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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-06-11
(54)【発明の名称】不顕性拒絶反応の非侵襲的診断
(51)【国際特許分類】
G01N 33/68 20060101AFI20240604BHJP
C12Q 1/6813 20180101ALI20240604BHJP
C12Q 1/686 20180101ALI20240604BHJP
C12Q 1/6869 20180101ALI20240604BHJP
C12N 15/12 20060101ALN20240604BHJP
C12N 15/115 20100101ALN20240604BHJP
C07K 16/18 20060101ALN20240604BHJP
【ＦＩ】
G01N33/68
C12Q1/6813 Z
C12Q1/686 Z
C12Q1/6869 Z
C12N15/12 ZNA
C12N15/115 Z
C07K16/18
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023573196
(86)(22)【出願日】2022-05-25
(85)【翻訳文提出日】2024-01-24
(86)【国際出願番号】 EP2022064247
(87)【国際公開番号】W WO2022248573
(87)【国際公開日】2022-12-01
(31)【優先権主張番号】21305713.6
(32)【優先日】2021-05-28
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．Ｂｌｕ－ｒａｙ
(71)【出願人】
【識別番号】516200884
【氏名又は名称】センター ホスピタリア ユニバーシタイア デ ナント
(71)【出願人】
【識別番号】519134337
【氏名又は名称】ナント ユニベルシテ
(71)【出願人】
【識別番号】514203362
【氏名又は名称】インセルム（インスティチュート ナショナル デ ラ サンテ エ デ ラ リシェルシェ メディカル）
(74)【代理人】
【識別番号】100114775
【弁理士】
【氏名又は名称】高岡 亮一
(74)【代理人】
【識別番号】100121511
【弁理士】
【氏名又は名称】小田 直
(74)【代理人】
【識別番号】100202751
【弁理士】
【氏名又は名称】岩堀 明代
(74)【代理人】
【識別番号】100208580
【弁理士】
【氏名又は名称】三好 玲奈
(74)【代理人】
【識別番号】100191086
【弁理士】
【氏名又は名称】高橋 香元
(72)【発明者】
【氏名】ブルアール，ソフィ
(72)【発明者】
【氏名】デンジャー，リチャード
(72)【発明者】
【氏名】ギラル，マガリ
【テーマコード（参考）】
2G045
4B063
4H045
【Ｆターム（参考）】
2G045DA13
2G045DA14
2G045JA01
4B063QA01
4B063QA13
4B063QA19
4B063QQ42
4B063QQ52
4B063QR08
4B063QR32
4B063QR35
4B063QR55
4B063QR62
4B063QS25
4B063QS34
4H045AA30
4H045CA40
4H045EA50
(57)【要約】
本明細書に記載の本発明は、互いに独立してまたは組み合わせであるかによらず、２つの遺伝子、ＡＫＲ１Ｃ３およびＴＣＬ１Ａのレベル、量、または濃度に基づいて不顕性拒絶反応を診断する方法に関する。組み合わせの場合、２つの遺伝子のレベル、量、または濃度を、複合スコアの形態で臨床パラメータとさらに組み合わせることができる。本発明はさらに、対象が本発明の方法を用いて不顕性拒絶反応と診断された場合／診断されたときに、対象における不顕性拒絶反応を処置する方法、ならびに、不顕性拒絶反応を診断する方法を実装するためのコンピュータシステムおよび部品キットも提供する。
【選択図】図なし
【選択図】図なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
それを必要とする対象における不顕性腎拒絶反応を診断する方法であって、ａ）前記対象から以前に採取されたサンプル中の、ＴＣＬ１ＡおよびＡＫＲ１Ｃ３からなる群から選択される少なくとも１つのバイオマーカーのレベル、量、または濃度を決定するステップと；
ｂ）前記少なくとも１つのバイオマーカーの前記レベル、量、または濃度を、少なくとも１人の参照対象において決定された同じ少なくとも１つのバイオマーカーのレベル、量、または濃度と比較するステップであって、
前記少なくとも１人の参照対象が：
‐腎移植を受けていない対象、
‐不顕性腎拒絶反応に罹っていない腎移植レシピエント、または
‐腎移植前に不顕性腎拒絶反応そのものに関して検査された対象
であるステップと；
ｃ）前記少なくとも１つのバイオマーカーの前記レベル、量、または濃度が、前記少なくとも１人の参照対象において決定された同じ少なくとも１つのバイオマーカーのレベル、量、または濃度よりも統計学的に有意に低い場合、前記対象が、不顕性腎拒絶反応を有していると結論付けるステップと
を含む方法。
【請求項2】
ステップａ）が、ＣＤ４０、ＣＴＬＡ４、ＩＤ３、および／またはＭＺＢ１のレベル、量、または濃度を決定することを含まない、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
ステップａ）が、ＴＣＬ１Ａおよび／またはＡＫＲ１Ｃ３以外のバイオマーカーのレベル、量、または濃度を決定することを含まない、請求項１または２に記載の方法。
【請求項4】
ステップａ）が、前記対象から以前に採取された前記サンプル中のＴＣＬ１Ａの前記レベル、量、または濃度を決定することを含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
ステップａ）が、前記対象から以前に採取された前記サンプル中のＡＫＲ１Ｃ３の前記レベル、量、または濃度を決定することを含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
ステップａ）が、前記対象から以前に採取された前記サンプル中のＴＣＬ１ＡおよびＡＫＲ１Ｃ３の両方の前記レベル、量、または濃度を決定することを含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
前記少なくとも１つのバイオマーカーの前記レベル、量、または濃度が、絶対的または相対的なレベル、量、または濃度に関して表され、好ましくは、１つまたはいくつかの参照マーカーの前記レベル、量、または濃度に対して正規化された相対レベル、量、または濃度に関して表される、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
ａ）ＴＣＬ１ＡおよびＡＫＲ１Ｃ３からなる群から選択される前記少なくとも１つのバイオマーカー、好ましくはＴＣＬ１ＡおよびＡＫＲ１Ｃ３の両方の前記レベル、量、または濃度によって複合スコアを決定するステップであって、前記複合スコアが、式（１）を使用して確立される：【数1】
「βｉ」は、前記少なくとも１つのバイオマーカーのそれぞれの前記レベル、量、または濃度の回帰係数を表す；
「Ｘｉ」は、前記少なくとも１つのバイオマーカーのそれぞれの前記レベル、量、または濃度の予測変数を表す；
「β０」は、方程式の切片を表す）ステップと；
ｂ）前記複合スコアを、前記少なくとも１人の参照対象において決定された参照複合スコアと比較するステップと；
ｃ）前記複合スコアが、前記少なくとも１人の参照対象において決定された前記参照複合スコアより実質的に高い場合、前記対象が不顕性腎拒絶反応に罹っていると結論付けるステップと
を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
ａ）‐ＴＣＬ１ＡおよびＡＫＲ１Ｃ３からなる群、好ましくはＴＣＬ１ＡおよびＡＫＲ１Ｃ３の両方からなる群から選択される前記少なくとも１つのバイオマーカーの前記レベル、量、または濃度；ならびに
‐以下から選択される１つ、２つ、または好ましくは３つの臨床パラメータ：
・採血前の拒絶反応エピソードの経験、
・レシピエントの性別、および
・採血時の免疫抑制剤（ＩＳ）の摂取、好ましくは採血時のタクロリムスまたはシクロスポリンＡ（ＣｓＡ）の摂取
によって複合スコアを決定するステップであって、
前記複合スコアが、式（２）を使用して確立される：
【数2】
「βＴＣＬ１Ａ」、「βＡＫＲ１Ｃ３」、「β以前の拒絶反応エピソード」、「βＩＳの摂取」、および「βレシピエントの性別」は、前記バイオマーカーの前記レベル、量、または濃度と前記臨床パラメータにおける各予測子の回帰係数を表す；
「以前の拒絶反応エピソード」は、採血前の拒絶反応エピソードの経験を定義する予測変数を表し、０＝「以前の拒絶反応エピソードなし」、１＝「以前の拒絶反応エピソードが１つまたは複数ある」である；
「ＩＳの摂取」は、採血時の免疫抑制剤（ＩＳ）の摂取、好ましくはタクロリムスまたはシクロスポリンＡ（ＣｓＡ）の摂取を定義する予測変数を表し、０＝「ＣｓＡの摂取なし」または「タクロリムスの摂取」、１＝「ＣｓＡの摂取」または「タクロリムスの摂取なし」である；
「レシピエントの性別」は、移植レシピエントの性別を定義する予測変数を表し、０＝「女性」、１＝「男性」である；
「Ｅｘｐｒ（ＴＣＬ１Ａ）」および「Ｅｘｐｒ（ＡＫＲ１Ｃ３）」は、それぞれＴＣＬ１ＡおよびＡＫＲ１Ｃ３のレベル、量、または濃度を定義する予測変数を表す；
「β０」は、方程式の切片を表す）ステップと；
ｂ）前記複合スコアを、前記少なくとも１人の参照対象において決定された参照複合スコアと比較するステップと；
ｃ）前記複合スコアが、前記少なくとも１人の参照対象において決定された前記参照複合スコアより実質的に高い場合、前記対象が不顕性腎拒絶反応に罹っていると結論付けるステップと
を含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項10】
前記採血時の免疫抑制剤（ＩＳ）の摂取が、前記採血時のタクロリムスの摂取である、請求項９に記載の方法。
【請求項11】
前記採血時の免疫抑制剤（ＩＳ）の摂取が、前記採血時のシクロスポリンＡ（ＣｓＡ）の摂取である、請求項９に記載の方法。
【請求項12】
前記複合スコアが：‐ＴＣＬ１ＡおよびＡＫＲ１Ｃ３の両方のレベル、量、または濃度、ならびに
‐以下の３つの臨床パラメータ：（ｉ）採血前の拒絶反応エピソードの経験、（ｉｉ）レシピエントの性別、および（ｉｉｉ）採血時のシクロスポリンＡ（ＣｓＡ）の摂取
によって決定される、請求項９または１１に記載の方法。
【請求項13】
前記不顕性腎拒絶反応が、不顕性Ｔ細胞媒介腎拒絶反応（ｓＴＣＭＲ）、不顕性抗体媒介腎拒絶反応（ｓＡＢＭＲ）および／またはｓＴＣＭＲ／ｓＡＢＭＲ混合型である、請求項９～１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項14】
ａ）‐ＴＣＬ１ＡおよびＡＫＲ１Ｃ３からなる群、好ましくはＴＣＬ１ＡおよびＡＫＲ１Ｃ３の両方からなる群から選択される少なくとも１つのバイオマーカーのレベル、量、または濃度；ならびに
‐以下から選択される１つ、２つ、３つ、または好ましくは４つの臨床パラメータ：
・採血前の拒絶反応エピソードの経験、
・レシピエントの性別、
・同種移植ランク、および
・ドナーとレシピエントのＨＬＡ不一致の数
によって複合スコアを決定するステップであって、
前記複合スコアが、式（３）を使用して確立される：
【数3】
「βＴＣＬ１Ａ」、「βＡＫＲ１Ｃ３」、「β以前の拒絶反応エピソード」、「β同種移植ランク」、「βＨＬＡ不一致」および「βレシピエントの性別」は、バイオマーカーのレベル、量、または濃度と臨床パラメータにおける各予測子の回帰係数を表す；
「以前の拒絶反応エピソード」は、採血前の拒絶反応エピソードの経験を定義する予測変数を表し、０＝「以前の拒絶反応エピソードなし」、１＝「以前の拒絶反応エピソードが１つまたは複数ある」である；
「同種移植ランク」は、以前の移植の発生を定義する予測変数を表し、０＝「以前の移植なし」、１＝「１回または複数回の以前の移植あり」である；
「ＨＬＡ不一致」は、ドナーとレシピエントのＨＬＡ不一致の発生を定義する予測変数を表し、０＝「ＨＬＡ－Ａ、－Ｂ、および／または－ＤＲ不一致が３つ以下」、１＝「ＨＬＡ－Ａ、－Ｂ、および／または－ＤＲ不一致が厳密に３つを超える」である；
「レシピエントの性別」は、移植レシピエントの性別を定義する予測変数を表し、０＝「女性」、１＝「男性」である；
「Ｅｘｐｒ（ＴＣＬ１Ａ）」および「Ｅｘｐｒ（ＡＫＲ１Ｃ３）」は、それぞれＴＣＬ１ＡおよびＡＫＲ１Ｃ３のレベル、量、または濃度を定義する予測変数を表す；
「β０」は、方程式の切片を表す）ステップと；
ｂ）前記複合スコアを、少なくとも１人の参照対象において決定された参照複合スコアと比較するステップと；
ｃ）前記複合スコアが、前記少なくとも１人の参照対象において決定された前記参照複合スコアより実質的に高い場合、前記対象が不顕性腎拒絶反応に罹っていると結論付けるステップと
を含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項15】
不顕性腎拒絶反応が、不顕性抗体媒介腎拒絶反応（ｓＡＢＭＲ）からなる、請求項１４に記載の方法。
【請求項16】
前記少なくとも１人の参照対象が、２人以上の参照対象を含む参照集団である、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項17】
コンピュータ実装されている、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項18】
それを必要とする対象における不顕性腎拒絶反応を診断するためのコンピュータシステムであって、ｉ）少なくとも１つのプロセッサと、
ｉｉ）前記プロセッサによって実行されたときに、前記プロセッサに
ａ．ＴＣＬ１ＡおよびＡＫＲ１Ｃ３からなる群から選択される前記少なくとも１つのバイオマーカーの入力レベル、量、または濃度を受信すること、
ｂ．前記入力レベル、量、または濃度を分析し、変換して、請求項８に記載の式（１）を使用して確立される複合スコアを導出すること、
ｃ．前記複合スコアである出力を生成すること、および
ｄ．前記出力に基づいて、前記対象が不顕性腎拒絶反応に罹っているか否かの診断を提供すること
を実行させる、前記プロセッサによって読み取り可能な少なくとも１つのコードを保存する少なくとも１つの記憶媒体と
を含むコンピュータシステム。
【請求項19】
前記プロセッサによって読み取り可能な前記少なくとも１つのコードが、前記プロセッサによって実行されたときに、前記プロセッサにａ．ＴＣＬ１ＡおよびＡＫＲ１Ｃ３からなる群から選択される前記少なくとも１つのバイオマーカーの入力レベル、量、または濃度を受信し、
（ｉ）採血前の拒絶反応エピソードの経験、
（ｉｉ）レシピエントの性別、および
（ｉｉｉ）採血時の免疫抑制剤（ＩＳ）の摂取、好ましくは採血時のタクロリムスまたはシクロスポリンＡ（ＣｓＡ）の摂取
から選択される１つ、２つ、または好ましくは３つの臨床パラメータの値を入力すること、
ｂ．前記入力レベル、量、または濃度、および入力値を分析し、変換して、請求項９に記載の式（２）を使用して確立された複合スコアを導出すること、
ｃ．前記複合スコアである出力を生成すること、ならびに
ｄ．前記出力に基づいて、対象が不顕性腎拒絶反応に罹っているか否かの診断を提供すること
を実行させる、請求項１８に記載のコンピュータシステム
【請求項20】
前記採血時の免疫抑制剤（ＩＳ）の摂取が、前記採血時のタクロリムスの摂取である、請求項１９に記載のコンピュータシステム。
【請求項21】
前記採血時の免疫抑制剤（ＩＳ）の摂取が、前記採血時のシクロスポリンＡ（ＣｓＡ）の摂取である、請求項１９に記載のコンピュータシステム。
【請求項22】
前記不顕性腎拒絶反応が、不顕性Ｔ細胞媒介腎拒絶反応（ｓＴＣＭＲ）、不顕性抗体媒介腎拒絶反応（ｓＡＢＭＲ）および／またはｓＴＣＭＲ／ｓＡＢＭＲ混合型である、請求項１８～２１のいずれか一項に記載のコンピュータシステム。
【請求項23】
前記プロセッサによって読み取り可能な前記少なくとも１つのコードが、前記プロセッサによって実行されたときに、前記プロセッサに、ａ．ＴＣＬ１ＡおよびＡＫＲ１Ｃ３からなる群から選択される前記少なくとも１つのバイオマーカーの入力レベル、量、または濃度を受信し、
（ｉ）採血前の拒絶反応エピソードの経験、
（ｉｉ）レシピエントの性別、
（ｉｉｉ）以前の移植、および
（ｉｖ）ドナーとレシピエントのＨＬＡ不一致の数
から選択される１つ、２つ、３つ、または好ましくは４つの臨床パラメータの値を入力すること、
ｂ．前記入力レベル、量、または濃度、および入力値を分析し、変換して、請求項１４に記載の式（３）を使用して確立された複合スコアを導出すること、
ｃ．前記複合スコアである出力を生成すること、ならびに
ｄ．前記出力に基づいて、前記対象が不顕性腎拒絶反応に罹っているか否かの診断を提供すること
を実行させる、請求項１８に記載のコンピュータシステム。
【請求項24】
不顕性腎拒絶反応が、不顕性抗体媒介腎拒絶反応（ｓＡＢＭＲ）からなる、請求項２３に記載のコンピュータシステム。
【請求項25】
前記対象が、前記出力が、少なくとも１人の参照対象において得られる同じ出力よりも実質的に高い場合に、不顕性腎拒絶反応に罹っていると診断され、前記参照対象が、腎移植を受けていない対象、不顕性拒絶反応に罹っていない腎移植レシピエント、腎移植前に不顕性拒絶反応そのものに関して検査された前記対象である、請求項１８～２４のいずれか一項に記載のコンピュータシステム。
【請求項26】
プロセッサによって実行されたときに、請求項１７に記載のコンピュータ実装方法を実行するように適合させた前記プロセッサによって読み取り可能なソフトウェアコードを含むコンピュータプログラム。
【請求項27】
コンピュータによって実行されたときに、請求項１７に記載のコンピュータ実装方法をプロセッサに実行させるコードを含む非一時的コンピュータ可読記憶媒体。
【請求項28】
ＴＣＬ１ＡおよびＡＫＲ１Ｃ３からなる群から選択される少なくとも１つのバイオマーカーのレベル、量、または濃度を決定するための手段、および任意により、少なくとも１つの参照マーカーのレベル、量、または濃度を決定するための手段、および前記方法を実施するための使用説明書を含む、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法を実施するための部品キット。
【請求項29】
前記手段が、核酸プローブ、抗体、およびアプタマーからなる群から選択される、請求項２８に記載の部品キット。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、不顕性拒絶反応（ＳＣＲ）の分野に関し、非侵襲性マーカーを使用して、日常的な方法でＳＣＲを診断するための手段および方法を提供する。
【背景技術】
【0002】
腎移植、不顕性拒絶反応（ＳＣＲ）、特に抗体媒介性不顕性拒絶反応（ｓＡＢＭＲ）は、同種移植の好ましくないアウトカムに関連する大きな脅威である（Ｆｉｌｉｐｐｏｎｅ＆Ｆａｒｂｅｒ，２０２０．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ；Ｌｏｕｐｙ ｅｔ ａｌ．，２０１５．Ｊ Ａｍ Ｓｏｃ Ｎｅｐｈｒｏｌ．２６（７）：１７２１３１；Ｍｅｈｔａ ｅｔ ａｌ．，２０１６．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．１００（８）：１６１０８；Ｒｕｓｈ ＆ Ｇｉｂｓｏｎ，２０１９．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．１０３（６）：ｅ１３９ｅ１４５；Ｓｈｉｓｈｉｄｏ ｅｔ ａｌ．，２００３．Ｊ Ａｍ Ｓｏｃ Ｎｅｐｈｒｏｌ．１４（４）：１０４６５２）。
【0003】
それにもかかわらず、急性および慢性拒絶反応の診断は、同種移植片の機能不全から臨床的に疑われ、組織学的に確認することができるが、定義上、ＳＣＲは、移植片病変が確立されている間の安定した移植片機能と関連している。したがって、その診断は、血清中クレアチニンまたは糸球体濾過率などの従来の腎機能測定に依存することはできない。初期の無症状病変を診断して予防し、最終的に処置するために、追跡後最初の１年以内のサーベイランス生検が、日常的な診療において提唱されている（Ｈｏｆｆｍａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１９．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．１０３（７）：１４５７１４６７；Ｌｏｕｐｙ ｅｔ ａｌ．，２０１５．Ｊ Ａｍ Ｓｏｃ Ｎｅｐｈｒｏｌ．２６（７）：１７２１３１；Ｍｏｒｅｓｏ ｅｔ ａｌ．，２００４．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．７８（７）：１０６４８；Ｎａｎｋｉｖｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，２００４．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．７８（２）：２４２９；Ｒｕｓｈ ｅｔ ａｌ．，１９９８．Ｊ Ａｍ Ｓｏｃ Ｎｅｐｈｒｏｌ．９（１１）：２１２９３４）。しかし、移植片生検は、リスクを伴う介入である（Ｆｅｒｅｉｒａ ｅｔａｌ．，２００４．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．７７（９）：１４７５６）が、これは、すべての移植施設で実施されているわけではない（ＣｏｕｖｒａｔＤｅｓｖｅｒｇｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，２０１９．ＮｅｐｈｒｏｌＤｉａｌＴｒａｎｓｐｌａｎｔ．３４（４）：７０３７１１；Ｍｅｈｔａ ｅｔ ａｌ．，２０１７．ＣｌｉｎＴｒａｎｓｐｌａｎｔ．３１（５））。臓器生検の結果はまた、特に生検領域が臓器全体の健康状態を表さない場合には、不正確であり得る。
【0004】
１年サーベイランス生検を実施する場合、半数は、正常または正常未満の組織像を示し、ＳＣＲは、症例のわずか２５％を表す（ＣｏｕｖｒａｔＤｅｓｖｅｒｇｎｅｓｅｔａｌ．，２０１９．ＮｅｐｈｒｏｌＤｉａｌＴｒａｎｓｐｌａｎｔ．３４（４）：７０３７１１；Ｌｏｕｐｙｅｔａｌ．，２０１５．ＪＡｍＳｏｃＮｅｐｈｒｏｌ．２６（７）：１７２１３１；Ｎａｎｋｉｖｅｌｌｅｔａｌ．，２００４．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．７８（２）：２４２９）。
【0005】
したがって、初期のＳＣＲを検出するのみでなく、重篤な組織学的病変を有しない大多数の患者に対する侵襲的手順を回避するために、移植片機能の低下がない非侵襲性バイオマーカーが必要とされている。中心生検の習慣に関係なく、そのような非侵襲性バイオマーカーは、サーベイランス生検のニーズを誘導し、患者の管理を改善するためのスクリーニングツールとして使用できる可能性がある（Ｆｒｉｅｄｅｗａｌｄ＆Ａｂｅｃａｓｓｉｓ，２０１９．ＡｍＪＴｒａｎｓｐｌａｎｔ．１９（７）：２１４１２１４２）。
【0006】
血液遺伝子シグネチャなど、ＳＣＲのいくつかのバイオマーカーがこれまでに提唱されている（国際公開第２０１５／１７９７７７号；国際公開第２０１９／２１７９１０号；Ｃｒｅｓｐｏ ｅｔ ａｌ．，２０１７．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．１０１（６）：１４００１４０９；Ｆｒｉｅｄｅｗａｌｄ ｅｔ ａｌ．，２０１９．ＡｍＪＴｒａｎｓｐｌａｎｔ．１９（１）：９８１０９；Ｖａｎ Ｌｏｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１９．ＥＢｉｏＭｅｄｉｃｉｎｅ．４６：４６３４７２；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１９．ＪＡｍＳｏｃＮｅｐｈｒｏｌ．３０（８）：１４８１１４９４）。
【0007】
Ｚｈａｎｇは、移植後３ヶ月で、８９％の陰性適中率および７３％の陽性適中率でＳＣＲおよび急性細胞性拒絶反応を診断できる１７個の遺伝子のシグネチャを公表した（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１９．Ｊ Ａｍ Ｓｏｃ Ｎｅｐｈｒｏｌ．３０（８）：１４８１１４９４）。同様に、５１個の遺伝子のシグネチャは、移植後２４ヶ月でのＳＣＲの同定を可能にする（Ｆｒｉｅｄｅｗａｌｄ ｅｔ ａｌ．，２０１９．Ａｍ Ｊ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．１９（１）：９８１０９）。しかし、これらの研究はいずれも、細胞性拒絶反応および境界領域拒絶反応のみに焦点を当てている。Ｖａｎ Ｌｏｏｎは、抗体媒介拒絶反応のみを診断するための８つの遺伝子のシグネチャについて報告した（Ｖａｎ Ｌｏｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１９．ＥＢｉｏＭｅｄｉｃｉｎｅ．４６：４６３４７２）。最後に、ｋＳｏｒｔ試験の１７個の遺伝子シグネチャもまた、６ヶ月の不顕性ＡＢＭＲ（ｓＡＢＭＲ）を診断するために提唱されている（Ｃｒｅｓｐｏ ｅｔ ａｌ．，２０１７．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．１０１（６）：１４００１４０９）が、１，１３４人の患者の大規模コホートでは検証されなかった（Ｖａｎ Ｌｏｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０２１．Ａｍ Ｊ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．２１（２）：７４０７５０）。したがって、これらのシグネチャはいずれも、現在はまだ日常的に使用されていない。
【0008】
したがって、日常的な方法でＳＣＲを検出することが可能な非侵襲性バイオマーカーの必要性が依然として存在する。
【0009】
ここで、発明者らは、２つの遺伝子、ＴＣＬ１ＡおよびＡＫＲ１Ｃ３が、互いに独立して、ＳＣＲに罹っている患者の特定を可能にすること、およびこれら両方の遺伝子を組み合わせることで、さらに優れた識別が可能になることを示す。本発明者らはさらに、移植後１年でＳＣＲのない患者を特定するための３つの臨床変数（採血前の拒絶反応エピソードの経験、移植片レシピエントの性別、および採血時のシクロスポリンＡ［ＣｓＡ］またはタクロリムスのいずれかの免疫抑制剤の摂取）と組み合わせたＴＣＬ１ＡおよびＡＫＲ１Ｃ３の発現に基づく複合スコアを提唱する。
【発明の概要】
【0010】
本発明は、それを必要とする対象における不顕性腎拒絶反応を診断する方法であって、
ａ）対象から以前に採取されたサンプル中の、ＴＣＬ１ＡおよびＡＫＲ１Ｃ３からなる群から選択される少なくとも１つのバイオマーカーのレベル、量、または濃度を決定するステップと；
ｂ）少なくとも１つのバイオマーカーのレベル、量、または濃度を、少なくとも１人の参照対象において決定された同じ少なくとも１つのバイオマーカーのレベル、量、または濃度と比較するステップであって、
ここで、少なくとも１人の参照対象は：
‐腎移植を受けたことがない対象、
‐不顕性腎拒絶反応に罹っていない腎移植レシピエント、または
‐腎移植前に不顕性腎拒絶反応そのものに関して検査された対象である、ステップと；
ｃ）少なくとも１つのバイオマーカーのレベル、量、または濃度が、少なくとも１人の参照対象において決定された同じ少なくとも１つのバイオマーカーのレベル、量、または濃度よりも統計学的に有意に低い場合、対象が、不顕性腎拒絶反応に罹っていると結論付けるステップとを含む方法に関する。
ａ）対象から以前に採取されたサンプル中の、ＴＣＬ１ＡおよびＡＫＲ１Ｃ３からなる群から選択される少なくとも１つのバイオマーカーのレベル、量、または濃度を決定するステップと；
ｂ）少なくとも１つのバイオマーカーのレベル、量、または濃度を、少なくとも１人の参照対象において決定された同じ少なくとも１つのバイオマーカーのレベル、量、または濃度と比較するステップであって、
ここで、少なくとも１人の参照対象は：
‐腎移植を受けたことがない対象、
‐不顕性腎拒絶反応に罹っていない腎移植レシピエント、または
‐腎移植前に不顕性腎拒絶反応そのものに関して検査された対象である、ステップと；
ｃ）少なくとも１つのバイオマーカーのレベル、量、または濃度が、少なくとも１人の参照対象において決定された同じ少なくとも１つのバイオマーカーのレベル、量、または濃度よりも統計学的に有意に低い場合、対象が、不顕性腎拒絶反応に罹っていると結論付けるステップとを含む方法に関する。
【0011】
いくつかの実施形態では、ステップａ）は、ＣＤ４０、ＣＴＬＡ４、ＩＤ３、および／またはＭＺＢ１のレベル、量、または濃度を決定することを含まない。いくつかの実施形態では、ステップａ）は、ＴＣＬ１Ａおよび／またはＡＫＲ１Ｃ３以外のバイオマーカーのレベル、量、または濃度を決定することを含まない。
【0012】
いくつかの実施形態では、ステップａ）は、対象から以前に採取されたサンプル中のＴＣＬ１Ａのレベル、量、または濃度を決定することを含む。いくつかの実施形態では、ステップａ）は、対象から以前に採取されたサンプル中のＡＫＲ１Ｃ３のレベル、量、または濃度を決定することを含む。いくつかの実施形態では、ステップａ）は、対象から以前に採取されたサンプル中のＴＣＬ１ＡおよびＡＫＲ１Ｃ３の両方のレベル、量、または濃度を決定することを含む。
【0013】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのバイオマーカーのレベル、量、または濃度は、絶対的または相対的なレベル、量、または濃度に関して表される；好ましくは、１つまたはいくつかの参照マーカーのレベル、量、または濃度に対して正規化された相対レベル、量、または濃度に関して表される。
【0014】
いくつかの実施形態では、方法は、
ａ）ＴＣＬ１ＡおよびＡＫＲ１Ｃ３からなる群から選択される少なくとも１つのバイオマーカー、好ましくはＴＣＬ１ＡおよびＡＫＲ１Ｃ３の両方のレベル、量、または濃度によって複合スコアを決定するステップであって、複合スコアが、式（１）を使用して確立される：
（式中：
「βｉ」は、少なくとも１つのバイオマーカーのそれぞれのレベル、量、または濃度の回帰係数を表す；
「Ｘｉ」は、少なくとも１つのバイオマーカーのそれぞれのレベル、量、または濃度の予測変数を表す；
「β０」は、方程式の切片を表す）；ステップと；
ｂ）複合スコアを、少なくとも１人の参照対象において決定された参照複合スコアと比較するステップと；
ｃ）複合スコアが、少なくとも１人の参照対象において決定された参照複合スコアより実質的に高い場合、対象が不顕性腎拒絶反応に罹っていると結論付けるステップとを含む。
ａ）ＴＣＬ１ＡおよびＡＫＲ１Ｃ３からなる群から選択される少なくとも１つのバイオマーカー、好ましくはＴＣＬ１ＡおよびＡＫＲ１Ｃ３の両方のレベル、量、または濃度によって複合スコアを決定するステップであって、複合スコアが、式（１）を使用して確立される：
【数1】
「βｉ」は、少なくとも１つのバイオマーカーのそれぞれのレベル、量、または濃度の回帰係数を表す；
「Ｘｉ」は、少なくとも１つのバイオマーカーのそれぞれのレベル、量、または濃度の予測変数を表す；
「β０」は、方程式の切片を表す）；ステップと；
ｂ）複合スコアを、少なくとも１人の参照対象において決定された参照複合スコアと比較するステップと；
ｃ）複合スコアが、少なくとも１人の参照対象において決定された参照複合スコアより実質的に高い場合、対象が不顕性腎拒絶反応に罹っていると結論付けるステップとを含む。
【0015】
いくつかの実施形態では、方法は、
ａ）
‐ＴＣＬ１ＡおよびＡＫＲ１Ｃ３からなる群、好ましくはＴＣＬ１ＡおよびＡＫＲ１Ｃ３の両方からなる群から選択される少なくとも１つのバイオマーカーのレベル、量、または濃度；ならびに
‐
・採血前の拒絶反応エピソードの経験、
・レシピエントの性別、および
・採血時の免疫抑制剤（ＩＳ）の摂取、好ましくは採血時のタクロリムスまたはシクロスポリンＡ（ＣｓＡ）の摂取；
から選択される１つ、２つ、または好ましくは３つの臨床パラメータによって複合スコアを決定するステップであって：
複合スコアが、式（２）を使用して確立される：
（式中：
「βＴＣＬ１Ａ」、「βＡＫＲ１Ｃ３」、「β以前の拒絶反応エピソード」、「βＩＳの摂取」、および「βレシピエントの性別」は、バイオマーカーのレベル、量、または濃度と臨床パラメータにおける各予測子の回帰係数を表す；
「以前の拒絶反応エピソード」は、採血前の拒絶反応エピソードの経験を定義する予測変数を表し、０＝「以前の拒絶反応エピソードなし」、１＝「以前の拒絶反応エピソードが１つまたは複数ある」である；
「ＩＳの摂取」は、採血時の免疫抑制剤（ＩＳ）の摂取、好ましくはタクロリムスまたはシクロスポリンＡ（ＣｓＡ）の摂取を定義する予測変数を表し、０＝「ＣｓＡの摂取なし」または「タクロリムスの摂取」、１＝「ＣｓＡの摂取」または「タクロリムスの摂取なし」である；
「レシピエントの性別」は、移植レシピエントの性別を定義する予測変数を表し、０＝「女性」、１＝「男性」である；
「Ｅｘｐｒ（ＴＣＬ１Ａ）」および「Ｅｘｐｒ（ＡＫＲ１Ｃ３）」は、それぞれＴＣＬ１ＡおよびＡＫＲ１Ｃ３のレベル、量、または濃度を定義する予測変数を表す；
「β０」は、方程式の切片を表す）；ステップと；
ｂ）複合スコアを、少なくとも１人の参照対象において決定された参照複合スコアと比較するステップと；
ｃ）複合スコアが、少なくとも１人の参照対象において決定された参照複合スコアより実質的に高い場合、対象が不顕性腎拒絶反応に罹っていると結論付けるステップと、を含む。
ａ）
‐ＴＣＬ１ＡおよびＡＫＲ１Ｃ３からなる群、好ましくはＴＣＬ１ＡおよびＡＫＲ１Ｃ３の両方からなる群から選択される少なくとも１つのバイオマーカーのレベル、量、または濃度；ならびに
‐
・採血前の拒絶反応エピソードの経験、
・レシピエントの性別、および
・採血時の免疫抑制剤（ＩＳ）の摂取、好ましくは採血時のタクロリムスまたはシクロスポリンＡ（ＣｓＡ）の摂取；
から選択される１つ、２つ、または好ましくは３つの臨床パラメータによって複合スコアを決定するステップであって：
複合スコアが、式（２）を使用して確立される：
【数2】
「βＴＣＬ１Ａ」、「βＡＫＲ１Ｃ３」、「β以前の拒絶反応エピソード」、「βＩＳの摂取」、および「βレシピエントの性別」は、バイオマーカーのレベル、量、または濃度と臨床パラメータにおける各予測子の回帰係数を表す；
「以前の拒絶反応エピソード」は、採血前の拒絶反応エピソードの経験を定義する予測変数を表し、０＝「以前の拒絶反応エピソードなし」、１＝「以前の拒絶反応エピソードが１つまたは複数ある」である；
「ＩＳの摂取」は、採血時の免疫抑制剤（ＩＳ）の摂取、好ましくはタクロリムスまたはシクロスポリンＡ（ＣｓＡ）の摂取を定義する予測変数を表し、０＝「ＣｓＡの摂取なし」または「タクロリムスの摂取」、１＝「ＣｓＡの摂取」または「タクロリムスの摂取なし」である；
「レシピエントの性別」は、移植レシピエントの性別を定義する予測変数を表し、０＝「女性」、１＝「男性」である；
「Ｅｘｐｒ（ＴＣＬ１Ａ）」および「Ｅｘｐｒ（ＡＫＲ１Ｃ３）」は、それぞれＴＣＬ１ＡおよびＡＫＲ１Ｃ３のレベル、量、または濃度を定義する予測変数を表す；
「β０」は、方程式の切片を表す）；ステップと；
ｂ）複合スコアを、少なくとも１人の参照対象において決定された参照複合スコアと比較するステップと；
ｃ）複合スコアが、少なくとも１人の参照対象において決定された参照複合スコアより実質的に高い場合、対象が不顕性腎拒絶反応に罹っていると結論付けるステップと、を含む。
【0016】
本実施形態において、採血時の免疫抑制剤（ＩＳ）の摂取は、採血時のタクロリムスの摂取であってもよく、または採血時のシクロスポリンＡ（ＣｓＡ）の摂取であってもよい。
【0017】
この実施形態では、複合スコアは：
‐ＴＣＬ１ＡおよびＡＫＲ１Ｃ３の両方のレベル、量、または濃度、および
‐以下の３つの臨床パラメータ：（ｉ）採血前の拒絶反応エピソードの経験、（ｉｉ）レシピエントの性別、および（ｉｉｉ）採血時のシクロスポリンＡ（ＣｓＡ）の摂取
によって決定され得る。
‐ＴＣＬ１ＡおよびＡＫＲ１Ｃ３の両方のレベル、量、または濃度、および
‐以下の３つの臨床パラメータ：（ｉ）採血前の拒絶反応エピソードの経験、（ｉｉ）レシピエントの性別、および（ｉｉｉ）採血時のシクロスポリンＡ（ＣｓＡ）の摂取
によって決定され得る。
【0018】
この実施形態では、不顕性腎拒絶反応は、不顕性Ｔ細胞媒介腎拒絶反応（ｓＴＣＭＲ）、不顕性抗体媒介腎拒絶反応（ｓＡＢＭＲ）および／またはｓＴＣＭＲ／ｓＡＢＭＲ混合型である。
【0019】
いくつかの実施形態では、方法は、
ａ）
‐ＴＣＬ１ＡおよびＡＫＲ１Ｃ３からなる群、好ましくはＴＣＬ１ＡおよびＡＫＲ１Ｃ３の両方からなる群から選択される少なくとも１つのバイオマーカーのレベル、量、または濃度；ならびに
‐
・採血前の拒絶反応エピソードの経験、
・レシピエントの性別、
・同種移植ランク、および
・ドナーとレシピエントのＨＬＡ不一致の数
から選択される１つ、２つ、３つ、または好ましくは４つの臨床パラメータによって複合スコアを決定するステップであって：
複合スコアが、式（３）を使用して確立される：
（式中：
「βＴＣＬ１Ａ」、「βＡＫＲ１Ｃ３」、「β以前の拒絶反応エピソード」、「β同種移植ランク」、「βＨＬＡ不一致」および「βレシピエントの性別」は、バイオマーカーのレベル、量、または濃度と臨床パラメータにおける各予測子の回帰係数を表す；
「以前の拒絶反応エピソード」は、採血前の拒絶反応エピソードの経験を定義する予測変数を表し、０＝「以前の拒絶反応エピソードなし」、１＝「以前の拒絶反応エピソードが１つまたは複数ある」である；
「同種移植ランク」は、以前の移植の発生を定義する予測変数を表し、０＝「以前の移植なし」、１＝「１回または複数回の以前の移植あり」である；
「ＨＬＡ不一致」は、ドナーとレシピエントのＨＬＡ不一致の発生を定義する予測変数を表し、０＝「ＨＬＡ－Ａ、－Ｂ、および／または－ＤＲ不一致が３つ以下」、１＝「ＨＬＡ－Ａ、－Ｂ、および／または－ＤＲ不一致が厳密に３つを超える」である；
「レシピエントの性別」は、移植レシピエントの性別を定義する予測変数を表し、０＝「女性」、１＝「男性」である；
「Ｅｘｐｒ（ＴＣＬ１Ａ）」および「Ｅｘｐｒ（ＡＫＲ１Ｃ３）」は、それぞれＴＣＬ１ＡおよびＡＫＲ１Ｃ３のレベル、量、または濃度を定義する予測変数を表す；
「β０」は、方程式の切片を表す）；ステップと；
ｂ）複合スコアを、少なくとも１人の参照対象において決定された参照複合スコアと比較するステップと；
ｃ）複合スコアが、少なくとも１人の参照対象において決定された参照複合スコアより実質的に高い場合、対象が不顕性腎拒絶反応に罹っていると結論付けるステップと、を含む。
ａ）
‐ＴＣＬ１ＡおよびＡＫＲ１Ｃ３からなる群、好ましくはＴＣＬ１ＡおよびＡＫＲ１Ｃ３の両方からなる群から選択される少なくとも１つのバイオマーカーのレベル、量、または濃度；ならびに
‐
・採血前の拒絶反応エピソードの経験、
・レシピエントの性別、
・同種移植ランク、および
・ドナーとレシピエントのＨＬＡ不一致の数
から選択される１つ、２つ、３つ、または好ましくは４つの臨床パラメータによって複合スコアを決定するステップであって：
複合スコアが、式（３）を使用して確立される：
【数3】
「βＴＣＬ１Ａ」、「βＡＫＲ１Ｃ３」、「β以前の拒絶反応エピソード」、「β同種移植ランク」、「βＨＬＡ不一致」および「βレシピエントの性別」は、バイオマーカーのレベル、量、または濃度と臨床パラメータにおける各予測子の回帰係数を表す；
「以前の拒絶反応エピソード」は、採血前の拒絶反応エピソードの経験を定義する予測変数を表し、０＝「以前の拒絶反応エピソードなし」、１＝「以前の拒絶反応エピソードが１つまたは複数ある」である；
「同種移植ランク」は、以前の移植の発生を定義する予測変数を表し、０＝「以前の移植なし」、１＝「１回または複数回の以前の移植あり」である；
「ＨＬＡ不一致」は、ドナーとレシピエントのＨＬＡ不一致の発生を定義する予測変数を表し、０＝「ＨＬＡ－Ａ、－Ｂ、および／または－ＤＲ不一致が３つ以下」、１＝「ＨＬＡ－Ａ、－Ｂ、および／または－ＤＲ不一致が厳密に３つを超える」である；
「レシピエントの性別」は、移植レシピエントの性別を定義する予測変数を表し、０＝「女性」、１＝「男性」である；
「Ｅｘｐｒ（ＴＣＬ１Ａ）」および「Ｅｘｐｒ（ＡＫＲ１Ｃ３）」は、それぞれＴＣＬ１ＡおよびＡＫＲ１Ｃ３のレベル、量、または濃度を定義する予測変数を表す；
「β０」は、方程式の切片を表す）；ステップと；
ｂ）複合スコアを、少なくとも１人の参照対象において決定された参照複合スコアと比較するステップと；
ｃ）複合スコアが、少なくとも１人の参照対象において決定された参照複合スコアより実質的に高い場合、対象が不顕性腎拒絶反応に罹っていると結論付けるステップと、を含む。
【0020】
この実施形態では、不顕性腎拒絶反応は、不顕性抗体媒介腎拒絶反応（ｓＡＢＭＲ）からなる。
【0021】
いくつかの実施形態では、少なくとも１人の参照対象は、２名以上の参照対象を含む参照集団である。
【0022】
いくつかの実施形態では、方法は、コンピュータ実装されている。
【0023】
本発明はまた、それを必要とする対象における不顕性腎拒絶反応を診断するためのコンピュータシステムであって、
ｉ）少なくとも１つのプロセッサと、
ｉｉ）プロセッサによって実行されたときに、プロセッサに：
ａ．ＴＣＬ１ＡおよびＡＫＲ１Ｃ３からなる群から選択される少なくとも１つのバイオマーカーの入力レベル、量、または濃度を受信すること、
ｂ．入力レベル、量、または濃度を分析し、変換して、請求項８に記載の式（１）を使用して確立される複合スコアを導出すること、
ｃ．複合スコアである出力を生成すること、ならびに
ｄ．出力に基づいて、対象が不顕性腎拒絶反応に罹っているか否かの診断を提供することを実行させる、プロセッサによって読み取り可能な少なくとも１つのコードを保存する少なくとも１つの記憶媒体と
を含むコンピュータシステムにも関する。
ｉ）少なくとも１つのプロセッサと、
ｉｉ）プロセッサによって実行されたときに、プロセッサに：
ａ．ＴＣＬ１ＡおよびＡＫＲ１Ｃ３からなる群から選択される少なくとも１つのバイオマーカーの入力レベル、量、または濃度を受信すること、
ｂ．入力レベル、量、または濃度を分析し、変換して、請求項８に記載の式（１）を使用して確立される複合スコアを導出すること、
ｃ．複合スコアである出力を生成すること、ならびに
ｄ．出力に基づいて、対象が不顕性腎拒絶反応に罹っているか否かの診断を提供することを実行させる、プロセッサによって読み取り可能な少なくとも１つのコードを保存する少なくとも１つの記憶媒体と
を含むコンピュータシステムにも関する。
【0024】
いくつかの実施形態では、プロセッサによって読み取り可能な少なくとも１つのコードは、プロセッサによって実行されたときに、プロセッサに：
ａ．ＴＣＬ１ＡおよびＡＫＲ１Ｃ３からなる群から選択される少なくとも１つのバイオマーカーの入力レベル、量、または濃度を受信し、以下：
（ｉ）採血前の拒絶反応エピソードの経験、
（ｉｉ）レシピエントの性別、および
（ｉｉｉ）採血時の免疫抑制剤（ＩＳ）の摂取、好ましくは採血時のタクロリムスまたはシクロスポリンＡ（ＣｓＡ）の摂取から選択される１つ、２つ、または好ましくは３つの臨床パラメータの値を入力すること、
ｂ．入力レベル、量、または濃度、および入力値を分析し、変換して、請求項９に定義される式（２）を使用して確立された複合スコアを導出すること、
ｃ．複合スコアである出力を生成すること、ならびに
ｄ．出力に基づいて、対象が不顕性腎拒絶反応に罹っているか否かの診断を提供することを実行させる。
ａ．ＴＣＬ１ＡおよびＡＫＲ１Ｃ３からなる群から選択される少なくとも１つのバイオマーカーの入力レベル、量、または濃度を受信し、以下：
（ｉ）採血前の拒絶反応エピソードの経験、
（ｉｉ）レシピエントの性別、および
（ｉｉｉ）採血時の免疫抑制剤（ＩＳ）の摂取、好ましくは採血時のタクロリムスまたはシクロスポリンＡ（ＣｓＡ）の摂取から選択される１つ、２つ、または好ましくは３つの臨床パラメータの値を入力すること、
ｂ．入力レベル、量、または濃度、および入力値を分析し、変換して、請求項９に定義される式（２）を使用して確立された複合スコアを導出すること、
ｃ．複合スコアである出力を生成すること、ならびに
ｄ．出力に基づいて、対象が不顕性腎拒絶反応に罹っているか否かの診断を提供することを実行させる。
【0025】
この実施形態では、採血時の免疫抑制剤（ＩＳ）の摂取は、採血時のタクロリムスの摂取であってもよく、または採血時のシクロスポリンＡ（ＣｓＡ）の摂取であってもよい。
【0026】
この実施形態では、不顕性腎拒絶反応は、不顕性Ｔ細胞媒介腎拒絶反応（ｓＴＣＭＲ）、不顕性抗体媒介腎拒絶反応（ｓＡＢＭＲ）および／またはｓＴＣＭＲ／ｓＡＢＭＲ混合型である。
【0027】
いくつかの実施形態では、プロセッサによって読み取り可能な少なくとも１つのコードは、プロセッサによって実行されたときに、プロセッサに：
ａ．ＴＣＬ１ＡおよびＡＫＲ１Ｃ３からなる群から選択される少なくとも１つのバイオマーカーの入力レベル、量、または濃度を受信し、
（ｉ）採血前の拒絶反応エピソードの経験、
（ｉｉ）レシピエントの性別、
（ｉｉｉ）以前の移植、および
（ｉｖ）ドナーとレシピエントのＨＬＡ不一致の数から選択される１つ、２つ、３つ、または好ましくは４つの臨床パラメータの値を入力すること、
ｂ．入力レベル、量、または濃度、および入力値を分析し、変換して、請求項１４に定義される式（３）を使用して確立された複合スコアを導出すること、
ｃ．複合スコアである出力を生成すること、ならびに
ｄ．出力に基づいて、対象が不顕性腎拒絶反応に罹っているか否かの診断を提供することを実行させる。
ａ．ＴＣＬ１ＡおよびＡＫＲ１Ｃ３からなる群から選択される少なくとも１つのバイオマーカーの入力レベル、量、または濃度を受信し、
（ｉ）採血前の拒絶反応エピソードの経験、
（ｉｉ）レシピエントの性別、
（ｉｉｉ）以前の移植、および
（ｉｖ）ドナーとレシピエントのＨＬＡ不一致の数から選択される１つ、２つ、３つ、または好ましくは４つの臨床パラメータの値を入力すること、
ｂ．入力レベル、量、または濃度、および入力値を分析し、変換して、請求項１４に定義される式（３）を使用して確立された複合スコアを導出すること、
ｃ．複合スコアである出力を生成すること、ならびに
ｄ．出力に基づいて、対象が不顕性腎拒絶反応に罹っているか否かの診断を提供することを実行させる。
【0028】
この実施形態では、不顕性腎拒絶反応は、不顕性抗体媒介腎拒絶反応（ｓＡＢＭＲ）からなる。
【0029】
いくつかの実施形態では、対象は、出力が、少なくとも１人の参照対象において得られる同じ出力よりも実質的に高い場合に、不顕性腎拒絶反応に罹っていると診断され、ここで、参照対象は、腎移植を受けていない対象、不顕性拒絶反応に罹っていない腎移植レシピエント、腎移植前に不顕性拒絶反応そのものについて検査された対象である。
【0030】
本発明はまた、プロセッサによって実行されたときに、本明細書に開示される不顕性腎拒絶反応を診断するコンピュータ実装方法を実行するように適合させたプロセッサによって読み取り可能なソフトウェアコードを含むコンピュータプログラムにも関する。
【0031】
本発明はまた、コンピュータによって実行されたときに、本明細書に開示される不顕性腎拒絶反応を診断するコンピュータ実装方法をプロセッサに実施させるコードを含む非一時的コンピュータ可読記憶媒体にも関する。
【0032】
本発明はまた、本明細書に開示される不顕性腎拒絶反応を診断する方法を実施するための部品キットにも関し、本部品キットは、ＴＣＬ１ＡおよびＡＫＲ１Ｃ３からなる群から選択される少なくとも１つのバイオマーカーのレベル、量、または濃度を決定するための手段、および任意により、少なくとも１つの参照マーカーのレベル、量、または濃度を決定するための手段、および方法を実施するための使用説明書を含む。
【0033】
いくつかの実施形態では、本手段は、核酸プローブ、抗体、およびアプタマーからなる群から選択される。
【0034】
定義
本発明において、以下の用語は、以下の意味を有する：
本発明において、以下の用語は、以下の意味を有する：
【0035】
「ＡＫＲ１Ｃ３」は、アルドケトレダクターゼファミリー１メンバーのＣ３タンパク質をコードする遺伝子を指す。天然に存在するヒトＡＫＲ１Ｃ３遺伝子は、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００１２５３９０８（２０２１年５月９日のバージョン２）に示されるヌクレオチド配列を有し、天然に存在するヒトアルドケトレダクターゼファミリー１メンバーＣ３タンパク質は、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００１２４０８３７（２０２１年５月９日のバージョン１）またはＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ４２３３０（２０１０年１０月５日のバージョン４）に示されるアミノ酸配列を有する。
【0036】
「ＴＣＬ１Ａ」は、Ｔ細胞白血病／リンパ腫タンパク質１Ａをコードする遺伝子を指す。天然に存在するヒトＴＣＬ１Ａ遺伝子は、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００１０９８７２５（２０２１年４月１８日のバージョン２）に示されるヌクレオチド配列を有し、天然に存在するヒトＴ細胞細胞白血病／リンパ腫タンパク質１Ａは、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００１０９２１９５（２０２１年４月１８日のバージョン１）またはＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ５６２７９（１９９８年７月１５日のバージョン１）に示されるアミノ酸配列を有する。
【0037】
「生物学的サンプル」とは、血液サンプル、血清サンプル、血漿サンプル、尿サンプル、リンパサンプル、または生検などの、対象、好ましくは移植対象から得られる任意のサンプルを指す。
【0038】
「免疫抑制療法」または「免疫抑制処置」とは、移植対象への１つ以上の免疫抑制薬（または免疫抑制剤）の投与を指す。移植処置で使用され得る免疫抑制薬としては、薬物および他の医療製品の分類のために世界保健機関（ＷＨＯ）によって開発された解剖学的治療化学分類システム（ＡＴＣ／ＤＤＤインデックス２０２１）の治療サブグループＬ０４に記載されているすべての薬物が挙げられる。これらは、参照により本明細書に組み込まれる。さらなる例としては、これらに限定されないが、以下が挙げられる：プリン合成阻害剤（アザチオプリン、ミコフェノール酸、ミコフェノール酸モフェチル）、ピリミジン合成阻害剤（例えば、レフルノミド、テリフルノミド）、葉酸拮抗薬（例えば、メトトレキサート）、タクロリムス、シクロスポリン、ピメクロリムス、ボクロスポリン、アベティマス、グスペリムス、免疫調節イミド薬 （例えば、レナリドマイド、ポマリドミド、サリドマイド、アプレミラスト）、ＩＬ１受容体アンタゴニスト（例えば、アナキンラ）、ｍＴＯＲ阻害剤（例えば、シロリムス、エベロリムス、リダフォロリムス、テムシロリムス、ウミロリムス、ゾタロリムス）、抗補体成分５抗体（例えば、エクリズマブ）、抗ＴＮＦ抗体（例えば、アダリムマブ、アフェリモマブ、セルトリズマブペゴル、ゴリムマブ、インフリキシマブ、ネレリモマブ）、ＴＮＦ阻害剤（例えば、エタネルセプト、ペグスネルセプト）、抗インターロイキン５抗体（例えば、メポリズマブ）、ＶＥＧＦ阻害剤（例えば、アフリベルセプト）、抗免疫グロブリンＥ抗体（例えば、オマリズマブ）、抗インターフェロン抗体（例えば、ファラリモマブ）、抗インターロイキン６抗体（例えば、クラザキズマブ、エルシリモマブ、フィルゴチニブ）、抗インターロイキン１２および／またはインターロイキン２３抗体（例えば、レブリキズマブ、ウステキヌマブ）、抗インターロイキン１７Ａ抗体（例えば、セクキヌマブ）、インターロイキン１阻害剤（例えば、リロナセプト）、抗ＣＤ３抗体（例えば、ムロモナブＣＤ３、オテリキシズマブ、テプリズマブ、ビシリズマブ）、抗ＣＤ４抗体（例えば、クレノリキシマブ、ケリキシマブ、ザノリムマブ）、抗ＣＤ１１ａ抗体（例えば、エファリズマブ）、抗ＣＤ１８抗体（例えば、エルリズマブ（ｅｒｌｉｚｕｍａｂ））、抗ＣＤ２０抗体（例えば、オビヌツズマブ、リツキシマブ、オクレリズマブ、パスコリズマブ）、抗ＣＤ２３抗体（例えば、ゴミリキシマブ、ルミリキシマブ）、抗ＣＤ４０抗体（例えば、テネリキシマブ、トラリズマブ）、抗ＣＤ６２Ｌ／Ｌセレクチン抗体（例えば、アセリズマブ）、抗ＣＤ８０抗体（例えば、ガリキシマブ）、抗ＣＤ１４７抗体（例えば、ｇａｖｉｌｉｍｏｍａｂ）、抗ＣＤ１５４抗体（例えば、ルプリズマブ（ｒｕｐｌｉｚｕｍａｂ））、抗ＢＬｙＳ抗体（例えば、ベリムマブ、ブリシビモド）、抗ＣＴＬＡ４抗体（例えば、アバタセプト）、ＣＴＬＡ４融合タンパク質（例えば、アバタセプト、ベラタセプト）、抗ＣＡＴ抗体（例えば、ベルティリムマブ（ｂｅｒｔｉｌｉｍｕｍａｂ）、レルデリムマブ（ｌｅｒｄｅｌｉｍｕｍａｂ）、メテリムマブ）、抗インテグリン抗体（例えば、ナタリズマブ、ベドリズマブ）、抗インターロイキン６受容体抗体（例えば、トシリズマブ）、抗ＬＦＡ１抗体（例えば、オデュリモマブ）、抗インターロイキン２受容体抗体（例えば、バシリキシマブ、ダクリズマブ、イノリモマブ）、抗ＣＤ５抗体（例えば、ゾリモマブ・アリトックス（ｚｏｌｉｍｏｍａｂ ａｒｉｔｏｘ））、ポリクローナル抗体の注入（例えば、抗胸腺細胞グロブリン、抗リンパ球グロブリン）、および他のモノクローナル抗体、例えば、アトロリムマブ、セデリズマブ、フォントリズマブ、マスリマブ（ｍａｓｌｉｍｏｍａｂ）、モロリムマブ（ｍｏｒｏｌｉｍｕｍａｂ）、ペキセリズマブ、レスリズマブ、ロベリズマブ、シプリズマブ、タリズマブ、テリモマブアリトックス（ｔｅｌｉｍｏｍａｂ ａｒｉｔｏｘ）、バパリキシマブ（ｖａｐａｌｉｘｉｍａｂ）、ベパリモマブ。これらの薬物は、単独療法または併用療法において使用され得る。
【0039】
「臓器移植」とは、疾患臓器、臓器の一部、組織を健康な臓器または組織に置き換える処置を指す。移植される臓器または組織は、対象自身（「自家移植片」と称する）、別のヒトのドナー（「同種移植片」と称される）、または動物（その後、「異種移植片」と称する）から得ることができる。移植される臓器は、人工または天然、全体（腎臓、心臓、および肝臓など）または部分的（心臓弁、皮膚、および骨など）であってもよい。
【0040】
「不顕性（腎）拒絶反応」または「ＳＣＲ」とは、バンフ分類に従って組織学的に定義された腎移植片の病変を指し、典型的には、移植後のフォローアップ中のサーベイランス生検によって特定される（リスクを伴う介入であり、すべての移植施設で実施されるわけではない）が、腎移植片の機能の悪化を伴わない（ベースライン値の１０％、２０％、または２５％を超えない血清中クレアチニンレベルとして変動可能に定義される、すなわち、成人男性では約０．６～約１．２ｍｇ／ｄＬ、成人女性では約０．５～１．１ｍｇ／ｄＬの範囲の血清中クレアチニンレベルを有するが、腎移植レシピエントは、典型的には、成人男性では約１．０～約１．９ｍｇ／ｄＬであり、女性対象では約０．８～約１．５ｍｇ／ｄＬの範囲の血清中クレアチニンレベルを有する）。これは、上記で定義したベースライン値の１０％、２０％、または２５％を超える血清中クレアチニンの上昇によって測定される機能的腎障害を特徴とする急性または慢性拒絶反応とは臨床的に異なる。ＳＣＲは２つのカテゴリーに分類できる：１つは主に、ドナー抗原に対して特異的に活性化され、移植された臓器に直接浸潤し、攻撃し、および損傷させるようになる細胞傷害性Ｔリンパ球による細胞応答である「不顕性Ｔ細胞媒介拒絶反応」または「ｓＴＣＭＲ」である。もう１つは、液性応答液性であり、臓器レシピエントの免疫系により、ドナー臓器に対するドナー特異的抗体（ＤＳＡ）を生じ、これにより、移植された臓器に対する免疫攻撃および傷害である「不顕性抗体媒介拒絶反応」または「ｓＡＢＭＲ」をもたらす。これら２つの免疫機構は、共存することもあり、その場合「ｓＴＣＭＲおよびｓＡＢＭＲ混合型」または「混合型ＳＣＲ」と称される。
【0041】
「対象」とは、これらに限定されないが、ヒト、ヒト霊長類（例えば、チンパンジー、他の類人猿およびサル種など）、家畜（例えば、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、およびブタなど）、飼育動物（ｄｏｍｅｓｔｉｃ ａｎｉｍａｌ）（例えば、ウサギ、イヌ、およびネコ）、実験動物（例えば、ラット、マウスおよびモルモットなど）などの任意の哺乳動物を指す。この用語は、特に明記されない限り、特定の年齢または性別を示すものではない。特に、対象は、ヒトであり、「患者」とも呼ばれる。特定の実施形態では、対象は、移植された対象であり、「グラフトまたは移植組織レシピエント」または「グラフトまたは移植された対象」とも呼ばれる。
【0042】
「移植された対象」（または「グラフトもしくは移植組織レシピエント」または「グラフトされた対象」）は、臓器移植を受けた対象を指す。
【発明を実施するための形態】
【0043】
本発明は、それを必要とする対象における不顕性拒絶反応を診断する方法に関する。
【0044】
用語「診断」およびその語形変化は、対象が所与の疾患または状態に罹っているか否かを推定もしくは決定すること、または所与の疾患もしくは状態の重症度（例えば、不顕性拒絶反応）を推定または決定することを指す。診断には、特定の疾患の有無を１００％の精度で判断する能力は必要なく、さらには、特定の経過または結果が発生する可能性が、発生しない場合よりも高いということさえも必要ない。代わりに、「診断」は、対象が特定の疾患または状態に罹っていない確率と比較して、対象が特定の疾患または状態に罹っている確率が上昇していることを指す。
【0045】
一実施形態では、対象は、哺乳動物である。特定の実施形態では、対象は、ヒトである。
【0046】
一実施形態では、対象は、移植された対象である。特定の実施形態では、対象は、腎移植レシピエントである。一実施形態では、腎移植レシピエントはさらに、腎ドナーの膵臓および／または十二指腸の一部をグラフトされていてもよい。
【0047】
一実施形態では、対象は、本発明の方法を実施する約１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、６ヶ月、９ヶ月または１年前に腎臓をグラフトされた。
【0048】
一実施形態では、対象は、免疫抑制療法を受けている、すなわち、対象は、１つ以上の免疫抑制薬を投与されている。
【0049】
一実施形態では、対象は、腎移植片の機能悪化を示さない。一実施形態では、対象の血清中クレアチニンレベルは、３ｍｇ／ｄＬ未満、２．５ｍｇ／ｄＬ未満、２ｍｇ／ｄＬ未満である。一実施形態では、対象の血清中クレアチニンレベルは、約０．５～約２．０ｍｇ／ｄＬの範囲である。
【0050】
一実施形態では、対象は、急性拒絶反応に罹っていない。
【0051】
一実施形態では、対象は、臨床的免疫寛容である腎移植レシピエントである。一実施形態では、対象は、臨床的免疫寛容である腎移植レシピエントである。腎移植レシピエントが臨床的免疫寛容であるか否かを決定する手段および方法は、当技術分野、特に国際公開第２０１８／０１５５５１号またはＤａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１７（Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ．９１（６）：１４７３１４８１）に記載されている。
【0052】
一実施形態では、対象は、不顕性拒絶反応のリスクがある。不顕性拒絶反応のリスク因子の例としては、これらに限定されないが、免疫抑制療法、以前の急性拒絶反応、慢性同種移植片腎症（ＣＡＮ）、組織不適合性、感作の程度、ドナーの年齢などが挙げられる。
【0053】
一実施形態では、方法は、対象からサンプルを提供するステップを含む。
【0054】
「サンプル」という用語は、一般に、バイオマーカーの発現レベルについて試験され得る対象からの任意のサンプルを指す。
【0055】
一実施形態では、サンプルは、身体組織または体液サンプルである。
【0056】
一実施形態では、サンプルは、身体組織サンプルである。対象から採取された身体組織サンプルは、「生検」とも呼ばれる。身体組織の例としては、これらに限定されないが、腎臓、肝臓、筋肉、心臓、肺、膵臓、脾臓、胸腺、食道、胃、腸、脳、神経、精巣、前立腺、卵巣、毛髪、皮膚、骨、乳房、子宮、膀胱、および脊髄が挙げられる。
【0057】
一実施形態では、サンプルは、腎組織サンプルである。
【0058】
一実施形態では、サンプルは、体液である。体液の例としては、これらに限定されないが、血液、血漿、血清、リンパ、腹水、嚢胞液、尿、胆汁、乳頭滲出液、関節液、気管支肺胞洗浄液、喀痰、羊水、腹水、脳脊髄液、胸水、心膜液、精液、唾液、汗、糞便、大便、および肺胞マクロファージが挙げられる。
【0059】
一実施形態では、サンプルは、血液、血漿、および血清を含むかまたはこれらからなる群から選択される体液である。
【0060】
一実施形態では、サンプルは、対象から事前に採取されたものである、すなわち、本発明の方法は、対象からサンプルを採取するステップを含まない。したがって、この実施形態によれば、本発明の方法は、非侵襲的方法または「ｉｎ ｖｉｔｒｏ法」である。
【0061】
一実施形態では、方法は、サンプル中のＴＣＬ１ＡおよびＡＫＲ１Ｃ３を含むかまたはそれらからなる群から選択される少なくとも１つのバイオマーカーのレベル、量、または濃度を決定するステップを含む。
【0062】
一実施形態では、方法は、サンプル中のＴＣＬ１Ａのレベル、量、または濃度を決定するステップを含む。
【0063】
一実施形態では、方法は、サンプル中のＡＫＲ１Ｃ３のレベル、量、または濃度を決定するステップを含む。
【0064】
一実施形態では、方法は、サンプル中のＴＣＬ１ＡおよびＡＫＲ１Ｃ３のレベル、量、または濃度を決定するステップを含む。
【0065】
一実施形態では、方法は、サンプル中のＴＣＬ１ＡおよびＡＫＲ１Ｃ３を含むかまたはそれらからなる群から選択される最大２つのバイオマーカーのレベル、量、または濃度を決定するステップを含む。したがって、一実施形態では、方法は、サンプル中のＴＣＬ１Ａおよび／またはＡＫＲ１Ｃ３以外のバイオマーカーのレベル、量、または濃度を決定することを含まない。特に、方法は、ＣＤ４０、ＣＴＬＡ４、ＩＤ３、およびＭＺＢ１のいずれかのレベル、量、または濃度を決定することを含まない。
【0066】
一実施形態では、レベル、量、または濃度は、少なくとも１つのバイオマーカーの転写レベル（すなわち、ｍＲＮＡの発現）または翻訳レベル（すなわち、対応するタンパク質の発現）に対応する。
【0067】
一実施形態では、少なくとも１つのバイオマーカーのレベル、量、または濃度は、ＲＮＡレベル、すなわち転写レベルで決定される。バイオマーカーの転写レベルを決定する方法は、当技術分野で周知である。このような方法の例としては、これらに限定されないが、リアルタイム定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）、ＲＴ ＰＣＲ、ＲＴ ｑＰＣＲ、ハイブリダイゼーション技術（例えば、マイクロアレイ、ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ（登録商標）法などを使用して）、ノーザンブロット、およびそれらの組み合わせ、例えば、これに限定されないが、ＲＴＰＣＲによって得られたアンプリコンのハイブリダイゼーション、シーケンシング（例えば、次世代ＤＮＡシーケンシングまたは「全トランスクリプトームショットガンシークエンシング」などとしても知られるＲＮＡｓｅｑ）などが挙げられる。
【0068】
一実施形態では、少なくとも１つのバイオマーカーのレベル、量、または濃度は、タンパク質レベル、すなわち翻訳レベルで決定される。バイオマーカーの翻訳レベルを決定するための方法は、当技術分野で周知である。このような方法の例としては、これらに限定されないが、免疫組織化学、マルチプレックス法（Ｌｕｍｉｎｅｘ）、ウエスタンブロット、酵素免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、サンドイッチＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー、蛍光連結免疫吸着検定法（ＦＬＩＳＡ）、酵素免疫検定法（ＥＩＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、質量分析法（例えば、タンデム質量分析法［ＭＳ／ＭＳ］）、クロマトグラフィー質量分析法およびそれらの組み合わせ）などが挙げられる。
【0069】
一実施形態では、レベル、量、または濃度は、絶対的または相対的なレベル、量、または濃度に関して表すことができる。
【0070】
相対レベル、量、または濃度に関して表される場合、レベル、量、または濃度は、１つまたはいくつかの参照マーカーのレベル、量、または濃度に対して正規化される。「参照マーカー」は、「ハウスキーピングマーカー」とも呼ばれ得、少なくとも１つのバイオマーカーのレベル、量、または濃度がＲＮＡレベルで決定される場合は、「ハウスキーピング遺伝子」であり得、または、少なくとも１つのバイオマーカーのレベル、量、または濃度がタンパク質レベルで決定される場合は、「ハウスキーピングタンパク質」であり得る。したがって、「ハウスキーピングマーカー」という用語は、構成的に発現され、基本的な維持および必須の細胞機能に必要な遺伝子またはタンパク質を指す。ハウスキーピングマーカーは通常、細胞または組織依存的で発現されず、ほとんどの場合、所与の生物体内のすべての細胞によって発現される。ハウスキーピングマーカーはまた、比較的安定した、または安定した発現を有し、したがって、それらは、対象のバイオマーカーのレベル、量、または濃度を正規化するための好適なマーカーとして作用する。ハウスキーピングマーカーおよびデータ正規化におけるそれらの使用は、当技術分野で周知である。
【0071】
一実施形態では、方法は、上記に記載のとおり、ＴＣＬ１ＡおよびＡＫＲ１Ｃ３バイオマーカーを含むかまたはそれらからなる群から選択される少なくとも１つのバイオマーカー、好ましくはＴＣＬ１ＡおよびＡＫＲ１Ｃ３バイオマーカーのうちの２つのレベル、量、または濃度によって複合スコアを決定するステップを含む。
【0072】
一実施形態では、複合スコア（以下「ＳＣＲスコア」）は、以下の式（１）を使用して確立される：
（式中：
「βｉ」は、バイオマーカーのレベル、量、または濃度の間の各予測子ｉの回帰係数を表す；
「Ｘｉ」は、バイオマーカーのレベル、量、または濃度の中の各予測子ｉの予測変数（独立変数、ｘ変数、または入力変数とも称される）を表す；
「β０」は、方程式の切片、すなわち予測変数がゼロに等しいときの基準の値を表す）。
【数4】
「βｉ」は、バイオマーカーのレベル、量、または濃度の間の各予測子ｉの回帰係数を表す；
「Ｘｉ」は、バイオマーカーのレベル、量、または濃度の中の各予測子ｉの予測変数（独立変数、ｘ変数、または入力変数とも称される）を表す；
「β０」は、方程式の切片、すなわち予測変数がゼロに等しいときの基準の値を表す）。
【0073】
一実施形態では、各予測子ｉの回帰係数βｉは、次式（４）を使用して確立される：
（式中：
「オッズ比予測子」は、特定の予測子のオッズ比を表す）。
【数5】
「オッズ比予測子」は、特定の予測子のオッズ比を表す）。
【0074】
本明細書で使用する「オッズ比」という用語は、２つの事象の間、特に予測子と所与の疾患または状態、すなわち不顕性拒絶反応との間の関連の強さを指す。換言すれば、オッズ比は、所与の疾患または状態のオッズ、すなわち、予測子の存在下での不顕性拒絶反応と、所与の疾患または状態の非存在下（すなわち、不顕性拒絶反応、またはその逆）での予測子のオッズとの比として定義することができる。オッズ比が１より大きい場合、２つの事象には正の相関がある。逆に、オッズ比が１未満の場合、２つの事象は、負の相関関係にある。
【0075】
オッズ比は、例えば、実施例の節に示すように、所与の疾患または状態、すなわち不顕性拒絶反応の診断を伴う各予測子の単変量または多変量ロジスティック回帰分析によって決定され得る。
【0076】
一実施形態では、オッズ比は、不顕性拒絶反応に罹っている対象のオッズの比であり得る。
【0077】
式（１）を使用して確立されたＳＣＲスコアは、以下の実施例１で実証されるように、概して、不顕性拒絶反応、すなわち、不顕性Ｔ細胞媒介腎拒絶反応（ｓＴＣＭＲ）、不顕性抗体媒介腎拒絶反応（ｓＡＢＭＲ）、および／またはｓＴＣＭＲ／ｓＡＢＭＲ混合型を診断するのに特に好適である。
【0078】
加えてまたはあるいは、方法は、以下によりＳＣＲスコアを決定するステップを含む：
‐上述のように、ＴＣＬ１ＡおよびＡＫＲ１Ｃ３バイオマーカーを含むかまたはそれらからなる群から選択される少なくとも１つのバイオマーカー、好ましくはＴＣＬ１ＡおよびＡＫＲ１Ｃ３バイオマーカーのうちの２つのバイオマーカーのレベル、量、または濃度；
‐１つ、２つ、３つ、または４つの臨床パラメータ、好ましくは３つまたは４つの臨床パラメータ。
‐上述のように、ＴＣＬ１ＡおよびＡＫＲ１Ｃ３バイオマーカーを含むかまたはそれらからなる群から選択される少なくとも１つのバイオマーカー、好ましくはＴＣＬ１ＡおよびＡＫＲ１Ｃ３バイオマーカーのうちの２つのバイオマーカーのレベル、量、または濃度；
‐１つ、２つ、３つ、または４つの臨床パラメータ、好ましくは３つまたは４つの臨床パラメータ。
【0079】
一実施形態では、臨床パラメータは、（ｉ）試験時の腎臓レシピエント対象の年齢、および（ｉｉ）移植時の腎臓レシピエント対象の年齢において選択されない。
【0080】
一実施形態では、臨床パラメータは、以下から選択される：
‐採血前の拒絶反応エピソードの経験（あり／なし）；
‐レシピエントの性別（Ｍ／Ｆ）；
‐採血時の免疫抑制剤（ＩＳ）の摂取（あり／なし）；
‐同種移植ランク、以前の移植の経験とも称される（以前の移植なし／以前の移植が１回またはそれ以上）；および
‐ＨＬＡ－Ａ、－Ｂ、および／または－ＤＲの不一致の数（０～３／＞３）。
‐採血前の拒絶反応エピソードの経験（あり／なし）；
‐レシピエントの性別（Ｍ／Ｆ）；
‐採血時の免疫抑制剤（ＩＳ）の摂取（あり／なし）；
‐同種移植ランク、以前の移植の経験とも称される（以前の移植なし／以前の移植が１回またはそれ以上）；および
‐ＨＬＡ－Ａ、－Ｂ、および／または－ＤＲの不一致の数（０～３／＞３）。
【0081】
一実施形態では、臨床パラメータは、（ｉ）採血前の拒絶反応エピソードの経験（あり／なし）、（ｉｉ）レシピエントの性別（Ｍ／Ｆ）、および（ｉｉｉ）採血時の免疫抑制剤（ＩＳ）の摂取（あり／なし）から選択される。
【0082】
一実施形態では、免疫抑制剤（ＩＳ）の摂取は、タクロリムスの摂取またはシクロスポリンＡ（ＣｓＡ）の摂取である。一実施形態では、免疫抑制剤（ＩＳ）の摂取は、タクロリムスの摂取である。一実施形態では、免疫抑制剤（ＩＳ）の摂取は、シクロスポリンＡ（ＣｓＡ）の摂取である。
【0083】
一実施形態では、ＳＣＲスコアは、上記の式（１）を使用して確立される（式中、
「βｉ」は、バイオマーカーのレベル、量、または濃度と臨床パラメータにおける各予測子ｉの回帰係数を表す；
「Ｘｉ」は、バイオマーカーのレベル、量、または濃度と臨床パラメータにおける各予測子ｉの予測変数を表す；
「β０」は、方程式の切片を表す）。
「βｉ」は、バイオマーカーのレベル、量、または濃度と臨床パラメータにおける各予測子ｉの回帰係数を表す；
「Ｘｉ」は、バイオマーカーのレベル、量、または濃度と臨床パラメータにおける各予測子ｉの予測変数を表す；
「β０」は、方程式の切片を表す）。
【0084】
一実施形態では、ＳＣＲスコアは、次式（２）を使用して確立される：
（式中：
「βＴＣＬ１Ａ」、「βＡＫＲ１Ｃ３」、「β以前の拒絶反応エピソード」、「βＩＳの摂取」、および「βレシピエントの性別」は、バイオマーカーのレベル、量、または濃度と臨床パラメータにおける各予測子の回帰係数を表す；
「以前の拒絶反応エピソード」は、採血前の拒絶反応エピソードの経験を定義する予測変数を表し、０＝以前の拒絶反応エピソードなし、１＝以前の拒絶反応エピソードが少なくとも１つまたは複数ある、である；
「ＩＳの摂取」は、採血時の免疫抑制剤の摂取を定義する予測変数を表す、０＝ＣｓＡの摂取なしまたはタクロリムスの摂取あり、１＝ＣｓＡの摂取ありまたはタクロリムスの摂取なし；
「レシピエントの性別」は、移植レシピエントの性別を定義する予測変数を表し、０＝「女性」、１＝「男性」である；
「Ｅｘｐｒ（ＴＣＬ１Ａ）」および「Ｅｘｐｒ（ＡＫＲ１Ｃ３）」は、それぞれＴＣＬ１ＡおよびＡＫＲ１Ｃ３のレベル、量、または濃度を定義する予測変数を表す；
「β０」は、方程式の切片、すなわち予測変数がゼロに等しいときの基準の値を表す）。
【数6】
「βＴＣＬ１Ａ」、「βＡＫＲ１Ｃ３」、「β以前の拒絶反応エピソード」、「βＩＳの摂取」、および「βレシピエントの性別」は、バイオマーカーのレベル、量、または濃度と臨床パラメータにおける各予測子の回帰係数を表す；
「以前の拒絶反応エピソード」は、採血前の拒絶反応エピソードの経験を定義する予測変数を表し、０＝以前の拒絶反応エピソードなし、１＝以前の拒絶反応エピソードが少なくとも１つまたは複数ある、である；
「ＩＳの摂取」は、採血時の免疫抑制剤の摂取を定義する予測変数を表す、０＝ＣｓＡの摂取なしまたはタクロリムスの摂取あり、１＝ＣｓＡの摂取ありまたはタクロリムスの摂取なし；
「レシピエントの性別」は、移植レシピエントの性別を定義する予測変数を表し、０＝「女性」、１＝「男性」である；
「Ｅｘｐｒ（ＴＣＬ１Ａ）」および「Ｅｘｐｒ（ＡＫＲ１Ｃ３）」は、それぞれＴＣＬ１ＡおよびＡＫＲ１Ｃ３のレベル、量、または濃度を定義する予測変数を表す；
「β０」は、方程式の切片、すなわち予測変数がゼロに等しいときの基準の値を表す）。
【0085】
一実施形態では、免疫抑制剤（ＩＳ）の摂取は、タクロリムスの摂取であり、式（２）は、以下のように読む：
（式中：
「βタクロリムスの摂取」は、予測子「採血時のタクロリムスの摂取」の回帰係数を表す；
「タクロリムスの摂取」は、採血時のタクロリムスの摂取を定義する予測変数を表し、０＝タクロリムスの摂取あり、１＝タクロリムスの摂取なしである）。
【数7】
「βタクロリムスの摂取」は、予測子「採血時のタクロリムスの摂取」の回帰係数を表す；
「タクロリムスの摂取」は、採血時のタクロリムスの摂取を定義する予測変数を表し、０＝タクロリムスの摂取あり、１＝タクロリムスの摂取なしである）。
【0086】
一実施形態では、免疫抑制剤（ＩＳ）の摂取は、シクロスポリンＡ（ＣｓＡ）の摂取であり、式（２）は、次のように読む：
（式中：
「βＣｓＡの摂取」は、予測子「採血時のＣｓＡの摂取」の回帰係数を表す；
「ＣｓＡの摂取」は、採血時のシクロスポリンＡの摂取を定義する予測変数を表し、０＝ＣｓＡの摂取なし、１＝ＣｓＡの摂取である）。
【数8】
「βＣｓＡの摂取」は、予測子「採血時のＣｓＡの摂取」の回帰係数を表す；
「ＣｓＡの摂取」は、採血時のシクロスポリンＡの摂取を定義する予測変数を表し、０＝ＣｓＡの摂取なし、１＝ＣｓＡの摂取である）。
【0087】
一実施形態では、オッズ比は、不顕性拒絶反応に罹っている対象のオッズ比であり、オッズ比ＴＣＬ１Ａ、オッズ比ＡＫＲ１Ｃ３、オッズ比レシピエントの性別、およびオッズ比タクロリムスの摂取が１未満である。
【0088】
一実施形態では、オッズ比が、不顕性拒絶反応に罹っている対象のオッズ比であり、オッズ比以前の拒絶反応エピソードおよびオッズ比ＣｓＡの摂取は１より大きい。
【0089】
例示的な実施形態では、不顕性拒絶反応に罹っている対象のオッズ比は、表３に定義されるとおりである。例として、不顕性拒絶反応に罹っている対象のオッズ比は、表３に定義されている９５％信頼レベル内にある。
【0090】
あるいは、オッズ比は、対象が不顕性拒絶反応に罹っていないオッズの比であってもよい。この実施形態によれば、不顕性拒絶反応に罹っている対象について、上記で定義されたオッズ比が逆転する、すなわち、オッズ比ＴＣＬ１Ａ、オッズ比ＡＫＲ１Ｃ３、オッズ比レシピエントの性別、およびオッズ比タクロリムスの摂取が１より大きいこと、ならびにオッズ比以前の拒絶反応エピソードおよびオッズ比ＣｓＡの摂取が１未満であることが予想される。
【0091】
式（２）を使用して確立されたＳＣＲスコアは、以下の実施例１で実証されるように、概して、不顕性拒絶反応、すなわち、不顕性Ｔ細胞媒介腎拒絶反応（ｓＴＣＭＲ）、不顕性抗体媒介腎拒絶反応（ｓＡＢＭＲ）、および／またはｓＴＣＭＲ／ｓＡＢＭＲ混合型を診断するのに特に好適である。
【0092】
一実施形態では、ＳＣＲスコアは、次式（３）を使用して確立される：
（式中：
「βＴＣＬ１Ａ」、「βＡＫＲ１Ｃ３」、「β以前の拒絶反応エピソード」、「β同種移植ランク」、「βＨＬＡ不一致」および「βレシピエントの性別」は、バイオマーカーのレベル、量、または濃度と臨床パラメータにおける各予測子の回帰係数を表す；
「以前の拒絶反応エピソード」は、採血前の拒絶反応エピソードの経験を定義する予測変数を表し、０＝「以前の拒絶反応エピソードなし」、１＝「以前の拒絶反応エピソードが１つまたは複数ある」である；
「同種移植ランク」は、以前の移植の発生を定義する予測変数を表し、０＝「以前の移植なし」、１＝「１回または複数回の以前の移植あり」である；
「ＨＬＡ不一致」は、ドナーとレシピエントのＨＬＡ不一致の発生を定義する予測変数を表し、０＝「ＨＬＡ－Ａ、－Ｂ、および／または－ＤＲ不一致が３つ以下」、１＝「ＨＬＡ－Ａ、－Ｂ、および／または－ＤＲ不一致が３つを超える」である；
「レシピエントの性別」は、移植レシピエントの性別を定義する予測変数を表し、０＝「女性」、１＝「男性」である；
「Ｅｘｐｒ（ＴＣＬ１Ａ）」および「Ｅｘｐｒ（ＡＫＲ１Ｃ３）」は、それぞれＴＣＬ１ＡおよびＡＫＲ１Ｃ３のレベル、量、または濃度を定義する予測変数を表す；
「β０」は、方程式の切片を表す）。
【数9】
「βＴＣＬ１Ａ」、「βＡＫＲ１Ｃ３」、「β以前の拒絶反応エピソード」、「β同種移植ランク」、「βＨＬＡ不一致」および「βレシピエントの性別」は、バイオマーカーのレベル、量、または濃度と臨床パラメータにおける各予測子の回帰係数を表す；
「以前の拒絶反応エピソード」は、採血前の拒絶反応エピソードの経験を定義する予測変数を表し、０＝「以前の拒絶反応エピソードなし」、１＝「以前の拒絶反応エピソードが１つまたは複数ある」である；
「同種移植ランク」は、以前の移植の発生を定義する予測変数を表し、０＝「以前の移植なし」、１＝「１回または複数回の以前の移植あり」である；
「ＨＬＡ不一致」は、ドナーとレシピエントのＨＬＡ不一致の発生を定義する予測変数を表し、０＝「ＨＬＡ－Ａ、－Ｂ、および／または－ＤＲ不一致が３つ以下」、１＝「ＨＬＡ－Ａ、－Ｂ、および／または－ＤＲ不一致が３つを超える」である；
「レシピエントの性別」は、移植レシピエントの性別を定義する予測変数を表し、０＝「女性」、１＝「男性」である；
「Ｅｘｐｒ（ＴＣＬ１Ａ）」および「Ｅｘｐｒ（ＡＫＲ１Ｃ３）」は、それぞれＴＣＬ１ＡおよびＡＫＲ１Ｃ３のレベル、量、または濃度を定義する予測変数を表す；
「β０」は、方程式の切片を表す）。
【0093】
一実施形態では、オッズ比が、不顕性拒絶反応に罹っている対象のオッズ比であり、オッズ比ＴＣＬ１Ａ、オッズ比ＡＫＲ１Ｃ３、およびオッズ比レシピエントの性別が１未満である。
【0094】
一実施形態では、オッズ比は、不顕性拒絶反応に罹っている対象のオッズ比であり、オッズ比以前の拒絶エピソード、オッズ比同種移植ランク、およびオッズ比ＨＬＡ不一致は、１より大きい。
【0095】
あるいは、オッズ比は、対象が不顕性拒絶反応に罹っていないオッズの比であってもよい。この実施形態によれば、不顕性拒絶反応に罹っている対象について上で定義されたオッズ比が逆転する、すなわち、オッズ比ＴＣＬ１Ａ、オッズ比ＡＫＲ１Ｃ３、およびオッズ比レシピエントの性別が１より大きく、オッズ比以前の拒絶反応エピソード、オッズ比同種移植ランク、およびオッズ比ＨＬＡ不一致が１未満であることが予想される。
【0096】
例示的な実施形態では、不顕性拒絶反応に罹っていない対象のオッズ比は、図１５Ａに定義されているとおりである。
【0097】
式（３）を用いて確立されたＳＣＲスコアは、以下の実施例２で実証されるように、不顕性拒絶反応の特定のサブタイプ、すなわち不顕性抗体媒介腎拒絶反応（ｓＡＢＭＲ）を診断するのに特に好適である。
【0098】
一実施形態では、方法は、少なくとも１つのバイオマーカーのレベル、量、または濃度を、少なくとも１人の参照対象において決定された同じ少なくとも１つのバイオマーカーのレベル、量、または濃度と比較するステップを含む。
【0099】
一実施形態では、参照対象は、腎移植前の対象自身である。
【0100】
一実施形態では、参照対象は、実質的に健康な対象、好ましくは腎移植を受けていない対象である。
【0101】
一実施形態では、参照対象は、不顕性拒絶反応に罹っていない腎移植レシピエントである。
【0102】
数人の参照対象からの多数のサンプルを含めることによって、少なくとも１つのバイオマーカーの中央値および／または平均レベル、量、または濃度を計算することも考えられる。
【0103】
したがって、一実施形態では、本方法は、少なくとも１つのバイオマーカーのレベル、量、または濃度を、参照集団において決定された同じ少なくとも１つのバイオマーカーの中央値および／または平均レベル、量、または濃度と比較するステップを含む。
【0104】
一実施形態では、参照集団は、２人以上、例えば２人、５人、１０人、２０人、３０人、４０人、５０人またはそれ以上の実質的に健康な対象、好ましくは腎移植を受けていない２人以上の対象を含むか、またはそれらからなる。
【0105】
一実施形態では、参照集団は、不顕性拒絶反応に罹っていない２人以上、例えば、２人、５人、１０人、２０人、３０人、４０人、５０人またはそれ以上の腎移植対象を含むか、またはそれらからなる。
【0106】
一実施形態では、方法は、少なくとも１つのバイオマーカーのレベル、量、または濃度を以下：
－上記で定義された少なくとも１人の参照対象において決定された同じ少なくとも１つのバイオマーカーのレベル、量、もしくは濃度、または上記で定義された参照集団において決定された同じ少なくとも１つのバイオマーカーのレベル、量、または濃度の中央値および／または平均レベル；および
－不顕性拒絶反応に罹っていることが判明している少なくとも１人の対象において決定された同じ少なくとも１つのバイオマーカーのレベル、量、もしくは濃度、または不顕性拒絶反応に罹っていることが判明している対象の集団において決定された同じ少なくとも１つのバイオマーカーの中央値および／または平均レベル
と比較するステップを含む。
－上記で定義された少なくとも１人の参照対象において決定された同じ少なくとも１つのバイオマーカーのレベル、量、もしくは濃度、または上記で定義された参照集団において決定された同じ少なくとも１つのバイオマーカーのレベル、量、または濃度の中央値および／または平均レベル；および
－不顕性拒絶反応に罹っていることが判明している少なくとも１人の対象において決定された同じ少なくとも１つのバイオマーカーのレベル、量、もしくは濃度、または不顕性拒絶反応に罹っていることが判明している対象の集団において決定された同じ少なくとも１つのバイオマーカーの中央値および／または平均レベル
と比較するステップを含む。
【0107】
加えて、または代わりに、方法は、複合スコアを、少なくとも１人の参照対象において決定された参照複合スコアと比較するステップを含む。
【0108】
一実施形態では、参照対象は、腎移植前の対象自身である。
【0109】
一実施形態では、参照対象は、実質的に健康な対象、好ましくは腎移植を受けていない対象である。
【0110】
一実施形態では、参照対象は、不顕性拒絶反応に罹っていない腎移植レシピエントである。
【0111】
複数の参照対象からの多数のサンプルを含めることにより、中央値および／または平均参照複合スコアを計算することも考えられる。
【0112】
したがって、一実施形態では、方法は、複合スコアを、参照集団において決定された中央値および／または平均参照複合スコアと比較するステップを含む。
【0113】
一実施形態では、参照集団は、２人以上、例えば２人、５人、１０人、２０人、３０人、４０人、５０人またはそれ以上の実質的に健康な対象、好ましくは腎移植を受けていない２人以上の対象を含むか、またはそれらからなる。
【0114】
一実施形態では、参照集団は、不顕性拒絶反応に罹っていない２人以上、例えば、２人、５人、１０人、２０人、３０人、４０人、５０人またはそれ以上の腎移植対象を含むか、またはそれらからなる。
【0115】
一実施形態では、方法は、複合スコアを以下：
‐上記で定義した少なくとも１人の参照対象において決定された参照複合スコア、または上記で定義された参照集団において決定された中央値および／または平均参照複合スコア；ならびに
‐不顕性拒絶反応に罹っていることが判明している少なくとも１人の対象において決定された複合スコア、または不顕性拒絶反応に罹っていることが判明している対象の集団において決定された中央値および／または平均複合スコア
と比較するステップを含む。
‐上記で定義した少なくとも１人の参照対象において決定された参照複合スコア、または上記で定義された参照集団において決定された中央値および／または平均参照複合スコア；ならびに
‐不顕性拒絶反応に罹っていることが判明している少なくとも１人の対象において決定された複合スコア、または不顕性拒絶反応に罹っていることが判明している対象の集団において決定された中央値および／または平均複合スコア
と比較するステップを含む。
【0116】
一実施形態では、方法は、前のステップでの比較に基づいて、対象が不顕性拒絶反応に罹っていると結論付けるステップを含む。あるいは、方法は、前のステップでの比較に基づいて、対象が不顕性拒絶反応に罹っていないと結論付けるステップを含んでもよい。
【0117】
一実施形態では、不顕性拒絶反応は、不顕性Ｔ細胞媒介拒絶反応（ｓＴＣＭＲ）または不顕性抗体媒介拒絶反応（ｓＡＢＭＲ）である。一実施形態では、不顕性拒絶反応は、不顕性Ｔ細胞媒介拒絶反応である（ｓＴＣＭＲ）である。一実施形態では、不顕性拒絶反応は、不顕性抗体媒介拒絶反応（ｓＡＢＭＲ）である。一実施形態では、不顕性拒絶反応は、ｓＴＣＭＲ／ｓＡＢＭＲ混合型である。
【0118】
一実施形態では、ＴＣＬ１ＡおよびＡＫＲ１Ｃ３のうちの少なくとも１つのバイオマーカーのレベル、量、もしくは濃度が、上記で定義した少なくとも１人の参照対象において決定された同じ少なくとも１つのバイオマーカーのレベル、量、もしくは濃度より、または上記で定義した参照集団において決定された同じ少なくとも１つのバイオマーカーの中央値および／または平均レベル、量、もしくは濃度よりも実質的に低い場合は、対象は、不顕性拒絶反応に罹っていると結論付けられる。
【0119】
一実施形態では、ＴＣＬ１Ａのレベル、量、または濃度が、上記で定義した少なくとも１人の参照対象において決定されたＴＣＬ１Ａのレベル、量、もしくは濃度、または上記で定義した参照集団において決定されたＴＣＬ１Ａの中央値および／もしくは平均レベル、量、もしくは濃度よりも実質的に低い場合、対象は、不顕性拒絶反応に罹っていると結論付けられる。
【0120】
一実施形態では、ＡＫＲ１Ｃ３のレベル、量、または濃度が、上記で定義した少なくとも１人の参照対象において決定されたＡＫＲ１Ｃ３のレベル、量、もしくは濃度、または上記で定義した参照集団において決定されたＡＫＲ１Ｃ３の中央値および／もしくは平均レベル、量、もしくは濃度よりも実質的に低い場合、対象は、不顕性拒絶反応に罹っていると結論付けられる。
【0121】
一実施形態では、ＴＣＬ１ＡおよびＡＫＲ１Ｃ３の両方のバイオマーカーのレベル、量、または濃度が、上記で定義した少なくとも１人の参照対象において決定されたＴＣＬ１ＡおよびＡＫＲ１Ｃ３の両方のレベル、量、もしくは濃度、または上記で定義した参照集団において決定されたＴＣＬ１ＡおよびＡＫＲ１Ｃ３の両方の中央値および／もしくは平均レベル、量、もしくは濃度よりも実質的に低い場合、対象は、不顕性拒絶反応に罹っていると結論付けられる。
【0122】
「実質的に低い」とは、所与のバイオマーカーの絶対的または相対的なレベル、量、または濃度が、少なくとも１人の参照対象または参照集団における同じバイオマーカーと比較して、統計学的に有意に減少している、例えば、少なくとも１人の参照対象または参照集団における同じバイオマーカーと比較して、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、またはそれ以上減少していることを意味する。
【0123】
一実施形態では、ＴＣＬ１ＡおよびＡＫＲ１Ｃ３のうちの少なくとも１つのバイオマーカーのレベル、量、または濃度が、不顕性拒絶反応に罹っていることが判明している少なくとも１人の対象において決定された同じ少なくとも１つのバイオマーカーのレベル、量、もしくは濃度、または不顕性拒絶反応に罹っていることが判明している対象の集団において決定された同じ少なくとも１つのバイオマーカーの中央値および／もしくは平均レベル、量、もしくは濃度と実質的に等しいか、もしくはそれより高い場合、対象は、不顕性拒絶反応に罹っていないと結論付けられる。
【0124】
一実施形態では、ＴＣＬ１Ａのレベル、量、または濃度が、不顕性拒絶反応に罹っていることが判明している少なくとも１人の対象において決定されたＴＣＬ１Ａのレベル、量、もしくは濃度、または不顕性拒絶反応に罹っていることが判明している対象の集団において決定されたＴＣＬ１Ａの中央値および／もしくは平均レベル、量、もしくは濃度と実質的に等しいか、もしくはそれより高い場合、対象は、不顕性拒絶反応に罹っていないと結論付けられる。
【0125】
一実施形態では、ＡＫＲ１Ｃ３のレベル、量、または濃度が、不顕性拒絶反応に罹っていることが判明している少なくとも１人の対象において決定されたＡＫＲ１Ｃ３のレベル、量、もしくは濃度、または不顕性拒絶反応に罹っていることが判明している対象の集団において決定されたＡＫＲ１Ｃ３の中央値および／もしくは平均レベル、量、もしくは濃度と実質的に等しいか、もしくはそれより高い場合、対象は、不顕性拒絶反応に罹っていないと結論付けられる。
【0126】
一実施形態では、ＴＣＬ１ＡおよびＡＫＲ１Ｃ３の両方のバイオマーカーのレベル、量、または濃度が、不顕性拒絶反応に罹っていることが判明している少なくとも１人の対象において決定されたＴＣＬ１ＡおよびＡＫＲ１Ｃ３の両方のレベル、量、もしくは濃度、または不顕性拒絶反応に罹っていることが判明している対象の集団において決定されたＴＣＬ１ＡおよびＡＫＲ１Ｃ３の両方の中央値および／もしくは平均レベル、量、もしくは濃度と実質的に等しいか、もしくはそれより高い場合、対象は、不顕性拒絶反応に罹っていないと結論付けられる。
【0127】
「実質的に等しい」とは、不顕性拒絶反応に罹っていることが判明している少なくとも１人の対象において、または不顕性拒絶反応に罹っていることが判明している対象の集団において、特定のバイオマーカーの絶対的または相対的なレベル、量、または濃度が、同じバイオマーカーのレベル、量、または濃度と統計学的に有意に異なっていないこと、例えば、不顕性拒絶反応に罹っていることが判明している少なくとも１人の対象、または不顕性拒絶反応に罹っていることが判明している対象の集団における同じバイオマーカーのレベル、量、または濃度の±１０％以内であることを意味する。
【0128】
「実質的に高い」とは、不顕性拒絶反応に罹っていることが判明している少なくとも１人の対象において、または不顕性拒絶反応に罹っていることが判明している対象の集団において、特定のバイオマーカーの絶対的または相対的なレベル、量、または濃度が、同じバイオマーカーと比較して統計学的に有意に増加している、例えば、不顕性拒絶反応に罹っていることが判明している少なくとも１人の対象において、または不顕性拒絶反応に罹っていることが判明している対象の集団において、同じバイオマーカーと比較して、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、またはそれ以上増加していることを意味する。
【0129】
加えて、または代わりに、複合スコアが、上記で定義した少なくとも１人の参照対象において決定された参照複合スコアよりも実質的に高い場合、または上記で定義した参照集団において決定された中央値および／または平均参照複合スコアよりも実質的に高い場合、対象は、不顕性拒絶反応に罹っていると結論付けられる。
【0130】
「実質的に高い」とは、複合スコアが、少なくとも１人の参照対象または参照集団の参照複合スコアと比較して、統計学的に有意に増加している、例えば、少なくとも１人の参照対象または参照集団の参照複合スコアと比較して、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％またはそれ以上増加していることを意味する。
【0131】
一実施形態では、複合スコアが、不顕性拒絶反応に罹っていることが判明している少なくとも１人の対象において決定された複合スコア以下、または不顕性拒絶反応に罹っていることが判明している対象の集団において決定された中央値および／もしくは平均複合スコア以下である場合、対象は、不顕性拒絶反応に罹っていないと結論付けられる。
【0132】
「実質的に等しい」とは、複合スコアが、不顕性拒絶反応に罹っていることが判明している少なくとも１人の対象、または、不顕性拒絶反応に罹っていることが判明している対象の集団における複合スコアよりも統計学的に有意ではないこと、例えば、不顕性拒絶反応に罹っていることが判明している少なくとも１人の対象、または不顕性拒絶反応に罹っていることが判明している対象の集団における複合スコアの±１０％以内であることを意味する。
【0133】
「実質的に低い」とは、複合スコアが、不顕性拒絶反応に罹っていることが判明している少なくとも１人の対象、または、不顕性拒絶反応に罹っていることが判明している対象の集団における複合スコアと比較して、統計学的に有意に減少していること、例えば、不顕性拒絶反応に罹っていることが判明している少なくとも１人の対象、または不顕性拒絶反応に罹っていることが判明している対象の集団における複合スコアと比較して、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％またはそれ以上減少することを意味する。
【0134】
本発明はまた、それを必要とする対象における不顕性拒絶反応を処置する方法にも関する。
【0135】
「処置」という用語およびその語形変化は、所与の疾患または状態の進行を阻止、阻害、遅延または逆転させるため、および／または所与の疾患もしくは状態の臨床症状を改善するため、および／または所与の疾患もしくは状態のさらなる臨床症状、例えば不顕性拒絶反応の出現を予防するために、対象に処置レジメンを施すことを指す。特に、不顕性拒絶反応は、移植片にとって有害であり得、処置しないままであると、慢性同種移植片腎症（ＣＡＮ）、慢性間質性線維症および尿細管萎縮（ｔｕｂｕｌａｒ ａｔｒｏｐｈｙ）、腎機能不全、クレアチニンクリアランスの低下、慢性拒絶反応、および最終的には移植片の生存期間の短縮に進行し得る。
【0136】
一実施形態では、方法は、上で詳述した方法を使用して、対象における不顕性拒絶反応を診断する第１のステップを含む。
【0137】
一実施形態では、本方法は、第１のステップにおいて対象が不顕性拒絶反応と診断された場合または診断されたときに、免疫抑制療法により対象を処置する第２のステップを含む。
【0138】
一実施形態では、不顕性拒絶反応と診断された対象を処置することは、以前に完了した免疫抑制療法を再開することを含む。
【0139】
一実施形態では、不顕性拒絶反応と診断された対象を処置することは、現在施されている免疫抑制療法の投与レジメンを増大させることを含む。
【0140】
一実施形態では、不顕性拒絶反応と診断された対象を処置することは、現在投与されている免疫抑制療法をより積極的な処置に変更することを含む。
【0141】
一実施形態では、不顕性拒絶反応と診断された対象を処置することは、現在投与されている免疫抑制療法に加えて、別の免疫抑制療法を投与することを含む。
【0142】
好適な免疫抑制療法の例は、本明細書の前半で十分に詳述されている。
【0143】
免疫抑制療法の例示的な処置プロトコルとして、腎移植レシピエントは、典型的には、タクロリムス（０．１ｍｇ／ｋｇ／日）、ミコフェノール酸モフェチル（２ｇ／日）およびコルチコイド（１ｍｇ／ｋｇ／日）と併用したバシリキシマブの２回注射からなる導入処置を受け、コルチコイド処置は、処置終了まで５日ごとに１０ｍｇずつ徐々に減少させる。より積極的なプロトコルには、０日目からミコフェノール酸モフェチル（２ｇ／日）およびコルチコステロイド（１ｍｇ／ｋｇ／日）を併用して、抗胸腺細胞グロブリン（例えば、０日目～７日目）、その後タクロリムス（０．１ｍｇ／ｋｇ／日；例えば、７日目から処置終了まで）の短期間のものが含まれ、コルチコイド処置は、処置終了まで５日ごとに１０ｍｇずつ徐々に減少させる。
【0144】
一実施形態では、不顕性拒絶反応と診断された対象を処置することは、例えば、血漿交換（ＰＬＥＸ）またはＩｇＧ分解酵素（イミフィダーゼなど）の投与により、また、任意でＩＶＩｇ（静脈内免疫グロブリン）をさらに投与することにより、対象における免疫グロブリンの数を除去または減少させることを含む。この処置コースでは、対象が抗体媒介拒絶反応（ｓＡＢＭＲ）に罹っていると診断されたときに特に好適であり得る。
【0145】
一実施形態では、不顕性拒絶反応と診断された対象を処置することは、抗胸腺細胞グロブリン（ＡＴＧ）および／またはＴ細胞枯渇抗体を投与することを含む。この処置コースでは、対象が抗体媒介拒絶反応（ｓＡＢＭＲ）に罹っていると診断されたときに特に好適であり得る。
【0146】
一実施形態では、不顕性拒絶反応と診断された対象を処置することは、対象の脾臓の外科的脾臓摘出術、脾臓塞栓術、および／または脾臓放射線照射を行うことを含む。
【0147】
一実施形態では、不顕性拒絶反応と診断された対象を処置することは、補体阻害剤を投与することを含む。補体阻害剤のいくつかの例としては、これらに限定されないが、Ｃ５阻害剤（例えば、抗Ｃ５抗体エクリズマブ）、またはＣ１エステラーゼ阻害剤が挙げられる。この処置コースは、対象が抗体媒介拒絶反応（ｓＡＢＭＲ）を有すると診断されたときに特に好適であり得る。
【0148】
ｓＡＢＭＲに特有の処置については、Ｓｃｈｉｎｓｔｏｃｋ ｅｔ ａｌ．，２０２０（Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．１０４（５）：９１１９２２））を参されたい。その内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【0149】
当業者であれば、これらの処置コースが排他的ではなく、医師の健全な医学的判断の範囲内で組み合わせることができることを容易に理解するであろう。
【0150】
本発明はまた、免疫抑制療法を受けている対象を、免疫抑制療法の中止または最小化の候補として同定するための方法にも関する。
【0151】
一実施形態では、方法は、上で詳述した方法を使用して、対象における不顕性拒絶反応を診断する第１のステップを含む。
【0152】
一実施形態では、本方法は、対象が第１のステップにおいて不顕性拒絶反応と診断されなかった場合または診断されなかったときに、好ましくは、さらに、対象が臨床的免疫寛容の腎移植レシピエントであると決定された場合または決定されたときに、対象における免疫抑制療法を軽減し、最終的に抑制する第２のステップを含む。腎移植レシピエントが臨床的免疫寛容であるか否かを決定する手段および方法は、当技術分野、特に国際公開第２０１８／０１５５５１号またはＤａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１７（Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ．９１（６）：１４７３１４８１）に記載されている。
【0153】
本発明はまた、それを必要とする対象における不顕性拒絶反応を診断するためのコンピュータシステムにも関する。本発明は、それを必要とする対象における不顕性拒絶反応を診断するためのコンピュータ実装方法にも関する。
【0154】
本明細書で使用される場合、「コンピュータシステム」という用語は、そのようなデバイスが電子的、機械的、論理的、または仮想的な性質であるか否かに関係なく、情報を保存および処理できる、および／または保存された情報を使用してデバイス自体の動作または実行を制御できるいずれかのおよびすべてのデバイスに関する。「コンピュータシステム」という用語は、１つのコンピュータを指すこともできるが、コンピュータシステム上でまたはコンピュータシステムによって実行されると説明されている機能を実行するために、協働する複数のコンピュータも含む。コンピュータシステムを使用して実装される方法は、「コンピュータ実装方法」と称する。
【0155】
一実施形態では、本発明によるコンピュータシステムは、
（ｉｉ）少なくとも１つのプロセッサと、
（ｉｉｉ）プロセッサによって読み取り可能なコードを保存する少なくとも１つのコンピュータ読み取り可能な記憶媒体とを含む。
（ｉｉ）少なくとも１つのプロセッサと、
（ｉｉｉ）プロセッサによって読み取り可能なコードを保存する少なくとも１つのコンピュータ読み取り可能な記憶媒体とを含む。
【0156】
本明細書で使用される場合、「プロセッサ」という用語は、例えば、記憶媒体からアクセスする命令、コード、コンピュータプログラム、およびスクリプトを実行するなど、少なくとも１つの命令ワードで動作を実行することが可能な任意の集積回路または他の電子デバイスを含むことを意味する。しかし、「プロセッサ」という用語は、ソフトウェアを実行できるハードウェアに限定するものと解釈されるものではなく、例えば、コンピュータ、マイクロプロセッサ、集積回路、またはプログラマブルロジックデバイス（ＰＬＤ）を含み得る一般的な意味での処理デバイスを指す。プロセッサは、コンピュータグラフィックスおよび画像処理または他の機能に利用されるか否かに関係なく、１つ以上のグラフィックス処理ユニット（ＧＰＵ）を含んでもよい。さらに、関連する機能および／または結果として生じる機能を実行することを可能にする命令および／またはデータは、プロセッサ読み取り可能な任意の媒体、例えば、これらに限定されないが、集積回路、ハードディスク、磁気テープ（フロッピーディスクおよびｚｉｐディスケットなど）、光ディスク（Ｂｌｕ－ｒａｙ、ＣＤおよびデジタルバーサタイルディスク）、フラッシュメモリ（メモリカード、およびＵＳＢフラッシュドライブ）、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）（ダイナミックＲＡＭおよびスタティックＲＡＭを含む）、読み取り専用メモリ（ＲＯＭ）またはキャッシュに保存され得る。命令は、特に、ハードウェア、ソフトウェア、ファームウェア、またはそれらの任意の組み合わせに保存され得る。
【0157】
プロセッサの例としては、これらに限定されないが、中央処理装置（ＣＰＵ）、マイクロプロセッサ、デジタルシグナルプロセッサ（ＤＳＰ）、汎用マイクロプロセッサ、特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）、フィールドプログラマブルロジックアレイ（ＦＰＧＡ）、および他の同等の集積論理回路または個別論理回路が挙げられる。
【0158】
一実施形態では、本発明によるコンピュータシステムは、ＴＣＬ１ＡおよびＡＫＲ１Ｃ３を含むかまたはそれらからなる群から選択される少なくとも１つのバイオマーカーのレベル、量、または濃度に関連する実験的に決定されたシグナルを受信するスキャナーなどに連結される。
【0159】
あるいは、サンプル発現レベルにおけるＴＣＬ１ＡおよびＡＫＲ１Ｃ３を含むかまたはそれらからなる群から選択される少なくとも１つのバイオマーカーのレベル、量、または濃度は、任意により、上記で定義した１つ、２つ、または好ましくは３つの臨床パラメータと共に、他の手段で入力することも可能である。
【0160】
本発明はまた、プロセッサによって実行されたときに、本明細書に記載のコンピュータ実装方法を実行するように適合させたプロセッサによって読み取り可能なソフトウェアコードを含むコンピュータプログラムにも関する。
【0161】
一実施形態では、本発明によるコンピュータシステムは、少なくとも１つのコンピュータプログラムを含む。コンピュータプログラムは、指定されたタスクを実行するために書かれた、デジタル処理デバイスのＣＰＵで実行可能な一連の命令を含み得る。コンピュータ可読命令は、特定のタスクを実行する、または特定の抽象データ型を実装する、関数、オブジェクト、アプリケーションプログラミングインターフェース（ＡＰＩ）、データ構造などのプログラムモジュールとして実装され得る。コンピュータプログラムは、様々なバージョンの様々な言語で書かれてもよい。
【0162】
一実施形態では、コンピュータプログラムは、部分的または全体的に、１つ以上のウェブアプリケーション、１つ以上のモバイルアプリケーション、１つ以上のスタンドアロンアプリケーション、１つ以上のウェブブラウザプラグイン、拡張子、アドイン、またはアドオン、またはそれらの組み合わせを含む。
【0163】
本発明は、プロセッサによって読み取り可能なコードを含むコンピュータ読み取り可能な記憶媒体にも関し、これは、プロセッサによって実行されたときに、プロセッサに本明細書に記載のコンピュータ実装方法のステップを実施させる。
【0164】
コンピュータ読み取り可能な記憶媒体の例としては、これらに限定されないが、集積回路、ハードディスク、磁気テープ（フロッピーディスクおよびｚｉｐディスケットなど）、光ディスク（Ｂｌｕ－ｒａｙ、ＣＤおよびデジタルバーサタイルディスク）、フラッシュメモリ（メモリカード、およびＵＳＢフラッシュドライブ）、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）（ダイナミックＲＡＭおよびスタティックＲＡＭを含む）、読み取りメモリ（ＲＯＭ）またはキャッシュが挙げられる。
【0165】
一実施形態では、コンピュータ読み取り可能な記憶媒体は、非一時的コンピュータ読み取り可能な記憶媒体である。
【0166】
一実施形態では、コンピュータ読み取り可能な記憶媒体に保存されたコードは、コンピュータシステムのプロセッサによって実行されたときに、プロセッサに：
ａ．ＴＣＬ１ＡおよびＡＫＲ１Ｃ３を含むかまたはそれらからなる群から選択される少なくとも１つのバイオマーカーの入力レベル、量、または濃度を受信すること、
ｂ．各入力レベルを整理および／または変更して、確率スコア、フィッティングスコア、および分類ラベルのうちの少なくとも１つを導出することによって、入力レベル、量、または濃度を分析および変換すること、
ｃ．出力を生成することであって、出力が、分類ラベル、フィッティングスコア、および確率スコアのうちの少なくとも１つである、生成すること、ならびに
ｄ．出力に基づいて、対象が不顕性拒絶反応に罹っているか否かの診断を提供することを実行させる。
ａ．ＴＣＬ１ＡおよびＡＫＲ１Ｃ３を含むかまたはそれらからなる群から選択される少なくとも１つのバイオマーカーの入力レベル、量、または濃度を受信すること、
ｂ．各入力レベルを整理および／または変更して、確率スコア、フィッティングスコア、および分類ラベルのうちの少なくとも１つを導出することによって、入力レベル、量、または濃度を分析および変換すること、
ｃ．出力を生成することであって、出力が、分類ラベル、フィッティングスコア、および確率スコアのうちの少なくとも１つである、生成すること、ならびに
ｄ．出力に基づいて、対象が不顕性拒絶反応に罹っているか否かの診断を提供することを実行させる。
【0167】
一実施形態では、分類ラベル、フィッティングスコア、および確率スコアのうちの少なくとも１つは、上記で定義された式（１）による複合スコア「ＳＣＲスコア」である。
【0168】
一実施形態では、コンピュータ読み取り可能な記憶媒体に保存されたコードは、コンピュータシステムのプロセッサによって実行されたときに、プロセッサに：
ａ．ＴＣＬ１ＡおよびＡＫＲ１Ｃ３を含むかまたはそれらからなる群から選択される少なくとも１つのバイオマーカーの入力レベル、量、または濃度を受信し、上記で定義された１つ、２つ、３つ、または４つの臨床パラメータ、好ましくは３つまたは４つの臨床パラメータの値を入力すること、
ｂ．各入力を整理および／または変更して、確率スコア、フィッティングスコア、および分類ラベルのうちの少なくとも１つを導出することで、入力レベル、量、または濃度、および入力値を分析および変換すること、
ｃ．出力を生成することであって、ここで、出力は、分類ラベル、フィッティングスコア、および確率スコアのうちの少なくとも１つである、生成すること、ならびに
ｄ．出力に基づいて、対象が不顕性拒絶反応に罹っているか否かの診断を提供することを実行させる。
ａ．ＴＣＬ１ＡおよびＡＫＲ１Ｃ３を含むかまたはそれらからなる群から選択される少なくとも１つのバイオマーカーの入力レベル、量、または濃度を受信し、上記で定義された１つ、２つ、３つ、または４つの臨床パラメータ、好ましくは３つまたは４つの臨床パラメータの値を入力すること、
ｂ．各入力を整理および／または変更して、確率スコア、フィッティングスコア、および分類ラベルのうちの少なくとも１つを導出することで、入力レベル、量、または濃度、および入力値を分析および変換すること、
ｃ．出力を生成することであって、ここで、出力は、分類ラベル、フィッティングスコア、および確率スコアのうちの少なくとも１つである、生成すること、ならびに
ｄ．出力に基づいて、対象が不顕性拒絶反応に罹っているか否かの診断を提供することを実行させる。
【0169】
一実施形態では、分類ラベル、フィッティングスコア、および確率スコアのうちの少なくとも１つは、上で定義された式（２）による複合スコア「ＳＣＲスコア」である。
【0170】
一実施形態では、分類ラベル、フィッティングスコア、および確率スコアのうちの少なくとも１つは、上で定義された式（３）による複合スコア「ＳＣＲスコア」である。
【0171】
本発明は、部品キットにも関する。
【0172】
本明細書で使用される場合、用語「部品キット」は、本発明による方法を実施するための１つ以上の手段または試薬が充填された１つ以上の容器を含む製品を指す。
【0173】
一実施形態では、部品キットは、サンプル中のＴＣＬ１ＡおよびＡＫＲ１Ｃ３を含むかまたはそれらからなる群から選択される少なくとも１つのバイオマーカーのレベル、量、または濃度を決定するための少なくとも１つの手段を含む。このような手段は、例えば、少なくとも１つのバイオマーカーのレベル、量、または濃度を、ＲＮＡまたはタンパク質レベルで決定するためのプローブであり得る。
【0174】
一実施形態では、キットは、部品キットは、上記に記載の少なくとも１つの参照マーカーのレベル、量、または濃度を決定するための少なくとも１つの手段を含む。このような手段は、例えば、ＲＮＡまたはタンパク質レベルで、少なくとも１つの参照マーカーのレベル、量、または濃度を決定するためのプローブであり得る。
【0175】
一実施形態では、部品キットは、ＴＣＬ１ＡおよびＡＫＲ１Ｃ３以外の他の任意のバイオマーカー、および任意により少なくとも１つの参照マーカーのレベル、量、または濃度を決定するための手段を含まない。特にキットは、部品キットは、ＣＤ４０、ＣＴＬＡ４、ＩＤ３、およびＭＺＢ１のいずれかのレベル、量、または濃度を決定するための手段を含まない。
【0176】
少なくとも１つのバイオマーカーおよび／または少なくとも１つの参照マーカーのレベル、量、または濃度をＲＮＡレベルで決定するためのプローブの例としては、これらに限定されないが、核酸プローブ（例えば、ＴａｑＭａｎ（商標）プローブ、ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇプローブ、Ｓｃｏｒｐｉｏｎｓ（登録商標）プローブ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎ、およびＬＮＡ（登録商標）（Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）プローブ）が挙げられる。
【0177】
少なくとも１つのバイオマーカーおよび／または少なくとも１つの参照マーカーのレベル、量、または濃度をタンパク質レベルで決定するためのプローブの例としては、これらに限定されないが、抗体（例えば、抗ＡＫＲ１Ｃ３抗体および抗ＴＣＬ１Ａ抗体）およびアプタマーが挙げられる。
【0178】
一実施形態では、プローブは、例えばアレイなどの固体支持体上に固定化され得る。
【0179】
一実施形態では、プローブは、少なくとも１つの検出可能な標識を含む。好適な検出可能な標識の例としては、これらに限定されないが、ＦＡＭ（５または６カルボキシフルオレセイン）、ＨＥＸ、ＣＹ５、ＶＩＣ、ＮＥＤ、フルオレセイン、ＦＩＴＣ、ＩＲＤ７００／８００、ＣＹ３、ＣＹ３．５、ＣＹ５．５、ＴＥＴ（５テトラクロロフルオレセイン）、ＴＡＭＲＡ、ＪＯＥ、ＲＯＸ、ＢＯＤＩＰＹ ＴＭＲ、オレゴングリーン、ローダミングリーン、ローダミングリーンレッド、テキサスレッド、ヤキマイエロー、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ＰＥＴ、ＢＩＯＳＥＡＲＣＨ ＢＬＵＥ（商標）、ＭＡＲＩＮＡ ＢＬＵＥ（登録商標）、ＢＯＴＨＥＬＬ ＢＬＵＥ（登録商標）、ＡＬＥＸＡ ＦＬＵＯＲ（登録商標）、３５０ ＦＡＭ（商標）、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ １、ＥｖａＧｒｅｅｎ（商標）、ＡＬＥＸＡ ＦＬＵＯＲ（登録商標）４８８ ＪＯＥ（商標）、２５ ＶＩＣ（商標）、ＨＥＸ（商標）、ＴＥＴ（商標）、ＣＡＬ ＦＬＵＯＲ（登録商標）Ｇｏｌｄ ５４０、ＹＡＫＩＭＡ ＹＥＬＬＯＷ（登録商標）、ＲＯＸ（商標）、ＣＡＬ ＦＬＵＯＲ（登録商標）Ｒｅｄ ６１０、Ｃｙ３．５（商標）、ＴＥＸＡＳ ＲＥＤ（登録商標）、ＡＬＥＸＡ ＦＬＵＯＲ（登録商標）５６８ ＣＲＹ５（商標）ＱＵＡＳＡＲ（商標）６７０、ＬＩＧＨＴＣＹＣＬＥＲ ＲＥＤ６４０（登録商標）、ＡＬＥＸＡ ＦＬＵＯＲ（登録商標）６３３ＱＵＡＳＡＲ（商標）７０５、ＬＩＧＨＴＣＹＣＬＥＲ ＲＥＤ７０５（登録商標）、ＡＬＥＸＡ ＦＬＵＯＲ（登録商標）６８０、ＳＹＴ０（登録商標）９、ＬＣ ＧＲＥＥＮ（登録商標）、ＬＣ ＧＲＥＥＮ（登録商標）Ｐｌｕｓ＋、およびＥＶＡＧＲＥＥＮ（商標）が上げられる。
【0180】
本明細書では以下も開示される：
【0181】
Ｅ１：それを必要とする対象における不顕性拒絶反応を診断する方法であって
ａ）対象から以前に採取されたサンプル中の、ＡＫＲ１Ｃ３およびＴＣＬ１Ａからなる群から選択される少なくとも１つのバイオマーカーのレベル、量、または濃度を決定するステップと；
ｂ）少なくとも１つのバイオマーカーのレベル、量、または濃度を、少なくとも１人の参照対象において決定された同じ少なくとも１つのバイオマーカーのレベル、量、または濃度と比較するステップと；
ｃ）少なくとも１つのバイオマーカーのレベル、量、または濃度が、少なくとも１人の参照対象において決定された同じ少なくとも１つのバイオマーカーのレベル、量、または濃度よりも統計学的に有意に低い場合、対象は、不顕性拒絶反応に罹っていると結論付けるステップと；
を含む方法。
ａ）対象から以前に採取されたサンプル中の、ＡＫＲ１Ｃ３およびＴＣＬ１Ａからなる群から選択される少なくとも１つのバイオマーカーのレベル、量、または濃度を決定するステップと；
ｂ）少なくとも１つのバイオマーカーのレベル、量、または濃度を、少なくとも１人の参照対象において決定された同じ少なくとも１つのバイオマーカーのレベル、量、または濃度と比較するステップと；
ｃ）少なくとも１つのバイオマーカーのレベル、量、または濃度が、少なくとも１人の参照対象において決定された同じ少なくとも１つのバイオマーカーのレベル、量、または濃度よりも統計学的に有意に低い場合、対象は、不顕性拒絶反応に罹っていると結論付けるステップと；
を含む方法。
【0182】
Ｅ２：ステップａ）が、対象から以前に採取されたサンプル中のＡＫＲ１Ｃ３のレベル、量、または濃度を決定することを含む、Ｅ１に記載の方法。
【0183】
Ｅ３：ステップａ）が、対象から以前に採取されたサンプル中のＴＣＬ１Ａのレベル、量、または濃度を決定することを含む、Ｅ１に記載の方法。
【0184】
Ｅ４：ステップａ）が、対象から以前に採取されたサンプル中のＡＫＲ１Ｃ３およびＴＣＬ１Ａの両方のレベル、量、または濃度を決定することを含む、Ｅ１～Ｅ３のいずれか１つに記載の方法。
【0185】
Ｅ５：少なくとも１つのバイオマーカーのレベル、量、または濃度は、絶対的または相対的なレベル、量、または濃度に関して表され、；好ましくは、１つまたはいくつかの参照マーカーのレベル、量、または濃度に対して正規化された相対レベル、量、または濃度に関して表される、Ｅ１～Ｅ４のいずれか１つに記載の方法。
【0186】
Ｅ６：
ａ）
‐ＡＫＲ１Ｃ３およびＴＣＬ１Ａからなる群、好ましくはＡＫＲ１Ｃ３およびＴＣＬ１Ａの両方からなる群から選択される少なくとも１つのバイオマーカーのレベル、量、または濃度；および
‐１つ、２つ、または好ましくは３つの臨床パラメータ
によって複合スコアを決定するステップと、
ｂ）複合スコアを、少なくとも１人の参照対象において決定された参照複合スコアと比較するステップと；
ｃ）複合スコアが、少なくとも１人の参照対象において決定された参照複合スコアより実質的に高い場合、対象が不顕性拒絶反応に罹っていると結論付けるステップと
を含む、Ｅ１～Ｅ５のいずれか１つに記載の方法。
ａ）
‐ＡＫＲ１Ｃ３およびＴＣＬ１Ａからなる群、好ましくはＡＫＲ１Ｃ３およびＴＣＬ１Ａの両方からなる群から選択される少なくとも１つのバイオマーカーのレベル、量、または濃度；および
‐１つ、２つ、または好ましくは３つの臨床パラメータ
によって複合スコアを決定するステップと、
ｂ）複合スコアを、少なくとも１人の参照対象において決定された参照複合スコアと比較するステップと；
ｃ）複合スコアが、少なくとも１人の参照対象において決定された参照複合スコアより実質的に高い場合、対象が不顕性拒絶反応に罹っていると結論付けるステップと
を含む、Ｅ１～Ｅ５のいずれか１つに記載の方法。
【0187】
Ｅ７：臨床パラメータが、（ｉ）採血前の拒絶反応エピソードの経験、（ｉｉ）レシピエントの性別、および（ｉｉｉ）採血時のシクロスポリンＡ（ＣｓＡ）の摂取から選択される、Ｅ６に記載の方法。
【0188】
Ｅ８：複合スコアが以下の式を使用して確立される、Ｅ６またはＥ７に記載の方法：
（式中：
‐「βＴＣＬ１Ａ」、「βＡＫＲ１Ｃ３」、「β以前の拒絶反応エピソード」、「βＣｓＡの摂取」、および「βレシピエントの性別」は、バイオマーカーのレベル、量、または濃度と臨床パラメータにおける各予測子の回帰係数を表す；
‐「以前の拒絶反応エピソード」は、採血前の拒絶反応エピソードの経験を定義する予測変数を表し、０＝以前の拒絶反応エピソードなし、１＝以前の拒絶反応エピソードが少なくとも１つまたは複数ある、である；
‐「ＣｓＡの摂取」は、採血時のシクロスポリンＡ（ＣｓＡ）の摂取を定義する予測変数を表し、０＝ＣｓＡの摂取なし、１＝ＣｓＡの摂取である；
‐「レシピエントの性別」は、移植レシピエントの性別を定義する予測変数を表し、０＝「女性」、１＝「男性」である；
‐「Ｅｘｐｒ（ＴＣＬ１Ａ）」および「Ｅｘｐｒ（ＡＫＲ１Ｃ３）」は、それぞれＴＣＬ１ＡおよびＡＫＲ１Ｃ３のレベル、量、または濃度を定義する予測変数を表す；
‐「β０」は、方程式の切片を表す）。
【数10】
‐「βＴＣＬ１Ａ」、「βＡＫＲ１Ｃ３」、「β以前の拒絶反応エピソード」、「βＣｓＡの摂取」、および「βレシピエントの性別」は、バイオマーカーのレベル、量、または濃度と臨床パラメータにおける各予測子の回帰係数を表す；
‐「以前の拒絶反応エピソード」は、採血前の拒絶反応エピソードの経験を定義する予測変数を表し、０＝以前の拒絶反応エピソードなし、１＝以前の拒絶反応エピソードが少なくとも１つまたは複数ある、である；
‐「ＣｓＡの摂取」は、採血時のシクロスポリンＡ（ＣｓＡ）の摂取を定義する予測変数を表し、０＝ＣｓＡの摂取なし、１＝ＣｓＡの摂取である；
‐「レシピエントの性別」は、移植レシピエントの性別を定義する予測変数を表し、０＝「女性」、１＝「男性」である；
‐「Ｅｘｐｒ（ＴＣＬ１Ａ）」および「Ｅｘｐｒ（ＡＫＲ１Ｃ３）」は、それぞれＴＣＬ１ＡおよびＡＫＲ１Ｃ３のレベル、量、または濃度を定義する予測変数を表す；
‐「β０」は、方程式の切片を表す）。
【0189】
Ｅ９：少なくとも１人の参照対象が、腎移植を受けていない対象および／または不顕性拒絶反応に罹っていない腎移植レシピエントである、Ｅ１～Ｅ８のいずれか１つに記載の方法。
【0190】
Ｅ１０：少なくとも１人の参照対象が、腎移植前の対象自身である、Ｅ１～Ｅ８のいずれか１つに記載の方法。
【0191】
Ｅ１１：少なくとも１人の参照対象が、２人以上の参照対象を含む参照集団である、Ｅ１～Ｅ１０のいずれか１つに記載の方法。
【0192】
Ｅ１２：本明細書において、それを必要とする対象における不顕性拒絶反応を診断するためのコンピュータシステムであって、
ｉ）少なくとも１つのプロセッサと、
ｉｉ）プロセッサによって実行されたときに、プロセッサに：
ａ．ＡＫＲ１Ｃ３およびＴＣＬ１Ａからなる群から選択される少なくとも１つのバイオマーカーの入力レベル、量、または濃度を受信すること、
ｂ．各入力レベルを整理および／または変更して、確率スコア、フィッティングスコア、および分類ラベルのうちの少なくとも１つを導出することによって、入力レベル、量、または濃度を分析および変換すること、
ｃ．出力を生成することであって、ここで、出力は、分類ラベル、フィッティングスコア、および確率スコアのうちの少なくとも１つである、生成すること、ならびに
ｄ．出力に基づいて、対象が不顕性拒絶反応に罹っているか否かの診断を提供すること
を実行させる、プロセッサによって読み取り可能な少なくとも１つのコードを保存する少なくとも１つの記憶媒体
とを含む、コンピュータシステムが開示される。
ｉ）少なくとも１つのプロセッサと、
ｉｉ）プロセッサによって実行されたときに、プロセッサに：
ａ．ＡＫＲ１Ｃ３およびＴＣＬ１Ａからなる群から選択される少なくとも１つのバイオマーカーの入力レベル、量、または濃度を受信すること、
ｂ．各入力レベルを整理および／または変更して、確率スコア、フィッティングスコア、および分類ラベルのうちの少なくとも１つを導出することによって、入力レベル、量、または濃度を分析および変換すること、
ｃ．出力を生成することであって、ここで、出力は、分類ラベル、フィッティングスコア、および確率スコアのうちの少なくとも１つである、生成すること、ならびに
ｄ．出力に基づいて、対象が不顕性拒絶反応に罹っているか否かの診断を提供すること
を実行させる、プロセッサによって読み取り可能な少なくとも１つのコードを保存する少なくとも１つの記憶媒体
とを含む、コンピュータシステムが開示される。
【0193】
Ｅ１３：プロセッサによって読み取り可能な少なくとも１つのコードが、プロセッサによって実行されたときに、プロセッサに：
ａ．ＡＫＲ１Ｃ３およびＴＣＬ１Ａからなる群から選択される少なくとも１つのバイオマーカーの入力レベル、量、または濃度を受信し、（ｉ）採血前の拒絶反応エピソードの経験、（ｉｉ）レシピエントの性別、および（ｉｉｉ）採血時のシクロスポリンＡ（ＣｓＡ）の摂取から選択される１つ、２つ、または好ましくは３つの臨床パラメータの値を入力すること：
ｂ．各入力を整理および／または変更して、確率スコア、フィッティングスコア、および分類ラベルのうちの少なくとも１つを導出することで、入力レベル、量、または濃度、および入力値を分析および変換すること、
ｃ．出力を生成することであって、ここで、出力は、分類ラベル、フィッティングスコア、および確率スコアのうちの少なくとも１つである、生成すること、ならびに
ｄ．出力に基づいて、対象が不顕性拒絶反応に罹っているか否かの診断を提供することを実行させる、Ｅ１２に記載のコンピュータシステム。
ａ．ＡＫＲ１Ｃ３およびＴＣＬ１Ａからなる群から選択される少なくとも１つのバイオマーカーの入力レベル、量、または濃度を受信し、（ｉ）採血前の拒絶反応エピソードの経験、（ｉｉ）レシピエントの性別、および（ｉｉｉ）採血時のシクロスポリンＡ（ＣｓＡ）の摂取から選択される１つ、２つ、または好ましくは３つの臨床パラメータの値を入力すること：
ｂ．各入力を整理および／または変更して、確率スコア、フィッティングスコア、および分類ラベルのうちの少なくとも１つを導出することで、入力レベル、量、または濃度、および入力値を分析および変換すること、
ｃ．出力を生成することであって、ここで、出力は、分類ラベル、フィッティングスコア、および確率スコアのうちの少なくとも１つである、生成すること、ならびに
ｄ．出力に基づいて、対象が不顕性拒絶反応に罹っているか否かの診断を提供することを実行させる、Ｅ１２に記載のコンピュータシステム。
【0194】
Ｅ１４：前記分類ラベル、前記フィッティングスコア、および前記確率スコアのうちの少なくとも１つが、請求項８に記載の複合スコアである、Ｅ１３に記載のコンピュータシステム。
【0195】
Ｅ１５：ＡＫＲ１Ｃ３およびＴＣＬ１Ａからなる群から選択される少なくとも１つのバイオマーカーのレベル、量、または濃度を決定するための手段、および任意により少なくとも１つの参照マーカーのレベル、量、または濃度を決定するための手段を含む、Ｅ１～Ｅ１１のいずれか１つに記載の方法を実施するための部品キット。
【図面の簡単な説明】
【0196】
【図1】この試験の患者の選択基準を示すフロー図である。
【図2】ｑＰＣＲ遺伝子発現によって安定した機能を有する患者の評価された４５０の生検の組織学的診断を表す図である。２０１５年バンフ分類による腎生検の組織学的特徴（Ｌｏｕｐｙ ｅｔａｌ．，２０１７．ＡｍＪＴｒａｎｓｐｌａｎｔ．１７（１）：２８４１）、６つの組織学的分類（正常、ｉＩＦＴＡ、境界領域、その他、液性および細胞性拒絶反応）および２つの群（ＮＲおよびＳＣＲ）を上のパネルで色分けする。下のパネルには、ｃＳｏＴを構成する６つの遺伝子のｑＰＣＲ測定からのスケーリングされた－ΔΔＣｔ値を、高い遺伝子発現および低い遺伝子発現を黄色および青色で表す。
【図3A-3B】２つのグラフのセットを示し、１～２年のｃＳｏＴスコア値が、腎機能（ＭＤＲＤ）に関連することを示す。図３Ａ：４５０人の患者において、ｒピアソン相関によって示されるように、ｃＳｏＴスコアは、移植後１２ヶ月、２４ヶ月、３６ヶ月、および４８ヶ月の腎機能（ＭＤＲＤ式、単位ｍＬ／ｍｉｎ／１．７３ｍ２）と有意に関連している。Ｐ値と分析されたペアの数をそれぞれ棒グラフの上および中に示す。図３Ｂ：ドットプロットは、ｃＳｏＴスコア値と対応させて、移植後１２ヶ月の機能（ＭＤＲＤ）を表す。
【図4A-4B】は、ＮＲ群およびＳＣＲ群（図４Ａ）ならびに６つの組織学群（図４Ｂ）のそれぞれにおけるｃＳｏＴスコアを表す２つのバイオリンプロットのセットである。ＮＲとＳＣＲを比較する多重検定のために補正したＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定からのｐ値（図４Ａ）、および正常群と他の群を比較するダンの事後検定を使用したクラスカル＝ウォリスのｐ値を示す。
【図5A-5B】ＮＲおよびＳＣＲ群（図５Ａ）ならびに６つの組織学群（図５Ｂ）のそれぞれにおけるＡＫＲ１Ｃ３発現を表す２つのバイオリンプロットのセットである。遺伝子発現は、ｑＰＣＲ測定からの－ΔΔＣｔ値を表す。ＮＲとＳＣＲを比較する多重検定用に補正されたスチューデントｔ検定からのｐ値（図５Ａ）、および正常群と他の群を比較するダンの事後検定を使用したクラスカル＝ウォリスのｐ値を示す。
【図6A-6B】ＮＲおよびＳＣＲ群（図６Ａ）ならびに６つの組織学群（図６Ｂ）のそれぞれにおけるＴＣＬ１Ａ発現を表す２つのバイオリンプロットのセットである。遺伝子発現は、ｑＰＣＲ測定からの－ΔΔＣｔ値を表す。ＮＲとＳＣＲを比較する多重検定のために補正したスチューデントｔ検定からのｐ値（図６Ａ）、および正常群と他の群を比較するダンの事後検定を使用したクラスカル＝ウォリスのｐ値を示す。
【図7A-7B】ＮＲおよびＳＣＲ群（図７Ａ）ならびに６つの組織学群のそれぞれ（図７Ｂ）における移植後１２ヶ月の機能（ＭＤＲＤ式、単位ｍＬ／ｍｉｎ／１．７３ｍ２）を表す２つのバイオリンプロットのセットを示す。ＮＲとＳＣＲを比較する多重検定のために補正したスチューデントｔ検定からのｐ値（図７Ａ）、および正常群と他の群を比較するダンの事後検定を使用したクラスカル＝ウォリスのｐ値を示す。
【図8A-8D】原因を調べる生検および／または１年間の血清中クレアチンレベルが１６０μｍｏｌ／Ｌを超えた１５０人の患者の６つの組織学群のそれぞれにおける、ｃＳｏＴスコア（図８Ａ）、ＡＫＲ１Ｃ３発現（図８Ｂ）、ＴＣＬ１Ａ発現（図８Ｃ）および移植後１２ヶ月の機能（ＭＤＲＤ式、単位ｍＬ／ｍｉｎ／１．７３ｍ２）（図８Ｄ）を表す４つのバイオリンプロットのセットを示す。遺伝子発現は、ｑＰＣＲ測定からの－ΔΔＣｔ値を表す。正常組織群と他の組織学群を比較したダンの事後検定を用いたクラスカル＝ウォリスのｐ値を示す。
【図9】ＳＲＣリスクのロジスティック回帰モデルをまとめたフォレストプロットである。値は、オッズ比を示し、＊および＊＊＊は、それぞれｐ値＜０．０５および＜０．００１を表す。
【図10A-10B】ｔ検定ｐ値を有するＮＲ患者対ＳＣＲ患者の複合スコア（ＳＣＲ－ｓ）値を示すバイオリンプロット（図１０Ａ）と、ＳＣＲ－ｓの特異度および感度を示すＲＯＣ曲線（太い黒の曲線）、３つの臨床パラメータ（ロジスティック回帰）（斜線の曲線）、および移植後１２ヶ月の機能（灰色の曲線）（図１０Ｂ）を示す２つのグラフのセットである。元のサンプルと同じ数の対照および症例によるブートストラップ検定を使用したＲＯＣ曲線比較からのｐ値を示す。
【図11A-11C】複合スコアＳＣＲ－ｓにより、ｓＡＢＭＲ患者およびｓＴＣＭＲ患者をＮＲ患者と識別できることを示す３つのグラフのセットである。バイオリンプロットは、正常とｓＡＢＭＲおよびｓＴＣＭＲとを比較するダンの事後検定を伴うクラスカル＝ウォリスによる、ＮＲとｓＡＢＭＲ患者およびｓＴＣＭＲ患者とを比較するＳＣＲ－ｓ値を示す（図１１Ａ）。正常とｓＡＢＭＲ（図１１Ｂ）および正常とｓＴＣＭＲ（図１１Ｃ）を比較する対応するＲＯＣ曲線を、ＡＵＣと共に示す。
【図12A-12B】ＮＲおよびＳＣＲ群（図１２Ａ）ならびに６つの組織学群（図１２Ｂ）のそれぞれにおけるＡＫＲ１Ｃ３発現を表す２つのバイオリンプロットのセットである。遺伝子発現は、ｑＰＣＲ測定からの－ΔΔＣｔ値およびＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ尺度の正規化されたカウントのｌｏｇ２を表す。ＮＲとＳＣＲを比較する多重検定用に補正されたスチューデントｔ検定からのｐ値（図１２Ａ）、および正常群と他の群を比較するダンの事後検定を使用したクラスカル＝ウォリスのｐ値を示す。
【図13A-13B】ＮＲおよびＳＣＲ群（図１３Ａ）および６つの組織学群（図１３Ｂ）のそれぞれにおけるＴＣＬ１Ａ発現を表す２つのバイオリンプロットのセットである。遺伝子発現は、ｑＰＣＲ測定からの－ΔΔＣｔ値およびＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ尺度の正規化されたカウントのｌｏｇ２を表す。ＮＲとＳＣＲを比較する多重検定のために補正されたスチューデントｔ検定からのｐ値（図１３Ａ）、および正常群と他の群を比較するダンの事後検定を使用したクラスカル＝ウォリスのｐ値を示す。
【図14A-14D】ｃＳｏＴ（図１４Ａ）、ＡＫＲ１Ｃ３（図１４Ｂ）およびＴＣＬ１Ａ（図１４Ｃ）発現レベルが、他の患者と比較して、ｓＡＭＲ患者からの血液中で有意に減少し、腎機能（ＭＤＲＤ式、単位ｍＬ／ｍｉｎ／１．７３ｍ２）は、２つの群間で有意差がない（図１４Ｄ）ことを示す４つのバイオリンプロットのセットを示す。遺伝子発現は、ｑＰＣＲ測定からの－ΔΔＣｔ値を表す。２つの群を比較するマン・ホイットニー検定のｐ値を示す。
【図15A-15B】４つの臨床パラメータおよび２つの遺伝子が、移植１年後にｓＡＭＲに罹っていない患者の同定を可能にすることを示す一連のグラフである。図１５Ａのフォレストプロットには、ｓＡＢＭＲ－ｓのロジスティック回帰モデルを要約する。数値は、オッズ比を示し、＊、＊＊、＊＊＊は、それぞれｐ値＜０．０５、＜０．０１、＜０．００１を表す。図１５Ｂのバイオリンプロットは、ｑＰＣＲ（左）またはＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ（右）を使用して、第１コホートにおけるマン・ホイットニーｐ値により、他の患者と比較したｓＡＢＭＲのｓＡＢＭＲ－ｓ値を示す。点線は、最適な閾値を示す（ｑＰＣＲ式およびＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ式に関してそれぞれ２．４０および３．４５）。
【0197】
実施例
本発明を、以下の実施例によってさらに説明する。
本発明を、以下の実施例によってさらに説明する。
【0198】
実施例１
材料および方法
試験集団
この非介入研究プロジェクトは、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆ Ｎａｎｔｅｓ（Ｆｒａｎｃｅ）、ＰａｒｉｓＮｅｃｋｅｒ Ｈｏｓｐｉｔａｌ（Ｆｒａｎｃｅ）およびＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆ Ｌｙｏｎ（Ｆｒａｎｃｅ）における腎移植患者の追跡調査を含んだ。これらのデータは、多施設ＤＩＶＡＴデータベースに前向きに収集され、Ｆｒｅｎｃｈ「Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ ｏｎ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｌｉｂｅｒｔｙ」［ＣＮＩＬ］（ＤＲ２０２５０８７ Ｎ ９１４１８４，Ｆｅｂ． １５， ２０１５）およびｔｈｅ Ｆｒｅｎｃｈ Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｈｉｇｈｅｒ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ｆｉｌｅ １３．３３４ｃｏｈｏｒｔ ＤＩＶＡＴ ＲＣ１２＿０４５２，ｗｗｗ．ｄｉｖａｔ．ｆｒ）によって承認された。
材料および方法
試験集団
この非介入研究プロジェクトは、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆ Ｎａｎｔｅｓ（Ｆｒａｎｃｅ）、ＰａｒｉｓＮｅｃｋｅｒ Ｈｏｓｐｉｔａｌ（Ｆｒａｎｃｅ）およびＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆ Ｌｙｏｎ（Ｆｒａｎｃｅ）における腎移植患者の追跡調査を含んだ。これらのデータは、多施設ＤＩＶＡＴデータベースに前向きに収集され、Ｆｒｅｎｃｈ「Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ ｏｎ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｌｉｂｅｒｔｙ」［ＣＮＩＬ］（ＤＲ２０２５０８７ Ｎ ９１４１８４，Ｆｅｂ． １５， ２０１５）およびｔｈｅ Ｆｒｅｎｃｈ Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｈｉｇｈｅｒ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ｆｉｌｅ １３．３３４ｃｏｈｏｒｔ ＤＩＶＡＴ ＲＣ１２＿０４５２，ｗｗｗ．ｄｉｖａｔ．ｆｒ）によって承認された。
【0199】
各患者について、移植から１年後のサーベイランス生検の際に、ＰＡＸｇｅｎｅ（商標）チューブ（ＰｒｅＡｎａｌｙｔｉｘ，Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に血液サンプルを採取した。サンプルを、参加した３つの病院のｌｏｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｅｎｔｅｒ（ＣＲＢ）に保管し、共通のソフトウェア上で仮想的に相互利用した（ＣＥＮＴＡＵＲＥ ｂｉｏｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎは、２００８年８月１３日以降、Ｎ ＰＦＳ０８０１７の下で、Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｒｅｓｅａｒｃｈに宣言した。ｗｗｗ．ｆｏｎｄａｔｉｏｎｃｅｎｔａｕｒｅ．ｏｒｇ）。各サンプルは、ＤＩＶＡＴデータベースの臨床データに関連する。すべての患者について書面による同意を得た。報告されている臨床研究活動は、イスタンブール宣言の原則と一致しており、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆ Ｎａｎｔｅｓの推奨実践に沿っている。
【0200】
合計６００人の単独の患者および一連の患者が、移植後１年の時点で、ＰＡＸｇｅｎｅ（商標）血液サンプルとサーベイランス生検との組み合わせによる選択基準を満たした。これら６００人の患者のうち、４５０人は、１年後（血清中クレアチニンレベルが１６０μｍｏｌ／Ｌ未満；平均ｅＧＦＲ（ＭＤＲＤ）＝５７．７９±１４．８６ｍＬ／ｍｉｎ／１．７３ｍ２）およびプロトコル生検において良好な機能を示し、ＳＣＲの非侵襲性バイオマーカーの恩恵を受けるが、１５０人の患者が、適応症の生検を受け、１６０μｍｏｌ／Ｌを超える１年血清中クレアチニン値を有した（図１）。臨床的特徴を表１に要約する：成人、２００８年１月から２０１６年１月の間に腎移植を受け、ＡＢＯ適合性、心臓の鼓動があるドナーまたは死亡したドナーからの腎移植。多臓器移植を受けた患者を含めなかった。入手可能なデータは、レシピエントの特徴（年齢、性別、糖尿病歴、心血管疾患歴および悪性腫瘍歴、初期の腎疾患（再発の有無）、腎代替療法およびサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）血清学）を含んだ。ベースライン移植パラメータは、移植ランク、低温虚血時間、ＨＬＡ－Ａ－Ｂ－ＤＲ不適合の数、移植前ドナー特異的抗体（ＤＳＡ）、導入療法（枯渇型と非枯渇型）および移植片機能遅延（ＤＧＦ、術後１週間以内の透析の必要性によって定義される）であった。ドナーの特徴は、年齢、性別、ドナーの種類（生存または死亡）、および最後の血清中クレアチニンレベルに関係した。移植後１年目に収集したパラメータは、移植後３ヶ月および１２ヶ月の血清中クレアチニンレベル、拒絶反応数、１２ヶ月後の維持処置（シクロスポリンＡ（ＣｓＡ）、タクロリムス、ｍＴＯＲｉ、ＭＭＦ／ＭＰＡ、ステロイド）およびｔ移植後１２ヶ月でのｄｅ ｎｏｖｏＤＳＡの存在であった。追跡調査およびデータ収集は、透析への逆戻り、死亡、または再移植時に中止する。
【0201】
表１：４５０人の移植患者の特徴
表１は、選択基準を満たし、対応のあるプロトコル生検を受け、移植後１年で正常な機能（血清中クレアチニンレベル＜１６０μｍｏｌ／Ｌ）を伴う血液ＲＮＡサンプルを有する４５０人の患者の臨床特徴を示す。
表１は、選択基準を満たし、対応のあるプロトコル生検を受け、移植後１年で正常な機能（血清中クレアチニンレベル＜１６０μｍｏｌ／Ｌ）を伴う血液ＲＮＡサンプルを有する４５０人の患者の臨床特徴を示す。
【表1】
【0202】
生検の評価
腎生検を、２０１５年のバンフ分類に従って、本発明者らの施設の腎臓病理学者によって解釈し、再検討した（Ｌｏｕｐｙ ｅｔａｌ．，２０１７．ＡｍＪＴｒａｎｓｐｌａｎｔ．１７（１）：２８４１）。４５０のプロトコル生検を２つの群に分類した（図１および図２）。
（１）ＳＣＲ群（ＳＣＲ、ｎ＝４５）：ＳＣＲのエビデンスを有する生検、抗体（ｓＡＢＭＲ、ｎ＝３３）媒介拒絶反応またはＴ細胞（ｓＴＣＭＲ、ｎ＝１２）媒介拒絶反応のいずれかを示し、患者は、それに応じて処置を受けた；
（２）非拒絶反応群（ＮＲ、ｎ＝４０５）：生検間質性線維症および尿細管萎縮（ＩＦＴＡ）および炎症性孤立性ＩＦＴＡグレード１（ｉＩＦＴＡ）を示す、正常および正常以下の組織学を有する生検生検をプールし、正常な生検とみなした（正常、ｎ＝３４２）；グレード２および３の炎症を伴うＩＦＴＡを有する生検（ｉＦＩＡＴ、ｎ＝９）、患者が処置を受けていない境界領域の変化を有する生検（境界線、ｎ＝１８）、および他の病変、例えば再発性糸球体腎炎（ｎ＝５）またはｄｅ ｎｏｖｏ糸球体腎炎（ｎ＝３）、ＢＫウイルス腎症（ｎ＝２）、およびＣＮＩ毒性（ｎ＝１）を伴う生検（その他、ｎ＝３６）。
腎生検を、２０１５年のバンフ分類に従って、本発明者らの施設の腎臓病理学者によって解釈し、再検討した（Ｌｏｕｐｙ ｅｔａｌ．，２０１７．ＡｍＪＴｒａｎｓｐｌａｎｔ．１７（１）：２８４１）。４５０のプロトコル生検を２つの群に分類した（図１および図２）。
（１）ＳＣＲ群（ＳＣＲ、ｎ＝４５）：ＳＣＲのエビデンスを有する生検、抗体（ｓＡＢＭＲ、ｎ＝３３）媒介拒絶反応またはＴ細胞（ｓＴＣＭＲ、ｎ＝１２）媒介拒絶反応のいずれかを示し、患者は、それに応じて処置を受けた；
（２）非拒絶反応群（ＮＲ、ｎ＝４０５）：生検間質性線維症および尿細管萎縮（ＩＦＴＡ）および炎症性孤立性ＩＦＴＡグレード１（ｉＩＦＴＡ）を示す、正常および正常以下の組織学を有する生検生検をプールし、正常な生検とみなした（正常、ｎ＝３４２）；グレード２および３の炎症を伴うＩＦＴＡを有する生検（ｉＦＩＡＴ、ｎ＝９）、患者が処置を受けていない境界領域の変化を有する生検（境界線、ｎ＝１８）、および他の病変、例えば再発性糸球体腎炎（ｎ＝５）またはｄｅ ｎｏｖｏ糸球体腎炎（ｎ＝３）、ＢＫウイルス腎症（ｎ＝２）、およびＣＮＩ毒性（ｎ＝１）を伴う生検（その他、ｎ＝３６）。
【0203】
ＲＮＡの単離
末梢血サンプルを、ＰＡＸｇｅｎｅ（商標）チューブ（ＰｒｅＡｎａｌｙｔｉｘ）に収集し、保管し、８０℃で発送した。総ＲＮＡの抽出および精製は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆ ＮａｎｔｅｓのＣＲＢで、製造業者のプロトコルに従って、ＰＡＸｇｅｎｅ（商標）Ｂｌｏｏｄ ｍｉＲＮＡ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して実施した。Ｎａｎｏｄｒｏｐ ＮＤ－１０００を使用して総ＲＮＡを定量し、５００ｎｇをリアルタイム定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）およびＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ法に使用した。
末梢血サンプルを、ＰＡＸｇｅｎｅ（商標）チューブ（ＰｒｅＡｎａｌｙｔｉｘ）に収集し、保管し、８０℃で発送した。総ＲＮＡの抽出および精製は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆ ＮａｎｔｅｓのＣＲＢで、製造業者のプロトコルに従って、ＰＡＸｇｅｎｅ（商標）Ｂｌｏｏｄ ｍｉＲＮＡ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して実施した。Ｎａｎｏｄｒｏｐ ＮＤ－１０００を使用して総ＲＮＡを定量し、５００ｎｇをリアルタイム定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）およびＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ法に使用した。
【0204】
ｃＳｏＴスコアの遺伝子発現
ｑＰＣＲのために、Ｈｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， Ｗａｌｔｈａｍ；ＭＡ，ＵＳＡ）を使用して、ｃＤＮＡを合成した。ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｆａｓｔ Ａｄｖａｎｃｅｄマスターミックスを、ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ（商標）リアルタイムＰＣＲシステム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により、最終容量１０μＬを用いて、使用した。遺伝子発現は、市販のＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ（表２に記載）を用いて評価し、Ｂ２ＭおよびＨＰＲＴ１参照遺伝子の定量サイクル値（Ｃｑ）の幾何平均によって正規化した。遺伝子発現を二連で実行し、０．５サイクルを超える差または３５を超えるＣｑを有する遺伝子発現を再度測定し、矛盾する場合は、廃棄した。末梢血白血球からの総ＲＮＡの市販サンプル（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ Ｅｕｒｏｐｅ ＳＡＳ、ＳａｉｎｔＧｅｒｍａｉｎｅｎＬａｙｅ，Ｆｒａｎｃｅ）をキャリブレーターとして使用して、２－ΔΔＣｔ法に従って遺伝子発現を計算した。
ｑＰＣＲのために、Ｈｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， Ｗａｌｔｈａｍ；ＭＡ，ＵＳＡ）を使用して、ｃＤＮＡを合成した。ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｆａｓｔ Ａｄｖａｎｃｅｄマスターミックスを、ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ（商標）リアルタイムＰＣＲシステム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により、最終容量１０μＬを用いて、使用した。遺伝子発現は、市販のＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ（表２に記載）を用いて評価し、Ｂ２ＭおよびＨＰＲＴ１参照遺伝子の定量サイクル値（Ｃｑ）の幾何平均によって正規化した。遺伝子発現を二連で実行し、０．５サイクルを超える差または３５を超えるＣｑを有する遺伝子発現を再度測定し、矛盾する場合は、廃棄した。末梢血白血球からの総ＲＮＡの市販サンプル（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ Ｅｕｒｏｐｅ ＳＡＳ、ＳａｉｎｔＧｅｒｍａｉｎｅｎＬａｙｅ，Ｆｒａｎｃｅ）をキャリブレーターとして使用して、２－ΔΔＣｔ法に従って遺伝子発現を計算した。
【0205】
表２：ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇおよびＴａｑＭａｎ（登録商標）情報を使用して解析した遺伝子。
測定した１３個の遺伝子について、ＴｔａｑＭａｎ（登録商標）プローブ参照（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）およびＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ標的配列を示す。
測定した１３個の遺伝子について、ＴｔａｑＭａｎ（登録商標）プローブ参照（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）およびＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ標的配列を示す。
【表2】
【0206】
ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ ＰｌｅｘＳｅｔ（商標）Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ，ＵＳＡ）を使用して、製造業者の説明書に従って、６つの遺伝子（ＡＫＲ１Ｃ３、ＣＤ４０、ＣＴＬＡ４、ＩＤ３、ＭＺＢ１、およびＴＣＬ１Ａ）および６つの参照遺伝子を測定した。ＭＳ４Ａ１遺伝子（ＣＤ２０をコードする）も並行して測定した。
【0207】
これらの６つの遺伝子は、これら６つの遺伝子の発現レベルと２つの臨床パラメータ（移植時および採血時の移植患者の年齢）を含む、腎移植レシピエントにおける自然発生の臨床的免疫寛容（すなわち、複数年にもわたる免疫抑制のない安定した許容可能な移植片機能）に関連する複合スコア（ｃＳｏＴ）について記載する、本発明者らによる以前の研究（国際公開第２０１８／０１５５５１号；Ｄａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１７．ＫｉｄｎｅｙＩｎｔ．９１（６）：１４７３１４８１）に基づいて選択された。
【0208】
目的の遺伝子の捕捉プローブは、ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ ｓｕｐｐｏｒｔによって設計され、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ，Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ）によって合成された。滴定実験により、プロバイダーの推奨に従って、カートリッジシグナルを飽和させないように、５００ｎｇの総ＲＮＡ投入量を選択して、非標識プローブを使用して、３つの高発現遺伝子（ＡＣＴ、Ｂ２Ｍ、ＧＡＰＤＨ）の９９％のシグナル減衰を実施した。２つのロットの試薬間のキャリブレーションを、ｑＰＣＲに使用される一般的なキャリブレーターサンプルによりＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ ｓｕｐｐｏｒｔによって実施した。ＩＤ３値は、以下のように計算した発現閾値を下回っていたため、廃棄した：
【数11】
【0209】
６つの参照遺伝子（ＡＣＴ、Ｂ２Ｍ、ＧＡＰＤＨ、ＨＰＲＴ１、ＴＵＢＡ４Ａ、およびＹＷＨＡＺ）の幾何平均を使用して、ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ ｎＳｏｌｖｅｒ（商標）ソフトウェア４．０を使用して遺伝子発現を正規化した。品質管理が不良で、値が発現閾値を下回るサンプルは、廃棄した。反復実験のサンプルについては、相関関係が０．９５を超えた場合に、発現値の平均を計算した。正規化されたカウントのＬｏｇ２または－ΔΔＣｔを、それぞれＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ値およびｑＰＣＲ値の下流の分析に使用した。
【0210】
統計分析
２つの群の比較を、３０を超えるサンプルによるスチューデントｔ検定を使用して実施し、複数群の比較を、連続変数についてはノンパラメトリッククラスカル＝ウォリスとダンの事後検定を使用して実施し、カテゴリー変数については、χ２検定またはフィッシャーの直接確率検定を使用して実施した。ピアソン相関を使用して、連続データ間の関係を評価した。段階回帰を使用して組織学的群と説明変数との間の関係を評価するためにロジスティック回帰を構築し、赤池情報量基準（ＡＩＣ）を使用して比較した。適合性の欠如の非存在を、重み付けされていない二乗和検定を使用して評価した（Ｈｏｓｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９７．ＳｔａｔＭｅｄ．１６（９）：９６５８０）（パッケージｒｍｓを使用）。受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線下面積（ＡＵＣ）、および９５％信頼区間（ＣＩ）を使用して、モデルの性能を評価し、元のサンプル（パッケージｐＲＯＣ）と同じ数の対照および症例を使用したブートストラップ検定（ｎ＝１０００）を使用して、ＲＯＣ曲線の比較を実行した（Ｒｏｂｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０１１．ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．１２：７７）。内部検証を、ｃａｒｅｔパッケージを用いて、ブートストラップ（ｎ＝１０００）によって実施した（Ｓｔｅｙｅｒｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，２００１．ＪＣｌｉｎＥｐｉｄｅｍｉｏｌ．５４（８）：７７４８１）。適切な場合には、多重検定を、Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ－Ｈｏｃｈｂｅｒｇ法の補正により補正した。分析を、Ｒ４．０．３およびＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ｖ．９（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して実施した。
２つの群の比較を、３０を超えるサンプルによるスチューデントｔ検定を使用して実施し、複数群の比較を、連続変数についてはノンパラメトリッククラスカル＝ウォリスとダンの事後検定を使用して実施し、カテゴリー変数については、χ２検定またはフィッシャーの直接確率検定を使用して実施した。ピアソン相関を使用して、連続データ間の関係を評価した。段階回帰を使用して組織学的群と説明変数との間の関係を評価するためにロジスティック回帰を構築し、赤池情報量基準（ＡＩＣ）を使用して比較した。適合性の欠如の非存在を、重み付けされていない二乗和検定を使用して評価した（Ｈｏｓｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９７．ＳｔａｔＭｅｄ．１６（９）：９６５８０）（パッケージｒｍｓを使用）。受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線下面積（ＡＵＣ）、および９５％信頼区間（ＣＩ）を使用して、モデルの性能を評価し、元のサンプル（パッケージｐＲＯＣ）と同じ数の対照および症例を使用したブートストラップ検定（ｎ＝１０００）を使用して、ＲＯＣ曲線の比較を実行した（Ｒｏｂｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０１１．ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．１２：７７）。内部検証を、ｃａｒｅｔパッケージを用いて、ブートストラップ（ｎ＝１０００）によって実施した（Ｓｔｅｙｅｒｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，２００１．ＪＣｌｉｎＥｐｉｄｅｍｉｏｌ．５４（８）：７７４８１）。適切な場合には、多重検定を、Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ－Ｈｏｃｈｂｅｒｇ法の補正により補正した。分析を、Ｒ４．０．３およびＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ｖ．９（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して実施した。
【0211】
結果
移植患者コホートの人口統計学的説明
選択基準を満たし、移植後１年でプロトコル生検と血液ＲＮＡサンプルをペアで採取し、血清中クレアチニンレベルが１６０μｍｏｌ／Ｌ未満であった４５０人の腎移植患者の臨床的特徴を表１に要約する。患者は、主にカルシニューリン阻害剤（ＣＮＩ：９３．３％；主にタクロリムス：８５．１％）、抗増殖剤（８６．０％、ミコフェノール酸モフェチル（ＭＭＦ）、ミコフェノール酸（ＭＰＡ）またはアザチオプリンを含む）、およびコルチコステロイドレジメン（７４．４％）による標準維持免疫抑制療法を受けた。７４人の患者（１６．４％）が移植時に抗ＨＬＡ ＤＳＡを有し、８９人（１９．７８％）が移植の１年後にＤＳＡを示した。
移植患者コホートの人口統計学的説明
選択基準を満たし、移植後１年でプロトコル生検と血液ＲＮＡサンプルをペアで採取し、血清中クレアチニンレベルが１６０μｍｏｌ／Ｌ未満であった４５０人の腎移植患者の臨床的特徴を表１に要約する。患者は、主にカルシニューリン阻害剤（ＣＮＩ：９３．３％；主にタクロリムス：８５．１％）、抗増殖剤（８６．０％、ミコフェノール酸モフェチル（ＭＭＦ）、ミコフェノール酸（ＭＰＡ）またはアザチオプリンを含む）、およびコルチコステロイドレジメン（７４．４％）による標準維持免疫抑制療法を受けた。７４人の患者（１６．４％）が移植時に抗ＨＬＡ ＤＳＡを有し、８９人（１９．７８％）が移植の１年後にＤＳＡを示した。
【0212】
ｃＳｏＴスコアは、ＳＣＲ患者では、移植後１年で低下する。
移植後１年において、良好な機能（血清中クレアチニンレベルが１６０μｍｏｌ／Ｌ未満）を有する４５０人の患者において、本発明者らは、ｃＳｏＴスコア（国際公開第２０１８／０１５５５１号およびＤａｎｇｅ ｅｔ ａｌ．，２０１７．Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ．９１（６）：１４７３１４８１に記載）が、移植後１２ヶ月、２４ヶ月、３６ヶ月、および４８ヶ月で、腎機能（ＭＤＲＤ）に有意に関連する（ｐ＜０．０１））（図３Ａおよび図３Ｂ）ことを見出した。この分類により、本発明者らは、ＮＲ患者と比較して、ＳＣＲ患者の血液中では、ｃＳｏＴスコアが顕著に低下しており（調整ｐ＝０．０１３、図４Ａおよび４Ｂ）、ＲＯＣ ＡＵＣが０．６１５（９５％ＣＩ＝［０．５３００．７００］）であることを見出した。
移植後１年において、良好な機能（血清中クレアチニンレベルが１６０μｍｏｌ／Ｌ未満）を有する４５０人の患者において、本発明者らは、ｃＳｏＴスコア（国際公開第２０１８／０１５５５１号およびＤａｎｇｅ ｅｔ ａｌ．，２０１７．Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ．９１（６）：１４７３１４８１に記載）が、移植後１２ヶ月、２４ヶ月、３６ヶ月、および４８ヶ月で、腎機能（ＭＤＲＤ）に有意に関連する（ｐ＜０．０１））（図３Ａおよび図３Ｂ）ことを見出した。この分類により、本発明者らは、ＮＲ患者と比較して、ＳＣＲ患者の血液中では、ｃＳｏＴスコアが顕著に低下しており（調整ｐ＝０．０１３、図４Ａおよび４Ｂ）、ＲＯＣ ＡＵＣが０．６１５（９５％ＣＩ＝［０．５３００．７００］）であることを見出した。
【0213】
ｃＳｏＴスコアから、ＳＣＲを示す可能性が低い患者を診断するには、ＡＫＲ１Ｃ３およびＴＣＬ１Ａで十分である。
本発明者らは、最初に、ｃＳｏＴスコアを構成する６つの遺伝子および２つの臨床パラメータを、正常な腎機能を有する４５０名の患者のＳＣＲを診断する能力について、独立して、および関連付けて検定を行った。本発明者らは、最初に、２つの臨床パラメータ（移植時および採血時のレシピエントの年齢）が、ＮＲ患者と比較して、ＳＣＲ患者においては意差がなく（それぞれｐ＝０．９３２および０．９３６）、したがってｃＳｏＴスコアが患者を識別する能力に影響を有しないことを示す。
本発明者らは、最初に、ｃＳｏＴスコアを構成する６つの遺伝子および２つの臨床パラメータを、正常な腎機能を有する４５０名の患者のＳＣＲを診断する能力について、独立して、および関連付けて検定を行った。本発明者らは、最初に、２つの臨床パラメータ（移植時および採血時のレシピエントの年齢）が、ＮＲ患者と比較して、ＳＣＲ患者においては意差がなく（それぞれｐ＝０．９３２および０．９３６）、したがってｃＳｏＴスコアが患者を識別する能力に影響を有しないことを示す。
【0214】
６つの遺伝子のうち、ＮＲ患者と比較して、ＳＣＲ患者の血液中では、ＡＫＲ１Ｃ３およびＴＣＬ１Ａ発現のみが有意に減少し（それぞれ、補正ｐ値＝０．０１６および＜０．０００１）（ＡＫＲ１Ｃ３については、図５Ａおよび図５Ｂ、ＴＣＬ１Ａについては図６Ａおよび図６Ｂ）、ＳＣＲ群の４５人の患者の平均減少率は、ＡＫＲ１Ｃ３について４５．９％、ＴＣＬ１Ａについて８１．３％であった。
【0215】
単独で使用する場合、ＡＫＲ１Ｃ３およびＴＣＬ１Ａは、それぞれ、ＡＵＣ０．６２３（９５％ＣＩ＝［０．６０４～０．７４１］）および０．６４０（９５％ＣＩ＝［０．５５８～０．７２１］）でＳＣＲ患者の識別を可能にしたできた。共に関連付けると、これら２つの遺伝子は、、ＡＵＣ０．７０３（９５％ＣＩ＝［０．６２９～０．７７７］）で、ＳＣＲ患者のさらに高度かつ良好な識別を可能にした。
【0216】
次に、これら４５０人の患者の組織学的診断を調べた。両方の遺伝子は、正常な組織型を有する患者と比較して、ｓＡＢＭＲ患者では有意に減少した（ＡＫＲ１Ｃ３およびＴＣＬ１Ａについて、それぞれｐ＝０．００６７およびｐ＝０．０１４５）。正常な組織像を有する患者と比較して、ｓＴＣＭＲを有する患者では、ＡＫＲ１Ｃ３の減少傾向も観察された（ｐ＝０．０７３）（図５Ｂ）。２つの遺伝子の関連性により、ｓＡＢＭＲと正常な組織像との差異がさらに強化される（ｐ＝０．０００２）。比較すると、移植後１年での腎機能は、正常な組織像とｓＡＢＭＲまたはｓＴＣＭＲのいずれかとの間で差はなかった（図７Ａおよび７Ｂ）。
【0217】
【0218】
新しい複合モデルは、移植後１年でＳＣＲに罹っていない患者を特定することを可能にする。
単変量解析でＮＲと比較して、ＳＣＲに有意に関連する臨床パラメータを、採血前の拒絶反応エピソードの経験（ｐ＜０．０００１）、移植前および採血時のＤＳＡの存在（それぞれ、ｐ＜０．００１およびｐ＝０．００２５）、レシピエントの性別（ｐ＝０．００５７）、コルチコステロイドおよびＣｓＡの摂取（それぞれｐ＝０．０１２およびｐ＝０．０１８）（表３）として決定した。採血前の拒絶反応エピソードの経験、レシピエントの性別、および採血時のＣｓＡの摂取のみを、多変量解析においてＳＣＲと有意に関連するものとして保持した（図９および表３）。
単変量解析でＮＲと比較して、ＳＣＲに有意に関連する臨床パラメータを、採血前の拒絶反応エピソードの経験（ｐ＜０．０００１）、移植前および採血時のＤＳＡの存在（それぞれ、ｐ＜０．００１およびｐ＝０．００２５）、レシピエントの性別（ｐ＝０．００５７）、コルチコステロイドおよびＣｓＡの摂取（それぞれｐ＝０．０１２およびｐ＝０．０１８）（表３）として決定した。採血前の拒絶反応エピソードの経験、レシピエントの性別、および採血時のＣｓＡの摂取のみを、多変量解析においてＳＣＲと有意に関連するものとして保持した（図９および表３）。
【0219】
表３：ＳＣＲ診断の臨床パラメータの単変量および多変量ロジスティック回帰分析
【表3】
【0220】
次に、２つの遺伝子ＡＫＲ１Ｃ３およびＴＣＬ１Ａの発現、ならびにこれら３つの臨床変数に基づいて複合モデルを実施し、正常な移植片機能を有する４５０人の患者において、その識別能力を試験した。このスコア（ＳＣＲ－ｓと称する）は、ロジスティック回帰を使用して構築され、拒絶反応エピソードの経験およびＣｓＡの摂取は、ＳＣＲのリスクと正の相関があり、レシピエントの性別（レシピエントの男性対女性）、ならびにＴＣＬ１ＡおよびＡＫＲ１Ｃ３の発現は、ＳＣＲのリスクと負の相関があった（尤度比ｐ＜０．０００１；図９）。あるいは、本発明者らは、拒絶反応エピソードの経験およびＣｓＡの摂取の経験が、ＮＲ状態と負に関連するが、レシピエントの性別（レシピエントの男性対女性）、ならびにＴＣＬ１ＡおよびＡＫＲ１Ｃ３の発現は、ＮＲ状態と正に関連すると定義することができる。
【0221】
代替のスコアでは、ＣｓＡの摂取を考慮するのではなく、このパラメータを、臨床現場でシクロスポリンＡよりもはるかに多く使用されている別の免疫抑制剤であるタクロリムスの摂取に置き換えた。ＳＣＲ－ｓでは、タクロリムスの摂取は、ＳＣＲのリスクと負に関連した（あるいは、ＮＲ状態と正に関連した）。ＳＣＲ－ｓにおけるＣｓＡの摂取およびタクロリムスの摂取の差は、自明であり、患者がＣｓＡを摂取する場合は、典型的には、タクロリムスを摂取せず、このパラメータは、ＳＣＲのリスクと正に関連する；逆に、患者がタクロリムスを摂取する場合、典型的には、ＣｓＡを摂取せず、このパラメータは、ＳＣＲのリスクと負に関連する。
【0222】
このＳＣＲ－ｓは、ＮＲ群と比較して、ＳＣＲ群で有意に高く（ＳＣＲ群の患者４５人中、平均６７．７０％の増加）（ｐ＜０．０００１；図１０Ａ）、ＡＵＣ０．８３８（９５％ＣＩ＝［０．７７９～０．８９７］）で、高い識別能力を示し、臨床パラメータのみよりも有意に高かった（ＡＵＣ＝０．７９７（９５％ＣＩ＝［０．７２６～０．８６７］）；ｐ＝０．０１２６；図１０Ｂ）。さらに、ＳＣＲ－ｓは、ＮＲと比較して、ｓＡＢＭＲまたはｓＴＣＭＲにおいて有意に高い値を示し（ｐ＜０．０００１）、両群で独立して試験した場合に、同様のＡＵＣを示した（ｓＡＢＭＲおよびｓＴＣＭＲは、それぞれ、ＡＵＣ＝０．８４３（９５％ＣＩ＝［０．７７３～０．９１４］および０．８５０（９５％ＣＩ＝［０．７６１～０．９３９］であった；図１１Ａ～Ｃ）。最適閾値（ヨーデン指標）では、特異度および感度はそれぞれ０．７８および０．８０であり、４０５人のＮＲ患者のうち３１７人の患者が真陰性と同定され、４５人のＳＣＲ患者のうち３６人が真陽性と同定された（図１０Ａ）。このような閾値では、陰性適中率（ＮＰＶ）は９７．２％であり、陽性適中率（ＰＰＶ）は２９．０％であった。最後に、ブートストラップリサンプリング（ｎ＝１０００）を使用して、モデルの最適性を補正する内部検証により、ＡＵＣ ０．８１０（９５％ＣＩ＝［０．７３～０．８９）で高い性能が得られた。
【0223】
独立したプラットフォームでのＳＣＲの検証
ＳＣＲ－ｓは、事前に使用した標準ｑＰＣＲとは異なるプローブを使用した酵素非含有プローブハイブリダイゼーションベースのＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ法を使用して測定した。本発明者らは、ｑＰＣＲとＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ遺伝子発現との間に高く有意な相関があることを見出した（ＴＣＬ１ＡおよびＡＫＲ１Ｃ３についてそれぞれｒ＝０．９２および０．７７８；ｐ＜０．００１）（表４）。
ＳＣＲ－ｓは、事前に使用した標準ｑＰＣＲとは異なるプローブを使用した酵素非含有プローブハイブリダイゼーションベースのＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ法を使用して測定した。本発明者らは、ｑＰＣＲとＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ遺伝子発現との間に高く有意な相関があることを見出した（ＴＣＬ１ＡおよびＡＫＲ１Ｃ３についてそれぞれｒ＝０．９２および０．７７８；ｐ＜０．００１）（表４）。
【0224】
表４：血液遺伝子発現は、測定方法に依存しない
相関図は、４５０人の患者のｑＰＣＲとＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ測定値との間の遺伝子発現のｒピアソン相関（１～－１）を表す。
相関図は、４５０人の患者のｑＰＣＲとＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ測定値との間の遺伝子発現のｒピアソン相関（１～－１）を表す。
【表4】
【0225】
酵素を含まないプローブハイブリダイゼーションベースのＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ法を使用して、ＮＲ患者と比較して、ＳＣＲ患者におけるＡＫＲ１Ｃ３およびＴＣＬ１Ａの有意な下方制御（それぞれｐ＝０．００４５および０．０１３）（ＡＫＲ１Ｃ３については図１２Ａ～Ｂ、ＴＣＬ１Ａについては図１３Ａ～Ｂ）およびＳＣＲ－ｓがＡＵＣ０．８１５（９５％ＣＩ＝［０．７２８０．８８０］）でＳＣＲ患者を識別する能力を確認した。
【0226】
独立した多施設検証セットにおけるＳＣＲ－ｓの検証
検証セットは、ＳＣＲを有する患者１１人を含む１１０人の患者を含んだ。このコホートでは、確立されたＳＣＲ－ｓは、１１人のＳＣＲ患者のうち９人の正確な分類を可能にし、０．８８４（９５％ＣＩ＝［０．７０１～０．９９］）のＡＵＣをもたらした（図１４）。
検証セットは、ＳＣＲを有する患者１１人を含む１１０人の患者を含んだ。このコホートでは、確立されたＳＣＲ－ｓは、１１人のＳＣＲ患者のうち９人の正確な分類を可能にし、０．８８４（９５％ＣＩ＝［０．７０１～０．９９］）のＡＵＣをもたらした（図１４）。
【0227】
訓練セットで決定された最適閾値（ヨーデン指標）を使用すると、特異度および感度は、それぞれ０．７９８おおよび０．９０９であり、ＮＰＶは、９８．７％であった。
【0228】
考察
ＳＣＲは、正常な同種移植片の機能を有する患者からのプロトコル生検でのみ検出され、移植後１年において、腎生検の最大２５％に影響を及ぼし、その発生率は、移植後時間と逆相関している（ＣｏｕｖｒａｔＤｅｓｖｅｒｇｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，２０１９．ＮｅｐｈｒｏｌＤｉａｌＴｒａｎｓｐｌａｎｔ．３４（４）：７０３７１１；Ｌｏｕｐｙ ｅｔ ａｌ．，２０１５．ＪＡｍＳｏｃＮｅｐｈｒｏｌ．２６（７）：１７２１３１；Ｎａｎｋｉｖｅｌｌ ｅｔａｌ．，２００４．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．７８（２）：２４２９）。
ＳＣＲは、正常な同種移植片の機能を有する患者からのプロトコル生検でのみ検出され、移植後１年において、腎生検の最大２５％に影響を及ぼし、その発生率は、移植後時間と逆相関している（ＣｏｕｖｒａｔＤｅｓｖｅｒｇｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，２０１９．ＮｅｐｈｒｏｌＤｉａｌＴｒａｎｓｐｌａｎｔ．３４（４）：７０３７１１；Ｌｏｕｐｙ ｅｔ ａｌ．，２０１５．ＪＡｍＳｏｃＮｅｐｈｒｏｌ．２６（７）：１７２１３１；Ｎａｎｋｉｖｅｌｌ ｅｔａｌ．，２００４．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．７８（２）：２４２９）。
【0229】
このような病変の検出は、好ましくない結果に関連し（Ｆｉｌｉｐｐｏｎｅ＆Ｆａｒｂｅｒ，２０２０．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ；Ｌｏｕｐｙ ｅｔ ａｌ．，２０１５．ＪＡｍＳｏｃＮｅｐｈｒｏｌ．２６（７）：１７２１３１；Ｍｅｈｔａ ｅｔ ａｌ．，２０１７．ＣｌｉｎＴｒａｎｓｐｌａｎｔ．３１（５）；Ｎａｎｋｉｖｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，２００４．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．７８（２）：２４２９；Ｒｕｓｈ＆Ｇｉｂｓｏｎ，２０１９．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．１０３（６）：ｅ１３９ｅ１４５；Ｓｈｉｓｈｉｄｏ ｅｔ ａｌ．，２００３．ＪＡｍＳｏｃＮｅｐｈｒｏｌ．１４（４）：１０４６５２）、早期処置は、グラフトのアウトカムにとって有益である（Ｋｅｅ ｅｔ ａｌ．，２００６．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．８２（１）：３６４２；Ｐａｒａｊｕｌｉ ｅｔ ａｌ．，２０１９．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．１０３（８）：１７２２１７２９；Ｒｕｓｈ ｅｔ ａｌ．，１９９８．ＪＡｍＳｏｃＮｅｐｈｒｏｌ．９（１１）：２１２９３４）。したがって、非侵襲的診断ツールを使用してそのような潜行性病変を検出することにより、移植の結果が改善され、ＳＣＲに罹っていない患者を診断することは、重篤な組織学的病変のない患者に対する侵襲的処置を回避し、患者管理を改善するのにも役立ち得る（ＣｏｕｖｒａｔＤｅｓｖｅｒｇｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，２０１９．ＮｅｐｈｒｏｌＤｉａｌＴｒａｎｓｐｌａｎｔ．３４（４）：７０３７１１；Ｆｒｉｅｄｅｗａｌｄ＆Ａｂｅｃａｓｓｉｓ，２０１９．ＡｍＪＴｒａｎｓｐｌａｎｔ．１９（７）：２１４１２１４２）。
【0230】
以前、本発明者らは、臨床的免疫寛容である患者の検出を可能にする６遺伝子血液シグネチャを報告した（Ｂｒｏｕａｒｄ ｅｔ ａｌ．，２０１２．ＡｍＪＴｒａｎｓｐｌａｎｔ．１２（１２）：３２９６３０７；Ｄａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１７．ＫｉｄｎｅｙＩｎｔ．９１（６）：１４７３１４８１；国際公開第２０１８／０１５５５１号）。さらに、このスコアは、抗ＨＬＡ抗体を生じた患者では低下することが見出され、このことはそれが免疫寛容の喪失に関連することを示唆した。
【0231】
これらのデータに基づいて、本発明者らは、このスコアが免疫拒絶反応のリスクが低いことを示す理想的なシグネチャであるとの仮説を立て、移植後早期に安定なグラフト機能を有する患者においてこのスコアがＳＣＲを診断能力を試験した。本明細書において、本発明者らはこのスコアがＳＣＲに関連しているのみでなく、それが改善されたことを示した。
【0232】
発明者らは、２つの遺伝子、ＡＫＲ１Ｃ３およびＴＣＬ１Ａのみが、互いに独立して、ＳＣＲに罹っている患者の特定を可能にすること、およびこれら両方の遺伝子の組み合わせが、さらに優れた識別を可能にすることを示す。
【0233】
次に、これら２つの遺伝子の発現および３つの臨床変数（以前の拒絶反応エピソードの経験、免疫抑制剤の摂取（特にＣｓＡの摂取またはタクロリムスの摂取）、レシピエントの性別）に基づいて、複合スコア（ＳＣＲ－ｓ）を構築し、移植後１年でＳＣＲのないことを高い検出で検出することが可能になる。
【0234】
血液遺伝子シグネチャを含む、ＳＣＲのいくつかのバイオマーカーがこれまでに提唱されている（国際公開第２０１５／１７９７７７号；国際公開第２０１９／２１７９１０号；Ｃｒｅｓｐｏ ｅｔ ａｌ．，２０１７．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．１０１（６）：１４００１４０９；Ｆｒｉｅｄｅｗａｌｄ ｅｔ ａｌ．，２０１９．ＡｍＪＴｒａｎｓｐｌａｎｔ．１９（１）：９８１０９；Ｖａｎ Ｌｏｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１９．ＥｂｉｏＭｅｄｉｃｉｎｅ．４６：４６３４７２；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１９．ＪＡｍＳｏｃＮｅｐｈｒｏｌ．３０（８）：１４８１１４９４）。Ｚｈａｎｇは、１７個の遺伝子のシグネチャが、移植後３ヶ月で、８９％ＮＰＶ、７３％ＰＰＶでＳＣＲおよび急性細胞性拒絶反応を診断できることを発表した（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１９．Ｊ Ａｍ Ｓｏｃ Ｎｅｐｈｒｏｌ．３０（８）：１４８１１４９４）。同様に、５１個の遺伝子のシグネチャは、移植後２４ヶ月でのＳＣＲの特定を可能にする（Ｆｒｉｅｄｅｗａｌｄ ｅｔ ａｌ．，２０１９．Ａｍ Ｊ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．１９（１）：９８１０９）。これらのシグネチャは、ＡＫＲ１Ｃ３およびＴＣＬ１Ａを含まなかったが、これは、両方の試験においては主に細胞性拒絶反応および境界領域拒絶反応が分析されたという事実によって説明され得る。Ｖａｎ Ｌｏｏｎは、８つの遺伝子のシグネチャについて報告したが、これは、ＡＢＭＲを単に診断するためであり、ｓＡＢＭＲに対する本発明者らのＳＣＲ－ｓと同等の性能を示した（Ｖａｎ Ｌｏｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１９．ＥｂｉｏＭｅｄｉｃｉｎｅ．４６：４６３４７２）。最後に、ｋＳｏｒｔ研究の１７個の遺伝子シグネチャもまた、６ヶ月のｓＡＢＭＲを診断するために提唱されている（Ｃｒｅｓｐｏ ｅｔ ａｌ．，２０１７．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．１０１（６）：１４００１４０９）が、１，１３４人の患者の大規模コホートでは検証されなかった（Ｖａｎ Ｌｏｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０２１．Ａｍ Ｊ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．２１（２）：７４０７５０）。
【0235】
本発明者らは、本明細書において移植後１年で１つの血液サンプルで正常な移植片機能を有するＳＣＲのない患者の検出を可能にする、２つのみの遺伝子および３つの臨床パラメータを含む複合スコア（ＳＣＲ－ｓ）を報告する。この非侵襲的ツールは、腎移植レシピエントの大規模集団の中で、ＳＣＲを示す可能性が低い患者の生検を回避するために使用され得る。実際、このＳＣＲ－ｓは、９７．２％ＮＰＶに達し、これは、検査陰性が、高い確率で真の陰性であることを意味する。一例として、これにより、４５０人の患者のコホートにおいて、３１７件の生検が回避される。さらに、および上記で詳述した従来の解決法とは対照的に、本発明者らのＳＣＲ－ｓは、不顕性Ｔ細胞媒介拒絶反応（ｓＴＣＭＲ）およびｓＡＢＭＲの両方の検出を可能にした。このＳＣＲ－ｓは、マイクロアレイまたはＲＮＡシーケンシングベースのシグネチャとは異なり、臨床施設で広く利用可能なｑＰＣＲを使用して、日常的に容易に実施され得る。本発明者らはまた、古典的なｑＰＣＲプラットフォームおよびＮａｎｏＳｔｒｉｎｇプラットフォームの両方を使用してモデルを検証し、技術的な堅牢性およびコスト効率を強化した。
【0236】
本発明者らは、１１０人の患者（サーベイランス生検中にＳＣＲと診断された患者１１人）を含む独立した多施設検証セットで、ＳＣＲ－ｓの最初の検証を実施した。ＳＣＲ－ｓでは、１１人のＳＣＲ患者のうち９人について、正確な分類を提供した。
【0237】
本発明者らのモデルは、独立した患者コホートでさらなる検証が必要であるにもかかわらず、本発明者らの仮説に基づく試験は、ごく少数の遺伝子の測定に焦点を当てていたため、フィッシング試験において発生し得るパラメータの「偶然」の関連が減少した。さらに、本発明者らの分析は、大規模な患者コホートに対する事前の患者選択を行わずに、「現実の」シナリオで行われている。
【0238】
実施例２
実施例１のＳＣＲ－ｓにより、本発明者らは、Ｔ細胞媒介拒絶反応（ｓＴＣＭＲ）および不顕性抗体媒介拒絶反応（ｓＡＢＭＲ）のいずれであるかにかかわらず、ＳＣＲを診断することができ、不顕性抗体媒介拒絶反応（ｓＡＢＭＲ）のみに特異的である代替複合モデルを開発することを目指した。
実施例１のＳＣＲ－ｓにより、本発明者らは、Ｔ細胞媒介拒絶反応（ｓＴＣＭＲ）および不顕性抗体媒介拒絶反応（ｓＡＢＭＲ）のいずれであるかにかかわらず、ＳＣＲを診断することができ、不顕性抗体媒介拒絶反応（ｓＡＢＭＲ）のみに特異的である代替複合モデルを開発することを目指した。
【0239】
材料および方法
実施例１と同じである。
実施例１と同じである。
【0240】
【0241】
本発明者らは、ｓＡＢＭＲ群のこれらの患者の血液では、ｃＳｏＴ（国際公開第２０１８／０１５５５１号およびＤａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， ２０１７．ＫｉｄｎｅｙＩｎｔ．９１（６）：１４７３１４８１に記載）が、ＮＲ群の患者およびｓＴＣＭＲ患者と比較して有意に減少し（ｐ＝０．０１０２、図１４Ａ）、ＡＵＣは、０．５７８（９５％ＣＩ＝［０．４６５０．６９１］）であることを見出した。
【0242】
ｃＳｏＴを構成する６つの遺伝子のうち、ＡＫＲ１Ｃ３およびＴＣＬ１Ａの発現レベルは、他のすべての患者と比較して、これら３３人のｓＡＢＭＲ患者の血液中で有意に減少した（それぞれ、ｐ＝０．００３４および０．００１１）（図１４Ｂおよび図１４Ｃ）。単独で使用した場合、ＡＫＲ１Ｃ３およびＴＣＬ１Ａは、それぞれ０．６５２（９５％ＣＩ＝［０．５７０～０．７３４］）および０．６６９（９５％ＣＩ＝［０．５７８～０．７６０］）のＡＵＣでｓＡＢＭＲ患者を識別することができた。２つの遺伝子を組み合わせると、ＡＵＣ０．７１１（９５％ＣＩ＝［０．６２４～０．７９７］）でｓＡＢＭＲ患者をうまく識別できたが、腎機能は２つの群間で有意差はなかった（ｐ＝０．１３６）（図１４Ｄ）。
【0243】
１１の臨床パラメータ、すなわち採血前の拒絶反応エピソードの経験（ｐ＜０．０００１）、同種移植ランク（ｐ＜０．０００１）、欠失導入処置（ｄｅｌｅｔｉｎｇ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）の使用（ｐ＝０．００２３５）、レシピエントの性別（ｐ＝０．００４７７）、レシピエントのＣＭＶ陽性率（ｐ＝０．０２７９）、移植後１２ヶ月のコルチコステロイドの摂取ｐ＝０．０３１８）、およびドナーとレシピエントとの間のＨＬＡ－Ａ、－Ｂ、および－ＤＲの不適合性数が厳密に３を超える（ｐ＝０．０３６２）が、単変量解析においてｓＡＢＭＲと有意に関連した（ｐ＜０．２０）
【0244】
ｓＡＢＭＲ（ｓＡＢＭＲ－ｓ）を検出するためのスコアの構築
これら１１の臨床パラメータと、単変量解析でｓＡＢＭＲに有意に関連する２つの遺伝子から、ｓＡＢＭＲの洗練された複合スコア（ｓＡＢＭＲ－ｓ）は、段階的な選択およびブートスケープリサンプリングによる多変量ロジスティック回帰を使用して構築した：採血前の拒絶反応エピソードの経験、同種移植片のランク、およびＨＬＡの不一致は、ｓＡＢＭＲ状態と正に関連し、ＴＣＬ１ＡおよびＡＫＲ１Ｃ３の血液遺伝子発現およびレシピエントの性別は、このｓＡＢＭＲ－ｓにおいてｓＡＢＭＲ状態と負に関連した（図１５Ａ）。ｓＡＢＭＲ－ｓは、他の診断を受けた群（ＮＲ群およびｓＴＣＭＲ群）よりもｓＡＢＭＲ群で有意に低く（ｐ＜０．０００１、図１５Ｂ）、ＡＵＣ０．８６０（９５％ＣＩ＝［０．７９４－０．９２５］）で高い識別能力を示した。
これら１１の臨床パラメータと、単変量解析でｓＡＢＭＲに有意に関連する２つの遺伝子から、ｓＡＢＭＲの洗練された複合スコア（ｓＡＢＭＲ－ｓ）は、段階的な選択およびブートスケープリサンプリングによる多変量ロジスティック回帰を使用して構築した：採血前の拒絶反応エピソードの経験、同種移植片のランク、およびＨＬＡの不一致は、ｓＡＢＭＲ状態と正に関連し、ＴＣＬ１ＡおよびＡＫＲ１Ｃ３の血液遺伝子発現およびレシピエントの性別は、このｓＡＢＭＲ－ｓにおいてｓＡＢＭＲ状態と負に関連した（図１５Ａ）。ｓＡＢＭＲ－ｓは、他の診断を受けた群（ＮＲ群およびｓＴＣＭＲ群）よりもｓＡＢＭＲ群で有意に低く（ｐ＜０．０００１、図１５Ｂ）、ＡＵＣ０．８６０（９５％ＣＩ＝［０．７９４－０．９２５］）で高い識別能力を示した。
【0245】
移植後１年間のドナー特異的抗体（ＤＳＡ）の存在は、単変量解析においてｓＡＢＭＲと有意に関連していたが（ｐ＜０．０００１）、このパラメータでは、２つの遺伝子を合わせた場合よりも有意にｓＡＢＭＲを識別することはできなかった（ＡＵＣ＝０．７６８（９５％ＣＩ＝［０．６８６～０．８４９］）、ｐ＝０．３０７）。
【0246】
ＤＳＡ測定とは独立して、ｓＡＢＭＲ病変のないｄｅ ｎｏｖｏＤＳＡ（ｄｎＤＳＡ）陽性患者の高い有病率に基づいてｓＡＢＭＲスコアを構築するため（本発明者らのコホートでは患者６４人、文献（例えば、Ｙａｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，２０１６．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．１００（１０）：２１９４２２０２、またはＢｅｒｔｒａｎｄ ｅｔ ａｌ．，２０２０．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．１０４（８）：１７２６１７３７を参照されたい）によれば６０％）、ＤＳＡの経験を、ｓＡＢＭＲ－ｓの構築には使用しなかった。本発明者らのｓＡＢＭＲ－Ｓは、移植１年目のＤＳＡ経験よりも識別能力が高く（ｐ＝０．００９２３）、ｓＡＢＭＲ－ｓにＤＳＡ経験を追加しても、その識別性能が大幅に改善することはなかった（ＡＵＣ＝０．８７７；９５％ＣＩ＝［０．８０９～０．９４４］）；ｐ＝０．２２２）。興味深いことに、ｓＡＢＭＲ－ｓは、ｓＡＢＭＲ以外の診断を受けたＤＳＡ陽性患者と比較して（ｐ＝０．００１１）、ｓＡＢＭＲ患者では有意に減少したままであり、ＡＵＣは、０．７７（９５％ＣＩ＝［０．６６６０．８７５］）であった。
【0247】
さらに、医療適用のために生検を受けた１４７人の患者のうち、ｓＡＢＭＲ－ｓはまた、他の診断による原因を調べる生検を受けた１２４人の患者と比較して、ｓＡＢＭＲおよび原因を調べる生検の２３人の患者について、有意に減少した（ｐ＝０．００２３）。
【0248】
特異度および感度を最大化する最適な閾値（ヨーデン指標）では、値２．４０に対応し、ｓＡＢＭＲ－ｓは、それぞれ０．８４０および０．７５８の特異度および感度を示した。この閾値では、ｓＡＢＭＲ－ｓは、陰性適中率（ＮＰＶ）９７．７％、陽性適中率（ＰＰＶ）２７．７％を有し、ｓＡＢＭＲ以外の診断を受けた患者４０８人のうち３４２人の患者が真陰性と同定され（８３．８％）、ｓＡＢＭＲ患者３３人のうち２５名（７５．８％）が真陽性と特定された。最後に、ブートストラップリサンプリング（ｎ＝１０００）を使用して、モデルの最適性を補正する内部検証により、ＡＵＣ ０．８３０（９５％ＣＩ＝［０．７４～０．９２）で高い性能が得られた。
【0249】
独立した技術プラットフォームでのｓＡＢＭＲ－ｓの検証
ｓＡＢＭＲ－ｓは、ＡＫＲ１Ｃ３およびＴＣＬ１Ａ測定用の標準ｑＰＣＲ法を使用して構築した。大規模での使用を可能にするために、本発明者らは、ｑＰＣＲに使用されるプローブとは異なるプローブを使用した酵素非含有プローブハイブリダイゼーションベースのＮａｎｏＳｔｒｉｎｇプラットフォームを使用して、この技術を検証した。本発明者らは、他の群と比較して、ｓＡＢＭＲにおけるＡＫＲ１Ｃ３およびＴＣＬ１Ａの有意な下方制御が確認され（それぞれ、ｐ＝０．０１３および０．０００４）（図１６Ａ～Ｂ）、ｑＰＣＲとＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ遺伝子発現との間には有意な高い相関を有していた（ＴＣＬ１ＡおよびＡＫＲ１Ｃ３について、それぞれ、ｒ＝０．９０１および０．７５７、ｐ＜０．０００１）（図１６Ｃ）。ｑＰＣＲ測定およびＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ測定は、異なるダイナミックレンジを示したことから、ｓＡＢＭＲ－ｓパラメータを使用して、ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇデータで係数を調整した。ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇデータを使用したｓＡＢＭＲ－ｓの識別能力は、ｑＰＣＲと同様の識別能力に達し、ＡＵＣは０．８５９であった（９５％ＣＩ＝［０．７９３～０．９２５］）（ｐ＜０．０００１；図１５Ｂ）。
ｓＡＢＭＲ－ｓは、ＡＫＲ１Ｃ３およびＴＣＬ１Ａ測定用の標準ｑＰＣＲ法を使用して構築した。大規模での使用を可能にするために、本発明者らは、ｑＰＣＲに使用されるプローブとは異なるプローブを使用した酵素非含有プローブハイブリダイゼーションベースのＮａｎｏＳｔｒｉｎｇプラットフォームを使用して、この技術を検証した。本発明者らは、他の群と比較して、ｓＡＢＭＲにおけるＡＫＲ１Ｃ３およびＴＣＬ１Ａの有意な下方制御が確認され（それぞれ、ｐ＝０．０１３および０．０００４）（図１６Ａ～Ｂ）、ｑＰＣＲとＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ遺伝子発現との間には有意な高い相関を有していた（ＴＣＬ１ＡおよびＡＫＲ１Ｃ３について、それぞれ、ｒ＝０．９０１および０．７５７、ｐ＜０．０００１）（図１６Ｃ）。ｑＰＣＲ測定およびＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ測定は、異なるダイナミックレンジを示したことから、ｓＡＢＭＲ－ｓパラメータを使用して、ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇデータで係数を調整した。ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇデータを使用したｓＡＢＭＲ－ｓの識別能力は、ｑＰＣＲと同様の識別能力に達し、ＡＵＣは０．８５９であった（９５％ＣＩ＝［０．７９３～０．９２５］）（ｐ＜０．０００１；図１５Ｂ）。
【0250】
免疫抑制は、ｓＡＢＭＲ－ｓの識別能力を変更しなかった。
ｓＡＢＭＲ－ｓは、コルチコステロイドまたは抗胸腺細胞グロブリン（ＡＴＧ）枯渇導入療法のいずれかで処置された、ｓＡＢＭＲ病変を有しない患者では、ｓＡＢＭＲ病変がなく、コルチコステロイドを服用しない、または非枯渇処置を受けたもしくは導入療法を受けていない患者と比較して、わずかに減少した（それぞれ、ｐ＝０．０００２および＜０．０００１）。タクロリムス（図１７Ａ）、コルチコステロイド（図１７Ｂ）、抗増殖剤（図１７Ｃ）または枯渇導入処置（図１７Ｄ）で処置した患者のサブセットでは、ｓＡＢＭＲを他の処置と比較するＡＵＣの値は、それぞれ、０．８６４（９５％ＣＩ＝［０．８０２～０．９２６］）、０．８３９（９５％ＣＩ＝［０．７６７～０．９１１］）、０．８５５（９５％ＣＩ＝［０．７９０～０．９２１］）、０．８１１（９５％ＣＩ＝［０．７２６～０．８９６］）であった。したがって、ｓＡＢＭＲ－ｓは、処置に関係なく、ｓＡＢＭＲ病変を有する患者と有しない患者を依然として識別することができた。
ｓＡＢＭＲ－ｓは、コルチコステロイドまたは抗胸腺細胞グロブリン（ＡＴＧ）枯渇導入療法のいずれかで処置された、ｓＡＢＭＲ病変を有しない患者では、ｓＡＢＭＲ病変がなく、コルチコステロイドを服用しない、または非枯渇処置を受けたもしくは導入療法を受けていない患者と比較して、わずかに減少した（それぞれ、ｐ＝０．０００２および＜０．０００１）。タクロリムス（図１７Ａ）、コルチコステロイド（図１７Ｂ）、抗増殖剤（図１７Ｃ）または枯渇導入処置（図１７Ｄ）で処置した患者のサブセットでは、ｓＡＢＭＲを他の処置と比較するＡＵＣの値は、それぞれ、０．８６４（９５％ＣＩ＝［０．８０２～０．９２６］）、０．８３９（９５％ＣＩ＝［０．７６７～０．９１１］）、０．８５５（９５％ＣＩ＝［０．７９０～０．９２１］）、０．８１１（９５％ＣＩ＝［０．７２６～０．８９６］）であった。したがって、ｓＡＢＭＲ－ｓは、処置に関係なく、ｓＡＢＭＲ病変を有する患者と有しない患者を依然として識別することができた。
【図1】
【図2】
【図3A】
【図3B】
【図4A】
【図4B】
【図5A】
【図5B】
【図6A】
【図6B】
【図7A】
【図7B】
【図8A】
【図8B】
【図8C】
【図8D】
【図9】
【図10A】
【図10B】
【図11A】
【図11B】
【図11C】
【図12A】
【図12B】
【図13A】
【図13B】
【図14A】
【図14B】
【図14C】
【図14D】
【図15A】
【図15B】
【図16A】
【図16B】
【図16C】
【図17A】
【図17B】
【図17C】
【図17D】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2024-02-05
【手続補正1】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
【国際調査報告】