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特表2024-522190ゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼ変異体、並びにそれを用いたテトラテルペン、その前駆体、及びテトラテルペンを前駆体とする物質の生産方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-06-11
(54)【発明の名称】ゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼ変異体、並びにそれを用いたテトラテルペン、その前駆体、及びテトラテルペンを前駆体とする物質の生産方法
(51)【国際特許分類】
C12N 9/10 20060101AFI20240604BHJP
C12N 15/54 20060101ALI20240604BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20240604BHJP
C12P 7/04 20060101ALI20240604BHJP
【ＦＩ】
C12N9/10 ZNA
C12N15/54
C12N1/19
C12P7/04
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023575966
(86)(22)【出願日】2022-06-09
(85)【翻訳文提出日】2023-12-25
(86)【国際出願番号】 KR2022008156
(87)【国際公開番号】W WO2022260455
(87)【国際公開日】2022-12-15
(31)【優先権主張番号】10-2021-0074819
(32)【優先日】2021-06-09
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】514199250
【氏名又は名称】シージェイ チェイルジェダング コーポレイション
(74)【代理人】
【識別番号】100105957
【弁理士】
【氏名又は名称】恩田 誠
(74)【代理人】
【識別番号】100068755
【弁理士】
【氏名又は名称】恩田 博宣
(74)【代理人】
【識別番号】100142907
【弁理士】
【氏名又は名称】本田 淳
(74)【代理人】
【識別番号】100152489
【弁理士】
【氏名又は名称】中村 美樹
(72)【発明者】
【氏名】イ、ピーター
(72)【発明者】
【氏名】パク、ヘ ミン
(72)【発明者】
【氏名】ハ、チョル ウン
(72)【発明者】
【氏名】イ、ドン ピル
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B064AC09
4B064CA02
4B064CA19
4B064DA10
4B065AA99X
4B065AA99Y
4B065AB01
4B065CA05
4B065CA24
4B065CA41
4B065CA43
(57)【要約】
本出願は、ゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼ（Geranylgeranyl pyrophosphate synthase）変異体に関し、前記変異体をコードするポリヌクレオチドに関し、前記ポリヌクレオチドを含むベクターに関し、前記変異体、ポリヌクレオチド及びベクターの少なくとも１つを含む微生物に関し、それを用いたテトラテルペン、テトラテルペンの前駆体、又はテトラテルペンを前駆体とする物質の生産方法に関し、テトラテルペン、テトラテルペンの前駆体、又はテトラテルペンを前駆体とする物質の生産用組成物に関し、かつ前記変異体、ポリヌクレオチド及びベクターの少なくとも１つを含む微生物における、テトラテルペン、その前駆体、及びテトラテルペンを前駆体とする物質の生産への使用に関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
配列番号１のアミノ酸配列のＮ末端から２９番目、４３番目、９０番目、１０３番目、１２２番目及び１４１番目の位置に相当するアミノ酸の少なくとも１つのアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼ（Geranylgeranyl pyrophosphate synthase）変異体。
【請求項2】
前記変異体は、配列番号１のアミノ酸配列のＮ末端から２９番目の位置に相当するアミノ酸のアスパラギン以外のアミノ酸への置換、４３番目のアミノ酸に相当するアミノ酸のフェニルアラニン以外のアミノ酸への置換、９０番目のアミノ酸に相当するアミノ酸のロイシン以外のアミノ酸への置換、１０３番目のアミノ酸に相当するアミノ酸のメチオニン以外のアミノ酸への置換、１２２番目のアミノ酸に相当するアミノ酸のイソロイシン以外のアミノ酸への置換、及び１４１番目のアミノ酸に相当するアミノ酸のアルギニン以外のアミノ酸への置換の少なくとも１つの置換を含むものである、請求項１に記載のゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼ変異体。
【請求項3】
他のアミノ酸への置換は、非極性（nonpolar）アミノ酸、極性（polar）アミノ酸、又は正に荷電した（塩基性）アミノ酸への置換である、請求項１に記載のゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼ変異体。
【請求項4】
前記他のアミノ酸は、トレオニン（Ｔｈｒ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、アルギニン（Ａｒｇ）、バリン（Ｖａｌ）及びリシン（Ｌｙｓ）からなる群から選択されるいずれかである、請求項１に記載のゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼ変異体。
【請求項5】
請求項１～４のいずれか一項に記載のゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼ変異体をコードするポリヌクレオチド。
【請求項6】
請求項１～４のいずれか一項に記載のゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼ変異体、及び前記変異体をコードするポリヌクレオチドの少なくとも１つを含む微生物。
【請求項7】
前記微生物は、テトラテルペン、テトラテルペンの前駆体、又はテトラテルペンを前駆体とする物質を生産するものである、請求項６に記載の微生物。
【請求項8】
前記微生物はヤロウィア属（Yarrowia sp.）である、請求項６に記載の微生物。
【請求項9】
前記微生物はヤロウィア・リポリティカ（Yarrowia lipolytica）である、請求項６に記載の微生物。
【請求項10】
前記微生物は、β－カロテン、β－カロテンの前駆体、又はβ－カロテンを前駆体とする物質を生産するものである、請求項６に記載の微生物。
【請求項11】
請求項６に記載の微生物を培地で培養するステップを含む、テトラテルペン、テトラテルペンの前駆体、又はテトラテルペンを前駆体とする物質の生産方法。
【請求項12】
前記方法は、前記培地又は微生物からテトラテルペン、テトラテルペンの前駆体、又はテトラテルペンを前駆体とする物質を回収するステップをさらに含む、請求項１１に記載の生産方法。
【請求項13】
前記微生物はヤロウィア属（Yarrowia sp.）である、請求項１１に記載の生産方法。
【請求項14】
前記方法は、スクアレン生産を減少させるものである、請求項１１に記載の生産方法。
【請求項15】
請求項１に記載の変異体、請求項６に記載の微生物、又は前記微生物の培養物を含む、テトラテルペン、テトラテルペンの前駆体、又はテトラテルペンを前駆体とする物質の生産用組成物。
【請求項16】
配列番号１のアミノ酸配列のＮ末端から２９番目、４３番目、９０番目、１０３番目、１２２番目及び１４１番目の位置に相当するアミノ酸の少なくとも１つのアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼ変異体、及び前記変異体をコードするポリヌクレオチドの少なくとも１つを含む微生物における、テトラテルペン、テトラテルペンの前駆体、又はテトラテルペンを前駆体とする物質の生産への使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本出願は、ゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼ（Geranylgeranyl pyrophosphate synthase）変異体に関し、前記変異体をコードするポリヌクレオチドに関し、前記ポリヌクレオチドを含むベクターに関し、前記変異体、ポリヌクレオチド及びベクターの少なくとも１つを含む微生物に関し、それを用いたテトラテルペン、その前駆体、及びテトラテルペンを前駆体とする物質の生産方法に関し、テトラテルペン、その前駆体、及びテトラテルペンを前駆体とする物質の生産用組成物に関し、かつ前記変異体、ポリヌクレオチド及びベクターの少なくとも１つを含む微生物における、テトラテルペン、その前駆体、及びテトラテルペンを前駆体とする物質の生産への使用に関する。
【背景技術】
【0002】
テルペノイド（terpenoid）は、カロテノイド（carotenoid）を含む概念であり、植物及び動物において様々な機能を発揮することにより、食品、飼料などの多方面の産業分野に用いられている。テルペノイドは、植物の薬効を発揮する代表的な物質として知られており、カロテノイド（carotenoid）と同様にテルペン（terpene）類である。とりわけ、β－カロテンなどのカロテノイドは、フリーラジカルの除去、動物におけるビタミンＡの母体、脊椎動物の免疫システムの増強、肺癌リスクの減少などの機能が報告されている物質である。
【0003】
しかし、このような利点にもかかわらず、カロテノイド、例えばβ－カロテンは、動物の体内で合成されないか、合成されたとしても合成量が足りない。また、変異した微生物を用いて産業的生産を試みているが（特許文献１）、依然として副産物によりβ－カロテンを高純度で生産することは困難な現状である。
【0004】
副産物に関して、カロテノイド又はテルペノイドの生産のための中心的な前駆物質であるゲラニルゲラニルピロリン酸（geranylgeranyl pyrophosphate; GGPP, C20）においては、イソプレノイド（isoprenoid）生合成経路でゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼ（geranylgeranyl pyrophosphate synthase）酵素によりファルネシルピロリン酸（farnesyl pyrophosphate; FPP, C15）とイソペンテニルピロリン酸（isopentenyl pyrophosphate; IPP, C5）が結合されて生産される。しかし、スクアレンシンターゼ（squalene synthase; ERG9）により、ファルネシルピロリン酸（FPP, C15）からスクアレン（C30）が副産物として共に生産される。よって、カロテノイド又はテルペノイドの生合成のための中心的な前駆物質であるＧＧＰＰの生成量を増大させ、競合経路であるスクアレンの生産を減少させる方法を開発する必要性が高まっている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0005】
【特許文献1】米国特許第７７４５１７０号明細書
【特許文献2】韓国公開特許第１０－２０２０－０１３６８１３号公報
【特許文献3】米国特許第７６６２９４３号明細書
【特許文献4】米国特許第１０５８４３３８号明細書
【特許文献5】米国特許第１０２７３４９１号明細書
【非特許文献】
【0006】
【非特許文献1】Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453
【非特許文献2】Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277
【非特許文献3】Pearson et al (1988) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85]: 2444
【非特許文献4】Devereux, J., et al, Nucleic Acids Research 12: 387 (1984)
【非特許文献5】Atschul, [S.] [F.,] [ET AL, J MOLEC BIOL 215]: 403 (1990)
【非特許文献6】Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, [ED.,] Academic Press, San Diego,1994
【非特許文献7】[CARILLO ETA/.](1988) SIAM J Applied Math 48: 1073
【非特許文献8】Smith and Waterman, Adv. Appl. Math (1981) 2:482
【非特許文献9】Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence And Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 (1979)
【非特許文献10】Gribskov et al(1986) Nucl. Acids Res. 14: 6745
【非特許文献11】J. Sambrook et al.,Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989
【非特許文献12】F.M. Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York, 9.50-9.51, 11.7-11.8
【非特許文献13】Sitnicka et al. Functional Analysis of Genes. Advances in Cell Biology. 2010, Vol. 2. 1-16
【非特許文献14】Sambrook et al. Molecular Cloning 2012
【非特許文献15】D.-C. Chen et al., Appl Microbiol Biotechnol, 1997
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
本出願が解決しようとする課題は、ゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼ変異体、並びにそれを用いたテトラテルペン、その前駆体、及びテトラテルペンを前駆体とする物質の生産方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【0008】
本出願は、配列番号１のアミノ酸配列のＮ末端から２９番目、４３番目、９０番目、１０３番目、１２２番目及び１４１番目の位置に相当するアミノ酸の少なくとも１つのアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼ（Geranylgeranyl pyrophosphate synthase）変異体を提供することを目的とする。
【0009】
また、本出願は、前記変異体をコードするポリヌクレオチドを提供することを目的とする。
さらに、本出願は、前記ポリヌクレオチドを含むベクターを提供することを目的とする。
さらに、本出願は、前記ポリヌクレオチドを含むベクターを提供することを目的とする。
【0010】
さらに、本出願は、前記変異体、ポリヌクレオチド及びベクターの少なくとも１つを含む微生物を提供することを目的とする。
さらに、本出願は、前記微生物を培地で培養するステップを含む、テトラテルペン（tetraterpene）、その前駆体、及びテトラテルペンを前駆体とする物質の生産方法を提供することを目的とする。
さらに、本出願は、前記微生物を培地で培養するステップを含む、テトラテルペン（tetraterpene）、その前駆体、及びテトラテルペンを前駆体とする物質の生産方法を提供することを目的とする。
【0011】
さらに、本出願は、前記変異体、ベクター、微生物又は前記微生物の培養物を含む、テトラテルペン、その前駆体、及びテトラテルペンを前駆体とする物質の生産用組成物を提供することを目的とする。
【0012】
さらに、本出願は、前記変異体、ポリヌクレオチド、ベクター及び微生物の少なくとも１つにおける、テトラテルペン、その前駆体、及びテトラテルペンを前駆体とする物質の生産への使用を提供することを目的とする。
【発明の効果】
【0013】
本出願のゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼ変異体を発現する微生物は、それを発現しない菌株に比べて、テトラテルペン、テトラテルペンの前駆体、又はテトラテルペンを前駆体とする物質を効果的に生産することができる。
【発明を実施するための形態】
【0014】
以下、本出願について具体的に説明する。なお、本出願で開示される一態様の説明及び実施形態は、共通事項について他の態様の説明及び実施形態にも適用される。また、本出願で開示される様々な要素のあらゆる組み合わせが本出願に含まれる。さらに、以下の具体的な記述に本出願が限定されるものではない。
【0015】
本出願の一態様は、配列番号１のアミノ酸配列のＮ末端から２９番目、４３番目、９０番目、１０３番目、１２２番目及び１４１番目の位置に相当するアミノ酸の少なくとも１つのアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼ（Geranylgeranyl pyrophosphate synthase）変異体を提供する。
【0016】
前記ゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼ変異体とは、ゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼ活性を有するポリペプチド、又はゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼにおいて、配列番号１のＮ末端から２９番目、４３番目、９０番目、１０３番目、１２２番目及び１４１番目の位置に相当するアミノ酸の少なくとも１つのアミノ酸が他のアミノ酸に置換された変異体を意味する。
【0017】
本出願における「ゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼ（Geranylgeranyl pyrophosphate synthase; GGS1）」とは、ファルネシルピロリン酸（Farnesyl pyrophosphate; FPP）からゲラニルゲラニルピロリン酸（Geranylgeranyl pyrophosphate synthase; GGPP）への合成を触媒する酵素を意味する。
【0018】
本出願のゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼは、本出願において提供するゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼ変異体を作製するために改変されたゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼ、又はゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼ活性を有するポリペプチドであってもよい。具体的には、自然に発生するポリペプチド又は野生型ポリペプチドであってもよく、その成熟ポリペプチドであってもよく、その変異体又は機能的フラグメントを含んでもよく、本出願のゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼ変異体の母体（parent）となるものであればいかなるものでもよい。
【0019】
本出願における前記ゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼは、これに限定されるものではないが、配列番号１のポリペプチドである。また、配列番号１のポリペプチドと約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％以上の配列同一性を有するポリペプチドであってもよく、配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチドと同一又は相当する活性を有するものであれば、いかなるものでもゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼに含まれる。
【0020】
本出願のゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼは、公知のデータベースであるＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋなどからその配列が得られる。具体的には、ｇｇｓ１遺伝子によりコードされるポリペプチドであるが、これに限定されるものではない。
【0021】
本出願における「変異体」とは、少なくとも１つのアミノ酸の保存的置換（conservative substitution）及び／又は改変（modification）により前記変異体の変異前のアミノ酸配列とは異なるが、機能（functions）又は特性（properties）が維持されるポリペプチドを意味する。このような変異体は、一般に前記ポリペプチドのアミノ酸配列の少なくとも１つのアミノ酸を改変し、その改変したポリペプチドの特性を評価することにより同定（identify）することができる。すなわち、変異体の能力は、変異前のポリペプチドより向上するか、変わらないか又は低下する。また、一部の変異体には、Ｎ末端リーダー配列や膜貫通ドメイン（transmembrane domain）などの少なくとも１つの部分が除去された変異体も含まれる。他の変異体には、成熟タンパク質（mature protein）のＮ及び／又はＣ末端から一部分が除去された変異体も含まれる。前記「変異体」は、変異型、改変、変異型ポリペプチド、変異したタンパク質、変異など（英語表現では、modification、modified polypeptide、modified protein、mutant、mutein、divergentなど）と混用されるが、変異を意味する用語であればいかなるものでもよい。
【0022】
また、変異体は、ポリペプチドの特性と二次構造に最小限の影響を及ぼすアミノ酸の欠失又は付加を含んでもよい。例えば、変異体のＮ末端には、翻訳と同時に（co-translationally）又は翻訳後に（post-translationally）タンパク質の移動（translocation）に関与するシグナル（又はリーダー）配列が結合されてもよい。また、前記変異体は、確認、精製又は合成できるように、他の配列又はリンカーに結合されてもよい。
【0023】
本出願の変異体は、配列番号１のアミノ酸配列のＮ末端から２９番目、４３番目、９０番目、１０３番目、１２２番目及び１４１番目の位置に相当するアミノ酸の少なくとも１つのアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼ変異体であってもよい。具体的には、前記２９番目、４３番目、９０番目、１０３番目、１２２番目及び１４１番目の位置の少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ又は少なくとも６つの位置のアミノ酸が置換されたものであるが、これらに限定されるものではない。
【0024】
前記変異体の母体となるゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼ活性を有するポリペプチド、又はゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼにおいて、配列番号１のアミノ酸配列のＮ末端から２９番目の位置に相当するアミノ酸はアスパラギンであり、４３番目の位置に相当するアミノ酸はフェニルアラニンであり、９０番目の位置に相当するアミノ酸はロイシンであり、１０３番目の位置に相当するアミノ酸はメチオニンであり、１２２番目の位置に相当するアミノ酸はイソロイシンであり、かつ／又は１４１番目の位置に相当するアミノ酸はアルギニンであるが、これらに限定されるものではない。
【0025】
一実施例として、前記変異体は、配列番号１のアミノ酸配列のＮ末端から２９番目の位置に相当するアミノ酸のアスパラギン以外のアミノ酸への置換、４３番目のアミノ酸に相当するアミノ酸のフェニルアラニン以外のアミノ酸への置換、９０番目のアミノ酸に相当するアミノ酸のロイシン以外のアミノ酸への置換、１０３番目のアミノ酸に相当するアミノ酸のメチオニン以外のアミノ酸への置換、１２２番目のアミノ酸に相当するアミノ酸のイソロイシン以外のアミノ酸への置換、及び１４１番目のアミノ酸に相当するアミノ酸のアルギニン以外のアミノ酸への置換の少なくとも１つの置換を含むものであるが、これらに限定されるものではない。
【0026】
前記「他のアミノ酸」は、置換前のアミノ酸とは異なるアミノ酸であればいかなるものでもよい。なお、本出願における「特定アミノ酸が置換された」とは、他のアミノ酸に置換されたと表記していなくても、置換前のアミノ酸とは異なるアミノ酸に置換されたことを意味することは言うまでもない。
【0027】
前記他のアミノ酸への置換は、非極性（nonpolar）アミノ酸、極性（polar）アミノ酸、又は正に荷電した（塩基性）アミノ酸への置換であってもよい。具体的には、前記非極性（nonpolar）アミノ酸は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン及びプロリンからなる群から選択されるものであるが、これらに限定されるものではない。前記極性（polar）アミノ酸は、親水性（hydrophilic）アミノ酸と混用されるものであって、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン及びグルタミンからなる群から選択されるものであり、前記正に荷電した（塩基性）アミノ酸は、アルギニン、リシン及びヒスチジンからなる群から選択されるものであるが、これらに限定されるものではない。
【0028】
具体的には、本出願の変異体は、参照（reference）タンパク質である配列番号１のアミノ酸配列の２９番目、４３番目、９０番目、１０３番目、１２２番目及び１４１番目の位置に相当するアミノ酸の少なくとも１つのアミノ酸が非極性アミノ酸、極性アミノ酸又は正に荷電した（塩基性）アミノ酸のうち、置換前のアミノ酸とは異なるアミノ酸に置換された変異体であるが、これらに限定されるものではない。前記非極性アミノ酸はイソロイシン（Ｉｌｅ）又はバリン（Ｖａｌ）であり、前記極性アミノ酸はトレオニン（Ｔｈｒ）であり、上記正に荷電したアミノ酸はアルギニン（Ａｒｇ）又はリシン（Ｌｙｓ）であるが、これらに限定されるものではない。
【0029】
また、前記他のアミノ酸は、トレオニン、イソロイシン、アルギニン、バリン及びリシンからなる群から選択されるいずれかであるが、これらに限定されるものではない。
一実施例として、本出願の変異体は、配列番号１のアミノ酸配列の２９番目、４３番目、９０番目、１０３番目、１２２番目及び１４１番目の位置に相当するアミノ酸の少なくとも１つのアミノ酸がトレオニン、イソロイシン、アルギニン、バリン及びリシンからなる群から選択されるいずれかに置換されたものであるが、これらに限定されるものではない。
一実施例として、本出願の変異体は、配列番号１のアミノ酸配列の２９番目、４３番目、９０番目、１０３番目、１２２番目及び１４１番目の位置に相当するアミノ酸の少なくとも１つのアミノ酸がトレオニン、イソロイシン、アルギニン、バリン及びリシンからなる群から選択されるいずれかに置換されたものであるが、これらに限定されるものではない。
【0030】
一実施例として、本出願の変異体は、配列番号１のアミノ酸配列の２９番目の位置に相当するアミノ酸のトレオニンへの置換、４３番目の位置に相当するアミノ酸のイソロイシンへの置換、９０番目の位置に相当するアミノ酸のアルギニンへの置換、１０３番目の位置に相当するアミノ酸のイソロイシンへの置換、１２２番目の位置に相当するアミノ酸のバリンへの置換、１４１番目の位置に相当するアミノ酸のリシンへの置換、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される置換が行われたものであるが、これらに限定されるものではない。
【0031】
本出願における「相当する（corresponding to）」とは、ポリペプチドにおいて列挙される位置のアミノ酸残基であるか、又はポリペプチドにおいて列挙される残基に類似、同一もしくは相当するアミノ酸残基であることを意味する。相当する位置のアミノ酸を確認することは、特定配列を参照する配列の特定アミノ酸を決定することであってもよい。本出願における「相当領域」とは、一般に関連タンパク質又は参照（reference）タンパク質における類似又は対応する位置を意味する。
【0032】
例えば、任意のアミノ酸配列を配列番号１とアラインメント（align）すると、それに基づいて、前記アミノ酸配列の各アミノ酸残基は、配列番号１のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基の数、位置を参照してナンバリングすることができる。例えば、本出願における配列アラインメントアルゴリズムは、クエリー配列（「参照配列」ともいう）と比較すると、アミノ酸の位置、又は置換、挿入、欠失などの改変が生じる位置を確認することができる。
【0033】
このようなアラインメントには、例えばＮｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（非特許文献１）、ＥＭＢＯＳＳパッケージのＮｅｅｄｌｅプログラム（EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, 非特許文献２）などを用いることができるが、これらに限定されるものではなく、当該技術分野で公知の配列アラインメントプログラム、ペアワイズ配列（pairwise sequence）比較アルゴリズムなどを適宜用いることができる。
【0034】
一実施例として、本出願の変異体は、配列番号１のポリペプチドと約８０％。８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％以上の配列同一性を有し、配列番号１の２９番目、４３番目、９０番目、１０３番目、１２２番目及び１４１番目の位置に相当するアミノ酸の少なくとも１つのアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたものであってもよい。
【0035】
一実施例として、本出願の変異体は、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５又は配列番号１７で表されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．７％又は９９．９％以上の相同性又は同一性を有するアミノ酸配列を含むものであってもよい。
【0036】
具体的には、本出願の変異体は、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５又は配列番号１７で表されるアミノ酸配列を有する（having）ものであってもよく、前記アミノ酸配列を含む（comprising）ものであってもよく、前記アミノ酸配列からなる（consisting of）ものであってもよく、前記アミノ酸配列から実質的に構成される（essentially consisting of）ものであってもよい。
【0037】
一実施例として、本出願の変異体は、配列番号１のアミノ酸配列において２９番目、４３番目、９０番目、１０３番目、１２２番目及び１４１番目の位置に相当するアミノ酸の少なくとも１つのアミノ酸が他のアミノ酸に置換され、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５又は配列番号１７で表されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．７％又は９９．９％以上の相同性又は同一性を有するアミノ酸配列を含むものであってもよい。
【0038】
一実施例として、本出願の変異体は、配列番号１のアミノ酸配列の１０３番目の位置に相当するアミノ酸であるメチオニンがイソロイシンに置換された配列番号３で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号１のアミノ酸配列の４３番目の位置に相当するアミノ酸であるフェニルアラニンがイソロイシンに置換された配列番号５で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号１のアミノ酸配列の２９番目の位置に相当するアミノ酸であるアスパラギンがトレオニンに置換され、かつ９０番目の位置に相当するアミノ酸であるロイシンがアルギニンに置換された配列番号７で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号１のアミノ酸配列の２９番目の位置に相当するアミノ酸であるアスパラギンがトレオニンに置換された配列番号９で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号１のアミノ酸配列の９０番目の位置に相当するアミノ酸であるロイシンがアルギニンに置換された配列番号１１で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号１のアミノ酸配列の１２２番目の位置に相当するアミノ酸であるイソロイシンがバリンに置換され、かつ１４１番目の位置に相当するアミノ酸であるアルギニンがリシンに置換された配列番号１３で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号１のアミノ酸配列の１２２番目の位置に相当するアミノ酸であるイソロイシンがバリンに置換された配列番号１５で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号１のアミノ酸配列の１４１番目の位置に相当するアミノ酸であるアルギニンがリシンに置換された配列番号１７で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドから選択される少なくとも１つであるが、これらに限定されるものではない。
【0039】
また、このような相同性又は同一性を有し、本出願の変異体に相当する効能を示すアミノ酸配列であれば、一部の配列が欠失、改変、置換、保存的置換又は付加されたアミノ酸配列を有する変異体も本出願に含まれることは言うまでもない。
【0040】
例えば、アミノ酸配列のＮ末端、Ｃ末端及び／又は内部に、本出願の変異体の機能を変更しない配列の付加もしくは欠失、自然に発生し得る突然変異、非表現突然変異（silent mutation）又は保存的置換を有するものが挙げられる。
【0041】
前記「保存的置換（conservative substitution）」とは、あるアミノ酸が類似した構造的及び／又は化学的性質を有する他のアミノ酸に置換されることを意味する。このようなアミノ酸置換は、一般に残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性及び／又は両親媒性（amphipathic nature）における類似性に基づいて発生し得る。通常、保存的置換は、タンパク質又はポリペプチドの活性にほとんど又は全く影響を及ぼさない。
【0042】
本出願における「相同性（homology）」又は「同一性（identity）」とは、２つの与えられたアミノ酸配列又は塩基配列が類似する程度を意味し、百分率で表される。相同性及び同一性は、しばしば互換的に用いられる。
【0043】
保存されている（conserved）ポリヌクレオチド又はポリペプチドの配列相同性又は同一性は標準配列アルゴリズムにより決定され、用いられるプログラムにより確立されたデフォルトギャップペナルティが共に用いられてもよい。実質的には、相同性を有するか（homologous）又は同じ（identical）配列は、中程度又は高いストリンジェントな条件（stringent conditions）下において、一般に配列全部又は一部分とハイブリダイズする。ハイブリダイゼーションには、ポリヌクレオチドにおいて一般のコドン又はコドン縮退を考慮したコドンを有するポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーションも含まれることは言うまでもない。
【0044】
任意の２つのポリヌクレオチド又はポリペプチド配列が相同性、類似性又は同一性を有するか否かは、例えば非特許文献３のようなデフォルトパラメーターと「ＦＡＳＴＡ」プログラムなどの公知のコンピュータアルゴリズムを用いて決定することができる。あるいは、ＥＭＢＯＳＳパッケージのニードルマンプログラム（EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, 非特許文献２）（バージョン５．０．０又はそれ以降のバージョン）で行われるように、ニードルマン＝ウンシュ（Needleman-Wunsch）アルゴリズム（非特許文献１）を用いて決定することができる（ＧＣＧプログラムパッケージ（非特許文献４）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡ（非特許文献５、６及び７）を含む）。例えば、国立生物工学情報センターのＢＬＡＳＴ又はＣｌｕｓｔａｌＷを用いて相同性、類似性又は同一性を決定することができる。
【0045】
ポリヌクレオチド又はポリペプチドの相同性、類似性又は同一性は、例えば非特許文献８に開示されているように、非特許文献１などのＧＡＰコンピュータプログラムを用いて、配列情報を比較することにより決定することができる。要約すると、ＧＡＰプログラムは、２つの配列のうち短いものにおける記号の総数で、類似する配列記号（すなわち、ヌクレオチド又はアミノ酸）の数を割った値と定義している。ＧＡＰプログラムのためのデフォルトパラメーターは、（１）二進法比較マトリックス（同一性は１、非同一性は０の値をとる）及び非特許文献９に開示されているように、非特許文献１０の加重比較マトリックス（又はＥＤＮＡＦＵＬＬ（ＮＣＢＩＮＵＣ４．４のＥＭＢＯＳＳバージョン）置換マトリックス）と、（２）各ギャップに３．０のペナルティ、及び各ギャップの各記号に追加の０．１０ペナルティ（又はギャップオープンペナルティ１０、ギャップ延長ペナルティ０．５）と、（３）末端ギャップに無ペナルティとを含む。
【0046】
一実施例として、本出願の変異体は、ゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼ活性を有するものであってもよい。一実施例として、本出願の変異体は、野生型又は非変異ゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼに比べて、テトラテルペン、テトラテルペンの前駆体、又はテトラテルペンを前駆体とする物質の生産能を向上させる活性を有するものであってもよい。一実施例として、本出願の変異体は、野生型又はゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼに比べて、テトラテルペン、テトラテルペンの前駆体、又はテトラテルペンを前駆体とする物質の生産経路の副産物生産レベルを低下させる活性を有するものであってもよい。一実施例として、本出願の変異体は、野生型又はゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼに比べて、スクアレン生産レベルを低下させる活性を有するものであってもよい。一実施例として、本出願の変異体は、野生型又は非変異ゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼに比べて、向上した活性を有するものであるが、これに限定されるものではない。
【0047】
本出願の他の態様は、本出願の変異体をコードするポリヌクレオチドを提供する。
本出願における「ポリヌクレオチド」とは、ヌクレオチド単量体（monomer）が共有結合により長く鎖状につながったヌクレオチドの重合体（polymer）であって、所定の長さより長いＤＮＡ又はＲＮＡ鎖を意味し、より具体的にはゲラニルゲラニルピロリン酸活性を有する前記変異体をコードするポリヌクレオチド断片を意味する。
本出願における「ポリヌクレオチド」とは、ヌクレオチド単量体（monomer）が共有結合により長く鎖状につながったヌクレオチドの重合体（polymer）であって、所定の長さより長いＤＮＡ又はＲＮＡ鎖を意味し、より具体的にはゲラニルゲラニルピロリン酸活性を有する前記変異体をコードするポリヌクレオチド断片を意味する。
【0048】
本出願の変異体をコードするポリヌクレオチドは、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５又は配列番号１７で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むものであってもよい。一実施例として、本出願のポリヌクレオチドは、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６又は配列番号１８の配列を有するものであってもよく、前記配列を含むものであってもよい。また、本出願のポリヌクレオチドは、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６又は配列番号１８の配列からなるものであってもよく、前記配列から実質的に構成されるものであってもよい。
【0049】
本出願のポリヌクレオチドは、コドンの縮退（degeneracy）により、又は本出願の変異体を発現させようとする生物において好まれるコドンを考慮して、本出願の変異体のアミノ酸配列が変化しない範囲でコード領域に様々な改変を行うことができる。具体的には、本出願のポリヌクレオチドは、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６もしくは配列番号１８の配列と相同性もしくは同一性が８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、及び１００％未満である塩基配列を有するものであるか、前記塩基配列を含むものであるか、又は配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６もしくは配列番号１８の配列と相同性もしくは同一性が８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、及び１００％未満である塩基配列からなるものであるか、前記塩基配列から実質的に構成されるものであるが、これらに限定されるものではない。
【0050】
ここで、前記相同性もしくは同一性を有する配列において、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６もしくは配列番号１８の２９番目、４３番目、９０番目、１０３番目、１２２番目及び１４１番目の位置に相当するアミノ酸をコードするコドンは、トレオニン、イソロイシン、アルギニン、バリン又はリシンをコードするコドンの１つであってもよい。
【0051】
また、本出願のポリヌクレオチドは、公知の遺伝子配列から調製されるプローブ、例えば本出願のポリヌクレオチド配列の全部又は一部に対する相補配列とストリンジェントな条件下でハイドリダイズする配列であればいかなるものでもよい。前記「ストリンジェントな条件（stringent condition）」とは、ポリヌクレオチド間の特異的ハイブリダイゼーションを可能にする条件を意味する。このような条件は、文献（非特許文献１１、１２参照）に具体的に記載されている。例えば、相同性もしくは同一性の高いポリヌクレオチド同士、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上の相同性もしくは同一性を有するポリヌクレオチド同士をハイブリダイズし、それより相同性もしくは同一性の低いポリヌクレオチド同士をハイブリダイズしない条件、又は通常のサザンハイブリダイゼーション（southern hybridization）の洗浄条件である６０℃、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、具体的には６０℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、より具体的には６８℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度及び温度において、１回、具体的には２回～３回洗浄する条件が挙げられる。
【0052】
ハイブリダイゼーションは、たとえハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに応じて塩基間のミスマッチ（mismatch）が可能であっても、２つの核酸が相補的配列を有することが求められる。「相補的」とは、互いにハイブリダイゼーションが可能なヌクレオチド塩基間の関係を表すために用いられるものである。例えば、ＤＮＡにおいて、アデニンはチミンに相補的であり、シトシンはグアニンに相補的である。よって、本出願のポリヌクレオチドには、実質的に類似する核酸配列だけでなく、全配列に相補的な単離された核酸フラグメントが含まれてもよい。
【0053】
具体的には、本出願のポリヌクレオチドと相同性又は同一性を有するポリヌクレオチドは、５５℃のＴｍ値でハイブリダイゼーションステップが行われるハイブリダイゼーション条件と前述した条件を用いて検出することができる。また、前記Ｔｍ値は、６０℃、６３℃又は６５℃であってもよいが、これらに限定されるものではなく、その目的に応じて当業者により適宜調節される。
【0054】
前記ポリヌクレオチドをハイブリダイズする適切なストリンジェンシーはポリヌクレオチドの長さ及び相補性の程度に依存し、変数は当該技術分野で公知である（例えば、非特許文献１１）。
【0055】
本出願のさらに他の態様は、本出願のポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。前記ベクターは、前記ポリヌクレオチドを宿主細胞において発現させるための発現ベクターであるが、これに限定されるものではない。
【0056】
本出願のベクターには、好適な宿主内で標的ポリペプチドを発現させることができるように、好適な発現調節領域（又は発現調節配列）に作動可能に連結された前記標的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列を含むＤＮＡ産物が含まれる。前記発現調節領域には、転写を開始するプロモーター、その転写を調節するための任意のオペレーター配列、好適なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、並びに転写及び翻訳の終結を調節する配列が含まれる。ベクターは、好適な宿主細胞に形質転換されると、宿主ゲノムに関係なく複製及び機能することができ、ゲノム自体に組み込まれる。
【0057】
本出願に用いられるベクターは、特に限定されるものではなく、当該技術分野で公知の任意のベクターが用いられる。通常用いられるベクターの例としては、天然状態又は組換え状態のプラスミド、コスミド、ウイルス及びバクテリオファージが挙げられる。例えば、ファージベクター又はコスミドベクターとしては、ｐＷＥ１５、Ｍ１３、ＭＢＬ３、ＭＢＬ４、ＩＸＩＩ、ＡＳＨＩＩ、ＡＰＩＩ、ｔ１０、ｔ１１、Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、Ｃｈａｒｏｎ２１Ａなどを用いることができ、プラスミドベクターとしては、ｐＤＣ系、ｐＢＲ系、ｐＵＣ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ系、ｐＧＥＭ系、ｐＴＺ系、ｐＣＬ系、ｐＥＴ系などを用いることができる。具体的には、ｐＤＣ、ｐＤＣＭ２（特許文献２）、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＣＬ、ｐＥＣＣＧ１１７、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＭＷ１１８、ｐＣＣ１ＢＡＣ、ｐＩＭＲ５３ベクターなどを用いることができる。
【0058】
例えば、細胞内染色体導入用ベクターにより、標的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを染色体内に挿入することができる。前記ポリヌクレオチドの染色体への挿入は、当該技術分野で公知の任意の方法、例えば相同組換え（homologous recombination）により行うことができるが、これに限定されるものではない。前記染色体に挿入されたか否かを確認するための選択マーカー（selection marker）をさらに含んでもよい。前記選択マーカーは、ベクターで形質転換された細胞を選択するためのもの、すなわち標的核酸分子が挿入されたか否かを確認するためのものであり、薬物耐性、栄養要求性、細胞毒性剤に対する耐性、表面ポリペプチドの発現などの選択可能表現型を付与するマーカーが用いられる。選択剤（selective agent）で処理した環境においては、選択マーカーを発現する細胞のみ生存するか、異なる表現形質を示すので、形質転換された細胞を選択することができる。
【0059】
本出願における「形質転換」とは、標的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを宿主細胞又は微生物内に導入することにより、宿主細胞内で前記ポリヌクレオチドがコードするポリペプチドを発現させることを意味する。形質転換されたポリヌクレオチドは、宿主細胞内で発現するものであれば、宿主細胞の染色体内に挿入されて位置するか、染色体外に位置するかに関係なく、いかなるものでもよい。また、前記ポリヌクレオチドは、標的ポリペプチドをコードするＤＮＡ及び／又はＲＮＡを含むものである。前記ポリヌクレオチドは、宿主細胞内に導入されて発現するものであれば、いかなる形態で導入されるものでもよい。例えば、前記ポリヌクレオチドは、自ら発現する上で必要な全ての要素を含む遺伝子構造体である発現カセット（expression cassette）の形態で宿主細胞に導入される。通常、前記発現カセットは、前記ポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーター（promoter）、転写終結シグナル、リボソーム結合部位及び翻訳終結シグナルを含む。前記発現カセットは、自己複製可能な発現ベクターの形態であってもよい。また、前記ポリヌクレオチドは、それ自体の形態で宿主細胞に導入され、宿主細胞において発現に必要な配列と作動可能に連結されたものであってもよいが、これに限定されるものではない。
【0060】
また、前記「作動可能に連結」されたものとは、本出願の標的変異体をコードするポリヌクレオチドの転写を開始及び媒介するプロモーター配列と前記ポリヌクレオチド配列が機能的に連結されたものを意味する。
【0061】
本出願のさらに他の態様は、本出願の変異体、前記変異体をコードするポリヌクレオチド、及び前記ポリヌクレオチドを含むベクターの少なくとも１つを含む微生物を提供する。
【0062】
本出願における「微生物」又は「菌株」は、野生型微生物や自然に又は人為的に遺伝的改変が行われた微生物が全て含まれるものであり、外部遺伝子が挿入されるか、内在性遺伝子の活性が強化又は不活性化されるなどの原因により、特定機序が弱化又は強化された微生物であって、目的とするポリペプチド、タンパク質又は産物の生産のために遺伝的改変（modification）が行われた微生物である。
【0063】
本出願の微生物は、本出願の変異体、本出願のポリヌクレオチド、及び本出願のポリヌクレオチドを含むベクターの少なくとも１つを含む微生物、本出願の変異体、もしくは本出願のポリヌクレオチドを発現するように改変された微生物、本出願の変異体、もしくは本出願のポリヌクレオチドを発現する微生物、又は本出願の変異体の活性を有する微生物（例えば、組換え微生物）であるが、これらに限定されるものではない。前記微生物は、リコペンシクラーゼ／フィトエンシンターゼ（lycopene cyclase/phytoene synthase, crtYB）及びフィトエンデサチュラーゼ（phytoene desaturase, crtI）タンパク質をコードするポリヌクレオチドをさらに含むように改変され、それらのタンパク質活性を示す微生物、又はそれらのタンパク質活性が強化された微生物であってもよい。前記リコペンシクラーゼ／フィトエンシンターゼ又はフィトエンデサチュラーゼは、キサントフィロマイセス・デンドロアス（Xanthophyllomyces dendrorhous）由来のタンパク質であるが、これに限定されるものではない。一具体例として、前記リコペンシクラーゼ／フィトエンシンターゼ又はフィトエンデサチュラーゼをコードするポリヌクレオチドは、それぞれ配列番号２７又は配列番号２８の配列を有するものであってもよく、前記配列を含むものであってもよい。前記ポリヌクレオチドは、コドンの縮退（degeneracy）により、又は本出願の変異体を発現させようとする微生物において好まれるコドンを考慮して、アミノ酸配列が変化しない範囲でコード領域に様々な改変を行うことができる。具体的には、前記ポリヌクレオチドは、配列番号２７もしくは配列番号２８の配列と相同性もしくは同一性が８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、及び１００％未満の塩基配列を有するものであるか、前記塩基配列を含むものであるか、又は配列番号２７もしくは配列番号２８の配列と相同性もしくは同一性が８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、及び１００％未満の塩基配列からなるものであるか、前記塩基配列から実質的に構成されるものであるが、これらに限定されるものではない。
【0064】
本出願の微生物は、テトラテルペン、テトラテルペンの前駆体、又はテトラテルペンを前駆体とする物質を生産するものであるか、テトラテルペン生産経路で生成される副産物の生産が減少するものであるか、スクアレンの生産が減少するものであるが、これらに限定されるものではない。
【0065】
本出願における「テトラテルペン（tetraterpene）」とは、テルペン（terpene）のうち、８つのイソプレン（isoprene）が重合したポリマー（C40）を意味し、テトラテルペン系物質が含まれる。前記テルペンはイソプレン単位の重合体であり、２つのイソプレン（C5）単位が重合したテルペンをモノテルペン（monoterpene, C10）といい、３つのイソプレン単位が重合したテルペンをセスキテルペン（Sesquiterpene, C15）というように、テルペンは重合されるイソプレン単位の数により区分される。
【0066】
具体的には、前記テトラテルペンはカロテノイド（carotenoid）であるが、これに限定されるものではない。
本出願において、テトラテルペンの前駆体はゲラニルゲラニルピロリン酸（Geranylgeranyl Pyrophosphate; GGPP）であるが、これに限定されるものではない。
本出願において、テトラテルペンの前駆体はゲラニルゲラニルピロリン酸（Geranylgeranyl Pyrophosphate; GGPP）であるが、これに限定されるものではない。
【0067】
本出願において、テトラテルペンを前駆体とする物質は、レチナール（retinal）及びレチノール（retinol）からなる群から選択される少なくとも１つであるが、これらに限定されるものではない。
【0068】
本出願における「テトラテルペノイド（tetraterpenoid）」とは、改変されたテトラテルペンを意味する。前記テトラテルペノイドは、官能基が結合したテトラテルペンであってもよい。
【0069】
本出願における「カロテノイド（carotenoid）」とは、果物及び野菜において黄色などの色を出すテトラテルペン又はその誘導体を意味し、前記テトラテルペン及びテトラテルペノイドと混用される。
【0070】
具体的には、前記カロテノイドは、キサントフィル（xanthophyll）、カロテン（carotene）、α－カロテン（alpha-carotene）、β－カロテン（beta-carotene）、γ－カロテン（gamma-carotene）、ルテイン（lutein）、リコペン（lycopene）、ゼアキサンチン（Zeaxanthin）、カプサンチン（Capsanthin）、カンタキサンチン（Canthaxanthin）及びアスタキサンチン（Astaxanthin）からなる群から選択される少なくとも１つであるが、これらに限定されるものではない。
【0071】
本出願において、カロテノイドの前駆体はゲラニルゲラニルピロリン酸（Geranylgeranyl Pyrophosphate; GGPP）であるが、これに限定されるものではない。
本出願において、カロテノイドを前駆体とする物質は、レチナール（retinal）及びレチノール（retinol）からなる群から選択される少なくとも１つであるが、これらに限定されるものではない。
本出願において、カロテノイドを前駆体とする物質は、レチナール（retinal）及びレチノール（retinol）からなる群から選択される少なくとも１つであるが、これらに限定されるものではない。
【0072】
本出願における「β－カロテン」とは、カロテノイド系物質の一つであり、カロテンのうち、分子の両末端にβ環を有するものを意味する。
本出願において、β－カロテンの前駆体は、フィトエン（phytoene）、フィトフルエン（phytofluene）、リコペン（lycopene）及びγ－カロテン（gamma-carotene）からなる群から選択される少なくとも１つであるが、これらに限定されるものではない。
本出願において、β－カロテンの前駆体は、フィトエン（phytoene）、フィトフルエン（phytofluene）、リコペン（lycopene）及びγ－カロテン（gamma-carotene）からなる群から選択される少なくとも１つであるが、これらに限定されるものではない。
【0073】
本出願において、β－カロテンを前駆体とする物質は、レチナール（retinal）、レチノール（retinol）及びビタミンＡからなる群から選択される少なくとも１つであるが、これらに限定されるものではない。
【0074】
前記テトラテルペン、テトラテルペンの前駆体、又はテトラテルペンを前駆体とする物質は、カロテノイド、カロテノイドの前駆体、又はカロテノイドを前駆体とする物質であってもよく、β－カロテン、β－カロテンの前駆体、又はβ－カロテンを前駆体とする物質であってもよいが、これらに限定されるものではない。
【0075】
本出願において、前記変異体、ポリヌクレオチド、ベクター及び微生物の少なくとも１つは、テトラテルペンを生産するためのものであってもよく、前記微生物は、テトラテルペンを生産するものであってもよく、テトラテルペンの前駆体を生産するものであってもよく、テトラテルペンを前駆体とする物質を生産するものであってもよい。
【0076】
本出願において、前記変異体、ポリヌクレオチド、ベクター及び微生物の少なくとも１つは、カロテノイドを生産するためのものであってもよく、前記微生物は、カロテノイドを生産するものであってもよく、カロテノイドの前駆体を生産するものであってもよく、カロテノイドを前駆体とする物質を生産するものであってもよい。
【0077】
本出願において、前記変異体、ポリヌクレオチド、ベクター及び微生物の少なくとも１つは、β－カロテンを生産するためのものであってもよく、前記微生物は、β－カロテンを生産するものであってもよく、β－カロテンの前駆体を生産するものであってもよく、β－カロテンを前駆体とする物質を生産するものであってもよい。
【0078】
一実施例として、ゲラニルゲラニルピロリン酸（geranylgeranyl pyrophosphate; GGPP）は、イソプレノイド（isoprenoid）生合成経路でゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼにより生産されるので、前記微生物は、ゲラニルゲラニルピロリン酸も生産するものであってもよい。
【0079】
本出願において、テトラテルペン生産経路で生成される副産物とは、テトラテルペン、テトラテルペンの前駆体、及びテトラテルペンを前駆体とする物質以外の物質を意味し、具体的にはスクアレン（squalene）であるが、これらに限定されるものではない。β－カロテンは、カロテノイド（Carotenoid）又はイソプレノイド生産経路で生産されるものであり、その過程でスクアレンシンターゼ（squalene synthase; ERG9）によりファルネシルピロリン酸（FPP, C15）２分子を消費し、スクアレン（C30）が副産物として共に生産される。
【0080】
本出願における「スクアレン」とは、不飽和炭化水素（Ｃ３０Ｈ５０）であって、ステロイドホルモン、ビタミンＤなどの生合成にも用いられる物質を意味する。本出願の微生物は、テトラテルペン生産経路で生成される副産物を減少させるものであり、具体的には、スクアレン生産を減少させるものであるが、これらに限定されるものではない。
【0081】
本出願の微生物又は菌株は、自然にゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼ又はテトラテルペン生産能を有する微生物であるか、ゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼ又はテトラテルペン生産能のない親株に、本出願の変異体もしくはそれをコードするポリヌクレオチド（もしくは前記ポリヌクレオチドを含むベクター）が導入され、かつ／又はテトラテルペン、テトラテルペンの前駆体、もしくはテトラテルペンを前駆体とする物質の生産能が付与された微生物であるが、これらに限定されるものではない。
【0082】
例えば、本出願の微生物又は菌株は、本出願のポリヌクレオチド、又は本出願の変異体をコードするポリヌクレオチドを含むベクターで形質転換され、本出願の変異体を発現する細胞又は微生物であり、本出願の目的上、本出願の微生物又は菌株は、本出願の変異体を含み、テトラテルペン、テトラテルペンの前駆体、又はテトラテルペンを前駆体とする物質を生産する微生物であればいかなるものでもよい。例えば、本出願の微生物又は菌株は、天然の野生型微生物又はテトラテルペンを生産する微生物に本出願の変異体をコードするポリヌクレオチドを導入することにより、ゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼ変異体が発現し、テトラテルペン、テトラテルペンの前駆体、又はテトラテルペンを前駆体とする物質の生産能が向上した組換え菌株であってもよい。前記組換え菌株は、天然の野生型微生物又はゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼ非改変微生物（すなわち、野生型ゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼを発現する微生物）に比べて、テトラテルペン、テトラテルペンの前駆体、又はテトラテルペンを前駆体とする物質の生産能が向上した微生物であるが、これらに限定されるものではない。
【0083】
一例として、前記組換え菌株は、変異前の親株又は非改変微生物のテトラテルペン、テトラテルペンの前駆体、又はテトラテルペンを前駆体とする物質の生産能に比べて、約１％以上、具体的には約３％、約５％以上向上したものであるが、変異前の親株又は非改変微生物の生産能に比べて、＋値の増加量を示すものであればいかなるものでもよい。
【0084】
他の例として、前記組換え菌株は、変異前の親株もしくは非改変微生物に比べて、テトラテルペン生産経路で生成される副産物の生産量が約８５％以下、約８０％以下、約７５％以下、約７０％以下、約６５％以下、約６０％以下、約５５％以下、約５０％以下、約３０％以下もしくは約１０％以下に低下したものであるか、又は副産物が生産されないものであるが、これらに限定されるものではない。
【0085】
前記「約（about）」とは、±０．５、±０．４、±０．３、±０．２、±０．１などが全て含まれる範囲であり、約という用語の後に続く数値と同等又は同程度の範囲の数値であればいかなるものでもよいが、これらに限定されるものではない。
【0086】
本出願における「非改変微生物」とは、微生物に自然に発生し得る突然変異を含む菌株を除外するものではなく、野生型菌株もしくは天然菌株自体、又は自然要因もしくは人為的要因により遺伝的に変異して形質が変化する前の菌株を意味する。例えば、前記非改変微生物とは、本出願のゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼ変異体が導入されていないか、導入される前の菌株を意味する。前記「非改変微生物」は、「改変前の菌株」、「改変前の微生物」、「非変異菌株」、「非改変菌株」、「非変異微生物」又は「基準微生物」と混用される。
【0087】
一実施例として、本出願の微生物は、ヤロウィア（Yarrowia sp.）属微生物であり、具体的にはヤロウィア・リポリティカ（Yarrowia lipolytica）であるが、これらに限定されるものではない。
【0088】
本出願におけるポリペプチド活性の「強化」とは、ポリペプチドの活性を内在性活性に比べて向上させることを意味する。前記強化は、活性化（activation）、上方調節（up-regulation）、過剰発現（overexpression）、向上（increase）などと混用される。ここで、活性化、強化、上方調節、過剰発現、向上には、本来なかった活性を示すようになることや、内在性活性又は改変前の活性に比べて活性が向上することが全て含まれる。前記「内在性活性」とは、自然要因又は人為的要因により遺伝的に変異して形質が変化する場合に、形質変化の前の親株又は非改変微生物が本来有していた特定ポリペプチドの活性を意味する。これは、「変形前の活性」と混用される。ポリペプチドの活性が内在性活性に比べて「強化」、「上方調節」、「過剰発現」又は「向上」するとは、形質変化の前の親株又は非改変微生物が本来有していた特定ポリペプチドの活性及び／又は濃度（発現量）に比べて向上することを意味する。
【0089】
前記強化は、外来ポリペプチドの導入により達成してもよく、内在性ポリペプチドの活性強化及び／又は濃度（発現量）増加により達成してもよい。前記ポリペプチドの活性が強化されたか否かは、当該ポリペプチドの活性の程度、発現量、又は当該ポリペプチドから生産される産物の量の増加により確認することができる。
【0090】
前記ポリペプチドの活性の強化には、当該分野で周知の様々な方法を適用することができ、標的ポリペプチドの活性を改変前の微生物より強化できるものであればいかなるものでもよい。具体的には、分子生物学における通常の方法であり、当該技術分野における通常の知識を有する者に周知の遺伝子工学及び／又はタンパク質工学を用いたものであるが、これらに限定されるものではない（例えば、非特許文献１３、１４など）。
【0091】
具体的には、本出願のポリペプチドの強化は、１）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの細胞内コピー数を増加させること、２）ポリペプチドをコードする染色体上の遺伝子の発現調節領域を活性が強力な配列に置換すること、３）ポリペプチドをコードする遺伝子転写産物の開始コドンもしくは５’ＵＴＲ領域をコードする塩基配列を改変すること、４）ポリペプチドの活性が強化されるように前記ポリペプチドのアミノ酸配列を改変すること、５）ポリペプチドの活性が強化されるように前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を改変すること（例えば、ポリペプチドの活性が強化されるように改変されたポリペプチドをコードするように前記ポリペプチド遺伝子のポリヌクレオチド配列を改変すること）、６）ポリペプチドの活性を示す外来ポリペプチドもしくはそれをコードする外来ポリヌクレオチドを導入すること、７）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのコドンを最適化すること、８）ポリペプチドの三次構造を分析し、露出部分を選択して改変すること、もしくは化学的に修飾すること、又は９）前記１）～８）から選択される２つ以上の組み合わせにより行われるが、特にこれらに限定されるものではない。
【0092】
より具体的には、前記１）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの細胞内コピー数を増加させることは、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが作動可能に連結された、宿主に関係なく複製されて機能するベクターを宿主細胞内に導入することにより行われる。あるいは、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを宿主細胞内の染色体に１コピー又は２コピー以上導入することにより行われてもよい。前記染色体への導入は、宿主細胞内の染色体に前記ポリヌクレオチドを挿入することのできるベクターを宿主細胞内に導入することにより行われるが、これに限定されるものではない。前記ベクターについては前述した通りである。
【0093】
前記２）ポリペプチドをコードする染色体上の遺伝子の発現調節領域（又は発現調節配列）を活性が強力な配列に置換することは、例えば前記発現調節領域の活性がさらに強化されるように、欠失、挿入、非保存的もしくは保存的置換、又はそれらの組み合わせにより配列上の変異を発生させるか、より高い活性を有する配列に置換することにより行われる。前記発現調節領域には、特にこれらに限定されるものではないが、プロモーター、オペレーター配列、リボソーム結合部位をコードする配列、転写及び翻訳の終結を調節する配列などが含まれる。例えば、本来のプロモーターを強力なプロモーターに置換することにより行われるが、これに限定されるものではない。
【0094】
公知の強力なプロモーターの例としては、ｃｊ１～ｃｊ７プロモーター（特許文献３）、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ラムダファージＰＲプロモーター、ＰＬプロモーター、ｔｅｔプロモーター、ｇａｐＡプロモーター、ＳＰＬ７プロモーター、ＳＰＬ１３（ｓｍ３）プロモーター（特許文献４）、Ｏ２プロモーター（特許文献５）、ｔｋｔプロモーター、ｙｃｃＡプロモーターなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【0095】
前記３）ポリペプチドをコードする遺伝子転写産物の開始コドンもしくは５’ＵＴＲ領域をコードする塩基配列を改変することは、例えば、内在性開始コドンに比べてポリペプチドの発現率が高い他の開始コドンをコードする塩基配列に置換することにより行われるが、これに限定されるものではない。
【0096】
前記４）及び５）のアミノ酸配列又はポリヌクレオチド配列を改変することは、ポリペプチドの活性が強化されるように、前記ポリペプチドのアミノ酸配列又は前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を欠失、挿入、非保存的もしくは保存的置換、又はそれらの組み合わせにより配列上の変異を発生させるか、より高い活性を有するように改良されたアミノ酸配列もしくはポリヌクレオチド配列、又は活性が向上するように改良されたアミノ酸配列もしくはポリヌクレオチド配列に置換することにより行われるが、これらに限定されるものではない。具体的には、前記置換は、相同組換えによりポリヌクレオチドを染色体に挿入することにより行われるが、これに限定されるものではない。ここで、用いられるベクターは、染色体に挿入されたか否かを確認するための選択マーカー（selection marker）をさらに含んでもよい。前記選択マーカーについては前述した通りである。
【0097】
前記６）ポリペプチドの活性を示す外来ポリヌクレオチドを導入することは、前記ポリペプチドと同一／類似の活性を示すポリペプチドをコードする外来ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入することにより行われる。前記外来ポリヌクレオチドは、前記ポリペプチドと同一／類似の活性を示すものであれば、その由来や配列はいかなるものでもよい。前記導入は、公知の形質転換方法を当業者が適宜選択して行うことができ、宿主細胞内で前述したように導入したポリヌクレオチドが発現することにより、ポリペプチドが生成されてその活性が向上する。
【0098】
前記７）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのコドンを最適化することは、宿主細胞内で転写又は翻訳が増加するように、内在ポリヌクレオチドのコドンを最適化するか、宿主細胞内で最適化された転写、翻訳が行われるように、外来ポリヌクレオチドのコドンを最適化することにより行われる。
【0099】
前記８）ポリペプチドの三次構造を分析し、露出部分を選択して改変すること、もしくは化学的に修飾することは、例えば分析しようとするポリペプチドの配列情報を既知のタンパク質の配列情報が保存されているデータベースと比較し、配列の類似性の程度に応じて鋳型タンパク質の候補を決定し、それを基に構造を確認し、改変又は化学的に修飾する露出部分を選択して改変又は修飾することにより行われる。
【0100】
このようなポリペプチド活性の強化は、対応するポリペプチドの活性又は濃度、発現量を野生型や改変前の微生物菌株で発現するポリペプチドの活性又は濃度に比べて向上させるか、当該ポリペプチドから生産される産物の量を増加させることにより行われるが、これらに限定されるものではない。
【0101】
本出願の微生物において、ポリヌクレオチドの一部又は全部の改変は、（ａ）微生物中の染色体導入用ベクターを用いた相同組換え、もしくは遺伝子はさみ（engineered nuclease, e.g., CRISPR-Cas9）を用いたゲノム編集、並びに／又は（ｂ）紫外線や放射線などの光及び／もしくは化学物質処理により誘導することができるが、これらに限定されるものではない。前記遺伝子の一部又は全部の改変方法には、ＤＮＡ組換え技術による方法が含まれる。例えば、標的遺伝子と相同性のあるヌクレオチド配列が含まれるヌクレオチド配列又はベクターを前記微生物に導入して相同組換え（homologous recombination）を起こすことにより遺伝子の一部又は全部の欠失が行われる。この導入されるヌクレオチド配列又はベクターには、優性選択マーカーが含まれてもよいが、これに限定されるものではない。
【0102】
本出願のさらに他の態様は、本出願の変異体、前記変異体をコードするポリヌクレオチド、及び前記ポリヌクレオチドを含むベクターの少なくとも１つを含む微生物を培地で培養するステップを含む、テトラテルペン、テトラテルペンの前駆体、又はテトラテルペンを前駆体とする物質の生産方法を提供する。前記テトラテルペン、テトラテルペンの前駆体、又はテトラテルペンを前駆体とする物質の生産方法は、スクアレン生産を減少させる方法であるが、これに限定されるものではない。
【0103】
本出願における「培養」とは、本出願の微生物を適宜調節した環境条件で生育させることを意味する。本出願の培養過程は、当該技術分野で公知の好適な培地と培養条件で行うことができる。このような培養過程は、当業者であれば選択される菌株に応じて容易に調整して用いることができる。具体的には、前記培養は、回分、連続及び／又は流加培養であるが、これらに限定されるものではない。
【0104】
本出願における「培地」とは、本出願の微生物を培養するために必要な栄養物質を主成分として混合した物質を意味し、生存及び発育に不可欠な水をはじめとする栄養物質や発育因子などを供給する。具体的には、本出願の微生物の培養に用いられる培地及び他の培養条件は、通常の微生物の培養に用いられる培地であればいかなるものでもよく、好適な炭素源、窒素源、リン源、無機化合物、アミノ酸及び／又はビタミンなどを含有する通常の培地中で好気性条件下にて温度、ｐＨなどを調節して本出願の微生物を培養することができる。
【0105】
本出願における前記炭素源としては、グルコース、サッカロース、ラクトース、フルクトース、スクロース、マルトースなどの炭水化物、マンニトール、ソルビトールなどの糖アルコール、ピルビン酸、乳酸、クエン酸などの有機酸、グルタミン酸、メチオニン、リシンなどのアミノ酸などが挙げられる。また、デンプン加水分解物、糖蜜、ブラックストラップ糖蜜、米糠、キャッサバ、バガス、トウモロコシ浸漬液などの天然の有機栄養源を用いることができ、具体的には、グルコースや殺菌した前処理糖蜜（すなわち、還元糖に変換した糖蜜）などの炭水化物を用いることができ、その他適量の炭素源であればいかなるものでも用いることができる。これらの炭素源は、単独で用いることもでき、２種以上を組み合わせて用いることもできるが、これらに限定されるものではない。
【0106】
前記窒素源としては、アンモニア、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、硝酸アンモニウムなどの無機窒素源と、グルタミン酸、メチオニン、グルタミンなどのアミノ酸、ペプトン、ＮＺ－アミン、肉類抽出物、酵母抽出物、麦芽抽出物、トウモロコシ浸漬液、カゼイン加水分解物、魚類又はその分解生成物、脱脂大豆ケーキ又はその分解生成物などの有機窒素源とを用いることができる。これらの窒素源は、単独で用いることもでき、２種以上を組み合わせて用いることもできるが、これらに限定されるものではない。
【0107】
前記リン源としては、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム又はそれらに相当するナトリウム含有塩などが挙げられる。無機化合物としては、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、塩化鉄、硫酸マグネシウム、硫酸鉄、硫酸マンガン、炭酸カルシウムなどを用いることができ、それ以外に、アミノ酸、ビタミン及び／又は好適な前駆体などを用いることができる。これらの構成成分又は前駆体は、培地に回分式又は連続式で添加することができる。しかし、これらに限定されるものではない。
【0108】
また、本出願の微生物の培養中に水酸化アンモニウム、水酸化カリウム、アンモニア、リン酸、硫酸などの化合物を培地に好適な方法で添加し、培地のｐＨを調整してもよい。さらに、培養中に脂肪酸ポリグリコールエステルなどの消泡剤を用いて気泡生成を抑制してもよい。さらに、培地の好気状態を維持するために、培地中に酸素又は酸素含有気体を注入してもよく、嫌気及び微好気状態を維持するために、気体を注入しなくてもよく、窒素、水素又は二酸化炭素ガスを注入してもよいが、これらに限定されるものではない。
【0109】
本出願の培養において、培養温度は２０～４５℃、具体的には２５～４０℃、２０～３５℃、又は２５～３５℃に維持し、約１０～１６０時間培養するが、これらに限定されるものではない。
【0110】
本出願の培養により生産されたテトラテルペン、テトラテルペンの前駆体、又はテトラテルペンを前駆体とする物質は、培地中に分泌されるか、細胞内に残留する。
本出願のテトラテルペン、テトラテルペンの前駆体、又はテトラテルペンを前駆体とする物質の生産方法は、本出願の微生物を準備するステップ、前記菌株を培養するための培地を準備するステップ、又はそれらの組み合わせ（任意の順序，in any order）を、例えば前記培養するステップの前にさらに含んでもよい。
本出願のテトラテルペン、テトラテルペンの前駆体、又はテトラテルペンを前駆体とする物質の生産方法は、本出願の微生物を準備するステップ、前記菌株を培養するための培地を準備するステップ、又はそれらの組み合わせ（任意の順序，in any order）を、例えば前記培養するステップの前にさらに含んでもよい。
【0111】
本出願のテトラテルペン、テトラテルペンの前駆体、又はテトラテルペンを前駆体とする物質の生産方法は、前記培養に用いた培地（培養が行われた培地）又は本出願の微生物からテトラテルペン、テトラテルペンの前駆体、又はテトラテルペンを前駆体とする物質を回収するステップをさらに含んでもよい。前記回収するステップは、前記培養するステップの後にさらに含んでもよい。
【0112】
前記回収は、本出願の微生物の培養方法、例えば回分、連続、流加培養方法などに応じて、当該技術分野で公知の好適な方法を用いて目的とするテトラテルペン、テトラテルペンの前駆体、又はテトラテルペンを前駆体とする物質を回収（collect）するものであってもよい。例えば、遠心分離、濾過、結晶化、タンパク質沈殿剤による処理（塩析法）、抽出、細胞破砕、超音波破砕、限外濾過、透析法、分子篩クロマトグラフィー（ゲル濾過）、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどの各種クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ又はそれらの組み合わせが用いられ、当該分野で公知の好適な方法を用いて培地又は微生物から目的とするテトラテルペン、テトラテルペンの前駆体、又はテトラテルペンを前駆体とする物質を回収することができる。
【0113】
また、本出願のテトラテルペン、テトラテルペンの前駆体、又はテトラテルペンを前駆体とする物質の生産方法は、精製ステップをさらに含んでもよい。前記精製は、当該技術分野で公知の好適な方法により行うことができる。例えば、本出願のテトラテルペン、テトラテルペンの前駆体、又はテトラテルペンを前駆体とする物質の生産方法が回収ステップと精製ステップの両方を含む場合、前記回収ステップと前記精製ステップは、順序に関係なく異時的（又は連続的）に行ってもよく、同時に又は１つのステップとして統合して行ってもよいが、これらに限定されるものではない。
【0114】
本出願のテトラテルペンを前駆体とする物質の生産方法は、テトラテルペンを前駆体とする物質にテトラテルペンを変換するステップをさらに含んでもよい。本出願のテトラテルペンを前駆体とする物質の生産方法において、前記培養するステップ又は前記回収するステップの後に、前記変換するステップをさらに含んでもよい。前記変換するステップは、当該技術分野で公知の好適な方法により行うことができる。例えば、前記変換は、β－カロテン１５，１５’－オキシゲナーゼ又はレチノールデヒドロゲナーゼ（retinol dehydrogenase）を用いて行うことができるが、これらに限定されるものではない。
【0115】
前記変異体、ポリヌクレオチド、ベクター、微生物、テトラテルペン、テトラテルペンの前駆体、テトラテルペンを前駆体とする物質などについては前述した通りである。
本出願のさらに他の態様は、本出願の変異体と、本出願のベクターと、本出願の変異体、前記変異体をコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含むベクター、又は本出願のポリヌクレオチドを含む微生物と、それを培養した培地と、それらの少なくとも２つの組み合わせとからなる群から選択されるいずれかを含む、テトラテルペン、テトラテルペンの前駆体、及びテトラテルペンを前駆体とする物質の生産用組成物を提供する。
本出願のさらに他の態様は、本出願の変異体と、本出願のベクターと、本出願の変異体、前記変異体をコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含むベクター、又は本出願のポリヌクレオチドを含む微生物と、それを培養した培地と、それらの少なくとも２つの組み合わせとからなる群から選択されるいずれかを含む、テトラテルペン、テトラテルペンの前駆体、及びテトラテルペンを前駆体とする物質の生産用組成物を提供する。
【0116】
本出願の組成物は、テトラテルペン、テトラテルペンの前駆体、及びテトラテルペンを前駆体とする物質の生産用組成物に通常用いられる任意の好適な賦形剤をさらに含んでもよい。このような賦形剤としては、例えば保存剤、湿潤剤、分散剤、懸濁化剤、緩衝剤、安定化剤、等張化剤などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【0117】
前記変異体、ポリヌクレオチド、ベクター、微生物、培地、テトラテルペン、テトラテルペンの前駆体、テトラテルペンを前駆体とする物質などについては前述した通りである。
【0118】
本出願のさらに他の態様は、本出願の変異体、ポリヌクレオチド、ベクター及び微生物の少なくとも１つにおける、テトラテルペン、テトラテルペンの前駆体、及びテトラテルペンを前駆体とする物質の生産への使用を提供する。
【0119】
前記変異体、ポリヌクレオチド、ベクター、微生物、テトラテルペン、テトラテルペンの前駆体、テトラテルペンを前駆体とする物質などについては前述した通りである。
【実施例】
【0120】
以下、実施例を挙げて本出願をより詳細に説明する。しかし、これらの実施例及び実験例は本出願を例示するものにすぎず、本出願がこれらの実施例及び実験例に限定されるものではない。
【0121】
［実施例１］
ＧＧＳ１変異ベクターライブラリーの構築
ヤロウィア・リポリティカ（Yarrowia lioplytica）染色体上でゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼをコードするＧＧＳ１遺伝子を増幅するために、ＫＥＧＧ（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）に登録されている塩基配列に基づいて、ＧＧＳ１（ＹＡＬＩ０Ｄ１７０５０）の配列番号１のアミノ酸及び配列番号２のポリヌクレオチド配列を確保した。Ｅｒｒｏｒ－ｐｒｏｎｅＰＣＲ（ｅｐ－ＰＣＲ）により任意の（random）変異を誘導するために、ｄｉｖｅｒｓｉｆｙＰＣＲ ｒａｎｄｏｍ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓｋｉｔ（Takara社）を用いた。ＰＣＲ条件及び方法は、最適化により取扱説明書（user manual）のｂｕｆｆｅｒ条件１及びｂｕｆｆｅｒ条件２でそれぞれ行った。具体的なＥｒｒｏｒ－ｐｒｏｎｅＰＣＲ条件を表１に示す。
ＧＧＳ１変異ベクターライブラリーの構築
ヤロウィア・リポリティカ（Yarrowia lioplytica）染色体上でゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼをコードするＧＧＳ１遺伝子を増幅するために、ＫＥＧＧ（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）に登録されている塩基配列に基づいて、ＧＧＳ１（ＹＡＬＩ０Ｄ１７０５０）の配列番号１のアミノ酸及び配列番号２のポリヌクレオチド配列を確保した。Ｅｒｒｏｒ－ｐｒｏｎｅＰＣＲ（ｅｐ－ＰＣＲ）により任意の（random）変異を誘導するために、ｄｉｖｅｒｓｉｆｙＰＣＲ ｒａｎｄｏｍ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓｋｉｔ（Takara社）を用いた。ＰＣＲ条件及び方法は、最適化により取扱説明書（user manual）のｂｕｆｆｅｒ条件１及びｂｕｆｆｅｒ条件２でそれぞれ行った。具体的なＥｒｒｏｒ－ｐｒｏｎｅＰＣＲ条件を表１に示す。
【0122】
【表1】
【0123】
ヤロウィア・リポリティカ（Yarrowia lipolytica）ＰＯ１ｆのゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号１９と配列番号２０のプライマーを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ条件は、９５℃で１分間の変性、５５℃で１分間のアニーリング、６８℃で１分間の重合反応を３２サイクル行うものとした。ＰＣＲにより増幅した２つの条件のＧＧＳ１ＰＣＲ産物を混合し、ｐＩＭＲ５３－ＥＸＰ１ｐ－ＣＹＣ１ｔベクターベースのＧＧＳ１変異体発現ベクターライブラリーを作製した。
【0124】
ｐＩＭＲ５３－ＥＸＰ１ｐ－ＣＹＣ１ｔベクターは、次の方法で作製した。ＥＸＰ１ｐを増幅するために、ヤロウィア・リポリティカ（Yarrowia lipolytica）ＰＯ１ｆのゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号２１と配列番号２２のプライマーを用いてＰＣＲを行い、ＣＹＣ１ｔターミネーターを増幅するために、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）のゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号２３と配列番号２４のプライマーを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ条件は、９５℃で１分間の変性、５５℃で１分間のアニーリング、６８℃で１分間の重合反応を３２サイクル行うものとした。さらに、ｐＩＭＲ５３ベクターを鋳型とし、配列番号２５と配列番号２６のプライマーを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ条件は、９５℃で１分間の変性、５５℃で１分間のアニーリング、６８℃で５分間の重合反応を３２サイクル行うものとした。
【0125】
その結果、６，７７４ｂｐのｌｉｎｅａｒｉｚｅｄｐＩＭＲ５３、１，０５０ｂｐのＥＸＰ１ｐ、及び２８９ｂｐのＣＹＣ１ｔが得られた。ＰＣＲにより増幅した前記ＥＸＰ１ｐ及びＣＹＣ１ｔのＤＮＡ断片は、Ｉｎｆｕｓｉｏｎクローニングキット（Invitrogen）を用いてｐＩＭＲ５３ベクターにライゲーションし、その後大腸菌ＤＨ５αに形質転換し、３０ｍｇ／Ｌのアンピシリン含有ＬＢ固体培地に塗抹した。ＰＣＲにより目的とするＥＸＰ１ｐプロモーターとＣＹＣ１ｔターミネーターが挿入されたプラスミドで形質転換されたコロニーを選択し、その後周知のプラスミド抽出法を用いてプラスミドを得た。そのプラスミドをｐＩＭＲ５３－ＥＸＰ１ｐ－ＣＹＣ１ｔと命名した。
【0126】
［実施例２］
β－カロテン生産用Ｙａｒｒｏｗｉａｌｉｐｏｌｙｔｉｃａプラットフォーム菌株の作製
実施例２－１．Ｘ．ｄｅｎｄｒｏｒｈｏｕｓ由来のｃｒｔＹＢ－ｃｒｔＩ挿入株の作製
β－カロテン生産のためのプラットフォーム菌株の作製のために、高脂肪酵母であるＹａｒｒｏｗｉａｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ ＣＣ０８－０１２５（寄託番号ＫＣＣＭ１２９７２Ｐ）菌株のゲノムにＸａｎｔｈｏｐｈｙｌｌｏｍｙｃｅｓｄｅｎｄｒｏｒｈｏｕｓ由来のｌｙｃｏｐｅｎｅ ｃｙｃｌａｓｅ／ｐｈｙｔｏｅｎｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ（ｃｒｔＹＢ）及びｐｈｙｔｏｅｎｅ ｄｅｓａｔｕｒａｓｅ（ｃｒｔＩ）遺伝子を挿入した。ｃｒｔＹＢはＮＣＢＩ（National Center for Biotechnology Information Search database）に登録されている塩基配列（GenBank: AY177204.1）に基づいて配列番号２７のポリヌクレオチドを確保し、ｃｒｔＩはＮＣＢＩに登録されている塩基配列（GenBank: AY177424.1）に基づいて配列番号２８のポリヌクレオチドを確保した。ｃｒｔＹＢとｃｒｔＩのポリヌクレオチド配列は、マクロジェン社に依頼してＴＥＦＩＮｔｐ－ｃｒｔＹＢ－ＣＹＣ１ｔ（配列番号２９）、ＴＥＦＩＮｔｐ－ｃｒｔＩ－ＣＹＣ１ｔ（配列番号３０）の形態に遺伝子を合成した。選択マーカーとしてＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａのＵＲＡ３遺伝子（配列番号３１）を用いて、ＭＨＹ１（ＹＡＬＩ０Ｂ２１５８２ｇ）遺伝子位置に挿入するカセットをデザインした。合成したｃｒｔＹＢ、ｃｒｔＩ遺伝子及びＫＣＣＭ１２９７２ＰのゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号３２及び配列番号３３、配列番号３４及び配列番号３５、配列番号３６及び配列番号３７、配列番号３８及び配列番号３９、配列番号４０及び配列番号４１、配列番号４２及び配列番号４３のプライマーを用いて各ＰＣＲを行った。ＰＣＲ条件は、９５℃で１分間の変性、５５℃で１分間のアニーリング、７２℃で３分３０秒間の重合反応を３５サイクル行うものとした。結果として得られた５つのＤＮＡ断片をｏｖｅｒｌａｐｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ＰＣＲにより１つのカセットに作製した。
β－カロテン生産用Ｙａｒｒｏｗｉａｌｉｐｏｌｙｔｉｃａプラットフォーム菌株の作製
実施例２－１．Ｘ．ｄｅｎｄｒｏｒｈｏｕｓ由来のｃｒｔＹＢ－ｃｒｔＩ挿入株の作製
β－カロテン生産のためのプラットフォーム菌株の作製のために、高脂肪酵母であるＹａｒｒｏｗｉａｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ ＣＣ０８－０１２５（寄託番号ＫＣＣＭ１２９７２Ｐ）菌株のゲノムにＸａｎｔｈｏｐｈｙｌｌｏｍｙｃｅｓｄｅｎｄｒｏｒｈｏｕｓ由来のｌｙｃｏｐｅｎｅ ｃｙｃｌａｓｅ／ｐｈｙｔｏｅｎｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ（ｃｒｔＹＢ）及びｐｈｙｔｏｅｎｅ ｄｅｓａｔｕｒａｓｅ（ｃｒｔＩ）遺伝子を挿入した。ｃｒｔＹＢはＮＣＢＩ（National Center for Biotechnology Information Search database）に登録されている塩基配列（GenBank: AY177204.1）に基づいて配列番号２７のポリヌクレオチドを確保し、ｃｒｔＩはＮＣＢＩに登録されている塩基配列（GenBank: AY177424.1）に基づいて配列番号２８のポリヌクレオチドを確保した。ｃｒｔＹＢとｃｒｔＩのポリヌクレオチド配列は、マクロジェン社に依頼してＴＥＦＩＮｔｐ－ｃｒｔＹＢ－ＣＹＣ１ｔ（配列番号２９）、ＴＥＦＩＮｔｐ－ｃｒｔＩ－ＣＹＣ１ｔ（配列番号３０）の形態に遺伝子を合成した。選択マーカーとしてＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａのＵＲＡ３遺伝子（配列番号３１）を用いて、ＭＨＹ１（ＹＡＬＩ０Ｂ２１５８２ｇ）遺伝子位置に挿入するカセットをデザインした。合成したｃｒｔＹＢ、ｃｒｔＩ遺伝子及びＫＣＣＭ１２９７２ＰのゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号３２及び配列番号３３、配列番号３４及び配列番号３５、配列番号３６及び配列番号３７、配列番号３８及び配列番号３９、配列番号４０及び配列番号４１、配列番号４２及び配列番号４３のプライマーを用いて各ＰＣＲを行った。ＰＣＲ条件は、９５℃で１分間の変性、５５℃で１分間のアニーリング、７２℃で３分３０秒間の重合反応を３５サイクル行うものとした。結果として得られた５つのＤＮＡ断片をｏｖｅｒｌａｐｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ＰＣＲにより１つのカセットに作製した。
【0127】
このように作製したカセットを熱ショック法（非特許文献１５）によりＫＣＣＭ１２９７２Ｐ菌株に導入し、その後ｕｒａｃｉｌ不含固体培地（ＹＬＭＭ１）で形成されたコロニーを得た。配列番号４４及び配列番号４５のプライマーを用いて、ゲノムへのカセット挿入が確認されたコロニーを５－ＦＯＡ固体培地にｓｐｏｔｔｉｎｇして３０℃で３日間培養し、５－ＦＯＡ固体培地で生育したコロニーを得ることにより、ＵＲＡ３マーカーを回収した。
【0128】
実施例２－２．ＨＭＧＲ強化株の作製
前述したように実施例２－１で作製したｃｒｔＹＢ、ｃｒｔＩ遺伝子を挿入した菌株のヒドロキシメチルグルタリルＣｏＡレダクターゼ（3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase, HMGR）遺伝子のｎａｔｉｖｅプロモーター（配列番号４６）部位をＴＥＦＩＮｔプロモーターに置換するためのカセットをデザインし、ＫＣＣＭ１２９７２ＰのゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号４７及び配列番号４８、配列番号４９及び配列番号５０、配列番号５１及び配列番号５２、配列番号５３及び配列番号５４、配列番号５５及び配列番号５６のプライマーを用いて各ＰＣＲを行った。ＰＣＲ条件は、９５℃で１分間の変性、５５℃で１分間のアニーリング、７２℃で１分３０秒間の重合反応を３５サイクル行うものとした。結果として得られた５つのＤＮＡ断片をｏｖｅｒｌａｐｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ＰＣＲにより１つのカセットに作製した。
前述したように実施例２－１で作製したｃｒｔＹＢ、ｃｒｔＩ遺伝子を挿入した菌株のヒドロキシメチルグルタリルＣｏＡレダクターゼ（3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase, HMGR）遺伝子のｎａｔｉｖｅプロモーター（配列番号４６）部位をＴＥＦＩＮｔプロモーターに置換するためのカセットをデザインし、ＫＣＣＭ１２９７２ＰのゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号４７及び配列番号４８、配列番号４９及び配列番号５０、配列番号５１及び配列番号５２、配列番号５３及び配列番号５４、配列番号５５及び配列番号５６のプライマーを用いて各ＰＣＲを行った。ＰＣＲ条件は、９５℃で１分間の変性、５５℃で１分間のアニーリング、７２℃で１分３０秒間の重合反応を３５サイクル行うものとした。結果として得られた５つのＤＮＡ断片をｏｖｅｒｌａｐｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ＰＣＲにより１つのカセットに作製した。
【0129】
このように作製したカセットを熱ショック法により実施例２－１で作製した菌株に導入し、その後ｕｒａｃｉｌ不含固体培地（ＹＬＭＭ１）で形成されたコロニーを得た。配列番号５７及び配列番号５８のプライマーを用いて、カセット挿入が確認されたコロニーを５－ＦＯＡ固体培地にｓｐｏｔｔｉｎｇして３０℃で３日間培養し、５－ＦＯＡ固体培地で生育したコロニーを得ることにより、ＵＲＡ３マーカーを回収した。最終的に作製されたβ－カロテン生産プラットフォーム菌株をＣＣ０８－１０２３と命名した。
【0130】
＜Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ ｍｉｎｉｍａｌ ｍｅｄｉａ１（ＹＬＭＭ１）＞
グルコース２０ｇ／Ｌ，アミノ酸不含酵母ニトロゲンベース（Yeast nitrogen base without amino acids）６．７ｇ／Ｌ，ウラシル不含酵母合成ドロップアウト培地用添加物（Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements without uracil）２ｇ／Ｌ，寒天（agar）１５ｇ／Ｌ
＜５－ＦｌｕｏｒｏｏｒｏｔｉｃＡｃｉｄ（５－ＦＯＡ）＞
グルコース２０ｇ／Ｌ，アミノ酸不含酵母ニトロゲンベース（Yeast nitrogen base without amino acids）６．７ｇ／Ｌ，ウラシル付含酵母合成ドロップアウト培地用添加物（Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements without uracil）２ｇ／Ｌ，ウラシル（Uracil）５０μｇ／ｍＬ，５－フルオロオロチン酸（5-Fluoroorotic acid; 5-FOA）１ｇ／Ｌ，寒天（agar）１５ｇ／Ｌ
［実施例３］
ＧＧＳ１活性強化株の１次選択
ＧＧＳ１活性強化株の１次選択のために、色ベースの１次選択を行った。
グルコース２０ｇ／Ｌ，アミノ酸不含酵母ニトロゲンベース（Yeast nitrogen base without amino acids）６．７ｇ／Ｌ，ウラシル不含酵母合成ドロップアウト培地用添加物（Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements without uracil）２ｇ／Ｌ，寒天（agar）１５ｇ／Ｌ
＜５－ＦｌｕｏｒｏｏｒｏｔｉｃＡｃｉｄ（５－ＦＯＡ）＞
グルコース２０ｇ／Ｌ，アミノ酸不含酵母ニトロゲンベース（Yeast nitrogen base without amino acids）６．７ｇ／Ｌ，ウラシル付含酵母合成ドロップアウト培地用添加物（Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements without uracil）２ｇ／Ｌ，ウラシル（Uracil）５０μｇ／ｍＬ，５－フルオロオロチン酸（5-Fluoroorotic acid; 5-FOA）１ｇ／Ｌ，寒天（agar）１５ｇ／Ｌ
［実施例３］
ＧＧＳ１活性強化株の１次選択
ＧＧＳ１活性強化株の１次選択のために、色ベースの１次選択を行った。
【0131】
まず、β－カロテンを少量生産するＹａｒｒｏｗｉａｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ ＣＣ０８－１０２３菌株に、ｐＩＭＲ５３（negative control; NC）、ｐＩＭＲ５３－ＥＸＰ１ｐ－ＧＧＳ１（野生型，配列番号２）－ＣＹＣ１ｔベクター（positive control; PC）及び実施例１で構築したＧＧＳ１ｒａｎｄｏｍ変異体発現ベクターライブラリーを熱ショック法（heat-shock）により形質転換した。その後、ウラシル（uracil）不含固体培地で形成されたコロニーを得た。
【0132】
９６ ｄｅｅｐ－ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ ２５枚にウラシル不含ＹＬＭＭ２（Yarrowia lipolytica minimal media 2）液体培地を３５０μｌずつ分注し、得られたコロニーを接種して３０℃で４８時間培養した。その後、ウラシル不含ＹＬＭＭ１固体培地に接種して３０℃で３日間培養し、培養終了後に、全２，４００種の菌株から、ｐｏｓｉｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌ（ＣＣ０８－１０２３／ｐＩＭＲ５３－ＥＸＰ１ｐ－ＧＧＳ１－ＣＹＣ１ｔ）ベクターで形質転換した菌株に比べて濃いオレンジ色の菌株３６種を１次選択した。前述したＹＬＭＭ２の製造方法及び組成は次の通りである。
【0133】
＜ＹＬＭＭ２（ｐＨ７．２）＞
ブドウ糖４０ｇ／Ｌ、アミノ酸及び硫酸アンモニウム不含酵母ニトロゲンベース（Yeast nitrogen base without amino acids and ammonium sulfate）１．７ｇ／Ｌ、ウラシル（Uracil）０．５ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム（Ammonium sulfate）２．５ｇ／Ｌを０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（sodium phosphate buffer）（ｐＨ７．２）に溶解させたもの
［実施例４］
ＧＧＳ１活性強化株の２次選択
ＧＧＳ１活性強化株の２次選択のために、実施例３で１次選択した３６種に対するフラスコ評価を行った。
ブドウ糖４０ｇ／Ｌ、アミノ酸及び硫酸アンモニウム不含酵母ニトロゲンベース（Yeast nitrogen base without amino acids and ammonium sulfate）１．７ｇ／Ｌ、ウラシル（Uracil）０．５ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム（Ammonium sulfate）２．５ｇ／Ｌを０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（sodium phosphate buffer）（ｐＨ７．２）に溶解させたもの
［実施例４］
ＧＧＳ１活性強化株の２次選択
ＧＧＳ１活性強化株の２次選択のために、実施例３で１次選択した３６種に対するフラスコ評価を行った。
【0134】
ウラシル不含ＹＬＭＭ２（Yarrowia lipolytica minimal media 2）５０ｍｌを入れた２５０ｍｌのコーナーバッフルフラスコに、前記３６種の菌株及びＰＣ（positive control）ベクターで形質転換された菌株を初期ＯＤが１になるようにそれぞれ接種し、３０℃、２５０ｒｐｍで４８時間振盪培養した。
【0135】
培養終了後に、培養液１ｍｌを遠心分離して上清を除去した。次に、ＤＭＳＯ（Dimethyl sulfoxide, sigma社）０．５ｍｌを添加し、５５℃、２０００ｒｐｍで１０分間振盪してセルを破砕した。さらに、アセトン（sigma社）０．５ｍｌを添加し、４５℃、２０００ｒｐｍで１５分間振盪してβ－カロテンとスクアレンを抽出した。抽出した物質において、ＨＰＬＣ設備で濃度を分析した。選択株のフラスコ評価における、ＯＤ、β－カロテン及びスクアレンの濃度及び含有量の測定結果を表２に示す。
【0136】
【表2-1】
【0137】
【表2-2】
【0138】
その後、評価試料から抽出したβ－カロテンとスクアレンの濃度をＤＣＷ（ｇ／Ｌ）で割った値を２次選択の基準として用いた。Ｎｏ．２、Ｎｏ．４、Ｎｏ．９及びＮｏ．２８菌株を除く３３種の評価菌株において、β－カロテン濃度をＤＣＷ（ｇ／Ｌ）で割った値（β-carotene (%)）がＰＣ（positive control）に比べて増加することが確認された。スクアレン濃度をＤＣＷ（ｇ／Ｌ）で割った値は、全ての評価菌株において、ＰＣ（positive control）に比べて減少することが確認された。
【0139】
よって、ＰＣ（positive control）から求めた値に基づいて基準値を設定し、２つの条件の両方に該当する菌株を選択し、条件１と条件２を同時に満足する候補群全４種を選択した。前記２次選択の基準値と２次選択の候補４種を表３に示す。
【0140】
【表3】
【0141】
選択した４種の菌株から形質転換されたプラスミドを抽出し、ＧＧＳ１ＯＲＦに位置するｒａｎｄｏｍ変異を確認するための配列分析を行った。Ｚｙｍｏｐｒｅｐｙｅａｓｔ ｐｌａｓｍｉｄ ｍｉｎｉｐｒｅｐｋｉｔ ２（Zymo research社）を用いて、選択した菌株から形質転換されたＧＧＳ１プラスミドを抽出し、配列分析の信頼性を高めるために、配列番号５９と配列番号６０のプライマーを用いて、両方向の配列分析を行った。ＧＧＳ１ＯＲＦの配列分析により確認されたアミノ酸変異を表４に示す。４種の候補群は、表４に示すように、１つ又は２つの突然変異を含むことが確認された。
【0142】
【表4】
【0143】
［実施例５］
ＧＧＳ１選択変異体の活性検証
実施例３及び実施例４で選択したＧＧＳ１変異体の活性検証実験を行った。
ＧＧＳ１選択変異体の活性検証
実施例３及び実施例４で選択したＧＧＳ１変異体の活性検証実験を行った。
【0144】
そのために、ＮＣ（negative control）及びＰＣ（positive control）ベクター、実施例４で選択した変異体４種（Ｍ１０３Ｉ変異体、Ｆ４３Ｉ変異体、Ｎ２９Ｔ及びＬ９０Ｒ変異体、並びにＩ１２２Ｖ及びＲ１４１Ｋ変異体）及び関連単独変異体４種（Ｎ２９Ｔ変異体、Ｌ９０Ｒ変異体、Ｉ１２２Ｖ変異体及びＲ１４１Ｋ変異体）発現ベクターを形質転換して作製した全１０種の菌株のフラスコ評価を行った。
【0145】
単独変異体４種（Ｎ２９Ｔ変異体、Ｌ９０Ｒ変異体、Ｉ１２２Ｖ変異体及びＲ１４１Ｋ変異体）それぞれの発現ベクターの作製方法は次の通りである。単独変異体４種（Ｎ２９Ｔ変異体、Ｌ９０Ｒ変異体、Ｉ１２２Ｖ変異体及びＲ１４１Ｋ変異体）のＤＮＡ断片を確保するために、野生型ＧＧＳ１配列を含むｐＩＭＲ５３－ＥＸＰ１ｐ－ＧＧＳ１－ＣＹＣ１ｔベクターを鋳型とし、配列番号６１と配列番号６２、配列番号６３と配列番号６４、配列番号６５と配列番号６６、配列番号６７と配列番号６８のプライマーを用いて各ＰＣＲを行った。ＰＣＲ条件は、９５℃で１分間の変性、５５℃で１分間のアニーリング、６８℃で５分間の重合反応を３２サイクル行うものとした。二重変異体であるＮ２９Ｔ及びＬ９０Ｒ変異体、又はＩ１２２Ｖ及びＲ１４１Ｋ変異体の発現ベクターは、それぞれ前述したように作製したＮ２９Ｔ発現ベクター又はＩ１２２Ｖ発現ベクターを鋳型とし、配列番号６３と配列番号６４のプライマー、又は配列番号６７と配列番号６８のプライマーを用いて、同様にＰＣＲを行って作製した。
【0146】
その結果、ＰＣＲにより増幅した前記変異体を導入したＤＮＡは、Ｉｎｆｕｓｉｏｎクローニングキット（Invitrogen）を用いて大腸菌ＤＨ５αに形質転換し、３０ｍｇ／Ｌのアンピシリン含有ＬＢ固体培地に塗抹した。形質転換されたＧＧＳ１変異体４種のベクターが挿入されたプラスミドで形質転換されたコロニーを選択し、その後周知のプラスミド抽出法を用いてプラスミドを得た。配列番号５９と配列番号６０を用いて、変異体配列を確認した。
【0147】
具体的には、ウラシル不含ＹＬＭＭ２（Yarrowia lipolytica minimal media 2）５０ｍｌを入れた２５０ｍｌのコーナーバッフルフラスコに、前記１０種の菌株を初期ＯＤが１になるように接種し、３０℃、２５０ｒｐｍで４８時間振盪培養した。
【0148】
培養終了後に、培養液１ｍｌを遠心分離して上清を除去した。その後、ＤＭＳＯ（Dimethyl sulfoxide, sigma社）０．５ｍｌを添加し、５５℃、２０００ｒｐｍで１０分間振盪してセルを破砕した。さらに、アセトン（sigma社）０．５ｍｌを添加し、４５℃、２０００ｒｐｍで１５分間振盪してβ－カロテン及びスクアレンを抽出し、ＨＰＬＣ設備で濃度を分析した。分析したＯＤ、β－カロテン及びスクアレンの濃度及び含有量の測定結果を表５に示す。
【0149】
【表5】
【0150】
表５に示すように、選択したＭ１０３Ｉ、Ｆ４３Ｉ、Ｎ２９Ｔ、Ｌ９０Ｒ、Ｉ１２２Ｖ及び／又はＲ１４１Ｋ変異を適用したＧＧＳ１変異体の全てにおいて、ＰＣ（positive control）に比べて、β－カロテン濃度が１４３～２３０％増加し、スクアレン濃度が１１～５１％減少することが確認された。その結果、単独変異体を導入した６種の菌株の中では、Ｆ４３Ｉ変異体を導入した菌株の効果が最も大きく、Ｉ１２２Ｖ及びＲ１４１Ｋ変異体においては、両変異体の単独適用に比べて、同時に適用した際のβ－カロテン濃度増加及びスクアレン生産量減少効果がさらに増加することが確認された。また、Ｎ２９Ｔ及びＬ９０Ｒ変異体においては、両変異体の単独適用に比べて、同時に適用した際のスクアレン生産減少効果がさらに増加することが確認された。
【0151】
［実施例６］
ＧＧＳ１変異体導入株の作製及び評価
前述した実施例で最も優れると判断されたＧＧＳ１Ｆ４３Ｉ変異体を実際に菌株に導入した際の効果を検証することを試みた。
ＧＧＳ１変異体導入株の作製及び評価
前述した実施例で最も優れると判断されたＧＧＳ１Ｆ４３Ｉ変異体を実際に菌株に導入した際の効果を検証することを試みた。
【0152】
そのために、ＣＣ０８－１０２３をベースにＧＧＳ１遺伝子のプロモーターを置換した菌株（ＣＣ０８－１２１４）、及びＧＧＳ１の４３番目のフェニルアラニンをイソロイシンに置換した変異体を発現する菌株（ＣＣ０８－１２１５）を順次作製した。
【0153】
実施例６－１．ＧＧＳ１ ｐｒｏｍｏｔｅｒ置換株（「ＣＣ０８－１２１４」）の作製
ヤロウィア・リポリティカ（Yarrowia lipolytica）染色体上でＧＧＳ１のｐｒｏｍｏｔｅｒをＴＥＦＩＮｔｐｒｏｍｏｔｅｒに置換するｃａｓｓｅｔｔｅを作製するために、ＫＥＧＧ（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）に登録されている塩基配列に基づいて、ＴＥＦ１（ＹＡＬＩ０Ｃ０９１４１ｐ）のｐｒｏｍｏｔｅｒ及びｓｐｌｉｃｉｎｇｐｏｉｎｔを含む配列番号６９のポリヌクレオチド配列を確保した。また、ＧＧＳ１のｐｒｏｍｏｔｅｒを置換するために、ＧＧＳ１（ＹＡＬＩ０Ｄ１７０５０ｇ）の配列番号２のポリヌクレオチド配列を確保した。Ｙａｒｒｏｗｉａｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ ＰＯ１ｆのゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号７０と配列番号７１、配列番号７２と配列番号７３、配列番号７４と配列番号７５、及び配列番号７６と配列番号７７のプライマーを用いて各ＰＣＲを行った。また、ＵＲＡ３ａｕｘｏｔｒｏｐｈｉｃ ｍａｒｋｅｒを鋳型とし、配列番号７８と配列番号７９のプライマーを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ条件は、９５℃で１分間の変性、５５℃で１分間のアニーリング、７２℃で１分３０秒間の重合反応を３５サイクル行うものとした。
ヤロウィア・リポリティカ（Yarrowia lipolytica）染色体上でＧＧＳ１のｐｒｏｍｏｔｅｒをＴＥＦＩＮｔｐｒｏｍｏｔｅｒに置換するｃａｓｓｅｔｔｅを作製するために、ＫＥＧＧ（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）に登録されている塩基配列に基づいて、ＴＥＦ１（ＹＡＬＩ０Ｃ０９１４１ｐ）のｐｒｏｍｏｔｅｒ及びｓｐｌｉｃｉｎｇｐｏｉｎｔを含む配列番号６９のポリヌクレオチド配列を確保した。また、ＧＧＳ１のｐｒｏｍｏｔｅｒを置換するために、ＧＧＳ１（ＹＡＬＩ０Ｄ１７０５０ｇ）の配列番号２のポリヌクレオチド配列を確保した。Ｙａｒｒｏｗｉａｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ ＰＯ１ｆのゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号７０と配列番号７１、配列番号７２と配列番号７３、配列番号７４と配列番号７５、及び配列番号７６と配列番号７７のプライマーを用いて各ＰＣＲを行った。また、ＵＲＡ３ａｕｘｏｔｒｏｐｈｉｃ ｍａｒｋｅｒを鋳型とし、配列番号７８と配列番号７９のプライマーを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ条件は、９５℃で１分間の変性、５５℃で１分間のアニーリング、７２℃で１分３０秒間の重合反応を３５サイクル行うものとした。
【0154】
その結果、１５００ｂｐの５’ＵＴＲａｒｍ、５３１ｂｐの５’ＵＴＲ＿ＲＰ、１５００ｂｐのＧＧＳ１ ａｒｍ、及び１５３３ｂｐのＵＲＡ３が得られた。ＰＣＲにより増幅したＤＮＡ断片は、ｏｖｅｒｌａｐｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ＰＣＲにより１つのＧＧＳ１ ｐｒｏｍｏｔｅｒ置換ｃａｓｓｅｔｔｅに作製した。ｃａｓｓｅｔｔｅｄｅｓｉｇｎは、５’ＵＴＲ ａｒｍ－ＴＥＦＩＮｔ－ＵＲＡ３－ＴＥＦＩＮｔ－ＧＧＳ１ ａｒｍの順序である。
【0155】
ＧＧＳ１ ｐｒｏｍｏｔｅｒ置換ｃａｓｓｅｔｔｅをＣＣ０８－１０２３に熱ショック法（heat-shock）により形質転換し、ｕｒａｃｉｌ不含ＹＬＭＭ１固体培地から選択した。選択した１次菌株を対象にさらに２次交差を行い、最終的にＧＧＳ１遺伝子のｐｒｏｍｏｔｅｒをＴＥＦＩＮｔｐｒｏｍｏｔｅｒに置換した菌株を作製した。このように作製した菌株を「ＣＣ０８－１２１４」と命名した。
【0156】
実施例６－２．ＧＧＳ１（Ｆ４３Ｉ）変異株（「ＣＣ０８－１２１５」）の作製
ヤロウィア・リポリティカ（Yarrowia lipolytica）染色体上にＧＧＳ１タンパク質Ｆ４３Ｉ変異体発現配列を導入するために、配列番号２のポリヌクレオチド配列の１２７番目のチミンをアデニンに置換するｃａｓｓｅｔｔｅを作製した。
ヤロウィア・リポリティカ（Yarrowia lipolytica）染色体上にＧＧＳ１タンパク質Ｆ４３Ｉ変異体発現配列を導入するために、配列番号２のポリヌクレオチド配列の１２７番目のチミンをアデニンに置換するｃａｓｓｅｔｔｅを作製した。
【0157】
具体的には、Ｙａｒｒｏｗｉａｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ ＰＯ１ｆのゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号８０と配列番号８１、配列番号８２と配列番号８３、配列番号８４と配列番号８５、配列番号８６と配列番号８３、配列番号８４と配列番号８７、及び配列番号９０と配列番号９１プライマーを用いて各ＰＣＲを行った。また、ＵＲＡ３ａｕｘｏｔｒｏｐｈｉｃ ｍａｒｋｅｒを鋳型とし、配列番号８８と配列番号８９のプライマーを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ条件は、９５℃で１分間の変性、５５℃で１分間のアニーリング、７２℃で１分３０秒間の重合反応を３５サイクル行うものとした。
【0158】
その結果、１５００ｂｐの５’ＵＴＲａｒｍ、６６１ｂｐのＴＥＦＩＮｔ－ＧＧＳ１＿１、１３９０ｂｐのＧＧＳ１＿２、６６１ｂｐのＲＰ＿１、１３９０ｂｐのＲＰ＿２、１５００ｂｐの３’ＵＴＲａｒｍ、及び１５３３ｂｐのＵＲＡ３が得られた。ＰＣＲにより増幅したＤＮＡ断片は、ｏｖｅｒｌａｐｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ＰＣＲにより１つのＧＧＳ１ ｐｒｏｍｏｔｅｒ置換ｃａｓｓｅｔｔｅに作製した。ｃａｓｓｅｔｔｅｄｅｓｉｇｎは、５’ＵＴＲ ａｒｍ－ＴＥＦＩＮｔ－ＧＧＳ１＿１－ＧＧＳ１＿２－ＲＰ＿１－ＲＰ＿２－３’ＵＴＲａｒｍの順序である。
【0159】
ＧＧＳ１（Ｆ４３Ｉ）変異置換ｃａｓｓｅｔｔｅをＣＣ０８－１２１４に熱ショック法（heat-shock）により形質転換し、ｕｒａｃｉｌ不含ＹＬＭＭ１固体培地から選択した。選択した１次菌株を対象にさらに２次交差を行い、最終的にＧＧＳ１の４３番目のアミノ酸残基をイソロイシンに置換したＦ４３Ｉ変異体を発現する菌株を作製した。このように作製した菌株を「ＣＣ０８－１２１５」と命名した。
【0160】
実施例６－３．ＧＧＳ１変異体導入株の評価
ＣＣ０８－１０２３をｎｅｇａｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌとして、ＣＣ０８－１２１４をｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌとして用いて、ＣＣ０８－１２１５と共にフラスコ評価を行った。
ＣＣ０８－１０２３をｎｅｇａｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌとして、ＣＣ０８－１２１４をｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌとして用いて、ＣＣ０８－１２１５と共にフラスコ評価を行った。
【0161】
具体的には、ウラシル含有ＹＬＭＭ２（Yarrowia lipolytica minimal media 2）５０ｍｌを入れた２５０ｍｌのコーナーバッフルフラスコに、前記ＣＣ０８－１２１５、ＣＣ０８－１０２３（negative control）及びＣＣ０８－１２１４（positive control）を初期ＯＤが１になるように接種し、３０℃、２５０ｒｐｍで４８時間振盪培養した。
【0162】
培養終了後に、培養液１ｍｌを遠心分離して上清を除去した。その後、ＤＭＳＯ（Dimethyl sulfoxide, sigma社）０．５ｍｌを添加し、５５℃、２０００ｒｐｍで１０分間振盪してセルを破砕した。さらに、アセトン（sigma社）０．５ｍｌを添加し、４５℃、２０００ｒｐｍで１５分間振盪してβ－カロテン及びスクアレンを抽出し、ＨＰＬＣ設備で濃度を分析した。分析したＯＤ、β－カロテン及びスクアレンの濃度及び含有量の測定結果を表６に示す。
【0163】
【表6】
【0164】
表６に示すように、選択したＦ４３Ｉ変異を適用したＣＣ０８－１２１５菌株において、ＣＣ０８－１２１４（ＰＣ）に比べて、β－カロテン濃度が５１．３％増加し、スクアレン濃度が８８．５％減少することが確認された。その結果、実際の菌株に適用しても、Ｆ４３Ｉ単独変異体を導入すると、β－カロテン濃度増加及びスクアレン生産量減少効果を発揮することが確認された。
【0165】
これらの結果から、本出願のＧＧＳ１変異体を導入すると、β－カロテン生産量が増加することが確認された。また、ＧＧＳ１変異体を導入し、β－カロテン生産と競合経路となるスクアレン合成を減少させることにより、β－カロテンの生産効率をさらに向上させることが確認された。
【0166】
さらに、これらの結果から、β－カロテン生産と同様に、ＧＧＳ１が関与するテトラテルペン類の生産効率をさらに向上させることが確認された。
以上の説明から、本出願の属する技術分野の当業者であれば、本出願がその技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態で実施できることを理解するであろう。なお、上記実施例はあくまで例示的なものであり、限定的なものでないことを理解すべきである。本出願には、明細書ではなく請求の範囲の意味及び範囲とその等価概念から導かれるあらゆる変更や変形された形態が含まれるものと解釈すべきである。
以上の説明から、本出願の属する技術分野の当業者であれば、本出願がその技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態で実施できることを理解するであろう。なお、上記実施例はあくまで例示的なものであり、限定的なものでないことを理解すべきである。本出願には、明細書ではなく請求の範囲の意味及び範囲とその等価概念から導かれるあらゆる変更や変形された形態が含まれるものと解釈すべきである。
【0167】
【表7】
【配列表】
【国際調査報告】