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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-06-18
(54)【発明の名称】新規多能性細胞
(51)【国際特許分類】
C12N 5/10 20060101AFI20240611BHJP
C12Q 1/02 20060101ALI20240611BHJP
A61K 35/545 20150101ALI20240611BHJP
C12N 15/12 20060101ALN20240611BHJP
【ＦＩ】
C12N5/10 ZNA
C12Q1/02
A61K35/545
C12N15/12
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023575400
(86)(22)【出願日】2022-06-02
(85)【翻訳文提出日】2024-01-29
(86)【国際出願番号】 KR2022007867
(87)【国際公開番号】W WO2022255825
(87)【国際公開日】2022-12-08
(31)【優先権主張番号】10-2021-0071679
(32)【優先日】2021-06-02
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】500197682
【氏名又は名称】コリア リサーチ インスティチュート オブ バイオサイエンス アンド バイオテクノロジー
(71)【出願人】
【識別番号】523456043
【氏名又は名称】テグ・キョンブク・インスティチュート・オブ・サイエンス・アンド・テクノロジー
【氏名又は名称原語表記】Ｄａｅｇｕ Ｇｙｅｏｎｇｂｕｋ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
(74)【代理人】
【識別番号】100145403
【弁理士】
【氏名又は名称】山尾 憲人
(74)【代理人】
【識別番号】100156144
【弁理士】
【氏名又は名称】落合 康
(72)【発明者】
【氏名】キム，ジャンファン
(72)【発明者】
【氏名】ハ，ジョンミン
(72)【発明者】
【氏名】キム，ジョンギョン
(72)【発明者】
【氏名】イ，チョンソ
(72)【発明者】
【氏名】ソン，ミヨン
(72)【発明者】
【氏名】チョン，ギョンスク
(72)【発明者】
【氏名】ナム，ジュヒョン
(72)【発明者】
【氏名】ベク，アルム
(72)【発明者】
【氏名】ジョン，ヨンジュ
【テーマコード（参考）】
4B063
4B065
4C087
【Ｆターム（参考）】
4B063QA01
4B063QA05
4B063QA18
4B063QQ08
4B063QQ13
4B063QS05
4B063QS38
4B063QX01
4B065AA91X
4B065AA91Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA01
4B065BB12
4B065BB25
4B065BB37
4B065BC11
4B065CA24
4B065CA44
4B065CA46
4C087AA03
4C087BB64
4C087CA04
4C087DA32
4C087NA20
(57)【要約】
本発明は、非多能性細胞を多能性細胞に変換する方法；該方法により産生された細胞；およびその使用に関する。本発明の多能性細胞は、3個の胚葉に分化できる優れた細胞分化能および多能性を有しながら低発癌性であり、リプログラミングの中間段階における多能性細胞を特異的に分離でき、故に、慣用の誘導多能性幹細胞と異なる特徴を有する多能性細胞の産生が可能である。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
非多能性細胞を多能性細胞に変換する方法であって、非多能性細胞をリプログラミング因子を発現するように誘導し、それによりデスモソーム関連遺伝子または上皮細胞分化関連遺伝子を過剰発現させる
ことを含む、方法。
【請求項2】
さらにデスモソーム関連遺伝子または上皮細胞分化関連遺伝子の過剰発現とその後の減少を含む、請求項1の方法。
【請求項3】
リプログラミング因子がOct4、Sox2、Klf4およびc-Mycからなる群から選択される1以上の因子である、請求項1の方法。
【請求項4】
リプログラミング因子の発現の制限を含む、請求項1の方法。
【請求項5】
デスモソーム関連遺伝子または上皮細胞分化関連遺伝子がDsg3、Dsg4、Dsp、Evpl、Jup、PerpおよびPkp1から選択される少なくとも1個の遺伝子である、請求項1の方法。
【請求項6】
請求項1の非多能性細胞を多能性細胞に変換する方法により産生された多能性細胞。
【請求項7】
多能性細胞が、誘導多能性幹細胞(iPSC)における対応する遺伝子と比較してNanog、Rex1およびEsrrbからなる群から選択される少なくとも1個の遺伝子の発現の減少を示す、請求項6の多能性細胞。
【請求項8】
多能性細胞が、外胚葉、中胚葉または内胚葉を構成する細胞に分化できる、請求項6の多能性細胞。
【請求項9】
多能性細胞が、iPSCと比較して発癌性が減少している、請求項6の多能性細胞。
【請求項10】
少なくとも1個の遺伝子がiPSCにおける対応する遺伝子と比較して少なくとも10倍の発現減少を示す、請求項7の多能性細胞。
【請求項11】
多能性細胞が、Spink2の発現がiPSCと比較して少なくとも10倍増加している、請求項6の多能性細胞。
【請求項12】
多能性細胞が、さらにShisa3、Foxo4、Ptp4a3、Blvra、Mbnl3、Mthfd2およびDctpp1からなる群から選択される少なくとも1個のマーカー遺伝子を発現する、請求項6の多能性細胞。
【請求項13】
デスモソーム関連遺伝子または上皮細胞分化関連遺伝子の発現がiPSCにおける対応する遺伝子の発現レベルより高い；またはSpink2遺伝子の発現レベルがiPSCにおける該遺伝子の発現レベルより高い；および
Nanog、Rex1およびEsrrbからなる群から選択される少なくとも1個の遺伝子の発現レベルがiPSCにおける対応する遺伝子の発現レベルと比較して減少している、
細胞。
【請求項14】
デスモソーム関連遺伝子または上皮細胞分化関連遺伝子の発現がiPSCにおける対応する遺伝子の発現レベルより高く、Dsp遺伝子およびShisa8遺伝子を発現する、請求項13の細胞。
【請求項15】
Spink2遺伝子の発現レベルがiPSCにおける該遺伝子の発現レベルより高く、外胚葉細胞、中胚葉細胞または内胚葉細胞の何れかに分化する能力である多能性を示す、請求項13の細胞。
【請求項16】
細胞を産生するための方法であって、請求項6～12の何れかの多能性細胞または請求項13～15の何れかの細胞の分化の誘導を含む、方法。
【請求項17】
細胞移植または生物組織再生のための組成物であって、活性成分として：請求項6～12の何れかの多能性細胞；
請求項13～15の何れかの細胞；または
請求項6～12の何れかの多能性細胞または請求項13～15の何れかの細胞の分化の誘導を含む、細胞を産生するための方法により産生された細胞
を含む、組成物。
【請求項18】
試験物質の有効性または毒性を評価するための方法であって：請求項6～12の何れかの多能性細胞；
請求項13～15の何れかの細胞；または
請求項6～12の何れかの多能性細胞または請求項13～15の何れかの細胞の分化の誘導を含む、細胞を産生するための方法により産生された細胞
を試験物質と接触させることを含む、方法。
【請求項19】
個体に：請求項6～12の何れかの多能性細胞；
請求項13～15の何れかの細胞；または
請求項6～12の何れかの多能性細胞または請求項13～15の何れかの細胞の分化の誘導を含む、細胞を産生するための方法により産生された細胞
を投与することによる、生物組織を再生する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、非多能性細胞を多能性細胞に変換する方法、該方法により変換された細胞およびその使用に関する。
【背景技術】
【0002】
多能性幹細胞は無限に自己再生し、全成熟細胞に分化し得る。一方では、多能性幹細胞は一般に胚幹細胞、核移植胚幹細胞および誘導多能性幹細胞(iPSC)に分裂する。胚幹細胞は、本質的に胚に由来することに基づく免疫拒絶反応による制限および倫理上の制限があり、体細胞の核を卵細胞に移植することにより産生された幹細胞である核移植胚幹細胞は、免疫拒絶反応がなく、大量生産の可能性がある利点を有するが、卵細胞の使用による倫理上の制限があり、かつ発癌性の欠点を有する。
【0003】
一方では、iPSCは、分化がすでに完了している体細胞を、特定の遺伝子操作により分化前の細胞期に誘導することにより製造される、幹細胞である。iPSCの利点は、個々の／疾患特異的多能性を有する幹細胞を産生できることである。しかしながら、分化した体細胞からiPSCを産生する効率がわずか1％以下であり、所望の特異的細胞に分化するiPSCの効率も低く、発癌性があるとの制限がある。
【0004】
従って、発癌性がiPSCで示される発癌性と比較して顕著に低減されているかまたは小さく、優れた細胞分化能を有する、所望の細胞に分化する多能性を有する新規多能性細胞および新規多能性細胞を産生する方法を開発する必要がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
本発明者らは、iPSCの特徴的マーカー遺伝子(Nanog、Rex1およびEsrrb)をほとんど発現せず、iPSCより低い発癌性ならびに3個の胚葉に分化できる細胞分化能および多能性を有する多能性細胞を、既に分化している非多能性細胞をリプログラミング因子で処理することによりまたは非多能性細胞がリプログラミング因子を発現するようにすることにより、細胞の運命を変更して産生して、本発明を完成させた。
【課題を解決するための手段】
【0006】
本発明のある実施態様において、本発明は、非多能性細胞を多能性細胞に変換する方法であって、非多能性細胞をリプログラミング因子を発現するように誘導し、それによりデスモソーム関連遺伝子または上皮細胞分化関連遺伝子を過剰発現させることを含む、方法を提供する。
【0007】
本発明の他の実施態様において、本発明は、非多能性細胞を多能性細胞に変換する方法により産生された多能性細胞を提供する。
【0008】
本発明のある実施態様において、本発明は、デスモソーム関連遺伝子または上皮細胞分化関連遺伝子の発現が誘導多能性幹細胞(iPSC)の対応する遺伝子の発現レベルより高いまたはSpink2遺伝子の発現レベルがiPSCにおける該遺伝子の発現レベルより高いおよびNanog、Rex1およびEsrrbからなる群から選択される少なくとも1個の遺伝子の発現レベルがiPSCにおける対応する遺伝子の発現レベルと比較して減少している細胞を提供する。
【0009】
本発明の他の実施態様において、本発明は、細胞を産生するための方法であって、デスモソーム関連遺伝子または上皮細胞分化関連遺伝子の発現が誘導多能性幹細胞(iPSC)の対応する遺伝子の発現レベルより高いまたはSpink2遺伝子の発現レベルがiPSCにおける該遺伝子の発現レベルより高いおよびNanog、Rex1およびEsrrbからなる群から選択される少なくとも1個の遺伝子の発現レベルがiPSCにおける対応する遺伝子の発現レベルと比較して減少している細胞の分化を誘導することを含む、方法を提供する。
【0010】
本発明のある実施態様において、本発明は、細胞移植または生物組織再生のための組成物であって、活性成分として多能性細胞；デスモソーム関連遺伝子または上皮細胞分化関連遺伝子の発現が誘導多能性幹細胞(iPSC)の対応する遺伝子の発現レベルより高いまたはSpink2遺伝子の発現レベルがiPSCにおける該遺伝子の発現レベルより高いおよびNanog、Rex1およびEsrrbからなる群から選択される少なくとも1個の遺伝子の発現レベルがiPSCにおける対応する遺伝子の発現レベルと比較して減少している細胞；または分化誘導細胞を含む、組成物を提供する。
【0011】
本発明のある実施態様において、本発明は、試験物質の有効性または毒性を評価するための方法であって、多能性細胞；デスモソーム関連遺伝子または上皮細胞分化関連遺伝子の発現が誘導多能性幹細胞(iPSC)の対応する遺伝子の発現レベルより高いまたはSpink2遺伝子の発現レベルがiPSCにおける該遺伝子の発現レベルより高いおよびNanog、Rex1およびEsrrbからなる群から選択される少なくとも1個の遺伝子の発現レベルがiPSCにおける対応する遺伝子の発現レベルと比較して減少している細胞；または分化誘導細胞と試験物質を接触させることを含む、方法を提供する。
【0012】
本発明の他の実施態様において、本発明は、多能性細胞；デスモソーム関連遺伝子または上皮細胞分化関連遺伝子の発現が誘導多能性幹細胞(iPSC)の対応する遺伝子の発現レベルより高いまたはSpink2遺伝子の発現レベルがiPSCにおける該遺伝子の発現レベルより高いおよびNanog、Rex1およびEsrrbからなる群から選択される少なくとも1個の遺伝子の発現レベルがiPSCにおける対応する遺伝子の発現レベルと比較して減少している細胞；または分化誘導細胞を個体に投与することによる、生物組織を再生する方法を提供する。
【発明の効果】
【0013】
本発明の非多能性細胞を多能性細胞に変換する方法により形成された多能性細胞は、3個の胚葉に分化できる優れた細胞分化能および多能性を有しながら、低発癌性を有し、リプログラミングの中間段階の多能性細胞を特異的に分離することにより、誘導多能性幹細胞の慣用の産生方法と比較して、生産期間の短縮を達成し得る。
【図面の簡単な説明】
【0014】
【0015】
【0016】
【0017】
【0018】
【0019】
【0020】
【0021】
【0022】
【0023】
【0024】
【0025】
【0026】
【図13】図13の上部はClueGO解析の結果としての上位5群を示し、左パネルは各群の代表的GOタームおよびランクを示し、右パネルは特異的GOタームに関連する遺伝子パーセンテージおよびタームp値を示す。図13の下部はGSEAによる上位15のGOタームを示し、ここで、GSEAは2°MEFおよび4F2A MEFリプログラミングの6日目に得た中間細胞(IC)のトランスクリプトーム、2°MEFおよび4F2A MEFのトランスクリプトームならびに2°MEFおよび4F2A MEFリプログラミングの12日目の終点細胞であったP12、P’12、N12およびD12のトランスクリプトームを使用して、実施した。棒は、各GOタームに含まれる正規化された高スコアおよび遺伝子数である、正規化されたエンリッチメントスコア(NES)を示す。
【0027】
【0028】
【0029】
【0030】
【0031】
【0032】
【0033】
【図20】図20Aは、shDsp-GFP陽性として分類された2° MEFのiPSCRおよびPDRの過程におけるDspおよびRpl7の発現のウェスタンブロット結果である。shDspの発現はIPTGの処理により誘導される。棒グラフはDspの定量的発現を示し、各サンプルはiPSCRおよびiNSCRの6日目に得た。Rpl7を充填対照群として使用した(p値＜0.0001)、D.W.は蒸留水を表し、IPTGはイソプロピルβ－D-1-チオガラクトピラノシドを表す。図20Bは、リプログラミングの12日目のウェル全体のAP染色画像およびAP陽性コロニー定量的解析結果(p値＝0.0112)を示し、図20Cはリプログラミングの12日目の各蒸留水またはIPTG処理群のNanog陽性コロニー定量的解析結果(p値＝0.0056)を示す。図20Dは、リプログラミングの12日目の各蒸留水またはIPTG処理群のPax6陽性コロニー定量的解析結果(p値＝0.0202)を示す。図20Eは、iPSCRの6日目の細胞凝集体の位相差画像および細胞凝集体の定量的解析結果を示し(shDsp(-)、p値＝0.80；shDsp(＋)、p値＝0.0047)、図20Fは、iNSCRの6日目の細胞凝集体の位相差画像および細胞凝集体の定量的解析結果を示す(shDsp(-)、p値＝0.34；shDsp(＋)、p値＝0.0015)。さらに、図20Aのエラーバーは±SEMを意味し(A)、図20B～20Fのエラーバーは±SDを意味し、統計解析を両側対応のあるスチューデントのt検定を使用して実施し、p値＜0.05を有意とみなしており、＊はp値＜0.05を示し、＊＊はp値＜0.01を示す。
【0034】
【0035】
【図22】図22は、ヒト線維芽細胞におけるDSPの過剰発現(DSP-OE)によるDSP発現の逆転写qPCR(RT-qPCR)解析の結果を示し、結果はRPL7の発現に対して正規化し、EVは空ベクターを示す(p値＜0.0001)。図22Bは、DSP過剰発現線維芽細胞のiPSCRの16日目のAP陽性コロニー数の定量的解析の結果を示す(p値＝0.0102)。図22Cは、DSP過剰発現線維芽細胞のiNSCRの16日目のPAX6陽性コロニー数の定量的解析の結果を示す(p値＝0.0053)。図22Dは、DSP過剰発現線維芽細胞のiPSCRの16日目のAP陽性コロニーの代表的AP染色画像であり、図22Eは図22Dの四角領域の拡大画像である。スケールバーは100μmであり、図22Aのエラーバーは±SEM(A)であり、図22Bのエラーバーは±SEであり、図22Cおよび22Dのエラーバーは±SDである。統計解析を両側対応のあるスチューデントのt検定を使用して実施し、p値＜0.05を有意とみなしており、＊はp値＜0.05を示し、＊＊はp値＜0.01を示し、＊＊＊はp値＜0.001を示す。
【0036】
【図23】図23Aは、ゼブラフィッシュのひれ切断後のひれ膜の位相差画像であり、ここで、ひれ膜切断は2pfで実施し、24時間後撮影した。グラフにおいて、薄灰色は切断後1日目(dpa)対0dpaひれ膜成長のパーセンテージを示し、濃灰色は1dpa対0dpaひれ膜阻害を示す。スケールバーは100μmである(n＝60、56胚、p値＜0.0001)。MOはモルホリノを意味し、hpaは切断後時間を意味する。図23Bは、対照MOまたはdsp混合MOの比較による再生ひれにおけるひれ膜の全載インサイチュハイブリダイゼーション解析の位相差画像および芽体マーカー遺伝子(junbb)発現の解析結果を示す。切断していないひれを対照群として使用し、点線はひれ膜の境界を示し、スケールバーは100μmであり、hpfは受精後時間を意味する(n＝40、48胚、p値＜0.0001)。図23Cは、対照MO、pou5f3 MO(陽性対照)およびdsp混合MO注入ならびにエレクトロポレーション後の成熟ひれの位相差画像および蛍光合成画像を示す。物質の注入を2dpa芽体の背側半に行い、24時間後撮影し、グラフは背びれ対腹びれの増殖(薄灰色)および背びれ対腹びれの平均阻害(濃灰色)を示す。図23Cの左画像の線は2dpaのひれを示し、スケールバーは500μmである(n＝7ゼブラフィッシュ、p値＜0.0001)。さらに、エラーバーは±SDであり、両側対応のあるスチューデントのt検定を統計解析に使用し、P値＜0.05であるとき有意とみなした(＊＊＊p値＜0.001)。
【0037】
【0038】
【図25】図25Aおよび25Bは、それぞれ正常条件下のiPSCRおよびiNSCRの6日目の細胞のDspおよびDsc3の免疫染色画像および位相差画像を示す。黒色アスタリスクはコロニーにおけるDspおよびDsc3陽性細胞を示し、白色アスタリスクはDspおよびDsc3陰性細胞を示す(スケールバー：50μm)。図25Cは、scRNA-seqのためのサンプリングの模式図である。図25Dは、各リプログラミング日の単一細胞ライブラリー数を示す。図25Eは、iPSCRまたはiNSCRの過程における細胞のUMAPプロットとしてのSlingshotによるブランチリプログラミング軌道を示し、陰影は各細胞収集時点で異なって示し、点線はリプログラミングが失敗した経路を示す。
【0039】
【0040】
【図27】図27Aは、iPSCRおよびiNSCRの5日目～7日目の細胞のscRNA-seqデータをUMAPプロットとして示す。図27Bはshisa8およびDsp遺伝子のシグネチャスコア分布を示し、図27CはUMAPにおけるdICおよびgICを規定する同一性遺伝子セットのシグネチャスコア分布を示す(スケールバーはリプログラミング過程全体において示される最小から最大シグネチャスコアを示す)。図27Dは、iPSCRまたはiNSCRの6日目からのgICの再付着の位相差画像および免疫染色画像を示し、免疫染色は再付着6日後Nanogで実施した(D＋6)(スケールバー：100μm)。図27EはNanog、Dsp、Shisa8およびCdk1遺伝子の逆転写qPCR結果を示し、ここで、2°MEFを陰性対照として使用し、iPSCを陽性対照として使用し、6日目の全細胞に含まれる6日目のサンプルおよびgICを6日目に分離した。図27Fは、Shisa8発現の存在または不在に依存すると予測されるリプログラミング経路を示す
【0041】
【図28】図28Aは、各遺伝子セットシグネチャスコアについてのiPSCまたはiNSCの過程における細胞のUMAPプロットを示す。図28Bは、5日目および7日目の細胞のUMAPプロットを示し、陰影を各収集時点で変えた。図28Cは多能性マーカーのRT-qPCR解析の結果を示し、ここで、2°MEFを陰性対照として使用し、iPSCを陽性対照として使用し、6日目の全細胞に含まれる6日目のサンプルおよびgICを6日目に分離した。エラーバーは±SEである。図28Dは各クラスターについて収集時点により陰影が異なる細胞の総数を棒プロットとして示す。図28Eは、iPSCRの過程におけるクラスター1およびクラスター8の子孫を強調する細胞のUMAPプロットを示し、図28FはiNSCRの過程におけるクラスター1およびクラスター8の子孫を強調する細胞のUMAPプロットを示し、色および強度はWOTおよび収集時点により推定される子孫確率を示す。
【0042】
【0043】
【図30】図30Aは、MK2206(Akt阻害剤)の存在または非存在に依存する、iPSCRおよびiNSCRの6日目のホスホ-Aktおよび総Aktのウェスタンブロット画像および定量的解析結果を示す。Rpl7を充填対照として使用し、iPSCRのp値は0.00008であり、iNSCRのp値は0.00095であった。図30Bは、MK2206の存在または非存在に依存するiPSCRの6日目のIC凝集体の定量的解析結果を示し(p値＝0.0009)、図30CはMK2206の存在または非存在に依存するiNSCRの6日目のIC凝集体の定量的解析結果を示す(p値＝0.0019)。図30DはMK2206の存在または非存在に依存するiPSCRの12日目のコロニー中AP陽性コロニーの全体的ウェル画像および定量的解析結果を示し(p値＝0.0020)、図30EはMK2206の存在または非存在に依存するiNSCRの12日目のコロニー中Pax6陽性コロニーの全体的ウェル画像および定量的解析結果を示す(p値＝0.0020)。図30FはMK2206の存在または非存在に依存するiPSCにおけるAP陽性コロニーの全体的ウェル画像および定量的解析結果を示し、図30GはMK2206の存在または非存在に依存するiPSCにおける多能性関連マーカーであるRex1のRT-qPCR解析結果を示す(p値＝0.13)。図30HはMK2206の存在または非存在に依存するiNSCにおけるPax6陽性細胞の蛍光画像および定量的解析結果を示す(スケールバー：100μm、p値＝0.15)。図30IはMK2206の存在または非存在に依存するにおけるiNSCにおける神経幹細胞マーカーであるPax6のRT-qPCR解析結果を示す。図30Aのエラーバーは±SEMであり、図30B～30Fおよび図30Hのエラーバーは±SDであり、図30Gおよび30Iのエラーバーは±SEである。全統計解析は、両側対応のあるスチューデントのt検定を使用して実施した。
【0044】
【0045】
【0046】
【0047】
【発明を実施するための形態】
【0048】
本発明の態様によると、本発明は、非多能性細胞を多能性細胞に変換する方法であって、非多能性細胞をリプログラミング因子を発現するように誘導し、それによりデスモソーム関連遺伝子また上皮細胞分化関連遺伝子を過剰発現させることを含む、方法に関する。
【0049】
「多能性」は、細胞が体または体細胞の全分化系列(すなわち、胚適合性)を形成する能力をいう。多能性は、一部細胞の多能性特徴の評価により決定され得る。本発明において、多能性特徴は、外胚葉、中胚葉および内胚葉に分化する能力を含むが、これに限定されない。
【0050】
非多能性細胞は、多能性を有さない細胞であり、既に分化されており、外胚葉、中胚葉および内胚葉に分化する能力を有しない細胞をいう。本発明のある実施態様において、非多能性細胞は動物由来の細胞であり得て、より好ましくは哺乳動物(例えば、ヒト、マウス、ラット、ネコ、ハムスター、モルモット、ブタ、イヌ、ウマ、ウシなどであるが、これらに限定されない)の細胞、特に、ヒト細胞であり得るが、これらに限定されない。さらに、非多能性細胞はカスタマイズされた細胞治療製品の投与を必要とする個体から収集された細胞であり得る。
【0051】
本発明のある実施態様において、非多能性細胞を多能性細胞に変換する方法はインビボまたはインビトロで実施し得る。
【0052】
本発明の他の実施態様において、非多能性細胞は、哺乳動物の骨髄、皮膚、骨格筋、胸腺、肝臓、脾臓、心臓、脳、眼球、消化管、軟骨、腎臓、精巣、卵巣、脂肪組織、末梢血および上皮組織などの種々の組織由来の細胞であり得るが、これらに限定されない。例えば、非多能性細胞は線維芽細胞、臓器上皮細胞、前立腺上皮細胞、内皮細胞、肝細胞、B細胞、T細胞、血液細胞、単球、軟骨細胞、筋肉細胞、神経細胞などであり得るが、これらに限定されない。
【0053】
非多能性細胞にリプログラミング因子を発現させるような細胞の誘導は、リプログラミング因子をコードする遺伝子を非多能性細胞に導入するまたは非多能性細胞を、外因的方法で、リプログラミング因子で処理することにより、非多能性細がリプログラミング遺伝子を発現することを可能とする。
【0054】
用語「リプログラミング」は、あるタイプの細胞から他のタイプの細胞への変換のための方法をいう。リプログラミングを介して、元の細胞よりも分化されていない細胞に変換され得てまたは特定細胞に変換され得る。
【0055】
用語「リプログラミング因子」は、単独でまたは他の薬剤と組み合わせて、細胞産生の効果を増加できる薬剤をいい、ポリヌクレオチド、ポリペプチドおよび小分子を含むが、これらに限定されない。リプログラミング因子の例は、例えば、転写因子および小分子リプログラミング剤を含む。さらに、リプログラミング因子は、OCT4ポリペプチド(OCT3ポリペプチドまたはPOU5F1ポリペプチド)、SOX2ポリペプチド、NANOGポリペプチド、KLF4ポリペプチド、LIN28ポリペプチド、C-MYCポリペプチド、SV40LTポリペプチド、hTERTポリペプチド、SALL4ポリペプチド、GLISポリペプチド、ESRRBポリペプチド、DPPA2ポリペプチド、ECAT1ポリペプチド、SOX1ポリペプチド、SOX3ポリペプチド、KLF2ポリペプチド、KLF5ポリペプチド、L-MYCポリペプチド、N-MYCポリペプチド、LRH1ポリペプチドおよびUTF1ポリペプチドから選択される1以上のタンパク質であり得る。特に、リプログラミング因子はOCT4ポリペプチド(OCT3ポリペプチドまたはPOU5F1ポリペプチド)、Sox2ポリペプチド、KLF4ポリペプチドおよびC-MYCポリペプチドから選択される1以上のタンパク質であってよくまたはOCT4ポリペプチド、Sox2ポリペプチド、KLF4ポリペプチドおよびC-MYCポリペプチドであり得る。
【0056】
さらに、各種からのOCT4ポリペプチド(OCT3ポリペプチドまたはPOU5F1ポリペプチド)、SOX2ポリペプチド、NANOGポリペプチド、KLF4ポリペプチド、LIN28ポリペプチド、C-MYCポリペプチド、SV40LTポリペプチド、hTERTポリペプチド、SALL4ポリペプチド、GLISポリペプチド、ESRRBポリペプチド、DPPA2ポリペプチド、ECAT1ポリペプチド、SOX1ポリペプチド、SOX3ポリペプチド、KLF2ポリペプチド、KLF5ポリペプチド、L-MYCポリペプチド、N-MYCポリペプチド、LRH1ポリペプチドおよびUTF1ポリペプチドのアミノ酸配列は、公開されたデータベース(例えば、GenBankまたはUniProt)から得られ得る。例として、UniProtは、ヒトOCT4ポリペプチド、ヒトOX2ポリペプチド、ヒトKLF4ポリペプチドおよびヒトC-MYCポリペプチドのアミノ酸配列を、それぞれUniProtKB - Q01860、UniProtKB - P48431、UniProtKB - O43474、UniProtKB - P01106およびUniProtKB - Q9H9Z2の名の下に提供する。
【0057】
リプログラミング因子をコードする遺伝子を細胞に導入する方法として、当分野で知られる方法を使用でき、リプログラミング因子をコードする遺伝子を、細胞に、例えば、一過性トランスフェクション、マイクロインジェクション、形質導入、電気細胞融合、リン酸カルシウム沈殿、リポソーム介在トランスフェクション、DEAEデキストラン介在トランスフェクション、ポリブレイン介在トランスフェクション、エレクトロポレーション、遺伝子銃または核酸の細胞への導入のための他の既知の方法により導入できるが、方法はこれらに限定されない(Wu et al., J. Bio. Chem., 267:963-967, 1992; Wu and Wu, J. Bio. Chem., 263:14621-14624, 1988)。
【0058】
リプログラミング因子はRNA、線状DNA、ペプチドまたはタンパク質または多能性幹細胞の細胞抽出物として提供され得る。
【0059】
さらに、リプログラミング因子をコードする遺伝子が非多能性細胞に導入されるとき、リプログラミング因子および非多能性細胞が由来する種は同一であり得る。例えば、ヒトリプログラミング因子を、形質転換によりヒト細胞に導入し得る。
【0060】
さらに、リプログラミング因子をコードする遺伝子を細胞に導入するとき、遺伝子は、プラスミドベクター、ウイルスベクターまたは他の発現カセットを使用して、導入され得る。さらに、リプログラミング因子をコードする遺伝子をコードするヌクレオチド配列を適切なベクターに挿入し、所望のポリペプチドを発現するために非多能性細胞に導入し得る。ベクターの例は、プラスミド、自己複製配列および転位因子を含む。ベクターのさらなる例は、プラスミド、ファージミド、コスミド、酵母人工染色体(YAC)、細菌人工染色体(BAC)またはP1由来P1由来人工染色体(PAC)などの人工染色体、ラムダファージまたはM13ファージなどのバクテリオファージおよび動物ウイルスを含むが、これらに限定されない。ベクターとして有用な動物ウイルスのカテゴリーの例は、レトロウイルス(レンチウイルスを含む)、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス(例えば、単純ヘルペスウイルス)、ポックスウイルス、バキュロウイルス、パピローマウイルスおよびパポーバウイルスウイルス(例えば、SV40)を含むが、これらに限定されない。発現ベクターの例は、哺乳動物細胞における発現のためのpClneoベクター(Promega)；レンチウイルス介在遺伝子導入および哺乳動物細胞における発現のためのpLenti4/V5-DESTTM、pLenti6/V5-DESTTMおよびpLenti6.2/V5-GW/lacZ(Invitrogen)を含むが、これらに限定されない。
【0061】
本発明の他の態様において、ベクターは、染色体外に維持されるエピソームベクターであり得る。用語「エピソーム」は、宿主の染色体DNAに組込まれることなく複製できるベクターをいい、分裂宿主細胞から徐々に喪失がないことはまた該ベクターが染色体外またはエピソームで複製することを意味する。ベクターは、リンパ球指向性ヘルペスウイルスまたはガンマヘルペスウイルス、アデノウイルス、SV40、ウシパピローマウイルスまたは酵母からのDNA複製起点または「ori」、特にEBVのoriPに対応するリンパ球指向性ヘルペスウイルスまたはガンマヘルペスウイルスの複製起点をコードする配列を保持するよう操作される。特定の態様において、リンパ球指向性ヘルペスウイルスはエプスタイン・バール・ウイルス(EBV)、カポジ肉腫ヘルペスウイルス(KSHV)、ヘルペスウイルス・サイミリ(HS)またはマレック病ウイルス(MDV)であり得る。エプスタイン・バール・ウイルス(EBV)およびカポジ肉腫ヘルペスウイルス(KSHV)もまたガンマヘルペスウイルスの例である。
【0062】
本発明のある実施態様において、テトラサイクリンなどの抗生物質の存在下でリプログラミング因子の発現を引き起こす発現カセットを含むベクターを非多能性細胞に導入し得る。さらに、発現カセットはNanog-GFPレポーターを含み得る。発現カセットは、ドキシサイクリン存在下でリプログラミング因子の発現を引き起こし得て、特に、発現カセットは、ドキシサイクリン投与により、OCT4ポリペプチド、Sox2ポリペプチド、KLF4ポリペプチドおよびC-MYCポリペプチドの発現を引き起こし得るが、これに限定されない。
【0063】
リプログラミング因子をコードする遺伝子が細胞に十分に導入されているかを確認する方法は、例えば、サザンおよびノーザンブロッティング、RT-PCRおよびPCRなどの当業者に周知の分子生物学的アッセイ；例えば、免疫学的手段(例えば、ELISAおよびウェスタンブロット)によりあるタンパク質／ペプチドの存在または不在を検出するような生化学的アッセイを含む。
【0064】
さらに、リプログラミング因子をコードする遺伝子が細胞に十分導入されているか否かを確認するために、リプログラミング因子が導入されている細胞を分離でき、抗生物質での処理により抗生物質に耐性を有する抗生物質を含む培地で連続的に培養できる細胞の第一スクリーニング過程である。抗生物質はドキシサイクリンなどのテトラサイクリンベースの抗生物質であり得るが、これらに限定されない。
【0065】
さらに、非多能性細胞を、外因的方法で、リプログラミング因子で処理することは、リプログラミング因子を細胞と直接接触させるかまたはリプログラミング因子を含む培地で細胞を培養することにより実施し得るが、これらに限定されない。
【0066】
本発明のある実施態様において、リプログラミング因子を発現させる細胞誘導は、リプログラミング培地で培養され得る。リプログラミング培地として、iPSC、神経幹細胞(iNSC)およびドーパミン作動性神経前駆細胞へのリプログラミングに一般に使用される培地が使用され得る。リプログラミング培地は白血病阻害性因子(LIF)を含んでも含まなくてもよい。例えば、リプログラミング培地は、ノックアウトDMEM(Thermo Fisher Scientific)、ノックアウト血清リプレースメント(Thermo Fisher Scientific)、FBS、Glutamax、MEM-NEAA、1×ペニシリン／ストレプトマイシンおよびβ－メルカプトエタノール(Thermo Fisher Scientific)を含む培地、ノックアウトDMEM(Thermo Fisher Scientific)、ノックアウト血清リプレースメント(Thermo Fisher Scientific)、FBS、Glutamax、MEM-NEAA、1×ペニシリン／ストレプトマイシン、β－メルカプトエタノール(Thermo Fisher Scientific)およびLIF(Millipore, Billerica, MA, USA)を含む培地、DMEM／F12(Thermo Fisher Scientific)、神経基底培地(Thermo Fisher Scientific)、BSA、N2(Thermo Fisher Scientific)、B27(Thermo Fisher Scientific)、Glutamax、β－メルカプトエタノール、FGF2(Peprotech, Rocky Hill, NJ, USA)、FGF4(Peprotech)およびEGF(Peprotech)を含む培地、アドバンスドDMEM／F12(Thermo Fisher Scientific)、神経基底培地(Thermo Fisher Scientific)、BSA、N2、B27、Glutamax、FGF8b(Peprotech)、SHH(Peprotech)およびβ－メルカプトエタノールまたはmTeSR 1(STEMCELL Technologies, Vancouver, Canada)培地を含むCHIR99021(Tocris Bioscience, Bristol, UK)、A83 01(Tocris)およびNaB(Sigma Aldrich)を添加された培地；アドバンスドDMEM／F12(Thermo Fisher Scientific)、神経基底培地(Thermo Fisher Scientific)、BSA、N2(Thermo Fisher Scientific)、B27(Thermo Fisher Scientific)、Glutamax、β－メルカプトエタノール、FGF2(Peprotech, Rocky Hill, NJ, USA)、FGF4(Peprotech)、EGF(Peprotech)、CHIR99021、A83 01およびhLIF(Peprotech)を含む培地であり得る。
【0067】
さらに、本発明のある実施態様において、リプログラミング因子を発現させる細胞誘導はデスモソーム関連遺伝子または上皮細胞分化関連遺伝子を発現し得る。
【0068】
デスモソームは、上皮組織の一種であり、隣接細胞のケラチンフィラメントを接続する細胞間結合である、上皮の細胞間結合である。デスモソームは、細胞骨格リンカータンパク質であるデスモソームカドヘリン(すなわち、デスモコリン(Dsc)およびデスモグレイン(Dsg))、アルマジロタンパク質(すなわち、プラコグロビンおよびプラコフィリン)およびデスモプラキン(Dsp)からなる。
【0069】
一方では、カドヘリンタンパク質およびデスモコリンタンパク質は細胞-細胞接着に関与し、デスモプラキン(Dsp)タンパク質はデスモソームをケラチンに結合する機能を発揮する。
【0070】
Dsg1、Dsg2、Dsg3、Dsg4、Dsc1、Dsc2、Dsc3、プラコグロビン(Jup)、プラコフィリン1～プラコフィリン3(Pkp1～Pkp3)、Perp、Dsp、krt8などはデスモソーム関連遺伝子または上皮細胞分化関連遺伝子として知られる。しかしながら、本発明において、発現レベルが測定されるデスモソーム関連遺伝子または上皮細胞分化関連遺伝子はこれらに限定されない。一方では、非多能性細胞を多能性細胞に変換する方法において発現レベルが測定されるデスモソーム関連遺伝子または上皮細胞分化関連遺伝子は、Dsp、Evpl、Dsg1a、Dsg1b、Dsg1c、Dsg3、Jup、Perp、Pkp1およびKrt8から選択される少なくとも1個の遺伝子またはDsg3、Dsg4、Dsp、Evpl、Jup、PerpおよびPkp1から選択される少なくとも1個の遺伝子であってよく、デスモソーム関連遺伝子または上皮細胞分化関連遺伝子はDspおよびPkp1であり得る。デスモソーム関連遺伝子または上皮細胞分化関連遺伝子のヌクレオチド配列は、GenBankなどの既知データベースから得ることができ、例えば、GenBankは、Dsp遺伝子のヌクレオチド配列を提供するGenBank Accession ID: 109620またはGenBank Accession ID: 832である。
【0071】
本発明の他の実施態様において、遺伝子の発現レベルは、該遺伝子によりコードされるタンパク質の核酸レベルまたは該遺伝子によりコードされるmRNAまたは遺伝子で測定し得る。タンパク質の量は、該遺伝子によりコードされるタンパク質に特異的に結合する抗体を使用して決定でき、好ましくは、タンパク質発現のレベル自体を、抗体を使用することなく測定し得る。
【0072】
例えば、タンパク質発現測定は、タンパク質チップ解析、免疫アッセイ、リガンド結合アッセイ、マトリクス脱離／イオン化飛行時間型マススペクトロメトリー(MALDI-TOF)解析、表面増強レーザー脱離／飛行マススペクトロメトリー(SELDI-TOF)解析、放射免疫アッセイ、放射状免疫拡散、放射免疫拡散、オクタロニー免疫拡散、ロケット免疫電気泳動、免疫組織化学解析、免疫細胞化学解析、補体結合解析、2D電気泳動解析、液体クロマトグラフィー-マススペクトロメトリー(LC-MS)、液体クロマトグラフィー-マススペクトロメトリー／マススペクトロメトリー(LC-MS／MS)、ウェスタンブロット、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)などを使用して実施し得るが、これらに限定されない。
【0073】
さらに、遺伝子のmRNA発現測定を転写ポリメラーゼ反応(RT-PCR)、競合的逆転写ポリメラーゼ反応(競合的RT-PCR)、リアルタイム逆転写ポリメラーゼ反応(リアルタイムRT-PCR)、RNase保護アッセイ(RPA)、ノーザンブロッティング、単一細胞RNAシーケンシング、DNAチップなどを使用して実施し得るが、これらに限定されない。遺伝子のmRNAレベルの測定のための薬剤は、好ましくはプライマー対またはプローブであり、遺伝子の核酸情報がGenBankなどで知られているため、当業者は、配列に基づきこれら遺伝子の特異的領域を特異的に増幅するプライマーまたはプローブを設計し得る。さらに、遺伝子のmRNAレベルの測定のための薬剤はプライマー対、プローブまたは該遺伝子に特異的に結合するアンチセンスヌクレオチドを含み得る。
【0074】
本発明のある態様において、本発明は、さらにデスモソーム関連遺伝子または上皮細胞分化関連遺伝子の過剰発現とその後の減少を含み得る。この場合、デスモソーム関連遺伝子または上皮細胞分化関連遺伝子誘導多能性幹細胞における対応する遺伝子の発現より低いレベルまで減少し得る。
【0075】
さらに、本発明のある実施態様において、非多能性細胞を多能性細胞に変換する方法は、さらにデスモソーム関連遺伝子または上皮細胞分化関連遺伝子が過剰発現されている細胞の分離を含み得る。細胞分離は、当分野で既知の標的タンパク質または標的遺伝子の発現レベルが高い細胞の分離のための方法を使用して実施し得る。例えば、細胞は、細胞の重量または密度差を使用する遠心分離、フローサイトメーターを使用する細胞分離などにより分離でき、機械的に分離できまたは酵素よりにより分離できまたは細胞の形態を使用して分離できる。
【0076】
本発明の他の実施態様において、非多能性細胞を多能性細胞に変換する方法は、デスモソーム関連遺伝子または上皮細胞分化関連遺伝子が急激に減少する期間の細胞の分離を含み得る。
【0077】
リプログラミングは、当分野で知られる方法により細胞分離の前、後または途中は制限され得る。リプログラミングの制限は、リプログラミングの一部または全ての停止を意味し得る。例えば、リプログラミング培地は、リプログラミング培地への誘導多能性幹細胞の産生を妨害する成分(例えば、JAK阻害剤)の添加またはフィーダーMEFの削除により変更され得る。当分野で知られる物質を、リプログラミングを制限する物質として使用でき、例えば、JMJD3を使用できるが、これらに限定されない。さらに、非多能性細胞を多能性細胞に変換する方法は、リプログラミング因子の発現の制限を含み得る。リプログラミング因子の発現の制限は、リプログラミング因子の一部または全ての発現の制限または停止であり得る。
【0078】
リプログラミング因子の発現制限のための条件は、リプログラミング因子を発現するための条件の変更(例えば、細胞がドキシサイクリンなどのテトラサイクリンを投与中、リプログラミング因子を発現することができるときの該細胞が培養されている培地からテトラサイクリンを除外する条件)またはリプログラミング因子をノックアウトするためのウイルスベクターでの細胞の処理を含み得るが、これらに限定されない。さらに、非多能性細胞を多能性細胞に変換する方法における細胞分離は、Nanog、Rex1およびEsrrbからなる群から選択される少なくとも1個の遺伝子の発現が阻害されている間に実施し得る。本発明の他の態様において、非多能性細胞を多能性細胞に変換する方法は、さらにデスモソーム関連遺伝子または上皮細胞分化関連遺伝子の発現レベルがiPSCにおける対応する遺伝子の発現レベルより高い細胞中でさらにShisa8遺伝子を発現する細胞を選択することを含み得る。Shisa8遺伝子は、Shisaファミリーメンバー8タンパク質をコードする遺伝子である。GenBankはShisa8遺伝子のヌクレオチド配列を提供し、例えば、ヒトShisa8遺伝子のGenBank accession IDは440829である。さらに、Shisa8遺伝子の発現は、遺伝子の発現レベルを測定するための上記方法により測定され得る。本発明の他の態様において、非多能性細胞を多能性細胞に変換する方法は、さらにリプログラミング培地で選択した細胞を培養することを含み得る。選択した細胞は、再脱着が可能である特性を有し得る。さらに、非多能性細胞を多能性細胞に変換する方法は、さらにリプログラミング培地で選択した細胞を培養することを含み得る。リプログラミング培地は、一般に上記のとおりiPSC、神経幹細胞(iNSC)およびドーパミン作動性神経前駆細胞へのリプログラミングに使用される培地である。一方では、リプログラミング培地として、当分野で知られる外胚葉、内胚葉または中胚葉細胞へのリプログラミングに適する培地を使用し得る。
【0079】
本発明の態様によると、非多能性細胞を多能性細胞に変換する方法は、さらにSpink2遺伝子の発現レベルが誘導多能性細胞(iPSC)より高い細胞を含み得る。Spink2遺伝子は、アクロシン-トリプシン阻害剤としても知られるセリンプロテアーゼ阻害剤Kazal2型(Spink2)をコードする遺伝子である。Spink2遺伝子は、慣用の多能性幹細胞では実質的に発現されない本発明の多能性細胞に特異的に発現される遺伝子マーカーである。
【0080】
さらに、GenBankは、Spink2遺伝子のヌクレオチド配列を提供し、例えば、ヒトSpink2遺伝子のGenBank accession IDは6691である。さらに、Spink2遺伝子の発現を、遺伝子の発現レベルを測定するための上記方法により測定し得る。
【0081】
本発明のある実施態様において、多能性細胞は、誘導多能性幹細胞と比較してSpink2遺伝子の1～700倍(1は除く)の発現増加を示し得る。具体的に、多能性細胞のSpink2遺伝子は、誘導多能性幹細胞と比較して10倍以上、1～700倍(1は除く)、3～650倍、10～600倍または20～570倍の発現増加を示し得る。本発明のある実施態様において、多能性細胞のSpink2遺伝子は、誘導多能性幹細胞より約569倍高い(39.81／0.07＝568.71)発現レベルを示し得る。
【0082】
本発明の他の実施態様において、多能性細胞のデスモソーム関連遺伝子または上皮細胞分化関連遺伝子の発現レベルは、Spink2遺伝子より少なくとも約2倍以上、少なくとも3倍、少なくとも5倍、少なくとも10倍、少なくとも15倍または少なくとも20倍低い。さらに、デスモソーム関連遺伝子または上皮細胞分化関連遺伝子の発現レベルは、Spink2遺伝子より約2～20倍、約5～15倍または約7～10倍低くて良い。
【0083】
本発明の他の態様において、多能性細胞は、iPSCにおける対応する遺伝子の発現レベルと比較して、Nanog、Rex1およびEsrrbからなる群から選択される少なくとも1個の遺伝子の発現減少を示し得る。GenBankは、Nanog、Rex1およびEsrrbのヌクレオチド配列を提供し、Nanog、Rex1およびEsrrb遺伝子の発現は、遺伝子の発現レベルを測定するための上記方法により決定され得る。
【0084】
さらに、多能性細胞は、iPSCにおける対応する遺伝子の発現レベルと比較して、Nanog、Rex1およびEsrrbからなる群から選択される少なくとも1個の遺伝子の10倍以上、11倍以上、12倍以上、13倍以上、14倍以上、15倍以上、16倍以上、17倍以上、18倍以上、19倍以上、20倍以上または100倍以上の発現減少を示し得る。さらに、Nanog遺伝子の発現は、iPSCにおける発現レベルと比較して、100倍以上減少し得る。
【0085】
本発明のある態様において、多能性細胞は、iPSCと比較して発癌性が減少した細胞であり得る。
【0086】
本発明の他の態様において、多能性細胞は外胚葉、中胚葉または内胚葉を構成する細胞に分化し得る。
【0087】
本発明の他の態様において、多能性細胞は、デスモソーム関連遺伝子または上皮細胞分化関連遺伝子の発現を、これら遺伝子が過剰発現される細胞において減少することにより形成され得る。さらに、多能性細胞は、Dsp遺伝子およびShisa8遺伝子を発現する細胞におけるDsp遺伝子の発現の減少により形成された細胞であり得る。
【0088】
本発明の他の態様において、多能性細胞は、Spink2遺伝子を発現し、Shisa3、Foxo4、Ptp4a3、Blvra、Mbnl3、Mthfd2およびDctpp1およびSpink2遺伝子からなる群から選択される少なくとも1個の遺伝子の発現がiPSCにおける対応する遺伝子の発現レベルとして増加している細胞であり得る。GenBankは、Shisa3、Foxo4、Ptp4a3、Blvra、Mbnl3、Mthfd2およびDctpp1のヌクレオチド配列を提供し、Shisa3、Foxo4、Ptp4a3、Blvra、Mbnl3、Mthfd2およびDctpp1遺伝子の発現を測定する方法は、遺伝子の発現レベルに使用した上記方法と同じである。
【0089】
Shisa3遺伝子は、単一膜貫通タンパク質Shisa3をコードする遺伝子である。Shisa3およびそれをコードするShisa3遺伝子は、遺伝子ID：330096(NCBI参照配列: NC_000071.7)または遺伝子ID：152573(NCBI参照配列: NC_000004.12)で公開された配列を有し得る。Shisa3は、FGFおよびWNTの各々のシグナル伝達系を独立して減弱させることにより前立腺間葉性細胞の成熟に必須の役割を有することが知られている。
【0090】
Foxo4遺伝子は、フォークヘッドボックスタンパク質O4ペプチド(Foxo4)をコードする遺伝子である。Foxo4およびそれをコードするFoxo4遺伝子は、遺伝子ID：54601(NCBI参照配列: NC_000086.8)または遺伝子ID：4303(NCBI参照配列: NC_000023.11)で公開された配列を有し得る。Foxo4は、インスリンシグナル伝達系の制御に含まれる転写因子であり、胚幹細胞における細胞周期阻害またはプロテアソーム活性増加に関与することが知られる。
【0091】
Ptp4a3遺伝子は、タンパク質チロシンホスファターゼタイプIVA 3(Ptp4a3)をコードする遺伝子である。Ptp4a3およびそれをコードするPtp4a3遺伝子は、遺伝子ID：19245(NCBI参照配列: NC_000081.7)または遺伝子ID：4303(NCBI参照配列: NC_000023.11)で公開された配列を有し得る。Ptp4a3はタンパク質チロシンホスファターゼ(PTP)群に属し、PTPは、種々の細胞過程の制御に役立つ細胞シグナル伝達物質である。Ptp4a3は細胞増殖および移動性の増強または腫瘍転移の促進に関与することが知られている。
【0092】
Blvra遺伝子は、ビリベルジンレダクターゼA(Blvra)をコードする遺伝子である。BlvraおよびそれをコードするBlvra遺伝子は、遺伝子ID：109778(NCBI参照配列: NC_000068.8)または遺伝子ID：644(NCBI参照配列: NC_000007.14)で公開された配列を有し得る。Blvraは、NADPHまたはNADH存在下でビリベルジンからビリルビンへの変換を触媒するビリベルジンレダクターゼファミリーに属する。Blvra遺伝子の変異が高ビリルビン血症または胆汁うっ滞などの疾患において検出されていることが知られる。
【0093】
Mbnl3遺伝子は、マッスルブラインド様タンパク質3(Mbnl3)をコードする遺伝子である。Mbnl3遺伝子は、遺伝子ID：171170(NCBI参照配列: NC_000086.8)または遺伝子ID：55796(NCBI参照配列: NC_000023.11)で公開された配列を有し得る。Mbnl3は選択的スプライシングの制御に関与し、筋萎縮の病理に役割を有することが知られる。
【0094】
Mthfd2遺伝子は、Mthfd2をコードする遺伝子である。Mthfd2およびそれをコードするMthfd2遺伝子は、遺伝子ID：17768(NCBI参照配列: NC_000072.7)または遺伝子ID：10797(NCBI参照配列: NC_000002.12)で公開された配列を有し得る。Mthfd2は、ホモ二量体として機能し、マグネシウムまたは無機リン酸と複合体を形成し、それによりNADに結合することができる。
【0095】
Dctpp1遺伝子は、dCTPピロホスファターゼ1(Dctpp1)をコードする遺伝子である。Dctpp1およびそれをコードするDctpp1遺伝子は、遺伝子ID：66422(NCBI参照配列: NC_000073.7)または遺伝子ID：79077(NCBI参照配列: NC_000016.10)で公開された配列を有し得る。Dctpp1は、dCTPをdCMPおよび無機ピロホスフェートに変換する酵素である。Dctpp1と関連する疾患は、アスパルチルグルコサミン尿症および耳硬化症を含む。
【0096】
多能性細胞は粒状形態を有し得るが、これらに限定されない。さらに、多能性細胞は、CD34細胞、造血内皮細胞、造血幹および前駆細胞(HSC)、造血多能性前駆細胞、T細胞前駆細胞、NK細胞前駆細胞、T細胞、NKT細胞、NK細胞およびB細胞に分化し得るが、これらに限定されない。さらに、多能性細胞はiPSC、iNSCまたはiDPに分化し得る。
【0097】
本発明のある態様において、本発明は、非多能性細胞を多能性細胞に変換する方法で作製した多能性細胞またはデスモソーム関連遺伝子または上皮細胞分化関連遺伝子の発現が増加した細胞に関する。デスモソーム関連遺伝子または上皮細胞分化関連遺伝子の発現が増加した細胞は、Dsp遺伝子およびShisa8遺伝子を発現する細胞であり得る。デスモソーム関連遺伝子または上皮細胞分化関連遺伝子の発現が増加した細胞を介して産生されたDsp遺伝子およびShisa8遺伝子を発現する細胞は、Spink2遺伝子を発現し、さらにShisa3、Foxo4、Ptp4a3、Blvra、Mbnl3、Mthfd2およびDctpp1からなる群から選択される1以上のマーカー遺伝子を発現し、顆粒細胞であり得る細胞であるが、本発明はそれに制限されない。多能性細胞の特徴は上記と同様である。
【0098】
非多能性細胞の多能性細胞への変換の過程において形成されたDsp遺伝子およびShisa8遺伝子を発現する細胞は、さらにiPSCリプログラミング培地、iNSCリプログラミング培地、iDPリプログラミング培地または本明細書の実施例に使用する三胚葉性(外胚葉、中胚葉および内胚葉)細胞などの目的の細胞のリプログラミングに適することが知られる培地で培養されまたは目的の細胞へのリプログラミングに適する条件に付したとき、目的の細胞に分化するまたは3個の胚葉に自然に脱分化する。目的の細胞のリプログラミングに適することが知られる培地および目的の細胞のリプログラミングに適する条件として、本発明が属する分野おいて知られる培地および条件が使用され得る。
【0099】
内胚葉、中胚葉および外胚葉は3個の胚葉を形成し、内胚葉において、胃、結腸、肝臓、膵臓、膀胱、尿道粘膜、気道の上皮部分、肺、咽頭、甲状腺、副甲状腺および小腸組織を形成する細胞が産生され、中胚葉において、骨格筋、骨、真皮、結合組織、泌尿器生殖器系、心臓、血液(リンパ球)、腎臓および脾臓を形成する細胞が産生され、外胚葉において、中枢神経系、目の水晶体、頭蓋骨および感覚、ガングリオンおよび神経、色素細胞、頭部結合組織、上皮、毛髪および乳腺を形成する細胞が産生される。
【0100】
本発明の他の態様において、本発明は、デスモソーム関連遺伝子または上皮細胞分化関連遺伝子の発現がiPSCにおける対応する遺伝子の発現レベルより高いまたはSpink2遺伝子の発現レベルがiPSCにおける該遺伝子の発現レベルより高いおよびNanog、Rex1およびEsrrbからなる群から選択される少なくとも1個の遺伝子の発現レベルがiPSCにおける対応する遺伝子の発現レベルと比較して減少している細胞に関する。デスモソーム関連遺伝子または上皮細胞分化関連遺伝子の発現がiPSCにおける対応する遺伝子の発現レベルより高い細胞は、Dsp、Evpl、Dsg1a、Dsg1b、Dsg1c、Dsg3、Jup、Perp、Pkp1およびKrt8からなる群から選択される少なくとも1個の遺伝子またはDsg3、Dsg4、Dsp、Evpl、Jup、PerpおよびPkp1からなる群から選択される少なくとも1個の遺伝子を発現する細胞であり得て、特に、Dsp遺伝子およびShisa8遺伝子を発現する細胞であり得るが、本発明はそれに制限されない。さらに、Spink2遺伝子の発現レベルがiPSCにおける該遺伝子の発現レベルより高い細胞は、外胚葉細胞、中胚葉細胞または内胚葉細胞の何れかに分化する能力である多能性を示す細胞であり得て、上記多能性細胞の特徴を有し得る。
【0101】
本発明の他の態様において、本発明は、細胞を産生するための方法であって、多能性細胞；またはデスモソーム関連遺伝子または上皮細胞分化関連遺伝子の発現がiPSCにおける対応する遺伝子の発現レベルより高いまたはSpink2遺伝子の発現レベルがiPSCにおける該遺伝子の発現レベルより高いおよびNanog、Rex1およびEsrrbからなる群から選択される少なくとも1個の遺伝子の発現レベルがiPSCにおける対応する遺伝子の発現レベルと比較して減少している細胞の分化を誘導することを含む、方法に関する。細胞分化の誘導は、目的の細胞を、外胚葉細胞、中胚葉細胞、内胚葉細胞、iPSCまたは神経幹細胞(iNSC)などの目的の細胞の分化に適することが知られる条件を適用して培養することによりまたはインビボまたはエクスビボでそのような条件を形成することにより、実施し得る。本発明の他の態様において、本発明は、細胞移植または生物組織再生のための組成物であって、活性成分として多能性細胞；デスモソーム関連遺伝子または上皮細胞分化関連遺伝子の発現がiPSCにおける対応する遺伝子の発現レベルより高いまたはSpink2遺伝子の発現レベルがiPSCにおける該遺伝子の発現レベルより高いおよびNanog、Rex1およびEsrrbからなる群から選択される少なくとも1個の遺伝子の発現レベルがiPSCにおける対応する遺伝子の発現レベルと比較して減少している細胞；または分化誘導細胞を含む、組成物に関する。生物組織は、潰瘍または褥瘡を有する組織、細胞変性による脳組織損傷、外科手技による脳組織一部喪失、外傷性脳疾患による脳組織損傷、炎症性脳疾患による脳組織損傷、損傷骨組織、損傷歯周組織、中枢神経系疾患による組織損傷および難治性皮膚炎による組織損傷から選択される損傷組織であり得て、生物組織再生は、損傷組織、上皮再生、分泌腺または毛包再生、皮膚組織の微小血管形成、創傷治癒、軟組織の欠損矯正、骨治癒または骨再生、軟骨再生などの復元であり得るが、これらに限定されない。
【0102】
本発明のある態様において、本発明は、非多能性細胞を多能性細胞、iPSCまたはiNSCに変換するであって、非多能性細胞においてデスモソーム関連遺伝子また上皮細胞分化関連遺伝子を過剰発現させることを含む、方法に関し、ここで、該方法は、非多能性細胞の多能性細胞、iPSCまたはiNSCへのリプログラミングの効率を増加させ得る。リプログラミング効率の増加は、非多能性細胞においてデスモソーム関連遺伝子または上皮細胞分化関連遺伝子を過剰発現させることなく、非多能性細胞を多能性細胞、iPSCまたはiNSCに変換した場合と比較して、得られた多能性細胞、iPSCまたはiNSCの数が1倍を超えて増加するまたは多能性細胞、iPSCまたはiNSCを得るのに必要な時間が短縮されることを意味する。
【0103】
一方では、本発明のある実施態様において、非多能性細胞を多能性細胞、iPSCまたはiNSCに変換する方法におけるデスモソーム関連遺伝子または上皮細胞分化関連遺伝子の過剰発現は、リプログラミング因子をコードする遺伝子を非多能性細胞に導入するのに使用した上記方法を使用して、達成し得る。さらに、非多能性細胞および多能性細胞の特徴は上記と同様である。過剰発現されたデスモソーム関連遺伝子または上皮細胞分化関連遺伝子はDsp、Evpl、Dsg1a、Dsg1b、Dsg1c、Dsg3、Jup、Perp、Pkp1およびKrt8からなる群から選択される少なくとも1個の遺伝子であり得るまたは好ましくはDspであり得るが、これらに限定されない。さらに、非多能性細胞を多能性細胞、iPSCまたはiNSCに変換する方法は、iPSCリプログラミング法、交差分化法、直接交差分化法または直接分化前因子介在リプログラミング法または本発明が属する分野において知られる細胞の運命を変換する方法であり得るが、これらに限定されない。本発明のある態様において、本発明は、試験物質の有効性または毒性を評価するための方法であって、多能性細胞；デスモソーム関連遺伝子または上皮細胞分化関連遺伝子の発現が誘導多能性幹細胞(iPSC)における対応する遺伝子の発現レベルより高いまたはSpink2遺伝子の発現レベルがiPSCにおける該遺伝子の発現レベルより高いおよびNanog、Rex1およびEsrrbからなる群から選択される少なくとも1個の遺伝子の発現レベルがiPSCにおける対応する遺伝子の発現レベルと比較して減少している細胞；または分化誘導細胞を試験物質と接触させることを含む、方法に関する。
【0104】
本発明のある態様において、非多能性細胞の、単離細胞の分化により産生される本発明の多能性細胞、外胚葉細胞、中胚葉細胞、内胚葉細胞、iPSC、iNSC、iDPなどへの変換のための方法における単離細胞を、再生医療で使用し得る。例えば、患者特異的細胞治療製品を調製するために、個体から得た体細胞運命の非多能性細胞を、単離細胞の分化により産生される多能性細胞、外胚葉細胞、中胚葉細胞、内胚葉細胞、iPSC、iNSC、iDPなどへの変換のための方法により変換することにより得た単離細胞を個体に移植または投与し得る。
【0105】
さらに、本発明のある実施態様において、細胞を、患者への細胞の移植により、処置する症状または状態のマーカーの測定可能な改善を生ずるのに十分な量で移植し得る。特定の対象に対して所望の治療応答を達成するための有効な量の細胞を移植するために、治療組成物の細胞の実際の移植レベルは変わり得る。選択した移植レベルは、治療組成物、製剤、投与経路、他の薬物または処置との組み合わせ、処置する状態の重症度、対象の身体的状態、処置する対象の病歴ならびに治療を投与する臨床医または施術者の経験および判断を含むが、これらに限定されない多様な因子に依存し得る。一般に、計画される移植の量および方法は、状態の進行の遅延、好ましくは阻害をもたらすのに十分であり、また好ましくは状態の1以上の症状またはマーカーの減少を達成する。
【0106】
本発明の他の態様において、本発明は、個体に、多能性細胞；デスモソーム関連遺伝子または上皮細胞分化関連遺伝子の発現が誘導多能性幹細胞(iPSC)における対応する遺伝子の発現レベルより高いまたはSpink2遺伝子の発現レベルがiPSCにおける該遺伝子の発現レベルより高いおよびNanog、Rex1およびEsrrbからなる群から選択される少なくとも1個の遺伝子の発現レベルがiPSCにおける対応する遺伝子の発現レベルと比較して減少している細胞または分化誘導細胞を投与することによる、生物組織を再生する方法に関する。細胞は、細胞が生物組織の再生が必要な部位に移植され、機能欠損領域を再構成または再生することを可能とする方法で投与され得る。例えば、細胞は、処置する疾患により、中枢神経系の実質または髄腔内部位に直接移植され得る。ある実施態様において、細胞を、静脈内、椎体内、脳室内、髄腔内、動脈内、筋肉内、腹腔内、皮下、眼内、眼球後方空間およびそれらの組み合わせにより患者に注射またはボーラス注入または持続注入の形態で注射または沈着させ得るが、方法はそれに制限されない。さらに、細胞を組織再生が必要な部位に直接移植し得る。さらに、再生生物組織は、細胞移植または生物組織再生のための組成物について上記したのと同じである。
【0107】
ここで使用する用語「個体」は、あらゆる動物、好ましくは、ヒト患者、家畜または家庭で飼育する他の動物をいう。
【0108】
本発明の他の態様において、本発明は、個体における疾患の処置用医薬の製造または細胞移植または生物組織再生のための組成物の製造に使用するための細胞の使用に関し、ここで、細胞は、非多能性細胞を、単離細胞の分化により産生される多能性細胞、外胚葉細胞、中胚葉細胞、内胚葉細胞、iPSC、iNSCまたはiDPなどに変換する方法における単離細胞である。
【0109】
発明の形態
以下、本発明を次に掲げる実施例を引用して、さらに詳細に記載する。本発明の範囲はそれらに制限されない。
以下、本発明を次に掲げる実施例を引用して、さらに詳細に記載する。本発明の範囲はそれらに制限されない。
【0110】
一方では、次の実施例で使用するプライマーのタイプおよびCRISPR sgRNAのタイプをそれぞれ表1および2に要約し、免疫蛍光染色およびウェスタンブロットに使用する抗体のタイプを表3に示す。
【0111】
【表1】
【表2】
【表3】
【0112】
【表4】
【0113】
【表5】
【表6】
【実施例】
【0114】
実施例1. 細胞リプログラミング
実施例1-1. 線維芽細胞のリプログラミング
Oct4、Sox2、Klf4およびc-Myc遺伝子(以後、OSKM)を発現するマウス胚線維芽細胞(以後、2° MEF)を、ドキシサイクリン(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)存在下で調製した。
実施例1-1. 線維芽細胞のリプログラミング
Oct4、Sox2、Klf4およびc-Myc遺伝子(以後、OSKM)を発現するマウス胚線維芽細胞(以後、2° MEF)を、ドキシサイクリン(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)存在下で調製した。
【0115】
具体的に、ドキシサイクリン投与によりNanog-GFPレポーターを誘導し、OSKMを過剰発現する誘導多能性幹細胞(NG1-iPSC)を、Stemgent(Beltsville、MD、USA)から購入した。次いで、2°MEFを、胚盤胞注射によりNG1-iPSC由来E13.5マウス胚から得た。2°MEFをMEF培地(10％FBS、1×Glutamax、1×MEM-非必須アミノ酸(MEM-NEAA)および1％ペニシリン／ストレプトマイシン添加ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM))に維持した。FBS、Glutamax、MEM-NEAAおよび1％ペニシリン／ストレプトマイシン添加DMEMは、全てThermo Fisher Scientific(Waltham、MA、USA)から購入した。2°MEFについては、J. Kim et al., Direct reprogramming of mouse fibroblasts to neural progenitors, Proc Natl Acad Sci USA 108, 7838-7843 (2011)に記載の方法に従った。
【0116】
ドキシサイクリン投与によりOSKMを発現する他のタイプの細胞(4F2A MEF)を、Jacson labから購入した血統＃011004マウスからMEFの収集により使用した。方法について、B. W. Carey, et al., Single-gene transgenic mouse strains for reprogramming adult somatic cells. Nat Methods 7, 56-59 (2010)に従った。
【0117】
次いで、2°MEFまたは4F2A MEFをiPSCにリプログラミングするために、MEFを解凍し、Geltrex(Thermo Fisher Scientific)プレートにMEF培地中2×104細胞／cm2の密度で播種した。この場合、ドキシサイクリンの誘導は翌日開始した。一方では、2°MEFのiPSCへのリプログラミング方法(すなわち、iPSCR)として、2種の方法を使用した(図1のiPSC)。具体的に、2°MEFをMEF培地で1日さらに培養し、培養を、培養4日目まで培地としてリプログラミング開始培地(RepM-Ini：ノックアウトDMEM(Thermo Fisher Scientific)、10％ノックアウト血清リプレースメント(Thermo Fisher Scientific)、5％FBS、1×Glutamax、1×MEM-NEAA、1％1×ペニシリン／ストレプトマイシンおよび0.055mM β－メルカプトエタノール(Thermo Fisher Scientific))として使用し、次いで培地を多能性幹細胞のためのiPSCリプログラミング培地(RepM-PSC：LIF(Millipore, Billerica, MA, USA) 1,000U／mL)に置き換え、培養を培養の最後まで実施しまたは培地をRepM-PSCに置き換え、次いで培養を培養の最後まで実施した。
【0118】
一方で、分化能を有する細胞を、培養期間の一時期のみドキシサイクリンを誘導する方法を使用して、2°MEFまたは4F2A MEFを神経幹細胞(iNSC)またはドーパミン作動性神経前駆細胞(iDP)にリプログラミングする方法を使用して、調製した(図1のPDR)。
【0119】
神経幹細胞(RepM-NSC)のためのRepM-IniおよびiNSCリプログラミング培地をiNSCリプログラミングに使用し、ドーパミン作動性神経前駆細胞(RepM-DP)のためのRepM-IniおよびiDPリプログラミング培地をiDPリプログラミングに使用した。RepM-Ini培地は上記と同様である。RepM-NSC培地を、0.05％BSA、1×N2(Thermo Fisher Scientific)、1×B27(Thermo Fisher Scientific)、1×Glutamax、0.11mM β－メルカプトエタノール、20ng／mL FGF2(Peprotech, Rocky Hill, NJ, USA)、2ng／mL FGF4(Peprotech)および20ng／mL EGF(Peprotech)を含む溶液を、1：1比でアドバンスドDMEM／F12(Thermo Fisher Scientific)および神経基底培地(Thermo Fisher Scientific)の混合により得た溶液に添加することにより調製した。RepM-DP培地を、0.05％BSA、1×N2、1×B27、1×Glutamax、100ng／mL FGF8b(Peprotection)、200ng／mL SHH(Peprotection)および0.11mM β－メルカプトエタノールを含む溶液を、1：1比でアドバンスドDMEM／F12(Thermo Fisher Scientific)および神経基底培地(Thermo Fisher Scientific)の混合により得た溶液に添加することにより調製した。
【0120】
MEFのNSCへのリプログラミングのために、MEFを解凍し、Geltrex(Thermo Fisher Scientific)被覆プレートにMEF培地中2×104細胞／cm2で播種した。この場合、ドキシサイクリンの誘導は翌日開始した。MEFを、さらにMEF培地で1日培養し、培養をリプログラミング4日目までRepM-Ini培地で実施し、次いで培地をRepM-NSCに置き換え、培養をリプログラミング終了までこの培地で実施した。
【0121】
MEFのiDPへのリプログラミングのために、MEFを解凍し、Geltrex(Thermo Fisher Scientific)被覆プレートに、MEF培地中2×104細胞／cm2で播種した。この場合、ドキシサイクリンの誘導は翌日開始した。2°MEFをさらにMEF培地で1日培養し、培養を培養4日目までRepM-Ini培地で実施し、次いで培地をRepM-DPで置き換え、培養をリプログラミングの終了までこの培地で実施した。
【0122】
実施例1-2. リプログラミング過程における細胞解析法
マイクロアレイ解析および定量的PCR
図1に示す各リプログラミング過程について、RNeasy PlusミニキットおよびQIAshredder(Qiagen、Hilden、Germany)を製造業者のマニュアルに従い隔日で使用して各細胞から総RNAを収集した。
マイクロアレイ解析および定量的PCR
図1に示す各リプログラミング過程について、RNeasy PlusミニキットおよびQIAshredder(Qiagen、Hilden、Germany)を製造業者のマニュアルに従い隔日で使用して各細胞から総RNAを収集した。
【0123】
さらに、総RNAを収集した期間の細胞を図2に示すとおり分類した。2° MEF自体Fと命名し、無LIF条件下の細胞をCと命名し、iPSCリプログラミング(iPSCR)の全期間LIF存在下の細胞をPと命名し、iPSCRの5日目から12日目のみLIFが存在した条件下の細胞をP’と命名し、iNSCリプログラミング条件下の細胞をNと命名し、iDPリプログラミング条件下の細胞をDと命名し、培養日をP、P’、NおよびDに続いて示した。
【0124】
マイクロアレイ解析について、全サンプルのRNA品質をAgilent 2100 Bioanalyzer Systemで同定し、増幅、標識およびハイブリダイゼーション工程を連続的に実施した。包括的遺伝子発現プロファイルを、Agilent Mouse Whole Genome 4×44Kアレイ(V2)チップ(1色プラットフォーム；Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)により分析し、全分析を製造業者のプロトコールに従い実施した。マイクロアレイデータをGeneSpringソフトウェア(Agilent Technologies)を使用して処理し、包括的規模正規化を介して正規化した。機能的にグループ化されたGOタームをCytoscapeソフトウェアプラットフォーム(v3.5.1; http://www.cytoscape.org/what_is_ cytoscape.tml)を使用して解析した。機能的にグループ化されたGOタームネットワークをClueGOプラグイン(v2.3.4; http://apps.cytoscape.org/apps/cluego)およびCluePedia(v1.3)を使用して可視化した。上位24遺伝子のClueGO解析を5アノテーショングループで実施した(群p値＜0.002)。生物学的過程、細胞成分および分子機能遺伝子エンリッチメントを、GSEAソフトウェア(v 3.0)を使用して解析した。GSEA可変値を、各遺伝子セットについて1,000／変異、古典的エンリッチメント統計値およびシグナル対ノイズ分離メトリックに設定した。さらに、リプログラミングの0日目および6日目に発現された遺伝子の発現レベルを比較したとき、互いに3倍を超えて発現された遺伝子群(DEG)を回析した。
【0125】
cDNAを、iScript cDNA合成キット(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)を使用して1μgの総RNAから合成した。次いで、cDNAを1／50濃度まで希釈し、iQ SYBR Green Supermix(Bio-Rad)と混合し、次いでリアルタイム定量的PCRをApplied Biosystems 7500 Fast Fast Real-Time PCR装置系(Thermo Fisher Scientific)を使用して、実施した。この場合、各標的遺伝子のサイクル閾値(Ct)を、製造業者により提供されるソフトウェアを使用して決定し、発現データを内部対照として使用したRpl7のCt値で正規化した。次いで、細胞サンプル間の変化倍率を比較するために、各サンプルの遺伝子発現値を比較し、MEFに基づき示した。
【0126】
単一細胞RNAシーケンシング(scRNA-seq)方法
単一細胞RNAシーケンシング(scRNA-seq)を、iPSCRの過程およびiNSCR、iPSC、iNSCで得た開始線維芽細胞および各培養日に得た細胞を含む計33,966細胞で実施した。
単一細胞RNAシーケンシング(scRNA-seq)を、iPSCRの過程およびiNSCR、iPSC、iNSCで得た開始線維芽細胞および各培養日に得た細胞を含む計33,966細胞で実施した。
【0127】
scRNA-seqライブラリーを、Chromium Single Cell 3’ Reagent Kit v2(PN-120267, 10X Genomics)、Chromium Single Cell A Chip Kit(PN-120236, 10X Genomics)およびChromium Single Cell i7 Multiplex Kit(PN-120262, 10X Genomics)を使用して製造業者のマニュアルに従い産生した。細胞生存能は、顕微鏡下トリパンブルー染色で確認したとき、90％を超えると推定された。細胞を0.04％BSA含有DPBSで2×105～2×106細胞／mLに希釈し、Chromiumマイクロ流体プラットフォームに充填して、3,000細胞／チャネルを捕捉した。ライブラリーをIllumina HiSeq 4000プラットフォーム(2×100bp)でシーケンシングした。
【0128】
生FASTQファイルをデフォルト引数(arguments)およびCell Rangerソフトウェア(v2.1.0)を使用して、処理した。読み取り値を、マウス参照ゲノム(GRCm38)とEnsembl GRCm38.92アノテーションでアラインした。各条件の細胞毎遺伝子固有の分子識別子(UMI)数マトリックスを「期待-細胞＝3,000」で作成し、単一数マトリックスに統合した。空滴をFDR≦0.05の条件下、DropletUtils(v0.99)RパッケージのemptyDrops機能を使用して、除去した。外れ値を、scater(v1.7.18)Rパッケージを使用する品質管理マトリクス上の主成分解析(PCA)プロットで目視検査し、1,000UMI未満、102.5検出遺伝子未満(iNSCについて103検出遺伝子)およびミトコンドリア遺伝子にマッピングされた10％を超えるUMIの低品質細胞を除去した。生数マトリクスを、scran(v1.14.6)Rパッケージにより推定した細胞特異的サイズ係数により正規化し、次いで疑似カウント1でlog2変換した。全細胞にわたる高度可変遺伝子(HVG)をRパッケージを使用して、同定した。全細胞を、Seurat(v3.2.2)RパッケージのRunUMAP機能を、最初の50PCsおよびn.neighbors＝10で使用する均一多様体近似と射影プロット(UMAPプロット)で可視化した。リプログラミング5日目と7日目の間の細胞を、最初の25PCsからUMAPプロットで可視化した。細胞を、RパッケージのFindClusters機能を最初の30PCsおよび解像度＝0.6で使用してクラスター化した。遺伝子セットシグネチャスコアを、SeuratのAddModuleScore機能および通常知られるマーカー遺伝子を使用して、計算した。W. Wang et al., Changes in regeneration-responsive enhancers shape regenerative capacities in vertebrates. Science 369, (2020)に記載の芽体特異的マーカーを芽体シグネチャスコアの計算に使用した。デスモソーム(GO：CC)および上皮細胞分化(EMT、ホールマーク)遺伝子リストをMSigDBから得た。
【0129】
UMAP空間における経路を、Slingshot(v1.4.0)RパッケージのSlingshot機能を所定の開始クラスター(5～7日目：1、2～8日目：3、ゼブラフィッシュ：6、アホロートル：7)と共に使用して、解析した。経路に沿ったシグネチャスコアを、回帰の低下により丸め、WOT解析において、路線図をwot(v1.0.8)pythonパッケージを使用してHVG-発現データでoptimal_transportコマンドラインインターフェイスおよびデフォルト引数を用いて実施した。
【0130】
アルカリホスファターゼ(AP)染色および免疫蛍光染色の方法
AP染色のために、各細胞をダルベッコリン酸緩衝化食塩水(DPBS, WELGENE, Daegu, Korea)で１回洗浄し、10％ホルマリン溶液(Sigma-Aldrich)で30秒間固定した。AP染色を、Sigma-Aldrichのマニュアルに従い白血球APキット(Sigma-Aldrich)を使用して、実施した。固定サンプルを１回洗浄し、P基質溶液と20分間暗所で静置させた。
AP染色のために、各細胞をダルベッコリン酸緩衝化食塩水(DPBS, WELGENE, Daegu, Korea)で１回洗浄し、10％ホルマリン溶液(Sigma-Aldrich)で30秒間固定した。AP染色を、Sigma-Aldrichのマニュアルに従い白血球APキット(Sigma-Aldrich)を使用して、実施した。固定サンプルを１回洗浄し、P基質溶液と20分間暗所で静置させた。
【0131】
免疫蛍光染色のために、各細胞をDPBSで洗浄し、固定し、4％パラホルムアルデヒド(Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA)および0.15％ピクリン酸(Sigma-Aldrich)含有DPBSで15分間遮断し、3％BSA(Thermo Fisher Scientific)および0.3％Triton X-100(Sigma-Aldrich)含有DPBSで1時間、室温で透過性処理した。一次抗体を1％BSAで希釈し、一夜、4℃で静置した。1％BSA含有DPBSで繰り返し洗浄後、全サンプルを室温で1時間、Alexa-594またはAlexa-488コンジュゲート二次抗体(Thermo Fisher Scientific)と静置した。全蛍光画像をAxio Vert. A1顕微鏡(Carl Zeiss, Oberkochen, Germany)およびEvos FL auto 2撮像系(Thermo Fisher Scientific)で得た。
【0132】
透過型電子顕微鏡撮像
デスモソーム形成を回析するために、リプログラミングをgeltrex被覆カバーガラス(Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA)上で実施した。細胞を、2.5％グルタラルデヒド含有0.1M カコジル酸溶液(pH7.0)で1時間固定した。その後、細胞を、2％四酸化オスミウムで4℃で2時間処理した。細胞を段階的アセトンで脱水し、次いでSpurrMedia(ElectronMicroscopy Services)に包埋した。各サンプルをウルトラミクロトーム(RMC MTXL; Boeckeler Instruments, Tuscon, AZ, USA)で60nmに切断し、2％酢酸ウラニルで20分間染色し、クエン酸鉛で10分間染色した。各切片を、H-7600(HITACHI, Tokyo, Japan)透過型電子顕微鏡で80kVで観察した。
デスモソーム形成を回析するために、リプログラミングをgeltrex被覆カバーガラス(Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA)上で実施した。細胞を、2.5％グルタラルデヒド含有0.1M カコジル酸溶液(pH7.0)で1時間固定した。その後、細胞を、2％四酸化オスミウムで4℃で2時間処理した。細胞を段階的アセトンで脱水し、次いでSpurrMedia(ElectronMicroscopy Services)に包埋した。各サンプルをウルトラミクロトーム(RMC MTXL; Boeckeler Instruments, Tuscon, AZ, USA)で60nmに切断し、2％酢酸ウラニルで20分間染色し、クエン酸鉛で10分間染色した。各切片を、H-7600(HITACHI, Tokyo, Japan)透過型電子顕微鏡で80kVで観察した。
【0133】
実施例1-3. 各リプログラミング法および各リプログラミング期間における細胞の変化
リプログラミングの12日目の細胞のiPSC特異的マーカーNanogおよびSSEA-1、iNSC特異的マーカーPax6およびPLZFおよびiDP特異的マーカーFoxA2の免疫染色画像解析によると、リプログラミングの12日目の細胞は、細胞からiPSC、iNSCおよびiDPへの適切な変換を示した(図3)。
リプログラミングの12日目の細胞のiPSC特異的マーカーNanogおよびSSEA-1、iNSC特異的マーカーPax6およびPLZFおよびiDP特異的マーカーFoxA2の免疫染色画像解析によると、リプログラミングの12日目の細胞は、細胞からiPSC、iNSCおよびiDPへの適切な変換を示した(図3)。
【0134】
さらに、iPSCリプログラミングの12日目のAP染色の結果、LIFの存在または不在は2° MEFのiPSCへのリプログラミングの過程に何ら影響しないことが確認された(図4)。
【0135】
さらに、リプログラミング0日目～12日目の位相差画像および免疫蛍光染色画像解析の結果、リプログラミング6日目までリプログラミング法による細胞の差異はほとんどないことが判明した(図5)。さらに、主成分解析(PCA)により解析したトランスクリプトーム類似性は、全細胞がリプログラミングの6日目まで同じグループに分割されたことを示した(図6のクラスターI)。階層クラスタリングにより図2に示す各細胞のマイクロアレイデータを回析した結果、iPSCRおよびPDRは、互いに区別されるリプログラミング法であるが、リプログラミング6日目まで共通の生物学的経路を介して細胞をリプログラミングすることが確認された(図7および8)。さらに、リプログラミングの6日目の全細胞が体細胞としての特徴を失い、多能性関連遺伝子がまだ活性化されていなかったため、リプログラミングの6日目を一種の「中間期」として分類した(図9)。
【0136】
リプログラミングの6日目の中間段階に寄与する遺伝子を、実施例1～2のDEG解析を介して解析した。DEGを、k平均クラスタリングを介して４グループに分類し、分類基準を図10に示す(図10の下部)。これらの中でグループIVに対応する遺伝子は、解析遺伝子の70％超で中間段階特異的発現を示した(図8および図10の上部)。
【0137】
さらに、ネットワークベースの遺伝子オントロジー解析をiPSCRのグループIVおよびPDRのグループIVに共通する244遺伝子のClueGOを使用して、実施した。これら244遺伝子は線維芽細胞、iPSC、iNSCおよびiDPではほとんど発現されないが、リプログラミングの6日目に発現レベルが高いことが判明した(図11および12)。これら遺伝子のGO解析で上位に位置するGOタームを図13に示す。
【0138】
一方では、培養6日目の時点の細胞で、リプログラミングが始まる細胞およびリプログラミングが完了した最終細胞を遺伝子セットエンリッチメント解析で解析し、最高順位であった遺伝子セットはデスモソームに関連することが判明し、さらに、上皮細胞分化に関連することが判明した(図14)。故に、上皮関連遺伝子はiPSCRおよびPDR両方で「中間段階」特異的であるデスモソームおよび上皮細胞分化に関連する特徴を有することが確認された。
【0139】
透過型電子顕微鏡でデスモソーム形成が確認されたとき、成熟デスモソームはリプログラミングの6日目の細胞でのみ形成された(図15および16)。
【0140】
実施例1-4. デスモソームとリプログラミング法の相関
間葉上皮転換(MET)はリプログラミング初期段階の必須過程である。従って、間葉性関連遺伝子および上皮関連遺伝子が発現されるかを確認した(図17)。上皮遺伝子の中で、デスモソームと無関係の遺伝子(Cdh1、Ep-camおよびCldn6)の発現増加がリプログラミングの6日目の細胞およびiPSCで観察された。他方で、間葉性遺伝子(Snail、Slug、Zeb1、Twist1、Twist2、Cdh2およびFn)の発現減少が全細胞で示された。しかしながら、デスモソーム成分遺伝子(DspおよびPkp1)およびサイトケラチン(Krt8およびKrt19)の発現が培養6日目の細胞で増加し、一方iPSCで減少することが判明した。これは、デスモソーム関連上皮遺伝子がMETに関与する上皮遺伝子(例えば、Cdh1)と異なって制御されることを示唆する。
間葉上皮転換(MET)はリプログラミング初期段階の必須過程である。従って、間葉性関連遺伝子および上皮関連遺伝子が発現されるかを確認した(図17)。上皮遺伝子の中で、デスモソームと無関係の遺伝子(Cdh1、Ep-camおよびCldn6)の発現増加がリプログラミングの6日目の細胞およびiPSCで観察された。他方で、間葉性遺伝子(Snail、Slug、Zeb1、Twist1、Twist2、Cdh2およびFn)の発現減少が全細胞で示された。しかしながら、デスモソーム成分遺伝子(DspおよびPkp1)およびサイトケラチン(Krt8およびKrt19)の発現が培養6日目の細胞で増加し、一方iPSCで減少することが判明した。これは、デスモソーム関連上皮遺伝子がMETに関与する上皮遺伝子(例えば、Cdh1)と異なって制御されることを示唆する。
【0141】
さらに、iPSCで主に発現されるデスモグレイン2(Dsg2)以外、あるデスモソームタンパク質がリプログラミングの6日目の細胞で特異的に発現されることが判明した(図18A～18C)。大部分のデスモソームタンパク質はリプログラミング中一過性に増加し、iPSCで減少する。
【0142】
実施例1-5. リプログラミングされる細胞およびリプログラミング法およびデスモソームの相関
プログラミング法およびリプログラミングされる細胞型は、リプログラミングの6日目デスモソームタンパク質の発現パターンに影響しないことが判明した。
プログラミング法およびリプログラミングされる細胞型は、リプログラミングの6日目デスモソームタンパク質の発現パターンに影響しないことが判明した。
【0143】
デスモソームタンパク質の発現パターンがヒト気管支上皮細胞(NHBEs)および前立腺上皮細胞(PrECs)のiPSCへの変換過程で変化するかを確認するために、accession number GSE50206の正規化マイクロアレイマトリクスを、NCBI Gene Expression Omnibus(GEO)から得て、GEOquery(v.2.58.0)RパッケージのGEO機能を使用して解析した。
【0144】
さらに、デスモソームタンパク質の発現パターンが2°B細胞をOSKMで処理することにより2°B細胞からiPSCへの変換過程で変換するかを確認するために、B. Di Stefano et al., C/EBPalpha poises B cells for rapid reprogramming into induced pluripotent stem cells, Nature 506, 235-239 (2014)により提供されたマイクロアレイデータを解析した。
【0145】
2° B細胞リプログラミングに関連するデータ解析の結果、一過性デスモソーム成分活性化が非多能性細胞である2° B細胞のiPSCへの変換過程で判明した(図19A)。さらに、類似結果がNHBEおよびPrECリプログラミングの過程で得られた(図19B)。これは、デスモソーム形成がOSKM関連リプログラミングの「中間段階」の主要事象であり、リプログラミングされる細胞のタイプおよびリプログラミング法と無関係に起こることを示す。
【0146】
実施例1-6. リプログラミングにおけるDsp役割(I)
DSPタンパク質は、成熟デスモソームの形成、中間径フィラメントのデスモソーム斑への連結における必須因子である。成熟デスモソーム形成がOSKMによるリプログラミングに必須であるかを決定するために、dspのためのβ-D-1-チオガラクトピラノシド(IPTG)誘導可能短ヘアピンRNA(shDsp)をiPSCRおよびiNSCRの過程で使用して、Dsp発現を阻害した(図20A)。
DSPタンパク質は、成熟デスモソームの形成、中間径フィラメントのデスモソーム斑への連結における必須因子である。成熟デスモソーム形成がOSKMによるリプログラミングに必須であるかを決定するために、dspのためのβ-D-1-チオガラクトピラノシド(IPTG)誘導可能短ヘアピンRNA(shDsp)をiPSCRおよびiNSCRの過程で使用して、Dsp発現を阻害した(図20A)。
【0147】
マウスDsp遺伝子のためのshRNA(配列番号85：GCCTACAAGAAAGGTCTCATT)を含むpLKO-GFP-IPTG-3xLacOレンチウイルスベクターを、Sigma-Aldrichに要求することにより調製した。この場合、オフターゲットshRNA含有プラスミドベクターであるshCTRL(Sigma Aldrich、SCH332)を対照群として使用した。レンチウイルスベクターをHEK 293T細胞を使用して産生し、細胞をTransIT-2020トランスフェクション剤(Mirus Bio, Madison, WI, USA)を使用して、水疱性口内炎ウイルスコートタンパク質プラスミド(pMD2.G; Addgene, Watertown, MA, USA)およびパッケージングプラスミド(psPAX2; Addgene)と共に調製したレンチウイルスベクターでトランスフェクトした。8時間～16時間後、トランスフェクトHEK 293T細胞をDPBSで洗浄し、次いでさらにMEF培地でさらに48時間培養した。48時間後、培地の上清を回収し、HEK293T細胞が遠心分離および濾過により除去されたウイルス上清を回収した。次いで、回収したウイルス上清を使用して、6μg／mLのポリブレン(Sigma-Aldrich)で2° MEFをトランスフェクトした。
【0148】
トランスフェクト2° MEFを、5分間0.05％トリプシン-EDTAで分離し、DPBSで洗浄し、次いでFACS緩衝液(0.5％BSA含有DPBS)に再懸濁し、FACSariaセルソーター(BD Biosciences)を使用して単離した。選択したトランスフェクト2°MEFを、geltrex被覆プレートで2×104細胞／cm2で播種した。Dsp遺伝子のノックダウンのために、細胞をトランスフェクション後の日から6日間1mMのIPTG(Sigma-Aldrich)で処理した。
【0149】
Dspノックダウン(Dsp KD)はiPSC産生の効率を減少し、細胞における多能性バイオマーカー(アルカリホスファターゼおよびNanog)を発現するコロニー数の有意な減少を示した(図20Bおよび20C)。Dsp KDは得られたiNSCも顕著に減少させた(図20D)。
【0150】
その結果、図20に示すとおり、DspノックダウンはgIC形成を減少させた(図20Eおよび20F)。従って、Dsp遺伝子の発現はgIC形成に関与する重要な因子であることが確認された。さらに、DspノックダウンはAktシグナル伝達を妨害することが判明した(図21)。
【0151】
実施例1-7. リプログラミングにおけるDsp役割(II)
実施例1-1で使用したiPSCRまたはiNSCR法の手段によるヒト線維芽細胞のリプログラミングの過程において、DSPは過剰発現した。
実施例1-1で使用したiPSCRまたはiNSCR法の手段によるヒト線維芽細胞のリプログラミングの過程において、DSPは過剰発現した。
【0152】
CRL-2097(American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA)、ヒト線維芽細胞を、24ウェルプレートに30,000細胞／cm2で播種し、製造業者のマニュアルに従い、センダイウイルス(SeV)混合物(CytoTuneTM-iPS 2.0 Sendai reprogramming kit; Thermo Fisher Scientific)を使用して形質転換した。翌日、SeV混合物をDPBSで洗浄した。
【0153】
ヒトiPSCリプログラミングのために、細胞を線維芽細胞培地(10％FBS、1×ピルビン酸ナトリウム(Thermo Fisher Scientific)および1×MEM-NEAAを添加したMEM培地(Thermo Fisher Scientific))でさらに2日間培養した。形質転換後3日目、線維芽細胞培地をiPSCリプログラミング培地(3.0μM CHIR99021(Tocris Bioscience, Bristol, UK)、0.5μM A83-01(Tokris)および0.2mM NaB(Sigma-Aldrich)を添加したmTeSR-1(STEMCELL Technologies, Vancouver, Canada)培地)に置き換えた。
【0154】
ヒトiNSCリプログラミングのために、SeV混合物をDPBSで洗浄し、培地を3.0μM CHIR99021、0.5μM A83-01および10ng／mL hLIF(Peprotection)が添加されたヒト神経リプログラミング培地に置き換え、ヒト神経リプログラミング培地を隔日で交換した。
【0155】
形質転換4日目、細胞を1μgのDSPプラスミド(Addgene, Cat。32227)および空プラスミド(pEGFP-N1; Takara Bio, Shiga, Japan)でトランスフェクトした。
【0156】
DSPの過剰発現は、iPSCおよびiNSC産生の効率を顕著に増加させた(図22A～22E)。これは、DspがOSKMによるリプログラミングの進行および中間期に影響する主要因子であることを示す。
【0157】
実施例2. Dsp遺伝子発現阻害実験(インビボ)
爬虫類および魚類は、体の損傷部位の細胞を脱分化して芽体を形成することにより、損傷部位を再生できる。芽体は、脱分化した多能性細胞集団であり、由来する組織の記憶を維持しながら、損傷組織または臓器を構成する細胞系譜特異的細胞に再分化する。一方では、Oct4、Sox2、Klf4およびc-Mycの一過性増加が芽体細胞の発生時観察されたため、実施例1のリプログラミングと爬虫類および魚類における組織再生は、共通機構を有することが期待された。
爬虫類および魚類は、体の損傷部位の細胞を脱分化して芽体を形成することにより、損傷部位を再生できる。芽体は、脱分化した多能性細胞集団であり、由来する組織の記憶を維持しながら、損傷組織または臓器を構成する細胞系譜特異的細胞に再分化する。一方では、Oct4、Sox2、Klf4およびc-Mycの一過性増加が芽体細胞の発生時観察されたため、実施例1のリプログラミングと爬虫類および魚類における組織再生は、共通機構を有することが期待された。
【0158】
従って、Dsp遺伝子の役割を確認する実験を、ゼブラフィッシュで実施した。ゼブラフィッシュ(Danio rerio、AB野生型)を、標準条件下、28.5℃で気候順化させた。ゼブラフィッシュに乾燥餌およびブラインシュリンプを毎日与え、14時間明所および10時間暗所のスケジュールで飼育した。ゼブラフィッシュの飼育および動物の管理は、KRIBBのガイドラインおよびKRIBB-IACUCの承認(Approval No.: KRIBB-AEC-17073、KRIBB-AEC-20056)に従い実施した。
【0159】
実施例2-1. Dsp遺伝子発現阻害による芽体細胞減少の確認
野生型ゼブラフィッシュの胚を、ペトリ皿で、E3卵海水(5mM NaCl、0.17mM KCl、0.33mM CaCl2、0.33mMMgSO4)で28.5℃に維持した。1nLの0.4mM 対照モルホリノ溶液(ctrlMO)または0.4mM dspaとdspbの混合モルホリノ溶液(dsp混合MO)を、単細胞卵に注入した。2日受精後(dpf)のゼブラフィッシュ幼生を、卵海水のトリカインで麻酔し、次いで尾ひれを外科的剃刀で切断した。ひれ切断部位として、脊索のすぐ後側の同じ部位を切断した。21時間後、ひれ切断部位を固定し、芽体細胞マーカー遺伝子であるjunbb遺伝子を、全載インサイチュハイブリダイゼーション(WISH)により確認した。
野生型ゼブラフィッシュの胚を、ペトリ皿で、E3卵海水(5mM NaCl、0.17mM KCl、0.33mM CaCl2、0.33mMMgSO4)で28.5℃に維持した。1nLの0.4mM 対照モルホリノ溶液(ctrlMO)または0.4mM dspaとdspbの混合モルホリノ溶液(dsp混合MO)を、単細胞卵に注入した。2日受精後(dpf)のゼブラフィッシュ幼生を、卵海水のトリカインで麻酔し、次いで尾ひれを外科的剃刀で切断した。ひれ切断部位として、脊索のすぐ後側の同じ部位を切断した。21時間後、ひれ切断部位を固定し、芽体細胞マーカー遺伝子であるjunbb遺伝子を、全載インサイチュハイブリダイゼーション(WISH)により確認した。
【0160】
具体的に、まず、インサイチュプローブを形成するために、PCRを使用して、野生型ゼブラフィッシュのcDNAにおける芽体細胞マーカー遺伝子であるjunbb遺伝子のためのDNA鋳型を増幅した。本例で使用したプローブを下表4に示す。
【表7】
【0161】
次いで、PCR産物を分離し、アガロースゲルで精製し、pCRTM Blunt II-TOPO(登録商標)ベクターにクローン化した。Dig標識アンチセンスプローブをインビトロでSP6またはT7 RNAポリメラーゼキット(Roche)により転写し、NucAwayスピンカラム(Thermo Fisher Scientific)で精製した。
【0162】
WISHのための成体および幼生ゼブラフィッシュのひれを4％パラホルムアルデヒド含有1×PBS溶液で固定し、メタノールを使用して脱水した。次いで、-20℃で30分間保存し、1×PBST溶液で連続的に再水和することにより調製した。再水和胚を1×PBSでプロテアーゼKで処理し、次いで4％パラホルムアルデヒドで固定した。アンチセンスプローブを、各発育段階の固定胚と、ハイブリダイゼーション溶液(5mg／mL Torula酵母RNAタイプVI、50μg／mL ヘパリン、50％ホルムアミド、5×SSC、0.1％Tween-20、1M クエン酸を使用してpH6.0に調整)中、一夜、70℃でハイブリダイズした。プローブを70℃で2×SSCT-F(2×SSCT、50％ホルムアミド、0.1％Tween20)、2×SSCT(2×SSCT、0.1％Tween20)、0.2×SSCT(0.2×SSCT、0.1％Tween20)でおよび室温で1×PBSTで連続的に洗浄した。
【0163】
その後、非特異的結合を、室温で遮断溶液(5％ウマ血清、1×PBST)で遮断し、アルカリホスファターゼ結合抗ジゴキシゲニン抗体(Roche)をそれに添加して、一夜、4℃で反応させた。NBT／BCIP溶液(Roche)を、トランスクリプトームの発現シグナルを検出するために、アルカリホスファターゼ(AP)基質として使用した。トランスクリプトームの発現パターンをOlympus SZX16顕微鏡を使用して観察し、TUCSEN Dhyana 400DC49で撮像した。WISHの定量を、ひれ膜のAP活性に従い実施した。遺伝子発現計算のために、データをPhotoshop(Adobe Systems Inc., San Jose, CA, USA)を使用して画素化し、AP陽性(青色)画素の数をImage Jソフトウェアを使用して計算した。この場合、Hpfは「受精後時間」を意味し、Hpaは「切断後時間」を意味する。
【0164】
その結果、ctrlMOを注入したとき、junbb遺伝子は、切断部位でjunbb(＋)細胞を形成することにより芽体細胞をマークすることが確認された。他方で、dsp混合MOを注入したとき、junbb(＋)細胞の形成が減少することが確認され、故に、Dsp遺伝子発現阻害により芽体細胞の形成が阻害されることが確認された(図23B)。
【0165】
実施例2-2. Dsp遺伝子発現阻害による芽体細胞マーカー遺伝子発現減少の確認
野生型ゼブラフィッシュの胚を、ペトリ皿中、28.5℃でE3卵海水(5mM NaCl、0.17mM KCl、0.33mM CaCl2、0.33mMMgSO4)中に維持した。1nLの0.4mM 対照モルホリノ溶液(ctrlMO)または0.4mM dspaとdspbの混合モルホリノ溶液(dsp混合MO)を単一細胞卵に注入した。2dpfのゼブラフィッシュ幼生を卵海水中のトリカインで麻酔し、次いで尾ひれを外科的剃刀を使用して切断した。ひれ切断部位として、脊索のすぐ後側の同じ部位を切断した。
野生型ゼブラフィッシュの胚を、ペトリ皿中、28.5℃でE3卵海水(5mM NaCl、0.17mM KCl、0.33mM CaCl2、0.33mMMgSO4)中に維持した。1nLの0.4mM 対照モルホリノ溶液(ctrlMO)または0.4mM dspaとdspbの混合モルホリノ溶液(dsp混合MO)を単一細胞卵に注入した。2dpfのゼブラフィッシュ幼生を卵海水中のトリカインで麻酔し、次いで尾ひれを外科的剃刀を使用して切断した。ひれ切断部位として、脊索のすぐ後側の同じ部位を切断した。
【0166】
各段階のゼブラフィッシュ胚をTRI剤(Thermo Fisher Scientific)を使用して得て、次いで、総RNAをDirect-zol RNA miniprepキット(Zymo Research, Irvine, CA, USA)で抽出し、SuperScript III First-Strand Synthesis System(Thermo Fisher Scientific)を使用してcDNAを合成した。合成cDNAを、上の表2に示すプライマーを使用する半定量的PCRを介して増幅した。
【0167】
その結果、msx1b、fgf20a、her6およびhspd1遺伝子は野生型ゼブラフィッシュで発現されるのに対し、dsp遺伝子がノックダウンされたゼブラフィッシュでこれら遺伝子の発現が有意に減少することが確認された(図24)。従って、ゼブラフィッシュの鰭再生に重要である芽体細胞マーカー遺伝子の発現が、dsp遺伝子をノックダウンしたとき減少することが確認された。
【0168】
実施例2-3. 芽体細胞形成減少による鰭再生能減少の確認
実施例2-1において、Dsp遺伝子発現阻害により芽体細胞が減少することが確認された。芽体細胞は、細胞再生に関与する重要な細胞である。鰭が再生する能力が、芽体細胞形成の減少により減少するかを確認するため、ひれの再生能をdsp遺伝子発現阻害後確認した。尾ひれ再生実験を、6～9カ月齢の成体ゼブラフィッシュで実施した。成体ゼブラフィッシュを実験前33℃で気候順化させた。ゼブラフィッシュを尾ひれ切断前トリカインで麻酔し、鰭肢帯遠位の７つの骨質部分で尾ひれを切断した。尾切断後、ゼブラフィッシュを33℃タンクに戻した。Dsp遺伝子ノックダウンのために、下表5のモルホリノオリゴヌクレオチド(Gene Tools Inc., Philomath, OR, USA、以後、モルホリノ)を使用した。
実施例2-1において、Dsp遺伝子発現阻害により芽体細胞が減少することが確認された。芽体細胞は、細胞再生に関与する重要な細胞である。鰭が再生する能力が、芽体細胞形成の減少により減少するかを確認するため、ひれの再生能をdsp遺伝子発現阻害後確認した。尾ひれ再生実験を、6～9カ月齢の成体ゼブラフィッシュで実施した。成体ゼブラフィッシュを実験前33℃で気候順化させた。ゼブラフィッシュを尾ひれ切断前トリカインで麻酔し、鰭肢帯遠位の７つの骨質部分で尾ひれを切断した。尾切断後、ゼブラフィッシュを33℃タンクに戻した。Dsp遺伝子ノックダウンのために、下表5のモルホリノオリゴヌクレオチド(Gene Tools Inc., Philomath, OR, USA、以後、モルホリノ)を使用した。
【表8】
【0169】
各モルホリノは3-フルオレセインタグを含み、水に再懸濁する。dspaおよびdspbのモルホリノを1：1比で混合して、両デスモプラキン遺伝子を同時にノックダウンした。切断48時間後、1mM モルホリノを各ゼブラフィッシュ尾ひれにPV380空気圧式ピコポンプ(World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA)を使用して背面の再生組織に注射した。各モルホリノ注射は各骨再生組織を標的とし、約70nLのモルホリノ溶液を注射した。
【0170】
モルホリノ溶液注射直後、エレクトロポレーションを、NEPA21 Electroporator(Nepa Gene Co., Ltd., Chiba, Japan)を使用して、ひれの背および腹(非特異的エレクトロポレーション効果を制御するため)両側に実施した。この場合、エレクトロポレーションパラメータは、CUY647 15mm直径白金粘土電極(Protech International Inc., Cornelius, NC, USA)を使用する、3連続15Vの50msecパルスとパルス間の50msec休止を使用した。エレクトロポレーションの効率を増加するために、エレクトロポレーションを同じパラメータを使用して２回実施した。次いで、ゼブラフィッシュを33℃の水槽に戻した。切断72時間後、各ひれを、TUCSEN Dhyana 400DCデジタルカメラを備えたOlympus SZX16顕微鏡を使用して、写真を撮った。
【0171】
背および腹ひれの再生領域を、Image Jソフトウェア(National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA)を使用して計算した。この場合、再生のパーセンテージを((D3dpa-D2dpa)／(v3dpa-V2dpa))×100により計算し、再生におけるモルホリノの統計的有意をスチューデントのt検定を使用して解析した。
【0172】
その結果、図23に示すとおり、Dsp遺伝子をノックダウンしたとき、ゼブラフィッシュのひれ再生能が減少することが確認された。
【0173】
実施例3. 多能性細胞およびその特徴の同定
実施例3-1. リプログラミング「中間期」に形成される細胞凝集体の同定および解析
リプログラミングの6日目、細胞凝集体が形成され(図5および20)、Dsp発現を抑制したとき、これら細胞凝集体の数が減少した(図20Eおよび20F)。
実施例3-1. リプログラミング「中間期」に形成される細胞凝集体の同定および解析
リプログラミングの6日目、細胞凝集体が形成され(図5および20)、Dsp発現を抑制したとき、これら細胞凝集体の数が減少した(図20Eおよび20F)。
【0174】
Accutase(MilliporeSigma, Billerica, MA, United States)を使用して細胞を1時間分離し、プレートからリプログラミングの6日目の細胞を単離した。さらに、リプログラミングの6日目上清を分離後、分離上清を300×gで3分間遠心分離し、DPBS(WELGENE, Daegu, Korea)で洗浄し、gICを単離した。
【0175】
細胞凝集体をDspに対する抗体およびDsc3に対する抗体で染色した(図25Aおよび25B)。解析の結果として、培養6日目に形成された細胞凝集体はDspおよびDsc3で2細胞群に分類されることが判明した。すなわち、細胞凝集体をDspおよびDsc3両者が発現される細胞集団である「デスモソーム成分発現中間細胞(dIC)」およびDspおよびDsc3の発現なく粒状形態を示す細胞集団である「粒状中間細胞(gIC)」。2タイプの細胞集団は1細胞凝集体で一緒に観察され、gICはDspを発現しなかったが、gICはDsp KD中に形成されなかった(図20E、20F、25Aおよび25B)。さらに、iPSCRおよびiNPCRによる確立されたコロニーのレトロスペクティブ追跡は、dICとgICの同じ階層関係を支持し(図26)、故に、Dsp発現がgIC形成に必要な条件であったことが確認された。
【0176】
実施例3-2. dICおよびgICの解析
dICおよびgICがリプログラミングの6日目に観察されたため、リプログラミングの5日目およびリプログラミングの7日目にある細胞を回析した(図27Aおよび28B)。リプログラミングの6日目までiPSCRおよびiNSCR両者で類似する細胞特徴が示されたが、iPSCリプログラミング中のMET成功のマーカーであるShisa8は、リプログラミング5日目および7日目の細胞集団の亜集団で観察された(図27Aおよび27B)。さらに、UMAPでShisa8＋／Dsp＋であると考えられる細胞はdICであり、UMAPでShisa8＋／Dsp-と考えられる細胞はgICであった(図27Bおよび27C)。
dICおよびgICがリプログラミングの6日目に観察されたため、リプログラミングの5日目およびリプログラミングの7日目にある細胞を回析した(図27Aおよび28B)。リプログラミングの6日目までiPSCRおよびiNSCR両者で類似する細胞特徴が示されたが、iPSCリプログラミング中のMET成功のマーカーであるShisa8は、リプログラミング5日目および7日目の細胞集団の亜集団で観察された(図27Aおよび27B)。さらに、UMAPでShisa8＋／Dsp＋であると考えられる細胞はdICであり、UMAPでShisa8＋／Dsp-と考えられる細胞はgICであった(図27Bおよび27C)。
【0177】
実際、単離gICにおいて、Dsp発現は低いままであったが、Shisa8およびCdk1は高度に発現された(図27E)。
【0178】
さらに、iPSCR過程を再付着後再開したとき、gICは培養皿から容易に脱離し、iPSC様コロニーを形成した(図27D)。gICはiPSCとなる能力を有するが、gICは多能性マーカー(Nanog、Rex1およびEsrrb)をほとんど発現せず、故に、gICはiPSCと異なる細胞であることが確認された(図27Eおよび27C)。
【0179】
さらに、Spink2遺伝子はiPSCで発現されず、一方その発現はgICで相当レベルであることが確認された(図29)。故に、gICは、iPSCと異なる特徴を有する細胞であることが確認された。
【0180】
dICとgICの細胞系譜相関を調査するため、Slingshot解析(K. Street et al., Slingshot: cell lineage and pseudotime inference for single-cell transcriptomics. BMC Genomics 19, 477 (2018)に開示の解析法)を実施した。解析の結果として、dIC集団(クラスター1、4および8; Shisa8＋／Dsp＋)はShisa8発現により2つのトラジェクトリーに分岐されることが判明した(図27Fおよび28D)。Shisa8陰性経路の細胞(クラスター2、6、7および11)はMEF同一性および老化などの間質シグネチャを発現し、これら細胞がリプログラミングに抵抗性であることが教示された(図27C、25Eおよび28A)。
【0181】
Shisa8陽性経路としてリプログラミング成功経路のdIはgIC集団に変換された(クラスター0、3および12; Shisa8＋／Dsp-)。Waddington最適輸送(WOT)解析(解析法はG. Schiebinger et al., Optimal-Transport Analysis of Single-Cell Gene Expression Identifies Developmental Trajectories in Reprogramming. Cell 176, 928-943 e922 (2019)に開示)は同じ結果を示し、gICがdICに由来することが確認された(図28Eおよび28F)。故に、Shisa8陽性リプログラミング成功経路、Dsp発現はdICの確立に必要であり、次いでDsp発現が減少してgICが確立されることが確認された。
【0182】
さらに、Aktシグナル伝達阻害剤であるMK2206を使用してリプログラミングを妨害したとき、細胞凝集体数は有意に減少したが、MK2206はiPSCおよびiNSCの自己再生に影響しないことが判明した(図30A～30I)。よって、Dsp-Aktシグナル伝達はdICおよびgIC産生のための特異的かつ必須の因子であることが確認された。
【0183】
さらに、MK2206を使用したときでも、iPSCは中間期で確立されず、scRNA-seqデータを回析しても、中間期にあるiPSCにより発現される多能性遺伝子を発現する細胞は検出されなかった。MK2206がiPSCの自己再生を妨害しないため、一過性にリプログラミング過程の中間期にあると考えられる細胞凝集体がiPSCを含まないことが確認された。
【0184】
結果として、dICおよびgICは細胞リプログラミング進行のための必須細胞であることが確認された。
【0185】
実施例3-3. リアルタイムPCR解析
gIC特異的マーカー遺伝子発現解析を実施例1-2で使用したリアルタイムPCR解析を使用して実施し、使用するプライマーは上の表1に示す。
gIC特異的マーカー遺伝子発現解析を実施例1-2で使用したリアルタイムPCR解析を使用して実施し、使用するプライマーは上の表1に示す。
【0186】
その結果、相当レベルのShisa3、Foxo4、Ptp4a3、Blvra、Mbnl3、Mthfd2およびDctpp1遺伝子がgICで発現し、一方これら遺伝子の発現はiPSCで極めて低かったことが確認された(図31)。故に、同様にgICがiPSCと異なる特徴を有する細胞であることが確認された。
【0187】
実施例3-4. gICの芽体細胞への分化能
gICを超低付着96ウェルプレート(Corning Incorporated, Kennebunk, ME, United States)に播種し、次いでドキシサイクリン含有RepM-Ini培地で24～48時間培養した。次いで、gIC凝集体を35mmペトリ皿に移し、ドキシサイクリン不含RepM-Ini培地で7日間懸濁培養した。その後、凝集体をgeltrex被覆培養プレートに付着させ、次いでさらに7日間培養した。実施例1-2に記載の免疫蛍光染色法により免疫蛍光染色を実施し、gICの3個の胚葉への分化能を確認した。この場合、使用した一次および二次抗体は上の表3に示す。
gICを超低付着96ウェルプレート(Corning Incorporated, Kennebunk, ME, United States)に播種し、次いでドキシサイクリン含有RepM-Ini培地で24～48時間培養した。次いで、gIC凝集体を35mmペトリ皿に移し、ドキシサイクリン不含RepM-Ini培地で7日間懸濁培養した。その後、凝集体をgeltrex被覆培養プレートに付着させ、次いでさらに7日間培養した。実施例1-2に記載の免疫蛍光染色法により免疫蛍光染色を実施し、gICの3個の胚葉への分化能を確認した。この場合、使用した一次および二次抗体は上の表3に示す。
【0188】
その結果、図32に示すとおり、gICは特異的分化条件なく、3個の胚葉を構成する種々の細胞に自然に分化できることが確認された。
【0189】
実施例3-5. gICのiPSCおよびiNSCへの変化
gICをgeltrex被覆プレートに2×104細胞／cm2で播種し、ドキシサイクリン含有RepM-Ini培地で2日間培養した。その後、培養培地をドキシサイクリン含有RepM-PSCまたはドキシサイクリン不含RepM-NSCに置き換え、次いで4日間培養した。
gICをgeltrex被覆プレートに2×104細胞／cm2で播種し、ドキシサイクリン含有RepM-Ini培地で2日間培養した。その後、培養培地をドキシサイクリン含有RepM-PSCまたはドキシサイクリン不含RepM-NSCに置き換え、次いで4日間培養した。
【0190】
次いで、培養細胞をDPBSで１回洗浄した。細胞を、0.15％ピクリン酸(Sigma-Aldrich)含有4％パラホルムアルデヒド(Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA)で15分間固定した。その後、DPBSで3回洗浄し、続いて、0.3％Triton X-100(Sigma-Aldrich)含有3％BSA(Thermo Fisher Scientific)中、1時間、室温で反応させた。細胞を1％BSAで希釈した一次抗体で処理し、一夜、4℃で反応させた。翌日、DPBSで3回洗浄後、Alexa-594またはAlexa-488標識二次抗体(Thermo Fisher Scientific)での処理により室温で1時間反応させた。DPBSで3回洗浄後、Axio Vert.A1顕微鏡(Carl Zeiss, Oberkochen, Germany)およびEvos FL auto 2 imaging system(Thermo Fisher Scientific)を使用して蛍光画像を捕捉した。この場合、使用した一次抗体を上の表3に示す。
【0191】
その結果、図26に示すとおりおよび33、iPSCおよび神経幹細胞(iNSC)はgICから形成されることが確認された。
【0192】
実施例3～6. gICの発癌性の実験(インビボ)
マウスの飼育および動物の管理は、KRIBBのガイドラインおよびKRIBB-IACUCの承認(Approval No.:KRIBB-AEC-20062)に従い実施した。
マウスの飼育および動物の管理は、KRIBBのガイドラインおよびKRIBB-IACUCの承認(Approval No.:KRIBB-AEC-20062)に従い実施した。
【0193】
gICの発癌性を確認するために、5×103、5×104または2×105細胞のgICおよび5×103または5×104細胞のiPSCを、肥満および糖尿病が引き起こされる重度複合免疫欠損マウス(Jackson Laboratory、計12マウス)に皮下注射した。その後、マウスを4～8週間モニターした。この場合、発癌性を有するiPSCを陽性対照として使用した。
【0194】
その結果、図34に示すとおり、iPSC投与マウスの場合腫瘍が移植後4週目で形成されたことが裸眼で確認された。他方で、gIC投与マウスの場合、2×105細胞である最大細胞が添加された1マウス以外、腫瘍が殆ど形成されなかったことが裸眼で確認された。さらに、マウスの腫瘍形成の程度測定の結果として、iPSC投与マウス(D、E)の場合、全腫瘍は4週目に形成され、一方2×105細胞のgICを投与されたマウス(A)の場合、腫瘍のわずか約20％が形成され、5×103および5×104細胞のgICを投与されたマウス(B、C)で腫瘍は形成されなかった。その後、gIC投与マウスを8週目まで観察したとき、腫瘍の約50％が2×105細胞のgICを投与されたマウス(A)で観察され、5×104細胞のgICを投与されたマウス(B)の場合約20％であり、5×103細胞でgICを投与されたマウス(C)の場合腫瘍は形成されなかった。よって、gICは、iPSCより有意に低い発癌性を有する多能性細胞であることが確認された。
【0195】
実施例4. gICの組織再生効果
創傷を引き起きたマウスモデルの皮膚のgICでの処置により、gICが実際組織再生効果を示したかを確認した。
創傷を引き起きたマウスモデルの皮膚のgICでの処置により、gICが実際組織再生効果を示したかを確認した。
【0196】
1匹の健常30週齢ICRマウスへの80μLの3％Avatinの腹腔注射およびマウスの麻酔実施後、電動バリカンで脊椎の背面の毛を剃り、5mm半径の2個の円形創傷を筋膜性までの一定の深さで作り、一方は処置なし(対照創傷)および他の創傷はgICで処置した(実験群創傷)。実験群において創傷表面を4.5×104 gICで処置後、創傷を起こした後3日目、6日目、13日目および16日目(すなわち、傷害後3日(d.p.i)、6d.p.i、13d.p.iおよび16d.p.i)の創傷の断面面積を確認して、どの程度創傷が治癒したかを決定した。各期間について、円形創傷がなお残っている面積対最初の円形創傷の断面面積(残存創傷比)および残存創傷比／創傷治癒比としての創傷治癒比を下表6に示す。
【表9】
【0197】
表6に示すとおり、gICで処置した創傷は速い創傷治癒効果および皮膚組織再生の顕著に優れた効果を示した。よって、gICは組織再生の優れた効果を有することが確認された。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【図28】
【図29】
【図30】
【図31】
【図32】
【図33】
【図34】
【配列表】
【国際調査報告】