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特表2024-522112エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼ、エフェクタータンパク質及びその用途
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-06-11
(54)【発明の名称】エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼ、エフェクタータンパク質及びその用途
(51)【国際特許分類】
C12N 9/16 20060101AFI20240604BHJP
C12N 15/09 20060101ALI20240604BHJP
C12N 15/55 20060101ALI20240604BHJP
C12N 15/864 20060101ALI20240604BHJP
C12Q 1/6883 20180101ALI20240604BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240604BHJP
C12Q 1/68 20180101ALI20240604BHJP
A01K 67/0275 20240101ALI20240604BHJP
A61K 38/46 20060101ALI20240604BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240604BHJP
A61P 9/00 20060101ALI20240604BHJP
A61P 37/02 20060101ALI20240604BHJP
A61P 3/00 20060101ALI20240604BHJP
A61P 25/28 20060101ALI20240604BHJP
A61P 27/02 20060101ALI20240604BHJP
A61P 31/04 20060101ALI20240604BHJP
A61P 31/12 20060101ALI20240604BHJP
【ＦＩ】
C12N9/16 Z ZNA
C12N15/09 110
C12N15/55
C12N15/864 100Z
C12Q1/6883 Z
C12N5/10
C12Q1/68 100Z
A01K67/0275
A61K38/46
A61P35/00
A61P9/00
A61P37/02
A61P3/00
A61P25/28
A61P27/02
A61P31/04
A61P31/12
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023573318
(86)(22)【出願日】2022-05-25
(85)【翻訳文提出日】2023-11-27
(86)【国際出願番号】 CN2022095072
(87)【国際公開番号】W WO2022247873
(87)【国際公開日】2022-12-01
(31)【優先権主張番号】PCT/CN2021/096477
(32)【優先日】2021-05-27
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(31)【優先権主張番号】202110581290.3
(32)【優先日】2021-05-27
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(31)【優先権主張番号】202111347952.7
(32)【優先日】2021-11-15
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】520176566
【氏名又は名称】中国科学院動物研究所
【氏名又は名称原語表記】ＩＮＳＴＩＴＵＴＥ ＯＦ ＺＯＯＬＯＧＹ，ＣＨＩＮＥＳＥ ＡＣＡＤＥＭＹ ＯＦ ＳＣＩＥＮＣＥＳ
【住所又は居所原語表記】Ｎｏ．５， １ Ｂｅｉｃｈｅｎ Ｗｅｓｔ Ｒｏａｄ， Ｃｈａｏｙａｎｇ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ， Ｂｅｉｊｉｎｇ １００１０１， Ｃｈｉｎａ
(71)【出願人】
【識別番号】523142607
【氏名又は名称】北京幹細胞与再生医学研究院
【氏名又は名称原語表記】ＢＥＩＪＩＮＧ ＩＮＳＴＩＴＵＴＥ ＦＯＲ ＳＴＥＭ ＣＥＬＬ ＡＮＤ ＲＥＧＥＮＥＲＡＴＩＶＥ ＭＥＤＩＣＩＮＥ
【住所又は居所原語表記】３Ａ， Ｄａｔｕｎ Ｒｏａｄ， Ｃｈａｏｙａｎｇ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ， Ｂｅｉｊｉｎｇ １００１０１， Ｃｈｉｎａ
(74)【代理人】
【識別番号】100136629
【弁理士】
【氏名又は名称】鎌田 光宜
(74)【代理人】
【識別番号】100080791
【弁理士】
【氏名又は名称】高島 一
(74)【代理人】
【識別番号】100125070
【弁理士】
【氏名又は名称】土井 京子
(74)【代理人】
【識別番号】100121212
【弁理士】
【氏名又は名称】田村 弥栄子
(74)【代理人】
【識別番号】100174296
【弁理士】
【氏名又は名称】當麻 博文
(74)【代理人】
【識別番号】100137729
【弁理士】
【氏名又は名称】赤井 厚子
(74)【代理人】
【識別番号】100152308
【弁理士】
【氏名又は名称】中 正道
(74)【代理人】
【識別番号】100201558
【弁理士】
【氏名又は名称】亀井 恵二郎
(72)【発明者】
【氏名】李偉
(72)【発明者】
【氏名】周▲き▼
(72)【発明者】
【氏名】陳陽燦
(72)【発明者】
【氏名】胡▲艶▼萍
(72)【発明者】
【氏名】王▲金▼閣
(72)【発明者】
【氏名】駱勝球
(72)【発明者】
【氏名】陳逸
【テーマコード（参考）】
4B063
4B065
4C084
【Ｆターム（参考）】
4B063QA18
4B063QA19
4B063QQ06
4B063QQ07
4B063QQ08
4B063QQ09
4B063QQ42
4B063QR14
4B063QR31
4B063QR56
4B063QS34
4B063QX01
4B065AA90X
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA43
4C084AA02
4C084BA44
4C084DC22
4C084NA14
4C084ZA151
4C084ZA331
4C084ZA661
4C084ZB071
4C084ZB261
4C084ZB331
4C084ZB351
4C084ZC192
4C084ZC211
(57)【要約】
本出願は（１）参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼ中のＰＡＭと相互作用する１以上のアミノ酸を正に帯電したアミノ酸に置換すること、及び／または（２）参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼ中のＤＮＡ二本鎖の開放に関与する１つまたは複数のアミノ酸を芳香環付きアミノ酸に置換すること、及び／または（３）参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼ中のＲｕｖＣドメインに位置し、一本鎖ＤＮＡ基質と相互作用する１つまたは複数のアミノ酸を正に帯電したアミノ酸に置換すること、及び／または（４）参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼ中のＤＮＡ－ＲＮＡ二重らせんと相互作用する１つまたは複数のアミノ酸を正に帯電したアミノ酸に置換すること、及び／または（５）参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼ中のＤＮＡ－ＲＮＡ二重らせんと相互作用する１つまたは複数の極性または正に帯電したアミノ酸を疎水性アミノ酸に置換することの１つまたは複数の、参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼに基づくの変異を含む、エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼ提供する。このエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼは、参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼに比べて有意に向上した遺伝子編集効率及び／又は有意に低下したオフターゲット現象を有する。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼであって、それは参照Ｃａｓ １２ｉに基づく１つまたは複数のヌクレアーゼの変異を含み、前記変異は：（１）参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼ中のＰＡＭと相互作用する１つまたは複数のアミノ酸を正に帯電したアミノ酸に置換すること；
（２）参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼ中のＤＮＡ二本鎖の開放に関与する１つまたは複数のアミノ酸を芳香環付きアミノ酸に置換すること；
（３）参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼ中のＲｕｖＣドメインに位置し、一本鎖ＤＮＡ基質と相互作用する１つまたは複数のアミノ酸を正に帯電したアミノ酸に置換すること；
（４）参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼ中のＤＮＡ－ＲＮＡ二重らせんと相互作用する１つまたは複数のアミノ酸を正に帯電したアミノ酸に置換すること；及び
（５）参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼ中のＤＮＡ－ＲＮＡ二重らせんと相互作用する１つまたは複数の極性または正電荷を有するアミノ酸を疎水性アミノ酸に置換することから選択され；
好ましくは、前記参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼはアミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の野生型Ｃａｓ１２ｉ２ヌクレアーゼである、エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼ。
【請求項2】
前記ＰＡＭと相互作用的一つまたは複数のアミノ酸はＰＡＭと３次元構造上９Å以内の距離にあるアミノ酸であり、好ましくは、前記ＰＡＭと相互作用する１つまたは複数のアミノ酸は１７６、１７８、２２６、２２７、２２９、２３７、２３８、２６４、４４７及び５６３位の１つまたは複数のアミノ酸であり、さらに好ましくは、前記ＰＡＭと相互作用する１つまたは複数のアミノ酸は、Ｅ１７６、Ｅ１７８、Ｙ２２６、Ａ２２７、Ｎ２２９、Ｅ２３７、Ｋ２３８、Ｋ２６４、Ｔ４４７及びＥ５６３の１つまたは複数のアミノ酸であり、
さらに好ましくは、前記ＰＡＭと相互作用する１つまたは複数のアミノ酸は、Ｅ１７６、Ｋ２３８、Ｔ４４７及びＥ５６３の１つまたは複数のアミノ酸であり、
そのうち、前記アミノ酸位置番号はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示す対応するアミノ酸位置に定義される、請求項１に記載のエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼ。
【請求項3】
前記正に帯電したアミノ酸Ｒ、ＫまたはＨである、請求項１または２に記載のエンジニアリングＣａｓ１２ｉ核酸酵素。
【請求項4】
前記参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼ中のＰＡＭと相互作用する１つまたは複数のアミノ酸を正に帯電したアミノ酸に置換することは、Ｅ１７６Ｒ、Ｋ２３８Ｒ、Ｔ４４７Ｒ及びＥ５６３Ｒ置換の１つまたは複数であり、；好ましくは、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼは（１）Ｅ５６３Ｒ；（２）Ｅ１７６Ｒ、Ｔ４４７Ｒ、Ｅ１７６Ｒ及びＥ５６３Ｒ；（３）Ｋ２３８ＲとＥ５６３Ｒ；（４）Ｅ１７６Ｒ、Ｋ２３８Ｒ及びＴ４４７Ｒ；（５）Ｅ１７６Ｒ、Ｋ２３８Ｒ及びＥ５６３Ｒ；（６）Ｅ１７６Ｒ、Ｔ４４７Ｒ及びＥ５６３Ｒ；及び（７）Ｅ１７６Ｒ、Ｋ２３８Ｒ、Ｔ４４７Ｒ及びＥ５６３Ｒ、のいずれの変異或いは変異の組み合わせを含み；
そのうち、前記アミノ酸位置はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示す対応するアミノ酸位置に定義される、請求項１から３のいずれか一項に記載のエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼ。
【請求項5】
前記ＤＮＡ二本鎖の開放に関与する１つまたは複数のアミノ酸は、ＰＡＭ中の標的鎖に対する３’末端の最後の塩基対と相互作用するアミノ酸であり；好ましくは、前記ＤＮＡ二本鎖の開放に関与する１つ又は複数のアミノ酸は１６３と１６４位の１つまたは複数のアミノ酸であり；
さらに好ましくは、前記ＤＮＡ二本鎖の開放に関与する１つ又は複数のアミノ酸Ｑ１６３とＮ１６４位の１つまたは複数のアミノ酸であり；さらに好ましくは、前記ＤＮＡ二本鎖の開放に関与するアミノ酸はＮ１６４であり；
そのうち、前記アミノ酸位置番号はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示す対応するアミノ酸位置に定義される、請求項１から４のいずれか一項に記載のエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼ。
【請求項6】
前記ＤＮＡ二本鎖の開放に関与する１つ又は複数のアミノ酸は芳香環付きアミノ酸に置換され、前記芳香環付きアミノ酸はＦ、ＹまたはＷであり、好ましくは、前記芳香環付きアミノ酸はＦまたはＹである、請求項１から５のいずれか一項に記載のエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼ。
【請求項7】
前記参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼ中のＤＮＡ二本鎖の開放に関与する一つ又は複数のアミノ酸は芳香環付きアミノ酸に置換することはＱ１６３Ｆ、Ｑ１６３Ｙ、Ｑ１６３Ｗ、及びＮ１６４Ｆの一つまたは複数の置換を含み；好ましくは、前記Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼはＮ１６４ＹまたはＮ１６４Ｆ変異を含み；さらに好ましくは、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼはＮ１６４Ｙを含む、請求項１から６のいずれか一項に記載のエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼ。
【請求項8】
前記ＲｕｖＣドメインに位置し、一本鎖ＤＮＡ基質と相互作用する１つまたは複数のアミノ酸は一本鎖ＤＮＡ基質と三次元構造上９Å以内の距離にあるアミノ酸であり；好ましくは、前記ＲｕｖＣドメインに位置し、一本鎖ＤＮＡ基質と相互作用する１つまたは複数のアミノ酸は３２３、３２７、３５５、３５９、３６０、３６１、３６２、３８８、３９０、３９１、３９２、３９３、４１４、４１７、４１８、４２１、４２４、４２５、６５０、６５２、６５３、６９６、７０５、７０８、７０９、７５１、７５２、７５５、８４０、８４８、８５１、８５６、８８５、８９７、９２５、９２６、９２８、９２９、９３２、１０２２位の１つまたは複数のアミノ酸であり；
さらに好ましくは、前記ＲｕｖＣドメインに位置し、一本鎖ＤＮＡ基質と相互作用する１つまたは複数のアミノ酸は、Ｅ３２３、Ｌ３２７、Ｖ３５５、Ｇ３５９、Ｇ３６０、Ｋ３６１、Ｄ３６２、Ｌ３８８、Ｎ３９０、Ｎ３９１、Ｆ３９２、Ｋ３９３、Ｑ４１４、Ｌ４１７、Ｌ４１８、Ｋ４２１、Ｑ４２４、Ｑ４２５、Ｓ６５０、Ｅ６５２、Ｇ６５３、Ｉ６９６、Ｋ７０５、Ｋ７０８、Ｅ７０９、Ｌ７５１、Ｓ７５２、Ｅ７５５、Ｎ８４０、Ｎ８４８、Ｓ８５１、Ａ８５６、Ｑ８８５、Ｍ８９７、Ｎ９２５、Ｉ９２６、Ｔ９２８、Ｇ９２９、Ｙ９３２、Ａ１０２２の１つまたは複数のアミノ酸であり；
さらに好ましくは、前記ＲｕｖＣドメインに位置し、一本鎖ＤＮＡ基質と相互作用する１つまたは複数のアミノ酸はＥ３２３、Ｄ３６２、Ｑ４２５、Ｎ９２５、Ｉ９２６、Ｎ３９１、Ｑ４２４及びＧ９２９の１つまたは複数のアミノ酸であり；
そのうち、前記アミノ酸位置番号はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示す対応するアミノ酸位置に定義される、請求項１から７のいずれか一項に記載のエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼ。
【請求項9】
参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼ中のＲｕｖＣドメインに位置し、一本鎖ＤＮＡ基質と相互作用する１つまたは複数のアミノ酸を正に帯電したアミノ酸に置換することはＲ或いはＫに置換することを含み、好ましくは、前記正に帯電した該アミノ酸はＲである、請求項１から８のいずれか一項に記載のエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼ。
【請求項10】
参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼ中のＲｕｖＣドメインに位置し、一本鎖ＤＮＡ基質と相互作用する１つまたは複数のアミノ酸を正に帯電したアミノ酸に置換することはＥ３２３Ｒ、Ｄ３６２Ｒ、Ｎ３９１Ｒ、Ｑ４２４Ｒ、Ｑ４２５Ｒ、Ｎ９２５Ｒ、Ｉ９２６Ｒ及びＧ９２９Ｒの１つまたは複数の置換を含み；好ましくは、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼは（１）Ｅ３２３Ｒ；（２）Ｄ３６２Ｒ；（３）Ｑ４２５Ｒ； （４）Ｎ９２５Ｒ； （５）Ｉ９２６Ｒ；（６）Ｅ３２３ＲとＤ３６２Ｒ；（７）Ｅ３２３ＲとＱ４２５Ｒ；（８）Ｅ３２３ＲとＩ９２６Ｒ；（９）Ｑ４２５ＲとＩ９２６Ｒ； （１０）Ｄ３６２ＲとＩ９２６Ｒ； （１１）Ｎ９２５ＲとＩ９２６Ｒ； （１２） Ｅ３２３Ｒ、Ｄ３６２Ｒ及びＱ４２５Ｒ； （１３）Ｅ３２３Ｒ、Ｄ３６２Ｒ及びＩ９２６Ｒ；（１４）Ｅ３２３Ｒ、Ｑ４２５Ｒ及びＩ９２６Ｒ；（１５）Ｄ３６２Ｒ、Ｎ９２５Ｒ及びＩ９２６Ｒ；及び（１６） Ｅ３２３Ｒ、Ｄ３６２Ｒ、Ｑ４２５Ｒ及びＩ９２６Ｒのいずれの変異或いは変異の組み合わせを含み；
そのうち、前記アミノ酸位置はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示す対応するアミノ酸位置に定義される、請求項１から９のいずれか一項に記載のエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼ。
【請求項11】
前記ＤＮＡ－ＲＮＡ二重らせんと相互作用する１つまたは複数のアミノ酸はＤＮＡ－ＲＮＡ二重らせんと三次元構造上９Å以内の距離にあるアミノ酸であり；好ましくは、前記ＤＮＡ－ＲＮＡ二重らせんと相互作用する１つまたは複数のアミノ酸は１１６、１１７、１５６、１５９、１６０、１６１、２４７、２９３、２９４、２９７、３０１、３０５、３０６、３０８、３１２、３１３、３１６、３１９、３２０、３４３、３４８、３４９、４２７、４３３、４３８、４４１、４４２、６７９、６８３、６９１、７８２、７８３、７９７、８００、８５２、８５３、８５５、８６１、８６５、９５７、９５８位の１つまたは複数のアミノ酸であり；
さらに好ましくは、前記ＤＮＡ－ＲＮＡ二重らせんと相互作用する１つまたは複数のアミノ酸はＧ１１６、Ｅ１１７、Ａ１５６、Ｔ１５９、Ｅ１６０、Ｓ１６１、Ｅ２４７、Ｇ２９３、Ｅ２９４、Ｎ２９７、Ｔ３０１、Ｉ３０５、Ｋ３０６、Ｔ３０８、Ｎ３１２、Ｆ３１３、Ｑ３１６、Ｅ３１９、Ｑ３２０、Ｅ３４３、Ｅ３４８、Ｅ３４９、Ｄ４２７、Ｋ４３３、Ｖ４３８、Ｎ４４１、Ｑ４４２、Ｎ６７９、Ｅ６８３、Ｅ６９１、Ｄ７８２、Ｅ７８３、Ｅ７９７、Ｅ８００、Ｍ８５２、Ｄ８５３、Ｌ８５５、Ｎ８６１、Ｑ８６５、Ｓ９５７、Ｄ９５８の１つまたは複数のアミノ酸であり；
さらに好ましくは、前記ＤＮＡ－ＲＮＡ二重らせんと相互作用する１つまたは複数のアミノ酸はＧ１１６、Ｅ１１７、Ｔ１５９、Ｓ１６１、Ｅ３１９、Ｅ３４３及びＤ９５８の１つまたは複数のアミノ酸であり；そのうち、前記アミノ酸の位置はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示す対応するアミノ酸位置に定義される、請求項１から１０のいずれか一項に記載のエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼ。
【請求項12】
参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼ中のＤＮＡ－ＲＮＡ二重らせんと相互作用する１つまたは複数のアミノ酸を正に帯電したアミノ酸に置換することはＲ或いはＫに置換することを含み、好ましくは、前記正に帯電したアミノ酸はＲである、請求項１から１１のいずれか一項に記載のエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼ。
【請求項13】
参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼ中のＤＮＡ－ＲＮＡ二重らせんと相互作用する１つまたは複数のアミノ酸を正に帯電したアミノ酸に置換することはＧ１１６Ｒ、Ｅ１１７Ｒ、Ｔ１５９Ｒ、Ｓ１６１Ｒ、Ｅ３１９Ｒ、Ｅ３４３Ｒ及びＤ９５８Ｒの１つまたは複数に置換することを含み；好ましくは、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼはＤ９５８Ｒ置換を含む；
そのうち、前記アミノ酸の位置はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示す対応するアミノ酸位置に定義される、請求項１から１２のいずれか一項に記載のエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼ。
【請求項14】
前記ＤＮＡ－ＲＮＡ二重らせんと相互作用する１つまたは複数の極性または正に帯電したアミノ酸は、３５７、３９４、７１５、７１９、８０７、８４４、８４８、８５７、８６１位の１つまたは複数のアミノ酸から選択され、即ちＨ３５７、Ｋ３９４、Ｒ７１５、Ｒ７１９、Ｋ８０７、Ｋ８４４、Ｎ８４８、Ｒ８５７、Ｒ８６１の１つまたは複数のアミノ酸であり； そのうち、前記アミノ酸の位置はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示す対応するアミノ酸位置に定義される、請求項１から１３のいずれか一項に記載のエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼ。
【請求項15】
参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼ中のＤＮＡ－ＲＮＡ二重らせんと相互作用する１つまたは複数の極性または正に帯電したアミノ酸を疎水性アミノ酸に置換することはアラニン（Ａ）に置換することを含む、請求項１から１４のいずれか一項に記載のエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼ。
【請求項16】
Ｈ３５７Ａ、Ｋ３９４Ａ、Ｒ７１５Ａ、Ｒ７１９Ａ、Ｋ８０７Ａ、Ｋ８４４Ａ、Ｎ８４８Ａ、Ｒ８５７Ａ、Ｒ８６１Ａかななる群より選択された一つまたは複数の変異を含み；好ましくは、Ｋ３９４Ａ、Ｒ７１９Ａ、Ｋ８４４Ａ、Ｒ８５７Ａかななる群より選択された一つまたは複数の変異を含み；
そのうち、前記アミノ酸位置はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示す対応するアミノ酸位置に定義される、請求項１から１５のいずれか一項に記載のエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼ。
【請求項17】
それはＲ７１９ＡとＫ８４４Ａアミノ酸置換を含み、またはＲ８５７ＡとＫ８４４Ａアミノ酸置換を含み； そのうち、前記アミノ酸位置はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示す対応するアミノ酸位置に定義される、請求項１から１６のいずれか一項に記載のエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼ。
【請求項18】
一つまたは複数のフレキシブル領域変異をさらに含み、前記変異は参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼ中のフレキシブル領域の柔軟性を増加させ、前記フレキシブル領域はアミノ酸残基４３９－４４３またはアミノ酸残基９２５－９２９から選択され；好ましくは、前記フレキシブル領域変異は４３９と／または９２６部位に位置し；
さらに好ましくは、前記フレキシブル領域変異はＬ４３９と／またはＩ９２６の変異であり；
そのうち、前記アミノ酸位置はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示す対応するアミノ酸位置に定義される、請求項１から１７のいずれか一項に記載のエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼ。
【請求項19】
前記一つまたは複数のフレキシブル領域変異は、該フレキシブル領域アミノ酸をＧに置換し、および／またはその後ろに１つまたは２つのＧを挿入することであり；好ましくは、前記一つまたは複数のフレキシブル領域変異はＩ９２６Ｇ、Ｌ４３９（Ｌ＋Ｇ）またはＬ４３９（Ｌ＋ＧＧ）を含み；
さらに好ましくは、前記一つまたは複数のフレキシブル領域変異はＬ４３９（Ｌ＋Ｇ）またはＬ４３９（Ｌ＋ＧＧ）を含み；
そのうち、前記アミノ酸位置番号はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示す対応するアミノ酸位置に定義される、請求項１８に記載のエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼ。
【請求項20】
エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼであって；前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼは
（１）Ｅ５６３Ｒ；（２）Ｅ１７６ＲとＴ４４７Ｒ；（３）Ｅ１７６ＲとＥ５６３Ｒ；（４）Ｋ２３８ＲとＥ５６３Ｒ；（５）Ｅ１７６Ｒ、Ｋ２３８Ｒ及びＴ４４７Ｒ；（６）Ｅ１７６Ｒ、Ｔ４４７Ｒ及びＥ５６３Ｒ；（７）Ｅ１７６Ｒ、Ｋ２３８Ｒ及びＥ５６３Ｒ；（８）Ｅ１７６Ｒ、Ｋ２３８Ｒ、Ｔ４４７Ｒ及びＥ５６３Ｒ；（９）Ｎ１６４Ｙ；（１０）Ｎ１６４Ｆ；（１１）Ｅ３２３Ｒ；（１２）Ｄ３６２Ｒ；（１３）Ｑ４２５Ｒ；（１４）Ｎ９２５Ｒ；（１５）Ｉ９２６Ｒ；（１６）Ｄ９５８Ｒ；（１７）Ｅ３２３ＲとＤ３６２Ｒ；（１８）Ｅ３２３ＲとＱ４２５Ｒ；（１９）Ｅ３２３ＲとＩ９２６Ｒ；（２０）Ｑ４２５ＲとＩ９２６Ｒ；（２１）Ｄ３６２ＲとＩ９２６Ｒ；（２２）Ｎ９２５ＲとＩ９２６Ｒ；（２３）Ｅ３２３Ｒ、Ｄ３６２Ｒ及びＱ４２５Ｒ；（２４）Ｅ３２３Ｒ、Ｄ３６２Ｒ及びＩ９２６Ｒ；（２５）Ｅ３２３Ｒ、Ｑ４２５Ｒ及びＩ９２６Ｒ；（２６）Ｄ３６２Ｒ、Ｎ９２５Ｒ及びＩ９２６Ｒ；（２７）Ｅ３２３Ｒ、Ｄ３６２Ｒ、Ｑ４２５Ｒ及びＩ９２６Ｒ；（２８）Ｄ３６２ＲとＩ９２６Ｇ；（２９）Ｎ９２５ＲとＩ９２６Ｇ；（３０）Ｄ３６２Ｒ、Ｎ９２５Ｒ及びＩ９２６Ｇ；（３１）Ｉ９２６ＲとＬ４３９（Ｌ＋Ｇ）；（３２）Ｉ９２６ＲとＬ４３９（Ｌ＋ＧＧ）；（３３）Ｅ３２３Ｒ、Ｄ３６２ＲとＩ９２６Ｇ；（３４）Ｒ７１９ＡとＫ８４４Ａ；及び（３５）Ｒ８５７ＡとＫ８４４Ａのいずれかの１つ群または複数群の変異を含み；
好ましくは、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼは（１）Ｅ１７６Ｒ、Ｋ２３８Ｒ、Ｔ４４７Ｒ及びＥ５６３Ｒ；（２）Ｎ１６４Ｙ；（３）Ｉ９２６Ｒ；（４）Ｅ３２３Ｒ及びＤ３６２Ｒ；（４）Ｉ９２６Ｇ；（５）Ｉ９２６Ｒ及びＬ４３９（Ｌ＋Ｇ）；（６）Ｉ９２６Ｒ及びＬ４３９（Ｌ＋ＧＧ）；ならびに（７）Ｄ９５８Ｒのいずれかの１つ群または複数群の変異を含み；
そのうち、前記アミノ酸位置はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示す対応するアミノ酸位置に定義される、エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼ。
【請求項21】
エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼであって、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼは（１）Ｅ１７６Ｒ、Ｋ２３８Ｒ、Ｔ４４７Ｒ、Ｅ５６３Ｒ及びＮ１６４Ｙ；（２）Ｅ１７６Ｒ、Ｋ２３８Ｒ、Ｔ４４７Ｒ、Ｅ５６３Ｒ及びＩ９２６Ｒ；（３）Ｎ１６４Ｙ、Ｅ３２３Ｒ及びＤ３６２Ｒ；（４）Ｅ１７６Ｒ、Ｋ２３８Ｒ、Ｔ４４７Ｒ、Ｅ５６３Ｒ、Ｅ３２３Ｒ及びＤ３６２Ｒ；（５）Ｎ１６４ＹとＩ９２６Ｒ；（６）Ｅ１７６Ｒ、Ｋ２３８Ｒ、Ｔ４４７Ｒ、Ｅ５６３Ｒ、Ｎ１６４Ｙ及びＩ９２６Ｒ；（７）Ｅ１７６Ｒ、Ｋ２３８Ｒ、Ｔ４４７Ｒ、Ｅ５６３Ｒ、Ｎ１６４Ｙ、Ｅ３２３Ｒ及びＤ３６２Ｒ；（８）Ｅ１７６Ｒ、Ｋ２３８Ｒ、Ｔ４４７Ｒ、Ｅ５６３Ｒ、Ｎ１６４Ｙ、Ｉ９２６Ｒ、Ｅ３２３Ｒ及びＤ３６２Ｒ；（９）Ｅ１７６Ｒ、Ｋ２３８Ｒ、Ｔ４４７Ｒ、Ｅ５６３Ｒ、Ｎ１６４Ｙ、Ｅ３２３Ｒ、Ｄ３６２Ｒ及びＩ９２６Ｇ；（１０）Ｅ１７６Ｒ、Ｋ２３８Ｒ、Ｔ４４７Ｒ、Ｅ５６３Ｒ、Ｎ１６４Ｙ、Ｅ３２３Ｒ、Ｄ３６２Ｒ、Ｉ９２６Ｇ及びＬ４３９（Ｌ＋ＧＧ）；（１１）Ｅ１７６Ｒ、Ｋ２３８Ｒ、Ｔ４４７Ｒ、Ｅ５６３Ｒ、Ｎ１６４Ｙ、Ｅ３２３Ｒ、Ｄ３６２Ｒ、Ｉ９２６Ｇ及びＬ４３９（Ｌ＋Ｇ）；（１２）Ｅ１７６Ｒ、Ｋ２３８Ｒ、Ｔ４４７Ｒ、Ｅ５６３Ｒ、Ｎ１６４Ｙ及びＤ９５８Ｒ；（１３）Ｅ１７６Ｒ、Ｋ２３８Ｒ、Ｔ４４７Ｒ、Ｅ５６３Ｒ、Ｉ９２６Ｒ及びＤ９５８Ｒ；（１４）Ｅ１７６Ｒ、Ｋ２３８Ｒ、Ｔ４４７Ｒ、Ｅ５６３Ｒ、Ｅ３２３Ｒ、Ｄ３６２Ｒ及びＤ９５８Ｒ；（１５）Ｎ１６４Ｙ、Ｉ９２６Ｒ及びＤ９５８Ｒ；（１６）Ｎ１６４Ｙ、Ｅ３２３Ｒ、Ｄ３６２Ｒ及びＤ９５８Ｒ；（１７）Ｅ１７６Ｒ、Ｋ２３８Ｒ、Ｔ４４７Ｒ、Ｅ５６３Ｒ、Ｎ１６４Ｙ、Ｉ９２６Ｒ及びＤ９５８Ｒ；（１８）Ｅ１７６Ｒ、Ｋ２３８Ｒ、Ｔ４４７Ｒ、Ｅ５６３Ｒ、Ｎ１６４Ｙ、Ｅ３２３Ｒ、Ｄ３６２Ｒ及びＤ９５８Ｒ；（１９）Ｅ１７６Ｒ、Ｋ２３８Ｒ、Ｔ４４７Ｒ、Ｅ５６３Ｒ、Ｎ１６４Ｙ、Ｉ９２６Ｒ、Ｅ３２３Ｒ、Ｄ３６２Ｒ及びＤ９５８Ｒ；（２０）Ｅ１７６Ｒ、Ｋ２３８Ｒ、Ｔ４４７Ｒ、Ｅ５６３Ｒ、Ｎ１６４Ｙ、Ｅ３２３Ｒ、Ｄ３６２Ｒ、Ｉ９２６Ｇ及びＤ９５８Ｒ；（２１）Ｅ１７６Ｒ、Ｋ２３８Ｒ、Ｔ４４７Ｒ、Ｅ５６３Ｒ、Ｎ１６４Ｙ、Ｅ３２３Ｒ、Ｄ３６２Ｒ、Ｉ９２６Ｇ、Ｌ４３９（Ｌ＋ＧＧ）及びＤ９５８Ｒ；（２２）Ｅ１７６Ｒ、Ｋ２３８Ｒ、Ｔ４４７Ｒ、Ｅ５６３Ｒ、Ｎ１６４Ｙ、Ｅ３２３Ｒ、Ｄ３６２Ｒ、Ｉ９２６Ｇ、Ｌ４３９（Ｌ＋Ｇ）及びＤ９５８Ｒ；（２３）Ｅ１７６Ｒ、Ｋ２３８Ｒ、Ｔ４４７Ｒ、Ｅ５６３Ｒ、Ｎ１６４Ｙ、Ｅ３２３Ｒ、Ｄ３６２Ｒ及びＲ８５７Ａ；（２４）Ｅ１７６Ｒ、Ｋ２３８Ｒ、Ｔ４４７Ｒ、Ｅ５６３Ｒ、Ｎ１６４Ｙ、Ｅ３２３Ｒ、Ｄ３６２Ｒ及びＮ８６１Ａ；（２５）Ｅ１７６Ｒ、Ｋ２３８Ｒ、Ｔ４４７Ｒ、Ｅ５６３Ｒ、Ｎ１６４Ｙ、Ｅ３２３Ｒ、Ｄ３６２Ｒ及びＫ８０７Ａ；（２６）Ｅ１７６Ｒ、Ｋ２３８Ｒ、Ｔ４４７Ｒ、Ｅ５６３Ｒ、Ｎ１６４Ｙ、Ｅ３２３Ｒ、Ｄ３６２Ｒ及びＮ８４８Ａ；（２７）Ｅ１７６Ｒ、Ｋ２３８Ｒ、Ｔ４４７Ｒ、Ｅ５６３Ｒ、Ｎ１６４Ｙ、Ｅ３２３Ｒ、Ｄ３６２Ｒ及びＲ７１５Ａ；（２８）Ｅ１７６Ｒ、Ｋ２３８Ｒ、Ｔ４４７Ｒ、Ｅ５６３Ｒ、Ｎ１６４Ｙ、Ｅ３２３Ｒ、Ｄ３６２Ｒ及びＲ７１９Ａ；（２９）Ｅ１７６Ｒ、Ｋ２３８Ｒ、Ｔ４４７Ｒ、Ｅ５６３Ｒ、Ｎ１６４Ｙ、Ｅ３２３Ｒ、Ｄ３６２Ｒ及びＫ３９４Ａ；（３０）Ｅ１７６Ｒ、Ｋ２３８Ｒ、Ｔ４４７Ｒ、Ｅ５６３Ｒ、Ｎ１６４Ｙ、Ｅ３２３Ｒ、Ｄ３６２Ｒ及びＨ３５７Ａ；（３１）Ｅ１７６Ｒ、Ｋ２３８Ｒ、Ｔ４４７Ｒ、Ｅ５６３Ｒ、Ｎ１６４Ｙ、Ｅ３２３Ｒ、Ｄ３６２Ｒ 及びＫ８４４Ａ；（３２）Ｅ１７６Ｒ、Ｋ２３８Ｒ、Ｔ４４７Ｒ、Ｅ５６３Ｒ、Ｎ１６４Ｙ、Ｅ３２３Ｒ、Ｄ３６２Ｒ、Ｒ７１９Ａ及びＫ８４４Ａ；または（３３）Ｅ１７６Ｒ、Ｋ２３８Ｒ、Ｔ４４７Ｒ、Ｅ５６３Ｒ、Ｎ１６４Ｙ、Ｅ３２３Ｒ、Ｄ３６２Ｒ、Ｒ８５７Ａ及びＫ８４４Ａのいずれの群の変異を含み；そのうち、前記アミノ酸位置はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示す対応するアミノ酸位置に定義される、エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼ。
【請求項22】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ：２～２４のいずれかに示すアミノ酸配列を含むエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼであり、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ：２～２４のいずれかの配列に示すアミノ酸配列と少なくとも８０％同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１から２１のいずれか一項に記載のエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼ。
【請求項23】
エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉエフェクタータンパク質であって、請求項１から２２のいずれか一項に記載のエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼまたはその機能的誘導体を含み；任意に、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼまたはその機能的誘導体は酵素活性を有し、または前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼまたはその機能的誘導体は酵素不活性変異体である、エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉエフェクタータンパク質。
【請求項24】
前記Ｃａｓ１２ｉエフェクタータンパク質はＤＮＡ分子中の二本鎖切断または一本鎖切断を誘導することができる、請求項２３に記載のエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉエフェクタータンパク質。
【請求項25】
前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼまたはその機能的誘導体はＤ５９９Ａ、Ｅ８３３Ａ、Ｓ８８３Ａ、Ｈ８８４Ａ、Ｒ９００Ａ及びＤ１０１９Ａの１つまたは複数の変異を含む酵素不活性変異体であり；そのうち、前記アミノ酸位置はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示す対応するアミノ酸位置に定義される、請求項２３に記載のエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉエフェクタータンパク質。
【請求項26】
前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼまたはその機能的誘導体と融合する機能ドメインをさらに含む、請求項２３から２５のいずれか一項に記載のエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉエフェクタータンパク質。
【請求項27】
前記機能ドメインは翻訳開始ドメイン、転写抑制ドメイン、トランス活性化ドメイン、エピジェネティック修飾ドメイン、核酸塩基編集ドメイン、逆転写酵素ドメイン、レポーター分子ドメイン、ヌクレアーゼドメインからなる群より選択される一つまたは複数である、請求項２６に記載のエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉエフェクタータンパク質。
【請求項28】
前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉエフェクタータンパク質は、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼまたはその機能的誘導体のＮ末端部分を含む第一ポリペプチドと、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼまたはその機能的誘導体のＣ末端部分を含む第二ポリペプチドとを備え、そのうち前記第一ポリペプチドと前記第二ポリペプチドは、標的核酸と特異的に結合するクラスター化され、規則的に間隔があいた短い回文構造の繰り返し配列（ＣＲＩＳＰＲ）複合体を形成するために、ガイド配列を含むガイドＲＮＡの存在下で互いに会合することができ、前記標的核酸は前記ガイド配列に相補的なターゲット配列を含み；好ましくは、前記第一ポリペプチドは項１－２２のいずれかに記載のエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼのＮ末端部分アミノ酸残基１～Ｘを含み、前記第二ポリペプチドは項１－２２のいずれかに記載のエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼのアミノ酸残基Ｘ＋１～前記Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼのＣ末端を含み；
あるいは、前記第一ポリペプチドと前記第二ポリペプチドはそれぞれ二量化ドメインを含み；
あるいは、前記第一ポリペプチドの二量体ドメインと前記第二ポリペプチドの二量体ドメインは誘導剤の存在下で互いに会合している、請求項２３から２７のいずれか一項に記載のエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉエフェクタータンパク質。
【請求項29】
エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１２ｉシステムであって、（ａ）請求項１から２８のいずれか一項に記載のエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼ、または請求項２３から２８のいずれか一項に記載のエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉエフェクタータンパク質；及び
（ｂ）ターゲット配列に相補的なガイド配列を含むガイドＲＮＡ、または前記ガイドＲＮＡをコードする１つまたは複数の核酸、を含み、
そのうち、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼまたはエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉエフェクタータンパク質と前記ガイドＲＮＡとはＣＲＩＳＰＲ複合体を形成することができ、前記ＣＲＩＳＰＲ複合体は前記ターゲット配列を含む標的核酸に特異的に結合し、且つ前記標的核酸の修飾を誘導し；
好ましくは、前記ガイドＲＮＡは前記ガイド配列を含むｃｒＲＮＡであり；
さらに好ましくは、前記エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１２ｉシステムは複数のｃｒＲＮＡをコードする前駆体ガイドＲＮＡアレイ（ａｒｒａｙ）を含み；
または、好ましくは前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼまたはエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉエフェクタータンパク質はメインエディタであり、前記ガイドＲＮＡは、プライム編集ガイドＲＮＡ（ｐｅｇＲＮＡ）である、エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１２ｉシステム。
【請求項30】
前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼまたはエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉエフェクタータンパク質をコードする一つまたは複数のベクターを含み；好ましくは、前記一つまたは複数のベクターはレトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ベクター、および単純ヘルペスベクターの群から選択され：；
さらに好ましくは、前記一つまたは複数のベクターはアデノ随伴ウイルスＡＡＶベクターであり；
さらに好ましくは、前記ＡＡＶベクターはまた前記ガイドＲＮＡをコードする、請求項２９に記載のエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１２ｉシステム。
【請求項31】
（ａ）サンプルを請求項２９におけるエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１２ｉシステム及びタグ付けされた検出核酸と接触させ、該検出核酸は一本鎖であり、前記ガイドＲＮＡのガイド配列とハイブリダイズしないこと；及び（ｂ）前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼまたはエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉエフェクタータンパク質が前記タグ付けされた検出核酸を切断することによって生成される検出可能なシグナルを測定し、標的核酸を検出することを含む、サンプル中の標的核酸を検出する方法。
【請求項32】
前記標的核酸を請求項２９または３０に記載の前記エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１２ｉシステムに接触させることを含み；好ましくは、前記方法はインビトロで、エクスビボまたはインビボで行われ；
さらに好ましくは、前記標的核酸は細胞中に存在しており；
さらに好ましくは、前記細菌細胞、酵母細胞、哺乳動物細胞、植物細胞または動物細胞であり；
さらに好ましくは、前記標的核酸はゲノムＤＮＡであり；
さらに好ましくは、前記ターゲット配列は疾患または障害に関連し；
さらに好ましくは、前記エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１２ｉシステムは複数のｃｒＲＮＡをコードする前駆体ガイドＲＮＡアレイを含み、そのうち、各ｃｒＲＮＡは異なるガイド配列を含む、ターゲット配列を含む標的核酸を修飾する方法。
【請求項33】
請求項２９或３０に記載の前記エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１２ｉシステムの個体の細胞中の標的核酸に関連する疾患または障害を治療するための薬剤の製造における使用であって、好ましくは、前記疾患または障害は、がん、心血管疾患、遺伝性疾患、自己免疫疾患、代謝性疾患、神経変性疾患、眼病、細菌感染、及びウイルス感染の群から選択される、使用。
【請求項34】
請求項３２に記載の方法を使用して個体の細胞中の標的核酸を修飾することにより、前記疾患または障害を治療することを含み、好ましくは、前記疾患または障害は、がん、心血管疾患、遺伝性疾患、自己免疫疾患、代謝性疾患、神経変性疾患、眼病、細菌感染、及びウイルス感染の群から選択される、個体の細胞中の標的核酸に関連する疾患または障害を治療する方法。
【請求項35】
標的核酸を請求項２９または３０に記載の前記エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１２ｉシステムに接触させることを含む、ターゲット配列を含む標的核酸を修飾する方法。
【請求項36】
請求項１から２２のいずれか一項に記載の前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼ、請求項２３から２８のいずれか一項に記載の前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉエフェクタータンパク質を含む組成物またはキット。
【請求項37】
修飾された標的核酸を含み、そのうち、標的核酸が請求項３２または３５に記載の方法で修飾される、エンジニアリングされた細胞。
【請求項38】
請求項３７に記載の一つまたは複数の前記エンジニアリングされた細胞を含む、エンジニアリングされた非ヒト動物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
優先権情報
本出願の要求：２０２１年１１月１５日に出願された中国特許出願ＣＮ２０２１１１３４７９５２．７、２０２１年５月２７日に出願された中国特許出願ＣＮ２０２１１０５８１２９０．３、及び２０２１年５月２７日に出願された国際出願ＰＣＴ／ＣＮ２０２１／０９６４７７に基づく優先権を主張し、これらの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本出願の要求：２０２１年１１月１５日に出願された中国特許出願ＣＮ２０２１１１３４７９５２．７、２０２１年５月２７日に出願された中国特許出願ＣＮ２０２１１０５８１２９０．３、及び２０２１年５月２７日に出願された国際出願ＰＣＴ／ＣＮ２０２１／０９６４７７に基づく優先権を主張し、これらの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【0002】
同時に提出された配列表ファイル
下記のＡＳＣＩＩコードテキストファイルのすべての内容は参照により本明細書に組み込まれる：コンピュータ読み取り可能なフォーマット（ＣＲＦ）の配列表（ＦＦ００６１４ＰＣＴ－ＮＳｅｑｕｅｎｃｅ６ｔｈＶｅｒｓｉｏｎ－２０２２０５２５．ｔｘｔ、日付：２０２２年５月２５日、大きさ：２１８ｋｂ）
下記のＡＳＣＩＩコードテキストファイルのすべての内容は参照により本明細書に組み込まれる：コンピュータ読み取り可能なフォーマット（ＣＲＦ）の配列表（ＦＦ００６１４ＰＣＴ－ＮＳｅｑｕｅｎｃｅ６ｔｈＶｅｒｓｉｏｎ－２０２２０５２５．ｔｘｔ、日付：２０２２年５月２５日、大きさ：２１８ｋｂ）
【0003】
本出願はバイオ技術分野に属する。より具体的には、本出願は、向上された触媒活性（例えば、遺伝子編集活性）を有するＣａｓ１２ｉヌクレアーゼ、エフェクタータンパク質、及びその用途に関する。
【背景技術】
【0004】
ゲノム編集は、ゲノム研究において重要かつ有用な技術である。ゲノム編集には、クラスター化され、規則的に間隔があいた短い回文構造の繰り返し配列（ＣＲＩＳＰＲ）－Ｃａｓシステム、転写活性因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）システム、及びジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）システムなど、複数のシステムが利用できる。
【0005】
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは効率的で且つ費用対効果の高いゲノム編集技術であり、酵母、植物からゼブラフィッシュ及び人間までの一連の真核生物に広く適用することができる（総説を参照する：Ｖａｎ ｄｅｒ Ｏｏｓｔ ２０１３， Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３９： ７６８－７７０，以及Ｃｈａｒｐｅｎｔｉｅｒ ａｎｄ Ｄｏｕｄｎａ， ２０１３， Ｎａｔｕｒｅ ４９５： ５０－５１）。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、Ｃａｓ１２ｉエフェクトタンパク質とＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）を結合することにより、古細菌と細菌の中で適応免疫を提供する。これまでに、六つのタイプ（Ｉ－ＶＩ型）と２種類（第１類と第２類）を含むＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、このシステムの顕著な機能的及び進化的モジュール性に基づいて特徴付けられてきた。第２類ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムでは、ＩＩ型Ｃａｓ９システムとＶ型Ａ／Ｂ／Ｅ／Ｊ Ｃａｓ１２ａ／Ｃａｓ１２ｂ／Ｃａｓ１２ｅ／Ｃａｓ１２ｊシステムがゲノム編集に利用されており、生物医学研究に広い将来性を提供している。
【0006】
しかし、現在のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、限られた遺伝子編集効率を含む様々な限界を有する。したがって、複数の遺伝子座にまたがる効果的なゲノム編集のためには、改善された方法及びシステムが必要とされている。
【発明の概要】
【0007】
本出願は下記技術的解決手段を提供する：
１．参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼに基づく一つ又は複数の変異を含み、前記変異は
（１）参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼ中のＰＡＭと相互作用する一つ又は複数のアミノ酸を正に帯電したアミノ酸に置換すること；
（２）参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼ中のＤＮＡ二本鎖の開放に関与する一つ又は複数のアミノ酸を芳香環付きアミノ酸に置換すること；
（３）参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼ中のＲｕｖＣドメインに位置し、一本鎖ＤＮＡ基質と相互作用する１つまたは複数のアミノ酸を正に帯電したアミノ酸に置換すること；
（４）参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼ中のＤＮＡ－ＲＮＡ二重らせんと相互作用する１つまたは複数のアミノ酸を正に帯電したアミノ酸に置換すること；及び
（５）参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼ中のＤＮＡ－ＲＮＡ二重らせんと相互作用する１つまたは複数の極性または正に帯電したアミノ酸を疎水性アミノ酸に置換することから選択され；
好ましくは、前記参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼはアミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１である野生型Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼである、エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼ。
１．参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼに基づく一つ又は複数の変異を含み、前記変異は
（１）参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼ中のＰＡＭと相互作用する一つ又は複数のアミノ酸を正に帯電したアミノ酸に置換すること；
（２）参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼ中のＤＮＡ二本鎖の開放に関与する一つ又は複数のアミノ酸を芳香環付きアミノ酸に置換すること；
（３）参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼ中のＲｕｖＣドメインに位置し、一本鎖ＤＮＡ基質と相互作用する１つまたは複数のアミノ酸を正に帯電したアミノ酸に置換すること；
（４）参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼ中のＤＮＡ－ＲＮＡ二重らせんと相互作用する１つまたは複数のアミノ酸を正に帯電したアミノ酸に置換すること；及び
（５）参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼ中のＤＮＡ－ＲＮＡ二重らせんと相互作用する１つまたは複数の極性または正に帯電したアミノ酸を疎水性アミノ酸に置換することから選択され；
好ましくは、前記参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼはアミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１である野生型Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼである、エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼ。
【0008】
２．前記ＰＡＭと相互作用する１つまたは複数のアミノ酸が、ＰＡＭと三次元構造上９Å以内の距離にあるアミノ酸である；好ましくは、前記ＰＡＭと相互作用する１つまたは複数のアミノ酸は、１７６、１７８、２２６、２２７、２２９、２３７、２３８、２６４、４４７、及び５６３位のうちの１つまたは複数の位置にあるアミノ酸であり、
さらに好ましくは、前記ＰＡＭと相互作用する１つまたは複数のアミノ酸は、Ｅ１７６、Ｅ１７８、Ｙ２２６、Ａ２２７、Ｎ２２９、Ｅ２３７、Ｋ２３８、Ｋ２６４、Ｔ４４７、及びＥ５６３のうちの１つまたは複数のアミノ酸であり、
さらに好ましくは、前記ＰＡＭと相互作用する１つまたは複数のアミノ酸は、Ｅ１７６、Ｋ２３８、Ｔ４４７及びＥ５６３のうちの１つまたは複数のアミノ酸であり、
そのうち、前記アミノ酸の位置番号はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示す対応するアミノ酸位置に定義される、項１に記載のエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼ。
さらに好ましくは、前記ＰＡＭと相互作用する１つまたは複数のアミノ酸は、Ｅ１７６、Ｅ１７８、Ｙ２２６、Ａ２２７、Ｎ２２９、Ｅ２３７、Ｋ２３８、Ｋ２６４、Ｔ４４７、及びＥ５６３のうちの１つまたは複数のアミノ酸であり、
さらに好ましくは、前記ＰＡＭと相互作用する１つまたは複数のアミノ酸は、Ｅ１７６、Ｋ２３８、Ｔ４４７及びＥ５６３のうちの１つまたは複数のアミノ酸であり、
そのうち、前記アミノ酸の位置番号はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示す対応するアミノ酸位置に定義される、項１に記載のエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼ。
【0009】
３．前記正に帯電したアミノ酸はＲ、Ｋ或いはＨである、項１または２に記載のエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼ。
【0010】
４．前記参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼ中のＰＡＭと相互作用する一つ又は複数のアミノ酸を正に帯電したアミノ酸に置換することはＥ１７６Ｒ、Ｋ２３８Ｒ、Ｔ４４７Ｒ及びＥ５６３Ｒのうちの１つまたは複数の置換を指し；
好ましくは、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼは下記：（１）Ｅ５６３Ｒ；（２）Ｅ１７６Ｒ、Ｔ４４７Ｒ、Ｅ１７６Ｒ及びＥ５６３Ｒ；（３）Ｋ２３８ＲとＥ５６３Ｒ；（４）Ｅ１７６Ｒ、Ｋ２３８Ｒ及びＴ４４７Ｒ；（５）Ｅ１７６Ｒ、Ｋ２３８Ｒ及びＥ５６３Ｒ；（６）Ｅ１７６Ｒ、Ｔ４４７Ｒ及びＥ５６３Ｒ；及び（７）Ｅ１７６Ｒ、Ｋ２３８Ｒ、Ｔ４４７Ｒ及びＥ５６３Ｒのうちのいずれかの変異または変異の組み合わせを含み；
そのうち、前記アミノ酸の位置はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示す対応するアミノ酸位置に定義される、項１から３のいずれか一項に記載のエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼ。
好ましくは、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼは下記：（１）Ｅ５６３Ｒ；（２）Ｅ１７６Ｒ、Ｔ４４７Ｒ、Ｅ１７６Ｒ及びＥ５６３Ｒ；（３）Ｋ２３８ＲとＥ５６３Ｒ；（４）Ｅ１７６Ｒ、Ｋ２３８Ｒ及びＴ４４７Ｒ；（５）Ｅ１７６Ｒ、Ｋ２３８Ｒ及びＥ５６３Ｒ；（６）Ｅ１７６Ｒ、Ｔ４４７Ｒ及びＥ５６３Ｒ；及び（７）Ｅ１７６Ｒ、Ｋ２３８Ｒ、Ｔ４４７Ｒ及びＥ５６３Ｒのうちのいずれかの変異または変異の組み合わせを含み；
そのうち、前記アミノ酸の位置はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示す対応するアミノ酸位置に定義される、項１から３のいずれか一項に記載のエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼ。
【0011】
５．前記ＤＮＡ二本鎖の開放に関与する一つ又は複数のアミノ酸はＰＡＭ中の標的鎖に対する３’末端の最後の塩基対と相互作用するアミノ酸であり；
好ましくは、前記ＤＮＡ二本鎖の開放に関与する一つ又は複数のアミノ酸は１６３と１６４位のうちの１つまたは複数の位置にあるアミノ酸であり；
さらに好ましくは、前記ＤＮＡ二本鎖の開放に関与する一つ又は複数のアミノ酸はＱ１６３とＮ１６４の１つまたは複数のアミノ酸であり；さらに好ましくは、前記ＤＮＡ二本鎖の開放に関与するアミノ酸はＮ１６４であり；
そのうち、前記アミノ酸の位置番号はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示す対応するアミノ酸位置に定義される、項１から４のいずれか一項に記載のエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼ。
好ましくは、前記ＤＮＡ二本鎖の開放に関与する一つ又は複数のアミノ酸は１６３と１６４位のうちの１つまたは複数の位置にあるアミノ酸であり；
さらに好ましくは、前記ＤＮＡ二本鎖の開放に関与する一つ又は複数のアミノ酸はＱ１６３とＮ１６４の１つまたは複数のアミノ酸であり；さらに好ましくは、前記ＤＮＡ二本鎖の開放に関与するアミノ酸はＮ１６４であり；
そのうち、前記アミノ酸の位置番号はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示す対応するアミノ酸位置に定義される、項１から４のいずれか一項に記載のエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼ。
【0012】
６．前記ＤＮＡ二本鎖の開放に関与する一つ又は複数のアミノ酸は芳香環付きアミノ酸に置換し、前記芳香環付きアミノ酸はＦ、Ｙ或いはＷであり、好ましくは、前記芳香環付きアミノ酸はＦ或いはＹである、項１から５のいずれか一項に記載のエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼ。
【0013】
７．前記参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼ中のＤＮＡ二本鎖の開放に関与する一つ又は複数のアミノ酸を芳香環付きアミノ酸に置換することはＱ１６３Ｆ、Ｑ１６３Ｙ、Ｑ１６３Ｗ、及びＮ１６４Ｆのうちの１つまたは複数の置換を含み；好ましくは、前記Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼはＮ１６４Ｙ或いはＮ１６４Ｆ変異を含み；さらに好ましくは、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼはＮ１６４Ｙを含む、項１から６のいずれか一項に記載のエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼ。
【0014】
８．前記ＲｕｖＣドメインに位置し、一本鎖ＤＮＡ基質と相互作用する１つまたは複数のアミノ酸は一本鎖ＤＮＡ基質と三次元構造上９Å以内の距離にあるアミノ酸であり；
好ましくは、前記ＲｕｖＣドメインに位置し、一本鎖ＤＮＡ基質と相互作用する１つまたは複数のアミノ酸は３２３、３２７、３５５、３５９、３６０、３６１、３６２、３８８、３９０、３９１、３９２、３９３、４１４、４１７、４１８、４２１、４２４、４２５、６５０、６５２、６５３、６９６、７０５、７０８、７０９、７５１、７５２、７５５、８４０、８４８、８５１、８５６、８８５、８９７、９２５、９２６、９２８、９２９、９３２、１０２２のうちの１つまたは複数の位置のアミノ酸である。
さらに好ましくは、前記ＲｕｖＣドメインに位置し、一本鎖ＤＮＡ基質と相互作用する１つまたは複数のアミノ酸はＥ３２３、Ｌ３２７、Ｖ３５５、Ｇ３５９、Ｇ３６０、Ｋ３６１、Ｄ３６２、Ｌ３８８、Ｎ３９０、Ｎ３９１、Ｆ３９２、Ｋ３９３、Ｑ４１４、Ｌ４１７、Ｌ４１８、Ｋ４２１、Ｑ４２４、Ｑ４２５、Ｓ６５０、Ｅ６５２、Ｇ６５３、Ｉ６９６、Ｋ７０５、Ｋ７０８、Ｅ７０９、Ｌ７５１、Ｓ７５２、Ｅ７５５、Ｎ８４０、Ｎ８４８、Ｓ８５１、Ａ８５６、Ｑ８８５、Ｍ８９７、Ｎ９２５、Ｉ９２６、Ｔ９２８、Ｇ９２９、Ｙ９３２、Ａ１０２２のうちの１つまたは複数のアミノ酸であり；
さらに好ましくは、前記ＲｕｖＣドメインに位置し、一本鎖ＤＮＡ基質と相互作用する１つまたは複数のアミノ酸はＥ３２３、Ｄ３６２、Ｑ４２５、Ｎ９２５、Ｉ９２６、Ｎ３９１、Ｑ４２４及びＧ９２９のうちの１つまたは複数のアミノ酸であり；
そのうち、前記アミノ酸の位置番号はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示す対応するアミノ酸位置に定義される、項１から７のいずれか一項に記載のエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼ。
好ましくは、前記ＲｕｖＣドメインに位置し、一本鎖ＤＮＡ基質と相互作用する１つまたは複数のアミノ酸は３２３、３２７、３５５、３５９、３６０、３６１、３６２、３８８、３９０、３９１、３９２、３９３、４１４、４１７、４１８、４２１、４２４、４２５、６５０、６５２、６５３、６９６、７０５、７０８、７０９、７５１、７５２、７５５、８４０、８４８、８５１、８５６、８８５、８９７、９２５、９２６、９２８、９２９、９３２、１０２２のうちの１つまたは複数の位置のアミノ酸である。
さらに好ましくは、前記ＲｕｖＣドメインに位置し、一本鎖ＤＮＡ基質と相互作用する１つまたは複数のアミノ酸はＥ３２３、Ｌ３２７、Ｖ３５５、Ｇ３５９、Ｇ３６０、Ｋ３６１、Ｄ３６２、Ｌ３８８、Ｎ３９０、Ｎ３９１、Ｆ３９２、Ｋ３９３、Ｑ４１４、Ｌ４１７、Ｌ４１８、Ｋ４２１、Ｑ４２４、Ｑ４２５、Ｓ６５０、Ｅ６５２、Ｇ６５３、Ｉ６９６、Ｋ７０５、Ｋ７０８、Ｅ７０９、Ｌ７５１、Ｓ７５２、Ｅ７５５、Ｎ８４０、Ｎ８４８、Ｓ８５１、Ａ８５６、Ｑ８８５、Ｍ８９７、Ｎ９２５、Ｉ９２６、Ｔ９２８、Ｇ９２９、Ｙ９３２、Ａ１０２２のうちの１つまたは複数のアミノ酸であり；
さらに好ましくは、前記ＲｕｖＣドメインに位置し、一本鎖ＤＮＡ基質と相互作用する１つまたは複数のアミノ酸はＥ３２３、Ｄ３６２、Ｑ４２５、Ｎ９２５、Ｉ９２６、Ｎ３９１、Ｑ４２４及びＧ９２９のうちの１つまたは複数のアミノ酸であり；
そのうち、前記アミノ酸の位置番号はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示す対応するアミノ酸位置に定義される、項１から７のいずれか一項に記載のエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼ。
【0015】
９．参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼ中のＲｕｖＣドメインに位置し、一本鎖ＤＮＡ基質と相互作用する１つまたは複数のアミノ酸を正に帯電したアミノ酸に置換することはＲ或いはＫに置換することを含み、好ましくは、前記正に帯電した該アミノ酸はＲである、項１から８のいずれか一項に記載のエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼ。
【0016】
１０．参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼ中のＲｕｖＣドメインに位置し、一本鎖ＤＮＡ基質と相互作用する１つまたは複数のアミノ酸を正に帯電したアミノ酸に置換することはＥ３２３Ｒ、Ｄ３６２Ｒ、Ｎ３９１Ｒ、Ｑ４２４Ｒ、Ｑ４２５Ｒ、Ｎ９２５Ｒ、Ｉ９２６Ｒ及びＧ９２９Ｒのうちの一つまたは複数の置換を含み；
好ましくは、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼは（１）Ｅ３２３Ｒ；（２）Ｄ３６２Ｒ；（３）Ｑ４２５Ｒ； （４）Ｎ９２５Ｒ； （５）Ｉ９２６Ｒ；（６）Ｅ３２３ＲとＤ３６２Ｒ；（７）Ｅ３２３ＲとＱ４２５Ｒ；（８）Ｅ３２３ＲとＩ９２６Ｒ；（９）Ｑ４２５ＲとＩ９２６Ｒ； （１０）Ｄ３６２ＲとＩ９２６Ｒ； （１１）Ｎ９２５ＲとＩ９２６Ｒ； （１２） Ｅ３２３Ｒ、Ｄ３６２Ｒ及びＱ４２５Ｒ； （１３）Ｅ３２３Ｒ、Ｄ３６２Ｒ及びＩ９２６Ｒ；（１４）Ｅ３２３Ｒ、Ｑ４２５Ｒ及びＩ９２６Ｒ；（１５）Ｄ３６２Ｒ、Ｎ９２５Ｒ及びＩ９２６Ｒ；及び（１６） Ｅ３２３Ｒ、Ｄ３６２Ｒ、Ｑ４２５Ｒ及びＩ９２６Ｒのうちのいずれかの変異または変異の組み合わせを含み；
そのうち、前記アミノ酸位置はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示す対応するアミノ酸位置に定義される、項１から９のいずれか一項に記載のエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼ。
好ましくは、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼは（１）Ｅ３２３Ｒ；（２）Ｄ３６２Ｒ；（３）Ｑ４２５Ｒ； （４）Ｎ９２５Ｒ； （５）Ｉ９２６Ｒ；（６）Ｅ３２３ＲとＤ３６２Ｒ；（７）Ｅ３２３ＲとＱ４２５Ｒ；（８）Ｅ３２３ＲとＩ９２６Ｒ；（９）Ｑ４２５ＲとＩ９２６Ｒ； （１０）Ｄ３６２ＲとＩ９２６Ｒ； （１１）Ｎ９２５ＲとＩ９２６Ｒ； （１２） Ｅ３２３Ｒ、Ｄ３６２Ｒ及びＱ４２５Ｒ； （１３）Ｅ３２３Ｒ、Ｄ３６２Ｒ及びＩ９２６Ｒ；（１４）Ｅ３２３Ｒ、Ｑ４２５Ｒ及びＩ９２６Ｒ；（１５）Ｄ３６２Ｒ、Ｎ９２５Ｒ及びＩ９２６Ｒ；及び（１６） Ｅ３２３Ｒ、Ｄ３６２Ｒ、Ｑ４２５Ｒ及びＩ９２６Ｒのうちのいずれかの変異または変異の組み合わせを含み；
そのうち、前記アミノ酸位置はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示す対応するアミノ酸位置に定義される、項１から９のいずれか一項に記載のエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼ。
【0017】
１１．前記ＤＮＡ－ＲＮＡ二重らせんと相互作用する１つまたは複数のアミノ酸はＤＮＡ－ＲＮＡ二重らせんと三次元構造上９Å以内の距離にあるアミノ酸であり；
好ましくは、前記ＤＮＡ－ＲＮＡ二重らせんと相互作用する１つまたは複数のアミノ酸は１１６、１１７、１５６、１５９、１６０、１６１、２４７、２９３、２９４、２９７、３０１、３０５、３０６、３０８、３１２、３１３、３１６、３１９、３２０、３４３、３４８、３４９、４２７、４３３、４３８、４４１、４４２、６７９、６８３、６９１、７８２、７８３、７９７、８００、８５２、８５３、８５５、８６１、８６５、９５７、９５８のうちの１つまたは複数の位置のアミノ酸であり；
さらに好ましくは、前記ＤＮＡ－ＲＮＡ二重らせんと相互作用する１つまたは複数のアミノ酸Ｇ１１６、Ｅ１１７、Ａ１５６、Ｔ１５９、Ｓ１６１、Ｔ３０１、Ｉ３０５、Ｋ３０６、Ｔ３０８、Ｎ３１２、Ｆ３１３、Ｄ４２７、Ｋ４３３、Ｖ４３８、Ｎ４４１、Ｑ４４２、Ｍ８５２、Ｌ８５５、Ｎ８６１、Ｑ８６５、Ｅ１６０、Ｑ３１６、Ｅ３１９、Ｑ３２０、Ｅ２４７、Ｅ３４３、Ｅ３４８、Ｅ３４９、Ｎ６７９、Ｅ６８３、Ｅ６９１、Ｄ７８２、Ｅ７８３、Ｅ７９７、Ｅ８００、Ｄ８５３、Ｓ９５７、Ｄ９５８、Ｇ２９３、Ｅ２９４及びＮ２９７；Ｇ１１６、Ｅ１１７、Ａ１５６、Ｔ１５９、Ｅ１６０、Ｓ１６１、Ｅ２４７、Ｇ２９３、Ｅ２９４、Ｎ２９７、Ｔ３０１、Ｉ３０５、Ｋ３０６、Ｔ３０８、Ｎ３１２、Ｆ３１３、Ｑ３１６、Ｅ３１９、Ｑ３２０、Ｅ３４３、Ｅ３４８、Ｅ３４９、Ｄ４２７、Ｋ４３３、Ｖ４３８、Ｎ４４１、Ｑ４４２、Ｎ６７９、Ｅ６８３、Ｅ６９１、Ｄ７８２、Ｅ７８３、Ｅ７９７、Ｅ８００、Ｍ８５２、Ｄ８５３、Ｌ８５５、Ｎ８６１、Ｑ８６５、Ｓ９５７、Ｄ９５８のうちの１つまたは複数のアミノ酸であり；
さらに好ましくは、前記ＤＮＡ－ＲＮＡ二重らせんと相互作用する１つまたは複数のアミノ酸はＧ１１６、Ｅ１１７、Ｔ１５９、Ｓ１６１、Ｅ３１９、Ｅ３４３及びＤ９５８のうちの１つまたは複数のアミノ酸であり；そのうち、前記アミノ酸の位置はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示す対応するアミノ酸位置に定義される、項１から１０のいずれか一項に記載のエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼ。
好ましくは、前記ＤＮＡ－ＲＮＡ二重らせんと相互作用する１つまたは複数のアミノ酸は１１６、１１７、１５６、１５９、１６０、１６１、２４７、２９３、２９４、２９７、３０１、３０５、３０６、３０８、３１２、３１３、３１６、３１９、３２０、３４３、３４８、３４９、４２７、４３３、４３８、４４１、４４２、６７９、６８３、６９１、７８２、７８３、７９７、８００、８５２、８５３、８５５、８６１、８６５、９５７、９５８のうちの１つまたは複数の位置のアミノ酸であり；
さらに好ましくは、前記ＤＮＡ－ＲＮＡ二重らせんと相互作用する１つまたは複数のアミノ酸Ｇ１１６、Ｅ１１７、Ａ１５６、Ｔ１５９、Ｓ１６１、Ｔ３０１、Ｉ３０５、Ｋ３０６、Ｔ３０８、Ｎ３１２、Ｆ３１３、Ｄ４２７、Ｋ４３３、Ｖ４３８、Ｎ４４１、Ｑ４４２、Ｍ８５２、Ｌ８５５、Ｎ８６１、Ｑ８６５、Ｅ１６０、Ｑ３１６、Ｅ３１９、Ｑ３２０、Ｅ２４７、Ｅ３４３、Ｅ３４８、Ｅ３４９、Ｎ６７９、Ｅ６８３、Ｅ６９１、Ｄ７８２、Ｅ７８３、Ｅ７９７、Ｅ８００、Ｄ８５３、Ｓ９５７、Ｄ９５８、Ｇ２９３、Ｅ２９４及びＮ２９７；Ｇ１１６、Ｅ１１７、Ａ１５６、Ｔ１５９、Ｅ１６０、Ｓ１６１、Ｅ２４７、Ｇ２９３、Ｅ２９４、Ｎ２９７、Ｔ３０１、Ｉ３０５、Ｋ３０６、Ｔ３０８、Ｎ３１２、Ｆ３１３、Ｑ３１６、Ｅ３１９、Ｑ３２０、Ｅ３４３、Ｅ３４８、Ｅ３４９、Ｄ４２７、Ｋ４３３、Ｖ４３８、Ｎ４４１、Ｑ４４２、Ｎ６７９、Ｅ６８３、Ｅ６９１、Ｄ７８２、Ｅ７８３、Ｅ７９７、Ｅ８００、Ｍ８５２、Ｄ８５３、Ｌ８５５、Ｎ８６１、Ｑ８６５、Ｓ９５７、Ｄ９５８のうちの１つまたは複数のアミノ酸であり；
さらに好ましくは、前記ＤＮＡ－ＲＮＡ二重らせんと相互作用する１つまたは複数のアミノ酸はＧ１１６、Ｅ１１７、Ｔ１５９、Ｓ１６１、Ｅ３１９、Ｅ３４３及びＤ９５８のうちの１つまたは複数のアミノ酸であり；そのうち、前記アミノ酸の位置はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示す対応するアミノ酸位置に定義される、項１から１０のいずれか一項に記載のエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼ。
【0018】
１２．参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼ中のＤＮＡ－ＲＮＡ二重らせんと相互作用する１つまたは複数のアミノ酸を正に帯電したアミノ酸に置換することはＲ或いはＫに置換することを含み、好ましくは、前記正に帯電したアミノ酸はＲである、項１から１１のいずれか一項に記載のエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼ。
【0019】
１３．参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼ中のＤＮＡ－ＲＮＡ二重らせんと相互作用する１つまたは複数のアミノ酸を正に帯電したアミノ酸に置換することはＧ１１６Ｒ、Ｅ１１７Ｒ、Ｔ１５９Ｒ、Ｓ１６１Ｒ、Ｅ３１９Ｒ、Ｅ３４３Ｒ及びＤ９５８Ｒのうちの一つまたは複数の置換を含み；
好ましくは、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼはＤ９５８Ｒ置換を含み；
そのうち、前記アミノ酸の位置はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示す対応するアミノ酸位置に定義される、項１から１２のいずれか一項に記載のエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼ。
好ましくは、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼはＤ９５８Ｒ置換を含み；
そのうち、前記アミノ酸の位置はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示す対応するアミノ酸位置に定義される、項１から１２のいずれか一項に記載のエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼ。
【0020】
１４．前記ＤＮＡ－ＲＮＡ二重らせんと相互作用する１つまたは複数の極性または正に帯電したアミノ酸は３５７、３９４、７１５、７１９、８０７、８４４、８４８、８５７、８６１のうちの一つまたは複数の位置のアミノ酸から選択され、即ち、Ｈ３５７、Ｋ３９４、Ｒ７１５、Ｒ７１９、Ｋ８０７、Ｋ８４４、Ｎ８４８、Ｒ８５７、Ｒ８６１のうちの一つまたは複数のアミノ酸であり；
そのうち、前記アミノ酸の位置はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示す対応するアミノ酸位置に定義される、項１から１３のいずれか一項に記載のエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼ。
そのうち、前記アミノ酸の位置はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示す対応するアミノ酸位置に定義される、項１から１３のいずれか一項に記載のエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼ。
【0021】
１５．参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼ中のＤＮＡ－ＲＮＡ二重らせんと相互作用する１つまたは複数の極性または正に帯電したアミノ酸を疎水性アミノ酸に置換することはアラニン（Ａ）に置換することを含む、項１から１４のいずれか一項に記載のエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼ。
【0022】
１６．Ｈ３５７Ａ、Ｋ３９４Ａ、Ｒ７１５Ａ、Ｒ７１９Ａ、Ｋ８０７Ａ、Ｋ８４４Ａ、Ｎ８４８Ａ、Ｒ８５７Ａ、Ｒ８６１Ａからなる群から選択された一つまたは複数の変異を含み；
好ましくは、Ｋ３９４Ａ、Ｒ７１９Ａ、Ｋ８４４Ａ、Ｒ８５７Ａからなる群から選択された一つまたは複数の変異を含み；
そのうち、前記アミノ酸位置はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示す対応するアミノ酸位置に定義される、項１から１５のいずれか一項に記載のエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼ。
好ましくは、Ｋ３９４Ａ、Ｒ７１９Ａ、Ｋ８４４Ａ、Ｒ８５７Ａからなる群から選択された一つまたは複数の変異を含み；
そのうち、前記アミノ酸位置はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示す対応するアミノ酸位置に定義される、項１から１５のいずれか一項に記載のエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼ。
【0023】
１７．Ｒ７１９ＡとＫ８４４Ａアミノ酸置換を含み、またはＲ８５７ＡとＫ８４４Ａアミノ酸置換を含み；そのうち、前記アミノ酸位置はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示す対応するアミノ酸位置に定義される、項１から１６のいずれか一項に記載のエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼ。
【0024】
１８．一つまたは複数のフレキシブル領域変異をさらに含み、前記変異は参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼ中のフレキシブル領域の柔軟性を増加させ、前記フレキシブル領域はアミノ酸残基４３９－４４３またはアミノ酸残基９２５－９２９から選択され；
好ましくは、前記フレキシブル領域変異は４３９及び／または９２６位に位置し；
さらに好ましくは、前記フレキシブル領域変異はＬ４３９と／またはＩ９２６の変異であり；
そのうち、前記アミノ酸位置はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示す対応するアミノ酸位置に定義される、項１から１７のいずれか一項に記載のエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼ。
好ましくは、前記フレキシブル領域変異は４３９及び／または９２６位に位置し；
さらに好ましくは、前記フレキシブル領域変異はＬ４３９と／またはＩ９２６の変異であり；
そのうち、前記アミノ酸位置はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示す対応するアミノ酸位置に定義される、項１から１７のいずれか一項に記載のエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼ。
【0025】
１９．前記一つまたは複数のフレキシブル領域変異は、該フレキシブル領域のアミノ酸をＧに置換し、及び／またはその後ろに１つまたは２つのＧを挿入することであり；
好ましくは、前記一つまたは複数のフレキシブル領域変異はＩ９２６Ｇ、Ｌ４３９（Ｌ＋Ｇ）またはＬ４３９（Ｌ＋ＧＧ）を含み；
さらに好ましくは、前記一つまたは複数のフレキシブル領域突然変異はＬ４３９（Ｌ＋Ｇ）またはＬ４３９（Ｌ＋ＧＧ）を含み；
そのうち、前記アミノ酸位置番号はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示す対応するアミノ酸位置に定義される、項１８に記載のエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼ。
好ましくは、前記一つまたは複数のフレキシブル領域変異はＩ９２６Ｇ、Ｌ４３９（Ｌ＋Ｇ）またはＬ４３９（Ｌ＋ＧＧ）を含み；
さらに好ましくは、前記一つまたは複数のフレキシブル領域突然変異はＬ４３９（Ｌ＋Ｇ）またはＬ４３９（Ｌ＋ＧＧ）を含み；
そのうち、前記アミノ酸位置番号はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示す対応するアミノ酸位置に定義される、項１８に記載のエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼ。
【0026】
２０．エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼであって；
前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼは
（１）Ｅ５６３Ｒ；（２）Ｅ１７６ＲとＴ４４７Ｒ；（３）Ｅ１７６ＲとＥ５６３Ｒ；（４）Ｋ２３８ＲとＥ５６３Ｒ；（５）Ｅ１７６Ｒ、Ｋ２３８Ｒ及びＴ４４７Ｒ；（６）Ｅ１７６Ｒ、Ｔ４４７Ｒ及びＥ５６３Ｒ；（７）Ｅ１７６Ｒ、Ｋ２３８Ｒ及びＥ５６３Ｒ；（８）Ｅ１７６Ｒ、Ｋ２３８Ｒ、Ｔ４４７Ｒ及びＥ５６３Ｒ；（９）Ｎ１６４Ｙ；（１０）Ｎ１６４Ｆ；（１１）Ｅ３２３Ｒ；（１２）Ｄ３６２Ｒ；（１３）Ｑ４２５Ｒ；（１４）Ｎ９２５Ｒ；（１５）Ｉ９２６Ｒ； （１６）Ｄ９５８Ｒ；（１７）Ｅ３２３ＲとＤ３６２Ｒ；（１８）Ｅ３２３ＲとＱ４２５Ｒ；（１９）Ｅ３２３ＲとＩ９２６Ｒ；（２０）Ｑ４２５ＲとＩ９２６Ｒ；（２１）Ｄ３６２ＲとＩ９２６Ｒ；（２２）Ｎ９２５ＲとＩ９２６Ｒ；（２３）Ｅ３２３Ｒ、Ｄ３６２Ｒ及びＱ４２５Ｒ；（２４） Ｅ３２３Ｒ、Ｄ３６２Ｒ及びＩ９２６Ｒ；（２５）Ｅ３２３Ｒ、Ｑ４２５Ｒ及びＩ９２６Ｒ；（２６）Ｄ３６２Ｒ、Ｎ９２５Ｒ及びＩ９２６Ｒ；（２７）Ｅ３２３Ｒ、Ｄ３６２Ｒ、Ｑ４２５Ｒ及びＩ９２６Ｒ；（２８）Ｄ３６２ＲとＩ９２６Ｇ；（２９）Ｎ９２５ＲとＩ９２６Ｇ；（３０）Ｄ３６２Ｒ、Ｎ９２５Ｒ及びＩ９２６Ｇ；（３１）Ｉ９２６ＲとＬ４３９（Ｌ＋Ｇ）；（３２）Ｉ９２６ＲとＬ４３９（Ｌ＋ＧＧ）；（３３）Ｅ３２３Ｒ、Ｄ３６２ＲとＩ９２６Ｇ；（３４）Ｒ７１９ＡとＫ８４４Ａ；及び（３５）Ｒ８５７ＡとＫ８４４Ａの１つまたは複数群の変異を含み；
好ましくは、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼは（１）Ｅ１７６Ｒ、Ｋ２３８Ｒ、Ｔ４４７Ｒ及びＥ５６３Ｒ；（２）Ｎ１６４Ｙ；（３）Ｉ９２６Ｒ；（４）Ｅ３２３ＲとＤ３６２Ｒ；（４）Ｉ９２６Ｇ；（５）Ｉ９２６ＲとＬ４３９（Ｌ＋Ｇ）；（６）Ｉ９２６ＲとＬ４３９（Ｌ＋ＧＧ）；及び（７）Ｄ９５８Ｒの１つまたは複数群の変異を含み；
そのうち、前記アミノ酸位置はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示す対応するアミノ酸位置に定義される。
前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼは
（１）Ｅ５６３Ｒ；（２）Ｅ１７６ＲとＴ４４７Ｒ；（３）Ｅ１７６ＲとＥ５６３Ｒ；（４）Ｋ２３８ＲとＥ５６３Ｒ；（５）Ｅ１７６Ｒ、Ｋ２３８Ｒ及びＴ４４７Ｒ；（６）Ｅ１７６Ｒ、Ｔ４４７Ｒ及びＥ５６３Ｒ；（７）Ｅ１７６Ｒ、Ｋ２３８Ｒ及びＥ５６３Ｒ；（８）Ｅ１７６Ｒ、Ｋ２３８Ｒ、Ｔ４４７Ｒ及びＥ５６３Ｒ；（９）Ｎ１６４Ｙ；（１０）Ｎ１６４Ｆ；（１１）Ｅ３２３Ｒ；（１２）Ｄ３６２Ｒ；（１３）Ｑ４２５Ｒ；（１４）Ｎ９２５Ｒ；（１５）Ｉ９２６Ｒ； （１６）Ｄ９５８Ｒ；（１７）Ｅ３２３ＲとＤ３６２Ｒ；（１８）Ｅ３２３ＲとＱ４２５Ｒ；（１９）Ｅ３２３ＲとＩ９２６Ｒ；（２０）Ｑ４２５ＲとＩ９２６Ｒ；（２１）Ｄ３６２ＲとＩ９２６Ｒ；（２２）Ｎ９２５ＲとＩ９２６Ｒ；（２３）Ｅ３２３Ｒ、Ｄ３６２Ｒ及びＱ４２５Ｒ；（２４） Ｅ３２３Ｒ、Ｄ３６２Ｒ及びＩ９２６Ｒ；（２５）Ｅ３２３Ｒ、Ｑ４２５Ｒ及びＩ９２６Ｒ；（２６）Ｄ３６２Ｒ、Ｎ９２５Ｒ及びＩ９２６Ｒ；（２７）Ｅ３２３Ｒ、Ｄ３６２Ｒ、Ｑ４２５Ｒ及びＩ９２６Ｒ；（２８）Ｄ３６２ＲとＩ９２６Ｇ；（２９）Ｎ９２５ＲとＩ９２６Ｇ；（３０）Ｄ３６２Ｒ、Ｎ９２５Ｒ及びＩ９２６Ｇ；（３１）Ｉ９２６ＲとＬ４３９（Ｌ＋Ｇ）；（３２）Ｉ９２６ＲとＬ４３９（Ｌ＋ＧＧ）；（３３）Ｅ３２３Ｒ、Ｄ３６２ＲとＩ９２６Ｇ；（３４）Ｒ７１９ＡとＫ８４４Ａ；及び（３５）Ｒ８５７ＡとＫ８４４Ａの１つまたは複数群の変異を含み；
好ましくは、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼは（１）Ｅ１７６Ｒ、Ｋ２３８Ｒ、Ｔ４４７Ｒ及びＥ５６３Ｒ；（２）Ｎ１６４Ｙ；（３）Ｉ９２６Ｒ；（４）Ｅ３２３ＲとＤ３６２Ｒ；（４）Ｉ９２６Ｇ；（５）Ｉ９２６ＲとＬ４３９（Ｌ＋Ｇ）；（６）Ｉ９２６ＲとＬ４３９（Ｌ＋ＧＧ）；及び（７）Ｄ９５８Ｒの１つまたは複数群の変異を含み；
そのうち、前記アミノ酸位置はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示す対応するアミノ酸位置に定義される。
【0027】
２１．エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼであって、 前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼは（１）Ｅ１７６Ｒ、Ｋ２３８Ｒ、Ｔ４４７Ｒ、Ｅ５６３Ｒ及びＮ１６４Ｙ；（２）Ｅ１７６Ｒ、Ｋ２３８Ｒ、Ｔ４４７Ｒ、Ｅ５６３Ｒ及びＩ９２６Ｒ；（３）Ｎ１６４Ｙ、Ｅ３２３Ｒ及びＤ３６２Ｒ；（４）Ｅ１７６Ｒ、Ｋ２３８Ｒ、Ｔ４４７Ｒ、Ｅ５６３Ｒ、Ｅ３２３Ｒ及びＤ３６２Ｒ；（５）Ｎ１６４ＹとＩ９２６Ｒ；（６）Ｅ１７６Ｒ、Ｋ２３８Ｒ、Ｔ４４７Ｒ、Ｅ５６３Ｒ、Ｎ１６４Ｙ及びＩ９２６Ｒ；（７）Ｅ１７６Ｒ、Ｋ２３８Ｒ、Ｔ４４７Ｒ、Ｅ５６３Ｒ、Ｎ１６４Ｙ、Ｅ３２３Ｒ及びＤ３６２Ｒ；（８）Ｅ１７６Ｒ、Ｋ２３８Ｒ、Ｔ４４７Ｒ、Ｅ５６３Ｒ、Ｎ１６４Ｙ、Ｉ９２６Ｒ、Ｅ３２３Ｒ及びＤ３６２Ｒ；（９）Ｅ１７６Ｒ、Ｋ２３８Ｒ、Ｔ４４７Ｒ、Ｅ５６３Ｒ、Ｎ１６４Ｙ、Ｅ３２３Ｒ、Ｄ３６２Ｒ及びＩ９２６Ｇ；（１０）Ｅ１７６Ｒ、Ｋ２３８Ｒ、Ｔ４４７Ｒ、Ｅ５６３Ｒ、Ｎ１６４Ｙ、Ｅ３２３Ｒ、Ｄ３６２Ｒ、Ｉ９２６Ｇ及びＬ４３９（Ｌ＋ＧＧ）；（１１）Ｅ１７６Ｒ、Ｋ２３８Ｒ、Ｔ４４７Ｒ、Ｅ５６３Ｒ、Ｎ１６４Ｙ、Ｅ３２３Ｒ、Ｄ３６２Ｒ、Ｉ９２６Ｇ及びＬ４３９（Ｌ＋Ｇ）；（１２）Ｅ１７６Ｒ、Ｋ２３８Ｒ、Ｔ４４７Ｒ、Ｅ５６３Ｒ、Ｎ１６４Ｙ及びＤ９５８Ｒ；（１３）Ｅ１７６Ｒ、Ｋ２３８Ｒ、Ｔ４４７Ｒ、Ｅ５６３Ｒ、Ｉ９２６Ｒ及びＤ９５８Ｒ；（１４）Ｅ１７６Ｒ、Ｋ２３８Ｒ、Ｔ４４７Ｒ、Ｅ５６３Ｒ、Ｅ３２３Ｒ、Ｄ３６２Ｒ及びＤ９５８Ｒ；（１５）Ｎ１６４Ｙ、Ｉ９２６Ｒ及びＤ９５８Ｒ；（１６）Ｎ１６４Ｙ、Ｅ３２３Ｒ、Ｄ３６２Ｒ及びＤ９５８Ｒ；（１７）Ｅ１７６Ｒ、Ｋ２３８Ｒ、Ｔ４４７Ｒ、Ｅ５６３Ｒ、Ｎ１６４Ｙ、Ｉ９２６Ｒ及びＤ９５８Ｒ；（１８）Ｅ１７６Ｒ、Ｋ２３８Ｒ、Ｔ４４７Ｒ、Ｅ５６３Ｒ、Ｎ１６４Ｙ、Ｅ３２３Ｒ、Ｄ３６２Ｒ及びＤ９５８Ｒ；（１９）Ｅ１７６Ｒ、Ｋ２３８Ｒ、Ｔ４４７Ｒ、Ｅ５６３Ｒ、Ｎ１６４Ｙ、Ｉ９２６Ｒ、Ｅ３２３Ｒ、Ｄ３６２Ｒ及びＤ９５８Ｒ；（２０）Ｅ１７６Ｒ、Ｋ２３８Ｒ、Ｔ４４７Ｒ、Ｅ５６３Ｒ、Ｎ１６４Ｙ、Ｅ３２３Ｒ、Ｄ３６２Ｒ、Ｉ９２６Ｇ及びＤ９５８Ｒ；（２１）Ｅ１７６Ｒ、Ｋ２３８Ｒ、Ｔ４４７Ｒ、Ｅ５６３Ｒ、Ｎ１６４Ｙ、Ｅ３２３Ｒ、Ｄ３６２Ｒ、Ｉ９２６Ｇ、Ｌ４３９（Ｌ＋ＧＧ）及びＤ９５８Ｒ；（２２）Ｅ１７６Ｒ、Ｋ２３８Ｒ、Ｔ４４７Ｒ、Ｅ５６３Ｒ、Ｎ１６４Ｙ、Ｅ３２３Ｒ、Ｄ３６２Ｒ、Ｉ９２６Ｇ、Ｌ４３９（Ｌ＋Ｇ）及びＤ９５８Ｒ；（２３）Ｅ１７６Ｒ、Ｋ２３８Ｒ、Ｔ４４７Ｒ、Ｅ５６３Ｒ、Ｎ１６４Ｙ、Ｅ３２３Ｒ、Ｄ３６２Ｒ及びＲ８５７Ａ；（２４）Ｅ１７６Ｒ、Ｋ２３８Ｒ、Ｔ４４７Ｒ、Ｅ５６３Ｒ、Ｎ１６４Ｙ、Ｅ３２３Ｒ、Ｄ３６２Ｒ及びＮ８６１Ａ；（２５）Ｅ１７６Ｒ、Ｋ２３８Ｒ、Ｔ４４７Ｒ、Ｅ５６３Ｒ、Ｎ１６４Ｙ、Ｅ３２３Ｒ、Ｄ３６２Ｒ及びＫ８０７Ａ；（２６）Ｅ１７６Ｒ、Ｋ２３８Ｒ、Ｔ４４７Ｒ、Ｅ５６３Ｒ、Ｎ１６４Ｙ、Ｅ３２３Ｒ、Ｄ３６２Ｒ及びＮ８４８Ａ；（２７）Ｅ１７６Ｒ、Ｋ２３８Ｒ、Ｔ４４７Ｒ、Ｅ５６３Ｒ、Ｎ１６４Ｙ、Ｅ３２３Ｒ、Ｄ３６２Ｒ及びＲ７１５Ａ；（２８）Ｅ１７６Ｒ、Ｋ２３８Ｒ、Ｔ４４７Ｒ、Ｅ５６３Ｒ、Ｎ１６４Ｙ、Ｅ３２３Ｒ、Ｄ３６２Ｒ及びＲ７１９Ａ；（２９）Ｅ１７６Ｒ、Ｋ２３８Ｒ、Ｔ４４７Ｒ、Ｅ５６３Ｒ、Ｎ１６４Ｙ、Ｅ３２３Ｒ、Ｄ３６２Ｒ及びＫ３９４Ａ；（３０）Ｅ１７６Ｒ、Ｋ２３８Ｒ、Ｔ４４７Ｒ、Ｅ５６３Ｒ、Ｎ１６４Ｙ、Ｅ３２３Ｒ、Ｄ３６２Ｒ及びＨ３５７Ａ；（３１）Ｅ１７６Ｒ、Ｋ２３８Ｒ、Ｔ４４７Ｒ、Ｅ５６３Ｒ、Ｎ１６４Ｙ、Ｅ３２３Ｒ、Ｄ３６２Ｒ及びＫ８４４Ａ；（３２）Ｅ１７６Ｒ、Ｋ２３８Ｒ、Ｔ４４７Ｒ、Ｅ５６３Ｒ、Ｎ１６４Ｙ、Ｅ３２３Ｒ、Ｄ３６２Ｒ、Ｒ７１９Ａ及びＫ８４４Ａ；または（３３）Ｅ１７６Ｒ、Ｋ２３８Ｒ、Ｔ４４７Ｒ、Ｅ５６３Ｒ、Ｎ１６４Ｙ、Ｅ３２３Ｒ、Ｄ３６２Ｒ、Ｒ８５７Ａ及びＫ８４４Ａのいずれかの群の変異を含み；そのうち、前記アミノ酸位置はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示す対応するアミノ酸位置に定義される。
【0028】
２２．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ：２～２４のいずれかに示すアミノ酸配列のエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼ、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ：２～２４のいずれかの配列に示すアミノ酸配列と少なくとも８０％同一性を有するアミノ酸配列を含む、項１から２１のいずれか一項に記載のエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼ。
【0029】
２３．エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉエフェクタータンパク質であって、項１から２２のいずれか一項に記載のエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼまたはその機能的誘導体を含み；
任意に、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼまたはその機能的誘導体は酵素活性を有し、または前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼまたはその機能的誘導体は酵素不活性変異体である、エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉエフェクタータンパク質。
任意に、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼまたはその機能的誘導体は酵素活性を有し、または前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼまたはその機能的誘導体は酵素不活性変異体である、エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉエフェクタータンパク質。
【0030】
２４．前記Ｃａｓ１２ｉエフェクタータンパク質はＤＮＡ分子中の二本鎖断裂または一本鎖断裂を誘導することができる、項２３に記載のエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉエフェクタータンパク質。
【0031】
２５．前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼまたはその機能的誘導体はＤ５９９Ａ、Ｅ８３３Ａ、Ｓ８８３Ａ、Ｈ８８４Ａ、Ｒ９００Ａ及びＤ１０１９Ａの１つまたは複数の変異を含む酵素不活性変異体であり；そのうち、前記アミノ酸位置はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示す対応するアミノ酸位置に定義される、項２３に記載のエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉエフェクタータンパク質。
【0032】
２６．前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼまたはその機能的誘導体と融合する機能ドメインをさらに含む、項２３から２５のいずれか一項に記載のエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉエフェクタータンパク質。
【0033】
２７．前記機能ドメインは以下：翻訳開始ドメイン、転写阻止ドメイン、トランス活性化ドメイン、エピジェネティック修飾ドメイン、核酸塩基編集ドメイン、逆転写酵素ドメイン、レポーター分子ドメイン、ヌクレアーゼドメインからなる群の一つまたは複数から選択される、項２６に記載のエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉエフェクタータンパク質。
【0034】
２８．前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉエフェクタータンパク質は、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼまたはその機能的誘導体のＮ末端部分を含む第一ポリペプチドと前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼまたはその機能的誘導体のＣ末端部分を含む第二ポリペプチドを備え、そのうち前記第一ポリペプチドと前記第二ポリペプチドは、標的核酸と特異的に結合するクラスター化され、規則的に間隔があいた短い回文構造の繰り返し配列（ＣＲＩＳＰＲ）複合体を形成するために、ガイド配列を含むガイドＲＮＡの存在下で互いに会合することができ、前記標的核酸は前記ガイド配列に相補的なターゲット配列を含み；
好ましくは、前記第一ポリペプチドは項１－２２のいずれかに記載のエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼのＮ末端部分アミノ酸残基１～Ｘを含み、前記第二ポリペプチドは項１－２２のいずれかに記載のエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼのアミノ酸残基Ｘ＋１～前記Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼのＣ末端を含み；
選択的に、前記第一ポリペプチドと前記第二ポリペプチドはそれぞれ二量化ドメインを含み；
選択的に、前記第一二量体ドメインと前記第二二量体ドメインは誘導剤の存在下で互いに会合している、項２３から２７のいずれか一項に記載のエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉエフェクタータンパク質。
好ましくは、前記第一ポリペプチドは項１－２２のいずれかに記載のエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼのＮ末端部分アミノ酸残基１～Ｘを含み、前記第二ポリペプチドは項１－２２のいずれかに記載のエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼのアミノ酸残基Ｘ＋１～前記Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼのＣ末端を含み；
選択的に、前記第一ポリペプチドと前記第二ポリペプチドはそれぞれ二量化ドメインを含み；
選択的に、前記第一二量体ドメインと前記第二二量体ドメインは誘導剤の存在下で互いに会合している、項２３から２７のいずれか一項に記載のエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉエフェクタータンパク質。
【0035】
２９．エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１２ｉシステムであって
（ａ）項１から２８のいずれか一項に記載のエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼ、または項２３から２８のいずれか一項に記載のエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉエフェクタータンパク質；及び
（ｂ）ターゲット配列に相補的なガイド配列を含むガイドＲＮＡ、または前記ガイドＲＮＡをコードする１つまたは複数の核酸を含み、
そのうち、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼまたはエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉエフェクタータンパク質と前記ガイドＲＮＡはＣＲＩＳＰＲ複合体を形成することができ、前記ＣＲＩＳＰＲ複合体の特異的結合は前記ターゲット配列の標的核酸を含み、且つ標的核酸の修飾を誘導し；
好ましくは、前記ガイドＲＮＡは前記ガイド配列を含むｃｒＲＮＡであり；
さらに好ましくは、前記エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１２ｉシステムは複数のｃｒＲＮＡをコードする前駆体ガイドＲＮＡアレイ（ａｒｒａｙ）を含み；
または、好ましくは、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼまたはエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉエフェクタータンパク質はメインエディタであり、前記ガイドＲＮＡは、プライム編集ガイドＲＮＡ（ｐｅｇＲＮＡ）である、エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１２ｉシステム。
（ａ）項１から２８のいずれか一項に記載のエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼ、または項２３から２８のいずれか一項に記載のエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉエフェクタータンパク質；及び
（ｂ）ターゲット配列に相補的なガイド配列を含むガイドＲＮＡ、または前記ガイドＲＮＡをコードする１つまたは複数の核酸を含み、
そのうち、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼまたはエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉエフェクタータンパク質と前記ガイドＲＮＡはＣＲＩＳＰＲ複合体を形成することができ、前記ＣＲＩＳＰＲ複合体の特異的結合は前記ターゲット配列の標的核酸を含み、且つ標的核酸の修飾を誘導し；
好ましくは、前記ガイドＲＮＡは前記ガイド配列を含むｃｒＲＮＡであり；
さらに好ましくは、前記エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１２ｉシステムは複数のｃｒＲＮＡをコードする前駆体ガイドＲＮＡアレイ（ａｒｒａｙ）を含み；
または、好ましくは、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼまたはエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉエフェクタータンパク質はメインエディタであり、前記ガイドＲＮＡは、プライム編集ガイドＲＮＡ（ｐｅｇＲＮＡ）である、エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１２ｉシステム。
【0036】
３０．前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼまたはエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉエフェクタータンパク質をコードする一つまたは複数のベクターを含み；
好ましくは、前記一つまたは複数のベクターは以下：レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ベクター、単純ヘルペスベクターの群から選択され；
さらに好ましくは、前記一つまたは複数のベクターはアデノ随伴ウイルスＡＡＶベクターであり；
さらに好ましくは、前記ＡＡＶベクターはまた前記ガイドＲＮＡをコードする、項２９に記載のエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１２ｉシステム。
好ましくは、前記一つまたは複数のベクターは以下：レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ベクター、単純ヘルペスベクターの群から選択され；
さらに好ましくは、前記一つまたは複数のベクターはアデノ随伴ウイルスＡＡＶベクターであり；
さらに好ましくは、前記ＡＡＶベクターはまた前記ガイドＲＮＡをコードする、項２９に記載のエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１２ｉシステム。
【0037】
３１．サンプル中の標的核酸を検出する方法であって、
（ａ）サンプルを項２９に記載のエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１２ｉシステム及びタグ付けされた検出核酸と接触させ、該検出核酸は一本鎖であり、前記ガイドＲＮＡのガイド配列とハイブリダイズしないこと；及び
（ｂ）標的核酸を検出するために、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼまたはエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉエフェクタータンパク質が前記タグ付けされた検出核酸を切断することによって生成される検出可能な信号を測定することを含む方法。
（ａ）サンプルを項２９に記載のエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１２ｉシステム及びタグ付けされた検出核酸と接触させ、該検出核酸は一本鎖であり、前記ガイドＲＮＡのガイド配列とハイブリダイズしないこと；及び
（ｂ）標的核酸を検出するために、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼまたはエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉエフェクタータンパク質が前記タグ付けされた検出核酸を切断することによって生成される検出可能な信号を測定することを含む方法。
【0038】
３２．ターゲット配列を含む標的核酸を修飾する方法であって、前記標的核酸を項２９または３０に記載のエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１２ｉシステムに接触させることを含み；
好ましくは、前記方法はインビトロで、エクスビボまたはインビボで行われ；
さらに好ましくは、前記標的核酸は細胞中に存在し；
さらに好ましくは、前記細菌細胞、酵母細胞、哺乳動物細胞、植物細胞または動物細胞であり；
さらに好ましくは、前記標的核酸はゲノムＤＮＡであり；
さらに好ましくは、前記ターゲット配列は疾患または障害に関連し；
さらに好ましくは、前記エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１２ｉシステムは複数のｃｒＲＮＡをコードする前駆体ガイドＲＮＡアレイを含み、そのうち、各ｃｒＲＮＡは異なるガイド配列を含む、方法。
好ましくは、前記方法はインビトロで、エクスビボまたはインビボで行われ；
さらに好ましくは、前記標的核酸は細胞中に存在し；
さらに好ましくは、前記細菌細胞、酵母細胞、哺乳動物細胞、植物細胞または動物細胞であり；
さらに好ましくは、前記標的核酸はゲノムＤＮＡであり；
さらに好ましくは、前記ターゲット配列は疾患または障害に関連し；
さらに好ましくは、前記エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１２ｉシステムは複数のｃｒＲＮＡをコードする前駆体ガイドＲＮＡアレイを含み、そのうち、各ｃｒＲＮＡは異なるガイド配列を含む、方法。
【0039】
３３．項２９または３０に記載のエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１２ｉシステムの、個体の細胞中の標的核酸に関連する疾患または障害を治療するための薬剤の製造における使用であって；好ましくは、前記疾患または障害は、癌、心血管疾患、遺伝性疾患、自己免疫疾患、代謝性疾患、神経退行性疾患、眼病、細菌感染、及びウイルス感染からなる群より選択される、使用。
【0040】
３４．個体の細胞中の標的核酸に関連する疾患または障害を治療する方法であって、前記方法は、項３２に記載の方法によって前記個体の細胞中の標的核酸を修飾し、前記疾患または障害を治療することを含み、好ましくは、疾患または障害は、癌、心血管疾患、遺伝性疾患、自己免疫疾患、代謝性疾患、神経退行性疾患、眼病、細菌感染、及びウイルス感染からなる群より選択される、方法。
【0041】
３５．ターゲット配列を含む標的核酸を修飾する方法であって、前記標的核酸を項２９または３０に記載のエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１２ｉシステムに接触させることを含む、方法。
【0042】
３６．項１から２２のいずれか一項に記載のエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼ、項２３から２８のいずれか一項に記載のエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉエフェクタータンパク質を含む組成物またはキット。
【0043】
３７．項３２または３５に記載の方法で修飾された標的核酸を含む、エンジニアリングされた細胞。
【0044】
３８．一つまたは複数の項３７に記載のエンジニアリングされた細胞を含む、エンジニアリングされた非ヒト動物。
【本出願の技術案が得た有益な効果】
【0045】
本出願でエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼ及びそのエフェクタータンパク質は、核酸基質を切断する触媒効率及び細胞内の遺伝子編集効率など、より高い活性を持っている。本出願におけるエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼは、従来のＣａｓ遺伝子編集ツールよりも優れた哺乳動物細胞（例えばヒト細胞）内の遺伝子編集効率を有し、例えば、本出願におけるいくつかの例示的なＣａｓ１２ｉ２ヌクレアーゼ変異体は、ヒト細胞中の複数の部位（例えば６２個の部位）で遺伝子編集効率を試験したところ、５７個の部位の遺伝子編集効率が約６０％を超え、平均遺伝子編集効率は７０％に近い。いくつかの実施形態では、本出願のエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼ及びそのエフェクタータンパク質は、タンパク質が小さく（１０５４ａａ）、ｃｒＲＮＡ成分が簡単であり、ＰＡＭ配列が簡単であり、タンパク質自体が前駆体ｃｒＲＮＡを加工することができるという１つまたは複数の利点も有する。さらに、本出願は、高活性エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼ（例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．８）に基づいてさらに人工的に改造された、より低いオフターゲット率とより高い特異性を有するＣａｓ１２ｉヌクレアーゼを提供する。これらの利点により、本出願の効率的なエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼ及びそのエフェクタータンパク質は、インビボでの遺伝子編集または遺伝子制御に非常に適している。
【図面の簡単な説明】
【0046】
【図1a】参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１に示す野生型Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼ）におけるＰＡＭと相互作用するアミノ酸を正に帯電したアミノ酸に置き換えることにより、遺伝子編集効率を高める。同図に示すように、Ｅ１７６Ｒ、Ｋ２３８Ｒ、Ｔ４４７Ｒ、Ｅ５６３Ｒの４つの変異体はヒト２９３Ｔ細胞における遺伝子編集効率を著しく向上させることができる。
【図1b】図１ａにおいて遺伝子編集効率を顕著に高めることができるアミノ酸変異（Ｅ１７６Ｒ、Ｋ２３８Ｒ、Ｔ４４７Ｒ、Ｅ５６３Ｒ）を組み合わせたところ、組み合わせた変異体がヒト２９３Ｔ細胞においてより高い遺伝子編集効率を示すことができる。
【図2】参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼ中のＤＮＡ二本鎖の開放に関与するアミノ酸を芳香環付きアミノ酸に置換することにより、遺伝子編集の効率を高める。同図に示すように、Ｑ１６３Ｆ、Ｑ１６３Ｙ、Ｑ１６３Ｗ、Ｎ１６４Ｆ、Ｎ１６４Ｙのような変異体は、ヒト２９３Ｔ細胞における遺伝子編集効率を著しく向上させることができる。
【図3a-3c】参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼ中のＲｕｖＣドメインに位置し、一本鎖ＤＮＡ基質と相互作用するアミノ酸を正に帯電したアミノ酸に置き換えることにより、遺伝子編集の効率を高める。図３ａ、３ｂ、３ｃに示すように、Ｅ３２３Ｒ、Ｌ３２７Ｒ、Ｖ３５５Ｒ、Ｇ３５９Ｒ、Ｇ３６０Ｒ、Ｄ３６２Ｒ、Ｎ３９１Ｒ、Ｑ４２４Ｒ、Ｑ４２５Ｒ、Ｎ９２５Ｒ、Ｉ９２６Ｒ、Ｇ９２９Ｒなどの変異体はヒト２９３Ｔ細胞における遺伝子編集効率を著しく向上させることができる。
【図3e】図３ａ、３ｂにおける効率を高める点突然変異と分子柔軟性原理に基づいて改造された変異（Ｌ４３９（Ｌ＋ＧＧ）、Ｉ９２６Ｇ）を組み合わせたところ、組み合わせた変異体はヒト２９３Ｔ細胞においてより高い遺伝子編集効率を示すことができる。
【図4】参照Ｃａｓ１２ｉ酵素中のＤＮＡ－ＲＮＡ二重らせんと相互作用するアミノ酸を正に帯電したアミノ酸に置換することにより、遺伝子編集効率を高める。図４に示すように、Ｇ１１６Ｒ、Ｅ１１７Ｒ、Ｔ１５９Ｒ、Ｓ１６１Ｒ、Ｅ３１９Ｒ、Ｅ３４３Ｒ、Ｄ９５８Ｒとの変異体はヒト２９３Ｔ細胞における遺伝子編集効率を明らかに高めることができる。そのうち、Ｄ９５８Ｒ変異が最適である。
【図5】図１ａ～図３ｅ中の３つの改造策から得られた高効率変異体と分子柔軟性原理に基づいて改造された変異（Ｌ４３９（Ｌ＋ＧＧ）、Ｉ９２６Ｇ）を組み合わせたところ、組み合わせた変異体はヒト２９３Ｔ細胞においてより高い遺伝子編集効率を示すことができる。組み合わせることにより遺伝子編集効率を大幅に向上させることができる。遺伝子編集効果が最も優れた変異体を選出し、ＣａｓＸＸと命名して後続の実験に使用する。ＣａｓＸＸ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）は、Ｅ１７６Ｒ＋Ｋ２３８Ｒ＋Ｔ４４７Ｒ＋Ｅ５６３Ｒ＋Ｎ１６４Ｙ＋Ｅ３２３Ｒ＋Ｄ３６２Ｒ変異の組み合わせ（アミノ酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に基づく参照Ｃａｓ１２ｉ２）を有するＣａｓ１２ｉエンジニアリング酵素である。
【図6a】６２個のヒトゲノム部位におけるＣａｓＸＸの遺伝子編集効率のまとめである。ＰＡＭ＝ＮＴＴＮ。
【図6b】ＣａｓＸＸとＡｓＣａｓ１２ａ、ＢｈＣａｓ１２ｂ ｖ４遺伝子編集効率の比較である。
【図6c】ＣａｓＸＸとＳｐＣａｓ９、ＳａＣａｓ９、ＳａＣａｓ９－ＫＫＨ遺伝子編集効率の比較である。
【図6d】マウスＨｅｐａ１－６細胞系におけるＣａｓＸＸの遺伝子編集効率の統計である。ＣａｓＸＸはマウスＨｅｐａ１－６細胞内の６５部位で強力な遺伝子編集能力を示し、平均遺伝子編集効率は６０％を超えていることが分かった。
【図7】図７は、６４ヒトゲノム部位におけるＣａｓＸＸの遺伝子編集効率を示す。そのうち、この６４部位に含まれるＰＡＭ配列は、ＮＴＴＮ、ＮＴＡＮ、ＮＴＣＮ、ＮＴＧＮ、ＮＡＴＮ、ＮＡＡＮ、ＮＡＣＮ、ＮＡＧＮ、ＮＣＴＮ、ＮＣＡＮ、ＮＣＣＮ、ＮＣＧＮ、ＮＧＴＮ、ＮＧＡＮ、ＮＧＣＮ、ＮＧＧＮというすべてのＮＮＮＮの組み合わせをカバーする。図７に示すように、ＣａｓＸＸはＮＴＴＮ、ＮＴＡＮ、ＮＴＣＮ、ＮＴＧＮ、ＮＡＴＮ、ＮＡＡＮ、ＮＣＴＮ、ＮＣＡＮ、ＮＧＴＮというＰＡＭ配列で効率的な遺伝子編集効率を示し、これらの部位での平均遺伝子編集効率は４０％を超えている。
【図8】図８は、野生型Ｃａｓ１２ｉ２タンパク質（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）及びＣａｓＸＸタンパク質がインビトロで二本鎖ＤＮＡを切断した結果を示す。野生型Ｃａｓ１２ｉ２タンパク質はＮＴＴＮ ＰＡＭを含む二本鎖ＤＮＡに対してのみ部分切断の効率を持つが、残りのＰＡＭに対して切断活性はほとんどない。しかし、ＣａｓＸＸタンパク質はＮＴＴＮ、ＮＴＡＮ、ＮＴＣＮ、ＮＴＧＮ、ＮＡＴＮ、ＮＡＡＮ、ＮＡＣＮ、ＮＣＴＮ、ＮＣＡＮ、ＮＧＴＮ、ＮＧＡＮ ＰＡＭを含む二本鎖ＤＮＡに対していずれも効率的な切断効率を示している。ＮＴＴＮ、ＮＴＡＮ、ＮＴＣＮ、ＮＡＴＮ、ＮＡＡＮ、ＮＡＣＮ、ＮＣＴＮ、ＮＣＡＮ、ＮＧＴＮ ＰＡＭを含む二本鎖ＤＮＡをほぼ完全に切断することができる。
【図9】Ｃａｓ１２ｉ２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）とＣａｓ１２ｉ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）のアミノ酸配列の相同性アライメントである。陰影で表示されたアミノ酸は２種類のＣａｓ１２ｉタンパク質が同じであるアミノ酸を表し、白枠で表示されたアミノ酸は２種類のＣａｓ１２ｉタンパク質の性質が似ているアミノ酸を表す。
【図10】図１０は、ＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑを用いたＥＭＸ１－７ターゲット部位におけるＣａｓＸＸのオフターゲット効果の検出である。配列に続く数字は、各配列について測定された読み取り（ｒｅａｄｓ）を表す。第１行の配列は参照ターゲット配列（ＳＥＱＩＤ ＮＯ：７７）であり、下の配列はそれぞれターゲット配列とオフターゲット配列、及びターゲット配列とオフターゲット配列に二本鎖ＤＮＡタグが濃縮された読み取り（ｒｅａｄｓ）を表す。該図は、ＣａｓＸＸがＥＭＸ１－７部位でオフターゲット効果があることを示している。
【図11】図１１はＣａｓＸＸの元の配列に新しい点突然変異を追加するか、元の点突然変異を削除し、新しいＨＦ変異体を構築することである。実験結果により、Ｒ８５７Ａ、Ｎ８６１ａ、Ｋ８０７Ａ、Ｎ８４８Ａ、Ｒ７１５Ａ、Ｒ７１９Ａ、Ｋ３９４Ａ、Ｈ３５７Ａ、Ｋ８４４ＡのＣａｓＸＸ配列に基づく単点突然変異体はＥＭＸ１－７－ＯＴ－１、ＥＭＸ１－７－ＯＴ－２、ＥＭＸ１－７－ＯＴ－３での挿入欠失の割合を効果的に低減できることが分かった。
【図12】図１２はＣａｓＸＸの元の配列に新しい点突然変異を追加するか、元の点突然変異を削除し、新しいＨＦ変異体を構築することである。実験の結果により、Ｒ８５７Ａ、Ｎ８６１ａ、Ｋ８０７Ａ、Ｎ８４８Ａ、Ｒ７１５Ａ、Ｒ７１９Ａ、Ｋ３９４Ａ、Ｈ３５７Ａ、Ｋ８４４ＡのＣａｓＸＸ配列に基づく単点突然変異体は、オフターゲットを模擬するｃｒＲＮＡ－ＲＮＦ２－１－Ｍｉｓ－１／２、ｃｒＲＮＡ－ＲＮＦ２－１－Ｍｉｓ－５／６、ｃｒＲＮＡ－ＲＮＦ２－１－Ｍｉｓ－１７／１８とｃｒＲＮＡ－ＲＮＦ２－１－Ｍｉｓ－１９／２０を使用する際に挿入欠失の割合を効果的に低減できることが分かった。
【図13】図１３は、蛍光報告システムを用いて遺伝子編集の特異性を高める変異体（ＣａｓＸＸに基づくＨＦ変異体）をスクリーニングする実験フローである。Ｃａｓタンパク質をコードするプラスミド６００ｎｇ、ｃｒＲＮＡをコードするプラスミド３００ｎｇ、ｍＣｈｅｒｒｙをコードするプラスミド１００ｎｇを、２４ウェル細胞培養ディッシュで培養した細胞にトランスフェクションした。３日間トランスフェクションした後、フローサイトメトリー分析を用いて各サンプルの残留ｍＣｈｅｒｒｙ陽性の割合を計算した。計算式を図のように示す。
【図14】図１４は、ＣａｓＸＸ及び変異体が２９３Ｔ細胞中でプラスミド上に位置するｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子を編集する図である。プラスミドのトランスフェクションした後、３日間培養し、フローサイトメトリー分析を行った。Ｃａｓタンパク質の遺伝子編集効率が高いほど、細胞中のｍＣｈｅｒｒｙ陽性の割合は低くなる。実験フローは図１３の実験フロー概略図に対応する；ｍＣｈｅｒｒｙ－ＦＭ、ｍＣｈｅｒｒｙ－Ｍｉｓ－１／２、ｍＣｈｅｒｒｙ－Ｍｉｓ－５／６、及びｍＣｈｅｒｒｙ－Ｍｉｓ－１９／２０に対するスペーサー配列がそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７、３８、３９、４０に示されている。
【図15】図１５は、ＣａｓＸＸの元の配列に基づいて新しいＨＦ変異体の組み合わせを構築する図である。実験の結果により、Ｒ８５７Ａ、Ｒ７１９Ａ、Ｋ３９４Ａ、Ｋ８４４Ａ、Ｒ７１９Ａ／Ｋ８４４Ａ及びＲ８５７Ａ／Ｋ８４４ＡのようなＣａｓＸＸ配列に基づく変異体は、ＥＭＸ１－７－ＯＴ－１、ＥＭＸ１－７－ＯＴ－２、ＥＭＸ１－７－ＯＴ－３でのオフターゲット挿入欠失の割合を効果的に低下させ、ターゲット部位での効率を犠牲にしないことが分かった。
【図16】ＣａｓＸＸの元の配列に基づいて新しいＨＦ変異体の組み合わせを構築する図である。実験結果により、Ｒ８５７Ａ、Ｒ７１９Ａ、Ｋ３９４Ａ、Ｋ８４４Ａ、Ｒ７１９Ａ／Ｋ８４４Ａ及びＲ８５７Ａ／Ｋ８４４ＡのようなＣａｓＸＸ配列に基づく変異体は、オフターゲットを模擬するｃｒＲＮＡ－ＲＮＦ２－１－Ｍｉｓ－１／２、ｃｒＲＮＡ－ＲＮＦ２－１－Ｍｉｓ－５／６、ｃｒＲＮＡ－ＲＮＦ２－１－Ｍｉｓ－１７／１８及びｃｒＲＮＡ－ＲＮＦ２－１－Ｍｉｓ－１９／２０を用いた場合、挿入欠失の割合を効果的に低減することができ、ターゲット部位での効率を犠牲しないことが分かった。
【発明を実施するための形態】
【0047】
なお、明細書及び特許請求の範囲では、特定の構成要素を指すためにいくつかの用語が使用されていることに留意されたい。当業者であれば、同じ構成要素を異なる用語を使用する場合があることを理解するのであろう。本明細書及び特許請求の範囲は、構成要素を区別する方法として名詞の差異を使用するのではなく、構成要素の機能上の差異を区分の基準として使用する。明細書及び特許請求の範囲全体で言及された「含有する」又は「含む」は開放的な用語であるため、「含むがこれに限定されない」と解釈すべきである。明細書における以下の記載は、本発明を実施するための好ましい実施形態であるが、これらの記載は、明細書の一般的な原理を目的としたものであり、本発明の範囲を限定するためのものではない。本発明の保護範囲は、添付の請求の範囲に定義されたものに準拠する。特に定義されていない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、本開示が属する分野の一般的な技術者が通常理解しているものと同じ意味を有する。
【0048】
Ｉ．用語
本明細書で使用される場合、「エフェクタータンパク質」とは、部位特異的結合活性、一本鎖ＤＮＡ切断活性、二鎖ＤＮＡ切断活性、一本鎖ＲＮＡ切断活性、ＤＮＡまたはＲＮＡ修飾（例えば切断、塩基置換、挿入、削除）または転写調節活性などの活性を有するタンパク質を指す。
本明細書で使用される場合、「エフェクタータンパク質」とは、部位特異的結合活性、一本鎖ＤＮＡ切断活性、二鎖ＤＮＡ切断活性、一本鎖ＲＮＡ切断活性、ＤＮＡまたはＲＮＡ修飾（例えば切断、塩基置換、挿入、削除）または転写調節活性などの活性を有するタンパク質を指す。
【0049】
本明細書で使用される場合、「ガイドＲＮＡ」と「ｇＲＮＡ」は、本明細書で交換可能に使用され、Ｃａｓ１２ｉエフェクタータンパク質及び標的核酸（例えば、二本鎖ＤＮＡ）と複合体を形成することができるＲＮＡを指す。本明細書はまた、複数のｃｒＲＮＡに加工することができる前駆体ガイドＲＮＡアレイを考慮した。「ｃｒＲＮＡ」または「ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ」は、ＣＲＩＳＰＲ複合体が標的核酸のターゲット配列に特異的に結合することを指示する、標的核酸（例えば、二本鎖ＤＮＡ）のターゲット配列と十分な相補性を有するガイド配列を含む。
【0050】
本明細書で使用される「ＣＲＩＳＰＲアレイ」という用語は、最初のＣＲＩＳＰＲリピートの最初のヌクレオチドから始まり、最後の（末端の）ＣＲＩＳＰＲリピートの最後のヌクレオチドで終わる、ＣＲＩＳＰＲリピートとスペーサーとを含む核酸（例えばＤＮＡ）断片を指す。典型的には、ＣＲＩＳＰＲアレイ内の各スペーサーは２つのリピートの間に位置する。本明細書で使用される用語「ＣＲＩＳＰＲリピート」または「ＣＲＩＳＰＲ直接リピート」または「直接リピート」は、ＣＲＩＳＰＲアレイにおいて非常に小さな配列変化または配列変化のない複数の短い直接リピート配列を意味する。適切には、直接リピートがステムループ構造を形成することができる。
【0051】
用語「核酸」、「ポリヌクレオチド」及び「ヌクレオチド配列」は交換可能に使用され、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、それらの組み合わせ及びそれらの類似物を含む任意の長さのヌクレオチドの重合形態を指す。「オリゴヌクレオチド」及び「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ」は交換可能に使用され、約５０ヌクレオチド未満の短いポリヌクレオチドを指す。本明細書で使用される場合、「相補性」とは、従来のワトソン・クリーク（Ｗａｔｓｏｎ－Ｃｒｉｃｋ）塩基対を介して核酸が他の核酸と水素結合を形成する能力を意味する。相補性パーセントは、第２の核酸と水素結合（すなわち、ワトソン－クリーク塩基対）を形成することができる核酸分子中の残基のパーセント（例えば、１０分の５、６、７、８、９、１０、それぞれ約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％）を表す。「完全相補的」とは、核酸配列のすべての連続残基が第２の核酸配列中の同じ数の連続残基と水素結合を形成することを意味する。本明細書で使用される場合、「基本的に相補的」とは、約４０、５０、６０、７０、８０、１００、１５０、２００、２５０またはそれ以上のヌクレオチドの領域において、相補性の程度が少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００のいずれかであるか、またはストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションされた２つの核酸を指す。
【0052】
本明細書で使用される場合、ハイブリダイゼーションのための「ストリンジェントな条件」とは、ターゲット配列と相補性を有する核酸が主としてターゲット配列とハイブリダイゼーションされ、非ターゲット配列と基本的にハイブリダイゼーションされない条件を指す。ストリンジェントな条件は通常、配列依存性であり、多くの要因に応じて変化する。一般に、配列が長いほど、配列とそのターゲット配列との特異的なハイブリダイゼーションの温度は高くなる。ストリンジェントな条件の非限定的な例は、Ｔｉｊｓｓｅｎ （１９９３）， Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ Ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ－ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ、第一部第２章「Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｂｅ ａｓｓａｙ，」，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ， Ｎ，Ｙに詳細に記述されている。
【0053】
「ハイブリダイゼーション」とは、一つまたは複数のポリヌクレオチドが反応して複合体を形成する反応を意味し、前記複合体がヌクレオチド残基の塩基間の水素結合によって安定化される。水素結合は、ウォゼンクリーク塩基対、ホグスタイン（Ｈｏｏｇｓｔｅｉｎ）結合、または任意の他の配列特異的な方法で発生することができる。所定の配列とハイブリダイゼーション可能な配列を、所定の配列の「相補体」と呼ぶ。
【0054】
核酸配列に対する「配列同一性パーセント（％）」は、（必要に応じて）最大の配列同一性パーセントを達成するためにギャップ（ｇａｐｓ）を許容することによって配列をアライメントした後、候補配列中の特定の核酸配列中のヌクレオチドと同じヌクレオチドのパーセントと定義される。ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質配列の「配列同一性パーセント（％）」は、（必要に応じて）最大の配列同一性パーセントを達成するためにギャップを許容することによって配列をアライメントした後、候補配列中の特定のペプチドまたはアミノ酸配列中のアミノ酸残基と同じ置換されたアミノ酸残基のパーセントである。アミノ酸配列の同一性パーセントを決定する目的で、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮまたはＭＥＧＡＬＩＧＮＴＭ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアのような一般的に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用し、当該技術分野の技術範囲内の様々な方法で実現することができる。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大のアライメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、測定とアライメントのための適切なパラメータを決定することができる。
【0055】
用語「ポリペプチド」及び「ペプチド」は、本明細書で交換可能に使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指す。前記ポリマーは、直鎖または分岐鎖であってもよく、修飾アミノ酸を含んでもよく、非アミノ酸によって中断されてもよい。タンパク質は、１つまたは複数のポリペプチドを有することができる。この用語は、例えば、ジスルフィド結合の形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、または他の任意の操作（標識成分との結合）など修飾されたアミノ酸ポリマーも含まれている。
【0056】
本明細書で使用される場合、「バリアント（Variant）」は、それぞれ参照ポリヌクレオチドまたはポリペプチドとは異なるが、必要な特性を保持するポリヌクレオチドまたはポリペプチドと解釈される。ポリヌクレオチドの典型的なバリアントは、別の参照ポリヌクレオチドの核酸配列とは異なる。バリアント核酸配列の変化は、参照ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を変化させてもよいし、変化させなくてもよい。ヌクレオチドの変化は、以下に説明するように、参照配列によってコードされるポリペプチド中のアミノ酸置換、添加、欠失、融合、及びトランケートをもたらすことがある。ポリペプチドの典型的なバリアントは、アミノ酸配列上の別の参照ポリペプチドとは異なる。一般に、差異は限られており、参照ポリペプチドとバリアントの配列は全体的に非常に類似し、多くの領域で同じである。バリアント及び参照ポリペプチドのアミノ酸配列は、１つまたは複数の置換、添加、欠失の任意の組み合わせによって異なることができる。置換または挿入されたアミノ酸残基は、遺伝暗号でコードされたアミノ酸残基であってもよく、またはそうでなくてもよい。ポリヌクレオチドまたはポリペプチドのバリアントは天然に存在する（対立遺伝子バリアントなど）ことができ、あるいは未知の天然に存在するバリアントであることができる。ポリヌクレオチド及びポリペプチドの天然に存在しないバリアントは、変異誘発技術、直接合成、及び当業者に知られている他の組換え方法によって製造することができる。
【0057】
本明細書で使用される場合、用語「野生型」は、自然の中に存在するときに変異体またはバリアントと区別される、典型的な形態の生物、菌株、遺伝子または特徴を意味する、当業者に一般的に理解されている意味を有する。自然界の資源から隔離され、意図的に修飾されていない。
【0058】
本明細書で使用される場合、用語「天然に存在しない」または「エンジニアリングされた(操作された」は交換可能に使用され、人為的関与を意味する。これらの用語が核酸分子またはポリペプチドを記述するために使用される場合、前記核酸分子またはポリペプチドは、その天然結合または天然に存在する少なくとも１つの他の成分を少なくとも基本的に含まないことを意味する。
【0059】
本明細書で使用される場合、用語「オーソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇｕｅ／ｏｒｔｈｏｌｏｇ）」は、当業者に一般的に理解される意味を有する。さらなる指導として、本明細書でいうタンパク質の「オーソログ」とは、そのオーソログであるタンパク質と同一または類似の機能を実行する異なる種に属するタンパク質を指す。
【0060】
本明細書で使用される場合、用語「同一性」は、２つのポリペプチド間または２つの核酸間の配列マッチングを表すために使用される。２つの比較配列の１つ位置が同じ塩基またはアミノ酸モノマーサブユニットによって占められている場合（例えば、２つのＤＮＡ分子のそれぞれの１つの位置がアデニンによって占められているか、または２つのポリペプチドのそれぞれの１つの位置がリシンによって占められている）、その位置にはそれぞれの分子が同じである。２つの配列間の「同一性パーセント」は、２つの配列に共通するマッチング位置数を、比較する位置数で割ったものｘ１００の関数です。例えば、２つの配列の１０の位置のうち６つが一致している場合、２つの配列は６０％の同一性を持っている。例えば、ＤＮＡ配列ＣＴＧＡＣＴとＣＡＧＴＴは５０％の同一性を有している（合計６箇所中３箇所が一致している）。通常、この比較は、最大の同一性を達するように２つの配列をアライメントする場合に行われる。この比較は、例えば、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ｅｔ ａｌ． （１９７０） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４８： ４４３－４５３の方法によって実現することができ、前記方法は、比較（Ａｌｉｇｎ）プログラム（ＤＮＡｓｔａｒ，Ｉｎｃ．）のようなコンピュータプログラムによって容易に行うことができる。ＰＡＭ１２０の重み付き残基テーブルを用いてもよく、Ｅ．ＭｅｙｅｒｓとＷ．ミラーのアルゴリズム（Ｃｏｍｐｕｔ． Ａｐｐｌ Ｂｉｏｓｃｉ．， ４： １１－１７ （１９８８））を用いてＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に統合されている。２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントを決定するために、ギャップ長ペナルティ１２とギャップペナルティ４にする。さらに、２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントを決定するために、１６、１４、１２、１０、８、６または４のギャップ重み、１、２、３、４、５または６の長さ重みを持つＢｌｏｓｓｕｍ６２行列またはＰＡＭ２５０行列を用いて、ＧＣＧパッケージ（ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍから入手可能）に統合されたＧＡＰプログラム内のＮｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈ（Ｊ ＭｏＩ Ｂｉｏｌ．４８：４４４－４５３（１９７０））アルゴリズムを使用することができる。
【0061】
本明細書で使用される「細胞」は、特定の単一細胞だけでなく、その細胞の子孫(後代)または潜在的子孫を指すと理解されるべきである。変異や環境影響により子孫に何らかの修飾が生じる可能性があるため、そのような子孫は実際には親細胞とは異なるかもしれないが、本明細書の用語の範囲内に含まれている。
【0062】
本明細書で使用される場合、用語「形質導入」及び「トランスフェクション」は、目的のタンパク質または分子を発現するために、当技術分野で知られている感染剤（例えばウイルス）または他の方法を用いてＤＮＡを細胞に導入する方法を含む。ウイルスまたはウイルスに類似する試薬の他に、リン酸カルシウム、樹状ポリマー、リポソームまたはカチオン性ポリマー（例えばＤＥＡＥ－デキストランまたはポリエチレンイミン）を用いたトランスフェクションなどの化学的トランスフェクション方法、エレクトロポレーション、細胞押出（ｃｅｌｌ ｓｑｕｅｅｓｉｎｇ）、ソノポレーション（ｓｏｎｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、光学トランスフェクション、穿刺トランスフェクション（ｉｍｐａｌｅｆｅｃｔｉｏｎ）、原形質体融合、プラスミド送達またはトランスポゾンなどの非化学的方法、遺伝子銃、磁気トランスフェクションまたは磁石を利用したトランスフェクション、粒子衝撃などの粒子に基づく方法、及びハイブリダイゼーション方法（ヌクレオフェクションなど）がある。
【0063】
本明細書で使用される場合、用語「トランスフェクションされた」、「形質転換された」または「形質導入された」は、外来性核酸を宿主細胞に移動または導入するプロセスを指す。「トランスフェクションされた」、「形質転換された」、または「形質導入された」細胞は、外因性核酸でトランスフェクションされ、形質転換され、または形質導入された細胞である。
【0064】
用語「インビボ」は、細胞がそこから得られる生物の体内を指す。「インビトロ」または「エクスビボ」とは、そこから細胞を得るこの生物の体外を意味する。
【0065】
本明細書で使用される場合、「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ／ｔｒｅａｔｉｎｇ）」は、有益な結果または所望の結果（臨床結果を含む）を得るための方法である。本発明の目的のために、有益なまたは所望の臨床結果としては、下記の１つまたは複数を含むが、これらに限定されない：疾患による一つまたは複数の症状の軽減、疾患の程度の軽減、疾患の安定化（例えば、疾患の悪化の予防または遅延）、疾患の拡散（例えば、転移）の予防または遅延、疾患の再発の予防または遅延、疾患の再発率の低下、疾患の進行の遅延または遅延、疾患状態の改善、疾病の（一部または全部）緩和を提供し、該疾病の治療に必要な１つまたは複数の他の薬物の用量を減らし、疾病の進展を遅らせ、生活の質を高め、及び／または生存期間を延長する。「治療」には、病気、病状、または病気の病理的結果を減少させることも含まれる。本発明の方法は、これらの治療の態様のいずれか１つまたは複数を考慮した。
【0066】
本明細書で使用される場合、用語「有効量」は、特定の障害、状態または疾患（例えば、１つまたは複数の症状の改善、緩和、軽減、及び／または遅延）を治療するのに十分な化合物または組成物の量を意味する。当技術分野で理解されるように、「有効量」は、１回または複数回の投与ができ、即ち、所望の治療終点を達成するために一回または複数回の投与を必要とする。
【0067】
「被験者」、「個体」、または「患者」は、本明細書において交換可能に使用され、治療の目的を達成するために、哺乳動物として分類される任意の動物を指し、ヒト、家畜、及び農場動物、犬、馬、猫、牛などの動物園、農場またはペット動物が含まれる。いくつかの実施形態では、前記個体はヒト個体である。
【0068】
本明細書に記載の本発明の実施形態は、「…からなる」及び／または「基本的に…からなる」実施形態を含むことが理解されるべきである。本明細書における「約」値またはパラメータの言及には、その値またはパラメータ自体に対する変化が含まれる（及び記述される）。例えば、「約Ｘ」についての説明は、「Ｘ」についての説明を含む。
【0069】
本明細書で使用される場合、「ノー」値またはパラメータの言及は、一般に、「…以外」値またはパラメータを意味して記述している。例えば、前記方法はＸ型癌の治療には使用されないというのは、Ｘ型以外の癌の治療に使用されることを意味する。
【0070】
本明細書で使用される場合、用語「約Ｘ－Ｙ」は、「約Ｘ～約Ｙ」と同じ意味を持つ。
【0071】
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用されるように、単数形「１つ／１種（ａ／ａｎ）」及び「前記」は、文脈が特に明記しない限り、複数のオブジェクトを含む。特許請求の範囲は、任意のオプションの要素を除外するように記述することもできることにも注意してください。したがって、この記述は、特許請求の範囲の要素の記述と組み合わせて、「ただ」、「のみ」などの排他的な用語を使用するための先行的な基礎として、または「ノー」を使用するための制限として意図されている。
【0072】
本明細書で使用される場合、用語「及び／または」は、「Ａ及び／またはＢ」などの用語において、Ａ及びＢの両方を含むことを意図し、ＡまたはＢ、Ａ（単独）、及びＢ（単独）。同様に、本明細書で使用される場合、用語「及び／または」は、「Ａ、Ｂ、及び／またはＣ」などの用語において、以下：Ａ、Ｂ、及びＣ、Ａ、ＢまたはＣ、ＡまたはＣ、ＡまたはＢ、ＢまたはＣ、ＡとＣ、ＡとＢ、ＢとＣ、Ａ（単独）、Ｂ（単独）、及びＣ（単独）の各実施形態を含むことを目的とする。
【0073】
ＩＩ．Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼ及びエフェクタータンパク質
エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼ
いくつかの実施形態では、エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼを提供し、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼは、参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼに基づく下記の１つまたは複数（例えば、２つ、３つ、４つまたは５つ）の変異を含み、前記変異は以下の
（１）参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼ中のＰＡＭと相互作用するアミノ酸を正に帯電したアミノ酸（Ｒ、Ｈ、Ｋなど）に置換すること；
（２）参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼ中のＤＮＡ二本鎖の開放に関与するアミノ酸を、芳香環付きアミノ酸（例えば、Ｆ、ＹまたはＷ）に置換すること；
（３）参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼ中のＲｕｖＣドメインに位置し、一本鎖ＤＮＡ基質と相互作用するアミノ酸を、正に帯電したアミノ酸（例えばＲ、ＨまたはＫ）に置換すること；
（４）参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼ中のＤＮＡ－ＲＮＡ二重らせんと相互作用するアミノ酸を、正に帯電したアミノ酸（例えばＲ、ＨまたはＫ）に置換すること；及び
（５）参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼ中のＤＮＡ－ＲＮＡ二重らせんと相互作用する１つまたは複数の極性または正に帯電したアミノ酸を疎水性アミノ酸（例えば、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｙ、Ｐ、ＣまたはＷ）に置換することから選択される。いくつかの実施形態では、前記参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるようなアミノ酸配列を有する野生型Ｃａｓ１２ｉ２ヌクレアーゼなどの天然Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、前記参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼは、天然バリアントなどのＣａｓ１２ｉヌクレアーゼのバリアントである。いくつかの実施形態では、前記参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼは、上記（１）～（５）の１つまたは複数の変異を含まないエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉ（例えば、Ｃａｓ１２ｉ２またはＣａｓ１２ｉ１）ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、前記アミノ酸位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示される対応するアミノ酸位置によって定義される。いくつかの実施形態では、前記アミノ酸位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１と異なる配列を有する野生型Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に対応するアミノ酸位置によって定義される。
エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼ
いくつかの実施形態では、エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼを提供し、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼは、参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼに基づく下記の１つまたは複数（例えば、２つ、３つ、４つまたは５つ）の変異を含み、前記変異は以下の
（１）参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼ中のＰＡＭと相互作用するアミノ酸を正に帯電したアミノ酸（Ｒ、Ｈ、Ｋなど）に置換すること；
（２）参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼ中のＤＮＡ二本鎖の開放に関与するアミノ酸を、芳香環付きアミノ酸（例えば、Ｆ、ＹまたはＷ）に置換すること；
（３）参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼ中のＲｕｖＣドメインに位置し、一本鎖ＤＮＡ基質と相互作用するアミノ酸を、正に帯電したアミノ酸（例えばＲ、ＨまたはＫ）に置換すること；
（４）参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼ中のＤＮＡ－ＲＮＡ二重らせんと相互作用するアミノ酸を、正に帯電したアミノ酸（例えばＲ、ＨまたはＫ）に置換すること；及び
（５）参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼ中のＤＮＡ－ＲＮＡ二重らせんと相互作用する１つまたは複数の極性または正に帯電したアミノ酸を疎水性アミノ酸（例えば、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｙ、Ｐ、ＣまたはＷ）に置換することから選択される。いくつかの実施形態では、前記参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるようなアミノ酸配列を有する野生型Ｃａｓ１２ｉ２ヌクレアーゼなどの天然Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、前記参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼは、天然バリアントなどのＣａｓ１２ｉヌクレアーゼのバリアントである。いくつかの実施形態では、前記参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼは、上記（１）～（５）の１つまたは複数の変異を含まないエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉ（例えば、Ｃａｓ１２ｉ２またはＣａｓ１２ｉ１）ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、前記アミノ酸位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示される対応するアミノ酸位置によって定義される。いくつかの実施形態では、前記アミノ酸位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１と異なる配列を有する野生型Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に対応するアミノ酸位置によって定義される。
【0074】
本明細書で使用される場合、「アミノ酸はＸ位置にあり、そのうち、前記アミノ酸位置はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示される野生型Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼの対応するアミノ酸位置によって定義される」、または「該アミノ酸は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１と異なる配列を有する野生型Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に対応するアミノ酸位置によって定義されるようなＸ位置にあり、そのアミノ酸残基は、参照酵素Ｃａｓ１２ｉのある位置にあり、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のＸ位置に相当し、また、参照酵素Ｃａｓ１２ｉのアミノ酸配列とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列は配列同一性に基づいて互いに整列している。例えば、図７はＣａｓ１２ｉ２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）とＣａｓ１２ｉ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）のアミノ酸配列の相同性比較を示している。当業者は、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａのような当業者によく使用されるソフトウェアを用いて、いずれかに記載の参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼのアミノ酸配列とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１との配列同一性比較と整列（ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）を行い、さらに、本出願に記載のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に基づいて定義されたアミノ酸部位に対応する参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼ中のアミノ酸部位を得ることができる。
【0075】
本出願は、上述の５つの改造原理の任意の１つまたは複数の組合せに基づくアミノ酸変異を導入することにより、インビトロ及び／またはインビボ酵素活性（例えばＤＮＡ一本鎖または二本鎖切断活性）の増加（例えば遺伝子の切断効率が約１００倍増加した）、ＰＡＭ数の増加を識別することができ（例えば、図８から分かるように、野生型の酵素はＰＡＭを識別することができ、上述のアミノ酸突然変異に基づくＣａｓＸＸ酵素は少なくとも１１種類のＰＡＭを識別することができる）、及び／またはオフターゲット率を低下させ、特異性を高める（例えば、表１８から分かるように、ＣａｓＸＸに対するＨＦ－Ｃａｓのオフターゲット効率は約９９％低下することができる）。前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼは、下記の１）～６）セクションに記載の１つまたは複数の特定の変異を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載された任意の１つまたは複数の変異を、より高い活性を有するエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼを提供するために、既存のＣａｓ１２ｉ変異（例えば、下記の７）セクションに記載された変異）と組み合わせることができる。
【0076】
いくつかの実施形態では、エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼを提供し、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼは、参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼ中のＰＡＭと相互作用する１つまたは複数のアミノ酸を正に帯電したアミノ酸に置換する変異を含む。いくつかの実施形態では、エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼを提供し、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼは、参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼ中のＤＮＡ二本鎖の開放に関与する１つまたは複数のアミノ酸を芳香環付きアミノ酸に置換する変異を含む。いくつかの実施形態では、エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼを提供し、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼは、参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼ中のＲｕｖＣドメインに位置し、一本鎖ＤＮＡ基質と相互作用する１つまたは複数のアミノ酸を正に帯電したアミノ酸に置換する変異を含む。いくつかの実施形態では、エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼを提供し、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼは、参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼ中のＤＮＡ－ＲＮＡ二重らせんと相互作用する１つまたは複数のアミノ酸を正に帯電したアミノ酸に置換する変異を含む。いくつかの実施形態では、エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼを提供し、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼは、参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼ中のＤＮＡ－ＲＮＡ二重らせんと相互作用する１つまたは複数の極性または正に帯電したアミノ酸を疎水性アミノ酸に置換する変異を含む。
【0077】
いくつかの実施形態では、エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼを提供し、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼは、１）参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼ中のＰＡＭと相互作用する１つまたは複数のアミノ酸を正に帯電したアミノ酸に置換する変異、及び２）参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼ中のＤＮＡ二本鎖の開放に関与する１つまたは複数のアミノ酸を芳香環付きアミノ酸に置換する変異を含む。いくつかの実施形態では、エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼを提供し、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼは、１）参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼ中のＰＡＭと相互作用する１つまたは複数のアミノ酸を正に帯電したアミノ酸に置換する変異、及び２）参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼ中のＲｕｖＣドメインに位置し、一本鎖ＤＮＡ基質と相互作用する１つまたは複数のアミノ酸を正に帯電したアミノ酸に置換する変異を含む。いくつかの実施形態では、エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼを提供し、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼは、１）参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼ中のＤＮＡ二本鎖の開放に関与する１つまたは複数のアミノ酸を芳香環付きアミノ酸に置換する変異、及び２）参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼ中のＲｕｖＣドメインに位置し、一本鎖ＤＮＡ基質と相互作用する１つまたは複数のアミノ酸を正に帯電したアミノ酸に置換する変異を含む。いくつかの実施形態では、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼは、参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼ中のＤＮＡ－ＲＮＡ二重らせんと相互作用する１つまたは複数の極性または正に帯電したアミノ酸を疎水性アミノ酸に置換する変異も含む。いくつかの実施形態では、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼは、フレキシブル領域の柔軟性を高めるために、１つまたは複数のフレキシブル領域の変異（例えば、Ｇに置換し、及び／または、その後に１つまたは２つのＧを挿入する）をさらに含む。いくつかの実施形態では、このように修正されたＣａｓ１２ｉエンジニアリングされた酵素は、少なくとも約１０％の柔軟性、例えば、少なくとも約２０％、３０％、５０％、１００％、１５０％、２００％、５００％、１０００％またはより高い柔軟性を増加させる。
【0078】
いくつかの実施形態では、エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼを提供し、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼは、１）参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼ中のＰＡＭと相互作用する１つまたは複数のアミノ酸を正に帯電したアミノ酸に置換する変異、及び２）参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼ中のＤＮＡ－ＲＮＡ二重らせんと相互作用する１つまたは複数のアミノ酸アミノ酸を正に帯電したアミノ酸に置換する変異を含む。いくつかの実施形態では、エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼを提供し、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼは、１）参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼ中のＤＮＡ二本鎖の開放に関与する１つまたは複数のアミノ酸を芳香環付きアミノ酸に置換する変異、及び２）参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼ中のＤＮＡ－ＲＮＡ二重らせんと相互作用する１つまたは複数のアミノ酸を正に帯電したアミノ酸に置換する変異を含む。いくつかの実施形態では、エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼを提供し、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼは、１）参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼ中のＲｕｖＣドメインに位置し、一本鎖ＤＮＡ基質と相互作用する１つまたは複数のアミノ酸を正に帯電したアミノ酸に置換する変異、及び２）参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼ中のＤＮＡ－ＲＮＡ二重らせんと相互作用する１つまたは複数のアミノ酸アミノ酸を正に帯電したアミノ酸に置換する変異含む。いくつかの実施形態では、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼは、参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼ中のＤＮＡ－ＲＮＡ二重らせんと相互作用する１つまたは複数の極性または正に帯電したアミノ酸を疎水性アミノ酸に置換する変異も含む。いくつかの実施形態では、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼは、フレキシブル領域の柔軟性を高めるための１つまたは複数のフレキシブル領域の変異をさらに含む。
【0079】
いくつかの実施形態では、エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼを提供し、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼは、１）参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼ中のＰＡＭと相互作用する１つまたは複数のアミノ酸を正に帯電したアミノ酸に置換する変異、２）参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼ中のＤＮＡ二本鎖の開放に関与する１つまたは複数のアミノ酸を芳香環付きアミノ酸に置換する変異、及び３）参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼ中のＲｕｖＣドメインに位置し、一本鎖ＤＮＡ基質と相互作用する１つまたは複数のアミノ酸を正に帯電したアミノ酸に置換する変異を含む。いくつかの実施形態では、エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼを提供し、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼは、１）参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼ中のＰＡＭと相互作用する１つまたは複数のアミノ酸を正に帯電したアミノ酸に置換する変異、２）参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼ中のＤＮＡ二本鎖の開放に関与する１つまたは複数のアミノ酸を芳香環付きアミノ酸に置換する変異、及び３）参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼ中のＤＮＡ－ＲＮＡ二重らせんと相互作用する１つまたは複数のアミノ酸アミノ酸を正に帯電したアミノ酸に置換する変異を含む。いくつかの実施形態では、エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼを提供し、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼは、１）参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼ中のＰＡＭと相互作用する１つまたは複数のアミノ酸を正に帯電したアミノ酸に置換する変異、２）参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼ中のＲｕｖＣドメインに位置し、一本鎖ＤＮＡ基質と相互作用する１つまたは複数のアミノ酸を正に帯電したアミノ酸に置換する変異、及び３）参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼ中のＤＮＡ－ＲＮＡ二重らせんと相互作用する１つまたは複数のアミノ酸アミノ酸を正に帯電したアミノ酸に置換する変異を含む。いくつかの実施形態では、エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼを提供し、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼは、１）参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼ中のＤＮＡ二本鎖の開放に関与する１つまたは複数のアミノ酸を芳香環付きアミノ酸に置換する変異、２）参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼ中のＲｕｖＣドメインに位置し、一本鎖ＤＮＡ基質と相互作用する１つまたは複数のアミノ酸を正に帯電したアミノ酸に置換する変異、及び３）参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼ中のＤＮＡ－ＲＮＡ二重らせんと相互作用する１つまたは複数のアミノ酸アミノ酸を正に帯電したアミノ酸に置換する変異を含む。いくつかの実施形態では、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼは、参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼ中のＤＮＡ－ＲＮＡ二重らせんと相互作用する１つまたは複数の極性または正に帯電したアミノ酸を疎水性アミノ酸に置換する変異も含む。いくつかの実施形態では、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼは、フレキシブル領域の柔軟性を高めるための１つまたは複数のフレキシブル領域変異をさらに含む。
【0080】
いくつかの実施形態では、エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼを提供し、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼは、１）参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼ中のＰＡＭと相互作用する１つまたは複数のアミノ酸を正に帯電したアミノ酸に置換する変異、２）参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼ中のＤＮＡ二本鎖の開放に関与する１つまたは複数のアミノ酸を芳香環付きアミノ酸に置換する変異、３）参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼ中のＲｕｖＣドメインに位置し、一本鎖ＤＮＡ基質と相互作用する１つまたは複数のアミノ酸を正に帯電したアミノ酸に置換すること、及び４）参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼ中のＤＮＡ－ＲＮＡ二重らせんと相互作用する１つまたは複数のアミノ酸アミノ酸を正に帯電したアミノ酸に置換する変異を含む。いくつかの実施形態では、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼは、参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼ中のＤＮＡ－ＲＮＡ二重らせんと相互作用する１つまたは複数の極性または正に帯電したアミノ酸を疎水性アミノ酸に置換する変異も含む。いくつかの実施形態では、エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼを提供し、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼは、１）参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼ中のＰＡＭと相互作用する１つまたは複数のアミノ酸を正に帯電したアミノ酸に置換する変異、２）参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼ中のＤＮＡ二本鎖の開放に関与する１つまたは複数のアミノ酸を芳香環付きアミノ酸に置換する変異、３）参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼ中のＲｕｖＣドメインに位置し、一本鎖ＤＮＡ基質と相互作用する１つまたは複数のアミノ酸を正に帯電したアミノ酸に置換する変異、４）参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼ中のＤＮＡ－ＲＮＡ二重らせんと相互作用する１つまたは複数のアミノ酸アミノ酸を正に帯電したアミノ酸に置換する変異、及び５）参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼ中のＤＮＡ－ＲＮＡ二重らせんと相互作用する１つまたは複数の極性または正に帯電したアミノ酸を疎水性アミノ酸に置換する変異を含む。いくつかの実施形態では、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼは、フレキシブル領域の柔軟性を高めるための１つまたは複数のフレキシブル領域変異をさらに含む。
【0081】
いくつかの実施形態では、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示される対応するアミノ酸位置に対する変異：Ｎ１６４Ｙ＋Ｅ１７６Ｒ＋Ｋ２３８Ｒ＋Ｅ３２３Ｒ＋Ｄ３６２Ｒ＋Ｔ４４７Ｒ＋Ｅ５６３Ｒ（これから「ＣａｓＸＸ」と命名する）を含む。いくつかの実施形態では、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８の配列を含む。
【0082】
１）参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼ中のＰＡＭと相互作用するアミノ酸を正に帯電したアミノ酸に置換すること
いくつかの実施形態では、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼは、参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼ中のＰＡＭと相互作用するアミノ酸をＲ、Ｈ、Ｋなどの正に帯電したアミノ酸に置換するための参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼ（例えばＣａｓ１２ｉ２）に基づく１つまたは複数の変異を含む。いくつかの実施形態では、エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼは、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つまたはそれ以上の前記アミノ酸残基の置換を含む。
いくつかの実施形態では、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼは、参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼ中のＰＡＭと相互作用するアミノ酸をＲ、Ｈ、Ｋなどの正に帯電したアミノ酸に置換するための参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼ（例えばＣａｓ１２ｉ２）に基づく１つまたは複数の変異を含む。いくつかの実施形態では、エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼは、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つまたはそれ以上の前記アミノ酸残基の置換を含む。
【0083】
いくつかの実施形態では、前記ＰＡＭと相互作用するアミノ酸は、ＰＡＭと三次元構造上距離が９Å以内のアミノ酸であり、例えば、ＰＡＭと三次元構造上距離が９Å以内のアミノ酸、ＰＡＭと三次元構造上距離が８Å以内のアミノ酸、ＰＡＭと三次元構造上距離が７Å以内のアミノ酸、ＰＡＭと三次元構造上距離が６Å以内のアミノ酸、ＰＡＭと三次元構造上距離が５Å以内のアミノ酸、ＰＡＭと三次元構造上距離が４Å以内のアミノ酸、ＰＡＭと三次元構造上距離が３Å以内のアミノ酸、ＰＡＭと三次元構造上距離が２Å以内のアミノ酸、またはより近いアミノ酸であってもよい。
【0084】
ＰＡＭとアミノ酸の空間構造上の距離は、解析されたＣａｓタンパク質－ＲＮＡ－ＤＮＡ三次元複合体の３Ｄ構造（ＰＤＢファイル）中の原子間の距離によって定義され、原子間の相互距離はＰＤＢファイル識別ソフトウェアによって表示されることができる。いくつかの実施形態では、前記ＰＡＭとアミノ酸の空間構造上の距離は、アミノ酸残基とヌクレオチドに含まれる原子との間の最小距離によって定義される。ＰＡＭとアミノ酸の空間構造上の距離を測定するために用いることができるプログラム、またはＰＤＢファイル識別ソフトウェアは当技術分野で広く知られており、ＰｙＭＯＬ、ＣｈｉｍｅｒａＸ、Ｓｗｉｓｓ－ｐｄｂｖｉｅｗｅｒなどを含むが、これらに限定されない。
【0085】
いくつかの実施形態では、前記参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼ中のＰＡＭと相互作用する１つまたは複数のアミノ酸を正に帯電したアミノ酸に置換する変異は、１７６、１７８、２２６、２２７、２２９、２３７、２３８、２６４、４４７、５６３のうちの１つまたは複数の位置におけるアミノ酸の変異である。いくつかの実施形態では、前記参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼ中のＰＡＭと相互作用する１つまたは複数のアミノ酸を正に帯電したアミノ酸に置換する変異は、Ｅ１７６、Ｅ１７８、Ｙ２２６、Ａ２２７、Ｎ２２９、Ｅ２３７、Ｋ２３８、Ｋ２６４、Ｔ４４７、Ｅ５６３のうちの１つまたは複数のアミノ酸の変異である。いくつかの実施形態では、前記参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼ中のＰＡＭと相互作用する１つまたは複数のアミノ酸を正に帯電したアミノ酸に置換する変異は、Ｅ１７６、Ｋ２３８、Ｔ４４７及びＥ５６３のうちの１つまたは複数のアミノ酸の変異である。いくつかの実施形態では、前記参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼ中のＰＡＭと相互作用するアミノ酸を正に帯電したアミノ酸に置換する変異は、Ｅ５６３などの５６３番アミノ酸残基に位置する。いくつかの実施形態では、前記アミノ酸位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示される野生型Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼの対応するアミノ酸位置によって定義される。
【0086】
いくつかの実施形態では、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼは、Ｅ１７６Ｒ、Ｅ１７８Ｒ、Ｙ２２６Ｒ、Ａ２２７Ｒ、Ｎ２２９Ｒ、Ｅ２３７Ｒ、Ｋ２３８Ｒ、Ｋ２６４Ｒ、Ｔ４４７Ｒ、及びＥ５６３Ｒのうちの１つまたは複数のアミノ酸の変異を含み、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示される野生型Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼの対応するアミノ酸位置によって定義される。
【0087】
本明細書の文脈において、Ｅ１７６の意味は、引用されたアミノ酸配列（例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に対して）において、１７６番目のアミノ酸Ｅ（グルタミン酸）であり、そのうち、一般的なアミノ酸とその三文字と一文字の略語は下記のように説明される：アラニンＡｌａ Ａ、アルギニンＡｒｇ Ｒ、アスパラギンＡｓｐ Ｄ、システインＣｙｓ Ｃ、グルタミンＧｌｎ Ｑ、グルタミン酸Ｇｌｕ Ｅ、ヒスチジンＨｉｓＨ、イソロイシンＩｌｅ Ｉ、グリシンＧｌｙ Ｇ、アスパラギンＡｓｎ Ｎ、ロイシンＬｅｕ Ｌ、リジンＬｙｓ Ｋ、メチオニンＭｅｔ Ｍ、フェニルアラニンＰｈｅ Ｆ、プロリンＰｒｏＰ、セリンＳｅｒ Ｓ、トレオニンＴｈｒ Ｔ、ロイシンＴｒｐ Ｗ、チロシンＴｙｒ Ｙ、バリンＶａｌ Ｖ。
【0088】
いくつかの実施形態では、前記参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼ中のＰＡＭと相互作用するアミノ酸を正に帯電したアミノ酸に置換する変異は、参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼ中の対応するアミノ酸残基をＲ、ＨまたはＫ、例えばＲまたはＫに置換することである。いくつかの実施形態では、前記参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼ中のＰＡＭと相互作用するアミノ酸を正に帯電したアミノ酸に置換する変異は、参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼ中の対応するアミノ酸残基をＲに置換することである。
【0089】
いくつかの実施形態では、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼは、１７６Ｒ、２３８Ｒ、４４７Ｒ、及び５６３Ｒのうちの１つまたは複数のアミノ酸変異を含み、そのうち、前記アミノ酸の位置が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示される野生型Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼの対応するアミノ酸位置に定義される。いくつかの実施形態では、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼは、参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼに基づく下記の１つまたは複数の変異を含む：Ｅ１７６、Ｋ２３８、Ｔ４４７、及びＥ５６３、そのうち、アミノ酸位置番号は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示される対応するアミノ酸位置によって定義される。いくつかの実施形態では、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼは、参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼに基づく下記の１つまたは複数の変異を含む：Ｅ１７６Ｒ、Ｋ２３８Ｒ、Ｔ４４７Ｒ及びＥ５６３Ｒ、そのうち、アミノ酸位置番号は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示される対応するアミノ酸位置によって定義される。いくつかの実施形態では、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼはＥ５６３Ｒ変異を含む、そのうち、アミノ酸位置番号は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示される対応するアミノ酸位置によって定義される。いくつかの実施形態では、遺伝子編集効率を改善する目的で、上記のエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼ（参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼ中のＰＡＭと相互作用する１つまたは複数のアミノ酸を正に帯電したアミノ酸に置換する）と少なくとも約８５％（例えば、少なくとも約８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％）の配列同一性を有するエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼを使用することもできる。
【0090】
本明細書の文脈において、Ｅ１７６Ｒは、引用されたアミノ酸配列において、１７６番目のアミノ酸Ｅ（グルタミン酸）をＲ（アルギニン）に置換することを意味する。
【0091】
いくつかの実施形態では、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼは下記の（ｉ）１７６、２３８、２６４、４４７、５６３、１７６＋２３８、１７６＋４４７、１７６＋５６３、２３８＋４４７、２３８＋５６３、４４７＋５６３、１７６＋２３８＋４４７、１７６＋２３８＋５６３、１７６＋４４７＋５６３、２３８＋４４７＋５６３、１７６＋２３８＋４４７＋５６３、のアミノ酸残基位置におけるいずれかの変異または変異の組み合わせを含み；そのうち、アミノ酸位置番号は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示される対応するアミノ酸位置によって定義される。いくつかの実施形態では、参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼ中のＰＡＭと相互作用する１つまたは複数のアミノ酸をプラスに帯電したアミノ酸に置換することは、Ｒ、Ｈ、またはＫ、例えばＲまたはＫ、好ましくはＲに置換することが含まれる。いくつかの実施形態では、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼは、下記の：Ｅ１７６、Ｋ２３８、Ｅ２６４、Ｔ４４７、Ｅ５６３、Ｅ１７６＋Ｋ２３８、Ｅ１７６＋Ｔ４４７、Ｅ１７６＋Ｅ５６３、Ｋ２３８＋Ｔ４４７、Ｋ２３８＋Ｅ５６３、Ｔ４４７＋Ｅ５６３、Ｅ１７６＋Ｋ２３８＋Ｔ４４７、Ｅ１７６＋Ｋ２３８＋Ｅ５６３、Ｅ１７６＋Ｔ４４７＋Ｅ５６３、Ｋ２３８＋Ｔ４４７＋Ｅ５６３、及びＥ１７６＋Ｋ２３８＋Ｔ４４７＋Ｅ５６３のアミノ酸残基のいずれかの変異または変異の組み合わせを含み；そのうち、アミノ酸位置番号はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示す対応するアミノ酸位置に定義される。
【0092】
いくつかの実施形態では、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼは下記のＥ１７６Ｒ、Ｋ２３８Ｒ、Ｅ２６４Ｒ、Ｔ４４７Ｒ、Ｅ５６３Ｒ、Ｅ１７６Ｒ＋Ｋ２３８Ｒ、Ｅ１７６Ｒ＋Ｔ４４７Ｒ、Ｅ１７６Ｒ＋Ｅ５６３Ｒ、Ｋ２３８Ｒ＋Ｔ４４７Ｒ、Ｋ２３８Ｒ＋Ｅ５６３Ｒ、Ｔ４４７Ｒ＋Ｅ５６３Ｒ、Ｅ１７６Ｒ＋Ｋ２３８Ｒ＋Ｔ４４７Ｒ、Ｅ１７６Ｒ＋Ｋ２３８Ｒ＋Ｅ５６３Ｒ、Ｅ１７６Ｒ＋Ｔ４４７Ｒ＋Ｅ５６３Ｒ、Ｋ２３８Ｒ＋Ｔ４４７Ｒ＋Ｅ５６３Ｒ、及びＥ１７６Ｒ＋Ｋ２３８Ｒ＋Ｔ４４７Ｒ＋Ｅ５６３Ｒの変異／変異の組み合わせのいずれかを含み；そのうち、アミノ酸位置番号は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示される対応するアミノ酸位置によって定義される。いくつかの実施形態では、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼは下記のＥ５６３Ｒ、Ｅ１７６Ｒ＋Ｔ４４７Ｒ、Ｅ１７６Ｒ＋Ｅ５６３Ｒ、Ｋ２３８Ｒ＋Ｅ５６３Ｒ、Ｅ１７６Ｒ＋Ｋ２３８Ｒ＋Ｔ４４７Ｒ、Ｅ１７６Ｒ＋Ｋ２３８Ｒ＋Ｅ５６３Ｒ、Ｅ１７６Ｒ＋Ｔ４４７Ｒ＋Ｅ５６３Ｒ、及びＥ１７６Ｒ＋Ｋ２３８Ｒ＋Ｔ４４７Ｒ＋Ｅ５６３Ｒの変異／変異の組み合わせのいずれかを含み；そのうち、アミノ酸位置番号は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示される対応するアミノ酸位置によって定義される。いくつかの実施形態では、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼは、Ｅ１７６Ｒ＋Ｋ２３８Ｒ＋Ｔ４４７Ｒ＋Ｅ５６３Ｒ変異の組み合わせを含み；そのうち、アミノ酸位置番号は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示される対応するアミノ酸位置によって定義される。遺伝子編集効率を改善する目的で、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼ（参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼ中のＰＡＭと相互作用する１つまたは複数のアミノ酸を正に帯電したアミノ酸に置換する）と少なくとも約８５％（例えば、少なくとも約８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％）の配列同一性を有するエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼを使用することもできる。
【0093】
２）参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼ中のＤＮＡ二本鎖の開放に関与するアミノ酸を芳香環付きアミノ酸に置換すること
いくつかの実施形態では、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼは、参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼ中のＤＮＡ二本鎖の開放に関与する１つまたは複数のアミノ酸を芳香環付きアミノ酸（Ｆ、ＹまたはＷなど）に置換する１つまたは複数の参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼ（例えばＣａｓ１２ｉ２）に基づく変異を含む。いくつかの実施形態では、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼは、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、またはそれ以上の前記アミノ酸残基の置換を含む。
いくつかの実施形態では、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼは、参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼ中のＤＮＡ二本鎖の開放に関与する１つまたは複数のアミノ酸を芳香環付きアミノ酸（Ｆ、ＹまたはＷなど）に置換する１つまたは複数の参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼ（例えばＣａｓ１２ｉ２）に基づく変異を含む。いくつかの実施形態では、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼは、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、またはそれ以上の前記アミノ酸残基の置換を含む。
【0094】
そのうち、前記ＤＮＡ二本鎖の開放に関与する一つ又は複数のアミノ酸は標的鎖に対するＰＡＭ中の３’末端の最後の塩基対と相互作用するアミノ酸である。例えば、Ｃａｓ１２ｉ２によって識別されるＰＡＭ配列は５’－ＮＴＴＮ－３’塩基対であり、ＰＡＭ配列中の３’末端のＮ塩基と標的鎖とが形成された塩基対は、「標的鎖に対するＰＡＭ中の３’末端の最後の塩基対」であり、この塩基対の後は標的部位の配列である。
【0095】
いくつかの実施形態では、前記ＤＮＡ二本鎖の開放に関与する１つまたは複数のアミノ酸は１６３及び／または１６４位置にあり；そのうち、アミノ酸位置番号はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示す対応するアミノ酸位置に定義される。いくつかの実施形態では、前記ＤＮＡ二本鎖の開放に関与する１つまたは複数のアミノ酸はＱ１６３、Ｎ１６４の１つまたは複数のアミノ酸であり；そのうち、アミノ酸位置番号はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示す対応するアミノ酸位置に定義される。いくつかの実施形態では、前記ＤＮＡ二本鎖の開放に関与するアミノ酸はＮ１６４であり；そのうち、アミノ酸位置番号はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示す対応するアミノ酸位置に定義される。
【0096】
いくつかの実施形態では、前記ＤＮＡ二本鎖の開放に関与するアミノ酸は、Ｆ、ＹまたはＷに置換される。いくつかの実施形態では、前記ＤＮＡ二本鎖の開放に関与するアミノ酸はＦに置換される。いくつかの実施形態では、前記ＤＮＡ二本鎖の開放に関与するアミノ酸はＹに置換される。
【0097】
いくつかの実施形態では、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼは１６３Ｆ、１６３Ｙ、１６３Ｗ、１６４Ｗ、１６４Ｆ、または１６４Ｙのいずれか１つまたは複数のアミノ酸残基の変異を含み；そのうち、アミノ酸位置番号はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示す対応するアミノ酸位置に定義される。いくつかの実施形態では、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼは１６３Ｆ、１６３Ｙ、１６３Ｗ、１６４Ｆまたは１６４Ｙのいずれか１つまたは複数のアミノ酸残基の変異を含み；そのうち、アミノ酸位置番号はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示す対応するアミノ酸位置に定義される。
【0098】
いくつかの実施形態では、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼはＱ１６３及び／またはＮ１６４のいずれかの変異を含み；そのうち、アミノ酸位置番号はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示す対応するアミノ酸位置に定義される。いくつかの実施形態では、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼはＱ１６３Ｆ、Ｑ１６３Ｙ、Ｑ１６３Ｗ、Ｎ１６４Ｗ、Ｎ１６４Ｆ、またはＮ１６４Ｙのいずれかの変異を含み；そのうち、アミノ酸位置番号はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示す対応するアミノ酸位置に定義される。いくつかの実施形態では、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼはＱ１６３Ｆ、Ｑ１６３Ｙ、Ｑ１６３Ｗ、Ｎ１６４ＦまたはＮ１６４Ｙのいずれかの変異を含み；そのうち、アミノ酸位置番号はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示す対応するアミノ酸位置に定義される。いくつかの実施形態では、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼは、Ｎ１６４ＹまたはＮ１６４Ｆ変異を含む；そのうち、アミノ酸位置番号はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示す対応するアミノ酸位置に定義される。いくつかの実施形態では、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼはＮ１６４Ｙ変異を含む；そのうち、アミノ酸位置番号はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示す対応するアミノ酸位置に定義される。いくつかの実施形態では、遺伝子編集効率を改善する目的を達成するために、上記のエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼ（参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼ中のＤＮＡ二本鎖の開放に関与する１つまたは複数のアミノ酸を芳香環付きアミノ酸に置換する）と少なくとも約８５％（例えば、少なくとも約８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％）の配列同一性を有するエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼを使用することもできる。
【0099】
３）参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼ中のＲｕｖＣドメインに位置し、一本鎖ＤＮＡ基質と相互作用するアミノ酸を正に帯電したアミノ酸に置換すること
いくつかの実施形態では、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼは、１つまたは複数の、参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼ（例えばＣａｓ１２ｉ２）に基づく変異を含み、前記変異は参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼ中のＲｕｖＣドメインに位置し、一本鎖ＤＮＡ基質と相互作用するアミノ酸を正に帯電したアミノ酸（Ｒ、Ｈ、Ｋなど）に置換することである。いくつかの実施形態では、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉ酵素は、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つまたはそれ以上のアミノ酸残基の置換を含む。
いくつかの実施形態では、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼは、１つまたは複数の、参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼ（例えばＣａｓ１２ｉ２）に基づく変異を含み、前記変異は参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼ中のＲｕｖＣドメインに位置し、一本鎖ＤＮＡ基質と相互作用するアミノ酸を正に帯電したアミノ酸（Ｒ、Ｈ、Ｋなど）に置換することである。いくつかの実施形態では、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉ酵素は、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つまたはそれ以上のアミノ酸残基の置換を含む。
【0100】
そのうち、前記ＲｕｖＣ構造域に位置し、一本鎖ＤＮＡ基質と相互作用する１つまたは複数のアミノ酸は、三次元構造上で一本鎖ＤＮＡ基質と距離が９Å以内のアミノ酸であり、例えば、三次元構造上で一本鎖ＤＮＡ基質と距離が８Å以内のアミノ酸、三次元構造上で一本鎖ＤＮＡ基質と距離が７Å以内のアミノ酸、三次元構造上で一本鎖ＤＮＡ基質と距離が６Å以内のアミノ酸、三次元構造上で一本鎖ＤＮＡ基質と５Å以内の距離のアミノ酸、三次元構造上で一本鎖ＤＮＡ基質と４Å以内の距離のアミノ酸、三次元構造上で一本鎖ＤＮＡ基質と３Å以内の距離のアミノ酸、三次元構造上で一本鎖ＤＮＡ基質と２Å以内の距離のアミノ酸、またはより近いアミノ酸であってもよい。
【0101】
ＲｕｖＣドメインは、Ｃａｓ１２ｉタンパク質中の一本鎖ＤＮＡまたは二鎖ＤＮＡの切断を担当する酵素活性ドメインである。タンパク質の一次配列では、Ｃａｓ１２ｉのＲｕｖＣドメインは、ＲｕｖＣ－１、ＲｕｖＣ－２、及びＲｕｖＣ－３の３つの部分に分けられる。これら３つの部分は三次元構造の中で隣接しており、共に酵素切断活性を有する触媒ポケットを構成している。Ｃａｓ１２ｉ２の三次元結晶構造、そのドメイン組成、ＤＮＡ基質との相互作用についての記述はＨｕａｎｇ Ｘ． ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ， １１， Ａｒｔｉｃｌｅ ｎｕｍｂｅｒ： ５２４１ （２０２０）を参照。Ｃａｓ１２ｉ１の三次元結晶構造、そのドメイン組成、及びＤＮＡ基質との相互作用についての記述はＺｈａｎｇ Ｈ．ｅｔａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ＆Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ２７，１０６９－１０７６（２０２０）を参照。相同性構造比較とモデル化（ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｍｏｄｅｌｉｎｇ）により、既知のＣａｓ１２ｉ三次元結晶構造を通じて、参照Ｃａｓ１２ｉと基質との相互作用の三次元構造モデルを得ることができる。実施例３には、Ｃａｓ１２ｉ２中のＲｕｖＣドメインに位置し、一本鎖ＤＮＡ基質から９Å以内の距離を有するアミノ酸を得るためのモデリング方法が記載されている。
【0102】
いくつかの実施形態では、ＲｕｖＣドメイン中のアミノ酸と一本鎖ＤＮＡ基質の空間構造上の距離は、解析されたＣａｓタンパク質－ＲＮＡ－ＤＮＡ三次元複合体の３Ｄ構造（ＰＤＢファイル）中の原子間の距離によって定義されることができ、原子間の相互距離はＰＤＢファイル識別ソフトウェアによって表示されることができる。いくつかの実施形態では、前記ＲｕｖＣドメイン中のアミノ酸と一本鎖ＤＮＡ基質の空間構造上の距離は、アミノ酸残基とヌクレオチドに含まれる原子との間の最小距離によって定義される。ＲｕｖＣドメイン中のアミノ酸と一本鎖ＤＮＡ基質との空間構造上の距離を測定するために用いることができるプログラム、またはＰＤＢファイル識別ソフトウェアは当技術分野で広く知られており、ＰｙＭＯＬ、ＣｈｉｍｅｒａＸ、Ｓｗｉｓｓ－ｐｄｂｖｉｅｗｅｒなどを含むが、これらに限定されない。
【0103】
いくつかの実施形態では、前記ＲｕｖＣドメインに位置し、一本鎖ＤＮＡ基質と相互作用する１つまたは複数のアミノ酸は３２３、３２７、３５５、３５９、３６０、３６１、３６２、３８８、３９０、３９１、３９２、３９３、４１４、４１７、４１８、４２１、４２４、４２５、６５０、６５２、６５３、６９６、７０５、７０８、７０９、７５１、７５２、７５５、８４０、８４８、８５1、８５６、８８５、８９７、９２５、９２６、９２８、９２９、９３２、及び１０２２の位置の１つまたは複数のアミノ酸である。いくつかの実施形態では、前記ＲｕｖＣドメインに位置し、一本鎖ＤＮＡ基質と相互作用する１つまたは複数のアミノ酸はＥ３２３、Ｌ３２７、Ｖ３５５、Ｇ３５９、Ｇ３６０、Ｋ３６１、Ｄ３６２、Ｌ３８８、Ｎ３９０、Ｎ３９１、Ｆ３９２、Ｋ３９３、Ｑ４１４、Ｌ４１７、Ｌ４１８、Ｋ４２１、Ｑ４２４、Ｑ４２５、Ｓ６５０、Ｅ６５２、Ｇ６５３、Ｉ６９６、Ｋ７０５、Ｋ７０８、Ｅ７０９、Ｌ７５１、Ｓ７５２、Ｅ７５５、Ｎ８４０、Ｎ８４８、Ｓ８５１、Ａ８５６、Ｑ８８５、Ｍ８９７、Ｎ９２５、Ｉ９２６、Ｔ９２８、Ｇ９２９、Ｙ９３２、Ａ１０２２の１つまたは複数のアミノ酸である。いくつかの実施形態では、前記ＲｕｖＣドメインに位置し、一本鎖ＤＮＡ基質と相互作用する１つまたは複数のアミノ酸はＥ３２３、Ｄ３６２、Ｌ３８８、Ｎ３９１、Ｌ４１７、Ｑ４２４、Ｑ４２５、Ｎ９２５、Ｉ９２６、及びＧ９２９の１つまたは複数のアミノ酸である。いくつかの実施形態では、前記アミノ酸位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示される野生型Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼの対応するアミノ酸位置によって定義される。
【0104】
いくつかの実施形態では、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼは、参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼ中のＲｕｖＣドメインに位置し、一本鎖ＤＮＡ基質と相互作用する１つまたは複数のアミノ酸をＲ、ＨまたはＫ（例えばＲまたはＫ）に置換する変異を含む。いくつかの実施形態では、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼは、参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼ中のＲｕｖＣドメインに位置し、一本鎖ＤＮＡ基質と相互作用する１つまたは複数のアミノ酸をＲに置換する変異を含む。
【0105】
いくつかの実施形態では、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼはＮ３９０Ｒ、Ｎ３９１Ｒ、Ｆ３９２Ｒ、Ｌ７５１Ｒ、Ｅ７５５Ｒ、Ｎ８４０Ｒ、Ｎ８４８Ｒ、Ｓ８５１Ｒ、Ａ８５６Ｒ、Ｑ８８５Ｒ、Ｍ８９７Ｒ、Ｉ９２６Ｒ、Ｇ９２９Ｒ、Ｙ９３２Ｒ、Ｅ３２３Ｒ、Ｌ３２７Ｒ、Ｖ３５５Ｒ、Ｇ３５９Ｒ、Ｇ３６０Ｒ、Ｋ３６１Ｒ、Ｄ３６２Ｒ、Ｑ４１４Ｒ、Ｋ４２１Ｒ、Ｑ４２５Ｒ、Ｓ６５０Ｒ、Ｅ６５２Ｒ、Ｋ７０５Ｒ、Ｋ７０８Ｒ、Ｅ７０９Ｒ、Ｓ７５２Ｒ、Ｎ９２５Ｒ、Ｔ９２８Ｒ、Ｅ３２３Ｒ＋Ｄ３６２Ｒ、Ｅ３２３Ｒ＋Ｑ４２５Ｒ、Ｅ３２３Ｒ＋Ｉ９２６Ｒ、Ｑ４２５Ｒ＋Ｉ９２６Ｒ、Ｅ３２３Ｒ＋Ｄ３６２Ｒ＋Ｑ４２５Ｒ、Ｅ３２３Ｒ＋Ｄ３６２Ｒ＋Ｉ９２６Ｒ、Ｅ３２３Ｒ＋Ｑ４２５Ｒ＋Ｉ９２６Ｒ、Ｅ３２３Ｒ＋Ｄ３６２Ｒ＋Ｑ４２５Ｒ＋Ｉ９２６Ｒ、Ｄ３６２Ｒ＋Ｉ９２６Ｒ、Ｎ９２５Ｒ＋Ｉ９２６Ｒ、Ｄ３６２Ｒ＋Ｎ９２５Ｒ＋Ｉ９２６Ｒ、Ｄ３６２Ｒ＋Ｎ９２５Ｒの１つまたは複数の変異または変異の組み合わせを含む；前記アミノ酸位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示される野生型Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼの対応するアミノ酸位置によって定義される。
【0106】
いくつかの実施形態では、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼはＥ３２３、Ｄ３６２、Ｑ４２５、Ｎ９２５、Ｉ９２６、Ｇ９２９いずれかのアミノ酸残基の位置の変異または変異の組み合わせを含み；そのうち、アミノ酸位置番号は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示される対応するアミノ酸位置によって定義される。いくつかの実施形態では、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼはＥ３２３、Ｄ３６２、Ｑ４２５、Ｎ９２５、Ｉ９２６、Ｅ３２３＋Ｄ３６２、Ｅ３２３＋Ｑ４２５、Ｅ３２３＋Ｉ９２６、Ｄ３６２＋Ｑ４２５、Ｄ３６２＋Ｎ９２５、Ｄ３６２＋Ｉ９２６、Ｑ４２５＋Ｉ９２６、Ｎ９２５＋Ｉ９２６、Ｅ３２３＋Ｄ３６２＋Ｑ４２５、Ｅ３２３＋Ｄ３６２＋Ｉ９２６、Ｅ３２３＋Ｑ４２５＋Ｉ９２６、Ｄ３６２＋Ｎ９２５＋Ｉ９２６、Ｄ３６２＋Ｑ４２５＋Ｉ９２６、Ｅ３２３＋Ｄ３６２＋Ｑ４２５＋Ｉ９２６のいずれかのアミノ酸残基の位置の変異または変異の組み合わせを含み；そのうち、アミノ酸位置番号は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示される対応するアミノ酸位置によって定義される。いくつかの実施形態では、前記変異は、前記位置のアミノ酸残基をＲ、ＨまたはＫ（例えばＲ）に置換する変異である。いくつかの実施形態において、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼは３２３Ｒ、３６２Ｒ、４２５Ｒ、９２５Ｒ、９２６Ｒ、３２３Ｒ＋３６２Ｒ、３２３Ｒ＋４２５Ｒ、３２３Ｒ＋９２６Ｒ、３６２Ｒ＋４２５Ｒ、３６２Ｒ＋９２６Ｒ、４２５Ｒ＋９２６Ｒ、９２５Ｒ＋９２６Ｒ、３２３Ｒ＋３６２Ｒ＋４２５Ｒ、３２３Ｒ＋３６２Ｒ＋９２６Ｒ、３２３Ｒ＋４２５Ｒ＋９２６Ｒ、３６２Ｒ＋９２５Ｒ＋９２６Ｒ ３２３Ｒ＋３６２Ｒ＋４２５Ｒ＋９２６Ｒ、及び３６２Ｒ＋４２５Ｒ＋９２６Ｒのいずれかのアミノ酸またはアミノ酸の組み合わせを含み；そのうち、アミノ酸位置番号は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示される対応するアミノ酸位置によって定義される。いくつかの実施形態では、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼはＥ３２３Ｒ、Ｄ３６２Ｒ、Ｑ４２４Ｒ、Ｑ４２５Ｒ、Ｎ９２５Ｒ、Ｉ９２６Ｒ、及びＧ９２９Ｒのいずれかの変異または変異の組み合わせを含み；そのうち、アミノ酸位置番号は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示される対応するアミノ酸位置によって定義される。いくつかの実施形態では、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼはＥ３２３Ｒ、Ｄ３６２Ｒ、Ｑ４２５Ｒ、Ｎ９２５Ｒ、Ｉ９２６Ｒ、Ｅ３２３Ｒ＋Ｄ３６２Ｒ、Ｅ３２３Ｒ＋Ｑ４２５Ｒ、Ｅ３２３Ｒ＋Ｉ９２６Ｒ、Ｄ３６２Ｒ＋Ｑ４２５Ｒ、Ｑ４２５Ｒ＋Ｉ９２６Ｒ、Ｄ３６２Ｒ＋Ｉ９２６Ｒ、Ｎ９２５Ｒ＋Ｉ９２６Ｒ、Ｅ３２３Ｒ＋Ｄ３６２Ｒ＋Ｑ４２５Ｒ、Ｅ３２３Ｒ＋Ｄ３６２Ｒ＋Ｉ９２６Ｒ、Ｅ３２３Ｒ＋Ｑ４２５Ｒ＋Ｉ９２６Ｒ、Ｄ３６２Ｒ＋Ｎ９２５Ｒ＋Ｉ９２６Ｒ、Ｄ３６２Ｒ＋Ｑ４２５Ｒ＋Ｉ９２６Ｒ、及びＥ３２３Ｒ＋Ｄ３６２Ｒ＋Ｑ４２５Ｒ＋Ｉ９２６Ｒのいずれかの変異または変異の組み合わせを含み；そのうち、アミノ酸位置番号は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示される対応するアミノ酸位置によって定義される。いくつかの実施形態では、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼはＩ９２６Ｒ変異を含み；そのうち、アミノ酸位置番号は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示される対応するアミノ酸位置によって定義される。いくつかの実施形態では、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼはＥ３２３Ｒ＋Ｄ３６２Ｒ変異を含み；そのうち、アミノ酸位置番号は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示される対応するアミノ酸位置によって定義される。いくつかの実施形態では、遺伝子編集効率を改善する目的を達成するために、上記のエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼ（参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼのＲｕｖＣドメインに位置させ、一本鎖ＤＮＡ基質と相互作用する１つまたは複数のアミノ酸を正に帯電したアミノ酸に置換したもの）と少なくとも約８５％（例えば、少なくとも約８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％）の配列同一性を有するエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼを使用することもできる。
【0107】
４）参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼ中のＤＮＡ－ＲＮＡ二重らせんと相互作用する１つまたは複数のアミノ酸を正に帯電したアミノ酸に置換すること
いくつかの実施形態では、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼは、参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼ中のＤＮＡ－ＲＮＡ二重らせんと相互作用する１つまたは複数のアミノ酸をＲ、Ｈ、Ｋなどの正に帯電したアミノ酸に置換するための１つまたは複数の参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼ（例えばＣａｓ１２ｉ２）に基づく変異を含む。いくつかの実施形態では、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉ酵素は、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、またはそれ以上の前記アミノ酸残基の置換を含む。
いくつかの実施形態では、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼは、参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼ中のＤＮＡ－ＲＮＡ二重らせんと相互作用する１つまたは複数のアミノ酸をＲ、Ｈ、Ｋなどの正に帯電したアミノ酸に置換するための１つまたは複数の参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼ（例えばＣａｓ１２ｉ２）に基づく変異を含む。いくつかの実施形態では、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉ酵素は、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、またはそれ以上の前記アミノ酸残基の置換を含む。
【0108】
そのうち、前記ＤＮＡ－ＲＮＡ二重らせんと相互作用する１つまたは複数のアミノ酸は、三次元構造上でＤＮＡ－ＲＮＡ二重らせんと９Å以内の距離を有するアミノ酸であり、例えば、三次元構造上でＤＮＡ－ＲＮＡ二重らせんと８Å以内の距離を有するアミノ酸、三次元構造上でＤＮＡ－ＲＮＡ二重らせんと７Å以内の距離を有するアミノ酸、三次元構造上でＤＮＡ－ＲＮＡ二重らせんと６Å以内の距離を有するアミノ酸、三次元構造上ＤＮＡ－ＲＮＡと二重らせん距離が５Å以内のアミノ酸、三次元構造上ＤＮＡ－ＲＮＡと二重らせん距離が４Å以内のアミノ酸、三次元構造上ＤＮＡ－ＲＮＡと二重らせん距離が３Å以内のアミノ酸、三次元構造上ＤＮＡ－ＲＮＡと二重らせん距離が２Å以内のアミノ酸、またはより近いアミノ酸である。いくつかのＣａｓヌクレアーゼの動作原理は下記の通りである：ＣａｓはｃｒＲＮＡなどのガイドＲＮＡと複合体を形成し、その中でｃｒＲＮＡと標的ＤＮＡが互いに対になってＤＮＡ－ＲＮＡ二重らせんを形成し、そしてＣａｓヌクレアーゼと相互作用し、二本鎖標的ＤＮＡを開放し、そしてＲ－ｌｏｏｐを形成し、Ｃａｓの酵素切断活性部位にｄｓＤＮＡの切断を完成させることができる。Ｃａｓ１２ｉ２の三次元結晶構造、そのドメイン組成、及びＤＮＡ－ＲＮＡ二重らせんとの相互作用の記述はＨｕａｎｇ Ｘ． ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ， １１， Ａｒｔｉｃｌｅ ｎｕｍｂｅｒ： ５２４１ （２０２０）を参照。
【0109】
いくつかの実施形態では、空間構造上のＤＮＡ－ＲＮＡ二重らせんとＣａｓアミノ酸との距離は、解析されたＣａｓタンパク質－ＲＮＡ－ＤＮＡ三次元複合体の３Ｄ構造（ＰＤＢファイル）中のアミノ酸残基とヌクレオチドに含まれる原子との最小距離によって定義されることができ、原子間の相互距離はＰＤＢファイル識別ソフトウェアによって表示されることができる。いくつかの実施形態では、前記Ｃａｓアミノ酸とＤＮＡ－ＲＮＡ二重らせんの空間構造上の距離は、原子仮説位置からの距離によって定義される。Ｃａｓアミノ酸とＤＮＡ－ＲＮＡ二重らせんの空間構造上の距離を測定するために使用できるプログラム、またはＰＤＢファイル識別ソフトウェアは当技術分野で広く知られており、ＰｙＭＯＬ、ＣｈｉｍｅｒａＸ、Ｓｗｉｓｓ－ｐｄｂｖｉｅｗｅｒなどを含むがこれらに限定されない。
【0110】
いくつかの実施形態では、前記ＤＮＡ－ＲＮＡ二重らせんと相互作用する１つまたは複数のアミノ酸は１１６、１１７、１５６、１５９、１６０、１６１、２４７、２９３、２９４、２９７、３０１、３０５、３０６、３０８、３１２、３１３、３１６、３１９、３２０、３４３、３４８、３４９、４２７、４３３、４３８、４４１、４４２、６７９、６８３、６９１、７８２、７８３、７９７、８００、８５２、８５３、８５５、８６１、８６５、９５７、９５８の位置の１つまたは複数のアミノ酸である。いくつかの実施形態では、前記ＤＮＡ－ＲＮＡ二重らせんと相互作用する１つまたは複数のアミノ酸はＧ１１６、Ｅ１１７、Ａ１５６、Ｔ１５９、Ｅ１６０、Ｓ１６１、Ｅ２４７、Ｇ２９３、Ｅ２９４、Ｎ２９７、Ｔ３０１、Ｉ３０５、Ｋ３０６、Ｔ３０８、Ｎ３１２、Ｆ３１３、Ｑ３１６、Ｅ３１９、Ｑ３２０、Ｅ３４８、Ｅ３４８、Ｅ３４９、Ｄ４２７、Ｋ４３３、Ｖ４３８、Ｎ４４１、Ｑ４４２、Ｎ６７９、Ｅ６８３、Ｅ６９１、Ｄ７８２、Ｅ７８３、Ｅ７９７、Ｅ８００、Ｍ８５２、Ｄ８５３、Ｌ８５５、Ｎ８６１、Ｑ８６５、Ｓ９５７、Ｄ９５８の１つまたは複数のアミノ酸である。いくつかの実施形態では、前記ＤＮＡ－ＲＮＡ二重らせんと相互作用する１つまたは複数のアミノ酸はＧ１１６、Ｅ１１７、Ｔ１５９、Ｓ１６１、Ｅ３１９、Ｅ３４３、またはＤ９５８の１つまたは複数のアミノ酸である。いくつかの実施形態では、前記ＤＮＡ－ＲＮＡ二重らせんと相互作用するアミノ酸はＤ９５８である。いくつかの実施形態では、前記アミノ酸位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示される野生型Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼの対応するアミノ酸位置によって定義される。
【0111】
いくつかの実施形態では、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼは、参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼ中のＤＮＡ－ＲＮＡ二重らせんと相互作用する１つまたは複数のアミノ酸をＲ、ＨまたはＫ（例えばＲまたはＫ）に置換する変異を含む。いくつかの実施形態では、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼは、参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼ中のＤＮＡ－ＲＮＡ二重らせん相互作用に関与する１つまたは複数のアミノ酸をＲに置換する変異を含む。
【0112】
いくつかの実施形態では、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼはＧ１１６Ｒ、Ｅ１１７Ｒ、Ａ１５６Ｒ、Ｔ１５９Ｒ、Ｓ１６１Ｒ、Ｔ３０１Ｒ、Ｉ３０５Ｒ、Ｋ３０６Ｒ、Ｔ３０８Ｒ、Ｎ３１２Ｒ、Ｆ３１３Ｒ、Ｄ４２７Ｒ、Ｋ４３３Ｒ、Ｖ４３８Ｒ、Ｎ４４１Ｒ、Ｑ４４２Ｒ、Ｍ８５２Ｒ、Ｌ８５５Ｒ、Ｎ８６１Ｒ、Ｑ８６５Ｒ、Ｅ１６０Ｒ、Ｑ３１６Ｒ、Ｅ３１９Ｒ、Ｑ３２０Ｒ、Ｅ２４７Ｒ、Ｅ３４３、Ｅ３４８Ｒ、Ｅ３４９Ｒ、Ｎ６７９Ｒ、Ｅ６８３Ｒ、Ｅ６９１Ｒ、Ｄ７８２Ｒ、Ｅ７８３Ｒ、Ｅ７９７Ｒ、Ｅ８００Ｒ、Ｄ８５３Ｒ、Ｓ９５７Ｒ、Ｄ９５８Ｒ、Ｇ２９３Ｒ、Ｅ２９４Ｒ、Ｎ２９７Ｒの１つまたは複数のアミノ酸突然変異を含み；アミノ酸位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示される野生型Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼの対応するアミノ酸位置によって定義される。
【0113】
いくつかの実施形態では、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼはＧ１１６、Ｅ１１７、Ｔ１５９、Ｓ１６１、Ｅ３１９、Ｅ３４３、またはＤ９５８のアミノ酸残基の位置のいずれかの変異または変異の組み合わせを含み；そのうち、アミノ酸位置番号は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示される対応するアミノ酸位置によって定義される。いくつかの実施形態では、前記変異は、前記位置のアミノ酸残基をＲ、ＨまたはＫ（例えばＲ）に置換する変異である。いくつかの実施形態では、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼは１１６Ｒ、１１７Ｒ、１５９Ｒ、１６１Ｒ、３１９Ｒ、３４３Ｒ、または９５８Ｒのいずれかの部位のアミノ酸またはアミノ酸変異の組み合わせを含み；そのうち、アミノ酸位置番号は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示される対応するアミノ酸位置によって定義される。いくつかの実施形態では、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼはＧ１１６Ｒ、Ｅ１１７Ｒ、Ｔ１５９Ｒ、Ｓ１６１Ｒ、Ｅ３１９Ｒ、Ｅ３４３Ｒ、またはＤ９５８Ｒのいずれかの変異または変異の組み合わせを含み；そのうち、アミノ酸位置番号は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示される対応するアミノ酸位置によって定義される。いくつかの実施形態では、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼはＤ９５８Ｒ変異を含む；そのうち、アミノ酸位置番号は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示される対応するアミノ酸位置によって定義される。いくつかの実施形態では、遺伝子編集効率を改善する目的を達成するために、上述のエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼと少なくとも約８５％（例えば、少なくとも約８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％）の配列同一性を有するエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼを使用することもできる。
【0114】
５）参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼ中のＤＮＡ－ＲＮＡ二重らせんと相互作用する１つまたは複数の極性または正に帯電したアミノ酸を疎水性アミノ酸に置換すること
いくつかの実施形態では、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼは、参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼ中のＤＮＡ－ＲＮＡ二重らせんと相互作用する１つまたは複数の極性または正に帯電したアミノ酸を疎水性アミノ酸（Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｙ、Ｐ、ＣまたはＷなど）に置換する、１つまたは複数の参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼに基づく変異を含む。前記変異（そのうちは「高特異性」または「ＨＦ」変異とも呼ばれる）は、Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼのオフターゲット率を低下させる（すなわち特異性を高める）ことができる。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸＸ－ＨＦのＣａｓＸＸに対するオフターゲット率は、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％またはそれ以上減少することができる。いくつかの実施形態では、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉ酵素は、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つまたはそれ以上の前記アミノ酸残基の置換を含む。
いくつかの実施形態では、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼは、参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼ中のＤＮＡ－ＲＮＡ二重らせんと相互作用する１つまたは複数の極性または正に帯電したアミノ酸を疎水性アミノ酸（Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｙ、Ｐ、ＣまたはＷなど）に置換する、１つまたは複数の参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼに基づく変異を含む。前記変異（そのうちは「高特異性」または「ＨＦ」変異とも呼ばれる）は、Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼのオフターゲット率を低下させる（すなわち特異性を高める）ことができる。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸＸ－ＨＦのＣａｓＸＸに対するオフターゲット率は、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％またはそれ以上減少することができる。いくつかの実施形態では、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉ酵素は、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つまたはそれ以上の前記アミノ酸残基の置換を含む。
【0115】
そのうち、前記ＤＮＡ－ＲＮＡ二重らせんと相互作用する１つまたは複数のアミノ酸は、三次元構造上でＤＮＡ－ＲＮＡ二重らせんと９Å以内の距離を有するアミノ酸であり、例えば、三次元構造上でＤＮＡ－ＲＮＡ二重らせんと８Å以内の距離を有するアミノ酸、三次元構造上でＤＮＡ－ＲＮＡ二重らせんと７Å以内の距離を有するアミノ酸、三次元構造上でＤＮＡ－ＲＮＡ二重らせんと６Å以内の距離を有するアミノ酸、三次元構造上ＤＮＡ－ＲＮＡと二重らせん距離が５Å以内のアミノ酸、三次元構造上ＤＮＡ－ＲＮＡと二重らせん距離が４Å以内のアミノ酸、三次元構造上ＤＮＡ－ＲＮＡと二重らせん距離が３Å以内のアミノ酸、三次元構造上ＤＮＡ－ＲＮＡと二重らせん距離が２Å以内のアミノ酸、またはより近いアミノ酸であってもよい。Ｃａｓ１２ｉ２の三次元結晶構造、そのドメイン組成、及びＤＮＡ－ＲＮＡ二重らせんとの相互作用の記述はＨｕａｎｇ Ｘ． ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ， １１， Ａｒｔｉｃｌｅ ｎｕｍｂｅｒ： ５２４１ （２０２０）を参照。
【0116】
いくつかの実施形態では、前記ＤＮＡ－ＲＮＡ二重らせんと相互作用する１つまたは複数の極性または正に帯電したアミノ酸は１１９、１６４、２９７、３０８、３０９、３１２、３４６、３５７、３９４、３９５、４０２、４４１、４３３、５６５、７１５、７１９、７６６、７８２、８０７、８４１、８４４、８４５、８４８、８５７、８６１、８６５の位置の１つまたは複数のアミノ酸である。いくつかの実施形態では、前記ＤＮＡ－ＲＮＡ二重らせんと相互作用する１つまたは複数の極性または正に帯電したアミノ酸はＹ１１９、Ｙ１６４、Ｎ２９７、Ｔ３０８、Ｒ３０９、Ｎ３１２、Ｓ３４６、Ｈ３５７、Ｋ３９４、Ｅ３９５、Ｒ４０２、Ｎ４４１、Ｋ４３３、Ｓ５６５、Ｒ７１５、Ｒ７１９、Ｓ７６６、Ｄ７８２、Ｋ８０７、Ｎ８４１、Ｋ８４４、Ｋ８４５、Ｎ８４８、Ｒ８５７、Ｎ８６１、Ｑ８６５の１つまたは複数のアミノ酸である。いくつかの実施形態では、前記ＤＮＡ－ＲＮＡ二重らせんと相互作用する１つまたは複数の極性または正に帯電したアミノ酸はＲ８５７、Ｒ８６１、Ｋ８０７、Ｎ８４８、Ｒ７１５、Ｒ７１９、Ｋ３９４、Ｈ３５７、及びＫ８４４の１つまたは複数のアミノ酸である。いくつかの実施形態では、前記ＤＮＡ－ＲＮＡ二重らせんと相互作用する１つまたは複数の極性または正に帯電したアミノ酸はＲ８５７、Ｒ７１９、Ｋ３９４、及びＫ８４４の１つまたは複数のアミノ酸である。そのうち、上述のようにアミノ酸位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１または８に示す対応するアミノ酸位置によって定義される。
【0117】
いくつかの実施形態では、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼはＳ５６５Ａ、Ｎ２９７Ａ、Ｑ８６５Ａ、Ｔ３０８Ａ、Ｒ３０９Ａ、Ｎ３１２Ａ、Ｎ４４１Ａ、Ｒ８５７Ａ、Ｎ８６１Ａ、Ｙ１１９Ｆ、Ｋ４３３Ａ、Ｋ８０７Ａ、Ｎ８４１Ａ、Ｎ８４８Ａ、Ｋ８４５Ａ、Ｄ７８２Ａ、Ｒ７１５Ａ、Ｒ７１９Ａ、Ｓ７６６Ａ、Ｋ３９４Ａ、Ｈ３５７Ａ、Ｋ８４４Ａ、Ｅ３９５Ａ、Ｓ３４６Ａ、Ｒ４０２Ａ、ＹＹ１６４Ｎの１つまたは複数の変異を含み；そのうち、アミノ酸位置番号は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１または８に示される対応するアミノ酸位置によって定義される。
【0118】
いくつかの実施形態では、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼは、参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼ中の３５７、３９４、７１５、７１９、８０７、８４４、８４８、８５７、８６１に位置する１つまたは複数の極性または正に帯電したアミノ酸を疎水性アミノ酸に置換する変異を含む。いくつかの実施形態では、前記疎水性アミノ酸は、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ及びＦ、例えばＡ、Ｖ、Ｌ又はＩから選択される。いくつかの実施形態では、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼは、参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼ中のＨ３５７、Ｋ３９４、Ｒ７１５、Ｒ７１９、Ｋ８０７、Ｋ８４４、Ｎ８４８、Ｒ８５７及び／またはＲ８６１に位置する１つまたは複数の極性または正に帯電したアミノ酸をＡに置換する変異を含む。そのうち、前記アミノ酸位置番号は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１または８に示す対応するアミノ酸位置によって定義される。いくつかの実施形態では、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼはＨ３５７Ａ、Ｋ３９４Ａ、Ｒ７１５Ａ、Ｒ７１９Ａ、Ｋ８０７Ａ、Ｋ８４４Ａ、Ｎ８４８Ａ、Ｒ８５７Ａ、及びＲ８６１Ａのいずれかの位置におけるアミノ酸またはアミノ酸の組み合わせの変異を含み；そのうち、アミノ酸位置番号は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１または８に示される対応するアミノ酸位置によって定義される。
【0119】
いくつかの実施形態では、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼは８５７、７１９、３９４、または８４４のアミノ酸残基の位置のいずれかの変異または変異の組み合わせを含み、そのうち、アミノ酸位置番号は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示される対応するアミノ酸位置によって定義される。いくつかの実施形態では、前記変異は、前記の位置アミノ酸残基を疎水性アミノ酸（例えばＡ）に置換する変異である。いくつかの実施形態では、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼはＲ８５７、Ｒ７１９、Ｋ３９４、またはＫ８４４のいずれかの位置におけるアミノ酸またはアミノ酸の組み合わせの変異を含み；そのうち、アミノ酸位置番号は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１または８に示される対応するアミノ酸位置によって定義される。いくつかの実施形態において、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼはＲ８５７、Ｒ７１９、Ｋ３９４、Ｋ８４４、Ｒ７１９＋Ｋ３９４、Ｋ３９４＋Ｋ８４４、Ｒ８５７＋Ｋ３９４、Ｒ７１９＋Ｋ８４４、Ｒ８５７＋Ｒ７１９、Ｒ８５７＋Ｋ８４４、Ｒ７１９＋Ｋ３９４＋Ｋ８４４、Ｒ８５７＋Ｒ７１９＋Ｋ３９４、Ｒ８５７＋Ｋ３９４＋Ｋ８４４、Ｒ８５７＋Ｋ３９４＋Ｋ８４４、Ｒ８５７＋Ｒ７１９＋Ｋ３９４＋Ｋ８４４のアミノ酸残基の位置のいずれかの変異または変異の組み合わせを含み；そのうち、アミノ酸位置番号はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１または８に示す対応するアミノ酸位置によって定義される；前記変異は、位置アミノ酸残基を疎水性アミノ酸（例えばＡ）に置換する変異である。いくつかの実施形態では、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼはＲ８５７Ａ、Ｒ７１９Ａ、Ｋ３９４Ａ、Ｋ８４４Ａ、Ｒ７１９Ａ＋Ｋ３９４Ａ、Ｋ３９４Ａ＋Ｋ８４４Ａ、Ｒ８５７Ａ＋Ｋ３９４Ａ、Ｒ７１９Ａ＋Ｋ８４４Ａ、Ｒ８５７Ａ＋Ｒ７１９Ａ、Ｒ８５７Ａ＋Ｋ８４４Ａ、Ｒ７１９Ａ＋Ｋ３９４Ａ＋Ｋ８４４Ａ、、Ｒ８５７Ａ＋Ｒ７１９Ａ＋Ｋ３９４Ａ、Ｒ８５７Ａ＋Ｋ３９４Ａ＋Ｋ８４４Ａ、Ｒ８５７Ａ＋Ｒ７１９Ａ＋Ｋ８４４Ａ、Ｒ８５７Ａ＋Ｒ７１９Ａ＋Ｋ３９４Ａ＋Ｋ８４４Ａのアミノ酸残基の位置のいずれかの変異または変異の組み合わせを含み；そのうち、アミノ酸位置番号は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１または８に示される対応するアミノ酸位置によって定義される。いくつかの実施形態では、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼはＲ８５７Ａ、Ｒ７１９Ａ、Ｋ３９４Ａ、またはＫ８４４Ａのいずれかの変異または変異の組み合わせを含み；そのうち、アミノ酸位置番号は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１または８に示される対応するアミノ酸位置によって定義される。いくつかの実施形態では、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼはＫ８４４Ａ変異を含む；そのうち、アミノ酸位置番号は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１または８に示される対応するアミノ酸位置によって定義される。いくつかの実施形態では、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼはＲ７１９Ａ及びＫ８４４Ａ変異を含む；そのうち、アミノ酸位置番号は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１または８に示される対応するアミノ酸位置によって定義される。いくつかの実施形態では、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼはＲ８５７Ａ及びＫ８４４Ａ変異を含む；そのうち、アミノ酸位置番号は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１または８に示される対応するアミノ酸位置によって定義される。いくつかの実施形態では、遺伝子編集効率を改善する目的を達成するために、上述のエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼ（参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼ中のＤＮＡ－ＲＮＡ二重らせんと相互作用する１つまたは複数の極性または正に帯電したアミノ酸を疎水性アミノ酸に置換する）と少なくとも約８５％（例えば、少なくとも約８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％）の配列同一性を有するエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼを使用することもできる。
【0120】
６）その他の変異
特に指定されない場合、本明細書に記載の変異は挿入、削除、置換の１つまたは複数を含むことができ、１つまたは複数のアミノ酸の変異であり得る。
特に指定されない場合、本明細書に記載の変異は挿入、削除、置換の１つまたは複数を含むことができ、１つまたは複数のアミノ酸の変異であり得る。
【0121】
１）～５）セクションに記載のいずれかまたは複数の変異は、標的結合、二本鎖切断活性、ニッカーゼ活性、及び／または遺伝子編集活性など、Ｃａｓ１２ｉ活性を増加させる任意または複数の既知の変異と結合することができる。例示的な行の変異は、例えば、ＰＣＴ／ＣＮ２０２０／０１３４２４９及びＣＮ１１２１９５１６４Ａの文献に見られ、これらの文献は全体的な参照により本明細書に組み込まれた。１）～５）セクションに記載されたいずれかまたは複数の変異は、標的結合、二本鎖切断活性、ニッカーゼ活性、及び／または遺伝子編集活性など、Ｃａｓ１２ｉ活性を低下させる任意または複数の既知の変異と組み合わせることもできる。
【0122】
いくつかの実施形態では、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼ（例えば、上記１）～５）セクションにおける１つまたは複数の変異を含むエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼ）は、１つまたは複数のフレキシブル領域変異をさらに含み、前記変異は、参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼ（または（１）～（５）節のいずれか１つまたは複数の変異を含むエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼ）中のフレキシブル領域の柔軟性（ｆｌｅｘｉｂｉｌｉｔｙ）（例えば、少なくとも約１０％、２０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１倍、１．１倍、１．２倍、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍またはそれ以上）を増加させる。前記参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼ中のフレキシブル領域は、当技術分野で知られている任意の方法を用いて決定することができる。いくつかの実施形態では、前記参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼのアミノ酸配列にのみ基づいて複数のフレキシブル領域を決定する。いくつかの実施形態では、２次構造、結晶構造、ＮＭＲ構造などを含む複数のフレキシブル領域は、前記参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼの構造情報に基づいて決定される。
【0123】
ここで前記Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼのフレキシブル領域を工学的に改造する方法は（ａ）複数のエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼを獲得し、各エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼは１つまたは複数の変異を含み、前記変異は参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼの１つまたは複数のフレキシブル領域中のフレキシブル領域の柔軟性を増加させること、及び（ｂ）前記複数のエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼの中から１つまたは複数のエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼを選択し、そのうち、前記１つまたは複数のエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼは前記参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼに比べて増加する活性（標的結合、二本鎖切断活性、ニッカーゼ活性、及び／または遺伝子編集活性など）を有することを含む。いくつかの実施形態では、前記方法はさらに、前記参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼ中の１つまたは複数のフレキシブル領域を決定することを含む。いくつかの実施形態では、前記方法は、哺乳動物細胞（例えばヒト細胞）などの真核細胞中でエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼの活性を測定することをさらに含む。
【0124】
いくつかの実施形態では、ＰｒｅｄｙＦｌｅｘｙ、ＦｏｌｄＵｎｆｏｌｄ、ＰＲＯＦｂｖａｌ、Ｆｌｅｘｓｅｒｖ、ＦｌｅｘＰｒｅｄ、ＤｙｎａＭｉｎｅ、及びＤｉｓｏｍｉｎｅの群から選択されるプログラムを使用して複数のフレキシブル領域が決定される。いくつかの実施形態では、前記１つまたは複数のフレキシブル領域はランダムコイルに位置する。いくつかの実施形態では、前記１つまたは複数のフレキシブル領域は、参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼ（または、前記（１）～（５）セクションのうちのいずれか１つまたは複数の変異を含むエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼ）のＤＮＡ及び／またはＲＮＡと相互作用するドメイン内にある。いくつかの実施形態では、前記フレキシブル領域は、少なくとも長さが約５つ（例えば、５つ）のアミノ酸を有する。
【0125】
いくつかの実施形態では、前記１つまたは複数の変異は、フレキシブル領域に１つまたは複数（例えば、２つ）のグリシン（Ｇ）残基を挿入することを含む。いくつかの実施形態では、前記１つまたは複数のＧ残基がフレキシブル領域における柔軟性アミノ酸残基のＮ末端に挿入され、そのうち、前記柔軟性アミノ酸残基はＧ、セリン（Ｓ）、アスパラギン（Ｎ）、アスパラギン（Ｄ）、ヒスチジン（Ｈ）、メチオニン（Ｍ）、トレオニン（Ｔ）、グルタミン酸（Ｅ）、グルタミン（Ｑ）、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、アラニン（Ａ）、プロリン（Ｐ）からなる群より選択される。いくつかの実施形態では、柔軟性アミノ酸残基は、Ｇ＞Ｓ＞Ｎ＞Ｄ＞Ｈ＞Ｍ＞Ｔ＞Ｅ＞Ｑ＞Ｋ＞Ｒ＞Ａ＞Ｐの優先順位に従って選択される。いくつかの実施形態では、前記１つまたは複数の変異は、１つまたは複数のＧ残基を１つまたは複数の非Ｇ残基に置換することを含む。
【0126】
いくつかの実施形態では、前記１つまたは複数の変異は、フレキシブル領域における疎水性アミノ酸残基をＧ残基で置換することを含み、そのうち、前記疎水性アミノ酸残基は、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）、システイン（Ｃ）、チロシン（Ｙ）、フェニルアラニン（Ｆ）、及びトリプトファン（Ｗ）の群から選択される。
【0127】
いくつかの実施形態では、前記活性は部位特異的ヌクレアーゼ活性である。いくつかの実施形態では、前記活性は真核細胞（例えばヒト細胞）中の遺伝子編集活性である。いくつかの実施形態では、前記遺伝子編集効率は、Ｔ７エンドヌクレアーゼ１（Ｔ７Ｅ１）アッセイ、標的ＤＮＡの配列測定、分解追跡挿入欠失（ＴＩＤＥ）アッセイ、または増幅子解析による挿入欠失検出（ＩＤＡＡ）アッセイを用いて測定される。
【0128】
いくつかの実施形態では、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼ（例えば、（１）～（５）セクションのいずれか１つまたは複数の変異を含むエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼ）は、参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ１２ｉ２ヌクレアーゼ、または（１）～（５）セクションのいずれか１つまたは複数の変異を含むエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼ）中のフレキシブル領域の柔軟性を増加させる１つまたは複数のフレキシブル領域変異を含み、前記フレキシブル領域は、アミノ酸残基２２８－２３２、アミノ酸残基４３９－４４３、アミノ酸残基４７８－４８２、アミノ酸残基５００－５０４、アミノ酸残基７７５－７７９、及びアミノ酸残基９２５－９２９の領域に対する群から選択され、前記アミノ酸残基番号はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示される対応するアミノ酸位置によって定義される。いくつかの実施形態では、前記フレキシブル領域は、アミノ酸残基４３９－４４３またはアミノ酸残基９２５－９２９から選択され、そのうち前記アミノ酸残基番号は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示される対応するアミノ酸位置によって定義される。いくつかの実施形態では、前記参照Ｃａｓ１２ｉ酵素はＣａｓ１２ｉ２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）である。いくつかの実施形態では、前記１つまたは複数のフレキシブル領域変異は、フレキシブル領域に１つまたは複数（例えば２つ）のＧ残基を挿入することを含む。いくつかの実施形態では、前記１つまたは複数のＧ残基は、前記フレキシブル領域中の柔軟性アミノ酸残基のＮ末端に挿入され、前記柔軟性アミノ酸残基は、Ｇ、Ｓ、Ｎ、Ｄ、Ｈ、Ｍ、Ｔ、Ｅ、Ｑ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｐの群から選択される。いくつかの実施形態では、前記柔軟性アミノ酸残基は、Ｇ＞Ｓ＞Ｎ＞Ｄ＞Ｈ＞Ｍ＞Ｔ＞Ｅ＞Ｑ＞Ｋ＞Ｒ＞Ａ＞Ｐの優先順位に従って選択される。いくつかの実施形態では、前記１つまたは複数のフレキシブル領域変異は、フレキシブル領域中の疎水性アミノ酸残基をＧ残基で置換することを含み、そのうち、前記疎水性アミノ酸残基は、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｙ、Ｐ、ＣまたはＷ、好ましくは、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｃ、Ｙ、Ｆ及びＷから選択される。
【0129】
いくつかの実施形態では、前記フレキシブル領域変異は４３９及び／または９２６に位置する。いくつかの実施形態では、それらはＬ４３９、Ｉ９２６の１つまたは複数のアミノ酸である。そのうち、前記アミノ酸位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示される対応するアミノ酸位置によって定義される。
【0130】
いくつかの実施形態では、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼ（例えば、（１）～（５）セクションのいずれか１つまたは複数の変異を含むエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼ）は９２６Ｇ及び／または４３９（Ｌ＋Ｇ）変異を含む。いくつかの実施形態では、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼは、Ｉ９２６Ｇ、Ｌ４３９（Ｌ＋Ｇ）及びＬ４３９（Ｌ＋ＧＧ）の１つまたは複数のフレキシブル領域変異を含む。いくつかの実施形態では、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼはＩ９２６Ｇ突然変異を含む。いくつかの実施形態では、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼはＬ４３９（Ｌ＋Ｇ）変異を含む。いくつかの実施形態では、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼはＬ４３９（Ｌ＋ＧＧ）変異を含む。そのうち、前記アミノ酸残基番号はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に基づく。
【0131】
本明細書の文脈において、Ｌ４３９（Ｌ＋Ｇ）の意味は、引用されたアミノ酸配列（例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）において、４３９番目のアミノ酸の後にひとつのグリシン（Ｇ）を挿入し、元の４３９位のＬ配列は変わらないことで、本出願の文脈及び図面において、４３９Ｇと表記されることもある。Ｌ４３９（Ｌ＋ＧＧ）の意味は、引用されたアミノ酸配列の中で、４３９番目のアミノ酸の後に２つのグリシン（ＧＧ）を挿入し、元の４３９番目のＬ配列は変わらないことで、本出願の文脈及び図面においては、４３９ＧＧと表記されることもある。
【0132】
いくつかの実施形態では、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼ（例えば、（１）～（５）セクションのいずれか１つまたは複数の変異を含むエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼ）は９２６、４３９、９２５＋９２６、３６２＋９２５＋９２６、４３９＋９２６、３２３＋３６２＋９２６（例えば、Ｉ９２６、Ｌ４３９、Ｎ９２５＋Ｉ９２６、Ｄ３６２＋Ｎ９２５＋Ｉ９２６、Ｌ４３９＋Ｉ９２６、Ｅ３２３＋Ｄ３６２＋Ｉ９２６）のアミノ酸残基の位置のいずれかの変異または変異の組み合わせを含み；そのうち、アミノ酸位置番号は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示される対応するアミノ酸位置によって定義される。いくつかの実施形態では、前記アミノ酸位置３２３、３６２、９２５または９２６に位置する変異は、前記位置のアミノ酸残基をＲ、ＨまたはＫ（例えばＲ）に置換する変異であり、そのうち、アミノ酸位置番号は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示される対応するアミノ酸位置によって定義される。いくつかの実施形態では、前記アミノ酸位置４３９または９２６に位置する変異は、前記位置のアミノ酸残基をＧに置換するか、または前記アミノ酸残基の後にＧまたはＧＧを挿入する変異である、そのうち、アミノ酸位置の番号は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示される対応するアミノ酸位置によって定義される。
【0133】
いくつかの実施形態では、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼ（例えば、（１）～（５）セクションのいずれか１つまたは複数の変異を含むエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼ）は、９２６Ｇ、４３９（Ｌ＋ＧＧ）、９２５Ｒ＋９２６Ｇ、３６２Ｒ＋９２５Ｒ＋９２６Ｇ、４３９（Ｌ＋ＧＧ）＋９２６Ｒ、または３２３Ｒ＋３６２Ｒ＋９２６Ｇのいずれかに記載のアミノ酸残基またはアミノ酸残基の組み合わせの変異を含む。そのうち、アミノ酸位置番号は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示される対応するアミノ酸位置によって定義される。
【0134】
いくつかの実施形態では、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼはＩ９２６Ｇ、Ｌ４３９（Ｌ＋ＧＧ）、Ｌ４３９（Ｌ＋ＧＧ）＋Ｉ９２６Ｒ、Ｎ９２５Ｒ＋Ｉ９２６Ｇ、Ｄ３６２Ｒ＋Ｎ９２５Ｒ＋Ｉ９２６Ｇ、Ｅ３２３Ｒ＋Ｄ３６２Ｒ＋Ｉ９２６Ｇのいずれかの変異または変異の組み合わせを含み；そのうち、アミノ酸位置番号はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示す対応するアミノ酸位置に定義される。
【0135】
いくつかの実施形態では、遺伝子編集効率を改善する目的を達成するために、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼ（例えば、（１）～（５）セクションのいずれか１つまたは複数の変異を含むエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼ、及び／または前記フレキシブル領域変異を含むエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼは、少なくとも約８５％（例えば、少なくとも約８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％）の配列同一性を有するエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼを使用することもできる。
【0136】
７）組み合わせの変異
本明細書における１）～６）セクションに記載された変異及び表１～表５、表９、表１２、表１４、表１６～１８の１つまたは複数のアミノ酸置換／挿入の組合せによって得られたエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼは、いずれも本出願の請求保護範囲にある。
本明細書における１）～６）セクションに記載された変異及び表１～表５、表９、表１２、表１４、表１６～１８の１つまたは複数のアミノ酸置換／挿入の組合せによって得られたエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼは、いずれも本出願の請求保護範囲にある。
【0137】
いくつかの実施形態では、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼは１６４、１７６、２３８、３２３、３５７、３６２、３９４、４３９、４４７、５６３、７１５、７１９、８０７、８４４、８４８、８５７、８６１、９２５、９２６、９５８、１７６＋２３８＋４４７＋５６３、３２３＋３６２、１７６＋２３８＋４４７＋５６３＋１６４、１７６＋２３８＋４４７＋５６３＋９２６、１７６＋２３８＋４４７＋５６３＋３２３＋３６２、１６４＋９２６、１６４＋３２３＋３６２、１７６＋２３８＋４４７＋５６３＋１６４＋９２６、１７６＋２３８＋４４７＋５６３＋１６４＋３２３＋３６２、１７６＋２３８＋４４７＋５６３＋１６４＋９２６＋３２３＋３６２、１７６＋２３８＋４４７＋５６３＋１６４＋３２３＋３６２＋９２６＋４３９、７１９＋８４４、８５７＋８４４、３６２＋９２６、９２５＋９２６、３６２＋９２５＋９２６、４３９＋９２６、３２３＋３６２＋９２６のアミノ酸残基の位置のいずれかの変異または変異の組み合わせを含み；そのうち、アミノ酸位置番号は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示される対応するアミノ酸位置によって定義される。いくつかの実施形態では、前記アミノ酸位置１７６、２３８、３２３、３６２、４４７、５６３、９２６、または９５８に位置する変異は、前記位置のアミノ酸残基をＲ、Ｈ、またはＫ（例えばＲ）に置換する変異である。いくつかの実施形態では、前記アミノ酸位置１６４に位置する変異は、前記位置のアミノ酸残基をＹまたはＦ（例えばＹ）に置換する変異である。いくつかの実施形態では、前記アミノ酸位置４３９または９２６に位置する変異は、前記位置のアミノ酸残基をＧに置換するか、または前記アミノ酸残基の後にＧまたはＧＧを挿入する変異である。いくつかの実施形態では、前記アミノ酸位置３５７、３９４、７１５、７１９、８０７、８４４、８４８、８５７、または８６１に位置する変異は、前記位置のアミノ酸残基を疎水性アミノ酸（例えばＡ）に置換することである。そのうち、アミノ酸位置番号はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示す対応するアミノ酸位置に定義される。
【0138】
いくつかの実施形態では、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼは、Ｎ１６４、Ｅ１７６；Ｋ２３８；Ｅ３２３、Ｄ３６２、Ｔ４４７；Ｅ５６３、Ｉ９２６、Ｉ９２６、Ｄ９５８、Ｌ４３９、Ｒ８５７、Ｎ８６１、Ｋ８０７、Ｎ８４８、Ｒ７１５、Ｒ７１９、Ｋ３９４、Ｈ３５７、Ｋ８４４、Ｅ１７６＋Ｋ２３８＋Ｔ４４７＋Ｅ５６３、Ｅ３２３＋Ｄ３６２、Ｅ１７６＋Ｋ２３８＋Ｔ４４７＋Ｅ５６３＋Ｎ１６４、Ｅ１７６＋Ｋ２３８＋Ｔ４４７＋Ｅ５６３＋Ｉ９２６、Ｅ１７６＋Ｋ２３８＋Ｔ４４７＋Ｅ５６３＋Ｅ３２３＋Ｄ３６２、Ｎ１６４＋Ｉ９２６、Ｎ１６４＋Ｅ３２３＋Ｄ３６２、Ｅ１７６＋Ｋ２３８＋Ｔ４４７＋Ｅ５６３＋Ｎ１６４＋Ｉ９２６、Ｅ１７６＋Ｋ２３８＋Ｔ４４７＋Ｅ５６３＋Ｎ１６４＋Ｅ３２３＋Ｄ３６２、Ｅ１７６＋Ｋ２３８＋Ｔ４４７＋Ｅ５６３＋Ｎ１６４＋Ｉ９２６＋Ｅ３２３＋Ｄ３６２、Ｅ１７６＋Ｋ２３８＋Ｔ４４７＋Ｅ５６３＋Ｎ１６４＋Ｅ３２３＋Ｄ３６２＋Ｉ９２６、Ｅ１７６＋Ｋ２３８＋Ｔ４４７＋Ｅ５６３＋Ｎ１６４＋Ｅ３２３＋Ｄ３６２＋Ｉ９２６＋Ｌ４３９、Ｅ１７６＋Ｋ２３８＋Ｔ４４７＋Ｅ５６３＋Ｎ１６４＋Ｅ３２３＋Ｄ３６２＋Ｉ９２６＋Ｌ４３９；
Ｅ１７６＋Ｋ２３８＋Ｔ４４７＋Ｅ５６３＋Ｎ１６４＋Ｄ９５８；
Ｅ１７６＋Ｋ２３８＋Ｔ４４７＋Ｅ５６３＋Ｉ９２６＋Ｄ９５８；
Ｅ１７６＋Ｋ２３８＋Ｔ４４７＋Ｅ５６３＋Ｅ３２３＋Ｄ３６２＋Ｄ９５８；
Ｎ１６４＋Ｉ９２６＋Ｄ９５８；
Ｎ１６４＋Ｅ３２３＋Ｄ３６２＋Ｄ９５８；
Ｅ１７６＋Ｋ２３８＋Ｔ４４７＋Ｅ５６３＋Ｎ１６４＋Ｄ９５８；
Ｅ１７６＋Ｋ２３８＋Ｔ４４７＋Ｅ５６３＋Ｎ１６４＋Ｉ９２６＋Ｄ９５８；
Ｅ１７６＋Ｋ２３８＋Ｔ４４７＋Ｅ５６３＋Ｎ１６４＋Ｅ３２３＋Ｄ３６２＋Ｄ９５８；
Ｅ１７６＋Ｋ２３８＋Ｔ４４７＋Ｅ５６３＋Ｎ１６４＋Ｉ９２６＋Ｅ３２３＋Ｄ３６２＋Ｄ９５８；
Ｅ１７６＋Ｋ２３８＋Ｔ４４７＋Ｅ５６３＋Ｎ１６４＋Ｅ３２３＋Ｄ３６２＋Ｉ９２６＋Ｄ９５８；
Ｅ１７６＋Ｋ２３８＋Ｔ４４７＋Ｅ５６３＋Ｎ１６４＋Ｅ３２３＋Ｄ３６２＋Ｉ９２６＋Ｌ４３９＋Ｄ９５８；
Ｅ１７６＋Ｋ２３８＋Ｔ４４７＋Ｅ５６３＋Ｎ１６４＋Ｅ３２３＋Ｄ３６２＋Ｉ９２６＋Ｌ４３９＋Ｄ９５８；
Ｒ７１９＋Ｋ８４４；
Ｒ８５７＋Ｋ８４４；
Ｅ１７６＋Ｋ２３８＋Ｔ４４７＋Ｅ５６３＋Ｎ１６４＋Ｅ３２３＋Ｄ３６２＋Ｒ８５７；
Ｅ１７６＋Ｋ２３８＋Ｔ４４７＋Ｅ５６３＋Ｎ１６４＋Ｅ３２３＋Ｄ３６２＋Ｎ８６１；
Ｅ１７６＋Ｋ２３８＋Ｔ４４７＋Ｅ５６３＋Ｎ１６４＋Ｅ３２３＋Ｄ３６２＋Ｋ８０７；
Ｅ１７６＋Ｋ２３８＋Ｔ４４７＋Ｅ５６３＋Ｎ１６４＋Ｅ３２３＋Ｄ３６２＋Ｎ８４８；
Ｅ１７６＋Ｋ２３８＋Ｔ４４７＋Ｅ５６３＋Ｎ１６４＋Ｅ３２３＋Ｄ３６２＋Ｒ７１５；
Ｅ１７６＋Ｋ２３８＋Ｔ４４７＋Ｅ５６３＋Ｎ１６４＋Ｅ３２３＋Ｄ３６２＋Ｒ７１９；
Ｅ１７６＋Ｋ２３８＋Ｔ４４７＋Ｅ５６３＋Ｎ１６４＋Ｅ３２３＋Ｄ３６２＋Ｋ３９４；
Ｅ１７６＋Ｋ２３８＋Ｔ４４７＋Ｅ５６３＋Ｎ１６４＋Ｅ３２３＋Ｄ３６２＋Ｈ３５７；
Ｅ１７６＋Ｋ２３８＋Ｔ４４７＋Ｅ５６３＋Ｎ１６４＋Ｅ３２３＋Ｄ３６２＋Ｋ８４４；
Ｅ１７６＋Ｋ２３８＋Ｔ４４７＋Ｅ５６３＋Ｎ１６４＋Ｅ３２３＋Ｄ３６２＋Ｒ７１９＋Ｋ８４４；
Ｅ１７６＋Ｋ２３８＋Ｔ４４７＋Ｅ５６３＋Ｎ１６４＋Ｅ３２３＋Ｄ３６２＋Ｒ８５７＋Ｋ８４４；または
Ｅ１７６＋Ｋ２３８＋Ｔ４４７＋Ｅ５６３＋Ｎ１６４＋Ｅ３２３＋Ｄ３６２＋Ｋ３９４のいずれかのアミノ酸残基またはアミノ酸残基の組み合わせの変異を含み；
そのうち、アミノ酸位置番号はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示す対応するアミノ酸位置に定義される。
Ｅ１７６＋Ｋ２３８＋Ｔ４４７＋Ｅ５６３＋Ｎ１６４＋Ｄ９５８；
Ｅ１７６＋Ｋ２３８＋Ｔ４４７＋Ｅ５６３＋Ｉ９２６＋Ｄ９５８；
Ｅ１７６＋Ｋ２３８＋Ｔ４４７＋Ｅ５６３＋Ｅ３２３＋Ｄ３６２＋Ｄ９５８；
Ｎ１６４＋Ｉ９２６＋Ｄ９５８；
Ｎ１６４＋Ｅ３２３＋Ｄ３６２＋Ｄ９５８；
Ｅ１７６＋Ｋ２３８＋Ｔ４４７＋Ｅ５６３＋Ｎ１６４＋Ｄ９５８；
Ｅ１７６＋Ｋ２３８＋Ｔ４４７＋Ｅ５６３＋Ｎ１６４＋Ｉ９２６＋Ｄ９５８；
Ｅ１７６＋Ｋ２３８＋Ｔ４４７＋Ｅ５６３＋Ｎ１６４＋Ｅ３２３＋Ｄ３６２＋Ｄ９５８；
Ｅ１７６＋Ｋ２３８＋Ｔ４４７＋Ｅ５６３＋Ｎ１６４＋Ｉ９２６＋Ｅ３２３＋Ｄ３６２＋Ｄ９５８；
Ｅ１７６＋Ｋ２３８＋Ｔ４４７＋Ｅ５６３＋Ｎ１６４＋Ｅ３２３＋Ｄ３６２＋Ｉ９２６＋Ｄ９５８；
Ｅ１７６＋Ｋ２３８＋Ｔ４４７＋Ｅ５６３＋Ｎ１６４＋Ｅ３２３＋Ｄ３６２＋Ｉ９２６＋Ｌ４３９＋Ｄ９５８；
Ｅ１７６＋Ｋ２３８＋Ｔ４４７＋Ｅ５６３＋Ｎ１６４＋Ｅ３２３＋Ｄ３６２＋Ｉ９２６＋Ｌ４３９＋Ｄ９５８；
Ｒ７１９＋Ｋ８４４；
Ｒ８５７＋Ｋ８４４；
Ｅ１７６＋Ｋ２３８＋Ｔ４４７＋Ｅ５６３＋Ｎ１６４＋Ｅ３２３＋Ｄ３６２＋Ｒ８５７；
Ｅ１７６＋Ｋ２３８＋Ｔ４４７＋Ｅ５６３＋Ｎ１６４＋Ｅ３２３＋Ｄ３６２＋Ｎ８６１；
Ｅ１７６＋Ｋ２３８＋Ｔ４４７＋Ｅ５６３＋Ｎ１６４＋Ｅ３２３＋Ｄ３６２＋Ｋ８０７；
Ｅ１７６＋Ｋ２３８＋Ｔ４４７＋Ｅ５６３＋Ｎ１６４＋Ｅ３２３＋Ｄ３６２＋Ｎ８４８；
Ｅ１７６＋Ｋ２３８＋Ｔ４４７＋Ｅ５６３＋Ｎ１６４＋Ｅ３２３＋Ｄ３６２＋Ｒ７１５；
Ｅ１７６＋Ｋ２３８＋Ｔ４４７＋Ｅ５６３＋Ｎ１６４＋Ｅ３２３＋Ｄ３６２＋Ｒ７１９；
Ｅ１７６＋Ｋ２３８＋Ｔ４４７＋Ｅ５６３＋Ｎ１６４＋Ｅ３２３＋Ｄ３６２＋Ｋ３９４；
Ｅ１７６＋Ｋ２３８＋Ｔ４４７＋Ｅ５６３＋Ｎ１６４＋Ｅ３２３＋Ｄ３６２＋Ｈ３５７；
Ｅ１７６＋Ｋ２３８＋Ｔ４４７＋Ｅ５６３＋Ｎ１６４＋Ｅ３２３＋Ｄ３６２＋Ｋ８４４；
Ｅ１７６＋Ｋ２３８＋Ｔ４４７＋Ｅ５６３＋Ｎ１６４＋Ｅ３２３＋Ｄ３６２＋Ｒ７１９＋Ｋ８４４；
Ｅ１７６＋Ｋ２３８＋Ｔ４４７＋Ｅ５６３＋Ｎ１６４＋Ｅ３２３＋Ｄ３６２＋Ｒ８５７＋Ｋ８４４；または
Ｅ１７６＋Ｋ２３８＋Ｔ４４７＋Ｅ５６３＋Ｎ１６４＋Ｅ３２３＋Ｄ３６２＋Ｋ３９４のいずれかのアミノ酸残基またはアミノ酸残基の組み合わせの変異を含み；
そのうち、アミノ酸位置番号はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示す対応するアミノ酸位置に定義される。
【0139】
いくつかの実施形態では、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼは、Ｎ１６４Ｙ；Ｅ１７６Ｒ；Ｋ２３８Ｒ；Ｅ３２３Ｒ；Ｄ３６２Ｒ；Ｔ４４７Ｒ；Ｅ５６３Ｒ；Ｉ９２６Ｒ；Ｄ９５８Ｒ；Ｌ４３９（Ｌ＋Ｇ）；Ｌ４３９（Ｌ＋ＧＧ）；Ｒ８５７Ａ；Ｎ８６１Ａ；Ｋ８０７Ａ；Ｎ８４８Ａ；Ｒ７１５Ａ；Ｒ７１９Ａ；Ｋ３９４Ａ；Ｈ３５７Ａ；Ｋ８４４Ａ；Ｒ７１９Ａ＋Ｋ８４４Ａ；Ｎ１６４Ｙ＋Ｉ９２６Ｒ；Ｅ３２３Ｒ＋Ｄ３６２Ｒ；Ｒ８５７Ａ＋Ｋ８４４Ａ；Ｒ８５７Ａ＋Ｋ８４４Ａ；Ｎ１６４Ｙ＋Ｉ９２６Ｒ＋Ｄ９５８Ｒ；Ｎ１６４Ｙ＋Ｅ３２３Ｒ＋Ｄ３６２Ｒ；Ｎ１６４Ｙ＋Ｅ３２３Ｒ＋Ｄ３６２Ｒ＋Ｄ９５８Ｒ；Ｅ１７６Ｒ＋Ｋ２３８Ｒ＋Ｔ４４７Ｒ＋Ｅ５６３Ｒ；Ｅ１７６Ｒ＋Ｋ２３８Ｒ＋Ｔ４４７Ｒ＋Ｅ５６３Ｒ＋Ｎ１６４Ｙ；Ｅ１７６Ｒ＋Ｋ２３８Ｒ＋Ｔ４４７Ｒ＋Ｅ５６３Ｒ＋Ｉ９２６Ｒ；Ｅ１７６Ｒ＋Ｋ２３８Ｒ＋Ｔ４４７Ｒ＋Ｅ５６３Ｒ＋Ｅ３２３Ｒ＋Ｄ３６２Ｒ；Ｅ１７６Ｒ＋Ｋ２３８Ｒ＋Ｔ４４７Ｒ＋Ｅ５６３Ｒ＋Ｎ１６４Ｙ＋Ｉ９２６Ｒ；Ｅ１７６Ｒ＋Ｋ２３８Ｒ＋Ｔ４４７Ｒ＋Ｅ５６３Ｒ＋Ｎ１６４Ｙ＋Ｅ３２３Ｒ＋Ｄ３６２Ｒ；Ｅ１７６Ｒ＋Ｋ２３８Ｒ＋Ｔ４４７Ｒ＋Ｅ５６３Ｒ＋Ｎ１６４Ｙ＋Ｉ９２６Ｒ＋Ｅ３２３Ｒ＋Ｄ３６２Ｒ；Ｅ１７６Ｒ＋Ｋ２３８Ｒ＋Ｔ４４７Ｒ＋Ｅ５６３Ｒ＋Ｎ１６４Ｙ＋Ｅ３２３Ｒ＋Ｄ３６２Ｒ＋Ｉ９２６Ｇ；Ｅ１７６Ｒ＋Ｋ２３８Ｒ＋Ｔ４４７Ｒ＋Ｅ５６３Ｒ＋Ｎ１６４Ｙ＋Ｅ３２３Ｒ＋Ｄ３６２Ｒ＋Ｉ９２６Ｇ＋Ｌ４３９（Ｌ＋ＧＧ）；Ｅ１７６Ｒ＋Ｋ２３８Ｒ＋Ｔ４４７Ｒ＋Ｅ５６３Ｒ＋Ｎ１６４Ｙ＋Ｅ３２３Ｒ＋Ｄ３６２Ｒ＋Ｉ９２６Ｇ＋Ｌ４３９（Ｌ＋Ｇ）；Ｅ１７６Ｒ＋Ｋ２３８Ｒ＋Ｔ４４７Ｒ＋Ｅ５６３Ｒ＋Ｎ１６４Ｙ＋Ｄ９５８Ｒ；
Ｅ１７６Ｒ＋Ｋ２３８Ｒ＋Ｔ４４７Ｒ＋Ｅ５６３Ｒ＋Ｉ９２６Ｒ＋Ｄ９５８Ｒ；
Ｅ１７６Ｒ＋Ｋ２３８Ｒ＋Ｔ４４７Ｒ＋Ｅ５６３Ｒ＋Ｅ３２３Ｒ＋Ｄ３６２Ｒ＋Ｄ９５８Ｒ；Ｅ１７６Ｒ＋Ｋ２３８Ｒ＋Ｔ４４７Ｒ＋Ｅ５６３Ｒ＋Ｎ１６４Ｙ＋Ｄ９５８Ｒ；Ｅ１７６Ｒ＋Ｋ２３８Ｒ＋Ｔ４４７Ｒ＋Ｅ５６３Ｒ＋Ｎ１６４Ｙ＋Ｉ９２６Ｒ＋Ｄ９５８Ｒ；
Ｅ１７６Ｒ＋Ｋ２３８Ｒ＋Ｔ４４７Ｒ＋Ｅ５６３Ｒ＋Ｎ１６４Ｙ＋Ｅ３２３Ｒ＋Ｄ３６２Ｒ＋Ｄ９５８Ｒ；
Ｅ１７６Ｒ＋Ｋ２３８Ｒ＋Ｔ４４７Ｒ＋Ｅ５６３Ｒ＋Ｎ１６４Ｙ＋Ｉ９２６Ｒ＋Ｅ３２３Ｒ＋Ｄ３６２Ｒ＋Ｄ９５８Ｒ；
Ｅ１７６Ｒ＋Ｋ２３８Ｒ＋Ｔ４４７Ｒ＋Ｅ５６３Ｒ＋Ｎ１６４Ｙ＋Ｅ３２３Ｒ＋Ｄ３６２Ｒ＋Ｉ９２６Ｇ＋Ｄ９５８Ｒ；
Ｅ１７６Ｒ＋Ｋ２３８Ｒ＋Ｔ４４７Ｒ＋Ｅ５６３Ｒ＋Ｎ１６４Ｙ＋Ｅ３２３Ｒ＋Ｄ３６２Ｒ＋Ｉ９２６Ｇ＋Ｌ４３９（Ｌ＋ＧＧ）＋Ｄ９５８Ｒ；Ｅ１７６Ｒ＋Ｋ２３８Ｒ＋Ｔ４４７Ｒ＋Ｅ５６３Ｒ＋Ｎ１６４Ｙ＋Ｅ３２３Ｒ＋Ｄ３６２Ｒ＋Ｉ９２６Ｇ＋Ｌ４３９（Ｌ＋Ｇ）＋Ｄ９５８Ｒ；Ｅ１７６Ｒ＋Ｋ２３８Ｒ＋Ｔ４４７Ｒ＋Ｅ５６３Ｒ＋Ｎ１６４Ｙ＋Ｅ３２３Ｒ＋Ｄ３６２Ｒ＋Ｒ８５７Ａ；
Ｅ１７６Ｒ＋Ｋ２３８Ｒ＋Ｔ４４７Ｒ＋Ｅ５６３Ｒ＋Ｎ１６４Ｙ＋Ｅ３２３Ｒ＋Ｄ３６２Ｒ＋Ｎ８６１Ａ；
Ｅ１７６Ｒ＋Ｋ２３８Ｒ＋Ｔ４４７Ｒ＋Ｅ５６３Ｒ＋Ｎ１６４Ｙ＋Ｅ３２３Ｒ＋Ｄ３６２Ｒ＋Ｋ８０７Ａ；
Ｅ１７６Ｒ＋Ｋ２３８Ｒ＋Ｔ４４７Ｒ＋Ｅ５６３Ｒ＋Ｎ１６４Ｙ＋Ｅ３２３Ｒ＋Ｄ３６２Ｒ＋Ｎ８４８Ａ；Ｅ１７６Ｒ＋Ｋ２３８Ｒ＋Ｔ４４７Ｒ＋Ｅ５６３Ｒ＋Ｎ１６４Ｙ＋Ｅ３２３Ｒ＋Ｄ３６２Ｒ＋Ｒ７１５Ａ；Ｅ１７６Ｒ＋Ｋ２３８Ｒ＋Ｔ４４７Ｒ＋Ｅ５６３Ｒ＋Ｎ１６４Ｙ＋Ｅ３２３Ｒ＋Ｄ３６２Ｒ＋Ｒ７１９Ａ；Ｅ１７６Ｒ＋Ｋ２３８Ｒ＋Ｔ４４７Ｒ＋Ｅ５６３Ｒ＋Ｎ１６４Ｙ＋Ｅ３２３Ｒ＋Ｄ３６２Ｒ＋Ｋ３９４Ａ；Ｅ１７６Ｒ＋Ｋ２３８Ｒ＋Ｔ４４７Ｒ＋Ｅ５６３Ｒ＋Ｎ１６４Ｙ＋Ｅ３２３Ｒ＋Ｄ３６２Ｒ＋Ｈ３５７Ａ；Ｅ１７６Ｒ＋Ｋ２３８Ｒ＋Ｔ４４７Ｒ＋Ｅ５６３Ｒ＋Ｎ１６４Ｙ＋Ｅ３２３Ｒ＋Ｄ３６２Ｒ＋Ｋ８４４Ａ；Ｅ１７６Ｒ＋Ｋ２３８Ｒ＋Ｔ４４７Ｒ＋Ｅ５６３Ｒ＋Ｎ１６４Ｙ＋Ｅ３２３Ｒ＋Ｄ３６２Ｒ＋Ｒ７１９Ａ＋Ｋ８４４Ａ；Ｅ１７６Ｒ＋Ｋ２３８Ｒ＋Ｔ４４７Ｒ＋Ｅ５６３Ｒ＋Ｎ１６４Ｙ＋Ｅ３２３Ｒ＋Ｄ３６２Ｒ＋Ｒ８５７Ａ＋Ｋ８４４Ａ；または
Ｅ１７６Ｒ＋Ｋ２３８Ｒ＋Ｔ４４７Ｒ＋Ｅ５６３Ｒ＋Ｎ１６４Ｙ＋Ｅ３２３Ｒ＋Ｄ３６２Ｒ＋Ｋ３９４Ａのいずれかの変異または変異の組み合わせを含み；
そのうち、アミノ酸位置番号はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示す対応するアミノ酸位置に定義される。
Ｅ１７６Ｒ＋Ｋ２３８Ｒ＋Ｔ４４７Ｒ＋Ｅ５６３Ｒ＋Ｉ９２６Ｒ＋Ｄ９５８Ｒ；
Ｅ１７６Ｒ＋Ｋ２３８Ｒ＋Ｔ４４７Ｒ＋Ｅ５６３Ｒ＋Ｅ３２３Ｒ＋Ｄ３６２Ｒ＋Ｄ９５８Ｒ；Ｅ１７６Ｒ＋Ｋ２３８Ｒ＋Ｔ４４７Ｒ＋Ｅ５６３Ｒ＋Ｎ１６４Ｙ＋Ｄ９５８Ｒ；Ｅ１７６Ｒ＋Ｋ２３８Ｒ＋Ｔ４４７Ｒ＋Ｅ５６３Ｒ＋Ｎ１６４Ｙ＋Ｉ９２６Ｒ＋Ｄ９５８Ｒ；
Ｅ１７６Ｒ＋Ｋ２３８Ｒ＋Ｔ４４７Ｒ＋Ｅ５６３Ｒ＋Ｎ１６４Ｙ＋Ｅ３２３Ｒ＋Ｄ３６２Ｒ＋Ｄ９５８Ｒ；
Ｅ１７６Ｒ＋Ｋ２３８Ｒ＋Ｔ４４７Ｒ＋Ｅ５６３Ｒ＋Ｎ１６４Ｙ＋Ｉ９２６Ｒ＋Ｅ３２３Ｒ＋Ｄ３６２Ｒ＋Ｄ９５８Ｒ；
Ｅ１７６Ｒ＋Ｋ２３８Ｒ＋Ｔ４４７Ｒ＋Ｅ５６３Ｒ＋Ｎ１６４Ｙ＋Ｅ３２３Ｒ＋Ｄ３６２Ｒ＋Ｉ９２６Ｇ＋Ｄ９５８Ｒ；
Ｅ１７６Ｒ＋Ｋ２３８Ｒ＋Ｔ４４７Ｒ＋Ｅ５６３Ｒ＋Ｎ１６４Ｙ＋Ｅ３２３Ｒ＋Ｄ３６２Ｒ＋Ｉ９２６Ｇ＋Ｌ４３９（Ｌ＋ＧＧ）＋Ｄ９５８Ｒ；Ｅ１７６Ｒ＋Ｋ２３８Ｒ＋Ｔ４４７Ｒ＋Ｅ５６３Ｒ＋Ｎ１６４Ｙ＋Ｅ３２３Ｒ＋Ｄ３６２Ｒ＋Ｉ９２６Ｇ＋Ｌ４３９（Ｌ＋Ｇ）＋Ｄ９５８Ｒ；Ｅ１７６Ｒ＋Ｋ２３８Ｒ＋Ｔ４４７Ｒ＋Ｅ５６３Ｒ＋Ｎ１６４Ｙ＋Ｅ３２３Ｒ＋Ｄ３６２Ｒ＋Ｒ８５７Ａ；
Ｅ１７６Ｒ＋Ｋ２３８Ｒ＋Ｔ４４７Ｒ＋Ｅ５６３Ｒ＋Ｎ１６４Ｙ＋Ｅ３２３Ｒ＋Ｄ３６２Ｒ＋Ｎ８６１Ａ；
Ｅ１７６Ｒ＋Ｋ２３８Ｒ＋Ｔ４４７Ｒ＋Ｅ５６３Ｒ＋Ｎ１６４Ｙ＋Ｅ３２３Ｒ＋Ｄ３６２Ｒ＋Ｋ８０７Ａ；
Ｅ１７６Ｒ＋Ｋ２３８Ｒ＋Ｔ４４７Ｒ＋Ｅ５６３Ｒ＋Ｎ１６４Ｙ＋Ｅ３２３Ｒ＋Ｄ３６２Ｒ＋Ｎ８４８Ａ；Ｅ１７６Ｒ＋Ｋ２３８Ｒ＋Ｔ４４７Ｒ＋Ｅ５６３Ｒ＋Ｎ１６４Ｙ＋Ｅ３２３Ｒ＋Ｄ３６２Ｒ＋Ｒ７１５Ａ；Ｅ１７６Ｒ＋Ｋ２３８Ｒ＋Ｔ４４７Ｒ＋Ｅ５６３Ｒ＋Ｎ１６４Ｙ＋Ｅ３２３Ｒ＋Ｄ３６２Ｒ＋Ｒ７１９Ａ；Ｅ１７６Ｒ＋Ｋ２３８Ｒ＋Ｔ４４７Ｒ＋Ｅ５６３Ｒ＋Ｎ１６４Ｙ＋Ｅ３２３Ｒ＋Ｄ３６２Ｒ＋Ｋ３９４Ａ；Ｅ１７６Ｒ＋Ｋ２３８Ｒ＋Ｔ４４７Ｒ＋Ｅ５６３Ｒ＋Ｎ１６４Ｙ＋Ｅ３２３Ｒ＋Ｄ３６２Ｒ＋Ｈ３５７Ａ；Ｅ１７６Ｒ＋Ｋ２３８Ｒ＋Ｔ４４７Ｒ＋Ｅ５６３Ｒ＋Ｎ１６４Ｙ＋Ｅ３２３Ｒ＋Ｄ３６２Ｒ＋Ｋ８４４Ａ；Ｅ１７６Ｒ＋Ｋ２３８Ｒ＋Ｔ４４７Ｒ＋Ｅ５６３Ｒ＋Ｎ１６４Ｙ＋Ｅ３２３Ｒ＋Ｄ３６２Ｒ＋Ｒ７１９Ａ＋Ｋ８４４Ａ；Ｅ１７６Ｒ＋Ｋ２３８Ｒ＋Ｔ４４７Ｒ＋Ｅ５６３Ｒ＋Ｎ１６４Ｙ＋Ｅ３２３Ｒ＋Ｄ３６２Ｒ＋Ｒ８５７Ａ＋Ｋ８４４Ａ；または
Ｅ１７６Ｒ＋Ｋ２３８Ｒ＋Ｔ４４７Ｒ＋Ｅ５６３Ｒ＋Ｎ１６４Ｙ＋Ｅ３２３Ｒ＋Ｄ３６２Ｒ＋Ｋ３９４Ａのいずれかの変異または変異の組み合わせを含み；
そのうち、アミノ酸位置番号はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示す対応するアミノ酸位置に定義される。
【0140】
いくつかの実施形態では、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼは、Ｅ１７６Ｒ＋Ｋ２３８Ｒ＋Ｔ４４７Ｒ＋Ｅ５６３Ｒ＋Ｎ１６４Ｙ＋Ｅ３２３Ｒ＋Ｄ３６２Ｒの変異組み合わせを含み；そのうち、アミノ酸位置番号はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示す対応するアミノ酸位置に定義される。この変異体は以下にＣａｓＸＸと命名され、その配列番号はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８である。
【0141】
いくつかの実施形態では、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼは、
Ｅ１７６Ｒ＋Ｋ２３８Ｒ＋Ｔ４４７Ｒ＋Ｅ５６３Ｒ＋Ｎ１６４Ｙ＋Ｅ３２３Ｒ＋Ｄ３６２Ｒ＋Ｒ８５７Ａ；
Ｅ１７６Ｒ＋Ｋ２３８Ｒ＋Ｔ４４７Ｒ＋Ｅ５６３Ｒ＋Ｎ１６４Ｙ＋Ｅ３２３Ｒ＋Ｄ３６２Ｒ＋Ｒ７１９Ａ；
Ｅ１７６Ｒ＋Ｋ２３８Ｒ＋Ｔ４４７Ｒ＋Ｅ５６３Ｒ＋Ｎ１６４Ｙ＋Ｅ３２３Ｒ＋Ｄ３６２Ｒ＋Ｋ３９４Ａ；
Ｅ１７６Ｒ＋Ｋ２３８Ｒ＋Ｔ４４７Ｒ＋Ｅ５６３Ｒ＋Ｎ１６４Ｙ＋Ｅ３２３Ｒ＋Ｄ３６２Ｒ＋Ｋ８４４Ａ；
Ｅ１７６Ｒ＋Ｋ２３８Ｒ＋Ｔ４４７Ｒ＋Ｅ５６３Ｒ＋Ｎ１６４Ｙ＋Ｅ３２３Ｒ＋Ｄ３６２Ｒ＋Ｒ７１９Ａ＋Ｋ８４４Ａ；
Ｅ１７６Ｒ＋Ｋ２３８Ｒ＋Ｔ４４７Ｒ＋Ｅ５６３Ｒ＋Ｎ１６４Ｙ＋Ｅ３２３Ｒ＋Ｄ３６２Ｒ＋Ｒ８５７Ａ＋Ｋ８４４Ａのいずれかの変異の組み合わせを含み；そのうち、アミノ酸位置番号はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示す対応するアミノ酸位置に定義される。これらＣａｓ１２ｉ変異体は、ＣａｓＸＸ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）に加えて更なる最適化を行った最適化された変異体である。
Ｅ１７６Ｒ＋Ｋ２３８Ｒ＋Ｔ４４７Ｒ＋Ｅ５６３Ｒ＋Ｎ１６４Ｙ＋Ｅ３２３Ｒ＋Ｄ３６２Ｒ＋Ｒ８５７Ａ；
Ｅ１７６Ｒ＋Ｋ２３８Ｒ＋Ｔ４４７Ｒ＋Ｅ５６３Ｒ＋Ｎ１６４Ｙ＋Ｅ３２３Ｒ＋Ｄ３６２Ｒ＋Ｒ７１９Ａ；
Ｅ１７６Ｒ＋Ｋ２３８Ｒ＋Ｔ４４７Ｒ＋Ｅ５６３Ｒ＋Ｎ１６４Ｙ＋Ｅ３２３Ｒ＋Ｄ３６２Ｒ＋Ｋ３９４Ａ；
Ｅ１７６Ｒ＋Ｋ２３８Ｒ＋Ｔ４４７Ｒ＋Ｅ５６３Ｒ＋Ｎ１６４Ｙ＋Ｅ３２３Ｒ＋Ｄ３６２Ｒ＋Ｋ８４４Ａ；
Ｅ１７６Ｒ＋Ｋ２３８Ｒ＋Ｔ４４７Ｒ＋Ｅ５６３Ｒ＋Ｎ１６４Ｙ＋Ｅ３２３Ｒ＋Ｄ３６２Ｒ＋Ｒ７１９Ａ＋Ｋ８４４Ａ；
Ｅ１７６Ｒ＋Ｋ２３８Ｒ＋Ｔ４４７Ｒ＋Ｅ５６３Ｒ＋Ｎ１６４Ｙ＋Ｅ３２３Ｒ＋Ｄ３６２Ｒ＋Ｒ８５７Ａ＋Ｋ８４４Ａのいずれかの変異の組み合わせを含み；そのうち、アミノ酸位置番号はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示す対応するアミノ酸位置に定義される。これらＣａｓ１２ｉ変異体は、ＣａｓＸＸ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）に加えて更なる最適化を行った最適化された変異体である。
【0142】
いくつかの実施形態では、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼは、以下：Ｅ１７６Ｒ＋Ｋ２３８Ｒ＋Ｔ４４７Ｒ＋Ｅ５６３Ｒ＋Ｎ１６４Ｙ＋Ｅ３２３Ｒ＋Ｄ３６２Ｒ＋Ｋ３９４Ａの変異の組み合わせを含み、そのうち、アミノ酸位置番号はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示す対応するアミノ酸位置に定義される。この変異体は以下に「ＨＦ－２０」と命名され、その配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０に示される。
【0143】
いくつかの実施形態では、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼは、Ｅ１７６Ｒ、Ｋ２３８Ｒ、Ｔ４４７Ｒ、Ｅ５６３Ｒ、Ｎ１６４Ｙ、Ｅ３２３Ｒ、及びＤ３６２Ｒ変異を含む。いくつかの実施形態では、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼは、Ｅ１７６Ｒ、Ｋ２３８Ｒ、Ｔ４４７Ｒ、Ｅ５６３Ｒ、Ｎ１６４Ｙ、及びＩ９２６Ｒ変異を含む。いくつかの実施形態では、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼは、Ｅ１７６Ｒ、Ｋ２３８Ｒ、Ｔ４４７Ｒ、Ｅ５６３Ｒ、Ｅ３２３Ｒ、及びＤ３６２Ｒ変異を含む。いくつかの実施形態では、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼは、Ｅ１７６Ｒ、Ｋ２３８Ｒ、Ｔ４４７Ｒ、Ｅ５６３Ｒ、Ｎ１６４Ｙ、Ｅ３２３Ｒ、Ｄ３６２Ｒ、及びＩ９２６Ｇ変異を含む。いくつかの実施形態では、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼは、Ｅ１７６Ｒ、Ｋ２３８Ｒ、Ｔ４４７Ｒ、Ｅ５６３Ｒ、Ｎ１６４Ｙ、Ｅ３２３Ｒ、Ｄ３６２Ｒ、Ｉ９２６Ｇ、及びＬ４３９（Ｌ＋ＧＧ）変異を含む。いくつかの実施形態では、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼは、Ｅ１７６Ｒ、Ｋ２３８Ｒ、Ｔ４４７Ｒ、Ｅ５６３Ｒ、Ｎ１６４Ｙ、Ｅ３２３Ｒ、Ｄ３６２Ｒ、Ｉ９２６Ｇ、及びＬ４３９（Ｌ＋Ｇ）変異を含む。いくつかの実施形態では、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼは、Ｅ１７６Ｒ、Ｋ２３８Ｒ、Ｔ４４７Ｒ、Ｅ５６３Ｒ、Ｎ１６４Ｙ、及びＤ９５８Ｒ変異を含む。いくつかの実施形態では、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼは、Ｅ１７６Ｒ、Ｋ２３８Ｒ、Ｔ４４７Ｒ、Ｅ５６３Ｒ、Ｎ１６４Ｙ、Ｉ９２６Ｒ、及びＤ９５８Ｒ変異を含む。いくつかの実施形態では、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼは、Ｅ１７６Ｒ、Ｋ２３８Ｒ、Ｔ４４７Ｒ、Ｅ５６３Ｒ、Ｎ１６４Ｙ、Ｅ３２３Ｒ、Ｄ３６２Ｒ、及びＤ９５８Ｒ変異を含む。いくつかの実施形態では、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼは、Ｅ１７６Ｒ、Ｋ２３８Ｒ、Ｔ４４７Ｒ、Ｅ５６３Ｒ、Ｎ１６４Ｙ、Ｉ９２６Ｒ、Ｅ３２３Ｒ、Ｄ３６２Ｒ、及びＤ９５８Ｒ変異を含む。いくつかの実施形態では、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼは、Ｅ１７６Ｒ、Ｋ２３８Ｒ、Ｔ４４７Ｒ、Ｅ５６３Ｒ、Ｎ１６４Ｙ、Ｅ３２３Ｒ、Ｄ３６２Ｒ、Ｉ９２６Ｇ、及びＤ９５８Ｒ変異を含む。いくつかの実施形態では、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼは、Ｅ１７６Ｒ、Ｋ２３８Ｒ、Ｔ４４７Ｒ、Ｅ５６３Ｒ、Ｎ１６４Ｙ、Ｅ３２３Ｒ、Ｄ３６２Ｒ、Ｉ９２６Ｇ、Ｌ４３９（Ｌ＋ＧＧ）、及びＤ９５８Ｒ変異を含む。いくつかの実施形態では、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼは、Ｅ１７６Ｒ、Ｋ２３８Ｒ、Ｔ４４７Ｒ、Ｅ５６３Ｒ、Ｎ１６４Ｙ、Ｅ３２３Ｒ、Ｄ３６２Ｒ、及びＫ８４４Ａ変異を含む。いくつかの実施形態では、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼは、Ｅ１７６Ｒ、Ｋ２３８Ｒ、Ｔ４４７Ｒ、Ｅ５６３Ｒ、Ｎ１６４Ｙ、Ｅ３２３Ｒ、Ｄ３６２Ｒ、Ｒ８１９ａ及びＫ８４４Ａ変異を含む。いくつかの実施形態では、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼは、Ｅ１７６Ｒ、Ｋ２３８Ｒ、Ｔ４４７Ｒ、Ｅ５６３Ｒ、Ｎ１６４Ｙ、Ｅ３２３Ｒ、Ｄ３６２Ｒ、Ｒ８５７Ａ及びＫ８４４Ａ変異を含む。そのうち、前記アミノ酸位置番号は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示す対応するアミノ酸位置に定義される。
【0144】
いくつかの実施形態では、遺伝子編集効率を改善する目的を達成するために、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼと少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％）の配列同一性を有するエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼを使用することもできる。
【0145】
いくつかの実施形態では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ：２～２４に示されるいずれかのアミノ酸配列、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ：２～２４に示されるいずれかのアミノ酸配列と少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼを提供する。
【0146】
参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼ
いくつかの実施形態では、前記参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼはＣａｓ１２ｉ１、Ｃａｓ１２ｉ２、またはそのオーソログである。いくつかの実施形態では、前記参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼは天然Ｃａｓ１２ｉ１、またはそのバリアント（例えば自然に存在するバリアント）である。いくつかの実施形態では、前記参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼは、天然Ｃａｓ１２ｉ２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるように）、またはそのバリアント（たとえば自然に存在するバリアント）である。いくつかの実施形態では、前記参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼは、工程的に改造されたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼ（本発明に記載の（１）～（５）セクションのいずれか１つまたは複数の変異を含むエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼ）である。いくつかの実施形態では、前記参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼはＣａｓＸＸ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）である。
いくつかの実施形態では、前記参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼはＣａｓ１２ｉ１、Ｃａｓ１２ｉ２、またはそのオーソログである。いくつかの実施形態では、前記参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼは天然Ｃａｓ１２ｉ１、またはそのバリアント（例えば自然に存在するバリアント）である。いくつかの実施形態では、前記参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼは、天然Ｃａｓ１２ｉ２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるように）、またはそのバリアント（たとえば自然に存在するバリアント）である。いくつかの実施形態では、前記参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼは、工程的に改造されたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼ（本発明に記載の（１）～（５）セクションのいずれか１つまたは複数の変異を含むエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼ）である。いくつかの実施形態では、前記参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼはＣａｓＸＸ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）である。
【0147】
Ｖ－Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１２ｉは、ＲＮＡガイド型ＤＮＡエンドヌクレアーゼシステムと同定されている。Ｃａｓ１２ｂやＣａｓ９のようなＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムとは異なり、Ｃａｓ１２ｉベースのＣＲＩＳＰＲシステムにはｔｒａｃＲＮＡ配列は必要がない。いくつかの実施形態では、前記ＲＮＡガイド配列はｃｒＲＮＡを含む。一般に、本明細書に記載のｃｒＲＮＡは、直接リピート配列及びスペーサー配列を含む。ある実施形態では、前記ｃｒＲＮＡは、ガイド配列またはスペーサー配列に連結された直接リピート配列を含み、基本的には直接リピート配列からなり、または直接リピート配列で構成される。いくつかの実施形態では、前記ｃｒＲＮＡは、他のＣＲＩＳＰＲシステムにおける前駆体ｃｒＲＮＡ（ｐｒｅ－ｃｒＲＮＡ）構造の典型的な特徴である直接リピート配列、スペーサー配列、及び直接リピート配列（ＤＲ－スペーサー－ＤＲ）を含む。いくつかの実施形態では、前記ｃｒＲＮＡは、加工されたまたは成熟したｃｒＲＮＡの典型的な特徴であるトランケートされた直接リピート配列及びスペーサー配列を含む。いくつかの実施形態では、前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１２ｉエフェクタータンパク質はＲＮＡガイド配列と複合体を形成し、前記スペーサー配列は、少なくとも７０％相補的なスペーサー配列と相補的な（例えば、少なくとも７０％相補的）標的核酸との配列特異的結合に複合体を導く。
【0148】
いくつかの実施形態では、本出願のエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉは、ターゲット配列の特定の部位に結合し、ガイドＲＮＡの指導の下で切断され、ＤＮＡ及びＲＮＡエンドヌクレアーゼ活性を有するヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、前記Ｃａｓ１２ｉは前駆体ｃｒＲＮＡアレイを加工することによって自律的なｃｒＲＮＡ生物発生を行うことができる。自律的前駆体ｃｒＲＮＡ処理は、単一ｃｒＲＮＡ転写物から２つの別個のゲノム部位に標的化できるので、Ｃａｓ１２ｉの送達を促進し、それによってダブルニックの適用を実現することができる。次に、Ｃａｓ１２ｉタンパク質はＣＲＩＳＰＲアレイを２つの相同性のｃｒＲＮＡに加工し、それによって対になったニック複合体を形成する。Ｖ－Ｉ型（Ｃａｓ１２ｉ）エフェクタータンパク質の多重化（Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｉｎｇ）は、前記エフェクタータンパク質の前駆体ｃｒＲＮＡ処理能力を用いて行われ、そのうちは、異なる配列を有する複数の標的に対して単一のＲＮＡガイド配列上でプログラムすることができる。これにより、複数の遺伝子またはＤＮＡターゲットを同時に操作して治療用途に使用することができる。いくつかの実施形態では、前記ガイドＲＮＡは、未加工のＤＲ配列と交錯するターゲット配列で構成されるＣＲＩＳＰＲ配列によって発現される前駆体ｃｒＲＮＡを含み、前記エフェクタータンパク質の内因性前駆体ｃｒＲＮＡ加工によって１つ、２つまたはそれ以上の部位を同時に標的にすることができるように繰り返している。
【0149】
複数の生物由来のＣａｓ１２ｉヌクレアーゼは、本出願のエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼ及びエフェクタータンパク質を提供するための参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼとして使用することができる。例示的なＣａｓ１２ｉヌクレアーゼは、全体的な参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１９／２０１３３１ａ１及びＵＳ２０２０／００６３１２６Ａ１に記載されている。いくつかの実施形態では、前記参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼは酵素活性を有する。いくつかの実施形態では、前記参照Ｃａｓ１２ｉは、ヌクレアーゼ、すなわちターゲットの二重らせん核酸（例えば、二重らせんＤＮＡ）の２本の鎖を切断する。いくつかの実施形態では、前記参照Ｃａｓ１２ｉは、ターゲットの二重らせん核酸（例えば、二重らせんＤＮＡ）の一本鎖を切断するニッケーゼである。いくつかの実施形態では、前記参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼは酵素不活性化されたものである。いくつかの実施形態では、前記参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼはＣａｓ１２ｉ１、Ｃａｓ１２ｉ２、またはＣａｓ１２ｉ－Ｐｈｉである。いくつかの実施形態では、前記参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼはＳＥＱＩＤ ＮＯ：１の配列を含む。Ｃａｓ１２ｉ（例えば、Ｃａｓ１２ｉ２）またはその機能性誘導体と配列同一性（例えば、少なくとも約６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上のいずれか）を有するオーソログは、本出願のエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼまたはエフェクタータンパク質を設計するための基礎として使用することができる。
【0150】
エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼの機能的バリアント
いくつかの実施形態では、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼは、天然に存在するＣａｓ１２ｉヌクレアーゼに基づく機能的バリアント（または機能的誘導体）である。いくつかの実施形態では、機能バリアント（または機能誘導体）のアミノ酸配列は、上記（１）～（７）のいずれか１つまたは複数の変異を含むエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼのような、対応するエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼのアミノ酸配列と比較して、少なくとも１つのアミノ酸残基の違い（例えば、欠失、挿入、置換、及び／または融合）を有する。いくつかの実施形態では、機能性バリアントは、アミノ酸置換、挿入、及び欠失などの１つまたは複数の変異を有する。例えば、前記機能バリアントは、野生型天然に存在するＣａｓ１２ｉヌクレアーゼと比較し、または前述のエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼと比較し、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上のアミノ酸のいずれか１つの置換を含むことができる。いくつかの実施形態では、バリアント１つまたは複数の置換は保存的置換である。いくつかの実施形態では、前記機能性バリアントは天然に存在するＣａｓ１２ｉヌクレアーゼの全ドメインを有する。いくつかの実施形態では、前記機能性バリアントは天然に存在するＣａｓ１２ｉヌクレアーゼの１つまたは複数のドメインを有しない。いくつかの実施形態では、前記機能性バリアントは、エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼのすべてのドメインを有する。いくつかの実施形態では、前記機能性バリアントは、エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼの１つまたは複数のドメインを有しない。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼの機能的バリアントの生物学的活性は、天然ヌクレアーゼから酵素不活性変異体への変換など、そのアミノ酸の変化によって変化する。
いくつかの実施形態では、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼは、天然に存在するＣａｓ１２ｉヌクレアーゼに基づく機能的バリアント（または機能的誘導体）である。いくつかの実施形態では、機能バリアント（または機能誘導体）のアミノ酸配列は、上記（１）～（７）のいずれか１つまたは複数の変異を含むエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼのような、対応するエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼのアミノ酸配列と比較して、少なくとも１つのアミノ酸残基の違い（例えば、欠失、挿入、置換、及び／または融合）を有する。いくつかの実施形態では、機能性バリアントは、アミノ酸置換、挿入、及び欠失などの１つまたは複数の変異を有する。例えば、前記機能バリアントは、野生型天然に存在するＣａｓ１２ｉヌクレアーゼと比較し、または前述のエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼと比較し、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上のアミノ酸のいずれか１つの置換を含むことができる。いくつかの実施形態では、バリアント１つまたは複数の置換は保存的置換である。いくつかの実施形態では、前記機能性バリアントは天然に存在するＣａｓ１２ｉヌクレアーゼの全ドメインを有する。いくつかの実施形態では、前記機能性バリアントは天然に存在するＣａｓ１２ｉヌクレアーゼの１つまたは複数のドメインを有しない。いくつかの実施形態では、前記機能性バリアントは、エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼのすべてのドメインを有する。いくつかの実施形態では、前記機能性バリアントは、エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼの１つまたは複数のドメインを有しない。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼの機能的バリアントの生物学的活性は、天然ヌクレアーゼから酵素不活性変異体への変換など、そのアミノ酸の変化によって変化する。
【0151】
本明細書に記載のＣａｓ１２ｉバリアントタンパク質（例えば、ニッカーゼＣａｓ１２ｉタンパク質、不活性化または触媒不活性化Ｃａｓ１２ｉ（ｄＣａｓ１２ｉ））のいずれかについて、前記Ｃａｓ１２ｉバリアントは、上述の同じパラメータ（例えば、存在するドメイン、同一性パーセントなど）を有するＣａｓ１２ｉタンパク質配列を含むことができる。
【0152】
いくつかの実施形態では、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼの機能的バリアントは、ＤＮＡ二本鎖または一本鎖切断活性のような酵素活性、または少なくとも参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼ（またはその親エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼ）の少なくとも約６０％（例えば、少なくとも約６５％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のいずれか）の酵素活性を有する。いくつかの実施形態では、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼの機能的変異体の酵素活性は、その親エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼの少なくとも１．１倍（例えば、少なくとも１．２倍、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍またはそれ以上）の酵素活性である。
【0153】
いくつかの実施形態では、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼの機能的バリアントは、エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼの非機能的バリアントの変異形態とは異なる触媒活性を有する。いくつかの実施形態では、前記機能性バリアント変異（例えば、アミノ酸置換、挿入、及び／または欠失）は、Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼの触媒ドメイン（例えば、ＲｕｖＣドメイン）中にある。いくつかの実施形態では、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼの機能的バリアントは、１つまたは複数の触媒ドメイン中の変異を含む。二本鎖標的核酸の一本鎖を切断して他の鎖を切断しないＣａｓ１２ｉヌクレアーゼは、本明細書で「ニッカーゼ」（例えば「Ｃａｓ１２ｉニッカーゼ」）と呼ばれる。本明細書では、基本的にヌクレアーゼ活性を有さないＣａｓ１２ｉヌクレアーゼを失活Ｃａｓ１２ｉタンパク質（「ｄＣａｓ１２ｉ」）と呼ぶ（それと融合した異種ポリペプチド（融合パートナー）はヌクレアーゼ活性を提供することができ、詳細には下記の「工学的Ｃａｓ１２ｉエフェクタータンパク質」の章を参照）。いくつかの実施形態において、Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼ機能変異体は、その非機能バリアントの変異形態に対して、機能バリアント変異酵素のＤＮＡ切断活性が約２５％、１０％、５％、１％、０．１％、０．０１％またはより低い場合、このＣａｓ１２ｉヌクレアーゼ機能バリアントは基本的にすべてのＤＮＡ切断活性を欠いていると考えられている。
【0154】
Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼ活性部位における１つまたは複数のアミノ酸残基の変異によって酵素活性が低下させまたは失われたＣａｓ１２ｉ（ｄＣａｓ１２ｉ）は、本発明では「ヌクレアーゼ活性欠失Ｃａｓ１２ｉ」または「酵素不活性変異体」とも呼ばれる。いくつかの実施形態では、本明細書で提供するエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼは、減少または欠失させたヌクレアーゼ活性を有するように修飾することができ、例えば、ヌクレアーゼ活性が欠失したＣａｓ１２ｉは、野生型Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼ（またはその親エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼ）と比較し、ヌクレアーゼ活性（例えば、ＤＮＡ二本鎖または一本鎖切断活性）は、少なくとも約５０％（例えば、少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のいずれか）を低下する。前記Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼ活性は、変異を、ＰＡＭと相互作用するドメイン、ＤＮＡ二本鎖の開放に関与するドメイン、ＲｕｖＣドメイン、核酸（ＤＮＡ／ＲＮＡ）と相互作用するエリアなど、前記Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼの１つまたは複数のドメインに導入することなど、いくつかの方法によって低下させることができる。いくつかの実施形態では、前記Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼ活性の触媒残基（例えば、任意の汎用の同定方法によって同定された触媒残基）は、異なるアミノ酸残基（例えば、グリシンまたはアラニン）に置き換えられて前記ヌクレアーゼ活性を低下させることができる。Ｃａｓ１２ｉ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３に示すなど）のような変異の例としては、Ｄ６４７Ａ、Ｅ８９４Ａ、及び／またはＤ９４８Ａが挙げられる。Ｃａｓ１２ｉ２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すなど）のような変異の例としては、Ｄ５９９ａ、Ｅ８３３Ａ、Ｓ８８３Ａ、Ｈ８８４Ａ、Ｄ８８６Ａ、Ｒ９００ａ、及び／またはＤ１０１９ａが挙げられる。いくつかの実施形態では、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼまたはその機能誘導体（例えば、上記（１）～（７）のいずれか１つまたは複数の変異を含むエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼ）はＤ５９９ａ、Ｅ８３３Ａ、Ｓ８８３Ａ、Ｈ８８４Ａ、Ｒ９００ａ、及びＤ１０１９ａの１つまたは複数のヌクレアーゼ活性欠失変異を含み；そのうち、前記アミノ酸位置はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示す対応するアミノ酸位置に定義される。
【0155】
エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼまたはその機能バリアントの特性
いくつかの実施形態では、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼ（またはその機能バリアント）は、前記参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼと比較して増加した活性を有する。いくつかの実施形態では、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼ（またはその機能バリアント）は、前記参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼと比較して低下した活性を有する。いくつかの実施形態では、前記活性は標的ＤＮＡ結合活性である。いくつかの実施形態では、前記活性は部位特異的ヌクレアーゼ活性である。いくつかの実施形態では、前記活性はＤＮＡ二本鎖を開く活性である。いくつかの実施形態では、前記活性は二本鎖ＤＮＡ切断活性である。いくつかの実施形態では、前記活性は一本鎖ＤＮＡ切断活性であり、例えば部位特異的ＤＮＡ切断活性または非特異的ＤＮＡ切断活性を含む。いくつかの実施形態では、前記活性は一本鎖ＲＮＡ切断活性、例えば部位特異的ＲＮＡ切断活性または非特異的ＲＮＡ切断活性である。いくつかの実施形態では、前記活性はインビトロで測定される。いくつかの実施形態では、前記活性は、細菌細胞、植物細胞、または真核細胞などの細胞中で測定される。いくつかの実施形態では、前記活性はげっ歯類細胞またはヒト細胞などの哺乳動物細胞中で測定される。いくつかの実施形態では、前記活性は２９３Ｔ細胞などのヒト細胞で測定される。いくつかの実施形態では、前記活性はマウス細胞、例えばＨｅｐａ１～６細胞で測定される。いくつかの実施形態では、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼ（またはその機能バリアント）は、参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼに比べて少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、８０％、９０％、９５％、１倍、１．１倍、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍またはそれ以上増加させるいずれかの活性（上記のような１つまたは複数の活性、例えば部位特異的ヌクレアーゼ活性）を有する。いくつかの実施形態では、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼ（またはその機能バリアント）は、参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼと比較して少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、８０％、９０％、９５％、１倍、１．１倍、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍またはそれ以上低下させるいずれかの活性（上記のような１つまたは複数の活性、例えば部位特異的ヌクレアーゼ活性）を有する。前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼ（またはその機能バリアント）の部位特異的ヌクレアーゼ活性は、例えば、本明細書で提供される実施形態に記載のアガロースゲル電気泳動に基づくインビトロ切断アッセイを含むゲルシフトアッセイなど、当技術分野で公知の方法を用いて測定することができる。
いくつかの実施形態では、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼ（またはその機能バリアント）は、前記参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼと比較して増加した活性を有する。いくつかの実施形態では、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼ（またはその機能バリアント）は、前記参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼと比較して低下した活性を有する。いくつかの実施形態では、前記活性は標的ＤＮＡ結合活性である。いくつかの実施形態では、前記活性は部位特異的ヌクレアーゼ活性である。いくつかの実施形態では、前記活性はＤＮＡ二本鎖を開く活性である。いくつかの実施形態では、前記活性は二本鎖ＤＮＡ切断活性である。いくつかの実施形態では、前記活性は一本鎖ＤＮＡ切断活性であり、例えば部位特異的ＤＮＡ切断活性または非特異的ＤＮＡ切断活性を含む。いくつかの実施形態では、前記活性は一本鎖ＲＮＡ切断活性、例えば部位特異的ＲＮＡ切断活性または非特異的ＲＮＡ切断活性である。いくつかの実施形態では、前記活性はインビトロで測定される。いくつかの実施形態では、前記活性は、細菌細胞、植物細胞、または真核細胞などの細胞中で測定される。いくつかの実施形態では、前記活性はげっ歯類細胞またはヒト細胞などの哺乳動物細胞中で測定される。いくつかの実施形態では、前記活性は２９３Ｔ細胞などのヒト細胞で測定される。いくつかの実施形態では、前記活性はマウス細胞、例えばＨｅｐａ１～６細胞で測定される。いくつかの実施形態では、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼ（またはその機能バリアント）は、参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼに比べて少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、８０％、９０％、９５％、１倍、１．１倍、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍またはそれ以上増加させるいずれかの活性（上記のような１つまたは複数の活性、例えば部位特異的ヌクレアーゼ活性）を有する。いくつかの実施形態では、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼ（またはその機能バリアント）は、参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼと比較して少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、８０％、９０％、９５％、１倍、１．１倍、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍またはそれ以上低下させるいずれかの活性（上記のような１つまたは複数の活性、例えば部位特異的ヌクレアーゼ活性）を有する。前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼ（またはその機能バリアント）の部位特異的ヌクレアーゼ活性は、例えば、本明細書で提供される実施形態に記載のアガロースゲル電気泳動に基づくインビトロ切断アッセイを含むゲルシフトアッセイなど、当技術分野で公知の方法を用いて測定することができる。
【0156】
いくつかの実施形態では、前記活性は細胞中の遺伝子編集活性である。いくつかの実施形態では、前記細胞は細菌細胞、植物細胞、または真核細胞である。いくつかの実施形態では、前記細胞はげっ歯類細胞またはヒト細胞などの哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態では、前記細胞は２９３Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、前記活性は、例えばＨｅｐａ１～６細胞などのマウス細胞で測定される。いくつかの実施形態では、前記活性は、細胞中の標的ゲノム部位の挿入欠失形成活性であり、例えば、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼ（またはその機能バリアント）による標的核酸の部位特異的切断、及び非相同末端結合（ＮＨＥＪ）メカニズムによるＤＮＡ修復である。いくつかの実施形態では、前記活性は、細胞中の標的ゲノム部位に外因性核酸配列を挿入する活性であり、例えば、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼ（またはその機能バリアント）により標的核酸の部位特異的切断、及び相同組換え（ＨＲ、修復テンプレートをさらに導入することによる）メカニズムによるＤＮＡ修復である。いくつかの実施形態では、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼ（またはその機能バリアント）は、参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼと比べて、細胞（例えば、２９３Ｔ細胞のようなヒト細胞、またはマウスＨｅｐａ１－６細胞）の標的ゲノム部位において、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、１倍、１．１倍、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍またはそれ以上のいずれかの遺伝子編集（例えば、切断、挿入欠失形成、または修復）活性を増加させる。いくつかの実施形態では、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼ（またはその機能バリアント）は、参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼと比べて、２９３Ｔ細胞のようなヒト細胞またはマウスＨｅｐａ１－６細胞の複数（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上）の標的ゲノム部位において、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、１倍、１．１倍、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍またはそれ以上のいずれかの遺伝子編集（例えば、切断、挿入欠失形成、または修復）活性を増加させる。いくつかの実施形態では、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼ（またはその機能バリアント）は、参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼと比べて、より多くの数（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０またはそれ以上）のゲノム部位を編集することができ、例えば、より多く（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０またはそれ以上）のＰＡＭ配列を識別することができる。いくつかの実施形態では、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼ（またはその機能バリアント）の共有ＰＡＭ配列は、前記参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼと同じである。
【0157】
インビトロまたは細胞中でエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼ（またはその機能バリアント）の遺伝子編集効率は、例えばＴ７エンドヌクレアーゼ１（Ｔ７Ｅ１）アッセイ、標的ＤＮＡの配列決定（例えば、Ｓａｎｇｅｒ配列、及び二世代シーケンスを含む）、分解によるインデルの追跡（ＴＩＤＥ）アッセイ、またはアンプリコン解析によるインデル検出（ＩＤＡＡ）アッセイを含む、当技術分野で知られている方法を用いて決定することができる。例えば、Ｓｅｎｔｍａｎａｔ ＭＦ ｅｔａｌ．，“Ａ ｓｕｒｖｅｙ ｏｆ ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ｅｄｉｔｉｎｇ，”Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ，２０１８，８，記事番号８８８を参照し、これは全体的な参照により本明細書に組み込まれている。いくつかの実施形態では、例えば、本明細書の実施形態で説明されるように、標的化された二世代シーケンス（ＮＧＳ）を用い、細胞中で前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼの遺伝子編集効率を測定する。前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼ（またはその機能バリアント）の遺伝子編集効率を決定するのに有用な例示的なゲノム部位としては、ＣＣＲ５、ＡＡＶＳ、ＣＤ３４、ＲＮＦ２、及びＥＭＸ１が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼ（またはその機能バリアント）の遺伝子編集効率は、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼの少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５またはそれ以上の部位（例えばヒト細胞ゲノム部位）における平均遺伝子編集効率である。いくつかの実施形態では、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼ（またはその機能バリアント）の遺伝子編集効率（例えば、挿入欠失率）は、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％またはそれ以上に達する。
【0158】
いくつかの実施形態では、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼ（またはその機能的バリアント）は、前記参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼと比較して増加した標的特異性、減少したオフターゲット率（例えば、識別されたオフターゲット部位を減少させ、及び／または１つまたは複数のオフターゲット部位に対する編集効率を低下させる）、及び／または増加したターゲット配列編集効率を有する。いくつかの実施形態では、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼ（またはその機能バリアント）は、前記参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼと比べて、少なくとも約５％（例えば、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％のいずれか）のオフターゲット率を低下させる。いくつかの実施形態では、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼ（またはその機能バリアント）は、前記参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼと比べて、少なくとも１つ（例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、５０またはそれ以上）のオフターゲット部位を減少させる。いくつかの実施形態では、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼ（またはその機能的バリアント）は、前記参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼと比べて、ターゲット配列の編集効率が同じまたは類似している（例えば１．１倍以内）、またはターゲット配列の編集効率が増加する（例えば参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼの少なくとも１．２倍、１．５倍、２倍、３倍、５倍、１０倍またはそれ以上）。いくつかの実施形態では、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼ（またはその機能バリアント）は、前記参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼと比べて、少なくとも約５％のオフターゲット率を低下させ、ターゲット配列に対する編集効率が同じ、類似（例えば１．１倍以内）、または増加させる。
【0159】
ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ
いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡは、５’から３’まで、直接リピート配列、スペーサー配列を含むか、またはそれらで構成される。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは５’から３’まで、直接リピート配列、スペーサー配列、直接リピート配列の連結により構築されたヌクレオチド配列を含むか、またはそれらで構成される。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドはｃｒＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡはｔｒａｃｃｒＲＮＡを含まない。
いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡは、５’から３’まで、直接リピート配列、スペーサー配列を含むか、またはそれらで構成される。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは５’から３’まで、直接リピート配列、スペーサー配列、直接リピート配列の連結により構築されたヌクレオチド配列を含むか、またはそれらで構成される。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドはｃｒＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡはｔｒａｃｃｒＲＮＡを含まない。
【0160】
一般的に、本明細書に記載されるｃｒＲＮＡは、直接リピート配列及びスペーサー配列を含む。いくつかの実施形態では、ｃｒＲＮＡは、ガイド配列またはスペーサー配列に連結された直接リピート配列を含み、基本的にはそれで構成される、またはそれで構成される。いくつかの実施形態では、ｃｒＲＮＡは、直接リピート配列、スペーサー配列、及び直接リピート配列（ＤＲ－スペーサー－ＤＲ）を含み、それは他のＣＲＩＳＰＲシステムに典型的な前駆体ｃｒＲＮＡ（前ｃｒＲＮＡ）構造である。いくつかの実施形態では、ｃｒＲＮＡは、トランケートされた直接リピート配列及びスペーサー配列を含み、それは典型的な加工された又は成熟したｃｒＲＮＡである。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタータンパク質は、ＲＮＡガイドと複合体を形成し、スペーサー配列は、この複合体を、スペーサー配列に相補的な標的核酸と配列特異的に結合させるように導く。
【0161】
いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドは直接リピートを含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドは、例えば、本明細書で説明するようなステムループ構造の２次構造を形成することができる。
【0162】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲシステムは、複数のＲＮＡガイド（例えば、２、３、４、５、１０、１５またはそれ以上）または複数のＲＮＡガイドをコードする複数の核酸を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲシステムは、単一のＲＮＡ鎖または単一のＲＮＡ鎖をコードする核酸を含み、そのうちＲＮＡガイドは直列に配置される。単一のＲＮＡ鎖は、同じＲＮＡガイドの複数のコピー、異なるＲＮＡガイドの複数のコピー、またはそれらの組み合わせを含むことができる。いくつかの実施形態では、各ＲＮＡガイドは異なる標的核酸に特異的である。
【0163】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲシステムは、ＲＮＡガイドまたはＲＮＡガイドをコードする核酸を含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドは、直接リピート配列と、標的核酸とハイブリダイズすることができる（例えば、適切な条件下でハイブリダイズする）スペーサー配列と、を含むか、またはそれらで構成される。
【0164】
いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイド配列は、ＣＲＩＳＰＲエフェクター複合体を形成し、ターゲット配列との結合に成功することを可能にし、同時に、成功したヌクレアーゼ活性を可能にしない（すなわち、ヌクレアーゼ活性がない／挿入欠失を起こさない）ように修飾される。これらの修飾されたガイド配列は、「不活化ガイド」または「不活化ガイド配列」と呼ばれる。これらの不活性化ガイドまたは不活性化ガイド配列は、ヌクレアーゼ活性に対して触媒的に不活性化されてもよいし、立体的に不活性化されてもよい。不活性化ガイド配列は、通常、活性ＲＮＡ切断をもたらす対応するガイド配列より短い。いくつかの実施形態では、不活性化ガイドは、ヌクレアーゼ活性を有する対応するＲＮＡガイドより少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％短い。ＲＮＡガイドの不活性化ガイド配列の長さは、１３～１５ヌクレオチド（例えば、１３、１４又は１５ヌクレオチド）、１５～１９ヌクレオチド、又は１７～１８ヌクレオチド（例えば、１７ヌクレオチド）であってもよい。いくつかの実施形態では、不活性化ガイドＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲシステムが検出可能な切断活性なしに細胞中の目的ゲノム遺伝子座に向けられるように、ターゲット配列とハイブリダイズすることができる。
【0165】
本明細書に記載されたＲＮＡガイド及びｃｒＲＮＡの配列及び長さは、最適化することができる。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドの最適化された長さは、ｃｒＲＮＡの加工形態を同定することによって、またはｃｒＲＮＡのＲＮＡガイドの経験的な長さの研究によって決定することができる。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイド配列は塩基修飾を含む。
【0166】
いくつかの実施形態では、本発明はまた核酸（例えばｃＤＮＡ）の可能なすべてのバリアントを提供し、前記バリアントは可能なコドン選択に基づいて組み合わせを選択することによって調製することができる。これらの組み合わせは、天然に存在するバリアントをコードするポリヌクレオチドに適用される標準的なトリプレット遺伝暗号に基づいて行われ、これらのすべてのバリアントは具体的に開示されていると考えられている。
【0167】
スペーサー（ｓｐａｃｅｒ）配列
いくつかの実施形態では、スペーサー配列（またはスペーサー、ガイド配列）は、ＤＮＡなどの標的核酸のターゲット配列、例えば、少なくとも約７０％（例えば、少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）と相補的であってもよい。いくつかの実施形態では、スペーサー配列は、ＤＮＡなどの標的核酸のターゲット配列と少なくとも１５（例えば、少なくとも１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０またはそれ以上）ヌクレオチド相補的である。
いくつかの実施形態では、スペーサー配列（またはスペーサー、ガイド配列）は、ＤＮＡなどの標的核酸のターゲット配列、例えば、少なくとも約７０％（例えば、少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）と相補的であってもよい。いくつかの実施形態では、スペーサー配列は、ＤＮＡなどの標的核酸のターゲット配列と少なくとも１５（例えば、少なくとも１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０またはそれ以上）ヌクレオチド相補的である。
【0168】
十分な相補性が機能することを前提として、完全な相補性は必要ないことが当技術分野で知られている。切断効率の調整は、ミスマッチ（例えば、１つまたは複数のミスマッチ、たとえばスペーサー／ターゲットに沿ったミスマッチの位置を含む、スペーサー配列とターゲット配列との間の１つまたは２つのミスマッチ）を導入することによって利用することができる。ミスマッチ、例えば二重ミスマッチは、中心部に位置する（すなわち、３’または５’端に位置しない）ほど、切断効率が受ける影響は大きい。したがって、スペーサー配列に沿ったミスマッチ位置を選択することにより、切断効率を調整することができる。例えば、標的の１００％未満の切断（例えば、細胞集団内）が所望される場合、スペーサー配列とターゲット配列との間の１つまたは２つのミスマッチをスペーサー配列に導入することができる。
【0169】
前記ガイド配列は適切な長さを有することができる。ＲＮＡガイドのスペーサー長は、約１１～５０ヌクレオチド（例えば、約１５～５０ヌクレオチド）の範囲であり得る。いくつかの実施形態では、前記ガイド配列は約１８～約３５ヌクレオチドの間にあり、例えば、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４または３５ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドのスペーサー長は、少なくとも１６ヌクレオチド、少なくとも１７ヌクレオチド、少なくとも１８ヌクレオチド、少なくとも１９ヌクレオチド、少なくとも２０ヌクレオチド、少なくとも２１ヌクレオチド、または少なくとも２２ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、スペーサー長は１５～１７ヌクレオチド、１５～２３ヌクレオチド、１６～２２ヌクレオチド、１７～２０ヌクレオチド、２０～２４ヌクレオチド（例えば、２０、２１、２２、２３又は２４ヌクレオチド）、２３～２５ヌクレオチド（例えば、２３、２４又は２５ヌクレオチド）、２４～２７ヌクレオチド、２７～３０ヌクレオチド、３０～４５ヌクレオチド（例えば、３０、３１、３２、３３、３４、３５、４０又は４５ヌクレオチド）、３０または３５～４０ヌクレオチド、４１～４５ヌクレオチド、４５～５０ヌクレオチド、またはそれ以上。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドのスペーサー長は３１ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドの直接リピート長は、少なくとも２１ヌクレオチド、または２１～３７ヌクレオチド（例えば、２３、２４、２５、３０、３５または３６ヌクレオチド）である。いくつかの実施形態では、スペーサー配列は、約１５～約３４ヌクレオチド（例えば、１６、１７、１８、１９、２０、２１、または２２ヌクレオチド）を含むか、またはそれで構成される。いくつかの実施形態では、スペーサー配列長は１７ヌクレオチドと３１ヌクレオチドの間である。いくつかの実施形態では、スペーサー配列長は１５ヌクレオチドと２４ヌクレオチドの間である。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドの直接リピート長は２３または２０ヌクレオチドである。
【0170】
直接リピート（ＤＲ）配列
直接リピート配列は、Ｃａｓ１２ｉタンパク質（本発明のいずれかに記載のエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼ、その機能バリアントまたはエフェクタータンパク質）をガイドして、ガイドｇＲＮＡ（またはｃｒＲＮＡ）に結合させ、ターゲット配列を標的とするＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ複合体を形成することができる。本出願においてエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼまたはエフェクタータンパク質をガイドｇＲＮＡ（またはｃｒＲＮＡ）に結合させてターゲット配列を標的とするＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ複合体を形成することができるＤＲのいずれか、例えば米国１１１６８３２４（そのすべてが全体的な参照により本明細書に組み込まれる）に記載されたＤＲ配列は、本発明に使用することができる。
直接リピート配列は、Ｃａｓ１２ｉタンパク質（本発明のいずれかに記載のエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼ、その機能バリアントまたはエフェクタータンパク質）をガイドして、ガイドｇＲＮＡ（またはｃｒＲＮＡ）に結合させ、ターゲット配列を標的とするＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ複合体を形成することができる。本出願においてエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼまたはエフェクタータンパク質をガイドｇＲＮＡ（またはｃｒＲＮＡ）に結合させてターゲット配列を標的とするＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ複合体を形成することができるＤＲのいずれか、例えば米国１１１６８３２４（そのすべてが全体的な参照により本明細書に組み込まれる）に記載されたＤＲ配列は、本発明に使用することができる。
【0171】
直接リピートは、介在されたヌクレオチドによって分離された、互いに相補的な２つのヌクレオチドセグメントを含むことができ、これにより、直接リピートは、ハイブリダイゼーションして二本鎖ＲＮＡ二重鎖 (ｄｓＲＮＡ二重鎖)を形成し、ステムループ構造になっており、ここで、２つの相補的なヌクレオチドセグメントがステムを形成し、介在されたヌクレオチドがループまたはヘアピンを形成する。例えば、「ループ」を形成する中間ヌクレオチドは、約６ヌクレオチド～約８ヌクレオチド、または約７個のヌクレオチドの長さを有する。異なる実施形態では、ステムは、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、または５つの塩基対を含むことができる。
【0172】
いくつかの実施形態では、直接リピートは、長さが約４～約７（例えば、４、５、６、７）ヌクレオチドの２つのヌクレオチド相補セグメントを含むことができ、その間に約５～約９（例えば、５、６、７、８、９）ヌクレオチドがある。当業者は、公知の直接リピート構造をシミュレーションすることができる。
【0173】
直接リピートは、約１３～約２３ヌクレオチド、約２２～約４０ヌクレオチド、または約２３～約３８ヌクレオチド、または約２３～約３６ヌクレオチドを含むか、またはそれで構成され得る。
【0174】
いくつかの実施形態では、直接リピート配列は、３’末端付近（スペーサー配列に隣接）のステムループ構造を含む。いくつかの実施形態では、直接リピート配列は、ステムの長さが５ヌクレオチドである３’末端に近いステムループを含む。いくつかの実施形態では、直接リピート配列は、ステムの長さが５ヌクレオチドであり、ループの長さが７ヌクレオチドである３’末端に近いステムループを含む。いくつかの実施形態では、直接リピート配列は、ステムの長さが５ヌクレオチドであり、ループの長さが６、７または８ヌクレオチドである３’末端に近いステムループを含む。
【0175】
いくつかの実施形態では、直接リピート配列は、３’末端に近い配列５’－ＣＣＧＵＣＮＮＮＮＮＮＵＧＡＣＧＧ－３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６８）を含み、そのうちＮは任意の核酸塩基を指す。いくつかの実施形態では、直接リピート配列は、３’末端に近い配列５’－ＧＵＧＣＣＮＮＮＮＮＮＵＧＧＣＡＣ－３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６９）を含み、そのうちＮは任意の核酸塩基を指す。
【0176】
いくつかの実施形態では、直接リピート配列は、３’末端に近い配列５’－ＧＵＧＵＣＮ５－６ＵＧＡＣＡＸ１－３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７０または７１）を含み、そのうちＮ５－６は任意の５または６個の核酸塩基の連続配列を指し、Ｘ１はＣまたはＴまたはＵを指す。いくつかの実施形態では、直接リピート配列は、３’末端に近い配列５’－ＵＣＸ３ＵＸ５Ｘ６Ｘ７ＵＵＧＡＣＧＧ－３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７２）を含み、そのうちＸ３はＣまたはＴまたはＵを指し、Ｘ５はＡまたはＴまたはＵを指し、Ｘ６はＡまたはＣまたはＧを指し、Ｘ８はＡまたはＧを指す。いくつかの実施形態では、直接リピート配列は、３’末端に近い配列５’－ＣＣＸ３Ｘ４Ｘ５ＣＸ７ＵＵＧＧＣＡＣ－３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７３）を含み、そのうちＸ３はＣまたはＴまたはＵを指し、Ｘ４はＡまたはＴまたはＵを指し、Ｘ５はＣまたはＴまたはＵを指し、Ｘ７はＡまたはＧを指す。いくつかの実施形態では、直接リピート配列をコードするヌクレオチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９（ＡＧＡＡＡＴＣＣＧＴＣＴＴＴＣＡＴＴＧＡＣＧＧ）またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７９（ＧＴＴＧＣＡＡＡＡＣＣＣＡＡＧＡＡＡＴ ＣＣＧＴＣＴＴＴＣＡＴＴＧＡＣＧＧ）と少なくとも約８０％同じ、例えば、少なくとも約８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％と同じヌクレオチド配列を含むか、またはそれで構成される。いくつかの実施形態では、直接リピート配列をコードするヌクレオチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７９の少なくとも２１（例えば、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５又は３６）ヌクレオチドを含む。
【0177】
「ステムループ構造」とは、二本鎖（ステム部）を形成することが知られているまたは予測されているヌクレオチド領域を含む二次構造を有する核酸を意味し、前記二本鎖（ステム部）は、一側で主に一本鎖ヌクレオチドである領域（ループ部）によって連結されている。用語「ヘアピン」及び「折り返し」構造は、本明細書ではステムリング構造を指すためにも使用される。このような構造は当技術分野において公知であり、これらの用語は当技術分野における公知の意味と一致して使用される。当技術分野で知られているように、ステムループ構造は正確な塩基対合を必要としない。したがって、ステムは１つまたは複数の塩基ミスマッチを含むことができる。代替的には、塩基対合は正確であり得、すなわち、ミスマッチを含まない。いくつかの実施形態では、直接リピートのステムは、互いにハイブリダイゼーションされた５つの相補的核酸塩基からなり、ループ長は６、７または９ヌクレオチドである。
【0178】
いくつかの実施形態では、直接リピートをコードする配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７９に示される配列を含むか、またはそれで構成される。いくつかの実施形態では、直接リピートをコードする配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７９核酸配列の最初の３つの５’ヌクレオチドを有するトランケートされた核酸を含むか、またはそれで構成される。いくつかの実施形態では、直接リピートをコードする配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７９核酸配列の最初の４つの５’ヌクレオチドを有するトランケートされた核酸を含むか、またはそれで構成される。いくつかの実施形態では、直接リピートをコードする配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７９核酸配列の最初の５’ヌクレオチドを有するトランケートされた核酸を含むか、またはそれで構成される。いくつかの実施形態では、直接リピートをコードする配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７９核酸配列の最初の六つの５’ヌクレオチドを有するトランケートされた核酸を含むか、またはそれで構成される。いくつかの実施形態では、直接リピートをコードする配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７９核酸配列の最初の七つの５’ヌクレオチドを有するトランケートされた核酸を含むか、またはそれで構成される。いくつかの実施形態では、直接リピートをコードする配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７９核酸配列の最初の八つの５’ヌクレオチドを有するトランケートされた核酸を含むか、またはそれで構成される。いくつかの実施形態では、直接リピートをコードする配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９によって示される配列を含むか、またはそれで構成される。
【0179】
いくつかの実施形態では、直接リピートは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９または７９によってコードされたＲＮＡ配列の「機能的バリアント」、例えば「機能的短縮バージョン」、「機能的延長バージョン」、または「機能的置換バージョン」、例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７９の一部（短縮バージョン）であり、依然としてＤＲ機能を有する。ＤＲ「機能性バリアント」は、参照ＤＲ（例えば、親ＤＲ）の５’及び／または３’末端延長（機能性延長バージョン）またはトランケート（機能性トランケートバージョン）、及び／または参照ＤＲ配列に１つまたは複数のヌクレオチドを挿入、欠失、及び／または置換（機能性置換バージョン）した後、依然として参照ＤＲの少なくとも２０％（例えば、少なくとも約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、またはそれ以上）の機能を有するＤＲ配列であり、すなわち、対応するｃｒＲＮＡにＣａｓ１２ｉタンパク質を結合させる機能を媒介する。ＤＲ機能性バリアントは一般的にＣａｓ１２ｉタンパク質結合のために使用できるステムループ様二次構造またはその部分を保持する。いくつかの実施形態では、ＤＲまたはその機能性バリアントは、Ｃａｓ１２ｉタンパク質結合のために使用され得るステムループ様二次構造またはその一部を含む。いくつかの実施形態では、ＤＲまたはその機能性バリアントは、Ｃａｓ１２ｉタンパク質結合のために使用できる少なくとも２つ（例えば、２、３、４、５またはそれ以上）のステムループ様二次構造またはその部分を含む。
【0180】
プライム編集ガイドｐｒｉｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ （ｐｅｇＲＮＡ）
ＰＥｇＲＮＡ（標準ガイドＲＮＡに対して）は、編集される標的内因性ＤＮＡ配列の鎖と相同であるが所望の１つまたは複数のヌクレオチド変化を含み、ポリメラーゼ（例えば、逆転写酵素）によって合成された後に標的ＤＮＡ分子に組み込まれる一本鎖ＤＮＡフラップをコードするＤＮＡ合成テンプレート配列を提供する延長部分を含むように変化する。ＰＥｇＲＮＡはすでにＷＯ２０２０１９１２４６、ＷＯ２０２１２２６５５８などに記載され、それは全体的な参照により本明細書に組み込まれる。
ＰＥｇＲＮＡ（標準ガイドＲＮＡに対して）は、編集される標的内因性ＤＮＡ配列の鎖と相同であるが所望の１つまたは複数のヌクレオチド変化を含み、ポリメラーゼ（例えば、逆転写酵素）によって合成された後に標的ＤＮＡ分子に組み込まれる一本鎖ＤＮＡフラップをコードするＤＮＡ合成テンプレート配列を提供する延長部分を含むように変化する。ＰＥｇＲＮＡはすでにＷＯ２０２０１９１２４６、ＷＯ２０２１２２６５５８などに記載され、それは全体的な参照により本明細書に組み込まれる。
【0181】
異なる実施形態では、延長されたガイドＲＮＡは、（ａ）ガイドＲＮＡ及び（ｂ）がガイドＲＮＡの５’または３’末端、またはガイドＲＮＡの分子内位置におけるＲＮＡ延長を含む。好ましくは、延長部分の分子内局在化は、プロトスペーサー領域の機能を損なわない。ＲＮＡ延長は、（ｉ）所望のヌクレオチド変化を含む逆転写テンプレート配列、（ｉｉ）逆転写プライマー結合部位、及び（ｉｉｉ）任意のリンカー配列を含むことができる。異なる実施形態では、逆転写テンプレート配列は、ニック部位に隣接する内因性ＤＮＡ配列に相補的な一本鎖ＤＮＡフラップをコードすることができ、一本鎖ＤＮＡフラップが所望のヌクレオチド変化を含む。一本鎖ＤＮＡフラップは、内因性一本鎖ＤＮＡをニック部位で置換することができる。異なる実施形態において、標的ＤＮＡに組み込まれる所望のヌクレオチド変化は、単一ヌクレオチドの変化（例えば、トランジションまたはトランスバージョン）、１つまたは複数のヌクレオチドの挿入、または１つまたは複数のヌクレオチドの欠失であり得る。
【0182】
異なる実施形態では、所望のヌクレオチド変化は、単一ヌクレオチドの変化（例えば、トランジションまたはトランスバージョン変化）、欠失または挿入であり得る。例えば、所望のヌクレオチド変化は、（１）Ｇ～Ｔ置換、（２）Ｇ～Ａ置換、（３）Ｇ～Ｃ置換、（４）Ｔ～Ｇ置換、（５）Ｔ～Ａ置換、（６）Ｔ～Ｃ置換、（７）Ｃ～Ｇ置換、（８）Ｃ～Ｔ置換、（９）Ｃ～Ａ置換、（１０）Ａ～Ｔ置換、（１１）Ａ～Ｇ置換、または（１２）Ａ～Ｃ置換であってもよい。
【0183】
ＰＡＭ
本発明に記載されたエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼ（またはその機能バリアント）は、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を識別することができる。いくつかの実施形態では、前記標的核酸はＰＡＭを含む。いくつかの実施形態では、ＰＡＭは標的核酸中のＲＮＡを誘導するターゲット配列に相補的な配列の５’末端に位置する。いくつかの実施形態では、ＰＡＭは、核酸配列５’－ＴＴＮ－３’、５’－ＴＴＨ－３’、５’－ＴＴＹ－３’、または５’－ＴＴＣ－３’を含むか、またはそれで構成される。いくつかの実施形態では、本発明に記載のエンジニアリングされたに適したＣａｓ１２ｉヌクレアーゼ（またはその機能バリアント）のＰＡＭは、核酸配列５’－ＮＮＮＮ－３’（Ｎ＝Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ）例えば５’－ＮＴＴＮ－３’、５’－ＮＴＡＮ－３’、５’－ＮＴＣＮ－３’、５’－ＮＴＧＮ－３’、５’－ＮＡＴＮ－３’、５’－ＮＡＡＮ－３’、５’－ＮＡＣＮ－３’、５’－ＮＡＧＮ－３’、５’－ＮＣＴＮ－３’、５’－ＮＣＡＮ－３’、５’－ＮＣＣＮ－３’、５’－ＮＣＧＮ－３’，５’－ＮＧＴＮ－３’，５’－ＮＧＡＮ－３’，５’－ＮＧＣＮ－３’，５’－ＮＧＧＮ－３’を含むか、またはそれで構成される。いくつかの実施形態では、前記ＰＡＭは、核酸配列５’－ＴＴＴＮ－３’を含むかまたはそれで構成される。いくつかの実施形態では、前記ＰＡＭは核酸配列５’－ＴＴＮ－３’を含むか、またはそれで構成される。
本発明に記載されたエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼ（またはその機能バリアント）は、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を識別することができる。いくつかの実施形態では、前記標的核酸はＰＡＭを含む。いくつかの実施形態では、ＰＡＭは標的核酸中のＲＮＡを誘導するターゲット配列に相補的な配列の５’末端に位置する。いくつかの実施形態では、ＰＡＭは、核酸配列５’－ＴＴＮ－３’、５’－ＴＴＨ－３’、５’－ＴＴＹ－３’、または５’－ＴＴＣ－３’を含むか、またはそれで構成される。いくつかの実施形態では、本発明に記載のエンジニアリングされたに適したＣａｓ１２ｉヌクレアーゼ（またはその機能バリアント）のＰＡＭは、核酸配列５’－ＮＮＮＮ－３’（Ｎ＝Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ）例えば５’－ＮＴＴＮ－３’、５’－ＮＴＡＮ－３’、５’－ＮＴＣＮ－３’、５’－ＮＴＧＮ－３’、５’－ＮＡＴＮ－３’、５’－ＮＡＡＮ－３’、５’－ＮＡＣＮ－３’、５’－ＮＡＧＮ－３’、５’－ＮＣＴＮ－３’、５’－ＮＣＡＮ－３’、５’－ＮＣＣＮ－３’、５’－ＮＣＧＮ－３’，５’－ＮＧＴＮ－３’，５’－ＮＧＡＮ－３’，５’－ＮＧＣＮ－３’，５’－ＮＧＧＮ－３’を含むか、またはそれで構成される。いくつかの実施形態では、前記ＰＡＭは、核酸配列５’－ＴＴＴＮ－３’を含むかまたはそれで構成される。いくつかの実施形態では、前記ＰＡＭは核酸配列５’－ＴＴＮ－３’を含むか、またはそれで構成される。
【0184】
いくつかの実施形態では、本発明に記載のエンジニアリングされたに適したＣａｓ１２ｉヌクレアーゼ（またはその機能バリアント）のＰＡＭは、核酸配列５’－ＴＴＴＡ－３’、５’－ＣＴＴＡ－３’、５’－ＧＴＴＡ－３’、５’－ＡＴＴＡ－３’、５’－ＴＴＴＣ－３’、５’－ＣＴＴＣ－３’、５’－ＧＴＴＣ－３’、５’－ＡＴＴＣ－３’、５’－ＴＴＴＧ－３’、５’－ＣＴＴＧ－３’、５’－ＧＴＴＧ－３’、５’－ＡＴＴＧ－３’、５’－ＴＴＴＴ－３’、５’－ＣＴＴＴ－３’、５’－ＧＴＴＴ－３’、５’－ＡＴＴＴ－３’を含む。
【0185】
エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉエフェクタータンパク質
本出願はエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉ（例えば、Ｃａｓ１２ｉ２）エフェクタータンパク質を提供し、それは標的結合、二本鎖切断活性、ニッカーゼ活性、及び／または遺伝子編集活性などの改善された活性を有する、本発明に記載の任意のエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼまたはその機能バリアント（例えば、ＳＥＱＩＤ ＮＯ：８に示すＣａｓＸＸ）を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼまたはその機能誘導体(例えばｄＣａｓ１２ｉ)のいずれかを含む、エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉエフェクタータンパク質（例えば、Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼ、Ｃａｓ１２ｉニッカーゼ、Ｃａｓ１２ｉ融合エフェクタータンパク質または分割型（ｓｐｌｉｔ）Ｃａｓ１２ｉエフェクタータンパク質）が提供する。いくつかの実施形態では、エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉエフェクタータンパク質は、本発明に記載の任意のエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼまたはその機能的バリアントを含むか、または主にそれで構成されるか、またはそれで構成される。
本出願はエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉ（例えば、Ｃａｓ１２ｉ２）エフェクタータンパク質を提供し、それは標的結合、二本鎖切断活性、ニッカーゼ活性、及び／または遺伝子編集活性などの改善された活性を有する、本発明に記載の任意のエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼまたはその機能バリアント（例えば、ＳＥＱＩＤ ＮＯ：８に示すＣａｓＸＸ）を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼまたはその機能誘導体(例えばｄＣａｓ１２ｉ)のいずれかを含む、エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉエフェクタータンパク質（例えば、Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼ、Ｃａｓ１２ｉニッカーゼ、Ｃａｓ１２ｉ融合エフェクタータンパク質または分割型（ｓｐｌｉｔ）Ｃａｓ１２ｉエフェクタータンパク質）が提供する。いくつかの実施形態では、エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉエフェクタータンパク質は、本発明に記載の任意のエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼまたはその機能的バリアントを含むか、または主にそれで構成されるか、またはそれで構成される。
【0186】
本明細書に記載のエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉ２ヌクレアーゼまたはその機能バリアント（例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に示されるＣａｓＸＸ）のいずれかに基づくエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉエフェクタータンパク質をさらに提供する。いくつかの実施形態では、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉエフェクタータンパク質は、ＤＮＡ二本鎖切断活性などの酵素活性を有する。いくつかの実施形態では、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉエフェクタータンパク質は、標的の二重らせん核酸（例えば、二重らせんＤＮＡ）の２本鎖を切断するヌクレアーゼ活性を有する。いくつかの実施形態では、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉエフェクタータンパク質は、標的の二重らせん核酸（例えば、二重らせんＤＮＡ）の一本鎖を切断するニッケーゼ活性を有する。いくつかの実施形態では、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉエフェクタータンパク質は、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼの酵素不活性変異体を含む。
【0187】
分割型Ｃａｓ１２ｉエフェクタータンパク質
本出願はまた、本明細書に記載のエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼまたはその機能バリアント（例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に示されるＣａｓＸＸ）のいずれかに基づく分割型Ｃａｓ１２ｉエフェクタータンパク質を提供する。分割型Ｃａｓ１２ｉエフェクタータンパク質は送達に有利である可能性がある。いくつかの実施形態では、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉエフェクタータンパク質は、酵素の２つの部分に分割され、この２つの部分が、基本的に機能するＣａｓ１２ｉエフェクタータンパク質を提供するために一緒に再構成されることができる。公知の方法を用いてＣａｓエフェクタータンパク質を提供することができ、例えば、Ｃａｓ１２及びＣａｓ９タンパク質の分割形態は、すでにＷＯ２０１６／１１２２４２、ＷＯ２０１６／２０５７４９及びＰＣＴ／ＣＮ２０２０／１１０５７に記載され、それは全体的な参照により本明細書に組み込まれる。
本出願はまた、本明細書に記載のエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼまたはその機能バリアント（例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に示されるＣａｓＸＸ）のいずれかに基づく分割型Ｃａｓ１２ｉエフェクタータンパク質を提供する。分割型Ｃａｓ１２ｉエフェクタータンパク質は送達に有利である可能性がある。いくつかの実施形態では、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉエフェクタータンパク質は、酵素の２つの部分に分割され、この２つの部分が、基本的に機能するＣａｓ１２ｉエフェクタータンパク質を提供するために一緒に再構成されることができる。公知の方法を用いてＣａｓエフェクタータンパク質を提供することができ、例えば、Ｃａｓ１２及びＣａｓ９タンパク質の分割形態は、すでにＷＯ２０１６／１１２２４２、ＷＯ２０１６／２０５７４９及びＰＣＴ／ＣＮ２０２０／１１０５７に記載され、それは全体的な参照により本明細書に組み込まれる。
【0188】
いくつかの実施形態では、分割型Ｃａｓ１２ｉエフェクタータンパク質を提供し、それは第１のポリペプチドと第２のポリペプチドを含み、前記第１のポリペプチドは本明細書で説明するエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼまたはその機能誘導体のいずれかのＮ末端部分を含み、第２のポリペプチドはエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼまたはその機能誘導体のいずれかのＣ末端部分を含み、そのうち、前記第１のポリペプチドと第２のポリペプチドは、前記ガイド配列に相補的なターゲット配列を含む標的核酸と特異的に結合するＣＲＩＳＰＲ複合体を形成するために、ガイド配列を含むガイドＲＮＡの存在下で互いに会合することができる。いくつかの実施形態では、前記第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドはそれぞれ二量化ドメインを含む。いくつかの実施形態では、前記第１の二量化ドメインと第２の二量化ドメインは、誘導剤（例えばラパマイシン）の存在下で互いに会合している。いくつかの実施形態では、前記第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドは二量化ドメインを含まない。いくつかの実施形態では、前記分割型Ｃａｓ１２ｉエフェクタータンパク質は自己誘導される。
【0189】
本発明に記載のエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉエフェクタータンパク質は、触媒ドメインに影響を与えないように分割することができる。Ｃａｓ１２ｉエフェクタータンパク質は、ヌクレアーゼ（ニッケーゼを含む）として使用することができ、または本質的には触媒活性が少ない、または触媒活性がない（例えば、その触媒ドメインにおける変異のため）ＲＮＡによって誘導されるＤＮＡ結合タンパク質である不活性化酵素であることができる。
【0190】
いくつかの実施形態では、エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉエフェクタータンパク質のヌクレアーゼローブ及びα－ヘリックスローブは分離ポリペプチドとして発現される。前記ヌクレアーゼローブ及びα－ヘリックスローブは自己相互作用しないが、ＲＮＡガイド配列はそれらを一つの複合体にリクルートし、前記複合体は全長Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼの活性を再現し、部位特異性のＤＮＡ切断を触媒する。いくつかの実施形態では、修飾されたＲＮＡガイド配列を使用し、二量化を防止することによって分割型酵素の活性を除去し、誘導型二量化システムの発展を可能にすることができる。この分割型酵素は、例えば、Ｗｒｉｇｈｔ， Ａｄｄｉｓｏｎ Ｖ．， ｅｔ ａｌ． “Ｒａｔｉｏｎａｌ ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ａ ｓｐｌｉｔ－Ｃａｓ９ ｅｎｚｙｍｅ ｃｏｍｐｌｅｘ，” Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， １１２．１０ （２０１５）： ２９８４－２９８９に記述され、それは全体的な参照により本明細書に組み込まれる。
【0191】
本明細書に記載の分割型Ｃａｓ１２ｉエフェクタータンパク質部分は、参照エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉエフェクタータンパク質（例えば、全長エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼ）を１つの分割位置で２つに分ける（すなわち、分割）ように設計されていてもよく、前記位置は、前記参照Ｃａｓ１２ｉエフェクタータンパク質のＮ端部とＣ端部と分離する点である。いくつかの実施形態では、前記Ｎ末端部分は前記参照Ｃａｓ１２ｉエフェクタータンパク質アミノ酸残基１～Ｘを含み、前記Ｃ末端部分はアミノ酸残基Ｘ＋１～前記参照Ｃａｓ１２ｉエフェクタータンパク質のＣ末端を含む。この例では、番号付けが連続しているが、必須ではない。それは、アミノ酸（またはそれらをコードするヌクレオチド）が分割された末端及び／または変異（例えば、挿入、削除、置換）のいずれかからポリペプチド鎖の内部領域でトリミングされ得ることも考慮されているためであり、条件は、再構成されたエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉエフェクタータンパク質が十分なＤＮＡ結合活性（必要であれば）、ＤＮＡニッカーゼ、またはカット活性、例えば、前記参照Ｃａｓ１２ｉエフェクタータンパク質と比べて、少なくとも約４０％（例えば、少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％またはそれ以上）の活性を保持していることである。
【0192】
コンピュータ（ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ）により分割点を設計し、構築物にクローンすることができる。この過程で、変異を分割型Ｃａｓ１２ｉエフェクタータンパク質に導入することができ、非機能ドメインを除去することができる。いくつかの実施形態では、前記分割型Ｃａｓ１２ｉエフェクタータンパク質の２つの部分または断片（すなわち、Ｎ末端及びＣ末端断片）は、完全なＣａｓ１２ｉエフェクタータンパク質を形成することができ、完全なＣａｓ１２ｉエフェクタータンパク質配列の少なくとも約７０％（例えば、少なくとも約８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上）を含む。
【0193】
前記分割型Ｃａｓ１２ｉエフェクタータンパク質は、それぞれ１つまたは複数の二量化ドメインを含むことができる。いくつかの実施形態では、前記第１のポリペプチドは、第１の分割型Ｃａｓ１２ｉエフェクタータンパク質と部分的に融合する第１の二量体ドメインを含み、前記第２のポリペプチドは、第２の分割型Ｃａｓ１２ｉエフェクタータンパク質と部分的に融合する第２の二量体ドメインを含む。二量化ドメインは、ペプチドリンカー（例えば、ＧＳリンカーなどのフレキシブルペプチドリンカー）または化学結合によって分割型Ｃａｓ１２ｉエフェクタータンパク質部分に融合することができる。いくつかの実施形態では、前記二量化ドメインは、分割型Ｃａｓ１２ｉエフェクタータンパク質部分のＮ末端と融合する。いくつかの実施形態では、前記二量化ドメインは、分割型Ｃａｓ１２ｉエフェクタータンパク質部分のＣ末端と融合する。
【0194】
いくつかの実施形態では、該分割型Ｃａｓ１２ｉエフェクタータンパク質は、二量化ドメインを含まない。
【0195】
いくつかの実施形態では、前記二量化ドメインは、２つの分割型Ｃａｓ１２ｉエフェクタータンパク質部分の会合を促進する。いくつかの実施形態では、前記分割型Ｃａｓ１２ｉエフェクタータンパク質部分は誘導剤によって誘導され、機能性Ｃａｓ１２ｉエフェクタータンパク質に会合または二量化される。いくつかの実施形態では、前記分割型Ｃａｓ１２ｉエフェクタータンパク質は、誘導可能な二量化ドメインを含む。いくつかの実施形態では、前記二量化ドメインは誘導性二量化ドメインではない、すなわち、前記二量化ドメインは誘導剤の非存在下で二量化する。
【0196】
誘導剤は、ガイドＲＮＡ（例えばｃｒＲＮＡ）以外の誘導エネルギー源または誘導分子であってもよい。前記誘導剤は、誘導された二量化ドメインの二量化により、２つの分割型Ｃａｓ１２ｉエフェクタータンパク質部分を機能性Ｃａｓ１２ｉエフェクタータンパク質に再構成する。いくつかの実施形態では、前記誘導剤は、誘導可能な二量化ドメインの誘導会合の作用によって２つの分割型Ｃａｓ１２ｉエフェクタータンパク質部分を結合させる。いくつかの実施形態では、誘導剤がない場合、２つの分割型Ｃａｓ１２ｉエフェクタータンパク質部分は互いに会合せず、機能性Ｃａｓ１２ｉエフェクタータンパク質として再構成される。いくつかの実施形態では、誘導剤がない場合、２つの別個のＣａｓ１２ｉエフェクタータンパク質部分は、ガイドＲＮＡ（例えばｃｒＲＮＡ）の存在下で互いに会合して機能性Ｃａｓ１２ｉエフェクタータンパク質として再構成することができる。
【0197】
本出願の誘導剤は、熱、超音波、電磁エネルギー、または化合物であってもよい。いくつかの実施形態では、前記誘導剤は抗生物質、小分子、ホルモン、ホルモン誘導体、ステロイドまたはステロイド誘導体である。いくつかの実施形態では、前記誘導剤は、アブシジン酸（ＡＢＡ）、ドキシサイクリン（ＤＯＸ）、イソプロピル安息香酸（ｃｕｍａｔｅ）、ラパマイシン、４－ヒドロキシタモキシフェン（４ＯＨＴ）、エストロゲン、または脱皮ホルモンである。いくつかの実施形態では、前記分割型Ｃａｓ１２ｉエフェクターシステムは、抗生物質ベースの誘導システム、電磁エネルギーベースの誘導システム、小分子ベースの誘導システム、核内受容体ベースの誘導システム、ホルモンベースの誘導システムからなる群より選択される誘導剤制御のシステムである。いくつかの実施形態では、前記分割型Ｃａｓ１２ｉエフェクターシステムは、テトラサイクリン（Ｔｅｔ）／ＤＯＸ誘導システム、光誘導システム、ＡＢＡ誘導システム、イソプロピル安息香酸（ｃｕｍａｔｅ）阻害物／オペロンシステム、４ＯＨＴ／エストロゲン誘導システム、脱皮ホルモンに基づく誘導システム、ＦＫＢＰ１２／ＦＲＡＰ（ＦＫＢＰ１２－ラパマイシン複合体）誘導システムからなる群より選択される誘導剤制御のシステムである。そのような誘導剤も、本明細書及びＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０５１４１８に議論され、それは全体的な参照により本明細書に組み込まれる。ＦＲＢ／ＦＫＢＰ／レパマイシンシステムは、Ｐａｕｌｍｕｒｕｇａｎ ａｎｄ Ｇａｍｂｈｉｒ， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ， Ａｕｇｕｓｔ １５， ２００５ ６５； ７４１３、及びＣｒａｂｔｒｅｅ ｅｔ ａｌ．， Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＆ Ｂｉｏｌｏｇｙ １３， ９９－１０７， Ｊａｎ ２００６に記載され、全体的な参照により本明細書に組み込まれる。
【0198】
いくつかの実施形態では、ペアとなる分割型Ｃａｓ１２ｉエフェクタータンパク質は、機能性Ｃａｓ１２ｉエフェクタータンパク質ヌクレアーゼの再構築をもたらす二量化ドメインの二量化（例えば、ＦＲＢ及びＦＫＢＰ）が誘導されるまで、分離され、不活性である。いくつかの実施形態では、誘導型二量体（例えばＦＲＢ）の第１の半分を含む第１分割型Ｃａｓ１２ｉエフェクタータンパク質は、分離して送達され、および/または誘導型二量体（例えばＦＫＢＰ）の第２の半分を含む第２分割型Ｃａｓ１２ｉエフェクタータンパク質から分離された位置にある。
【0199】
本明細書に記載の誘導剤制御に用いることができる分割型Ｃａｓ１２ｉエフェクターシステムの他の例示的なＦＫＢＰベース誘導システムとしては、ＦＫ５０６の存在下でカルシニューリン（ＣＮＡ）と二量化したＦＫＢＰ、ＦＫＣｓＡの存在下でＣｙＰ－Ｆａｓと二量化されたＦＫＢＰ、ラパマイシンの存在下でＦＲＢと二量化するＦＫＢＰ、クマリンマイシンの存在下でＧｒｙＢと二量化するＧｙｒＢ、ジベレリンの存在下でＧＩＤ１と二量化するＧＡＩ、またはＨａＸＳの存在下でＨａｌｏＴａｇと二量化するＳｎａｐ－ｔａｇを含むが、これらに限定されない。
【0200】
ＦＫＢＰファミリー自体内の代替案も考えられている。例えば、ＦＫ１０１２の存在下でＦＫＢＰはホモダイマー化される（すなわち、１つのＦＫＢＰが別のＦＫＢＰとダイマー化される）。
【0201】
いくつかの実施形態では、前記二量化ドメインはＦＫＢＰであるが、誘導剤はＦＫ１０１２である。いくつかの実施形態では、前記二量化ドメインはＧｒｙＢであるが、誘導剤はクマリンマイシンである。いくつかの実施形態では、前記二量化ドメインはＡＢＡであるが、誘導剤はエリスロマイシンである。
【0202】
いくつかの実施形態では、分割型Ｃａｓ１２ｉエフェクタータンパク質部分は、機能性Ｃａｓ１２ｉエフェクタータンパク質に会合／二量化されるために誘導剤なしで自動的に誘導（すなわち、自動活性化または自己誘導）されることができる。いかなる理論または仮定にも縛られないが、ｃｒＲＮＡのようなガイドＲＮＡと結合することによって、分割型Ｃａｓ１２ｉエフェクタータンパク質部分の自動誘導を媒介することができる。いくつかの実施形態では、前記第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドは二量化ドメインを含まない。いくつかの実施形態では、前記第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドは、二量化ドメインを含む。
【0203】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の分割型Ｃａｓ１２ｉエフェクターシステム（誘導剤制御及び自動誘導システムを含む）の再構成されたＣａｓ１２ｉエフェクタータンパク質は、参照Ｃａｓ１２ｉエフェクタータンパク質編集効率に対し、少なくとも約６０％（例えば、少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、またはそれ以上のいずれか）の編集効率を有する。
【0204】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の誘導剤制御分割型Ｃａｓ１２ｉエフェクターシステムの再構成されたＣａｓ１２ｉエフェクタータンパク質は、誘導剤のない状況（すなわち自動誘導による）では、参照Ｃａｓ１２ｉエフェクタータンパク質編集効率に対して、約５０％（例えば、約４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％またはそれ下記のいずれか）未満の編集効率を有する。
【0205】
融合Ｃａｓ１２ｉエフェクタータンパク質
本出願はまた、接合部、核局在化／輸送配列、機能ドメイン、及び／またはレポータータンパク質などの追加のタンパク質ドメイン及び／または成分を含む、エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉエフェクタータンパク質を提供する。
本出願はまた、接合部、核局在化／輸送配列、機能ドメイン、及び／またはレポータータンパク質などの追加のタンパク質ドメイン及び／または成分を含む、エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉエフェクタータンパク質を提供する。
【0206】
いくつかの実施形態では、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉエフェクタータンパク質は、１つまたは複数の異種タンパク質ドメイン（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上のドメイン）と、本発明に記載されたエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼのいずれかの核酸標的ドメインまたはその機能誘導体を含むタンパク質複合体である。いくつかの実施形態では、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉエフェクタータンパク質は、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼまたはその機能的バリアント（例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に示されるＣａｓＸＸ）と融合した１つまたは複数の異種タンパク質ドメイン（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上のドメイン）を含む融合タンパク質である。
【0207】
いくつかの実施形態では、本出願のエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉエフェクタータンパク質は、（例えば、ＧＳペプチドリンカーなどの１つまたは複数のペプチドリンカーによるタンパク質の融合により）１つまたは複数の機能ドメインを含み、または１つまたは複数の機能ドメインが（例えば、複数のタンパク質の共発現による）それに会合されることができる。いくつかの実施形態では、前記１つまたは複数の機能ドメインは酵素ドメインである。これらの機能ドメインは、ＤＮＡ及び／またはＲＮＡメチラーゼ活性、ヌクレオチドデアミナーゼ活性（アデノシンデアミナーゼ活性、シチジンデアミナーゼ活性）、デメチラーゼ活性、転写活性化活性、転写抑制活性、転写放出因子活性、ヒストン修飾活性、ＲＮＡ切断活性、ＤＮＡ切断活性（例えば、二本鎖エンドヌクレアーゼ活性、ニッカーゼ活性）、核酸結合活性及びスイッチング活性（例えば、光誘導又は化学誘導）など、多くの活性を有することができる。いくつかの実施形態では、前記１つまたは複数の機能ドメインは、転写活性化ドメイン（すなわち、トランス活性化ドメイン）またはリプレッサードメインである。いくつかの実施形態では、前記１つまたは複数の機能ドメインは、ヒストン修飾ドメインである。いくつかの実施形態では、前記１つまたは複数の機能ドメインは、トランスポザーゼドメイン、ＨＲ（相同性組換え）機構ドメイン、リコンビナーゼドメイン、及び／またはインテグラーゼドメインである。いくつかの実施形態では、前記機能ドメインは、Ｋｒuｐｐｅｌ相関カセット（ＫＲＡＢ）、ＶＰ６４、ＶＰ１６、Ｆｏｋ１、Ｐ６５、ＨＳＦ１、ＭｙｏＤ１、ビオチン－ＡＰＥＸ、ＡＰＯＢＥＣ１、ＡＩＤ、ＰｍＣＤＡ１、Ｔａｄ１、及びＭ－ＭＬＶ逆転写酵素である。いくつかの実施形態では、前記機能ドメインは、翻訳開始ドメイン、転写抑制ドメイン、トランス活性化ドメイン、エピジェネティック修飾ドメイン、核塩基編集ドメイン（例えばＣＢＥまたはＡＢＥドメイン）、逆転写酵素ドメイン、レポーター分子ドメイン（例えば蛍光ドメイン）、及びヌクレアーゼドメインの群から選択される。
【0208】
いくつかの実施形態では、前記機能ドメインは、標的ＤＮＡまたは標的ＤＮＡ関連タンパク質を修飾する活性を有し、前記活性は、ヌクレアーゼ活性（例えば、ＨＮＨヌクレアーゼ、ＲｕｖＣヌクレアーゼ、Ｔｒｅｘ１ヌクレアーゼ、Ｔｒｅｘ２ヌクレアーゼ）、メチル化活性、脱メチル化活性、ＤＮＡ修復活性、ＤＮＡ損傷活性、脱アミノ化活性、ジスムターゼ活性、アルキル化活性、脱プリン活性、酸化活性、ピリミジン二量体形成活性、インテグラーゼ活性、トランスポザーゼ活性、リコンビナーゼ活性、ポリメラーゼ活性、リガーゼ活性、ヘリカーゼ活性、フォトリアーゼ活性、グリコシラーゼ活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、脱アセチラーゼ活性、キナーゼ活性、ホスファターゼ活性、ユビキチンリガーゼ活性、脱ユビキチン化活性、アデノシン酸化活性、脱アデノシン酸化活性、ＳＵＭＯ化活性、脱ＳＵＭＯ化活性、リボキシル化活性、脱リボキシル化活性、ミリスチル化活性、脱ミリスチル化活性、グリコシル化活性（例えば、Ｏ－ＧｌｃＮＡｃ転移酵素由来）、脱グリコシル化活性、転写抑制活性及び転写活性化活性のうちの１種または複数の種類から選択される。標的ＤＮＡ関連タンパク質とは、ヒストン、転写因子、Ｍｅｄｉａｔｏｒなど、標的ＤＮＡを結合することができるタンパク質、または標的ＤＮＡを結合することができるタンパク質と結合可能なタンパク質、を指す。
【0209】
いくつかの実施形態では、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉエフェクタータンパク質中の１つまたは複数の機能ドメインの局在化は、与えられた機能的作用を有する標的に影響を与えるために機能ドメインの正確な空間配向を可能にする。例えば、前記機能ドメインが転写アクチベーター（例えば、ＶＰ１６、ＶＰ６４、またはｐ６５）である場合、前記転写アクチベーターは、ターゲット転写に影響を与えることができる空間方位上に配置される。同様に、転写リプレッサーは標的の転写に影響を与えるように配置され、ヌクレアーゼ（例えば、Ｆｏｋ１）は標的を切断または部分的に切断するように配置される。いくつかの実施形態では、前記機能ドメインは、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉエフェクタータンパク質のＮ末端に位置する。いくつかの実施形態では、前記機能ドメインは、エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉエフェクタータンパク質のＣ末端に位置する。いくつかの実施形態では、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉエフェクタータンパク質は、Ｎ末端に第１の機能ドメインを含み、Ｃ末端に第２の機能ドメインを含む。いくつかの実施形態では、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉエフェクタータンパク質は、１つまたは複数の機能ドメインと融合した、本明細書でエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼのいずれかの触媒失活変異体（ｄＣａｓ１２ｉ）を含む。
【0210】
いくつかの実施形態では、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉエフェクタータンパク質は転写アクチベーターである。いくつかの実施形態では、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉエフェクタータンパク質は、トランス活性化ドメインと融合した、本明細書でエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼのいずれかの酵素不活性化バリアントを含む。いくつかの実施形態では、前記トランス活性化ドメインは、ＶＰ６４、ｐ６５、ＨＳＦ１、ＶＰ１６、ＭｙｏＤ１、ＨＳＦ１、ＲＴＡ、ＳＥＴ７／９、及びそれらの組み合わせの群から選択される。いくつかの実施形態では、前記トランス活性化ドメインはＶＰ６４、ｐ６５、及びＨＳＦ１を含む。いくつかの実施形態では、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉエフェクタータンパク質は、２つの分割型Ｃａｓ１２ｉエフェクトポリペプチドを含み、それぞれがトランス活性化ドメインと融合している。
【0211】
いくつかの実施形態では、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉエフェクタータンパク質は転写リプレッサーである。いくつかの実施形態では、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉエフェクタータンパク質は、転写抑制ドメインと融合した、本明細書でエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼのいずれかの酵素不活性化バリアントを含む。いくつかの実施形態では、前記転写リプレッサードメインは、Ｋｒuｐｐｅｌ相関カセット（ＫＲＡＢ）、ＥｎＲ、ＮｕＥ、ＮｃｏＲ、ＳＩＤ、ＳＩＤ４Ｘ、及びそれらの組み合わせの群から選択される。いくつかの実施形態では、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉエフェクタータンパク質は、２つの分割型Ｃａｓ１２ｉエフェクトポリペプチドを含み、それぞれが転写抑制ドメインと融合する。
【0212】
いくつかの実施形態では、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉエフェクタータンパク質は、シトシンエディターまたはアデノシンエディターなどの塩基エディターである。いくつかの実施形態では、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉエフェクタータンパク質は、シトシン塩基編集（ＣＢＥ）ドメインまたはアデノシン塩基編集（ＡＢＥ）ドメインなどの核塩基編集ドメインと融合した、本明細書に記載の任意のエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼのいずれかの酵素不活性化バリアントを含む。いくつかの実施形態では、前記核酸塩基編集ドメインはＤＮＡ編集ドメインである。いくつかの実施形態では、前記核酸塩基編集ドメインはデアミナーゼ活性を有する。いくつかの実施形態では、前記核酸塩基編集ドメインはシトシンデアミナーゼドメインである。いくつかの実施形態では、前記核酸塩基編集ドメインはアデノシンデアミナーゼドメインである。Ｃａｓヌクレアーゼに基づく例示的な塩基エディターは、例えば、全体的な参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１８／１６５６２９Ａ１及びＷＯ２０１９／２２６９５３Ａ１に記載されている。例示的なＣＢＥドメインには、活性化誘導シトシンデアミナーゼまたはＡＩＤ（例えばｈＡＩＤ）、アポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡ編集複合体またはＡＰＯＢＥＣ（例えばラットＡＰＯＢＥＣ１、ｈＡＰＯＢＥＣ３Ａ／Ｂ／Ｃ／Ｄ／Ｅ／Ｆ／Ｇ）、及びＰｍＣＤＡ１が含まれるが、これらに限定されない。例示的なＡＢＥドメインとしては、ＴａｄＡ、ＡＢＥ８及びそのバリアントが挙げられるが、これらに限定されない（例えば、Ｇａｕｄｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．， ２０１７， Ｎａｔｕｒｅ ５５１： ４６４－４７１； ａｎｄ Ｒｉｃｈｔｅｒ ｅｔ ａｌ．， ２０２０， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３８： ８８３－８９１を参照）。いくつかの実施形態では、前記機能ドメインは、ラットＡＰＯＢＥＣ１ドメインなどのＡＰＯＢＥＣ１ドメインである。いくつかの実施形態では、前記機能的ドメインは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴａｄＡドメインなどのＴａｄＡドメインである。いくつかの実施形態では、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉエフェクタータンパク質は、さらに１つまたは複数の核局在配列を含む。
【0213】
アデノシンデアミナーゼ
本明細書で使用される場合、用語「アデノシンデアミナーゼ」または「アデノシンデアミナーゼタンパク質」は、以下に示すように、アデニン（または分子のアデニン部分）をヒポキサンチン（または分子のヒポキサンチン部分）に変換する加水分解脱アミノ反応を触媒することができる、タンパク質、ポリペプチド、またはタンパク質またはポリペプチドの１つまたは複数の機能ドメインを指す。いくつかの実施形態では、アデニン含有分子はアデノシン（Ａ）であり、ヒポキサンチン含有分子はイノシン（Ｉ）である。アデニン含有分子は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）であり得る。
本明細書で使用される場合、用語「アデノシンデアミナーゼ」または「アデノシンデアミナーゼタンパク質」は、以下に示すように、アデニン（または分子のアデニン部分）をヒポキサンチン（または分子のヒポキサンチン部分）に変換する加水分解脱アミノ反応を触媒することができる、タンパク質、ポリペプチド、またはタンパク質またはポリペプチドの１つまたは複数の機能ドメインを指す。いくつかの実施形態では、アデニン含有分子はアデノシン（Ａ）であり、ヒポキサンチン含有分子はイノシン（Ｉ）である。アデニン含有分子は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）であり得る。
【0214】
本発明のエンジニアリング可能なＣａｓ１２ｉヌクレアーゼのいずれかの酵素不活性化バリアントと組み合わせて使用できるアデノシンデアミナーゼには、ＲＮＡに作用するアデノシンデアミナーゼと呼ばれる酵素ファミリーメンバー（ＡＤＡＲ）、ｔＲＮＡに作用するアデノシンデアミナーゼと呼ばれる酵素ファミリーメンバー（ＡＤＡＴ）、及びその他のアデノシンデアミナーゼドメイン（ＡＤＡＤ）を含むファミリーメンバーが含まれるが、これらに限定されない。アデノシンデアミナーゼはＲＮＡ／ＤＮＡとＲＮＡ二本鎖中のアデニンを標的にすることができる。実際、Ｚｈｅｎｇら（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０１７、４５（６）：３３６９－３３７７）は、ＡＤＡＲがＲＮＡ／ＤＮＡとＲＮＡ／ＲＮＡ二本鎖体にアデノシンからイノシンへの編集反応を行うことができることを確認した。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＲＮＡ二本鎖のＲＮＡ／ＤＮＡ異種二本鎖中のＤＮＡを編集する能力を高めるように修飾されることができる。
【0215】
いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは１種または複数の後生動物種に由来し、哺乳類、鳥類、カエル、イカ、魚、ハエ、及びワームを含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ヒト、イカ、またはショウジョウバエのアデノシンデアミナーゼである。
【0216】
いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼはヒトＡＤＡＲであり、ｈＡＤＡＲ１、ｈＡＤＡＲ２、ｈＡＤＡＲ３を含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＡＤＲ－１及びＡＤＲ－２を含む、カエノラブディティス・エレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ）ＡＤＡＲタンパク質である。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ｄＡｄａｒを含むショウジョウバエＡＤＡＲタンパク質である。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼはイカ（Ｌｏｌｉｇｏ ｐｅａｌｅｉｉ）ＡＤＡＲタンパク質であり、ｓｑＡＤＡＲ２ａ及びｓｑＡＤＡＲ２ｂを含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼはヒトＡＤＡＴタンパク質である。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼはショウジョウバエＡＤＡＴタンパク質である。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴＥＮＲ（ｈＡＤＡＤ１）及びＴＥＮＲＬ（ｈＡＤＡＤ２）を含むヒトＡＤＡＤタンパク質である。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼはＴａｄＡ８ｅである。
【0217】
いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、大腸菌ＴａｄＡなどのＴａｄＡタンパク質である。Ｋｉｍら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ４５：６４０７－６４１６（２００６）、Ｗｏｌｆら、ＥＭＢＯ Ｊ．２１：３８４１－３８５１（２００２）を参照。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼはマウスＡＤＡである。Ｇｒｕｎｅｂａｕｍら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６３０－６３８（２０１３）を参照。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼはヒトＡＤＡＴ２である。Ｆｕｋｕｉら、Ｊ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ２０１０：２６０５１２（２０１０）を参照。いくつかの実施形態において、デアミナーゼ（例えばアデノシンまたはシチジンデアミナーゼ）は、下記の文献に記載するもののうちの１つまたは複数である：Ｃｏｘら、Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１７年１１月２４日、３５８（６３６６）：１０１９－１０２７；Ｋｏｍｏｒｅら、Ｎａｔｕｒｅ．２０１６年５月１９日、５３３（７６０３）：４２０－４；そしてＧａｕｄｅｌｌｉら、Ｎａｔｕｒｅ．２０１７年１１月２３日、５５１（７６８１）：４６４－４７１を参照。
【0218】
いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼタンパク質は１つまたは複数のデアミナーゼドメインを含む。特定の理論に縛られることを望ましくないが、２本鎖核酸基質中に含まれる１つまたは複数の標的アデノシン（Ａ）残基を識別し、それをイノシン（Ｉ）残基に変換するためにデアミナーゼドメインが使用されることが予想される。
【0219】
シチジンデアミナーゼ
いくつかの実施形態では、デアミナーゼはシチジンデアミナーゼである。本明細書で使用される場合、用語「シトシンデアミナーゼ」または「シトシンデアミナーゼタンパク質」は、シトシン（または分子のシトシン部分）をウラシル（または分子のウラシル部分）に変換する加水分解脱アミノ反応を触媒することができるタンパク質、ポリペプチドまたはタンパク質またはポリペプチドの１つまたは複数の機能ドメインを指す。いくつかの実施形態では、シトシン含有分子はシトシン（Ｃ）であり、ウラシル含有分子はウリジン（Ｕ）である。前記シトシン含有分子は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）であり得る。
いくつかの実施形態では、デアミナーゼはシチジンデアミナーゼである。本明細書で使用される場合、用語「シトシンデアミナーゼ」または「シトシンデアミナーゼタンパク質」は、シトシン（または分子のシトシン部分）をウラシル（または分子のウラシル部分）に変換する加水分解脱アミノ反応を触媒することができるタンパク質、ポリペプチドまたはタンパク質またはポリペプチドの１つまたは複数の機能ドメインを指す。いくつかの実施形態では、シトシン含有分子はシトシン（Ｃ）であり、ウラシル含有分子はウリジン（Ｕ）である。前記シトシン含有分子は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）であり得る。
【0220】
本発明のエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼのいずれかの酵素不活性化バリアントと組み合わせて使用することができるシトシンデアミナーゼには、アポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡ編集複合体（ＡＰＯＢＥＣ）ファミリーデアミナーゼと呼ばれる酵素ファミリーのメンバー、活性化誘導デアミナーゼ（ＡＩＤ）、またはシトシンデアミナーゼ１（ＣＤＡ１）が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、ＡＰＯＢＥＣ１デアミナーゼ、ＡＰＯＢＥＣ２デアミナーゼ、ＡＰＯＢＥＣ３Ａデアミナーゼ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｂデアミナーゼ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｃデアミナーゼ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｄデアミナーゼ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｅデアミナーゼ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｆデアミナーゼ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇデアミナーゼ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｈデアミナーゼ、またはＡＰＯＢＥＣ４デアミナーゼ中のデアミナーゼである。
【0221】
いくつかの実施形態では、シトシンデアミナーゼはＤＮＡ一本鎖中のシトシンを標的化することができる。いくつかの実施形態では、シトシンデアミナーゼは、結合成分の外部に存在する一本鎖上で編集することができる。いくつかの実施形態では、シトシンデアミナーゼは、標的編集部位においてガイド配列のミスマッチにより形成された局所的なバブルなど、局所的なバブルで編集することができる。いくつかの実施形態では、シトシンデアミナーゼは、Ｋｉｍら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２０１７）３５（４）：３７１－３７７（ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．３８０３に記載されているような活性の集中に寄与する変異を含むことができる。
【0222】
いくつかの実施形態では、シチジンデアミナーゼは一つまたは複数の後生動物種から由来し、哺乳類、鳥類、カエル、イカ、魚、ハエ、及びワームを含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、シチジンデアミナーゼは、ヒト、霊長類、ウシ、イヌ、ラットまたはマウスのシチジンデアミナーゼである。
【0223】
いくつかの実施形態では、シトシンデアミナーゼはｈＡＰＯＢＥＣ１またはｈＡＰＯＢＥＣ３を含むヒトＡＰＯＢＥＣである。いくつかの実施形態では、シチジンデアミナーゼはヒトＡＩＤである。
【0224】
いくつかの実施形態では、シトシンデアミナーゼタンパク質は１つまたは複数のデアミナーゼドメインを含む。理論に縛られることは望ましくないが、ＲＮＡ二本鎖体の一本鎖バブルに含まれる１つまたは複数の標的シトシン（Ｃ）残基を識別し、ウラシル（Ｕ）残基に変換するためにデアミナーゼドメインが使用されることが予想される。
【0225】
いくつかの実施形態では、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉエフェクタータンパク質はメインエディタである。Ｃａｓ９ベースのメインエディタは、例えば、Ａ． Ａｎｚａｌｏｎｅ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ２０１９， ５７６ （７７８５）： １４９－１５７に記述され、これは全体的な参照により本明細書に組み込まれている。いくつかの実施形態では、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉエフェクタータンパク質は、逆転写酵素のドメインと融合した、本明細書でエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼのいずれかのニッカーゼバリアントを含む。いくつかの実施形態では、前記機能ドメインは逆転写酵素ドメインである。いくつかの実施形態では、前記逆転写酵素ドメインは、Ｄ２００Ｎ、Ｔ３０６Ｋ、Ｗ３１３Ｆ、Ｔ３３０Ｐ及びＬ６０３Ｗを有する１つまたは複数の変異体などのＭ－ＭＬＶ逆転写酵素またはそのバリアントである。いくつかの実施形態では、前記メインエディタを含むエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｉシステムが提供される。いくつかの実施形態では、前記エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｉシステムはまた、第２のＣａｓ１２ｉニッカーゼを含み、例えば、メインエディタと同じエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼに基づく。いくつかの実施形態では、前記エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｉシステムは、プライマー結合部位及び逆転写酵素（ＲＴ）テンプレート配列を含むプライム編集ガイドＲＮＡ（ｐｅｇＲＮＡ）を含む。
【0226】
いくつかの実施形態では、本出願は、分割型Ｃａｓ１２ｉエフェクタータンパク質部分の１つまたは２つと会合（すなわち、結合または融合）する１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６つまたはそれ以上）の機能ドメインを有する分割型Ｃａｓ１２ｉエフェクトシステムを提供する。前記機能ドメインは、構築体内の融合物として、第１及び／または第２の分割型Ｃａｓ１２ｉエフェクタータンパク質の一部として提供することができる。前記機能ドメインは、一般に、ＧＳリンカーなどのペプチドリンカーを介して分割型Ｃａｓ１２ｉエフェクタータンパク質中の他の部分（例えば、分割型Ｃａｓ１２ｉエフェクタータンパク質部分）と融合する。これらの機能ドメインは、触媒不活性化Ｃａｓ１２ｉエフェクタータンパク質に基づいて分割型Ｃａｓ１２ｉエフェクトシステムを再変換する機能に使用することができる。
【0227】
いくつかの実施形態では、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉエフェクタータンパク質は、１つまたは複数の核局在配列（ＮＬＳ）及び／または１つまたは複数の核外輸送配列（ＮＥＳ）を含む。例示的なＮＬＳ配列は、例えば、ＰＫＫＫＲＫＶＰＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６６）及びＡＳＰＫＫＫＲＫＶ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６７）を含む。ＮＬＳ及び／又はＮＥＳは、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉエフェクタータンパク質のＮ末端及び／又はＣ末端又は前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉエフェクタータンパク質中のポリペプチド鎖に動作可能に連結することができる。いくつかの実施形態では、ＮＬＳ及び／またはＮＥＳは、本発明による任意のエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼまたはその機能バリアントのＮ末端及び／またはＣ末端に連結することができる。
【0228】
いくつかの実施形態では、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉエフェクタータンパク質は、レポータータンパク質などの追加の成分をコードすることができる。いくつかの実施形態では、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉエフェクタータンパク質は、蛍光タンパク質、例えばＧＦＰを含む。このようなシステムは、ゲノム部位のイメージングを可能にすることができる（例えば、「Ｄｙｎａｍｉｃ Ｉｍａｇｉｎｇ ｏｆ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｌｏｃｉ ｉｎ Ｌｉｖｉｎｇ Ｈｕｍａｎ Ｃｅｌｌｓ ｂｙａｎ Ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ Ｓｙｓｔｅｍ」Ｃｈｅｎ Ｂ ｅｔａｌ．Ｃｅｌｌ２０１３を参照）。いくつかの実施形態では、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉエフェクタータンパク質は、ゲノム部位のイメージングに有用な誘導可能な分割型Ｃａｓ１２ｉエフェクターシステムである。
【0229】
いくつかの実施形態では、エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉエフェクタータンパク質を提供し、そのうち、前記エフェクタータンパク質はＤＮＡ分子中の二本鎖切断または一本鎖切断を誘導することができる。
【0230】
いくつかの実施形態では、エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉエフェクタータンパク質を提供し、そのうち、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼの機能的誘導体が、Ｄ５９９Ａ、Ｅ８３３Ａ、Ｓ８８３Ａ、Ｈ８８４Ａ、Ｄ８８６Ａ、Ｒ９００Ａ、及び／またはＤ１０１９Ａを含むＣａｓ１２ｉ２ヌクレアーゼ不活性変異体（前記アミノ酸位置はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示される対応するアミノ酸位置に定義される）、及びＤ６４７Ａ、Ｅ８９４Ａ及び／またはＤ９４８ＡのＣａｓ１２ｉ１ヌクレアーゼ不活性変異体（前記アミノ酸位置はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３に示される対応するアミノ酸位置によって定義される）である。既知のＣａｓ１２ｉ２ヌクレアーゼの酵素不活化変異体、例えば、ＵＳ１０８０８２４５Ｂ２及びＨｕａｎｇ Ｘ．ｅｔａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ、１１、Ａｒｔｉｃｌｅ ｎｕｍｂｅｒ：５２４１（２０２０）に記載のＣａｓ１２ｉ２ヌクレアーゼのいかなる酵素不活化変異も、本出願における変異と組み合わせて、エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼの機能的誘導体及びそれに対応するエフェクタータンパク質を提供することができる。
【0231】
エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１２ｉシステム
いくつかの実施形態では、エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１２ｉシステムを提供し、（ａ）本出願に記載のいずれかのエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉエフェクタータンパク質（例えば、エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼまたはその機能バリアント、例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に示すＣａｓＸＸ）、及び（ｂ）ターゲット配列に相補的なガイド配列を含むガイドＲＮＡ、または前記ガイドＲＮＡをコードする１つまたは複数の核酸を含む；
そのうち、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉエフェクタータンパク質及び前記ガイドＲＮＡは、前記ターゲット配列の標的核酸を含み、前記標的核酸の修飾（例えば、二本鎖又は一本鎖切断、塩基編集など）を誘導するＣＲＩＳＰＲ複合体を形成することができる。本明細書の文脈において、「修飾」という用語は、核酸二本鎖または一本鎖上の標的部位に対するヌクレアーゼの切断、塩基編集、置換、修復などを含む。
いくつかの実施形態では、エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１２ｉシステムを提供し、（ａ）本出願に記載のいずれかのエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉエフェクタータンパク質（例えば、エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼまたはその機能バリアント、例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に示すＣａｓＸＸ）、及び（ｂ）ターゲット配列に相補的なガイド配列を含むガイドＲＮＡ、または前記ガイドＲＮＡをコードする１つまたは複数の核酸を含む；
そのうち、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉエフェクタータンパク質及び前記ガイドＲＮＡは、前記ターゲット配列の標的核酸を含み、前記標的核酸の修飾（例えば、二本鎖又は一本鎖切断、塩基編集など）を誘導するＣＲＩＳＰＲ複合体を形成することができる。本明細書の文脈において、「修飾」という用語は、核酸二本鎖または一本鎖上の標的部位に対するヌクレアーゼの切断、塩基編集、置換、修復などを含む。
【0232】
いくつかの実施形態では、前記エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１２ｉシステムは、（ａ）本明細書で記載されたエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉエフェクタータンパク質のいずれか（例えば、エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼまたはその機能性バリアントのいずれか、またはエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼまたはその機能性バリアントに基づくニッカーゼ、分割型Ｃａｓ１２ｉ、転写リプレッサー質、転写アクチベーター、塩基エディター、またはメインエディタ）、及び（ｂ）ターゲット配列に相補的なガイド配列を含むガイドＲＮＡ、または前記ガイドＲＮＡをコードする１つまたは複数の核酸を含む；そのうち、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉエフェクタータンパク質及びガイドＲＮＡは、前記ターゲット配列を含む標的核酸に特異的に結合し、前記標的核酸の修飾（例えば、二本鎖又は一本鎖切断、塩基編集など）を誘導するＣＲＩＳＰＲ複合体を形成することができる。いくつかの実施形態では、前記エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１２ｉシステムは、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉエフェクタータンパク質（例えば、エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼまたはその機能バリアント、例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に示されるＣａｓＸＸ）及び／または前記ガイドＲＮＡの１つまたは複数の核酸を含む。いくつかの実施形態では、前記エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１２ｉシステムは、例えばエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉエフェクタータンパク質によって複数のｃｒＲＮＡに加工されることができる前駆体ガイドＲＮＡアレイを含む。いくつかの実施形態では、前記エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１２ｉシステムは、エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉエフェクタータンパク質及び／またはガイドＲＮＡをコードする１つまたは複数のベクターを含む。いくつかの実施形態では、前記エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１２ｉシステムは、前記ガイドＲＮＡに結合した前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉエフェクタータンパク質を含む、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を含む。
【0233】
本出願のエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１２ｉシステムは、任意の適切なガイドＲＮＡを含むことができる。ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）は、細胞中の標的ゲノム部位などの標的核酸中のターゲット配列とハイブリダイゼーション可能なガイド配列を含むことができる。いくつかの実施形態では、前記ｇＲＮＡは、前記ガイド配列を含むＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）配列を含む。
【0234】
一般的に、本明細書に記載のｃｒＲＮＡは、直接リピート配列及びスペーサー配列を含む。ある実施形態では、前記ｃｒＲＮＡは、ガイド配列またはスペーサー配列に連結された直接リピート配列を含み、基本的にはそれで構成され、またはそれで構成される。いくつかの実施形態では、前記ｃｒＲＮＡは、直接リピート配列、スペーサー配列、及び直接リピート配列（ＤＲ－スペーサー配列－ＤＲ）を含み、それは、前駆体ｃｒＲＮＡ（ｐｒｅ－ｃｒＲＮＡ）構造の典型的な特徴である。いくつかの実施形態では、前記ｃｒＲＮＡは、加工されたまたは成熟したｃｒＲＮＡの典型的な特徴である、トランケートされた直接リピート配列及びスペーサー配列を含む。いくつかの実施形態では、前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１２ｉエフェクタータンパク質はＲＮＡガイド配列と複合体を形成し、前記スペーサー配列は、前記複合体を、スペーサー配列と相補的な（例えば、少なくとも７０％相補的な）標的核酸と配列特異的に結合するように誘導する。
【0235】
いくつかの実施形態では、前記ガイドＲＮＡはガイド配列を含むｃｒＲＮＡである。いくつかの実施形態では、前記エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１２ｉシステムは、複数のｃｒＲＮＡをコードする前駆体ガイドＲＮＡアレイを含む。いくつかの実施形態では、前記Ｃａｓ１２ｉエフェクタータンパク質は、複数のｃｒＲＮＡを生成するために前記前駆体ガイドＲＮＡアレイを切断する。いくつかの実施形態では、前記エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１２ｉシステムは、複数のｃｒＲＮＡをコードする前駆体ガイドＲＮＡアレイを含み、各ｃｒＲＮＡは異なるガイド配列を含む。
【0236】
構築物とベクター
本明細書はまた、本明細書に記載のエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉエフェクタータンパク質（例えば、エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼまたはその機能バリアント）のいずれかをコードする構築物、ベクター、及び発現システムを提供する。いくつかの実施形態では、前記構築物、ベクター、または発現システムは、１つまたは複数のｇＲＮＡまたはｃｒＲＮＡアレイをさらに含む。
本明細書はまた、本明細書に記載のエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉエフェクタータンパク質（例えば、エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼまたはその機能バリアント）のいずれかをコードする構築物、ベクター、及び発現システムを提供する。いくつかの実施形態では、前記構築物、ベクター、または発現システムは、１つまたは複数のｇＲＮＡまたはｃｒＲＮＡアレイをさらに含む。
【0237】
「ベクター」は、分離された核酸を含み、分離された核酸を細胞内部に送達するために使用することができる物質組成物である。多くのベクターは当技術分野で知られ、線状ポリヌクレオチド、イオンまたは両親媒性化合物と会合するポリヌクレオチド、プラスミド、及びウイルスを含むが、これらに限定されない。一般に、適切なベクターは、少なくとも１つの生物において作用する複製開始点、プロモーター配列、便利な制限的ヌクレオチダーゼ部位、及び１つまたは複数の選択的マーカーを含む。用語「ベクター」はまた、例えばポリリジン化合物、リポソームなどの核酸の細胞への転移を促進する非プラスミド及び非ウイルス化合物を含むと解釈されるべきである。
【0238】
いくつかの実施形態では、前記ベクターはウイルスベクターである。ウイルスベクターの例としては、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター及びその誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、前記ベクターはファージベクターである。ウイルスベクター技術は当技術分野で周知であり、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら（２００１， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、その他のウイルス学及び分子生物学的マニュアルに記載されている。
【0239】
哺乳動物細胞に遺伝子を導入するために、ウイルスに基づく多くのシステムが開発されてきた。例えば、レトロウイルスは遺伝子送達システムに便利なプラットフォームを提供する。異種核酸は、当該技術分野で公知の技術を用いてベクターに挿入され、レトロウイルス粒子中に包装されてもよい。次いで、組換えウイルスを分離し、インビトロまたはエクスビボで哺乳動物細胞に送達することができる。多くのレトロウイルスシステムは当技術分野で知られている。いくつかの実施形態では、アデノウイルスベクターが使用される。多くのアデノウイルスベクターは当技術分野で知られている。いくつかの実施形態では、レンチウイルスベクターが使用される。いくつかの実施形態では、自己不活化レンチウイルスベクターを使用する。
【0240】
ある実施形態では、前記ベクターは、アデノ随伴ウイルス (ＡＡＶ) ベクター、たとえばＡＡＶ２、ＡＡＶ８、または ＡＡＶ９であり、それは少なくとも１×１０５個の粒子（粒子単位、ｐｕとも呼ばれる）を含む単回投与によってアデノウイルスまたはアデノ随伴ウイルスを投与してもよい。いくつかの実施形態では、前記投与量は少なくとも約１×１０６個の粒子、少なくとも約１×１０７個の粒子、少なくとも約１×１０８個の粒子、または少なくとも約１×１０９の粒子のアデノ随伴ウイルス。送達方法及び投与量は、ＷＯ２０１６２０５７６４及び米国特許第８４５４９７２号に記載され、全体的な参照により本明細書に組み込まれる。
【0241】
いくつかの実施形態では、前記ベクターは組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターである。例えば、いくつかの実施形態では、修飾されたＡＡＶベクターによる送達を使用することができる。修飾されたＡＡＶベクターは、ＡＡＶ１、ＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、ＡＡＶ８．２、ＡＡＶ９、ＡＡＶ ｒｈ１０、修飾されたＡＡＶベクター（例えば、修飾されたＡＡＶ２、修飾されたＡＡＶ３、修飾されたＡＡＶ６）及び偽ＡＡＶ（例えば、ＡＡＶ２／８、ＡＡＶ２／５及びＡＡＶ２／６）を含むいくつかのカプシドタイプのうちの１つ以上に基づくことができる。ｒＡＡＶ粒子の生成に用いることができる例示的なＡＡＶベクター及び技術は、当技術分野で知られている（例えば、Ａｐｏｎｔｅ－Ｕｂｉｌｌｕｓ ｅｔａｌ．（２０１８）Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１０２（３）：１０４５－５４；Ｚｈｏｎｇ ｅｔａｌ． （２０１２） Ｊ． Ｇｅｎｅｔ． Ｓｙｎｄｒ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． Ｓ１： ００８；Ｗｅｓｔ ｅｔａｌ． （１９８７） Ｖｉｒｏｌｏｇｙ１６０：３８－４７（１９８７）；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ ｅｔａｌ． （１９８５） Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．５：３２５１－６０；米国特許Ｎｏ．４７９７３６８及び５１７３４１４、国際公開第ＷＯ２０１５／０５４６５３号と第ＷＯ９３／２４６４１号を参照し、それぞれ参照により本明細書に組み込まれている）。
【0242】
Ｃａｓ９及び他のＣａｓタンパク質を送達するための任意の公知のＡＡＶベクターは、本出願のエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉシステムを送達するために使用することができる。
【0243】
いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ構築物は、経腸的に被験者に投与することができる。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ構築物は非経口的に被験者に投与することができる。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、皮下、眼内、硝子体内、網膜下、静脈内（ＩＶ）、脳室内、筋肉内、鞘内（ＩＴ）、脳槽内、腹膜内、吸入、局所的または直接注射により１つまたは複数の細胞、組織または器官に注射することができる。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は肝動脈または門脈に注射することによって被験者に投与することができる。
【0244】
哺乳動物細胞にベクターを導入する方法は当技術分野で知られている。ベクターは、物理的、化学的、または生物学的方法によって宿主細胞に移すことができる。
【0245】
ベクターを宿主細胞に導入するための物理的方法としては、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション、粒子ボンバードメント、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションなどが挙げられる。ベクター及び／または外因性核酸を含む細胞を産生する方法は、当技術分野で周知である。Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔａｌ．（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋなどを参照。いくつかの実施形態では、前記ベクターはエレクトロポレーションによって細胞に導入される。
【0246】
異種核酸を宿主細胞に導入するための生物学的方法としては、ＤＮＡ及びＲＮＡベクターの使用が挙げられる。ウイルスベクターは、ヒト細胞などの哺乳動物に遺伝子を挿入する最も広く用いられる方法となっている。
【0247】
ベクターを宿主細胞に導入するための化学的方法は、高分子複合体、ナノカプセル、マイクロスフェア、ビーズ、及び脂質ベースシステムなどのコロイド分散系を含み、前記脂質ベースシステムには水中油エマルジョン、ミセル、混合ミセル、及びリポソームを含む。インビトロ送達ベクターとして使用される典型的なコロイド系は、リポソーム（例えば、人工膜小胞）である。いくつかの実施形態では、前記エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１２ｉシステムは、ＲＮＰの形態でナノ粒子中に送達される。
【0248】
いくつかの実施形態では、前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１２ｉシステムまたはその成分をコードするベクターまたは発現システムは、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１２ｉシステム（例えば、初期及び大規模）によって修飾された細胞を分離または効率的に選択する手段を提供する１つまたは複数の選択可能または検出可能なマーカーを含む。
【0249】
レポーター遺伝子は、トランスフェクションの可能性がある細胞を同定し、調節配列の機能を評価するために使用することができる。一般に、レポーター遺伝子は受容体生体または組織中に存在しないか、または発現しない遺伝子であり、コードされるポリペプチドの発現は、酵素活性などの検出しやすい性質によって証明される。ＤＮＡを受容体細胞に導入した後の適切な時間において、レポーター遺伝子の発現を決定する。適切なレポーター遺伝子には、ルシフェラーゼを、β－ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、分泌されるアルカリホスファターゼをコードする遺伝子または緑色蛍光タンパク質遺伝子（例えば、Ｕｉ－Ｔｅｉ ｅｔａｌ．ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ４７９：７９－８２（２０００）））を含むことができる。
【0250】
宿主細胞中の異種核酸の存在を確認する他の方法としては、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ及びＮｏｒｔｈｅｒｎブロッティング、ＲＴ－ＰＣＲ及びＰＣＲなどの当業者に周知の分子生物学的アッセイ、ＥＬＩＳＡ及びＷｅｓｔｅｒｎブロッティングなどの免疫学的方法により特定のペプチドの存在又は不存在を検出する生化学的アッセイを含む。
【0251】
いくつかの実施形態では、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉエフェクタータンパク質及び／または前記ガイドＲＮＡをコードする核酸配列はプロモーターと動作可能に連結される。いくつかの実施形態では、前記プロモーターは、前記エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１２ｉシステムを用いて工学的に改変される細胞の内因性プロモーターである。例えば、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉエフェクタータンパク質をコードする核酸は、当該技術分野で知られている任意の方法を用いてエンジニアリングされた哺乳類細胞のゲノム中で内因性プロモーターの下流に位置するようにノックインすることができる。いくつかの実施形態では、内因性プロモーターは豊富なタンパク質（例えば、β－アクチン）のプロモーター。いくつかの実施形態では、前記内因性プロモーターは誘導可能なプロモーターであり、例えば、エンジニアリングされた哺乳類細胞の内因性活性化シグナルによって誘導することができる。いくつかの実施形態では、前記エンジニアリングされた哺乳類細胞はＴ細胞であり、前記プロモーターはＴ細胞活性化依存プロモーター（ＩＬ－２プロモーター、ＮＦＡＴプロモーター、またはＮＦκＢプロモーターなど）である。
【0252】
いくつかの実施形態では、前記プロモーターは、前記エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１２ｉシステムを用いて工学的に改変される細胞に対する異種プロモーターである。哺乳動物細胞中で遺伝子を発現するために複数のプロモーターが探索され、当技術分野で知られている任意のプロモーターが本出願に使用できる。プロモーターは、構成型プロモーターまたは制御されたプロモーター、例えば誘導型プロモーターに大別することができる。
【0253】
いくつかの実施形態では、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉエフェクタータンパク質及び／またはガイドＲＮＡをコードする核酸配列は、構成型プロモーターと動作可能に連結される。構成型プロモーターは、異種遺伝子（トランスジェニックとも呼ばれる）の宿主細胞中での構成的発現を可能にする。本明細書で考慮される例示的な構成型プロモーターにはサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ヒト伸長因子－１α （ｈＥＦ１α）、ユビキチンＣプロモーター（ＵｂｉＣ）、ホスホグリセロールキナーゼプロモーター（ＰＧＫ）、シミアンマウイルス４０初期プロモーター（ＳＶ４０）及びニワトリβ－アクチンプロモーターとＣＭＶ最初期エンハンサー（ＣＡＧ）と結合したものを含むが、それに限定されない。いくつかの実施形態では、前記プロモーターはＣＡＧプロモーターであり、それが、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期エンハンサー要素、プロモーター、ニワトリβ－アクチン遺伝子の第１のエクソンと第１のイントロン、及びウサギβ－グロビン遺伝子のスプライシング受容体を含む。
【0254】
いくつかの実施形態では、前記エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１２ｉエフェクタータンパク質及び／または前記ＲＮＡをコードする核酸配列は、誘導型プロモーターに動作可能に連結される。誘導型プロモーターは制御されたプロモータータイプに属する。誘導型プロモーターは、物理的条件、微小環境、または宿主細胞の生理的状態、誘導物（すなわち誘導剤）、またはそれらの組み合わせなどの１つまたは複数の条件によって誘導することができる。いくつかの実施形態では、前記誘導条件は、誘導剤、照射（例えば電離放射線、光）、温度（例えば熱）、酸化還元状態、腫瘍環境、及びエンジニアリングされるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１２ｉシステムによって工学的に改造されるべき細胞の活性化状態の群から選択される。いくつかの実施形態では、前記プロモーターは化合物などの小分子誘導剤によって誘導されてもよい。いくつかの実施形態では、前記小分子は、ドキシサイクリン、テトラサイクリン、アルコール、金属またはステロイドの群から選択される。化学誘導プロモーターは最も広く研究されている。そのようなプロモーターには、その転写活性がドキシサイクリン、テトラサイクリン、アルコール、ステロイド、金属及び他の化合物の存在または非存在によって調節される小分子化学物質を含む。逆テトラサイクリン制御性トランス活性化因子（ｒｔＴＡ）とテトラサイクリン応答素子プロモーター（ＴＲＥ）を有するドキシサイクリン誘導システムは現在最も成熟したシステムである。ＷＯ９４２９４４２は、テトラサイクリン応答性プロモーターによる真核細胞中の遺伝子発現の厳格な制御を記述している。ＷＯ９６０１３１３はテトラサイクリン調節転写調節剤を開示している。さらに、Ｔｅｔ－ｏｎシステムのようなＴｅｔ技術は、例えばＴｅｔＳｙｓｔｅｍｓ．ｃｏｍウェブサイトに記載されている。本出願では、前記エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１２ｉタンパク質をコードする、及び／または前記ガイドＲＮＡの発現を駆動するために、任意の既知の化学的調節プロモーターを使用することができる。
【0255】
いくつかの実施形態では、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉエフェクタータンパク質をコードする核酸配列はコドンによって最適化される。
【0256】
いくつかの実施形態では、コドンによって最適化された配列を含む発現構築物が提供され、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉエフェクタータンパク質をコードするこの配列は、ＢＰＫ２１０４－ｃｃｄＢベクターに結合される。いくつかの実施形態では、前記発現構築物は、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉエフェクタータンパク質のＣ末端に動作可能に連結されたラベル（例えば１０×Ｈｉｓラベル）をコードする。
【0257】
いくつかの実施形態では、各エンジニアリングされた分割型Ｃａｓ１２ｉ構築物は、ＧＦＰまたはＲＦＰなどの蛍光タンパク質をコードする。前記レポータータンパク質は、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉタンパク質の共局在化及び／または二量化の、例えば顕微鏡を用いた評価に使用されることができる。エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉエフェクタータンパク質をコードする核酸配列は、Ｔ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｅ２ＡまたはＦ２Ａペプチドなどの自己切断ペプチドをコードする配列を用いて、追加の成分をコードする核酸配列と融合されることができる。
【0258】
いくつかの実施形態では、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉエフェクタータンパク質をコードする核酸配列を含む、哺乳動物細胞（例えばヒト細胞）に用いる発現構築物が提供される。いくつかの実施形態では、前記発現構築物は、ｐＣＡＧ－２Ａ－ｅＧＦＰベクターに挿入されたエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉエフェクタータンパク質をコードするコドン最適化配列を含み、それによりＣａｓ１２ｉタンパク質をｅＧＦＰに動作可能に連結する。いくつかの実施形態では、哺乳動物細胞（例えばヒト細胞）におけるガイドＲＮＡ（例えばｃｒＲＮＡ又は前駆体ｃｒＲＮＡアレイ）の発現のための第２のベクターが提供される。いくつかの実施形態では、前記ガイドＲＮＡをコードする配列は、ｐＵＣ１９－Ｕ６－ｉ２－ｃｒ ＲＮＡベクター主鎖中で発現する。
【0259】
いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１２ｉシステムの１つまたは複数の要素が発現した１つまたは複数のベクターが宿主細胞に導入され、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１２ｉシステムの要素の発現が１つまたは複数の標的部位での核酸標的化複合体の形成をガイドする。例えば、Ｃａｓ１２ｉ核酸標的化エフェクター酵素及び核酸標的化ガイドＲＮＡは、それぞれ別々のベクター上の別々の調節要素に動作可能に連結することができる。核酸標的化システムのＲＮＡは、トランスジェニックＣａｓ１２ｉ核酸標的化エフェクタータンパク質動物または哺乳動物、例えば、核酸標的化エフェクタータンパク質を構成的または誘導的または条件付きで発現する動物または哺乳動物に送達することができ、あるいは核酸標的エフェクタータンパク質または核酸標的エフェクタータンパク質を含む細胞を有する動物または哺乳動物に、ほかの方法例えば、インビボ核酸標的化エフェクタータンパク質をコードし発現する１つまたは複数のベクターを事前に投与することにより発現することができる。あるいは、同一または異なる制御要素によって発現される２つ以上の要素を単一のベクターに組み込むことができ、一方、１つまたは複数の追加のベクターは、第１のベクターに含まれない核酸標的化システムの任意の成分を提供する。単一のベクターに組み込まれた核酸標的化系要素は、例えば、１つの要素が第２の要素に対して（「上流」）５′に位置しているか、または第２の要素に対して（「下流」）３′に位置しているかのように、任意の適切な方向に配列することができる。１つの要素のコード配列は、第２の要素のコード配列のセンス鎖またはアンチセンス鎖上に位置し、同一または逆の方向に配向することができる。いくつかの実施形態では、単一プロモーターが、Ｃａｓ１２ｉ核酸標的化エフェクタータンパク質及び核酸標的化ガイドＲＮＡをコードする転写物の発現を駆動し、前記転写物は１つまたは複数のイントロン配列内に組み込まれた（例えば、それぞれが異なるイントロン中に、２つ以上は少なくとも１つのイントロン中に、又はすべては単一イントロン中に）。いくつかの実施形態では、核酸標的化エフェクタータンパク質及び核酸標的化ガイドＲＮＡは、同じプロモーターに動作可能に連結され、同じプロモーターで発現することができる。核酸標的化システムの１つまたは複数の要素を発現するための送達媒体、ベクター、粒子、ナノ粒子、製剤、及びその成分は、ＷＯ２０１４／０９３６２２（ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４６６７）などの上述の文書で使用されている通りである。いくつかの実施形態では、ベクターは１つまたは複数の挿入部位、例えば制限エンドヌクレアーゼ認識配列（「クローニング部位」とも呼ばれる）を含む。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の挿入部位（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上の挿入部位）は、１つまたは複数のベクターの１つまたは複数の配列要素の上流及び／または下流に位置する。複数の異なるガイド配列を使用する場合、単一発現構築物を使用して、核酸標的化活性を細胞内の複数の異なる対応するターゲット配列に標的化することができる。例えば、単一ベクターは、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０またはそれ以上のガイド配列を含むことができる。いくつかの実施形態では、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上のこのようなガイド配列を含むベクターを提供し、任意に細胞に送達することができる。いくつかの実施形態では、ベクターは、核酸標的化エフェクタータンパク質をコードする酵素コード配列に動作可能に連結された制御要素を含む。Ｃａｓ１２ｉ核酸標的化エフェクタータンパク質又は１種以上の核酸標的化ガイドＲＮＡは別々に送達することができ、そして有利には、これらのうちの少なくとも１つは粒子複合体を介して送達される。Ｃａｓ１２ｉ核酸標的化エフェクタータンパク質を発現する時間を残すために、核酸標的化ガイドＲＮＡの前に核酸標的化エフェクタータンパク質ｍＲＮＡを送達することができる。核酸標的化エフェクタータンパク質ｍＲＮＡは、核酸標的化ガイドＲＮＡを投与する１～１２時間前（好ましくは約２～６時間）に投与することができる。あるいは、核酸標的化エフェクタータンパク質ｍＲＮＡと核酸標的化ガイドＲＮＡとを一緒に投与することができる。有利には、最初に核酸標的化エフェクタータンパク質ｍＲＮＡ＋ガイドＲＮＡを投与した後１～１２時間（好ましくは約２～６時間）にガイドＲＮＡの第２強化用量を投与することができる。核酸標的化エフェクタータンパク質ｍＲＮＡ及び／またはガイドＲＮＡの他の投与を指示することは、最も有効なゲノム修飾レベルを達成するのに有用である可能性がある。
【0260】
いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１２ｉシステムを提供し、（１）いずれかに記載のエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉエフェクタータンパク質（いずれかに記載のエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼまたはその機能バリアント）、またはいずれかに記載のエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉエフェクタータンパク質をコードするポリヌクレオチドと、（２）ｃｒＲＮＡまたはｃｒＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを含み、前記ｃｒＲＮＡは（ｉ）標的ＤＮＡのターゲット配列とハイブリダイズすることができるスペーサー配列と、（ｉｉ）スペーサー配列に連結され、エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉエフェクタータンパク質を、ターゲット配列を標的とするＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１２ｉ複合体を形成するために前記ｃｒＲＮＡに結合させることを誘導することができる直接リピート配列とを含む。
【0261】
いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１２ｉシステムを提供し、それは一つまたは複数のベクターを含み、前記１つまたは複数のベクターは（１）前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉエフェクタータンパク質（例えば、エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼまたはその機能バリアント）のいずれかをコードするヌクレオチド配列に動作可能に連結された第１の調節要素と、（２）ｃｒＲＮＡをコードするポリヌクレオチドに動作可能に連結された第２の制御要素を含む。前記ｃｒＲＮＡは（ｉ）標的ＤＮＡのターゲット配列とハイブリダイズすることができるスペーサー配列と、（ｉｉ）前記スペーサー配列に連結された、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉエフェクタータンパク質を前記ｃｒＲＮＡに結合させて前記ターゲット配列を標的とするＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１２ｉ複合体を形成することが誘導可能な直接リピート配列とを含み、前記第１の制御要素と前記第２の制御要素は、前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１２ｉシステムの同一又は異なるベクター上に位置する。
【0262】
いくつかの実施形態では、前記第１の制御要素及び第２の制御要素は、前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１２ｉシステムの異なるベクター上に配置される。いくつかの実施形態では、前記第１の制御要素と前記第２の制御要素は、前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１２ｉシステムの同じベクター上に配置される。いくつかの実施形態では、前記第１の制御要素及び前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉエフェクタータンパク質をコードするヌクレオチド配列は、前記第２の制御要素及び前記ｃｒＲＮＡをコードするポリヌクレオチドの上流にある。いくつかの実施形態では、前記第１の制御要素及び前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉエフェクタータンパク質をコードするヌクレオチド配列は、前記第２の制御要素及び前記ｃｒＲＮＡをコードするポリヌクレオチドの下流にある。いくつかの実施形態では、前記第１の制御要素と前記第２の制御要素は同じである。いくつかの実施形態では、前記第１の制御要素と前記第２の制御要素は異なる。
【0263】
いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１２ｉシステムを提供し、それは一つのベクターを含み、前記ベクターは（１）いずれかの前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉエフェクタータンパク質（エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼまたはその機能バリアントのいずれか）をコードするポリヌクレオチド、（２）ｃｒＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを含み、前記ｃｒＲＮＡは、（ｉ）標的ＤＮＡのターゲット配列とハイブリダイズすることができるスペーサー配列と、（ｉｉ）前記スペーサー配列に連結され、前記エンジニアリングＣａｓ１２ｉエフェクタータンパク質を前記ｃｒＲＮＡに結合させて前記ターゲット配列を標的とするＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１２ｉ複合体を形成することを誘導することができる直接リピート配列と、（３）前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉエフェクタータンパク質をコードするポリヌクレオチドと前記ｃｒＲＮＡをコードするポリヌクレオチドとに動作可能に連結される制御要素とを含む。
【0264】
いくつかの実施形態では、前記ベクターは、５’から３’まで、前記制御要素、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉエフェクタータンパク質をコードするポリヌクレオチド、及び前記ｃｒＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、前記ベクターは、５’から３’まで、前記制御要素、前記ｃｒＲＮＡをコードするポリヌクレオチド、及び前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉエフェクタータンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、前記ｃｒＲＮＡをコードするポリヌクレオチド及び前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉエフェクタータンパク質をコードするポリヌクレオチドはリンカー配列例えば、Ｐ２Ａ、Ｔ２Ａ、Ｅ２Ａ、Ｆ２Ａ、ＢｍＣＰＶ２Ａ、ＢｍＩＦＶ２Ａ、（ＧＳ）ｎ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７４）、（ＧＧＳ）ｎ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７５）及び（ＧＧＧＳ）ｎ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７６）のいずれかをコードするポリヌクレオチド配列（ｎは少なくとも１の整数）、又はいずれのＩＲＥＳ、ＳＶ４０、ＣＭＶ、ＵＢＣ、ＥＦ１α、ＰＧＫ及びＣＡＧＧのポリヌクレオチド配列、またはそれらの任意の組み合わせによって結合される。
【0265】
いくつかの実施形態では、本発明に記載されたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１２ｉシステムの成分は、ＤＮＡ／ＲＮＡまたはＲＮＡ／ＲＮＡまたはタンパク質ＲＮＡの組み合わせなど、様々な形態で送達され得る。例えば、エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉエフェクタータンパク質（前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼまたはその機能バリアントのいずれか）は、ＤＮＡをコードするポリヌクレオチドとして、またはＲＮＡをコードするポリヌクレオチドとして、またはタンパク質として送達されることができる。前記ガイドは、ＤＮＡコードポリヌクレオチドまたはＲＮＡとして送達されることができる。混合された送達方法を使用してもよい。
【0266】
いくつかの態様では、本発明は、１つまたは複数のポリヌクレオチド、例えば、本明細書に記載の１つまたは複数のベクター、その１つまたは複数の転写物、及び／またはそれから転写された１つまたは複数のタンパク質を宿主細胞に送達することを含む方法を提供する。
【0267】
ＩＩＩ．使用方法
本出願は、本明細書に記載のエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉエフェクタータンパク質（前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼまたはその機能バリアントのいずれか）またはＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１２ｉシステムのいずれかを用いて標的核酸または修飾核酸をインビトロ、エクスビボ、またはインビボで検出する方法、及び前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉエフェクタータンパク質またはＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１２ｉシステムを用いて治療（例えば遺伝子編集）または診断する方法を提供する。また細胞中の核酸を検出または修飾するための本明細書に記載のエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉエフェクタータンパク質またはＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１２ｉシステム、ならびに被験者の疾患または状態を治療または診断するための用途、及び細胞中の核酸の検出または修飾、ならびに被験者の疾患または状態の治療または診断のための医薬品の製造における、エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉエフェクタータンパク質のいずれかまたは前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉエフェクタータンパク質の１つまたは複数の成分を含む組成物の用途を提供する。
本出願は、本明細書に記載のエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉエフェクタータンパク質（前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼまたはその機能バリアントのいずれか）またはＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１２ｉシステムのいずれかを用いて標的核酸または修飾核酸をインビトロ、エクスビボ、またはインビボで検出する方法、及び前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉエフェクタータンパク質またはＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１２ｉシステムを用いて治療（例えば遺伝子編集）または診断する方法を提供する。また細胞中の核酸を検出または修飾するための本明細書に記載のエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉエフェクタータンパク質またはＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１２ｉシステム、ならびに被験者の疾患または状態を治療または診断するための用途、及び細胞中の核酸の検出または修飾、ならびに被験者の疾患または状態の治療または診断のための医薬品の製造における、エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉエフェクタータンパク質のいずれかまたは前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉエフェクタータンパク質の１つまたは複数の成分を含む組成物の用途を提供する。
【0268】
試料中の標的核酸の検出方法
本出願はまた、改善された活性を有する前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉエフェクタータンパク質またはＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１２ｉシステムのいずれかを用いて標的核酸を検出する方法を提供する。検出試薬としてＣａｓ１２ｉエフェクタータンパク質を使用することは、標的ＤＮＡを検出することによって活性化されると、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ１２ｉ）は、非標的一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡまたはＲＮＡ、すなわちガイドＲＮＡのガイド配列がハイブリダイズしない一本鎖核酸）を混在して切断することができることが利用できる。したがって、試料中に標的ＤＮＡ（二本鎖または一本鎖）が存在する場合（例えば、場合によっては閾値量を超える）、その結果、試料中の一本鎖核酸の切断であり、これは任意の便利な検出方法を用いて検出することができる（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡなどのラベル付き一本鎖を用いて検出する）。Ｃａｓ１２ｉはｓｓＤＮＡとｓｓＲＮＡを切断することができる。例えば、Ｃａｓタンパク質を検出試薬として使用する方法は、ＵＳ１０２５３３６５及びＷＯ２０２０／０５６９２４に記載され、全体的な参照により本明細書に組み込まれる。
本出願はまた、改善された活性を有する前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉエフェクタータンパク質またはＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１２ｉシステムのいずれかを用いて標的核酸を検出する方法を提供する。検出試薬としてＣａｓ１２ｉエフェクタータンパク質を使用することは、標的ＤＮＡを検出することによって活性化されると、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ１２ｉ）は、非標的一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡまたはＲＮＡ、すなわちガイドＲＮＡのガイド配列がハイブリダイズしない一本鎖核酸）を混在して切断することができることが利用できる。したがって、試料中に標的ＤＮＡ（二本鎖または一本鎖）が存在する場合（例えば、場合によっては閾値量を超える）、その結果、試料中の一本鎖核酸の切断であり、これは任意の便利な検出方法を用いて検出することができる（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡなどのラベル付き一本鎖を用いて検出する）。Ｃａｓ１２ｉはｓｓＤＮＡとｓｓＲＮＡを切断することができる。例えば、Ｃａｓタンパク質を検出試薬として使用する方法は、ＵＳ１０２５３３６５及びＷＯ２０２０／０５６９２４に記載され、全体的な参照により本明細書に組み込まれる。
【0269】
いくつかの実施形態では、試料中の標的ＤＮＡ（例えば、二本鎖または一本鎖）を検出する方法が提供され、それは、（ａ）前記試料を、（ｉ）本明細書に記載のエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉエフェクタータンパク質（いずれかのエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼまたはその機能バリアント）、（ｉｉ）前記標的ＤＮＡとハイブリダイゼーションするためのガイド配列を含むガイドＲＮＡ、及び（ｉｉｉ）一本鎖（すなわち「一本鎖検出核酸」）であって、前記ガイドＲＮＡのガイド配列とハイブリダイズしない検出核酸のいずれかを接触させることと、（ｂ）前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉエフェクタータンパク質によって前記一本鎖検出核酸を切断することによって生成される検出可能なシグナルを測定することとを含む。場合によっては、前記一本鎖検出核酸は、蛍光を放出する染料対（例えば、蛍光を放出する染料対は蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）対、消光剤／蛍光対）を含む。場合によっては、前記標的ＤＮＡはウイルスＤＮＡ（例えば、パピローマウイルス、ヘパドナウイルス、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、ポックスウイルス、パルボウイルスなど）である。いくつかの実施形態では、前記一本鎖検出核酸はＤＮＡである。いくつかの実施形態では、前記一本鎖検出核酸はＲＮＡである。
【0270】
本開示のサンプル中の標的ＤＮＡ（一本鎖または二本鎖）を検出するための方法は、高感度で標的ＤＮＡを検出することができる。場合によっては、本開示の方法は、複数のＤＮＡ（前記標的ＤＮＡ及び複数の非標的ＤＮＡを含む）を含むサンプル中に存在する標的ＤＮＡを検出するために使用することができ、そのうち、前記標的ＤＮＡが非標的ＤＮＡ１０７個当たり１つ又は複数のコピーで存在する（例えば、非標的ＤＮＡ１０６個当たり１つ又は複数のコピー、非標的ＤＮＡ１０５個当たり１つ又は複数のコピー、非標的ＤＮＡ１０４個当たり１つ又は複数のコピー、非標的ＤＮＡ１０３個当たり１つ又は複数のコピー、非標的ＤＮＡ１０２個当たり１つ又は複数のコピー、非標的ＤＮＡ５０個当たり１つ又は複数のコピー、非標的ＤＮＡ２０個当たり１つ又は複数のコピー、非標的ＤＮＡ１０個当たり１つ又は複数のコピー、または非標的ＤＮＡ５個当たり１つまたは複数のコピー）。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉエフェクタータンパク質は、前記参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼよりも高い感度で標的ＤＮＡを検出することができる。いくつかの実施形態では、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉエフェクタータンパク質は、前記参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼと比較し、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％またはそれ以上の感度で標的ＤＮＡを検出することができる。
【0271】
修飾の方法
いくつかの実施形態では、本出願はターゲット配列を含む標的核酸を修飾する方法を提供し、前記方法は本明細書に記載のエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１２ｉシステムのいずれかに前記標的核酸を接触させることを含む。いくつかの実施形態では、前記方法はインビトロで行われる。いくつかの実施形態では、前記標的核酸は細胞中に存在する。いくつかの実施形態では、前記細胞は細菌細胞、酵母細胞、哺乳動物細胞、植物細胞または動物細胞である。いくつかの実施形態では、方法はエクスビボで行われる。いくつかの実施形態では、前記方法はインビボで行われる。標的核酸の修飾は、標的核酸の一本鎖切断、二本鎖切断、塩基置換、塩基挿入、塩基削除、変異（例えば、病原性変異）配列修復などが含まれるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、本出願はターゲット配列を含む標的核酸を修飾する方法を提供し、前記方法は本明細書に記載のエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１２ｉシステムのいずれかに前記標的核酸を接触させることを含む。いくつかの実施形態では、前記方法はインビトロで行われる。いくつかの実施形態では、前記標的核酸は細胞中に存在する。いくつかの実施形態では、前記細胞は細菌細胞、酵母細胞、哺乳動物細胞、植物細胞または動物細胞である。いくつかの実施形態では、方法はエクスビボで行われる。いくつかの実施形態では、前記方法はインビボで行われる。標的核酸の修飾は、標的核酸の一本鎖切断、二本鎖切断、塩基置換、塩基挿入、塩基削除、変異（例えば、病原性変異）配列修復などが含まれるが、これらに限定されない。
【0272】
いくつかの実施形態では、前記エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１２ｉシステムによって前記標的核酸を切断するか、または標的核酸中のターゲット配列を変化させる。いくつかの実施形態では、前記標的核酸の発現は、前記エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１２ｉシステムによって変化する。いくつかの実施形態では、前記標的核酸はゲノムＤＮＡである。いくつかの実施形態では、前記ターゲット配列は、例えば、ターゲット配列の誤った発現（過発現、非発現、または病原性ＲＮＡまたはタンパク質の発現）に基づく疾患または状態に関連している。いくつかの実施形態では、前記エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１２ｉシステムは、複数のｃｒＲＮＡをコードする前駆体ガイドＲＮＡアレイを含み、各ｃｒＲＮＡは異なるガイド配列を含む。
【0273】
いくつかの実施形態では、本出願は、本明細書に記載の方法のいずれかを用いて、疾患または状態を処理するために、個体細胞中の標的核酸を修飾することを含む、前記個体細胞中の前記標的核酸に関連する疾患または状態を処理する方法を提供する。いくつかの実施形態では、前記疾患または状態は、がん、心血管疾患、遺伝性疾患（例えば鎌状赤血球貧血（ＳＣＤ）またはβ－サラセミア（ＴＤＴ）などの遺伝的欠陥疾患、自己免疫疾患、代謝性疾患、神経変性疾患、眼病、細菌感染、ウイルス感染の群から選択される。
【0274】
本明細書に記載のエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１２ｉシステムは、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１２ｉシステムにおいてエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉエフェクタータンパク質のタイプに応じて、細胞中の標的核酸を様々な方法で修飾することができる。いくつかの実施形態では、前記方法は標的核酸中の部位特異的切断を誘導する。いくつかの実施形態では、前記方法は、細胞、例えば細菌細胞、植物細胞又は動物細胞（例えば哺乳動物細胞）中でゲノムＤＮＡを切断する。いくつかの実施形態では、前記方法は細胞中のゲノムＤＮＡを切断することによって細胞を殺す。いくつかの実施形態では、前記方法は細胞中でウイルス核酸を切断する。
【0275】
いくつかの実施形態では、前記方法は、細胞中の前記標的核酸の発現レベルを変化させる（例えば、増加または減少させる）。いくつかの実施形態では、前記方法は、例えば、トランス活性化ドメインに融合した酵素活性のないＣａｓ１２ｉタンパク質に基づき、エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉエフェクタータンパク質を使用することにより、細胞中の前記標的核酸の発現レベルを高める。いくつかの実施形態では、前記方法は、例えば、転写抑制ドメインに融合された酵素活性のないＣａｓ１２ｉタンパク質に基づいて、エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉエフェクタータンパク質を使用することにより、細胞中の前記標的核酸の発現レベルを低下させる。いくつかの実施形態では、前記方法は、例えば、エピジェネティック修飾ドメインに融合された酵素活性のないＣａｓ１２ｉタンパク質に基づいて、エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉエフェクタータンパク質を使用することにより、細胞における前記標的核酸または標的核酸関連タンパク質（例えば、標的核酸に結合されたまたはその近傍のタンパク質、例えば転写因子またはヒストン）にエピジェネティック修飾を導入する。本明細書に記載のエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉシステムは、エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉエフェクタータンパク質に含まれる機能ドメインに応じて、前記標的核酸に他の修飾を導入するために使用することができる。
【0276】
いくつかの実施形態では、前記方法は、細胞中の前記標的核酸中のターゲット配列を変化させる。いくつかの実施形態では、前記方法は、変異を細胞中の前記標的核酸に導入し、例えば、病原性変異を非病原性配列に変異させる（例えば、アデノシンデアミナーゼまたはシチシンデアミナーゼに融合したいずれかの本発明のｄＣａｓ１２ｉにより）。いくつかの実施形態では、前記方法は、ＣＲＩＳＰＲ複合体による配列特異的切断の結果として、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）または相同性配向型修復（ＨＤＲ）などの１つまたは複数の内因性ＤＮＡ修復経路を使用し、細胞中で標的ＤＮＡに誘導される二本鎖切断を修復する。例示的な変異には、挿入、欠失、置換、及びフレームシフトが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、ターゲット配列切断を同時に行い、ＤＮＡ修復テンプレートを提供するためにｐｅｇＲＮＡを使用する。いくつかの実施形態では、前記方法は標的部位にドナーＤＮＡを挿入する。いくつかの実施形態では、ドナーＤＮＡの挿入は、選択マーカーまたはレポータータンパク質の細胞への導入をもたらす。いくつかの実施形態では、ドナーＤＮＡの挿入は遺伝子のノックインをもたらす。いくつかの実施形態では、ドナーＤＮＡの挿入はノックアウト変異をもたらす。いくつかの実施形態では、ドナーＤＮＡの挿入は、モノヌクレオチド置換などの置換変異をもたらす。いくつかの実施形態では、前記方法は細胞の表現型変化を誘導する。
【0277】
いくつかの実施形態では、前記エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１２ｉシステムは、遺伝子回路（ｇｅｎｅｔｉｃ ｃｉｒｃｕｉｔ）の一部、または遺伝子回路を細胞のゲノムＤＮＡに挿入するために使用される。本明細書に記載される誘導剤で制御されたエンジニアリングされた分割型Ｃａｓ１２ｉエフェクタータンパク質は、特に遺伝子回路の成分として使用されることができる。遺伝子回路は遺伝子療法に用いることができる。遺伝子回路を設計し使用する方法及び技術は当技術分野で知られている。さらに、例えば、Ｂｒｏｐｈｙ， Ｊｅｎｎｉｆｅｒ ＡＮ， ａｎｄ Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ Ａ． Ｖｏｉｇｔ． “Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｇｅｎｅｔｉｃ ｃｉｒｃｕｉｔ ｄｅｓｉｇｎ．” Ｎａｔｕｒｅ ｍｅｔｈｏｄｓ １１．５ （２０１４）： ５０８を参照することができる。
【0278】
本明細書に記載のエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１２ｉシステムは、複数の標的核酸を修飾するために使用することができる。いくつかの実施形態では、前記標的核酸は細胞中にある。いくつかの実施形態では、前記標的核酸はゲノムＤＮＡである。いくつかの実施形態では、前記標的核酸は染色体外ＤＮＡである。いくつかの実施形態では、前記標的核酸は細胞に対して外因性である。いくつかの実施形態では、前記標的核酸はウイルスＤＮＡなどのウイルス核酸である。いくつかの実施形態では、前記標的核酸は細胞中のプラスミドである。いくつかの実施形態では、前記標的核酸は水平移動（ｈｏｒｉｚｏｎｔａｌｌｙ ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ）されたプラスミドである。いくつかの実施形態では、前記標的核酸はＲＮＡである。
【0279】
いくつかの実施形態では、前記標的核酸は、分離されたＤＮＡなどの分離された核酸である。いくつかの実施形態では、前記標的核酸は細胞のない環境に存在する。いくつかの実施形態では、前記標的核酸は、分離されたプラスミドなどのベクターである。いくつかの実施形態では、前記標的核酸は分離された線状ＤＮＡ断片である。
【0280】
本明細書に記載された方法は、任意の適切な細胞型に適している。いくつかの実施形態では、前記細胞は細菌、酵母細胞、真菌細胞、藻類細胞、植物細胞または動物細胞（例えば、ヒト細胞などの哺乳動物細胞）である。いくつかの実施形態では、前記細胞は、組織生検によって分離された細胞などの自然由来の細胞である。いくつかの実施形態では、前記細胞はインビトロ培養細胞系から分離された細胞である。いくつかの実施形態では、前記細胞は初代細胞株由来である。いくつかの実施形態では、前記細胞は永生化細胞株由来である。いくつかの実施形態では、前記細胞は遺伝子操作された細胞である。
【0281】
いくつかの実施形態では、前記細胞は、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ブタ、シカ、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、ウサギ、魚の群から選択される生物の動物細胞である。
【0282】
いくつかの実施形態において、前記細胞は、トウモロコシ、小麦、大麦、オーツ麦、イネ、大豆、アブラヤシ、ベニバナ、ゴマ、タバコ、亜麻、綿、ヒマワリ、真珠粟、粟、ソルガム、キャノーラ、大麻、野菜作物、飼料作物、工業作物、木本作物、バイオマス作物の群から選択される生物の植物細胞である。
【0283】
いくつかの実施形態では、前記細胞は哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態では、前記細胞はヒト細胞である。いくつかの実施形態では、前記ヒト細胞はヒト胚性腎２９３Ｔ（ＨＥＫ２９３Ｔまたは２９３Ｔ）細胞またはＨｅＬａ細胞である。いくつかの実施形態では、前記細胞はヒト胚腎（ＨＥＫ２９３Ｔ）細胞である。いくつかの実施形態では、前記細胞はマウスＨｅｐａ１～６細胞である。いくつかの実施形態では、前記哺乳動物細胞は、免疫細胞、肝細胞、腫瘍細胞、幹細胞、血液細胞、神経細胞、接合子、筋肉細胞（例えば心筋細胞）、及び皮膚細胞の群から選択される。
【0284】
いくつかの実施形態では、前記細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）Ｔ細胞、ｉＮＫ－Ｔ細胞、ＮＫ－Ｔ様細胞、γδＴ細胞、腫瘍浸潤性Ｔ細胞、及び樹状細胞（ＤＣ）により活性化されるＴ細胞の群から選択される免疫細胞である。いくつかの実施形態では、前記方法は、ＣＡＲ－Ｔ細胞またはＴＣＲ－Ｔ細胞などの修飾された免疫細胞を産生する。
【0285】
いくつかの実施形態では、前記細胞は胚性幹（ＥＳ）細胞、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞、配偶子の前駆細胞、配偶子、接合子または胚内の細胞である。
【0286】
本明細書に記載の方法は、標的細胞をインビボ、エクスビボ、またはインビトロで修飾するために使用することができ、修飾されると、修飾された細胞の子孫または細胞株が改変された表現型を保持するように、細胞を変更する方法で行うことができる。前記修飾された細胞及び子孫は、ゲノム編集及び遺伝子療法のようなエクスビボ又はインビボ応用を有する植物又は動物のような多細胞生物の一部であってもよい。
【0287】
いくつかの実施形態では、前記方法はエクスビボで行われる。いくつかの実施形態では、前記エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１２ｉシステムを細胞に導入した後、前記修飾された細胞（例えば、哺乳類細胞）がエクスビボで増殖する。いくつかの実施形態では、前記修飾細胞を培養して少なくとも約１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、１０日、１２日または１４日のいずれかを増殖させる。いくつかの実施形態では、前記修飾された細胞は、約１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、１０日、１２日、または１４日のいずれかを超えないように培養される。いくつかの実施形態では、前記修飾された細胞をさらに評価またはスクリーニングし、１つまたは複数の所望の表現型または特性を有する細胞を選択する。
【0288】
いくつかの実施形態では、前記ターゲット配列は疾患または状態に関連する配列である。例示的な疾患または状態としては、癌、心血管疾患、遺伝性疾患、自己免疫性疾患、代謝性疾患、神経変性疾患、眼病、細菌感染、及びウイルス感染が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、前記疾患または状態は遺伝的疾患である。いくつかの実施形態では、前記疾患または状態は単一遺伝子疾患または状態である。いくつかの実施形態では、前記疾患または状態は多遺伝子疾患または状態である。
【0289】
いくつかの実施形態では、前記ターゲット配列は、野生型配列と比較して変異を有する。いくつかの実施形態では、前記ターゲット配列は、疾患または状態に関連する一塩基多型（ＳＮＰ）を有する。
【0290】
いくつかの実施形態では、前記標的核酸に挿入されたドナーＤＮＡは、レポータータンパク質、抗原特異的受容体、治療的タンパク質、抗生物質耐性タンパク質、ＲＮＡｉ分子、サイトカイン、キナーゼ、抗原、抗原特異的受容体、細胞因子受容体、及び自殺ポリペプチドの群から選択される生物産物をコードする。いくつかの実施形態では、前記ドナーＤＮＡは治療的タンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、前記ドナーＤＮＡは、遺伝子療法に使用できる治療的タンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、前記ドナーＤＮＡは治療的抗体をコードする。いくつかの実施形態では、前記ドナーＤＮＡは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）または操作されたＴＣＲなどの操作された受容体をコードする。いくつかの実施形態では、前記ドナーＤＮＡは、低分子ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ）または長鎖ノンコーディングＲＮＡ（ｌｉｎｃＲＮＡ）などの治療的ＲＮＡをコードする。
【0291】
本明細書に記載の方法は、２つまたはそれ以上（例えば、２、３、４、５、６、８、１０またはそれ以上）の異なる標的部位における多重遺伝子編集または調節のために使用することができる。いくつかの実施形態では、前記方法は、複数の標的核酸または標的核酸配列を検出または修飾する。いくつかの実施形態では、前記方法は、各ｃｒＲＮＡが異なるターゲット配列を含む複数（例えば、２、３、４、５、６、８、１０またはそれ以上）のｃｒＲＮＡ配列を含むガイドＲＮＡに標的核酸を接触させることを含む。
【0292】
本明細書に記載のいずれかの方法を用いて生成された、修飾された標的核酸を含むエンジニアリングされた細胞も提供される。前記エンジニアリングされた細胞は細胞療法に使用することができる。本明細書に記載された細胞療法のための方法を用いて自己または同種の細胞からエンジニアリングされた細胞を作製することができる。
【0293】
本明細書に記載の方法は、遺伝的バリアントを研究するために細胞（例えば哺乳動物細胞）の同質遺伝子系を生成するためにも使用することができる。
【0294】
本明細書に記載のエンジニアリングされた細胞を含むエンジニアリングされた非ヒト動物も提供される。いくつかの実施形態では、前記エンジニアリングされた非ヒト動物は、ゲノム編集された非ヒト動物である。前記エンジニアリングされた非ヒト動物は、疾患モデルとして使用することができる。
【0295】
非ヒトゲノム編集またはトランスジェニック動物を生成する技術は、前核マイクロインジェクション、ウイルス感染、胚性幹細胞及び人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞への形質転換を含むが、これらに限定されない、当技術分野で周知である。使用できる詳細な方法としては、Ｓｕｎｄｂｅｒｇ及びＩｃｈｉｋｉによって記述された方法（２００６， Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｍｉｃｅ Ｈａｎｄｂｏｏｋ， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ）及びＧｉｂｓｏｎによって記述された方法（２００４， Ａ Ｐｒｉｍｅｒ Ｏｆ Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２ｎｄ ｅｄ． Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ， Ｍａｓｓ．： Ｓｉｎａｕｅｒ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【0296】
エンジニアリングされた動物は、ウシ、ウマ、ヒツジ、イヌ、シカ、ネコ科動物、ヤギ、ブタ、霊長類、及びゾウ、シカ、シマウマまたはラクダなどのあまり理解されていない哺乳類を含む任意の適切な種であってもよいが、これらに限定されない。
【0297】
治療方法
いくつかの実施形態では、個体の細胞中の標的核酸に関連する疾患または障害を治療するための医薬の製造における、前記エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１２ｉシステムの用途が提供される。いくつかの実施形態では、前記エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１２ｉシステムにより、個体の細胞中の標的核酸に関連する疾患または障害を治療する方法が提供される。
いくつかの実施形態では、個体の細胞中の標的核酸に関連する疾患または障害を治療するための医薬の製造における、前記エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１２ｉシステムの用途が提供される。いくつかの実施形態では、前記エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１２ｉシステムにより、個体の細胞中の標的核酸に関連する疾患または障害を治療する方法が提供される。
【0298】
いくつかの実施形態では、本発明は、必要とされる被験者（例えばヒト）の疾患を治療する方法を提供し、前記方法は、本発明のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１２ｉシステムを前記被験者に投与(例えば静脈注射または点滴)することを含み、前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１２ｉシステムは（１）いずれかのエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉエフェクタータンパク質（例えば、エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼまたはその機能バリアントのいずれか）、またはエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉエフェクタータンパク質をコードするポリヌクレオチド、及び（２）ｃｒＲＮＡ、または前記ｃｒＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを含み、前記ｃｒＲＮＡは、（ｉ）該疾患に関連する標的核酸上のターゲット配列とハイブリダイゼーションすることができるスペーサー配列と、（ｉｉ）前記スペーサー配列に連結され、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉエフェクタータンパク質を前記ｃｒＲＮＡに結合させて前記ターゲット配列を標的とするＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１２ｉ複合体を形成することを誘導することができる直接リピート配列を含み、前記スペーサー配列と前記ターゲット配列のハイブリダイゼーションは、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉエフェクタータンパク質と前記ターゲット配列との接触を媒介し、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉエフェクタータンパク質が前記ターゲット配列を修飾（例えば切断または塩基編集）することをもたらし、それによって前記被験者の疾患を治療する。そのうち、前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１２ｉシステムの任意の成分は、同時に送達されてもよく、順次送達されてもよく、又はＤＮＡ／ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＤＮＡ、ＲＮＡ／ＲＮＡ、タンパク質／ＲＮＡ、又はタンパク質／ＤＮＡのいずれの形態で送達されてもよい。
【0299】
本明細書に記載の細胞中の標的核酸を修飾するための方法のいずれかを使用する治療方法をさらに提供する。いくつかの実施形態において、本出願は、本明細書に記載の工学的ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１２ｉシステムのいずれかに標的核酸を接触させることを含む、個体細胞中の標的核酸に関連する疾患または状態を治療する方法を提供し、前記ガイドＲＮＡのガイド配列は前記標的核酸のターゲット配列に相補的であり、そのうち、標的核酸を修飾(例えば切断または塩基置換)するために、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉエフェクタータンパク質と前記ガイドＲＮＡは、前記標的核酸に結合するために互いに会合し、それによって前記疾患または状態を治療する。いくつかの実施形態では、変異（例えばノックアウトまたはノックアウト変異）を前記標的核酸に導入する。いくつかの実施形態では、前記標的核酸の発現が増強される。いくつかの実施形態では、前記標的核酸の発現は抑制される。いくつかの実施形態では、本出願は、本明細書に記載のエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１２ｉシステムのうちの１つと、治療剤をコードするドナーＤＮＡ（例えば、非病原性天然配列を修復テンプレートとして使用する）との有効量を個体に投与することを含む個体の疾患または状態を治療する方法を提供し、そのうち、前記ガイドＲＮＡのガイド配列は、前記個体の標的核酸のターゲット配列に相補的であり、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉエフェクタータンパク質と前記ガイドＲＮＡとが互いに結合して、前記標的核酸に結合しかつドナーＤＮＡを前記ターゲット配列に挿入するようにし、それによって前記疾患または病状を治療する。
【0300】
いくつかの実施形態において、本出願は、本明細書でエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１２ｉシステムのいずれかに細胞を接触させることによって作製された、修飾された標的核酸を含むエンジニアリングされた細胞を個体に有効量投与することを含む、前記個体の疾患または状態を治療する方法を提供し、そのうち、前記ガイドＲＮＡのガイド配列は前記標的核酸のターゲット配列に相補的であり、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉエフェクタータンパク質と前記ガイドＲＮＡは、標的核酸を修飾するために標的核酸に結合するように互いに会合される。いくつかの実施形態では、前記エンジニアリングされた細胞は免疫細胞である。いくつかの実施形態では、前記エンジニアリングされた細胞は、造血幹細胞、神経幹細胞などの幹細胞である。いくつかの実施形態では、前記エンジニアリングされた細胞は神経細胞である。いくつかの実施形態では、前記個体はヒトである。いくつかの実施形態では、前記個体はげっ歯動物、ペット、または農場動物などのモデル動物である。いくつかの実施形態では、前記個体は、ネコ、イヌ、ウサギ、ハムスターなどの哺乳動物である。
【0301】
いくつかの実施形態では、前記疾患または状態は、癌、心血管疾患、遺伝性疾患、自己免疫性疾患、代謝性疾患、神経変性疾患、眼病、細菌感染、及びウイルス感染の群から選択される。いくつかの実施形態では、前記標的核酸はＰＣＳＫ９である。いくつかの実施形態では、前記疾患または状態は心血管疾患である。いくつかの実施形態では、前記疾患または状態は冠動脈疾患である。いくつかの実施形態では、前記方法は個体のコレステロールレベルを低下させる。いくつかの実施形態では、前記方法は個体の糖尿病を治療する。
【0302】
本発明のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１２ｉシステムを用いて治療することができる障害または疾患としては、嚢胞性線維症、遺伝性血管浮腫、糖尿病、進行性仮性肥大性筋ジストロフィー、ベイカー型筋ジストロフィー、α－１－アンチトリプシン欠損症、ポンペイ病、強直性筋ジストロフィー、ハンチントン病、脆弱Ｘ症候群、フリードライヒ運動失調、筋萎縮側索硬化、前頭側頭型認知症、遺伝性慢性腎臓病、高脂血症、高コレステロール血症、レーバー先天性黒内障、鎌状赤血球症またはβサラセミアなどが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、前記障害または疾患は、野生型トランスサイレチンアミロイドーシス（ｔｒａｎｓｔｈｙｒｅｔｉｎ－ｒｅｌａｔｅｄ ｗｉｌｄ－ｔｙｐｅ ａｍｙｌｏｉｄｏｓｉｓ、ＡＴＴＲｗｔ）、遺伝性トランスサイレチンアミロイドーシス（ｔｒａｎｓｔｈｙｒｅｔｉｎ－ｒｅｌａｔｅｄ ｈｅｒｅｄｉｔａｒｙ ａｍｙｌｏｉｄｏｓｉｓ、ＡＴＴＲｍ）、家族性アミロイドポリニューロパチー（ｆａｍｉｌｉａｌ ａｍｙｌｏｉｄ ｐｏｌｉｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ、ＦＡＰ、ＡＴＴＲ－ＰＮ）、または家族性アミロイド心筋症（ｆａｍｉｌｉａｌ ａｍｙｌｏｉｄ ｃａｒｄｉｏｍｙｏｐａｔｈｙ、ＦＡＣ、ＡＴＴＲ－ＣＭ）のようなトランスサイレチンアミロイドーシスである。いくつかの実施形態では、前記障害または疾患は、ＴＴＲ遺伝子の変異または異常発現（例えば高発現）によるトランスチロキシンタンパク質の不安定性である。いくつかの実施形態では、前記障害または疾患はＴＴＲ遺伝子変異または異常発現（高発現など）に起因する他の障害または疾患、または派生障害または疾患である。
【0303】
送達方法
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１２ｉシステムまたはその成分、その核酸分子、またはその成分をコードまたは提供する核酸分子は、プラスミドまたはウイルスなどの様々な送達系を介して宿主細胞（例えば、上記「構築物及びベクター」セクションに記載のベクターのいずれか）に送達することができる。いくつかの実施形態または方法では、前記エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１２ｉシステムは、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉエフェクタータンパク質及びその１つまたは複数の相同性ＲＮＡガイド配列で構成されるリボ核タンパク質複合体のヌクレオフェクションまたはエレクトロポレーションなどの他の方法によって送達することができる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１２ｉシステムまたはその成分、その核酸分子、またはその成分をコードまたは提供する核酸分子は、プラスミドまたはウイルスなどの様々な送達系を介して宿主細胞（例えば、上記「構築物及びベクター」セクションに記載のベクターのいずれか）に送達することができる。いくつかの実施形態または方法では、前記エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１２ｉシステムは、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉエフェクタータンパク質及びその１つまたは複数の相同性ＲＮＡガイド配列で構成されるリボ核タンパク質複合体のヌクレオフェクションまたはエレクトロポレーションなどの他の方法によって送達することができる。
【0304】
いくつかの実施形態では、ナノ粒子またはエクソソームを介して送達される。
【0305】
いくつかの実施形態では、ペアとなるＣａｓ１２ｉニッカーゼ複合体は、２つのペアとなるｃｒＲＮＡ要素を含む複合体が共に送達されるように、ナノ粒子または他の直接タンパク質送達方法を用いて直接送達することができる。さらに、タンパク質は、ウイルスベクターを介して、または細胞に直接送達することができ、次いで、二重ニックのための２つの対のスペーサー領域を含むＣＲＩＳＰＲアレイを直接送達することができる。場合によっては、直接ＲＮＡ送達に対し、Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）（特にトライアングルＧａｌＮＡｃ）などの少なくとも１つの糖部分にＲＮＡを結合することができる。
【0306】
いくつかの実施形態または方法では、前記エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１２ｉシステムは、静脈注射または点滴による送達、または腫瘍内送達などの疾患部位の局所送達など、治療に適した任意の送達方法を用いて送達することができる。本明細書に記載のエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１２ｉシステムを投与するための適切な方法としては、局所、皮下、経皮、皮内、病巣内、関節内、腹腔内、膀胱内、経粘膜、歯肉、歯内、蝸牛内、経鼓膜、臓器内、硬膜外、髄腔内、筋肉内、静脈内、血管内、骨内、眼周、腫瘍内、脳内、脳室内投与が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１２ｉシステムは、注射、カテーテル、座薬、またはインプラントを介して被験者に投与され、前記インプラントは、シアル酸膜のようなフィルム、または繊維を含む多孔質、非多孔質、またはゲル状の材料である。
【0307】
ＩＶ．キットと製品
本明細書に記載のエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼまたはその機能バリアント、エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉエフェクタータンパク質、またはエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１２ｉシステムのいずれか１つまたは複数の成分を含む組成物、キット、単位薬剤及び製品も提供される。
本明細書に記載のエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼまたはその機能バリアント、エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉエフェクタータンパク質、またはエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１２ｉシステムのいずれか１つまたは複数の成分を含む組成物、キット、単位薬剤及び製品も提供される。
【0308】
いくつかの実施形態では、キットを提供し、それは本明細書で説明するようにエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼまたはその機能バリアント、エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉエフェクタータンパク質、またはエンジニアリングＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１２ｉシステムのいずれかをコードする１つまたは複数のＡＡＶベクターを含む。いくつかの実施形態では、前記キットは、１つまたは複数のガイドＲＮＡ（またはそれをコードするＤＮＡまたはベクター）をさらに含む。いくつかの実施形態では、前記キットはドナーＤＮＡをさらに含む。いくつかの実施形態では、前記キットは、ヒト細胞などの細胞をさらに含む。
【0309】
前記キットは、エンジニアリングされた細胞の増殖を可能にするために、容器、試薬、培地、サイトカイン、緩衝液、抗体などの１つまたは複数の追加成分を含んでもよい。前記キットはまた、組成物を投与するための装置を含むことができる。
【0310】
前記キットはまた、本明細書に記載のエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１２ｉシステムを使用するためのプロトコール、例えば標的核酸を検出または修飾する方法を含むことができる。いくつかの実施形態では、前記キットは、疾患または状態を処理または診断するためのプロトコールを含む。前記キットの成分の使用に関するプロトコールは、通常、意図的に処理された投与量、投与スケジュール、及び投与経路に関する情報を含む。前記容器は、単位用量、バルク包装（例えば、多用量包装）又はサブユニット用量であってもよい。例えば、このようなキット（十分な量の本明細書に開示された組成物）を提供し、延長された期間にわたって個体に対する有効な処理を提供することができる。キットはまた、複数の単位用量の組成物及び取扱説明書を含むことができ、その包装数量は、薬局（例えば、病院薬局及び複方薬局）に保存及び使用するのに十分である。
【0311】
本発明のキットは、適切なパッケージ内にある。適切な包装としては、限定されないが、バイアル、ボトル、広口ボトル、軟包装（例えば、密封されたポリエステルフィルムまたはビニール袋）などが挙げられる。キットは、バッファ液や説明的情報などの追加の成分を任意に提供することができる。したがって、本出願は、バイアル（密封されたバイアルなど）、ボトル、広口バイアル、フレキシブルパッケージなどを含む製品も提供する。
【0312】
前記製品は、容器と、容器上または容器に接着されたラベルまたは包装インサートとを含むことができる。適切な容器としては、例えばボトル、バイアル、注射器などが挙げられる。前記容器は、ガラスやプラスチックなどの様々な材料で形成することができる。一般に、前記容器は、本明細書に記載の疾患または障害を効果的に処理するための組成物を収容し、無菌入口（例えば、容器は静脈注射溶液バッグであってもよく、皮下注射針により穿刺可能な栓を有するバイアルであってもよい）を有することができる。前記ラベルまたは包装インサートは、組成物が個体中の特定の状態を処理するために使用されることを示す。前記ラベルまたは包装インサートは、組成物を個体に投与するためのプロトコールをさらに含む。
【0313】
パッケージインサートとは、通常、そのような治療製品を使用する適応症、用法、投与量、投与、禁忌症及び／または警告に関する情報を含む治療製品の商業パッケージに含まれる説明を指す。
【0314】
さらに、前記製品は、静菌注射用水（ＢＷＦＩ）、リン酸塩緩衝食塩水、リンゲル溶液、及びグルコース溶液などの薬学的に許容される緩衝液を含む第２の容器を含むことができる。ビジネス及びユーザーの観点から見ると、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針、注射器などの他の材料を含むこともできる。必要に応じて、注射部位の痛みを緩和するために、可溶化剤及び局所麻酔剤（例えば、リドカイン）を含むこともできる。
【0315】
一般に、成分は、アンプルまたは小袋などの活性用量を示す密封容器中の乾燥凍結乾燥粉末または無水濃縮物などの単位剤形で単独で提供または混合して提供される。薬物が輸液によって投与される場合、無菌の薬学的レベルの水または塩水を入れた輸液瓶で調剤することができる。医薬組成物を注射により投与する場合、投与前に成分を混合できるように、無菌注射用水または塩水のアンプルを提供することができる。
実施例部分
実施例部分
【0316】
以下、図面を参照して本発明の具体的な実施例についてより詳細に説明する。図面には本発明の具体的な実施例が示されているが、本明細書に記載された実施例に限定されることなく、様々な形態で本発明を実現することができることを理解すべきである。対照的に、これらの実施例を提供することは、本発明をより完全に理解し、本発明の範囲を当業者に完全に伝えることができるようにするためである。
【0317】
実施例１：参照Ｃａｓ１２ｉ２酵素中のＰＡＭと相互作用するアミノ酸を正に帯電したアミノ酸に置換し、その遺伝子編集効率を検証する。
プラスミド構築
Ｃａｓ１２ｉ２のコード配列はコドン最適化（ヒト）され合成された。ＰＣＲに基づく部位特異的突然変異誘発によりＣａｓタンパク質のバリアントが生成された。具体的な方法は変異の部位を中心にＣａｓ１２ｉ２タンパク質のＤＮＡ配列を２つの部分に分けて設計し、２対のプライマーを設計してそれぞれこの２つの部分のＤＮＡ配列を増幅し、同時にプライマーに変異を必要とする配列を導入し、最後にＧｉｂｓｏｎクローニングの方式で２つの断片をｐＣＡＧ－２Ａ－ｅＧＦＰベクター（ペニシリン耐性を持つ）に組み込んだ。変異体の組み合わせは、Ｃａｓ１２ｉ２タンパク質のＤＮＡを多段に分割し、ＰＣＲ、Ｇｉｂｓｏｎ ｃｌｏｎｅを用いて構築を実現した。変異体の位置決定は、Ｃａｓ１２ｉ２の構造情報を分析するために、当技術分野で一般的に使用されているタンパク質構造可視化ソフトウェア（例えばＰｙＭｏｌ、Ｃｈｉｍｅｒａなどのソフトウェア）を使用して得られた。Ｃａｓ１２ｉ２の構造情報はＰＤＢ：６ＬＴＵ、６ＬＴＲ、６ＬＵ０、６ＬＴＰ）を参照する。Ｃａｓ１２ｉ２エフェクタータンパク質は、ｐＣＡＧ－２Ａ－ｅＧＦＰベクターを介してヒト２９３Ｔ細胞中で発現された。Ｃａｓ１２ｉ２タンパク質をコードするＤＮＡをＸｍａＩとＮｈｅＩの間に挿入した。２９３ＴでＣａｓ１２ｉ２を発現するｃｒＲＮＡのベクターは、ターゲット配列を含むアニールオリゴヌクレオチドをＢａｓＩにより消化したｐＵＣ１９－Ｕ６－ｉ２－ｃｒＲＮＡ骨格に連結合することにより構築された。ＤＲをコードするヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９である。
プラスミド構築
Ｃａｓ１２ｉ２のコード配列はコドン最適化（ヒト）され合成された。ＰＣＲに基づく部位特異的突然変異誘発によりＣａｓタンパク質のバリアントが生成された。具体的な方法は変異の部位を中心にＣａｓ１２ｉ２タンパク質のＤＮＡ配列を２つの部分に分けて設計し、２対のプライマーを設計してそれぞれこの２つの部分のＤＮＡ配列を増幅し、同時にプライマーに変異を必要とする配列を導入し、最後にＧｉｂｓｏｎクローニングの方式で２つの断片をｐＣＡＧ－２Ａ－ｅＧＦＰベクター（ペニシリン耐性を持つ）に組み込んだ。変異体の組み合わせは、Ｃａｓ１２ｉ２タンパク質のＤＮＡを多段に分割し、ＰＣＲ、Ｇｉｂｓｏｎ ｃｌｏｎｅを用いて構築を実現した。変異体の位置決定は、Ｃａｓ１２ｉ２の構造情報を分析するために、当技術分野で一般的に使用されているタンパク質構造可視化ソフトウェア（例えばＰｙＭｏｌ、Ｃｈｉｍｅｒａなどのソフトウェア）を使用して得られた。Ｃａｓ１２ｉ２の構造情報はＰＤＢ：６ＬＴＵ、６ＬＴＲ、６ＬＵ０、６ＬＴＰ）を参照する。Ｃａｓ１２ｉ２エフェクタータンパク質は、ｐＣＡＧ－２Ａ－ｅＧＦＰベクターを介してヒト２９３Ｔ細胞中で発現された。Ｃａｓ１２ｉ２タンパク質をコードするＤＮＡをＸｍａＩとＮｈｅＩの間に挿入した。２９３ＴでＣａｓ１２ｉ２を発現するｃｒＲＮＡのベクターは、ターゲット配列を含むアニールオリゴヌクレオチドをＢａｓＩにより消化したｐＵＣ１９－Ｕ６－ｉ２－ｃｒＲＮＡ骨格に連結合することにより構築された。ＤＲをコードするヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９である。
【0318】
細胞培養、トランスフェクション及び蛍光活性化細胞選別法（ＦＡＣＳ）
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を１％ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）と１０％ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ）を含むＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）で培養した。細胞を２４ウェル－細胞シャーレ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に播種して、細胞密度が７０％に達するまでに１６時間培養した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用することにより、Ｃａｓ１２ｉ２タンパク質をコードするプラスミド６００ｎｇとｃｒＲＮＡをコードするプラスミド３００ｎｇを各２４ウェル細胞シャーレにトランスフェクションした。約７２ｈトランスフェクションした後、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）されるＨＥＫ２９３Ｔ細胞をトリプシン－ＥＤＴＡ（０．０５％）（Ｇｉｂｃｏ）で消化した。ＧＦＰチャネルを有するＭｏＦｌｏ ＸＤＰ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いて細胞選別を行った。
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を１％ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）と１０％ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ）を含むＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）で培養した。細胞を２４ウェル－細胞シャーレ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に播種して、細胞密度が７０％に達するまでに１６時間培養した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用することにより、Ｃａｓ１２ｉ２タンパク質をコードするプラスミド６００ｎｇとｃｒＲＮＡをコードするプラスミド３００ｎｇを各２４ウェル細胞シャーレにトランスフェクションした。約７２ｈトランスフェクションした後、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）されるＨＥＫ２９３Ｔ細胞をトリプシン－ＥＤＴＡ（０．０５％）（Ｇｉｂｃｏ）で消化した。ＧＦＰチャネルを有するＭｏＦｌｏ ＸＤＰ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いて細胞選別を行った。
【0319】
ゲノム修飾のためのターゲットディープシーケンス解析
ＦＡＣＳで選別したＧＦＰ－陽性ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を緩衝液Ｌで溶解し、５５℃で３時間インキュベートした後、９５℃で１０分間インキュベートした。異なるゲノム部位に標的部位を含むｄｓＤＮＡ断片を、対応するプライマーを用いてＰＣＲ増幅した。ターゲットのディープシーケンスには、細胞分解液をテンプレートとして直接使用し、バーコード（ｂａｒｃｏｄｅｄ）ＰＣＲにより標的部位を直接増幅した。ＰＣＲ生成物を精製し、高スループットシーケンスのためにいくつかのライブラリーにまとめた。挿入または欠失を含む読み取り（ｒｅａｄｓ）の比率を計算することにより、ＣＲＩＳＰＲｅｓｓｏ２ソフトウェアを使用して挿入欠失の頻度（％）を分析した。本出願では、遺伝子編集効率の比較と分析のために、挿入欠失の頻度（％）という指標を統一的に用いる。完全な読み取りの０．０５％未満の読み取りが破棄される。
ＦＡＣＳで選別したＧＦＰ－陽性ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を緩衝液Ｌで溶解し、５５℃で３時間インキュベートした後、９５℃で１０分間インキュベートした。異なるゲノム部位に標的部位を含むｄｓＤＮＡ断片を、対応するプライマーを用いてＰＣＲ増幅した。ターゲットのディープシーケンスには、細胞分解液をテンプレートとして直接使用し、バーコード（ｂａｒｃｏｄｅｄ）ＰＣＲにより標的部位を直接増幅した。ＰＣＲ生成物を精製し、高スループットシーケンスのためにいくつかのライブラリーにまとめた。挿入または欠失を含む読み取り（ｒｅａｄｓ）の比率を計算することにより、ＣＲＩＳＰＲｅｓｓｏ２ソフトウェアを使用して挿入欠失の頻度（％）を分析した。本出願では、遺伝子編集効率の比較と分析のために、挿入欠失の頻度（％）という指標を統一的に用いる。完全な読み取りの０．０５％未満の読み取りが破棄される。
【0320】
実施例１－Ａ 単一のアミノ酸置換を有する４つのエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉ２を選出した
実施例１に記載の方法に従って、アミノ酸配列が単一の変異を有するエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉ２酵素をそれぞれ発現し、好ましいアミノ酸置換方法及びその対応する遺伝子編集効率を図１ａ、図１ｂ及び表１に示す。我々はまずＣａｓ１２ｉ２がＰＡＭ ＤＮＡに９Å以内にある１０個のアミノ酸Ｅ１７６、Ｅ１７８、Ｙ２２６、Ａ２２７、Ｎ２２９、Ｅ２３７、Ｋ２３８、Ｋ２６４、Ｔ４４７、Ｅ５６３を選択して、アルギニン（Ｒ）の点突然変異試験を行った。図１ａ及び表１に示すように、これらＣａｓ１２ｉ変異体と野生型Ｃａｓ１２ｉ２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）の２つのゲノム部位：ＣＣＲ５－３、ＲＮＦ２－７における遺伝子編集効率を２９３Ｔ細胞で比較することにより、下記のアミノ酸置換を有するＣａｓ１２ｉ変異体：Ｅ１７６Ｒ、Ｋ２３８Ｒ、Ｔ４４７ＲとＥ５６３Ｒは遺伝子編集効率を効果的に高めることができ（図１ａに示すように、Ｅ１７６Ｒ、Ｋ２３８Ｒ、Ｔ４４７ＲとＥ５６３Ｒの４種類のモノアミノ酸置換はすべて約１０％より高い（これはＣＣＲ５－３に対する参照酵素の遺伝子編集効率である）、及び約１２％より高い（これはＲＮＦ２－７に対する参照酵素の遺伝子編集効率である）挿入欠失率が得られ、他の単一アミノ酸置換スキームより明らかに優れている）、残りの６種類の変異体は遺伝子編集効率の向上に役立たず、ひいては低下した。ここで使用されるＣＣＲ５－３及びＲＮＦ２－７に対するｃｒＲＮＡスペーサー配列のコード配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０及び６１に示す。
実施例１に記載の方法に従って、アミノ酸配列が単一の変異を有するエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉ２酵素をそれぞれ発現し、好ましいアミノ酸置換方法及びその対応する遺伝子編集効率を図１ａ、図１ｂ及び表１に示す。我々はまずＣａｓ１２ｉ２がＰＡＭ ＤＮＡに９Å以内にある１０個のアミノ酸Ｅ１７６、Ｅ１７８、Ｙ２２６、Ａ２２７、Ｎ２２９、Ｅ２３７、Ｋ２３８、Ｋ２６４、Ｔ４４７、Ｅ５６３を選択して、アルギニン（Ｒ）の点突然変異試験を行った。図１ａ及び表１に示すように、これらＣａｓ１２ｉ変異体と野生型Ｃａｓ１２ｉ２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）の２つのゲノム部位：ＣＣＲ５－３、ＲＮＦ２－７における遺伝子編集効率を２９３Ｔ細胞で比較することにより、下記のアミノ酸置換を有するＣａｓ１２ｉ変異体：Ｅ１７６Ｒ、Ｋ２３８Ｒ、Ｔ４４７ＲとＥ５６３Ｒは遺伝子編集効率を効果的に高めることができ（図１ａに示すように、Ｅ１７６Ｒ、Ｋ２３８Ｒ、Ｔ４４７ＲとＥ５６３Ｒの４種類のモノアミノ酸置換はすべて約１０％より高い（これはＣＣＲ５－３に対する参照酵素の遺伝子編集効率である）、及び約１２％より高い（これはＲＮＦ２－７に対する参照酵素の遺伝子編集効率である）挿入欠失率が得られ、他の単一アミノ酸置換スキームより明らかに優れている）、残りの６種類の変異体は遺伝子編集効率の向上に役立たず、ひいては低下した。ここで使用されるＣＣＲ５－３及びＲＮＦ２－７に対するｃｒＲＮＡスペーサー配列のコード配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０及び６１に示す。
【0321】
実施例１－Ｂ 複数の好ましいアミノ酸置換を同時に有するエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉ２を比較する
実施例１に記載された方法に従って、そのアミノ酸配列が２つ以上の好ましいアミノ酸置換を同時に有するエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉ２酵素をそれぞれ発現し、その組み合わせ方及びその遺伝子編集効率の比較を表１及び図１ｂに示す。実施例１－Ａのスクリーニングにより得られたＥ１７６Ｒ、Ｋ２３８Ｒ、Ｔ４４７Ｒ、Ｅ５６３Ｒの４つの効率を高めることができる変異体中の点突然変異を組み合わせる。図１ｂと表１に示すように、ＣＣＲ５－３、ＣＣＲ５－５、ＲＮＦ２－７の３つのゲノム部位におけるこれらの変異体と野生型Ｃａｓ１２ｉ２との遺伝子編集効率を２９３Ｔ細胞中で比較することにより、点突然変異の組み合わせ後に効率がさらに向上する変異体を得ることができることを発見した。特に、４種類の変異を組み合わせた場合（Ｅ１７６Ｒ＋Ｋ２３８Ｒ＋Ｔ４４７Ｒ＋Ｅ５６３Ｒ）に効率が最も優れた組み合わせ変異を得ることができる。そのうち使用されるＣＣＲ５－３、ＲＮＦ２－７、及びＣＣＲ５－５に対するｃｒＲＮＡスペーサー配列のコード配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０、６１、６２に示す。
実施例１に記載された方法に従って、そのアミノ酸配列が２つ以上の好ましいアミノ酸置換を同時に有するエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉ２酵素をそれぞれ発現し、その組み合わせ方及びその遺伝子編集効率の比較を表１及び図１ｂに示す。実施例１－Ａのスクリーニングにより得られたＥ１７６Ｒ、Ｋ２３８Ｒ、Ｔ４４７Ｒ、Ｅ５６３Ｒの４つの効率を高めることができる変異体中の点突然変異を組み合わせる。図１ｂと表１に示すように、ＣＣＲ５－３、ＣＣＲ５－５、ＲＮＦ２－７の３つのゲノム部位におけるこれらの変異体と野生型Ｃａｓ１２ｉ２との遺伝子編集効率を２９３Ｔ細胞中で比較することにより、点突然変異の組み合わせ後に効率がさらに向上する変異体を得ることができることを発見した。特に、４種類の変異を組み合わせた場合（Ｅ１７６Ｒ＋Ｋ２３８Ｒ＋Ｔ４４７Ｒ＋Ｅ５６３Ｒ）に効率が最も優れた組み合わせ変異を得ることができる。そのうち使用されるＣＣＲ５－３、ＲＮＦ２－７、及びＣＣＲ５－５に対するｃｒＲＮＡスペーサー配列のコード配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０、６１、６２に示す。
【0322】
【表1】
【0323】
実施例２：参照Ｃａｓ１２ｉ２酵素中のＤＮＡ二本鎖開放に関与するアミノ酸を芳香環付きアミノ酸に置換し、それぞれの遺伝子編集の効率を検証する
プラスミド構築
ＰＣＲに基づく部位特異的突然変異誘発によりＣａｓ１２ｉ２タンパク質の変異体を産生し、具体的な方法は変異の部位を中心にＣａｓ１２ｉ２タンパク質のＤＮＡ配列を２つの部分に分け、２対のプライマーを設計してそれぞれこの２つの部分ＤＮＡ配列を増幅し、同時にプライマーに変異を必要とする配列を導入し、最後にＧｉｂｓｏｎ ｃｌｏｎｅの方式で２つの断片をｐＣＡＧ－２Ａ－ｅＧＦＰベクターに組み込んだ。アミノ酸置換位置の決定は、一般的なタンパク質構造可視化ソフトウェア（例えば、ＰｙＭｏｌ、Ｃｈｉｍｅｒａなどのソフトウェアを用いることができる）を用いてＣａｓ１２ｉ２の構造情報を解析して得ることができる。Ｃａｓ１２ｉ２の構造情報はＰＤＢ：６ＬＴＵ、６ＬＴＲ、６ＬＵ０、６ＬＴＰを参照する。Ｃａｓ１２ｉ２エフェクタータンパク質は、ｐＣＡＧ－２Ａ－ｅＧＦＰベクターを介してヒト２９３Ｔ細胞中で発現する。Ｃａｓ１２ｉ２タンパク質をコードするＤＮＡをＸｍａＩとＮｈｅＩの間に挿入した。２９３ＴでＣａｓ１２ｉ２ｃｒＲＮＡを発現するベクターは、ターゲット配列を含むアニールオリゴヌクレオチドをＢａｓＩにより消化したｐＵＣ１９－Ｕ６－ｉ２－ｃｒＲＮＡ骨格に結合することによって構築された。ＤＲをコードするヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９である。
プラスミド構築
ＰＣＲに基づく部位特異的突然変異誘発によりＣａｓ１２ｉ２タンパク質の変異体を産生し、具体的な方法は変異の部位を中心にＣａｓ１２ｉ２タンパク質のＤＮＡ配列を２つの部分に分け、２対のプライマーを設計してそれぞれこの２つの部分ＤＮＡ配列を増幅し、同時にプライマーに変異を必要とする配列を導入し、最後にＧｉｂｓｏｎ ｃｌｏｎｅの方式で２つの断片をｐＣＡＧ－２Ａ－ｅＧＦＰベクターに組み込んだ。アミノ酸置換位置の決定は、一般的なタンパク質構造可視化ソフトウェア（例えば、ＰｙＭｏｌ、Ｃｈｉｍｅｒａなどのソフトウェアを用いることができる）を用いてＣａｓ１２ｉ２の構造情報を解析して得ることができる。Ｃａｓ１２ｉ２の構造情報はＰＤＢ：６ＬＴＵ、６ＬＴＲ、６ＬＵ０、６ＬＴＰを参照する。Ｃａｓ１２ｉ２エフェクタータンパク質は、ｐＣＡＧ－２Ａ－ｅＧＦＰベクターを介してヒト２９３Ｔ細胞中で発現する。Ｃａｓ１２ｉ２タンパク質をコードするＤＮＡをＸｍａＩとＮｈｅＩの間に挿入した。２９３ＴでＣａｓ１２ｉ２ｃｒＲＮＡを発現するベクターは、ターゲット配列を含むアニールオリゴヌクレオチドをＢａｓＩにより消化したｐＵＣ１９－Ｕ６－ｉ２－ｃｒＲＮＡ骨格に結合することによって構築された。ＤＲをコードするヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９である。
【0324】
細胞培養、トランスフェクション及び蛍光活性化細胞選別法（ＦＡＣＳ）
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を１％ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）と１０％ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ）を含むＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）で培養した。細胞を２４ウェル－細胞シャーレ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に播種し、細胞密度が７０％に達するまでに１６時間培養た。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用することにより、Ｃａｓ１２ｉ２タンパク質をコードするプラスミド６００ｎｇとｃｒＲＮＡをコードするプラスミド３００ｎｇを各２４ウェル細胞シャーレにトランスフェクションした。６８ｈトランスフェクションした後、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）されるＨＥＫ２９３Ｔ細胞をトリプシン－ＥＤＴＡ（０．０５％）（Ｇｉｂｃｏ）で消化した。ＧＦＰチャネルを有するＭｏＦｌｏ ＸＤＰ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いて細胞選別を行った。
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を１％ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）と１０％ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ）を含むＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）で培養した。細胞を２４ウェル－細胞シャーレ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に播種し、細胞密度が７０％に達するまでに１６時間培養た。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用することにより、Ｃａｓ１２ｉ２タンパク質をコードするプラスミド６００ｎｇとｃｒＲＮＡをコードするプラスミド３００ｎｇを各２４ウェル細胞シャーレにトランスフェクションした。６８ｈトランスフェクションした後、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）されるＨＥＫ２９３Ｔ細胞をトリプシン－ＥＤＴＡ（０．０５％）（Ｇｉｂｃｏ）で消化した。ＧＦＰチャネルを有するＭｏＦｌｏ ＸＤＰ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いて細胞選別を行った。
【0325】
ゲノム修飾のためのターゲットディープシーケンス解析
ＦＡＣＳで選別したＧＦＰ－陽性ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を緩衝液Ｌで溶解し、５５℃で３時間インキュベートした後、９５℃で１０分間インキュベートした。異なるゲノム部位に標的部位を含むｄｓＤＮＡ断片を、対応するプライマーを用いてＰＣＲ増幅した。ターゲットのディープシーケンスには、細胞分解液をテンプレートとして直接使用し、バーコード（ｂａｒｃｏｄｅｄ）ＰＣＲにより標的部位を直接増幅した。ＰＣＲ生成物を精製し、高スループットシーケンスのためにいくつかのライブラリーにまとめた。挿入または欠失を含む読み取り（ｒｅａｄｓ）の比率を計算することにより、ＣＲＩＳＰＲｅｓｓｏ２ソフトウェアを使用して挿入欠失の頻度（％）を分析する。完全な読み取りの０．０５％未満の読み取りは破棄される。
ＦＡＣＳで選別したＧＦＰ－陽性ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を緩衝液Ｌで溶解し、５５℃で３時間インキュベートした後、９５℃で１０分間インキュベートした。異なるゲノム部位に標的部位を含むｄｓＤＮＡ断片を、対応するプライマーを用いてＰＣＲ増幅した。ターゲットのディープシーケンスには、細胞分解液をテンプレートとして直接使用し、バーコード（ｂａｒｃｏｄｅｄ）ＰＣＲにより標的部位を直接増幅した。ＰＣＲ生成物を精製し、高スループットシーケンスのためにいくつかのライブラリーにまとめた。挿入または欠失を含む読み取り（ｒｅａｄｓ）の比率を計算することにより、ＣＲＩＳＰＲｅｓｓｏ２ソフトウェアを使用して挿入欠失の頻度（％）を分析する。完全な読み取りの０．０５％未満の読み取りは破棄される。
【0326】
まず、Ｃａｓ１２ｉ２酵素中のＤＮＡ二本鎖開放に関与するアミノ酸：Ｑ１６３とＮ１６４を選択し、芳香環付きアミノ酸（Ｙ、Ｆ、Ｗ）の点突然変異試験を行った。図２と表２から、２９３Ｔ細胞中でこれらの変異体と野生型Ｃａｓ１２ｉ２の３つのゲノム部位：ＣＣＲ５－３、ＣＣＲ５－５、ＲＮＦ２－７での遺伝子編集効率を比較することにより、５つの変異体：Ｑ１６３Ｗ、Ｑ１６３Ｙ、Ｑ１６３Ｆ、Ｎ１６４Ｙ、Ｎ１６４Ｆが有効に遺伝子編集効率を高めることができることを発見した（少なくとも１つのゲノム部位）。特に、Ｎ１６４Ｙ及びＮ１６４Ｆは３つのゲノム部位で優れた遺伝子編集効率を示している。Ｎ１６４Ｗは参照酵素に比べて遺伝子編集効率を改善する効果がない。
【0327】
【表2】
【0328】
実施例３：参照Ｃａｓ１２ｉ２酵素中のＲｕｖＣドメインに位置し、一本鎖ＤＮＡ基質と相互作用するアミノ酸を正に帯電したアミノ酸に置換し、その遺伝子編集の効率を検証する
プラスミド構築
ＰＣＲに基づく部位特異的突然変異誘発によりＣａｓ１２ｉ２タンパク質のバリアントを産生し、具体的な方法は変異の部位を中心にＣａｓ１２ｉ２タンパク質のＤＮＡ配列を２つの部分に分け、２対のプライマーを設計してそれぞれこの２つの部分のＤＮＡ配列を増幅し、同時にプライマーに変異を必要とする配列を導入し、最後にＧｉｂｓｏｎ ｃｌｏｎｅの方式で２つの断片をｐＣＡＧ－２Ａ－ｅＧＦＰベクターに組み込んだ。変異体の組み合わせは、Ｃａｓ１２ｉ２タンパク質のＤＮＡを多段に分割し、ＰＣＲ、Ｇｉｂｓｏｎ ｃｌｏｎｅを用いて構築を実現する。変異体の位置決定は、Ｃａｓ１２ｉ２の構造情報を一般的なタンパク質構造可視化ソフトウェア（例えば、ＰｙＭｏｌ、Ｃｈｉｍｅｒａなどのソフトウェアで使用可能）を用いて分析することにより得られたものである。Ｃａｓ１２ｉ２の構造情報はＰＤＢ ＩＤ：６ＬＴＵ、６ＬＴＲ、６ＬＵ０、６ＬＴＰを参照する。これらのＣａｓ１２ｉ２構造で示されるｓｓＤＮＡ基質は５ｎｔのみである。より長いｓｓＤＮＡとＣａｓ１２ｉ２との相互作用の情報を得るために、Ｃａｓ１２ｉ１の構造（ＰＤＢ ＩＤ：６Ｗ５Ｃ、６Ｗ６２と６Ｗ６４、Ｚｈａｎｇ Ｈ．ｅｔａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ＆Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ２７，１０６９－１０７６（２０２０））をＣａｓ１２ｉ２の構造と相同性アラインメントをし、Ｃａｓ１２ｉ１構造中のｓｓＤＮＡ基質（９ｎｔ）をＣａｓ１２ｉ２のＲｕｖＣ触媒ポケットに入れ、このモデルを通じて９ａ内のアミノ酸をさらに探した。Ｃａｓ１２ｉ２エフェクタータンパク質は、ｐＣＡＧ－２Ａ－ｅＧＦＰベクターを介してヒト２９３Ｔ細胞中で発現される。Ｃａｓ１２ｉ２タンパク質をコードするＤＮＡをＸｍａＩとＮｈｅＩの間に挿入した。２９３ＴでＣａｓ１２ｉ２ｃｒＲＮＡを発現するベクターは、ターゲット配列を含むアニールオリゴヌクレオチドをＢａｓＩにより消化されたｐＵＣ１９－Ｕ６－ｉ２－ｃｒＲＮＡ骨格に結合することによって構築された。ＤＲをコードするヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９である。ＣＣＲ５－３及びＲＮＦ２－７に対するｃｒＲＮＡスペーサー配列のためのコード配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０及び６１に示される。
プラスミド構築
ＰＣＲに基づく部位特異的突然変異誘発によりＣａｓ１２ｉ２タンパク質のバリアントを産生し、具体的な方法は変異の部位を中心にＣａｓ１２ｉ２タンパク質のＤＮＡ配列を２つの部分に分け、２対のプライマーを設計してそれぞれこの２つの部分のＤＮＡ配列を増幅し、同時にプライマーに変異を必要とする配列を導入し、最後にＧｉｂｓｏｎ ｃｌｏｎｅの方式で２つの断片をｐＣＡＧ－２Ａ－ｅＧＦＰベクターに組み込んだ。変異体の組み合わせは、Ｃａｓ１２ｉ２タンパク質のＤＮＡを多段に分割し、ＰＣＲ、Ｇｉｂｓｏｎ ｃｌｏｎｅを用いて構築を実現する。変異体の位置決定は、Ｃａｓ１２ｉ２の構造情報を一般的なタンパク質構造可視化ソフトウェア（例えば、ＰｙＭｏｌ、Ｃｈｉｍｅｒａなどのソフトウェアで使用可能）を用いて分析することにより得られたものである。Ｃａｓ１２ｉ２の構造情報はＰＤＢ ＩＤ：６ＬＴＵ、６ＬＴＲ、６ＬＵ０、６ＬＴＰを参照する。これらのＣａｓ１２ｉ２構造で示されるｓｓＤＮＡ基質は５ｎｔのみである。より長いｓｓＤＮＡとＣａｓ１２ｉ２との相互作用の情報を得るために、Ｃａｓ１２ｉ１の構造（ＰＤＢ ＩＤ：６Ｗ５Ｃ、６Ｗ６２と６Ｗ６４、Ｚｈａｎｇ Ｈ．ｅｔａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ＆Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ２７，１０６９－１０７６（２０２０））をＣａｓ１２ｉ２の構造と相同性アラインメントをし、Ｃａｓ１２ｉ１構造中のｓｓＤＮＡ基質（９ｎｔ）をＣａｓ１２ｉ２のＲｕｖＣ触媒ポケットに入れ、このモデルを通じて９ａ内のアミノ酸をさらに探した。Ｃａｓ１２ｉ２エフェクタータンパク質は、ｐＣＡＧ－２Ａ－ｅＧＦＰベクターを介してヒト２９３Ｔ細胞中で発現される。Ｃａｓ１２ｉ２タンパク質をコードするＤＮＡをＸｍａＩとＮｈｅＩの間に挿入した。２９３ＴでＣａｓ１２ｉ２ｃｒＲＮＡを発現するベクターは、ターゲット配列を含むアニールオリゴヌクレオチドをＢａｓＩにより消化されたｐＵＣ１９－Ｕ６－ｉ２－ｃｒＲＮＡ骨格に結合することによって構築された。ＤＲをコードするヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９である。ＣＣＲ５－３及びＲＮＦ２－７に対するｃｒＲＮＡスペーサー配列のためのコード配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０及び６１に示される。
【0329】
細胞培養、トランスフェクション及び蛍光活性化細胞選別法（ＦＡＣＳ）
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を１％ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）と１０％ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ）を含むＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）で培養した。細胞を２４ウェル－細胞シャーレ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に播種し、細胞密度が７０％に達するまでに１６時間培養した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用することにより、Ｃａｓ１２ｉ２タンパク質をコードするプラスミド６００ｎｇとｃｒＲＮＡをコードするプラスミド３００ｎｇを各２４ウェル細胞シャーレにトランスフェクションした。６８ｈトランスフェクションした後、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）されるＨＥＫ２９３Ｔ細胞をトリプシン－ＥＤＴＡ（０．０５％）（Ｇｉｂｃｏ）で消化した。ＧＦＰチャネルを有するＭｏＦｌｏ ＸＤＰ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いて細胞選別を行った。
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を１％ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）と１０％ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ）を含むＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）で培養した。細胞を２４ウェル－細胞シャーレ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に播種し、細胞密度が７０％に達するまでに１６時間培養した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用することにより、Ｃａｓ１２ｉ２タンパク質をコードするプラスミド６００ｎｇとｃｒＲＮＡをコードするプラスミド３００ｎｇを各２４ウェル細胞シャーレにトランスフェクションした。６８ｈトランスフェクションした後、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）されるＨＥＫ２９３Ｔ細胞をトリプシン－ＥＤＴＡ（０．０５％）（Ｇｉｂｃｏ）で消化した。ＧＦＰチャネルを有するＭｏＦｌｏ ＸＤＰ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いて細胞選別を行った。
【0330】
ゲノム修飾のためのターゲットディープシーケンス解析
ＦＡＣＳで選別したＧＦＰ－陽性ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を緩衝液Ｌで溶解し、５５℃で３時間インキュベートした後、９５℃で１０分間インキュベートした。異なるゲノム部位に標的部位を含むｄｓＤＮＡ断片を、対応するプライマーを用いてＰＣＲ増幅した。ターゲットのディープシーケンスには、細胞分解液をテンプレートとして直接使用し、バーコード（ｂａｒｃｏｄｅｄ）ＰＣＲにより標的部位を直接増幅した。ＰＣＲ生成物を精製し、高スループットシーケンスのためにいくつかのライブラリーにまとめた。挿入または欠失を含む読み取り（ｒｅａｄｓ）の比率を計算することにより、ＣＲＩＳＰＲｅｓｓｏ２ソフトウェアを使用して挿入欠失の頻度（％）を分析する。完全な読み取りの０．０５％未満の読み取りが破棄される。
ＦＡＣＳで選別したＧＦＰ－陽性ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を緩衝液Ｌで溶解し、５５℃で３時間インキュベートした後、９５℃で１０分間インキュベートした。異なるゲノム部位に標的部位を含むｄｓＤＮＡ断片を、対応するプライマーを用いてＰＣＲ増幅した。ターゲットのディープシーケンスには、細胞分解液をテンプレートとして直接使用し、バーコード（ｂａｒｃｏｄｅｄ）ＰＣＲにより標的部位を直接増幅した。ＰＣＲ生成物を精製し、高スループットシーケンスのためにいくつかのライブラリーにまとめた。挿入または欠失を含む読み取り（ｒｅａｄｓ）の比率を計算することにより、ＣＲＩＳＰＲｅｓｓｏ２ソフトウェアを使用して挿入欠失の頻度（％）を分析する。完全な読み取りの０．０５％未満の読み取りが破棄される。
【0331】
参照Ｃａｓ１２ｉ２酵素中のＲｕｖＣドメインに位置し、一本鎖ＤＮＡ基質と相互作用するアミノ酸を正に帯電したアミノ酸に置き換えた。これらの変異体と野生型Ｃａｓ１２ｉ２のＣＣＲ５－３及び／またはＲＮＦ２－７ゲノム部位における遺伝子編集効率を２９３Ｔ細胞で比較した。図３ａ及び表３に示すように、Ｎ３９１Ｒ、Ｉ９２６Ｒ、Ｇ９２９Ｒは、遺伝子編集効率（少なくとも１つのゲノム部位）を効果的に向上させることができる。その中でＩ９２６Ｒは２つのゲノム部位で優れた遺伝子編集効率を示している。図３ｂ、３ｃ及び表３に示すように、多くの変異体は遺伝子編集効率（少なくとも１つのゲノム部位）を効果的に向上させることができる。そのうち、遺伝子編集効率が向上した単一アミノ酸置換スキームの順位は、Ｄ３６２Ｒ＞Ｅ３２３Ｒ＞Ｑ４２５Ｒ＞Ｎ９２５Ｒ＞その他の効率が向上した変異体である。
【0332】
図３ａ、３ｂ、３ｃでスクリーニングして得られたＥ３２３Ｒ、Ｄ３６２Ｒ、Ｑ４２５Ｒ、Ｉ９２６Ｒの４つの効率を高めることができる変異体中の点変異を組み合わせた。図３ｄと表３に示すように、２つのゲノム部位：ＣＣＲ５－３、ＲＮＦ２－７におけるこれらの変異体と野生型Ｃａｓ１２ｉ２の遺伝子編集効率を２９３Ｔ細胞で比較することにより、点変異を組み合わせ後に遺伝子編集効率がより向上した変異体（少なくとも１つの部位）を得ることができることを発見した。
【0333】
図３ａ、３ｂ、３ｃ、３ｄのスクリーニングで得られた、効率を高めることができる変異体の一部中の点変異または組み合わせをフレキシブル領域変異Ｉ９２６Ｇ、Ｌ４３９（Ｌ＋ＧＧ）と組み合わせた。図３ｅと表３に示すように、ＲＮＦ２－７部位におけるこれらの変異体と野生型Ｃａｓ１２ｉ２の遺伝子編集効率を２９３Ｔ細胞で比較することにより、点変異を組み合わせた後、より効率的に向上した変異体、例えばＮ９２５Ｒ＋Ｉ９２６Ｇ、Ｉ９２６Ｒ＋Ｌ４３９（Ｌ＋ＧＧ）を得ることができることを発見した。このことから、フレキシブル領域変異のさらなる導入はＣａｓ１２ｉ変異体の遺伝子編集効率を高めることができる。
【0334】
【表3-1】
【0335】
【表3-2】
【0336】
実施例４：参照Ｃａｓ１２ｉ２酵素中のＤＮＡ－ＲＮＡ二重らせんと相互作用するアミノ酸を正に帯電したアミノ酸に置換し、その遺伝子編集の効率を検証する
プラスミド構築
ＰＣＲに基づく部位特異的突然変異誘発によりＣａｓ１２ｉ２タンパク質のバリアントを産生し、具体的な方法は変異の部位を中心にＣａｓ１２ｉ２タンパク質のＤＮＡ配列を２つの部分に分け、２対のプライマーを設計してそれぞれこの２つの部分ＤＮＡ配列を増幅し、同時にプライマーに変異を必要とする配列を導入し、最後にＧｉｂｓｏｎ ｃｌｏｎｅの方式で２つの断片をｐＣＡＧ－２Ａ－ｅＧＦＰベクターに組み込んだ。変異体の組み合わせは、Ｃａｓ１２ｉ２タンパク質のＤＮＡを多段に分割し、ＰＣＲ、Ｇｉｂｓｏｎ ｃｌｏｎｅを用いて構築を実現する。変異体の位置決定は、Ｃａｓ１２ｉ２の構造情報を一般的なタンパク質構造可視化ソフトウェア（例えば、ＰｙＭｏｌ、Ｃｈｉｍｅｒａなどのソフトウェアで使用可能）を用いて分析することにより得られたものである。Ｃａｓ１２ｉ２の構造情報はＰＤＢ：６ＬＴＵ、６ＬＴＲ、６ＬＵ０、６ＬＴＰ）を参照する。Ｃａｓ１２ｉ２エフェクタータンパク質は、ｐＣＡＧ－２Ａ－ｅＧＦＰベクターを介してヒト２９３Ｔ細胞中で発現される。Ｃａｓ１２ｉ２タンパク質をコードするＤＮＡをＸｍａＩとＮｈｅＩの間に挿入した。２９３ＴでＣａｓ１２ｉ２ｃｒＲＮＡを発現するベクターは、ターゲット配列を含むアニールオリゴヌクレオチドをＢａｓＩにより消化されたｐＵＣ１９－Ｕ６－ｉ２－ｃｒＲＮＡ骨格に連結することによって構築された。ＤＲをコードするヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９である。ＣＣＲ５－３及びＲＮＦ２－７に対するｃｒＲＮＡスペーサー配列のためのコード配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０及び６１に示される。
プラスミド構築
ＰＣＲに基づく部位特異的突然変異誘発によりＣａｓ１２ｉ２タンパク質のバリアントを産生し、具体的な方法は変異の部位を中心にＣａｓ１２ｉ２タンパク質のＤＮＡ配列を２つの部分に分け、２対のプライマーを設計してそれぞれこの２つの部分ＤＮＡ配列を増幅し、同時にプライマーに変異を必要とする配列を導入し、最後にＧｉｂｓｏｎ ｃｌｏｎｅの方式で２つの断片をｐＣＡＧ－２Ａ－ｅＧＦＰベクターに組み込んだ。変異体の組み合わせは、Ｃａｓ１２ｉ２タンパク質のＤＮＡを多段に分割し、ＰＣＲ、Ｇｉｂｓｏｎ ｃｌｏｎｅを用いて構築を実現する。変異体の位置決定は、Ｃａｓ１２ｉ２の構造情報を一般的なタンパク質構造可視化ソフトウェア（例えば、ＰｙＭｏｌ、Ｃｈｉｍｅｒａなどのソフトウェアで使用可能）を用いて分析することにより得られたものである。Ｃａｓ１２ｉ２の構造情報はＰＤＢ：６ＬＴＵ、６ＬＴＲ、６ＬＵ０、６ＬＴＰ）を参照する。Ｃａｓ１２ｉ２エフェクタータンパク質は、ｐＣＡＧ－２Ａ－ｅＧＦＰベクターを介してヒト２９３Ｔ細胞中で発現される。Ｃａｓ１２ｉ２タンパク質をコードするＤＮＡをＸｍａＩとＮｈｅＩの間に挿入した。２９３ＴでＣａｓ１２ｉ２ｃｒＲＮＡを発現するベクターは、ターゲット配列を含むアニールオリゴヌクレオチドをＢａｓＩにより消化されたｐＵＣ１９－Ｕ６－ｉ２－ｃｒＲＮＡ骨格に連結することによって構築された。ＤＲをコードするヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９である。ＣＣＲ５－３及びＲＮＦ２－７に対するｃｒＲＮＡスペーサー配列のためのコード配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０及び６１に示される。
【0337】
細胞培養、トランスフェクション及び蛍光活性化細胞選別法（ＦＡＣＳ）
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を１％ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）と１０％ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ）を含むＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）で培養した。細胞を２４ウェル－細胞シャーレ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に播種し、細胞密度が７０％に達するまでに１６時間培養した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用することにより、Ｃａｓ１２ｉ２タンパク質をコードするプラスミド６００ｎｇとｃｒＲＮＡをコードするプラスミド３００ｎｇを各２４ウェル細胞シャーレにトランスフェクションした。６８ｈトランスフェクションした後、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）されるＨＥＫ２９３Ｔ細胞をトリプシン－ＥＤＴＡ（０．０５％）（Ｇｉｂｃｏ）で消化した。ＧＦＰチャネルを有するＭｏＦｌｏ ＸＤＰ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いて細胞選別を行った。
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を１％ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）と１０％ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ）を含むＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）で培養した。細胞を２４ウェル－細胞シャーレ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に播種し、細胞密度が７０％に達するまでに１６時間培養した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用することにより、Ｃａｓ１２ｉ２タンパク質をコードするプラスミド６００ｎｇとｃｒＲＮＡをコードするプラスミド３００ｎｇを各２４ウェル細胞シャーレにトランスフェクションした。６８ｈトランスフェクションした後、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）されるＨＥＫ２９３Ｔ細胞をトリプシン－ＥＤＴＡ（０．０５％）（Ｇｉｂｃｏ）で消化した。ＧＦＰチャネルを有するＭｏＦｌｏ ＸＤＰ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いて細胞選別を行った。
【0338】
ゲノム修飾のためのターゲットディープシーケンス解析
ＦＡＣＳで選別したＧＦＰ－陽性ＨＥＫ ２９３ Ｔ細胞を緩衝液Ｌで溶解し、５５℃で３時間インキュベートした後、９５℃で１０分間インキュベートした。異なるゲノム部位に標的部位を含むｄｓＤＮＡ断片を、対応するプライマーを用いてＰＣＲ増幅した。ターゲットのディープシーケンスには、細胞分解液をテンプレートとして直接に使用し、バーコード（ｂａｒｃｏｄｅｄ）ＰＣＲにより標的部位を直接に増幅した。ＰＣＲ生成物を精製し、高スループットシーケンスのためにいくつかのライブラリーにまとめた。挿入または欠失を含む読み取り（ｒｅａｄｓ）の比率を計算することにより、ＣＲＩＳＰＲｅｓｓｏ２ソフトウェアを使用して挿入欠失の頻度（％）を分析する。完全な読み取りの０．０５％未満の読み取りは破棄される。
ＦＡＣＳで選別したＧＦＰ－陽性ＨＥＫ ２９３ Ｔ細胞を緩衝液Ｌで溶解し、５５℃で３時間インキュベートした後、９５℃で１０分間インキュベートした。異なるゲノム部位に標的部位を含むｄｓＤＮＡ断片を、対応するプライマーを用いてＰＣＲ増幅した。ターゲットのディープシーケンスには、細胞分解液をテンプレートとして直接に使用し、バーコード（ｂａｒｃｏｄｅｄ）ＰＣＲにより標的部位を直接に増幅した。ＰＣＲ生成物を精製し、高スループットシーケンスのためにいくつかのライブラリーにまとめた。挿入または欠失を含む読み取り（ｒｅａｄｓ）の比率を計算することにより、ＣＲＩＳＰＲｅｓｓｏ２ソフトウェアを使用して挿入欠失の頻度（％）を分析する。完全な読み取りの０．０５％未満の読み取りは破棄される。
【0339】
図４と表４は、２９３Ｔ細胞における本実施例におけるＣａｓ１２ｉ２変異体と野生型Ｃａｓ１２ｉ２との２つのゲノム部位：ＣＣＲ５－３、ＲＮＦ２－７における遺伝子編集効率の比較をまとめたものである。我々はがＧ１１６Ｒ、Ｅ１１７Ｒ、Ｔ１５９Ｒ、Ｓ１６１Ｒ、Ｅ３１９Ｒ、Ｅ３４３Ｒ、及びＤ９５８Ｒという７つの変異体は遺伝子編集効率を効果的に高めることができる（少なくとも１つのゲノム部位にある）ことを発見した。そのうちＤ９５８Ｒは２つのゲノム部位で優れた遺伝子編集効率を示している。
【0340】
【表4】
【0341】
実施例５：実施例１～４でスクリーニングして得られた遺伝子編集効率を向上したＣａｓ１２ｉ２のエンジニアリングされたアミノ酸変異の一部を組み合わせ、それらの遺伝子編集の効率を検証する。
プラスミド構築
変異体の組み合わせは、Ｃａｓ１２ｉ２タンパク質のＤＮＡを多段に分割し、ＰＣＲ、Ｇｉｂｓｏｎ ｃｌｏｎｅを用いて構築を実現する。変異体の位置決定は、一般的なタンパク質構造可視化ソフトウェア（例えば、ＰｙＭｏｌ、Ｃｈｉｍｅｒａなどのソフトウェアで使用可能）によりＣａｓ１２ｉ２の構造情報を解析して得られる。Ｃａｓ１２ｉ２の構造情報はＰＤＢ：６ＬＴＵ、６ＬＴＲ、６ＬＵ０、６ＬＴＰ）を参照する。Ｃａｓ１２ｉ２エフェクタータンパク質は、ｐＣＡＧ－２Ａ－ｅＧＦＰベクターを介してヒト２９３Ｔ細胞中で発現される。Ｃａｓ１２ｉ２タンパク質をコードするＤＮＡをＸｍａＩとＮｈｅＩの間に挿入した。２９３ＴでＣａｓ１２ｉ２ｃｒＲＮＡを発現するベクターは、ターゲット配列を含むアニールオリゴヌクレオチドをＢａｓＩにより消化されたｐＵＣ１９－Ｕ６－ｉ２－ｃｒＲＮＡ骨格に結合することによって構築された。ＤＲをコードするヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９である。
プラスミド構築
変異体の組み合わせは、Ｃａｓ１２ｉ２タンパク質のＤＮＡを多段に分割し、ＰＣＲ、Ｇｉｂｓｏｎ ｃｌｏｎｅを用いて構築を実現する。変異体の位置決定は、一般的なタンパク質構造可視化ソフトウェア（例えば、ＰｙＭｏｌ、Ｃｈｉｍｅｒａなどのソフトウェアで使用可能）によりＣａｓ１２ｉ２の構造情報を解析して得られる。Ｃａｓ１２ｉ２の構造情報はＰＤＢ：６ＬＴＵ、６ＬＴＲ、６ＬＵ０、６ＬＴＰ）を参照する。Ｃａｓ１２ｉ２エフェクタータンパク質は、ｐＣＡＧ－２Ａ－ｅＧＦＰベクターを介してヒト２９３Ｔ細胞中で発現される。Ｃａｓ１２ｉ２タンパク質をコードするＤＮＡをＸｍａＩとＮｈｅＩの間に挿入した。２９３ＴでＣａｓ１２ｉ２ｃｒＲＮＡを発現するベクターは、ターゲット配列を含むアニールオリゴヌクレオチドをＢａｓＩにより消化されたｐＵＣ１９－Ｕ６－ｉ２－ｃｒＲＮＡ骨格に結合することによって構築された。ＤＲをコードするヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９である。
【0342】
細胞培養、トランスフェクション及び蛍光活性化細胞選別法（ＦＡＣＳ）
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を１％ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）と１０％ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ）を含むＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）で培養した。細胞を２４ウェル－細胞シャーレ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に播種し、細胞密度が７０％に達するまでに１６時間培養した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用することにより、Ｃａｓ１２ｉ２タンパク質をコードするプラスミド６００ｎｇとｃｒＲＮＡをコードするプラスミド３００ｎｇを各２４ウェル細胞シャーレにトランスフェクションした。約６８ｈトランスフェクションした後、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）されるＨＥＫ ２９３ Ｔ細胞をトリプシン－ＥＤＴＡ（０．０５％）（Ｇｉｂｃｏ）で消化した。細胞選別は、ＧＦＰチャネルを有するＭｏＦｌｏ ＸＤＰ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いて行った。
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を１％ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）と１０％ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ）を含むＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）で培養した。細胞を２４ウェル－細胞シャーレ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に播種し、細胞密度が７０％に達するまでに１６時間培養した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用することにより、Ｃａｓ１２ｉ２タンパク質をコードするプラスミド６００ｎｇとｃｒＲＮＡをコードするプラスミド３００ｎｇを各２４ウェル細胞シャーレにトランスフェクションした。約６８ｈトランスフェクションした後、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）されるＨＥＫ ２９３ Ｔ細胞をトリプシン－ＥＤＴＡ（０．０５％）（Ｇｉｂｃｏ）で消化した。細胞選別は、ＧＦＰチャネルを有するＭｏＦｌｏ ＸＤＰ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いて行った。
【0343】
ゲノム修飾のためのターゲットディープシーケンス解析
ＦＡＣＳで選別したＧＦＰ－陽性ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を緩衝液Ｌで溶解し、５５℃で３時間インキュベートした後、９５℃で１０分間インキュベートした。異なるゲノム部位に標的部位を含むｄｓＤＮＡ断片を、対応するプライマーを用いてＰＣＲ増幅した。ターゲットのディープシーケンスには、細胞分解液をテンプレートとして直接使用し、バーコード（ｂａｒｃｏｄｅｄ）ＰＣＲにより標的部位を直接増幅した。ＰＣＲ生成物を精製し、高スループットシーケンスのためにいくつかのライブラリーにまとめた。挿入または欠失を含む読み取り（ｒｅａｄｓ）の比率を計算することにより、ＣＲＩＳＰＲｅｓｓｏ２ソフトウェアを使用して挿入欠失の頻度（％）を分析する。完全な読み取りの０．０５％未満の読み取りは破棄される。
ＦＡＣＳで選別したＧＦＰ－陽性ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を緩衝液Ｌで溶解し、５５℃で３時間インキュベートした後、９５℃で１０分間インキュベートした。異なるゲノム部位に標的部位を含むｄｓＤＮＡ断片を、対応するプライマーを用いてＰＣＲ増幅した。ターゲットのディープシーケンスには、細胞分解液をテンプレートとして直接使用し、バーコード（ｂａｒｃｏｄｅｄ）ＰＣＲにより標的部位を直接増幅した。ＰＣＲ生成物を精製し、高スループットシーケンスのためにいくつかのライブラリーにまとめた。挿入または欠失を含む読み取り（ｒｅａｄｓ）の比率を計算することにより、ＣＲＩＳＰＲｅｓｓｏ２ソフトウェアを使用して挿入欠失の頻度（％）を分析する。完全な読み取りの０．０５％未満の読み取りは破棄される。
【0344】
実施例１～４でスクリーニングしたアミノ酸変異またはアミノ酸変異の組み合わせ：Ｅ１７６Ｒ＋Ｋ２３８Ｒ＋Ｔ４４７Ｒ＋Ｅ５６３Ｒ、Ｎ１６４Ｙ、Ｅ３２３Ｒ＋Ｄ３６２Ｒ、Ｉ９２６Ｒ、Ｅ３２３Ｒ＋Ｄ３６２Ｒ＋Ｉ９２６Ｒ、Ｅ３２３Ｒ＋Ｄ３６２Ｒ＋Ｉ９２６Ｇ、Ｅ３２３Ｒ＋Ｄ３６２Ｒ＋Ｉ９２６Ｇ＋Ｌ４３９（Ｌ＋Ｇ）、Ｅ３２３Ｒ＋Ｄ３６２Ｒ＋Ｉ９２６Ｇ＋Ｌ４３９（Ｌ＋ＧＧ）をさらに組み合わせた。図５と表５に示すように、これらの変異体と野生型Ｃａｓ１２ｉが５つのゲノム部位：ＣＣＲ５－３、ＣＣＲ５－５、ＣＤ３４－８、ＣＤ３４－９、ＲＮＦ２－１４に作用する遺伝子編集効率を２９３Ｔ細胞で比較することにより、異なる種類の点突然変異を組み合わせた後、より効率的に向上した変異体を得ることができることを発見した。同時に、効率が最も優れていると考えられている変異体（Ｅ１７６Ｒ＋Ｋ２３８Ｒ＋Ｔ４４７Ｒ＋Ｅ５６３Ｒ＋Ｎ１６４Ｙ＋Ｅ３２３Ｒ＋Ｄ３６２Ｒ）をＣａｓＸＸと命名した。そのうち、使用されるＣＤ３４－８、ＣＤ３４－９及びＲＮＦ２－１４に対するｃｒＲＮＡスペーサー配列のコード配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６３、６４及び６５にそれぞれ示される。
【0345】
【表5】
【0346】
また、下記の変異の組み合わせを構築した：Ｅ１７６Ｒ＋Ｋ２３８Ｒ＋Ｔ４４７Ｒ＋Ｅ５６３Ｒ＋Ｎ１６４Ｙ＋Ｄ９５８Ｒ；
Ｅ１７６Ｒ＋Ｋ２３８Ｒ＋Ｔ４４７Ｒ＋Ｅ５６３Ｒ＋Ｉ９２６Ｒ＋Ｄ９５８Ｒ；
Ｅ１７６Ｒ＋Ｋ２３８Ｒ＋Ｔ４４７Ｒ＋Ｅ５６３Ｒ＋Ｅ３２３Ｒ＋Ｄ３６２Ｒ＋Ｄ９５８Ｒ；
Ｎ１６４Ｙ＋Ｉ９２６Ｒ＋Ｄ９５８Ｒ；Ｎ１６４Ｙ＋Ｅ３２３Ｒ＋Ｄ３６２Ｒ＋Ｄ９５８Ｒ；
Ｅ１７６Ｒ＋Ｋ２３８Ｒ＋Ｔ４４７Ｒ＋Ｅ５６３Ｒ＋Ｎ１６４Ｙ＋Ｉ９２６Ｒ＋Ｄ９５８Ｒ；
Ｅ１７６Ｒ＋Ｋ２３８Ｒ＋Ｔ４４７Ｒ＋Ｅ５６３Ｒ＋Ｎ１６４Ｙ＋Ｅ３２３Ｒ＋Ｄ３６２Ｒ＋Ｄ９５８Ｒ；
Ｅ１７６Ｒ＋Ｋ２３８Ｒ＋Ｔ４４７Ｒ＋Ｅ５６３Ｒ＋Ｎ１６４Ｙ＋Ｉ９２６Ｒ＋Ｅ３２３Ｒ＋Ｄ３６２Ｒ＋Ｄ９５８Ｒ；
Ｅ１７６Ｒ＋Ｋ２３８Ｒ＋Ｔ４４７Ｒ＋Ｅ５６３Ｒ＋Ｎ１６４Ｙ＋Ｅ３２３Ｒ＋Ｄ３６２Ｒ＋Ｉ９２６Ｇ＋Ｄ９５８Ｒ；
Ｅ１７６Ｒ＋Ｋ２３８Ｒ＋Ｔ４４７Ｒ＋Ｅ５６３Ｒ＋Ｎ１６４Ｙ＋Ｅ３２３Ｒ＋Ｄ３６２Ｒ＋Ｉ９２６Ｇ＋Ｌ４３９（Ｌ＋ＧＧ）＋Ｄ９５８Ｒ；及びＥ１７６Ｒ＋Ｋ２３８Ｒ＋Ｔ４４７Ｒ＋Ｅ５６３Ｒ＋Ｎ１６４Ｙ＋Ｅ３２３Ｒ＋Ｄ３６２Ｒ＋Ｉ９２６Ｇ＋Ｌ４３９（Ｌ＋Ｇ）＋Ｄ９５８Ｒ。その遺伝子編集効率は、Ｔ７７エンドヌクレアーゼ１（Ｔ７Ｅ１）アッセイ及びターゲットディープシーケンスによって検出することができる。
Ｅ１７６Ｒ＋Ｋ２３８Ｒ＋Ｔ４４７Ｒ＋Ｅ５６３Ｒ＋Ｉ９２６Ｒ＋Ｄ９５８Ｒ；
Ｅ１７６Ｒ＋Ｋ２３８Ｒ＋Ｔ４４７Ｒ＋Ｅ５６３Ｒ＋Ｅ３２３Ｒ＋Ｄ３６２Ｒ＋Ｄ９５８Ｒ；
Ｎ１６４Ｙ＋Ｉ９２６Ｒ＋Ｄ９５８Ｒ；Ｎ１６４Ｙ＋Ｅ３２３Ｒ＋Ｄ３６２Ｒ＋Ｄ９５８Ｒ；
Ｅ１７６Ｒ＋Ｋ２３８Ｒ＋Ｔ４４７Ｒ＋Ｅ５６３Ｒ＋Ｎ１６４Ｙ＋Ｉ９２６Ｒ＋Ｄ９５８Ｒ；
Ｅ１７６Ｒ＋Ｋ２３８Ｒ＋Ｔ４４７Ｒ＋Ｅ５６３Ｒ＋Ｎ１６４Ｙ＋Ｅ３２３Ｒ＋Ｄ３６２Ｒ＋Ｄ９５８Ｒ；
Ｅ１７６Ｒ＋Ｋ２３８Ｒ＋Ｔ４４７Ｒ＋Ｅ５６３Ｒ＋Ｎ１６４Ｙ＋Ｉ９２６Ｒ＋Ｅ３２３Ｒ＋Ｄ３６２Ｒ＋Ｄ９５８Ｒ；
Ｅ１７６Ｒ＋Ｋ２３８Ｒ＋Ｔ４４７Ｒ＋Ｅ５６３Ｒ＋Ｎ１６４Ｙ＋Ｅ３２３Ｒ＋Ｄ３６２Ｒ＋Ｉ９２６Ｇ＋Ｄ９５８Ｒ；
Ｅ１７６Ｒ＋Ｋ２３８Ｒ＋Ｔ４４７Ｒ＋Ｅ５６３Ｒ＋Ｎ１６４Ｙ＋Ｅ３２３Ｒ＋Ｄ３６２Ｒ＋Ｉ９２６Ｇ＋Ｌ４３９（Ｌ＋ＧＧ）＋Ｄ９５８Ｒ；及びＥ１７６Ｒ＋Ｋ２３８Ｒ＋Ｔ４４７Ｒ＋Ｅ５６３Ｒ＋Ｎ１６４Ｙ＋Ｅ３２３Ｒ＋Ｄ３６２Ｒ＋Ｉ９２６Ｇ＋Ｌ４３９（Ｌ＋Ｇ）＋Ｄ９５８Ｒ。その遺伝子編集効率は、Ｔ７７エンドヌクレアーゼ１（Ｔ７Ｅ１）アッセイ及びターゲットディープシーケンスによって検出することができる。
【0347】
実施例６：ＣａｓＸＸと従来の遺伝子編集ツールの比較による遺伝子編集効率の検証。
プラスミド構築
ＣａｓＸＸと他のＣａｓの遺伝子編集活性を比較するために、ＡｓＣａｓ１２ａ、ＢｈＣａｓ１２ｂ ｖ４、ＳｐＣａｓ９、ＳａＣａｓ９、ＳａＣａｓ９－ＫＫＨのコード配列をコドン最適化（ヒト）して合成した。Ｃａｓエフェクタータンパク質は、ｐＣＡＧ－２Ａ－ｅＧＦＰベクターを介してヒト２９３Ｔ細胞中で発現される。Ｃａｓタンパク質をコードするＤＮＡをＸｍａＩとＮｈｅＩの間に挿入した。ターゲット配列を含むアニーリングオリゴヌクレオチドを、ＢａｓＩにより消化されたｐＵＣ１９－Ｕ６－ｉ２－ｃｒＲＮＡ骨格に連結することにより、２９３ＴでＡｓＣａｓ１２ａ、ＢｈＣａｓ１２ｂ ｖ４、ＳｐＣａｓ９、ＳａＣａｓ９、ＳａＣａｓ９－ＫＫＨ、Ｃａｓ１２ｉ２を発現するｓｇＲＮＡまたはｃｒＲＮＡのベクターを構築した。ＣａｓＸＸをコードするＤＲのヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９である。
プラスミド構築
ＣａｓＸＸと他のＣａｓの遺伝子編集活性を比較するために、ＡｓＣａｓ１２ａ、ＢｈＣａｓ１２ｂ ｖ４、ＳｐＣａｓ９、ＳａＣａｓ９、ＳａＣａｓ９－ＫＫＨのコード配列をコドン最適化（ヒト）して合成した。Ｃａｓエフェクタータンパク質は、ｐＣＡＧ－２Ａ－ｅＧＦＰベクターを介してヒト２９３Ｔ細胞中で発現される。Ｃａｓタンパク質をコードするＤＮＡをＸｍａＩとＮｈｅＩの間に挿入した。ターゲット配列を含むアニーリングオリゴヌクレオチドを、ＢａｓＩにより消化されたｐＵＣ１９－Ｕ６－ｉ２－ｃｒＲＮＡ骨格に連結することにより、２９３ＴでＡｓＣａｓ１２ａ、ＢｈＣａｓ１２ｂ ｖ４、ＳｐＣａｓ９、ＳａＣａｓ９、ＳａＣａｓ９－ＫＫＨ、Ｃａｓ１２ｉ２を発現するｓｇＲＮＡまたはｃｒＲＮＡのベクターを構築した。ＣａｓＸＸをコードするＤＲのヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９である。
【0348】
細胞培養、トランスフェクション及び蛍光活性化細胞選別法（ＦＡＣＳ）
ＨＥＫ ２９３ Ｔ細胞を１％ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）と１０％ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ）を含むＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）で培養した。細胞を２４ウェル－細胞シャーレ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に播種し、細胞密度が７０％に達するまでに１６時間培養した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用することにより、Ｃａｓ１２ｉ ２タンパク質をコードするプラスミド６００ ｎｇとｃｒＲＮＡをコードするプラスミド３００ ｎｇを各２４ウェル細胞シャーレにトランスフェクションした。約６８ ｈトランスフェクションした後、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）されるＨＥＫ２９３Ｔ細胞をトリプシン－ＥＤＴＡ（０．０５％）（Ｇｉｂｃｏ）で消化した。ＧＦＰチャネルを有するＭｏＦｌｏ ＸＤＰ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いて細胞選別を行った。
ＨＥＫ ２９３ Ｔ細胞を１％ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）と１０％ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ）を含むＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）で培養した。細胞を２４ウェル－細胞シャーレ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に播種し、細胞密度が７０％に達するまでに１６時間培養した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用することにより、Ｃａｓ１２ｉ ２タンパク質をコードするプラスミド６００ ｎｇとｃｒＲＮＡをコードするプラスミド３００ ｎｇを各２４ウェル細胞シャーレにトランスフェクションした。約６８ ｈトランスフェクションした後、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）されるＨＥＫ２９３Ｔ細胞をトリプシン－ＥＤＴＡ（０．０５％）（Ｇｉｂｃｏ）で消化した。ＧＦＰチャネルを有するＭｏＦｌｏ ＸＤＰ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いて細胞選別を行った。
【0349】
ゲノム修飾のためのターゲットディープシーケンス解析
ＦＡＣＳで選別したＧＦＰ－陽性ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を緩衝液Ｌで溶解し、５５℃で３時間インキュベートした後、９５℃で１０分間インキュベートした。異なるゲノム部位に標的部位を含むｄｓＤＮＡ断片を、対応するプライマーを用いてＰＣＲ増幅した。ターゲットのディープシーケンスには、細胞分解液をテンプレートとして直接使用し、バーコード（ｂａｒｃｏｄｅｄ）ＰＣＲにより標的部位を直接増幅した。ＰＣＲ生成物を精製し、高スループットシーケンスのためにいくつかのライブラリーにまとめた。挿入または欠失を含む読み取り（ｒｅａｄｓ）の比率を計算することにより、ＣＲＩＳＰＲｅｓｓｏ２ソフトウェアを使用して挿入欠失の頻度（％）を分析する。完全な読み取りの０．０５％未満の読み取りは破棄される。
ＦＡＣＳで選別したＧＦＰ－陽性ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を緩衝液Ｌで溶解し、５５℃で３時間インキュベートした後、９５℃で１０分間インキュベートした。異なるゲノム部位に標的部位を含むｄｓＤＮＡ断片を、対応するプライマーを用いてＰＣＲ増幅した。ターゲットのディープシーケンスには、細胞分解液をテンプレートとして直接使用し、バーコード（ｂａｒｃｏｄｅｄ）ＰＣＲにより標的部位を直接増幅した。ＰＣＲ生成物を精製し、高スループットシーケンスのためにいくつかのライブラリーにまとめた。挿入または欠失を含む読み取り（ｒｅａｄｓ）の比率を計算することにより、ＣＲＩＳＰＲｅｓｓｏ２ソフトウェアを使用して挿入欠失の頻度（％）を分析する。完全な読み取りの０．０５％未満の読み取りは破棄される。
【0350】
我々はまず、異なるＰＡＭ配列を含む６２パーソナルゲノム部位におけるＣａｓＸＸの遺伝子編集効率を試験した。設計されたスペーサー配列は２０ヌクレオチドである。図６ａに示すように、ＣａｓＸＸは極めて強力な遺伝子編集能力を示し、平均遺伝子編集効率は６０％を超え、試験されたすべての部位の遺伝子編集効率は５０％を超えた。また、任意のＮＴＴＮ ＰＡＭ（Ｎ＝Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ）に対して高い遺伝子編集効率を示した。
【0351】
エンジニアリングされたＣａｓＸＸの遺伝子編集能力をさらに示すために、ＣａｓＸＸをＡｓＣａｓ１２ａと、ＴＴＴＮ ＰＡＭ部位で比較し、さらにＢｈＣａｓ１２ｂ ｖ４とＴＴＮ ＰＡＭ部位で比較した。図６ｂに示すように、ＣａｓＸＸは２種類のＰＡＭを持つ標的部位でより高い平均遺伝子編集効率を示している。
【0352】
また、ＣａｓＸＸとＳｐＣａｓ９、ＳａＣａｓ９、ＳａＣａｓ９－ＫＫＨを同じ位置で比較した。図６ｃに示すように、ＣａｓＸＸは試験部位でより高い平均遺伝子編集効率を示した。
【0353】
体内でのＣａｓＸＸの遺伝子編集活性を試験するために、ＣａｓＸＸをコードするｐＣＡＧ－２Ａ－ｅＧＦＰベクター及びｃｒＲＮＡをコードするｐＵＣ１９－Ｕ６－ｉ２－ｃｒＲＮＡベクターをリポソームトランスフェクション法でマウスＨｅｐａ１－６肝癌細胞系にトランスフェクションした。そのうち、それぞれ６５個の内因性遺伝子部位に対応するｃｒＲＮＡを設計した。設計されたｓｐａｃｅｒ配列は２０ヌクレオチドである。挿入欠失頻度はＰＣＲ増幅シーケンスから得られ、外来遺伝子編集分析方法と類似している。
【0354】
図６ｄに示すように、ＣａｓＸＸはマウスＨｅｐａ１－６細胞系の６５個の内因性遺伝子部位に対して強大な遺伝子編集能力を示し、平均遺伝子編集効率は６０％を超えた。
【0355】
実施例７：異なるＰＡＭを含むゲノム部位でのＣａｓＸＸを用いた遺伝子編集。
プラスミド構築
ＣａｓＸＸをコードするＤＮＡ配列をｐＣＡＧ－２Ａ－ＥＧＦＰプラスミドに組み込んで、ＣａｓＸＸ発現するプラスミドを構築した。ＨＥＫ２９３ＴにおけるｃｒＲＮＡの発現のためのベクターは、ターゲット配列を含むアニールオリゴヌクレオチドをＢａｓＩ消化ｐＵＣ１９－Ｕ６－ｃｒＲＮＡ骨格に連結することによって構築された。そのうち、６４の異なるｃｒＲＮＡが６４のヒト内因性部位を標的として設計された。前記内因性標的核酸の５’末端は、異なるＰＡＭに対するＣａｓＸＸの認識能力を検出するために、図７に示すように異なるＰＡＭ５’－ＮＮＮＮ－３’（Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧまたはＣ）を有し、。そのうち、この６４個の部位に含まれるＰＡＭ配列は、すべてのＮＮＮＮの組み合わせをカバーする：ＮＴＴＮ、ＮＴＡＮ、ＮＴＣＮ、ＮＴＧＮ、ＮＡＴＮ、ＮＡＡＮ、ＮＡＣＮ、ＮＡＧＮ、ＮＣＴＮ、ＮＣＡＮ、ＮＣＣＮ、ＮＣＧＮ、ＮＧＴＮ、ＮＧＡＮ、ＮＧＣＮ、ＮＧＧＮ。ＤＲをコードするヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９である。設計されたスペーサー配列は２０のヌクレオチドである。
プラスミド構築
ＣａｓＸＸをコードするＤＮＡ配列をｐＣＡＧ－２Ａ－ＥＧＦＰプラスミドに組み込んで、ＣａｓＸＸ発現するプラスミドを構築した。ＨＥＫ２９３ＴにおけるｃｒＲＮＡの発現のためのベクターは、ターゲット配列を含むアニールオリゴヌクレオチドをＢａｓＩ消化ｐＵＣ１９－Ｕ６－ｃｒＲＮＡ骨格に連結することによって構築された。そのうち、６４の異なるｃｒＲＮＡが６４のヒト内因性部位を標的として設計された。前記内因性標的核酸の５’末端は、異なるＰＡＭに対するＣａｓＸＸの認識能力を検出するために、図７に示すように異なるＰＡＭ５’－ＮＮＮＮ－３’（Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧまたはＣ）を有し、。そのうち、この６４個の部位に含まれるＰＡＭ配列は、すべてのＮＮＮＮの組み合わせをカバーする：ＮＴＴＮ、ＮＴＡＮ、ＮＴＣＮ、ＮＴＧＮ、ＮＡＴＮ、ＮＡＡＮ、ＮＡＣＮ、ＮＡＧＮ、ＮＣＴＮ、ＮＣＡＮ、ＮＣＣＮ、ＮＣＧＮ、ＮＧＴＮ、ＮＧＡＮ、ＮＧＣＮ、ＮＧＧＮ。ＤＲをコードするヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９である。設計されたスペーサー配列は２０のヌクレオチドである。
【0356】
細胞培養、トランスフェクション及び蛍光活性化細胞選別法（ＦＡＣＳ）
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を１％ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）と１０％ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ）を含むＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）で培養した。細胞を２４細胞シャーレ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に播種し、細胞密度が７０％に達するまでに１６時間培養した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、Ｃａｓタンパク質をコードするプラスミド６００ｎｇとｃｒＲＮＡをコードするプラスミドを３００ｎｇ２４ウェル細胞シャーレで培養した細胞中にトランスフェクションした。７２ｈトランスフェクションした後、細胞をトリプシン－ＥＤＴＡ（０．０５％）（Ｇｉｂｃｏ）で消化した後、ＧＦＰ蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を行った。
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を１％ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）と１０％ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ）を含むＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）で培養した。細胞を２４細胞シャーレ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に播種し、細胞密度が７０％に達するまでに１６時間培養した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、Ｃａｓタンパク質をコードするプラスミド６００ｎｇとｃｒＲＮＡをコードするプラスミドを３００ｎｇ２４ウェル細胞シャーレで培養した細胞中にトランスフェクションした。７２ｈトランスフェクションした後、細胞をトリプシン－ＥＤＴＡ（０．０５％）（Ｇｉｂｃｏ）で消化した後、ＧＦＰ蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を行った。
【0357】
ゲノム修飾のためのターゲットディープシーケンス解析
ＦＡＣＳで選別したＧＦＰ－陽性２９３ＦＴ細胞を緩衝液Ｌで溶解し、５５℃で３時間インキュベートした後、９５℃で１０分間インキュベートした。異なるゲノム部位に標的部位を含むｄｓＤＮＡ断片を、対応するプライマーを用いてＰＣＲ増幅した。ターゲットのディープシーケンスには、細胞分解液をテンプレートとして直接使用し、バーコード（ｂａｒｃｏｄｅｄ）ＰＣＲにより標的部位を直接増幅した。ＰＣＲ生成物を精製し、高スループットシーケンスのためにいくつかのライブラリーにまとめた。挿入または欠失を含む読み取り（ｒｅａｄｓ）の比率を計算することにより、ＣＲＩＳＰＲｅｓｓｏ２ソフトウェアを使用して挿入欠失の頻度（％）を分析する。完全な読み取りの０．０５％未満の読み取りは破棄される。実験結果を図７に示す。
ＦＡＣＳで選別したＧＦＰ－陽性２９３ＦＴ細胞を緩衝液Ｌで溶解し、５５℃で３時間インキュベートした後、９５℃で１０分間インキュベートした。異なるゲノム部位に標的部位を含むｄｓＤＮＡ断片を、対応するプライマーを用いてＰＣＲ増幅した。ターゲットのディープシーケンスには、細胞分解液をテンプレートとして直接使用し、バーコード（ｂａｒｃｏｄｅｄ）ＰＣＲにより標的部位を直接増幅した。ＰＣＲ生成物を精製し、高スループットシーケンスのためにいくつかのライブラリーにまとめた。挿入または欠失を含む読み取り（ｒｅａｄｓ）の比率を計算することにより、ＣＲＩＳＰＲｅｓｓｏ２ソフトウェアを使用して挿入欠失の頻度（％）を分析する。完全な読み取りの０．０５％未満の読み取りは破棄される。実験結果を図７に示す。
【0358】
図７に示すように、ＣａｓＸＸは５’末端にＮＴＴＮ、ＮＴＡＮ、ＮＴＣＮ、ＮＴＧＮ、ＮＡＴＮ、ＮＡＡＮ、ＮＣＴＮ、ＮＣＡＮ、ＮＧＴＮというＰＡＭを有する標的部位はいずれも効率的な遺伝子編集効率を示し、これらの部位での平均遺伝子編集効率は４０％を超えている。
【0359】
実施例８：ＣａｓＸＸを用いた異なるＰＡＭを含む二本鎖ＤＮＡのインビトロ切断
変異体の発現プラスミドの構築
野生型Ｃａｓ１２ｉ２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）及びＣａｓＸＸ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）をコードするＤＮＡ配列をＢＰＫ２０１４プラスミド（クロラムフェニコール耐性を有する）に組み込んで、Ｃａｓ１２ｉ２及びＣａｓＸＸタンパク質の原核発現プラスミドを構築した。
変異体の発現プラスミドの構築
野生型Ｃａｓ１２ｉ２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）及びＣａｓＸＸ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）をコードするＤＮＡ配列をＢＰＫ２０１４プラスミド（クロラムフェニコール耐性を有する）に組み込んで、Ｃａｓ１２ｉ２及びＣａｓＸＸタンパク質の原核発現プラスミドを構築した。
【0360】
タンパク質精製
ＢＰＫ２０１４原核発現プラスミドを大腸菌株ＢＬ２１（λＤＥ３）（ＴｒａｎｓＧｅｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）に形質転換した。形質転換された菌液をクロラムフェニコール含有固体ＬＢ上に塗布した。３つのクローンを５ｍｌの液体ＬＢに採取し、一晩培養した。その後、細菌を３Ｌ液体ＬＢに移して、ＯＤ６００が０．６～ ０．８に達するまで培養を続けた。その後、ＩＰＴＧ（０．５ｍＭ）を用いて１６℃で２０時間誘導した。超遠心分離し、Ｃａｓ１２ｉを発現する細菌を収穫し、分解緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．５、３００ｍＭ ＮａＣｌ）に再懸濁し、超音波により破砕した。遠心分離後、まず上澄み中のＣａｓ１２ｉタンパク質をＮｉカラムで精製した。簡単に言えば、上澄み液と共にインキュベートした後、Ｎｉカラムは０ｍＭ、２０ｍＭ、５０ｍＭイミダゾールを添加した溶解緩衝液で順次洗浄した。その後、Ｃａｓ１２ｉタンパク質を５００ｍＭイミダゾール添加溶解緩衝液で溶出した。その後、収集したサンプルをイオン交換カラム（ＣＭ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ，ＧＥ）にロードした。野生型Ｃａｓ１２ｉ２とＣａｓＸＸタンパク質を貯蔵緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、３００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＴＣＥＰ、１０％グリセリン、ｐＨ７．５）で溶出した。タンパク質はフィルターを通じて滅菌され、－８０°Ｃに貯蔵される。
ＢＰＫ２０１４原核発現プラスミドを大腸菌株ＢＬ２１（λＤＥ３）（ＴｒａｎｓＧｅｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）に形質転換した。形質転換された菌液をクロラムフェニコール含有固体ＬＢ上に塗布した。３つのクローンを５ｍｌの液体ＬＢに採取し、一晩培養した。その後、細菌を３Ｌ液体ＬＢに移して、ＯＤ６００が０．６～ ０．８に達するまで培養を続けた。その後、ＩＰＴＧ（０．５ｍＭ）を用いて１６℃で２０時間誘導した。超遠心分離し、Ｃａｓ１２ｉを発現する細菌を収穫し、分解緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．５、３００ｍＭ ＮａＣｌ）に再懸濁し、超音波により破砕した。遠心分離後、まず上澄み中のＣａｓ１２ｉタンパク質をＮｉカラムで精製した。簡単に言えば、上澄み液と共にインキュベートした後、Ｎｉカラムは０ｍＭ、２０ｍＭ、５０ｍＭイミダゾールを添加した溶解緩衝液で順次洗浄した。その後、Ｃａｓ１２ｉタンパク質を５００ｍＭイミダゾール添加溶解緩衝液で溶出した。その後、収集したサンプルをイオン交換カラム（ＣＭ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ，ＧＥ）にロードした。野生型Ｃａｓ１２ｉ２とＣａｓＸＸタンパク質を貯蔵緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、３００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＴＣＥＰ、１０％グリセリン、ｐＨ７．５）で溶出した。タンパク質はフィルターを通じて滅菌され、－８０°Ｃに貯蔵される。
【0361】
ｃｒＲＮＡ インビトロ転写
ＤＲをコードするヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９である。Ｔ７プロモーター配列を含むオリゴヌクレオチド（Ｔ７－Ｆと命名）とｃｒＲＮＡとＴ７プロモーター相補配列を含むオリゴヌクレオチド（Ｔ７－１２ｉ－ｃｒＲＮＡ－Ｒと命名）を合成し、１ｘ ＮＥＢｕｆｆｅｒＴＭ２（ＮＥＢ）中でアニールした。これらのオリゴヌクレオチドの配列を表６に示す。アニーリング生成物をテンプレートとして使用し、ＨｉＳｃｒｉｂｅＴＭ Ｔ７Ｑｕｉｃｋ Ｈｉｇｈ Ｙｉｅｌｄ ＲＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ＮＥＢ）によりｃｒＲＮＡを製造した。Ｍｏｎａｒｃｈ(R) ＲＮＡ Ｃｌｅａｎｕｐ Ｋｉｔ（ＮＥＢ）を用いて転写されたｃｒＲＮＡを精製する。
ＤＲをコードするヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９である。Ｔ７プロモーター配列を含むオリゴヌクレオチド（Ｔ７－Ｆと命名）とｃｒＲＮＡとＴ７プロモーター相補配列を含むオリゴヌクレオチド（Ｔ７－１２ｉ－ｃｒＲＮＡ－Ｒと命名）を合成し、１ｘ ＮＥＢｕｆｆｅｒＴＭ２（ＮＥＢ）中でアニールした。これらのオリゴヌクレオチドの配列を表６に示す。アニーリング生成物をテンプレートとして使用し、ＨｉＳｃｒｉｂｅＴＭ Ｔ７Ｑｕｉｃｋ Ｈｉｇｈ Ｙｉｅｌｄ ＲＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ＮＥＢ）によりｃｒＲＮＡを製造した。Ｍｏｎａｒｃｈ(R) ＲＮＡ Ｃｌｅａｎｕｐ Ｋｉｔ（ＮＥＢ）を用いて転写されたｃｒＲＮＡを精製する。
【0362】
【表6】
【0363】
Ｃａｓ１２ｉタンパク質のインビトロ酵素切断
インビトロ切断用の線状ｄｓＤＮＡ基質を調製するために、まず同じプロトタイプスペーサー領域と異なるＰＡＭを含むターゲットをＥｃｏＲ１とＨｉｎｄＩＩＩで処理されたｐＵＣ１９（ペニシリン耐性を有する）にクローニングした。５’のＰＡＭを有するターゲット配列を表７に示す。次にターゲットを担持したｐＵＣ１９プラスミドをＳａｃＩにより線形化し、ＤＮＡ Ｃｌｅａｎ＆Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いて精製した。インビトロ切断実験では、まず４００ｎＭ Ｃａｓ１２ｉタンパク質を２μＭ ｃｒＲＮＡと３７℃で１５分間インキュベートした。次に、１ｘ ＮＥＢｕｆｆｅｒＴＭ３．１（ＮＥＢ）を含む１０μｌ反応系において、Ｃａｓ１２ｉ－ｃｒＲＮＡ ＲＮＰと１５０ｎｇ線形化標的ＤＮＡを３７℃で４０分間反応させた。その後、５０ｍＭ ＥＤＴＡを用いて反応を終了し、ＲＮＡをＲＮａｓｅ ｃｏｃｋｔａｉｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて３７°Ｃで１５分間消化した。最後に、試料をプロテアーゼ（ＮＥＢ）で３７°Ｃで１５分間処理した。反応生成物を１．２％アガロースゲル上で電気泳動により分離した。
インビトロ切断用の線状ｄｓＤＮＡ基質を調製するために、まず同じプロトタイプスペーサー領域と異なるＰＡＭを含むターゲットをＥｃｏＲ１とＨｉｎｄＩＩＩで処理されたｐＵＣ１９（ペニシリン耐性を有する）にクローニングした。５’のＰＡＭを有するターゲット配列を表７に示す。次にターゲットを担持したｐＵＣ１９プラスミドをＳａｃＩにより線形化し、ＤＮＡ Ｃｌｅａｎ＆Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いて精製した。インビトロ切断実験では、まず４００ｎＭ Ｃａｓ１２ｉタンパク質を２μＭ ｃｒＲＮＡと３７℃で１５分間インキュベートした。次に、１ｘ ＮＥＢｕｆｆｅｒＴＭ３．１（ＮＥＢ）を含む１０μｌ反応系において、Ｃａｓ１２ｉ－ｃｒＲＮＡ ＲＮＰと１５０ｎｇ線形化標的ＤＮＡを３７℃で４０分間反応させた。その後、５０ｍＭ ＥＤＴＡを用いて反応を終了し、ＲＮＡをＲＮａｓｅ ｃｏｃｋｔａｉｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて３７°Ｃで１５分間消化した。最後に、試料をプロテアーゼ（ＮＥＢ）で３７°Ｃで１５分間処理した。反応生成物を１．２％アガロースゲル上で電気泳動により分離した。
【0364】
図８に示すように、野生型Ｃａｓ１２ｉ２タンパク質は５’－ＮＴＴＮ－３’ＰＡＭを含む二本鎖ＤＮＡに対してのみ部分切断の効率を持つが、残りのＰＡＭに対しては切断活性はほとんどない。しかし、ＣａｓＸＸタンパク質はＮＴＴＮ、ＮＴＡＮ、ＮＴＣＮ、ＮＴＧＮ、ＮＡＴＮ、ＮＡＡＮ、ＮＡＣＮ、ＮＣＴＮ、ＮＣＡＮ、ＮＧＴＮ、ＮＧＡＮ ＰＡＭを含む二本鎖ＤＮＡに対して効率的な切断効率を示している。ＣａｓＸＸは、ＮＴＴＮ、ＮＴＡＮ、ＮＴＣＮ、ＮＡＴＮ、ＮＡＡＮ、ＮＡＣＮ、ＮＣＴＮ、ＮＣＡＮ、ＮＧＴＮ ＰＡＭを含む二本鎖ＤＮＡをほぼ完全に切断することができる。したがって、本発明が提供するエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼは、より広範な遺伝子編集または治療に使用することができる。
【0365】
【表7】
【0366】
実施例９：ＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑを用いたCasXXのオフターゲット効果の検出
プラスミド構築
ＣａｓＸＸをコードするＤＮＡ配列をｐＣＡＧ－２Ａ－ＥＧＦＰプラスミドに組み込んで、ＣａｓＸＸを発現するプラスミドを構築した。２９３Ｔ（ヒト腎上皮細胞系）においてＣａｓタンパク質ｃｒＲＮＡを発現するベクターを、ターゲット配列を含むアニールオリゴヌクレオチドをＢａｓＩ消化ｐＵＣ１９－Ｕ６－ｃｒＲＮＡ骨格に連結することにより構築した。そのうち、ｃｒＲＮＡは、ＥＭＸ１－７の内因性部位を標的とすることができるスペーサー配列（ｓｐａｃｅｒ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７７）を含む。ＤＲをコードするヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９である。
プラスミド構築
ＣａｓＸＸをコードするＤＮＡ配列をｐＣＡＧ－２Ａ－ＥＧＦＰプラスミドに組み込んで、ＣａｓＸＸを発現するプラスミドを構築した。２９３Ｔ（ヒト腎上皮細胞系）においてＣａｓタンパク質ｃｒＲＮＡを発現するベクターを、ターゲット配列を含むアニールオリゴヌクレオチドをＢａｓＩ消化ｐＵＣ１９－Ｕ６－ｃｒＲＮＡ骨格に連結することにより構築した。そのうち、ｃｒＲＮＡは、ＥＭＸ１－７の内因性部位を標的とすることができるスペーサー配列（ｓｐａｃｅｒ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７７）を含む。ＤＲをコードするヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９である。
【0367】
細胞培養、トランスフェクション及び蛍光活性化細胞選別法（ＦＡＣＳ）
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を１％ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）と１０％ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ）を含むＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）で培養した。細胞を２４細胞シャーレ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に播種し、細胞密度が７０％に達するまでに１６時間培養した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、Ｃａｓタンパク質をコードするプラスミド６００ｎｇ、ｃｒＲＮＡをコードするプラスミド３００ｎｇ、及び１０ｐｍｏｌのアニールした二本鎖ＤＮＡタグ（配列は表８参照）を２４ウェル細胞シャーレで培養した細胞にトランスフェクションした。７２ｈトランスフェクションした後、細胞をトリプシン－ＥＤＴＡ（０．０５％）（Ｇｉｂｃｏ）で消化した後、ＧＦＰ蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を行った。選ばれたのはＣａｓ酵素の発現に成功した細胞である。
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を１％ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）と１０％ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ）を含むＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）で培養した。細胞を２４細胞シャーレ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に播種し、細胞密度が７０％に達するまでに１６時間培養した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、Ｃａｓタンパク質をコードするプラスミド６００ｎｇ、ｃｒＲＮＡをコードするプラスミド３００ｎｇ、及び１０ｐｍｏｌのアニールした二本鎖ＤＮＡタグ（配列は表８参照）を２４ウェル細胞シャーレで培養した細胞にトランスフェクションした。７２ｈトランスフェクションした後、細胞をトリプシン－ＥＤＴＡ（０．０５％）（Ｇｉｂｃｏ）で消化した後、ＧＦＰ蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を行った。選ばれたのはＣａｓ酵素の発現に成功した細胞である。
【0368】
【表8】
【0369】
全ゲノム範囲におけるＣａｓＸＸのオフターゲット効果の検出
Ｅ．Ｚ．Ｎ．Ａ．(R) ＭｉｃｒｏＥｌｕｔｅ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｋｉｔ （Ｏｍｅｇａ）キットを使用して、ＦＡＣＳによって選別されたＧＦＰ－陽性２９３Ｔ細胞用のゲノムを抽出した。精製したゲノムはＱｕｂｉｔを用いて定量した。Ｃｏｖａｒｉｓ Ｓ２２０機器を用いて、機器推奨プログラムに従ってゲノムを５００ｂｐ程度まで断片化した。その後、ＶＡＨＴＳ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｐｒｏ ＤＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔ ｆｏｒ Ｉｌｌｕｍｉｎａ（Ｖａｚｙｍｅ）キットを用いてＤＮＡライブラリー構築を行った。ライブラリー作成プロセスは参考文献（Ｔｓａｉ，ＳＱ ｅｔａｌ．“ＧＵＩＤＥ－ｓｅｑ ｅｎａｂｌｅｓ ｇｅｎｏｍｅ－ｗｉｄｅ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｏｆ ｏｆｆ－ｔａｒｇｅｔ ｃｌｅａｖａｇｅ ｂｙ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ，”Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１５、３３（２）：１８７－１９７を参照し、その内容は参照により全体的に本明細書に組み込まれる）。ライブラリー生成物を高スループットシーケンスした。シーケンスの結果を分析し、潜在的なオフターゲット部位を探した。ＥＭＸ１－７部位におけるＣａｓＸＸのオフターゲット効果について系統的な分析を行い、具体的な分析結果は図１０を参照。第１行の配列は参照ターゲット配列であり、下記の配列はそれぞれターゲット配列とオフターゲット配列、及びターゲット配列とオフターゲット配列に二本鎖ＤＮＡタグが濃縮されたｒｅａｄｓ数を表す。
より高いオフターゲット数から分かるように、哺乳動物細胞におけるＣａｓＸＸ酵素の編集特異性はあまり理想的ではなく、さらに最適化する必要がある。
Ｅ．Ｚ．Ｎ．Ａ．(R) ＭｉｃｒｏＥｌｕｔｅ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｋｉｔ （Ｏｍｅｇａ）キットを使用して、ＦＡＣＳによって選別されたＧＦＰ－陽性２９３Ｔ細胞用のゲノムを抽出した。精製したゲノムはＱｕｂｉｔを用いて定量した。Ｃｏｖａｒｉｓ Ｓ２２０機器を用いて、機器推奨プログラムに従ってゲノムを５００ｂｐ程度まで断片化した。その後、ＶＡＨＴＳ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｐｒｏ ＤＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔ ｆｏｒ Ｉｌｌｕｍｉｎａ（Ｖａｚｙｍｅ）キットを用いてＤＮＡライブラリー構築を行った。ライブラリー作成プロセスは参考文献（Ｔｓａｉ，ＳＱ ｅｔａｌ．“ＧＵＩＤＥ－ｓｅｑ ｅｎａｂｌｅｓ ｇｅｎｏｍｅ－ｗｉｄｅ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｏｆ ｏｆｆ－ｔａｒｇｅｔ ｃｌｅａｖａｇｅ ｂｙ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ，”Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１５、３３（２）：１８７－１９７を参照し、その内容は参照により全体的に本明細書に組み込まれる）。ライブラリー生成物を高スループットシーケンスした。シーケンスの結果を分析し、潜在的なオフターゲット部位を探した。ＥＭＸ１－７部位におけるＣａｓＸＸのオフターゲット効果について系統的な分析を行い、具体的な分析結果は図１０を参照。第１行の配列は参照ターゲット配列であり、下記の配列はそれぞれターゲット配列とオフターゲット配列、及びターゲット配列とオフターゲット配列に二本鎖ＤＮＡタグが濃縮されたｒｅａｄｓ数を表す。
より高いオフターゲット数から分かるように、哺乳動物細胞におけるＣａｓＸＸ酵素の編集特異性はあまり理想的ではなく、さらに最適化する必要がある。
【0370】
実施例１０：ＣａｓＸＸ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）に基づいて新しいアミノ酸変異を導入し、この変異体の特異性向上の特徴を検証する（２つの標的部位を選択して変異体スクリーニング実験を行った、すなわちＥＭＸ１－７部位とＲＮＦ２－１部位）
スクリーニング実験準備：変異体の発現プラスミドの構築
ＣａｓＸＸ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に基づくＮ１６４Ｙ＋Ｅ１７６Ｒ＋Ｋ２３８Ｒ＋Ｅ３２３Ｒ＋Ｄ３６２Ｒ＋Ｔ４４７Ｒ＋Ｅ５６３Ｒ変異を含む）に基づいて、私たちはさらに新しいアミノ酸点変異を導入してＣａｓＸＸ遺伝子編集の特異性を高め、オフターゲット効果を低下させる。我々はＣａｓＸＸの配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）に基づいて、変異塩基を有するプライマーを用いてＣａｓＸＸのＤＮＡ配列に対してＰＣＲをし、ＮＥＢｕｉｌｄｅｒ(R) ＨｉＦｉ ＤＮＡＡｓｓｅｍｂｌｙ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＮＥＢ）キットを用いて、精製されたＰＣＲ生成物をｐＣＡＧ－２Ａ－ＥＧＦＰプラスミドに組み込んで、それにより、導入された関連点変異を発現するＣａｓＸＸプラスミドを構築した。ＣａｓＸＸ配列に基づく、単一アミノ酸変異を含む２６種類の変異体を獲得し、それぞれＣａｓＸＸ－ＨＦ－１からＨＦ－２６と命名した。具体的な変異方式を表９に示す。そのうち、ＣａｓＸＸ－ＨＦ－２６はＣａｓＸＸ中のＮ１６４Ｙ点変異を野生型Ｃａｓ１２ｉ２の原始アミノ酸Ｎ、すなわちＹ１６４Ｎに回復した（すなわち、Ｎ１６４Ｙという変異を削除した）。
スクリーニング実験準備：変異体の発現プラスミドの構築
ＣａｓＸＸ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に基づくＮ１６４Ｙ＋Ｅ１７６Ｒ＋Ｋ２３８Ｒ＋Ｅ３２３Ｒ＋Ｄ３６２Ｒ＋Ｔ４４７Ｒ＋Ｅ５６３Ｒ変異を含む）に基づいて、私たちはさらに新しいアミノ酸点変異を導入してＣａｓＸＸ遺伝子編集の特異性を高め、オフターゲット効果を低下させる。我々はＣａｓＸＸの配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）に基づいて、変異塩基を有するプライマーを用いてＣａｓＸＸのＤＮＡ配列に対してＰＣＲをし、ＮＥＢｕｉｌｄｅｒ(R) ＨｉＦｉ ＤＮＡＡｓｓｅｍｂｌｙ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＮＥＢ）キットを用いて、精製されたＰＣＲ生成物をｐＣＡＧ－２Ａ－ＥＧＦＰプラスミドに組み込んで、それにより、導入された関連点変異を発現するＣａｓＸＸプラスミドを構築した。ＣａｓＸＸ配列に基づく、単一アミノ酸変異を含む２６種類の変異体を獲得し、それぞれＣａｓＸＸ－ＨＦ－１からＨＦ－２６と命名した。具体的な変異方式を表９に示す。そのうち、ＣａｓＸＸ－ＨＦ－２６はＣａｓＸＸ中のＮ１６４Ｙ点変異を野生型Ｃａｓ１２ｉ２の原始アミノ酸Ｎ、すなわちＹ１６４Ｎに回復した（すなわち、Ｎ１６４Ｙという変異を削除した）。
【0371】
【表9】
【0372】
ＥＭＸ１～７部位を標的とするｃｒＲＮＡの発現プラスミドを構築する
ターゲット配列を含むアニールオリゴヌクレオチドをＴ４ｌｉｇａｓｅ（ＮＥＢ）でＢａｓＩ（ＮＥＢ）で消化処理されたｐＵＣ１９－Ｕ６－ｃｒＲＮＡ骨格に連結することにより、２９３ＴでＣａｓタンパク質ｃｒＲＮＡを発現するベクターを構築した。前記ｃｒＲＮＡは、ＥＭＸ１～７部位を標的とするように設計されている。具体的な配列を表１０に示す。ＤＲをコードするヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９である。
ターゲット配列を含むアニールオリゴヌクレオチドをＴ４ｌｉｇａｓｅ（ＮＥＢ）でＢａｓＩ（ＮＥＢ）で消化処理されたｐＵＣ１９－Ｕ６－ｃｒＲＮＡ骨格に連結することにより、２９３ＴでＣａｓタンパク質ｃｒＲＮＡを発現するベクターを構築した。前記ｃｒＲＮＡは、ＥＭＸ１～７部位を標的とするように設計されている。具体的な配列を表１０に示す。ＤＲをコードするヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９である。
【0373】
【表10】
【0374】
細胞培養、トランスフェクション及び蛍光活性化細胞選別法（ＦＡＣＳ）
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を１％ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）と１０％ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ）を含むＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）で培養した。細胞を２４細胞シャーレ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に播種し、細胞密度が７０％に達するまでに１６時間培養した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、Ｃａｓタンパク質をコードするプラスミド６００ｎｇとｃｒＲＮＡをコードするプラスミド３００ｎｇを２４ウェル細胞シャーレで培養した細胞中にトランスフェクションした。７２ｈトランスフェクションした後、細胞をトリプシン－ＥＤＴＡ（０．０５％）（Ｇｉｂｃｏ）で消化した後、ＧＦＰ蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を行った。
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を１％ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）と１０％ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ）を含むＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）で培養した。細胞を２４細胞シャーレ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に播種し、細胞密度が７０％に達するまでに１６時間培養した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、Ｃａｓタンパク質をコードするプラスミド６００ｎｇとｃｒＲＮＡをコードするプラスミド３００ｎｇを２４ウェル細胞シャーレで培養した細胞中にトランスフェクションした。７２ｈトランスフェクションした後、細胞をトリプシン－ＥＤＴＡ（０．０５％）（Ｇｉｂｃｏ）で消化した後、ＧＦＰ蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を行った。
【0375】
Ｔ７Ｅ１酵素消化法を用いたＥＭＸ１－７標的部位及びオフターゲット部位におけるＣａｓタンパク質の編集効率の検出
ＦＡＣＳにより選別されたＧＦＰ陽性ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を４０μＬ緩衝液Ｌ（ｂｉｍａｋｅ）で分解し、５５°Ｃで３時間インキュベートした後、９５°Ｃで１０分間インキュベートした。異なるゲノム部位にターゲット部位またはオフターゲット部位を含むｄｓＤＮＡ断片を、ＥＭＸ１－７ターゲット部位、ＥＭＸ１－７オフターゲット部位１、ＥＭＸ１－７オフターゲット部位２、及びＥＭＸ１－７オフターゲット部位３（図１０）に対するプライマーを用いてＰＣＲ増幅した。ターゲット部位またはオフターゲット部位の配列は表１１を参照。その後、１０μＬ ＰＣＲ生成物を再アニールして異種二本鎖ｄｓＤＮＡを形成した。次に、混合物を１／１０体積のＮＥＢｕｆｆｅｒＴＭ２．１と０．２μＬ Ｔ７ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ｉ（ＮＥＢ）を３７°Ｃで５０分間処理した。消化生成物を～２．５％アガロースゲル電気泳動により分析した。バンドのグレースケール値に基づいて挿入欠失の割合（Ｉｎｄｅｌ，％）を計算した。各Ｃａｓ１２ｉ変異体のターゲット部位またはオフターゲット部位への挿入欠失の割合の値を表１２に示し、図１１に対応する。実験の結果、Ｒ８５７Ａ、Ｎ８６１Ａ、Ｋ８０７Ａ、Ｎ８４８Ａ、Ｒ７１５Ａ、Ｒ７１９Ａ、Ｋ３９４Ａ、Ｈ３５７Ａ、Ｋ８４４ＡというＣａｓＸＸ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）に基づく単点変異体（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４－２２のエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼに対応し、表９参照）は、オフターゲット部位ＥＭＸ１－７－ＯＴ－１、ＥＭＸ１－７－ＯＴ－２、ＥＭＸ１－７－ＯＴ－３での挿入欠失割合を効果的に低下させることができ、より高い特異性を持つことが分かった。実験結果では、オフターゲット部位における挿入欠失率の低下とターゲット部位における編集効率の基本的な不変（または上昇）を編集特異性の向上と定義した。
ＦＡＣＳにより選別されたＧＦＰ陽性ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を４０μＬ緩衝液Ｌ（ｂｉｍａｋｅ）で分解し、５５°Ｃで３時間インキュベートした後、９５°Ｃで１０分間インキュベートした。異なるゲノム部位にターゲット部位またはオフターゲット部位を含むｄｓＤＮＡ断片を、ＥＭＸ１－７ターゲット部位、ＥＭＸ１－７オフターゲット部位１、ＥＭＸ１－７オフターゲット部位２、及びＥＭＸ１－７オフターゲット部位３（図１０）に対するプライマーを用いてＰＣＲ増幅した。ターゲット部位またはオフターゲット部位の配列は表１１を参照。その後、１０μＬ ＰＣＲ生成物を再アニールして異種二本鎖ｄｓＤＮＡを形成した。次に、混合物を１／１０体積のＮＥＢｕｆｆｅｒＴＭ２．１と０．２μＬ Ｔ７ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ｉ（ＮＥＢ）を３７°Ｃで５０分間処理した。消化生成物を～２．５％アガロースゲル電気泳動により分析した。バンドのグレースケール値に基づいて挿入欠失の割合（Ｉｎｄｅｌ，％）を計算した。各Ｃａｓ１２ｉ変異体のターゲット部位またはオフターゲット部位への挿入欠失の割合の値を表１２に示し、図１１に対応する。実験の結果、Ｒ８５７Ａ、Ｎ８６１Ａ、Ｋ８０７Ａ、Ｎ８４８Ａ、Ｒ７１５Ａ、Ｒ７１９Ａ、Ｋ３９４Ａ、Ｈ３５７Ａ、Ｋ８４４ＡというＣａｓＸＸ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）に基づく単点変異体（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４－２２のエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼに対応し、表９参照）は、オフターゲット部位ＥＭＸ１－７－ＯＴ－１、ＥＭＸ１－７－ＯＴ－２、ＥＭＸ１－７－ＯＴ－３での挿入欠失割合を効果的に低下させることができ、より高い特異性を持つことが分かった。実験結果では、オフターゲット部位における挿入欠失率の低下とターゲット部位における編集効率の基本的な不変（または上昇）を編集特異性の向上と定義した。
【0376】
【表11】
【0377】
【表12-1】
【0378】
【表12-2】
【0379】
ＲＮＦ２－１部位を標的とするｃｒＲＮＡの発現プラスミドを構築する
ターゲット配列を含むアニールオリゴヌクレオチドをＴ４ｌｉｇａｓｅ（ＮＥＢ）でＢａｓＩ（ＮＥＢ）で消化処理されたｐＵＣ１９－Ｕ６－ｃｒＲＮＡ骨格に連結することにより、ＨＥＫ２９３Ｔ中でＣａｓタンパク質ｃｒＲＮＡを発現するベクターを構築した。最終的なｃｒＲＮＡはすべて同じＲＮＦ２－１部位に標的化されるが、ｓｐａｃｅｒ配列は異なる。これらのｓｐａｃｅｒをコードする具体的な配列を表１３に示す。そのうち、ＲＮＦ２－１－ＦＭは、ｃｒＲＮＡ中のｓｐａｃｅｒ配列がＲＮＦ２－１部位と完全にマッチングすることを表す。ＲＮＦ２－１－Ｍｉｓ－１／２は、ｃｒＲＮＡ中のｓｐａｃｅｒ配列がＲＮＦ２－１部位と１番目と２番目の塩基位置でマッチングせず、残りの位置でマッチングしていることを表す。ＲＮＦ２－１－Ｍｉｓ－５／６は、ｃｒＲＮＡ中のｓｐａｃｅｒ配列がＲＮＦ２－１部位と５番目と６番目の塩基位置でマッチングせず、残りの位置でマッチングしていることを表す。ＲＮＦ２－１－Ｍｉｓ－１７／１は、ｃｒＲＮＡ中のｓｐａｃｅｒ配列がＲＮＦ２－１部位と１７番目と１８番目の塩基位置でマッチングせず、残りの位置でマッチングしていることを表す。ＲＮＦ２－１－Ｍｉｓ－１９／２０は、ｃｒＲＮＡ中のｓｐａｃｅｒ配列がＲＮＦ２－１部位と１９番目と２０番目の塩基位置でマッチングせず、残りの位置でマッチングしていることを表す。そのうち、塩基不整合を設定する目的は、オフターゲット効果をシミュレーションするためである。ＤＲをコードするヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９である。
ターゲット配列を含むアニールオリゴヌクレオチドをＴ４ｌｉｇａｓｅ（ＮＥＢ）でＢａｓＩ（ＮＥＢ）で消化処理されたｐＵＣ１９－Ｕ６－ｃｒＲＮＡ骨格に連結することにより、ＨＥＫ２９３Ｔ中でＣａｓタンパク質ｃｒＲＮＡを発現するベクターを構築した。最終的なｃｒＲＮＡはすべて同じＲＮＦ２－１部位に標的化されるが、ｓｐａｃｅｒ配列は異なる。これらのｓｐａｃｅｒをコードする具体的な配列を表１３に示す。そのうち、ＲＮＦ２－１－ＦＭは、ｃｒＲＮＡ中のｓｐａｃｅｒ配列がＲＮＦ２－１部位と完全にマッチングすることを表す。ＲＮＦ２－１－Ｍｉｓ－１／２は、ｃｒＲＮＡ中のｓｐａｃｅｒ配列がＲＮＦ２－１部位と１番目と２番目の塩基位置でマッチングせず、残りの位置でマッチングしていることを表す。ＲＮＦ２－１－Ｍｉｓ－５／６は、ｃｒＲＮＡ中のｓｐａｃｅｒ配列がＲＮＦ２－１部位と５番目と６番目の塩基位置でマッチングせず、残りの位置でマッチングしていることを表す。ＲＮＦ２－１－Ｍｉｓ－１７／１は、ｃｒＲＮＡ中のｓｐａｃｅｒ配列がＲＮＦ２－１部位と１７番目と１８番目の塩基位置でマッチングせず、残りの位置でマッチングしていることを表す。ＲＮＦ２－１－Ｍｉｓ－１９／２０は、ｃｒＲＮＡ中のｓｐａｃｅｒ配列がＲＮＦ２－１部位と１９番目と２０番目の塩基位置でマッチングせず、残りの位置でマッチングしていることを表す。そのうち、塩基不整合を設定する目的は、オフターゲット効果をシミュレーションするためである。ＤＲをコードするヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９である。
【0380】
【表13】
【0381】
細胞培養、トランスフェクション及び蛍光活性化細胞選別法（ＦＡＣＳ）
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を１％ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）と１０％ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ）を含むＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）で培養した。細胞を２４細胞シャーレ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に播種し、細胞密度が７０％に達するまでに１６時間培養した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、Ｃａｓタンパク質をコードするプラスミド６００ｎｇとｃｒＲＮＡをコードするプラスミド３００ｎｇを、２４ウェル細胞シャーレで培養した細胞中にトランスフェクションした。７２ｈトランスフェクションした後、細胞をトリプシン－ＥＤＴＡ（０．０５％）（Ｇｉｂｃｏ）で消化した後、ＧＦＰ蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を行った。選ばれたのはＣａｓ酵素の発現に成功した細胞である。
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を１％ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）と１０％ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ）を含むＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）で培養した。細胞を２４細胞シャーレ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に播種し、細胞密度が７０％に達するまでに１６時間培養した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、Ｃａｓタンパク質をコードするプラスミド６００ｎｇとｃｒＲＮＡをコードするプラスミド３００ｎｇを、２４ウェル細胞シャーレで培養した細胞中にトランスフェクションした。７２ｈトランスフェクションした後、細胞をトリプシン－ＥＤＴＡ（０．０５％）（Ｇｉｂｃｏ）で消化した後、ＧＦＰ蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を行った。選ばれたのはＣａｓ酵素の発現に成功した細胞である。
【0382】
Ｔ７Ｅ１酵素消化法を用いたＲＮＦ２－１及びオフターゲット部位におけるＣａｓ１２ｉ変異体の編集効率の検出
ＦＡＣＳにより選別されたＧＦＰ陽性ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を４０μＬ緩衝液Ｌ（ｂｉｍａｋｅ）で分解し、５５°Ｃで３時間インキュベートした後、９５°Ｃで１０分間インキュベートした。ＲＮＦ２－１部位ｄｓＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅するためにＲＮＦ２－１プライマーを使用した。その後、１０μＬ ＰＣＲ生成物を再アニールして異種二本鎖ｄｓＤＮＡを形成した。次に、混合物を１／１０体積のＮＥＢｕｆｆｅｒＴＭ２．１と０．２μＬ Ｔ７ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ｉ（ＮＥＢ）を３７°Ｃで５０分間処理した。消化生成物をアガロースゲル電気泳動の２．５％により分析した。バンドのグレースケール値に基づいて挿入欠失の割合（Ｉｎｄｅｌ，％）を計算する。異なるｃｒＲＮＡを用いた場合の各Ｃａｓ１２ｉ変異体のターゲット部位への挿入欠失の割合の値を表１４に示し、図１２に対応する。実験の結果、Ｒ８５７Ａ、Ｎ８６１Ａ、Ｋ８０７Ａ、Ｎ８４８Ａ、Ｒ７１５Ａ、Ｒ７１９Ａ、Ｋ３９４Ａ、Ｈ３５７Ａ、Ｋ８４４ＡというＣａｓＸＸ配列に基づく単点変異体（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ：１４－２２のエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼに対応し、表９を参照）は、オフターゲットを模擬したｃｒＲＮＡ－ＲＮＦ２－１－Ｍｉｓ－１／２、ｃｒＲＮＡ－ＲＮＦ２－１－Ｍｉｓ－５／６、ｃｒＲＮＡ－ＲＮＦ２－１－Ｍｉｓ－１７／１８及びｃｒＲＮＡ－ＲＮＦ２－１－Ｍｉｓ－１９／２０を用いても挿入欠失の割合を効果的に低減できることが分かった。実験結果では、オフターゲット部位における挿入欠失率の低下とターゲット部位における編集効率の基本的な不変（または向上）を編集特異性の向上と定義した。
ＦＡＣＳにより選別されたＧＦＰ陽性ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を４０μＬ緩衝液Ｌ（ｂｉｍａｋｅ）で分解し、５５°Ｃで３時間インキュベートした後、９５°Ｃで１０分間インキュベートした。ＲＮＦ２－１部位ｄｓＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅するためにＲＮＦ２－１プライマーを使用した。その後、１０μＬ ＰＣＲ生成物を再アニールして異種二本鎖ｄｓＤＮＡを形成した。次に、混合物を１／１０体積のＮＥＢｕｆｆｅｒＴＭ２．１と０．２μＬ Ｔ７ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ｉ（ＮＥＢ）を３７°Ｃで５０分間処理した。消化生成物をアガロースゲル電気泳動の２．５％により分析した。バンドのグレースケール値に基づいて挿入欠失の割合（Ｉｎｄｅｌ，％）を計算する。異なるｃｒＲＮＡを用いた場合の各Ｃａｓ１２ｉ変異体のターゲット部位への挿入欠失の割合の値を表１４に示し、図１２に対応する。実験の結果、Ｒ８５７Ａ、Ｎ８６１Ａ、Ｋ８０７Ａ、Ｎ８４８Ａ、Ｒ７１５Ａ、Ｒ７１９Ａ、Ｋ３９４Ａ、Ｈ３５７Ａ、Ｋ８４４ＡというＣａｓＸＸ配列に基づく単点変異体（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ：１４－２２のエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼに対応し、表９を参照）は、オフターゲットを模擬したｃｒＲＮＡ－ＲＮＦ２－１－Ｍｉｓ－１／２、ｃｒＲＮＡ－ＲＮＦ２－１－Ｍｉｓ－５／６、ｃｒＲＮＡ－ＲＮＦ２－１－Ｍｉｓ－１７／１８及びｃｒＲＮＡ－ＲＮＦ２－１－Ｍｉｓ－１９／２０を用いても挿入欠失の割合を効果的に低減できることが分かった。実験結果では、オフターゲット部位における挿入欠失率の低下とターゲット部位における編集効率の基本的な不変（または向上）を編集特異性の向上と定義した。
【0383】
【表14-1】
【0384】
【表14-2】
【0385】
実施例１１：ＣａｓＸＸ配列に基づいて新規アミノ酸変異を導入した変異体
ＣａｓＸＸ配列に新たなアミノ酸変異を導入した変異体について、蛍光報告システムにおいて特異性が向上したものをスクリーニングし、本実施例と実施例１０の違いは、編集効率を示す分析手段がアガロースゲル電気泳動から蛍光に変更されたことである。
ＣａｓＸＸ配列に新たなアミノ酸変異を導入した変異体について、蛍光報告システムにおいて特異性が向上したものをスクリーニングし、本実施例と実施例１０の違いは、編集効率を示す分析手段がアガロースゲル電気泳動から蛍光に変更されたことである。
【0386】
ｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子を標的とするｃｒＲＮＡの発現プラスミドを構築する
ターゲット配列を含むアニールオリゴヌクレオチドをＴ４ｌｉｇａｓｅ（ＮＥＢ）でＢａｓＩ（ＮＥＢ）で消化処理されたｐＵＣ１９－Ｕ６－ｃｒＲＮＡ骨格に連結することにより、ＨＥＫ２９３Ｔ中でＣａｓタンパク質ｃｒＲＮＡを発現するベクターを構築した。最終的なｃｒＲＮＡはすべて同じｍＣｈｅｒｒｙ部位に標的化されるが、ｓｐａｃｅｒ配列は異なる。ｓｐａｃｅｒをコードする具体的な配列を表１５に示す。そのうち、ｍＣｈｅｒｒｙ－ＦＭは、ｃｒＲＮＡ中のｓｐａｃｅｒ配列がｍＣｈｅｒｒｙ部位と完全にマッチングすることを表す。ｃｒＲＮＡ－ｍＣｈｅｒｒｙ－Ｍｉｓ－１／２は、ｃｒＲＮＡ中のｓｐａｃｅｒ配列がｃｒＲＮＡ－ｍＣｈｅｒｒｙ部位と１番目と２番目の塩基位置でマッチングせず、残りの位置でマッチングしていることを表す。ｃｒＲＮＡ－ｍＣｈｅｒｒｙ－Ｍｉｓ－５／６は、ｃｒＲＮＡ中のｓｐａｃｅｒ配列がｃｒＲＮＡ－ｍＣｈｅｒｒｙ部位と５番目と６番目の塩基位置でマッチングせず、残りの位置でマッチングしていることを表す。ｃｒＲＮＡ－ｍＣｈｅｒｒｙ－Ｍｉｓ－１９／２０は、ｃｒＲＮＡ中のｓｐａｃｅｒ配列がｃｒＲＮＡ－ｍＣｈｅｒｒｙ部位と１９番目と２０番目の塩基位置でマッチングせず、残りの位置でマッチングしていることを表す。ＤＲをコードするヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９である。
ターゲット配列を含むアニールオリゴヌクレオチドをＴ４ｌｉｇａｓｅ（ＮＥＢ）でＢａｓＩ（ＮＥＢ）で消化処理されたｐＵＣ１９－Ｕ６－ｃｒＲＮＡ骨格に連結することにより、ＨＥＫ２９３Ｔ中でＣａｓタンパク質ｃｒＲＮＡを発現するベクターを構築した。最終的なｃｒＲＮＡはすべて同じｍＣｈｅｒｒｙ部位に標的化されるが、ｓｐａｃｅｒ配列は異なる。ｓｐａｃｅｒをコードする具体的な配列を表１５に示す。そのうち、ｍＣｈｅｒｒｙ－ＦＭは、ｃｒＲＮＡ中のｓｐａｃｅｒ配列がｍＣｈｅｒｒｙ部位と完全にマッチングすることを表す。ｃｒＲＮＡ－ｍＣｈｅｒｒｙ－Ｍｉｓ－１／２は、ｃｒＲＮＡ中のｓｐａｃｅｒ配列がｃｒＲＮＡ－ｍＣｈｅｒｒｙ部位と１番目と２番目の塩基位置でマッチングせず、残りの位置でマッチングしていることを表す。ｃｒＲＮＡ－ｍＣｈｅｒｒｙ－Ｍｉｓ－５／６は、ｃｒＲＮＡ中のｓｐａｃｅｒ配列がｃｒＲＮＡ－ｍＣｈｅｒｒｙ部位と５番目と６番目の塩基位置でマッチングせず、残りの位置でマッチングしていることを表す。ｃｒＲＮＡ－ｍＣｈｅｒｒｙ－Ｍｉｓ－１９／２０は、ｃｒＲＮＡ中のｓｐａｃｅｒ配列がｃｒＲＮＡ－ｍＣｈｅｒｒｙ部位と１９番目と２０番目の塩基位置でマッチングせず、残りの位置でマッチングしていることを表す。ＤＲをコードするヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９である。
【0387】
【表15】
【0388】
細胞培養、トランスフェクション
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を１％ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）と１０％ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ）を含むＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）で培養した。細胞を２４細胞シャーレ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に播種し、細胞密度が７０％に達するまでに１６時間培養した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、Ｃａｓタンパク質をコードするプラスミド６００ｎｇ、ｃｒＲＮＡをコードするプラスミド３００ｎｇ、ｍＣｈｅｒｒｙをコードするプラスミド１００ｎｇを、２４ウェル細胞シャーレで培養した細胞中にトランスフェクションした。
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を１％ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）と１０％ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ）を含むＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）で培養した。細胞を２４細胞シャーレ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に播種し、細胞密度が７０％に達するまでに１６時間培養した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、Ｃａｓタンパク質をコードするプラスミド６００ｎｇ、ｃｒＲＮＡをコードするプラスミド３００ｎｇ、ｍＣｈｅｒｒｙをコードするプラスミド１００ｎｇを、２４ウェル細胞シャーレで培養した細胞中にトランスフェクションした。
【0389】
ｍＣｈｅｒｒｙ部位におけるＣａｓタンパク質の編集効率を測定するためのフローサイトメトリー分析法
７２ｈトランスフェクションした後、トリプシン－ＥＤＴＡ（０．０５％）（Ｇｉｂｃｏ）を用いて細胞を消化し、次いでフローサイトメトリー分析を行い、ＧＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙ蛍光の割合を計算した。ｍＣｈｅｒｒｙの割合が低いほど、Ｃａｓタンパク質がｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子を編集する効率が高いことを意味する。フローチャート及びｍＣｈｅｒｒｙ編集効率式は、図１３を参照する。
７２ｈトランスフェクションした後、トリプシン－ＥＤＴＡ（０．０５％）（Ｇｉｂｃｏ）を用いて細胞を消化し、次いでフローサイトメトリー分析を行い、ＧＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙ蛍光の割合を計算した。ｍＣｈｅｒｒｙの割合が低いほど、Ｃａｓタンパク質がｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子を編集する効率が高いことを意味する。フローチャート及びｍＣｈｅｒｒｙ編集効率式は、図１３を参照する。
【0390】
実験結果により、Ｒ８５７Ａ、Ｒ７１９Ａ、Ｋ３９４Ａ、Ｋ８４４Ａ（それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４、１９、２０、２２に対応）とのＣａｓＸＸ配列に基づく単点変異体は、オフターゲットを模擬するｃｒＲＮＡ－ｍＣｈｅｒｒｙ－Ｍｉｓ－１／２、ｃｒＲＮＡ－ｍＣｈｅｒｒｙ－Ｍｉｓ－５／６とｃｒＲＮＡ－ｍＣｈｅｒｒｙ－Ｍｉｓ－１９／２０を使用するとｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子を編集する効率が明らかに低下し、図１４（オフターゲット部位ｍＣｈｅｒｒｙ％が高いほどオフターゲット効率が低下する）を参照。そのうち、オフターゲット部位における挿入欠失率の低下とターゲット部位における編集効率の基本的な不変（または上昇）を編集特異性の向上と定義した。
【0391】
実施例１２：ＣａｓＸＸ配列にアミノ酸の組み合わせ変異を導入し、内因性遺伝子（組み合わせ）部位で特異性が向上した変異体をスクリーニングする
スクリーニング実験準備：変異体の発現プラスミドを構築する
実施例１０と１１に基づいて、Ｒ８５７Ａ、Ｒ７１９Ａ、Ｋ３９４Ａ、Ｋ８４４Ａのいくつかの点変異を選択し、さらに組み合わせて検討した。我々はＣａｓＸＸの配列に基づいて、変異塩基を有するプライマーを用いてＣａｓＸＸのＤＮＡ配列に対してＰＣＲをし、我々はＮＥＢｕｉｌｄｅｒ(R) ＨｉＦｉ ＤＮＡ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＮＥＢ）キットを用いて、精製されたＰＣＲ生成物をｐＣＡＧ－２Ａ－ＥＧＦＰプラスミドに組み込んで、組み合わせ変異を有するＣａｓＸＸプラスミドを構築した。ＣａｓＸＸ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）に基づく１１種類の変異体命名及び組み合わせ変異を含む変異体命名及び具体的な変異方式を表１６に示す。
スクリーニング実験準備：変異体の発現プラスミドを構築する
実施例１０と１１に基づいて、Ｒ８５７Ａ、Ｒ７１９Ａ、Ｋ３９４Ａ、Ｋ８４４Ａのいくつかの点変異を選択し、さらに組み合わせて検討した。我々はＣａｓＸＸの配列に基づいて、変異塩基を有するプライマーを用いてＣａｓＸＸのＤＮＡ配列に対してＰＣＲをし、我々はＮＥＢｕｉｌｄｅｒ(R) ＨｉＦｉ ＤＮＡ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＮＥＢ）キットを用いて、精製されたＰＣＲ生成物をｐＣＡＧ－２Ａ－ＥＧＦＰプラスミドに組み込んで、組み合わせ変異を有するＣａｓＸＸプラスミドを構築した。ＣａｓＸＸ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）に基づく１１種類の変異体命名及び組み合わせ変異を含む変異体命名及び具体的な変異方式を表１６に示す。
【0392】
【表16】
【0393】
ＥＭＸ１－７部位及びＲＮＦ２－１を標的とするｃｒＲＮＡの発現プラスミドを構築する
ターゲット配列を含むアニールオリゴヌクレオチドをＴ４ｌｉｇａｓｅ（ＮＥＢ）でＢａｓＩ（ＮＥＢ）消化処理されたｐＵＣ１９－Ｕ６－ｃｒＲＮＡ骨格に連結することにより、２９３ＴでＣａｓタンパク質ｃｒＲＮＡを発現するベクターを構築した。ｃｒＲＮＡは、ＥＭＸ１－７またはＲＮＦ２－１を標的とするか、ＲＮＦ２－１のオフターゲットを模擬し、実施例１０に記載されているように設計される。Ｓｐａｃｅｒコード配列を表１０及び１３に示す。
ターゲット配列を含むアニールオリゴヌクレオチドをＴ４ｌｉｇａｓｅ（ＮＥＢ）でＢａｓＩ（ＮＥＢ）消化処理されたｐＵＣ１９－Ｕ６－ｃｒＲＮＡ骨格に連結することにより、２９３ＴでＣａｓタンパク質ｃｒＲＮＡを発現するベクターを構築した。ｃｒＲＮＡは、ＥＭＸ１－７またはＲＮＦ２－１を標的とするか、ＲＮＦ２－１のオフターゲットを模擬し、実施例１０に記載されているように設計される。Ｓｐａｃｅｒコード配列を表１０及び１３に示す。
【0394】
細胞培養、トランスフェクション及び蛍光活性化細胞選別法（ＦＡＣＳ）
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を１％ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）と１０％ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ）を含むＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）で培養した。細胞を２４細胞シャーレ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に播種し、細胞密度が７０％に達するまでに１６時間培養した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、Ｃａｓタンパク質をコードするプラスミド６００ｎｇとｃｒＲＮＡをコードするプラスミド３００ｎｇを、２４ウェル細胞シャーレで培養した細胞中にトランスフェクションした。７２ｈトランスフェクションした後、トリプシン－ＥＤＴＡ（０．０５％）（Ｇｉｂｃｏ）で細胞を消化し、その後蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を行った。選ばれたのはＣａｓ酵素の発現に成功した細胞である。
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を１％ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）と１０％ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ）を含むＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）で培養した。細胞を２４細胞シャーレ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に播種し、細胞密度が７０％に達するまでに１６時間培養した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、Ｃａｓタンパク質をコードするプラスミド６００ｎｇとｃｒＲＮＡをコードするプラスミド３００ｎｇを、２４ウェル細胞シャーレで培養した細胞中にトランスフェクションした。７２ｈトランスフェクションした後、トリプシン－ＥＤＴＡ（０．０５％）（Ｇｉｂｃｏ）で細胞を消化し、その後蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を行った。選ばれたのはＣａｓ酵素の発現に成功した細胞である。
【0395】
Ｔ７Ｅ１酵素消化法を用いた標的部位及びオフターゲット部位におけるＣａｓタンパク質の編集効率の検出
ＦＡＣＳにより選別されたＧＦＰ陽性ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を４０μＬ緩衝液Ｌ（ｂｉｍａｋｅ）で分解し、５５°Ｃで３時間インキュベートした後、９５°Ｃで１０分間インキュベートした。実施例１０に記載の対応するプライマーを用いて、異なるゲノム部位に標的部位またはオフターゲット部位を含むｄｓＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅した。標的部位またはオフターゲット部位の配列は表１１及び１３を参照。その後、１０μＬ ＰＣＲ生成物を再アニールして異種二本鎖ｄｓＤＮＡを形成した。次に、混合物を１／１０体積のＮＥＢｕｆｆｅｒＴＭ２．１と０．２μＬ Ｔ７ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ｉ（ＮＥＢ）を３７°Ｃで５０分間処理した。消化生成物を～２．５％アガロースゲル電気泳動により分析した。バンドのグレースケール値に基づいて挿入欠失の割合（Ｉｎｄｅｌ，％）を計算した。実験結果により、Ｒ８５７Ａ、Ｒ７１９Ａ、Ｋ３９４Ａ、Ｋ８４４Ａ、Ｒ７１９Ａ／Ｋ８４４Ａ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３）及びＲ８５７Ａ／Ｋ８４４Ａ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４）のようなＣａｓＸＸ配列に基づく変異体はＥＭＸ１－７－ＯＴ－１、ＥＭＸ１－７－ＯＴ－２、ＥＭＸ１－７－ＯＴ－３オフターゲット部位での挿入欠失割合を、ターゲット部位での編集効率を犠牲にすることなく効果的に低減でき、表１７に示し、図１５に対応する。同時に、Ｒ８５７Ａ、Ｒ７１９Ａ、Ｋ３９４Ａ、Ｋ８４４Ａ、Ｒ７１９Ａ／Ｋ８４４Ａ及びＲ８５７Ａ／Ｋ８４４ＡのようなＣａｓＸＸ配列に基づく変異体は、オフターゲットを模擬するｃｒＲＮＡ－ＲＮＦ２－１－Ｍｉｓ－１／２、ｃｒＲＮＡ－ＲＮＦ２－１－Ｍｉｓ－５／６、ｃｒＲＮＡ－ＲＮＦ２－１－Ｍｉｓ－１７／１８及びｃｒＲＮＡ－ＲＮＦ２－１－Ｍｉｓ－１９／２０を使用すると、挿入欠失の割合を、ターゲット部位での効率を犠牲にすることはなく効果的に低減することができ、表１８に示し、図１６に対応する。そのうち、オフターゲット部位における挿入欠失率の低下とターゲット部位における編集効率の基本的な不変（または上昇）を編集特異性の向上と定義した。
ＦＡＣＳにより選別されたＧＦＰ陽性ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を４０μＬ緩衝液Ｌ（ｂｉｍａｋｅ）で分解し、５５°Ｃで３時間インキュベートした後、９５°Ｃで１０分間インキュベートした。実施例１０に記載の対応するプライマーを用いて、異なるゲノム部位に標的部位またはオフターゲット部位を含むｄｓＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅した。標的部位またはオフターゲット部位の配列は表１１及び１３を参照。その後、１０μＬ ＰＣＲ生成物を再アニールして異種二本鎖ｄｓＤＮＡを形成した。次に、混合物を１／１０体積のＮＥＢｕｆｆｅｒＴＭ２．１と０．２μＬ Ｔ７ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ｉ（ＮＥＢ）を３７°Ｃで５０分間処理した。消化生成物を～２．５％アガロースゲル電気泳動により分析した。バンドのグレースケール値に基づいて挿入欠失の割合（Ｉｎｄｅｌ，％）を計算した。実験結果により、Ｒ８５７Ａ、Ｒ７１９Ａ、Ｋ３９４Ａ、Ｋ８４４Ａ、Ｒ７１９Ａ／Ｋ８４４Ａ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３）及びＲ８５７Ａ／Ｋ８４４Ａ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４）のようなＣａｓＸＸ配列に基づく変異体はＥＭＸ１－７－ＯＴ－１、ＥＭＸ１－７－ＯＴ－２、ＥＭＸ１－７－ＯＴ－３オフターゲット部位での挿入欠失割合を、ターゲット部位での編集効率を犠牲にすることなく効果的に低減でき、表１７に示し、図１５に対応する。同時に、Ｒ８５７Ａ、Ｒ７１９Ａ、Ｋ３９４Ａ、Ｋ８４４Ａ、Ｒ７１９Ａ／Ｋ８４４Ａ及びＲ８５７Ａ／Ｋ８４４ＡのようなＣａｓＸＸ配列に基づく変異体は、オフターゲットを模擬するｃｒＲＮＡ－ＲＮＦ２－１－Ｍｉｓ－１／２、ｃｒＲＮＡ－ＲＮＦ２－１－Ｍｉｓ－５／６、ｃｒＲＮＡ－ＲＮＦ２－１－Ｍｉｓ－１７／１８及びｃｒＲＮＡ－ＲＮＦ２－１－Ｍｉｓ－１９／２０を使用すると、挿入欠失の割合を、ターゲット部位での効率を犠牲にすることはなく効果的に低減することができ、表１８に示し、図１６に対応する。そのうち、オフターゲット部位における挿入欠失率の低下とターゲット部位における編集効率の基本的な不変（または上昇）を編集特異性の向上と定義した。
【0396】
【表17】
【0397】
【表18】
【0398】
本明細書におけるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４に示す変異体（表１６において配列番号が付されている変異体に対応）は、明らかに高い特異性を有する。
【0399】
実施例１３：ＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑを用いてＣａｓＸＸ及びＣａｓＸＸ＋Ｋ３９４Ａ変異体のオフターゲット効果の検出。
プラスミド構築
ＣａｓＸＸ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）及びＣａｓＸＸ＋Ｋ３９４Ａ変異体（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０）をコードするＤＮＡ配列をｐＣＡＧ－２Ａ－ＥＧＦＰプラスミドに組み込んで、ＣａｓＸＸまたは（ＣａｓＸＸ＋Ｋ３９４Ａ）を発現するプラスミドを構築した。ＨＥＫ２９３Ｔ中でＣａｓ１２ｉタンパク質ｃｒＲＮＡを発現するベクターは、ターゲット配列を含むアニールオリゴヌクレオチドをＢａｓＩ消化ｐＵＣ１９－Ｕ６－ｃｒＲＮＡ骨格に連結することによって構築された。そのうち、ｃｒＲＮＡは、ＣＤ３４－７内因性部位を標的とすることができるスペーサー配列を含むように設計されている。ＤＲをコードするヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９である。ｓｐａｃｅｒをコードするヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７８を含む。
プラスミド構築
ＣａｓＸＸ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）及びＣａｓＸＸ＋Ｋ３９４Ａ変異体（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０）をコードするＤＮＡ配列をｐＣＡＧ－２Ａ－ＥＧＦＰプラスミドに組み込んで、ＣａｓＸＸまたは（ＣａｓＸＸ＋Ｋ３９４Ａ）を発現するプラスミドを構築した。ＨＥＫ２９３Ｔ中でＣａｓ１２ｉタンパク質ｃｒＲＮＡを発現するベクターは、ターゲット配列を含むアニールオリゴヌクレオチドをＢａｓＩ消化ｐＵＣ１９－Ｕ６－ｃｒＲＮＡ骨格に連結することによって構築された。そのうち、ｃｒＲＮＡは、ＣＤ３４－７内因性部位を標的とすることができるスペーサー配列を含むように設計されている。ＤＲをコードするヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９である。ｓｐａｃｅｒをコードするヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７８を含む。
【0400】
細胞培養、トランスフェクション及び蛍光活性化細胞選別法（ＦＡＣＳ）
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を１％ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）と１０％ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ）を含むＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）で培養した。細胞を２４細胞シャーレ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に播種し、細胞密度が７０％に達するまでに１６時間培養した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、ＣａｓＸＸまたは（ＣａｓＸＸ＋Ｋ３９４Ａ）タンパク質をコードするプラスミド６００ｎｇ、ｃｒＲＮＡをコードするプラスミド３００ｎｇ、及び１０ｐｍｏｌのアニールした二本鎖ＤＮＡタグ（配列は表８参照）を２４ウェル細胞シャーレで培養した細胞にトランスフェクションした。７２ｈトランスフェクションした後、細胞をトリプシン－ＥＤＴＡ（０．０５％）（Ｇｉｂｃｏ）で消化した後、ＧＦＰ蛍光活性化細胞選別を行った。
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を１％ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）と１０％ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ）を含むＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）で培養した。細胞を２４細胞シャーレ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に播種し、細胞密度が７０％に達するまでに１６時間培養した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、ＣａｓＸＸまたは（ＣａｓＸＸ＋Ｋ３９４Ａ）タンパク質をコードするプラスミド６００ｎｇ、ｃｒＲＮＡをコードするプラスミド３００ｎｇ、及び１０ｐｍｏｌのアニールした二本鎖ＤＮＡタグ（配列は表８参照）を２４ウェル細胞シャーレで培養した細胞にトランスフェクションした。７２ｈトランスフェクションした後、細胞をトリプシン－ＥＤＴＡ（０．０５％）（Ｇｉｂｃｏ）で消化した後、ＧＦＰ蛍光活性化細胞選別を行った。
【0401】
Ｃａｓ１２ｉ２変異体のオフターゲット効果を全ゲノム範囲で検出する
Ｅ．Ｚ．Ｎ．Ａ．(R) ＭｉｃｒｏＥｌｕｔｅ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｋｉｔ （Ｏｍｅｇａ）キットを使用し、ＦＡＣＳによって選別されたＧＦＰ－陽性ＨＥＫ２９３Ｔ細胞用のゲノムを抽出した。精製したゲノムはＱｕｂｉｔを用いて定量した。Ｃｏｖａｒｉｓ Ｓ２２０機器を用いて、機器推奨プログラムに従ってゲノムを５００ｂｐ程度まで断片化した。その後、ＶＡＨＴＳ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｐｒｏ ＤＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔ ｆｏｒ Ｉｌｌｕｍｉｎａ（Ｖａｚｙｍｅ）キットを用いてＤＮＡライブラリー構築を行った。ライブラリー作成プロセスは参考文献（Ｔｓａｉ， ＳＱ ｅｔ ａｌ． “ＧＵＩＤＥ－ｓｅｑ ｅｎａｂｌｅｓ ｇｅｎｏｍｅ－ｗｉｄｅ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｏｆ ｏｆｆ－ｔａｒｇｅｔ ｃｌｅａｖａｇｅ ｂｙ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ，” Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２０１５；３３（２）：１８７－１９７）を参照する。ライブラリー生成物を高スループットシーケンスした。シーケンシング結果を分析し、潜在的なオフターゲット部位を探した。ＣＤ３４－７内のＣａｓＸＸと（ＣａｓＸＸ＋Ｋ３９４Ａ）の内因性部位におけるオフターゲット効果について系統的な分析を行い、具体的な分析結果は図１７を参照。第１行の配列は参照ターゲット配列であり、下記の配列はそれぞれターゲット配列とオフターゲット配列、及びターゲット配列とオフターゲット配列に二本鎖ＤＮＡタグが濃縮されたｒｅａｄｓ数を表す。図１７は、ＣａｓＸＸがＣＤ３４－７部位でオフターゲット効果を有することを示しているが、ＣａｓＸＸ＋Ｋ３９４Ａ変異体はこの部位ではオフターゲット効果を有しない。したがって、ＣａｓＸＸ配列に加えてＫ３９４Ａ点変異を追加導入することで、ＣａｓＸＸの忠実度を大幅に高めることができ、ＣａｓＸＸに高い特異性を持たせることができる。
Ｅ．Ｚ．Ｎ．Ａ．(R) ＭｉｃｒｏＥｌｕｔｅ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｋｉｔ （Ｏｍｅｇａ）キットを使用し、ＦＡＣＳによって選別されたＧＦＰ－陽性ＨＥＫ２９３Ｔ細胞用のゲノムを抽出した。精製したゲノムはＱｕｂｉｔを用いて定量した。Ｃｏｖａｒｉｓ Ｓ２２０機器を用いて、機器推奨プログラムに従ってゲノムを５００ｂｐ程度まで断片化した。その後、ＶＡＨＴＳ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｐｒｏ ＤＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔ ｆｏｒ Ｉｌｌｕｍｉｎａ（Ｖａｚｙｍｅ）キットを用いてＤＮＡライブラリー構築を行った。ライブラリー作成プロセスは参考文献（Ｔｓａｉ， ＳＱ ｅｔ ａｌ． “ＧＵＩＤＥ－ｓｅｑ ｅｎａｂｌｅｓ ｇｅｎｏｍｅ－ｗｉｄｅ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｏｆ ｏｆｆ－ｔａｒｇｅｔ ｃｌｅａｖａｇｅ ｂｙ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ，” Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２０１５；３３（２）：１８７－１９７）を参照する。ライブラリー生成物を高スループットシーケンスした。シーケンシング結果を分析し、潜在的なオフターゲット部位を探した。ＣＤ３４－７内のＣａｓＸＸと（ＣａｓＸＸ＋Ｋ３９４Ａ）の内因性部位におけるオフターゲット効果について系統的な分析を行い、具体的な分析結果は図１７を参照。第１行の配列は参照ターゲット配列であり、下記の配列はそれぞれターゲット配列とオフターゲット配列、及びターゲット配列とオフターゲット配列に二本鎖ＤＮＡタグが濃縮されたｒｅａｄｓ数を表す。図１７は、ＣａｓＸＸがＣＤ３４－７部位でオフターゲット効果を有することを示しているが、ＣａｓＸＸ＋Ｋ３９４Ａ変異体はこの部位ではオフターゲット効果を有しない。したがって、ＣａｓＸＸ配列に加えてＫ３９４Ａ点変異を追加導入することで、ＣａｓＸＸの忠実度を大幅に高めることができ、ＣａｓＸＸに高い特異性を持たせることができる。
【0402】
以上、添付図面に関連して本発明の実施形態について説明したが、本発明は上述の具体的な実施形態及び応用分野に限定されるものではなく、上述の具体的な実施形態は例示的、指導的であり、限定的ではない。当業者は、本明細書の啓示の下で、及び本発明の特許請求の範囲によって保護された範囲を逸脱することなく、さらに多くの形態をとることができ、これらはすべて本発明の保護の範囲に属する。
【0403】
【図1a】
【図1b】
【図2】
【図3a】
【図3b】
【図3c】
【図3d】
【図3e】
【図4】
【図5】
【図6a】
【図6b】
【図6c】
【図6d】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2023-11-27
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼであって、それは参照Ｃａｓ １２ｉに基づく１つまたは複数のヌクレアーゼの変異を含み、前記変異は：（１）参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼ中のＰＡＭと相互作用する１つまたは複数のアミノ酸を正に帯電したアミノ酸に置換すること；
（２）参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼ中のＤＮＡ二本鎖の開放に関与する１つまたは複数のアミノ酸を芳香環付きアミノ酸に置換すること；
（３）参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼ中のＲｕｖＣドメインに位置し、一本鎖ＤＮＡ基質と相互作用する１つまたは複数のアミノ酸を正に帯電したアミノ酸に置換すること；
（４）参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼ中のＤＮＡ－ＲＮＡ二重らせんと相互作用する１つまたは複数のアミノ酸を正に帯電したアミノ酸に置換すること；及び
（５）参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼ中のＤＮＡ－ＲＮＡ二重らせんと相互作用する１つまたは複数の極性または正電荷を有するアミノ酸を疎水性アミノ酸に置換することから選択され；
好ましくは、前記参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼはアミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の野生型Ｃａｓ１２ｉ２ヌクレアーゼである、エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼ。
【請求項2】
前記ＰＡＭと相互作用的一つまたは複数のアミノ酸はＰＡＭと３次元構造上９Å以内の距離にあるアミノ酸であり、好ましくは、前記ＰＡＭと相互作用する１つまたは複数のアミノ酸は１７６、１７８、２２６、２２７、２２９、２３７、２３８、２６４、４４７及び５６３位の１つまたは複数のアミノ酸であり、さらに好ましくは、前記ＰＡＭと相互作用する１つまたは複数のアミノ酸は、Ｅ１７６、Ｅ１７８、Ｙ２２６、Ａ２２７、Ｎ２２９、Ｅ２３７、Ｋ２３８、Ｋ２６４、Ｔ４４７及びＥ５６３の１つまたは複数のアミノ酸であり、
さらに好ましくは、前記ＰＡＭと相互作用する１つまたは複数のアミノ酸は、Ｅ１７６、Ｋ２３８、Ｔ４４７及びＥ５６３の１つまたは複数のアミノ酸であり、
そのうち、前記アミノ酸位置番号はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示す対応するアミノ酸位置に定義される、又は
前記正に帯電したアミノ酸Ｒ、ＫまたはＨである、
請求項１に記載のエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼ。
【請求項3】
前記参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼ中のＰＡＭと相互作用する１つまたは複数のアミノ酸を正に帯電したアミノ酸に置換することは、Ｅ１７６Ｒ、Ｋ２３８Ｒ、Ｔ４４７Ｒ及びＥ５６３Ｒ置換の１つまたは複数であり、；好ましくは、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼは（１）Ｅ５６３Ｒ；（２）Ｅ１７６Ｒ、Ｔ４４７Ｒ、Ｅ１７６Ｒ及びＥ５６３Ｒ；（３）Ｋ２３８ＲとＥ５６３Ｒ；（４）Ｅ１７６Ｒ、Ｋ２３８Ｒ及びＴ４４７Ｒ；（５）Ｅ１７６Ｒ、Ｋ２３８Ｒ及びＥ５６３Ｒ；（６）Ｅ１７６Ｒ、Ｔ４４７Ｒ及びＥ５６３Ｒ；及び（７）Ｅ１７６Ｒ、Ｋ２３８Ｒ、Ｔ４４７Ｒ及びＥ５６３Ｒ、のいずれの変異或いは変異の組み合わせを含み；
そのうち、前記アミノ酸位置はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示す対応するアミノ酸位置に定義される、請求項１に記載のエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼ。
【請求項4】
前記ＤＮＡ二本鎖の開放に関与する１つまたは複数のアミノ酸は、ＰＡＭ中の標的鎖に対する３’末端の最後の塩基対と相互作用するアミノ酸であり；好ましくは、前記ＤＮＡ二本鎖の開放に関与する１つ又は複数のアミノ酸は１６３と１６４位の１つまたは複数のアミノ酸であり；
さらに好ましくは、前記ＤＮＡ二本鎖の開放に関与する１つ又は複数のアミノ酸Ｑ１６３とＮ１６４位の１つまたは複数のアミノ酸であり；さらに好ましくは、前記ＤＮＡ二本鎖の開放に関与するアミノ酸はＮ１６４であり；
そのうち、前記アミノ酸位置番号はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示す対応するアミノ酸位置に定義され、
更に好ましく前記ＤＮＡ二本鎖の開放に関与する１つ又は複数のアミノ酸は芳香環付きアミノ酸に置換され、前記芳香環付きアミノ酸はＦ、ＹまたはＷであり、好ましくは、前記芳香環付きアミノ酸はＦまたはＹであり、
更に好ましく、前記参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼ中のＤＮＡ二本鎖の開放に関与する一つ又は複数のアミノ酸は芳香環付きアミノ酸に置換することはＱ１６３Ｆ、Ｑ１６３Ｙ、Ｑ１６３Ｗ、及びＮ１６４Ｆの一つまたは複数の置換を含み；好ましくは、前記Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼはＮ１６４ＹまたはＮ１６４Ｆ変異を含み；さらに好ましくは、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼはＮ１６４Ｙを含む、請求項１に記載のエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼ。
【請求項5】
前記ＲｕｖＣドメインに位置し、一本鎖ＤＮＡ基質と相互作用する１つまたは複数のアミノ酸は一本鎖ＤＮＡ基質と三次元構造上９Å以内の距離にあるアミノ酸であり；好ましくは、前記ＲｕｖＣドメインに位置し、一本鎖ＤＮＡ基質と相互作用する１つまたは複数のアミノ酸は３２３、３２７、３５５、３５９、３６０、３６１、３６２、３８８、３９０、３９１、３９２、３９３、４１４、４１７、４１８、４２１、４２４、４２５、６５０、６５２、６５３、６９６、７０５、７０８、７０９、７５１、７５２、７５５、８４０、８４８、８５１、８５６、８８５、８９７、９２５、９２６、９２８、９２９、９３２、１０２２位の１つまたは複数のアミノ酸であり；
さらに好ましくは、前記ＲｕｖＣドメインに位置し、一本鎖ＤＮＡ基質と相互作用する１つまたは複数のアミノ酸は、Ｅ３２３、Ｌ３２７、Ｖ３５５、Ｇ３５９、Ｇ３６０、Ｋ３６１、Ｄ３６２、Ｌ３８８、Ｎ３９０、Ｎ３９１、Ｆ３９２、Ｋ３９３、Ｑ４１４、Ｌ４１７、Ｌ４１８、Ｋ４２１、Ｑ４２４、Ｑ４２５、Ｓ６５０、Ｅ６５２、Ｇ６５３、Ｉ６９６、Ｋ７０５、Ｋ７０８、Ｅ７０９、Ｌ７５１、Ｓ７５２、Ｅ７５５、Ｎ８４０、Ｎ８４８、Ｓ８５１、Ａ８５６、Ｑ８８５、Ｍ８９７、Ｎ９２５、Ｉ９２６、Ｔ９２８、Ｇ９２９、Ｙ９３２、Ａ１０２２の１つまたは複数のアミノ酸であり；
さらに好ましくは、前記ＲｕｖＣドメインに位置し、一本鎖ＤＮＡ基質と相互作用する１つまたは複数のアミノ酸はＥ３２３、Ｄ３６２、Ｑ４２５、Ｎ９２５、Ｉ９２６、Ｎ３９１、Ｑ４２４及びＧ９２９の１つまたは複数のアミノ酸であり；
そのうち、前記アミノ酸位置番号はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示す対応するアミノ酸位置に定義され、
更に好ましく、参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼ中のＲｕｖＣドメインに位置し、一本鎖ＤＮＡ基質と相互作用する１つまたは複数のアミノ酸を正に帯電したアミノ酸に置換することはＲ或いはＫに置換することを含み、好ましくは、前記正に帯電した該アミノ酸はＲであり、
更に好ましく、参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼ中のＲｕｖＣドメインに位置し、一本鎖ＤＮＡ基質と相互作用する１つまたは複数のアミノ酸を正に帯電したアミノ酸に置換することはＥ３２３Ｒ、Ｄ３６２Ｒ、Ｎ３９１Ｒ、Ｑ４２４Ｒ、Ｑ４２５Ｒ、Ｎ９２５Ｒ、Ｉ９２６Ｒ及びＧ９２９Ｒの１つまたは複数の置換を含み；
好ましくは、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼは（１）Ｅ３２３Ｒ；（２）Ｄ３６２Ｒ；（３）Ｑ４２５Ｒ； （４）Ｎ９２５Ｒ； （５）Ｉ９２６Ｒ；（６）Ｅ３２３ＲとＤ３６２Ｒ；（７）Ｅ３２３ＲとＱ４２５Ｒ；（８）Ｅ３２３ＲとＩ９２６Ｒ；（９）Ｑ４２５ＲとＩ９２６Ｒ； （１０）Ｄ３６２ＲとＩ９２６Ｒ； （１１）Ｎ９２５ＲとＩ９２６Ｒ； （１２） Ｅ３２３Ｒ、Ｄ３６２Ｒ及びＱ４２５Ｒ； （１３）Ｅ３２３Ｒ、Ｄ３６２Ｒ及びＩ９２６Ｒ；（１４）Ｅ３２３Ｒ、Ｑ４２５Ｒ及びＩ９２６Ｒ；（１５）Ｄ３６２Ｒ、Ｎ９２５Ｒ及びＩ９２６Ｒ；及び（１６） Ｅ３２３Ｒ、Ｄ３６２Ｒ、Ｑ４２５Ｒ及びＩ９２６Ｒのいずれの変異或いは変異の組み合わせを含み；
そのうち、前記アミノ酸位置はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示す対応するアミノ酸位置に定義される、請求項１に記載のエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼ。
【請求項6】
前記ＤＮＡ－ＲＮＡ二重らせんと相互作用する１つまたは複数のアミノ酸はＤＮＡ－ＲＮＡ二重らせんと三次元構造上９Å以内の距離にあるアミノ酸であり；好ましくは、前記ＤＮＡ－ＲＮＡ二重らせんと相互作用する１つまたは複数のアミノ酸は１１６、１１７、１５６、１５９、１６０、１６１、２４７、２９３、２９４、２９７、３０１、３０５、３０６、３０８、３１２、３１３、３１６、３１９、３２０、３４３、３４８、３４９、４２７、４３３、４３８、４４１、４４２、６７９、６８３、６９１、７８２、７８３、７９７、８００、８５２、８５３、８５５、８６１、８６５、９５７、９５８位の１つまたは複数のアミノ酸であり；
さらに好ましくは、前記ＤＮＡ－ＲＮＡ二重らせんと相互作用する１つまたは複数のアミノ酸はＧ１１６、Ｅ１１７、Ａ１５６、Ｔ１５９、Ｅ１６０、Ｓ１６１、Ｅ２４７、Ｇ２９３、Ｅ２９４、Ｎ２９７、Ｔ３０１、Ｉ３０５、Ｋ３０６、Ｔ３０８、Ｎ３１２、Ｆ３１３、Ｑ３１６、Ｅ３１９、Ｑ３２０、Ｅ３４３、Ｅ３４８、Ｅ３４９、Ｄ４２７、Ｋ４３３、Ｖ４３８、Ｎ４４１、Ｑ４４２、Ｎ６７９、Ｅ６８３、Ｅ６９１、Ｄ７８２、Ｅ７８３、Ｅ７９７、Ｅ８００、Ｍ８５２、Ｄ８５３、Ｌ８５５、Ｎ８６１、Ｑ８６５、Ｓ９５７、Ｄ９５８の１つまたは複数のアミノ酸であり；
さらに好ましくは、前記ＤＮＡ－ＲＮＡ二重らせんと相互作用する１つまたは複数のアミノ酸はＧ１１６、Ｅ１１７、Ｔ１５９、Ｓ１６１、Ｅ３１９、Ｅ３４３及びＤ９５８の１つまたは複数のアミノ酸であり；そのうち、前記アミノ酸の位置はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示す対応するアミノ酸位置に定義され、
更に好ましく、参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼ中のＤＮＡ－ＲＮＡ二重らせんと相互作用する１つまたは複数のアミノ酸を正に帯電したアミノ酸に置換することはＲ或いはＫに置換することを含み、好ましくは、前記正に帯電したアミノ酸はＲである、請求項１に記載のエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼ。
【請求項7】
参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼ中のＤＮＡ－ＲＮＡ二重らせんと相互作用する１つまたは複数のアミノ酸を正に帯電したアミノ酸に置換することはＧ１１６Ｒ、Ｅ１１７Ｒ、Ｔ１５９Ｒ、Ｓ１６１Ｒ、Ｅ３１９Ｒ、Ｅ３４３Ｒ及びＤ９５８Ｒの１つまたは複数に置換することを含み；好ましくは、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼはＤ９５８Ｒ置換を含む；
そのうち、前記アミノ酸の位置はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示す対応するアミノ酸位置に定義される、請求項１に記載のエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼ。
【請求項8】
前記ＤＮＡ－ＲＮＡ二重らせんと相互作用する１つまたは複数の極性または正に帯電したアミノ酸は、３５７、３９４、７１５、７１９、８０７、８４４、８４８、８５７、８６１位の１つまたは複数のアミノ酸から選択され、即ちＨ３５７、Ｋ３９４、Ｒ７１５、Ｒ７１９、Ｋ８０７、Ｋ８４４、Ｎ８４８、Ｒ８５７、Ｒ８６１の１つまたは複数のアミノ酸であり； そのうち、前記アミノ酸の位置はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示す対応するアミノ酸位置に定義される、請求項１に記載のエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼ。
【請求項9】
参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼ中のＤＮＡ－ＲＮＡ二重らせんと相互作用する１つまたは複数の極性または正に帯電したアミノ酸を疎水性アミノ酸に置換することはアラニン（Ａ）に置換することを含む、請求項１に記載のエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼ。
【請求項10】
Ｈ３５７Ａ、Ｋ３９４Ａ、Ｒ７１５Ａ、Ｒ７１９Ａ、Ｋ８０７Ａ、Ｋ８４４Ａ、Ｎ８４８Ａ、Ｒ８５７Ａ、Ｒ８６１Ａかななる群より選択された一つまたは複数の変異を含み；好ましくは、Ｋ３９４Ａ、Ｒ７１９Ａ、Ｋ８４４Ａ、Ｒ８５７Ａかななる群より選択された一つまたは複数の変異を含み；
そのうち、前記アミノ酸位置はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示す対応するアミノ酸位置に定義され、
好ましく、それはＲ７１９ＡとＫ８４４Ａアミノ酸置換を含み、またはＲ８５７ＡとＫ８４４Ａアミノ酸置換を含み；
そのうち、前記アミノ酸位置はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示す対応するアミノ酸位置に定義される、請求項１に記載のエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼ。
【請求項11】
一つまたは複数のフレキシブル領域変異をさらに含み、前記変異は参照Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼ中のフレキシブル領域の柔軟性を増加させ、前記フレキシブル領域はアミノ酸残基４３９－４４３またはアミノ酸残基９２５－９２９から選択され；好ましくは、前記フレキシブル領域変異は４３９と／または９２６部位に位置し；
さらに好ましくは、前記フレキシブル領域変異はＬ４３９と／またはＩ９２６の変異であり；
そのうち、前記アミノ酸位置はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示す対応するアミノ酸位置に定義され、
好ましく、前記一つまたは複数のフレキシブル領域変異は、該フレキシブル領域アミノ酸をＧに置換し、および／またはその後ろに１つまたは２つのＧを挿入することであり；
好ましくは、前記一つまたは複数のフレキシブル領域変異はＩ９２６Ｇ、Ｌ４３９（Ｌ＋Ｇ）またはＬ４３９（Ｌ＋ＧＧ）を含み；
さらに好ましくは、前記一つまたは複数のフレキシブル領域変異はＬ４３９（Ｌ＋Ｇ）またはＬ４３９（Ｌ＋ＧＧ）を含み；
そのうち、前記アミノ酸位置番号はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示す対応するアミノ酸位置に定義される、請求項１に記載のエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼ。
【請求項12】
エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼであって；前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼは
（１）Ｅ５６３Ｒ；（２）Ｅ１７６ＲとＴ４４７Ｒ；（３）Ｅ１７６ＲとＥ５６３Ｒ；（４）Ｋ２３８ＲとＥ５６３Ｒ；（５）Ｅ１７６Ｒ、Ｋ２３８Ｒ及びＴ４４７Ｒ；（６）Ｅ１７６Ｒ、Ｔ４４７Ｒ及びＥ５６３Ｒ；（７）Ｅ１７６Ｒ、Ｋ２３８Ｒ及びＥ５６３Ｒ；（８）Ｅ１７６Ｒ、Ｋ２３８Ｒ、Ｔ４４７Ｒ及びＥ５６３Ｒ；（９）Ｎ１６４Ｙ；（１０）Ｎ１６４Ｆ；（１１）Ｅ３２３Ｒ；（１２）Ｄ３６２Ｒ；（１３）Ｑ４２５Ｒ；（１４）Ｎ９２５Ｒ；（１５）Ｉ９２６Ｒ；（１６）Ｄ９５８Ｒ；（１７）Ｅ３２３ＲとＤ３６２Ｒ；（１８）Ｅ３２３ＲとＱ４２５Ｒ；（１９）Ｅ３２３ＲとＩ９２６Ｒ；（２０）Ｑ４２５ＲとＩ９２６Ｒ；（２１）Ｄ３６２ＲとＩ９２６Ｒ；（２２）Ｎ９２５ＲとＩ９２６Ｒ；（２３）Ｅ３２３Ｒ、Ｄ３６２Ｒ及びＱ４２５Ｒ；（２４）Ｅ３２３Ｒ、Ｄ３６２Ｒ及びＩ９２６Ｒ；（２５）Ｅ３２３Ｒ、Ｑ４２５Ｒ及びＩ９２６Ｒ；（２６）Ｄ３６２Ｒ、Ｎ９２５Ｒ及びＩ９２６Ｒ；（２７）Ｅ３２３Ｒ、Ｄ３６２Ｒ、Ｑ４２５Ｒ及びＩ９２６Ｒ；（２８）Ｄ３６２ＲとＩ９２６Ｇ；（２９）Ｎ９２５ＲとＩ９２６Ｇ；（３０）Ｄ３６２Ｒ、Ｎ９２５Ｒ及びＩ９２６Ｇ；（３１）Ｉ９２６ＲとＬ４３９（Ｌ＋Ｇ）；（３２）Ｉ９２６ＲとＬ４３９（Ｌ＋ＧＧ）；（３３）Ｅ３２３Ｒ、Ｄ３６２ＲとＩ９２６Ｇ；（３４）Ｒ７１９ＡとＫ８４４Ａ；及び（３５）Ｒ８５７ＡとＫ８４４Ａのいずれかの１つ群または複数群の変異を含み；
好ましくは、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼは（１）Ｅ１７６Ｒ、Ｋ２３８Ｒ、Ｔ４４７Ｒ及びＥ５６３Ｒ；（２）Ｎ１６４Ｙ；（３）Ｉ９２６Ｒ；（４）Ｅ３２３Ｒ及びＤ３６２Ｒ；（４）Ｉ９２６Ｇ；（５）Ｉ９２６Ｒ及びＬ４３９（Ｌ＋Ｇ）；（６）Ｉ９２６Ｒ及びＬ４３９（Ｌ＋ＧＧ）；ならびに（７）Ｄ９５８Ｒのいずれかの１つ群または複数群の変異を含み；
そのうち、前記アミノ酸位置はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示す対応するアミノ酸位置に定義される、エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼ。
【請求項13】
エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼであって、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼは（１）Ｅ１７６Ｒ、Ｋ２３８Ｒ、Ｔ４４７Ｒ、Ｅ５６３Ｒ及びＮ１６４Ｙ；（２）Ｅ１７６Ｒ、Ｋ２３８Ｒ、Ｔ４４７Ｒ、Ｅ５６３Ｒ及びＩ９２６Ｒ；（３）Ｎ１６４Ｙ、Ｅ３２３Ｒ及びＤ３６２Ｒ；（４）Ｅ１７６Ｒ、Ｋ２３８Ｒ、Ｔ４４７Ｒ、Ｅ５６３Ｒ、Ｅ３２３Ｒ及びＤ３６２Ｒ；（５）Ｎ１６４ＹとＩ９２６Ｒ；（６）Ｅ１７６Ｒ、Ｋ２３８Ｒ、Ｔ４４７Ｒ、Ｅ５６３Ｒ、Ｎ１６４Ｙ及びＩ９２６Ｒ；（７）Ｅ１７６Ｒ、Ｋ２３８Ｒ、Ｔ４４７Ｒ、Ｅ５６３Ｒ、Ｎ１６４Ｙ、Ｅ３２３Ｒ及びＤ３６２Ｒ；（８）Ｅ１７６Ｒ、Ｋ２３８Ｒ、Ｔ４４７Ｒ、Ｅ５６３Ｒ、Ｎ１６４Ｙ、Ｉ９２６Ｒ、Ｅ３２３Ｒ及びＤ３６２Ｒ；（９）Ｅ１７６Ｒ、Ｋ２３８Ｒ、Ｔ４４７Ｒ、Ｅ５６３Ｒ、Ｎ１６４Ｙ、Ｅ３２３Ｒ、Ｄ３６２Ｒ及びＩ９２６Ｇ；（１０）Ｅ１７６Ｒ、Ｋ２３８Ｒ、Ｔ４４７Ｒ、Ｅ５６３Ｒ、Ｎ１６４Ｙ、Ｅ３２３Ｒ、Ｄ３６２Ｒ、Ｉ９２６Ｇ及びＬ４３９（Ｌ＋ＧＧ）；（１１）Ｅ１７６Ｒ、Ｋ２３８Ｒ、Ｔ４４７Ｒ、Ｅ５６３Ｒ、Ｎ１６４Ｙ、Ｅ３２３Ｒ、Ｄ３６２Ｒ、Ｉ９２６Ｇ及びＬ４３９（Ｌ＋Ｇ）；（１２）Ｅ１７６Ｒ、Ｋ２３８Ｒ、Ｔ４４７Ｒ、Ｅ５６３Ｒ、Ｎ１６４Ｙ及びＤ９５８Ｒ；（１３）Ｅ１７６Ｒ、Ｋ２３８Ｒ、Ｔ４４７Ｒ、Ｅ５６３Ｒ、Ｉ９２６Ｒ及びＤ９５８Ｒ；（１４）Ｅ１７６Ｒ、Ｋ２３８Ｒ、Ｔ４４７Ｒ、Ｅ５６３Ｒ、Ｅ３２３Ｒ、Ｄ３６２Ｒ及びＤ９５８Ｒ；（１５）Ｎ１６４Ｙ、Ｉ９２６Ｒ及びＤ９５８Ｒ；（１６）Ｎ１６４Ｙ、Ｅ３２３Ｒ、Ｄ３６２Ｒ及びＤ９５８Ｒ；（１７）Ｅ１７６Ｒ、Ｋ２３８Ｒ、Ｔ４４７Ｒ、Ｅ５６３Ｒ、Ｎ１６４Ｙ、Ｉ９２６Ｒ及びＤ９５８Ｒ；（１８）Ｅ１７６Ｒ、Ｋ２３８Ｒ、Ｔ４４７Ｒ、Ｅ５６３Ｒ、Ｎ１６４Ｙ、Ｅ３２３Ｒ、Ｄ３６２Ｒ及びＤ９５８Ｒ；（１９）Ｅ１７６Ｒ、Ｋ２３８Ｒ、Ｔ４４７Ｒ、Ｅ５６３Ｒ、Ｎ１６４Ｙ、Ｉ９２６Ｒ、Ｅ３２３Ｒ、Ｄ３６２Ｒ及びＤ９５８Ｒ；（２０）Ｅ１７６Ｒ、Ｋ２３８Ｒ、Ｔ４４７Ｒ、Ｅ５６３Ｒ、Ｎ１６４Ｙ、Ｅ３２３Ｒ、Ｄ３６２Ｒ、Ｉ９２６Ｇ及びＤ９５８Ｒ；（２１）Ｅ１７６Ｒ、Ｋ２３８Ｒ、Ｔ４４７Ｒ、Ｅ５６３Ｒ、Ｎ１６４Ｙ、Ｅ３２３Ｒ、Ｄ３６２Ｒ、Ｉ９２６Ｇ、Ｌ４３９（Ｌ＋ＧＧ）及びＤ９５８Ｒ；（２２）Ｅ１７６Ｒ、Ｋ２３８Ｒ、Ｔ４４７Ｒ、Ｅ５６３Ｒ、Ｎ１６４Ｙ、Ｅ３２３Ｒ、Ｄ３６２Ｒ、Ｉ９２６Ｇ、Ｌ４３９（Ｌ＋Ｇ）及びＤ９５８Ｒ；（２３）Ｅ１７６Ｒ、Ｋ２３８Ｒ、Ｔ４４７Ｒ、Ｅ５６３Ｒ、Ｎ１６４Ｙ、Ｅ３２３Ｒ、Ｄ３６２Ｒ及びＲ８５７Ａ；（２４）Ｅ１７６Ｒ、Ｋ２３８Ｒ、Ｔ４４７Ｒ、Ｅ５６３Ｒ、Ｎ１６４Ｙ、Ｅ３２３Ｒ、Ｄ３６２Ｒ及びＮ８６１Ａ；（２５）Ｅ１７６Ｒ、Ｋ２３８Ｒ、Ｔ４４７Ｒ、Ｅ５６３Ｒ、Ｎ１６４Ｙ、Ｅ３２３Ｒ、Ｄ３６２Ｒ及びＫ８０７Ａ；（２６）Ｅ１７６Ｒ、Ｋ２３８Ｒ、Ｔ４４７Ｒ、Ｅ５６３Ｒ、Ｎ１６４Ｙ、Ｅ３２３Ｒ、Ｄ３６２Ｒ及びＮ８４８Ａ；（２７）Ｅ１７６Ｒ、Ｋ２３８Ｒ、Ｔ４４７Ｒ、Ｅ５６３Ｒ、Ｎ１６４Ｙ、Ｅ３２３Ｒ、Ｄ３６２Ｒ及びＲ７１５Ａ；（２８）Ｅ１７６Ｒ、Ｋ２３８Ｒ、Ｔ４４７Ｒ、Ｅ５６３Ｒ、Ｎ１６４Ｙ、Ｅ３２３Ｒ、Ｄ３６２Ｒ及びＲ７１９Ａ；（２９）Ｅ１７６Ｒ、Ｋ２３８Ｒ、Ｔ４４７Ｒ、Ｅ５６３Ｒ、Ｎ１６４Ｙ、Ｅ３２３Ｒ、Ｄ３６２Ｒ及びＫ３９４Ａ；（３０）Ｅ１７６Ｒ、Ｋ２３８Ｒ、Ｔ４４７Ｒ、Ｅ５６３Ｒ、Ｎ１６４Ｙ、Ｅ３２３Ｒ、Ｄ３６２Ｒ及びＨ３５７Ａ；（３１）Ｅ１７６Ｒ、Ｋ２３８Ｒ、Ｔ４４７Ｒ、Ｅ５６３Ｒ、Ｎ１６４Ｙ、Ｅ３２３Ｒ、Ｄ３６２Ｒ 及びＫ８４４Ａ；（３２）Ｅ１７６Ｒ、Ｋ２３８Ｒ、Ｔ４４７Ｒ、Ｅ５６３Ｒ、Ｎ１６４Ｙ、Ｅ３２３Ｒ、Ｄ３６２Ｒ、Ｒ７１９Ａ及びＫ８４４Ａ；または（３３）Ｅ１７６Ｒ、Ｋ２３８Ｒ、Ｔ４４７Ｒ、Ｅ５６３Ｒ、Ｎ１６４Ｙ、Ｅ３２３Ｒ、Ｄ３６２Ｒ、Ｒ８５７Ａ及びＫ８４４Ａのいずれの群の変異を含み；そのうち、前記アミノ酸位置はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示す対応するアミノ酸位置に定義される、エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼ。
【請求項14】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ：２～２４のいずれかに示すアミノ酸配列を含むエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼであり、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ：２～２４のいずれかの配列に示すアミノ酸配列と少なくとも８０％同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼ。
【請求項15】
エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉエフェクタータンパク質であって、請求項１に記載のエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼまたはその機能的誘導体を含み；任意に、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼまたはその機能的誘導体は酵素活性を有し、または前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼまたはその機能的誘導体は酵素不活性変異体であり、
好ましく、前記Ｃａｓ１２ｉエフェクタータンパク質はＤＮＡ分子中の二本鎖切断または一本鎖切断を誘導することができ、
更に好ましく、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼまたはその機能的誘導体はＤ５９９Ａ、Ｅ８３３Ａ、Ｓ８８３Ａ、Ｈ８８４Ａ、Ｒ９００Ａ及びＤ１０１９Ａの１つまたは複数の変異を含む酵素不活性変異体であり；そのうち、前記アミノ酸位置はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示す対応するアミノ酸位置に定義され、
更に好ましく、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼまたはその機能的誘導体と融合する機能ドメインをさらに含む、
前記機能ドメインは翻訳開始ドメイン、転写抑制ドメイン、トランス活性化ドメイン、エピジェネティック修飾ドメイン、核酸塩基編集ドメイン、逆転写酵素ドメイン、レポーター分子ドメイン、ヌクレアーゼドメインからなる群より選択される一つまたは複数である、エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉエフェクタータンパク質。
【請求項16】
前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉエフェクタータンパク質は、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼまたはその機能的誘導体のＮ末端部分を含む第一ポリペプチドと、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼまたはその機能的誘導体のＣ末端部分を含む第二ポリペプチドとを備え、そのうち前記第一ポリペプチドと前記第二ポリペプチドは、標的核酸と特異的に結合するクラスター化され、規則的に間隔があいた短い回文構造の繰り返し配列（ＣＲＩＳＰＲ）複合体を形成するために、ガイド配列を含むガイドＲＮＡの存在下で互いに会合することができ、前記標的核酸は前記ガイド配列に相補的なターゲット配列を含み；好ましくは、前記第一ポリペプチドは項１－２２のいずれかに記載のエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼのＮ末端部分アミノ酸残基１～Ｘを含み、前記第二ポリペプチドは項１－２２のいずれかに記載のエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼのアミノ酸残基Ｘ＋１～前記Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼのＣ末端を含み；
あるいは、前記第一ポリペプチドと前記第二ポリペプチドはそれぞれ二量化ドメインを含み；
あるいは、前記第一ポリペプチドの二量体ドメインと前記第二ポリペプチドの二量体ドメインは誘導剤の存在下で互いに会合している、請求項１５に記載のエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉエフェクタータンパク質。
【請求項17】
エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１２ｉシステムであって、（ａ）請求項１に記載のエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼ、または当該Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼを含むエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉエフェクタータンパク質；及び
（ｂ）ターゲット配列に相補的なガイド配列を含むガイドＲＮＡ、または前記ガイドＲＮＡをコードする１つまたは複数の核酸、を含み、
そのうち、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼまたはエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉエフェクタータンパク質と前記ガイドＲＮＡとはＣＲＩＳＰＲ複合体を形成することができ、前記ＣＲＩＳＰＲ複合体は前記ターゲット配列を含む標的核酸に特異的に結合し、且つ前記標的核酸の修飾を誘導し；
好ましくは、前記ガイドＲＮＡは前記ガイド配列を含むｃｒＲＮＡであり；
さらに好ましくは、前記エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１２ｉシステムは複数のｃｒＲＮＡをコードする前駆体ガイドＲＮＡアレイ（ａｒｒａｙ）を含み；
または、好ましくは前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼまたはエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉエフェクタータンパク質はメインエディタであり、前記ガイドＲＮＡは、プライム編集ガイドＲＮＡ（ｐｅｇＲＮＡ）であり、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼまたはエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉエフェクタータンパク質をコードする一つまたは複数のベクターを含み；
好ましくは、前記一つまたは複数のベクターはレトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ベクター、および単純ヘルペスベクターの群から選択され；
さらに好ましくは、前記一つまたは複数のベクターはアデノ随伴ウイルスＡＡＶベクターであり；
さらに好ましくは、前記ＡＡＶベクターはまた前記ガイドＲＮＡをコードする、エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１２ｉシステム。
【請求項18】
（ａ）サンプルを請求項１７におけるエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１２ｉシステム及びタグ付けされた検出核酸と接触させ、該検出核酸は一本鎖であり、前記ガイドＲＮＡのガイド配列とハイブリダイズしないこと；及び（ｂ）前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼまたはエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉエフェクタータンパク質が前記タグ付けされた検出核酸を切断することによって生成される検出可能なシグナルを測定し、標的核酸を検出することを含む、サンプル中の標的核酸を検出する方法。
【請求項19】
前記標的核酸を請求項１７に記載の前記エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１２ｉシステムに接触させることを含み；好ましくは、前記方法はインビトロで、エクスビボまたはインビボで行われ；
さらに好ましくは、前記標的核酸は細胞中に存在しており；
さらに好ましくは、前記細菌細胞、酵母細胞、哺乳動物細胞、植物細胞または動物細胞であり；
さらに好ましくは、前記標的核酸はゲノムＤＮＡであり；
さらに好ましくは、前記ターゲット配列は疾患または障害に関連し；
さらに好ましくは、前記エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１２ｉシステムは複数のｃｒＲＮＡをコードする前駆体ガイドＲＮＡアレイを含み、そのうち、各ｃｒＲＮＡは異なるガイド配列を含む、ターゲット配列を含む標的核酸を修飾する方法。
【請求項20】
請求項１７に記載の前記エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１２ｉシステムの個体の細胞中の標的核酸に関連する疾患または障害を治療するための薬剤の製造における使用であって、好ましくは、前記疾患または障害は、がん、心血管疾患、遺伝性疾患、自己免疫疾患、代謝性疾患、神経変性疾患、眼病、細菌感染、及びウイルス感染の群から選択される、使用。
【請求項21】
標的核酸を請求項１７に記載の前記エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１２ｉシステムに接触させることを含む、ターゲット配列を含む標的核酸を修飾する方法。
【請求項22】
請求項１に記載の前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｉヌクレアーゼ、当該Ｃａｓ１２ｉヌクレアーゼを含むエンジニアリングされたＣａｓ１２ｉエフェクタータンパク質を含む組成物またはキット。
【請求項23】
修飾された標的核酸を含み、そのうち、標的核酸が請求項１９に記載の方法で修飾される、エンジニアリングされた細胞。
【請求項24】
請求項２３に記載の一つまたは複数の前記エンジニアリングされた細胞を含む、エンジニアリングされた非ヒト動物。
【国際調査報告】