特表 2024-522385 ヒトメタニューモウイルスワクチン

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-06-19

(54)【発明の名称】ヒトメタニューモウイルスワクチン

(51)【国際特許分類】

   A61K 39/12 20060101AFI20240612BHJP

   C07K 14/08 20060101ALI20240612BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20240612BHJP

   C12P 21/02 20060101ALI20240612BHJP

   A61P 31/14 20060101ALI20240612BHJP

   A61P 37/04 20060101ALI20240612BHJP

【ＦＩ】

A61K39/12

C07K14/08 ZNA

C12N15/63 Z

C12P21/02 C

A61P31/14

A61P37/04

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023554016

(86)(22)【出願日】2022-04-08

(85)【翻訳文提出日】2023-09-04

(86)【国際出願番号】 EP2022059492

(87)【国際公開番号】W WO2022214678

(87)【国際公開日】2022-10-13

(31)【優先権主張番号】21167609.3

(32)【優先日】2021-04-09

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．プルロニツク

(71)【出願人】

【識別番号】520054792

【氏名又は名称】ヴァルネヴァ エスイー

(74)【代理人】

【識別番号】100114775

【弁理士】

【氏名又は名称】高岡 亮一

(74)【代理人】

【識別番号】100121511

【弁理士】

【氏名又は名称】小田 直

(74)【代理人】

【識別番号】100202751

【弁理士】

【氏名又は名称】岩堀 明代

(74)【代理人】

【識別番号】100208580

【弁理士】

【氏名又は名称】三好 玲奈

(74)【代理人】

【識別番号】100191086

【弁理士】

【氏名又は名称】高橋 香元

(72)【発明者】

【氏名】ランドバーグ，アーバン

(72)【発明者】

【氏名】メインケ，アンドレアス

(72)【発明者】

【氏名】ペルギ，ファビアン

【テーマコード（参考）】

4B064

4C085

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B064AG32

4B064CA19

4B064CC24

4B064DA01

4C085AA03

4C085BA51

4C085CC05

4C085CC08

4C085CC21

4C085DD62

4C085DD86

4C085EE01

4C085EE06

4C085FF01

4C085FF12

4C085GG03

4C085GG04

4C085GG05

4C085GG08

4C085GG10

4H045AA11

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA10

4H045BA50

4H045CA01

4H045DA86

4H045EA31

4H045FA74

(57)【要約】

本発明は、呼吸器系のヒトメタニューモウイルス感染症等の呼吸器系感染症を予防及び／又は治療するためのワクチン組成物に関する。このワクチン組成物は、融合前融合コンフォメーション形態で提供される、１つ、２つ以上の改変ヒトメタニューモウイルス（ｈＭＰＶ）Ｆタンパク質又はそのバリアントを含む。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

唯一のｈＭＰＶ抗原としてのヒトメタニューモウイルス（ｈＭＰＶ）Ｆタンパク質又はその断片の安定化された融合前コンフォメーション形態と、任意選択的に１つ以上のアジュバント及び／又は少なくとも１つの薬学的に正しい担体若しくは賦形剤とから本質的になる、免疫原性組成物であって、前記ｈＭＰＶタンパク質が、遺伝子型Ａ又はＢの１つのサブグループに由来し、前記免疫原性組成物が、別のサブグループ及び／又は遺伝子型からのｈＭＰＶを交差中和する、免疫原性組成物。

【請求項2】

前記ヒトメタニューモウイルス（ｈＭＰＶ）Ｆタンパク質又はその断片の前記安定化された融合前コンフォメーション形態が、Ａ１サブグループのものである、請求項１に記載の組成物。

【請求項3】

前記組成物が、ｉ）前記遺伝子型Ａの前記ヒトメタニューモウイルス（ｈＭＰＶ）Ｆタンパク質又はその断片の安定化された融合前コンフォメーション形態、及びｉｉ）前記遺伝子型Ｂの前記ヒトメタニューモウイルス（ｈＭＰＶ）Ｆタンパク質又はその断片の安定化された融合前コンフォメーション形態と、任意選択的に１つ以上のアジュバント及び／又は少なくとも１つの薬学的に正しい担体若しくは賦形剤とから本質的になり、前記免疫原性組成物が、他のサブグループ及び／又は他の遺伝子型を交差中和する、請求項１又は２に記載の組成物。

【請求項4】

前記遺伝子型Ａの前記ヒトメタニューモウイルス（ｈＭＰＶ）Ｆタンパク質又はその断片の前記安定化された融合前コンフォメーション形態が、前記Ａ１サブグループのものであり、前記遺伝子型Ｂの前記ヒトメタニューモウイルス（ｈＭＰＶ）Ｆタンパク質又はその断片の前記安定化された融合前コンフォメーション形態が、前記Ｂ１サブグループのものである、請求項３に記載の組成物。

【請求項5】

前記融合前Ｆタンパク質が、組換えタンパク質である、先行請求項のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。

【請求項6】

前記融合前Ｆタンパク質が、細胞質尾部及び／又は膜貫通ドメインを欠いている、先行請求項のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。

【請求項7】

前記融合前Ｆタンパク質が、前記ｈＭＰＶ株又は臨床分離株に由来する天然Ｆタンパク質の改変アミノ酸配列であるアミノ酸配列を有する、先行請求項のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。

【請求項8】

前記天然Ｆタンパク質配列が、ｈＭＰＶ株ＮＬ／１／００、ＮＬ／１７／００、ＴＮ／９４－４９、ＮＣＬ１７４、ＣＡＮ９７－８３、ＮＬ／１／９、ＮＤＬ００－１、Ｃ１－３３４、ＣＡＮ９７－８２、及びＴＮ／８９－５１５に由来する配列番号１～１０のアミノ酸配列からなる群から選択される、請求項９に記載の免疫原性組成物。

【請求項9】

前記融合前Ｆタンパク質が、配列番号１～１０の天然Ｆタンパク質配列に対して、少なくとも１つの変異（置換又は欠失）、好ましくは、最大１０個の変異を含む、先行請求項のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。

【請求項10】

前記融合前Ｆタンパク質が、システインに対する１つ以上のアミノ酸置換を含み、それが前記融合前コンフォメーションを安定化する１つ以上の非天然ジスルフィド結合を導入する、先行請求項のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。

【請求項11】

前記システイン置換が、
位置１０３～１２０のうちのいずれか１つ及び位置３３５～３４５のうちのいずれか１つ、
位置１０７～１１８のうちのいずれか１つ及び位置３３５～３４２のうちのいずれか１つ、
位置１１７～１２９のうちのいずれか１つ及び位置２５６～２６１のうちのいずれか１つ、
位置８７～１０２のうちのいずれか１つ及び位置１１７～１２７のうちのいずれか１つ、
位置１０２～１１３のうちのいずれか１つ及び位置１１７～１２７のうちのいずれか１つ、
位置１０２～１１３のうちのいずれか１つ及び位置８７～１０２のいずれか１つ、
位置３３７～３４１のうちのいずれか１つ及び位置４２１～４２６のうちのいずれか１つ、
位置１１２～１２０のうちのいずれか１つ及び位置４２４～４３２のうちのいずれか１つ、
位置１５０～１５６のうちのいずれか１つ及び位置３９２～４００のうちのいずれか１つ、
位置１１２～１２０のうちのいずれか１つ及び位置３７０～３７７のうちのいずれか１つ、
位置３６５～３７５のうちのいずれか１つ及び位置４５５～４６５のうちのいずれか１つ、
位置３６５～３７５のうちのいずれか１つ及び位置１０５～１１５のうちのいずれか１つ、又は
位置６０～７０のうちのいずれか１つ及び位置１７５～１８５のうちのいずれか１つで導入され、
前記位置が、配列番号１～１０の前記天然Ｆタンパク質配列のアミノ酸に対応する、請求項１０に記載の免疫原性組成物。

【請求項12】

前記融合前Ｆタンパク質が、少なくとも１つの非天然ジスルフィド結合によって安定化された単一ポリペプチド鎖からなる、先行請求項のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。

【請求項13】

前記一本鎖融合前Ｆタンパク質が、前記天然Ｆタンパク質と比較してＦ１ドメインとＦ２ドメインとの間にプロテアーゼ切断部位を欠いている、請求項１２に記載の免疫原性組成物。

【請求項14】

前記一本鎖融合前Ｆタンパク質が、前記天然Ｆタンパク質のアミノ酸位置に対して１０２位に、アルギニンの別のアミノ酸、好ましくはグリシンへの置換を含む、請求項１２及び１３に記載の免疫原性組成物。

【請求項15】

前記天然Ｆタンパク質の１０３～１１８位のアミノ酸残基が、システイン残基を含む１～５個のアミノ酸残基からなる異種リンカーで置き換えられ、前記システイン残基が、前記Ｆ１ドメイン内のシステイン残基とジスルフィド結合を形成する、請求項１２～１４のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。

【請求項16】

前記異種リンカーが、少なくとも１つのアラニン、グリシン又はバリン残基を含み、好ましくは、前記リンカーが、配列ＣＧＡＧＡ又はＣＧＡＧＶを有する、請求項１５に記載の免疫原性組成物。

【請求項17】

前記融合前Ｆタンパク質が、前記天然ｈＭＰＶ Ｆタンパク質の４９、５１、６７、８０、１３７、１４７、１５９、１６０、１６１、１６６、１７７、２５８、２６６、４８０、及び／又は４８１位に対応する位置に１つ以上の置換を含む、請求項１２～１６に記載の免疫原性組成物。

【請求項18】

前記置換が、Ｔ４９Ｍ、Ｅ８０Ｎ、Ｉ１３７Ｗ、Ａ１４７Ｖ、Ａ１５９Ｖ、Ｔ１６０Ｆ、Ａ１６１Ｍ、Ｉ６７Ｌ、Ｉ１７７Ｌ、Ｆ２５８Ｉ、Ｓ２６６Ｄ、Ｉ４８０Ｃ、及び／又はＬ４８１Ｃからなる群から選択される、請求項１７に記載の免疫原性組成物。

【請求項19】

前記一本鎖融合前Ｆタンパク質が、以下の置換組み合わせのうちの１つを含む、請求項１２～１８のいずれか一項に記載の免疫原性組成物：
Ｎ９７Ｑ、Ｒ１０２Ｇ及びＧ２９４Ｅ；
Ｎ９７Ｑ、Ｒ１０２Ｇ、Ｔ１６０Ｆ、Ｉ１７７Ｌ及びＧ２９４Ｅ；
Ｎ９７Ｑ、Ｒ１０２Ｇ、Ｔ４９Ｍ、Ｉ６７Ｌ、Ａ１６１Ｍ、Ｅ８０Ｎ、Ｆ２５８Ｉ及びＧ２９４Ｅ；
Ｎ９７Ｑ、Ｒ１０２Ｇ、Ｔ４９Ｍ、Ｉ６７Ｌ、Ａ１６１Ｍ、Ｅ５１Ｃ、Ｋ１６６Ｃ、Ｓ２６６Ｄ、Ｇ２９４Ｅ、Ｉ４８０Ｃ及びＬ４８１Ｃ；又は
Ｎ９７Ｑ、Ｒ１０２Ｇ、Ｔ４９Ｍ、Ａ１６１Ｍ、Ｉ１３７Ｗ、Ａ１５９Ｖ、Ａ１４７Ｖ、Ｉ１７７Ｌ、及びＧ２９４Ｅ。

【請求項20】

前記融合前Ｆタンパク質が、配列番号１１のアミノ酸配列（Ｌ７Ｆ＿Ａ１＿２３）を含むか又はそれからなる、請求項１２～１９のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。

【請求項21】

前記融合前Ｆタンパク質が、配列番号１２のアミノ酸配列（Ｌ７Ｆ＿Ｂ１＿２３）を含むか又はそれからなる、請求項１２～１９のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。

【請求項22】

前記融合前Ｆタンパク質が、配列番号１３のアミノ酸配列（Ｌ７Ｆ＿Ａ１＿２３．２）を含むか又はそれからなる、請求項１２～１９のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。

【請求項23】

前記融合前Ｆタンパク質が、配列番号１４のアミノ酸配列（Ｌ７Ｆ＿Ｂ１＿２３．２）を含むか又はそれからなる、請求項１２～１９のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。

【請求項24】

前記融合前Ｆタンパク質が、配列番号１５のアミノ酸配列（ｓＦ＿Ａ１＿Ｋ＿Ｌ７）を含むか又はそれからなる、請求項１２～１９のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。

【請求項25】

前記融合前Ｆタンパク質が、配列番号１６のアミノ酸配列（Ｌ７Ｆ＿Ａ１＿３１）を含むか又はそれからなる、請求項１２～１９のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。

【請求項26】

前記融合前Ｆタンパク質が、配列番号１７のアミノ酸配列（Ｌ７Ｆ＿Ａ１＿３３）を含むか又はそれからなる、請求項１２～１９のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。

【請求項27】

前記融合前Ｆタンパク質が、配列番号１８のアミノ酸配列（構築物Ｌ７Ｆ＿Ａ１＿４．２）を含むか又はそれからなる、請求項１２～１９のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。

【請求項28】

前記融合前Ｆタンパク質が、配列番号５０のアミノ酸配列（構築物ｓＦ＿Ｂ１＿Ｋ＿Ｌ７）を含むか又はそれからなる、請求項１２～１９のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。

【請求項29】

前記融合前Ｆタンパク質が、配列番号５１のアミノ酸配列（構築物Ｌ７Ｆ＿Ｂ１＿３１）を含むか又はそれからなる、請求項１２～１９のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。

【請求項30】

前記融合前Ｆタンパク質が、配列番号５２のアミノ酸配列（構築物Ｌ７Ｆ＿Ｂ１＿３３）を含むか又はそれからなる、請求項１２～１９のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。

【請求項31】

前記融合前Ｆタンパク質が、配列番号５３のアミノ酸配列（構築物Ｌ７Ｆ＿Ｂ１＿４．２）を含むか又はそれからなる、請求項１２～１９のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。

【請求項32】

前記融合前Ｆタンパク質が、２つのポリペプチド鎖を有するタンパク質であり、配列番号１９のアミノ酸配列を含むか又はそれからなる、請求項１～１１のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。

【請求項33】

前記融合前Ｆタンパク質が、２つのポリペプチド鎖を有するタンパク質であり、配列番号２０のアミノ酸配列を含むか又はそれからなる、請求項１～１１のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。

【請求項34】

前記安定化された融合後Ｆタンパク質が、前記天然Ｆタンパク質のアミノ酸位置と比較して、１０３～１１１位のアミノ酸残基の欠失、リンカーＫＫＲＫＲＲによるＲ１０２の置き換え、及び前記置換Ｇ２９４Ｅを含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。

【請求項35】

前記融合前Ｆタンパク質が、ｉ）配列番号１～２０からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ｉｉ）その免疫原性が、配列番号１～２０の親Ｆタンパク質の免疫原性と同様である、請求項１～３４のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。

【請求項36】

前記融合前Ｆタンパク質が、ｉ）配列番号１～２０からなる群から選択される前記アミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ｉｉ）その免疫原性が、配列番号１～２０の前記親Ｆタンパク質の免疫原性と等しいか又は同様である、請求項１～３４のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。

【請求項37】

前記融合前Ｆタンパク質が、ｉ）配列番号１～２０からなる群から選択される前記アミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ｉｉ）その免疫原性が、配列番号１～２０の前記親Ｆタンパク質の免疫原性と等しいか又は同様である、請求項１～３４のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。

【請求項38】

前記融合前ｈＭＰＶ Ｆタンパク質が、配列番号２３～２８の配列を有する三量体化ヘルパードメイン（フォールドン）又はそのバリアントを含む、先行請求項のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。

【請求項39】

前記Ｆタンパク質が、ホモ又はヘテロ三量体として産生される、先行請求項のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。

【請求項40】

前記組成物が、更なる非ｈＭＰＶ抗原を含む、先行請求項のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。

【請求項41】

前記アジュバントが、ミョウバン、ＣｐＧ、例えば、ＣｐＧ１０１８、ＯＤＮ、Ｉ－ＯＤＮ、ＩＣ３１（登録商標）、ＭＦ５９（登録商標）、ＡｄｄａＶａｘ（商標）、ＡＳ０３、ＡＳ０１、ＱＳ２１、ＭＰＬ、ＧＬＡ－ＳＥ、ＧＬＡ－３Ｍ－０５２－ＬＳ、３Ｍ－０５２－ミョウバン、又はそれらの組み合わせからなる群から選択される、先行請求項のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。

【請求項42】

前記アジュバントが、ミョウバン、ＣｐＧ、例えば、ＣｐＧ１０１８、ＯＤＮ、Ｉ－ＯＤＮ、ＩＣ３１（登録商標）、ＭＦ５９（登録商標）、ＡｄｄａＶａｘ（商標）、ＡＳ０３、ＡＳ０１、ＱＳ２１、ＭＰＬ、ＧＬＡ－ＳＥ、ＧＬＡ－３Ｍ－０５２－ＬＳ及び３Ｍ－０５２－ミョウバンからなる群から選択される２つ以上のアジュバントからなる、先行請求項のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。

【請求項43】

前記アジュバントが、ミョウバンである、先行請求項のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。

【請求項44】

前記アジュバントが、ＩＣ３１（登録商標）である、先行請求項のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。

【請求項45】

前記アジュバントが、ＧＬＡ－ＳＥである、先行請求項のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。

【請求項46】

前記アジュバントが、３Ｍ－０５２－ミョウバンである、先行請求項のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。

【請求項47】

前記アジュバントが、ＧＬＡ－３Ｍ－０５２－ＬＳである、先行請求項のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。

【請求項48】

前記アジュバントが、ミョウバン及びＣｐＧ１０１８からなる、先行請求項のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。

【請求項49】

前記アジュバントが、ミョウバン及びＭＰＬからなる、先行請求項のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。

【請求項50】

前記アジュバントが、ミョウバン及びＩＣ３１（登録商標）からなる、先行請求項のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。

【請求項51】

前記アジュバントが、ＡｄｄａＶａｘ（商標）である、先行請求項のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。

【請求項52】

前記組成物が、前記融合前Ｆタンパク質に対する中和抗体を誘発することができる、先行請求項のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。

【請求項53】

前記融合前タンパク質又は融合前及び融合前タンパク質を含む組成物が、同じ総タンパク質量で使用される前記融合後Ｆタンパク質を含む組成物によって誘発される免疫応答（中和抗体価）と比較して、優れた免疫応答（中和抗体価）を提供する、先行請求項のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。

【請求項54】

前記組成物が、１つより多くのｈＭＰＶ株に対する防御を提供する、先行請求項のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。

【請求項55】

前記組成物が、前記遺伝子型ＡのｈＭＰＶ株に対する防御を提供する、先行請求項のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。

【請求項56】

前記組成物が、前記遺伝子型ＢのｈＭＰＶ株に対する防御を提供する、先行請求項のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。

【請求項57】

前記組成物が、前記遺伝子型Ａ及び遺伝子型ＢのｈＭＰＶ株に対する防御を提供する、先行請求項のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。

【請求項58】

前記組成物がワクチンである、先行請求項のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。

【請求項59】

薬物として使用するための、先行請求項のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。

【請求項60】

対象におけるｈＭＰＶ感染及び関連疾患を治療及び／又は予防するための、先行請求項のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。

【請求項61】

対象においてｈＭＰＶ Ｆタンパク質に対する免疫応答を生成するための方法であって、前記対象に有効量の請求項１～６０のいずれか一項に記載の免疫原性組成物を投与することを含む、方法。

【請求項62】

前記免疫原性組成物が、筋肉内、皮内、皮下、粘膜、直腸内、又は経口的に投与される、請求項６１に記載の方法。

【請求項63】

前記方法が、請求項１～５５のいずれか一項に記載の免疫原性組成物のプライム・ブースト投与を含み、前記プライム・ブーストが、同じ免疫原性組成物で行われる、請求項６１及び６２に記載の方法。

【請求項64】

前記方法が、請求項１～５５のいずれか一項に記載の免疫原性組成物のプライム・ブースト投与を含み、前記プライム投与が、遺伝子型ＡのＦタンパク質を含む組成物で行われ、前記ブースト投与が、遺伝子型ＢのＦタンパク質を含む組成物で行われるか、又はその逆である、請求項６１及び６３に記載の方法。

【請求項65】

対象におけるｈＭＰＶ感染を治療及び／又は予防するための方法であって、融合前ｈＭＰＶ Ｆタンパク質に対する中和抗体を生成し、少なくとも１つの遺伝子型Ａ又はＢ、好ましくは両方のｈＭＰＶ株に対する防御を提供するために、前記対象に治療有効量の請求項１～５５のいずれか一項に記載の免疫原性組成物を投与することを含む、方法。

【請求項66】

前記方法が、ｉ）宿主細胞内の発現ベクターに挿入された対応する核酸分子からの組換え融合前Ｆタンパク質の発現、ｉｉ）前記発現された組換えＦタンパク質を精製すること、及びｉｉｉ）前記精製された組換えタンパク質を、薬学的に許容される担体及び／又は賦形剤と、任意選択的にアジュバントと組み合わせることを含む、請求項１～６０のいずれか一項に記載の免疫原性組成物を生成するための方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、呼吸器系のヒトメタニューモウイルス感染症等の呼吸器系感染症を予防及び／又は治療するためのワクチン組成物に関する。このワクチン組成物は、融合前コンフォメーション形態で提供される、ｉ）１つの又はＩＩ）２つ以上の改変ヒトメタニューモウイルス（ｈＭＰＶ）のＦタンパク質又はそのバリアントを含む。

【背景技術】

【0002】

現在、ヒト又は動物等の対象におけるｈＭＰＶ感染を予防又は治療するために利用可能なワクチン又は特定の抗ウイルス薬はない。乳児、５歳未満の幼児のいくつかのカテゴリー、６５歳以上の高齢者、及び免疫不全の患者は、ｈＭＰＶ感染により重度の細気管支炎又は肺炎を発症するリスクが特に高い。しかしながら、例えば、自然のｈＭＰＶ感染によって誘導される中和抗体応答は、残念ながら長続きせず、経時的に低下し、また特異的なメモリーＢ細胞の応答が弱いため、ワクチン開発は困難である（Ｆａｌｓｅｙ，Ａ．Ｒ．；Ｈｅｎｎｅｓｓｅｙ，Ｐ．Ａ．；Ｆｏｒｍｉｃａ，Ｍ．Ａ．；Ｃｒｉｄｄｌｅ，Ｍ．Ｍ．；Ｂｉｅａｒ，Ｊ．Ｍ．；Ｗａｌｓｈ，Ｅ．Ｅ．Ｈｕｍｏｒａｌ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｔｏ ｈｕｍａｎ ｍｅｔａｐｎｅｕｍｏｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ａｄｕｌｔｓ．Ｖａｃｃｉｎｅ ２００９，２８，１４７７－１４８０）。

【0003】

様々なｈＭＰＶ株及び臨床分離株由来のゲノム配列の系統発生分析によって、２つの主要な遺伝子型（系統）、すなわちＡ及びＢが明らかになり、それぞれがサブグループ（５つの亜系統又はサブグループ）Ａ１／Ａ２ａ／Ａ２ｂ、及びＢ１／Ｂ２に分けられている（ｖａｎ ｄｅｎ Ｈｏｏｇｅｎ ＢＧ，Ｈｅｒｆｓｔ Ｓ，Ｓｐｒｏｎｇ Ｌ，Ｃａｎｅ ＰＡ，Ｆｏｒｌｅｏ－Ｎｅｔｏ Ｅ，Ｓｗａｒｔ ＲＬ ｄｅ，Ｏｓｔｅｒｈａｕｓ ＡＤＭＥ，Ｆｏｕｃｈｉｅｒ ＲＡＭ．（２００４）Ａｎｔｉｇｅｎｉｃ ａｎｄ ｇｅｎｅｔｉｃ ｖａｒｉａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｍｅｔａｐｎｅｕｍｏｖｉｒｕｓｅｓ．Ｅｍｅｒｇｉｎｇ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｄｉｓｅａｓｅｓ １０（４）：６５８－６６）。

【0004】

ｈＭＰＶに対する防御は、主に、融合（Ｆ）糖タンパク質に対する抗体を中和することによって得られる（Ｗｉｌｌｉａｍｓ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ａ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｈｕｍａｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｏ Ｈｕｍａｎ Ｍｅｔａｐｎｅｕｍｏｖｉｒｕｓ Ｆｕｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｈａｔ Ｎｅｕｔｒａｌｉｚｅｓ Ｖｉｒｕｓ Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ ａｎｄ Ｉｓ Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｌｌｙ Ｉｎ Ｖｉｖｏ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ ８１（１５）：８３１５－８３２４；Ｂａｔｔｌｅｓ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ．１６；８（１）：１５２８）。Ｆタンパク質は免疫優性であり、ｈＭＰＶ株間で非常に保存されている。Ｆタンパク質における稀な変異は、中和エピトープの不安定な損失をもたらさないため、ｈＭＰＶの遺伝子型及びサブグループは、経時的に遺伝的に非常に安定している（Ｙａｎｇ ＣＦ，Ｗａｎｇ ＣＫ，Ｔｏｌｌｅｆｓｏｎ ＳＪ，Ｐｉｙａｒａｔｎａ Ｒ，Ｌｉｎｔａｏ ＬＤ，Ｃｈｕ Ｍ，Ｌｉｅｍ Ａ，Ｍａｒｋ Ｍ，Ｓｐａｅｔｅ ＲＲ，Ｃｒｏｗｅ ＪＥ，Ｊｒ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＪＶ．（２００９）Ｇｅｎｅｔｉｃ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ａｎｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｍｅｔａｐｎｅｕｍｏｖｉｒｕｓ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｖｅｒ ｔｗｅｎｔｙ ｙｅａｒｓ．Ｖｉｒｏｌ Ｊ ６：１３８）。いくつかの動物モデルにおいて、遺伝子型（Ａ及びＢ）及びサブグループ（Ａ１、Ａ２ａ、Ａ２ｂ、Ｂ１及びＢ２）間で交差防御が得られたが、データには議論の余地がある。例えば、遺伝子型Ａ又はＢから単離された可溶性Ｆタンパク質による免疫時の交差防御免疫の誘導が、ハムスターにおいて実証された（Ｎｅｒｆｓｔ ｅｔ ａｌ．２００７．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（２００７），８８，２７０２－２７０９）。逆に、ある遺伝子型に感染したフェレットからの血清を用いて行われたインビトロ試験では、別の遺伝子型のウイルスは中和されなかった（Ｋａｈｎ Ｊ．Ｓ．（２００６）Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｍｅｔａｐｎｅｕｍｏｖｉｒｕｓ．Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ １９（３）：５４６－５５７）。ヒトにおける異なるｈＭＰＶ遺伝子型に対する免疫原性応答は、まだ十分に理解されていない（Ｒａｈｍａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１８）Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｔｕｄｉｅｓ ｉｎ Ｂａｎｇｌａｄｅｓｈ．Ｊ Ｍｅｄ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２０１８：１－６）。したがって、多数のｈＭＰＶバリアントの循環は、幅広いワクチンを開発する上で複雑な事態を引き起こし得る。

【0005】

ｈＭＰＶ Ｆタンパク質は、ウイルス膜と細胞膜との融合を媒介し、ウイルスのリボ核タンパク質が細胞質に侵入して、ウイルス複製を開始することを可能にする（Ｃｏｘ ＲＧ，Ｌｉｖｅｓａｙ ＳＢ，Ｊｏｈｎｓｏｎ Ｍ，Ｏｈｉ ＭＤ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＪＶ（２０１２）Ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｍｅｔａｐｎｅｕｍｏｖｉｒｕｓ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｅｄｉａｔｅｓ ｅｎｔｒｙ ｖｉａ ａｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ＲＧＤ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｉｎｔｅｇｒｉｎｓ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ ８６：１２１４８－１２１６０）。Ｆタンパク質は、そのＣ末端に、タンパク質をウイルス膜に固定する疎水性膜貫通（ＴＭ）ドメインと、短い細胞質尾部とを含む、Ｉ型内在性膜タンパク質である。天然Ｆタンパク質は、不活性な一本鎖前駆体Ｆ０として合成され、細胞プロテアーゼによる切断後に活性化され、２つのポリペプチド鎖、Ｆ１及びＦ２を生成する（図１を参照されたい）。生物学的に活性なｈＭＰＶ Ｆタンパク質は、準安定な融合前形態と、非常に安定な融合後形態の２つのコンフォメーションで存在する（図２を参照されたい）。融合前及び融合後形態の公開された結晶構造は、Ｆタンパク質の免疫原性及び抗原性特性に影響を及ぼし得る２つのコンフォメーション間の本質的な違いを明らかにした（Ｍｅｌｅｒｏ ＪＡ＆Ｍａｓ Ｖ．（２０１５）Ｔｈｅ Ｐｎｅｕｍｏｖｉｒｉｎａｅ ｆｕｓｉｏｎ（Ｆ）ｐｒｏｔｅｉｎ：Ａ ｃｏｍｍｏｎ ｔａｒｇｅｔ ｆｏｒ ｖａｃｃｉｎｅｓ ａｎｄ ａｎｔｉｖｉｒａｌｓ．Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０９：１２８－１３５）。

【0006】

いくつかの研究により、融合前及び融合後の両方のＦタンパク質形態が、抗原エピトープを有し、中和抗体を誘発することができることが示された（Ｗｅｎ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｈｕｍａｎ Ｍｅｔａｐｎｅｕｍｏｖｉｒｕｓ Ｆｕｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｗｉｔｈ Ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ ａ Ｐｎｅｕｍｏｖｉｒｕｓ Ａｎｔｉｇｅｎｉｃ Ｓｉｔｅ．Ｎａｔ Ｓｔｒｕｃｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．１９（４）：４６１－４６３、Ｂａｔｔｌｅｓ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ．１６，８（１）：１５２８、Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１９）Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｐｉｔｏｐｅｓ ｏｆ Ｐｎｅｕｍｏｖｉｒｕｓ Ｆｕｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０，２７７８，ｒｅｖｉｅｗ）。例えば、Ｍｅｌｅｒｏのグループは、動物において、組換え融合前Ｆタンパク質が中和抗体を誘導すること、及び免疫原性研究を実証した（Ｍｅｌｅｒｏ ＪＡ＆Ｍａｓ Ｖ．２０１５）Ｔｈｅ Ｐｎｅｕｍｏｖｉｒｉｎａｅ ｆｕｓｉｏｎ（Ｆ）ｐｒｏｔｅｉｎ：Ａ ｃｏｍｍｏｎ ｔａｒｇｅｔ ｆｏｒ ｖａｃｃｉｎｅｓ ａｎｄ ａｎｔｉｖｉｒａｌｓ．Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０９：１２８－１３５、Ｍｉｃｈａｅｌ Ｂ Ｂａｔｔｌｅｓ，Ｖｉｃｅｎｔｅ Ｍａｓ，Ｅｄｕａｒｄｏ Ｏｌｍｅｄｉｌｌａｓ，Ｏｌｇａ Ｃａｎｏ，Ｍｏｎｉｃａ Ｖａｚｑｕｅｚ，Ｌａｕｒａ Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ，Ｊｏｓｅ Ａ Ｍｅｌｅｒｏ，Ｊａｓｏｎ Ｓ ＭｃＬｅｌｌａｎ．Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ．２０１７ Ｎｏｖ １６；８（１）：１５２８．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓ４１４６７－０１７－０１７０８－９）。別の研究では、組換え融合後Ｆタンパク質が、血清陽性ヒト血清からｈＭＰＶ中和抗体を枯渇させることができることが示された（Ｍａｓ Ｖ，Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ Ｌ，Ｏｌｍｅｄｉｌｌａｓ Ｅ，Ｃａｎｏ Ｏ，Ｐａｌｏｍｏ Ｃ，Ｔｅｒｒｏｎ ＭＣ，Ｌｕｑｕｅ Ｄ，Ｍｅｌｅｒｏ ＪＡ，ＭｃＬｅｌｌａｎ ＪＳ．（２０１６）Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｈｕｍａｎ Ｍｅｔａｐｎｅｕｍｏｖｉｒｕｓ Ｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ｔｈｅ Ｐｏｓｔｆｕｓｉｏｎ Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ．ＰＬｏＳ ｐａｔｈｏｇｅｎｓ．１２（９））。もう１つのグループは、融合前コンフォメーションの安定化につながるＦタンパク質の改変及びそれらのワクチン開発への適用性を開示している（米国特許第１，０４２０，８３４号を参照されたい）。

【0007】

以前に、我々は、ｈＭＰＶ Ｆタンパク質の安定化された融合前形態による免疫時に、高力価中和抗体の誘導及びマウスの防御を実証した（ＷＯ２０２０／２３４３００Ａ１を参照されたい）。この研究では、単一の免疫原として製剤化された５つのＦタンパク質候補が、好ましくは、適切なサブグループ候補Ａ１、好ましくはＬ７Ｆ＿Ａ１＿２３（配列番号１１）が選択されるか、又は５つのＦタンパク質候補のうちの１つのＡ１及びＢ１サブグループ、好ましくはＬ７Ｆ＿Ａ１＿２３（配列番号１１）及びＬ７Ｆ＿Ｂ１＿２３（配列番号１２）の組み合わせである場合、肺コロニー形成／感染モデル、ＭＮＡ、ＦＦＡ、及び／又はＲＴ－ｑＰＣＲモデルにおいて有望な防御効果を示した。複数のｈＭＰＶ株及び臨床分離株に対してより効果的である単純なフォーマット（一価又は二価のみ）のこれらの改良されたワクチンは重要である。今日まで、ワクチン製剤中にＦタンパク質の融合前コンフォメーションを組み合わせる（又はそれらを一価フォーマットで試験する）試みは、臨床試験において説明されていない。別の場合には、融合後ｓＦ＿Ａ１＿ＭＦｕｒもまた、本発明の免疫原性組成物における好ましい候補である。

【発明の概要】

【0008】

本発明は、ｉ）融合前コンフォメーションで提供される１つ以上の改変組換えｈＭＰＶ Ｆタンパク質若しくはそのバリアントを含む、又はｉｉ）融合前コンフォメーションで提供される１つ以上の改変組換えｈＭＰＶ Ｆタンパク質若しくはそのバリアントの組み合わせを含む、組成物を提供する。これらの改変組換えタンパク質は、異なるｈＭＰＶ遺伝子型Ａ及びＢに由来するか、又は同じ遺伝子型に由来するが、異なるサブグループ、又は両方が、好ましくは、一価ワクチン又はその免疫原性組成物（すなわち、特に、Ｌ７Ｆ＿Ａ１＿２３（配列番号１１））及び二価ワクチン又はその免疫原性組成物（すなわち、特に、Ｌ７Ｆ＿Ａ１＿２３（配列番号１１）及びＬ７Ｆ＿Ｂ１＿２３（配列番号１２）である。本発明は、上記改変組換えタンパク質を産生するためのタンパク質構築物及び発現ベクターを更に提供する。本発明はまた、特定の免疫応答を誘導することができる、並びに／又はｈＭＰＶ感染に対する防御を提供することを可能にする、並びに／又は、特にｈＭＰＶの他のサブグループ及び／若しくは遺伝子型を交差中和及び防御する、免疫原性組成物（ワクチン等）も提供する。更に、２つ以上、好ましくは２つの融合前Ｆタンパク質の特定の組み合わせの使用は、相同及び異種ｈＭＰＶ株に対する防御を達成することを可能にする。本発明はまた、開示された組換えタンパク質及び免疫原性組成物を産生する方法、並びに軽度、中等度、又は重度のｈＭＰＶ感染を有するヒト又は動物対象を治療及び／又は予防するためにそれらを使用する方法に関する。

【0009】

本発明の根底にある問題は、例えば、ｈＭＰＶファミリーのサブグループ及び／又は他の遺伝子型（Ａ１、Ａ２ａ、Ａ２ｂ、Ｂ１、Ｂ２サブグループ、それぞれ、ｈＭＰＶのＡ及びＢ）を交差中和及び／又は交差防御する、融合前コンフォメーションで存在する単一のｈＭＰＶ Ｆタンパク質を含有する既知の免疫原性組成物よりも、強力で長続きする免疫応答を増強し、様々なｈＭＰＶ株及び臨床分離株に対してより良好な防御を提供する免疫原性組成物（ワクチン）を開発することであり、これにより、単純な抗原設計、したがって非常に合理的な生産コスト（より単純な生産、より単純な品質評価等）を可能にする。

【0010】

本発明の根底にある問題は、融合前コンフォメーション形態で提供される１つ又は２つの異なる（異なるサブグループ及び／又は遺伝子型）Ｆタンパク質又はそのバリアントのみを含む組成物を提供することによって解決される。更に、そのような解決策は、同じ又は異なる遺伝子型に属する異なるｈＭＰＶ株に由来する１つの組成物中に配合された２つ以上のＦタンパク質を含むが、ワクチン／免疫原性組成物中に異なるサブグループの全てを追加するよりも単純な設計を依然として提供する。

【0011】

この問題を解決するために、異なるｈＭＰＶ遺伝子群及びそのサブグループからの数個のＦタンパク質候補を、改変された（すなわち、融合前コンフォメーションで安定化している）組換えタンパク質として産生し、マウスチャレンジモデル又は他の機能モデルにおいて免疫原性及び防御効果について互いにいくつかの組み合わせで試験した。具体的には、サブグループＡ１及びＢ１からの融合前Ｆタンパク質の組み合わせ又は単一の融合前Ｆタンパク質で免疫したマウスを、サブグループＡ２ａ、Ａ２ｂ及び／又はＢ１のウイルスでチャレンジし、中和抗体の誘導及びウイルス量を調べた。代替的に、サブグループＡ１及び／若しくはＢ１からの融合前Ｆタンパク質の組み合わせ又は単一の融合前Ｆタンパク質で免疫したマウスを、サブグループＡ１、Ａ２ａ、Ａ２ｂ及び／又はＢ１のウイルスでチャレンジすることができる。それ以外の場合、サブグループＡ１及び／又はＢ１からの融合前Ｆタンパク質の組み合わせ又は単一の融合前Ｆタンパク質で免疫したマウスの防御は、ｈＭＰＶサブグループＡ２ａ、Ａ２ｂ若しくはＢ２又は他の反復でチャレンジした後に評価することができる。その結果、２つの遺伝子型Ａ及びＢの間並びに異なるサブグループ間の交差防御が観察される。

【0012】

一実施形態によれば、組成物の改変（安定化）Ｆタンパク質は、融合前コンフォメーションで存在する。上記融合前Ｆタンパク質は、Ｆエクトドメインと同様の一本鎖ポリペプチドからなるが、Ｆ１ドメインとＦ２ドメインとの間にプロテアーゼ切断部位及び融合ペプチド（ＦＰ）を欠いている。代わりに、一本鎖Ｆタンパク質は、Ｆ１ドメインとＦ２ドメインとの間に異種ペプチドリンカーを含み、これは、Ｆ１ドメイン内の別のシステイン残基と非天然ジスルフィド（Ｓ－Ｓ）結合を形成し、したがって融合前コンフォメーションを安定化する、少なくとも１つのシステイン残基を含む。代替的に、融合前ｈＭＰＶ Ｆタンパク質は、２つ以上のＳ－Ｓ結合によって共有結合された２つのポリペプチド鎖、すなわちＦ１及びＦ２ドメインを含んでもよい。そのようなタンパク質は、融合前コンフォメーションを安定化する変異を含み得る。

【0013】

更に別の実施形態によれば、組成物の更なる第２のＦタンパク質は、融合前コンフォメーションでも存在する改変（安定化）Ｆタンパク質である。上記融合前Ｆタンパク質は、Ｆエクトドメインと同様の一本鎖ポリペプチドからなるが、Ｆ１ドメインとＦ２ドメインとの間にプロテアーゼ切断部位及び融合ペプチド（ＦＰ）を欠いている。代わりに、一本鎖Ｆタンパク質は、Ｆ１ドメインとＦ２ドメインとの間に異種ペプチドリンカーを含み、これは、Ｆ１ドメイン内の別のシステイン残基と非天然ジスルフィド（Ｓ－Ｓ）結合を形成し、したがって融合前コンフォメーションを安定化する、少なくとも１つのシステイン残基を含む。代替的に、融合前ｈＭＰＶ Ｆタンパク質は、２つ以上のＳ－Ｓ結合によって共有結合された２つのポリペプチド鎖、すなわちＦ１及びＦ２ドメインを含んでもよい。そのようなタンパク質は、融合前コンフォメーションを安定化する変異を含有し得る。本発明の別の実施形態によれば、融合前Ｆタンパク質は、親Ｆタンパク質のアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。参照親Ｆタンパク質と高い配列同一性を有する改変Ｆタンパク質は、本明細書においてバリアントとも称される。一般に、タンパク質の相同体又はバリアントは、当該技術分野で周知の標準的な方法を使用して整列させた場合、比較的高い程度の配列同一性を有する（他の配列と比較するときに、調査される配列のグローバルアラインメント、例えば、標準設定を使用したＮｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムが好ましい）。重要なことに、相同Ｆタンパク質又はバリアントは、例えば、本明細書のインビトロアッセイ、例えば、本明細書の他の箇所に記載されるＭＮＡ、ＦＦＡ又はＰＣＲを使用して測定されるように、親Ｆタンパク質と同様に免疫原性及び防御性である。

【0014】

更に、本発明の融合前Ｆタンパク質は、異種宿主細胞において、ホモ三量体として、又は好ましくはヘテロ若しくはホモ三量体として産生される、膜貫通ドメイン（本明細書では「ＴＭ」とも称される）及び／又は細胞質尾部を有しない組換えタンパク質である。三量体化プロセスを容易にするために、１つ以上の特異的改変又は三量体化ヘルパードメインが、Ｆタンパク質のＣ末端部分に導入され得る。

【0015】

更に別の実施形態によれば、ある融合前Ｆタンパク質は、薬学的に正しい担体及び／又は賦形剤を更に含む単一の組成物中に配合される。Ｆタンパク質の他に、そのような組成物は、１つ以上の追加の抗原、例えば、呼吸器系の感染を引き起こす別の病原体に対する別のｈＭＰＶタンパク質又は別の抗原を含み得る。

【0016】

典型的には、本発明の組成物は、ｈＭＰＶ中和抗体及びｈＭＰＶに対する特異的Ｔ細胞応答を誘発することができる免疫原性組成物（ワクチン）である。任意選択的に、免疫原性組成物は、そのような免疫応答を増強するための、及び／又は免疫応答を所望のＴｈ１型方向にシフトさせるための、アジュバントを更に含んでもよい。一般に、本発明の免疫原性組成物によって誘導される免疫応答（中和抗体価）は、ｈＭＰＶ感染から防御するのに十分である。更に、両方のコンフォメーション形態のＦタンパク質又はそのバリアントを含む免疫原性組成物は、融合前コンフォメーションのいずれかで存在する等量の単一のＦタンパク質によって誘発される免疫応答（中和抗体価）よりも優れた免疫応答（中和抗体価）を誘発する。

【0017】

更に、本発明の免疫原性組成物は、１つより多くのｈＭＰＶ株、特に、異なる遺伝子型又は１つの遺伝子型の異なるサブグループに属する株に対する防御を提供することができる。例えば、免疫原性組成物は、Ａ１及び／又はＡ２ａ、Ａ２ｂサブグループ、代替的に、Ｂ１及び／又はＢ２サブグループ、又はＡ及びＢの両方の遺伝子型に対する防御を提供することができる。特に、遺伝子型Ａと遺伝子型Ｂとの間の交差防御が望ましい。

【0018】

本発明によれば、本発明の免疫原性組成物（ワクチン）は、ｈＭＰＶ感染に対するヒト及び／又は動物対象の治療及び／又は予防に有用であるが、ｈＭＰＶ感染によって引き起こされる軽度、重度、入院又は死亡の治療及び／又は予防等の他の適応も、本発明の組成物の潜在的な標的適応である。

【0019】

更なる実施形態において、本発明は、融合前コンフォメーションで利用可能な改変Ｆタンパク質又はそのバリアント（組み合わせを含む）を用いて免疫応答を生成するための方法を提供する。そのような方法は、対象に、治療有効量のＦタンパク質の融合前形態を含有する免疫原性組成物を投与することを含む。

【0020】

更に一実施形態において、本発明は、ｈＭＰＶ感染又は関連疾患に対して対象を治療及び／又は予防するための方法を提供する。したがって、免疫原性組成物（ワクチン）は、非経口経路（例えば、筋肉内、皮内、又は皮下）又は粘膜経路（例えば、鼻腔内、経口）を介して対象に投与される。その結果、ｈＭＰＶに対して免疫された対象の防御を確実にする抗Ｆタンパク質中和抗体の高い力価がもたらされる。好ましい実施形態において、本発明のワクチンは、１つより多くのｈＭＰＶ株、より好ましくは、同じ遺伝子型のｈＭＰＶ株、最も好ましくは、Ａ及びＢの両方の遺伝子型に対する防御免疫応答を誘導する。更に一実施形態において、ワクチンの投与量は、ｈＭＰＶ感染に対する堅牢な抗ｈＭＰＶ防御を提供するのに十分である。更に、方法は、異なるｈＭＰＶサブグループ及び／又は遺伝子型に由来する改変Ｆタンパク質又はそのバリアントを含む、同じ又は異なる免疫原性組成物によるプライム・ブースト免疫を含み得る。例えば、プライム免疫は、本発明の遺伝子型ＡのＦタンパク質を含むワクチンで行われてもよく、一方、ブースト免疫は、本発明の遺伝子型ＢのＦタンパク質を含むワクチンで行われてもよい。このようにして、遺伝子型Ａと遺伝子型Ｂとの間に更に良好な交差防御を達成することができる。更に、方法は、特に高齢者又は成人（例えば、リスクのある成人）のための、異なるｈＭＰＶサブグループ及び／又は遺伝子型に由来する改変Ｆタンパク質又はそのバリアントを含む、同じ又は異なる免疫原性組成物によるブースト免疫のみを含み得るが、それは、これらの集団のほとんどが既に曝露されているためである。

【0021】

更に、本発明は、安定化された融合前コンフォメーションで存在する組換え改変Ｆタンパク質、及びこれらのタンパク質を含む免疫原性組成物を生成するための方法を提供する。前述の方法は、以下のステップを含む：ｉ）宿主細胞内の発現ベクターに挿入された対応する核酸分子から組換え改変Ｆタンパク質を発現させること、ｉｉ）上記組換えＦタンパク質を精製すること、及びｉｉｉ）上記精製された組換えタンパク質を、薬学的に許容される担体及び／又は賦形剤、任意選択的に医薬組成物又はワクチン中のアジュバントと組み合わせること。

【0022】

より具体的には、以下の実施形態が提供される。
１．唯一のｈＭＰＶ抗原としてのヒトメタニューモウイルス（ｈＭＰＶ）Ｆタンパク質又はその断片の安定化された融合前コンフォメーション形態と、任意選択的に１つ以上のアジュバント及び／又は少なくとも１つの薬学的に正しい担体若しくは賦形剤とから本質的になる、免疫原性組成物であって、上記ｈＭＰＶタンパク質が、遺伝子型Ａ又はＢの１つのサブグループに由来し、上記免疫原性組成物が、別のサブグループ及び／又は遺伝子型からｈＭＰＶを交差中和する、免疫原性組成物。
２．ヒトメタニューモウイルス（ｈＭＰＶ）Ｆタンパク質又はその断片の安定化融合前コンフォメーション形態が、Ａ１サブグループのものである、実施形態１に記載の組成物。
３．組成物が、ｉ）遺伝子型Ａのヒトメタニューモウイルス（ｈＭＰＶ）Ｆタンパク質又はその断片の安定化された融合前コンフォメーション形態、及びｉｉ）遺伝子型Ｂのヒトメタニューモウイルス（ｈＭＰＶ）Ｆタンパク質又はその断片の安定化された融合前コンフォメーション形態と、任意選択的に１つ以上のアジュバント及び／又は少なくとも１つの薬学的に正しい担体若しくは賦形剤とから本質的になり、上記免疫原性組成物が、他のサブグループ及び／又は他を交差中和する、実施形態１～２に記載の組成物。
４．遺伝子型Ａのヒトメタニューモウイルス（ｈＭＰＶ）Ｆタンパク質又はその断片の安定化された融合前コンフォメーション形態が、Ａ１サブグループのものであり、遺伝子型Ｂのヒトメタニューモウイルス（ｈＭＰＶ）Ｆタンパク質又はその断片の安定化された融合前コンフォメーション形態が、Ｂ１サブグループのものである、実施形態３に記載の組成物。
５．融合前Ｆタンパク質が、組換えタンパク質である、前述の実施形態のいずれかに記載の免疫原性組成物。
６．融合前Ｆタンパク質が、細胞質尾部及び／又は膜貫通ドメインを欠いている、前述の実施形態のいずれかに記載の免疫原性組成物。
７．融合前Ｆタンパク質が、ｈＭＰＶ株又は臨床分離株に由来する天然Ｆタンパク質の改変アミノ酸配列であるアミノ酸配列を有する、前述の実施形態のいずれかに記載の免疫原性組成物。
８．天然Ｆタンパク質配列が、ｈＭＰＶ株ＮＬ／１／００、ＮＬ／１７／００、ＴＮ／９４－４９、ＮＣＬ１７４、ＣＡＮ９７－８３、ＮＬ／１／９、ＮＤＬ００－１、Ｃ１－３３４、ＣＡＮ９７－８２、及びＴＮ／８９－５１５に由来する配列番号１～１０のアミノ酸配列からなる群から選択される、実施形態９に記載の免疫原性組成物。
９．融合前Ｆタンパク質が、配列番号１～１０の天然Ｆタンパク質配列に対して、少なくとも１つの変異（置換又は欠失）、好ましくは最大１０個の変異を含む、前述の実施形態のいずれかに記載の免疫原性組成物。
１０．融合前Ｆタンパク質が、システインに対する１つ以上のアミノ酸置換を含み、それが融合前コンフォメーションを安定化する１つ以上の非天然ジスルフィド結合を導入する、前述の実施形態のいずれかに記載の免疫原性組成物。
１１．システイン置換が、
位置１０３～１２０のうちのいずれか１つ及び位置３３５～３４５のうちのいずれか１つ、
位置１０７～１１８のうちのいずれか１つ及び位置３３５～３４２のうちのいずれか１つ、
位置１１７～１２９のうちのいずれか１つ及び位置２５６～２６１のうちのいずれか１つ、
位置８７～１０２のうちのいずれか１つ及び位置１１７～１２７のうちのいずれか１つ、
位置１０２～１１３のうちのいずれか１つ及び位置１１７～１２７のうちのいずれか１つ、
位置１０２～１１３のうちのいずれか１つ及び位置８７～１０２のいずれか１つ、
位置３３７～３４１のうちのいずれか１つ及び位置４２１～４２６のうちのいずれか１つ、
位置１１２～１２０のうちのいずれか１つ及び位置４２４～４３２のうちのいずれか１つ、
位置１５０～１５６のうちのいずれか１つ及び位置３９２～４００のうちのいずれか１つ、
位置１１２～１２０のうちのいずれか１つ及び位置３７０～３７７のうちのいずれか１つ、
位置３６５～３７５のうちのいずれか１つ及び位置４５５～４６５のうちのいずれか１つ、
位置３６５～３７５のうちのいずれか１つ及び位置１０５～１１５のうちのいずれか１つ、又は
位置６０～７０のうちのいずれか１つ及び位置１７５～１８５のうちのいずれか１つで導入され、
位置が、配列番号１～１０及び４９の天然Ｆタンパク質配列のアミノ酸に対応する、実施形態１０に記載の免疫原性組成物。
１２．融合前Ｆタンパク質が、少なくとも１つの非天然ジスルフィド結合によって安定化された単一ポリペプチド鎖からなる、前述の実施形態のいずれかに記載の免疫原性組成物。
１３．一本鎖融合前Ｆタンパク質が、天然Ｆタンパク質と比較してＦ１ドメインとＦ２ドメインとの間にプロテアーゼ切断部位を欠いている、実施形態１２に記載の免疫原性組成物。
１４．一本鎖融合前Ｆタンパク質が、天然Ｆタンパク質のアミノ酸位置に対して１０２位に、アルギニンの別のアミノ酸、好ましくはグリシンへの置換を含む、実施形態１２及び１３に記載の免疫原性組成物。
１５．天然Ｆタンパク質の１０３～１１８位のアミノ酸残基が、システイン残基を含む１～５個のアミノ酸残基からなる異種リンカーで置き換えられ、上記システイン残基が、Ｆ１ドメイン内のシステイン残基とジスルフィド結合を形成する、実施形態１２～１４に記載の免疫原性組成物。
１６．異種リンカーが、少なくとも１つのアラニン、グリシン又はバリン残基を含み、好ましくは、リンカーが、配列ＣＧＡＧＡ又はＣＧＡＧＶを有する、実施形態１５に記載の免疫原性組成物。
１７．融合前Ｆタンパク質が、天然ｈＭＰＶ Ｆタンパク質の４９、５１、６７、８０、１３７、１４７、１５９、１６０、１６１、１６６、１７７、２５８、２６６、４８０、及び／又は４８１位に対応する位置に１つ以上の置換を含む、実施形態１２～１６に記載の免疫原性組成物。
１８．置換が、Ｔ４９Ｍ、Ｅ８０Ｎ、Ｉ１３７Ｗ、Ａ１４７Ｖ、Ａ１５９Ｖ、Ｔ１６０Ｆ、Ａ１６１Ｍ、Ｉ６７Ｌ、Ｉ１７７Ｌ、Ｆ２５８Ｉ、Ｓ２６６Ｄ、Ｉ４８０Ｃ、及び／又はＬ４８１Ｃからなる群から選択される、実施形態１７に記載の免疫原性組成物。
１９．一本鎖融合前Ｆタンパク質が、以下の置換組み合わせのうちの１つを含む、実施形態１２～１８に記載の免疫原性組成物。
Ｎ９７Ｑ、Ｒ１０２Ｇ及びＧ２９４Ｅ；
Ｎ９７Ｑ、Ｒ１０２Ｇ、Ｔ１６０Ｆ、Ｉ１７７Ｌ及びＧ２９４Ｅ；
Ｎ９７Ｑ、Ｒ１０２Ｇ、Ｔ４９Ｍ、Ｉ６７Ｌ、Ａ１６１Ｍ、Ｅ８０Ｎ、Ｆ２５８Ｉ及びＧ２９４Ｅ；
Ｎ９７Ｑ、Ｒ１０２Ｇ、Ｔ４９Ｍ、Ｉ６７Ｌ、Ａ１６１Ｍ、Ｅ５１Ｃ、Ｋ１６６Ｃ、Ｓ２６６Ｄ、Ｇ２９４Ｅ、Ｉ４８０Ｃ及びＬ４８１Ｃ；又は
Ｎ９７Ｑ、Ｒ１０２Ｇ、Ｔ４９Ｍ、Ａ１６１Ｍ、Ｉ１３７Ｗ、Ａ１５９Ｖ、Ａ１４７Ｖ、Ｉ１７７Ｌ、及びＧ２９４Ｅ。
２０．融合前Ｆタンパク質が、配列番号１１のアミノ酸配列（Ｌ７Ｆ＿Ａ１＿２３）を含むか又はそれからなる、実施形態１２～１９のいずれかに記載の免疫原性組成物。
２１．融合前Ｆタンパク質が、配列番号１２のアミノ酸配列（Ｌ７Ｆ＿Ｂ１＿２３）を含むか又はそれからなる、実施形態１２～１９のいずれかに記載の免疫原性組成物。
２２．融合前Ｆタンパク質が、配列番号１３のアミノ酸配列（Ｌ７Ｆ＿Ａ１＿２３．２）を含むか又はそれからなる、実施形態１２～１９のいずれかに記載の免疫原性組成物。
２３．融合前Ｆタンパク質が、配列番号１４のアミノ酸配列（Ｌ７Ｆ＿Ｂ１＿２３．２）を含むか又はそれからなる、実施形態１２～１９のいずれかに記載の免疫原性組成物。
２４．融合前Ｆタンパク質が、配列番号１５のアミノ酸配列（ｓＦ＿Ａ１＿Ｋ＿Ｌ７）を含むか又はそれからなる、実施形態１２～１９のいずれかに記載の免疫原性組成物。
２５．融合前Ｆタンパク質が、配列番号１６のアミノ酸配列（Ｌ７Ｆ＿Ａ１＿３１）を含むか又はそれからなる、実施形態１２～１９のいずれかに記載の免疫原性組成物。
２６．融合前Ｆタンパク質が、配列番号１７のアミノ酸配列（Ｌ７Ｆ＿Ａ１＿３３）を含むか又はそれからなる、実施形態１２～１９のいずれかに記載の免疫原性組成物。
２７．融合前Ｆタンパク質が、配列番号１８のアミノ酸配列（構築物Ｌ７Ｆ＿Ａ１＿４．２）を含むか又はそれからなる、実施形態１２～１９のいずれかに記載の免疫原性組成物。
２８．融合前Ｆタンパク質が、２つのポリペプチド鎖を有するタンパク質であり、配列番号１９のアミノ酸配列を含むか又はそれからなる、実施形態１～１１のいずれかに記載の免疫原性組成物。
２９．融合前Ｆタンパク質が、２つのポリペプチド鎖を有するタンパク質であり、配列番号２０のアミノ酸配列を含むか又はそれからなる、実施形態１～１１のいずれかに記載の免疫原性組成物。
３０．安定化された融合後Ｆタンパク質が、天然Ｆタンパク質のアミノ酸位置と比較して、１０３～１１１位のアミノ酸残基の欠失、リンカーＫＫＲＫＲＲによるＲ１０２の置き換え、及び置換Ｇ２９４Ｅを含む、実施形態１～１１のいずれかに記載の免疫原性組成物。
３１．融合前Ｆタンパク質が、ｉ）配列番号１～２０からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ｉｉ）その免疫原性が、配列番号１～２０の親Ｆタンパク質の免疫原性と同様である、実施形態１～３０のいずれかに記載の免疫原性組成物。
３２．融合前Ｆタンパク質が、ｉ）配列番号１～２０からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ｉｉ）その免疫原性が、配列番号１～２０の親Ｆタンパク質の免疫原性と等しいか又は同様である、実施形態１～３０のいずれかに記載の免疫原性組成物。
３３．融合前Ｆタンパク質ｉ）が、配列番号１～２０からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ｉｉ）その免疫原性が、配列番号１～２０の親Ｆタンパク質の免疫原性と等しいか又は同様である、実施形態１～３０のいずれかに記載の免疫原性組成物。
３４．融合前及び融合後ｈＭＰＶ Ｆタンパク質が、配列番号２３～２８の配列を有する三量体化ヘルパードメイン（フォールドン）又はそのバリアントを含む、前述の実施形態のいずれかに記載の免疫原性組成物。
３５．Ｆタンパク質が、ホモ又はヘテロ三量体として産生される、前述の実施形態のいずれかに記載の免疫原性組成物。
３６．組成物が、更なる非ｈＭＰＶ抗原を含む、前述の実施形態のいずれかに記載の免疫原性組成物。
３７．アジュバントが、ミョウバン、ＣｐＧ、例えば、ＣｐＧ１０１８、ＯＤＮ、Ｉ－ＯＤＮ、ＩＣ３１（登録商標）、ＭＦ５９（登録商標）、ＡｄｄａＶａｘ（商標）、ＡＳ０３、ＡＳ０１、ＱＳ２１、ＭＰＬ、ＧＬＡ－ＳＥ、ＧＬＡ－３Ｍ－０５２－ＬＳ、３Ｍ－０５２－ミョウバン、又はそれらの組み合わせからなる群から選択される、前述の実施形態のいずれかに記載の免疫原性組成物。
３８．アジュバントが、ミョウバン、ＣｐＧ、例えば、ＣｐＧ１０１８、ＯＤＮ、Ｉ－ＯＤＮ、ＩＣ３１（登録商標）、ＭＦ５９（登録商標）、ＡｄｄａＶａｘ（商標）、ＡＳ０３、ＡＳ０１、ＱＳ２１、ＭＰＬ、ＧＬＡ－ＳＥ、ＧＬＡ－３Ｍ－０５２－ＬＳ及び３Ｍ－０５２－ミョウバンからなる群から選択される２つ以上のアジュバントからなる、前述の実施形態のいずれかに記載の免疫原性組成物。
３９．アジュバントがミョウバンである、前述の実施形態のいずれかに記載の免疫原性組成物。
４０．アジュバントがＩＣ３１（登録商標）である、前述の実施形態のいずれかに記載の免疫原性組成物。
４１．アジュバントが、ＧＬＡ－ＳＥである、前述の実施形態のいずれかに記載の免疫原性組成物。
４２．アジュバントが、３Ｍ－０５２－ミョウバンである、前述の実施形態のいずれかに記載の免疫原性組成物。
４３．アジュバントが、ＧＬＡ－３Ｍ－０５２－ＬＳである、前述の実施形態のいずれかに記載の免疫原性組成物。
４４．アジュバントが、ミョウバン及びＣｐＧ１０１８からなる、前述の実施形態のいずれかに記載の免疫原性組成物。
４５．アジュバントが、ミョウバン及びＭＰＬからなる、前述の実施形態のいずれかに記載の免疫原性組成物。
４６．アジュバントが、ミョウバン及びＩＣ３１（登録商標）からなる、前述の実施形態のいずれかに記載の免疫原性組成物。
４７．アジュバントがＡｄｄａＶａｘ（商標）である、前述の実施形態のいずれかに記載の免疫原性組成物。
４８．組成物が、融合前Ｆタンパク質に対する中和抗体を誘発することができる、前述の実施形態のいずれかに記載の免疫原性組成物。
４９．融合前タンパク質又は融合前タンパク質の組み合わせを含む組成物が、同じ総タンパク質量で使用される融合後Ｆタンパク質を含む組成物によって誘発される免疫応答（中和抗体価）と比較して、優れた免疫応答（中和抗体価）を提供する、前述の実施形態のいずれかに記載の免疫原性組成物。
５０．組成物が、１つより多くのｈＭＰＶ株に対する防御を提供する、前述の実施形態のいずれかに記載の免疫原性組成物。
５１．組成物が、遺伝子型ＡのｈＭＰＶ株に対する防御を提供する、前述の実施形態のいずれかに記載の免疫原性組成物。
５２．組成物が、遺伝子型ＢのｈＭＰＶ株に対する防御を提供する、前述の実施形態のいずれかに記載の免疫原性組成物。
５３．組成物が、遺伝子型Ａ及び遺伝子型ＢのｈＭＰＶ株に対する防御を提供する、前述の実施形態のいずれかに記載の免疫原性組成物。
５４．組成物がワクチンである、前述の実施形態のいずれかに記載の免疫原性組成物。
５５．薬剤として使用するための、前述の実施形態のいずれかに記載の免疫原性組成物。
５６．対象におけるｈＭＰＶ感染及び関連疾患を治療及び／又は予防するための、前述の実施形態のいずれかに記載の免疫原性組成物。
５７．対象においてｈＭＰＶ Ｆタンパク質に対する免疫応答を生成するための方法であって、対象に有効量の前述の実施形態１～４８のいずれかに記載の免疫原性組成物を投与することを含む、方法。
５８．免疫原性組成物が、筋肉内、皮内、皮下、粘膜、直腸内、又は経口的に投与される、実施形態５６に記載の方法。
５９．方法が、実施形態１～５５のいずれかに記載の免疫原性組成物のプライム・ブースト投与を含み、プライム・ブーストが、同じ免疫原性組成物で行われる、実施形態５６及び５７に記載の方法。
６０．方法が、実施形態１～５５のいずれかに記載の免疫原性組成物のプライム・ブースト投与を含み、プライム投与が、遺伝子型ＡのＦタンパク質を含む組成物で行われ、ブースト投与が、遺伝子型ＢのＦタンパク質を含む組成物で行われるか、若しくはその逆である、実施形態５６及び５８に記載の方法、又は方法が、実施形態１～５５のいずれかに記載の免疫原性組成物のブースト投与を含み、プライム投与が、遺伝子型ＡのＦタンパク質を含む免疫原性組成物で行われ、ブースト投与が、遺伝子型ＢのＦタンパク質を含む組成物で行われるか、若しくはその逆である、実施形態５６及び５８に記載の方法。
６１．対象におけるｈＭＰＶ感染を治療及び／又は予防するための方法であって、融合前ｈＭＰＶ Ｆタンパク質に対する中和抗体を生成し、少なくとも１つの遺伝子型Ａ又はＢ、好ましくは両方のｈＭＰＶ株に対する防御を提供するために、対象に治療有効量の実施形態１～５５のいずれかに記載の免疫原性組成物を投与することを含む、方法。
６２．方法が、ｉ）宿主細胞内の発現ベクターに挿入された対応する核酸分子からの組換え融合前Ｆタンパク質の発現、ｉｉ）発現された組換えＦタンパク質を精製すること、及びｉｉｉ）精製された組換えタンパク質を、薬学的に許容される担体及び／又は賦形剤と、任意選択的にアジュバントと組み合わせることを含む、実施形態１～５５のいずれかに記載の免疫原性組成物を生成するための方法。
６３．唯一のｈＭＰＶ抗原としてのヒトメタニューモウイルス（ｈＭＰＶ）Ｆタンパク質又はその断片の安定化された融合後コンフォメーション形態から本質的になる、免疫原性組成物であって、上記ｈＭＰＶタンパク質が、遺伝子型Ａ又はＢの１つのサブグループに由来し、上記免疫原性組成物が、別のサブグループ及び／又は遺伝子型からのｈＭＰＶを交差中和する、免疫原性組成物。
６４．ヒトメタニューモウイルス（ｈＭＰＶ）Ｆタンパク質又はその断片の安定化された融合後コンフォメーション形態が、Ａ１サブグループのものである、実施形態６３に記載の組成物。
６５．組成物が、ｉ）遺伝子型Ａのヒトメタニューモウイルス（ｈＭＰＶ）Ｆタンパク質又はその断片の安定化された融合後コンフォメーション形態、及びｉｉ）遺伝子型Ｂのヒトメタニューモウイルス（ｈＭＰＶ）Ｆタンパク質又はその断片の安定化された融合前コンフォメーション形態と、任意選択的に１つ以上のアジュバント及び／又は少なくとも１つの薬学的に正しい担体若しくは賦形剤とから本質的になり、上記免疫原性組成物が、他のサブグループ及び／又は他を交差中和する、実施形態６３～６４に記載の組成物。
６６．遺伝子型Ａのヒトメタニューモウイルス（ｈＭＰＶ）Ｆタンパク質又はその断片の安定化された融合後コンフォメーション形態が、Ａ１サブグループのものであり、遺伝子型Ｂのヒトメタニューモウイルス（ｈＭＰＶ）Ｆタンパク質又はその断片の安定化された融合後コンフォメーション形態が、Ｂ１サブグループのものである、実施形態６５に記載の組成物。
６７．融合後Ｆタンパク質が、組換えタンパク質である、前述の実施形態のいずれかに記載の免疫原性組成物。
６８．融合後Ｆタンパク質が、細胞質尾部及び／又は膜貫通ドメインを欠いている、前述の実施形態のいずれかに記載の免疫原性組成物。
６９．融合後Ｆタンパク質が、ｈＭＰＶ株又は臨床分離株に由来する天然Ｆタンパク質の改変アミノ酸配列であるアミノ酸配列を有する、前述の実施形態のいずれかに記載の免疫原性組成物。
７０．天然Ｆタンパク質配列が、ｈＭＰＶ株ＮＬ／１／００、ＮＬ／１７／００、ＴＮ／９４－４９、ＮＣＬ１７４、ＣＡＮ９７－８３、ＮＬ／１／９、ＮＤＬ００－１、Ｃ１－３３４、ＣＡＮ９７－８２、及びＴＮ／８９－５１５に由来する配列番号１～１０のアミノ酸配列からなる群から選択される、実施形態６９に記載の免疫原性組成物。
７１．融合後Ｆタンパク質が、配列番号２１（ＳＦ＿Ａ１＿ＭＦｕｒ）又は配列番号２２（ＳＦ＿Ｂ１＿ＭＦｕｒ）のアミノ酸配列を有する、任意の前述の実施形態に記載の免疫原性組成物。

【図面の簡単な説明】

【0023】

【図1】示されるドメインを有する天然ｈＭＰＶ Ｆタンパク質の概略図を示す。Ｆ０－タンパク質前駆体；Ｆ１及びＦ２ドメイン；ＳＰ－シグナルペプチド；ＦＰ－融合ペプチド；ＨＲＡ、ＨＲＢ－ヘプタッドリピートドメインＡ及びＢ；ＴＭ－膜貫通ドメイン；ＣＹＴ－細胞質尾部；Ｓ－Ｓ－ジスルフィド結合。

【図2】（Ａ）融合前コンフォメーション及び（Ｂ）融合後コンフォメーションのＦタンパク質の三次元構造（リボン図）を示す。

【図3】Ｆタンパク質当たり（Ａ）０．６μｇ、（Ｂ）０．２μｇ、（Ｃ）０．０２μｇの抗原用量を含む融合前及び融合後Ｆタンパク質の組み合わせに対して産生されたマウスの血清中和抗体価を示す。融合前及び融合後Ｆタンパク質の組み合わせは、２倍の量の抗原を含むことに留意されたい。融合後Ｆタンパク質に対して産生された抗体は、主に融合前フォーマットを交差防御する可能性がある。したがって、融合後フォーマットＦタンパク質の添加は必要ではない場合がある。

【図4】Ａ１若しくはＢ１サブグループ、又はそれらの組み合わせに由来するＦタンパク質候補（抗原当たり０．０２μｇ）に対して誘導された中和力価（Ａ２ａサブグループを用いたチャレンジ）（Ｆタンパク質当たりの用量）。融合前及び融合後Ｆタンパク質の組み合わせは、２倍の量の抗原を含むことに留意されたい。融合後Ｆタンパク質に対して産生された抗体は、主に融合前フォーマットを交差防御する可能性がある。したがって、融合後フォーマットＦタンパク質の添加は、必要ではない場合がある。

【図5】ｈＭＰＶ Ａ２ａサブグループを用いたチャレンジ時のマウスの防御：（Ａ）ＦＦＡ、（Ｂ）ＲＴ－ｑＰＣＲ。融合前及び融合後Ｆタンパク質の組み合わせは、２倍の量の抗原を含むことに留意されたい。融合後Ｆタンパク質に対して産生された抗体は、主に融合前フォーマットを交差防御する可能性がある。したがって、融合後フォーマットＦタンパク質の添加は、必要ではない場合がある。

【図6】融合前及び融合後フォーマットでＡ群及びＢ群に由来するＦタンパク質候補（抗原当たり４０、１２０及び４００ｎｇ）に対して誘導された中和力価（Ａ）ｈＭＰＶ Ａ１株に対するＭＮＡ；（Ｂ）ｈＭＰＶ Ｂ１株に対するＭＮＡ。両方のアッセイにおいて、全ての群で用量反応が観察される。マウスを融合前Ａ１候補で免疫した場合、ｈＭＰＶ Ａ１（Ａ）株及びＢ１（Ｂ）株それぞれに対して良好な中和及び交差中和が認められた。融合前Ａ１候補はまた、より高い免疫原性を誘導し得、したがって、より良好な中和及び交差中和をもたらし得る。融合前Ｂ１候補で免疫した場合、ｈＭＰＶ Ａ１株に対する交差中和はあまり効果的ではなかった。同じ観察を融合後の候補について行うことができる。しかしながら、融合後の候補が同様の抗体（すなわち、融合前フォーマットに対する中和抗体、及び融合後フォーマット部分に対する追加の非中和抗体又は主に非中和抗体）を産生する可能性がある。したがって、融合前フォーマットがおそらく依然として好ましいというのが、この段階での我々の解釈である。

【図7】中和及び交差中和。全体として、融合前－融合後の組み合わせによる中和力価は、単一の候補で得られるものよりも弱い。以前に観察されたように、Ａ１候補のみによる免疫は、より高い交差中和性を示し、かつ／又はより高い免疫原性を生じると考えられる。その実験では、最良の組み合わせは、融合前＋融合後Ａ１又は融合前Ｂ１＋融合後Ａ１であるが、中和力価は、依然として、単一の候補による免疫における力価よりも低い。

【図8】ｈＭＰＶ中和抗体の誘導に対するアジュバント効果。異なるアジュバントを用いて、又はアジュバントなしで製剤化されたワクチンＬ７－Ａ１－２３＋ｓＦ－Ａ１－ＭＦｕｒ（各抗原当たり０．２μｇ）によるマウスの免疫。アジュバントなしで製剤化された混合ワクチンでは、中和抗体は誘導されなかった。異なるアジュバントを用いて製剤化された混合ワクチンは、中和抗体を誘導した。この実験から、試験した全てのアジュバントは、Ｆタンパク質に基づくｈＭＰＶワクチンの製剤のための貴重な選択肢である。

【発明を実施するための形態】

【0024】

本発明の目的は、多数のｈＭＰＶ株に対して対象を治療及び／又は予防するためのｈＭＰＶサブユニットワクチンを提供することである。サブユニットワクチンは、様々な安定化アプローチによって融合前コンフォメーションの１つで安定化された改変ｈＭＰＶ Ｆタンパク質に基づく（図１を参照されたい）。

【0025】

ｈＭＰＶ株は、Ａ及びＢの２つの遺伝子型に分類され、それぞれが、サブグループＡ１、Ａ２ａ、Ａ２ｂ、Ｂ１及びＢ２に分けられている。本明細書に開示される改変Ｆタンパク質又はその断片は、任意のｈＭＰＶ株又は臨床分離株に由来し得る。好ましくは、１つの組成物（又はワクチン）中の２つのＦタンパク質は、同じ遺伝子型の異なるサブグループに属し、更により好ましくは、異なる遺伝子型に属する。異なる株に由来する天然Ｆタンパク質配列の例を表１に示す。

【表1】

【0026】

一態様において、本発明は、感染プロセス中にウイルスと細胞膜との融合を媒介する可溶性Ｆタンパク質に関する。Ｆタンパク質は、ウイルス膜を１回貫通する内在性膜タンパク質であり、Ｎ末端に切断可能なシグナル配列を含み、Ｃ末端に、タンパク質を膜に固定する疎水性ＴＭドメインと、短い細胞質尾部とを含む（図１を参照されたい）。天然Ｆタンパク質は、融合前及び融合後の２つのコンフォメーション形態で存在する（図２を参照されたい）。細胞外では、ウイルスのＦタンパク質は、不安定な球状の融合前コンフォメーションにあり、細胞膜と接触すると、細長い融合後形態にリフォールディングする。両方のＦタンパク質コンフォメーションは抗原性であり、いくつかのエピトープを共有するが、いくつかのエピトープは各コンフォメーションに固有である。Ｆタンパク質に対して産生された抗体は、中和性であり、ｈＭＰＶ感染と戦う際に重要な役割を果たすことが以前に示された。

【0027】

安定化された融合前コンフォメーションでＦタンパク質を産生するために、天然Ｆタンパク質を組換え技術（遺伝子工学）によって改変し、組換え宿主でＤＮＡ構築物を発現させた。

【0028】

一実施形態によれば、組換え融合前Ｆタンパク質は、一本鎖ポリペプチドとして産生された。一本鎖Ｆポリペプチドは、Ｆエクトドメインの配列と同様のアミノ酸配列を有するが、天然Ｆタンパク質の１０３～１１８位のアミノ酸残基、具体的には、配列番号１～１０及び４９の天然Ｆタンパク質配列にわたる融合ペプチド（ＦＰ）を欠いている。更に、一本鎖Ｆポリペプチドは、Ｆ１ドメインとＦ２ドメインとの間にプロテアーゼ切断部位を欠いており、これは、好ましくは、天然Ｆタンパク質のアミノ酸配列に対して１０２位に変異を導入することによって排除される。より好ましくは、この変異は、アルギニン残基のグリシンへの置換（Ｒ１０２Ｇ）である。更に、融合前Ｆタンパク質は、少なくとも１つの追加のアミノ酸改変（置換、欠失、又は挿入等）、特にシステインへの少なくとも１つの置換を含む。この追加のシステイン残基は、融合前コンフォメーションを更に安定化する別のシステイン残基と非天然ジスルフィド（Ｓ－Ｓ）結合を形成することができる。

【0029】

更に別の実施形態によれば、一本鎖Ｆタンパク質において、Ｆ１及びＦ２ドメインは、天然Ｆタンパク質のアミノ酸１０３～１１８を置き換える異種ペプチドリンカーによって連結される。リンカーは、アラニン、グリシン及び／又はバリンを含む最大５つのアミノ酸、並びに少なくとも１つのシステインを含む。好ましくは、システイン残基は、天然Ｆタンパク質の１０３位に対応する位置にある。最も好ましくは、リンカーは、Ｃが１０３位にある配列ＣＧＡＧＡ又はＣＧＡＧＶを有する。このシステインは、Ｆ１ドメインのシステイン残基とジスルフィド結合を形成することができる。

【0030】

更に一実施形態によれば、システイン残基は、
位置１０３～１２０のうちのいずれか１つ及び位置３３５～３４５のうちのいずれか１つ、
位置１０７～１１８のうちのいずれか１つ及び位置３３５～３４２のうちのいずれか１つ、
位置１１７～１２９のうちのいずれか１つ及び位置２５６～２６１のうちのいずれか１つ、
位置８７～１０２のうちのいずれか１つ及び位置１１７～１２７のうちのいずれか１つ、
位置１０２～１１３のうちのいずれか１つ及び位置１１７～１２７のうちのいずれか１つ、
位置１０２～１１３のうちのいずれか１つ及び位置８７～１０２のいずれか１つ、
位置３３７～３４１のうちのいずれか１つ及び位置４２１～４２６のうちのいずれか１つ、
位置１１２～１２０のうちのいずれか１つ及び位置４２４～４３２のうちのいずれか１つ、
位置１５０～１５６のうちのいずれか１つ及び位置３９２～４００のうちのいずれか１つ、
位置１１２～１２０のうちのいずれか１つ及び位置３７０～３７７のうちのいずれか１つ、
位置３６５～３７５のうちのいずれか１つ及び位置４５５～４６５のうちのいずれか１つ、
位置３６５～３７５のうちのいずれか１つ及び位置１０５～１１５のうちのいずれか１つ、又は
位置６０～７０のうちのいずれか１つ及び位置１７５～１８５のうちのいずれか１つで導入され、
位置は、天然Ｆタンパク質配列、特に、配列番号１～１０及び４９の天然Ｆタンパク質配列のアミノ酸に対応する。

【0031】

更に１つの実施形態によれば、融合前Ｆタンパク質は、天然Ｆタンパク質配列、具体的には、配列番号１～１０の天然Ｆタンパク質配列のアミノ酸位置に対して、４９、５１、６７、８０、１３７、１４７、１５９、１６０、１６１、１６６、１７７、２５８、２６６、４８０及び／又は４８１位に対応する１つ以上の置換を含む。好ましい置換は、Ｔ４９Ｍ、Ｅ８０Ｎ、Ｉ１３７Ｗ、Ａ１４７Ｖ、Ａ１５９Ｖ、Ｔ１６０Ｆ、Ａ１６１Ｍ、Ｉ６７Ｌ、Ｉ１７７Ｌ、Ｆ２５８Ｉ、Ｓ２６６Ｄ、Ｉ４８０Ｃ及び／又はＬ４８１Ｃからなる群から選択される。

【0032】

より好ましくは、一本鎖融合前Ｆタンパク質は、以下の組み合わせのうちの１つを含む：
Ｎ９７Ｑ、Ｒ１０２Ｇ及びＧ２９４Ｅ；
Ｎ９７Ｑ、Ｒ１０２Ｇ、Ｔ１６０Ｆ、Ｉ１７７Ｌ及びＧ２９４Ｅ；
Ｎ９７Ｑ、Ｒ１０２Ｇ、Ｔ４９Ｍ、Ｉ６７Ｌ、Ａ１６１Ｍ、Ｅ８０Ｎ、Ｆ２５８Ｉ及びＧ２９４Ｅ；
Ｎ９７Ｑ、Ｒ１０２Ｇ、Ｔ４９Ｍ、Ｉ６７Ｌ、Ａ１６１Ｍ、Ｅ５１Ｃ、Ｋ１６６Ｃ、Ｓ２６６Ｄ、Ｇ２９４Ｅ、Ｉ４８０Ｃ及びＬ４８１Ｃ；又は
Ｎ９７Ｑ、Ｒ１０２Ｇ、Ｔ４９Ｍ、Ａ１６１Ｍ、Ｉ１３７Ｗ、Ａ１５９Ｖ、Ａ１４７Ｖ、Ｉ１７７Ｌ、及びＧ２９４Ｅ。

【0033】

いくつかの実施形態において、融合前一本鎖Ｆタンパク質は、限定されないが、以下のタンパク質構築物からなる群から選択され得る：Ｌ７Ｆ＿Ａ１＿２３（配列番号１１）、Ｌ７Ｆ＿Ｂ１＿２３（配列番号１２）、Ｌ７Ｆ＿Ａ１＿２３．２（配列番号１３）、Ｌ７Ｆ＿Ｂ１＿２３．２（配列番号１４）、ｓＦ＿Ａ１＿Ｋ＿Ｌ７（配列番号１５）、Ｌ７Ｆ＿Ａ１＿３１（配列番号１６）、Ｌ７Ｆ＿Ａ１＿３３（配列番号１７）及び／又はＬ７Ｆ＿Ａ１＿４．２（配列番号１８）。

【0034】

具体的には、融合前Ｆタンパク質は、配列番号１１のアミノ酸配列（Ｌ７Ｆ＿Ａ１＿２３構築物）を含むか又はそれからなる。具体的には、融合前Ｆタンパク質は、配列番号１３のアミノ酸配列（Ｌ７Ｆ＿Ａ１＿２３．２構築物）を含むか又はそれからなる。具体的には、融合前Ｆタンパク質は、配列番号１５のアミノ酸配列（ｓＦ＿Ａ１＿Ｋ＿Ｌ７構築物）を含むか又はそれからなる。具体的には、融合前Ｆタンパク質は、配列番号１６のアミノ酸配列（Ｌ７Ｆ＿Ａ１＿３１構築物）を含むか又はそれからなる。具体的には、融合前Ｆタンパク質は、配列番号１７のアミノ酸配列（Ｌ７Ｆ＿Ａ１＿３３構築物）を含むか又はそれからなる。具体的には、融合前Ｆタンパク質は、配列番号１８のアミノ酸配列（構築物Ｌ７Ｆ＿Ａ１＿４．２構築物）を含むか又はそれからなる。具体的には、融合前Ｆタンパク質は、配列番号１２のアミノ酸配列（Ｌ７＿Ｂ１＿２３構築物）を含むか又はそれからなる。具体的には、融合前Ｆタンパク質は、配列番号１４のアミノ酸配列（Ｌ７＿Ｂ１＿２３．２構築物）を含むか又はそれからなる。

【0035】

別の実施形態によれば、融合前Ｆタンパク質は、２つのポリペプチド鎖、すなわち、好ましくはＦ１ドメインに、少なくとも１つの安定化変異を更に含む、２つ以上のＳ－Ｓ結合によって連結された別個のＦ１ドメイン及びＦ２ドメインからなる。例示的な２鎖融合前Ｆタンパク質は、ｓＦ＿Ａ１＿Ｋ－Ｅ２９４構築物（配列番号１９）及びｓＦ＿Ｂ１＿Ｋ－Ｅ２９４構築物（配列番号２０）である。

【0036】

更に別の実施形態によれば、本明細書に開示される組成物の第２のタンパク質は、融合前構造の安定化された改変Ｆタンパク質である。融合前Ｆタンパク質は、１つ以上の安定化変異を含む。具体的には、融合前Ｆタンパク質は、配列番号１１のアミノ酸配列（Ｌ７Ｆ＿Ａ１＿２３構築物）を含むか又はそれからなる。具体的には、融合前Ｆタンパク質は、配列番号１３のアミノ酸配列（Ｌ７Ｆ＿Ａ１＿２３．２構築物）を含むか又はそれからなる。具体的には、融合前Ｆタンパク質は、配列番号１５のアミノ酸配列（ｓＦ＿Ａ１＿Ｋ＿Ｌ７構築物）を含むか又はそれからなる。具体的には、融合前Ｆタンパク質は、配列番号１６のアミノ酸配列（Ｌ７Ｆ＿Ａ１＿３１構築物）を含むか又はそれからなる。具体的には、融合前Ｆタンパク質は、配列番号１７のアミノ酸配列（Ｌ７Ｆ＿Ａ１＿３３構築物）を含むか又はそれからなる。具体的には、融合前Ｆタンパク質は、配列番号１８のアミノ酸配列（構築物Ｌ７Ｆ＿Ａ１＿４．２構築物）を含むか又はそれからなる。具体的には、融合前Ｆタンパク質は、配列番号１２のアミノ酸配列（Ｌ７＿Ｂ１＿２３構築物）を含むか又はそれからなる。具体的には、融合前Ｆタンパク質は、配列番号１４のアミノ酸配列（Ｌ７＿Ｂ１＿２３．２構築物）を含むか又はそれからなる。

【0037】

別の実施形態によれば、融合前Ｆタンパク質は、２つのポリペプチド鎖、すなわち、好ましくはＦ１ドメインに、少なくとも１つの安定化変異を更に含む、２つ以上のＳ－Ｓ結合によって連結された別個のＦ１ドメイン及びＦ２ドメインからなる。例示的な二本鎖の融合前Ｆタンパク質は、ｓＦ＿Ａ１＿Ｋ－Ｅ２９４構築物（配列番号１９）及びｓＦ＿Ｂ１＿Ｋ－Ｅ２９４構築物（配列番号２０）である。

【0038】

更に別の実施形態において、本発明は、融合後Ｆタンパク質組成物を提供する。特に、安定化された融合後Ｆタンパク質は、配列番号１～９の天然Ｆタンパク質のアミノ酸位置と比較して、１０３～１１１位のアミノ酸残基の欠失、リンカーＫＫＲＫＲＲによるＲ１０２の置き換え、及び置換Ｇ２９４Ｅを含む。融合後Ｆタンパク質構築物の例は、ｓＦ＿Ａ１＿Ｍｆｕｒ（配列番号２１）及びｓＦ＿Ｂ１＿Ｍｆｕｒ（配列番号２２）である。代替的に、融合後構築物は、ｓＦ＿Ａ２＿Ｍｆｕｒ及びｓＦ＿Ｂ２＿Ｍｆｕｒである。

【0039】

更に別の実施形態によれば、融合前Ｆタンパク質は、配列番号１１～２２の配列からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなってもよく、パーセンテージ配列同一性は、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムを使用することにより親配列の全長にわたって決定される（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ＆Ｗｕｎｓｃｈ．（１９７０）Ａ ｇｅｎｅｒａｌ ｍｅｔｈｏｄ ａｐｐｌｉｃａｂｌｅ ｔｏ ｔｈｅ ｓｅａｒｃｈ ｆｏｒ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｉｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｗｏ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｊ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３－４５３）。それ以外の場合、配列同一性パーセントは、マッチの数を、同定された配列に示される配列の長さ、又は明確に区切られた長さ（例えば、同定された配列に示されるある配列から１００個の連続したヌクレオチド又はアミノ酸残基）で除した後、得られた値に１００を乗じることによって決定される。好ましくは、配列同一性パーセンテージは、配列の全長にわたって決定される。例えば、１５５４個のアミノ酸を有する試験配列と整列させたときに１１６６個のマッチを有するペプチド配列は、試験配列と７５．０％同一である（１１６６÷１５５４×１００＝７５．０）。配列同一性のパーセンテージ値は、小数第１位まで四捨五入される。例えば、７５．１１、７５．１２、７５．１３、及び７５．１４は、７５．１に切り捨てられ、７５．１５、７５．１６、７５．１７、７５．１８、及び７５．１９は、７５．２に切り上げられる。タンパク質の相同体及びバリアントは、典型的には、参照配列の少なくとも５０、１００、１５０、２５０、５００個のアミノ酸残基にわたって、参照配列の全長にわたって、又は参照アミノ酸配列との全長アラインメントにわたってカウントされる、少なくとも約７５％の配列同一性を有することを特徴とする。重要なことに、そのような相同タンパク質又はタンパク質バリアントは、任意の配列番号１１～２２の配列を有する親Ｆタンパク質の免疫原性及び防御効果に匹敵する免疫原性及び防御効果を有し、同等の免疫原性は、ＥＬＩＳＡ（ＩＣ_５０値）及び／又は中和アッセイ（ＰＲＮＴ_５０値）で測定することができ、読み出しは、＋／－５０％マージン、好ましくは＋／－４０％、より好ましくは＋／－３０％、２０％又は１０％マージン内である。

【0040】

更なる実施形態において、本発明の融合前Ｆタンパク質は、膜貫通ドメイン及び細胞質尾部を有しない。それにもかかわらず、ホモ又はヘテロ三量体として産生することができる。三量体化は、天然Ｆプロトマーの残基４８０～４９５に及ぶ配列に起因して生じ得るが、三量体化は、この領域に改変を導入することによって促進され得る。１つの改変は、共有結合環の形態で３つのプロトマーにわたる３つのジスルフィド結合の導入を可能にするシステインの近傍残基Ｉ４８０及びＬ４８１の置換を含む。別の改変は、いわゆるフォールドンドメインと呼ばれる三量体化ヘルパーの挿入である。三量体化ヘルパーの添加は、安定で可溶性のタンパク質三量体の形成を支持する。フォールドンドメイン内のシステイン環の利用可能性は、３つのプロトマー間に共有結合を作製するジスルフィド結合を形成することを可能にする。一実施形態において、フォールドンドメインは、Ｔ４バクテリオファージのフィブリチンに由来する配列番号２３の配列、又はｈＭＰＶ非特異的エピトープを隠すのを助ける、１つ以上のＮ－グリコシル化部位（モチーフＮｘＴ／Ｓ、ここで「ｘ」はプロリンを除く任意のアミノ酸残基）を含む改変配列を有する。そのような改変されたフォールドン配列の例は、配列番号２４～２８のものである。代替的に、フォールドンドメインのバリアントは、ＧＣＮ４ロイシンジッパー由来の構造要素（Ｈａｒｂｕｒｙ ｅｔ ａｌ．１９９３．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６２：１４０１）又は自己組織化ナノ粒子のモノマー、例えば、フェリチン又はルマシン（ｌｕｍａｃｉｎｅ）シンターゼを含み得る。更に、リンカーを、例えば、Ａ４９６残基の置き換えによって導入される切断部位と組み合わせて使用してもよい。短いリンカーの非限定的な例は、ＧＧ、ＳＧ、ＧＳ、ＧＧＧ、ＧＧＡ、ＧＧＳ、ＳＧＧ、ＳＳＧ、ＳＧＳ、ＳＧＡ、ＧＧＡ、ＳＳＡ及びＳＧＧＳである。

【0041】

更に別の実施形態において、フォールドンドメインは、Ｆタンパク質のＣ末端に結合され、膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインを置き換える。この場合、フォールドンドメインのＮ末端のグリシン残基は、Ｆ１ドメインのＣ末端に、直接、又は少なくとも１つのプロテアーゼ部位を含み得るペプチドリンカーを介して結合される。例えば、フォールドンドメインは、「ＶＳＬ」（配列番号２９）又は「ＶＳＡ」（配列番号３０）リンカーを介して結合することができる。そのようなリンカーは、トロンビン切断部位、ＴＥＶ（タバコエッチウイルスプロテアーゼ）又は第Ｘａ因子切断部位等のプロテアーゼ切断部位と組み合わせて使用されてもよい。そのようなフォールドンは、配列番号４２～４７の配列を有し得る。

【0042】

いくつかの実施形態において、組換えタンパク質の精製をより容易にするために、一本鎖ポリペプチドは、先行技術で既知の任意の精製タグ配列を含み得る。精製を補助するポリペプチドの例として、限定されないが、Ｈｉｓタグ、ｍｙｃタグ、Ｓペプチドタグ、ＭＢＰタグ、ＧＳＴタグ、ＦＬＡＧタグ、チオレドキシンタグ、ＧＦＰタグ、ＢＣＣＰ、カルモジュリンタグ、ストレプトアビジンタグ、ＨＳＶ－エピトープタグ、Ｖ５－エピトープタグ、及びＣＢＰタグが挙げられる。好ましくは、本発明のＦタンパク質は、Ｈｉｓ及び／又はストレプトアビジンタグを含む。

【0043】

更に別の実施形態において、本発明は、本明細書に開示される配列番号１１～２２の組換えｈＭＰＶ Ｆタンパク質をコードする単離された核酸分子を提供する。ある特定の実施形態において、本発明のタンパク質をコードする核酸は、配列番号３１～４０の配列を含むか又はそれからなる。別の実施形態では、ｈＭＰＶ Ｆタンパク質をコードする核酸は、置換、欠失、又は挿入等の１つ以上の改変を含み得る。いくつかの実施形態において、本出願は、配列番号１１～２２のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有するタンパク質をコードする核酸分子も包含する。好ましくは、核酸配列は、配列番号３１～４０のポリヌクレオチド配列に対して、約８０～１００％（又はその間の任意の値）の配列同一性を示す。配列同一性は、当業者に周知の配列アラインメントプログラム及びパラメータによって判定することができる。そのようなツールとしては、局所アラインメント用ＢＬＡＳＴスイートが挙げられる（Ａｌｔｓｃｈｕｌ Ｓ．Ｆ．，ｅｔ ａｌ．１９９７．「Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ ａｎｄ ＰＳＩ－ＢＬＡＳＴ：ａ ｎｅｗ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄａｔａｂａｓｅ ｓｅａｒｃｈ ｐｒｏｇｒａｍｓ」，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２）。一般的なグローバルアラインメントは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムを使用することにより行うことができる（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ＆Ｗｕｎｓｃｈ．１９７０．Ａ ｇｅｎｅｒａｌ ｍｅｔｈｏｄ ａｐｐｌｉｃａｂｌｅ ｔｏ ｔｈｅ ｓｅａｒｃｈ ｆｏｒ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｉｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｗｏ ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｊ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３－４５３）。

【0044】

更なる実施形態において、本明細書に記載される核酸は、タンパク質三量体の形成を強化するために使用され得るセグメント（いわゆるフォールドンドメイン）又は発現したタンパク質の精製を強化するために使用され得るセグメント（精製タグ）をコードする追加のヌクレオチド配列を含み得る。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される核酸はコドン最適化配列を有し得る。「コドン最適化」として知られる手順は、例えば、米国特許第５，５４７，８７１号に記載されている。遺伝暗号の縮重は、Ｆタンパク質のヌクレオチド配列の変形を可能にする一方で、天然ポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドと同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを依然として産生する。

【0045】

更に一実施形態によれば、本明細書に開示される融合前及び融合後Ｆタンパク質は、異種宿主細胞において産生される組換えタンパク質である。組換えタンパク質の産生は、原核細胞又は真核細胞の培養におけるタンパク質コード配列の一過性及び／又は安定な発現を含むがこれらに限定されない、任意の好適な方法によって達成され得る。タンパク質をコードする（ポリヌクレオチド）構築物は、標準的な組換え技術を使用して便利に調製される（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（上記）を参照されたい）。本明細書に開示されるタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列は、組換えタンパク質が発現される宿主細胞に導入される１つ以上のベクターに含まれ得る。本発明のタンパク質をコードする配列を発現するために使用することができるベクターの非限定的な例としては、ウイルス系ベクター（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、アルファウイルス、バキュロウイルス又はワクシニアウイルス）、プラスミドベクター、酵母ベクター、昆虫ベクター、哺乳動物ベクター又は人工ベクターが挙げられる。多くの好適な発現系が市販されている。発現ベクターは、典型的には、好適な宿主細胞においてコード配列の発現を可能にするコード配列及び発現制御エレメントを含む。本発明は、単離されたポリペプチドの発現及び提供を支援するように設計された発現系を提供する。本出願はまた、組換えｈＭＰＶタンパク質の発現のための宿主細胞を提供する。一実施形態において、宿主細胞は、原核生物、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉであってもよい。別の実施形態において、宿主細胞は、例えば、限定されないが、ＥＢ６６（登録商標）（Ｖａｌｎｅｖａ ＳＥ）、Ｖｅｒｏ、ＭＤＣＫ、ＢＨＫ、ＭＲＣ－５、ＷＩ－３８、ＨＴ１０８０、ＣＨＯ、ＣＯＳ－７、ＨＥＫ２９３、Ｊｕｒｋａｔ、ＣＥＭ、ＣＥＭＸ１７４、及び骨髄腫細胞（例えば、ＳＢ２０細胞）からなる群から選択される真核細胞であってもよい（これらの細胞株の多くはＡＴＣＣから入手可能である）。本発明の融合前Ｆタンパク質の産生に特に好ましい細胞株は、ＣＨＯ細胞株である。１つ以上の上記のタンパク質を発現する細胞株は、該タンパク質をコードする１つ以上の発現ベクターを構成的プロモーター又は誘導性プロモーターに安定的に組み込むことによって容易に生成することができる。適切な成長条件及び培地の選択は、当該技術分野の技術の範囲内である。

【0046】

本明細書に開示される組換えタンパク質又はそれらのタンパク質をコードする単離された核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）分子を産生するための方法が、本開示に組み込まれる。具体的には、組換えタンパク質を精製するための方法が含まれる。細胞培養培地手順からの好適な精製の非限定的な例としては、遠心分離及び／又は密度勾配遠心分離（例えば、スクロース勾配）、濾過、ペレット化、並びに／あるいはイオン交換、アフィニティー、サイズ排除及び／若しくは疎水性相互作用化学、接線濾過等を含む、カラムクロマトグラフィー又はバッチクロマトグラフィーが挙げられる。そのような方法は、当業者に既知であり、例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｅ．Ｌ．Ｖ．Ｈａｒｒｉｓ ａｎｄ Ｓ．Ａｎｇａｌ．，Ｅｄｓ．，１９９０）に記載される。

【0047】

更なる実施形態において、本発明のＦタンパク質は、２つの遺伝子型Ａ及びＢのいずれか１つ、又はサブグループＡ１、Ａ２、Ｂ１若しくはＢ２に属するｈＭＰＶ株又は臨床分離株のいずれかに由来し得る。

【0048】

更なる実施形態において、本発明は、１つのＦタンパク質を含む組成物、特に、融合前コンフォメーションで存在するＦタンパク質を含む組成物を提供する。一般に、Ｆタンパク質は、任意のｈＭＰＶ株又は臨床分離株に由来し得る。一実施形態において、本発明の組成物は、遺伝子型Ａ又はＢ、すなわち、サブグループＡ１及びＡ２ａ、Ａ２ｂ（代替的に、Ｂ１及びＢ２）に由来するＦタンパク質を含む。別の好ましい実施形態において、本発明の組成物は、サブグループＡ１に由来するＦタンパク質を含む（表２も参照されたい）。

【0049】

更なる実施形態において、本発明は、少なくとも２つのＦタンパク質、特に、融合前コンフォメーションで存在するＦタンパク質を含む組成物の組み合わせを含む組成物を提供する。一般に、Ｆタンパク質は、任意のｈＭＰＶ株又は臨床分離株に由来し得る。一実施形態において、本発明の組成物は、同じ遺伝子型Ａ又はＢ、異なるサブグループ、特にサブグループＡ１及びＡ２ａ、Ａ２ｂ（代替的に、Ｂ１及びＢ２）に由来するＦタンパク質を含む。別の実施形態において、本発明の組成物は、異なる遺伝子型Ａ及びＢ、例えば、サブグループＡ１（又はＡ２ａ、Ａ２ｂ）及びＢ１（又はＢ２）に由来するＦタンパク質を含む。好ましくは、サブグループＡ１のＦタンパク質と、Ｂ１又はＢ２のＦタンパク質との組み合わせである。

【0050】

１つの特定の実施形態において、組み合わせは、遺伝子型Ａ、特にサブグループＡ１又はサブグループＡ２ａ、Ａ２ｂ、代替的にサブグループＡ１及びＡ２の両方に由来する融合前Ｆタンパク質を含む。別の実施形態において、組み合わせは、遺伝子型Ｂ、特にサブグループＢ１又はサブグループＢ２、代替的にサブグループＢ１及びＢ２の両方に由来する融合前Ｆタンパク質を含む。更に別の実施形態において、組み合わせは、異なる遺伝子型Ａ及びＢに由来する融合前Ｆタンパク質を含む。具体的には、融合前Ｆタンパク質は、サブグループＡ１（又はＡ２ａ、Ａ２ｂ）に由来し、融合前Ｆタンパク質は、サブグループＢ１（又はＢ２）に由来する。代替的に、融合前Ｆタンパク質は、サブグループＢ１（又はＢ２）に由来し、融合前Ｆタンパク質は、サブグループＡ１（又はＡ２ａ、Ａ２ｂ）に由来する。より具体的には、融合前Ｆタンパク質の組み合わせを含む、本発明の一部である組成物を表２に挙げる。

【表2】

【0051】

更なる実施形態において、本発明の免疫原性組成物は、１つより多くのｈＭＰＶ株、特に１つの遺伝子型の異なる遺伝子型又は異なるサブグループに属する株に対する防御を提供することができる。例えば、免疫原性組成物は、Ａ１及び／又はＡ２ａ、Ａ２ｂサブグループ、代替的に、Ｂ１及び／又はＢ２サブグループ、又はＡ及びＢの両方の遺伝子型に対する防御を提供することができる。特に、遺伝子型Ａと遺伝子型Ｂとの間の交差防御が望ましい。

【0052】

更なる実施形態において、本発明は、融合前コンフォメーション形態で利用可能な２つの組換えＦタンパク質の組み合わせを含む医薬組成物を提供する。典型的には、医薬組成物は、少なくとも１つの薬学的に許容される担体又は賦形剤を更に含む。薬学的に許容される担体は、臨床投与のためのｈＭＰＶ Ｆタンパク質を製剤化するために使用される。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ｂｙ Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，１９ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９５は、免疫原の薬学的送達に好適な組成物及び製剤を記載している。一般に、担体の性質は、用いられる特定の投与様式に依存する。例えば、非経口製剤は、通常、注射可能で生理学的に許容される流体、例えば、水、生理食塩水、バランスのとれた塩溶液、デキストロース水溶液、グリセロール等をビヒクルとして含む。固体組成物（例えば、散剤、丸剤、錠剤、又はカプセル剤の形態）の場合、従来の非毒性固体担体は、例えば、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、又はステアリン酸マグネシウムを含むことができる。生物学的に中性の担体に加えて、医薬組成物は、湿潤剤又は乳化剤、防腐剤、及びｐＨ緩衝剤等の少量の非毒性補助物質、例えば、酢酸ナトリウム又はソルビタンモノラウレートを含有し得る。特定の実施形態において、対象への投与に好適な担体は、滅菌されており、かつ／又は、所望の抗ｈＭＰＶ免疫応答を誘導するのに適した組成物の１回以上の測定用量を含有する単位剤形に懸濁されるか若しくはさもなければ含まれる。単位剤形は、例えば、注射用の密封されたバイアル又はシリンジ中に存在するか、又は後続の可溶化及び投与のために凍結乾燥されるか、又は固体若しくは制御放出剤形であり得る。

【0053】

いくつかの実施形態では、免疫原性組成物（又はワクチン）は、アジュバントを更に含み得る。アジュバントとは、おそらくは抗原提示細胞の活性化を介して、抗原特異的免疫応答を特異的又は非特異的に増強するために使用される任意の物質を意味する。アジュバントの非限定的な例としては、水酸化アルミニウム又はリン酸アルミニウム等のアルミニウム塩（しばしば「ミョウバン」と称される）（ＷＯ２０１３／０８３７２６に記載）、油エマルジョン（完全又は不完全なフロイントアジュバント等）、ＩＳＡ５１等のＳｅｐｐｉｃ社製Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ不完全アジュバント、ＭＦ５９（登録商標）（Ｓｅｑｉｒｕｓ）等のスクアレンベースの水中油型エマルジョンアジュバント（Ｏｔｔ Ｇ．ｅｔ ａｌ．１９９５．Ｐｈａｒｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ６：２７７－９６）、ＡｄｄａＶａｘ（商標）（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）、モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）（Ｃｌｕｆｆ ＣＷ．２０１０．Ａｄｖ Ｅｘｐ Ｍｅｄ Ｂｉｏｌ ６６７：１１１－２３）、グルコピラノシル脂質アジュバント（ＧＬＡ）（Ｃｏｌｅｒ ＲＮ ｅｔ ａｌ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ ｌｉｐｉｄ ａｄｊｕｖａｎｔ ｓｙｓｔｅｍ ａｓ ａ ｖａｃｃｉｎｅ ａｄｊｕｖａｎｔ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１１， ６（１）：ｅ１６３３３）、３Ｍ－０５２等のＴｏｌｌ様受容体７／８アゴニスト（Ｚｈａｏ ＢＧ，ｅｔ ａｌ．Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｔｈｅｒａｐｙ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｔｏｌｌ ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ７，８ ａｎｄ ９ ｅｌｉｍｉｎａｔｅｓ ｌａｒｇｅ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ｔｕｍｏｒｓ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ Ｃａｎｃｅｒ．２０１４ Ｍａｙ １３；２：１２に記載）、ポリアルギニン（ｐｏｌｙＲ）等のポリカチオン性ペプチド又は少なくとも２つのＬｙｓＬｅｕＬｙｓモチーフ、特にＫＬＫＬＬＬＬＬＫＬＫを含むペプチド（ＷＯ０２／３２４５１に記載）、非メチル化シトシン－グアニンジヌクレオチドを含む免疫刺激性オリゴデオキシヌクレオチド（ＣｐＧ ＯＤＮ）、例えば、ＣｐＧ １０１８（Ｄｙｎａｖａｘ）（例えば、ＷＯ９６／０２５５５に記載）、又はポリＩＣ等のイノシン及びシチジンに基づくＯＤＮ（Ｉ－ＯＤＮ）（例えば、ＷＯ０１／９３９０３に記載）、又はデオキシ－イノシン及び／又はデオキシウリジン残基を含むデオキシ核酸（ＷＯ０２／９５０２７に記載）、特にオリゴ（ｄＩｄＣ）_１３系アジュバントＩＣ３１（登録商標）（Ｖａｌｎｅｖａ ＳＥ）（ＷＯ２００４／０８４９３８及びＯｌａｆｓｄｏｔｔｉｒ ｅｔ ａｌ．２００９．Ｓｃａｎｄ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．６９（３）：１９４－２０２に記載）、神経活性化合物、特にヒト成長ホルモン（ＷＯ０１／２４８２２に記載）、ケモカイン（例えば、ディフェンシン１若しくは２、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ１－α、ＭＩＰ－２、インターロイキン－８、又はサイトカイン（例えば、インターロイキン－１β、－２、－６、－１０若しくは１２；インターフェロン－γ；腫瘍壊死因子－α；又は顆粒球－単球－コロニー刺激因子）、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）バリアント、細菌毒素の非毒性バリアント、ＱＳ－２１（Ａｎｔｉｇｅｎｉｃｓ Ｉｎｃ．）、Ｑｕｉｌｌ Ａ、Ｓａｒｋａｒ ｅｔ ａｌ．（２０１９）に記載されるＭＴＰ－ＰＥ及び他、並びにＡＦ０３、ＡＳ０１、ＡＳ０３及びＡＳ０４等のアジュバントシステム（Ｇｉｕｄｉｃｅ ｅｔ ａｌ．２０１８．Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ３９：１４－２１）が挙げられる。通常、適切なアジュバントの選択は、特定のワクチンに望ましいＢ細胞又はＴ細胞免疫応答の種類に依存する（Ｓａｒｋａｒ ｅｔ ａｌ．（２０１９）Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｄｊｕｖａｎｔｓ ｆｏｒ ｖａｃｃｉｎｅｓ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐａｔｈｏｇｅｎｓ．Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ Ｖａｃｃｉｎｅｓ １８（５）：５０５－５２１）。一般に、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、及びＴＬＲ９受容体を介して免疫学的シグナルを伝達するアジュバントは、Ｔｈ１バイアス免疫を促進し、ＴＬＲ２／ＴＬＲ１、ＴＬＲ２／ＴＬＲ６、及びＴＬＲ５を介したシグナル伝達は、Ｔｈ２バイアス免疫を促進する。例えば、ＣｐＧ ＯＤＮ、ポリＩＣ及びＭＰＬのようなアジュバントは、Ｔｈ１応答を主に誘導し、ミョウバンは、Ｔｈ２応答の強力な誘導剤であり、一方、ＭＦ５９（登録商標）、ＡｄｄａＶａｘ（商標）、及びＩＣ３１（登録商標）は、Ｔｈ１及びＴｈ２の混合応答を誘導する。本発明のワクチンにおいて有用な好ましいアジュバントは、限定されないが、ＣｐＧ１０１８（Ｄｙｎａｖａｘ）、ポリＩＣ、ＩＣ３１（登録商標）（Ｖａｌｎｅｖａ）、ＭＦ５９（登録商標）（Ｓｅｑｉｒｕｓ）、ＡｄｄａＶａｘ（商標）、ＡＳ０３（ＧＳＫ）、ＡＳ０１（ＧＳＫ）若しくはＱＳ２１（Ｐｆｉｚｅｒ）、又はそれらの組み合わせ等のミョウバン、ＣｐＧ ＯＤＮから選択され得る。本発明で特に有用なアルミニウムアジュバントは、水性免疫原性組成物の重量に基づいて、３５０ｐｐｂ未満の重金属（Ｃｕ、Ｎｉ、Ｗ、Ｃｏ、Ｏｓ、Ｒｕ、Ｃｄ、Ａｇ、Ｆｅ、Ｖ、Ｃｒ、Ｐｂ、Ｒｂ及びＭｏ等）、特に１．２５ｐｐｂ未満の銅（特に、Ｃｕ^＋又はＣｕ^２＋）を含む水性免疫原性組成物を提供するアルミニウム塩である。いくつかの実施形態において、アルミニウムアジュバント、特に１．２５ｐｐｂを超えるクーパー（ｃｏｏｐｅｒ）又は３５０ｐｐｂを超える重金属を含むアルミニウムアジュバントは、十分な量で、特に免疫原性組成物中に少なくとも１０ｍｍｏｌ／ｌの濃度で存在するＬ－メチオニン等のラジカルクエンチング化合物と組み合わせて使用されてもよい。いくつかの実施形態において、アルミニウムアジュバントを含む免疫原性組成物は、酸化還元活性化合物、ラジカル構築化合物、安定化化合物、及びそれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される反応性化合物を更に含んでもよく、特に、反応性化合物は、ホルムアルデヒド、エタノール、クロロホルム、トリクロロエチレン、アセトン、トリトンＸ－１００、トリトンＸ－１１４、デオキシコール酸塩、ジエチルピロカーボネート、亜硫酸塩、Ｎａ_２Ｓ_２Ｏ_５、ベータプロピオラクトン、ポリソルベート、例えば、Ｔｗｅｅｎ ２０（登録商標）、Ｔｗｅｅｎ ８０（登録商標）、Ｏ_２、フェノール、プルロニツク型コポリマー、及びそれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される。アジュバントは、１つの免疫原性組成物中に抗原とともに製剤化されてもよいか、又は抗原と同じ経路又は異なる経路のいずれかによって別々に投与されてもよい。

【0054】

いくつかの実施形態において、本明細書に開示される免疫原性組成物（又はワクチン）は、１つ以上の追加の抗原、好ましくはｈＭＰＶに由来するウイルスタンパク質、例えば別のＦタンパク質又は異なるｈＭＰＶタンパク質を含み得る。おそらく、追加のｈＭＰＶタンパク質をＦタンパク質ベースのワクチンに含めることで、改善された（よりバランスのとれた、かつ堅牢な）免疫応答をもたらすことができる。異なるｈＭＰＶタンパク質の中でも、Ｍタンパク質は、体液性及び細胞性免疫応答（特にＴｈ１／Ｔｈ２バランス）を調節することができ、それによって、Ｍタンパク質がＦタンパク質と組み合わされたときにマウスにアジュバント効果をもたらすことができるものとして記載されている（Ａｅｒｔｓ ｅｔ ａｌ．２０１５．Ａｄｊｕｖａｎｔ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｍｅｔａｐｎｅｕｍｏｖｉｒｕｓ （ＨＭＰＶ） ｍａｔｒｉｘ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ＨＭＰＶ ｓｕｂｕｎｉｔ ｖａｃｃｉｎｅｓ．Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．９６（Ｐｔ４）：７６７－７７４）。したがって、一実施形態において、本明細書に記載される免疫原性組成物は、ワクチンによって付与される防御を高めるための組換えｈＭＰＶ Ｍタンパク質を含む。組換えＭタンパク質は、配列番号４１のアミノ酸配列若しくはその断片、又は親Ｍタンパク質に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するそのバリアントを含み得る。好ましくは、本発明の組換えＭタンパク質は、配列番号４１のアミノ酸配列からなる。

【0055】

追加のｈＭＰＶタンパク質は、表面糖タンパク質Ｇ又は小さな疎水性タンパク質ＳＨであり得る。Ｇ及びＳＨタンパク質に対して誘導された抗体は、動物モデルにおいてｈＭＰＶ感染から防御しないという事実にもかかわらず（Ｓｋｉｄｏｐｏｕｌｕｓ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｍｅｔａｐｎｅｕｍｏｖｉｒｕｓ Ｆ，Ｇ，ａｎｄ ＳＨ ｓｕｒｆａｃｅ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ ｔｏ ｔｈｅ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｉｔｙ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３４５：４９２－５０１、Ｒｙｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，（２０１０）Ｓｏｌｕｂｌｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ｍｅｔａｐｎｅｕｍｏｖｉｒｕｓ Ｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｓ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ ｂｕｔ ｎｏｔ ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ．Ｖａｃｃｉｎｅ ２８（２５）：４１４５－４１５２）、これらの抗原がヒトにおける防御に寄与することができることが示唆され得る。更に、これらのタンパク質の遺伝子型Ａと遺伝子型Ｂとの間の高度な遺伝的多様性は免疫学的予防のために重要となり得るため、両方の遺伝子型がワクチンに示される必要がある。

【0056】

いくつかの実施形態において、追加の抗原は、ＲＳＶ（呼吸器合胞体ウイルス）、ＰＩＶ３（パラインフルエンザウイルス３型）、インフルエンザウイルス又はコロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ＭＥＲＳ等）等の呼吸器感染を引き起こす別のウイルスに由来し得る。例えば、追加の抗原は、ＲＳＶ Ｆタンパク質、ＰＩＶ３Ｆタンパク質、インフルエンザヘマグルチニン又はコロナウイルスＳタンパク質であり得る。そのような免疫原性組成物（ワクチン）は、１つより多くのウイルスに対して防御的であり、呼吸器感染に対する組み合わせワクチンを意味する。

【0057】

更なる実施形態において、本発明の組成物は、少なくとも２つの免疫原性ｈＭＰＶ Ｆタンパク質、特に、融合前コンフォメーションで利用可能な２つのＦタンパク質の組み合わせを含む免疫原性組成物又はワクチンである。典型的には、免疫原性組成物又はワクチンは、免疫原性タンパク質に対する抗原特異的免疫応答を誘発することができる。免疫応答は、体液性、細胞性、又はその両方であり得る。体液性応答は、免疫原性組成物への曝露時に、哺乳動物宿主によるＦタンパク質特異的抗体の産生をもたらす。Ｆタンパク質特異的抗体は、活性化Ｂ細胞によって産生される。中和抗体の産生は、特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化に依存する。加えて、ｈＭＰＶ感染に対する防御は、ＣＤ４＋Ｔ細胞と相乗的に協働するＣＤ８^＋Ｔ細胞（ＣＴＬ応答）を使用し得るという証拠がある（Ｋｏｌｌｉ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｔ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅ ｔｏ Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ａｎｄ Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｈｕｍａｎ Ｍｅｔａｐｎｅｕｍｏｖｉｒｕｓ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＶＩＲＯＬＯＧＹ，Ｓｅｐｔ．２００８，ｐ．８５６０－８５６９）。したがって、本発明の免疫原性組成物又はワクチンは、対象に投与されたときに、ｈＭＰＶ Ｆタンパク質に対する測定可能なＢ細胞応答（抗体の産生等）及び／又はｈＭＰＶウイルスに対する測定可能なＣＴＬ応答を誘導する。

【0058】

本発明によれば、免疫原性組成物は、Ｆタンパク質の両方のコンフォメーション、すなわち融合前融合に対する抗体を誘発することができる。好ましくは、抗Ｆタンパク質抗体は、任意の（又は両方の）コンフォメーションで存在する天然Ｆ抗原を妨害し、ウイルスを不活性化することができる中和抗体である。最も好ましくは、免疫した対象において誘導される中和抗体応答は、ｈＭＰＶ感染と戦うのに十分である。中和抗体応答は、ＥＬＩＳＡ及び／又はＰＲＮＴ及び／又はＭＮＡ方法又は当該技術分野で既知の任意の他の方法によって血清中で測定され得る。

【0059】

更に、融合前及び融合後コンフォメーションの２つのＦタンパク質を含む組成物に対して産生された免疫応答（例えば、中和抗体価）は、本明細書に開示される組み合わせを含む組成物と同じ量で使用される単一の（融合前）Ｆタンパク質を含む組成物によって誘発される免疫応答（中和抗体価）よりも優れている。更に、１つの組成物中に２つの免疫原性Ｆタンパク質を組み合わせることによる相乗効果によって、免疫原性組成物（又はワクチン）を単一のＦタンパク質組成物（又はワクチン）よりも強力にし、治療又は予防投与量を減少させることができる。

【0060】

一実施形態において、免疫原性組成物又はワクチンは、投与時の対象における対照と比較して、ｈＭＰＶ感染に関連する症状の重症度を軽減すること、及び／又はウイルス量を減少させることができる。別の実施形態において、免疫原性組成物又はワクチンは、ｈＭＰＶ感染を軽減又は予防することができる。好ましい実施形態において、本発明の免疫原性組成物又はワクチンは、免疫した哺乳動物対象をｈＭＰＶ感染から防御することができる。

【0061】

更に、本発明の免疫原性組成物は、１つより多くのｈＭＰＶ株、特に異なるｈＭＰＶサブグループ又は遺伝子型に対する防御を提供することができる。一実施形態において、免疫原性組成物は、遺伝子型Ａのウイルスに対する防御を提供することができる。更に一実施形態において、免疫原性組成物は、遺伝子型Ｂのウイルスに対する防御を提供することができる。好ましい実施形態では、本明細書に記載の免疫原性組成物は、Ａ及びＢの両方の遺伝子型に対して防御的である。特定の実施形態において、免疫原性組成物は、Ａ１及び／又はＡ２ａ／Ａ２ｂサブグループに対して、代替的に、Ｂ１及び／又はＢ２サブグループに対して、又はＡ及びＢの両方の遺伝子型に対する防御を提供することができる。好ましい実施形態において、遺伝子型Ａと遺伝子型Ｂとの間の交差防御が実行可能である。

【0062】

更なる実施形態において、本発明は、本明細書に開示される免疫原性組成物又はワクチンと、異なるｈＭＰＶワクチン又は別の呼吸器ワクチン、例えば、抗ＲＳＶ、ＰＩＶ３、インフルエンザ又はコロナウイルス（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ＭＥＲＳ等）ワクチンとの組み合わせを含む。特に、組み合わせは、組換えｈＭＰＶ融合前／融合後Ｆタンパク質と、別のサブユニットのｈＭＰＶワクチン、又は全ウイルス若しくはＶＬＰ粒子に基づくｈＭＰＶワクチンとを含むｈＭＰＶワクチンを含み得る。更に、組み合わせは、本明細書に開示される組換えｈＭＰＶ Ｆタンパク質ワクチン及びＲＳＶワクチン、又は組換えｈＭＰＶ Ｆタンパク質ワクチン及びＰＩＶ３ワクチン、又は組換えｈＭＰＶ Ｆタンパク質ワクチン及びインフルエンザワクチン、又は組換えｈＭＰＶ Ｆタンパク質ワクチン及びコロナウイルス（特に、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）ワクチンを含み得る。好ましくは、組み合わせは、本明細書に開示される組換えｈＭＰＶ Ｆタンパク質ワクチン及び組換えＲＳＶ Ｆタンパク質ワクチンを含む。一実施形態において、組み合わせは、同じ又は異なる経路によって同時に又は後に投与される別個のワクチン製剤の組み合わせとして理解される。別の実施形態において、２つのワクチンは、単一の製剤に組み合わせられる。

【0063】

別の実施形態において、本明細書に開示される免疫原性組成物は、特に哺乳動物対象における治療及び／又は予防のために、特にｈＭＰＶ感染と関連付けられる又は関連する疾患との関連で、薬物又はワクチンとして使用され得る。したがって、本明細書に記載される免疫原性組成物（又はワクチン）は、治療有効量で対象に投与される。治療有効量は、障害又は疾患の症状及び／又は根底にある原因を予防、治療（予防を含む）、軽減及び／又は緩和するのに十分な、例えば、ｈＭＰＶ感染を予防、阻害及び／又は治療するのに十分な、開示される免疫原又は免疫原性組成物の量である。いくつかの実施形態において、治療有効量は、ｈＭＰＶ感染等の疾患の症状を軽減又は排除するのに十分である。例えば、これは、ウイルス複製を阻害若しくは防止するため、又はウイルス感染の表面的な症状を測定可能に変化させるために必要な量であり得る。一般に、この量は、ウイルスの複製又は感染性を測定可能に阻害するのに十分な量である。典型的には、所望の免疫応答は、ｈＭＰＶ感染を阻害、軽減、又は予防する。一実施形態において、方法が有効であるために、感染が完全に排除、軽減、又は予防される必要はない。例えば、治療有効量の薬剤の投与は、好適な対照と比較して、例えば、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は更には１００％感染を低下させることができる（細胞の感染、又は感染した対象の数若しくは割合によって測定される）。別の実施形態では、検出可能なｈＭＰＶ感染の完全な排除又は予防が望ましい。更なる標的適応は、ｈＭＰＶ感染によって引き起こされる軽度の呼吸器疾患、重度の呼吸器疾患、入院及び／又は死亡からなる群から選択される。

【0064】

本明細書に開示される医薬組成物（又はワクチン）は、当業者に既知の任意の手段及び経路によって投与され得る。いくつかの実施形態において、組成物（ワクチン）は、注射による非経口投与のために製剤化され得る。本明細書で使用される場合、「非経口」投与は、限定されないが、皮下、皮内、静脈内、筋肉内、関節内、髄腔内、又は注入によるものを含む。いくつかの実施形態において、組成物は粘膜（鼻腔内又は経口）投与のために製剤化され得る。注射用製剤は、単位剤形、例えば、アンプル又は多用量容器において、添加される防腐剤とともに提示されてもよい。

【0065】

ｈＭＰＶに対する防御免疫応答を得るためには、免疫原性組成物の複数回投与が必要であり得ることを理解されたい。したがって、治療有効量は、以前の又は後続の投与と組み合わせて、防御免疫応答を達成することに寄与する分画用量を包含する。例えば、治療有効量の薬剤は、治療過程（プライム・ブーストワクチン接種レジメン等）の間に、例えば毎日、単回用量で又は数回用量で投与することができる。しかしながら、治療有効量は、治療される対象、治療される状態の重症度及びタイプ、並びに投与様式に依存し得る。薬剤の単位剤形は、治療量で、又は治療量の倍数で、例えば、バイアル（例えば、貫通可能な蓋を有する）又は無菌成分を有するシリンジに包装することができる。

【0066】

本発明によれば、最適な所望の応答を提供するために、投与レジメンを調整する必要がある。一般に、予防的及び／又は治療的治療のための本明細書に開示される組成物の有効用量は、投与手段、標的部位、患者の生理学的状態、年齢、患者がヒトであるか非ヒトであるか、投与される他の薬物、治療が予防的であるか治療的であるか等を含む多くの異なる要因に応じて変化し得る。本発明によれば、単位用量中のＦタンパク質の量は、約０．０１μｇ～約１００ｍｇの広い範囲内のいずれかであり得、特に、本発明の組成物は、約１μｇ～約１０ｍｇ、特に約１０μｇ～約１ｍｇの範囲の量で投与され得る。好ましくは、抗原製剤の投与量は、安全性及び有効性を最適化するために滴定される必要がある。

【0067】

更なる実施形態において、本発明は、治療有効量の免疫原性組成物を必要とする対象に投与することを含む、対象において抗ｈＭＰＶ免疫応答を生成するための方法を提供する。方法は、ｈＭＰＶ感染又は関連疾患から上記対象を防御するために、Ｆタンパク質特異的抗体を産生するためのＢ細胞、及びサイトカイン産生Ｔヘルパー細胞を刺激することを含む。ある場合には、そのような方法は、免疫原性組成物のプライム・ブースト投与を含み得る。他の場合、そのような方法は、本発明の免疫原性組成物のブースト投与を含み得る。ブースター効果は、哺乳動物宿主が後に同じ又は同様の免疫原性組成物に曝露されたときの、免疫原性組成物に対する免疫応答の増加を指す。例えば、プライミングは、遺伝子型ＡのＦタンパク質を含む組成物の投与を含み、ブーストは、遺伝子型ＢのＦタンパク質を含む組成物の投与を含み、逆もまた同様である。代替的に、プライム・ブースト免疫は、同じ組成物（相同ブースティング）、特に、遺伝子型Ａ及びＢの両方のＦタンパク質を含む混合組成物を用いる。

【0068】

更なる実施形態において、本開示は、対象におけるｈＭＰＶ感染を治療及び／又は予防するための方法であって、対象に治療有効量の免疫原性組成物を投与して中和抗体を生成し、１つの遺伝子型Ａ又はＢのｈＭＰＶに対する、好ましくは両方の遺伝子型Ａ及びＢのｈＭＰＶに対する防御を提供することを含む、方法を提供する。

【0069】

更なる実施形態では、本開示は、本発明で用いられるワクチンを含む医薬（免疫原性）組成物を生成するための方法を提供する。方法は、ｉ）宿主細胞内の発現ベクターに挿入された対応する核酸分子から組換え融合前又は融合後Ｆタンパク質を発現させること、ｉｉ）組換えＦタンパク質を精製すること、及びｉｉｉ）精製された組換えタンパク質を、薬学的に許容される担体及び／又は賦形剤、任意選択的にアジュバントと組み合わせることを含む。

【0070】

ワクチンを含む、本発明の薬学的（免疫原性）組成物は、周知の方法及び当技術分野で日常的に実施される方法に従って生成することができる（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．２０ｔｈ ｅｄ．２０００、及び米国疾病管理予防センターからのワクチンの原料に関するファクトシート、例えば、アジュバント、エンハンサー、防腐剤、及び安定剤を参照されたい）。本明細書に開示される組成物は、好ましくは、ＧＭＰ条件下で製造される。ワクチンを含む、本発明の組成物は、当業者に既知の従来の方法によって薬学的に許容される剤形に製剤化される。

【0071】

本発明は、その適用において、以下の説明に示される、又は図面に示される構成の詳細及び構成要素の配置に限定されない。本発明は、他の実施形態であることが可能であり、様々な方法で実施又は実行されることが可能である。また、本明細書で使用される表現及び専門用語は、説明を目的とし、限定するものとみなされるべきではない。本明細書における「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、又は「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「関与する（ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ）」、及びそれらの変形例の使用は、その後に列挙される項目及びその等価物、並びに追加の項目を包含することを意味する。

【0072】

本開示の方法及び技術は、別段の指示がない限り、概して、当該技術分野で周知の従来の方法に従って、また本明細書全体を通して引用及び議論される様々な一般的及びより具体的な参考文献に記載されるように行われる。本明細書に記載されるものと同様又は同等の任意の方法及び材料を本発明の実施に使用することができるが、好ましい方法及び材料を本明細書に記載する。

【0073】

本発明は、以下の実施例、図、表、及び配列表によって更に示され、それらから更なる特徴、実施形態、及び利点が理解され得るが、それは決して更なる限定として解釈されるべきではない。

【実施例】

【0074】

実施例１：組換え融合前及び融合後Ｆタンパク質の産生
株
天然ｈＭＰＶ Ｆタンパク質は、配列番号１～１０の配列、又はその断片若しくはバリアントによって表される任意のｈＭＰＶ株及び任意の血清型から選択することができる。特定の実施形態において、ｈＭＰＶ Ｆタンパク質は、配列番号１で表される株ＮＬ／１／００、遺伝子型Ａ、サブグループＡ１、配列番号２で表される株ＴＮ／９４－４９、遺伝子型Ａ、サブグループＡ２ａ、配列番号４で表される株ＮＣＬ１７４、遺伝子型Ａ、サブグループＡ２ｂ、配列番号９で表される株Ｃ１－３３４、遺伝子型Ｂ、サブグループＢ１、又は配列番号４９で表される株ＣＡＮ９７／８２、遺伝子型Ｂ、サブグループＢ１、及び配列番号１０で表される株ＴＮ／９８－５１５、遺伝子型Ｂ、サブグループＢ２に由来する。

【0075】

発現ベクター
クローニングに使用したプラスミドｐＶＶＳ １３７１は、以下を含有する：
－ニワトリβ－グロビン遺伝子座からのＨＳ４インスレーター配列、
－２つのＣＭＶプロモーター、
－ヒトβ－グロビン遺伝子の第１イントロンからの５’ドナー部位、並びに免疫グロブリン遺伝子重鎖可変領域のイントロンからの分岐点及び３’アクセプター部位から構成される、ＣＭＶプロモーターの下流の２つのキメライントロン。ドナー部位及びアクセプター部位の配列を、分岐点部位とともに、スプライシングのためのコンセンサス配列と一致するように適合させた。イントロンは、ｃＤＮＡ配列内の可能性のある隠れた５’ドナースプライス部位の使用を阻止するために、ｃＤＮＡ挿入断片の上流に位置する。
－ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル配列（ｂＧＨ Ａ）、
－ＳＶ４０エンハンサー及び初期プロモーター領域の調節下にあるＴｎ５由来のネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子、
－単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ遺伝子のＨＳＶ ＴＫポリアデニル化シグナルは、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子の下流に位置する、
－細菌プロモーターの制御下にあるカナマイシン耐性遺伝子、並びに
－複製のｐＵＣ起点。

【0076】

野生型Ｆタンパク質のコード配列を、ｈＭＰＶ株ＮＬ／１／００、サブグループＡ１から単離し、ＣＨＯ細胞における発現のためにコドン最適化した。ＣＨＯ細胞における一過性又は安定なタンパク質発現のために、野生型及び改変Ｆタンパク質のコード配列をｐＶＶＳ１３７１プラスミドにクローニングした。

【0077】

簡潔に述べると、制限部位ＳａｌＩ及びＰａｃＩを使用して、ｐＶＶＳ１３７１ベクターのキメライントロンとポリアデニル化部位ｂＧＨとの間にコード配列をクローニングした。ベクター及び合成したコード配列（合成はＧｅｎｅＡｒｔによって行われた）を、ＳａｌＩ及びＰａｃＩで消化した後、アガロースゲル上で精製した。断片をＴ４ ＤＮＡリガーゼでライゲーションし、ライゲーション産物を使用してＭＡＸ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ＤＨ５αコンピテント細胞を形質転換した。選択したクローンを、配列解析によって設計した変異について調べた。

【0078】

ＣＨＯ細胞における発現
タンパク質発現は、ＭａｘＣｙｔｅ（登録商標）ＳＴＸ Ｓｃａｌａｂｌｅ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍデバイスを使用し、供給業者の実験的推奨に従い、ＣＨＯ細胞の一過性トランスフェクションに基づいていた。簡潔に述べると、エレクトロポレーションの前に、ＣＨＯ細胞をペレット化し、ＭａｘＣｙｔｅ（登録商標）エレクトロポレーション緩衝液に懸濁し、対応する発現プラスミドＤＮＡと混合した。細胞－ＤＮＡ混合物をカセット処理アセンブリに移し、ＭａｘＣｙｔｅ（登録商標）ＳＴＸ Ｓｃａｌａｂｌｅ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍにロードした。デバイスにプレロードされた「ＣＨＯ」プロトコルを使用して細胞をエレクトロポレーションし、直ちに培養フラスコに移し、８％のＣＯ_２とともに３７℃で３０～４０分間インキュベートした。回復期間後、細胞をＥＸ－ＣＥＬＬ ＡＣＦ ＣＨＯ培地（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）に高密度で再懸濁した。エレクトロポレーション後の細胞培養は、８％ＣＯ_２及び軌道振盪を用いて３７℃で行った。

【0079】

産生動態は、培養温度を３２℃に低下させること、及びＣＨＯ細胞における一過性タンパク質発現のために開発された流加バッチ培地（ＣＨＯ ＣＤ ＥｆｆｉｃｉｅｎｔＦｅｅｄ（商標）Ａ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、酵母酢酸塩、グルコース及びｇｌｕｔａＭａｘを補充）を毎日トランスフェクト細胞に供給することからなる。約７～１４日間の培養後、細胞生存率を確認し、最大速度で１０分間の２回の遠心分離に対応する細胞浄化後に馴化培地を回収した。浄化した生成物を０．２２μｍの滅菌膜を通して濾過し、タンパク質精製まで－８０℃で保存した。

【0080】

細胞内免疫染色によるタンパク質の検出
トランスフェクション後７日目に、細胞をＰＢＳ中で１回洗浄し、室温の４％パラホルムアルデヒド中で１０分間固定した。固定した細胞を室温で１５分間、ＢＤ Ｐｅｒｍ洗浄液中で透過処理し、ＢＤ Ｐｅｒｍ洗浄液に希釈した一次抗体とともに４℃で１時間インキュベートした。最後に、蛍光マーカーに結合した二次抗体を４℃で１時間添加し、フローサイトメトリー（ＭａｃｓＱｕａｎｔ Ａｎａｌｙｚｅｒ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）による分析まで４℃のＰＢＳ中に保存した。一次抗体として、ｈＭＰＶ Ｆタンパク質の融合前コンフォメーションを特異的に認識するＭＰＥ８ Ｎ１１３Ｓ抗体（ＰＲＯ－２０１５－０２６－０１）、又は融合前及び融合後の両方のｈＭＰＶ Ｆタンパク質を認識するＤＳ７ ＩｇＧ１抗体（ＰＲＯ－２０１６－００３）が使用された。蛍光ＦＩＴＣ標識二次抗体は、ヤギ抗マウスＩｇＧ＋ＩｇＭ（ＪＩＲ １１５－０９６－０６８）であった。

【0081】

タンパク質の精製
凍結した上清を室温にし、標準グレードの再生セルロース透析膜Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ（登録商標）１－７ＣＲ（ＭＷＣＯ：３．５ｋＤａ）（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ）を用いてＰＢＳに対して透析した。続いて、５０ｍＭ Ｎａ_２ＨＰＯ_４緩衝液（ｐＨ８．０）、３００ｍＭ ＮａＣｌで平衡化し、固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）、続いてゲル濾過クロマトグラフィーを使用してタンパク質の精製を行った。

【0082】

ＩＭＡＣのために、Ｎｉ^２＋（Ｈｉｓ ＧｒａｖｉＴｒａｐ）を含有するアガロース樹脂が製造業者（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によってクロマトグラフィーカラムに充填された。樹脂を２体積の脱イオン水で洗浄し、製造業者によって支持されるように、３体積の平衡化及び洗浄緩衝液（０．５Ｍ塩化ナトリウム及び２０ｍＭイミダゾールを含む２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４）で平衡化した。試料をロードした後、カラムを１０ｍＬの洗浄緩衝液で洗浄した。Ｈｉｓタグ付きタンパク質を、製造業者によって示されるように、３～１０カラム体積の溶出緩衝液（０．５Ｍ塩化ナトリウム及び５００ｍＭイミダゾールを含む５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ８．０）を使用してカラムから溶出した。次いで、溶出液を０．２２μｍフィルターで濾過し、Ｓｌｉｄｅ－Ａ－Ｌｙｚｅｒ（商標）カセットで保存緩衝液（５０ｍＭ Ｎａ_２ＨＰＯ_４、３００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）に対して２回透析した後、アリコートに分けて、－２０℃で保存した。組換えタンパク質の純度、サイズ及び凝集の解析を、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥ－ＨＰＬＣ）によって行い、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ ＳＥ－ＨＰＬＣ（Ｓｈｉｍａｄｚｕ）をＳＵＰＥＲＤＥＸ２００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）カラム上で実行した。

【0083】

実施例２：組換えｈＭＰＶ Ｆタンパク質のコンフォメーション
サンドイッチＥＬＩＳＡによるコンフォメーションプロファイルの決定
中ビンジング（ｂｉｎｇｉｎｇ）プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ）を２００ｎｇ／ウェルのヒトＩｇＧ１ ＤＳ７捕捉抗体（Ｗｉｌｌｉａｍｓ ｅｔ ａｌ．，２００７）でコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。水で３回洗浄した後、攪拌下でＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０及び５％脱脂粉乳（飽和緩衝液）を用いて、３７℃で２時間プレートを飽和させた。液体をウェルから除去し、水で３回洗浄した後、プレートを、飽和緩衝液に希釈した精製された目的のタンパク質（２．５ｎｇ／ウェル）とともに３７℃で１時間インキュベートした。洗浄後、融合前ｈＭＰＶ Ｆタンパク質に対するマウス抗体ＭＰＥ８ Ｎ１１３Ｓ（Ｃｏｒｔｉ ｅｔ ａｌ．，２０１３）又は融合後ｈＭＰＶ Ｆタンパク質に対するマウス抗体ＭＦ１（Ｍｅｌｅｒｏ、私信）の飽和緩衝液中の５倍段階希釈液を３７℃で１時間インキュベートした。次いで、ペルオキシダーゼＨＲＰヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｃｏｖａｌａｂ、実験番号０２５２）で標識した二次α－Ｉｇ種特異的抗体、続いて５０μＬのペルオキシダーゼ基質（ＴＭＢ、Ｓｉｇｍａ）を用いて、３７℃で１時間インキュベートすることによって免疫複合体を検出した。３Ｎ Ｈ_２ＳＯ_４を添加することにより比色反応を停止し、分光光度計（ＭｕｌｔｉＳｋａｎ）を用いて４９０ｎｍで各ウェルの吸光度を測定した。

【0084】

実施例３：免疫原性試験
マウスにおける免疫原性
５～１０匹のＢＡＬＢ／ｃマウスの群を、アジュバントを用いて又は用いずに、２週間又は３週間の間隔（例えば、０日目、１４日目、２１日目、及び２８日目又は４２日目）で、マウス１匹当たり０．０２～６．０μｇの量の、単独で又は異なる組み合わせで使用される組換え融合前及び融合後Ｆタンパク質で皮下免疫した。最後の免疫の１～４週間後、後眼窩採血により血液を採取し、血清を調製した。免疫応答の評価は、以下に記載するように間接ＥＬＩＳＡによって行った。

【0085】

サブクラスＩｇＧ ＥＬＩＳＡ
組換えＦタンパク質を炭酸塩／重炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．６）に希釈し、ウェル当たり５０ｎｇのタンパク質を９６ウェルの高結合プレートに添加した（５０μＬ／ウェル、Ｇｒｅｉｎｅｒ）。プレートを４℃で一晩インキュベートした。１５０μＬのＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０及び５％乾燥脱脂乳（飽和緩衝液）を用いて、室温で３０分間ウェルを飽和させた。液体をウェルから除去し、プレートを、飽和緩衝液中の異なる希釈率（５倍段階希釈）の免疫マウスの血清（５０μＬ／ウェル）とともに室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０で３回洗浄した後、ペルオキシダーゼで標識した５０μｌの二次抗ＩｇＧ_１又はＩｇＧ_２ａマウス特異的抗体、続いて５０μＬのペルオキシダーゼ基質（ＴＭＢ、Ｓｉｇｍａ）を用いて室温で１時間インキュベートすることによって免疫複合体を検出した。オルトリン酸を添加することにより比色反応を停止し、分光光度計（ＭｕｌｔｉＳｋａｎ）を用いて４９０ｎｍで各ウェルの吸光度を測定した。読み出しとして、特定の抗体価を評価するためにＩＣ_５０値を算出した。

【0086】

実施例４：中和抗体の誘導
中和アッセイ
簡潔に述べると、マイクロ中和アッセイ（ＭＮＡ）を使用して、対照血清／抗体と比較してｈＭＰＶウイルスプラークの数を５０％減少させるために必要な免疫対象の血清／抗体力価を決定した（ＭＮＡ_５０）。ｈＭＰＶに感染させることができる細胞の単層を使用することによりＭＮＡ_５０を実施した。対象からの血清を希釈し、生ｈＭＰＶウイルスとともにインキュベートした。ウイルス感染は、ＨＲＰ標識抗Ｆタンパク質特異的モノクローナル抗体を使用して決定した。ＰＲＮＴ_５０／ＭＮＡ_５０における血清の１：１０希釈の中和抗体の閾値は、防御の証拠として一般に受け入れられた（Ｈｏｍｂａｃｈ ｅｔ ．ａｌ．２００５．Ｖａｃｃｉｎｅ ２３：５２０５－５２１１）。中和抗体は、防御免疫が確立されたことを示す最良の証拠を提供し、中和の生物学的アッセイは、防御との相関を示す（Ｈｏｍｂａｃｈ ｅｔ ａｌ．，２００５）。

【0087】

免疫及びチャレンジのプロトコル
以前に記載されたように（Ｗｉｌｌｉａｍｓ ｅｔ ａｌ．２００５．Ｔｈｅ ｃｏｔｔｏｎ ｒａｔ（Ｓｉｇｍｏｄｏｎ ｈｉｓｐｉｄｕｓ）ｉｓ ａ ｐｅｒｍｉｓｓｉｖｅ ｓｍａｌｌ ａｎｉｍａｌ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｍｅｔａｐｎｅｕｍｏｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ，ａｎｄ ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｉｔｙ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７９：１０９４４－１０９５１）ＬＬＣ－ＭＫ２細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ－７）で増殖させたＡ１（ＮＬ／１／００株）、Ａ２（ＴＮ／９４－４９株）、Ｂ１（Ｃ１－３３４株）又はＢ２（ＴＮ／８９－５１５株）サブグループのｈＭＰＶウイルスを、動物チャレンジ実験に使用した。

【0088】

ＢＡＬＢ／ｃマウスを、前述のように、アジュバント化した組換えＦタンパク質で２週間間隔で３回免疫し、免疫後２週間目に、約１×１０^６ｐｆｕのｈＭＰＶで鼻腔内チャレンジを行う。４～５日後、動物を屠殺し、個々の血清試料を採取して凍結した。ウイルス量を測定するために、肺組織試料を採取し、秤量し、１ｍＬの培地中で均質化した。肺組織のウイルス量は、以下に記載されるように、ウイルスフォーカスの免疫染色によって決定した。代替的又は追加的に、ＲＴ－ｑＰＣＲを使用して肺のウイルス量を決定した。

【0089】

ＭＮＡプロトコル
１日目に、２％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）及び１％の抗生物質－抗真菌剤（Ａｎｔｉ－Ａｎｔｉ）を含有するＯｐｔｉＭＥＭで増殖させたＬＬＣ ＭＫ２細胞を、２×１０^５細胞／ｍＬ（１００μＬ／ウェル）の密度で平底９６ウェルプレートに播種し、３７℃／５％ＣＯ_２で一晩インキュベートした。０日目に、血清試料を、Ｕ底９６ウェルプレート中の１００μＭ ＣａＣｌ_２及び１％のＡｎｔｉ－Ａｎｔｉを含有するＯｐｔｉＭＥＭに希釈した。試料希釈液は、後にウイルスと１：１で混合されるため、２倍濃度の希釈液を調製する必要がある。ウイルスを含まない対照ウェルには、２倍濃度のウイルス希釈液の代わりに培地を添加した。トリプシン非依存性株であるｈＭＰＶ Ａ１ウイルスの希釈液を、実験設定に従って、Ｕ底９６ウェルプレート中の１００μＭ ＣａＣｌ_２及び１％のＡｎｔｉ－Ａｎｔｉを含有するＯｐｔｉＭＥＭ中で調製した。ウイルス希釈液は、後に希釈した血清試料と１：１で混合されるため、ウイルス試料を２倍濃度で調製した（例えば、１２０ｐｆｕ／６０μＬ）。ブランクウェルには培地を充填する。ｈＭＰＶ Ｂ１ウイルス及び他の全てのトリプシン依存性ｈＭＰＶ株については、血清濃度に応じて８～５０ｍｒＰｕ／ｍＬの範囲で、感染を助けるためにトリプシン（すなわち、ＴｒｙｐＬＥ）を培地に添加する。中和のために、等体積（６０μＬ）の血清希釈液及びウイルス希釈液を混合し（最終濃度：１２０ｐｆｕ／１２０μＬ）、試料を室温で１時間インキュベートした。ＬＬＣ ＭＫ２細胞を含む平底９６ウェルプレートを１５０μＬ／ウェルのＰＢＳで１回洗浄した。ＰＢＳを除去した後、１００μＬのプレインキュベートした血清：ウイルス混合物を、ＬＬＣ ＭＫ２細胞を含むプレートに移し、３７℃／５％ＣＯ_２で５日間インキュベートした。５日目に、１ウェル当たり１５０μＬの中性緩衝ホルマリン溶液を添加し、プレートを室温で１時間インキュベートした。プレートを３００μＬ／ウェルのＰＢＳで２回洗浄し、吸引した。１００μＬ／ウェルの透過緩衝液（０．５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０を含有するＰＢＳ）を添加し、プレートを４℃で３０分間インキュベートした。透過緩衝液の吸引後、１００μＬ／ウェルのブロッキング緩衝液（０．５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０及び１０％脱脂乳を含有するＰＢＳ）を添加し、プレートを４℃で１時間インキュベートした。ＨＲＰ標識抗体（ＤＳ７ ｍＩｇＧ２ａ）をブロッキング緩衝液（上記を参照されたい）中で０．５μｇ／ｍＬの濃度に希釈し、ブロッキング緩衝液の吸引後、ウェル当たり５０μＬの抗体溶液を添加した。次いで、プレートを、３７℃／５％ＣＯ_２で１時間インキュベートした後、ＥＬＩＳＡ洗浄装置を使用して２００μＬ／ウェルのＰＢＳで６回洗浄した。１ウェル当たり１００μＬのＴＭＢ基質を添加し、約１０分間室温でインキュベートした。１ウェル当たり５０μＬの１Ｍ硫酸で反応を停止し、４５０ｎｍで吸光度を測定した。

【0090】

融合前／融合後Ｆタンパク質の組み合わせを試験するために、融合前Ｌ７Ｆ＿Ａ１＿２３又はＬ７Ｆ＿Ｂ１＿２３候補及び融合後ｓＦ＿Ａ１＿Ｍｆｕｒ又はｓＦ＿Ｂ１＿Ｍｆｕｒ候補を選択した。融合前及び融合後Ｆタンパク質の以下の組成（組み合わせ）を、ｈＭＰＶ中和抗体の誘導について調べた（表３を参照されたい）。

【表3】

【0091】

マウスで行った６つの実験（表４を参照されたい）では、各マウスを単一のＦタンパク質又は組み合わせワクチンのいずれかで免疫した。マウス血清を、上記のようなマイクロ中和アッセイ（ＭＮＡ）によって行われる中和抗体価の試験に使用した。これらの実験の結果を図３（Ａ～Ｃ）、図４及び図６（Ａ）に示す。

【表4】

【0092】

図３及び図４に示されるデータは、１用量当たりの抗原につき０．０２μｇの量で使用される融合前構築物Ｌ７Ｆ＿Ａ１＿２３と融合後構築物ｓＦ＿Ａ１＿Ｍｆｕｒの組み合わせが、単一のＦタンパク質と比較して中和力価の約５倍の改善を示したことを実証するものである（図３Ｃ及び図４を参照されたい）。０．２μｇ及び０．６μｇのより高い抗原用量では、融合前及び融合後Ｆタンパク質の相乗効果はそれほど顕著ではない（図３Ａ及び図３Ｂを参照されたい）。これらの実験から、Ａ１サブグループからの２つのＦタンパク質の組み合わせが、同じ遺伝子型Ａ、特にＡ２サブグループのウイルスによるチャレンジに対して防御的であることも明らかである。

【0093】

図６に示すデータ（実験４７６３）は、両方のアッセイにおける全ての群について用量応答を実証するものであった。マウスを融合前Ａ１候補で免疫した場合、ｈＭＰＶ Ａ１（Ａパネル）及びＢ１（Ｂパネル）に対する良好な中和及び交差中和が認められたが、融合前Ｂ１候補で免疫した場合、ｈＭＰＶ Ａ１株に対する交差中和はあまり効果的ではなかった。融合前Ａ１候補はまた、より高い免疫原性を誘導し得る。

【0094】

図７に示すデータ（実験４７７５）は、全体として、組み合わせ候補による中和力価が単一の候補で得られるものよりも弱いことを実証した。以前に観察されたように、Ａ１候補のみによる免疫は、より高い交差中和性を示す（Ｂ１候補で免疫されたマウスではＡ１に対する中和が非常に弱い）と考えられる。この実験では、最良の組み合わせは融合前－融合後Ａ１であり、この場合も同様に、Ａ１候補が交差中和のために好ましいことが示唆される。しかしながら、前述のように、中和力価は、単一の候補による免疫よりも依然として低かった。

【0095】

実施例５：マウスにおける防御
異なる融合前／融合後Ｆタンパク質組成物による免疫時のマウスの防御を、マウス肺感染モデルにおいて評価した。

【0096】

免疫及びチャレンジのプロトコル
ＢＡＬＢ／ｃマウスを、前述のように、アジュバント化した組換えＦタンパク質で２週間間隔で３回免疫し、免疫後２週間目に、約１×１０^６ｐｆｕのｈＭＰＶで鼻腔内チャレンジを行う。４～５日後、動物を屠殺し、肺を採取して凍結する。ウイルス量を決定するために、肺組織試料を採取し、秤量し、１ｍＬの培地中で均質化する。肺組織中のウイルス量は、以下に記載されるように、ウイルスフォーカスの免疫染色によって決定される。追加的に、ＲＴ－ｑＰＣＲを使用して肺のウイルス量を決定する。

【0097】

ウイルスプラーク（フォーカス）の免疫染色
ｈＭＰＶフォーカスの定量のためのアッセイは、Ｗｉｌｌｉａｍｓ ｅｔ ａｌ．，２００５．Ｊ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７９（１７）：１０９４４－５１、Ｗｉｌｌｉａｍｓ ｅｔ ａｌ．，２００７．Ｊ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ８１（１５）：８３１５－２４、及びＣｏｘ ｅｔ ａｌ．，２０１２．Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ８６（２２）：１２１４８－６０に公開された方法に基づいて開発された。簡潔に述べると、２４ウェルプレート中のＶｅｒｏ細胞又はＬＬＣ－ＭＫ２細胞のコンフルエント培養物を、培地に希釈した１２５μＬ／ウェルの肺ホモジネートに感染させる。３７℃／５％ＣＯ_２で１時間インキュベーションした後、培地中に１．５％のメチルセルロースを含有するオーバーレイを加える。感染後６日目に、上清を除去し、細胞をＰＢＳで２回洗浄する。細胞単層を固定し、ＤＳ７抗体（マウスＩｇＧ_２ａ）で染色する。フォーカスを計数し、２．５倍又は１０倍の対物レンズを使用するか、又はＢｉｏＲｅａｄｅｒ ６０００を使用して、Ｚｅｉｓｓ顕微鏡で細胞画像を取得する。免疫染色の結果は、１ミリリットル当たりのフォーカス形成単位、又はＦＦＵ／ｍＬとして表される。

【0098】

ＲＴ－ｑＰＣＲのプロトコル
製造業者の指示に従ってＱＩＡａｍｐ Ｖｉｒａｌ ＲＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔを使用して、１４０μＬの肺ホモジネートからＲＮＡを抽出し、該ＲＮＡを６０μＬで溶出する。ＲＴ－ｑＰＣＲは、ｉＴａｑ（商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｐｒｏｂｅｓ Ｏｎｅ－Ｓｔｅｐ Ｋｉｔ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を使用して行う。Ｎ遺伝子の増幅のために、以下のプライマー（例えば、フォワード５’－ＣＡＴＡＴＡＡＧＣＡＴＧＣＴＡＴＡＴＴＡＡＡＡＧＡＧＴＣＴＣ－３’及びリバース５’－ＣＣＴＡＴＴＴＣＴＧＣＡＧＣＡＴＡＴＴＴＧＴＡＡＴＣＡＧ－３’）及びプローブ（例えば、ＦＡＭ－ＴＧＹＡＡＴＧＡＴＧＡＧＧＧＴＧＴＣＡＣＴＧＣＧＧＴＴＧ－ＢＨＱ１）を使用する。ＲＴ－ｑＰＣＲの反応体積は、４００ｎＭの各プライマー、２００ｎＭのプローブ及び４μＬのＲＮＡを使用して２０μＬである。表５に列挙される条件でＣＦＸ９６ Ｔｏｕｃｈ Ｄｅｅｐ Ｗｅｌｌ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を使用して、逆転写及び増幅を行う。

【表5】

【0099】

ｈＭＰＶ ＲＮＡの量は、Ｂｉｏ－Ｒａｄ社製ＣＦＸ ｍａｅｓｔｒｏプログラムを使用して、各実行に含まれる既知の濃度を有する既知の全長ｈＭＰＶ ＲＮＡ標準に対して算出される。

【0100】

本明細書で使用される場合、ｈＭＰＶ感染のクリアランス又は軽減は、当該技術分野で既知の任意の方法によって判定され得る。いくつかの実施形態において、対象におけるｈＭＰＶ感染のレベルは、例えば、リアルタイム逆転写定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ｑＰＣＲ）によってウイルスの存在を検出することによって決定される。

【0101】

本研究で対処される最初の問題は、融合前又は融合後形態のいずれかで使用される組換え単一Ｆタンパク質を含む組成物と、融合前及び融合後Ｆタンパク質の組み合わせを含む組成物とで、ワクチン接種後の防御効果を比較することである。対処される２番目の問題は、融合前／融合後Ｆタンパク質の組み合わせを含有する組成物の最適な抗原用量を評価することである。本明細書で対処されるべき３番目の問題は、異なるｈＭＰＶ遺伝子型及び／又はサブグループ間に交差防御を確立することである。

【0102】

防御効果を評価するために、表４に示される任意の組成物で免疫されたマウスを、株ＴＮ／９４－４９（Ａ２サブグループ）又はＣ１－３３４（Ｂ１サブグループ）でチャレンジした。

【0103】

防御のレベルを評価するために、肺感染をＦＦＡ及びＲＴ－ｑＰＣＲ法によって評価した。その結果を、図５（Ａ、Ｂ）、図６（Ｂ、Ｃ）、及び図７（Ａ、Ｂ）に示す。特に、図５Ａは、Ａ１サブグループからの融合前及び融合後Ｆタンパク質の組み合わせで免疫し、Ａ２株でチャレンジしたマウスに、肺感染を示す最低レベルのフォーカスが生じることを示している。残念ながら、ＰＴ－ｑＰＣＲ法を使用した場合、そのような顕著な効果は示されず（図５Ｂを参照されたい）、ＦＦＡは生ウイルスを測定し、ＲＴ－ｑＰＣＲは、死滅したウイルスがまだ肺から排除されていない時点で、生ウイルスの非存在下であっても検出可能なウイルスＲＮＡ（生ウイルス及び死ウイルス）を測定する可能性が最も高い。

【0104】

４０ｎｇ、１２０ｎｇ及び４００ｎｇの用量の表４に示される異なる組み合わせを、Ａ１、Ａ２株又はＢ１株のいずれかを用いたチャレンジ実験で試験し、その結果を図６（Ｂ、Ｃ）及び図７（Ａ、Ｂ）に示す。フォーカス形成アッセイ（図６Ｂ及び７Ｂ）及びＲＴ－ｑＰＣＲ（データ図示せず）によって決定されたＴＮ９４－４９（サブグループＡ２）及びＣ１－３３４（サブグループＢ１）による肺感染の観点から、異なる組み合わせの間で非常に類似した結果が見られる。

【0105】

実施例６：免疫賦活作用の影響
ＢＡＬＢ／ｃマウスを、前述のように、アジュバント化した組換えＦタンパク質ワクチンで２週間間隔で３回免疫した。最後の免疫の２週間後、後眼窩採血により血液を採取し、血清を調製した。免疫応答の評価は、上記のようにマイクロ中和アッセイ（ＭＮＡ）によって行った。

【0106】

ｈＭＰＶワクチンの有効性に対する免疫賦活作用の影響を調べるために、融合前／融合後Ｆタンパク質Ｌ７Ｆ＿Ａ１＿２３及びｓＦ＿Ａ１＿Ｍｆｕｒの１つの例示的な組み合わせを試験した。

【表6】

【0107】

マウスを、表５に示すように３用量の組成物で免疫した。その後、マウスをｈＭＰＶ株、遺伝子型サブグループＡ１でチャレンジした。血清を採取し、中和抗体価の評価のためにＭＮＡアッセイで使用した。

【0108】

結果として、全ての試験したアジュバントは、マウスにおいて相同ｈＭＰＶに対する中和抗体の産生の増強を示した。同時に、アジュバントの非存在下では、中和抗体は検出されなかった。アジュバントであるミョウバン＋ＭＰＬ及びＩＣ３１_ｈｉｇｈ＋ミョウバンを用いて製剤化された融合前及び融合後Ｆタンパク質の組み合わせは、最大量の中和抗体を生成した。３Ｍ－０５２－ミョウバン及びＡｄｄａＶａｘを用いた組成物にはやや弱い影響が観察された。その結果を図８に示す。

【0109】

これらの実験から、試験したアジュバントのいずれも、他の動物種及びヒトにおける更なる試験から除外することはできない。

配列

配列番号１１
精製タグ付きＬ７Ｆ＿Ａ１＿２３タンパク質配列
ＭＳＷＫＶＶＩＩＦＳＬＬＩＴＰＱＨＧＬＫＥＳＹＬＥＥＳＣＳＴＩＴＥＧＹＬＳＶＬＲＴＧＷＹＴＮＶＦＴＬＥＶＧＤＶＥＮＬＴＣＡＤＧＰＳＬＩＫＴＥＬＤＬＴＫＳＡＬＲＥＬＲＴＶＳＡＤＱＬＡＲＥＥＱＩＥＱＰＲＱＳＧＣＧＡＧＡＴＡＧＶＡＩＡＫＴＩＲＬＥＳＥＶＴＡＩＫＮＡＬＫＫＴＮＥＡＶＳＴＬＧＮＧＶＲＶＬＡＴＡＶＲＥＬＫＤＦＶＳＫＮＬＴＲＡＩＮＫＮＫＣＤＩＡＤＬＫＭＡＶＳＦＳＱＦＮＲＲＦＬＮＶＶＲＱＦＳＤＮＡＧＩＴＰＡＩＳＬＤＬＭＴＤＡＥＬＡＲＡＶＳＮＭＰＴＳＡＧＱＩＫＬＭＬＥＮＲＡＭＶＲＲＫＧＦＧＦＬＩＧＶＹＧＳＳＶＩＹＭＶＱＬＰＩＦＧＶＩＤＴＰＣＷＩＶＫＡＡＰＳＣＳＥＫＫＧＮＹＡＣＬＬＲＥＤＱＧＷＹＣＱＮＡＧＳＴＶＹＹＰＮＥＫＤＣＥＴＲＧＤＨＶＦＣＤＴＣＡＧＩＮＶＡＥＱＳＫＥＣＮＩＮＩＳＴＴＮＹＰＣＫＶＳＴＧＲＨＰＩＳＭＶＡＬＳＰＬＧＡＬＶＡＣＹＫＧＶＳＣＳＩＧＳＮＲＶＧＩＩＫＱＬＮＫＧＣＳＹＩＴＮＱＤＡＤＴＶＴＩＤＮＴＶＹＱＬＳＫＶＥＧＥＱＨＶＩＫＧＲＰＶＳＳＳＦＤＰＶＫＦＰＥＤＱＦＮＶＡＬＤＱＶＦＥＳＩＥＮＳＱＡＬＶＤＱＳＮＲＩＬＳＡＧＹＩＰＥＡＰＲＤＧＱＡＹＶＲＫＤＧＥＷＶＬＬＳＴＦＬＧＧＬＶＰＲＧＳＨＨＨＨＨＨＳＡＷＳＨＰＱＦＥＫ

Ｌ７Ｆ＿Ａ１＿２３成熟タンパク質配列
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配列番号１２
精製タグ付きＬ７Ｆ＿Ｂ１＿２３タンパク質配列
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Ｌ７Ｆ＿Ｂ１＿２３成熟タンパク質配列
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配列番号１３
精製タグ付きＬ７Ｆ＿Ａ１＿２３．２タンパク質配列
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Ｌ７Ｆ＿Ａ１＿２３．２成熟タンパク質配列
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配列番号１４
精製タグ付きＬ７Ｆ＿Ｂ１＿２３．２タンパク質配列
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Ｌ７Ｆ＿Ｂ１＿２３．２成熟タンパク質配列
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配列番号１５
精製タグ付きｓＦ＿Ａ１＿Ｋ＿Ｌ７タンパク質配列
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配列番号１６
精製タグ付きＬ７Ｆ＿Ａ１＿３１タンパク質配列
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精製タグのないＬ７Ｆ＿Ａ１＿３１成熟タンパク質配列
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配列番号１７
精製タグ付きＬ７Ｆ＿Ａ１＿３３タンパク質配列
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精製タグのないＬ７Ｆ＿Ａ１＿３３成熟タンパク質配列
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配列番号１８
精製タグ付きＬ７Ｆ＿Ａ１＿４．２タンパク質配列
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精製タグのないＬ７Ｆ＿Ａ１＿４．２成熟タンパク質配列
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配列番号１９
ｓＦ＿Ａ１＿Ｋ－Ｅ２９４ 三量体化ヘルパーＫＬＬ及び精製タグ付き２つのポリペプチド鎖タンパク質配列
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配列番号２０
ｓＦ＿Ｂ１＿Ｋ－Ｅ２９４ 三量体化ヘルパーＫＬＬ及び精製タグ付き２つのポリペプチド鎖タンパク質配列
ＭＳＷＫＶＭＩＩＩＳＬＬＩＴＰＱＨＧＬＫＥＳＹＬＥＥＳＣＳＴＩＴＥＧＹＬＳＶＬＲＴＧＷＹＴＮＶＦＴＬＥＶＧＤＶＥＮＬＴＣＴＤＧＰＳＬＩＫＴＥＬＤＬＴＫＳＡＬＲＥＬＫＴＶＳＡＤＱＬＡＲＥＥＱＩＥＮＰＲＱＳＲＦＶＬＧＡＩＡＬＧＶＣＴＡＡＡＶＴＡＧＩＡＩＡＫＴＩＲＬＥＳＥＶＮＡＩＫＧＡＬＫＱＴＮＥＡＶＳＴＬＧＮＧＶＲＶＬＡＦＡＶＲＥＬＫＥＦＶＳＫＮＬＴＳＡＬＮＲＮＫＣＤＩＡＤＬＫＭＡＶＳＦＳＱＦＮＲＲＦＬＮＶＶＲＱＦＳＤＮＡＧＩＴＰＡＩＳＬＤＬＭＴＤＡＥＬＡＲＡＶＳＹＭＰＴＳＡＧＱＩＫＬＭＬＥＮＲＡＭＶＲＲＫＧＦＧＩＬＩＧＶＹＧＳＳＶＩＹＭＶＱＬＰＩＦＧＶＩＤＴＰＣＷＩＩＫＡＡＰＳＣＳＥＫＮＧＮＹＡＣＬＬＲＥＤＱＧＷＹＣＫＮＡＧＳＴＶＹＹＰＮＥＫＤＣＥＴＲＧＤＨＶＦＣＤＴＡＣＧＩＮＶＡＥＱＳＲＥＣＮＩＮＩＳＴＴＮＹＰＣＫＶＳＴＧＲＨＰＩＳＭＶＡＬＳＰＬＧＡＬＶＡＣＹＫＧＶＳＣＳＩＧＳＮＷＶＧＩＩＫＱＬＰＫＧＣＳＹＩＴＮＱＤＡＤＴＶＴＩＤＮＴＶＹＱＬＳＫＶＥＧＥＱＨＶＩＫＧＲＰＶＳＳＳＦＤＰＩＫＦＰＥＤＱＦＮＶＡＬＤＱＶＦＥＳＩＥＮＳＱＡＬＶＤＱＳＮＫＩＬＮＳＡＥＳＡＩＧＧＹＩＰＥＡＰＲＤＧＱＡＹＶＲＫＤＧＥＷＶＬＬＳＴＦＬＧＧＬＶＰＲＧＳＨＨＨＨＨＨＳＡＷＳＨＰＱＦＥＫ

精製タグのないＳＦ＿Ｂ１＿Ｋ－Ｅ２９４
ＭＳＷＫＶＭＩＩＩＳＬＬＩＴＰＱＨＧＬＫＥＳＹＬＥＥＳＣＳＴＩＴＥＧＹＬＳＶＬＲＴＧＷＹＴＮＶＦＴＬＥＶＧＤＶＥＮＬＴＣＴＤＧＰＳＬＩＫＴＥＬＤＬＴＫＳＡＬＲＥＬＫＴＶＳＡＤＱＬＡＲＥＥＱＩＥＮＰＲＱＳＲＦＶＬＧＡＩＡＬＧＶＣＴＡＡＡＶＴＡＧＩＡＩＡＫＴＩＲＬＥＳＥＶＮＡＩＫＧＡＬＫＱＴＮＥＡＶＳＴＬＧＮＧＶＲＶＬＡＦＡＶＲＥＬＫＥＦＶＳＫＮＬＴＳＡＬＮＲＮＫＣＤＩＡＤＬＫＭＡＶＳＦＳＱＦＮＲＲＦＬＮＶＶＲＱＦＳＤＮＡＧＩＴＰＡＩＳＬＤＬＭＴＤＡＥＬＡＲＡＶＳＹＭＰＴＳＡＧＱＩＫＬＭＬＥＮＲＡＭＶＲＲＫＧＦＧＩＬＩＧＶＹＧＳＳＶＩＹＭＶＱＬＰＩＦＧＶＩＤＴＰＣＷＩＩＫＡＡＰＳＣＳＥＫＮＧＮＹＡＣＬＬＲＥＤＱＧＷＹＣＫＮＡＧＳＴＶＹＹＰＮＥＫＤＣＥＴＲＧＤＨＶＦＣＤＴＡＣＧＩＮＶＡＥＱＳＲＥＣＮＩＮＩＳＴＴＮＹＰＣＫＶＳＴＧＲＨＰＩＳＭＶＡＬＳＰＬＧＡＬＶＡＣＹＫＧＶＳＣＳＩＧＳＮＷＶＧＩＩＫＱＬＰＫＧＣＳＹＩＴＮＱＤＡＤＴＶＴＩＤＮＴＶＹＱＬＳＫＶＥＧＥＱＨＶＩＫＧＲＰＶＳＳＳＦＤＰＩＫＦＰＥＤＱＦＮＶＡＬＤＱＶＦＥＳＩＥＮＳＱＡＬＶＤＱＳＮＫＩＬＮＳＡＥＳＡＩＧＧＹＩＰＥＡＰＲＤＧＱＡＹＶＲＫＤＧＥＷＶＬＬＳＴＦＬ

配列番号２１
融合後コンフォメーションで安定化された、精製タグ付きｓＦ＿Ａ１＿ＭＦｕｒタンパク質配列
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精製タグのないｓＦ＿Ａ１＿ＭＦｕｒ
ＭＳＷＫＶＶＩＩＦＳＬＬＩＴＰＱＨＧＬＫＥＳＹＬＥＥＳＣＳＴＩＴＥＧＹＬＳＶＬＲＴＧＷＹＴＮＶＦＴＬＥＶＧＤＶＥＮＬＴＣＡＤＧＰＳＬＩＫＴＥＬＤＬＴＫＳＡＬＲＥＬＲＴＶＳＡＤＱＬＡＲＥＥＱＩＥＮＰＲＱＳＫＫＲＫＲＲＶＡＴＡＡＡＶＴＡＧＶＡＩＡＫＴＩＲＬＥＳＥＶＴＡＩＫＮＡＬＫＫＴＮＥＡＶＳＴＬＧＮＧＶＲＶＬＡＴＡＶＲＥＬＫＤＦＶＳＫＮＬＴＲＡＩＮＫＮＫＣＤＩＡＤＬＫＭＡＶＳＦＳＱＦＮＲＲＦＬＮＶＶＲＱＦＳＤＮＡＧＩＴＰＡＩＳＬＤＬＭＴＤＡＥＬＡＲＡＶＳＮＭＰＴＳＡＧＱＩＫＬＭＬＥＮＲＡＭＶＲＲＫＧＦＧＦＬＩＧＶＹＧＳＳＶＩＹＭＶＱＬＰＩＦＧＶＩＤＴＰＣＷＩＶＫＡＡＰＳＣＳＥＫＫＧＮＹＡＣＬＬＲＥＤＱＧＷＹＣＱＮＡＧＳＴＶＹＹＰＮＥＫＤＣＥＴＲＧＤＨＶＦＣＤＴＡＡＧＩＮＶＡＥＱＳＫＥＣＮＩＮＩＳＴＴＮＹＰＣＫＶＳＴＧＲＨＰＩＳＭＶＡＬＳＰＬＧＡＬＶＡＣＹＫＧＶＳＣＳＩＧＳＮＲＶＧＩＩＫＱＬＮＫＧＣＳＹＩＴＮＱＤＡＤＴＶＴＩＤＮＴＶＹＱＬＳＫＶＥＧＥＱＨＶＩＫＧＲＰＶＳＳＳＦＤＰＶＫＦＰＥＤＱＦＮＶＡＬＤＱＶＦＥＳＩＥＮＳＱＡＬＶＤＱＳＮＲＩＬＳＳＡＥＫＧＮＴＳＧＲＥＮＬＹＦＱＧＧＧＧＳＧＹＩＰＥＡＰＲＤＧＱＡＹＶＲＫＤＧＥＷＶＬＬＳＴＦＬ

配列番号２２
融合後コンフォメーションで安定化された、精製タグ付きｓＦ＿Ｂ１＿ＭＦｕｒタンパク質配列
ＭＳＷＫＶＭＩＩＩＳＬＬＩＴＰＱＨＧＬＫＥＳＹＬＥＥＳＣＳＴＩＴＥＧＹＬＳＶＬＲＴＧＷＹＴＮＶＦＴＬＥＶＧＤＶＥＮＬＴＣＴＤＧＰＳＬＩＫＴＥＬＤＬＴＫＳＡＬＲＥＬＫＴＶＳＡＤＱＬＡＲＥＥＱＩＥＮＰＲＱＳＫＫＲＫＲＲＶＡＴＡＡＡＶＴＡＧＩＡＩＡＫＴＩＲＬＥＳＥＶＮＡＩＫＧＡＬＫＱＴＮＥＡＶＳＴＬＧＮＧＶＲＶＬＡＴＡＶＲＥＬＫＥＦＶＳＫＮＬＴＳＡＩＮＲＮＫＣＤＩＡＤＬＫＭＡＶＳＦＳＱＦＮＲＲＦＬＮＶＶＲＱＦＳＤＮＡＧＩＴＰＡＩＳＬＤＬＭＴＤＡＥＬＡＲＡＶＳＹＭＰＴＳＡＧＱＩＫＬＭＬＥＮＲＡＭＶＲＲＫＧＦＧＩＬＩＧＶＹＧＳＳＶＩＹＭＶＱＬＰＩＦＧＶＩＤＴＰＣＷＩＩＫＡＡＰＳＣＳＥＫＮＧＮＹＡＣＬＬＲＥＤＱＧＷＹＣＫＮＡＧＳＴＶＹＹＰＮＥＫＤＣＥＴＲＧＤＨＶＦＣＤＴＡＡＧＩＮＶＡＥＱＳＲＥＣＮＩＮＩＳＴＴＮＹＰＣＫＶＳＴＧＲＨＰＩＳＭＶＡＬＳＰＬＧＡＬＶＡＣＹＫＧＶＳＣＳＩＧＳＮＷＶＧＩＩＫＱＬＰＫＧＣＳＹＩＴＮＱＤＡＤＴＶＴＩＤＮＴＶＹＱＬＳＫＶＥＧＥＱＨＶＩＫＧＲＰＶＳＳＳＦＤＰＩＫＦＰＥＤＱＦＮＶＡＬＤＱＶＦＥＳＩＥＮＳＱＡＬＶＤＱＳＮＫＩＬＮＳＡＥＫＧＮＴＳＧＲＥＮＬＹＦＱＧＧＧＧＳＧＹＩＰＥＡＰＲＤＧＱＡＹＶＲＫＤＧＥＷＶＬＬＳＴＦＬＧＧＬＶＰＲＧＳＨＨＨＨＨＨＳＡＷＳＨＰＱＦＥＫ

精製タグのないＳＦ＿Ｂ１＿ＭＦｕｒ
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配列番号２３
バクテリオファージＴ４のフィブリチンからの三量体化ヘルパードメイン（フォールドン）
ＧＹＩＰＥＡＰＲＤＧＱＡＹＶＲＫＤＧＥＷＶＬＬＳＴＦＬ

配列番号２４
フォールドン－ｇｌｙｃ－１
ＧＹＩＰＥＡＰＲＮＧＴＡＹＶＲＫＤＧＥＷＶＬＬＳＴＦＬ

配列番号２５
フォールドン－ｇｌｙｃ－２
ＧＹＩＰＥＡＰＲＤＧＱＡＹＶＲＫＮＧＴＷＶＬＬＳＴＦＬ

配列番号２６
フォールドン－ｇｌｙｃ－３
ＧＹＩＰＥＡＰＲＤＧＱＡＹＶＲＫＤＧＮＷＴＬＬＳＴＦＬ

配列番号２７
フォールドン－ｇｌｙｃ－４
ＧＹＩＰＥＡＰＲＮＧＴＡＹＶＲＫＮＧＴＷＶＬＬＳＴＦＬ

配列番号２８
フォールドン－ｇｌｙｃ－５
ＧＹＩＰＥＡＰＲＮＧＴＡＹＶＲＫＤＧＮＷＴＬＬＳＴＦＬ

配列番号２９
三量体化ヘルパーＶＳＬモチーフ
ＩＬＳＡ

配列番号３０
三量体化ヘルパーＶＳＡモチーフ
ＣＣＳＡ

配列番号３１
コドン最適化されたＬ７Ｆ＿Ａ１＿２３コードヌクレオチド配列
ＡＴＧＴＣＴＴＧＧＡＡＧＧＴＧＧＴＣＡＴＣＡＴＣＴＴＣＴＣＣＣＴＧＣＴＧＡＴＣＡＣＣＣＣＴＣＡＧＣＡＣＧＧＣＣＴＧＡＡＡＧＡＧＴＣＣＴＡＣＣＴＧＧＡＡＧＡＧＡＧＣＴＧＣＴＣＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＧＡＧＧＧＣＴＡＣＣＴＧＴＣＴＧＴＧＣＴＧＡＧＡＡＣＣＧＧＣＴＧＧＴＡＣＡＣＣＡＡＣＧＴＧＴＴＣＡＣＣＣＴＧＧＡＡＧＴＧＧＧＣＧＡＣＧＴＧＧＡＡＡＡＣＣＴＧＡＣＣＴＧＴＧＣＴＧＡＴＧＧＣＣＣＣＡＧＣＣＴＧＡＴＣＡＡＧＡＣＣＧＡＧＣＴＧＧＡＣＣＴＧＡＣＣＡＡＧＴＣＴＧＣＣＣＴＧＡＧＡＧＡＡＣＴＧＡＧＧＡＣＣＧＴＧＴＣＴＧＣＣＧＡＴＣＡＧＣＴＧＧＣＣＡＧＡＧＡＧＧＡＡＣＡＧＡＴＣＧＡＧＣＡＧＣＣＴＡＧＡＣＡＧＴＣＣＧＧＡＴＧＴＧＧＴＧＣＴＧＧＴＧＣＴＡＣＡＧＣＴＧＧＣＧＴＧＧＣＣＡＴＴＧＣＣＡＡＧＡＣＣＡＴＣＣＧＧＣＴＧＧＡＡＴＣＴＧＡＡＧＴＧＡＣＣＧＣＣＡＴＣＡＡＧＡＡＣＧＣＣＣＴＧＡＡＡＡＡＧＡＣＣＡＡＣＧＡＧＧＣＣＧＴＧＴＣＴＡＣＣＣＴＣＧＧＣＡＡＴＧＧＣＧＴＴＡＧＡＧＴＧＣＴＧＧＣＣＡＣＡＧＣＣＧＴＧＣＧＣＧＡＧＣＴＧＡＡＧＧＡＴＴＴＣＧＴＧＴＣＣＡＡＧＡＡＣＣＴＧＡＣＣＡＧＧＧＣＣＡＴＣＡＡＣＡＡＧＡＡＣＡＡＧＴＧＴＧＡＴＡＴＣＧＣＣＧＡＣＣＴＧＡＡＧＡＴＧＧＣＣＧＴＧＴＣＣＴＴＣＡＧＣＣＡＧＴＴＣＡＡＣＣＧＧＣＧＧＴＴＣＣＴＧＡＡＴＧＴＣＧＴＧＣＧＧＣＡＧＴＴＣＴＣＴＧＡＣＡＡＣＧＣＣＧＧＣＡＴＣＡＣＣＣＣＴＧＣＣＡＴＣＡＧＣＣＴＧＧＡＴＣＴＧＡＴＧＡＣＣＧＡＴＧＣＣＧＡＧＣＴＧＧＣＴＡＧＡＧＣＣＧＴＧＴＣＣＡＡＣＡＴＧＣＣＴＡＣＣＴＣＴＧＣＣＧＧＣＣＡＧＡＴＣＡＡＧＣＴＧＡＴＧＣＴＧＧＡＡＡＡＣＡＧＡＧＣＣＡＴＧＧＴＣＣＧＡＣＧＧＡＡＡＧＧＣＴＴＣＧＧＣＴＴＴＣＴＧＡＴＣＧＧＣＧＴＧＴＡＣＧＧＣＴＣＣＴＣＣＧＴＧＡＴＣＴＡＣＡＴＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＣＣＴＡＴＣＴＴＣＧＧＣＧＴＧＡＴＣＧＡＣＡＣＣＣＣＴＴＧＣＴＧＧＡＴＣＧＴＧＡＡＧＧＣＣＧＣＴＣＣＴＡＧＣＴＧＣＴＣＴＧＡＧＡＡＧＡＡＧＧＧＣＡＡＣＴＡＣＧＣＣＴＧＣＣＴＧＣＴＧＡＧＡＧＡＧＧＡＣＣＡＡＧＧＣＴＧＧＴＡＣＴＧＴＣＡＧＡＡＣＧＣＣＧＧＣＴＣＣＡＣＣＧＴＧＴＡＣＴＡＣＣＣＣＡＡＣＧＡＧＡＡＧＧＡＣＴＧＣＧＡＧＡＣＡＡＧＡＧＧＣＧＡＣＣＡＣＧＴＧＴＴＣＴＧＣＧＡＴＡＣＣＴＧＣＧＣＴＧＧＣＡＴＣＡＡＴＧＴＧＧＣＣＧＡＧＣＡＧＴＣＣＡＡＡＧＡＧＴＧＣＡＡＣＡＴＣＡＡＣＡＴＣＴＣＣＡＣＣＡＣＣＡＡＣＴＡＴＣＣＣＴＧＣＡＡＧＧＴＧＴＣＣＡＣＣＧＧＣＡＧＧＣＡＣＣＣＴＡＴＴＴＣＣＡＴＧＧＴＧＧＣＴＣＴＧＴＣＴＣＣＡＣＴＧＧＧＣＧＣＣＣＴＧＧＴＧＧＣＴＴＧＴＴＡＴＡＡＧＧＧＣＧＴＧＴＣＣＴＧＣＴＣＣＡＴＣＧＧＣＴＣＣＡＡＣＡＧＡＧＴＧＧＧＣＡＴＣＡＴＣＡＡＧＣＡＧＣＴＧＡＡＣＡＡＧＧＧＣＴＧＣＡＧＣＴＡＣＡＴＣＡＣＣＡＡＣＣＡＧＧＡＣＧＣＣＧＡＴＡＣＣＧＴＧＡＣＣＡＴＣＧＡＣＡＡＴＡＣＣＧＴＧＴＡＴＣＡＧＣＴＧＴＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＡＧＧＣＧＡＧＣＡＧＣＡＣＧＴＧＡＴＣＡＡＧＧＧＣＡＧＡＣＣＴＧＴＧＴＣＣＴＣＣＡＧＣＴＴＣＧＡＣＣＣＣＧＴＧＡＡＧＴＴＣＣＣＴＧＡＧＧＡＴＣＡＧＴＴＣＡＡＣＧＴＧＧＣＣＣＴＧＧＡＣＣＡＧＧＴＧＴＴＣＧＡＧＴＣＣＡＴＣＧＡＧＡＡＣＴＣＴＣＡＧＧＣＴＣＴＧＧＴＧＧＡＣＣＡＧＴＣＣＡＡＣＣＧＧＡＴＴＣＴＧＴＣＴＧＣＣＧＧＣＴＡＣＡＴＣＣＣＣＧＡＧＧＣＴＣＣＴＡＧＡＧＡＴＧＧＡＣＡＧＧＣＣＴＡＣＧＴＣＡＧＡＡＡＧＧＡＣＧＧＣＧＡＡＴＧＧＧＴＧＣＴＧＣＴＧＴＣＴＡＣＣＴＴＴＣＴＣＧＧＡＧＧＣＣＴＧＧＴＧＣＣＴＡＧＡＧＧＣＴＣＴＣＡＣＣＡＣＣＡＴＣＡＴＣＡＣＣＡＣＴＣＣＧＣＴＴＧＧＴＣＣＣＡＴＣＣＡＣＡＧＴＴＣＧＡＧＡＡＧＴＧＡ

配列番号３２
コドン最適化されたＬ７Ｆ＿Ｂ１＿２３コードヌクレオチド配列
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コドン最適化されたＬ７Ｆ＿Ａ１＿２３．２コードヌクレオチド配列
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配列番号３７
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配列番号３８
コドン最適化されたＬ７Ｆ＿Ａ１＿４．２コードヌクレオチド配列
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配列番号３９
コドン最適化されたｓＦ＿Ａ１＿Ｋ－Ｅ２９４コードヌクレオチド配列
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配列番号４０
コドン最適化されたｓＦ＿Ａ１＿ＭＦｕｒコードヌクレオチド配列
ＡＴＧＴＣＣＴＧＧＡＡＧＧＴＣＧＴＧＡＴＣＡＴＣＴＴＣＴＣＣＣＴＧＣＴＧＡＴＣＡＣＣＣＣＣＣＡＧＣＡＣＧＧＣＣＴＧＡＡＡＧＡＧＴＣＣＴＡＣＣＴＧＧＡＡＧＡＧＡＧＣＴＧＣＴＣＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＧＡＧＧＧＣＴＡＣＣＴＧＴＣＴＧＴＧＣＴＧＣＧＧＡＣＣＧＧＣＴＧＧＴＡＣＡＣＣＡＡＣＧＴＧＴＴＣＡＣＣＣＴＧＧＡＡＧＴＧＧＧＣＧＡＣＧＴＧＧＡＡＡＡＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＧＣＣＧＡＴＧＧＣＣＣＣＡＧＣＣＴＧＡＴＣＡＡＧＡＣＣＧＡＧＣＴＧＧＡＣＣＴＧＡＣＣＡＡＧＴＣＣＧＣＣＣＴＧＣＧＧＧＡＡＣＴＧＡＧＡＡＣＣＧＴＧＴＣＴＧＣＣＧＡＴＣＡＧＣＴＧＧＣＣＡＧＡＧＡＧＧＡＡＣＡＧＡＴＣＧＡＧＡＡＣＣＣＣＣＧＧＣＡＧＴＣＣＡＡＧＡＡＡＣＧＧＡＡＧＣＧＧＡＧＡＧＴＧＧＣＣＡＣＣＧＣＣＧＣＴＧＣＴＧＴＧＡＣＡＧＣＴＧＧＣＧＴＧＧＣＣＡＴＴＧＣＣＡＡＧＡＣＣＡＴＣＣＧＧＣＴＧＧＡＡＴＣＣＧＡＡＧＴＧＡＣＣＧＣＣＡＴＣＡＡＧＡＡＣＧＣＣＣＴＧＡＡＡＡＡＧＡＣＣＡＡＣＧＡＧＧＣＣＧＴＧＴＣＴＡＣＣＣＴＧＧＧＣＡＡＴＧＧＣＧＴＧＣＧＡＧＴＧＣＴＧＧＣＴＡＣＡＧＣＴＧＴＧＣＧＣＧＡＧＣＴＧＡＡＧＧＡＣＴＴＣＧＴＧＴＣＣＡＡＧＡＡＣＣＴＧＡＣＣＣＧＧＧＣＣＡＴＣＡＡＣＡＡＧＡＡＣＡＡＧＴＧＴＧＡＴＡＴＣＧＣＣＧＡＣＣＴＧＡＡＧＡＴＧＧＣＣＧＴＧＴＣＣＴＴＴＡＧＣＣＡＧＴＴＣＡＡＣＣＧＧＣＧＧＴＴＣＣＴＧＡＡＣＧＴＣＧＴＧＣＧＧＣＡＧＴＴＣＴＣＴＧＡＣＡＡＣＧＣＣＧＧＣＡＴＣＡＣＣＣＣＴＧＣＣＡＴＣＴＣＣＣＴＧＧＡＴＣＴＧＡＴＧＡＣＣＧＡＣＧＣＣＧＡＧＣＴＧＧＣＴＡＧＡＧＣＣＧＴＧＴＣＣＡＡＣＡＴＧＣＣＴＡＣＣＴＣＴＧＣＣＧＧＣＣＡＧＡＴＣＡＡＧＣＴＧＡＴＧＣＴＧＧＡＡＡＡＣＣＧＧＧＣＣＡＴＧＧＴＧＣＧＡＣＧＧＡＡＧＧＧＣＴＴＣＧＧＣＴＴＴＣＴＧＡＴＣＧＧＣＧＴＧＴＡＣＧＧＣＴＣＣＴＣＣＧＴＧＡＴＣＴＡＣＡＴＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＣＣＴＡＴＣＴＴＣＧＧＣＧＴＧＡＴＣＧＡＣＡＣＣＣＣＣＴＧＣＴＧＧＡＴＣＧＴＧＡＡＧＧＣＣＧＣＴＣＣＴＡＧＣＴＧＣＴＣＣＧＡＧＡＡＧＡＡＧＧＧＣＡＡＣＴＡＣＧＣＣＴＧＣＣＴＧＣＴＧＡＧＡＧＡＧＧＡＣＣＡＧＧＧＣＴＧＧＴＡＣＴＧＴＣＡＧＡＡＣＧＣＣＧＧＣＴＣＣＡＣＣＧＴＧＴＡＣＴＡＣＣＣＣＡＡＣＧＡＧＡＡＧＧＡＣＴＧＣＧＡＧＡＣＡＣＧＧＧＧＣＧＡＣＣＡＣＧＴＧＴＴＣＴＧＴＧＡＴＡＣＣＧＣＴＧＣＴＧＧＣＡＴＣＡＡＣＧＴＧＧＣＣＧＡＧＣＡＧＴＣＣＡＡＡＧＡＧＴＧＣＡＡＣＡＴＣＡＡＣＡＴＣＴＣＣＡＣＣＡＣＣＡＡＣＴＡＣＣＣＣＴＧＣＡＡＧＧＴＧＴＣＣＡＣＣＧＧＣＡＧＧＣＡＣＣＣＣＡＴＣＴＣＴＡＴＧＧＴＧＧＣＣＣＴＧＴＣＴＣＣＴＣＴＧＧＧＣＧＣＣＣＴＧＧＴＧＧＣＴＴＧＴＴＡＣＡＡＧＧＧＣＧＴＧＴＣＣＴＧＣＴＣＣＡＴＣＧＧＣＴＣＣＡＡＣＡＧＡＧＴＧＧＧＣＡＴＣＡＴＣＡＡＧＣＡＧＣＴＧＡＡＣＡＡＧＧＧＣＴＧＣＡＧＣＴＡＣＡＴＣＡＣＣＡＡＣＣＡＧＧＡＣＧＣＣＧＡＣＡＣＣＧＴＧＡＣＣＡＴＣＧＡＣＡＡＴＡＣＣＧＴＧＴＡＴＣＡＧＣＴＧＴＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＡＧＧＣＧＡＧＣＡＧＣＡＣＧＴＧＡＴＣＡＡＧＧＧＣＡＧＡＣＣＣＧＴＧＴＣＣＴＣＣＡＧＣＴＴＣＧＡＣＣＣＣＧＴＧＡＡＧＴＴＣＣＣＣＧＡＧＧＡＴＣＡＧＴＴＣＡＡＴＧＴＧＧＣＣＣＴＧＧＡＣＣＡＧＧＴＧＴＴＣＧＡＧＴＣＣＡＴＣＧＡＧＡＡＣＴＣＣＣＡＧＧＣＴＣＴＧＧＴＧＧＡＣＣＡＧＴＣＣＡＡＣＣＧＧＡＴＣＣＴＧＴＣＣＴＣＴＧＣＣＧＡＧＡＡＧＧＧＡＡＡＣＡＣＣＴＣＣＧＧＣＡＧＡＧＡＧＡＡＣＣＴＧＴＡＴＴＴＴＣＡＡＧＧＣＧＧＣＧＧＡＧＧＣＴＣＣＧＧＣＴＡＣＡＴＣＣＣＴＧＡＧＧＣＴＣＣＴＡＧＡＧＡＴＧＧＣＣＡＧＧＣＣＴＡＣＧＴＧＣＧＧＡＡＧＧＡＴＧＧＣＧＡＡＴＧＧＧＴＧＣＴＧＣＴＧＴＣＣＡＣＣＴＴＣＣＴＧＧＧＣＧＧＣＡＴＣＧＡＧＧＧＣＡＧＡＣＡＣＣＡＣＣＡＴＣＡＴＣＡＣＣＡＣＴＧＡ

配列番号４１
精製タグ付きのＣＡＮ９７－８３株（受託番号Ｑ６ＷＢ９９）由来のＭタンパク質配列
ＭＧＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨＳＳＧＨＩＤＤＤＤＫＱＥＳＹＬＶＤＴＹＱＧＩＰＹＴＡＡＶＱＶＤＬＶＥＫＤＬＬＰＡＳＬＴＩＷＦＰＬＦＱＡＮＴＰＰＡＶＬＬＤＱＬＫＴＬＴＩＴＴＬＹＡＡＳＱＳＧＰＩＬＫＶＮＡＳＡＱＧＡＡＭＳＶＬＰＫＫＦＥＶＮＡＴＶＡＬＤＥＹＳＫＬＥＦＤＫＬＴＶＣＥＶＫＴＶＹＬＴＴＭＫＰＹＧＭＶＳＫＦＶＳＳＡＫＰＶＧＫＫＴＨＤＬＩＡＬＣＤＦＭＤＬＥＫＮＴＰＶＴＩＰＡＦＩＫＳＶＳＩＫＥＳＥＳＡＴＶＥＡＡＩＳＳＥＡＤＱＡＬＴＱＡＫＩＡＰＹＡＧＬＩＭＩＭＴＭＮＮＰＫＧＩＦＫＫＬＧＡＧＴＱＶＩＶＥＬＧＡＹＶＱＡＥＳＩＳＫＩＣＫＴＷＳＨＱＧＴＲＹＶＬＫＳＲ


配列番号４２
ＣＣＫＱＴＮＥＣＣＫＮＬＥＲＡＶＳＡ

配列番号４３
ＣＣＲＥＬＫＥＣＣＫＮＬＥＮＡＶＳＡ

配列番号４４
ＣＣＲＥＬＫＤＣＣＫＮＬＥＮＡＶＳＡ

配列番号４５
ＣＣＲＥＬＫＤＣＣＫＮＬＥＲＡＶＳＡ

配列番号４６
ＣＣＲＥＬＫＤＣＣＫＱＬＮＫＡＶＳＡ

配列番号４７
ＣＣＲＥＬＫＥＣＣＫＱＬＮＫＡＶＳＡ

配列番号４８
コドン最適化されたｓＦ＿Ｂ１＿Ｍコードヌクレオチド配列
ＡＴＧＡＴＣＡＴＴＡＴＣＴＣＣＣＴＧＣＴＧＡＴＣＡＣＣＣＣＣＣＡＧＣＡＣＧＧＣＣＴＧＡＡＡＧＡＧＴＣＣＴＡＣＣＴＧＧＡＡＧＡＧＡＧＣＴＧＣＴＣＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＧＡＧＧＧＣＴＡＣＣＴＧＴＣＴＧＴＧＣＴＧＣＧＧＡＣＣＧＧＣＴＧＧＴＡＣＡＣＣＡＡＣＧＴＧＴＴＣＡＣＣＣＴＧＧＡＡＧＴＧＧＧＣＧＡＣＧＴＧＧＡＡＡＡＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＡＣＣＧＡＴＧＧＣＣＣＣＡＧＣＣＴＧＡＴＣＡＡＧＡＣＣＧＡＧＣＴＧＧＡＣＣＴＧＡＣＣＡＡＧＴＣＣＧＣＣＣＴＧＣＧＣＧＡＧＣＴＧＡＡＡＡＣＣＧＴＧＴＣＴＧＣＣＧＡＴＣＡＧＣＴＧＧＣＣＡＧＡＧＡＧＧＡＡＣＡＧＡＴＣＧＡＧＡＡＣＣＣＣＣＧＧＣＡＧＴＣＣＡＡＧＡＡＡＣＧＧＡＡＧＣＧＧＡＧＡＧＴＧＧＣＣＡＣＣＧＣＣＧＣＴＧＣＴＧＴＧＡＣＡＧＣＴＧＧＡＡＴＣＧＣＴＡＴＣＧＣＣＡＡＧＡＣＣＡＴＣＣＧＧＣＴＧＧＡＡＴＣＣＧＡＡＧＴＧＡＡＣＧＣＣＡＴＣＡＡＧＧＧＣＧＣＴＣＴＧＡＡＧＣＡＧＡＣＣＡＡＣＧＡＧＧＣＣＧＴＧＴＣＴＡＣＣＣＴＧＧＧＣＡＡＴＧＧＣＧＴＧＣＧＡＧＴＧＣＴＧＧＣＴＡＣＡＧＣＴＧＴＧＣＧＧＧＡＡＣＴＧＡＡＡＧＡＡＴＴＣＧＴＧＴＣＣＡＡＧＡＡＣＣＴＧＡＣＣＡＧＣＧＣＣＡＴＣＡＡＣＣＧＧＡＡＣＡＡＧＴＧＴＧＡＴＡＴＣＧＣＣＧＡＣＣＴＧＡＡＧＡＴＧＧＣＣＧＴＧＴＣＣＴＴＣＡＧＣＣＡＧＴＴＣＡＡＣＣＧＧＣＧＧＴＴＣＣＴＧＡＡＣＧＴＣＧＴＧＣＧＧＣＡＧＴＴＣＴＣＴＧＡＣＡＡＣＧＣＣＧＧＣＡＴＣＡＣＣＣＣＴＧＣＣＡＴＣＴＣＣＣＴＧＧＡＴＣＴＧＡＴＧＡＣＣＧＡＣＧＣＣＧＡＧＣＴＧＧＣＴＡＧＡＧＣＣＧＴＧＴＣＴＴＡＣＡＴＧＣＣＴＡＣＣＴＣＴＧＣＣＧＧＣＣＡＧＡＴＣＡＡＧＣＴＧＡＴＧＣＴＧＧＡＡＡＡＣＣＧＧＧＣＣＡＴＧＧＴＧＣＧＡＣＧＧＡＡＧＧＧＣＴＴＣＧＧＣＡＴＣＣＴＧＡＴＣＧＧＣＧＴＧＴＡＣＧＧＣＴＣＣＴＣＣＧＴＧＡＴＣＴＡＣＡＴＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＣＣＴＡＴＣＴＴＣＧＧＣＧＴＧＡＴＣＧＡＣＡＣＣＣＣＣＴＧＣＴＧＧＡＴＴＡＴＣＡＡＧＧＣＣＧＣＴＣＣＣＡＧＣＴＧＣＴＣＣＧＡＧＡＡＧＡＡＣＧＧＣＡＡＣＴＡＣＧＣＣＴＧＣＣＴＧＣＴＧＡＧＡＧＡＧＧＡＣＣＡＧＧＧＣＴＧＧＴＡＣＴＧＣＡＡＧＡＡＣＧＣＣＧＧＣＴＣＣＡＣＣＧＴＧＴＡＣＴＡＣＣＣＣＡＡＣＧＡＧＡＡＧＧＡＣＴＧＣＧＡＧＡＣＡＣＧＧＧＧＣＧＡＣＣＡＣＧＴＧＴＴＣＴＧＴＧＡＴＡＣＣＧＣＴＧＣＴＧＧＣＡＴＣＡＡＣＧＴＧＧＣＣＧＡＧＣＡＧＴＣＣＡＧＡＧＡＧＴＧＣＡＡＣＡＴＣＡＡＣＡＴＣＴＣＣＡＣＣＡＣＣＡＡＣＴＡＣＣＣＣＴＧＣＡＡＧＧＴＧＴＣＣＡＣＣＧＧＣＡＧＧＣＡＣＣＣＣＡＴＣＴＣＴＡＴＧＧＴＧＧＣＣＣＴＧＴＣＴＣＣＴＣＴＧＧＧＡＧＣＣＣＴＧＧＴＧＧＣＴＴＧＴＴＡＣＡＡＧＧＧＣＧＴＧＴＣＣＴＧＣＴＣＣＡＴＣＧＧＣＴＣＣＡＡＣＴＧＧＧＴＧＧＧＡＡＴＣＡＴＣＡＡＧＣＡＧＣＴＧＣＣＣＡＡＧＧＧＣＴＧＣＡＧＣＴＡＣＡＴＣＡＣＣＡＡＣＣＡＧＧＡＣＧＣＣＧＡＣＡＣＣＧＴＧＡＣＣＡＴＣＧＡＣＡＡＴＡＣＣＧＴＧＴＡＴＣＡＧＣＴＧＴＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＡＧＧＣＧＡＧＣＡＧＣＡＣＧＴＧＡＴＣＡＡＧＧＧＣＡＧＡＣＣＣＧＴＧＴＣＣＡＧＣＴＣＣＴＴＣＧＡＣＣＣＣＡＴＣＡＡＧＴＴＣＣＣＣＧＡＧＧＡＴＣＡＧＴＴＣＡＡＴＧＴＧＧＣＣＣＴＧＧＡＣＣＡＧＧＴＧＴＴＣＧＡＧＴＣＣＡＴＣＧＡＧＡＡＣＴＣＣＣＡＧＧＣＴＣＴＧＧＴＧＧＡＣＣＡＧＴＣＣＡＡＣＡＡＧＡＴＣＣＴＧＡＡＣＴＣＣＧＣＣＧＡＧＡＡＧＧＧＣＡＡＣＡＣＣＴＣＣＧＧＣＡＧＡＧＡＧＡＡＣＣＴＧＴＡＴＴＴＴＣＡＡＧＧＣＧＧＣＧＧＡＧＧＣＴＣＣＧＧＣＴＡＣＡＴＣＣＣＴＧＡＧＧＣＴＣＣＴＡＧＡＧＡＴＧＧＣＣＡＧＧＣＣＴＡＣＧＴＧＣＧＧＡＡＧＧＡＴＧＧＣＧＡＡＴＧＧＧＴＧＣＴＧＣＴＧＴＣＣＡＣＣＴＴＣＣＴＧＴＧＡ

配列番号５０
＞ｓＦ＿Ｂ１＿Ｋ－Ｌ７
ＭＳＷＫＶＭＩＩＩＳＬＬＩＴＰＱＨＧＬＫＥＳＹＬＥＥＳＣＳＴＩＴＥＧＹＬＳＶＬＲＴＧＷＹＴＮＶＦＴＬＥＶＧＤＶＥＮＬＴＣＴＤＧＰＳＬＩＫＴＥＬＤＬＴＫＳＡＬＲＥＬＫＴＶＳＡＤＱＬＡＲＥＥＱＩＥＱＰＲＱＳＧＣＧＡＧＡＴＡＧＩＡＩＡＫＴＩＲＬＥＳＥＶＮＡＩＫＧＡＬＫＱＴＮＥＡＶＳＴＬＧＮＧＶＲＶＬＡＦＡＶＲＥＬＫＥＦＶＳＫＮＬＴＳＡＬＮＲＮＫＣＤＩＡＤＬＫＭＡＶＳＦＳＱＦＮＲＲＦＬＮＶＶＲＱＦＳＤＮＡＧＩＴＰＡＩＳＬＤＬＭＴＤＡＥＬＡＲＡＶＳＹＭＰＴＳＡＧＱＩＫＬＭＬＥＮＲＡＭＶＲＲＫＧＦＧＩＬＩＧＶＹＧＳＳＶＩＹＭＶＱＬＰＩＦＧＶＩＤＴＰＣＷＩＩＫＡＡＰＳＣＳＥＫＮＧＮＹＡＣＬＬＲＥＤＱＧＷＹＣＫＮＡＧＳＴＶＹＹＰＮＥＫＤＣＥＴＲＧＤＨＶＦＣＤＴＣＡＧＩＮＶＡＥＱＳＲＥＣＮＩＮＩＳＴＴＮＹＰＣＫＶＳＴＧＲＨＰＩＳＭＶＡＬＳＰＬＧＡＬＶＡＣＹＫＧＶＳＣＳＩＧＳＮＷＶＧＩＩＫＱＬＰＫＧＣＳＹＩＴＮＱＤＡＤＴＶＴＩＤＮＴＶＹＱＬＳＫＶＥＧＥＱＨＶＩＫＧＲＰＶＳＳＳＦＤＰＩＫＦＰＥＤＱＦＮＶＡＬＤＱＶＦＥＳＩＥＮＳＱＡＬＶＤＱＳＮＫＩＬＮＳＡＥＳＡＩＧＧＹＩＰＥＡＰＲＤＧＱＡＹＶＲＫＤＧＥＷＶＬＬＳＴＦＬＧＧＬＶＰＲＧＳＨＨＨＨＨＨＳＡＷＳＨＰＱＦＥＫ

配列番号５１
＞Ｌ７Ｆ＿Ｂ１＿３１
ＭＳＷＫＶＭＩＩＩＳＬＬＩＴＰＱＨＧＬＫＥＳＹＬＥＥＳＣＳＴＩＴＥＧＹＬＳＶＬＲＴＧＷＹＴＮＶＦＭＬＥＶＧＤＶＥＮＬＴＣＴＤＧＰＳＬＬＫＴＥＬＤＬＴＫＳＡＬＲＮＬＫＴＶＳＡＤＱＬＡＲＥＥＱＩＥＱＰＲＱＳＧＣＧＡＧＡＴＡＧＩＡＩＡＫＴＩＲＬＥＳＥＶＮＡＩＫＧＡＬＫＱＴＮＥＡＶＳＴＬＧＮＧＶＲＶＬＡＴＭＶＲＥＬＫＥＦＶＳＫＮＬＴＳＡＩＮＲＮＫＣＤＩＡＤＬＫＭＡＶＳＦＳＱＦＮＲＲＦＬＮＶＶＲＱＦＳＤＮＡＧＩＴＰＡＩＳＬＤＬＭＴＤＡＥＬＡＲＡＶＳＹＭＰＴＳＡＧＱＩＫＬＭＬＥＮＲＡＭＶＲＲＫＧＦＧＩＬＩＧＶＹＧＳＳＶＩＹＭＶＱＬＰＩＦＧＶＩＤＴＰＣＷＩＩＫＡＡＰＳＣＳＥＫＮＧＮＹＡＣＬＬＲＥＤＱＧＷＹＣＫＮＡＧＳＴＶＹＹＰＮＥＫＤＣＥＴＲＧＤＨＶＦＣＤＴＣＡＧＩＮＶＡＥＱＳＲＥＣＮＩＮＩＳＴＴＮＹＰＣＫＶＳＴＧＲＨＰＩＳＭＶＡＬＳＰＬＧＡＬＶＡＣＹＫＧＶＳＣＳＩＧＳＮＷＶＧＩＩＫＱＬＰＫＧＣＳＹＩＴＮＱＤＡＤＴＶＴＩＤＮＴＶＹＱＬＳＫＶＥＧＥＱＨＶＩＫＧＲＰＶＳＳＳＦＤＰＩＫＦＰＥＤＱＦＮＶＡＬＤＱＶＦＥＳＩＥＮＳＱＡＬＶＤＱＳＮＫＩＬＮＡＧＹＩＰＥＡＰＲＤＧＱＡＹＶＲＫＤＧＥＷＶＬＬＳＴＦＬＧＧＬＶＰＲＧＳＨＨＨＨＨＨＳＡＷＳＨＰＱＦＥＫ

配列番号５２
＞Ｌ７Ｆ＿Ｂ１＿３３
ＭＳＷＫＶＭＩＩＩＳＬＬＩＴＰＱＨＧＬＫＥＳＹＬＥＥＳＣＳＴＩＴＥＧＹＬＳＶＬＲＴＧＷＹＴＮＶＦＭＬＣＶＧＤＶＥＮＬＴＣＴＤＧＰＳＬＬＫＴＥＬＤＬＴＫＳＡＬＲＥＬＫＴＶＳＡＤＱＬＡＲＥＥＱＩＥＱＰＲＱＳＧＣＧＡＧＡＴＡＧＩＡＩＡＫＴＩＲＬＥＳＥＶＮＡＩＫＧＡＬＫＱＴＮＥＡＶＳＴＬＧＮＧＶＲＶＬＡＴＭＶＲＥＬＣＥＦＶＳＫＮＬＴＳＡＩＮＲＮＫＣＤＩＡＤＬＫＭＡＶＳＦＳＱＦＮＲＲＦＬＮＶＶＲＱＦＳＤＮＡＧＩＴＰＡＩＳＬＤＬＭＴＤＡＥＬＡＲＡＶＳＹＭＰＴＳＡＧＱＩＫＬＭＬＥＮＲＡＭＶＲＲＫＧＦＧＩＬＩＧＶＹＧＳＤＶＩＹＭＶＱＬＰＩＦＧＶＩＤＴＰＣＷＩＩＫＡＡＰＳＣＳＥＫＮＧＮＹＡＣＬＬＲＥＤＱＧＷＹＣＫＮＡＧＳＴＶＹＹＰＮＥＫＤＣＥＴＲＧＤＨＶＦＣＤＴＣＡＧＩＮＶＡＥＱＳＲＥＣＮＩＮＩＳＴＴＮＹＰＣＫＶＳＴＧＲＨＰＩＳＭＶＡＬＳＰＬＧＡＬＶＡＣＹＫＧＶＳＣＳＩＧＳＮＷＶＧＩＩＫＱＬＰＫＧＣＳＹＩＴＮＱＤＡＤＴＶＴＩＤＮＴＶＹＱＬＳＫＶＥＧＥＱＨＶＩＫＧＲＰＶＳＳＳＦＤＰＩＫＦＰＥＤＱＦＮＶＡＬＤＱＶＦＥＳＩＥＮＳＱＡＬＶＤＱＳＮＫＣＣＮＡＧＹＩＰＥＡＰＲＤＧＱＡＹＶＲＫＤＧＥＷＶＬＬＳＴＦＬＧＧＬＶＰＲＧＳＨＨＨＨＨＨＳＡＷＳＨＰＱＦＥＫ

配列番号５３
＞Ｌ７Ｆ＿Ｂ１＿４．２
ＭＳＷＫＶＭＩＩＩＳＬＬＩＴＰＱＨＧＬＫＥＳＹＬＥＥＳＣＳＴＩＴＥＧＹＬＳＶＬＲＴＧＷＹＴＮＶＦＭＬＥＶＧＤＶＥＮＬＴＣＴＤＧＰＳＬＩＫＴＥＬＤＬＴＫＳＡＬＲＥＬＫＴＶＳＡＤＱＬＡＲＥＥＱＩＥＱＰＲＱＳＧＣＧＡＧＡＴＡＧＩＡＩＡＫＴＩＲＬＥＳＥＶＮＡＷＫＧＡＬＫＱＴＮＥＶＶＳＴＬＧＮＧＶＲＶＬＶＴＭＶＲＥＬＫＥＦＶＳＫＮＬＴＳＡＬＮＲＮＫＣＤＩＡＤＬＫＭＡＶＳＦＳＱＦＮＲＲＦＬＮＶＶＲＱＦＳＤＮＡＧＩＴＰＡＩＳＬＤＬＭＴＤＡＥＬＡＲＡＶＳＹＭＰＴＳＡＧＱＩＫＬＭＬＥＮＲＡＭＶＲＲＫＧＦＧＩＬＩＧＶＹＧＳＳＶＩＹＭＶＱＬＰＩＦＧＶＩＤＴＰＣＷＩＩＫＡＡＰＳＣＳＥＫＮＧＮＹＡＣＬＬＲＥＤＱＧＷＹＣＫＮＡＧＳＴＶＹＹＰＮＥＫＤＣＥＴＲＧＤＨＶＦＣＤＴＣＡＧＩＮＶＡＥＱＳＲＥＣＮＩＮＩＳＴＴＮＹＰＣＫＶＳＴＧＲＨＰＩＳＭＶＡＬＳＰＬＧＡＬＶＡＣＹＫＧＶＳＣＳＩＧＳＮＷＶＧＩＩＫＱＬＰＫＧＣＳＹＩＴＮＱＤＡＤＴＶＴＩＤＮＴＶＹＱＬＳＫＶＥＧＥＱＨＶＩＫＧＲＰＶＳＳＳＦＤＰＩＫＦＰＥＤＱＦＮＶＡＬＤＱＶＦＥＳＩＥＮＳＱＡＬＶＤＱＳＮＫＩＬＮＳＡＥＳＡＩＧＧＹＩＰＥＡＰＲＤＧＱＡＹＶＲＫＤＧＥＷＶＬＬＳＴＦＬＧＧＬＶＰＲＧＳＨＨＨＨＨＨＳＡＷＳＨＰＱＦＥＫ

【図1】

【図2】

【図3-1】

【図3-2】

【図3-3】

【図4】

【図5-1】

【図5-2】

【図6-1】

【図6-2】

【図7-1】

【図7-2】

【図8】

【配列表】

2024522385000001.app

【手続補正書】

【提出日】2023-10-30

【手続補正1】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】配列表

【補正方法】追加

【補正の内容】

【配列表】

2024522385000001.app

【手続補正書】

【提出日】2023-11-08

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【請求項1】

唯一のｈＭＰＶ抗原としてのヒトメタニューモウイルス（ｈＭＰＶ）Ｆタンパク質又はその断片の安定化された融合前コンフォメーション形態と、任意選択的に１つ以上のアジュバント及び／又は少なくとも１つの薬学的に許容される担体若しくは賦形剤とから本質的になる、免疫原性組成物であって、前記ｈＭＰＶタンパク質が、遺伝子型Ａ又はＢの１つのサブグループに由来し、前記免疫原性組成物が、別のサブグループ及び／又は遺伝子型からのｈＭＰＶを交差中和する、免疫原性組成物。

【請求項2】

前記ヒトメタニューモウイルス（ｈＭＰＶ）Ｆタンパク質又はその断片の前記安定化された融合前コンフォメーション形態が、Ａ１サブグループのものである、及び／又は
前記組成物が、ｉ）前記遺伝子型Ａの前記ヒトメタニューモウイルス（ｈＭＰＶ）Ｆタンパク質又はその断片の安定化された融合前コンフォメーション形態、及びｉｉ）前記遺伝子型Ｂの前記ヒトメタニューモウイルス（ｈＭＰＶ）Ｆタンパク質又はその断片の安定化された融合前コンフォメーション形態と、任意選択的に１つ以上のアジュバント及び／又は少なくとも１つの薬学的に許容される担体若しくは賦形剤とから本質的になり、前記免疫原性組成物が、他のサブグループ及び／又は他の遺伝子型を交差中和する、及び／又は
前記遺伝子型Ａの前記ヒトメタニューモウイルス（ｈＭＰＶ）Ｆタンパク質又はその断片の前記安定化された融合前コンフォメーション形態が、前記Ａ１サブグループのものであり、前記遺伝子型Ｂの前記ヒトメタニューモウイルス（ｈＭＰＶ）Ｆタンパク質又はその断片の前記安定化された融合前コンフォメーション形態が、前記Ｂ１サブグループのものである、及び／又は
前記融合前Ｆタンパク質が、組換えタンパク質である、
請求項１に記載の免疫原性組成物。

【請求項3】

前記融合前Ｆタンパク質が、
細胞質尾部及び／又は膜貫通ドメインを欠いている、及び／又は
前記ｈＭＰＶ株又は臨床分離株に由来する天然Ｆタンパク質の改変アミノ酸配列であるアミノ酸配列を有する、及び／又は
ｈＭＰＶ株ＮＬ／１／００、ＮＬ／１７／００、ＴＮ／９４－４９、ＮＣＬ１７４、ＣＡＮ９７－８３、ＮＬ／１／９、ＮＤＬ００－１、Ｃ１－３３４、ＣＡＮ９７－８２、及びＴＮ／８９－５１５に由来する配列番号１～１０のアミノ酸配列からなる群から選択される天然Ｆタンパク質配列に由来する、及び／又は
配列番号１～１０の天然Ｆタンパク質配列に対して、少なくとも１つの変異（置換又は欠失）、好ましくは、最大１０個の変異を含む、及び／又は
前記融合前Ｆタンパク質が、システインに対する１つ以上のアミノ酸置換を含み、それが前記融合前コンフォメーションを安定化する１つ以上の非天然ジスルフィド結合を導入する、及び／又は
システイン置換が、
位置１０３～１２０のうちのいずれか１つ及び位置３３５～３４５のうちのいずれか１つ、
位置１０７～１１８のうちのいずれか１つ及び位置３３５～３４２のうちのいずれか１つ、
位置１１７～１２９のうちのいずれか１つ及び位置２５６～２６１のうちのいずれか１つ、
位置８７～１０２のうちのいずれか１つ及び位置１１７～１２７のうちのいずれか１つ、
位置１０２～１１３のうちのいずれか１つ及び位置１１７～１２７のうちのいずれか１つ、
位置１０２～１１３のうちのいずれか１つ及び位置８７～１０２のうちのいずれか１つ、
位置３３７～３４１のうちのいずれか１つ及び位置４２１～４２６のうちのいずれか１つ、
位置１１２～１２０のうちのいずれか１つ及び位置４２４～４３２のうちのいずれか１つ、
位置１５０～１５６のうちのいずれか１つ及び位置３９２～４００のうちのいずれか１つ、
位置１１２～１２０のうちのいずれか１つ及び位置３７０～３７７のうちのいずれか１つ、
位置３６５～３７５のうちのいずれか１つ及び位置４５５～４６５のうちのいずれか１つ、
位置３６５～３７５のうちのいずれか１つ及び位置１０５～１１５のうちのいずれか１つ、又は
位置６０～７０のうちのいずれか１つ及び位置１７５～１８５のうちのいずれか１つで導入され、
前記位置が、配列番号１～１０の前記天然Ｆタンパク質配列のアミノ酸に対応する、
請求項１又は２に記載の免疫原性組成物。

【請求項4】

前記融合前Ｆタンパク質が、少なくとも１つの非天然ジスルフィド結合によって安定化された単一ポリペプチド鎖からなる、及び／又は
前記融合前Ｆタンパク質が、少なくとも１つの導入されたジスルフィド結合によって安定化された単一ペプチドを含み、前記天然Ｆタンパク質と比較してＦ１ドメインとＦ２ドメインとの間にプロテアーゼ切断部位を欠いている、及び／又は
前記一本鎖融合前Ｆタンパク質が、前記天然Ｆタンパク質のアミノ酸位置に対して１０２位に、アルギニンの別のアミノ酸、好ましくはグリシンへの置換を含む、及び／又は
前記天然Ｆタンパク質の１０３～１１８位のアミノ酸残基が、少なくとも１つのシステイン残基を含む１～５個のアミノ酸残基からなる異種リンカーで置き換えられ、前記少なくとも１つのシステイン残基が、前記Ｆ１ドメイン内のシステイン残基とジスルフィド結合を形成する、及び／又は
前記異種リンカーが、少なくとも１つのアラニン、グリシン又はバリン残基を含み、好ましくは、前記リンカーが、配列ＣＧＡＧＡ又はＣＧＡＧＶを有する、及び／又は
前記融合前Ｆタンパク質が、前記天然ｈＭＰＶ Ｆタンパク質の４９、５１、６７、８０、１３７、１４７、１５９、１６０、１６１、１６６、１７７、２５８、２６６、４８０、及び／又は４８１位に対応する位置に１つ以上の置換を含む、及び／又は
前記置換が、Ｔ４９Ｍ、Ｅ８０Ｎ、Ｉ１３７Ｗ、Ａ１４７Ｖ、Ａ１５９Ｖ、Ｔ１６０Ｆ、Ａ１６１Ｍ、Ｉ６７Ｌ、Ｉ１７７Ｌ、Ｆ２５８Ｉ、Ｓ２６６Ｄ、Ｉ４８０Ｃ、及び／又はＬ４８１Ｃからなる群から選択される、及び／又は
前記一本鎖融合前Ｆタンパク質が、以下の置換組み合わせ：
Ｎ９７Ｑ、Ｒ１０２Ｇ及びＧ２９４Ｅ；
Ｎ９７Ｑ、Ｒ１０２Ｇ、Ｔ１６０Ｆ、Ｉ１７７Ｌ及びＧ２９４Ｅ；
Ｎ９７Ｑ、Ｒ１０２Ｇ、Ｔ４９Ｍ、Ｉ６７Ｌ、Ａ１６１Ｍ、Ｅ８０Ｎ、Ｆ２５８Ｉ及びＧ２９４Ｅ；
Ｎ９７Ｑ、Ｒ１０２Ｇ、Ｔ４９Ｍ、Ｉ６７Ｌ、Ａ１６１Ｍ、Ｅ５１Ｃ、Ｋ１６６Ｃ、Ｓ２６６Ｄ、Ｇ２９４Ｅ、Ｉ４８０Ｃ及びＬ４８１Ｃ；又は
Ｎ９７Ｑ、Ｒ１０２Ｇ、Ｔ４９Ｍ、Ａ１６１Ｍ、Ｉ１３７Ｗ、Ａ１５９Ｖ、Ａ１４７Ｖ、Ｉ１７７Ｌ、及びＧ２９４Ｅ
のうちの１つを含む、及び／又は
前記融合前Ｆタンパク質が、配列番号１１（Ｌ７Ｆ＿Ａ１＿２３）、配列番号１２（Ｌ７Ｆ＿Ｂ１＿２３）、配列番号１３（Ｌ７Ｆ＿Ａ１＿２３．２）、配列番号１４（Ｌ７Ｆ＿Ｂ１＿２３．２）、配列番号１５（ｓＦ＿Ａ１＿Ｋ＿Ｌ７）、配列番号１６（Ｌ７Ｆ＿Ａ１＿３１）、配列番号１７（Ｌ７Ｆ＿Ａ１＿３３）、配列番号１８（構築物Ｌ７Ｆ＿Ａ１＿４．２）、配列番号５０（構築物ｓＦ＿Ｂ１＿Ｋ＿Ｌ７）、配列番号５１（構築物Ｌ７Ｆ＿Ｂ１＿３１）、配列番号５２（構築物Ｌ７Ｆ＿Ｂ１＿３３）、及び配列番号５３（構築物Ｌ７Ｆ＿Ｂ１＿４．２）から選択されるアミノ酸配列を含むか又はそれからなる、
請求項１～３のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。

【請求項5】

前記融合前Ｆタンパク質が、２つのポリペプチド鎖を有するタンパク質であり、配列番号１９又は配列番号２０のアミノ酸配列を含むか又はそれからなる、及び／又は
前記安定化された融合後Ｆタンパク質が、前記天然Ｆタンパク質のアミノ酸位置と比較して、１０３～１１１位のアミノ酸残基の欠失、リンカーＫＫＲＫＲＲによるＲ１０２の置き換え、及び前記置換Ｇ２９４Ｅを含む、
請求項１～３のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。

【請求項6】

前記融合前Ｆタンパク質が、ｉ）配列番号１～２０からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ｉｉ）その免疫原性が、配列番号１～２０の親Ｆタンパク質の免疫原性と同様である、及び／又は
前記融合前ｈＭＰＶ Ｆタンパク質が、配列番号２３～２８の配列を有する三量体化ヘルパードメイン（フォールドン）又はそのバリアントを含む、及び／又は
前記Ｆタンパク質が、ホモ又はヘテロ三量体として産生される、及び／又は
前記組成物が、更なる非ｈＭＰＶ抗原を含む、及び／又は
前記アジュバントが、ミョウバン、ＣｐＧ、例えば、ＣｐＧ１０１８、ＯＤＮ、Ｉ－ＯＤＮ、ＩＣ３１（登録商標）、ＭＦ５９（登録商標）、ＡｄｄａＶａｘ（商標）、ＡＳ０３、ＡＳ０１、ＱＳ２１、ＭＰＬ、ＧＬＡ－ＳＥ、ＧＬＡ－３Ｍ－０５２－ＬＳ、３Ｍ－０５２－ミョウバン、又はそれらの組み合わせからなる群から選択される、及び／又は
前記アジュバントが、ミョウバン、ＣｐＧ、例えば、ＣｐＧ１０１８、ＯＤＮ、Ｉ－ＯＤＮ、ＩＣ３１（登録商標）、ＭＦ５９（登録商標）、ＡｄｄａＶａｘ（商標）、ＡＳ０３、ＡＳ０１、ＱＳ２１、ＭＰＬ、ＧＬＡ－ＳＥ、ＧＬＡ－３Ｍ－０５２－ＬＳ及び３Ｍ－０５２－ミョウバンからなる群から選択される２つ以上のアジュバントからなる、
請求項１～５のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。

【請求項7】

前記免疫原性組成物が、前記融合前Ｆタンパク質に対する中和抗体を誘発することができる、及び／又は
前記融合前タンパク質又は融合前及び融合後タンパク質を含む前記免疫原性組成物が、同じ総タンパク質量で使用される前記融合後Ｆタンパク質を含む組成物によって誘発される免疫応答（中和抗体価）と比較して、優れた免疫応答（中和抗体価）を提供する、及び／又は
前記免疫原性組成物が、１つより多くのｈＭＰＶ株に対する防御を提供する、及び／又は
前記免疫原性組成物が、遺伝子型ＡのｈＭＰＶ株に対する防御を提供する、及び／又は
前記免疫原性組成物が、遺伝子型ＢのｈＭＰＶ株に対する防御を提供する、及び／又は
前記免疫原性組成物が、遺伝子型Ａ及び遺伝子型ＢのｈＭＰＶ株に対する防御を提供する、及び／又は
前記免疫原性組成物がワクチンである、
請求項１～６のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。

【請求項8】

薬物として使用するための、請求項１～７のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。

【請求項9】

対象におけるｈＭＰＶ感染及び／又は関連疾患の治療及び／又は予防における使用のための、請求項１～８のいずれか一項に記載の免疫原性組成物であって、
前記方法が、前記対象に有効量の請求項１～８のいずれか一項に記載の免疫原性組成物を投与することを含む、及び／又は
前記免疫原性組成物が、筋肉内、皮内、皮下、粘膜、直腸内、又は経口的に投与される、及び／又は
前記方法が、請求項１～８のいずれか一項に記載の免疫原性組成物のプライム・ブースト投与を含み、前記プライム・ブーストが、同じ免疫原性組成物で行われる、及び／又は
前記方法が、請求項１～８のいずれか一項に記載の免疫原性組成物のプライム・ブースト投与を含み、前記プライム投与が、遺伝子型ＡのＦタンパク質を含む組成物で行われ、前記ブースト投与が、遺伝子型ＢのＦタンパク質を含む組成物で行われるか、又はその逆である、及び／又は
前記方法が、融合前ｈＭＰＶ Ｆタンパク質に対する中和抗体を生成し、少なくとも１つの遺伝子型Ａ又はＢ、好ましくは両方のｈＭＰＶ株に対する防御を提供するために、前記対象に治療有効量の請求項１～８のいずれか一項に記載の免疫原性組成物を投与することを含む、
免疫原性組成物。

【請求項10】

請求項１～８のいずれか一項に記載の免疫原性組成物を生成するための方法であって、ｉ）宿主細胞内の発現ベクターに挿入された対応する核酸分子からの組換え融合前Ｆタンパク質の発現、ｉｉ）前記発現された組換えＦタンパク質を精製すること、及びｉｉｉ）前記精製された組換えタンパク質を、薬学的に許容される担体及び／又は賦形剤と、任意選択的にアジュバントと組み合わせることを含む、方法。

【国際調査報告】