＹＣＬＨＧＱＣＩＹＬＶＤＭＲＥＫＦＣＲＣＥＶＧＹＴＧＬＲＣＥＨＦＦＬＧ
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【0145】
マウスＴＧＦα Ｈｉｓ（配列番号２９）
ＶＶＳＨＦＮＫＣＰＤＳＨＴＱＹＣＦＨＧＴＣＲＦＬＶＱＥＥＫＰＡＣＶＣＨＳＧＹＶＧＶＲＣＥＨＡＤＬＬＡＧＨＨＨＨＨＨ
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【0146】
抗体１のＨＣＤＲ１（Ｋａｂａｔ）（配列番号３１）
ＳＹＹＷＳ
ＳＹＹＷＳ
【0147】
抗体１のＨＣＤＲ２（Ｋａｂａｔ）（配列番号３２）
ＲＩＹＰＳＧＮＴＮＹＮＰＳＬＫＳ
ＲＩＹＰＳＧＮＴＮＹＮＰＳＬＫＳ
【0148】
抗体１のＨＣＤＲ３（Ｋａｂａｔ）（配列番号３３）
ＧＧＬＶＭＤＶ
ＧＧＬＶＭＤＶ
【0149】
抗体１のＬＣＤＲ１（Ｋａｂａｔ）（配列番号３４）
ＲＡＳＱＳＶＥＦＳＹＬＡ
ＲＡＳＱＳＶＥＦＳＹＬＡ
【0150】
抗体１のＬＣＤＲ２（Ｋａｂａｔ）（配列番号３５）
ＧＡＳＳＲＡＴ
ＧＡＳＳＲＡＴ
【0151】
抗体１のＬＣＤＲ３（Ｋａｂａｔ）（配列番号３６）
ＨＱＹＧＴＮＰＦＴ
ＨＱＹＧＴＮＰＦＴ
【0152】
抗体１のＨＣＤＲ１（Ｃｈｏｔｈｉａ）（配列番号３７）
ＧＧＳＩＳＳＹ
ＧＧＳＩＳＳＹ
【0153】
抗体１のＨＣＤＲ２（Ｃｈｏｔｈｉａ）（配列番号３８）
ＹＰＳＧＮ
ＹＰＳＧＮ
【0154】
抗体１のＨＣＤＲ３（Ｃｈｏｔｈｉａ）（配列番号３９）
ＧＧＬＶＭＤＶ
ＧＧＬＶＭＤＶ
【0155】
抗体１のＬＣＤＲ１（Ｃｈｏｔｈｉａ）（配列番号４０）
ＲＡＳＱＳＶＥＦＳＹＬＡ
ＲＡＳＱＳＶＥＦＳＹＬＡ
【0156】
抗体１のＬＣＤＲ２（Ｃｈｏｔｈｉａ）（配列番号４１）
ＧＡＳＳＲＡＴ
ＧＡＳＳＲＡＴ
【0157】
抗体１のＬＣＤＲ３（Ｃｈｏｔｈｉａ）（配列番号４２）
ＨＱＹＧＴＮＰＦＴ
ＨＱＹＧＴＮＰＦＴ
【0158】
抗体１のＨＣＤＲ１（ＩＭＧＴ）（配列番号４３）
ＧＧＳＩＳＳＹＹ
ＧＧＳＩＳＳＹＹ
【0159】
抗体１のＨＣＤＲ２（ＩＭＧＴ）（配列番号４４）
ＩＹＰＳＧＮＴ
ＩＹＰＳＧＮＴ
【0160】
抗体１のＨＣＤＲ３（ＩＭＧＴ）（配列番号４５）
ＡＲＧＧＬＶＭＤＶ
ＡＲＧＧＬＶＭＤＶ
【0161】
抗体１のＬＣＤＲ１（ＩＭＧＴ）（配列番号４６）
ＱＳＶＥＦＳＹ
ＱＳＶＥＦＳＹ
【0162】
抗体１のＬＣＤＲ２（ＩＭＧＴ）（配列番号４７）
ＧＡＳ
ＧＡＳ
【0163】
抗体１のＬＣＤＲ３（ＩＭＧＴ）（配列番号４８）
ＨＱＹＧＴＮＰＦＴ
ＨＱＹＧＴＮＰＦＴ
【0164】
ＩｇＧ４ＰＡＡヒンジ領域（配列番号５１）
ＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰ
ＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰ
【0165】
ＩｇＧ４ＰＡＡ Ｆｃ領域（配列番号５２）
ＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧ
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【0166】
モノＦｃ ｈｕＥＲＥＧ Ｌ７７Ｆ（配列番号５３）
ＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＱＬＥＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＬＥＶＬＦＱＧＰＧＶＳＩＴＫＣＳＳＤＭＮＧＹＣＦＨＧＱＣＩＹＬＶＤＭＳＱＮＹＣＲＣＥＶＧＹＴＧＶＲＣＥＨＦＦＬＧ
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【0167】
モノＦｃ ｈｕＥＲＥＧ Ｈ７８Ａ（配列番号５４）
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【0168】
モノＦｃ ｈｕＥＲＥＧ Ｈ７８Ｎ（配列番号５５）
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【0169】
モノＦｃ ｈｕＥＲＥＧ Ｅ９５Ａ（配列番号５６）
ＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＱＬＥＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＬＥＶＬＦＱＧＰＧＶＳＩＴＫＣＳＳＤＭＮＧＹＣＬＨＧＱＣＩＹＬＶＤＭＳＱＮＹＣＲＣＡＶＧＹＴＧＶＲＣＥＨＦＦＬＧ
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【0170】
モノＦｃ ｈｕＥＲＥＧ Ｅ９５Ｈ（配列番号５７）
ＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＱＬＥＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＬＥＶＬＦＱＧＰＧＶＳＩＴＫＣＳＳＤＭＮＧＹＣＬＨＧＱＣＩＹＬＶＤＭＳＱＮＹＣＲＣＨＶＧＹＴＧＶＲＣＥＨＦＦＬＧ
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【0171】
モノＦｃ ｈｕＥＲＥＧ Ｙ９８Ａ（配列番号５８）
ＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＱＬＥＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＬＥＶＬＦＱＧＰＧＶＳＩＴＫＣＳＳＤＭＮＧＹＣＬＨＧＱＣＩＹＬＶＤＭＳＱＮＹＣＲＣＥＶＧＡＴＧＶＲＣＥＨＦＦＬＧ
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【0172】
モノＦｃ ｈｕＥＲＥＧ Ｒ１０２Ａ（配列番号５９）
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【0173】
モノＦｃ ｈｕＥＲＥＧ Ｆ１０６Ａ（配列番号６０）
ＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＱＬＥＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＬＥＶＬＦＱＧＰＧＶＳＩＴＫＣＳＳＤＭＮＧＹＣＬＨＧＱＣＩＹＬＶＤＭＳＱＮＹＣＲＣＥＶＧＹＴＧＶＲＣＥＨＡＦＬＧ
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【0174】
モノＦｃ ｈｕＥＲＥＧ Ｆ１０６Ｋ（配列番号６１）
ＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＱＬＥＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＬＥＶＬＦＱＧＰＧＶＳＩＴＫＣＳＳＤＭＮＧＹＣＬＨＧＱＣＩＹＬＶＤＭＳＱＮＹＣＲＣＥＶＧＹＴＧＶＲＣＥＨＡＫＬＧ
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【0175】
抗体１ Ｆａｂ ＨＣ（配列番号６２）
ＱＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＥＴＬＳＬＴＣＴＶＳＧＧＳＩＳＳＹＹＷＳＷＩＲＱＰＡＧＫＧＬＥＷＩＧＲＩＹＰＳＧＮＴＮＹＮＰＳＬＫＳＲＶＴＩＳＶＤＴＳＫＮＱＦＳＬＫＬＳＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＧＬＶＭＤＶＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫ
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【0176】
抗体１ Ｆａｂ ＬＣ（配列番号６３）
ＥＩＶＬＴＱＳＰＧＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＥＦＳＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＧＡＳＳＲＡＴＧＩＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＲＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＨＱＹＧＴＮＰＦＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＱＧＴＴＳＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
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【0177】
抗体１ ＶＲキメラｈ／ｍＩｇＧ１ ＨＣ（配列番号６４）
ＱＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＥＴＬＳＬＴＣＴＶＳＧＧＳＩＳＳＹＹＷＳＷＩＲＱＰＡＧＫＧＬＥＷＩＧＲＩＹＰＳＧＮＴＮＹＮＰＳＬＫＳＲＶＴＩＳＶＤＴＳＫＮＱＦＳＬＫＬＳＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＧＬＶＭＤＶＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＧＳＡＡＱＴＮＳＭＶＴＬＧＣＬＶＫＧＹＦＰＥＰＶＴＶＴＷＮＳＧＳＬＳＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＤＬＹＴＬＳＳＳＶＴＶＰＳＳＴＷＰＳＥＴＶＴＣＮＶＡＨＰＡＳＳＴＫＶＤＫＫＩＶＰＲＤＣＧＣＫＰＣＩＣＴＶＰＥＶＳＳＶＦＩＦＰＰＫＰＫＤＶＬＴＩＴＬＴＰＫＶＴＣＶＶＶＤＩＳＫＤＤＰＥＶＱＦＳＷＦＶＤＤＶＥＶＨＴＡＱＴＱＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＳＶＳＥＬＰＩＭＨＱＤＷＬＮＧＫＥＦＫＣＲＶＮＳＡＡＦＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＲＰＫＡＰＱＶＹＴＩＰＰＰＫＥＱＭＡＫＤＫＶＳＬＴＣＭＩＴＤＦＦＰＥＤＩＴＶＥＷＱＷＮＧＱＰＡＥＮＹＫＮＴＱＰＩＭＤＴＤＧＳＹＦＶＹＳＫＬＮＶＱＫＳＮＷＥＡＧＮＴＦＴＣＳＶＬＨＥＧＬＨＮＨＨＴＥＫＳＬＳＨＳＰＧＫ
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【0178】
抗体１ ＶＲキメラｈ／ｍカッパＬＣ（配列番号６５）
ＥＩＶＬＴＱＳＰＧＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＥＦＳＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＧＡＳＳＲＡＴＧＩＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＲＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＨＱＹＧＴＮＰＦＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＴＶＳＩＦＰＰＳＳＥＱＬＴＳＧＧＡＳＶＶＣＦＬＮＮＦＹＰＫＤＩＮＶＫＷＫＩＤＧＳＥＲＱＮＧＶＬＮＳＷＴＤＱＤＳＫＤＳＴＹＳＭＳＳＴＬＴＬＴＫＤＥＹＥＲＨＮＳＹＴＣＥＡＴＨＫＴＳＴＳＰＩＶＫＳＦＮＲＮＥＣ
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【0179】
ヒトエピゲン／ＥＰＧＮ（配列番号６６）
ＫＦＳＨＬＣＬＥＤＨＮＳＹＣＩＮＧＡＣＡＦＨＨＥＬＥＫＡＩＣＲＣＦＴＧＹＴＧＥＲＣＥＨＬＴＬＴ
ＫＦＳＨＬＣＬＥＤＨＮＳＹＣＩＮＧＡＣＡＦＨＨＥＬＥＫＡＩＣＲＣＦＴＧＹＴＧＥＲＣＥＨＬＴＬＴ
【0180】
ヒトアンフィレギュリン／ＡＲＥＧ（配列番号６７）
ＫＫＫＮＰＣＮＡＥＦＱＮＦＣＩＨＧＥＣＫＹＩＥＨＬＥＡＶＴＣＫＣＱＱＥＹＦＧＥＲＣＧＥＫＳＭＫ
ＫＫＫＮＰＣＮＡＥＦＱＮＦＣＩＨＧＥＣＫＹＩＥＨＬＥＡＶＴＣＫＣＱＱＥＹＦＧＥＲＣＧＥＫＳＭＫ
【0181】
ヒトヘパリン結合上皮成長因子／ＨＢＥＧＦ（配列番号６８）
ＫＫＲＤＰＣＬＲＫＹＫＤＦＣＩＨＧＥＣＫＹＶＫＥＬＲＡＰＳＣＩＣＨＰＧＹＨＧＥＲＣＨＧＬＳＬ
ＫＫＲＤＰＣＬＲＫＹＫＤＦＣＩＨＧＥＣＫＹＶＫＥＬＲＡＰＳＣＩＣＨＰＧＹＨＧＥＲＣＨＧＬＳＬ
【0182】
ヒトベータセルリン／ＢＴＣ（配列番号６９）
ＧＨＦＳＲＣＰＫＱＹＫＨＹＣＩＫＧＲＣＲＦＶＶＡＥＱＴＰＳＣＶＣＤＥＧＹＩＧＡＲＣＥＲＶＤＬＦＹ
ＧＨＦＳＲＣＰＫＱＹＫＨＹＣＩＫＧＲＣＲＦＶＶＡＥＱＴＰＳＣＶＣＤＥＧＹＩＧＡＲＣＥＲＶＤＬＦＹ
【0183】
ヒト形質転換成長因子アルファ／ＴＧＦα（配列番号７０）
ＶＶＳＨＦＮＤＣＰＤＳＨＴＱＦＣＦＨＧＴＣＲＦＬＶＱＥＤＫＰＡＣＶＣＨＳＧＹＶＧＡＲＣＥＨＡＤＬＬＡ
ＶＶＳＨＦＮＤＣＰＤＳＨＴＱＦＣＦＨＧＴＣＲＦＬＶＱＥＤＫＰＡＣＶＣＨＳＧＹＶＧＡＲＣＥＨＡＤＬＬＡ
【0184】
ヒト上皮成長因子／ＥＧＦ（配列番号７１）
ＮＳＤＳＥＣＰＬＳＨＤＧＹＣＬＨＤＧＶＣＭＹＩＥＡＬＤＫＹＡＣＮＣＶＶＧＹＩＧＥＲＣＱＹＲＤＬＫＷ
ＮＳＤＳＥＣＰＬＳＨＤＧＹＣＬＨＤＧＶＣＭＹＩＥＡＬＤＫＹＡＣＮＣＶＶＧＹＩＧＥＲＣＱＹＲＤＬＫＷ
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2023-11-17
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ヒトエピレギュリンに結合する抗体であって、前記抗体が、重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、前記ＶＨが、重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み、前記ＶＬが、軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含み、前記ＨＣＤＲ１が、配列番号５を含み、
前記ＨＣＤＲ２が、配列番号６を含み、
前記ＨＣＤＲ３が、配列番号７を含み、
前記ＬＣＤＲ１が、配列番号８を含み、
前記ＬＣＤＲ２が、配列番号９を含み、
前記ＬＣＤＲ３が、配列番号１０を含む、抗体。
【請求項2】
前記ＶＨが、配列番号３を含み、前記ＶＬが、配列番号４を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項3】
前記抗体が、配列番号１を含む重鎖（ＨＣ）及び配列番号２を含む軽鎖（ＬＣ）を含む、請求項１又は２に記載の抗体。
【請求項4】
配列番号１１又は１２の配列を含む、核酸。
【請求項5】
請求項４に記載の核酸を含む、ベクター。
【請求項6】
前記ベクターが、配列番号１１の第１の核酸配列及び配列番号１２の第２の核酸配列を含む、請求項５に記載のベクター。
【請求項7】
配列番号１１の核酸配列を含む第１のベクター及び配列番号１２の核酸配列を含む第２のベクターを含む、組成物。
【請求項8】
請求項５又は６に記載のベクターを含む、細胞。
【請求項9】
配列番号１１の核酸配列を含む第１のベクター及び配列番号１２の核酸配列を含む第２のベクターを含む、細胞。
【請求項10】
前記細胞が、哺乳動物細胞である、請求項８又は９に記載の細胞。
【請求項11】
抗体を産生するプロセスであって、前記抗体が発現するような条件下で、請求項８～１０のいずれか一項に記載の細胞を培養することと、発現した前記抗体を培養培地から回収することと、を含む、プロセス。
【請求項12】
請求項１１に記載のプロセスによって産生される、抗体。
【請求項13】
請求項１～３又は１２のいずれか一項に記載の抗体と、薬学的に許容される賦形剤、希釈剤又は担体と、を含む、医薬組成物。
【請求項14】
治療有効量の請求項１～３若しくは１２のいずれか一項に記載の抗体又は請求項１３に記載の医薬組成物を含む、疼痛障害の治療用医薬組成物。
【請求項15】
前記疼痛障害が、変形性関節症疼痛、糖尿病性末梢神経障害疼痛及び慢性腰痛症からなる群から選択される、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項16】
前記疼痛障害が、変形性関節症疼痛である、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項17】
前記疼痛障害が、糖尿病性末梢神経障害疼痛である、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項18】
前記疼痛障害が、慢性腰痛症である、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項19】
前記疼痛障害が、療法抵抗性である、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項20】
療法に使用するための、請求項１～３又は１２のいずれか一項に記載の抗体を含む医薬。
【請求項21】
請求項１～３若しくは１２のいずれか一項に記載の抗体を含む疼痛障害の治療に使用するための医薬。
【請求項22】
前記疼痛障害が、変形性関節症疼痛、糖尿病性末梢神経障害疼痛及び慢性腰痛症からなる群から選択される、請求項２１に記載の医薬。
【請求項23】
前記疼痛障害が、変形性関節症疼痛である、請求項２１に記載の医薬。
【請求項24】
前記疼痛障害が、糖尿病性末梢神経障害疼痛である、請求項２１に記載の医薬。
【請求項25】
前記疼痛障害が、慢性腰痛症である、請求項２１に記載の医薬。
【請求項26】
疼痛障害の治療のための医薬品の製造における、請求項１～３又は１２のいずれか一項に記載の抗体の使用。
【請求項27】
前記疼痛障害が、変形性関節症疼痛、糖尿病性末梢神経障害疼痛及び慢性腰痛症からなる群から選択される、請求項２６に記載の使用。
【請求項28】
体液試料中のヒトエピレギュリンレベルを決定する方法であって、（ａ）前記体液試料を、請求項１～３のいずれか一項に記載の抗ヒトエピレギュリン診断用モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントと接触させることと、
（ｂ）任意選択で、非特異的に結合したあらゆるモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントを除去することと、
（ｃ）ヒトエピレギュリンに特異的に結合するモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントの量を検出及び／又は定量化することと、を含む、方法。
【請求項29】
前記体液試料が、血液、血清若しくは血漿試料、又は脳脊髄液試料であり、前記接触させることが、エクスビボで生じる、請求項２８に記載の方法。【国際調査報告】