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特表2024-522452全分子量分布のヒアルロン酸ナトリウム及びその調製方法と応用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-06-21
(54)【発明の名称】全分子量分布のヒアルロン酸ナトリウム及びその調製方法と応用
(51)【国際特許分類】
C08B 37/08 20060101AFI20240614BHJP
A61K 8/73 20060101ALI20240614BHJP
A61K 31/728 20060101ALI20240614BHJP
A61Q 19/00 20060101ALI20240614BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20240614BHJP
A61K 47/36 20060101ALI20240614BHJP
A23L 33/10 20160101ALI20240614BHJP
【ＦＩ】
C08B37/08 Z
A61K8/73
A61K31/728
A61Q19/00
A61P29/00
A61K47/36
A23L33/10
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023568598
(86)(22)【出願日】2022-07-31
(85)【翻訳文提出日】2023-12-27
(86)【国際出願番号】 CN2022109329
(87)【国際公開番号】W WO2023006108
(87)【国際公開日】2023-02-02
(31)【優先権主張番号】202110874694.1
(32)【優先日】2021-07-30
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】523419897
【氏名又は名称】梅曄生物医藥股▲ふん▼有限公司
【氏名又は名称原語表記】ＭＥＹＥＲ ＢＩＯ－ＭＥＤＩＣＩＮＥ ＣＯ．， ＬＴＤ．
【住所又は居所原語表記】Ｎｏ．６ Ｊｉｎｙｕａｎ Ｒｏａｄ，Ｌｉｃｈｅｎｚｈｕａｎｇ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｐａｒｋ，Ｌａｉｗｕ Ｈｉｇｈ－ｔｅｃｈ Ｚｏｎｅ Ｊｉｎａｎ，Ｓｈａｎｄｏｎｇ ２７１１００，ＣＨＩＮＡ
(71)【出願人】
【識別番号】523419901
【氏名又は名称】山東美貌製藥有限公司
【氏名又は名称原語表記】ＳＨＡＮＤＯＮＧ ＭＥＩＭＡＯ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＣＯ．，ＬＴＤ．
【住所又は居所原語表記】Ｎｏ．６ Ｊｉｎｙｕａｎ Ｒｏａｄ，Ｌｉｃｈｅｎｚｈｕａｎｇ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｐａｒｋ，Ｌａｉｗｕ Ｈｉｇｈ－ｔｅｃｈ Ｚｏｎｅ Ｊｉｎａｎ，Ｓｈａｎｄｏｎｇ ２７１１００，ＣＨＩＮＡ
(71)【出願人】
【識別番号】523419912
【氏名又は名称】山東貫天下生物科技有限公司
【氏名又は名称原語表記】ＳＨＡＮＤＯＮＧ ＧＵＡＮＴＩＡＮＸＩＡ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ＣＯ．，ＬＴＤ．
【住所又は居所原語表記】Ｎｏ．１ Ｘｉｎｇｆｕ Ｓｔｒｅｅｔ，Ｌｉｎｓｈｕ Ｅｃｏｎｏｍｉｃ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｚｏｎｅ Ｌｉｎｙｉ，Ｓｈａｎｄｏｎｇ ２７６０００，ＣＨＩＮＡ
(74)【代理人】
【識別番号】110001841
【氏名又は名称】弁理士法人ＡＴＥＮ
(72)【発明者】
【氏名】▲リン▼ 沛学
(72)【発明者】
【氏名】邵 華栄
(72)【発明者】
【氏名】曽 慶▲カイ▼
【テーマコード（参考）】
4B018
4C076
4C083
4C086
4C090
【Ｆターム（参考）】
4B018MD01
4B018MD18
4B018MD27
4B018MF01
4B018MF06
4B018MF14
4C076BB01
4C076BB31
4C076CC04
4C076EE37
4C076FF70
4C083AD331
4C083CC03
4C083EE12
4C083FF01
4C086AA01
4C086AA03
4C086AA04
4C086EA25
4C086MA01
4C086MA04
4C086NA14
4C086ZB11
4C090AA01
4C090AA05
4C090AA08
4C090AA09
4C090BA67
4C090BD37
4C090BD41
4C090CA31
4C090DA23
4C090DA26
4C090DA27
(57)【要約】
本発明は、全分子量分布のヒアルロン酸ナトリウムの調製方法を提供し、上記方法は以下を含む：ステップ１）であって、ヒアルロン酸ナトリウム固体原料に対して過酸化水素水噴霧及び紫外線照射処理を行い、ヒアルロン酸ナトリウム分解材料を得る。ステップ２）であって、上記ヒアルロン酸ナトリウム分解材料を水に溶解し、ＮａＯＨ溶液でｐＨをアルカリ性に調整することで、ヒアルロン酸ナトリウムのアルカリ性溶液を得る。ステップ３）であって、上記ヒアルロン酸ナトリウムのアルカリ溶液に対して超音波処理を行う。ステップ４）であって、上記ヒアルロン酸固体原料を、０．１％～１％（ｗ／ｖ）の濃度を有するヒアルロン酸ナトリウム溶液に調製し、２０％～６０％（ｖ／ｖ）の添加割合で、超音波処理後のヒアルロン酸ナトリウムのアルカリ性溶液と均一に混合する。ステップ５）であって、それぞれ珪藻土と活性炭を用いて吸着処理を行い、且つナノ濾過膜を用いて濾過濃縮し、乾燥後に得られる。本発明の全分子量分布ヒアルロン酸ナトリウムの調製方法によって、水分補給、保湿、抗炎症、細胞保護等の活性に優れたヒアルロン酸ナトリウムを得ることができる。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
全分子量分布のヒアルロン酸ナトリウムの調製方法であって、前記方法は、
ヒアルロン酸ナトリウム固体原料に対して過酸化水素水噴霧及び紫外線照射処理を行い、ヒアルロン酸ナトリウム分解材料を得る、ステップ１）と、
前記ヒアルロン酸ナトリウム分解材料を水に溶解し、ＮａＯＨ溶液でｐＨをアルカリ性に調整することで、ヒアルロン酸ナトリウムのアルカリ性溶液を得る、ステップ２）と、
前記ヒアルロン酸ナトリウムのアルカリ溶液に対して超音波処理を行う、ステップ３）と、
前記ヒアルロン酸ナトリウム固体原料を、０．１％～１％（ｗ／ｖ）の濃度を有するヒアルロン酸ナトリウム溶液に調製し、２０％～６０％（ｖ／ｖ）の添加割合で、ステップ３）で得られた超音波処理後のヒアルロン酸ナトリウムのアルカリ性溶液と均一に混合する、ステップ４）と、
それぞれ珪藻土と活性炭を用いて吸着処理を行い、且つナノ濾過膜を用いて濾過濃縮し、乾燥した後に前記全分子量分布のヒアルロン酸ナトリウムを得る、ステップ５）とを含む、ことを特徴とする全分子量分布のヒアルロン酸ナトリウムの調製方法。
【請求項2】
前記ステップ１）において、キログラム当たりの前記ヒアルロン酸ナトリウム固体原料は、質量濃度１％～５％の過酸化水素水５０～１００ミリリットルを噴霧し、紫外照射線量が３００～１５００μＷ／ｃｍ２であり、照射時間が５０～７０分である、ことを特徴とする請求項１に記載の全分子量分布のヒアルロン酸ナトリウムの調製方法。
【請求項3】
前記ヒアルロン酸ナトリウム固体原料の分子量は、１００万～２００万である、ことを特徴とする請求項１に記載の全分子量分布のヒアルロン酸ナトリウムの調製方法。
【請求項4】
前記ヒアルロン酸ナトリウム固体原料は、化粧品グレードのヒアルロン酸ナトリウム、食品グレードのヒアルロン酸ナトリウム、医薬グレードのヒアルロン酸ナトリウムのうちの一つ又は複数から選択される、ことを特徴とする請求項３に記載の全分子量分布のヒアルロン酸ナトリウムの調製方法。
【請求項5】
前記ステップ２）において、前記ヒアルロン酸ナトリウム分解材料を水に溶解した後の体積濃度は１％～１０％（ｗ／ｖ）であり、及び／又は、ＮａＯＨ溶液でｐＨを１０～１２に調整する、ことを特徴とする請求項１に記載の全分子量分布のヒアルロン酸ナトリウムの調製方法。
【請求項6】
前記ステップ３）において、超音波処理の周波数は１０～１００ｋＨｚであり、時間は１５～１８０分である、ことを特徴とする請求項１に記載の全分子量分布のヒアルロン酸ナトリウムの調製方法。
【請求項7】
前記ステップ５）において、珪藻土を採用する吸着処理のステップは、以下の含み、
前記ヒアルロン酸ナトリウムのアルカリ溶液の質量に基づき、０．１％～１％（ｗ／ｖ）の珪藻土を加え、４５～８０℃で撹拌して３０～６０分間吸着し、濾過し、及び／又は、
活性炭を採用する吸着処理のステップは、以下を含み、
希酸溶液でｐＨを６～７に調整し、前記ヒアルロン酸ナトリウム溶液の質量に基づく０．１％～１％（ｗ／ｖ）の活性炭を加え、４５～８０℃で撹拌して３０～６０分間吸着し、濾過し、好ましくは、前記希酸溶液は、希塩酸溶液、希硫酸溶液、希酢酸溶液、希次亜塩素酸溶液のうちの一種又は多種から選択される、ことを特徴とする請求項１に記載の全分子量分布のヒアルロン酸ナトリウムの調製方法。
【請求項8】
前記ステップ５）において、前記ナノ濾過膜の分画分子量は２００－３００Ｄａであり、操作圧力を１５－３０ｂａｒに制御し、温度を３０～５０℃に制御する、ことを特徴とする請求項１に記載の全分子量分布のヒアルロン酸ナトリウムの調製方法。
【請求項9】
前記全分子量分布のヒアルロン酸ナトリウムの重量平均分子量範囲は０．２万～１５０万であり、分子量分散係数Ｍｗ／Ｍｎは５以上であり、好ましくは、前記ヒアルロン酸ナトリウムにおけるエンドトキシン含有量は＜０．０１ＥＵであり、タンパク質含有量は＜０．０１％であり、
好ましくは、前記ヒアルロン酸ナトリウムは、２８０ｎｍでＯＤ値＜０．０１であり、２６０ｎｍでＯＤ値＜０．０１である、ことを特徴とする請求項１～８のいずれか一項に記載の調製方法で調製された全分子量分布のヒアルロン酸ナトリウム。
【請求項10】
請求項１～８のいずれか一項に記載の調製方法で調製された全分子量ヒアルロン酸ナトリウムが医薬用、食品用及び／又は化粧品用の保湿剤、潤滑剤、抗炎症剤及び／又は細胞修復剤の調製における応用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本出願は生体材料技術分野に関し、具体的には全分子量分布のヒアルロン酸ナトリウム及びその調製方法と応用に関する。
【0002】
ヒアルロン酸（Ｈａｌｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ，ＨＡ）は、Ｄ－グルクロン酸とＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミンが連結された直鎖多糖であり、分子量が数十万から数百万ダルトンであり、動物組織、特にヒトの皮膚、臍帯、硝子体および関節滑液に広く分布しており、植物や微生物にも広く分布している。天然では、ＨＡ構造は同一であり、人種差がなく、免疫原性がない。
【0003】
ＨＡは高濃度（１％）では分子間が網目状に存在し、高い粘弾性を有する。ＨＡの水溶液は粘弾性流体であり、細胞とコラーゲン繊維の空間に充填され且つ特定の表皮組織を覆い、主な機能は細胞を保護及び潤滑し、この弾性マトリックスにおける細胞の移動を調整することである。皮膚において、ＨＡは水分を閉じ込めることができ、皮膚を滑らかで柔らかくし、皮膚の弾性を維持する。人体関節滑液におけるＨＡは、関節を潤滑し、有害な信号因子の刺激を隔離し、関節軟骨を保護する機能を果たすことができる。眼硝子体中のＨＡは、眼房を支え、網膜を保護し、眼を明るくする働きをする。ＨＡは国際的に認められた理想的な天然保湿因子であり、様々な化粧品に応用することができ、美容保湿の効果を果たす。ＨＡは経口吸収した後、体内ＨＡの合成に関与することができ、人体皮膚、関節腔及び眼硝子体に分布し、関節滑液内のヒアルロン酸を補充することができ、皮膚弾性を増加させる。
【0004】
ＨＡは生産及び応用する時にヒアルロン酸ナトリウムの形態で存在することが多く、異なる種類のヒアルロン酸ナトリウムは効果の差が大きく、例えば、高分子量ヒアルロン酸ナトリウム（分子量＞５０万）は比較的良好な粘膜保護作用を有し、低分子量ヒアルロン酸ナトリウム（分子量１万～５０万）及びオリゴヒアルロン酸ナトリウム（分子量＜１万）は皮膚浸透能力及び経口吸収能力の方面において比較的良好な利点を有する。現在、ヒアルロン酸製品は主に単一分子量分布のヒアルロン酸に集中し、分子量分布の幅が狭く、品質のばらつきがある。そのため、従来の方法は広い分子量分布のヒアルロン酸ナトリウムを取得しようとすれば、各分子量段のヒアルロン酸ナトリウムを混合して配合する必要があり、しかし、異なる分子量のヒアルロン酸ナトリウム製品の間の粘度等の性能差が大きく、直接混合して取得した生成物の均一性を保証しにくい。従来技術においてさらにいくつかの物理的、化学的又は生物系のヒアルロン酸ナトリウムの分解方法を提供する。しかし従来の分解方法で処理した後のヒアルロン酸ナトリウムの分子量分布が均一ではなく、安定性に劣り、ヒアルロン酸ナトリウム製品の品質をさらに向上させることが困難である。
【0005】
上記問題を解決するために、本発明は均一性に優れ、安定性が高く且つ全分子量分布の高品質ヒアルロン酸ナトリウム、及びその調製方法と応用を提供することを目的とする。
【0006】
一方、本出願は全分子量分布のヒアルロン酸ナトリウムの調製方法を提供し、上記方法は以下を含む：
ステップ１）であって、ヒアルロン酸ナトリウム固体原料に対して過酸化水素水噴霧及び紫外線照射処理を行い、ヒアルロン酸ナトリウム分解材料を得る。
ステップ２）であって、上記ヒアルロン酸ナトリウム分解材料を水に溶解し、ＮａＯＨ溶液でｐＨをアルカリ性に調整することで、ヒアルロン酸ナトリウムのアルカリ性溶液を得る。
ステップ３）であって、上記ヒアルロン酸ナトリウムのアルカリ溶液に対して超音波処理を行う。
ステップ４）であって、上記ヒアルロン酸ナトリウム固体原料を、０．１％～１％（ｗ／ｖ）の濃度を有するヒアルロン酸ナトリウム溶液に調製し、２０％～６０％（ｖ／ｖ）の添加割合で、ステップ３）で得られた超音波処理後のヒアルロン酸ナトリウムのアルカリ性溶液と均一に混合する。
ステップ５）であって、それぞれ珪藻土と活性炭を用いて吸着処理を行い、且つナノ濾過膜を用いて濾過濃縮し、乾燥した後に上記全分子量分布のヒアルロン酸ナトリウムを得る。
ステップ１）であって、ヒアルロン酸ナトリウム固体原料に対して過酸化水素水噴霧及び紫外線照射処理を行い、ヒアルロン酸ナトリウム分解材料を得る。
ステップ２）であって、上記ヒアルロン酸ナトリウム分解材料を水に溶解し、ＮａＯＨ溶液でｐＨをアルカリ性に調整することで、ヒアルロン酸ナトリウムのアルカリ性溶液を得る。
ステップ３）であって、上記ヒアルロン酸ナトリウムのアルカリ溶液に対して超音波処理を行う。
ステップ４）であって、上記ヒアルロン酸ナトリウム固体原料を、０．１％～１％（ｗ／ｖ）の濃度を有するヒアルロン酸ナトリウム溶液に調製し、２０％～６０％（ｖ／ｖ）の添加割合で、ステップ３）で得られた超音波処理後のヒアルロン酸ナトリウムのアルカリ性溶液と均一に混合する。
ステップ５）であって、それぞれ珪藻土と活性炭を用いて吸着処理を行い、且つナノ濾過膜を用いて濾過濃縮し、乾燥した後に上記全分子量分布のヒアルロン酸ナトリウムを得る。
【0007】
さらに、上記ステップ１）において、キログラム当たりの上記ヒアルロン酸ナトリウム固体原料は、質量濃度１％～５％の過酸化水素水５０～１００ミリリットルを噴霧し、紫外照射線量が３００～１５００μＷ／ｃｍ２であり、照射時間が５０～７０分である。
【0008】
理解されるように、本出願における上記紫外線照射線量は単位面積で受けた紫外線の光束を指す。選択的に、上記紫外線照射のステップは紫外線ランプの下に置いて照射を行うことで、そのうち紫外線ランプの照射波長は２００－４００ｎｍであり、好ましくは２２０－３２０ｎｍである。
【0009】
さらに、上記ヒアルロン酸ナトリウム固体原料の分子量は、１００万～２００万である。
【0010】
本明細書に記載されるヒアルロン酸ナトリウムの分子量は、その重量平均分子量（mass average molar mass）を指すことが理解される。
【0011】
さらに、使用されるヒアルロン酸ナトリウム固体原料は、化粧品グレードのヒアルロン酸ナトリウム、食品グレードのヒアルロン酸ナトリウム、医薬グレードのヒアルロン酸ナトリウムのうちの一つ又は複数から選択される。
【0012】
さらに、上記ステップ２）において、上記ヒアルロン酸ナトリウム分解材料を水に溶解した後の体積濃度は１％～１０％（ｗ／ｖ）である。及び／又は、ＮａＯＨ溶液でｐＨを１０～１２に調整する。
【0013】
さらに、上記ステップ３）において、超音波処理の周波数は１０～１００ｋＨｚであり、時間は１５～１８０分である。
【0014】
さらに、上記ステップ５）において、珪藻土を採用する吸着処理ステップは以下を含む： 上記ヒアルロン酸ナトリウムのアルカリ溶液の質量に基づき、０．１％～１％（ｗ／ｖ）の珪藻土を加え、４５～８０℃で撹拌して３０～６０分間吸着し、濾過する。及び／又は、活性炭による吸着処理のステップは以下を含む：希酸溶液でｐＨを６～７に調整し、上記ヒアルロン酸ナトリウム溶液の質量に基づく０．１％～１％（ｗ／ｖ）の活性炭を加え、４５～８０℃で撹拌して３０～６０分間吸着し、濾過する。好ましくは、上記希酸溶液は、希塩酸溶液、希硫酸溶液、希酢酸溶液、希次亜塩素酸溶液のうちの一種又は多種から選択される。
【0015】
さらに、上記ステップ５）において、上記ナノ濾過膜の分画分子量は２００－３００Ｄａであり、操作圧力を１５－３０ｂａｒに制御し、温度を３０～５０℃に制御する。
【0016】
一方、本出願はさらに上記方法で調製された全分子量分布のヒアルロン酸ナトリウムを提供し、上記全分子量分布のヒアルロン酸ナトリウムの重量平均分子量範囲は、０．２万～１５０万であり、分子量分散係数Ｍｗ／Ｍｎは５以上である。
好ましくは、上記ヒアルロン酸ナトリウムにおけるエンドトキシン含有量は＜０．０１ＥＵであり、タンパク質含有量は＜０．０１％である。
好ましくは、上記ヒアルロン酸ナトリウムは、２８０ｎｍでＯＤ値＜０．０１であり、２６０ｎｍでＯＤ値＜０．０１である。
好ましくは、上記ヒアルロン酸ナトリウムにおけるエンドトキシン含有量は＜０．０１ＥＵであり、タンパク質含有量は＜０．０１％である。
好ましくは、上記ヒアルロン酸ナトリウムは、２８０ｎｍでＯＤ値＜０．０１であり、２６０ｎｍでＯＤ値＜０．０１である。
【0017】
一方、本出願はさらに上記調製方法で調製されたヒアルロン酸ナトリウムが医薬用、食品用及び／又は化粧品用の保湿剤、潤滑剤、抗炎症剤及び／又は細胞修復剤の調製における応用を提供する。
【0018】
従来技術に比べ、本発明の有益な効果は以下のとおりである：
１、本発明の提供する調製方法は迅速に、効率的に全分子量分布のヒアルロン酸ナトリウムを調製して得ることができ、調製されたヒアルロン酸ナトリウムは均一性に優れ、安定性が高く、各分子量のヒアルロン酸ナトリウムの効能優位性を十分に利用することができ、分子量分散係数Ｍｗ／Ｍｎは５以上である。
２、本発明の提供する全分子量ヒアルロン酸ナトリウムの調製方法は、同時に紫外線照射分解、超音波－アルカリ分解処理、珪藻土濾過、活性炭吸着及びナノ膜濾過を融合し、得られたヒアルロン酸ナトリウムのエンドトキシン含有量＜０．０１ＥＵ、タンパク質含有量＜０．０１％、２８０ｎｍでＯＤ値＜０．０１、２６０ｎｍでＯＤ値＜０．０１であり、より高い生体適合性を有し、より高い品質レベルに達することができ、ヒアルロン酸ナトリウムが皮膚保湿、細胞保護、経口などの方面における応用効果を向上させることに有利である。
３、本発明の提供する全分子量ヒアルロン酸ナトリウムの調製方法は、紫外線照射分解、超音波分解を高粘度ヒアルロン酸溶液の濾過前に置き、高粘度溶液の濾過の難易度を大幅に低下させ、調製効率及び収率を向上させ、不純物の除去効率を向上させる。
４、本発明の提供する全分子量ヒアルロン酸ナトリウムの調製方法は、得られた高品質全分子量分布ヒアルロン酸ナトリウムは、優れたスマート補水保湿、抗炎症及び細胞保護等の活性を備える。
１、本発明の提供する調製方法は迅速に、効率的に全分子量分布のヒアルロン酸ナトリウムを調製して得ることができ、調製されたヒアルロン酸ナトリウムは均一性に優れ、安定性が高く、各分子量のヒアルロン酸ナトリウムの効能優位性を十分に利用することができ、分子量分散係数Ｍｗ／Ｍｎは５以上である。
２、本発明の提供する全分子量ヒアルロン酸ナトリウムの調製方法は、同時に紫外線照射分解、超音波－アルカリ分解処理、珪藻土濾過、活性炭吸着及びナノ膜濾過を融合し、得られたヒアルロン酸ナトリウムのエンドトキシン含有量＜０．０１ＥＵ、タンパク質含有量＜０．０１％、２８０ｎｍでＯＤ値＜０．０１、２６０ｎｍでＯＤ値＜０．０１であり、より高い生体適合性を有し、より高い品質レベルに達することができ、ヒアルロン酸ナトリウムが皮膚保湿、細胞保護、経口などの方面における応用効果を向上させることに有利である。
３、本発明の提供する全分子量ヒアルロン酸ナトリウムの調製方法は、紫外線照射分解、超音波分解を高粘度ヒアルロン酸溶液の濾過前に置き、高粘度溶液の濾過の難易度を大幅に低下させ、調製効率及び収率を向上させ、不純物の除去効率を向上させる。
４、本発明の提供する全分子量ヒアルロン酸ナトリウムの調製方法は、得られた高品質全分子量分布ヒアルロン酸ナトリウムは、優れたスマート補水保湿、抗炎症及び細胞保護等の活性を備える。
【発明を実施するための形態】
【0019】
本出願の全体的な概念をより明確に説明するために、以下では、実施例として詳細に説明する。当業者であれば、以下の実施例は、本発明を説明するためにのみ使用されるものであり、本発明の範囲を限定するものとみなされるべきではないことを理解するであろう。
【0020】
実施例１
該実施例は全分子量分布ヒアルロン酸ナトリウムの調製方法を提供し、具体的には以下のステップを含む：
ステップ１）であって、分子量が１００万の食品グレードのヒアルロン酸ナトリウム原料１ｋｇを取り、ヒアルロン酸ナトリウム原料の表面に１％の過酸化水素水５０ｍＬを均一に噴霧し、３００μＷ／ｃｍ２の線量で紫外線照射を６０分間行う。
ステップ２）であって、紫外線照射後のヒアルロン酸ナトリウム材料を水に溶解し、濃度が１％（ｗ／ｖ）であり、室温で撹拌し、完全に溶解させる。
ステップ３）であって、２％のＮａＯＨ溶液を用いてｐＨを１０に調整し、１０ｋＨｚの超音波下で１５分間超音波処理する。
ステップ４）であって、濃度１％（ｗ／ｖ）の１００万ヒアルロン酸ナトリウム溶液を調製し、添加割合６０％（ｖ／ｖ）で上記処理後のヒアルロン酸ナトリウムのアルカリ性溶液と混合する。
ステップ５）であって、０．１％の珪藻土を用い、４５℃で攪拌し、３０分間吸着処理し、濾過する。
ステップ６）であって、２％の希塩酸溶液でｐＨを５．０に調整した後、０．１％の活性炭を用いて４５℃で攪拌し、３０分間吸着処理し、濾過する。
ステップ７）であって、ナノ濾過膜システムを用いて濾過液を濃縮し、そのうちナノ濾過膜の分画分子量が３００Ｄａであり、操作圧力が１５ｂａｒであり、温度を４０℃に制御し、ナノ濾過濃縮液を得て、それを噴霧乾燥し、高品質の全分子量分布ヒアルロン酸ナトリウムのサンプルを得る。
該実施例は全分子量分布ヒアルロン酸ナトリウムの調製方法を提供し、具体的には以下のステップを含む：
ステップ１）であって、分子量が１００万の食品グレードのヒアルロン酸ナトリウム原料１ｋｇを取り、ヒアルロン酸ナトリウム原料の表面に１％の過酸化水素水５０ｍＬを均一に噴霧し、３００μＷ／ｃｍ２の線量で紫外線照射を６０分間行う。
ステップ２）であって、紫外線照射後のヒアルロン酸ナトリウム材料を水に溶解し、濃度が１％（ｗ／ｖ）であり、室温で撹拌し、完全に溶解させる。
ステップ３）であって、２％のＮａＯＨ溶液を用いてｐＨを１０に調整し、１０ｋＨｚの超音波下で１５分間超音波処理する。
ステップ４）であって、濃度１％（ｗ／ｖ）の１００万ヒアルロン酸ナトリウム溶液を調製し、添加割合６０％（ｖ／ｖ）で上記処理後のヒアルロン酸ナトリウムのアルカリ性溶液と混合する。
ステップ５）であって、０．１％の珪藻土を用い、４５℃で攪拌し、３０分間吸着処理し、濾過する。
ステップ６）であって、２％の希塩酸溶液でｐＨを５．０に調整した後、０．１％の活性炭を用いて４５℃で攪拌し、３０分間吸着処理し、濾過する。
ステップ７）であって、ナノ濾過膜システムを用いて濾過液を濃縮し、そのうちナノ濾過膜の分画分子量が３００Ｄａであり、操作圧力が１５ｂａｒであり、温度を４０℃に制御し、ナノ濾過濃縮液を得て、それを噴霧乾燥し、高品質の全分子量分布ヒアルロン酸ナトリウムのサンプルを得る。
【0021】
実施例２
該実施例は全分子量分布ヒアルロン酸ナトリウムの調製方法を提供し、具体的には以下のステップを含む：
ステップ１）であって、分子量が１２０万の食品グレードのヒアルロン酸ナトリウム原料１ｋｇを取り、ヒアルロン酸ナトリウム原料の表面に３％の過酸化水素水８０ｍＬを均一に噴霧し、６００μＷ／ｃｍ２の線量で紫外線照射を６０分間行う。
ステップ２）であって、紫外線照射後のヒアルロン酸ナトリウム材料を水に溶解し、濃度が３％（ｗ／ｖ）であり、室温で撹拌し、完全に溶解させる。
ステップ３）であって、５％のＮａＯＨ溶液を用いてｐＨを１２に調整し、３０ｋＨｚの超音波下で３０分間超音波処理する。
ステップ４）であって、濃度０．８％（ｗ／ｖ）の１２０万ヒアルロン酸ナトリウム溶液を調製し、添加割合４０％（ｖ／ｖ）で上記処理後のヒアルロン酸ナトリウムのアルカリ性溶液と混合する。
ステップ５）であって、０．２％の珪藻土を用い、５０℃で攪拌し、４０分間吸着処理し、濾過する。
ステップ６）であって、２％の希硫酸溶液でｐＨを５．０に調整した後、０．３％の活性炭を用いて５０℃で攪拌し、５０分間吸着処理し、濾過する。
ステップ７）であって、ナノ濾過膜システムを用いて濾過液を濃縮し、そのうちナノ濾過膜の分画分子量が２５０Ｄａであり、操作圧力が２０ｂａｒであり、温度を５０℃に制御し、ナノ濾過濃縮液を得て、それを噴霧乾燥し、高品質の全分子量分布ヒアルロン酸ナトリウムのサンプルを得る。
該実施例は全分子量分布ヒアルロン酸ナトリウムの調製方法を提供し、具体的には以下のステップを含む：
ステップ１）であって、分子量が１２０万の食品グレードのヒアルロン酸ナトリウム原料１ｋｇを取り、ヒアルロン酸ナトリウム原料の表面に３％の過酸化水素水８０ｍＬを均一に噴霧し、６００μＷ／ｃｍ２の線量で紫外線照射を６０分間行う。
ステップ２）であって、紫外線照射後のヒアルロン酸ナトリウム材料を水に溶解し、濃度が３％（ｗ／ｖ）であり、室温で撹拌し、完全に溶解させる。
ステップ３）であって、５％のＮａＯＨ溶液を用いてｐＨを１２に調整し、３０ｋＨｚの超音波下で３０分間超音波処理する。
ステップ４）であって、濃度０．８％（ｗ／ｖ）の１２０万ヒアルロン酸ナトリウム溶液を調製し、添加割合４０％（ｖ／ｖ）で上記処理後のヒアルロン酸ナトリウムのアルカリ性溶液と混合する。
ステップ５）であって、０．２％の珪藻土を用い、５０℃で攪拌し、４０分間吸着処理し、濾過する。
ステップ６）であって、２％の希硫酸溶液でｐＨを５．０に調整した後、０．３％の活性炭を用いて５０℃で攪拌し、５０分間吸着処理し、濾過する。
ステップ７）であって、ナノ濾過膜システムを用いて濾過液を濃縮し、そのうちナノ濾過膜の分画分子量が２５０Ｄａであり、操作圧力が２０ｂａｒであり、温度を５０℃に制御し、ナノ濾過濃縮液を得て、それを噴霧乾燥し、高品質の全分子量分布ヒアルロン酸ナトリウムのサンプルを得る。
【0022】
実施例３
該実施例は全分子量分布ヒアルロン酸ナトリウムの調製方法を提供し、具体的には以下のステップを含む：
ステップ１）であって、分子量が１２０万の化粧品グレードのヒアルロン酸ナトリウム原料１ｋｇを取り、ヒアルロン酸ナトリウム原料の表面に５％の過酸化水素水８０ｍＬを均一に噴霧し、９００μＷ／ｃｍ２の線量で紫外線照射を６０分間行う。
ステップ２）であって、紫外線照射後のヒアルロン酸ナトリウム材料を水に溶解し、濃度が５％（ｗ／ｖ）であり、室温で撹拌し、完全に溶解させる。
ステップ３）であって、５％（ｗ／ｖ）のＮａＯＨ溶液を用いてｐＨを１２に調整し、６０ｋＨｚの超音波下で６０分間超音波処理する。
ステップ４）であって、濃度０．６％（ｗ／ｖ）の１２０万の高分子量ヒアルロン酸ナトリウム溶液を調製し、添加割合４０％（ｖ／ｖ）で上記処理後のヒアルロン酸ナトリウムのアルカリ性溶液と混合する。
ステップ５）であって、０．４％の珪藻土を用い、５５℃で攪拌し、４０分間吸着処理し、濾過する。
ステップ６）であって、２％の希硫酸溶液でｐＨを５．０に調整した後、０．３％の活性炭を用いて５５℃で攪拌し、５０分間吸着処理し、濾過する。
ステップ７）であって、ナノ濾過膜システムを用いて濾過液を濃縮し、そのうちナノ濾過膜の分画分子量が２００Ｄａであり、操作圧力が３０ｂａｒであり、温度を５０℃に制御し、ナノ濾過濃縮液を得て、それを噴霧乾燥し、高品質の全分子量分布ヒアルロン酸ナトリウムのサンプルを得る。
該実施例は全分子量分布ヒアルロン酸ナトリウムの調製方法を提供し、具体的には以下のステップを含む：
ステップ１）であって、分子量が１２０万の化粧品グレードのヒアルロン酸ナトリウム原料１ｋｇを取り、ヒアルロン酸ナトリウム原料の表面に５％の過酸化水素水８０ｍＬを均一に噴霧し、９００μＷ／ｃｍ２の線量で紫外線照射を６０分間行う。
ステップ２）であって、紫外線照射後のヒアルロン酸ナトリウム材料を水に溶解し、濃度が５％（ｗ／ｖ）であり、室温で撹拌し、完全に溶解させる。
ステップ３）であって、５％（ｗ／ｖ）のＮａＯＨ溶液を用いてｐＨを１２に調整し、６０ｋＨｚの超音波下で６０分間超音波処理する。
ステップ４）であって、濃度０．６％（ｗ／ｖ）の１２０万の高分子量ヒアルロン酸ナトリウム溶液を調製し、添加割合４０％（ｖ／ｖ）で上記処理後のヒアルロン酸ナトリウムのアルカリ性溶液と混合する。
ステップ５）であって、０．４％の珪藻土を用い、５５℃で攪拌し、４０分間吸着処理し、濾過する。
ステップ６）であって、２％の希硫酸溶液でｐＨを５．０に調整した後、０．３％の活性炭を用いて５５℃で攪拌し、５０分間吸着処理し、濾過する。
ステップ７）であって、ナノ濾過膜システムを用いて濾過液を濃縮し、そのうちナノ濾過膜の分画分子量が２００Ｄａであり、操作圧力が３０ｂａｒであり、温度を５０℃に制御し、ナノ濾過濃縮液を得て、それを噴霧乾燥し、高品質の全分子量分布ヒアルロン酸ナトリウムのサンプルを得る。
【0023】
実施例４
該実施例は全分子量分布ヒアルロン酸ナトリウムの調製方法を提供し、具体的には以下のステップを含む：
ステップ１）であって、分子量が１４０万の化粧品グレードのヒアルロン酸ナトリウム原料１ｋｇを取り、ヒアルロン酸ナトリウム原料の表面に５％の過酸化水素水１００ｍＬを均一に噴霧し、１２００μＷ／ｃｍ２の線量で紫外線照射を６０分間行う。
ステップ２）であって、紫外線照射後のヒアルロン酸ナトリウム材料を水に溶解し、濃度が５％（ｗ／ｖ）であり、室温で撹拌し、完全に溶解させる。
ステップ３）であって、６％（ｗ／ｖ）のＮａＯＨ溶液を用いてｐＨを１２に調整し、９０ｋＨｚの超音波下で６０分間超音波処理する。
ステップ４）であって、濃度０．３％（ｗ／ｖ）の１４０万の高分子量ヒアルロン酸ナトリウム溶液を調製し、添加割合３０％（ｖ／ｖ）で上記処理後のヒアルロン酸ナトリウムのアルカリ性溶液と混合する。
ステップ５）であって、０．６％の珪藻土を用い、５５℃で攪拌し、６０分間吸着処理し、濾過する。
ステップ６）であって、２％の希硫酸溶液でｐＨを５．０に調整した後、０．４％の活性炭を用いて５５℃で攪拌し、６０分間吸着処理し、濾過する。
ステップ７）：であって、ナノ濾過膜システムを用いて濾過液を濃縮し、そのうちナノ濾過膜の分画分子量が２００Ｄａであり、操作圧力が３０ｂａｒであり、温度を５０℃に制御し、ナノ濾過濃縮液を得て、それを噴霧乾燥し、高品質の全分子量分布ヒアルロン酸ナトリウムのサンプルを得る。
該実施例は全分子量分布ヒアルロン酸ナトリウムの調製方法を提供し、具体的には以下のステップを含む：
ステップ１）であって、分子量が１４０万の化粧品グレードのヒアルロン酸ナトリウム原料１ｋｇを取り、ヒアルロン酸ナトリウム原料の表面に５％の過酸化水素水１００ｍＬを均一に噴霧し、１２００μＷ／ｃｍ２の線量で紫外線照射を６０分間行う。
ステップ２）であって、紫外線照射後のヒアルロン酸ナトリウム材料を水に溶解し、濃度が５％（ｗ／ｖ）であり、室温で撹拌し、完全に溶解させる。
ステップ３）であって、６％（ｗ／ｖ）のＮａＯＨ溶液を用いてｐＨを１２に調整し、９０ｋＨｚの超音波下で６０分間超音波処理する。
ステップ４）であって、濃度０．３％（ｗ／ｖ）の１４０万の高分子量ヒアルロン酸ナトリウム溶液を調製し、添加割合３０％（ｖ／ｖ）で上記処理後のヒアルロン酸ナトリウムのアルカリ性溶液と混合する。
ステップ５）であって、０．６％の珪藻土を用い、５５℃で攪拌し、６０分間吸着処理し、濾過する。
ステップ６）であって、２％の希硫酸溶液でｐＨを５．０に調整した後、０．４％の活性炭を用いて５５℃で攪拌し、６０分間吸着処理し、濾過する。
ステップ７）：であって、ナノ濾過膜システムを用いて濾過液を濃縮し、そのうちナノ濾過膜の分画分子量が２００Ｄａであり、操作圧力が３０ｂａｒであり、温度を５０℃に制御し、ナノ濾過濃縮液を得て、それを噴霧乾燥し、高品質の全分子量分布ヒアルロン酸ナトリウムのサンプルを得る。
【0024】
実施例５
該実施例は全分子量分布ヒアルロン酸ナトリウムの調製方法を提供し、具体的には以下のステップを含む：
ステップ１）であって、分子量が１５０万の化粧品グレードのヒアルロン酸ナトリウム原料１ｋｇを取り、ヒアルロン酸ナトリウム原料の表面に５％の過酸化水素水１００ｍＬを均一に噴霧し、１５００μＷ／ｃｍ２の線量で紫外線照射を６０分間行う。
ステップ２）であって、紫外線照射後のヒアルロン酸ナトリウム材料を水に溶解し、濃度が３％（ｗ／ｖ）であり、室温で撹拌し、完全に溶解させる。
ステップ３）であって、５％のＮａＯＨ溶液を用いてｐＨを１２に調整し、９０ｋＨｚの超音波下で６０分間超音波処理する。
ステップ４）であって、濃度０．３％（ｗ／ｖ）の１５０万の高分子量ヒアルロン酸ナトリウム溶液を調製し、添加割合２０％（ｖ／ｖ）で上記処理後のヒアルロン酸アルカリ性溶液と混合する。
ステップ５）であって、０．８％の珪藻土を用い、５５℃で攪拌し、３０分間吸着処理し、濾過する。
ステップ６）であって、２％の希硫酸溶液でｐＨを５．０に調整した後、０．６％の活性炭を用いて５５℃で攪拌し、３０分間吸着処理し、濾過する。
ステップ７）：であって、ナノ濾過膜システムを用いて濾過液を濃縮し、そのうちナノ濾過膜の分画分子量が３００Ｄａであり、操作圧力が３０ｂａｒであり、温度を５０℃に制御し、ナノ濾過濃縮液を得て、それを噴霧乾燥し、高品質の全分子量分布ヒアルロン酸ナトリウムのサンプルを得る。
該実施例は全分子量分布ヒアルロン酸ナトリウムの調製方法を提供し、具体的には以下のステップを含む：
ステップ１）であって、分子量が１５０万の化粧品グレードのヒアルロン酸ナトリウム原料１ｋｇを取り、ヒアルロン酸ナトリウム原料の表面に５％の過酸化水素水１００ｍＬを均一に噴霧し、１５００μＷ／ｃｍ２の線量で紫外線照射を６０分間行う。
ステップ２）であって、紫外線照射後のヒアルロン酸ナトリウム材料を水に溶解し、濃度が３％（ｗ／ｖ）であり、室温で撹拌し、完全に溶解させる。
ステップ３）であって、５％のＮａＯＨ溶液を用いてｐＨを１２に調整し、９０ｋＨｚの超音波下で６０分間超音波処理する。
ステップ４）であって、濃度０．３％（ｗ／ｖ）の１５０万の高分子量ヒアルロン酸ナトリウム溶液を調製し、添加割合２０％（ｖ／ｖ）で上記処理後のヒアルロン酸アルカリ性溶液と混合する。
ステップ５）であって、０．８％の珪藻土を用い、５５℃で攪拌し、３０分間吸着処理し、濾過する。
ステップ６）であって、２％の希硫酸溶液でｐＨを５．０に調整した後、０．６％の活性炭を用いて５５℃で攪拌し、３０分間吸着処理し、濾過する。
ステップ７）：であって、ナノ濾過膜システムを用いて濾過液を濃縮し、そのうちナノ濾過膜の分画分子量が３００Ｄａであり、操作圧力が３０ｂａｒであり、温度を５０℃に制御し、ナノ濾過濃縮液を得て、それを噴霧乾燥し、高品質の全分子量分布ヒアルロン酸ナトリウムのサンプルを得る。
【0025】
実施例６
該実施例は全分子量分布ヒアルロン酸ナトリウムの調製方法を提供し、具体的には以下のステップを含む：
ステップ１）であって、分子量が２００万の化粧品グレードのヒアルロン酸ナトリウム原料１ｋｇを取り、ヒアルロン酸ナトリウム原料の表面に５％の過酸化水素水１００ｍＬを均一に噴霧し、１５００μＷ／ｃｍ２の線量で紫外線照射を６０分間行う。
ステップ２）であって、紫外線照射後のヒアルロン酸ナトリウム材料を水に溶解し、濃度が１％（ｗ／ｖ）であり、室温で撹拌し、完全に溶解させる。
ステップ３）であって、５％のＮａＯＨ溶液を用いてｐＨを１２に調整し、１００ｋＨｚの超音波下で６０分間超音波処理する。
ステップ４）であって、濃度０．１％（ｗ／ｖ）の２００万の高分子量ヒアルロン酸ナトリウム溶液を調製し、添加割合３０％（ｖ／ｖ）で上記処理後のヒアルロン酸ナトリウムのアルカリ性溶液と混合する。
ステップ５）であって、１％の珪藻土を用い、５５℃で攪拌し、５０分間吸着処理し、濾過する。
ステップ６）であって、２％の希硫酸溶液でｐＨを５．０に調整した後、１％の活性炭を用いて５５℃で攪拌し、５０分間吸着処理し、濾過する。
ステップ７）：であって、ナノ濾過膜システムを用いて濾過液を濃縮し、そのうちナノ濾過膜の分画分子量が３００Ｄａであり、操作圧力が３０ｂａｒであり、温度を５０℃に制御し、ナノ濾過濃縮液を得て、それを噴霧乾燥し、高品質の全分子量分布ヒアルロン酸ナトリウムのサンプルを得る。
該実施例は全分子量分布ヒアルロン酸ナトリウムの調製方法を提供し、具体的には以下のステップを含む：
ステップ１）であって、分子量が２００万の化粧品グレードのヒアルロン酸ナトリウム原料１ｋｇを取り、ヒアルロン酸ナトリウム原料の表面に５％の過酸化水素水１００ｍＬを均一に噴霧し、１５００μＷ／ｃｍ２の線量で紫外線照射を６０分間行う。
ステップ２）であって、紫外線照射後のヒアルロン酸ナトリウム材料を水に溶解し、濃度が１％（ｗ／ｖ）であり、室温で撹拌し、完全に溶解させる。
ステップ３）であって、５％のＮａＯＨ溶液を用いてｐＨを１２に調整し、１００ｋＨｚの超音波下で６０分間超音波処理する。
ステップ４）であって、濃度０．１％（ｗ／ｖ）の２００万の高分子量ヒアルロン酸ナトリウム溶液を調製し、添加割合３０％（ｖ／ｖ）で上記処理後のヒアルロン酸ナトリウムのアルカリ性溶液と混合する。
ステップ５）であって、１％の珪藻土を用い、５５℃で攪拌し、５０分間吸着処理し、濾過する。
ステップ６）であって、２％の希硫酸溶液でｐＨを５．０に調整した後、１％の活性炭を用いて５５℃で攪拌し、５０分間吸着処理し、濾過する。
ステップ７）：であって、ナノ濾過膜システムを用いて濾過液を濃縮し、そのうちナノ濾過膜の分画分子量が３００Ｄａであり、操作圧力が３０ｂａｒであり、温度を５０℃に制御し、ナノ濾過濃縮液を得て、それを噴霧乾燥し、高品質の全分子量分布ヒアルロン酸ナトリウムのサンプルを得る。
【0026】
比較例１
該比較例はある商品化された市販のヒアルロン酸ナトリウム１号（化粧品グレード、１２５万の重量平均分子量）を選択する。
該比較例はある商品化された市販のヒアルロン酸ナトリウム１号（化粧品グレード、１２５万の重量平均分子量）を選択する。
【0027】
比較例２
該比較例はある商品化された市販のヒアルロン酸ナトリウム２号（化粧品グレード、１０万の重量平均分子量）を選択する。
該比較例はある商品化された市販のヒアルロン酸ナトリウム２号（化粧品グレード、１０万の重量平均分子量）を選択する。
【0028】
比較例３
該比較例は実施例１の調製方法とほぼ同じであり、相違点は、ステップ１）において１％の過酸化水素水５０ｍＬのみを均一に散布し、紫外線照射を行わず、且つ活性炭で吸着した後にナノ濾過膜システムを使用した濾過液を濾過濃縮しないことである。
該比較例は実施例１の調製方法とほぼ同じであり、相違点は、ステップ１）において１％の過酸化水素水５０ｍＬのみを均一に散布し、紫外線照射を行わず、且つ活性炭で吸着した後にナノ濾過膜システムを使用した濾過液を濾過濃縮しないことである。
【0029】
比較例４
該比較例は実施例１の調製方法とほぼ同じであり、相違点は、ステップ１）において３００μＷ／ｃｍ２線量を採用して６０分間紫外線照射を行うのみで、過酸化水素水処理を使用せず、且つ活性炭を採用して吸着した後に、ナノ濾過膜システムを使用した濾液に対する濾過濃縮を行わないことである。
該比較例は実施例１の調製方法とほぼ同じであり、相違点は、ステップ１）において３００μＷ／ｃｍ２線量を採用して６０分間紫外線照射を行うのみで、過酸化水素水処理を使用せず、且つ活性炭を採用して吸着した後に、ナノ濾過膜システムを使用した濾液に対する濾過濃縮を行わないことである。
【0030】
比較例５
この比較例は、２００万の重量平均分子量を有する高分子量ヒアルロン酸ナトリウム、１００万の重量平均分子量を有するヒアルロン酸ナトリウム、３０万の重量平均分子量を有する低分子量ヒアルロン酸ナトリウム、及び１万未満の重量平均分子量を有するオリゴヒアルロン酸ナトリウムを、単独でそれぞれ１：１：１：１の質量比で６０分間混合撹拌し、ヒアルロン酸ナトリウムのサンプルを得る。
この比較例は、２００万の重量平均分子量を有する高分子量ヒアルロン酸ナトリウム、１００万の重量平均分子量を有するヒアルロン酸ナトリウム、３０万の重量平均分子量を有する低分子量ヒアルロン酸ナトリウム、及び１万未満の重量平均分子量を有するオリゴヒアルロン酸ナトリウムを、単独でそれぞれ１：１：１：１の質量比で６０分間混合撹拌し、ヒアルロン酸ナトリウムのサンプルを得る。
【0031】
実施例7：
上記実施例１～６及び比較例３～５で得られた異なるヒアルロン酸ナトリウムに対して異なる位置のサンプリングを行い、均一性及び安定性を測定し、２５℃でＮＤＪ－１型回転粘度計３号回転子を用い、それぞれ１％の異なるヒアルロン酸ナトリウム溶液に対して６０ｒ／分で粘度を測定する。各サンプルをそれぞれ調製後４℃で保存し、６ヶ月後にサンプリングして粘度を測定する。結果は表１に示すように、実施例１～６で得られたヒアルロン酸ナトリウムは外観が均一で、安定性に優れる。比較例３及び比較例４で得られたヒアルロン酸ナトリウムは外観が比較的均一であるが、安定性がやや悪く、且つ粘度が比較的大きく、濾過効率が低く、且つナノ濾過膜システムを用いて濾過することが困難であり、比較例５で得られたヒアルロン酸ナトリウムは均一性及び安定性がいずれも悪い。
［表１］
上記実施例１～６及び比較例３～５で得られた異なるヒアルロン酸ナトリウムに対して異なる位置のサンプリングを行い、均一性及び安定性を測定し、２５℃でＮＤＪ－１型回転粘度計３号回転子を用い、それぞれ１％の異なるヒアルロン酸ナトリウム溶液に対して６０ｒ／分で粘度を測定する。各サンプルをそれぞれ調製後４℃で保存し、６ヶ月後にサンプリングして粘度を測定する。結果は表１に示すように、実施例１～６で得られたヒアルロン酸ナトリウムは外観が均一で、安定性に優れる。比較例３及び比較例４で得られたヒアルロン酸ナトリウムは外観が比較的均一であるが、安定性がやや悪く、且つ粘度が比較的大きく、濾過効率が低く、且つナノ濾過膜システムを用いて濾過することが困難であり、比較例５で得られたヒアルロン酸ナトリウムは均一性及び安定性がいずれも悪い。
［表１］
【0032】
実施例８
上記実施例と比較例で得られたヒアルロン酸ナトリウムのサンプルの分子量分布を測定すると、重量平均分子量Ｍｗがそれぞれ０．２万～１万、１万～３０万、３０万～１００万、＞１００万の範囲にあるヒアルロン酸ナトリウム分子の割合が表２のようになる。
［表２］
表２のデータから、実施例１～６で得られたヒアルロン酸ナトリウム原料は、市販の異なる分子量規格のヒアルロン酸ナトリウムと比較して分子量分布の幅が広く、分子量分散係数Ｍｗ／Ｍｎが５以上であることが分かる。比較例３と比較例４では分子量分布範囲が狭く、分子量分散係数が２．５以下であることから、紫外線照射や過酸化水素水処理の単独使用では効果が期待できないことが分かる。
上記実施例と比較例で得られたヒアルロン酸ナトリウムのサンプルの分子量分布を測定すると、重量平均分子量Ｍｗがそれぞれ０．２万～１万、１万～３０万、３０万～１００万、＞１００万の範囲にあるヒアルロン酸ナトリウム分子の割合が表２のようになる。
［表２］
【0033】
実施例９
上記実施例１～６で調製したヒアルロン酸ナトリウムのエンドトキシンと異種タンパク質について、それぞれリムルス試薬検出法、Ｆｏｌｉｎフェノール法を用いて測定した結果を表３に示す。
［表３］
表３の結果から、実施例１～６の調製方法で得られたヒアルロン酸は、エンドトキシン含有量が０．０１ＥＵ未満、タンパク質含有量が０．０１％未満であり、２８０ｎｍでのＯＤ値が０．０１未満、２６０ｎｍでのＯＤ値が０．０１未満であり、生体適合性が高く、品質レベルが高いことが分かる。
上記実施例１～６で調製したヒアルロン酸ナトリウムのエンドトキシンと異種タンパク質について、それぞれリムルス試薬検出法、Ｆｏｌｉｎフェノール法を用いて測定した結果を表３に示す。
［表３］
【0034】
実施例１０
有効な受験希望者４５名を選択し、年齢は２０～５５歳で、２～３日前の受験部位にはどの製品（化粧品や外用薬品などが含まれる）も使用できない。試験前に、被験者は両手の前腕の内側を統一的に清潔にし、４×４ｃｍの試験エリアに印をつけ、調合１～８サンプル（それぞれ実施例１～６の全分子量ヒアルロン酸ナトリウム１％、調合７の市販１２０万ヒアルロン酸ナトリウム１％、調合８の比較例５ヒアルロン酸ナトリウム１％、調合中の残りの成分はグリセリン２％、ブタンジオール２％）を左右の腕に均一に塗布しランダムに分布し、使用量は３ｍｇ／ｃｍ２であり、皮膚水分測定器で製品塗布前及び塗布後３０分間、１時間、３時間、６時間の時の被検皮膚エリアの水分量を測定し、各エリアごとに平行に５回測定し、平均値を測定値とする。同一被験者の測定は同一の測定者が完成し、すべての被験者は、測定前後に、温度と湿度が一定の室内空間に居る。皮膚水分増加量（％）＝（塗布後水分量?塗布前水分量）／塗布前水分量×１００％である。
［表４］
表４の結果から、本発明により調製された全分子量ヒアルロン酸ナトリウムは、優れた保湿性を有し、市販のヒアルロン酸ナトリウム製品よりも優れており、化粧品に使用することにより優れた保湿効果を発揮することが分かった。
有効な受験希望者４５名を選択し、年齢は２０～５５歳で、２～３日前の受験部位にはどの製品（化粧品や外用薬品などが含まれる）も使用できない。試験前に、被験者は両手の前腕の内側を統一的に清潔にし、４×４ｃｍの試験エリアに印をつけ、調合１～８サンプル（それぞれ実施例１～６の全分子量ヒアルロン酸ナトリウム１％、調合７の市販１２０万ヒアルロン酸ナトリウム１％、調合８の比較例５ヒアルロン酸ナトリウム１％、調合中の残りの成分はグリセリン２％、ブタンジオール２％）を左右の腕に均一に塗布しランダムに分布し、使用量は３ｍｇ／ｃｍ２であり、皮膚水分測定器で製品塗布前及び塗布後３０分間、１時間、３時間、６時間の時の被検皮膚エリアの水分量を測定し、各エリアごとに平行に５回測定し、平均値を測定値とする。同一被験者の測定は同一の測定者が完成し、すべての被験者は、測定前後に、温度と湿度が一定の室内空間に居る。皮膚水分増加量（％）＝（塗布後水分量?塗布前水分量）／塗布前水分量×１００％である。
［表４］
【0035】
実施例１１
インターロイキンＩＬ－１βによりヒト不死化上皮細胞（ＨａＣａＴ）の炎症反応を誘導することをモデルとして、本発明により調製された全分子量分布のヒアルロン酸ナトリウムが抗炎症効果を有することを検証する。
ヒト不死化上皮細胞（ＨａＣａＴ）を９６孔プレートに、５×１０３ｃｅｌｌｓ／ｍＬで、１孔あたり１００μＬで接種し、１群あたり６個の複数孔を設け、２４時間培養後、１０ｎｇ／ｍＬのインターロイキンＩＬ-１β、２０ｍｇ／ｍＬの本発明の全分子量ヒアルロン酸ナトリウム（実施例１～６）、及び比較例ヒアルロン酸ナトリウム（比較例１～５）を含む培地を交換し、ＩＬ－１及びヒアルロン酸ナトリウムを加えない細胞を正常対照群とし、ＩＬ－１βのみを加えヒアルロン酸ナトリウムを加えない細胞をモデル対照群とし、２４時間培養を続けた後、ＥＬＩＳＡキットを用いてインターロイキンＩＬ－１α及び腫瘍壊死因子ＴＮＦ－αの発現レベルを測定する。
［表５］
表５のデータから、異なる実施例と比較例のヒアルロン酸は、細胞のＩＬ－１α及びＴＮＦ－αの発現レベルを低下させ、いずれも一定の抗炎症効果を示しているが、本発明のプロセスで調製された全分子量分布ヒアルロン酸ナトリウムは比較例の通常のヒアルロン酸ナトリウムよりも優れた抗炎症効果を示していることが分かる。
インターロイキンＩＬ－１βによりヒト不死化上皮細胞（ＨａＣａＴ）の炎症反応を誘導することをモデルとして、本発明により調製された全分子量分布のヒアルロン酸ナトリウムが抗炎症効果を有することを検証する。
ヒト不死化上皮細胞（ＨａＣａＴ）を９６孔プレートに、５×１０３ｃｅｌｌｓ／ｍＬで、１孔あたり１００μＬで接種し、１群あたり６個の複数孔を設け、２４時間培養後、１０ｎｇ／ｍＬのインターロイキンＩＬ-１β、２０ｍｇ／ｍＬの本発明の全分子量ヒアルロン酸ナトリウム（実施例１～６）、及び比較例ヒアルロン酸ナトリウム（比較例１～５）を含む培地を交換し、ＩＬ－１及びヒアルロン酸ナトリウムを加えない細胞を正常対照群とし、ＩＬ－１βのみを加えヒアルロン酸ナトリウムを加えない細胞をモデル対照群とし、２４時間培養を続けた後、ＥＬＩＳＡキットを用いてインターロイキンＩＬ－１α及び腫瘍壊死因子ＴＮＦ－αの発現レベルを測定する。
［表５］
【0036】
実施例１２
ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）で皮膚モデル損傷を誘導することをモデルとし、本発明で調製した全分子量分布ヒアルロン酸ナトリウムの抗細胞損傷及び細胞修復効果を検証する。
ＥｐｉＳｋｉｎ皮膚モデルを１２孔プレートに移して培養し、２４時間培養後に、０．５％（ｖ／ｖ）ＳＤＳを含む培地を交換し、２時間インキュベートした後、１孔当たり１％（ｗ／ｖ）の本発明の全分子量ヒアルロン酸ナトリウム（実施例１～６）、及び比較例ヒアルロン酸ナトリウム（比較例１～５）を含む同量培地を直接添加し、培地のヒアルロン酸ナトリウム含有最終濃度を０．５％（ｗ／ｖ）とし、ＳＤＳ及びヒアルロン酸ナトリウムを添加しない細胞を正常対照群とし、ＳＤＳのみ添加しヒアルロン酸ナトリウムを添加しない細胞をモデル対照群とし、２４時間培養を続けた後、皮膚組織モデルを取り出し、ＭＴＴ法で酵素マーカーを用いて５７０ｎｍにおける吸光度値を測定し、組織細胞の活性は次の式で計算する：
組織細胞活性（％）＝Ａｐ（ｔ）／Ａｎ×１００％
ここで、Ａｐ（ｔ）は陽性対照群又は実験群の吸光度値である。Ａｎは陰性対照群の吸光度値であり、結果は次の表のようになる。
［表６］
表６のデータから、本発明により調製された全分子量分布ヒアルロン酸ナトリウムは、ＳＤＳによって誘導されるＥｐｉＳｋｉｎ皮膚モデルの損傷を強く抑制し、損傷した細胞の修復を効果的に促進することが明らかになった。本発明の方法により調製された全分子量分布ヒアルロン酸ナトリウムは、比較例の通常のヒアルロン酸ナトリウムと比較して、細胞修復促進効果が高い。
ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）で皮膚モデル損傷を誘導することをモデルとし、本発明で調製した全分子量分布ヒアルロン酸ナトリウムの抗細胞損傷及び細胞修復効果を検証する。
ＥｐｉＳｋｉｎ皮膚モデルを１２孔プレートに移して培養し、２４時間培養後に、０．５％（ｖ／ｖ）ＳＤＳを含む培地を交換し、２時間インキュベートした後、１孔当たり１％（ｗ／ｖ）の本発明の全分子量ヒアルロン酸ナトリウム（実施例１～６）、及び比較例ヒアルロン酸ナトリウム（比較例１～５）を含む同量培地を直接添加し、培地のヒアルロン酸ナトリウム含有最終濃度を０．５％（ｗ／ｖ）とし、ＳＤＳ及びヒアルロン酸ナトリウムを添加しない細胞を正常対照群とし、ＳＤＳのみ添加しヒアルロン酸ナトリウムを添加しない細胞をモデル対照群とし、２４時間培養を続けた後、皮膚組織モデルを取り出し、ＭＴＴ法で酵素マーカーを用いて５７０ｎｍにおける吸光度値を測定し、組織細胞の活性は次の式で計算する：
組織細胞活性（％）＝Ａｐ（ｔ）／Ａｎ×１００％
ここで、Ａｐ（ｔ）は陽性対照群又は実験群の吸光度値である。Ａｎは陰性対照群の吸光度値であり、結果は次の表のようになる。
［表６］
【0037】
上記は、本出願の実施例に過ぎず、本出願を限定するものではない。当業者にとっては、本出願は種々の変更及び変化を伴うことができる。本願の精神及び原理の範囲内で行われた補正、均等置換、改良等は、本願の特許請求の範囲内に含まれるものとする。
【手続補正書】
【提出日】2024-02-08
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
全分子量分布のヒアルロン酸ナトリウムの調製方法であって、前記方法は、
ヒアルロン酸ナトリウム固体原料に対して過酸化水素水噴霧及び紫外線照射処理を行い、キログラム当たりの前記ヒアルロン酸ナトリウム固体原料は、質量濃度１％～５％の過酸化水素水５０～１００ミリリットルを噴霧し、紫外照射線量が３００～１５００μＷ／ｃｍ ２ であり、照射時間が５０～７０分であり、ヒアルロン酸ナトリウム分解材料を得る、ステップ１）と、
前記ヒアルロン酸ナトリウム分解材料を水に溶解し、ＮａＯＨ溶液でｐＨをアルカリ性に調整することで、ヒアルロン酸ナトリウムのアルカリ性溶液を得る、ステップ２）と、
前記ヒアルロン酸ナトリウムのアルカリ溶液に対して超音波処理を行う、ステップ３）と、
前記ヒアルロン酸ナトリウム固体原料を、０．１％～１％（ｗ／ｖ）の濃度を有するヒアルロン酸ナトリウム溶液に調製し、２０％～６０％（ｖ／ｖ）の添加割合で、ステップ３）で得られた超音波処理後のヒアルロン酸ナトリウムのアルカリ性溶液と均一に混合する、ステップ４）と、
それぞれ珪藻土と活性炭を用いて吸着処理を行い、且つナノ濾過膜を用いて濾過濃縮し、乾燥した後に前記全分子量分布のヒアルロン酸ナトリウムを得る、ステップ５）とを含む、ことを特徴とする全分子量分布のヒアルロン酸ナトリウムの調製方法。
【請求項2】
前記ヒアルロン酸ナトリウム固体原料の分子量は、１００万～２００万である、ことを特徴とする請求項１に記載の全分子量分布のヒアルロン酸ナトリウムの調製方法。
【請求項3】
前記ヒアルロン酸ナトリウム固体原料は、化粧品グレードのヒアルロン酸ナトリウム、食品グレードのヒアルロン酸ナトリウム、医薬グレードのヒアルロン酸ナトリウムのうちの一つ又は複数から選択される、ことを特徴とする請求項２に記載の全分子量分布のヒアルロン酸ナトリウムの調製方法。
【請求項4】
前記ステップ２）において、前記ヒアルロン酸ナトリウム分解材料を水に溶解した後の体積濃度は１％～１０％（ｗ／ｖ）であり、及び／又は、ＮａＯＨ溶液でｐＨを１０～１２に調整する、ことを特徴とする請求項１に記載の全分子量分布のヒアルロン酸ナトリウムの調製方法。
【請求項5】
前記ステップ３）において、超音波処理の周波数は１０～１００ｋＨｚであり、時間は１５～１８０分である、ことを特徴とする請求項１に記載の全分子量分布のヒアルロン酸ナトリウムの調製方法。
【請求項6】
前記ステップ５）において、珪藻土を採用する吸着処理のステップは、以下の含み、
前記ヒアルロン酸ナトリウムのアルカリ溶液の質量に基づき、０．１％～１％（ｗ／ｖ）の珪藻土を加え、４５～８０℃で撹拌して３０～６０分間吸着し、濾過し、及び／又は、
活性炭を採用する吸着処理のステップは、以下を含み、
希酸溶液でｐＨを６～７に調整し、前記ヒアルロン酸ナトリウム溶液の質量に基づく０．１％～１％（ｗ／ｖ）の活性炭を加え、４５～８０℃で撹拌して３０～６０分間吸着し、濾過し、前記希酸溶液は、希塩酸溶液、希硫酸溶液、希酢酸溶液、希次亜塩素酸溶液のうちの一種又は多種から選択される、ことを特徴とする請求項１に記載の全分子量分布のヒアルロン酸ナトリウムの調製方法。
【請求項7】
前記ステップ５）において、前記ナノ濾過膜の分画分子量は２００－３００Ｄａであり、操作圧力を１５－３０ｂａｒに制御し、温度を３０～５０℃に制御する、ことを特徴とする請求項１に記載の全分子量分布のヒアルロン酸ナトリウムの調製方法。
【請求項8】
前記全分子量分布のヒアルロン酸ナトリウムの重量平均分子量範囲は０．２万～１５０万であり、分子量分散係数Ｍｗ／Ｍｎは５以上であり、前記ヒアルロン酸ナトリウムにおけるエンドトキシン含有量は＜０．０１ＥＵであり、タンパク質含有量は＜０．０１％であり、
前記ヒアルロン酸ナトリウムは、２８０ｎｍでＯＤ値＜０．０１であり、２６０ｎｍでＯＤ値＜０．０１である、ことを特徴とする請求項１～７のいずれか一項に記載の調製方法で調製された全分子量分布のヒアルロン酸ナトリウム。
【請求項9】
請求項１～７のいずれか一項に記載の調製方法で調製された全分子量ヒアルロン酸ナトリウムが医薬用、食品用及び／又は化粧品用の保湿剤、潤滑剤、抗炎症剤及び／又は細胞修復剤の調製における使用。
【国際調査報告】