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特表2024-522167肝疾患の処置のための併用療法

書誌要約請求の範囲詳細な説明課題実施例実施するための形態図面の説明

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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-06-11

(54)【発明の名称】肝疾患の処置のための併用療法

(51)【国際特許分類】

A61K 45/06 20060101AFI20240604BHJP

A61P 1/16 20060101ALI20240604BHJP

A61P 43/00 20060101ALI20240604BHJP

A61K 31/7088 20060101ALI20240604BHJP

A61K 31/712 20060101ALI20240604BHJP

A61K 31/7115 20060101ALI20240604BHJP

A61K 31/7125 20060101ALI20240604BHJP

A61K 38/26 20060101ALI20240604BHJP

A61K 38/22 20060101ALI20240604BHJP

A61P 3/04 20060101ALI20240604BHJP

A61P 29/00 20060101ALI20240604BHJP

A61K 47/54 20170101ALI20240604BHJP

C07K 14/605 20060101ALI20240604BHJP

C12N 15/113 20100101ALI20240604BHJP

【ＦＩ】

A61K45/06 ZNA

A61P1/16

A61P43/00 111

A61P43/00 121

A61K31/7088

A61K31/712

A61K31/7115

A61K31/7125

A61K38/26

A61K38/22

A61P3/04

A61P29/00

A61P43/00 105

A61K47/54

C07K14/605

C12N15/113 130Z

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023575549

(86)(22)【出願日】2022-06-07

(85)【翻訳文提出日】2024-01-26

(86)【国際出願番号】 IB2022055292

(87)【国際公開番号】W WO2022259145

(87)【国際公開日】2022-12-15

(31)【優先権主張番号】63/208,299

(32)【優先日】2021-06-08

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】391008951

【氏名又は名称】アストラゼネカ・アクチエボラーグ

【氏名又は名称原語表記】ＡＳＴＲＡＺＥＮＥＣＡＡＫＴＩＥＢＯＬＡＧ

(74)【代理人】

【識別番号】100106518

【弁理士】

【氏名又は名称】松谷道子

(74)【代理人】

【識別番号】100156144

【弁理士】

【氏名又は名称】落合康

(72)【発明者】

【氏名】リンデン，ダニエル

【テーマコード（参考）】

4C076

4C084

4C086

4H045

【Ｆターム（参考）】

4C076DD66

4C084AA02

4C084AA20

4C084BA01

4C084BA08

4C084BA19

4C084BA23

4C084DB35

4C084DB37

4C084MA55

4C084NA05

4C084NA14

4C084ZA701

4C084ZA751

4C084ZB111

4C084ZB211

4C084ZC411

4C084ZC751

4C086AA01

4C086AA02

4C086EA16

4C086MA02

4C086MA04

4C086MA55

4C086NA05

4C086NA14

4C086ZA70

4C086ZA75

4C086ZB11

4C086ZB21

4C086ZC41

4C086ZC75

4H045AA10

4H045AA30

4H045BA18

4H045BA50

4H045BA55

4H045CA40

4H045DA30

4H045EA20

(57)【要約】

対象の肝疾患を処置する方法であって、この対象に、ｉ）パタチン様ホスホリパーゼドメイン含有３（ＰＮＰＬＡ３）発現の阻害剤と、ｉｉ）グルカゴン受容体及び／又はグルカゴン様ペプチド－１（ＧＬＰ－１）受容体のアゴニストとを投与することを含む方法が提供される。ｉ）ＰＮＰＬＡ３発現の阻害剤と、ｉｉ）グルカゴン受容体及び／又はＧＬＰ－１受容体のアゴニストとを含む医薬及びキットが同様に提供される。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

対象の肝疾患を処置する方法であって、前記対象に、
ｉ）パタチン様ホスホリパーゼドメイン含有３（ＰＮＰＬＡ３）発現の阻害剤と、
ｉｉ）グルカゴン受容体及び／又はグルカゴン様ペプチド－１（ＧＬＰ－１）受容体のアゴニストと
を投与することを含む方法。

【請求項2】

前記ＰＮＰＬＡ３発現の阻害剤は、ＰＮＰＬＡ３をコードする核酸の領域に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＰＮＰＬＡ３をコードする核酸のヌクレオチド５５６７～５７３１内の部位に相補的である、請求項２に記載の方法。

【請求項4】

前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＰＮＰＬＡ３をコードする核酸のヌクレオチド５６４４～５７３１内の部位に相補的である、請求項２に記載の方法。

【請求項5】

前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＰＮＰＬＡ３をコードする核酸のヌクレオチド５５６７～５６４２内の部位に相補的である、請求項２に記載の方法。

【請求項6】

前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＰＮＰＬＡ３をコードする核酸のヌクレオチド５５６７～５６２０内の部位に相補的である、請求項２に記載の方法。

【請求項7】

前記ＰＮＰＬＡ３をコードする核酸は、ｍＲＮＡである、請求項２～６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項8】

前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、１２～３０個のヌクレオシドの長さである、請求項２～７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項9】

前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、１６～３０個のヌクレオシドの長さである、請求項２～７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項10】

前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、１つ又は複数の修飾糖部分を含む、請求項２～９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項11】

前記１つ又は複数の修飾糖部分は、２’－デオキシ、２’－Ｏ－メチル、２’－Ｏ－メトキシメチル、２’－Ｏ－メトキシエチル、２’－フルオロ、４’－ＣＨ（ＣＨ３）－Ｏ－２’、４’－ＣＨ２－Ｏ－２’、４’－（ＣＨ２）２－Ｏ－２’、又はこれらの組み合わせである、請求項１０に記載の方法。

【請求項12】

前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、１つ又は複数の修飾塩基を含む、請求項２～１１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項13】

前記１つ又は複数の修飾塩基は、５－メチルシトシンである、請求項１２に記載の方法。

【請求項14】

前記アンチセンスオリゴヌクレオチド中の全てのシトシンは、５’メチルシトシンである、請求項１３に記載の方法。

【請求項15】

前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、１つ又は複数の非天然のヌクレオシド間結合を含む、請求項２～１４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項16】

前記１つ又は複数のヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート結合である、請求項１５に記載の方法。

【請求項17】

全てのヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート結合である、請求項１６に記載の方法。

【請求項18】

前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号２、３、４、５、６、７、８、９、及び１０の内のいずれか１つの少なくとも８個の連続塩基を有する配列を含む、請求項２～１７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項19】

前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号２、３、４、５、６、７、８、９、及び１０の内の１つを含む、請求項２～１７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項20】

前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、
ａ）１０個の結合デオキシヌクレオシドからなるギャップセグメント；
ｂ）３つの結合ヌクレオシドからなる５’ウイングセグメント；及び
ｃ）３つの結合ヌクレオシドからなる３’ウイングセグメント
を含み、
前記ギャップセグメントは、前記５’ウイングセグメントと前記３’ウイングセグメントとの間に位置しており、各ウイングセグメントの各ヌクレオシドは、拘束エチル糖を含み、
各ヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート結合であり、各シトシンは、５－メチルシトシンである、
請求項２～１９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項21】

前記ＰＮＰＬＡ３発現の阻害剤は、コンジュゲート基をさらに含む、請求項２～２０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項22】

前記コンジュゲート基は、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドの５’末端に存在している、請求項２１に記載の方法。

【請求項23】

前記コンジュゲート基は、

【化1】

である、請求項２１又は２２に記載の方法。

【請求項24】

前記ＰＮＰＬＡ３発現の阻害剤は、下記式（配列番号２）：

【化2】

の化合物、又はその薬学的に許容される塩である、請求項１～２３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項25】

前記グルカゴン受容体及び／又はＧＬＰ－１受容体のアゴニストは、ペプチドである、請求項１～２４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項26】

前記ペプチドは、アミノ酸配列：
ＨＸ２ＱＧＴＦＴＳＤＸ１０ＳＸ１２Ｘ１３ＬＸ１５Ｘ１６Ｘ１７Ｘ１８ＡＸ２０Ｘ２１ＦＸ２３Ｘ２４ＷＬＸ２７Ｘ２８ＧＸ３０（配列番号２５）
を含み、式中、
（１）Ｘ２は、Ｓであり、Ｘ１０は、Ｙであり、Ｘ１２は、Ｋであり、Ｘ１３は、Ｋであり、Ｘ１５は、Ｄであり、Ｘ１６は、Ｓであり、Ｘ１７は、Ｅであり、Ｘ１８は、Ｒであり、Ｘ２０は、Ｒであり、Ｘ２１は、Ｄであり、Ｘ２３は、Ｖであり、Ｘ２４は、Ａであり、Ｘ２７は、Ｖであり、Ｘ２８は、Ａであり、Ｘ３０は、Ｇであるか（配列番号１４）；
（２）Ｘ２は、Ｓであり、Ｘ１０は、Ｋであり、Ｘ１２は、Ｅであり、Ｘ１３は、Ｙであり、Ｘ１５は、Ｄであり、Ｘ１６は、Ｓであり、Ｘ１７は、Ｅであり、Ｘ１８は、Ｒであり、Ｘ２０は、Ｒであり、Ｘ２１は、Ｄであり、Ｘ２３は、Ｖであり、Ｘ２４は、Ａであり、Ｘ２７は、Ｅであり、Ｘ２８は、Ａであり、Ｘ３０は、Ｇであるか（配列番号１５）；
（３）Ｘ２は、Ｓであり、Ｘ１０は、Ｋであり、Ｘ１２は、Ｋであり、Ｘ１３は、Ｙであり、Ｘ１５は、Ｅであり、Ｘ１６は、Ｇであり、Ｘ１７は、Ｑであり、Ｘ１８は、Ａであり、Ｘ２０は、Ｋであり、Ｘ２１は、Ｅであり、Ｘ２３は、Ｉであり、Ｘ２４は、Ａであり、Ｘ２７は、Ｅであり、Ｘ２８は、Ｋであり、Ｘ３０は、Ｒであるか（配列番号２０）；
（４）Ｘ２は、Ｓであり、Ｘ１０は、Ｋであり、Ｘ１２は、Ｓであり、Ｘ１３は、Ｙであり、Ｘ１５は、Ｄであり、Ｘ１６は、Ｓであり、Ｘ１７は、Ｒであり、Ｘ１８は、Ｓであり、Ｘ２０は、Ｒであり、Ｘ２１は、Ｄであり、Ｘ２３は、Ｖであり、Ｘ２４は、Ａであり、Ｘ２７は、Ｅであり、Ｘ２８は、Ａであり、Ｘ３０は、Ｇであるか（配列番号１８）；
（５）Ｘ２は、Ｓであり、Ｘ１０は、Ｋであり、Ｘ１２は、Ｅであり、Ｘ１３は、Ｙであり、Ｘ１５は、Ｄであり、Ｘ１６は、Ｓであり、Ｘ１７は、Ｅであり、Ｘ１８は、Ｒであり、Ｘ２０は、Ｒであり、Ｘ２１は、Ｄであり、Ｘ２３は、Ｖであり、Ｘ２４は、Ａであり、Ｘ２７は、Ｅであり、Ｘ２８は、Ａであり、Ｘ３０は、Ｇであるか（配列番号３３）；又は
（６）Ｘ２は、Ｓであり、Ｘ１０は、Ｋであり、Ｘ１２は、Ｓであり、Ｘ１３は、Ｙであり、Ｘ１５は、Ｄであり、Ｘ１６は、Ｓであり、Ｘ１７は、Ｒであり、Ｘ１８は、Ｒであり、Ｘ２０は、Ｒであり、Ｘ２１は、Ｄであり、Ｘ２３は、Ｖであり、Ｘ２４は、Ａであり、Ｘ２７は、Ｅであり、Ｘ２８は、Ａであり、Ｘ３０は、Ｇである（配列番号１９）、
請求項２５に記載の方法。

【請求項27】

前記ペプチドは、アミノ酸配列ＨＳＱＧＴＦＴＳＤＫＳＥＹＬＤＳＥＲＡＲＤＦＶＡＷＬＥＡＧＧ（配列番号３３）を含む、請求項２５に記載の方法。

【請求項28】

前記ペプチドは、前記アミノ酸配列中のアミノ酸に対する修飾をさらに含む、請求項２５～２７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項29】

前記修飾は、アシル部分の付加である、請求項２８に記載の方法。

【請求項30】

前記修飾は、リシン残基のＮ（ε）基上のパルミトイル部分である、請求項２９に記載の方法。

【請求項31】

前記パルミトイル基は、リンカーを介して前記リシンに結合している、請求項３０に記載の方法。

【請求項32】

前記リンカーは、γグルタミン酸である、請求項３１に記載の方法。

【請求項33】

前記ＰＮＰＬＡ３発現の阻害剤と、前記グルカゴン受容体及び／又はＧＬＰ－１受容体のアゴニストとを、同時に投与する、請求項１～３２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項34】

前記ＰＮＰＬＡ３発現の阻害剤と、前記グルカゴン受容体及び／又はＧＬＰ－１受容体のアゴニストとを、互いに１時間以内に投与する、請求項１～３２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項35】

前記ＰＮＰＬＡ３発現の阻害剤と、前記グルカゴン受容体及び／又はＧＬＰ－１受容体のアゴニストとを、互いに２４時間以内に投与する、請求項１～３２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項36】

前記ＰＮＰＬＡ３発現の阻害剤と、前記グルカゴン受容体及び／又はＧＬＰ－１受容体のアゴニストとを、互いに７２時間以内に投与する、請求項１～３２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項37】

前記ＰＮＰＬＡ３発現の阻害剤と、前記グルカゴン受容体及び／又はＧＬＰ－１受容体のアゴニストとを、互いに１週間以内に投与する、請求項１～３２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項38】

前記ＰＮＰＬＡ３発現の阻害剤と、前記グルカゴン受容体及び／又はＧＬＰ－１受容体のアゴニストとを、互いに２週間以内に投与する、請求項１～３２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項39】

前記ＰＮＰＬＡ３発現の阻害剤を、非経口投与する、請求項１～３８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項40】

前記ＰＮＰＬＡ３発現の阻害剤を、１日１回、１日２回、又は１日３回投与する、請求項１～３９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項41】

前記ＰＮＰＬＡ３発現の阻害剤を、週１回、週２回、又は週３回投与する、請求項１～３９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項42】

前記ＰＮＰＬＡ３発現の阻害剤を、月１回、月２回、又は月３回投与する、請求項１～３９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項43】

前記グルカゴン受容体及び／又はＧＬＰ－１受容体のアゴニストを、非経口投与する、請求項１～４２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項44】

前記グルカゴン受容体及び／又はＧＬＰ－１受容体のアゴニストを、１日１回、１日２回、又は１日３回投与する、請求項１～４２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項45】

前記グルカゴン受容体及び／又はＧＬＰ－１受容体のアゴニストを、週１回、週２回、又は週３回投与する、請求項１～４２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項46】

前記グルカゴン受容体及び／又はＧＬＰ－１受容体のアゴニストを、月１回、月２回、又は月３回投与する、請求項１～４２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項47】

前記対象は、肥満であり、及び／又は２型糖尿病である、請求項１～４６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項48】

前記肝疾患は、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）である、請求項１～４７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項49】

前記肝疾患は、非アルコール性脂肪性肝炎である、請求項１～４７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項50】

前記肝疾患は、肝繊維症である、請求項１～４７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項51】

肝疾患を有する対象の肝臓における脂肪肝を軽減する方法であって、前記対象に、
ｉ）パタチン様ホスホリパーゼドメイン含有３（ＰＮＰＬＡ３）発現の阻害剤と、
ｉｉ）グルカゴン受容体及び／又はグルカゴン様ペプチド－１（ＧＬＰ－１）受容体のアゴニストと
を投与することを含む方法。

【請求項52】

前記ＰＮＰＬＡ３発現の阻害剤は、ＰＮＰＬＡ３をコードする核酸の領域に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項５１に記載の方法。

【請求項53】

前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、１２～３０個のヌクレオシドの長さである、請求項５２に記載の方法。

【請求項54】

前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、１６～３０個のヌクレオシドの長さである、請求項５２に記載の方法。

【請求項55】

前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号２、３、４、５、６、７、８、９、及び１０の内のいずれか１つの少なくとも８個の連続塩基を有する配列を含む、請求項５２～５４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項56】

前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号２、３、４、５、６、７、８、９、及び１０の内の１つを含む、請求項５２～５４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項57】

前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、
ａ）１０個の結合デオキシヌクレオシドからなるギャップセグメント；
ｂ）３つの結合ヌクレオシドからなる５’ウイングセグメント；及び
ｃ）３つの結合ヌクレオシドからなる３’ウイングセグメント
を含み、
前記ギャップセグメントは、前記５’ウイングセグメントと前記３’ウイングセグメントとの間に位置しており、各ウイングセグメントの各ヌクレオシドは、拘束エチル糖を含み、各ヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート結合であり、各シトシンは、５－メチルシトシンである、
請求項５２～５６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項58】

前記グルカゴン受容体及び／又はＧＬＰ－１受容体のアゴニストは、ペプチドである、請求項５１～５７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項59】

【請求項60】

前記対象の総脂肪肝は、前記ＰＮＰＬＡ３発現の阻害剤、又は前記グルカゴン受容体ＧＬＰ－１受容体のアゴニストを単独で投与した場合の総脂肪肝と比較して軽減される、請求項５１～５９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項61】

前記対象の総脂肪肝は、前記ＰＮＰＬＡ３発現の阻害剤、又は前記グルカゴン受容体ＧＬＰ－１受容体のアゴニストを単独で投与した場合の総脂肪肝と比較して少なくとも３０％軽減される、請求項５１～５９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項62】

【請求項63】

前記肝疾患は、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）である、請求項５１～６２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項64】

前記肝疾患は、非アルコール性脂肪性肝炎である、請求項５１～６２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項65】

前記肝疾患は、肝繊維症である、請求項５１～６２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項66】

非アルコール性脂肪性肝疾患を有する対象の肝臓における炎症を軽減する方法であって、前記対象に、
ｉ）パタチン様ホスホリパーゼドメイン含有３（ＰＮＰＬＡ３）発現の阻害剤と、
ｉｉ）グルカゴン受容体及び／又はグルカゴン様ペプチド－１（ＧＬＰ－１）受容体のアゴニストと
を投与することを含む方法。

【請求項67】

前記ＰＮＰＬＡ３発現の阻害剤は、ＰＮＰＬＡ３をコードする核酸の領域に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項６６に記載の方法。

【請求項68】

前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、１２～３０個のヌクレオシドの長さである、請求項６７に記載の方法。

【請求項69】

前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、１６～３０個のヌクレオシドの長さである、請求項６７に記載の方法。

【請求項70】

前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号２、３、４、５、６、７、８、９、及び１０の内のいずれか１つの少なくとも８個の連続塩基を有する配列を含む、請求項６７～６９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項71】

前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号２、３、４、５、６、７、８、９、及び１０の内の１つを含む、請求項６７～６９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項72】

前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、
ａ）１０個の結合デオキシヌクレオシドからなるギャップセグメント；
ｂ）３つの結合ヌクレオシドからなる５’ウイングセグメント；及び
ｃ）３つの結合ヌクレオシドからなる３’ウイングセグメント
を含み、
前記ギャップセグメントは、前記５’ウイングセグメントと前記３’ウイングセグメントとの間に位置しており、各ウイングセグメントの各ヌクレオシドは、拘束エチル糖を含み、各ヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート結合であり、各シトシンは、５－メチルシトシンである、
請求項６７～７１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項73】

前記グルカゴン受容体及び／又はＧＬＰ－１受容体のアゴニストは、ペプチドである、請求項６６～７２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項74】

【請求項75】

前記対象の前記肝臓における炎症は、前記ＰＮＰＬＡ３発現の阻害剤、又は前記グルカゴン受容体ＧＬＰ－１受容体のアゴニストを単独で投与した場合の肝臓における炎症と比較して少なくとも５０％軽減される、請求項５０～５８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項76】

肝疾患を有する対象の肝コラーゲンを減少させる方法であって、前記対象に、
ｉ）パタチン様ホスホリパーゼドメイン含有３（ＰＮＰＬＡ３）発現の阻害剤と、
ｉｉ）グルカゴン受容体及び／又はグルカゴン様ペプチド－１（ＧＬＰ－１）受容体のアゴニストと
を投与することを含む方法。

【請求項77】

前記ＰＮＰＬＡ３発現の阻害剤は、ＰＮＰＬＡ３をコードする核酸の領域に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項７６に記載の方法。

【請求項78】

前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、１２～３０個のヌクレオシドの長さである、請求項７７に記載の方法。

【請求項79】

前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、１６～３０個のヌクレオシドの長さである、請求項７７に記載の方法。

【請求項80】

前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号２、３、４、５、６、７、８、９、及び１０の内のいずれか１つの少なくとも８個の連続塩基を有する配列を含む、請求項７７～７９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項81】

前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号２、３、４、５、６、７、８、９、及び１０の内の１つを含む、請求項７７～７９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項82】

前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、
ａ）１０個の結合デオキシヌクレオシドからなるギャップセグメント；
ｂ）３つの結合ヌクレオシドからなる５’ウイングセグメント；及び
ｃ）３つの結合ヌクレオシドからなる３’ウイングセグメント
を含み、
前記ギャップセグメントは、前記５’ウイングセグメントと前記３’ウイングセグメントとの間に位置しており、各ウイングセグメントの各ヌクレオシドは、拘束エチル糖を含み、各ヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート結合であり、各シトシンは、５－メチルシトシンである、
請求項７７～８１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項83】

前記グルカゴン受容体及び／又はＧＬＰ－１受容体のアゴニストは、ペプチドである、請求項７６～８２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項84】

【請求項85】

前記対象の肝コラーゲンは、前記ＰＮＰＬＡ３発現の阻害剤、又は前記グルカゴン受容体ＧＬＰ－１受容体のアゴニストを単独で投与した場合の肝コラーゲンと比較して少なくとも２５％減少する、請求項５０～８４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項86】

前記対象は、肥満であり、及び／又は２型糖尿病である、請求項５０～８５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項87】

前記肝疾患は、非アルコール性脂肪性肝炎である、請求項５０～８５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項88】

前記肝疾患は、肝繊維症である、請求項５０～８５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項89】

ｉ）パタチン様ホスホリパーゼドメイン含有３（ＰＮＰＬＡ３）発現の阻害剤と、
ｉｉ）グルカゴン受容体及び／又はグルカゴン様ペプチド－１（ＧＬＰ－１）受容体のアゴニストと、
ｉｉｉ）少なくとも１種の薬学的に許容される賦形剤と
を含む薬学的に許容される組成物。

【請求項90】

前記ＰＮＰＬＡ３発現の阻害剤は、ＰＮＰＬＡ３をコードする核酸の領域に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項８９に記載の組成物。

【請求項91】

前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号２、３、４、５、６、７、８、９、及び１０の内のいずれか１つの少なくとも８個の連続塩基を有する配列を含む、請求項９０に記載の組成物。

【請求項92】

前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号２、３、４、５、６、７、８、９、及び１０の内の１つを含む、請求項９０に記載の組成物。

【請求項93】

前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、
ａ）１０個の結合デオキシヌクレオシドからなるギャップセグメント；
ｂ）３つの結合ヌクレオシドからなる５’ウイングセグメント；及び
ｃ）３つの結合ヌクレオシドからなる３’ウイングセグメント
を含み、
前記ギャップセグメントは、前記５’ウイングセグメントと前記３’ウイングセグメントとの間に位置しており、各ウイングセグメントの各ヌクレオシドは、拘束エチル糖を含み、各ヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート結合であり、各シトシンは、５－メチルシトシンである、
請求項９０～９２のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項94】

前記グルカゴン受容体及び／又はＧＬＰ－１受容体のアゴニストは、ペプチドである、請求項８９～９３のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項95】

【請求項96】

前記組成物は、非経口投与用に製剤化されている、請求項８９～９５のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項97】

ｉ）パタチン様ホスホリパーゼドメイン含有３（ＰＮＰＬＡ３）発現の阻害剤と、
ｉｉ）グルカゴン受容体及び／又はグルカゴン様ペプチド－１（ＧＬＰ－１）受容体のアゴニストと
を含むキット。

【請求項98】

前記ＰＮＰＬＡ３発現の阻害剤は、ＰＮＰＬＡ３をコードする核酸の領域に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項９７に記載のキット。

【請求項99】

前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号２、３、４、５、６、７、８、９、及び１０の内のいずれか１つの少なくとも８個の連続塩基を有する配列を含む、請求項９８に記載のキット。

【請求項100】

前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号２、３、４、５、６、７、８、９、及び１０の内の１つを含む、請求項９８に記載のキット。

【請求項101】

前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、
ａ）１０個の結合デオキシヌクレオシドからなるギャップセグメント；
ｂ）３つの結合ヌクレオシドからなる５’ウイングセグメント；及び
ｃ）３つの結合ヌクレオシドからなる３’ウイングセグメント
を含み、
前記ギャップセグメントは、前記５’ウイングセグメントと前記３’ウイングセグメントとの間に位置しており、各ウイングセグメントの各ヌクレオシドは、拘束エチル糖を含み、各ヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート結合であり、各シトシンは、５－メチルシトシンである、
請求項９８～１００のいずれか一項に記載のキット。

【請求項102】

前記グルカゴン受容体及び／又はＧＬＰ－１受容体のアゴニストは、ペプチドである、請求項９７～１０１のいずれか一項に記載のキット。

【請求項103】

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的手段により提出されており且つその全体が参照により本明細書に組み込まれる配列表を含む。前記ＡＳＣＩＩコピーは、２０２１年６月４日に作成されており、名称が００９８－００７６ＰＲ１＿ＳＬ．ｔｘｔであり、サイズが６０，６４２バイトである。

【0002】

本開示は、対象の肝疾患を処置する方法であって、この対象に、ｉ）パタチン様ホスホリパーゼドメイン含有３（ＰＮＰＬＡ３）発現の阻害剤と、ｉｉ）グルカゴン受容体及び／又はグルカゴン様ペプチド－１（ＧＬＰ－１）受容体のアゴニストとを投与することを含む方法を提供する。同様に提供されるのは、ｉ）ＰＮＰＬＡ３発現の阻害剤と、ｉｉ）グルカゴン受容体及び／又はＧＬＰ－１受容体のアゴニストとを含む医薬及びキットである。

【背景技術】

【0003】

肝疾患の発生率は、世界的に増加しており、特に西欧諸国で増加している。特に多いのは、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）である。ＮＡＦＬＤは、脂肪症から非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）及び肝硬変に至る多様な肝疾患を包含する。ＮＡＦＬＤは、著しいアルコール摂取、脂肪合成薬物療法（ｓｔｅａｔｏｇｅｎｉｃｍｅｄｉｃａｔｉｏｎ）、又は遺伝性障害がない状態で、肝臓に５重量％超の脂肪が蓄積されるものとして定義されている（非特許文献１）。

【0004】

非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）は、炎症及び肝障害の徴候があるＮＡＦＬＤである。ＮＡＳＨは、大滴性脂肪症、肝細胞の風船様腫大、及び小葉の炎症性浸潤によって組織学的に定義されている（非特許文献２）。ＮＡＳＨは、一般的な集団の２～３％に影響を及ぼすものと推定されている。肥満症又は糖尿病等の他の病態がある場合には、推定罹患率は、それぞれ７％及び６２％まで増大する（非特許文献３）。

【0005】

ＰＮＰＬＡ３は、ＥＲ中及び脂質滴で発現されるパタチン様ホスホリパーゼドメイン含有ファミリの４８１アミノ酸メンバーである。ＰＮＰＬＡ３は、ヒトでは肝臓内に高発現されるが、脂肪組織での発現は、５分の１である（非特許文献４）。

【0006】

グルカゴン及びグルカゴン様ペプチド－１（ＧＬＰ－１）は、１５８アミノ酸前駆体ポリペプチドであるプレプログルカゴンに由来しており、これは、様々な組織でタンパク質分解性プロセシングされて、グルカゴン、グルカゴン様ペプチド－１（ＧＬＰ－１）、グルカゴン様ペプチド－２（ＧＬＰ－２）、及びオキシントモジュリン（ＯＸＭ）等の幾つかの異なるプログルカゴン由来ペプチドを形成し、これらは、グルコースホメオスタシス、インスリン分泌、胃内容排出、及び腸成長、並びに食物摂取の制御等の多様な生理学的機能に関与する。グルカゴンは、プログルカゴンのアミノ酸３３～６１（プレプログルカゴンの５３～８１）に対応する２９アミノ酸ペプチドであるのに対し、ＧＬＰ－１は、プログルカゴンのアミノ酸７２～１０８（プレプログルカゴンの９２～１２８）に対応する３７アミノ酸ペプチドとして生成される。ＧＬＰ－１（７～３６）アミド又はＧＬＰ－１（７～３７）酸は、ＧＬＰ－１受容体で本質的に同等の活性を示すＧＬＰ－１の生物活性形態である。

【0007】

グルカゴンは、膵島により産生され、グルカゴン受容体（「ＧＣＧＲ」）を活性化する。グルカゴンは、肝臓内で作用して、糖新生及びグリコーゲン分解によって血糖を上昇させる。血糖が下がり始めると、グルカゴンは、グリコーゲンを分解してグルコースを放出するように肝臓にシグナルを送り、且つグルコースの産生を刺激し、血糖値を通常のレベルへと上昇させる。グルカゴンはまた、エネルギー消費を増加させること、ケトン体の産生を増加させること、脂肪生成を阻害すること、脂肪酸の酸化を促進すること、胃内容排出を遅延させること、及び食欲を抑制することも知られている（非特許文献５）（非特許文献６）。

【0008】

ＧＬＰ－１は、グルカゴンと比較して異なる生物活性を有する。ＧＬＰ－１は、消化管内Ｌ細胞（ｇｕｔＬｃｅｌｌｓ）から分泌され、ＧＬＰ－１受容体に結合する。ＧＬＰ－１の活性として、インクレチン効果によるインスリン分泌の増強、グルカゴン分泌の阻害、及び食物摂取の阻害が挙げられる。グルカゴン及びＧＬＰ－１は両者とも、そのそれぞれの受容体でアゴニストとして作用し、体重減少に有効であることが示されている。ある特定のＧＬＰ－１類似体は、肥満症の処置用に販売されているか、又は開発中であり、例えば、リラグルチド（ＶＩＣＴＯＺＡ（登録商標）、ＮｏｖｏＮｏｒｄｉｓｋ製）及びエキセナチド（Ｂｙｅｔｔａ（登録商標）、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａＡＢ製）が挙げられる。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0009】

【非特許文献1】Ｋｏｔｒｏｎｅｎｅｔａｌ，ＡｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒＴｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．２００８，２８：２７－３８

【非特許文献2】Ｓａｎｙａｌ，Ｈｅｐａｔｏｌ．Ｒｅｓ．２０１１．４１：６７０－４

【非特許文献3】Ｈａｓｈｉｍｏｔｏｅｔａｌ，Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．２０１１．４６（１）：６３－６９

【非特許文献4】Ｈｕａｎｇｅｔａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ２０１０．１０７：７８９２－７

【非特許文献5】Ｍｕｅｌｌｅｒｅｔａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｉｎｔｌ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｏｌｅｃｕｌａｒＳｃｉｅｎｃｅｓ２０２０．２１（２）：３８３

【非特許文献6】Ｂｏｌａｎｄｅｔａｌ．，ＮａｔＭｅｔａｂ．，２０２０．２（５）：４１３－４３１

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0010】

本開示は、対象の肝疾患を処置する方法であって、この対象に、ｉ）パタチン様ホスホリパーゼドメイン含有３（ＰＮＰＬＡ３）発現の阻害剤と、ｉｉ）グルカゴン受容体及び／又はグルカゴン様ペプチド－１（ＧＬＰ－１）受容体のアゴニストとを投与することを含む方法を対象とする。

【0011】

いくつかの実施形態では、ＰＮＰＬＡ３発現の阻害剤は、ＰＮＰＬＡ３をコードする核酸の領域に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＰＮＰＬＡ３をコードする核酸のヌクレオチド５５６７～５７３１内の部位に相補的である。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＰＮＰＬＡ３をコードする核酸のヌクレオチド５６４４～５７３１内の部位に相補的である。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＰＮＰＬＡ３をコードする核酸のヌクレオチド５５６７～５６４２内の部位に相補的である。くつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＰＮＰＬＡ３をコードする核酸のヌクレオチド５５６７～５６２０内の部位に相補的である。いくつかの実施形態では、ＰＮＰＬＡ３をコードする核酸は、ｍＲＮＡである。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、１２～３０個のヌクレオシドの長さである。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、１６～３０個のヌクレオシドの長さである。

【0012】

いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、１つ又は複数の修飾糖部分を含む。いくつかの実施形態では、この１つ又は複数の修飾糖部分は、２’－デオキシ、２’－Ｏ－メチル、２’－Ｏ－メトキシメチル、２’－Ｏ－メトキシエチル、２’－フルオロ、４’－ＣＨ（ＣＨ３）－Ｏ－２’、４’－ＣＨ２－Ｏ－２’、４’－（ＣＨ２）２－Ｏ－２’、又はこれらの組み合わせである。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、１つ又は複数の修飾塩基を含む。いくつかの実施形態では、１つ又は複数の修飾塩基は、５－メチルシトシンである。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド中の全てのシトシンは、５’メチルシトシンである。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、１つ又は複数の非天然のヌクレオシド間結合を含む。いくつかの実施形態では、１つ又は複数のヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート結合である。いくつかの実施形態において、全てのヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート結合である。

【0013】

いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号２、３、４、５、６、７、８、９、及び１０の内のいずれか１つの少なくとも８個の連続塩基を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号２、３、４、５、６、７、８、９、及び１０の内の１つを含む。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ａ）１０個の結合デオキシヌクレオシドからなるギャップセグメント；ｂ）３つの結合ヌクレオシドからなる５’ウイングセグメント；及びｃ）３つの結合ヌクレオシドからなる３’ウイングセグメントを含み、ギャップセグメントは、５’ウイングセグメントと３’ウイングセグメントとの間に位置しており、各ウイングセグメントの各ヌクレオシドは、拘束エチル糖を含み、各ヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート結合であり、各シトシンは、５－メチルシトシンである。

【0014】

いくつかの実施形態において、ＰＮＰＬＡ３発現の阻害剤は、コンジュゲート基をさらに含む。

【0015】

いくつかの実施形態において、グルカゴン受容体及び／又はＧＬＰ－１受容体のアゴニストは、ペプチドである。いくつかの実施形態において、このペプチドは、アミノ酸配列：
ＨＸ２ＱＧＴＦＴＳＤＸ１０ＳＸ１２Ｘ１３ＬＸ１５Ｘ１６Ｘ１７Ｘ１８ＡＸ２０Ｘ２１ＦＸ２３Ｘ２４ＷＬＸ２７Ｘ２８ＧＸ３０（配列番号２５）
を含み、式中、
（１）Ｘ２は、Ｓであり、Ｘ１０は、Ｙであり、Ｘ１２は、Ｋであり、Ｘ１３は、Ｋであり、Ｘ１５は、Ｄであり、Ｘ１６は、Ｓであり、Ｘ１７は、Ｅであり、Ｘ１８は、Ｒであり、Ｘ２０は、Ｒであり、Ｘ２１は、Ｄであり、Ｘ２３は、Ｖであり、Ｘ２４は、Ａであり、Ｘ２７は、Ｖであり、Ｘ２８は、Ａであり、Ｘ３０は、Ｇであるか（配列番号１４）；
（２）Ｘ２は、Ｓであり、Ｘ１０は、Ｋであり、Ｘ１２は、Ｅであり、Ｘ１３は、Ｙであり、Ｘ１５は、Ｄであり、Ｘ１６は、Ｓであり、Ｘ１７は、Ｅであり、Ｘ１８は、Ｒであり、Ｘ２０は、Ｒであり、Ｘ２１は、Ｄであり、Ｘ２３は、Ｖであり、Ｘ２４は、Ａであり、Ｘ２７は、Ｅであり、Ｘ２８は、Ａであり、Ｘ３０は、Ｇであるか（配列番号１５）；
（３）Ｘ２は、Ｓであり、Ｘ１０は、Ｋであり、Ｘ１２は、Ｋであり、Ｘ１３は、Ｙであり、Ｘ１５は、Ｅであり、Ｘ１６は、Ｇであり、Ｘ１７は、Ｑであり、Ｘ１８は、Ａであり、Ｘ２０は、Ｋであり、Ｘ２１は、Ｅであり、Ｘ２３は、Ｉであり、Ｘ２４は、Ａであり、Ｘ２７は、Ｅであり、Ｘ２８は、Ｋであり、Ｘ３０は、Ｒであるか（配列番号２０）；
（４）Ｘ２は、Ｓであり、Ｘ１０は、Ｋであり、Ｘ１２は、Ｓであり、Ｘ１３は、Ｙであり、Ｘ１５は、Ｄであり、Ｘ１６は、Ｓであり、Ｘ１７は、Ｒであり、Ｘ１８は、Ｓであり、Ｘ２０は、Ｒであり、Ｘ２１は、Ｄであり、Ｘ２３は、Ｖであり、Ｘ２４は、Ａであり、Ｘ２７は、Ｅであり、Ｘ２８は、Ａであり、Ｘ３０は、Ｇであるか（配列番号１８）；
（５）Ｘ２は、Ｓであり、Ｘ１０は、Ｋであり、Ｘ１２は、Ｅであり、Ｘ１３は、Ｙであり、Ｘ１５は、Ｄであり、Ｘ１６は、Ｓであり、Ｘ１７は、Ｅであり、Ｘ１８は、Ｒであり、Ｘ２０は、Ｒであり、Ｘ２１は、Ｄであり、Ｘ２３は、Ｖであり、Ｘ２４は、Ａであり、Ｘ２７は、Ｅであり、Ｘ２８は、Ａであり、Ｘ３０は、Ｇであるか（配列番号３３）；又は
（６）Ｘ２は、Ｓであり、Ｘ１０は、Ｋであり、Ｘ１２は、Ｓであり、Ｘ１３は、Ｙであり、Ｘ１５は、Ｄであり、Ｘ１６は、Ｓであり、Ｘ１７は、Ｒであり、Ｘ１８は、Ｒであり、Ｘ２０は、Ｒであり、Ｘ２１は、Ｄであり、Ｘ２３は、Ｖであり、Ｘ２４は、Ａであり、Ｘ２７は、Ｅであり、Ｘ２８は、Ａであり、Ｘ３０は、Ｇである（配列番号１９）。

【0016】

いくつかの実施形態において、ペプチドは、アミノ酸配列ＨＳＱＧＴＦＴＳＤＫＳＥＹＬＤＳＥＲＡＲＤＦＶＡＷＬＥＡＧＧ（配列番号３３）を含む。

【0017】

いくつかの実施形態において、ペプチドは、アミノ酸配列中のアミノ酸に対する修飾をさらに含む。いくつかの実施形態において、この修飾は、アシル部分の付加である。いくつかの実施形態において、この修飾は、リシン残基のＮ（ε）基上のパルミトイル部分である。いくつかの実施形態において、このパルミトイル基は、リンカーを介してリシンに結合している。いくつかの実施形態において、このリンカーは、γグルタミン酸である。少なくとも１つの実施形態において、ペプチドは、ＨＳＱＧＴＦＴＳＤＫＳＥＹＬＤＳＥＲＡＲＤＦＶＡＷＬＥＡＧＧ（配列番号３３）であり、式中、リシンは、グルタミン酸リンカーを介してパルミトイル部分で修飾されている。

【0018】

いくつかの実施形態において、ＰＮＰＬＡ３発現の阻害剤と、グルカゴン受容体及び／又はＧＬＰ－１受容体のアゴニストとを、同時に投与する。いくつかの実施形態において、ＰＮＰＬＡ３発現の阻害剤と、グルカゴン受容体及び／又はＧＬＰ－１受容体のアゴニストとを、互いに１時間以内に投与する。いくつかの実施形態において、ＰＮＰＬＡ３発現の阻害剤と、グルカゴン受容体及び／又はＧＬＰ－１受容体のアゴニストとを、互いに２４時間以内に投与する。いくつかの実施形態において、ＰＮＰＬＡ３発現の阻害剤と、グルカゴン受容体及び／又はＧＬＰ－１受容体のアゴニストとを、互いに７２時間以内に投与する。いくつかの実施形態において、ＰＮＰＬＡ３発現の阻害剤と、グルカゴン受容体及び／又はＧＬＰ－１受容体のアゴニストとを、互いに１週間以内に投与する。いくつかの実施形態において、ＰＮＰＬＡ３発現の阻害剤と、グルカゴン受容体及び／又はＧＬＰ－１受容体のアゴニストとを、互いに２週間以内に投与する。いくつかの実施形態において、ＰＮＰＬＡ３発現の阻害剤を、非経口投与する。いくつかの実施形態において、ＰＮＰＬＡ３発現の阻害剤を、１日１回、１日２回、又は１日３回投与する。いくつかの実施形態において、ＰＮＰＬＡ３発現の阻害剤を、週１回、週２回、又は週３回投与する。いくつかの実施形態において、ＰＮＰＬＡ３発現の阻害剤を、月１回、月２回、又は月３回投与する。

【0019】

いくつかの実施形態において、グルカゴン受容体及び／又はＧＬＰ－１受容体のアゴニストを、非経口投与する。いくつかの実施形態において、グルカゴン受容体及び／又はＧＬＰ－１受容体のアゴニストを、１日１回、１日２回、又は１日３回投与する。いくつかの実施形態において、グルカゴン受容体及び／又はＧＬＰ－１受容体のアゴニストを、週１回、週２回、又は週３回投与する。いくつかの実施形態において、グルカゴン受容体及び／又はＧＬＰ－１受容体のアゴニストを、月１回、月２回、又は月３回投与する。

【0020】

いくつかの実施形態において、対象は、肥満であり、及び／又は２型糖尿病である。いくつかの実施形態において、肝疾患は、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）である。いくつかの実施形態において、肝疾患は、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）である。いくつかの実施形態において、肝疾患は、肝繊維症及び／又は肝硬変である。

【0021】

【0022】

いくつかの実施形態において、対象の総脂肪肝は、ＰＮＰＬＡ３発現の阻害剤、又はグルカゴン受容体ＧＬＰ－１受容体のアゴニストを単独で投与した場合の総脂肪肝と比較して軽減される。いくつかの実施形態において、対象の総脂肪肝は、ＰＮＰＬＡ３発現の阻害剤、又はグルカゴン受容体ＧＬＰ－１受容体のアゴニストを単独で投与した場合の総脂肪肝と比較して少なくとも３０％軽減される。いくつかの実施形態において、対象の総脂肪肝は、ＰＮＰＬＡ３発現の阻害剤、又はグルカゴン受容体ＧＬＰ－１受容体のアゴニストを単独で投与した場合の総脂肪肝と比較して少なくとも３０％軽減される。いくつかの実施形態において、肝疾患は、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）である。いくつかの実施形態において、肝疾患は、非アルコール性脂肪性肝炎である。いくつかの実施形態において、肝疾患は、肝繊維症である。

【0023】

いくつかの実施形態において、本開示は、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）を有する対象の肝臓における炎症を軽減する方法であって、この対象に、ｉ）パタチン様ホスホリパーゼドメイン含有３（ＰＮＰＬＡ３）発現の阻害剤と、ｉｉ）グルカゴン受容体及び／又はグルカゴン様ペプチド－１（ＧＬＰ－１）受容体のアゴニストとを投与することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態において、肝臓における炎症は、ＰＮＰＬＡ３発現の阻害剤、又はグルカゴン受容体ＧＬＰ－１受容体のアゴニストを単独で投与した場合の肝臓における炎症と比較して少なくとも５０％軽減される。

【0024】

いくつかの実施形態において、本開示は、肝疾患を有する対象の肝コラーゲンを減少させる方法であって、この対象に、ｉ）パタチン様ホスホリパーゼドメイン含有３（ＰＮＰＬＡ３）発現の阻害剤と、ｉｉ）グルカゴン受容体及び／又はグルカゴン様ペプチド－１（ＧＬＰ－１）受容体のアゴニストとを投与することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態において、対象の肝コラーゲンは、ＰＮＰＬＡ３発現の阻害剤、又はグルカゴン受容体ＧＬＰ－１受容体のアゴニストを単独で投与した場合の肝コラーゲンと比較して少なくとも２５％減少する。

【0025】

いくつかの実施形態において、本開示は、ｉ）パタチン様ホスホリパーゼドメイン含有３（ＰＮＰＬＡ３）発現の阻害剤と、ｉｉ）グルカゴン受容体及び／又はグルカゴン様ペプチド－１（ＧＬＰ－１）受容体のアゴニストと、ｉｉｉ）少なくとも１種の薬学的に許容される賦形剤とを含む薬学的に許容される組成物を提供する。いくつかの実施形態において、この組成物は、非経口投与用に製剤化されている。

【0026】

いくつかの実施形態において、本開示は、ｉ）パタチン様ホスホリパーゼドメイン含有３（ＰＮＰＬＡ３）発現の阻害剤と、ｉｉ）グルカゴン受容体及び／又はグルカゴン様ペプチド－１（ＧＬＰ－１）受容体のアゴニストとを含むキットを提供する。

【0027】

下記の図面は、本明細書の一部を形成し、且つ本開示のある特定の態様の例示的な実施形態をさらに実証するために含まれる。

【図面の簡単な説明】

【0028】

【図1A-B】図１Ａは、実施例１で説明する、３６週間にわたりＮＡＳＨ誘発食餌を給餌し、１４週間にわたり１）対照ＡＳＯ＋生理食塩水、２）Ｐｎｐｌａ３ＡＳＯ＋生理食塩水、３）対照ＡＳＯ＋コタデュチド（Ｃｏｔａｄｕｔｉｄｅ）、又は４）Ｐｎｐｌａ３ＡＳＯ＋コタデュチドのいずれかを投与して処置したホモ接合性Ｐｎｐｌａ３^{１４８Ｍ／Ｍ}ノックインマウスの体重変化の百分率のプロットを示す。図１Ｂは、実施例１で説明するように測定した、同一マウスに関する肝臓ｍＰｎｐｌａ３ｍＲＮＡ濃度のプロットを示す。

【図2A-D】図２は、図１Ａ及び実施例１に関して上記で説明したマウスから採取した、染色された肝臓切片から測定した総脂肪肝（図２Ａ）、大滴性脂肪症（図２Ｂ）、及び小滴性脂肪症（図２Ｃ）のプロットを示す。図２Ｄは、各切片の面積当たりの総脂肪滴の割合と共に、染色された切片の画像を示す。

【図3A-B】図３Ａは、図１Ａ及び実施例１に関して上記で説明したマウスから採取した肝臓切片に関して測定した肝臓マクロファージの割合のプロットを示す。図３Ｂは、図１Ａ及び実施例１に関して上記で説明したマウスから得られた肝臓の炎症スコアのプロットを示す。

【図4】図１Ａ及び実施例１に関して上記で説明したマウスに関して、実施例１で説明するように算出するＮＡＦＬＤ活動性スコア（ＮＡＳ）のプロットを示す。

【図5】図１Ａ及び実施例１に関して上記で説明したマウスから採取された肝臓切片における肝臓コラーゲンＡ１Ａの割合のプロットを示す。肝臓コラーゲンを、実施例１で説明するように測定する。

【発明を実施するための形態】

【0029】

本開示は、肝疾患（例えば、ＮＡＳＨ及び又はＮＡＦＬＤ）を処置する方法を提供する。いくつかの実施形態において、本開示は、対象の肝疾患を処置する方法であって、この対象に、ｉ）パタチン様ホスホリパーゼドメイン含有３（ＰＮＰＬＡ３）発現の阻害剤と、ｉｉ）グルカゴン受容体及び／又はグルカゴン様ペプチド－１（ＧＬＰ－１）受容体のアゴニストとを投与することを含む方法を提供する。

【0030】

定義
別途示されない限り、下記の用語は、下記の意味を有する。

【0031】

本明細書全体を通して、「約」という用語は、ある値が、この値を決定するために利用される方法／装置に固有の誤差の変動を含むか又は試験対象間に存在する変動を含むことを示すために使用される。典型的には、「約」という用語は、状況に応じて、およそ若しくは１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、若しくは２０％未満の変動性、又はより高い変動性を包含することを意味する。実施形態において、当業者は、本明細書で使用される文脈に起因して、「約」という用語によって示される変動のレベルを理解するであろう。「約」という用語の使用には、具体的に列挙された値も含まれることも理解されるべきである。

【0032】

特許請求の範囲における「又は」という用語の使用は、代替物のみを指すものと明示されない限り、又はこの代替物が相互に排他的でない限り、「及び／又は」を意味するために使用されるが、本開示は、代替物のみ、及び「及び／又は」を指す定義を支持する。

【0033】

本明細書で使用される場合、「～」とは、範囲の両端を含む範囲のことである。例えば、ｘ～ｙの数は、ｘ及びｙの数、並びにｘとｙとの範囲に入るあらゆる数が明示的に含まれる。

【0034】

「２’－デオキシヌクレオシド」は、天然に存在するデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）に見られるような、２’－Ｈ（Ｈ）フラノシル糖部分を含むヌクレオシドを意味する。ある特定の実施形態において、２’－デオキシヌクレオシドは、修飾核酸塩基を含んでもよいし、又はＲＮＡ核酸塩基（ウラシル）を含んでもよい。

【0035】

「２’－Ｏ－メトキシエチル」（２’－ＭＯＥとも称される）は、リボシル環の２’－－ＯＨ基の代わりに２’－Ｏ（ＣＨ_２）_２－－ＯＣＨ_３）を指す。２’－Ｏ－メトキシエチル修飾糖は、修飾糖である。

【0036】

「２’－ＭＯＥヌクレオシド」（２’－Ｏ－メトキシエチルヌクレオシドとも称される）は、２’－ＭＯＥ修飾糖部分を含むヌクレオシドを意味する。

【0037】

「２’－置換ヌクレオシド」又は「２－修飾ヌクレオシド」は、２’－置換糖部分又は２’－修飾糖部分を含むヌクレオシドを意味する。本明細書で使用される場合、糖部分に関する「２’－置換」又は「２－修飾」は、Ｈ又はＯＨ以外の少なくとも１つの２’－置換基を含む糖部分を意味する。

【0038】

「３’標的部位」は、特定の化合物の最も３’側のヌクレオチドに相補的な標的核酸のヌクレオチドを指す。

【0039】

「５’標的部位」は、特定の化合物の最も５’側のヌクレオチドに相補的な標的核酸のヌクレオチドを指す。

【0040】

「５－メチルシトシン」は、メチル基が５位に結合したシトシンを意味する。

【0041】

「投与」又は「投与すること」は、本明細書で提供される化合物又は組成物を個体に導入してその目的の機能を実施する経路を指す。使用され得る投与経路の一例として、非経口投与（例えば、皮下、静脈内、又は筋肉内への注射又は注入）が挙げられるが、これに限定されない。

【0042】

「同時に投与する」又は「共投与」は、２種以上の化合物を、患者に両方の薬理学的効果が現れる任意の様式で投与することを意味する。同時投与は、両化合物を、単一の医薬組成物中で、同一の剤形で、同一の投与経路によって、又は同時に投与することを必要とするわけではない。両化合物の効果は、同時に現れる必要はない。効果は、ある期間にわたり重複している必要があるだけで、同一時間にわたる必要はない。同時投与又は共投与は、並行投与又は順次投与を包含する。

【0043】

「寛解」は、関連する疾患、障害、又は状態の少なくとも１つの指標、徴候、又は病症の改善又は軽減を指す。ある特定の実施形態では、寛解は、状態又は疾患の１つ又は複数の指標の進行又は重症度における遅延又は緩徐化を含む。この指標の進行又は重症度は、当業者に既知の客観的な又は主観的な尺度により決定され得る。

【0044】

「動物」は、ヒト又は非ヒト動物（例えば、限定されないが、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタ）、並びに非ヒト霊長類（例えば、限定されないが、サル及びチンパンジー）を指す。

【0045】

「アンチセンス化合物」は、オリゴヌクレオチドと、任意選択的な１種又は複数種の追加の機構（例えば、コンジュゲート基又は末端基）とを含む化合物を意味する。アンチセンス化合物の例として、一本鎖化合物及び二本鎖化合物が挙げられ、例えば、オリゴヌクレオチド、リボザイム、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｓＲＮＡ、及び占有をベースとする（ｏｃｃｕｐａｎｃｙ－ｂａｓｅｄ）化合物が挙げられる。

【0046】

「アンチセンスオリゴヌクレオチド」は、標的核酸又はその領域若しくはセグメントに相補的な核酸塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを意味する。ある特定の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的核酸又はその領域若しくはセグメントに特異的にハイブリダイズ可能である。

【0047】

「ｃＥｔ」又は「拘束エチル」は、リボシル二環式糖部分であって、二環式糖の第２の環は、４’－炭素及び２’－炭素を連結する架橋を介して形成されており、この架橋は、式：４’－ＣＨ（ＣＨ_３）－Ｏ－２’を有しており、この架橋のメチル基は、Ｓ立体配置である、リボシル二環式糖部分を意味する。

【0048】

「ｃＥｔヌクレオシド」は、ｃＥｔ修飾糖部分を含むヌクレオシドを意味する。

【0049】

化合物における「化学修飾」は、化合物中の単位の元の状態と比較した、任意のそのような単位の化学反応による置換又は変化について説明するものである。「修飾ヌクレオシド」は、修飾糖部分及び／又は修飾核酸塩基を独立して有するヌクレオシドを意味する。「修飾オリゴヌクレオチド」は、少なくとも１つの修飾ヌクレオシド間結合、修飾糖、及び／又は修飾核酸塩基を含むオリゴヌクレオチドを意味する。

【0050】

「化学的に異なる領域」は、同一の化合物の別の領域と何らかの形で化学的に異なる化合物の領域を指す。例えば、２’－Ｏ－メトキシエチルヌクレオチドを有する領域は、２’－Ｏ－メトキシエチル修飾のないヌクレオチドを有する領域とは化学的に異なる。

【0051】

「キメラアンチセンス化合物」は、少なくとも２つの化学的に異なる領域を有しているアンチセンス化合物であって、各位置が複数のサブユニットを有する、アンチセンス化合物を意味する。

【0052】

「コンジュゲート基」は、オリゴヌクレオチドに結合する原子団を意味する。コンジュゲート基は、コンジュゲート部分と、このコンジュゲート部分をオリゴヌクレオチドに結合させるコンジュゲートリンカーとを含む。

【0053】

「コンジュゲートリンカー」は、コンジュゲート部分をオリゴヌクレオチドに連結する少なくとも１つの結合を含む原子団を意味する。

【0054】

「コンジュゲート部分」は、コンジュゲートリンカーを介してオリゴヌクレオチドに結合する原子団を意味する。

【0055】

オリゴヌクレオチドに関する「連続」は、互いに直接隣接しているヌクレオシド、核酸塩基、糖部分、又はヌクレオシド間結合を指す。例えば、「連続核酸塩基」は、配列中で互いに直接隣接する核酸塩基を意味する。

【0056】

「用量」は、単回投与で提供されるか又は特定の期間に提供される化合物又は医薬品の特定の量を意味する。ある特定の実施形態において、用量は、２回以上のボーラス、錠剤、又は注射で投与されてもよい。例えば、皮下投与が所望されるある特定の実施形態において、所望の用量は、単回注射では容易に収容されない容量が必要となる場合がある。そのような実施形態では、所望の用量を達成するために、２回以上の注射を使用し得る。ある特定の実施形態において、個体における注射部位反応を最小限に抑えるために、用量を２回以上の注射で投与してもよい。他の実施形態では、化合物又は医薬品を、長期間にわたって、又は持続的に、注入により投与する。用量は、１時間、１日、１週間、又は１か月当たりの医薬品の量として示され得る。

【0057】

「投与計画」は、１つ又は複数の所望の効果を達成するために設計された用量の組み合わせである。

【0058】

「有効量」は、化合物を必要とする個体における所望の生理学的結果を実現するのに十分な化合物の量を意味する。有効量は、処置を受ける個体の健康状態及び身体的状態、処置を受ける個体の分類群、組成物の配合、個体の医学的症状の評価、並びに他の関連因子に応じて、個体間で変動し得る。

【0059】

「ギャップマー」は、１つ又は複数のヌクレオシドを有する外部領域の間に位置する、ＲＮアーゼＨ開裂を支持する複数のヌクレオシドを有する内部領域を含むオリゴヌクレオチドを意味しており、内部領域を含むヌクレオシドは、外部領域を含むヌクレオシドとは化学的に異なる。内部領域は、「ギャップ」と称され得、外部領域は、「ウイング」と称され得る。

【0060】

「直接隣接している」は、直接隣接している同一種類の要素間に介在要素が存在しないことを意味する（例えば、直接隣接している核酸塩基間に介在核酸塩基が存在しない）。

【0061】

「ヌクレオシド間結合」は、オリゴヌクレオチド内の隣接するヌクレオシド間の共有結合を形成する基又は結合を意味する。「修飾ヌクレオシド間結合」は、天然に存在するホスフェートヌクレオシド間結合以外のあらゆるヌクレオシド間結合を意味する。非リン酸結合は、本明細書中では、修飾ヌクレオシド間結合を指す。

【0062】

「リンカーヌクレオシド」は、オリゴヌクレオチドをコンジュゲート部分に結合するヌクレオシドを意味する。リンカーヌクレオシドは、化合物のコンジュゲートリンカー内に位置する。リンカーヌクレオシドは、オリゴヌクレオチドに連続している場合であっても、化合物のオリゴヌクレオチド部分の一部とみなされない。

【0063】

「ミスマッチ」又は「非相補的」は、第１及び第２のオリゴヌクレオチドをアラインした場合に、第２のオリゴヌクレオチド又は標的核酸の対応する核酸塩基に相補的でない、第１のオリゴヌクレオチドの核酸塩基を意味する。例えば、核酸塩基（例えば、限定されないが、ユニバーサル核酸塩基、イノシン、及びヒポキサンチン）は、少なくとも１つの核酸塩基とハイブリダイズし得るが、それがハイブリダイズした核酸塩基に対して依然としてミスマッチしているか、又は非相補的である。別の例として、第１及び第２のオリゴヌクレオチドをアラインした場合に、第２のオリゴヌクレオチド又は標的核酸の対応する核酸塩基にハイブリダイズし得ない、第１のオリゴヌクレオチドの核酸塩基は、ミスマッチ核酸塩基又は非相補的核酸塩基である。

【0064】

「モジュレートすること」は、細胞、組織、臓器、又は生物における機構を変化させるか又は調整することを指す。例えば、ＰＮＰＬＡ３ＲＮＡをモジュレートすることは、細胞、組織、臓器、又は生物中のＰＮＰＬＡ３ＲＮＡ及び／又はＰＮＰＬＡ３タンパク質のレベルを上昇させるか又は低下させることを意味し得る。「モジュレーター」は、細胞、組織、臓器、又は生物に変化をもたらすものである。例えば、ＰＮＰＬＡ３化合物は、細胞、組織、臓器、又は生物中のＰＮＰＬＡ３ＲＮＡ及び／又はＰＮＰＬＡ３タンパク質の量を減少させるモジュレーターであり得る。

【0065】

「ＭＯＥ」は、メトキシエチルを意味する。

【0066】

「非二環式修飾糖」又は「非二環式修飾糖部分」は、糖の２つの原子間に架橋を形成して第２の環を形成しない、置換基等の修飾を含む修飾糖部分を意味する。

【0067】

「オリゴマー化合物」は、単一オリゴヌクレオチドと、任意選択的な１種又は複数種の追加の機構（例えば、コンジュゲート基又は末端基）とを含む化合物を意味する。

【0068】

「オリゴヌクレオチド」は、結合ヌクレオシドのポリマーであって、結合ヌクレオシドのそれぞれは、互いに独立して修飾され得るか、又は非修飾であり得る、ポリマーを意味する。別途指示されない限り、オリゴヌクレオチドは、８～８０個の結合ヌクレオシドからなる。「修飾オリゴヌクレオチド」は、オリゴヌクレオチドであって、少なくとも１つの糖、核酸塩基、又はヌクレオシド間結合が修飾されている、オリゴヌクレオチドを意味する。「非修飾オリゴヌクレオチド」は、オリゴヌクレオチドであって、いかなる糖修飾も、核酸塩基修飾も、又はヌクレオシド間修飾も含まないオリゴヌクレオチドを意味する。

【0069】

「ホスホロチオエート結合」は、非架橋酸素原子の１つが硫黄原子に置き換えられている修飾ホスフェート結合を意味する。ホスホロチオエートヌクレオシド間連結は、修飾ヌクレオシド間連結である。

【0070】

「部分」は、核酸の規定数の連続（即ち、結合）した核酸塩基を意味する。ある特定の実施形態において、部分は、標的核酸の規定数の連続核酸塩基である。ある特定の実施形態において、部分は、オリゴマー化合物の規定数の連続核酸塩基である。

【0071】

「ＲｅｆＳｅｑ番号」は、配列が特定の標的転写産物（例えば、標的遺伝子）に関するものであることを示すために配列に割り当てられる、文字と数字との一意の組み合わせである。標的遺伝子に関するそのような配列及び情報（まとめて遺伝子記録）を、遺伝子配列データベース内に見出し得る。遺伝子配列データベースとして、ＮＣＢＩＲｅｆｅｒｅｎｃｅＳｅｑｕｅｎｃｅデータベース、ジェンバンク、ＥｕｒｏｐｅａｎＮｕｃｌｅｏｔｉｄｅＡｒｃｈｉｖｅ、及び日本ＤＮＡデータバンクが挙げられる（後者の３つは、国際塩基配列データベース協力体制（ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＮｕｃｌｅｏｔｉｄｅＳｅｑｕｅｎｃｅＤａｔａｂａｓｅＣｏｌｌａｂｏｒａｔｉｏｎ）、即ちＩＮＳＤＣを組織している）。

【0072】

「ＲＮＡｉ化合物」は、標的核酸及び／又は標的核酸によってコードされるタンパク質をモジュレートするために、少なくとも部分的にＲＩＳＣ又はＡｇｏ２を介して作用するがＲＮアーゼＨを介さずに作用するアンチセンス化合物を意味する。ＲＮＡｉ化合物として、二本鎖ｓｉＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）、及びマイクロＲＮＡ模倣体を含むマイクロＲＮＡが挙げられるが、これらに限定されない。

【0073】

「糖部分」は、非修飾糖部分又は修飾糖部分を意味する。「非修飾糖部分」又は「非修飾糖」は、ＲＮＡに見られるような２’－ＯＨ（Ｈ）リボシル部分（「非修飾ＲＮＡ糖部分」）、又はＤＮＡに見られるような２’－Ｈ（Ｈ）部分（「非修飾ＤＮＡ糖部分」）を意味する。「修飾糖部分」又は「修飾糖」は、修飾フラノシル糖部分又は糖代替物を意味する。「修飾フラノシル糖部分」は、非修飾糖部分の少なくとも１つの水素又は水酸基の代わりに非水素置換基を含むフラノシル糖を意味する。ある特定の実施形態において、修飾フラノシル糖部分は、２’－置換糖部分である。そのような修飾フラノシル糖部分として、二環式糖及び非二環式糖が挙げられる。

【0074】

「糖代替物」は、核酸塩基をオリゴヌクレオチド内の別の基（例えば、ヌクレオシド間結合、コンジュゲート基、又は末端基）に結合させ得るフラノシル部分以外のものを有する修飾糖部分を意味する。糖代替物を含む修飾ヌクレオシドは、オリゴヌクレオチド内の１箇所又は複数箇所の位置に組み込まれ得、そのようなオリゴヌクレオチドは、相補的な化合物又は核酸にハイブリダイズし得る。

【0075】

「治療的有効量」は、治療的利益を個体にもたらす化合物、医薬品、又は組成物の量を意味する。

【0076】

本明細書で使用される場合、「ポリペプチド」という用語は、単数の「ポリペプチド」及び複数の「ポリペプチド」を包含し、且つ２つ以上のアミノ酸の任意の一本鎖又は複数鎖を含むことが意図されている。したがって、本明細書で使用される場合、１つの「ペプチド」、１つの「ペプチドサブユニット」、１つの「タンパク質」、１本の「アミノ酸鎖」、１つの「アミノ酸配列」、又は２つ以上のアミノ酸の１つ若しくは複数の鎖を指すのに用いられる他の任意の用語は、たとえこれらの用語の各々が、より具体的な意味を有し得るとしても、「ポリペプチド」の定義に含まれる。「ポリペプチド」という用語は、これらの用語のいずれかの代わりに使用され得るか、又はこれら用語のいずれかと互換的に使用され得る。この用語は、翻訳後修飾又は合成後修飾（例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、既知の保護基／ブロッキング基による誘導体化、タンパク分解開裂、又は非自然発生のアミノ酸による修飾）を受けたポリペプチドをさらに含む。

【0077】

「配列同一性」という用語は、本明細書で使用される場合、２つ以上のポリヌクレオチド配列間の関係、又は２つ以上のポリペプチド配列間の関係を指す。１つの配列におけるある位置に、比較配列の対応する位置の同じ核酸塩基又はアミノ酸が存在する場合は、これらの配列は、その位置で「同一」であると言える。「配列同一性」の割合は、両方の配列で同一の核酸塩基又はアミノ酸が存在する位置の数を決定して「同一」の位置の数を得ることによって、算出される。次いで、「同一」の位置の数を、比較ウィンドウにおける位置の合計数で除し、この値に１００を乗じて「配列同一性」のパーセンテージを得る。「配列同一性」の割合は、比較ウィンドウにわたって最適にアラインされた２つの配列を比較することによって決定される。比較用に配列を最適にアラインさせるために、比較ウィンドウにおけるポリヌクレオチド配列又はポリペプチド配列の一部は、基準配列が一定に維持されたまま、ギャップと呼ばれる付加又は欠失を含み得る。最適なアラインメントとは、たとえギャップがあっても、基準配列と比較配列との間の「同一」の位置の数を可能な限り最大限にするアラインメントのことである。２つの配列間の「配列同一性」の割合を、国立バイオテクノロジー情報センター（ＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｅｒｆｏｒＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）（２００４年９月１日現在）から入手可能なプログラム「ＢＬＡＳＴ２Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」のバージョンを使用して決定し得、このプログラムは、プログラムＢＬＡＳＴＮ（ヌクレオチド配列の比較用）と、ＢＬＡＳＴＰ（ポリペプチド配列の比較用）とを含み、これらのプログラムは、ＫａｒｌｉｎａｎｄＡｌｔｓｃｈｕｌ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０（１２）：５８７３－５８７７，１９９３）のアルゴリズムに基づいている。「ＢＬＡＳＴ２Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」を利用すると、語長（３）、オープンギャップペナルティー（１１）、延長ギャップペナルティー（１）、ギャップドロップオフ（５０）、予想値（１０）、及び任意の他の必要なパラメータ（例えば、限定されないが、マトリクックスオプション）に対して、２００４年９月１日時点でデフォルトパラメータであったパラメータを使用し得る。

【0078】

ＰＮＰＬＡ３
いくつかの実施形態において、本開示は、ＰＮＰＬＡ３阻害剤を投与することにより肝疾患を処置する方法を提供する。ＰＮＰＬＡ３は、ＥＲ中及び脂質滴で発現されるパタチン様ホスホリパーゼドメイン含有ファミリの４８１アミノ酸メンバーである。ＰＮＰＬＡ３は、ヒトでは肝臓内に高発現されるが、脂肪組織での発現は、５分の１である（Ｈｕａｎｇｅｔａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ２０１０．１０７：７８９２－７）。いくつかの実施形態において、ＰＮＰＬＡ３は、配列番号１を指す。「ＰＮＰＬＡ３」は、ＰＮＰＬＡ３の任意の核酸又はタンパク質を意味する。「ＰＮＰＬＡ３核酸」は、ＰＮＰＬＡ３をコードする任意の核酸を意味する。例えば、ある特定の実施形態では、ＰＮＰＬＡ３核酸として、ＰＮＰＬＡ３をコードするＤＮＡ配列、ＰＮＰＬＡ３をコードするＤＮＡ（例えば、イントロン及びエクソンを含むゲノムＤＮＡ）から転写されたＲＮＡ配列、並びにＰＮＰＬＡ３をコードするｍＲＮＡ配列が挙げられる。「ＰＮＰＬＡ３ｍＲＮＡ」は、ＰＮＰＬＡ３タンパク質をコードするｍＲＮＡを意味する。標的は、大文字又は小文字のいずれかで示され得る。

【0079】

いくつかの実施形態において、本開示は、グルカゴン受容体及び／又はＧＬＰ－１受容体のアゴニストと組み合わせた、肝疾患の処置のためにＰＮＰＬＡ３（ＰＮＰＬＡ３）発現を阻害するための方法、化合物、及び組成物を提供する。本明細書で提供されるある特定の実施形態は、ＰＮＰＬＡ３の阻害剤を投与することにより肝疾患を処置する方法に関する。「ＰＮＰＬＡ３特異的阻害剤」は、ＰＮＰＬＡ３ＲＮＡ及び／又はＰＮＰＬＡ３タンパク質の発現又は活性を分子レベルで特異的に阻害可能な任意の薬剤を指し得る。例えば、ＰＮＰＬＡ３特異的阻害剤として、ＰＮＰＬＡ３ＲＮＡ及び／又はＰＮＰＬＡ３タンパク質の発現を阻害可能な核酸（アンチセンス化合物を含む）、ペプチド、抗体、小分子、及び他の薬剤が挙げられる。

【0080】

「ＰＮＰＬＡ３の阻害剤」、「ＰＮＰＬＡ３阻害剤」、及び「発現のＰＮＰＬＡ３阻害剤」という用語は、本明細書では互換的に使用される。ＰＮＰＬＡ３発現を阻害することは、ＰＮＰＬＡ３を標的とする化合物の投与により、個体におけるＰＮＰＬＡ３に関連した疾患を処置するか、予防するか、又は寛解させるのに有用であり得る。ある特定の実施形態において、ＰＮＰＬＡ３阻害剤は、ＰＮＰＬＡ３特異的阻害剤であり得る。ある特定の実施形態において、ＰＮＰＬＡ３阻害剤は、ＰＮＰＬＡ３を標的とするアンチセンス化合物、オリゴマー化合物、又はオリゴヌクレオチドであり得る。いくつかの実施形態において、ＰＮＰＬＡ３は、アンチセンスオリゴヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、このオリゴヌクレオチドは、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ標的化オリゴヌクレオチド、又は一本鎖ＲＮＡｉ化合物、例えば小ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、一本鎖ｓｉＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）、及びマイクロＲＮＡ模倣体である。

【0081】

いくつかの実施形態において、ＰＮＰＬＡ３阻害剤は、ＰＮＰＬＡ３核酸を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドである。ある特定の実施形態において、ＰＮＰＬＡ３核酸は、米国特許第１０，７７４，３３３号明細書（参照により組み込まれる）に記載されている配列、例えば、ＲｅｆＳｅｑ又はＧＥＮＢＡＮＫＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．ＮＭ＿０２５２２５．２；ヌクレオチド４３９２１００１～４３，９５４，５００が切断されているＮＣ＿００００２２．１１（配列番号２）；ＡＫ１２３８０６．１；ＢＱ６８６３２８．１；ＢＦ７６２７１１．１；ＤＡ２９０４９１．１；並びに米国特許第１０，７７４，３３３号明細書中の「配列番号７、８、９、及び１０」として列挙されている配列を有する。ある特定の実施形態において、ＰＮＰＬＡ３阻害剤は、アンチセンスオリゴヌクレオチド又はオリゴマー化合物である。ある特定の実施形態において、ＰＮＰＬＡ３阻害剤は、一本鎖である。ある特定の実施形態において、ＰＮＰＬＡ３阻害剤は、二本鎖である。

【0082】

ある特定の実施形態において、ＰＮＰＬＡ３阻害剤は、１６個の結合ヌクレオシドの長さの修飾オリゴヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態において、ＰＮＰＬＡ３阻害剤は、アンチセンス化合物又はオリゴマー化合物である。

【0083】

いくつかの実施形態において、ＰＮＰＬＡ３阻害剤は、１２～３０個の結合ヌクレオシドの長さであり且つ米国特許第１０，７７４，３３３号明細書（参照により本明細書に組み込まれる）で説明されている核酸塩基配列の内のいずれか（例えば、米国特許第１０，７７４，３３３号明細書の「配列番号１７～２１６９」の内のいずれか１つ）を含む核酸塩基配列を有する修飾オリゴヌクレオチドである。ある特定の実施形態において、ＰＮＰＬＡ３阻害剤は、アンチセンス化合物又はオリゴマー化合物である。ある特定の実施形態において、ＰＮＰＬＡ３阻害剤は、一本鎖である。ある特定の実施形態において、ＰＮＰＬＡ３阻害剤は、二本鎖である。ある特定の実施形態において、ＰＮＰＬＡ３阻害剤は、１６～３０個の結合ヌクレオシドの長さの修飾オリゴヌクレオチドである。

【0084】

いくつかの実施形態において、ＰＮＰＬＡ３阻害剤は、米国特許第１０，７７４，３３３号明細書（参照により本明細書に組み込まれる）で見出される核酸塩基配列の内のいずれか（例えば、米国特許第１０，７７４，３３３号明細書の「配列番号１７～２１６９」の内のいずれか１つ）からなる修飾オリゴヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態において、ＰＮＰＬＡ３阻害剤は、アンチセンス化合物又はオリゴマー化合物である。ある特定の実施形態において、ＰＮＰＬＡ３阻害剤は、一本鎖である。ある特定の実施形態において、ＰＮＰＬＡ３阻害剤は、二本鎖である。

【0085】

いくつかの実施形態において、ＰＮＰＬＡ３阻害剤は、１２～３０個の結合ヌクレオシドの長さであり且つ米国特許第１０，７７４，３３３号明細書（参照により本明細書に組み込まれる）で見出される核酸塩基（例えば、配列番号１の核酸塩基５５６７～５６４２、５６４４～５７３１、５５６７～５７３１、５５６７～５６２０、１３６９７～１３７３３、２０５５３～２０６７６、２０６６４～２０８２４、２０５５３～２０８２４、及び２５８４４～２５９１２）内で相補的な修飾オリゴヌクレオチドを含み、前記修飾オリゴヌクレオチドは、配列番号１に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％相補的である。ある特定の実施形態において、ＰＮＰＬＡ３阻害剤は、アンチセンス化合物又はオリゴマー化合物である。ある特定の実施形態において、ＰＮＰＬＡ３阻害剤は、一本鎖である。ある特定の実施形態において、ＰＮＰＬＡ３阻害剤は、二本鎖である。ある特定の実施形態において、修飾オリゴヌクレオチドは、１６～３０個の結合ヌクレオシドの長さである。

【0086】

いくつかの実施形態において、ＰＮＰＬＡ３発現の阻害剤は、ＰＮＰＬＡをコードする核酸の領域に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドである。ある特定の実施形態において、ＰＮＰＬＡ３阻害剤は、ＰＮＰＬＡ３核酸のヌクレオチド５５６７～５６２０を標的とする。ある特定の実施形態において、ＰＮＰＬＡ３阻害剤は、配列番号１の核酸塩基配列を有するＰＮＰＬＡ３核酸のヌクレオチド５５６７～５６４２、５６４４～５７３１、５５６７～５７３１、５５６７～５６２０内で見出されるヌクレオチド内を標的とする。ある特定の実施形態において、ＰＮＰＬＡ３阻害剤は、ＰＮＰＬＡ３をコードする核酸配列（例えば配列番号１）の５５６７～５７３１内の部位に相補的である。ある特定の実施形態において、ＰＮＰＬＡ３阻害剤は、ＰＮＰＬＡ３をコードする核酸配列（例えば配列番号１）の５６４４～５７３１内の部位に相補的である。ある特定の実施形態において、ＰＮＰＬＡ３阻害剤は、ＰＮＰＬＡ３をコードする核酸配列（例えば配列番号１）の５５６７～５６４２内の部位に相補的である。ある特定の実施形態において、ＰＮＰＬＡ３阻害剤は、ＰＮＰＬＡ３をコードする核酸配列（例えば配列番号１）の５５６７～５６２０内の部位に相補的である。ある特定の実施形態において、これらの化合物は、アンチセンス化合物、オリゴマー化合物、又はオリゴヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、ＰＮＰＬＡ３をコードする核酸は、ｍＲＮＡである。

【0087】

ある特定の実施形態では、ＰＮＰＬＡ３阻害剤は、１２～３０個の結合ヌクレオシドの長さの修飾オリゴヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態において、ＰＮＰＬＡ３阻害剤は、１６～３０個の結合ヌクレオシドの長さの修飾オリゴヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態において、ＰＮＰＬＡ３阻害剤は、１２～３０個の結合ヌクレオシドの長さであり且つ配列番号２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０の内のいずれか１つの少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、又は１６個の連続核酸塩基部分を含む核酸塩基配列を有する修飾オリゴヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態において、ＰＮＰＬＡ３阻害剤は、配列番号２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０の内のいずれか１つの少なくとも８個の連続核酸塩基を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態において、修飾オリゴヌクレオチドは、１６～３０個の結合ヌクレオシドの長さである。

【0088】

ある特定の実施形態において、ＰＮＰＬＡ３阻害剤は、１２～３０個の結合ヌクレオシドの長さであり且つ配列番号２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０の内のいずれか１つを含む核酸塩基配列を有する修飾オリゴヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態において、修飾オリゴヌクレオチドは、１６～３０個の結合ヌクレオシドの長さである。ある特定の実施形態において、ＰＮＰＬＡ３阻害剤は、配列番号２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０の内のいずれか１つの少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、又は少なくとも１６個の連続塩基を有する配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態において、ＰＮＰＬＡ３阻害剤は、配列番号２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０のいずれか１つの少なくとも８個の連続塩基を有する配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。

【0089】

ある特定の実施形態において、ＰＮＰＬＡ３阻害剤は、配列番号２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０のいずれか１つを含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。

【0090】

ある特定の実施形態において、ＰＮＰＬＡ３を標的とするＰＮＰＬＡ３阻害剤は、米国特許第１０，７７４，３３３号明細書（参照により本明細書に組み込まれる）で説明されているＩＯＮ９１６３３３、９７５６１６、９９４２８４、９７５６０５、９９４２８２、９７５６１３、９７５６１７、９７５７３５、９７５７３６、又は９７５６１２である。

【0091】

ある特定の実施形態において、前述の修飾オリゴヌクレオチドの内のいずれかは、少なくとも１つの修飾ヌクレオシド間結合、少なくとも１つの修飾糖、及び／又は少なくとも１つの修飾核酸塩基を含む。ある特定の実施形態において、前述の修飾オリゴヌクレオチドの内のいずれかは、少なくとも１つの修飾糖部分を含む。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの修飾糖部分は、２’－デオキシ、２’－Ｏ－メチル、２’－Ｏ－メトキシメチル、２’－Ｏ－メトキシエチル、２’－フルオロ、４’－ＣＨ（ＣＨ３）－Ｏ－２’、４’－ＣＨ２－Ｏ－２’、４’－（ＣＨ２）２－Ｏ－２’、又はこれらの組み合わせである。ある特定の実施形態において、少なくとも１つの修飾糖は、２’－デオキシ、２’－Ｏ－メトキシエチル基を含む。ある特定の実施形態において、少なくとも１つの修飾糖は、４’－ＣＨ（ＣＨ３）－Ｏ－２’基、４’－ＣＨ２－Ｏ－２’基、又は４’－（ＣＨ２）２－Ｏ－２’基等の二環式糖である。

【0092】

ある特定の実施形態において、前述の修飾オリゴヌクレオチドの内のいずれかは、１つ又は複数の修飾塩基を含む。いくつかの実施形態において、この修飾塩基は、５－メチルシトシンである。いくつかの実施形態において、１、２、３、４、５、６個、又はより多くのシトシンは、５－メチルシトシンである。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチド中の全てのシトシンは、５－メチルシトシンである。

【0093】

ある特定の実施形態において、修飾オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾ヌクレオシド間結合を含み、例えば、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合を含む。いくつかの実施形態において、全てのヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエートヌクレオシド結合である。

【0094】

ある特定の実施形態において、前述の修飾オリゴヌクレオチドの内のいずれかは、結合デオキシヌクレオシドからなるギャップセグメント；結合ヌクレオシドからなる５’ウイングセグメント；及び結合ヌクレオシドからなる３’ウイングセグメントとを含み、ギャップセグメントは、５’ウイングセグメントと３’ウイングセグメントとの間に位置しており、各ウイングセグメントの各ヌクレオシドは、修飾糖を含む。ある特定の実施形態において、修飾オリゴヌクレオチドは、配列番号２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０の内のいずれか１つに列挙された配列を含む核酸塩基配列を有する、１２～３０個の結合ヌクレオシドの長さである。ある特定の実施形態において、修飾オリゴヌクレオチドは、配列番号２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０の内のいずれか１つに列挙された配列を含む核酸塩基配列を有する、１６～３０個の結合ヌクレオシドの長さである。ある特定の実施形態において、修飾オリゴヌクレオチドは、配列番号２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０の内のいずれか１つに列挙された配列からなる核酸塩基配列を有する、１６個の結合ヌクレオシドの長さである。

【0095】

ある特定の実施形態において、ＰＮＰＬＡ３阻害剤は、
１０個の結合デオキシヌクレオシドからなるギャップセグメント；
３個の結合ヌクレオシドからなる５’ウイングセグメント；及び
３個の結合ヌクレオシドからなる３’ウイングセグメント
を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドであり、
ギャップセグメントは、５’ウイングセグメントと３’ウイングセグメントとの間に位置しており、各ウイングセグメントの各ヌクレオシドは、ｃＥｔ糖を含み、各ヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート結合であり、各シトシンは、５－メチルシトシンである。

【0096】

ある特定の実施形態において、ＰＮＰＬＡ３阻害剤は、配列番号２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０の内のいずれか１つに列挙される配列を含む核酸塩基配列を有する、１２～３０個の結合核酸塩基の長さの修飾オリゴヌクレオチドを含むアンチセンスオリゴヌクレオチドであり、この修飾オリゴヌクレオチドは、
１０個の結合デオキシヌクレオシドからなるギャップセグメント；
３個の結合ヌクレオシドからなる５’ウイングセグメント；及び
３個の結合ヌクレオシドからなる３’ウイングセグメント
を含み、
ギャップセグメントは、５’ウイングセグメントと３’ウイングセグメントとの間に位置しており、各ウイングセグメントの各ヌクレオシドは、ｃＥｔ糖を含み、各ヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート結合であり、各シトシンは、５－メチルシトシンである。ある特定の実施形態において、この修飾オリゴヌクレオチドは、１６～３０個の結合ヌクレオシドからなる。ある特定の実施形態において、この修飾オリゴヌクレオチドは、１６個の結合ヌクレオシドからなる。

【0097】

ある特定の実施形態において、化合物は、修飾オリゴヌクレオチドを含むか、又はそれからなり、この修飾オリゴヌクレオチドは、１６個の結合ヌクレオシドの長さであり、且つ配列番号２の配列からなり、この修飾オリゴヌクレオチドは、
１０個の結合デオキシヌクレオシドからなるギャップセグメント；
３個の結合ヌクレオシドからなる５’ウイングセグメント；及び
３個の結合ヌクレオシドからなる３’ウイングセグメント
を含み、
ギャップセグメントは、５’ウイングセグメントと３’ウイングセグメントとの間に位置しており、各ウイングセグメントの各ヌクレオシドは、ｃＥｔ糖を含み、各ヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート結合であり、各シトシンは、５－メチルシトシンである。

【0098】

いくつかの実施形態において、ＰＮＰＬＡ３阻害剤は、コンジュゲート基をさらに含むアンチセンスオリゴヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、このコンジュゲート基は、アンチセンスオリゴヌクレオチドの５’末端に存在している。そのため、ある特定の実施形態において、化合物は、修飾オリゴヌクレオチドと、コンジュゲート基とからなり、この修飾オリゴヌクレオチドは、１６個の結合ヌクレオシドの長さであり、且つ配列番号２の配列からなり、この修飾オリゴヌクレオチドは、
１０個の結合デオキシヌクレオシドからなるギャップセグメント；
３個の結合ヌクレオシドからなる５’ウイングセグメント；及び
３個の結合ヌクレオシドからなる３’ウイングセグメント
を含み、
ギャップセグメントは、５’ウイングセグメントと３’ウイングセグメントとの間に位置しており、各ウイングセグメントの各ヌクレオシドは、ｃＥｔ糖を含み、各ヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート結合であり、各シトシンは、５－メチルシトシンであり、コンジュゲート基は、修飾オリゴヌクレオチドの５’末端に位置しており、

【化1】

である。

【0099】

いくつかの実施形態において、ＰＮＰＬＡ３発現の阻害剤は、下記式（配列番号２）：

【化2】

の化合物である。

【0100】

いくつかの実施形態において、ＰＮＰＬＡ３発現の阻害剤は、下記式（配列番号２）：

【化3】

の化合物である。

【0101】

前述の実施形態の内のいずれかにおいて、ＰＮＰＬＡ３阻害剤は、アンチセンスオリゴヌクレオチドであり、このアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＰＮＰＬＡ３をコードする核酸に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％相補的であり得る。

【0102】

前述の実施形態の内のいずれかにおいて、ＰＮＰＬＡ３阻害剤は、アンチセンスオリゴヌクレオチドであり、このアンチセンスオリゴヌクレオチドは、一本鎖であり得る。ある特定の実施形態において、ＰＮＰＬＡ３阻害剤は、デオキシリボヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態において、ＰＮＰＬＡ３阻害剤は、二本鎖である。ある特定の実施形態において、ＰＮＰＬＡ３阻害剤は、二本鎖であり、且つリボヌクレオチドを含む。

【0103】

前述の実施形態の内のいずれかにおいて、ＰＮＰＬＡ３阻害剤は、アンチセンス化合物又はオリゴマー化合物であり得る。

【0104】

前述の実施形態の内のいずれかにおいて、ＰＮＰＬＡ３阻害剤は、アンチセンスオリゴヌクレオチドであり、このアンチセンスオリゴヌクレオチドは、８～８０、１０～３０、１２～５０、１３～３０、１３～５０、１４～３０、１４～５０、１５～３０、１５～５０、１６～３０、１６～５０、１７～３０、１７～５０、１８～２２、１８～２４、１８～３０、１８～５０、１９～２２、１９～３０、１９～５０、又は２０～３０個の結合ヌクレオシドの長さであり得る。いくつかの実施形態において、ＰＮＰＬＡ３阻害剤は、オリゴヌクレオチドである。

【0105】

ある特定の実施形態において、ＰＮＰＬＡ３阻害剤は、アンチセンスオリゴヌクレオチドであり、このアンチセンスオリゴヌクレオチドは、本明細書で説明されている修飾オリゴヌクレオチドと、コンジュゲート基とを含む。ある特定の実施形態において、コンジュゲート基は、修飾オリゴヌクレオチドの５’末端で修飾オリゴヌクレオチドに結合している。ある特定の実施形態において、コンジュゲート基は、修飾オリゴヌクレオチドの３’末端で修飾オリゴヌクレオチドに結合している。ある特定の実施形態において、コンジュゲート基は、少なくとも１つのＮ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、少なくとも２つのＮ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、又は少なくとも３つのＮ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）を含む。

【0106】

ある特定の実施形態において、本明細書で提供されるＰＮＰＬＡ３阻害剤は、修飾オリゴヌクレオチドの薬学的に許容される塩を含む。ある特定の実施形態において、この塩は、ナトリウム塩である。ある特定の実施形態において、この塩は、カリウム塩である。

【0107】

ある特定の実施形態において、本明細書で説明されているＰＮＰＬＡ３阻害剤は、２μＭ未満、１．５μＭ未満、１μＭ未満、０．９μＭ未満、０．８μＭ未満、０．７μＭ未満、０．６μＭ未満、０．５μＭ未満、０．４μＭ未満、０．３μＭ未満、０．２μＭ未満、０．１μＭ未満、０．０５μＭ未満、０．０４μＭ未満、０．０３μＭ未満、０．０２μＭ未満、又は０．０１μＭ未満のインビトロＩＣ_５０の内の少なくとも１つを有することにより活性である。

【0108】

ある特定の実施形態において、本明細書で説明されているＰＮＰＬＡ３阻害剤は、対照動物に対して４倍、３倍、若しくは２倍以下のアラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）若しくはアスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）値の上昇、又は対照動物と比較して３０％、２０％、１５％、１２％、１０％、５％、若しくは２％以下の肝臓、脾臓、若しくは腎臓の重量の増加の内の少なくとも一方を有することにより示されるように、忍容性が高い。ある特定の実施形態において、本明細書で説明されているＰＮＰＬＡ３阻害剤は、対照動物と比較してＡＬＴ又はＡＳＴの上昇がないことにより示されるように、忍容性が高い。ある特定の実施形態において、本明細書で説明されているＰＮＰＬＡ３阻害剤は、対照動物と比較して肝臓、脾臓、又は腎臓の重量の増加がないことにより示されるように、忍容性が高い。

【0109】

ある特定の実施形態は、前述した実施形態の内のいずれかのＰＮＰＬＡ３阻害剤、又はその薬学的に許容される任意の塩と、薬学的に許容される担体又は希釈剤の内の少なくとも１つとを含む組成物を提供する。ある特定の実施形態において、この組成物は、約４０センチポアズ（ｃＰ）未満、約３０センチポアズ（ｃＰ）未満、約２０センチポアズ（ｃＰ）未満、約１５センチポアズ（ｃＰ）未満、又は約１０センチポアズ（ｃＰ）未満の粘度を有する。ある特定の実施形態において、前述した粘度の内のいずれかを有する組成物は、約１００ｍｇ／ｍＬ、約１２５ｍｇ／ｍＬ、約１５０ｍｇ／ｍＬ、約１７５ｍｇ／ｍＬ、約２００ｍｇ／ｍＬ、約２２５ｍｇ／ｍＬ、約２５０ｍｇ／ｍＬ、約２７５ｍｇ／ｍＬ、又は約３００ｍｇ／ｍＬの濃度で、本明細書で提供されるＰＮＰＬＡ３阻害剤を含む。ある特定の実施形態において、前述した粘度及び／又はＰＮＰＬＡ３阻害剤濃度の内のいずれかを有する組成物は、室温、又は約２０℃、約２１℃、約２２℃、約２３℃、約２４℃、約２５℃、約２６℃、約２７℃、約２８℃、約２９℃、若しくは約３０℃の温度を有する。

【0110】

ＧＬＰ－１ペプチド
グルコン及びグルカゴン様ペプチド－１（ＧＬＰ－１）は、１５８アミノ酸前駆体ポリペプチドであるプレプログルカゴンに由来しており、これは、様々な組織でプロセシングされて、グルカゴン、グルカゴン様ペプチド－１（ＧＬＰ－１）、グルカゴン様ペプチド－２（ＧＬＰ－２）、及びオキシントモジュリン（ＯＸＭ）等のいくつかの異なるプログルカゴン由来のペプチドを形成するが、これらは、グルコースホメオスタシス、インスリン分泌、胃内容排出、及び腸成長、並びに食物摂取の調節等の多様な生理学的機能に関与する。グルカゴンは、プログルカゴンのアミノ酸３３～６１（プレプログルカゴンの５３～８１）に対応する２９アミノ酸ペプチドであるのに対し、ＧＬＰ－１は、プログルカゴンのアミノ酸７２～１０８（プレプログルカゴンの９２～１２８）に対応する３７アミノ酸ペプチドとして生成される。ＧＬＰ－１（７～３６）アミド又はＧＬＰ－１（７～３７）酸は、ＧＬＰ－１受容体で本質的に同等の活性を示すＧＬＰ－１の生物活性の形態である。例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第９，７６５，１３０号明細書を参照されたい。

【0111】

本明細書で使用される場合、「ＧＬＰ－１／グルカゴンアゴニストペプチド」は、アッセイ１の条件下で、グルカゴン受容体において、天然グルカゴンと比較して、少なくとも約１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、又はより高い活性を呈し、且つＧＬＰ－１受容体において、天然ＧＬＰ－１と比較して、少なくとも約１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、又はより高い活性を呈するキメラペプチドである。

【0112】

本明細書で使用される場合、「ネイティブグルカゴン」という用語は、配列番号１１の配列を含む、天然に存在するグルカゴン（例えば、ヒトグルカゴン）を指す。「天然ＧＬＰ－１」という用語は、天然起源のＧＬＰ－１（例えば、ヒトＧＬＰ－１）を指しており、例えば、ＧＬＰ－１（７～３６）アミド（配列番号１２）、ＧＬＰ－１（７～３７）酸（配列番号１３）、又はこれら２つの化合物の混合物を包含する総称である。本明細書で使用される場合、「グルカゴン」又は「ＧＬＰ－１」への一般的な言及は、それ以上の呼称がない場合、天然ヒトグルカゴン又は天然ヒトＧＬＰ－１をそれぞれ意味することが意図されている。他に指示がない限り、「グルカゴン」は、ヒトグルカゴンを指しており、「ＧＬＰ－１」は、ヒトＧＬＰ－１を指す。

【0113】

グルカゴンは、膵臓により生成され得、グルカゴン受容体（「ＧＣＧＲ」）と相互作用し得る。グルカゴンは、肝臓内で作用して、糖新生及びグリコーゲン分解によって血糖を上昇させ得る。血糖が下がり始めると、グルカゴンは、グリコーゲンを分解してグルコースを放出するように肝臓にシグナルを送り得、血糖値が通常のレベルへと上昇する。ＧＬＰ－１は、グルカゴンと比較して異なる生物活性を有し得る。ＧＬＰ－１は、消化管内Ｌ細胞から分泌され得、ＧＬＰ－１受容体に結合し得る。ＧＬＰ－１活性として、インスリンの合成及び分泌の刺激、グルカゴン分泌の阻害、及び食物摂取の阻害が挙げられ得る。

【0114】

本明細書で提供されるのは、グルカゴン受容体又はグルカゴン様ペプチド－１（ＧＬＰ－１）のアゴニストである。いくつかの実施形態において、グルカゴン受容体又はグルカゴン様ペプチド－１（ＧＬＰ－１）のアゴニストは、ポリペプチドを含む。グルカゴン受容体とＧＬＰ－１受容体との両方に結合するペプチド。ある特定の実施形態において、本明細書で提供されるペプチドは、グルカゴン及びＧＬＰ－１活性のコアゴニストである。そのようなペプチドは、本明細書では、ＧＬＰ－１／グルカゴンアゴニストペプチドと称される。本明細書で提供されるＧＬＰ－１／グルカゴンアゴニストペプチドは、体重減少を促進し、体重増加を防止するか、又は望ましい体重を維持するのに有利な比でＧＬＰ－１活性及びグルカゴン活性を有し、最適な溶解性、製剤化性、及び安定性を有する。ある特定の実施形態において、本明細書で提供されるＧＬＰ－１／グルカゴンアゴニストペプチドは、ヒトＧＬＰ－１及びヒトグルカゴン受容体において活性であり、ある特定の実施形態において、ＧＬＰ－１受容体において天然リガンドと比較した相対活性は、グルカゴン受容体でのものより、少なくとも約１倍、２倍、５倍、８倍、１０倍、１５倍、２０倍、又は２５倍高い。

【0115】

本明細書で使用される場合、「ペプチド」という用語は、完全長ペプチド、及びその断片、変異体、又は誘導体を包含しており、例えば、ＧＬＰ－１／グルカゴンアゴニストペプチド（例えば、２９、３０、又は３１個のアミノ酸の長さ）を包含する。本明細書で開示されている「ペプチド」（例えば、ＧＬＰ－１／グルカゴンアゴニストペプチド）は、例えば、半減期を延長するためのＦｃドメイン又はアルブミンドメイン等の別の成分を含む融合ポリペプチドの一部であり得る。本明細書で説明されているペプチドをまた、多数の異なる方法で誘導体化し得る。

【0116】

「断片」、「類似体」、「誘導体」、又は「変異体」という用語は、ＧＬＰ－１／グルカゴンアゴニストペプチドを指す場合には、少なくとも一部の要望される活性（例えば、グルカゴン及び／又はＧＬＰ－１受容体への結合）を保持する任意のペプチドを含む。本明細書で提供されるＧＬＰ－１／グルカゴンアゴニストペプチドの断片として、発現、精製、及び又は対象への投与の際に望ましい特性を呈する、タンパク質分解断片、欠失断片が挙げられる。

【0117】

ある特定の実施形態において、開示されているＧＬＰ－１／グルカゴンアゴニストペプチドは、グルカゴン及びＧＬＰ－１受容体において望ましい力価を有しており、体重減少を促進する上で望ましい相対力価を有する。ある特定の実施形態において、開示されているＧＬＰ－１／グルカゴンアゴニストペプチドは、ｃＡＭＰアッセイ１（実施例２を参照されたい）でのＥＣ５０により示されるように、ＧＬＰ－１受容体において、１０，０００ｐＭ未満、５０００ｐＭ未満、２５００ｐＭ未満、１０００ｐＭ未満、９００ｐＭ未満、８００ｐＭ未満、７００ｐＭ未満、６００ｐＭ未満、５００ｐＭ未満、４００ｐＭ未満、３００ｐＭ未満、２００ｐＭ未満、１００ｐＭ未満、５０ｐＭ未満、２５ｐＭ未満、２０ｐＭ未満、１５ｐＭ未満、１０ｐＭ未満、５ｐＭ未満、４ｐＭ未満、３ｐＭ未満、又は２ｐＭ未満のインビトロ力価を呈示する。ある特定の実施形態において、開示されているＧＬＰ－１／グルカゴンアゴニストペプチドは、４．４％ヒト血清アルブミン中のｃＡＭＰアッセイ（アッセイ２、実施例２を参照されたい）でのＥＣ５０により示されるように、ＧＬＰ－１受容体において、１０，０００ｐＭ未満、５０００ｐＭ未満、２５００ｐＭ未満、１０００ｐＭ未満、９００ｐＭ未満、８００ｐＭ未満、７００ｐＭ未満、６００ｐＭ未満、５００ｐＭ未満、４００ｐＭ未満、３００ｐＭ未満、２００ｐＭ未満、１００ｐＭ未満、５０ｐＭ未満、２５ｐＭ未満、２０ｐＭ未満、１５ｐＭ未満、１０ｐＭ未満、５ｐＭ未満、４ｐＭ未満、３ｐＭ未満、又は２ｐＭ未満のインビトロ力価を呈示する。ある特定の実施形態において、開示されているＧＬＰ－１／グルカゴンアゴニストペプチドは、ｃＡＭＰアッセイ１（参照により本明細書に組み込まれる米国特許第９，７６５，１３０号明細書の実施例２を参照されたい）でのＥＣ５０により示されるように、グルカゴン受容体において、１０，０００ｐＭ未満、５０００ｐＭ未満、２５００ｐＭ未満、１０００ｐＭ未満、９００ｐＭ未満、８００ｐＭ未満、７００ｐＭ未満、６００ｐＭ未満、５００ｐＭ未満、４００ｐＭ未満、３００ｐＭ未満、２００ｐＭ未満、１００ｐＭ未満、５０ｐＭ未満、２５ｐＭ未満、２０ｐＭ未満、１５ｐＭ未満、１０ｐＭ未満、５ｐＭ未満、４ｐＭ未満、３ｐＭ未満、又は２ｐＭ未満のインビトロ力価を呈示する。ある特定の実施形態において、開示されているＧＬＰ－１／グルカゴンアゴニストペプチドは、４．４％ヒト血清アルブミンにおけるｃＡＭＰアッセイ（アッセイ２、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第９，７６５，１３０号明細書の実施例２を参照されたい）でのＥＣ５０により示されるように、グルカゴン受容体において、１０，０００ｐＭ未満、５０００ｐＭ未満、２５００ｐＭ未満、１０００ｐＭ未満、９００ｐＭ未満、８００ｐＭ未満、７００ｐＭ未満、６００ｐＭ未満、５００ｐＭ未満、４００ｐＭ未満、３００ｐＭ未満、２００ｐＭ未満、１００ｐＭ未満、５０ｐＭ未満、２５ｐＭ未満、２０ｐＭ未満、１５ｐＭ未満、１０ｐＭ未満、５ｐＭ未満、４ｐＭ未満、３ｐＭ未満、又は２ｐＭ未満のインビトロ力価を呈示する。ある特定の実施形態において、開示されているＧＬＰ－１／グルカゴンアゴニストペプチドは、ネイティブリガンドと比較した場合に、アッセイ２を使用する場合に約０．０１～０．５０の範囲、例えば、約０．０２～０．３０の範囲、例えば、約０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１０、０．１１、０．１２、０．１３、０．１４、０．１５、０．１６、０．１７、０．１８、０．１９、０．２０、０．２１、０．２２、０．２３、０．２４、０．２５、０．２６、０．２７、０．２８、又は０．３０の相対ＧＬＰ１－Ｒ／ＧＣＧＲ力価比を有する。

【0118】

ある特定の実施形態において、開示されているＧＬＰ－１／グルカゴンアゴニストペプチドは、ｃＡＭＰアッセイ１（参照により本明細書に組み込まれる米国特許第９，７６５，１３０号明細書の実施例２を参照されたい）でのＥＣ５０により示されるように、グルコース依存性インスリン分泌性ペプチド（胃抑制ペプチド）（ＧＩＰＲ）において、１０，０００ｐＭ未満、５０００ｐＭ未満、２５００ｐＭ未満、１０００ｐＭ未満、９００ｐＭ未満、８００ｐＭ未満、７００ｐＭ未満、６００ｐＭ未満、５００ｐＭ未満、４００ｐＭ未満、３００ｐＭ未満、２００ｐＭ未満、１００ｐＭ未満、５０ｐＭ未満、２５ｐＭ未満、２０ｐＭ未満、１５ｐＭ未満、１０ｐＭ未満、５ｐＭ未満、４ｐＭ未満、３ｐＭ未満、又は２ｐＭ未満のインビトロ力価を呈示する。ある特定の実施形態において、開示されているＧＬＰ－１／グルカゴンアゴニストペプチドは、４．４％ヒト血清アルブミンにおけるｃＡＭＰアッセイ（アッセイ２、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第９，７６５，１３０号明細書の実施例２を参照されたい）でのＥＣ５０により示されるように、ＧＩＰＲにおいて、１０，０００ｐＭ未満、５０００ｐＭ未満、２５００ｐＭ未満、１０００ｐＭ未満、９００ｐＭ未満、８００ｐＭ未満、７００ｐＭ未満、６００ｐＭ未満、５００ｐＭ未満、４００ｐＭ未満、３００ｐＭ未満、２００ｐＭ未満、１００ｐＭ未満、５０ｐＭ未満、２５ｐＭ未満、２０ｐＭ未満、１５ｐＭ未満、１０ｐＭ未満、５ｐＭ未満、４ｐＭ未満、３ｐＭ未満、又は２ｐＭ未満のインビトロ力価を呈示する。

【0119】

ある特定の実施形態において、本明細書で提供されるＧＬＰ－１／グルカゴンアゴニストペプチドは、許容可能な可溶性、製剤化のしやすさ、血漿安定性、及び改善された薬物動力学特性の内の１つ又は複数の基準を有する。ある特定の実施形態において、開示されているＧＬＰ－１／グルカゴンアゴニストペプチドは、広範なｐＨ範囲にわたって標準バッファーに可溶性である。

【0120】

ある特定の実施形態において、ＧＬＰ－１／グルカゴンアゴニストペプチドは、一般的バッファー溶液に、最大０．５ｍｇ／ｍｌ、０．６ｍｇ／ｍｌ、０．７ｍｇ／ｍｌ、０．８ｍｇ／ｍｌ、０．９ｍｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌ、２ｍｇ／ｍｌ、３ｍｇ／ｍｌ、４ｍｇ／ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌ、６ｍｇ／ｍｌ、７ｍｇ／ｍｌ、８ｍｇ／ｍｌ、９ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、又はそれを超える濃度で、バッファー系に、例えば、０．２５～１５０ｍＭのイオン強度の範囲で可溶性であり、限定されないが、リン酸バッファー、Ｔｒｉｓバッファー、グルタミン酸バッファー、酢酸バッファー、コハク酸バッファー、又はヒスチジンバッファーが挙げられる。例示的バッファーとして、１００ｍＭグルタミン酸ｐＨ４．５バッファー、１００ｍＭ酢酸ｐＨ５バッファー、１００ｍＭコハク酸ｐＨ５バッファー、１００ｍＭリン酸ｐＨ６バッファー、１００ｍＭヒスチジンｐＨ６バッファー、１００ｍＭリン酸ｐＨ６．５バッファー、１００ｍＭリン酸ｐＨ７．０バッファー、１００ｍＭヒスチジンｐＨ７．０バッファー、１００ｍＭリン酸ｐＨ７．５バッファー、１００ｍＭＴｒｉｓｐＨ７．５バッファー、及び１００ｍＭＴｒｉｓｐＨ８．０バッファーが挙げられる。ある特定の実施形態において、開示されているＧＬＰ－１／グルカゴンアゴニストペプチドは、例えば、ｐＨ４．０～ｐＨ８．０のｐＨ範囲にわたって、例えば、ｐＨ４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、又は８．５で、０．８ｍｇ／ｍｌの標準的バッファーに可溶性である。ある特定の実施形態において、開示されているＧＬＰ－１／グルカゴンアゴニストペプチドは、ｐＨ４．５～８．０、５．０～８．０、５．５～８．０、６．０～８．０、６．５～８．０、７．０～８．０、４．５～８．５、５．５～８．５、５．５～８．５、６．０～８．５、６．５～８．５、又は７．０～８．５の標準的バッファーに可溶性である。

【0121】

ある特定の実施形態において、開示されているＧＬＰ－１／グルカゴンアゴニストペプチドは、標準的医薬製剤に製剤化可能である。代表的な製剤として下記が挙げられるが、これらに限定されない：０．１ＭＴｒｉｓｐＨ７．５、１５０ｍＭマンニトール、最終製剤ｐＨ＝７．２；０．０５ＭＴｒｉｓ、５０ｍＭアルギニン／プロリン、最終製剤ｐＨ＝８．０；又はリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ８）／１．８５％Ｗ／Ｖプロピレングリコール、最終製剤ｐＨ＝７．０。ある特定の実施形態において、開示されているＧＬＰ－１／グルカゴンアゴニストペプチドは、最大０．５ｍｇ／ｍｌ、０．６ｍｇ／ｍｌ、０．７ｍｇ／ｍｌ、０．８ｍｇ／ｍｌ、０．９ｍｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌ、２ｍｇ／ｍｌ、３ｍｇ／ｍｌ、４ｍｇ／ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌ、６ｍｇ／ｍｌ、７ｍｇ／ｍｌ、８ｍｇ／ｍｌ、９ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、又はそれを超える濃度で、これらの製剤又は他の製剤に可溶性である。

【0122】

ある特定の実施形態において、開示されているＧＬＰ－１／グルカゴンアゴニストペプチドは、血清又は血漿中のプロテアーゼに対して許容可能に安定している。グルカゴン又はＧＬＰ－１の一般的分解産物として、＋１産物（酸）及びＤＰＰＩＶ－分解産物が挙げられる。＋１質量の産物は、グルタミンのアミド基又はＣ末端での分解から生じ得、分解産物は、血漿中でのプロテアーゼＤＰＰＩＶの作用により生じる。ある特定の実施形態において、開示されているＧＬＰ－１／グルカゴンアゴニストペプチドは、３７℃の血漿中２４時間後、最大３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％のレベルで血漿中に安定したままである。

【0123】

本明細書で提供されるのは、下記のアミノ酸配列を含むＧＬＰ－１／グルカゴンアゴニストペプチドである：
ＨＸ２ＱＧＴＦＴＳＤＸ１０ＳＸ１２Ｘ１３ＬＸ１５Ｘ１６Ｘ１７Ｘ１８ＡＸ２０Ｘ２１ＦＸ２３Ｘ２４ＷＬＸ２７Ｘ２８ＧＸ３０
（式中、Ｘ２は、Ｇ又はＳであり、Ｘ１０は、Ｙ又はＫであり、Ｘ１２は、Ｋ、Ｅ、Ｒ、又はＳであり、Ｘ１３は、Ｋ又はＹであり、Ｘ１５は、Ｄ又はＥであり、Ｘ１６は、Ｓ又はＧであり、Ｘ１７は、Ｅ、Ｒ、Ｑ、又はＫであり、Ｘ１８は、Ｒ、Ｓ、又はＡであり、Ｘ２０は、Ｒ、Ｋ、又はＱであり、Ｘ２１は、Ｄ又はＥであり、Ｘ２３は、Ｖ又はＩであり、Ｘ２４は、Ａ又はＱであり、Ｘ２７は、Ｅ又はＶであり、Ｘ２８は、Ａ又はＫであり、Ｘ３０は、Ｇ又はＲである）（配列番号２５）。ある特定の実施形態において、上記に示された単離ペプチドが提供され、式中、Ｘ２は、Ｓであり、Ｘ１０は、Ｙ又はＫであり、Ｘ１２は、Ｋ、Ｅ、Ｒ、又はＳであり、Ｘ１３は、Ｋ又はＹであり、Ｘ１５は、Ｄであり、Ｘ１６は、Ｓであり、Ｘ１７は、Ｅ、Ｒ、Ｑ、又はＫであり、Ｘ１８は、Ｒ、Ｓ、又はＡであり、Ｘ２０は、Ｒであり、Ｘ２１は、Ｄであり、Ｘ２３は、Ｖであり、Ｘ２４は、Ａであり、Ｘ２７は、Ｅ又はＶであり、Ｘ２８は、Ａであり、Ｘ３０は、Ｇである（配列番号２６）。ある特定の実施形態において、上記に示された単離ペプチドが提供され、式中、Ｘ１７がＥであり、且つＸ１８がＲである場合には、Ｘ２は、Ｓであり、Ｘ１０は、Ｙ又はＫであり、Ｘ１２は、Ｋ、Ｅ、Ｒ、又はＳであり、Ｘ１３は、Ｋ又はＹであり、Ｘ１５は、Ｄであり、Ｘ１６は、Ｓであるか、又はＸ１７がＲであり、且つＸ１８がＳである場合には、Ｘ２０は、Ｒであり、Ｘ２１は、Ｄであり、Ｘ２３は、Ｖであり、Ｘ２４は、Ａであり、Ｘ２７は、Ｅ又はＶであり、Ｘ２８は、Ａであり、Ｘ３０は、Ｇである（それぞれ、配列番号２７及び配列番号２８）。

【0124】

ある特定の実施形態において、上記に示された単離ペプチドが提供され、式中、Ｘ１７がＥであり、且つＸ１８がＲである場合には、Ｘ２は、Ｓであり、Ｘ１０は、Ｙであり、Ｘ１２は、Ｋであり、Ｘ１３は、Ｋであり、Ｘ１５は、Ｄであり、Ｘ１６は、Ｓであるか、又はＸ１７がＲであり、且つＸ１８がＳである場合には、Ｘ２０は、Ｒであり、Ｘ２１は、Ｄであり、Ｘ２３は、Ｖであり、Ｘ２４は、Ａであり、Ｘ２７は、Ｖであり、Ｘ２８は、Ａであり、Ｘ３０は、Ｇである（それぞれ、配列番号２９及び配列番号３０）。ある特定の実施形態において、上記に示された単離ペプチドが提供され、式中、Ｘ１２が、Ｋ、Ｅ、又はＲである場合には、及びＸ１２がＫ、Ｅ、Ｒ、又はＳである場合には、Ｘ２は、Ｓであり、Ｘ１０がＫであり、Ｘ１７がＥであり、且つＸ１８がＲである場合には、及びＸ１７がＲであり、且つＸ１８がＳである場合には、Ｘ１３は、Ｙであり、Ｘ１５は、Ｄであり、Ｘ１６は、Ｓであり、Ｘ２０は、Ｒであり、Ｘ２１は、Ｄであり、Ｘ２３は、Ｖであり、Ｘ２４は、Ａであり、Ｘ２７は、Ｅであり、Ｘ２８は、Ａであり、Ｘ３０は、Ｇである（それぞれ、配列番号３１及び配列番号３２）。ある特定の実施形態において、上記に示された単離ペプチドが提供され、式中、Ｘ１７がＥであり、且つＸ１８がＲである場合には、Ｘ２は、Ｓであり、Ｘ１０は、Ｋであり、Ｘ１２は、Ｅであり、Ｘ１３は、Ｙであり、Ｘ１５は、Ｄであり、Ｘ１６は、Ｓであるか、又はＸ１７がＲであり、且つＸ１８がＳである場合には、Ｘ２０は、Ｒであり、Ｘ２１は、Ｄであり、Ｘ２３は、Ｖであり、Ｘ２４は、Ａであり、Ｘ２７は、Ｅであり、Ｘ２８は、Ａであり、Ｘ３０は、Ｇである（それぞれ、配列番号３３及び配列番号３４）。ある特定の実施形態において、上記に示された単離ペプチドが提供され、式中、Ｘ１７がＥであり、且つＸ１８がＲである場合には、Ｘ２は、Ｓであり、Ｘ１０は、Ｋであり、Ｘ１２は、Ｒであり、Ｘ１３は、Ｙであり、Ｘ１５は、Ｄであり、Ｘ１６は、Ｓであるか、又はＸ１７がＲであり、且つＸ１８がＳである場合には、Ｘ２０は、Ｒであり、Ｘ２１は、Ｄであり、Ｘ２３は、Ｖであり、Ｘ２４は、Ａであり、Ｘ２７は、Ｅであり、Ｘ２８は、Ａであり、Ｘ３０は、Ｇである（それぞれ、配列番号３５及び配列番号３６）。

【0125】

本明細書で提供されるＧＬＰ－１／グルカンアゴニストペプチドとして下記が挙げられ得るが、これらに限定されない：Ｇ７３０（配列番号１４）、Ｇ７９７（配列番号１５）、Ｇ８４９（配列番号１６）、Ｇ９３３（配列番号１７）、Ｇ８６５（配列番号１８）、Ｇ７９６（配列番号１９）、Ｇ８１２（配列番号２０）、及びＧ３８０（配列番号２１）。これらのＧＬＰ－１／グルカンアゴニストペプチドを、表１に列挙する。

【0126】

【表1】

【0127】

ｉ．グルカゴン受容体及び／又はＧＬＰ－１受容体に対するアゴニストを製造する方法
ＧＬＰ－１／グルカゴンアゴニストペプチド。本明細書で提供されるＧＬＰ－１／グルカゴンアゴニストペプチドを、任意の好適な方法により製造し得、例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第９，７６５，１３０号明細書で説明されている方法により製造し得る。例えば、ある特定の実施形態において、本明細書で提供されるＧＬＰ－１／グルカゴンアゴニストペプチドを、当業者に公知の方法により化学的に合成し、例えば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ（１９６３，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９－２１５４）により説明されている固相合法により化学的に合成する。例えば、標準的試薬を使用する自動合成装置を使用して、固相ペプチド合成を達成し得る。

【0128】

或いは、本明細書で提供されるＧＬＰ－１／グルカゴンアゴニストペプチドを、当業者には公知である好都合なベクター／宿主細胞の組み合わせを用いて、組み換えにより製造し得る。ＧＬＰ－１／グルカゴンアゴニストペプチドを組換えにより製造するために、様々な方法が利用可能である。一般に、ＧＬＰ－１／グルカゴンアゴニストペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を、適切な発現媒体（例えば、挿入されたコード配列の転写及び翻訳に必要なエレメントを含有するベクター）に挿入する。ＧＬＰ－１／グルカゴンアゴニストペプチドをコードする核酸を、適切なリーディングフレーム内でベクターに挿入する。次に、ＧＬＰ－１／グルカゴンアゴニストペプチドを発現する好適な宿主細胞に、発現ベクターをトランスフェクトする。好適な宿主細胞として、細菌、酵母、又は哺乳動物細胞が挙げられるが、これらに限定されない。市販の様々な宿主発現ベクター系を利用して、本明細書で説明されているＧＬＰ－１／グルカゴンアゴニストペプチドを発現させ得る。

【0129】

ｉｉ．修飾、コンジュゲート、融合、及び誘導体化。
いくつかの実施形態において、本明細書で説明されているペプチドは、アミノ酸配列中のアミノ酸に対する修飾を含む。ある特定の実施形態において、本明細書で提供されるＧＬＰ－１／グルカゴンアゴニストペプチドは、アミノ酸修飾により安定化されている。ある特定の実施形態において、Ｃ末端アミノ酸のカルボキシル基は、アミド化されている。ある特定の実施形態において、Ｃ末端アミノ酸は、アミド化グリシンであり、例えば、Ｇ７３０、Ｇ７９７、Ｇ８４９、Ｇ８６５、Ｇ７９６、Ｇ８１２、及びＧ３８０である。ある特定の実施形態において、例えば、Ｇ９３３（即ち、Ｃ末端グリシン）は、非修飾酸である。ある特定の実施形態において、１つ又は複数のアミノ酸残基がアシル化されている（即ち、アシル部分の付加）ＧＬＰ－１／グルカゴンアゴニストペプチドが提供される。例えば、ある特定の実施形態において、本明細書で提供されるＧＬＰ－１／グルカゴンアゴニストペプチドは、１つ又は複数のリシン残基を含有し、ここで、パルミトイル部分は、Ｎ（ε）基に結合している。ある特定の実施形態において、リンカーは、リシンとパルミトイル基との間に組み込まれる。このリンカーは、γグルタミン酸基であり得るか、又は限定されないが、βアラニン及びアミノヘキサン酸等の別のリンカーであり得る。コレステロール又はミリストイル基の付加等の異なるアシル化方法を使用してもよい。ある特定の実施形態において、パルミトイル部分は、１３位（例えば、Ｇ７３０）に付加されている。ある特定の実施形態において、パルミトイル部分は、１０位（例えば、Ｇ７９７、Ｇ８４９、Ｇ９３３、Ｇ８６５、Ｇ７９６、及びＧ８１２）に付加されている。ある特定の実施形態において、パルミトイル部分は、１７位（例えば、Ｇ３８０）に付加されている。

【0130】

本明細書で提供されるＧＬＰ－１／グルカゴンアゴニストペプチド（例えば、Ｇ７３０、Ｇ７９７、Ｇ８４９、及びＧ９３３）を、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第９，７６５，１３０号明細書の実施例１で説明されているように、パルミトイル化して、血清アルブミンとの会合により半減期を延長させ、これによって腎クリアランスの傾向を低減させ得る。

【0131】

或いは、又はこれに加えて、例えば、半減期を延長させるために、本明細書で開示されているＧＬＰ－１／グルカゴンアゴニストペプチドを、異種部分と会合させ得る。この異種部分は、タンパク質、ペプチド、タンパク質ドメイン、リンカー、有機ポリマー、無機ポリマー、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ビオチン、アルブミン、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、ＨＳＡＦｃＲｎ結合部分、抗体、抗体のドメイン、抗体断片、一本鎖抗体、ドメイン抗体、アルブミン結合ドメイン、酵素、リガンド、受容体、結合ペプチド、非ＦｎＩＩＩスキャフォールド、エピトープタグ、組換えポリペプチドポリマー、サイトカイン、及びこのような部分の内の２つ以上の組み合わせであり得る。

【0132】

例えば、ＧＬＰ－１／グルカゴンアゴニストペプチドを、異種ポリペプチドと融合させ得る。組換え遺伝子融合及び発現、又は化学コンジュゲーションのいずれかによって、このペプチドをタンパク質と融合させ得る。融合するパートナーとして好適なタンパク質として、ヒト血清アルブミン、抗体、及び抗体のＦｃ部分との融合を含む抗体断片が挙げられるが、これらに限定されない。ＧＬＰ－１は、力価を保持しながら、これらのタンパク質と融合している（Ｌ．Ｂａｇｇｉｏｅｔａｌ，Ｄｉａｂｅｔｅｓ５３２４９２－２５００（２００４）；Ｐ．ＢａｒｒｉｎｇｔｏｎｅｔａｌＤｉａｂｅｔｅｓ，ＯｂｅｓｉｔｙａｎｄＭｅｔａｂｏｌｉｓｍ１３４２６－４３３（２０１１）；Ｐ．ＰａｕｌｉｋｅｔａｌＡｍｅｒｉｃａｎＤｉａｂｅｔｅｓＡｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ２０１２，Ｐｏｓｔｅｒ１９４６）。伸長された組換えペプチド配列はまた、ペプチドに高分子量を付与することも説明されている（Ｖ．ＳｃｈｅｌｌｅｎｂｅｒｇｅｒｅｔａｌＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ２７１１８６－１１９０（２００９）；ＰＡＳｙｌａｔｉｏｎ（欧州特許出願公開第２１７３８９０号明細書））。ある特定の実施形態において、ＧＬＰ－１／グルカゴンアゴニストペプチドは、Ｃ末端での融合パートナー（例えば、アルブミン又はＦｃ部分）と一緒に、融合タンパク質のＮ末端部分として組み込まれる。本明細書で説明されているＧＬＰ－１／グルカゴンアゴニストペプチドをまた、ヒト血清アルブミンに対する親和性を有する「Ａｌｂｕｄａｂｓ」等のペプチド又はタンパク質ドメインにも融合させ得る（Ｍ．Ｓ．ＤｅｎｎｉｓｅｔａｌＪＢｉｏｌＣｈｅｍ２７７３５０３５－３５０４３（２００２）；Ａ．ＷａｌｋｅｒｅｔａｌＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇＤｅｓｉｇｎＳｅｌｅｃｔｉｏｎ２３２７１－２７８（２０１０））。本明細書で開示されているＧＬＰ－１／グルカゴンアゴニストペプチドを異種ポリペプチド（例えば、アルブミン又はＦｃ領域）と融合させる方法は、当業者に公知である。

【0133】

他の異種部分をＧＬＰ－１／グルカゴンアゴニストペプチドにコンジュゲートさせて、さらに安定化させ得るか、又はさらに半減期を延長させ得る。化学的融合の場合には、ある特定の実施形態は、遊離Ｎ末端の維持を特徴とするが、誘導体化のための代替点を作製し得る。さらに別の方法は、このペプチドを、高分子量ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の大きな化学的部分（ｌａｒｇｅｃｈｅｍｉｃａｌｍｏｉｅｔｙ）で誘導体化させることである。「ペグ化ＧＬＰ－１／グルカゴンアゴニストペプチド」は、これに共有結合したＰＥＧ鎖を有する。ＧＬＰ－１／グルカゴンアゴニストペプチドの誘導体化（例えば、ペグ化）を、パルミトイル化したリシンで行い得るか、或いは置換されたか又は誘導体化を可能にするような伸長により組み込まれたシステイン等の残基で行い得る。前述のＧＬＰ－１／グルカゴンアゴニストペプチドフォーマットを、インビトロ及び／又はインビボで、相対力価と、ＧＬＰ－１及びグルカゴン受容体活性化の間の均衡とに関して特徴付け得る。

【0134】

一般的用語「ポリエチレングリコール鎖」又は「ＰＥＧ鎖」は、エチレンオキシドの縮合ポリマーと水との混合物を指しており、これは、一般式Ｈ（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｎＯＨ（ｎは、３、４、５、６、７、８、９、又はそれを超える整数である）で表される分岐鎖又は直鎖である。ＰＥＧ鎖は、約５００～約４０，０００ダルトンの範囲から選択される平均総分子量を有するエチレングリコールのポリマーを含む。ＰＥＧ鎖の平均分子量は、数値により示され、例えば、ＰＥＧ－５，０００は、約５，０００の総平均分子量を有するポリエチレングリコール鎖を指す。

【0135】

ＰＥＧ化を、当該技術分野で既知のＰＥＧ化反応のいずれかにより実行し得る。例えば、ＦｏｃｕｓｏｎＧｒｏｗｔｈＦａｃｔｏｒｓ，３：４－１０，１９９２、並びに欧州特許出願公開第０１５４３１６号明細書及び同第０４０１３８４号明細書を参照されたい。ＰＥＧ化を、反応性ポリエチレングリコール分子（又は類似の反応性水溶性ポリマー）とのアシル化反応又はアルキル化反応を使用して実行し得る。

【0136】

ＰＥＧ化ＧＬＰ－１／グルカゴンアゴニストペプチドを調製する方法は、一般に、（ａ）分子が、１つ又は複数のＰＥＧ基に結合する条件下で、ＧＬＰ－１／グルカゴンアゴニストペプチドをポリエチレングリコール（例えば、ＰＥＧの反応性エステル又はアルデヒド誘導体）と反応させるステップと、（ｂ）反応産物を取得するステップとを含む。

【0137】

投与
本開示は、対象に、ＰＮＰＬＡ３発現の阻害剤と、グルカゴン受容体及び／又はＧＬＰ－１受容体のアゴニストとを投与することにより、この対象の肝疾患を処置する方法を提供する。いくつかの実施形態において、ＰＮＰＬＡ３発現の阻害剤と、グルカゴン受容体及び／又はＧＬＰ－１受容体のアゴニストとを、同時に投与する。いくつかの実施形態において、ＰＮＰＬＡ３発現の阻害剤と、グルカゴン受容体及び／又はＧＬＰ－１受容体のアゴニストとを、互いに１時間以内に投与する。いくつかの実施形態において、ＰＮＰＬＡ３発現の阻害剤と、グルカゴン受容体及び／又はＧＬＰ－１受容体のアゴニストとを、互いに２４時間以内に投与する。いくつかの実施形態において、ＰＮＰＬＡ３発現の阻害剤と、グルカゴン受容体及び／又はＧＬＰ－１受容体のアゴニストとを、互いに７２時間以内に投与する。いくつかの実施形態において、ＰＮＰＬＡ３発現の阻害剤と、グルカゴン受容体及び／又はＧＬＰ－１受容体のアゴニストとを、互いに１週間以内に投与する。いくつかの実施形態において、ＰＮＰＬＡ３発現の阻害剤と、グルカゴン受容体及び／又はＧＬＰ－１受容体のアゴニストとを、互いに２週間以内に投与する。いくつかの実施形態において、ＰＮＰＬＡ３発現の阻害剤と、グルカゴン受容体及び／又はＧＬＰ－１受容体のアゴニストとを、互いに１ヶ月以内に投与するか、互いに２ヶ月以内に投与するか、又は互いに３ヶ月以上以内に投与する。

【0138】

様々な投与様式が当業者に既知であり、ＰＮＰＬＡ３発現の阻害剤と、グルカゴン受容体及び／又はＧＬＰ－１受容体のアゴニストとを投与するために使用され得る。例えば、投与様式として、経口、非経口、吸入、又は局所が挙げられ得る。「非経口投与」は、注射又は注入を介した投与を意味し得る。非経口投与として、皮下投与、静脈内投与、筋肉内投与、動脈内投与、腹腔内投与、又は頭蓋内投与、例えば、髄腔内投与若しくは脳室内投与、膣内投与、又は直腸内投与が挙げられ得る。投与のための別の形態例は、注射液であり、特に、静脈内注射又は動脈内注射又は滴注用の溶液である。本明細書で提供されるＰＮＰＬＡ３発現の阻害剤及び／又はＧＬＰ－１／グルカゴンアゴニストペプチドを、単回用量又は複数回用量として投与し得る。ある特定の実施形態において、ＰＮＰＬＡ３発現の阻害剤、及び／又はＧＬＰ－１／グルカゴンアゴニストペプチドを、皮下注射により投与する。

【0139】

いくつかの実施形態において、ＰＮＰＬＡ３発現の阻害剤と、グルカゴン受容体及び／又はＧＬＰ－１受容体のアゴニストとを、同一の投与様式で投与する。いくつかの実施形態において、ＰＮＰＬＡ３発現の阻害剤と、グルカゴン受容体及び／又はＧＬＰ－１受容体のアゴニストとを、異なる投与様式で投与する。いくつかの実施形態において、ＰＮＰＬＡ３発現の阻害剤を、非経口投与する。いくつかの実施形態において、グルカゴン受容体及び／又はＧＬＰ－１受容体のアゴニストを、非経口投与する。

【0140】

非経口製剤は、単回ボーラス用量、注入又は負荷ボーラス用量であり得、その後に維持用量が続く。これらの組成物を、特定の固定間隔又は変動間隔で投与し得、例えば、１日１回投与し得るか、又は「必要に応じて」投与し得る。投薬量レジメンもまた、所望される最適反応（例えば、治療的反応又は予防的反応）を実現するように調整し得る。

【0141】

ＰＮＰＬＡ３発現の阻害剤、並びに／又はグルカゴン受容体及び／若しくはＧＬＰ－１受容体のアゴニストの投与頻度を、過度な実験を行うことなく、当業者により決定し得る。いくつかの実施形態において、ＰＮＰＬＡ３発現の阻害剤の投与頻度は、グルカゴン受容体及び／又はＧＬＰ－１受容体のアゴニストの投与頻度と同じである。いくつかの実施形態において、ＰＮＰＬＡ３発現の阻害剤の投与頻度は、グルカゴン受容体及び／又はＧＬＰ－１受容体のアゴニストの投与頻度と異なっており、例えば、より多い頻度であるか、又はより少ない頻度である。いくつかの実施形態において、ＰＮＰＬＡ３発現の阻害剤を、１日１回、１日２回、又は１日３回投与する。いくつかの実施形態において、ＰＮＰＬＡ３発現の阻害剤を、週１回、週２回、又は週３回投与する。いくつかの実施形態において、ＰＮＰＬＡ３発現の阻害剤を、月１回、月２回、又は月３回投与する。いくつかの実施形態において、ＰＮＰＬＡ３発現の阻害剤を、１週間に１回、２週間に１回、３週間に１回、４週間に１回、５週間に１回、６週間に１回、又は７週間に１回以下投与する。いくつかの実施形態において、グルカゴン受容体及び／又はＧＬＰ－１受容体のアゴニストを、１日１回、１日２回、又は１日３回投与する。いくつかの実施形態において、グルカゴン受容体及び／又はＧＬＰ－１受容体のアゴニストを、週１回、週２回、又は週３回投与する。いくつかの実施形態において、グルカゴン受容体及び／又はＧＬＰ－１受容体のアゴニストを、月１回、月２回、又は月３回投与する。いくつかの実施形態において、グルカゴン受容体及び／又はＧＬＰ－１受容体のアゴニストを、１週間に１回、２週間に１回、３週間に１回、４週間に１回、５週間に１回、６週間に１回、又は７週間に１回以下投与する。

【0142】

適応症
本明細書で説明されている方法、化合物、ペプチド、及び組成物を使用して、対象の肝疾患を処置し得る。「対象」という用語は、本明細書で提供されるＰＮＰＬＡ３発現の阻害剤及びＧＬＰ－１／グルカゴンアゴニストペプチドの組み合わせによる処置を必要とする任意の対象（特に、哺乳動物対象）を意味する。哺乳動物対象として、ヒト、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、ウシ、クマ、乳牛、類人猿、サル、オランウータン、及びチンパンジー等が挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、対象はヒト対象である。いくつかの実施形態において、対象は、ヒト対象である。一実施形態において、対象は、雄対象である。

【0143】

本明細書で使用される場合、「それを必要とする対象」は、処置することが望ましい個体を指しており、例えば、肝疾患を有する対象を指す。いくつかの実施形態において、本開示は、肝疾患（例えば、ＮＡＳＨ及び又はＮＡＦＬＤ）を処置する方法を提供する。非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）は、脂肪症から非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）及び肝硬変に至る多様な肝疾患を含み得る。ＮＡＦＬＤは、著しいアルコール摂取、脂肪合成薬物療法、又は遺伝性障害がない状態で、肝臓に５重量％超の脂肪が蓄積されるものとして定義され得る（例えば、Ｋｏｔｒｏｎｅｎｅｔａｌ，ＡｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒＴｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．２００８，２８：２７－３８を参照されたい）。

【0144】

非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）は、炎症及び肝障害の徴候があるＮＡＦＬＤであり得る。いくつかの実施形態において、ＮＡＳＨは、大滴性脂肪症、肝細胞の風船様腫大、及び小葉の炎症性浸潤によって組織学的に定義され得る（Ｓａｎｙａｌ，Ｈｅｐａｔｏｌ．Ｒｅｓ．２０１１．４１：６７０－４）。いくつかの研究では、ＮＡＳＨは、一般的な集団の２～３％に影響を及ぼすものと推定されている。肥満症又は糖尿病等の他の病態がある場合には、いくつかの研究から、推定罹患率が、それぞれ７％及び６２％に増大することが報告されている（例えば、Ｈａｓｈｉｍｏｔｏｅｔａｌ，Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．２０１１．４６（１）：６３－６９を参照されたい）。

【0145】

いくつかの実施形態において、本明細書で提供される方法は、肝疾患、ＮＡＦＬＤ、脂肪肝、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、肝硬変、肝細胞癌、アルコール性肝疾患、アルコール性脂肪性肝炎（ＡＳＨ）、ＨＣＶ肝炎、慢性肝炎、遺伝性ヘモクロマトーシス、又は原発性硬化性胆管炎の処置に好適である。本明細書で提供されるある特定の実施形態は、肝損傷、脂肪症、肝線維症、肝炎、肝瘢痕若しくは肝硬変、肝不全、肝腫大、トランスアミナーゼの上昇、又は肝脂肪の蓄積を動物において低減させる化合物及び組成物を対象とする。

【0146】

いくつかの実施形態において、対象は、二次適応症を有し得る（例えば、体重若しくは体脂肪の減少、体重若しくは体脂肪の維持を促進することが望ましいか又は特定の期間にわたり体重増加を予防するか若しくは最小限に抑えることが望ましい肥満対象又は肥満傾向のある対象）。いくつかの実施形態において、肝疾患は、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）である。いくつかの実施形態において、肝疾患は、非アルコール性脂肪性肝炎である。いくつかの実施形態において、肝疾患は、肝線維症である。

【0147】

いくつかの実施形態において、本開示は、肝疾患を有する対象の肝臓における脂肪肝を軽減する方法であって、この対象に、ｉ）パタチン様ホスホリパーゼドメイン含有３（ＰＮＰＬＡ３）発現の阻害剤と、ｉｉ）グルカゴン受容体及び／又はグルカゴン様ペプチド－１（ＧＬＰ－１）受容体のアゴニストとを投与することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態において、対象の総脂肪肝は、ＰＮＰＬＡ３発現の阻害剤、又はグルカゴン受容体ＧＬＰ－１受容体のアゴニストを単独で投与した場合の総脂肪肝と比較して軽減される。いくつかの実施形態において、対象の総脂肪肝は、ＰＮＰＬＡ３発現の阻害剤、又はグルカゴン受容体ＧＬＰ－１受容体のアゴニストを単独で投与した場合の総脂肪肝と比較して少なくとも３０％軽減される。いくつかの実施形態において、対象の総脂肪肝は、ＰＮＰＬＡ３発現の阻害剤、又はグルカゴン受容体ＧＬＰ－１受容体のアゴニストを単独で投与した場合の総脂肪肝と比較して、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、又は少なくとも６０％軽減される。

【0148】

いくつかの実施形態において、対象の総脂肪肝は、ＰＮＰＬＡ３発現の阻害剤、又はグルカゴン受容体ＧＬＰ－１受容体のアゴニストを単独で投与した場合の総脂肪肝と比較して少なくとも３０％軽減される。いくつかの実施形態において、対象の総脂肪肝は、ＰＮＰＬＡ３発現の阻害剤、又はグルカゴン受容体ＧＬＰ－１受容体のアゴニストを単独で投与した場合の総脂肪肝と比較して、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、又は少なくとも６０％軽減される。

【0149】

いくつかの実施形態において、本開示は、非アルコール性脂肪性肝疾患を有する対象の肝臓における炎症を軽減する方法であって、この対象に、ｉ）パタチン様ホスホリパーゼドメイン含有３（ＰＮＰＬＡ３）発現の阻害剤と、ｉｉ）グルカゴン受容体及び／又はグルカゴン様ペプチド－１（ＧＬＰ－１）受容体のアゴニストとを投与することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態において、対象の肝臓における炎症は、ＰＮＰＬＡ３発現の阻害剤、又はグルカゴン受容体ＧＬＰ－１受容体のアゴニストを単独で投与した場合の肝臓における炎症と比較して少なくとも５０％軽減される。いくつかの実施形態において、対象の肝臓における炎症は、ＰＮＰＬＡ３発現の阻害剤、又はグルカゴン受容体ＧＬＰ－１受容体のアゴニストを単独で投与した場合の肝臓における炎症と比較して、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、又は少なくとも７５％軽減される。

【0150】

いくつかの実施形態において肝疾患を有する対象の肝コラーゲンを減少させる方法であって、この対象に、ｉ）パタチン様ホスホリパーゼドメイン含有３（ＰＮＰＬＡ３）発現の阻害剤と、ｉｉ）グルカゴン受容体及び／又はグルカゴン様ペプチド－１（ＧＬＰ－１）受容体のアゴニストとを投与することを含む方法。いくつかの実施形態において、対象の肝コラーゲンは、ＰＮＰＬＡ３発現の阻害剤、又はグルカゴン受容体ＧＬＰ－１受容体のアゴニストを単独で投与した場合の肝コラーゲンと比較して少なくとも２５％減少する。いくつかの実施形態において、対象の肝コラーゲンは、ＰＮＰＬＡ３発現の阻害剤、又はグルカゴン受容体ＧＬＰ－１受容体のアゴニストを単独で投与した場合の肝コラーゲンと比較して、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、又は少なくとも５０％減少する。

【0151】

医薬製剤
いくつかの実施形態において、本開示は、パタチン様ホスホリパーゼドメイン含有３（ＰＮＰＬＡ３）発現の阻害剤、並びにグルカゴン受容体及び／又はグルカゴン様ペプチド－１（ＧＬＰ－１）受容体のアゴニストと、少なくとも１種の薬学的に許容される賦形剤とを含む薬学的に許容される組成物を提供する。

【0152】

「組成物」又は「医薬組成物」という用語は、本明細書で提供されるＰＮＰＬＡ３発現の阻害剤、並びにグルカゴン受容体及び／又はＧＬＰ－１受容体のアゴニストを、例えば、処置を必要とする対象（例えば、肝疾患を有するヒト対象）に投与される薬学的に許容される担体、賦形剤、又は希釈剤と一緒に含む組成物を指す。

【0153】

「薬学的に許容される」という用語は、健全な医学的判断の範囲内で、合理的なベネフィット／リスク比と釣り合った、過剰な毒性又は他の合併症がない、ヒト及び動物の組織との接触に適切である組成物を指す。「医薬組成物」又は「医薬製剤」は、個体への投与に好適な物質の混合物を含み得る。例えば、医薬組成物は、１種又は複数種の化合物又はその塩と、滅菌水溶液とを含み得る。いくつかの実施形態において、医薬製剤は、薬学的に許容される担体又は希釈剤を含む。「薬学的に許容される担体又は希釈剤」は、個体への投与に使用するのに好適なあらゆる物質を意味する。例えば、薬学的に許容される担体は、滅菌水溶液であり得、例えば、ＰＢＳ又は注射水であり得る。

【0154】

いくつかの実施形態において、医薬製剤は、薬学的に許容される塩を含む。「薬学的に許容される塩」は、オリゴマー化合物又はオリゴヌクレオチド等の化合物の生理学的に及び薬学的に許容される塩（即ち、親化合物の所望の生物活性を保持し、且つ望ましくない毒性学的影響を付与しない塩）を意味する。

【0155】

さらに提供されるのは、代謝性疾患（例えば、肝疾患）の処置のために製剤化されている、本明細書で提供されるＰＮＰＬＡ３発現の阻害剤並びにグルカゴン受容体及び／又はＧＬＰ－１受容体のアゴニストの有効量を含む組成物（例えば、医薬組成物）である。「有効量」とは、単一用量又はシリーズの一部としてのいずれかで、対象に投与した場合に、処置（例えば、肝疾患の処置）に有効な、本明細書で提供されるＰＮＰＬＡ３発現の阻害剤並びにグルカゾン受容体及び／又はＧＬＰ－１受容体のアゴニストの量のことである。この量は、処置を受ける全ての対象について一定用量であり得るか、又は処置しようとする対象の体重、健康状態、及び体調、要望される減量又は体重維持の程度、ペプチドの製剤化、医学的状況の専門的評価、並びに他の関連因子に応じて変動し得る。

【0156】

本開示の組成物を、既知の方法に従って製剤化し得る。好適な調製方法は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，１９ｔｈＥｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，ｅｄ．，ＭａｃｋＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．（１９９５）で説明されており、この文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。組成物は、種々の形態であり得、水溶液、乳濁液、ゲル、懸濁液、凍結乾燥形態、又は当該技術分野で既知の任意の他の形態が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、組成物は、例えば、希釈剤、結合剤、安定剤、及び防腐剤を含む、薬学的に許容される添加剤を含み得る。製剤化されると、本開示の組成物を、対象に直接投与し得る。

【0157】

本開示の組成物で使用可能な担体は、当該技術分野で公知であり、例えば、サイログロブリン、アルブミン、例えば、ヒト血清アルブミン、破傷風トキソイド、及びポリアミノ酸、例えば、ポリＬ－リシン、ポリＬ－グルタミン酸、インフルエンザ、Ｂ型肝炎ウイルスコアタンパク質等が挙げられるが、これらに限定されない。種々の水性担体を使用し得、例えば、水、緩衝化水、０．８％生理食塩水、０．３％グリシン、ヒアルロン酸等を使用し得る。組成物を、従来の公知の滅菌技法により滅菌し得るか、又は滅菌濾過し得る。得られた組成物を、そのまま用いるためにパッケージングし得るか、又は凍結乾燥させ得、凍結乾燥調製物を、投与前に滅菌溶液と組み合わせる。組成物は、生理的状態に近づけるのに必要とされる薬学的に許容される助剤物質を含み得、例えば、ｐＨ調整剤及び緩衝剤、等張化剤、浸潤剤等、例えば、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、ソルビタンラウリン酸モノエステル、トリエタノールアミンオレアート（ｔｒｉｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅｏｌｅａｔｅ）等を含み得る。いくつかの実施形態において、組成物は、非経口投与用に製剤化されている。

【0158】

いくつかの実施形態において、本開示は、ｉ）ＰＮＰＬＡ３発現の阻害剤と、ｉｉ）グルカゴン受容体及び／又はＧＬＰ－１受容体のアゴニストとを含むキットを提供する。いくつかの実施形態において、ＰＮＰＬＡ３発現の阻害剤、並びにグルカゴン受容体及び／又はＧＬＰ受容体のアゴニストは、キット中において同一の剤形である。いくつかの実施形態において、ＰＮＰＬＡ３発現の阻害剤、並びにグルカゴン受容体及び／又はＧＬＰ－１受容体のアゴニストは、キット中において異なる剤形である。

【0159】

本明細書に引用される全ての参考文献（例えば、特許、特許出願、論文、教科書等）、及びこれらに引用される参考文献は、それらが既に引用されていない限り、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【実施例】

【0160】

実施例１－ＰＮＰＬＡ３サイレンシング阻害と、インクレチンベースの療法であるＧＬＰ－１及びグルカゴン受容体二重アゴニストとの組み合わせは、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、及び肝繊維症の改善に対して優れた効力を有する
序論
非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）及びそのより進行した発病型である非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）は、多くの増大する人口に影響を及ぼす満たされない医療ニーズである（ＹｏｕｎｏｓｓｉｅｔａｌＮａｔＲｅｖＧａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌＨｅｐａｔｏｌ，２０１８，ＤＯＩ：１０．１０３８／ｎｒｇａｓｔｒｏ．２０１７．１０９）。ＮＡＦＬＤは、アルコール摂取以外の原因により引き起こされる過剰な肝脂肪蓄積（脂肪肝）と定義されており、ＮＡＦＬ、ＮＡＳＨ、線維症、肝硬変を含む。脂肪肝は、個人差はあるが線維症を伴うか又は伴うことなく、脂肪性肝炎、ＮＡＳＨへと進行し、最終的には、感受性がある個体では、肝硬変、肝不全、及び肝細胞癌へと至る（ＦｒｉｅｄｍａｎｅｔａｌＮａｔＭｅｄ，２０１８，ＤＯＩ：１０．１０３８／ｓ４１５９１－０１８－０１０４－９）。

【0161】

ＮＡＦＬＤ及びＮＡＳＨには、強力な遺伝要素がある。これらの状態と関連する最も一般的な変異は、パタチン様ホスホリパーゼドメイン含有３（ＰＮＰＬＡ３）遺伝子のｒｓ７３８４０９変異体（１４８Ｍ）である（ＣａｒｌｓｓｏｎｅｔａｌＡｌｉｍｅｎｔＰｈａｒｍａｃｏｌＴｈｅｒ，２０２０，ＤＯＩ：１０．１１１１／ａｐｔ．１５７３８）。肝臓におけるＰｎｐｌａ３サイレンシングは、マウスＰｎｐｌａ３遺伝子のヒトリスク対立遺伝子変異体（１４８Ｍ）を持つように遺伝子操作されたマウスモデルにおいて、ＮＡＦＬＤ、ＮＡＳＨ、及び関連する肝線維症を改善する（ＬｉｎｄｅｎｅｔａｌＭｏｌＭｅｔａｂ，２０１９，ＤＯＩ：１０．１０１６／ｊ．ｍｏｌｍｅｔ．２０１９．０１．０１３）。

【0162】

肥満及び２型糖尿病（Ｔ２ＤＭ）は、ＮＡＦＬＤ及びＮＡＳＨの発症の主要な危険因子であり、体重を減少させてグルコースホメオスタシスを改善するインクレチンホルモンによる処置がＮＡＦＬＤ及びＮＡＳＨを改善することが分かっている。そのようなインクレチンホルモンとして、グルカゴン様ペプチド－１（ＧＬＰ－１）受容体、ＧＬＰ－１受容体及びグルカゴン受容体の両方、又はＧＬＰ－１及び胃抑制ポリペプチド（ＧＩＰ）受容体に結合するペプチド類似体が挙げられる（ＮｅｗｓｏｍｅｅｔａｌＮＥＪＭ，２０２０，ＤＯＩ：１０．１０５６／ＮＥＪＭｏａ２０２８３９５；ＡｍｂｒｙｅｔａｌＬａｎｃｅｔ，２０１８，ＤＯＩ：１０．１０１６／Ｓ０１４０－６７３６（１８）３０７２６－８；ＢｏｌａｎｄｅｔａｌＮａｔＭｅｔａｂ，２０２０，ＤＯＩ：１０．１０３８／ｓ４２２５５－０２０－０２０９－６＋ＨａｒｔｍａｎｅｔａｌＤｉａｂｅｔｅｓＣａｒｅ，２０２０，ＤＯＩ：１０．２３３７／ｄｃ１９－１８９２；ＫａｎｎｔｅｔａｌＤｉａｂｅｔｅｓＯｂｅｓＭｅｔａｂ，２０２０，ＤＯＩ：１０．１１１１／ｄｏｍ．１４０３５）。

【0163】

ＰＮＰＬＡ３サイレンシング阻害と、インクレチンホルモン受容体の活性化との併用処置により、ＮＡＦＬＤ、ＮＡＳＨ、及び肝線維症の処置への相加的な有益効果を得ることができるという仮説が立てられた。このことを調べるために、ヒトＰＮＰＬＡ３Ｉ１４８ＭＮＡＳＨリスク対立遺伝子の遺伝子操作マウスモデルを、ＮＡＳＨ誘発食餌を摂取させつつ使用した。次いで、このマウスを、下記で処置した：１）対照アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）；２）Ｐｎｐｌａ３ＡＳＯ；３）バランスのとれたＧＬＰ－１受容体及びグルカゴン受容体の二重アゴニストペプチドであるコタデュチド；又は４）Ｐｎｐｌａ３ＡＳＯとコタデュチドとの両方の組み合わせ。

【0164】

本研究から、ＰＮＰＬＡ３ＡＳＯサイレンシング阻害処置と、インクレチン模倣処置（コタデュチドに例示される）とを組み合わせることにより、ＮＡＦＬＤ、ＮＡＳＨ、及び肝線維症に対して驚くべき優れた有益な処置効果が得られることが初めて実証される。この併用処置により得られた結果は、それぞれの単独処置と比較して相乗効果を示す。

【0165】

材料及び方法
マウスＰｎｐｌａ３ｃＥｔ５’－ＧａｌＮＡｃ_３コンジュゲート型ｃＥｔＡＳＯ及びコタデュチド
マウスＰｎｐｌａ３遺伝子（５’－ＴＡＴＴＴＴＴＧＧＴＧＴＡＴＣＣ－３’）（配列番号３７）を標的とする最適で強力なマウスＳ拘束エチル（ｃＥｔ）修飾１６ｍｅｒＡＳＯを使用した（ＬｉｎｄｅｎｅｔａｌＭｏｌＭｅｔａｂ，２０１９，ＤＯＩ：１０．１０１６／ｊ．ｍｏｌｍｅｔ．２０１９．０１．０１３）。このマウスＰｎｐｌａ３ＡＳＯを、皮下投与後のインビボにおける肝細胞標的化をさらに増強させるために、３分岐型Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ_３）との５’－コンジュゲートにより修飾した。化学的に一致したスクランブル対照のＧａｌＮＡｃ_３コンジュゲート型ＡＳＯ（５’－ＧＧＣＣＡＡＴＡＣＧＣＣＧＴＣＡ－３’）（配列番号３８）を使用して、標的ノックダウンの特異性を実証した。コタデュチド（ＭＥＤＩ０３８２）は、ＧＬＰ－１受容体及びグルカゴン受容体のアゴニズムのバランスをとるように操作されている（ＧＬＰ－１受容体親和性への約５：１のバイアスがある）（ＨｅｎｄｅｒｓｏｎｅｔａｌＤｉａｂｅｔｅｓＯｂｅｓＭｅｔａｂ，２０１６，ＤＯＩ：１０．１１１１／ｄｏｍ．１２７３５）。

【0166】

動物
全ての動物実験は、人道的保護のもとで実施され、スウェーデンのＧｏｔｈｅｎｂｕｒｇＥｔｈｉｃｓＣｏｍｍｉｔｔｅｅｆｏｒＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＡｎｉｍａｌｓによって承認された。保有設備は、実験動物ケア評価認証協会（ＡＡＡＬＡＣ）から完全な認可を受けている。既に説明されている相同組換えを使用して、マウスＰｎｐｌａ３遺伝子のアミノ酸１４８位のイソロイシンコドンをメチオニンコドンに置き換えることにより、ヒトＰＮＰＬＡ３Ｉ１４８Ｍ変異を、マウスＰｎｐｌａ３遺伝子に導入した（ＬｉｎｄｅｎｅｔａｌＭｏｌＭｅｔａｂ，２０１９，ＤＯＩ：１０．１０１６／ｊ．ｍｏｌｍｅｔ．２０１９．０１．０１３）。ヘテロ接合性Ｐｎｐｌａ３^{１４８Ｉ／Ｍ}マウスを交雑させて、薬理学研究のための実験用ホモ接合性Ｐｎｐｌａ３^{１４８Ｍ／Ｍ}ノックインマウスを作製した。全ての実験動物を、既に説明されているように、研究開始前にＰＣＲを使用して正しい遺伝子型を有することを検証し、終了後にＰＣＲを使用して再度検証した（ＬｉｎｄｅｎｅｔａｌＭｏｌＭｅｔａｂ，２０１９，ＤＯＩ：１０．１０１６／ｊ．ｍｏｌｍｅｔ．２０１９．０１．０１３）。全ての動物を、アスペン材チップの床敷材及び巣の材料を使用した透明のｍａｋｒｏｌｏｎケージに収容し、保有設備の温度（２１±１℃）及び湿度（５０±１０％）を制御した。１２時間の昼／夜サイクルで、マウスに水道水及び食餌を自由に与えた。

【0167】

雄Ｐｎｐｌａ３^{１４８Ｍ／Ｍ}マウス（６～８週齢）に、２２週間にわたり、脂肪（４０ｋｃａｌ％脂肪（非トランス脂肪ＰｒｉｍｅｘＳｈｏｒｔｅｎｉｎｇ）、果糖（２０ｋｃａｌ％）、及びコレステロール（２％）が多い食餌（ＮＡＳＨ食餌；Ｄ１６０２２３０１、ＲｅｓｅａｒｃｈＤｉｅｔｓ，ＮｅｗＢｒｕｎｓｗｉｃｋ，ＮＪ）を給餌した。次いで、このマウスを、体重に基づいて試験群に割り当て、同一のＮＡＳＨ食餌を給餌し、１４週間にわたり、１）対照ＡＳＯ＋生理食塩水、２）Ｐｎｐｌａ３ＡＳＯ＋生理食塩水、３）対照ＡＳＯ＋コタデュチド、又は４）Ｐｎｐｌａ３ＡＳＯ＋コタデュチドのいずれかを投与した。ＡＳＯを、ビヒクルとして生理食塩水を使用して、１週間当たり２回の皮下注射により、５ｍｇ／ｋｇ／週で投与した。コタデュチドを、ビヒクルとして生理食塩水を使用して、毎日の皮下注射により、１ｎｍｏｌ／ｋｇで投与した。コタデュチド処置を施さなかったマウスに、毎日ビヒクル（生理食塩水）を注射して、全てに動物に、同一回数の皮下注射を行った。試験全体にわたり、体重を記録した。屠殺時に、絶食していないマウスを、イソフルラン（Ｆｏｒｅｎｅ，ＡｂｂｏｔＳｃａｎｄｉｎａｖｉａＡＢ，Ｓｗｅｄｅｎ）で安楽死させ、血液を採取して血漿を単離し、肝臓を採取して、断片（全てのマウスで左側葉の同一の位置）を、組織学的検査のためにＰＢＳ中４％ホルムアルデヒドで固定するか、又は液体Ｎ_２で急速凍結して－８０℃で保存した。

【0168】

肝臓組織学
４μｍ厚のホルムアルデヒド固定パラフィン包埋マウス肝臓切片（１匹のマウス当たり１つの肝臓切片）を、ヘマトキシリン・エオシン（ＨＥ）で通常通り染色した。隣接切片を、コラーゲン１Ａ１に関して免疫組織学的に染色した（Ｃｏｌ１Ａ１，ＬＳ－Ｃ３４３９２１，ＢｉｏＳｉｔｅ，ＵＳＡ）。スライドを、ＰａｎｏｒａｍｉｃＳｃａｎＩＩ（３Ｄｈｉｓｔｅｃｈ，Ｈｕｎｇａｒｙ）でスキャンし、デジタル画像を、画像解析プログラムＶｉｓｉｏｐｈａｒｍ（バージョン２０２０．０３．０．７３００，Ｖｉｓｉｏｐｈａｒｍ，Ｈｏｒｓｈｏｌｍ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を使用して、ガレクチン－３又はコラーゲン１Ａ１の総切片面積当たりの染色面積を検出することにより解析した。

【0169】

脂肪肝を、ＨＥ染色された肝臓切片の評価により決定した。総脂肪肝を、切片の面積の割合として脂質滴の総量を測定することにより決定した。大滴性脂肪症を、切片の面積の割合として大きな脂質滴の量を測定することにより決定した。小滴性脂肪症を、切片の面積の割合として小さい脂質滴の量を測定することにより決定した。

【0170】

肝マクロファージを、様々な肝臓切片をガレクチン－３（Ｍａｃ２）で染色し、染色された切片の割合を決定することにより決定した。

【0171】

ＮＡＦＬＤ活動性スコア（ＮＡＳ）を、Ｋｌｅｉｎｅｒ他（ＫｌｅｉｎｅｒｅｔａｌＨｅｐａｔｏｌｏｇｙ，２００５，ＤＯＩ：１０．１００２／ｈｅｐ．２０７０１）により報告された方法に従って決定した。ＮＡＳは、脂肪肝スコア（脂肪症５％未満＝スコア０、５％～３３％＝スコア１、３３％超～６６％＝スコア２、６６％超＝スコア３）、及び炎症スコア（病巣なし＝スコア０、２００×視野当たり２個未満の病巣＝スコア１、２００×視野当たり２～４個の病巣＝スコア２、２００×視野当たり４個超の病巣＝スコア３）の組み合わせに基づいていた。肝細胞の膨化変性は、どのマウス肝臓にも見出されず、このことは、ヒトＮＡＳＨ病理とは対照的に前臨床げっ歯類ＮＡＳＨモデルではめったに観察されないことから予想外ではなかった。全ての組織学的評価を、処置を知らない委員会認定の獣医病理学者により実施した。

【0172】

ＲＮＡ調製及びｑＰＣＲ
ＲＮｅａｓｙＭｉｎｉＫｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、急速凍結した肝臓組織からＲＮＡを単離した。ｃＤＮＡキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ，Ｓｗｅｄｅｎ）による逆転写により、ｃＤＮＡテンプレートを作製し、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ７Ｆｌｅｘ装置（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ，Ｓｗｅｄｅｎ）によるリアルタイム定量ＰＣＲに使用した。市販の完全なアッセイを使用して、マウスＰｎｐｌａ３ｍＲＮＡの発現を解析した（Ｍｍ００５０４４２０＿ｍ１，ＴａｑＭａｎ，ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓＥｕｒｏｐｅ，Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ，Ｓｗｅｄｅｎ）。結果を、フォワードプライマー５’－ＧＡＧＧＡＡＴＣＡＧＡＴＧＡＧＧＡＴＡＴＧＧＧＡ－３’（配列番号３９）、リバースプライマー５’－ＡＡＧＣＡＧＧＣＴＧＡＣＴＴＧＧＴＴＧＣ－３’（配列番号４０）、及び参照遺伝子としてのＦＡＭ－ＴＡＭ－標識プローブ５’－ＴＣＧＧＴＣＴＣＴＴＣＧＡＣＴＡＡＴＣＣＣＧＣＣＡＡ－３’（配列番号４１）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）により、マウスリボソームタンパク質ラージＰ０（Ｒｐｌｐ０、３６Ｂ４）に対して正規化した。

【0173】

統計解析
処置群間の差違を、一元ＡＮＯＶＡ、その後のＴｕｋｅｙの事後検定（ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍｖ．８．０．１．、ＧｒａｐｈＰａｄＳｏｆｔｗａｒｅ，ＣＡ）を使用して調べた。肝臓組織に由来するＮＡＦＬＤ活動性スコア（ＮＡＳ）に関する処置群間の差違を、順序回帰分析、その後のＳｉｄａｋ法を使用するファミリーワイズエラー率の補正により解析した。０．０５未満のｐ値を、有意とみなした。データを、個体値及び平均±平均の標準誤差（ＳＥＭ）で示す。

【0174】

結果及び結論
Ｐｎｐｌａ３ＡＳＯ及びコタデュチドの併用処置は、ＮＡＳＨ誘発食餌を給餌したＰｎｐｌａ３^{１４８Ｍ／Ｍ}マウスにおいて、ＮＡＦＬＤ、ＮＡＳＨ、及び肝線維症の改善に相加的効果を有する。Ｐｎｐｌａ３ＡＳＯ及びコタデュチドの併用処置を試験するために、ホモ接合性Ｐｎｐｌａ３^{１４８Ｍ／Ｍ}ノックインマウスに、３６週間にわたり、ＮＡＳＨ誘発食餌を給餌した。最後の１４週間の間に、マウスをまた、Ｐｎｐｌａ３ＡＳＯ又はコタデュチドの単独又は組み合わせによっても処置し、対照ＡＳＯ処置動物と比較した（全てのマウスに、同一回数の皮下注射を行った）。コタデュチド処置は、対照ＡＳＯ処置動物と比較して、処置期間中に体重増加を減少させたが、Ｐｎｐｌａ３ＡＳＯ処置は減少させなかった（図１Ａ）。Ｐｎｐｌａ３ＡＳＯ処置は、肝臓Ｐｎｐｌａ３ｍＲＮＡレベルを９７％以上顕著に低下させたが、コタデュチド処置は低下させなかった（図１Ｂ）。

【0175】

総脂肪肝（図２Ａ）、大滴性脂肪症（図２Ｂ）、及び小滴性脂肪症（図２Ｃ）を、説明したように決定した。染色された切片を、図２Ｄに示し、各切片に関して、面積当たりの総脂質滴の割合を示す。図２Ａ～Ｃで見られるように、Ｐｎｐｌａ３ＡＳＯ及びコタデュチドによる併用処置は、いずれかの処置単独と比較して、全てのタイプの脂肪症を有意に軽減させた。肝臓マクロファージの割合（図３Ａ）及び炎症スコア（図３Ｂ）を、説明されている各処置に関して決定した。図３Ａ及び３Ｂに示されるように、肝臓マクロファージ及び炎症スコアは、対照と比較して、全ての処置群で減少した。

【0176】

ＮＡＦＬＤ活動性スコア（ＮＡＳ）を、上記で説明したように算出した。Ｐｎｐｌａ３ＡＳＯ処置は、対照ＡＳＯ処置動物と比較して、ＮＡＳを減少させた（ｐ＜０．００５）（図４）。コタデュチド処置も、対照ＡＳＯ処置動物と比較してＮＡＳを減少させた（ｐ＜０．００１）（図４）。重要なことに、Ｐｎｐｌａ３ＡＳＯ及びコタデュチドの併用処置は、対照ＡＳＯ処置動物と比較して（ｐ＜０．００１）、Ｐｎｐｌａ３ＡＳＯ処置動物と比較して（ｐ＜０．００１）、及びコタデュチド処置動物と比較して（ｐ＜０．００１）、ＮＡＳを減少させた（図４）。これらの結果から、Ｐｎｐｌａ３ノックダウン阻害剤と、二重ＧＬＰ－１及びグルカゴン受容体アゴニストとの併用処置が、ＮＡＦＬＤ及びＮＡＳＨの改善に対する有益な処置効果を改善することが示される。

【0177】

Ｐｎｐｌａ３ＡＳＯ処置は、肝臓コラーゲン１Ａ１含有量として測定される肝線維症を軽減する傾向があり、同様に、コタデュチド処置も、肝臓コラーゲン１Ａ１含有量を減少させる傾向があった（図５）。重要なことに、Ｐｎｐｌａ３ＡＳＯ及びコタデュチドの併用処置は、対照ＡＳＯ処置動物と比較して肝臓コラーゲン１Ａ１含有量を有意に減少させた（ｐ＜０．００５）（図５）。そのため、これらの結果から、Ｐｎｐｌａ３ノックダウン阻害と二重ＧＬＰ－１及びグルカゴン受容体アゴニストとの併用処置は、肝線維症の改善に対して優れた有益な処置効果を有することが分かる。

【図1】