特表 2024-522164 抗体－ＮＫＧ２Ｄリガンドドメイン融合タンパク質

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-06-11

(54)【発明の名称】抗体－ＮＫＧ２Ｄリガンドドメイン融合タンパク質

(51)【国際特許分類】

   C07K 19/00 20060101AFI20240604BHJP

   C07K 16/00 20060101ALI20240604BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20240604BHJP

   C12N 15/62 20060101ALI20240604BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20240604BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20240604BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20240604BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20240604BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20240604BHJP

   C12N 5/0786 20100101ALI20240604BHJP

   C12N 5/078 20100101ALI20240604BHJP

【ＦＩ】

C07K19/00

C07K16/00 ZNA

C12N15/13

C12N15/62 Z

C12N15/63 Z

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

C12N5/0786

C12N5/078

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023575496

(86)(22)【出願日】2022-06-07

(85)【翻訳文提出日】2023-12-06

(86)【国際出願番号】 US2022032539

(87)【国際公開番号】W WO2022261121

(87)【国際公開日】2022-12-15

(31)【優先権主張番号】63/208,407

(32)【優先日】2021-06-08

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＲＩＴＯＮ

(71)【出願人】

【識別番号】518455871

【氏名又は名称】サイフォス、バイオサイエンシズ、インコーポレイテッド

【氏名又は名称原語表記】ＸＹＰＨＯＳ ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥＳ ＩＮＣ．

(74)【代理人】

【識別番号】100136629

【弁理士】

【氏名又は名称】鎌田 光宜

(74)【代理人】

【識別番号】100080791

【弁理士】

【氏名又は名称】高島 一

(74)【代理人】

【識別番号】100125070

【弁理士】

【氏名又は名称】土井 京子

(74)【代理人】

【識別番号】100121212

【弁理士】

【氏名又は名称】田村 弥栄子

(74)【代理人】

【識別番号】100174296

【弁理士】

【氏名又は名称】當麻 博文

(74)【代理人】

【識別番号】100137729

【弁理士】

【氏名又は名称】赤井 厚子

(74)【代理人】

【識別番号】100152308

【弁理士】

【氏名又は名称】中 正道

(74)【代理人】

【識別番号】100201558

【弁理士】

【氏名又は名称】亀井 恵二郎

(72)【発明者】

【氏名】キム、カマン

(72)【発明者】

【氏名】ランドグラフ、カイル

【テーマコード（参考）】

4B065

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B065AA90X

4B065AA90Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA24

4B065CA25

4B065CA44

4H045AA11

4H045AA30

4H045BA10

4H045BA41

4H045CA50

4H045DA76

4H045FA74

(57)【要約】

本開示は、抗体融合タンパク質であって、（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含む可変領域配列を含む重鎖と、（ｉｉ）配列番号８のアミノ酸配列を含む可変領域配列を含む軽鎖であって、軽鎖が、配列番号１１のアミノ酸配列を含むＡ１－Ａ２ドメインにＣ末端で融合されている、軽鎖と、を含む、抗体融合タンパク質を提供する。抗体融合タンパク質の全部又は一部をコードする核酸、並びに、例えば、ＣＤ２０陽性がんの治療において、抗体融合タンパク質を使用する方法が提供される。本開示は、変異型Ａ１－Ａ２ドメインペプチドを更に提供する。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

抗体融合タンパク質であって、（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含む可変領域配列を含む重鎖と、（ｉｉ）配列番号８のアミノ酸配列を含む可変領域配列を含む軽鎖であって、前記軽鎖が、配列番号１１のアミノ酸配列を含むＡ１－Ａ２ドメインにＣ末端で融合されている、軽鎖と、を含む、抗体融合タンパク質。

【請求項2】

前記Ａ１－Ａ２ドメインが、配列番号１０のアミノ酸配列を含むリンカーを介して前記軽鎖に融合されている、請求項１に記載の抗体融合タンパク質。

【請求項3】

配列番号１３のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、請求項１又は請求項２に記載の抗体融合タンパク質。

【請求項4】

前記重鎖が、配列番号３のアミノ酸配列を含む定常ドメインを含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の抗体融合タンパク質。

【請求項5】

配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖を含む、請求項４に記載の抗体融合タンパク質。

【請求項6】

前記重鎖が、配列番号２のアミノ酸配列を含む定常ドメインを含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の抗体融合タンパク質。

【請求項7】

配列番号６のアミノ酸配列を含む重鎖を含む、請求項６に記載の抗体融合タンパク質。

【請求項8】

配列番号１３のアミノ酸配列を含む軽鎖と、配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖と、を含む、抗体融合タンパク質。

【請求項9】

配列番号１３のアミノ酸配列を含む軽鎖と、配列番号６のアミノ酸配列を含む重鎖と、を含む、抗体融合タンパク質。

【請求項10】

請求項１～９のいずれか一項に記載の抗体融合タンパク質の軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含む、核酸分子。

【請求項11】

請求項１０に記載の核酸分子と、請求項１～９のいずれか一項に記載の抗体融合タンパク質の重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子と、を含む、組成物。

【請求項12】

請求項１０に記載の核酸分子を含む、発現ベクター。

【請求項13】

請求項１～９のいずれか一項に記載の抗体融合タンパク質の重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を更に含む、請求項１２に記載の発現ベクター。

【請求項14】

請求項１２又は請求項１３に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。

【請求項15】

請求項１２に記載の発現ベクターと、請求項１～９のいずれか一項に記載の抗体融合タンパク質の重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を含む発現ベクターと、を含む、宿主細胞。

【請求項16】

抗体融合タンパク質を生成する方法であって、
請求項１～９のいずれか一項に記載の抗体融合タンパク質の軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子と、請求項１～９のいずれか一項に記載の抗体融合タンパク質の重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子と、を含む、宿主細胞を培養することと、
前記抗体融合タンパク質を回収することと、を含む、方法。

【請求項17】

請求項１～９のいずれか一項に記載の抗体融合タンパク質を含む１つ以上の容器と、使用説明書と、を含む、キット。

【請求項18】

配列番号１５を含むキメラ抗原受容体を含む哺乳動物細胞を含む１つ以上の容器を更に含む、請求項１７に記載のキット。

【請求項19】

前記哺乳動物細胞が、ヒトリンパ球又はヒトマクロファージである、請求項１８に記載のキット。

【請求項20】

前記キメラ抗原受容体が、配列番号１６～１８を更に含む、請求項１８又は請求項１９に記載のキット。

【請求項21】

ＣＤ２０陽性がんに罹患している対象を治療する方法であって、前記対象に、請求項１～９のいずれか一項に記載の抗体融合タンパク質と、配列番号１５を含むキメラ抗原受容体を含む哺乳動物細胞と、を投与することを含む、方法。

【請求項22】

前記哺乳動物細胞が、ヒトリンパ球又はヒトマクロファージである、請求項２１に記載の方法。

【請求項23】

前記キメラ抗原受容体が、配列番号１６～１８を更に含む、請求項２１又は請求項２２に記載の方法。

【請求項24】

配列番号３０に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、Ａ１－Ａ２ドメインペプチドであって、前記ペプチドが、配列番号３０の４０位、５４位、及び／又は８４位のうちの１つ以上にアラニン又はグルタミンを含む、Ａ１－Ａ２ドメインペプチド。

【請求項25】

前記ペプチドが、配列番号３０の４０位及び５４位にグルタミン残基を含む、請求項２４に記載のＡ１－Ａ２ドメインペプチド。

【請求項26】

前記ペプチドが、配列番号３０の８４位にグルタミンを含む、請求項２４又は請求項２５に記載のＡ１－Ａ２ドメイン。

【請求項27】

前記ペプチドが、配列番号３０の８４位にアラニンを含む、請求項２４又は請求項２５に記載のＡ１－Ａ２ドメイン。

【請求項28】

前記ペプチドが、配列番号１１、配列番号３１、又は配列番号３２を含む、請求項２４に記載のＡ１－Ａ２ドメインペプチド。

【請求項29】

抗体軽鎖に融合された、請求項２４～２８のいずれか一項に記載のＡ１－Ａ２ドメインペプチド。

【請求項30】

抗体重鎖に融合された、請求項２４～２８のいずれか一項に記載のＡ１－Ａ２ドメインペプチド。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、非天然ＮＫＧ２Ｄ受容体に結合する非天然ＮＫＧ２ＤリガンドのＡ１－Ａ２ドメイン、及びこのドメインを含む抗体融合タンパク質に関する。

【0002】

関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年６月８日に出願された米国仮特許出願第６３／２０８，４０７号の利益を主張するものであり、参照によりその内容全体が本明細書に完全に組み込まれる。

【0003】

電子的に提出された資料の参照による組み込み
本明細書と同時に提出され、以下のように識別されるコンピュータ読取可能なヌクレオチド／アミノ酸配列表が、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる：２０２２年６月７日に作成された「５６８６７＿Ｓｅｑｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ」という名称の６３，７２７バイトのＡＳＣＩＩ（テキスト）ファイル。

【背景技術】

【0004】

キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現させるための患者由来Ｔ細胞の操作は、養子細胞療法の情勢を変化させ、科学者及び臨床医に、Ｔ細胞の強力な細胞溶解能力を利用して、それらをＭＨＣ非依存的な様式で特定の抗原発現標的に誘導する能力を提供する。血液系腫瘍を治療するための初期適用は、驚くべき反応をもたらし、非血液学的適応症における効果的な使用を促進するための研究努力の急増をもたらした。しかしながら、ＣＡＲ－Ｔ細胞療法は、単一目的の標的化ドメインの利用、サイトカイン放出症候群に寄与し得る用量制御の欠如、疾患再発につながる腫瘍抗原喪失に対応することができないこと、及び持続性の欠如につながる非ヒト標的化ドメインの免疫原性によって制限される。当該技術分野には、現在の治療選択肢のこれらの限界に対応するために、改善されたＣＡＲベースの細胞療法の必要性が存在する。

【発明の概要】

【0005】

本開示は、抗体融合タンパク質であって、（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含む可変領域配列を含む重鎖と、（ｉｉ）配列番号８のアミノ酸配列を含む可変領域配列を含む軽鎖であって、軽鎖が、配列番号１１のアミノ酸配列を含むＡ１－Ａ２ドメインにＣ末端で融合されている、軽鎖と、を含む、抗体融合タンパク質を提供する。様々な態様において、重鎖は、配列番号３のアミノ酸配列を含む定常ドメインを含む。任意選択的に、Ａ１－Ａ２ドメインは、配列番号１０のアミノ酸配列を含むリンカーを介して軽鎖に融合されている。この点に関して、軽鎖は、様々な態様において、配列番号１３のアミノ酸配列を含む。様々な態様において、重鎖は、配列番号７のアミノ酸配列を含む。

【0006】

本開示は、抗体融合タンパク質の軽鎖（例えば、配列番号８のアミノ酸配列を含む可変領域配列を含む軽鎖であって、軽鎖が、配列番号１１のアミノ酸配列を含むＡ１－Ａ２ドメインにＣ末端で融合されている、軽鎖）をコードするヌクレオチド配列を含む、核酸分子を更に提供する。本開示は、抗体融合タンパク質の軽鎖をコードする核酸分子と、本明細書に記載の抗体融合タンパク質の重鎖（例えば、配列番号１のアミノ酸配列を含む可変領域配列を含む重鎖）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子と、を含む、組成物を更に提供する。また、本明細書に記載の抗体融合タンパク質の軽鎖をコードする核酸分子を含み、任意選択的に、本明細書に記載の抗体融合タンパク質の重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を更に含む、発現ベクターも提供される。本明細書に記載の発現ベクターを含む宿主細胞が更に提供される。本開示は、抗体融合タンパク質の軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子と、抗体融合タンパク質の重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子と、を含む、宿主細胞を提供する。抗体融合タンパク質を生成する方法であって、抗体融合タンパク質の軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子と、抗体融合タンパク質の重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子と、を含む、宿主細胞を培養することと、抗体融合タンパク質を回収することと、を含む、方法も提供される。

【0007】

また、本明細書に記載の抗体融合タンパク質を含む１つ以上の容器を含む、キットも提供される。任意選択的に、キットは、配列番号１５を含むキメラ抗原受容体を含む哺乳動物細胞（例えば、ヒトリンパ球又はヒトマクロファージ）を含む１つ以上の容器を更に含む。様々な態様において、キメラ抗原受容体は、配列番号１６～１８を更に含む。

【0008】

本開示は、ＣＤ２０陽性がんに罹患している対象を治療する方法であって、対象に、本明細書に記載の抗体融合タンパク質と、配列番号１５を含むキメラ抗原受容体を含む哺乳動物細胞（例えば、ヒトリンパ球又はヒトマクロファージ）と、を投与することを含む、方法を更に提供する。任意選択的に、キメラ抗原受容体は、配列番号１６～１８を更に含む。ＣＤ２０陽性がんを治療するための抗体融合タンパク質及び哺乳動物細胞の使用、並びにＣＤ２０陽性がんを治療するための薬物の調製における抗体融合タンパク質及び哺乳動物細胞の使用が提供される。

【0009】

本開示はまた、配列番号３０に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、Ａ１－Ａ２ドメインペプチドであって、ペプチドが、配列番号３０の４０位、５４位、及び／又は８４位のうちの１つ以上にアラニン又はグルタミンを含む、Ａ１－Ａ２ドメインペプチドも提供する。様々な態様において、ペプチドは、配列番号３０の４０位及び５４位にグルタミン残基を含む。任意選択的に、ペプチドは、配列番号３０の８４位にグルタミン、又は配列番号３０の８４位にアラニンを含む。

【0010】

本明細書の様々な実施形態は、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という文言を使用して提示されるが、様々な状況下で、関連する実施形態は、「～からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」又は「～から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」という文言を使用して説明され得ることも理解されたい。本開示は、特徴から「～からなる」又は「～から本質的になる」実施形態を含む特徴を「含む」として説明される実施形態を企図する。「ａ」又は「ａｎ」という用語は、１つ以上を指す。したがって、「ａ」（又は「ａｎ」）、「１つ以上」、及び「少なくとも１つ」という用語は、本明細書において互換的に使用され得る。「又は」という用語は、文脈が明確に別段の要求をしない限り、代替的に又は一緒に項目を包含すると理解されるべきである。

【0011】

本明細書における値の範囲の列挙は、本明細書において別段の指示がない限り、その範囲及び各エンドポイント内に属する各個別の値を個別に指す簡略的な方法としての役割を果たすことを意図しているに過ぎず、各個別の値及びエンドポイントは、それがあたかも本明細書に個別に列挙されているかのように本明細書に組み込まれる。しかしながら、説明はまた、より低い及び／又はより高いエンドポイントが除外されるのと同じ範囲を企図する。「約」という用語が使用される場合、それは、その列挙される数のプラス又はマイナス５％、１０％、又はそれ以上を意味する。意図される実際の変動は、文脈から決定される。

【0012】

本明細書に記載される全ての方法は、本明細書に別段の指示がない限り、又は文脈と明らかに矛盾しない限り、任意の好適な順序で行われ得る。本明細書に提供されるあらゆる例、又は例示的な文言（例えば、「等」）の使用は、本開示をより良く説明することを意図しているに過ぎず、別段に特許請求されない限り、本開示の範囲を限定するものではない。本明細書において本発明に重要であると記載されているそのような限定のみがそのようにみなされるべきであり、本明細書において重要であると記載されていない限定を欠く本発明の変形は、本発明の態様として意図される。

【0013】

本発明の追加の特徴及び変形例は、図面及び詳細な説明を含む本出願の全体から当業者に明白であり、全てのそのような特徴は本発明の態様として意図される。同様に、本明細書に記載の本発明の特徴は、特徴の組み合わせが本発明の態様又は実施形態として指定されるかどうかにかかわらず、再び組み合わせて追加の実施形態とすることができ、それらもまた本発明の態様として意図される。文書全体が統一された開示として関連していることが意図され、たとえ特徴の組み合わせが本文書の同じ文、又は段落、又は節内に一緒に見られない場合であっても、本明細書に記載される特徴の全ての組み合わせが（たとえ別々の節に記載されていても）企図されることを理解されたい。

【図面の簡単な説明】

【0014】

【図1】本明細書に記載の様々な配列を提供するチャートである。

【図2A】Ｈｉｓタグ付き単量体野生型ＭＩＣリガンドの、野生型ＮＫＧ２Ｄ又はｉＮＫＧ２Ｄ．ＹＡのいずれかとの相互作用についてのＯｃｔｅｔ ＢＬＩ動態的結合データを示す。Ｆｃ－ｗｔＮＫＧ２Ｄ又はＦｃ－ｉＮＫＧ２Ｄ．ＹＡを、ベースライン確立後に、各リガンドの希釈系列に関連する抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ捕捉（ＡＨＣ）バイオセンサー先端で捕捉した（括弧内の値は、調べた最高濃度を示す）。ＵＬＢＰ４は、単量体として発現及び精製することができなかったため、このアッセイには含まれなかった。全ての軸は同じスケールであることに留意されたい（結合－０ｎｍ、０．４ｎｍ、０．８ｎｍ、１．２ｎｍ（ｙ軸）；時間－０秒、５０秒、１００秒、１５０秒、２００秒、２５０秒、３００秒、３５０秒（ｘ軸））。データは、単一の実験からのものである。

【図2B】ｉＮＫＧ２Ｄ．ＹＡが天然リガンドと関与することができないことを裏付けるＥＬＩＳＡの結果を示す。リガンド－Ｆｃ融合物（Ｒ＆Ｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）をマイクロタイタープレート上にコーティングし、ビオチン化Ｆｃ－ｗｔＮＫＧ２Ｄ（破線）又はＦｃ－ｉＮＫＧ２Ｄ．ＹＡ（実線）の滴定を適用し、ストレプトアビジン－ＨＲＰによって検出した。（ＥＬＩＳＡシグナル（ＯＤ４５０）（ｙ軸）；ｎＭリガンドＦｃ（ｘ軸）。）

【図3A-3D】ＮＫＧ２Ｄ Ｙ１５２Ａ／１９９Ｆ（ｉＮＫＧ２Ｄ．ＡＦ）（本開示のＮＫＧ２Ｄ外部ドメイン）への直交Ｕ２Ｓ３リガンド（Ａ１－Ａ２ドメイン）の選択的結合。濃度を増加させたＦｃ－ｗｔＮＫＧ２Ｄ競合物質に対する選択ラウンド中に、ビオチン化二重変異型Ｆｃ－ｉＮＫＧ２Ｄ．ＡＦを使用したことを除いて、実施したライブラリー設計及びファージパニングは、ｉＮＫＧ２Ｄ．ＹＡについて記載したとおりであった。データは、Ｆｃ－ｗｔＮＫＧ２Ｄ又はＦｃ－ｉＮＫＧ２Ｄ．ＡＦのいずれかに対する単量体リガンドの相互作用についての単一の実験（図３Ａ）のＯｃｔｅｔ ＢＬＩ結合データを表す。データは、２つの実験からのものである。（図３Ｂ）ファージディスプレイライブラリーから選択されたリードバリアントを、リツキシマブ軽鎖のＣ末端への融合物としてクローニングし、Ｆｃ－ｗｔＮＫＧ２Ｄ、Ｆｃ－ｉＮＫＧ２Ｄ．ＹＡ、及びＦｃ－ｉＮＫＧ２Ｄ．ＡＦに差次的に結合させ、ＥＬＩＳＡによって定量した。示されるのは、他の２つの受容体ではなく、Ｆｃ－ｉＮＫＧ２Ｄ．ＹＡと選択的に関与する４つのバリアントである。図３Ｂの折れ線グラフでは、ｗｔＮＫＧ２Ｄは菱形で表され、ｉＮＫＧ２Ｄは正方形で表され、ｉＮＫＧ２Ｄ．ＡＦは三角形で表される。（図３Ｃ）選択された受容体バリアント（それぞれ、Ｆｃ－ｉＮＫＧ２Ｄ．ＹＡ及びＦｃ－ｉＮＫＧ２Ｄ．ＡＦ）へのＵ２Ｓ３及びＵ２Ｒリガンド結合の排他性を示すＥＬＩＳＡ。Ｕ２Ｓ３リガンドは、例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許公開第２０１９／０３００５９４号に更に記載されている。（図３Ｄ）ｉＮＫＧ２Ｄ．ＹＡ－ＣＡＲ又はｉＮＫＧ２Ｄ．ＡＦ－ＣＡＲのいずれかを発現するＣＤ８＋Ｔ細胞と、２０：１のエフェクター：標的比（Ｅ：Ｔ）でＲａｍｏｓ標的細胞を用いたカルセイン放出アッセイ、及びリツキシマブＬＣ－Ｕ２Ｓ３又はリツキシマブＬＣ－Ｕ２Ｒの滴定。エラーバーは、技術的反復の±ＳＤを表す。

【図4A】濃度を増加させたｗｔＮＫＧ２Ｄ競合物質の存在下での第３及び第４ラウンドのパンニング後の、選択されたファージのＦｃ－ｉＮＫＧ２Ｄ．ＹＡ及びＦｃ－ｗｔＮＫＧ２Ｄへの相対的結合。三角形で囲まれたグラフの一部におけるファージクローンを、更なる特徴付けのために選択した。

【図4B】３つのファージバリアント－Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３－を、ＭｉｃＡｂｏｄｙとして抗ＦＧＦＲ３抗体クローンＲ３Ｍａｂ重鎖のＣ末端への融合物として発現させ、野生型ＵＬＢＰ２及びＲ８１Ｗバージョンとともに、選択的バリアントがＦｃ－ｉＮＫＧ２Ｄ．ＹＡ結合（実線）をＦｃ－ｗｔＮＫＧ２Ｄ（破線）よりも優先的に保持する能力について試験した。全ての精製されたＭｉｃＡｂｏｄｙは、ヒトＦＧＦＲ３への結合を保持した（データは図示せず）。

【図4C】Ｈｉｓタグ付き単量体野生型ＵＬＢＰ２、ＵＬＢＰ２ Ｒ８１Ｗ、並びにＦｃ－ＮＫＧ２Ｄ及びＦｃ－ｉＮＫＧ２Ｄ．ＹＡへの直交Ｕ２Ｓ３リガンド結合の結合解析。Ｆｃ－ｗｔＮＫＧ２Ｄ又はＦｃ－ｉＮＫＧ２Ｄ．ＹＡを、抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ捕捉（ＡＨＣ）バイオセンサー先端で捕捉し、次いで、リガンドの希釈系列と関連付けた。データは、単一の実験からのものである。

【図5】リツキシマブの重鎖又は軽鎖のいずれかのＣ末端に融合された場合のＵ２Ｓ３直交性のＯｃｔｅｔ ＢＬＩによる検証。Ｆｃ－ｗｔＮＫＧ２Ｄ又はＦｃ－ｉＮＫＧ２Ｄ．ＹＡを、抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ捕捉（ＡＨＣ）バイオセンサー先端で捕捉し、次いで、５０ｎＭから始まるＭｉｃＡｂｏｄｙの２倍希釈系列と関連付けた。結合応答に対応するｙ軸を、全てのセンサグラムについて同じスケールに設定した。Ｋｄ値は、示される２つの正の結合相互作用についてのみ計算することができた。

【図6】左側のポリペプチドのＮ末端から始まるｉＮＫＧ２Ｄ．ＹＡＣＡＲ受容体の概略図であり、成熟したＩ型膜貫通タンパク質には存在しないシグナル配列（ＳＳ）を含む。下線付き配列は、シグナル配列に対応し、イタリック体の配列は、ｉＮＫＧ２Ｄドメイン（配列番号１５）に対応し、特別な表示のない配列は、ＣＤ８ａヒンジ／膜貫通ドメイン（配列番号１６）に対応し、下線付きのイタリック体の配列は、４－１ＢＢドメイン（配列番号１７）に対応し、太字の配列は、ＣＤ３ζドメイン（配列番号１８）に対応し、二重下線付き配列は、リンカーに対応し、点線の下線付き配列は、ｅＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）配列に対応する。

【図7A-7C】ｃｏｎｖｅｒｔｉｂｌｅＣＡＲの要素。（図７Ａ）ＮＫＧ２Ｄ－ＭＩＣ軸の構成要素をｃｏｎｖｅｒｔｉｂｌｅＣＡＲシステムに変換するための操作の概要。ｉＮＫＧ２Ｄ．ＹＡ及びＵ２Ｓ３は、それぞれ第２世代ＣＡＲ受容体及び二重特異性アダプター分子（ＭｉｃＡｂｏｄｙ）の構成要素になった。「ＴＡＡ」は、腫瘍関連抗原である。（図７Ｂ）ＣＤ４又はＣＤ８細胞のいずれかへのｉＮＫＧ２Ｄ．ＹＡ－ＣＡＲの高効率レンチウイルス形質導入の代表的な例。形質導入効率はドナー間で異なっていたが、＞７０％のＧＦＰ＋収率が一貫して達成された。比較のためにＲＩＴｓｃＦｖ－ＣＡＲを示しており、ｉＮＫＧ２Ｄ．ＹＡの代わりにリツキシマブのＶＨ／ＶＬドメインに基づくｓｃＦｖが使用されたことを除いて、ｉＮＫＧ２Ｄ－ＣＡＲと同じアーキテクチャを有する。（図７Ｃ）細胞をリツキシマブ．ＬＣ－Ｕ２Ｓ３ ＭｉｃＡｂｏｄｙとともにインキュベートし、続いてＰＥコンジュゲートマウス－抗ヒトカッパ鎖抗体染色することによって、ｉＮＫＧ２Ｄ．ＹＡ－ＣＡＲの表面発現をＣＤ８＋Ｔ細胞において決定した。比較のために、非形質導入Ｔ細胞を示す。

【図8A-8C】ｉＮＫＧ２Ｄ－ＣＡＲを発現するＣＤ８＋Ｔ細胞のリガンド依存的活性化及びＭｉｃＡｂｏｄｙ依存性の受容体内在化。（図８Ａ）ＣＤ８＋Ｔ細胞を、受容体ドメインとして野生型ＮＫＧ２Ｄ又はｉＮＫＧ２Ｄ．ＹＡのいずれかからなるＣＡＲ構築物で形質導入した。野生型Ｈｉｓタグ付き単量体リガンド又はＨｉｓタグ付き単量体Ｕ２Ｓ３を、１０ｕｇ／ｍＬから始まる１：３の希釈系列でマイクロタイタープレートのウェルにコーティングした。１×１０^５ＣＡＲ発現細胞を、外因性ＩＬ２なしで１５０ｕＬの体積でウェルに導入し、２４時間後に上清を収集し、産生及び放出されたサイトカインの量をサイトカイン特異的ＥＬＩＳＡによって定量した。Ｈｉｓタグ付きバージョンは発現及び精製できなかったため、ＵＬＢＰ４はアッセイに含まれなかった。（図８Ｂ）ｉＮＫＧ２Ｄ－ＣＡＲ又はＲＩＴｓｃＦｖ－ＣＡＲのいずれかを発現するＣＤ８＋細胞を、ｉＮＫＧ２Ｄ－ＣＡＲ細胞の場合にはＲｉｔ－Ｓ３ ＭｉｃＡｂｏｄｙ（ｎＭ）の濃度を増加させながら、４：１のＥ：ＴでＲａｍｏｓ細胞と共培養した。２４時間後、培養上清を採取し、放出されたサイトカインをＥＬＩＳＡによって定量した。細胞溶解を、２時間の共インキュベーション後のカルセイン放出によって測定した。全てのエラーバーは技術的３連測定の±ＳＤである。全てのデータは、単一の実験からのものである。（図８Ｃ）ｉＮＫＧ２Ｄ－ＣＤ８＋細胞を５ｎＭのトラスツズマブ．ＬＣ－Ｕ２Ｓ３ ＭｉｃＡｂｏｄｙとともにプレインキュベートし、次いでＨｅｒ２の滴定によりプレコーティングされたウェルに曝露した。２時間後、表面にアクセス可能なＭｉｃＡｂｏｄｙを検出するために、細胞を抗カッパ－ＰＥ抗体とともにインキュベートし、発現したｉＮＫＧ２Ｄ－ＣＡＲの総レベルを求めるためにＧＦＰを調べた。

【図9A-9D】ｃｏｎｖｅｒｔｉｂｌｅＣＡＲ活性のインビトロでの特徴付け。（図９Ａ）Ｒａｍｏｓ（ＣＤ２０＋）標的細胞を５：１のＥ：ＴでｃｏｎｖｅｒｔｉｂｌｅＣＡＲ－ＣＤ８細胞に曝露し、濃度を増加させたリツキシマブ抗体（ＡＤＣＣ欠損）、リツキシマブ．ＬＣ－Ｕ２Ｓ３ ＭｉｃＡｂｏｄｙ、又はトラスツズマブ．ＬＣ－Ｕ２Ｓ３ ＭｉｃＡｂｏｄｙと共培養した。２４時間後、上清を採取し、ＩＬ－２（塗りつぶされたバー）又はＩＦＮγ（斜線付きバー）をＥＬＩＳＡによって定量した。Ｒｉｔ－Ｕ２Ｓ３は、５０００ｐｇ／ｍＬ以上でサイトカイン放出を示した唯一の試料であった。（図９Ｂ）ＣｏｎｖｅｒｔｉｂｌｅＣＡＲ－ＣＤ８細胞を、濃度を増加させたＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７コンジュゲート型Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ．ＬＣ－Ｕ２Ｓ３とともに３０分間インキュベートし、過剰分を洗い流し、ＭＦＩをフローサイトメトリーによって定量した。５ｎＭは、受容体が最大限占有される変曲点を示す。（図９Ｃ）ＣｏｎｖｅｒｔｉｂｌｅＣＡＲ－ＣＤ８細胞を、（Ｂ）に記載されるように濃度を増加させたリツキシマブ．ＬＣ－Ｕ２Ｓ３で武装し、次いで、２０：１のＥ：Ｔのカルセインを添加したＲａｍｏｓ細胞と２時間共インキュベートし、その後、放出されたカルセインの量を定量した。（図９Ｄ）ｉＮＫＧ２Ｄ．ＹＡ－ＣＡＲ ＣＤ８＋細胞を、（Ｂ）に記載されているように、５ｎＭのリツキシマブ．ＬＣ－Ｕ２Ｓ３、５ｎＭのトラスツズマブ．ＬＣ－Ｕ２Ｓ３、又は各々２．５ｎＭの等モル混合物で予め武装し、次いで、カルセインを添加したＲａｍｏｓ細胞又はＣＴ２６－Ｈｅｒ２細胞に、示される２つのＥ：Ｔ比で曝露した。放出されたカルセインの量を２時間後に定量した。図９Ｂを除いて、データは、少なくとも２つの独立した実験からのものであり、技術的３連測定の平均としてプロットされる。

【図10A-10C】重鎖対軽鎖Ｕ２Ｓ３融合物とリツキシマブ（ＡＤＣＣ－）抗体との比較。（図１０Ａ）ヒトＴ細胞又は腫瘍の非存在下でのＮＳＧマウスにおける１００ｕｇの静脈内投与後の血清リツキシマブ－Ｕ２Ｓ３ ＭｉｃＡｂｏｄｙレベルの薬物動態。使用した全てのＭｉｃＡｂｏｄｙ及び抗体対照は、ＡＤＣＣ欠損であった。左側のグラフは、軽鎖Ｕ２Ｓ３融合物と親抗体との比較であり、右側のグラフは、重鎖Ｕ２Ｓ３融合物と親抗体との比較である。全てのエラーバーは技術的３連測定の±ＳＤである。（図１０Ｂ）ｉＮＫＧ２Ｄ－ＣＡＲ ＣＤ８＋Ｔ細胞をＲａｍｏｓ標的細胞と２０：１のＥ：Ｔで２時間共培養し、リツキシマブ－ＭｉｃＡｂｏｄｙを滴定した後の、インビトロカルセイン放出アッセイ。エラーバーは、実験の±ＳＤを表し、データは、複数の実験からのものである。グラフ内の上の線はＲｉｔｕｘｕｍａｂ．ＬＣ－Ｕ２Ｓ３に対応し、中央の線はＲｉｔｕｘｕｍａｂ．ＨＣ－Ｕ２Ｓ３に対応し、下の線はＲｉｔｕｘｉｍａｂに対応する。（図１０Ｃ）マウスＮＫＧ２ＤへのリツキシマブＬＣ－Ｕ２Ｓ３の結合を示すＥＬＩＳＡ。Ａ４８０の吸光度値が示されている。マウスＮＫＧ２Ｄに自然に結合するマウス野生型Ｒａｅ１ｂリガンドを有するＴｒａｓｔｕｚｕｍａｂ．ＬＣ－Ｒａｅ１ｂを陽性対照として含めた。

【図11A-11E】ＮＳＧマウスにおける播種性Ｒａｊｉ Ｂ細胞リンパ腫の制御。（図１１Ａ）各コホートの平均発光出力±ＳＤと、（図１１Ｂ）５×１０^６又は（図１１Ｃ）１５×１０^６個の総Ｔ細胞を与えた群の個々の動物のトレースとを含む。（図１１Ｄ）血液中のヒトＣＤ３＋細胞及び（図１１Ｅ）抗Ｆ（ａｂ’）２によって検出された結合ＭｉｃＡｂｏｄｙを調べる試験の過程にわたるＴ細胞動態。示されるのは、コホート平均±ＳＤであり、ｎ＝５である。

【図12A-12C】ｃｏｎｖｅｒｔｉｂｌｅＣＡＲ－Ｔ細胞による、ＮＳＧマウスに皮下移植されたＲａｊｉ腫瘍の制御。（図１２Ａ）各コホートの平均腫瘍体積、ｎ＝５。腫瘍は、各群内でサイズが大きく異なるため、エラーバーはグラフに示さなかった。逆三角形（７ＭのｃＣＡＲ－Ｔ＋６０ｕｇのＲｉｔｕｘ－Ｓ３）及び正方形（３５ｍの予め武装したｃＣＡＲ－Ｔ）の２つのコホートは、重複しており、２６日目を超えるとグラフで区別することができない。（図１２Ｂ）移植後１４日、２１日、及び４５日の血清Ｒｉｔ－Ｓ３レベルを示す棒グラフ。各時点に、３５Ｍの予め武装したｃＣＡＲ－Ｔ（左側のバー）、７ＭのｃＣＡＲ－Ｔ＋６０ｕｇのＲｉｔｕｘ－Ｓ３（中央のバー）、及び３５ＭのｃＣＡＲ－Ｔ＋６０ｕｇのＲｉｔｕｘ－Ｓ３（右側のバー）の３つのバーが提供される。エラーバーは、所与のコホートにおけるマウス由来の±ＳＤ試料を示した。（図１２Ｃ）血液中のＣＤ３＋Ｔ細胞動態、及び表面関連ＭｉｃＡｂｏｄｙＦ（ａｂ’）２染色によるＴ細胞のパーセンテージの定量を、±ＳＤエラーバーとともに示す。

【図13A-13F】ｉＮＫＧ２Ｄ．ＡＦ－ＣＡＲ細胞に対する補体因子Ｃ１ｑの標的化された動員により、それらの補体媒介性消耗が誘導される。（図１３Ａ）Ｎ末端又はＣ末端融合物のいずれかとして発現するヒトＩｇＧのＦｃ部分に対する直交リガンド融合物の構造。野生型Ｆｃに加えて、Ｃ１ｑ結合を増強するＣＨ２ドメインにおける２セットの変異、Ｓ２６７Ｅ／Ｈ２６８Ｆ／Ｓ３２４Ｔ／Ｇ２３６Ａ／Ｉ３３２Ｅ（「ＥＦＴＡＥ」）及びＫ３２６Ａ／Ｅ３３３Ａ（「ＡＡ」）を独立して探索した。（図１３Ｂ）各精製融合タンパク質へのヒトＣ１ｑの結合を調べるＥＬＩＳＡ。Ｋｄのランク順序は、融合の方向に関係なく、ＥＦＴＡＥ＜ＡＡ＜ｗｔ（それぞれ０．１２、０．３５、及び０．６７ｎＭ）であった。（図１３Ｃ及び１３Ｄ）Ｃ１ｑ結合に関する補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）アッセイはＦｃ融合を増強する。ｉＮＫＧ２Ｄ．ＡＦ－ＣＡＲ又は非形質導入ＣＤ８＋Ｔ細胞を、各融合分子及び１０％正常ヒト血清補体を滴定しながら３時間インキュベートした後、死滅したＴ細胞をＳＹＴＯＸ Ｒｅｄを用いて列挙した。（図１３Ｅ及び１３Ｆ）上記（図１３Ｃ）に記載されるように、ｉＮＫＧ２Ｄ．ＹＡ－ＣＡＲ細胞に補体を誘導するためのＵ２Ｓ３直交リガンド融合を用いたＣＤＣアッセイ。全てのエラーバーは、別々の実験として実施されたｉＮＫＧ２Ｄ－ＡＦ及びｉＮＫＧ２Ｄ－ＹＡを用いた３連の技術的測定の±ＳＤである。

【図14A-14E】ｉＮＫＧ２Ｄ－ＣＡＲ ＣＤ８＋Ｔ細胞への変異型ＩＬ２サイトカインの標的化送達。（図１４Ａ）３０ＩＵｅ／ｍＬのサイトカイン又はサイトカイン－Ｕ２Ｓ２融合物によるｗｔＮＫＧ２Ｄ－ＣＡＲ（左バー）又はｉＮＫＧ２Ｄ．ＹＡ－ＣＡＲ（右バー）の処理の３日間後のインビトロ増殖。濃い影は、選択性を強調するためのものである。（図１４Ｂ）低効率（４５％ＧＦＰ＋）のｉＮＫＧ２Ｄ．ＹＡ－ＣＡＲ形質導入物を、３０ＩＵｅ／ｍＬの非選択的（Ｕ２Ｒ８１Ｗ）又はｉＮＫＧ２Ｄ．ＹＡ選択的（Ｕ２Ｓ２）ｍｕｔＩＬ２融合物とともに培養し、７日間維持した。フローサイトメトリーによって細胞を定期的に調べて、各集団におけるＧＦＰ＋細胞のパーセントを定量した。上の線は、Ｕ２Ｓ２－ｈＦｃ－ｍｕｔｌＬ２（正方形）及びＵ２Ｓ２－ｍｕｔｌＬ２（円）に対応し、下の線は、Ｕ２Ｒ８０Ｗ－ｍｕｔｌＬ２（円）及びＵ２Ｒ８０Ｗ－ｈＦｃ－ｍｕｔｌＬ２（正方形）に対応する。（図１４Ｃ）ｉＮＫＧ２Ｄ－ＣＡＲ ＣＤ８＋Ｔ細胞を、３０ＩＵｅ／ｍＬの野生型ＩＬ－２又はＵ２Ｓ３－ｈＦｃ－ｍｕｔＩＬ２のいずれかとともに培養し、次いで、リツキシマブＬＣ－Ｕ２Ｓ３の濃度を増加させながら、２０：１のＥ：ＴでＲａｍｏｓ細胞と共培養した。遊離カルセインを定量し、非形質導入ＣＤ８＋細胞を、陰性対照として機能したｒｈＩＬ－２に維持した。（図１４Ｄ）非形質導入（右側のバー）又はｉＮＫＧ２Ｄ－ＣＡＲ ＣＡＲ ＣＤ８＋Ｔ細胞（左側のバー）を様々なサイトカイン分子とともに３日間インキュベートし、増殖を定量した。対照分子は、単量体Ｕ２Ｓ３－ｈＦｃ、及びＲｉｔ－Ｓ３ ＭｉｃＡｂｏｄｙを含んでいた。括弧内の値は、試験したＩＵｅ／ｍＬ濃度である。示されるデータは、技術的３連測定の平均である。（図１４Ｅ）ＮＳＧマウスにおける６０ｕｇのＩＰ注射後のＵ２Ｓ３－ｈＦｃ－ｍｕｔＩＬ２の血清ＰＫ（Ｎ＝３）。全てのエラーバーは、生物学的３連測定の±ＳＤである。データは、少なくとも２つの実験からのものである。

【図15A-15B】Ｕ２Ｓ３－ｈＦｃ－ｍｕｔＩＬ２に対するｃｏｎｖｅｒｔｉｂｌｅＣＡＲ－Ｔ細胞のインビボ応答。（図１５Ａ）ＮＳＧマウスに、合計７×１０^６個のｉＮＫＧ２Ｄ形質導入細胞（ＣＤ４：ＣＤ８ １：１）を注射した。１４日目のＴ細胞の収縮後、マウスに３０ｕｇのＵ２Ｓ３－ｈＦｃ－ｍｕｔＩＬ２又はＰＢＳを週に１回注射し（三角形で示される）、Ｔ細胞動態をフローサイトメトリーによってモニターした。末梢血中のヒトＣＤ３＋Ｔ細胞の％を示し、各トレースは個々のマウスに対応し、ｎ＝５である。（図１５Ｂ）ＣＤ８＋細胞の増殖、及びＵ２Ｓ３－ｍｕｔＩＬ２処理時のＧＦＰ＋（ＣＡＲ発現）細胞の割合の増加のプロット。上の線のクラスターは、ＣＤ８＋細胞の％ＧＦＰ＋に対応し、下の線のクラスターは、血液中の％ＣＤ８＋に対応する。

【図16】Ｕ２Ｓ３－ｈＦｃ－ｍｕｔＩＬ２に対するヒトＰＢＭＣの応答性。３人のドナーからのヒトＰＢＭＣを、対照とともに、４日間、濃度を増加させたＵ２Ｓ３－ｈＦｃ－ｍｕｔＩＬ２又はＵ２Ｓ３－ｈＦｃ－ｗｔＩＬ２とともにインキュベートした。各条件下で増殖応答を定量するために、標識した細胞型の各々をマーカーＫｉ－６７について調べた。ドナー１、２、及び３の各々について１１のバーが示されており、バーは、各パネルの左から右へ、未処理の抗ＣＤ３［２ｕｇ／ｍｌ］、ＩＬ－２［３００ＩＵｅ／ｍｌ］、ｍｕｔＩＬ２［３０ＩＵｅ／ｍｌ］、ｍｕｔＩＬ２［３００ＩＵｅ／ｍｌ］、ｍｕｔＩＬ２［３０００ＩＵｅ／ｍｌ］、ｍｕｔＩＬ２［３００００ＩＵｅ／ｍｌ］、ｗｔＩＬ２［３０ＩＵｅ／ｍｌ］、ｗｔＩＬ２［３００ＩＵｅ／ｍｌ］、ｗｔＩＬ２［３０００ＩＵｅ／ｍｌ］、及びｗｔＩＬ２［３００００ＩＵｅ／ｍｌ］を表す。エラーバーは３連測定の±ＳＤであり、データは単一の実験を表す。

【図17A-17B】異なる位置に結合され、異なるリンカーを使用するＡ１－Ａ２ドメインを有するＭｉｃＡｂｏｄｙを評価する試験を示す。図１７Ａは、試験した構築物を示す。Ｒｉｔ．ＨＣｄ．Ｓ３は、ＧＧＧＳ（配列番号１４）リンカーを介して重鎖に融合された実施例に記載されている、Ｕ２Ｓ３ Ａ１－Ａ２ドメインを含むリツキシマブ抗体に対応する。Ｒｉｔ．ＨＣｄ．ａｐｔｓ．Ｓ３は、ＡＰＴＳＳＳＧＧＧＧＳ（配列番号１０）リンカーを介して重鎖に融合されたＵ２Ｓ３ Ａ１－Ａ２ドメインを含むリツキシマブ抗体に対応する。Ｒｉｔ．ＨＣｄ．ＬＣ．Ｓ３は、ＡＰＴＳＳＳＧＧＧＧＳ（配列番号１０）リンカーを介して軽鎖に融合されたＵ２Ｓ３ Ａ１－Ａ２ドメインを含むリツキシマブ抗体に対応する。Ｒｉｔ．ＨＣｄ．ＬＣ．ｇｇｇｓ．Ｓ３は、ＧＧＧＳ（配列番号１４）リンカーを介して軽鎖に融合されたＵ２Ｓ３ Ａ１－Ａ２ドメインを含むリツキシマブ抗体に対応する。図１７Ｂは、２０：１のＥ：ＴでｉＮＫＧ２Ｄ－ＣＡＲ ＣＤ８＋Ｔ細胞をＲａｍｏｓ標的細胞と２時間共培養し、リツキシマブ－ＭｉｃＡｂｏｄｙを滴定した後のインビトロカルセイン放出アッセイにおいて、様々な濃度のＭｉｃＡｂｏｄｙを使用して達成された細胞溶解（最大％；ｙ軸）を示す棒グラフである。各構築物について、０ｎＭ（１番目の棒）、０．００８ｎＭ（２番目の棒）、０．０４ｎＭ（３番目の棒）、０．２ｎＭ（４番目の棒）、１ｎＭ（５番目の棒）、及び５ｎＭ（６番目の棒）のＭｉｃＡｂｏｄｙについて、細胞溶解の最大％を示す。Ｒｉｔ．ＨＣｄ．ＬＣ．Ｓ３（ＡＰＴＳＳＳＧＧＧＧＳ（配列番号１０）リンカーによって連結された軽鎖上のＡ１－Ａ２ドメインを含む）は、ＧＧＧＳ（配列番号１４）リンカーを有するバージョンよりも優れており、リンカーにかかわらず、重鎖に融合されたＡ１－Ａ２ドメインを有する構築物よりも優れていた。

【図18】抗体の軽鎖に融合された配列番号３０（Ｕ２Ｓ３）又は配列番号１１（Ｕ２Ｓ３（ＮＱ））のＡ１－Ａ２ドメインを含むリツキシマブ融合タンパク質を使用したｉＮＫＧ２Ｄ．ＹＡ捕捉を示す折れ線グラフである。配列番号３０に関して４０位及び５４位に置換を有するＡ１－Ａ２ドメインは、配列番号３０のＡ１－Ａ２ドメインと同様の性能を示した。

【図19】抗体の軽鎖に融合された配列番号３０（Ｕ２Ｓ３）又は配列番号１１（Ｕ２Ｓ３（ＮＱ））のＡ１－Ａ２ドメインを含むリツキシマブ（「Ｒｉｔ」）融合タンパク質が野生型ＮＫＧ２Ｄに結合する能力の低下を示す折れ線グラフ。「Ｒｉｔ．Ｐ」は、Ａ１－Ａ２ドメインに融合されなかったリツキシマブ親抗体に言及する。「Ｒｉｔ．Ｕ２ｗｔ」は、野生型ＮＫＧ２Ｄに結合することが予想される、野生型ＵＬＢＰ２ドメインに融合されたリツキシマブに言及する。「Ｒｉｔ．Ｓ３」及び「Ｔｒａｓｔ．Ｓ３」は、それぞれ、Ｕ２Ｓ３ドメイン（配列番号３０）に融合されたリツキシマブ又はトラスツズマブに言及する。「Ｒｉｔ．ＮＱ」は、Ｕ２Ｓ３（ＮＱ）に融合されたリツキシマブ（配列番号１１）を参照する。Ｕ２Ｓ３ドメインへのＮＱ変異の導入は、構築物の直交性に影響を及ぼさず、野生型ＮＫＧ２Ｄへの結合に関して復帰はなかった（すなわち、構築物は、野生型ＮＫＧ２Ｄに結合しなかった）。

【図20】２０：１のＥ：ＴでｉＮＫＧ２Ｄ－ＣＡＲ ＣＤ８＋Ｔ細胞をＲａｍｏｓ標的細胞と２時間共培養し、リツキシマブ－ＭｉｃＡｂｏｄｙを滴定した後のインビトロカルセイン放出アッセイにおいて、様々な濃度のＭｉｃＡｂｏｄｙを使用して達成された細胞溶解（最大％；ｙ軸）を示す棒グラフである。各構築物について、０ｎＭ（１番目の棒）、０．００８ｎＭ（２番目の棒）、０．０４ｎＭ（３番目の棒）、０．２ｎＭ（４番目の棒）、１ｎＭ（５番目の棒）、及び５ｎＭ（６番目の棒）のＭｉｃＡｂｏｄｙについて、細胞溶解の最大％を示す。Ｒｉｔ．Ｓ３（配列番号３０のＡ１－Ａ２ドメインを含む）、Ｒｉｔ．Ｓ３．ＮＱ（４０位及び５４位にグルタミンを含む配列番号３０のＡ１－Ａ２ドメインを含む）、Ｒｉｔ．Ｓ３．ＮＱ．ＡＹＴ（４０位及び５４位にグルタミンを含み、８２位にアラニンを含む、配列番号３０のＡ１－Ａ２ドメインを含む）、及びＲｉｔ．Ｓ３．ＮＱ．ＱＹＴ（４０位及び５４位にグルタミンを含み、８２位にグルタミン酸を含む配列番号３０のＡ１－Ａ２ドメインを含む）を試験した。

【発明を実施するための形態】

【0015】

本開示は、抗体（又は他の抗原結合タンパク質）及び非天然ＮＫＧ２ＤリガンドのＡ１－Ａ２ドメインを含む融合タンパク質を提供する。非天然ＮＫＧ２Ｄリガンドは、非天然ＮＫＧ２Ｄ受容体に選択的に結合する。本開示の様々な態様において、融合タンパク質は、Ａ１－Ａ２ドメインが結合する非天然ＮＫＧ２Ｄ受容体を示すＣＡＲ－Ｔ細胞に関連して使用され、それによって、現在のＣＡＲ－Ｔ細胞ベースの治療薬の多くの欠点を克服する、目的に合ったＣＡＲ－Ｔ細胞治療を送達するための強力なシステムを提供する。現在利用可能なＣＡＲ－Ｔ細胞ベースの治療法とは異なり、本開示の融合タンパク質及びシステムは、選択した抗原にＴ細胞活性を誘導する柔軟な標的化、抗原喪失に関連する再発の可能性を低減するマルチプレックス機能、ＣＡＲ－Ｔ細胞の差次的関与のための用量制御、及びＣＡＲ発現細胞への調節剤の選択的送達を可能にする。

【0016】

本開示は、特に有利な特性を有する非天然ＮＫＧ２ＤリガンドのＡ１－Ａ２ドメインを提供する。ＮＫＧ２Ｄは、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、いくつかの骨髄細胞、及び特定のＴ細胞上でＩＩ型ホモ二量体の統合膜タンパク質として発現する活性化受容体である。ヒトＮＫＧ２Ｄは、様々なストレスに応答して細胞の表面上で上方制御される８つの異なる天然ＭＩＣリガンド（ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＵＬＢＰ１～ＵＬＢＰ６）を有し、それらの差次的制御は、免疫系に、付随的損傷を最小限に抑えながら広範囲の緊急のキューに応答する手段を提供する。Ｇｒｏｈ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９３，１２４４５－１２４５０（１９９６）、Ｚｗｉｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６０，３２３－３３０（１９９９）、及びＳｐｉｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９，１０１３－１０１５（２００８）。ＮＫＧ２Ｄ外部ドメイン、いくつかの可溶性リガンド、及び外部ドメインへのリガンドの結合複合体の構造が解明され、さもなければ異なったアミノ酸同一性を有するリガンドの構造的に保存されたＡ１－Ａ２ドメインに関与するホモ二量体界面における鞍状の溝が明らかになった。Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２，４４３－４５１（２００１）、Ｒａｄａｅｖ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １５，１０３９－１０４９（２００１）、Ｚｕｏ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ Ｓｉｇｎａｌ １０，（２０１７）、及びＭｃＦａｒｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １９，８０３－８１２（２００３）。本開示の「Ａ１－Ａ２ドメイン」は、天然に存在するＡ１－Ａ２ドメインではなく、ＮＫＧ２Ｄ外部ドメインの変異バージョンに結合し、野生型ＮＫＧ２Ｄ（ｗｔＮＫＧ２Ｄ）には結合しない（又は少なくとも、インビボで生物学的に適切な様式ではｗｔＮＫＧ２Ｄに結合しない）アミノ酸配列を含む。実施例に記載されるＵ２Ｓ３ドメイン（配列番号３０）に基づくこの直交Ａ１－Ａ２ドメインは、有利な特性を有する独自のグリコシル化パターンを可能にする。様々な態様において、本開示は、配列番号３０に対して少なくとも９５％の同一性（例えば、配列番号３０に対する少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、少なくとも９９％の同一性、又は１００％の同一性）を有するアミノ酸配列を含むＡ１－Ａ２ドメインペプチドを提供し、ペプチドは、配列番号３０の位置４０、５４、及び／又は８４のうちの１つ以上にアラニン又はグルタミンを含む。この点に関して、Ａ１－Ａ２ドメインは、４０位のグルタミン、４０位のアラニン、５４位のグルタミン、５４位のアラニン、４０位のアラニン及び５４位のグルタミン（任意選択的に、８４位のグルタミン又はアラニン）、４０位のアラニン及び５４位のアラニン（任意選択的に、８４位のグルタミン又はアラニン）、４０位のグルタミン及び５４位のアラニン（任意選択的に、８４位のグルタミン又はアラニン）、４０位のグルタミン及び５４位のグルタミン（任意選択的に、８４位のグルタミン又はアラニン）、４０位のアラニン及び８４位のグルタミン、４０位のアラニン及び８４位のアラニン、４０位のグルタミン及び８４位のアラニン、４０位のグルタミン及び８４位のグルタミン、５４位のアラニン及び８４位のグルタミン、５４位のアラニン及び８４位のアラニン、５４位のグルタミン及び８４位のアラニン、又は５４位のグルタミン及び８４位のグルタミンを含み得、位置は、配列番号３０内のアミノ酸位置を参照している。例えば、本開示は、配列番号３０の配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するＡ１－Ａ２ドメインペプチドであって、ペプチドが、配列番号３０の配列に関して４０位及び５４位にグルタミン残基を含む、Ａ１－Ａ２ドメインペプチドを提供する。任意選択的に、Ａ１－Ａ２ドメインは、配列番号３０の８４位にグルタミンを含む。代替的に、Ａ１－Ａ２ドメインは、様々な態様において、配列番号３０の８４位にアラニンを含んでもよい。様々な態様において、Ａ１－Ａ２ドメインペプチドは、配列番号１１、配列番号３１、又は配列番号３２を含む（又はそれらからなる）。本明細書で更に説明されるように、本開示の任意のＡ１－Ａ２ドメインを、抗体（又は他の抗原結合タンパク質）の重鎖又は軽鎖に融合させて、例えば、標的抗原及び変異型ＮＫＧ２Ｄ外部ドメインの両方に結合する二重特異性融合タンパク質を作製することができる。この形態（Ａ１－Ａ２ドメインに融合された抗体）は、「ＭｉｃＡｂｏｄｙ」とも称される。

【0017】

本開示は、（ｉ）配列番号１の可変領域配列を含む重鎖と、（ｉｉ）配列番号８の可変領域配列を含む軽鎖と、を含む、抗体融合タンパク質を提供する。軽鎖は、配列番号１１のアミノ酸配列を含むＡ１－Ａ２ドメインにＣ末端で融合されている。本発明の抗体融合タンパク質の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域は、Ｂ細胞に表示される表面抗原ＣＤ２０に結合するキメラモノクローナル抗体（ＩｇＧ１カッパ免疫グロブリン）であるリツキシマブのものである。リツキシマブは、例えば、米国特許第５，７３６，１３７号、同第５，７７６，４５６号、及び同第５，８４３，４３９号に更に記載されている。Ｂ細胞は、特定の自己免疫疾患及びがんの病因において役割を果たし、リツキシマブは、様々な障害において有益な効果を達成するように、Ｂ細胞を標的として殺傷するのに有効である。例えば、リツキシマブは、白血病（例えば、有毛細胞白血病（ＨＣＬ）及び慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ））及びリンパ腫（例えば、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ、例えば、びまん性大型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、バーキットリンパ腫（ＢＬ）、マンテル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、及び濾胞性リンパ腫）等のがんの治療において有効性を示している。リツキシマブはまた、関節リウマチ、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、慢性炎症性脱髄性多発神経炎、及び自己免疫関連性貧血等の自己免疫疾患の治療における有効性を実証した。また、リツキシマブは、多発血管炎性肉芽腫症（ＧＰＡ）（ウェゲナー肉芽腫症）及び顕微鏡的多発性血管炎（ＭＰＡ）を伴う肉芽腫症の治療のためにも承認されている。

【0018】

本明細書で使用される「抗体」という用語は、完全長重鎖及び軽鎖を有する免疫グロブリンを指す。本開示の抗体は、４つの高度に保存されたサブクラス（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４）を含み、定常領域（例えば、ヒンジドメイン及び／又はＣＨ２ドメイン）が概して異なる、ＩｇＧ抗体である。任意選択的に、本開示の抗体融合タンパク質は、ＩｇＧ１抗体を含み、その定常領域は、抗体依存性細胞溶解（ＡＤＣＣ）を誘発する抗体の能力を低減又は不活性化するように修飾され得る（例えば、Ｄ２６５Ａ／Ｄ２９７Ａ置換をＦｃドメインに導入することによって）。様々な態様において、抗体融合タンパク質の重鎖は、配列番号３のアミノ酸配列を含む定常ドメインを含む。本開示はまた、重鎖が配列番号２のアミノ酸配列を含む定常領域を含む、抗体融合タンパク質を企図する。本開示はまた、重鎖が配列番号３と少なくとも９０％同一又は少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含むが、配列番号３内の２３４位、２３５位、及び３２９位のアミノ酸がアラニンである、抗体融合タンパク質を企図する。いくつかの態様において、抗体融合タンパク質は、配列番号７の重鎖を含む。この点に関して、本開示は、配列番号２１の軽鎖及び配列番号７の重鎖を含む抗体融合タンパク質を提供する。他の態様において、抗体融合タンパク質は、配列番号６の重鎖を含む。この点に関して、本開示は、配列番号２１の軽鎖及び配列番号６の重鎖を含む抗体融合タンパク質を企図する。

【0019】

本開示の様々な態様において、抗体の軽鎖は、配列番号８の可変領域配列を含む。任意選択的に、軽鎖は、配列番号９のアミノ酸配列（又は配列番号９と少なくとも約９０％同一又は９５％同一の配列）を含む定常領域を含む。したがって、様々な態様において、本開示の抗体融合タンパク質の軽鎖は、配列番号８及び配列番号９（配列番号２１）を含む。

【0020】

軽鎖は、配列番号１１のアミノ酸配列を含むＮＫＧ２ＤリガンドＡ１－Ａ２ドメインにＣ末端で任意選択的に融合されている。以下でより詳細に説明されるように、軽鎖アミノ酸配列のＣ末端へのＡ１－Ａ２ドメインの融合は、本開示の抗体の重鎖に対うるＡ１－Ａ２ドメインの融合と比較して優れた活性をもたらした。本明細書に記載の抗体融合タンパク質上のドメインの配置の優れた特性は、実施例に記載の試験より前に予測することができなかった。

【0021】

様々な態様において、Ａ１－Ａ２ドメインは、リンカー、任意選択的に、配列番号１０を含む（又はそれからなる）リンカーを介して、軽鎖のＣ末端に融合されている。以下により詳細に説明されるように、配列番号１０のリンカーは、Ｂ細胞の細胞傷害性の観点から他の抗体融合構築物よりも予想外に優れたＭｉｃＡｂｏｄｙを生成した。本開示の例示的な態様において、本開示の抗体融合タンパク質は、配列番号８の可変領域配列と、配列番号１０のリンカー配列を介して軽鎖のＣ末端に融合された配列番号１１のＡ１－Ａ２ドメインと、を含み、任意選択的に、配列番号９の軽鎖定常領域を含む。この点に関して、本開示の様々な態様において、抗体融合タンパク質の軽鎖は、配列番号１３のアミノ酸配列を含む。

【0022】

本開示は、配列番号１３の軽鎖、及び配列番号７の重鎖を含む抗体融合タンパク質を提供する。本開示はまた、配列番号１３の軽鎖、及び配列番号６の重鎖を含む抗体融合タンパク質も提供する。抗体及び抗体融合タンパク質を作製する方法は、当該技術分野で既知であり、例えば、以下の実施例に記載されている。

【0023】

本開示はまた、本明細書に記載の抗体融合タンパク質を含む１つ以上の容器を含む、キットを提供する。キットは、抗体融合タンパク質の適応及び使用に関する説明書及び書面による情報を更に含んでもよい。シリンジ、例えば、単回使用シリンジ又はプレフィルドシリンジ、滅菌した密封容器、例えば、バイアル、ボトル、器、及び／又は抗体融合タンパク質を含むキット若しくはパッケージもまた、任意選択的に好適な使用説明書とともに、企図される。更なる態様において、本開示は、（ａ）本明細書に記載の抗体融合タンパク質を含む組成物、（ｂ）上記組成物を含む容器、及び（ｃ）上記容器に貼付されたラベル、又は疾患若しくは障害（例えば、がん）の治療における上記抗体融合タンパク質の使用に言及する上記容器に含まれる添付文書を含む、製造物品又は単位用量形態を提供する。また、本明細書において、抗体融合タンパク質（及び、様々な態様において、本明細書に記載のＣＡＲを発現する哺乳動物細胞）と、薬学的に許容される担体、賦形剤、又は希釈剤と、を含む、組成物が提供される。例示的な態様において、組成物は無菌組成物である。

【0024】

本開示は、ＣＤ２０表示細胞を標的とする細胞療法レジメンの構成要素を含む、システム又はキットを更に提供する。様々な態様において、第１の構成要素は、本明細書に記載の抗体融合タンパク質、すなわち、ＣＤ２０及びＮＫＧ２Ｄ外部ドメインを含むＣＡＲの両方に結合する二重特異性の抗体ベースの融合タンパク質である。第２の構成要素は、それ自体が不活性（すなわち、非武装ＣＡＲ－Ｔ）であるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように遺伝子改変された哺乳動物細胞（例えば、ヒト細胞）である。様々な態様において、哺乳動物細胞は、リンパ球又はマクロファージ、例えば、ヒトリンパ球（ヒトＴ細胞等）又はヒトマクロファージである。様々な態様において、第２の構成要素は、ヒトＮＫ（ナチュラルキラー）細胞（例えば、自己ヒトＮＫ細胞）であり、Ｔ細胞に関する本明細書における開示は、ＮＫ細胞にも適用される。キットは、ＣＡＲを発現する哺乳動物細胞を含む１つ以上の容器と、抗体融合タンパク質を含む１つ以上の容器と、を含む。キットは、本明細書に記載の構成要素の適応及び使用に関する説明書及び書面による情報を更に含んでもよい。

【0025】

「キメラ抗原受容体」又は「ＣＡＲ」は、腫瘍細胞などの標的細胞によって発現される抗原を認識し、それに結合するように操作された人工免疫細胞受容体を指す。一般に、ＣＡＲはＴ細胞用に設計されており、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体のシグナル伝達ドメイン及び抗原認識ドメイン（例えば、抗体又は他の抗体断片の一本鎖断片（ｓｃＦｖ））のキメラである。例えば、Ｅｎｂｌａｄ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ．２０１５；２６（８）：４９８－５０５を参照されたい。Ｔ細胞及びＮＫ細胞は、遺伝子移入技術を用いて修飾して、新規の抗原特異性を付与する膜貫通シグナル伝達受容体を表面上に直接かつ安定的に発現させることができる。例えば、Ｇｉｌｌ＆Ｊｕｎｅ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ２０１５．Ｖｏｌ．２６３：６８－８９、Ｇｌｉｅｎｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．ｄｏｉ：１０．３３８９／ｆｐｈａｒ．２０１５．０００２１を参照されたい。ＣＡＲには様々な形態があり、各々が異なる構成要素を含有する。「第１世代」ＣＡＲは、ヒンジ及び膜貫通ドメインを介して、Ｔ細胞受容体のＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメインに抗原結合ドメインを結合する。「第２世代」ＣＡＲは、共刺激シグナルを供給するために、追加のドメイン、例えば、ＣＤ２８、４－１ＢＢ（４１ＢＢ）、又はＩＣＯＳを組み込む。「第３世代」ＣＡＲは、ＴＣＲ ＣＤ３ζ鎖に融合された２つの共刺激ドメインを含有する。第３世代共刺激ドメインは、例えば、ＣＤ３ζ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＩＣＯＳ、又はＯＸ４０の組み合わせを含み得る。そのように構築されたＣＡＲは、例えば、内因性Ｔ細胞受容体と同様ではあるが、主要組織適合抗原（ＭＨＣ）とは独立して、標的抗原に結合したときにＴ細胞活性化を誘発することができる。

【0026】

本開示のキメラ抗原受容体は、ＣＡＲの「抗原結合ドメイン」として、天然リガンドに関与することができない変異型ＮＫＧ２Ｄ外部ドメインを含む。ＮＫＧ２Ｄ外部ドメインの変異は、例えば、Ｃｕｌｐｅｐｐｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４８，５１６－５２３（２０１１）及び実施例に更に記載される。変異型ＮＫＧ２Ｄは、本明細書において「ｉＮＫＧ２Ｄ」と称される。様々な態様において、ｉＮＫＧ２Ｄドメインは、配列番号１５のアミノ酸配列を含む。外部ドメインは、好ましくは、膜貫通ドメイン、共刺激分子（例えば、４－１ＢＢ又はＣＤ２８）の細胞内ドメイン、及び／又はＴ細胞受容体細胞内シグナル伝達ドメインと関連付けられる。例えば、本開示の例示的な態様において、ｉＮＫＧ２Ｄ外部ドメインは、ＣＤ８ａヒンジ／膜貫通ドメイン（例えば、配列番号１６の配列を含む、又はそれからなる）、４－１ＢＢドメイン（例えば、配列番号１７の配列を含む、又はそれからなる）、及び／又はＣＤ３ζドメイン（例えば、配列番号１８の配列を含む、又はそれからなる）に融合されている。様々な態様において、ＣＡＲは、これらの構成要素（例えば、配列番号１５～１８又は配列番号１９）の全てを含む。

【0027】

ＣＡＲは不活性であるため、ＣＡＲは、その受容体に非共有結合したその同族の抗体融合タンパク質で「武装」したときに、抗原を示す標的細胞との生産的な免疫学的シナプスを形成し、細胞溶解を活性化することができるだけである。ＣＡＲ発現細胞は、本明細書において「ｃｏｎｖｅｒｔｉｂｌｅＣＡＲ」と称される。システムの例を図７Ａに示す。本明細書に記載の抗体融合タンパク質は、ＣＤ２０を発現する細胞の存在下でのみ、ｉＮＫＧ２Ｄ－ＣＡＲ発現細胞（例えば、Ｔ細胞）を活性化することができる。他の抗原を標的とする追加のＭｉｃＡｂｏｄｙ（すなわち、異なる細胞表面抗原に結合する異なる可変領域を有する抗体融合タンパク質）とともに使用される場合、ｃｏｎｖｅｒｔｉｂｌｅＣＡＲ－Ｔ細胞は、細胞溶解を媒介するために、同時に又は連続して異なる抗原を標的とすることができる。このアプローチは、例えば、複数の異なる自己ＣＡＲ細胞を作製、拡張、及び注入する必要なく、標的抗原消失の結果としての腫瘍耐性及び腫瘍エスケープに対応するのに役立ち得る。この高度にモジュール化されたｃｏｎｖｅｒｔｉｂｌｅＣＡＲシステムは、養子細胞療法の可能性を拡大し、重度の全身毒性、抗原エスケープ、及び現在のＣＡＲ－Ｔ及びＣＡＲ－ＮＫ細胞療法の制限された制御不能な持続性を含む、既存の細胞療法の多くの欠点を克服する。更に、単一のＣＡＲを様々な状況で使用することができるため（標的特異性は、ＣＡＲではなく、投与される抗体融合タンパク質によって決定されるため）、細胞の製造が簡素化され、より安価である。

【0028】

ＣＡＲ細胞療法は、表面上で特定のＣＡＲを産生することができるように操作された対象又は患者自身の免疫細胞を利用する免疫療法であり得る。いくつかの状況において、細胞（例えば、Ｔ細胞）は、アフェレーシスによって対象又は患者の体から採取される。次いで、体から採取された細胞（例えば、Ｔ細胞）を遺伝子操作して、それらの表面上で特定のキメラ抗原受容体を産生させる。ＣＡＲ発現細胞は、実験室で成長させることによって増殖され、次いで、対象若しくは患者、又は別の対象若しくは患者に投与される。ＣＡＲ発現細胞は、それらの表面上に標的抗原を発現する細胞（例えば、がん細胞）を認識して殺傷する。細胞は、治療のレシピエントとなる対象から単離されてもよいか、又は治療の最終的なレシピエントではないドナー対象から単離されてもよい。様々な態様において、細胞は、自己ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞である。

【0029】

本開示は、がん（ＣＤ２０陽性がん）等のＣＤ２０を発現する細胞に関連する疾患又は障害のために対象を治療する方法を更に提供する。方法は、対象に、本明細書に記載のＣＡＲ発現細胞（例えば、本明細書に記載のｉＮＫＧ２ＤベースのＣＡＲを発現するＴ細胞又はＮＫ細胞）を投与することと、対象に、本明細書に記載の抗体融合タンパク質を投与することと、を含む。がんの例としては、限定されないが、白血病及びリンパ腫、例えば、有毛細胞白血病、慢性リンパ性白血病、及び非ホジキンリンパ腫（例えば、びまん性大型Ｂ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、マンテル細胞リンパ腫、及び濾胞性リンパ腫）が挙げられる。

【0030】

本明細書で使用される場合、「治療する」という用語、及びそれに関連する単語は、必ずしも１００％の又は完全な治療又は寛解を意味するわけではない。むしろ、当業者が潜在的な利益又は治療効果を有すると認識する治療の程度には様々なものがある。この点において、疾患又は障害を治療する方法は、任意の量又は任意のレベルの治療を提供することができる。更に、本方法によって提供される治療は、治療される疾患の１つ以上の状態又は症状又は徴候の治療を含み得る。例えば、本開示の治療方法は、疾患の１つ以上の症状を抑制し得る。また、本開示の方法によって提供される治療は、疾患の進行を遅らせることを包含し得る。

【0031】

がんの治療は、多数の方法のいずれかによって決定され得る。対象の福祉における任意の改善が企図される（例えば、本明細書に記載の任意のパラメータの少なくとも又は約１０％の減少、少なくとも又は約２０％の減少、少なくとも又は約３０％の減少、少なくとも又は約４０％の減少、少なくとも又は約５０％の減少、少なくとも又は約６０％の減少、少なくとも又は約７０％の減少、少なくとも又は約８０％の減少、少なくとも又は約９０％の減少、又は少なくとも又は約９５％の減少）。例えば、治療応答は、疾患における以下の改善のうちの１つ以上を指す：（１）腫瘍性細胞の数の減少；（２）腫瘍性細胞死の増加；（３）腫瘍性細胞生存の阻害；（５）腫瘍成長若しくは新たな病変の出現の阻害（すなわち、ある程度遅らせる、好ましくは停止する）；（６）腫瘍サイズ若しくは負荷の減少；（７）臨床的に検出可能な疾患の不在；（８）がんマーカーのレベルの低下；（９）患者生存率の増加；及び／又は（１０）疾患若しくは状態（例えば、疼痛）に関連する１つ以上の症状からのいくらかの緩和。更に、治療有効性は、他の免疫療法処置又は化学療法に対する応答性の点でも特徴付けることができる。様々な態様において、本開示の方法は、対象における治療をモニタリングすることを更に含む。

【0032】

対象は、限定されないが、マウス及びハムスター等のげっ歯目の哺乳動物、並びにウサギ等のウサギ目の哺乳動物、ネコ（ネコ）及びイヌ（イヌ）を含む食肉目の哺乳動物、ウシ（ウシ）及びブタ（ブタ）を含む偶蹄目の哺乳動物、又はウマ（ウマ）を含む奇蹄目の哺乳動物である。いくつかの態様において、哺乳動物は、霊長目、セボイド（Ｃｅｂｏｉｄ）、又はシモイド（Ｓｉｍｏｉｄ）（サル）、又は真猿亜目（ヒト及び類人猿）の順序である。いくつかの態様において、哺乳動物はヒトである。治療用組成物は、非経口、局所、経口、髄腔内又は局所投与を含む様々な経路のいずれかを使用して、対象に送達することができる。実際、組成物は、皮下投与、皮内投与、真皮内投与、静脈内投与、動脈内投与、腫瘍内投与、非経口投与、腹腔内投与、筋肉内投与、眼内投与、骨内投与、硬膜外投与、硬膜内投与、腫瘍内投与等を行ってもよい。

【0033】

本開示はまた、（ｉ）本明細書に記載の抗体融合タンパク質の軽鎖をコードする核酸分子（すなわち、単離核酸）、及び（ｉｉ）本明細書に記載の抗体融合タンパク質の重鎖をコードする核酸分子（すなわち、単離核酸）、並びに（ｉ）及び／又は（ｉｉ）を含む組成物を提供する。本開示は、本明細書に開示されるＡ１－Ａ２ドメインペプチドのいずれかをコードする核酸分子を更に提供する。本開示の核酸は、本明細書に開示されるアミノ酸配列のいずれかをコードする核酸、並びに本開示の核酸（すなわち、配列表に記載される核酸配列）に対して少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約９５％、及び最も好ましくは少なくとも約９８％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸を含む。本開示の核酸は、本明細書に開示されるアミノ酸配列のいずれかをコードする核酸、並びに本開示のアミノ酸配列（すなわち、配列表に記載されるアミノ酸配列）に対して少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約９５％、及び最も好ましくは少なくとも約９８％の同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸を含む。本開示の核酸は、相補的核酸も含む。ある場合には、配列は、整列させたときに完全に相補的である（ミスマッチがない）。他の場合には、最大約２０％のミスマッチが配列に存在し得る。本開示は、本開示の抗体融合タンパク質の重鎖及び軽鎖の両方をコードする核酸配列を含む核酸分子を提供する。

【0034】

本開示の核酸は、プラスミド、コスミド、バクミド、ファージ、人工染色体（ＢＡＣ、ＹＡＣ）又はウイルス等の発現ベクターにクローニングすることができ、そこに別の遺伝子配列又はエレメント（ＤＮＡ又はＲＮＡのいずれか）を挿入して、結合した配列又はエレメントの複製をもたらすことができる。いくつかの実施形態において、発現ベクターは、構成的に活性なプロモーターセグメント（限定されないが、ＣＭＶ、ＳＶ４０、伸長因子又はＬＴＲ配列等）又はステロイド誘導性ｐＩＮＤベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）等の誘導性プロモーター配列を含有し、核酸の発現を制御することができる。本開示の発現ベクターは、制御配列、例えば、内部リボソーム進入部位を更に含み得る。分泌型シグナルペプチド配列はまた、任意選択的に、細胞から目的のポリペプチドをより容易に単離するために、発現したポリペプチドが組換え宿主細胞によって分泌され得るように、目的のコード配列に作動可能に連結された発現ベクターによってコードされ得る。発現ベクターは、例えば、トランスフェクションによって細胞に導入することができる。

【0035】

（任意選択的に発現ベクターに含まれる）核酸分子を含む組換え宿主細胞もまた提供される。組換え宿主細胞は、原核細胞、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞、又は真核細胞、例えば、哺乳動物細胞又は酵母細胞であり得る。酵母細胞は、例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ、及びＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ細胞を含む。哺乳動物細胞として、例えば、Ｖｅｒｏ、ＨｅＬａ、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、Ｗ１３８、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）、ＣＯＳ－７、ＭＤＣＫ、ヒト胚性腎臓細胞株２９３、アフリカミドリザル腎臓細胞、及びＣＯＳ細胞が挙げられる。本開示の組換えタンパク質産生細胞はまた、例えば、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞等の既知の任意の昆虫発現細胞株を含む。一実施形態において、細胞は、ＣＨＯ細胞等の哺乳動物細胞である。

【0036】

抗体融合タンパク質を更に生成する方法が本開示によって提供される。方法は、抗体融合タンパク質の軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子と、抗体融合タンパク質の重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子と、を含む、宿主細胞（単離宿主細胞）を培養することを含む。方法は、抗体融合タンパク質を回収することを更に含む。本開示はまた、本明細書に記載のＡ１－Ａ２ドメインペプチドを生成する方法を提供する。方法は、Ａ１－Ａ２ドメインペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を含む宿主細胞（単離宿主細胞）を培養することを含む。方法は、ドメインペプチド（任意選択的に別のペプチドに融合されている）を回収することを更に含む。抗体タンパク質等の組換えタンパク質を作製するための培養条件及び方法は、当該技術分野で既知である。同様に、タンパク質精製方法は当該技術分野で既知であり、細胞培養培地からの組換えタンパク質の回収のために本明細書で利用される。いくつかの態様において、タンパク質及び抗体の精製方法は、濾過、親和性カラムクロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィー、アニオン交換クロマトグラフィー、及び濃縮を含む。任意選択的に、方法は、抗体融合タンパク質又はＡ１－Ａ２ドメインペプチドを製剤化することを含む。

【0037】

前述の開示は、様々な態様において、Ａ１－Ａ２ドメインペプチドの融合パートナーとしての抗ＣＤ２０抗体に焦点を当てているが、本開示のＡ１－Ａ２ドメインペプチドは、他の抗体などの他の抗原結合ペプチドを含む、他のペプチドに融合され得ることを理解されたい。抗ＣＤ２０抗体の構造に関する前述の開示は、他の抗原結合タンパク質及び抗体（すなわち、他の標的に結合する抗体）にも適用される。抗体は、モノクローナル抗体又は多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）であり得る。Ａ１－Ａ２ドメインペプチドは、抗体の抗原結合断片に融合されてもよい。抗体断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、及びＦｖ断片が挙げられる。他の抗原結合タンパク質は、ダイアボディ、線形抗体、一本鎖抗体分子等を含む。抗原結合タンパク質は、がん細胞の表面上に発現する抗原等の任意の好適な抗原を標的とし得る。抗原の例としては、ＣＤ１９、ＢＭＣＡ、ＨＥＲ２、ＥＧＦＲ、ＥｐＣＡＭ、ＣＥＡ、ＢＣＭＡ、ＰＳＭＡ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ１２３、ＣＤ２７６（Ｂ７－Ｈ３）、ＧＰＣ２、ＧＰＣ３、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＷＴ－１、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＣＬＤＮ４、ＣＬＤＮ６、ＣＬＤＮ１８．２、ＰＳＣＡ、及びＴＳＰＡＮ８が挙げられるが、これらに限定されない。本開示は、疾患又は障害（例えば、がん）のために対象を治療する方法を更に提供する。方法は、本明細書に記載のＣＡＲ発現細胞（例えば、本明細書に記載のｉＮＫＧ２ＤベースのＣＡＲを発現するＴ細胞又はＮＫ細胞）を対象に投与することと、本明細書に記載のＡ１－Ａ２ドメインペプチドを含む抗原結合融合タンパク質を対象に投与することとを含む。がん等の例は、上で考察され、本開示のこの態様に適用される。

【0038】

以下の実施例は、単に本発明を例示するために与えられたものであり、その範囲を限定するためのものではない。

【実施例】

【0039】

本実施例は、本開示の抗体融合タンパク質及びＮＫＧ２Ｄ外部ドメインを含むＣＡＲ－Ｔ細胞を生成する例示的な方法を説明する。実施例は更に、リツキシマブ由来の可変領域配列を含み、軽鎖のＣ末端に融合されたＡ１－Ａ２ドメインを含む抗体融合タンパク質が、配列番号１５～１８のアミノ酸配列を含むＣＡＲ－Ｔ細胞に選択的に結合する能力、及び抗体融合タンパク質とＣＡＲ－Ｔ細胞との組み合わせが、インビボでＣＤ２０を保有するがん細胞を殺傷する能力を実証する。

【0040】

材料及び方法
クローニング、発現、及び精製：ＮＫＧ２Ｄの野生型外部ドメイン（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｐ２６７１８，残基７８－２１６；ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ）は、短い第Ｘａ因子を認識できるＩｌｅ－Ｇｌｕ－Ｇｌｙ－Ａｒｇリンカー（Ｆｃ－ｗｔＮＫＧ２Ｄ）を介したヒトＩｇＧ１ ＦｃのＣ末端への融合物として発現させた。単一のＹ１５２Ａ（ｉＮＫＧ２Ｄ．ＹＡ）又は二重Ｙ１５２Ａ／Ｙ１９９Ａ置換（ｉＮＫＧ２Ｄ．ＡＦ）のいずれかを含む不活性ＮＫＧ２Ｄバリアントを、ＰＣＲ媒介性変異誘発又は合成によって作製した（ｇＢｌｏｃｋｓ（登録商標）、ＩＤＴ）。Ｆｃ－ＮＫＧ２Ｄ分子のＤＮＡ構築物をＥｘｐｉ２９３（商標）細胞（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で発現させ、二量体分泌タンパク質をプロテインＡアフィニティークロマトグラフィー（Ｐｉｅｒｃｅ（商標）番号２０３３４、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）によって精製した。溶出した材料を、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００カラム（ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用したＡＫＴＡ Ｐｕｒｅシステム上のサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって特徴付け、更に精製した。正しく組み立てられた、適切なサイズの単量体材料を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に分画した。

【0041】

ヒトＭＩＣＡ＊００１（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｑ２９９８３、残基２４～２０５）、ＭＩＣＢ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｑ２９９８０．１、２４～２０５）、ＵＬＢＰ１（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｑ９ＢＺＭ６、２９～２１２）、ＵＬＢＰ２（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｑ９ＢＺＭ５、２９～２１２）、ＵＬＢＰ３（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｑ９ＢＺＭ４、３０～２１２）、ＵＬＢＰ５（ＮＣＢＩ受託番号ＮＰ＿００１００１７８８．２、２９～２１２）、及びＵＬＢＰ６（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ、２９～２１２）のＡ１－Ａ２ドメインを、Ｃ末端６ｘ－Ｈｉｓタグでクローニングした。単量体タンパク質をＥｘｐｉ２９３（商標）上清Ｎｉ－ＮＴＡ樹脂（ＨｉｓＰｕｒ（商標）、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）から精製し、溶出した材料をＰＤ－１０脱塩カラム（ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）中のＳｅｐｈａｄｅｘＧ－２５を用いてＰＢＳに交換した。

【0042】

ＭＩＣリガンド及び直交バリアントを、それぞれＡＰＴＳＳＳＧＧＧＧＳ又はＧＧＧＳリンカーのいずれかを介して、ヒトＩｇＧ１抗体のカッパ軽鎖又は重鎖のいずれかのＣ末端への融合物として、ライゲーション非依存的アセンブリ（ＨｉＦｉ ＤＮＡ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ、ＮＥＢ番号Ｅ２６２１）によってクローニングした。更に、抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）機能を排除するために、全ての抗体及びＭｉｃＡｂｏｄｙクローンの重鎖のＣＨ２ドメインにＤ２６５Ａ／Ｎ２９７Ａ（Ｋａｂａｔ番号付け）変異を導入した。所与の抗体クローンの重鎖及び軽鎖プラスミドＤＮＡ（哺乳動物発現ベクターｐＤ２６１０－Ｖ１２（ＡＴＵＭ）中）をＥｘｐｉ２９３（商標）細胞に同時トランスフェクトし、プロテインＡによって精製した。作製された任意のモノクローナル抗体融合物について、適切なＶＬ又はＶＨドメインをカッパ軽鎖又はＡＤＣＣ欠損ＩｇＧ１重鎖のいずれかと入れ替えた。

【0043】

不活性ＮＫＧ２Ｄ及び直交リガンドの操作：ＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｏｃｔｅｔシステム（Ｐａｌｌ ＦｏｒｔｅＢｉｏ ＬＬＣ）を用いたバイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）を実施して、ｉＮＫＧ２Ｄによる野生型ＭＩＣリガンド結合の損失を確認した。Ｆｃ－ｗｔＮＫＧ２Ｄ、Ｆｃ－ｉＮＫＧ２Ｄ．ＹＡ、又はＦｃ－ｉＮＫＧ２Ｄ．ＡＦを、抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ捕捉（ＡＨＣ）バイオセンサー先端上に捕捉し、単量体ＭＩＣ－Ｈｉｓリガンドの滴定シリーズにおいて会合／解離動態をモニターした。更に、マイクロタイタープレートにコーティングされたＭＩＣＡ－Ｆｃ、ＭＩＣＢ－Ｆｃ、ＵＬＢＰ１－Ｆｃ、ＵＬＢＰ２－Ｆｃ、ＵＬＢＰ３－Ｆｃ、又はＵＬＢＰ４－Ｆｃ（Ｒ＆Ｄシステム）を用いてＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着測定法）結合アッセイを行い、ビオチン化Ｆｃ－ｗｔＮＫＧ２Ｄ又はＦｃ－ｉＮＫＧ２Ｄ．ＹＡの滴定を行い、ストレプトアビジン－ＨＲＰ（Ｒ＆Ｄシステム番号ＤＹ９９８）で検出し、１－Ｓｔｅｐ Ｕｌｔｒａ ＴＭＢ ＥＬＩＳＡ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ番号３４２０８）で展開した。

【0044】

ファージディスプレイを用いて、ｉＮＫＧ２Ｄ．ＹＡ又はｉＮＫＧ２Ｄ．ＡＦのいずれかへの排他的結合を示した直交ＵＬＢＰ２ Ａ１－Ａ２バリアントを同定した。合成ＮＮＫ（Ｎ＝Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｔ及びＫ＝Ｇ／Ｔであり、終止コドンなしで２０個全てのアミノ酸を提示する）ＤＮＡライブラリーを、天然ＮＫＧ２Ｄ受容体４５上のＹ１５２位に近接して位置する結合状態にあるヘリックス２（残基７４～７８、成熟タンパク質に基づく番号付け）又はヘリックス４（残基１５６～１６０）のコドンを標的とするように作製した。Ｍｕｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｐａｔｈｏｇ．６，ｅ１０００７２３（２０１０）。ヘリックス２単独、ヘリックス４単独、又はその組み合わせを探索するライブラリーを、Ｍ１３ファージのマイナーコートタンパク質ｐＩＩＩへの融合物としてクローニングし、変異誘発されたＡ１－Ａ２ドメインバリアントを示すファージ粒子を、標準的な方法に従ってＳＳ３２０ Ｅ．ｃｏｌｉ細胞で産生させた。これらのＡ１－Ａ２ファージライブラリーを、ビオチン化Ｆｃ－ｉＮＫＧ２Ｄ．ＹＡ又はＦｃ－ｉＮＫＧ２Ｄ．ＡＦタンパク質（ＥＺ－Ｌｉｎｋ（商標）ＮＨＳ－Ｂｉｏｔｉｎ Ｋｉｔ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ番号２０２１７）のいずれかで捕捉し、非ビオチン化Ｆｃ－ｗｔＮＫＧ２Ｄ競合物質の濃度を増加させながら４ラウンドの選択を繰り返すことによって濃縮した。スポットＥＬＩＳＡによって、プレート結合Ｆｃ－ｉＮＫＧ２Ｄ．ＹＡ又はＦｃ－ｉＮＫＧ２Ｄ．ＡＦへの選択的結合についてＦｃ－ｗｔＮＫＧ２Ｄと比較して陽性ファージクローンを検証し、結合したファージをビオチン化Ｍ１３ファージコートタンパク質モノクローナル抗体Ｅ１（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ番号ＭＡ１－３４４６８）で検出し、続いてストレプトアビジン－ＨＲＰでインキュベーションした。

【0045】

ファージバリアントを配列決定し、次いで、更なる検証のためにヒトＩｇＧ１モノクローナル抗体融合物としてクローニングした。直交バリアントの選択性が二価のＭｉｃＡｂｏｄｙフォーマットで維持されたことを確認するために、ＥＬＩＳＡウェルを１μｇ／ｍＬのＦｃ－ｗｔＮＫＧ２Ｄ、Ｆｃ－ｉＮＫＧ２Ｄ．ＹＡ、又はＦｃ－ｉＮＫＧ２Ｄ．ＡＦでコーティングし、結合したＭｉｃＡｂｏｄｙをＨＲＰコンジュゲートマウス抗ヒトカッパ鎖抗体（Ａｂｃａｍ番号ａｂ７９１１５）で検出した。単量体及び抗体融合ＵＬＢＰ２バリアントの両方の親和性も、前述のようにＯｃｔｅｔ分析により決定した。

【0046】

ｃｏｎｖｅｒｔｉｂｌｅＣＡＲ－Ｔ細胞の作製：ＣＤ８α鎖シグナル配列、ＮＫＧ２Ｄバリアント、ＣＤ８αヒンジ及び膜貫通ドメイン、４－１ＢＢ、ＣＤ３ζ、並びにｅＧＦＰを含むヒトコドン最適化ＤＮＡ（ＧｅｎｅＡｒｔ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を、パッケージングプラスミドｐＣＭＶｄＲ８．９１及びｐＭＤ２．Ｇ４８とともに、第２世代のＰａｎｔｒｏｐｉｃ ＶＳＶ－Ｇ偽型レンチウイルス産生のためのｐＨＲ－ＰＧＫトランスファープラスミドにクローニングした。（ＧＧＧＧＳ）_３リンカーによって分離されたリツキシマブのＶＨ及びＶＬドメインをＮＫＧ２Ｄモジュールに置換して、リツキシマブｓｃＦｖベースのＣＡＲ（ＲＩＴｓｃＦｖ－ＣＡＲ）を作製した。生成されたレンチウイルスの各バッチについて、６×１０^６個のＬｅｎｔｉ－Ｘ ２９３Ｔ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ番号６３２１８０）細胞を、トランスフェクションの前日に１０ｃｍの皿に播種した。次いで、１２．９μｇのｐＣＭＶｄＲ８．９１、２．５μｇのｐＭＤ２．Ｇ及び７．２μｇのｐＨＲ－ＰＧＫ－ＣＡＲ構築物を、７２０μｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ番号３１９８５０６２）中で組み合わせ、次いで６７．５μｌのＦｕｇｅｎｅ ＨＤ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．Ｅ２３１１）と混合し、短時間ボルテックスし、室温で１０分間インキュベートした後、細胞の皿に添加した。２日後、遠心分離によって上清を収集し、０．２２μｍフィルターを通過させた。５倍濃縮ＰＥＧ－６０００及びＮａＣｌを添加して、最終濃度８．５％のＰＥＧ－６０００（Ｈａｍｐｔｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ番号ＨＲ２－５３３）及び０．３ＭのＮａＣｌを得、氷上で２時間インキュベートした後、４℃で２０分間遠心分離した。濃縮したウイルス粒子を０．０１体積のＰＢＳ中に再懸濁し、－８０℃で凍結保存した。

【0047】

初代ヒトＴ細胞の単離のために、匿名ドナーからのヒト末梢血Ｌｅｕｋｏ Ｐａｋ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ番号７０５００．１）を、等量のＰＢＳ＋２％ＦＢＳで希釈し、次いで５００×ｇで１０分間、室温で遠心分離した。細胞をＰＢＳ＋２％ ＦＢＳに５×１０^７細胞／ｍｌで再懸濁し、細胞１ｍｌ当たり５０μｌの単離カクテルを添加し、室温で５分間インキュベートすることによるネガティブセレクション（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ ＥａｓｙＳｅｐ（商標）Ｈｕｍａｎ ＣＤ４ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ番号１７９５２又はＥａｓｙＳｅｐ Ｈｕｍａｎ ＣＤ８ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ番号１７９５３）によってＣＤ４＋又はＣＤ８＋細胞を濃縮した。続いて、細胞１ｍｌ当たり５０μｌのＲａｐｉｄＳｐｈｅｒｅｓ（商標）を添加して試料を満たした（各２１ｍＬの細胞、１４ｍＬのＰＢＳ）。ＥａｓｙＳＥＰ（商標）磁石で細胞を１０分間単離し、続いて、磁場を維持しながら緩衝液を除去した。濃縮された細胞を、新鮮な緩衝液を含む新しい試験管に移し、磁石を再度適用して第２ラウンドの濃縮を行い、その後、細胞を再懸濁し、計数し、１０～１５×１０^６細胞／クライオバイアルで凍結保存した（ＲＰＭＩ－１６４０、Ｃｏｒｎｉｎｇ番号１５－０４０－ＣＶ；２０％ヒトＡＢ血清、Ｖａｌｌｅｙ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ番号ＨＰ１０２２；１０％ＤＭＳＯ、Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ番号４２７８０）。

【0048】

ＣＡＲ－Ｔ細胞を作製するために、凍結保存細胞の１本のバイアルを解凍し、１０ｍＬのＴ細胞培地「ＴＣＭ」（ＴｅｘＭＡＣＳ培地、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ１３０－０９７－１９６；５％ヒトＡＢ血清、Ｖａｌｌｅｙ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ番号ＨＰ１０２２；１０ｍＭ中和Ｎ－アセチル－Ｌ－システイン；１Ｘ２－メルカプトエタノール、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ番号２１９８５０２３、１０００Ｘ；４５ＩＵｅ／ｍｌヒトＩＬ－２ＩＳ「ｒｈＩＬ－２」、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ番号１３０－０９７－７４６）に添加した（細胞への添加時に添加した）。細胞を４００×ｇで５分間遠心分離し、次いで１０ｍｌのＴＣＭ中に再懸濁し、１×１０^６／ｍｌに調整し、２４ウェルプレートに１ｍｌ／ウェルで播種した。一晩静置した後、２０μＬのＤｙｎａｂｅａｄｓ（商標）Ｈｕｍａｎ Ｔ－Ａｃｔｉｖａｔｏｒ ＣＤ３／ＣＤ２８（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ番号１１３１Ｄ）をウェル毎に添加し、２４時間インキュベートした。濃縮したレンチウイルス粒子（５０μＬ）をウェル毎に添加し、細胞を一晩インキュベートし、次いで、６ｍｌのＴＣＭを添加したＴ２５フラスコに移した。増殖の３日後、Ｄｙｎａｂｅａｄｓを除去し（ＭａｇＣｅｌｌｅｃｔ磁石、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ ＭＡＧ９９７）、ＧＦＰのフローサイトメトリーによって形質導入効率を評価し、５×１０^５細胞／ｍＬに逆希釈し、４×１０^６細胞／ｍＬを超えないことを確実にするために細胞密度を毎日モニターした。必要に応じて、ＭｉｃＡｂｏｄｙを使用し、ＰＥ－抗ヒトカッパ鎖（Ａｂｃａｍ＃ａｂ７９１１３）で検出することによって、又はリツキシマブ－ＭｉｃＡｂｏｄｙをＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ番号Ａ２０１７３、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）に直接コンジュゲートすることによって、ｉＮＫＧ２Ｄの表面発現をＧＦＰ発現と相関させた。ｃｏｎｖｅｒｔｉｂｌｅＣＡＲ－ＣＤ８細胞の表面上でのｉＮＫＧ２Ｄ発現量を、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７とコンジュゲートしたリツキシマブ－ＭｉｃＡｂｏｄｙを使用して定量し、蛍光強度の中央値を、Ｑｕａｎｔｕｍ（商標）ＭＥＳＦ ６４７ビーズ（Ｂａｎｇｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ番号６４７）と相関させた。全てのフローサイトメトリーは、Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｓ３ｅ Ｃｅｌｌ Ｓｏｒｔｅｒ又はＭｉｌｔｅｎｙｉ ＭＡＣＳＱｕａｎｔ Ａｎａｌｙｚｅｒ １０機器のいずれかで行った。

【0049】

細胞株及びインビトロアッセイ：ＲａｍｏｓヒトＢ細胞性リンパ腫細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ－１５９６）を、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ及び１０％ＦＢＳを補充したＲＰＭＩ中で培養した。ヒトＨｅｒ２を発現するようにトランスフェクトされたマウス大腸がん株ＣＴ２６も使用した。標的抗原が発現したことをフローサイトメトリーによって検証することを除いて、追加のマイコプラズマ試験又は認証は行われなかった。

【0050】

カルセイン放出アッセイでは、腫瘍細胞を遠心分離し、Ｔ細胞培地中の４ｍＭプロベネシド（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ番号１５６３７０）＋２５μＭカルセイン－ＡＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ番号Ｃ１４３０）に１～２×１０^６細胞／ｍｌで１時間、３７℃で再懸濁し、１回洗浄し、８×１０^５細胞／ｍｌに調整した。ＣＤ８＋ＣＡＲ－Ｔ細胞をペレット化し、ＴＣＭ中の６０ＩＵｅ／ｍｌのＩＬ－２及び４ｍＭのプロベネシド中に４×１０^６細胞／ｍＬで再懸濁した後、所望のエフェクター：標的比率に従って調整した（形質導入効率については調整されていない）。２５μＬの標的細胞を播種し、続いて２５μＬの培地又は希釈したＭｉｃＡｂｏｄｙを播種した。次いで、１００μＬ培地（最小溶解）、培地＋３％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ１００（最大溶解）、又はＣＡＲ－Ｔ細胞を添加し、プレートを３７℃で２時間インキュベートした。細胞をペレット化し、７５μＬの上清を黒い透明底プレートに移し、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ２ｅプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）で蛍光（励起４８５ｎｍ、放出カットオフ４９５ｎｍ、放出５３０ｎｍ、リード当たり６回の点滅）を取得した。武装ｃｏｎｖｅｒｔｉｂｌｅＣＡＲ－ＣＤ８＋を用いた実験では、Ｔ細胞を３７℃で飽和（５ｎＭ）又は滴定のいずれかのＭｉｃＡｂｏｄｙで３０分間プレインキュベートしてから洗浄し、非結合ＭｉｃＡｂｏｄｙを除去し、カルセインを添加した標的細胞と共培養した。

【0051】

Ｔ細胞の標的依存性の活性化を定量するために、カルセインのプレローディングが省略され、ＩＬ－２を補充していないＴ細胞培地にアッセイが設定されたことを除いて、前述のように実験を設定した。２４時間の共培養後、上清を採取し、遊離サイトカインの量をＥＬＩＳＡ ＭＡＸＴＭ Ｈｕｍａｎ ＩＬ－２又はＨｕｍａｎ ＩＦＮ－ｇ検出キット（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ番号４３１８０１及び番号４３０１０１）を用いて定量できるまで－８０℃で保存した。

【0052】

ＭｉｃＡｂｏｄｙ結合曲線データは、ＰｒｏＭａｂ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ）によって作製された。３×１０^５個のｃｏｎｖｅｒｔｉｂｌｅＣＡＲ－ＣＤ８＋細胞を９６ウェルＶ底プレートに播種し、２００ｎＭから始まる滴定曲線を用いて最終体積１００μＬのＲＰＭＩ＋１％ＦＢＳ中で、標識されたＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７で標識されたＲｉｔｕｘｉｍａｂ．ＬＣ－Ｕ２Ｓ３ ＭｉｃＡｂｏｄｙとともに、室温で３０分間インキュベートした。次いで、細胞をすすぎ、フローサイトメトリーによって各滴定点で蛍光強度の中央値を決定した。

【0053】

動物試験：ＭｉｃＡｂｏｄｙの血清レベルのＰＫ分析のために、６週齢の雌ＮＳＧマウス（ＮＯＤ．Ｃｇ－Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ ＩＬ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ、Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ番号００５５５７）に、１００μｇの親リツキシマブ抗体（ＡＤＣＣ欠損）、リツキシマブの重鎖Ｕ２Ｓ３融合物（Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ．ＨＣ－Ｕ２Ｓ３）、又は軽鎖融合物（Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ．ＬＣ－Ｕ２Ｓ３）のいずれかを静脈内（ＩＶ）に注射した。収集した血清を、ヒト抗リツキシマブイディオタイプ抗体（ＨＣＡ１８６、Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で捕捉することによってＥＬＩＳＡに供し、ラット抗リツキシマブ－ＨＲＰ抗体（ＭＣＡ２２６０Ｐ、Ｂｉｏ－Ｒａｄ）で検出し、リツキシマブ又はリツキシマブ－Ｕ２Ｓ３のいずれかの標準曲線を使用して血清レベルを補間した。Ｕ２Ｓ３－ｈＦｃ－ｍｕｔＩＬ２のＰＫ分析は、６０μｇのＩＰ注射とそれに続く定期的な血清収集によってＮＳＧマウスにおいて行った。Ｆｃ－ｉＮＫＧ２Ｄを用いたＥＬＩＳＡ捕捉及びビオチン化ウサギ－抗ヒトＩＬ－２ポリクローナル抗体（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ番号５００－Ｐ２２ＢＴ）による検出、続いてストレプトアビジン－ＨＲＰによるインキュベーションによって試料を調べた。半減期は、非線形回帰分析、プラトーをゼロに制限した指数関数的な単相減衰分析を用いて、曲線のβ相に基づいてＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍで計算した。

【0054】

播種性Ｒａｊｉ Ｂ細胞リンパ腫の試験では、Ｌｕｃｉｏｌａ ｉｔａｌｉｃａ由来のルシフェラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ＲｅｄｉＦｅｃｔ Ｒｅｄ－ＦＬｕｃ－ＧＦＰ番号ＣＬＳ９６０００３）を構成的に発現するように安定にトランスフェクトされたＲａｊｉ細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ－８６）を、６週齢の雌ＮＳＧマウスの静脈内に移植した。治療投与の開始は、各インビボ試験図に詳述されている。全ての実験において、ＣＤ４及びＣＤ８初代ヒトＴ細胞は、独立して形質導入され、細胞型間又はＣＡＲ構築物間のトランスフェクション効率について正規化することなく、ＣＤ４：ＣＤ８細胞の１：１混合物で増殖後に組み合わされ、混合物を静脈内注射前にフローサイトメトリーによって検証された。ＭｉｃＡｂｏｄｙ又は対照抗体の投与は、特に明記しない限り腹腔内（ＩＰ）経路によるものであり、生物発光のインビボイメージングは、Ｘｅｎｏｇｅｎ ＩＶＩＳシステム（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いて行った。動物を定期的に出血させて、フローサイトメトリーによってヒトＴ細胞動態をモニターし、ＡＰＣ抗ヒトＣＤ３（クローンＯＫＴ３、番号２０－００３７－Ｔ１００、Ｔｏｎｂｏ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で染色し、ＧＦＰをモニターし、細胞関連ＭｉｃＡｂｏｄｙレベルをビオチン化抗ヒトＦ（ａｂ’）２（番号１０９－０６６－０９７、Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．）で検査し、続いてストレプトアビジン－ＰＥ検出（ＢＤ番号５５４０６１）を行った。ＭｉｃＡｂｏｄｙレベルをモニターするための血清ＥＬＩＳＡを前述のように行った。

【0055】

皮下腫瘍試験のために、マトリゲル中の１×１０^６個のＲａｊｉ細胞を６週齢の雌ＮＳＧマウスの右側腹部に移植し、腫瘍が７０～１００ｍｍ^３に達したときに治療を開始した。武装ｃｏｎｖｅｒｔｉｂｌｅＣＡＲ－Ｔ細胞を投与したコホートでは、細胞を５ｎＭのＲｉｔｕｘｉｍａｂ．ＬＣ－Ｕ２Ｓ３ ＭｉｃＡｂｏｄｙとともにエクスビボで３０分間室温でインキュベートした後、洗浄し、最終的に混合して所望の１：１のＣＤ４：ＣＤ８比及び細胞濃度を達成した。ビオチン化抗ヒトＦ（ａｂ’）_２抗体を用いたフローサイトメトリーによって武装を確認し、ＧＦＰとＦ（ａｂ’）_２ＭＦＩとの間の強い相関が明らかになった。これらのマウスには、別個のＭｉｃＡｂｏｄｙ投与を行わなかった。腫瘍体積を推定するためにキャリパー測定を定期的に行い（Ｌ×Ｗ×Ｗ×０．５＝ｍｍ^３）、最終的な腫瘍量を測定した。

【0056】

ｉＮＫＧ２Ｄ．ＡＦ－ＣＡＲ細胞の補体媒介アブレーション：増強された補体結合及びｉＮＫＧ２Ｄ．ＡＦを発現するＴ細胞への標的化送達を伴うＦｃ試薬を作製するために、直交リガンドを、ＧＧＧＳリンカーを介してヒトＩｇＧ１ ＦｃのＮ末端（Ｕ２Ｒ－Ｆｃ）又はＣ末端（Ｆｃ－Ｕ２Ｒ）のいずれかへの融合物としてクローニングし、Ｆｃは、ヒンジ、ＣＨ２、及びＣＨ３ドメインを含んでいた。野生型Ｆｃに加えて、Ｋ３２６Ａ／Ｅ３３３Ａ２１（Ｋａｂａｔ番号付け、「ＡＡ」）及びＳ２６７Ｅ／Ｈ２６８Ｆ／Ｓ３２４Ｔ／Ｇ２３６Ａ／Ｉ３３２Ｅ２０（「ＥＦＴＡＥ」）といったＣ１ｑの結合を増強した変異体セットを探索した。全てをＥｘｐｉ２９３Ｔ細胞に発現させ、前述のように精製し、分画した。確認的ＥＬＩＳＡは、Ｆｃ－ＮＫＧ２Ｄ．ＡＦで捕捉し、続いて１μｇ／ｍＬの濃度でＵ２Ｒ／Ｆｃバリアント融合物を結合させ、ヒトＣ１ｑタンパク質（Ａｂｃａｍ番号ａｂ９６３６３）で滴定し、次いでポリクローナルヒツジ抗Ｃ１ｑ－ＨＲＰ抗体（Ａｂｃａｍ番号ａｂ４６１９１）で検出することによって行った。補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）アッセイは、ｉＱ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｂｅｒｋｅｌｅｙ，ＣＡ）によって行われた。端的に述べると、ＮＫＧ２Ｄ．ＡＦ－ＣＡＲ形質導入からの５×１０^４個のＣＤ８＋細胞を９６ウェルプレートに播種し、最終濃度（ｖ／ｖ）１０％の正常なヒト血清補体（Ｑｕｉｄｅｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）の存在下で、各Ｕ２Ｒ／Ｆｃバリアント融合物の連続希釈物と３時間、３回インキュベートした。次いで、細胞を採取し、５μｇ／ｍＬの最終濃度でＳＹＴＯＸ（商標）Ｒｅｄ死細胞染色試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）とともに再懸濁し、フローサイトメトリーによって分析した。細胞障害性のＥＣ５０値を、非線形回帰曲線に適合したＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍで計算した。

【0057】

ｉＮＫＧ２Ｄ－ＣＡＲを発現するＴ細胞への変異型ＩＬ２の送達：Ｕ２Ｓ３リガンドの単量体であり、変異型ＩＬ－２の単量体であり、ＩＬ－２Ｒα（ｍｕｔＩＬ２、Ｒ３８Ａ／Ｆ４２Ｋ）に結合する能力を持たないが（Ｈｅａｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５３，２５９７－２６０２（１９９３）、Ｓａｕｖｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８８，４６３６－４６４０（１９９１））、血清安定性を保持する試薬を作製するために、ヘテロ二量体Ｆｃ戦略を採用した。Ｇｕｎａｓｅｋａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８５，１９６３７－１９６４６（２０１０）。Ｕ２Ｓ３を、Ｋ３９２Ｄ／Ｋ４０９Ｄ（Ｋａｂａｔ番号付け）変異を有する一方の鎖のＦｃヒンジのＮ末端に融合させ、ｍｕｔＩＬ２を、Ｅ３５６Ｋ／Ｄ３９９Ｋ変異を有する第２のＦｃ鎖のＣ末端に融合させた。更に、Ｄ２６５Ａ／Ｎ２９７Ａ変異を両方のＦｃ鎖に導入して、ＦｃをＡＤＣＣ欠損にした。Ｅｘｐｉ２９３Ｔ細胞における発現及び精製は、前述のとおりであった。適切に組み立てられたＵ２Ｓ３－ｈＦｃ－ｍｕｔＩＬ２材料をＳＥＣによって分画し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥを変性させることによって個々の適切なサイズのポリペプチドの存在を確認した。グリシン－セリン結合、フラグタグ、及び６ｘＨｉｓタグを含むリンカーを用いた、直交リガンドと、単一ポリペプチドとして発現するｍｕｔＩＬ２との間の直接融合も形成し、Ｎｉ－ＮＴＡ交換クロマトグラフィーによって精製した。Ｇｈａｓｅｍｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ７，１２８７８（２０１６）。ＩＵｅ活性当量の決定は、野生型ＩＬ－２の４．４μＭ溶液が１０００ＩＵ／μＬの当量を有するという計算に基づいていた。ＩＬ－１５Ｒαへの結合を減少させたが生体活性を保持したＶ４９Ｄ変異を有するＩＬ－１５を、Ｕ２Ｓ３で同様にフォーマットした。Ｂｅｒｎａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９，２４３１３－２４３２２（２００４）。

【0058】

様々なサイトカイン又はＵ２Ｓ３－サイトカイン融合物に応答したＣＡＲ－Ｔ細胞増殖を、ＷＳＴ－１細胞増殖試薬（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ番号５０１５９４４００１）で定量した。端的に述べると、ＣＡＲ－Ｔ細胞をペレット化し、ＩＬ－２を含まないＴ細胞培地中に再懸濁し、９６ウェルプレートに４×１０^４細胞／ウェルで分注し、適切な量の希釈Ｕ２Ｓ３－サイトカイン融合物を添加して、ウェル当たり１００μＬの最終アッセイ体積で３０ＩＵｅ／ｍＬ又は必要に応じてそれ以上の濃度を達成した。組換えヒトＩＬ２及びＩＬ１５（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ番号２００－０２及び番号２００－１５）を対照として含めた。３７℃で３日間インキュベートした後、１０μＬのＷＳＴ－１を各ウェルに添加し、３０～６０分間インキュベートさせた後、プレートリーダー上で発色の強度を定量した。Ｕ２Ｓ３－サイトカイン融合物に応答したＧＦＰ＋ＣＡＲ発現細胞の割合の変化をフローサイトメトリーによってモニターした。サイトカイン融合物が関与したときのＳＴＡＴ３又はＳＴＡＴ５の活性化をモニターするために、ＩＬ－２を補充していないＴＣＭ培地中に細胞を一晩静置し、次いで、１５０ＩＵｅ／ｍＬのＩＬ－２、ＩＬ－１５、Ｕ２Ｓ３－ｈＦｃ－ｍｕｔＩＬ２、又はＵ２Ｓ３－ｈＦｃ－ｍｕｔＩＬ１５で２時間処理した後、細胞内のｐｈｏｓｐｏ－ＳＴＡＴ３（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ＰＥ抗ＳＴＡＴ３Ｔｙｒ７０５クローン１３Ａ３－１）及び－ＳＴＡＴ５（ＢＤ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７抗ＳＴＡＴ５ ｐＹ６９４クローン４７）を固定して染色した。時間的応答をモニターするために、サイトカイン又はＵ２Ｓ３－ｈＦｃ－サイトカイン融合物への曝露の０、３０、６０、及び１２０分後に、処理されたｃｏｎｖｅｒｔｉｂｌｅＣＡＲ－ＣＤ８Ｔ細胞を固定し、次いで染色した。

【0059】

ヒトＰＢＭＣ刺激及び免疫表現型試験を行った。端的に述べると、３人のドナーからの正常なＰＢＭＣを、１×１０^５細胞／ウェルで９６ウェルプレートに播種し、Ｕ２Ｓ３－ｈＦｃ－ｍｕｔＩＬ２又はＵ２Ｓ３－ｈＦｃ－ｗｔＩＬ２（野生型ＩＬ２）のいずれかの１０倍希釈系列に、５％ＣＯ_２を用いて３７℃で４日間曝露した。陽性対照は、２μｇ／ｍＬの抗ヒトＣＤ３（ＯＫＴ２）及び３００ＩＵｅ／ｍＬのｒｈＩＬ－２でコーティングしたウェルを含んでいた。インキュベーション後、細胞をＴｒｕＳｔａｉｎ ＦｃＸ Ｂｌｏｃｋ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ番号４２２３０１）で処理し、続いて、増殖Ｔ細胞（ＣＤ８クローンＲＰＡ－Ｔ８番号３０１０５０、ＣＤ４クローンＯＫＴ４番号３１７４１０、ＣＤ３クローンＯＫＴ３番号３００４３０、Ｋｉ－６７番号３５０５１４）、及びＴｒｅｇ細胞（Ｆｏｘ３クローン２０６Ｄ番号３２０１０６、ＣＤ４クローンＯＫＴ４、ＣＤ３クローンＯＫＴ３、Ｋｉ－６７）用のＢｉｏＬｅｇｅｎｄ抗体パネルで染色した。

【0060】

結果
直交ＮＫＧ２Ｄ－リガンド相互作用を操作する：各ＮＫＧ２Ｄ単量体中の２つの中央チロシン残基は、受容体－リガンド相互作用を駆動する上で重要な役割を有する。Ｃｕｌｐｅｐｐｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４８，５１６－５２３（２０１１）。これらの残基における変異を深く探求し、Ｙ１５２Ａ変異体（「ｉＮＫＧ２Ｄ．ＹＡ」）及びＹ１５２Ａ／Ｙ１９９Ｆ二重変異体（「ｉＮＫＧ２Ｄ．ＡＦ」）を更なる試験のために選択し、バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）（図２Ａ及び３Ａ）及びＥＬＩＳＡ（図２Ｂ）によって、全ての天然に存在するヒトリガンドへの結合が消失したことを確認した。ＵＬＢＰ２ Ａ１Ａ２ドメインは、多型ではないため、ｉＮＫＧ２Ｄバリアントの各々への高親和性結合を示す変異体のファージディスプレイベースの選択のために選択された。ヘリックス２及びヘリックス４を照合するＮＮＫライブラリーでは、ヘリックス４バリアントのみが見つかり、その場合であっても、ＵＬＢＰ２ Ａ１Ａ２ドメインに対する安定化の役割を有する可能性が高い自発的なＲ８１Ｗ変異との関連性においてのみであった。ｗｔＮＫＧ２Ｄの濃度を増加させたラウンドでの競合的選択（図４Ａ）により、抗ＦＧＦＲ３抗体クローンＲ３ＭａｂのＩｇＧ１重鎖のＣ末端への融合物として再フォーマットされた場合であっても、ｉＮＫＧ２Ｄ．ＹＡに対して排他的に再現性よく結合する３つのバリアント、Ｕ２Ｓ１、Ｕ２Ｓ２、及びＵ２Ｓ３が得られた（図４Ｂ）。Ｒ８１Ｗ変異単独で、ｗｔＮＫＧ２Ｄ及びｉＮＫＧ２Ｄ．ＹＡの両方に対する親和性が増強されたが（図４Ｂ及び４Ｃ）、その野生型残基への復帰がｉＮＫＧ２Ｄ．ＹＡへの結合の損失をもたらしたため、ｉＮＫＧ２Ｄ選択的バリアントにおけるその存在が不可欠であるとみなされた。Ｕ２Ｓ３は一貫してより大きな結合差異を示したため、より徹底的な特徴付けを行って、野生型ＵＬＢＰ２のｗｔＮＫＧ２Ｄに対する親和性よりも１０倍高い親和性をｉＮＫＧ２Ｄ．ＹＡに対して有する単量体として示された（図４Ｃ）。配列番号１１のＡ１－Ａ２ドメインは、Ｕ２Ｓ３リガンド（配列番号３０）に基づく。ｉＮＫＧ２Ｄ．ＹＡへのピコモル結合を二価のリツキシマブ抗体融合物で測定したところ、軽鎖（ＬＣ）及び重鎖（ＨＣ）の両方の融合構成によって直交性が保持されていた（図５）。

【0061】

候補直交バリアントをｉＮＫＧ２Ｄ．ＡＦの場合と同様に同定し、リツキシマブ－ＬＣ融合物をＦｃ－ｗｔＮＫＧ２Ｄ、Ｆｃ－ｉＮＫＧ２Ｄ．ＹＡ、及びＦｃ－ｉＮＫＧ２Ｄ．ＡＦと比較したＥＬＩＳＡによって、ｉＮＫＧ２Ｄ．ＡＦにのみ選択的に結合する４つのバリアントが同定されたが（図３Ｂ）、Ｕ２Ｒバリアントが最も選択的であった。ｉＮＫＧ２Ｄ．ＹＡ及びｉＮＫＧ２Ｄ．ＡＦの両方に対するリツキシマブ．ＬＣ－Ｕ２Ｓ３及びリツキシマブ．ＬＣ－Ｕ２Ｒの結合を比較したＥＬＩＳＡによって、独立して選択されたこれら２つの直交リガンドが、それが進化した不活性ＮＫＧ２Ｄバリアントに排他的に関与していたことが確認された（図３Ｃ）。

【0062】

キメラ抗原受容体としてのｉＮＫＧ２Ｄ．ＹＡの発現：４－１ＢＢ、ＣＤ３ζ、及びｅＧＦＰに融合されたｉＮＫＧ２Ｄ．ＹＡの、初代ヒトＴ細胞へのレンチウイルス形質導入により、同じヒンジ、膜貫通、及び細胞内アーキテクチャを有するリツキシマブ－ｓｃＦｖベースのＣＡＲ構築物（ＲＩＴｓｃＦｖ－ＣＡＲ）と同等のロバストな導入遺伝子発現を示すｃｏｎｖｅｒｔｉｂｌｅＣＡＲ－Ｔ細胞を効率的に作製した（図２ｂ及び図６）。リツキシマブＬＣ－Ｕ２Ｓ３ ＭｉｃＡｂｏｄｙによるｉＮＫＧ２Ｄ．ＹＡの表面染色は、ＧＦＰ発現と強く相関しており、ＣＡＲ発現の効率とＴ細胞表面上のｉＮＫＧ２Ｄの提示との間の直接的な関係が示唆された（図７Ｃ）。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７とコンジュゲートしたリツキシマブ．ＬＣ－Ｕ２Ｓ３ ＭｉｃＡｂｏｄｙ及び標準定量ビーズのフローサイトメトリーを用いて、表面上に発現するｉＮＫＧ２Ｄ．ＹＡの量の中央値は２１，０００分子であると推定された。野生型又はＵ２Ｓ３リガンドでコーティングされたマイクロタイタープレートへのｃｏｎｖｅｒｔｉｂｌｅＣＡＲ－ＣＤ８＋細胞のインキュベーションによるｉＮＫＧ２Ｄ．ＹＡ－ＣＡＲ受容体の直接的な関与は、ＩＬ－２及びＩＦＮγの活性化及び遊離をＵ２Ｓ３のみでもたらしたが、ｗｔＮＫＧ２Ｄ－ＣＡＲ担持細胞は野生型リガンドにのみ応答したことから、Ｔ細胞との関連おける直交相互作用の選択性が裏付けられる（図８Ａ）。更に、ｃｏｎｖｅｒｔｉｂｌｅＣＡＲ－Ｔ細胞機能の活性化は、適切な同族ＵＬＢＰ２バリアントの存在に依存していた。ｉＮＫＧ２Ｄ．ＹＡを発現する又はｉＮＫＧ２Ｄ．ＡＦを発現するＴ細胞のみが、それぞれの直交リガンド、すなわちＵ２Ｓ３又はＵ２Ｒを有するＭｉｃＡｂｏｄｙで武装した場合に、Ｒａｍｏｓ（ＣＤ２０＋）標的細胞を溶解した（図３Ｄ）。Ｒａｍｏｓ細胞の共培養単独では、ｃｏｎｖｅｒｔｉｂｌｅＣＡＲ－ＣＤ８＋細胞の活性化を駆動するのに十分ではなかった。リツキシマブ抗体もトラスツズマブＬＣ－Ｕ２Ｓ３もＣＡＲ細胞を活性化しなかったのに対し、リツキシマブＬＣ－Ｕ２Ｓ３は３２～１６０ｐＭの範囲で最大サイトカイン放出を引き起こしたため、代わりに適切な抗原標的化ＭｉｃＡｂｏｄｙが必要であった。更に、リツキシマブ．ＬＣ－Ｕ２Ｓ３ ＭｉｃＡｂｏｄｙを有するｃｏｎｖｅｒｔｉｂｌｅＣＡＲ－Ｔ細胞によるサイトカイン放出は、ＲＩＴｓｃＦｖ－ＣＡＲ細胞の放出を上回った（図８Ｂ）。これらのデータは、Ｔ細胞機能のロバストな活性化を駆動するためには、標的とｃｏｎｖｅｒｔｉｂｌｅＣＡＲ－Ｔ細胞との間にｓｃＦｖ－ＣＡＲ１９について特徴付けられるものと恐らく同様の接合部を形成するための、適切な抗原標的化ＭｉｃＡｂｏｄｙが必要であることを実証した（図９Ａ）。

【0063】

蛍光標識されたリツキシマブＬＣ－Ｕ２Ｓ３ ＭｉｃＡｂｏｄｙを用いたｃｏｎｖｅｒｔｉｂｌｅＣＡＲ－ＣＤ８＋細胞の染色により、５ｎＭで全ｉＮＫＧ２Ｄ．ＹＡ－ＣＡＲ受容体の飽和が明らかになった（図９Ｂ）。しかしながら、減少する量のリツキシマブＬＣ－Ｕ２Ｓ３で武装したｃｏｎｖｅｒｔｉｂｌｅＣＡＲ－ＣＤ８＋細胞の共培養殺傷実験において、Ｒａｍｏｓ標的細胞の溶解活性は、受容体の完全占有に必要とされるよりも２桁少ない量である３０ｐＭで飽和応答に達した（図９Ｃ）。この結果は、過剰な非占有ｉＮＫＧ２Ｄ．ＹＡ－ＣＡＲ受容体を異種ＭｉｃＡｂｏｄｙで武装して、複数の標的に対する活性を同時に誘導することができることを示唆している。これを直接試験するために、ｃｏｎｖｅｒｔｉｂｌｅＣＡＲ－ＣＤ８＋細胞をリツキシマブ．ＬＣ－Ｕ２Ｓ３、トラスツズマブ．ＬＣ－Ｕ２Ｓ３（Ｈｅｒ２を標的とする）、又は２つのＭｉｃＡｂｏｄｙの等モル混合物で武装し、Ｒａｍｏｓ細胞又はＣＴ２６－Ｈｅｒ２のいずれかに曝露した。単一のＭｉｃＡｂｏｄｙで武装したＣＡＲ細胞は、同種抗原を発現する腫瘍細胞のみに溶解を誘導したが、二重武装ＣＡＲは、溶解能を損なうことなく両方の腫瘍細胞株を標的とした（図９Ｄ）。

【0064】

ｃｏｎｖｅｒｔｉｂｌｅＣＡＲ－Ｔ細胞は、播種性Ｂ細胞リンパ腫を抑制する：ＮＳＧマウスにおけるＨＣ及びＬＣ両方のリツキシマブ－Ｕ２Ｓ３ ＭｉｃＡｂｏｄｙの薬物動態は（図１０Ａ）、内因性マウス野生型ＮＫＧ２ＤへのＵ２Ｓ３結合の保持に起因するＭｉｃＡｂｏｄｙのより急なα相を有する親抗体に匹敵するβ相を明らかにした（図１０Ｃ）。ＬＣ－Ｕ２Ｓ３融合物（すなわち、Ａ１－Ａ２ドメインが抗体の軽鎖に融合されている抗体融合タンパク質）は、ＨＣ融合ＭｉｃＡｂｏｄｙ（すなわち、Ａ１－Ａ２ドメインが抗体の重鎖に融合されている抗体融合タンパク質）よりも長い末端半減期を有していた。ＬＣ－Ｕ２Ｓ３融合物はまた、Ｒａｍｏｓ標的細胞を用いたインビトロ殺傷アッセイでＨＣ融合物よりも優れており（図１０Ｂ）、ＮＳＧマウスにおけるＲａｊｉ Ｂ細胞リンパ腫の増殖を抑制する際に早期時点でより有効であると考えられた。要約すると、抗体の軽鎖のＮ末端に融合されたＡ１－Ａ２ドメインを含む抗体融合タンパク質は、Ａ１－Ａ２ドメインが重鎖に融合された抗体構築物よりも驚くほど優れていた。

【0065】

リツキシマブＬＣ－Ｕ２Ｓ３（Ｒｉｔ－Ｓ３；Ｕ２Ｓ３のＡ１－Ａ２ドメインが抗体の軽鎖に融合されている抗体融合タンパク質）を、リンパ腫を制御するための投与パラメータを探索する更なる実験に用いた。高い濃度は、ＣＡＲ細胞上の受容体及び腫瘍細胞上の抗原の過剰飽和をもたらし得、それによって生産的な関与を妨げる可能性があるため、２０μｇの中間的なＲｉｔ－Ｓ３用量が最も有効であることが示された。更に、４日毎に対して２日毎というより高い頻度のＲｉｔ－Ｓ３投与を、より高い用量（１０×１０^６）のｃｏｎｖｅｒｔｉｂｌｅＣＡＲ－Ｔ細胞と組み合わせると、腫瘍増殖の最大の抑制がもたらされた。Ｒｉｔ－Ｓ３単独では、腫瘍制御には効果がなかったが、移植片対腫瘍効果は、非形質導入コホート及びｃｏｎｖｅｒｔｉｂｌｅＣＡＲのみのコホートの両方で一貫して観察された。Ｒｉｔ－Ｓ３は、試験期間を通じてマウスの血清中で検出可能であり、より頻繁な投与ではより早くピークレベルが出現した。

【0066】

最適化されたｃｏｎｖｅｒｔｉｂｌｅＣＡＲ－Ｔ投与を用いたＲａｊｉ播種性リンパ腫モデルを実施し、２日毎に２０μｇのＲｉｔ－Ｓ３を投与して、５×１０^６（５Ｍ）と１５×１０^６（１５Ｍ）のｃｏｎｖｅｒｔｉｂｌｅＣＡＲ－Ｔ細胞を比較した。陽性対照として、ｃｏｎｖｅｒｔｉｂｌｅＣＡＲ－Ｔ細胞に匹敵するインビトロでのＲａｍｏｓ殺傷力を有するＲＩＴｓｃＦｖ－ＣＡＲ細胞も含めた（図８Ｂ）。合計５ＭのＴ細胞で、ＲＩＴｓｃＦｖ－ＣＡＲ及びｃｏｎｖｅｒｔｉｂｌｅＣＡＲ＋Ｒｉｔ－Ｓ３の両方が、腫瘍を制御するのに有効であった。腫瘍の平均生物発光シグナルはＲＩＴｓｃＦｖ－ＣＡＲコホートの方が低く（図１１Ａ）、そのコホートの５匹のマウスのうち４匹の腫瘍組織が消失したように見えたが、ｃｏｎｖｅｒｔｉｂｌｅＣＡＲ＋Ｒｉｔ－Ｓ３コホートでは５匹のマウスのうち３匹で消失したように見えた（図１１Ｂ）。ＣＡＲ－Ｔ細胞の総注入用量を１５Ｍ細胞に増加させた場合、ＲＩＴｓｃＦｖ－ＣＡＲ及びｃｏｎｖｅｒｔｉｂｌｅＣＡＲ＋Ｒｉｔ－Ｓ３の両方が、腫瘍増殖を完全にブロックすることができた（図１１Ａ及び１１Ｂ）。全ての試験において、末梢ヒトＣＤ３＋Ｔ細胞のピークレベルは、注入後約７日で一貫して出現し、１４日までには、ｓｃＦｖ－ＣＡＲ及びｃｏｎｖｅｒｔｉｂｌｅＣＡＲ－Ｔ細胞の両方で大部分のマウスに収縮が認められた（図１１Ｄ）。非形質導入コホート及びｃｏｎｖｅｒｔｉｂｌｅＣＡＲのみのコホートにおけるＣＤ３＋細胞の遅延増殖があったが、それは移植片対腫瘍応答の開始と同時期であり、特異的反応性クローンの増殖の結果であった可能性が高い。ｃｏｎｖｅｒｔｉｂｌｅＣＡＲ＋Ｒｉｔ－Ｓ３コホートにおいて、マウスの血液中にＭｉｃＡｂｏｄｙと関連したｃｏｎｖｅｒｔｉｂｌｅＣＡＲ－Ｔ細胞が観察された（図１１Ｅ）。

【0067】

ｃｏｎｖｅｒｔｉｂｌｅＣＡＲ－Ｔ細胞は、皮下リンパ腫を抑制する：Ｒａｊｉ Ｂ細胞を皮下移植して、ｃｏｎｖｅｒｔｉｂｌｅＣＡＲシステムが固形腫瘍塊の増殖を抑制する能力を評価した。腫瘍が１０日で確立されてから、６０μｇのＲｉｔ－Ｓ３の単回静脈内投与後に、７×１０^６（７Ｍ）又は３５×１０^６（３５Ｍ）のいずれかのｃｏｎｖｅｒｔｉｂｌｅＣＡＲ－Ｔを投与した。更に、１つのコホートには、投与前に飽和濃度のＲｉｔ－Ｓ３で予め武装した３５Ｍの細胞を与えたが、追加のＭｉｃＡｂｏｄｙを導入する注射は行わなかった。Ｒｉｔ－Ｓ３とともに７ＭのｃｏｎｖｅｒｔｉｂｌｅＣＡＲ－Ｔ細胞を投与すると（７Ｍ＋Ｒｉｔ－Ｓ３）、ｃｏｎｖｅｒｔｉｂｌｅＣＡＲ－Ｔ細胞単独と比較して腫瘍サイズが縮小した（図１２Ａ）。更に、３５Ｍ＋Ｒｉｔ－Ｓ３コホートでは、腫瘍増殖が完全に抑制された。３５Ｍの予め武装した細胞を与えたコホートにおける腫瘍増殖も阻害された。注入後２日までに、予め武装していたｃｏｎｖｅｒｔｉｂｌｅＣＡＲ－Ｔ細胞は、検出可能な表面関連Ｒｉｔ－Ｓ３ ＭｉｃＡｂｏｄｙ（図１２Ｃ）を有しなかったが、これは恐らく活性化誘導性の細胞増殖と武装受容体のターンオーバーとの組み合わせに起因する武装解除の結果である。Ｒｉｔ－Ｓ３の血清レベルは、試験全体にわたって両方のＣＡＲ－Ｔ細胞用量で同等であり、２１日目まで持続し（図１２Ｂ）、高レベルの武装した末梢ＣＡＲ細胞に対応する約６００ｎｇ／ｍＬ（３．２ｎＭ）で検出された（図１２Ｃ）。試験の４５日目までに、３５Ｍ＋Ｒｉｔ－Ｓ３を与えたコホートは、比較的高いＣＤ３＋Ｔ細胞数を維持したが、ＭｉｃＡｂｏｄｙで十分に武装されておらず、７Ｍ＋Ｒｉｔ－Ｓ３コホートは、表面関連ＭｉｃＡｂｏｄｙを維持した細胞を有していた。このことは、ＭｉｃＡｂｏｄｙレベルが血漿中で検出可能限界を下回ったために、高いＣＡＲ－Ｔ細胞レベルでＣＡＲの武装を維持できなかったことを示唆するものであった。代替の可能性は、３５Ｍ＋Ｒｉｔ－Ｓ３コホートにおけるより高いＣＤ３＋細胞数が、ＣＡＲ構築物を発現しない細胞の移植片対腫瘍サブセットの増殖を反映するというものである。しかしながら、３５Ｍの予め武装したコホートではＣＤ３＋細胞数の上昇が見られなかったため、この場合には当てはまらないことが示唆される。要約すると、予め武装したｃｏｎｖｅｒｔｉｂｌｅＣＡＲ－Ｔは、腫瘍増殖を阻害する強力な抗腫瘍応答を発揮することができた。更に、ｃｏｎｖｅｒｔｉｂｌｅＣＡＲ－Ｔは、適切なインビボレベルでのｃｏｎｖｅｒｔｉｂｌｅＣＡＲ－Ｔ細胞の武装が維持されたときに、固形リンパ腫を効果的に制御することができた。

【0068】

ｃｏｎｖｅｒｔｉｂｌｅＣＡＲ－Ｔ細胞への生体分子の選択的送達：ｉＮＫＧ２Ｄバリアントとそれらの直交リガンドとの間の特権的相互作用は、単純にそれらをペイロードとして直交リガンド自体に融合させることによって、ｉＮＫＧ２Ｄ－ＣＡＲ発現細胞への薬剤の選択的送達を可能にする。この特徴の有用性を実証するために、補体系を利用した標的化アブレーション及び活性化サイトカインの選択的送達の２つの異なる応用を探索した。第１の応用では、Ｕ２Ｒバリアントを、野生型ヒトＩｇＧ１ ＦｃドメインのＮ末端若しくはＣ末端のいずれか、又はＣ１ｑ結合を増強すると前述した変異型ＦｃドメインＳ２６７Ｅ／Ｈ２６８Ｆ／Ｓ３２４Ｔ／Ｇ２３６Ａ／Ｉ３３２Ｅ（「ＥＦＴＡＥ」）及びＫ３２６Ａ／Ｅ３３３Ａ（「ＡＡ」）に融合させた（図１３Ａ）。エピトープタグ化ＣＡＲ細胞を標的とする完全な治療用抗体とは対照的に、Ｆｃ部分のみを使用することにより、非ｉＮＫＧ２Ｄ発現細胞のオプソニン化の付随的影響を回避する。増強されたＣ１ｑ結合を、ＥＦＴＡＥ＜ＡＡ＜ｗｔの相対的順序のＫｄでＥＬＩＳＡによって確認した（図１３Ｂ）。ｉＮＫＧ２Ｄ．ＡＦ－ＣＡＲ細胞は、濃度及びＣ１ｑ親和性の両方に依存する様式でヒト補体による殺傷に感受性であったが（図１３Ｃ及び１３Ｄ）、非形質導入細胞は影響を受けなかった。興味深いことに、Ｕ２Ｒ融合の方向は機能にとって重要であり、Ｆｃを抗体と一致する様式で配向するＮ末端融合が、はるかに効果的であった。Ｕ２Ｓ３とｉＮＫＧ２Ｄ．ＹＡのペアリングで同様の結果が得られた（図１３Ｅ及び１３Ｆ）。

【0069】

ｉＮＫＧ２Ｄ－ＣＡＲ発現細胞に選択的にサイトカインを送達する直交リガンドの潜在的な能力は、それらの増殖を促進するだけでなく、Ｔ細胞の表現型及び機能を制御するために差次的サイトカインシグナル伝達を潜在的に活用するという利点を有する。一般的な設計原理として、ＣＡＲを発現しない免疫細胞との関与を減少させ、野生型サイトカインに関連する毒性を最小限に抑えるために、それらの天然受容体複合体への結合を減少させた変異型サイトカインを用いた。更に、サイトカイン融合物を一価に維持して、結合活性が増強された結合及びシグナル伝達を排除した。この目的のために、ＩＬ－２（ｍｕｔＩＬ２）２５のＲ３８Ａ／Ｆ４２Ｋ変異及びＩＬ－１５（ｍｕｔＩＬ１５）のＶ４９Ｄ変異は、ＩＬ－２Ｒβ／γ複合体の関与を維持しながら、各サイトカインのそれぞれのＲαサブユニットへの結合を劇的に減少させる。ｍｕｔＩＬ２又はｍｕｔＩＬ１５のいずれかに融合されたｉＮＫＧ２Ｄ．ＹＡ直交バリアントＵ２Ｓ２を用いた初期実験では、ｉＮＫＧ２Ｄ．ＹＡ－ＣＡＲ発現細胞の増殖は促進されたが、ｗｔＮＫＧ２Ｄ－ＣＡＲを発現する細胞の増殖は促進されなかった（図１４Ａ）。両方の細胞集団は、ｗｔＮＫＧ２ＤとｉＮＫＧ２Ｄ．ＹＡとを区別しないＵＬＢＰ２．Ｒ８１Ｗバリアントの存在下で増殖した。リガンドへの直接融合又はヘテロ二量体Ｆｃ結合（例えば、Ｕ２Ｓ２－ｈＦｃ－ｍｕｔＩＬ２）を介した融合は、存在する非形質導入細胞を超える密度までＧＦＰ＋ｃｏｎｖｅｒｔｉｂｌｅＣＡＲ－Ｔ細胞の増殖を促進し（図１４Ｂ）、これらの増殖したｃｏｎｖｅｒｔｉｂｌｅＣＡＲ－Ｔ細胞は、その細胞溶解能を維持した（図１４Ｃ）。ＭｉｃＡｂｏｄｙ、一価Ｕ２Ｓ３－ｈＦｃ（サイトカインのペイロードなし）、又はｍｕｔＩＬ２単独によるｉＮＫＧ２Ｄ．ＹＡの関与は、ｃｏｎｖｅｒｔｉｂｌｅＣＡＲ－ＣＤ８細胞の増殖を促進するには不十分であった（図１４Ａ及び１４Ｄ）。ＳＴＡＴ３及びＳＴＡＴ５のリン酸化（ｐＳＴＡＴ３及びｐＳＴＡＴ５）のフローサイトメトリーによる特徴付けによって、野生型ＩＬ－２又はＩＬ－１５への曝露が、非形質導入細胞及びｃｏｎｖｅｒｔｉｂｌｅＣＡＲ－ＣＤ８細胞の両方においてｐＳＴＡＴ３及びｐＳＴＡＴ５の増加をもたらすことが明らかになった。Ｕ２Ｓ３－ｈＦｃ－ｍｕｔＩＬ２による非形質導入細胞の処理は、非サイトカイン対照と比較してｐＳＴＡＴ５の最小限のシフトをもたらしたのみであり、ＩＬ－２Ｒβ／γｃ結合のｍｕｔＩＬ２の保持と一致していた。ｃｏｎｖｅｒｔｉｂｌｅＣＡＲ－ＣＤ８細胞は、ＪＡＫ３のγ鎖活性化を介したｐＳＴＡＴ５レベルの増加を伴って、Ｕ２Ｓ３－ｈＦｃ－ｍｕｔＩＬ２及びＵ２Ｓ３－ｈＦｃ－ｍｕｔＩＬ１５の両方に応答した。野生型サイトカインとは異なり、ｐＳＴＡＴ３シグナルの増加は観察されず、Ｒα結合の破壊の結果として、両方のシナリオにおいてＩＬ－２Ｒβ２８によるＪＡＫ１活性化の低下が示され、ＩＬ－２Ｒβに対するＩＬ－１５の親和性を増加させる際のＩＬ－１５Ｒαの役割によって仮説が裏付けられた。Ｕ２Ｓ３－ｈＦｃ－ｍｕｔＩＬ２及びＵ２Ｓ３－ｈＦｃ－ｍｕｔＩＬ１５の応答の動態はほぼ同一であり、それらの変異形態における機能的冗長性が示唆された。

【0070】

Ｕ２Ｓ３－ｈＦｃ－ｍｕｔＩＬ２は、数日間のインビボＰＫ半減期を有することが示された（図１４Ｅ）。腫瘍の非存在下でＮＳＧマウスに投与されたｃｏｎｖｅｒｔｉｂｌｅＣＡＲ－Ｔ細胞は、恒常的増殖を経て、３日間でピークに達し、続いて収縮した。１週間間隔で段階的に行われたＵ２Ｓ３－ｈＦｃ－ｍｕｔＩＬ２の３回の注射が、末梢血中のヒトＴ細胞の劇的な増殖をもたらし（図１５Ａ）、Ｕ２Ｓ３－ｈＦｃ－ｍｕｔＩＬ２の停止後にＴ細胞数が減少したことは、増殖の大部分を駆動するＣＤ８＋Ｔ細胞によって裏付けられた。増殖と並行して、ＧＦＰ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の割合が１００％に増加し、ｉＮＫＧ２Ｄ－ＣＡＲ発現細胞の選択的増殖が実証されたが、非形質導入細胞では実証されなかった（図１５Ｂ）。

【0071】

濃度を増加させた薬剤に４日間曝露した後、増殖マーカーＫｉ－６７に陽性の細胞をフローベースで定量することによって、３人のドナーからの正常なヒトＰＢＭＣに対するＵ２Ｓ３－ｈＦｃ－ｍｕｔＩＬ２の効果をインビトロで探索した（図１６）。－ｍｕｔＩＬ２融合物に加えて、野生型ＩＬ２融合物（Ｕ２Ｓ３－ｈＦｃ－ｗｔＩＬ２）を含めて、ｍｕｔＩＬ２生物活性の低下が、融合フォーマット自体ではなく、用いられた変異の結果であることを直接実証した。ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞は、抗ＣＤ３及び野生型ＩＬ－２陽性対照の両方、並びに最低用量のＵ２Ｓ３－ｈＦｃ－ｗｔＩＬ２に対してロバストに応答した。Ｕ２Ｓ３－ｈＦｃ－ｍｕｔＩＬ２に対する増殖応答は用量依存的な様式で起こり、３００ＩＵｅ／ｍＬを超えるレベルでドナー全体にわたって増殖が観察されたが、３０，０００ＩＵｅ／ｍＬまでＩＬ－２陽性対照のレベルと同等のレベルは達成されなかった。Ｔｒｅｇ応答は、他のドナーよりも低い濃度でＵ２Ｓ３－ｈＦｃ－ｍｕｔＩＬ２に応答した１人のドナーからの細胞（追加的に抗ＣＤ３刺激に対して弱い応答を示した）を除いて、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋細胞のものと同等であった。総合すると、これらのデータは、毒性及びＴｒｅｇ活性化を最小限に抑えながら、リガンド融合ｍｕｔＩＬ２をｃｏｎｖｅｒｔｉｂｌｅＣＡＲ細胞に選択的に送達するための幅広い投与期間を潜在的に提供する超生理学的レベルを除いて、正常なヒトＰＢＭＣがＵ２Ｓ３－ｈＦｃ－ｍｕｔＩＬ２に応答しないという仮説を支持する。

【0072】

Ａ１－Ａ２ドメインの位置及びリンカーの比較：上記の試験に加えて、抗体重鎖又は軽鎖をＡ１－Ａ２ドメインに接続する異なるリンカーを含む構築物を調べた。図１７Ａを参照されたい。ＧＧＧＳ（配列番号１４）リンカー（Ｒｉｔｕｘ．ＨＣｄ．Ｓ３）又はＡＰＴＳＳＳＧＧＧＳ（配列番号１０）リンカー（Ｒｉｔｕｘ．ＨＣｄ．ａｐｔｓ．Ｓ３）を介して重鎖（Ｒｉｔｕｘ．ＨＣｄ）に結合されたＵ２Ｓ３ベースのＡ１－Ａ２ドメインを含むリツキシマブ抗体を作製した。同じリンカー（Ｒｉｔｕｘ．ＨＣｄ．ＬＣ．Ｓ３（ＡＰＴＳＳＳＧＧＧＧＳリンカー（配列番号１０））及びＲｉｔｕｘ．ＨＣｄ．ＬＯＣ．ｇｇｇｓ．Ｓ３（ＧＧＧＳリンカー（配列番号１４）））を介して、Ａ１－Ａ２ドメインをリツキシマブ抗体の軽鎖に融合させた類似の構築物を作製した。構築物を、図１０Ｂに関連して本明細書に記載される方法を用いて調べた。その結果を図１７Ｂに示す。抗体融合構築物であって、配列番号１の可変領域配列を含む重鎖と、配列番号８の可変領域配列を含む軽鎖であって、軽鎖が、Ａ１－Ａ２ドメインにＣ末端で融合された、軽鎖と、を含む、構築物は、腫瘍細胞の殺傷において、Ａ１－Ａ２ドメインが重鎖に結合された構築物よりも優れていた。更に、Ａ１－Ａ２ドメインがＡＰＴＳＳＳＧＧＧＧＳリンカー（配列番号１０）を介して軽鎖に融合された構築物は、ほぼ全ての濃度（０．０４ｎＭ、０．２ｎＭ、１ｎＭ、及び５ｎＭ）で試験された全ての構築物よりも驚くほど優れていた。

【0073】

グリコシル化に影響を与える変異：タンパク質治療薬の製造中に導入されるグリコシル化は、最終生成物に望ましくない不均一性をもたらし得る。配列番号３０内の４０位及び５４位に存在するものを変異させて、置換を介してアラニン又はグルタミンを導入した。これらの置換は、ＨＥＫ２９３細胞でペプチドを発現させたときにＮ－グリコシル化を低下させた。驚くべきことに、ＣＨＯ細胞でペプチドが産生されたとき、変異型Ａ１－Ａ２ドメインペプチドにおいてＮ－グリコシル化が観察された。置換を介してアラニン又はグルタミンを導入するために、８４位の配列に更なる変異を導入した。

【0074】

４０位、５４位、及び／又は８４位に置換を含む変異型Ａ１－Ａ２ドメインの活性は、リツキシマブに融合されたＵ２Ｒリガンドとの関連で確認された。（１）Ａ１－Ａ２ドメインの４０位及び５４位にアラニンを含む、又は（２）Ａ１－Ａ２ドメインの４０位及び５４位にグルタミンを含む、Ｕ２Ｒリガンドを含むリツキシマブ融合タンパク質を、ＣＤ２０＋ｖｅ Ｒａｍｏｓ細胞に対するｉＮＫＧ２Ｄ．ＡＦ－ＣＡＲ細胞を用いた殺傷アッセイで試験した。変異型Ａ１－Ａ２ドメインを含む融合物は、親Ａ１－Ａ２ドメインを有する融合物（４０位及び５４位に置換が存在しない）と同様の性能を示した。

【0075】

配列番号３０（Ｕ２Ｓ３（ＮＱ））の４０位及び５４位でも置換を行い、リツキシマブの軽鎖に融合された変異型Ａ１－Ａ２ドメインを含む融合タンパク質を作製した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより、変異型Ａ１－Ａ２ドメイン融合物が、Ｅｘｐｉ－２９３細胞で発現させたときにＮ－グリコシル化の減少を示したことを確認した。同様の結果がＣＨＯ細胞において観察された。ＥＬＩＳＡアッセイを、前述のものと同様の方法を用いて行い、Ｕ２Ｓ３（ＮＱ）ドメインを含む抗体が、配列番号３０の未修飾Ｕ２Ｓ３ドメインを含む抗体と同様に、ｉＮＫＧ２Ｄ．ＹＡに結合したことを確認した。図１８を参照されたい。野生型ＮＫＧ２Ｄへの結合も試験した。図１９を参照されたい。Ｕ２Ｓ３及びＵ２Ｓ３（ＮＱ）を含むＭｉｃＡｂｏｄｙは、野生型ＮＫＧ２Ｄへの結合が実質的に減少したことを示し、４０位及び５４位にグルタミンを導入すると、野生型ＮＫＧ２Ｄ結合に対して驚くほどに更に不活性な融合がもたらされたことが観察された（すなわち、置換を含むＡ１－Ａ２ドメインは、置換を伴わない親ドメインと同様の程度にｉＮＫＧ２Ｄ．ＹＡに結合したが、野生型ＮＫＧ２Ｄへの結合が更に減少したことが示された）。

【0076】

Ｕ２Ｓ３（ＮＱ）ドメインをＣＨＯ細胞で発現させたとき、ＨＥＫ２９３細胞で発現が行われたときにはＮ－グリコシル化が実質的に存在しないように見えたという事実にもかかわらず、Ｎ－グリコシル化が観察された。Ｕ２Ｓ３（ＮＱ）Ａ１－Ａ２ドメインの更なる置換を行って、アラニン（Ｕ２Ｓ３（ＡＹＴ））又はグルタミン（Ｕ２Ｓ３（ＱＹＴ））を８４位に導入した。リツキシマブ－ＭｉｃＡｂｏｄｙとの関連で、この追加の変異を用いてＯｃｔｅｔ結合実験を行った。８４位でのアラニン又はグルタミンによる置換は、ｉＮＫＧ２Ｄ．ＹＡへの結合を変化させなかった。細胞傷害性も確認された。図２０を参照されたい。Ｒａｍｏｓ標的細胞にカルセインを添加し、ｎＭ濃度を増加させた各被検ＭｉｃＡｂｏｄｙ（Ｕ２Ｓ３、Ｕ２Ｓ３（ＮＱ）、Ｕ２Ｓ３（ＡＹＴ）、及びＵ２Ｓ３（ＱＹＴ）に融合されたリツキシマブ）の存在下で、２０：１のＥ：Ｔ比で２時間、ｉＮＫＧ２Ｄ－ＣＡＲ ＣＤ８＋Ｔ細胞と共培養した。放出されたカルセインの量を定量した。全てのＭｉｃＡｂｏｄｙは同等のレベルの細胞傷害性を媒介したことから、（ａ）ＣＤ２０の関与が損なわれなかったこと及び（ｂ）ｉＮＫＧ２Ｄの関与が本明細書に記載される置換によって損なわれなかったことを示す、したがって、本明細書に記載のＡ１－Ａ２ドメインは、ｉＮＫＧ２Ｄ－ＣＡＲを使用して、グリコシル化の減少を実証し、同等レベルの標的細胞結合及び細胞傷害性を媒介し、野生型ＮＫＧ２Ｄへの更に減少した結合を実証した。

【0077】

考察
本開示は、多用途かつ広範囲に制御可能なプラットフォームをもたらす、非常に適応性の高いＣＡＲのヒト成分から構成される特権的な受容体－リガンド（ｉＮＫＧ２Ｄ．ＹＡ及びＵ２Ｓ３）ペアリングの操作を説明している。ｉＮＫＧ２Ｄ．ＹＡ－ＣＡＲ受容体自体は、直交リガンドを適切な抗原認識抗体に結合させることによって潜在的に任意の目的の抗原に容易に誘導されるＣＡＲ機能を有するＴ細胞上で不変に維持される。このようにして、例えば、元の腫瘍抗原が治療過程中に下方制御された場合、同じｃｏｎｖｅｒｔｉｂｌｅＣＡＲ－Ｔ細胞を必要に応じて再標的化することができる。この標的化の柔軟性は、抗原の逐次的関与に限定されるものではないが、抗原喪失による腫瘍エスケープの可能性を低減するため、腫瘍内抗原発現の不均一性の問題に対応するため、又は腫瘍及び腫瘍微小環境の抑制性細胞成分を同時に標的とするために、Ｔ細胞を同時に複数の抗原に誘導するように多重化することもできる。従来のｓｃＦｖ－ＣＡＲ細胞は、一般に、健康な細胞上に存在する抗原レベルと異常な細胞上に存在する抗原レベルとを区別する能力を低下させる受容体の固定発現レベルに深く関与している。ｃｏｎｖｅｒｔｉｂｌｅＣＡＲ－Ｔ細胞を有するＭｉｃＡｂｏｄｙのようなスイッチ／アダプター戦略の使用は、ＣＡＲ－Ｔを差次的に関与させて、重篤な有害事象のリスクを低減する治療指標を達成する機会を提供し得る。

【0078】

追加の細胞工学を用いることなく、ｉＮＫＧ２Ｄ担持細胞に特異的にペイロードを送達するために特権的な受容体－リガンド相互作用を使用することは、別の利点である。インターロイキン機能を利用して、増殖及び活性化を駆動し、消耗を防ぎ、又は更には制御及び標的化された様式で抑制を促進する能力は、有効性及び安全性にとって有益な結果をもたらすことができる。ＣＡＲ製造中のサイトカイン－リガンド融合物の導入は、患者Ｔ細胞の定性的及び定量的限界に対応することができ、ＣＡＲ注入後のそれらの投与はＣＡＲ－Ｔ細胞の数を拡大することができ、ＣＤ１９－ＣＡＲ療法によるそれらの持続性は奏効率と正の相関がある。ほとんどのＣＡＲ療法は、ＣＡＲ細胞の生着及び増殖を促進するために、リンパ球枯渇プレコンディショニング法を必要とするが、１つの論理的根拠は、ＣＡＲが増殖するためのより未熟な免疫学的設定を提供することである。患者におけるロバストかつ制御可能なｃｏｎｖｅｒｔｉｂｌｅＣＡＲ－Ｔの増殖は、リンパ球枯渇の必要性に取って代わることができ、初期のｃｏｎｖｅｒｔｉｂｌｅＣＡＲ媒介抗腫瘍活性を支持するのに十分な能力を有する内因性免疫機能の保持を可能にし得る。別の臨床戦略は、恐らくは、Ｔ細胞の消耗を低減し、メモリーＴ細胞の維持を促進するためのサイクリングレジメンを用いて、ｃｏｎｖｅｒｔｉｂｌｅＣＡＲ－Ｔ機能を増強するためのサイトカイン－リガンド融合物を送達することであり得る。そして最後に、ＣＡＲが注入後何年もヒトにおいて存続することが実証されているため、新たなバッチのＣＡＲ細胞を再設計又は作製する必要なく、常在するｃｏｎｖｅｒｔｉｂｌｅＣＡＲ－Ｔをリコールして原発性又は二次性の悪性腫瘍を攻撃する能力（元の標的化ＭｉｃＡｂｏｄｙ又は異なるもののいずれかを用いて）は、非常に有利であるはずである。ＣＡＲがサイトカインを構成的に発現するように操作されているシナリオとは異なり、ｃｏｎｖｅｒｔｉｂｌｅＣＡＲ－Ｔ細胞への排他的なサイトカインの送達は、製造上の又は臨床的ニーズに応じて調節され得る。

【0079】

意図的に、ｃｏｎｖｅｒｔｉｂｌｅＣＡＲシステムの各構成要素であるｉＮＫＧ２ＤベースのＣＡＲ受容体及びＭｉｃＡｂｏｄｙ（ＡＤＣＣ欠損）は、それ自体が機能的に不活性である。これは、特に、従来のｓｃＦｖベースのＣＡＲが同士討ちに起因する増殖困難に遭遇するＴ細胞悪性腫瘍等の適応症に関連して、製造中に利点を有する。更に、これは治療中のＣＡＲ機能の制御を増強する。本開示は、従来のｓｃＦｖ－ＣＡＲと同等の抗腫瘍活性の初期バーストを提供するために、投与前にｃｏｎｖｅｒｔｉｂｌｅＣＡＲ－Ｔ細胞をＭｉｃＡｂｏｄｙで武装することができることを実証する。活性化誘導性の複製に加えて、これらの細胞はまた、他の４－１ＢＢ／ＣＤ３ζ ｓｃＦｖ－ＣＡＲで観察されたものと一致する様式で、関与するＣＡＲ受容体を内在化する。これらの２つのプロセスの結果として、ｃｏｎｖｅｒｔｉｂｌｅＣＡＲ－Ｔ細胞は、初期増殖及び標的関与の後に急速に武装解除し、次いで、ＭｉｃＡｂｏｄｙ投与によって制御される様式で再武装及び再関与する機会を提供する。

【0080】

ＵＬＢＰ２に基づくｉＮＫＧ２Ｄ－Ｕ２Ｓ３のペアリングに加えて、本開示は、ヘリックス４ドメインを通るアミノ酸組成が冗長ではないｉＮＫＧ２Ｄ．ＹＡに対する高親和性直交ＭｉｃＡ及びＵＬＢＰ３バリアントを同定する。更に、完全に独立したｉＮＫＧ２Ｄ．ＡＦとＵ２Ｒのペアリングが記載されている。相互に排他的な受容体－リガンドペアを有することにより、例えば、別個の細胞集団（例えば、ＣＤ４及びＣＤ８Ｔ細胞）にそれらを導入して、必要に応じてそれらに差次的に関与することが可能となる。更に、同じ細胞内で、２つのｉＮＫＧ２Ｄバリアントを分割された細胞内シグナル伝達ドメインで発現させて、二重抗原依存性の活性化を提供して腫瘍選択性を高めることができる。代替的に、２つのｉＮＫＧ２Ｄバリアントを、活性化ドメイン又は免疫抑制ドメインのいずれかに差次的に連結して、腫瘍間又は健常組織間のＴ細胞の識別力をそれぞれ増強することができる。

【0081】

要約すると、本明細書に記載のシステムは、異なる細胞表面抗原に容易に標的化されるだけでなく、細胞増殖を駆動するために選択的に外因的に関与することもできる能力を実証した。開発された特権的な受容体－リガンド相互作用は、細胞型に依存せず、細胞に適したシグナル伝達ドメインが提供される限り、任意の目的の細胞に設計することができる。更に、養子細胞療法分野は、製造の時間、複雑さ、及びコストを削減して、より一貫した、容易に利用できる製品を提供するために、同種異系細胞の開発を積極的に追求している。非常に適応性の高いＣＡＲシステムは、同種異系に関する取り組みと極めて相乗的であり、真に普遍的な同種異系ＣＡＲシステムが実証されると、治療分野は、個別化された選択を行うことができるアダプター分子のライブラリーの開発及び実装が比較的容易であることを特徴とするようになるであろう。この戦略はまた、標的化可能な表面抗原を有する任意の病原性細胞への応用の潜在的な領域を拡張する。

【0082】

本明細書で引用される刊行物、特許出願、及び特許を含む全ての参考文献は、各参考文献が個々にかつ具体的に参照により組み込まれることが示され、その全体が本明細書に記載されているかのように、参照により本明細書に組み込まれる。

【図1-1】

【図1-2】

【図1-3】

【図1-4】

【図2A】

【図2B】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図3D】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図5】

【図6】

【図7A】

【図7B】

【図7C】

【図8A】

【図8B】

【図8C】

【図9A】

【図9B】

【図9C】

【図9D】

【図10A】

【図10B】

【図10C】

【図11A】

【図11B】

【図11C】

【図11D】

【図11E】

【図12A】

【図12B】

【図12C】

【図13A】

【図13B】

【図13C】

【図13D】

【図13E】

【図13F】

【図14A】

【図14B】

【図14C】

【図14D】

【図14E】

【図15A】

【図15B】

【図16】

【図17A】

【図17B】

【図18】

【図19】

【図20】

【配列表】

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【国際調査報告】