特表 2024-522095 抗体

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-06-11

(54)【発明の名称】抗体

(51)【国際特許分類】

   C07K 16/28 20060101AFI20240604BHJP

   C07K 16/46 20060101ALI20240604BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20240604BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20240604BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20240604BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20240604BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20240604BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20240604BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20240604BHJP

   A61K 31/7088 20060101ALI20240604BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20240604BHJP

   A61K 35/76 20150101ALI20240604BHJP

   A61K 35/12 20150101ALI20240604BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20240604BHJP

   A61P 17/00 20060101ALI20240604BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20240604BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20240604BHJP

   A61P 37/02 20060101ALI20240604BHJP

   A61P 19/02 20060101ALI20240604BHJP

   A61P 37/08 20060101ALI20240604BHJP

   A61P 11/06 20060101ALI20240604BHJP

   A61P 17/14 20060101ALI20240604BHJP

   A61P 17/06 20060101ALI20240604BHJP

【ＦＩ】

C07K16/28 ZNA

C07K16/46

C12N15/13

C12N15/63 Z

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

A61K39/395 N

A61K31/7088

A61K48/00

A61K35/76

A61K35/12

A61P29/00

A61P17/00

A61K45/00

A61P43/00 121

A61P37/02

A61P19/02

A61P37/08

A61P11/06

A61P17/14

A61P17/06

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023572771

(86)(22)【出願日】2022-05-20

(85)【翻訳文提出日】2024-01-23

(86)【国際出願番号】 GB2022051285

(87)【国際公開番号】W WO2022248839

(87)【国際公開日】2022-12-01

(31)【優先権主張番号】2107517.1

(32)【優先日】2021-05-26

(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB

(31)【優先権主張番号】2116709.3

(32)【優先日】2021-11-19

(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】507226592

【氏名又は名称】オックスフォード ユニヴァーシティ イノヴェーション リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100106518

【弁理士】

【氏名又は名称】松谷 道子

(74)【代理人】

【識別番号】100122301

【弁理士】

【氏名又は名称】冨田 憲史

(74)【代理人】

【識別番号】100170520

【弁理士】

【氏名又は名称】笹倉 真奈美

(74)【代理人】

【識別番号】100221545

【弁理士】

【氏名又は名称】白江 雄介

(72)【発明者】

【氏名】オッグ，グレアム

(72)【発明者】

【氏名】ハードマン，クレア

(72)【発明者】

【氏名】チェン，イー－リン

【テーマコード（参考）】

4B065

4C084

4C085

4C086

4C087

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B065AA01X

4B065AA57X

4B065AA72X

4B065AA87X

4B065AA92Y

4B065AA94Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA25

4B065CA44

4B065CA46

4C084AA13

4C084AA19

4C084NA14

4C084ZA02

4C084ZA61

4C084ZA89

4C084ZA92

4C084ZA96

4C084ZB07

4C084ZB11

4C084ZB13

4C084ZB15

4C084ZC75

4C085AA14

4C085BB11

4C085DD62

4C085EE01

4C085EE03

4C086AA01

4C086AA02

4C086EA16

4C086MA01

4C086MA02

4C086MA04

4C086NA14

4C086ZA02

4C086ZA61

4C086ZA89

4C086ZA92

4C086ZA96

4C086ZB07

4C086ZB11

4C086ZB13

4C086ZB15

4C086ZC75

4C087AA01

4C087AA02

4C087BB65

4C087BC83

4C087CA12

4C087NA14

4C087ZA02

4C087ZA61

4C087ZA89

4C087ZA92

4C087ZA96

4C087ZB07

4C087ZB11

4C087ZB13

4C087ZB15

4C087ZC75

4H045AA11

4H045AA30

4H045BA57

4H045DA76

4H045EA20

4H045EA28

4H045EA50

4H045EA51

4H045FA74

(57)【要約】

本発明は、ＣＤ１ａに結合可能な抗体またはその抗原結合断片であって、１つもしくは複数の炎症性皮膚もしくは粘膜障害、または１つもしくは複数の関連する全身性疾患もしくは障害、または１つもしくは複数の全身的に現れる炎症性薬物反応、またはＣＤ１ａ発現悪性疾患の治療または予防に特に適する、抗体またはその抗原結合断片に関する。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

１つもしくは複数の炎症性皮膚もしくは粘膜疾患もしくは障害、または１つもしくは複数の関連する全身性疾患もしくは障害、または１つもしくは複数の全身的に現れる炎症性薬物反応、または１つもしくは複数のＣＤ１ａ発現悪性疾患の治療または予防における使用のための、ＣＤ１ａに結合する抗体またはその抗原結合断片。

【請求項2】

ａ）配列番号３５もしくはそれに対して少なくとも８０％の同一性を有する配列のＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、および／または配列番号３８もしくはそれに対して少なくとも８０％の同一性を有する配列のＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、あるいは
ｂ）配列番号３もしくはそれに対する少なくとも８０％の同一性を有する配列の相補性決定領域ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、および／または配列番号６もしくはそれに対して少なくとも８０％の同一性を有する配列のＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、あるいは
ｃ）配列番号１１もしくはそれに対して少なくとも８０％の同一性を有する配列のＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、および／または配列番号１４もしくはそれに対して少なくとも８０％の同一性を有する配列のＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、あるいは
ｄ）配列番号１９もしくはそれに対して少なくとも８０％の同一性を有する配列のＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、および／または配列番号２２もしくはそれに対して少なくとも８０％の同一性を有する配列のＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、あるいは
ｅ）配列番号２７もしくはそれに対して少なくとも８０％の同一性を有する配列のＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、および／または配列番号３０もしくはそれに対して少なくとも８０％の同一性を有する配列のＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域
を含む、抗体またはその抗原結合断片。

【請求項3】

ａ）配列番号３３のＣＤＲ１、
配列番号３４のＣＤＲ２、および
配列番号３５のＣＤＲ３、
もしくはそれらに対して少なくとも８０％の同一性を有する配列
を含む重鎖可変領域、ならびに／または
配列番号３６のＣＤＲ１、
配列番号３７のＣＤＲ２、および
配列番号３８のＣＤＲ３、
もしくはそれらに対して少なくとも８０％の同一性を有する配列
を含む軽鎖可変領域、あるいは
ｂ）配列番号１のＣＤＲ１、
配列番号２のＣＤＲ２、および
配列番号３のＣＤＲ３、
もしくはそれらに対して少なくとも８０％の同一性を有する配列
を含む重鎖可変領域、ならびに／または
配列番号４のＣＤＲ１、
配列番号５のＣＤＲ２、および
配列番号６のＣＤＲ３、
もしくはそれらに対して少なくとも８０％の同一性を有する配列
を含む軽鎖可変領域、あるいは
ｃ）配列番号９のＣＤＲ１、
配列番号１０のＣＤＲ２、および
配列番号１１のＣＤＲ３、
もしくはそれらに対して少なくとも８０％の同一性を有する配列
を含む重鎖可変領域、ならびに／または
配列番号１２のＣＤＲ１、
配列番号１３のＣＤＲ２、および
配列番号１４のＣＤＲ３、
もしくはそれらに対して少なくとも８０％の同一性を有する配列
を含む軽鎖可変領域、あるいは
ｄ）配列番号１７のＣＤＲ１、
配列番号１８のＣＤＲ２、および
配列番号１９のＣＤＲ３、
もしくはそれらに対して少なくとも８０％の同一性を有する配列
を含む重鎖可変領域、ならびに／または
配列番号２０のＣＤＲ１、
配列番号２１のＣＤＲ２、および
配列番号２２のＣＤＲ３、
もしくはそれらに対して少なくとも８０％の同一性を有する配列
を含む軽鎖可変領域、あるいは
ｅ）配列番号２５のＣＤＲ１、
配列番号２６のＣＤＲ２、および
配列番号２７のＣＤＲ３、
もしくはそれらに対して少なくとも８０％の同一性を有する配列
を含む重鎖可変領域、ならびに／または
配列番号２８のＣＤＲ１、
配列番号２９のＣＤＲ２、および
配列番号３０のＣＤＲ３、
もしくはそれらに対して少なくとも８０％の同一性を有する配列
を含む軽鎖可変領域
を含む、抗体またはその抗原結合断片。

【請求項4】

ｅ）配列番号３９を含むかもしくはそれからなる重鎖可変領域、および／または配列番号４０を含むかもしくはそれからなる軽鎖可変領域
あるいはそれらに対して少なくとも８０％の同一性を有する配列、あるいは
ｂ）配列番号７を含むかもしくはそれからなる重鎖可変領域、および／または配列番号８を含むかもしくはそれからなる軽鎖可変領域
あるいはそれらに対して少なくとも８０％の同一性を有する配列、あるいは
ｃ）配列番号１５を含むかもしくはそれからなる重鎖可変領域、および／または配列番号１６を含むかもしくはそれからなる軽鎖可変領域
あるいはそれらに対して少なくとも８０％の同一性を有する配列、あるいは
ｄ）配列番号２３を含むかもしくはそれからなる重鎖可変領域、および／または配列番号２４を含むかもしくはそれからなる軽鎖可変領域
あるいはそれらに対して少なくとも８０％の同一性を有する配列、あるいは
ｅ）配列番号３１を含むかもしくはそれからなる重鎖可変領域、および／または配列番号３２を含むかもしくはそれからなる軽鎖可変領域
あるいはそれらに対して少なくとも８０％の同一性を有する配列
を含む、抗体またはその抗原結合断片。

【請求項5】

ａ）配列番号４９を含むかもしくはそれからなる重鎖、および／または配列番号５０を含むかもしくはそれからなる軽鎖、
あるいはそれらに対して少なくとも８０％の同一性を有する配列、あるいは
ｂ）配列番号４１を含むかもしくはそれからなる重鎖、および／または配列番号４２を含むかもしくはそれからなる軽鎖、
あるいはそれらに対して少なくとも８０％の同一性を有する配列、あるいは
ｃ）配列番号４３を含むかもしくはそれからなる重鎖、および／または配列番号４４を含むかもしくはそれからなる軽鎖、
あるいはそれらに対して少なくとも８０％の同一性を有する配列、あるいは
ｄ）配列番号４５を含むかもしくはそれからなる重鎖、および／または配列番号４６を含むかもしくはそれからなる軽鎖、
あるいはそれらに対して少なくとも８０％の同一性を有する配列、あるいは
ｅ）配列番号４７を含むかもしくはそれからなる重鎖、および／または配列番号４８を含むかもしくはそれからなる軽鎖、
あるいはそれらに対して少なくとも８０％の同一性を有する配列
を含む、抗体またはその抗原結合断片。

【請求項6】

ＳｃＦｖまたは他の修飾フォーマットを含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。

【請求項7】

安定化および／または半減期を延長するように修飾し、前記修飾が、ＰＥＧ化であってもよい、請求項１から６のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。

【請求項8】

ヒト化抗体またはその抗原結合断片である、請求項１から７のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。

【請求項9】

ヒトＩｇＧ１アイソタイプもしくはヒトＩｇＧ４アイソタイプまたは他の天然もしくは修飾アイソタイプである、請求項１から８のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。

【請求項10】

二特異性または多特異性抗体またはその抗原結合断片である、請求項１から９のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。

【請求項11】

請求項１から１０のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片をコードする核酸。

【請求項12】

請求項１１に記載の核酸を含むベクター。

【請求項13】

発現ベクター、プラスミド、またはウイルスベクターである、請求項１２に記載のベクター。

【請求項14】

請求項１から１０のいずれか一項に記載の抗体もしくはその抗原結合断片、請求項１１に記載の核酸、および／または請求項１２もしくは請求項１３に記載のベクターを含む、宿主細胞。

【請求項15】

細菌細胞または哺乳動物細胞である、請求項１４に記載の宿主細胞。

【請求項16】

請求項１から１０のいずれか一項に記載の１つもしくは複数の抗体もしくはその抗原結合断片、請求項１１に記載の核酸、請求項１２もしくは請求項１３に記載のベクター、および／または請求項１４もしくは請求項１５に記載の宿主細胞を含む、医薬組成物。

【請求項17】

医学における使用のための、請求項２から１０のいずれか一項に記載の抗体もしくはその抗原結合断片、請求項１１に記載の核酸、請求項１２もしくは請求項１３に記載のベクター、請求項１４もしくは請求項１５に記載の宿主細胞、または請求項１６に記載の医薬組成物。

【請求項18】

１つもしくは複数の炎症性皮膚もしくは粘膜疾患もしくは障害、または１つもしくは複数の関連する全身性疾患もしくは障害、または１つもしくは複数の全身的に現れる炎症性薬物反応、またはＣＤ１ａ発現悪性疾患の治療または予防における使用のための、請求項２から１０のいずれか一項に記載の１つもしくは複数の抗体もしくはその抗原結合断片、請求項１１に記載の１つもしくは複数の核酸、請求項１２もしくは請求項１３に記載の１つもしくは複数のベクター、請求項１４もしくは請求項１５に記載の１つもしくは複数の宿主細胞、または請求項１６に記載の１つもしくは複数の医薬組成物。

【請求項19】

２つの抗体またはその抗原結合断片を含むかまたはそれらからなり、それぞれが、
ａ）配列番号３３のＣＤＲ１、配列番号３４のＣＤＲ２、および配列番号３５のＣＤＲ３、またはそれらに対して少なくとも８０％の同一性を有する配列
を含む重鎖可変領域と、
配列番号３６のＣＤＲ１、配列番号３７のＣＤＲ２、および配列番号３８のＣＤＲ３、またはそれらに対して少なくとも８０％の同一性を有する配列
を含む軽鎖可変領域と
を有する、第１の抗体またはその抗原結合断片、ならびに
配列番号１のＣＤＲ１、配列番号２のＣＤＲ２、および配列番号３のＣＤＲ３、またはそれらに対して少なくとも８０％の同一性を有する配列
を含む重鎖可変領域と、
配列番号４のＣＤＲ１、配列番号５のＣＤＲ２、および配列番号６のＣＤＲ３、またはそれらに対して少なくとも８０％の同一性を有する配列
を含む軽鎖可変領域と
を有する、第２の抗体またはその抗原結合断片、あるいは
ｂ）配列番号３９を含むかもしくはそれからなる重鎖可変領域、および配列番号４０を含むかもしくはそれからなる軽鎖可変領域、またはそれらに対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を有する、第１の抗体またはその抗原結合断片、ならびに
配列番号７を含むかもしくはそれからなる重鎖可変領域、および配列番号８を含むかもしくはそれからなる軽鎖可変領域、またはそれらに対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を有する、第２の抗体またはその抗原結合断片、あるいは
ｃ）配列番号４９を含むかもしくはそれからなる重鎖、および配列番号５０を含むかもしくはそれからなる軽鎖、またはそれらに対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を有する、第１の抗体またはその抗原結合断片、ならびに
配列番号４１を含むかもしくはそれからなる重鎖、および配列番号４２を含むかもしくはそれからなる軽鎖、またはそれらに対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を有する、第２の抗体またはその抗原結合断片
を含むかまたはそれからなる、請求項１８に記載の使用のための１つまたは複数の抗体またはその抗原結合断片。

【請求項20】

ａ）１つまたは複数の炎症性皮膚または粘膜疾患または障害が、
ｉ）好中球優勢皮膚疾患、例えば、ざ瘡、汎発性膿疱性乾癬、尋常性乾癬、滴状乾癬、掌蹠膿疱症、ＳＡＰＨＯ症候群、急性熱性好中球性皮膚症（スイート症候群）、組織球様好中球性皮膚炎、手背部好中球性皮膚症、壊疽性膿皮症、好中球性エクリン汗腺炎、化膿性汗腺炎、持久性隆起性紅斑、ベーチェット病、腸関連皮膚炎・関節炎症候群、他の感染症に関連する炎症、好中球性蕁麻疹様皮膚症、柵状好中球性肉芽腫性皮膚炎、ほ行性迂回状紅斑、好中球性環状紅斑、急性汎発性発疹性膿疱症（ＡＧＥＰ）、血管炎他；
ｉｉ）自己免疫障害、例えば、結合組織疾患（例えば、ループス、皮膚筋炎、強皮症／全身性硬化症、チャーグ・ストラウス症候群）、脂肪織炎、血管炎、自己免疫性水疱形成症状（例えば、水疱性類天疱瘡、天疱瘡、線状ＩｇＡ病）、ヘルペス状皮膚炎、セリアック病、一部の自己炎症性疾患、白斑、円形脱毛症、汎発性脱毛症、全頭脱毛症、脂肪織炎、扁平苔癬、多形性紅斑、硬化性苔癬、他の苔癬状および多形性紅斑様疾患、乾癬性関節炎、炎症性腸疾患、関節リウマチ、多発性硬化症、ギラン・バレー症候群、横断性脊髄炎、甲状腺炎、神経変性他；
ｉｉｉ）肥満細胞障害および好酸球性障害、例えば、マックル・ウェルズ症候群、好酸球増加および全身性症候症候群、蕁麻疹、血管浮腫、角結膜炎、食物アレルギー、アトピー性皮膚炎を含む他のアレルギーまたはアトピー、鼻炎、結膜炎、喘息、好酸球性食道炎および他の好酸球性粘膜疾患、接触性皮膚炎他；
ｉｖ）移植片対宿主病；ならびに
ｖ）スティーブンス・ジョンソン症候群、中毒性表皮壊死症、薬物反応による好酸球増加および全身性症候症候群（ＤＲＥＳＳ）と急性汎発性発疹性膿疱症（ＡＧＥＰ）、多形性紅斑、水疱性疾患、固定薬疹、ならびに炎症性皮膚または粘膜疾患または障害として現れる他の薬物反応を含む、炎症性皮膚または粘膜疾患または障害として現れる他の薬物反応
の１つまたは複数であるか、あるいは
ｂ）１つもしくは複数の関連する全身性疾患もしくは障害、または１つもしくは複数の全身的に現れる炎症性薬物反応が、アルダラ（イミキモド）に対する炎症性反応であるか、あるいは
ｃ）ＣＤ１ａ発現悪性疾患が、ランゲルハンス細胞組織球症、Ｔ細胞リンパ腫または胸腺腫の１つまたは複数である、
請求項１８または請求項１９に記載の使用のための、１つもしくは複数の抗体もしくはその抗原結合断片、核酸、ベクター、宿主細胞、または医薬組成物。

【請求項21】

１つまたは複数の炎症性皮膚または粘膜疾患または障害が、乾癬、皮膚炎、エリテマトーデス、または炎症性皮膚もしくは粘膜疾患もしくは障害として現れる薬物反応の１つまたは複数である、請求項２０に記載の使用のための、１つもしくは複数の抗体もしくはその抗体結合断片、核酸、ベクター、宿主細胞、または医薬組成物。

【請求項22】

その抗原結合断片、核酸、ベクター、宿主細胞、または医薬組成物が、単独で、または１つまたは複数の他の治療剤と組み合わせて投与されることを意図する、請求項１４から２１のいずれか一項に記載の使用のための、１つもしくは複数の抗体もしくはその抗原結合断片、核酸、ベクター、宿主細胞、または医薬組成物。

【請求項23】

１つまたは複数の他の治療剤が、細胞毒性物質、抗炎症物質、例えば、ステロイド、およびＣＡＲ－Ｔ細胞、例えば、調節性もしくは細胞溶解性ＣＡＲ－Ｔ細胞、または請求項１から１０のいずれか一項に記載の１つもしくは複数の抗体もしくは抗原結合断片を発現もしくは提示する他の細胞を含む群から選択される、請求項２２に記載の使用のための、１つもしくは複数の抗体もしくはその抗原結合断片、核酸、ベクター、宿主細胞、または医薬組成物。

【請求項24】

１つもしくは複数の炎症性皮膚もしくは粘膜疾患もしくは障害、または１つもしくは複数の関連する全身性疾患もしくは障害、または１つもしくは複数の全身的に現れる炎症性薬物反応、または１つもしくは複数のＣＤ１ａ発現悪性疾患の治療または予防のための医薬の製造における、請求項２から１０のいずれか一項に記載の１つもしくは複数の抗体もしくはその抗原結合断片、請求項１１に記載の核酸、請求項１２もしくは請求項１３に記載のベクター、請求項１４もしくは請求項１５に記載の宿主細胞、または請求項１６に記載の医薬組成物の使用。

【請求項25】

１つまたは複数の抗体またはその抗原結合断片が、２つの抗体またはその抗原結合断片を含むかまたはそれらからなり、それぞれが、
ａ）配列番号３３のＣＤＲ１、配列番号３４のＣＤＲ２、および配列番号３５のＣＤＲ３、またはそれらに対して少なくとも８０％の同一性を有する配列
を含む重鎖可変領域と、
配列番号３６のＣＤＲ１、配列番号３７のＣＤＲ２、および配列番号３８のＣＤＲ３、またはそれらに対して少なくとも８０％の同一性を有する配列
を含む軽鎖可変領域と
を有する、第１の抗体またはその抗原結合断片、ならびに
配列番号１のＣＤＲ１、配列番号２のＣＤＲ２、および配列番号３のＣＤＲ３、またはそれらに対して少なくとも８０％の同一性を有する配列
を含む重鎖可変領域と、
配列番号４のＣＤＲ１、配列番号５のＣＤＲ２、および配列番号６のＣＤＲ３、またはそれらに対して少なくとも８０％の同一性を有する配列
を含む軽鎖可変領域と
を有する、第２の抗体またはその抗原結合断片、あるいは
ｂ）配列番号３９を含むかもしくはそれからなる重鎖可変領域、および配列番号４０を含むかもしくはそれからなる軽鎖可変領域、またはそれらに対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を有する、第１の抗体またはその抗原結合断片、ならびに
配列番号７を含むかもしくはそれからなる重鎖可変領域、および配列番号８を含むかもしくはそれからなる軽鎖可変領域、またはそれらに対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を有する、第２の抗体またはその抗原結合断片、あるいは
ｃ）配列番号４９を含むかもしくはそれからなる重鎖、および配列番号５０を含むかもしくはそれからなる軽鎖、またはそれらに対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を有する、第１の抗体またはその抗原結合断片、ならびに
配列番号４１を含むかもしくはそれからなる重鎖、および配列番号４２を含むかもしくはそれからなる軽鎖、またはそれらに対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を有する、第２の抗体またはその抗原結合断片
を含むかまたはそれからなる、請求項２４に記載の使用。

【請求項26】

有効量の請求項２から１０のいずれか一項に記載の１つもしくは複数の抗体もしくはその抗原結合断片、請求項１１に記載の核酸、請求項１２もしくは請求項１３に記載のベクター、請求項１４もしくは請求項１５に記載の宿主細胞、または請求項１６に記載の医薬組成物を対象に投与することを含む、対象における１つもしくは複数の炎症性皮膚もしくは粘膜疾患もしくは障害、または１つもしくは複数の関連する全身性疾患もしくは障害、または１つもしくは複数の全身的に現れる炎症性薬物反応、または１つもしくは複数のＣＤ１ａ発現悪性疾患を治療する方法。

【請求項27】

１つまたは複数の抗体またはその抗原結合断片が、２つの抗体またはその抗原結合断片を含むかまたはそれらからなり、それぞれが、
ａ）配列番号３３のＣＤＲ１、配列番号３４のＣＤＲ２、および配列番号３５のＣＤＲ３、またはそれらに対して少なくとも８０％の同一性を有する配列
を含む重鎖可変領域と、
配列番号３６のＣＤＲ１、配列番号３７のＣＤＲ２、および配列番号３８のＣＤＲ３、またはそれらに対して少なくとも８０％の同一性を有する配列
を含む軽鎖可変領域と
を有する、第１の抗体またはその抗原結合断片、ならびに
配列番号１のＣＤＲ１、配列番号２のＣＤＲ２、および配列番号３のＣＤＲ３、またはそれらに対して少なくとも８０％の同一性を有する配列
を含む重鎖可変領域と、
配列番号４のＣＤＲ１、配列番号５のＣＤＲ２、および配列番号６のＣＤＲ３、またはそれらに対して少なくとも８０％の同一性を有する配列
を含む軽鎖可変領域と
を有する、第２の抗体またはその抗原結合断片、あるいは
ｂ）配列番号３９を含むかもしくはそれからなる重鎖可変領域、および配列番号４０を含むかもしくはそれからなる軽鎖可変領域、またはそれらに対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を有する、第１の抗体またはその抗原結合断片、ならびに
配列番号７を含むかもしくはそれからなる重鎖可変領域、および配列番号８を含むかもしくはそれからなる軽鎖可変領域、またはそれらに対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を有する、第２の抗体またはその抗原結合断片、あるいは
ｃ）配列番号４９を含むかもしくはそれからなる重鎖、および配列番号５０を含むかもしくはそれからなる軽鎖、またはそれらに対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を有する、第１の抗体またはその抗原結合断片、ならびに
配列番号４１を含むかもしくはそれからなる重鎖、および配列番号４２を含むかもしくはそれからなる軽鎖、またはそれらに対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を有する、第２の抗体またはその抗原結合断片
を含むかまたはそれからなる、請求項２６に記載の方法。

【請求項28】

ｉ．対象から得られる生体試料を用意することと、
ｉｉ．治療前、または治療の合間、または治療が無い期間に対象から得られた試料においてＣＤ１ａ発現細胞に対する請求項１から１０のいずれか一項に記載の１つまたは複数の抗体または抗原結合断片の結合レベルを決定することと、
ｉｉｉ．治療後または治療の合間または治療が無い期間に腫瘍量、またはＣＤ１ａ発現細胞に対する１つもしくは複数の本発明の抗体もしくは抗原結合断片の結合レベルが低下し、適宜、腫瘍量またはＣＤ１ａ発現細胞に対する請求項２から１０のいずれか一項に記載の１つもしくは複数の抗体もしくは抗原結合断片の結合レベルの低下が、２５％以上である場合、治療が有効であるか、または病状が改善していると判定することと
を含む、ＣＤ１ａ発現悪性疾患であると診断された対象における治療有効性または病状を監視する方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、抗体、ならびに炎症性皮膚および粘膜疾患もしくは障害、または関連する全身性疾患もしくは障害、または全身的に現れる炎症性薬物反応、またはＣＤ１ａ発現悪性疾患の治療、予防または監視におけるそれらの使用に関する。

【背景技術】

【0002】

抗原提示は、免疫系が感染症、組織の損傷および疾患を含む脅威を検出して、目的に応じた防御を編成する、宿主免疫の基本的柱の１つである。抗原提示は、特殊化した抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面上の提示分子による抗原の内部移行、プロセシングおよび呈示を包含する。抗原の提示は、抗原源を標的とする免疫応答の最適な活性化を達成し、脅威を除くために組織化される。抗原は、ペプチド、脂質および代謝物等を含む広範な分子を包含する。ＭＨＣＩおよびＭＨＣＩＩは、ＡＰＣの表面上に発現するタンパク質であり、これらはペプチド抗原に結合し、大部分はＣＤ８＋Ｔ細胞およびＣＤ４＋Ｔ細胞にそれぞれ提示する。これらのＴ細胞サブセットは、細胞表面Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）によるＭＨＣ結合ペプチド抗原の認識時に、それらのエフェクター機能を発揮するように誘導されて、病原体およびがんに対する免疫が可能となる。しかし、非侵害性抗原、例えば、アレルギー性疾患におけるアレルゲン、または自己免疫における自己タンパク質提示の調節不全により、宿主の損傷、炎症および疾患が引き起こされる。したがって、抗原提示経路の標的化は、結果として生じる免疫応答を調節する強力な手段である。

【0003】

ＣＤ１分子は、ＭＨＣＩに構造的に似た抗原提示分子のファミリーを構成する。対照的に、ＣＤ１分子は相対的に非多形性であり、ＣＤ１抗原結合溝は、脂質種の提示を可能とする疎水性アミノ酸が濃縮されている。脂質は、宿主および病原体細胞膜の不可欠な成分を形成する重要な抗原であり、タンパク質由来のペプチド抗原よりも突然変異を受けにくい。ＣＤ１ファミリーは、細胞表面群１分子ＣＤ１ａ／ｂ／ｃおよび群２ＣＤ１ｄおよび群３ＣＤ１ｅを構成する。ＣＤ１脂質提示およびＴ細胞応答の理解のほとんどは、部分的にはＣＤ１ｄがマウスで正常に発現する唯一のＣＤ１であるため、糖脂質結合ＣＤ１ｄの不変異ナチュラルキラーＴ細胞認識の研究によってもたらされた。ＣＤ１ｄおよびＭＨＣＩ分子は、広く発現し、一方、ＭＨＣＩＩおよび群１のＣＤ１発現は、相対的にＡＰＣに制限される。しかし、このような分子の中でもユニークなＣＤ１ａは、皮膚および粘膜に対して高度に特異的である。ＣＤ１ａは、皮膚の表皮および粘膜のランゲルハンス細胞（ＬＣ）により構成的に発現し（1）、ランゲリン（ｌａｎｇｅｒｉｎ）に加えてＬＣの同定マーカーとして一般に使用される。加えて、ＣＤ１ａは、真皮樹状細胞のサブセット上に低レベルで発現し（2-4）、皮膚自然リンパ球系細胞（ＩＬＣ）、特には、ＩＬＣ２上で発現および上方制御され得る（5）。重要なことには、ＣＤ１ａは、未成熟胸腺細胞の表面上に存在すると最初に記載されたが、発現は、Ｔ細胞成熟時に典型的に失われる（6）。皮膚におけるＣＤ１ａの高レベルの構成的発現は、健常および罹患ヒト皮膚におけるＣＤ１ａ依存的監視およびＴ細胞活性化の重要な生理学的役割を示す。その上、アトピー性皮膚炎の皮膚におけるＣＤ１ａ発現の上昇は、炎症性皮膚疾患におけるＣＤ１ａ反応性Ｔ細胞集団の活性化向上の基礎をなし得る。

【0004】

マイコバクテリア脂質に基づく抗原を提示するＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂまたはＣＤ１ｃ分子により方向づけられるＴ細胞応答は、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）およびらい菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｐｒａｅ）感染症に対するヒト免疫応答に意味づけられている。ＣＤ１ａ制限Ｔ細胞による他のさらに一般的な病原性または共生細菌脂質の認識は、進行中の研究の主題であり、一部のデータを本明細書において提示する。ＭＨＣ制限Ｔ細胞によるペプチド抗原のＴＣＲ認識は一般に、ペプチド抗原に対して高度に特異的であるが、ＴＣＲ認識のＣＤ１による方法は、さらに多様であり、ＣＤ１ａ自己反応性Ｔ細胞の場合のように、高度な脂質特異的応答（7）、および直接的ＴＣＲ－ＣＤ１相互作用により媒介される交差反応的または明らかな脂質非依存的シグナル伝達をも有する（8-10）。一部の場合では、ＣＤ１ａ自己反応性Ｔ細胞は、小型の疎水性宿主由来脂質の認識時に活性化され、この脂質は、ＣＤ１ａ抗原結合溝内に営巣して突出せず、ＴＣＲが脂質とではなくＣＤ１ａタンパク質それ自体と相互作用することが可能となる。この場合では、大型または帯電した頭部との脂質の結合により、自己反応性ＴＣＲおよびＣＤ１ａの間の相互作用が妨げられ、これによりＴ細胞活性化が妨げられる（11,12）。

【0005】

ＣＤ１ａは、相対的に非多形性であり、このため、炎症性の皮膚および粘膜疾患および障害、例えば、アトピー性皮膚炎、乾癬、エリテマトーデス、または関連する全身性疾患もしくは障害、または全身的に現れる炎症性薬物反応の予防および／または治療における集団規模での可能性が結果として存在し、この場合、ＣＤ１ａ発現樹状細胞サブセットの発生頻度が変更され、ＬＣまたは応答するＴ細胞の遊走パターンが変更される（13-15）。その上、ＣＤ１ａは、炎症性腸疾患、多発性硬化症、ギラン・バレー症候群、甲状腺炎および神経変性を含む他の全身性障害に関連付けられている（Al-amodi Inflammatory Bowel Diseases 2018 24: 1225-1236；Caporale J Neuroimmunol 2006 177:112-8；Jamshidian Immunological Investigations 2010 3:874-889；Roura-Mir J Immunol 2005 174:3773-80；Wang Aging 2019 11: 4521-4535）。加えて、ＣＤ１ａは、ランゲルハンス細胞組織球症、Ｔ細胞リンパ腫のサブセット、胸腺腫のサブセットを含む特定の悪性疾患および他の悪性疾患のまれな性状、例えば、肥満細胞症のサブセットにより発現し得る。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

本発明の目的は、抗ＣＤ１ａ抗体を提供することである。このような抗体は、皮膚もしくは粘膜の炎症性疾患もしくは障害、例えば、乾癬、皮膚炎、エリテマトーデスまたは炎症性皮膚もしくは粘膜疾患もしくは障害として現れる薬物反応の治療または予防において特に有用である。また、このような抗体は、関連する全身性疾患もしくは障害、または全身的に現れる炎症性薬物反応の治療または予防において、またはＣＤ１ａ発現悪性疾患の治療において有益であり得る。

【課題を解決するための手段】

【0007】

ある態様では、ＣＤ１ａに結合可能な抗体またはその抗原結合断片を本発明により提供する。抗体またはその抗原結合断片は、ＣＤ１ａに特異的に結合し得る。抗体またはその抗原結合断片は、ＣＤ１ａに優先的に結合し得る。抗体またはその抗原結合断片は、ＣＤ１ａを発現する細胞の細胞死を誘導し得る。抗体またはその抗原結合断片は、ＣＤ１ａに対するリガンドの結合を遮断し得る。

【0008】

抗体またはその抗原結合断片は、配列番号３またはそれに対して少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％、９９％もしくは１００％の同一性を有する配列の相補性決定領域（ＣＤＲ）３（ＣＤＲ３）を含む重鎖可変領域を含んでもよく、および／あるいは
抗体またはその抗原結合断片は、配列番号６またはそれに対して少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％、９９％もしくは１００％の同一性を有する配列のＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含み得る。

【0009】

抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１１またはそれに対して少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％、９９％もしくは１００％の同一性を有する配列のＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を含んでもよく、および／あるいは
抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１４またはそれに対して少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％、９９％もしくは１００％の同一性を有する配列のＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含み得る。

【0010】

抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１９またはそれに対して少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％、９９％もしくは１００％の同一性を有する配列のＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を含んでもよく、および／あるいは
抗体またはその抗原結合断片は、配列番号２２またはそれに対して少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％、９９％もしくは１００％の同一性を有する配列のＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含み得る。

【0011】

抗体またはその抗原結合断片は、配列番号２７またはそれに対して少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％、９９％もしくは１００％の同一性を有する配列のＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を含んでもよく、および／あるいは
抗体またはその抗原結合断片は、配列番号３０またはそれに対して少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％、９９％もしくは１００％の同一性を有する配列のＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含み得る。

【0012】

抗体またはその抗原結合断片は、配列番号３５またはそれに対して少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％、９９％もしくは１００％の同一性を有する配列のＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を含んでもよく、および／あるいは
抗体またはその抗原結合断片は、配列番号３８またはそれに対して少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％、９９％もしくは１００％の同一性を有する配列のＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含み得る。

【0013】

抗体またはその抗原結合断片は、
ａ）配列番号１のＣＤＲ１、
配列番号２のＣＤＲ２、および
配列番号３のＣＤＲ３、
またはそれらに対して少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％、９９％もしくは１００％の同一性を有する配列
を含む重鎖可変領域、ならびに／あるいは
ｂ）配列番号４のＣＤＲ１、
配列番号５のＣＤＲ２、および
配列番号６のＣＤＲ３、
またはそれらに対して少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％、９９％もしくは１００％の同一性を有する配列
を含む軽鎖可変領域
を含むかまたはそれらからなり得る。

【0014】

抗体またはその抗原結合断片は、
ａ）配列番号９のＣＤＲ１、
配列番号１０のＣＤＲ２、および
配列番号１１のＣＤＲ３、
またはそれらに対して少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％、９９％もしくは１００％の同一性を有する配列
を含む重鎖可変領域、ならびに／あるいは
ｂ）配列番号１２のＣＤＲ１、
配列番号１３のＣＤＲ２、および
配列番号１４のＣＤＲ３、
またはそれらに対して少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％、９９％もしくは１００％の同一性を有する配列
を含む軽鎖可変領域
を含むかまたはそれらからなり得る。

【0015】

抗体またはその抗原結合断片は、
ａ）配列番号１７のＣＤＲ１、
配列番号１８のＣＤＲ２、および
配列番号１９のＣＤＲ３、
またはそれらに対して少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％、９９％もしくは１００％の同一性を有する配列
を含む重鎖可変領域、ならびに／あるいは
ｂ）配列番号２０のＣＤＲ１、
配列番号２１のＣＤＲ２、および
配列番号２２のＣＤＲ３
またはそれらに対して少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％、９９％もしくは１００％の同一性を有する配列
を含む軽鎖可変領域
を含むかまたはそれらからなり得る。

【0016】

抗体またはその抗原結合断片は、
ａ）配列番号２５のＣＤＲ１、
配列番号２６のＣＤＲ２、および
配列番号２７のＣＤＲ３、
またはそれらに対して少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％、９９％もしくは１００％の同一性を有する配列
を含む重鎖可変領域、ならびに／あるいは
ｂ）配列番号２８のＣＤＲ１、
配列番号２９のＣＤＲ２、および
配列番号３０のＣＤＲ３、
またはそれらに対して少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％、９９％もしくは１００％の同一性を有する配列
を含む軽鎖可変領域
を含むかまたはそれらからなり得る。

【0017】

抗体またはその抗原結合断片は、
ａ）配列番号３３のＣＤＲ１、
配列番号３４のＣＤＲ２、および
配列番号３５のＣＤＲ３、
またはそれらに対して少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％、９９％もしくは１００％の同一性を有する配列
を含む重鎖可変領域、ならびに／あるいは
ｂ）配列番号３６のＣＤＲ１、
配列番号３７のＣＤＲ２、および
配列番号３８のＣＤＲ３、
またはそれらに対して少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％、９９％もしくは１００％の同一性を有する配列
を含む軽鎖可変領域
を含むかまたはそれらからなり得る。

【0018】

ＣＤＲは、任意のフレームワーク領域と結合し得る。好ましくは、フレームワーク領域は、ヒト起源である。

【0019】

抗体またはその抗原結合断片は、
ａ）配列番号７またはそれに対して少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％、９９％もしくは１００％の同一性を有する配列を含むかまたはそれからなる重鎖可変領域、および／あるいは
ｂ）配列番号８またはそれに対して少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％、９９％もしくは１００％の同一性を有する配列を含むかまたはそれからなる軽鎖可変領域
を含むかまたはそれらからなり得る。

【0020】

抗体またはその抗原結合断片は、
ａ）配列番号１５またはそれに対して少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％、９９％もしくは１００％の同一性を有する配列を含むかまたはそれからなる重鎖可変領域、および／あるいは
ｂ）配列番号１６またはそれに対して少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％、９９％もしくは１００％の同一性を有する配列を含むかまたはそれからなる軽鎖可変領域
を含むかまたはそれらからなり得る。

【0021】

抗体またはその抗原結合断片は、
ａ）配列番号２３またはそれに対して少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％、９９％もしくは１００％の同一性を有する配列を含むかまたはそれからなる重鎖可変領域、および／あるいは
ｂ）配列番号２４またはそれに対して少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％、９９％もしくは１００％の同一性を有する配列を含むかまたはそれからなる軽鎖可変領域
を含むかまたはそれらからなり得る。

【0022】

抗体またはその抗原結合断片は、
ａ）配列番号３１またはそれに対して少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％、９９％もしくは１００％の同一性を有する配列を含むかまたはそれからなる重鎖可変領域、および／あるいは
ｂ）配列番号３２またはそれに対して少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％、９９％もしくは１００％の同一性を有する配列を含むかまたはそれからなる軽鎖可変領域
を含むかまたはそれらからなり得る。

【0023】

抗体またはその抗原結合断片は、
ａ）配列番号３９またはそれに対して少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％、９９％もしくは１００％の同一性を有する配列を含むかまたはそれからなる重鎖可変領域、および／あるいは
ｂ）配列番号４０またはそれに対して少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％、９９％もしくは１００％の同一性を有する配列を含むかまたはそれからなる軽鎖可変領域
を含むかまたはそれらからなり得る。

【0024】

抗体またはその抗原結合断片は、
ａ）配列番号７を含むかまたはそれからなる重鎖可変領域、および
ｂ）配列番号８を含むかまたはそれからなる軽鎖可変領域
からなり得る。

【0025】

抗体またはその抗原結合断片は、
ａ）配列番号１５を含むかまたはそれからなる重鎖可変領域、および
ｂ）配列番号１６を含むかまたはそれからなる軽鎖可変領域
からなり得る。

【0026】

抗体またはその抗原結合断片は、
ａ）配列番号２３を含むかまたはそれからなる重鎖可変領域、および
ｂ）配列番号２４を含むかまたはそれからなる軽鎖可変領域
からなり得る。

【0027】

抗体またはその抗原結合断片は、
ａ）配列番号３１を含むかまたはそれからなる重鎖可変領域、および
ｂ）配列番号３２を含むかまたはそれからなる軽鎖可変領域
からなり得る。

【0028】

抗体またはその抗原結合断片は、
ａ）配列番号３９を含むかまたはそれからなる重鎖可変領域、および
ｂ）配列番号４０を含むかまたはそれからなる軽鎖可変領域
からなり得る。

【0029】

抗体またはその抗原結合断片は、
ａ）配列番号４１またはそれに対して少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％、９９％もしくは１００％の同一性を有する配列を含むかまたはそれからなる重鎖、および／あるいは
ｂ）配列番号４２またはそれに対して少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％、９９％もしくは１００％の同一性を有する配列を含むかまたはそれからなる軽鎖
を含むかまたはそれらからなり得る。

【0030】

抗体またはその抗原結合断片は、
ａ）配列番号４３またはそれに対して少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％、９９％もしくは１００％の同一性を有する配列を含むかまたはそれからなる重鎖、および／あるいは
ｂ）配列番号４４またはそれに対して少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％、９９％もしくは１００％の同一性を有する配列を含むかまたはそれからなる軽鎖
を含むかまたはそれらからなり得る。

【0031】

抗体またはその抗原結合断片は、
ａ）配列番号４５またはそれに対して少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％、９９％もしくは１００％の同一性を有する配列を含むかまたはそれからなる重鎖、および／あるいは
ｂ）配列番号４６またはそれに対して少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％、９９％もしくは１００％の同一性を有する配列を含むかまたはそれからなる軽鎖
を含むかまたはそれらからなり得る。

【0032】

抗体またはその抗原結合断片は、
ａ）配列番号４７またはそれに対して少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％、９９％もしくは１００％の同一性を有する配列を含むかまたはそれからなる重鎖、および／あるいは
ｂ）配列番号４８またはそれに対して少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％、９９％もしくは１００％の同一性を有する配列を含むかまたはそれからなる軽鎖
を含むかまたはそれらからなり得る。

【0033】

抗体またはその抗原結合断片は、
ａ）配列番号４９またはそれに対して少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％、９９％もしくは１００％の同一性を有する配列を含むかまたはそれからなる重鎖、および／あるいは
ｂ）配列番号５０またはそれに対して少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％、９９％もしくは１００％の同一性を有する配列を含むかまたはそれからなる軽鎖
を含むかまたはそれらからなり得る。

【0034】

抗体またはその抗原結合断片は、
ａ）配列番号４１を含むかまたはそれからなる重鎖、および
ｂ）配列番号４２を含むかまたはそれからなる軽鎖
からなり得る。

【0035】

抗体またはその抗原結合断片は、
ａ）配列番号４３を含むかまたはそれからなる重鎖、および
ｂ）配列番号４４を含むかまたはそれからなる軽鎖
からなり得る。

【0036】

抗体またはその抗原結合断片は、
ａ）配列番号４５を含むかまたはそれからなる重鎖、および
ｂ）配列番号４６を含むかまたはそれからなる軽鎖
からなり得る。

【0037】

抗体またはその抗原結合断片は、
ａ）配列番号４７を含むかまたはそれからなる重鎖、および
ｂ）配列番号４８を含むかまたはそれからなる軽鎖
からなり得る。

【0038】

抗体またはその抗原結合断片は、
ａ）配列番号４９を含むかまたはそれからなる重鎖、および
ｂ）配列番号５０を含むかまたはそれからなる軽鎖
からなり得る。

【0039】

本発明の抗体またはその抗原結合断片は、単離され得る。

【0040】

任意の態様では、「抗体またはその抗原結合断片」は、列挙する抗体またはその抗原結合断片の１つまたは複数、例えば、２つを指し得る。例えば、任意の態様では、２つの抗体またはその抗原結合断片を想定してもよく、それぞれは、
ａ）配列番号３３のＣＤＲ１、配列番号３４のＣＤＲ２、および配列番号３５のＣＤＲ３、またはそれらに対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む重鎖可変領域と、
配列番号３６のＣＤＲ１、配列番号３７のＣＤＲ２、および配列番号３８のＣＤＲ３、またはそれらに対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む軽鎖可変領域と
を有する、第１の抗体またはその抗原結合断片、ならびに
配列番号１のＣＤＲ１、配列番号２のＣＤＲ２、および配列番号３のＣＤＲ３、またはそれらに対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む重鎖可変領域と、
配列番号４のＣＤＲ１、配列番号５のＣＤＲ２、および配列番号６のＣＤＲ３、またはそれらに対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む軽鎖可変領域と
を有する、第２の抗体またはその抗原結合断片、あるいは
ｂ）配列番号３９を含むかもしくはそれからなる重鎖可変領域、および配列番号４０を含むかもしくはそれからなる軽鎖可変領域、またはそれらに対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を有する、第１の抗体またはその抗原結合断片、ならびに
配列番号７を含むかもしくはそれからなる重鎖可変領域、および配列番号８を含むかもしくはそれからなる軽鎖可変領域、またはそれらに対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を有する、第２の抗体またはその抗原結合断片、あるいは
ｃ）配列番号４９を含むかもしくはそれからなる重鎖、および配列番号５０を含むかもしくはそれからなる軽鎖、またはそれらに対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を有する、第１の抗体またはその抗原結合断片、ならびに
配列番号４１を含むかもしくはそれからなる重鎖、および配列番号４２を含むかもしくはそれからなる軽鎖、またはそれらに対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を有する、第２の抗体またはその抗原結合断片
を含むかまたはそれらからなる。

【0041】

例えば、本明細書に開示の任意の治療適用および／または本明細書に開示の任意の監視方法では、抗体または抗原結合断片の任意の組合せを使用し得る。好ましくは、Ａｂ１１６および１６を併用する。

【0042】

別の実施形態では、Ａｂ１１６は、本明細書に開示の任意の治療適用において使用してもよく、Ａｂ１６は、同一の対象の監視において使用し得る。あるいは、Ａｂ１６は、本明細書に開示の任意の治療適用において使用してもよく、Ａｂ１１６は、同一の対象の監視において使用し得る。

【0043】

「抗体」という用語は、本明細書において言及する場合、ジスルフィド結合により相互に結合する少なくとも２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖を含む糖タンパク質を指す。各重鎖は、重鎖可変領域（ＶＨ）および重鎖定常領域で構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（ＶＬ）および軽鎖定常領域で構成される。重および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。ＶＨおよびＶＬ領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性の領域にさらに細分することができ、これには、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる、さらに保存された領域が散在する。抗体の定常領域は、免疫系の種々の細胞（例えば、エフェクター細胞）および古典的補体系の第１の成分（Ｃｌｑ）を含む、宿主組織または因子に対する免疫グロブリンの結合を媒介し得る。

【0044】

抗体の「その抗原結合断片」という用語は、抗原に選択的に結合する能力を保持する、１つまたは複数の抗体断片を指す。その抗原結合断片は、Ｆａｂ、修飾Ｆａｂ、Ｆａｂ’、修飾Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、単一ドメイン抗体（例えば、ＶＨまたはＶＬまたはＶＨＨ）、ｓｃＦｖ、二価、三価または四価抗体、ビスｓｃＦｖ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディおよび上のいずれかのエピトープ結合断片であり得るが、それらに制限されない（Holliger and Hudson, 2005, Nature Biotech. 23(9): 1126-1136；Adair and Lawson, 2005, Drug Design Reviews - Online 2(3), 209-217）。このような抗原結合断片を生成および製造するための方法は、当技術分野において周知である（例えば、Verma et al., 1998, Journal of Immunological Methods, 216, 165-181を参照）。

【0045】

抗体またはその抗原結合断片は、モノクローナル抗体、二特異性抗体、多特異性抗体、ＳｃＦｖまたは他の一本鎖もしくは修飾フォーマット、Ｆａｂ、（Ｆａｂ’）２、Ｆｖ、ｄＡｂ、Ｆｄ、ナノボディ、ラクダ抗体またはダイアボディであり得る。好ましくは、抗体またはその抗原結合断片は、モノクローナル抗体である。

【0046】

発明者らは、炎症性皮膚および粘膜疾患および障害、または関連する全身性疾患もしくは障害、または全身的に現れる炎症性薬物反応におけるＣＤ１ａおよびその潜在的役割を、有効なモノクローナル抗体を生成することにより標的とした。ＣＤ１ａが皮膚および粘膜において高度に発現するため、このような抗体の使用により、オフターゲット作用を最小化しながら炎症性皮膚および粘膜疾患および障害を選択的に治療する契機がもたらされる。ＣＤ１ａは、マウスでは発現しないが、他の哺乳動物では発現する。ヒトＣＤ１ａ（UniProtKB/Swiss-Prot: P06126-CD1A_HUMAN）は、優勢なアレルにより世界的に発現し、中国の一部の民族に存在する変異体を有する（18）。また、ＣＤ１ａ抗原提示を標的化すると、他のサイトカイン特異的抗体療法、例えば、抗ＩＬ１７療法または他の免疫療法の上流で炎症経路が妨害され、このため免疫カスケードの初期に炎症促進性障害を調節する強力な手段がもたらされる。その上、例えば、二特異性もしくは多特異性またはコンジュゲート抗体技術を使用して低分子、薬物、核酸、ペプチド、抗体または細胞コンジュゲート療法を特異的に標的とすることにより、皮膚に対するＣＤ１ａの特異性を利用すると、皮膚に対してさらなる療法を方向づける手段がもたらされ得る。なお、さらに、ＣＤ１ａは相対的に非多形性であるため、本発明では、ＣＤ１ａ発現樹状細胞サブセットの発生頻度が上昇してＬＣの遊走パターンが変更される炎症性皮膚および粘膜疾患、例えば、アトピー性皮膚炎および乾癬（13-15）、またはＣＤ１ａ発現悪性疾患の予防および／または治療における普遍的可能性を提供する。

【0047】

ＣＤ１ａ発現細胞の数および機能を修飾することにより、抗体は、脂質反応性に留まらない作用を有し、ペプチド特異的Ｔ細胞に対する抗原提示および先天性経路（例えば、好中球）を含むＣＤ１ａ発現細胞のすべての役割に影響する。本発明の抗体は、マウスＩｇＧ１の性質にもかかわらずランゲルハンス細胞を減少させることが可能である。このような減少により、補体／ＡＤＣＣ関連炎症を有せずに幅広い炎症経路を制御する手段がもたらされ、これにより治療的有用性がもたらされ得る。これは、本明細書に記載のイミキモドモデルにおいて示され、この場合、本発明による抗体により、例えば、野生型マウスを有意に下回るレベルまで炎症が低下し、先天性経路、例えば、好中球および好酸球を含むＣＤ１ａ発現細胞に留まらない経路に対する著明な抗炎症作用が実証される。また、本発明の抗体は、広範な臨床疾患に関連する、ＩＦＮガンマおよびＩＬ－２２を含む多様なサイトカインの産生を阻害する。

【0048】

別の態様では、本発明の抗体またはその抗原結合断片をコードする核酸を本発明により提供する。このような核酸は、配列番号５１～９０のいずれかにより提供し得る。当業者は、コドン冗長性のため、多くのＤＮＡ配列を使用して本発明の抗体またはその抗原結合断片をコードし得ることを理解する。あるいは、ヌクレオチド配列のコドン最適化を使用して、本発明の抗体またはその抗原結合断片の生成のための発現系における翻訳の効率を改善させることができる。

【0049】

別の態様では、本発明の核酸を含むベクターを本発明により提供する。プロモーター配列、ターミネーター配列、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、マーカー遺伝子および他の配列を含む適切な調節配列を必要に応じて含む、適するベクターを選択または構築することができる。ベクターは、例えば、プラスミドまたはウイルスであり得る。さらなる詳細については、例えば、（Sambrook, J., E. F. Fritsch, and T. Maniatis. (1989), Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York）を参照されたい。例えば、核酸コンストラクトの調製、突然変異誘発、シーケンシング、細胞へのＤＮＡの導入および遺伝子発現における核酸の操作、ならびにタンパク質の解析のための多くの公知の技術およびプロトコールは、（Ausubel et al., Current protocols in molecular biology. New York: Greene Publishing Association; Wiley-Interscience, 1992）に詳細が記載されている。ベクターは、発現ベクターであり得る。ベクターまたは発現ベクターは、プラスミドであり得る。

【0050】

本発明の核酸分子またはベクターは、適する任意の発現系を使用して、例えば、適する宿主細胞または無細胞系において発現させ得る。

【0051】

別の態様では、本発明の抗体もしくはその抗原結合断片、核酸および／またはベクターを含む宿主細胞を本発明により提供する。宿主細胞は、細菌宿主細胞（原核生物系）、例えば、大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）もしくは真核細胞、例えば、酵母、真菌の細胞、昆虫細胞または哺乳動物細胞から選択され得る。好ましくは、本発明の宿主細胞は、本発明の抗体またはその抗原結合断片を産生することが可能である。産生された抗体またはその抗原結合断片は、選択および／または単離の手段により濃縮し得る。

【0052】

また、本発明の抗体またはその抗原結合断片は、化学合成により生成し得る。得られた抗体またはその抗原結合断片は、選択および／または単離の手段により濃縮し得る。

【0053】

さらなる態様によれば、本発明の抗体またはその抗原結合断片、核酸、ベクターおよび／または宿主細胞を、適宜１つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤または希釈剤とともに含む、医薬組成物を本発明により提供する。

【0054】

本発明の抗体またはその抗原結合断片、核酸、ベクターまたは宿主細胞は、確立された調製方法を使用して医薬組成物に製剤化することができる（Gennaro, A.L. and Gennaro, A.R. (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Ed., Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA）。医薬組成物を調製するために、薬学的に不活性な無機または有機賦形剤を使用することができる。例えば、丸剤、散剤、ゼラチンカプセルまたは坐剤の調製には、ラクトース、タルク、ステアリン酸およびその塩、脂肪、ワックス、固体または液体ポリオール、天然および硬化油が、使用可能な薬学的に許容される賦形剤の例となる。溶液、懸濁液、乳濁液、エアロゾル混合物、または溶液もしくはエアロゾル混合物の使用前の再構成のための散剤の生成に適する賦形剤としては、水、アルコール、グリセロール、ポリオールおよび適するそれらの混合物、ならびに植物油が挙げられる。

【0055】

本発明の医薬組成物は、治療的に有効な任意の非経口または経口（経腸）経路を介して投与し得る。非経口適用方法としては、例えば、注射液、注入液または混合物の形態による、例えば、皮内、皮下、筋肉内、気管内、鼻腔内、硝子体内または静脈内注射および注入技術、ならびに例えば、エアロゾル混合物、スプレーまたは散剤の形態による、エアロゾル導入および吸入が挙げられる。本発明の医薬組成物は、従来の非毒性の薬学的に許容される賦形剤または担体、添加剤および媒体を要望に応じて含む製剤により全身的または局所的に投与することができる。静脈内および皮下注入および／または注射の組合せは、化合物が相対的に短いかもしくは長い血清半減期を有するか、または作用の速やかな発現を必要とする場合に最も好都合であり得る。好ましくは、医薬組成物は、皮下または静脈内に投与する。医薬組成物は、水溶液、水中油乳濁液または油中水乳濁液であり得る。

【0056】

静脈内注射または患部もしくは他の投与部位における注射では、活性成分は、発熱物質不含であり、適するｐＨ、等張性および安定性を有する、非経口的に許容される水溶液の形態である。当業者は、例えば、等張性媒体、例えば、塩化ナトリウム注射剤、リンゲル注射剤、乳酸リンゲル注射剤を使用した適する溶液の調製に熟達している。保存剤、安定剤、緩衝液、抗酸化剤および／または他の添加剤を必要に応じて含み得る。

【0057】

組成物は、好ましくは、個体に有用性を示すのに十分な「治療有効量」で個体に投与する。最適投与量は、抗体またはその抗原結合断片の体内分布、投与方法、治療する疾患／障害の重症度ならびに患者の医学的症状に依存する。望ましい場合、抗体またはその抗原結合断片は、持続放出製剤、例えば、リポソーム分散剤またはヒドロゲルベースのポリマーミクロスフェア、例えば、ＰｏｌｙＡｃｔｉｖｅ（商標）またはＯｃｔｏＤＥＸ（商標）により投与し得る（Bos et al., Business Briefing: Pharmatech 2003: 1-6を参照）。利用可能な他の持続放出製剤は、例えば、ＰＬＧＡベースのポリマー（ＰＲｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社）、ＰＬＡ－ＰＥＧベースのヒドロゲル（Ｍｅｄｉｎｃｅｌｌ社）およびＰＥＡベースのポリマー（Ｍｅｄｉｖａｓ社）である。治療薬の処方、例えば、投与量の決定等は、医師の責任の範囲内であり、典型的に、治療する障害、個々の患者の症状、送達部位、投与方法および医師に公知の他の因子を考慮する。

【0058】

また、医薬組成物は、添加剤、例えば、充填剤、結合剤、湿潤剤、流動促進剤、安定剤、保存剤、乳化剤、さらなる溶媒または溶解剤あるいはデポ作用を達成するための薬剤等を含み得る。最後者は、融合タンパク質を徐放もしくは持続放出または標的送達系、例えば、リポソームおよびマイクロカプセルに組み込み得る。

【0059】

別の態様では、本発明の抗体もしくはその抗原結合断片、核酸、ベクター、宿主細胞または医薬組成物は、対象における１つまたは複数の疾患または障害の治療または予防における使用のためのものであり得る。

【0060】

ある態様では、有効量の本発明の抗体もしくはその抗原結合断片、核酸、ベクター、宿主細胞または組成物を対象に投与する工程を含む、対象における１つまたは複数の疾患または障害を治療または予防する方法を提供する。

【0061】

ある態様では、対象における１つまたは複数の疾患または障害の治療または予防のための医薬の製造における、本発明の抗体もしくはその抗原結合断片、核酸、ベクター、宿主細胞または医薬組成物の使用を提供する。

【0062】

任意の態様では、対象は、哺乳動物であり得る。哺乳動物は、ＣＤ１ａオルソログを発現し得る。好ましくは、対象は、ヒトである。

【0063】

１つまたは複数の疾患または障害は、１つもしくは複数の炎症性皮膚もしくは粘膜障害もしくは疾患、または１つもしくは複数の関連する全身性疾患もしくは障害、または１つもしくは複数の全身的に現れる炎症性薬物反応、またはＣＤ１ａ発現悪性疾患であり得る。

【0064】

炎症性皮膚または粘膜疾患または障害は、次から選択され得る。
ａ）好中球優勢皮膚疾患、例えば、ざ瘡、汎発性膿疱性乾癬、尋常性乾癬、滴状乾癬、掌蹠膿疱症、ＳＡＰＨＯ症候群、急性熱性好中球性皮膚症（スイート症候群）、組織球様好中球性皮膚炎、手背部好中球性皮膚症、壊疽性膿皮症、好中球性エクリン汗腺炎、化膿性汗腺炎、持久性隆起性紅斑、ベーチェット病、腸関連皮膚炎・関節炎症候群、他の感染症に関連する炎症、好中球性蕁麻疹様皮膚症、柵状好中球性肉芽腫性皮膚炎、ほ行性迂回状紅斑（ｅｒｙｔｈｅｍａ ｇｙｒａｔｕｍ ｒｅｐｅｎｓ）、好中球性環状紅斑、急性汎発性発疹性膿疱症（ＡＧＥＰ）、血管炎他；
ｂ）自己免疫障害、例えば、結合組織疾患（例えば、ループス、皮膚筋炎、強皮症／全身性硬化症、チャーグ・ストラウス症候群）、脂肪織炎、血管炎、自己免疫性水疱形成症状（例えば、水疱性類天疱瘡、天疱瘡、線状ＩｇＡ病）、ヘルペス状皮膚炎、セリアック病、一部の自己炎症性疾患、白斑、円形脱毛症、汎発性脱毛症、全頭脱毛症、脂肪織炎、扁平苔癬、多形性紅斑、硬化性苔癬、他の苔癬状および多形性紅斑様疾患、小胞化乾癬性関節炎、関節リウマチ、炎症性腸疾患、多発性硬化症、ギラン・バレー症候群、甲状腺炎、横断性脊髄炎、神経変性他；
ｃ）肥満細胞障害および好酸球性障害、例えば、マックル・ウェルズ症候群、好酸球増加および全身性症候症候群、蕁麻疹、血管浮腫、角結膜炎、食物アレルギー、アトピー性皮膚炎を含む他のアレルギーまたはアトピー、鼻炎、結膜炎、喘息、好酸球性食道炎（ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌｉｃ ｏｅｓｏｐｈａｇｉｔｉｓ）および他の好酸球性粘膜疾患、接触性皮膚炎他；
ｄ）炎症性皮膚または粘膜疾患または障害として現れる薬物有害反応、例えば、スティーブンス・ジョンソン症候群、中毒性表皮壊死症、薬物反応による好酸球増加および全身性症候症候群（ｄｒｕｇ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌｉａ ａｎｄ ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｓｙｍｐｔｏｍｓ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）（ＤＲＥＳＳ）ならびに急性汎発性発疹性膿疱症（ＡＧＥＰ）、多形性紅斑、水疱性疾患、固定薬疹他；
ｅ）移植片対宿主病。

【0065】

ＣＤ１ａ発現悪性疾患は、本明細書において言及する場合、ＣＤ１ａ発現を検出可能な任意の悪性疾患であり得る。このような悪性疾患としては、ランゲルハンス細胞組織球症、Ｔ細胞リンパ腫のサブセット、胸腺腫のサブセットまたは他の悪性疾患のまれに生じる症例、例えば、肥満細胞症のサブセットが挙げられ得る。好ましくは、ＣＤ１ａ発現悪性疾患は、Ｔ細胞リンパ腫のサブセットである。

【0066】

好ましくは、１つまたは複数の疾患または障害は、乾癬、皮膚炎、エリテマトーデス、好中球性皮膚疾患、関連する全身性疾患もしくは障害、および／または全身的に現れる炎症性薬物反応、またはＣＤ１ａ発現悪性疾患を含むかまたはそれらからなる。

【0067】

関連する全身性疾患または障害は、本明細書において使用する場合、本明細書に定義の炎症性皮膚または粘膜疾患または障害と関連し得る任意の非皮膚部位合併症を指し得る。これは、非皮膚エリテマトーデスを含み得る。

【0068】

全身的に現れる炎症性薬物反応は、非皮膚部位、例えば、脾臓における反応であり得る。関連する全身性疾患もしくは障害、または全身的に現れる炎症性薬物反応は、炎症応答の結果であり得る。炎症応答は、例えば、薬物、例えば、アルダラ（Ａｌｄａｒａ、イミキモド５％のクリーム）に対するものであり得る。炎症応答により、ＣＤ４Ｔ細胞、ＣＤ８Ｔ細胞、好中球もしくは好酸球の数もしくは活性の上昇、ならびに／またはＩＬ－２３、ＩＬ－１２、ＩＬ－１βおよび／もしくはＭＣＰ－１のレベルの上昇、ならびに／またはＩＬ－１０および／もしくはＩＬ－２７の低下が生じ得る。

【0069】

その上、本発明の抗体もしくはその抗原結合断片、核酸、ベクター、宿主細胞または医薬組成物は、単独で、または１つまたは複数の他の治療剤と組み合わせて、同時、逐次または別々のいずれかにより、治療する症状に応じて投与され得る。１つまたは複数の他の治療剤は、細胞毒性剤、免疫活性化剤、例えば、チェックポイント阻害剤またはＴＬＲアゴニスト、抗炎症剤、例えば、ステロイド、ＣＡＲ－Ｔ細胞、例えば、調節性もしくは細胞溶解性ＣＡＲ－Ｔ細胞、または１つもしくは複数の本発明の抗体もしくは抗原結合断片を発現もしくは提示する他の細胞を含む群から選択され得る。

【0070】

別の態様では、
ｉ．対象から得られる生体試料を用意することと、
ｉｉ．治療前、または治療の合間、または治療が無い期間に対象から得られた試料においてＣＤ１ａ発現細胞に対する１つまたは複数の本発明の抗体または抗原結合断片の結合レベルを決定することと、
ｉｉｉ．治療後または治療の合間または治療が無い期間に腫瘍量、またはＣＤ１ａ発現細胞に対する１つもしくは複数の本発明の抗体もしくは抗原結合断片の結合レベルが低下する場合、治療が有効であるか、または病状が改善していると判定することと
を含む、ＣＤ１ａ発現悪性疾患であると診断された対象における治療有効性または病状を監視する方法を提供する。

【0071】

生体試料は、血液もしくは血清試料、組織生検、脳脊髄液、唾液または尿試料であり得る。好ましくは、生体試料は、血液または血清試料であり得る。

【0072】

試料におけるＣＤ１ａ発現細胞に対する１つまたは複数の本発明の抗体または抗原結合断片の結合レベルは、当業者に公知の任意の方法を使用して決定し得る。このような一方法では、例えば、フローサイトメトリーまたは検出可能な標識を利用する他の任意の技術を使用して、試料におけるＣＤ１ａ発現細胞数の決定が可能となる。

【0073】

腫瘍量は、当業者に公知の適する任意の技術により決定し得る。

【0074】

腫瘍量またはＣＤ１ａ発現細胞に対する１つもしくは複数の本発明の抗体もしくは抗原結合断片の結合レベルの低下は、１０％以上、例えば、２５％以上、５０％以上、７５％以上または９０％以上の低下であり得る。

【0075】

治療の合間または治療が無い期間は、２週間以上、例えば、４週間以上、８週間以上、１２週間以上、６カ月以上または１２カ月以上であり得る。

【0076】

抗体およびその抗原結合断片の生成のための技術は、当技術分野において周知である。「抗体」という用語は、種々のクラス（すなわち、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＤおよびＩｇＥ）およびサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２等）の免疫グロブリン（Ｉｇ）をも含む。抗体またはその抗原結合断片の説明的な例としては、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ断片、一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）、ダイアボディ、ドメイン抗体または二特異性抗体が挙げられる（Holt LJ et al., Trends Biotechnol. 21(11), 2003, 484-490）。また、例としては、単一ＣＨドメインまたは単独で抗原に結合可能なＶＬドメインからなるｄＡＢ断片が挙げられる。抗体またはその抗原結合断片は、キメラ、ナノボディ、一本鎖および／またはヒト化抗体またはその抗原結合断片であり得る。抗体またはその抗原結合断片は、ヒトＩｇＧ１アイソタイプもしくはヒトＩｇＧ４アイソタイプまたは他の天然もしくは修飾アイソタイプであり得る。抗体は、モノクローナル（ｍＡｂ）またはポリクローナル抗体であり得る。

【0077】

抗体またはその抗原結合断片は、インビボ（in vivo）での安定性および／または半減期を変更するように修飾し得る。修飾は、例えば、ＰＥＧ化であり得る。

【0078】

抗体またはその抗原結合断片は、抗体様分子であってもよく、これは、合成分子、例えば、ＳＭＩＰおよび小型の抗体ミメティックと別々または組み合わせたＣＤＲの使用を含む。

【0079】

２つのアミノ酸配列または２つの核酸配列のパーセント同一性は一般に、最適な比較目的のための配列のアラインメント（例えば、第２の配列による最良のアラインメントのために第１の配列にギャップを導入することができる）および対応する位置におけるアミノ酸残基またはヌクレオチドの比較により決定する。「最良のアラインメント」は、最も高いパーセント同一性が生じる２つの配列のアラインメントである。パーセント同一性は、配列内の同一のアミノ酸残基またはヌクレオチドの数を比較することにより決定する（すなわち、％同一性＝同一位置の数／位置の総数×１００）。

【0080】

２つの配列間のパーセント同一性の決定は、当業者に公知の数理アルゴリズムを使用して達成することができる。２つの配列の比較のための数理アルゴリズムの例は、Karlin and Altschul, 1990, PNAS, 87(6):2264-8のアルゴリズムであり、Karlin and Altschul, 1993, PNAS, 90(12):5873-5877等により改変された。Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol., 215:403-10のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラムでは、このようなアルゴリズムを組み込んでいる。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、ＮＢＬＡＳＴプログラムのｓｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄ ｌｅｎｇｔｈ＝１２により実施して、本発明の核酸分子に相同なヌクレオチド配列を得ることができる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、ＸＢＬＡＳＴプログラムのｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄ ｌｅｎｇｔｈ＝３により実施して、本発明のタンパク質分子に相同なアミノ酸配列を得るできる。比較目的でギャップアラインメントを得るには、Altschul et al. (1997)に記載のようにＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴを利用することができる。あるいは、ＰＳＩ－Ｂｌａｓｔを使用して反復検索を実施し、これにより分子間の距離関係を検出することができる（同上）。ＢＬＡＳＴ、ＧａｐｐｅｄＢＬＡＳＴおよびＰＳＩ－Ｂｌａｓｔプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメータを使用することができる。http://www.ncbi.nlm.nih.govを参照されたい。配列の比較に利用する数理アルゴリズムの別の例は、ＭｙｅｒｓおよびＭｉｌｌｅｒのアルゴリズムである。ＧＣＧ配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部であるＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）では、このようなアルゴリズムを組み込んでいる。当技術分野において公知の配列解析のための他のアルゴリズムとしては、Torellis and Robotti (1994)に記載のＡＤＶＡＮＣＥおよびＡＤＡＭ、ならびにPearson and Lipman (1988)に記載のＦＡＳＴＡが挙げられる。ＦＡＳＴＡでは、ｋｔｕｐは、検索の感度および速度を設定する制御オプションである。

【0081】

本発明の抗体またはその抗原結合断片は、１つまたは複数の突然変異アミノ酸残基を含み得る。本発明の核酸または抗体もしくはその抗原結合断片に関する「突然変異した」、「突然変異体」および「突然変異」という用語は、「天然に」存在する核酸またはポリペプチド、すなわち、野生型を定義するのに利用可能な参照配列と比較した、１つまたは複数のヌクレオチドまたはアミノ酸の置換、欠失または挿入をそれぞれ指す。

【0082】

ＣＤＲ配列におけるアミノ酸変異は、保存的アミノ酸置換であり得る。

【0083】

突然変異は置換であってもよく、この場合、置換は保存的置換である。保存的置換は一般に、次の置換であり、これらは突然変異するアミノ酸に従って列挙し、それぞれが、保存的であると考えられ得る１つまたは複数の置換（複数可）を後に伴う：Ａｌａ→Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ；Ａｒｇ→Ｌｙｓ；Ａｓｎ→Ｇｌｎ、Ｈｉｓ；Ａｓｐ→Ｇｌｕ；Ｃｙｓ→Ｓｅｒ；Ｇｌｎ→Ａｓｎ；Ｇｌｕ→Ａｓｐ；Ｇｌｙ→Ａｌａ；Ｈｉｓ→Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；Ｉｌｅ→Ｌｅｕ、Ｖａｌ；Ｌｅｕ→Ｉｌｅ、Ｖａｌ；Ｌｙｓ→Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ；Ｍｅｔ→Ｌｅｕ、Ｔｙｒ、Ｈｅ；Ｐｈｅ→Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｔｙｒ；Ｓｅｒ→Ｔｈｒ；Ｔｈｒ→Ｓｅｒ；Ｔｒｐ→Ｔｙｒ；Ｔｙｒ→Ｔｒｐ、Ｐｈｅ；Ｖａｌ→Ｈｅ、Ｌｅｕ。他の置換も容認され、経験的に、または他の公知の保存的もしくは非保存的置換に合わせて決定することができる。

【0084】

本発明の抗体またはその抗原結合断片のＣＤＲにおいて１、２または３つの保存的置換を行い得る。

【0085】

抗体またはその抗原結合断片を生成する方法は、当技術分野において周知である。当業者は、例えば、ハイブリドーマ技術を使用し得るか、または組換えＤＮＡ技術を使用して、それぞれの抗体配列をベクター、例えば、発現ベクターにクローニングし得る。二特異性抗体分子を生成する方法は、当技術分野において公知であり、例えば、組換えＤＮＡ技術、２つの異なるモノクローナル抗体の化学コンジュゲーション、または例えば、２つの抗体断片、例えば、２つのＦａｂ断片の化学コンジュゲーションもが挙げられる。あるいは、二特異性抗体分子は、クアドローマ技術により生成し、これは、親抗体を産生するハイブリドーマの融合によるものである。ＨおよびＬ鎖のランダムな組合せにより、１０種の異なる抗体構造の潜在的混合物を生成し、このうちの唯１つが、所望の結合特異性を有する。本発明の二特異性抗体分子は、各標的に対するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）として作用し得る。抗体またはその抗原結合断片は、キメラ、ヒト化または完全ヒト抗体またはその抗原結合断片であり得る。抗体またはその抗原結合断片は、ヒトＩｇＧ１アイソタイプもしくはヒトＩｇＧ４アイソタイプまたは他の天然もしくは修飾アイソタイプであり得る。二特異性抗体分子または多特異性抗体は、例えば、二特異性タンデム一本鎖Ｆｖ、二特異性Ｆａｂ２または二特異性ダイアボディであり得る。

【0086】

本明細書に開示の特徴はすべて、任意の態様または任意の実施形態との組合せを含む任意の組合せで併用し得る。

【図面の簡単な説明】

【0087】

【図1】図１は、抗ＣＤ１ａ抗体のパネルによるポリクローナルＴ細胞応答の阻害を示す。Ａ．抗ＣＤ１ａ抗体の上昇濃度（０．０１～１０μｇ／ｍｌ）によるポリクローナルＴ細胞ＩＦＮγ応答の用量滴定曲線（ｎ＝６ドナー）。Ｂ．新たに生成した抗ＣＤ１ａ抗体のパネルおよび市販の抗体について算出したＩＣ５０値（ＯＫＴ６、ＨＩ１４９およびＳＫ９、ｎ＝６ドナー）。

【図2-1】図２は、抗ＣＤ１ａ抗体のパネルによるＣＤ１ａ制限濃縮Ｔ細胞株応答の阻害を実証する。Ａ～Ｂ．空ベクター（ＥＶ）または内因性リガンドを提示するＣＤ１ａトランスフェクトＫ５６２により誘導されるＣＤ１ａ制限濃縮Ｔ細胞株のサイトカイン分泌応答。ＩＦＮγ（Ａ．）またはＩＬ－２２（Ｂ．）の阻害を、新たに生成した抗ＣＤ１ａ抗体のパネルについてフローサイトメトリーにより評価した。Ｃ．内因性リガンドを提示するＣＤ１ａコーティングビーズにより誘導されるＣＤ１ａ制限濃縮Ｔ細胞株のＩＦＮγ分泌応答。新たに生成した抗ＣＤ１ａ抗体のパネルについてフローサイトメトリーにより阻害を評価した。新たに生成した抗ＣＤ１ａ抗体のパネルについてフローサイトメトリーにより阻害を評価した（Ｎ＝４～１９濃縮Ｔ細胞株、二元配置分散分析とともにテューキーの検定、＊，Ｐ＜０．０５；＊＊，Ｐ＜０．０１；＊＊＊，Ｐ＜０．００１；＊＊＊＊，Ｐ＜０．０００１、ここで＊は「ＣＤ１ａ」に対する比較に関する有意性を示す）。

【図2-2】図２は、抗ＣＤ１ａ抗体のパネルによるＣＤ１ａ制限濃縮Ｔ細胞株応答の阻害を実証する。Ａ～Ｂ．空ベクター（ＥＶ）または内因性リガンドを提示するＣＤ１ａトランスフェクトＫ５６２により誘導されるＣＤ１ａ制限濃縮Ｔ細胞株のサイトカイン分泌応答。ＩＦＮγ（Ａ．）またはＩＬ－２２（Ｂ．）の阻害を、新たに生成した抗ＣＤ１ａ抗体のパネルについてフローサイトメトリーにより評価した。Ｃ．内因性リガンドを提示するＣＤ１ａコーティングビーズにより誘導されるＣＤ１ａ制限濃縮Ｔ細胞株のＩＦＮγ分泌応答。新たに生成した抗ＣＤ１ａ抗体のパネルについてフローサイトメトリーにより阻害を評価した。新たに生成した抗ＣＤ１ａ抗体のパネルについてフローサイトメトリーにより阻害を評価した（Ｎ＝４～１９濃縮Ｔ細胞株、二元配置分散分析とともにテューキーの検定、＊，Ｐ＜０．０５；＊＊，Ｐ＜０．０１；＊＊＊，Ｐ＜０．００１；＊＊＊＊，Ｐ＜０．０００１、ここで＊は「ＣＤ１ａ」に対する比較に関する有意性を示す）。

【図3-1】図３は、ＣＤ１ａ遺伝子導入マウスの特性決定を実証する。Ａ．それぞれのフローサイトメトリープロットおよびＢ．野生型（ＷＴ）およびＣＤ１ａ遺伝子導入（ＣＤ１ａ）マウスの細胞によるＣＤ１ａタンパク質発現の要約図。ＣＤ１ａタンパク質発現が、（左から右に）総生耳皮膚細胞、ＣＤ４５＋皮膚細胞、真皮樹状細胞（ｄＤＣ、ＣＤ４５＋／ＣＤ１１ｃ＋／ランゲリン－）およびランゲルハンス細胞（ＬＣ、ＣＤ４５＋／ＣＤ１１ｃ＋／ランゲリン＋）において上昇した。Ｃ．免疫蛍光により可視化した野生型（ＷＴ）およびＣＤ１ａ遺伝子導入（ＣＤ１ａ）マウスの耳皮膚におけるＣＤ１ａタンパク質発現。凍結切片をＤＡＰＩ（青）および抗ＣＤ１ａ ＡＦ－５９４（ＯＫＴ６、赤）で染色した。スケールバーは、左から右に５０μｍ、５０μｍおよび１０μｍ。Ｄ．ＣＤ１ａフォワードおよびリバースプライマーならびに尾部ゲノムＤＮＡを使用したＣＤ１ａ遺伝子導入マウス系統同腹仔（レーンＡ～Ｆ）の例となるＰＣＲ遺伝子型決定。６５５ｂｐにおける予想ＣＤ１ａバンド。レーンＧ：ファウンダーマウス由来の陽性対照ゲノムＤＮＡ。レーンＨ：ＤＮＡ鋳型を欠く陰性対照。Ｅ．野生型（ＷＴ）およびＣＤ１ａ遺伝子導入（ＣＤ１ａ）マウスによる胸腺ＣＤ１ａタンパク質発現の代表的フローサイトメトリープロット。

【図3-2】図３は、ＣＤ１ａ遺伝子導入マウスの特性決定を実証する。Ａ．それぞれのフローサイトメトリープロットおよびＢ．野生型（ＷＴ）およびＣＤ１ａ遺伝子導入（ＣＤ１ａ）マウスの細胞によるＣＤ１ａタンパク質発現の要約図。ＣＤ１ａタンパク質発現が、（左から右に）総生耳皮膚細胞、ＣＤ４５＋皮膚細胞、真皮樹状細胞（ｄＤＣ、ＣＤ４５＋／ＣＤ１１ｃ＋／ランゲリン－）およびランゲルハンス細胞（ＬＣ、ＣＤ４５＋／ＣＤ１１ｃ＋／ランゲリン＋）において上昇した。Ｃ．免疫蛍光により可視化した野生型（ＷＴ）およびＣＤ１ａ遺伝子導入（ＣＤ１ａ）マウスの耳皮膚におけるＣＤ１ａタンパク質発現。凍結切片をＤＡＰＩ（青）および抗ＣＤ１ａ ＡＦ－５９４（ＯＫＴ６、赤）で染色した。スケールバーは、左から右に５０μｍ、５０μｍおよび１０μｍ。Ｄ．ＣＤ１ａフォワードおよびリバースプライマーならびに尾部ゲノムＤＮＡを使用したＣＤ１ａ遺伝子導入マウス系統同腹仔（レーンＡ～Ｆ）の例となるＰＣＲ遺伝子型決定。６５５ｂｐにおける予想ＣＤ１ａバンド。レーンＧ：ファウンダーマウス由来の陽性対照ゲノムＤＮＡ。レーンＨ：ＤＮＡ鋳型を欠く陰性対照。Ｅ．野生型（ＷＴ）およびＣＤ１ａ遺伝子導入（ＣＤ１ａ）マウスによる胸腺ＣＤ１ａタンパク質発現の代表的フローサイトメトリープロット。

【図4】図４は、インビボでの抗ＣＤ１ａ抗体の特性決定である。Ａ．イミキモド誘発皮膚炎症および抗ＣＤ１ａ予防投与の模式図。Ｂ．マウスＩｇＧ１アイソタイプ対照をｉ．ｐ．注射した野生型（ＷＴ）およびＣＤ１ａ遺伝子導入マウス（ＣＤ１ａ）ならびに模式的パネルＡ．のように抗ＣＤ１ａ抗体の改良パネルを注射したＣＤ１ａ遺伝子導入マウスのイミキモド処置により誘発される耳腫脹の毎日の測定（Ｎ＝６、二元配置分散分析とともにダネットの検定、＊＊，Ｐ＜０．０１；＊＊＊＊，Ｐ＜０．０００１、６日目または示す日数における「ＣＤ１ａ」に対する比較に関する有意性を示す）。

【図5】図５は、イミキモド誘発皮膚免疫応答に対する抗ＣＤ１ａの作用を実証する。Ａ～Ｃ．マウスＩｇＧ１アイソタイプ処置野生型（ＷＴ）およびＣＤ１ａ遺伝子導入（ＣＤ１ａ）ならびに予防投与モデルに従って抗ＣＤ１ａ抗体の改良パネルを注射したＣＤ１ａ遺伝子導入マウスの耳皮膚のフローサイトメトリー解析。皮膚Ｔ細胞を数え上げ（Ａ．）、細胞表面ＣＤ６９発現（Ｂ．）について評価し、皮膚好中球（Ｃ．）および好酸球（Ｄ．）発生頻度を決定した（Ｎ＝４、一元配置分散分析とともにダネットの検定、＊，Ｐ＜０．０５；＊＊，Ｐ＜０．０１；＊＊＊，Ｐ＜０．００１）。

【図6】図６は、イミキモド誘発細胞性ランゲルハンス細胞皮膚およびリンパ節応答に対する抗ＣＤ１ａの作用を実証する。マウスＩｇＧ１アイソタイプ処置野生型（ＷＴ）およびＣＤ１ａ遺伝子導入（ＣＤ１ａ）ならびに予防投与モデルに従って抗ＣＤ１ａ抗体の改良パネルを注射したＣＤ１ａ遺伝子導入マウスの耳皮膚（Ａ～Ｂ．）および流入領域頸部リンパ節（Ｃ～Ｄ．）のフローサイトメトリー解析。皮膚ＬＣを数え上げ（Ａ．）、細胞表面ＣＤ１ａ発現について評価した（Ｂ．）。リンパ節ＬＣを数え上げ（Ｃ．）、細胞表面ＣＤ１ａ発現について評価した（Ｄ．）（Ｎ＝４、一元配置分散分析とともにダネットの検定、＊，Ｐ＜０．０５；＊＊，Ｐ＜０．０１；＊＊＊，Ｐ＜０．００１；＊＊＊＊，Ｐ＜０．０００１）。

【図7-1】図７は、抗体依存性枯渇（表現型変化）を実証する。Ａ．抗体誘導ＣＤ１ａ依存性細胞減少（例えば、死）のフローサイトメトリー解析。抗ＣＤ１ａ抗体またはマウスＩｇＧ１アイソタイプ対照（ｉｓｏ、５μｇ／ｍｌ）をＥＶまたはＣＤ１ａ－Ｋ５６２とともに指示のように４８時間インキュベートし、無処理Ｋ５６２の参照集団に対して抗体誘導減少のパーセンテージを算出してＥＶ対照細胞に対して正規化した。Ｂ．上昇濃度の抗ＣＤ１ａ抗体（０．６２５～５μｇ／ｍｌ）による抗体誘導ＣＤ１ａ－Ｋ５６２細胞減少の用量滴定曲線。Ｃ～Ｄ．抗ＣＤ１ａ抗体またはマウスＩｇＧ１アイソタイプ対照（ｉｓｏ、５μｇ／ｍｌ）をＭｏＤＣ（上パネル）およびＭｏＬＣ（下パネル）とともに指示のように５日間インキュベートして０日目または２日目に抗体およびサイトカインを加え、Ｉｎｃｕｃｙｔｅ生細胞イメージング（Ｎ＝４、二元配置分散分析とともにテューキーの検定）（Ｃ．）およびＭｏＬＣの代表的画像（Ｄ．）を使用してパーセンテージコンフルエンスにより測定したアイソタイプ対照に対して抗体誘導減少のパーセンテージを算出した。Ｅ．Ｋ５６２－ＣＤ１ａまたはＫ５６２－ＥＶ（空ベクター）を抗ＣＤ１ａ抗体とともに２４時間インキュベートし、アネキシンＶに染色し、フローサイトメトリーにより解析した（Ｎ＝３～４、一元配置分散分析とともにテューキーの検定）。Ｆ．補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）のフローサイトメトリー解析。Ｋ５６２－ＣＤ１ａ細胞を１０％の正常ヒト血清とともに５μｇ／ｍｌのアイソタイプ対照抗体または指示抗体のいずれかの存在下に３７℃で３時間インキュベートした。無処理Ｋ５６２の参照集団に対してパーセンテージ細胞毒性を算出し、アイソタイプ対照処理細胞に対して正規化した（Ｎ＝６、一元配置分散分析とともにテューキーの検定）。Ｇ．抗体依存性細胞媒介細胞毒性（ＡＤＣＣ）のフローサイトメトリー解析。Ｋ５６２－ＣＤ１ａ細胞をＰＢＭＣと１：５０の比率により、５μｇ／ｍｌのアイソタイプ対照抗体または指示抗体のいずれかの存在下に３７℃で５時間同時培養した。無処理Ｋ５６２の参照集団に対してパーセンテージ細胞毒性を算出し、アイソタイプ対照処理細胞に対して正規化した（Ｎ＝４～６、一元配置分散分析とともにテューキーの検定）。Ｈ．ＮＳＧマウスにＣＤ１ａ－Ｋ５６２細胞２５万細胞を側腹部に皮下注射し、１８日間腫瘍を発生させた。６、１０および１４日目にマウスの腹腔内をアイソタイプ対照抗体または指示抗体１００μｇで処置した。腫瘍量を経時的に測定した（Ｎ＝６～１５、二元配置分散分析とともにテューキーの検定、アスタリスクは、１８日目の「ＣＤ１ａ－ｉｓｏ」に対する比較に関する有意性を示す）。＊，Ｐ＜０．０５；＊＊，Ｐ＜０．０１；＊＊＊，Ｐ＜０．００１；＊＊＊＊，Ｐ＜０．０００１。

【図7-2】図７は、抗体依存性枯渇（表現型変化）を実証する。Ａ．抗体誘導ＣＤ１ａ依存性細胞減少（例えば、死）のフローサイトメトリー解析。抗ＣＤ１ａ抗体またはマウスＩｇＧ１アイソタイプ対照（ｉｓｏ、５μｇ／ｍｌ）をＥＶまたはＣＤ１ａ－Ｋ５６２とともに指示のように４８時間インキュベートし、無処理Ｋ５６２の参照集団に対して抗体誘導減少のパーセンテージを算出してＥＶ対照細胞に対して正規化した。Ｂ．上昇濃度の抗ＣＤ１ａ抗体（０．６２５～５μｇ／ｍｌ）による抗体誘導ＣＤ１ａ－Ｋ５６２細胞減少の用量滴定曲線。Ｃ～Ｄ．抗ＣＤ１ａ抗体またはマウスＩｇＧ１アイソタイプ対照（ｉｓｏ、５μｇ／ｍｌ）をＭｏＤＣ（上パネル）およびＭｏＬＣ（下パネル）とともに指示のように５日間インキュベートして０日目または２日目に抗体およびサイトカインを加え、Ｉｎｃｕｃｙｔｅ生細胞イメージング（Ｎ＝４、二元配置分散分析とともにテューキーの検定）（Ｃ．）およびＭｏＬＣの代表的画像（Ｄ．）を使用してパーセンテージコンフルエンスにより測定したアイソタイプ対照に対して抗体誘導減少のパーセンテージを算出した。Ｅ．Ｋ５６２－ＣＤ１ａまたはＫ５６２－ＥＶ（空ベクター）を抗ＣＤ１ａ抗体とともに２４時間インキュベートし、アネキシンＶに染色し、フローサイトメトリーにより解析した（Ｎ＝３～４、一元配置分散分析とともにテューキーの検定）。Ｆ．補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）のフローサイトメトリー解析。Ｋ５６２－ＣＤ１ａ細胞を１０％の正常ヒト血清とともに５μｇ／ｍｌのアイソタイプ対照抗体または指示抗体のいずれかの存在下に３７℃で３時間インキュベートした。無処理Ｋ５６２の参照集団に対してパーセンテージ細胞毒性を算出し、アイソタイプ対照処理細胞に対して正規化した（Ｎ＝６、一元配置分散分析とともにテューキーの検定）。Ｇ．抗体依存性細胞媒介細胞毒性（ＡＤＣＣ）のフローサイトメトリー解析。Ｋ５６２－ＣＤ１ａ細胞をＰＢＭＣと１：５０の比率により、５μｇ／ｍｌのアイソタイプ対照抗体または指示抗体のいずれかの存在下に３７℃で５時間同時培養した。無処理Ｋ５６２の参照集団に対してパーセンテージ細胞毒性を算出し、アイソタイプ対照処理細胞に対して正規化した（Ｎ＝４～６、一元配置分散分析とともにテューキーの検定）。Ｈ．ＮＳＧマウスにＣＤ１ａ－Ｋ５６２細胞２５万細胞を側腹部に皮下注射し、１８日間腫瘍を発生させた。６、１０および１４日目にマウスの腹腔内をアイソタイプ対照抗体または指示抗体１００μｇで処置した。腫瘍量を経時的に測定した（Ｎ＝６～１５、二元配置分散分析とともにテューキーの検定、アスタリスクは、１８日目の「ＣＤ１ａ－ｉｓｏ」に対する比較に関する有意性を示す）。＊，Ｐ＜０．０５；＊＊，Ｐ＜０．０１；＊＊＊，Ｐ＜０．００１；＊＊＊＊，Ｐ＜０．０００１。

【図7-3】図７は、抗体依存性枯渇（表現型変化）を実証する。Ａ．抗体誘導ＣＤ１ａ依存性細胞減少（例えば、死）のフローサイトメトリー解析。抗ＣＤ１ａ抗体またはマウスＩｇＧ１アイソタイプ対照（ｉｓｏ、５μｇ／ｍｌ）をＥＶまたはＣＤ１ａ－Ｋ５６２とともに指示のように４８時間インキュベートし、無処理Ｋ５６２の参照集団に対して抗体誘導減少のパーセンテージを算出してＥＶ対照細胞に対して正規化した。Ｂ．上昇濃度の抗ＣＤ１ａ抗体（０．６２５～５μｇ／ｍｌ）による抗体誘導ＣＤ１ａ－Ｋ５６２細胞減少の用量滴定曲線。Ｃ～Ｄ．抗ＣＤ１ａ抗体またはマウスＩｇＧ１アイソタイプ対照（ｉｓｏ、５μｇ／ｍｌ）をＭｏＤＣ（上パネル）およびＭｏＬＣ（下パネル）とともに指示のように５日間インキュベートして０日目または２日目に抗体およびサイトカインを加え、Ｉｎｃｕｃｙｔｅ生細胞イメージング（Ｎ＝４、二元配置分散分析とともにテューキーの検定）（Ｃ．）およびＭｏＬＣの代表的画像（Ｄ．）を使用してパーセンテージコンフルエンスにより測定したアイソタイプ対照に対して抗体誘導減少のパーセンテージを算出した。Ｅ．Ｋ５６２－ＣＤ１ａまたはＫ５６２－ＥＶ（空ベクター）を抗ＣＤ１ａ抗体とともに２４時間インキュベートし、アネキシンＶに染色し、フローサイトメトリーにより解析した（Ｎ＝３～４、一元配置分散分析とともにテューキーの検定）。Ｆ．補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）のフローサイトメトリー解析。Ｋ５６２－ＣＤ１ａ細胞を１０％の正常ヒト血清とともに５μｇ／ｍｌのアイソタイプ対照抗体または指示抗体のいずれかの存在下に３７℃で３時間インキュベートした。無処理Ｋ５６２の参照集団に対してパーセンテージ細胞毒性を算出し、アイソタイプ対照処理細胞に対して正規化した（Ｎ＝６、一元配置分散分析とともにテューキーの検定）。Ｇ．抗体依存性細胞媒介細胞毒性（ＡＤＣＣ）のフローサイトメトリー解析。Ｋ５６２－ＣＤ１ａ細胞をＰＢＭＣと１：５０の比率により、５μｇ／ｍｌのアイソタイプ対照抗体または指示抗体のいずれかの存在下に３７℃で５時間同時培養した。無処理Ｋ５６２の参照集団に対してパーセンテージ細胞毒性を算出し、アイソタイプ対照処理細胞に対して正規化した（Ｎ＝４～６、一元配置分散分析とともにテューキーの検定）。Ｈ．ＮＳＧマウスにＣＤ１ａ－Ｋ５６２細胞２５万細胞を側腹部に皮下注射し、１８日間腫瘍を発生させた。６、１０および１４日目にマウスの腹腔内をアイソタイプ対照抗体または指示抗体１００μｇで処置した。腫瘍量を経時的に測定した（Ｎ＝６～１５、二元配置分散分析とともにテューキーの検定、アスタリスクは、１８日目の「ＣＤ１ａ－ｉｓｏ」に対する比較に関する有意性を示す）。＊，Ｐ＜０．０５；＊＊，Ｐ＜０．０１；＊＊＊，Ｐ＜０．００１；＊＊＊＊，Ｐ＜０．０００１。

【図7-4】図７は、抗体依存性枯渇（表現型変化）を実証する。Ａ．抗体誘導ＣＤ１ａ依存性細胞減少（例えば、死）のフローサイトメトリー解析。抗ＣＤ１ａ抗体またはマウスＩｇＧ１アイソタイプ対照（ｉｓｏ、５μｇ／ｍｌ）をＥＶまたはＣＤ１ａ－Ｋ５６２とともに指示のように４８時間インキュベートし、無処理Ｋ５６２の参照集団に対して抗体誘導減少のパーセンテージを算出してＥＶ対照細胞に対して正規化した。Ｂ．上昇濃度の抗ＣＤ１ａ抗体（０．６２５～５μｇ／ｍｌ）による抗体誘導ＣＤ１ａ－Ｋ５６２細胞減少の用量滴定曲線。Ｃ～Ｄ．抗ＣＤ１ａ抗体またはマウスＩｇＧ１アイソタイプ対照（ｉｓｏ、５μｇ／ｍｌ）をＭｏＤＣ（上パネル）およびＭｏＬＣ（下パネル）とともに指示のように５日間インキュベートして０日目または２日目に抗体およびサイトカインを加え、Ｉｎｃｕｃｙｔｅ生細胞イメージング（Ｎ＝４、二元配置分散分析とともにテューキーの検定）（Ｃ．）およびＭｏＬＣの代表的画像（Ｄ．）を使用してパーセンテージコンフルエンスにより測定したアイソタイプ対照に対して抗体誘導減少のパーセンテージを算出した。Ｅ．Ｋ５６２－ＣＤ１ａまたはＫ５６２－ＥＶ（空ベクター）を抗ＣＤ１ａ抗体とともに２４時間インキュベートし、アネキシンＶに染色し、フローサイトメトリーにより解析した（Ｎ＝３～４、一元配置分散分析とともにテューキーの検定）。Ｆ．補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）のフローサイトメトリー解析。Ｋ５６２－ＣＤ１ａ細胞を１０％の正常ヒト血清とともに５μｇ／ｍｌのアイソタイプ対照抗体または指示抗体のいずれかの存在下に３７℃で３時間インキュベートした。無処理Ｋ５６２の参照集団に対してパーセンテージ細胞毒性を算出し、アイソタイプ対照処理細胞に対して正規化した（Ｎ＝６、一元配置分散分析とともにテューキーの検定）。Ｇ．抗体依存性細胞媒介細胞毒性（ＡＤＣＣ）のフローサイトメトリー解析。Ｋ５６２－ＣＤ１ａ細胞をＰＢＭＣと１：５０の比率により、５μｇ／ｍｌのアイソタイプ対照抗体または指示抗体のいずれかの存在下に３７℃で５時間同時培養した。無処理Ｋ５６２の参照集団に対してパーセンテージ細胞毒性を算出し、アイソタイプ対照処理細胞に対して正規化した（Ｎ＝４～６、一元配置分散分析とともにテューキーの検定）。Ｈ．ＮＳＧマウスにＣＤ１ａ－Ｋ５６２細胞２５万細胞を側腹部に皮下注射し、１８日間腫瘍を発生させた。６、１０および１４日目にマウスの腹腔内をアイソタイプ対照抗体または指示抗体１００μｇで処置した。腫瘍量を経時的に測定した（Ｎ＝６～１５、二元配置分散分析とともにテューキーの検定、アスタリスクは、１８日目の「ＣＤ１ａ－ｉｓｏ」に対する比較に関する有意性を示す）。＊，Ｐ＜０．０５；＊＊，Ｐ＜０．０１；＊＊＊，Ｐ＜０．００１；＊＊＊＊，Ｐ＜０．０００１。

【図7-5】図７は、抗体依存性枯渇（表現型変化）を実証する。Ａ．抗体誘導ＣＤ１ａ依存性細胞減少（例えば、死）のフローサイトメトリー解析。抗ＣＤ１ａ抗体またはマウスＩｇＧ１アイソタイプ対照（ｉｓｏ、５μｇ／ｍｌ）をＥＶまたはＣＤ１ａ－Ｋ５６２とともに指示のように４８時間インキュベートし、無処理Ｋ５６２の参照集団に対して抗体誘導減少のパーセンテージを算出してＥＶ対照細胞に対して正規化した。Ｂ．上昇濃度の抗ＣＤ１ａ抗体（０．６２５～５μｇ／ｍｌ）による抗体誘導ＣＤ１ａ－Ｋ５６２細胞減少の用量滴定曲線。Ｃ～Ｄ．抗ＣＤ１ａ抗体またはマウスＩｇＧ１アイソタイプ対照（ｉｓｏ、５μｇ／ｍｌ）をＭｏＤＣ（上パネル）およびＭｏＬＣ（下パネル）とともに指示のように５日間インキュベートして０日目または２日目に抗体およびサイトカインを加え、Ｉｎｃｕｃｙｔｅ生細胞イメージング（Ｎ＝４、二元配置分散分析とともにテューキーの検定）（Ｃ．）およびＭｏＬＣの代表的画像（Ｄ．）を使用してパーセンテージコンフルエンスにより測定したアイソタイプ対照に対して抗体誘導減少のパーセンテージを算出した。Ｅ．Ｋ５６２－ＣＤ１ａまたはＫ５６２－ＥＶ（空ベクター）を抗ＣＤ１ａ抗体とともに２４時間インキュベートし、アネキシンＶに染色し、フローサイトメトリーにより解析した（Ｎ＝３～４、一元配置分散分析とともにテューキーの検定）。Ｆ．補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）のフローサイトメトリー解析。Ｋ５６２－ＣＤ１ａ細胞を１０％の正常ヒト血清とともに５μｇ／ｍｌのアイソタイプ対照抗体または指示抗体のいずれかの存在下に３７℃で３時間インキュベートした。無処理Ｋ５６２の参照集団に対してパーセンテージ細胞毒性を算出し、アイソタイプ対照処理細胞に対して正規化した（Ｎ＝６、一元配置分散分析とともにテューキーの検定）。Ｇ．抗体依存性細胞媒介細胞毒性（ＡＤＣＣ）のフローサイトメトリー解析。Ｋ５６２－ＣＤ１ａ細胞をＰＢＭＣと１：５０の比率により、５μｇ／ｍｌのアイソタイプ対照抗体または指示抗体のいずれかの存在下に３７℃で５時間同時培養した。無処理Ｋ５６２の参照集団に対してパーセンテージ細胞毒性を算出し、アイソタイプ対照処理細胞に対して正規化した（Ｎ＝４～６、一元配置分散分析とともにテューキーの検定）。Ｈ．ＮＳＧマウスにＣＤ１ａ－Ｋ５６２細胞２５万細胞を側腹部に皮下注射し、１８日間腫瘍を発生させた。６、１０および１４日目にマウスの腹腔内をアイソタイプ対照抗体または指示抗体１００μｇで処置した。腫瘍量を経時的に測定した（Ｎ＝６～１５、二元配置分散分析とともにテューキーの検定、アスタリスクは、１８日目の「ＣＤ１ａ－ｉｓｏ」に対する比較に関する有意性を示す）。＊，Ｐ＜０．０５；＊＊，Ｐ＜０．０１；＊＊＊，Ｐ＜０．００１；＊＊＊＊，Ｐ＜０．０００１。

【図7-6】図７は、抗体依存性枯渇（表現型変化）を実証する。Ａ．抗体誘導ＣＤ１ａ依存性細胞減少（例えば、死）のフローサイトメトリー解析。抗ＣＤ１ａ抗体またはマウスＩｇＧ１アイソタイプ対照（ｉｓｏ、５μｇ／ｍｌ）をＥＶまたはＣＤ１ａ－Ｋ５６２とともに指示のように４８時間インキュベートし、無処理Ｋ５６２の参照集団に対して抗体誘導減少のパーセンテージを算出してＥＶ対照細胞に対して正規化した。Ｂ．上昇濃度の抗ＣＤ１ａ抗体（０．６２５～５μｇ／ｍｌ）による抗体誘導ＣＤ１ａ－Ｋ５６２細胞減少の用量滴定曲線。Ｃ～Ｄ．抗ＣＤ１ａ抗体またはマウスＩｇＧ１アイソタイプ対照（ｉｓｏ、５μｇ／ｍｌ）をＭｏＤＣ（上パネル）およびＭｏＬＣ（下パネル）とともに指示のように５日間インキュベートして０日目または２日目に抗体およびサイトカインを加え、Ｉｎｃｕｃｙｔｅ生細胞イメージング（Ｎ＝４、二元配置分散分析とともにテューキーの検定）（Ｃ．）およびＭｏＬＣの代表的画像（Ｄ．）を使用してパーセンテージコンフルエンスにより測定したアイソタイプ対照に対して抗体誘導減少のパーセンテージを算出した。Ｅ．Ｋ５６２－ＣＤ１ａまたはＫ５６２－ＥＶ（空ベクター）を抗ＣＤ１ａ抗体とともに２４時間インキュベートし、アネキシンＶに染色し、フローサイトメトリーにより解析した（Ｎ＝３～４、一元配置分散分析とともにテューキーの検定）。Ｆ．補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）のフローサイトメトリー解析。Ｋ５６２－ＣＤ１ａ細胞を１０％の正常ヒト血清とともに５μｇ／ｍｌのアイソタイプ対照抗体または指示抗体のいずれかの存在下に３７℃で３時間インキュベートした。無処理Ｋ５６２の参照集団に対してパーセンテージ細胞毒性を算出し、アイソタイプ対照処理細胞に対して正規化した（Ｎ＝６、一元配置分散分析とともにテューキーの検定）。Ｇ．抗体依存性細胞媒介細胞毒性（ＡＤＣＣ）のフローサイトメトリー解析。Ｋ５６２－ＣＤ１ａ細胞をＰＢＭＣと１：５０の比率により、５μｇ／ｍｌのアイソタイプ対照抗体または指示抗体のいずれかの存在下に３７℃で５時間同時培養した。無処理Ｋ５６２の参照集団に対してパーセンテージ細胞毒性を算出し、アイソタイプ対照処理細胞に対して正規化した（Ｎ＝４～６、一元配置分散分析とともにテューキーの検定）。Ｈ．ＮＳＧマウスにＣＤ１ａ－Ｋ５６２細胞２５万細胞を側腹部に皮下注射し、１８日間腫瘍を発生させた。６、１０および１４日目にマウスの腹腔内をアイソタイプ対照抗体または指示抗体１００μｇで処置した。腫瘍量を経時的に測定した（Ｎ＝６～１５、二元配置分散分析とともにテューキーの検定、アスタリスクは、１８日目の「ＣＤ１ａ－ｉｓｏ」に対する比較に関する有意性を示す）。＊，Ｐ＜０．０５；＊＊，Ｐ＜０．０１；＊＊＊，Ｐ＜０．００１；＊＊＊＊，Ｐ＜０．０００１。

【図8-1】図８（Ａ）は、ＣＤ１ａエピトープ解析によるヒートマップである。ＣＤ１ａ－ＡＦ６４７平均蛍光強度（ＭＦＩ）により測定したフローサイトメトリーによるＣＤ１ａ抗体結合のマトリックスヒートマップ表示。フルオロフォアＡＦ６４７にコンジュゲートした抗ＣＤ１ａ抗体によるＣＤ１ａ－Ｋ６５２の染色前に、関連する精製抗体を細胞とともにインキュベートして、ＡＦ６４７コンジュゲート抗体のＣＤ１ａ結合における干渉を評価した。グレースケールは干渉の程度を示し、最上行（－）の色調は無干渉を示す。（Ｂ）では、インビボでのＣＤ１ａ抗体エピトープ競合アッセイ結果を実証する。Ａ．抗ＣＤ１ａ抗体ＳＫ９（左パネル）またはＨＩ１４９（右パネル）による染色によって測定したＣＤ１ａ発現のフローサイトメトリープロット。０、２および４日目に抗ＣＤ１ａ抗体１１６（１００μｇ ｉ．ｐ．）を投与して、５日目に耳皮膚組織を採取、処理し、ＣＤ１ａについて染色した。

【図8-2】図８（Ａ）は、ＣＤ１ａエピトープ解析によるヒートマップである。ＣＤ１ａ－ＡＦ６４７平均蛍光強度（ＭＦＩ）により測定したフローサイトメトリーによるＣＤ１ａ抗体結合のマトリックスヒートマップ表示。フルオロフォアＡＦ６４７にコンジュゲートした抗ＣＤ１ａ抗体によるＣＤ１ａ－Ｋ６５２の染色前に、関連する精製抗体を細胞とともにインキュベートして、ＡＦ６４７コンジュゲート抗体のＣＤ１ａ結合における干渉を評価した。グレースケールは干渉の程度を示し、最上行（－）の色調は無干渉を示す。（Ｂ）では、インビボでのＣＤ１ａ抗体エピトープ競合アッセイ結果を実証する。Ａ．抗ＣＤ１ａ抗体ＳＫ９（左パネル）またはＨＩ１４９（右パネル）による染色によって測定したＣＤ１ａ発現のフローサイトメトリープロット。０、２および４日目に抗ＣＤ１ａ抗体１１６（１００μｇ ｉ．ｐ．）を投与して、５日目に耳皮膚組織を採取、処理し、ＣＤ１ａについて染色した。

【図9-1】図９は、イミキモド誘発炎症の治療における抗ＣＤ１ａ抗体の適用の有効性を実証する。Ａ．抗ＣＤ１ａ製剤投与によるイミキモド誘発炎症モデルの模式図。Ｂ．耳腫脹の毎日の測定、ならびにＣ．野生型（ＷＴ）およびＣＤ１ａ遺伝子導入マウス（ＣＤ１ａ）のイミキモド処置後のマウスＩｇＧ１アイソタイプ対照によるｉ．ｐ．処置（８日目）、またはＣＤ１ａ遺伝子導入マウスの模式的パネルＡのような抗ＣＤ１ａ抗体の改良パネルによる注射（３日目の矢印）によって誘発される炎症の代表的画像（Ｎ＝２～１０、二元配置分散分析とともにダネットの検定、＊＊，Ｐ＜０．０１；＊＊＊＊，Ｐ＜０．０００１、８日目または示す日数における「ＣＤ１ａ」に対する比較に関する有意性を示す）。Ｄ．免疫蛍光により可視化したイミキモド（Ｉｍｉｑ）で処置したかまたは無処置（Ｕ）の野生型（ＷＴ）およびＣＤ１ａ遺伝子導入（ＣＤ１ａ）マウスの耳および表皮厚ならびに耳皮膚におけるＣＤ１ａタンパク質発現。凍結切片をＤＡＰＩ（青）および抗ＣＤ１ａ ＡＦ－５９４（ＯＫＴ６、赤）で染色した。スケールバーは、上パネル１０μｍおよび下パネル１００μｍ。Ｅ～Ｇ．マウスＩｇＧ１アイソタイプ処置野生型（ＷＴ）およびＣＤ１ａ遺伝子導入（ＣＤ１ａ）ならびに治療投与モデルに従って抗ＣＤ１ａ抗体の改良パネルを注射したＣＤ１ａ遺伝子導入マウスの耳皮膚のフローサイトメトリー解析。皮膚Ｔ細胞を数え上げ、細胞表面ＣＤ１１ａ発現（Ｅ．）について評価し、好中球（Ｆ．）および好酸球（Ｇ．）発生頻度を決定した（Ｎ＝７～９、一元配置分散分析とともにダネットの検定、＊，Ｐ＜０．０５；＊＊，Ｐ＜０．０１；＊＊＊，Ｐ＜０．００１）。

【図9-2】図９は、イミキモド誘発炎症の治療における抗ＣＤ１ａ抗体の適用の有効性を実証する。Ａ．抗ＣＤ１ａ製剤投与によるイミキモド誘発炎症モデルの模式図。Ｂ．耳腫脹の毎日の測定、ならびにＣ．野生型（ＷＴ）およびＣＤ１ａ遺伝子導入マウス（ＣＤ１ａ）のイミキモド処置後のマウスＩｇＧ１アイソタイプ対照によるｉ．ｐ．処置（８日目）、またはＣＤ１ａ遺伝子導入マウスの模式的パネルＡのような抗ＣＤ１ａ抗体の改良パネルによる注射（３日目の矢印）によって誘発される炎症の代表的画像（Ｎ＝２～１０、二元配置分散分析とともにダネットの検定、＊＊，Ｐ＜０．０１；＊＊＊＊，Ｐ＜０．０００１、８日目または示す日数における「ＣＤ１ａ」に対する比較に関する有意性を示す）。Ｄ．免疫蛍光により可視化したイミキモド（Ｉｍｉｑ）で処置したかまたは無処置（Ｕ）の野生型（ＷＴ）およびＣＤ１ａ遺伝子導入（ＣＤ１ａ）マウスの耳および表皮厚ならびに耳皮膚におけるＣＤ１ａタンパク質発現。凍結切片をＤＡＰＩ（青）および抗ＣＤ１ａ ＡＦ－５９４（ＯＫＴ６、赤）で染色した。スケールバーは、上パネル１０μｍおよび下パネル１００μｍ。Ｅ～Ｇ．マウスＩｇＧ１アイソタイプ処置野生型（ＷＴ）およびＣＤ１ａ遺伝子導入（ＣＤ１ａ）ならびに治療投与モデルに従って抗ＣＤ１ａ抗体の改良パネルを注射したＣＤ１ａ遺伝子導入マウスの耳皮膚のフローサイトメトリー解析。皮膚Ｔ細胞を数え上げ、細胞表面ＣＤ１１ａ発現（Ｅ．）について評価し、好中球（Ｆ．）および好酸球（Ｇ．）発生頻度を決定した（Ｎ＝７～９、一元配置分散分析とともにダネットの検定、＊，Ｐ＜０．０５；＊＊，Ｐ＜０．０１；＊＊＊，Ｐ＜０．００１）。

【図9-3】図９は、イミキモド誘発炎症の治療における抗ＣＤ１ａ抗体の適用の有効性を実証する。Ａ．抗ＣＤ１ａ製剤投与によるイミキモド誘発炎症モデルの模式図。Ｂ．耳腫脹の毎日の測定、ならびにＣ．野生型（ＷＴ）およびＣＤ１ａ遺伝子導入マウス（ＣＤ１ａ）のイミキモド処置後のマウスＩｇＧ１アイソタイプ対照によるｉ．ｐ．処置（８日目）、またはＣＤ１ａ遺伝子導入マウスの模式的パネルＡのような抗ＣＤ１ａ抗体の改良パネルによる注射（３日目の矢印）によって誘発される炎症の代表的画像（Ｎ＝２～１０、二元配置分散分析とともにダネットの検定、＊＊，Ｐ＜０．０１；＊＊＊＊，Ｐ＜０．０００１、８日目または示す日数における「ＣＤ１ａ」に対する比較に関する有意性を示す）。Ｄ．免疫蛍光により可視化したイミキモド（Ｉｍｉｑ）で処置したかまたは無処置（Ｕ）の野生型（ＷＴ）およびＣＤ１ａ遺伝子導入（ＣＤ１ａ）マウスの耳および表皮厚ならびに耳皮膚におけるＣＤ１ａタンパク質発現。凍結切片をＤＡＰＩ（青）および抗ＣＤ１ａ ＡＦ－５９４（ＯＫＴ６、赤）で染色した。スケールバーは、上パネル１０μｍおよび下パネル１００μｍ。Ｅ～Ｇ．マウスＩｇＧ１アイソタイプ処置野生型（ＷＴ）およびＣＤ１ａ遺伝子導入（ＣＤ１ａ）ならびに治療投与モデルに従って抗ＣＤ１ａ抗体の改良パネルを注射したＣＤ１ａ遺伝子導入マウスの耳皮膚のフローサイトメトリー解析。皮膚Ｔ細胞を数え上げ、細胞表面ＣＤ１１ａ発現（Ｅ．）について評価し、好中球（Ｆ．）および好酸球（Ｇ．）発生頻度を決定した（Ｎ＝７～９、一元配置分散分析とともにダネットの検定、＊，Ｐ＜０．０５；＊＊，Ｐ＜０．０１；＊＊＊，Ｐ＜０．００１）。

【図10-1】図１０は、イミキモド適用の全身作用のＣＤ１ａ依存性を実証する。Ａ．野生型（ＷＴ）およびＣＤ１ａ遺伝子導入マウス（ＣＤ１ａ）のイミキモド処置後のマウスＩｇＧ１アイソタイプ対照によるｉ．ｐ．処置、またはＣＤ１ａ遺伝子導入マウスの模式図のような抗ＣＤ１ａ抗体の改良パネルによる注射による８日目の脾臓重量（ｍｇ）測定および代表的画像（図９Ａ）。Ｂ～Ｅ．マウスＩｇＧ１アイソタイプ処置野生型（ＷＴ）およびＣＤ１ａ遺伝子導入（ＣＤ１ａ）、ならびに治療投与モデルに従って抗ＣＤ１ａ抗体の改良パネルを注射したＣＤ１ａ遺伝子導入マウスの脾臓のフローサイトメトリー解析。脾臓ＣＤ４（Ｂ．）およびＣＤ８（Ｃ．）Ｔ細胞ＣＤ６９発現を評価し、好中球（Ｄ．）および好酸球（Ｅ．）を数え上げた（Ｎ＝７～９、一元配置分散分析とともにダネットの検定、＊，Ｐ＜０．０５；＊＊，Ｐ＜０．０１；＊＊＊，Ｐ＜０．００１；＊＊＊＊，Ｐ＜０．０００１）。Ｆ．マウスＩｇＧ１アイソタイプ処置野生型（ＷＴ）およびＣＤ１ａ遺伝子導入（ＣＤ１ａ）、ならびに治療投与モデルに従って抗ＣＤ１ａ抗体を注射したＣＤ１ａ遺伝子導入マウスの血液の血漿サイトカインレベル（Ｎ＝７～９、一元配置分散分析とともにダネットの検定、＊，Ｐ＜０．０５；＊＊，Ｐ＜０．０１；＊＊＊，Ｐ＜０．００１；＊＊＊＊，Ｐ＜０．０００１）。

【図10-2】図１０は、イミキモド適用の全身作用のＣＤ１ａ依存性を実証する。Ａ．野生型（ＷＴ）およびＣＤ１ａ遺伝子導入マウス（ＣＤ１ａ）のイミキモド処置後のマウスＩｇＧ１アイソタイプ対照によるｉ．ｐ．処置、またはＣＤ１ａ遺伝子導入マウスの模式図のような抗ＣＤ１ａ抗体の改良パネルによる注射による８日目の脾臓重量（ｍｇ）測定および代表的画像（図９Ａ）。Ｂ～Ｅ．マウスＩｇＧ１アイソタイプ処置野生型（ＷＴ）およびＣＤ１ａ遺伝子導入（ＣＤ１ａ）、ならびに治療投与モデルに従って抗ＣＤ１ａ抗体の改良パネルを注射したＣＤ１ａ遺伝子導入マウスの脾臓のフローサイトメトリー解析。脾臓ＣＤ４（Ｂ．）およびＣＤ８（Ｃ．）Ｔ細胞ＣＤ６９発現を評価し、好中球（Ｄ．）および好酸球（Ｅ．）を数え上げた（Ｎ＝７～９、一元配置分散分析とともにダネットの検定、＊，Ｐ＜０．０５；＊＊，Ｐ＜０．０１；＊＊＊，Ｐ＜０．００１；＊＊＊＊，Ｐ＜０．０００１）。Ｆ．マウスＩｇＧ１アイソタイプ処置野生型（ＷＴ）およびＣＤ１ａ遺伝子導入（ＣＤ１ａ）、ならびに治療投与モデルに従って抗ＣＤ１ａ抗体を注射したＣＤ１ａ遺伝子導入マウスの血液の血漿サイトカインレベル（Ｎ＝７～９、一元配置分散分析とともにダネットの検定、＊，Ｐ＜０．０５；＊＊，Ｐ＜０．０１；＊＊＊，Ｐ＜０．００１；＊＊＊＊，Ｐ＜０．０００１）。

【図11】図１１は、イミキモド適用の全身作用のＣＤ１ａ依存性を実証する。Ａ～Ｅ．マウスＩｇＧ１アイソタイプ処置野生型（ＷＴ）およびＣＤ１ａ遺伝子導入（ＣＤ１ａ）、ならびに治療投与モデルに従って抗ＣＤ１ａ抗体の改良パネルを注射したＣＤ１ａ遺伝子導入マウスの血液の血液細胞解析。循環Ｔ細胞（Ａ．）、ＣＤ４＋（Ｂ．）およびＣＤ８（Ｃ．）、好中球（Ｄ．）および好酸球（Ｅ．）を数え上げた（Ｎ＝５～７、一元配置分散分析とともにダネットの検定、＊，Ｐ＜０．０５；＊＊，Ｐ＜０．０１；＊＊＊，Ｐ＜０．００１；＊＊＊＊，Ｐ＜０．０００１）。

【図12】図１２は、イミキモドがＣＤ１ａリガンドを構成しないことを示す。等電点電気泳動（ＩＥＦ）ゲルｐＨ３～７上の偽およびイミキモド「添加」ＣＤ１ａタンパク質の等電点依存的遊走。偽：媒体対照ＴＢＳ ２％ＣＨＡＰＳ ７％ＤＭＳＯ。

【図13-1】図１３は、イミキモド誘発炎症の持続的制御における抗ＣＤ１ａ抗体適用の有効性である。Ａ．後に抗ＣＤ１ａを投与しないイミキモド再曝露モデルの模式図。Ｂ．マウスＩｇＧ１アイソタイプ対照をｉ．ｐ．で注射した野生型（ＷＴ）およびＣＤ１ａ遺伝子導入マウス（ＣＤ１ａ）ならびに模式的パネル１３Ａのように抗ＣＤ１ａ抗体の改良パネルを注射したＣＤ１ａ遺伝子導入マウスのイミキモド処置により誘発された耳腫脹の毎日の測定（二元配置分散分析とともにダネットの検定、＊，Ｐ＜０．０５；＊＊，Ｐ＜０．０１、イミキモド再適用から７日目の「ＣＤ１ａ」アイソタイプに対する比較に関する有意性を示す）。

【図13-2】図１３は、イミキモド誘発炎症の持続的制御における抗ＣＤ１ａ抗体適用の有効性である。Ａ．後に抗ＣＤ１ａを投与しないイミキモド再曝露モデルの模式図。Ｂ．マウスＩｇＧ１アイソタイプ対照をｉ．ｐ．で注射した野生型（ＷＴ）およびＣＤ１ａ遺伝子導入マウス（ＣＤ１ａ）ならびに模式的パネル１３Ａのように抗ＣＤ１ａ抗体の改良パネルを注射したＣＤ１ａ遺伝子導入マウスのイミキモド処置により誘発された耳腫脹の毎日の測定（二元配置分散分析とともにダネットの検定、＊，Ｐ＜０．０５；＊＊，Ｐ＜０．０１、イミキモド再適用から７日目の「ＣＤ１ａ」アイソタイプに対する比較に関する有意性を示す）。

【図14】図１４は、標準治療と比較した、イミキモド誘発炎症の治療における抗ＣＤ１ａ抗体適用の有効性である。野生型（ＷＴ）およびＣＤ１ａ遺伝子導入マウス（ＣＤ１ａ）のイミキモド処置後のマウスＩｇＧ１アイソタイプ対照によるｉ．ｐ．処置（ＣＤ１ａ）、またはＣＤ１ａ遺伝子導入マウスの模式的パネル図９Ａのような抗ＣＤ１ａ抗体の改良パネルおよび抗ＩＬ－１７Ａによる注射によって誘発された耳腫脹の毎日の測定。ｄｘ＝ＣＤ１ａ遺伝子導入マウスの耳厚と比較して有意性が達成されたモデルの日数。

【図15-1】図１５は、イミキモド／ＭＣ９０３誘発炎症の治療における抗ＣＤ１ａ抗体適用の有効性の比較解析である。Ａ．抗ＣＤ１ａ製剤投与によるイミキモド誘発炎症の模式図。Ｂ．野生型（ＷＴ）およびＣＤ１ａ遺伝子導入マウス（ＣＤ１ａ）のイミキモド処置後のマウスＩｇＧ１アイソタイプ対照によるｉ．ｐ．処置、またはＣＤ１ａ遺伝子導入マウスの模式的パネルＡのような抗ＣＤ１ａ抗体の改良パネルもしくはＣＲ２１１３による注射によって誘発された耳腫脹の毎日の測定。Ｎ＝２～７、二元配置分散分析とともにダネットの検定、＊，Ｐ＜０．０５，＊＊，Ｐ＜０．０１；＊＊＊＊，Ｐ＜０．０００１、８日目の「ＣＤ１ａ」または８日目のＯＸ１１６対ＣＲ２１１３に対する比較に関する有意性を示す。Ｃ．ＷＴを補正した、（Ｂ）に示すデータおよび比較。Ｄ．ＭＣ９０３誘発炎症予防薬によるＭＣ９０３誘発炎症の模式図。Ｅ．野生型（ＷＴ）およびＣＤ１ａ遺伝子導入マウス（ＣＤ１ａ）のマウスＩｇＧ１アイソタイプ対照によるｉ．ｐ．処置後のＭＣ９０３処置、あるいはＣＤ１ａ遺伝子導入マウスの模式的パネルＤのような１６、１１０もしくは１１６抗ＣＤ１ａ抗体またはＣＲ２１１３による注射によって誘発された耳腫脹の毎日の測定。ＷＴを補正した。Ｎ＝３～４、二元配置分散分析とともにダネットの検定、＊，Ｐ＜０．０５、７日目の「ＣＤ１ａ」に対する比較に関する有意性を示す。Ｆ．フローサイトメトリーにより測定した皮膚Ｔ細胞パーセンテージおよび好酸球数。Ｎ＝３～４、二元配置分散分析とともにダネットの検定、＊，Ｐ＜０．０５；＊＊，Ｐ＜０．０１；＊＊＊，Ｐ＜０．００１。

【図15-2】図１５は、イミキモド／ＭＣ９０３誘発炎症の治療における抗ＣＤ１ａ抗体適用の有効性の比較解析である。Ａ．抗ＣＤ１ａ製剤投与によるイミキモド誘発炎症の模式図。Ｂ．野生型（ＷＴ）およびＣＤ１ａ遺伝子導入マウス（ＣＤ１ａ）のイミキモド処置後のマウスＩｇＧ１アイソタイプ対照によるｉ．ｐ．処置、またはＣＤ１ａ遺伝子導入マウスの模式的パネルＡのような抗ＣＤ１ａ抗体の改良パネルもしくはＣＲ２１１３による注射によって誘発された耳腫脹の毎日の測定。Ｎ＝２～７、二元配置分散分析とともにダネットの検定、＊，Ｐ＜０．０５，＊＊，Ｐ＜０．０１；＊＊＊＊，Ｐ＜０．０００１、８日目の「ＣＤ１ａ」または８日目のＯＸ１１６対ＣＲ２１１３に対する比較に関する有意性を示す。Ｃ．ＷＴを補正した、（Ｂ）に示すデータおよび比較。Ｄ．ＭＣ９０３誘発炎症予防薬によるＭＣ９０３誘発炎症の模式図。Ｅ．野生型（ＷＴ）およびＣＤ１ａ遺伝子導入マウス（ＣＤ１ａ）のマウスＩｇＧ１アイソタイプ対照によるｉ．ｐ．処置後のＭＣ９０３処置、あるいはＣＤ１ａ遺伝子導入マウスの模式的パネルＤのような１６、１１０もしくは１１６抗ＣＤ１ａ抗体またはＣＲ２１１３による注射によって誘発された耳腫脹の毎日の測定。ＷＴを補正した。Ｎ＝３～４、二元配置分散分析とともにダネットの検定、＊，Ｐ＜０．０５、７日目の「ＣＤ１ａ」に対する比較に関する有意性を示す。Ｆ．フローサイトメトリーにより測定した皮膚Ｔ細胞パーセンテージおよび好酸球数。Ｎ＝３～４、二元配置分散分析とともにダネットの検定、＊，Ｐ＜０．０５；＊＊，Ｐ＜０．０１；＊＊＊，Ｐ＜０．００１。

【図15-3】図１５は、イミキモド／ＭＣ９０３誘発炎症の治療における抗ＣＤ１ａ抗体適用の有効性の比較解析である。Ａ．抗ＣＤ１ａ製剤投与によるイミキモド誘発炎症の模式図。Ｂ．野生型（ＷＴ）およびＣＤ１ａ遺伝子導入マウス（ＣＤ１ａ）のイミキモド処置後のマウスＩｇＧ１アイソタイプ対照によるｉ．ｐ．処置、またはＣＤ１ａ遺伝子導入マウスの模式的パネルＡのような抗ＣＤ１ａ抗体の改良パネルもしくはＣＲ２１１３による注射によって誘発された耳腫脹の毎日の測定。Ｎ＝２～７、二元配置分散分析とともにダネットの検定、＊，Ｐ＜０．０５，＊＊，Ｐ＜０．０１；＊＊＊＊，Ｐ＜０．０００１、８日目の「ＣＤ１ａ」または８日目のＯＸ１１６対ＣＲ２１１３に対する比較に関する有意性を示す。Ｃ．ＷＴを補正した、（Ｂ）に示すデータおよび比較。Ｄ．ＭＣ９０３誘発炎症予防薬によるＭＣ９０３誘発炎症の模式図。Ｅ．野生型（ＷＴ）およびＣＤ１ａ遺伝子導入マウス（ＣＤ１ａ）のマウスＩｇＧ１アイソタイプ対照によるｉ．ｐ．処置後のＭＣ９０３処置、あるいはＣＤ１ａ遺伝子導入マウスの模式的パネルＤのような１６、１１０もしくは１１６抗ＣＤ１ａ抗体またはＣＲ２１１３による注射によって誘発された耳腫脹の毎日の測定。ＷＴを補正した。Ｎ＝３～４、二元配置分散分析とともにダネットの検定、＊，Ｐ＜０．０５、７日目の「ＣＤ１ａ」に対する比較に関する有意性を示す。Ｆ．フローサイトメトリーにより測定した皮膚Ｔ細胞パーセンテージおよび好酸球数。Ｎ＝３～４、二元配置分散分析とともにダネットの検定、＊，Ｐ＜０．０５；＊＊，Ｐ＜０．０１；＊＊＊，Ｐ＜０．００１。

【図15-4】図１５は、イミキモド／ＭＣ９０３誘発炎症の治療における抗ＣＤ１ａ抗体適用の有効性の比較解析である。Ａ．抗ＣＤ１ａ製剤投与によるイミキモド誘発炎症の模式図。Ｂ．野生型（ＷＴ）およびＣＤ１ａ遺伝子導入マウス（ＣＤ１ａ）のイミキモド処置後のマウスＩｇＧ１アイソタイプ対照によるｉ．ｐ．処置、またはＣＤ１ａ遺伝子導入マウスの模式的パネルＡのような抗ＣＤ１ａ抗体の改良パネルもしくはＣＲ２１１３による注射によって誘発された耳腫脹の毎日の測定。Ｎ＝２～７、二元配置分散分析とともにダネットの検定、＊，Ｐ＜０．０５，＊＊，Ｐ＜０．０１；＊＊＊＊，Ｐ＜０．０００１、８日目の「ＣＤ１ａ」または８日目のＯＸ１１６対ＣＲ２１１３に対する比較に関する有意性を示す。Ｃ．ＷＴを補正した、（Ｂ）に示すデータおよび比較。Ｄ．ＭＣ９０３誘発炎症予防薬によるＭＣ９０３誘発炎症の模式図。Ｅ．野生型（ＷＴ）およびＣＤ１ａ遺伝子導入マウス（ＣＤ１ａ）のマウスＩｇＧ１アイソタイプ対照によるｉ．ｐ．処置後のＭＣ９０３処置、あるいはＣＤ１ａ遺伝子導入マウスの模式的パネルＤのような１６、１１０もしくは１１６抗ＣＤ１ａ抗体またはＣＲ２１１３による注射によって誘発された耳腫脹の毎日の測定。ＷＴを補正した。Ｎ＝３～４、二元配置分散分析とともにダネットの検定、＊，Ｐ＜０．０５、７日目の「ＣＤ１ａ」に対する比較に関する有意性を示す。Ｆ．フローサイトメトリーにより測定した皮膚Ｔ細胞パーセンテージおよび好酸球数。Ｎ＝３～４、二元配置分散分析とともにダネットの検定、＊，Ｐ＜０．０５；＊＊，Ｐ＜０．０１；＊＊＊，Ｐ＜０．００１。

【図16-1】図１６は、イミキモド誘発炎症による皮膚および全身性免疫応答における抗ＣＤ１ａ抗体の作用の比較解析である。マウスＩｇＧ１アイソタイプ処置野生型（ＷＴ）およびＣＤ１ａ遺伝子導入（ＣＤ１ａ）ならびに模式図１５Ａに示す治療投与モデルに従って抗ＣＤ１ａ抗体の改良パネルを注射したＣＤ１ａ遺伝子導入マウス由来の耳皮膚、流入領域頸部リンパ節および血漿試料を解析した。Ａ．皮膚Ｔ細胞ＩＬ－１７Ａ発現を、フローサイトメトリーにより検出した細胞内サイトカイン発現を使用して直接的にエクスビボで解析し（左パネル）、頸部リンパ節好酸球を数え上げた（右パネル）。Ｂ～Ｃ．血漿（Ｂ）および皮膚分解物（Ｃ）サイトカインレベルをＥＬＩＳＡにより測定した（Ｎ＝２～７、一元配置分散分析とともにダネットの検定、＊，Ｐ＜０．０５；＊＊，Ｐ＜０．０１；＊＊＊，Ｐ＜０．００１；＊＊＊＊，Ｐ＜０．０００１）。

【図16-2】図１６は、イミキモド誘発炎症による皮膚および全身性免疫応答における抗ＣＤ１ａ抗体の作用の比較解析である。マウスＩｇＧ１アイソタイプ処置野生型（ＷＴ）およびＣＤ１ａ遺伝子導入（ＣＤ１ａ）ならびに模式図１５Ａに示す治療投与モデルに従って抗ＣＤ１ａ抗体の改良パネルを注射したＣＤ１ａ遺伝子導入マウス由来の耳皮膚、流入領域頸部リンパ節および血漿試料を解析した。Ａ．皮膚Ｔ細胞ＩＬ－１７Ａ発現を、フローサイトメトリーにより検出した細胞内サイトカイン発現を使用して直接的にエクスビボで解析し（左パネル）、頸部リンパ節好酸球を数え上げた（右パネル）。Ｂ～Ｃ．血漿（Ｂ）および皮膚分解物（Ｃ）サイトカインレベルをＥＬＩＳＡにより測定した（Ｎ＝２～７、一元配置分散分析とともにダネットの検定、＊，Ｐ＜０．０５；＊＊，Ｐ＜０．０１；＊＊＊，Ｐ＜０．００１；＊＊＊＊，Ｐ＜０．０００１）。

【図16-3】図１６は、イミキモド誘発炎症による皮膚および全身性免疫応答における抗ＣＤ１ａ抗体の作用の比較解析である。マウスＩｇＧ１アイソタイプ処置野生型（ＷＴ）およびＣＤ１ａ遺伝子導入（ＣＤ１ａ）ならびに模式図１５Ａに示す治療投与モデルに従って抗ＣＤ１ａ抗体の改良パネルを注射したＣＤ１ａ遺伝子導入マウス由来の耳皮膚、流入領域頸部リンパ節および血漿試料を解析した。Ａ．皮膚Ｔ細胞ＩＬ－１７Ａ発現を、フローサイトメトリーにより検出した細胞内サイトカイン発現を使用して直接的にエクスビボで解析し（左パネル）、頸部リンパ節好酸球を数え上げた（右パネル）。Ｂ～Ｃ．血漿（Ｂ）および皮膚分解物（Ｃ）サイトカインレベルをＥＬＩＳＡにより測定した（Ｎ＝２～７、一元配置分散分析とともにダネットの検定、＊，Ｐ＜０．０５；＊＊，Ｐ＜０．０１；＊＊＊，Ｐ＜０．００１；＊＊＊＊，Ｐ＜０．０００１）。

【発明を実施するための形態】

【0088】

材料および方法
マウス
すべてのマウスは、特定の無菌施設において飼育した。個々の実験では、マウスの年齢、性別およびバックグラウンド系統を、対応対照として使用した野生型同腹仔と一致させた。この試験において行ったすべての実験は、英国内務省（ＵＫ Ｈｏｍｅ Ｏｆｆｉｃｅ）の承認を得て行った。

【0089】

ＣＤ１ａ遺伝子導入マウスの生成
マウスは、ＯｘｆｏｒｄのＷｅｌｌｃｏｍｅ Ｔｒｕｓｔ Ｃｅｎｔｒｅ ｆｏｒ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓにより生成した。０．８ｋｂの上流配列および０．８ｋｂの下流配列を含むＣＤ１Ａ遺伝子全体を包含する５．７ｋｂのゲノム断片を、ヒトゲノムＤＮＡからＰＣＲによりプライマー５’－ＡＴＧＧＴＡＣＣＡＡＧＡＧＧＡＡＴＧＴＡＡＡＴＧＴＧＴＣＣＧＧＣ－３’および５’－ＡＡＧＣＧＧＣＣＧＣＧＡＴＣＡＴＧＴＴＡＡＣＣＡＡＧＧＴＣＡＧＧＡＡ－３’を使用して増幅し、そのようなＰＣＲプライマーに組み込んだＫｐｎＩおよびＮｏｔＩ部位を介してＬｉｔｍｕｓ２８ベクター（ＮＥＢ社）にサブクローニングした。コードするエクソンの配列検証後、導入遺伝子断片をベクター骨格から切り取り、精製し、顕微注射緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．４、０．２５ｍＭのＥＤＴＡ）中２ｎｇ／μｌで再懸濁し、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスから調製した受精卵の前核に顕微注射した。一晩の培養後、生じた２細胞期の胚を偽妊娠ＣＤ１養母の輸卵管に外科的に移植し、妊娠出産させた。遺伝子導入出生仔は、ＰＣＲにより導入遺伝子特異的プライマーを使用して同定し、野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスとともに個々の系統として飼育した。

【0090】

ＣＤ１ａ遺伝子型決定
粗製ゲノムＤＮＡ調製をＣＤ１ａ遺伝子導入マウス由来の刻耳試料に対して実施した。０．４ｍｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫ（Ｓｉｇｍａ社）を追加したＤｉｒｅｃｔＰＣＲ耳溶解緩衝液（Ｖｉａｇｅｎ社）１００μｌを刻耳に加え、５５℃で一晩インキュベートした。次いで、酵素を８５℃で１時間熱失活させた。試料は、遠心分離してペレット片とし、その溶解物を清潔なチューブに移した。溶解物１μｌを遺伝子型決定の鋳型として使用した。以下のＰＣＲ反応を遺伝子型決定に使用した。ＰＣＲ産物は、１％のＴＡＥアガロースゲル上にＳｙｂｅｒＳａｆｅとともに添加し、電気泳動を実行して、ゲルをＵＶ下で画像化した。予想されたバンドが６５５ｂｐで検出された場合、マウスは、ＣＤ１ａ導入遺伝子に対して陽性であると考えた。

【0091】

【表1】

【0092】

【表2】

【0093】

細胞株
空ベクターをトランスフェクトしたＫ５６２（ＥＶ－Ｋ５６２）およびＣＤ１ａをトランスフェクトしたＫ５６２（ＣＤ１ａ－Ｋ５６２）細胞（Ｂｒｉｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｏｍｅｎ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ、Ｈａｒｖａｒｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｈｏｏｌ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡのＢ．Ｍｏｏｄｙから寄贈）を、１０％のＦＣＳ、１００ＩＵ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）、２ｍＭのＬ－グルタミン（Ｇｉｂｃｏ社）、１×非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）（Ｇｉｂｃｏ社）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ社）、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（Ｇｉｂｃｏ社）、５００μＭの２－メルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ社）および２００μｇ／ｍｌのＧ４１８抗生物質（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を追加したＲＰＭＩ１６４０培地中に維持した。

【0094】

ＥＬＩＳｐｏｔ解析
ＥＬＩＳｐｏｔアッセイを使用して、モデルＣＤ１ａ発現抗原提示細胞との同時培養時のポリクローナルＴ細胞による活性化誘導サイトカイン分泌を検出した。健常ドナー血液由来のＰＢＭＣを密度勾配により単離し（Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ）、抗ＣＤ３磁気ビーズ選別を製造者のプロトコールに従って使用してＴ細胞を精製した（ＭＡＣＳ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社）。すべての試験参加者から書面により完全なインフォームドコンセントを得た［Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ（ＮＨＳ）Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｅｔｈｉｃｓ Ｓｅｒｖｉｃｅ（ＮＲＥＳ）研究倫理委員会１４／ＳＣ／０１０６］。次いで、Ｔ細胞をＩＬ－２（２００Ｕ／ｍｌ）とともに３日間培養して数を増大させた後、非パルス／内因性脂質結合ＣＤ１ａトランスフェクトＫ５６２（ＣＤ１ａ－Ｋ５６２）または対照の空ベクタートランスフェクトＫ５６２（ＥＶ－Ｋ５６２）とともにＫ５６２を２５０００細胞対ポリクローナルＴ細胞５００００細胞の比率で一晩同時培養した。抗ＣＤ１ａ抗体の機能性を評価するために、抗ＩＦＮγ捕捉抗体をコーティングしたＥＬＩＳｐｏｔプレート内でポリクローナルＴ細胞と同時培養する１時間前および同時培養中に、Ｋ５６２を１０μｇ／ｍｌの抗ＣＤ１ａ抗体とともにインキュベートした。ＩＦＮγ分泌は、ビオチン化抗ＩＦＮγ検出抗体により検出し、ストレプトアビジン－アルカリホスファターゼ展開により可視化した。生じたスポットは、サイトカイン産生Ｔ細胞を示した。これは、自動ＥＬＩＳｐｏｔリーダー（Ａｕｔｉｍｍｕｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｋａ ｇｍｂｈ社ＥＬＩＳｐｏｔ Ｒｅａｄｅｒ Ｃｌａｓｓｉｃ）を使用して数え上げ、サイトカイン産生スポットのＥＶバックグラウンドレベルの減算後に抗体処理および無処理群の比較時に％遮断を算出した。ＥＶ－Ｋ５６２の寄与（抗体有り無し）は、ＣＤ１ａ ＩＦＮγスポット数（それぞれ抗体有り無し）から減算した。次いで、補正したＣＤ１ａ－Ｋ５６２抗体処理群のスポット数をＣＤ１ａ無抗体群により割り、％遮断の算出に使用した。

【0095】

ＣＤ１ａ反応性Ｔ細胞生成および活性化解析：
ＣＤ１ａ制限Ｔ細胞を蛍光活性化細胞選別により単離した。Ｔ細胞をＣＤ１ａ－Ｋ５６２のＥＶ－Ｋ５６２と同時培養し、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社のＭＡＣＳサイトカイン分泌アッセイを製造者の指示に従って使用してサイトカイン産生応答Ｔ細胞を検出した。簡潔には、ＣＤ１ａ－Ｋ５６２との６時間の培養後にＴ細胞を抗サイトカイン（ＩＬ－２２またはＩＦＮγ）抗体でコーティングして、ＣＤ１ａ依存性自己分泌サイトカイン産生を検出した。次いで、生応答細胞を培養プレート内に選別した。ＣＤ１ａ制限Ｔ細胞の複合リンパ球反応を増大させて、純度およびＣＤ１ａ応答性を上のＦＡＣＳに基づくサイトカイン分泌アッセイ方法により解析フローサイトメーターを使用して評価した。ＣＤ１ａ制限Ｔ細胞の活性は、次のように解析した。Ｋ５６２細胞２×１０５細胞をＣＤ１ａ自己反応性Ｔ細胞１～５×１０５細胞とともに４時間同時培養した。ヘルパーサイトカインを同時培養物に加えてＣＤ１ａ依存性サイトカイン産生を支持した。ＩＦＮγ産生Ｔ細胞培養物には、ＩＬ－１２（１ｎｇ／ｍＬ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社）、ＩＬ－１８（１ｎｇ／ｍＬ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社）およびＩＬ－２（２５Ｕ／ｍＬ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社）を追加し、ＩＬ－２２産生Ｔ細胞培養物には、ＩＬ－６（５ｎｇ／ｍＬ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社）、ＴＮＦ－γ（５ｎｇ／ｍＬ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社）およびＩＬ－２（２５Ｕ／ｍＬ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社）を追加した。Ｔ細胞の活性化は、Ｔ細胞のサイトカイン産生により、上の分泌アッセイ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社）を製造者の指示に従って使用して評価した。

【0096】

マウスへのイミキモド投与
マウスをイソフルランにより軽度に麻酔し、予防モデル（図４Ａ）では０、１、２、３、４、５日目または治療モデル（図９Ａ）では０、１、２および４、５、６、７日目に５％のイミキモドを含むアルダラクリーム１５ｍｇを耳介の背側および腹側に適用した。予防モデル（図４Ａ）では－５、－３、－１、１、３、５日目または治療モデル（図９Ａ）では３、５、７日目に抗ＣＤ１ａ抗体またはマウスＩｇＧ１アイソタイプ対照１００μｇを腹腔内に投与した。予防モデル（図４Ａ）では０～６日または治療モデル（図９Ａ）では０～８日のアルダラ適用の期間毎日、マイクロメーター（Ｍｉｔｕｔｏｙｏ社）を使用して耳厚測定を行った。曝露後２４時間にマウスを犠死させ、組織を採取した。

【0097】

マウスへのＭＣ９０３投与
マウスをイソフルランにより軽度に麻酔し、１用量あたり２ｎｍｏｌのＭＣ９０３を７日間毎日、耳の腹側および背側に適用した（各耳側に１０マイクロリットル）。図１５Ｄに示すように、抗ＣＤ１ａ抗体またはマウスＩｇＧ１アイソタイプ対照１００μｇを腹腔内に投与した。マイクロメーター（Ｍｉｔｕｔｏｙｏ社）を使用して毎日、耳厚測定を行った。

【0098】

組織の処理
最終イミキモド曝露後２４時間にマウスを犠死させ、組織を採取した。耳、頸部リンパ節（ｃＬＮ）および脾臓を採取して免疫表現型決定またはイメージングを行った。脾臓およびｃＬＮの細胞懸濁液は、組織を７０μｍの濾過器を通過させることにより得、１０％のＦＣＳを含むＲＰＭＩで洗浄した。脾臓細胞懸濁液の赤血球は、ＲＢＣ溶解液（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）とのインキュベーションにより除去した。

【0099】

耳皮膚組織をＨＢＳＳにより洗浄して過剰なイミキモドを除去し、腹側方向に分割し、０．５ｍｍ未満のさいの目に切り出し、１ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼＰ（Ｒｏｃｈｅ社）および０．１ｍｇ／ｍＬのＤＮａｓｅＩ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）を含むＤＭＥＭで３×３０分間、撹拌しながら分解し、３０分の最終分解工程において５ｍｇ／ｍＬのディスパーゼを加えた。１０％のＦＣＳを含むＤＭＥＭを用いて７０μｍの濾過器を通過させることにより洗浄して単一細胞懸濁洗浄液を得た後、フローサイトメトリーにより解析した。

【0100】

フローサイトメトリー
ＦＡＣＳ表面染色では、細胞を次の抗マウス抗体で標識した（他に述べない限りＢｉｏｌｅｇｅｎｄ社により供給）：ＣＤ３（５００Ａ２、ＢＵＶ４９５：７４１０６４ ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社）、ＣＤ１１ｂ（Ｍ１／７０、ＢＵＶ３９５：５６３５５３ ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社）、ＣＤ１１ｃ（Ｎ４１８、ＢＶ７１１：１１７３４９）、ＣＤ８（５３－６．７、ＢＵＶ８０５：６１２８９８ ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社）、ＣＤ４（ＧＫ１．５、ＡＦ７００：１００４３０）、ＣＤ４５（２Ｄ１、ＦＩＴＣ：３６８５０７）、ＣＤ１１ａ（Ｉ２１／７、ＰＥＣｙ７：１５３１０８）、ＣＤ６９（Ｈ１．２Ｆ３、ＢＶ６５０：１０４５４１）、ランゲリン（４Ｃ７、ＰＥ：１４４２０４）、Ｌｙ６Ｃ（ＲＢ６－８Ｃ５、ＢＶ６０５：１０８４４０）、Ｌｙ６Ｇ（１Ａ８、ＰＥＴｘＲｅｄ：１２７６４８）、ＭＨＣＩＩ（Ｍ５／１１４．１５．２、ＢＶ７８５：１０７６４５）、ＳｉｇｌｅｃＦ（Ｓ１７００７Ｌ、ＢＶ４２１：１５５５０９）、ＩＬ－１７Ａ（ＴＣ１１－１８Ｈ１０．１、ＰＥＣｙ７：５０６９２２）、Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ Ａｑｕａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）および抗ヒトＣＤ１ａ（ＡＰＣまたは精製ＳＫ９、ＨＩ１４９、ＯＫＴ６、ＮＡ１／３４）。

【0101】

フローサイトメトリー：エピトープ競合アッセイ
ＣＤ１ａ－Ｋ５６２細胞を新たに生成した精製抗ＣＤ１ａ一次抗体および市販の抗ＣＤ１ａ抗体とともに氷上で３０分間インキュベートし（２５μｇ／ｍｌ）、次いで、非結合抗体を洗い流し、次いで、種々の抗体のＡｌｅｘａ－Ｆｌｕｏｒ－６４７コンジュゲート形態を細胞とともに氷上で３０分間マトリックス配置によりインキュベートした（１０μｇ／ｍｌ）。平均蛍光強度（ＭＦＩ）を使用してフルオロフォアコンジュゲート抗体の結合の程度を評価した。

【0102】

共焦点イメージング
マウスの耳皮膚を最適切断温度包埋化合物中に凍結し、－８０℃で保存した。凍結切片１０μｍをＬｅｉｃａ社のクリオスタットを使用して切断し、Ｓｕｐｅｒｆｒｏｓｔ Ｐｌｕｓスライド上に採取して３０分間風乾した後、－８０℃で保存した。スライドをＰＢＳ中で１０分間再水和した後、染色した。試料の内因性ペルオキシダーゼ活性を、０．１５％の過酸化水素溶液を室温で５分間加えることにより失活させた。内因性ビオチンをアビジン／ビオチンブロッキングキット（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｌｔｄ社）によりブロッキングし、１０％のヤギ血清を使用して抗体の非特異的結合を低下させた。抗ＣＤ１ａ抗体を共焦点顕微鏡観察に使用した（１：１００、ＯＫＴ６；自家生成およびビオチンにコンジュゲート）。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５９４チラミド（Ｔｙｒａｍｉｄｅ）ＳｕｐｅｒＢｏｏｓｔキット（ストレプトアビジン；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を製造者の指示に従って使用してシグナルを増強した。簡潔には、スライドを４℃で一次抗体とともに一晩インキュベートした。洗浄後、ＨＲＰコンジュゲートストレプトアビジンを切片に加え、４℃で一晩インキュベートした。過剰なストレプトアビジン－ＨＲＰを洗い流し、組織をチラミド希釈標準溶液とともに室温で８分間インキュベートして、反応停止試薬により反応を停止した。染色後、スライドを、ＤＡＰＩを加えた抗退色封入培地（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｌｔｄ社）を使用して封入し、カバーガラスを適用して、スライドを共焦点顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ社ＬＳＭ７８０共焦点顕微鏡－倒立顕微鏡；２５×／０．８ Ｉｍｍ Ｋｏｒｒ ＤＩＣ Ｍ２７；室温；Ａｘｉｏｃａｍカメラ；Ｚｅｎソフトウェア）により解析するまで暗所で冷蔵し、Ｆｉｊｉを使用して画像処理を行った。

【0103】

細胞表現型および細胞毒性アッセイ：
抗ＣＤ１ａ抗体（５μｇ／ｍｌ）および市販の対照薬ＮＡ１／３４（５μｇ／ｍｌ）をＣＤ１ａ発現Ｋ５６２またはＥＶ対照Ｋ５６２とともに４８時間インキュベートし、細胞の減少をフローサイトメトリーにより評価した。抗体の直接的誘導による細胞減少を測定するために、Ｋ５６２をＣｅｌｌＴｒａｃｅＶｉｏｌｅｔにより蛍光標識した後、抗ＣＤ１ａ抗体とともに４８時間インキュベートした。フローサイトメトリーによる減少の評価前に、無処理のＣＦＳＥ標識Ｋ５６２の参照集団を、抗体で処理したＫ５６２に１：１の比率で加えた。次いで、誘導された減少のパーセンテージを次の式を用いて、解析した種々の集団、抗体処理および無処理の参照ＣＤ１ａ＋およびＥＶＫ５６２の生細胞の発生頻度を比較することによって算出した。％減少＝１００－（（％抗体処理ＣＤ１ａ－Ｋ５６２生細胞／％参照ＣＦＳＥ標識Ｋ５６２生細胞）／（％無処理ＣＤ１ａ－Ｋ５６２生細胞／％参照ＣＦＳＥ標識Ｋ５６２生細胞）×１００）。ＣＤ１ａ発現細胞のアポトーシスに対する抗ＣＤ１ａ抗体の作用を調べるために、Ｋ５６２－ＣＤ１ａまたはＫ５６２－ＥＶを、アイソタイプ対照または抗ＣＤ１ａ抗体（５μｇ／ｍｌ）のいずれかとともにインキュベートし、インキュベーション後２４時間にアネキシンＶ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社）に染色した。

【0104】

補体媒介溶解（ＣＤＣ）および抗体依存性細胞毒性ＡＤＣＣアッセイ：
ＣＤＣアッセイでは、Ｋ５６２－ＣＤ１ａ細胞（１ウェルあたり５×１０４細胞）を、５μｇ／ｍｌのアイソタイプ対照抗体または指示抗体のいずれかで３０分間前処理し、１０％の正常ヒト血清とともに５％ＣＯ２により３７℃で３時間インキュベートした。ＡＤＣＣアッセイでは、新鮮ＰＢＭＣを使用した。Ｋ５６２－ＣＤ１ａ細胞（１ウェルあたり５×１０３細胞）は、５μｇ／ｍｌのアイソタイプ対照抗体または指示抗体のいずれかと組み合わせて、ＩＬ－２（１００Ｕ／ｍｌ）を加え５％ＣＯ２により３７℃で５時間、ＰＢＭＣ（１ウェルあたり２．５×１０５細胞）と同時培養した（エフェクター／標的比５０：１）。細胞毒性は、生存した標的Ｋ５６２－ＣＤ１ａのパーセンテージを、次の式：％細胞毒性＝（（％ＣＤ１ａ抗体処理ＣＤ１ａ－Ｋ５６２生細胞／％参照生細胞）／（％アイソタイプ抗体処理ＣＤ１ａ－Ｋ５６２生細胞／％参照生細胞）×１００）を使用して算出することにより決定した。

【0105】

インビボでのＣＤ１ａ＋細胞枯渇：
「ＮＳＧ」（ＮＯＤ－ｓｃｉｄ ＩＬ２Ｒｇａｍｍａｎｕｌｌ）マウスに、ＥＣＭゲル（Ｍｅｒｃｋ社）懸濁液（ｖｏｌ＝１００μｌ）中ＣＤ１ａ－Ｋ５６２細胞２５万細胞を側腹部に皮下注射し、１８日間腫瘍を発生させた。６、１０および１４日目にマウスの腹腔内をアイソタイプ対照抗体または指示抗体１００μｇで処置し、腫瘍サイズを測定した。

【0106】

等電点電気泳動アッセイ（ＩＥＦ）：
ＣＤ１ａ １０μｇを、トリス緩衝食塩水および２％のＣＨＡＰＳ、７％のＤＭＳＯに溶解した１００×モル過剰のイミキモド（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ社）または媒体単独（偽）とともに３７℃で２時間および室温で一晩インキュベートすることにより脂質添加を評価した。ＣＤ１ａ試料を等電点電気泳動（ＩＥＦ）により分離した。簡潔には、ＣＤ１ａ－イミキモドおよびＣＤ１ａ－偽タンパク質をＩＥＦ ｐＨ３～７ゲル（Ｎｏｖｅｘ）上に添加し、次いでこれを１００Ｖで１時間、２００Ｖで１時間および最終的に５００Ｖで３０分実行した。次いで、ゲルを１２％のＴＣＡで固定し、ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ ＳａｆｅＳｔａｉｎで７分間染色し、ＤＩ水中で一晩脱染した。

【0107】

統計学的解析：
一元および二元配置分散分析検査をＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍバージョン６．００（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ社）を使用して実施した。エラーバーは、指示のとおり標準偏差を表す。

【0108】

抗ＣＤ１ａ抗体製剤７７Ａ（ＶＲ１１８５１）、１１０（ＶＲ１２１１２）、１１１（ＶＲ１２１１３）、１１６（ＶＲ１２１１７）および１６（ＶＲ１１８３４）の生成および選択
様々な種にわたる多くの動物（マウスおよびウサギを含む）を免疫した。マウスは、ヒトＣＤ１ａおよびマウスＢ２ＭをトランスフェクトしたＮＩＨ３Ｔ３細胞により免疫した。ウサギは、ヒトＣＤ１ａおよびウサギＢ２ＭをトランスフェクトしたＲａｂ９細胞により免疫した。３～５回の注射後、動物を犠死させ、ＰＢＭＣ、脾臓、骨髄およびリンパ節を回収した。ヒトＣＤ１ａおよびヒトＢ２Ｍを発現するＨＥＫ－２９３細胞に対する結合について、フローサイトメトリーを介して血清を監視した。

【0109】

メモリーＢ細胞培養物を設定し（７７Ａ（ＶＲ１１８５１）、１１０（ＶＲ１２１１２）、１１１（ＶＲ１２１１３）および１１６（ＶＲ１２１１７）に関連）、ＴＴＰ Ｌａｂｔｅｃｈ社のＭｉｒｒｏｒｂａｌｌシステム上でのビーズに基づくアッセイにおいて、ヒトＣＤ１ａを一過性にトランスフェクトしたＨＥＫ－２９３細胞に結合する能力について上清を最初にスクリーニングした。これは、細胞色素で染色したヒトＣＤ１ａおよびヒトＢ２Ｍを発現するＨＥＫ－２９３細胞を使用する多重アッセイであり、ヤギ抗種Ｆｃ－ＦＩＴＣコンジュゲートを暴露物質として使用して、ＣＤ１ｂ、ＣＤ１ｃまたはＣＤ１ｄをヒトＢ２Ｍとともに発現する対比染色ＨＥＫ－２９３細胞に対して対比スクリーニングした。

【0110】

Ｍｉｒｒｏｒｂａｌｌによる一次スクリーニングにおいて、合計１０×２００プレートのＢ培養実験から、およそ３５００件のＣＤ１ａ特異的陽性的中が同定された。次いで、このアッセイの陽性上清は、次によってさらなる特性決定に進んだ。
・ ＥＬＩＳＡ、ヒトＣＤ１ａタンパク質に対する結合を確認する（以下に詳述）
・ ＥＬＩＳＡ、キメラＣＤ１ａタンパク質上のＣＤ１ａ脂質結合ドメイン（ＣＤ１ａのヒト脂質結合ドメイン、ＣＤ１ｄのマウスＩｇドメイン）に対する結合を確認する（以下に詳述）
・ フローサイトメトリー、ＨＥＫ－２９３細胞上に発現するヒトＣＤ１ａ（ヒトβ２Ｍと同時発現）に対する結合を確認する（以下に詳述）

【0111】

上のアッセイにおいて結合を実証したウェルは、蛍光焦点法を使用するＶ領域の回収に進んだ。

【0112】

また、骨髄由来の形質細胞は、ヒトＣＤ１ａに結合する能力について、蛍光焦点法を使用して直接的にスクリーニングした（１６（ＶＲ１１８３４）に関連）。ここでは、ＣＤ１ａ特異的抗体を分泌するＢ細胞は、ヤギ抗種Ｆｃ－ＦＩＴＣコンジュゲート暴露試薬を使用して、ストレプトアビジンビーズ上に固定したビオチン化ヒトＣＤ１ａ上に採取した。およそ３００件の直接的焦点を採取した。

【0113】

採取した細胞の逆転写（ＲＴ）およびＰＣＲ後、抗体のＶ領域をコードする「転写的に活性なＰＣＲ」（ＴＡＰ）産物を生成および使用して、ＨＥＫ－２９３細胞を一過性にトランスフェクトした。組換え抗体を含む生じたＴＡＰ上清は、次によってさらに特性決定した。
・ ＥＬＩＳＡ、ヒトＣＤ１ａタンパク質およびキメラＣＤ１ａタンパク質（ＣＤ１ａのヒト脂質結合ドメイン、ＣＤ１ｄのマウスＩｇドメイン）に対する結合を確認する（以下に詳述）
・ フローサイトメトリー、ＨＥＫ－２９３細胞上に発現するヒトＣＤ１ａ（ヒトβ２Ｍと同時発現）に対する結合を確認し、関連する類似タンパク質：ＨＥＫ－２９３細胞上に発現するＣＤ１ｂ、ＣＤ１ｃまたはＣＤ１ｄ（ヒトβ２Ｍと同時発現）に対する交差結合に対して対比スクリーニングする（以下に詳述）

【0114】

次いで、興味深いＴＡＰ産物由来の重および軽鎖可変領域遺伝子対をウサギまたはマウス完全長抗体のいずれかとしてクローニングし、ＨＥＫ－２９３一過性発現系において再発現させた。合計１１９種のＶ領域をクローニングして記録した。次いで、組換えクローン抗体を、次によってさらに特性決定した。
・ 上のフローサイトメトリーおよびＥＬＩＳＡアッセイの反復
・ フローサイトメトリー、複数の細胞株において発現するＣＤ１ａに対する結合を評価する
これは、結合が脂質に非依存的であるという最初の示唆となった。次に対する結合について上清をスクリーニングした。
－ ＣＤ１ａまたは空ベクターを発現する（ヒトβ２Ｍと同時発現）安定に形質導入したＣ１Ｒ細胞。これらは、１１０（ＶＲ１２１１２）、１１１（ＶＲ１２１１３）および１１６（ＶＲ１２１１７）に関連する（以下に詳述）。
－ ＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂ、ＣＤ１ｃ、ＣＤ１ｄおよびβ２Ｍを内因的に発現するＭＯＬＴ４細胞。これらは、１１０（ＶＲ１２１１２）、１１１（ＶＲ１２１１３）および１１６（ＶＲ１２１１７）に関連する（以下に詳述）。
・ ＢＩＡｃｏｒｅによるプロファイリング、解離速度（ｏｆｆ－ｒａｔｅ）および親和性を推定する（以下に詳述）

【0115】

上のアッセイにおける結合および１００ｎＭ未満の親和性を実証した抗体を精製のために選択した。細胞培養上清は、プロテインＡ親和性精製を使用して精製した。精製試料は、緩衝液を１０ｍＭおよびｐＨ７．４のＰＢＳに交換し、回収および純度についてＵＶ分光法、解析用サイズ排除クロマトグラフィー、ＳＤＳ Ｐａｇｅ電気泳動およびＬＡＬエンドトキシンアッセイをそれぞれ使用して解析した。ここで、必要とされる試料を第２の精製ラウンドに供して単量体レベルを上昇させた。最終試料は、滅菌濾過し、１０ｍＭおよびｐＨ７．４のＰＢＳ中に保存した。

【0116】

次いで精製後、５つすべての抗体は、次によってさらに特性決定した。
・ 上のフローサイトメトリー、ＥＬＩＳＡおよびＢＩＡｃｏｒｅアッセイの反復
・ ＥＬＩＳＡ、カニクイザルＣＤ１ａタンパク質および中国において一般的なヒトＣＤ１ａタンパク質の変異体（18）に対する結合を評価する（以下に詳述）
・ フローサイトメトリー、
－ カニクイザルβ２Ｍと同時トランスフェクトしたカニクイザルＣＤ１ａ
－ ヒトβ２Ｍと同時トランスフェクトした、中国において一般的なヒトＣＤ１ａの変異体
を一過性にトランスフェクトしたＨＥＫ－２９３細胞に対する結合を評価する（以下に詳述）

【0117】

７７Ａ（ＶＲ１１８５１）、１１０（ＶＲ１２１１２）、１１１（ＶＲ１２１１３）、１１６（ＶＲ１２１１７）および１６（ＶＲ１１８３４）は、それぞれの抗体発見段階において、組換えおよび細胞発現ＣＤ１ａタンパク質の検査したすべての形態に対して結合する能力を実証した（表１～９）。唯一の例外は、１１６（ＶＲ１２１１７）であり、これは、組換えまたは細胞発現カニクイザルＣＤ１ａに対して結合を示さなかった（表４および９）。後続のインビトロ（in vitro）およびインビボでの解析において抗体１１６を含むことは、明白であるとは考えられなかったが、それにもかかわらず、脂質結合ドメインがヒトおよびカニクイザルとの間で異なり、潜在的に異なる機能性作用を有する、エピトープ結合領域に焦点を合わせるための計画的工程となった。いずれの抗体も、ＨＥＫ－２９３細胞上に発現するＣＤ１ｂ、ＣＤ１ｃまたはＣＤ１ｄに対する結合を実証せず（表５）、このような抗体がＣＤ１ａ特異的であることを示した。ＨＥＫ－２９３細胞におけるＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂ、ＣＤ１ｃおよびＣＤ１ｄ発現は、市販の抗体により確認され、この結論を支持した（データ非指示）。複数の細胞型（ＨＥＫ、Ｃ１ＲおよびＭＯＬＴ４）上に発現するＣＤ１ａに対する結合は、ＣＤ１ａが各細胞株における異なる脂質プールから添加されると思われるため、抗体結合が脂質に非依存的であり得るという最初の示唆となった。

【0118】

抗体発見後、以下のＴ細胞アッセイにおいてインビトロでの機能について抗体を評価した。

【0119】

マウスＩｇＧ１骨格上の７７Ａ（ＶＲ１１８５１）、１１０（ＶＲ１２１１２）、１１１（ＶＲ１２１１３）および１１６（ＶＲ１２１１７）の重および軽鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡをＡＴＵＭにおいて合成し、自家のＨＥＫ－２９３一過性発現系において発現させた。次いで、抗体に精製およびエンドトキシン除去を行い、以下のようにインビボでのアッセイにおいて検査した。

【0120】

ヒトＣＤ１ａに対する７７Ａ（ＶＲ１１８５１）、１１０（ＶＲ１２１１２）、１１１（ＶＲ１２１１３）、１１６（ＶＲ１２１１７）および１６（ＶＲ１１８３４）の親和性
ヒトＣＤ１ａに対する精製抗体の親和性を、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を使用して、固定した抗種ＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）２に対する抗体を捕捉した後、ヒトＣＤ１ａを滴定することにより評価した。Ａｆｆｉｎｉｐｕｒｅヤギ抗種ＩｇＧ－Ｆ（ａｂ’）２特異的断片（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ社）をＣＭ５センサーチップ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）上に、約５０００応答単位（ＲＵ）の捕捉レベルまでのアミン共役化学反応を介して固定した。ＨＢＳ－ＥＰ＋緩衝液（１０ｍＭおよびｐＨ７．４のＨＥＰＥＳ、０．１５ＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．０５％の界面活性剤Ｐ２０、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を１０μＬ／分の流量で泳動緩衝液として使用した。０．５μｇ／ｍＬの検査抗体の注射１０μＬを、固定ヤギ抗種Ｆａｂによる捕捉に使用した。ヒトＣＤ１ａは、３０μＬ／分の流量で、捕捉した抗体に対して滴定して（０ｎＭ、０．６ｎＭ、１．８ｎＭ、５．５ｎＭ、１６．６ｎＭおよび５０ｎＭ、泳動緩衝液中で希釈）親和性を評価した。

【0121】

４０ｍＭのＨＣｌの注射２×１０μLによりサイクル間に表面を再生し、５ｍＭのＮａＯＨの注射１０μＬにより１０μＬ／分の流量で分散させた。バックグラウンドを減算した結合曲線を、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００評価ソフトウェアを標準手順に従って使用して解析した。動態パラメータは、適合アルゴリズムにより決定した。このアッセイは、クローン上清および精製抗体段階において実施した。ヒトＣＤ１ａに対する抗体結合の動態パラメータは、表１０に示す。

【0122】

ＥＬＩＳＡにより評価した７７Ａ（ＶＲ１１８５１）、１１０（ＶＲ１２１１２）、１１１（ＶＲ１２１１３）、１１６（ＶＲ１２１１７）および１６（ＶＲ１１８３４）の結合
ＣＤ１ａ特異的抗体をＥＬＩＳＡにより同定した。ＥＬＩＳＡプレートを２μｇ／ｍＬの目的のタンパク質（ヒトＣＤ１ａプールＢ、キメラＣＤ１ａプールＢ［ヒト脂質結合ドメインおよびマウスＣＤ１ｄ Ｉｇドメイン］、中国変異体ＣＤ１ａまたはカニクイザルＣＤ１ａ）（２０μＬ／ウェル）により４℃で一晩コーティングし、次いで、洗浄緩衝液（ＰＢＳ中０．２％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ－２０（ｐＨ７．４））で洗浄した。次いで、プレートを８０μｌ／ウェルのブロッキング緩衝液（１％（ｗ／ｖ）のウシ血清アルブミン）により室温で１時間ブロッキングし、次いで、洗浄緩衝液中で洗浄した。抗体試料（Ｂ細胞培養上清、ＴＡＰ上清、クローン上清、精製抗体溶液）希釈物２０μＬをＥＬＩＳＡプレートに移し、室温で１時間インキュベートした後、洗浄緩衝液で洗浄した。２０μｌ／ウェルのペルオキシダーゼコンジュゲートヤギ抗種ＩｇＧ Ｆｃ特異的Ｆ（ａｂ’）２断片（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ社）を１：５０００でブロッキング緩衝液により希釈して加え、室温で１時間インキュベートした後、洗浄緩衝液で洗浄した。ＴＭＢ基質（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）を加えて（２０μＬ／ウェル）結合を可視化し、反応物を室温で５分間インキュベートした後、マイクロプレートリーダーを使用して６３０ｎＭで光学密度を測定した。このアッセイは、Ｂ細胞上清段階（ヒトＣＤ１ａプールＢ）、ＴＡＰ上清段階（ヒトＣＤ１ａプールＢ、キメラＣＤ１ａプールＢ）、クローン上清段階（ヒトＣＤ１ａプールＢ、キメラＣＤ１ａプールＢ）および精製抗体段階（ヒトＣＤ１ａプールＢ、キメラＣＤ１ａプールＢ、中国変異体ＣＤ１ａ、カニクイザルＣＤ１ａ）において実施した。精製抗体のデータは、表１～４に示す。

【0123】

フローサイトメトリーにより評価した７７Ａ（ＶＲ１１８５１）、１１０（ＶＲ１２１１２）、１１１（ＶＲ１２１１３）、１１６（ＶＲ１２１１７）および１６（ＶＲ１１８３４）の結合
ＣＤ１ａ特異的抗体をフローサイトメトリーにより同定した。ＨＥＫ、Ｃ１ＲおよびＭＯＬＴ４細胞株上に発現したタンパク質に対する結合を評価した。ＨＥＫ－２９３細胞に目的のタンパク質（ＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂ、ＣＤ１ｃ、ＣＤ１ｄ、中国変異体ＣＤ１ａまたはカニクイザルＣＤ１ａ）および種特異的β２Ｍ（上に示すもの）をトランスフェクトした。トランスフェクションは、Ｅｘｐｉｆｅｃｔａｍｉｎｅ２９３キット（Ｇｉｂｃｏ社）を使用して実施し、一晩インキュベートした。Ｃ１Ｒ－ＣＤ１ａ、Ｃ１Ｒ－空ベクターおよびＭＯＬＴ４細胞株は、必要とされる日に１×ＰＢＳ中で洗浄した。すべての細胞株を計数して１×ＰＢＳ中に再懸濁し、次いで、ＤｉＩまたはＤｉＯ細胞染色（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を使用して３７℃で３０分間染色した。細胞をフローサイトメトリー緩衝液（ＰＢＳ中１％のウシ血清アルブミン、２ｍＭのＥＤＴＡおよび０．１％のアジ化ナトリウム）で洗浄した後、２つのＤｉＩ染色およびＤｉＯ染色集団をともに混合した。次いで、細胞（２０μｌ／ウェル）を抗体試料（Ｂ細胞培養上清、ＴＡＰ上清、クローン上清、精製抗体溶液）（２０μｌ／ウェル）の希釈物に加え、フローサイトメトリーアッセイプレート内に４℃で１時間インキュベートした後、フローサイトメトリー緩衝液で洗浄した。１０μｌ／ウェルのＡｌｅｘａｆｌｕｏｒ６４７コンジュゲートヤギ抗種ＩｇＧ Ｆｃ特異的Ｆ（ａｂ’）２断片（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ社）を１：２５００でフローサイトメトリー緩衝液により希釈して加え、４℃で３０分間インキュベートした後、洗浄緩衝液で洗浄した。次いで、蛍光強度をｉＱｕｅ ｓｃｒｅｅｎｅｒ ＰＬＵＳ上で測定した。このアッセイは、Ｂ細胞上清段階（ヒトＣＤ１ａを発現するＨＥＫ－２９３細胞）、ＴＡＰ上清段階（ヒトＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂ、ＣＤ１ｃまたはＣＤ１ｄを発現するＨＥＫ－２９３細胞）、クローン上清段階（ヒトＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂ、ＣＤ１ｃまたはＣＤ１ｄを発現するＨＥＫ－２９３細胞；ヒトＣＤ１ａまたは空ベクターを発現するＣ１Ｒ細胞；ＭＯＬＴ４細胞株）および精製抗体段階（ヒトＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂ、ＣＤ１ｃ、ＣＤ１ｄ、中国変異体ＣＤ１ａまたはカニクイザルＣＤ１ａを発現するＨＥＫ－２９３細胞；ヒトＣＤ１ａまたは空ベクターを発現するＣ１Ｒ細胞；ＭＯＬＴ４細胞）において実施した。精製抗体のデータは、表５～９に示す。

【0124】

【表3】

【0125】

【表4】

【0126】

【表5】

【0127】

【表6】

【0128】

【表7-1】

【表7-2】

【0129】

【表8】

【0130】

【表9】

【0131】

【表10】

【0132】

【表11】

【0133】

【表12】

【0134】

【表13】

【実施例】

【0135】

［実施例１］

【0136】

抗ＣＤ１ａパネルの改良：抗ＣＤ１ａ抗体の機能的評価
ＣＤ１ａ結合評価の後、阻害機能のために生成した抗ＣＤ１ａ抗体の大型パネルをスクリーニングした。Ｔ細胞のサイトカイン産生をインビトロでの抗原提示モデルにおいてＥｌｉＳｐｏｔにより測定した。このようなデータの要約は、図１に示す。新たに生成した抗体の多くが、ＣＤ１ａＴ細胞応答の阻害において市販の抗ＣＤ１ａ抗体ＯＫＴ６、ＨＩ１４９およびＳＫ９よりも強力であることが判定された。注目すべきは、抗体１６、２２、３９、４６、７７、８７、１１０、１１６はすべて、ＯＫＴ６よりも少なくとも１ｌｏｇ低いＩＣ５０を有し（図１Ｂ）、これは、形質導入クローン不死Ｔ細胞よりも感受性が低いと予想されるポリクローナルＴ細胞の使用にもかかわらず、先行技術に記載の抗体を超える改善である。
［実施例２］

【0137】

抗ＣＤ１ａパネルの改良：ＣＤ１ａ制限濃縮Ｔ細胞株応答の阻害
インビボでの解析のための抗体候補の最終選抜リスト作成を助けるために、異なる手法を取ってＣＤ１ａＴ細胞応答を評価した。ＣＤ１ａ制限濃縮Ｔ細胞株を単離および増殖させて、低いシグナル対ノイズ比により阻害性抗体の可能性が部分的に隠蔽され得る複合的ポリクローナルＴ細胞バックグラウンドではなく、単離してＣＤ１ａ応答を解析した。

【0138】

このようなアッセイでは、抗体１１６および１６が、強力な阻害性抗体として優れており、１６は、ＩＬ－２２の自己反応的／内因的産生をユニークに阻害した（図２Ａおよび２Ｂ）。この改善は、ＩＦＮγが果たす役割を有する条件に加えて、ＩＬ－２２が病原性の役割を果たす条件下で抗体を使用する可能性を示す。種々のサイトカインに対する差次的作用が見られることは、驚くべきことであった。さらに、無ＡＰＣ系を使用して、ＣＤ１ａ制限Ｔ細胞活性化の抗体依存性阻害を評価した。ＣＤ１ａをコーティングしたビーズをＡＰＣの代替物として使用し、生じたＴ細胞ＩＦＮγ産生をフローサイトメトリーにより測定した。このアッセイによって、すべての抗体、特には、７７ａ、８７、１１０、１１１および１１６によるＣＤ１ａ依存性サイトカイン応答の有意な阻害が明らかとなった（図２Ｃ）。
［実施例３］

【0139】

皮膚炎症における阻害性抗体のインビボでの評価
この試験の目的は、ヒト疾患および障害の治療における臨床的使用のための抗体を生成することであり、このため、ヒト疾患に似た複雑な免疫系における有効性を確かめることが必須であった。新たに生成した最良の抗体の高度に改良されたパネルを上のデータの解析から選択し（抗体１６、７７ａ、１１０、１１１および１１６）、乾癬、皮膚炎、ループスのインビボでのモデルにおいて、ならびに炎症性皮膚もしくは粘膜疾患もしくは障害として現れる薬物反応、または関連する全身性疾患もしくは障害、または１つもしくは複数の全身的に現れる炎症性薬物反応のモデルとして、これらの可能性を決定しようとした。実験的乾癬および皮膚炎は、ＣＤ１ａ遺伝子導入マウスにおいて、ＷＴと比較して増悪することが示され、ＣＤ１ａ依存性炎症は、抗ＣＤ１ａ抗体の投与により回復させることができる（Kim et al 2016）。一部の個体が、多くの皮膚障害のために局所的に使用したイミキモドに対する皮膚／粘膜炎症性薬物反応を生じることも注目すべきであり、このような薬物反応としては、乾癬性反応、皮膚炎反応、水疱性疾患、脱毛症、小胞形成、苔癬反応、好中球性疾患、エリテマトーデス、多形性紅斑、口腔びらん、ならびに重度の薬物反応、例えば、ＤＲＥＳＳ、ＡＧＥＰ、スティーブンス・ジョンソン症候群および中毒性表皮壊死症が挙げられる（19-29）。

【0140】

ＣＤ１ａ遺伝子導入マウスの生成
皮膚および関連する全身性炎症におけるＣＤ１ａの可能な役割を評価するために、発明者らは、ＣＤ１ａ遺伝子導入マウスを生成した。ＣＤ１ａは、マウスゲノムには存在しないため、プロモーターエレメントを含む０．８ｋｂ５’および０．８ｋｂ３’隣接領域を有するヒトＣＤ１ａ遺伝子座をクローニングし、この導入遺伝子を、公表されているＣＤ１ａ遺伝子導入モデルと同様であるが、さらなる導入遺伝子断片ステッチを必要とする、顕微注射により挿入した（Illing et al., Nature 486, 554-558 (2012)）。遺伝子型陽性ファウンダーマウスを飼育し、系統をＣＤ１ａ導入遺伝子発現についてスクリーニングした。発明者らはさらに、マウスの表現型を決定して、ＣＤ１ａタンパク質発現が予想プロファイルに従い、ヒトＣＤ１ａ細胞発現の代表的なものであるかどうかを判定した。野生型およびＣＤ１ａ遺伝子導入（ＣＤ１ａＴｇ）マウスの耳皮膚を採取し、酵素的に処理してフローサイトメトリーによる皮膚細胞環の解析を可能とした（図３Ａ）。ＣＤ１ａ発現は、総皮膚細胞の４．２％（＋／－１．７９）およびＣＤ４５＋細胞の２３．６％（＋／－６．６８）を占める皮膚において検出した。細胞の発現調節を評価するために、真皮ＤＣ（ｄＤＣ）およびランゲルハンス細胞（ＬＣ）をＣＤ１ａタンパク質について評価した。真皮ＤＣサブセットは、ＣＤ１ａを発現することが報告されており、ランゲルハンス細胞は、特徴的には、構成的なＣＤ１ａｈｉｇｈである。ＣＤ１ａは、ｄＤＣの４１．５％（＋／－２０．３８）およびＬＣの８８％（＋／－４．６０６）が発現することが見出された（図３Ａ～Ｂ）。免疫蛍光によって皮膚におけるＣＤ１ａタンパク質発現をさらに特性決定し、特徴的な表皮の位置と、ＬＣに典型的な樹状突起を有する細胞とが明らかとなった（図３Ｃ）。ＣＤ１ａ遺伝子型が確認され（図３Ｄ）、胸腺におけるＣＤ１ａ発現は、主に、ＣＤ４＋ＣＤ８＋二重陽性胸腺細胞の割合によって観察された（図３Ｅ）。ＣＤ１ａＴｇマウスは、定常状態では異常な皮膚炎症を示さなかった。要約すると、発明者らは、ヒト組織発現と表現型的に同様にＣＤ１ａ発現を呈するＣＤ１ａ遺伝子導入マウスを生成した。

【0141】

このモデルを使用して、抗ＣＤ１ａ抗体を炎症性皮膚疾患および障害の予防について検査した（図４Ａ）。ＴＬＲ７／８アゴニストであるイミキモド５％を含むアルダラクリームの適用は、皮膚肥厚、鱗屑および発赤により典型的に表される乾癬様、皮膚炎様、ループス様皮膚炎症を誘発する確立されたモデルである（30,31）。ＣＤ１ａ遺伝子導入マウスの耳の炎症が、アルダラに応答して、ＷＴ対応マウスのそれよりもかなり高いことが見出された。その上、イミキモドの前に投与したすべての抗ＣＤ１ａ抗体では、その後の耳肥厚が低下したが、抗体１１６および１６では、ＣＤ１ａ依存性炎症が少なくともＷＴレベルまで低下した（図４Ｂ）。実験のエンドポイントまでには、抗体１６および１１０で処置したＣＤ１ａ遺伝子導入（－Ｔｇ）マウスは、耳肥厚のＷＴレベルまで炎症の低下を示した。著しくかつ予想外なことには、抗体１１６の処置により、ＣＤ１ａ－Ｔｇ耳皮膚炎症のレベルが、ＷＴ皮膚のレベル未満に有意に低下した（図４Ｂ）。
［実施例４］

【0142】

皮膚免疫応答に対する阻害性抗体のインビボでの作用
これにより、イミキモド誘発ＣＤ１ａ依存性耳炎症への皮膚免疫集団の寄与について解析しようとした。

【0143】

皮膚Ｔ細胞浸潤がＣＤ１ａ遺伝子導入マウスにおいて上昇し、この集団の発生頻度が抗ＣＤ１ａ抗体、特には、予防モデルの抗体１１６、１６および１１０により低下することが見出された（図５Ａ）。注目すべきは、１６および１１６では、皮膚Ｔ細胞浸潤を野生型未満のレベルに低下させることが可能であり、インビボでの炎症に対する著明な作用の改善が示唆された。その上、活性化マーカーＣＤ６９が、ＣＤ１ａ遺伝子導入マウスの皮膚Ｔ細胞の表面上で上昇し、抗ＣＤ１ａ抗体の一部、特には、予防モデルの１１６および１６により阻害された（図５Ｂ）。好中球は、乾癬性応答およびマウスイミキモドモデルを含む多くの炎症性障害の重要な細胞であることがわかっている。ここでは、イミキモド処置時の皮膚において好中球発生頻度の上昇、およびＣＤ１ａ遺伝子導入マウスにおいてさらなる上昇が見出され、これは、予防モデルの抗ＣＤ１ａ抗体１１６および１６によりＷＴレベルまたは未満に低下した（図５Ｃ）。抗体に応答した皮膚好酸球の低下も認められ、これは、薬物反応性の多くの形態における好酸球の公知の役割を考慮すれば興味深いものである（図５Ｄ）。好酸球に対する作用がこれまでに観察されていないため、この予想外の知見は、改善の代表的なものである。

【0144】

ヒト皮膚炎症性障害において観察されたように、ＣＤ１ａ遺伝子導入マウスのイミキモド曝露時の皮膚において、ＣＤ１１ｃ＋ランゲリン＋としてここで定義するランゲルハンス細胞も、ＷＴと比較して増加した。抗体１６、１１６、１１１および非有意性には１１０の投与により、予防モデルにおいて皮膚ＬＣ数が減少した（図６Ａ）。注目すべきことには、抗体１１６により、皮膚ＬＣ数が、野生型皮膚における数未満に減少し、驚くべき作用レベルの改善が示された。主なＣＤ１ａ発現集団として、ＬＣのＣＤ１ａ発現に対する抗体の作用を評価した。抗体１１０および１１６では染色が減少したが、これは、ＨＩ１４９検出抗体による結合に対する１１０／１１６抗体の干渉のためであることは注目すべきであった（図６Ｂ）。これは、驚くべき作用であり、治療的利点と関連する、インビボでの抗体の持続的結合を示す。また、この知見は、診断もしくは予後目的または処置前および処置中のＣＤ１ａ発現細胞の監視のために抗体を使用する可能性を高める。この観察は、以下に示すように非競合ＳＫ９検出抗体では見られなかった。観察されたＬＣ減少は、抗体依存性ＬＣ死もしくは遊走または表現型の変更のためであり得る。したがって、頸部リンパ節をＣＤ１１ｃ＋ランゲリン＋ＬＣの存在について解析した。しかし、ＣＤ１ａ遺伝子導入マウスのリンパ節におけるＬＣ数の、ＷＴと比較した増加が見出されたが、ＬＮへの遊走は、抗体１１０および１１６で処置したマウスにおける皮膚ＬＣの減少の説明がつくとは考えられなかった（図６Ｃ）。注目すべきことには、抗体１１６により、野生型皮膚のそれに近い免疫学的改善がもたらされ、驚くべき作用レベルの改善が示された。興味深いことには、リンパ節由来ＬＣ上のＣＤ１ａの発現レベルは、以下にさらに考察するように、ＨＩ１４９検出抗体による結合に対する１１０／１１６抗体の干渉のためであるＬＣの染色が減少した点において、皮膚のレベルと類似のパターンに従った（図６Ｄ）。これは、非競合ＳＫ９検出抗体では見られなかった。リンパ節由来ＬＣが、皮膚の場合より少なく１細胞あたりのＣＤ１ａを発現したことは注目すべきであり、これは、全身的炎症を予防する制御機構であり得る。したがって、抗体は、皮膚において、およびリンパ節への遊走後であっても、インビボでＬＣに対する作用を維持する。臨床作用がより持続性であるため、これは重要な増強である。
［実施例５］

【0145】

ＣＤ１ａ発現細胞表現型に対する作用において発現した抗ＣＤ１ａ抗体観察細胞毒性
遊走の増強によって皮膚ＬＣ減少の説明が十分にはつかなかったことを考慮して、抗体により誘導されるＣＤ１ａ＋細胞表現型変更の可能性を、マウスＩｇＧ１の性質にかかわらず検討した。

【0146】

すべての抗ＣＤ１ａ抗体、特には、１１０および１１６により、ＭＨＣクラスＩおよびＩＩを欠くため、応答の比較が可能であるＣＤ１ａ＋Ｋ５６２細胞の数をインビトロで減少可能であることを実証した（図７Ａ）。抗体１１０および１１６は、より詳細に検査したところ、用量依存的減少を示し（図７Ｂ）、ＩｇＧ１アイソタイプを考慮すると、これは改善かつ驚異となった。これは、公表されているＣＲ２１１３抗体とは異なると思われ（１６、１８）（米国特許第１０８４４１１８号明細書およびカナダ国特許出願公開第２９２４８８２号明細書）、これには、補体および／または抗体依存性細胞性細胞毒性を必要とすると述べられている。詳細には、「ＣＲ２１１３はアポトーシスを直接的に誘導しない」と述べられ（１７）、ＮＡ１／３４が直接的殺傷を誘導しないことが認められた。しかし、種々のＦｃ領域によりエフェクター機能が影響されるため、マウスＩｇＧ１バックグラウンドのＣＲ２１１３の比較可能な作用を以下に直接的に取り上げる。発明者らは、初代ヒトＣＤ１ａ発現細胞の直接的減少を誘導する抗体の能力をさらに評価した。サイトカインＩＬ－４／ＧＭ－ＣＳＦおよびＩＬ－４／ＧＭ－ＣＳＦ／ＴＧＦ－βをそれぞれ使用し、培養から０または２日目に抗ＣＤ１ａ抗体を加える、５日のインビトロでの単球の分化により、ＤＣおよびＬＣ様細胞を生成した。抗体１１０および１１６により、ＬＣおよび比較的程度は小さいがＤＣがインビトロで減少することが観察された（図７Ｃのそれぞれ上および下パネル）。この減少の根底にある機構の調査では、発明者らは、細胞クラスター形成培養物の著しい表現型形態と関連する減少を見出した（図７Ｄ）。数の減少は、このクラスター形成により部分的に説明がつき得るが、加えて、抗体によってＣＤ１ａ発現標的細胞のアポトーシスが誘導可能かどうかを検査し、ＣＲ２１１３と比較した（マウスＩｇＧ１バックグラウンド）。図７Ｅは、１１０および１１６（１６ではなく）ならびにＣＲ２１１３（マウスＩｇＧ１バックグラウンド）が、補体またはＡＤＣＣの非存在下であっても、ＣＤ１ａ発現Ｋ５６２によるアネキシンＶ発現を誘導することを示す。これは、１１０、１１６およびＣＲ２１１３抗体が、Ｋ５６２細胞死をある程度まで媒介可能であることを示唆する。補体媒介溶解（ＣＤＣ）および抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）の役割を検討するために、Ｋ５６２－ＣＤ１ａを補体（図７Ｆ）および／またはヒトＰＢＭＣ（図７Ｇ）とともにインキュベートした。マウスＩｇＧ１の抗体の性質にもかかわらず、補体媒介溶解およびＡＤＣＣの証拠が存在した。インビボでの機構をさらに検討するために、リンパ球応答および他の作用を広く欠損する免疫不全ＮＳＧモデルのＫ５６２－ＣＤ１ａ皮下腫瘍を使用して、新たなモデルを確立した。データは、３つすべての抗体により、１０日目までにリンパ球系細胞腫瘍のサイズが低下し、１６および１１６では、１５～２０日目まで作用が持続する（２５％以上のＣＤ１ａ発現腫瘍細胞量の低下まで）が、ＣＲ２１１３では、失われることを示した（図７Ｈ）。インビトロおよびインビボでの応答の差異は、インビボで存在する他の共同因子、例えば、補体、異なるＦｃに対する特異性を有するＦｃＲを担持する多数の自然細胞サブセット、差次的標的細胞密度、インビボでの抗体半減期の短縮、および組織到達の変更により説明がつき得る。ＣＤ１ａ発現標的細胞表現型のこのような直接的変更により、ＣＤ１ａ発現細胞の低炎症性応答が促進され得る。したがって、１１０および１１６で処置したＣＤ１ａ－Ｔｇマウスの皮膚におけるＬＣの減少は、ＣＤ１ａ＋ＬＣの表現型における直接的抗体依存的変化により部分的に説明がつき、臨床作用、例えば、１１６では、野生型のレベル未満までの炎症の低下に寄与し得る。また、データにより、ランゲルハンス細胞組織球症およびＴ細胞リンパ腫の一部の型および胸腺腫の一部の型を含むＣＤ１ａ発現悪性疾患の治療における有用性を、抗体が有し得る可能性が高まる。しかし、ＣＤ１ａビーズアッセイ（図２Ｃ）が、いかなる枯渇作用によっても影響されないため、標的細胞の表現型変更では、図２に示すＴ細胞機能的応答の低下の説明がつかない。
［実施例６］

【0147】

ＣＤ１ａ抗体のエピトープ結合解析
本明細書において示すデータにより、５つの新たに生成した抗ＣＤ１ａ抗体が様々な機能性を有することを実証し、抗体が重複結合部位を有するかどうかを、フローサイトメトリー交差遮断アッセイを使用して判定しようとした。加えて、エピトープの重複を市販の抗体ＯＫＴ６、ＨＩ１４９、ＳＫ９およびＮＡ１／３４（上記のようにＣＲ２１１３と重複することが公知の結合部位）により評価した。

【0148】

ＣＤ１ａ－Ｋ５６２細胞を精製抗ＣＤ１ａ一次抗体とともにインキュベートし（図８ＡのＹ軸、２５μｇ／ｍｌ）、次いで、非結合抗体を洗い流し、次いで、種々の抗体のＡｌｅｘａ－Ｆｌｕｏｒ－６４７コンジュゲート形態を細胞とともに図８Ａのマトリックス配置によりインキュベートした（Ｘ軸、１０μｇ／ｍｌ）。平均蛍光強度（ＭＦＩ）を使用してフルオロフォアコンジュゲート抗体の結合の程度を評価したところ、精製一次抗体の結合により生じる任意の立体干渉が、ＭＦＩの低下により表された。結果は、抗体ＨＩ１４９、ＯＫＴ６、１１０および１１６が、重複または密接に結合するエピトープを有し得、抗体ＮＡ１／３４、７７ａ、１１１および１６を含む第２の群が、密接に関連する結合部位を有し得ることを示した。これは、インビボで観察されたＣＤ１ａ発現の低下（図６ＢおよびＤ）が、ＨＩ／１４９検出抗体による結合に対する１１０／１１６抗体の干渉のためであることを示唆する。実際、この作用は、非競合ＳＫ９検出抗体では見られなかった（図８Ｂ）。重要かつ予想外なことには、これにより抗体は、皮膚において、ならびにリンパ節への遊走および次の皮膚組織の酵素分解後であっても、インビボでＬＣ上に存在を維持する。これは、より長期で実質的な臨床的有用性と関連する可能性を有する。抗体が、競合しない２つの主な群に分けられるため、図８（ＡおよびＢ）は、各群から選択される抗体メンバーの組合せを、例えば、治療／監視または併用治療として、ともに使用可能であることを示す。このような組合せの１つは、１１６および１６である。
［実施例７］

【0149】

イミキモド誘発炎症およびさらには全身的に関連する炎症の治療に対する本発明の抗体の有効性の実証
循環するＣＤ１ａ反応性Ｔ細胞の存在が実証されているが（１１）、ＣＤ１ａの皮膚に優勢な発現を考慮して、ほとんどの試験では、皮膚特異的機能性作用に焦点を合わせていた。皮膚に留まらない組織の炎症におけるＣＤ１ａの役割は、大規模には試験されていなかった。その上、ＣＤ１ａは、イミキモド皮膚応答を増幅することが公知であるが（１６）、関連する全身性続発症の試験は存在していない。発明者らは、新規のＣＤ１ａ遺伝子導入マウスおよびＣＤ１ａ反応性Ｔ細胞を生成し、抗ＣＤ１ａ抗体の機能性をインビトロおよびインビボでヒトおよびマウスアッセイをそれぞれ使用して特性決定する。この知見により、ＣＤ１ａ依存性作用が全身作用に及ぶことが確認され、有害な炎症性薬物反応を含む全身的に関連する皮膚疾患の治療に意味づけられる。

【0150】

抗ＣＤ１ａ抗体の治療可能性
新たに生成した抗ＣＤ１ａ抗体の治療可能性をさらに評価するために、発明者らは、３つの臨床的に最も有効な抗体１６、１１０および１１６をイミキモド処置モデルにおいて検査し、この場合、イミキモド誘発炎症の確立後に抗ＣＤ１ａ抗体を導入した（図９Ａ）。イミキモドの適用が進行中であるにもかかわらず、３つすべての抗体により、開始後速やかに臨床応答が改善した（図９Ｂ～Ｃ）。１１６では、応答が最も著名であり、これにより耳厚が低下した（図９Ｂ）。皮膚全体（上パネル）および表皮（下パネル）の肥厚を共焦点顕微鏡により可視化し（図９Ｄ）、これによりマイクロメーター評価が確認された（図９Ｂ）。ＣＤ１ａタンパク質発現をＣＤ１ａ遺伝子導入表皮において評価し（抗ＣＤ１ａ ＯＫＴ６ ＡＦ－５９４、赤）、１１０および１１６により処置した皮膚において、細胞死およびエピトープ競合により低下することを認めた（図８Ａおよび図９Ｄ）。イミキモド処置モデル後の皮膚細胞免疫応答の解析時、我々は、抗体の導入後の皮膚Ｔ細胞数および活性化の低下、皮膚ＬＣの減少、ならびに皮膚好中球の減少を観察した（図９Ｅ～Ｇ）。

【0151】

ＣＤ１ａはイミキモドに対する全身性免疫反応に関与する
イミキモド処置のヒト作用は、皮膚を越えて拡大させることができ、マウスモデルでは、脾腫を誘発することがわかっている。この経路に対するＣＤ１ａの寄与を評価した。著しくは、皮膚に留まらない全身作用と一致して、イミキモド処置ＣＤ１ａ Ｔｇマウスでは、脾臓重量が野生型と比較して上昇し、抗体により脾臓サイズおよび重量が低下した（図１０Ａ）。その上、ＣＤ６９発現（１１６および１１０、図１０Ｂ～Ｃ）、脾臓好中球（非有意傾向）、および好酸球発生頻度（１６、１１０、１１６）（それぞれ図１０Ｄおよび１０Ｅ）により決定した場合、抗体により、ＣＤ４およびＣＤ８Ｔ細胞活性化が低下した。８日目に血漿サイトカインレベルを評価した。イミキモド処置ＣＤ１ａ遺伝子導入マウスでは、ＩＬ－２３、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－１β、ＩＬ－１αおよびＭＣＰ－１の有意な上昇が観察され、１６、１１０および１１６処置群の一部またはすべてでは、低下した（図１０Ｆ）。それぞれ抗体１６および１１６の存在下では、血漿免疫調節サイトカインＩＬ－１０およびＩＬ－２７は上昇した（他では同様の傾向）。次いで、循環免疫細胞に対する影響を確かめた。脾臓と同様に、イミキモド処置ＣＤ１ａ遺伝子導入群では、血中ＣＤ４およびＣＤ８Ｔ細胞数、好中球増加症および好酸球増加症が増加した。この増加は、１６、１１０または１１６による処置後に有意に遮断された（図１１Ａ～Ｅ）。最後に発明者らは、イミキモドそれ自体がＣＤ１ａリガンドであり得るかどうかを検討したところ、これが事実ではないことを示し、ＣＤ１ａ経路のより広範な自己免疫および自己炎症作用と意味づけた（図１２）。したがって皮膚のＣＤ１ａにより、幅広い全身性炎症免疫応答が刺激されるか、または影響されることを示唆することができる。

【0152】

抗ＣＤ１ａ抗体がイミキモド適用後に皮膚炎症の持続的リセットをもたらし得るかどうかを検討するために、模式図１３Ａに示すモデルを試み、ここでは、抗ＣＤ１ａ抗体の非再投与下でイミキモドの再曝露を行った（図１３Ｂ）。驚くべきことには、持続的な免疫学的作用と一致して、１６、１１０および１１６のすべてにより、抗体の非反復投与下で耳厚の持続的改善がもたらされた。また、免疫学的応答が持続するとともに、皮膚Ｔ細胞の発生頻度（１１０、１１６）、皮膚Ｔ細胞活性化（１６、１１０、１１６）、皮膚好酸球（１１６）および皮膚好中球（１６、１１０、１１６）、リンパ節Ｔ細胞発生頻度（１１０、１１６）、リンパ節Ｔ細胞活性化（１６、１１６）、リンパ節ランゲルハンス細胞（１１６）、リンパ節好酸球（１１６）およびリンパ節好中球（１１６）、血中Ｔ細胞発生頻度（１１０、１１６）、血中Ｔ細胞活性化（１１６）、血中好酸球（１１０、１１６）、血漿ＩＬ－１α（１１６）、ＩＦＮγ（１６、１１０、１１６）、ＩＬ－１β（１６、１１０、１１６）、ＩＬ－６（１６、１１６）、ＩＬ－１７Ａ（１６、１１０、１１６）が有意に減少した。

【0153】

中等～重度の乾癬の管理における現在の標準治療と抗体の能力を比較するために、イミキモド処置モデル（図９Ａ）を、抗ＣＤ１ａ抗体と同時かつ同一用量（１００μｇ）による抗ＩＬ－１７Ａ（ＩｇＧ１アイソタイプ）の投与と並行して反復した（図１４）。すべての抗ＣＤ１ａ抗体は再び、耳厚の結果における有意な改善を示し、すべてが抗ＩＬ－１７Ａよりも早期に有意な改善をもたらした。種々の抗ＣＤ１ａ抗体とは対照的に、抗ＩＬ－１７Ａにより、皮膚Ｔ細胞、皮膚ランゲルハンス細胞、皮膚好酸球、リンパ節Ｔ細胞、リンパ節好中球、リンパ節好酸球、血漿ＩＬ－２３、ＭＣＰ－１、ＩＬ－６の発生頻度は有意に低下しないことが認められた。

【0154】

本明細書に記載の抗体とＣＲ２１１３との間の皮膚および全身性炎症の結果を直接的に比較するために、イミキモド皮膚処置モデルを試みた（図１５Ａ）。すべての抗ＣＤ１ａ抗体が耳厚に対する有利な作用を有したが、抗体１１６は、ＣＲ２１１３よりも有意に上昇した（図１５Ｂ～Ｃ）。ＣＲ２１１３に対する抗ＣＤ１ａ抗体１６、１１０および１１６の改善の検討を拡大するために、皮膚炎症のさらなるモデル、すなわち、ＭＣ９０３誘発炎症についての比較を行ったところ（図１５Ｄ）、ＣＲ２１１３ではなく抗体１６、１１０および１１６において有意な有用性が観察されたため、改善を示す（図１５Ｅ）。１６および１１６では、皮膚Ｔ細胞パーセンテージおよび皮膚好酸球数において有意な低下を示すが、ＣＲ２１１３では、有意な低下は示さなかったことが認められた（図１５Ｆ）。皮膚抽出サイトカインが有意に低下し、この場合、ＣＲ２１１３では、ＩＬ－５（１６、１１０、１１６）、ＩＬ－６（１６、１１０、１１６）、ＩＬ－９（１６）、ＩＬ－２３（１１６）、ＩＬ－１７Ｆ（１６、１１０、１１６）の有意な低下は示さなかった。

【0155】

イミキモドに対する皮膚、リンパ節および血漿炎症応答の低下において、１１６がＣＲ２１１３よりも一貫した改善を示すことがさらに観察された（図１６）。一部の結果では、１６はまた、ＣＲ２１１３よりも有意に改善した（図１６）。詳細には、皮膚Ｔ細胞によるＩＬ－１７Ａ発現の低下および流入領域リンパ節好酸球の発生頻度において、抗体１１６は、ＣＲ２１１３よりも改善した。１１６は、血漿ＩＦＮγ、ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－５、ＩＬ－９、ＩＬ－１７Ａ、ＩＬ－１７Ｆ、ＩＬ－２２、ならびに皮膚分解物ＩＬ－１α、ＩＬ－２２およびＴＮＦαの低下においてもＣＲ２１１３よりも改善した。１６は、リンパ節好酸球、血漿ＩＬ－１β、ＩＬ－２２、ＩＬ－９およびＩＬ－５、ならびに皮膚分解物ＩＬ－１αおよびＩＬ－１７Ａでは強力な傾向による低下においてＣＲ２１１３よりも改善した。全体的に見て、本明細書に記載の抗体により、イミキモドおよびＭＣ９０３に対する皮膚および全身性炎症応答を阻害可能であることがデータにより確認された。

【0156】

考察
皮膚炎症、例えば、皮膚炎、乾癬、およびループスは、理学的かつ心理学的罹患率と顕著に関連する一般的障害である。薬物に対する皮膚有害反応も一般的であり、入院患者１０００名あたり１．８～７の範囲に及ぶ。広汎かつ全身的作用を有する重度の皮膚有害反応、例えば、ＳＪＳ、ＴＥＮ、ＡＧＥＰ、およびＤＲＥＳＳは、それほど一般的ではなく、例えば、ＳＪＳ／ＴＥＮは、１年に個体百万名あたりおよそ１～６症例の発症率を有する（M. Mockenhaupt, Allergol Select 1, 96-108 (2017)）。ＧｅｌｌおよびＣｏｏｍｂｓは、１９６０年代に過敏症の分類を定義し、ここでは、遅延型ＩＶ過敏症に、エフェクターＴ細胞の役割を必要とした（R. R. A. Coombs, Gell, P.G.H., Classification of allergic reactions responsible for drug hypersensitivity reactions. In Clinical Aspects of Immunology. (Davis, Philadelphia, ed. second, 1968)）。この分類では薬物過敏症のすべての態様の説明はつかないという認識が高まっているが、共有結合ハプテンまたは非共有結合修飾ペプチド／ＭＨＣ分子の認識の変更に、なお大部分が焦点を合わせている。しかし現在のモデルでは、薬物過敏症の皮膚および粘膜合併症が優勢である説明がつかない（M. Mockenhaupt, Allergol Select 1, 96-108 (2017)）。

【0157】

ＣＤ１ａ遺伝子導入マウスおよび自己反応性ヒトＣＤ１ａ制限濃縮Ｔ細胞株の生成、ならびに機能性抗ＣＤ１ａ抗体の特性決定により、ここに示すデータは、内因性脂質リガンドのＣＤ１ａ提示の誘導を示す。これによって、自己反応性Ｔ細胞により媒介される皮膚および全身性炎症が引き起こされる。抗ＣＤ１ａ抗体は、遮断または遮断／調節しているかにかかわらず、臨床的かつ免疫学的作用を有し、Ｔ細胞に対するＣＤ１ａ脂質提示が意義を有することを示唆した。ＴＬＲ７は一本鎖ＲＮＡを認識可能であるため、ウイルス感染症に対する反応性が、乾癬、皮膚炎、ループス、ならびにＳＪＳおよびＴＥＮを含む薬物に対する有害炎症反応を含む、皮膚炎症の種々の重症型の臨床表現型を模倣可能であることは興味深い。このように共有された最終的な一般臨床所見により、多くの沈殿剤がＣＤ１ａ自己反応性および自己炎症を促進し得ることが示され得る。このモデルは、エリテマトーデスおよびＤＲＥＳＳ症候群を含む特定の薬物反応と関連する自己免疫のリスク上昇の説明にも役立ち得る。その上、この知見によって、より広範なＴ細胞寛容の破壊にＣＤ１ａ自己反応性が意味づけられる。

【0158】

イミキモド含有薬物であるアルダラに対するＴ細胞応答への作用に加えて、皮膚、流入領域リンパ節、および脾臓における好中球および好酸球応答の上昇が、ＣＤ１ａ遺伝子導入マウスにおいて観察された。このような作用は、本発明の抗体、特には、１６、１１０および１１６の投与により阻害された。これにより、ＣＤ１ａ依存性免疫カスケードが当初の予測よりも広範に及ぶことが意味づけられる。好中球の枯渇により、イミキモドにより誘発される炎症の重症度が回復することがわかっている（H. Sumida et al., Interplay between CXCR2 and BLT1 facilitates neutrophil infiltration and resultant keratinocyte activation in a murine model of imiquimod-induced psoriasis. J Immunol 192, 4361-4369 (2014)）。

【0159】

アルダラ／イミキモドの適用により、上に考察するＴ細胞および好中球浸潤を含む、乾癬、皮膚炎、ループスおよび重度の皮膚過敏症反応を含む、皮膚炎症ならびに関連する全身性疾患および障害の種々の形態の鍵となる態様が再現される。本明細書において実証するデータにより、皮膚、リンパ節および脾臓のイミキモド依存性好酸球浸潤が、ＣＤ１ａ遺伝子導入マウスにおいて増強され、本発明の抗体、特には、１６、１１０および１１６の投与により低下することが示される。

【0160】

その上、乾癬、皮膚炎、ループス、および斑状丘薬疹を含む炎症性皮膚疾患または障害の種々の形態を有する患者の病変皮膚におけるＬＣ数が、非病変皮膚と比較して増加し、皮疹が消散すると非病変レベルまで減少することが報告されている（D. I. Dascalu, Y. Kletter, M. Baratz, S. Brenner, Acta Derm Venereol 72, 175-177 (1992)）。興味深いことには、乾癬は、ＬＣ遊走の変更と関連し、イミキモドの適用ならびに乾癬およびループスおよび皮膚炎の有効なマウスモデルは十分に研究されているが、有害薬物炎症性薬物反応に対する適応性をも有することが示唆される。ここで、発明者らは、ＬＣのＣＤ１ａ抗体依存的調節が、本発明の抗体、特には、１１０および１１６の投与時の皮膚炎症の低下と関連したことを示し、これは、乾癬、皮膚炎、ループス、炎症性薬物反応および他の症状の治療に対して治療的意義を有し得る。エピトープ解析では、エピトープ結合部位の潜在的な治療的意義が強調され、抗ＣＤ１ａ抗体は、結合部位および生じるエフェクター機能に基づいて２つの群に分けられる。エピトープ部位により、抗体を主に遮断していた抗体７７ａ、１１１および１６ではなく１１０および１１６によって見られるクラスター形成および表現型作用の変化が促進され得る。クラスター形成により、実際、架橋／凝集様細胞形態が引き起こされることがあり、ＣＤ１ａトランスフェクトＫ５６２および単球由来ＬＣが単球由来ＤＣよりも高い高レベルのＣＤ１ａを発現するため、これによっても両細胞型の減少の説明がつき得る。２つの群の種々の抗体結合部位は競合しないため、２つの群のそれぞれから選択される組合せに対する、例えば、治療／監視または併用療法における有用性が存在する。

【0161】

皮膚炎症および関連する全身性疾患の病態形成におけるＣＤ１ａの役割により、乾癬、皮膚炎およびエリテマトーデスならびに薬物過敏症を含む多くの疾患におけるこの役割が意味づけられる。その上、ＣＤ１ａ遮断および調節抗体の特性決定により、皮膚炎症およびＣＤ１ａ発現悪性疾患に対する予防法および治療法の開発への新たな潜在的経路がもたらされる。

【0162】

要約
要約すると、発明者らは、炎症性皮膚および粘膜障害の予防および／または治療における治療可能性を有する抗ＣＤ１ａ抗体の改良パネルを生成した。５つの抗体１６、７７ａ、１１０、１１１および１１６では、インビトロでのヒトＣＤ１ａ抗原提示の強力な阻害物質であることが示され、乾癬、皮膚炎、エリテマトーデスおよび炎症性皮膚または粘膜疾患または障害として現れる薬物反応、ならびに全身性（非皮膚性）障害の特徴を有する、例となる炎症性皮膚疾患の予防および治療モデル、ならびに異種移植腫瘍モデルにおける有効性が示された。改善抗体の同定における抗体発見プロセスの成功は、次の併用に起因し得る：ａ）多数のヒット（３５００）のスクリーニングを、ｂ）新規のキメラ免疫原の使用により行い、これによってヒトＣＤ１ａ脂質結合ドメインを宿主生物ＣＤ１ｄ Ｉｇドメインに融合し、したがって脂質結合ドメインに対して抗体生成を標的とした。この場合、機能的阻害可能性は、ｃ）種々の機能的結果を調べる多様なポリクローナルおよび濃縮Ｔ細胞解析次第であり得る。

【0163】

インビトロでのヒト機能性アッセイでは、この抗体が、市販の抗体よりも強力であることが示され、初代ポリクローナルＴ細胞応答の阻害のＩＣ５０評価により測定された。その上、高度に感受性のヒトＣＤ１ａ制限Ｔ細胞クローンアッセイを使用して、抗ＣＤ１ａ抗体１６および１１６が、炎症性皮膚および粘膜疾患の鍵となる調節因子であるＩＬ－２２産生を遮断可能であることを判定した。これは抗ＣＤ１ａ ＣＲ２１１３の既存の公表文献または特許においては示されず（（１６、１７）、米国特許第１０８４４１１８号明細書およびカナダ国特許出願公開第２９２４８８２号明細書）、ここではＩＬ－１７またはＩＦＮγ産生がマウス系において誘導および阻害されたため、このような活性は改善かつ驚異となった。ＩＬ－２２が皮膚および粘膜疾患の鍵となる調節因子であるため、ＩＬ－２２阻害は、抗体の重要な利点である。

【0164】

ヒトおよびインビボでのマウスモデルの並行解析では、新たに生成した抗体の治療的有用性を評価する強力な手段がもたらされる。インビボでは、イミキモドを利用して乾癬様、皮膚炎様、ループス様、薬物反応様表現型を誘発し、モデル皮膚炎症系をもたらした。また、イミキモドは、多くの炎症性疾患および障害だけでなく関連する全身性疾患または障害および全身的に現れる炎症性薬物反応に対して、より広く適用可能であり得る。ここでは、抗体１１０、１１６および１６が、イミキモドにより誘発されたＣＤ１ａ依存性炎症を有意に低下させることが示され、標準治療（抗ＩＬ－１７Ａ）および対照薬である同一のマウスＩｇＧ１バックグラウンドの抗ＣＤ１ａ抗体（ＣＲ２１１３）よりも改善した。重要かつ予想外なことには、抗体１１６は、ＷＴイミキモド処置マウスのレベル未満に皮膚炎症を低下させ、皮膚および全身性免疫マーカーの多くをＷＴのレベルまで正常化し、抗ＣＤ１ａ １１６が、ＣＤ１ａ－ＴＣＲシグナル伝達の阻害に留まらない作用を有する機構を示唆した。皮膚の免疫表現型を決定し、抗体１１０、１１６および１６の投与によるＷＴレベルへの好中球浸潤と同様に、Ｔ細胞数および活性化の低下を観察した。ＷＴレベルへの好中球の減少が観察されたことは、公表された抗ＣＤ１ａ ＣＲ２１１３に対する予想外の改善であり、これによって抗体１１０、１１６および１６の可能性が強調される。

【0165】

重要なことには、皮膚におけるＬＣ集団を解析すると、抗体１１０および１１６の投与後にＣＤ１１ｃ＋ランゲリン＋ＬＣの有意な低下が観察された。この低下は、流入領域リンパ節への遊走の増強では説明がつかなかった。しかし、抗体１１０およびかなりの程度の１１６が、ＣＤ１ａ＋細胞をインビボで直接的に減少させる可能である可能性を有し、インビボでの皮膚ＬＣの減少の説明がつき、インビトロでのヒトＣＤ１ａ＋細胞の著しい低下によって証明される。これは、抗体のマウスＩｇＧ１アイソタイプを考慮すると驚くべき結果であり、この場合、マウスＩｇＧ２ａアイソタイプは、補体媒介溶解または抗体依存性細胞性細胞毒性を介して細胞毒性を引き起こす可能性がより高い。また、ここではＣＤ１ａ発現細胞のアポトーシスがマウスＩｇＧ１バックグラウンドのＣＲ２１１３によっても誘導され得ることがわかったが、特許を有し公開されているさらなる抗ＣＤ１ａ ＣＲ２１１３では、直接的枯渇が不可能であると報告されている（１７）。このような抗体の調節能力は、ＷＴアイソタイプ処置マウスのレベル未満のイミキモド誘発炎症の低下の説明に役立ち得る。抗体１１６は、ＴＣＲとのＣＤ１ａの相互作用を遮断するだけでなく、皮膚の炎症可能性を低下／リセットするＬＣを修飾し、皮膚および全身性免疫マーカーの多くをＷＴのレベルまで正常化する。これにより、抗ＣＤ１ａ ＣＲ２１１３にはない、野生型を凌ぐ改善へのＣＤ１ａ依存性応答を超えて上回る回復作用の説明がつき得る。

【0166】

その上、データにより、ここに示す１６、１１０および／または１１６抗体が、ＣＤ１ａ発現悪性疾患、例えば、ランゲルハンス細胞組織球症またはＴ細胞リンパ腫および胸腺腫の一部の型の治療における有用性を有することが示唆される。これは、直接的作用によるものであり得るか、またはこの場合、抗ＣＤ１ａ抗体は、細胞毒性剤、抗炎症剤、例えば、ステロイド、およびＣＡＲ－Ｔ細胞、例えば、調節性もしくは細胞溶解性ＣＡＲ－Ｔ細胞、または抗体もしくは抗原結合断片を発現もしくは提示する他の細胞を含む群から選択される１つまたは複数の他の治療剤と共役または会合させる。

【0167】

この検討では、抗体１６が、ＣＤ１ａ依存性炎症をインビボで直接的アポトーシスを誘導せずに除去する高度に有効な遮断抗体であり、１１０が、ＬＣ表現型および機能を修飾してＣＤ１ａ依存性炎症をインビボで有意に低下させ、１１６が、ＷＴレベル未満に炎症を低下させ、皮膚および全身性免疫マーカーの多くをＷＴのレベルまで正常化する高度に有効な遮断および修飾抗体であることを実証する。抗体のこの群化は、抗体１１０および１１６クラスターを直接的に修飾し、抗体７７ａ、１１１および１６クラスターを遮断する、基本的エピトープ解析と一致する。また、このエピトープ解析により、群７７ａ、１１１および１６が、非枯渇ＮＡ１／３４と重複するエピトープを認識することが明らかとなった。ＮＡ１／３４が抗ＣＤ１ａ ＣＲ２１１３の結合を交差遮断することがわかっているため、これは、注目すべき重要なことである。抗体１１０および１１６は、ＮＡ１／３４を交差遮断せず、このため異なるエピトープ領域を表す可能性を有する。抗体は、皮膚において、およびリンパ節への遊走後であっても、インビボでＬＣ上に存在を維持する。臨床作用がより持続性であるため、これは重要な増強である。

【0168】

このようなデータにより、発明者らは、制限されないが、乾癬、皮膚炎、ループスを含む炎症性皮膚および粘膜症状の予防および治療における、ならびに１つもしくは複数の関連する全身性疾患または障害、または１つもしくは複数の全身的に現れる炎症性薬物反応の治療および／または予防における使用のための、改善した抗ＣＤ１ａ抗体のこの改良パネルの可能性を実証する。ＬＣ、Ｔ細胞および好中球を含む広く連鎖する炎症に対する作用、特には、抗体１１０、１１６および１６の作用は、乾癬、皮膚炎、ループスを含む炎症性皮膚および粘膜障害ならびに炎症性皮膚もしくは粘膜疾患もしくは障害として現れる薬物反応、またはＣＤ１ａ発現悪性疾患において、広範に及ぶ作用を有する。

【0169】

結論として、発明者らは、抗ＣＤ１ａ抗体１６、７７ａ、１１０、１１１および１１６の改善を、ＣＤ１ａの遮断および／またはＣＤ１ａ＋細胞の表現型／機能の修飾により、炎症性皮膚および粘膜疾患もしくは障害、または関連する全身性疾患もしくは障害、または全身的に現れる炎症性薬物反応、またはＣＤ１ａ発現悪性疾患を予防および治療するための方法として実証する。

【0170】

参考文献



特許、特許出願、論文、テキスト等を含む、本明細書に引用するすべての参考文献、およびそれらに引用される参考文献は、これらを既に組み込んでいない限りにおいて、これらの全体を参照により本明細書にこれによって組み込む。

【0171】

【表14-1】

【表14-2】

【表14-3】

【表14-4】

【表14-5】

【表14-6】

【表14-7】

【表14-8】

【表14-9】

【表14-10】

【図1】

【図2-1】

【図2-2】

【図3-1】

【図3-2】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7-1】

【図7-2】

【図7-3】

【図7-4】

【図7-5】

【図7-6】

【図8-1】

【図8-2】

【図9-1】

【図9-2】

【図9-3】

【図10-1】

【図10-2】

【図11】

【図12】

【図13-1】

【図13-2】

【図14】

【図15-1】

【図15-2】

【図15-3】

【図15-4】

【図16-1】

【図16-2】

【図16-3】

【配列表】

2024522095000001.app

【国際調査報告】