特表 2024-522149 ナノベシクルリアクター及びその製造方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-06-11

(54)【発明の名称】ナノベシクルリアクター及びその製造方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/12 20060101AFI20240604BHJP

   C12N 11/04 20060101ALI20240604BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20240604BHJP

【ＦＩ】

C12N5/12

C12N11/04

C12N5/10

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023574640

(86)(22)【出願日】2022-06-07

(85)【翻訳文提出日】2024-01-24

(86)【国際出願番号】 KR2022007994

(87)【国際公開番号】W WO2022255851

(87)【国際公開日】2022-12-08

(31)【優先権主張番号】10-2021-0072646

(32)【優先日】2021-06-04

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(31)【優先権主張番号】10-2022-0068477

(32)【優先日】2022-06-03

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】516355542

【氏名又は名称】インスティテュート フォー ベーシック サイエンス

【氏名又は名称原語表記】ＩＮＳＴＩＴＵＴＥ ＦＯＲ ＢＡＳＩＣ ＳＣＩＥＮＣＥ

(71)【出願人】

【識別番号】316016667

【氏名又は名称】ウルサン ナショナル インスティテュート オブ サイエンス アンド テクノロジー

(74)【代理人】

【識別番号】100107984

【弁理士】

【氏名又は名称】廣田 雅紀

(74)【代理人】

【識別番号】100182305

【弁理士】

【氏名又は名称】廣田 鉄平

(74)【代理人】

【識別番号】100096482

【弁理士】

【氏名又は名称】東海 裕作

(74)【代理人】

【識別番号】100131093

【弁理士】

【氏名又は名称】堀内 真

(74)【代理人】

【識別番号】100150902

【弁理士】

【氏名又は名称】山内 正子

(74)【代理人】

【識別番号】100141391

【弁理士】

【氏名又は名称】園元 修一

(74)【代理人】

【識別番号】100221958

【弁理士】

【氏名又は名称】篠田 真希恵

(74)【代理人】

【識別番号】100192441

【弁理士】

【氏名又は名称】渡辺 仁

(72)【発明者】

【氏名】チョ ユン－ギョン

(72)【発明者】

【氏名】サミット クマール

【テーマコード（参考）】

4B033

4B065

【Ｆターム（参考）】

4B033NA22

4B033NB62

4B033ND20

4B065AB01

4B065AB02

4B065CA27

4B065CA46

4B065CA54

(57)【要約】

本発明は、ナノベシクルリアクター及びその製造方法に関し、詳しくは、ベシクルの表面に第１受容体を含有する第１ベシクル、及びベシクルの表面に第２受容体を含有する第２ベシクルを含み、前記第１受容体及び第２受容体は、リガンドシステムにより互いに結合され、第１ベシクルと第２ベシクルが融合してナノベシクルリアクターを形成することを特徴とするナノベシクルリアクター製造用組成物及びその製造方法を提供することにより、細胞の酵素反応による細胞エネルギー生成、薬物伝達システム、及び診断システムに活用することができる。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ナノベシクルリアクター製造用組成物であって、ベシクルの表面に第１受容体を含有する第１ベシクル、及びベシクルの表面に第２受容体を含有する第２ベシクルを含み、
前記第１受容体及び第２受容体は、リガンドシステムにより互いに結合され、第１ベシクルと第２ベシクルが融合してナノベシクルリアクターを形成することを特徴とする、前記ナノベシクルリアクター製造用組成物。

【請求項2】

前記第１受容体と第２受容体は、互いに独立してＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＣＤ８２、ＣＤ１４７、ＣＤ１０７ａ、ＣＤ１５１、ＣＤ１３、ＣＤ２６、ＩＴＧＡ３、ＩＴＧＡ６、ＩＴＧＢ１、ＩＴＧＢ４、ＡＤＡＭ１０、ＣＤ３１Ｂ、ＥＧＦＲ、ＥｐＣＡＭ、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ９、ＰＳＭＡ、及びＰＳＡからなる群より選択される、請求項１に記載のナノベシクルリアクター製造用組成物。

【請求項3】

前記リガンドシステムは、配位結合性化合物を含む、請求項１に記載のナノベシクルリアクター製造用組成物。

【請求項4】

前記配位結合性化合物は、極性置換基を含む芳香族化合物である、請求項３に記載のナノベシクルリアクター製造用組成物。

【請求項5】

前記極性置換基は、ドロキシル基又はカルボン酸基を含む、請求項４に記載のナノベシクルリアクター製造用組成物。

【請求項6】

前記リガンドシステムは、多価金属イオンをさらに含む、請求項１に記載のナノベシクルリアクター製造用組成物。

【請求項7】

前記第１ベシクルと第２ベシクルは、細胞外ベシクル（Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅ）である、請求項１に記載のナノベシクルリアクター製造用組成物。

【請求項8】

前記第１ベシクルと第２ベシクルは、互いに異なる酵素を含む、請求項１に記載のナノベシクルリアクター製造用組成物。

【請求項9】

前記第１ベシクルと第２ベシクルは、１０～１０００ｎｍの平均直径を有する、請求項１に記載のナノベシクルリアクター製造用組成物。

【請求項10】

請求項１に記載のナノベシクルリアクター製造用組成物を、エマルジョン内部の水相中に含む、ナノベシクルリアクター含有エマルジョン。

【請求項11】

前記エマルジョンは、２～１００μｍの平均直径を有する、請求項１０に記載のナノベシクルリアクター含有エマルジョン。

【請求項12】

請求項１に記載のナノベシクルリアクターを含む、細胞。

【請求項13】

前記ナノベシクルリアクターは、エネルギー生成用である、請求項１２に記載の細胞。

【請求項14】

前記ナノベシクルリアクターに含まれる第１ベシクルはＡＴＰ合成酵素を含み、第２ベシクルはｂｏ３オキシダーゼを含む、請求項１２に記載の細胞。

【請求項15】

前記ナノベシクルリアクターは薬物をさらに含む、請求項１２に記載の細胞。

【請求項16】

（Ｓ１）ベシクルの表面に第１受容体を含有する第１ベシクル溶液を製造するステップと、
（Ｓ２）ベシクルの表面に第２受容体を含有する第２ベシクル溶液を製造するステップと、
（Ｓ３）第１ベシクル溶液と第２ベシクル溶液を混合して混合液を製造するステップと、
（Ｓ４）前記混合液に多価金属イオンを混合して第１ベシクルと第２ベシクルを融合するステップと、
を含む、ナノベシクルリアクターの製造方法。

【請求項17】

前記（Ｓ１）及び（Ｓ２）ステップにおける第１ベシクル溶液及び第２ベシクル溶液は、互いに独立して配位結合性化合物で処理するステップをさらに含む、請求項１６に記載のナノベシクルリアクターの製造方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ナノベシクルリアクター及びその製造方法に関し、詳しくは、改質されたナノベシクルを用いて、生きている細胞内で起こる化学反応を容易に制御するナノベシクルリアクターに関する。

【背景技術】

【0002】

生命活動は、体内の物質やエネルギーの移動によって維持される。生体内における様々な触媒反応を担う酵素や補助因子を収容するための細胞器官又は細胞のコア構造が存在し、生体内における化学反応が調節され、最近、細胞小器官を人工的に合成して生体触媒反応をシミュレートしようとする研究が行われている。

【0003】

細胞小器官は細胞の臓器と言え、細胞呼吸を担うミトコンドリアや、細胞内の消化器官を担うリソソームが具体的な例である。ベシクル（Ｖｅｓｉｃｌｅ）は、脂質二重層で取り囲まれ、細胞質と区分される細胞小器官であり、細胞の生産物、副産物、排泄物を貯蔵、運搬又は消化する役割を担う。

【0004】

細胞小器官は、複雑な生化学反応を行う微細空間に分かれており、その内部には重要な細胞機能を行う様々な酵素が存在する。このうち、エクソソームは、細胞から分泌される直径５０～２００ｎｍの細胞外ベシクルであり、細胞間の信号伝達を行うキャリアとして機能することが知られている。エクソソームには、タンパク質、脂肪、ＲＮＡ、成長因子など親細胞の様々な情報が含まれているため、疾患の診断マーカーとして用いられるほか、生体適合性の特徴より薬物キャリアとしての活用に関する研究が活発に行われている。エクソソームの成分及び機能に関する研究が盛んに行われているが、エクソソームにはタンパク質、遺伝子及び核酸などの多量の生体指標が含まれているため、エクソソームの分離精製技術には依然として限界がある。

【0005】

また、エクソソームのような人工細胞小器官を生きている細胞に適用するためには、細胞内の物質伝達効率、安定性、生体適合性などの要素を考慮しなければならない。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

そこで、本発明は、生きている細胞へのより安定的かつ効率的な細胞内物質伝達方法を提示する技術的課題を解決するために、ナノベシクルの改質及びその融合を用いて細胞の機能を制御できるナノベシクルリアクターを提供することを目的とする。

【0007】

本発明の一実施形態によると、ナノリアクタープラットフォーム技術を用いて、細胞内でエネルギー生成が可能なナノベシクルリアクターを提供することを目的とする。

【0008】

本発明の一実施形態によると、ナノベシクルの融合を用いた効果的な薬物伝達システムを提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0009】

本発明は、前記技術的課題を解決するために、ナノベシクルリアクター製造用組成物であって、ベシクルの表面に第１受容体を含有する第１ベシクル、及びベシクルの表面に第２受容体を含有する第２ベシクルを含み、前記第１受容体及び第２受容体は、リガンドシステムにより互いに結合され、第１ベシクルと第２ベシクルが融合してナノベシクルリアクターを形成することを特徴とする、前記ナノベシクルリアクター製造用組成物を提供することができる。

【0010】

本発明の一実施形態において、前記第１受容体と第２受容体は、互いに独立してＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＣＤ８２、ＣＤ１４７、ＣＤ１０７ａ、ＣＤ１５１、ＣＤ１３、ＣＤ２６、ＩＴＧＡ３、ＩＴＧＡ６、ＩＴＧＢ１、ＩＴＧＢ４、ＡＤＡＭ１０、ＣＤ３１Ｂ、ＥＧＦＲ、ＥｐＣＡＭ、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ９、ＰＳＭＡ、及びＰＳＡからなる群より選択されてもよい。

【0011】

本発明の一実施形態において、前記リガンドシステムは、配位結合性化合物を含んでもよい。

【0012】

本発明の一実施形態において、前記配位結合性化合物は、極性置換基を含む芳香族化合物であってもよい。

【0013】

本発明の一実施形態において、前記極性置換基は、ヒドロキシル基又はカルボン酸基を含んでもよい。

【0014】

本発明の一実施形態において、前記リガンドシステムは、多価金属イオンをさらに含んでもよい。

【0015】

本発明の一実施形態において、前記第１ベシクルと第２ベシクルは、細胞外ベシクル（Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅ）であってもよい。

【0016】

本発明の一実施形態において、前記第１ベシクルと第２ベシクルは、互いに異なる酵素を含んでもよい。

【0017】

本発明の一実施形態において、前記第１ベシクルと第２ベシクルは、１０～１０００ｎｍの平均直径を有してもよい。

【0018】

また、本発明は、上述のナノベシクルリアクター製造用組成物を、エマルジョン内部の水相中に含むナノリアクター含有エマルジョンを提供することができる。

【0019】

本発明の一実施形態において、前記エマルジョンは、２～１００μｍの平均直径を有してもよい。

【0020】

また、本発明は、内部に上述のナノベシクルリアクターを含む細胞を提供することができる。

【0021】

本発明の一実施形態において、前記ナノベシクルリアクターは、エネルギー生成用であってもよい。

【0022】

本発明の一実施形態において、前記ナノベシクルリアクターに含まれる第１ベシクルはＡＴＰ合成酵素を含み、第２ベシクルはｂｏ３オキシダーゼを含んでもよい。

【0023】

本発明の一実施形態において、前記ナノベシクルリアクターは薬物をさらに含んでもよい。

【0024】

また、本発明は、（Ｓ１）ベシクルの表面に第１受容体を含有する第１ベシクル溶液を製造するステップと、（Ｓ２）ベシクルの表面に第２受容体を含有する第２ベシクル溶液を製造するステップと、（Ｓ３）第１ベシクル溶液と第２ベシクル溶液を混合して混合液を製造するステップと、（Ｓ４）前記混合液に多価金属イオンを混合して第１ベシクルと第２ベシクルを融合するステップと、を含むナノベシクルリアクターの製造方法を提供することができる。

【0025】

本発明の一実施形態において、前記（Ｓ１）及び（Ｓ２）ステップの第１ベシクル溶液及び第２ベシクル溶液は、互いに独立して配位結合性化合物で処理するステップをさらに含んでもよい。

【発明の効果】

【0026】

本発明は、生きている細胞間の情報伝達体として細胞外ベシクル（Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｖｅｓｉｃｌｅｓ）をリプログラミングすることにより、細胞内でエネルギー生成が可能な人工細胞小器官を提供することができる。これは、細胞内で安定しており、組織内の深くまで浸透する点から、薬物伝達システムとしての活用価値が高い。

【0027】

本発明の一実施形態によると、細胞内でＡＴＰを直接合成し、エネルギー供給が欠乏している癌細胞の深部までＡＴＰを伝達することができるため、損傷した細胞にエネルギーを供給することができる。

【0028】

本発明の一実施形態によると、ナノベシクルリアクターに薬物をさらに含み、効果的な薬物伝達システムとして活用することができる。

【図面の簡単な説明】

【0029】

【図1】本発明によって表面にカテコール基を有するように改質されたエクソソーム（ＣＥｘ）と金属イオンとを反応させてエクソソーム融合を誘導する原理を示す模式図である。

【図2】ＮＴＡ（ナノ粒子追跡分析）を用いたエクソソーム、ＣＥｘ及びＦＥｘのサイズ特性を確認した結果を示す図である。

【図3】（ａ）は、ＣＥｘ（コア直径＝１１５±２６ｎｍ）及びＦＥｘ（コア直径＝２４７±３３ｎｍ）のサイズを示すＴＥＭ画像であり、（ｂ）は、動的光散乱によるＣＥｘ（ＣＥｘ－１＝１２１±８ｎｍ、ＣＥｘ－２＝１２３±５ｎｍ）及びＦＥｘ（２６５±１４ｎｍ）のサイズ分布を示すグラフである。

【図4】ＣＥｘ融合をモニタリングするためのコバルト－カルセイン分析の結果を示す図である。

【図5】多価金属イオンの種類を変えて融合の程度を確認した結果を示す図である。

【図6】ＦＥｘ内にグルコースオキシダーゼ（ｇｌｕｃｏｓｅ ｏｘｉｄａｓｅ、ＧＯｘ）とＨＲＰ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）酵素の連続段階反応に対する模式図を示す図である。グルコースを添加して開始され、好気酸化によってＨ_２Ｏ_２が生成され、これは、アンプレックスレッド（Ａｍｐｌｅｘ Ｒｅｄ）を酸化させてレゾルフィンを生成したことを示す。

【図7】ＦＥｘナノリアクターにカプセル化された３つの酵素の触媒作用を示す模式図である。乳糖の存在下では、β－ガラクトシダーゼ触媒の加水分解によりグルコースとガラクトースが生成される。このグルコースの好気性ＧＯｘ触媒の酸化は、グルコン酸とＨ_２Ｏ_２を生成し、これによって、アンプレックスレッドの酸化を触媒してレゾルフィンが生成された。

【図8】ＦＥｘ－ＧＯｘ－ＨＲＰナノリアクターにカプセル化された２－酵素カスケードによるレゾルフィンの蛍光強度の経時変化を示す図である。レゾルフィンの蛍光強度が徐々に増加し、８０分後に飽和状態に逹することを確認することができる。

【図9】ＦＥｘ－β－ガラクトシダーゼ－ＧＯｘ－ＨＲＰナノリアクターにカプセル化された３－酵素カスケードによる乳糖の濃度に応じた反応速度を示す図である。

【図10】ＦＥｘナノリアクター（ＦＥｘ－ＧＯｘ－ＨＲＰ）内にカプセル化された酵素及び溶液内の遊離酵素の相対的活性変化を示す図であり、（ａ）貯蔵性、（ｂ）熱安定性、及び（ｃ）サイクル特性に対する酵素特性の結果グラフである。

【図11】本発明による区画化されたプラットフォーム内の触媒機能を評価した実験例３に関し、（ａ）パラジウムナノ粒子（Ｐｄ）を融合して製造したＦＥｘ－Ｐｄ－ｐｒｏＲｈｏナノリアクターを用いて細胞内でｐｒｏＲｈｏの遊離ローダミンへの触媒転換を示す模式図である。（ｂ）ＦＥｘ－Ｐｄ－ｐｒｏＲｈｏの代表的なＴＥＭ画像（～６ｎｍのＰｄナノ構造、スケールバー、１０ｎｍ）を示す図である。

【図12】（ａ）は、ＦＥｘ及びＣＥｘでローダミンをデマスキングするための蛍光放出スペクトル（λＥｘ＝４９８ｎｍ）、（ｂ）は、ＦＥｘ－Ｐｄ－ｐｒｏＲｈｏ及びＣＥｘ－ｐｒｏＲｈｏで時間関数としてのデマスキング反応の蛍光強度（％）（５２７ｎｍにおける）変化を示す図である。

【図13】（ａ）は、ＦＥｘ－Ｐｄ－ｐｒｏＦＵナノリアクターを用いたプロドラッグ（ｐｒｏ－ｄｒｕｇ）の薬物への触媒による転換を示す模式図である。ＦＥｘ－Ｐｄ－ｐｒｏＦＵナノリアクターを用いた抗がん剤５－フルオロウラシル（ｐｒｏ－ＦＵ）の活性化を示し、（ｂ）は、様々な濃度（１０μｇ／ｍＬ、３０μｇ／ｍＬ、６０μｇ／ｍＬ及び９０μｇ／ｍＬ）のナノリアクターＦＥｘ－Ｐｄ－ｐｒｏＦＵ及びＣＥｘ－ｐｒｏＦＵを培養した後のＭＣＦ－１０Ａ細胞の細胞生存率の結果を示すグラフである。

【図14】本発明の実施例２によるエネルギー生成用の人工細胞小器官（ＦＥｘ－１）を示す模式図である。エクソソーム膜と内部にそれぞれＡＴＰ合成酵素とグルコースオキシダーゼを搭載したエクソソーム（ＡＴＰｓｙｎ－ＣＥｘ－ＧＯｘ）と、ｂｏ３オキシダーゼとＨＲＰ酵素を搭載したエクソソーム（ｂｏ３Ｏｘｉ－ＣＥｘ－ＨＲＰ）との融合によって作成された人工細胞小器官でＡＴＰ産生を行って低酸素条件の細胞までエネルギーを供給することができる。

【図15】細胞に吸収された後、ＦＥｘ－１ナノリアクター内部でエネルギーが生成されたか否かを確認するための、（ａ）経時によるｐＨ勾配、（ｂ）経時によるＡＴＰ産生を観察した結果グラフである。

【図16】（ａ）は、ＦＥｘ－１が、低酸素症が誘導された細胞に吸収された後のＡＴＰ活性を示す図であり、（ｂ）は、異なる濃度で処理されたＦＥｘ－１ナノリアクターの細胞内ＲＯＳレベルを定量化して示す図である。

【図17】本発明の実施例２及び比較例２による融合エクソソーム又は個別エクソソームにより合成されたＡＴＰを発光の程度で示すグラフである。

【図18】低酸素コアを含む生体内組織と非常に類似の三次元多細胞スフェロイド構造を示す図であり、ＦＥｘがスフェロイドに侵透し、ＡＴＰ産生により低酸素条件で細胞酸化－還元を制御できることを示す模式図である。

【図19】融合エクソソーム（ＦＥｘ－１）を処理し、２４時間培養した後のスフェロイドのＡＴＰ活性レベルを測定した結果を示すグラフである。

【図20】カルセイン－ＡＭ（ａｃｅｔｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）を用いたスフェロイドの細胞の生存力を分析した結果を示すグラフである。

【図21】融合エクソソーム（ＦＥｘ－１）処理した後のスフェロイドの活性酸素（ＲＯＳ）レベルを測定した結果を示すグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0030】

以下、本発明によるナノベシクルリアクター製造用組成物、ナノベシクルリアクター含有エマルジョン、ナノベシクルリアクターを含む細胞、及びナノベシクルリアクターの製造方法について詳しく説明する。

【0031】

このとき、他に定義されない限り、本明細書のすべての技術的用語及び科学的用語は、本発明が属する技術分野における通常の知識を有する者が通常理解している意味を有する。

【0032】

本発明の詳細な説明に用いられる用語は、単に特定の実施形態を効果的で記述するためのものであり、本発明をこれに限定することを意図したものではない。

【0033】

また、本発明の構成要素を説明するにあたって、第１、第２、Ａ、Ｂ、（ａ）、（ｂ）などの用語を使用することができる。このような用語はその構成要素を他の構成要素と区別するためのものであり、その用語によって該当の構成要素の本質や順番又は手順などが限定されない。

【0034】

また、本明細書で特に記載しない添加物の単位は重量％であってもよい。

【0035】

また、本明細書で単数形は文脈で特に指示がない限り複数形も含むことを意図することができる。

【0036】

また、ある部分がある構成要素を「含む」という場合、これは、特に反対の記載がない限り、他の構成要素を除外するのでなく、他の構成要素をさらに含み得ることを意味する。

【0037】

なお、本明細書において、本発明の要旨を不必要に曖昧にする公知効果及び構成についての記載は省略する。

【0038】

本明細書において、「ナノベシクルリアクター」は、細胞や生体にナノ粒子を入れ、生体内で起こるか又は起こらない化学反応を誘導する機能を行うプラットフォームを意味することができる。本明細書において、「ナノリアクター」又は「ベシクルナノリアクター」と同じ意味で解釈することができる。

【0039】

本明細書において、「受容体」は、ベシクル膜表面に結合された分子であって、特異物質と選択的に結合する分子を意味することができる。

【0040】

本明細書において、「リガンドシステム」は、前記受容体と特異的に結合する特異物質を意味することができる。

【0041】

細胞小器官を人工的に合成して活用する人工細胞小器官の開発は、まだ初期段階にあり、中でも細胞外ベシクルであるエクソソームは、ナノサイズで生体来由の物質という点から、薬物、遺伝子及びワクチンの伝達に多様に活用できるという利点のため研究が続けられているが、生きている細胞に適用するためには、細胞内でも活性を長く維持でき、細胞の生存に影響を与えない必要がある。

【0042】

本発明者は、生きている細胞間の情報伝達体として機能する細胞外ベシクルをリプログラミングすることにより、液滴ベースのマイクロ流体リアクター上での化学反応によって２種類のナノベシクルリアクターが結合することで、内部物質同士の化学反応により融合することを確認し、本発明を完成した。

【0043】

本発明は、内部及び膜タンパク質に互いに異なる酵素を有するナノベシクルリアクターの融合反応によって、生触媒反応を容易に制御でき、細胞のエネルギー源であるＡＴＰを合成できる酵素を含むことで、生きている細胞内でエネルギー生成が可能な融合ナノベシクルリアクターを提供することができる。

【0044】

以下、本発明によるナノベシクルリアクター製造用組成物について詳しく説明する。

【0045】

具体的に、ナノベシクルリアクター製造用組成物は、ベシクルの表面に第１受容体を含有する第１ベシクル、及びベシクルの表面に第２受容体を含有する第２ベシクルを含み、第１受容体及び第２受容体は、リガンドシステムにより互いに結合され、第１ベシクルと第２ベシクルが融合してナノベシクルリアクターを形成することを特徴とすることができる。このとき、本発明の一実施形態において、第１受容体と第２受容体は互いに同一であってもよく、異なってもよい。本発明の目的によって、必要に応じて同一又は異なる受容体を選択してもよい。

【0046】

具体的に、第１受容体と第２受容体は、細胞表面タンパク質であってもよい。細胞表面タンパク質の具体的な例としては、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＣＤ８２、ＣＤ１４７、ＣＤ１０７ａ、ＣＤ１５１、ＣＤ１３、ＣＤ２６、ＩＴＧＡ３、ＩＴＧＡ６、ＩＴＧＢ１、ＩＴＧＢ４、ＡＤＡＭ１０、ＣＤ３１Ｂ、ＥＧＦＲ、ＥｐＣＡＭ、ＰＳＭＡ、及びＰＳＡからなる群より選択されるものであってもよいが、こられに特に限定されるものではない。

【0047】

また、本発明の一実施形態において、第１受容体と第２受容体は癌特異的抗体であってもよい。

【0048】

前記リガンドシステムは、受容体と特異的な非共有結合によって相互作用する受容体結合部を含んでもよい。非共有結合の例としては、水素結合、イオン結合、疎水性相互作用、又はファンデルワールス力であってもよい。前記受容体結合部は、受容体と特異的非共有結合を形成できるａｎｔｉ－ＣＤ９、ａｎｔｉ－ＣＤ６３、ａｎｔｉ－ＣＤ８１、ａｎｔｉ－ＣＤ８２、ａｎｔｉ－ＣＤ１４７、ａｎｔｉ－ＣＤ１０７ａ、ａｎｔｉ－ＣＤ１５１、ａｎｔｉ－ＣＤ１３、ａｎｔｉ－ＣＤ２６、ａｎｔｉ－ＩＴＧＡ３、ａｎｔｉ－ＩＴＧＡ６、ａｎｔｉ－ＩＴＧＢ１、ａｎｔｉ－ＩＴＧＢ４、ａｎｔｉ－ＡＤＡＭ１０、ａｎｔｉ－ＣＤ３１Ｂ、ａｎｔｉ－ＥＧＦＲ、ａｎｔｉ－ＥｐＣＡＭ、ａｎｔｉ－ＰＳＭＡ、及びａｎｔｉ－ＰＳＡであってもよいが、これらに必ずしも限定されるものではない。このとき、「ａｎｔｉ－」は、前記細胞表面タンパク質と特異的結合を形成する１つ以上のエピトープを含む分子又は分子群を意味することができる。

【0049】

また、本発明によるナノベシクルリアクター製造用組成物は、前記リガンドシステムに配位結合性化合物を含んでもよい。このとき、本発明の一実施形態において、配位結合性化合物は、極性置換基を含む芳香族化合物であってもよい。具体的に、フェノール系化合物であってもよい。より具体的に、ヒドロキシル基又はカルボン酸基を１つ以上含むフェノール系化合物であってもよく、例えば、フェノール（Ｐｈｅｎｏｌ）、カテコール（Ｃａｔｅｃｈｏｌ）、プロトカテク酸（Ｐｒｏｔｏｃａｔｅｃｈｕｉｃ ａｃｉｄ）、タンニン酸（Ｔａｎｎｉｃ ａｃｉｄ）、没食子酸（Ｇａｌｌｉｃ ａｃｉｄ）、リグニン（ｌｉｇｎｉｎ）、エラグ酸（Ｅｌｌａｇｉｃ ａｃｉｄ）などであってもよいが、これらに限定されない。

【0050】

また、リガンドシステムは、多価金属イオンをさらに含んでもよい。具体的に、多価金属イオンは、アルミニウムイオン、チタンイオン，セシウムイオン、亜鉛イオン、又は鉄イオンであってもよい。より具体的に、Ａｌ^３＋、Ｔｉ^４＋、Ｃｅ^３＋、Ｚｎ^２＋、又はＦｅ^３＋であってもよく、さらに具体的には、Ａｌ^３＋、Ｚｎ^２＋、又はＦｅ^３＋であってもよい。

【0051】

これによって、前記受容体結合部及び配位結合性化合物の複合体は、前記多価金属イオンと配位結合を形成することができ、配位結合性化合物の極性置換基は、ヒドロキシル基又はカルボン酸基を含み、前記多価金属イオンと共に容易に金属－フェノール配位結合（Ｍｅｔａｌ－ｐｈｅｎｏｌｉｃ ｃｏｏｒｄｉｎａｔｉｏｎ）を形成することができる。金属－フェノール配位結合によって、図１に示すように、第１ベシクル及び第２ベシクルの融合を誘導することができる。

【0052】

本発明において、ベシクルは、細胞膜の構造と同一のリン脂質（ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ）の二重膜の形態からなり、外膜が内部の物質を安定して維持できるものであれば種類は特に限定されない。ベシクルの平均直径は、１０～１０００ｎｍ、又は３０～５００ｎｍであってもよい。ベシクルは、天然来由又は人工的に合成されたナノベシクルであってもよい。

【0053】

本発明の非限定的な一実施形態において、ナノベシクルは、生物来由の様々な細胞外ベシクルであってもよい。

【0054】

本発明の一実施形態において、１０μｍ以下の平均直径を有する液滴ベースのマイクロ流体リアクターを用いて、２種類のナノベシクル融合を行うことができる。このとき、２種類のナノベシクルは、エクソソーム、エクソソーム以外の細胞外ベシクル又はこれらの組み合わせであってもよい。具体的に、例えば、ｉ）互いに異なるエクソソーム、ｉｉ）異なるエクソソーム以外の細胞外ベシクル、ｉｉｉ）エクソソーム、及びエクソソーム以外の細胞外ベシクルであってもよい。

【0055】

液滴ベースのマイクロ流体リアクターは、水と油のように互いに混ざらない２つの流体を用いて、マイクロ流体チップ上に複数の液滴（ｄｒｏｐｌｅｔ）を形成し、このように互いに分離された区域を有する複数の小さな液滴を、バイオリアクターで活用して新しい機能性材料を合成するか、又は生体物質を高感度分析するために用いる。本発明の一実施形態によると、液滴ベースのマイクロ流体リアクターを用いたナノベシクルの融合によって、各ナノベシクルの内部物質の化学反応を誘導することができる。

【0056】

本発明の一実施形態において、前記液滴ベースのマイクロ流体リアクター当たりのベシクルは、２００個以下、具体的に１００個以下、より具体的に６０個以下で含まれてもよい。これによって、ナノベシクル内部及び膜タンパク質に互いに異なる酵素を有するナノベシクルの融合反応により生触媒反応を成功的に制御することができる。

【0057】

本発明の非限定的な一実施形態において、細胞外ベシクルは、酵素カスケード反応を安定して行うことができ、標的能に優れたエクソソームであってもよい。エクソソームナノリアクターの主な利点は、膜タンパク質が透過性シェルの役割をし、化学試薬の流れを促進し、向上した生体触媒性能のために組み込まれた酵素の浸出を防止して深部組織への浸透が容易であるという点である。

【0058】

本発明の一実施形態において、第１ベシクルと第２ベシクルは同じ受容体を含むものであり、互いに異なる酵素を含んでもよい。このとき、酵素は、２種類以上又は３種類以上であってもよく、ナノベシクルリアクターは、複数の酵素によってカスケード反応を行うことができる。

【0059】

酵素の具体的な例としては、ＮＡＤＨ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（ＮＡＤＨ脱水素酵素）、Ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅｓｔｅｒａｓｅ、Ａｌｃｏｈｏｌ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（アルコール脱水素酵素）、Ｂａｃｔｅｒｉｏｒｈｏｄｏｐｓｉｎ（バクテリオロドプシン）、Ｐｈｏｔｏｓｙｓｔｅｍ ＩＩ（光化学系ＩＩ）などであってもよいが、これらに限定されず、ベシクル内にカプセル化できるものであれば必要に応じて多様に適用することができる。

【0060】

図９は、３触媒－カスケード反応の結果を示し、具体的には、ＦＥｘ－β－ガラクトシダーゼ－ＧＯｘ－ＨＲＰナノリアクターにカプセル化された３種の酵素カスケードを示す図である。基質として乳糖の存在下で、β－ガラクトシダーゼ（２３．６μｇ／ｍｇ）は、乳糖の加水分解を触媒してグルコースとガラクトースを生成した。生成されたグルコースの好気性ＧＯｘ触媒（３１．２μｇ／ｍｇ）の酸化により、グルコン酸とＨ_２Ｏ_２が生成され、ＨＲＰ（１８．９μｇ／ｍｇ）がこれを用いてアンプレックスレッドを酸化させてレゾルフィンを形成した。蛍光顕微鏡を用いてレゾルフィンの蛍光乳糖依存性の変化をモニタリングした。運動定数（Ｋｍ及びＶｍａｘ）を計算するために、反応速度（μＭ／ｓｅｃ）を乳糖の濃度（μＭ）に対して示した。ＦＥｘ－β－ガラクトシダーゼ－ＧＯｘ－ＨＲＰナノリアクターとＣＥｘ－β－ガラクトシダーゼがあるＦＥｘ－ＧＯｘ－ＨＲＰに対するＫｍ値は、それぞれ２８．７８×１０^－６Ｍ及び４８９．６５×１０^－６Ｍであり、ＦＥｘに対するＶｍａｘ値は、－β－ガラクトシダーゼ－ＧＯｘ－ＨＲＰナノリアクターとＣＥｘ－β－ガラクトシダーゼがあるＦＥｘ－ＧＯｘ－ＨＲＰの場合、それぞれ１２３．１６×１０^－６Ｍ／ｍｉｎ及び４３．０６×１０^－６Ｍ／ｍｉｎであった。

【0061】

また、本発明は、内水相に上述のナノベシクルリアクター製造用組成物を含むエマルジョンを提供することができる。このとき、前記エマルジョンは、２～１００μｍ、又は１～５０μｍの平均直径を有してもよい。

【0062】

さらに、本発明は、上述のナノベシクルリアクター製造用組成物を含む細胞を提供することができる。非限定的な例として、前記ナノベシクルリアクターは、第１ベシクル内にＡＴＰ合成酵素、第２ベシクル内にｂｏ３オキシダーゼを含んでもよい。これによって、ナノベシクルリアクターは、エネルギーを生成するために用いられ、低酸素症により損傷した細胞にエネルギーを供給するナノ錠剤として活用できるという利点を提供することができる。

【0063】

本発明の一実施形態において、ナノベシクルリアクターは、細胞に吸収されて作動することができる。具体的に、エンドサイトーシス（ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）によってもよいが、これに限定されず、様々なメカニズムにより細胞に吸収されてもよい。

【0064】

本発明によるナノベシクルリアクターは、低酸素コアを含む多細胞スフェロイドのコア部まで深く侵透することができる。図１９～図２１に示すように、人工エクソソームは、乳がんを模したスフェロイド内の深部まで侵透できることを確認した。これは、人工エクソソームが低酸素症により損傷した細胞にエネルギーを供給するナノ錠剤として活用される可能性を示唆する。これによって、腫瘍中心部のＡＴＰ欠乏に対する解決策を提供することができる。

【0065】

ナノベシクルリアクターを含む細胞は、バクテリア、植物又はヒトを含む動物来由の細胞であってもよい。

【0066】

また、本発明は、（Ｓ１）ベシクルの表面に第１受容体を含有する第１ベシクル溶液を製造するステップと、（Ｓ２）ベシクルの表面に第２受容体を含有する第２ベシクル溶液を製造するステップと、（Ｓ３）第１ベシクル溶液と第２ベシクル溶液を混合して含んで混合液を製造するステップと、（Ｓ４）前記混合液に多価金属イオンを混合して第１ベシクルと第２ベシクルを融合するステップと、を含むナノベシクルリアクターの製造方法を提供することができる。

【0067】

本発明の一実施形態において、前記（Ｓ１）及び（Ｓ２）ステップにおける第１ベシクル溶液及び第２ベシクル溶液は、互いに独立して配位結合性化合物で処理するステップをさらに含んでもよい。

【0068】

以下、実施例により本発明についてより詳しく説明する。ただし、下記の実施例は、本発明を詳しく説明するための参照例にすぎず、本発明はこれらに限定されるものではなく、多様な形態で実施することができる。

【0069】

製造例１．カテコールで改質されたエクソソーム（ＣＥｘ）の製造
ヒト乳房上皮細胞ＭＣＦ－１０Ａ（ｃａｔ＃ＣＲＬ－１０３１７、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ））を、５％ウマ血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＃１６０５０－１２２）、２０ｎｇ／ｍｌ表皮成長因子（ＥＧＦ、ｃａｔ＃ ＡＦ－１００－１５、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、０．５ｍｇ／ｍｌヒドロコルチゾン（ｃａｔ＃ Ｈ０８８８、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、１０μｇ／ｍｌインスリン（ｃａｔ＃ Ｉ１８８２、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、１％抗生剤／抗真菌剤（１００Ｕ／ｍｌペニシリン及び１００ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン）が補充されたダルベッコ変形培地（ＤＭＥＭ／Ｆ－１２；ｃａｔ＃ １１３３０－０３２）１８ｍｌを含むＴ７５細胞培養フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ、ＵＳＡ）にフラスコ当たりに５×１０^６個細胞の密度で播種した。細胞を６０～７０％コンフルエントになるまで５％ＣＯ_２を含む加湿雰囲気のインキュベーター内で３７℃で培養した後、１ｘリン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を用いて２回洗浄し、また１０％Ｅｘｏ－Ｆｒｅｅ ＦＢＳ（Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ、ＣＡ、ＵＳＡ）及び１％抗生剤／抗真菌溶液で補充したＲＰＭＩ（Ｒｏｓｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）培地（Ｇｉｂｃｏ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で洗浄した。その後、細胞を３７℃のインキュベーター内で４８時間インキュベーションした後、細胞培養上清を収集し、超遠心分離によってエクソソームを直ちに単離した。

【0070】

ドーパミン塩酸塩（１ｍＭ、ｃａｔ＃ ６２－３１－７、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）及び２ｍＭジスクシンイミジルカーボネート溶液をそれぞれ１ｍＬ及び１５ｍＬジメチルホルムアミドで製造し、ドーパミン塩酸塩溶液を２ｍＭジスクシンイミジルカーボネート溶液に撹拌しながら３０分間かけて滴加した後、２ｍＭのＥｔ_３Ｎをゆっくり添加した。１時間後、溶媒を部分的に蒸発させて１ＮのＨＣｌを添加した。最後に、ＥｔＯＡｃを用いてこの混合物から生成物を抽出した。その後、抗ＣＤ９抗体を結合するために、カテコール－ＮＨＳ（１ｍｇ）を最小量のジメチルホルムアミドに溶解し、ＰＢＳ（０．２ｍｇ／ｍＬ）中のＣＤ９抗体溶液（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、マウスモノクローナル）に添加した。試薬に対する抗体溶液のモル比は、＞１０に調整された。２時間後、ＰＢＳに対する透析により生成物を精製した。ＭＣＦ－１０Ａ来由のエクソソームをカテコール抗ＣＤ９（５００ｎｇ／ｍＬ）と共に３７℃で１時間インキュベーションし、カテコールで操作されたエクソソーム（ＣＥｘ）を得た。最終生成物を超遠心分離（１２０，０００×ｇ、４℃で２時間）によって反応混合物から精製して得ることができた。

【0071】

実施例１．融合エクソソームＦＥｘの製造
５０μＭカルセイン（ｃａｌｃｅｉｎ）、１μＭのＣｏＣｌ２、１０ｍＭのＭＯＰＳ（ｐＨ７．４）、及び前記製造例１によって製造された１０μｇ／ｍＬのＣＥｘ混合物を室温で３分間超音波処理して、カルセイン及びＣｏ^２＋錯体をＣＥｘ内にカプセル化（ＣＥｘ－１）した。また、１０μＭのＥＤＴＡ、１０ｍＭのＭＯＰＳ（ｐＨ７．４）、及び前記製造例１によって製造された１０μｇ／ｍＬのＣＥｘと混合して、ＥＤＴＡをＣＥｘ内にカプセル化（ＣＥｘ－２）した。前記ＣＥｘ－１及びＣＥｘ－２は、いずれも１２０，０００×ｇで１時間の間２回遠心分離して過剰のＥＤＴＡとコバルトカルセインを除去した。明るいオレンジ色のペレットを１０ｍＭのＭＯＰＳ（ｐＨ７．４）を含む０．６ｍＬ緩衝液に再懸濁し、ＣＥｘ懸濁液（３×１０^９ｐａｒｔｉｃｌｅｓ／ｍＬ）とＦｅＣｌ_３・６Ｈ_２Ｏ（４０ｎｇ／ｍＬ）溶液の水相をマイクロ流体装置に注入してＣＥｘ－１及びＣＥｘ－２エクソソーム融合を行った。

【0072】

実施例２．融合エクソソームＦＥｘ－１（ＡＴＰｓｙｎ－ｂｏ３Ｏｘｉ－ＦＥｘ－Ｇｏｘ－ＨＲＰ）の製造
１０％ナトリウムコレート（ｓｏｄｉｕｍ ｃｈｏｌａｔｅ）６０μＬ、ＭＣＦ－１０Ａ来由のエクソソーム懸濁液３００μＬ（ＮＴＡを用いて計算した５×１０^９±２．６×１０^８ｐａｒｔｉｃｌｅｓ／ｍＬ、ＢＣＡ分析を用いて計算した８７μｇ）及びＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．４）２００μＬの混合物に、ＡＴＰ合成酵素及びｂｏ３オキシダーゼ（ＢＣＡ分析を用いて計算した１ｍｇ／ｍＬ）１００μＬを各２つの反応に別に添加した。この混合物を４℃で１５分間撹拌し、これを室温でＭＯＰＳ緩衝液で平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－５０樹脂を含有する重力カラムに通した。濁った画分を新しい超遠心分離器管に移し、エクソソーム懸濁液を２回洗浄してＴｉ４５固定角回転子（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）で１２０，０００×ｇ及び４℃で２時間遠心分離して過剰なＡＴＰ合成酵素を除去し、融合エクソソームＦＥｘ－１（ＡＴＰｓｙｎ－ｂｏ３Ｏｘｉ－ＦＥｘ－Ｇｏｘ－ＨＲＰ）を製造した。

【0073】

エクソソームペレットを２００μＬの予め濾過したＰＢＳに再懸濁し、すぐに使用するために４℃で、又は長期保管するために－８０℃で保管した。エクソソームに融合されたＡＴＰ合成酵素とｂｏ３オキシダーゼの量は、それぞれ２３ｎｇ／μｇ及び１７ｎｇ／μｇであると測定された。

【0074】

実施例３．融合エクソソームＦＥｘ－Ｐｄ－ｐｒｏＲｈｏの製造
前記製造例１によって製造された１０μｇ／ｍＬのＣＥｘ混合物にパラジウムナノ粒子（Ｐｄ ＮＰｓ）を入れ、ＣＥｘにカプセル化したエクソソーム（ＣＥｘ－Ｐｄ）を製造し、同一の方法によりビス－アリルオキシカルボニル保護ローダミン（ｐｒｏＲｈｏ）が組み込まれたエクソソーム（ＣＥｘ－ｐｒｏＲｈｏ）を製造した。前記ＣＥｘ－Ｐｄ及びＣＥｘ－ｐｒｏＲｈｏエクソソーム間の融合を行うことで、融合されたエクソソーム（ＦＥｘ－Ｐｄ－ｐｒｏＲｈｏ）を製造した。

【0075】

比較例２．酵素を直接組み込んだエクソソームの製造（Ａ）ＧＯｘ、Ｈｒｐ、ＡＴｐｓｙｎｔｈａｓｅ及びｂｏ３Ｏｘｉｄａｓｅを併用してエクソソーム内にカプセル化したエクソソームの製造
最終のタンパク質濃度が３．６μｇ／ｍＬのエクソソーム懸濁液（２５０μＬ）を氷上で冷却し、０．２％サポニン溶液を添加した。混合物を４２ｋＨｚの周波数及び１００Ｗの電力でＦＳ３０Ｄ ｂａｔｈ型超音波処理器（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、２分間蓋付きガラスバイアルで超音波処理した。室温で２０分間振とうした後、酵素が組み込まれたエクソソームを超遠心分離（１２０，０００×ｇ及び４℃で２時間）で遊離酵素を除去した後、Ｐｉｅｒｃｅ^ＴＭＢＣＡタンパク質分析キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて定量した。

【0076】

（Ｂ）ＧＯｘ、Ｈｒｐ、ＡＴｐｓｙｎｔｈａｓｅ及びｂｏ３Ｏｘｉｄａｓｅを順にエクソソーム内にカプセル化したエクソソームの製造
すべての酵素（ＧＯｘ、Ｈｒｐ、ＡＴｐｓｙｎｔｈａｓｅ及びｂｏ３Ｏｘｉｄａｓｅ）をステップの間で洗浄する度に順にカプセル化したことを除いて、前記（Ａ）製造過程と同様に行った。

【0077】

［実験例１］融合エクソソーム特性の確認
１－１．ＤＬＳ（Ｄｙｎａｍｉｃ Ｌｉｇｈｔ Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ）を用いて測定したエクソソームのサイズ分布
Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ（Ｎａｎｏ ＺＳ）を用いて固定された角度で散乱光強度の動的変動によるエクソソームの移動速度の分布を分析してエクソソームのサイズ分布を記録した。ブラウン運動によって、エクソソームの流体力学的半径は、ストック－アインシュタイン方程式で計算された。エクソソーム溶液を無粒子ＰＢＳ（１０００ｘ、２００ｎｍフィルターを通過する）に希釈した。約１ｍＬのサンプルを３０秒間ボルテックスし、凝集を避けるために使い捨てキュベッに迅速にロードした。エクソソーム、ＣＥｘ及びＦＥｘのサイズ分布は、最小３回の独立した実験により測定した。その結果を図３に示す。

【0078】

１－２．カルセイン－Ｃｏ ^２＋ の分析
融合エクソソーム（ＦＥｘ）が単純接合でなく内部内容物の混合であることを確認するために、ＣＥｘ－１とＣＥｘ－２を別に融合した後、カルセイン－Ｃｏ^２＋分析を行った。その結果を図４に示す。時間に対する蛍光強度をプロットすると、融合後に信号が約１０倍増加し、１０分以内に飽和することが分かった。これは、膜と内部物質との間の混合が起こると、ＣＥｘ－２内にカプセル化されたＥＤＴＡがＣＥｘ－１内にカプセル化されたＣｏ^２＋に優先して結合し、カルセインが蛍光を起こさないようにするためであり、内容物の混合が確認された。

【0079】

［実験例２］融合エクソソームナノリアクター内のマルチ酵素カスケード作動の評価
ｔｗｏ－ｅｎｚｙｍｅ ｃａｓｃａｄｅ ｒｅａｃｔｉｏｎｓ：
図６の模式図に示すように、グルコースオキシダーゼ（ＧＯｘ）とＨＲＰ酵素をそれぞれ搭載したエクソソームを融合した後、融合エクソソームナノリアクター（ＦＥｘ－ＧＯｘ－ＨＲＰ）の内部でマルチ酵素生体触媒連続段階反応（ｃａｓｃａｄｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ）を行った。ブドウ糖（グルコース）を添加して好気性酸化によって過酸化水素及びグルコン酸（ｇｌｕｃｏｎｉｃ ａｃｉｄ）が生成され、ＨＲＰ付近で生成された過酸化水素は基質として作用し、ＨＲＰがアンプレックスレッド酸化を触媒し、蛍光生成物であるレゾルフィンを生成できるようにした。

【0080】

ＦＥｘ－Ｇｏｘ－ＨＲＰナノリアクターの酵素活性と動力学をモニタリングした。酵素カプセル化効率は、他の染料で標識された酵素に対する補正曲線を用いて、蛍光分光光度法によって決定された。酵素生体触媒カスケード反応の速度は、マイクロプレートリーダー（ＴＥＣＡＮ無限Ｍ２００ＰＲＯ）を用いて５６３ｎｍでレゾルフィン（ｒｅｓｏｒｕｆｉｎ）の蛍光強度を用いて測定した。ＦＥｘナノリアクターのＶｍａｘ及びＫＭを決定するために、標準ミカエリス・メンテン（Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ－Ｍｅｎｔｅｎ）酵素動力学方程式を用い、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ８．０．１を用いた。ＦＥｘ－ＧＯｘ－ＨＲＰナノリアクターのミカエリス・メンテン定数（Ｋｍ）値は、ＣＥｘ－ＧＯｘとＣＥｘ－ＨＲＰの均質混合物に比べて１６倍まで減少し、最大反応速度（Ｖｍａｘ）は、ＦＥｘ－ＧＯｘ－ＨＲＰナノリアクターの場合、３倍まで増加することが確認された。

【0081】

１）貯蔵安定性の評価
ＦＥｘナノリアクター（ＦＥｘ－ＧＯｘ－ＨＲＰ）内にカプセル化された溶液及び酵素内の遊離ＧＯｘ及びＨＲＰの相対的活性変化を調べるために、室温（２５℃）で数日間保管した後、貯蔵安定性を測定するために、遊離酵素（ＧＯｘ＋ＨＲＰ）とＦＥｘ－ＧＯｘ－ＨＲＰをＰＢＳに室温（２５℃）で貯蔵した。貯蔵中に安定性を決定するために７日間活性を測定した。結果は、図１０の（ａ）に示す。遊離酵素の場合、相対活性が２０％に減少した一方、ＦＥｘナノリアクター内のカプセル化された酵素は、７日後でも活性の６９％を維持することが確認された。

【0082】

２）熱安定性の評価
６０℃で１時間培養した後、溶液及びＦＥｘナノリアクター（ＦＥｘ－ＧＯｘ－ＨＲＰ）内にカプセル化された遊離ＧＯｘ及びＨＲＰの相対的活性変化を分析し、結果を図１０の（ｂ）に示す。触媒活性は、熱安定性を決定するために１０分ごとに測定された。遊離酵素の場合、相対的活性が～５％に減少した一方、カプセル化された酵素は、１時間培養後にも活性の６４％を示すことを確認した。

【0083】

３）リサイクル性の評価
５回の繰り返しサイクルの後、ＭＦＥｘ－ＧＯｘ－ＨＲＰシステムの相対活性変化を分析し、結果を図１０の（ｃ）に示す。ＦＥｘ－ＧＯｘ－ＨＲＰの初期活性は、５回の繰り返し実験後でも８９％以上維持されることを確認した。

【0084】

［実験例３］融合エクソソームにおける生体直交触媒の作用
３－１．融合エクソソームの区画化内の触媒機能の評価
区画化内の触媒機能を評価するために、図１１に示すように、細胞内のアリルカルバメート（ａｌｌｙｌｃａｒｂａｍａｔｅ）に捕捉された蛍光団から蛍光を生成するためのモデル生体直交反応によりパラジウム触媒脱アリル化を行った。実施例３によって製造されたＦＥｘ－Ｐｄ－ｐｒｏＲｈｏ内のＰｄ ＮＰは、ＩＣＰ－ＭＳで定量化した。Ｐｄ ＮＰの存在は、図１１の（ｂ）に示す高解像度ＴＥＭによって確認することができる。

【0085】

ナノリアクターの触媒特性は、蛍光計でモニタリングした蛍光生成物ローダミンの形成によって評価された。図１２に示すように、反応溶液の蛍光強度はＦＥｘ－Ｐｄ－ｐｒｏＲｈｏの場合、５２７ｎｍから時間の経過と共に増加したが、ＣＥｘ－ｐｒｏＲｈｏはほとんど変化がなかった。

【0086】

３－２．融合エクソソームの細胞内触媒作用
１）蛍光画像の確認
ＦＥｘ－Ｐｄ－ｐｒｏＲｈｏナノリアクター（３０μｇ／ｍＬ）をＭＣＦ－１０Ａ細胞と共に３７℃で２４時間培養して細胞内触媒実験を行った。ＭＣＦ－１０Ａ細胞のＣＬＳＭ画像は、ｐｒｏＲｈｏの蛍光性ローダミンへの触媒転換によって緑蛍光を示したが、ＣＥｘを用いた対照実験では蛍光信号が検出されなかった。

【0087】

２）前駆染料の活性化に対するフローサイトメトリーの分析
ＭＣＦ－１０Ａヒト乳房上皮細胞（１×１０^５ｃｅｌｌｓ）を６ウェルプレートに接種し、５％ウマ血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＃１６０５０－１２２）、２０ｎｇ／ｍＬ表皮成長因子（ＥＧＦ、ｃａｔ＃ ＡＦ－１００－１５、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、０．５ｍｇ／ｍＬヒドロコルチゾン（ｃａｔ＃ Ｈ０８８８、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、１０μｇ／ｍＬインスリン（ｃａｔ＃ Ｉ１８８２、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、及び１％抗生剤／抗真菌剤（１００Ｕ／ｍＬペニシリン及び１００ｍｇ／ｍＬストレプトマイシン）が補充されたＤＭＥＭで３７℃及び５％ＣＯ_２で培養した。２４時間後、上清を除去し、ＦＥＸ－Ｐｄ－ｐｒｏＲｈｏ（３０μｇ／ｍＬ）の懸濁液が含有された新鮮な培地と交換した。過剰なＦＥｘ－Ｐｄ－ｐｒｏＲｈｏを除去するために、２４時間培養した後にＰＢＳで洗浄した。セルをＰＢＳで洗浄した後、セルストリッパー液（Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）１００ｍＬ Ｃｅｌｌｓｔｒｉｐｅｒ^ＴＭ）で２０分間培養して分離した。その後、１２００ｒｐｍで３分間細胞を採取し、２％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を用いてＰＢＳでまた再懸濁させた。細胞は、ＦＳＣ ｘＶ、ＳＳＣ ｘＶ、ＦＩＴＣ ｘＶ、ＡＰＣ ｘＶ設定を用いてフローサイトメトリー測定（ＣｙｔｏＦＬＥＸ、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｌｉｆｅ）のために準備した。サンプル当たりに５０，０００個のイベントが記録された。使用された励起波長と放出波長は、それぞれローダミンの場合、５３０／３０ｎｍ ＦＩＴＣであった。データは、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＦｌｏｗＪｏ、ＬＬＣ）を用いて分析した。図示されてはいないが、フローサイトメトリー分析によって、蛍光強度信号が反応後に１００倍高いことが確認された。

【0088】

３）薬物伝達システム特性の評価
図１３の（ａ）に示すように、ＦＥｘ－Ｐｄ－ｐｒｏＦＵナノリアクターを用いたプロドラッグ（ｐｒｏ－ｄｒｕｇ）の薬物への転換特性を確認した。５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）の生体直交デマスキングのために、ＣＥｘ－Ｐｄとマスクされた不活性治療分子［５－ｆｌｕｏｒｏ－１－ｐｒｏｐａｒｇｙｌ ｕｒａｃｉｌ（ｐｒｏＦＵ）］－ｌｏａｄｅｄ ＣＥｘとの間の融合を行った。この薬物は、Ｎ１位置の機能化によって細胞毒性ヌクレオチド代謝産物を転換させた後、チミジレートシンターゼ（ｔｈｙｍｉｄｙｌａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ）を抑制し、ＲＮＡ及びＤＮＡ鎖に統合して細胞機能を妨害する役割をする。この薬物の細胞内機能／脱マスクを確認するために、ＦＥｘ－Ｐｄ－ｐｒｏＦＵと共に２４時間培養した後、ＭＣＦ－１０Ａ細胞に対してｌｉｖｅ／ｄｅａｄ細胞分析によって細胞毒性を評価した。その結果を図１３の（ｂ）に示す。ＦＥｘ－Ｐｄ－ｐｒｏＦＵと共に培養すると細胞生存率が２３％に低下する一方、ＣＥｘ細胞の場合には９１％が生存することを確認することができる。

【0089】

［実験例４］融合エクソソームのエネルギー生成の確認
実施例２によって製造された融合エクソソームＦＥｘ－１（ＡＴＰａｓｅ－ｂｏ３Ｏｘｉ－ＦＥｘ－Ｇｏｘ－ＨＲＰ）ナノリアクター、及び比較例２によって製造された酵素の直接組み込みによるエクソソームのＡＴＰ産生の有無を確認するために、ｐＨ変化及びＡＴＰ活性を測定した。

【0090】

４－１．ｐＨ変化
他の酵素（ＨＲＰ、ＧＯｘ、ＡＴＰ合成酵素及びｂｏ３オキシダーゼ）を含むＦＥｘ－１ナノリアクターをグルコースとＤＴＴで処理して酵素反応を開始させた。ＨＰＴＳをＦＥｘ－１にカプセル化して黒い９６ウェルプレートでタンパク質を最終濃度１３７μｇ／ｍＬに希釈した後、３０℃で５分間培養した。その後、４０μＭコエンザイムＱ１と２ｍＭのＤＴＴを加えた。ＤＴＴは、Ｑ１を還元してｂｏ３オキシダーゼに使用できるようにする。ＤＴＴ添加１分後、グルコース（３００ｎＭ）を反応混合物に添加した。蛍光スペクトルは、３８０±５～４８０±５ｎｍの励起、及び５１２±５ｎｍの放出で分光光度計（ＴＥＣＡＮ、Ｍｏｒｒｉｓｖｉｌｌｅ、ＮＣ、ＵＳＡ）を用いて、０分～９０分まで測定し、ｐＨは検量線から求めた。その結果を図９の（ａ）に示す。

【0091】

ｐＨ検出指示薬であるＨＰＴＳ（ｈｙｄｒｏｘｙｐｙｒｅｎｅ－１，３，６－ｔｒｉｓｕｌｐｈｏｎｉｃ ａｃｉｄ）の蛍光信号を測定してナノリアクター内部のプロトンの生成を確認した。グルコースの濃度を増加させると、ＦＥｘ－ＧＯｘ－ＨＲＰ及びＦＥｘ－１に対してナノリアクター内部の酸性化（ΔｐＨ－０．４）が観察されたが、膜貫通ｐＨ勾配は低かった。ＦＥｘ－１膜の組み立てられた電子伝達鎖の活性化は、還元したＤＴＴを添加することで引き起こされ、これは、補助酵素Ｑ１を還元してｂｏ３オキシダーゼ活性に用い、ｂｏ３オキシダーゼによって還元したＱ１（Ｑ１Ｈ）が酸化してプロトンを各融合した後、小胞でポンピングして９０分後にΔｐＨ＝－１．６になった。これは、ＡＴＰ合成を誘導するに十分なプロトン原動力（ＰＭＦ）を構築した。すなわち、融合エクソソームナノリアクターのｂｏ３オキシダーゼプロトンポンプの活性によって再構成されたタンパク質が完全な機能を行うことができることを確認した。

【0092】

４－２．ＡＴＰ活性
ＡＴＰ測定キットＡ２２０６６（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）プロトコールによって標準検量曲線を描いた。８．９ｍＬのＨ_２Ｏ、０．５ｍＬ反応緩衝液（５００ｍＭトリシン緩衝液（ｐＨ７．８）１００ｍＭ、ＭｇＳＯ_４、及び２ｍＭのＥＤＴＡ、２ｍＭのアジ化ナトリウム）を含む標準溶液、０．１Ｍ ＤＴＴ ０．５ｍＬ、１０ｍＭ Ｄ－ルシフェリン０．５ｍＬ及び５ｍｇ／ｍＬホタルルシフェラーゼ２．５μＬを準備した。合成されたＡＴＰがルシフェラーゼによってピロリン酸とアデノシン一リン酸に変換されると発光するため、分光光度計（ＴＥＣＡＮ、Ｍｏｒｒｉｓｖｉｌｌｅ、ＮＣ、ＵＳＡ）を用いて発光性を測定した。その結果を図９の（ｂ）に示す。グルコース又はＤＴＴのみ添加したＡＴＰ産生と比較して、グルコース－ＤＴＴ（１．３１±０．０５ＡＴＰμｍｏｌ／ｍｇ）を添加したＡＴＰ産生の場合、相対的に速く増加した。これに対し、グルコースとＤＴＴがないと、ＡＴＰ産生はほとんど検出されなかった。

【0093】

図１１は、比較例２によって製造された個別構成要素（ＧＯｘ、ＨＲＰ、ＡＴＰｓｙｎｔｈａｓｅ及びｂｏ３Ｏｘｉｄａｓｅ）をエクソソームに直接組み込んだ場合、及び実施例２によって製造された融合エクソソームのＡＴＰ産生を発光の程度で示す図である。酵素を直接カプセル化した場合よりも、本発明によって融合されたエクソソームでのＡＴＰ産生が顕著に増加したことが確認された。

【0094】

［実験例５］融合エクソソームのスフェロイド浸透効果の確認
５－１．融合エクソソームを含む低酸素症が誘導されたスフェロイドの準備
ＭＣＦ－１０Ａ（３０μＬ、１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）細胞懸濁液をペトリ皿に分注し、反転した状態で維持した。プレートの下部には蒸発を防止して湿度を維持するために１０ｍＬのＰＢＳが満たされた。２４時間ごとに培地を～５μＬずつ吸引し、１０μＬの新鮮な培地と交換してスフェロイドを培養した。ＦＥｘ－１ナノリアクター（２０６μｇ）を含む１０μＬの新鮮な細胞培地と交換し、２４時間後にスフェロイドをＰＢＳで洗浄した。その後、６００μＭのＡＤＰ及び５ｍＭのＭｇＣｌ_２を含む３０μＬの細胞培地を添加した後、６０μＭの補酵素Ｑ１及び３ｍＭのＤＴＴ（Ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ）を添加した。２４時間培養後、スフェロイドを３０μＭのＴＢＨＰ（ｔｅｒｔ－ｂｕｔｙｌ ｈｙｄｒｏｐｅｒｏｘｉｄｅ）で３時間処理し、低酸素症が誘導されたスフェロイドを製造した。

【0095】

５－２．ＡＴＰ活性の測定
ＡＴＰ産生は、ルシフェリン－ルシフェラーゼ（ｌｕｃｉｆｅｒｉｎ－ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）分析を用いて発光で測定された。標準検量曲線は、ＡＴＰの量を０～１０００ｎＭの範囲で変化させ、発光強度（ルシフェリンからオキシ－ルシフェリン）をモニタリングして得て、ＡＴＰ活性（％）は、正常条件で存在するＡＴＰの総量を基準として求めた。その結果を図１２に示す。低酸素条件ではＡＴＰ活性は１３倍ほど減少したが、ＦＥｘ－１ナノリアクターが内部化されたスフェロイドにグルコース－ＤＴＴを加えると、ＡＴＰ活性レベルは、低酸素症のない陽性対照群のレベルに近い８１．１±５．９％レベルに回復することが観察された。

【0096】

５－３．細胞生存率（Ｃｅｌｌ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）の測定
低酸素症を誘導した後、哺乳類細胞用ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ生存率／細胞毒性キット（ｃａｔ＃ Ｌ３２２４、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてスフェロイドの細胞生存率を測定した。ＰＢＳに８μＭのカルセイン－ＡＭ及び１６μＭのエチジウムホモダイマ－１を混合して入れ、低酸素症が誘導されたスフェロイドを含むハンギングドロップの体積の２５％をこの混合物で置き換えた。４５分間インキュベーションした後、スフェロイドを新鮮なＰＢＳで３回洗浄して過剰な染料を除去した。細胞生存率は、カルセイン－ＡＭ（λ_ｅｘ＝４９０ｎｍ及びλ_ｅｍ＝５２０ｎｍ）を用いて測定して図１３に示す。データは、ｎ＝３個の独立した実験の平均±ＳＤを示す。

【0097】

低酸素条件下では細胞生存率は６倍ほど減少したが、ＦＥｘ－１ナノリアクターが内部化されたスフェロイドにグルコース－ＤＴＴを加えると、細胞生存率は、低酸素症のない陽性対照群のレベルに近い９３．７±４．５％レベルに回復することが観察された。

【0098】

５－４．酸化ストレス（Ｒｅａｃｔｉｖｅ ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｓｔｒｅｓｓ、ＲＯＳ）レベルの測定
ＲＯＳを測定するための陽性及び陰性対照群の場合、スフェロイドをそれぞれ１時間の間３０μＭパラコート又は５０μＭグルタチオンで処理し、ＰＢＳで２回洗浄した後、スフェロイドを１００μＬジクロロジヒドロフルオレセイン二酢酸と共に３７℃で１時間インキュベーションした。その後、ＰＢＳで穏やかに洗浄し、４８５ｎｍでの励起及び５３５ｎｍでの放出によって、分光光度計（ＴＥＣＡＮ、Ｍｏｒｒｉｓｖｉｌｌｅ、ＮＣ、ＵＳＡ）を用いて蛍光強度を測定した。データは、ｎ＝３個の独立した実験の平均±ＳＤを示す。図１４に示すように、ＦＥｘ－１ナノリアクター及びグルコース－ＤＴＴで処理したとき、スフェロイドでＲＯＳが２倍ほど減少する結果により、本発明によるナノベシクルリアクターは、酸化ストレス除去効果を提供できることが確認された。

【0099】

これによって、本発明によるベシクルナノリアクターは、様々な疾患の条件下で観察される低酸素症による細胞損傷を低減でき、細胞の代謝活性を調節できることを確認した。また、スフェロイドコアまで深く浸透された結果から、本発明のナノベシクルリアクターは、組み込まれた酵素が浸出することなく、腫瘍の深部組織まで侵透することにより、生体触媒の性能を向上させることができることが予想される。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【国際調査報告】