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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-06-11
(54)【発明の名称】試料のオミクス情報を分析するための製品および方法
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/6816 20180101AFI20240604BHJP
C12Q 1/6841 20180101ALI20240604BHJP
C12Q 1/6823 20180101ALI20240604BHJP
C12Q 1/6869 20180101ALI20240604BHJP
C12Q 1/686 20180101ALI20240604BHJP
G01N 33/50 20060101ALI20240604BHJP
G01N 33/68 20060101ALI20240604BHJP
G01N 33/92 20060101ALI20240604BHJP
G01N 33/53 20060101ALI20240604BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/6816 Z ZNA
C12Q1/6841 Z
C12Q1/6823 Z
C12Q1/6869 Z
C12Q1/686 Z
G01N33/50 P
G01N33/68
G01N33/92
G01N33/53 D
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023575728
(86)(22)【出願日】2022-06-06
(85)【翻訳文提出日】2024-02-06
(86)【国際出願番号】 CN2022097049
(87)【国際公開番号】W WO2022257867
(87)【国際公開日】2022-12-15
(31)【優先権主張番号】202110631874.7
(32)【優先日】2021-06-07
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
(71)【出願人】
【識別番号】519180161
【氏名又は名称】オーシャン ユニバーシティ オブ チャイナ
【氏名又は名称原語表記】Ｏｃｅａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃｈｉｎａ
【住所又は居所原語表記】Ｎｏ．２３８， Ｓｏｎｇｌｉｎｇ Ｒｏａｄ， Ｌａｏｓｈａｎ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ， Ｑｉｎｇｄａｏ， Ｓｈａｎｄｏｎｇ， Ｃｈｉｎａ
(74)【代理人】
【識別番号】110000855
【氏名又は名称】弁理士法人浅村特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】シー、 ウェイヤン
【テーマコード（参考）】
2G045
4B063
【Ｆターム（参考）】
2G045AA40
2G045BB17
2G045BB20
2G045BB22
2G045CB01
2G045DA13
2G045DA14
2G045DA36
2G045DA60
2G045FB02
2G045FB03
4B063QA01
4B063QA18
4B063QQ02
4B063QQ42
4B063QQ52
4B063QQ53
4B063QR56
4B063QR73
4B063QS24
4B063QS32
4B063QS34
4B063QS36
4B063QS40
4B063QX02
(57)【要約】
本出願は、試料のオミクス情報を分析するための製品および方法に関する。本方法は、プローブを標的分子に結合させる条件下で、試料中の少なくとも１つの標的分子を少なくとも１つのプローブと接触させる工程であって、前記プローブは、前記標的分子に特異的に結合することが可能な標的分子結合ドメインと、少なくとも１つの反応遮断修飾とを含有する工程と；前記試料の第１の領域に対して第１の処理を実行し、および前記試料中の前記第１の領域とは異なる第２の領域に対して第２の処理を実行して、前記第１の領域中の前記プローブを第１のタグ配列に付着させ、および前記第２の領域中の前記プローブを第２のタグ配列に付着させる工程であって、前記第２のタグ配列は前記第１のタグ配列とは異なる、工程と；前記第１のタグ配列に付着した前記プローブの組成および前記第２のタグ配列に付着した前記プローブの組成を決定する工程とを含む。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
プローブを標的分子に特異的に結合させる条件下で、試料中の少なくとも１つの標的分子を少なくとも１つのプローブと接触させる工程であって、前記プローブは、前記標的分子に特異的に結合することが可能な標的分子結合ドメインと、少なくとも１つの反応遮断修飾とを含有する、工程と；前記試料の第１の領域に対して第１の処理を実行する工程であって、前記第１の処理は、前記第１の領域内の前記プローブ上の前記反応遮断修飾を少なくとも部分的に除去して、前記第１の領域内の前記プローブを第１のタグ配列に付着させることが可能である、工程と；
前記試料中の、前記第１の領域とは異なる第２の領域に対して第２の処理を実行する工程であって、前記第２の処理は、前記第２の領域中の前記プローブ上の前記反応遮断修飾を少なくとも部分的に除去して、前記第２の領域中の前記プローブを第２のタグ配列に付着させることが可能であり、前記第２のタグ配列は前記第１のタグ配列とは異なる、工程と；
前記第１のタグ配列に付着した前記プローブおよび前記第２のタグ配列に付着した前記プローブの組成を決定し、ならびに前記プローブの前記組成から、前記試料中の前記第１の領域の前記標的分子の存在および／または含有量および前記第２の領域の前記標的分子の存在および／または含有量を決定する工程と
を含む、方法。
【請求項2】
前記試料が組織切片を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記組織切片が、１～１０００μｍの範囲の厚さを有する、請求項２に記載の方法。
【請求項4】
前記組織切片が、凍結切片、パラフィン切片、カルボワックス切片、極薄切片およびプラスチック切片からなる群から選択される、請求項２～３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
前記組織切片が固定された組織切片を含む、請求項２～４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
前記組織切片がホルマリン固定された組織切片を含む、請求項２～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
前記組織切片がホルマリン固定されたパラフィン切片である、請求項２～６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項8】
前記組織切片が凍結切片である、請求項２～７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項9】
前記組織切片中の組織が多細胞生物由来である、請求項２～８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項10】
前記組織切片中の組織がヒト由来である、請求項２～９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項11】
前記組織切片が臨床的に意義のある組織試料である、請求項２～１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項12】
前記組織切片中の組織が、心筋組織、肝組織、脾臓組織、肺組織、腎組織および脳組織からなる群から選択される組織に由来する、請求項２～１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項13】
前記第１の領域が、前記組織切片上の第１の領域であり、および前記第２の領域が、前記組織切片上の、前記第１の領域と実質的に重複していない第２の領域である、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項14】
前記試料が単一の細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項15】
前記細胞が、生物から単離された細胞、インビトロで培養された細胞、初代細胞および外植片からの分離した細胞からなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項16】
前記細胞が固定されている、請求項１４～１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項17】
前記第１の領域が、前記細胞内の第１の細胞内構造である、請求項１４～１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項18】
前記第２の領域が、前記細胞内の第２の細胞内構造である、請求項１４～１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項19】
前記標的分子が、タンパク質、核酸分子および／または脂質を含む、請求項１～１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項20】
前記核酸分子がＤＮＡ分子および／またはＲＮＡ分子を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項21】
前記ＤＮＡがｃＤＮＡを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項22】
前記ＲＮＡが、ｃＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡおよび／またはｅＲＮＡを含む、請求項２０～２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項23】
前記標的分子がＲＮＡを含む場合に、前記プローブ中の前記標的分子結合ドメインが前記ＲＮＡに相補的な核酸配列を含む、請求項１～２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項24】
前記プローブ中の前記標的分子結合ドメインがポリＡを含む、請求項１～２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項25】
前記プローブ中の前記標的分子結合ドメインがポリＴを含む、請求項１～２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項26】
前記プローブ中の前記標的分子結合ドメインが、前記標的分子の配列に少なくとも５０％相補的である、請求項１～２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項27】
前記試料中の２つ以上の標的分子を２つ以上のプローブと接触させる工程を含み、前記２つ以上のプローブは前記２つ以上の標的分子を特異的に結合することが可能である、請求項１～２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項28】
前記２つ以上の標的分子が異なる、請求項２７に記載の方法。
【請求項29】
前記標的分子がＲＮＡを含む場合に、前記第１の領域中の前記プローブ上の前記反応遮断修飾が、遊離可能な、塩基を修飾された基、切断可能なリンカーおよび感光性基からなる群から選択される、請求項２０～２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項30】
前記標的分子がＲＮＡを含む場合に、前記第１の領域中の前記プローブ上の前記反応遮断修飾が切断可能なリンカーである、請求項２９に記載の方法。
【請求項31】
前記リンカーが、前記第１の領域中の前記プローブの５’末端に位置する、請求項３０に記載の方法。
【請求項32】
前記リンカーが、前記第１の処理時に切断可能である、請求項３０～３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項33】
前記第１の処理が、電子ビーム処理、音波および照明からなる群から選択される、請求項３２に記載の方法。
【請求項34】
前記第１の処理が照明である、請求項３３に記載の方法。
【請求項35】
前記光が、アークランプ、レーザ、ＵＶ光源および発光ダイオードからなる群から選択される光源によって提供される、請求項３３～３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項36】
前記光がＵＶ光源によって提供される、請求項３３～３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項37】
前記第１の領域中の前記プローブ上の前記反応遮断修飾が、遊離可能な、塩基を修飾された基である、請求項２９～３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項38】
前記第１の領域中の前記プローブ上の前記反応遮断修飾が、少なくとも１つの遊離可能な、塩基を修飾された基を含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項39】
前記第１の領域中の前記プローブ上の前記反応遮断修飾が、少なくとも１つの遊離可能な感光性基を含む、請求項３７～３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項40】
前記塩基を修飾された基が、ＮＰＯＭ保護基を含む、請求項３７～３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項41】
前記塩基を修飾された基が、前記第１の処理時に遊離可能である、請求項３７～４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項42】
前記第１の処理が、電子ビーム処理、音波および照明からなる群から選択される、請求項３７～４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項43】
前記第１の処理が照明である、請求項４２に記載の方法。
【請求項44】
前記光が、アークランプ、レーザ、ＵＶ光源および発光ダイオードからなる群から選択される光源によって提供される、請求項４２～４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項45】
前記光がＵＶ光源によって提供される、請求項４２～４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項46】
前記標的分子がＲＮＡを含む場合に、前記第２の領域中の前記プローブ上の前記反応遮断修飾が、遊離可能な、塩基を修飾された基、切断可能なリンカーおよび感光性基からなる群から選択される、請求項２０～４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項47】
前記第２の領域中の前記プローブ上の前記反応遮断修飾が切断可能なリンカーである、請求項４６に記載の方法。
【請求項48】
前記リンカーが、前記第２の領域中の前記プローブの５’末端に位置する、請求項４７に記載の方法。
【請求項49】
前記リンカーが、前記第２の処理時に切断可能である、請求項４７～４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項50】
前記第２の処理が、電子ビーム処理、音波および照明からなる群から選択される、請求項４９に記載の方法。
【請求項51】
前記第２の処理が照明である、請求項４９～５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項52】
前記光が、アークランプ、レーザ、ＵＶ光源および発光ダイオードからなる群から選択される光源によって提供される、請求項５０～５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項53】
前記光がＵＶ光源によって提供される、請求項５０～５２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項54】
前記第２の領域中の前記プローブ上の前記反応遮断修飾が、遊離可能な、塩基を修飾された基である、請求項４６～５３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項55】
前記第２の領域中の前記プローブ上の前記反応遮断修飾が、少なくとも１つの遊離可能な、塩基を修飾された基を含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項56】
前記第２の領域中の前記プローブ上の前記反応遮断修飾が、少なくとも１つの遊離可能な感光性基を含む、請求項５４～５５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項57】
前記塩基を修飾された基が、ＮＰＯＭ保護基を含む、請求項５４～５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項58】
前記塩基を修飾された基が、前記第２の処理時に遊離可能である、請求項５４～５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項59】
前記第２の処理が、電子ビーム処理、音波および照明からなる群から選択される、請求項５８に記載の方法。
【請求項60】
前記第２の処理が照明である、請求項５９に記載の方法。
【請求項61】
前記光が、アークランプ、レーザ、ＵＶ光源および発光ダイオードからなる群から選択される光源によって提供される、請求項５９～６０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項62】
前記光がＵＶ光源によって提供される、請求項５９～６１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項63】
前記第１の処理および前記第２の処理が同じであるかまたは異なる、請求項１～６２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項64】
前記試料の前記第１の領域に対して前記第１の処理を実行する間または実行した後に、前記試料の前記第２の領域に対して前記第２の処理を実行することを含む、請求項１～６３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項65】
前記第１の処理の後、第１のタグ配列を含有する第１のタグ分子を前記試料の前記第１の領域に投与することを含む、請求項１～６４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項66】
前記第２の処理の後、第２のタグ配列を含有する第２のタグ分子を前記試料の前記第２の領域に投与することを含む、請求項１～６５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項67】
前記第１の領域中の前記プローブがアダプターの第１の結合ドメインを含み、前記アダプターの前記第１の結合ドメインが少なくとも１つの反応遮断修飾を含む、請求項１～６６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項68】
前記プローブにおいて、前記アダプターの前記第１の結合ドメインが、前記標的分子結合ドメインの５’末端に位置する、請求項６７に記載の方法。
【請求項69】
前記第１の処理時に、前記第１の領域中の前記プローブが前記第１のタグ配列およびオリゴヌクレオチドアダプターと複合体を形成することをさらに含み、前記オリゴヌクレオチドアダプターはプローブ結合ドメインおよびタグ結合ドメインを含む、請求項１～６８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項70】
前記第１のタグ配列が、少なくとも１つのバーコードおよびアダプターの第２の結合ドメインを含む、請求項１～６９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項71】
前記第１の処理時に、前記プローブ結合ドメイン中の核酸配列が、前記第１の領域中の前記プローブ中の前記アダプターの前記第１の結合ドメイン中の核酸配列に相補的であり、および前記タグ結合ドメイン中の核酸配列が、前記第１のタグ配列中の前記アダプターの前記第２の結合ドメイン中の核酸配列に相補的であり、その結果、部分的に二本鎖構造を形成することをさらに含む、請求項６９～７０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項72】
前記第１のタグ配列中の前記アダプターの前記第２の結合ドメインが、リガーゼによって、前記第１の領域中の前記プローブ中の前記アダプターの前記第１の結合ドメインに連結され、その結果、前記第１のタグ配列に付着した前記プローブを産生する、請求項７０～７１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項73】
前記リガーゼがＴ４リガーゼを含む、請求項７２に記載の方法。
【請求項74】
前記第１のタグ配列中の前記バーコードが、前記第１の領域の空間的位置情報を特徴付ける、請求項７０～７３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項75】
前記第１のタグ配列が複数のバーコードを含む、請求項７０～７４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項76】
前記第１のタグ配列中の前記複数のバーコードが異なる、請求項７５に記載の方法。
【請求項77】
前記第１のタグ配列中の前記アダプターの前記第２の結合ドメイン中の前記核酸配列が、前記第１のタグ配列中の前記バーコードの３’末端に位置する、請求項７０～７６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項78】
前記第１のタグ配列が、固有の分子識別領域を含む、請求項１～７７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項79】
前記第１のタグ配列が配列決定プライマーを含む、請求項１～７８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項80】
前記第２の領域中の前記プローブがアダプターの第１の結合ドメインを含み、前記アダプターの前記第１の結合ドメインが少なくとも１つの反応遮断修飾を含む、請求項１～７９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項81】
前記プローブにおいて、前記アダプターの前記第１の結合ドメインが、前記標的分子結合ドメインの５’末端に位置する、請求項８０に記載の方法。
【請求項82】
前記第２の処理時に、前記第２の領域中の前記プローブが前記第２のタグ配列およびオリゴヌクレオチドアダプターと複合体を形成することをさらに含み、前記オリゴヌクレオチドアダプターはプローブ結合ドメインおよびタグ結合ドメインを含む、請求項１～８１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項83】
前記第２のタグ配列が、少なくとも１つのバーコードおよびアダプターの第２の結合ドメインを含む、請求項１～８２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項84】
前記第２の処理時に、前記プローブ結合ドメイン中の核酸配列が、前記第２の領域中の前記プローブ中の前記アダプターの前記第１の結合ドメイン中の核酸配列に相補的であり、および前記タグ結合ドメイン中の核酸配列が、前記第２のタグ配列中の前記アダプターの前記第２の結合ドメイン中の核酸配列に相補的であり、その結果、部分的に二本鎖構造を形成することをさらに含む、請求項８２～８３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項85】
前記第２のタグ配列中の前記アダプターの前記第２の結合ドメインが、リガーゼによって、前記第２の領域中の前記プローブ中の前記アダプターの前記第１の結合ドメインに連結され、その結果、前記第２のタグ配列に付着した前記プローブを産生する、請求項８３～８４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項86】
前記リガーゼがＴ４リガーゼを含む、請求項８５に記載の方法。
【請求項87】
前記第２のタグ配列中の前記バーコードが、前記第２の領域の空間的位置情報を特徴付ける、請求項８３～８６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項88】
前記第２のタグ配列が複数のバーコードを含む、請求項１～８７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項89】
前記第２のタグ配列中の前記複数のバーコードが異なる、請求項８８に記載の方法。
【請求項90】
前記第２のタグ配列中の前記アダプターの前記第２の結合ドメイン中の前記核酸配列が、前記第２のタグ配列中の前記バーコードの３’末端に位置する、請求項８３～８９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項91】
前記第２のタグ配列が、固有の分子識別領域を含む、請求項１～９０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項92】
前記第２のタグ配列が配列決定プライマーを含む、請求項１～９１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項93】
前記試料中の少なくとも１つの標的分子と少なくとも１つのプローブとの間でインサイチュハイブリダイゼーションを行うことを含む、請求項１～９２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項94】
前記インサイチュハイブリダイゼーションの後、前記試料を消化して、前記第１のタグ配列に付着した前記プローブおよび前記第２のタグ配列に付着した前記プローブを得ることを含む、請求項１～９３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項95】
得られた、前記第１のタグ配列に付着した前記プローブおよび前記第２のタグ配列に付着した前記プローブを増幅することを含む、請求項１～９４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項96】
得られた、前記第１のタグ配列に付着した前記プローブおよび前記第２のタグ配列に付着した前記プローブを増幅した後、前記第１のタグ配列に付着した前記プローブおよび前記第２のタグ配列に付着した前記プローブを配列決定して、前記第１のタグ配列に付着した前記プローブおよび前記第２のタグ配列に付着した前記プローブの組成を決定することをさらに含む、請求項１～９５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項97】
前記標的分子がタンパク質を含む場合に、前記プローブ中の前記標的分子結合ドメインが、前記タンパク質に特異的に結合するタンパク質結合分子を含む、請求項１～２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項98】
前記タンパク質結合分子が、抗体、ペプチドおよびペプトイドからなる群から選択される、請求項９７に記載の方法。
【請求項99】
前記標的分子が脂質を含む場合に、前記プローブ中の前記標的分子結合ドメインが前記標的分子を認識し、および結合する、請求項１～２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項100】
前記標的分子が、前記試料に由来するＤＮＡを含む、請求項１～２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項101】
前記ＤＮＡが、ゲノムＤＮＡ、オープンクロマチンＤＮＡ、タンパク質によって結合されたＤＮＡ領域、ならびに／またはタンパク質、脂質および／もしくは小分子化合物と連結された外因性核酸を含み、前記タンパク質、脂質および／または小分子化合物は前記細胞内の前記標的分子を結合することが可能である、請求項１００に記載の方法。
【請求項102】
前記試料中の少なくとも１つの標的分子を少なくとも１つのプローブと接触させる前に、前記ＤＮＡを断片化することを含む、請求項１００～１０１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項103】
前記断片化が、トランスポザーゼ－核酸複合体を使用して前記プローブを含有する配列を前記ＤＮＡ中に組み込むこと、および前記トランスポザーゼを遊離させることを含む、請求項１０２に記載の方法。
【請求項104】
前記トランスポザーゼ－核酸複合体がトランスポザーゼおよびトランスポゾン末端核酸分子を含み、前記トランスポゾン末端核酸分子が前記オリゴヌクレオチドアダプター配列を含む、請求項１０３に記載の方法。
【請求項105】
前記トランスポザーゼがＴｎ５を含む、請求項１０４に記載の方法。
【請求項106】
前記ＤＮＡが、タンパク質によって結合されたＤＮＡ領域を含み、前記トランスポザーゼ－核酸複合体が、前記タンパク質を直接的にまたは間接的に認識する部分をさらに含む、請求項１００～１０５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項107】
前記タンパク質を直接的にまたは間接的に認識する前記部分が、前記タンパク質を特異的に結合する抗体およびプロテインＡまたはプロテインＧからなる群の１つまたは複数を含む、請求項１０６に記載の方法。
【請求項108】
前記第１の領域中の前記プローブ上の前記反応遮断修飾が、遊離可能な、塩基を修飾された基、切断可能なリンカーおよび感光性基からなる群から選択される、請求項９７～１０７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項109】
前記第１の領域中の前記プローブ上の前記反応遮断修飾が切断可能なリンカーである、請求項１０８に記載の方法。
【請求項110】
前記リンカーが、前記第１の領域中の前記プローブの５’末端に位置する、請求項１０９に記載の方法。
【請求項111】
前記リンカーが、前記第１の処理時に切断可能である、請求項１０９～１１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項112】
前記第１の処理が、電子ビーム処理、音波および照明からなる群から選択される、請求項１１１に記載の方法。
【請求項113】
前記第１の処理が照明である、請求項１１２に記載の方法。
【請求項114】
前記光が、アークランプ、レーザ、ＵＶ光源および発光ダイオードからなる群から選択される光源によって提供される、請求項１１２～１１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項115】
前記光がＵＶ光源によって提供される、請求項１１２～１１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項116】
前記第１の領域中の前記プローブ上の前記反応遮断修飾が、遊離可能な、塩基を修飾された基である、請求項１０８～１１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項117】
前記第１の領域中の前記プローブ上の前記反応遮断修飾が、少なくとも１つの遊離可能な、塩基を修飾された基を含む、請求項１１６に記載の方法。
【請求項118】
前記第１の領域中の前記プローブ上の前記反応遮断修飾が、少なくとも１つの遊離可能な感光性基を含む、請求項１１６～１１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項119】
前記塩基を修飾された基が、ＮＰＯＭ保護基を含む、請求項１１６～１１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項120】
前記塩基を修飾された基が、前記第１の処理時に遊離可能である、請求項１１６～１１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項121】
前記第１の処理が、電子ビーム処理、音波および照明からなる群から選択される、請求項１２０に記載の方法。
【請求項122】
前記第１の処理が照明である、請求項１２１に記載の方法。
【請求項123】
前記光が、アークランプ、レーザ、ＵＶ光源および発光ダイオードからなる群から選択される光源によって提供される、請求項１２１～１２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項124】
前記光がＵＶ光源によって提供される、請求項１２１～１２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項125】
前記第２の領域中の前記プローブ上の前記反応遮断修飾が、遊離可能な、塩基を修飾された基、切断可能なリンカーおよび感光性基からなる群から選択される、請求項９７～１２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項126】
前記第２の領域中の前記プローブ上の前記反応遮断修飾が切断可能なリンカーである、請求項１２５に記載の方法。
【請求項127】
前記リンカーが、前記第２の領域中の前記プローブの５’末端に位置する、請求項１２６に記載の方法。
【請求項128】
前記リンカーが、前記第２の処理時に切断可能である、請求項１２６～１２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項129】
前記第２の処理が、電子ビーム処理、音波および照明からなる群から選択される、請求項１２８に記載の方法。
【請求項130】
前記第２の処理が照明である、請求項１２９に記載の方法。
【請求項131】
前記光が、アークランプ、レーザ、ＵＶ光源および発光ダイオードからなる群から選択される光源によって提供される、請求項１２９～１３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項132】
前記光がＵＶ光源によって供給される、請求項１２９～１３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項133】
前記第２の領域中の前記プローブ上の前記反応遮断修飾が、遊離可能な、塩基を修飾された基である、請求項１２５に記載の方法。
【請求項134】
前記第２の領域中の前記プローブ上の前記反応遮断修飾が、少なくとも１つの遊離可能な、塩基を修飾された基を含む、請求項１３３に記載の方法。
【請求項135】
前記塩基を修飾された基が、ＮＰＯＭ保護基を含む、請求項１３３～１３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項136】
前記塩基を修飾された基が、前記第２の処理時に遊離可能である、請求項１３３～１３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項137】
前記第２の処理が、電子ビーム処理、音波および照明からなる群から選択される、請求項１３６に記載の方法。
【請求項138】
前記第２の処理が照明である、請求項１３７に記載の方法。
【請求項139】
前記光が、アークランプ、レーザ、ＵＶ光源および発光ダイオードからなる群から選択される光源によって提供される、請求項１３７～１３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項140】
前記光がＵＶ光源によって供給される、請求項１３７～１３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項141】
前記第１の処理および前記第２の処理が同じであるかまたは異なる、請求項１～２２および９７～１４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項142】
前記試料の前記第１の領域に対して前記第１の処理を実行する間または実行した後に、前記試料の前記第２の領域に対して前記第２の処理を実行することを含む、請求項１～２２および９７～１４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項143】
前記第１の処理の後、前記第１のタグ配列を含有する前記第１のタグ分子を前記試料の前記第１の領域に投与することを含む、請求項１～２２および９７～１４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項144】
前記第２の処理の後、前記第２のタグ配列を含有する前記第２のタグ分子を前記試料の前記第２の領域に投与することを含む、請求項１～２２および９７～１４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項145】
前記プローブがアダプターの第１の結合ドメインを含み、前記アダプターの前記第１の結合ドメインが少なくとも１つの反応遮断修飾を含む、請求項１～２２および９７～１４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項146】
前記プローブにおいて、前記アダプターの前記第１の結合ドメインが、前記標的分子結合ドメインの５’末端に位置する、請求項１４５に記載の方法。
【請求項147】
前記プローブがバーコードをさらに含む、請求項１４５～１４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項148】
前記バーコードが抗体の同一性を特徴付ける、請求項１４７に記載の方法。
【請求項149】
前記第１の処理時に、前記第１の領域中の前記プローブが前記第１のタグ配列およびオリゴヌクレオチドアダプターと複合体を形成することを含み、前記オリゴヌクレオチドアダプターはプローブ結合ドメインおよびタグ結合ドメインを含む、請求項１～２２および９７～１４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項150】
前記第１のタグ配列が、少なくとも１つのバーコードとアダプターの第２の結合ドメインとを含む、請求項１～２２および９７～１４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項151】
前記第１の処理時に、前記プローブ結合ドメイン中の核酸配列が、前記第１の領域中の前記プローブ中の前記アダプターの前記第１の結合ドメイン中の核酸配列に相補的であり、および前記タグ結合ドメイン中の核酸配列が、前記第１のタグ配列中の前記アダプターの前記第２の結合ドメイン中の核酸配列に相補的であり、その結果、部分的に二本鎖構造を形成することを含む、請求項１５０に記載の方法。
【請求項152】
前記第１のタグ配列中の前記アダプターの前記第２の結合ドメインが、リガーゼによって、前記第１の領域中の前記プローブ中の前記アダプターの前記第１の結合ドメインに連結され、その結果、前記第１のタグ配列に付着した前記プローブを産生する、請求項１５０～１５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項153】
前記リガーゼがＴ４リガーゼを含む、請求項１５２に記載の方法。
【請求項154】
前記第１のタグ配列の前記バーコードが、前記第１の領域の空間的位置情報を特徴付ける、請求項１５０～１５３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項155】
前記第１のタグ配列が複数のバーコードを含む、請求項１５０～１５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項156】
前記第１のタグ配列中の前記複数のバーコードが異なる、請求項１５５に記載の方法。
【請求項157】
前記第１のタグ配列中の前記アダプターの前記第２の結合ドメイン中の前記核酸配列が、前記第１のタグ配列中の前記バーコードの３’末端に位置する、請求項１５０～１５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項158】
前記第１のタグ配列が、固有の分子識別領域を含む、請求項１～２２および９７～１５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項159】
前記第１のタグ配列が配列決定プライマーを含む、請求項１～２２および９７～１５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項160】
前記第２の領域中の前記プローブがアダプターの第１の結合ドメインを含み、前記アダプターの前記第１の結合ドメインが少なくとも１つの反応遮断修飾を含む、請求項１～２２および９７～１５９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項161】
前記プローブにおいて、前記アダプターの前記第１の結合ドメインが、前記標的分子結合ドメインの５’末端に位置する、請求項１６０に記載の方法。
【請求項162】
前記第２の処理時に、前記第２の領域中の前記プローブが前記第２のタグ配列およびオリゴヌクレオチドアダプターと複合体を形成することを含む、請求項１～２２および９７～１６１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項163】
前記第２のタグ配列が、少なくとも１つのバーコードおよびアダプターの第２の結合ドメインを含む、請求項１～２２および９７～１６２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項164】
前記第２の処理時に、前記プローブ結合ドメイン中の核酸配列が、前記第２の領域中の前記プローブ中の前記アダプターの前記第１の結合ドメイン中の核酸配列に相補的であり、および前記タグ結合ドメイン中の核酸配列が、前記第２のタグ配列中の前記アダプターの前記第２の結合ドメイン中の核酸配列に相補的であり、その結果、部分的に二本鎖構造を形成することを含む、請求項１６３に記載の方法。
【請求項165】
前記第２のタグ配列中の前記アダプターの前記第２の結合ドメインが、リガーゼによって、前記第２の領域中の前記プローブ中の前記アダプターの前記第１の結合ドメインに連結され、その結果、前記第２のタグ配列に付着した前記プローブを産生する、請求項１６３～１６４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項166】
前記リガーゼがＴ４リガーゼを含む、請求項１６５に記載の方法。
【請求項167】
前記第２のタグ配列中の前記バーコードが、前記第２の領域の空間的位置情報を特徴付ける、請求項１６３～１６６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項168】
前記第２のタグ配列が複数のバーコードを含む、請求項１６３～１６７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項169】
前記第２のタグ配列中の前記複数のバーコードが異なる、請求項１６８に記載の方法。
【請求項170】
前記第２のタグ配列中の前記アダプターの前記第２の結合ドメイン中の前記核酸配列が、前記第２のタグ配列中の前記バーコードの３’末端に位置する、請求項１６３～１６９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項171】
前記第２のタグ配列が、固有の分子識別領域を含む、請求項１～２２および９７～１７０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項172】
前記第２のタグ配列が配列決定プライマーを含む、請求項１～２２および９７～１７１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項173】
前記少なくとも１つのプローブが、前記試料中の少なくとも１つの標的分子を特異的に認識する、請求項１～２２および９７～１７２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項174】
前記試料を消化して、前記第１のタグ配列に付着した前記プローブおよび前記第２のタグ配列に付着した前記プローブを得ることを含む、請求項１～２２および９７～１７３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項175】
得られた、前記第１のタグ配列に付着した前記プローブおよび前記第２のタグ配列に付着した前記プローブを増幅することを含む、請求項１～２２および９７～１７４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項176】
得られた、前記第１のタグ配列に付着した前記プローブおよび前記第２のタグ配列に付着した前記プローブを増幅した後、前記第１のタグ配列に付着した前記プローブおよび前記第２のタグ配列に付着した前記プローブを配列決定して、前記第１のタグ配列に付着した前記プローブおよび前記第２のタグ配列に付着した前記プローブの組成を決定することをさらに含む、請求項１～２２および９７～１７５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項177】
組み合わせであって、（１）複数のプローブであって、前記プローブの各々が、標的分子結合ドメインと、アダプターの第１の結合ドメインと、少なくとも１つの反応遮断修飾とを含む、複数のプローブと；（２）プローブ結合ドメインとタグ結合ドメインとを含むオリゴヌクレオチドアダプターと；（３）複数のタグ配列であって、前記タグ配列の各々が、少なくとも１つのバーコードとアダプターの第２の結合ドメインとを含む、複数のタグ配列とを含み、前記プローブ結合ドメイン中の核酸配列が、前記アダプターの前記第１の結合ドメイン中の核酸配列に相補的であり、および前記タグ結合ドメイン中の核酸配列が、前記アダプターの前記第２の結合ドメイン中の核酸配列に相補的である、組み合わせ。
【請求項178】
前記複数のタグ配列の２つ以上における前記バーコードが異なる、請求項１７７に記載の組み合わせ。
【請求項179】
前記反応遮断修飾が、遊離可能な、塩基を修飾された基、切断可能なリンカーおよび感光性基からなる群から選択される、請求項１７７～１７８のいずれか一項に記載の組み合わせ。
【請求項180】
前記反応遮断修飾が切断可能なリンカーである、請求項１７７～１７９のいずれか一項に記載の組み合わせ。
【請求項181】
前記反応遮断修飾が、遊離可能な、塩基を修飾された基である、請求項１７７～１８０のいずれか一項に記載の組み合わせ。
【請求項182】
前記１）、２）および３）が互いに独立して存在する、請求項１７７～１８１のいずれか一項に記載の組み合わせ。
【請求項183】
前記１）、２）および３）が混合物として存在する、請求項１７７～１８２のいずれか一項に記載の組み合わせ。
【請求項184】
請求項１７７～１８３のいずれか一項に記載の組み合わせを含むキット。
【請求項185】
トランスポザーゼを含む、請求項１８４に記載のキット。
【請求項186】
核酸増幅剤、逆転写酵素、固定剤、透過剤、連結剤および溶解剤の少なくとも１つをさらに含む、請求項１８４～１８５のいずれか一項に記載のキット。
【請求項187】
使用説明書を含む、請求項１８４～１８６のいずれか一項に記載のキット。
【請求項188】
前記使用説明書が、以下の方法：（ａ）プローブを標的分子に特異的に結合させる条件下で、試料中の少なくとも１つの標的分子を少なくとも１つのプローブと接触させる工程であって、前記プローブは、前記標的分子に特異的に結合することが可能な標的分子結合ドメインと、少なくとも１つの反応遮断修飾とを含有する、工程と；（ｂ）前記試料の第１の領域に対して第１の処理を実行する工程であって、前記第１の処理は、前記第１の領域内の前記プローブ上の前記反応遮断修飾を少なくとも部分的に除去して、前記第１の領域内の前記プローブを前記タグ配列中の第１のタグ配列に付着させることが可能である、工程と；（ｃ）前記試料中の、前記第１の領域とは異なる第２の領域に対して第２の処理を実行する工程であって、前記第２の処理は、前記第２の領域中の前記プローブ上の前記反応遮断修飾を少なくとも部分的に除去して、前記第２の領域中の前記プローブを前記タグ配列中の第２のタグ配列に付着させることが可能であり、前記第２のタグ配列は前記第１のタグ配列とは異なる、工程と；（ｄ）前記第１のタグ配列に付着した前記プローブおよび前記第２のタグ配列に付着した前記プローブの組成を決定し、ならびに前記プローブの前記組成から、前記試料中の前記第１の領域の前記標的分子の存在および／または含有量および前記第２の領域の前記標的分子の存在および／または含有量を決定する工程とを記載する、請求項１８７に記載のキット。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本出願は、生物医学の分野に関し、特に、試料のオミクス情報を分析するための製品および方法に関する。
【背景技術】
【0002】
ヒトおよび他の種のゲノムの配列決定が徐々に完了するにつれて、現代の生物学における研究は、ポストゲノム時代に入った。近年、ゲノム技術、トランスクリプトーム技術、プロテオミクス技術などを含む、様々な生物学的高分子の研究のためのハイスループット技術が絶えず開発されている。さらに、少量または単一細胞試料に対する様々なオミクスアプローチが盛んになっており、適用されている。大量のデータ処理および分析に対する需要が増大するにつれて、バイオインフォマティクスも急速に発展している。
【0003】
インサイチュハイブリダイゼーションおよび異なる転写物の他の多重検出などの伝統的な方法は、遺伝子発現の空間的分布を明らかにし、発達および疾患の分子的基礎を解明するのに役立ってきた。しかしながら、これらの方法は、試料中の様々な空間的位置における複数の遺伝子の発現または複数のタンパク質の存在およびもしくは活性を同時に測定することができない。
【0004】
したがって、試料中の複数の領域のオミクス情報を解析するために、試料中の複数の領域を高い効率で同時に検出することが可能な方法が必要とされている。
【発明の概要】
【0005】
本出願は、以下の特性のうちの１つまたは複数を有する、試料のオミクス情報を分析するための方法を提供する：１）高い効率でトランスクリプトーム検出およびプロテオミクス検出を行うことが可能である；２）オミクス情報に対して複数の検出を同時に行うことが可能である。
【0006】
本出願は、プローブを標的分子に特異的に結合させる条件下で、試料中の少なくとも１つの標的分子を少なくとも１つのプローブと接触させる工程であって、前記プローブは、前記標的分子に特異的に結合することが可能な標的分子結合ドメインと、少なくとも１つの反応遮断修飾とを含有する、工程と；
前記試料の第１の領域に対して第１の処理を実行する工程であって、前記第１の処理は、前記第１の領域内の前記プローブ上の前記反応遮断修飾を少なくとも部分的に除去して、前記第１の領域内の前記プローブを第１のタグ配列に付着させることが可能である、工程と；
前記試料中の、前記第１の領域とは異なる第２の領域に対して第２の処理を実行する工程であって、前記第２の処理は、前記第２の領域中の前記プローブ上の前記反応遮断修飾を少なくとも部分的に除去して、前記第２の領域中の前記プローブを第２のタグ配列に付着させることが可能であり、前記第２のタグ配列は前記第１のタグ配列とは異なる、工程と；
前記第１のタグ配列に付着した前記プローブおよび前記第２のタグ配列に付着した前記プローブの組成を決定し、ならびに前記プローブの前記組成から、前記試料中の前記第１の領域の前記標的分子の存在および／または含有量および前記第２の領域の前記標的分子の存在および／または含有量を決定する工程と
を含む、方法を提供する。
前記試料の第１の領域に対して第１の処理を実行する工程であって、前記第１の処理は、前記第１の領域内の前記プローブ上の前記反応遮断修飾を少なくとも部分的に除去して、前記第１の領域内の前記プローブを第１のタグ配列に付着させることが可能である、工程と；
前記試料中の、前記第１の領域とは異なる第２の領域に対して第２の処理を実行する工程であって、前記第２の処理は、前記第２の領域中の前記プローブ上の前記反応遮断修飾を少なくとも部分的に除去して、前記第２の領域中の前記プローブを第２のタグ配列に付着させることが可能であり、前記第２のタグ配列は前記第１のタグ配列とは異なる、工程と；
前記第１のタグ配列に付着した前記プローブおよび前記第２のタグ配列に付着した前記プローブの組成を決定し、ならびに前記プローブの前記組成から、前記試料中の前記第１の領域の前記標的分子の存在および／または含有量および前記第２の領域の前記標的分子の存在および／または含有量を決定する工程と
を含む、方法を提供する。
【0007】
いくつかの態様において、試料は組織切片を含む。
【0008】
いくつかの態様において、組織切片は、１～１０００μｍの範囲の厚さを有する。
【0009】
いくつかの態様において、本方法における組織切片は、凍結切片、パラフィン切片、カルボワックス切片、極薄切片およびプラスチック切片からなる群から選択される。
【0010】
いくつかの態様において、組織切片は、固定された組織切片を含む。
【0011】
いくつかの態様において、組織切片は、ホルマリン固定された組織切片を含む。
【0012】
いくつかの態様において、組織切片は、ホルマリン固定されたパラフィン切片である。
【0013】
いくつかの態様において、組織切片は凍結切片である。
【0014】
いくつかの態様において、組織切片中の組織は、多細胞生物に由来する。
【0015】
いくつかの態様において、組織切片中の組織はヒト由来である。
【0016】
いくつかの態様において、組織切片は臨床的に意義のある組織試料である。
【0017】
いくつかの態様において、組織切片中の組織は、心筋組織、肝組織、脾臓組織、肺組織、腎組織および脳組織からなる群に由来する。
【0018】
いくつかの態様において、第１の領域は、組織切片上の第１の領域であり、および第２の領域は、組織切片上の、第１の領域と実質的に重複していない第２の領域である。
【0019】
いくつかの態様において、試料は単一の細胞である。
【0020】
いくつかの態様において、細胞は、生物から単離された細胞、インビトロで培養された細胞、初代細胞および外植片からの分離した細胞からなる群から選択される。
【0021】
いくつかの態様において、本方法における細胞は固定されている。
【0022】
いくつかの態様において、第１の領域は、細胞内の第１の細胞内構造である。
【0023】
いくつかの態様において、第２の領域は、細胞内の第２の細胞内構造である。
【0024】
いくつかの態様において、標的分子は、タンパク質、核酸分子および／または脂質を含む。
【0025】
いくつかの態様において、核酸分子は、ＤＮＡ分子および／またはＲＮＡ分子を含む。
【0026】
いくつかの態様において、ＤＮＡはｃＤＮＡを含む。
【0027】
いくつかの態様において、ＲＮＡは、ｃＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡおよび／またはｅＲＮＡを含む。
【0028】
いくつかの態様において、標的分子がＲＮＡを含む場合に、プローブ中の標的分子結合ドメインは、当該ＲＮＡに相補的な核酸配列を含む。
【0029】
いくつかの態様において、プローブ中の標的分子結合ドメインはポリＡを含む。
【0030】
いくつかの態様において、プローブ中の標的分子結合ドメインはポリＴを含む。
【0031】
いくつかの態様において、プローブ中の標的分子結合ドメインは、標的分子の配列に少なくとも５０％相補的である。
【0032】
いくつかの態様において、本方法は、試料中の２つ以上の標的分子を２つ以上のプローブと接触させる工程を含み、２つ以上のプローブは２つ以上の標的分子を特異的に結合することが可能である。
【0033】
いくつかの態様において、２つ以上の標的分子は異なる。
【0034】
いくつかの態様において、本方法では、第１の領域中のプローブ上の反応遮断修飾は、遊離可能な、塩基を修飾された基、切断可能なリンカーおよび感光性基からなる群から選択される。
【0035】
いくつかの態様において、標的分子がＲＮＡを含む場合に、前記方法における第１の領域中のプローブ上の反応遮断修飾は切断可能なリンカーである。
【0036】
いくつかの態様において、本方法におけるリンカーは第１の領域中のプローブの５’末端に位置する。
【0037】
いくつかの態様において、第１の領域中のプローブ中のリンカーは、第１の処理時に切断可能である。
【0038】
いくつかの態様において、本方法における第１の処理は、電子ビーム処理、音波および照明からなる群から選択される。
【0039】
いくつかの態様において、本方法における第１の処理は照明である。
【0040】
いくつかの態様において、本方法における光は、アークランプ、レーザ、ＵＶ光源および発光ダイオードからなる群から選択される光源によって提供される。
【0041】
いくつかの態様において、本方法における光は、ＵＶ光源によって提供される。
【0042】
いくつかの態様において、本方法では、第１の領域中のプローブ上の反応遮断修飾は、遊離可能な、塩基を修飾された基である。
【0043】
いくつかの態様において、本方法では、第１の領域中のプローブ上の反応遮断修飾は、少なくとも１つの遊離可能な、塩基を修飾された基を含む。
【0044】
いくつかの態様において、第１の領域中のプローブ上の反応遮断修飾は、少なくとも１つの遊離可能な感光性基を含む。
【0045】
いくつかの態様において、第１の領域中のプローブ中の塩基を修飾された基は、ＮＰＯＭ保護基を含む。
【0046】
いくつかの態様において、第１の領域中のプローブ中の塩基を修飾された基は、第１の処理時に遊離可能である。
【0047】
いくつかの態様において、本方法における第１の処理は、電子ビーム処理、音波および照明からなる群から選択される。
【0048】
いくつかの態様において、本方法における第１の処理は照明である。
【0049】
いくつかの態様において、本方法における光は、アークランプ、レーザ、ＵＶ光源および発光ダイオードからなる群から選択される光源によって提供される。
【0050】
いくつかの態様において、本方法における光は、ＵＶ光源によって提供される。
【0051】
いくつかの態様において、標的分子がＲＮＡを含む場合に、第２の領域中のプローブ上の反応遮断修飾は、遊離可能な、塩基を修飾された基、切断可能なリンカーおよび感光性基からなる群から選択される。
【0052】
いくつかの態様において、本方法では、第２の領域中のプローブ上の反応遮断修飾は、切断可能なリンカーである。
【0053】
いくつかの態様において、本方法におけるリンカーは第２の領域中のプローブの５’末端に位置する。
【0054】
いくつかの態様において、第２の領域中のプローブ中のリンカーは、第２の処理時に切断可能である。
【0055】
いくつかの態様において、本方法における第２の処理は、電子ビーム処理、音波および照明からなる群から選択される。
【0056】
いくつかの態様において、本方法における第２の処理は照明である。
【0057】
いくつかの態様において、本方法における光は、アークランプ、レーザ、ＵＶ光源および発光ダイオードからなる群から選択される光源によって提供される。
【0058】
いくつかの態様において、本方法における光は、ＵＶ光源によって提供される。
【0059】
いくつかの態様において、本方法では、第２の領域中のプローブ上の反応遮断修飾は、遊離可能な、塩基を修飾された基である。
【0060】
いくつかの態様において、本方法では、第２の領域中のプローブ上の反応遮断修飾は、少なくとも１つの遊離可能な、塩基を修飾された基を含む。
【0061】
いくつかの態様において、本方法では、第２の領域中のプローブ上の反応遮断修飾は、少なくとも１つの遊離可能な感光性基を含む。
【0062】
いくつかの態様において、本方法における塩基を修飾された基は、ＮＰＯＭ保護基を含む。
【0063】
いくつかの態様において、第２の領域中のプローブ中の塩基を修飾された基は、第２の処理時に遊離可能である。
【0064】
いくつかの態様において、本方法における第２の処理は、電子ビーム処理、音波および照明からなる群から選択される。
【0065】
いくつかの態様において、本方法における第２の処理は照明である。
【0066】
いくつかの態様において、本方法における光は、アークランプ、レーザ、ＵＶ光源および発光ダイオードからなる群から選択される光源によって提供される。
【0067】
いくつかの態様において、本方法における光は、ＵＶ光源によって提供される。
【0068】
いくつかの態様において、本方法における第１の処理および第２の処理は同じであるかまたは異なる。
【0069】
いくつかの態様において、試料の第１の領域に対して第１の処理を実行する間または後に、試料の第２の領域に対して第２の処理が実行される。
【0070】
いくつかの態様において、本方法は、第１の処理の後、第１のタグ配列を含有する第１のタグ分子を前記試料の前記第１の領域に投与することを含む。
【0071】
いくつかの態様において、本方法は、第２の処理の後、第２のタグ配列を含有する第２のタグ分子を前記試料の前記第２の領域に投与することを含む。
【0072】
いくつかの態様において、プローブはアダプターの第１の結合ドメインをさらに含み、アダプターの第１の結合ドメインは少なくとも１つの反応遮断修飾を含む。
【0073】
いくつかの態様では、プローブにおいて、アダプターの第１の結合ドメインは、標的分子結合ドメインの５’末端に位置する。
【0074】
いくつかの態様において、本方法は、第１の処理時に、第１の領域中のプローブが第１のタグ配列およびオリゴヌクレオチドアダプターと複合体を形成することを含み、オリゴヌクレオチドアダプターはプローブ結合ドメインおよびタグ結合ドメインを含む。
【0075】
いくつかの態様において、本方法における第１のタグ配列は、少なくとも１つのバーコードとアダプターの第２の結合ドメインとを含む。
【0076】
いくつかの態様において、本方法は、第１の処理時に、プローブ結合ドメイン中の核酸配列が、第１の領域中のプローブ中のアダプターの第１の結合ドメイン中の核酸配列に相補的であり、およびタグ結合ドメイン中の核酸配列が、第１のタグ配列中のアダプターの第２の結合ドメイン中の核酸配列に相補的であり、その結果、部分的に二本鎖構造を形成することを含む。
【0077】
いくつかの態様において、第１のタグ配列中のアダプターの第２の結合ドメインが、リガーゼによって、第１の領域中のプローブ中のアダプターの第１の結合ドメインに連結され、その結果、第１のタグ配列に付着したプローブを産生する。
【0078】
いくつかの態様において、リガーゼはＴ４リガーゼを含む。
【0079】
いくつかの態様において、第１のタグ配列のバーコードは、第１の領域の空間的位置情報を特徴付ける。
【0080】
いくつかの態様において、第１のタグ配列は複数のバーコードを含む。
【0081】
いくつかの態様において、第１のタグ内の複数のバーコードは異なる。
【0082】
いくつかの態様において、第１のタグ配列中のアダプターの第２の結合ドメイン中の核酸配列は、第１のタグ配列中のバーコードの３’末端に位置する。
【0083】
いくつかの態様において、第１のタグ配列は、固有の分子識別領域を含む。
【0084】
いくつかの態様において、第１のタグ配列は配列決定プライマーを含む。
【0085】
いくつかの態様において、第２の領域中のプローブはアダプターの第１の結合ドメインを含み、アダプターの第１の結合ドメインは少なくとも１つの反応遮断修飾を含む。
【0086】
いくつかの態様では、プローブにおいて、アダプターの第１の結合ドメインは、標的分子結合ドメインの５’末端に位置する。
【0087】
いくつかの態様において、本方法は、第２の処理時に、第２の領域中のプローブが第２のタグ配列およびオリゴヌクレオチドアダプターと複合体を形成することを含み、オリゴヌクレオチドアダプターはプローブ結合ドメインおよびタグ結合ドメインを含む。
【0088】
いくつかの態様において、第２のタグ配列は、少なくとも１つのバーコードとアダプターの第２の結合ドメインとを含む。
【0089】
いくつかの態様において、本方法は、第２の処理時に、プローブ結合ドメイン中の核酸配列が、第２の領域中のプローブ中のアダプターの第１の結合ドメイン中の核酸配列に相補的であり、およびタグ結合ドメイン中の核酸配列が、第２のタグ配列中のアダプターの第２の結合ドメイン中の核酸配列に相補的であり、その結果、部分的に二本鎖構造を形成することを含む。
【0090】
いくつかの態様において、第２のタグ配列中のアダプターの第２の結合ドメインが、リガーゼによって、第２の領域中のプローブ中のアダプターの第１の結合ドメインに連結され、その結果、第２のタグ配列に付着したプローブを産生する。
【0091】
いくつかの態様において、リガーゼはＴ４リガーゼを含む。
【0092】
いくつかの態様において、第２のタグ配列中のバーコードは、第２の領域の空間的位置情報を特徴付ける。
【0093】
いくつかの態様において、第２のタグ配列は、複数のバーコードを含む。
【0094】
いくつかの態様において、第２のタグ配列中の複数のバーコードは異なる。
【0095】
いくつかの態様において、第２のタグ配列中のアダプターの第２の結合ドメイン中の核酸配列は、第２のタグ配列中のバーコードの３’末端に位置する。
【0096】
いくつかの態様において、第２のタグ配列は、固有の分子識別領域を含む。
【0097】
いくつかの態様において、第２のタグ配列は配列決定プライマーを含む。
【0098】
いくつかの態様において、試料中の少なくとも１つの標的分子は、少なくとも１つのプローブとのインサイチュハイブリダイゼーションに供される。
【0099】
いくつかの態様において、本方法は、インサイチュハイブリダイゼーションの後、試料を消化して、第１のタグ配列に付着したプローブおよび第２のタグ配列に付着したプローブを得ることを含む。
【0100】
いくつかの態様において、本方法は、得られた、第１のタグ配列に付着したプローブおよび第２のタグ配列に付着したプローブを増幅することを含む。
【0101】
いくつかの態様において、本方法は、得られた、第１のタグ配列に付着したプローブおよび第２のタグ配列に付着したプローブを増幅した後、第１のタグ配列に付着したプローブおよび第２のタグ配列に付着したプローブを配列決定して、第１のタグ配列に付着したプローブおよび第２のタグ配列に付着したプローブの組成を決定することをさらに含む。
【0102】
いくつかの態様において、標的分子がタンパク質を含む場合に、プローブ中の標的分子結合ドメインは、タンパク質に特異的に結合するタンパク質結合分子を含む。
【0103】
いくつかの態様において、タンパク質結合分子は、抗体、ペプチドおよびペプトイドからなる群から選択される。
【0104】
いくつかの態様において、標的分子が脂質を含む場合に、プローブ中の標的分子結合ドメインは標的分子を認識し、および結合する。
【0105】
いくつかの態様において、標的分子は、試料に由来するＤＮＡを含む。
【0106】
いくつかの態様において、ＤＮＡは、ゲノムＤＮＡ、オープンクロマチンＤＮＡ、タンパク質によって結合されたＤＮＡ領域、ならびに／またはタンパク質、脂質および／もしくは小分子化合物と連結された外因性核酸を含み、タンパク質、脂質および／または小分子化合物は細胞内の標的分子を結合することが可能である。
【0107】
いくつかの態様において、本方法は、試料中の少なくとも１つの標的分子を少なくとも１つのプローブと接触させる前にＤＮＡを断片化することを含む。
【0108】
いくつかの態様において、本方法における断片化は、トランスポザーゼ－核酸複合体を使用してプローブを含有する配列をＤＮＡ中に組み込むこと、およびトランスポザーゼを遊離させることを含む。
【0109】
いくつかの態様において、本方法におけるトランスポザーゼ－核酸複合体はトランスポザーゼおよびトランスポゾン末端核酸分子を含み、トランスポゾン末端核酸分子はオリゴヌクレオチドアダプター配列を含む。
【0110】
いくつかの態様において、トランスポザーゼはＴｎ５を含む。
【0111】
いくつかの態様において、ＤＮＡは、タンパク質によって結合されたＤＮＡ領域を含み、トランスポザーゼ－核酸複合体は、タンパク質を直接的にまたは間接的に認識する部分をさらに含む。
【0112】
いくつかの態様において、本方法では、タンパク質を直接的にまたは間接的に認識する部分は、タンパク質を特異的に結合する抗体およびプロテインＡまたはプロテインＧからなる群の１つまたは複数を含む。
【0113】
いくつかの態様において、本方法では、第１の領域中のプローブ上の反応遮断修飾は、遊離可能な、塩基を修飾された基、切断可能なリンカーおよび感光性基からなる群から選択される。
【0114】
いくつかの態様において、第１の領域中のプローブ上の反応遮断修飾は、切断可能なリンカーである。
【0115】
いくつかの態様において、リンカーは、第１の領域中のプローブの５’末端に位置する。
【0116】
いくつかの態様において、リンカーは、第１の処理時に切断可能である。
【0117】
いくつかの態様において、第１の処理は、電子ビーム処理、音波および照明からなる群から選択される。
【0118】
いくつかの態様において、第１の処理は照明である。
【0119】
いくつかの態様において、光は、アークランプ、レーザ、ＵＶ光源および発光ダイオードからなる群から選択される光源によって提供される。
【0120】
いくつかの態様において、光はＵＶ光源によって提供される。
【0121】
いくつかの態様において、第１の領域中のプローブ上の反応遮断修飾は、遊離可能な、塩基を修飾された基である。
【0122】
いくつかの態様において、第１の領域中のプローブ上の反応遮断修飾は、少なくとも１つの遊離可能な、塩基を修飾された基を含む。
【0123】
いくつかの態様において、第１の領域中のプローブ上の反応遮断修飾は、少なくとも１つの遊離可能な感光性基を含む。
【0124】
いくつかの態様において、塩基を修飾された基は、ＮＰＯＭ保護基を含む。
【0125】
いくつかの態様において、塩基を修飾された基は、第１の処理時に遊離可能である。
【0126】
いくつかの態様において、第１の処理は、電子ビーム処理、音波および照明からなる群から選択される。
【0127】
いくつかの態様において、第１の処理は照明である。
【0128】
いくつかの態様において、光は、アークランプ、レーザ、ＵＶ光源および発光ダイオードからなる群から選択される光源によって提供される。
【0129】
いくつかの態様において、光はＵＶ光源によって提供される。
【0130】
いくつかの態様において、第２の領域中のプローブ上の反応遮断修飾は、遊離可能な、塩基を修飾された基、切断可能なリンカーおよび感光性基からなる群から選択される。
【0131】
いくつかの態様において、第２の領域中のプローブ上の反応遮断修飾は、切断可能なリンカーである。
【0132】
いくつかの態様において、リンカーは、第２の領域中のプローブの５’末端に位置する。
【0133】
いくつかの態様において、リンカーは、第２の処理時に切断可能である。
【0134】
いくつかの態様において、第２の処理は、電子ビーム処理、音波および照明からなる群から選択される。
【0135】
いくつかの態様において、第２の処理は照明である。
【0136】
いくつかの態様において、光は、アークランプ、レーザ、ＵＶ光源および発光ダイオードからなる群から選択される光源によって提供される。
【0137】
いくつかの態様において、光はＵＶ光源によって提供される。
【0138】
いくつかの態様において、第２の領域中のプローブ上の反応遮断修飾は、遊離可能な、塩基を修飾された基である。
【0139】
いくつかの態様において、第２の領域中のプローブ上の反応遮断修飾は、少なくとも１つの遊離可能な、塩基を修飾された基を含む。
【0140】
いくつかの態様において、塩基を修飾された基は、ＮＰＯＭ保護基を含む。
【0141】
いくつかの態様において、塩基を修飾された基は、第２の処理時に遊離可能である。
【0142】
いくつかの態様において、第２の処理は、電子ビーム処理、音波および照明からなる群から選択される。
【0143】
いくつかの態様において、第２の処理は照明である。
【0144】
いくつかの態様において、光は、アークランプ、レーザ、ＵＶ光源および発光ダイオードからなる群から選択される光源によって提供される。
【0145】
いくつかの態様において、光はＵＶ光源によって提供される。
【0146】
いくつかの態様において、第１の処理および第２の処理は同じであるかまたは異なる。
【0147】
いくつかの態様において、試料の第１の領域に対して第１の処理を実行する間または後に、試料の第２の領域に対して第２の処理が実行される。
【0148】
いくつかの態様において、本方法は、第１の処理の後、第１のタグ配列を含有する第１のタグ分子を前記試料の第１の領域に投与することを含む。
【0149】
いくつかの態様において、本方法は、第２の処理の後に、第２のタグ配列を含有する第２のタグ分子を試料の第２の領域に投与することを含む。
【0150】
いくつかの態様において、プローブはアダプターの第１の結合ドメインを含有し、アダプターの第１の結合ドメインは少なくとも１つの反応遮断修飾を含む。
【0151】
いくつかの態様では、プローブにおいて、アダプターの第１の結合ドメインは、標的分子結合ドメインの５’末端に位置する。
【0152】
いくつかの態様において、プローブはバーコードをさらに含む。
【0153】
いくつかの態様において、プローブ中のバーコードは抗体の同一性を特徴付ける。
【0154】
いくつかの態様において、本方法は、第１の処理時に、第１の領域中のプローブが第１のタグ配列およびオリゴヌクレオチドアダプターと複合体を形成することを含み、オリゴヌクレオチドアダプターはプローブ結合ドメインおよびタグ結合ドメインを含む。
【0155】
いくつかの態様において、第１のタグ配列は、少なくとも１つのバーコードとアダプターの第２の結合ドメインとを含む。
【0156】
いくつかの態様において、本方法は、第１の処理時に、プローブ結合ドメイン中の核酸配列が、第１の領域中のプローブ中のアダプターの第１の結合ドメイン中の核酸配列に相補的であり、およびタグ結合ドメイン中の核酸配列が、第１のタグ配列中のアダプターの第２の結合ドメイン中の核酸配列に相補的であり、その結果、部分的に二本鎖構造を形成することを含む。
【0157】
いくつかの態様において、第１のタグ配列中のアダプターの第２の結合ドメインが、リガーゼによって、第１の領域中のプローブ中のアダプターの第１の結合ドメインに連結され、その結果、第１のタグ配列に付着したプローブを産生する。
【0158】
いくつかの態様において、リガーゼはＴ４リガーゼを含む。
【0159】
いくつかの態様において、第１のタグ配列のバーコードは、第１の領域の空間的位置情報を特徴付ける。
【0160】
いくつかの態様において、第１のタグ配列は複数のバーコードを含む。
【0161】
いくつかの態様において、第１のタグ配列中の複数のバーコードは異なる。
【0162】
いくつかの態様において、第１のタグ配列中のアダプターの第２の結合ドメイン中の核酸配列は、第１のタグ配列中のバーコードの３’末端に位置する。
【0163】
いくつかの態様において、第１のタグ配列は、固有の分子識別領域を含む。
【0164】
いくつかの態様において、第１のタグ配列は配列決定プライマーを含む。
【0165】
いくつかの態様において、第２の領域中のプローブはアダプターの第１の結合ドメインを含み、アダプターの第１の結合ドメインは少なくとも１つの反応遮断修飾を含む。
【0166】
いくつかの態様では、プローブにおいて、アダプターの第１の結合ドメインは、標的分子結合ドメインの５’末端に位置する。
【0167】
いくつかの態様において、本方法は、第２の処理時に第２の領域中のプローブが第２のタグ配列およびオリゴヌクレオチドアダプターと複合体を形成することを含む。
【0168】
いくつかの態様において、第２のタグ配列は、少なくとも１つのバーコードとアダプターの第２の結合ドメインとを含む。
【0169】
いくつかの態様において、本方法は、第２の処理時に、プローブ結合ドメイン中の核酸配列が、第２の領域中のプローブ中のアダプターの第１の結合ドメイン中の核酸配列に相補的であり、およびタグ結合ドメイン中の核酸配列が、第２のタグ配列中のアダプターの第２の結合ドメイン中の核酸配列に相補的であり、その結果、部分的に二本鎖構造を形成することを含む。
【0170】
いくつかの態様において、第２のタグ配列中のアダプターの第２の結合ドメインが、リガーゼによって、第２の領域中のプローブ中のアダプターの第１の結合ドメインに連結され、その結果、第２のタグ配列に付着したプローブを産生する。
【0171】
いくつかの態様において、リガーゼはＴ４リガーゼを含む。
【0172】
いくつかの態様において、第２のタグ配列中のバーコードは、第２の領域の空間的位置情報を特徴付ける。
【0173】
いくつかの態様において、第２のタグ配列は、複数のバーコードを含む。
【0174】
いくつかの態様において、第２のタグ配列中の複数のバーコードは異なる。
【0175】
いくつかの態様において、第２のタグ配列中のアダプターの第２の結合ドメイン中の核酸配列は、第２のタグ配列中のバーコードの３’末端に位置する。
【0176】
いくつかの態様において、第２のタグ配列は、固有の分子識別領域を含む。
【0177】
いくつかの態様において、第２のタグ配列は配列決定プライマーを含む。
【0178】
いくつかの態様において、少なくとも１つのプローブは、試料中の少なくとも１つの標的分子を特異的に認識する。
【0179】
いくつかの態様において、本方法は、試料を消化して、第１のタグ配列に付着したプローブおよび第２のタグ配列に付着したプローブを得ることを含む。
【0180】
いくつかの態様において、本方法は、得られた、第１のタグ配列に付着したプローブおよび第２のタグ配列に付着したプローブを増幅することを含む。
【0181】
いくつかの態様において、得られた、第１のタグ配列に付着したプローブおよび第２のタグ配列に付着したプローブを増幅した後、本方法は、第１のタグ配列に付着したプローブおよび第２のタグ配列に付着したプローブを配列決定して、第１のタグ配列に付着したプローブおよび第２のタグ配列に付着したプローブの組成を決定することをさらに含む。
【0182】
別の局面において、本出願は、組み合わせであって、
１）複数のプローブであって、プローブの各々が、標的分子結合ドメインと、アダプターの第１の結合ドメインと、少なくとも１つの反応遮断修飾とを含む、複数のプローブと；
２）プローブ結合ドメインとタグ結合ドメインとを含むオリゴヌクレオチドアダプターと；
３）複数のタグ配列であって、タグ配列の各々が、少なくとも１つのバーコードとアダプターの第２の結合ドメインとを含む、複数のタグ配列とを含み、プローブ結合ドメイン中の核酸配列が、アダプターの第１の結合ドメイン中の核酸配列に相補的であり、およびタグ結合ドメイン中の核酸配列が、アダプターの第２の結合ドメイン中の核酸配列に相補的である、組み合わせを提供する。
１）複数のプローブであって、プローブの各々が、標的分子結合ドメインと、アダプターの第１の結合ドメインと、少なくとも１つの反応遮断修飾とを含む、複数のプローブと；
２）プローブ結合ドメインとタグ結合ドメインとを含むオリゴヌクレオチドアダプターと；
３）複数のタグ配列であって、タグ配列の各々が、少なくとも１つのバーコードとアダプターの第２の結合ドメインとを含む、複数のタグ配列とを含み、プローブ結合ドメイン中の核酸配列が、アダプターの第１の結合ドメイン中の核酸配列に相補的であり、およびタグ結合ドメイン中の核酸配列が、アダプターの第２の結合ドメイン中の核酸配列に相補的である、組み合わせを提供する。
【0183】
いくつかの態様において、組み合わせにおけるバーコードは、複数のタグ配列の２つ以上において異なる。
【0184】
いくつかの態様において、組み合わせにおける反応遮断修飾は、遊離可能な、塩基を修飾された基、切断可能なリンカーおよびビオチンからなる群から選択される。
【0185】
いくつかの態様において、組み合わせにおける反応遮断修飾は、切断可能なリンカーである。
【0186】
いくつかの態様において、組み合わせにおける反応遮断修飾は、遊離可能な、塩基を修飾された基である。
【0187】
いくつかの態様では、組み合わせにおいて、１）、２）および３）は互いに独立して存在する。
【0188】
いくつかの態様では、組み合わせにおいて、１）、２）および３）は混合物として存在する。
【0189】
別の局面において、本出願は、組み合わせを含むキットを提供する。
【0190】
いくつかの態様において、キットはトランスポザーゼを含む。
【0191】
いくつかの態様において、キットは、核酸増幅剤、逆転写酵素、固定剤、透過剤、連結剤および溶解剤の少なくとも１つをさらに含む。
【0192】
いくつかの態様において、キットは使用説明書を含む。
【0193】
いくつかの態様において、使用説明書は、以下の方法：
プローブを標的分子に特異的に結合させる条件下で、試料中の少なくとも１つの標的分子を少なくとも１つのプローブと接触させる工程であって、プローブは、標的分子に特異的に結合することが可能な標的分子結合ドメインと、少なくとも１つの反応遮断修飾とを含有する、工程と；
試料の第１の領域に対して第１の処理を実行する工程であって、第１の処理は、第１の領域内のプローブ上の反応遮断修飾を少なくとも部分的に除去して、第１の領域内のプローブをタグ配列中の第１のタグ配列に付着させることが可能である、工程と；
試料中の、第１の領域とは異なる第２の領域に対して第２の処理を実行する工程であって、第２の処理は、第２の領域中のプローブ上の反応遮断修飾を少なくとも部分的に除去して、第２の領域中のプローブをタグ配列中の第２のタグ配列に付着させることが可能であり、第２のタグ配列は第１のタグ配列とは異なる、工程と；
第１のタグ配列に付着したプローブおよび第２のタグ配列に付着したプローブの組成を決定し、ならびにプローブの組成から、試料中の第１の領域の標的分子の存在および／または含有量および第２の領域の標的分子の存在および／または含有量を決定する工程と
を記載する。
プローブを標的分子に特異的に結合させる条件下で、試料中の少なくとも１つの標的分子を少なくとも１つのプローブと接触させる工程であって、プローブは、標的分子に特異的に結合することが可能な標的分子結合ドメインと、少なくとも１つの反応遮断修飾とを含有する、工程と；
試料の第１の領域に対して第１の処理を実行する工程であって、第１の処理は、第１の領域内のプローブ上の反応遮断修飾を少なくとも部分的に除去して、第１の領域内のプローブをタグ配列中の第１のタグ配列に付着させることが可能である、工程と；
試料中の、第１の領域とは異なる第２の領域に対して第２の処理を実行する工程であって、第２の処理は、第２の領域中のプローブ上の反応遮断修飾を少なくとも部分的に除去して、第２の領域中のプローブをタグ配列中の第２のタグ配列に付着させることが可能であり、第２のタグ配列は第１のタグ配列とは異なる、工程と；
第１のタグ配列に付着したプローブおよび第２のタグ配列に付着したプローブの組成を決定し、ならびにプローブの組成から、試料中の第１の領域の標的分子の存在および／または含有量および第２の領域の標的分子の存在および／または含有量を決定する工程と
を記載する。
【0194】
本出願の他の局面および利点は、以下の詳細な説明から当業者によって容易に認知され得る。以下の詳細な説明では、本出願の例示的な態様のみが示され、記載されている。当業者によって認識されるように、本出願の内容は、当業者が、本出願に含まれる本発明の精神および範囲から逸脱することなく、開示された特定の態様に変更を加えることを可能にする。これに対応して、本出願の明細書中の図面および説明は、限定的ではなく単なる例示である。
【0195】
本出願に含まれる本発明の特定の特徴は、添付の特許請求の範囲に示されている通りである。本出願に含まれる本発明の特徴および利点は、以下に詳述する例示的な態様および添付の図面を参照することによってよりよく理解することができる。図面の簡単な説明は以下の通りである。
【図面の簡単な説明】
【0196】
【発明を実施するための形態】
【0197】
本発明の実施は、特定の態様を参照しながら以下に記載されており、本発明の他の利点および効果は、本明細書に開示されている内容から当業者に容易に知られるであろう。
【0198】
用語の定義
本出願において、「特徴付ける」という用語は、配列決定またはゲノミクスおよび／もしくはプロテオミクスなどの他の生物学的分析方法によって得られた、核酸および他の関連分子に関する情報の記述を一般的に指す。例えば、情報は、全ゲノム配列決定からの配列情報、入手可能なクロマチン配列および分布に関する情報、核酸配列と核酸配列の結合因子との結合に関する情報、疾患を引き起こす遺伝子中の変異に関する情報、一塩基多型（ＳＮＰ）、ヌクレオチドメチル化、トランスクリプトーム情報（例えば、遺伝子発現レベルの時間的または空間的変動）などを含み得る。
本出願において、「特徴付ける」という用語は、配列決定またはゲノミクスおよび／もしくはプロテオミクスなどの他の生物学的分析方法によって得られた、核酸および他の関連分子に関する情報の記述を一般的に指す。例えば、情報は、全ゲノム配列決定からの配列情報、入手可能なクロマチン配列および分布に関する情報、核酸配列と核酸配列の結合因子との結合に関する情報、疾患を引き起こす遺伝子中の変異に関する情報、一塩基多型（ＳＮＰ）、ヌクレオチドメチル化、トランスクリプトーム情報（例えば、遺伝子発現レベルの時間的または空間的変動）などを含み得る。
【0199】
本出願において、「配列決定」という用語は、核酸分子配列の情報を得るための技術を一般的に指す。例えば、特定のＤＮＡ断片の塩基配列を解析する場合（例えば、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）およびグアニン（Ｇ）などの配置）；配列決定方法には、サンガージデオキシ鎖終結法、パイロシーケンシングおよび新世代配列決定のためにＩｌｌｕｍｉｎａ、Ｌｉｆｅ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓおよびＲｏｃｈｅによって使用される「合成による並列配列決定」または「ライゲーションによる配列決定」プラットフォーム、ＭＧＩ Ｔｅｃｈ／Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓからの配列決装置が含まれ得る；一般に、配列決定法には、ナノポア配列決定法、例えばＯｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによって開発された方法、ＰａｃＢｉｏの第３世代配列決装置、または電子検出に基づく方法、例えばＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによって発売されたＩｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ技術なども含まれ得る。
【0200】
本出願において、「プロテインＡ」という用語は、異なる種からの抗体の重鎖の保存領域に結合することができる細胞由来のタンパク質、すなわち抗体の認識タンパク質を一般的に指す。例えば、プロテインＡは、ヒトおよび様々な哺乳動物の血清からのＩｇＧ分子のＦｃ断片に結合することができ、哺乳動物には、ブタ、イヌ、ウサギ、ヒト、サル、ラット、マウスおよびウシなどが含まれ得、プロテインＡが結合するＩｇＧのサブクラスには、主にＩｇＧ１、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４が含まれ得；ＩｇＧへの結合に加えて、プロテインＡは血清中のＩｇＭおよびＩｇＡにも結合することができる。例えば、プロテインＡは、ブドウ球菌のプロテインＡ（ＳＰＡ）を含み得る。ＳＰＡは細胞壁抗原の主成分であり、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）株のほぼ９０％以上に存在する。しかしながら、異なる株間でこの成分の含有量には著しい変動が存在する。抗体に結合するプロテインＡの機能性は、標的タンパク質－抗体－プロテインＡ複合体の形成を通じて標的タンパク質の局在化および／または分析を可能にする。
【0201】
本出願において、「固有の分子識別領域」という用語は、「分子バーコード」、「分子マーカー」、「固有の識別子（ＵＩＤ）」、「固有の分子識別領域子（ＵＭＩ）」などとも称され得、同じ試料中のそれぞれの元のヌクレオチド断片上に固有の配列をコードすることを一般的に指す。固有分子識別領域は、典型的には、完全にランダムなヌクレオチド鎖（例えば、ＮＮＮＮＮＮＮ）、部分的に指定されたヌクレオチド鎖（例えば、ＮＮＮＲＮＹＮ）、または指定されたヌクレオチド鎖（例えば、鋳型分子が限定されている場合）として設計することができる。ＵＭＩの設計、組み込みおよび適用は、例えばＩｓｌａｍらの国際公開第２０１２／１４２２１３号 Ｋｉｖｉｏｊａ，Ｔ．らの（Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ）（２０１４）１１：１６３－１６６および（Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ）（２０１２）９：７２－７４に開示されているように、当技術分野で公知の様式で実行され得、これらは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
【0202】
本出願において、「バーコード」という用語は、プローブの供給源を同定することができるヌクレオチド配列またはその誘導されたもしくは修飾された形態を一般的に指す。例えば、バーコードは、異なる領域に由来するプローブを識別することができる。
【0203】
本出願において、「オリゴヌクレオチドアダプター」という用語は、プローブ中のアダプターの第１の結合ドメインに相補的であり得、およびタグ配列中のアダプターの第２の結合ドメインに相補的であり得るヌクレオチド配列を一般的に指す。ヌクレオチド配列は、部分的に二本鎖構造であり得、例えば、タグ配列とハイブリダイズする顕著な配列を有し得る。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドアダプターは、増幅プライマー認識配列も含み得る。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドアダプターは逆転写プライマー配列も含み得る。
【0204】
本出願において、「トランスポザーゼ－核酸複合体」という用語は、トランスポザーゼと、プローブ中のアダプターの第１の結合ドメインを含有する配列とから形成される複合体を一般的に指す。トランスポザーゼは、トランスポゾン末端に結合し、カットアンドペーストまたは複製的転位などの機構を介してゲノムの他の部分へのトランスポゾンの移動を触媒することが可能な酵素を一般的に指す。トランスポゾンは、ゲノム内で自由に移動することができるヌクレオチドのセグメントを一般的に指し、トウモロコシの遺伝機構に関する研究中に、１９４０年代後半にＢａｒｂａｒａ ＭｃＣｌｉｎｔｏｃｋによって最初に提案された概念である。他のグループによるその後の研究により、転位の分子的基礎が解明された。例えば、ＭｃＣｌｉｎｔｏｃｋは、染色体セグメントが位置を変化させ、ある染色体から別の染色体に飛び移り得ることを発見した。これらのトランスポゾンの再配置は、他の遺伝子の発現を変化させることができる。例えば、トウモロコシでは、トランスポゾンは色の変化を引き起こすことができる。細菌などの他の生物では、トランスポゾンは、ヒトの進化の過程で抗生物質耐性を誘発することができる。トランスポザーゼ－核酸複合体は、２つのトランスポザーゼによって形成される二量体を含むことができ、各々はプローブ内のアダプターの第１の結合ドメインに結合し、２つのトランスポザーゼは同じであってもよく、または異なっていてもよい。
【0205】
本出願において、「Ｔｎ５」という用語は、リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）スーパーファミリーのメンバーであるＴｎ５トランスポザーゼを一般的に指す。Ｔｎ５は、シェワネラ・オネイデンシス（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｏｎｅｉｄｅｎｓｉｓ）および大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）において見出すことができる。Ｔｎ５は、天然に存在するＴｎ５トランスポザーゼおよびその様々な活性変異型を含み得る。他のトランスポザーゼの多くと同様に、Ｔｎ５は、トランスポゾンの転位を媒介するための触媒活性部位として働くＤＤＥモチーフを含有する。ＤＤＥモチーフは、反応を触媒する上で重要な役割を果たすマグネシウムおよびマンガンなどの二価金属イオンと配位することができることが報告されている。トランスポザーゼＴｎ５は、上昇した転位活性を有し、ＤＤＥ領域中の変異を介してトランスポゾンの移動を触媒し得る。例えば、３２６位のグルタミン酸はアスパラギン酸に変換され、９７および１８８位の２つのアスパラギン酸はグルタミン酸に変換される（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＹＰ＿００１４４６２８９のアミノ酸配列のアミノ酸ナンバリングに基づく）。
【0206】
本出願では、用語「ハイブリダイズされた」、「ハイブリダイズ可能」または「相補的」は、核酸（例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ）が、適切な温度および溶液イオン強度のインビトロおよび／またはインビボ条件下で別の核酸配列に非共有結合的に特異的に結合する（すなわち、ワトソン・クリック塩基対および／またはＧ／Ｕ塩基対を形成する）ことが可能なヌクレオチド配列を含むことを一般に意味する。ワトソン・クリック塩基対合には、チミジン／チミン（Ｔ）と対になったアデニン／アデノシン（Ａ）、ウラシル／ウリジン（Ｕ）と対になったＡ、シトシン／シチジン（Ｃ）と対になったグアニン／グアノシン（Ｇ）が含まれる。いくつかの態様において、Ｇはまた、２つのＲＮＡ分子間のハイブリダイゼーション（例えば、ｄｓＲＮＡ）のために、またはＤＮＡ分子とＲＮＡ分子間のハイブリダイゼーション（例えば、ＤＮＡ標的核酸の塩基がガイドＲＮＡと対になっている場合など）のためにＵ塩基と対になり得る。ハイブリダイゼーションは、２つの核酸が相補的配列を含むことを必要とするが、塩基間の起こり得るミスマッチを排除することはできない。２つの核酸間のハイブリダイゼーションに適した条件は核酸の長さおよび相補性の程度に依存し、これらは当技術分野において周知である。２つのヌクレオチド配列間の相補性の程度が大きいほど、これらの相補的配列を有する核酸のハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）の値は大きくなる。
【0207】
本出願において、「遊離可能な、塩基を修飾された基」とは、処理後にプローブから遊離され得る、塩基を修飾された基を一般的に指す。例えば、「遊離可能な、塩基を修飾された基」は、感光性基を含み得る。いくつかの例では、感光性基を導入することによって、反応（例えば、相補的ハイブリダイゼーション）を制御することができる。例えば、感光性基は、光切断性（ｐｈｏｔｏｃｌｅａｖａｂｌｅ）基および光異化性基を含み得る。光に曝露されると、感光性基はエネルギーを吸収し、電子移動およびエネルギー準位遷移を受けることができ、結合の切断および修飾されたプローブの遊離をもたらす。例えば、感光性基は、ｏ－ニトロベンジル（ＮＰＰ）およびその誘導体を含み得る。例えば、感光性基は、４，５－ジメトキシ－２－ニトロベンジル（ＤＭＮＢ）および／または６－ニトロ－３，４－メチレンジオキシベンゾキシメチル（ＮＰＯＭ）を含み得る。
【0208】
本出願において、「切断可能なリンカー」は、処理（例えば、光学的処理）の際に切断可能なヌクレオチド配列のセグメントを一般的に指す。いくつかの態様において、ヌクレオチドは、固定されたヌクレオチド配列のセグメントであり得る。例えば、切断可能なリンカーは、光切断性リンカー（ＰＣリンカー）を含み得る。例えば、光切断性リンカーは、ＤＮＡ塩基の間に位置し得る。例えば、プローブの５’－リン酸基は、光切断性リンカーが切断された後に露出され得る。
【0209】
本出願において、「実質的に重複していない」とは、第１の領域と第２の領域との重複部分が０に近づくことを一般的に意味する。例えば、第１の領域は、第２の領域と重複していない。
【0210】
発明の詳細な説明
一局面において、本出願は、プローブを標的分子に特異的に結合させる条件下で、試料中の少なくとも１つの標的分子を少なくとも１つのプローブと接触させる工程であって、前記プローブは、前記標的分子に特異的に結合することが可能な標的分子結合ドメインと、少なくとも１つの反応遮断修飾とを含有する、工程と；
前記試料の第１の領域に対して第１の処理を実行する工程であって、前記第１の処理は、前記第１の領域内の前記プローブ上の前記反応遮断修飾を少なくとも部分的に除去して、前記第１の領域内の前記プローブを第１のタグ配列に付着させることが可能である、工程と；
前記試料中の、前記第１の領域とは異なる第２の領域に対して第２の処理を実行する工程であって、前記第２の処理は、前記第２の領域中の前記プローブ上の前記反応遮断修飾を少なくとも部分的に除去して、前記第２の領域中の前記プローブを第２のタグ配列に付着させることが可能であり、前記第２のタグ配列は前記第１のタグ配列とは異なる、工程と；
前記第１のタグ配列に付着した前記プローブおよび前記第２のタグ配列に付着した前記プローブの組成を決定し、ならびに前記プローブの前記組成から、前記試料中の前記第１の領域の前記標的分子の存在および／または含有量および前記第２の領域の前記標的分子の存在および／または含有量を決定する工程と
を含む、方法を提供する。
一局面において、本出願は、プローブを標的分子に特異的に結合させる条件下で、試料中の少なくとも１つの標的分子を少なくとも１つのプローブと接触させる工程であって、前記プローブは、前記標的分子に特異的に結合することが可能な標的分子結合ドメインと、少なくとも１つの反応遮断修飾とを含有する、工程と；
前記試料の第１の領域に対して第１の処理を実行する工程であって、前記第１の処理は、前記第１の領域内の前記プローブ上の前記反応遮断修飾を少なくとも部分的に除去して、前記第１の領域内の前記プローブを第１のタグ配列に付着させることが可能である、工程と；
前記試料中の、前記第１の領域とは異なる第２の領域に対して第２の処理を実行する工程であって、前記第２の処理は、前記第２の領域中の前記プローブ上の前記反応遮断修飾を少なくとも部分的に除去して、前記第２の領域中の前記プローブを第２のタグ配列に付着させることが可能であり、前記第２のタグ配列は前記第１のタグ配列とは異なる、工程と；
前記第１のタグ配列に付着した前記プローブおよび前記第２のタグ配列に付着した前記プローブの組成を決定し、ならびに前記プローブの前記組成から、前記試料中の前記第１の領域の前記標的分子の存在および／または含有量および前記第２の領域の前記標的分子の存在および／または含有量を決定する工程と
を含む、方法を提供する。
【0211】
別の局面において、本出願は、試料のオミクス情報を分析するための方法であって、
プローブを標的分子に特異的に結合させる条件下で、試料中の少なくとも１つの標的分子を少なくとも１つのプローブと接触させる工程であって、前記プローブは、前記標的分子に特異的に結合することが可能な標的分子結合ドメインと、少なくとも１つの反応遮断修飾とを含有する、工程と；
前記試料の第１の領域に対して第１の処理を実行する工程であって、前記第１の処理は、前記第１の領域内の前記プローブ上の前記反応遮断修飾を少なくとも部分的に除去して、前記第１の領域内の前記プローブを第１のタグ配列に付着させることが可能である、工程と；
前記試料中の、前記第１の領域とは異なる第２の領域に対して第２の処理を実行する工程であって、前記第２の処理は、前記第２の領域中の前記プローブ上の前記反応遮断修飾を少なくとも部分的に除去して、前記第２の領域中の前記プローブを第２のタグ配列に付着させることが可能であり、前記第２のタグ配列は前記第１のタグ配列とは異なる、工程と；
前記第１のタグ配列に付着した前記プローブおよび前記第２のタグ配列に付着した前記プローブの組成を決定し、ならびに前記プローブの前記組成から、前記試料中の前記第１の領域の前記標的分子の存在および／または含有量および前記第２の領域の前記標的分子の存在および／または含有量を決定する工程と
を含む、方法をさらに提供する。
プローブを標的分子に特異的に結合させる条件下で、試料中の少なくとも１つの標的分子を少なくとも１つのプローブと接触させる工程であって、前記プローブは、前記標的分子に特異的に結合することが可能な標的分子結合ドメインと、少なくとも１つの反応遮断修飾とを含有する、工程と；
前記試料の第１の領域に対して第１の処理を実行する工程であって、前記第１の処理は、前記第１の領域内の前記プローブ上の前記反応遮断修飾を少なくとも部分的に除去して、前記第１の領域内の前記プローブを第１のタグ配列に付着させることが可能である、工程と；
前記試料中の、前記第１の領域とは異なる第２の領域に対して第２の処理を実行する工程であって、前記第２の処理は、前記第２の領域中の前記プローブ上の前記反応遮断修飾を少なくとも部分的に除去して、前記第２の領域中の前記プローブを第２のタグ配列に付着させることが可能であり、前記第２のタグ配列は前記第１のタグ配列とは異なる、工程と；
前記第１のタグ配列に付着した前記プローブおよび前記第２のタグ配列に付着した前記プローブの組成を決定し、ならびに前記プローブの前記組成から、前記試料中の前記第１の領域の前記標的分子の存在および／または含有量および前記第２の領域の前記標的分子の存在および／または含有量を決定する工程と
を含む、方法をさらに提供する。
【0212】
試料のオミクス情報を分析するための例示的な方法の概略図が図１に示されている。
【0213】
別の局面において、本出願は、配列決定方法であって、
プローブを標的分子に特異的に結合させる条件下で、試料中の少なくとも１つの標的分子を少なくとも１つのプローブと接触させる工程であって、前記プローブは、前記標的分子に特異的に結合することが可能な標的分子結合ドメインと、少なくとも１つの反応遮断修飾とを含有する、工程と；
前記試料の第１の領域に対して第１の処理を実行する工程であって、前記第１の処理は、前記第１の領域内の前記プローブ上の前記反応遮断修飾を少なくとも部分的に除去して、前記第１の領域内の前記プローブを第１のタグ配列に付着させることが可能である、工程と；
前記試料中の、前記第１の領域とは異なる第２の領域に対して第２の処理を実行する工程であって、前記第２の処理は、前記第２の領域中の前記プローブ上の前記反応遮断修飾を少なくとも部分的に除去して、前記第２の領域中の前記プローブを第２のタグ配列に付着させることが可能であり、前記第２のタグ配列は前記第１のタグ配列とは異なる、工程と；
前記第１のタグ配列に付着した前記プローブおよび前記第２のタグ配列に付着した前記プローブの組成を決定し、ならびに前記プローブの前記組成から、前記試料中の前記第１の領域の前記標的分子の存在および／または含有量および前記第２の領域の前記標的分子の存在および／または含有量を決定する工程と
を含む、配列決定方法を提供する。
プローブを標的分子に特異的に結合させる条件下で、試料中の少なくとも１つの標的分子を少なくとも１つのプローブと接触させる工程であって、前記プローブは、前記標的分子に特異的に結合することが可能な標的分子結合ドメインと、少なくとも１つの反応遮断修飾とを含有する、工程と；
前記試料の第１の領域に対して第１の処理を実行する工程であって、前記第１の処理は、前記第１の領域内の前記プローブ上の前記反応遮断修飾を少なくとも部分的に除去して、前記第１の領域内の前記プローブを第１のタグ配列に付着させることが可能である、工程と；
前記試料中の、前記第１の領域とは異なる第２の領域に対して第２の処理を実行する工程であって、前記第２の処理は、前記第２の領域中の前記プローブ上の前記反応遮断修飾を少なくとも部分的に除去して、前記第２の領域中の前記プローブを第２のタグ配列に付着させることが可能であり、前記第２のタグ配列は前記第１のタグ配列とは異なる、工程と；
前記第１のタグ配列に付着した前記プローブおよび前記第２のタグ配列に付着した前記プローブの組成を決定し、ならびに前記プローブの前記組成から、前記試料中の前記第１の領域の前記標的分子の存在および／または含有量および前記第２の領域の前記標的分子の存在および／または含有量を決定する工程と
を含む、配列決定方法を提供する。
【0214】
試料
本出願において、試料は、ほとんど全ての生物に由来し得、植物、真菌および動物などの多細胞生物を含み得る。例えば、試料は、動物（例えば、哺乳動物）に由来し得る。例えば、試料は、ヒト起源に由来し得る。例えば、試料は、生検腫瘍またはその一部であり得る。例えば、試料は、臨床的に意義のある組織試料であり得る。例えば、腫瘍は固形腫瘍を含み得る。例えば、腫瘍は血液腫瘍を含み得る。
本出願において、試料は、ほとんど全ての生物に由来し得、植物、真菌および動物などの多細胞生物を含み得る。例えば、試料は、動物（例えば、哺乳動物）に由来し得る。例えば、試料は、ヒト起源に由来し得る。例えば、試料は、生検腫瘍またはその一部であり得る。例えば、試料は、臨床的に意義のある組織試料であり得る。例えば、腫瘍は固形腫瘍を含み得る。例えば、腫瘍は血液腫瘍を含み得る。
【0215】
本出願では、試料は、ほとんど全ての生物の細胞（初代細胞および培養された細胞株の両方を含む）、細胞溶解物または抽出物（限定されないが、ＲＮＡ抽出物、精製ｍＲＮＡを含む）、組織および組織抽出物（限定されないが、ＲＮＡ抽出物、精製ｍＲＮＡを含む）、体液（限定されないが、血液、尿、血清、リンパ、胆汁、脳脊髄液、間質液、水性またはガラス性液、初乳、痰、羊水、唾液、肛門および膣分泌物、汗および精液、滲出液（ｅｘｕｄａｔｅ）、滲出液（ｅｘｕｄａｔｅｓ）（例えば、膿瘍または感染もしくは炎症の任意の他の部位からの体液）または関節（例えば、正常な関節または関節リウマチ、変形性関節症、痛風もしくは化膿性関節炎などの疾患に罹患した関節）からの体液を含む）を含むがこれらに限定されない任意の数の物質を含有し得る。試験試料は、細胞外液、細胞培養物からの細胞外上清、細菌中の封入体、細胞区画、ペリプラズムおよびミトコンドリア区画を含む。
【0216】
本出願では、試料は少なくとも１つの細胞を含み得る。例えば、試料は、１つ以上、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上または６つ以上の細胞を含み得る。本出願において、細胞は、生物から単離された細胞、インビトロで培養された細胞、初代細胞および外植片からの分離した細胞からなる群から選択され得る。例えば、「生物から単離された細胞」は、多細胞生物に由来する細胞を一般的に指す。例えば、細胞はヒトから単離され得る。例えば、「インビトロで培養された細胞」は、エクスビボ環境において適切な培養条件下で培養された細胞を一般的に指す。例えば、インビトロで培養された細胞は、培地中で培養され得る。例えば、「初代細胞」は、生物から採取された直後に培養された細胞を一般的に指す。例えば、「外植片からの分離した細胞」は、植物組織を加水分解することによって得られる分離した細胞を一般的に指す。
【0217】
本出願において、試料は、組織切片を含み得る。本出願において、組織切片は、１～１０００μｍの範囲の厚さを有する。例えば、組織切片の厚さは、少なくとも１μｍ、少なくとも５μｍ、少なくとも２０μｍ、少なくとも５０μｍ、少なくとも１００μｍ、少なくとも１５０μｍ、少なくとも２００μｍ、少なくとも２５０μｍ、少なくとも３００μｍ、少なくとも３５０μｍ、少なくとも４００μｍ、少なくとも４５０μｍ、少なくとも５００μｍ、少なくとも５５０μｍ、少なくとも６００μｍ、少なくとも６５０μｍ、少なくとも７００μｍ、少なくとも７５０μｍ、少なくとも８００μｍ、少なくとも８５０μｍ、少なくとも９００μｍ、少なくとも９５０μｍである。
【0218】
本出願において、試料は、凍結切片、パラフィン切片、カルボワックス切片、極薄切片およびプラスチック切片からなる群から選択され得る。例えば、組織切片は、固定された組織切片であり得る。例えば、組織切片は、ホルマリン固定された組織切片であり得る。例えば、組織切片は、ホルマリン固定されたパラフィン切片であり得る。例えば、組織切片は凍結切片であり得る。例えば、組織切片中の組織は、心筋組織、肝組織、脾臓組織、肺組織、腎組織および脳組織からなる群に由来し得る。
【0219】
本出願において、「凍結切片」とは、低温で、組織をある硬度に急速に冷却した後に切片化する方法を一般的に指す。本出願において、「パラフィン切片」とは、切片化のために、組織を固定し、パラフィン中に包埋することを一般的に指す。本出願において、「カルボワックス切片」は、組織を固定し、洗浄し、次いで、切片化のために組織をカルボワックス中に直接包埋させることを一般的に指す。本出願において、「極薄切片」とは、典型的には樹脂で包埋されている、透過型電子顕微鏡用の極薄標本切片を一般的に指す。本出願において、「プラスチック切片」は、組織を固定し、次いで切片化のためにプラスチックで包埋することを一般的に指す。
【0220】
プローブおよび標的分子
本出願において、プローブは標的分子結合ドメインを含み得る。本出願において、標的分子は、タンパク質、核酸分子、代謝産物および／または脂質からなる群から選択される１つまたは複数を含み得る。例えば、核酸分子は、ＤＮＡ分子および／またはＲＮＡ分子を含み得る。例えば、ＤＮＡ分子はｃＤＮＡであり得る。例えば、ＲＮＡ分子は、ｃＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡおよび／またはｅＲＮＡを含み得る。例えば、ＲＮＡはｍＲＮＡであり得る。例えば、脂質は、脂肪、コレステロール（ｃｐｏｒｅｓｔｅｒｏｌ）、コレステロール（ｃｐｏｒｅｓｔｅｒｏｌ）エステル、リン脂質および／または糖脂質を含み得る。
本出願において、プローブは標的分子結合ドメインを含み得る。本出願において、標的分子は、タンパク質、核酸分子、代謝産物および／または脂質からなる群から選択される１つまたは複数を含み得る。例えば、核酸分子は、ＤＮＡ分子および／またはＲＮＡ分子を含み得る。例えば、ＤＮＡ分子はｃＤＮＡであり得る。例えば、ＲＮＡ分子は、ｃＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡおよび／またはｅＲＮＡを含み得る。例えば、ＲＮＡはｍＲＮＡであり得る。例えば、脂質は、脂肪、コレステロール（ｃｐｏｒｅｓｔｅｒｏｌ）、コレステロール（ｃｐｏｒｅｓｔｅｒｏｌ）エステル、リン脂質および／または糖脂質を含み得る。
【0221】
本出願において、標的分子がＲＮＡを含む場合に、プローブ中の標的分子結合ドメインは、ＲＮＡに相補的な核酸配列を含む。本出願において、プローブ中の標的分子結合ドメインはポリＡを含み得る。例えば、ポリＡの長さは、少なくとも、１ヌクレオチド、２ヌクレオチド、３ヌクレオチド、４ヌクレオチド、５ヌクレオチド、６ヌクレオチド、７ヌクレオチド、８ヌクレオチド、９ヌクレオチド、１０ヌクレオチド、１１ヌクレオチド、１２ヌクレオチド、１３ヌクレオチド、１４ヌクレオチド、１５ヌクレオチド、１６ヌクレオチド、１７ヌクレオチド、１８ヌクレオチド、１９ヌクレオチド、２０ヌクレオチドまたはそれより多くであり得る。本出願において、プローブ中の標的分子結合ドメインは、ポリＴを含む。例えば、ポリＴの長さは、少なくとも、１ヌクレオチド、２ヌクレオチド、３ヌクレオチド、４ヌクレオチド、５ヌクレオチド、６ヌクレオチド、７ヌクレオチド、８ヌクレオチド、９ヌクレオチド、１０ヌクレオチド、１１ヌクレオチド、１２ヌクレオチド、１３ヌクレオチド、１４ヌクレオチド、１５ヌクレオチド、１６ヌクレオチド、１７ヌクレオチド、１８ヌクレオチド、１９ヌクレオチド、２０ヌクレオチドまたはそれより多くであり得る。
【0222】
本出願において、標的分子はｍＲＮＡを含み得、プローブの標的分子結合ドメインは一本鎖核酸を含み得る。例えば、標的分子は、標的分子結合ドメインとハイブリダイズする。ハイブリダイゼーションに関して、２つの核酸間のハイブリダイゼーションに適した条件は、核酸の長さおよび相補性の程度に依存し、これらは当技術分野で周知である。２つのヌクレオチド配列間の相補性の程度が大きいほど、これらの相補的配列を有する核酸のハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）の値は大きくなる。例えば、一本鎖核酸は、少なくとも１０個のヌクレオチドを含み得る。例えば、一本鎖核酸は、１０ヌクレオチド以上、１２ヌクレオチド以上、１４ヌクレオチド以上、１６ヌクレオチド以上、１８ヌクレオチド以上、２０ヌクレオチド以上、２２ヌクレオチド以上、２４ヌクレオチド以上、２６ヌクレオチド以上、２８ヌクレオチド以上、３０ヌクレオチド以上、３２ヌクレオチド以上、３４ヌクレオチド以上、３６ヌクレオチド以上、３８ヌクレオチド以上、４０ヌクレオチド以上、４２ヌクレオチド以上、４４ヌクレオチド以上、４６ヌクレオチド以上、４８ヌクレオチド以上、５０ヌクレオチド以上、５２ヌクレオチド以上、５４ヌクレオチド以上、５６ヌクレオチド以上、５８ヌクレオチド以上または６０ヌクレオチド以上を含み得る。例えば、ハイブリダイゼーションは、塩基間のミスマッチの可能性を排除しない。例えば、プローブ中の標的分子結合ドメインは、ｍＲＮＡ配列に少なくとも５０％相補的である。例えば、相補性は、５０％以上、５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上、９９．５％以上、９９．９％以上であり得る。残りの非相補的ヌクレオチドは、相補的ヌクレオチドと共にクラスター化されるかまたは散在していてもよく、互いにまたは相補的ヌクレオチドに隣接している必要はない。例えば、ポリヌクレオチドは、中間のまたは隣接するセグメントがハイブリダイゼーション事象に関与しないように（例えば、ヘアピン構造の形成、「バンプ（ｂｕｍｐｓ）」など）、１つまたは複数のセグメント上でハイブリダイズし得る。
【0223】
本出願において、標的分子はタンパク質を含み得、プローブの標的分子結合ドメインは、標的分子を特異的に結合することが可能な抗体または抗原結合断片を含み得る。例えば、抗原結合断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、Ｆｖ断片、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ジｓｃＦｖ、ＶＨＨおよび／またはｄＡｂを含み得る。
【0224】
本出願では、試料中の２つ以上の標的分子を２つ以上のプローブと接触させることができる。例えば、２つ以上の標的分子は、同じであってもよく、または異なっていてもよい。
【0225】
本出願では、標的分子は、試料に由来するＤＮＡを含み得る。例えば、ＤＮＡは、ゲノムＤＮＡ、オープンクロマチンＤＮＡ、タンパク質によって結合されたＤＮＡ領域、ならびに／またはタンパク質、脂質および／もしくは小分子化合物と連結された外因性核酸を含み得、タンパク質、脂質および／または小分子化合物は細胞内の標的分子を結合することが可能である。
【0226】
本出願において、本方法は、試料中の少なくとも１つの標的分子を少なくとも１つのプローブと接触させる前にＤＮＡを断片化することを含み得る。断片化は、トランスポザーゼ－核酸複合体を使用してプローブを含有する配列をＤＮＡ中に組み込むこと、およびトランスポザーゼを遊離させることを含み得る。例えば、プローブ配列は、トランスポゾン末端配列を含む。例えば、トランスポゾン末端配列は、Ｔｎ５または修飾されたＴｎ５トランスポゾン末端配列である。例えば、トランスポゾン末端配列は、Ｍｕトランスポゾン末端配列である。例えば、Ｔｎ５もしくは修飾されたＴｎ５トランスポゾン末端配列またはＭｕトランスポゾン末端配列は、１５～２５ヌクレオチド、例えば１６ヌクレオチド、１７ヌクレオチド、１８ヌクレオチド、１９ヌクレオチド、２０ヌクレオチド、２１ヌクレオチド、２２ヌクレオチド、２３ヌクレオチド、２４ヌクレオチドを含み得る。
【0227】
例えば、トランスポゾン末端配列として、例えば、Ｔｎ５ＭおよびＴｎ５Ｂを使用することができる。
Ｔｎ５Ｂ：5'-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG-3'；（配列番号１１）
Ｔｎ５Ｍ：5'-CTGTCTCTTATACACATCT-3'。（配列番号１２）
Ｔｎ５Ｂ：5'-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG-3'；（配列番号１１）
Ｔｎ５Ｍ：5'-CTGTCTCTTATACACATCT-3'。（配列番号１２）
【0228】
本出願では、様々な方法を使用してＤＮＡを断片化することができる。例えば、制限エンドヌクレアーゼを利用する制限消化は、両鎖上の平滑末端切断または不均一な切断のいずれかによってＤＮＡ配列に切断部位を作り出し、粘着末端を生成する。例えば、剪断応力によって媒介されるＤＮＡ鎖破壊は、超音波処理、音響剪断、針剪断、ピペッティングまたは微粒化などのプロセスを含み得る。超音波処理は流体力学的剪断の一種であり、ＤＮＡ配列を短期間の剪断力に曝露し、約７００ｂｐの断片サイズをもたらす。音響剪断は、カップ型トランスデューサ内のＤＮＡ試料に高周波音響エネルギーを加える。針剪断は、ＤＮＡを小径針に通すことによって剪断力を発生させ、ＤＮＡをより小さなセグメントに物理的に引き裂く。微粒化力は、ネブライザーユニットの小さな開口部にＤＮＡを通すことによって発生させることができ、ネブライザーユニットの中で、生じたＤＮＡ断片はユニットを出る微細なミスト液滴から収集される。典型的には、これらの断片は、約２００～約１０００００塩基の任意の長さであり得る。例えば、断片は、約２００ｂｐ～約５００ｂｐ、約５００ｂｐ～約１ｋｂ、約１ｋｂ～約１０ｋｂ、または約５ｋｂ～約５０ｋｂ、または約１０ｋｂ～約３０ｋｂ、例えば約１５ｋｂ～約２５ｋｂである。例えば、より大きな遺伝子成分の断片化は、例えば、市販の剪断に基づく断片化システム（例えば、Ｃｏｖａｒｉｓ断片化システム）、サイズを標的とした断片化システム（例えば、Ｂｌｕｅ Ｐｉｐｐｉｎ（Ｓａｇｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ））、酵素的断片化法（例えば、ＤＮＡエンドヌクレアーゼ、ＤＮＡエキソヌクレアーゼ）などを含む任意の容易に入手可能な方法によって行うことができる。例えば、断片化は、超音波処理の使用による破壊を伴う。
【0229】
例えば、トランスポザーゼには、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）Ｔｎ５（Ｃｏｌｅｇｉｏ ｅｔ，ａｌ．，Ｊ．ＢａｃｔｅｒｉｏＬ，１８３：２３８４－８，２００１；Ｋｉｒｂｙ Ｃ ｅｔ，ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，４３：１７３－８６，２００２）、タイロシン（Ｔｙｌ）（Ｄｅｖｉｎｅ ａｎｄ Ｂｏｅｋｅ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２２：３７６５－７２，１９９４および国際公開第９５／２３８７５号）、トランスポゾンＴｎ７（Ｃｒａｉｇ，Ｎ Ｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２７１：１５１２，１９９６；ｔｈｅ ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ Ｃｒａｉｇ，Ｎ Ｌ ｉｎ Ｃｕｒｒ Ｔｏｐ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２０４：２７－４８，１９９６）、Ｔｎ／ＯおよびＩＳ １０（ＫｌｅｃｋｎｅｒＮ ｅｔ，ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｔｏｐ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２０４：４９－８２，１９９６）、マリナートランスポザーゼ（Ｌａｍｐｅ Ｄ Ｊ ｅｔ，ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．，１５：５４７０－９，１９９６）、Ｔｅｌ（Ｐｌａｓｔｅｒｋ Ｒ Ｈ，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２０４：１２５－４３，１９９６）、Ｐ因子（Ｇｌｏｏｒ，Ｇ Ｂ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２６０：９７－１１４，２００４）、Ｔｎ３（Ｉｃｈｉｋａｗａ ａｎｄ Ｏｈｔｓｕｂｏ，Ｊ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６５：１８８２９－３２，１９９０）、細菌挿入配列（Ｏｈｔｓｕｂｏ ａｎｄ Ｓｅｋｉｎｅ，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２０４：１－２６，１９９６）、レトロウイルス（Ｂｒｏｗｎ ｅｔ，ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，８６：２５２５－９，１９８９）および酵母レトロトランスポゾン（Ｂｏｅｋｅ ａｎｄ Ｃｏｒｃｅｓ，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，４３：４０３－３４，１９８９）、およびＩＳ５、Ｔｎ１０、Ｔｎ９０３、ＩＳ９１１およびトランスポザーゼファミリー酵素の操作された形態（Ｚｈａｎｇ ｅｔ，ａｌ．，（２００９），ＰＬｏＳ Ｇｅｎｅｔ．，５：ｅｌ０００６８９．Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃａｌｌｙ ｏｎ Ｏｃｔｏｂｅｒ １６，２００９；Ｗｉｌｓｏｎ Ｃ．ｅｔ，ａｌ．（２００７），Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，７１：３３２－５）が含まれる。
【0230】
例えば、トランスポザーゼはＭｕトランスポザーゼである。例えば、トランスポザーゼは、Ｔｎ５トランスポザーゼまたはＴｎ１０トランスポザーゼである。Ｔｎ５トランスポザーゼは、完全長Ｔｎ５トランスポザーゼ、Ｔｎ５トランスポザーゼのいくつかの機能ドメイン、Ｔｎ５トランスポザーゼの変異体から選択される。Ｔｎ１０トランスポザーゼは、完全長Ｔｎ１０トランスポザーゼ、Ｔｎ１０トランスポザーゼのいくつかの機能ドメイン、Ｔｎ１０トランスポザーゼの変異体から選択される。例えば、Ｔｎ５トランスポザーゼの変異体は、Ｒ３０Ｑ、Ｋ４０Ｑ、Ｙ４１Ｈ、Ｔ４７Ｐ、Ｅ５４Ｋ／Ｖ、Ｍ５６Ａ、Ｒ６２Ｑ、Ｄ９７Ａ、Ｅ１１０Ｋ、Ｄ１８８Ａ、Ｙ３１９Ａ、Ｒ３２２Ａ／Ｋ／Ｑ、Ｅ３２６Ａ、Ｋ３３０Ａ／Ｒ、Ｋ３３３Ａ、Ｒ３４２Ａ、Ｅ３４４Ａ、Ｅ３４５Ｋ、Ｎ３４８Ａ、Ｌ３７２Ｐ、Ｓ４３８Ａ、Ｋ４３９Ａ、Ｓ４４５Ａ、Ｇ４６２Ｄ、Ａ４６６Ｄから選択され得る。
【0231】
例えば、２つのトランスポザーゼ分子は、挿入部位が１つまたは２つのＤＮＡで印を付けられるように、同一のまたは異なる二本鎖ＤＮＡトランスポゾンを結合することができる。例えば、２つのトランスポザーゼ分子（例えば、Ｔｎ５および高活性Ｔｎまたは点変異を含有する別のタイプのトランスポザーゼ）をプローブ配列および別の標準的なトランスポゾンＤＮＡ配列と集合させて、ハイブリッド転位複合体を形成することができる。あるいは、上記の二本鎖構造２のみを使用して、単一のＴｎ５転位複合体を形成する。標準的なトランスポゾンＤＮＡ配列は、増幅プライマー配列および／または配列決定プライマー配列を含み得る。
【0232】
例えば、ＤＮＡは、タンパク質によって結合されたＤＮＡ領域を含み得、トランスポザーゼ－核酸複合体は、タンパク質を直接的にまたは間接的に認識する部分をさらに含む。例えば、タンパク質を直接的または間接的に認識する部分には、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）プロテインＡ（プロテインＡ）、連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）プロテインＧ（プロテインＧ）、連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）プロテインＬ（プロテインＬ）または抗体を結合する機能を有する他のタンパク質類似体が含まれ得る。例えば、タンパク質を直接的または間接的に認識する部分には、タンパク質を特異的に結合する抗体も含まれ得る。例えば、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）プロテインＡ（プロテインＡ）、連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）プロテインＧ（プロテインＧ）、連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）プロテインＬ（プロテインＬ）または抗体を結合する機能を有する他のタンパク質類似体は、それぞれ、タンパク質を特異的に結合する抗体を結合することが可能である。
【0233】
例えば、トランスポザーゼは、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）プロテインＡ（プロテインＡ）、連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）プロテインＧ（プロテインＧ）、連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）プロテインＬ（プロテインＬ）または抗体を結合する機能を有する他のタンパク質類似体と融合タンパク質を形成する。
【0234】
例えば、融合タンパク質は、タンパク質を特異的に結合する抗体と複合体を形成し、次いでタンパク質を標的とする。
【0235】
例えば、タンパク質を特異的に結合する抗体がタンパク質に結合した後、融合タンパク質は抗体に結合してタンパク質を標的とする。例えば、本明細書に記載の転位反応およびプロセスは、バッチで行うことができる。
【0236】
本出願において、プローブは、１００ｎＭ、７０ｎＭ、６０ｎＭ、５０ｎＭ、４０ｎＭ、３０ｎＭ、２０ｎＭ、１０ｎＭ、９ｎＭ、８ｎＭ、７ｎＭ、６ｎＭ、５ｎＭ、４ｎＭ、３ｎＭ、２ｎＭ、１ｎＭ、０．９ｎＭ、０．８ｎＭ、０．７ｎＭ、０．６ｎＭ、０．５ｎＭ、０．４ｎＭ、０．３ｎＭ、０．２ｎＭ、０．１ｎＭ、０．０９ｎＭ、０．０８ｎＭ、０．０７ｎＭ、０．０６ｎＭ、０．０５ｎＭ、０．０４ｎＭ、０．０３ｎＭ、０．０２ｎＭ、０．０１ｎＭまたはそれ未満の濃度、およびこれらの間の任意の濃度で提供され得る。
【0237】
反応遮断修飾
本出願において、反応遮断修飾は、遊離可能な、塩基を修飾された基、切断可能なリンカーおよびビオチンからなる群の１つまたは複数から選択され得る。例えば、反応遮断修飾は、プローブの５’末端を修飾することができる。例えば、反応遮断修飾は、プローブの３’末端を修飾することができる。
本出願において、反応遮断修飾は、遊離可能な、塩基を修飾された基、切断可能なリンカーおよびビオチンからなる群の１つまたは複数から選択され得る。例えば、反応遮断修飾は、プローブの５’末端を修飾することができる。例えば、反応遮断修飾は、プローブの３’末端を修飾することができる。
【0238】
例えば、反応遮断修飾は、遊離可能な、塩基を修飾された基であり得る。例えば、塩基を修飾された基は、感光性基を含み得る。例えば、感光性基は、光切断性基および光異化性基を含み得る。光に曝露されると、感光性基はエネルギーを吸収し、電子移動およびエネルギー準位遷移を受けることができ、結合の切断および修飾されたプローブの遊離をもたらす。例えば、感光性基は、ｏ－ニトロベンジル（ＮＰＰ）およびその誘導体を含み得る。例えば、感光性基は、４，５－ジメトキシ－２－ニトロベンジル（ＤＭＮＢ）および／または６－ニトロ－３，４－メチレンジオキシベンゾキシメチル（ＮＰＯＭ）を含み得る。感光性基を導入することにより、反応（例えば、相補的ハイブリダイゼーション）を制御することができる。本出願においては、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０またはそれより多くの反応遮断修飾がプローブ上に含まれ得る。
【0239】
例えば、切断可能なリンカーは、固定されたヌクレオチド配列のセグメントであり得る。例えば、切断可能なリンカーは、光切断性リンカー（ＰＣリンカー）を含み得る。例えば、光切断性リンカーは、ＤＮＡ塩基の間に位置し得る。例えば、プローブの５’－リン酸基は、光切断性リンカーが切断された後に露出され得る。本出願において、試料は、リンカーを切断して試料を光励起することが可能な波長の励起光下に置かれ、それによってリンカーを切断し、５’－リン酸基を露出させる。
【0240】
処理
本出願では、試料の２つ以上の領域を処理することができる。例えば、２つ以上の領域は異なることができる。例えば、試料の少なくとも第１の領域を処理することができる。例えば、試料の少なくとも第２の領域を処理することができる。例えば、試料の少なくとも、第３の領域、第４の領域、第５の領域、第６の領域、第７の領域、第８の領域、第９の領域、第１０の領域、第１１の領域、第１２の領域、第１３の領域、第１４の領域、第１５の領域、第１６の領域、第１７の領域、第１８の領域、第１９の領域、第２０の領域を処理することができる。例えば、試料の２つ以上（例えば、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上、８つ以上、９つ以上、１０以上、１１以上、１２以上、１３以上、１４以上、１５以上、１６以上、１７以上、１８以上、１９以上、２０以上）の領域を同時に処理することができる。
本出願では、試料の２つ以上の領域を処理することができる。例えば、２つ以上の領域は異なることができる。例えば、試料の少なくとも第１の領域を処理することができる。例えば、試料の少なくとも第２の領域を処理することができる。例えば、試料の少なくとも、第３の領域、第４の領域、第５の領域、第６の領域、第７の領域、第８の領域、第９の領域、第１０の領域、第１１の領域、第１２の領域、第１３の領域、第１４の領域、第１５の領域、第１６の領域、第１７の領域、第１８の領域、第１９の領域、第２０の領域を処理することができる。例えば、試料の２つ以上（例えば、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上、８つ以上、９つ以上、１０以上、１１以上、１２以上、１３以上、１４以上、１５以上、１６以上、１７以上、１８以上、１９以上、２０以上）の領域を同時に処理することができる。
【0241】
本出願では、プローブが標的分子に特異的に結合した後、試料の第１の領域に対して第１の処理を行うことができる。例えば、第１の処理は、電子ビーム処理、音波および照明からなる群から選択され得る。例えば、第１の処理は、照明であり得る。例えば、光は、アークランプ、レーザ、ＵＶ光源および発光ダイオードからなる群から選択される光源によって提供され得る。例えば、光は、ＵＶ光源によって提供され得る。
【0242】
本出願では、プローブが標的分子に特異的に結合した後、試料の第２の領域に対して第２の処理を行うことができる。例えば、第２の処理は、電子ビーム処理、音波および照明からなる群から選択され得る。例えば、第２の処理は、照明であり得る。例えば、光は、アークランプ、レーザ、ＵＶ光源および発光ダイオードからなる群から選択される光源によって提供され得る。例えば、光は、ＵＶ光源によって提供され得る。
【0243】
オリゴヌクレオチドアダプター
本出願において、オリゴヌクレオチドアダプターは、プローブ結合ドメインおよびタグ結合ドメインを含み得る。例えば、オリゴヌクレオチドアダプター中のプローブ結合ドメインは、一本鎖核酸を含み得る。例えば、オリゴヌクレオチドアダプター中のプローブ結合ドメインの長さは、１ヌクレオチド以上、２ヌクレオチド以上、３ヌクレオチド以上、５ヌクレオチド以上、８ヌクレオチド以上、１０ヌクレオチド以上、１２ヌクレオチド以上、１５ヌクレオチド以上、２０ヌクレオチド以上、２２ヌクレオチド以上、２５ヌクレオチド以上または３０ヌクレオチド以上であり得る。
本出願において、オリゴヌクレオチドアダプターは、プローブ結合ドメインおよびタグ結合ドメインを含み得る。例えば、オリゴヌクレオチドアダプター中のプローブ結合ドメインは、一本鎖核酸を含み得る。例えば、オリゴヌクレオチドアダプター中のプローブ結合ドメインの長さは、１ヌクレオチド以上、２ヌクレオチド以上、３ヌクレオチド以上、５ヌクレオチド以上、８ヌクレオチド以上、１０ヌクレオチド以上、１２ヌクレオチド以上、１５ヌクレオチド以上、２０ヌクレオチド以上、２２ヌクレオチド以上、２５ヌクレオチド以上または３０ヌクレオチド以上であり得る。
【0244】
本出願において、オリゴヌクレオチドアダプターのプローブ結合ドメインは、プローブ中のアダプターの第１の結合ドメインと相補的であり得る。プローブ結合ドメインに関して、２つの核酸間のハイブリダイゼーションに適した条件は核酸の長さおよび相補性の程度に依存し、これらは当技術分野で周知である。２つのヌクレオチド配列間の相補性の程度が大きいほど、これらの相補的配列を有する核酸のハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）の値は大きくなる。例えば、プローブ結合ドメインの長さは、プローブ結合ドメインが相補的であるアダプターの第１の結合ドメインと二本鎖構造を形成するのに十分である。
【0245】
例えば、オリゴヌクレオチドアダプター中のタグ結合ドメインの長さは、１ヌクレオチド以上、２ヌクレオチド以上、３ヌクレオチド以上、５ヌクレオチド以上、８ヌクレオチド以上、１０ヌクレオチド以上、１２ヌクレオチド以上、１５ヌクレオチド以上、２０ヌクレオチド以上、２２ヌクレオチド以上、２５ヌクレオチド以上または３０ヌクレオチド以上であり得る。
【0246】
本出願において、オリゴヌクレオチドアダプターのタグ結合ドメインは、タグ配列中のアダプターの第２の結合ドメインと相補的であり得る。タグ結合ドメインに関して、２つの核酸間のハイブリダイゼーションに適した条件は核酸の長さおよび相補性の程度に依存し、これらは当技術分野で周知である。２つのヌクレオチド配列間の相補性の程度が大きいほど、これらの相補的配列を有する核酸のハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）の値は大きくなる。例えば、タグ結合ドメインの長さは、タグ結合ドメインが相補的であるアダプターの第２の結合ドメインと二本鎖構造を形成するのに十分である。
【0247】
例えば、オリゴヌクレオチド配列中のタグ結合ドメインの長さは、プローブ結合ドメインの核酸配列の長さと同じであってもよく、または異なっていてもよい。
【0248】
例えば、二本鎖構造は、塩基間のミスマッチの可能性を排除しない。例えば、タグ結合ドメインまたはプローブ結合ドメインは、その相補的配列に対して１００％相補的である必要はない。例えば、相補性は、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上、９９．５％以上であり得る。残りの非相補的ヌクレオチドは、相補的ヌクレオチドと共にクラスター化されるかまたは散在していてもよく、互いにまたは相補的ヌクレオチドに隣接している必要はない。例えば、ポリヌクレオチドは、中間のまたは隣接するセグメントがハイブリダイゼーション事象に関与しないように（例えば、ヘアピン構造の形成、「バンプ（ｂｕｍｐｓ）」など）、１つまたは複数のセグメント上でハイブリダイズし得る。
【0249】
タグ配列
本出願において、タグ配列は、少なくとも１つのバーコードとアダプターの第２の結合ドメインとを含み得る。例えば、バーコードは、異なる領域の空間的位置情報を特徴付け得る。例えば、タグ配列中のアダプターの第２の結合ドメインは、一本鎖核酸を含み得る。アダプターの第２の結合ドメインの長さは、１ヌクレオチド以上、２ヌクレオチド以上、３ヌクレオチド以上、５ヌクレオチド以上、８ヌクレオチド以上、１０ヌクレオチド以上、１２ヌクレオチド以上、１５ヌクレオチド以上、２０ヌクレオチド以上、２２ヌクレオチド以上、２５ヌクレオチド以上または３０ヌクレオチド以上であり得る。
本出願において、タグ配列は、少なくとも１つのバーコードとアダプターの第２の結合ドメインとを含み得る。例えば、バーコードは、異なる領域の空間的位置情報を特徴付け得る。例えば、タグ配列中のアダプターの第２の結合ドメインは、一本鎖核酸を含み得る。アダプターの第２の結合ドメインの長さは、１ヌクレオチド以上、２ヌクレオチド以上、３ヌクレオチド以上、５ヌクレオチド以上、８ヌクレオチド以上、１０ヌクレオチド以上、１２ヌクレオチド以上、１５ヌクレオチド以上、２０ヌクレオチド以上、２２ヌクレオチド以上、２５ヌクレオチド以上または３０ヌクレオチド以上であり得る。
【0250】
本出願では、第１の処理時に、第１の領域中のプローブは、第１のタグ配列およびオリゴヌクレオチドアダプターと複合体を形成し得、オリゴヌクレオチドアダプターはプローブ結合ドメインおよびタグ結合ドメインを含む。例えば、第１の処理時に、プローブ結合ドメイン中の核酸配列は、第１の領域中のプローブ中のアダプターの第１の結合ドメイン中の核酸配列に相補的であり、およびタグ結合ドメイン中の核酸配列は、第１のタグ配列中のアダプターの第２の結合ドメイン中の核酸配列に相補的であり、その結果、部分的に二本鎖構造を形成する。
【0251】
例えば、二本鎖構造は、塩基間のミスマッチの可能性を排除しない。例えば、タグ結合ドメインまたはプローブ結合ドメインは、その相補的配列に対して１００％相補的である必要はない。例えば、相補性は、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上、９９．５％以上であり得る。残りの非相補的ヌクレオチドは、相補的ヌクレオチドと共にクラスター化されるかまたは散在していてもよく、互いにまたは相補的ヌクレオチドに隣接している必要はない。例えば、ポリヌクレオチドは、中間のまたは隣接するセグメントがハイブリダイゼーション事象に関与しないように（例えば、ヘアピン構造の形成、「バンプ（ｂｕｍｐｓ）」など）、１つまたは複数のセグメント上でハイブリダイズし得る。
【0252】
本出願において、第１のタグ配列中のアダプターの第２の結合ドメインは、リガーゼによって、第１の領域中のプローブ中のアダプターの第１の結合ドメインに連結され得、その結果、第１のタグ配列に付着したプローブを産生する。
【0253】
例えば、リガーゼは、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ））ＤＮＡリガーゼ、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ、Ｔ７ ＤＮＡリガーゼ、哺乳動物リガーゼ（例えば、ＤＮＡリガーゼＩ、ＤＮＡリガーゼＩＩＩ、ＤＮＡリガーゼＩＶ）、熱安定性リガーゼなどのＤＮＡリガーゼを含み得る。Ｔ４ ＤＮＡリガーゼは、ＤＮＡ、オリゴヌクレオチド、ＲＮＡおよびＲＮＡ－ＤＮＡハイブリッドを含有するセグメントと連結され得る。ライゲーションは、ＤＮＡリガーゼを伴わなくてもよいが、トポイソメラーゼなどの代替物を使用する。迅速なライゲーションは、ＰＥＧの包含と共に高濃度のＤＮＡリガーゼを使用することによって達成することができる。ライゲーションに最適な温度を選択するために、ＤＮＡリガーゼの好ましい温度（例えば、３７℃であり得る）および連結されるべきＤＮＡの融解温度を考慮することができる。ライゲーションに影響を及ぼし得るイオン化を最小限に抑えるために、標的核酸およびバーコードを付された固体支持体を適切な緩衝液中に懸濁することができる。例えば、リガーゼはＴ４リガーゼを含み得る。
【0254】
例えば、第１のタグ配列のバーコードは、第１の領域の空間的位置情報を特徴付け得る。例えば、第１のタグ配列は、複数のバーコードを含み得る。例えば、第１のタグ内の複数のバーコードは異なり得る。
【0255】
本出願において、第１のタグ配列中のアダプターの第２の結合ドメイン中の核酸配列は、第１のタグ配列中のバーコードの３’末端に位置し得る。
【0256】
本出願において、第１のタグ配列は、固有の分子識別領域を含み得る。例えば、固有の分子識別領域は、一本鎖核酸を含み得る。例えば、固有の分子識別領域中の一本鎖核酸は、１ヌクレオチド以上、２ヌクレオチド以上、３ヌクレオチド以上、または４ヌクレオチド以上、５ヌクレオチド以上、６ヌクレオチド以上、７ヌクレオチド以上、または８ヌクレオチド以上、９ヌクレオチド以上、１２ヌクレオチド以上、１５ヌクレオチド以上または２０ヌクレオチド以上を含み得る。例えば、固有の分子識別領域中の一本鎖核酸は、８つのヌクレオチドを含み得る。本出願において、第１のタグ配列は配列決定プライマーを含み得る。
【0257】
本出願において、第２の処理時に、第２の領域中のプローブは、第２のタグ配列およびオリゴヌクレオチドアダプターと複合体を形成し得る。
【0258】
本出願において、第２のタグ配列は、少なくとも１つのバーコードとアダプターの第１の結合ドメインとを含み得る。例えば、第２の処理時に、プローブ結合ドメイン中の核酸配列は、第２の領域中のプローブ中のアダプターの第１の結合ドメイン中の核酸配列に相補的であり、およびタグ結合ドメイン中の核酸配列は、第２のタグ配列中のアダプターの第２の結合ドメイン中の核酸配列に相補的であり、その結果、部分的に二本鎖構造を形成する。
【0259】
例えば、二本鎖構造は、塩基間のミスマッチの可能性を排除しない。例えば、タグ結合ドメインまたはプローブ結合ドメインは、その相補的配列に対して１００％相補的である必要はない。例えば、相補性は、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上、９９．５％以上であり得る。残りの非相補的ヌクレオチドは、相補的ヌクレオチドと共にクラスター化されるかまたは散在していてもよく、互いにまたは相補的ヌクレオチドに隣接している必要はない。例えば、ポリヌクレオチドは、中間のまたは隣接するセグメントがハイブリダイゼーション事象に関与しないように（例えば、ヘアピン構造の形成、「バンプ（ｂｕｍｐｓ）」など）、１つまたは複数のセグメント上でハイブリダイズし得る。
【0260】
例えば、第２のタグ配列中のアダプターの第２の結合ドメインは、リガーゼによって、第２の領域中のプローブ中のアダプターの第１の結合ドメインに連結され得、その結果、第２のタグ配列に付着したプローブを産生する。
【0261】
例えば、リガーゼは、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ））ＤＮＡリガーゼ、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ、Ｔ７ ＤＮＡリガーゼ、哺乳動物リガーゼ（例えば、ＤＮＡリガーゼＩ、ＤＮＡリガーゼＩＩＩ、ＤＮＡリガーゼＩＶ）、熱安定性リガーゼなどのＤＮＡリガーゼを含み得る。Ｔ４ ＤＮＡリガーゼは、ＤＮＡ、オリゴヌクレオチド、ＲＮＡおよびＲＮＡ－ＤＮＡハイブリッドを含有するセグメントと連結され得る。ライゲーションは、ＤＮＡリガーゼを伴わなくてもよいが、トポイソメラーゼなどの代替物を使用する。迅速なライゲーションは、ＰＥＧの包含と共に高濃度のＤＮＡリガーゼを使用することによって達成することができる。ライゲーションに最適な温度を選択するために、ＤＮＡリガーゼの好ましい温度（例えば、３７℃であり得る）および連結されるべきＤＮＡの融解温度を考慮することができる。ライゲーションに影響を及ぼし得るイオン化を最小限に抑えるために、標的核酸およびバーコードを付された固体支持体を適切な緩衝液中に懸濁することができる。例えば、リガーゼはＴ４リガーゼを含み得る。
【0262】
本出願において、第２のタグ配列中のバーコードは、第２の領域の空間的位置情報を特徴付け得る。例えば、第２のタグ配列は、複数のバーコードを含み得る。例えば、第２のタグ配列中の複数のバーコードは異なり得る。
【0263】
本出願において、第２のタグ配列は、固有の分子識別領域を含み得る。例えば、固有の分子識別領域は、一本鎖核酸を含み得る。例えば、固有の分子識別領域中の一本鎖核酸は、１ヌクレオチド以上、２ヌクレオチド以上、３ヌクレオチド以上、または４ヌクレオチド以上、５ヌクレオチド以上、６ヌクレオチド以上、７ヌクレオチド以上、または８ヌクレオチド以上、９ヌクレオチド以上、１２ヌクレオチド以上、１５ヌクレオチド以上または２０ヌクレオチド以上を含み得る。例えば、固有の分子識別領域中の一本鎖核酸は、８つのヌクレオチドを含み得る。本出願において、第２のタグ配列は、配列決定プライマーを含み得る。
【0264】
本出願では、試料の２つ以上の領域を処理することができる。例えば、処理時に、試料中の第３の領域、第４の領域、第５の領域、第６の領域、第７の領域、第８の領域、第９の領域、第１０の領域、第１１の領域、第１２の領域、第１３の領域、第１４の領域、第１５の領域、第１６の領域、第１７の領域、第１８の領域、第１９の領域、第２０の領域中のプローブは、第３のタグ配列、第４のタグ配列、第５のタグ配列、第６のタグ配列、第７のタグ配列、第８のタグ配列、第９のタグ配列、第１０のタグ配列、第１１のタグ配列、第１２のタグ配列、第１３のタグ配列、第１４のタグ配列、第１５のタグ配列、第１６のタグ配列、第１７のタグ配列、第１８のタグ配列、第１９のタグ配列、第２０のタグ配列およびオリゴヌクレオチドアダプターと複合体を形成し得る。
【0265】
処理時に、オリゴヌクレオチドアダプター中のプローブ結合ドメイン中の核酸配列は、第２の領域、第３の領域、第４の領域、第５の領域、第６の領域、第７の領域、第８の領域、第９の領域、第１０の領域、第１１の領域、第１２の領域、第１３の領域、第１４の領域、第１５の領域、第１６の領域、第１７の領域、第１８の領域、第１９の領域、第２０の領域中のプローブ中のアダプターの第１の結合ドメイン中の核酸配列と相補的であり、タグ結合ドメイン中の核酸配列は、第２のタグ配列、第３のタグ配列、第４のタグ配列、第５のタグ配列、第６のタグ配列、第７のタグ配列、第８のタグ配列、第９のタグ配列、第１０のタグ配列、第１１のタグ配列、第１２のタグ配列、第１３のタグ配列、第１４のタグ配列、第１５のタグ配列、第１６のタグ配列、第１７のタグ配列、第１８のタグ配列、第１９のタグ配列、第２０のタグ配列中のアダプターの第２の結合ドメイン中の核酸配列と相補的であり、その結果、部分的に二本鎖構造を形成する。
【0266】
例えば、二本鎖構造は、塩基間のミスマッチの可能性を排除しない。例えば、タグ結合ドメインまたはプローブ結合ドメインは、その相補的配列に対して１００％相補的である必要はない。例えば、相補性は、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上、９９．５％以上であり得る。残りの非相補的ヌクレオチドは、相補的ヌクレオチドと共にクラスター化されるかまたは散在していてもよく、互いにまたは相補的ヌクレオチドに隣接している必要はない。例えば、ポリヌクレオチドは、中間のまたは隣接するセグメントがハイブリダイゼーション事象に関与しないように（例えば、ヘアピン構造の形成、「バンプ（ｂｕｍｐｓ）」など）、１つまたは複数のセグメント上でハイブリダイズし得る。
【0267】
組成物およびキット
本出願は、組み合わせであって、複数のプローブであって、プローブの各々が、標的分子結合ドメインと、アダプターの第１の結合ドメインと、少なくとも１つの反応遮断修飾とを含む、複数のプローブと；プローブ結合ドメインとタグ結合ドメインとを含むオリゴヌクレオチドアダプターと；複数のタグ配列であって、タグ配列の各々が、少なくとも１つのバーコードとアダプターの第２の結合ドメインとを含む、複数のタグ配列とを含み、プローブ結合ドメイン中の核酸配列が、アダプターの第１の結合ドメイン中の核酸配列に相補的であり、およびタグ結合ドメイン中の核酸配列が、アダプターの第２の結合ドメイン中の核酸配列に相補的である、組み合わせも提供する。例えば、複数のタグ配列の２つ以上におけるバーコードは異なり得る。例えば、反応遮断修飾は、遊離可能な、塩基を修飾された基、切断可能なリンカーおよび感光性基からなる群から選択され得る。例えば、反応遮断修飾は、切断可能なリンカーであり得る。例えば、反応遮断修飾は、遊離可能な、塩基を修飾された基であり得る。例えば、組み合わせは、組成物であり得る。
本出願は、組み合わせであって、複数のプローブであって、プローブの各々が、標的分子結合ドメインと、アダプターの第１の結合ドメインと、少なくとも１つの反応遮断修飾とを含む、複数のプローブと；プローブ結合ドメインとタグ結合ドメインとを含むオリゴヌクレオチドアダプターと；複数のタグ配列であって、タグ配列の各々が、少なくとも１つのバーコードとアダプターの第２の結合ドメインとを含む、複数のタグ配列とを含み、プローブ結合ドメイン中の核酸配列が、アダプターの第１の結合ドメイン中の核酸配列に相補的であり、およびタグ結合ドメイン中の核酸配列が、アダプターの第２の結合ドメイン中の核酸配列に相補的である、組み合わせも提供する。例えば、複数のタグ配列の２つ以上におけるバーコードは異なり得る。例えば、反応遮断修飾は、遊離可能な、塩基を修飾された基、切断可能なリンカーおよび感光性基からなる群から選択され得る。例えば、反応遮断修飾は、切断可能なリンカーであり得る。例えば、反応遮断修飾は、遊離可能な、塩基を修飾された基であり得る。例えば、組み合わせは、組成物であり得る。
【0268】
本出願は、本出願の組み合わせを含み得るキットも提供する。例えば、キットは、トランスポザーゼをさらに含み得る。例えば、キットは、核酸増幅剤、逆転写酵素、固定剤、透過剤、連結剤および溶解剤の少なくとも１つをさらに含み得る。例えば、キットは、使用説明書も含み得る。例えば、使用説明書は、以下の方法：
プローブを標的分子に特異的に結合させる条件下で、試料中の少なくとも１つの標的分子を少なくとも１つのプローブと接触させる工程であって、プローブは、標的分子に特異的に結合することが可能な標的分子結合ドメインと、少なくとも１つの反応遮断修飾とを含有する、工程と；
試料の第１の領域に対して第１の処理を実行する工程であって、第１の処理は、第１の領域内のプローブ上の反応遮断修飾を少なくとも部分的に除去して、第１の領域内のプローブをタグ配列中の第１のタグ配列に付着させることが可能である、工程と；
試料中の、第１の領域とは異なる第２の領域に対して第２の処理を実行する工程であって、第２の処理は、第２の領域中のプローブ上の反応遮断修飾を少なくとも部分的に除去して、第２の領域中のプローブをタグ配列中の第２のタグ配列に付着させることが可能であり、第２のタグ配列は第１のタグ配列とは異なる、工程と；
第１のタグ配列に付着したプローブおよび第２のタグ配列に付着したプローブの組成を決定し、ならびにプローブの組成から、試料中の第１の領域の標的分子の存在および／または含有量および第２の領域の標的分子の存在および／または含有量を決定する工程と
を記載する。
プローブを標的分子に特異的に結合させる条件下で、試料中の少なくとも１つの標的分子を少なくとも１つのプローブと接触させる工程であって、プローブは、標的分子に特異的に結合することが可能な標的分子結合ドメインと、少なくとも１つの反応遮断修飾とを含有する、工程と；
試料の第１の領域に対して第１の処理を実行する工程であって、第１の処理は、第１の領域内のプローブ上の反応遮断修飾を少なくとも部分的に除去して、第１の領域内のプローブをタグ配列中の第１のタグ配列に付着させることが可能である、工程と；
試料中の、第１の領域とは異なる第２の領域に対して第２の処理を実行する工程であって、第２の処理は、第２の領域中のプローブ上の反応遮断修飾を少なくとも部分的に除去して、第２の領域中のプローブをタグ配列中の第２のタグ配列に付着させることが可能であり、第２のタグ配列は第１のタグ配列とは異なる、工程と；
第１のタグ配列に付着したプローブおよび第２のタグ配列に付着したプローブの組成を決定し、ならびにプローブの組成から、試料中の第１の領域の標的分子の存在および／または含有量および第２の領域の標的分子の存在および／または含有量を決定する工程と
を記載する。
【0269】
いずれの理論によっても限定されるものではないが、以下の例は、本出願の組成物、キット、分析方法および用途を例示することが意図されており、本発明の範囲を限定することは意図されていない。
【0270】
例
例１．トランスクリプトームの検出
１．１．反応遮断修飾を含有するプローブの設計
（１）切断可能なリンカー（ＰＣリンカー）を含有するプローブ
プローブ構造：５’ＰＣ－リンカー－アダプターの第１の結合ドメイン－ＵＭＩ－ポリＴ
プローブ配列：
5'PC－リンカー－AGGCCAGAGCATTCG（配列番号１）NNNNNNNNTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT
ここで、アダプターの第１の結合ドメインの配列はAGGCCAGAGCATTCG（配列番号１）であり、ＵＭＩはNNNNNNNNである。
（２）ＮＰＯＭ保護基を含有するプローブの設計
プローブ配列：
p-AGGCCAGAGCA（ＮＰＯＭ－Ｔ）（ＮＰＯＭ－Ｔ）CG（配列番号１）NNNNNNNNTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT
例１．トランスクリプトームの検出
１．１．反応遮断修飾を含有するプローブの設計
（１）切断可能なリンカー（ＰＣリンカー）を含有するプローブ
プローブ構造：５’ＰＣ－リンカー－アダプターの第１の結合ドメイン－ＵＭＩ－ポリＴ
プローブ配列：
5'PC－リンカー－AGGCCAGAGCATTCG（配列番号１）NNNNNNNNTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT
ここで、アダプターの第１の結合ドメインの配列はAGGCCAGAGCATTCG（配列番号１）であり、ＵＭＩはNNNNNNNNである。
（２）ＮＰＯＭ保護基を含有するプローブの設計
プローブ配列：
p-AGGCCAGAGCA（ＮＰＯＭ－Ｔ）（ＮＰＯＭ－Ｔ）CG（配列番号１）NNNNNNNNTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT
【0271】
１．２タグ配列およびオリゴヌクレオチドアダプターの設計
（１）タグ配列
タグ配列は、増幅プライマー認識領域－６塩基対バーコード－アダプターの第２の結合ドメインの構造を有する
タグ配列の特定の組成：
CCCTACACGACGCTCTTCCGATCT（配列番号３）－６塩基対バーコード－ATCCACGTGCTTGAG（配列番号２）
６塩基対バーコードは、任意の塩基の組み合わせであり得る、切片上の異なる領域を区別するために使用され、任意の塩基は、Ａ、Ｔ、ＣおよびＧであり得る。アダプターの第２の結合ドメインは、ATCCACGTGCTTGAG（配列番号２）であり、増幅プライマー認識領域は、CCCTACACGACGCTCTTCCGATCT（配列番号３）である。
（２）オリゴヌクレオチドアダプター
CGAATGCTCTGGCCTCTCAAGCACGTGGAT（配列番号４）
（３）アニーリング後、例示的なタグ配列およびオリゴヌクレオチドアダプターは、以下に示されるように部分的二本鎖構造Ｉを形成することができる。
（１）タグ配列
タグ配列は、増幅プライマー認識領域－６塩基対バーコード－アダプターの第２の結合ドメインの構造を有する
タグ配列の特定の組成：
CCCTACACGACGCTCTTCCGATCT（配列番号３）－６塩基対バーコード－ATCCACGTGCTTGAG（配列番号２）
６塩基対バーコードは、任意の塩基の組み合わせであり得る、切片上の異なる領域を区別するために使用され、任意の塩基は、Ａ、Ｔ、ＣおよびＧであり得る。アダプターの第２の結合ドメインは、ATCCACGTGCTTGAG（配列番号２）であり、増幅プライマー認識領域は、CCCTACACGACGCTCTTCCGATCT（配列番号３）である。
（２）オリゴヌクレオチドアダプター
CGAATGCTCTGGCCTCTCAAGCACGTGGAT（配列番号４）
（３）アニーリング後、例示的なタグ配列およびオリゴヌクレオチドアダプターは、以下に示されるように部分的二本鎖構造Ｉを形成することができる。
【化1】
【0272】
（１．３）試料の調製
（１）試料の種類：ホルマリン固定されたパラフィン切片またはホルムアルデヒド固定された凍結切片。
（２）固定された切片を抗原露出処理に供した：最初に、試料をＡｂｃａｍ抗原露出溶液または他の緩衝液で、１００℃で５分間処理し、次いで、プロテアーゼＫまたはペプシン（１ｍｇ／ｍｌの濃度を有する）のＰＢＳ希釈溶液によって３７℃で１０～３０分間消化し、最後にＰＢＳで洗浄した。
（１）試料の種類：ホルマリン固定されたパラフィン切片またはホルムアルデヒド固定された凍結切片。
（２）固定された切片を抗原露出処理に供した：最初に、試料をＡｂｃａｍ抗原露出溶液または他の緩衝液で、１００℃で５分間処理し、次いで、プロテアーゼＫまたはペプシン（１ｍｇ／ｍｌの濃度を有する）のＰＢＳ希釈溶液によって３７℃で１０～３０分間消化し、最後にＰＢＳで洗浄した。
【0273】
１．４．１×逆転写緩衝液、１μＭ ｄＮＴＰ、２μＭ逆転写プライマー、２μＭ逆転写プライマー、１％Ｔｒｉｔｏｎ、１％ＢＳＡおよび２ｕ／μｌ逆転写酵素を含む反応系を用いて逆転写反応を行った。上記の試薬の量は、試料サイズに関連する。組織切片が１ｃｍ×１ｃｍのサイズであった場合、反応系は約５０μｌの溶液であった。
【0274】
それらを７２℃で５分間および４℃で１０分間反応させ、次いで４２℃で１時間放置した。
【0275】
１．５ 抗体の染色
（１）１％ＢＳＡを含有する１×ＰＢＳ緩衝液で、１つまたは複数の抗体を１μｇ／１００μｌの濃度に希釈した。
（２）一次抗体結合：抗体溶液を２５℃で１時間または４℃で一晩切片と反応させた。
（３）１％ＢＳＡを含有する１×ＰＢＳ緩衝液で切片を洗浄した。
（４）二次抗体結合：１％ＢＳＡを含有する１×ＰＢＳ緩衝液で二次抗体を希釈し、室温で１時間、切片と反応させた。
（５）１％ＢＳＡを含有する１×ＰＢＳ緩衝液で切片を洗浄した。
（１）１％ＢＳＡを含有する１×ＰＢＳ緩衝液で、１つまたは複数の抗体を１μｇ／１００μｌの濃度に希釈した。
（２）一次抗体結合：抗体溶液を２５℃で１時間または４℃で一晩切片と反応させた。
（３）１％ＢＳＡを含有する１×ＰＢＳ緩衝液で切片を洗浄した。
（４）二次抗体結合：１％ＢＳＡを含有する１×ＰＢＳ緩衝液で二次抗体を希釈し、室温で１時間、切片と反応させた。
（５）１％ＢＳＡを含有する１×ＰＢＳ緩衝液で切片を洗浄した。
【0276】
１．６ 顕微鏡観察：切片内の関心対象の領域に２８０ｎｍのＵＶ励起光を１０秒～５分間照射した。
【0277】
１．７ １％ＢＳＡを含有する１×ＰＢＳ緩衝液で切片を洗浄した。
【0278】
１．８ １×Ｔ４リガーゼ緩衝液、１μＭタグ配列および１μｌ／μｌのＴ４ ＤＮＡリガーゼを切片に添加し、室温で１５分間反応させた。次いで、１％ＢＳＡを含有する１×ＰＢＳ緩衝液で切片を洗浄して、タグ配列を除去した。
【0279】
１．９ 次の関心対象の領域が照射され、切片上の異なる関心対象の領域が異なるタグ配列で標識されるように、上記工程１．６～１．８を繰り返した。
【0280】
１．１０ 全ての反応の終了後、１％ＳＤＳを含有する１×ＰＢＳ中のプロテアーゼＫの希釈液（２０μｇ／ｍｌの濃度を有する）で、切片を６５℃で１時間消化した。
【0281】
１．１１ 次いで、ｃＤＮＡを磁気ビーズで精製し、消化されたｃＤＮＡ、１×逆転写緩衝液、１μＭ鎖変換プライマー、１μＭ ｄＮＴＰおよび１ｕ／μｌ逆転写酵素を含む反応系において二本鎖合成を行った。上記の試薬の量は、試料サイズに関連する。組織切片が１ｃｍ×１ｃｍのサイズであった場合、反応系は約５０μｌの溶液であった。
【0282】
ここで、鎖変換プライマーは、AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACATGGG（配列番号１４）である。
【0283】
４２℃で１時間反応させた後、ｃＤＮＡを磁気ビーズで精製し、次いで、１μＭプライマー１、１μＭプライマー２、１×Ｔａｑ緩衝液、１μＭ ｄＮＴＰおよび１ｕ／μｌ Ｔａｑ酵素を含むＰＣＲ増幅系においてＰＣＲ増幅を行った。プライマー１の配列は、AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT（配列番号５）であり、プライマー２の配列は、CCCTACACGACGCTCTTCCGATCT（配列番号３）である。上記の試薬の量は、試料サイズに関連する。組織切片が１ｃｍ×１ｃｍのサイズであった場合、増幅系は約５０μｌの溶液であった。
【0284】
よく混合した後、ＰＣＲ反応を行った。
９５℃ ３分
９５℃ ３０秒
５５℃ ３０秒
７２℃ ３分 上記工程を２０～３０サイクル繰り返す
７２℃ ５分
９５℃ ３分
９５℃ ３０秒
５５℃ ３０秒
７２℃ ３分 上記工程を２０～３０サイクル繰り返す
７２℃ ５分
【0285】
１．１２ ｃＤＮＡを精製し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｎｅｘｔｅｒａキットによりライブラリーを構築した。
（１）Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｎｅｘｔｅｒａ反応系は、１ｎｇのｃＤＮＡ、１×Ｎｅｘｔｅｒａ緩衝液および１μｌのＮｅｘｔｅｒａ酵素を含む。反応体積は２０μｌである。
反応は５５℃で７分間行った。
（２）反応産物を、上記（１）における反応産物、１μＭプライマー３、１μＭ Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｎ７０ ｘプライマー、１×Ｔａｑ緩衝液、１μＭ ｄＮＴＰおよび１ｕ／μｌ Ｔａｑ酵素を含む反応系でのＰＣＲ増幅に供した。ここで、プライマー３は、CCCTACACGACGCTCTTCCGATCT（配列番号３）である。反応体積は２０μｌである。
よく混合した後、ＰＣＲ反応を行った。
９５℃ ３分
９５℃ ３０秒
５５℃ ３０秒
７２℃ ３分 上記工程を２０～３０サイクル繰り返す
７２℃ ５分
（３）精製されたライブラリーの配列決定
（４）タグ配列中のバーコードに従って、最終的な配列決定産物がどの光処理された関心対象の領域に由来するかが決定される。
（１）Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｎｅｘｔｅｒａ反応系は、１ｎｇのｃＤＮＡ、１×Ｎｅｘｔｅｒａ緩衝液および１μｌのＮｅｘｔｅｒａ酵素を含む。反応体積は２０μｌである。
反応は５５℃で７分間行った。
（２）反応産物を、上記（１）における反応産物、１μＭプライマー３、１μＭ Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｎ７０ ｘプライマー、１×Ｔａｑ緩衝液、１μＭ ｄＮＴＰおよび１ｕ／μｌ Ｔａｑ酵素を含む反応系でのＰＣＲ増幅に供した。ここで、プライマー３は、CCCTACACGACGCTCTTCCGATCT（配列番号３）である。反応体積は２０μｌである。
よく混合した後、ＰＣＲ反応を行った。
９５℃ ３分
９５℃ ３０秒
５５℃ ３０秒
７２℃ ３分 上記工程を２０～３０サイクル繰り返す
７２℃ ５分
（３）精製されたライブラリーの配列決定
（４）タグ配列中のバーコードに従って、最終的な配列決定産物がどの光処理された関心対象の領域に由来するかが決定される。
【0286】
例２．逆転写に基づかないトランスクリプトームの検出
２．１ プライマーの設計
当技術分野で周知のプライマー設計プログラムによって、プライマーを設計した（例えば、プライマー３）。標的種のトランスクリプトーム遺伝子モデルでは、標的遺伝子を選択し、各遺伝子に対して１０対のプライマーを設計した。遺伝子内の隣接位置について、２５塩基対の長さを有する上流および下流プライマーをそれぞれ設計して、それらの特異性を確保した。
２．１ プライマーの設計
当技術分野で周知のプライマー設計プログラムによって、プライマーを設計した（例えば、プライマー３）。標的種のトランスクリプトーム遺伝子モデルでは、標的遺伝子を選択し、各遺伝子に対して１０対のプライマーを設計した。遺伝子内の隣接位置について、２５塩基対の長さを有する上流および下流プライマーをそれぞれ設計して、それらの特異性を確保した。
【0287】
具体例：
プライマーの各対の上流プライマー：ATCCACGTGCTTGAG（配列番号２）－ＵＭＩ－プローブ配列
プライマーの各対の下流プライマー：プローブ－AGATCGGAAGAGCACACGTCTG（配列番号９）
ここで、ＵＭＩの配列は、nnnnnnnn（ランダムな配列）である。
プライマーの各対の上流プライマー：ATCCACGTGCTTGAG（配列番号２）－ＵＭＩ－プローブ配列
プライマーの各対の下流プライマー：プローブ－AGATCGGAAGAGCACACGTCTG（配列番号９）
ここで、ＵＭＩの配列は、nnnnnnnn（ランダムな配列）である。
【0288】
（１）上流プライマーの合成
まず、Ｔｗｉｓｔ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅにより、プローブプライマーセットを並行して合成した。
プローブプライマーセットの配列は、
ATCCACGTGCTTGAG（配列番号２）－nnnnnnnn－プローブ－GATCACTCTGCGTTGATACCAC（配列番号１５）である。
以下に示されるように、プライマーを用いて、ＰＣＲによって上流プライマーのライブラリーを増幅した。
プライマー４：ビオチン－ATCCACGTGCTTGAG（配列番号２）
プライマー５：GTGGTATCAACGCAGAGTGATC（配列番号６）
その後、ＰＣＲ産物を精製し、ＤｐｎＩＩ酵素によって消化してプローブの下流配列を除去した。
次いで、これをストレプトアビジン（簡略に、ＳＡ）磁気ビーズに結合させ、配列は以下に示されている通りである：
磁気ビーズ－ＳＡ－ビオチン－ATCCACGTGCTTGAG（配列番号２）nnnnnnnn－プローブ－
次いで、これを０．１Ｍ ＮａＯＨによって変性させてＰＣＲ相補鎖を除去した。
その後、これを１００℃に加熱して、ストレプトアビジン磁気ビーズに結合したフォワードプローブプライマーを遊離させた。
ビオチン－ATCCACGTGCTTGAG（配列番号２）nnnnnnnn－プローブ－
（２）下流プライマーの合成
Ｔｗｉｓｔ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅにより、プローブプライマーセットを並行して合成した。
プローブプライマーセットの配列は、
CTTCCGATCTGGTCTCG（配列番号７）－プローブ－AGATCGGAAGAGCACACGTCTG（配列番号９）である。
以下に示されるように、プライマーを用いて、ＰＣＲによって下流プライマーのライブラリーを増幅した。
プライマー６：ビオチン－CTTCCGATCTGGTCTCG（配列番号７）
プライマー７：ビオチン－CAGACGTGTGCTCTTCCGATCT（配列番号８）
ＰＣＲ産物をストレプトアビジン磁気ビーズに結合させ、ＢｓａＩ－ＨＦ酵素による消化によって過剰なプライマー配列を除去した。
その後、９５℃で加熱することによって変性させて、以下に示されるような最終プライマーを得た。
プローブ－AGATCGGAAGAGCACACGTCTG（配列番号９）
（３）切断可能なリンカー（ＰＣリンカー）を含有するプローブの調製
例１と同様に、切断可能なリンカーをプローブの５’末端に連結した。
（４）ＮＰＯＭ保護基を含有するプローブの調製
例１と同様に、プローブの５’末端にＮＰＯＭ保護基を連結した。
まず、Ｔｗｉｓｔ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅにより、プローブプライマーセットを並行して合成した。
プローブプライマーセットの配列は、
ATCCACGTGCTTGAG（配列番号２）－nnnnnnnn－プローブ－GATCACTCTGCGTTGATACCAC（配列番号１５）である。
以下に示されるように、プライマーを用いて、ＰＣＲによって上流プライマーのライブラリーを増幅した。
プライマー４：ビオチン－ATCCACGTGCTTGAG（配列番号２）
プライマー５：GTGGTATCAACGCAGAGTGATC（配列番号６）
その後、ＰＣＲ産物を精製し、ＤｐｎＩＩ酵素によって消化してプローブの下流配列を除去した。
次いで、これをストレプトアビジン（簡略に、ＳＡ）磁気ビーズに結合させ、配列は以下に示されている通りである：
磁気ビーズ－ＳＡ－ビオチン－ATCCACGTGCTTGAG（配列番号２）nnnnnnnn－プローブ－
次いで、これを０．１Ｍ ＮａＯＨによって変性させてＰＣＲ相補鎖を除去した。
その後、これを１００℃に加熱して、ストレプトアビジン磁気ビーズに結合したフォワードプローブプライマーを遊離させた。
ビオチン－ATCCACGTGCTTGAG（配列番号２）nnnnnnnn－プローブ－
（２）下流プライマーの合成
Ｔｗｉｓｔ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅにより、プローブプライマーセットを並行して合成した。
プローブプライマーセットの配列は、
CTTCCGATCTGGTCTCG（配列番号７）－プローブ－AGATCGGAAGAGCACACGTCTG（配列番号９）である。
以下に示されるように、プライマーを用いて、ＰＣＲによって下流プライマーのライブラリーを増幅した。
プライマー６：ビオチン－CTTCCGATCTGGTCTCG（配列番号７）
プライマー７：ビオチン－CAGACGTGTGCTCTTCCGATCT（配列番号８）
ＰＣＲ産物をストレプトアビジン磁気ビーズに結合させ、ＢｓａＩ－ＨＦ酵素による消化によって過剰なプライマー配列を除去した。
その後、９５℃で加熱することによって変性させて、以下に示されるような最終プライマーを得た。
プローブ－AGATCGGAAGAGCACACGTCTG（配列番号９）
（３）切断可能なリンカー（ＰＣリンカー）を含有するプローブの調製
例１と同様に、切断可能なリンカーをプローブの５’末端に連結した。
（４）ＮＰＯＭ保護基を含有するプローブの調製
例１と同様に、プローブの５’末端にＮＰＯＭ保護基を連結した。
【0289】
２．２ 試料の調製および試料とのプローブのハイブリダイゼーション
（１）まず、組織切片をＰＢＳ中の４％ホルムアルデヒドにより室温で１０分間固定し、その後、細胞を脱水し、－２０℃で１００％エタノール中に保存した。
（２）続いて、１０％ホルムアミド＋２×クエン酸ナトリウム緩衝液（ＳＳＣ）＋１０％デキストラン硫酸の成分を用いて、ハイブリダイゼーション溶液を配合した。
（３）４２℃で、ハイブリダイゼーション溶液中で、組織切片を１時間プレハイブリダイズさせた。
（４）上流プライマープールおよび下流プライマープールを１０μＭの合計濃度で組織切片中に添加した。
（５）次いで、それらを４２℃で１２～２４時間ハイブリダイズさせた。
（６）組織切片をハイブリダイゼーション溶液で２回洗浄した。
（７）１％ＢＳＡを含有するＰＢＳで組織切片を２回さらに洗浄した。
（８）これをＴ４リガーゼで、室温で１時間連結した。
（９）１％ＢＳＡを含有するＰＢＳで組織切片を２回さらに洗浄した。
（１）まず、組織切片をＰＢＳ中の４％ホルムアルデヒドにより室温で１０分間固定し、その後、細胞を脱水し、－２０℃で１００％エタノール中に保存した。
（２）続いて、１０％ホルムアミド＋２×クエン酸ナトリウム緩衝液（ＳＳＣ）＋１０％デキストラン硫酸の成分を用いて、ハイブリダイゼーション溶液を配合した。
（３）４２℃で、ハイブリダイゼーション溶液中で、組織切片を１時間プレハイブリダイズさせた。
（４）上流プライマープールおよび下流プライマープールを１０μＭの合計濃度で組織切片中に添加した。
（５）次いで、それらを４２℃で１２～２４時間ハイブリダイズさせた。
（６）組織切片をハイブリダイゼーション溶液で２回洗浄した。
（７）１％ＢＳＡを含有するＰＢＳで組織切片を２回さらに洗浄した。
（８）これをＴ４リガーゼで、室温で１時間連結した。
（９）１％ＢＳＡを含有するＰＢＳで組織切片を２回さらに洗浄した。
【0290】
２．３ 抗体の染色
（１）１％ＢＳＡを含有する１×ＰＢＳ緩衝液で、１つまたは複数の抗体を１μｇ／１００μｌの濃度に希釈した。
（２）一次抗体結合：抗体溶液を２５℃で１時間または４℃で一晩切片と反応させた。
（３）１％ＢＳＡを含有する１×ＰＢＳ緩衝液で切片を洗浄した。
（４）二次抗体結合：１％ＢＳＡを含有する１×ＰＢＳ緩衝液で二次抗体を希釈し、室温で１時間、切片と反応させた。
（５）１％ＢＳＡを含有する１×ＰＢＳ緩衝液で切片を洗浄した。
（１）１％ＢＳＡを含有する１×ＰＢＳ緩衝液で、１つまたは複数の抗体を１μｇ／１００μｌの濃度に希釈した。
（２）一次抗体結合：抗体溶液を２５℃で１時間または４℃で一晩切片と反応させた。
（３）１％ＢＳＡを含有する１×ＰＢＳ緩衝液で切片を洗浄した。
（４）二次抗体結合：１％ＢＳＡを含有する１×ＰＢＳ緩衝液で二次抗体を希釈し、室温で１時間、切片と反応させた。
（５）１％ＢＳＡを含有する１×ＰＢＳ緩衝液で切片を洗浄した。
【0291】
２．４ 顕微鏡観察：切片内の関心対象の領域に２８０ｎｍのＵＶ励起光を１０秒～５分間照射した。
【0292】
２．５ １％ＢＳＡを含有する１×ＰＢＳ緩衝液で切片を洗浄した。
【0293】
２．６ １×Ｔ４リガーゼ緩衝液、１μＭタグ配列および１μｌ／μｌのＴ４ ＤＮＡリガーゼを切片に添加し、室温で１５分間反応させた。次いで、１％ＢＳＡを含有する１×ＰＢＳ緩衝液で切片を洗浄して、タグ配列を除去した。
【0294】
２．７ 次の関心対象の領域が照射され、切片上の異なる関心対象の領域が異なるタグ配列で標識されるように、上記工程２．４～２．６を繰り返した。
【0295】
２．８ 全ての反応の終了後、１％ＳＤＳを含有する１×ＰＢＳ中のプロテアーゼＫの希釈液（２０μｇ／ｍｌの濃度を有する）で、切片を６５℃で１時間消化した。
【0296】
２．９．ライブラリーの構築および配列決定。
【0297】
例３ エピゲノム解析
３．１．反応遮断修飾を含有するプローブの設計
（１）切断可能なリンカー（ＰＣリンカー）を含有するプローブ
エピゲノム解析のためのプローブ：
5'PC－リンカー－AGGCCAGAGCATTCGAGATGTGTATAAGAGACAG（配列番号１０）
（２）ＮＰＯＭ保護基を含有するプローブの設計
p-AGGCCAGAGCA（ＮＰＯＭ－Ｔ）（ＮＰＯＭ－Ｔ）CGAGATGTGTATAAGAGACAG（配列番号１０）
３．１．反応遮断修飾を含有するプローブの設計
（１）切断可能なリンカー（ＰＣリンカー）を含有するプローブ
エピゲノム解析のためのプローブ：
5'PC－リンカー－AGGCCAGAGCATTCGAGATGTGTATAAGAGACAG（配列番号１０）
（２）ＮＰＯＭ保護基を含有するプローブの設計
p-AGGCCAGAGCA（ＮＰＯＭ－Ｔ）（ＮＰＯＭ－Ｔ）CGAGATGTGTATAAGAGACAG（配列番号１０）
【0298】
３．２ 上記プライマーとＴｎ５Ｍプライマー５’－Ｐ－CTGTCTCTTATACACATCT（配列番号１２）をアニールして二本鎖を形成した。
【0299】
３．３ Ｔｎ５Ｂプライマー
Ｔｎ５Ｂプライマーは、GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG（配列番号１１）であり、Ｔｎ５ＢプライマーとＴｎ５Ｍプライマー５’－Ｐ－CTGTCTCTTATACACATCT（配列番号１２）をアニールして二本鎖を形成した。
Ｔｎ５Ｂプライマーは、GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG（配列番号１１）であり、Ｔｎ５ＢプライマーとＴｎ５Ｍプライマー５’－Ｐ－CTGTCTCTTATACACATCT（配列番号１２）をアニールして二本鎖を形成した。
【0300】
３．４ 等量の保護されたＴｎ５トランスポゾンおよびＴｎ５Ｂトランスポゾンを混合し、さらに、等モル量のＴｎ５タンパク質と混合してＴｎ５酵素を組み立てた。
【0301】
３．５ ホルムアルデヒド固定された凍結切片を調製し、０．１％Ｔｒｉｏｎ １０ ｍＭＴｒｉｓ緩衝液で組織を透過させた。
【0302】
３．６ １×ＴＤ緩衝液（Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｎｅｘｔｅｒａキットから入手）と上記工程で組み立てた５μＭのＴｎ５酵素を切片に添加し、３７℃で１時間ＡＴＡＣ反応させた。
【0303】
３．７ １％ＢＳＡを含有する１×ＰＢＳ緩衝液で切片を洗浄して、未反応のＴｎ５酵素を除去した。
【0304】
３．８ 切片の顕微鏡観察：切片内の関心対象の領域に２８０ｎｍのＵＶ励起光を１０秒～５分間照射した。
【0305】
３．９ １％ＢＳＡを含有する１×ＰＢＳ緩衝液で切片を洗浄した。
【0306】
３．１０ １×Ｔ４リガーゼ緩衝液、１μＭタグ配列および１μｌ／μｌのＴ４ ＤＮＡリガーゼを切片に添加し、室温で１５分間反応させた。次いで、１％ＢＳＡを含有する１×ＰＢＳ緩衝液で切片を洗浄して、タグ配列を除去した。
【0307】
３．１１ 次の関心対象の領域が照射され、切片上の異なる関心対象の領域が異なるタグ配列で標識されるように、上記工程３．８～３．１０を繰り返した。
【0308】
３．１２ 全ての反応の終了後、１％ＳＤＳを含有する１×ＰＢＳ中のプロテアーゼＫの希釈液（２０μｇ／ｍｌの濃度を有する）で、切片を６５℃で１時間消化した。
【0309】
３．１３ ＤＮＡを磁気ビーズで精製した後、上記反応産物、１μＭプライマー５、１μＭ Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｎ７０ｘプライマー、１×Ｔａｑ緩衝液、１μＭ ｄＮＴＰおよび１ｕ／μｌ Ｔａｑ酵素を含む増幅系において増幅した。プライマー８の配列は、CCCTACACGACGCTCTTCCGATCT（配列番号３）である。上記の試薬の量は、試料サイズに関連する。組織切片が１ｃｍ×１ｃｍのサイズであった場合、増幅系は約５０μｌの溶液であった。
【0310】
よく混合した後、増幅を行った。
７２ｃ ５分
９５ｃ ３分
９５ｃ ３０秒
５５ｃ ３０秒
７２ｃ ３分 上記工程を２０～３０サイクル繰り返す
７２ｃ ５分
７２ｃ ５分
９５ｃ ３分
９５ｃ ３０秒
５５ｃ ３０秒
７２ｃ ３分 上記工程を２０～３０サイクル繰り返す
７２ｃ ５分
【0311】
３．１４ 精製されたライブラリーの配列決定
【0312】
３．１５ タグ配列中のバーコードに従って、最終的な配列決定産物がどの光処理された関心対象の領域に由来するかが決定される。
【0313】
例４．タンパク質のマルチオミクス検出
４．１ 以下の構造を抗体に結合させた：
抗体プローブ：AGGCCAGAGCATTCG（配列番号１）NNNNNNNN－バーコード－CTGTCTCTTATACACATCTCCGAGCCCACGAGAC（配列番号１３）
ここで、抗体プローブの５’末端配列は、アダプターの第１の結合ドメインの配列AGGCCAGAGCATTCG（配列番号１）であり、抗体プローブの３’末端配列は、CTGTCTCTTATACACATCTCCGAGCCCACGAGAC（配列番号１３）である。
４．１ 以下の構造を抗体に結合させた：
抗体プローブ：AGGCCAGAGCATTCG（配列番号１）NNNNNNNN－バーコード－CTGTCTCTTATACACATCTCCGAGCCCACGAGAC（配列番号１３）
ここで、抗体プローブの５’末端配列は、アダプターの第１の結合ドメインの配列AGGCCAGAGCATTCG（配列番号１）であり、抗体プローブの３’末端配列は、CTGTCTCTTATACACATCTCCGAGCCCACGAGAC（配列番号１３）である。
【0314】
４．２ 例１と同様に、切断可能なリンカーまたはＮＰＯＭ保護基を抗体プローブの５’末端に連結した。バーコードは異なる抗体を区別するために使用された。
【0315】
４．３ 抗体プローブの３’末端はアミノ修飾を有しており、これを一般的な抗体オリゴカップリングキットによって標的抗体に結合させることができる。
【0316】
４．４ 抗体結合：例２の工程２．３と同じである。
【0317】
４．５ ライブラリーを構築する際に、追加の精製工程を加えた、すなわち、組織切片全体をプロテアーゼで消化した後、抗体のオリゴ部分（１００ｂｐ未満）を磁気ビーズでの精製によって得、増幅し、一方、１００ｂｐを超える長さを有する部分を従来のｃＤＮＡまたはＴｎ５増幅に供した。
【0318】
例５ 結果の分析
マウス組織の異なる領域が検出された。図２は、眼および上皮などのマウス組織の異なる領域を示す。
マウス組織の異なる領域が検出された。図２は、眼および上皮などのマウス組織の異なる領域を示す。
【0319】
【0320】
【0321】
以下の表は、図２におけるマウス組織の領域２（上皮）についての遺伝子発現結果を示す。結果は、本出願の方法が領域２（上皮）において上皮に特異的な遺伝子発現を同定することができることを示している。
【表2】
【0322】
図４は、図２におけるマウス組織の領域１（眼）および領域２（上皮）についてのＡＴＡＣオミクス解析の結果を示す。結果は、配列決定された断片のゲノム分布が典型的なＡＴＡＣシグナルパターンを示すこと、すなわち、配列決定された断片は主に転写開始部位の周囲に分布し、ピーク値を示したことを示す。
【0323】
【0324】
アクチンは上皮組織では高い発現を示すが眼では低い発現を示すことが知られており、配列決定結果により得られた分子の数はそれと一致している。
【0325】
上記の結果は、本出願の方法が様々なオミクス情報を同時に検出できることを示している。
【0326】
前述の詳細な説明は、説明および例によって提供され、添付の特許請求の範囲を限定することを意図するものではない。本明細書に列挙された態様の様々な変更は、当業者には明らかであり、添付の特許請求の範囲およびその均等な態様の範囲内に保持される。
【配列表フリーテキスト】
【0327】
配列表１ ＜２２３＞アダプターの第１の結合ドメイン
配列表２ ＜２２３＞アダプターの第２の結合ドメイン；プライマー４
配列表３ ＜２２３＞増幅プライマー認識配列；プライマー２；プライマー３、プライマー８
配列表４ ＜２２３＞オリゴヌクレオチドアダプター
配列表５ ＜２２３＞プライマー１
配列表６ ＜２２３＞プライマー５
配列表７ ＜２２３＞プライマー６
配列表８ ＜２２３＞プライマー７
配列表９ ＜２２３＞プローブ
配列表１０ ＜２２３＞エピゲノム解析のためのプローブ
配列表１１ ＜２２３＞Ｔｎ５Ｂプライマー
配列表１２ ＜２２３＞Ｔｎ５Ｍプライマー
配列表１３ ＜２２３＞抗体プローブの３末端配列
配列表１４ ＜２２３＞鎖変換プライマー
配列表１５ ＜２２３＞下流配列
配列表２ ＜２２３＞アダプターの第２の結合ドメイン；プライマー４
配列表３ ＜２２３＞増幅プライマー認識配列；プライマー２；プライマー３、プライマー８
配列表４ ＜２２３＞オリゴヌクレオチドアダプター
配列表５ ＜２２３＞プライマー１
配列表６ ＜２２３＞プライマー５
配列表７ ＜２２３＞プライマー６
配列表８ ＜２２３＞プライマー７
配列表９ ＜２２３＞プローブ
配列表１０ ＜２２３＞エピゲノム解析のためのプローブ
配列表１１ ＜２２３＞Ｔｎ５Ｂプライマー
配列表１２ ＜２２３＞Ｔｎ５Ｍプライマー
配列表１３ ＜２２３＞抗体プローブの３末端配列
配列表１４ ＜２２３＞鎖変換プライマー
配列表１５ ＜２２３＞下流配列
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【配列表】
【国際調査報告】