(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-06-11
(54)【発明の名称】酵素核酸合成のための組成物および方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/10 20060101AFI20240604BHJP
C12N 9/10 20060101ALN20240604BHJP
【ＦＩ】
C12N15/10 110Z
C12N9/10 ZNA
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023577185
(86)(22)【出願日】2022-06-13
(85)【翻訳文提出日】2024-02-09
(86)【国際出願番号】 US2022033312
(87)【国際公開番号】W WO2022266019
(87)【国際公開日】2022-12-22
(31)【優先権主張番号】63/210,429
(32)【優先日】2021-06-14
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
(71)【出願人】
【識別番号】523466617
【氏名又は名称】プリムローズ バイオ、インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】110000855
【氏名又は名称】弁理士法人浅村特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】オルソン、ダニエル
(72)【発明者】
【氏名】シェイ、ドンシン カレン
(72)【発明者】
【氏名】バファート、サブリナ
(72)【発明者】
【氏名】ツィーラー、ヘルゲ
(57)【要約】
本開示は、核酸の鋳型非依存性酵素的合成に有用な組成物および方法を記載する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
（ａ）単一容器中で、核酸基質、過剰の遊離非ブロック化ヌクレオシドトリホスファート、および少なくとも１つの鋳型非依存性核酸ポリメラーゼを組み合わせることと、（ｂ）（ａ）の混合物を、前記少なくとも１つの鋳型非依存性核酸ポリメラーゼが活性であり、反応物中に存在する前記核酸基質の分子に単一ヌクレオチドのみを付加する条件下で反応させて、新規核酸分子を形成することと、
（ｃ）遊離ヌクレオチドから、および任意に前記少なくとも１つの鋳型非依存性核酸ポリメラーゼから前記新規核酸分子を分離することと、
（ｄ）所望の合成された核酸を得るために工程（ａ）～（ｃ）を繰り返すことであって、所望の核酸が合成されるまで、工程（ｃ）の前記新規核酸分子が工程（ａ）の前記核酸基質として働く、繰り返すことと
を含む、所望の核酸を合成するプロセス。
【請求項2】
前記核酸基質がＲＮＡである、請求項１に記載のプロセス。
【請求項3】
前記核酸基質がＤＮＡである、請求項１に記載のプロセス。
【請求項4】
前記核酸基質が、リボヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチドの両方を含有するキメラ核酸である、請求項１に記載のプロセス。
【請求項5】
前記合成された核酸がＲＮＡである、請求項１～４のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項6】
前記合成された核酸がＤＮＡである、請求項１～４のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項7】
前記合成された核酸が、リボヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチドの両方を含有するキメラ分子である、請求項１～４のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項8】
前記核酸ポリメラーゼがＲＮＡポリメラーゼである、請求項１～８のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項9】
前記核酸ポリメラーゼがＤＮＡポリメラーゼである、請求項１～８のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項10】
前記核酸ポリメラーゼがＸファミリーＤＮＡポリメラーゼである、請求項１～８のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項11】
前記核酸ポリメラーゼがＹファミリーＤＮＡポリメラーゼである、請求項１～８のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項12】
前記核酸基質が固体支持体上に固定化される、請求項１～１１のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項13】
前記鋳型非依存性核酸ポリメラーゼが、単一ヌクレオチドのみを前記核酸基質に付加するのに３６～１００％効率的である、請求項１～１２のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項14】
前記鋳型非依存性核酸ポリメラーゼが、単一ヌクレオチドのみを前記核酸基質に付加するのに６０～１００％効率的である、請求項１～１３のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項15】
前記鋳型非依存性核酸ポリメラーゼが、単一ヌクレオチドのみを前記核酸基質に付加するのに８０～１００％効率的である、請求項１～１４のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項16】
前記鋳型非依存性核酸ポリメラーゼが、単一ヌクレオチドのみを前記核酸基質に付加するのに９０～１００％効率的である、請求項１～１５のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項17】
前記鋳型非依存性核酸ポリメラーゼが、単一ヌクレオチドのみを前記核酸基質に付加するのに１００％効率的である、請求項１～１６のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項18】
核酸基質末端に対してモル過剰の鋳型非依存性核酸ポリメラーゼが存在する、請求項１～１７のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項19】
等モル量の鋳型非依存性核酸ポリメラーゼおよび核酸基質末端が存在する、請求項１～１７のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項20】
鋳型非依存性核酸ポリメラーゼに対してモル過剰の核酸基質末端が存在する、請求項１～１７のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項21】
（ｄ）において使用される前記少なくとも１つの鋳型非依存性核酸ポリメラーゼが、工程（ａ）において使用される前記少なくとも１つの鋳型非依存性核酸とは異なる、請求項１～２０のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項22】
前記少なくとも１つの鋳型非依存性核酸ポリメラーゼが固体支持体上に固定化される、請求項１～２１のいずれか一項に記載のプロセス。【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【0001】
政府のライセンス権
本発明は、国立衛生研究所によって授与された賞番号１Ｒ４３ＨＧ０１０９９５－０１Ａ１およびユニーク連邦賞識別番号（ＦＡＩＮ）Ｒ４３ＨＧ０１０９９５の下で政府の支援を受けてなされた。政府は、本発明に一定の権利を有する。
本発明は、国立衛生研究所によって授与された賞番号１Ｒ４３ＨＧ０１０９９５－０１Ａ１およびユニーク連邦賞識別番号（ＦＡＩＮ）Ｒ４３ＨＧ０１０９９５の下で政府の支援を受けてなされた。政府は、本発明に一定の権利を有する。
【0002】
配列表の組み込み
サイズが約１７３ＫＢである、（ＰＧ００２０配列表改訂版１０－２８－２１＿ＳＴ２５．ｔｘｔ）という名称のＡＳＣＩＩテキストファイルで電子的に提出された配列表の内容は、２０２１年１０月２８日に作成され、２０２２年６月１３日にｅＰＣＴを介して電子的に提出された。
サイズが約１７３ＫＢである、（ＰＧ００２０配列表改訂版１０－２８－２１＿ＳＴ２５．ｔｘｔ）という名称のＡＳＣＩＩテキストファイルで電子的に提出された配列表の内容は、２０２１年１０月２８日に作成され、２０２２年６月１３日にｅＰＣＴを介して電子的に提出された。
【0003】
合成ＤＮＡおよびＲＮＡを製造する現在の方法である化学的オリゴヌクレオチド合成（ＣＯＳ）は、ほぼ４０年前のものであり、機能的ゲノミクス、合成生物学、ＤＮＡベースのデータストレージ、および迅速かつ安価なＤＮＡ合成に依存する医療用途などの分野における新たな発見のために制限されつつある。ＣＯＳのコストは、この四半世紀（例えば、バイオエコノミーウェブサイトのバイオエコノミーダッシュボードに表示されるデータを参照されたい。）にわたって２０倍しか改善されておらず、合成ＤＮＡの需要の高まりに追いついていない。さらに、ＣＯＳは、最大または約２００ヌクレオチドを有する核酸鎖に限定され、高度な装置および製造プロセスを使用する大規模で集中的な設備を必要とする。合成核酸に対する急速に高まっている需要は、長い核酸分子を送達することができる新しい迅速で安価な合成経路を必要としている。天然にはＤＮＡポリメラーゼおよびＲＮＡポリメラーゼが豊富に存在するため、酵素的核酸合成経路が非常に注目されている。
【0004】
酵素的オリゴヌクレオチド合成（ＥＯＳ）は、様々な商業的グループによって数年間にわたって追求されてきており（Ｅｆｃａｖｉｔｃｈ ２０１６、Ｈｉａｔｔ １９９５、Ｈｉａｔｔ １９９５ ａ）、最近の興味深い発見および進歩がある（Ｐａｌｌｕｋ ２０１８、Ｐｅｒｋｅｌ ２０１９、Ｈｏｆｆ ２０２０、Ｌｅｅ ２０２０）。そのような戦略は、ＲＮＡもしくはＤＮＡオリゴヌクレオチド、またはＲＮＡ－ＤＮＡキメラの作製を目的とすることができる。
【0005】
ほとんどのＥＯＳ戦略は、インビトロで一本鎖ＤＮＡの３’末端にヌクレオチドを付加することができる鋳型非依存性ＤＮＡポリメラーゼ（ＴＩＤＰ）である末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）を使用する（Ｄｅｉｂｅｌ １９８０、Ｆｏｗｌｅｒ ２００６、Ｍｏｔｅａ ２０１０、Ｊｅｎｓｅｎ ２０１８、Ｌｏｃ’ｈ ２０１８、Ｄｅｓｈｐａｎｄｅ ２０１９、Ｓａｒａｃ ２０１９）。公知のＴｄＴは、高い加工性または酵素の高いオン－オフ速度のいずれかによって（Ｇｏｕｇｅ ２０１３）、数百ヌクレオチド長のＤＮＡを重合させる（Ｄｅｉｂｅｌ １９８０、Ｄｅｌａｒｕｅ ２００２、Ｆｏｗｌｅｒ ２００６、Ｍｏｔｅａ ２０１０、Ｊｅｎｓｅｎ ２０１８、Ｌｏｃ’ｈ ２０１８、Ｓａｒａｃ ２０１９）。他のＤＮＡポリメラーゼ、特にＤＮＡ修復プロセスに関与するものも、インビトロで鋳型非依存性ＤＮＡポリメラーゼ（ＴＩＤＰ）活性を有することが示されているが（Ｃｌａｒｋ １９８８、Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ ２０００、Ｒｕｉｚ ２００１、Ｊｕａｒｅｚ ２００６、Ｍｏｏｎ ２００７、Ｍｏｏｎ ２００７ ａ、Ｈｏｇｇ ２０１２、Ｍｏｏｎ ２０１４、Ｋｅｎｔ ２０１６、Ｆｒａｎｋ ２０１７、Ｙａｎｇ ２０１８、Ｃｈａｎｇ ２０１９）、非ＴｄＴ酵素のＴＩＤＰ活性は広く研究されていない。
【0006】
定義された長さおよび配列のポリヌクレオチドを作製するために、現在のＥＯＳプロセスは、各付加サイクル後にブロッキング基を除去して、３’－ブロックヌクレオチドを使用する（図１Ａ）。３’ブロッキング基は、付加サイクル当たりの複数のヌクレオチドの付加を防止する。
【0007】
しかしながら、３’－ブロックされたヌクレオチドは、この分野における進行を制限するいくつかの欠点を有する。第一に、ほとんどの天然ＤＮＡポリメラーゼは、３’修飾を有するヌクレオチドを非常に非効率的に組み込み、顕著な塩基選好性および配列特異性をも示す。第二に、３’ブロッキング基の化学的性質は、それが付加工程中の自発的または酵素触媒による除去を回避するのに十分に安定であると同時に、次の付加工程の準備のために完全に除去可能である必要があるため、重要である。このバランスをとることは困難であり、この分野は、望ましい品質を有する少数のブロッキング基化学に限定されている。第三に、酵素は、ヌクレオチド化学および酵素最適化の相互接続された課題を作り出す３’ブロッキング基に適応する必要がある。第四に、この戦略の脱ブロッキング工程は、そうでなければ酵素合成プロセスに化学反応工程を追加し、プロセスの複雑さを増大させ、高価で有毒な化学物質の使用を潜在的に伴う。
【0008】
天然または非ブロック化ヌクレオシドトリホスファートを使用するオリゴヌクレオチド合成の代替アプローチが記載されている（Ｓｃｈｏｔｔ １９８４）。鋳型非依存性核酸ポリメラーゼによる複数のヌクレオチドのプロセッシブな付加のために、この方法は、各付加サイクルの後に、単一ヌクレオチド付加を受けたオリゴヌクレオチド分子が、０個、２個またはそれを超えるヌクレオチドを受けたオリゴヌクレオチドから分離されることを必要とする。各付加サイクル後のオリゴヌクレオチド精製の必要性は、この方法の有用性を制限している。
【0009】
酵素的オリゴヌクレオチド合成の問題を単純化し、効率的な酵素的オリゴヌクレオチド合成プロセスのための差別化されたアプローチを作り出すために、本発明者らは、天然ヌクレオチドのみを使用する図１Ｂに示す戦略を開発した。ヌクレオチドを効率的に付加した後、転位することができず、ＤＮＡ鋳型と会合したままであるＴＩＤＰは、合成サイクル当たり単一ヌクレオチドのみを確実に付加する。それにより、酵素は、オリゴヌクレオチド基質の３’末端への２つ以上のヌクレオチドの付加を防止し、修飾ヌクレオチドの必要性を排除する。新しいサイクルを開始する前に、ヌクレオチドを除去し、洗浄、加熱および／またはカオトロピック塩によって酵素を解離させる。このプロセスに適したＴＩＤＰの進化は大幅に合理化され、ＤＮＡ合成コストは大幅に削減される。原始遺伝学のコストモデルは、そのようなＥＯＳプロセスが、小（ｆｍｏｌ）および中（ｎｍｏｌ－μｍｏｌ）の合成スケールでＣＯＳよりも１０倍～１００倍のコスト上の利点を有することを示している。
【0010】
本開示は、一本鎖オリゴヌクレオチドの末端に単一ヌクレオチドを組み込む能力を有する一組の第一世代ＤＮＡ合成酵素を使用するこの独特のＤＮＡ合成アプローチの実現可能性を実証する。
【0011】
合成ＤＮＡの用途が急速に拡大しているため、この分野における商業的機会は膨大である。世界のオリゴヌクレオチド合成市場規模は２０１８年に４３億ドルであり、化合物年間成長率（ＣＡＧＲ）１０～１２．５％で成長し、２０２５年までに８０億ドル超に達すると予測されている（世界のオリゴヌクレオチド合成市場規模２０１８）。合成ＤＮＡの主な用途には、分子生物学および合成生物学のＲ＆Ｄ、ゲノミクス（標的濃縮）、治療、診断（ＤＮＡマイクロアレイ、ＰＣＲおよびＦＩＳＨ）、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システム、ナノテクノロジー、ならびにＤＮＡベースのデータストレージおよびＤＮＡコンピューティングなどの新興技術が含まれる（グローバルオリゴヌクレオチド合成市場サイズ２０１８、Ｌｅｅ ２０１８、Ｊｅｎｓｅｎ ２０１８、Ｌｅｅ ２０１９）。
【0012】
本開示は、以下「非ブロック化ヌクレオシドトリホスファート」と呼ばれる、遊離または非ブロック化３’ヒドロキシル基を基質として有するヌクレオシドトリホスファートを使用するオリゴヌクレオチド合成への新規酵素経路を記載する。これまでに記載されているＴＩＤＰ活性を有するＤＮＡポリメラーゼは、典型的には、インビトロでトリホスファートと一緒に反応させた場合、一本鎖オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド末端へのヌクレオチドのプロセッシブな付加を示す。本開示は、非ブロック化ヌクレオシドトリホスファートと一緒に使用される場合、オリゴヌクレオチドの３’末端に単一ヌクレオチドを付加する能力を有するＤＮＡポリメラーゼを記載する。
【0013】
本開示は、既知のＤＮＡポリメラーゼ機構に確実に根ざしている。手短に言えば、全てのＤＮＡポリメラーゼが、１）ＤＮＡ基質へのポリメラーゼの結合、２）ヌクレオシドトリホスファートとの最初の三元複合体の形成、３）生成的な三元基質複合体をもたらす立体構造変化、４）化学反応後生成物三元複合体をもたらす触媒、５）産物（ＰＰｉ）放出をもたらす立体構造変化、および６）ＤＮＡ基質からの次の一連のヌクレオチド付加またはポリメラーゼ解離の準備のためのポリメラーゼ転位の６つの重要な機構的ステップを経ることが知られている（Ｂｅｒｄｉｓ ２００９、Ｂｅａｒｄ ２０１４、Ｂｅｒｄｉｓ ２０１４）。これらの様々な機構的ステップは、ポリメラーゼの異なるドメインによって媒介される（Ｋａｍｉｎｓｋｙ ２０２０）。
【0014】
ポリメラーゼ転位は、特定のＤＮＡポリメラーゼ配列およびドメインに関連することが知られており（Ｓａｍｋｕｒａｓｈｖｉｌｉ １９９６、Ｒｅｃｈｋｏｂｌｉｔ ２００６、Ｇｏｌｏｓｏｖ ２０１０、Ｄａｈｌ ２０１４、Ｒｅｎ ２０１６、Ｙａｎｇ ２０１８、Ｈｏｉｔｓｍａ ２０２０）、基質からの解離速度が大きく異なるポリメラーゼが報告されている（Ａｎｄｒａｄｅ ２００９、Ｚａｈｎ ２０１１）。突然変異が、転位速度に影響を及ぼすＤＮＡポリメラーゼおよびＲＮＡポリメラーゼの両方で同定されており（Ｓａｍｋｕｒａｓｈｖｉｌｉ １９９６、Ｄａｈｌ ２０１４、Ｒｅｎ ２０１６）、ポリメラーゼ転位は、ＤＮＡポリメラーゼおよびＲＮＡポリメラーゼに見られる特異的ドメインおよび配列モチーフに関連している（Ｓａｍｋｕｒａｓｈｖｉｌｉ １９９６、Ｒｅｃｈｋｏｂｌｉｔ ２００６、Ｇｏｌｏｓｏｖ ２０１０、Ｄａｈｌ ２０１４、Ｈｏｉｔｓｍａ ２０２０）。したがって、単一の非ブロック化ヌクレオチドを付加し、転位することができないために他のヌクレオチドを付加することができない核酸ポリメラーゼを開発することが可能である。
【0015】
核酸ポリメラーゼは異なるクラスに分類され、クラス内のポリメラーゼは、それらを別のクラス内のポリメラーゼと区別する特定の配列または特性を示す。例えば、ＤＮＡポリメラーゼは、ファミリーＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｘ、ＹおよびＲＴに分類される（Ｂｅｂｅｎｅｋ ２００２、Ｒａｍａｄａｎ ２００４、Ｊａｒｏｓｚ ２００７、Ｇｕｏ ２００９、Ｕｃｈｉｙａｍａ ２００９、Ｙａｍｔｉｃｈ ２０１０、Ｂｅｒｄｉｓ ２０１４、Ｍａｘｗｅｌｌ ２０１４、Ｍｏｏｎ ２０１４、Ｔｒａｋｓｅｌｉｓ ２０１４、Ｙａｎｇ ２０１４、Ｖａｉｓｍａｎ ２０１７、Ｙａｎｇ ２０１８、Ｈｏｉｔｓｍａ ２０２０、Ｋａｚｌａｕｓｋａｓ ２０２０）。異なるファミリーのポリメラーゼは、核酸の複製、修復および組換えにおいて異なる生物学的機能を有する。異なるファミリーからの精製ポリメラーゼは、上記の参考文献に例示されているように、インビトロで異なる活性セットを有することが多い。
【0016】
核酸ポリメラーゼはまた、核酸を重合する際に特定の配列に対して強い配列特異性または選好性を示すことが知られている。核酸ポリメラーゼはまた、核酸を重合するときに塩基特異性を示すことが示されている（Ｆｉａｌａ ２００７、Ｈｏｉｔｓｍａ ２０２０）。
【0017】
ＤＮＡポリメラーゼの既知の品質に基づいて、複数のヌクレオチドのプロセッシブな付加のリスクなしに一本鎖核酸分子の３’末端への単一ヌクレオチドの付加を達成するための様々な可能性のある方法が存在し、それには、１）修飾された核酸分子の３’末端配列に対して高い配列特異性を有するポリメラーゼの使用（この末端配列特異性は、特定のタイプのヌクレオチド（すなわち、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、ＵまたはＩ）を組み込むポリメラーゼの選好性という観点から、塩基特異性に連結されてもされなくてもよい）、２）ヌクレオチド付加後に転位することができず（上記ステップ６）、ヌクレオチド付加後に核酸分子の３’末端と会合したままであるＤＮＡポリメラーゼの使用、３）それらの組み合わせ、４）ＴＩＤＰが核酸基質に非プロセッシブに作用し、鋳型非依存的に単一の非ブロック化ヌクレオチドのみを付加することを可能にする他の機構が含まれるが、これらに限定されない。
【発明の概要】
【0018】
本開示は、ヌクレオシドトリホスファートモノマー上に３’ブロッキング基を使用せずに、鋳型非依存性核酸ポリメラーゼ（ＴＩＮＡＰ）によって核酸基質に単一ヌクレオチドを付加することを含む、核酸の酵素的デノボ合成の新規アプローチを記載する。本開示はまた、鋳型非依存的に核酸の３’末端に単一ヌクレオチドを付加することができる酵素を記載する。この驚くべき発見は、ＤＮＡポリメラーゼが知られており、作動すると考えられている漸進的な様式と矛盾する。結果として、そのような酵素またはその改変された誘導体は、一度に１つのヌクレオチドである核酸の３’末端へのヌクレオチドの制御された付加を必要とするＥＯＳプロセスの開発において有用性を見出す。本開示は、工業的、医学的、診断的、農業的および／またはＲ＆Ｄ使用のための核酸を合成するために使用されるプロセスにおけるそのような酵素の使用を記載する。
【図面の簡単な説明】
【0019】
【図1A】オリゴヌクレオチドへの３’－ブロックヌクレオチドの環状付加による酵素的オリゴヌクレオチド合成の概略図である（Ｊｅｎｓｅｎ ２０１８参照）。ビーズにカップリングされたオリゴヌクレオチド（左上）を、３’－ブロック化ヌクレオシドトリホスファート（上）およびビーズへのヌクレオチドの付加を触媒する酵素（右上）と組み合わせる。酵素および過剰のヌクレオシドトリホスファート（図示せず）を除去した後、３’保護基を切断して（底部）、別の付加の基質である遊離３’末端を残す。合成が完了すると、脱保護オリゴヌクレオチドをビーズから切断することができる（左下）。この図は、ＤＮＡオリゴへのＣ残基の付加を示すが、任意のＲＮＡもしくはＤＮＡオリゴヌクレオチド、またはその修飾形態もしくはキメラに付加された任意のヌクレオチドに等しく適用される。
【0020】
【図1B】オリゴヌクレオチドへのヌクレオチドの環状付加による酵素的オリゴヌクレオチド合成の概略図であり、保護基の除去が核酸合成サイクルをどのように単純化できるかを示す。
【0021】
【図1C】オリゴヌクレオチドへの非ブロック化ヌクレオチドの環状付加による酵素的オリゴヌクレオチド合成の概略図である。ビーズにカップリングされたオリゴヌクレオチド（左上）を、遊離３’末端を有するヌクレオシドトリホスファート（上）およびビーズへの単一ヌクレオチドの付加を触媒する酵素（右上）と組み合わせる。酵素（左下）および過剰のヌクレオシドトリホスファート（図示せず）を除去した後、サイクルを繰り返すことができる。合成が完了すると、オリゴヌクレオチドをビーズから切断することができる（左下）。この図は、ＤＮＡオリゴへのＣ残基の付加を示すが、任意のＲＮＡもしくはＤＮＡオリゴヌクレオチド、またはその修飾形態もしくはキメラに付加された任意のヌクレオチドに等しく適用される。
【0022】
【図1D】非ブロック化ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドへの環状付加による酵素的オリゴヌクレオチド合成の概略図であり、付加サイクルごとに単一ヌクレオチドが付加される１つの可能な機構を示す。ビーズにカップリングされたオリゴヌクレオチド（左上）を、遊離３’末端を有するヌクレオシドトリホスファート（上）およびビーズへの単一ヌクレオチドの付加を触媒する酵素（右上）と組み合わせる。ヌクレオチド付加後、酵素はオリゴヌクレオチドの３’末端に結合したままであり、さらなる核酸重合を妨げる。酵素（左下）および過剰のヌクレオシドトリホスファート（図示せず）を除去した後、サイクルを繰り返すことができる。合成が完了すると、オリゴヌクレオチドをビーズから切断することができる（左下）。この図は、ＤＮＡオリゴへのＣ残基の付加を示すが、任意のＲＮＡもしくはＤＮＡオリゴヌクレオチド、またはその修飾形態もしくはキメラに付加された任意のヌクレオチドに等しく適用される。
【0023】
【図2】オリゴヌクレオチド基質（配列番号４２～４５）と混合ヌクレオシドトリホスファート（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰの等モル混合物）との混合を含むヌクレオチド付加反応の結果。ゲル画像の左側の標識によって示される分子サイズを含む一本鎖ＤＮＡラダーが「Ｍ」レーンに示されている。本開示に列挙される全ての酵素に使用される識別子である試験した酵素のＥＤＳ数（詳細については表１を参照）をゲル画像の下に示す。試験した酵素は、様々な長さの配列の基質への付加を示す。
【表1】
【0024】
【図3】異なる塩基で終結するオリゴヌクレオチド基質への単一ヌクレオチドの制御された付加の結果。Ａ．反応後にゲルによってアッセイした、異なるオリゴヌクレオチド基質への単一ヌクレオチドの付加。ゲル画像の左側の標識によって示される分子サイズを含む一本鎖ＤＮＡラダーが左側のレーンに示されている。Ｂ．第１の付加工程後のオリゴヌクレオチドの精製を伴うオリゴヌクレオチド基質への２つのヌクレオチドの連続的付加。ゲル画像の左側の標識によって示される分子サイズを含む一本鎖ＤＮＡラダーが、レーン１の左側およびレーン６の左側に示されている。「３’末端塩基」とラベル付けされた以下の表の列は、各レーンに存在する主要なオリゴヌクレオチドの３’末端塩基を列挙している。
【表2】
【図4】Ｏｌｉｇｏ Ｐｒｏ ＩＩキャピラリー電気泳動装置（カリフォルニア州サンタクララのＡｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）で実施した、酵素的ヌクレオチド付加の前後のオリゴヌクレオチドの代表的なキャピラリー電気泳動分離クロマトグラム。クロマトグラムに示される全ての反応は、ｄＴＴＰおよびオリゴ：ＰＧ５８６１（GTCCTCAATCGCACTGGAAT、配列番号４５）を使用した。各サンプル中に存在するオリゴヌクレオチドへの長さの明確な割り当てのために、オリゴヌクレオチド標準を含むおよび含まないサンプルの二重分析を行った。使用したオリゴヌクレオチド標準はＰＧ１３５０（GCGTCACGCTACCAACCA、配列番号４１）、ＰＧ５８６１（GTCCTCAATCGCACTGGAAT、配列番号４５）、ＰＧ５８７０（GTCCTCAATCGCACTGGAAACATCAAGGTC、配列番号５１）およびＰＧ５８７１（GTCCTCAATCGCACTGGAAACATCAAGGTCATACGGAACG、配列番号５２）であった。Ａ：未反応（すなわち、酵素なし）オリゴヌクレオチドＰＧ５８６１（GTCCTCAATCGCACTGGAAT、配列番号４５）。Ｂ：オリゴヌクレオチド標準と組み合わせた未反応（すなわち、酵素なし）オリゴヌクレオチドＰＧ５８６１（GTCCTCAATCGCACTGGAAT、配列番号４５）。Ｃ：ｄＴＴＰおよび酵素ＥＤＳ０８２と反応させたオリゴヌクレオチドＰＧ５８６１（GTCCTCAATCGCACTGGAAT、配列番号４５）。Ｄ：オリゴヌクレオチド標準との反応後に組み合わせた、ｄＴＴＰおよび酵素ＥＤＳ０８２と反応させたオリゴヌクレオチドＰＧ５８６１（GTCCTCAATCGCACTGGAAT、配列番号４５）。Ｅ：ｄＴＴＰおよび酵素ＥＤＳ０５４と反応させたオリゴヌクレオチドＰＧ５８６１（GTCCTCAATCGCACTGGAAT、配列番号４５）。Ｆ：オリゴヌクレオチド標準との反応後に組み合わせた、ｄＴＴＰおよび酵素ＥＤＳ０５４と反応させたオリゴヌクレオチドＰＧ５８６１（GTCCTCAATCGCACTGGAAT、配列番号４５）。Ｇ：ｄＴＴＰおよび酵素ＥＤＳ０６６と反応させたオリゴヌクレオチドＰＧ５８６１（GTCCTCAATCGCACTGGAAT、配列番号４５）。Ｈ：オリゴヌクレオチド標準との反応後に組み合わせた、ｄＴＴＰおよび酵素ＥＤＳ０６６と反応させたオリゴヌクレオチドＰＧ５８６１（GTCCTCAATCGCACTGGAAT、配列番号４５）。
【0025】
【図5】基質への様々な長さの配列の付加を示すヌクレオチド付加反応の結果。Ａ：ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰおよびＵＴＰならびに酵素ＥＤＳ０１５、ＥＤＳ０１７、ＥＤＳ０２９、ＥＤＳ０４８、ＥＤＳ０５３、ＥＤＳ０５４またはＥＤＳ０６６の等モル混合物を含むオリゴヌクレオチド基質（配列番号４２～４５）。ゲル画像の左側の標識によって示される分子サイズを含む一本鎖ＤＮＡラダーが「Ｍ」レーンに示されている。Ｂ：ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰおよびＵＴＰならびに酵素ＥＤＳ０１７、ＥＤＳ０２４、ＥＤＳ０２９、ＥＤＳ０３０、ＥＤＳ０５３、ＥＤＳ０５４、ＥＤＳ０６６またはＥＤＳ０８２の等モル混合物を含む単一オリゴヌクレオチド基質（配列番号４５）。ゲル画像の左側の標識によって示される分子サイズを含む一本鎖ＤＮＡラダーが「Ｍ」レーンに示されている。
【表3-1】
【表3-2】
【発明を実施するための形態】
【0026】
以下の略語および定義は、本明細書および特許請求の範囲の解釈に使用される。
【0027】
本明細書で使用される場合、「を含み、」、「を含み、」、「を含み、」、「を含み、」、「を有し、」、「を有し、」、「含有物」、または「を含み、」という用語、またはそれらの任意の他の変形は、非排他的包含を網羅することを意図している。例えば、要素のリストを含む組成物、混合物、プロセス、方法、物品または装置は、必ずしもそれらの要素のみに限定されず、明示的に列挙されていないかまたはそのような組成物、混合物、プロセス、方法、物品または装置に固有の他の要素を含み得る。さらに、そうではないと明示的に述べられていない限り、「または」は、包括的な「または」を指し、排他的な「または」を指すものではない。例えば、条件ＡまたはＢは、以下のいずれか１つによって満たされる：Ａが真（または存在）であり、Ｂが偽（または存在しない）、Ａが偽（または存在しない）であり、Ｂが真（または存在）、およびＡとＢの両方が真（または存在）。
【0028】
付加サイクル：本明細書で使用される場合、この語句は、２回以上のそのような付加を含む核酸合成プロセスにおける１回のヌクレオチド付加を指す。各付加サイクルにおいて、合成されている一本鎖核酸をヌクレオシドトリホスファートおよび核酸ポリメラーゼと組み合わせ、核酸ポリメラーゼが活性である反応条件下でインキュベートし、一本鎖核酸へのヌクレオチド付加をもたらす。
【0029】
核酸ポリメラーゼの塩基特異性：この語句は、異なる塩基と比較して、特定の塩基を含有するヌクレオチドを付加する核酸ポリメラーゼの選好性を指す。例えば、ｄＴＴＰに選好性を有するＤＮＡポリメラーゼは、Ａ、ＣまたはＧなどの他の塩基を含有するヌクレオチドよりも効率的にｄＴＭＰ（デオキシチミジンモノホスファート）残基を核酸の３’末端に付加する。別の例では、等モル量のヌクレオシドトリホスファートｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰを含有する混合反応において、ｄＴＴＰに選好性を有するＤＮＡポリメラーゼは、他の３つの塩基Ａ、ＣまたはＧを含有するヌクレオチドよりも多くのｄＴＭＰ残基を核酸の３’末端に付加する。
【0030】
キメラ核酸：本明細書で使用される場合、キメラ核酸は、リボヌクレオチド残基およびデオキシリボヌクレオチド残基の混合物を含む核酸分子を指す。混合物は、任意の数のリボヌクレオチド残基が、任意の数のデオキシヌクレオチド残基と共に同じ核酸鎖中に存在することを意味する。
【0031】
相補的ヌクレオチド配列：本明細書で使用される場合、相補的ヌクレオチド配列は、各ポリヌクレオチド鎖中の全ての塩基がそれらの対応物と対を形成して塩基対を形成するように、全ての塩基が反対の５’から３’極性の別のポリヌクレオチド配列と塩基対を形成することができるポリヌクレオチド配列である。
【0032】
制御エレメント：「制御エレメント」という用語は、コード領域の上流（５’非コード配列）、コード領域内、またはコード配列の下流（３’非コード配列）に位置し、関連するコード配列の転写、ＲＮＡプロセシング、安定性または翻訳に影響を及ぼすヌクレオチド配列を指す。調節配列には、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、ポリアデニル化認識配列、ＲＮＡプロセシング部位、エフェクター結合部位およびステムループ構造が含まれるが、これらに限定されない。
【0033】
縮重配列：本出願では、縮重配列は、特定の配列位置が集団中の異なる分子またはクローン間で異なる配列の集団として定義される。配列の相違は、任意の数の単一ヌクレオチドまたは複数ヌクレオチドであり得、例は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００ヌクレオチド、またはその間の任意の数である。縮重配列における配列の相違は、配列、分子またはクローンの集団内のその位置における２、３または４個の異なるヌクレオチドの存在を含み得る。配列の特定の位置における縮重ヌクレオチドの例は、ＡまたはＣ；ＡまたはＧ；ＡまたはＴ；ＣまたはＧ；ＣまたはＴ；ＧまたはＴ；Ａ、ＣまたはＧ；Ａ、ＣまたはＴ；Ａ、ＧまたはＴ；Ｃ、ＧまたはＴ；Ａ、Ｃ、ＧまたはＴである。
【0034】
ＤＮＡ：ＤＮＡは、デオキシリボヌクレオチドのポリマーである核酸である。ＤＮＡは、一本鎖または二本鎖の形態で存在する。本明細書で使用される場合、ＤＮＡは、それぞれがＣＨ２の形態の２’炭素を有するヌクレオチド残基を含む。
【0035】
酵素的オリゴヌクレオチド合成（ＥＯＳ）：本明細書で使用される場合、核酸の末端への単一ヌクレオチドの段階的な酵素的付加を使用して核酸を合成し、したがって一度に１ヌクレオチドずつ新しい核酸を作成する制御された酵素プロセスである。
【0036】
発現：本明細書で使用される「発現」という用語は、開示される核酸に由来するセンス（ｍＲＮＡ）またはアンチセンスＲＮＡの転写および安定な蓄積、ならびにｍＲＮＡの翻訳の産物としてのポリペプチドの蓄積を指す。
【0037】
遊離ヌクレオチド：本明細書で使用される場合、典型的には溶液中の単量体ヌクレオチドを意味する。
【0038】
完全長オープンリーディングフレーム：本明細書で使用される場合、完全長オープンリーディングフレームは、細胞または生物において発現されるように、その天然の開始コドンからその天然の最終アミノ酸コードコドンまで延びる完全長タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを指す。特定のオープンリーディングフレーム配列が、細胞または生物内で発現される複数の異なる完全長タンパク質を生じさせる場合、この配列内の各オープンリーディングフレームは、複数の異なるタンパク質のうちの１つをコードし、完全長と見なされる。全長オープンリーディングフレームは、イントロンによって連続的または中断され得る。
【0039】
全長タンパク質：本明細書で使用される場合、全長タンパク質は、細胞または生物のゲノムにコードされ、細胞または生物において発現されるように、その天然の第１のアミノ酸からその天然の最終アミノ酸まで延びるポリペプチドである。
【0040】
遺伝子：「遺伝子」という用語は、コード配列の前（５’非コード配列）および後（３’非コード配列）の調節配列を任意に含む、特定のタンパク質として発現することができる核酸断片を指す。「ネイティブ遺伝子」は、その天然の宿主生物において自然界で見出されるような遺伝子を指す。「天然遺伝子」は、プロモーターおよびターミネーターなどのその天然の制御配列を有する遺伝子を指す。「キメラ遺伝子」は、天然には一緒に見られない調節配列およびコード配列を含む任意の遺伝子を指す。したがって、キメラ遺伝子は、異なる供給源に由来する調節配列およびコード配列、または同じ供給源に由来するが、天然に見出される様式とは異なる様式で配置された調節配列およびコード配列を含み得る。同様に、「異物」遺伝子は、宿主生物には通常見られないが、遺伝子導入によって宿主生物に導入される遺伝子を指す。外来遺伝子には、非ネイティブ生物に挿入されたネイティブ遺伝子、またはキメラ遺伝子が含まれる。「導入遺伝子」は、形質転換手順によってゲノムに導入された遺伝子である。
【0041】
インフレーム：本出願、特に「インフレーム融合ポリヌクレオチド」という語句における「インフレーム」という用語は、上流または５’ポリヌクレオチドまたはＯＲＦ中のコドンのリーディングフレームであって、上流または５’ポリヌクレオチドまたはＯＲＦと融合した上流ポリヌクレオチドまたはＯＲＦの下流または３’に配置されたポリヌクレオチドまたはＯＲＦ中のコドンのリーディングフレームと同じリーディングフレームであるものを指す。そのようなインフレーム融合ポリヌクレオチドは、５’ポリヌクレオチドおよび３’ポリヌクレオチドの両方によってコードされる融合タンパク質または融合ペプチドをコードする。
【0042】
インビトロ転写反応：本明細書で使用される「インビトロ転写反応」は、インビトロでＤＮＡ鋳型を転写することによってＲＮＡを生成するように設計された反応である。インビトロ転写反応は、転写されるＲＮＡをコードする１つ以上のＤＮＡ鋳型分子、１つ以上の完全または部分的に精製された単一サブユニットＲＮＡポリメラーゼ、反応に必要な単一サブユニットＲＮＡポリメラーゼの基質としての最低４つのヌクレオシドトリホスファート、緩衝液、二価カチオンおよび塩を含む。
【0043】
反復／反復的：本出願では、反復するとは、材料またはサンプルに方法または手順を繰り返し適用することを意味する。典型的には、処理、変更または修正の各回から生成された処理、変更または修正された材料またはサンプルは、次の処理、変更または修正の各回のための出発材料として使用される。反復選択は、１回の選択の生存者を後続のラウンドの出発材料として使用して、選択を２回以上反復または繰り返す選択プロセスを指す。
【0044】
ライブラリ：遺伝子またはポリヌクレオチド配列のライブラリは、互いに異なり、配列の増殖のためにベクターにクローニングされる配列のコレクションである。異なるライブラリでは、配列は、配列内容、起源、起源生物、長さ、構造、他の配列との会合、および／またはポリヌクレオチド配列の任意の他の特性によって異なる。例えば、アミノ酸反復融合遺伝子のライブラリは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ゲノムによってコードされる複数の異なるＯＲＦを含む開始ＯＲＦコレクションを、プロモーター、この配列がＯＲＦに直接かつインフレームで連結されるように配向されたアミノ酸反復をコードする配列、ターミネーター、プラスミド骨格および抗生物質耐性遺伝子を含む細菌クローニングおよび発現ベクターにクローニングすることによって生成される。開始ＯＲＦコレクションは、５以上の数、例えば５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００、２００００、３００００、４００００、５００００、６００００、７００００、８００００、９００００、１０００００以上、またはその間の任意の数の、任意の数のＯＲＦを含むことができる。本開示の特定の態様では、ライブラリを生成するために使用されるＯＲＦコレクションは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の特定の望ましい特性をコードする高い可能性を与えるのに十分な数のＯＲＦ、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ゲノムによってコードされるＯＲＦの５０％以上、または合計４１４８個のＯＲＦを列挙する
ウィスコンシン大学（マディソン）によって調製された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＭＧ１６５５ゲノムアノテーションのアノテーションを使用する場合は２０７４以上のＯＲＦを含む。
ウィスコンシン大学（マディソン）によって調製された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＭＧ１６５５ゲノムアノテーションのアノテーションを使用する場合は２０７４以上のＯＲＦを含む。
【0045】
リンカー配列：この語句は、融合ポリヌクレオチドまたは融合ポリペプチド中の２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチドを分離するポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列を指す。例えば、融合ポリヌクレオチドは、融合ポリヌクレオチドの発現および翻訳から生じるポリペプチドの２つの部分を分離するペプチドをコードするリンカー配列によって分離された２つ以上のＯＲＦを含む。リンカーは、タンパク質または酵素からエピトープタグを分離することもできる。リンカー配列は、多様な長さおよび／または配列組成を有し得る。
【0046】
非相同：本出願における「非相同」という用語は、５０％未満のヌクレオチドレベルでの配列同一性を有すると定義される。
【0047】
核酸：核酸という用語は、ホスホジエステル結合、ホスホロチオアート結合または他の結合を介して互いに結合したヌクレオチドからなるバイオポリマーを指す。「核酸」または「核酸分子」は、ポリヌクレオチドと互換的に使用することができる。本明細書で使用される場合、核酸という用語は、核酸の一本鎖を指す。核酸は、ＤＮＡである場合はデオキシリボヌクレオチド残基からなるか、ＲＮＡである場合はリボヌクレオチド残基からなるか、またはキメラ核酸である場合はデオキシリボヌクレオチド残基およびリボヌクレオチド残基の両方を含むことができる。
【0048】
核酸基質または基質核酸分子：これは、核酸ポリメラーゼによって触媒され、ヌクレオシドトリホスファートをヌクレオチド源として使用する反応中にヌクレオチドアクセプターとして働く酵素的ヌクレオチド付加反応または酵素的核酸合成反応に存在する核酸分子である。例えば、酵素および１つ以上のデオキシヌクレオシドトリホスファートの存在下で反応する一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、この反応における基質核酸分子である。
【0049】
核酸ポリメラーゼ：これは、ヌクレオシドトリホスファートおよび非ブロック化核酸を基質として使用して核酸の重合を触媒し、非ブロック化核酸の３’末端に単一ヌクレオチドを連続的に付加する酵素である。科学文献に記載されている核酸ポリメラーゼは、典型的にはＤＮＡポリメラーゼおよびＲＮＡポリメラーゼのクラスに分類され、ＤＮＡを重合することができるＤＮＡポリメラーゼおよびＲＮＡを重合することができるＲＮＡポリメラーゼを有する。しかしながら、特定の酵素は、ＤＮＡおよびＲＮＡの両方の合成を触媒する二重の能力を有し得る。例えば、ＤＮＡポリメラーゼは、リボヌクレオチドをＤＮＡまたはＲＮＡ分子の３’末端に付加する能力を有し得、ＲＮＡポリメラーゼは、デオキシリボヌクレオチドをＤＮＡまたはＲＮＡ分子の３’末端に付加する能力を有し得る。
【0050】
核酸合成：これは、核酸ポリメラーゼ、モノマー構成要素としての１つ以上のヌクレオシドトリホスファートおよび核酸基質を最小限に必要とする、自然界または人間によって核酸が生成されるプロセスである。
【0051】
デノボ核酸合成：これは、人工ＤＮＡの合成を指すために使用され、核酸の特定の配列および構造を作成するための核酸基質への特定のヌクレオチドの制御された付加を含む。
【0052】
ヌクレオチド：これらは、３つの成分：５炭素糖、リン酸基および窒素塩基からなる核酸のモノマー構成要素である。ヌクレオチドの２つの主要なクラスは、ＤＮＡの構成要素であるデオキシリボヌクレオチドおよびＲＮＡの構成要素であるリボヌクレオチドである。糖がリボースである場合、核酸はＲＮＡであり、糖がリボース誘導体デオキシリボースである場合、核酸はＤＮＡである。本明細書で使用される場合、デオキシリボヌクレオチドは、リボース糖中の２’炭素として基ＣＨ２を有する。２’炭素の他の全ての構造は、リボヌクレオチドという用語に分類される。本明細書で使用される場合、ヌクレオチドは、核酸、ヌクレオシドモノホスファート、ヌクレオシドジホスファート、ヌクレオシドトリホスファートまたはそれらの任意の誘導体もしくは修飾内に存在するヌクレオチド残基を意味し得る。
【0053】
ヌクレオシドトリホスファート：本出願における「ヌクレオシドトリホスファート」は、ＲＮＡ合成に使用されるリボヌクレオシドトリホスファートＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＩＴＰ、ＵＴＰおよびＸＴＰなどのいずれか、またはＤＮＡ合成に使用されるデオキシリボヌクレオシドトリホスファートｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＩＴＰ、ｄＴＴＰおよびｄＸＴＰなどのいずれか、またはホスホロチオアート結合を含有する誘導体を含むそれらの任意の修飾類似体、誘導体または変異体として定義される。ＤＮＡ合成に使用される４つのカノニカルヌクレオシドトリホスファートの混合物（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ）は、略記「ｄＮＴＰ」によって示され、ＲＮＡ合成に使用される４つのカノニカルヌクレオシドトリホスファートの混合物（ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰおよびＵＴＰ）は、略記「ＮＴＰ」によって示される。
【0054】
オリゴヌクレオチド：オリゴヌクレオチドという用語は、２つ以上のヌクレオチドからなる一本鎖核酸を指す。
【0055】
オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）：ＯＲＦは、特定のリーディングフレーム内のコドンのストリングとしてタンパク質またはペプチドをコードする核酸内のヌクレオチドの任意の配列として定義される。この特定のリーディングフレーム内で、ＯＲＦはアミノ酸を指定する任意のコドンを含むことができるが、終止コドンを含まない。開始コレクション中のＯＲＦは、特定のアミノ酸で開始または終了する必要はない。ＯＲＦは、連続的であるか、または１つ以上のイントロンによって中断されている。
【0056】
作動可能に連結された：「作動可能に連結される」という用語は、一方の機能が他方によって影響を受けるような、単一の核酸断片上の核酸配列の会合を指す。例えば、プロモーターは、そのコード配列の発現を行うことができる場合、そのコード配列と作動可能に連結される（すなわち、コード配列がプロモーターの転写制御下にあること）。コード配列は、センスまたはアンチセンス配向で調節配列に作動可能に連結され得る。
【0057】
ペプチド結合：Ａ「ペプチド結合」は、第１のアミノ酸と、第１のアミノ酸のアルファ－アミノ基が第２のアミノ酸のアルファ－カルボキシル基に結合している第２のアミノ酸との間の共有結合である。
【0058】
配列同一性のパーセンテージ：「配列同一性パーセント」という用語は、任意の所与のクエリ配列、例えば配列番号１０と対象配列との間の同一性の程度を指す。対象配列は、典型的には、クエリ配列の長さの約８０％～２００％、例えば、クエリ配列の長さの８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９３、９５、９７、９９、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０または２００％の長さを有する。クエリ核酸またはポリペプチドに対する任意の対象核酸またはポリペプチドの同一性パーセントは、以下のように決定される。クエリ配列（例えば、核酸またはアミノ酸配列）は、コンピュータプログラムＣｌｕｓｔａｌＷ（バージョン１．８３、デフォルトパラメータ）を使用して１つ以上の対象核酸またはアミノ酸配列にアラインメントされ、核酸またはタンパク質配列のアラインメントをそれらの全長にわたって実行することを可能にする（グローバルアラインメント、Ｃｈｅｎｎａ ２００３）。
【0059】
クエリ配列に対する対象または核酸またはアミノ酸配列の同一性パーセントを決定するために、ＣｌｕｓｔａｌＷを用いて配列をアラインメントし、アラインメントにおける同一のマッチの数をクエリ長で除算し、結果に１００を掛ける。同一性パーセント値は、１０分の１に最も近い値に四捨五入され得ることに留意されたい。例えば、７８．１１、７８．１２、７８．１３、および７８．１４は７８．１に切り捨てられ、７８．１５、７８．１６、７８．１７、７８．１８、および７８．１９は７８．２に切り上げられる。
【0060】
ＣｌｕｓｔａｌＷは、クエリと１つ以上の対象配列との間の最良一致を計算し、同一性、類似性および相違を決定できるようにそれらを整列させる。配列アラインメントを最大化するために、１つ以上の残基のギャップをクエリ配列、対象配列、またはその両方に挿入することができる。核酸配列の高速ペアワイズアラインメントのために、以下のデフォルトパラメータが使用される：ワードサイズ：２；ウィンドウサイズ：４；スコアリング方法：パーセンテージ；頂部対角線の数：４；ギャップペナルティ：５。核酸配列の多重アラインメントのために、以下のパラメータが使用される：ギャップオープニングペナルティ：１０．０；ギャップ拡張ペナルティ：５．０；および重み遷移：Ｙｅｓ。タンパク質配列の高速ペアワイズアラインメントのために、以下のデフォルトパラメータが使用される：ワードサイズ：１；ウィンドウサイズ：５；スコアリング方法：パーセンテージ；頂部対角線の数：５；ギャップペナルティ：３。タンパク質配列の複数のアラインメントのために、以下のパラメータが使用される：重量マトリックス：ブロサム；ギャップオープニングペナルティ：１０．０；ギャップ拡張ペナルティ：０．０５；親水性ギャップ：オン；親水性残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、ＡｒｇおよびＬｙｓ；残基固有のギャップペナルティ：オン。ＣｌｕｓｔａｌＷ出力は、配列間の関係を反映する配列アラインメントである。ＣｌｕｓｔａｌＷは、例えば、ワールドワイドウェブ上のベイラー医科大学サーチランチャーウェブサイトおよび欧州バイオインフォマティクス研究所ウェブサイトで実行することができる。
【0061】
プラスミドおよびベクター：「プラスミド」および「ベクター」という用語は、細胞または生物の天然部分ではない遺伝子を保有するために使用される遺伝要素を指す。プラスミドは、典型的には、自律的なエピソーム遺伝要素として染色体外に複製するが、ベクターはゲノムに組み込まれ得るか、または線状もしくは環状ＤＮＡ断片として染色体外に維持され得る。プラスミドおよびベクターは直鎖状または環状であり得、任意の供給源に由来する一本鎖および／または二本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡからなり得る。プラスミドおよびベクターは、細胞または生物にポリヌクレオチド配列を導入し、生物内で遺伝子を発現させるのに有用な独特の構造に結合または組み換えられた、異なる供給源からの多数のヌクレオチド配列を含むことが多い。プラスミド上またはベクター上に存在する配列には、自律複製配列；セントロメア配列；ゲノム組込み配列；複製起点；プロモーターおよび／またはターミネーターなどの制御配列；オープンリーディングフレーム；抗生物質耐性遺伝子などの選択マーカー遺伝子；蛍光タンパク質をコードする遺伝子などの可視マーカー遺伝子；制限エンドヌクレアーゼ認識部位；組換え部位；および／または明らかな機能もしくは既知の機能を有さない配列が含まれるが、これらに限定されない。
【0062】
ポリペプチドまたはタンパク質：「ポリペプチド」または「タンパク質」という用語は、ペプチド結合によって結合された複数のアミノ酸モノマーで構成されるポリマーを示す。ポリマーは、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００またはその間の任意の数を含む１０個以上のモノマーを含む。
【0063】
プロモーター：「プロモーター」という用語は、コード配列または機能性ＲＮＡの発現を制御することができるＤＮＡ配列を指す。一般に、コード配列は、プロモーター配列の３’側に位置する。プロモーターは、その全体が天然の遺伝子に由来し得るか、および／または天然に見出される種々のプロモーターに由来する種々の要素から構成され得るか、または合成ＤＮＡセグメントを含み得る。種々のプロモーターが、種々の組織もしくは細胞型において、または種々の発生段階において、または種々の環境条件もしくは生理学的条件に応答して、遺伝子の発現を指示することが当業者によって理解される。多くの場合においてほとんどの細胞型で遺伝子を発現させるプロモーターは、一般に「構成的プロモーター」と呼ばれる。ほとんどの場合、調節配列の正確な境界は完全には定義されていないので、異なる長さのＤＮＡ断片が同一のプロモーター活性を有し得ることがさらに認識されている。
【0064】
ランダム／ランダム化：本明細書で使用される場合、方法または意識的な決定なしに行われたまたは選択されたことを意味する。
【0065】
ＲＮＡ：ＲＮＡは、リボヌクレオチドのポリマーである核酸である。ＲＮＡは、一本鎖または二本鎖の形態で存在する。本明細書で使用される場合、ＲＮＡは、それぞれがＣＨ２以外の形態の２’炭素を有するヌクレオチド残基を含む。
【0066】
配列：当業者に知られているように、「配列」は、生物学的文脈で使用される場合、核酸中のヌクレオチドの配列またはタンパク質中のアミノ酸の配列を意味し得る。本明細書で使用される場合、「配列」という用語は、その用語が使用される文脈に依存する意味を有する。例えば、ゲノム配列、遺伝子配列またはＯＲＦなどの核酸を示唆する文脈で使用される場合、配列はヌクレオチド配列を指す。タンパク質またはポリペプチド、例えばプロテオーム、タンパク質または酵素を示唆する文脈において、配列はアミノ酸配列を指す。
【0067】
配列特異的ヌクレオチド付加：本明細書で使用される場合、これは、それらの活性において配列特異性を示す核酸ポリメラーゼの特徴である。例えば、鋳型非依存性ＤＮＡポリメラーゼは、ｄＴ残基で終結する核酸の３’末端にヌクレオチドを付加することのみを可能にし、他のヌクレオチドで終結する３’末端にはヌクレオチドを付加しない配列特異性を有し得る。核酸ポリメラーゼのそのような配列特異性は、部分的または完全であり得る。部分的である場合、上記の例のＤＮＡポリメラーゼは、３’ｄＴ残基で終結する核酸にヌクレオチドをより効率的に付加するが、３’ｄＡ、ｄＣまたはｄＧ残基で終結する核酸も修飾するが、効率は低い。完全である場合、上記の例のＤＮＡポリメラーゼは、３’ｄＴ残基で終結する核酸にのみヌクレオチドを付加し、３’ｄＡ、ｄＣまたはｄＧ残基で終結する核酸を修飾することができない。
【0068】
鋳型非依存性核酸ポリメラーゼ：「鋳型非依存性核酸ポリメラーゼ」は、合成中の鎖と塩基対合し、合成中の鎖の鋳型として機能する別の核酸鎖の非存在下で、無機リン酸の放出を伴う、核酸の３’－ヒドロキシル末端でのヌクレオチドの取り込みを触媒する酵素である。具体的には、鋳型非依存性ＤＮＡポリメラーゼは鋳型を使用せずにＤＮＡ鎖の重合を触媒し、鋳型非依存性ＲＮＡポリメラーゼは鋳型を使用せずにＲＮＡ鎖の重合を触媒する。
【0069】
鋳型非依存性核酸合成：これは、合成中の核酸と塩基対合し、合成中の鎖の鋳型として機能する鋳型鎖を使用せずに、核酸ポリメラーゼが核酸の重合を触媒するプロセスである。
【0070】
形質転換：「形質転換」という用語は、ポリヌクレオチド配列の導入による遺伝子改変を意味する。
【0071】
形質転換：本明細書で使用される場合、「変換」という用語は、遺伝的に安定な遺伝をもたらす核酸断片の宿主生物への移入を指す。形質転換された核酸断片を含有する宿主生物は、「トランスジェニック」または「組換え体」または「形質転換」生物と呼ばれる。
【0072】
形質転換生物：形質転換生物は、生物のゲノムへのポリヌクレオチド配列の導入によって遺伝子改変された生物である。
【0073】
転位：核酸ポリメラーゼの「転位」とは、核酸基質へのヌクレオチドの付加後の核酸重合の方向（５’から３’）への核酸鋳型に沿った酵素の移動を指す。核酸ポリメラーゼは、基質へのヌクレオチドの付加後に鋳型または核酸基質に沿って転位する。
【0074】
好ましくない条件：本明細書で使用される場合、この語句は、通常の増殖条件の下よりも遅い増殖をもたらすか、または通常の増殖条件と比較して細胞の生存率を低下させる、物理的または化学的な増殖条件の任意の部分を意味する。
【0075】
非ブロック化核酸：この語句は、遊離３’ヒドロキシル基を有する核酸を意味する。
【0076】
非ブロック化ヌクレオチドまたは非ブロック化ヌクレオシドトリホスファートまたは非ブロック化ｄＮＴＰまたは非ブロック化ＮＴＰ：これらの句は互換的に使用され、遊離３’ヒドロキシル基を有するヌクレオチドまたはヌクレオシドトリホスファートを指す。
【0077】
本開示、特に「インフレーム融合ポリヌクレオチド」という語句における「インフレーム」という用語は、上流または５’ポリヌクレオチド、遺伝子またはＯＲＦ中のコドンのリーディングフレームであって、上流または５’ポリヌクレオチド、遺伝子またはＯＲＦと融合した上流ポリヌクレオチドまたはＯＲＦの下流または３’に配置されたポリヌクレオチド、遺伝子またはＯＲＦ中のコドンのリーディングフレームと同じであるものを指す。そのようなインフレーム融合ポリヌクレオチドのコレクションは、インフレームである上流ポリヌクレオチドおよび下流ポリヌクレオチドを含む融合ポリヌクレオチドのパーセンテージが互いに異なり得る。全コレクション中のパーセンテージは少なくとも１０％であり、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％またはその間の任意の数であり得る。
【0078】
ＸＴＰまたはｄＸＴＰ：「ＸＴＰ」または「ｄＸＴＰ」という用語は、ＲＮＡまたはＲＮＡの修飾形態を合成するために使用される任意のリボヌクレオシドトリホスファートまたは天然に存在するリボヌクレオシドトリホスファートの任意の修飾形態、またはＤＮＡまたはＤＮＡの修飾形態をそれぞれ合成するために使用される任意のデオキシリボヌクレオシドトリホスファートまたは天然に存在するデオキシリボヌクレオシドトリホスファートの任意の修飾形態を指す。
【0079】
本開示は、鋳型に依存しない様式で核酸を合成するための組成物および方法を提供する。特定の核酸ポリメラーゼは、付加を誘導する鋳型または付加されるヌクレオチドのタイプなしに、核酸の遊離３’末端にヌクレオチドを付加する能力を有する。本開示では、そのようなポリメラーゼは、鋳型非依存性核酸ポリメラーゼ（ＴＩＮＡＰ）活性を有するといわれる。
【0080】
ＴＩＮＡＰ活性を有するポリメラーゼは、インビトロで人工核酸を作製するための有用性を有する。例えば、ＴＩＮＡＰ活性を有する核酸ポリメラーゼは、核酸合成を可能にする実験条件下（例えば、生理学的ｐＨで、緩衝剤および二価カチオン補因子の存在下で、核酸重合を可能にする温度でのインキュベーション）で、１つ以上のヌクレオシドトリホスファートおよび遊離３’ヒドロキシル基を含有する１つ以上の基質核酸と組み合わせることができる。ポリメラーゼは、単一の付加サイクルにおいて、基質核酸の３’末端が単一ヌクレオチドによって伸長されるように、３’末端へのヌクレオチド付加を触媒する。次いで、核酸分子を酵素および／またはヌクレオシドトリホスファートから分離し、サイクルを繰り返す。このようにして、任意の特定の核酸配列を、一度に１つのヌクレオチドずつ、周期的に合成することができる。
【0081】
上記の戦略において特定の核酸配列を合成する能力は、ＴＩＮＡＰ活性を有する核酸ポリメラーゼが、付加サイクルごとに単一ヌクレオチドだけ基質核酸を伸長する能力に依存する。核酸ポリメラーゼの小さなサブセットは、この能力を有する。
【0082】
今日まで、一度に１つのヌクレオチドの核酸を合成することができるＥＯＳ戦略を開発するための他の努力は、核酸に付加されるヌクレオチドの３’ヒドロキシルに共有結合した化学基を含有する３’ブロックヌクレオチドの使用を必要としていた。３’ヒドロキシルを修飾する化学的ブロッキング基は、基質核酸分子の遊離３’ヒドロキシル基への複数のヌクレオチドの付加を防止する。一連の添加後、核酸基質分子を酵素およびヌクレオシドトリホスファートから分離し、基質核酸分子の残りを変化させない処理によって化学的ブロッキング基を除去する。３’ヒドロキシルは、この脱ブロッキング工程中に露出され、別の付加サイクルのために基質核酸分子を準備する。この戦略を図１Ａに示す。
【0083】
本開示に記載されるＥＯＳ戦略は、非ブロック化または遊離３’ヒドロキシルを有する天然ヌクレオチドを使用することによって３’ブロック化ヌクレオチドを使用する上記のものとは異なる。本開示における付加サイクルあたりの単一ヌクレオチドの付加は、付加サイクルあたり単一ヌクレオチドで基質核酸分子を伸長することを可能にするＴＩＮＡＰ活性を有する核酸ポリメラーゼの特定の品質に依存する。本開示に記載のＥＯＳ戦略を図１Ｃに示す。
【0084】
本開示に記載される戦略に基づく核酸合成プロセスは、ポリメラーゼ活性に適した反応混合物中で基質核酸分子、核酸ポリメラーゼ（ＴＩＮＡＰ）および１つ以上のヌクレオシドトリホスファートを組み合わせることと（生理学的ｐＨまたはそれに近いｐＨで緩衝剤および二価カチオンを最小限に含む）、反応が完了するのに十分な時間反応を進行させることと、次いで、単一ヌクレオチドの付加によって修飾された基質核酸分子を核酸ポリメラーゼおよび組み込まれていないヌクレオシドトリホスファートから分離することと、サイクルを繰り返すことと、を最小限に含む。
【0085】
本開示は、核酸を合成するための任意の非ブロック化ヌクレオシドトリホスファートの使用を含む。ヌクレオシドトリホスファートは、ＲＮＡまたはＲＮＡの修飾形態を合成するために使用される、ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＩＴＰ、ＵＴＰもしくはＸＴＰまたはそれらの任意の修飾形態などのリボヌクレオシドトリホスファートであり得る。ヌクレオシドトリホスファートは、ＤＮＡまたはＤＮＡの修飾形態を合成するために使用される、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＩＴＰ、ｄＵＴＰもしくはｄＸＴＰまたはそれらの任意の修飾形態などのデオキシリボヌクレオシドトリホスファートであり得る。
【0086】
ヌクレオチドの修飾形態には、メチル基、Ｏ－メチル基、ヒドロキシル基、アミノ基、ホスファート、塩素またはフッ素原子、単糖類、二糖類またはポリ糖類、色素、蛍光基、ホスホロチオエート基（ホスホジエステル結合上の酸素原子を硫黄原子で置換する）、結合基（ビオチンまたはジゴキシゲニンなど）、アジド、アルデヒド、ケトン、チオール、ジスルフィドまたはアミンなどの反応性基、または上記の１つ以上を含有する分子の共有結合付加によって修飾されたヌクレオチドが含まれるが、これらに限定されない。修飾基は、ヌクレオチドの窒素塩基またはリボース糖の２’または５’炭素に付加することができる（例えば、２’－フルオロまたは２’－Ｏ－メチル置換）が、３’－ヒドロキシル基を除いて、ヌクレオチドに見られる任意の炭素、窒素または酸素原子を修飾することができる。複数の修飾基を単一ヌクレオチド分子に付加することができる。ヌクレオチドに付加された修飾基の目的は、修飾ヌクレオチドが共有結合的に付加された分子の特異的検出、精製、（生物の組織または細胞型への）標的化または安定化、またはそれらの組み合わせを可能にすることである。
【0087】
本開示は、任意の配列の任意の核酸分子を合成するために使用することができる。合成された核酸分子は、ＤＮＡもしくはＲＮＡもしくはその修飾形態、またはリボヌクレオチドとデオキシリボヌクレオチドの両方を含有するキメラ核酸もしくはその修飾形態であり得る。合成された配列は、２’－フルオロまたは２’－Ｏ－メチル置換を含むがこれらに限定されないリボース糖に対するいくつかの修飾のいずれかを有する、カノニカルリボースもしくはデオキシリボース骨格またはその修飾形態を含むことができる。合成された配列は、ＤＮＡおよびＲＮＡに見られるカノニカル塩基のいずれか（アデニン、シチジン、グアニン、チミン、ウラシル）または一般的でない塩基（例えばヒポキサンチン、キサンチン）または任意のそのような塩基の修飾形態、または天然もしくは修飾塩基の任意の混合物を含むことができる。窒素塩基の修飾形態には、メチル基、Ｏ－メチル基、ヒドロキシル基、アミノ基、ホスファート、塩素またはフッ素原子、単糖類、二糖類またはポリ糖類、色素、蛍光基、ホスホロチオアート基（ホスファートを置換する）、結合基（ビオチンまたはジゴキシゲニンなど）、アジド、アルデヒド、ケトン、チオール、ジスルフィドまたはアミンなどの反応性基、または上記の１つ以上を含有する分子の共有結合付加によって修飾された塩基が含まれるが、これらに限定されない。
【0088】
酵素的核酸合成反応においてヌクレオチドアクセプターとして使用される基質核酸分子は、任意の長さまたは配列であり得る。例えば、基質核酸分子は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００、２００００、３００００、４００００、５００００、６００００、７００００、８００００、９００００もしくは１０００００ヌクレオチド長、またはそれ以上、またはその間の任意の長さであり得る。
【0089】
酵素的核酸合成反応においてヌクレオチドアクセプターとして使用される基質核酸分子は、溶液中に遊離していてもよく、またはアガロースビーズ、ポリスチレンビーズもしくは磁気ビーズなどの固体支持体上に固定化されていてもよい。基質核酸分子の固定化は、固体支持体への共有結合を介して、または固体支持体との非共有結合によって起こり得る。
【0090】
酵素的核酸合成反応においてヌクレオチドアクセプターとして使用される基質核酸分子は、一本鎖または部分的一本鎖のいずれかであり得る。ヌクレオチドアクセプターとして働く基質核酸分子の３’末端は一本鎖であり、これは相同ヌクレオチドと塩基対を形成しないことを意味するが、３’末端の５’側にある基質核酸分子中の任意のヌクレオチドは一本鎖または二本鎖であり得る。
【0091】
酵素的核酸合成反応においてヌクレオチドアクセプターとして使用される基質核酸分子は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００、２００００、３００００、４００００、５００００、６００００、７００００、８００００、９００００もしくは１０００００ヌクレオチド長、またはそれ以上、またはその間の任意の長さを含む任意の長さであり得る。
【0092】
酵素的核酸合成反応においてヌクレオチドアクセプターとして使用される基質核酸分子は、デオキシリボヌクレオチド残基もしくはリボヌクレオチド残基、またはデオキシリボヌクレオチド残基とリボヌクレオチド残基の両方の混合物を含むことができる。基質核酸分子中のヌクレオチド残基は、リボース糖に対する修飾、または塩基に対する修飾、または骨格に対する修飾を含む任意の修飾を含むことができる。
【0093】
酵素的核酸合成反応においてヌクレオチドアクセプターとして使用される基質核酸分子は、特定の配列および構造の純粋な分子であり得るか、または異なる配列または構造の混合集団であり得る。
【0094】
本開示に記載される組成物および方法を使用して合成された核酸配列は、合成されたタイプの核酸（すなわち、ＤＮＡの場合はＡ、Ｃ、ＧおよびＴ）に一般的に見られる全ての塩基またはこれらの塩基のサブセットを含むことができる。合成された配列は、複雑であっても非反復的であってもよく、または１つ以上の特異的配列が繰り返される反復的であってもよい。合成された配列は、ホモポリマー（単一ヌクレオチドのみを含有する）であってもよく、または繰り返し長さ当たり２個以上のヌクレオチドの単純な繰り返し、または５個以上のヌクレオチド長の複雑な繰り返しを含んでいてもよい。
【0095】
本開示に記載される組成物および方法を使用して合成される核酸分子は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００、２００００、３００００、４００００、５００００、６００００、７００００、８００００、９００００もしくは１０００００ヌクレオチド以上、またはその間の任意の長さを含む、任意の長さの２ヌクレオチド以上であり得る。
【0096】
本開示に記載される組成物および方法を使用して核酸を合成する場合のヌクレオチド付加の効率は、１％～１００％の範囲であり得る。これは、単一の付加サイクル中に、核酸基質分子のサブセットのみが核酸ポリメラーゼによってさらなるヌクレオチドによって伸長され得ることを意味する。例えば、任意の特定のヌクレオチドの、任意の特定の核酸基質分子への付加効率は、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１５、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％もしくは１００％、またはそれらの間の任意の割合であり得る。
【0097】
核酸ポリメラーゼによるヌクレオチド付加の効率は、付加反応に存在するそれぞれのヌクレオシドトリホスファートの濃度、酵素濃度、および酵素活性に影響を及ぼす反応条件を含むがこれらに限定されない、反応における多くの因子または変数によって影響され得る。例えば、特定のヌクレオシドトリホスファートの濃度を上げると、そのヌクレオシドトリホスファートの取り込み効率を高めることができる。同様に、特定のヌクレオシドトリホスファートの取り込みを触媒する酵素の濃度を増加させると、ヌクレオシドトリホスファートの取り込み頻度を増加させることができる。同じことが、反応混合物および反応条件を改変することによって、例えば、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、グリセロール、ポリアミン、洗剤、界面活性剤、ウシ血清アルブミン、ＤＮＡ結合タンパク質、ホルムアミド、またはペプチドもしくは小分子などの核酸ポリメラーゼ活性に影響を及ぼすもしくは核酸ポリメラーゼ活性を改変する分子を含むがこれらに限定されない緩衝剤（例えば、トリス、ナトリウムホスファートもしくはカリウムホスファート、ナトリウムアセタートもしくはカリウムアセタートまたはナトリウムカコジラートもしくはカリウムカコジラート）、塩、二価カチオンおよび反応添加剤または安定化剤の存在を変化させることによって、または、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、グリセロール、ポリアミン、洗剤、界面活性剤、ウシ血清アルブミン、ＤＮＡ結合タンパク質、ホルムアミド、またはペプチドもしくは小分子などの核酸ポリメラーゼ活性に影響を及ぼすもしくは核酸ポリメラーゼ活性を改変する分子を含むがこれらに限定されない緩衝剤、塩、二価カチオン、ヌクレオシドトリホスファート、および他の反応成分の濃度を変化させることによって達成することができる。
【0098】
核酸合成プロセスの反応ｐＨは、生理学的ｐＨ付近で数ｐＨ単位、例えばｐＨ ４．０、５．０、６．０、７．０、８．０、９．０もしくは１０．０またはその間の任意のｐＨだけ変動し得る。
【0099】
核酸ポリメラーゼによるヌクレオチド付加の既知の機構に基づいて、ＴＩＮＡＰが、複数のヌクレオチドのプロセッシブな付加を受けることなく、非ブロック化核酸の３’末端への単一ヌクレオチドの付加を触媒することができる様々な可能な機構が存在する。これらには、以下が含まれるが、これらに限定されない。１）核酸ポリメラーゼは、核酸基質上の末端塩基を含む特定の核酸配列に特異的であり得、この特定の配列を含む基質分子にヌクレオチドを付加するだけである。いったんヌクレオチドが付加されると、末端配列は異なり、ポリメラーゼは別のヌクレオチドを基質に付加することができない場合がある。２）核酸ポリメラーゼは、そのヌクレオチド付加機構の転位ステップにおいて欠損している場合があり、これは、ヌクレオチド付加およびピロホスファートの放出の触媒ステップの後に酵素を失速させ、ポリメラーゼが単一ヌクレオチドのみを付加することを可能にする。３）核酸ポリメラーゼは、核酸分子の末端と共有結合または非共有結合様式で強固に会合したままであり得、ヌクレオチド付加後のポリメラーゼの解離を防止し、ポリメラーゼの別の分子による核酸の３’末端へのアクセスを防止する。４）核酸ポリメラーゼは、単一ヌクレオチドの付加後に触媒活性を失うことがあり、それによってさらなるヌクレオチドを付加することができなくなる。これらの機構および酵素の性質は、特定の核酸ポリメラーゼにおいて個別にまたは組み合わせて存在し得る。
【0100】
核酸の３’末端へのヌクレオチドの付加において配列特異性を示す核酸ポリメラーゼ（上記の単一ヌクレオチド付加の第１の機構）は、核酸の異なる部分に位置する異なる数のヌクレオチドを認識し、それらに特異的であり得る。例えば、核酸ポリメラーゼは、核酸の３’末端に存在する配列または３’末端に存在するヌクレオチドを含まない内部配列に特異的であり得る。ポリメラーゼは、核酸の３’末端または内部に存在する１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０またはそれ以上のヌクレオチドに特異的であり得る。核酸の内部の特定の配列を認識する場合、核酸の３’末端からの距離は、核酸の３’末端から異なる長さ、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０またはそれ以上のヌクレオチドであり得る。核酸ポリメラーゼの配列特異性を支配する認識配列はまた、核酸内の２つ以上の不連続配列に存在し得る。
【0101】
核酸の３’末端に単一ヌクレオチドを付加した後に触媒活性を失う核酸ポリメラーゼは、可逆的または不可逆的にそうすることができる。可逆的であれば、ｐＨ変化；塩、二価カチオン、ピロホスファート、ヌクレオシドモノホスファート、ヌクレオシドジホスファート、ヌクレオシドトリホスファート、還元剤、または前述のいずれかの組み合わせの濃度の変化；ポリメラーゼ濃度の変化；グアニジン、尿素またはアルコールなどのカオトロピック剤による処理；部分的または完全なアンフォールディングとそれに続くリフォールディングまたはポリメラーゼの活性を回復させる当業者に公知の任意の他の処理などの処理がある。活性の喪失が不可逆的である場合、これらの処理はポリメラーゼ活性を回復させない。
【0102】
工業的核酸合成プロセスで使用される核酸ポリメラーゼは、一度使用された後に廃棄され得るか、または継続使用のためにヌクレオチド付加サイクルの間に再利用され得る。核酸ポリメラーゼは、任意の数、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００サイクルまたはその間の任意の数のヌクレオチド付加サイクルのために使用され得る。サイクル間で、核酸ポリメラーゼは、それだけに限らないが、アフィニティークロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーまたは限外濾過を含むいくつかのタンパク質精製方法のいずれかによって脱塩、濃縮または他の反応成分から分離されて、次のヌクレオチド付加サイクルのためにそれを調製することができる。
【0103】
ヌクレオチド付加サイクルの間に、工業的核酸合成プロセスで使用される核酸ポリメラーゼは、部分的または完全にアンフォールディングまたは変性され（タンパク質をその特徴的な三次元構造からランダムコイルに部分的または完全に移行させることを意味する）、次のヌクレオチド付加サイクルのためにそれを調製するためにその天然の三次元構造にリフォールディングされ得る。
【0104】
単一ヌクレオチド付加反応は、酵素に対する基質の異なる化学量論を使用することができ、３つの属のカテゴリーに分類される：１）モル過剰の酵素；２）等モル量の酵素末端および基質末端ならびに３）モル過剰の核酸基質３’末端。モル過剰の酵素の場合、酵素は、核酸基質３’末端の濃度と比較して倍過剰に相当する濃度、例えば１．０１×、１．１×、１．２×、１．３×、１．４×、１．５×、１．６×、１．７×、１．８×、１．９×、２×、３×、４×、５×、６×、７×、８×、９×、１０×、２０、３０×、４０×、５０×、６０×、７０×、８０×、９０×、１００×、またはその間の任意の数／倍過剰で存在し得る。モル過剰の核酸基質３’末端の場合、核酸基質または基質の３’末端（例えば、共有結合的に固定化された基質の場合）は、酵素の濃度と比較して倍過剰に相当する濃度、例えば１．０１×、１．１×、１．２×、１．３×、１．４×、１．５×、１．６×、１．７×、１．８×、１．９×、２×、３×、４×、５×、６×、７×、８×、９×、１０×、２０、３０×、４０×、５０×、６０×、７０×、８０×、９０×、１００×、２００×、３００×、４００×、５００×、６００×、７００×、８００×、９００×、１０００×、またはその間の任意の数／倍過剰で存在し得る。
【0105】
単一ヌクレオチドの制御された付加によって核酸を合成する能力を活用して、核酸合成のための工業的プロセスを作り出すことができる。そのような工業的プロセスは、典型的には、溶液中または固体支持体上のいずれかで合成される核酸に関連する材料の特定の組成物、合成が行われる専用の入れ物または容器（例えばフローカラム）、酵素およびヌクレオシドトリホスファートを添加および除去するための特定の技術（例えば、専用の送達システムまたはマイクロ流体を含む）、各ヌクレオチド付加ステップ後に過剰な酵素およびヌクレオシドトリホスファートを除去するための特定の技術、ならびに合成後に反応容器から酵素を除去し、合成中に存在する材料、例えば固体支持体、緩衝剤、塩および他の溶質から酵素を分離する特定の方法を含む。
【0106】
核酸合成のための工業的プロセスは、異なる反応温度、例えば０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０もしくは１２０℃、またはその間の任意の温度で開発することができる。反応温度は、一定であってもよく、または任意の様式で、例えば、開始温度からの線形もしくは非線形増加、または開始温度からの線形もしくは非線形減少、または周期的温度変化、またはそれらの任意の組み合わせによって、反応の過程で変化してもよい。
【0107】
工業的核酸合成プロセスは、ヌクレオチド付加サイクルごとに異なる反応時間、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、４０、５０もしくは６０秒／サイクルもしくはその間の任意の時間、または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、４０、５０もしくは６０分／サイクルもしくはその間の任意の時間、または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３もしくは２４時間／サイクルもしくはその間の任意の時間を使用することができる。
【0108】
核酸合成のための工業的プロセスは、異なる量の核酸の効率的な合成を可能にするために様々なスケールで設定することができる。スケールは、合成された核酸のｆモル量からモル量以上まで変化し得る。例えば、特定のプロセスは、１ｘ１０－１６、２ｘ１０－１６、３ｘ１０－１６、４ｘ１０－１６、５ｘ１０－１６、６ｘ１０－１６、７ｘ１０－１６、８ｘ１０－１６、９ｘ１０－１６、１ｘ１０－１５、２ｘ１０－１５、３ｘ１０－１５、４ｘ１０－１５、５ｘ１０－１５、６ｘ１０－１５、７ｘ１０－１５、８ｘ１０－１５、９ｘ１０－１５、１ｘ１０－１４、２ｘ１０－１４、３ｘ１０－１４、４ｘ１０－１４、５ｘ１０－１４、６ｘ１０－１４、７ｘ１０－１４、８ｘ１０－１４、９ｘ１０－１４、１ｘ１０－１３、２ｘ１０－１３、３ｘ１０－１３、４ｘ１０－１３、５ｘ１０－１３、６ｘ１０－１３、７ｘ１０－１３、８ｘ１０－１３、９ｘ１０－１３、１ｘ１０－１２、２ｘ１０－１２、３ｘ１０－１２、４ｘ１０－１２、５ｘ１０－１２、６ｘ１０－１２、７ｘ１０－１２、８ｘ１０－１２、９ｘ１０－１２、１ｘ１０－１１、２ｘ１０－１１、３ｘ１０－１１、４ｘ１０－１１、５ｘ１０－１１、６ｘ１０－１１、７ｘ１０－１１、８ｘ１０－１１、９ｘ１０－１１、１ｘ１０－１０、２ｘ１０－１０、３ｘ１０－１０、４ｘ１０－１０、５ｘ１０－１０、６ｘ１０－１０、７ｘ１０－１０、８ｘ１０－１０、９ｘ１０－１０、１ｘ１０－９、２ｘ１０－９、３ｘ１０－９、４ｘ１０－９、５ｘ１０－９、６ｘ１０－９、７ｘ１０－９、８ｘ１０－９、９ｘ１０－９、１ｘ１０－８、２ｘ１０－８、３ｘ１０－８、４ｘ１０－８、５ｘ１０－８、６ｘ１０－８、７ｘ１０－８、８ｘ１０－８、９ｘ１０－８、１ｘ１０－７、２ｘ１０－７、３ｘ１０－７、４ｘ１０－７、５ｘ１０－７、６ｘ１０－７、７ｘ１０－７、８ｘ１０－７、９ｘ１０－７、１ｘ１０－６、２ｘ１０－６、３ｘ１０－６、４ｘ１０－６、５ｘ１０－６、６ｘ１０－６、７ｘ１０－６、８ｘ１０－６、９ｘ１０－６、１ｘ１０－５、２ｘ１０－５、３ｘ１０－５、４ｘ１０－５、５ｘ１０－５、６ｘ１０－５、７ｘ１０－５、８ｘ１０－５、９ｘ１０－５、１ｘ１０－４、２ｘ１０－４、３ｘ１０－４、４ｘ１０－４、５ｘ１０－４、６ｘ１０－４、７ｘ１０－４、８ｘ１０－４、９ｘ１０－４、１ｘ１０－３、２ｘ１０－３、３ｘ１０－３、４ｘ１０－３、５ｘ１０－３、６ｘ１０－３、７ｘ１０－３、８ｘ１０－３、９ｘ１０－３、１ｘ１０－２、２ｘ１０－２、３ｘ１０－２、４ｘ１０－２、５ｘ１０－２、６ｘ１０－２、７ｘ１０－２、８ｘ１０－２、９ｘ１０－２、１ｘ１０－１、２ｘ１０－１、３ｘ１０－１、４ｘ１０－１、５ｘ１０－１、６ｘ１０－１、７ｘ１０－１、８ｘ１０－１、９ｘ１０－１、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００モルの核酸、またはその間の任意のスケールの合成のために考案され得る。
【0109】
核酸合成のための工業的プロセスは、任意の構造を有する任意のヌクレオチドを任意の核酸の３’末端に付加するために必要な全ての活性を有する単一の酵素に依存し得るか、またはプロセスは、特定の核酸への特定のヌクレオチドの付加を触媒するための特殊な酵素に依存し得る。例えば、リボヌクレオチドの付加に使用される核酸ポリメラーゼは、デオキシリボヌクレオチドの付加に使用される核酸ポリメラーゼとは異なり得る。異なる核酸ポリメラーゼを使用して、異なる塩基または異なる修飾を含むヌクレオチドを付加することができる。異なる核酸ポリメラーゼを使用して、核酸’３’末端に存在する配列または核酸の内部に存在する配列が異なる核酸にヌクレオチドを付加することができる。異なる核酸ポリメラーゼを使用して、異なる結合、例えば、ホスホロチオアート結合と比較してカノニカルホスホジエステル結合を有するヌクレオチドを付加することができる。工業的プロセスは、核酸の異なる配列および／または構造の合成を可能にするために、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００または１０００個の異なる核酸ポリメラーゼ、またはその間の任意の数を使用し得る。
【0110】
核酸合成の各サイクルについて、核酸ポリメラーゼを添加して、このサイクルに必要な特異的付加反応を触媒する。核酸ポリメラーゼは、単一の酵素または２つ以上の酵素の混合物であり得る。
【0111】
酵素的オリゴヌクレオチド合成は、オリゴヌクレオチド中の特定の位置に縮重または混合ヌクレオチドを組み込むことを可能にすることができる。これは、特定の付加サイクルのために複数のヌクレオシドトリホスファートを酵素的付加反応に添加することを含む。混合位置に組み込まれるヌクレオチドの構造に応じて、１つ以上の核酸ポリメラーゼを添加して、取り込み反応を触媒する。
【0112】
特定の位置に縮重または混合ヌクレオチドを有する核酸を合成する場合、複数の酵素を添加して、特定の付加サイクルで核酸の単一の位置に複数のヌクレオチドを付加することができる。
【0113】
縮重位置に組み込まれたヌクレオチドの比は、付加反応に存在するそれぞれのヌクレオシドトリホスファートの濃度、酵素濃度、および異なる酵素の相対速度に影響を及ぼす反応条件によって影響され得る。例えば、２つ以上のヌクレオシドトリホスファートの混合物中の特定のヌクレオシドトリホスファートの濃度を上昇させると、典型的には、そのヌクレオシドトリホスファートの取り込み効率が増加する。同様に、混合物中の特定のヌクレオシドトリホスファートの取り込みを触媒する酵素の濃度を増加させると、そのヌクレオシドトリホスファートの取り込み頻度を増加させる。同じことが、核酸ポリメラーゼの活性を最適化するために、または混合物中に存在する他の核酸ポリメラーゼと比較して１つの核酸ポリメラーゼの活性を優先するために、反応条件（緩衝剤、塩、二価カチオンおよびポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、グリセロール、ポリアミン、洗剤、ウシ血清アルブミン、ＤＮＡ結合タンパク質またはホルムアミドを含むがこれらに限定されない反応添加剤または安定化剤の存在；緩衝剤、塩、二価カチオン、ヌクレオシドトリホスファートおよびポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、グリセロール、ポリアミン、洗剤、ウシ血清アルブミン、ＤＮＡ結合タンパク質またはホルムアミドを含むがこれらに限定されない他の反応成分の濃度；ｐＨ；温度）を変更することによって達成され得る。
【0114】
酵素的に合成されたオリゴヌクレオチドは、任意の数の縮重ヌクレオチド、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００、２００００、３００００、４００００、５００００、６００００、７００００、８００００、９００００もしくは１０００００またはそれ以上の縮重ヌクレオチドを、オリゴヌクレオチドの全長まで含み得る。オリゴヌクレオチド中の縮重位置は、４つ全てのカノニカルヌクレオチドＡ、Ｃ、ＧおよびＴの混合物、または塩基のサブセット（例えば、Ａ＋Ｃ、Ａ＋Ｇ、Ａ＋Ｔ、Ｃ＋Ｇ、Ｃ＋Ｔ、Ｇ＋Ｔ、Ａ＋Ｃ＋Ｇ、Ａ＋Ｃ＋Ｔ、Ａ＋Ｇ＋Ｔ、Ｃ＋Ｇ＋Ｔ）、または任意の種類の非天然もしくは修飾ヌクレオチドとのカノニカルヌクレオチドの任意の混合物からなり得る。
【0115】
酵素的核酸合成プロセスでは、合成される核酸は、溶液中にあるか、固体支持体に結合されているか、またはそれらの組み合わせであり得る。固体支持体を使用する場合、核酸は、固体支持体に共有結合していてもよく、または非共有結合していてもよい。
【0116】
種々の固体支持体を使用して、合成中に核酸を固定化することができ、それは当業者に公知である。これらには、制御細孔ガラス（ＣＰＧ）ビーズ、アガロースビーズまたは樹脂、ポリスチレンビーズまたは樹脂、ＰＥＧビーズまたは樹脂、シリカゲルビーズ、および化学基、酵素または核酸の固定化のために開発された他の多くの特殊な材料が含まれるが、これらに限定されない。固体支持体は、０．０１～１０００ミクロンの範囲の様々なビーズサイズおよび０．０１～１０００ミクロンの範囲の細孔サイズを有することができる。
【0117】
酵素的核酸合成反応で使用される核酸ポリメラーゼは、溶液中に遊離していてもよく、またはアガロースビーズ、ポリスチレンビーズもしくは磁気ビーズを含むがこれらに限定されない固体支持体上に固定化されていてもよい。核酸ポリメラーゼの固定化は、固体支持体への共有結合を介して、または固体支持体との非共有結合によって起こり得る。核酸ポリメラーゼを固定化するために使用される固体支持体は、核酸基質を固定化するために使用されるのと同じ固体支持体であり得るか、または異なる支持体であり得る。
【0118】
酵素的核酸合成反応で使用される核酸ポリメラーゼは、その天然の機能に基づいてＤＮＡポリメラーゼまたはＲＮＡポリメラーゼであり得る。ＤＮＡポリメラーゼの場合、ポリメラーゼは、限定するものではないが、ファミリーＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｘ、ＹおよびＲＴを含む、ＤＮＡポリメラーゼの様々な既知のファミリーのいずれかに属することができる。
【0119】
酵素的核酸合成反応で使用される核酸ポリメラーゼは、天然酵素または操作された酵素であり得、これは、その配列または構造が、デノボ核酸合成のためのその有用性を高めるために人の手によって改変されていることを意味する。
【0120】
本開示は、核酸分子の３’末端に単一ヌクレオチドを付加することができる７つの新規核酸ポリメラーゼを記載する。これらの酵素の配列番号を以下の表１に示し、それらの活性を例１に記載する。
列Ａの配列番号は天然配列（アミノ酸）である。
列Ｂの配列番号は、クローン化遺伝子配列（核酸）である。
列Ｃの配列番号は、発現されたタンパク質配列（アミノ酸）である。
列Ｄの配列番号は、発現プラスミド配列（核酸）である。
【表4】
列Ａの配列番号は天然配列（アミノ酸）である。
列Ｂの配列番号は、クローン化遺伝子配列（核酸）である。
列Ｃの配列番号は、発現されたタンパク質配列（アミノ酸）である。
列Ｄの配列番号は、発現プラスミド配列（核酸）である。
【0121】
上記のように、核酸ポリメラーゼは、核酸基質の３’末端に単一ヌクレオチドを付加する部分的な能力を有することができ、これは、反応中の核酸基質への単一ヌクレオチドの付加効率が１００％未満であり得ることを意味する。この効率を高めるために、核酸ポリメラーゼをより効率的になるように操作することができる。これは、反応における付加効率が親酵素よりも高い、元の酵素の変異体が生成されることを意味する。核酸ポリメラーゼは、その基質特異性を変化させるように操作することもできる。例えば、Ｔで終わる核酸の３’末端にヌクレオチドを効率的に付加する核酸ポリメラーゼを、任意のヌクレオチドで終わる核酸にヌクレオチドを効率的に付加するように操作することができる。別の例として、核酸の３’末端にＡを効率的に付加する核酸ポリメラーゼは、変異体酵素が核酸分子の３’末端に任意のヌクレオチドを効率的に付加することができるように、より広い基質特異性のために操作され得る。さらに別の例では、反応中に核酸の３’末端に複数のヌクレオチドをプロセッシブな様式で付加する核酸ポリメラーゼを、反応中に３’末端に単一ヌクレオチドのみを付加するように操作することができる。さらなる例では、デオキシリボースのヌクレオチドを核酸の３’末端に効率的に付加する核酸ポリメラーゼを、リボヌクレオチドを効率的に付加するように操作することができる。さらなる例では、ＤＮＡ分子の３’末端にデオキシリボースのヌクレオチドを効率的に付加する核酸ポリメラーゼを、ＲＮＡ分子にデオキシリボヌクレオチドを効率的に付加するように操作することができる。最後の例では、ＤＮＡ分子の３’末端にリボヌクレオチドを効率的に付加する核酸ポリメラーゼを、ＲＮＡ分子の３’末端にリボヌクレオチドを効率的に付加するように操作することができる。これらの例は網羅的ではなく、実際には、この活性を欠くかまたはこの活性を低効率で示す出発酵素を操作することによって、任意の特定の望ましい核酸ポリメラーゼ活性を操作することが可能である。
【0122】
タンパク質工学のための多くのアプローチおよび方法が文献に記載されており、これらには以下の総説論文に列挙されているものが含まれるが、これらに限定されない：Ｌｅａｔｈｅｒｂａｒｒｏｗ １９８６、Ｚｏｌｌｅｒ １９９１、Ｌｕｔｚ ２０００、Ｌｅｉｓｏｌａ ２００７、Ｅｉｓｅｎｂｅｉｓ ２０１０、Ｏ’Ｆａｇａｉｎ ２０１１、Ｆｏｏ ２０１２、Ｚａｗａｉｒａ ２０１２、Ｍａｒｃｈｅｓｃｈｉ ２０１３、Ｗｏｏｄｌｅｙ ２０１３、Ｊｏｈｎｓｏｎ ２０１４、Ｐａｃｋｅｒ ２０１５、Ｓｈｉｎ ２０１５、Ｃｈｅｎ ２０１６、Ｋａｕｓｈｉｋ ２０１６、Ｓｗｉｎｔ－Ｋｒｕｓｅ ２０１６、Ｗｒｅｎｂｅｃｋ ２０１７、Ｂｏｒｎｓｃｈｅｕｅｒ ２０１８、Ｌｕｔｚ ２０１８、Ｓｉｎｇｈ ２０１８、Ｓｉｎｈａ ２０１９、Ｗｉｌｄｉｎｇ ２０１９、Ｙａｎｇ ２０１９。
【0123】
一般に、タンパク質工学は、目的の酵素をコードする遺伝子配列を多様化するために１つ以上の方法を使用し、続いて１つ以上の目的の品質が改善された変異体酵素をコードする遺伝子を選択するために使用される１つ以上の選択またはスクリーニング方法を使用する。対象となる性質としては、これらに限定されないが、特定の反応条件における、または特定の基質を修飾する場合のヌクレオチド付加効率；核酸基質に関する基質特異性；阻害剤耐性；ヌクレオシドトリホスファートに関する基質特異性；高温暴露時の安定性；塩、ピロホスファートもしくは他の反応生成物、または任意の他の化学物質もしくは化合物の反応中の存在など、親酵素を不活性化し得る条件下での安定性；上記のいずれかの反応における高濃度；または酵素的核酸合成プロセスに対するその適合性を改善し得る酵素の任意の他の品質が挙げられる。
【0124】
目的の核酸ポリメラーゼをコードする遺伝子を多様化するための方法には、これらに限定されないが、点突然変異の導入を意味する突然変異；酵素コード配列内の様々な長さの挿入および欠失の導入；コード配列の５’末端または３’末端のいずれかにおける他の配列との融合；多型の再集合をもたらす関連するコード配列との相同配列交換；および配列多様性を作り出す任意の他の手段が含まれる。
【0125】
鋳型非依存性核酸ポリメラーゼのサブセットは、核酸ポリメラーゼ活性に必須ではなく、ＤＮＡ合成または修復に関与する他のタンパク質との相互作用を媒介し得るＢＲＣＴドメインを含む（Ｃａｌｌｅｂａｕｔ １９９７，Ｒｅｐａｓｋｙ ２００４）。ＢＲＣＴドメインを除去するためのタンパク質の切断は、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼにおけるＤＮＡポリメラーゼ活性を刺激することが報告されている（Ｍｕｅｌｌｅｒ ２００９）。ＢＲＣＴドメインを除去する同様の標的化切断を使用して、他のＴＩＮＡＰの活性を変化させることができる。
【0126】
目的の１つ以上の品質が改善された酵素をコードする遺伝子を選択するために使用される方法およびアプローチには、微小液滴またはエマルジョン中でのインビトロ区画化を使用するアプローチが含まれ、これにより、少量の多数の酵素変異体の効率的な処理が可能になる。そのようなアプローチは、一般的な様式で、核酸処理酵素への特定の用途において文献に記載されている（Ｔａｗｆｉｋ １９９８、Ｇｈａｄｅｓｓｙ ２００１、Ｄｉｅｈｌ ２００６、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ ２００６、Ｍｉｌｌｅｒ ２００６、Ｇｈａｄｅｓｓｙ ２００７、Ｔａｙ ２０１０、Ｔａｋｅｕｃｈｉ ２０１４）。
【0127】
例
例１：溶液中のオリゴヌクレオチドへの単一ヌクレオチド付加
ＤＮＡポリメラーゼ、酵素発現および精製：
それぞれＮ末端に６－ヒスチジンタグ（配列番号２１～３０）を有する表１に記載のＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子を核酸配列（配列番号１１～２０）として設計し、商業的な遺伝子合成供給業者によって合成し、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において高いコピー数を付与するＭＢ１プラスミドレプリコンを有する細菌発現プラスミドにクローニングする。プラスミド上のＤＮＡポリメラーゼ遺伝子の挿入部位は、アラビノース誘導性プロモーターおよびラムダＴ１ターミネーターに隣接し、各ポリメラーゼのアラビノース誘導性発現を可能にする。発現構築物は、クローニング後に配列検証される。本開示に含まれるＤＮＡポリメラーゼの発現構築物の完全な配列は、配列番号３１～４０に示されている。
例１：溶液中のオリゴヌクレオチドへの単一ヌクレオチド付加
ＤＮＡポリメラーゼ、酵素発現および精製：
それぞれＮ末端に６－ヒスチジンタグ（配列番号２１～３０）を有する表１に記載のＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子を核酸配列（配列番号１１～２０）として設計し、商業的な遺伝子合成供給業者によって合成し、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において高いコピー数を付与するＭＢ１プラスミドレプリコンを有する細菌発現プラスミドにクローニングする。プラスミド上のＤＮＡポリメラーゼ遺伝子の挿入部位は、アラビノース誘導性プロモーターおよびラムダＴ１ターミネーターに隣接し、各ポリメラーゼのアラビノース誘導性発現を可能にする。発現構築物は、クローニング後に配列検証される。本開示に含まれるＤＮＡポリメラーゼの発現構築物の完全な配列は、配列番号３１～４０に示されている。
【0128】
ＥＤＳ０８２をコードする遺伝子のコード配列は、ＥＤＳ０３０をコードする配列を短縮して得た。ＥＤＳ０３０のＮ末端に存在するＢＲＣＴドメインをコードする配列を、他のポリメラーゼ（Ｍｕｅｌｌｅｒ ２００９）について記載されているように除去し、短縮されたコード配列の開始部に挿入されたメチオニンコドンを除去した。
【0129】
発現プラスミドを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１株に形質転換し、培養およびタンパク質発現のために単コロニーを採取する。細菌細胞をＬＢ培地中３７℃で対数期培養に増殖させ、Ｌ－アラビノースの添加によって誘導する。１５℃で１８時間インキュベートした後、培養物を遠心分離によって回収し、回収した大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞を溶解する。ＤＮＡポリメラーゼを、製造者の説明書に従ってニッケルアフィニティークロマトグラフィーで精製する。ＤＮＡポリメラーゼをイミダゾール溶液で溶出し、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅによって販売されているＡＭＩＣＯＮ（商標）超遠心フィルター（ダルムシュタット）で濃縮し、５０ｍＭ ＫＰＯ４、ｐＨ ７．３、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１．４３ｍＭベータメルカプトエタノール、０．０５％ Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ１００および５０％グリセロールで構成される保存緩衝液に交換する。
【0130】
オリゴヌクレオチドおよびｄＮＴＰプールを用いたインビトロヌクレオチド付加アッセイ
ｐＨ ７．５の５０ｍＭカリウムアセタートおよび２０ｍＭトリスアセタートからなる緩衝液中で反応を行うことによって、酵素活性をアッセイする。反応緩衝液に１０ｍＭマグネシウムアセタートおよび２５０μＭ塩化コバルトを補充する。反応は、５００μＭのｄＮＴＰ、１０μＭの一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドおよび１μｇの酵素／１０μｌの反応物の存在下で行う。反応物を、１５℃で開始し、１℃／分の速度で５０℃まで上昇する温度勾配を用いてインキュベートする。反応を１０μｌ容量で行い、氷上でセットアップする。
ｐＨ ７．５の５０ｍＭカリウムアセタートおよび２０ｍＭトリスアセタートからなる緩衝液中で反応を行うことによって、酵素活性をアッセイする。反応緩衝液に１０ｍＭマグネシウムアセタートおよび２５０μＭ塩化コバルトを補充する。反応は、５００μＭのｄＮＴＰ、１０μＭの一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドおよび１μｇの酵素／１０μｌの反応物の存在下で行う。反応物を、１５℃で開始し、１℃／分の速度で５０℃まで上昇する温度勾配を用いてインキュベートする。反応を１０μｌ容量で行い、氷上でセットアップする。
【0131】
活性スクリーニングのために、一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドの等モル混合物を使用する：ＰＧ５８６１（GTCCTCAATCGCACTGGAAT、配列番号４５）；ＰＧ５８５９（GTCCTCAATCGCACTGGAAG、配列番号４３）；ＰＧ５８６０（GTCCTCAATCGCACTGGAAC、配列番号４４）；ＰＧ５８５８（GTCCTCAATCGCACTGGAAA、配列番号４２）。一本鎖オリゴヌクレオチドの混合物を、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＣＴＰの等モル混合物と合わせる。オリゴヌクレオチドは、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（ルーズビル、ケンタッキー州）によって合成され、ｄＮＴＰは、ニューイングランドバイオラボ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）（ビバリー、マサチューセッツ州）から購入される。
【0132】
等体積の２×ＮＯＶＥＸ（商標）ＴＢＥ－尿素サンプルバッファー（サーモフィッシャ－（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、ウォルサム、マサチューセッツ州）を添加して反応を停止させ、７０℃で３分間加熱する。サンプルを冷却し、１５μｌをＮＯＶＥＸ（商標）ＴＢＥ－尿素ポリアクリルアミドゲル（１５％、サーモフィッシャ－（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、ウォルサム、マサチューセッツ州）に添加し、１５０Ｖで電気泳動し、メチレンブルーで染色し、脱イオン水で脱染色し、ＡＺＵＲＥ（商標）２００ゲルイメージングワークステーション（アズール・バイオシステムズ（Ａｚｕｒｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、ダブリン、カリフォルニア州）を使用して白色光で画像化する。
【0133】
１０個のＤＮＡポリメラーゼの活性の評価の例を図２に示す。様々な酵素は、１つまたはいくつかのヌクレオチドを一本鎖オリゴヌクレオチドに付加する傾向を示し、これは酵素的核酸合成プロセスに対する適合性を示し得る。
【0134】
ゲル電気泳動による単一ヌクレオチド付加のアッセイ
ｐＨ ７．５の５０ｍＭカリウムアセタートおよび２０ｍＭトリスアセタートからなる緩衝液中で反応を行うことによって、個々のｄＮＴＰを使用する酵素活性をアッセイする。反応緩衝液に１０ｍＭマグネシウムアセタートおよび２５０μＭ塩化コバルトを補充する。反応は、５００μＭのｄＮＴＰ、１０μＭの一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドおよび１μｇの酵素／１０μｌの反応物の存在下で行う。反応物を３０℃で１５分間インキュベートする。反応を１０μｌ容量で行い、氷上でセットアップした。
ｐＨ ７．５の５０ｍＭカリウムアセタートおよび２０ｍＭトリスアセタートからなる緩衝液中で反応を行うことによって、個々のｄＮＴＰを使用する酵素活性をアッセイする。反応緩衝液に１０ｍＭマグネシウムアセタートおよび２５０μＭ塩化コバルトを補充する。反応は、５００μＭのｄＮＴＰ、１０μＭの一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドおよび１μｇの酵素／１０μｌの反応物の存在下で行う。反応物を３０℃で１５分間インキュベートする。反応を１０μｌ容量で行い、氷上でセットアップした。
【0135】
以下の個々のｄＮＴＰおよびＤＮＡオリゴヌクレオチド対を各反応に使用する：ｄＴＴＰ＋ＰＧ５８６１（GTCCTCAATCGCACTGGAAT、配列番号４５）；ｄＧＴＰ＋ＰＧ５８６４（GTCCTCAATCGCACTGGAATT、配列番号４６）；ｄＡＴＰ＋ＰＧ５８６５（GTCCTCAATCGCACTGGAATTG、配列番号４７）；ｄＣＴＰ＋ＰＧ５８６６（GTCCTCAATCGCACTGGAATTGA、配列番号４８）。標準的なオリゴヌクレオチドも分析に使用する。：ＰＧ５８６７（GTCCTCAATCGCACTGGAATTGAC、配列番号５４）
【0136】
等体積の２×ＮＯＶＥＸ（商標）ＴＢＥ－尿素サンプルバッファー（サーモフィッシャ－（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、ウォルサム、マサチューセッツ州）を添加して反応を停止させ、７０℃で３分間加熱する。サンプルを冷却し、１５μｌをＮＯＶＥＸ（商標）ＴＢＥ－尿素ポリアクリルアミドゲル（１５％、サーモフィッシャ－（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、ウォルサム、マサチューセッツ州）に添加し、１５０Ｖで電気泳動し、メチレンブルーで染色し、脱イオン水で脱染色し、ＡＺＵＲＥ（商標）２００ゲルイメージングワークステーション（アズール・バイオシステムズ（Ａｚｕｒｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、ダブリン、カリフォルニア州）を使用して白色光で画像化する。
【0137】
図３Ａは、上に列挙した４つの異なるオリゴヌクレオチド基質への単一ヌクレオチドの効率的な付加を示す。
【0138】
連続的なヌクレオチド付加のためのアッセイ
ｐＨ ７．５の５０ｍＭカリウムアセタートおよび２０ｍＭトリスアセタートからなる緩衝液中で連続的ヌクレオチド付加反応を行う。反応緩衝液に１０ｍＭマグネシウムアセタートおよび２５０μＭ塩化コバルトを補充した。反応は、５００μＭのｄＮＴＰ、１０μＭの一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドおよび１μｇの酵素／１０μｌの反応物の存在下で行う。反応物を３０℃で１５分間インキュベートする。複数のｄＮＴＰを添加するために連続的反応を行う場合、反応体積を１００μｌまで拡大する。最初の反応は、ヌクレオシドトリホスファートとして以下の配列ＰＧ５８６１（GTCCTCAATCGCACTGGAAT、配列番号４５）およびｄＴＴＰを有する一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドを使用して行う。
ｐＨ ７．５の５０ｍＭカリウムアセタートおよび２０ｍＭトリスアセタートからなる緩衝液中で連続的ヌクレオチド付加反応を行う。反応緩衝液に１０ｍＭマグネシウムアセタートおよび２５０μＭ塩化コバルトを補充した。反応は、５００μＭのｄＮＴＰ、１０μＭの一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドおよび１μｇの酵素／１０μｌの反応物の存在下で行う。反応物を３０℃で１５分間インキュベートする。複数のｄＮＴＰを添加するために連続的反応を行う場合、反応体積を１００μｌまで拡大する。最初の反応は、ヌクレオシドトリホスファートとして以下の配列ＰＧ５８６１（GTCCTCAATCGCACTGGAAT、配列番号４５）およびｄＴＴＰを有する一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドを使用して行う。
【0139】
反応を１００℃で３分間沸騰させることによって停止させ、オリゴヌクレオチドを、ザイモリサーチ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）（アーバイン、カリフォルニア州）製のオリゴヌクレオチドクリーンアンドコンセントレーター（Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｃｌｅａｎ ａｎｄ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ）キットを製造者の説明書に従って使用してシリカカラム上の反応成分から精製し、蒸留水に溶出させる。精製されたオリゴヌクレオチドの濃度を、サーモサイエンティフィック（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）（ウォルサム、マサチューセッツ州）製のＮＡＮＯＤＲＯＰ（商標）Ｏｎｅ分光光度計およびゲル電気泳動のために確保されたアリコートを使用して測定する。次いで、残りの精製オリゴヌクレオチドを、出発オリゴヌクレオチドと同じプロセスでｄＧＴＰを使用する付加反応に使用する。
【0140】
以下のオリゴヌクレオチドをサンプルに添加し、二重分析（図４Ｂ、図４Ｄ、図４Ｆおよび図４Ｈを参照されたい。）を行うことによって標準として使用する：ＰＧ５８６１（GTCCTCAATCGCACTGGAAT、配列番号４５）；ＰＧ５８６４（GTCCTCAATCGCACTGGAATT、配列番号４６）；ＰＧ５８６５（GTCCTCAATCGCACTGGAATTG、配列番号４７）；ＰＧ５８６６（GTCCTCAATCGCACTGGAATTGA、配列番号４８）；およびＰＧ５８６７（GTCCTCAATCGCACTGGAATTGAC、配列番号５４）。
【0141】
ゲル電気泳動による分析のために、等体積の２×ＮＯＶＥＸ（商標）ＴＢＥ－尿素サンプルバッファー（サーモフィッシャ－（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、ウォルサム、マサチューセッツ州）を添加してサンプルを希釈し、７０℃で３分間加熱する。サンプルを冷却し、１５μｌをＮＯＶＥＸ（商標）ＴＢＥ－尿素ポリアクリルアミドゲル（１５％、サーモフィッシャ－（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、ウォルサム、マサチューセッツ州）に添加し、１５０Ｖで電気泳動し、メチレンブルーで染色し、脱イオン水で脱染色し、ＡＺＵＲＥ（商標）２００ゲルイメージングワークステーション（アズール・バイオシステムズ（Ａｚｕｒｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、ダブリン、カリフォルニア州）を使用して白色光で画像化する。
【0142】
図３Ｂは、配列番号４５に示される配列を有するオリゴヌクレオチド基質への２つのヌクレオチドの効率的な連続的付加を示す。
【0143】
キャピラリー電気泳動による単一ヌクレオチド付加のアッセイ
ｐＨ ７．５の５０ｍＭカリウムアセタートおよび２０ｍＭトリスアセタートからなる緩衝液中で反応を行うことによって、個々のｄＮＴＰオリゴヌクレオチド対を使用する酵素活性をアッセイする。反応緩衝液に１０ｍＭマグネシウムアセタートおよび２５０μＭ塩化コバルトを補充する。反応は、５００μＭのｄＮＴＰ、１０μＭの一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドおよび１μｇの酵素／１０μｌの反応物の存在下で行う。反応物を３０℃で１５分間インキュベートする。反応を１０μｌ容量で行い、氷上でセットアップする。
ｐＨ ７．５の５０ｍＭカリウムアセタートおよび２０ｍＭトリスアセタートからなる緩衝液中で反応を行うことによって、個々のｄＮＴＰオリゴヌクレオチド対を使用する酵素活性をアッセイする。反応緩衝液に１０ｍＭマグネシウムアセタートおよび２５０μＭ塩化コバルトを補充する。反応は、５００μＭのｄＮＴＰ、１０μＭの一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドおよび１μｇの酵素／１０μｌの反応物の存在下で行う。反応物を３０℃で１５分間インキュベートする。反応を１０μｌ容量で行い、氷上でセットアップする。
【0144】
使用オリゴヌクレオチド：ＰＧ５８６１（GTCCTCAATCGCACTGGAAT、配列番号４５）；ＰＧ５８６４（GTCCTCAATCGCACTGGAATT、配列番号４６）；ＰＧ５８７２（GTCCTCAATCGCACTGGAATG、配列番号５３）；ＰＧ５８５９（GTCCTCAATCGCACTGGAAG、配列番号４３）；ＰＧ５８６８（GTCCTCAATCGCACTGGAAGT、配列番号４９）；ＰＧ５８６９（GTCCTCAATCGCACTGGAAGC、配列番号５０）；ＰＧ５８５８（GTCCTCAATCGCACTGGAAA、配列番号４２）。
【0145】
各オリゴヌクレオチドへの酵素的付加を、個々の反応においてｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＣＴＰを用いて別々に評価する。反応を１００℃で３分間沸騰させることによって停止させ、オリゴヌクレオチドを、ザイモリサーチ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）（アーバイン、カリフォルニア州）製のオリゴヌクレオチドクリーンアンドコンセントレーター（Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｃｌｅａｎ ａｎｄ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ）キットを製造者の説明書に従って使用してシリカカラム上の反応成分から精製し、蒸留水に溶出させる。次いで、精製されたオリゴヌクレオチドを、２４キャピラリーアレイを使用して、アジレント・テクノロジー（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）（サンタクララ、カリフォルニア州）によるＡｇｉｌｅｎｔ Ｏｌｉｇｏ Ｐｒｏ ＩＩキャピラリー電気泳動システムで分析する。９～１２ｋＶの範囲の注入法を用いて１０秒間分析し、続いて１５ｋＶで７０分間分離するために、水中の精製オリゴヌクレオチドを約０．５～２μＭに希釈する。データを、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｏｌｉｇｏ Ｐｒｏ ＩＩ データ分析ソフトウェア２．０．０．３（アジレント・テクノロジー（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、サンタクララ、カリフォルニア州）を使用して分析する。反応の分析は、各サンプルに対して２回の独立した実行を行うことによって行われる。１回の実行は、出発オリゴヌクレオチド（図４Ａ、図４Ｃ、図４Ｅおよび図４Ｇ）の純度および転化率を評価するためにＡｇｉｌｅｎｔ Ｏｌｉｇｏ Ｐｒｏ ＩＩ上の純粋なサンプルのみを含む。反応を行った後、精製されたオリゴヌクレオチドを正確にサイズ決定するために、各サンプルにスパイクされた標準を用いて第２の実行を行う（図４Ｂ、図４Ｄ、図４Ｆおよび図４Ｈ）。
【0146】
以下のオリゴヌクレオチド標準を約１μＭの最終濃度でスパイクインする：ＰＧ１３５０（GCGTCACGCTACCAACCA、配列番号４１）；ＰＧ５８７０（GTCCTCAATCGCACTGGAAACATCAAGGTC、配列番号５１）；ＰＧ５８７１（GTCCTCAATCGCACTGGAAACATCAAGGTCATACGGAACG、配列番号５２）。各特異的反応で使用されるオリゴヌクレオチドはまた、標準物質と共に約１μＭでスパイクインされる。
【0147】
Ａｇｉｌｅｎｔ Ｏｌｉｇｏ Ｐｒｏ ＩＩ機器での代表的なキャピラリー電気泳動の実行からのプロファイルを図４Ａ～Ｈに示す。図４Ａおよび４Ｂは、酵素反応で処理されていない対照オリゴヌクレオチドのキャピラリー電気泳動の実行を示す。図４Ｃおよび図４Ｄは、オリゴヌクレオチドＰＧ５８６１（配列番号４５）とｄＴＴＰおよび酵素ＥＤＳ０８２との反応後の一本鎖オリゴヌクレオチドへの単一ヌクレオチドの部分的付加を示す（表１参照）。図４Ｅおよび図４Ｆは、オリゴヌクレオチドＰＧ５８６１（配列番号４５）とｄＴＴＰおよび酵素ＥＤＳ０５４との反応後の一本鎖オリゴヌクレオチドへの単一ヌクレオチドの効率的付加を示す（表１参照）。図４Ｇおよび４Ｈは、オリゴヌクレオチドＰＧ５８６１（配列番号４５）とｄＴＴＰおよび酵素ＥＤＳ０６６との反応後の一本鎖オリゴヌクレオチドへの１、２、３、４および５ヌクレオチドの付加を示す（表１参照）。
【0148】
単一ヌクレオチド付加を示す５０の代表的な反応の結果を以下の表２に要約する。
Ｎは、これらの反応において基質として働くオリゴヌクレオチドのヌクレオチド長を意味する。
％＜Ｎは、Ｎよりも短い生成物（例えば、オリゴヌクレオチド基質の分解生成物）のパーセントを意味する。
％Ｎは、Ｎの長さを有する生成物（例えば、未反応オリゴヌクレオチド基質）のパーセントを意味する。
％Ｎ＋１は、Ｎよりも１ヌクレオチド長い生成物（例えば所望の伸長生成物）のパーセントを意味する。
％Ｎ＋＞１は、Ｎよりも２ヌクレオチド以上長い生成物（例えば、２ヌクレオチド以上の付加ヌクレオチドを受けたオリゴヌクレオチド基質の伸長生成物）のパーセントを意味する。
表は、各例における所望のＮ＋１伸長生成物の収率を明確に示し、単一ヌクレオチド付加効率は３６％～１００％の範囲である。
Ｎは、これらの反応において基質として働くオリゴヌクレオチドのヌクレオチド長を意味する。
％＜Ｎは、Ｎよりも短い生成物（例えば、オリゴヌクレオチド基質の分解生成物）のパーセントを意味する。
％Ｎは、Ｎの長さを有する生成物（例えば、未反応オリゴヌクレオチド基質）のパーセントを意味する。
％Ｎ＋１は、Ｎよりも１ヌクレオチド長い生成物（例えば所望の伸長生成物）のパーセントを意味する。
％Ｎ＋＞１は、Ｎよりも２ヌクレオチド以上長い生成物（例えば、２ヌクレオチド以上の付加ヌクレオチドを受けたオリゴヌクレオチド基質の伸長生成物）のパーセントを意味する。
表は、各例における所望のＮ＋１伸長生成物の収率を明確に示し、単一ヌクレオチド付加効率は３６％～１００％の範囲である。
【表5-1】
【表5-2】
【0149】
リボヌクレオチドの付加のためのアッセイ
ｐＨ ７．５の５０ｍＭカリウムアセタートおよび２０ｍＭトリスアセタートからなる緩衝液中で反応を行うことによって、４つのＮＴＰの等モル混合物を使用する酵素活性をアッセイする。反応緩衝液に１０ｍＭマグネシウムアセタートおよび２５０μＭ塩化コバルトを補充した。反応は、５００μＭのＮＴＰ、１０μＭの一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドおよび１μｇの酵素／１０μｌの反応物の存在下で行う。反応物を、１５℃で開始し、１℃／分の速度で３７℃まで上昇する温度範囲でインキュベートする。反応を１０μｌ容量で行い、氷上でセットアップする。
ｐＨ ７．５の５０ｍＭカリウムアセタートおよび２０ｍＭトリスアセタートからなる緩衝液中で反応を行うことによって、４つのＮＴＰの等モル混合物を使用する酵素活性をアッセイする。反応緩衝液に１０ｍＭマグネシウムアセタートおよび２５０μＭ塩化コバルトを補充した。反応は、５００μＭのＮＴＰ、１０μＭの一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドおよび１μｇの酵素／１０μｌの反応物の存在下で行う。反応物を、１５℃で開始し、１℃／分の速度で３７℃まで上昇する温度範囲でインキュベートする。反応を１０μｌ容量で行い、氷上でセットアップする。
【0150】
初期活性スクリーニング（図５Ａ）のために、一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドの等モル混合物を使用する：ＰＧ５８６１（GTCCTCAATCGCACTGGAAT、配列番号４５）；ＰＧ５８５９（GTCCTCAATCGCACTGGAAG、配列番号４３）；ＰＧ５８６０（GTCCTCAATCGCACTGGAAC、配列番号４４）；ＰＧ５８５８（GTCCTCAATCGCACTGGAAA、配列番号４２）。一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドへのＮＴＰの付加をアッセイするために（図５Ｂ）、ＰＧ５８６１（GTCCTCAATCGCACTGGAAT、配列番号４５）を各反応に使用する。
【0151】
等体積の２×ＮＯＶＥＸ（商標）ＴＢＥ－尿素サンプルバッファー（サーモフィッシャ－（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、ウォルサム、マサチューセッツ州）を添加して反応を停止させ、７０℃に３分間加熱する。サンプルを冷却し、１５μｌをＮＯＶＥＸ（商標）ＴＢＥ－尿素ポリアクリルアミドゲル（１５％、サーモフィッシャ－（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、ウォルサム、マサチューセッツ州）に添加し、１５０Ｖで電気泳動し、メチレンブルーで染色し、水で脱染色し、ＡＺＵＲＥ（商標）２００ゲルイメージングワークステーションを使用して白色光で画像化する。
【0152】
リボヌクレオチドのＤＮＡオリゴヌクレオチドへの付加からの結果の例を図５に示す。酵素ＥＤＳ０１７、ＥＤＳ０２４、ＥＤＳ０２９、ＥＤＳ０３０、ＥＤＳ０６６、ＥＤＳ０８２、ＥＤＳ０４８およびＥＤＳ０１５は全て、リボヌクレオチドを組み込む能力を示した。ほとんどの場合、この取り込みは１～３ヌクレオチドに限定された。
【0153】
異なる酵素がリボヌクレオチドをＤＮＡオリゴヌクレオチドの末端に付加する能力を表３に要約する。
【表6】
【0154】
参考文献
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【0245】
Ｚｏｌｌｅｒ ＭＪ（１９９１）．タンパク質工学のための新しい分子生物学的方法（Ｎｅｗ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）．Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２（４）：５２６－５３１．
【0246】
本明細書中で引用される全ての刊行物、データベース、ＧｅｎＢａｎｋ配列、特許および特許出願は、それぞれが参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示されているかのように、参照により本明細書中に組み込まれる。
【配列表フリーテキスト】
【0247】
配列表１１ ＜２２３＞Ｈｉｓ６タグ付きクローンＥＤＳ０１７配列
配列表１２ ＜２２３＞Ｈｉｓ６タグ付きクローンＥＤＳ０２４配列
配列表１３ ＜２２３＞Ｈｉｓ６タグ付きクローンＥＤＳ０２９配列
配列表１４ ＜２２３＞Ｈｉｓ６タグ付きクローンＥＤＳ０３０配列
配列表１５ ＜２２３＞Ｈｉｓ６タグ付きクローンＥＤＳ０５３配列
配列表１６ ＜２２３＞Ｈｉｓ６タグ付きクローンＥＤＳ０５４配列
配列表１７ ＜２２３＞Ｈｉｓ６タグ付きクローンＥＤＳ０６６配列
配列表１８ ＜２２３＞Ｈｉｓ６タグ付きクローンＥＤＳ０８２配列
配列表１９ ＜２２３＞Ｈｉｓ６タグ付きクローンＥＤＳ０４８配列
配列表２０ ＜２２３＞Ｈｉｓ６タグ付きクローンＥＤＳ０１５配列
配列表２１ ＜２２３＞Ｈｉｓ６タグ付きＥＤＳ０１７発現タンパク質配列
配列表２２ ＜２２３＞Ｈｉｓ６タグ付きＥＤＳ０２４発現タンパク質配列
配列表２３ ＜２２３＞Ｈｉｓ６タグ付きＥＤＳ０２９発現タンパク質配列
配列表２４ ＜２２３＞Ｈｉｓ６タグ付きＥＤＳ０３０発現タンパク質配列
配列表２５ ＜２２３＞Ｈｉｓ６タグ付きＥＤＳ０５３発現タンパク質配列
配列表２６ ＜２２３＞Ｈｉｓ６タグ付きＥＤＳ０５４発現タンパク質配列
配列表２７ ＜２２３＞Ｈｉｓ６タグ付きＥＤＳ０６６発現タンパク質配列
配列表２８ ＜２２３＞Ｈｉｓ６タグ付きＥＤＳ０８２発現タンパク質配列
配列表２９ ＜２２３＞Ｈｉｓ６タグ付きＥＤＳ０４８発現タンパク質配列
配列表３０ ＜２２３＞Ｈｉｓ６タグ付きＥＤＳ０１５発現タンパク質配列
配列表３１ ＜２２３＞ＰＰ１０７７発現ベクター全配列
配列表３２ ＜２２３＞ＰＰ１０８４発現ベクター全配列
配列表３３ ＜２２３＞ＰＰ１０８９発現ベクター全配列
配列表３４ ＜２２３＞ＰＰ１０９０発現ベクター全配列
配列表３５ ＜２２３＞ＰＰ１１１３発現ベクター全配列
配列表３６ ＜２２３＞ＰＰ１１１４発現ベクター全配列
配列表３７ ＜２２３＞ＰＰ１１２６発現ベクター全配列
配列表３８ ＜２２３＞ＰＰ１１４２発現ベクター全配列
配列表３９ ＜２２３＞ＰＰ１１０８発現ベクター全配列
配列表４０ ＜２２３＞ＰＰ１０７５発現ベクター全配列
配列表４１ ＜２２３＞ＰＧ１３５０オリゴヌクレオチド
配列表４２ ＜２２３＞ＰＧ５８５８オリゴヌクレオチド
配列表４３ ＜２２３＞ＰＧ５８５９オリゴヌクレオチド
配列表４４ ＜２２３＞ＰＧ５８６０オリゴヌクレオチド
配列表４５ ＜２２３＞ＰＧ５８６１オリゴヌクレオチド
配列表４６ ＜２２３＞ＰＧ５８６４オリゴヌクレオチド
配列表４７ ＜２２３＞ＰＧ５８６５オリゴヌクレオチド
配列表４８ ＜２２３＞ＰＧ５８６６オリゴヌクレオチド
配列表４９ ＜２２３＞ＰＧ５８６８オリゴヌクレオチド
配列表５０ ＜２２３＞ＰＧ５８６９オリゴヌクレオチド
配列表５１ ＜２２３＞ＰＧ５８７０オリゴヌクレオチド
配列表５２ ＜２２３＞ＰＧ５８７１オリゴヌクレオチド
配列表５３ ＜２２３＞ＰＧ５８７２オリゴヌクレオチド
配列表５４ ＜２２３＞ＰＧ５８６７オリゴヌクレオチド
配列表１２ ＜２２３＞Ｈｉｓ６タグ付きクローンＥＤＳ０２４配列
配列表１３ ＜２２３＞Ｈｉｓ６タグ付きクローンＥＤＳ０２９配列
配列表１４ ＜２２３＞Ｈｉｓ６タグ付きクローンＥＤＳ０３０配列
配列表１５ ＜２２３＞Ｈｉｓ６タグ付きクローンＥＤＳ０５３配列
配列表１６ ＜２２３＞Ｈｉｓ６タグ付きクローンＥＤＳ０５４配列
配列表１７ ＜２２３＞Ｈｉｓ６タグ付きクローンＥＤＳ０６６配列
配列表１８ ＜２２３＞Ｈｉｓ６タグ付きクローンＥＤＳ０８２配列
配列表１９ ＜２２３＞Ｈｉｓ６タグ付きクローンＥＤＳ０４８配列
配列表２０ ＜２２３＞Ｈｉｓ６タグ付きクローンＥＤＳ０１５配列
配列表２１ ＜２２３＞Ｈｉｓ６タグ付きＥＤＳ０１７発現タンパク質配列
配列表２２ ＜２２３＞Ｈｉｓ６タグ付きＥＤＳ０２４発現タンパク質配列
配列表２３ ＜２２３＞Ｈｉｓ６タグ付きＥＤＳ０２９発現タンパク質配列
配列表２４ ＜２２３＞Ｈｉｓ６タグ付きＥＤＳ０３０発現タンパク質配列
配列表２５ ＜２２３＞Ｈｉｓ６タグ付きＥＤＳ０５３発現タンパク質配列
配列表２６ ＜２２３＞Ｈｉｓ６タグ付きＥＤＳ０５４発現タンパク質配列
配列表２７ ＜２２３＞Ｈｉｓ６タグ付きＥＤＳ０６６発現タンパク質配列
配列表２８ ＜２２３＞Ｈｉｓ６タグ付きＥＤＳ０８２発現タンパク質配列
配列表２９ ＜２２３＞Ｈｉｓ６タグ付きＥＤＳ０４８発現タンパク質配列
配列表３０ ＜２２３＞Ｈｉｓ６タグ付きＥＤＳ０１５発現タンパク質配列
配列表３１ ＜２２３＞ＰＰ１０７７発現ベクター全配列
配列表３２ ＜２２３＞ＰＰ１０８４発現ベクター全配列
配列表３３ ＜２２３＞ＰＰ１０８９発現ベクター全配列
配列表３４ ＜２２３＞ＰＰ１０９０発現ベクター全配列
配列表３５ ＜２２３＞ＰＰ１１１３発現ベクター全配列
配列表３６ ＜２２３＞ＰＰ１１１４発現ベクター全配列
配列表３７ ＜２２３＞ＰＰ１１２６発現ベクター全配列
配列表３８ ＜２２３＞ＰＰ１１４２発現ベクター全配列
配列表３９ ＜２２３＞ＰＰ１１０８発現ベクター全配列
配列表４０ ＜２２３＞ＰＰ１０７５発現ベクター全配列
配列表４１ ＜２２３＞ＰＧ１３５０オリゴヌクレオチド
配列表４２ ＜２２３＞ＰＧ５８５８オリゴヌクレオチド
配列表４３ ＜２２３＞ＰＧ５８５９オリゴヌクレオチド
配列表４４ ＜２２３＞ＰＧ５８６０オリゴヌクレオチド
配列表４５ ＜２２３＞ＰＧ５８６１オリゴヌクレオチド
配列表４６ ＜２２３＞ＰＧ５８６４オリゴヌクレオチド
配列表４７ ＜２２３＞ＰＧ５８６５オリゴヌクレオチド
配列表４８ ＜２２３＞ＰＧ５８６６オリゴヌクレオチド
配列表４９ ＜２２３＞ＰＧ５８６８オリゴヌクレオチド
配列表５０ ＜２２３＞ＰＧ５８６９オリゴヌクレオチド
配列表５１ ＜２２３＞ＰＧ５８７０オリゴヌクレオチド
配列表５２ ＜２２３＞ＰＧ５８７１オリゴヌクレオチド
配列表５３ ＜２２３＞ＰＧ５８７２オリゴヌクレオチド
配列表５４ ＜２２３＞ＰＧ５８６７オリゴヌクレオチド
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図1D】
【図2】
【図3】
【図4-1】
【図4-2】
【図4-3】
【図4-4】
【図5】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2024-02-13
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
（ａ）単一容器中で、核酸基質、過剰の遊離非ブロック化ヌクレオシドトリホスファート、および少なくとも１つの鋳型非依存性核酸ポリメラーゼを組み合わせることと、（ｂ）（ａ）の混合物を、前記少なくとも１つの鋳型非依存性核酸ポリメラーゼが活性であり、反応物中に存在する前記核酸基質の分子に単一ヌクレオチドのみを付加する条件下で反応させて、前記鋳型非依存性核酸ポリメラーゼの活性の変化を誘発または誘導する、反応への変化または反応中の変化なしに、新規核酸分子を形成することと、
（ｃ）遊離ヌクレオチドから、および任意に前記少なくとも１つの鋳型非依存性核酸ポリメラーゼから前記新規核酸分子を分離することと、
（ｄ）所望の合成された核酸を得るために工程（ａ）～（ｃ）を繰り返すことであって、所望の核酸が合成されるまで、工程（ｃ）の前記新規核酸分子が工程（ａ）の前記核酸基質として働く、繰り返すことと
を含む、所望の核酸を合成するプロセス。
【請求項2】
前記核酸基質がＲＮＡである、請求項１に記載のプロセス。
【請求項3】
前記核酸基質がＤＮＡである、請求項１に記載のプロセス。
【請求項4】
前記核酸基質が、リボヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチドの両方を含有するキメラ核酸である、請求項１に記載のプロセス。
【請求項5】
前記合成された核酸がＲＮＡである、請求項１～４のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項6】
前記合成された核酸がＤＮＡである、請求項１～４のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項7】
前記合成された核酸が、リボヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチドの両方を含有するキメラ分子である、請求項１～４のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項8】
前記核酸ポリメラーゼがＲＮＡポリメラーゼである、請求項１～８のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項9】
前記核酸ポリメラーゼがＤＮＡポリメラーゼである、請求項１～８のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項10】
前記核酸ポリメラーゼがＸファミリーＤＮＡポリメラーゼである、請求項１～８のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項11】
前記核酸ポリメラーゼがＹファミリーＤＮＡポリメラーゼである、請求項１～８のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項12】
前記核酸基質が固体支持体上に固定化される、請求項１～１１のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項13】
前記鋳型非依存性核酸ポリメラーゼが、単一ヌクレオチドのみを前記核酸基質に付加するのに３６～１００％効率的である、請求項１～１２のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項14】
前記鋳型非依存性核酸ポリメラーゼが、単一ヌクレオチドのみを前記核酸基質に付加するのに６０～１００％効率的である、請求項１～１３のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項15】
前記鋳型非依存性核酸ポリメラーゼが、単一ヌクレオチドのみを前記核酸基質に付加するのに８０～１００％効率的である、請求項１～１４のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項16】
前記鋳型非依存性核酸ポリメラーゼが、単一ヌクレオチドのみを前記核酸基質に付加するのに９０～１００％効率的である、請求項１～１５のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項17】
前記鋳型非依存性核酸ポリメラーゼが、単一ヌクレオチドのみを前記核酸基質に付加するのに１００％効率的である、請求項１～１６のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項18】
核酸基質末端に対してモル過剰の鋳型非依存性核酸ポリメラーゼが存在する、請求項１～１７のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項19】
等モル量の鋳型非依存性核酸ポリメラーゼおよび核酸基質末端が存在する、請求項１～１７のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項20】
鋳型非依存性核酸ポリメラーゼに対してモル過剰の核酸基質末端が存在する、請求項１～１７のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項21】
（ｄ）において使用される前記少なくとも１つの鋳型非依存性核酸ポリメラーゼが、工程（ａ）において使用される前記少なくとも１つの鋳型非依存性核酸ポリメラーゼとは異なる、請求項１～２０のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項22】
前記少なくとも１つの鋳型非依存性核酸ポリメラーゼが固体支持体上に固定化される、請求項１～２１のいずれか一項に記載のプロセス。
【国際調査報告】