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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-06-11
(54)【発明の名称】複素環系ＪＡＫ阻害剤
(51)【国際特許分類】
C07D 487/04 20060101AFI20240604BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20240604BHJP
A61P 37/06 20060101ALI20240604BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20240604BHJP
A61P 1/04 20060101ALI20240604BHJP
A61P 17/00 20060101ALI20240604BHJP
A61P 19/02 20060101ALI20240604BHJP
A61P 17/06 20060101ALI20240604BHJP
A61P 17/14 20060101ALI20240604BHJP
A61K 31/5377 20060101ALI20240604BHJP
A61K 31/4985 20060101ALI20240604BHJP
【ＦＩ】
C07D487/04 144
C07D487/04 CSP
A61P43/00 111
A61P37/06
A61P29/00
A61P1/04
A61P17/00
A61P19/02
A61P29/00 101
A61P17/06
A61P17/14
A61K31/5377
A61K31/4985
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023576366
(86)(22)【出願日】2021-12-16
(85)【翻訳文提出日】2023-12-12
(86)【国際出願番号】 CN2021138842
(87)【国際公開番号】W WO2022127869
(87)【国際公開日】2022-06-23
(31)【優先権主張番号】202011495497.0
(32)【優先日】2020-12-18
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＢＲＩＪ
(71)【出願人】
【識別番号】519063510
【氏名又は名称】北京諾誠健華医薬科技有限公司
(74)【代理人】
【識別番号】100145403
【弁理士】
【氏名又は名称】山尾 憲人
(74)【代理人】
【識別番号】100156144
【弁理士】
【氏名又は名称】落合 康
(74)【代理人】
【識別番号】100103230
【弁理士】
【氏名又は名称】高山 裕貢
(72)【発明者】
【氏名】陳 向陽
(72)【発明者】
【氏名】▲パン▼ 育成
【テーマコード（参考）】
4C086
【Ｆターム（参考）】
4C086AA01
4C086AA02
4C086AA03
4C086CB05
4C086GA12
4C086MA01
4C086MA04
4C086NA14
4C086ZA68
4C086ZA89
4C086ZA96
4C086ZB08
4C086ZB11
4C086ZB15
4C086ZC20
(57)【要約】
本発明は、Janusキナーゼ(JAK)への阻害剤としての複素環化合物又はその薬学的に許容される塩に関する。具体的には、本発明は、一般式(I)で表される化合物、又はその薬学的に許容される塩に関する。本発明は、さらに前記化合物又はその薬学的に許容される塩の製造方法に関する。本発明の化合物は、JAKが介在する疾患、特に炎症性疾患、自己免疫疾患及び癌の治療及び/又は予防に適用することができる。ただし、一般式(I)における各基の定義は、説明書のとおりである。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
一般式(I):【化1】
結合aは単結合又は二重結合であり、
R1とR2は、それぞれ独立して、H、D、C1-6アルキル又はC3-6シクロアルキルから選択され、ただし、前記アルキルの1つ又は複数の水素は場合により、D又はフルオロで置換されていてもよく、
AはC3-10シクロアルキル、4～10員のヘテロシクリル、C6-10アリール又は5～10員のヘテロアリールであり、ただし、前記シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリールおよびヘテロアリールの1つ又は複数の水素は場合により、D、ハロゲン、シアノ、-ORa、-NRaRb、-C(O)Ra、-C(O)NRaRb、-S(O)2Ra、-P(O)(CH3)2、C1-6アルキル、C3-6シクロアルキル、4～8員のヘテロシクリルおよび5～6員のヘテロアリールから選択される置換基で置換されていてもよく、
Bはフェニル又は5～6員のヘテロアリールであり、ただし、前記フェニルおよびヘテロアリールの1つ又は複数の水素は場合により、D、ハロゲン、シアノ、ORa、-NRaRb、-COORa、-C(O)Ra、-NRaC(O)Rb、-C(O)NRaRb、-S(O)2Ra、-S(O)2NRaRb、-S(O)(NRa)Rb、-P(O)(CH3)2およびR11から選択される置換基で置換されていてもよく、
R11はC1-6アルキル、C3-6シクロアルキル、4～8員のヘテロシクリル又は5～6員のヘテロアリールであり、ただし、前記アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル及びヘテロアリールの1つ又は複数の水素は場合により、D、ハロゲン、CN、-OH、-NH2、C1-6アルキル、-OC1-6アルキル、-COORa、-C(O)Ra及び-C(O)NRaRbから選択される置換基で置換されていてもよく、
RaとRbは、それぞれ独立して、H、C1-6アルキル、C3-6シクロアルキル、又は4～8員のヘテロシクリルから選択され、ただし、前記アルキル、シクロアルキル及びヘテロシクリルの1つ又は複数の水素は場合により、D、ハロゲン、又はC1-6アルキルで置換されていてもよい]
で表される化合物、又はその薬学的に許容される塩、安定な同位体誘導体、異性体及びプロドラッグ。
【請求項2】
R1とR2は両方ともHである請求項1に記載の化合物、又は薬学的に許容される塩、安定な同位体誘導体、異性体およびプロドラッグ。
【請求項3】
一般式(II)：【化2】
AはC3-8シクロアルキル、4～8員のヘテロシクリル、フェニル、又は5～6員のヘテロアリールであり、ただし、前記シクロアルキル、ヘテロシクリル、フェニル、およびヘテロアリールの1つ又は複数の水素は場合により、ハロゲン、-C(O)Ra、C1-6アルキル、およびC3-6シクロアルキルから選択される置換基で置換されていてもよく、
Bはフェニル又は5～6員のヘテロアリールであり、ただし、前記フェニルおよびヘテロアリールの1つ又は複数の水素は場合により、ハロゲン、-COORa、-C(O)Ra、-C(O)NRaRb、-S(O)2Ra、C1-6アルキル、C3-6シクロアルキル、N、S及び/又はOのヘテロ原子を含む4～8員のヘテロシクリルから選択される置換基で置換されていてもよく、前記アルキル、シクロアルキルおよびヘテロシクリルの1つ又は複数の水素は場合により、C1-6アルキル、-C(O)Raおよび-C(O)NRaRbから選択される置換基でさらに置換されていてもよく、
RaとRbは、それぞれ独立して、H、C1-6アルキル、C3-6シクロアルキル、又はN、S及び/又はOのヘテロ原子を含む4～6員のヘテロシクリルから選択され、ただし、前記アルキル、シクロアルキル及びヘテロシクリルの1つ又は複数の水素は場合により、C1-6アルキルで置換されていてもよい］
で表される化合物である請求項1又は2に記載の化合物、又は薬学的に許容される塩、安定な同位体誘導体、異性体およびプロドラッグ。
【請求項4】
Aはフェニルであり、ただし、前記フェニルの1つ又は複数の水素は場合により、ハロゲンで置換されていてもよい請求項1-3のいずれかに記載の化合物、又は薬学的に許容される塩、安定な同位体誘導体、異性体およびプロドラッグ。
【請求項5】
一般式(III)：【化3】
Aはフェニルであり、ただし、前記フェニルの1つ又は複数の水素は場合により、ハロゲンで置換されていてもよく、
Bがフェニル又は5～6員のヘテロアリールであり、ただし、前記フェニルおよびヘテロアリールの1つ又は複数の水素は場合により、ハロゲン、-COORa、-C(O)Ra、-C(O)NRaRb、-S(O)2Ra、C1-6アルキル、C3-6シクロアルキル、N、Sおよび/又はOのヘテロ原子を含む4～8員のヘテロシクリルから選択される置換基で置換されていてもよく、前記アルキル、シクロアルキルおよびヘテロシクリルの1つ又は複数の水素は場合により、C1-6アルキル、-C(O)Raおよび-C(O)NRaRbから選択される置換基でさらに置換されていてもよく、
RaとRbは、それぞれ独立して、H、C1-6アルキル、C3-6シクロアルキル、又はN、S及び/又はOのヘテロ原子を含む4～6員のヘテロシクリルから選択され、ただし、前記アルキル、シクロアルキル及びヘテロシクリルの1つ以上の1つ又は複数の水素は場合により、C1-6アルキルで置換されていてもよい］
で表される化合物である請求項1に記載の化合物、又は薬学的に許容される塩、安定な同位体誘導体、異性体およびプロドラッグ。
【請求項6】
前記化合物は以下【化4-1】
【化4-2】
【化4-3】
【請求項7】
以下の化合物【化5-1】
【化5-2】
【請求項8】
請求項1-7のいずれか一項に記載の化合物、又は薬学的に許容される塩、安定な同位体誘導体、異性体およびプロドラッグ、ならびに1つ又は複数の薬学的に許容される担体又は賦形剤を含む、医薬組成物。
【請求項9】
必要とする患者に治療有効量の請求項1-8のいずれか一項に記載の化合物、又はその薬学的に許容される塩、安定な同位体誘導体、異性体およびプロドラッグ、又は前記化合物を含む医薬組成物を投与することを含む、JAKが介在する疾患を治療又は予防する方法であって、JAKが介在する疾患は炎症性疾患、自己免疫疾患又は癌などである、方法。
【請求項10】
前記疾患は、炎症性腸疾患、皮膚炎、湿疹、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、乾癬、円形脱毛症などである請求項9に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、Janusキナーゼ(JAK)活性を調節又は阻害する複素環化合物又はその薬学的に許容される塩に関する。本発明はまた、前記化合物又はその薬学的に許容される塩の製造方法に関する。本発明はさらに、炎症性疾患、自己免疫疾患及びがんの治療及び/又は予防における、前記化合物又は薬学的に許容される塩の使用並びに使用方法に関する。
【背景技術】
【0002】
JAKは、JAK1、JAK2、JAK3及びTYK2の4種のファミリーから成る非受容体型のチロシンキナーゼである。JAKには7つの相同性ドメイン(JAK Homology Domain, JH)を有し、そのうちJH1ドメインはキナーゼドメイン、JH2ドメインは(JH1のキナーゼ活性を調節する)偽キナーゼドメイン、JH6とJH7は受容体結合ドメインである。サイトカイン受容体(CytokineReceptor)の細胞表面の領域にサイトカイン(Cytokine)が結合すると、JAKが結合している細胞内の領域がリン酸化され、それによってシグナル伝達兼転写活性化タンパク質(STAT)の結合部位が作成される。STATタンパク質は、活性化されたJAKによってさらにリン酸化されて、二量体を形成し、それは核に入って、関連遺伝子の発現と転写を調節し、細胞膜から核へのシグナル伝達を可能にする(Lionard et. al, Ann.Rev. Immunol. 1998, 16, 293-322)。したがって、JAKは、JAK-STAT経路を介してサイトカインが仲介するシグナルを伝達し、細胞増殖、分化、アポトーシス及び免疫応答のサイトカインに依存する調節など、多くの細胞機能において重要な役割を果たし、炎症性疾患、自己免疫疾患及びがんの治療の標的として一般的である(Alicea-Velazquez et. al, Curr. Drug Targets 2011, 12, 546-55)。骨髄線維症の治療に使用するJAK1/JAK2阻害剤のルキソリチニブ(ruxolitinib)及びJAK2阻害剤のフェドラチニブ(fedratinib)、関節リウマチの治療に使用する汎JAK阻害剤のトファシチニブ(tofacitinib)、JAK1/JAK2阻害剤のバリシチニブ(baricitinib)、汎JAK阻害剤のペフィシチニブ(peficitinib)及びJAK1阻害剤のウパダシチニブ(upadacitinib)、などを含む、JAKを調節する医薬品の販売が承認されている。
【0003】
JAK及びSTATは、異なる免疫応答の制御に高度的に特異的に作用する。一種のJAKキナーゼは、複数のサイトカインのシグナル伝達プロセスに関与することができ、また一種のサイトカインのシグナル伝達経路は、複数のJAKキナーゼを活性化することもできるが、サイトカインは、活性化されたSTATタンパク質に対する選択性を有し、例えばインターロイキン(IL)-4はSTAT1/3/5/6を活性化し、IL-12はSTAT4を特異的に活性化する。JAK1、JAK2、TYK2は、様々な組織及び細胞に広く存在し、JAK1は、IL-6やインターフェロン(IFN)等の炎症性因子の活性化と密接に関係している。従って、JAK1選択的阻害剤は、関節リウマチ(RA)、乾癬等の自己免疫疾患の治療に有力な治療効果を有すると考えられている。JAK2は、エリスロポエチン(EPO)およびトロンボポエチン(TPO)などのサイトカインのシグナル伝達を単独で介在することができ(Won et al.，BMC Bioinformatics2009，10，S53)、血液細胞の増殖分化と密接に相関する。TYK2は、インターフェロン(IFNs)、IL-12及びIL-23等のような炎症性サイトカインのシグナル伝達に関連し、自然免疫及び適応免疫において重要な役割を果たして、従って、乾癬、全身性エリテマトーデス(SLE)及び炎症性腸疾患(IBD)等の治療のためのTYK2阻害剤等の自己免疫疾患の標的としても非常に注目されている。JAK3は骨髄系やリンパ系にのみ存在し、IL-2、IL-4、IL-7、IL-9、IL-15、IL-21のシグナル伝達を媒介するが、これらのサイトカインは、T細胞の増殖分化誘導、B細胞産生抗体の活性化、マクロファージの活性化、ナチュラルキラー細胞(NK細胞)の活性増強、IFN等の他のサイトカインの誘導に重要な役割を有して、従って、JAK3選択的阻害剤は臓器移植、自己免疫疾患、炎症性肺炎等の治療に重要な役割を有すると期待されている。
【0004】
炎症性腸疾患(IBD)は、クローン病(Crohn's disease、CD)、潰瘍性大腸炎(ulcerative colitis、UC)及び非確定的IBD(IBDU)を含む、一般的な慢性の腸の炎症性疾患である。炎症性腸疾患は世界中500万人に影響を及ぼし、有病率は年々増加している。臨床症状は、下痢、血便、腹痛、疲労、高熱などであり、5-アミノサリチル酸(5-ASAs)、グルココルチコイド、免疫抑制剤(例えば、アザチオプリン)及び生物学的薬剤(例えば、抗TNF、IL-12/IL-23モノクローナル抗体)などを含む治療薬が一般的に使用されているが、治療を受ける多くの患者は寛解を示さず、80%のクローン病患者及び30%のUC患者が最終的に手術を受ける必要がある。この分野はまた、巨大な医療の需要を存在し、より効果的で安全な薬剤を必要とする。
【0005】
この発症過程でIL-13やIL-17などの炎症促進因子の発現が増加し、JAK-STAT経路を介した炎症が誘発される。JAK阻害剤は、CDおよびUCの治療のための潜在的用途を有する新規経口小分子薬としての使用を有し、ここで、トファチニブ(tofacitinib)は、多くの国においてUCの治療のために承認されているが、トファチニブは、JAK1/2/3を非選択的に阻害し、例えば重篤な感染および悪性腫瘍の発生などの重篤な副作用を引き起こす。しかしながら、JAKキナーゼファミリーのメンバーの触媒活性部位の高い配列類似性のために、治療に必要な全身暴露量を有する経口の選択的JAK阻害剤を設計することは、かなり困難である。そこで、新たなJAK阻害剤が開発され、結腸や皮膚などの作用部位のみに治療に必要な局所的な被曝量を富化させ、しかも血液への溶解性を極めて低くして全身性の副作用を回避し、薬効を発揮させ、安全性を高めることが行われている。Theravance社によって開発されたTD-1473は、腸内局所吸収を有する汎JAK阻害剤であり、臨床第3相試験に移行し、良好な耐性を示した。
【発明の概要】
【0006】
定義
別段の定めがある場合を除き、本明細書で使用する以下の用語は、以下の意味を有する。
別段の定めがある場合を除き、本明細書で使用する以下の用語は、以下の意味を有する。
【0007】
「Cx-y」は、炭素原子数の範囲を指し、x及びyはいずれも整数で、例えば、C3-8シクロアルキルは3～8個の炭素原子を有するシクロアルキル、すなわち、3、4、5、6、7または8個の炭素原子を有するシクロアルキルを示す。また、「C3-8」は、その中の任意のサブレンジ、例えば、C3-7、C3-6、C4-7、C4-6、C5-6なども含むことが理解されるべきである。
【0008】
「アルキル」は、1～20個の炭素原子、例えば、1～8個の炭素原子、1～6個の炭素原子又は1～4個の炭素原子を含む飽和で直鎖又は分枝鎖のヒドロカルビル置換基を指す。アルキルの非限定的な例には、メチル、エチル、n-プロピル、イソプロピル、n-ブチル、イソブチル、tert-ブチル、sec-ブチル、n-ペンチル、1,1-ジメチルプロピル、1,2-ジメチルプロピル、2,2-ジメチルプロピル、1-エチルプロピル、2-メチルブチル、3-メチルブチル、n-ヘキシル、1-エチル-2-メチルプロピル、1,1,2-トリメチルプロピル、1,1-ジメチルブチル、1,2-ジメチルブチル、2,2-ジメチルブチル、1,3-ジメチルブチル及び2-エチルブチルが含まれるが、これらには限定されない。
【0009】
「シクロアルキル」とは、3～14個の炭素環原子を含む飽和環状ヒドロカルビル置換基を意味する。シクロアルキルは、典型的には3～8個、3～7個、または3～6個の炭素環原子を含む単環式炭素環であってもよい。単環式シクロアルキルの非限定的な例としては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチルなどがある。シクロアルキルはまた、縮合、架橋またはスピロである二環式または三環式、例えば、デカヒドロナフタレニル、ビシクロ[2.2.2]オクタン、スピロ[3.3]ヘプタンなどであってもよい。
【0010】
「ヘテロシクリルまたはヘテロ環」とは、3～20個の環原子、例えば3～14個、3～12個、3～10個、3～8個、3～6個または5～6個の環原子を含む飽和または部分不飽和単環式または多環式環状基であって、そのうちの一つまたはそれ以上は窒素、酸素またはS(O)m(ただし、mは0～2の整数)から選択され(但し、-O-O-、-O-S-、または-S-S-環部分以外は除き)、残りの環原子は炭素であるものを意味する。好ましくは3～12個の環原子、より好ましくは3～10個の環原子、より好ましくは4～7個の環原子、より好ましくは4～6個の環原子、最も好ましくは5個または6個の環原子含み、そのうち1～4個がヘテロ原子、より好ましくは1～3個がヘテロ原子、最も好ましくは1～2個がヘテロ原子である。単環式ヘテロシクリルの非限定的な例としては、ピロリジニル、オキセタニル、ピペリジニル、ピペラジニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロチオピラニル、モルホリニル、チオモルホリニル、ホモピペラジニル、アゼチジニル、などがある。多環式ヘテロシクリルの非限定的な例としては、縮合、架橋またはスピロの多環式ヘテロ環式基、例えば、オクタヒドロシクロペンタ[c]ピロール、オクタヒドロピロロ[1,2-a]ピラジン、3,8-ジアザビシクロ[3.2.1]オクタン、5-アザスピロ[2.4]ヘプタン、2-オキサ-7-アザスピロ[3.5]ノナン、などがある。
【0011】
「アリールまたは芳香環」とは、6～14個の炭素原子を含む芳香族単環式または縮合多環式基を意味し、好ましくは6～10員であり、例えばフェニルおよびナフチル、最も好ましくはフェニルである。アリール環は、ヘテロアリール、ヘテロシクリルまたはシクロアルキル環に縮合されていてもよく、ただし、母体構造に結合している環はアリール環であり、その非限定例としては
などがある。
【化1】
【0012】
「ヘテロアリールまたはヘテロ芳香環」とは、5～14個の環原子を含むヘテロ芳香族系であって、そのうち1～4個の環原子は酸素、硫黄および窒素を含むヘテロ原子から選択されるものを意味する。ヘテロアリールは、好ましくは5～10員、より好ましくは5員または6員であり、例えばフリル、チエニル、ピリジニル、ピロリル、ピリミジニル、ピラジニル、ピラゾリル、イミダゾリル、テトラゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、キノリニル、イソキノリル、インドリル、イソインドリル、などがある。ヘテロアリール環は、アリール、ヘテロシクリルまたはシクロアルキル環に縮合されていてもよく、ただし、母体構造に結合している環はヘテロアリール環であり、その非限定例としては、
などがある。
【化2】
【0013】
「ハロゲン」とは、フッ素、塩素、臭素またはヨウ素を意味する。
【0014】
「シアノ」とは、-CNを意味する。
【0015】
「場合により」とは、その後に記載される事象または状況が起こり得るが起こる必要はないことを意味し、その表現は、その事象または状況が起こる場合と起こらない場合とを含むことを意味する。例えば、「場合によりアルキル基によって置換されていてもよいヘテロ環式基」とは、アルキル基が存在してもよいが存在しなくてもよいことを意味し、その表現はヘテロ環式基がアルキル基によって置換されている場合およびヘテロ環式基がアルキル基によって置換されていない場合を含む。
【0016】
「置換」とは、基中の1個またはそれ以上の水素原子、好ましくは5個、より好ましくは1～3個の水素原子が独立して対応する数の置換基によって置換されていることを意味する。置換基は、その可能な化学的位置にのみあり、当業者であれば、無理な努力なしに、可能な置換または不可能な置換を(実験または理論によって)決定できることは言うまでもないことである。例えば、遊離水素を有するアミノ基またはヒドロキシル基は、不飽和(例えば、エチレン性)結合を有する炭素原子に結合した場合、不安定になる可能性がある。置換基としては、ハロゲン、シアノ、ニトロ、オキソ、-SF5、C1-4アルキル、C3-7シクロアルキル、4～7員のヘテロシクリル、フェニル、5～6員のヘテロアリールなどがあるが、これらに限定されない。
【0017】
「異性体」とは、分子式は同じであるが、原子の結合の性質または順序、原子の空間的な配置が異なる化合物を意味する。原子の空間的配置が異なる異性体は「立体異性体」と称される。立体異性体には、光学異性体、幾何異性体、およびコンフォメーション異性体などがある。
【0018】
本発明の化合物は、光学異性体の形態で存在し得る。光学異性体には、エナンチオマーおよびジアステレオ異性体が含まれる。エナンチオマーは、互いに鏡像であるが重ねることができない二つの立体異性体である。ラセミ混合物またはラセミ体とは、キラル分子の左手と右手のエナンチオマーが等量の混合物を意味する。ジアステレオ異性体とは、二つの立体異性体が互いに鏡像でなく、重ねることができないものを意味する。光学異性体が単一異性体であり、その絶対配置が決定される場合、キラル炭素原子上の置換基の配置に従って、「R」または「S」の絶対配置となり、光学異性体の絶対配置が決定されない場合、測定された光学回転に従って、(+)または(-)となる。光学異性体を調製し、分離する方法は、当技術分野で知られている。
【0019】
本発明の化合物は、幾何異性体として存在し得る。本発明は、炭素-炭素二重結合、炭素-窒素二重結合、シクロアルキル基またはヘテロ環式基の周囲の置換基の分布から生じる様々な幾何異性体およびその混合物を考慮する。炭素-炭素二重結合または炭素-窒素結合の周りの置換基はZまたはE配置を割り当てられ、シクロアルキルまたはヘテロ環の周りの置換基はcisまたはtrans配置を割り当てられる。
【0020】
また、本発明の化合物は互変異性、例えばケト-エノール互変異性を示し得る。
【0021】
本発明は、いずれかの互変異性形態または立体異性形態およびその混合物を含み、化合物の命名法または化学構造式で用いられるいずらかの一つの互変異性形態または立体異性形態に限定されないことが理解されるべきである。
【0022】
「同位体」とは、本発明の化合物中に存在する全ての原子の同位体を意味する。同位体には、同じ原子番号を有するが、異なる質量数を有する原子が含まれる。本発明の化合物に組み込むのに適した同位体の例としては、水素、炭素、窒素、酸素、リン、硫黄、フッ素および塩素、例えば、2H(D)、3H、13C、14C、15N、17O、18O、31P、32P、35S、18Fおよび36Clがあるが、これらに限定されない。本発明の同位体標識化合物は、一般に、非同位体標識試薬の代わりに適切な同位体標識試薬を用いて、当業者に公知の従来技術または添付の実施例に記載の方法に類似する方法によって調製することができる。このような化合物は、例えば、生物学的活性のアッセイにおける標準物質および試薬として、様々な潜在的用途を有する。安定な同位体の場合、そのような化合物は、生物学的、薬理学的または薬物動態学的性質を有利に変化させる可能性を有している。重水素(D)は、本発明の好ましい同位体であり、例えば、メチル、メチレンまたはメチン中の水素は、重水素によって置き換えられていてもよい。
【0023】
本発明の化合物は、プロドラッグの形態で投与され得る。「プロドラッグ」とは、インビボでの生理学的条件下で、酸化、還元、加水分解など(それぞれ酵素を用いて、または酵素の関与なしに行われる)により、本発明の生物活性化合物に変換される誘導体を意味する。プロドラッグの例としては、以下の化合物がある。本発明の化合物中のアミノ基がアシル化、アルキル化またはリン酸化されているもの、例えばエイコサノイルアミノ、アラニルアミノ、ピバロイルオキシメチルアミノ、またはヒドロキシル基がアシル化、アルキル化、リン酸化またはボレートに変換されているもの、例えばアセトキシ、パルミトイルオキシ、ピバロイルオキシ、スクシニルオキシ、フマリルオキシ、アラニルオキシ、またはカルボキシル基がエステル化またはアミド化されているもの、またはスルフヒドリル基が、標的および/または細胞のサイトゾルへ薬物を選択的に送達するペプチドなどの担体分子とジスルフィド橋を形成するもの。これらの化合物は、公知の方法に従って、本発明の化合物から調製することができる。
【0024】
「薬学的に許容される塩」とは、無機塩基または酸および有機塩基または酸を含む薬学的に許容される塩基または酸から調製される塩を意味する。本発明の化合物が一つまたはそれ以上の酸性基または塩基性基を含む場合、本発明はまた、それらの対応する薬学的に許容される塩も含む。酸性基を含む本発明による化合物は、したがって塩の形態で存在することができ、例えばアルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩またはアンモニウム塩として、本発明に従って使用され得る。このような塩のより具体的な例としては、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩またはアンモニアもしくは有機アミン、例えばエチルアミン、エタノールアミン、トリエタノールアミンまたはアミノ酸との塩がある。塩基性基を含む本発明による化合物は、塩の形態で存在することができ、無機酸または有機酸との付加塩の形態で本発明に従って使用され得る。適切な酸の例としては、塩酸、臭化水素酸、リン酸、硫酸、硝酸、メタンスルホン酸、p-トルエンスルホン酸、ナフタレンジスルホン酸、シュウ酸、酢酸、酒石酸、乳酸、サリチル酸、安息香酸。ギ酸、プロピオン酸、ピバリン酸、マロン酸、コハク酸、ピメリン酸、フマル酸、マレイン酸、リンゴ酸、スルファミン酸、フェニルプロピオン酸、グルコン酸、アスコルビン酸、イソニコチン酸、クエン酸、アジピン酸、および当業者に知られている他の酸ある。本発明による化合物が分子内に酸性基と塩基性基を同時に含む場合、本発明は、言及した塩の形態に加えて、内塩またはベタインを含む。個々の塩は、当業者に公知の従来の方法、例えば、これらを溶媒または分散媒中で有機酸もしくは無機酸または塩基と接触させることによって、あるいは他の塩とアニオン交換またはカチオン交換することによって、得ることができる。
【0025】
「医薬組成物」とは、本発明の一つまたはそれ以上の化合物またはその薬学的に許容される塩、安定な同位体誘導体、異性体、プロドラッグまたはこれらの混合物、および薬学的に許容される担体および賦形剤などの他の成分を含む組成物を意味する。医薬組成物の目的は、生体への投与を促進し、活性成分の吸収を容易にし、その結果、生物学的活性を発揮させることである。
【0026】
したがって、本願において「化合物」、「本発明の化合物」または「本発明にかかる化合物」と称する場合、前記化合物の全ての形態、例えば、薬学的に許容される塩、安定な同位体誘導体、異性体、プロドラッグ、またはこれらの混合物が含まれる。
【0027】
本明細書において、「がん/腫瘍」には、消化管/胃腸がん、結腸がん、肝臓がん、乳がん、卵巣がん、前立腺がん、頭頸部がん、皮膚がん、リンパ腫、白血病(急性骨髄性白血病および慢性骨髄性白血病を含む)、腎臓がん、肺がん、筋肉がん、骨がん、膀胱がん、脳腫瘍、黒色腫、多発性骨髄腫、血管異形成関連疾患/腫瘍が含まれるが、これらに限定されない。
【0028】
本明細書において、「炎症性疾患又は自己免疫疾患」には、関節炎、橋本甲状腺炎、自己免疫性溶血性貧血、悪性貧血の自己免疫性萎縮性胃炎、自己免疫性脳脊髄炎、自己免疫性精巣炎、グッドパスチャー疾患、自己免疫性血小板減少症、交感性眼炎、重症筋無力症、グレーブス疾患、原発性胆汁性肝硬変、肝炎、原発性硬化性胆管炎、慢性侵襲性肝炎、非アルコール性脂肪性肝疾患、非アルコール性脂肪性肝炎、潰瘍性大腸炎、膜性糸球体症、全身性エリテマトーデス、リウマチ性関節炎、乾癬性関節炎、シェーグレン症候群、ライター症候群、多発性筋炎、皮膚筋炎、I型インターフェロン疾患(Aicardi-Goutieres症候群)および過剰発現I型インターフェロンによる他の全身性硬化症、メンデル疾患、結節性多発性動脈炎、多発性硬化症、再発寛解型多発性硬化症、一次性進行型多発性硬化症、二次性進行型多発性硬化症、類天疱瘡、クローン病、潰瘍性大腸炎、炎症性腸疾患、セリアック病、直腸炎、好酸球性胃腸炎、肥満細胞症の炎症性腸疾患、アトピー性皮膚炎、湿疹、乾癬、強皮症、痒疹又はその他のそう痒症、白斑、円形脱毛症の皮膚疾患、コーガン症候群、強直性脊椎炎、ウェゲナー肉芽腫症、自己免疫性脱毛症、I型または若年性糖尿病、甲状腺炎を含むO-細胞(体液性)またはT-細胞を基礎とする自己免疫性疾患、アレルギー性皮膚炎、夏の湿疹(summereczema)、馬蹄状丘疹(itchy horseshoes)、けいれん、炎症性気道疾患、再発性気道閉塞、気道過敏症及び慢性閉塞性肺疾患のアレルギー性疾患、慢性又は過度の喘息、遅発性喘息、気管支炎、気管支喘息、アレルギー性喘息、内因性の喘息、外因性の喘息、チリダニによる喘息を含む喘息及び他の閉塞性気道疾患で、これらに限定されない。
【0029】
本明細書において、「治療有効量」とは、疾患を処置または予防するのに有効な本発明の化合物の量を含むことを意味する。
【0030】
本明細書において、「患者」とは、哺乳動物、特に、ヒトを意味する。
【0031】
本発明は、JAK阻害剤としての一般式(I)：
【0032】
【化3】
結合aは単結合又は二重結合であり、
R1とR2は、それぞれ独立して、H、D、C1-6アルキル又はC3-6シクロアルキルから選択され、ただし、前記アルキルの1つ又は複数の水素は場合により、D又はフルオロで置換されていてもよく、
AはC3-10シクロアルキル、4～10員のヘテロシクリル、C6-10アリール又は5～10員のヘテロアリールであり、ただし、前記シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリールおよびヘテロアリールの1つ又は複数の水素は場合により、D、ハロゲン、シアノ、-ORa、-NRaRb、-C(O)Ra、-C(O)NRaRb、-S(O)2Ra、-P(O)(CH3)2、C1-6アルキル、C3-6シクロアルキル、4～8員のヘテロシクリルおよび5～6員のヘテロアリールから選択される置換基で置換されていてもよく、
Bはフェニル又は5～6員のヘテロアリールであり、ただし、前記フェニルおよびヘテロアリールの1つ又は複数の水素は場合により、D、ハロゲン、シアノ、ORa、-NRaRb、-COORa、-C(O)Ra、-NRaC(O)Rb、-C(O)NRaRb、-S(O)2Ra、-S(O)2NRaRb、-S(O)(NRa)Rb、-P(O)(CH3)2およびR11から選択される置換基で置換されていてもよく、
R11はC1-6アルキル、C3-6シクロアルキル、4～8員のヘテロシクリル又は5～6員のヘテロアリールであり、ただし、前記アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル及びヘテロアリールの1つ又は複数の水素は場合により、D、ハロゲン、CN、-OH、-NH2、C1-6アルキル、-OC1-6アルキル、-COORa、-C(O)Ra及び-C(O)NRaRbから選択される置換基で置換されていてもよく、
RaとRbは、それぞれ独立して、H、C1-6アルキル、C3-6シクロアルキル、又は4～8員のヘテロシクリルから選択され、ただし、前記アルキル、シクロアルキル及びヘテロシクリルの1つ又は複数の水素は場合により、D、ハロゲン、又はC1-6アルキルで置換されていてもよい］
で表される化合物、又はその薬学的に許容される塩、安定な同位体誘導体、異性体及びプロドラッグを提供する。
【0033】
一つの好ましい実施態様において、R1とR2は両方ともHである。
【0034】
一つの好ましい実施形態において、AはC3-8シクロアルキル、4～8員のヘテロシクリル、フェニル又は5～6員のヘテロアリールであり、ただし、前記シクロアルキル、ヘテロシクリル、フェニルおよびヘテロアリールの1つ又は複数の水素は場合により、ハロゲン、-C(O)Ra、C1-6アルキルおよびC3-6シクロアルキルから選択される置換基で置換されている。
【0035】
より好ましい実施形態において、Aはフェニルであり、ここでフェニルの1つ又は複数の水素は場合により、ハロゲンで置換されている。
【0036】
一つの実施形態において、Bはフェニル又は5～6員のヘテロアリールであり、ただし、前記フェニル及びヘテロアリール基の1つ又は複数の水素は場合により、ハロゲン、-COORa、-C(O)Ra、-C(O)NRaRb、-S(O)2Ra、C1-6アルキル、C3-6シクロアルキル、N、S及び/又はOのヘテロ原子を含む4～8員のヘテロシクリルから選択される置換基で置換されて、前記アルキル、シクロアルキル及びヘテロシクリル基の1つ又は複数の水素は場合により、C1-6アルキル、-C(O)Ra及び-C(O)NRaRbから選択される置換基でさらに置換されている。
【0037】
一つの実施形態において、RaとRbは、それぞれ独立して、H、C1-6アルキル、C3-6シクロアルキル、又はN、S及び/又はOのヘテロ原子を含む4～6員のヘテロシクリから選択され、ただし、前記アルキル、シクロアルキル及びヘテロシクリルの1つ又は複数の水素は場合により、C1-6アルキルで置換されている。
【0038】
いくつかの実施形態において、式(I)で表される化合物は、式(II)：
［式中、
AはC3-8シクロアルキル、4～8員のヘテロシクリル、フェニル、又は5～6員のヘテロアリールであり、ただし、前記シクロアルキル、ヘテロシクリル、フェニル、およびヘテロアリールの1つ又は複数の水素は場合により、ハロゲン、-C(O)Ra、C1-6アルキル、およびC3-6シクロアルキルから選択される置換基で置換されていてもよく、
好ましい一実施形態において、Aはフェニルであり、ただし、前記フェニルの1つ又は複数の水素は場合により、ハロゲンで置換されていてもよく、
Bはフェニル又は5～6員のヘテロアリールであり、ただし、前記フェニルおよびヘテロアリールの1つ又は複数の水素は場合により、ハロゲン、-COORa、-C(O)Ra、-C(O)NRaRb、-S(O)2Ra、C1-6アルキル、C3-6シクロアルキル、N、S及び/又はOのヘテロ原子を含む4～8員のヘテロシクリルから選択される置換基で置換されていてもよく、前記アルキル、シクロアルキルおよびヘテロシクリルの1つ又は複数の水素は場合により、C1-6アルキル、-C(O)Raおよび-C(O)NRaRbから選択される置換基でさらに置換されていてもよく、
RaとRbは、それぞれ独立して、H、C1-6アルキル、C3-6シクロアルキル、又はN、S及び/又はOのヘテロ原子を含む4～6員のヘテロシクリルから選択され、ただし、前記アルキル、シクロアルキル及びヘテロシクリルの1つ又は複数の水素は場合により、C1-6アルキルで置換されている］
で表される化合物である。
【化4】
AはC3-8シクロアルキル、4～8員のヘテロシクリル、フェニル、又は5～6員のヘテロアリールであり、ただし、前記シクロアルキル、ヘテロシクリル、フェニル、およびヘテロアリールの1つ又は複数の水素は場合により、ハロゲン、-C(O)Ra、C1-6アルキル、およびC3-6シクロアルキルから選択される置換基で置換されていてもよく、
好ましい一実施形態において、Aはフェニルであり、ただし、前記フェニルの1つ又は複数の水素は場合により、ハロゲンで置換されていてもよく、
Bはフェニル又は5～6員のヘテロアリールであり、ただし、前記フェニルおよびヘテロアリールの1つ又は複数の水素は場合により、ハロゲン、-COORa、-C(O)Ra、-C(O)NRaRb、-S(O)2Ra、C1-6アルキル、C3-6シクロアルキル、N、S及び/又はOのヘテロ原子を含む4～8員のヘテロシクリルから選択される置換基で置換されていてもよく、前記アルキル、シクロアルキルおよびヘテロシクリルの1つ又は複数の水素は場合により、C1-6アルキル、-C(O)Raおよび-C(O)NRaRbから選択される置換基でさらに置換されていてもよく、
RaとRbは、それぞれ独立して、H、C1-6アルキル、C3-6シクロアルキル、又はN、S及び/又はOのヘテロ原子を含む4～6員のヘテロシクリルから選択され、ただし、前記アルキル、シクロアルキル及びヘテロシクリルの1つ又は複数の水素は場合により、C1-6アルキルで置換されている］
で表される化合物である。
【0039】
他の実施形態において、一般式(I)で表される化合物は、一般式(III)：
［式中、
Aはフェニルであり、ただし、前記フェニルの1つ又は複数の水素は場合により、ハロゲンで置換されていてもよく、
Bがフェニル又は5～6員のヘテロアリールであり、ただし、前記フェニルおよびヘテロアリールの1つ又は複数の水素は場合により、ハロゲン、-COORa、-C(O)Ra、-C(O)NRaRb、-S(O)2Ra、C1-6アルキル、C3-6シクロアルキル、N、Sおよび/又はOのヘテロ原子を含む4～8員のヘテロシクリルから選択される置換基で置換されていてもよく、前記アルキル、シクロアルキルおよびヘテロシクリルの1つ又は複数の水素は場合により、C1-6アルキル、-C(O)Raおよび-C(O)NRaRbから選択される置換基でさらに置換されていてもよく、
RaとRbは、それぞれ独立して、H、C1-6アルキル、C3-6シクロアルキル、又はN、S及び/又はOのヘテロ原子を含む4～6員のヘテロシクリルから選択され、ただし、前記アルキル、シクロアルキル及びヘテロシクリルの1つ以上の1つ又は複数の水素は場合により、C1-6アルキルで置換されている］
で表される化合物である。
【化5】
Aはフェニルであり、ただし、前記フェニルの1つ又は複数の水素は場合により、ハロゲンで置換されていてもよく、
Bがフェニル又は5～6員のヘテロアリールであり、ただし、前記フェニルおよびヘテロアリールの1つ又は複数の水素は場合により、ハロゲン、-COORa、-C(O)Ra、-C(O)NRaRb、-S(O)2Ra、C1-6アルキル、C3-6シクロアルキル、N、Sおよび/又はOのヘテロ原子を含む4～8員のヘテロシクリルから選択される置換基で置換されていてもよく、前記アルキル、シクロアルキルおよびヘテロシクリルの1つ又は複数の水素は場合により、C1-6アルキル、-C(O)Raおよび-C(O)NRaRbから選択される置換基でさらに置換されていてもよく、
RaとRbは、それぞれ独立して、H、C1-6アルキル、C3-6シクロアルキル、又はN、S及び/又はOのヘテロ原子を含む4～6員のヘテロシクリルから選択され、ただし、前記アルキル、シクロアルキル及びヘテロシクリルの1つ以上の1つ又は複数の水素は場合により、C1-6アルキルで置換されている］
で表される化合物である。
【0040】
本発明はまた、以下の化合物1～40、又は薬学的に許容される塩、安定な同位体誘導体、異性体、プロドラッグ、およびそれらの混合物に関する。
【表1-1】
【表1-2】
【表1-3】
【表1-4】
【表1-5】
【表1-6】
【表1-7】
【表1-8】
【表1-9】
【表1-10】
【0041】
本発明の化合物は、JAKの活性を効果的に阻害することができ、好ましくはIC50が100nM未満であり、より好ましくはIC50が10nM未満である。
【0042】
本発明はまた、一般式(I)で表される化合物、又はその薬学的に許容される塩、安定な同位体誘導体、異性体及びプロドラッグと1つ又は複数の薬学的に許容される担体又は賦形剤を含む医薬組成物に関する。
【0043】
別の態様において、本発明は、JAKが介在する疾患を治療又は予防する方法であって、必要とする患者に、治療有効量の一般式(I)で表される化合物、又はその薬学的に許容される塩、安定な同位体誘導体、異性体、プロドラッグ、およびそれらの混合物、又は前記化合物を含む医薬組成物を投与することを含む方法を提供します。前記疾患としては、炎症性疾患、自己免疫疾患及びがん、特に炎症性腸疾患、皮膚炎、湿疹、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、乾癬、円形脱毛症などが挙げられが、これらに限定されない。
【0044】
本発明によれば、薬物は、錠剤、カプセル剤、溶液剤、凍結乾燥製剤、注射剤を含むが、これらに限定されない任意の医薬剤形であってよい。
【0045】
本発明の医薬調剤は、用量単位あたり所定量の活性成分を含有する投与単位形態でで投与され得る。このような単位は、治療される状態、投与方法、ならびに患者の年齢、体重および状態に応じて、例えば、0.5mgから1g、好ましくは1mgから700mg、特に好ましくは5mgから500mgの本発明の化合物を含有し得る。さらに、この種の医薬調剤は、活性成分を1つ以上の賦形剤および/またはアジュバントと混合するなど、薬学の分野で公知の方法を用いて調製することができる。
【0046】
本発明の医薬製剤は、任意の所望の適切な方法による投与に適合させることができ、例えば、経口(口腔又は舌下を含む)、直腸、経鼻、局所(口腔、舌下又は経皮を含む)、膣又は非経口(皮下、筋肉内、静脈内又は皮内を含む)方法による投与に適合させることができる。
【0047】
本発明はまた、前記化合物を調製する方法を提供する。本発明の一般式(I)で示される化合物の調製は、以下の例示的な方法および実施例によって達成することができるが、これらの方法および実施例は、本発明の範囲を何ら限定するものであると考えるべきではない。本発明に記載の化合物はまた、当業者に公知の合成技術により合成することができ、または当業者に公知の方法と本発明に記載の方法とを組み合わせて使用することもできる。各反応工程で得られた生成物は、抽出、濾過、蒸留、結晶化、クロマトグラフ分離などを含むが、これらに限定されない。当業者に公知の分離技術によって得られる。合成に必要な出発物質および化学試薬は、文献(SciFinderで入手可能)に従って従来通りに合成することができ、また購入することもできる。
【0048】
合成方法
本発明の一般式(I)で表される複素環式化合物は、以下のスキームで調製することができる：1)カルボン酸A1とアミンA2とを縮合してA3を得ること、2)A3を酸性条件下で脱水環化してA4を得ること、3)A4をNBSで臭素化してA5を得ること、4)A5をナトリウムメトキシドと反応させてA6を得ること、5)A6とアミンB-NH2とをBulkwaldカップリング反応によってA7を得ること、6)A7を脱保護してA8を得ることによって、合成することができる。数種類のA7およびA8の官能基FG1およびFG2は、さらに誘導体化させ、別の目的化合物に転換し、例えば、FG1中に保護されたアミン、脱保護されたアミン、アミンをさらにアミド化又は還元的アミノ化により生成したアミド又は置換アミンが含まれ、また、FG2のエステルは塩基(例えばLiOH)で加水分解されて酸となり、さらに酸をアミド化してアミドを生成させる。
本発明の一般式(I)で表される複素環式化合物は、以下のスキームで調製することができる：1)カルボン酸A1とアミンA2とを縮合してA3を得ること、2)A3を酸性条件下で脱水環化してA4を得ること、3)A4をNBSで臭素化してA5を得ること、4)A5をナトリウムメトキシドと反応させてA6を得ること、5)A6とアミンB-NH2とをBulkwaldカップリング反応によってA7を得ること、6)A7を脱保護してA8を得ることによって、合成することができる。数種類のA7およびA8の官能基FG1およびFG2は、さらに誘導体化させ、別の目的化合物に転換し、例えば、FG1中に保護されたアミン、脱保護されたアミン、アミンをさらにアミド化又は還元的アミノ化により生成したアミド又は置換アミンが含まれ、また、FG2のエステルは塩基(例えばLiOH)で加水分解されて酸となり、さらに酸をアミド化してアミドを生成させる。
【0049】
【化6】
【0050】
本発明の一般式(I)で表される複素環化合物は、また、以下のスキームで調製することができる：1)A8の水素化により、B1を得ることによって合成できる。数種類のB1の官能基FG1及びFG2は、さらに誘導体化させ、別の目標化合物に転換し、例えば、FG2のエステルを塩基(例えばLiOH)で加水分解して酸を生成させ、さらに酸をアミド化してアミドを生成させる。
【0051】
【化7】
【実施例】
【0052】
本発明の出発物質は、当技術分野で知られている方法に従って合成され得るか、または化学会社、例えばABCR GmbH&Co. KG、Acros Organics、Aldrich Chemical Company、Accela ChemBio Inc.、とBeijing OUHE technology Co. Ltdから購入することができる。
【0053】
本発明の化合物の構造は、核磁気共鳴(NMR)および/または質量分析(MS)により同定した。NMRによる同定は、Bruker ASCEND-400 核磁気分析装置を使用し、重水素化ジメチルスルホキシド(DMSO-d6)、重水素化クロロホルム(CDCl3)または重水素化メタノール(CD3OD)などの溶媒を用い、テトラメチルシラン(TMS)を内部標準として行い、10-6(ppm)の単位で化学シフトを得た。MS同定は、Agilent SQD(ESI)マススペクトロメーター(Agilent 6120)を用いて行った。
【0054】
HPLCとして、Agilent 1260 DAD高圧液体クロマトグラフ(Poroshell 120 EC-C18, 50×3.0 mm, 2.7μmクロマトグラフカラム)またはWaters Arc高圧液体クロマトグラフ(Sunfirc C18, 150×4.6mm, 5μmクロマトグラフカラム)で行った。
【0055】
実施例で特に断らない限り、反応温度は室温(20℃～30℃)とした。
【0056】
実施例で特に断らない限り、反応はアルゴン雰囲気または窒素雰囲気下で行った。アルゴン雰囲気または窒素雰囲気とは、反応瓶を約1Lの容積のアルゴンバルーンまたは窒素バルーンに接続していることを意味した。
【0057】
水素雰囲気とは、反応瓶を真空にした後水素を充填する操作を3回繰り返し、約1Lの容積の水素バルーンに接続することを意味する。
【0058】
マイクロ波反応には、CEM Discover-SP型マイクロ波反応器を使用した。
【0059】
実施例における反応の進行のモニタリングは、Agilent 液体クロマトグラフ(1260/6120)を用いて、行った。また、シリカゲルプレートの厚さが0.15～0.2 mm(Qingdao Haiyang GF254)である薄層クロマトグラフィー(TLC)を用いて、行ってもよかった。
【0060】
化合物の精製は、カラムクロマトグラフィー又は薄層クロマトグラフィーを用い、カラムクロマトグラフィーにはQingdao Haiyang の200～300メッシュのシリカゲルを用い、薄層クロマトグラフィーにはQingdao Haiyang の厚さ0.4～0.5mmのGF254シリカゲルプレートを用いた。
【0061】
カラムクロマトグラフィーまたは薄層クロマトグラフィーの展開溶媒系は、通常、a)ジクロロメタンおよびメタノール系、b)石油エーテルおよび酢酸エチル系、または実施例に示されるものであった。溶媒の体積比は、化合物の極性に応じて調整し、少量のトリエチルアミンまたは他の酸性または塩基性試薬を追加することによってさらに調整することもできた。
【0062】
また、化合物の精製はWatersのマススペクトロメーターガイド自動調製システム(マススペクトロメーター検出器:SQD2)で行い、化合物の極性に応じて、適切なアセトニトリル/水(0.1%トリフルオロ酢酸またはギ酸、または0.05%アンモニア水を含む)勾配で20mL/minの流速で逆相高圧カラム(XBridge-C18, 19×150mm, 5μm)を溶出した。実施例の一部では、自動調製システムによる精製後に1Nの希塩酸を添加し、減圧下で溶媒を除去して塩酸塩を生成することができた。
【0063】
略語DMFは、N,N-ジメチルホルムアミドを意味する。
【0064】
略語TFAはトリフルオロ酢酸を意味する。
【0065】
略称DIPEAは、N,N-ジイソプロピルエチルアミンを意味する。
【0066】
略称NBSは、N-ブロモスクシンイミドを意味する。
【0067】
略称HATUは、O-(7-アザベンゾトリアゾール-1-イル)-N,N,N',N'-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェートを意味する。
【0068】
略語XantPhosは、4,5-ビス(ジフェニルホスフィノ)-9,9-ジメチルキサンテンを意味する。
【0069】
略称Pd2(dba)3は、トリス(ジベンジリデンアセトン)ジパラジウムを意味する。
【0070】
略語Brettphosは、2-(ジシクロヘキシルホスフィノ)-3,6-ジメトキシ-2',4',6'-トリイソプロピル-1,1'-ビフェニルを意味する。
【0071】
実施例1
1-ブロモ-3-(2,6-ジフルオロフェニル)-8-メトキシイミダゾ[1,5-a]ピラジン(中間体1f)
1-ブロモ-3-(2,6-ジフルオロフェニル)-8-メトキシイミダゾ[1,5-a]ピラジン(中間体1f)
【化8】
【0072】
第1工程
N-((3-クロロピラジン-2-イル)メチル)-2,6-ジフルオロベンズアミド(1c)
2,6-ジフルオロ安息香酸1a(5 g、31.6 mmol)をジクロロメタン(100 mL)に溶解し、DMFを3滴で添加し、0℃に冷却し、塩化オキサリル(8 g、63.3 mmol)を滴下添加した。室温で1時間撹拌した後、混合物を濃縮乾固した。残渣をジクロロメタン(10mL)に溶解して、溶液Aを得た。別の250 mL丸底フラスコに、(3-クロロピラジン-2-イル)メタンアミンハイドロクロライド1b(5.7 g、31.6 mmol)を添加し、ジクロロメタン(100 mL)及びトリエチルアミン(9.6 g、94.8 mmol)を添加し、0℃に冷却し、溶液Aを滴下した。混合物を室温で1時間撹拌した後、水(50 mL)でクエンチした。分離した有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、ろ過し、ろ液を減圧で濃縮乾固させ、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(酢酸エチル/ジクロロメタン= 1/1)で精製し、目的物1c(6.8 g、76%)を得た。
N-((3-クロロピラジン-2-イル)メチル)-2,6-ジフルオロベンズアミド(1c)
2,6-ジフルオロ安息香酸1a(5 g、31.6 mmol)をジクロロメタン(100 mL)に溶解し、DMFを3滴で添加し、0℃に冷却し、塩化オキサリル(8 g、63.3 mmol)を滴下添加した。室温で1時間撹拌した後、混合物を濃縮乾固した。残渣をジクロロメタン(10mL)に溶解して、溶液Aを得た。別の250 mL丸底フラスコに、(3-クロロピラジン-2-イル)メタンアミンハイドロクロライド1b(5.7 g、31.6 mmol)を添加し、ジクロロメタン(100 mL)及びトリエチルアミン(9.6 g、94.8 mmol)を添加し、0℃に冷却し、溶液Aを滴下した。混合物を室温で1時間撹拌した後、水(50 mL)でクエンチした。分離した有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、ろ過し、ろ液を減圧で濃縮乾固させ、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(酢酸エチル/ジクロロメタン= 1/1)で精製し、目的物1c(6.8 g、76%)を得た。
【0073】
MS m/z (ESI): 284 [M+1]
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.47 (d, J = 2.5 Hz, 1H), 8.39 - 8.30 (m, 1H), 7.44 - 7.37 (m, 2H), 7.03 - 6.90 (m, 2H), 4.93 (d, J = 4.5 Hz, 2H).
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.47 (d, J = 2.5 Hz, 1H), 8.39 - 8.30 (m, 1H), 7.44 - 7.37 (m, 2H), 7.03 - 6.90 (m, 2H), 4.93 (d, J = 4.5 Hz, 2H).
【0074】
第2工程
8-クロロ-3-(2,6-ジフルオロフェニル)イミダゾ[1,5-a]ピラジン(1d)
1c(6.8 g、24 mmol)のアセトニトリル(80 mL)の溶液に、オキシ塩化ホスフィン(18.4 g、120 mmol)を添加した。混合物を90℃に加熱し、16時間撹拌した。室温まで冷却した後、オキシ塩化ホスフィン(18.4 g、120 mmol)をさらに添加し、混合物を90℃に再度加熱し、28時間撹拌した。室温に冷却し、濃縮乾固し、次いで、飽和炭酸水素ナトリウム溶液(50 mL)を添加し、ジクロロメタン(2×100 mL)で抽出した。合わせた有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過し、ろ液を減圧で濃縮乾固させ、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(酢酸エチル/ジクロロメタン= 1/2)で精製して、目的物1d(5.9 g、92%)を得た。
8-クロロ-3-(2,6-ジフルオロフェニル)イミダゾ[1,5-a]ピラジン(1d)
1c(6.8 g、24 mmol)のアセトニトリル(80 mL)の溶液に、オキシ塩化ホスフィン(18.4 g、120 mmol)を添加した。混合物を90℃に加熱し、16時間撹拌した。室温まで冷却した後、オキシ塩化ホスフィン(18.4 g、120 mmol)をさらに添加し、混合物を90℃に再度加熱し、28時間撹拌した。室温に冷却し、濃縮乾固し、次いで、飽和炭酸水素ナトリウム溶液(50 mL)を添加し、ジクロロメタン(2×100 mL)で抽出した。合わせた有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過し、ろ液を減圧で濃縮乾固させ、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(酢酸エチル/ジクロロメタン= 1/2)で精製して、目的物1d(5.9 g、92%)を得た。
【0075】
MS m/z (ESI): 266 [M+1]
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.10 (s, 1H), 7.60 - 7.50 (m, 2H), 7.44 (d, J = 5.0 Hz, 1H), 7.14 (t, J = 8.1 Hz, 2H).
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.10 (s, 1H), 7.60 - 7.50 (m, 2H), 7.44 (d, J = 5.0 Hz, 1H), 7.14 (t, J = 8.1 Hz, 2H).
【0076】
第3工程
1-ブロモ-8-クロロ-3-(2,6-ジフルオロフェニル)イミダゾ[1,5-a]ピラジン(1e)
1d(880 mg、3.31 mmol)のアセトニトリル(40 mL)の溶液に、NBS(590 mg、3.31 mmol)を添加した。混合物を室温で18時間撹拌し、次いで濃縮乾固した。残渣を酢酸エチル(100 mL)に溶解し、水(2×50 mL)で洗浄し、次いで無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。ろ過した後、ろ液を減圧で濃縮乾固させ、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(石油エーテル/酢酸エチル= 2/1)で精製して、目的物1e(940 mg、82%)を得た。
1-ブロモ-8-クロロ-3-(2,6-ジフルオロフェニル)イミダゾ[1,5-a]ピラジン(1e)
1d(880 mg、3.31 mmol)のアセトニトリル(40 mL)の溶液に、NBS(590 mg、3.31 mmol)を添加した。混合物を室温で18時間撹拌し、次いで濃縮乾固した。残渣を酢酸エチル(100 mL)に溶解し、水(2×50 mL)で洗浄し、次いで無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。ろ過した後、ろ液を減圧で濃縮乾固させ、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(石油エーテル/酢酸エチル= 2/1)で精製して、目的物1e(940 mg、82%)を得た。
【0077】
MS m/z (ESI): 344 [M+1]
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.57 (tt, J = 8.5, 6.3 Hz, 1H), 7.49 - 7.46 (m, 1H), 7.41 (d, J = 5.0 Hz, 1H), 7.13 (t, J = 8.1 Hz, 2H).
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.57 (tt, J = 8.5, 6.3 Hz, 1H), 7.49 - 7.46 (m, 1H), 7.41 (d, J = 5.0 Hz, 1H), 7.13 (t, J = 8.1 Hz, 2H).
【0078】
第4工程
1-ブロモ-3-(2,6-ジフルオロフェニル)-8-メトキシイミダゾ[1,5-a]ピラジン(1f)
1e(590 mg、1.71 mmol)をメタノール(40 mL)に溶解し、0℃に冷却し、ナトリウムメトキシド溶液(463 mg、2.57 mmol、30%メタノール溶液)を滴下添加した。得られた混合物を2時間撹拌し、次いで、飽和塩化アンモニウム溶液(100 mL)に注ぎ、添加し、酢酸エチル(3×50 mL)で抽出した。合わせた有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過した後、ろ液を減圧で濃縮乾固させ、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(石油エーテル/酢酸エチル= 1/1)で精製して、目的物1f(570 mg、98%)を得た。
1-ブロモ-3-(2,6-ジフルオロフェニル)-8-メトキシイミダゾ[1,5-a]ピラジン(1f)
1e(590 mg、1.71 mmol)をメタノール(40 mL)に溶解し、0℃に冷却し、ナトリウムメトキシド溶液(463 mg、2.57 mmol、30%メタノール溶液)を滴下添加した。得られた混合物を2時間撹拌し、次いで、飽和塩化アンモニウム溶液(100 mL)に注ぎ、添加し、酢酸エチル(3×50 mL)で抽出した。合わせた有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過した後、ろ液を減圧で濃縮乾固させ、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(石油エーテル/酢酸エチル= 1/1)で精製して、目的物1f(570 mg、98%)を得た。
【0079】
MS m/z (ESI): 340 [M+1]
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.56-7.49 (m, 1H), 7.21 (dt, J = 5.0, 1.9 Hz, 1H), 7.17 (d, J = 5.1 Hz, 1H), 7.13 - 7.08 (m, 2H), 4.18 (s, 3H)
以下の表中のすべて中間体について、実施例1の実験手順を参照して操作したが、第1の工程において、2,6-ジフルオロ安息香酸1aの代わり、異なるカルボン酸に置き換えた。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.56-7.49 (m, 1H), 7.21 (dt, J = 5.0, 1.9 Hz, 1H), 7.17 (d, J = 5.1 Hz, 1H), 7.13 - 7.08 (m, 2H), 4.18 (s, 3H)
以下の表中のすべて中間体について、実施例1の実験手順を参照して操作したが、第1の工程において、2,6-ジフルオロ安息香酸1aの代わり、異なるカルボン酸に置き換えた。
【表2】
【0080】
中間体3f、19aの核磁気データは、以下の通りであった：
【表3】
【0081】
実施例2
2-(4-アミノフェニル)-2-メチルプロパンアミド(中間体33c)
2-(4-アミノフェニル)-2-メチルプロパンアミド(中間体33c)
【化9】
【0082】
第1工程
2-メチル-2-(4-ニトロフェニル)プロパンアミド(33b)
2-メチル-2-(4-ニトロフェニル)プロピオニトリル33a(2.00 g、10.52 mmol)のエタノール/水(20 mL、体積比1/1)の溶液に、0℃にて、炭酸カリウム(0.58 g、4.21 mmol)と30%過酸化水素水溶液(35 mL)を添加し、0℃にて0.5時間撹拌した後、室温に昇温して16時間撹拌した。反応が完了した後、飽和亜硫酸ナトリウム溶液(50 mL)を添加し、室温で0.5時間撹拌し、次いで、酢酸エチル(3×50 mL)で抽出した。合わせた有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過した後、ろ液を減圧で濃縮乾固させ、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ジクロロメタン/メタノール= 20/1)で精製して、目的物33b(0.76 g、35%)を得た。
2-メチル-2-(4-ニトロフェニル)プロパンアミド(33b)
2-メチル-2-(4-ニトロフェニル)プロピオニトリル33a(2.00 g、10.52 mmol)のエタノール/水(20 mL、体積比1/1)の溶液に、0℃にて、炭酸カリウム(0.58 g、4.21 mmol)と30%過酸化水素水溶液(35 mL)を添加し、0℃にて0.5時間撹拌した後、室温に昇温して16時間撹拌した。反応が完了した後、飽和亜硫酸ナトリウム溶液(50 mL)を添加し、室温で0.5時間撹拌し、次いで、酢酸エチル(3×50 mL)で抽出した。合わせた有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過した後、ろ液を減圧で濃縮乾固させ、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ジクロロメタン/メタノール= 20/1)で精製して、目的物33b(0.76 g、35%)を得た。
【0083】
MS m/z (ESI): 209 [M+1]
第2工程
2-(4-アミノフェニル)-2-メチルプロパンアミド(33c)
33b(0.76 g、3.65 mmol)のメタノール(10mL)の溶液に、20%パラジウム炭素(0.15 g)を添加した。混合物を水素雰囲気下で12時間撹拌し、次いで、ろ過した。ろ液を減圧で濃縮乾固させ、目的物33c(0.65 g、100%)を得た。
第2工程
2-(4-アミノフェニル)-2-メチルプロパンアミド(33c)
33b(0.76 g、3.65 mmol)のメタノール(10mL)の溶液に、20%パラジウム炭素(0.15 g)を添加した。混合物を水素雰囲気下で12時間撹拌し、次いで、ろ過した。ろ液を減圧で濃縮乾固させ、目的物33c(0.65 g、100%)を得た。
【0084】
MS m/z (ESI): 179 [M+1]
実施例3
tert-ブチル4-(2-(4-アミノフェニル)-2-メチルプロパノイル)ピペラジン-1-カルボキシラート(中間体36d)
実施例3
tert-ブチル4-(2-(4-アミノフェニル)-2-メチルプロパノイル)ピペラジン-1-カルボキシラート(中間体36d)
【化10】
【0085】
第1工程
2-メチル-2-(4-ニトロフェニル)プロパン酸(36a)
33a(5.00 g、26.29 mmol)と水(25m L)の混合物に濃硫酸(25 mL)を0℃で添加し、次いで120℃に加熱し、12時間撹拌した。室温まで冷却した後、水(50 mL)を添加し、飽和炭酸水素ナトリウム溶液でpH = 8に調整し、次いで酢酸エチル(3×50 mL)で抽出した。合わせた有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過した後、ろ液を減圧で濃縮乾固させ、目的物36a(5.00 g、91%)を得た。
2-メチル-2-(4-ニトロフェニル)プロパン酸(36a)
33a(5.00 g、26.29 mmol)と水(25m L)の混合物に濃硫酸(25 mL)を0℃で添加し、次いで120℃に加熱し、12時間撹拌した。室温まで冷却した後、水(50 mL)を添加し、飽和炭酸水素ナトリウム溶液でpH = 8に調整し、次いで酢酸エチル(3×50 mL)で抽出した。合わせた有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過した後、ろ液を減圧で濃縮乾固させ、目的物36a(5.00 g、91%)を得た。
【0086】
MS m/z (ESI): 210 [M+1]
【0087】
第2工程
2-メチル-2-(4-ニトロフェニル)プロピオニルクロリド(36b)
36a(5.00 g，23.90 mmol)を塩化チオニルに0℃で添加した後、85℃に加熱し12時間撹拌した。室温まで冷却後、濃縮乾固することで目的物36b(5.20 g、96%)を得た。
2-メチル-2-(4-ニトロフェニル)プロピオニルクロリド(36b)
36a(5.00 g，23.90 mmol)を塩化チオニルに0℃で添加した後、85℃に加熱し12時間撹拌した。室温まで冷却後、濃縮乾固することで目的物36b(5.20 g、96%)を得た。
【0088】
第3工程
tert-ブチル4-(2-メチル-2-(4-ニトロフェニル)プロピオニル)ピペラジン-1-カルボキシラート
tert-ブチル-ピペラジン-1-カルボキシラート(1.84 g、9.89 mmol)のジクロロメタン(20 mL)の溶液に、室温でトリエチルアミン(2.00 g、19.77 mmol)を添加し、10分間撹拌した。次いで、0℃に冷却し、36c(1.50 g、6.59 mmol)のジクロロメタン(10 mL)の溶液を添加した。室温で2時間撹拌した後、水(20 mL)を添加し、ジクロロメタン(3×30 mL)で抽出した。合わせた有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過し、ろ液を濃縮乾固させ、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ジクロロメタン/メタノール= 100/1)で精製して、目的物36c(1.50 g、60%)を得た。
tert-ブチル4-(2-メチル-2-(4-ニトロフェニル)プロピオニル)ピペラジン-1-カルボキシラート
tert-ブチル-ピペラジン-1-カルボキシラート(1.84 g、9.89 mmol)のジクロロメタン(20 mL)の溶液に、室温でトリエチルアミン(2.00 g、19.77 mmol)を添加し、10分間撹拌した。次いで、0℃に冷却し、36c(1.50 g、6.59 mmol)のジクロロメタン(10 mL)の溶液を添加した。室温で2時間撹拌した後、水(20 mL)を添加し、ジクロロメタン(3×30 mL)で抽出した。合わせた有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過し、ろ液を濃縮乾固させ、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ジクロロメタン/メタノール= 100/1)で精製して、目的物36c(1.50 g、60%)を得た。
【0089】
MS m/z (ESI): 378 [M+1]
第4工程
tert-ブチル4-(2-(4-アミノフェニル)-2-メチルプロパノイル)ピペラジン-1-カルボキシラート(36d)
36c(1.50 g、3.97 mmol)のメタノール(250 mL)の溶液に、20%パラジウム炭素(0.3 g)を添加し、次いで水素雰囲気下で12時間撹拌した。ろ過し、ろ液を濃縮乾固させ、目的物36d(1.38 g、100%)を得た。
第4工程
tert-ブチル4-(2-(4-アミノフェニル)-2-メチルプロパノイル)ピペラジン-1-カルボキシラート(36d)
36c(1.50 g、3.97 mmol)のメタノール(250 mL)の溶液に、20%パラジウム炭素(0.3 g)を添加し、次いで水素雰囲気下で12時間撹拌した。ろ過し、ろ液を濃縮乾固させ、目的物36d(1.38 g、100%)を得た。
【0090】
MS m/z (ESI): 348 [M+1]
【0091】
中間体35dについて、実施例3の実験手順を参照して、第3工程においてtert-ブチル-ピペラジン-1-カルボキシラートの代わりにN-メチルピペリジンを使用し、合成した。
【表4】
【0092】
実施例4
3-(2,6-ジフルオロフェニル)-1-((4-(モルホリン-4-カルボニル)フェニル)アミノ)イミダゾ[1,5-a]ピラジン-8(7H)-オン(化合物1)
3-(2,6-ジフルオロフェニル)-1-((4-(モルホリン-4-カルボニル)フェニル)アミノ)イミダゾ[1,5-a]ピラジン-8(7H)-オン(化合物1)
【化11】
【0093】
第1工程
(4-((3-(2,6-ジフルオロフェニル)-8-メトキシイミダゾ[1,5-a]ピラジン-1-イル)アミノ)フェニル)(モルホリノ)メタノン(1h)
1f(200 mg、0.59 mmol)、(4-アミノフェニル)(モルホリノ)メタノン1g(121 mg、0.59 mmol)及び1,4-ジオキサン(2 mL)の混合物に、tert-ブトキシドナトリウム(144 mg、1.5 mmol)、次いでXantPhos(69 mg、0.12 mmol)及びPd2(dba)3(55 mg、0.06 mmol)を添加した。混合物をマイクロ波反応器内で100℃に加熱し、1時間撹拌した。室温まで冷却した後、反応混合物を水(20 mL)で希釈し、次いで酢酸エチル(3×20 mL)で抽出した。合わせた有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過し、ろ液を減圧で濃縮乾固させ、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ジクロロメタン/メタノール= 20/1)で精製して、目的物1h(260 mg、95%)を得た。
(4-((3-(2,6-ジフルオロフェニル)-8-メトキシイミダゾ[1,5-a]ピラジン-1-イル)アミノ)フェニル)(モルホリノ)メタノン(1h)
1f(200 mg、0.59 mmol)、(4-アミノフェニル)(モルホリノ)メタノン1g(121 mg、0.59 mmol)及び1,4-ジオキサン(2 mL)の混合物に、tert-ブトキシドナトリウム(144 mg、1.5 mmol)、次いでXantPhos(69 mg、0.12 mmol)及びPd2(dba)3(55 mg、0.06 mmol)を添加した。混合物をマイクロ波反応器内で100℃に加熱し、1時間撹拌した。室温まで冷却した後、反応混合物を水(20 mL)で希釈し、次いで酢酸エチル(3×20 mL)で抽出した。合わせた有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過し、ろ液を減圧で濃縮乾固させ、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ジクロロメタン/メタノール= 20/1)で精製して、目的物1h(260 mg、95%)を得た。
【0094】
MS m/z (ESI): 466 [M+1]
第2工程
3-(2,6-ジフルオロフェニル)-1-((4-(モルホリン-4-カルボニル)フェニル)アミノ)イミダゾ[1,5-a]ピラジン-8(7H)-オン(1)
1h(260 mg、0.56 mmol)のアセトニトリル(10mL)の溶液に、6N塩酸(10mL)を添加し、70℃に加熱し、1時間撹拌した。室温まで冷却後、濃縮乾固して、残渣を水(10mL)で希釈し、次いで飽和炭酸水素ナトリウム溶液でpH = 8に調整し、酢酸エチル(2×50 mL)で抽出した。合わせた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過した後、ろ液を減圧で濃縮乾固させ、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ジクロロメタン/メタノール= 20/1)で精製して、目的物1(固体、150 mg、59%)を得た。
第2工程
3-(2,6-ジフルオロフェニル)-1-((4-(モルホリン-4-カルボニル)フェニル)アミノ)イミダゾ[1,5-a]ピラジン-8(7H)-オン(1)
1h(260 mg、0.56 mmol)のアセトニトリル(10mL)の溶液に、6N塩酸(10mL)を添加し、70℃に加熱し、1時間撹拌した。室温まで冷却後、濃縮乾固して、残渣を水(10mL)で希釈し、次いで飽和炭酸水素ナトリウム溶液でpH = 8に調整し、酢酸エチル(2×50 mL)で抽出した。合わせた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過した後、ろ液を減圧で濃縮乾固させ、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ジクロロメタン/メタノール= 20/1)で精製して、目的物1(固体、150 mg、59%)を得た。
【0095】
MS m/z (ESI): 452 [M+1]
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10.56 (d, J = 5.3 Hz, 1H), 8.42 (s, 1H), 7.78 - 7.63 (m, 3H), 7.43 - 7.27 (m, 4H), 6.84 (d, J = 5.3 Hz, 1H), 6.59 (t, J = 5.7 Hz, 1H), 3.59 (d, J = 4.5 Hz, 4H), 3.50 (s, 4H).
下記の表中の化合物又は中間体のすべてについて、実施例4の実験手順を参照して操作したが、第1の工程において、1fおよび1gの代わりに、それぞれ異なる化合物に置き換えた。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10.56 (d, J = 5.3 Hz, 1H), 8.42 (s, 1H), 7.78 - 7.63 (m, 3H), 7.43 - 7.27 (m, 4H), 6.84 (d, J = 5.3 Hz, 1H), 6.59 (t, J = 5.7 Hz, 1H), 3.59 (d, J = 4.5 Hz, 4H), 3.50 (s, 4H).
下記の表中の化合物又は中間体のすべてについて、実施例4の実験手順を参照して操作したが、第1の工程において、1fおよび1gの代わりに、それぞれ異なる化合物に置き換えた。
【表5-1】
【表5-2】
【表5-3】
【0096】
化合物3、4、6、7、9、11、14、22、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37および38の核磁気データは、以下の通りであった：
【表6-1】
【表6-2】
【表6-3】
【0097】
実施例5
3-(2,6-ジフルオロフェニル)-1-((4-(モルホリン-4-カルボニル)フェニル)アミノ)-6,7-ジヒドロイミダゾ[1,5-a]ピラジン-8(5H)-オン(化合物2)
1(97 mg、0.215 mmol)、メタノール(30 mL)及び10%パラジウム炭素(97 mg)を混合した後、水素雰囲気下で30℃に加熱し、16時間撹拌した。ろ過した後、ろ液を濃縮乾固して、残渣を逆相分取高速液体クロマトグラフィーにより精製して、目的物2(固体、25 mg、26%)を得た。
3-(2,6-ジフルオロフェニル)-1-((4-(モルホリン-4-カルボニル)フェニル)アミノ)-6,7-ジヒドロイミダゾ[1,5-a]ピラジン-8(5H)-オン(化合物2)
【化12】
【0098】
MS m/z (ESI): 490 [M+1]
1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 7.73 (d, J = 6.3 Hz, 1H), 7.66 (td, J = 6.2, 2.8 Hz, 3H), 7.58 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 7.28 (ddd, J = 9.1, 7.6, 3.3 Hz, 1H), 7.19 (dd, J = 9.1, 4.2 Hz, 1H), 6.94 (d, J = 6.4 Hz, 1H), 4.73 (s, 2H), 4.52 (t, J = 11.5 Hz, 1H), 3.99 (s, 3H), 3.76 -3.70 (m, 1H), 2.21 -2.03 (m, 6H), 1.63 - 1.53 (m, 2H).
1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 7.73 (d, J = 6.3 Hz, 1H), 7.66 (td, J = 6.2, 2.8 Hz, 3H), 7.58 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 7.28 (ddd, J = 9.1, 7.6, 3.3 Hz, 1H), 7.19 (dd, J = 9.1, 4.2 Hz, 1H), 6.94 (d, J = 6.4 Hz, 1H), 4.73 (s, 2H), 4.52 (t, J = 11.5 Hz, 1H), 3.99 (s, 3H), 3.76 -3.70 (m, 1H), 2.21 -2.03 (m, 6H), 1.63 - 1.53 (m, 2H).
【0099】
下記の表中のすべて化合物について、実施例5の実験手順を参照して操作したが、操作中、化合物1の代わりに異なる化合物を用いた。
【表7】
【0100】
化合物5、8、10、12、16、18および23の核磁気データは、以下の通りであった：
【表8】
【0101】
実施例6
1-((4-(1-(アゼチジン-1-イル)-2-メチル-1-オキソプロパン-2-イル)フェニル)アミノ)-3-(2,6-ジフルオロフェニル)-6,7-ジヒドロイミダゾ[1,5-a]ピラジン-8(5H)-オン(化合物13)
1-((4-(1-(アゼチジン-1-イル)-2-メチル-1-オキソプロパン-2-イル)フェニル)アミノ)-3-(2,6-ジフルオロフェニル)-6,7-ジヒドロイミダゾ[1,5-a]ピラジン-8(5H)-オン(化合物13)
【化13】
【0102】
第1工程
tert-ブチル2-(4-((3-(2,6-ジフルオロフェニル)-8-メトキシイミダゾ[1,5-a]ピラジン-1-イル)アミノ)フェニル)-2-メチルプロパノエート(13b)
1f(200 mg、0.588 mmol)の1,4-ジオキサン(5 mL)の溶液に、tert-ブチル2-(4-アミノフェニル)-2-メチルプロパノエート13a(280 mg、1.17 mmol)、Brettphos(62 mg、0.118 mmol)、Pd2(dba)3(53 mg、0.058 mmol)および炭酸セシウム(600 mg、1.76 mmol)を窒素雰囲気下で添加し、次いで、マイクロ波反応器内で90℃に加熱し、1時間撹拌した。室温まで冷却後、減圧で濃縮乾固し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(石油エーテル/酢酸エチル= 100/0～7/3)で精製し、目的物13b(200 mg、68%)を得た。
tert-ブチル2-(4-((3-(2,6-ジフルオロフェニル)-8-メトキシイミダゾ[1,5-a]ピラジン-1-イル)アミノ)フェニル)-2-メチルプロパノエート(13b)
1f(200 mg、0.588 mmol)の1,4-ジオキサン(5 mL)の溶液に、tert-ブチル2-(4-アミノフェニル)-2-メチルプロパノエート13a(280 mg、1.17 mmol)、Brettphos(62 mg、0.118 mmol)、Pd2(dba)3(53 mg、0.058 mmol)および炭酸セシウム(600 mg、1.76 mmol)を窒素雰囲気下で添加し、次いで、マイクロ波反応器内で90℃に加熱し、1時間撹拌した。室温まで冷却後、減圧で濃縮乾固し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(石油エーテル/酢酸エチル= 100/0～7/3)で精製し、目的物13b(200 mg、68%)を得た。
【0103】
MS m/z (ESI): 495 [M+1]
【0104】
第2工程
エチル2-(4-((3-(2,6-ジフルオロフェニル)-8-オキソ-7,8-ジヒドロイミダゾ[1,5-a]ピラジン-1-イル)アミノ)フェニル)-2-メチルプロパノエート(13c)
13b(100 mg、0.1 mmol)のエタノール(4 mL)の溶液に、HClのエタノール溶液(12N、2 mL)を添加した。この溶液を70℃で2時間撹拌した後、室温まで冷却し、濃縮乾固して目的物13c(90 mg)を得た。生成物は、さらに精製せずに、次の反応に直接使用した。
エチル2-(4-((3-(2,6-ジフルオロフェニル)-8-オキソ-7,8-ジヒドロイミダゾ[1,5-a]ピラジン-1-イル)アミノ)フェニル)-2-メチルプロパノエート(13c)
13b(100 mg、0.1 mmol)のエタノール(4 mL)の溶液に、HClのエタノール溶液(12N、2 mL)を添加した。この溶液を70℃で2時間撹拌した後、室温まで冷却し、濃縮乾固して目的物13c(90 mg)を得た。生成物は、さらに精製せずに、次の反応に直接使用した。
【0105】
MS m/z (ESI): 453 [M+1]
【0106】
第3工程
エチル2-(4-((3-(2,6-ジフルオロフェニル)-8-オキソ-5,6,7,8-テトラヒドロイミダゾ[1,5-a]ピラジン-1-イル)アミノ)フェニル)-2-メチルプロパノエート(13d)
13c(90 mg、0.2 mmol)、エタノール(5 mL)および10%パラジウム炭素(100 mg)を混合し、水素雰囲気下で3時間撹拌した後、ろ過し、ろ液を濃縮乾固して、目的物13d(80 mg、88%)を得た。
エチル2-(4-((3-(2,6-ジフルオロフェニル)-8-オキソ-5,6,7,8-テトラヒドロイミダゾ[1,5-a]ピラジン-1-イル)アミノ)フェニル)-2-メチルプロパノエート(13d)
13c(90 mg、0.2 mmol)、エタノール(5 mL)および10%パラジウム炭素(100 mg)を混合し、水素雰囲気下で3時間撹拌した後、ろ過し、ろ液を濃縮乾固して、目的物13d(80 mg、88%)を得た。
【0107】
MS m/z (ESI): 455 [M+1]
【0108】
第4工程
2-(4-((3-(2,6-ジフルオロフェニル)-8-オキソ-5,6,7,8-テトラヒドロイミダゾ[1,5-a]ピラジン-1-イル)アミノ)フェニル)-2-メチルプロパン酸(13e)
13d(90 mg、0.2 mmol)のテトラヒドロフラン(5 mL)の溶液に、水酸化リチウム一水和物(17 mg、0.4 mmol)を添加し、60℃に加熱し、18時間撹拌した。室温まで冷却後、反応溶液を濃縮乾固して、残渣を逆相分取高速液体クロマトグラフィーにより精製し、目的物13e(TFA含有60 mg)を得た。
2-(4-((3-(2,6-ジフルオロフェニル)-8-オキソ-5,6,7,8-テトラヒドロイミダゾ[1,5-a]ピラジン-1-イル)アミノ)フェニル)-2-メチルプロパン酸(13e)
13d(90 mg、0.2 mmol)のテトラヒドロフラン(5 mL)の溶液に、水酸化リチウム一水和物(17 mg、0.4 mmol)を添加し、60℃に加熱し、18時間撹拌した。室温まで冷却後、反応溶液を濃縮乾固して、残渣を逆相分取高速液体クロマトグラフィーにより精製し、目的物13e(TFA含有60 mg)を得た。
【0109】
MS m/z (ESI): 427 [M+1]
【0110】
第5工程
1-((4-(1-(アゼチジン-1-イル)-2-メチル-1-オキソプロパン-2-イル)フェニル)アミノ)-3-(2,6-ジフルオロフェニル)-6,7-ジヒドロイミダゾ[1,5-a]ピラジン-8(5H)-オン(13)
13e(17 mg、0.04 mmol)、DMF(2 mL)、HATU(20 mg、0.052 mmol)およびアゼチジン(10mg、0.12 mmol)の混合物に、ジイソプロピルエチルアミン(26 mg、0.2 mmol)を添加した。得られた溶液を室温で1時間撹拌した後、逆相分取高速液体クロマトグラフィーで直接精製して、目的物13(固体、2.69 mg、14%)を得た。
1-((4-(1-(アゼチジン-1-イル)-2-メチル-1-オキソプロパン-2-イル)フェニル)アミノ)-3-(2,6-ジフルオロフェニル)-6,7-ジヒドロイミダゾ[1,5-a]ピラジン-8(5H)-オン(13)
13e(17 mg、0.04 mmol)、DMF(2 mL)、HATU(20 mg、0.052 mmol)およびアゼチジン(10mg、0.12 mmol)の混合物に、ジイソプロピルエチルアミン(26 mg、0.2 mmol)を添加した。得られた溶液を室温で1時間撹拌した後、逆相分取高速液体クロマトグラフィーで直接精製して、目的物13(固体、2.69 mg、14%)を得た。
【0111】
MS m/z (ESI): 466 [M+1]
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.04 (s, 1H), 7.81 (s, 1H), 7.75 - 7.65 (m, 1H), 7.59 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 7.42 - 7.29 (m, 2H), 7.10 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 4.06 - 3.93 (m, 2H), 3.86 - 3.71 (m, 2H), 3.53 - 3.47 (m, 2H), 2.59 - 2.51 (m, 2H), 2.03 - 1.84 (m, 2H), 1.37 (s, 6H).
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.04 (s, 1H), 7.81 (s, 1H), 7.75 - 7.65 (m, 1H), 7.59 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 7.42 - 7.29 (m, 2H), 7.10 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 4.06 - 3.93 (m, 2H), 3.86 - 3.71 (m, 2H), 3.53 - 3.47 (m, 2H), 2.59 - 2.51 (m, 2H), 2.03 - 1.84 (m, 2H), 1.37 (s, 6H).
【0112】
実施例7
3-(2-クロロ-6-フルオロフェニル)-1-((4-(モルホリン-4-カルボニル)フェニル)アミノ)-6,7-ジヒドロイミダゾ[1,5-a]ピラジン-8(5H)-オン(化合物15)
3(140 mg、0.3 mmol)のエタノール(10mL)の溶液に、クロロベンゼン(1 mL)および二酸化白金(70 mg)を添加した。混合物を水素雰囲気下で70分間撹拌し、次いで、ろ過した。ろ液を濃縮乾固し、残渣を逆相分取高速液体クロマトグラフィーにより精製して、目的物15(固体、62.7 mg、44%)を得た。
3-(2-クロロ-6-フルオロフェニル)-1-((4-(モルホリン-4-カルボニル)フェニル)アミノ)-6,7-ジヒドロイミダゾ[1,5-a]ピラジン-8(5H)-オン(化合物15)
【化14】
【0113】
MS m/z (ESI): 312 [M+1]
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.29 (s, 1H), 7.87 (s, 1H), 7.72 - 7.63 (m, 3H), 7.57 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 7.47 (t, J = 8.7 Hz, 1H), 7.31 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 3.95 - 3.90 (m, 2H), 3.61 - 3.55 (m, 4H), 3.54 - 3.45 (m, 6H).
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.29 (s, 1H), 7.87 (s, 1H), 7.72 - 7.63 (m, 3H), 7.57 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 7.47 (t, J = 8.7 Hz, 1H), 7.31 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 3.95 - 3.90 (m, 2H), 3.61 - 3.55 (m, 4H), 3.54 - 3.45 (m, 6H).
【0114】
実施例8
3-(2,6-ジフルオロフェニル)-1-((4-(2-メチル-1-モルホリノ-1-オキソプロパン-2-イル)フェニル)アミノ)イミダゾ[1,5-a]ピラジン-8(7H)-オン(化合物17)
3-(2,6-ジフルオロフェニル)-1-((4-(2-メチル-1-モルホリノ-1-オキソプロパン-2-イル)フェニル)アミノ)イミダゾ[1,5-a]ピラジン-8(7H)-オン(化合物17)
【化15】
【0115】
第1工程
2-(4-((3-(2,6-ジフルオロフェニル)-8-オキソ-7,8-ジヒドロイミダゾ[1,5-a]ピラジン-1-イル)アミノ)フェニル)-2-メチルプロパン酸(17a)
13b(420 mg、0.848 mmol)のトリフルオロ酢酸(10mL)の溶液を70℃に加熱し、1時間撹拌した。室温まで冷却後、反応液を減圧で濃縮乾固して目的物17a(360 mg)を得た。この生成物をさらに精製せずにそのまま次の工程で使用した。
2-(4-((3-(2,6-ジフルオロフェニル)-8-オキソ-7,8-ジヒドロイミダゾ[1,5-a]ピラジン-1-イル)アミノ)フェニル)-2-メチルプロパン酸(17a)
13b(420 mg、0.848 mmol)のトリフルオロ酢酸(10mL)の溶液を70℃に加熱し、1時間撹拌した。室温まで冷却後、反応液を減圧で濃縮乾固して目的物17a(360 mg)を得た。この生成物をさらに精製せずにそのまま次の工程で使用した。
【0116】
MS m/z (ESI): 425 [M+1]
【0117】
第2工程
3-(2,6-ジフルオロフェニル)-1-((4-(2-メチル-1-モルホリノ-1-オキソプロパン-2-イル)フェニル)アミノ)イミダゾ[1,5-a]ピラジン-8(7H)-オン塩酸塩(17)
17a(360 mg、0.85 mmol)、DMF(5 mL)、HATU(420 mg、1.1 mmol)、モルホリン(220 mg、2.55 mmol)およびDIPEA(442 mg、3.2 mmol)を混合した。室温で1時間撹拌した後、反応混合物を逆相分取高速液体クロマトグラフィーで直接精製して、目的物17(固体、320 mg、76%、塩酸塩)を得た。
3-(2,6-ジフルオロフェニル)-1-((4-(2-メチル-1-モルホリノ-1-オキソプロパン-2-イル)フェニル)アミノ)イミダゾ[1,5-a]ピラジン-8(7H)-オン塩酸塩(17)
17a(360 mg、0.85 mmol)、DMF(5 mL)、HATU(420 mg、1.1 mmol)、モルホリン(220 mg、2.55 mmol)およびDIPEA(442 mg、3.2 mmol)を混合した。室温で1時間撹拌した後、反応混合物を逆相分取高速液体クロマトグラフィーで直接精製して、目的物17(固体、320 mg、76%、塩酸塩)を得た。
【0118】
MS m/z (ESI): 494 [M+1]
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10.47 (d, J = 5.3 Hz, 1H), 8.12 (s, 1H), 7.78 - 7.67 (m, 1H), 7.64 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 7.42 - 7.31 (m, 2H), 7.08 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 6.81 (d, J = 5.5 Hz, 1H), 6.62 - 6.49 (m, 1H), 3.69 - 3.41 (m, 8H), 1.40 (s, 6H).
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10.47 (d, J = 5.3 Hz, 1H), 8.12 (s, 1H), 7.78 - 7.67 (m, 1H), 7.64 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 7.42 - 7.31 (m, 2H), 7.08 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 6.81 (d, J = 5.5 Hz, 1H), 6.62 - 6.49 (m, 1H), 3.69 - 3.41 (m, 8H), 1.40 (s, 6H).
【0119】
実施例9
3-(1-アセチルピペリジン-4-イル)-1-((4-(モルホリン-4-カルボニル)フェニル)アミノ)イミダゾ[1,5-a]ピラジン-8(7H)-オン(化合物19)
3-(1-アセチルピペリジン-4-イル)-1-((4-(モルホリン-4-カルボニル)フェニル)アミノ)イミダゾ[1,5-a]ピラジン-8(7H)-オン(化合物19)
【化16】
【0120】
第1工程
ベンジル4-(8-メトキシ-1-((4-(モルホリン-4-カルボニル)フェニル)アミノ)イミダゾ[1,5-a]ピラジン-3-イル)ピペリジン-1-カルボキシラート(19b)
19a(206 mg、1 mmol)、1,4-ジオキサン(8 mL)及び炭酸セシウム(813 mg、2.5 mmol)の混合物に、XantPhos(116 mg、0.2 mmol)及びPd2(dba)3(92 mg、0.1 mmol)を添加した。混合物をマイクロ波反応器内で90℃に加熱して1時間撹拌した。室温まで冷却後、ろ過し、ろ液を濃縮乾固させ、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ジクロロメタン/メタノール= 100/0～19/1)で精製して、目的物19b(490 mg、86%)を得た。
ベンジル4-(8-メトキシ-1-((4-(モルホリン-4-カルボニル)フェニル)アミノ)イミダゾ[1,5-a]ピラジン-3-イル)ピペリジン-1-カルボキシラート(19b)
19a(206 mg、1 mmol)、1,4-ジオキサン(8 mL)及び炭酸セシウム(813 mg、2.5 mmol)の混合物に、XantPhos(116 mg、0.2 mmol)及びPd2(dba)3(92 mg、0.1 mmol)を添加した。混合物をマイクロ波反応器内で90℃に加熱して1時間撹拌した。室温まで冷却後、ろ過し、ろ液を濃縮乾固させ、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ジクロロメタン/メタノール= 100/0～19/1)で精製して、目的物19b(490 mg、86%)を得た。
【0121】
MS M/z(ESI)：571 [M +1]
【0122】
第2工程
(4-((8-メトキシ-3-(ピペリジン-4-イル)イミダゾ[1,5-a]ピラジン-1-イル)アミノ)フェニル)(モルホリノ)メタノン(19c)
19b(230 mg、0.403 mmol)のメタノール(10mL)の溶液に、10%パラジウム炭素(115 mg)を添加した。混合物を水素雰囲気下で30分間撹拌し、次いでろ過した。ろ液を濃縮乾固して、目的物19c(190 mg)を得た。生成物は、精製せずに、そのまま次の反応に使用した。
(4-((8-メトキシ-3-(ピペリジン-4-イル)イミダゾ[1,5-a]ピラジン-1-イル)アミノ)フェニル)(モルホリノ)メタノン(19c)
19b(230 mg、0.403 mmol)のメタノール(10mL)の溶液に、10%パラジウム炭素(115 mg)を添加した。混合物を水素雰囲気下で30分間撹拌し、次いでろ過した。ろ液を濃縮乾固して、目的物19c(190 mg)を得た。生成物は、精製せずに、そのまま次の反応に使用した。
【0123】
MS m/z (ESI): 437 [M+1]
【0124】
第3工程
1-(4-(8-メトキシ-1-((4-(モルホリン-4-カルボニル)フェニル)アミノ)イミダゾ[1,5-a]ピラジン-3-イル)ピペリジン-1-イル)エタン-1-オン(19d)
19c(122 mg、0.279 mmol)のジクロロメタン(5 mL)の溶液に、トリエチルアミン(85 mg、0837 mmol)を添加した。0℃に冷却後、塩化アセチル(22 mg、0.279 mmol)を滴下した。室温で30分間撹拌した後、濃縮乾固させ、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ジクロロメタン/メタノール= 100/0～19/1)で精製して、目的物19d(81 mg、61%)を得た。
1-(4-(8-メトキシ-1-((4-(モルホリン-4-カルボニル)フェニル)アミノ)イミダゾ[1,5-a]ピラジン-3-イル)ピペリジン-1-イル)エタン-1-オン(19d)
19c(122 mg、0.279 mmol)のジクロロメタン(5 mL)の溶液に、トリエチルアミン(85 mg、0837 mmol)を添加した。0℃に冷却後、塩化アセチル(22 mg、0.279 mmol)を滴下した。室温で30分間撹拌した後、濃縮乾固させ、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ジクロロメタン/メタノール= 100/0～19/1)で精製して、目的物19d(81 mg、61%)を得た。
【0125】
MS m/z (ESI): 479 [M+1]
【0126】
第4工程
3-(1-アセチルピペリジン-4-イル)-1-((4-(モルホリン-4-カルボニル)フェニル)アミノ)イミダゾ[1,5-a]ピラジン-8(7H)-オン(19)
19d(81 mg、0.17 mmol)のアセトニトリル(2 mL)の溶液に、HClのエタノール溶液(33%、1 mL)を添加し、次いで50℃に加熱し、30分間撹拌した。室温まで冷却した後、反応混合物を濃縮乾固して、黄色固体(85 mg)を得た。45 mgを取り出し、逆相分取高速液体クロマトグラフィーで精製し、目的物19(固体、31.1 mg、69%)を得た。
3-(1-アセチルピペリジン-4-イル)-1-((4-(モルホリン-4-カルボニル)フェニル)アミノ)イミダゾ[1,5-a]ピラジン-8(7H)-オン(19)
19d(81 mg、0.17 mmol)のアセトニトリル(2 mL)の溶液に、HClのエタノール溶液(33%、1 mL)を添加し、次いで50℃に加熱し、30分間撹拌した。室温まで冷却した後、反応混合物を濃縮乾固して、黄色固体(85 mg)を得た。45 mgを取り出し、逆相分取高速液体クロマトグラフィーで精製し、目的物19(固体、31.1 mg、69%)を得た。
【0127】
MS m/z (ESI): 465 [M+1]
1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 7.50 - 7.42 (m, 3H), 7.34 - 7.28 (m, 2H), 6.88 (d, J = 6.1 Hz, 1H), 4.72 (d, J = 13.5 Hz, 1H), 4.14 (d, J = 13.8 Hz, 1H), 3.85 - 3.57 (m, 9H), 3.38 (dd, J = 19.4, 7.5 Hz, 1H), 2.88 (t, J = 11.9 Hz, 1H), 2.19 (s, 3H), 2.17 - 2.06 (m, 2H), 1.97 - 1.75 (m, 2H).
1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 7.50 - 7.42 (m, 3H), 7.34 - 7.28 (m, 2H), 6.88 (d, J = 6.1 Hz, 1H), 4.72 (d, J = 13.5 Hz, 1H), 4.14 (d, J = 13.8 Hz, 1H), 3.85 - 3.57 (m, 9H), 3.38 (dd, J = 19.4, 7.5 Hz, 1H), 2.88 (t, J = 11.9 Hz, 1H), 2.19 (s, 3H), 2.17 - 2.06 (m, 2H), 1.97 - 1.75 (m, 2H).
【0128】
実施例10
1-((4-(モルホリン-4-カルボニル)フェニル)アミノ)-3-(ピペリジン-4-イル)イミダゾ[1,5-a]ピラジン-8(7H)-オン(化合物20)
19c(40 mg、0.092 mmol)のアセトニトリル(2 mL)の溶液に、HCl溶液(30%エタノール溶液、1 mL)を添加し、50℃に加熱し、30分間撹拌した。室温まで冷却した後、濃縮乾固させ、残渣を逆相分取高速液体クロマトグラフィーにより精製し、目的物20(固体、10.3 mg、25%)を得た。
1-((4-(モルホリン-4-カルボニル)フェニル)アミノ)-3-(ピペリジン-4-イル)イミダゾ[1,5-a]ピラジン-8(7H)-オン(化合物20)
【化17】
【0129】
MS m/z (ESI): 423 [M+1]
1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 7.66 - 7.61 (m, 2H), 7.44 - 7.39 (m, 2H), 7.28 (d, J = 6.1 Hz, 1H), 6.63 (d, J = 6.0 Hz, 1H), 3.72 (s, 8H), 3.62 (t, J = 3.5 Hz, 1H), 3.58 (t, J = 3.5 Hz, 1H), 3.56 - 3.49 (m, 1H), 3.30 - 3.20 (m, 2H), 2.29 -2.17 (m, 4H).
1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 7.66 - 7.61 (m, 2H), 7.44 - 7.39 (m, 2H), 7.28 (d, J = 6.1 Hz, 1H), 6.63 (d, J = 6.0 Hz, 1H), 3.72 (s, 8H), 3.62 (t, J = 3.5 Hz, 1H), 3.58 (t, J = 3.5 Hz, 1H), 3.56 - 3.49 (m, 1H), 3.30 - 3.20 (m, 2H), 2.29 -2.17 (m, 4H).
【0130】
実施例11
3-(1-シクロプロピルピペリジン-4-イル)-1-((4-(モルホリン-4-カルボニル)フェニル)アミノ)イミダゾ[1,5-a]ピラジン-8(7H)-オン(化合物21)
3-(1-シクロプロピルピペリジン-4-イル)-1-((4-(モルホリン-4-カルボニル)フェニル)アミノ)イミダゾ[1,5-a]ピラジン-8(7H)-オン(化合物21)
【化18】
【0131】
第1工程
(4-((3-(1-シクロプロピルピペリジン-4-イル)-8-メトキシイミダゾ[1,5-a]ピラジン-1-イル)アミノ)フェニル)(モルホリノ)メタノン(21a)
19c(150 mg、0.344 mmol)、メタノール(2 mL)およびテトラヒドロフラン(2 mL)の混合物に、(1-エトキシシクロプロポキシ)トリメチルシラン(120 mg、0.687 mmol) を添加し、続いて酢酸(103 mg、1.72 mmol)およびシアノ水素化ホウ素ナトリウム(32 mg、0.86 mmol)を添加した。混合物を60℃に加熱し、20時間撹拌した。室温まで冷却後、飽和炭酸水素ナトリウム溶液(20 mL)を添加し、次いで、酢酸エチル(3×20 mL)で抽出した。合わせた有機相を飽和食塩水(20 mL)で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。ろ過した後、ろ液を濃縮乾固し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ジクロロメタン/メタノール= 100/0～19/1)で精製し、目的物21a(46 mg、28%)を得た。
(4-((3-(1-シクロプロピルピペリジン-4-イル)-8-メトキシイミダゾ[1,5-a]ピラジン-1-イル)アミノ)フェニル)(モルホリノ)メタノン(21a)
19c(150 mg、0.344 mmol)、メタノール(2 mL)およびテトラヒドロフラン(2 mL)の混合物に、(1-エトキシシクロプロポキシ)トリメチルシラン(120 mg、0.687 mmol) を添加し、続いて酢酸(103 mg、1.72 mmol)およびシアノ水素化ホウ素ナトリウム(32 mg、0.86 mmol)を添加した。混合物を60℃に加熱し、20時間撹拌した。室温まで冷却後、飽和炭酸水素ナトリウム溶液(20 mL)を添加し、次いで、酢酸エチル(3×20 mL)で抽出した。合わせた有機相を飽和食塩水(20 mL)で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。ろ過した後、ろ液を濃縮乾固し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ジクロロメタン/メタノール= 100/0～19/1)で精製し、目的物21a(46 mg、28%)を得た。
【0132】
MS m/z (ESI): 477 [M+1]
【0133】
第2工程
3-(1-シクロプロピルピペリジン-4-イル)-1-((4-(モルホリン-4-カルボニル)フェニル)アミノ)イミダゾ[1,5-a]ピラジン-8(7H)-オン(21)
21a(46 mg、0.0965 mmol)のアセトニトリル(2 mL)の溶液に、HCl溶液(30%エタノール溶液、1 mL)を添加し、次いで、50℃に加熱し、30分間撹拌した。室温まで冷却した後、濃縮乾固して、逆相分取高速液体クロマトグラフィーにより残渣を精製し、目的物21(固体、16.9 mg、38%)を得た。
3-(1-シクロプロピルピペリジン-4-イル)-1-((4-(モルホリン-4-カルボニル)フェニル)アミノ)イミダゾ[1,5-a]ピラジン-8(7H)-オン(21)
21a(46 mg、0.0965 mmol)のアセトニトリル(2 mL)の溶液に、HCl溶液(30%エタノール溶液、1 mL)を添加し、次いで、50℃に加熱し、30分間撹拌した。室温まで冷却した後、濃縮乾固して、逆相分取高速液体クロマトグラフィーにより残渣を精製し、目的物21(固体、16.9 mg、38%)を得た。
【0134】
MS m/z (ESI): 463 [M+1]
1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 7.77 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 7.38 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 7.15 (d, J = 6.0 Hz, 1H), 6.46 (d, J = 6.0 Hz, 1H), 3.71 (s, 4H), 3.68 (s, 4H), 3.28 (d, J = 11.9 Hz, 2H), 3.15-3.06 (m, 1H), 2.57 (t, J = 10.5 Hz, 2H), 2.13 - 1.94(m, 4H), 1.90 (s, 1H), 0.66 - 0.49 (m, 4H).
1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 7.77 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 7.38 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 7.15 (d, J = 6.0 Hz, 1H), 6.46 (d, J = 6.0 Hz, 1H), 3.71 (s, 4H), 3.68 (s, 4H), 3.28 (d, J = 11.9 Hz, 2H), 3.15-3.06 (m, 1H), 2.57 (t, J = 10.5 Hz, 2H), 2.13 - 1.94(m, 4H), 1.90 (s, 1H), 0.66 - 0.49 (m, 4H).
【0135】
実施例12
3-(2,6-ジフルオロフェニル)-1-((1-(2-モルホリノ-2-オキソエチル)-1H-ピラゾール-4-イル)アミノ)-6,7-ジヒドロイミダゾ[1,5-a]ピラジン-8(5H)-オン(化合物24)
3-(2,6-ジフルオロフェニル)-1-((1-(2-モルホリノ-2-オキソエチル)-1H-ピラゾール-4-イル)アミノ)-6,7-ジヒドロイミダゾ[1,5-a]ピラジン-8(5H)-オン(化合物24)
【化19】
【0136】
第1工程
tert-ブチル2-(4-ニトロ-1H-ピラゾール-1-イル)アセタート(24b)
4-ニトロ-1H-ピラゾール24a(2 g、17.7 mmol)、炭酸カリウム(4.8 g、35 mmol)およびDMF(10mmol)の混合物に、tert-ブチル2-ブロモアセタート(4 g、17.7 mmol)を室温で添加した。得られた混合物を室温で12時間撹拌した後、水(200 mL)で希釈し、次いで、酢酸エチル(2×150 mL)で抽出した。合わせた有機相を飽和食塩水(2×150 mL)で洗浄し、次いで無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。ろ過した後、ろ液を減圧で濃縮乾固する。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ジクロロメタン/メタノール= 100/0～99/1)で精製して、目的物24b(5 g、110%)を得た。
tert-ブチル2-(4-ニトロ-1H-ピラゾール-1-イル)アセタート(24b)
4-ニトロ-1H-ピラゾール24a(2 g、17.7 mmol)、炭酸カリウム(4.8 g、35 mmol)およびDMF(10mmol)の混合物に、tert-ブチル2-ブロモアセタート(4 g、17.7 mmol)を室温で添加した。得られた混合物を室温で12時間撹拌した後、水(200 mL)で希釈し、次いで、酢酸エチル(2×150 mL)で抽出した。合わせた有機相を飽和食塩水(2×150 mL)で洗浄し、次いで無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。ろ過した後、ろ液を減圧で濃縮乾固する。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ジクロロメタン/メタノール= 100/0～99/1)で精製して、目的物24b(5 g、110%)を得た。
【0137】
MS m/z (ESI): 228 [M+1]
【0138】
第2工程
tert-ブチル2-(4-アミノ-1H-ピラゾール-1-イル)アセタート(24c)
24b(5 g、20 mmol)のエタノール(20 mL)の溶液に、10%パラジウム炭素(700 mg)を添加し、水素雰囲気下で12時間撹拌し、次いで、ろ過した。ろ液を減圧で濃縮乾固させ、目的物24c(3.45 g、77%) を得た。
tert-ブチル2-(4-アミノ-1H-ピラゾール-1-イル)アセタート(24c)
24b(5 g、20 mmol)のエタノール(20 mL)の溶液に、10%パラジウム炭素(700 mg)を添加し、水素雰囲気下で12時間撹拌し、次いで、ろ過した。ろ液を減圧で濃縮乾固させ、目的物24c(3.45 g、77%) を得た。
【0139】
MS m/z (ESI): 198 [M+1]
【0140】
第3工程
tert-ブチル2-(4-((3-(2,6-ジフルオロフェニル)-8-メトキシイミダゾ[1,5-a]ピラジン-1-イル)アミノ)-1H-ピラゾール-1-イル)アセタート(24d)
1f(600 mg、1.77 mmol)、1,4-ジオキサン(15 mL)、24c(720 mg、3.53 mmol)、Brettphos(192 mg、0.353 mmol)、Pd2(dba)3(180 mg、0.177 mmol)及び炭酸セシウム(1.7 g、5.32 mmol)の混合物を窒素雰囲気下でマイクロ波反応器を用いて90℃に加熱し、1時間撹拌した。室温まで冷却後、溶媒を減圧留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(石油エーテル/酢酸エチル= 100/0～1/4)で精製し、目的物24d(450 mg、47%)を得た。
tert-ブチル2-(4-((3-(2,6-ジフルオロフェニル)-8-メトキシイミダゾ[1,5-a]ピラジン-1-イル)アミノ)-1H-ピラゾール-1-イル)アセタート(24d)
1f(600 mg、1.77 mmol)、1,4-ジオキサン(15 mL)、24c(720 mg、3.53 mmol)、Brettphos(192 mg、0.353 mmol)、Pd2(dba)3(180 mg、0.177 mmol)及び炭酸セシウム(1.7 g、5.32 mmol)の混合物を窒素雰囲気下でマイクロ波反応器を用いて90℃に加熱し、1時間撹拌した。室温まで冷却後、溶媒を減圧留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(石油エーテル/酢酸エチル= 100/0～1/4)で精製し、目的物24d(450 mg、47%)を得た。
【0141】
MS m/z (ESI): 457 [M+1]
【0142】
第4工程
2-(4-((3-(2,6-ジフルオロフェニル)-8-オキソ-7,8-ジヒドロイミダゾ[1,5-a]ピラジン-1-イル)アミノ)-1H-ピラゾール-1-イル)酢酸(24e)
24d(450 mg、0.98 mmol)のトリフルオロ酢酸(10mL)の溶液を80℃に加熱し、12時間撹拌した。室温まで冷却後、反応液を減圧で濃縮乾固して目的物24e(815 mg)を得た。生成物は、さらに精製せずに、次の反応に直接使用した。
2-(4-((3-(2,6-ジフルオロフェニル)-8-オキソ-7,8-ジヒドロイミダゾ[1,5-a]ピラジン-1-イル)アミノ)-1H-ピラゾール-1-イル)酢酸(24e)
24d(450 mg、0.98 mmol)のトリフルオロ酢酸(10mL)の溶液を80℃に加熱し、12時間撹拌した。室温まで冷却後、反応液を減圧で濃縮乾固して目的物24e(815 mg)を得た。生成物は、さらに精製せずに、次の反応に直接使用した。
【0143】
MS m/z (ESI): 387 [M+1]
【0144】
第5工程
2-(4-((3-(2,6-ジフルオロフェニル)-8-オキソ-5,6,7,8-テトラヒドロイミダゾ[1,5-a]ピラジン-1-イル)アミノ)-1H-ピラゾール-1-イル)酢酸(24f)
24e(800 mg、2.07 mmol)のエタノール(30 mL)の溶液に、10%パラジウム炭素(300 mg)を添加し、次いで、水素雰囲気下で12時間撹拌した。ろ過した後、ろ液を減圧で濃縮乾固して、目的物24f(280 mg、35%)を得た。
2-(4-((3-(2,6-ジフルオロフェニル)-8-オキソ-5,6,7,8-テトラヒドロイミダゾ[1,5-a]ピラジン-1-イル)アミノ)-1H-ピラゾール-1-イル)酢酸(24f)
24e(800 mg、2.07 mmol)のエタノール(30 mL)の溶液に、10%パラジウム炭素(300 mg)を添加し、次いで、水素雰囲気下で12時間撹拌した。ろ過した後、ろ液を減圧で濃縮乾固して、目的物24f(280 mg、35%)を得た。
【0145】
MS m/z (ESI): 389 [M+1]
【0146】
第6工程
3-(2,6-ジフルオロフェニル)-1-((1-(2-モルホリノ-2-オキソエチル)-1H-ピラゾール-4-イル)アミノ)-6,7-ジヒドロイミダゾ[1,5-a]ピラジン-8(5H)-オン(24)
24f(10mg、0.0257 mmol)、HATU(13 mg、0.0335 mmol)、モルホリン(0.025 mL)およびDMF(0.5 mL)に、DI P EA(10mg、0.0771 mmol)を添加した。室温で1時間撹拌した後、反応溶液を逆相分取高速液体クロマトグラフィーで直接精製して、目的物24(固体、2.12 mg、18%)を得た。
3-(2,6-ジフルオロフェニル)-1-((1-(2-モルホリノ-2-オキソエチル)-1H-ピラゾール-4-イル)アミノ)-6,7-ジヒドロイミダゾ[1,5-a]ピラジン-8(5H)-オン(24)
24f(10mg、0.0257 mmol)、HATU(13 mg、0.0335 mmol)、モルホリン(0.025 mL)およびDMF(0.5 mL)に、DI P EA(10mg、0.0771 mmol)を添加した。室温で1時間撹拌した後、反応溶液を逆相分取高速液体クロマトグラフィーで直接精製して、目的物24(固体、2.12 mg、18%)を得た。
【0147】
MS m/z (ESI): 458 [M+1]
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.84 - 7.81 (m, 1H), 7.80 (s, 1H), 7.72 - 7.62 (m, 2H), 7.55 (s, 1H), 7.36 - 7.29 (m, 2H), 5.03 (s, 2H), 3.97 - 3.90 (m, 2H), 3.60 - 3.52 (m, 2H), 3.50 - 3.39 (m, 8H).
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.84 - 7.81 (m, 1H), 7.80 (s, 1H), 7.72 - 7.62 (m, 2H), 7.55 (s, 1H), 7.36 - 7.29 (m, 2H), 5.03 (s, 2H), 3.97 - 3.90 (m, 2H), 3.60 - 3.52 (m, 2H), 3.50 - 3.39 (m, 8H).
【0148】
化合物25について、実施例12の実験手順に準じて操作したが、第6工程では、モルホリンの代わりにN-メチルピペラジンを使用した。
【表9】
【0149】
化合物25の核磁気データは以下の通りであった：
【表10】
【0150】
実施例13
4-((3-(2,6-ジフルオロフェニル)-8-オキソ-7,8-ジヒドロイミダゾ[1,5-a]ピラジン-1-イル)アミノ)安息香酸(化合物39)
39a(150 mg、0.37 mmol)のメタノール、テトラヒドロフラン及び水(3/3/1v/v/v、7 mL)の混合溶液に、水酸化リチウム一水和物(155 mg、3.7 mmol)を添加した後、50℃に加熱し、12時間撹拌した。室温まで冷却した後、減圧下で有機溶媒を濃縮除去した。残渣を1N塩酸でpH = 1に調整し、室温で5時間撹拌し、次いで濃縮乾固した。残渣を逆相分取高速液体クロマトグラフィーにより精製して、目的物39(固体、25 mg、18%)を得た。
4-((3-(2,6-ジフルオロフェニル)-8-オキソ-7,8-ジヒドロイミダゾ[1,5-a]ピラジン-1-イル)アミノ)安息香酸(化合物39)
【化20】
【0151】
MS m/z (ESI): 383 [M+1]
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12.36 (s, 1H), 10.61 (d, J = 5.5 Hz, 1H), 8.62 (s, 1H), 7.81 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 7.70 (d, J = 8.9 Hz, 3H), 7.39 (d, J = 8.2 Hz, 2H),6.87 (d, J = 5.6 Hz, 1H), 6.60 (s, 1H).
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12.36 (s, 1H), 10.61 (d, J = 5.5 Hz, 1H), 8.62 (s, 1H), 7.81 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 7.70 (d, J = 8.9 Hz, 3H), 7.39 (d, J = 8.2 Hz, 2H),6.87 (d, J = 5.6 Hz, 1H), 6.60 (s, 1H).
【0152】
化合物40について、実施例13の実験手順を参照して操作したが、39aの代わりに40aを使用した。
【表11】
【0153】
化合物40についての核磁気データは、以下の通りであった：
【表12】
【0154】
生物学的実験
実施例14
JAK2の活性阻害実験
JAK2の酵素活性に対する本発明の化合物の影響を、in vitroでキナーゼアッセイ実験により評価した。
実施例14
JAK2の活性阻害実験
JAK2の酵素活性に対する本発明の化合物の影響を、in vitroでキナーゼアッセイ実験により評価した。
【0155】
実験方法の概要は以下の通りであった:
JAK2の酵素活性を、均一系時間分解蛍光(HTRF)キナーゼアッセイ検出キット(Cisbio、62TK0PEC)を用い、キナーゼ反応における基質のリン酸化のレベルを検出することにより、測定した。反応バッファーは以下の成分を含んでいた: キットに付きの酵素反応バッファー(1×)、5mMのMgCl2、1mMのDTT及び0.01%の0.01% Brij35。ヒト組換えJAK2タンパク質(Carna Biosciences、08-045)が反応バッファーで0.15ng/μLに希釈されたキナーゼ溶液となった。基質反応溶液は、反応バッファーで0.25μMに希釈したビオチン標識チロシンキナーゼ基質と2.5μM ATPを含み、検出バッファーは、反応バッファーで0.1 ng/Lに希釈したEu3+標識ケージ抗体(Cisbio、61T66KLB)及び12.5nMのストレプトアビジン標識XL665(Cisbio、610SAXLB)を含み、受験化合物をDMSOに溶解して10μMとし、さらに、DMSOで続けて4倍段階の希釈を行い最小濃度を0.061 nMとした。各濃度の試料を反応バッファーで更に40倍希釈した。
JAK2の酵素活性を、均一系時間分解蛍光(HTRF)キナーゼアッセイ検出キット(Cisbio、62TK0PEC)を用い、キナーゼ反応における基質のリン酸化のレベルを検出することにより、測定した。反応バッファーは以下の成分を含んでいた: キットに付きの酵素反応バッファー(1×)、5mMのMgCl2、1mMのDTT及び0.01%の0.01% Brij35。ヒト組換えJAK2タンパク質(Carna Biosciences、08-045)が反応バッファーで0.15ng/μLに希釈されたキナーゼ溶液となった。基質反応溶液は、反応バッファーで0.25μMに希釈したビオチン標識チロシンキナーゼ基質と2.5μM ATPを含み、検出バッファーは、反応バッファーで0.1 ng/Lに希釈したEu3+標識ケージ抗体(Cisbio、61T66KLB)及び12.5nMのストレプトアビジン標識XL665(Cisbio、610SAXLB)を含み、受験化合物をDMSOに溶解して10μMとし、さらに、DMSOで続けて4倍段階の希釈を行い最小濃度を0.061 nMとした。各濃度の試料を反応バッファーで更に40倍希釈した。
【0156】
384ウェルのアッセイプレート(Corning、3674)に、4μLの化合物溶液と2μLのキナーゼ溶液を加えた。均一に混合した後、室温で15分間インキュベートし、次いで4μLの基質反応溶液を加えた。さらに、室温で30分間インキュベートした後、反応混合物に検出バッファー10μLを加え、均一に混合した後、室温で30分間放置した。Envisionプレートリーダー(Perkin Elmer)を使用して、反応の進行を620nm及び665nmの波長で測定した。シグナル値(吸光度 665
nm /吸光度 620
nm)は、基質のリン酸化の程度と正に相関するので、JAK2キナーゼの活性を検出した。この実験では、JAK2キナーゼタンパク質を加えない群が100%阻害群であり、JAK2キナーゼタンパク質を加え、受験化合物を加えない群が0%阻害群であった。受験化合物の阻害曲線をXLfitソフトウェアでプロットし、阻害率IC50を算出し、その結果を表1に示した。
【0157】
実施例15
TYK2の活性阻害実験
TYK2活性に対する本発明の化合物の影響を、in vitroでキナーゼアッセイ実験により評価した。
TYK2の活性阻害実験
TYK2活性に対する本発明の化合物の影響を、in vitroでキナーゼアッセイ実験により評価した。
【0158】
実験方法の概要は以下の通りであった：
TYK2の酵素活性を、均一系時間分解蛍光(HTRF)キナーゼアッセイ検出キット(Cisbio、62TK0PEC)を用い、キナーゼ反応における基質のリン酸化のレベルを検出することにより、測定した。反応バッファーは以下の成分を含んでいた: キットに付きの酵素反応バッファー(1×)、5mMのMgCl2、1mMのDTT及び0.01%の0.01% Brij35。ヒト組換えTYK2タンパク質(Carna Biosciences、08-147)が反応バッファーで0.25 ng/μLに希釈されたキナーゼ溶液となった。基質反応溶液は、反応バッファーで0.5 μMに希釈したビオチン標識チロシンキナーゼ基質と11.25μM ATPを含み、検出バッファーは、反応バッファーで0.1 ng/Lに希釈したEu3+標識ケージ抗体(Cisbio、61T66KLB)及び25 nMのストレプトアビジン標識XL665(Cisbio、610SAXLB)を含み、受験化合物をDMSOに溶解して10 μMとし、さらに、DMSOで続けて4倍段階の希釈を行い最小濃度を0.061 nMとした。各濃度の試料を反応バッファーで更に40倍希釈した。
TYK2の酵素活性を、均一系時間分解蛍光(HTRF)キナーゼアッセイ検出キット(Cisbio、62TK0PEC)を用い、キナーゼ反応における基質のリン酸化のレベルを検出することにより、測定した。反応バッファーは以下の成分を含んでいた: キットに付きの酵素反応バッファー(1×)、5mMのMgCl2、1mMのDTT及び0.01%の0.01% Brij35。ヒト組換えTYK2タンパク質(Carna Biosciences、08-147)が反応バッファーで0.25 ng/μLに希釈されたキナーゼ溶液となった。基質反応溶液は、反応バッファーで0.5 μMに希釈したビオチン標識チロシンキナーゼ基質と11.25μM ATPを含み、検出バッファーは、反応バッファーで0.1 ng/Lに希釈したEu3+標識ケージ抗体(Cisbio、61T66KLB)及び25 nMのストレプトアビジン標識XL665(Cisbio、610SAXLB)を含み、受験化合物をDMSOに溶解して10 μMとし、さらに、DMSOで続けて4倍段階の希釈を行い最小濃度を0.061 nMとした。各濃度の試料を反応バッファーで更に40倍希釈した。
【0159】
384ウェルのアッセイプレート(Corning、3674)に、4μLの化合物溶液と2μLのキナーゼ溶液を加えた。均一に混合した後、室温で15分間インキュベートし、次いで4μLの基質反応溶液を加えた。さらに、室温で40分間インキュベートした後、反応混合物に検出バッファー10μLを加え、均一に混合した後、室温で30分間放置した。Envisionプレートリーダー(Perkin Elmer)を使用して、反応の進行を620nm及び665nmの波長で測定した。シグナル値(吸光度 665
nm /吸光度 620
nm)は、基質のリン酸化の程度と正に相関するので、TYK2キナーゼの活性を検出した。この実験では、TYK2キナーゼタンパク質を加えない群が100%阻害群であり、TYK2キナーゼタンパク質を加え、受験化合物を加えない群が0%阻害群であった。受験化合物の阻害曲線をXLfitソフトウェアでプロットし、阻害率IC50を算出し、その結果を表1に示した。
【0160】
【表13】
【0161】
本発明の化合物は、JAK2キナーゼとTYK2キナーゼドにに対して阻害活性を示した。好ましくはIC50は100 nM未満であり、より好ましくはIC50は10nM未満であった。
【0162】
実施例16
NK92細胞におけるIL-12で誘導したIFN-γ分泌量阻害の測定
IL-12で誘導したNK92細胞におけるIFN-γ分泌に対する本発明の化合物の影響を、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)で評価した。
NK92細胞におけるIL-12で誘導したIFN-γ分泌量阻害の測定
IL-12で誘導したNK92細胞におけるIFN-γ分泌に対する本発明の化合物の影響を、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)で評価した。
【0163】
この実験原理は以下の通りであった。IL-12は、活性化T細胞、NK細胞(NK92はNK細胞株である)、DC細胞及びB細胞で発現していた。IL-12に結合すると、NK細胞及びTリンパ球のJAK2/TYK2シグナル伝達経路が活性化され、IFN-γ分泌が誘導された。
【0164】
実験方法の概要は以下の通りであった：
化合物をDMSOで溶解し2.5 mMに希釈し、次いでDMSOで0.31μMの最小濃度まで4倍段階の希釈をし、各濃度の溶液をFBS非含有MEMα培地(Thermofisher、12561-056)でさらに50倍希釈した。
化合物をDMSOで溶解し2.5 mMに希釈し、次いでDMSOで0.31μMの最小濃度まで4倍段階の希釈をし、各濃度の溶液をFBS非含有MEMα培地(Thermofisher、12561-056)でさらに50倍希釈した。
【0165】
NK92細胞(Nanjing Cobioer, CBP60980)を、12.5%のFBS(Ausbian, VS500T)、12.5%のウマ血清(Gibco, 16050-122)、0.02mMの葉酸(Sigma, F8758)、0.2mMのイノシトール(Sigma, 17850)、0.55mMのβ-メルカプトエタノール(Thermofish、21985-023)、200U/mLのIL-2(R&D Systems, 202-1L)及び100U/mLのペニシリン(Thermofisher、15140122)を含む完全MEMα培地でインキュベートした。培養容器の表面の80～90%が覆われると、細胞を分散させ、96ウェルプレート(ThermoFisher, 167425)に1ウェルあたり100,000個の細胞(IL-2を含まない完全MEMα培地、80μL)を播種した。次いで、96ウェルプレートを37℃/5%CO2で一晩インキュベートした。
【0166】
一晩のインキュベーション後、希釈した受験化合物10μLと50ng/mLのIL-12(R&D Systems、219-1L)10μLを各ウェルに加え、穏やかに混合し、96ウェルプレートを、さらに、37℃/5%CO2のインキュベーターで、インキュベートし続けた。24時間の後、取り出して、室温、800rpmでプレートを10分間遠心分離し、上清50μLを、抗IFN-γ抗体をコーティングした96ウェルプレート(Sigma, CLS3695)に移した。Human IFN-γDuoSet ELISAキット(R&D Systems、DY285B)の指導に従い、IFN-γの分泌量を検出した。実験では、IL-12及び受験化合物を加えなく、MEMα培地で加えた群を非刺激対照群(100%阻害)とし、IL-12及び0.2% DMSOを加えた群を刺激群(0%阻害)とした。受験化合物の阻害曲線をXLfitソフトウェアでプロットし、阻害率IC50を算出し、その結果を表2に示した。
【0167】
【表14】
【0168】
実施例17
マウス薬物動態実験
受験化合物を20%HP-β-CDのビヒクル中、投与試料(懸濁液又は溶液) 5 mg/mLに製剤化した。
マウス薬物動態実験
受験化合物を20%HP-β-CDのビヒクル中、投与試料(懸濁液又は溶液) 5 mg/mLに製剤化した。
【0169】
投与試料5mL/kgを25mg/kgの用量で3匹の雌性C57マウスにそれぞれ経口投与(PO)し、投与4時間後に血液を採取した後、CO2処刑を行い、直腸端近傍の結腸を採取し、長さ約4～6 cmに切り取り、冷食塩水で洗浄し、吸水紙で吸引乾燥し、秤量した。
【0170】
API-4500質量分析装置を用いて、血漿及びエンテロホモジネート試料中の被験化合物の濃度をLC-MS/MSで定量分析し、血漿定量限界(LOQ)は1 ng/mLであった。薬物動態学(PK)パラメータをWinNonlinを用いて計算し、結果を表3にまとめた。
【0171】
【表15】
【国際調査報告】