特表 2024-522178 コンジュゲート

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-06-11

(54)【発明の名称】コンジュゲート

(51)【国際特許分類】

   C07K 14/705 20060101AFI20240604BHJP

   C12N 15/12 20060101ALI20240604BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20240604BHJP

   A61K 38/02 20060101ALI20240604BHJP

   A61K 31/7088 20060101ALI20240604BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20240604BHJP

   A61K 35/12 20150101ALI20240604BHJP

   A61K 47/60 20170101ALI20240604BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240604BHJP

   A61K 39/08 20060101ALI20240604BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20240604BHJP

   A61K 47/68 20170101ALI20240604BHJP

   G01N 33/53 20060101ALI20240604BHJP

   C07K 16/28 20060101ALN20240604BHJP

   C12N 9/10 20060101ALN20240604BHJP

【ＦＩ】

C07K14/705

C12N15/12

C12N15/63 Z

A61K38/02

A61K31/7088

A61K48/00

A61K35/12

A61K47/60

A61P35/00

A61K39/08

A61P43/00 121

A61K47/68

G01N33/53 Y

G01N33/53 N

C07K16/28

C12N9/10

【審査請求】未請求

【予備審査請求】有

(21)【出願番号】P 2023575731

(86)(22)【出願日】2022-06-09

(85)【翻訳文提出日】2024-02-07

(86)【国際出願番号】 EP2022065777

(87)【国際公開番号】W WO2022258794

(87)【国際公開日】2022-12-15

(31)【優先権主張番号】21178648.8

(32)【優先日】2021-06-09

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】522222065

【氏名又は名称】ウルティモバックス アクチボラグ

(74)【代理人】

【識別番号】100079108

【弁理士】

【氏名又は名称】稲葉 良幸

(74)【代理人】

【識別番号】100109346

【弁理士】

【氏名又は名称】大貫 敏史

(74)【代理人】

【識別番号】100117189

【弁理士】

【氏名又は名称】江口 昭彦

(74)【代理人】

【識別番号】100134120

【弁理士】

【氏名又は名称】内藤 和彦

(72)【発明者】

【氏名】ミシェル，ダナ

(72)【発明者】

【氏名】グラナス，ミカエル

(72)【発明者】

【氏名】テデバーク，ウルフ

(72)【発明者】

【氏名】ガウダーナック，グスタフ

(72)【発明者】

【氏名】スクルトベイト，ロアルド

(72)【発明者】

【氏名】マングスボ，サラ

【テーマコード（参考）】

4C076

4C084

4C085

4C086

4C087

4H045

【Ｆターム（参考）】

4C076AA94

4C076AA95

4C076CC27

4C076CC41

4C076CC42

4C076EE23

4C076EE41

4C076EE59

4C076FF32

4C076FF34

4C084AA01

4C084AA07

4C084AA13

4C084BA41

4C084NA05

4C084NA13

4C084NA14

4C084NA15

4C084ZB26

4C084ZC75

4C085AA03

4C085EE03

4C086AA01

4C086AA02

4C086EA16

4C086MA01

4C086MA02

4C086MA04

4C086MA07

4C086NA05

4C086NA13

4C086NA14

4C086NA15

4C086ZB26

4C086ZC75

4C087AA01

4C087BB65

4C087CA12

4C087CA20

4C087NA05

4C087NA13

4C087NA14

4C087NA15

4C087ZB26

4C087ZC75

4H045AA10

4H045AA30

4H045BA51

4H045CA40

4H045DA50

4H045DA89

4H045EA20

(57)【要約】

Ｂ細胞エピトープの配列を含む少なくとも１つのポリペプチド及びＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープの配列を含む少なくとも１つのポリペプチドを含むコンジュゲートが提供される。ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープは、ユニバーサル腫瘍抗原の少なくとも１２個のアミノ酸の領域又はその領域に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含み、及びＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープは、集団の少なくとも５０％において免疫原性である。ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープの配列を含む少なくとも１つのポリペプチドは、５００アミノ酸以下の長さである。Ｂ細胞エピトープの配列は、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープの配列と異なり、及びＢ細胞エピトープに特異的な抗体は、コンジュゲートに結合する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

コンジュゲートであって、
（ａ）Ｂ細胞エピトープの配列を含む少なくとも１つのポリペプチド；及び
（ｂ）ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープの配列を含む少なくとも１つのポリペプチドであって、前記ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープは、ユニバーサル腫瘍抗原の少なくとも１２個のアミノ酸の領域又は前記領域に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含み、前記ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープは、集団の少なくとも５０％において免疫原性であり、前記ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープの前記配列を含む前記少なくとも１つのポリペプチドは、５００アミノ酸以下の長さである、少なくとも１つのポリペプチド
を含み、
前記Ｂ細胞エピトープの前記配列は、前記ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープの前記配列と異なり、
前記Ｂ細胞エピトープに特異的な抗体は、前記コンジュゲートに結合する、コンジュゲート。

【請求項2】

Ｂ細胞エピトープの配列を含む前記少なくとも１つのポリペプチド及びＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープの配列を含む前記少なくとも１つのポリペプチドは、コアを介して連結され、
前記コアは、連結前に、
本体部分；
前記本体部分に結合された１つ以上の第１の連結基；及び
前記本体部分に結合された１つ以上の第２の連結基
を含み、
前記第１の連結基及び第２の連結基は、互いに直交しており、
前記第１の連結基は、Ｂ細胞エピトープの配列を含む前記少なくとも１つのポリペプチドに連結されて第１の接続要素を形成し、及び前記第２の連結基は、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープの配列を含む前記少なくとも１つのポリペプチドに連結されて第２の接続要素を形成し；好ましくは、
（ｉ）前記第１の連結基及び前記第２の連結基は、アルキン（例えば、末端アルキン）、アルケン（例えば、末端アルケン、ノルボルネン）、シクロアルキン、トランスシクロアルケン、テトラジン、共役ジエン、マレイミド、α－ハロカルボニル、チオール及びアジドから独立して選択され；並びに／又は
（ｉｉ）前記第１の接続要素及び前記第２の接続要素は、１，２，３－トリアゾール結合、ジヒドロピリダジン結合、ピリダジン結合及びスルフィド結合から独立して選択される、請求項１に記載のコンジュゲート。

【請求項3】

Ｂ細胞エピトープの配列を含む少なくとも１つのポリペプチド及びＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープの配列を含む少なくとも１つのポリペプチドを含むコンジュゲートが投与された対象において、前記ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープに対するＣＤ４＋Ｔ細胞応答の存在を決定する方法であって、
（ａ）前記コンジュゲートの投与前に、前記対象に由来するサンプル中における前記コンジュゲートに特異的な抗体の量又は不存在を検出するステップであって、前記抗体の前記量又は前記不存在は、第１のレベルで検出される、ステップ；及び
（ｂ）前記コンジュゲートの１回以上の投与後、前記対象に由来するサンプル中における前記コンジュゲートに特異的な抗体の量又は不存在を検出するステップであって、前記抗体の前記量又は前記不存在は、第２のレベルで検出される、ステップ
を含み、前記第１のレベルでの前記抗体の前記量又は前記不存在と比較した前記第２のレベルでの前記抗体の前記量の増加は、前記対象における前記ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープに対するＣＤ４＋Ｔ細胞応答の存在を示す、方法。

【請求項4】

ステップ（ｂ）は、前記コンジュゲートの２回以上の投与、好ましくは前記コンジュゲートの３回以上の投与、より好ましくは前記コンジュゲートの４回の投与後、対象に由来するサンプル中における前記コンジュゲートに特異的な抗体の量又は不存在を検出することを含む、請求項３に記載の方法。

【請求項5】

前記コンジュゲートに特異的な前記抗体は、前記Ｂ細胞エピトープに特異的な抗体である、請求項３又は４に記載の方法。

【請求項6】

Ｂ細胞エピトープの配列を含む前記少なくとも１つのポリペプチドは、Ｂ細胞エピトープの配列を含む第１及び第２のポリペプチド、好ましくはＢ細胞エピトープの配列を含む第１、第２及び第３のポリペプチドである、請求項１若しくは２に記載のコンジュゲート又は請求項３～５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項7】

前記Ｂ細胞エピトープは、
（ｉ）配列番号３において連続する少なくとも１０個のアミノ酸を含む配列、好ましくは配列番号５において連続する少なくとも１０個のアミノ酸を含む配列；又は
（ｉｉ）（ｉ）に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する配列
から選択される配列を含む、請求項１、２若しくは６に記載のコンジュゲート又は請求項３～６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項8】

前記Ｂ細胞エピトープは、
（ｉ）配列番号５において連続しており、及び配列表の配列番号６によって表されるアミノ酸配列ＧＩＴＥＬＫＫＬを含む少なくとも１０個のアミノ酸を含む配列；又は
（ｉ）（ｉ）に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する配列
から選択される配列を含む、請求項７に記載のコンジュゲート又は方法。

【請求項9】

前記Ｂ細胞エピトープは、
（ｉ）配列番号７；又は
（ｉｉ）（ｉ）に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する配列
から選択される配列を含む、請求項８に記載のコンジュゲート又は方法。

【請求項10】

前記ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープは、自己抗原若しくは腫瘍関連抗原の少なくとも１２個のアミノ酸の領域又は前記領域に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含み、前記ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープの前記配列を含む前記少なくとも１つのポリペプチドは、５００アミノ酸以下の長さであり、好ましくは、前記自己抗原又は前記腫瘍関連抗原は、ユニバーサル腫瘍抗原である、請求項３～９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項11】

前記ユニバーサル腫瘍抗原は、テロメラーゼ逆転写酵素、サバイビン、ＤＮＡトポイソメラーゼ２－アルファ、シトクロムＰ４５０ １Ｂ１及びＥ３ユビキチン－タンパク質リガーゼＭｄｍ２からなる群から選択される、請求項１、２若しくは６～９のいずれか一項に記載のコンジュゲート又は請求項１０に記載の方法。

【請求項12】

前記ユニバーサル腫瘍抗原は、テロメラーゼ逆転写酵素であり、前記ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープは、
（ｉ）配列番号１；
（ｉｉ）配列番号１１６；
（ｉｉｉ）配列番号１１７；
（ｉｖ）少なくとも１２個のアミノ酸を含む、（ｉ）、（ｉｉ）若しくは（ｉｉｉ）の免疫原性断片の配列；及び／又は
（ｖ）（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）若しくは（ｉｖ）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列
から選択される１つ以上の配列を含む、請求項１１に記載のコンジュゲート又は方法。

【請求項13】

前記ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープの前記配列を含む前記少なくとも１つのポリペプチドは、さらなるＴ細胞エピトープの配列を含み、前記さらなるＴ細胞エピトープは、さらなるＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープ及び／又はＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープである、請求項１、２、６～９、１１若しくは１２のいずれか一項に記載のコンジュゲート又は請求項３～１２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項14】

前記コンジュゲートは、さらなる物質を含み、好ましくは、前記さらなる物質は、エピトープの配列を含むさらなるポリペプチドであり、より好ましくは、前記エピトープは、さらなるＴ細胞エピトープであり、より好ましくは、前記さらなるＴ細胞エピトープは、さらなるＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープ及び／又はＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープである、請求項１、２、６～９若しくは１１～１３のいずれか一項に記載のコンジュゲート又は請求項３～１３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項15】

前記ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープは、
（ｉ）配列番号１；
（ｉｉ）少なくとも１２個のアミノ酸を含む、（ｉ）の免疫原性断片の配列；又は
（ｉｉｉ）（ｉ）若しくは（ｉｉ）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列
から選択される配列を含み、
前記さらなるＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープは、
（ｉｖ）配列番号１１６；
（ｖ）少なくとも１２個のアミノ酸を含む、（ｉｖ）の免疫原性断片の配列；又は
（ｖｉ）（ｉｖ）若しくは（ｖ）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列
から選択される配列を含む、請求項１３又は１４に記載のコンジュゲート又は方法。

【請求項16】

第１及び第２の異なるコンジュゲートを含むコンジュゲートのカクテルであって、前記第１のコンジュゲート及び／又は前記第２のコンジュゲートは、請求項１、２、６～９又は１１～１５のいずれか一項に記載のコンジュゲートである、カクテル。

【請求項17】

前記第１のコンジュゲートは、
（ｉ）配列番号１；
（ｉｉ）少なくとも１２個のアミノ酸を含む、（ｉ）の免疫原性断片の配列；又は
（ｉｉｉ）（ｉ）若しくは（ｉｉ）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列
から選択される配列を含むＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープを含み、
前記第２のコンジュゲートは、
（ｉｖ）配列番号１１６；
（ｖ）少なくとも１２個のアミノ酸を含む、（ｉｖ）の免疫原性断片の配列；又は
（ｖｉ）（ｉｖ）若しくは（ｖ）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列
から選択される配列を含むＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープを含む、請求項１６に記載のコンジュゲートのカクテル。

【請求項18】

請求項１の（ａ）に定義されたポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列、及び請求項１の（ｂ）に定義されたポリペプチドをコードする第２のヌクレオチド配列を含む核酸分子。

【請求項19】

ポリペプチドであって、
（ｉ）配列番号１１６；
（ｉｉ）（ｉ）に対して少なくとも９１％の配列同一性を有する配列；
（ｉｉｉ）配列番号１１７；又は
（ｉｖ）（ｉｉｉ）に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する配列
から選択される配列を含み、（ｉ）又は（ｉｉ）から選択される前記配列を含む前記ポリペプチドは、１００アミノ酸以下の長さであり、（ｉｉｉ）又は（ｉｖ）から選択される前記配列を含む前記ポリペプチドは、４０アミノ酸以下の長さである、ポリペプチド。

【請求項20】

（ｉ）又は（ｉｉ）から選択される前記配列を含む前記ポリペプチドは、７５又は５０アミノ酸以下の長さである、請求項１９に記載のポリペプチド。

【請求項21】

（ｉｉｉ）又は（ｉｖ）から選択される前記配列を含む前記ポリペプチドは、３５、３４、３３、３２又は３１アミノ酸以下の長さである、請求項１９に記載のポリペプチド。

【請求項22】

請求項１９～２１のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列からなる核酸分子。

【請求項23】

請求項１８又は２２に記載の核酸分子を含むベクター。

【請求項24】

第１の産物及び第２の産物を含む組み合わせであって、前記第１の産物は、以下の（ｉ）～（ｖ）：
（ｉ）配列番号１の配列を含むポリペプチド；
（ｉｉ）少なくとも８個のアミノ酸を含む、（ｉ）の免疫原性断片を含むポリペプチド；
（ｉｉｉ）（ｉ）又は（ｉｉ）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むポリペプチド；
（ｉｖ）（ｉ）～（ｉｉｉ）のいずれか１つに定義される前記ポリペプチドを含むコンジュゲート；
（ｖ）（ｉ）～（ｉｉｉ）のいずれか１つに定義されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列からなる核酸分子
から選択され、
前記第２の産物は、以下の（ｖｉ）～（ｘ）：
（ｖｉ）配列番号１１６の配列を含むポリペプチド；
（ｖｉｉ）少なくとも１７個のアミノ酸を含む、（ｖｉ）の免疫原性断片を含むポリペプチド；
（ｖｉｉｉ）（ｖｉ）又は（ｖｉｉ）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むポリペプチド；
（ｉｘ）（ｖｉ）～（ｖｉｉｉ）のいずれか１つに定義される前記ポリペプチドを含むコンジュゲート；
（ｘ）（ｖｉ）～（ｖｉｉｉ）のいずれか１つに定義されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列からなる核酸分子
から選択され、
前記第１の産物及び前記第２の産物は、任意選択により、以下の条件：
（ａ）前記第１の産物及び前記第２の産物は、単一のポリペプチドであり、前記第１の産物は、（ｉ）～（ｉｉｉ）のいずれか１つに定義されるとおりであり、並びに前記第２の産物は、（ｖｉ）～（ｖｉｉｉ）のいずれか１つに定義されるとおりである場合、前記単一のポリペプチドは、１７０アミノ酸以下の長さであること；
（ｂ）前記第１の産物及び前記第２の産物は、単一の産物であり、前記第１の産物は、（ｖ）に定義されるとおりであり、及び前記第２の産物は、（ｘ）に定義されるとおりである場合、前記単一の核酸分子は、１５００ヌクレオチド未満の長さであること
に従う単一の産物である、組み合わせ。

【請求項25】

ポリペプチドのカクテルを含み、前記第１の産物は、請求項２４の（ｉ）、（ｉｉ）又は（ｉｉｉ）に定義されるポリペプチドであり、前記第２の産物は、請求項２４の（ｖｉ）、（ｖｉｉ）又は（ｖｉｉｉ）に定義されるポリペプチドである、請求項２４に記載の組み合わせ。

【請求項26】

核酸分子のカクテルを含み、前記第１の産物は、請求項２４の（ｖ）に定義される核酸分子であり、及び前記第２の産物は、請求項２４の（ｘ）に定義される核酸分子である、請求項２４に記載の組み合わせ。

【請求項27】

前記若しくは各ポリペプチド又は前記若しくは各核酸分子は、さらなる物質に連結される、請求項１９若しくは２０に記載のポリペプチド、請求項２１に記載の核酸分子又は請求項２４～２６のいずれか一項に記載の組み合わせ。

【請求項28】

第２の産物と同時に、別個に又は連続的に投与することによる医薬における使用のための第１の産物であって、以下の（ｉ）～（ｖ）：
（ｉ）配列番号１の配列を含むポリペプチド；
（ｉｉ）少なくとも８個のアミノ酸を含む、（ｉ）の免疫原性断片を含むポリペプチド；
（ｉｉｉ）（ｉ）又は（ｉｉ）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むポリペプチド；
（ｉｖ）（ｉ）～（ｉｉｉ）のいずれか１つに定義される前記ポリペプチドを含むコンジュゲート；
（ｖ）（ｉ）～（ｉｉｉ）のいずれか１つに定義されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列からなる核酸分子
から選択され、
前記第２の産物は、以下の（ｖｉ）～（ｘ）：
（ｖｉ）配列番号１１６の配列を含むポリペプチド；
（ｖｉｉ）少なくとも１７個のアミノ酸を含む、（ｖｉ）の免疫原性断片を含むポリペプチド；
（ｖｉｉｉ）（ｖｉ）又は（ｖｉｉ）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むポリペプチド；
（ｉｘ）（ｖｉ）～（ｖｉｉｉ）のいずれか１つに定義される前記ポリペプチドを含むコンジュゲート；
（ｘ）（ｖｉ）～（ｖｉｉｉ）のいずれか１つに定義されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列からなる核酸分子
から選択され、
前記第１の産物及び前記第２の産物は、任意選択により、以下の条件：
（ａ）前記第１の産物及び前記第２の産物は、単一のポリペプチドであり、前記第１の産物は、（ｉ）～（ｉｉｉ）のいずれか１つに定義されるとおりであり、並びに前記第２の産物は、（ｖｉ）～（ｖｉｉｉ）のいずれか１つに定義されるとおりである場合、前記単一のポリペプチドは、１７０アミノ酸以下の長さであること；
（ｂ）前記第１の産物及び前記第２の産物は、単一の産物であり、前記第１の産物は、（ｖ）に定義されるとおりであり、及び前記第２の産物は、（ｘ）に定義されるとおりである場合、前記単一の核酸分子は、１５００ヌクレオチド以下の長さであること
に従う単一の産物である、第１の産物。

【請求項29】

第１の産物と同時に、別個に又は連続的に投与することによる医薬における使用のための第２の産物であって、以下の（ｉ）～（ｖ）：
（ｉ）配列番号１１６の配列を含むポリペプチド；
（ｉｉ）少なくとも１７個のアミノ酸を含む、（ｉ）の免疫原性断片を含むポリペプチド；
（ｉｉｉ）（ｉ）又は（ｉｉ）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むポリペプチド；
（ｉｖ）（ｉ）～（ｉｉｉ）のいずれか１つに定義される前記ポリペプチドを含むコンジュゲート；
（ｖ）（ｉ）～（ｉｉｉ）のいずれか１つに定義されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列からなる核酸分子
から選択され、
前記第１の産物は、以下の（ｖｉ）～（ｘ）：
（ｖｉ）配列番号１の配列を含むポリペプチド；
（ｖｉｉ）少なくとも８個のアミノ酸を含む、（ｖｉ）の免疫原性断片を含むポリペプチド；
（ｖｉｉｉ）（ｖｉ）又は（ｖｉｉ）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むポリペプチド；
（ｉｘ）（ｖｉ）～（ｖｉｉｉ）のいずれか１つに定義される前記ポリペプチドを含むコンジュゲート；
（ｘ）（ｖｉ）～（ｖｉｉｉ）のいずれか１つに定義されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列からなる核酸分子
から選択され、
前記第２の産物及び前記第１の産物は、任意選択により、以下の条件：
（ａ）前記第２の産物及び前記第１の産物は、単一のポリペプチドであり、前記第２の産物は、（ｉ）～（ｉｉｉ）のいずれか１つに定義されるとおりであり、並びに前記第１の産物は、（ｖｉ）～（ｖｉｉｉ）のいずれか１つに定義されるとおりである場合、前記単一のポリペプチドは、１７０アミノ酸以下の長さであること；
（ｂ）前記第２の産物及び前記第１の産物は、単一の産物であり、前記第２の産物は、（ｖ）に定義されるとおりであり、及び前記第１の産物は、（ｘ）に定義されるとおりである場合、前記単一の核酸分子は、１５００ヌクレオチド以下の長さであること
に従う単一の産物である、第２の産物。

【請求項30】

医薬における使用のための、請求項１、２、６～９若しくは１１～１５のいずれか一項に記載のコンジュゲート、請求項１６若しくは１７に記載のコンジュゲートのカクテル、請求項１８、２１若しくは２７に記載の核酸分子、請求項１９、２０若しくは２７に記載のポリペプチド又は請求項２４～２７のいずれか一項に記載の組み合わせ。

【請求項31】

癌の治療又は予防における使用のための、請求項２８に記載の第１の産物、請求項２９に記載の第２の産物又は請求項３０に記載のコンジュゲート、コンジュゲートのカクテル、核酸分子、ポリペプチド若しくは組み合わせ。

【請求項32】

請求項１、２、６～９若しくは１１～１５のいずれか一項に記載のコンジュゲート、請求項１６若しくは１７に記載のコンジュゲートのカクテル、請求項１８、２１若しくは２７に記載の核酸分子、請求項１９、２０若しくは２７に記載のポリペプチド又は請求項２４～２７のいずれか一項に記載の組み合わせ、並びに薬学的に許容される希釈剤、賦形剤又はアジュバント及び任意選択により別の治療成分を含む医薬組成物。

【請求項33】

コアであって、
本体部分；
前記本体部分に結合された１つ以上の第１の連結基；及び
前記本体部分に結合された１つ以上の第２の連結基
を含み、
前記第１の連結基及び第２の連結基は、互いに直交しており、
前記第１の連結基及び前記第２の連結基の少なくとも１つは、２つ以上の第１の連結基又は第２の連結基を含み、並びに
前記第１の連結基及び前記第２の連結基は、アルキン（例えば、末端アルキン）、アルケン（例えば、末端アルケン、ノルボルネン）、シクロアルキン、トランスシクロアルケン、テトラジン、共役ジエン、マレイミド、α－ハロカルボニル、チオール及びアジドから独立して選択され；好ましくは、前記第１の連結基及び前記第２の連結基は、アルキン（例えば、末端アルキン）、シクロアルキン、マレイミド及びα－ハロカルボニルから独立して選択され；より好ましくは、前記第１の連結基及び前記第２の連結基は、アルキン（例えば、末端アルキン）、シクロアルキン及びα－ハロカルボニルから独立して選択され；
前記コアは、

【化1】

【化2】

ではない、コア。

【請求項34】

前記本体部分は、式１及び２：

【化3】

【化4】

の１つによって表され、
式１において、
Ｌ_１１及びＬ_１２は、リンカーであり；
Ｒ_１３は、水素、ヒドロキシ、任意選択により置換されたアミノ、ハロゲン、任意選択により置換されたアルキル、－Ｓ－（任意選択により置換されたアルキル）、任意選択により置換されたシクロアルキル、任意選択により置換されたヘテロシクロアルキル、任意選択により置換されたアルコキシ、任意選択により置換されたアルカノイル、任意選択により置換されたアリール及び任意選択により置換されたヘテロアリールから選択され；
ａ１１は、前記炭素原子に結合された［（Ｌ_１１）－^＊］基の数を表し、及び１、２又は３から選択され；
ａ１２は、前記炭素原子に結合された［（Ｌ_１２）－^＊＊］基の数を表し、及び１、２又は３から選択され；
ａ１３は、前記炭素原子に結合されたＲ_１３基の数を表し、及び０又は１から選択され；
ａ１１＋ａ１２＋ａ１３は、４であり；
^＊は、前記第１の連結基への接続点を表し；
^＊＊は、前記第２の連結基への接続点を表し；
式２において、
ＡＡは、アミノ酸を表し；
ｎは、独立して選択されるＡＡ基の数を表し、及び１～１２から選択され；
Ｌ_２１及びＬ_２２は、リンカーであり；
Ｒ_２３は、水素、ヒドロキシ、任意選択により置換されたアミノ、任意選択により置換されたアルキル、－Ｓ－（任意選択により置換されたアルキル）、任意選択により置換されたシクロアルキル、任意選択により置換されたヘテロシクロアルキル、任意選択により置換されたアルコキシ、任意選択により置換されたアルカノイル、任意選択により置換されたアリール及び任意選択により置換されたヘテロアリールから選択され；
ａ２１は、［（ＡＡ）］_ｎに結合された［（Ｌ_２１）－^＊］基の数を表し、及び１、２又は３から選択され；
ａ２２は、［（ＡＡ）］_ｎに結合された［（Ｌ_２２）－^＊＊］基の数を表し、及び１、２又は３から選択され；
ａ２３は、Ｃ末端及び／又はＮ末端で［（ＡＡ）］_ｎに結合されたＲ_２３基の数を表し、及び０、１又は２から選択され；
^＊は、前記ＡＡ基の１つのＮ末端、Ｃ末端又は側鎖を介した前記第１の連結基への接続点を表し；
^＊＊は、前記ＡＡ基の１つのＮ末端、Ｃ末端又は側鎖を介した前記第２の連結基への接続点を表す、請求項２若しくは請求項２に従属する請求項６～９若しくは１１～１５のいずれか一項に記載のコンジュゲート又は請求項３３に記載のコア。

【請求項35】

Ｌ_１１、Ｌ_１２、Ｌ_２１及びＬ_２２は、－（任意選択により置換されたアルキレン）－、－Ｏ－、－（ＣＯＮＨ）－、－（ＮＨＣＯ）－、－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－、－（ＣＯ）－、－（任意選択により置換されたアルキレン）－Ｏ－、－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＣＯＮＨ）－、－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＮＨＣＯ）－、－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－、－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＣＯ）－、－Ｏ－（任意選択により置換されたアルキレン）－、－Ｏ－（ＣＯＮＨ）－、－Ｏ－（ＮＨＣＯ）－、－Ｏ－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－、－Ｏ－（ＣＯ）－、－（ＣＯＮＨ）－（任意選択により置換されたアルキレン）－、－（ＣＯＮＨ）－Ｏ－、－（ＣＯＮＨ）－（ＮＨＣＯ）－、－（ＣＯＮＨ）－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－、－（ＣＯＮＨ）－（ＣＯ）－、－（ＮＨＣＯ）－（任意選択により置換されたアルキレン）－、－（ＮＨＣＯ）－Ｏ－、－（ＮＨＣＯ）－（ＣＯＮＨ）－、－（ＮＨＣＯ）－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－、－（ＮＨＣＯ）－（ＣＯ）－、－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－（任意選択により置換されたアルキレン）－、－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－Ｏ－、－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－（ＣＯＮＨ）－、－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－（ＮＨＣＯ）－、－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－（ＣＯ）－、－（ＣＯ）－（任意選択により置換されたアルキレン）、－（ＣＯ）－Ｏ－、－（ＣＯ）－（ＣＯＮＨ）－、－（ＣＯ）－（ＮＨＣＯ）－、－（ＣＯ）－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－、－（ＣＯ）－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＣＯ）－、－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＮＨＣＯ）－（任意選択により置換されたアルキレン）－、－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＣＯＮＨ）－（任意選択により置換されたアルキレン）－、－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＮＨＣＯ）－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－（任意選択により置換されたアルキレン）－、－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＣＯＮＨ）－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－（任意選択により置換されたアルキレン）－、－（任意選択により置換されたアルキレン）－Ｏ－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＮＨＣＯ）－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－（任意選択により置換されたアルキレン）－、－（任意選択により置換されたアルキレン）－Ｏ－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＣＯＮＨ）－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－（任意選択により置換されたアルキレン）－、－（ＣＯＮＨ）－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＣＯＮＨ）－Ｏ－、－（ＮＨＣＯ）－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＣＯＮＨ）－Ｏ－、－（ＣＯＮＨ）－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＮＨＣＯ）－Ｏ－、－（ＮＨＣＯ）－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＮＨＣＯ）－Ｏ－、－（ＣＯＮＨ）－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＣＯＮＨ）－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＣＯ）－、－（ＮＨＣＯ）－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＣＯＮＨ）－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＣＯ）－、－（ＣＯＮＨ）－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＮＨＣＯ）－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＣＯ）－、－（ＮＨＣＯ）－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＮＨＣＯ）－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＣＯ）－から独立して選択される、請求項２若しくは請求項２に従属する請求項６～９若しくは１１～１５のいずれか一項に記載のコンジュゲート又は請求項３３又は３４に記載のコア。

【請求項36】

前記本体部分は、式２によって表される、請求項２若しくは請求項２に従属する請求項６～９若しくは１１～１５のいずれか一項に記載のコンジュゲート又は請求項３３～３５のいずれか一項に記載のコア。

【請求項37】

前記コアは、前記本体部分に結合された第３の連結基をさらに含み、前記第３の連結基は、前記第１の連結基及び前記第２の連結基に直交しており；好ましくは、前記第３の連結基は、アルキン（例えば、末端アルキン）、アルケン（例えば、末端アルケン、ノルボルネン）、シクロアルキン、トランスシクロアルケン、テトラジン、共役ジエン、マレイミド、α－ハロカルボニル、チオール及びアジドから独立して選択される、請求項２若しくは請求項２に従属する請求項６～９若しくは１１～１５のいずれか一項に記載のコンジュゲート又は請求項３３～３６のいずれか一項に記載のコア。

【請求項38】

コンジュゲートであって、
（ａ）Ｂ細胞エピトープの配列を含む少なくとも１つのポリペプチド；又は
（ｂ）ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープの配列を含む少なくとも１つのポリペプチド
を含み、
Ｂ細胞エピトープの配列を含む前記少なくとも１つのポリペプチド又はＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープの配列を含む前記少なくとも１つのポリペプチドは、コアに連結され、前記コアは、連結前に、
本体部分；
前記本体部分に結合された１つ以上の第１の連結基；及び
前記本体部分に結合された１つ以上の第２の連結基
を含み、
前記第１の連結基及び第２の連結基は、互いに直交しており、
前記コアは、

【化5】

ではなく；
前記第１の連結基は、Ｂ細胞エピトープの配列を含む前記少なくとも１つのポリペプチドに連結されて第１の接続要素を形成するか、又は前記第２の連結基は、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープの配列を含む前記少なくとも１つのポリペプチドに連結されて第２の接続要素を形成し；
好ましくは、前記コアは、請求項３３～３７のいずれか一項に記載のものである、コンジュゲート。

【請求項39】

（ａ）Ｂ細胞エピトープの配列を含む少なくとも１つのポリペプチド；及び
（ｂ）ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープの配列を含む少なくとも１つのポリペプチド
を含み、前記第１の連結基は、Ｂ細胞エピトープの配列を含む前記少なくとも１つのポリペプチドに連結されて第１の接続要素を形成し、及び前記第２の連結基は、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープの配列を含む前記少なくとも１つのポリペプチドに連結されて第２の接続要素を形成する、請求項３８に記載のコンジュゲート。

【請求項40】

コンジュゲートを製造するプロセスであって、
（ａ）コアであって、
本体部分；
前記本体部分に結合された１つ以上の第１の連結基；及び
前記本体部分に結合された１つ以上の第２の連結基
を含むコアを提供するステップであって、
前記第１の連結基及び第２の連結基は、互いに直交しており、
前記第１の連結基及び前記第２の連結基の少なくとも１つは、２つ以上の第１の連結基又は第２の連結基を含み、並びに
前記第１の連結基及び前記第２の連結基は、アルキン（例えば、末端アルキン）、アルケン（例えば、末端アルケン、ノルボルネン）、シクロアルキン、シクロアルケン、テトラジン、共役ジエン、マレイミド、α－ハロカルボニル、チオール及びアジドから独立して選択され；好ましくは、前記第１の連結基及び前記第２の連結基は、アルキン（例えば、末端アルキン）、シクロアルキン、マレイミド及びα－ハロカルボニルから独立して選択され；より好ましくは、前記第１の連結基及び前記第２の連結基は、アルキン（例えば、末端アルキン）、シクロアルキン及びα－ハロカルボニルから独立して選択され；
前記コアは、

【化6】

ではなく、好ましくは、前記コアは、請求項３３～３７のいずれか一項に記載のものである、ステップ；
（ｂ）Ｂ細胞エピトープの配列を含む少なくとも１つのポリペプチド又はＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープの配列を含む少なくとも１つのポリペプチドを提供し；及び前記コアを、Ｂ細胞エピトープの配列を含む前記少なくとも１つのポリペプチドと反応させて第１の接続要素を形成するか、又は前記コアを、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープの配列を含む前記少なくとも１つのポリペプチドと反応させて第２の接続要素を形成するステップ
を含むプロセス。

【請求項41】

（ｃ）ステップ（ｂ）で提供されない、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープの配列を含む少なくとも１つのポリペプチド又はＢ細胞エピトープの配列を含む少なくとも１つのポリペプチドの他方を提供し；及び前記第１の接続要素がステップ（ｂ）で形成された場合、前記コアを、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープの配列を含む前記少なくとも１つのポリペプチドと反応させて第２の接続要素を形成するか；又は前記第２の接続要素がステップ（ｂ）で形成された場合、前記コアを、Ｂ細胞エピトープの配列を含む前記少なくとも１つのポリペプチドと反応させて第１の接続要素を形成するステップ
をさらに含む、請求項４０に記載のプロセス。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

発明の分野
本発明は、コンジュゲート、ポリペプチド、核酸分子及びベクターに関する。本発明は、第１の産物と第２の産物とを含む組み合わせ及びコンジュゲートのカクテルにも関する。本発明は、コンジュゲート、コンジュゲートのカクテル、核酸分子、ポリペプチド又は組み合わせを含む医薬組成物にも関する。加えて、本発明は、医薬における使用のためのコンジュゲート、コンジュゲートのカクテル、核酸分子、ポリペプチド、組み合わせ、第１の産物又は第２の産物に関する。さらに、本発明は、コア、中間コンジュゲート及びコンジュゲートを製造するプロセスに関する。本発明は、コンジュゲートが投与された対象において、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープに対するＣＤ４＋Ｔ細胞応答の存在を決定する方法にも関する。

【背景技術】

【0002】

発明の背景
癌は、個体内の細胞の新たな、異常な及び／又は制御されない増殖を特徴とする不均一な疾患である。典型的には、異なるタイプの癌間及び同じタイプの癌を有する個人間で高度な多様性が存在する。したがって、患者集団にわたって効果的な癌治療を提供することは、困難である。

【0003】

癌の治療のために多くのアプローチが提案されている。１つのアプローチは、腫瘍関連抗原の断片を含む抗原ペプチドを含むものなどの癌ワクチンの提供である。このような抗原ペプチドは、個体に投与されると、腫瘍関連抗原を発現する細胞に対するＣＤ８＋（ＭＨＣクラスＩ拘束性）又はＣＤ４＋（ＭＨＣクラスＩＩ拘束性）Ｔ細胞応答を誘発することができる。

【0004】

国際公開第２０１１／１０１１７３号は、癌の治療のためのヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）からの様々なポリペプチドを開示してる。国際公開第２０１７／２０７８１４号は、癌の治療のための免疫チェックポイント阻害剤と組み合わせたｈＴＥＲＴからのポリペプチドをさらに開示している。

【0005】

さらなる抗原性ポリペプチド（及びそのようなペプチドをコードする核酸分子）を含むさらなる抗癌治療を提供する必要性が依然として存在する。

【0006】

国際公開第２０１１／１１５４８３号は、抗原、免疫原又は抗原若しくは免疫原を含むビヒクルにコンジュゲートされた、破傷風毒素（ＴＴｘ）由来のペプチドを含むワクチンコンジュゲートに関する。

【0007】

特に西側諸国では、大多数の人が人生の早い段階で破傷風のワクチン接種を受けているため、ヒト集団には、ＴＴｘに対する循環抗体が多くの場合に存在する。世界保健機関によると、２０１５年には、世界中の乳児の約８６％が破傷風のワクチン接種を受けた。破傷風ワクチンは、タンパク質をホルマリンで処理して、ＴＴｘを解毒することによって調製される破傷風トキソイド（ＴＴｄ）を含む。ＴＴｄは、ＴＴｘの修飾形態である（したがって異なるタンパク質である）が、ＴＴｄは、破傷風に対する防御免疫を誘導することができ、これは、ＴＴｄワクチン接種によって生じた抗体がＴＴｘを認識することを意味する。ＴＴｄは、３つの感染性疾患（ジフテリア、百日咳（pertussis）（百日咳（whooping cough））及び破傷風）に対する小児用ＤＴＰ混合ワクチンに使用される。さらに、破傷風感染の潜在的原因が疑われる傷害後の抗破傷風ワクチン接種は、一般的な手順であり、一部の国では１０年ごとの追加刺激を受けることが推奨されているため、多くの人が後年になってＴＴｄを投与されている。その結果、先進国の人口の大部分に抗ＴＴｘ／ＴＴｄ抗体が存在している。

【0008】

個体内の循環抗体は、ＴＴｘ由来のペプチドに結合し、強力な免疫応答を提供するために、そのコンジュゲートを抗原提示細胞（ＡＰＣ）に標的化すると考えられている。国際公開第２０１１／１１５４８３号は、ＴＴｘに由来する様々なペプチドを開示している。癌に関連する抗原を含むコンジュゲートの具体的な例又はデータは、提示されていない。

【0009】

Mangsbo et al. Mol Immunol. 2018 Jan; 93: 115-124は、１８量体ペプチド配列を含む、ＴＴｘに由来するペプチドを開示してる。オボアルブミン（ＯＶＡ）由来のＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ又はヒト糖タンパク質１００（ｈｇｐ１００）由来のＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープにコンジュゲートした１８量体の破傷風エピトープを含むペプチドコンジュゲートが構築された。

【0010】

Fletcher et al. J Immunol. 2018 Jul 1; 201(1): 87-97は、Mangsbo et al. 2018に記載されているＴＴｘ由来の１８量体ペプチド配列を開示してる。ＣＭＶ又はインフルエンザのいずれかからのＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを含む合成長鎖ペプチドにコンジュゲートした１８量体の破傷風エピトープを含むコンジュゲートが構築された。

【0011】

ＣＤ８＋及び／又はＣＤ４＋Ｔ細胞応答が起こるには、抗原性ポリペプチドがＭＨＣ分子上に提示されなければならないことを理解されたい。ＭＨＣクラスＩ分子は、大半の細胞の表面に存在し、典型的には長さが８～１０アミノ酸残基のポリペプチドに結合する。ＭＨＣクラスＩ分子は、ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘発するために、タンパク質分解によるサイトゾルタンパク質に由来するポリペプチドをＣＤ８＋Ｔ細胞（細胞傷害性Ｔ細胞又はＣＴＬとしても知られる）に提示する。対照的に、ＭＨＣクラスＩＩ分子は、抗原提示細胞及び活性化Ｔ細胞の表面に存在し、一般的により長い、典型的には１２～２４アミノ酸の長さのポリペプチドに結合する。ＭＨＣクラスＩＩ分子は、ＣＤ４＋Ｔ細胞応答を誘発するために、エンドサイトーシスによって内在化され、消化された細胞外タンパク質に由来するポリペプチドをＣＤ４＋Ｔ細胞（他にヘルパーＴ細胞又はＴｈ細胞としても知られている）に提示する。

【0012】

ヒト集団内のＭＨＣ分子には広範囲のばらつきがある。特に、異なる個体は、異なるＨＬＡ対立遺伝子（すなわちヒトＭＨＣ分子をコードする）を有し、これらは、ポリペプチドのアミノ酸配列に応じて、ポリペプチドに対する様々な結合親和性を有する。したがって、１つの特定のＨＬＡ対立遺伝子を有する個体は、特定の配列のポリペプチドに結合するＭＨＣ分子を有し得るが、ＨＬＡ対立遺伝子を欠く他の個体は、ＭＨＣ分子がそのポリペプチドに結合し、それを提示することができない（又は少なくともそのＭＨＣ分子は、ポリペプチドに対する親和性が非常に低いために比較的低レベルで存在する）。

【0013】

抗原性ポリペプチド（及びそのようなポリペプチドをコードする核酸分子）並びに個人及び／又は集団の大部分にわたって有効な免疫応答を誘発するそのような成分を含むさらなるアプローチの必要性が依然として存在する。さらに、そのような免疫応答をモニタリングする方法も依然として必要とされている。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0014】

本発明は、上記の問題の１つ以上を軽減することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0015】

発明の概要
本発明の態様は、Ｂ細胞エピトープの配列を含むポリペプチドと、ｈＴＥＲＴなどのユニバーサル腫瘍抗原からのＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープの配列を含むポリペプチドとを含むコンジュゲートの特性を同定することから生じたものである。このようなコンジュゲートが個体に投与されると、Ｂ細胞エピトープを認識する抗体（既存のもの（例えば、Ｂ細胞エピトープによる以前のワクチン接種によるもの）又はコンジュゲートの投与により生じたもののいずれか）により、抗体媒介性のコンジュゲートの取り込みが生じる。これは、二重の効果を有する：第一に、コンジュゲートのＢ細胞エピトープに特異的なさらなる抗体産生を伴う正のフィードバックメカニズム；第二に、樹状細胞によるＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞へのＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープの提示である。活性化されたＣＤ４＋Ｔ細胞は、ユニバーサル腫瘍抗原を発現する腫瘍細胞に特異的であり、正のフィードバック機構がＣＤ４＋Ｔ細胞活性化のメカニズムを駆動するため、抗腫瘍ＣＤ４＋Ｔ細胞免疫応答の送達に特に効果的である。

【0016】

本発明の他の態様は、この二重効果の別の結果が、コンジュゲートのＢ細胞エピトープに特異的な抗体の抗体力価（個人について比較的容易に決定できる）がコンジュゲートのＴ細胞エピトープに特異的な活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞のレベルを示すことであるという観察から生じたものである（そうでなければ個人について決定することが困難である）。

【0017】

本発明の他の態様は、上記のコンジュゲートのＢ細胞エピトープ及びＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープを連結するために使用できるコアの特定の構造の同定から生じたものである。

【0018】

本発明の他の態様は、ｈＴＥＲＴタンパク質配列の特定のポリペプチドが特に多数の臨床関連エピトープを含有し、したがって集団の広範な割合で免疫応答を誘導できるワクチンにおける使用に適しているであろうという観察から生じたものである。

【0019】

本発明の第１の態様によれば、コンジュゲートであって、
（ａ）Ｂ細胞エピトープの配列を含む少なくとも１つのポリペプチド；及び
（ｂ）ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープの配列を含む少なくとも１つのポリペプチドであって、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープは、ユニバーサル腫瘍抗原の少なくとも１２個のアミノ酸の領域又はその領域に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含み、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープは、集団の少なくとも５０％において免疫原性であり、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープの配列を含む少なくとも１つのポリペプチドは、５００アミノ酸以下の長さである、少なくとも１つのポリペプチド
を含み、
Ｂ細胞エピトープの配列は、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープの配列と異なり、
Ｂ細胞エピトープに特異的な抗体は、コンジュゲートに結合する、コンジュゲートが提供される。

【0020】

好都合には、Ｂ細胞エピトープの配列を含む少なくとも１つのポリペプチド及びＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープの配列を含む少なくとも１つのポリペプチドは、コアを介して連結され、
コアは、連結前に、
本体部分；
本体部分に結合された１つ以上の第１の連結基；及び
本体部分に結合された１つ以上の第２の連結基
を含み、
第１の連結基及び第２の連結基は、互いに直交しており、
第１の連結基は、Ｂ細胞エピトープの配列を含む少なくとも１つのポリペプチドに連結されて第１の接続要素を形成し、及び第２の連結基は、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープの配列を含む少なくとも１つのポリペプチドに連結されて第２の接続要素を形成する。

【0021】

好ましくは、第１の連結基及び第２の連結基は、アルキン（例えば、末端アルキン）、アルケン（例えば、末端アルケン、ノルボルネン）、シクロアルキン、トランスシクロアルケン、テトラジン、共役ジエン、マレイミド、α－ハロカルボニル、チオール及びアジドから独立して選択され；並びに／又は第１の接続要素及び第２の接続要素は、１，２，３－トリアゾール結合、ジヒドロピリダジン結合、ピリダジン結合及びスルフィド結合から独立して選択される。

【0022】

本発明の第２の態様によれば、Ｂ細胞エピトープの配列を含む少なくとも１つのポリペプチド及びＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープの配列を含む少なくとも１つのポリペプチドを含むコンジュゲートが投与された対象において、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープに対するＣＤ４＋Ｔ細胞応答の存在を決定する方法であって、
（ａ）コンジュゲートの投与前に、対象に由来するサンプル中におけるＢ細胞エピトープに特異的な抗体の量又は不存在を検出するステップであって、抗体の量又は不存在は、第１のレベルで検出される、ステップ；及び
（ｂ）コンジュゲートの１回以上の投与後、対象に由来するサンプル中におけるＢ細胞エピトープに特異的な抗体の量又は不存在を検出するステップであって、抗体の量又は不存在は、第２のレベルで検出される、ステップ
を含み、第１のレベルでの抗体の量又は不存在と比較した第２のレベルでの抗体の量の増加は、対象におけるＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープに対するＣＤ４＋Ｔ細胞応答の存在を示す、方法が提供される。

【0023】

好ましくは、ステップ（ｂ）は、コンジュゲートの２回以上の投与、好ましくはコンジュゲートの３回以上の投与、より好ましくはコンジュゲートの４回の投与後、対象に由来するサンプル中におけるＢ細胞エピトープに特異的な抗体の量又は不存在を検出することを含む。

【0024】

好都合には、Ｂ細胞エピトープの配列を含む少なくとも１つのポリペプチドは、Ｂ細胞エピトープの配列を含む第１及び第２のポリペプチド、好ましくはＢ細胞エピトープの配列を含む第１、第２及び第３のポリペプチドである。

【0025】

有利には、Ｂ細胞エピトープは、
（ｉ）配列番号３において連続する少なくとも１０個のアミノ酸を含む配列、好ましくは配列番号５において連続する少なくとも１０個のアミノ酸を含む配列；又は
（ｉｉ）（ｉ）に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する配列
から選択される配列を含む。

【0026】

好ましくは、Ｂ細胞エピトープは、
（ｉ）配列番号５において連続しており、及び配列表の配列番号６によって表されるアミノ酸配列ＧＩＴＥＬＫＫＬを含む少なくとも１０個のアミノ酸を含む配列；又は
（ｉ）（ｉ）に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する配列
から選択される配列を含む。

【0027】

好都合には、Ｂ細胞エピトープは、
（ｉ）配列番号７；又は
（ｉｉ）（ｉ）に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する配列
から選択される配列を含む。

【0028】

有利には、本発明の第２の態様では、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープは、自己抗原若しくは腫瘍関連抗原の少なくとも１２個のアミノ酸の領域又はその領域に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含み、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープの配列を含む少なくとも１つのポリペプチドは、５００アミノ酸以下の長さであり、好ましくは、自己抗原又は腫瘍関連抗原は、ユニバーサル腫瘍抗原である。

【0029】

代わりに、本発明の第２の態様では、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープは、内在性タンパク質又はウイルス若しくは細菌タンパク質の少なくとも１２個のアミノ酸の領域を含む。好ましくは、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープは、細胞内タンパク質の少なくとも１２個のアミノ酸の領域を含む。

【0030】

好都合には、ユニバーサル腫瘍抗原は、テロメラーゼ逆転写酵素、サバイビン、ＤＮＡトポイソメラーゼ２－アルファ、シトクロムＰ４５０ １Ｂ１及びＥ３ユビキチン－タンパク質リガーゼＭｄｍ２からなる群から選択される。

【0031】

好ましくは、ユニバーサル腫瘍抗原は、テロメラーゼ逆転写酵素であり、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープは、
（ｉ）配列番号１；
（ｉｉ）配列番号１１６；
（ｉｉｉ）配列番号１１７；
（ｉｖ）少なくとも１２個のアミノ酸を含む、（ｉ）、（ｉｉ）若しくは（ｉｉｉ）の免疫原性断片の配列；及び／又は
（ｖ）（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）若しくは（ｉｖ）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列
から選択される１つ以上の配列を含む。

【0032】

有利には、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープの配列を含む少なくとも１つのポリペプチドは、さらなるＴ細胞エピトープの配列を含み、さらなるＴ細胞エピトープは、さらなるＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープ及び／又はＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープである。

【0033】

好都合には、コンジュゲートは、さらなる物質を含む。

【0034】

好ましくは、さらなる物質は、エピトープの配列を含むさらなるポリペプチドであり、より好ましくは、エピトープは、さらなるＴ細胞エピトープであり、より好ましくは、さらなるＴ細胞エピトープは、さらなるＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープ及び／又はＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープである。

【0035】

有利には、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープは、
（ｉ）配列番号１；
（ｉｉ）少なくとも１２個のアミノ酸を含む、（ｉ）の免疫原性断片の配列；又は
（ｉｉｉ）（ｉ）若しくは（ｉｉ）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列
から選択される配列を含み、
さらなるＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープは、
（ｉｖ）配列番号１１６；
（ｖ）少なくとも１２個のアミノ酸を含む、（ｉｖ）の免疫原性断片の配列；又は
（ｖｉ）（ｉｖ）若しくは（ｖ）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列
から選択される配列を含む。

【0036】

本発明の第３の態様によれば、第１及び第２の異なるコンジュゲートを含むコンジュゲートのカクテルが提供され、第１のコンジュゲート及び／又は第２のコンジュゲートは、それぞれ本発明のコンジュゲートである。

【0037】

好都合には、第１のコンジュゲートは、
（ｉ）配列番号１；
（ｉｉ）少なくとも１２個のアミノ酸を含む、（ｉ）の免疫原性断片の配列；又は
（ｉｉｉ）（ｉ）若しくは（ｉｉ）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列
から選択される配列を含むＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープを含み、
第２のコンジュゲートは、
（ｉｖ）配列番号１１６；
（ｖ）少なくとも１２個のアミノ酸を含む、（ｉｖ）の免疫原性断片の配列；又は
（ｖｉ）（ｉｖ）若しくは（ｖ）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列
から選択される配列を含むＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープを含む。

【0038】

有利には、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープは、集団の少なくとも６０％、好ましくは集団の少なくとも６５％において免疫原性である。

【0039】

好都合には、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープは、集団内に存在する以下のＨＬＡ対立遺伝子の１つ以上と結合する：ＨＬＡ－ＤＲＢ１^＊１５、ＨＬＡ－ＤＲＢ１^＊０７、ＨＬＡ－ＤＲＢ１^＊０４、ＨＬＡ－ＤＱＢ１^＊０６、ＨＬＡ－ＤＱＢ１^＊０３、ＨＬＡ－ＤＱＢ１^＊０５、ＨＬＡ－ＤＰＢ１^＊０４及び／又はＨＬＡ－ＤＰＢ１^＊０１。

【0040】

本発明の第４の態様によれば、コンジュゲートであって、
（ａ）Ｂ細胞エピトープの配列を含む少なくとも１つのポリペプチド；及び
（ｂ）ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープの配列を含む少なくとも１つのポリペプチドであって、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープは、
（ｉ）配列番号１；
（ｉｉ）配列番号１１６；
（ｉｉｉ）配列番号１１７；
（ｉｖ）少なくとも１２個のアミノ酸を含む、（ｉ）、（ｉｉ）若しくは（ｉｉｉ）の免疫原性断片の配列；及び／又は
（ｖ）（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）若しくは（ｉｖ）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列
から選択される１つ以上の配列を含む、少なくとも１つのポリペプチド
を含み、
Ｂ細胞エピトープの配列は、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープの配列と異なり、
Ｂ細胞エピトープに特異的な抗体は、コンジュゲートに結合する、コンジュゲートが提供される。

【0041】

本発明の第５の態様によれば、本発明のＢ細胞エピトープの配列を含むポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列及び／又は本発明のＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープの配列を含むポリペプチドをコードする第２のヌクレオチド配列を含む分子が提供される。

【0042】

好ましくは、分子は、核酸分子である。

【0043】

本発明の第６の態様によれば、ポリペプチドであって、
（ｉ）配列番号１１６；
（ｉｉ）（ｉ）に対して少なくとも９１％の配列同一性を有する配列；
（ｉｉｉ）配列番号１１７；又は
（ｉｖ）（ｉｉｉ）に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する配列
から選択される配列を含み、（ｉ）又は（ｉｉ）から選択される配列を含むポリペプチドは、１７０アミノ酸以下の長さであり、（ｉｉｉ）又は（ｉｖ）から選択される配列を含むポリペプチドは、４０アミノ酸以下の長さである、ポリペプチドが提供される。

【0044】

有利には、（ｉ）又は（ｉｉ）から選択される配列を含むポリペプチドは、１５０、１２５、１００、７５又は５０アミノ酸以下の長さである。

【0045】

代わりに、（ｉｉｉ）又は（ｉｖ）から選択される配列を含むポリペプチドは、３５、３４、３３、３２又は３１アミノ酸以下の長さである。

【0046】

本発明の第７の態様によれば、本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列からなる核酸分子が提供される。

【0047】

本発明の第８の態様によれば、本発明の核酸分子を含むベクターが提供される。

【0048】

本発明の第９の態様によれば、第１の産物及び第２の産物を含む組み合わせであって、第１の産物は、以下の（ｉ）～（ｖ）：
（ｉ）配列番号１の配列を含むポリペプチド；
（ｉｉ）少なくとも８個のアミノ酸を含む、（ｉ）の免疫原性断片を含むポリペプチド；
（ｉｉｉ）（ｉ）又は（ｉｉ）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むポリペプチド；
（ｉｖ）（ｉ）～（ｉｉｉ）のいずれか１つに定義されるポリペプチドを含むコンジュゲート；
（ｖ）（ｉ）～（ｉｉｉ）のいずれか１つに定義されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列からなる核酸分子
から選択され、
第２の産物は、以下の（ｖｉ）～（ｘ）：
（ｖｉ）配列番号１１６の配列を含むポリペプチド；
（ｖｉｉ）少なくとも１７個のアミノ酸を含む、（ｖｉ）の免疫原性断片を含むポリペプチド；
（ｖｉｉｉ）（ｖｉ）又は（ｖｉｉ）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むポリペプチド；
（ｉｘ）（ｖｉ）～（ｖｉｉｉ）のいずれか１つに定義されるポリペプチドを含むコンジュゲート；
（ｘ）（ｖｉ）～（ｖｉｉｉ）のいずれか１つに定義されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列からなる核酸分子
から選択され、
第１の産物及び第２の産物は、任意選択により、以下の条件：
（ａ）第１の産物及び第２の産物は、単一のポリペプチドであり、第１の産物は、（ｉ）～（ｉｉｉ）のいずれか１つに定義されるとおりであり、並びに第２の産物は、（ｖｉ）～（ｖｉｉｉ）のいずれか１つに定義されるとおりである場合、単一のポリペプチドは、１７０アミノ酸以下の長さであること；
（ｂ）第１の産物及び第２の産物は、単一の産物であり、第１の産物は、（ｖ）に定義されるとおりであり、及び第２の産物は、（ｘ）に定義されるとおりである場合、単一の核酸分子は、１５００ヌクレオチド未満の長さであること
に従う単一の産物である、組み合わせが提供される。

【0049】

好ましくは、組み合わせは、ポリペプチドのカクテルを含み、第１の産物は、上記（ｉ）、（ｉｉ）又は（ｉｉｉ）に定義されるポリペプチドであり、第２の産物は、上記（ｖｉ）、（ｖｉｉ）又は（ｖｉｉｉ）に定義されるポリペプチドである。

【0050】

有利には、組み合わせは、核酸分子のカクテルを含み、第１の産物は、上記（ｖ）に定義される核酸分子であり、及び第２の産物は、上記（ｘ）に定義される核酸分子である。

【0051】

好都合には、その若しくは各ポリペプチド又はその若しくは各核酸分子は、さらなる物質に連結される。

【0052】

本発明の第１０の態様によれば、第２の産物と同時に、別個に又は連続的に投与することによる医薬における使用のための第１の産物であって、以下の（ｉ）～（ｖ）：
（ｉ）配列番号１の配列を含むポリペプチド；
（ｉｉ）少なくとも８個のアミノ酸を含む、（ｉ）の免疫原性断片を含むポリペプチド；
（ｉｉｉ）（ｉ）又は（ｉｉ）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むポリペプチド；
（ｉｖ）（ｉ）～（ｉｉｉ）のいずれか１つに定義されるポリペプチドを含むコンジュゲート；
（ｖ）（ｉ）～（ｉｉｉ）のいずれか１つに定義されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列からなる核酸分子
から選択され、
第２の産物は、以下の（ｖｉ）～（ｘ）：
（ｖｉ）配列番号１１６の配列を含むポリペプチド；
（ｖｉｉ）少なくとも１７個のアミノ酸を含む、（ｖｉ）の免疫原性断片を含むポリペプチド；
（ｖｉｉｉ）（ｖｉ）又は（ｖｉｉ）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むポリペプチド；
（ｉｘ）（ｖｉ）～（ｖｉｉｉ）のいずれか１つに定義されるポリペプチドを含むコンジュゲート；
（ｘ）（ｖｉ）～（ｖｉｉｉ）のいずれか１つに定義されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列からなる核酸分子
から選択され、
第１の産物及び第２の産物は、任意選択により、以下の条件：
（ａ）第１の産物及び第２の産物は、単一のポリペプチドであり、第１の産物は、（ｉ）～（ｉｉｉ）のいずれか１つに定義されるとおりであり、並びに第２の産物は、（ｖｉ）～（ｖｉｉｉ）のいずれか１つに定義されるとおりである場合、単一のポリペプチドは、１７０アミノ酸以下の長さであること；
（ｂ）第１の産物及び第２の産物は、単一の産物であり、第１の産物は、（ｖ）に定義されるとおりであり、及び第２の産物は、（ｘ）に定義されるとおりである場合、単一の核酸分子は、１５００ヌクレオチド以下の長さであること
に従う単一の産物である、第１の産物が提供される。

【0053】

本発明の第１１の態様によれば、第１の産物と同時に、別個に又は連続的に投与することによる医薬における使用のための第２の産物であって、以下の（ｉ）～（ｖ）：
（ｉ）配列番号１１６の配列を含むポリペプチド；
（ｉｉ）少なくとも１７個のアミノ酸を含む、（ｉ）の免疫原性断片を含むポリペプチド；
（ｉｉｉ）（ｉ）又は（ｉｉ）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むポリペプチド；
（ｉｖ）（ｉ）～（ｉｉｉ）のいずれか１つに定義されるポリペプチドを含むコンジュゲート；
（ｖ）（ｉ）～（ｉｉｉ）のいずれか１つに定義されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列からなる核酸分子
から選択され、
第１の産物は、以下の（ｖｉ）～（ｘ）：
（ｖｉ）配列番号１の配列を含むポリペプチド；
（ｖｉｉ）少なくとも８個のアミノ酸を含む、（ｖｉ）の免疫原性断片を含むポリペプチド；
（ｖｉｉｉ）（ｖｉ）又は（ｖｉｉ）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むポリペプチド；
（ｉｘ）（ｖｉ）～（ｖｉｉｉ）のいずれか１つに定義されるポリペプチドを含むコンジュゲート；
（ｘ）（ｖｉ）～（ｖｉｉｉ）のいずれか１つに定義されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列からなる核酸分子
から選択され、
第２の産物及び第１の産物は、任意選択により、以下の条件：
（ａ）第２の産物及び第１の産物は、単一のポリペプチドであり、第２の産物は、（ｉ）～（ｉｉｉ）のいずれか１つに定義されるとおりであり、並びに第１の産物は、（ｖｉ）～（ｖｉｉｉ）のいずれか１つに定義されるとおりである場合、単一のポリペプチドは、１７０アミノ酸以下の長さであること；
（ｂ）第２の産物及び第１の産物は、単一の産物であり、第２の産物は、（ｖ）に定義されるとおりであり、及び第１の産物は、（ｘ）に定義されるとおりである場合、単一の核酸分子は、１５００ヌクレオチド以下の長さであること
に従う単一の産物である、第２の産物が提供される。

【0054】

本発明の第１２の態様によれば、医薬における使用のための、本発明のコンジュゲート、本発明のコンジュゲートのカクテル、本発明の核酸分子、本発明のポリペプチド又は本発明の組み合わせが提供される。

【0055】

好ましくは、第１の産物、第２の産物、コンジュゲート、コンジュゲートのカクテル、核酸分子、ポリペプチド又は組み合わせは、癌の治療又は予防における使用のためのものである。

【0056】

本発明の第１３の態様によれば、本発明のコンジュゲート、本発明のコンジュゲートのカクテル、本発明の核酸分子、本発明のポリペプチド又は本発明の組み合わせ並びに薬学的に許容される希釈剤、賦形剤又はアジュバント及び任意選択により別の治療成分を含む医薬組成物が提供される。

【0057】

好都合には、医薬組成物は、医学、好ましくは癌の治療又は予防における使用のためのものである。

【0058】

好ましくは、本発明のコンジュゲート、本発明のコンジュゲートのカクテル、前述のものを含む本発明の組み合わせ若しくは医薬組成物又は前述もののいずれかをコードする本発明の核酸分子は、Ｂ細胞エピトープに対するＢ細胞応答を誘導するワクチンが投与された対象における使用のためのものである。

【0059】

有利には、Ｂ細胞エピトープに対するＢ細胞応答を誘導するワクチンは、対象に少なくとも２回投与されている。

【0060】

好都合には、Ｂ細胞エピトープに対するＢ細胞応答を誘導するワクチンは、破傷風ワクチンである。

【0061】

本発明の第１４の態様によれば、本発明のコンジュゲート、本発明のコンジュゲートのカクテル、本発明の核酸分子、本発明のポリペプチド、本発明の組み合わせ及び／又は本発明の医薬組成物を治療有効量で投与することを含む、対象における癌の治療又は予防方法が提供される。

【0062】

本発明の第１５の態様によれば、第１の産物を第２の産物と同時に、別個に又は連続的に投与することを含む、患者における癌の治療又は予防方法であって、第１の産物は、以下の（ｉ）～（ｖ）：
（ｉ）配列番号１の配列を含むポリペプチド；
（ｉｉ）少なくとも８個のアミノ酸を含む、（ｉ）の免疫原性断片を含むポリペプチド；
（ｉｉｉ）（ｉ）又は（ｉｉ）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むポリペプチド；
（ｉｖ）（ｉ）～（ｉｉｉ）のいずれか１つに定義されるポリペプチドを含むコンジュゲート；
（ｖ）（ｉ）～（ｉｉｉ）のいずれか１つに定義されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列からなる核酸分子
から選択され、
第２の産物は、以下の（ｖｉ）～（ｘ）：
（ｖｉ）配列番号１１６の配列を含むポリペプチド；
（ｖｉｉ）少なくとも１７個のアミノ酸を含む、（ｖｉ）の免疫原性断片を含むポリペプチド；
（ｖｉｉｉ）（ｖｉ）又は（ｖｉｉ）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むポリペプチド；
（ｉｘ）（ｖｉ）～（ｖｉｉｉ）のいずれか１つに定義されるポリペプチドを含むコンジュゲート；
（ｘ）（ｖｉ）～（ｖｉｉｉ）のいずれか１つに定義されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列からなる核酸分子
から選択され、
第１の産物及び第２の産物は、任意選択により、以下の条件：
（ａ）第１の産物及び第２の産物は、単一のポリペプチドであり、第１の産物は、（ｉ）～（ｉｉｉ）のいずれか１つに定義されるとおりであり、並びに第２の産物は、（ｖｉ）～（ｖｉｉｉ）のいずれか１つに定義されるとおりである場合、単一のポリペプチドは、１７０アミノ酸以下の長さであること；
（ｂ）第１の産物及び第２の産物は、単一の産物であり、第１の産物は、（ｖ）に定義されるとおりであり、及び第２の産物は、（ｘ）に定義されるとおりである場合、単一の核酸分子は、１５００ヌクレオチド以下の長さであること
に従う単一の産物であり、第１の産物及び／又は第２の産物は、それぞれ治療有効量で投与される、方法が提供される。いくつかの実施形態では、第１の産物が第２の産物の前に投与され、他の実施形態では、第１の産物が第２の産物の後に投与される。

【0063】

好ましくは、Ｂ細胞エピトープの配列を含む少なくとも１つのポリペプチド及びＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープの配列を含む少なくとも１つのポリペプチドは、共有結合している。

【0064】

有利には、連結前に、第１の連結基及び第２の連結基の少なくとも１つは、２つ以上の第１の連結基又は第２の連結基を含む。

【0065】

好ましくは、連結前に、第１の連結基及び第２の連結基は、アルキン（例えば、末端アルキン）、アルケン（例えば、末端アルケン、ノルボルネン）、シクロアルキン、トランスシクロアルケン、テトラジン、共役ジエン、マレイミド、α－ハロカルボニル、チオール及びアジドから独立して選択され；より好ましくは、第１の連結基及び第２の連結基は、アルキン（例えば、末端アルキン）、シクロアルキン、マレイミド及びα－ハロカルボニルから独立して選択され；より好ましくは、第１の連結基及び第２の連結基は、アルキン（例えば、末端アルキン）、シクロアルキン及びα－ハロカルボニルから独立して選択される。

【0066】

好都合には、連結前に、Ｂ細胞エピトープの配列を含む少なくとも１つのポリペプチド及びＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープの配列を含む少なくとも１つのポリペプチドは、独立して、チオール基、アジド基、アルキン（例えば、末端アルキン）、アルケン（例えば、末端アルケン、ノルボルネン）、シクロアルキン、トランスシクロアルケン、テトラジン、共役ジエン、マレイミド及びα－ハロカルボニルを含む。好ましくは、Ｂ細胞エピトープの配列を含む少なくとも１つのポリペプチド及びＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープの配列を含む少なくとも１つのポリペプチドは、独立して、チオール基又はアジド基を含む。

【0067】

有利には、第１の接続要素及び第２の接続要素は、１，２，３－トリアゾール結合、ジヒドロピリダジン結合、ピリダジン結合及びスルフィド結合（例えば、チオール－エン反応から形成される）から独立して選択される。第１の接続要素及び第２の接続要素は、１，２，３－トリアゾール結合及びスルフィド結合から独立して選択されることが特に好ましい。

【0068】

好ましくは、第１の接続要素及び第２の接続要素は、

【化1】

から独立して選択され、式中、
Ｘ_１は、－（ＣＨ_２）_ａｘ１１－及び－（ＣＨ_２）_ａｘ１２－Ｘ_１２－から選択され；
Ｘ_１２は、Ｏ、ＮＲ_１２又はＳから選択され；
Ｒ_１２は、水素、任意選択により置換されたアルキル、任意選択により置換されたシクロアルキル、任意選択により置換されたヘテロシクロアルキル、任意選択により置換されたアリール及び任意選択により置換されたヘテロアリール；好ましくは水素及び任意選択により置換されたアルキルから選択され；
Ｘ_２は、Ｎ又はＣＨから選択され；
ａｘ１１及びａｘ１２は、０～１２から独立して選択され、
波線は、Ｂ細胞エピトープの配列を含む少なくとも１つのポリペプチド又はＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープ及び／又はコアの配列を含む少なくとも１つのポリペプチドへの接続点を表す。

【0069】

本発明の第１６の態様によれば、コアであって、
本体部分；
本体部分に結合された１つ以上の第１の連結基；及び
本体部分に結合された１つ以上の第２の連結基
を含み、
第１の連結基及び第２の連結基は、互いに直交しており、
第１の連結基及び第２の連結基の少なくとも１つは、２つ以上の第１の連結基又は第２の連結基を含み、並びに
第１の連結基及び第２の連結基は、アルキン（例えば、末端アルキン）、アルケン（例えば、末端アルケン、ノルボルネン）、シクロアルキン、トランスシクロアルケン、テトラジン、共役ジエン、マレイミド、α－ハロカルボニル、チオール及びアジドから独立して選択され；好ましくは、第１の連結基及び第２の連結基は、アルキン（例えば、末端アルキン）、シクロアルキン、マレイミド及びα－ハロカルボニルから独立して選択され；より好ましくは、第１の連結基及び第２の連結基は、アルキン（例えば、末端アルキン）、シクロアルキン及びα－ハロカルボニルから独立して選択され；
コアは、

【化2】

【化3】

ではない、コアが提供される。

【0070】

好ましくは、コアは、２つ又は３つの第１の連結基、好ましくは３つの第１の連結基を含む。

【0071】

好都合には、コアは、１つ又は２つの第２の連結基、好ましくは１つの第２の連結基を含む。

【0072】

有利には、第１の連結基及び第２の連結基は、

【化4】

から独立して選択され、
Ｘ_１２は、Ｏ、ＮＲ_１２又はＳであり；
Ｒ_１２は、水素、任意選択により置換されたアルキル、任意選択により置換されたシクロアルキル、任意選択により置換されたヘテロシクロアルキル、任意選択により置換されたアリール及び任意選択により置換されたヘテロアリール；好ましくは水素及び任意選択により置換されたアルキルから選択され；
ａｘ１１及びａｘ１２は、０～１２から独立して選択される。

【0073】

好ましくは、本体部分は、式１及び２：

【化5】

【化6】

の１つによって表され、
式１において、
Ｌ_１１及びＬ_１２は、リンカーであり；
Ｒ_１３は、水素、ヒドロキシ、任意選択により置換されたアミノ、ハロゲン、任意選択により置換されたアルキル、－Ｓ－（任意選択により置換されたアルキル）、任意選択により置換されたシクロアルキル、任意選択により置換されたヘテロシクロアルキル、任意選択により置換されたアルコキシ、任意選択により置換されたアルカノイル、任意選択により置換されたアリール及び任意選択により置換されたヘテロアリールから選択され；
ａ１１は、炭素原子に結合された［（Ｌ_１１）－^＊］基の数を表し、及び１、２又は３から選択され；
ａ１２は、炭素原子に結合された［（Ｌ_１２）－^＊＊］基の数を表し、及び１、２又は３から選択され；
ａ１３は、炭素原子に結合されたＲ_１３基の数を表し、及び０又は１から選択され；
ａ１１＋ａ１２＋ａ１３は、４であり；
^＊は、第１の連結基への接続点を表し；
^＊＊は、第２の連結基への接続点を表し；
式２において、
ＡＡは、アミノ酸を表し；
ｎは、独立して選択されるＡＡ基の数を表し、及び１～１２から選択され；
Ｌ_２１及びＬ_２２は、リンカーであり；
Ｒ_２３は、水素、ヒドロキシ、任意選択により置換されたアミノ、任意選択により置換されたアルキル、－Ｓ－（任意選択により置換されたアルキル）、任意選択により置換されたシクロアルキル、任意選択により置換されたヘテロシクロアルキル、任意選択により置換されたアルコキシ、任意選択により置換されたアルカノイル、任意選択により置換されたアリール及び任意選択により置換されたヘテロアリールから選択され；
ａ２１は、［（ＡＡ）］_ｎに結合された［（Ｌ_２１）－^＊］基の数を表し、及び１、２又は３から選択され；
ａ２２は、［（ＡＡ）］_ｎに結合された［（Ｌ_２２）－^＊＊］基の数を表し、及び１、２又は３から選択され；
ａ２３は、Ｃ末端及び／又はＮ末端で［（ＡＡ）］_ｎに結合されたＲ_２３基の数を表し、及び０、１又は２から選択され；
^＊は、ＡＡ基の１つのＮ末端、Ｃ末端又は側鎖を介した第１の連結基への接続点を表し；
^＊＊は、ＡＡ基の１つのＮ末端、Ｃ末端又は側鎖を介した第２の連結基への接続点を表す。

【0074】

本発明の第１７の態様によれば、本発明の第１の態様によるコンジュゲート又は本発明の第２の態様によるコアであって、本体部分は、式１及び２：

【化7】

【化8】

の１つによって表され、
式１において、
Ｌ_１１及びＬ_１２は、リンカーであり；
Ｒ_１３は、水素、ヒドロキシ、任意選択により置換されたアミノ、ハロゲン、任意選択により置換されたアルキル、－Ｓ－（任意選択により置換されたアルキル）、任意選択により置換されたシクロアルキル、任意選択により置換されたヘテロシクロアルキル、任意選択により置換されたアルコキシ、任意選択により置換されたアルカノイル、任意選択により置換されたアリール及び任意選択により置換されたヘテロアリールから選択され；
ａ１１は、炭素原子に結合された［（Ｌ_１１）－^＊］基の数を表し、及び１、２又は３から選択され；
ａ１２は、炭素原子に結合された［（Ｌ_１２）－^＊＊］基の数を表し、及び１、２又は３から選択され；
ａ１３は、炭素原子に結合されたＲ_１３基の数を表し、及び０又は１から選択され；
ａ１１＋ａ１２＋ａ１３は、４であり；
^＊は、第１の連結基への接続点を表し；
^＊＊は、第２の連結基への接続点を表し；
式２において、
ＡＡは、アミノ酸を表し；
ｎは、独立して選択されるＡＡ基の数を表し、及び１～１２から選択され；
Ｌ_２１及びＬ_２２は、リンカーであり；
Ｒ_２３は、水素、ヒドロキシ、任意選択により置換されたアミノ、任意選択により置換されたアルキル、－Ｓ－（任意選択により置換されたアルキル）、任意選択により置換されたシクロアルキル、任意選択により置換されたヘテロシクロアルキル、任意選択により置換されたアルコキシ、任意選択により置換されたアルカノイル、任意選択により置換されたアリール及び任意選択により置換されたヘテロアリールから選択され；
ａ２１は、［（ＡＡ）］_ｎに結合された［（Ｌ_２１）－^＊］基の数を表し、及び１、２又は３から選択され；
ａ２２は、［（ＡＡ）］_ｎに結合された［（Ｌ_２２）－^＊＊］基の数を表し、及び１、２又は３から選択され；
ａ２３は、Ｃ末端及び／又はＮ末端で［（ＡＡ）］_ｎに結合されたＲ_２３基の数を表し、及び０、１又は２から選択され；
^＊は、ＡＡ基の１つのＮ末端、Ｃ末端又は側鎖を介した第１の連結基への接続点を表し；
^＊＊は、ＡＡ基の１つのＮ末端、Ｃ末端又は側鎖を介した第２の連結基への接続点を表す、コンジュゲート又はコアが提供される。

【0075】

好都合には、本体部分は、式２によって表される。

【0076】

好ましくは、Ｌ_１１、Ｌ_１２、Ｌ_２１及びＬ_２２は、－（任意選択により置換されたアルキレン）－、－Ｏ－、－（ＣＯＮＨ）－、－（ＮＨＣＯ）－、－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－、－（ＣＯ）－、－（任意選択により置換されたアルキレン）－Ｏ－、－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＣＯＮＨ）－、－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＮＨＣＯ）－、－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－、－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＣＯ）－、－Ｏ－（任意選択により置換されたアルキレン）－、－Ｏ－（ＣＯＮＨ）－、－Ｏ－（ＮＨＣＯ）－、－Ｏ－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－、－Ｏ－（ＣＯ）－、－（ＣＯＮＨ）－（任意選択により置換されたアルキレン）－、－（ＣＯＮＨ）－Ｏ－、－（ＣＯＮＨ）－（ＮＨＣＯ）－、－（ＣＯＮＨ）－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－、－（ＣＯＮＨ）－（ＣＯ）－、－（ＮＨＣＯ）－（任意選択により置換されたアルキレン）－、－（ＮＨＣＯ）－Ｏ－、－（ＮＨＣＯ）－（ＣＯＮＨ）－、－（ＮＨＣＯ）－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－、－（ＮＨＣＯ）－（ＣＯ）－、－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－（任意選択により置換されたアルキレン）－、－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－Ｏ－、－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－（ＣＯＮＨ）－、－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－（ＮＨＣＯ）－、－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－（ＣＯ）－、－（ＣＯ）－（任意選択により置換されたアルキレン）、－（ＣＯ）－Ｏ－、－（ＣＯ）－（ＣＯＮＨ）－、－（ＣＯ）－（ＮＨＣＯ）－、－（ＣＯ）－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－、－（ＣＯ）－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＣＯ）－、－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＮＨＣＯ）－（任意選択により置換されたアルキレン）－、－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＣＯＮＨ）－（任意選択により置換されたアルキレン）－、－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＮＨＣＯ）－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－（任意選択により置換されたアルキレン）－、－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＣＯＮＨ）－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－（任意選択により置換されたアルキレン）－、－（任意選択により置換されたアルキレン）－Ｏ－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＮＨＣＯ）－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－（任意選択により置換されたアルキレン）－、－（任意選択により置換されたアルキレン）－Ｏ－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＣＯＮＨ）－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－（任意選択により置換されたアルキレン）－、－（ＣＯＮＨ）－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＣＯＮＨ）－Ｏ－、－（ＮＨＣＯ）－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＣＯＮＨ）－Ｏ－、－（ＣＯＮＨ）－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＮＨＣＯ）－Ｏ－、－（ＮＨＣＯ）－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＮＨＣＯ）－Ｏ－、－（ＣＯＮＨ）－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＣＯＮＨ）－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＣＯ）－、－（ＮＨＣＯ）－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＣＯＮＨ）－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＣＯ）－、－（ＣＯＮＨ）－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＮＨＣＯ）－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＣＯ）－、－（ＮＨＣＯ）－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＮＨＣＯ）－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＣＯ）－から独立して選択される。

【0077】

好都合には、式２による本体部分は、任意選択により置換されたアミノ基を含む側鎖を有する１つ以上のＡＡ基を含む。好ましくは、アミノ基を含む側鎖は、－（任意選択により置換されたアルキレン）－（任意選択により置換されたアミノ）基であり得る。

【0078】

有利には、アミノ基を含む側鎖は、１つ以上のリジン基、好ましくは３つのリジン基を含み得る。

【0079】

好ましくは、ｎは、２～１０、好ましくは２～６、より好ましくは３又は４、さらにより好ましくは３である。

【0080】

有利には、Ｃ末端に接続されたＲ_２３基は、ヒドロキシ、任意選択により置換されたアミノ及び任意選択により置換されたアルコキシ；好ましくはヒドロキシ及び任意選択により置換されたアミノ；より好ましくは任意選択により置換されたアミノから選択される。

【0081】

好ましくは、第１の連結基への接続点は、ＡＡ基の１つの側鎖を介するものである。

【0082】

好都合には、第１の連結基のそれぞれの接続点は、独立して選択されたＡＡ基の側鎖を介するものである。

【0083】

有利には、第２の連結基への接続点は、Ｎ末端を経由するものである。

【0084】

好ましくは、コアは、本体部分に結合された第３の連結基をさらに含み、第３の連結基は、第１の連結基及び第２の連結基に直交しており、より好ましくは、第３の連結基は、アルキン（例えば、末端アルキン）、アルケン（例えば、末端アルケン、ノルボルネン）、シクロアルキン、トランスシクロアルケン、テトラジン、共役ジエン、マレイミド、α－ハロカルボニル、チオール及びアジドから独立して選択される。

【0085】

好都合には、第３の連結基への接続点は、ＡＡ基の１つの側鎖（例えば、セリン基）を介するか又はＣ末端を介するものである。好ましくは、第３の連結基への接続点は、Ｃ末端を介する。

【0086】

本発明の第１８の態様によれば、コンジュゲートであって、
（ａ）Ｂ細胞エピトープの配列を含む少なくとも１つのポリペプチド；又は
（ｂ）ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープの配列を含む少なくとも１つのポリペプチド
を含み、
Ｂ細胞エピトープの配列を含む少なくとも１つのポリペプチド又はＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープの配列を含む少なくとも１つのポリペプチドは、コアに連結され、コアは、連結前に、
本体部分；
本体部分に結合された１つ以上の第１の連結基；及び
本体部分に結合された１つ以上の第２の連結基
を含み、
第１の連結基及び第２の連結基は、互いに直交しており、
コアは、

【化9】

ではなく；
第１の連結基は、Ｂ細胞エピトープの配列を含む少なくとも１つのポリペプチドに連結されて第１の接続要素を形成するか、又は第２の連結基は、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープの配列を含む少なくとも１つのポリペプチドに連結されて第２の接続要素を形成する、コンジュゲートが提供される。

【0087】

好ましくは、コンジュゲートであって、
（ａ）Ｂ細胞エピトープの配列を含む少なくとも１つのポリペプチド；及び
（ｂ）ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープの配列を含む少なくとも１つのポリペプチド
を含み、
第１の連結基は、Ｂ細胞エピトープの配列を含む少なくとも１つのポリペプチドに連結されて第１の接続要素を形成し、及び第２の連結基は、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープの配列を含む少なくとも１つのポリペプチドに連結されて第２の接続要素を形成する、コンジュゲートが提供される。

【0088】

好ましくは、コアは、上記のいずれか１つに定義されるとおりである。

【0089】

好都合には、Ｂ細胞エピトープ及び／又はＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープは、上記のいずれか１つに定義されるとおりである。

【0090】

本発明の第１９の態様によれば、コンジュゲートを製造するプロセスであって、
（ａ）Ｂ細胞エピトープの配列を含む少なくとも１つのポリペプチドを提供するステップ；及び
（ｂ）ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープの配列を含む少なくとも１つのポリペプチドを提供し、及びＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープの配列を含む少なくとも１つのポリペプチドを、Ｂ細胞エピトープの配列を含む少なくとも１つのポリペプチドに連結するステップ
を含み、
ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープは、ユニバーサル腫瘍抗原の少なくとも１２個のアミノ酸の領域又はその領域に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含み、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープは、集団の少なくとも５０％において免疫原性であり、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープの配列を含む少なくとも１つのポリペプチドは、５００アミノ酸以下の長さであり、
Ｂ細胞エピトープの配列は、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープの配列と異なり、
Ｂ細胞エピトープに特異的な抗体は、コンジュゲートに結合する、プロセスが提供される。

【0091】

好都合には、Ｂ細胞エピトープの配列を含む少なくとも１つのポリペプチド及びＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープの配列を含む少なくとも１つのポリペプチドは、コアを介して連結され、
コアは、連結前に、
本体部分；
本体部分に結合された１つ以上の第１の連結基；及び
本体部分に結合された１つ以上の第２の連結基
を含み、
第１の連結基及び第２の連結基は、互いに直交しており、
第１の連結基は、Ｂ細胞エピトープの配列を含む少なくとも１つのポリペプチドに連結されて第１の接続要素を形成し、及び第２の連結基は、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープの配列を含む少なくとも１つのポリペプチドに連結されて第２の接続要素を形成する。

【0092】

本発明の第２０の態様によれば、コンジュゲートを製造するプロセスであって、
（ａ）コアであって、
本体部分；
本体部分に結合された１つ以上の第１の連結基；及び
本体部分に結合された１つ以上の第２の連結基
を含むコアを提供するステップであって、
第１の連結基及び第２の連結基は、互いに直交しており、
第１の連結基及び第２の連結基の少なくとも１つは、２つ以上の第１の連結基又は第２の連結基を含み、及び
第１の連結基及び第２の連結基は、アルキン（例えば、末端アルキン）、アルケン（例えば、末端アルケン、ノルボルネン）、シクロアルキン、トランスシクロアルケン、テトラジン、共役ジエン、マレイミド、α－ハロカルボニル、チオール又はアジドから独立して選択され；好ましくは、第１の連結基及び第２の連結基は、アルキン（例えば、末端アルキン）、シクロアルキン、マレイミド及びα－ハロカルボニルから独立して選択され；より好ましくは、第１の連結基及び第２の連結基は、アルキン（例えば、末端アルキン）、シクロアルキン及びα－ハロカルボニルから独立して選択され；
コアは、

【化10】

ではなく、好ましくは、コアは、上記のいずれか１つに定義されるとおりである、ステップ；
（ｂ）Ｂ細胞エピトープの配列を含む少なくとも１つのポリペプチド又はＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープの配列を含む少なくとも１つのポリペプチドを提供し；及びコアを、Ｂ細胞エピトープの配列を含む少なくとも１つのポリペプチドと反応させて第１の接続要素を形成するか、又はコアを、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープの配列を含む少なくとも１つのポリペプチドと反応させて第２の接続要素を形成するステップ
を含むプロセスが提供される。

【0093】

好ましくは、プロセスは、
（ｃ）ステップ（ｂ）で提供されない、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープの配列を含む少なくとも１つのポリペプチド又はＢ細胞エピトープの配列を含む少なくとも１つのポリペプチドの他方を提供し；及び第１の接続要素がステップ（ｂ）で形成された場合、コアを、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープの配列を含む少なくとも１つのポリペプチドと反応させて第２の接続要素を形成するか；又は第２の接続要素がステップ（ｂ）で形成された場合、コアを、Ｂ細胞エピトープの配列を含む少なくとも１つのポリペプチドと反応させて第１の接続要素を形成するステップ
をさらに含む。

【0094】

本発明の第２１の態様によれば、ポリペプチドであって、
（ｉ）ＵＶ３６（配列番号１６６）、ＵＶ５７（配列番号１６７）、ＵＶ５８（配列番号１６８）、ＵＶ５９（配列番号１６９）、ＵＶ６０（配列番号１７０）、ＵＶ６４（配列番号１７１）、ＵＶ６５（配列番号１７２）又はＵＶ６６（配列番号１７３）の配列；
（ｉｉ）少なくとも８個のアミノ酸を含む、（ｉ）の免疫原性断片の配列；又は
（ｉｉｉ）（ｉ）又は（ｉｉ）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列
から選択される配列を含み、２５、２２、２０、１８、１５又は１０アミノ酸以下の長さであるポリペプチドが提供される。

【0095】

好ましくは、ポリペプチドは、配列番号１２６又は１７１の配列から構成されないか又はそれを含まない。

【0096】

本発明の第２２の態様によれば、本発明の第２１の態様によるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列からなる核酸分子が提供される。

【0097】

本発明の第２３の態様によれば、医薬における使用のための、好ましくは免疫応答の誘導のための、より好ましくは癌の治療又は予防のための、本発明の第２１の態様のポリペプチド又は本発明の第２２の態様の核酸分子が提供される。

【0098】

「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」という用語は、本明細書において互換的に使用され、アミノ酸残基（直鎖状、環状、部分環状又は多環状を含む）のポリマーを指す。この用語は、１つ以上のアミノ酸残基が修飾残基又は対応する天然に存在するアミノ酸の人工化学模倣物などの非天然残基である、アミノ酸ポリマー及び天然に存在するアミノ酸ポリマーに適用される。一実施形態では、この用語は、側鎖伸長を含むアミノ酸ポリマーも包含する。一実施形態では、主鎖及び／又は側鎖伸長は、アミド結合以外の結合を含む。一実施形態では、ポリペプチド又はその断片中の遮断基は、アミノ酸ではない。

【0099】

本明細書で使用される「アミノ酸」という用語は、天然存在するアミノ酸及び合成アミノ酸並びに天然に存在するアミノ酸と同様の機能を有するアミノ酸類似体及びアミノ酸模倣物を指す。天然に存在するアミノ酸は、遺伝コードによってコードされているもの及び細胞内で翻訳された後に修飾されたもの（例えば、ヒドロキシプロリン、ガンマ－カルボキシグルタミン酸、Ｏ－ホスホセリン）である。「アミノ酸類似体」という語句は、天然に存在するアミノ酸と同じ基本的な化学構造要素（水素、カルボキシ基、アミノ基及びＲ基に結合したアルファ炭素）を有するが、修飾されたＲ基又は修飾された骨格を有する化合物（例えば、ホモセリン、ベータ－アラニン、ＰＮＡ、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウム）を指す。「アミノ酸模倣物」という語句は、天然に存在するアミノ酸と構造が異なるが、機能が類似した化合物を指す。したがって、一実施形態では、アミノ酸類似体及び／又はアミノ酸模倣物は、構造の違いを有するにもかかわらず、天然に存在するアミノ酸のものと同様の生物学的特性を提供する。

【0100】

ポリペプチドに関して本明細書で使用される「断片」という用語は、ポリペプチドの一部を形成する連続した一連のアミノ酸を意味する。ポリペプチドの「免疫原性断片」は、対象に投与された場合、Ｔ細胞応答などの免疫応答を誘発することができる、以前に定義された断片である。一実施形態では、「免疫原性断片」は、対象に投与されると、ＣＤ４＋Ｔ細胞応答を誘発することができる。一実施形態では、「免疫原性断片」は、対象に投与された場合、ＣＤ４＋及び／又はＣＤ８＋Ｔ細胞免疫応答を誘発することができる。いくつかの実施形態では、免疫原性断片は、それが由来するポリペプチドの少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８又は２９個のアミノ酸を含む。

【0101】

「遺伝子」、「オリゴヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド」及び「核酸分子」という用語は、本明細書において互換的に使用され、複数のヌクレオチドのポリマーを指す。核酸分子は、天然に存在する核酸を含み得るか、又はペプチド核酸（ＰＮＡ）、モルホリノ（ＰＭＯ）及びロックド核酸並びにグリコール核酸及びトレオース核酸などの人工核酸を含み得る。「オリゴヌクレオチド」は、例えば、ポリマー骨格、非骨格修飾などの非核酸誘導体も含み得る。

【0102】

本明細書で使用される「ヌクレオチド」という用語は、天然に存在するヌクレオチド及び例えば細胞酵素によって認識される合成ヌクレオチド類似体を指す。

【0103】

本明細書で使用される「癌」及び「腫瘍」という用語は、新たな、異常な及び／又は制御されない増殖を示す対象における細胞の存在を指す。一実施形態では、細胞は、隣接する組織に浸潤する能力及び／又は体内の他の部位に伝播する能力を有する（すなわち、細胞は、転移することができる）。一実施形態では、癌細胞は、腫瘍（すなわち異常な組織塊）の形態である。本明細書で使用される「腫瘍」という用語には、良性及び悪性新生物の両方が含まれる。

【0104】

本明細書で使用される「治療」という用語は、任意の部分的又は完全な治療を指し、疾患又は症状を阻害すること、すなわちその発症を阻止すること；及び疾患又は症状を緩和すること、すなわち疾患又は症状の退行を引き起こすことを含む。

【0105】

本明細書で使用される「予防」という用語は、疾患の発症を防ぐために取られる方法を指す。一実施形態では、疾患は、癌である。

【0106】

本明細書で使用される「抗原」という用語は、対象において免疫応答を誘発することができる分子を指す。一実施形態では、「抗原」は、タンパク質若しくはポリペプチドであるか、又はタンパク質若しくはポリペプチドに由来する。一実施形態では、「抗原」は、抗体、Ｂ細胞受容体及び／又はＴ細胞受容体によって認識され得る。

【0107】

本明細書で使用される「エピトープ」という用語は、抗体、Ｂ細胞受容体及び／又はＴ細胞受容体によって認識される抗原の部分を指す。本明細書で使用される「エピトープ」という用語は、立体構造エピトープ（すなわち配列上、分離されているが、タンパク質の折り畳みによって一緒になっているアミノ酸残基から構成される）及び線状エピトープ（すなわちアミノ酸残基の線状配列である）を含む。

【0108】

本明細書で使用される「抗体」という用語は、特定の抗原に特異的に結合できる免疫グロブリン分子又はその断片を指す。本明細書で使用される「抗体」という用語には、免疫グロブリンの５つのクラス：免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥのいずれか１つから選択される抗体が含まれる。

【0109】

本明細書で使用される「Ｂ細胞」（「Ｂリンパ球」としても知られる）という用語は、細胞表面Ｂ細胞受容体を有する免疫系の細胞を指す。

【0110】

本明細書で使用される「Ｂ細胞エピトープ」という用語は、抗体及び／又はＢ細胞受容体が結合できる抗原内の部位を指す。一実施形態では、Ｂ細胞エピトープは、配列番号７の配列を含む（「最小破傷風毒素エピトープ」又は「ＭＴＴＥ」とも呼ばれる）。

【0111】

本明細書で使用される「Ｔ細胞」（「Ｔリンパ球」としても知られる）という用語は、細胞表面Ｔ細胞受容体を有する免疫系の細胞を指す。一実施形態では、「Ｔ細胞」という用語は、ＣＤ４＋Ｔ細胞（ヘルパーＴ細胞又はＴｈ細胞としても知られる）、ＣＤ８＋Ｔ細胞（細胞傷害性Ｔ細胞又はＣＴＬとしても知られる）、メモリーＴ細胞及び制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）などの異なるタイプのＴ細胞を含む。本明細書で使用される「ＣＤ４＋Ｔ細胞」という用語は、その細胞表面にＣＤ４糖タンパク質を含むＴ細胞を指す。本明細書で使用される「ＣＤ８＋Ｔ細胞」という用語は、その細胞表面にＣＤ８糖タンパク質を含むＴ細胞を指す。

【0112】

本明細書で使用される「Ｔ細胞エピトープ」という用語は、Ｔ細胞受容体によって認識することができる抗原内の部位を指す。Ｔ細胞受容体は、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子に関連してエピトープを認識する。

【0113】

本明細書で使用される「ＭＨＣ分子」という用語は、ポリペプチドとアセンブリし、細胞表面でＴ細胞に対してポリペプチドを提示することができるタンパク質構造を指す。ＭＨＣ分子は、主要な組織適合性複合体内の遺伝子によってコードされている。いくつかの実施形態では、「ＭＨＣ分子」という用語は、ＭＨＣクラスＩ分子及び／又はＭＨＣクラスＩＩ分子を指す。

【0114】

本明細書で使用される「ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）」という用語は、ヒト主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）を指す。主要なヒトＨＬＡクラスＩ遺伝子は、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－Ｃを含む。主要なヒトＨＬＡクラスＩＩ遺伝子は、ＨＬＡ－ＤＰＡ、ＨＬＡ－ＤＰＢ、ＨＬＡ－ＤＱＡ、ＨＬＡ－ＤＱＢ、ＨＬＡ－ＤＲＡ及びＨＬＡ－ＤＲＢを含む。本明細書で使用される「ＨＬＡ対立遺伝子」という用語は、ＨＬＡ遺伝子座に存在する遺伝子の別の形態を指す。

【0115】

本明細書で使用される「ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープ」という用語は、ＣＤ４＋Ｔ細胞によって認識することができるエピトープを指す。ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープ又はその一部は、ＭＨＣクラスＩＩ分子によって提示され、ＣＤ４＋Ｔ細胞のＴ細胞受容体に結合することができる。一実施形態では、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープは、配列番号１、１１６及び／又は１１７から選択される１つ以上の配列又はそれに対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む。さらなる実施形態では、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープは、少なくとも１２個のアミノ酸を含む、配列番号１、１１６及び／又は１１７の免疫原性断片を含む。

【0116】

本明細書で使用される「ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ」という用語は、ＣＤ８＋Ｔ細胞によって認識することができるエピトープを指す。ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ又はその一部は、ＭＨＣクラスＩ分子によって提示され、ＣＤ８＋Ｔ細胞のＴ細胞受容体に結合することができる。一実施形態では、ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープは、前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）に由来する。一実施形態では、ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープは、配列「ＮＰＩＬＬＷＱＰＩＰＶ」（配列番号１１９）を含む。さらなる実施形態では、ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープは、配列番号１５５～１５９から選択される配列を含む。

【0117】

本明細書で使用される「コンジュゲート」という用語は、２つ以上の成分、例えば、Ｂ細胞エピトープの配列を含むポリペプチドとＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープの配列を含むポリペプチドとの間の、カップリング又は連結を指す。一実施形態では、任意の２つの成分間の連結は、直接的な連結であり得る。代替的実施形態では、任意の２つの成分間の連結は、例えば、本明細書に定義されるコアによる間接的な連結であり得る。結合は、非共有結合（例えば、イオン結合、水素結合、疎水性相互作用、π－π相互作用、ファンデルワールス相互作用、親和性相互作用及びホスト－ゲスト相互作用の１つ以上の相互作用による）又は共有結合を介したものであり得る。好ましい実施形態では、連結は、共有結合である。

【0118】

本明細書で使用される「カクテル」という用語は、２つ以上の化合物の混合物を指す。一実施形態では、混合物中の化合物は、互いに連結又はカップリングしていない。いくつかの実施形態では、カクテルは、２つ以上の異なるポリペプチド、２つ以上の異なる核酸分子、２つ以上の異なるコンジュゲート及び／又はそれらの任意の組み合わせの混合物を含む。一実施形態では、ポリペプチド、核酸分子及び／又はコンジュゲートは、異なるアミノ酸配列又はヌクレオチド配列を含むという意味で異なる。

【0119】

本明細書で使用される「ユニバーサル腫瘍抗原」という用語は、高い割合の腫瘍タイプで発現される抗原を指す。一実施形態では、ユニバーサル腫瘍抗原は、少なくとも５０％、６０％若しくは７０％又は全ての腫瘍タイプで、より好ましくは全ての腫瘍タイプの少なくとも８０％、８５％又は９０％で発現される。さらなる実施形態では、ユニバーサル腫瘍抗原は、各腫瘍タイプ内の高い割合の患者でも発現される。一実施形態では、ユニバーサル腫瘍抗原は、一般に、各腫瘍タイプ内の患者の少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％又は９０％で発現される。一実施形態では、ユニバーサル腫瘍抗原は、発癌において直接的な役割を有する。一実施形態では、ユニバーサル腫瘍抗原は、テロメラーゼ逆転写酵素、サバイビン、ＤＮＡトポイソメラーゼ２－アルファ（Ｔｏｐ２α）、シトクロムＰ４５０ １Ｂ１（ＣＹＰ１Ｂ１）及びＥ３ユビキチン－タンパク質リガーゼＭｄｍ２からなる群から選択される。好ましくは、ユニバーサル腫瘍抗原は、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）である。

【0120】

本明細書で使用される「ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープは、集団の少なくとも５０％において免疫原性である」という語句は、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープが免疫応答を誘発することができる集団内の個体の割合を指す。一実施形態では、集団は、世界的集団である。すなわち、集団は、特定の地理的地域に限定されない。一実施形態では、集団は、特定の地理的範囲からの集団である。一実施形態では、集団は、ヨーロッパ集団、北アメリカ集団、南及び／又は中央アメリカ集団、北アフリカ、南アフリカ、東アフリカ、西アフリカ、中央アフリカ及び／又はサハラ以南のアフリカ集団、西インド諸島集団、西アジア、東アジア、北東アジア、南アジア、東南アジア及び／又は西南アジア集団、オセアニア集団及び／又はオーストラリア集団のいずれか１つ以上である。さらなる実施形態では、集団は、一般集団である。すなわち、集団は、健康な個人及び癌などの疾患を有する個人の両方を含む。代替的実施形態では、集団は、癌患者である個人からなる。さらなる実施形態では、癌患者は、非小細胞肺癌、前立腺癌及び／又は悪性黒色腫を有する患者である。一実施形態では、集団は、膵臓癌を有する癌患者をさらに含む。一実施形態では、Ｔ細胞免疫応答は、個体からの血液サンプルを使用したＴ細胞増殖アッセイ（^３Ｈ－チミジン）によって測定される（Inderberg-Suso et al. Oncoimmunology. 2012 Aug 1; 1(5): 670-686に以前に記載されているとおり）。一実施形態では、ＣＤ４＋エピトープに対する応答がバックグラウンドの少なくとも２倍である場合（刺激指数、ＳＩ≧２）、Ｔ細胞免疫応答は陽性であるとみなされる。代替的実施形態では、ＣＤ４＋エピトープに対する応答がバックグラウンドの少なくとも３倍である場合（刺激指数、ＳＩ≧３）、Ｔ細胞免疫応答は陽性であるとみなされる。一実施形態では、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープが免疫原性である集団内の個体の割合は、集団から無作為に選択された少なくとも５０人のサンプル中のＣＤ４＋エピトープに対するＴ細胞免疫応答を測定することによって決定される。さらなる実施形態では、サンプルは、集団から無作為に選択された少なくとも１００人の個人を含む。サンプル中で測定されるＴ細胞免疫応答は、集団を全体として代表するものとみなされる。一実施形態では、Ｔ細胞免疫応答を測定するために代替的方法が使用される。一実施形態では、方法は、遅延型過敏（ＤＴＨ）アッセイ、ELISpotアッセイ及び／又はフローサイトメトリーを含む。

【0121】

本明細書で使用される「Ｂ細胞エピトープに特異的な抗体がコンジュゲートに結合する」という語句は、Ｂ細胞エピトープに特異的な抗体がコンジュゲート内に含まれる場合にエピトープと相互作用する能力を指す。一実施形態では、抗体は、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体、好ましくは、ポリクローナル抗体である。一実施形態では、Ｂ細胞エピトープは、配列番号７の配列（ＭＴＴＥ）を含み、抗体は、抗ＭＴＴＥ抗体である。一実施形態では、Ｂ細胞エピトープに特異的な抗体がコンジュゲートに結合する能力は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）プロトコルを使用して決定される。一実施形態では、間接又はサンドイッチＥＬＩＳＡプロトコルが使用される。一実施形態では、実施例９又は１３に記載のＥＬＩＳＡプロトコルが使用される。

【0122】

本明細書で使用される「Ｂ細胞エピトープに対するＢ細胞応答を誘導するワクチン」という語句は、投与された対象において、Ｂ細胞エピトープに特異的な抗体の（Ｂ細胞による）産生を誘発することができるワクチンを指す。一実施形態では、Ｂ細胞エピトープに対するＢ細胞応答は、ＥＬＩＳＡプロトコルを使用して対象に由来するサンプル中における抗体の量を測定することによって決定される。適切なＥＬＩＳＡプロトコルは、例えば、過去にFletcher et al. J Immunol. 2018 Jul 1; 201(1): 87-97に記載されており、これは、参照により本明細書に組み込まれる。

【0123】

本明細書で使用される「破傷風ワクチン」という用語は、対象において破傷風毒素に対する免疫応答を誘発することができるワクチンを指す。一実施形態では、「破傷風ワクチン」は、破傷風トキソイド、その断片及び／又は破傷風毒素の断片を含む。破傷風トキソイドは、破傷風毒素の不活化形態である。一実施形態では、破傷風ワクチンは、さらなる抗原及び／又はトキソイドと組み合わせて提供される。一実施形態では、「破傷風ワクチン」は、ジフテリア、破傷風及び百日咳（ＤＴＰ）混合ワクチン又は任意の破傷風トキソイド含有ワクチンレジメンである。

【0124】

本明細書で使用される「Ｂ細胞エピトープに対するＢ細胞応答を誘導するワクチンは、対象に少なくとも２回投与されている」という語句は、プライム－ブースト免疫化戦略を指す。すなわち、対象は、ワクチンの少なくとも１回の第１（初回刺激）の用量を受け、その後、ワクチンの少なくとも１回の第２（追加刺激）の用量を受けた。一実施形態では、初回刺激用量に使用されるワクチンの特定の組成は、１回以上の追加刺激用量に使用されるものと同じである。代替的実施形態では、ワクチンが依然としてＢ細胞エピトープに対するＢ細胞応答を誘導することができる場合、初回刺激用量に使用されるワクチンの特定の組成物は、１回以上の追加刺激用量に使用されるものと異なる。一実施形態では、破傷風トキソイド含有ワクチンは、本発明のコンジュゲートによるプライム－ブースト免疫化戦略前に抗破傷風（例えば、抗ＭＴＴＥ）抗体力価を高めるために使用される。

【0125】

本明細書で使用される「ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープに対するＣＤ４＋Ｔ細胞応答の存在」という語句は、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープを認識できるＣＤ４＋Ｔ細胞の存在を指す。ＣＤ４＋Ｔ細胞は、適切なＭＨＣ分子上に提示されると、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープ又はその一部を認識し、結合することができる。一実施形態では、「ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープに対するＣＤ４＋Ｔ細胞応答の存在」は、上記のようなＴ細胞増殖アッセイ（^３Ｈ－チミジン）によって確認することができる。

【0126】

本明細書で使用される「Ｂ細胞エピトープに特異的な抗体の量又は不存在を検出する」という語句は、サンプル中に存在し、Ｂ細胞エピトープに結合することができる抗体の量又は不存在を決定することを指す。一実施形態では、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を使用して、抗体の量又は不在を検出する。一実施形態では、抗体力価が計算される。

【0127】

本明細書で使用される「対象に由来するサンプル」という用語は、対象から得られた（すなわちエクスビボで）サンプルを指す。一実施形態では、サンプルは、血液サンプルである。一実施形態では、サンプルは、血漿サンプル又は希釈血漿サンプルである。

【0128】

本明細書で使用される「自己抗原」という用語は、人体内に天然に存在するタンパク質に由来する抗原を指す。一般に、正常な条件下では、胸腺内のＴ細胞のネガティブ選択により、免疫系は自己抗原に反応しない。ただし、癌を有する患者では、自己抗原が免疫系によって異物として認識され（例えば、癌細胞が自己抗原の由来となるタンパク質を過剰発現するか、又は癌が発生した組織について不適切に発現した結果として）、自己抗原に対するＴ細胞免疫応答が開始され得る。一実施形態では、「自己抗原」は、テロメラーゼ逆転写酵素に由来する。

【0129】

本明細書で使用される「腫瘍関連抗原」という用語は、腫瘍又は癌細胞並びに正常細胞に関連する抗原を指す。いくつかの実施形態では、「自己抗原」は、「腫瘍関連抗原」である。

【0130】

本明細書で使用される「コンジュゲートに対する臨床的に関連する応答」という語句は、癌患者における改善された臨床アウトカムを指す。一実施形態では、改善された臨床アウトカムは、部分奏功又は完全奏功（部分寛解又は完全寛解としても知られる）又は安定状態である。完全奏効は、治療に応答した体内の検出可能な腫瘍又は癌の消失を指し；部分奏功は、治療に応答した、腫瘍サイズ又は体内の癌の範囲の減少を指し；安定状態は、体内の腫瘍又は癌の程度又は重症度が減少も増加もしていないことを意味する。

【0131】

本明細書において、２つの配列間の「同一性」のパーセンテージは、EMBOSS Needle Pairwise Sequence Alignment（Rice et al., Trends Genet. 2000 Jun; 16(6): 276-7；Nucleic Acids Res. 2019 Jul 2; 47(W1): W636-W641）を使用して、デフォルトのパラメータを用いて決定される。特に、EMBOSS Needleは、ＵＲＬ：https://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/を使用してインターネット上でアクセスできる。

【0132】

本明細書で使用される「本体部分」という用語は、本明細書に定義される１つ以上の第１の連結基及び本明細書に定義される１つ以上の第２の連結基に結合することができる任意の骨格を指す。本体部分は、第１の連結基を第２の連結基に連結するものであれば特に限定されない。本体部分の非限定的な例としては、式１による本体部分、アミノ酸、ペプチド（例えば、式２による本体部分）、炭水化物、他の足場、他の生体分子又はそれらの組み合わせが挙げられる。

【0133】

本明細書で使用される「（ＡＡ）_ｎ」という用語は、以下のジラジカル構造：

【化11】

を指し、式中、Ｒ_ａａは、アミノ酸側鎖（例えば、天然アミノ酸（グリシン、すなわちＨを含む）又は非天然アミノ酸の側鎖）を表し、個々のＡＡ基は、任意の配向で次のＡＡ基に接続され得（例えば、別のＡＡ基のアミン部分に接続された１つのＡＡ基のカルボニル部分、別のＡＡ基の側鎖を介して接続された１つのＡＡ基のカルボニル部分、別のＡＡ基の側鎖を介して接続された１つのＡＡ基のアミン部分又は別のＡＡ基の側鎖を介して接続された１つのＡＡ基の側鎖）、個々のＡＡ基は、任意選択によりリンカーによって相互に間隔をあけられているか；又は個々のＡＡ基が第二級アミンを有するアミノ酸に基づいている場合（例えば、ＡＡがプロリン）、Ｒ_ａａ及びＡＡ基のＮ原子は、それらが結合している炭素原子と一緒になって、

【化12】

の構造を有する環を形成する。

【0134】

「（ＡＡ）_ｎ」という用語の文脈で使用される「Ｃ末端」という用語は、「（ＡＡ）_ｎ」の構造の任意の末端カルボニル基を指す。したがって、基がＣ末端に接続されている場合、リンカー又は他のＡＡ基に結合していない末端カルボニル基を介して接続されている。

【0135】

「（ＡＡ）_ｎ」という用語の文脈で使用される「Ｎ末端」という用語は、「（ＡＡ）_ｎ」の構造の末端アミン基を指す。したがって、基がＮ末端に接続されている場合、リンカー又は他のＡＡ基に結合していない末端アミン基を介して接続されている。

【0136】

本明細書で使用される「第１の連結基」という用語は、第１の反応物（例えば、Ｂ細胞エピトープの配列を含むポリペプチド）とのカップリング反応を受けて、非共有結合又は共有結合を形成することができ、したがって第１の接続要素を形成することができる官能基を指す。好ましい実施形態では、連結は、付加環化反応（例えば、銅触媒によるアジド－アルキン付加環化及び歪み促進型アジド－アルキン付加環化又はアジド－アルケン付加環化を含む、１，３－双極性付加環化；テトラジン及びシクロアルキン又はトランスシクロアルケンなどによる、テトラジンライゲーション；ディールス・アルダー付加環化反応）、求核置換、マイケル反応又はクリック若しくはクリック様反応の他の例によるものなどの共有結合である。第１の連結基の非限定的な例としては、アルキン（例えば、末端アルキン）、アルケン（例えば、末端アルケン、ノルボルネン）、シクロアルキン、トランスシクロアルケン、テトラジン、共役ジエン、マレイミド、α－ハロカルボニル、チオール及びアジドが挙げられる。１つ以上の第１の連結基に言及する場合、第１の連結基のそれぞれは、互いに同一であるか又は異なり得る。いくつかの場合、第１の連結基は、それぞれ互いに同一である。

【0137】

本明細書で使用される「第２の連結基」という用語は、第２の反応物（例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープの配列を含むポリペプチド）とのカップリング反応を受けて、非共有結合又は共有結合を形成することができ、したがって第２の接続要素を形成することができる官能基を指す。好ましい実施形態では、連結は、付加環化反応（例えば、銅触媒によるアジド－アルキン付加環化及び歪み促進型アジド－アルキン付加環化又はアジド－アルケン付加環化を含む、１，３－双極性付加環化；テトラジン及びシクロアルキン又はトランスシクロアルケンなどによる、テトラジンライゲーション；ディールス・アルダー付加環化反応）、求核置換、マイケル反応又はクリック若しくはクリック様反応の他の例によるものなどの共有結合である。第２の連結基の非限定的な例としては、アルキン（例えば、末端アルキン）、アルケン（例えば、末端アルケン、ノルボルネン）、シクロアルキン、トランスシクロアルケン、テトラジン、共役ジエン、マレイミド、α－ハロカルボニル、チオール及びアジドが挙げられる。１つ以上の第２の連結基に言及する場合、第２の連結基のそれぞれは、互いに同一であるか又は異なり得る。いくつかの場合、第２の連結基は、それぞれ互いに同一である。第２の連結基は、第１の連結基と異なり得る。第２の連結基は、第１の連結基に直交し得る。

【0138】

本明細書で使用される「第３の連結基」という用語は、第３の反応物（えば、本明細書に定義されるさらなる物質）とのカップリング反応を受けて、非共有結合又は共有結合を形成することができ、したがって第３の接続要素を形成することができる官能基を指す。好ましい実施形態では、連結は、付加環化反応（例えば、銅触媒によるアジド－アルキン付加環化及び歪み促進型アジド－アルキン付加環化又はアジド－アルケン付加環化を含む、１，３－双極性付加環化；テトラジン及びシクロアルキン又はトランスシクロアルケンなどによる、テトラジンライゲーション；ディールス・アルダー付加環化反応）、求核置換、マイケル反応又はクリック若しくはクリック様反応の他の例によるものなどの共有結合である。第３の連結基の非限定的な例としては、アルキン（例えば、末端アルキン）、アルケン（例えば、末端アルケン、ノルボルネン）、シクロアルキン、トランスシクロアルケン、テトラジン、共役ジエン、マレイミド、α－ハロカルボニル、チオール及びアジドが挙げられる。１つ以上の第３の連結基に言及する場合、第３の連結基のそれぞれは、互いに同一であるか又は異なり得る。いくつかの場合、第３の連結基は、それぞれ互いに同一である。第３の連結基は、第１の連結基と異なり得る。第３の連結基は、第１の連結基に直交し得る。第３の連結基は、第２の連結基と異なり得る。第３の連結基は、第２の連結基に直交し得る。第３の連結基は、第１の連結基及び第２の連結基と異なり得る。第３の連結基は、第１の連結基及び第２の連結基に直交し得る。

【0139】

本明細書で使用される「第１の接続要素」という用語は、第１の連結基と第１の反応物（例えば、Ｂ細胞エピトープの配列を含むポリペプチド）との間に形成された非共有結合又は共有結合を指す。第１の接続要素の非限定的な例としては、１，２，３－トリアゾール結合、ジヒドロピリダジン結合、ピリダジン結合及びスルフィド結合（例えば、チオール－エン反応から形成される）が挙げられる。第１の接続要素の位置異性体が形成される場合（例えば、１，２，３－トリアゾール及び／又は開環マレイミド－チオール付加物の位置異性体）、本発明は、位置異性体産物の混合物及び精製された別個の位置異性体を包含する。

【0140】

本明細書で使用される「第２の接続要素」という用語は、第２の連結基と第２の反応物（例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープの配列を含むポリペプチド）との間に形成された非共有結合又は共有結合を指す。第２の接続要素の非限定的な例としては、１，２，３－トリアゾール、ジヒドロピリダジン結合、ピリダジン結合及びスルフィド結合（例えば、チオール－エン反応から形成される）が挙げられる。第２の接続要素の位置異性体が形成される場合（例えば、１，２，３－トリアゾール及び／又は開環マレイミド－チオール付加物の位置異性体）、本発明は、位置異性体産物の混合物及び精製された別個の位置異性体を包含する。

【0141】

本明細書で使用される「第３の接続要素」という用語は、第３の連結基と第３の反応物（例えば、本明細書に定義されるさらなる物質）との間に形成された非共有結合又は共有結合を指す。第３の接続要素の非限定的な例としては、１，２，３－トリアゾール、ジヒドロピリダジン結合、ピリダジン結合及びスルフィド結合（例えば、チオール－エン反応から形成される）が挙げられる。第３の接続要素の位置異性体が形成される場合（例えば、１，２，３－トリアゾール及び／又は開環マレイミド－チオール付加物の位置異性体）、本発明は、位置異性体産物の混合物及び精製された別個の位置異性体を包含する。

【0142】

本明細書で使用される「直交」という用語は、別の異なる官能基（例えば、第２の連結基及び／又は第３の連結基）の存在下、反応物（例えば、求電子剤／求核剤、ジエン／求ジエン剤又は双極子／求双極子剤などの第１の反応物）と選択的に反応し得る官能基（例えば、求核剤／求電子剤、求ジエン剤／ジエン又は求双極子剤／双極子としての第１の連結基）を指し、反応物は、別の官能基と実質的に反応しない（例えば、異なるタイプの官能基ペア、反応条件の違い、電子が豊富な官能基と電子が少ない官能基の違いの結果として）。例えば、官能基は、別の異なる官能基と比較して反応物に対して１０倍以上の選択性（例えば、別の異なる官能基の％変換に対する反応物の変換％に関して）、好ましくは１５倍以上の選択性、より好ましくは２０倍以上の選択性、さらに好ましくは２５倍以上の選択性、さらにより好ましくは３０倍以上の選択性、さらにより好ましくは４０倍以上の選択性、さらにより好ましくは５０倍以上の選択性、さらにより好ましくは６０倍以上の選択性、さらにより好ましくは７０倍以上の選択性、さらにより好ましくは８０倍以上の選択性、さらにより好ましくは９０倍以上の選択性、最も好ましくは１００倍以上の選択性を有し得る。

【0143】

本明細書で使用される「コア」という用語は、本体部分、本体部分に結合された１つ以上の第１の連結基及び本体部分に結合された１つ以上の第２の連結基を含む化合物を指し、第１の連結基及び第２の連結基は、互いに直交している。コアは、非共有結合又は共有結合を介して２つ以上の成分（例えば、Ｂ細胞エピトープの配列を含むポリペプチド及びＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープの配列を含むポリペプチド）を接続できる限り、特に限定されない。

【0144】

「ＡＡ基の１つの側鎖を介して」という用語は、アミノ酸側鎖残基（例えば、－ＮＨ_２、－ＣＯＯＨを含むＯＨ、ＳＨ）がアミノ酸側鎖残基の同等のラジカル形態を介して接続されることを指す（例えば、－ＮＨ－、－Ｏ－、－Ｓ－）。

【0145】

本明細書で使用される表記：

【化13】

は、以下の位置異性体：

【化14】

の位置異性体混合物を指す。

【0146】

本明細書で使用される表記：

【化15】

は、以下の位置異性体：

【化16】

の位置異性体混合物を指す。

【0147】

本明細書で使用される「末端アルキン」という用語は、－Ｃ≡Ｃ－Ｈ部分を含む基を指す。

【0148】

本明細書で使用される「シクロアルキン」という用語は、環内に８～１２個の炭素原子、例えば８～１０個の炭素原子を含み、少なくとも１つの環内炭素－炭素三重結合原子を含有する、閉じた非芳香族の単環式、二環式又は三環式の環を指す。環内の炭素原子は、ヘテロ原子、例えば窒素原子で置換され得る。シクロアルキンの非限定的な例は、シクロオクチン、ビシクロノニン（例えば、ビシクロ［６．１．０］ノン－４－イン）、ジベンゾシクロオクチン及びアザジベンゾシクロオクチンを含み得る。

【0149】

本明細書で使用される場合、「マレイミド」という用語は、以下の構造：

【化17】

を指し、式中、Ｒ’及びＲ’’は、水素、ハロゲン、任意選択により置換されたアルキル、任意選択により置換されたシクロアルキル、任意選択により置換されたヘテロシクロアルキル、任意選択により置換されたアリール及び任意選択により置換されたヘテロアリールから独立して選択され；
波線は、化合物の残りの部分との接続を表す。

【0150】

「α－ハロカルボニル」という用語は、以下の構造：

【化18】

を指し、式中、Ｒ’及びＲ’’は、水素、ハロゲン、任意選択により置換されたアルキル、任意選択により置換されたシクロアルキル、任意選択により置換されたヘテロシクロアルキル、任意選択により置換されたアリール及び任意選択により置換されたヘテロアリールから独立して選択され；
Ｘは、ハロゲンであり；
波線は、化合物の残りの部分との接続を表す。

【0151】

本明細書で使用される「ハロ」又は「ハロゲン」という用語は、フッ素、塩素、臭素又はヨウ素の任意のラジカルを指す。

【0152】

本明細書で使用される「アルキル」という用語は、それ自体で又は別の基の一部として、炭素数１２までの直鎖及び分枝鎖ラジカルの両方を指す。例えば、アルキル基は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１又は１２個の炭素原子を含有し得る。Ｃ_１～Ｃ_１２アルキル基の非限定的な例には、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、ｓｅｃ－ブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、３－ペンチル、ヘキシル及びオクチル基が含まれる。好ましくは、本明細書で使用される「アルキル」という用語は、それ自体で又は別の基の一部として、１～８個の炭素原子、より好ましくは１～６個の炭素原子、さらにより好ましくは１～４個の炭素原子を含む、直鎖又は分枝鎖ラジカルを指し得る。「任意選択により置換されたアルキル」基は、「任意選択により置換された」という用語に関して以下に記載されるような置換基を含み得る。例えば、「任意選択により置換されたアルキル」基は、「ハロアルキル」基を含み得る。

【0153】

本明細書で使用される「ハロアルキル」という用語は、それ自体で又は別の基の一部として、少なくとも１つのハロゲン原子を含む、炭素原子１２個までの直鎖及び分枝鎖ラジカルの両方を指す。例えば、ハロアルキル基は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１又は１２個の炭素原子を含有し得る。好ましくは、本明細書で使用される「ハロアルキル」という用語は、それ自体で又は別の基の一部として、１～８個の炭素原子、より好ましくは１～６個の炭素原子、さらにより好ましくは１～４個の炭素原子を含み、少なくとも１つのハロゲン原子を含む、直鎖又は分枝鎖ラジカルを指し得る。

【0154】

例えば、「ハロアルキル」基は、フルオロアルキル基又はペルフルオロアルキル基であり得る。

【0155】

好ましくは、「ハロアルキル」基は、Ｃ_１～Ｃ_６フルオロアルキル基又はＣ_１～Ｃ_６ペルフルオロアルキル基であり得る。

【0156】

さらにより好ましくは、「ハロアルキル」基は、Ｃ_１～Ｃ_４フルオロアルキル基又はＣ_１～Ｃ_４ペルフルオロアルキル基であり得る。例えば、「ハロアルキル」基は、ジフルオロメチル、トリフルオロメチル又はペンタフルオロエチルを含み得る。

【0157】

本明細書で使用される「シクロアルキル」という用語は、３～８個の炭素原子、例えば３～６個の炭素原子を含む、閉環を含むアルキル基を指す。例えば、シクロアルキル基は、３、４、５、６、７又は８個の炭素原子を含有し得る。シクロアルキル基の非限定的な例には、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、（シクロヘキシル）メチル及び（シクロヘキシル）エチルが含まれる。「任意選択により置換されたシクロアルキル」基は、「任意選択により置換された」という用語に関して以下に記載されるような置換基を含み得る。

【0158】

本明細書で使用される「ヘテロシクロアルキル」という用語は、炭素原子と、Ｏ、Ｎ及びＳからなる群から独立して選択される１～４個のヘテロ原子からなる、飽和又は部分飽和の３～７員単環式又は７～１０員二環式環系を指し、窒素及び硫黄ヘテロ原子は、任意選択により酸化され得、窒素は、任意選択により四級化され得、上記で定義された環のいずれかがベンゼン環に縮合した任意の二環式基を含み、得られる化合物が安定であれば、環は、炭素原子上又は窒素原子上で置換され得る。一般的な飽和又は部分飽和ヘテロシクロアルキル基の非限定的な例としては、アゼチニル、オキセタニル、テトラヒドロフラニル、ピラニル、ピペリジニル、ピペラジニル、ピロリジニル、イミダゾリジニル、イミダゾリニル、インドリニル、イソインドリニル、キヌクリジニル、モルホリニル、イソクロマニル、クロマニル、ピラゾリジニル、ピラゾリニル、テトロノイル及びテトラモイル基が挙げられる。「任意選択により置換されたヘテロシクロアルキル」基は、「任意選択により置換された」という用語に関して以下に記載されるような置換基を含み得る。

【0159】

本明細書で使用される「アルコキシ」という用語は、それ自体で又は別の基の一部として、酸素原子を介して親分子部分に付加された、本明細書に定義されるアルキル基を指す。例えば、アルコキシ基は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１又は１２個の炭素原子を含有し得る。好ましくは、本明細書で使用される「アルコキシ」は、それ自体で又は別の基の一部として、酸素原子を介して親分子部分に付加された、１～８個の炭素原子、より好ましくは１～６個の炭素原子、さらにより好ましくは１～４個の炭素原子を含む、直鎖又は分枝鎖ラジカルを指し得る。アルコキシ基の非限定的な例には、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、２－プロポキシ、ブトキシ、ｔｅｒｔ－ブトキシ、ペンチルオキシ及びヘキシルオキシが含まれる。「任意選択により置換されたアルコキシ」基は、「任意選択により置換された」という用語に関して以下に記載されるような置換基を含み得る。例えば、「任意選択により置換されたアルコキシ」基は、「ハロアルコキシ」基を含み得る。

【0160】

本明細書で使用される「ハロアルコキシ」という用語は、それ自体で又は別の基の一部として、少なくとも１つのハロゲン原子を含み、酸素原子を介して親分子部分に付加された、炭素原子１２個までの直鎖及び分枝鎖ラジカルの両方を指す。例えば、ハロアルコキシ基は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１又は１２個の炭素原子を含有し得る。好ましくは、本明細書で使用される「ハロアルコキシ」という用語は、それ自体で又は別の基の一部として、少なくとも１つのハロゲン原子を含み、酸素原子を介して親分子部分に付加された、１～８個の炭素原子、より好ましくは１～６個の炭素原子、さらにより好ましくは１～４個の炭素原子を含む、直鎖又は分枝鎖ラジカルを指し得る。

【0161】

例えば、「ハロアルコキシ」基は、フルオロアルコキシ基又はペルフルオロアルコキシ基であり得る。

【0162】

好ましくは、「ハロアルコキシ」基は、Ｃ_１～Ｃ_６フルオロアルコキシ基又はＣ_１～Ｃ_６ペルフルオロアルコキシ基であり得る。

【0163】

さらにより好ましくは、「ハロアルコキシ」基は、Ｃ_１～Ｃ_４フルオロアルコキシ基又はＣ_１～Ｃ_４ペルフルオロアルコキシ基であり得る。例えば、「ハロアルコキシ」基は、ジフルオロメトキシ、トリフルオロメトキシ又はペンタフルオロエトキシを含み得る。

【0164】

本明細書で使用される「アルカノイル」という用語は、それ自体で又は別の基の一部として、酸素原子を介したＲ^ｘ－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－基を介して親分子部分に付加された、本明細書に定義されるアルキル基を指し、Ｒ^ｘは、アルキル基を表す。例えば、アルカノイル基は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２又は１３個の炭素原子を含有し得る。好ましくは、本明細書で使用される「アルカノイル」という用語は、それ自体で又は別の基の一部として、２～８個の炭素原子、より好ましくは２～６個の炭素原子、さらにより好ましくは２～４個の炭素原子を含み、酸素原子を介したＲ^ｘ－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－基を介して親分子部分に付加された、直鎖又は分枝鎖ラジカルを指し得、Ｒ^ｘは、アルキル基を表す。アルカノイル基の非限定的な例には、アセトキシ、プロピオニルオキシ、ブチリルオキシ及びペンタノイルオキシが含まれる。「任意選択により置換されたアルカノイル」基は、「任意選択により置換された」という用語に関して以下に記載されるような置換基を含み得る。

【0165】

本明細書において単独で又は別の基の一部として使用される「アリール」という用語は、環内に６～１４個の炭素原子を含有する単環式、二環式又は三環式芳香族基を指す。一般的なアリール基は、Ｃ_６～Ｃ_１４アリール、例えば、Ｃ_６～Ｃ_１０アリールを含む。Ｃ_６～Ｃ_１４アリール基の非限定的な例には、フェニル、ナフチル、フェナントレニル、アントラセニル、インデニル、アズレニル、ビフェニル、ビフェニレニル及びフルオレニル基が含まれる。「任意選択により置換されたアリール」基は、「任意選択により置換された」という用語に関して以下に記載されるような置換基を含み得る。

【0166】

本明細書で使用される「ヘテロアリール」という用語は、５～１４個の環原子（例えば、５～１０個の環原子）を有し、炭素原子及び１、２又は３個の酸素、窒素又は硫黄ヘテロ原子を含有する芳香族基を指す。ヘテロアリール基の例には、チエニル（チオフェニル）、ベンゾ［ｂ］チエニル、ナフト［２，３－ｂ］チエニル、チアントレニル、フリル（フラニル）、ピラニル、イソベンゾフラニル、クロメニル、キサンテニル、フェノキサンチニル、ピロリル（２Ｈ－ピロリルを含むがこれに限定されない）、イミダゾリル、ピラゾリル、ピリジル（ピリジニル）（２－ピリジル、３－ピリジル及び４－ピリジルを含むがこれに限定されない）、ピラジニル、ピリミジニル、ピリダジニル、インドリジニル、イソインドリル、３Ｈ－インドリル、インドリル、インダゾリル、プリニル、４Ｈ－キノリジニル、イソキノリル、キノリル、フタラジニル、ナフチリジニル、キノザリニル、シンノリニル、プテリジニル、カルバゾリル、β－カルボリニル、フェナントリジニル、アクリンジニル、ペリミジニル、フェナントロリニル、フェナジニル、イソチアゾリル、フェノチアジニル、イソオキサゾリル、フラザニル、フェノキサジニル、フタラジン－１－オン、１，４－ジヒドロキノキサリン－２，３－ジオン、７－アミノイソクマリン、ピリド［１，２－α］ピリミジン－４－オン、ピラゾロ［１，５－α］ピリミジニル（ピラゾロ［１，５－α］ピリミジン－３－イルを含むがこれに限定されない）、１，２－ベンゾイソオキサゾール－３－イル、ベンズイミダゾリル、２－オキシインドリル及び２－オキソベンズイミダゾリルが含まれる。ヘテロアリール基が環内に窒素原子を含有する場合、そのような窒素原子は、Ｎ－オキシド、例えばピリジルＮ－オキシド、ピラジニルＮ－オキシド及びピリミジニルＮ－オキシドの形態であり得る。「任意選択により置換されたヘテロアリール」基は、「任意選択により置換された」という用語に関して以下に記載されるような置換基を含み得る。

【0167】

本明細書で使用される「アルキレン」という用語は、１～１２個の炭素原子を有する二価の直鎖及び分枝鎖基を指す。好ましくは、アルキレン基は、１～６個の炭素原子を有する直鎖又は分枝鎖のアルキレン基であり、より好ましくは、１～４個の炭素原子を有する直鎖又は分枝鎖のアルキレン基である。アルキレン基は、本明細書に記載されるように、１つ以上の「置換基」を任意選択により含み得る。

【0168】

本明細書に記載されるように、化合物は、「任意選択により置換された」部分を含有し得る。一般に、「置換された」という用語は、「任意選択により」という用語が前に付くかどうかにかかわらず、指定部分の１つ以上の水素原子が適切な置換基で置き換えられることを意味する。別段の記載がない限り、「任意選択により置換された」基は、その基の各置換可能な位置に適切な置換基を有し得、任意の所与の構造における複数の位置が、特定の基から選択される複数の置換基で置換され得る場合、その置換基は、全ての位置で同じであるか又は異なり得る。本発明によって想定される置換基の組み合わせは、好ましくは、安定な又は化学的に実現可能な化合物の形成を生じるものである。本明細書で使用される「安定な」という用語は、その産生、検出並びに特定の実施形態ではその回収、精製及び１つ以上の本明細書に開示される目的のための使用を可能にする条件に供された場合に実質的に変化しない化合物を指す。

【0169】

例えば、本明細書で使用される「任意選択により置換された」という用語は、少なくとも１つの置換基が、オキソ、ヒドロキシ、ハロゲン、シアノ、任意選択により置換されたアルキル、ハロアルキル、任意選択により置換されたシクロアルキル、任意選択により置換されたヘテロシクロアルキル、任意選択により置換されたアルコキシ、ハロアルコキシ、任意選択により置換されたアルカノイル、任意選択により置換されたアミノ、任意選択により置換されたアリール及び任意選択により置換されたヘテロアリールなどの非限定的な例から選択される場合を指し得る。

【0170】

好ましくは、本明細書で使用される「任意選択により置換された」という用語は、少なくとも１つの置換基が、ハロゲン、ヒドロキシ、Ｃ_１～Ｃ_６アルキル基、Ｃ_１～Ｃ_６ハロアルキル基、Ｃ_１～Ｃ_６アルコキシ基及びＣ_１～Ｃ_６ハロアルコキシ基から選択される場合を指し得る。

【0171】

より好ましくは、本明細書で使用される「任意選択により置換された」という用語は、少なくとも１つの置換基が、ハロゲン、ヒドロキシ、Ｃ_１～Ｃ_４アルキル基、Ｃ_１～Ｃ_４ハロアルキル基、Ｃ_１～Ｃ_４アルコキシ基及びＣ_１～Ｃ_４ハロアルコキシ基から選択される場合を指し得る。

【0172】

さらにより好ましくは、本明細書で使用される「任意選択により置換された」という用語は、少なくとも１つの置換基が、フルオロ、ヒドロキシ、メチル基、トリフルオロメチル基、メトキシ基及びトリフルオロメトキシ基から選択される場合を指し得る。

【0173】

本発明のコンジュゲートは、「塩」形態で提供され得る。本明細書で使用される「塩」という用語は、適切な無機及び有機酸並びに塩基から誘導される、本明細書に記載の化合物の塩を指す。塩基性基の塩としては、塩酸、臭化水素酸、リン酸、硫酸及び過塩素酸等の無機酸又はトリフルオロ酢酸、酢酸、シュウ酸、マレイン酸、酒石酸、クエン酸、コハク酸若しくはマロン酸などの有機酸と形成されたもの又はイオン交換などの当技術分野で使用される他の方法を使用して形成されたものが挙げられる。他の塩としては、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、重硫酸塩、ホウ酸塩、酪酸塩、樟脳酸塩、樟脳スルホン酸塩、クエン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、ギ酸塩、フマル酸塩、グルコヘプトン酸塩、グリセロリン酸塩、グルコン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、ヨウ化水素酸塩、２－ヒドロキシエタンスルホン酸塩、ラクトビオン酸塩、乳酸塩、ラウリン酸塩、ラウリル硫酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メタンスルホン酸塩、２－ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３－フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩、ピバリン酸塩、プロピオン酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、ｐ－トルエンスルホン酸塩、ウンデカン酸塩、吉草酸塩などが挙げられる。適切な塩基から誘導される塩には、アルカリ金属、アルカリ土類金属、アンモニウム及びＮ^＋（Ｃ_１～Ｃ_４アルキル）_４塩が含まれる。代表的なアルカリ又はアルカリ土類金属塩には、ナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムなどが含まれる。さらなる塩には、適切な場合、非毒性のアンモニウム、第四級アンモニウム並びにハロゲン化物、水酸化物、カルボン酸塩、硫酸塩、リン酸塩、硝酸塩、アルキルスルホン酸塩及びアリールスルホン酸塩などの対イオンを使用して形成されるアミンカチオンが含まれる。

【0174】

本開示の特定の化合物は、非溶媒和形態及び水和形態を含む溶媒和形態で存在し得る。「水和物」は、水分子と溶質の分子又はイオンの組み合わせによって形成される複合体を指す。「溶媒和物」は、溶媒分子と溶質の分子又はイオンの組み合わせによって形成される複合体を指す。溶媒は、有機化合物、無機化合物又は両方の混合物であり得る。溶媒和物は、水和物を含むことを意味する。溶媒のいくつかの例には、メタノール、アセトニトリル、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、テトラヒドロフラン、ジメチルスルホキシド及び水が含まれるが、これらに限定されない。一般に、溶媒和形態は、非溶媒和形態と同等であり、本開示の範囲内に包含される。本開示の特定の化合物は、例えば、複数の結晶又は非晶質の形態で固体物質として存在し得る。一般に、全ての物理的形態は、本開示によって企図される用途について均等であり、本開示の範囲内にあることが意図される。

【0175】

「互変異性体」とは、分子の１つの原子のプロトンが別の原子にシフトする現象によって産生される化合物を意味する（Jerry March, Advanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanisms and Structures, Fourth Edition, John Wiley & Sons, pages 69-74 (1992)を参照されたい）。互変異性体は、平衡状態で存在し、ある異性体から別の異性体に容易に変換される２つ以上の構造異性体の１つも指す。例には、アセトン／プロペン－２－オール、イミン－エナミン互変異性体などのケト－エノール互変異性体、グルコース／２，３，４，５，６－ペンタヒドロキシ－ヘキサナールなどの環鎖互変異性体、ピラゾール、イミダゾール、ベンズイミダゾール、トリアゾール、テトラゾールなどの－Ｎ＝Ｃ（Ｈ）－ＮＨ－環原子配置を含有するヘテロアリール基の互変異性体が含まれる。化合物が、例えばケト若しくはオキシム基又は芳香族部分を含有する場合、互変異性（tautomeric isomerism）（「互変異性（tautomerism）」）が生じ得る。本明細書に記載の化合物は、１つ以上の互変異性体を有し得、したがって、様々な異性体を含み得る。当業者であれば、他の互変異性環原子配置も可能であることを認識するであろう。これらの化合物のそのような異性体は全て、本開示に明示的に含まれる。

【0176】

「異性体」は、同一の分子式を有するが、その原子の結合の性質若しくは配列又は空間内のその原子の配置が異なる化合物を意味する。空間内の原子の配置が異なる異性体は、「立体異性体」と呼ばれる。「立体異性体」は、１つ以上の不斉中心又は不斉置換を有する二重結合を保有する場合、異なる立体異性体形態で存在する化合物を指し、したがって、個々の立体異性体として又は混合物として産生され得る。立体異性体は、エナンチオマー及びジアステレオマーを含む。互いに鏡像ではない立体異性体は「ジアステレオマー」と呼ばれ、互いに重ね合わせることができない鏡像である立体異性体は「エナンチオマー」と呼ばれる。化合物が不斉中心を有する場合、例えば、それが４つの異なる基に結合している場合、一対のエナンチオマーが可能である。エナンチオマーは、その不斉中心の絶対配置によって特徴付けられ得、カーンとプレローグのＲ及びＳ配列規則又は分子が偏光面を回転する方法によって記述され、右旋性又は左旋性として（すなわちそれぞれ（＋）又は（－）異性体として）指定される。キラル化合物は、個々のエナンチオマー又はそれらの混合物のいずれかとして存在し得る。エナンチオマーを等しい割合で含有する混合物を「ラセミ混合物」と呼ぶ。別段の記載がない限り、説明は個々の立体異性体及び混合物を含むことが意図される。１つ以上の立体中心のキラリティーが異なる立体化学の決定及び立体異性体の分離方法は、当技術分野で周知である（Advanced Organic Chemistry, 6th edition J. March, John Wiley and Sons, New York, 2007の第４章の議論を参照されたい）。

【0177】

本開示は、１つ以上の原子が、通常天然に見られる原子量又は質量数と異なる原子量又は質量数を有する原子で置換されているという事実以外、本明細書に列挙したものと同一である本開示の同位体標識化合物も包含する。本開示の化合物に組み込まれ得る同位体の例としては、限定されないが、^２Ｈ（重水素、Ｄ）、^３Ｈ（トリチウム）、^１１Ｃ、^１３Ｃ、^１４Ｃ、^１５Ｎ、^１８Ｆ、^３１Ｐ、^３２Ｐ、^３５Ｓ、^３６Ｃｌ及び^１２５Ｉなど、水素、炭素、窒素、酸素、リン、フッ素及び塩素の同位体が挙げられる。別段明記しない限り、位置が特に「Ｈ」又は「水素」として指定されている場合、その位置は、天然存在比の同位体組成又は重水素（Ｄ）やトリチウム（^３Ｈ）などのその同位体に水素があると理解される。本開示の特定の同位体標識化合物（例えば、^３Ｈ及び^１４Ｃで標識されたもの）は、化合物及び／又は基質組織分布アッセイにおいて有用である。トリチウム化（すなわち^３Ｈ）同位体、炭素－１４（すなわち^１４Ｃ）及びフッ素－１８（すなわち^１８Ｆ）同位体は、調製の容易さ及び検出可能性について有用である。さらに、重水素（すなわち^２Ｈ）などのより重い同位体による置換は、より良い代謝安定性に起因する特定の治療上の利点（例えば、インビボ半減期の増加又は必要な投与量の減少）を生じ得、したがって、状況によっては好ましい場合がある。本開示の同位体標識化合物は、一般に、非同位体標識試薬を同位体標識試薬に置き換えることにより、本明細書に記載のものと同様の手順に従って調製され得る。

【図面の簡単な説明】

【0178】

図の簡単な説明

【図1A】本発明の一実施形態によるコンジュゲートを示す概略図である。この実施形態では、コンジュゲートは、スペーサー配列（２）を介してコア（３）に連結された配列番号７のＭＴＴＥ配列（１）をそれぞれ含む３つのポリペプチドを含む。これにより、ユニバーサル腫瘍抗原に由来するＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープを含むポリペプチドへのＭＴＴＥ配列（配列番号７）の連結が可能になる（４）。一実施形態では、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープは、配列番号１である。他の実施形態では、ユニバーサル腫瘍抗原は、広いＨＬＡカバレッジを有する代替的ｈＴＥＲＴペプチドからのものである。さらなる実施形態では、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープを含むポリペプチドは、さらなるエピトープを含む。

【図1B】本発明の実施形態が免疫応答を誘発する、提案されたメカニズムを示す概略図である。まず、（１）合成ペプチドコンジュゲートの非経口投与があり、次いで（２）ペプチドコンジュゲートがスカベンジャー受容体及び既存の抗ＭＴＴＥ抗体の抗体媒介取り込みを介して樹状細胞に取り込まれる。（３）エピトーププロセシング及びＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞へのＣＤ４＋エピトープ提示を通して、ＭＴＴＥ特異的Ｂ細胞の活性化を通して追加のフィードバックが提供されて、可溶性抗破傷風抗体を産生する形質細胞になる。（４）正のフィードバックメカニズムにより、コンジュゲート内のＣＤ４＋Ｔ－ヘルパーエピトープを介した抗体産生及び免疫複合体形成が強化される。（５）したがって、活性化されたＣＤ４＋Ｔ細胞は、腫瘍特異的（テロメラーゼ特異的など）であり、腫瘍に移動して腫瘍内の免疫応答を強化することができる（エピトープ拡大）。

【図2A】特定のポリペプチドの組み合わせ間のカバーされたＨＬＡクラスＩの比較を示すベン図である。配列番号１１６（ＧＶ＿ＬＳＥ）及び配列番号１（Ｐ７１９－２０）間の比較を示す。

【図2B】特定のポリペプチドの組み合わせ間のカバーされたＨＬＡクラスＩの比較を示すベン図である。配列番号１１６（ＧＶ＿ＬＳＥ）及び１１８（Ｃ末端ペプチド）間の比較を示す。

【図2C】ＨＬＡクラスＩＩ対立遺伝子の比較を示すベン図である。配列番号１１６（ＧＶ＿ＬＳＥ）及び１１８（Ｃ末端ペプチド）間の比較を示す。

【図2D】特定のポリペプチドの組み合わせ間のカバーされたＨＬＡクラスＩの比較を示すベン図である。配列番号１１６（ＧＶ＿ＬＳＥ）及び１２６（ＧＶ１００１）間の比較を示す。

【図2E】ＨＬＡクラスＩＩ対立遺伝子の比較を示すベン図である。配列番号１１６（ＧＶ＿ＬＳＥ）及び１２６（ＧＶ１００１）間の比較を示す。

【図3A】それぞれＨＬＡクラスＩエピトープ及びＨＬＡクラスＩＩエピトープに基づいて、配列番号１（Ｐ７１９～２０）及び１１６（ＧＶ＿ＬＳＥ）のポリペプチドによって提供される予測集団カバレッジを示すグラフである。

【図3B】それぞれＨＬＡクラスＩエピトープ及びＨＬＡクラスＩＩエピトープに基づいて、配列番号１（Ｐ７１９～２０）及び１１６（ＧＶ＿ＬＳＥ）のポリペプチドによって提供される予測集団カバレッジを示すグラフである。

【図4A】それぞれＨＬＡクラスＩエピトープ及びＨＬＡクラスＩＩエピトープに基づいて、配列番号１２６（ＧＶ１００１）及び１１６（ＧＶ＿ＬＳＥ）のポリペプチドによって提供される予測集団カバレッジを示すグラフである。

【図4B】それぞれＨＬＡクラスＩエピトープ及びＨＬＡクラスＩＩエピトープに基づいて、配列番号１２６（ＧＶ１００１）及び１１６（ＧＶ＿ＬＳＥ）のポリペプチドによって提供される予測集団カバレッジを示すグラフである。

【図5A】それぞれＨＬＡクラスＩエピトープ及びＨＬＡクラスＩＩエピトープに基づいて、配列番号１２６（ＧＶ１００１）、１（Ｐ７１９－２）及び１１６（ＧＶ＿ＬＳＥ）のポリペプチドによって提供される予測集団カバレッジを示すグラフである。

【図5B】それぞれＨＬＡクラスＩエピトープ及びＨＬＡクラスＩＩエピトープに基づいて、配列番号１２６（ＧＶ１００１）、１（Ｐ７１９－２）及び１１６（ＧＶ＿ＬＳＥ）のポリペプチドによって提供される予測集団カバレッジを示すグラフである。

【図6A】それぞれＨＬＡクラスＩエピトープ及びＨＬＡクラスＩＩエピトープに基づいて、配列番号１２６（ＧＶ１００１）、１（Ｐ７１９－２０）、１１６（ＧＶ＿ＬＳＥ）及び１１８（Ｃ末端－ｐｅｐ）のポリペプチドによって提供される予測集団カバレッジを示すグラフである。

【図6B】それぞれＨＬＡクラスＩエピトープ及びＨＬＡクラスＩＩエピトープに基づいて、配列番号１２６（ＧＶ１００１）、１（Ｐ７１９－２０）、１１６（ＧＶ＿ＬＳＥ）及び１１８（Ｃ末端－ｐｅｐ）のポリペプチドによって提供される予測集団カバレッジを示すグラフである。

【図7A】マウスに既知の活性ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープが含まれていないか（「ＳＣ注射マウス（コンジュゲート２ｎｍｏｌ）」）又は対照としてモノクローナル抗ＭＴＴＥ ＩｇＧ１抗体を投与された（「ＳＣ注射マウス（ａＭＴＴＥ ＩｇＧ１）」）、アミノ酸配列ＡＶＧＡＬＥＧＳＲＮＱＤＷＬＧＶＰＲＱＬ（配列番号５４）を有する合成長鎖ペプチド（ＳＬＰ）を含むコンジュゲートを投与された雌のＣ５７ＢＬ／６マウスからの血液サンプルにおいて、ＥＬＩＳＡによって測定された抗ＭＴＴＥ ＩｇＧ１抗体力価を示すグラフである。

【図7B】ユニバーサルＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープ「ＰＡＤＲＥ」を含むか（「コンジュゲート：ＭＴＴＥ３－ＨＹ－ＰＡＤＲＥ」）又はコンジュゲートなしでＳＬＰのみが投与された（「ＳＬＰ：ＨＹ－ＰＡＤＲＥ」）、アミノ酸配列ＡＲＷＷＷＭＨＨＮＭＤＬＩＧＧＡＫｘＶＡＡＷＴＬＫＡｕ（配列番号５５）を有するＳＬＰを含むコンジュゲートを投与されたマウスからの血液サンプルにおいて、ＥＬＩＳＡによって測定された抗ＭＴＴＥ ＩｇＧ１抗体力価を示すグラフである。

【図8A】実施例８の実験で使用されるプライム－ブーストワクチン接種スケジュールの概略図である。

【図8B】破傷風トキソイド（ＴＴｄ）ワクチンを４回（１週目、３週目、５週目及び７週目）皮下ワクチン接種し、その後、癌ワクチンTENDUを低用量、中用量又は高用量のいずれかで４回皮下ワクチン接種した雄ウサギにおける抗ＭＴＴＥ抗体力価を示すグラフである。血清学的分析のための血漿サンプルは、８週目及び１５週目に収集された。ウサギ抗ＭＴＴＥ抗体力価は、インハウスＥＬＩＳＡでCapra Science抗体ＡＢによって測定された。^＊＊対応のあるｔ検定を使用してＰ＜０．０１；ｎｓ＝有意でない。

【図8C】「TENDU」ワクチン内に含まれるＬＵＧ１－６のコンジュゲートの詳細を提供する表である。

【図9A】ＧＭＰ ＬＵＧ１－６コンストラクトのヒト抗ＭＴＴＥ抗体への結合を示す。モノクローナルヒトＩｇＧ１抗ＭＴＴＥ抗体へのコンジュゲートの結合を示す。コンジュゲートを様々な濃度（０．０００４５７～１ｎｍｏｌ／ｍｌ）でＥＬＩＳＡプレート上にコーティングした。ヒト組換え抗ＭＴＴＥ ＩｇＧ１抗体を一次抗体として使用し、抗ヒトカッパ軽鎖二次抗体を使用して検出を実施した。

【図9B】ＧＭＰ ＬＵＧ１－６コンストラクトのヒト抗ＭＴＴＥ抗体への結合を示す。ポリクローナルヒト抗ＭＴＴＥ抗体を含有する血清へのコンジュゲートの結合を示す。コンジュゲートを様々な濃度（０．００４～１ｎｍｏｌ／ｍｌ）でＥＬＩＳＡプレート上にコーティングし、希釈したドナー血漿とともにインキュベートした。検出は、抗ヒトカッパ軽鎖二次抗体を使用して実施した。

【図10】ＬＵＧ２コンジュゲートによる動物のワクチン接種の抗ＭＴＴＥ力価に対する効果を示す（Ａ）（ＤＲ４ ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープを保有することが知られている）、及び（Ｂ）ＨＬＡ－ＤＲ４マウスが実施例１０に記載されるようにＬＵＧ２でワクチン接種された後のＴ細胞応答のELISPOT分析を示す。ELISPOTは、脾細胞を合成長鎖ペプチドＵＶ０２（配列番号１４３）及びＵＶ０８（配列番号１４４）と４８時間インキュベートすることによって実施した。ＳＥＢを陽性対照として使用し、未処理の脾細胞を陰性対照として使用した。

【図11A】配列番号１のポリペプチドがＨＬＡ－ＤＲ４トランスジェニックマウスに投与された実施例１１の実験デザインの概略図を示す。

【図11B】配列番号１、抗ＣＤ４抗体と組み合わせた配列番号１又は陰性対照としての細胞単独による、脾細胞の刺激後のＴ細胞応答を測定したELISpotアッセイからの結果のグラフである。統計分析は、クラスカル・ウォリス検定及びダンの多重比較検定を使用して実施した。「^＊＊」は、ｐ＜０．０１を指し、「ｎｓ」は、有意でないことを指す。

【図12A】抗原提示細胞としてのＥＢＶ細胞との共培養物中で０．５、１．５及び５μＭ濃度の配列番号１、配列番号５２又はコンジュゲートＣＤ１２Ｂに曝露したときの、配列番号１に特異的なＧＦＰ発現Ｔ細胞のパーセンテージを示すグラフである。各バーは、配列番号１及びＣＤ１２Ｂの複製の平均値＋／－ＳＤを表し、配列番号５２は、各濃度について単一サンプルとして実行された。

【図12B】０．５、１．５及び３μＭ濃度のコンジュゲートＣＤ１２Ｂ若しくはＣＤ２０Ｂに曝露したとき又は０．５、１．５及び５μＭ濃度の配列番号１又は配列番号５２に曝露したときの、配列番号１に特異的なＧＦＰ発現Ｔ細胞のパーセンテージを示すグラフである。

【図13A】それぞれ血漿産物TetaQuinからの抗ＭＴＴＥポリクローナル抗体へのコンジュゲートの結合を評価したサンドイッチＥＬＩＳＡ実験の結果を示すグラフ及び表である。

【図13B】それぞれ血漿産物TetaQuinからの抗ＭＴＴＥポリクローナル抗体へのコンジュゲートの結合を評価したサンドイッチＥＬＩＳＡ実験の結果を示すグラフ及び表である。

【図14A】それぞれポリクローナル抗体を含有するヒト血清へのコンジュゲートの結合を評価した間接ＥＬＩＳＡ実験の結果を示すグラフ及び表である（血清は、血液サンプル採取前に最近破傷風トキソイドをワクチン接種したドナーに由来するものであった）。

【図14B】それぞれポリクローナル抗体を含有するヒト血清へのコンジュゲートの結合を評価した間接ＥＬＩＳＡ実験の結果を示すグラフ及び表である（血清は、血液サンプル採取前に最近破傷風トキソイドをワクチン接種したドナーに由来するものであった）。

【図15A】それぞれポリクローナル抗体を含有するヒト血清へのコンジュゲートの結合を評価した間接ＥＬＩＳＡ実験の結果を示すグラフ及び表である（血清は、血液サンプル採取前に最近破傷風トキソイドをワクチン接種したドナーに由来するものであった）。

【図15B】それぞれポリクローナル抗体を含有するヒト血清へのコンジュゲートの結合を評価した間接ＥＬＩＳＡ実験の結果を示すグラフ及び表である（血清は、血液サンプル採取前に最近破傷風トキソイドをワクチン接種したドナーに由来するものであった）。

【図16A】実施例１４の実験デザインの概略図である。

【図16B】配列番号１／ＣｐＧ又はコンジュゲートＣＤ１２Ｂで先にワクチン接種されたトランスジェニックＨＬＡ－Ａ２／ＨＬＡ－ＤＲ１マウスから得られた脾細胞が配列番号７（ＭＴＴＥ）又は配列番号１（Ｐ７１９－２０）のポリペプチドで刺激されたELISpotアッセイの結果を示すグラフである。統計分析は、Sidakの多重比較検定を使用して実施した（^＊ｐ＜０．０５、「ｎｓ」＝有意でない）。

【図16C】抗ＣＤ８の存在下又は不存在下において、予測されるＭＨＣクラスＩ又はクラスＩＩエピトープを含む配列番号１からのポリペプチドによりＣＤ１２Ｂ曝露動物からの脾細胞を刺激したELISpotアッセイの結果を示すグラフである。統計分析は、グラフパッド及びSidakの多重比較検定を使用して実施した（^＊ｐ＜０．０５；^＊＊ｐ＜０．０１；「ｎｓ」＝有意でない）。

【図16D】抗ＣＤ４抗体（図１６Ｄ）の存在下又は不存在下において、予測されるＭＨＣクラスＩ又はクラスＩＩエピトープを含む配列番号１からのポリペプチドによりＣＤ１２Ｂ曝露動物からの脾細胞を刺激したELISpotアッセイの結果を示すグラフである。統計分析は、グラフパッド及びSidakの多重比較検定を使用して実施した（^＊ｐ＜０．０５；^＊＊ｐ＜０．０１；「ｎｓ」＝有意でない）。

【図17A】血清反応陽性又は血清反応陰性のＨＬＡ－ＤＲ４マウスにおけるＣＤ２０Ｂコンジュゲートの免疫原性のインビボ評価に関する。実施例１５に記載される実験の終了時にマウスにおける抗ＭＴＴＥ抗体レベルを検出するために測定される光学密度（ＯＤ）のグラフである。有意性は、マン・ホイットニー検定^＊ｐ＝０．０２８６によって評価された。

【図17B】血清反応陽性又は血清反応陰性のＨＬＡ－ＤＲ４マウスにおけるＣＤ２０Ｂコンジュゲートの免疫原性のインビボ評価に関する。血清反応陽性動物についてのＣＤ２０Ｂ曝露前後の抗ＭＴＴＥ ＯＤ値（ｘ軸）と、ＵＶ１８及びＵＶ１９を組み合わせたペプチド混合物による刺激に応答したＴ細胞応答（ｙ軸）との間の相関分析を示すグラフである。ピアソンｒ＝０．９３４８。プロットされた曲線は、最良適合線の９５％信頼帯を有する単純回帰線である。分析は、Graph pad prismを使用して実施した。

【図17C】血清反応陽性又は血清反応陰性のＨＬＡ－ＤＲ４マウスにおけるＣＤ２０Ｂコンジュゲートの免疫原性のインビボ評価に関する。コンジュゲートＣＤ２０Ｂ又はＩＦＡ及びＣｐＧ中に配合された配列番号１のポリペプチドのいずれかを投与されたマウスからの脾細胞の刺激後のＴ細胞応答を測定するためのELISpotアッセイの結果を示すグラフである。刺激は、ＵＶ１８／１９の組み合わせを使用して実施した。

【図17D】血清反応陽性又は血清反応陰性のＨＬＡ－ＤＲ４マウスにおけるＣＤ２０Ｂコンジュゲートの免疫原性のインビボ評価に関する。コンジュゲートＣＤ２０Ｂ又はＩＦＡ及びＣｐＧ中に配合された配列番号１のポリペプチドのいずれかを投与されたマウスからの脾細胞の刺激後のＴ細胞応答を測定するためのELISpotアッセイの結果を示すグラフである。刺激は、ＵＶ１６単独を使用して実施した。

【図18】本発明の一実施形態によるコンジュゲートの概略図を示す。本体部分（楕円）、３つの第１の連結基（白の角丸長方形）及び第２の連結基（白の五角形）を含むコアが図の上部に示される。コアは、３つのＢ細胞エピトープ、この場合にはＭＴＴＥ（黒の角丸長方形）；及び１つのＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープ（黒の五角形）を含むＳＬＰに連結できる。これにより、第１の接続要素（淡色の角丸長方形）によってＢ細胞エピトープに結合され、第２の接続要素（淡色の五角形）によってＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープを含むＳＬＰに結合された、図の下部に示す３＋１コンジュゲートが形成される。

【図19】合成例１７の逆相クロマトグラフィートレースを示す（Reprosil Gold 200 C18、カラム温度４０℃、流速１ｍＬ／分、溶離液Ａ＝水中０．１％ＴＦＡ、溶離液Ｂ＝アセトニトリル中０．１ＴＦＡ、９５：５（Ａ：Ｂ）から２：９８の勾配）。

【図20】合成例１７のＬＣＭＳトレースを示す。「＃」で標識されるピークは、様々な電荷での産物のピークに対応し（例えば、［Ｍ＋１０Ｈ］^１０＋では１４６２．２、［Ｍ＋１１Ｈ］^１１＋では１３２９．４、［Ｍ＋１２Ｈ］^１２＋では１２１８．６など）、予測質量は、１４６１４である。

【図21】実施例１６のワクチン接種スケジュールの概略図を示す。ＣＤ２９コンジュゲート又は３＋１＋１コンジュゲートを、プライム－ブースト－ブーストワクチン接種スケジュールを使用してＨＬＡ２－ＤＲ１マウスのグループに投与した。マウスの第３のグループは、プライム－ブースト－ブーストワクチン接種スケジュールを使用して、ＩＦＡを含むエマルション中のＵＶ３４ポリペプチド（ＧＶＥｘｔ５－配列番号１１６）で免疫化した。コンジュゲート及びペプチドは、各注射間に１週間の間隔をおいて免疫化された。動物を屠殺し、脾細胞及び流入領域リンパ節をインビトロアッセイのために収集した。

【図22A】ELISpotアッセイの結果を示す。脾臓及びリンパ節を使用してエクスビボELISpotアッセイを実施して、培地に放出されたペプチド特異的応答Ｔ細胞及びＩＦＮ－ガンマの頻度を同定した。以前のELISpotアッセイと同様のELISpotプロトコル。ＣＤ２９コンジュゲートの結果を示す。

【図22B】ELISpotアッセイの結果を示す。脾臓及びリンパ節を使用してエクスビボELISpotアッセイを実施して、培地に放出されたペプチド特異的応答Ｔ細胞及びＩＦＮ－ガンマの頻度を同定した。以前のELISpotアッセイと同様のELISpotプロトコル。３＋１＋１コンジュゲートの結果を示す。

【図22C】ELISpotアッセイの結果を示す。脾臓及びリンパ節を使用してエクスビボELISpotアッセイを実施して、培地に放出されたペプチド特異的応答Ｔ細胞及びＩＦＮ－ガンマの頻度を同定した。以前のELISpotアッセイと同様のELISpotプロトコル。配列番号１１６のポリペプチド（ＵＶ３４－ＧＶＥｘｔ５）＋ＩＦＡの結果を示す。

【図23】（配列番号１２６－ＧＶ１００１）の投与後の個々のペプチドに対するＴ細胞応答のグラフを示す。水平破線は、ベースラインとみなされる「細胞単独」の応答レベルである「カットオフ」を示す。カットオフライン／ベースラインを超えるペプチドのバーは、特定のペプチドに対するＴ細胞応答とみなされる。

【図24】（配列番号１１６－ＧＶＥｘｔ５）の投与後の個々のペプチドに対するＴ細胞応答のグラフを示す。水平破線は、ベースラインとみなされる「細胞単独」の応答レベルである「カットオフ」を示す。カットオフライン／ベースラインを超えるペプチドのバーは、特定のペプチドに対するＴ細胞応答とみなされる。

【図25】図２３及び２４の個別の結果を表にしたものを示す。

【図26】ヒト血漿産物TetaQuinからの抗ＭＴＴＥポリクローナル抗体へのコンジュゲートの結合を評価したサンドイッチＥＬＩＳＡアッセイの結果を示すグラフである。捕捉抗体は、抗ｐ７１９－２０（配列番号１）ウサギポリクローナルであった。

【図27】ヒト血漿産物TetaQuinからの抗ＭＴＴＥポリクローナル抗体へのコンジュゲートの結合を評価したサンドイッチＥＬＩＳＡアッセイの結果を示すグラフである。捕捉抗体は、抗ＧＶＥｘｔ５（配列番号１１６）ウサギポリクローナルであった。

【図28】間接ＥＬＩＳＡにおける、３つの異なる塩形態のＵＶＣ１－０１７（ｐ７１９－２０含有コンジュゲート）のモノクローナル抗ＭＴＴＥ（配列番号７）抗体への結合の結果を示すグラフである。ＴＦＡ塩の形態のコンジュゲートＵＶＣ１－０１７は、わずかに良好な結合を示した。

【図29】間接ＥＬＩＳＡにおける、３つの異なる塩形態のＵＶＣ１－０１７（ｐ７１９－２０含有コンジュゲート）のポリクローナル抗ＭＴＴＥ（配列番号７）抗体への結合の結果を示すグラフである。ＴＦＡ塩の形態のコンジュゲートＵＶＣ１－０１７は、わずかに良好な結合を示した。

【図30】間接ＥＬＩＳＡにおける、３つの異なる塩形態のＵＶＣ２－００１（ＧｖＥｘｔ５含有コンジュゲート）のモノクローナル抗ＭＴＴＥ（配列番号７）抗体への結合の結果を示すグラフである。同様の結合が３つの塩形態の全てで観察される。

【図31】間接ＥＬＩＳＡにおける、３つの異なる塩形態のＵＶＣ２－００１（ＧｖＥｘｔ５含有コンジュゲート）のポリクローナル抗ＭＴＴＥ（配列番号７）抗体への結合の結果を示すグラフである。同様の結合が３つの塩形態の全てで観察される。

【図32】TENDUワクチン接種試験に登録された患者からの血清中で測定された抗ＭＴＴＥ ＩｇＧの濃度を示すグラフである。

【図33】トランスジェニックＨＬＡ－Ａ２／ＨＬＡ－ＤＲ１動物におけるコンジュゲートの形態のＧＶＥｘｔ５ペプチド（配列番号１１６）及びペプチド＋ＩＦＡの免疫原性のインビボ評価のためのワクチン接種スケジュールの概略図である。

【図34】図３３のワクチン接種スケジュールに従った血清抗ＭＴＴＥ抗体研究の結果を示す。Ａは、実験終了時のマウスにおける抗ＭＴＴＥ抗体力価を示すグラフである。Ｂは、個々のグループのマウスにおけるコース免疫化中の様々な時点での抗ＭＴＴＥ抗体力価を示すグラフである。

【図35】図３３のワクチン接種スケジュールに従った研究の結果を示す。各グラフは、個々のペプチドによる刺激後のＴ細胞応答を示す：Ａ．ＵＶ３６；Ｂ．ＵＶ５８；Ｃ．ＵＶ５９；Ｄ．ＵＶ６０；Ｅ．ＵＶ６４；Ｆ．ＵＶ６５；及びＧ．ＵＶ６６。

【図36】図３３のワクチン接種スケジュールに従った研究の結果を示す。Ａは、ＵＶ３６ペプチド内の様々な長さのポリペプチド配列に対する、ＣＤ２９に曝露されたマウスのＴ細胞応答の合計を示すグラフである。Ｂは、個々のマウスのＴ細胞応答を示すグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0179】

発明の詳細な説明
本発明の実施形態では、コンジュゲートであって、
（ａ）Ｂ細胞エピトープの配列を含む少なくとも１つのポリペプチド；及び
（ｂ）ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープの配列を含む少なくとも１つのポリペプチドであって、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープは、ユニバーサル腫瘍抗原の少なくとも１２個のアミノ酸の領域又はその領域に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む、少なくとも１つのポリペプチド
を含むコンジュゲートが提供される。ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープは、集団の少なくとも５０％において免疫原性であり、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープの配列を含む少なくとも１つのポリペプチドは、５００アミノ酸以下の長さである。Ｂ細胞エピトープの配列は、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープの配列と異なり、Ｂ細胞エピトープに特異的な抗体は、コンジュゲートに結合する。Ｂ細胞エピトープの配列を含む少なくとも１つのポリペプチド及びＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープの配列を含む少なくとも１つのポリペプチドは、任意選択により、本明細書に定義されるようにコアを介して連結される。

【0180】

本発明の他の実施形態では、コンジュゲートの一部を形成しないポリペプチド及び核酸分子が提供される。

【0181】

本発明の上記実施形態の成分のさらなる詳細を以下に説明する。

【0182】

ポリペプチド
本発明の一態様によれば、配列番号１１６（すなわちＬＳＥＡＥＶＲＱＨＲＥＡＲＰＡＬＬＴＳＲＬＲＦＩＰＫＰＤＧＬ）及び１１７（すなわちＨＲＥＡＲＰＡＬＬＴＳＲＬＲＦＩＰＫＰＤＧＬＲＰＩＶＮＭＤＹ）から選択される配列を含むヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）タンパク質のポリペプチドが提供される。一実施形態では、配列番号１１６の配列を含むポリペプチドは、１７０アミノ酸以下の長さである。さらなる実施形態では、配列番号１１６の配列を含むポリペプチドは、１５０、１４０、１３０、１２５、１２０、１１０、１００、９０、８０、７５、６０、５０、４０又は３５アミノ酸以下の長さである。一実施形態では、配列番号１１７の配列を含むポリペプチドは、４０アミノ酸以下の長さである。さらなる実施形態では、配列番号１１７の配列を含むポリペプチドは、３８、３６、３５、３４、３３、３２又は３１アミノ酸以下の長さである。

【0183】

いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１１６又は１１７に示される配列からなる。他の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１１６又は１１７に示される配列を含む。一実施形態では、天然に存在するｈＴＥＲＴタンパク質には、Ｎ末端及び／又はＣ末端に任意の追加のアミノ酸が存在する。代替的実施形態では、Ｎ末端及び／又はＣ末端の任意の追加のアミノ酸は、天然に存在するｈＴＥＲＴタンパク質に存在するアミノ酸と異なる。

【0184】

他の実施形態では、前述のポリペプチドの免疫原性断片が提供され；断片は、配列番号１１６又は１１７の少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８又は２９個のアミノ酸を含む。

【0185】

テロメラーゼは、これらの領域は、通常の方法では酵素ＤＮＡポリメラーゼによって伸長できないため、真核細胞の直鎖状ＤＮＡ鎖のテロメア領域の３’末端を複製する機能を有する酵素である。テロメラーゼ酵素は、ＴＥＲＴサブユニット（ヒトでは「ｈＴＥＲＴ」）及びテロメラーゼＲＮＡを含む。テロメラーゼＲＮＡを鋳型として使用することにより、ＴＥＲＴサブユニットは、ＤＮＡ鎖の３’末端を延長するために、真核細胞の染色体の３’末端に反復配列を付加する。全長ｈＴＥＲＴ ｍＲＮＡ配列は、GenBankアクセッション番号ＡＦ０１５９５０．１に記載されており、アミノ酸配列は、UniProtアクセッション番号Ｏ１４７４６に記載されており、配列番号２にも記載されている。配列番号１１６及び１１７は、それぞれｈＴＥＲＴタンパク質の３０個のアミノ酸断片からなる。

【0186】

さらなる実施形態では、ポリペプチドは、前述のポリペプチド又はその免疫原性断片の１つと正確な配列同一性を有しない。代わりに、ポリペプチドは、配列番号１１６又はその免疫原性断片のものに対して少なくとも９１％の配列同一性を有する配列を含む。配列は、上記のものに対して少なくとも９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有することが特に好ましい。一実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１１７又はその免疫原性断片のものに対して少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含む。配列は、上記のものに対して少なくとも９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有することが特に好ましい。アミノ酸配列の任意の付加又は置換が元のアミノ酸側鎖の特性の保存をもたらすことも好ましい。すなわち、置換又は修飾は、「保存的」である。

【0187】

機能的に類似したアミノ酸を提供する保存的置換表は、当技術分野において周知である。アミノ酸側鎖の性質の例は、疎水性アミノ酸（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｗ、Ｙ、Ｖ）、親水性アミノ酸（Ｒ、Ｄ、Ｎ、Ｃ、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｓ、Ｔ）並びに以下の共通の官能基又は特徴を有する側鎖：脂肪族側鎖（Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ）；水酸基含有側鎖（Ｓ、Ｔ、Ｙ）；硫黄原子含有側鎖（Ｃ、Ｍ）；カルボン酸及びアミド含有側鎖（Ｄ、Ｎ、Ｅ、Ｑ）；塩基含有側鎖（Ｒ、Ｋ、Ｈ）；及び芳香族含有側鎖（Ｈ、Ｆ、Ｙ、Ｗ）である。さらに、以下の８つのグループは、互いの保存的置換であるアミノ酸をそれぞれ含有する（例えば、Creighton, Proteins (1984)を参照されたい）：
１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；
２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；
３）アスパルギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；
４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；
５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；
６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；
７）セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）；及び
８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）。

【0188】

いくつかの実施形態では、ポリペプチドのカクテル（すなわち混合物）が提供され、カクテルは、配列番号１、１１６及び１１７からの配列を含む少なくとも２つの異なるポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、カクテルは、前記ポリペプチドの免疫原性断片を含み、免疫原性断片は、少なくとも８個のアミノ酸を含む。さらなる実施形態では、カクテル中のポリペプチド又は各ポリペプチドは、配列番号１、１１６若しくは１１７の配列又はその免疫原性断片に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む。配列は、上記のものに対して少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有することが特に好ましい。好ましい実施形態では、カクテル中のポリペプチドは、配列番号１及び１１６の配列又はその免疫原性断片を含む。このような実施形態では、配列番号１の免疫原性断片は、その少なくとも８個のアミノ酸、より好ましくはその１２個のアミノ酸を含み、配列番号１１６の免疫原性断片は、その少なくとも１７個のアミノ酸を含むことが好ましい。一実施形態では、ポリペプチドは、５００アミノ酸以下、好ましくは４００、３００、２００、１７０、１５０、１２５、１００、９０、８０、７０、７５、６０、５０、４０又は３０アミノ酸以下の長さである。少なくとも２つのポリペプチドは、配列番号１、１１６及び１１７から選択される異なる配列に基づくという意味で異なることが好ましい。

【0189】

さらなる実施形態では、上記のポリペプチド又は各ポリペプチドは、コンジュゲート内に含まれる。したがって、一実施形態では、コンジュゲートのカクテル（すなわち混合物）が提供される。一実施形態では、本発明のポリペプチドを含むコンジュゲートは、以下にさらに詳細に記載されるコンジュゲートである。

【0190】

一実施形態では、配列番号１、１１６及び１１７の配列を含む少なくとも２つの異なるポリペプチドは、単一のポリペプチド内に提供される。すなわち、配列番号１、１１６及び１１７から選択される少なくとも２つの異なる配列を含む単一のポリペプチド鎖が提供される。いくつかの実施形態では、単一のポリペプチドは、前記ポリペプチドの免疫原性断片を含み、免疫原性断片は、少なくとも８個のアミノ酸を含む。さらなる実施形態では、単一のポリペプチドは、配列番号１、１１６若しくは１１７の１つ以上から選択される配列又はその免疫原性断片に対して、少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む。配列は、上記のものに対して少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有することが特に好ましい。

【0191】

好ましい実施形態では、単一のポリペプチドは、配列番号１及び１１６の配列又はその免疫原性断片を含む。このような実施形態では、配列番号１の免疫原性断片は、その少なくとも８個のアミノ酸、より好ましくはその１２個のアミノ酸を含み、配列番号１１６の免疫原性断片は、その少なくとも１７個のアミノ酸を含むことが好ましい。

【0192】

いくつかの実施形態では、上記のような単一のポリペプチドは、１７０アミノ酸以下である。好ましくは、長さは、１５０、１４０、１３０、１２５、１２０、１１０、１００、９０、８０、７５又は６０アミノ酸以下の長さである。いくつかの実施形態では、単一のポリペプチド内に含まれる２つの異なるポリペプチド又は免疫原性断片間の介在配列（例えば、配列番号１及び１１６）が提供される。一実施形態では、介在配列は、天然に存在するｈＴＥＲＴタンパク質で見出されるものと同じである。代替的実施形態では、介在配列は、天然に存在するｈＴＥＲＴタンパク質に見られるものと異なる（すなわち１００％未満の配列同一性を有する）。一実施形態では、介在配列は、ｈＴＥＲＴに由来しない。一実施形態では、介在配列は、プロテアソーム切断部位である。

【0193】

カクテル又は単一のポリペプチド中の少なくとも２つの異なるポリペプチドが、広範囲のＨＬＡクラスＩ及び／又はＨＬＡクラスＩＩ対立遺伝子によって認識され得るエピトープを含むことが特に好ましい。いくつかの実施形態では、カクテル又は単一のポリペプチドが、異なる配列を有する３つ以上のポリペプチドを含むことも理解されたい。一実施形態では、３、４、５個又はそれを超える異なるポリペプチドが提供される。

【0194】

いくつかの実施形態では、特定のＨＬＡ対立遺伝子のＭＨＣ分子に対するポリペプチドの結合親和性を変化させる（例えば増加させる）ために、上記のようなポリペプチドの配列が改変される。他の実施形態では、ポリペプチドは、上に示したもの加えて、そのＮ末端及び／又はＣ末端にさらなるアミノ酸を有する。このような追加のアミノ酸は、ＭＨＣ分子に対するポリペプチドの結合親和性を変化させる（例えば増加させる）ために使用することもできる。

【0195】

ポリペプチド（特にその配列が上記のように改変されたポリペプチド）は、ＣＤ４＋及び／又はＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘発することができる。すなわち、ポリペプチドは、抗原提示細胞（例えば、樹状細胞）によって提示された場合、ＣＤ４＋及び／又はＣＤ８＋Ｔ細胞を誘導できるはずである。一実施形態では、ＣＤ４＋Ｔ細胞免疫応答は、Ｔ細胞増殖アッセイ（３Ｈ－チミジン）によって測定される（Inderberg-Suso et al. Oncoimmunology. 2012 Aug 1; 1(5): 670-686に以前に記載されているとおり）。一実施形態では、ＣＤ４＋エピトープに対する応答がバックグラウンドの少なくとも２又は３倍である場合（刺激指数、ＳＩ≧２又は３）、ＣＤ４＋Ｔ細胞免疫応答は陽性であるとみなされる。一実施形態では、ＣＤ８＋Ｔ細胞誘導性の確認は、ヒトＭＨＣ抗原を保有する抗原提示細胞（例えば、Ｂリンパ球、マクロファージ又は樹状細胞）又はより具体的にはヒト末梢血単核白血球由来の樹状細胞を誘導することによって達成することができ、ポリペプチドによる刺激後、ＣＤ８＋細胞と混合し、標的細胞に対してＣＤ８＋Ｔ細胞によって産生及び放出されるＩＦＮ－ガンマを測定する。反応系としては、ヒトＨＬＡ抗原を発現するように産生されたトランスジェニック動物（例えば、BenMohamed L, Krishnan R, Longmate J, Auge C, Low L, Primus J, Diamond DJ, Hum Immunol 61(8): 764-79, 2000 Aug, Related Articles, Books, Linkout Induction of CTL response by a minimal epitope vaccine in HLA A*0201/DR1 transgenic mice: dependence on HLA class II restricted T(H) responseに記載されているもの）を使用できる。例えば、標的細胞は、^５１Ｃｒで放射性標識することができ、細胞傷害活性は標的細胞から放出される放射能から計算できる。

【0196】

一実施形態では、ＨＬＡ抗原を発現するトランスジェニック動物を使用して、ポリペプチドがＣＤ４＋及び／又はＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘発できるかどうかを評価する。一実施形態では、ＨＬＡ－ＤＲ４マウスモデルを使用して、ＣＤ４＋Ｔ細胞免疫応答を測定する。代替的実施形態では、ＨＬＡ－Ａ２／ＨＬＡ－ＤＲ１マウスモデルを使用して、ＣＤ４＋及び／又はＣＤ８＋Ｔ細胞免疫応答を測定する。

【0197】

さらなる実施形態では、ＣＤ４＋及び／又はＣＤ８＋Ｔ細胞誘導性は、ELISpotアッセイを使用して調べることができる。一実施形態では、固定化ペプチドを保有する抗原提示細胞の存在下でＣＤ４＋及び／又はＣＤ８＋Ｔ細胞によって産生及び放出されるＩＦＮ－ガンマが測定され、抗ＩＦＮ－ガンマモノクローナル抗体を使用して培地上の阻害ゾーンが視覚化される。より具体的には、Ｔ細胞は、ＩＦＮ－ガンマに対する固定化抗体を含有する膜上で培養される。これらの抗体は、関連するＴ細胞によって産生されるインターフェロンガンマを捕捉し、ＩＦＮガンマに対する二次抗体によって視覚化できる。この抗体は酵素標識されており、基質を加えると抗原反応性細胞を含有する部位にスポットが可視化される。ELISpotアッセイのさらなる例を以下に記載する（例えば、実施例１０、１１、１４、１５）。

【0198】

本発明のいくつかのさらなる実施形態では、ポリペプチドは、ＣＤ４＋及び／又はＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘導するその能力を保持しながら、さらなる物質に（例えば、共有結合で）連結される。このようなさらなる物質には、脂質、糖又は糖鎖、アセチル基、天然又は合成ポリマーなどが含まれる。一実施形態では、ポリペプチドは、以下に詳細に記載されるように、コンジュゲートの形態でさらなるペプチドに連結される。一実施形態では、本明細書に定義されるポリペプチド又は免疫原性断片と、さらなるポリペプチドとを含む、より長い抗原リッチなポリペプチド鎖（すなわち単一のポリペプチド）が提供される。一実施形態では、さらなるポリペプチドは、さらなるｈＴＥＲＴ由来配列（例えば、長さが少なくとも１０、１５、２０、２５、３０又は３５アミノ酸）である。すなわち、いくつかの実施形態では、２つ以上の異なるｈＴＥＲＴ由来ポリペプチド配列が、単一のポリペプチド鎖内に一緒に含まれる。一実施形態では、介在配列（例えば、リンカー要素）は、２つのポリペプチド間に提供される。一実施形態では、介在配列は、ｈＴＥＲＴに由来しないか、又は天然に存在するｈＴＥＲＴ配列と１００％未満の配列同一性を有する。一実施形態では、リンカー要素は、プロテアソーム切断部位である。特定の実施形態では、ポリペプチドは、グリコシル化、側鎖酸化又はリン酸化などの修飾を含有する。

【0199】

いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、当技術分野で公知の従来のプロセスによって産生される。代わりに、ポリペプチドは、例えば、臭化シアンを使用した切断及びその後の精製によって産生されるテロメラーゼタンパク質の断片である。酵素的切断も使用され得る。さらなる実施形態では、ポリペプチドは、組換え発現ポリペプチドの形態である。例えば、発現可能な形態（例えば、プロモーター配列に対応する調節配列の下流）でポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む適切なベクターが調製され、適切な宿主細胞に形質転換される。次いで、宿主細胞を培養して、目的のポリペプチドを産生する。他の実施形態では、ポリペプチドは、インビトロ翻訳系を使用してインビトロで産生される。

【0200】

いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、ＨＲＥＡＲＰＡＬＬＴＳＲＬＲＦＩＰＫＰＤＧＬＲＰＩＶＮＭＤＹＶＶＧＡＲＴＦＲＲＥＫ（配列番号１２０）、ＥＡＲＰＡＬＬＴＳＲＬＲＦＩＰＫＰＤＧＬＲＰＩＶＮＭＤＹ（配列番号１２１）、ＥＡＲＰＡＬＬＴＳＲＬＲＦＩＰＫＰＤＧＬＲＰＩＶＮＭＤＹＶ（配列番号１２２）、ＥＡＲＰＡＬＬＴＳＲＬＲＦＩＰＫＰＤＧＬＲＰＩＶＮＭＤ（配列番号１２３）又はＡＥＶＲＱＨＲＥＡＲＰＡＬＬＴＳＲＬＲＦＩＰＫＰＤＧＬ（配列番号１２４）のいずれかの配列から構成されない。

【0201】

核酸分子
本発明の代替的実施形態では、上記のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列からなる核酸分子が提供される。一実施形態では、配列番号１、１１６又は１１７をコードするヌクレオチド配列は、それぞれ配列番号１６０～１６２に示されるとおりである。

【0202】

いくつかの実施形態では、上記のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列からなる核酸分子の長さは、１，５００ヌクレオチド以下である。好ましくは、長さは、１，２００、９００、６００、５１０、４５０、４２０、３９０、３７５、３６０、３３０、３００、２７０、２４０、２２５、１８０、１５０、１２０、１１４、１０８、１０５、１０２、９６又は９０ヌクレオチド以下である。

【0203】

いくつかの実施形態では、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、天然に存在するｈＴＥＲＴ配列（例えば、GenBankアクセッション番号ＡＦ０１５９５０．１に示される）の配列に対し１００％未満の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、コドン最適化は、例えば、適切な宿主細胞内での発現のために、ヌクレオチド配列を変更するために使用される。このような実施形態では、コドン最適化により、天然に存在するｈＴＥＲＴ配列と比較して、ヌクレオチド配列に変化が生じることを理解されたい。さらなる実施形態では、追加のヌクレオチドは、本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の３’又は５’末端に組み込まれる。いくつかの実施形態では、そのような追加のヌクレオチドは、天然に存在するｈＴＥＲＴ配列に見出されるものと異なる。一実施形態では、核酸分子は、５’キャップを含む。一実施形態では、本明細書に定義されるポリペプチド又は免疫原性断片をコードするヌクレオチド配列及びさらなるポリペプチドをコードするさらなるヌクレオチド配列を含む核酸分子が提供される。一実施形態では、さらなるヌクレオチド配列は、さらなるｈＴＥＲＴ由来配列をコードする（例えば、さらなるヌクレオチド配列が少なくとも３０～６００ヌクレオチド長であるように、少なくとも１０～２００アミノ酸の長さをコードする）。すなわち、いくつかの実施形態では、ｈＴＥＲＴ由来のポリペプチド配列をコードする２つ以上の異なるヌクレオチド配列が、単一の核酸分子内に一緒に含まれる。一実施形態では、介在配列（例えば、リンカー要素をコードする）は、２つのヌクレオチド配列間に提供される。一実施形態では、介在配列は、ｈＴＥＲＴに由来しないか、又は天然に存在するｈＴＥＲＴ配列と１００％未満の配列同一性を有する。一実施形態では、コードされたリンカー要素は、プロテアソーム切断部位である。

【0204】

いくつかの実施形態では、核酸分子は、さらなる物質に（例えば、共有結合で）連結される。一実施形態では、核酸分子は、キャリア部分に連結される。一実施形態では、キャリア部分は、免疫原性キャリアである。一実施形態では、核酸分子は、脂質ナノ粒子内に含まれる。

【0205】

さらなる実施形態では、配列番号１、１１６又は１１７の配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む少なくとも２つの異なる核酸分子を含む核酸分子のカクテル（すなわち混合物）が提供される。代替的実施形態では、コードされたポリペプチドは配列番号１、１１６又は１１７の免疫原性断片であり、免疫原性断片は、少なくとも８個のアミノ酸を含む。別のバリアントでは、コードされたポリペプチドの配列は、前述のものと同一ではないが、それに対して少なくとも８０％の配列同一性を有する。好ましくは、前述のものに対して少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性。好ましい実施形態では、カクテル中のコードされたポリペプチドは、配列番号１及び１１６の配列又はその免疫原性断片を含む。このような実施形態では、コードされる配列番号１の免疫原性断片は、その少なくとも８個のアミノ酸、より好ましくはその１２個のアミノ酸を含むことが好ましく、コードされる配列番号１１６の免疫原性断片は、その少なくとも１７個のアミノ酸を含むことが好ましい。一実施形態では、コードされたポリペプチドは、５００、４００、３００、２００、１７０、１５０、１２５、１００、９０、８０、７０、７５、６０、５０、４０又は３０アミノ酸以下の長さである。少なくとも２つの核酸分子は、配列番号１、１１６及び１１７から選択される異なる配列に基づくという意味で異なることが好ましい。

【0206】

一実施形態では、配列番号１、１１６又は１１７の配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む少なくとも２つの異なる核酸分子が単一分子内に提供される。すなわち、少なくとも２つの異なるヌクレオチド配列を含み、それぞれが配列番号１、１１６及び１１７の配列から選択されるポリペプチドをコードする、単一の分子が提供される。いくつかの実施形態では、コードされたポリペプチドは配列番号１、１１６又は１１７の免疫原性断片であり、免疫原性断片は、少なくとも８個のアミノ酸を含む。さらなる実施形態では、コードされたポリペプチドの配列は、前述のものと同一ではないが、それに対して少なくとも８０％の配列同一性を有する。好ましくは、前述のものに対して少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性。

【0207】

好ましい実施形態では、単一分子は、ヌクレオチド配列を含み、そのそれぞれが配列番号１及び１１６の配列を含むポリペプチド又はその免疫原性断片をコードする。このような実施形態では、コードされる配列番号１の免疫原性断片は、その少なくとも８個のアミノ酸、より好ましくはその１２個のアミノ酸を含むことが好ましく、コードされる配列番号１１６の免疫原性断片は、その少なくとも１７個のアミノ酸を含むことが好ましい。

【0208】

一実施形態では、単一分子は、単一の核酸分子である。いくつかの実施形態では、単一の核酸分子の長さは、１，５００ヌクレオチド以下である。好ましくは、長さは、１，２００、９００、６００、５１０、４５０、４２０、３９０、３７５、３６０、３３０、３００、２７０、２４０、２２５又は１８０ヌクレオチド以下である。

【0209】

いくつかの実施形態では、単一分子又は核酸分子内に含まれる２つの異なるヌクレオチド配列（例えば、配列番号１及び１１６をコードするもの）間の介在ヌクレオチド配列が提供される。一実施形態では、介在配列は、天然に存在するｈＴＥＲＴタンパク質をコードするヌクレオチド配列に見出されるものと同じである。代替的実施形態では、介在配列は、天然に存在するｈＴＥＲＴタンパク質をコードするヌクレオチド配列に見られるものと異なる（すなわち１００％未満の配列同一性を有する）。一実施形態では、介在配列は、ｈＴＥＲＴに由来しない。一実施形態では、介在配列は、プロテアソーム切断部位をコードする。

【0210】

いくつかの実施形態では、カクテルが異なる配列を有する２つを超える異なる核酸分子を含むか、又は単一の核酸分子が２つを超える異なるヌクレオチド配列を含むことも理解されたい。一実施形態では、３、４、５個又はそれを超える異なる核酸分子又は異なるヌクレオチド配列が提供される。

【0211】

さらなる実施形態では、上記の核酸分子又はその断片を含むベクターが提供される。使用される特定のベクターは、核酸分子が発現される宿主生物又は細胞、宿主細胞を形質転換するために使用される方法及び／又はタンパク質発現（又はベクターの他の意図された用途）に使用される方法に依存し得る。一実施形態では、ベクターは、核酸分子のエンドソーム脱出を促進する物質を含む。

【0212】

遺伝暗号の縮重により、特定のポリペプチドをコードする核酸分子は、ある範囲のポリヌクレオチド配列を有し得ることを理解されたい。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ及びＧＣＴは、全てアミノ酸アラニンをコードする。

【0213】

核酸分子は、ＤＮＡ若しくはＲＮＡ又はそれらの誘導体のいずれでもあり得る。

【0214】

一実施形態では、上記のポリペプチド及び／又は核酸分子のいずれか１つの組み合わせが提供される。

【0215】

コンジュゲート
本発明のさらなる態様によれば、Ｂ細胞エピトープの配列を含む少なくとも１つのポリペプチドと、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープの配列を含む少なくとも１つのポリペプチドとを含むコンジュゲートが提供される。

【0216】

Ｂ細胞エピトープの配列を含む少なくとも１つのポリペプチドは、Ｂ細胞エピトープの配列を含む２つ以上のポリペプチドであることが好ましく、Ｂ細胞エピトープの配列を含む２つ又は３つのポリペプチドが特に好ましい。Ｂ細胞エピトープの配列を含むポリペプチドを超えるものが存在するいくつかの実施形態では、これらのポリペプチドは、それぞれ同じ配列を有する。

【0217】

第１の実施形態では、コンジュゲートのＢ細胞エピトープは、配列番号７の配列（すなわちＦＩＧＩＴＥＬＫＫＬＥＳＫＩＮＫＶＦ）を含む。好ましい実施形態では、Ｂ細胞エピトープは、配列番号７の配列からなる。配列番号７の長さは１８アミノ酸であり、破傷風毒素（ＴＴｘ）の配列に由来する。ＴＴｘは、嫌気性条件下で破傷風菌（Clostridium tetani）の栄養胞子によって産生される神経毒であり、ヒトにおいて破傷風を引き起こす。ＴＴｘアミノ酸配列は、UniProtアクセッション番号Ｐ０４９５８及び配列表の配列番号３に記載されている。ＴＴｘは、破傷風菌（C. tetani）によって単一のポリペプチド鎖として合成され、タンパク質分解されて、アミノ末端に由来する軽鎖（ＬＣ；アルファ鎖としても知られる）及びカルボキシル末端に由来する重鎖（ＨＣ；ベータ鎖としても知られる）の２つの断片が得られる。ＴＴｘ軽鎖及び重鎖は、それぞれ配列表の配列番号４及び５によって表される。ＴＴｘでは、軽鎖と重鎖がジスルフィド結合によって連結される。配列番号７は、ＴＴｘ重鎖のアミノ酸３８１～３９８、すなわち配列番号５のアミノ酸３８１～３９８に対応する。

【0218】

コンジュゲートのＢ細胞エピトープの機能（以下でさらに詳細に説明する）は、コンジュゲートを抗原提示細胞（ＡＰＣ）に指向させるために、対象内の循環抗体に結合することである。（西側世界では）大多数の人が小児期に破傷風に対して免疫化されており、集団の大部分がＴＴｘに対する循環抗体を有すると予想されるため、ＴＴｘ由来のＢ細胞エピトープを有することは有利である。

【0219】

配列番号７は、アミノ酸配列「ＧＩＴＥＬＫＫＬ」（配列表の配列番号６によって表される）を含み、より具体的には、配列番号６は、配列番号７のアミノ酸位置３～１０に位置することを理解されたい。配列番号６は、ＴＴｘ重鎖のアミノ酸３８３～３９０、すなわち配列番号５のアミノ酸３８３～３９０に対応する。

【0220】

第１の実施形態では、配列番号７の配列を含む少なくとも１つのポリペプチドは、配列番号７の配列を含む第１、第２及び第３のポリペプチドである。換言すれば、コンジュゲートは、配列番号７の配列を含むポリペプチドの３つのコピーを含む。代替的実施形態では、配列番号７の配列を含む少なくとも１つのポリペプチドは、単一のポリペプチド又は第１及び第２のポリペプチドである。一実施形態では、コンジュゲートは、さらなる物質を含む。すなわち、コンジュゲートは、Ｂ細胞エピトープの配列を含む少なくとも１つのポリペプチド及びＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープの配列を含む少なくとも１つのポリペプチドに加えて、さらなる物質を含む。一実施形態では、さらなる物質は、さらなるポリペプチドである。好ましい実施形態では、さらなるポリペプチドは、エピトープの配列を含む。一実施形態では、エピトープは、免疫応答を誘発することができる抗原の任意の配列である。一実施形態では、エピトープの配列は、さらなるＴ細胞エピトープ、好ましくは、さらなるＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープ及び／又はＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープである。さらなる実施形態では、コンジュゲートは、配列番号７の配列を含む４、５、６、７、８、９、１０個又はそれを超えるポリペプチドを含む。

【0221】

代替的実施形態では、コンジュゲートのＢ細胞エピトープは、配列番号７のものと異なる配列を有する。一実施形態では、Ｂ細胞エピトープは、配列番号５（すなわちＴＴｘ重鎖）において連続しており、及び配列表の配列番号６によって表されるアミノ酸配列「ＧＩＴＥＬＫＫＬ」を含む少なくとも１０個のアミノ酸を含む、異なる配列を含む。一実施形態では、異なる配列は、配列番号５において連続しており、及び配列表の配列番号６によって表されるアミノ酸配列「ＧＩＴＥＬＫＫＬ」を含む、少なくとも１２、１５又は１８個のアミノ酸を含む。さらなる実施形態では、Ｂ細胞エピトープは、配列番号５において連続しており、及び配列表の配列番号６によって表されるアミノ酸配列「ＧＩＴＥＬＫＫＬ」を含む、少なくとも２０、２５、３０、３５、４０、４５又は５０個のアミノ酸を含む、配列を含む。一実施形態では、Ｂ細胞エピトープは、上記のような配列のいずれか１つからなる。

【0222】

一実施形態では、Ｂ細胞エピトープは、配列番号５９～１１５のいずれか１つから選択される配列を含む。さらなる実施形態では、Ｂ細胞エピトープは、配列番号５９～１１５のいずれか１つから選択される配列からなる。

【0223】

さらなる代替的実施形態では、Ｂ細胞エピトープは、配列表の配列番号６によって表されるアミノ酸配列「ＧＩＴＥＬＫＫＬ」を含むもの以外の、配列番号５において連続している、少なくとも１０個のアミノ酸を含む。すなわち、Ｂ細胞エピトープは、配列番号５の配列の異なる領域に由来する。なおさらなる実施形態では、Ｂ細胞エピトープは、配列番号３において連続している少なくとも１０個のアミノ酸を含む。

【0224】

一実施形態では、Ｂ細胞エピトープの配列を含む少なくとも１つのポリペプチドは、配列番号５の配列を含まない。すなわち、Ｂ細胞エピトープを含む少なくとも１つのポリペプチドは、ＴＴｘ重鎖の完全配列を含まない。一実施形態では、Ｂ細胞エピトープを含む少なくとも１つのポリペプチドは、５００、４００、３００、２００又は１００アミノ酸以下の長さである。さらなる実施形態では、Ｂ細胞エピトープを含む少なくとも１つのポリペプチドは、９０、８０、７５、７０、６０、５０、４０又は３０アミノ酸以下の長さである。

【0225】

さらなる実施形態では、Ｂ細胞エピトープ及び／又はＢ細胞エピトープの配列を含むポリペプチドは、前述の配列の１つに対して正確な配列同一性を有しない。代わりに、ポリペプチド及び／又はＢ細胞エピトープは、上記に示されるものと少なくとも７０％の配列同一性を有する。好ましくは、上記のものに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性。アミノ酸配列の任意の付加又は置換が元のアミノ酸側鎖の特性の保存をもたらすことも好ましい。すなわち、置換又は修飾は、「保存的」である（上記のとおり）。

【0226】

一実施形態では、Ｂ細胞エピトープは、配列番号７の配列に対して１００％未満の配列同一性を有する配列を含むか又はそれからなるが、配列番号７の位置３～５及び１１に相当する位置のアミノ酸は、配列番号７の位置３～５及び１１のアミノ酸から変化していない。

【0227】

前述のＢ細胞エピトープの１つに対し１００％の配列同一性を有しないＢ細胞エピトープは、「バリアントＢ細胞エピトープ」と呼ばれる。ＴＴｘに由来するバリアントＢ細胞エピトープ（例えば、配列番号３～５のいずれか１つに由来する）が抗ＴＴｘ抗体によって結合できることが重要である。一実施形態では、配列番号３～５のいずれか１つに由来するバリアントＢ細胞エピトープが抗ＴＴｘ抗体に結合することの確認は、Tettox ELISAを使用して達成される。「Tettox ELISA」は、抗ＴＴｘ抗体に特異的なＥＬＩＳＡアッセイである。当業者であれば、抗ＴＴｘ抗体が、配列番号３～５のいずれか１つに由来する目的の特定のバリアントＢ細胞エピトープに結合するかどうかを同定するためにＥＬＩＳＡアッセイを実施する方法を理解するであろう。このようなバリアントＢ細胞エピトープは、当技術分野で公知の任意の方法、例えば、化学合成によって生成され得る。抗ＴＴｘ抗体は、破傷風トキソイドワクチンを受けたヒトドナーからポリクローナル抗体血清として取得され得る。例示的なTettox ELISAプロトコルは、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１１／１１５４８３号に詳細に記載されている。

【0228】

代替的実施形態では、Ｂ細胞エピトープは、破傷風毒素ではないタンパク質又はポリペプチドに由来する。

【0229】

本発明のコンジュゲートは、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープの配列を含む少なくとも１つのポリペプチドも含む。一実施形態では、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープは、ユニバーサル腫瘍抗原の少なくとも１２個のアミノ酸の領域を含む。

【0230】

ユニバーサル腫瘍抗原は、高い割合の腫瘍タイプで発現される抗原である。一実施形態では、ユニバーサル腫瘍抗原は、正常（すなわち非癌性）組織では広く発現されない。一実施形態では、これは、正常組織の限られたサブセットで発現される。さらなる実施形態では、ユニバーサル腫瘍抗原は、各腫瘍タイプ内の高い割合の患者で発現される。癌は不均一な疾患であり、異なる腫瘍タイプ間及び同じ腫瘍タイプ内の患者間で高度な多様性が存在する。ユニバーサル腫瘍抗原を標的化することにより、患者集団にわたる（すなわち癌及び／又は腫瘍タイプ内及びその間の）癌療法の適用可能性が改善する。

【0231】

本発明の第１の実施形態では、ユニバーサル腫瘍抗原は、テロメラーゼ酵素のテロメラーゼ逆転写酵素サブユニット（ヒトについては「ＴＥＲＴ」又は「ｈＴＥＲＴ」）である（上記のとおり）。テロメラーゼは、骨髄及び胃腸管の幹細胞などの特定の正常組織で発現する。しかし、テロメラーゼ酵素は全てのヒトの癌の大部分で活性化されていることが観察されている（例えば、Kim et al., Science. 1994 266(5193): 2011-5；Shay & Wright, FEBS Lett. 2010 584(17): 3819-25）。テロメラーゼ酵素の発現がなければ、細胞のテロメアは徐々に失われ、細胞の細胞分裂の各ラウンドで染色体の完全性が低下し、最終的に細胞のアポトーシスを引き起こすため、テロメラーゼはヒトの癌の大部分で活性化されていると考えられている。したがって、テロメラーゼ酵素の発現がなければ、プログラムされた細胞死が通常デフォルトで起こるため、テロメラーゼ酵素の発現は、癌細胞が発生するために一般に必要である。癌におけるテロメラーゼ活性化の役割を考慮すると、ＴＥＲＴ／ｈＴＥＲＴからのポリペプチドはユニバーサル腫瘍抗原とみなされる。

【0232】

好ましい実施形態では、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープは、配列番号１（すなわちＡＬＦＳＶＬＮＹＥＲＡＲＲＰＧＬＬＧＡＳＶＬＧＬＤＤＩＨＲＡ）、配列番号１１６（すなわちＬＳＥＡＥＶＲＱＨＲＥＡＲＰＡＬＬＴＳＲＬＲＦＩＰＫＰＤＧＬ）及び／又は配列番号１１７（すなわちＨＲＥＡＲＰＡＬＬＴＳＲＬＲＦＩＰＫＰＤＧＬＲＰＩＶＮＭＤＹ）の配列を含む。ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープは、配列番号１、１１６及び／又は１１７の配列からなることが好ましい。より好ましくは、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープは、配列番号１又は１１６の配列を含むか又はそれからなる。配列番号１、１１６又は１１７のポリペプチドは、それぞれ３０アミノ酸の長さである。配列番号１、１１６及び１１７は、それぞれｈＴＥＲＴの３０個のアミノ酸断片からなる。

【0233】

他の実施形態では、少なくとも１２個のアミノ酸を含む、配列番号１、１１６又は１１７の免疫原性断片が提供される。一実施形態では、免疫原性断片は、配列番号１、１１６又は１１７の１２個のアミノ酸からなる。代替的実施形態では、免疫原性断片は、配列番号１、１１６又は１１７の、少なくとも１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８又は２９個のアミノ酸を含む。さらなる実施形態では、免疫原性断片は、配列番号１、１１６又は１１７の、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８又は２９個のアミノ酸からなる。配列番号１の例示的な免疫原性断片には、配列番号１２～３５に示されるものが含まれる。

【0234】

第１の実施形態では、配列番号１、１１６又は１１７の配列を含む少なくとも１つのポリペプチドは、単一のポリペプチドである（すなわち、コンジュゲートは、配列番号１の配列を含む１つのポリペプチドを含有する）。代替的実施形態では、配列番号１、１１６又は１１７の配列を含む少なくとも１つのポリペプチドは第１のポリペプチドであり、コンジュゲートは複数のポリペプチドを含み、そのそれぞれが配列番号１、１１６又は１１７から選択される配列をコードする。一実施形態では、コンジュゲートは、配列番号１の配列を含むポリペプチド及び配列番号１１６の配列を含むポリペプチドを含む。

【0235】

さらなる実施形態では、コンジュゲートは、さらなる物質を含む。すなわち、コンジュゲートは、Ｂ細胞エピトープの配列を含む少なくとも１つのポリペプチド及びＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープの配列を含む少なくとも１つのポリペプチドに加えて、さらなる物質を含む。一実施形態では、さらなる物質は、さらなるポリペプチドである。好ましい実施形態では、さらなるポリペプチドは、エピトープの配列を含む。一実施形態では、エピトープは、免疫応答を誘発することができる抗原の任意の配列である。一実施形態では、エピトープの配列は、さらなるＴ細胞エピトープ、好ましくは、さらなるＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープ及び／又はＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープである。いくつかの実施形態では、さらなるＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープは、配列番号１、１１６又は１１７の配列を含むものと異なることを理解されたい。一実施形態では、さらなるＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープ及び／又はＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープは、それぞれＣＤ４＋Ｔ細胞又はＣＤ８＋Ｔ細胞によって認識することができる任意の配列である。一実施形態では、コンジュゲートは、配列番号１、１１６又は１１７の配列を含むポリペプチドと、それぞれがエピトープを含む、さらに１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれを超えるポリペプチドとを含む。

【0236】

したがって、いくつかの実施形態では、コンジュゲートは、Ｂ細胞エピトープの配列を含む少なくとも１つのポリペプチド及びＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープの配列を含む少なくとも１つのポリペプチドに加えて、さらなる物質を含む。

【0237】

一実施形態では、配列番号１、１１６又は１１７の配列を含む少なくとも１つのポリペプチドは、さらなるＴ細胞エピトープの配列を含む。一実施形態では、さらなるＴ細胞エピトープは、さらなるＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープ及び／又はＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープである。一実施形態では、少なくとも１つのポリペプチドは、配列番号１の配列を含み、さらなるＴ細胞エピトープは、配列番号１１６又は１１７、好ましくは配列番号１１６の配列を含む。代替的実施形態では、さらなるＴ細胞エピトープは、配列番号１、１１６又は１１７のものと異なる配列を含む。したがって、いくつかの実施形態では、さらなるＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープ及び／又はＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープは、それぞれＣＤ４＋Ｔ細胞又はＣＤ８＋Ｔ細胞によって認識することができる任意の配列である。さらなるＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープを含む特定の実施形態では、配列番号１、１１６又は１１７の配列及びさらなるＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープの配列は、少なくとも１つのポリペプチド内で連続的に及び／又は重複して配置される。ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを含む特定の実施形態では、ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープは、配列番号１、１１６又は１１７の配列内に含まれる。すなわち、配列番号１、１１６又は１１７の配列は、ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープの配列を包含する。代替的実施形態では、配列番号１、１１６又は１１７の配列及びＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープは、少なくとも１つのポリペプチド内で連続的に及び／又は重複して配置される。エピトープが連続的に配置される実施形態では、２つのエピトープ間の介在配列は、存在しても又はしなくてもよい。

【0238】

いくつかの実施形態では、さらなるＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープ及び／又はＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ（配列番号１、１１６若しくは１１７の同じポリペプチド内に含まれるか、又はコンジュゲート中のさらなるポリペプチド内に含まれる）は、自己抗原、腫瘍関連抗原及び／又はユニバーサル腫瘍抗原に由来する。一実施形態では、ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープは、前立腺癌関連抗原、好ましくは、前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）に由来する。一実施形態では、ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープは、ＰＡＰに由来する配列「ＮＰＩＬＬＷＱＰＩＰＶ」（配列番号１１９）を含む。好ましい実施形態では、少なくとも１つのポリペプチドは、連続的に配置された配列番号１及び配列番号１１９の配列を含む。一実施形態では、配列番号１及び配列番号１１９の配列は、以下のように連続的に配置され：ＡＬＦＳＶＬＮＹＥＲＡＲＲＰＧＬＬＧＡＳＶＬＧＬＤＤＩＨＲＡＮＰＩＬＬＷＱＰＩＰＶ（配列番号１２５）、さらなる実施形態では、配列番号１及び配列番号１１９の順序が反転する。

【0239】

さらなる実施形態では、さらなるＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープ及び／又はＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ（配列番号１、１１６若しくは１１７の同じポリペプチド内に含まれるか、又はコンジュゲート中のさらなるポリペプチド内に含まれる）は、配列番号４７～５１及び／又は４５のいずれか１つに含まれる。一実施形態では、さらなるＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープは、配列番号３９及び４１～４５の１つ以上を含む。一実施形態では、さらなるＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープは、配列番号１５５～１５９の１つ以上を含む。一実施形態では、さらなるＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープ及び／又はＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープは、図８Ｃ（「ＳＬＰ」）に示す配列又はその断片を含む。

【0240】

異なる長さのポリペプチドは、異なるＴ細胞応答を誘発することを理解されたい。上述のようなユニバーサル腫瘍抗原の少なくとも１２個のアミノ酸を含むポリペプチドは、ＭＨＣクラスＩＩ分子上に提示され、したがってＣＤ４＋Ｔ細胞応答を誘発するのに適切な長さである（すなわち、ＭＨＣクラスＩＩ分子上に提示されるポリペプチドは、典型的には、１２～２４アミノ酸の長さであるため）。対照的に、ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘発するには、ポリペプチドがＭＨＣクラスＩ分子上に存在する必要があり、これは、典型的には、長さが８～１０アミノ酸残基のより短いポリペプチドにのみ結合する。

【0241】

本発明の特定のＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープ（例えば、配列番号１、１１６及び１１７）は、ＭＨＣクラスＩＩ分子に通常収容されるものよりも長いことに留意されたい。この長さのポリペプチドは、合成長鎖ペプチド（ＳＬＰ）であり、より強力な免疫応答を誘導することが示されている（例えば、Welters et al., Clin Cancer Res. 2008 Jan 1; 14(1): 178-87；Rosalia et al., Eur J Immunol. 2013 Oct; 43(10): 2554-65）。理論に拘束されることを望むものではないが、特定の実施形態におけるそのようなポリペプチドは、対象へのそれらの投与後、細胞によって飲食され／取り込まれ、プロテアソーム内でタンパク質分解を受け、その後、ＭＨＣクラスＩＩ（及び／又はクラスＩ）分子上に提示されると考えられる。したがって、そのようなポリペプチドは、ＭＨＣクラスＩＩ（及び／又はＭＨＣクラスＩ）拘束性Ｔ細胞応答を引き起こすことができる。このような実施形態では、本発明のＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープの一部は、ＭＨＣクラスＩＩ分子によって提示され、ＣＤ４＋Ｔ細胞応答を誘発するためにＣＤ４＋Ｔ細胞のＴ細胞受容体によって結合されることを理解されたい。より長鎖のポリペプチドは、より短鎖のポリペプチドよりも長期間、対象内に存在し、したがってそれらが免疫応答を誘発し得る期間がより長いことも理解されたい。これは、比較的低いＭＨＣ結合親和性を有するポリペプチドに関して特に重要である。

【0242】

上記実施形態では、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープは、ｈＴＥＲＴの少なくとも１２個のアミノ酸の領域を含む。代替的実施形態では、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープは、ｈＴＥＲＴ以外のユニバーサル腫瘍抗原の少なくとも１２個のアミノ酸の領域を含む。一実施形態では、ユニバーサル腫瘍抗原は、サバイビン、ＤＮＡトポイソメラーゼ２－アルファ（Ｔｏｐ２α）、シトクロムＰ４５０ １Ｂ１（ＣＹＰ１Ｂ１）及びＥ３ユビキチン－タンパク質リガーゼＭｄｍ２からなる群から選択される。一実施形態では、ユニバーサル腫瘍抗原は、サバイビンである（Sorensen et al., Cancer Biol Ther. 2008 7(12): 1885-7；Wobser et al., Cancer Immunol Immunother. 2006 55(10): 1294-8）。サバイビン（バキュロウイルスＩＡＰリピート含有タンパク質５としても知られる）は、ヒトのＢＩＲＣ５遺伝子によってコードされており、アポトーシスの阻害剤である。サバイビンの１４２アミノ酸アイソフォームは、UniProtKB参照番号Ｏ１５３９２（アイソフォーム１）に記載されており、配列番号８にも記載されている。一実施形態では、ユニバーサル腫瘍抗原は、ＤＮＡトポイソメラーゼ２－アルファ（Ｔｏｐ２α）である（Park et al., Cancer Immunol Immunother. 2010 (5): 747-57）。ＤＮＡトポイソメラーゼ２－アルファは、ヒトのＴＯＰ２Ａ遺伝子によってコードされており、ＤＮＡ鎖の一時的な切断及びその後の再結合によってＤＮＡの形態的状態を制御する。トポイソメラーゼＩＩは、二本鎖を切断する。ＤＮＡトポイソメラーゼ２－アルファの１，５３１アミノ酸アイソフォームは、UniProtKB参照番号Ｐ１１３８８（アイソフォーム１）に記載されており、配列番号９にも記載されている。一実施形態では、ユニバーサル腫瘍抗原は、シトクロムＰ４５０ １Ｂ１（ＣＹＰ１Ｂ１）である（Gribben et al., Clin Cancer Res. 2005 11(12): 4430-6）。シトクロムＰ４５０ １Ｂ１は、ヒトのＣＹＰ１Ｂ１遺伝子によってコードされており、様々な生体異物及び内因性化合物の代謝に関与している。シトクロムＰ４５０ １Ｂ１の５４３個のアミノ酸配列は、UniProtKB参照番号Ｑ１６６７８に記載されており、配列番号１０にも記載されている。一実施形態では、ユニバーサル腫瘍抗原は、Ｅ３ユビキチン－タンパク質リガーゼＭｄｍ２である（Gordan and Vonderheide, Cytotherapy. 2002; 4(4): 317-27）。Ｅ３ユビキチン－タンパク質リガーゼＭｄｍ２は、ヒトのＭＤＭ２遺伝子によってコードされており、ｐ５３腫瘍抑制因子の負の制御因子である。Ｅ３ユビキチン－タンパク質リガーゼＭｄｍ２の４９１アミノ酸アイソフォームは、UniProtKB参照番号Ｑ００９８７（アイソフォームＭｄｍ２）に記載されており、配列番号１１にも記載されている。

【0243】

好ましい実施形態では、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープは、ユニバーサル腫瘍抗原の少なくとも１３、１４、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０個のアミノ酸の領域を含む。特に好ましい実施形態では、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープは、ユニバーサル腫瘍抗原の１３、１４、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０個のアミノ酸の領域からなる。上記で論じたように、配列番号１、１１６又は１１７は、それぞれｈＴＥＲＴの３０個のアミノ酸の領域からなる。一実施形態では、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープを含む少なくとも１つのポリペプチドは、５００アミノ酸以下の長さである。さらなる実施形態では、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープを含む少なくとも１つのポリペプチドは、４００、３００、２００、１７０、１５０、１２５、１００、９０、８０、７０、７５、６０、５０、４０又は３０アミノ酸以下の長さである。

【0244】

一実施形態では、「ユニバーサル腫瘍抗原」は、癌／精巣抗原１（ＮＹ－ＥＳＯ－１）、前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）及び／又はグルタミン酸カルボキシペプチダーゼ２（ＧＣＰＩＩ）ではない。ＮＹ－ＥＳＯ－１は、一般に、各腫瘍タイプ内で高い割合の患者で発現されないため、本明細書で使用される「ユニバーサル腫瘍抗原」という用語には包含されないことを理解されたい（Ishihara et al. BMC Cancer. 2020; 20: 606）。さらに、ＰＡＰ及びＧＣＰＩＩは前立腺癌関連タンパク質であるため、本明細書で使用される「ユニバーサル腫瘍抗原」という用語にも包含されないことを理解されたい。ＮＹ－ＥＳＯ－１はヒトのＣＴＡＧ１Ａ遺伝子によってコードされており、UniProtアクセッション番号Ｐ７８３５８を有する。ＮＹ－ＥＳＯ－１のアミノ酸配列を配列番号３６に示す。ＰＡＰはヒトのＡＣＰＰ遺伝子によってコードされており、UniProtアクセス番号Ｐ１５３０９を有する。ＰＡＰのアミノ酸配列を配列番号３７に示す。ＧＣＰＩＩ（前立腺特異的膜抗原［ＰＳＭＡ］としても知られている）は、ヒトのＦＯＬＨ１遺伝子によってコードされており、UniProtアクセッション番号Ｑ０４６０９を有する。ＧＣＰＩＩのアミノ酸配列を配列番号３８に示す。

【0245】

一実施形態では、ユニバーサル腫瘍抗原の少なくとも１２個のアミノ酸の領域を含むＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープは、配列番号３９～４５のいずれか１つの配列を含まない。配列番号３９（すなわちＧＱＤＬＦＧＩＷＳＫＶＹＤＰＬ）及び４０（すなわちＴＥＤＴＭＴＫＬＲＥＬＳＥＬＳ）は、ＰＡＰから派生し；配列番号４１～４４（すなわちそれぞれＧＫＶＦＲＧＮＫＶＫＮＡＱＬＡ、ＴＧＮＦＳＴＱＫＶＫＭＨＩＨＳ、ＮＹＴＬＲＶＤＣＴＰＬＭＹＳＬ、ＲＱＩＹＶＡＡＦＴＶＱＡＡＡＥ）は、ＧＣＰＩＩから派生し；配列番号４５（すなわちＧＡＲＧＰＥＳＲＬＬＥＦＹＬＡＭＰＦＡＴＰＭＥＡＥＬＡ）は、ＮＹ－ＥＳＯ－１に由来する。

【0246】

ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープは、ユニバーサル腫瘍抗原の少なくとも１２個のアミノ酸を含むことに加え、集団の少なくとも５０％において免疫原性を有する。すなわち、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープは、集団内の５０％以上の個人において免疫応答を誘発することができる。好ましい実施形態では、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープは、集団の５５％以上又は６０％以上において免疫原性である。特に好ましい実施形態では、ＣＤ４＋Ｔ細胞免疫応答は、集団の６５％以上において免疫原性である。一実施形態では、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープは、配列番号１の配列を含み、集団の６５％以上において免疫原性である。さらなる実施形態では、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープは、配列番号１１６又は１１７の配列を含み、集団の少なくとも５０％において免疫原性である。配列番号１１６又は１１７の配列を含むポリペプチドは、ワクチン接種を受けた個体の少なくとも５０％において免疫応答を誘導することが報告されている、ＥＡＲＰＡＬＬＴＳＲＬＲＦＩＰＫ（配列番号１２６）の配列を含むことを理解されたい（例えば、Bernhardt et al. Br J Cancer. 2006 Dec 4; 95(11): 1474-82；Inderberg-Suso et al. 2012；及びKyte et al. Clin Cancer Res July 1 2011 (17) (13) 4568-4580を参照されたい）。これらの配列は、実施例５及び６でさらに分析される。

【0247】

第１の実施形態では、集団は、一般集団である。すなわち、集団は、健康な個人及び癌などの疾患を有する個人の両方を含む。代替的実施形態では、集団は、癌患者である個人からなる。さらなる実施形態では、癌患者は、非小細胞肺癌、前立腺癌及び／又は悪性黒色腫を有する患者である。一実施形態では、集団は、膵臓癌を有する癌患者をさらに含む。

【0248】

集団が免疫原性であるために、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープ（又はその一部）は、集団中に存在するＨＬＡクラスＩＩ分子上に提示（すなわち結合）できなければならないことを理解されたい。世界中の様々な地域におけるＨＬＡクラスＩＩ対立遺伝子の頻度を表１に示す（Dosset et al., Cancers. 2020 Jun 25; 12(6): E1687から適合）。「頻度」は、各対立遺伝子を保有する集団内の個人の割合を意味する。一実施形態では、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープ（又はその一部）は、集団中に１０％以上の頻度で存在する１つ以上のＨＬＡクラスＩＩ対立遺伝子によって結合される。一実施形態では、集団中に１０％以上の頻度で存在するＨＬＡクラスＩＩ対立遺伝子は、ＤＲＢ１^＊０１、ＤＰＡ１^＊０１、ＤＰＡ１^＊０２、ＤＰＢ１^＊０２、ＤＰＢ１^＊０３、ＤＰＢ１^＊０４、ＤＱＡ１^＊０１、ＤＱＡ１^＊０２、ＤＱＡ１^＊０３、ＤＱＢ１^＊０２、ＤＱＢ１^＊０３からなる群から選択される。さらなる実施形態では、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープ（又はその一部）は、集団中に４０％以上、好ましくは５０％以上、より好ましくは６０％、７０％、８０％、９０％、９５％以上又は１００％の頻度で存在する１つ以上のＨＬＡクラスＩＩ対立遺伝子によって結合される。一実施形態では、集団中に４０％以上の頻度で存在するＨＬＡクラスＩＩ対立遺伝子は、ＤＰＡ１^＊０１、ＤＰＡ１^＊０２、ＤＰＢ１^＊０２、ＤＰＢ１^＊０３、ＤＰＢ１^＊０４、ＤＱＡ１^＊０１、ＤＱＡ１^＊０３、ＤＱＢ１^＊０２及びＤＱＢ１^＊０３からなる群から選択される。

【0249】

一実施形態では、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープ（又はその一部）は、ＨＬＡ－ＤＲＢ１^＊１５、ＨＬＡ－ＤＲＢ１^＊０７、ＨＬＡ－ＤＲＢ１^＊０４、ＨＬＡ－ＤＱＢ１^＊０６、ＨＬＡ－ＤＱＢ１^＊０３、ＨＬＡ－ＤＱＢ１^＊０５、ＨＬＡ－ＤＰＢ１^＊０４及びＨＬＡ－ＤＰＢ１^＊０１からなる群から選択される１つ以上のＨＬＡクラスＩＩ対立遺伝子によって結合される。特に好ましい実施形態では、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープ（又はその一部）は、ＨＬＡ－ＤＲＢ１^＊１５：０１、ＨＬＡ－ＤＲＢ１^＊０７：０１、ＨＬＡ－ＤＲＢ１^＊０４：０１、ＨＬＡ－ＤＱＢ１^＊０６：０２、ＨＬＡ－ＤＱＢ１^＊０３：０２、ＨＬＡ－ＤＱＢ１^＊０５：０１、ＨＬＡ－ＤＰＢ１^＊０４：０１、ＨＬＡ－ＤＰＢ１^＊０４：０２及びＨＬＡ－ＤＰＢ１^＊０１：０１からなる群から選択される１つ以上のＨＬＡクラスＩＩ対立遺伝子によって結合される。さらに好ましい実施形態では、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープ（又はその一部）は、ＨＬＡ－ＤＲＢ１^＊１５：０１、ＨＬＡ－ＤＲＢ１^＊０７：０１、ＨＬＡ－ＤＲＢ１^＊０４：０１、ＨＬＡ－ＤＱＢ１^＊０６：０２、ＨＬＡ－ＤＱＢ１^＊０５：０１、ＨＬＡ－ＤＰＢ１^＊０４：０１、ＨＬＡ－ＤＰＢ１^＊０４：０２、さらにより好ましくは、ＨＬＡ－ＤＲＢ１^＊１５：０１及び／又はＨＬＡ－ＤＲＢ１^＊０７：０１からなる群から選択される１つ以上のＨＬＡクラスＩＩ対立遺伝子によって結合される。上述のＨＬＡクラスＩＩ対立遺伝子を有する個体は、配列番号１のポリペプチドに対する免疫応答を誘発することが示されている。

【0250】

集団におけるＨＬＡクラスＩＩ対立遺伝子の頻度は地理的地域に応じて異なり得ることを理解されたい（例えば、表１を参照されたい）。一実施形態では、集団は、ヨーロッパ集団である。代替的実施形態では、集団は、北アメリカ集団、南／中央アメリカ集団、北アフリカ集団、サハラ以南アフリカ集団、西アジア集団、北東アジア集団、東南アジア集団及び／又はオーストラリア集団である。一実施形態では、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープ（又はその一部）は、前述の集団の１つにおいて１０％以上、好ましくは４０％又は５０％以上、より好ましくは６０％、７０％、８０％、９０％、９５％以上又は１００％の頻度で存在する１つ以上のＨＬＡクラスＩＩ対立遺伝子によって結合される。

【0251】

一実施形態では、集団がヨーロッパ集団である場合、ＨＬＡクラスＩＩ対立遺伝子は、ＤＰＡ１^＊０１、ＤＰＢ１^＊０３、ＤＰＢ１^＊０４、ＤＱＡ１^＊０１及びＤＱＢ１^＊０２からなる群から選択される少なくとも１つである。一実施形態では、集団が北アメリカ集団である場合、ＨＬＡクラスＩＩ対立遺伝子は、ＤＰＡ１^＊０１、ＤＰＢ１^＊０４、ＤＱＡ１^＊０３及びＤＱＢ１^＊０３からなる群から選択される１つ以上である。一実施形態では、集団が南／中央アメリカ集団である場合、ＨＬＡクラスＩＩ対立遺伝子は、ＤＰＡ１^＊０１、ＤＰＡ１^＊０２、ＤＰＢ１^＊０４、ＤＱＡ１^＊０１、ＤＱＡ１^＊０３及びＤＱＢ１^＊０３からなる群から選択される１つ以上である。一実施形態では、集団が北アフリカ集団である場合、ＨＬＡクラスＩＩ対立遺伝子は、ＤＱＢ１^＊０２である。一実施形態では、集団がサハラ以南のアフリカ集団である場合、ＨＬＡクラスＩＩ対立遺伝子は、ＤＰＡ１^＊０１、ＤＰＡ１^＊０２、ＤＰＢ１^＊０４、ＤＱＡ１^＊０１及びＤＱＢ１^＊０３からなる群から選択される１つ以上である。一実施形態では、集団が西アジア集団である場合、ＨＬＡクラスＩＩ対立遺伝子は、ＤＰＢ１^＊０４、ＤＱＡ１^＊０１、ＤＱＢ１^＊０２及びＤＱＢ１^＊０３からなる群から選択される１つ以上である。一実施形態では、集団が北東アジア集団である場合、ＨＬＡクラスＩＩ対立遺伝子は、ＤＰＡ１^＊０１、ＤＰＡ１^＊０２、ＤＰＢ１^＊０２、ＤＰＢ１^＊０４、ＤＱＡ１^＊０１、ＤＱＡ１^＊０３及びＤＱＢ１^＊０３からなる群から選択される１つ以上である。一実施形態では、集団が東南アジア集団である場合、ＨＬＡクラスＩＩ対立遺伝子は、ＤＰＡ１^＊０１、ＤＰＡ１^＊０２、ＤＰＢ１^＊０４、ＤＱＡ１^＊０１及びＤＱＢ１^＊０３からなる群から選択される１つ以上である。表１から、前述のＨＬＡクラスＩＩ対立遺伝子は、一般に、前述の集団中に４０％以上の頻度で存在することを理解されたい。

【0252】

ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープ（又はその一部）は、集団中の複数の異なるＨＬＡクラスＩＩ対立遺伝子によって結合され得ることを理解されたい。一実施形態では、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープは、複数（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個以上又は全て）の前述の異なるＨＬＡクラスＩＩ対立遺伝子によって結合される。集団内でより高い頻度で存在する１つ又は複数のＨＬＡクラスＩＩ対立遺伝子に結合することは、集団のより高い割合でＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープが免疫原性であることを示唆するため、すなわち、集団内のより高い割合の個体が、ＣＤ４＋Ｔ細胞応答を誘発するためにＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープ（又はその一部）を提示できる適切なＨＬＡクラスＩＩ対立遺伝子を保有するため、好ましい。

【0253】

【表1】

【0254】

さらなる実施形態では、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープ及び／又はＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープの配列を含むポリペプチドは、前述の配列の１つに対して正確な配列同一性を有しない。代わりに、ポリペプチド及び／又はＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープは、上記に示されるものと少なくとも８０％の配列同一性を有する。好ましくは、上記のものに対して少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性。アミノ酸配列の任意の付加又は置換が元のアミノ酸側鎖の特性の保存をもたらすことも好ましい。すなわち、置換又は修飾は、「保存的」である（上記のとおり）。

【0255】

ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープ（特にその配列が上記のように変更されたもの）は、ＣＤ４＋Ｔ細胞応答を誘導することができる。すなわち、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープは、抗原提示細胞（例えば、樹状細胞）によって適切なＭＨＣクラスＩＩ分子上に提示された場合、ＣＤ４＋（ヘルパー）Ｔ細胞を誘導できるはずである。ＣＤ４＋Ｔ細胞免疫応答が誘導されていることの確認は、上記のＴ細胞増殖アッセイ（^３Ｈ－チミジン）を使用して達成することができる。

【0256】

コンジュゲートは、上記のようなＢ細胞エピトープの配列を含む少なくとも１つのポリペプチド及びＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープの配列を含む少なくとも１つのポリペプチドを含む場合、上述のポリペプチドの任意の組み合わせを含有し得る。Ｂ細胞エピトープの配列は、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープの配列と異なることを理解されたい。一実施形態では、Ｂ細胞エピトープの配列は、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープの配列を含まない。さらなる実施形態では、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープの配列は、Ｂ細胞エピトープの配列を含まない。

【0257】

さらなる実施形態では、本明細書に定義されるコンジュゲートのいずれか１つのカクテル（すなわち混合物）が提供される。いくつかの実施形態では、コンジュゲートのカクテルは、配列番号１、１１６及び１１７から選択されるＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープの配列を含む、少なくとも２つの異なるコンジュゲートを含む。いくつかの実施形態では、カクテルは、前記ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープの免疫原性断片を含むコンジュゲートを含み、免疫原性断片は、少なくとも１２個のアミノ酸を含む。さらなる実施形態では、カクテル中のコンジュゲート又は各コンジュゲートは、配列番号１、１１６若しくは１１７の配列又はその免疫原性断片に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープの配列を含む。配列は、上記のものに対して少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有することが特に好ましい。好ましい実施形態では、カクテル中のコンジュゲートは、配列番号１及び１１６のＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープの配列又は少なくとも１２個のアミノ酸を含むその免疫原性断片を含む。一実施形態では、各コンジュゲート内に含まれる、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープの配列を含むポリペプチドは、５００アミノ酸以下、好ましくは４００、３００、２００、１７０、１５０、１２５、１００、９０、８０、７０、７５、６０、５０、４０又は３０アミノ酸以下の長さである。少なくとも２つのコンジュゲートは、配列番号１、１１６及び１１７から選択される異なるＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープに基づくという意味で異なることが好ましい。

【0258】

いくつかの実施形態では、Ｂ細胞エピトープの配列を含むポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列及び／又はＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープの配列を含むポリペプチドをコードする第２のヌクレオチド配列を含む分子が提供される。いくつかの実施形態では、第１及び／又は第２のヌクレオチド配列は、Ｂ細胞エピトープ及び／又はＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープの配列を含むポリペプチドの断片をコードする。一実施形態では、分子は、核酸分子である。特定の実施形態では、分子又は核酸分子は、第１のヌクレオチド配列と第２のヌクレオチド配列との間に介在配列を含む。

【0259】

さらなる実施形態では、上記の核酸分子又はその断片を含むベクターが提供される。使用される特定のベクターは、核酸分子が発現される宿主生物又は細胞、宿主細胞を形質転換するために使用される方法及び／又はタンパク質発現（又はベクターの他の意図された用途）に使用される方法に依存し得る。一実施形態では、ベクターは、細胞内への核酸分子の送達及び／又は対象への核酸分子の投与のために使用される。

【0260】

一実施形態では、Ｂ細胞エピトープの配列を含む少なくとも１つのポリペプチド及びＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープの配列を含む少なくとも１つのポリペプチドは、非共有結合又は共有結合され得る。好ましくは、Ｂ細胞エピトープの配列を含む少なくとも１つのポリペプチド及びＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープの配列を含む少なくとも１つのポリペプチドは、共有結合され得る。

【0261】

一実施形態では、Ｂ細胞エピトープの配列を含む少なくとも１つのポリペプチド及びＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープの配列を含む少なくとも１つのポリペプチドは、直接的に連結され得る。別の実施形態では、Ｂ細胞エピトープの配列を含む少なくとも１つのポリペプチド及びＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープの配列を含む少なくとも１つのポリペプチドは、間接的に連結され得る。

【0262】

一実施形態では、Ｂ細胞エピトープの配列を含む少なくとも１つのポリペプチド及びＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープの配列を含む少なくとも１つのポリペプチドは、コアを介して連結され得、
コアは、連結前に、
本体部分；
本体部分に結合された１つ以上の第１の連結基；及び
本体部分に結合された１つ以上の第２の連結基
を含み、
第１の連結基及び第２の連結基は、互いに直交しており、
第１の連結基は、Ｂ細胞エピトープの配列を含む少なくとも１つのポリペプチドに連結されて第１の接続要素を形成し、及び第２の連結基は、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープの配列を含む少なくとも１つのポリペプチドに連結されて第２の接続要素を形成する。

【0263】

好ましい実施形態では、Ｂ細胞エピトープの配列を含む少なくとも１つのポリペプチド及びＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープの配列を含む少なくとも１つのポリペプチドは、本明細書に定義されるコア構造を介してコンジュゲート内で連結される。すなわち、好ましい実施形態では、Ｂ細胞エピトープの配列及びＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープの配列は、単一のポリペプチド鎖内で連続的に及び／又は重複して配置されない。

【0264】

図１８は、本発明の一実施形態によるコンジュゲートの概略図を示す。

【0265】

一実施形態では、連結前に、Ｂ細胞エピトープの配列を含む少なくとも１つのポリペプチド及びＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープの配列を含む少なくとも１つのポリペプチドは、独立して、それぞれ本明細書に定義される第１の連結基及び本明細書に定義される第２の連結基とのカップリング反応を受けるように構成された反応性官能基を含み得る。例えば、反応性官能基は、天然アミノ酸残基（例えば、システイン残基のチオール基）上に存在し得る。他の場合、天然アミノ酸残基は、反応性官能基（例えば、アジドリジン残基のアジド基又はアルキン（例えば、末端アルキン）、アルケン（例えば、末端アルケン、ノルボルネン）、シクロアルキン、トランスシクロアルケン、テトラジン、共役ジエン、マレイミド又はα－ハロカルボニル）を含むように修飾され得る。反応性官能基の好ましい例には、チオール基及びアジド基が含まれる。

【0266】

一実施形態では、反応性官能基は、Ｂ細胞エピトープの配列を含む少なくとも１つのポリペプチド及び／又はＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープの配列を含む少なくとも１つのポリペプチドのＣ末端に提供され得る。別の実施形態では、反応性官能基は、Ｂ細胞エピトープの配列を含む少なくとも１つのポリペプチド及び／又はＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープの配列を含む少なくとも１つのポリペプチドのＮ末端に提供され得る。

【0267】

一実施形態では、Ｂ細胞エピトープの配列を含む少なくとも１つのポリペプチド及びＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープの配列を含む少なくとも１つのポリペプチドは、独立してシステイン残基を含み得る。いくつかの実施形態では、Ｂ細胞エピトープの配列を含む少なくとも１つのポリペプチド及びＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープの配列を含む少なくとも１つのポリペプチドは、独立して１つのみのシステイン残基を含み得る。

【0268】

一実施形態では、Ｂ細胞エピトープの配列を含む少なくとも１つのポリペプチド及びＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープの配列を含む少なくとも１つのポリペプチドは、独立してアジドリジン（すなわちＫ（Ｎ_３））残基を含み得る。いくつかの実施形態では、Ｂ細胞エピトープの配列を含む少なくとも１つのポリペプチド及びＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープの配列を含む少なくとも１つのポリペプチドは、独立して１つのみのアジドリシン残基を含み得る。

【0269】

一実施形態では、連結前に、Ｂ細胞エピトープの配列を含む少なくとも１つのポリペプチド及びＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープの配列を含む少なくとも１つのポリペプチドは、独立してスペーサー配列を含み得る。代替的実施形態では、スペーサーは、コア内に含まれる（例えば、本体部分と第１の連結基との間又は本体部分と第２の連結基との間）。Ｂ細胞エピトープの配列又はＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープの配列を含む少なくとも１つのポリペプチドは、それぞれＢ細胞エピトープ又はＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープのＮ末端及び／又はＣ末端のいずれかにスペーサー配列を含み得る。一実施形態では、スペーサー配列は、反応性官能基とエピトープ配列との間にある。いくつかの実施形態では、スペーサー配列は、Ｂ細胞エピトープの配列を含む少なくとも１つのポリペプチド内に含まれる。好ましい実施形態では、スペーサー配列は、アミノ酸配列を含む。一実施形態では、スペーサー配列の長さは、１０アミノ酸である。さらなる実施形態では、スペーサー配列は、１～２０、１～１５又は１～１２個のアミノ酸、好ましくは、３～１２、６～１２又は９～１２個のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、スペーサーは、ＡＥＫＹＡＲＶＲＡＫ（配列番号１２７）、ＡＡＫＹＡＲＶＲＡＫ（配列番号１２８）、ＡＡＫＹＡＲＶＲＡＫＣ（配列番号１２９）若しくはＳＳＡＦＡＤＶＥＡＡ（配列番号１５４）の配列又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％の配列同一性を有する配列を含むか又はそれからなる。好ましくは、スペーサー配列は、ＡＥＫＹＡＲＶＲＡＫ（配列番号１２７）の配列を含むか又はそれからなる。しかし、スペーサー配列は、前述の配列に限定されず、当業者であれば代替のスペーサー配列を認識するであろう。一実施形態では、スペーサー配列は、コンジュゲートの特性（例えば、溶解性及び／又は構造特性）に寄与する。

【0270】

一実施形態では、第１の接続要素及び第２の接続要素は、１，２，３－トリアゾール結合、ジヒドロピリダジン結合、ピリダジン結合及びスルフィド結合（例えば、チオール－エン反応から形成される）から独立して選択される。好ましくは、第１の接続要素及び第２の接続要素は、１，２，３－トリアゾール結合及びスルフィド結合から独立して選択される。より好ましくは、第１の接続要素及び第２の接続要素は、

【化19】

から独立して選択され、式中、
Ｘ_１は、－（ＣＨ_２）_ａｘ１１－及び－（ＣＨ_２）_ａｘ１２－Ｘ_１２－から選択され；
Ｘ_１２は、Ｏ、ＮＲ_１２又はＳから選択され；
Ｒ_１２は、水素、任意選択により置換されたアルキル、任意選択により置換されたシクロアルキル、任意選択により置換されたヘテロシクロアルキル、任意選択により置換されたアリール及び任意選択により置換されたヘテロアリール；好ましくは水素及び任意選択により置換されたアルキルから選択され；
Ｘ_２は、Ｎ又はＣＨから選択され；
ａｘ１１及びａｘ１２は、０～１２から独立して選択され、
波線は、Ｂ細胞エピトープの配列を含む少なくとも１つのポリペプチド又はＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープ及び／又はコアの配列を含む少なくとも１つのポリペプチドへの接続点を表す。

【0271】

一実施形態では、第３の接続要素は、１，２，３－トリアゾール結合、ジヒドロピリダジン結合、ピリダジン結合及びスルフィド結合（例えば、チオール－エン反応から形成される）から選択される。好ましくは、第３の接続要素は、１，２，３－トリアゾール結合から選択される。より好ましくは、第３の接続要素は、

【化20】

から独立して選択され、式中、
Ｘ_１は、－（ＣＨ_２）_ａｘ１１－及び－（ＣＨ_２）_ａｘ１２－Ｘ_１２－から選択され；
Ｘ_１２は、Ｏ、ＮＲ_１２又はＳから選択され；
Ｒ_１２は、水素、任意選択により置換されたアルキル、任意選択により置換されたシクロアルキル、任意選択により置換されたヘテロシクロアルキル、任意選択により置換されたアリール及び任意選択により置換されたヘテロアリール；好ましくは水素及び任意選択により置換されたアルキルから選択され；
Ｘ_２は、Ｎ又はＣＨから選択され；
ａｘ１１及びａｘ１２は、０～１２から独立して選択され、
波線は、Ｂ細胞エピトープの配列を含む少なくとも１つのポリペプチド又はＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープ及び／又はコアの配列を含む少なくとも１つのポリペプチドへの接続点を表す。

【0272】

好ましくは、ａｘ１１及びａｘ１２は、１～１２から独立して選択される。より好ましくは、ａｘ１１及びａｘ１２は、１～６から独立して選択される。さらにより好ましくは、ａｘ１１及びａｘ１２は、１～４から独立して選択される。

【0273】

好ましくは、Ｘ１２は、Ｏ又はＮＲ１２であり得る。より好ましくは、Ｘ_１２は、Ｏであり得る。

【0274】

コアに関する他の好ましい実施形態は、以下でさらに詳細に説明され、コンジュゲートにも同様に適用される。

【0275】

本発明の別の態様によれば、コンジュゲートであって、
（ａ）Ｂ細胞エピトープの配列を含む少なくとも１つのポリペプチド；及び
（ｂ）ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープの配列を含む少なくとも１つのポリペプチド
を含み、
Ｂ細胞エピトープの配列を含む少なくとも１つのポリペプチド又はＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープの配列を含む少なくとも１つのポリペプチドは、コアを介して連結され、コアは、連結前に、
本体部分；
本体部分に結合された１つ以上の第１の連結基；及び
本体部分に結合された１つ以上の第２の連結基
を含み、
第１の連結基及び第２の連結基は、互いに直交しており、
コアは、

【化21】

ではなく；
第１の連結基は、Ｂ細胞エピトープの配列を含む少なくとも１つのポリペプチドに連結されて第１の接続要素を形成し、及び第２の連結基は、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープの配列を含む少なくとも１つのポリペプチドに連結されて第２の接続要素を形成する、コンジュゲートが提供される。コンジュゲートに関する他の好ましい実施形態は、上記で説明されており、このコンジュゲートにも同様に適用される。コアに関する他の好ましい実施形態は、以下でさらに詳細に説明され、このコンジュゲートにも同様に適用される。

【0276】

本発明の別の態様によれば、中間コンジュゲートであって、
（ａ）Ｂ細胞エピトープの配列を含む少なくとも１つのポリペプチド；又は
（ｂ）ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープの配列を含む少なくとも１つのポリペプチド
を含み、
Ｂ細胞エピトープの配列を含む少なくとも１つのポリペプチド又はＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープの配列を含む少なくとも１つのポリペプチドは、コアに連結され、コアは、連結前に、
本体部分；
本体部分に結合された１つ以上の第１の連結基；及び
本体部分に結合された１つ以上の第２の連結基
を含み、
第１の連結基及び第２の連結基は、互いに直交しており、
コアは、

【化22】

ではなく；
第１の連結基は、Ｂ細胞エピトープの配列を含む少なくとも１つのポリペプチドに連結されて第１の接続要素を形成するか、又は第２の連結基は、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープの配列を含む少なくとも１つのポリペプチドに連結されて第２の接続要素を形成する、中間コンジュゲートが提供される。コンジュゲートに関する他の好ましい実施形態は、上記で説明されており、中間コンジュゲートにも同様に適用される。コアに関する他の好ましい実施形態は、以下でさらに詳細に説明され、中間コンジュゲートにも同様に適用される。

【0277】

一実施形態では、コンジュゲートは、

【化23】

【化24】

【化25】

から選択され得る。

【0278】

コア
本発明の別の態様によれば、コアであって、
本体部分；
本体部分に結合された１つ以上の第１の連結基；及び
本体部分に結合された１つ以上の第２の連結基
を含み、第１の連結基及び第２の連結基は、互いに直交している、コアが提供される。

【0279】

一実施形態では、本体部分は、Ｂ細胞エピトープを含むポリペプチドが１つ以上の第１の連結基に結合すると、Ｂ細胞エピトープに特異的な抗体がＢ細胞エピトープに結合できるように構成される。

【0280】

一実施形態では、コアは、

【化26】

ではない。任意選択により、これは、本発明のコンジュゲート、中間コンジュゲート又は方法にも適用され得る。しかし、本発明のコンジュゲート、中間コンジュゲート又は方法は、必ずしもこれらに限定されるものではない。

【0281】

コア自体に関連する実施形態では、コアは、

【化27】

【化28】

ではない。任意選択により、これは、本発明のコンジュゲート、中間コンジュゲート又は方法にも適用され得る。しかし、本発明のコンジュゲート、中間コンジュゲート又は方法は、必ずしもこれらに限定されるものではない。

【0282】

本発明によるコアは、一般に、以下のコアなどの他のコアと比較して、より効率的に合成される。

【化29】

【0283】

特に、上記に示したコアの合成の全収率は、およそ０．５％であり、合成の完了におよそ１４日間かかる。

【0284】

対照的に、本発明によるコア（特に式２の本体部分を有する化合物について）は、より高い収率（一般に０．５％の６０倍まで）及びより短い時間スケール（一般に約５日間）で合成することができる。さらに、本発明によるコアは、より少ない反応ステップ及びより少ない精製ステップ（特にサイズ排除クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー及び結晶化）を使用して合成することができる。さらに、本発明のコアを使用すると、ヒドラジン水和物、アジ化ナトリウム及びジクロロメタンなどの危険な化学物質の使用を回避することができる。

【0285】

さらに、本発明によるコアは、より高い結合効率の達成を可能にする。

【0286】

式２の本体部分を有するコアは、天然アミノ酸ベースであり得る。

【0287】

一実施形態では、第１の連結基及び第２の連結基の少なくとも１つは、２つ以上の第１の連結基又は第２の連結基を含み得る。

【0288】

一実施形態では、第１の連結基は、Ｂ細胞エピトープに連結可能であるように構成され得る。例えば、第１の連結基は、Ｂ細胞エピトープの配列を含むポリペプチドに連結可能であるように構成され得る。

【0289】

一実施形態では、コアは、２つ以上の第１の連結基を含み得る。好ましくは、コアは２～４個の第１の連結基を含み得る。より好ましくは、コアは、２つ又は３つの第１の連結基を含み得る。さらにより好ましくは、コアは、３つの第１の連結基を含み得る。

【0290】

一実施形態では、第２の連結基は、Ｔ細胞エピトープに連結可能であるように構成され得る。例えば、第２の連結基は、Ｔ細胞エピトープの配列を含むポリペプチドに連結可能であるように構成され得る。好ましくは、Ｔ細胞エピトープは、ＣＤ４＋及び／又はＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープである。

【0291】

一実施形態では、コアは、１～４つの第２の連結基を含み得る。好ましくは、コアは、１つ又は２つの第２の連結基を含み得る。より好ましくは、コアは、１つの第２の連結基を含み得る。

【0292】

一実施形態では、コアは、３つの第１の連結基及び少なくとも１つの第２の連結基を含む。一実施形態では、３つの第１の連結基は、Ｂ細胞エピトープの配列を含むポリペプチドに連結可能であるようにそれぞれ構成される。一実施形態では、少なくとも１つの第２の連結基は、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープの配列を含むポリペプチドに連結可能であるように構成される。

【0293】

一実施形態では、コアは、本体部分に結合され、本明細書に定義されるさらなる物質に連結可能であるように構成された、第３の連結基をさらに含み得る。第３の連結基は、第１の連結基及び第２の連結基と異なり得る。第３の連結基は、第１の連結基及び第２の連結基に直交し得る。コアは、１～４個の第３の連結基、好ましくは１つの第３の連結基を含み得る。

【0294】

一実施形態では、第１の連結基及び第２の連結基は、アルキン（例えば、末端アルキン）、アルケン（例えば、末端アルケン、ノルボルネン）、シクロアルキン、トランスシクロアルケン、テトラジン、共役ジエン、マレイミド、α－ハロカルボニル、チオール及びアジドから独立して選択され得；好ましくは、第１の連結基及び第２の連結基は、アルキン（例えば、末端アルキン）、シクロアルキン、マレイミド及びα－ハロカルボニルから独立して選択され；より好ましくは、第１の連結基及び第２の連結基は、アルキン（例えば、末端アルキン）、シクロアルキン及びα－ハロカルボニルから独立して選択される。

【0295】

一実施形態では、第３の連結基は、アルキン（例えば、末端アルキン）、アルケン（例えば、末端アルケン、ノルボルネン）、シクロアルキン、トランスシクロアルケン、テトラジン、共役ジエン、マレイミド、α－ハロカルボニル、チオール及びアジドから独立して選択され得；好ましくは、第１の連結基及び第２の連結基は、アルキン（例えば、末端アルキン）、シクロアルキン、マレイミド及びα－ハロカルボニルから独立して選択され；より好ましくは、第３の連結基は、アルキン（例えば、末端アルキン）、シクロアルキン及びα－ハロカルボニルから選択される。

【0296】

一実施形態では、第１の連結基及び第２の連結基は、

【化30】

から独立して選択され得、
Ｘ_１２は、Ｏ、ＮＲ_１２又はＳであり；
Ｒ_１２は、水素、任意選択により置換されたアルキル、任意選択により置換されたシクロアルキル、任意選択により置換されたヘテロシクロアルキル、任意選択により置換されたアリール及び任意選択により置換されたヘテロアリール；好ましくは水素及び任意選択により置換されたアルキルから選択され；
ａｘ１１及びａｘ１２は、０～１２から独立して選択される。

【0297】

一実施形態では、第３の連結基は、

【化31】

から独立して選択され得、
Ｘ_１２は、Ｏ、ＮＲ_１２又はＳであり；
Ｒ_１２は、水素、任意選択により置換されたアルキル、任意選択により置換されたシクロアルキル、任意選択により置換されたヘテロシクロアルキル、任意選択により置換されたアリール及び任意選択により置換されたヘテロアリール；好ましくは水素及び任意選択により置換されたアルキルから選択され；
ａｘ１１及びａｘ１２は、０～１２から独立して選択される。

【0298】

好ましくは、ａｘ１１及びａｘ１２は、１～１２から独立して選択される。より好ましくは、ａｘ１１及びａｘ１２は、１～６から独立して選択される。さらにより好ましくは、ａｘ１１及びａｘ１２は、１～４から独立して選択される。

【0299】

好ましくは、Ｘ１２は、Ｏ又はＮＨであり得る。より好ましくは、Ｘ_１２は、Ｏであり得る。

【0300】

一実施形態では、第１の連結基は、アルキン（例えば、末端アルキン）、マレイミド及びα－ハロカルボニルから選択され得る。好ましくは、第１の連結基は、アルキン（例えば、末端アルキン）及びα－ハロカルボニルから選択され得る。

【0301】

一実施形態では、第１の連結基は、

【化32】

から選択され得、式中、Ｘ_１２、ａｘ１１及びａｘ１２は本明細書に定義されるとおりである。

【0302】

好ましくは、第１の連結基は、

【化33】

から選択され得、式中、Ｘ_１２、ａｘ１１及びａｘ１２は本明細書に定義されるとおりである。

【0303】

一実施形態では、第２の連結基は、アルキン（例えば、末端アルキン）及びシクロアルキンから選択され得る。

【0304】

一実施形態では、第２の連結基は、

【化34】

から選択され得、式中、Ｘ_１２、ａｘ１１及びａｘ１２は本明細書に定義されるとおりである。

【0305】

一実施形態では、第３の連結基は、アルキン（例えば、末端アルキン）であり得る。

【0306】

一実施形態では、第３の連結基は、

【化35】

から選択され得、式中、Ｘ_１２、ａｘ１１及びａｘ１２は本明細書に定義されるとおりである。

【0307】

一実施形態では、コアは、式１：

【化36】

による本体部分を含み得、
式１において、
Ｌ_１１及びＬ_１２は、リンカーであり；
Ｒ_１３は、水素、ヒドロキシ、任意選択により置換されたアミノ、ハロゲン、任意選択により置換されたアルキル、－Ｓ－（任意選択により置換されたアルキル）、任意選択により置換されたシクロアルキル、任意選択により置換されたヘテロシクロアルキル、任意選択により置換されたアルコキシ、任意選択により置換されたアルカノイル、任意選択により置換されたアリール及び任意選択により置換されたヘテロアリールから選択され；
ａ１１は、炭素原子に結合された［（Ｌ_１１）－^＊］基の数を表し、及び１、２又は３から選択され；
ａ１２は、炭素原子に結合された［（Ｌ_１２）－^＊＊］基の数を表し、及び１、２又は３から選択され；
ａ１３は、炭素原子に結合されたＲ_１３基の数を表し、及び０又は１から選択され；
ａ１１＋ａ１２＋ａ１３は、４であり；
^＊は、第１の連結基への接続点を表し；
^＊＊は、第２の連結基への接続点を表す。

【0308】

Ｌ_１１及びＬ_１２のリンカーのタイプは、第１の連結基又は第２の連結基と接続可能であれば特に限定されない。非限定的な例には、アルキレン結合、アリーレン結合、ＰＥＧ結合、カルボニルベースの結合（例えば、ケトン、エステル、アミド）又は結合の他の組み合わせが含まれる。一実施形態では、リンカーは、切断不可能なリンカーである。別の実施形態では、リンカーは、切断可能なリンカーである。

【0309】

一実施形態では、Ｌ_１１及びＬ_１２は、それぞれ独立して１～６個の単位を含み、各単位は、－（任意選択により置換されたアルキレン）－、－Ｏ－、－（ＣＯＮＨ）－、－（ＮＨＣＯ）－、－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－、－（ＣＯ）－、－（任意選択により置換されたアルキレン－ＣＯ）－及び－（ＣＯ－任意選択により置換されたアルキレン）－から独立して選択され、式中、ｗは、１～６から選択される。

【0310】

一実施形態では、Ｌ_１１及びＬ_１２は、それぞれ独立して２～６個の単位を含み得る。好ましくは、Ｌ_１１及びＬ_１２は、それぞれ独立して、３～６個の単位を含み得る。より好ましくは、Ｌ_１１及びＬ_１２は、それぞれ独立して、４～６個の単位を含み得る。

【0311】

一実施形態では、Ｌ_１１及びＬ_１２内の任意の２つの隣接する単位は、互いに異なり得る。

【0312】

一実施形態では、Ｌ_１１及びＬ_１２は、－（任意選択により置換されたアルキレン）－、－Ｏ－、－（ＣＯＮＨ）－、－（ＮＨＣＯ）－、－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－、－（ＣＯ）－、－（任意選択により置換されたアルキレン）－Ｏ－、－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＣＯＮＨ）－、－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＮＨＣＯ）－、－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－、－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＣＯ）－、－Ｏ－（任意選択により置換されたアルキレン）－、－Ｏ－（ＣＯＮＨ）－、－Ｏ－（ＮＨＣＯ）－、－Ｏ－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－、－Ｏ－（ＣＯ）－、－（ＣＯＮＨ）－（任意選択により置換されたアルキレン）－、－（ＣＯＮＨ）－Ｏ－、－（ＣＯＮＨ）－（ＮＨＣＯ）－、－（ＣＯＮＨ）－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－、－（ＣＯＮＨ）－（ＣＯ）－、－（ＮＨＣＯ）－（任意選択により置換されたアルキレン）－、－（ＮＨＣＯ）－Ｏ－、－（ＮＨＣＯ）－（ＣＯＮＨ）－、－（ＮＨＣＯ）－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－、－（ＮＨＣＯ）－（ＣＯ）－、－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－（任意選択により置換されたアルキレン）－、－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－Ｏ－、－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－（ＣＯＮＨ）－、－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－（ＮＨＣＯ）－、－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－（ＣＯ）－、－（ＣＯ）－（任意選択により置換されたアルキレン）、－（ＣＯ）－Ｏ－、－（ＣＯ）－（ＣＯＮＨ）－、－（ＣＯ）－（ＮＨＣＯ）－、－（ＣＯ）－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－、－（ＣＯ）－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＣＯ）－、－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＮＨＣＯ）－（任意選択により置換されたアルキレン）－、－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＣＯＮＨ）－（任意選択により置換されたアルキレン）－、－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＮＨＣＯ）－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－（任意選択により置換されたアルキレン）－、－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＣＯＮＨ）－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－（任意選択により置換されたアルキレン）－、－（任意選択により置換されたアルキレン）－Ｏ－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＮＨＣＯ）－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－（任意選択により置換されたアルキレン）－、－（任意選択により置換されたアルキレン）－Ｏ－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＣＯＮＨ）－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－（任意選択により置換されたアルキレン）－、－（ＣＯＮＨ）－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＣＯＮＨ）－Ｏ－、－（ＮＨＣＯ）－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＣＯＮＨ）－Ｏ－、－（ＣＯＮＨ）－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＮＨＣＯ）－Ｏ－、－（ＮＨＣＯ）－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＮＨＣＯ）－Ｏ－、－（ＣＯＮＨ）－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＣＯＮＨ）－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＣＯ）－、－（ＮＨＣＯ）－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＣＯＮＨ）－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＣＯ）－、－（ＣＯＮＨ）－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＮＨＣＯ）－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＣＯ）－、－（ＮＨＣＯ）－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＮＨＣＯ）－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＣＯ）－から独立して選択され得る。好ましくは、Ｌ_１１及びＬ_１２は、－（任意選択により置換されたアルキレン）－Ｏ－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＮＨＣＯ）－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－（任意選択により置換されたアルキレン）－、－（任意選択により置換されたアルキレン）－Ｏ－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＣＯＮＨ）－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－（任意選択により置換されたアルキレン）－、－（ＣＯＮＨ）－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＣＯＮＨ）－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＣＯ）－、－（ＮＨＣＯ）－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＣＯＮＨ）－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＣＯ）－、－（ＣＯＮＨ）－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＮＨＣＯ）－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＣＯ）－、－（ＮＨＣＯ）－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＮＨＣＯ）－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＣＯ）－から独立して選択され得る。より好ましくは、Ｌ_１１及びＬ_１２は、－（任意選択により置換されたアルキレン）－Ｏ－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＣＯＮＨ）－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－（任意選択により置換されたアルキレン）－及び－（ＮＨＣＯ）－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＮＨＣＯ）－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＣＯ）－から独立して選択され得る。本明細書で示される左から右へのＬ_１１及びＬ_１２の単位の順序は、それぞれ炭素原子から第１の連結基への接続点（^＊）及び第２の連結基への接続点（^＊＊）へと読まれ得る。

【0313】

一実施形態では、Ｌ_１１は、－（任意選択により置換されたアルキレン）－、－Ｏ－、－（ＣＯＮＨ）－、－（ＮＨＣＯ）－、－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－、－（ＣＯ）－、－（任意選択により置換されたアルキレン）－Ｏ－、－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＣＯＮＨ）－、－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＮＨＣＯ）－、－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－、－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＣＯ）－、－Ｏ－（任意選択により置換されたアルキレン）－、－Ｏ－（ＣＯＮＨ）－、－Ｏ－（ＮＨＣＯ）－、－Ｏ－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－、－Ｏ－（ＣＯ）－、－（ＣＯＮＨ）－（任意選択により置換されたアルキレン）－、－（ＣＯＮＨ）－Ｏ－、－（ＣＯＮＨ）－（ＮＨＣＯ）－、－（ＣＯＮＨ）－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－、－（ＣＯＮＨ）－（ＣＯ）－、－（ＮＨＣＯ）－（任意選択により置換されたアルキレン）－、－（ＮＨＣＯ）－Ｏ－、－（ＮＨＣＯ）－（ＣＯＮＨ）－、－（ＮＨＣＯ）－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－、－（ＮＨＣＯ）－（ＣＯ）－、－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－（任意選択により置換されたアルキレン）－、－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－Ｏ－、－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－（ＣＯＮＨ）－、－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－（ＮＨＣＯ）－、－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－（ＣＯ）－、－（ＣＯ）－（任意選択により置換されたアルキレン）、－（ＣＯ）－Ｏ－、－（ＣＯ）－（ＣＯＮＨ）－、－（ＣＯ）－（ＮＨＣＯ）－、－（ＣＯ）－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－、－（ＣＯ）－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＣＯ）－、－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＮＨＣＯ）－（任意選択により置換されたアルキレン）－、－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＣＯＮＨ）－（任意選択により置換されたアルキレン）－、－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＮＨＣＯ）－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－（任意選択により置換されたアルキレン）－、－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＣＯＮＨ）－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－（任意選択により置換されたアルキレン）－、－（任意選択により置換されたアルキレン）－Ｏ－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＮＨＣＯ）－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－（任意選択により置換されたアルキレン）－、－（任意選択により置換されたアルキレン）－Ｏ－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＣＯＮＨ）－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－（任意選択により置換されたアルキレン）－、－（ＣＯＮＨ）－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＣＯＮＨ）－Ｏ－、－（ＮＨＣＯ）－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＣＯＮＨ）－Ｏ－、－（ＣＯＮＨ）－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＮＨＣＯ）－Ｏ－、－（ＮＨＣＯ）－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＮＨＣＯ）－Ｏ－、－（ＣＯＮＨ）－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＣＯＮＨ）－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＣＯ）－、－（ＮＨＣＯ）－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＣＯＮＨ）－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＣＯ）－、－（ＣＯＮＨ）－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＮＨＣＯ）－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＣＯ）－、－（ＮＨＣＯ）－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＮＨＣＯ）－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＣＯ）－から選択され得る。好ましくは、Ｌ_１１は、－（任意選択により置換されたアルキレン）－Ｏ－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＮＨＣＯ）－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－（任意選択により置換されたアルキレン）－及び－（任意選択により置換されたアルキレン）－Ｏ－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＣＯＮＨ）－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－（任意選択により置換されたアルキレン）－から選択され得る。より好ましくは、Ｌ_１１は、－（任意選択により置換されたアルキレン）－Ｏ－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＣＯＮＨ）－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－（任意選択により置換されたアルキレン）－であり得る。

【0314】

一実施形態では、Ｌ_１２は、－（任意選択により置換されたアルキレン）－、－Ｏ－、－（ＣＯＮＨ）－、－（ＮＨＣＯ）－、－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－、－（ＣＯ）－、－（任意選択により置換されたアルキレン）－Ｏ－、－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＣＯＮＨ）－、－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＮＨＣＯ）－、－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－、－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＣＯ）－、－Ｏ－（任意選択により置換されたアルキレン）－、－Ｏ－（ＣＯＮＨ）－、－Ｏ－（ＮＨＣＯ）－、－Ｏ－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－、－Ｏ－（ＣＯ）－、－（ＣＯＮＨ）－（任意選択により置換されたアルキレン）－、－（ＣＯＮＨ）－Ｏ－、－（ＣＯＮＨ）－（ＮＨＣＯ）－、－（ＣＯＮＨ）－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－、－（ＣＯＮＨ）－（ＣＯ）－、－（ＮＨＣＯ）－（任意選択により置換されたアルキレン）－、－（ＮＨＣＯ）－Ｏ－、－（ＮＨＣＯ）－（ＣＯＮＨ）－、－（ＮＨＣＯ）－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－、－（ＮＨＣＯ）－（ＣＯ）－、－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－（任意選択により置換されたアルキレン）－、－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－Ｏ－、－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－（ＣＯＮＨ）－、－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－（ＮＨＣＯ）－、－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－（ＣＯ）－、－（ＣＯ）－（任意選択により置換されたアルキレン）、－（ＣＯ）－Ｏ－、－（ＣＯ）－（ＣＯＮＨ）－、－（ＣＯ）－（ＮＨＣＯ）－、－（ＣＯ）－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－、－（ＣＯ）－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＣＯ）－、－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＮＨＣＯ）－（任意選択により置換されたアルキレン）－、－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＣＯＮＨ）－（任意選択により置換されたアルキレン）－、－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＮＨＣＯ）－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－（任意選択により置換されたアルキレン）－、－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＣＯＮＨ）－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－（任意選択により置換されたアルキレン）－、－（任意選択により置換されたアルキレン）－Ｏ－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＮＨＣＯ）－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－（任意選択により置換されたアルキレン）－、－（任意選択により置換されたアルキレン）－Ｏ－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＣＯＮＨ）－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－（任意選択により置換されたアルキレン）－、－（ＣＯＮＨ）－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＣＯＮＨ）－Ｏ－、－（ＮＨＣＯ）－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＣＯＮＨ）－Ｏ－、－（ＣＯＮＨ）－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＮＨＣＯ）－Ｏ－、－（ＮＨＣＯ）－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＮＨＣＯ）－Ｏ－、－（ＣＯＮＨ）－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＣＯＮＨ）－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＣＯ）－、－（ＮＨＣＯ）－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＣＯＮＨ）－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＣＯ）－、－（ＣＯＮＨ）－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＮＨＣＯ）－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＣＯ）－、－（ＮＨＣＯ）－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＮＨＣＯ）－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＣＯ）－から選択され得る。好ましくは、Ｌ_１２は、－（ＣＯＮＨ）－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＣＯＮＨ）－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＣＯ）－、－（ＮＨＣＯ）－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＣＯＮＨ）－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＣＯ）－、－（ＣＯＮＨ）－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＮＨＣＯ）－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＣＯ）－、－（ＮＨＣＯ）－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＮＨＣＯ）－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＣＯ）－から選択され得る。より好ましくは、Ｌ_１２は、－（ＮＨＣＯ）－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＮＨＣＯ）－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＣＯ）－であり得る。

【0315】

一実施形態では、Ｌ_１１及びＬ_１２のｗは、１～４から独立して選択され得る。

【0316】

一実施形態では、Ｒ_１３は、水素、ハロゲン、任意選択により置換されたアルキル及び任意選択により置換されたシクロアルキルから選択され得る。好ましくは、Ｒ_１３は、水素、任意選択により置換されたアルキルから選択され得る。より好ましくは、Ｒ_１３は、水素であり得る。

【0317】

一実施形態では、ａ１１は、２又は３であり得る。好ましくは、ａ１１は、３であり得る。

【0318】

一実施形態では、ａ１２は、１又は２であり得る。好ましくは、ａ１２は、１であり得る。

【0319】

一実施形態では、ａ１３は、０であり得る。別の実施形態では、ａ１３は、１であり得る。

【0320】

一実施形態では、コアは、式２：

【化37】

による本体部分を含み得、
式２において、
ＡＡは、アミノ酸を表し；
ｎは、独立して選択されるＡＡ基の数を表し、及び１～１２から選択され；
Ｌ_２１及びＬ_２２は、リンカーであり；
Ｒ_２３は、水素、ヒドロキシ、任意選択により置換されたアミノ、任意選択により置換されたアルキル、－Ｓ－（任意選択により置換されたアルキル）、任意選択により置換されたシクロアルキル、任意選択により置換されたヘテロシクロアルキル、任意選択により置換されたアルコキシ、任意選択により置換されたアリール及び任意選択により置換されたヘテロアリールから選択され；
ａ２１は、［（ＡＡ）］_ｎに結合された［（Ｌ_２１）－^＊］基の数を表し、及び１、２又は３から選択され；
ａ２２は、［（ＡＡ）］_ｎに結合された［（Ｌ_２２）－^＊＊］基の数を表し、及び１、２又は３から選択され；
ａ２３は、Ｃ末端及び／又はＮ末端で［（ＡＡ）］_ｎに結合されたＲ_２３基の数を表し、及び０、１又は２から選択され；
^＊は、ＡＡ基の１つのＮ末端、Ｃ末端又は側鎖を介した第１の連結基への接続点を表し；
^＊＊は、ＡＡ基の１つのＮ末端、Ｃ末端又は側鎖を介した第２の連結基への接続点を表す。

【0321】

Ｌ_２１及びＬ_２２のリンカーのタイプは、第１の連結基又は第２の連結基と接続可能であれば特に限定されない。非限定的な例には、アルキレン結合、アリーレン結合、ＰＥＧ結合、カルボニルベースの結合（例えば、ケトン、エステル、アミド）又は結合の他の組み合わせが含まれる。一実施形態では、リンカーは、切断不可能なリンカーである。別の実施形態では、リンカーは、切断可能なリンカーである。

【0322】

一実施形態では、Ｌ_２１及びＬ_２２は、それぞれ独立して０～６個の単位を含み、各単位は、－（任意選択により置換されたアルキレン）－、－Ｏ－、－（ＣＯＮＨ）－、－（ＮＨＣＯ）－、－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－、－（ＣＯ）－、－（任意選択により置換されたアルキレン－ＣＯ）－及び－（ＣＯ－任意選択により置換されたアルキレン）－から独立して選択され、式中、ｗは、１～６から選択される。

【0323】

Ｌ_２１及び／又はＬ_２２が０単位を含む場合、これは、第１の連結基又は第２の連結基は、ＡＡ基の１つのＮ末端、Ｃ末端又は側鎖に直接接続される場合を指す。

【0324】

一実施形態では、式２による本体部分は、任意選択により置換されたアミノ基を含む側鎖を有する１つ以上のＡＡ基を含み得る。好ましくは、アミノ基を含む側鎖は、－（任意選択により置換されたアルキレン）－（任意選択により置換されたアミノ）基であり得る。

【0325】

一実施形態では、アミノ基を含む側鎖は、１つ以上のリジン基を含み得る。好ましくは、式２による本体部分は、１～４個のリジン基を含み得る。より好ましくは、式２による本体部分は、３つのリジン基を含み得る。さらにより好ましくは、式２による本体部分は、３つのリジン基（Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ）から構成され得るか、又は３つのリジン基及び１つのセリン基（例えば、Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｓｅｒ）から構成され得る。

【0326】

一実施形態では、ｎは、２～１０から選択され得る。好ましくは、ｎは、２～６から選択され得る。より好ましくは、ｎは、３～６から選択され得る。さらにより好ましくは、ｎは、３又は４であり得る。さらにより好ましくは、ｎは、３であり得る。

【0327】

一実施形態では、任意の２つのＡＡ基は、リンカーによって分離され得る。任意の２つのＡＡ基間のリンカーのタイプは、それらが２つのＡＡ基に接続可能であれば特に限定されない。非限定的な例には、アルキレン結合、アリーレン結合、ＰＥＧ結合、カルボニルベースの結合（例えば、ケトン、エステル、アミド）又は結合の他の組み合わせが含まれる。一実施形態では、リンカーは、切断不可能なリンカーである。別の実施形態では、リンカーは、切断可能なリンカーである。

【0328】

任意の２つのＡＡ基間のリンカーは、０～６単位を含み得、各単位は、－（任意選択により置換されたアルキレン）－、－Ｏ－、－（ＣＯＮＨ）－、－（ＮＨＣＯ）－、－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－、－（ＣＯ）－、－（任意選択により置換されたアルキレン－ＣＯ）－及び－（ＣＯ－任意選択により置換されたアルキレン）－から独立して選択され、式中、ｗは、１～６から選択される。

【0329】

好ましくは、任意の２つのＡＡ基間のリンカーは、－（任意選択により置換されたアルキレン）－、－Ｏ－、－（ＣＯＮＨ）－、－（ＮＨＣＯ）－、－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－、－（ＣＯ）－、－（任意選択により置換されたアルキレン）－Ｏ－、－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＣＯＮＨ）－、－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＮＨＣＯ）－、－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－、－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＣＯ）－、－Ｏ－（任意選択により置換されたアルキレン）－、－Ｏ－（ＣＯＮＨ）－、－Ｏ－（ＮＨＣＯ）－、－Ｏ－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－、－Ｏ－（ＣＯ）－、－（ＣＯＮＨ）－（任意選択により置換されたアルキレン）－、－（ＣＯＮＨ）－Ｏ－、－（ＣＯＮＨ）－（ＮＨＣＯ）－、－（ＣＯＮＨ）－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－、－（ＣＯＮＨ）－（ＣＯ）－、－（ＮＨＣＯ）－（任意選択により置換されたアルキレン）－、－（ＮＨＣＯ）－Ｏ－、－（ＮＨＣＯ）－（ＣＯＮＨ）－、－（ＮＨＣＯ）－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－、－（ＮＨＣＯ）－（ＣＯ）－、－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－（任意選択により置換されたアルキレン）－、－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－Ｏ－、－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－（ＣＯＮＨ）－、－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－（ＮＨＣＯ）－、－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－（ＣＯ）－、－（ＣＯ）－（任意選択により置換されたアルキレン）、－（ＣＯ）－Ｏ－、－（ＣＯ）－（ＣＯＮＨ）－、－（ＣＯ）－（ＮＨＣＯ）－、－（ＣＯ）－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－、－（ＣＯ）－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＣＯ）－、－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＮＨＣＯ）－（任意選択により置換されたアルキレン）－、－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＣＯＮＨ）－（任意選択により置換されたアルキレン）－、－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＮＨＣＯ）－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－（任意選択により置換されたアルキレン）－、－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＣＯＮＨ）－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－（任意選択により置換されたアルキレン）－、－（任意選択により置換されたアルキレン）－Ｏ－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＮＨＣＯ）－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－（任意選択により置換されたアルキレン）－、－（任意選択により置換されたアルキレン）－Ｏ－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＣＯＮＨ）－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－（任意選択により置換されたアルキレン）－、－（ＣＯＮＨ）－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＣＯＮＨ）－Ｏ－、－（ＮＨＣＯ）－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＣＯＮＨ）－Ｏ－、－（ＣＯＮＨ）－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＮＨＣＯ）－Ｏ－、－（ＮＨＣＯ）－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＮＨＣＯ）－Ｏ－、－（ＣＯＮＨ）－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＣＯＮＨ）－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＣＯ）－、－（ＮＨＣＯ）－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＣＯＮＨ）－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＣＯ）－、－（ＣＯＮＨ）－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＮＨＣＯ）－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＣＯ）－、－（ＮＨＣＯ）－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＮＨＣＯ）－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＣＯ）－から選択され得る。

【0330】

一実施形態では、任意の２つのＡＡ基は、互いに直接接続され得る。

【0331】

一実施形態では、全ての「（ＡＡ）_ｎ」における任意の２つのＡＡ基は、互いに直接接続される。

【0332】

一実施形態では、１つのＡＡ基のカルボニル部分は別のＡＡ基のアミン部分に接続され得、１つのＡＡ基のカルボニル部分は別のＡＡ基の側鎖を介して接続され得、１つのＡＡ基のアミン部分は別の１つのＡＡ基の側鎖を介して接続され得るか、又は１つのＡＡ基の側鎖は別のＡＡ基の側鎖を介して接続される（任意選択により、本明細書に定義される１つのＡＡグループと別のＡＡグループとの間にリンカーを伴う）。

【0333】

一実施形態では、「（ＡＡ）_ｎ」は、ＡＡ基の直鎖状配列であり得、各ＡＡ基は、１つのＡＡ基のカルボニル部分が別のＡＡ基のアミン部分に接続されるように次のＡＡ基に接続される（任意選択により、本明細書に定義される１つのＡＡグループと別のＡＡグループとの間にリンカーを伴う）。いくつかの実施形態では、ＡＡ基の直鎖状配列は、任意の２つのＡＡ基が互いに直接接続されるように（すなわち任意の２つのＡＡ基間にリンカーなしで）接続され得る。

【0334】

一実施形態では、Ｌ_２１及びＬ_２２は、それぞれ独立して０～５個の単位を含み得る。好ましくは、Ｌ_２１及びＬ_２２は、それぞれ独立して、０～３個の単位を含み得る。

【0335】

一実施形態では、Ｌ_２１及びＬ_２２内の任意の２つの隣接する単位は、互いに異なり得る。

【0336】

一実施形態では、Ｌ_２１及びＬ_２２の各単位は、－（任意選択により置換されたアルキレン）－及び－（ＣＯ）－から独立して選択され得る。

【0337】

一実施形態では、Ｌ_２１及びＬ_２２は、－（任意選択により置換されたアルキレン）－、－Ｏ－、－（ＣＯＮＨ）－、－（ＮＨＣＯ）－、－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－、－（ＣＯ）－、－（任意選択により置換されたアルキレン）－Ｏ－、－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＣＯＮＨ）－、－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＮＨＣＯ）－、－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－、－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＣＯ）－、－Ｏ－（任意選択により置換されたアルキレン）－、－Ｏ－（ＣＯＮＨ）－、－Ｏ－（ＮＨＣＯ）－、－Ｏ－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－、－Ｏ－（ＣＯ）－、－（ＣＯＮＨ）－（任意選択により置換されたアルキレン）－、－（ＣＯＮＨ）－Ｏ－、－（ＣＯＮＨ）－（ＮＨＣＯ）－、－（ＣＯＮＨ）－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－、－（ＣＯＮＨ）－（ＣＯ）－、－（ＮＨＣＯ）－（任意選択により置換されたアルキレン）－、－（ＮＨＣＯ）－Ｏ－、－（ＮＨＣＯ）－（ＣＯＮＨ）－、－（ＮＨＣＯ）－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－、－（ＮＨＣＯ）－（ＣＯ）－、－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－（任意選択により置換されたアルキレン）－、－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－Ｏ－、－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－（ＣＯＮＨ）－、－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－（ＮＨＣＯ）－、－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－（ＣＯ）－、－（ＣＯ）－（任意選択により置換されたアルキレン）、－（ＣＯ）－Ｏ－、－（ＣＯ）－（ＣＯＮＨ）－、－（ＣＯ）－（ＮＨＣＯ）－、－（ＣＯ）－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－、－（ＣＯ）－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＣＯ）－、－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＮＨＣＯ）－（任意選択により置換されたアルキレン）－、－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＣＯＮＨ）－（任意選択により置換されたアルキレン）－、－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＮＨＣＯ）－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－（任意選択により置換されたアルキレン）－、－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＣＯＮＨ）－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－（任意選択により置換されたアルキレン）－、－（任意選択により置換されたアルキレン）－Ｏ－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＮＨＣＯ）－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－（任意選択により置換されたアルキレン）－、－（任意選択により置換されたアルキレン）－Ｏ－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＣＯＮＨ）－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－（任意選択により置換されたアルキレン）－、－（ＣＯＮＨ）－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＣＯＮＨ）－Ｏ－、－（ＮＨＣＯ）－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＣＯＮＨ）－Ｏ－、－（ＣＯＮＨ）－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＮＨＣＯ）－Ｏ－、－（ＮＨＣＯ）－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＮＨＣＯ）－Ｏ－、－（ＣＯＮＨ）－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＣＯＮＨ）－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＣＯ）－、－（ＮＨＣＯ）－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＣＯＮＨ）－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＣＯ）－、－（ＣＯＮＨ）－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＮＨＣＯ）－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＣＯ）－、－（ＮＨＣＯ）－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＮＨＣＯ）－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＣＯ）－から独立して選択され得る。好ましくは、Ｌ_２１及びＬ_２２は、－（ＣＯ）－、－（ＣＯ）－（任意選択により置換されたアルキレン）－及び－（ＣＯ）－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＣＯ）－から独立して選択され得る。本明細書で示される左から右へのＬ_２１及びＬ_２２の単位の順序は、それぞれＡＡ基から第１の連結基への接続点（^＊）及び第２の連結基への接続点（^＊＊）へと読まれ得る。

【0338】

一実施形態では、Ｌ_２１は、－（任意選択により置換されたアルキレン）－、－Ｏ－、－（ＣＯＮＨ）－、－（ＮＨＣＯ）－、－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－、－（ＣＯ）－、－（任意選択により置換されたアルキレン）－Ｏ－、－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＣＯＮＨ）－、－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＮＨＣＯ）－、－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－、－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＣＯ）－、－Ｏ－（任意選択により置換されたアルキレン）－、－Ｏ－（ＣＯＮＨ）－、－Ｏ－（ＮＨＣＯ）－、－Ｏ－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－、－Ｏ－（ＣＯ）－、－（ＣＯＮＨ）－（任意選択により置換されたアルキレン）－、－（ＣＯＮＨ）－Ｏ－、－（ＣＯＮＨ）－（ＮＨＣＯ）－、－（ＣＯＮＨ）－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－、－（ＣＯＮＨ）－（ＣＯ）－、－（ＮＨＣＯ）－（任意選択により置換されたアルキレン）－、－（ＮＨＣＯ）－Ｏ－、－（ＮＨＣＯ）－（ＣＯＮＨ）－、－（ＮＨＣＯ）－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－、－（ＮＨＣＯ）－（ＣＯ）－、－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－（任意選択により置換されたアルキレン）－、－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－Ｏ－、－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－（ＣＯＮＨ）－、－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－（ＮＨＣＯ）－、－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－（ＣＯ）－、－（ＣＯ）－（任意選択により置換されたアルキレン）、－（ＣＯ）－Ｏ－、－（ＣＯ）－（ＣＯＮＨ）－、－（ＣＯ）－（ＮＨＣＯ）－、－（ＣＯ）－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－、－（ＣＯ）－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＣＯ）－、－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＮＨＣＯ）－（任意選択により置換されたアルキレン）－、－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＣＯＮＨ）－（任意選択により置換されたアルキレン）－、－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＮＨＣＯ）－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－（任意選択により置換されたアルキレン）－、－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＣＯＮＨ）－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－（任意選択により置換されたアルキレン）－、－（任意選択により置換されたアルキレン）－Ｏ－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＮＨＣＯ）－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－（任意選択により置換されたアルキレン）－、－（任意選択により置換されたアルキレン）－Ｏ－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＣＯＮＨ）－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－（任意選択により置換されたアルキレン）－、－（ＣＯＮＨ）－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＣＯＮＨ）－Ｏ－、－（ＮＨＣＯ）－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＣＯＮＨ）－Ｏ－、－（ＣＯＮＨ）－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＮＨＣＯ）－Ｏ－、－（ＮＨＣＯ）－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＮＨＣＯ）－Ｏ－、－（ＣＯＮＨ）－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＣＯＮＨ）－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＣＯ）－、－（ＮＨＣＯ）－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＣＯＮＨ）－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＣＯ）－、－（ＣＯＮＨ）－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＮＨＣＯ）－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＣＯ）－、－（ＮＨＣＯ）－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＮＨＣＯ）－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＣＯ）－から選択され得る。好ましくは、Ｌ_２１は、－（ＣＯ）－及び－（ＣＯ）－（任意選択により置換されたアルキレン）－から選択され得る。

【0339】

一実施形態では、Ｌ_２２は、－（任意選択により置換されたアルキレン）－、－Ｏ－、－（ＣＯＮＨ）－、－（ＮＨＣＯ）－、－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－、－（ＣＯ）－、－（任意選択により置換されたアルキレン）－Ｏ－、－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＣＯＮＨ）－、－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＮＨＣＯ）－、－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－、－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＣＯ）－、－Ｏ－（任意選択により置換されたアルキレン）－、－Ｏ－（ＣＯＮＨ）－、－Ｏ－（ＮＨＣＯ）－、－Ｏ－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－、－Ｏ－（ＣＯ）－、－（ＣＯＮＨ）－（任意選択により置換されたアルキレン）－、－（ＣＯＮＨ）－Ｏ－、－（ＣＯＮＨ）－（ＮＨＣＯ）－、－（ＣＯＮＨ）－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－、－（ＣＯＮＨ）－（ＣＯ）－、－（ＮＨＣＯ）－（任意選択により置換されたアルキレン）－、－（ＮＨＣＯ）－Ｏ－、－（ＮＨＣＯ）－（ＣＯＮＨ）－、－（ＮＨＣＯ）－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－、－（ＮＨＣＯ）－（ＣＯ）－、－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－（任意選択により置換されたアルキレン）－、－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－Ｏ－、－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－（ＣＯＮＨ）－、－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－（ＮＨＣＯ）－、－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－（ＣＯ）－、－（ＣＯ）－（任意選択により置換されたアルキレン）、－（ＣＯ）－Ｏ－、－（ＣＯ）－（ＣＯＮＨ）－、－（ＣＯ）－（ＮＨＣＯ）－、－（ＣＯ）－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－、－（ＣＯ）－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＣＯ）－、－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＮＨＣＯ）－（任意選択により置換されたアルキレン）－、－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＣＯＮＨ）－（任意選択により置換されたアルキレン）－、－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＮＨＣＯ）－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－（任意選択により置換されたアルキレン）－、－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＣＯＮＨ）－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－（任意選択により置換されたアルキレン）－、－（任意選択により置換されたアルキレン）－Ｏ－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＮＨＣＯ）－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－（任意選択により置換されたアルキレン）－、－（任意選択により置換されたアルキレン）－Ｏ－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＣＯＮＨ）－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－（任意選択により置換されたアルキレン）－、－（ＣＯＮＨ）－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＣＯＮＨ）－Ｏ－、－（ＮＨＣＯ）－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＣＯＮＨ）－Ｏ－、－（ＣＯＮＨ）－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＮＨＣＯ）－Ｏ－、－（ＮＨＣＯ）－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＮＨＣＯ）－Ｏ－、－（ＣＯＮＨ）－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＣＯＮＨ）－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＣＯ）－、－（ＮＨＣＯ）－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＣＯＮＨ）－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＣＯ）－、－（ＣＯＮＨ）－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＮＨＣＯ）－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＣＯ）－、－（ＮＨＣＯ）－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＮＨＣＯ）－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＣＯ）－から選択され得る。好ましくは、Ｌ_２２は、－（ＣＯ）－及び－（ＣＯ）－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＣＯ）－から選択され得る。

【0340】

一実施形態では、Ｌ_２１及びＬ_２２のｗは、１～４から独立して選択され得る。

【0341】

一実施形態では、Ｃ末端に接続されたＲ_２３基は、ヒドロキシ、任意選択により置換されたアミノ及び任意選択により置換されたアルコキシから選択され得る。好ましくは、Ｃ末端に接続されたＲ_２３基は、ヒドロキシ及び任意選択により置換されたアミノから選択され得る。より好ましくは、Ｃ末端に接続されたＲ_２３基は、任意選択により置換されたアミノであり得る。さらにより好ましくは、Ｃ末端に接続されたＲ_２３基は、－ＮＨ_２であり得る。

【0342】

一実施形態では、Ｎ末端に接続されたＲ_２３基は、水素、任意選択により置換されたアルキル、任意選択により置換されたシクロアルキル、任意選択により置換されたヘテロシクロアルキル、任意選択により置換されたアリール及び任意選択により置換されたヘテロアリールから選択され得る。好ましくは、Ｎ末端に接続されたＲ_２３基は、水素及び任意選択により置換されたアルキルから選択され得る。より好ましくは、Ｎ末端に接続されたＲ_２３基は、水素であり得る。

【0343】

一実施形態では、ａ２１は、２又は３であり得る。好ましくは、ａ２１は、３であり得る。

【0344】

一実施形態では、ａ２２は、１又は２であり得る。好ましくは、ａ２２は、１であり得る。

【0345】

一実施形態では、ａ２３は、０であり得る。別の実施形態では、ａ２３は、１であり得る。

【0346】

一実施形態では、第１の連結基への接続点は、ＡＡ基の１つの側鎖を介するものであり得る。２つ以上の第１の連結基が存在する実施形態では、第１の連結基への少なくとも１つの接続点は、ＡＡ基の少なくとも１つの側鎖を介するものであり得る。好ましくは、２つ以上の第１の連結基が存在する場合、第１の連結基への接続点は、それぞれ独立して選択されたＡＡ基の側鎖を介するものである。いくつかの実施形態では、個々のＡＡ基は、最大１つの第１の連結基に接続され得る。

【0347】

一実施形態では、第２の連結基への接続点は、Ｃ末端又はＮ末端を介するものであり得る。好ましくは、第２の連結基への接続点は、Ｎ末端を介するものであり得る。

【0348】

存在する場合、第３の連結基への接続点は、ＡＡ基の１つの側鎖（例えば、セリン基）を介するか又はＣ末端を介するものであり得る。好ましくは、第３の連結基への接続点は、Ｃ末端を介するものであり得る。

【0349】

第３の連結基は、存在する場合、本体部分に直接接続され得る。他の実施形態では、第３の連結基は、リンカーを介して本体部分に間接的に接続され得る。このような場合、第３の連結基のリンカーのタイプは、第３の連結基を本体部分に（共有結合的に）接続可能であれば特に限定されない。非限定的な例には、アルキレン結合、アリーレン結合、ＰＥＧ結合、カルボニルベースの結合（例えば、ケトン、エステル、アミド）又は結合の他の組み合わせが含まれる。一実施形態では、リンカーは、切断不可能なリンカーである。別の実施形態では、リンカーは、切断可能なリンカーである。

【0350】

一実施形態では、第３の連結基のリンカーは、－（任意選択により置換されたアルキレン）－、－Ｏ－、－（ＣＯＮＨ）－、－（ＮＨＣＯ）－、－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－、－（ＣＯ）－、－（任意選択により置換されたアルキレン）－Ｏ－、－（ＮＨ）－（任意選択により置換されたアルキレン）－、－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＣＯＮＨ）－、－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＮＨＣＯ）－、－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－、－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＣＯ）－、－Ｏ－（任意選択により置換されたアルキレン）－、－Ｏ－（ＣＯＮＨ）－、－Ｏ－（ＮＨＣＯ）－、－Ｏ－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－、－Ｏ－（ＣＯ）－、－（ＣＯＮＨ）－（任意選択により置換されたアルキレン）－、－（ＣＯＮＨ）－Ｏ－、－（ＣＯＮＨ）－（ＮＨＣＯ）－、－（ＣＯＮＨ）－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－、－（ＣＯＮＨ）－（ＣＯ）－、－（ＮＨＣＯ）－（任意選択により置換されたアルキレン）－、－（ＮＨＣＯ）－Ｏ－、－（ＮＨＣＯ）－（ＣＯＮＨ）－、－（ＮＨＣＯ）－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－、－（ＮＨＣＯ）－（ＣＯ）－、－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－（任意選択により置換されたアルキレン）－、－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－Ｏ－、－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－（ＣＯＮＨ）－、－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－（ＮＨＣＯ）－、－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－（ＣＯ）－、－（ＣＯ）－（任意選択により置換されたアルキレン）、－（ＣＯ）－Ｏ－、－（ＣＯ）－（ＣＯＮＨ）－、－（ＣＯ）－（ＮＨＣＯ）－、－（ＣＯ）－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－、－（ＣＯ）－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＣＯ）－、－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＮＨＣＯ）－（任意選択により置換されたアルキレン）－、－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＣＯＮＨ）－（任意選択により置換されたアルキレン）－、－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＮＨＣＯ）－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－（任意選択により置換されたアルキレン）－、－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＣＯＮＨ）－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－（任意選択により置換されたアルキレン）－、－（任意選択により置換されたアルキレン）－Ｏ－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＮＨＣＯ）－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－（任意選択により置換されたアルキレン）－、－（任意選択により置換されたアルキレン）－Ｏ－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＣＯＮＨ）－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－（任意選択により置換されたアルキレン）－、－（ＣＯＮＨ）－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＣＯＮＨ）－Ｏ－、－（ＮＨＣＯ）－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＣＯＮＨ）－Ｏ－、－（ＣＯＮＨ）－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＮＨＣＯ）－Ｏ－、－（ＮＨＣＯ）－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＮＨＣＯ）－Ｏ－、－（ＣＯＮＨ）－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＣＯＮＨ）－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＣＯ）－、－（ＮＨＣＯ）－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＣＯＮＨ）－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＣＯ）－、－（ＣＯＮＨ）－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＮＨＣＯ）－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＣＯ）－、－（ＮＨＣＯ）－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＮＨＣＯ）－（任意選択により置換されたアルキレン）－（ＣＯ）－から選択され得る。好ましくは、第３の連結基へのリンカーは、－（ＮＨ）－（任意選択により置換されたアルキレン）－であり得る。本明細書で示される第３の連結基の左から右への単位の順序は、（ＡＡ）_ｎ基から第３の連結基への接続点へと読まれ得る。

【0351】

一実施形態では、コアは、

【化38】

【化39】

【化40】

から選択される。

【0352】

製造プロセス
本発明の別の態様によれば、コンジュゲートを製造するプロセスであって、
（ａ）Ｂ細胞エピトープの配列を含む少なくとも１つのポリペプチドを提供するステップ；並びに
（ｂ）ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープの配列を含む少なくとも１つのポリペプチドを提供し、及びＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープの配列を含む少なくとも１つのポリペプチドを、Ｂ細胞エピトープの配列を含む少なくとも１つのポリペプチドに連結するステップ
を含み、
ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープは、ユニバーサル腫瘍抗原の少なくとも１２個のアミノ酸の領域又はその領域に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含み、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープは、集団の少なくとも５０％において免疫原性であり、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープの配列を含む少なくとも１つのポリペプチドは、５００アミノ酸以下の長さであり、
Ｂ細胞エピトープの配列は、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープの配列と異なり、
Ｂ細胞エピトープに特異的な抗体は、コンジュゲートに結合する、プロセスが提供される。

【0353】

一実施形態では、Ｂ細胞エピトープの配列を含む少なくとも１つのポリペプチド及びＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープの配列を含む少なくとも１つのポリペプチドは、コアを介して連結され、
コアは、連結前に、
本体部分；
本体部分に結合された１つ以上の第１の連結基；及び
本体部分に結合された１つ以上の第２の連結基
を含み、
第１の連結基及び第２の連結基は、互いに直交しており、
第１の連結基は、Ｂ細胞エピトープの配列を含む少なくとも１つのポリペプチドに連結されて第１の接続要素を形成し、及び第２の連結基は、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープの配列を含む少なくとも１つのポリペプチドに連結されて第２の接続要素を形成する。

【0354】

本発明の別の態様によれば、コンジュゲートを製造するプロセスであって、
（ａ）コアであって、
本体部分；
本体部分に結合された１つ以上の第１の連結基；及び
本体部分に結合された１つ以上の第２の連結基
を含むコアを提供するステップであって、
第１の連結基及び第２の連結基は、互いに直交しており、
第１の連結基及び第２の連結基の少なくとも１つは、２つ以上の第１の連結基又は第２の連結基を含み、並びに
第１の連結基及び第２の連結基は、アルキン（例えば、末端アルキン）、アルケン（例えば、末端アルケン、ノルボルネン）、シクロアルキン、トランスシクロアルケン、テトラジン、共役ジエン、マレイミド、α－ハロカルボニル、チオール及びアジドから独立して選択され；好ましくは、第１の連結基及び第２の連結基は、アルキン（例えば、末端アルキン）、シクロアルキン、マレイミド及びα－ハロカルボニルから独立して選択され；より好ましくは、第１の連結基及び第２の連結基は、アルキン（例えば、末端アルキン）、シクロアルキン及びα－ハロカルボニルから独立して選択され；
コアは、

【化41】

ではなく、好ましくは、コアは、本明細書に定義されるとおりである、ステップ；
（ｂ）Ｂ細胞エピトープの配列を含む少なくとも１つのポリペプチド又はＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープの配列を含む少なくとも１つのポリペプチドを提供し；及びコアを、Ｂ細胞エピトープの配列を含む少なくとも１つのポリペプチドと反応させて第１の接続要素を形成するか、又はコアを、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープの配列を含む少なくとも１つのポリペプチドと反応させて第２の接続要素を形成するステップ
を含むプロセスが提供される。Ｂ細胞エピトープの配列を含む少なくとも１つのポリペプチド及び／又はＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープの配列を含む少なくとも１つのポリペプチドに関する他の好ましい実施形態は上記に記載されており、本プロセスに同様に適用される。コアに関する他の好ましい実施形態は、上記でさらに詳細に説明されており、プロセスにも同様に適用される。

【0355】

一実施形態では、プロセスは、
（ｃ）ステップ（ｂ）で提供されない、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープの配列を含む少なくとも１つのポリペプチド又はＢ細胞エピトープの配列を含む少なくとも１つのポリペプチドの他方を提供し；及び第１の接続要素がステップ（ｂ）で形成された場合、コアを、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープの配列を含む少なくとも１つのポリペプチドと反応させて第２の接続要素を形成するか；又は第２の接続要素がステップ（ｂ）で形成された場合、コアを、Ｂ細胞エピトープの配列を含む少なくとも１つのポリペプチドと反応させて第１の接続要素を形成するステップ
をさらに含み得る。

【0356】

一実施形態では、ステップ（ｂ）は、非共有結合又は共有結合の形成を含み得る。好ましくは、ステップ（ｂ）は、共有結合の形成を含み得る。

【0357】

一実施形態では、ステップ（ｂ）は、クリック反応を含み得る。好ましくは、反応は、付加環化反応（例えば、銅触媒によるアジド－アルキン付加環化及び歪み促進型アジド－アルキン付加環化又はアジド－アルケン付加環化を含む、１，３－双極性付加環化；テトラジン及びシクロアルキン又はトランスシクロアルケンなどによる、テトラジンライゲーション；ディールス・アルダー付加環化反応）、求核置換、マイケル反応又はクリック反応の他の例を含む。

【0358】

一実施形態では、ステップ（ｃ）は、非共有結合又は共有結合の形成を含み得る。好ましくは、ステップ（ｃ）は、共有結合の形成を含み得る。

【0359】

一実施形態では、ステップ（ｃ）は、クリック反応を含み得る。好ましくは、反応は、付加環化反応（例えば、銅触媒によるアジド－アルキン付加環化及び歪み促進型アジド－アルキン付加環化又はアジド－アルケン付加環化を含む、１，３－双極性付加環化；テトラジン及びシクロアルキン又はトランスシクロアルケンなどによる、テトラジンライゲーション；ディールス・アルダー付加環化反応）、求核置換、マイケル反応又はクリック反応の他の例を含む。

【0360】

一実施形態では、コアが第３の連結基を含む場合、プロセスは、
（ｄ）本明細書に定義されるさらなる物質を提供し、コアをさらなる物質と反応させて第３の接続要素を形成するステップ
をさらに含み得る。

【0361】

一実施形態では、ステップ（ｄ）は、ステップ（ｃ）後に実施され得る。

【0362】

一実施形態では、ステップ（ｄ）は、非共有結合又は共有結合の形成を含み得る。好ましくは、ステップ（ｄ）は、共有結合の形成を含み得る。

【0363】

一実施形態では、ステップ（ｄ）は、クリック反応を含み得る。好ましくは、反応は、付加環化反応（例えば、銅触媒によるアジド－アルキン付加環化及び歪み促進型アジド－アルキン付加環化又はアジド－アルケン付加環化を含む、１，３－双極性付加環化；テトラジン及びシクロアルキン又はトランスシクロアルケンなどによる、テトラジンライゲーション；ディールス・アルダー付加環化反応）、求核置換、マイケル反応又はクリック反応の他の例を含む。

【0364】

一実施形態では、プロセスは、マレイミド－チオール付加環を開環する（すなわちスクシンイミド環を開環する）ステップをさらに含み得る。一実施形態では、マレイミド－チオール付加環を開環するステップは、ステップ（ｂ）後に提供され得る。別の実施形態では、マレイミド－チオール付加環を開環するステップは、ステップ（ｃ）後に提供され得る。別の実施形態では、マレイミド－チオール付加環を開環するステップは、ステップ（ｄ）後に提供され得る。

【0365】

追加の成分
さらなる実施形態では、ポリペプチド、ポリペプチドのカクテル、核酸分子、核酸分子のカクテル、コンジュゲート、コンジュゲートのカクテル及び／又は上記のようなこれらの組み合わせ（以下、「薬剤」と呼ぶ）を含む、組成物、医薬組成物及び／又はキットが提供される。特定の実施形態では、組み合わせは、上記のポリペプチド及び／又は核酸分子及び／又はコンジュゲートのいずれか１つの混合物を含むが、代替的実施形態では、それぞれの成分がキットの形態で別個の容器に提供される。さらなる実施形態では、混合物で提供される下記の第１の産物及び第２の産物が提供されるか、又は代わりに第１及び第２の産物がキットの形態で別個の容器に提供される。

【0366】

一実施形態では、医薬組成物及び／又はキットは、薬学的に許容されるアジュバント、希釈剤及び／又は賦形剤を含む。さらなる実施形態では、医薬組成物及び／又はキットは、薬学的に許容される希釈剤及び／又は賦形剤を含む。いくつかの実施形態では、薬学的に許容されるアジュバント、希釈剤及び／又は賦形剤は、薬剤との製剤中に提供されるが、他の実施形態では、薬学的に許容されるアジュバント、希釈剤及び／又は賦形剤は、キットの形態で、薬剤とは別個の容器で提供されることを理解されたい。成分は、単一製剤中に混合して提供されることが好ましい。

【0367】

成分がキット内の別々の容器に提供される場合、いくつかの実施形態では、キットが使用されるとき、成分は、個体に投与される前に組み合わされるが、他の実施形態では、キットが使用される場合、成分は、個人に別々に投与されることも理解されたい。

【0368】

例示的なアジュバントとしては、ポリＩ：Ｃ（ヒルトノール）、ＣｐＧ、リポソーム、ミクロスフェア、ウイルス様粒子（免疫刺激複合体、ＩＳＣＯＭＳ）、不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、ミョウバン及び／又は細菌毒素（例えば、コレラ毒素及び／又はサルモネラ毒素）又は任意の種類のナノ粒子製剤が挙げられる。一実施形態では、アジュバントは、１つ以上のアジュバントの組み合わせである。一実施形態では、アジュバントは、ＩＦＡ及びＣｐＧである。さらなる例示的なアジュバントには、イミキモド、グルコピラノシル及び／又はリピドＡが含まれる。好ましいアジュバントは、ＧＭ－ＣＳＦ（顆粒球マクロファージコロニー刺激因子）である。一実施形態では、ＧＭ－ＣＳＦは、サルグラモスチムである。免疫系のＴ細胞アームを標的とするワクチンにおける使用のための例示的なアジュバントは、Petrovsky & Aguilar Immunol Cell Biol. 2004 82(5): 488-96に詳述されており、これは、参照により本明細書に組み込まれる。

【0369】

例示的な希釈剤及び賦形剤には、滅菌水、生理食塩水、培養液及び／又はリン酸緩衝液若しくは脂質及び／又はナノ粒子ベースの製剤が含まれる。

【0370】

特定の実施形態では、薬剤は核酸分子であり、これは脂質又はナノ粒子製剤で提供されることも理解されたい。

【0371】

いくつかの実施形態では、医薬組成物及び／又はキットは、さらなる治療成分も含む。さらなる治療成分の例としては、インターロイキン－２（ＩＬ－２）、インターロイキン－１２（ＩＬ－１２）、さらなるポリペプチド（すなわち上記で論じたもの以外のポリペプチド）、化学療法剤、鎮痛剤、抗炎症剤が挙げられる。－炎症剤及び／又は抗癌剤。

【0372】

医薬組成物及び／又はキットの追加成分のさらなる詳細は、Remington’s Pharmaceutical Sciences and US Pharmacopoeia, 1984, Mack Publishing Company, Easton, PA, USAに見出され得る。

【0373】

発明の方法
使用において、コンジュゲート、コンジュゲートのカクテル、ポリペプチド、ポリペプチドのカクテル、核酸分子、核酸分子のカクテル、組み合わせ、上記で説明した組成物又は医薬組成物（「薬剤」）は、対象に投与される。

【0374】

本発明のコンジュゲート、ポリペプチド、ポリペプチドのカクテル、核酸分子、核酸分子のカクテル及び／又は組み合わせを含むキットが提供される実施形態では、使用時にキットの各成分が対象に投与される。上記のようなキットの成分は、同時に、別々に又は連続的に対象に投与される。一実施形態では、キットは、上記のさらなる治療成分を含む。このような実施形態では、コンジュゲート、ポリペプチド、ポリペプチドのカクテル、核酸分子、核酸分子のカクテル及び／又は組み合わせは、さらなる治療成分と同時に、別々に又は連続的に対象に投与される。

【0375】

他の実施形態では、第１の産物及び第２の産物が対象に投与され、この点において、第１の産物及び第２の産物は、必ずしも単一の産物ではないが、合わせて「薬剤」とみなすことができる。第１の産物は、以下の（ｉ）～（ｖ）：
（ｉ）配列番号１の配列を含むポリペプチド；
（ｉｉ）少なくとも８個のアミノ酸を含む、（ｉ）の免疫原性断片を含むポリペプチド；
（ｉｉｉ）（ｉ）又は（ｉｉ）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むポリペプチド；
（ｉｖ）（ｉ）～（ｉｉｉ）のいずれか１つに定義されるポリペプチドを含むコンジュゲート；及び
（ｖ）（ｉ）～（ｉｉｉ）のいずれか１つに定義されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列からなる核酸分子
から選択される。

【0376】

第２の産物は、以下の（ｖｉ）～（ｘ）：
（ｖｉ）配列番号１１６の配列を含むポリペプチド；
（ｖｉｉ）少なくとも１７個のアミノ酸を含む、（ｖｉ）の免疫原性断片を含むポリペプチド；
（ｖｉｉｉ）（ｖｉ）又は（ｖｉｉ）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むポリペプチド；
（ｉｘ）（ｖｉ）～（ｖｉｉｉ）のいずれか１つに定義されるポリペプチドを含むコンジュゲート；及び
（ｘ）（ｖｉ）～（ｖｉｉｉ）のいずれか１つに定義されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列からなる核酸分子
から選択される。

【0377】

この実施形態のいくつかの変形では、第１の産物及び第２の産物の両方が、同時に、連続的に又は別々に投与される。これらの変形では、第１の産物が第２の産物の前に投与され得、第２の産物が第１の産物の前に投与され得る。この実施形態のいくつかの代替変形例では、第１の産物と第２の産物は、単一の産物（すなわち混合物）として組み合わされ、単一の産物として投与され、これらの代替変形例では、以下の条件：
（ａ）第１の産物及び第２の産物は、単一のポリペプチドであり、第１の産物は、（ｉ）～（ｉｉｉ）のいずれか１つに定義されるとおりであり、及び第２の産物は、（ｖｉ）～（ｖｉｉｉ）のいずれか１つに定義されるとおりである場合、単一のポリペプチドは、１７０アミノ酸以下の長さであること；並びに
（ｂ）第１の産物及び第２の産物は、単一の産物であり、第１の産物は、（ｖ）に定義されるとおりであり、及び第２の産物は、（ｘ）に定義されるとおりである場合、単一の核酸分子は、１５００ヌクレオチド未満の長さであること
が適用される。

【0378】

例えば、一実施形態では、第１の産物は配列番号１の配列を含むポリペプチドであり、第２の産物は配列番号１１６の配列を含むポリペプチドであり、第１の産物と第２の産物は混合されるが、別個の分子のままである。別の実施形態では、第１の産物は配列番号１の配列を含む第１のポリペプチドであり、第２の産物は配列番号１１６の配列を含む第２のポリペプチドであり、第１及び第２のポリペプチドは一緒になって長さが１７０アミノ酸残基以下の単一の融合タンパク質を形成する。別の実施形態では、第１の産物は配列番号１の配列を含むポリペプチドをコードする核酸分子であり、第２の産物は配列番号１１６の配列を含むポリペプチドをコードする核酸分子であり、第１及び第２の産物は、混合されるが、別個の分子のままである。別の実施形態では、第１の産物は配列番号１の配列を含むポリペプチドをコードする第１の核酸分子であり、第２の産物は配列番号１１６の配列を含むポリペプチドをコードする第２の核酸分子であり、第１及び第２の核酸分子は一緒になって、長さが１５００ヌクレオチド未満の単一の核酸分子を形成する。

【0379】

一実施形態では、対象は、治療を必要とする患者である。さらなる実施形態では、患者は、癌患者である。代替的実施形態では、予防療法を提供するために、疾患の症状が現れる前に、薬剤又はキットの成分が対象に投与される。一実施形態では、疾患は癌であり、癌に対する防御免疫を提供するために、癌の症状が現れる前に、薬剤又はキットの成分が対象に投与される。

【0380】

上記のように、本発明のコンジュゲートは、Ｂ細胞エピトープの配列を含む少なくとも１つのポリペプチドを含む。一実施形態では、薬剤又はキットの成分が投与される対象は、Ｂ細胞エピトープに特異的な既存の循環抗体を有する。代替的実施形態では、対象は、Ｂ細胞エピトープに特異的な既存の循環抗体を有しない。さらなる実施形態では、対象は、Ｂ細胞エピトープに特異的な既存の循環抗体を有するが、抗体のレベルを増加させることが望ましい。対象が既存の循環抗体を有していないか、又はそのレベルを増加させることが望ましい実施形態では、対象は、薬剤又はキットの成分を投与する前に、Ｂ細胞エピトープに対するＢ細胞応答を誘導する（したがって抗体産生を誘導する）ワクチンを投与される。一実施形態では、コンジュゲートが投与される対象におけるＢ細胞エピトープに特異的な抗体の存在及び／又はレベルは、コンジュゲートの投与前に決定される。一実施形態では、Ｂ細胞エピトープに対するＢ細胞応答を誘導するワクチンは、薬剤又はキットの成分の投与への少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０週間以上前に投与される。

【0381】

代替的実施形態では、対象にＢ細胞エピトープに特異的な抗体を受動的に投与して、対象におけるＢ細胞エピトープに対する受動液性免疫応答を提供する。一実施形態では、Ｂ細胞エピトープに特異的な抗体は、薬剤又はキットの成分と同時に、別個に又は連続的に対象に投与される。一実施形態では、Ｂ細胞エピトープに特異的な抗体は、溶液又は血清中に提供される。

【0382】

Ｂ細胞エピトープが配列番号３～５のいずれか１つに由来する実施形態では、Ｂ細胞エピトープに対するＢ細胞応答を誘導するワクチンは、破傷風ワクチンである。一実施形態では、破傷風ワクチンは、破傷風トキソイド（ＴＴｄ）、その断片及び／又は破傷風毒素（ＴＴｘ）の断片を含む。さらなる実施形態では、「破傷風ワクチン」は、ジフテリア、破傷風及び百日咳（ＤＴＰ）混合ワクチン又は任意の破傷風トキソイド含有ワクチンである。代替的実施形態では、抗ＴＴｘ／ＴＴｄ抗体は、薬剤又はキットの成分と同時に、別個に又は連続的に対象に受動的に投与される。一実施形態では、対象は、抗ＴＴｘ／ＴＴｄ抗体、例えば、テタキン又は同等の抗ＴＴｘ／ＴＴｄ抗体調製物を含む、溶液又は血清を投与される。一実施形態では、対象は、高力価の抗ＴＴｘ／ＴＴｄドナーからの単離されたＩｇＧ画分を投与される。一実施形態では、コンジュゲートが投与される対象における抗ＴＴｘ／ＴＴｄ抗体の存在及び／又はレベルは、コンジュゲートの投与前に決定される。好ましい実施形態では、上記のようなTettox ELISAを使用して、抗ＴＴｘ／ＴＴｄ抗体の存在及び／又はレベルを決定する。

【0383】

一実施形態では、Ｂ細胞エピトープに対するＢ細胞応答を誘導するワクチンは、対象に少なくとも２回投与される。したがって、対象は、ワクチンの少なくとも１回の第１（初回刺激）の用量及び少なくとも１回の第２（追加刺激）の用量を受ける。一実施形態では、対象は小児期に少なくとも１回の第１（初回刺激）の用量及び少なくとも１回の第２（追加刺激）の用量を受けており、コンジュゲートの投与前に少なくとも１回のさらなる追加刺激用量が投与される。一実施形態では、少なくとも１回の追加刺激用量は、薬剤又はキットの成分を投与する１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０週間以上前に投与される。

【0384】

理論に拘束されることを望むものではないが、コンジュゲートを投与すると、対象内の循環抗体（すなわち既存の、ワクチン接種後に誘導された又は受動的に移入された）がＢ細胞エピトープに結合して免疫複合体（ＩＣ）を形成し、これがコンジュゲートを抗原提示細胞（ＡＰＣ）に指向させる／標的化すると考えられる。したがって、各コンジュゲートがＢ細胞エピトープを含む複数のポリペプチドを含むことは、複数の抗体が同時に各コンジュゲートに結合することができ、それによって免疫複合体の形成を促進するため有利である。一実施形態では、Ｂ細胞エピトープに結合した抗体のＦｃ部分は、ＡＰＣ上のＦｃ受容体に結合する。さらなる実施形態では、補体及びＣ１ｑ結合は、補体受容体陽性ＡＰＣ又はスカベンジャー受容体による、コンジュゲートの取り込みを促進する。Ｆｃ受容体及び／又は補体受容体を介したコンジュゲートのＡＰＣ（一実施形態では、ＡＰＣは樹状細胞（ＤＣ）である）への標的化及び結合は、活性化ＡＰＣによるコンジュゲートの内在化及び細胞内プロセシングを伴うＡＰＣの活性化を促進する。このようにして、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープは、ＡＰＣ上のＭＨＣクラスＩＩ分子によって関連するＣＤ４＋Ｔ細胞に提示され、ＣＤ４＋Ｔ細胞応答を誘発する。一実施形態では、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープは、コンジュゲートの投与の部位を流入させるリンパ節内のＡＰＣ上のＭＨＣクラスＩＩ分子により、関連するＣＤ４＋Ｔ細胞に提示される（一実施形態では、投与の部位は、ワクチン注射部位である）。したがって、コンジュゲートは、ＡＰＣへの効率的な標的化を可能にし、関連するＣＤ４＋Ｔ細胞へのＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープのプロセシング及び提示を促進する。一実施形態では、コンジュゲートは、外部アジュバント（ＧＭ－ＣＳＦなど）による前刺激及び／又は共刺激の必要性を回避する。

【0385】

さらに、コンジュゲートのＢ細胞エピトープに特異的なＢ細胞受容体を含むＢ細胞は、コンジュゲートに結合し、Ｂ細胞受容体媒介性内在化によって内在化することができる。このようにして、Ｂ細胞は、関連するＣＤ４＋Ｔ細胞へのコンジュゲートのＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープもプロセシング及び提示する（ＭＨＣクラスＩＩ分子上で）。

【0386】

関連するＣＤ４＋Ｔ細胞へのＡＰＣ上の提示を通して、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープを含む少なくとも１つのポリペプチドは、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープが由来するユニバーサル腫瘍抗原に対するヘルパーＴ細胞応答を生成することができる。これは、ユニバーサル腫瘍抗原のＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープに対する特異的な免疫応答の生成をサポートする。一実施形態では、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープを含む少なくとも１つのポリペプチドは、Ｔｈ１免疫応答を促進する。Ｔｈ１免疫応答は、癌細胞に対する免疫応答にとって重要であり、したがって癌の治療又は予防に寄与する。一実施形態では、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープを含む少なくとも１つのポリペプチドは、Ｔメモリー細胞応答を生成する。Ｔメモリー細胞応答は、癌の長期監視を促進するために重要である。

【0387】

コンジュゲートのＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープによって促進されるＴヘルパー応答は、コンジュゲートが投与された対象における抗体制御のフィードバックループをサポートする。より具体的には、コンジュゲートのＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープによって刺激されるヘルパーＴ細胞は、コンジュゲートのＢ細胞エピトープに特異的なＢ細胞を共刺激することができる。刺激されたＢ細胞は、Ｂ細胞エピトープに特異的な抗体を生成し、したがって、コンジュゲートの投与後の対象におけるＢ細胞エピトープに特異的な抗体のレベルを増加させる。一実施形態では、Ｂ細胞エピトープに特異的な抗体のレベルの増加は、Ｂ細胞エピトープに特異的なＩｇＧ抗体のレベルの増加である。Ｂ細胞エピトープに特異的な抗体のレベルが増加すると、ＩＣ形成及びＡＰＣに対するコンジュゲートの標的化が改善される。したがって、抗体調節のこのフィードバックループは、Ｂ細胞エピトープを含む少なくとも１つのポリペプチドのアジュバント機能を改善する。

【0388】

図１Ｂは、本発明の実施形態が免疫応答を誘発する、提案されたメカニズムを示す。

【0389】

コンジュゲートがＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを含む実施形態では、活性化ＡＰＣによるコンジュゲートの細胞内プロセシングの結果として、ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープがＭＨＣクラスＩ分子と複合体を形成して細胞表面に提示され、それによってＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘発し得ることを理解されたい。

【0390】

薬剤がポリペプチドを含む実施形態では、ポリペプチドは抗原提示細胞によって飲食され、抗原プロセシングを受け得、次いで細胞表面上にＭＨＣクラスＩ又はクラスＩＩ分子との複合体で提示される。Ｔ細胞表面のＴ細胞受容体との相互作用を通して、ＣＤ４＋又はＣＤ８＋Ｔ細胞応答が誘発される。薬剤が核酸分子を含む実施形態では、核酸分子も飲食され、次いで転写され（核酸分子がＤＮＡの場合）、コードされたポリペプチドは内因性細胞経路を通して合成される。続いて、標的細胞が抗原提示細胞である場合、前述のように、Ｔ細胞応答を誘発するために、コードされたポリペプチドがプロセシングされ、ＭＨＣ分子上に提示される。代わりに、標的細胞が筋細胞、線維芽細胞及び他の非抗原提示細胞などの別の細胞である場合、コードされたポリペプチドが分泌され、抗原提示細胞によって取り込まれる。したがって、薬剤は、ＣＤ４＋又はＣＤ８＋Ｔ細胞免疫を誘発するためのワクチンとして使用され得る。

【0391】

原則として、薬剤又はキットの成分の任意の投与方法が使用され得るが、注射が特に好ましい。一実施形態では、薬剤又はキットの成分は、非経口経路によって対象に投与される。すなわち、投与は、皮内、皮下、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内又は病巣内経路によるものである。好ましい実施形態では、薬剤又はキットの成分は、皮内、皮下又は筋肉内経路によって投与される。一実施形態では、ボーラス注射としての投与が有用である。

【0392】

薬剤がポリペプチドである実施形態では、ポリペプチドの適切な投与量は１００～７００μｇであるが、この範囲外の投与量（例えば、１～１５００μｇ）を要する場合もある。一実施形態では、ポリペプチドは、アジュバント、好ましくはＧＭ－ＣＳＦ、最も好ましくはサルグラモスチムと同時に、別々に又は連続的に投与される。ＧＭ－ＣＳＦ、好ましくはサルグラモスチムの適切な用量は、２０～１００μｇである。一実施形態では、用量は３７．５μｇであり、好ましい実施形態では、用量は７５μｇである。

【0393】

薬剤が核酸分子である実施形態では、核酸分子の適切な投与量は１０～１０００μｇであるが、この範囲外の投与量（例えば、１～１５００μｇ）が必要な場合もある。

【0394】

薬剤が本発明のコンジュゲートである実施形態では、コンジュゲートの適切な投与量は１００～２０００マイクログラムであるが、この範囲外の投与量（例えば、１～５０００μｇ）が必要な場合もある。

【0395】

一実施形態では、個体に本発明のコンジュゲートを投与する少なくとも７日前に、個体に破傷風追加刺激ワクチンを投与する。このようにして、本発明のコンジュゲートを投与される前に、最小破傷風毒素エピトープ配列に対する個体の免疫応答がブーストされる。

【0396】

特定の実施形態では、複数の薬剤が提供され、個体に同時に、別々に又は連続的に投与される。すなわち、薬剤は、実質的に同時に投与されるだけでなく、異なる時間に投与され得る。本明細書で使用される「同時に」という用語は、同時に複数の薬剤を投与することを指す。同時に（simultaneously）は、同時に（contemporaneously）、すなわち同じ期間中の投与を含む。特定の実施形態では、薬剤は、同じ時間に同時に又は同じ日に同時に投与される。いくつかの実施形態では、「連続的に」という用語は、相互に３０日以内に投与される薬剤を指す。

【0397】

ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープは、高い割合の腫瘍タイプで発現されるユニバーサル腫瘍抗原に由来するため、本発明の有効性はいかなる特定のタイプの腫瘍／癌にも限定されないことを理解されたい。ユニバーサル腫瘍抗原がｈＴＥＲＴである実施形態では、原則として、薬剤又はキットの成分は、テロメラーゼ遺伝子が活性化されている任意のタイプの癌を患っている患者に投与され得る。代わりに、薬剤又はキットの成分は、テロメラーゼ遺伝子が活性化される任意のタイプの癌のリスクがある対象に予防的に投与され得る。テロメラーゼ遺伝子が活性化される癌には、乳癌、前立腺癌、膵臓癌、結腸直腸癌、肺癌、膀胱癌、悪性黒色腫、白血病、リンパ腫、卵巣癌、子宮頸癌及び胆道癌が含まれるが、これらに限定されない。ただし、テロメラーゼ酵素は大部分の癌で発現されるため、本発明の有効性は特定のタイプの癌に限定されないことを理解されたい。

【0398】

テロメラーゼが大部分の癌で発現していることは、Kim et al. Science. 1994 Dec 23; 266(5193): 2011-5及びBearss et al. Oncogene. 2000 Dec 27; 19(56): 6632-41などの研究で実証されている（いずれも参照により本明細書に組み込まれる）。

【0399】

Kim et al. 1994は、１８の異なるヒト組織を表す培養細胞において、１００の不死集団のうちの９８がテロメラーゼ陽性であり、２２の死亡集団はいずれもテロメラーゼ陽性ではないことを示した。テロメラーゼ活性を有する不死細胞株が由来するヒト組織には、皮膚、結合組織、脂肪、乳房、肺、胃、膵臓、卵巣、子宮頸部、腎臓、膀胱、結腸、前立腺、ＣＮＳ、網膜及び血液が含まれる。したがって、本発明は、これらの組織に由来する癌に対する使用に適しているであろう。同様に、１２のヒト腫瘍タイプを表す１０１の生検のうちの９０がテロメラーゼ陽性であり、５０の正常体細胞組織はいずれもテロメラーゼ陽性でなかった。テロメラーゼ活性を示したヒト腫瘍タイプには、肝細胞癌、結腸癌、扁平上皮癌（頭頸部）、ウィルムス腫瘍、乳癌（乳管及び小葉、リンパ節陽性）、乳癌（腋窩リンパ節陰性）、前立腺癌、前立腺上皮内新生物３型、良性前立腺肥大、神経芽細胞腫、脳腫瘍、肺小細胞癌、横紋筋肉腫、平滑筋肉腫、血液悪性腫瘍（急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、リンパ腫（成人）を含む）が含まれる。

【0400】

Bearss et al. 2000により、広範囲の癌タイプにわたる患者から直接採取された腫瘍細胞にテロメラーゼ活性が存在することがさらに実証された。これらの腫瘍タイプには、血液悪性腫瘍（急性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病（初期）、慢性リンパ性白血病（後期）、骨髄腫、低悪性度リンパ腫、高悪性度リンパ腫を含む）；胸；前立腺；肺（非小細胞及び小細胞を含む）；結腸；卵巣；頭頸部；腎臓；黒色腫；神経芽細胞腫；神経膠芽腫；肝細胞癌；胃；及び膀胱が含まれる。

【0401】

テロメラーゼは上述の癌タイプで活性化されるため、本発明はこれらのタイプの癌のいずれか（実際、テロメラーゼが活性化されるあらゆる癌タイプ）に対する使用に適していることを理解されたい。さらに、テロメラーゼの活性化は癌タイプ間で共有される共通の特性であるため、本発明が特定のタイプの癌に限定されないことは明らかである。

【0402】

対象は、一般に、テロメラーゼ逆転写などの自己抗原のエピトープに対して、そのようなエピトープと反応するＴ細胞がＴ細胞の発生中に対象の胸腺内で破壊されるプロセスを通してある程度の免疫寛容を発現していることも理解されたい。したがって、本発明のいくつかの実施形態では、比較的低いＭＨＣ結合親和性を有するエピトープが望ましい。これは、ＭＨＣ結合親和性が低いエピトープは成熟Ｔ細胞にさらされる速度が低く、エピトープと反応する対象のＴ細胞の全てが対象のＴ細胞レパートリーから削除される可能性が低いためである。したがって、いくつかの実施形態では、比較的低いＭＨＣ結合親和性を有するエピトープは、より容易に免疫寛容を克服することができる。

【0403】

いくつかの実施形態では、薬剤又はキットの成分の投与は「エピトープ拡大」をもたらし、それによって免疫応答が他の二次エピトープに拡大される（Gulley et al. J Natl Cancer Inst. 2017 Apr 1; 109(4)）。

【0404】

アッセイ方法
本発明のさらなる態様によれば、Ｂ細胞エピトープの配列を含む少なくとも１つのポリペプチド及びＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープの配列を含む少なくとも１つのポリペプチドを含むコンジュゲートが投与された対象において、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープに対するＣＤ４＋Ｔ細胞応答の存在を決定する方法が提供される。本発明者らは、驚くべきことに、このようなコンジュゲートの投与により、コンジュゲートがＢ細胞エピトープ及びＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープを含む場合にのみ、コンジュゲートに特異的な抗体（コンジュゲート中のＢ細胞エピトープに特異的な抗体など）のレベルが増加することを見出した。例えば、これは実施例７に示されており、Ｂ細胞エピトープ及びＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを含むコンジュゲートは、Ｂ細胞エピトープに特異的な抗体レベルの増加を駆動することができなかったが、Ｂ細胞エピトープ及びＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープを含むコンジュゲートは、それが可能であった。

【0405】

理論に拘束されることを望むものではないが、コンジュゲートに特異的な抗体（コンジュゲート中のＢ細胞エピトープに特異的な抗体など）のレベルの増加は、コンジュゲートのＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープのＣＤ４＋Ｔ細胞の認識に起因すると考えられる。特に、コンジュゲートのＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープによって刺激されるＣＤ４＋Ｔ細胞は、コンジュゲートに特異的なＢ細胞（コンジュゲートのＢ細胞エピトープに特異的な抗体など）を共刺激することができ、その結果、刺激されたＢ細胞がコンジュゲートに特異的な抗体を生成し、この抗体のレベルが増加する。本発明者らは、コンジュゲートに特異的な抗体のレベルが、コンジュゲートが投与された対象におけるコンジュゲートのＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープに対するＣＤ４＋Ｔ細胞応答の存在についてのバイオマーカーとして使用できるという驚くべき認識を得た。

【0406】

本発明の方法では、血液サンプルが対象から採取される。第１の実施形態では、Ｂ細胞エピトープの配列を含む少なくとも１つのポリペプチド及びＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープの配列を含む少なくとも１つのポリペプチドを含むコンジュゲートの投与前に血液サンプルを採取する。第１の実施形態では、コンジュゲートのＢ細胞エピトープは、配列番号７の配列を含み、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープは、配列番号１の配列を含む。第１の実施形態では、配列番号７の配列を含む少なくとも１つのポリペプチドは、配列番号７の配列を含む第１、第２及び第３のポリペプチドである。次いで、コンジュゲートは、対象に少なくとも１回投与される。好ましい実施形態では、対象は、コンジュゲートの１サイクルの投与を受け、投与サイクルは、コンジュゲートの複数回の注射、好ましくは４回の注射を含む。したがって、いくつかの実施形態では、「投与」という用語は投与サイクルを包含することを理解されたい。いくつかの実施形態では、血液サンプルは、コンジュゲートの最初の投与又は投与サイクル前に対象から採取される（すなわち、対象は、「ナイーブ」対象である）。代替的実施形態では、血液サンプルは、コンジュゲートのさらなる投与又は投与サイクル前に採取される（すなわち、対象は、「ナイーブ」対象ではない）。第１の実施形態では、第１の時点でコンジュゲートの投与に続いて血液サンプルが対象から採取される。一実施形態では、血液サンプルは、コンジュゲートの投与の１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５又は３０日後に採取される。

【0407】

さらなる実施形態では、コンジュゲートの投与前に採取される血液サンプルは、Ｂ細胞エピトープに対するＢ細胞応答を誘導するためのワクチンの少なくとも１回の投与後に採取される。すなわち、対象は、Ｂ細胞応答を誘導するワクチンを少なくとも１回投与され、その後、血液サンプルが採取される。好ましい実施形態では、対象は、Ｂ細胞応答を誘導するためにワクチンの２、３、４、５回又はそれを超える投与を受ける。したがって、コンジュゲートが投与される対象は、Ｂ細胞エピトープに対する免疫応答を有する対象である。このようなサンプルは、「コンジュゲートの投与前の対象に由来するサンプル」という用語に含まれることを理解されたい。好ましい実施形態では、Ｂ細胞エピトープに対するＢ細胞応答を誘導するワクチンは、血液サンプルが採取される前に少なくとも２回投与される。第１の実施形態では、Ｂ細胞エピトープが配列番号７の配列を有する場合、それに対するＢ細胞応答を誘導するワクチンは、破傷風ワクチンである（例えば、本明細書に定義される）。一実施形態では、血液サンプルは、ワクチンの少なくとも１回の投与の１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５又は３０日後に採取され、Ｂ細胞エピトープにＢ細胞応答を誘導する。

【0408】

第１の実施形態では、コンジュゲートの投与又は投与サイクルの前後に対象に由来するサンプルを、配列番号７の配列を含むポリペプチドが固定化されたプレートとそれぞれ接触させる。一実施形態では、配列番号７の配列を含むポリペプチドは、ビオチン化され、ストレプトアビジンでコーティングされたプレート上に固定される。第１の実施形態では、各血液サンプル中の配列番号７の配列に特異的な抗体の量又は不存在が、ＥＬＩＳＡによって検出される。ＥＬＩＳＡ手順は、例えば、過去にFletcher et al. J Immunol. 2018 Jul 1; 201(1): 87-97に記載されており、これは、参照により本明細書に組み込まれる。簡潔には、各サンプルをプレートと接触させると、サンプル中に存在する配列番号７の配列に特異的な抗体は、配列番号７の配列を含む固定化ポリペプチドに結合する。一実施形態では、配列番号７の配列に特異的な抗体は、ＩｇＧ抗体である。次いで、プレートを洗浄し、非特異的結合を防ぐためにブロッキングする。反応を触媒して検出可能なシグナルを生成する酵素にコンジュゲートした二次抗体をプレートと接触させ、過剰な二次抗体を洗浄によって除去する。一実施形態では、検出されるべき抗体がＩｇＧ抗体である場合、二次抗体は、抗ＩｇＧ抗体である。一実施形態では、二次抗体にコンジュゲートした酵素は西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）であり、色の変化を引き起こすテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）の酸化から、検出可能なシグナルが生成される。シグナルが検出され、各サンプルにおける配列番号７の配列に特異的な抗体の量又は不存在を決定するために使用される。一実施形態では、シグナルは、分光光度計で４５０ｎｍの吸光度を測定することによって検出される。

【0409】

コンジュゲートの投与前の対象由来のサンプル中の配列番号７の配列に特異的な抗体の量又は不存在は、上記の方法により、第１のレベルで検出される。コンジュゲートの投与後の対象由来のサンプル中の配列番号７の配列に特異的な抗体の量又は不存在は、上記の方法により、第２のレベルで検出される。第１の実施形態では、第２のレベルと第１のレベルが比較される。第１のレベルに対する第２のレベルの増加は、コンジュゲートの投与後の対象に由来するサンプル中に存在する抗体の量が、コンジュゲートの投与前の対象に由来するサンプル中における抗体の量よりも多いことを示す。一実施形態では、増加は、統計的に有意な増加である。増加は、対象における配列番号１のポリペプチドに対するＣＤ４＋Ｔ細胞応答の存在を示す。これは、配列番号１のポリペプチドが、ＣＤ４＋Ｔ細胞の刺激を通して、配列番号７の配列に特異的なＢ細胞を共刺激し、これにより、配列番号７の配列に特異的な抗体が産生されるため生じると考えられる。

【0410】

逆に、第２のレベルと第１のレベルの比較により、変化がないか、１０％未満の変化及び／又は統計的に有意でない変化が明らかになった場合、これは、配列番号１のポリペプチドに対するＣＤ４＋Ｔ細胞応答が対象に存在しないことを示す。

【0411】

さらなる実施形態では、コンジュゲートの投与後の第２の時点で対象から血液サンプルを採取する。一実施形態では、第２の時点は、上記第１の時点より前である。すなわち、これは、時間的にコンジュゲートの投与と近い。一実施形態では、第２の時点は、コンジュゲートの投与後１日未満又は１、２、３、４若しくは５日後である。第２の時点における対象由来のサンプル中の配列番号７の配列に特異的な抗体の量又は不存在は、上記の方法により第３のレベルで検出される。第３のレベルと第２のレベルが比較される。第３のレベルに対する第２のレベルの増加は、第１の時点（すなわちコンジュゲートの投与からより遠い時点）での対象に由来するサンプル中に存在する抗体の量が、第２の時点（すなわちコンジュゲートの投与により近い時点）での対象に由来するサンプル中における抗体の量よりも多いことを示す。一実施形態では、増加は、統計的に有意な増加である。増加は、対象における配列番号１のポリペプチドに対するＣＤ４＋Ｔ細胞応答の存在を示す。これは、２つの時点間の介在期間中、ＣＤ４＋Ｔ細胞の刺激を通して、配列番号１のポリペプチドが配列番号７の配列に特異的なＢ細胞を共刺激し、これにより、配列番号７の配列に特異的な抗体が産生されるため生じると考えられる。

【0412】

逆に、第２のレベルと第３のレベルの比較により、変化がないか、１０％未満の変化及び／又は統計的に有意でない変化が明らかになった場合、これは、配列番号１のポリペプチドに対するＣＤ４＋Ｔ細胞応答が対象に存在しないことを示す。

【0413】

上記実施形態では、コンジュゲートの投与後の第１及び第２の時点で血液サンプルが採取される。さらなる実施形態では、コンジュゲートの投与後、３、４、５、６、７、８、９又は１０以上の時点で血液サンプルを採取する。抗体の量又は不存在がこれらの時点の任意の２つの間で比較され得、及び／又は対象における抗体のレベルが経時的にプロットされるように各時点での抗体の量又は不存在が比較され得ることを理解されたい。

【0414】

第１の実施形態の変形では、血液サンプルは、上記のようにコンジュゲートの投与後に採取されるが、コンジュゲートの投与前には採取されない。コンジュゲートの投与後の対象由来のサンプル中の配列番号７の配列に特異的な抗体の量又は不存在は、上記の方法により、あるレベルで検出される。レベルが閾値より高い場合、それは、対象における配列番号１のポリペプチドに対するＣＤ４＋Ｔ細胞応答の存在を示す。一実施形態では、閾値は、複数の対象からのデータの照合から決定される。

【0415】

上記実施形態では、血液サンプルは、対象から採取される。一実施形態では、血液サンプルは、本発明の方法で使用される前に、例えば血漿サンプル又は希釈血漿サンプルを得るために、さらに処理される。抗体を含有する対象に由来する任意の適切なサンプルを本発明の方法で使用することができる。

【0416】

上記実施形態では、検出される配列番号７の配列に特異的な抗体は、ＩｇＧ抗体である。好ましい実施形態では、抗体は、ＩｇＧ１抗体又はＩｇＧ４抗体である。代替的実施形態では、検出される抗体は、異なる免疫グロブリンクラス（すなわちＩｇＧ以外）からのものである。

【0417】

上記実施形態では、Ｂ細胞エピトープに特異的な抗体を検出するためにＥＬＩＳＡ手順が使用される。上記で参照されるＥＬＩＳＡ手順に対する様々な修正は、当業者には明らかであろう。代替的実施形態では、ＥＬＩＳＡ以外の手順を使用して、Ｂ細胞エピトープに特異的な抗体の量又は不存在を検出する。１つのそのような代替的実施形態では、ディップスティックアッセイ、スポットアッセイ、ラテラルフローアッセイ及び／又はメソスケールアッセイが使用される。

【0418】

Ｂ細胞エピトープに対するＢ細胞応答を誘導するためのコンジュゲート及び／又はワクチンは、対象に複数回投与されている可能性があり、例えば、Ｂ細胞応答を誘導するためのコンジュゲート及び／又はワクチンは、対象に２回（又はそれを超えて）投与されている可能性があることを理解されたい。Ｂ細胞応答を誘導するためにコンジュゲート及び／又はワクチンを複数回投与することが計画されている場合、いくつかの実施形態では、対象から採取される血液サンプルは、最終計画投与後に採取される。したがって、いくつかの実施形態では、血液サンプルは、Ｂ細胞応答を誘導するためのコンジュゲート及び／又はワクチンの最終計画投与の１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５又は３０日後に採取される。代替的実施形態では、Ｂ細胞応答を誘導するためのコンジュゲート及び／又はワクチンの各投与後に血液サンプルが採取される。対象における免疫応答の発生に関するより詳細な情報を提供するために、このような追加のサンプルが使用され得ることを理解されたい。

【0419】

上記実施形態では、ＣＤ４＋Ｔ細胞応答の存在を示す抗体の２つの検出レベル間の増加は、統計的に有意な増加である。一実施形態では、統計的に有意な増加は、対応のあるｔ検定及びｐ値≦０．０５、好ましくはｐ値≦０．０１を使用して決定される。一実施形態では、２つの検出レベル間の増加は、２倍の増加である。いくつかの実施形態では、ＣＤ４＋Ｔ細胞応答の存在を示す増加は、少なくとも５０％の増加、好ましくは少なくとも７５％、１００％、１５０％、２００％の増加である。

【0420】

上記第１の実施形態では、対象に投与されたコンジュゲートのＢ細胞エピトープは、配列番号７の配列を含む。代替的実施形態では、Ｂ細胞エピトープは、異なる配列を含む。一実施形態では、Ｂ細胞エピトープは、配列番号７の配列に対して少なくとも７０％の配列同一性、好ましくは、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する配列を含む。さらなる実施形態では、Ｂ細胞エピトープは、配列番号７の配列以外の破傷風毒素の配列（配列番号３）又は破傷風毒素重鎖（配列番号５）に由来する配列を含む。一実施形態では、Ｂ細胞エピトープは、（ｉ）配列番号５において連続しており、アミノ酸配列ＧＩＴＥＬＫＫＬ（配列表の配列番号６によって表される）を含む少なくとも１０個のアミノ酸を含む、配列；又は（ｉｉ）（ｉ）に対して少なくとも７０％の配列同一性、好ましくは、（ｉ）に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する配列を含む。一実施形態では、Ｂ細胞エピトープは、ＴＴｘ重鎖の完全配列（配列番号５）を含まない。一実施形態では、Ｂ細胞エピトープは、前述のセクションに記載されたＢ細胞エピトープのいずれか１つから選択される。

【0421】

上記第１の実施形態では、対象に投与されたコンジュゲートのＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープは、配列番号１の配列を含む。代替的実施形態では、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープは、異なる配列を含む。一実施形態では、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープは、配列番号１１６又は１１７の配列を含む。一実施形態では、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープは、少なくとも１２個のアミノ酸を含む、配列番号１、１１６又は１１７の免疫原性断片の配列を含む。さらなる実施形態では、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープは、配列番号１、１１６若しくは１１７の配列又はその免疫原性断片に対して少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する配列を含む。なおさらなる実施形態では、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープは、テロメラーゼ逆転写酵素の少なくとも１２個のアミノ酸の領域（配列番号１、１１６又は１１７の配列以外）又はその領域に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む。一実施形態では、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープは、異なる自己抗原、異なる腫瘍関連抗原及び／又は異なるユニバーサル腫瘍抗原（すなわちテロメラーゼ逆転写酵素以外）の少なくとも１２個のアミノ酸の領域又はその領域に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む。一実施形態では、ユニバーサル腫瘍抗原は、サバイビン、ＤＮＡトポイソメラーゼ２－アルファ（Ｔｏｐ２α）、シトクロムＰ４５０ １Ｂ１（ＣＹＰ１Ｂ１）及びＥ３ユビキチン－タンパク質リガーゼＭｄｍ２からなる群から選択される。好ましい実施形態では、上記の領域のいずれか１つに対する配列同一性は、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％である。一実施形態では、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープを含むポリペプチドは、５００アミノ酸以下の長さである。さらなる実施形態では、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープを含む少なくとも１つのポリペプチドは、４００、３００、２００、１７０、１５０、１２５、１００、９０、８０、７０、７５、６０、５０、４０又は３０以下である。一実施形態では、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープは、前述のセクションに記載されたＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープのいずれか１つから選択される。

【0422】

ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープは、内因性タンパク質又は腫瘍微小環境に関連するものなどのウイルス若しくは細菌タンパク質からのエピトープなど、天然に存在するタンパク質からのものであることが特に好ましい。ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープが、細胞内起源の腫瘍抗原又は細菌若しくはウイルス抗原の一部であるペプチドなどの細胞内ペプチドであることも好ましい。いくつかの実施形態では、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープは、内因性腫瘍抗原として存在する。このようにして、コンジュゲートに特異的な抗体の測定は、腫瘍又は（任意選択により腫瘍関連）病原体（ウイルス又は細菌）に向けられたＴ細胞応答に関連するバイオマーカーとして機能する。

【0423】

上記実施形態では、対象に投与されたコンジュゲートは、Ｂ細胞エピトープを含む第１、第２及び第３のポリペプチドと、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープを含む第１のポリペプチドとを含む。一実施形態では、本発明の方法は、Ｂ細胞エピトープを含む第１、第１及び第２又は第１、第２及び第３のポリペプチド並びにＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープを含む第１、第１及び第２又は第１、第２及び第３のポリペプチドの任意の組み合わせを含有するコンジュゲートが投与された対象に由来するサンプルを使用して実施される。一実施形態では、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープの配列を含む少なくとも１つのポリペプチドは、さらなるＴ細胞エピトープの配列を含む。一実施形態では、さらなるＴ細胞エピトープは、ＣＤ８＋Ｔ細胞及び／又はさらなるＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープである。さらなる実施形態では、本発明の方法は、Ｂ細胞エピトープの配列を含む少なくとも１つのポリペプチド、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープの配列を含む少なくとも１つのポリペプチド及びさらなるエピトープの配列を含む少なくとも１つのポリペプチドを含むコンジュゲートが投与された対象に由来するサンプルを使用して実施される。このようなコンジュゲートは、上でさらに詳細に説明されている。

【0424】

一実施形態では、本発明の方法は、複数のコンジュゲートを含むワクチンが投与された対象に由来するサンプルを使用して実施される。一実施形態では、複数のコンジュゲートは、本明細書に定義されるコンジュゲートのカクテルである。さらなる実施形態では、複数のコンジュゲートを含むワクチンは、「TENDU」ワクチンである。TENDUワクチンは、配列番号４７～５１及び４５の配列を含む６つのＳＬＰ（「ＬＵＧ１～６」と呼ばれる）を含み、これらは、ＰＡＰ、ＧＣＰＩＩ／ＰＳＭＡ及びＮＹ－ＥＳＯ－１に由来するエピトープを含有する（図８Ｃに示す）。６つのＳＬＰは、配列番号７の配列を含む配列の３つのコピー、より具体的にはコア（コア１．０、参考合成例６）を介して、配列番号４６からなる配列の３つのコピーにそれぞれコンジュゲートされる。

【0425】

本発明の方法は、前述の特定のコンジュゲートに限定されないことを理解されたい。一般に、本発明の方法は、少なくとも１つのＢ細胞エピトープ及び少なくとも１つのＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープを含む任意のコンジュゲートに適用可能であり、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープは、コンジュゲートが投与された対象における抗体調節のフィードバックループをサポートするＴヘルパー応答を促進することができる。すなわち、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープは、抗体が生成され、対象のコンジュゲートに特異的な抗体のレベルが増加するように、コンジュゲートのＢ細胞エピトープに特異的なＢ細胞を共刺激するＣＤ４＋Ｔ細胞免疫応答を誘発することができる。このようにして、コンジュゲートに特異的な抗体の量は、コンジュゲートが投与された対象におけるＣＤ４＋Ｔ細胞応答の存在についてのバイオマーカーとして使用することができる。

【0426】

ＣＤ４＋Ｔ細胞応答を直接測定することとは対照的に、ＣＤ４＋Ｔ細胞応答の存在に対するバイオマーカーとしてコンジュゲートに特異的な抗体の量を測定することには多くの利点があることを理解されたい。典型的には、抗体の量の測定は、より少ない量の対象から採取される血液を要し、抗体の量を測定する方法は、より迅速で、複雑さがより少なく、実施コストがより低い。

【0427】

一実施形態では、コンジュゲートが投与され、サンプルが採取される対象は、癌患者である。ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープがユニバーサル腫瘍抗原であり、したがって広範囲の癌タイプに対して効果的であることが期待される実施形態では、患者が罹患している癌は、いかなる特定のタイプの癌にも限定されない（上記のとおり）。対象がTENDUワクチンを投与されている場合（上記のとおり）、癌患者は、前立腺癌患者である。

【0428】

本発明の方法は、癌患者におけるコンジュゲートのＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープに対するＣＤ４＋Ｔ細胞応答の存在（又は不存在）に関する情報を提供することができる。一実施形態では、この情報は、患者集団内で癌患者を層別化し、及び／又は癌患者が受けるその後の治療及び／又は手順を知らせるために使用される。一実施形態では、コンジュゲートのＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープに対するＣＤ４＋Ｔ細胞応答の存在は、癌患者におけるコンジュゲートに対する臨床的に関連した応答を示す。すなわち、癌患者の臨床アウトカムの改善に関連する応答である。一実施形態では、改善された臨床アウトカムは、部分奏功又は完全奏功（部分寛解又は完全寛解としても知られる）又は安定状態である。したがって、本発明の方法は、癌患者の臨床アウトカムの改善が期待される（又は期待されない）臨床状況を特定するために使用され得る。一実施形態では、本発明の方法は、さらなる物質と組み合わせた本発明によるコンジュゲートを調査する（例えば、臨床試験において）ために使用される。

【0429】

検出されるコンジュゲートに特異的な抗体は、コンジュゲート中のＢ細胞エピトープに特異的な抗体であることが好ましい。

【実施例】

【0430】

実施例
以下では、実施例を参照して本発明を具体的に説明する。ただし、これらの実施例は、本発明の技術的範囲を限定するものではない。

【0431】

実施例１：配列番号１は、癌ワクチンＵＶ１をワクチン接種した患者の６５％において免疫原性である。
背景
癌ワクチンＵＶ１は、配列番号１（ＡＬＦＳＶＬＮＹＥＲＡＲＲＰＧＬＬＧＡＳＶＬＧＬＤＤＩＨＲＡ；ｐ７１９－２０）、配列番号５２（ＲＴＦＶＬＲＶＲＡＱＤＰＰＰＥ；ｐ７２５）及び配列番号５３（ＡＥＲＬＴＳＲＶＫＡＬＦＳＶＬ；ｐ７２８）の配列を有する３つのｈＴＥＲＴポリペプチドのカクテルである。ＵＶ１特異的免疫応答は、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）（ＵＶ１／ｈＴＥＲＴ－２０１２－Ｌ）又は前立腺癌（ＵＶ１／ｈＴＥＲＴ－２０１２－Ｐ）を有する患者における２つの臨床研究で単剤療法として、及び悪性黒色腫（ＵＶ１／ｈＴＥＲＴ－ＭＭ）を有する患者において抗ＣＴＬＡ－４抗体イピリムマブと組み合わせて研究されている。この研究では合計５２人の患者が治療され、そのうちの５１人が免疫応答のモニタリングにつき評価可能であった。

【0432】

材料及び方法
ワクチン特異的免疫応答は、ＵＶ１ワクチン接種前、その間及びその後に採取された末梢血単核球（ＰＢＭＣ）の再刺激後、標準的なＴ細胞増殖アッセイ（^３Ｈ－チミジン組み込みによる増殖の測定；Inderberg-Suso et al. Oncoimmunology. 2012 Aug 1; 1(5): 670-686に以前に記載されているとおり）を使用して測定した。ＰＢＭＣの再刺激は、ＵＶ１ワクチン混合物及び個々のワクチンペプチド（ｐ７１９－２０、ｐ７２５及びｐ７２８）を使用して実施された。ペプチド応答がワクチンペプチド又はＵＶ１ワクチン混合物の少なくとも１つについてバックグラウンド（刺激指数、ＳＩ≧３）の少なくとも３倍である場合、特異的Ｔ細胞応答は陽性とみなした。

【0433】

結果
表２は、個々のＵＶ１ペプチド（すなわちｐ７１９－２０、ｐ７２５及びｐ７２８）、ＵＶ１ワクチン（すなわちｐ７１９－２０、ｐ７２５及びｐ７２８の混合物）又は個々のＵＶ１ペプチド若しくはＵＶ１ワクチンのいずれかに対する免疫応答を示す。データは、第１のＵＶ１ワクチン接種後２年間のフォローアップを含む。

【0434】

【表2】

【0435】

表２を参照すると、免疫モニタリングデータは、患者の７８％で検出可能なＵＶ１特異的免疫応答を示した（すなわち個々のペプチド又はＵＶ１ワクチンの１つに対する免疫応答を示した患者；「ｐ７１９－２０、ｐ７２８、ｐ７２５又はＵＶ１」と題する欄を参照されたい）。個々のペプチドレベルでは、患者の６５％がｐ７１９－２０ペプチド（配列番号１）を認識し、２４％がｐ７２８ペプチド（配列番号５３）を認識し、３９％がｐ７２５ペプチド（配列番号５２）を認識した。

【0436】

個々の患者レベルでは、患者の２０％が３つの個別のＵＶ１ペプチド全てを認識し、２０％が２つのペプチドを認識し、４０％が１つのペプチド又はＵＶ１ワクチンを認識した。１つのペプチドのみを認識した患者のうち、１３人はｐ７１９－２０（配列番号１）を認識し、１人はｐ７２８（配列番号５３）を認識し、１人はｐ７２５（配列番号５２）のみを認識した。

【0437】

考察
表２に示されるデータは、配列番号１の配列を有するポリペプチドが、患者の６５％で免疫原性であることを示す。患者集団は、単剤療法として又は抗ＣＴＬＡ－４阻害剤イピリムマブと組み合わせてＵＶ１癌ワクチンを投与された、ＮＳＣＬＣ、前立腺癌又は悪性黒色腫を有する患者で構成されていた。

【0438】

実施例２：ＵＶ１ワクチン接種を受けた患者集団におけるＨＬＡ対立遺伝子タイプの頻度はヨーロッパ集団を表す
背景
この患者集団に存在するＨＬＡ対立遺伝子の頻度が一般的なヨーロッパ集団を表すものであることを確認し、及びＵＶ１ペプチドのＴ細胞エピトープの提示にＨＬＡ対立遺伝子を使用する際にバイアスの兆候があるかどうかを調査するために、ＵＶ１癌ワクチンでワクチン接種された患者（すなわち実施例１に記載の５２人の患者の集団）のＨＬＡ対立遺伝子タイピングを実施した。

【0439】

材料及び方法
ＵＶ１でワクチン接種した全ての患者のＨＬＡ対立遺伝子タイピングは、ＰＣＲ配列特異的オリゴヌクレオチドによって決定され、主要な対立遺伝子グループが４桁に分解された。分析はレトロスペクティブに（すなわち臨床試験への患者の参加後に）実施された。分析は、患者の血液サンプルから単離されたＰＢＭＣに対して行われた。ＨＬＡ対立遺伝子タイピングデータは、ＵＶ１でワクチン接種された５２人の非ＨＬＡ選択患者の集団の４８人の患者から得られた。

【0440】

結果
表３は、ＵＶ１でワクチン接種された患者の集団に存在する最も一般的なＨＬＡ対立遺伝子の頻度を、ヨーロッパ集団にわたるこれらの対立遺伝子の対応する頻度（括弧内、太字）とともに示す。ＨＬＡ対立遺伝子頻度は、The Allele Frequency（http://www.allelefrequencies.net/default.asp）から取得される。

【0441】

【表3】

【0442】

表３を参照すると、ＨＬＡタイピングデータは、ＵＶ１でワクチン接種された患者の集団中に広範囲のＨＬＡ対立遺伝子タイプが存在することを示した。さらに、患者集団内で観察された頻度は、一般的なコーカサス／ヨーロッパ集団で記録されたものとよく一致した（http://www.allelefrequencies.net/default.asp）。これらの結果は、臨床試験への患者の募集がＨＬＡタイピングに基づいていないという事実と一致していた。

【0443】

考察
表３のデータは、ＵＶ１ワクチン接種を受けた患者集団におけるＨＬＡ対立遺伝子タイプの頻度が一般的なヨーロッパ集団を表すことを示す。

【0444】

実施例３：配列番号１の配列を有するポリペプチドに対する免疫応答は様々な共通のＨＬＡクラスＩＩ対立遺伝子を有する患者において生成された
背景
実施例２のＨＬＡ対立遺伝子タイピングデータをさらに分析して、ｐ７１９－２０ペプチド（配列番号１）に対する免疫応答を示したＵＶ１ワクチン接種患者におけるＨＬＡクラスＩＩ対立遺伝子分布を調査した。

【0445】

結果
表４は、患者数（ｎ＝）並びに最も一般的な３つのＨＬＡ－ＤＲ、－ＤＱ及び－ＤＰハプロタイプ（対立遺伝子）のそれぞれを有する患者の対応するパーセンテージを示す（すなわち表の３列目に示される上側の数字のセット）。表４は、配列番号１の配列を有するポリペプチドに応答した各対立遺伝子を保有する患者数（ｎ＝；下線）及び配列番号１の配列を有するポリペプチドに応答した各対立遺伝子を保有する患者のパーセンテージ（括弧内）（すなわち表の３列目に示される下側の数字のセット）も示す。

【0446】

【表4】

【0447】

表４のデータを参照すると、個々の患者に対して実施された配列番号１のポリペプチドに関するＨＬＡ対立遺伝子決定及び免疫応答分析では、配列番号１のポリペプチドに対する免疫応答が、最も一般的なＨＬＡクラスＩＩハプロタイプの全てにわたる患者で生成され、最も一般的な９つのハプロタイプのうちの７つで＞５０％の応答者を有していたことが示された。

【0448】

考察
表４のデータは、配列番号１のポリペプチドが一般的なヨーロッパ集団に共通する様々なＨＬＡクラスＩＩ対立遺伝子によって認識され得ることを示す。この観察は、完全にヘテロ接合性の患者が９つの異なるＨＬＡクラスＩＩハプロタイプを発現するという事実と合わせて、３つの異なる患者集団にわたって配列番号１のポリペプチドに対する免疫応答者の割合が高いことを説明する（実施例１に記載のとおり）。したがって、配列番号１のポリペプチドは、ユニバーサル腫瘍抗原ｈＴＥＲＴに由来しており、幅広い（又は全ての）癌適応症の広範な集団カバレッジを提供することが予想される。

【0449】

実施例４：配列番号１内の異なる領域はＵＶ１ワクチン接種患者からの異なるＴ細胞クローンによって認識される
背景
ヒト対象におけるＴ細胞免疫応答は、２つの細胞型（ＡＰＣ及びＴ細胞）によって決定され、その特異性は、３つの分子（ＨＬＡクラスＩ／ＩＩ、ペプチド及びＴ細胞受容体（ＴＣＲ））によって決定される。１人の個人では、６つの異なるＨＬＡクラスＩ分子及び６つのＨＬＡクラスＩＩ分子が発現し得るが、集団ベースでは数千の異なる多型バリアントが存在する。異なるペプチドの数は、事実上無制限である。単一個体内の異なるＴＣＲの数も極めて多い。

【0450】

ＨＬＡクラスＩ結合のためのペプチドのプロセシングは高度に制御されており、プロテアソーム内で行われ、短いペプチド（８～１０量体）が生じる。プロテアソームの切断部位により、所与のタンパク質から産生できる８～１０量体の数が制限される。ＨＬＡクラスＩへのペプチドのローディングも、トランスポーター及びシャペロンなどを介して高度に制御されている。対照的に、ＨＬＡクラスＩＩ結合のためのペプチドのプロセシングは非常に複雑であり（Stern LJ, Santambrogio L. Curr Opin Immunol. 2016; 40: 70-77）、当初はエンドソーム内でのみ起こると考えられていた。エンドソームは、タンパク質の選別及び分解のための高度に動的及び多様なシステムを表す。タンパク質分解におけるエンドソームの主な役割の１つは、タンパク質合成に再利用される単一のアミノ酸を提供することである。この目標は、複数のエンドプロテアーゼとエキソプロテアーゼの組み合わせの使用により達成される。クラスＩＩ分子は、その結合部位がインバリアント鎖（Ｉｉ）で保護された状態でエンドソームに到達し、この鎖はリソエンドソーム内で切断され、特定のクラスＩＩ分子に適合するアミノ酸配列／結合モチーフを有するペプチドを捕捉できるように結合部位が開いたままになる。したがって、ＨＬＡクラスＩＩ分子は、そのような分子をさらなる分解からレスキューし、細胞表面に輸送される。ペプチドのコア結合モチーフは結合に必要であるが、ペプチドの溶出とその後の質量分析により、そのようなペプチドがコア結合モチーフの両方の部位に伸びる「不規則な末端」を有することが示された（Muntasell et al. J Immunol. 2002 Nov 1; 169(9): 5052-60.）。個々のＣＤ４＋Ｔ細胞クローンによる認識には、コア結合モチーフを介した関連するクラスＩＩ分子への結合が必要であるが、隣接するアミノ酸の影響を受ける。

【0451】

したがって、配列番号１などのポリペプチドに由来し、同じ結合モチーフを有する異なる長さのペプチドは、異なるＴ細胞を活性化し得る。異なるＨＬＡクラスＩＩ分子に結合するペプチドが無差別に存在すると、活性化される異なるＴ細胞クローンの数がさらに増加する。したがって、いくつかのコア結合モチーフが埋め込まれた配列番号１などの長鎖ペプチドは、ワクチンの集団カバレッジを拡大することになる。

【0452】

結果
表５は、Ｔ細胞クローンの詳細なマッピング及び各クローンによって認識される配列番号１内の配列を示す。データは、ＵＶ１ワクチン接種に応答した患者由来のＴ細胞クローンに基づく。表５に挙げた全てのクローンは、インビトロで試験した場合（実施例１に記載のＴ細胞増殖アッセイを使用）、配列番号１のポリペプチドに応答した。さらに、配列番号１に由来する一連の重複ペプチドを使用してＴ細胞クローンを試験した。表５に示すように、ＨＬＡ－ＤＲ分子は、少なくとも２つの対立遺伝子（ＤＲ１２及びＤＲ７）を有する配列番号１の３０量体ポリペプチドのＮ末端半分に存在するペプチドを優先的に提示したが、ＤＱ２及びＤＱ７対立遺伝子はＣ末端部分を提示した。データは、配列番号１の３０量体ポリペプチドに由来する一連の１４量体ペプチドが異なるＨＬＡクラスＩＩ分子によって提示され、異なるＴ細胞クローンによって認識され得ることを示す。

【0453】

個々のＴ細胞クローンは、表５に示す１４量体ペプチドによって表される配列番号１の異なる「フレーム」を認識する。したがって、３つのＤＲ１２拘束性クローンは、第１のＮ末端１４量体のみを認識した。Ｎ末端のアラニンを除去し、Ｃ末端のグリシンを付加すると反応性が失われる。ＤＲ７拘束性クローンは、その選好性で分割された。クローン４、１２、２１及び９２の反応性は、Ｎ末端セリンが除去され、Ｃ末端グリシンが付加されると失われる。一方、クローン１５は依然としてこのペプチドを認識したが、Ｎ末端バリンが除去され、Ｃ末端アスパラギン酸が付加されると認識は消失した。逆に、患者５からのクローン１０９は、６つの異なる１４量体ペプチドを認識し、「ＮＹＥＲＡＲＲＰＧ」（配列番号１６３の９量体コア結合配列の存在にのみ依存しているようであった。これらのクローンの暫定的なＤＲ特異性は、ＨＬＡ－ＤＲ８である。同様の結果がＨＬＡ－ＤＱ７拘束性Ｔ細胞クローンでも見られた。クローン８は、「ＲＲＰＧＬＬＧＡＳ」（配列番号１６４）の９量体コア結合配列を必要とするようであったが、クローン１０は、クローン８によって認識される最初の２つのペプチドを認識しなかった。したがって、このクローンによる認識を得るには、Ｃ末端ロイシンが適切な位置にある必要がある。クローン５２は、コア結合領域「ＬＬＧＡＳＶＬＧＬＤＤＩ」（配列番号１６５）からなるＣ末端フレームを認識する。

【0454】

【表5】

【0455】

考察
このデータは、異なるＨＬＡクラスＩＩ分子が「コア結合」配列の優先性に基づいて長鎖ポリペプチドから個々の「フレーム」を選択する、ペプチドのＨＬＡ結合の役割を示すだけでなく、癌患者において配列番号１などのポリペプチドによって生成される免疫応答の有効性を決定する際の隣接領域の構成の役割も強調する。したがって、配列番号１などのポリペプチドは、その全体配列内に、異なるＴ細胞クローンによって認識される異なる領域を含み、これがこのポリペプチドの高い免疫原性に寄与し得る（例えば、実施例１で論じたとおり）。

【0456】

実施例５：配列番号１１６のポリペプチドはＴ細胞免疫応答を誘発することができる多数のエピトープを含む
材料及び方法
エピトープ分析は、ＧＶ１００１（ｎ＝４）又はｈＴＥＲＴｍＲＮＡでトランスフェクトされた樹状細胞（ＤＣ）（ｎ＝３）でワクチン接種され、臨床応答者として同定された癌患者からのサンプルに対して実施された（参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１１／１０１１７３号及びSuso et al.Cancer Immunol Immunother.2011 Jun; 60(6): 809-18に記載されるとおり）。癌患者には、黒色腫、肺癌、結腸癌、膵臓癌の患者が含まれていた。簡潔には、７３１、７１３、７１４、７３０、７１５、７２９、７２２、７０９、７２６、７２７、７３２、７２３のペプチドを使用して、ワクチン接種中の様々な時点からの末梢血単核細胞（ＰＭＢＣ）を、重複するｈＴＥＲＴペプチドライブラリーで刺激し、次いでＴ細胞増殖アッセイで特異的なＴ細胞応答を試験した（参照により本明細書に組み込まれるBernhardt et al., 2006に記載されるとおり）。

【0457】

結果
表６は、エピトープ解析に供したｈＴＥＲＴの活性部位領域の配列を示す。Ｔ細胞増殖アッセイで試験された個々のペプチドには番号が付され、下線が引かれており（すなわち７３１、７１３、７１４、７３０、７１５、７２９、７２２、７０９、７２６、７２７、７３２、７２３）、ＧＶ１００１の配列（配列番号１２６、１６量体ポリペプチド）、配列番号１１６（３０量体ポリペプチド）及び配列番号１１８（３０量体ポリペプチド）のＣ末端参照配列にはハイライトが付され、下線が引かれている。ＧＶ１００１ワクチン接種後のエピトープ拡大の結果として（患者４人）又はｈＴＥＲＴ ｍＲＮＡトランスフェクトＤＣによるワクチン接種の結果として（患者３人）、陽性の免疫応答を与えた試験ポリペプチドは、配列番号１１６と８個のアミノ酸の最小配列（最小エピトープ／コア結合領域であると考えられる）を共有する場合、例えば配列番号１１６に埋め込まれたエピトープを含有するとみなされた。各ポリペプチドのそのようなヒット数を以下の表６及び表７に示す。

【0458】

【表6】

【0459】

【表7】

【0460】

考察
表６及び表７のデータは、配列番号１１６が、ＤＣ及びＧＶ１００１ワクチン接種を受けた患者において、ＧＶ１００１及び配列番号１１８のＣ末端参照配列と比較して、Ｔ細胞免疫応答を開始することができる最も多くのエピトープを含有することを示す。２つの異なるタイプの患者材料を使用すると、エピトープの重要な検証が可能になる。特に、ＧＶ１００１ワクチン接種からのエピトープ拡大とｍＲＮＡワクチン接種の両方が、ｈＴＥＲＴタンパク質からの個々のエピトープのプロセシングに依存しているため、データは真正な自然にプロセシングされたｈＴＥＲＴエピトープを同定する。いくつかのエピトープが異なる患者で同定されるという観察は、これらのエピトープの独立した検証を提供する。配列番号１１８のＣ末端参照配列と比較した、配列番号１１６及びＧＶ１００１に対する応答者の数の差は、ＧＶ１００１に対する直接的なワクチン応答との重複のため、ＤＣワクチン接種患者と比較して、ＧＶ１００１ワクチン接種患者において相対的に高い。

【0461】

この分析は、臨床応答者として特定された患者からのサンプルに対して実施され、これは、本明細書で分析したポリペプチドに対して検出されたＴ細胞応答が臨床的に関連するエピトープを表すことを示す。したがって、配列番号１１６のポリペプチドは、多数の臨床関連エピトープ及び表６及び７に含まれるデータによって示されるように、ＧＶ１００１又は配列番号１１８のＣ末端参照配列よりも多数のエピトープを含有するようである。

【0462】

実施例６：予測されるＴ細胞エピトープ数及び集団カバレッジ
背景
癌治療に使用される治療用ペプチドの集団カバレッジは、Ｔ細胞エピトープ含有量及び集団ＨＬＡ頻度を見ることによって推定できる。多くの場合、ペプチド又はペプチド混合物には、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の両方の活性化を誘発できるペプチドを含有する。これは、ＨＬＡクラスＩ及びＨＬＡクラスＩＩ結合の両方が関連していることを意味する。以下の表８に記載されるように、多数のペプチドについて集団カバレッジを評価した。ＨＬＡペプチド結合のインシリコ予測は、カバレッジを推定するために集団ＨＬＡ対立遺伝子頻度データとともに使用された。

【0463】

材料及び方法
集団のＨＬＡ対立遺伝子の頻度
Allele Frequency Netデータベース（Gonzalez-Galarza et al., Nucleic Acids Res.2020 Jan 8; 48(D1): D783-D788）からのＨＬＡ頻度データを使用した。このデータベースには、１，０００万人を超えるドナーからの１，６００を超える集団に関する情報が含まれている。課題は、多くの場合、地域的なもの又は特定の民族グループに焦点を当てた小規模な研究に基づいて、代表的な高レベルの集団（例えば、ヨーロッパ、アジア）を選択することである。オーストラリアを例に挙げると、ヨーロッパ系オーストラリア人とアボリジニ系オーストラリア人は大幅に異なる。しかし、ヨーロッパ系アメリカ人をドイツのコホートと比較すると、対立遺伝子の分布が非常に類似していることがわかる。小規模な研究を高レベル集団グループに結合するために、Buiet al.（BMC Bioinformatics. 2006 Mar 17; 7: 153）は、最新のアプローチでデータが１６の地理的領域に分割される戦略を使用した。

【0464】

ＨＬＡペプチド結合／Ｔ細胞エピトープのインシリコ予測
ＨＬＡクラスＩ及びＨＬＡクラスＩＩ結合の両方の予測は、SciCrossインハウスアルゴリズムを使用して行われた。発生頻度の高いＨＬＡ対立遺伝子の場合、予測モデルの精度は一般に高くなる。これは、アルゴリズムトレーニング用のデータが十分に入手可能であるためである。まれな対立遺伝子については、Tepitopepanに類似したアプローチがＨＬＡクラスＩＩ予測に使用された（Zhang et al., PLoS One. 2012; 7(2): e30483）。

【0465】

対立遺伝子のカバレッジ
対立遺伝子のカバレッジは２ステップで計算され、最終分析はＨＬＡクラスＩとＨＬＡクラスＩＩのカバレッジに別々に分割される：（ｉ）目的のペプチドを使用して、全ての対立遺伝子についてＨＬＡ結合予測が実行される。予測スコアがモデルのスコア分布の上位５％パーセンタイルに入る場合、対立遺伝子特異的バインダーが考えられる。少なくとも１つの９量体サブペプチドバインダーが予測される場合、ペプチドは所与のＨＬＡ対立遺伝子のバインダーであるとみなされる。アウトプットは、ペプチドが少なくとも１つの予測バインダーを有する対立遺伝子の数である。（ｉｉ）予測される対立遺伝子は、異なる集団におけるカバレッジを計算するために使用される。このステップで使用されるアプローチは、Bui et al. 2006に記載された方法の実践である。さらに、ペプチドの組み合わせの集団カバレッジは、カバーされる個々の対立遺伝子を組み合わせることによって計算できる。

【0466】

分析に使用したペプチド配列
集団カバレッジ及び総エピトープ数は、以下の表８に記載される５つのペプチド／組み合わせペプチドグループについて計算した。さらに、ＨＬＡクラスＩ及びクラスＩＩ対立遺伝子のカバレッジ及び集団カバレッジに関するペプチドのいくつかの具体的な比較を、以下のａ）～ｃ）に記載するように実施した。

【0467】

【表8】

【0468】

ペプチドの具体的な比較：
ａ）配列番号１対配列番号１１６及びそれらの組み合わせ；
ｂ）配列番号１１６対配列番号１１８；
ｃ）配列番号１１６対配列番号１２６（及び対配列番号１）

【0469】

結果：
予測されるエピトープの総数
表９は、上記の表８に記載される５つのペプチド／ペプチドの組み合わせについて予測されるエピトープの総数を示す。括弧内には、カバーされる固有のＨＬＡ対立遺伝子の総数が示される。表９に示すように、配列番号１１６は、特に多数の予測されるクラスＩエピトープを含むと思われる。さらに、配列番号１と配列番号１１６の組み合わせは、多数の予測されるクラスＩ及びクラスＩＩエピトープをもたらすようであり、これらのペプチドの組み合わせが高レベルの有効性を有することが予想されることを示唆している。

【0470】

【表9】

【0471】

具体的な比較
ａ）配列番号１対配列番号１１６及びそれらの組み合わせ：
配列番号１及び配列番号１１６は、ＨＬＡクラスＩ及びＨＬＡクラスＩＩ対立遺伝子の予測されるカバレッジが異なる。配列番号１１６は、クラスＩ対立遺伝子について配列番号１よりも高いカバレッジを有し、一方、配列番号１は、クラスＩＩ対立遺伝子について配列番号１１６よりも高いカバレッジを有する（表９）。図２Ａは、配列番号１及び配列番号１１６間のカバーされたＨＬＡクラスＩ対立遺伝子の比較を示す。配列番号１と配列番号１１６を組み合わせると、より高いクラスＩ対立遺伝子のカバレッジが得られると予想される。最も多くのクラスＩエピトープに寄与するのは、配列番号１１６のペプチドである（１９の固有の対立遺伝子をカバーする。図２Ａを参照されたい）。配列番号１と配列番号１１６の組み合わせは、各ポリペプチド単独と比較して、クラスＩ及びクラスＩＩエピトープの両方についてより高い総予測エピトープ数を与える（表９）。図３は、ＨＬＡクラスＩ（図３Ａ）及びＨＬＡクラスＩＩ対立遺伝子（図３Ｂ）に基づく配列番号１及び１１６の集団カバレッジを示す。いずれのポリペプチドも、ＨＬＡクラスＩＩ対立遺伝子に基づいて高い集団カバレッジを提供すると予測される（一般に配列番号１１６よりわずかに高いカバレッジを提供する配列番号１を有する）。配列番号１１６は、ＨＬＡクラスＩ対立遺伝子に基づいて、特に高い集団カバレッジを提供する。

【0472】

ｂ）配列番号１１６対配列番号１１８：
配列番号１１６は、配列番号１１８と比較して、予測されるエピトープ数がより多く、ＨＬＡクラスＩ対立遺伝子につき、より良好なカバレッジを有する。図２Ｂは、カバーされるクラスＩ対立遺伝子間の重複を示す。ここで、配列番号１１８によってカバーされる大部分の対立遺伝子が配列番号１１６によってもカバーされることが分かる。配列番号１１６及び１１８間のＨＬＡクラスＩＩ対立遺伝子の総カバレッジはある程度類似している。図２Ｃは、配列番号１１６及び配列番号１１８間のカバーされたＨＬＡクラスＩＩ対立遺伝子の比較を示す。カバーされる対立遺伝子には大きい重複があるが、個々のペプチドは、特定の対立遺伝子のセットもカバーする。同様のパターンの結果が集団カバレッジに関しても認められており（図６Ａ及び６Ｂ、「ＧＶ＿ＬＳＥ」と「Ｃ－ｔｅｒｍ－ｐｅｐ」を比較）、配列番号１１６は、特にＨＬＡクラスＩエピトープに基づいて、より高い集団カバレッジを提供すると予想される。

【0473】

ｃ）配列番号１１６対配列番号１２６（及び対配列番号１）：
図２Ｄ及び２Ｅは、配列番号１１６及び配列番号１２６間の、それぞれカバーされたＨＬＡクラスＩ対立遺伝子とＨＬＡクラスＩＩ対立遺伝子の比較を示す。カバーされたＨＬＡクラスＩ及びＩＩ対立遺伝子間にはいくらかの重複があるが、配列番号１１６は、特にＨＬＡクラスＩＩ対立遺伝子に関して、配列番号１２６と比較して多数の固有の対立遺伝子に寄与する。図４Ａ及び４Ｂは、配列番号１１６が、配列番号１２６と比較して、ＨＬＡクラスＩエピトープ（図４Ａ）及びＨＬＡクラスＩＩエピトープ（図４Ｂ）に基づいて、より高い集団カバレッジを提供するであろうことを示す。図５Ａ及び５Ｂは、配列番号１１６、１２６、さらには配列番号１の、ＨＬＡクラスＩ及びクラスＩＩエピトープに基づく集団カバレッジをさらに示す。上で論じたように、配列番号１は、ＨＬＡクラスＩＩ対立遺伝子に基づいて、特に高い集団カバレッジを提供する。

【0474】

中央アメリカについて入手可能なＨＬＡ頻度データはほとんどないことに注意されたい。これは、一見低いカバレッジからは結論を導くことができないことを意味する。

【0475】

考察
予測されるＴ細胞エピトープ及び集団カバレッジデータは、配列番号１及び配列番号１１６、特にこれらのポリペプチドの組み合わせが、広範囲の（全世界の）ヒト集団にわたり高レベルの有効性を提供すると予想されることを示す。

【0476】

実施例７：ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープを有する又は有しないコンジュゲートのマウスへの投与
実施例７ａ）：ＣＤ４＋エピトープを有しないコンジュゲートはマウスのＢ細胞エピトープに対する抗体応答を駆動しない
材料及び方法
雌のＣ５７ＢＬ／６マウスに、Ｂ細胞エピトープ（ＭＴＴＥ；配列番号７）の配列を含むポリペプチドと、ｍｇｐ１００のマウスＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを含有するＡＶＧＡＬＥＧＳＲＮＱＤＷＬＧＶＰＲＱＬ（配列番号５４）の配列を含むポリペプチドとを含む、コンジュゲートを投与した。このコンジュゲートは、既知の完全ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープ又はユニバーサル腫瘍抗原由来のＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープを含んでいなかった。コンジュゲートの投与は、２ｎｍｏｌのコンジュゲートの各皮下（ＳＣ）投与間に１週間の間隔をおいて３回実施した。コンジュゲートの最後の投与から２３日後、マウスから血液を採取し、ＭＴＴＥコーティングされたストレプトアビジンプレートを用いて抗ＭＴＴＥ ＩｇＧ ＥＬＩＳＡを実施して、マウスが抗ＭＴＴＥ抗体を発現したかどうかを評価した。コンジュゲートの注射と同じ時点で、対照としてモノクローナル抗ＭＴＴＥ ＩｇＧ１抗体（３００μｇのＳＣ注射）を数匹のマウスに注射した。ＥＬＩＳＡは、ストレプトアビジンプレートを１ｎｍｏｌ／ｍｌの濃度のビオチン化ＭＴＴＥ含有ペプチドで、４℃で一晩コーティングすることによって実施した。この後、プレートを０．０５％ Tween溶液で３回洗浄し、次いで１０％ＦＢＳ及び０．０５％ Tweenを含有する溶液でブロッキングした。希釈した血漿サンプルを室温で２時間インキュベートし、再度３回洗浄した。二次ポリクローナル抗マウスＩｇＧ１／ＨＲＰ抗体を使用して、プレートに結合した抗ＭＴＴＥ抗体を検出した。二次検出抗体を室温で１時間インキュベートし、その後、プレートを洗浄し、ＴＭＢ（３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン）を使用してプレートを展開した。１Ｍ Ｈ_２ＳＯ_４を使用して反応を停止した。吸光度を４５０ｎｍで読み取った。

【0477】

結果
図７Ａは、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープを欠くコンジュゲートによって内因性抗ＭＴＴＥ ＩｇＧ１抗体が誘導されなかったことを示す（図７Ａ、「ＳＣ注射マウス（コンジュゲート２ｎｍｏｌ）」を参照されたい）。抗ＭＴＴＥ ＩｇＧ１を注射した動物は、循環中に抗ＭＴＴＥ抗体を提示した（図７Ａ、「ＳＣ注射マウス（ａＭＴＴＥ ＩｇＧ１）」を参照されたい）。したがって、モノクローナル抗ＭＴＴＥ ＩｇＧ１抗体の受動的移入で注射されたマウスのみが、測定可能な抗ＭＴＴＥ抗体力価を示した。

【0478】

考察
図７Ａに示すデータは、既知のＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープを有しないコンジュゲートの投与では、マウスにおける抗ＭＴＴＥ抗体の産生を駆動できないことを示す。

【0479】

実施例７ｂ）：ＣＤ４＋エピトープを含むコンジュゲートはマウスのＢ細胞エピトープに対する抗体応答を駆動することができる
材料及び方法
マウスに、Ｂ細胞エピトープ（ＭＴＴＥ；配列番号７）の配列を含むポリペプチドと、「ＰＡＤＲＥ」と呼ばれる、非内因性のユニバーサルＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープを含む、配列番号５５の配列を含むポリペプチドとを含む、コンジュゲートを投与した。
配列番号５５：ＡＲＷＷＷＭＨＨＮＭＤＬＩＧＧＡＫｘＶＡＡＷＴＬＫＡｕ
式中、
ｘは、シクロヘキシル－Ａｌａを表し；
ｕは、Ｄ－Ａｌａを表し；
ＡＲＷＷ（配列番号５６）は、ＴＡＰ配列である（ＴＡＰ配列は、宿主細胞の小胞体へのポリペプチドのＴＡＰ駆動輸送を媒介できる配列である）。
ＷＭＨＨＮＭＤＬＩ（配列番号５７）は、マイナーＨＹ抗原のマウスＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープである。
ＧＧは、プロテアソーム切断部位であり；
ＡＫｘＶＡＡＷＴＬＫＡｕ（配列番号５８）は、ＰＡＤＲＥ配列（すなわち非内因性のユニバーサルＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープ）である。

【0480】

マウスに、１ｎｍｏｌのコンジュゲート又は配列番号５５のネイキッドペプチド単独（すなわちＭＴＴＥ配列への結合なし）を皮下注射した。注射を１週間間隔で３回行い、コンジュゲート又はネイキッドペプチドの最後の投与から９日後、マウスから血液を採取し、実施例１ａ）に記載されるようにＭＴＴＥコーティングされたストレプトアビジンプレートを用いて抗ＭＴＴＥ ＩｇＧ ＥＬＩＳＡを実施して、マウスが抗ＭＴＴＥ抗体を発現したかどうかを評価した。

【0481】

結果
図７Ｂは、コンジュゲートに曝露された全てのマウスが測定可能な抗ＭＴＴＥ ＩｇＧ１抗体力価を有していたため、ユニバーサルＰＡＤＲＥ配列（すなわちＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープ）を含むコンジュゲートが、コンジュゲートに対する抗ＭＴＴＥ ＩｇＧ１抗体の産生を駆動できたことを示す（図７Ｂ「コンジュゲート：ＭＴＴＥ３－ＨＹ－ＰＡＤＲＥ」を参照されたい）。対照的に、ＰＡＤＲＥ配列を含有する配列番号５５のネイキッドペプチド（すなわちＭＴＴＥ配列とコンジュゲートしていない）のみに曝露されたマウスは、ＭＴＴＥ配列に対する抗体を有しなかった（図７Ｂ、「ＳＬＰ：ＨＹ－ＰＡＤＲＥ」を参照されたい）（ＭＴＴＥ配列に曝露されていないことから予想されるとおり）。

【0482】

考察
図７Ｂに示すデータは、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープのコンジュゲートへの組み込みがマウスにおける抗ＭＴＴＥ抗体の産生を駆動することを示す。したがって、コンジュゲート中のＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープ（この例ではＰＡＤＲＥ配列）の存在により、マウスが破傷風ワクチン接種に曝露されていないにもかかわらず、抗ＭＴＴＥ抗体レベルが上昇した。これは、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープを有しないコンジュゲートがマウスにおける抗ＭＴＴＥ抗体の産生を駆動することができなかった実施例７ａ）と対照的であり得る。

【0483】

実施例８：Ｂ細胞エピトープ及びＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープを含有するコンジュゲートを含むワクチン（「TENDU」）はウサギにおいてＢ細胞エピトープに対する抗体応答を駆動することができる
材料及び方法
TENDUワクチンは、それぞれが３コピーのＢ細胞エピトープ（ＭＴＴＥ；配列番号７）と、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープを含むＳＬＰとを含有するコンジュゲートを含む（TENDUワクチンの構造のさらなる詳細は図８Ｃに提供される）。これは、Meditox（Konarovice、Czech Republic）によって雄ウサギで試験した。ウサギに破傷風トキソイド（ＴＴｄ）ワクチン（Equip（登録商標）T vet。≧３０ＩＵ／ｍｌ、Orion Pharma Animal Health）を４回（２週間間隔で）皮下ワクチン接種して、循環抗ＭＴＴＥ抗体を生成した（図８Ａ）。さらに２週間後、ウサギに低（１０μｇ／コンジュゲート、ｎ＝５）、中（１００μｇ／コンジュゲート、ｎ＝５）又は高（２４０μｌ／コンジュゲート、ｎ＝８）用量で、TENDUを４回（２週間間隔で）皮下ワクチン接種した。２つの対照グループは、ＴＴｄワクチンのみを投与されたウサギ（ｎ＝５）と、高用量のTENDUのみを投与され、Equip（登録商標）T vetは投与されなかったウサギ（ｎ＝５）であった。ＴＴｄワクチン接種サイクル後（第８週）及びTENDUワクチン接種サイクル後（第１５週）に、ＭＴＴＥ特異的抗体産生を検出するための血清学的分析のために血液サンプルが収集され、これは、Capra Science（Sweden）によって実施された。ウサギ抗ＭＴＴＥ力価は、ビオチン化ＭＴＴＥでコーティングされたストレプトアビジンプレートを使用して、ＴＴｄワクチン接種前後及びTENDUワクチン接種前後で誘導されたウサギ抗ＭＴＴＥ抗体を検出する、インハウスＥＬＩＳＡでCapra Science抗体ＡＢによって測定された。アルカリホスファターゼにコンジュゲートしたヤギ抗ウサギＩｇＧを二次抗体として使用した。基質４－ニトロフェニルリン酸二ナトリウム塩六水和物（１ｍｇ／ｍｌ）を使用した。吸光度を４０５ｎｍで測定し、曲線フィッティングを使用してワクチン接種前後の力価を決定した。

【0484】

結果
図８Ｂは、ＴＴｄがウサギにおいて低レベルの抗ＭＴＴＥ抗体力価を誘導し、これが中用量及び高用量のTENDUワクチンコンジュゲートでのTENDUワクチン接種によって大幅に強化されたことを示す（図８Ｂ）。TENDUワクチンのみでワクチン接種したウサギ（図８Ｂ、「ＴＴｄなし」）は、ＴＴｄワクチン接種によって誘導された既存の抗ＭＴＴＥ抗体反応を有するグループと比較して、抗ＭＴＴＥ抗体のレベルが低かった。したがって、ウサギは、ＴＴｄ曝露によって誘発された既存の抗ＭＴＴＥ応答を有するかどうかに応じて、抗ＭＴＴＥ力価応答に違いを示した。既存の抗ＭＴＴＥ応答を有するウサギは、高用量TENDUワクチン接種サイクル前及び後に抗ＭＴＴＥ抗体の力価の有意な上昇を示し（対応のあるｔ検定；ｐ＝０．００１３）、これは、同じ高用量のTENDUに曝露されたがＭＴＴＥ配列に対する既存の抗体を有しなかった動物では認められなかった。

【0485】

考察
TENDUワクチンは、ウサギ特異的Ｔ細胞エピトープを保持するように特にデザインされているわけではないが、それでもウサギＭＨＣ分子はTENDUワクチンコンジュゲート内に含まれる合成長鎖ペプチドからのペプチドを提示することができ、そのためこれらの長鎖ペプチドは、ウサギの抗ＭＴＴＥ抗体の産生を駆動するように作用することができる。既存の抗体を有するウサギでは、図１に例示されているような作用機序に従って免疫応答を誘導するはずである免疫複合体の形成が発生し得る。力価データは、活性物質が臨床関連モデルに投与されていることと、ＭＴＴＥ Ｂ細胞エピトープ及びＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープを含有するコンジュゲートを含むワクチンがモデルにおける抗ＭＴＴＥ抗体の産生を駆動できることとを示す。データは、選択された送達経路及び用量による作用機序を確認するものである。（ＭＴＴＥ）Ｂ細胞エピトープ及びＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープを含むコンジュゲート（この例ではTENDUワクチン）によるワクチン接種の開始前のＴＴｄ追加ワクチン接種の使用もサポートする。ただし、コンジュゲートをさらに注射すると、抗体産生の点でＴＴｄブースターの使用と同様の効果が得られる可能性がある。

【0486】

実施例９：抗ＭＴＴＥ抗体によるコンジュゲート結合の評価
材料及び方法
ＧＭＰ ＬＵＧ１－６コンストラクトのヒトモノクローナル抗ＭＴＴＥ ＩｇＧ１抗体への結合
インハウスＥＬＩＳＡを使用して、ＧＭＰ産生ＬＵＧ１－６コンジュゲートの組換えヒトモノクローナル抗ＭＴＴＥ ＩｇＧ１抗体への結合を確認した。ＥＬＩＳＡプレートを、Milli-Q水中、様々な濃度（０．０００４５７～１ｎｍｏｌ／ｍｌ、１ウェルあたり１つのコンジュゲート）で希釈した１００μｌ／ウェルのコンジュゲートでコーティングした。プレートを覆い、４℃で一晩インキュベートした。続いてプレートを４回洗浄し、１０％ＢＳＡ及び０．０５％ Tween20を含有する２００μｌ／ウェルのＰＢＳでブロッキングし、室温（ＲＴ）で１時間インキュベートした。洗浄後、ヒトキメラ抗ＭＴＴＥ ＩｇＧ１抗体（Evitria AG, Switzerland社製特注品、＞９９％の単量体含有量及び＜０．１ＥＵ／ｍｇのエンドトキシン）を、１％ＢＳＡ及び０．０５％ Tween20を補充したＰＢＳ中０．１μｇ／ｍｌで加えた。プレートを、０．０５％ Tween20を含有する２５０μｌ／ウェルのＰＢＳで４回洗浄し、１％ＢＳＡを補充したＰＢＳで１：８０００に希釈した二次抗体（抗ヒトカッパ軽鎖二次抗体、Thermo Fisher Scientific ＃Ａ１８８５３）を全てのウェルに加えた（１００μｌ／ウェル）。暗所、室温で１時間インキュベートした後、プレートを洗浄し、１００μｌのＴＭＢをウェルに加えた。反応を１００μｌ／ウェルの１Ｍ Ｈ_２ＳＯ_４で停止し、吸光度を４５０～５７０ｎｍの波長で測定した。

【0487】

ＧＭＰ ＬＵＧ１－６コンストラクトのヒトポリクローナル抗ＭＴＴＥ抗体への結合
上記と同じインハウスＥＬＩＳＡを使用して、以前に抗ＭＴＴＥ抗体を有することが確認されたヒトドナーの血漿からのヒトポリクローナル抗ＭＴＴＥ抗体に対するＧＭＰ産生ＬＵＧ１－６コンストラクトの結合を確認した。ＥＬＩＳＡプレートを、Milli-Q水中、様々な濃度（０．００４、０．０３、０．４及び１ｎｍｏｌ／ｍｌ、１ウェルあたり１つのコンジュゲート）で希釈した１００μｌ／ウェルのコンジュゲートでコーティングした。プレートを覆い、室温で２時間インキュベートした。次いで、プレートを０．０５％ Tween20を含有する２５０μｌ／ウェルのＰＢＳで４回洗浄した。次いで、プレートを２００μｌ／ウェルのSuperblock T20（Thermo Scientific）を用いて室温で５分間、３回ブロッキングした。プレートを、０．０５％ Tween20を含有する２５０μｌ／ウェルのＰＢＳで４回洗浄した。ドナーヒト血漿を、１％ＢＳＡ及び０．０５％ Tween20を補充したＰＢＳで１：２００に希釈し、１００μｌ／ウェルをプレートに適用し、次いでこれをＲＴで２時間インキュベートした。プレートを再度、０．０５％ Tween20を含有する２５０μｌ／ウェルのＰＢＳで４回洗浄し、１％ＢＳＡを補充したＰＢＳで１：８０００に希釈した二次抗体（抗ヒトカッパ軽鎖二次抗体、Thermo Fisher Scientific ＃Ａ１８８５３）を全てのウェルに加えた（１００μｌ／ウェル）。暗所、室温で１時間インキュベートした後、プレートを洗浄し、１００μｌのＴＭＢをウェルに加えた。反応を１００μｌ／ウェルの１Ｍ Ｈ_２ＳＯ_４で停止し、吸光度を４５０～５７０ｎｍの波長で測定した。

【0488】

結果及び考察
図９Ａ及び９Ｂは、コンジュゲートＬＵＧ１－６がそれぞれＥＬＩＳＡプレート上にコーティングされ、モノクローナル抗ＭＴＴＥ抗体（図９Ａ）及び確認された抗ＭＴＴＥ抗体を有するドナーのヒト血漿からのポリクローナル抗体（図９Ｂ）によって検出できることを示す。したがって、濃度が増加すると、ＬＵＧ１－６コンジュゲートは、モノクローナル抗ＭＴＴＥ抗体及び特定のドナーからの内因性ポリクローナル抗体に結合することがそれぞれ示された。データは、抗ＭＴＴＥ抗体（モノクローナル及びポリクローナル）がコンジュゲート内に含まれる場合、ＭＴＴＥ配列に結合できることを示す。

【0489】

実施例１０：ヒト化ＨＬＡ－ＤＲ４マウスへのＬＵＧ２コンジュゲートの投与
材料及び方法
ヒト化ＨＬＡ－ＤＲ４マウスにおけるエピトープ特異的Ｔ細胞応答の評価
Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンドの雌のＨＬＡ－ＤＲ４トランスジェニックマウス（研究開始時に１２週齢）をTaconic（Germantown, MD, USA）から入手した。ＨＬＡ－ＤＲ４動物の尾根部にＬＵＧ２コンストラクト（２０μｇ）を皮下投与し、２週間後に追加刺激を行った。１週間後、マウスを屠殺し、下記のようにELISPOTによる分析用の単一細胞懸濁液を生成するために脾臓を収集した。ＬＵＧ２曝露後の抗ＭＴＴＥ力価を分析するために心採血を実施した。ＬＵＧ２に曝露されていない尾静脈からサンプル採取したＨＬＡ－ＤＲ４動物を、ベースライン力価評価の対照として使用した（曝露されていない動物）。

【0490】

免疫応答の評価
ＭＴＴＥ配列に対する抗体力価は、インハウスＥＬＩＳＡを使用して決定された。ストレプトアビジンプレート（Thermo Scientific）を、Ｃ末端でビオチン化されたＦＩＧＩＴＥＬＫＫＬＥＳＫＩＮＫＶＦＳＳＡＦＡＤＶＥＡＡ（配列番号１４２）の配列を有するペプチドで、４℃で一晩コーティングした。プレートをＰＢＳ（０．０５％ Tween）で洗浄し、ＰＢＳ（１０％ＢＳＡ及び０．０５％ Tween）を用いて室温で１時間ブロッキングした。マウス血清をＰＢＳ（１％ＢＳＡ及び０．０５％ Tween）で連続希釈し、プレートに適用し、室温で２時間インキュベートした。マウスＭＴＴＥ特異的ＩｇＧ抗体は、ＨＲＰコンジュゲート二次抗体：ヤギ抗マウスＩｇＧ（Dako製ポリクローナル抗体；１：４０００希釈）で検出された。ＨＲＰコンジュゲート二次抗体をＰＢＳ（１％ＢＳＡ）で希釈し、室温で１時間、プレート上でインキュベートした。反応は基質ＴＭＢ（Dako）で進行させ、１Ｍ Ｈ_２ＳＯ_４で停止した。iMarkマイクロプレートリーダー（Bio-Rad）を使用して、４５０～５７０ｎｍで吸光度を読み取った。

【0491】

ＨＬＡ－ＤＲ４エピトープの免疫原性は、埋め込まれたＨＬＡ－ＤＲ４配列を含有するＳＬＰで脾細胞を刺激することによって評価された。これは、エクスビボＩＦＮγ ELISpotアッセイ（マウスＩＦＮγ／３３２１－２Ａ用ELISpotキット、Mabtech, Stockholm, Sweden）を使用して実施された。ＴＡＰ配列を有するＬＵＧ２ ＳＬＰは、アミノ酸配列：ＡＲＷＷＬＬＨＥＴＤＳＡＶＡＡＡＲＱＩＹＶＡＡＦＴＶＱＡＡＡＥ（配列番号１４３）を有し、ＴＡＰ配列を有しないＬＵＧ２ ＳＬＰは、アミノ酸配列：ＬＬＨＥＴＤＳＡＶＡＡＡＡＲＱＩＹＶＡＡＦＴＶＱＡＡＡＥ（配列番号１４４）を有し；いずれも埋め込まれたＨＬＡ－ＤＲ４配列を含有する。脾臓を採取する１日前に、製造元のプロトコルに従って、ＩＦＮ－γ ELISpotアッセイ用の９６ウェルELISpotプレート（Millipore）を捕捉抗体でプレコートした。ＰＢＳ／Tweenで５回洗浄し、１％ｗ／ｖ Ｌ－グルタミン（SLS／Lonza）、１０％ｖ／ｖ ＦＢＳ（Fisher／GE Healthcare）、２％ＨＥＰＥＳ（SLS／Lonza）、０．１％ｖ／ｖ Fungizone（Promega）を含有するRPMI1640（Life Technologies／Thermo Fisher Scientific）を含むＴ細胞培地で最低３０分間ブロッキングした後、０．５ｘ１０^６／ウェルの新たに単離した脾細胞を、最終濃度１０μｇ／ｍｌのそれぞれのＳＬＰ１００μｌとともにプレートに三重に播種した。次いで、細胞を５％ＣＯ_２インキュベーター中３７℃で４８時間インキュベートし、その後、プレートをＤＰＢＳＴで５回洗浄した。次いで、マウスＩＦＮγに対する５０μｌ／ウェルのビオチン化検出抗体（１／１０００希釈）を加え、プレートを室温で２時間インキュベートした。次いで、プレートをＤＰＢＳＴで５回洗浄し、続いて５０μｌ／ウェルのストレプトアビジンアルカリホスファターゼ（１／１０００希釈）を加えた。次いで、プレートを室温で１時間３０分間インキュベートした。インキュベーション後、プレートを再度ＤＰＢＳＴで６回洗浄し、次いで５０μｌ／ウェルの展開溶液（ＢＣＩＰ／ＮＢＴ、bioRad）を加えた。スポットが見えるまで、プレートを室温で暗所に放置した。スポットが発生したら、プレートを水道水ですすぐことによって反応を停止した。次いで、プレートを放置して乾燥させ、ELISpotプレートリーダー（Cellular Technology Limited, Shaker Heights, OH, USA）を使用してスポットを定量した。各ELISpotアッセイにつき、ＳＥＢ、ブドウ球菌エンテロトキシン－Ｂ（２．５μｇ／ｍｌ）を陽性対照として使用し、未刺激の脾細胞（細胞のみ）を陰性対照として使用した。全ての実験は３回繰り返して実施した。細胞のみのウェル内のスポット数が２０を超えず、ペプチド含有ウェル内の反応が対照ウェルの平均の標準偏差の少なくとも２倍である場合、動物は陽性反応を有するとスコア付けされた。

【0492】

結果及び考察
ＬＵＧ２はＨＬＡ－ＤＲ４拘束性ＰＳＭＡエピトープを含むため、動物をＬＵＧ２コンジュゲートに曝露してＣＤ４＋Ｔ細胞の初回刺激を評価することが可能であった。ＨＬＡ－ＤＲ４マウスは、ＬＵＧ２コンストラクトを用いたプライム／ブーストワクチン接種スケジュールを受けた。図１０Ａは、非曝露（対照）動物及びＬＵＧ２曝露動物から収集した血清から、ＬＵＧ２に曝露されたマウスが抗ＭＴＴＥ力価の増加を示したことを示す。図１０Ｂは、ＬＵＧ２ワクチン接種動物からの脾細胞を、ＬＵＧ２コンストラクトに含有されるＳＬＰ（ＵＶ０２、配列番号１４３）又はＴＡＰ ＡＲＷＷ配列を含まないＳＬＰ（ＵＶ０８、配列番号１４４）で処理すると、ＩＦＮ－γ産生Ｔ細胞の数の増加が観察された。図１０は、２０μｇのＬＵＧ２でワクチン接種したマウスから得られた結果を示す。同様のパターンの結果が、５μｇのＬＵＧ２でワクチン接種したマウスから得られた（データは示さず）。したがって、前立腺癌関連抗原に由来するＢ細胞エピトープ及びＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープを含むコンジュゲートをＨＬＡ－ＤＲ４マウスに投与すると、非曝露マウスに対し、曝露マウスにおいて、Ｂ細胞エピトープに特異的な抗体（抗ＭＴＴＥ抗体）の力価が上昇し、コンジュゲートのＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープに対するＴ細胞応答が生じた。データは、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープがコンジュゲートに組み込まれた場合、インビボでの抗体レベルの増加及びＴ細胞応答を観察するために、コンジュゲートによるワクチン接種前に追加ワクチン接種を要しないことも示す。さらに、データは、天然の前立腺癌関連抗原に由来するＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープが、非内因性ＰＡＤＲＥ配列と同様の抗ＭＴＴＥ抗体の誘導を達成できることを示す。

【0493】

合成例１～２２
以下の合成例は、本発明の実施形態によるコア化合物及びコア化合物を含むコンジュゲートの合成を説明する。

【0494】

コア合成－合成例１～１０
以下の合成例は、本発明の実施形態によるコア化合物の合成を説明する。

【0495】

合成例１：ＤＢＣＯ－コアＡ：

【化42】

ＤＢＣＯ－酸は、ＤＭＦ中のPyOxim／Oxyma pure及びＤＩＰＥＡを使用して活性化され、ＤＭＦ中のアミノ－ＰＥＧ４－トリス－ＰＥＧ４－アルキン（コアＡ）と反応する。産物をフラッシュクロマトグラフィーで精製する（スキーム１）。
ＬＣＭＳ特性データ：ＭＷ_理論＝１５１０．８；ＭＷ_観測＝１５１１．７［Ｍ＋Ｈ^＋］

【化43】

【0496】

スキーム１．ＤＢＣＯ－酸のコアＡへのカップリング。
合成例２：ＰＧ－［Ｌｙｓ（Ｂｒ）］_３

【化44】

Rinkアミド樹脂から出発して、Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）－ＯＨを、ＳＰＰＳ条件を使用して３回連続してカップリングする。Ｆｍｏｃ除去後、ＤＭＦ中のＤＩＰＥＡを使用してクロロギ酸プロパルギルをカップリングし、ＴＦＡを使用してコアを樹脂から切り離す。ブロモ酢酸は、ＤＭＦ中のＤＩＣを使用してカップリングされ、産物はＲＰ－ＨＰＬＣ精製によって精製され、凍結乾燥される（スキーム２）。

【0497】

ＳＰＰＳ条件：アミノ酸は、ＤＭＦ中のＤＩＣ／Oxyma pure及び５倍過剰のＤＩＰＥＡを使用して、リンカー誘導体化された標準ペプチド合成樹脂にカップリングされる。Ｆｍｏｃは、ＮＭＰ中の２０％ピペリジンを使用して除去される。
ＬＣＭＳ特性データ：ＭＷ_理論＝８４５．０；ＭＷ_観測＝８４６．０［Ｍ＋Ｈ^＋］

【化45】

【0498】

スキーム２：樹脂からの切断を含むＰＧ－［Ｌｙｓ（Ｂｒ）］_３のＳＰＰＳ。
合成例３：ＰＧ－［Ｌｙｓ（Ｍａｌ）］_３

【化46】

ブロモ酢酸の代わりに６－マレイミドヘキサン酸を使用したことを除いて、合成例２と同じ手順を使用した（スキーム３）。
ＬＣＭＳ特性データ：ＭＷ_理論＝１０６２．５；ＭＷ_観測＝１０６３．８［Ｍ＋Ｈ^＋］

【化47】

【0499】

スキーム３：樹脂からの切断を含むＰＧ－［Ｌｙｓ（Ｍａｌ）］_３のＳＰＰＳ。
合成例４：ＤＢＣＯ－［Ｌｙｓ（Ｂｒ）］_３

【化48】

Sieber樹脂から出発して、Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｍｔｔ）－ＯＨを、ＳＰＰＳ条件を使用して３回連続してカップリングする。Ｆｍｏｃ除去後、ＤＭＦ中のＤＩＣ／Oxyma pure及びＤＩＰＥＡを使用してＤＢＣＯ－酸をカップリングし、ＴＦＡを使用してコアを樹脂から切り離す。ブロモ酢酸は、ＤＭＦ中のＤＩＣを使用してカップリングされ、産物はＲＰ－ＨＰＬＣ精製によって精製され、凍結乾燥される（スキーム４）。
ＬＣＭＳ特性データ：ＭＷ_理論＝１０５０．０；ＭＷ_観測＝１０５１．０［Ｍ＋Ｈ^＋］

【化49】

【0500】

スキーム４：樹脂からの切断を含むＤＢＣＯ－［Ｌｙｓ（Ｂｒ）］_３のＳＰＰＳ。
合成例５：ＤＢＣＯ－［Ｌｙｓ（ＰＧ）］_３

【化50】

Rinkアミド樹脂から出発して、Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）－ＯＨを、ＳＰＰＳ条件を使用して３回連続してカップリングする。コアを樹脂から切り離し、ＤＭＦ中のＤＩＰＥＡを使用してクロロギ酸プロパルギルをカップリングする。ＤＭＦ中の２０％ピペリジンを使用してＦｍｏｃを除去した後、中間体をＲＰ－ＨＰＬＣ精製によって精製し、凍結乾燥する。ＤＭＦ中のＤＩＣ／Oxyma pure及びＤＩＰＥＡを使用してＤＢＣＯ－酸をカップリングし、産物をＲＰ－ＨＰＬＣ精製によって精製し、凍結乾燥する（スキーム５）。
ＬＣＭＳ特性データ：ＭＷ_理論＝９３４．４；ＭＷ_観測＝９３５．５［Ｍ＋Ｈ^＋］

【化51】

【0501】

スキーム５：樹脂からの切断を含むＤＢＣＯ－［Ｌｙｓ（ＰＧ）］_３のＳＰＰＳ。
参考合成例６：コア１．０

【化52】

コア１．０は、欧州特許第２５４７３６４Ｂ１号の［１１３］～［１２１］に記載されているように合成した。

【0502】

合成例７：ＤＢＣＯ－コアＢ

【化53】

ＤＢＣＯ－酸は、ＤＭＦ中のPyOxim／Oxyma pure及びＤＩＰＥＡを使用して活性化され、ＤＭＦ中のアミノ－ＰＥＧ４－ビス－ＰＥＧ４－アルキン（コアＢ）と反応する。産物をフラッシュクロマトグラフィーで精製する（スキーム６）。
ＬＣＭＳ特性データ：ＭＷ_理論＝１１９６．６２；ＭＷ_観測＝１１９７．１０［Ｍ＋Ｈ^＋］

【化54】

【0503】

スキーム６．ＤＢＣＯ－酸のコアＢへのカップリング。
合成例８：ＤＢＣＯ－Ｌｙｓ（Ｂｒ）－Ｌｙｓ（Ｂｒ）－Ｌｙｓ（Ｂｒ）－ＮＨ－ＰＧ

【化55】

Ｆｍｏｃ脱保護の条件：ＭｅＣＮ、１～５当量のＥｔ_２ＮＨ及び／又はピペリジン。

【0504】

カップリング条件：１当量のアミノ酸、１当量のPyOxim、１当量のOxyma pure、ＭｅＣＮ中２当量；１～２時間。

【0505】

プロパルギルアミンは、カップリング条件を使用してＦｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｍｔｔ）－ＯＨとカップリングして、Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｍｔｔ）－ＮＨ－ＰＧを産生する。Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｍｔｔ）－ＮＨ－ＰＧは、Ｆｍｏｃの脱保護条件を使用して脱保護され、カップリング条件を使用してＦｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｍｔｔ）－ＯＨとカップリングされて、Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｍｔｔ）－Ｌｙｓ（Ｍｔｔ）－ＮＨ－ＰＧを産生する。Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｍｔｔ）－Ｌｙｓ（Ｍｔｔ）－ＮＨ－ＰＧは、Ｆｍｏｃの脱保護条件を使用して脱保護され、カップリング条件を使用してＦｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｍｔｔ）－ＯＨとカップリングされて、Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｍｔｔ）－Ｌｙｓ（Ｍｔｔ）－Ｌｙｓ（Ｍｔｔ）－ＮＨ－ＰＧを産生する。

【0506】

次いで、Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｍｔｔ）－Ｌｙｓ（Ｍｔｔ）－Ｌｙｓ（Ｍｔｔ）－ＮＨ－ＰＧは、Ｆｍｏｃ条件の脱保護を使用して脱保護され、カップリング条件を使用してＤＢＣＯ－酸とカップリングされて、ＤＢＣＯ－Ｌｙｓ（Ｍｔｔ）－Ｌｙｓ（Ｍｔｔ）－Ｌｙｓ（Ｍｔｔ）－ＮＨ－ＰＧを産生する。過剰のＴＦＡを使用してＭｔｔを除去すると、ＤＢＣＯ－Ｌｙｓ（ＮＨ_２）－Ｌｙｓ（ＮＨ_２）－Ｌｙｓ（ＮＨ_２）－ＮＨ－ＰＧが得られ、これを精製して凍結乾燥する。

【0507】

精製及び凍結乾燥したＤＢＣＯ－Ｌｙｓ（ＮＨ_２）－Ｌｙｓ（ＮＨ_２）－Ｌｙｓ（ＮＨ_２）－ＮＨ－ＰＧを少量のＤＭＦに溶解する。ブロモ酢酸をＤＭＦに溶解し、ＤＩＣを加える。混合物を混濁するまで撹拌し、コアに加える。反応が完了するまで（一晩）混合物を撹拌する。反応物をＤＣＭで希釈し、水で数回洗浄してＤＭＦを除去する。

【0508】

ＤＣＭを蒸発させ、産物をＲＰ精製によって直ちに精製し、産物を含有する画分を凍結乾燥する（スキーム７）。
ＬＣＭＳ特性データ：ＭＷ_理論＝１０８９．１９；ＭＷ_観測＝１０８９．０５［Ｍ＋Ｈ^＋］

【化56】

【0509】

スキーム７．ＤＢＣＯ－Ｌｙｓ（Ｂｒ）－Ｌｙｓ（Ｂｒ）－Ｌｙｓ（Ｂｒ）－ＮＨ－ＰＧの合成
合成例９：ＤＢＣＯ－Ｌｙｓ（Ｂｒ）－Ｌｙｓ（Ｂｒ）－Ｌｙｓ（Ｂｒ）－ＮＨ－ＰＥＧ１－ＰＧ

【化57】

プロパルギルアミンの代わりに２－（プロプ－２－イン－１－イルオキシ）エタン－１－アミンを使用したことを除いて、合成例８と同じ手順を使用した（スキーム８）。
ＬＣＭＳ特性データ：ＭＷ_理論＝１１３３．２２；ＭＷ_観測＝１１３３．１３［Ｍ＋Ｈ^＋］

【化58】

【0510】

スキーム８．ＤＢＣＯ－Ｌｙｓ（Ｂｒ）－Ｌｙｓ（Ｂｒ）－Ｌｙｓ（Ｂｒ）－ＮＨ－ＰＥＧ１－ＰＧの合成
合成例１０：ＤＢＣＯ－Ｌｙｓ（Ｂｒ）－Ｌｙｓ（Ｂｒ）－Ｌｙｓ（Ｂｒ）－Ｓｅｒ（ＰＧ）－ＮＨ_２

【化59】

５００ｍｇ（０．３ｍｍｏｌ）のＦｍｏｃ－Sieber－ポリスチレン樹脂（０．６１ｍｍｏｌ／ｇローディング）をＤＭＦ中で２時間膨潤させる。ＦｍｏｃをＮＭＰ中の２０％ピペリジンで除去し、樹脂をＮＭＰ及びＤＭＦで洗浄する。第１のアミノ酸（Ｆｍｏｃ－Ｓｅｒ（ＰＧ）－ＯＨ）は、ＤＩＣ／Oxyma pure及びＤＭＦ中の５倍過剰のＤＩＰＥＡを使用してロードされる。アミノ酸は、両方のカップリングで５倍過剰を使用して６時間カップリングし、２回目に１４時間カップリングする。Ｆｍｏｃを切断し（ＮＭＰ／ピペリジン）、続いて、両方のカップリングで５倍過剰を使用して、アミノ酸（Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｍｔｔ）－ＯＨ）を６時間カップリングし、２回目に１４時間カップリングした。Ｆｍｏｃ除去及び（Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｍｔｔ）－ＯＨ）とのカップリングのステップをさらに２回繰り返す。

【0511】

アセンブリ後、Ｆｍｏｃが切断され、ＤＭＦ中のＤＩＣ／Oxyma pure及びＤＩＰＥＡを使用して２当量のＤＢＣＯ酸が６時間カップリングされる。さらに、２当量のＤＢＣＯ酸を、ＤＭＦ中のＤＩＣ／Oxyma pure及びＤＩＰＥＡを使用して１４時間、２回目のカップリングをする。側鎖保護基及び配列は、ＴＦＡ／ＴＩＳ／ＤＣＭ／ＭｅＯＨ（１：２：４５：４５）を９０分間使用して同時に切断される。切断混合物を濃縮し、ジエチルエーテル／水（１：１）に再溶解する。画分を分離し、水相を凍結乾燥する。ブロモ酢酸（１６当量）を１０ｍｇ／ｍＬの濃度でＤＭＦに溶解し、ＤＩＣ（８当量）を混合物に加える。混合物を、混濁するまで２０～３０分間撹拌する。ＤＢＣＯ－［Ｌｙｓ（ＮＨ_２）］_３Ｓｅｒ（ＰＧ）－ＮＨ_２を２０ｍｇ／ｍＬの濃度でＤＭＦに溶解し、事前に活性化したブロモ酢酸を加える。反応は、ＬＣＭＳを使用してモニタリングされる。産物は、Biotage（登録商標）Sfaer Bio C18D-Duo ３００Å ２０μｍカラム及び０～４０％Ｂ勾配（Ａ：水中０．１％ＴＦＡ、Ｂ：ＡＣＮ中０．１％ＴＦＡ）を使用するＲＰ精製によって精製される。純粋な産物を含有する画分を合わせ、凍結乾燥して、産物を３０％の収率で得た（スキーム９）。
ＬＣＭＳ特性データ：ＭＷ_理論＝１１７６．２２；ＭＷ_観測＝１１７６．２０［Ｍ＋Ｈ^＋］

【化60】

【0512】

スキーム９．樹脂からの切断を含むＤＢＣＯ－Ｌｙｓ（Ｂｒ）－Ｌｙｓ（Ｂｒ）－Ｌｙｓ（Ｂｒ）－Ｓｅｒ（ＰＧ）－ＮＨ_２のＳＰＰＳ。
コンジュゲート合成－合成例１１～２２
以下に詳述するようにコンジュゲートを合成した。表１０Ａ及び１０Ｂは、コアコンストラクトの概要である。

【0513】

【表10】

【0514】

【表11】

【0515】

【表12】

【0516】

（注：Ｂ細胞エピトープ、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープ及びさらなる物質に関する表１０Ａ及びＢの「Ｈ－」は、Ｎ末端の水素を指す。）

【0517】

表１０Ａ及びＢに含まれるコンジュゲートは、コアにコンジュゲートしたＢ細胞エピトープの配列を含むポリペプチドの２つ又は３つのコピーをそれぞれ含むことに留意されたい。

【0518】

Ｂ細胞エピトープ及びＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープを含むポリペプチド配列は、当技術分野で公知の従来のプロセスを使用して、及び／又は以前に記載されているように（例えば、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１１／１１５４８３号に記載されているように）合成した。

【0519】

合成例１１：ＤＢＣＯ－コアＡを使用した３＋１コンストラクトＣＤ１２Ｂの合成

【化61】

ＤＢＣＯ－コアＡと７１９－２０Ｋを混合し、ＡＣＮ／水に溶解する。反応が完了するまで混合物を撹拌し、０＋１中間体をＲＰ－ＨＰＬＣで精製し、凍結乾燥する。０＋１中間体とＴＥＴ００１Ｋを混合し、ＡＣＮ／水に溶解し、Ｃｕ（Ｉ）を加える。反応が完了するまで混合物を撹拌し、産物をＲＰ－ＨＰＬＣで精製し、凍結乾燥する（スキーム１０）。

【0520】

デコンボリューションされたＨＲＭＳ特性データ：ＭＷ_理論＝１５２４８．９；ＭＷ_観測＝１５２４８．６

【化62】

【0521】

スキーム１０．コアＤＢＣＯ－コアＡを使用した３＋１コンストラクトＣＤ１２Ｂの合成
合成例１２：ＤＢＣＯ－コアＡを使用した３＋１コンストラクトＣＤ３１の合成

【化63】

７１９－２０Ｋの代わりにＧＶＥｘｔ１３Ｍを使用したことを除き、合成例１１と同じ手順を使用した（スキーム１１）。

【0522】

デコンボリューションされたＨＲＭＳ特性データ：ＭＷ_理論＝１５５００．３；ＭＷ_観測＝１５４９９．８

【化64】

【0523】

スキーム１１：コアＤＢＣＯ－［Ｌｙｓ（Ｂｒ）］_３を使用した３＋１コンストラクトＣＤ３１の合成
合成例１３：ＤＢＣＯ－コアＡを使用した３＋１コンストラクトＣＤ２８の合成

【化65】

７１９－２０Ｋの代わりにＰＥＰ３２４２を使用したことを除き、合成例１１と同じ手順を使用した（スキーム１２）。

【0524】

デコンボリューションされたＨＲＭＳ特性データ：ＭＷ_理論＝１６５１９．８；ＭＷ_観測＝１６５１９．５

【化66】

【0525】

スキーム１２：コアＤＢＣＯ－［Ｌｙｓ（Ｂｒ）］_３を使用した３＋１コンストラクトＣＤ２８の合成
合成例１４：ＤＢＣＯ－［Ｌｙｓ（Ｂｒ）］_３を使用した３＋１コンストラクトＣＤ２０Ｂの合成

【化67】

ＴＥＴ００１ＣとＤＢＣＯ－［Ｌｙｓ（Ｂｒ）］_３を混合し、ＡＣＮ／水に溶解する。ｐＨは、０．５Ｍ ＮａＨＣＯ_３を使用して８．５に調整される。カップリングの完了（およそ１５分）後、５％ＡｃＯＨでｐＨを５に下げ、７１９－２０Ｋを加え、カップリングが完了するまで反応物を撹拌する。産物をＲＰ－ＨＰＬＣで精製し、凍結乾燥する（スキーム１３）。

【0526】

デコンボリューションされたＨＲＭＳ特性データ：ＭＷ_理論＝１４３９４．０；ＭＷ_観測＝１４３９２．６

【化68】

【0527】

スキーム１３：コアＤＢＣＯ－［Ｌｙｓ（Ｂｒ）］_３を使用した３＋１コンストラクトＣＤ２０Ｂの合成
合成例１５：ＤＢＣＯ－［Ｌｙｓ（Ｂｒ）］_３を使用した３＋１コンストラクトＣＤ２９の合成

【化69】

７１９－２０Ｋの代わりにＧＶＥｘｔ５を使用したことを除き、合成例１４と同じ手順を使用した（スキーム１４）。

【化70】

【0528】

スキーム１４：コアＤＢＣＯ－［Ｌｙｓ（Ｂｒ）］_３を使用した３＋１コンストラクトＣＤ２９の合成
デコンボリューションされたＨＲＭＳ特性データ：ＭＷ_理論＝１４５６８．２；ＭＷ_観測＝１４５６７．４

【0529】

合成例１６：ＤＢＣＯ－［Ｌｙｓ（Ｂｒ）］_３を使用した３＋１コンストラクトＣＤ３０の合成

【化71】

７１９－２０Ｋの代わりにＧＶＥｘｔ１３Ｍを使用したことを除き、合成例１４と同じ手順を使用した（スキーム１５）。

【化72】

【0530】

スキーム１５：コアＤＢＣＯ－［Ｌｙｓ（Ｂｒ）］_３を使用した３＋１コンストラクトＣＤ３０の合成
デコンボリューションされたＨＲＭＳ特性データ：ＭＷ_理論＝１４６４４．４；ＭＷ_観測＝１４６４３．４

【0531】

合成例１７：コア１．０を使用した３＋１コンストラクトＣＤ３２の合成

【化73】

アセトニトリル中のコア１．０を、光から保護された脱気水及び脱気０．５Ｍ ＮａＨＣＯ_３水溶液中のＴＥＴ００１Ｃの溶液に加えた。反応混合物を室温で３時間撹拌した。ＤＭＳＯ中のペプチド７１９－２０Ｋの溶液を加え、室温での撹拌を一晩続けた。

【0532】

４．２％ＮａＨＣＯ_３水溶液を反応混合物に加え、４０℃で３日間撹拌した。ＡｃＯＨ及びＴＣＥＰを室温で加え、混合物を１５分間撹拌し、分取ＬＣ－ＭＳバイアルに移し、逆相クロマトグラフィーで精製し、凍結乾燥した（スキーム１６）。

【0533】

逆相クロマトグラフィー及びＬＣＭＳトレースを図１９及び２０に示す。

【化74】

【0534】

スキーム１６：コア１．０を使用した３＋１コンストラクトＣＤ３２の合成
合成例１８：ＤＢＣＯ－［Ｌｙｓ（ＰＧ）］_３を使用した３＋１コンストラクトＣＤ２０の合成

【化75】

ＤＢＣＯ－［Ｌｙｓ（ＰＧ）］_３コアを水中８５％ＡＣＮに懸濁し、水に溶解した７１９－２０Ｋペプチドを含有するバイアルに移した。追加のＡＣＮを加えて乳濁溶液を清澄化した。ＩＰＣを確認した後（ＬＣ－ＭＳ、２．５時間）、反応混合物をＣ１８カラムで精製して中間体０＋１コンストラクトを得、これをさらなる特性評価を行わずに次のステップで使用した。水に溶解／懸濁した０＋１中間コンストラクトに、水に溶解したＴＥＴ００１Ｋを加え、続いてアミノグアニジン塩酸塩、ＣｕＳＯ_４及びＴＨＰＴＡ（ＣＡＳ ７６０９５２－８８－３）の水溶液を加え、青色の反応混合物を得た。アスコルビン酸ナトリウム溶液の添加により、反応を活性化した。ＣｕＳＯ_４及びアスコルビン酸ナトリウム溶液の連続的な添加後、２４時間後に完全な変換が達成された。３＋１コンストラクトをＣ４ ＲＰカラムで精製した（スキーム１７）。

【0535】

デコンボリューションされたＨＲＭＳ特性データ：ＭＷ_理論＝１４６４７．２；ＭＷ_観測＝１４６４６．４

【化76】

【0536】

スキーム１７：ＤＢＣＯ－［Ｌｙｓ（ＰＧ）］_３を使用した３＋１コンストラクトＣＤ２０の合成
合成例１９：ＤＢＣＯ－コアＢを使用した２＋１コンストラクトＣＤ１４の合成

【化77】

７１９－２０－ｂ－１をＡＣＮ／水（１：３）に溶解し、ＡＣＮ／水（１：１）に溶解したＤＢＣＯ－コアＢと混合する。反応は、ＬＣＭＳによってモニタリングされ、１８時間で完了する。混合物を水で希釈し、Biotage（登録商標）Sfaer Bio C4 D - Duo ３００Å ２０μｍカラム及び０～３０％Ｂ勾配（Ａ：水中の０．１％ＴＦＡ、Ｂ：ＡＣＮ中の０．１％ＴＦＡ）を使用するＲＰ精製によって精製する。純粋な産物を含有する画分を合わせ、凍結乾燥し、産物を単離した。

【0537】

７１９－２０－ｂ－１－ＤＢＣＯ－コアＢを水に溶解し、ＡＣＮ／水（４：１）に溶解したＴＥＴ００５－ＰＥＧ２－Ｋ（Ｎ_３）－ＯＨと混合する。ＣｕＢｒ・ＳＭｅ_２及びＴＨＰＴＡを水に溶解し、反応混合物に加える。ＤＩＰＥＡを反応物に加え、反応物をＬＣＭＳによってモニタリングする。完了後、ＥＤＴＡ（１１当量）を加える。混合物を水で希釈し、Biotage（登録商標）Sfaer Bio C4 D - Duo ３００Å ２０μｍカラム及び０～４０％Ｂ勾配（Ａ：水中の０．１％ＴＦＡ、Ｂ：ＡＣＮ中の０．１％ＴＦＡ）を使用するＲＰ精製によって精製する。純粋な産物を含有する画分を合わせ、凍結乾燥し、産物を単離した（スキーム１８）。

【0538】

デコンボリューションされたＨＲＭＳ特性データ：ＭＷ_理論＝９４３０．０；ＭＷ_観測＝９４２９．５

【化78】

【0539】

スキーム１８．コアＤＢＣＯ－コアＢを使用した２＋１コンストラクトＣＤ１４の合成
合成例２０：ＤＢＣＯ－Ｌｙｓ（Ｂｒ）－Ｌｙｓ（Ｂｒ）－Ｌｙｓ（Ｂｒ）－ＮＨ－ＰＧを使用した３＋１＋１コンストラクトの合成（バッチ番号２１Ｅ３２９９／ＰＤ００７２３）

【化79】

ＤＢＣＯ－Ｌｙｓ（Ｂｒ）－Ｌｙｓ（Ｂｒ）－Ｌｙｓ（Ｂｒ）－ＮＨ－ＰＧコアを２ｍｇ／ｍＬの濃度でＡＣＮ／水（１：１）に溶解し、５ｍｇ／ｍＬの濃度でＡＣＮ／水（４：１）に溶解したＴＥＴ００１Ｃ（３．５当量）と混合する。０．５Ｍ ＮａＨＣＯ_３を使用して、ｐＨを８に調整した。反応は、ＬＣＭＳによってモニタリングされる。カップリングの完了後、５％酢酸水溶液及びＡＣＮ／水（４：１）に５ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解した７１９－２０Ｋ（１．１当量）を使用して、ｐＨを５に下げる。反応をＬＣＭＳによってモニタリングし、完了後にＴＣＥＰ（３当量）を加える。混合物を水で希釈し、Biotage（登録商標）Sfaer Bio C4 D - Duo ３００Å ２０μｍカラム及び０～４０％Ｂ勾配（Ａ：水中の０．１％ＴＦＡ、Ｂ：ＡＣＮ中の０．１％ＴＦＡ）を使用するＲＰ精製によって精製する。純粋な中間体３＋１＋０産物を含有する画分を合わせ、凍結乾燥し、次のステップに使用した。

【0540】

３＋１＋０中間体及びＧＶＥｘｔ５（１．５当量）を、Ｎ_２下、２ｍｇ／ｍＬの濃度で脱気水に溶解した。Ｎ_２下、１ｍｇ／ｍＬの濃度で脱気水と混合した、臭化銅（Ｉ）－ジメチルスルフィド錯体（２０当量）及びトリス（３－ヒドロキシプロピルトリアゾリルメチル）アミン（ＴＨＰＴＡ）（２０当量）を、反応混合物に加えた。室温で３０分間撹拌した。Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）（２０当量）を使用してｐＨを７に調整した。反応は、ＬＣＭＳによってモニタリングされる。カップリングの完了後、反応混合物を水中のＥＤＴＡ（２５当量）でクエンチし、水中の５％トリフルオロ酢酸を使用してｐＨを４に下げた。混合物を水で希釈し、Biotage（登録商標）Sfaer Bio C4 D - Duo ３００Å ２０μｍカラム及び０～４０％Ｂ勾配（Ａ：水中の０．１％ＴＦＡ、Ｂ：ＡＣＮ中の０．１％ＴＦＡ）を使用するＲＰ精製によって精製する。純粋な産物を含有する画分を合わせ、凍結乾燥した（スキーム１９）。

【0541】

デコンボリューションされたＨＲＭＳ特性データ：ＭＷ_理論＝１８０４２．２；ＭＷ_観測＝１８０４１．８

【化80】

【0542】

スキーム１９．コアＤＢＣＯ－Ｌｙｓ（Ｂｒ）－Ｌｙｓ（Ｂｒ）－Ｌｙｓ（Ｂｒ）－ＮＨ－ＰＧを使用した３＋１＋１コンストラクト バッチ番号２１Ｅ３２９９の合成
合成例２１：ＤＢＣＯ－Ｌｙｓ（Ｂｒ）－Ｌｙｓ（Ｂｒ）－Ｌｙｓ（Ｂｒ）－ＮＨ－ＰＥＧ１－ＰＰＧを使用した３＋１＋１コンストラクトの合成（バッチ番号２１Ｅ３３００／ＰＤ００７２４）

【化81】

ＤＢＣＯ－Ｌｙｓ（Ｂｒ）－Ｌｙｓ（Ｂｒ）－Ｌｙｓ（Ｂｒ）－ＮＨ－ＰＧの代わりにＤＢＣＯ－Ｌｙｓ（Ｂｒ）－Ｌｙｓ（Ｂｒ）－Ｌｙｓ（Ｂｒ）－ＮＨ－ＰＥＧ１－ＰＧを使用したことを除いて、合成例２０と同じ手順を使用した（スキーム２０）。

【0543】

デコンボリューションされたＨＲＭＳ特性データ：ＭＷ_理論＝１８０８４．２；ＭＷ_観測＝１８０８２．３

【化82】

【0544】

スキーム２０．コアＤＢＣＯ－Ｌｙｓ（Ｂｒ）－Ｌｙｓ（Ｂｒ）－Ｌｙｓ（Ｂｒ）－ＮＨ－ＰＥＧ１－ＰＧを使用した３＋１＋１コンストラクト バッチ番号２１Ｅ３３００の合成
合成例２２：ＤＢＣＯ－Ｌｙｓ（Ｂｒ）－Ｌｙｓ（Ｂｒ）－Ｌｙｓ（Ｂｒ）－Ｓｅｒ（ＰＰＧ）－ＮＨ２を使用した３＋１＋１コンストラクトの合成（バッチ番号２１Ｅ３３０１／ＰＤ００７２５）

【化83】

ＤＢＣＯ－Ｌｙｓ（Ｂｒ）－Ｌｙｓ（Ｂｒ）－Ｌｙｓ（Ｂｒ）－ＮＨ－ＰＧの代わりにＤＢＣＯ－Ｌｙｓ（Ｂｒ）－Ｌｙｓ（Ｂｒ）－Ｌｙｓ（Ｂｒ）－Ｓｅｒ（ＰＧ）－ＮＨ_２を使用したことを除いて、合成例２０と同じ手順を使用した（スキーム２１）。

【0545】

デコンボリューションされたＨＲＭＳ特性データ：ＭＷ_理論＝１８１２７．３；ＭＷ_観測＝１８１２５．５

【化84】

【0546】

スキーム２１．コアＤＢＣＯ－Ｌｙｓ（Ｂｒ）－Ｌｙｓ（Ｂｒ）－Ｌｙｓ（Ｂｒ）－Ｓｅｒ（ＰＧ）－ＮＨ_２を使用した３＋１＋１コンストラクト バッチ番号２１Ｅ３３０１の合成
実施例１１：配列番号１はトランスジェニックＨＬＡ－ＤＲ４マウスにおいて免疫原性である
材料及び方法
この研究は、雌のＢ６．１２９Ｓ２－Ｈ２－Ａｂ１ｔｍ１ＧｒｕＴｇ（ＨＬＡ－ＤＲＡ／Ｈ２－Ｅａ，ＨＬＡＤＲＢ１＊０４０１／Ｈ２－Ｅｂ）１Ｋｉｔｏ系統マウスにおいて、配列番号１の配列を有するｈＴＥＲＴポリペプチドを、用量３０μｇ（９ｎｍｏｌ）で、ＩＦＡと混合した２５μｇのＣｐＧ１８２６を用いて免疫原性を調べるようにデザインされた。Ｂ６．１２９Ｓ２－Ｈ２－Ａｂ１ｔｍ１ＧｒｕＴｇ（ＨＬＡ－ＤＲＡ／Ｈ２－Ｅａ，ＨＬＡＤＲＢ１＊０４０１／Ｈ２－Ｅｂ）１Ｋｉｔｏ系統マウスは、Taconic Biosciences A/Sから入手した。ＩＦＡをペプチド／ＣｐＧと１：１の比率で混合し、残りの体積はペプチド単独又はペプチドとＣｐＧのいずれかで占められた。

【0547】

図１１Ａに示すように、第１及び第２の免疫化間におよそ２週間の間隔をあけたプライムブーストワクチン接種スケジュールを用いて試験物質を投与し、第２の免疫化の１週間後に動物を屠殺し、剖検を実施した。培地（完全増殖培地）に放出された応答Ｔ細胞及びＩＦＮ－ガンマの頻度を示すために、脾臓を使用してエクスビボELISpotを実施した。Ｔ細胞培地（RPMI 1640、Life Technologies／Thermo Fisher Scientific、１％ｗ／ｖ Ｌ－グルタミン（SLS／Lonza）、１０％ｖ／ｖ ＦＢＳ（Fisher／GE Healthcare）、２％ＨＥＰＥＳ（SLS／Lonza）、０．１％ｖ／ｖ Fungizone（Promega））を使用して脾臓を洗い流し、その後、濾過器に通して組織片を除去し、３００ｇで１０分間遠心分離した。細胞ペレットを、計数及びプレーティングのためにＴ細胞培地に再懸濁した。BioXCellの抗ＣＤ４抗体を使用して、エクスビボ再刺激中のＣＤ４＋Ｔ細胞活性化をブロッキングした。全てのペプチドは、最終濃度１０μｇ／ｍＬで使用した。インビトロで４８時間刺激した後のワクチン誘導応答性細胞の頻度を、マウスＩＦＮ－γ ELISpotキット（Mabtech）を使用して測定した。このために、膜貫通型９６ウェルMilliporeプレートを、製造元のプロトコルに従って捕捉抗体でプレコートした。各実験では、０．５ｘ１０^６脾細胞／ウェルを、４ウェル＋／－１０μｇ／ｍＬのペプチド＋／－抗ＣＤ４抗体でプレーティングした。ブドウ球菌エンテロトキシンＢ（Staphylococcal Enterotoxin B、ＳＥＢ）を陽性対照として使用した。培地のみの細胞を陰性対照として使用した。次いで、細胞を計数した。

【0548】

結果
図１１Ｂは、１グループあたりの個々のマウス（ｎ＝８）を示し、別々の時点で行われた３つの異なる実験からプールされたマウスを表す。統計分析は、クラスカル・ウォリス検定及びダンの多重比較検定を使用して実施した。「^＊＊」は、ｐ＜０．０１を指し、「ｎｓ」は、有意でないことを指す。図１１Ｂは、配列番号１で刺激された細胞、抗ＣＤ４抗体と組み合わせた配列番号１で刺激された細胞又は陰性対照としての細胞単独のいずれかからのデータを示す。陽性対照としてのＳＥＢは示されていないが、強い細胞活性化を示した。データは、細胞単独と比較してスポットの数が大幅に増加しているため、配列番号１を使用した再刺激に対する強力なＣＤ４駆動型Ｔ細胞活性化応答を示す。抗ＣＤ４抗体が活性化に影響を与えたため、応答はＣＤ４＋Ｔ細胞媒介性であり得る。

【0549】

考察
図１１Ｂに示されるデータは、配列番号１の配列を有するポリペプチドが、９ｎｍｏｌの用量で、雌のＢ６．１２９Ｓ２－Ｈ２－Ａｂ１ｔｍ１ＧｒｕＴｇ（ＨＬＡ－ＤＲＡ／Ｈ２－Ｅａ，ＨＬＡＤＲＢ１＊０４０１／Ｈ２－Ｅｂ）１Ｋｉｔｏ系統マウスにおいて免疫原性であることを示す。この用量レベルでは応答は、均一ではないが（非応答者及び応答者の両方が観察された）、さらなる実験は、全てのマウスが２２ｎｍｏｌの用量に応答するようであることを実証している（例えば、以下の実施例１５を参照されたい）。したがって、これらのデータは、トランスジェニックＨＬＡ－ＤＲ４マウスが、配列番号１及び配列番号１を含むコンジュゲートを含むインビボ実験に使用するのに適していることを示す。

【0550】

実施例１２：より高い分子量を有するペプチドコンジュゲートが処理され、同様に効率的にＴ細胞に提示される
目的は、より高い分子量（例えば、＞１４ｋＤａ）を有するペプチドコンジュゲートが、溶液中で配列番号１の配列を有するポリペプチドと同程度にプロセシングされ、Ｔ細胞に提示され得るかどうかを評価することであった。全タンパク質は、合成長鎖ペプチドよりもプロセシング効率が低いことが報告されている（Rosalia et al., Eur J Immunol. 2013 Oct; 43(10): 2554-65）。２つの安定にトランスフェクトされた細胞株に基づくアッセイを使用した。

【0551】

材料及び方法
Jurkat派生細胞株Ｊ７６は、配列番号１に特異的なＴＣＲであるＵＴ１で安定にトランスフェクトされている。Ｊ７６は、ＴＣＲａ及びＴＣＲｂ鎖の発現を欠く。ＵＴ１は、ポリペプチドのＵＶ１カクテル（配列番号１、５２及び５３）を含む臨床試験において配列番号１特異的Ｔ細胞応答を示した個体からのＴ細胞からクローン化された。同じ細胞株をレポーターＮＦＡＴ－ＧＦＰで安定にトランスフェクトした。ＮＦＡＴは、Ｔ細胞活性化において重要な役割を果たす転写因子である。ＧＦＰ発現の上方制御は、ＵＴ１による配列番号１の認識に応答して得られる細胞株Ｊ７６ １４３９ ９０７の特異的活性化を分析するために使用することができる。第２の細胞株は、ＵＴ１に一致し、同じ個体からクローン化されたＨＬＡ－ＤＱを発現するエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）リンパ芽球様細胞株（ＬＣＬ）であった（ＥＢＶ ＬＣＬ ８０２）。

【0552】

配列番号１又は５２のポリペプチドを滅菌水中で５００μＭに再構成した。配列番号１のポリペプチドを含むコンジュゲート（ＣＤ１２Ｂ又はＣＤ２０Ｂ；表１０を参照されたい）を滅菌水中で１ｍｇ／ｍｌ（５２．９ｕＭ）に再構成した。Ｊ７６及びＥＢＶ細胞を遠心分離によって洗浄し、２５％ＦＢＳを含むＲＰＭＩに再懸濁し、９６ウェル組織培養処理プレートに加えて、１ウェルあたり１００，０００個のＪ７６細胞と２００，０００個のＥＢＶ細胞を含む総量１５０μｌとした。Ｊ７６及びＥＢＶ細胞のみのウェルも陰性対照として評価した。ペプチド（配列番号１又は５２）及びペプチドコンジュゲート（ＣＤ１２Ｂ又はＣＤ２０Ｂ）を、単純RPMI1640培地中の５倍濃縮ストック溶液（１ウェルあたり５０μｌ）に加え、次いでペプチド（配列番号１又は５２）及びペプチドコンジュゲート（ＣＤ１２Ｂ又はＣＤ２０Ｂ）を細胞に加えた。１つの実験では、コンジュゲート（ＣＤ１２Ｂ）及びペプチド（配列番号１又は５２）を、最終濃度０．５、１．５及び５μＭまで加えた。第２の実験では、配列番号１及び５２を最終濃度０．５、１．５及び５μＭになるように加え、ＣＤ１２Ｂ及びＣＤ２０Ｂを最終濃度０．５、１．５及び３μＭまで加えた。細胞とペプチドの共インキュベーション物の最終体積は、２５０μｌであった。プレートを３７℃で２４時間インキュベートした。配列番号５２のポリペプチドは、配列番号１特異的Ｔ細胞を活性化しないはずであるため、陰性対照ペプチドとして使用した。

【0553】

この後、抗体で染色し、その後、フローサイトメトリー分析を行うために、細胞をＶ字型９６ウェルプレートに移した。細胞を遠心分離により洗浄し、染色前に３回再懸濁した。染色は室温で２５分間実施され、洗浄後、Cytoflex ADPアナライザーで細胞が分析された。死細胞を除外するために、live/deadマーカーを使用した。アロフィコシアニン（ＡＰＣ）で標識された抗ＣＤ３抗体及びフィコエリスリン（ＰＥ）で標識された抗ＣＤ１９抗体を使用して、細胞を染色した。単一染色ビーズを使用して補正を実施した（細胞染色に使用したＡＰＣ及びＰＥ標識抗体を使用）。

【0554】

結果及び考察
図１２Ａは、３つの異なる濃度のペプチド（配列番号１；「７１９－２０」又は配列番号５２；「ｐ７２５」）又はペプチドコンジュゲート（「ＣＤ１２ｂ」）に曝露したときのＧＦＰ発現ＣＤ３陽性細胞を示す（ゲーティングによって同定）。各バーは、配列番号１（「ｐ７１９－２０」）及び配列番号１を含むコンジュゲート（「ＣＤ１２ｂ」）の複製の平均値＋／－ＳＤを表し、配列番号５２（「ｐ７２５」）は、各濃度について単一サンプルとして実行された。Ｊ７６細胞は、ＥＢＶ細胞が配列番号１に由来するエピトープを提示すると活性化される。活性化によりＧＦＰ発現が増加する。図１２Ａは、配列番号１の配列（「ｐ７１９－２０」）を含むポリペプチド及びＢ細胞エピトープ（「ＣＤ１２ｂ」）に連結された配列番号１のポリペプチドを含むコンジュゲートが、等モル用量で使用した場合、Ｔ細胞も同様に良好に活性化できることを示す。抗原提示細胞（ＥＢＶ）が培養物中に存在しない場合、Ｔ細胞の活性化は認められなかった（データは示さず）。図１２Ｂは、コンジュゲートＣＤ２０Ｂが同じアッセイにおいて同様に良好に機能することを示す。したがって、コンジュゲートのより大きい分子量は、配列番号１のポリペプチドのプロセシング及びＴ細胞へのその提示を妨げない。

【0555】

実施例１３：ｈＴＥＲＴ由来のＢ細胞エピトープ及びＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープを含むコンジュゲートはＢ細胞エピトープに特異的なポリクローナル抗体によって結合される
配列番号７のＢ細胞エピトープ（ＭＴＴＥ）及びｈＴＥＲＴ由来のＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープ（配列番号１、１１６又は１１７）を含むコンジュゲートをＥＬＩＳＡによって試験して、配列番号７に特異的な抗体によるコンジュゲートの結合を評価した。ｈＴＥＲＴ由来の配列を含むコンジュゲートのさらなる詳細を上記の表１０に示す。

【0556】

材料及び方法
間接及びサンドイッチＥＬＩＳＡを使用して、以下のプロトコルを使用してコンジュゲートに結合するポリクローナル抗体を評価した。間接ＥＬＩＳＡでは、試験されるコンジュゲートがプレート上にコーティングされたのに対し、サンドイッチＥＬＩＳＡでは、試験される配列番号１のポリペプチドを含むコンジュゲートが配列番号１に特異的なウサギポリクローナル抗体を介してプレート上に捕捉されたことを理解されたい。

【0557】

サンドイッチＥＬＩＳＡ：サンドイッチＥＬＩＳＡは、以下の手順に従ってスウェーデンのCapra Scienceによって実施した。Thermo Scientific（商標）透明平底免疫非滅菌９６ウェルプレートを使用し、ポリクローナルウサギ抗ｐ７１９－２０（配列番号１）抗体（１ウェルあたり０．５μｇ）合計５０μｌ／ウェルでコーティングし、一晩、４℃でインキュベートした。タンパク質を含まないブロッキング溶液（Pierce）を使用してプレートを室温で１時間ブロッキングし、続いてＰＢＳ及び０．０５％ Tween洗浄溶液を使用して洗浄した。コンジュゲートを、示された濃度で、段階希釈でプレートに加え、室温で１時間インキュベートした。続いて、プレートを洗浄溶液で洗浄し、次いでTetaquin（登録商標）（高力価抗破傷風ドナーからのポリクローナルヒトＩｇＧ又はモノクローナル組換えキメラ抗ＭＴＴＥ抗体に基づく抗ＭＴＴＥ抗体とともにインキュベートした。プレートを洗浄溶液で洗浄し、その後、二次抗体、ヤギ抗ヒトカッパＨＲＰを、１％ＢＳＡを含むＰＢＳ溶液に加えた。１時間のインキュベーション後、プレートを再度洗浄し、次いで基質ＴＭＢを加えてアッセイを展開し、１Ｍ Ｈ_２ＳＯ_４の停止溶液を加えた後、吸光度を使用してプレートを読み取った。

【0558】

間接ＥＬＩＳＡ：間接ＥＬＳＩＡは、以下の手順に従ってインハウスで実施した。コンジュゲートをマイクロプレート、９６ウェル、ＰＳ、Ｕ底透明非結合プレートで溶解及び希釈し、調製した溶液１００μｌをＥＬＩＳＡプレートCorning costar９６ウェルプレートに加え、室温で２時間インキュベートした。プレートを２５０μｌ／ウェルのＰＢＳ＋０．０５％＋Tween20（ＰＢＳＴ）で洗浄した。プレートを２００μｌのSuperblock T20（Thermo Scientific）でブロッキングし、５分間インキュベートした。プレートを空にし、ブロッキング溶液の添加を合計３回繰り返した。プレートをＰＢＳＴ溶液で再度洗浄した。ＭＴＴＥの検出は、ＴＴｄワクチン接種を受けた個体からサンプル採取した希釈血清又はモノクローナル組換えキメラ抗ＭＴＴＥ抗体のいずれかを１ウェルあたり１００μｌで用いて実施し、室温で２時間インキュベートした。プレートをＰＢＳＴで洗浄した。抗体は、二次ＨＲＰヤギ抗ヒトカッパ軽鎖二次抗体を使用して検出され、室温で１時間インキュベートした。洗浄後、ＴＭＢをウェルに加え、発色をモニタリングし、１００ｕｌの１Ｍ Ｈ_２ＳＯ_４の添加により反応を停止し、吸光度を読み取った。

【0559】

結果
図１３Ａ及び１３Ｂは、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープとして配列番号１のポリペプチドを含むコンジュゲートを使用したサンドイッチＥＬＩＳＡ実験の結果を示す。ＣＤ０９は、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープを含まず、陰性対照として使用した。図１３Ａ及び１３Ｂに示すように、配列番号１を含むＣＤ１２Ｂ、ＣＤ２０及びＣＤ２０Ｂのコンジュゲートは、ＭＴＴＥ（配列番号７）を認識するヒトポリクローナル抗体（血漿産物TetaQuinから）によってそれぞれ結合された。

【0560】

図１４Ａ及び１４Ｂは、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープとして配列番号１（ＣＤ２０Ｂ）、１１６（ＣＤ２９）又は１１７（ＣＤ３０、ＣＤ３１）のポリペプチドを含むコンジュゲートを使用した間接ＥＬＩＳＡ実験の結果を示す。ＮＹ－ＥＳＯ－１に由来する配列番号４５を含むコンジュゲートＬＵＧ６を陽性対照として使用した。図１４Ａ及び１４Ｂに示すように、ＣＤ２９（配列番号１１６を含む）、ＣＤ３０及びＣＤ３１（配列番号１１７を含む）又はＣＤ２０Ｂ（配列番号１を含む）のコンジュゲートは、ＭＴＴＥ（配列番号７）を認識するポリクローナル抗体を含有する血清由来のヒトポリクローナル抗体によってそれぞれ結合された。

【0561】

図１５Ａ及び１５Ｂは、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープとして配列番号１（ＣＤ１２Ｂ、ＣＤ２８、ＣＤ２０Ｂ）又は配列番号１１６（ＣＤ３２）のポリペプチドを含むコンジュゲートを使用した間接ＥＬＩＳＡ実験の結果を示す。コンジュゲートＣＤ２８は、配列番号１の配列に加えて、ＰＡＰ由来のＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ（ＮＰＩＬＬＷＱＰＩＰＶ；配列番号１１９）を含む。図１５Ａ及び１５Ｂに示すように、ＣＤ１２Ｂ、ＣＤ２８、ＣＤ２０Ｂ（配列番号１を含む）又はＣＤ３２（配列番号１１６を含む）のコンジュゲートは、ＭＴＴＥ（配列番号７）を認識するポリクローナル抗体を含有する血清由来のヒトポリクローナル抗体によってそれぞれ結合された。この実験では、ＣＤ３２はヒトポリクローナル抗体血清に対して比較的弱い結合を示した。

【0562】

考察
Ｂ細胞エピトープとしてのＭＴＴＥ配列（配列番号７）及びｈＴＥＲＴ由来のＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープ（配列番号１、１１６又は１１７）を含むコンジュゲートは、配列番号７に特異的なポリクローナル抗体によって結合される。したがって、抗ＭＴＴＥ抗体は、上述のコンジュゲート内に含まれる場合、配列番号７のＭＴＴＥ配列を認識することができる。

【0563】

実施例１４：配列番号１を含むコンジュゲートは、トランスジェニックＨＬＡ－Ａ２／ＨＬＡ－ＤＲ１マウスにおいてＴ細胞応答の上昇を誘導する
材料及び方法
系統Ｂ２ｍ，Ｔｇ（ＨＬＡ－Ａ／Ｈ２－Ｄ／Ｂ２Ｍ）１Ｂｐｅ，Ｔｇ（ＨＬＡ－ＤＲＡ^＊０１０１，ＨＬＡ－ＤＲＢ１^＊０１０１）１Ｄｍａ，Ｈ２－Ａｂ１（EMMA Repository, Orleans, FRANCE）の雌マウスを、図１６Ａに示されるスケジュールに従って、ＣｐＧと混合した配列番号１のポリペプチド（参照アジュバント、ＴＬＲ９アゴニストとして）（グループ１：配列番号１（２０μｇ）＋ＣｐＧ（２５ｕｇ）（５０μＬ／マウス）；ｎ＝３）又は化合物ＣＤ１２Ｂ（表１０を参照されたい）、３つのＭＴＴＥ（配列番号７）ポリペプチド及び配列番号１のポリペプチドを含むコンジュゲート（グループ２：ＣＤ１２Ｂ、２０ｕｇ／マウス（１００μＬ／マウス）；ｎ＝３）のいずれかで尾根部に免疫化（初回刺激／追加刺激）した。終了日に脾臓を採取し、脾細胞の単一細胞懸濁液を調製した。

【0564】

Ｔ細胞培地（RPMI 1640、Life Technologies／Thermo Fisher Scientific、１％ｗ／ｖ Ｌ－グルタミン（SLS／Lonza）、１０％ｖ／ｖ ＦＢＳ（Fisher／GE Healthcare）、２％ＨＥＰＥＳ（SLS／Lonza）、０．１％ｖ／ｖ Fungizone（Promega））を使用して脾臓を洗い流し、その後、濾過器に通して組織片を除去し、３００ｇで１０分間遠心分離した。細胞ペレットを、計数及びプレーティングのためにＴ細胞培地に再懸濁した。

【0565】

選択されたポリペプチド（表１１に示されるとおり）によりインビトロで４８時間刺激した後のワクチン誘導応答性細胞の頻度を、マウスＩＦＮ－γ ELISpotキット（Mabtech）を使用して測定した。このために、膜貫通型９６ウェルMilliporeプレートを、製造元のプロトコルに従って捕捉抗体でプレコートした。各実験では、０．５ｘ１０^６脾細胞／ウェルを、４ウェル＋／－１０μｇ／ｍＬのペプチド＋／－抗ＣＤ４又はＣＤ８抗体でプレーティングした。ブドウ球菌エンテロトキシンＢ（Staphylococcal Enterotoxin B、ＳＥＢ）を陽性対照として使用した。培地のみの細胞を陰性対照として使用した。

【0566】

【表13】

【0567】

結果
図１６Ｂは、配列番号７（ＭＴＴＥ配列）は、刺激のために単独で使用した場合、ＣＤ１２Ｂに曝露された動物からの脾細胞においてＴ細胞応答を誘導しなかったことを示し、これは、配列番号７がそれ自体ではこれらのマウスにおいてＴ細胞エピトープを提供しないことを示している。配列番号１のポリペプチドによる刺激は、Sidakの多重比較検定を使用した試験用量で、配列番号１／ＣｐＧワクチン接種動物と比較して、ＣＤ１２Ｂ曝露動物において測定可能及び有意に上昇したＴ細胞応答を誘導した（^＊ｐ＜０．０５）。

【0568】

Ｔ細胞応答がＣＤ４＋又はＣＤ８＋由来のどちらであるかを評価するために、ＣＤ１２Ｂに曝露された動物からの脾細胞を、予測されるＭＨＣクラスＩエピトープ（ＵＶ１３～１５、表１１）又は予測されるＭＨＣクラスＩＩエピトープ（ＵＶ１６～ＵＶ１８、表１１）を含むポリペプチドで刺激した。クラスＩ由来の刺激は抗ＣＤ８抗体を伴い又は伴わず実施され、クラスＩＩエピトープ由来の刺激は抗ＣＤ４由来抗体を使用して実施された。統計分析は、グラフパッド及びSidakの多重比較検定を使用して実施した（^＊ｐ＜０．０５；^＊＊ｐ＜０．０１；「ｎｓ」＝有意でない）。図１６Ｄは、抗ＣＤ４抗体（「＋ａＣＤ４」）がＵＶ１７及びＵＶ１８に対するＴ細胞応答を有意に減少させることができたため、ＣＤ１２ＢコンジュゲートがＤＲ１由来のＣＤ４＋Ｔ細胞応答を誘導することを示す。これは、より長い配列番号１のペプチド刺激培養物でも同様に見られた（データは示さず）。図１６Ｃは、抗ＣＤ８抗体（「＋ａＣＤ８」）がＴ細胞活性化に影響を及ぼさなかったことを示し、これは、この場合、測定可能なＣＤ８＋Ｔ細胞応答の誘導がなかったことを示す。

【0569】

考察
ＣＤ１２Ｂ化合物は、ＨＬＡ－Ａ２／ＨＬＡ－ＤＲ１発現トランスジェニックマウスにおいてＣＤ４＋Ｔ細胞応答を誘導することができ、非連結形態で、溶液中でアジュバントＣｐＧと組み合わせた配列番号１の投与と比較して、改善されたＴ細胞応答をもたらす。マウスは抗ＭＴＴＥ抗体を誘導するためのプレワクチン接種を受けておらず、既存の抗ＭＴＴＥ抗体を有する動物では、ＣＤ１２Ｂに対する免疫応答が改善され得ると考えられる。データは、ＭＴＴＥ配列自体は、ＤＲＢ^＊０１連結Ｔ細胞応答を誘導することができるＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープを含有しないことを示す。

【0570】

実施例１５：血清反応陽性又は血清反応陰性のＨＬＡ－ＤＲ４動物におけるＣＤ２０Ｂコンジュゲートの免疫原性のインビボ評価
材料及び方法
Ｂ細胞エピトープとして配列番号７（ＭＴＴＥ）の３つのコピー及びＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープとして配列番号１を含む、ＣＤ２０Ｂコンジュゲートの免疫原性（表１０を参照されたい）を、血清反応陽性又は血清反応陰性の雌のＢ６．１２９Ｓ２－Ｈ２－Ａｂ１ｔｍ１ＧｒｕＴｇ（ＨＬＡ－ＤＲＡ／Ｈ２－Ｅａ，ＨＬＡＤＲＢ１＊０４０１／Ｈ２－Ｅｂ）１Ｋｉｔｏ系統マウスにおいて、調べた。Ｂ６．１２９Ｓ２－Ｈ２－Ａｂ１ｔｍ１ＧｒｕＴｇ（ＨＬＡ－ＤＲＡ／Ｈ２－Ｅａ，ＨＬＡＤＲＢ１＊０４０１／Ｈ２－Ｅｂ）１Ｋｉｔｏ系統マウスは、Taconic Biosciences A/Sから入手した。血清学的状態は、マウスにおけるＭＴＴＥに対する既存の抗体の有無を指す。ＩＦＡ中のペプチド（配列番号７、ＭＴＴＥ）ハプテン化オボアルブミン（ＯＶＡ）を使用して、プレワクチン接種を行った。したがって、ＭＴＴＥ－ＯＶＡを免疫原として使用してマウスを免疫化し、ＭＴＴＥ配列に対する抗体を得、血清反応陽性動物を得た。免疫化は、ＩＦＡ中で１：１の比率で乳化したＰＢＳ中の７５μｇのＭＴＴＥ－ＯＶＡの溶液を使用して実施した。これを、血清反応陽性グループにつき０日目及び１４日目にマウスの尾根部に皮下投与し、一方、血清反応陰性グループは、ＭＴＴＥ－ＯＶＡ／ＩＦＡに曝露されなかった。最後のＭＴＴＥ－ＯＶＡ投与の６日後、血清反応陽性グループ及び血清反応陰性グループの両方に、滅菌緩衝溶液中の６０μｇ（およそ３ｎｍｏｌ）のＣＤ２０Ｂを尾部基部に初回刺激注射として投与した。ＣＤ２０Ｂの追加刺激注射は、ＣＤ２０Ｂの第１の注射の７日後に投与した。最後の注射から７日後、マウスを屠殺し、さらなる分析のために脾細胞を単離した。血液サンプルは、エンドポイントの日の心採血と併せて、ＭＴＴＥ－ＯＶＡワクチン接種の前後及び各ＣＤ２０Ｂ投与の前後に採取した。

【0571】

培地（完全増殖培地）に放出された応答Ｔ細胞及びＩＦＮ－ガンマの頻度を示すために、脾臓を使用してエクスビボELISpotを実施した。Ｔ細胞培地（RPMI 1640、Life Technologies／Thermo Fisher Scientific、１％ｗ／ｖ Ｌ－グルタミン（SLS／Lonza）、１０％ｖ／ｖ ＦＢＳ（Fisher／GE Healthcare）、２％ＨＥＰＥＳ（SLS／Lonza）、０．１％ｖ／ｖ Fungizone（Promega））を使用して脾臓を洗い流し、その後、濾過器に通して組織片を除去し、３００ｇで１０分間遠心分離した。細胞ペレットを、計数及びプレーティングのためにＴ細胞培地に再懸濁した。全てのペプチドは、最終濃度１０μｇ／ｍＬで使用した。インビトロで４８時間刺激した後のワクチン誘導応答性細胞の頻度を、マウスＩＦＮ－γ ELISpotキット（Mabtech）を使用して測定した。このために、膜貫通型９６ウェルMilliporeプレートを、製造元のプロトコルに従って捕捉抗体でプレコートした。各実験では、０．５ｘ１０^６脾細胞／ウェルを、４ウェル＋／－１０μｇ／ｍＬのペプチドでプレーティングした。ブドウ球菌エンテロトキシンＢ（Staphylococcal Enterotoxin B、ＳＥＢ）を陽性対照として使用した。培地のみの細胞を陰性対照として使用した。

【0572】

ELISpotアッセイの刺激には、以下のペプチドを使用した。
・配列番号１（Ｐ７１９－２０）：ＡＬＦＳＶＬＮＹＥＲＡＲＲＰＧＬＬＧＡＳＶＬＧＬＤＤＩＨＲＡ（純度９６％）
・配列番号１５０（ＵＶ１６）：ＦＳＶＬＮＹＥＲＡＲＲＰＧＬＬ（純度９５％）（ＨＬＡ－ＤＲ４）
・配列番号１５２（ＵＶ１８）：ＶＬＮＹＥＲＡＲＲＰＧＬＬＧＡ（純度９５％）（ＨＬＡ－ＤＲ４）
・配列番号１５３（ＵＶ１９）：ＲＰＧＬＬＧＡＳＶＬＧＬＤＤＩ（純度９５％）（ＨＬＡ－ＤＲ４）

【0573】

抗ＭＴＴＥ抗体力価のＥＬＩＳＡ測定は、以下のプロトコルに従って実施した：
１．ストレプトアビジンでコーティングされたＥＬＩＳＡプレートを、プレートのレイアウトに従って１００μｌのビオチン化ペプチド（ＰＢＳで希釈したＭＴＴＥ－ビオチン１ｎｍｏｌ／ｍｌ）でコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。
２．プレートを２５０μｌのＰＢＳ／０．０５％ Tween20で４回洗浄した。
３．プレートを２００μｌのＰＢＳ／１０％ＢＳＡ／０．０５％ Tween20でブロッキングし、室温（ＲＴ）で１時間インキュベートした。
４．プレートを２５０μｌのＰＢＳ／０．０５％ Tween20で４回洗浄した。
５．血漿をＰＢＳ／１％ＢＳＡ／０．０５％ Tween20で希釈した（最初は１：５０、続いて２倍希釈で１００倍、２０倍希釈で１０００倍）。１ウェルあたり１００μｌの希釈上清を加え、室温で２時間インキュベートした。
６．プレートを２５０μｌのＰＢＳ／０．０５％ Tween20で４回洗浄した。
７．１ウェルあたり１００μｌの二次抗体ヤギ抗マウスＩｇ－ＨＲＰを加え、ＰＢＳ／１％ＢＳＡで１：５０００に希釈し、室温、暗所で１時間インキュベートした。
８．プレートを２５０μｌのＰＢＳ／０．０５％ Tween20で４回洗浄した。
９．１ウェルあたり１００μｌのＴＭＢを加え、１００μｌの１Ｍ Ｈ_２ＳＯ_４で反応を停止した。吸光度を４５０～５７０ｎｍで読み取った。展開時間は、ＭＴＴＥ－ＯＶＡで免疫化したマウスからの血清を有するプレートについては３分、ＣＤ２０Ｂで免疫化したマウスからの血清を有するプレートについては４分であった。

【0574】

結果
図１７Ａは、実験終了時のマウスにおける抗ＭＴＴＥ抗体レベルを示す。マウスはＭＴＴＥ－ＯＶＡでプレワクチン接種されているか、又はＭＴＴＥ－ＯＶＡでプレワクチン接種されていなかったが、全てプライムブースト設定でＰＢＳ中の６０μｇのＣＤ２０ｂに曝露された。有意性は、マン・ホイットニー検定^＊ｐ＝０．０２８６によって評価された。図１６Ａに示すように、ＭＴＴＥ－ＯＶＡに曝露されていないマウスは、ＭＴＴＥ配列に対する抗体を発現せず、その後のＣＤ２０Ｂコンジュゲートへの曝露時にＭＴＴＥ配列に対する抗体応答を開始することができなかった。しかし、ＭＴＴＥ－ＯＶＡに曝露されたマウスは、ＭＴＴＥ－ＯＶＡ／ＣＤ２０Ｂワクチン接種サイクル後に高力価の抗ＭＴＴＥ抗体を有していた。

【0575】

配列番号１からのペプチド断片（ＵＶ１８及びＵＶ１９）に対するＴ細胞応答が、ＣＤ２０Ｂ曝露前後の抗ＭＴＴＥ力価の増加と相関するかどうかを評価するために、図１７Ｂに示すように、相関分析を実施した。図１７Ｂを参照すると、ｘ軸は、血清反応陽性動物のＣＤ２０Ｂ曝露前後（抗体反応を評価する際の血清の１：１０００希釈）の抗ＭＴＴＥ ＯＤ値の倍率変化と、ＵＶ１８とＵＶ１９を組み合わせたペプチド混合物による刺激に対するＴ細胞応答とのその相関を示す。相関関係は高く、ピアソンｒは０．９３４８である。プロットされた曲線は、最良適合線の９５％信頼帯を有する単純回帰線である。分析は、Graph pad prismを使用して実施した。したがって、抗ＭＴＴＥ力価の増加と、配列番号１のペプチドに対するＴ細胞応答との間に強い相関関係がある。

【0576】

図１７Ｃ及び１７Ｄは、配列番号１からのペプチドによる刺激後のＴ細胞応答を示す。ＵＶ１８／１９の組み合わせ（図１７Ｃ）又はＵＶ１６単独（図１７Ｄ）。血清反応陰性グループは、ＲＯＵＴを使用した外れ値分析後の上記の分析で除去された外れ値を示した（Ｑ＝２％）。図１７Ｃ及び１７Ｄに示すように、３ｎｍｏｌの用量でＣＤ２０Ｂに曝露された血清反応陽性動物においてＴ細胞応答が観察された。対照的に、ＣＤ２０Ｂに曝露された血清反応陰性動物は、ＵＶ１８／ＵＶ１９又はＵＶ１６刺激に対する応答によって測定されるＴ細胞応答を開始しなかった。ＣＤ２０Ｂに曝露された血清反応陽性動物におけるＴ細胞応答は、はるかに高い用量（２２ｎｍｏｌ）の、ＩＦＡ及びＣｐＧ中に配合された配列番号１（Ｐ７１９－２０）のペプチドを単独（すなわち非コンジュゲート）で投与された動物で測定されたものとほぼ等しかった。

【0577】

考察
データは、トランスジェニックＨＬＡ－ＤＲ４マウスが、ＣＤ２０Ｂコンジュゲートでワクチン接種された場合、配列番号１（Ｐ７１９－２０）に対する効率的なＴ細胞応答を開始できることをサポートする。Ｔ細胞応答は血清反応陽性動物にのみ存在し、これは、抗原／抗体複合体形成が細胞（すなわちＴ細胞）免疫応答を駆動するものとして機能することを示唆している。配列番号１（ＣＤ２０Ｂ）を含むコンジュゲートの投与は、配列番号１の非コンジュゲートペプチドにつき要するものよりもおよそ７倍低い用量で効率的なＴ細胞応答を促進することができる。

【0578】

ＣＤ２０Ｂ曝露（初回／追加ワクチン接種）前と比較したＣＤ２０Ｂ曝露後の抗体レベルの増加は、血清反応陽性マウスにおけるＴ細胞応答と相関している。これは、コンジュゲートの投与前と比較して、コンジュゲートの投与後の抗体レベルの増加が、Ｔ細胞免疫応答の存在を示すために使用できることをサポートする。したがって、コンジュゲート曝露後のそのような抗体の増加は、より複雑な細胞アッセイのリードアウトの代わりとなり、臨床試験における免疫応答者のリードアウトを簡素化し得る。

【0579】

実施例１６
この例は、トランスジェニックＨＬＡ－Ａ２／ＨＬＡ－ＤＲ１動物における３＋１コンジュゲート又は３＋１＋１コンジュゲート又はＧＶＥｘｔ５ペプチド＋ＩＦＡの形態の配列番号１１６（ＵＶ３４－ＧＶＥｘｔ５）のペプチドの免疫原性のインビボ評価に関する。

【0580】

材料及び方法
以下の形態のＧＶＥｘｔ５ペプチドの免疫原性：ＣＤ２９（３＋１）［Ｂ細胞エピトープとしてＵＶ３０（ＭＴＴＥ）（配列番号７）の３個のコピー、ＵＶ３４（ＧＶＥｘｔ５）（配列番号１１６））Ｔ細胞エピトープ］又はＴＦＡ－３＋１＋１コンジュゲート［Ｂ細胞エピトープとしてＵＶ３０（ＭＴＴＥ）の３つのコピー、Ｔ－細胞エピトープとしてｐ７１９－２０（配列番号１）及びＵＶ３４（ＧＶＥｘｔ５）を含む）細胞エピトープを含む］。血清学的状態は、オボアルブミン（ＯＶＡ）にコンジュゲートしたＭＴＴＥペプチドによるワクチン接種後のマウスにおけるＭＴＴＥに対する既存の抗体の有無を指す。

【0581】

ＵＶ３４（ＧＶＥｘｔ５）ネイキッドペプチド（配列番号１１６）は、血清反応陰性の雌及びオス（研究開始時に生後０８～０９週齢）Ｂ２ｍ，Ｔｇ（ＨＬＡ－Ａ／Ｈ２－Ｄ／Ｂ２Ｍ）１Ｂｐｅ，Ｔｇ（ＨＬＡ－ＤＲＡ^＊０１０１，ＨＬＡ－ＤＲＢ１^＊０１０１）１Ｄｍａ，Ｈ２－Ａｂ１（EMMA Repository, Orleans, FRANCE）系統のマウスにおいて調べた。

【0582】

後にＣＤ２９（４．１ｎｍｏｌ）又は３＋１＋１（３．７ｎｍｏｌ）コンジュゲートの形態でＵＶ３４を投与する予定のマウスのグループへのプレワクチン接種を、ＩＦＡ中のオボアルブミン（ＯＶＡ）にコンジュゲートしたＭＴＴＥペプチドを使用して実施した。したがって、ＭＴＴＥ－ＯＶＡを免疫原として使用してマウスを免疫化し、ＭＴＴＥ配列に対する抗体を誘導した。免疫化は、ＩＦＡ中で１：１の比率で乳化したＰＢＳ中の７５μｇのＭＴＴＥ－ＯＶＡを使用して実施した。エマルションを、血清反応陽性グループにつき０日目にマウスの尾根部に皮下投与した。ＰＢＳ中のネイキッドＵＶ３４を受ける予定の血清反応陰性対照グループには、プレワクチン接種としてのみ、１：１の比のＩＦＡとＣｐＧ（２５ｕｇ）（参照アジュバントとして）を含むエマルションで投与した。

【0583】

ＭＴＴＥ－ＯＶＡ投与（プレワクチン接種）の２１日後、血清反応陽性グループに、コンジュゲートＣＤ２９を投与した［６０μｇ／マウス＝４．１ｎｍｏｌ；１００μＬ／マウス、ｎ＝４］又はＴＦＡ－３＋１＋１［３＋１＋１、１１２．５μｇ／マウス＝３．７ｎｍｏｌ；９０μＬ／マウス、ｎ＝４］。血清反応陰性マウスにＵＶ３４を投与した［１４ｕｇ／マウス＝４．１ｎｍｏｌ；１００μＬ／マウス；ｎ＝４］。コンジュゲート及びポリペプチドを、プライマー注射としてマウス（それぞれのグループ）の尾根部に皮下注射として投与した。ＣＤ２９、ＴＦＡ－３＋１＋１コンジュゲート及びポリペプチドＵＶ３４の２回の追加刺激注射を、図２１のスケジュールに従って、各追加刺激間に１週間の間隔を置いて（それぞれのグループのマウスに）投与した。終了日に、脾臓及び流入領域リンパ節（腸骨、鼠径部及び補助）を採取し、これらの器官のプール単一細胞懸濁液をマウスごとに別個に調製した。

【0584】

ワクチン接種スケジュールを図２１に概略的に示す。

【0585】

Ｔ細胞培地（RPMI 1640、Life Technologies／Thermo Fisher Scientific、１％ｗ／ｖ Ｌ－グルタミン（SLS／Lonza）、１０％ｖ／ｖ ＦＢＳ（Fisher／GE Healthcare）、２％ＨＥＰＥＳ（SLS／Lonza）、０．１％ｖ／ｖ Fungizone（Promega））を使用して脾臓を洗い流し、その後、濾過器に通して組織片を除去し、３００ｇで１０分間遠心分離した。細胞ペレットを、計数及びプレーティングのためにＴ細胞培地に再懸濁した。

【0586】

まずリンパ節を２ｍＬのＴ細胞培地を含有するペトリ皿上で押しつぶし、次いで滅菌シリンジの背部を使用してEASYstrainer１００μＭを通し、フィルターを１ｍＬのＴ細胞培地ですすいだ。細胞を３００ｇで１０分間遠心沈殿させた。ペレットを、計数及びプレーティングのために２ｍＬのＴ細胞培地に再懸濁した。

【0587】

選択されたポリペプチド（表１２に示されるとおり）によりインビトロで４８時間刺激した後のワクチン誘導応答性細胞の頻度を、マウスＩＦＮ－γ ELISpotキット（Mabtech）を使用して測定した。脾臓及びリンパ節を採取する１日前に、製造元のプロトコルに従って、ＩＦＮ－γ ELISpotアッセイ用の９６ウェルELISpotプレート（Millipore）を捕捉抗体でプレコートした。ＰＢＳ／Tweenで５回洗浄し、１％ｗ／ｖ Ｌ－グルタミン（SLS／Lonza）、１０％ｖ／ｖ ＦＢＳ（Fisher／GE Healthcare）、２％ＨＥＰＥＳ（SLS／Lonza）、０．１％ｖ／ｖ Fungizone（Promega）を含有するRPMI1640（Life Technologies／Thermo Fisher Scientific）を含むＴ細胞培地で最低３０分間ブロッキングした後、０．５ｘ１０^６／ウェルの新たに単離した脾細胞＋リンパ節細胞を、最終濃度１０μｇ／ｍｌ又は１μｇ／ｍｌ（ペプチドＵＶ６４及びＵＶ６５について）のそれぞれのＳＬＰ１００μｌとともにプレートに三重に播種した。次いで、細胞を５％ＣＯ_２インキュベーター中３７℃で４８時間インキュベートし、その後、プレートをＤＰＢＳＴで５回洗浄した。次いで、マウスＩＦＮγに対する５０μｌ／ウェルのビオチン化検出抗体（１／１０００希釈）を加え、プレートを室温で２時間インキュベートした。次いで、プレートをＤＰＢＳＴで５回洗浄し、続いて５０μｌ／ウェルのストレプトアビジンアルカリホスファターゼ（１／１０００希釈）を加えた。次いで、プレートを室温で１時間３０分間インキュベートした。インキュベーション後、プレートを再度ＤＰＢＳＴで６回洗浄し、次いで５０μｌ／ウェルの展開溶液５（ＢＣＩＰ／ＮＢＴ、Superblock T20（Thermo Scientific））を加えた。スポットが見えるまで、プレートを室温で暗所に放置した。スポットが発生したら、プレートを水道水ですすぐことによって反応を停止した。次いで、プレートを放置して乾燥させ、ELISpotプレートリーダー（Cellular Technology Limited, Shaker Heights, OH, USA）を使用してスポットを定量した。様々な糖タンパク質、糖脂質及び糖に見出されるアルファ－Ｄ－グルコース及びアルファ－Ｄ－マンノース部分に結合し、強力な白血球マイトジェンであるレクチン（タチナタマメ（Jack bean）、タチナタマメ（Canavlia ensiformis）から単離）、コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）を陽性対照として１μｌ／ｍｌで使用した。未刺激の脾細胞（細胞のみ）を、各ELISpotアッセイの陰性対照として使用した。全ての実験は３回繰り返して実施した。

【0588】

【表14】

【0589】

結果
図２２Ａ及びＢは、脾細胞リンパ節培養物のプールされたＴ細胞応答を、個々のポリペプチド培養物刺激を組み合わせた結果とともに示す。結果は、マン・ホイットニー検定^＊ｐ＝０．０３３を使用して、ペプチドの不存在下（細胞のみ）と比較して、ＣＤ２９及びＴＦＡ－３＋１＋１（コンジュゲート）に曝露された動物におけるＴ細胞応答が、測定可能で有意に上昇していることを示す。図２２Ｃは、ＵＶ３４ポリペプチド＋ＩＦＡで免疫化したマウスからの、細胞のみと比較した、ポリペプチドのＵＶ３４内の様々な長さの単一ポリペプチド配列で刺激した培養物に対する脾細胞－リンパ節共培養物応答の合計の比較を示す。

【0590】

考察
データは、Ｂ細胞エピトープとしてＵＶ３０（ＭＴＴＥ）（配列番号７）の３つのコピーを含む、ＣＤ２９又は３＋１＋１コンジュゲートでワクチン接種した場合、トランスジェニックＨＬＡ－ＤＲ１血清反応陽性マウスからの脾細胞リンパ節培養物が、ＵＶ３４（ＧＶＥｘｔ５）（配列番号１１６）由来のペプチド（エピトープ）に対する強力及び有意に上昇した免疫応答を開始することを示している。

【0591】

実施例１７
この例は、ＧＶ１００１（ＵＶ８０－配列番号１２６）とＧＶＥｘｔ５（ＵＶ３４－配列番号１１６）によるワクチン接種の違いの特定に関する。

【0592】

マウスには配列番号１２６（ＧＶ１００１－ＵＶ８０）又は配列番号１１６（ＵＶ３４－ＧＶＥｘｔ５）のポリペプチドを投与した。投与されたペプチドの濃度が１６．４ｎｍｏｌであり、マウスが全て雌であったことを除いて、実施例１６と同じプロトコルを使用した（ｎ＝４）。

【0593】

結果
図２３及び２４は、個々のペプチドに対するＴ細胞応答を示すグラフである。水平破線は、ベースラインとみなされる「細胞単独」の応答レベルである「カットオフ」を示す。カットオフライン／ベースラインを超えるペプチドのバーは、特定のペプチドに対するＴ細胞応答とみなされる。各グループの「細胞のみ」が内部カットオフ点として機能する。

【0594】

図２３の閾値を超えるペプチド（投与された配列番号１２６－ＧＶ１００１）は、ＵＶ５７である。図２４の閾値を超えるペプチド（投与された配列番号１１６－ＧＶＥｘｔ５）は、ＵＶ３６、ＵＶ５７、ＵＶ５８、ＵＶ５９、ＵＶ６０、ＵＶ６４及びＵＶ６６である。

【0595】

個々の結果を図２５に示し、各ペプチドに対する平均Ｔ細胞応答がどのように計算されたかを示す。

【0596】

【表15】

【0597】

【表16】

【0598】

知見の説明：
ＧＶ１００１（ＵＶ８０）ワクチン接種グループ：
マウスＭ１０は、ELISPOTプレート内の真菌汚染のため評価できなかった。評価可能な３匹のマウスでは、一般に、免疫応答がないか、弱い免疫応答がった。Ｍ９及び１２は、試験したペプチドのいずれにも応答しなかった。Ｍ１１はＵＶ５７に対してわずかな免疫応答を示したが、このペプチドはワクチン接種に使用されるＧＶ１００１と配列相同性を全く共有していないため、弱い反応性はバックグラウンド変動の結果であり得る。

【0599】

結論：ＧＶ１００１は、マウスで使用される標準的なアジュバントと組み合わせた場合、ＨＬＡ－Ａ２／ＤＲ１トランスジェニックマウスにおいてわずかな免疫応答を示す。

【0600】

ＧＶ１００１ Extension-5（ＵＶ３４）ワクチン接種グループ：
マウスＭ１６は、ＵＶ３４と５個のアミノ酸の重複があるＵＶ５７及びＨＬＡ－Ａ２結合モチーフを有する、ＵＶ３４に埋め込まれた１０量体ペプチド由来のＵＶ６５に対してわずかな免疫応答を示した。

【0601】

マウスＭ１５は、いくぶん広範囲に応答し、ＧＶ１００１の配列に対するExtension 5 Ｎ末端に新しいエピトープを含有し、ＧＶ１００１と５個のアミノ酸の重複を有する、ＵＶ５８を認識した。このマウスからの細胞は、Ｃ末端Ｋの不存在を除いてＧＶ１００１と同一である、ＵＶ５９にも応答した。興味深いことに、ＧＶ１００１は認識されず、ＧＶ１００１に存在するこのアミノ酸（すなわちＣ末端リジン残基）がＨＬＡ－ＤＲ１への結合に不利である可能性があることを示す。ペプチドＵＶ６０も認識された。このペプチドは、ＧＶ１００１と重複する６個のアミノ酸及びＵＶ３４に特有の１０個のアミノ酸を有し、したがって、ＧＶ Extension 5（配列番号１１６）における新しいエピトープを表す。

【0602】

マウスＭ１３及びマウスＭ１４は、同様のペプチド認識パターンで非常に強い応答性を示した。どちらもＵＶ３６、ＵＶ５７、ＵＶ５８、ＵＶ６４及びＵＶ６６を認識した。ＵＶ３６は、ＵＶ３４に特有の追加の４個のアミノ酸を有する全長ＧＶ１００１配列を含有する。これら２匹のマウスはＧＶ１００１（ＵＶ８０）を認識できなかったため、本発明者らは、これらのデータは、Extension 5からのこれら４つのアミノ酸とＧＶ１００１のアミノ酸を組み合わせると、ＨＬＡ－ＤＲ１提示の状況で認識される新規エピトープが作成されることを意味すると解釈する。唯一の共通アミノ酸としてＵＶ３４と５個のアミノ酸の重複を有するＵＶ５７は、これらのアミノ酸が、短いが特に強力な結合モチーフを表し得ることを示す。ＵＶ５８は、３匹全ての応答マウスがこのペプチドを認識するため、優れたエピトープとしても際立っている（上記を参照されたい）。９量体ＨＬＡ－Ａ２エピトープであるＵＶ６４もこれらのマウスによって認識され、新しいＨＬＡ－Ａ２エピトープが同定された。最後に、両方のマウスは、ＧＶ１００１と１４個のアミノ酸が重複するＵＶ６６を認識した。修飾は、Extension 5からのＮ末端Ｒ残基の付加及びＣ末端からのＰＫの除去である。繰り返しになるが、これらの修飾が２匹のマウスによって認識されたのに対し、ＧＶ１００１では認識されなかったことは興味深い。最も幅広い認識レパートリー及び最も多くのスポット形成細胞を示したマウスＭ１４は、ＵＶ５９及びＵＶ６０も認識した。ＵＶ５９は、ＧＶ１００１のＣ末端Ｋ残基を有しないバージョンである。繰り返しになるが、これは、このアミノ酸の存在がＨＬＡ－ＤＲ１提示と不適合であることを示す。ＵＶ６０の認識については、上記のＭ１５を参照されたい。

【0603】

結論：ＧＶ１００１ Extension 5（配列番号１１６）は、ＨＬＡ－ＤＲ１／Ａ２トランスジェニックマウスにおいて高い免疫原性を有する。免疫化マウスの反応性パターンによって明らかなように、このワクチンペプチド内の複数のエピトープの存在により、強力な免疫原性が得られる。これらのエピトープは、部分的にＧＶ１００１ Extension 5（配列番号１１６）に存在するが、ＧＶ１００１（配列番号１２６）には存在しないアミノ酸からなり、驚くべきことに、ＵＶ５９及びＵＶ６６によって例示される、ＧＶ１００１に存在するエピトープも含む。本発明者らは、ＧＶ１００１でのワクチン接種によるこの後者のグループのペプチドに対する免疫応答の生成の欠如は、抗原プロセシング細胞におけるペプチドのプロセシング、おそらくＣ末端の塩基性アミノ酸のリジン（Ｋ）をＧＶ１００１から除去する能力に関連していると解釈する。これは、ＧＶ１００１ Extension 5のＣ末端部分に存在するがＧＶ１００１には存在しないさらなるアミノ酸に依存している可能性があるためである。重要なことに、ＨＬＡ－Ａ２結合ペプチドとしてデザインされたペプチドＵＶ６４（９量体）及びＵＶ６５（１０量体）は、ＧＶ１００１ Extension 5によるワクチン接種後にも認識され、このワクチンペプチドの有効性がＣＴＬ応答の誘導を含むように拡大された。

【0604】

実施例１８
この実施例は、ｈＴＥＲＴ由来のＢ細胞エピトープ及び２つのＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープを含む３＋１＋１コンジュゲートがＢ細胞エピトープに特異的なポリクローナル抗体によって結合されることを示す。

【0605】

Ｂ細胞エピトープ（ＭＴＴＥ－配列番号７）及びｈＴＥＲＴ由来の２つのＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープ（ｐ７１９－２０（配列番号１）及びＧＶＥｘｔ５（ＵＶ３４；配列番号１１６）を含むコンジュゲートをＥＬＩＳＡで試験して、ＭＴＴＥに特異的な抗体によるコンジュゲートの結合を評価した。

【0606】

材料及び方法
サンドイッチＥＬＩＳＡ技術を使用して、以下のプロトコルを使用してコンジュゲートに結合するヒトポリクローナル抗体を評価した。間接ＥＬＩＳＡ，３０では、試験されるコンジュゲートがプレート上にコーティングされたのに対し、サンドイッチＥＬＩＳＡでは、試験される配列番号１のポリペプチドを含むコンジュゲートが配列番号１に特異的なウサギポリクローナル抗体を介してプレート上に捕捉されたことを理解されたい。

【0607】

サンドイッチＥＬＩＳＡ：サンドイッチＥＬＩＳＡは、以下の手順に従ってスウェーデンのCapra Scienceによって実施した。Thermo Scientific（商標）透明平底免疫非滅菌９６ウェルプレートを使用し、ポリクローナルウサギ抗ｐ７１９－２０又はポリクローナルウサギ抗ＧＶＥｘｔ５抗体（１ウェルあたり０．５μｇ）合計５０μｌ／ウェルでコーティングし、一晩、４℃でインキュベートした。タンパク質を含まないブロッキング溶液（Pierce）を使用してプレートを室温で１時間５分ブロッキングし、続いてＰＢＳ及び０．０５％ Tween洗浄溶液を使用して洗浄した。コンジュゲートを、示された濃度で、段階希釈でプレートに加え、室温で１時間インキュベートした。続いて、プレートを洗浄溶液で洗浄し、次いでTetaQuin（登録商標）（高力価抗破傷風ドナーからのポリクローナルヒトＩｇＧ又は１０のモノクローナル組換えキメラ抗ＭＴＴＥ抗体に基づく抗ＭＴＴＥ抗体とともにインキュベートした。プレートを洗浄溶液で洗浄し、その後、二次抗体、ヤギ抗ヒトカッパＡＬＰを、１％ＢＳＡを含むＰＢＳ溶液に加えた。二次抗体との１時間のインキュベーション後、プレートを再度洗浄バッファーで洗浄し、基質ＰＮＰＰ（１ｍｇ／ｍｌ）とともに室温で１時間インキュベートして、アッセイを展開した。

【0608】

結果

【0609】

【表17】

【0610】

【表18】

【0611】

図２６及び２７はグラフであり、表１５及び１６は、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープとして、ポリペプチドｐ７１９－２０（配列番号１）及びＧＶＥｘｔ５（配列番号１１６）を含むコンジュゲートを使用するサンドイッチＥＬＩＳＡアッセイにおける抗ＭＴＴＥポリクローナル抗体の結合を示す表である。図２６及び表１５に関し、捕捉抗体は、抗ｐ７１９－２０ウサギポリクローナルであった。図２７及び表１６に関し、捕捉抗体は、抗ＧＶＥｘｔ５ウサギポリクローナルであった。ＣＤ０９は、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープを含まず、陰性対照として使用した。図２６及び２７に示すように、ポリペプチドｐ７１９－２０（配列番号：１）及びＧＶＥｘｔ５（配列番号１１６）を含む、３つのバッチ２１Ｅ３２９９（合成例２０）、２１Ｅ３３０（合成例２１）及び２１Ｅ３３０１（合成例２２）のそれぞれからの３＋１＋１コンジュゲートは、ＭＴＴＥを認識するヒトポリクローナル抗体（血漿産物TetaQuinから）によって結合された。

【0612】

実施例１９
この例は、ＴＦＡ、ＨＣＬ及び酢酸塩形態のコンジュゲートの結合を評価するための結合アッセイに関する。

【0613】

実験手順
・コンジュゲートＵＶＣ２－００１（すなわちＣＤ２９、ＧＶＥｘｔ５（配列番号１１６）を含有するコンジュゲート）及びＵＶＣ１－０１７（すなわちＣＤ２０Ｂ、ｐ７１９－２０（配列番号１）を含有するコンジュゲート）の再構成：先使用、Ｅ－トキセート水
・コーティングバッファー：ＰＢＳ
・一次抗体：ＣＤ０１（モノクローナルｈＩｇＧ１抗ＭＴＴＥ）又はＦＦ１０（ヒトポリクローナル抗ＭＴＴＥ血清）
・二次抗体：ヤギ－抗Ｈｕカッパ軽鎖－ＨＲＰ
・リードアウト：吸光度（４５０ｎｍ～５７０ｎｍ）

【0614】

表１７は、コンジュゲートのｐＨを示す。水中で再構成した後のコンジュゲートのｐＨは、各塩形態の２つのコンジュゲート（ＵＶＣ１－０１７（ＣＤ２０Ｂ）及びＵＶＣ２－００１（ＣＤ２９））間で同じである。作業溶液をＰＢＳで希釈し、試験した全てのコンジュゲートのｐＨは７であった。結果は、図２８～３１にも示される。

【0615】

【表19】

【0616】

実施例２０
この実施例は、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを保有する合成長鎖ペプチド（ＳＬＰ）にコンジュゲートしたＢ細胞エピトープＭＴＴＥを含むペプチドコンジュゲートワクチンであるTENDUを受けた患者において測定された抗ＭＴＴＥ ＩｇＧ抗体に関する。

【0617】

材料及び方法
ワクチン接種
TENDUワクチンは、それぞれが３コピーのＢ細胞エピトープ（ＭＴＴＥ）と、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを含むＳＬＰとを含有するコンジュゲートを含む。TENDU試験に参加した患者は全員、TENDUワクチン接種開始の１週間前、スクリーニング来院時にBoostrixの投与を受け、その後、各投与間で２週間の間隔を空けてTENDUワクチンを４回接種した。この実施例では、TENDUワクチンは、Ｂ細胞エピトープとして３つのＭＴＴＥ（配列番号４６）ペプチドと、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープとして、ＬＵＧ１（配列番号４７）、ＬＵＧ３（配列番号４９）、ＬＵＧ４（配列番号５０）及びＬＵＧ５（配列番号５１）ペプチドの１つとを含むコンジュゲートをそれぞれ含有していた。試験は、TENDUワクチンの用量及び安全域をアドバイスするための用量漸増試験であった。４０、４００及び９６０μｇがそれぞれコホート＃１、コホート＃２及びコホート＃３に投与される。サンプルは、スクリーニング来院、来院２、来院４、来院５及び安全性来院（ワクチン接種の最後の投与から３０日後）時に収集された。現在までに、コホート＃３の全時点で登録及びサンプル採取された患者は、１人のみである。

【0618】

ＥＬＩＳＡ
ストレプトアビジンでコーティングされたプレート（Thermo Scientific、カタログ番号１５５０１）を、コーティングバッファー（０．２％ＨＳＡ、０．０５％ Tween-20、ＰＢＳ）で希釈した１μＭのビオチン化されたＭＴＴＥ又はｐ７２５ペプチド（配列番号５２）（参照陰性対照ペプチド）で、４℃で一晩コーティングした。翌朝、プレートをＰＢＳ／０．０５％ Tween-20で４回洗浄し、０．５ｍｇ／ｍＬのビオチン－Ｄ（０．２％ＨＳＡ、０．０５％ Tween-20、ＰＢＳに溶解）を用いて室温で１時間コーティングした。次いで、プレートを空にし（洗浄なし）、Pierce無タンパク質ブロッキング溶液（Thermo Scientific、カタログ番号３７５７２）を用いて室温で１時間ブロッキングし、洗浄バッファー（ＰＢＳ／０．０５％ Tween-20）で５回洗浄した。血漿希釈バッファー（０．２％ＨＳＡ、０．０５％ Tween-20、ＰＢＳ）で希釈した抗ＭＴＴＥ ＩｇＧ抗体標準、患者血清サンプル及びコントロールを二重にウェルに加え、室温で２時間インキュベートした。洗浄後、血漿希釈バッファーで希釈したＦｃ特異的ヤギ抗ヒトＩｇＧペルオキシダーゼ抗体（Sigma-Aldrich、カタログ番号Ａ０１７０ａ）を加え、プレートを室温で１時間インキュベートした。プレートを再度洗浄し、基質溶液をウェルに加えた。３０分後、４１５ｎＭで吸光度を読み取った。

【0619】

抗ＭＴＴＥ ＩｇＧ抗体に基づく標準曲線を、GraphPad Prismバージョン９．３．１ソフトウェア（GraphPadソフトウェア）を使用してプロットし、全ての患者サンプル及び対照の総ＩｇＧ濃度を計算するために使用した。全てのサンプルについて、血清ＩｇＧ濃度を計算するために１：２５の希釈が選択された。

【0620】

結果及び考察
データ（図３２を参照されたい）は、抗ＭＴＴＥ濃度がスクリーニング及び来院２の時に観察された濃度と比較して、来院４で顕著に上昇したことを示す。来院２では、抗ＭＴＴＥ濃度の顕著な増加は観察されなかった。これは、Boostrixの７日後、患者がTENDUワクチンの第１の用量を受ける前の時点である。大半の患者の抗ＭＴＴＥ濃度が増加し、来院４（TENDUワクチン接種開始後）以降のサンプルでは高いままであることが観察できるが、コホート＃１及び＃２では濃度は依然として低かったである。コホート＃３では、血清抗ＭＴＴＥ濃度が大きく上昇した。これはおそらく用量の増加の結果であり、免疫活性化が起こるのに十分な薬物曝露につながり、それによってＢ細胞エピトープに対するＴ細胞媒介性（ＣＤ４ヘルパーエピトープ）駆動型抗体応答が可能になった。データはウサギの研究（実施例８）と一致しており、破傷風トキソイドに曝露された全てのウサギは最高用量で大幅に上昇した抗ＭＴＴＥ濃度を示したが、より低い用量又は破傷風ナイーブのウサギは、TENDU曝露前のレベルと比較して、抗ＭＴＴＥ抗体レベルの一貫した増加を開始することができなかった。

【0621】

実施例２１
この実施例は、トランスジェニックＨＬＡ－Ａ２／ＨＬＡ－ＤＲ１動物におけるコンジュゲートの形態のＧＶＥｘｔ５ペプチド（配列番号１１６）及びペプチド＋ＩＦＡの免疫原性のインビボ評価に関する。

【0622】

材料及び方法
以下の形態のＧＶＥｘｔ５ペプチド（配列番号１１６）の免疫原性：ＣＤ２９コンジュゲート［Ｂ細胞エピトープとしてＵＶ３０（ＭＴＴＥ）（配列番号７）の３個のコピー及びＵＶ３４（ＧＶＥｘｔ５）（配列番号１１６）Ｔ細胞エピトープ］は、血清反応陽性又はネイキッドペプチド＋ＩＦＡの形態で血清反応陰性の雌のＢ２ｍ，Ｔｇ（ＨＬＡ－Ａ／Ｈ２－Ｄ／Ｂ２Ｍ）１Ｂｐｅ，Ｔｇ（ＨＬＡ－ＤＲＡ^＊０１０１，ＨＬＡ－ＤＲＢ１^＊０１０１）１Ｄｍａ，Ｈ２－Ａｂ１（EMMA Repository, Orleans, FRANCE）系統のマウスで調査した。血清学的状態は、オボアルブミン（ＯＶＡ）にコンジュゲートしたＭＴＴＥペプチドを使用したワクチン接種後のマウスにおけるＭＴＴＥに対する既存の抗体の有無を指す。

【0623】

ワクチン接種スケジュールは、図３３に概略的に示され、以下のように要約される：
・４×グループ１：首筋に、１：１ＩＦＡ中のＭＴＴＥ－ＯＶＡ（７５ｕｇ）、続いてマウス１匹あたり１００ｕＬでＣＤ２９（６０ｕｇ、４．１ｎｍｏｌ）をプレワクチン接種した。尾の付け根、両側で免疫化。
・４×グループ２：首筋に、ＩＦＡ、続いてマウス１匹あたり５０ｕＬでＩＦＡ（１：１）中のＵＶ３４（マウス１匹あたり１４ｕｇ、マウス１匹あたり４．１ｎｍｏｌ）をプレワクチン接種した。尾の付け根、両側で免疫化。

【0624】

プレワクチン接種は、ＩＦＡ中のオボアルブミン（ＯＶＡ）にコンジュゲートしたＭＴＴＥペプチドを使用して実施した。したがって、ＭＴＴＥ－ＯＶＡを免疫原として使用してマウスを免疫化し、ＭＴＴＥ配列に対する抗体を得、血清反応陽性動物を得た。免疫化は、ＩＦＡ中で１：１の比率で乳化したＰＢＳ中の７５μｇのＭＴＴＥ－ＯＶＡの溶液を使用して実施した。これを、血清反応陽性グループにつき０日目にマウスの尾根部に皮下投与した。血清反応陰性グループは、ＭＴＴＥ－ＯＶＡ／ＩＦＡに曝露されなかった。

【0625】

ＭＴＴＥ－ＯＶＡ投与（プレワクチン接種）の２１日後、血清反応陽性グループにコンジュゲートを投与した［グループ１：ＣＤ２９、６０ｕｇ／マウス＝４．１ｎｍｏｌ（１００μＬ／マウス）ｎ＝４］。血清反応陰性グループには、ＩＦＡ（参照アジュバントとして）と混合したポリペプチドＵＶ３４（グループ１のマウスと等モル）を投与した［グループ２：ＵＶ３４、１４ｕｇ／マウス＝４．１ｎｍｏｌ（１００μＬ／マウス）；ｎ＝４］。コンジュゲート及びポリペプチドを、プライマー注射としてマウス（それぞれのグループ）の尾根部に皮下注射として投与した。図３３に示すスケジュールに従って、プライマー注射の７日後（第１の追加刺激）及び１４日後（第２の追加刺激）に、ＣＤ２９コンジュゲート及びポリペプチドＵＶ３４の２回の追加刺激注射（後の２回の異なる機会）を（それぞれのグループのマウスに）投与した。終了日に、脾臓及び流入領域リンパ節（腸骨、鼠径部及び補助）を採取し、これらの器官の単一細胞懸濁液を調製した。

【0626】

Ｔ細胞培地（RPMI 1640、Life Technologies／Thermo Fisher Scientific、１％ｗ／ｖ Ｌ－グルタミン（SLS／Lonza）、１０％ｖ／ｖ ＦＢＳ（Fisher／GE Healthcare）、２％ＨＥＰＥＳ（SLS／Lonza）、０．１％ｖ／ｖ Fungizone（Promega））を使用して脾臓を洗い流し、その後、濾過器に通して組織片を除去し、３００ｇで１０分間遠心分離した。細胞ペレットを、計数及びプレーティングのためにＴ細胞培地に再懸濁した。

【0627】

まずリンパ節を２ｍＬのＴ細胞培地を含有するペトリ皿上で押しつぶし、次いで滅菌シリンジの背部を使用してEASYstrainer１００μＭを通し、フィルターを１ｍＬのＴ細胞培地ですすいだ。細胞を３００ｇで１０分間遠心沈殿させた。ペレットを、計数及びプレーティングのために２ｍＬのＴ細胞培地に再懸濁した。

【0628】

選択されたポリペプチド（表１３に示されるとおり）によりインビトロで４８時間刺激した後のワクチン誘導応答性細胞の頻度を、マウスＩＦＮ－γ ELISpotキット（Mabtech）を使用して測定した。このために、膜貫通型９６ウェルMilliporeプレートを、製造元のプロトコルに従って捕捉抗体でプレコートした。各実験では、０．５ｘ１０^６細胞（０．２５ｘ１０^６脾細胞＋０．２５ｘ１０^６プール流入領域ＬＮ細胞－共培養）／ウェルを３ウェル＋／－１０μｇ／ｍＬのペプチドでプレーティングした。コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）を陽性対照として使用した。培地のみの細胞を陰性対照として使用した。

【0629】

抗ＭＴＴＥ抗体力価のＥＬＩＳＡ測定は、以下のプロトコルに従って実施した：
１０．ストレプトアビジンでコーティングされたＥＬＩＳＡプレートを、プレートのレイアウトに従って１００μｌのビオチン化ペプチド（ＰＢＳで希釈したＭＴＴＥ－ビオチン１ｎｍｏｌ／ｍｌ）でコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。
１１．プレートを２５０μｌのＰＢＳ／０．０５％ Tween20で４回洗浄した。
１２．プレートを２００μｌのＰＢＳ／１０％ＢＳＡ／０．０５％ Tween20でブロッキングし、室温（ＲＴ）で１時間インキュベートした。
１３．プレートを２５０μｌのＰＢＳ／０．０５％ Tween20で４回洗浄した。
１４．血漿をＰＢＳ／１％ＢＳＡ／０．０５％ Tween20で希釈した（最初は１：５０、続いて２倍希釈で１００倍、２０倍希釈で１０００倍）。１ウェルあたり１００μｌの希釈上清を加え、室温で２時間インキュベートした。
１５．プレートを２５０μｌのＰＢＳ／０．０５％ Tween20で４回洗浄した。
１６．１ウェルあたり１００μｌの二次抗体ヤギ抗マウスＩｇ－ＨＲＰを加え、ＰＢＳ／１％ＢＳＡで１：５０００に希釈し、室温、暗所で１時間インキュベートした。
１７．プレートを２５０μｌのＰＢＳ／０．０５％ Tween20で４回洗浄した。
１８．１ウェルあたり１００μｌのＴＭＢを加え、１００μｌの１Ｍ Ｈ_２ＳＯ_４で反応を停止した。吸光度を４５０～５７０ｎｍで読み取った。展開時間は、ＭＴＴＥ－ＯＶＡで免疫化したマウスからの血清を有するプレートについては９０秒、ＵＶ３４で免疫化したマウスからの血清を有するプレートについては１５０秒であった。

【0630】

結果
図３４Ａは、実験終了時のマウスにおける抗ＭＴＴＥ抗体力価を表す。マウスは、ＭＴＴＥ－ＯＶＡでプレワクチン接種され、続いてコンジュゲートＣＤ２９で免疫化されているか（グループ１）、又はＭＴＴＥ－ＯＶＡでプレワクチン接種されておらず、ＩＦＡ（１：１ｖ／ｖ）中の等モル量のポリペプチドＵＶ３４（配列番号１１６）にのみ曝露されたかのいずれかであった。コンジュゲート及びペプチド＋ＩＦＡの免疫化スキームは、プライム－ブースト－ブースト設定で行われた。ＭＴＴＥ－ＯＶＡに続いてコンジュゲートＣＤ２９に曝露されていないマウスは、ＭＴＴＥ配列に対する抗体を発現せず、ＵＶ３４＋ＩＦＡへの曝露時にＭＴＴＥ配列に対する抗体応答を開始することができなかった。しかし、ＭＴＴＥ－ＯＶＡに曝露されたマウスは、ＭＴＴＥ－ＯＶＡ／ＣＤ２９ワクチン接種サイクル後に高力価の抗ＭＴＴＥ抗体を有しており、有意性は、マン・ホイットニー検定^＊ｐ＝０．０２８６によって評価された。図３４Ｂは、グループ１の個々のマウスにおける抗ＭＴＴＥ抗体力価を示す。実験期間中、マウス１及び３は、抗体力価の増加の程度は様々であったが、３回のＣＤ２９（プライム－ブースト－ブースト）の投与により、抗ＭＴＴＥ抗体力価の緩やかな増加を示した。マウス２では、初期の高い抗体力価は、時間とともにわずかに減少した。

【0631】

図３５は、７つの個別のポリペプチドＵＶ３６、ＵＶ５８、ＵＶ５９、ＵＶ６０、ＵＶ６４、ＵＶ６５及びＵＶ６６（表１３を参照されたい）による脾細胞－ＬＮ共培養の刺激が、マン・ホイットニー検定^＊ｐ＝０．０２８６を使用した試験用量で、ポリペプチドＵＶ３４＋ＩＦＡワクチン接種した動物（血清反応陰性）と比較して、ＣＤ２９（コンジュゲート）曝露動物（血清反応陽性）において測定可能な有意に上昇したＴ細胞応答を誘導したことを示す。図３６Ａは、ＵＶ３６ペプチド内の様々な長さのポリペプチド配列に対する、ＣＤ２９に曝露されたマウスのＴ細胞応答の合計が、マン・ホイットニー検定^＊ｐ＝０．０２８６を使用して、ポリペプチドＵＶ３４＋ＩＦＡに曝露されたマウスのＴ細胞応答の合計と比較して有意に上昇していることを示す。

【0632】

考察
データは、トランスジェニックＨＬＡ－ＤＲ１血清反応陽性マウスが、ＭＴＴＥ Ｂ細胞エピトープの３つのコピーを含むＵＶ３４コンジュゲート（ＣＤ２９）でワクチン接種した場合、ＩＦＡをアジュバントとして含む等モルのＵＶ３４ペプチドでワクチン接種した血清反応陰性マウスと比較して、ＵＶ３４（ＧＶＥｘｔ５－配列番号１１６）由来のペプチド（エピトープ）に対して優れたＴ細胞応答を開始することを示している。

【0633】

ＧＶｅｘｔ５（配列番号１１６）は、ｈＴＥＲＴ配列に由来する９個のＮ末端アミノ酸及び４個のＣ末端アミノ酸を有するＧＶ１００１（配列番号１２６）の伸長バージョンである。ＧＶＥｘｔ５の長さは、ＧＶ１００１よりも８１％長い。

【0634】

ワクチン接種動物からの細胞を、長さ２０、１５、１４、１０又は９アミノ酸の７つの特定の個別ペプチドで刺激すると、Ｔ細胞応答が観察された（表１３を参照されたい）。試験した全てのペプチドについて、ＩＦＡのExtension 5と比較して、Extension 5コンジュゲートでワクチン接種した動物で優れたＴ細胞応答が見られた。興味深いことに、これらの実験は、ＵＶ６４（表１３）で表され、ＵＶ５８及びＵＶ６０を除く試験した全てのペプチドに存在する、ＧＶ１００１配列のコア結合モチーフも同定する（表１３）。重要なことに、これら２つのペプチドは、ＧＶ１００１には存在しない、Extension 5に存在する１０個のＮ末端アミノ酸（ＵＶ５８）及び４個のＣ末端アミノ酸（ＵＶ６０）を含有する。Extension 5コンジュゲートによるワクチン接種後のこれら２つのペプチドの認識は、Extension 5がそれぞれＮ及びＣ末端の隣接アミノ酸によって定義される新規エピトープを含有することを示す。これらのデータは、Extension 5のＧＶ１００１よりも優れた免疫原性のさらなるエビデンスを提供する。興味深いことに、ＵＶ６０の認識は、ＧＶ１００１への４つのＣ末端アミノ酸ＰＤＧＬ（配列番号１７８）の付加が、追加の５つのアミノ酸のＣ末端「テール」（ＲＰＩＶＮ（配列番号１７７））を含有するペプチドの認識をもたらすことを意味し、これは、ｈＴＥＲＴ配列中に存在するが、ワクチン接種に使用されるExtension 5ペプチド配列には存在しない。これは、ワクチン接種のデザインにより標的抗原を認識できる特定のＴ細胞のレパートリーを広げ得る、さらなるメカニズムを表す。

【0635】

この実施例は、ＯＶＡ－ＭＴＴＥプレワクチン、続いてＣＤ２９コンジュゲートを投与されたマウスにおいてのみ、実験終了時の抗ＭＴＴＥ抗体力価の上昇を実証する（図３６Ａ）。個々のマウスにおける抗ＭＴＴＥ抗体力価（図３４Ｂ）は、各マウスによって誘発される総Ｔ細胞応答、図３６Ｂに対応する。

【0636】

【表20】

【0637】

【表21】

【0638】

【表22】

【0639】

【表23】

【0640】

【表24】

【0641】

【表25】

【0642】

【表26】

【0643】

【表27】

【0644】

【表28】

【0645】

【表29】

【0646】

【表30】

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16-1】

【図16-2】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27】

【図28】

【図29】

【図30】

【図31】

【図32】

【図33】

【図34】

【図35】

【図36】

【配列表】

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【国際調査報告】