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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-06-21
(54)【発明の名称】二重特異性結合分子
(51)【国際特許分類】
C07K 16/46 20060101AFI20240614BHJP
C07K 16/18 20060101ALI20240614BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20240614BHJP
A61K 38/17 20060101ALI20240614BHJP
A61P 25/00 20060101ALI20240614BHJP
A61P 25/28 20060101ALI20240614BHJP
A61P 21/00 20060101ALI20240614BHJP
A61P 9/10 20060101ALI20240614BHJP
A61P 25/16 20060101ALI20240614BHJP
A61P 25/18 20060101ALI20240614BHJP
A61P 25/14 20060101ALI20240614BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240614BHJP
【ＦＩ】
C07K16/46 ZNA
C07K16/18
A61K39/395 N
A61K38/17 100
A61P25/00
A61P25/28
A61P21/00
A61P9/10 101
A61P25/16
A61P25/18
A61P25/14
A61P35/00
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023575853
(86)(22)【出願日】2022-06-10
(85)【翻訳文提出日】2024-02-06
(86)【国際出願番号】 EP2022065915
(87)【国際公開番号】W WO2022258841
(87)【国際公開日】2022-12-15
(31)【優先権主張番号】21179103.3
(32)【優先日】2021-06-11
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】519007514
【氏名又は名称】バイオアークティック アクティエボラーグ
(74)【代理人】
【識別番号】100099759
【弁理士】
【氏名又は名称】青木 篤
(74)【代理人】
【識別番号】100123582
【弁理士】
【氏名又は名称】三橋 真二
(74)【代理人】
【識別番号】100117019
【弁理士】
【氏名又は名称】渡辺 陽一
(74)【代理人】
【識別番号】100141977
【弁理士】
【氏名又は名称】中島 勝
(74)【代理人】
【識別番号】100138210
【弁理士】
【氏名又は名称】池田 達則
(72)【発明者】
【氏名】ロニー ファルク
(72)【発明者】
【氏名】ペール－オーラ フレスクゴード
(72)【発明者】
【氏名】ケン ホーネク
(72)【発明者】
【氏名】リサ サンダーフェー
【テーマコード（参考）】
4C084
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C084AA02
4C084AA07
4C084BA41
4C084DA39
4C084MA16
4C084MA66
4C084NA14
4C084ZA02
4C084ZA15
4C084ZA16
4C084ZA18
4C084ZA45
4C084ZA94
4C084ZB26
4C085AA14
4C085BB31
4C085CC23
4C085EE01
4C085GG02
4C085GG04
4H045AA11
4H045AA30
4H045BA10
4H045BA41
4H045CA40
4H045DA75
4H045DA76
4H045EA20
4H045EA50
(57)【要約】
二重特異性結合分子であって、血液脳関門（ＢＢＢ）を通過する該二重特異性結合分子の輸送を媒介する標的に対して親和性を有する一本鎖結合モジュールに連結された、２つの同一の抗体軽鎖を含む１つのポリペプチド鎖である１つの一本鎖成分と、２つの同一の抗体重鎖とを含んで成る、二重特異性結合分子が提供される。この二重特異性結合分子の治療、予防、予後予測および診断用途も提供される。
【選択図】図１
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
以下の３つのポリペプチド鎖：（Ａ）哺乳動物の脳内に存在する第一の標的に対して親和性を有するモノクローナル抗体に由来する２つの同一の抗体重鎖（ＨＣ）と、
（Ｂ）連続ポリペプチド鎖中に以下の５つの要素：
ｉ）前記第一の標的に対して親和性を有する前記モノクローナル抗体に由来する２つの同一の抗体軽鎖（ＬＣ）；
ｉｉ）血液脳関門を介した二重特異性結合分子の輸送を媒介する第二の標的に対して親和性を有する１つの単鎖結合モジュール（ｓｃＢＭ）；および
ｉｉｉ）２つのアミノ酸リンカーＬ１とＬ２
を含む１つの一本鎖成分と
を含んで成る二重特異性結合分子であって、
前記軽鎖（ＬＣ）と前記一本鎖結合モジュール（ｓｃＢＭ）とが、前記リンカーＬ１およびＬ２によって分離され、それによりＮ末端からＣ末端まで以下の群：
［ＬＣ－Ｌ１－ｓｃＢＭ－Ｌ２－ＬＣ］、
［ＬＣ－Ｌ１－ＬＣ－Ｌ２－ｓｃＢＭ］、および
［ｓｃＭＢ－ｌ１－ＬＣ－Ｌ２－ＬＣ］
から成る群より選択された配列を形成している、二重特異性結合分子。
【請求項2】
前記一本鎖成分におけるＮ末端からＣ末端までの要素の配列が、［ＬＣ－Ｌ１－ｓｃＢＭ－Ｌ２－ＬＣ］および
［ＬＣ－Ｌ１－ＬＣ－Ｌ２－ｓｃＢＭ］
から成る群より選択される、請求項１に記載の二重特異性結合分子。
【請求項3】
前記第一の標的が、アミロイド－βペプチドまたはその誘導体もしくはフラグメント、α－シヌクレインまたはその誘導体もしくはフラグメント、ＴＡＲ ＤＮＡ結合タンパク質４３（ＴＤＰ－４３）またはその誘導体もしくはフラグメント、骨髄細胞上に発現されるトリガー受容体２（ＴＲＥＭ２）、β－セクレターゼ１（ＢＡＣＥ１）、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）、ハンチンチン、トランスサイレチン、Ｐ－セクレターゼ１、上皮成長因子、上皮成長因子受容体２、タウ、リン酸化タウまたはそのフラグメント、アポリポタンパク質Ｅ４、ＣＤ２０、プリオンタンパク質、ロイシンリッチリピートキナーゼ２、パーキン（ｐａｒｋｉｎ）、プレセニリン２、γ－セクレターゼ、死受容体６、アミロイドβ前駆体タンパク質、ｐ７５ニューロトロフィン受容体、ニューレグリンおよびカスパーゼ６から成る群より選択される、請求項１～２のいずれか一項に記載の二重特異性結合分子。
【請求項4】
前記第一の標的に対して親和性を有する前記モノクローナル抗体が、レカネマブ、ガンテネルマブ、アデュカヌマブ、ドナネマブ、ＰＢＤ－Ｃ０６およびＫＨＫ６６４０から成る群より選択される、請求項１～３のいずれか一項に記載の二重特異性結合分子。
【請求項5】
前記第一の標的に対して親和性を有する前記モノクローナル抗体が、抗α－シヌクレイン抗体ＡＢＢＶ０８０５である、請求項１～３のいずれか一項に記載の二重特異性結合分子。
【請求項6】
前記ｓｃＢＭがｓｃＦｖ、ｓｃＦａｂ、ＶＨＨおよびＶＮＡＲから成る群より選択されたタイプのものである、請求項１～５のいずれか一項に記載の二重特異性結合分子。
【請求項7】
前記ｓｃＢＭがｓｃＦｖである、請求項６に記載の二重特異性結合分子。
【請求項8】
前記第二の標的が、トランスフェリン受容体１（ＴｆＲ１）、インスリン受容体（ＩｎｓＲ）、インスリン様成長因子１受容体（ＩＧＦ－１Ｒ）、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質８（Ｌｒｐ８）、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質１（Ｌｒｐ１）、ＣＤ９８、膜貫通タンパク質５０Ａ（ＴＭＥＭ５０Ａ）、グルコース輸送体１（Ｇｌｕｔ１）、ベイシジン（ＢＳＧ）およびヘパリン結合上皮成長因子様成長因子から成る群より選択される、請求項１～７のいずれか一項に記載の二重特異性結合分子。
【請求項9】
前記アミノ酸リンカーＬ１およびＬ２の両方がフレキシブルリンカーである、請求項１～８のいずれか一項に記載の二重特異性結合分子。
【請求項10】
前記フレキシブルリンカーが、グリシン、セリン、アラニンおよび／またはスレオニン残基を含む、請求項９に記載の二重特異性結合分子。
【請求項11】
前記アミノ酸リンカーＬ１およびＬ２の少なくとも１つが、長さ１０～５０アミノ酸残基、例えば長さ１０～３０アミノ酸残基、例えば長さ１５～２５アミノ酸残基、または長さ１０～２０アミノ酸である、請求項１～１０のいずれか一項に記載の二重特異性結合分子。
【請求項12】
前記アミノ酸リンカーＬ１およびＬ２が同じ長さであるか、または前記アミノ酸リンカーＬ１およびＬ２が異なる長さである、請求項１～１１のいずれか一項に記載の二重特異性結合分子。
【請求項13】
請求項１～１２のいずれか一項に記載の二重特異性結合分子と薬学的に許容される担体または賦形剤とを含んでなる医薬組成物。
【請求項14】
処置における使用のための、例えば治療処置もしくは予防処置における使用のための、またはインビボ診断もしくはインビボ予後診断における使用のための、請求項１～１２のいずれか一項に記載の二重特異性結合分子または請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項15】
前記治療、予防、インビボ診断またはインビボ予後診断が、・神経変性疾患、例えばアルツハイマー病およびＡβタンパク質凝集に関連する他の疾患、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）、レビー小体認知症（ＬＢＤ）、ダウン症候群（ＤＳ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、前頭型認知症、タウオパチー、全身性アミロイドーシス、アテローム性動脈硬化、パーキンソン病（ＰＤ）、パーキンソン病認知症（ＰＤＤ）、アルツハイマー病のレビー小体変性症、多系統萎縮症、精神病、統合失調症、クロイツフェルト・ヤコブ病、ハンチントン病および家族性アミロイド神経疾患から選択された疾患；または
・脳腫瘍、多発性硬化症およびリソソーム蓄積症から選択された疾患
に関するものである、請求項１４に記載の使用のための特異性結合分子または組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本開示は、２つの同一の抗体重鎖と１つの一本鎖成分とを含んで成る二重特異性結合分子に関し、前記一本鎖成分が、前記二重特異性結合分子が血液脳関門（ＢＢＢ）を通過する輸送を媒介する標的（ターゲット）に対して親和性を有する一本鎖結合モジュールに連結されている、２つの同一の抗体軽鎖を含むポリペプチド鎖であることを特徴とする。前記抗体重鎖と抗体軽鎖は、哺乳動物の脳内に存在する標的に対して親和性を有するモノクローナル抗体に由来する。
【0002】
本開示はまた、二重特異性結合分子の治療的、予防的、予後予測的および診断的使用に関する。
【背景技術】
【0003】
脳および神経疾患の治療モダルティは、血流にて運搬される大部分の物質に対して脳血管が不透過性であるために、非常に制限されている（ＦｒｅｓｋｇａｒｄおよびＵｒｉｃｈ（２０１７）、Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、１２０：３８－５５；Ｓｔａｎｉｍｉｒｏｖｉｃ他（２０１８）、ＢｉｏＤｒｕｇｓ、３２：５４７－５５９）。血液脳関門（ＢＢＢ）と総称される脳の微小血管（毛細血管）は、体の周囲に存在する血管と比較してユニークである。星状膠細胞、周皮細胞およびニューロンなどの神経細胞に対してＢＢＢの内皮細胞（ＥＣ）が緊密に並置されており、観察される不透過性の一因となる表現型特性を生み出している。ＢＢＢ中のＥＣ間の密着結合は、傍細胞輸送を制限し、その一方で受動的飲小胞と蝸牛窓小窩の欠如が、非特異的な細胞間輸送を制限する。これらの因子は協働して、血液から脳への分子フラックスを、一般的に大きさが５００ダルトン（Ｄａ）未満でかつ親油性である分子に限定する。そのため、所望の薬理特性を有する薬剤が、偶然にもＢＢＢを通過するのを可能にするサイズと親油性特性を有するような状況でない限り、輸送媒体として血流の大質量輸送表面積（ヒト脳では６００ｋｍの毛細血管から２０ｍ２超の表面積）を使用できるという有望な可能性が、ほとんど実現不可能になる。かかる制限のため、全ての小分子薬剤の９８％以上、そしてタンパク質や遺伝子治療薬の新興クラスのほぼ１００％が、ＢＢＢを通過しないと推定されている。
【0004】
国際公開ＷＯ９１／０３２５９は、ＢＢＢを通過する神経学的薬剤を輸送するための原理を提唱しており、それはトランスフェリン受容体と反応性である抗体に該薬剤をコンジュゲーション（連結）することを含む。この開示によれば、トランスフェリン受容体へのコンジュゲート（連結体）の結合が、ＢＢＢを通過する該コンジュゲートの能動輸送をもたらしている。それ以後の研究は、この基本的概念を更に発展させ、例えば、トランスフェリン受容体に代わるものとして、ＢＢＢ輸送に有用であり得る別の受容体を提案している。
【0005】
国際公開ＷＯ２０１２／０７５０３７は、ＢＢＢ受容体に特異的であり、且つ輸送を媒介する１つのＦａｂ部分と、脳内の治療標的（ターゲット）に特異的な１つのＦａｂ部分とを有する、二重特異性抗体を開示している。ＷＯ２０１２／０７５０３７の図３Ａは、この教示の代表的な実施形態を示している。
【0006】
国際公開ＷＯ２０１４／０３３０７４は、脳内の治療標的に向けられた標準的な一特異性でかつ二価の抗体と、ＢＢＢ受容体に特異的である結合ドメインとを含む、二重特異性結合分子を開示している。前記結合ドメインは、抗体の２つの重鎖のうちの１つのＣ末端に結合される。ＷＯ２０１４／０３３０７４の図１Ｂは、この教示の代表的な実施形態を示している。さらに、ＢＢＢ受容体への一価結合が、二価結合よりも効率的なＢＢＢ輸をもたらすことが開示されている。Ｒｏｃｈｅ社からのルーマニア特許ＲＯ７１２６２０９に記載の生物医薬品候補は、国際公開ＷＯ２０１４／０３３０７４に記載の設計を使用していると思われる。ルーマニア特許ＲＯ７１２６２０９は、ｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｇоｖ．（ＮＩＨとＦＤＡ共同の臨床試験登録システム）上に登録された治験識別番号ＮＣＴ０４０２３９９４およびＮＣＴ０４６３９０５０を有する臨床試験に入っている。
【0007】
国際公開ＷＯ２０１８／０１１３５３は、脳内の治療標的に対して向けられた標準的な一特異性でかつ二価の抗体に、複数のＢＢＢ受容体結合性要素を具備させたが、それにもかかわらず、ＢＢＢ受容体への所望の一価結合が可能であるようにそれらの要素が配置されている、別の代替構築物を開示している。ＷＯ２０１８／０１１３５３の図１Ａは、この教示の代表的な実施形態を示している。
【0008】
トランスフェリン受容体および他の受容体によって媒介される能動輸送を介してＢＢＢを通過する能力を有する抗体および抗体由来のバイオ医薬品を提供するための様々な実験フォーマットの存在にもかかわらず、これらのいずれも１つ以上の欠点を有しており、脳および中枢神経系の疾患を検出して治療するための、高機能性の治療的、予防的、診断的および予後予測的ツールのさらなる開発のために、ＢＢＢを横断することができる新規バイオ医薬品のニーズが依然として残っている。
【発明の概要】
【0009】
発明の説明
本発明の目的は、抗体ベースの治療薬を脳に到達できるようにする設計フォーマットを提供することである。
本発明の目的は、抗体ベースの治療薬を脳に到達できるようにする設計フォーマットを提供することである。
【0010】
本発明の別の目的は、脳内の標的に対しておよびＢＢＢ輸送メディエータ（媒介物質）に対して親和性を有する二重特異性結合分子のための、フォーマットを提供することである。
【0011】
本発明の別の目的は、発現および組立てが容易であり、同時にＢＢＢ輸送メディエータに対して一価結合を提供する、対称性フォーマットを提供することである。
【0012】
本発明の別の目的は、ＢＢＢ輸送メディエータとの二価の相互作用につながり得る任意の生成物の形成を防止する、対称性フォーマットを提供することである。
【0013】
本発明の別の目的は、２つの異なる連続ポリペプチド鎖のみから、使用準備が整っている対称性二重特異性結合分子を作製することである。
【0014】
開示される様々な態様によって、これらの目的のうちの１つ以上、および本開示全体を読み取ることから当業者に明らかである他の目的が満たされる。
【0015】
したがって、第一の態様では、本開示は、以下の３つのポリペプチド鎖：
（Ａ）哺乳動物の脳内に存在する第一の標的に対して親和性を有するモノクローナル抗体に由来する２つの同一の抗体重鎖（ＨＣ）と、
（Ｂ）連続ポリペプチド鎖中に以下の５つの要素：
ｉ）前記第一の標的に対して親和性を有する前記モノクローナル抗体に由来する２つの同一の抗体軽鎖（ＬＣ）；
ｉｉ）血液脳関門を通過する二重特異性結合分子の輸送を媒介する第二の標的に対して親和性を有する１つの一本鎖結合モジュール（ｓｃＢＭ）；および
ｉｉｉ）２つのアミノ酸リンカーＬ１およびＬ２
を含む１つの一本鎖成分と
を含んで成る二重特異性結合分子であって、
前記軽鎖（ＬＣ）と前記一本鎖結合モジュール（ｓｃＢＭ）とが、前記リンカーＬ１およびＬ２によって分離され、それによりＮ末端からＣ末端まで以下：
［ＬＣ－Ｌ１－ｓｃＢＭ－Ｌ２－ＬＣ］、
［ＬＣ－Ｌ１－ＬＣ－Ｌ２－ｓｃＢＭ］および
［ｓｃＭＢ－Ｌ１－ＬＣ－Ｌ２－ＬＣ］
から成る群より選択された配列を形成している、二重特異性結合分子を提供する。
（Ａ）哺乳動物の脳内に存在する第一の標的に対して親和性を有するモノクローナル抗体に由来する２つの同一の抗体重鎖（ＨＣ）と、
（Ｂ）連続ポリペプチド鎖中に以下の５つの要素：
ｉ）前記第一の標的に対して親和性を有する前記モノクローナル抗体に由来する２つの同一の抗体軽鎖（ＬＣ）；
ｉｉ）血液脳関門を通過する二重特異性結合分子の輸送を媒介する第二の標的に対して親和性を有する１つの一本鎖結合モジュール（ｓｃＢＭ）；および
ｉｉｉ）２つのアミノ酸リンカーＬ１およびＬ２
を含む１つの一本鎖成分と
を含んで成る二重特異性結合分子であって、
前記軽鎖（ＬＣ）と前記一本鎖結合モジュール（ｓｃＢＭ）とが、前記リンカーＬ１およびＬ２によって分離され、それによりＮ末端からＣ末端まで以下：
［ＬＣ－Ｌ１－ｓｃＢＭ－Ｌ２－ＬＣ］、
［ＬＣ－Ｌ１－ＬＣ－Ｌ２－ｓｃＢＭ］および
［ｓｃＭＢ－Ｌ１－ＬＣ－Ｌ２－ＬＣ］
から成る群より選択された配列を形成している、二重特異性結合分子を提供する。
【0016】
上記に定義されるような二重特異性結合分子は、該二重特異性結合分子が第一の標的に対して親和性を有するモノクローナル抗体を実質的に再現する標準的な抗体構造を取るように、前記一本鎖成分中の各軽鎖ＬＣ要素と各重鎖ＨＣとの会合を通して形成されるだろう。ここで前記リンカーＬ１およびＬ２を介してその二重特異性結合分子に一本鎖結合モジュールｓｃＢＭがカップリングされており、前記重鎖（ＨＣ）および軽鎖（ＬＣ）は前記モノクローナル抗体に由来する（二重特異性結合分子の２つの異なる実施形態の概略については図１および２を参照されたい）。
【発明の効果】
【0017】
理論に束縛されることを望むものではないが、非限定的な例として、本開示の二重特異性結合分子は、ＢＢＢを通過して治療抗体を輸送するための既存のフォーマットを上回る下記の利点を提供する。
【0018】
国際公開ＷＯ２０１２／０７５０３７およびＷＯ２０１４／０３３０７４に開示された構築物は、両方とも非対称性の構築物であり、例えばノブ・イントゥ・ホール（ｋｎｏｂ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅ）技術を使用して組み立てる（ａｓｓｅｍｂｌｅ）必要がある、異なる重鎖要素の発現を必要とする。これは、生産の非効率化、鎖の不均衡問題の可能性、および望ましくない副生成物の随伴生成につながる場合がある（例えば、ホモ二量体であるノブ－ノブ副生成物やホール－ホール副生成物の生成；Ｋｕｇｌｓｔａｔｔｅｒ他（２０１７）、Ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｅｎｇ．Ｄｅｓ．Ｓｅｌ．３０：６４９－６５６を参照されたい）。任意の抗体ヘテロ二量化技術のためには、ホモ二量体副生成物の不純物が低含有量であるかあるいは存在しないことさえ望まれる。これは、望ましくないホモ二量体が所望の生成物と同様の生物物理学的性質を有する場合に当てはまり、生産規模での精製工程を使用して分離することを困難にしてしまう。望ましくないホモ二量体が、ＢＢＢ輸送メディエータに対する親和性のような生物活性を保持している場合にも、その状況が同様に当てはまる。これは、ホモ二量体副生成物が、望ましくない生物活性、例えばＢＢＢ輸送メディエータの二量体化または多量体化につながる活性を誘発し、ひいては分子の機能を低下させることになる可能性を有する場合に特に重要である。一方、本開示の二重特異性結合分子は１種類だけの重鎖から成り、この意味では対称性の構築物である。
【0019】
国際公開ＷＯ２０１８／０１１３５３に開示された構築物は、重鎖の非対称性に関連する欠点を持たないが、その代わりに、２つの別個のＢＢＢ結合成分を含むために、ＢＢＢ輸送メディエータへの必要な一価結合を提供することができない場合もあり得る。ＷＯ２０１８／０１１３５３において発明者らは、二価構築物が特定の状況ではそれでも一価結合を付与することを開示しているが、ＷＯ２０１８／０１１３５３における原理の一般的適用性に関する不確実さは残る。本開示の二重特異性結合分子は、この不確実さが除去され、ＢＢＢ輸送のメディエータに対する真の一価結合が達成される。
【発明を実施するための形態】
【0020】
一本鎖成分の全体的アーキテクチャ
本開示によれば、一本鎖成分は、一本の連続ポリペプチド鎖中に５つの要素を含む。５つの要素のうちの１つは、ＢＢＢを通過する輸送を媒介する標的との親和性を有する一本鎖結合モジュール（ｓｃＢＭ）である。５つの要素のうちの２つは、２本の同一の重鎖（ＨＣ）と結合して二重特異性結合分子の抗体部分を形成する２本の同一の抗体軽鎖（ＬＣ）である。当業者によって理解されるように、ｓｃＢＭおよびＬＣ要素は、その各々が重鎖（ＨＣ）と会合すること（軽鎖要素の場合）か、またはＢＢＢ標的に対して結合親和性を有する二重特異性結合分子を提供する（ｓｃＢＭの場合）ことのいずれかの目的を果たすことができるように、一本鎖成分中で互いに分離されていなければならない。この目的上、これらの３つの要素は、一本鎖成分中の残りの２つの要素、すなわち２つのアミノ酸リンカーＬ１およびＬ２によって分離される。この点に関し、前記リンカーが３つの結合要素を分離する限り、一本鎖成分内で各要素の任意の順序が可能であることが企図される。言い換えれば、二重特異性結合分子の一本鎖成分中の３つの可能な配列は、Ｎ末端からＣ末端まで以下の配列である：
［ＬＣ－Ｌ１－ｓｃＢＭ－Ｌ２－ＬＣ］、
［ＬＣ－Ｌ１－ＬＣ－Ｌ２－ｓｃＢＭ］、および
［ｓｃＢＭ－Ｌ１－ＬＣ－Ｌ２－ＬＣ］。
本開示によれば、一本鎖成分は、一本の連続ポリペプチド鎖中に５つの要素を含む。５つの要素のうちの１つは、ＢＢＢを通過する輸送を媒介する標的との親和性を有する一本鎖結合モジュール（ｓｃＢＭ）である。５つの要素のうちの２つは、２本の同一の重鎖（ＨＣ）と結合して二重特異性結合分子の抗体部分を形成する２本の同一の抗体軽鎖（ＬＣ）である。当業者によって理解されるように、ｓｃＢＭおよびＬＣ要素は、その各々が重鎖（ＨＣ）と会合すること（軽鎖要素の場合）か、またはＢＢＢ標的に対して結合親和性を有する二重特異性結合分子を提供する（ｓｃＢＭの場合）ことのいずれかの目的を果たすことができるように、一本鎖成分中で互いに分離されていなければならない。この目的上、これらの３つの要素は、一本鎖成分中の残りの２つの要素、すなわち２つのアミノ酸リンカーＬ１およびＬ２によって分離される。この点に関し、前記リンカーが３つの結合要素を分離する限り、一本鎖成分内で各要素の任意の順序が可能であることが企図される。言い換えれば、二重特異性結合分子の一本鎖成分中の３つの可能な配列は、Ｎ末端からＣ末端まで以下の配列である：
［ＬＣ－Ｌ１－ｓｃＢＭ－Ｌ２－ＬＣ］、
［ＬＣ－Ｌ１－ＬＣ－Ｌ２－ｓｃＢＭ］、および
［ｓｃＢＭ－Ｌ１－ＬＣ－Ｌ２－ＬＣ］。
【0021】
一実施形態では、前記要素の配列は、［ＬＣ－Ｌ１－ｓｃＢＭ－Ｌ２－ＬＣ］および［ＬＣ－Ｌ１－ＬＣ－Ｌ２－ｓｃＢＭ］から選択される。特定の実施形態では、前記要素の配列は［ＬＣ－Ｌ１－ｓｃＢＭ－Ｌ２－ＬＣ］である。別の特定の実施形態では、前記要素の配列は［ＬＣ－Ｌ１－ＬＣ－Ｌ２－ｓｃＢＭ］である。
【0022】
抗体重鎖および軽鎖
本開示の二重特異性結合分子では、抗体重鎖要素と抗体軽鎖要素、すなわちＨＣおよびＬＣは、それぞれ、哺乳動物の脳内に存在する第一の標的に対して親和性を有するモノクローナル抗体に由来する。この特定の文脈で使用される場合、「に由来する」とは、ＨＣおよびＬＣの各々のアミノ酸配列が、そのＨＣとＬＣが由来する「親」モノクローナル抗体の配列と比較して、本質的に変化しないことを意味する。すなわち、本開示の二重特異性結合分子は、モノクローナル抗体の重鎖および軽鎖をそれぞれＨＣおよびＬＣとして組み込んでいる。
本開示の二重特異性結合分子では、抗体重鎖要素と抗体軽鎖要素、すなわちＨＣおよびＬＣは、それぞれ、哺乳動物の脳内に存在する第一の標的に対して親和性を有するモノクローナル抗体に由来する。この特定の文脈で使用される場合、「に由来する」とは、ＨＣおよびＬＣの各々のアミノ酸配列が、そのＨＣとＬＣが由来する「親」モノクローナル抗体の配列と比較して、本質的に変化しないことを意味する。すなわち、本開示の二重特異性結合分子は、モノクローナル抗体の重鎖および軽鎖をそれぞれＨＣおよびＬＣとして組み込んでいる。
【0023】
本開示の二重特異性結合分子では、２つの抗体重鎖（ＨＣ）要素と、一本鎖成分中の２つの軽鎖（ＬＣ）要素とが結合して古典的な抗体構造を形成し、ｓｃＢＭがＬ１およびＬ２リンカーを介してそれに取り付けられている。したがって、二重特異性結合分子は、ＨＣおよびＬＣの各ペアからの２つのＶＨ－ＶＬペアを含み、それらが由来する（親の）モノクローナル抗体と同じかまたは本質的に同じ方法で、相補性決定領域（ＣＤＲ）を介して第一の標的に結合する能力を有する。
【0024】
その結合したＨＣ要素とＬＣ要素を介して、本開示の二重特異性結合分子は哺乳動物の脳内に存在する第一の標的に対する親和性を有する。この標的は、典型的には、そのような疾患の治療または予防の文脈において、標的と結合、ブロッキング、活性化または他の方法で相互作用するというような様式で疾患と関連づけられる。しかしながら、本開示にかかる二重特異性結合分子の特定の利点は、主に、脳内の狙った目的地に到達するための標的結合活性の能力の向上からもたらされるのであり、それがいずれかの特定の第一の標的に結合するという事実からではない。したがって、第一の標的の特別な性質は限定されず、その標的と相互作用するために重要でありうる脳内の任意の標的であることができる。
【0025】
それにもかかわらず、例示として、前記第一の標的は、特定の実施形態では、アミロイドβペプチドまたはその誘導体もしくはそのフラグメント、α－シヌクレインまたはその誘導体もしくはフラグメント、ＴＡＲ ＤＮＡ結合タンパク質４３（ＴＤＰ－４３）またはその誘導体もしくはフラグメント、骨髄細胞上に発現されるトリガー受容体２（ＴＲＥＭ２）、β－セクレターゼ１（ＢＡＣＥ１）、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）、ハンチンチン、トランスサイレチン、Ｐ－セクレターゼ１、上皮成長因子、上皮成長因子受容体２、タウ、リン酸化タウまたはそのフラグメント、アポリポタンパク質Ｅ４、ＣＤ２０、プリオンタンパク質、ロイシンリッチリピートキナーゼ２、パーキン（ｐａｒｋｉｎ）、プレセニリン２、γセクレターゼ、死受容体６、アミロイドβ前駆体タンパク質、ｐ７５ニューロトロフィン受容体、ニューレグリンおよびカスパーゼ６から成る群より選択され得る。
【0026】
より具体的な実施形態では、第一の標的は、アミロイドβペプチドまたはその誘導体もしくはフラグメント、α－シヌクレインまたはその誘導体もしくはフラグメント、ＴＡＲ ＤＮＡ結合タンパク質４３（ＴＤＰ－４３）またはその誘導体もしくはフラグメント、トリガー受容体、骨髄細胞２（ＴＲＥＭ２）、タウ、リン酸化タウまたはそのフラグメントおよびアポリポタンパク質Ｅ４から成る群より選択される。
【0027】
特に特定の実施形態では、第一の標的は、アミロイドβペプチドまたはその誘導体もしくはフラグメント、α－シヌクレインまたはその誘導体もしくはフラグメント、並びにＴＡＲ ＤＮＡ結合タンパク質４３（ＴＤＰ－４３）またはその誘導体もしくはフラグメントから成る群より選択される。
【0028】
哺乳動物の脳内に存在する上記に列挙した標的のいずれか１つ以上に結合する任意のモノクローナル抗体は、本開示の二重特異性結合分子内のＨＣ要素およびＬＣ要素の供給源として有用であると考えられる。生物医薬研究分野の当業者は、このような標的に対して親和性を有する多数のモノクローナル抗体を熟知している。
【0029】
一実施形態では、ＨＣ要素とＬＣ要素が由来する（親の）モノクローナル抗体は、ＩｇＧクラスの抗体である。より具体的な実施形態では、抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４から選択されるサブクラスのものであり、例えばＩｇＧ１およびＩｇＧ４から選択される。使用される所望のサブクラスは、例えば、モノクローナル抗体の必要な機能に依存する。より具体的な実施形態では、抗体は、サブクラスＩｇＧ１のものである。ＩｇＧ１抗体は、例えば効果的な抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）または補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）が所望される場合に特に好ましい。
【0030】
一実施形態では、ＨＣ要素とＬＣ要素が由来する（親の）モノクローナル抗体は、ヒト抗体、ヒト化抗体、およびエフェクター機能を低下させるため、血漿中半減期を延長するため、またはヒトにおけるその抗原性を低下させるために突然変異されている抗体から成る群より選択される。
【0031】
ＨＣ要素とＬＣ要素が由来する特定のモノクローナル抗体の非限定的な例は、レカネマブ、ゲンテネルマブ、アデュカヌマブ、ドナネマブ、ＰＢＤ－Ｃ０６およびＫＨＫ６６４０から成る群より選択されるような、アミロイドβの様々な形態に対して向けられた既知抗体である。ＨＣ要素とＬＣ要素が由来するモノクローナル抗体の別の例は、α―シヌクレインに対して向けられた抗体、例えばＡＢＢＶ０８０５である。
【0032】
以下の実施例において、本開示の二重特異性結合分子の概念を試験したところ、意図した方法で機能することが見出された。具体的には、実施例１０、１４および１５は、インビボでのマウス研究において本明細書に定義されるような種々の二重特異性結合分子を示している。マウスにおける適切な概念検証（プルーフ・オブ・コンセプト）構築物として機能するためには、実施例で試験した二重特異性結合分子が、上述したヒトでの使用を目的に企図されているヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体のいずれか由来のものではなく、アミロイドβプロトフィブリルに対する親和性を有するマウスモノクローナル抗体（ｍＡｂ１５８）由来の抗体重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを有する。このマウス抗体ｍＡｂ１５８は、ヒト化モノクローナル抗体レカネマブ（別名ＢＡＮ２４０１；国際公開ＷＯ２００７／１０８７５６を参照）のマウス前駆体である。
【0033】
一本鎖結合モジュール
一実施形態では、一本鎖成分の一本鎖結合モジュール（ｓｃＢＭ）要素は、抗体由来のものである。ｓｃＢＭは、例えば、既知の一本鎖フォーマット、例えばｓｃＦｖ、ｓｃＦａｂ、ＶＨＨおよびＶＮＡＲから成る群より選択することができる。一実施形態では、ｓｃＢＭは、ｓｃＦｖおよびｓｃＦａｂから成る群より選択される。より具体的な実施形態では、ｓｃＢＭはｓｃＦｖである。別の特定の実施形態では、ｓｃＢＭはｓｃＦａｂである。
一実施形態では、一本鎖成分の一本鎖結合モジュール（ｓｃＢＭ）要素は、抗体由来のものである。ｓｃＢＭは、例えば、既知の一本鎖フォーマット、例えばｓｃＦｖ、ｓｃＦａｂ、ＶＨＨおよびＶＮＡＲから成る群より選択することができる。一実施形態では、ｓｃＢＭは、ｓｃＦｖおよびｓｃＦａｂから成る群より選択される。より具体的な実施形態では、ｓｃＢＭはｓｃＦｖである。別の特定の実施形態では、ｓｃＢＭはｓｃＦａｂである。
【0034】
別の実施形態では、一本鎖成分のｓｃＢＭ要素は、抗体由来ではない。この実施形態では、ｓｃＢＭは、例えば、既知の非抗体スキャフォールド、例えば、モノボディ〔アドネクチン（Ａｄｎｅｃｔｉｎ）（登録商標）分子〕、プロテインＺ変異体〔アフィボディ（Ａｆｆｉｂоｄｙ（登録商標）分子〕、リポカリン〔アンチカリン（Ａｎｔｉｃａｌｉｎ）（登録商標）タンパク質〕、二環式ペプチド、アンカイリンリピートタンパク質〔ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）分子〕、フィノマーおよびクニッツ（Ｋｕｎｉｔｚ）ドメインから成る群より選択される。
【0035】
本開示の二重特異性結合分子の一本鎖成分中に提供される一本鎖結合モジュール（ｓｃＢＭ）は、第二の標的、すなわち被験体に投与したときにＢＢＢを通過する二重特異性結合分子の輸送を媒介する第二の標的に対して親和性を有する。この第二の標的は、例えば、ＢＢＢの内皮細胞の表面上に見出される受容体または他のリガンドであり得る。当業者は、ＢＢＢ輸送、いわゆる「ブレイン・シャトル（ｂｒａｉｎ ｓｈｕｔｔｌｉｎｇ；脳内への物質の行き来）」の目的で試験されている多数の異なる標的を理解しており、かかる標的に対するその親和性に基づいて適切な一本鎖結合モジュールを選択することができる。
【0036】
一実施形態では、第二の標的は、トランスフェリン受容体１（ＴｆＲ１）、インスリン受容体（ＩｎｓＲ）、インスリン様成長因子１受容体（ＩＧＦ－１Ｒ）、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質８（Ｌｒｐ８）、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質１（Ｌｒｐ１）、ＣＤ９８、膜貫通タンパク質５０Ａ（ＴＭＥＭ５０Ａ）、グルコース輸送体１（Ｇｌｕｔｌ）、ベイシジン（ＢＳＧ）、およびヘパリン結合上皮成長因子様成長因子から成る群より選択される。
【0037】
より具体的な実施形態では、前記第二の標的は、トランスフェリン受容体１（ＴｆＲ１）、インスリン受容体（ＩｎｓＲ）、インスリン様成長因子１受容体（ＩＧＦ－１Ｒ）および低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質８（Ｌｒｐ８）から成る群より選択される。
【0038】
さらにより具体的な実施形態では、前記第二の標的はトランスフェリン受容体１（ＴｆＲ１）である。
【0039】
以下の実施例で報告される概念検証（プルーフ・オブ・コンセプト）試験では、試験される二重特異性結合分子は、マウストランスフェリン受容体１（ｍＴｆＲ１）に対して親和性を有するｓｃＦｖドメインをｓｃＢＭとして使用する。ｓｃＦｖドメインは、モノクローナルマウス抗ｍＴｆＲ１抗体８Ｄ３（Ｋｉｓｓｅｌ他（１９９８）、Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１０：６３－７２）のＶＨドメインとＶＬドメインとから構築される。
【0040】
リンカーＬ１およびＬ２
リンカーＬ１およびＬ２の設計に関して、当業者は、二重特異性結合分子の一本鎖成分などの融合タンパク質の構築が、融合しようとする機能的成分の間にリンカーの使用をしばしば伴うこと、そして様々な性質を有する様々な種類のリンカー、例えばフレキシブルアミノ酸リンカー、剛性アミノ酸リンカー、切断可能アミノ酸リンカーのようなリンカーが存在しうることを理解している。上述のように、本開示にかかる二重特異性結合分子内の一本鎖成分は、２つのリンカーＬ１およびＬ２を含む。一実施形態では、Ｌ１およびＬ２の一方または両方が、フレキシブルアミノ酸リンカー、剛性アミノ酸リンカーおよび切断可能アミノ酸リンカーから適切に選択される。一実施形態では、Ｌ１およびＬ２の少なくとも一方が、フレキシブルアミノ酸リンカーである。別の実施形態では、Ｌ１およびＬ２の両方がフレキシブルアミノ酸リンカーである。当業者により周知のとおり、フレキシブルリンカーは、結合されるドメインまたは要素が、ある程度の動きまたは相互作用を必要とする場合に頻繁に使用され、本開示の二重特異性結合分子のいくつかの実施形態において特に有用であり得る。フレキシブルリンカーは、通常、非極性（例えばＧまたはＡ）または極性（例えばＳまたはＴ）の小型アミノ酸から構成される。いくつかのフレキシブルリンカーは、主にＧおよびＳ残基の伸長鎖、例えば（ＧＧＧＧＳ）ｐから成る。コピー数「ｐ」を調整することによって、機能性成分間の適切な分離を果たすために、または必要な成分間相互作用を維持するために、リンカーを最適化することが可能になる。ＧおよびＳリンカーとは別に、他のフレキシブルリンカー、例えば柔軟性を維持するためにＴおよびＡなどの追加のアミノ酸残基、および／または可溶性を高めるために極性アミノ酸残基、を含有するＧおよびＳリンカーといった他のフレキシブルリンカーが当技術分野で知られている。
リンカーＬ１およびＬ２の設計に関して、当業者は、二重特異性結合分子の一本鎖成分などの融合タンパク質の構築が、融合しようとする機能的成分の間にリンカーの使用をしばしば伴うこと、そして様々な性質を有する様々な種類のリンカー、例えばフレキシブルアミノ酸リンカー、剛性アミノ酸リンカー、切断可能アミノ酸リンカーのようなリンカーが存在しうることを理解している。上述のように、本開示にかかる二重特異性結合分子内の一本鎖成分は、２つのリンカーＬ１およびＬ２を含む。一実施形態では、Ｌ１およびＬ２の一方または両方が、フレキシブルアミノ酸リンカー、剛性アミノ酸リンカーおよび切断可能アミノ酸リンカーから適切に選択される。一実施形態では、Ｌ１およびＬ２の少なくとも一方が、フレキシブルアミノ酸リンカーである。別の実施形態では、Ｌ１およびＬ２の両方がフレキシブルアミノ酸リンカーである。当業者により周知のとおり、フレキシブルリンカーは、結合されるドメインまたは要素が、ある程度の動きまたは相互作用を必要とする場合に頻繁に使用され、本開示の二重特異性結合分子のいくつかの実施形態において特に有用であり得る。フレキシブルリンカーは、通常、非極性（例えばＧまたはＡ）または極性（例えばＳまたはＴ）の小型アミノ酸から構成される。いくつかのフレキシブルリンカーは、主にＧおよびＳ残基の伸長鎖、例えば（ＧＧＧＧＳ）ｐから成る。コピー数「ｐ」を調整することによって、機能性成分間の適切な分離を果たすために、または必要な成分間相互作用を維持するために、リンカーを最適化することが可能になる。ＧおよびＳリンカーとは別に、他のフレキシブルリンカー、例えば柔軟性を維持するためにＴおよびＡなどの追加のアミノ酸残基、および／または可溶性を高めるために極性アミノ酸残基、を含有するＧおよびＳリンカーといった他のフレキシブルリンカーが当技術分野で知られている。
【0041】
本開示の二重特異性結合分子の一実施形態では、リンカーＬ１およびＬ２の少なくとも一方が、グリシン（Ｇ）、セリン（Ｓ）、アラニン（Ａ）および／またはスレオニン（Ｔ）残基を含むフレキシブルリンカーである。別の実施形態では、リンカーＬ１およびＬ２の両方が、かかるフレキシブルリンカーである。
【0042】
本開示の二重特異性結合分子の一実施形態では、リンカーＬ１およびＬ２の少なくとも一方が、（ＧｎＳｍ）ｐおよび（ＳｎＧｍ）ｐから選択される一般式を有し、ここで、独立して、ｎ＝１～７、ｍ＝０～７、ｎ＋ｍ≦８およびｐ＝１～１０である。一実施形態では、ｎ＝１～５である。一実施形態では、ｍ＝０～５である。一実施形態では、ｐ＝３～１０である。より特定の実施形態では、ｎ＝４、ｍ＝１およびｐ＝１～４である。一実施形態では、リンカーＬ１およびＬ２の少なくとも一方が、（Ｇ４Ｓ）３（配列番号１）、（Ｇ４Ｓ）５（配列番号２）、（Ｇ４Ｓ）６（配列番号３）および（Ｇ４Ｓ）１０（配列番号４）から成る群より選択される。特定の一実施形態では、Ｌ１およびＬ２の少なくとも一方が（Ｇ４Ｓ）３である。別の実施形態では、Ｌ１およびＬ２の少なくとも一方が（Ｇ４Ｓ）５である。
【0043】
本開示の二重特異性結合分子の一実施形態では、リンカーＬ１およびＬ２のうちの少なくとも一方が、Ｇ、Ｓ、ＴおよびＡ残基を含むフレキシブルリンカーである。１つのそのような実施形態では、Ｌ１およびＬ２のうちの少なくとも一方が、配列番号５のアミノ酸配列を有する。別の実施形態では、Ｌ１およびＬ２の少なくとも一方が、配列番号６のアミノ酸配列を有する。
【0044】
本開示の二重特異性結合分子の一実施形態では、Ｌ１とＬ２は同一である。別の実施形態では、Ｌ１とＬ２は異なる。
【0045】
一実施形態では、Ｌ１およびＬ２は同じ長さを有し、すなわち同数のアミノ酸残基を有する。別の実施形態では、Ｌ１およびＬ２は異なる長さを有する。そのような実施形態では、Ｌ１はＬ２より長くてよく、逆もまた同様である。
【0046】
一実施形態では、Ｌ１および／またはＬ２は、１０～５０アミノ酸残基の長さ、例えば１０～３０アミノ酸残基の長さ、例えば１５～２５アミノ酸残基の長さ、または１０～２０アミノ酸残基の長さのものである。
【0047】
標的に対する親和性
本明細書で使用する場合、「Ｘに対する特異的結合」、「Ｘに対する選択的結合」、「Ｘに対する親和性」〔ここでＸは標的（例えば抗原またはエピトープ）である〕という用語は、抗体またはその抗原結合フラグメントのような結合分子の特性を指し、それは例えばＥＬＩＳＡにより、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により、結合平衡除外法（Ｋｉｎｅｔｉｃ Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ Ａｓｓａｙ；ＫｉｎＥｘＡ（登録商標））によりまたはバイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）により、試験することができる。当業者は、これらの方法および他の方法を心得ている。
本明細書で使用する場合、「Ｘに対する特異的結合」、「Ｘに対する選択的結合」、「Ｘに対する親和性」〔ここでＸは標的（例えば抗原またはエピトープ）である〕という用語は、抗体またはその抗原結合フラグメントのような結合分子の特性を指し、それは例えばＥＬＩＳＡにより、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により、結合平衡除外法（Ｋｉｎｅｔｉｃ Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ Ａｓｓａｙ；ＫｉｎＥｘＡ（登録商標））によりまたはバイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）により、試験することができる。当業者は、これらの方法および他の方法を心得ている。
【0048】
例えば、標的、抗原またはエピトープＸに対する結合親和性は、試験すべき結合分子を、ＸがコーティングされたまたはエピトープＸを含む分子がコーティングされたＥＬＩＳＡプレート上で捕捉し、次いでビオチン化検出抗体を添加し、続いてストレプトアビジン結合西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を添加するという実験において試験することができる。あるいは、前記検出抗体をＨＲＰと直接結合してもよい。テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質を添加し、ＥＬＩＳＡマルチウェルプレートリーダーを用いて４５０ｎｍでの吸光度を測定する。次いで、当業者は、かかる実験によって得られた結果を解釈して、少なくとも結合分子のＸに対する結合親和性の定性的尺度を確立することができる。定量測定が望まれる場合、例えば、相互作用についてのＥＣ５０値（５０％最大有効濃度）を決定するために、ＥＬＩＳＡを使用してもよい。Ｘの希釈系列に対する結合分子の応答は、上記のＥＬＩＳＡを使って測定することができる。次いで、当業者は、例えばＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ｖ．９および非線形回帰を使用して、かかる実験によって得られた結果を解釈し、その結果からＥＣ５０値を算出することができる。
【0049】
本明細書で使用される場合、「ＥＣ５０」という用語は、特定の露光時間後にベースラインと最大値の間の半分のレスポンスを誘導する結合分子の５０％最大有効濃度を指す。
【0050】
さらに、阻害ＥＬＩＳＡを使用して、「ＩＣ５０」（５０％最大阻害濃度）を決定することにより、相互作用の定量的尺度を得ることができる。阻害ＥＬＩＳＡでは、流体試料中の標的Ｘの濃度は、期待されるシグナル出力において干渉を検出することによって測定される。理論上、既知の標的またはエピトープ担持物質が、マルチウェルプレートをコーティングするために使用される。並行して、標的に対して期待親和性を有する結合分子を添加し、変化させた濃度で標的を含有する溶液と共にインキュベートする。標準的なブロッキングおよび洗浄工程に続いて、前記結合分子と前記標的との混合物を含む試料をウェルに添加する。次いで、前記結合分子に対して親和性を有する標識された検出抗体を、関連の基質（例えばＴＭＢ）を用いた検出のために適用する。原則として、流体試料中に高濃度の標的が存在する場合、シグナル出力の有意な低下が観察される。対照的に、流体試料中に極少量の標的が存在する場合、期待されるシグナル出力の減少は非常に小さくなるだろう。当業者は、シグナル出力もまた、前記標的に対する結合分子の親和性に依存することを心得ている。
【0051】
本明細書で使用される場合、「ＩＣ５０」という用語は、特定の露光時間の後にベースラインと最大阻害との間のレスポンスを誘発する結合分子の５０％最大阻害濃度を指す。本明細書では、より低いＩＣ５０値は、高いＩＣ５０値と比較して、プレート上にコーティングされた既知標的に対する検出抗体の結合を阻害するために、より低い濃度の標的が必要であることを示す。したがって、より低いＩＣ５０値は、典型的には、より高い親和性に該当する。
【0052】
結合分子の結合親和性は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって試験することも可能である。例えば、親和性は、標的またはエピトープＸを装置のセンサーチップ上に固定し、そして試験すべき結合分子を含む試料を、該チップに通過させるという実験において試験することができる。あるいは、試験すべき結合分子を装置のセンサーチップ上に固定化し、Ｘを含む試料をチップに通過させてもよい。次いで、当業者は、かかる実験によって得られた結果を解釈して、少なくとも結合分子のＸに対する結合親和性の定性的尺度を確立することができる。例えば相互作用についてのＫＤ値を決定するために、定量的尺度が所望される場合、ＳＰＲを使用してもよい。結合力価は、例えば、ＢｉａｃｏｒｅＴＭ（商標）（Ｃｙｔｉｖａ社）またはＰｒｏｔｅＯｎＴＭ（商標）ＸＰＲ３６（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社）機器において限定することができる。標的またはエピトープは、機器のセンサーチップ上に好適に固定され、その親和性を決定しようとする結合分子の試料が、連続希釈によって調製され、機器に注入される。次いで、その結果から、典型的には、機器の製造業者によって提供される、ＢｉａｃｏｒｅＴＭ（商標）Ｉｎｓｉｇｈｔ解析ソフトウェア２．０または他の適切なソフトウェアの１：１ラングミュア結合モデルを使用して、前記結果からＫＤ値を算出することができる。
【0053】
結合親和性はまた、バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）、すなわちインタラクトーム分野の生体分子の相互作用を測定するためのラベルフリー技術により、測定することもできる。それは、２つの表面：バイオセンサーチップ上に固定されたタンパク質の層；および内部標準層、から反射された白色光の干渉パターンを分析する光学的分析技術である。バイオセンサーチップ表面上に固定されたリガンド（標的またはエピトープＸ）と溶液中の分析対象（アナライト）（例えば、Ｘに対して推定親和性を有する結合分子など）との間の結合が、バイオセンサーチップにおいて光学的厚さの増加をもたらし、その結果、波長シフトΔλを引き起こす。波長シフトΔλは、生物学的層の厚さの変化の直接的尺度である。相互作用はリアルタイムで測定され、真度と精度をもって結合特異性、会合および解離の速度、または濃度をモニターする能力を提供する。
【0054】
当業者は、標的またはエピトープＸに対する結合分子の親和性を、定性的もしくは定量的のいずれかで、またはその両方で、測定するための上記および他の方法を熟知している。
【0055】
医薬組成物
第二の態様では、本開示は、本明細書に記載の二重特異性結合分子と、少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤または担体とを含む、医薬組成物を提供する。
第二の態様では、本開示は、本明細書に記載の二重特異性結合分子と、少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤または担体とを含む、医薬組成物を提供する。
【0056】
ヒト治療用途のための抗体およびそれらの誘導体などのポリペプチドを製剤化するための技術は、当該技術分野において周知であり、例えば、Ｗａｎｇ他（２００７）、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ、９６：１－２６頁中に概説されており、その内容は、全体として本明細書に組み込まれる。
【0057】
組成物を製剤化するために使用することができる薬学的に許容される賦形剤は、限定されるものではないが、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、ヒト血清アルブミンなどの血清タンパク質、リン酸塩、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物脂肪酸の部分グリセリド混合物、水、塩類または電解質などの緩衝物質、例えば硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイド状シリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロース系物質（例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム）、ポリエチレングリコール、ポリアクリレート、ワックス、ポリエチレン－ポリオキシプロピレンブロックポリマー、ポリエチレングリコールおよび羊毛油脂を包含する。
【0058】
特定の実施形態では、医薬組成物は、筋肉内、静脈内、皮内、腹腔内注射、皮下、硬膜外、鼻腔内、経口、直腸、局所、吸入、頬側（例えば舌下）、および経皮投与を含むがこれらに限定されない、任意の適切な投与経路を介した被験体への投与のために製剤化される。好ましい実施形態では、組成物は、静脈内投与または皮下投与のために製剤化される。
【0059】
予防、治療、診断、予後予測および検出の方法
本開示に係る二重特異性結合分子は、治療、予防、診断および／または予後予測薬として有用であり得る。
本開示に係る二重特異性結合分子は、治療、予防、診断および／または予後予測薬として有用であり得る。
【0060】
したがって、本開示のさらなる態様では、医薬として使用するための、第一態様に係る二重特異性結合分子、または第二態様に係る医薬組成物が提供される。
【0061】
本開示のさらに別の態様では、診断薬として使用するための、第一態様に係る二重特異性結合分子、または第二態様に係る医薬組成物が提供される。
【0062】
本開示のさらに別の態様では、予後予測薬として使用するための、第一態様に係る二重特異性結合分子、または第二態様に係る医薬組成物が提供される。
【0063】
また、疾患の予防、治療もしくは診断方法または疾患の予後の評価方法であって、本明細書に開示される二重特異性結合分子を、それを必要とする被験体、典型的にはヒト被験体に投与することを含む方法も提供される。
【0064】
また、列挙された疾患のいずれか１つの予防、治療、診断および／または予後予測に使用する組成物（例えば医薬）の製造のための、本開示の二重特異性結合分子の使用も提供される。
【0065】
したがって、一実施形態では、二重特異性結合分子、またはそれを含む医薬組成物は、神経変性疾患、例えば、アルツハイマー病およびＡβタンパク質凝集に関連する他の疾患、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）、レビー小体型認知症（ＬＢＤ）、ダウン症候群（ＤＳ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、前頭型認知症、タウオパチー、全身性アミロイドーシス、アテローム性動脈硬化症、パーキンソン病（ＰＤ）、パーキンソン病に伴う認知症（ＰＤＤ）、アルツハイマー病のレビー小体変性症、多系統萎縮症、精神病、統合失調症、クロイフェルツ・ヤコブ病、ハンチントン病、および家族性アミロイド神経疾患から選択された疾患の治療、予防、診断および／または予後予測において有用である。
【0066】
より具体的な実施形態では、前記疾患は、アルツハイマー病およびＡβタンパク質凝集、レビー小体型認知症（ＬＢＤ）、ダウン症候群（ＤＳ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、前頭型認知症、タウオパチー、パーキンソン病（ＰＤ）、パーキンソン病に伴う認知症（ＰＤＤ）並びにアルツハイマー病のレビー小体変性症に関連する他の疾患から選択される。
【0067】
より具体的な実施形態では、前記疾患は、アルツハイマー病およびＡβタンパク質凝集、レビー小体型認知症（ＬＢＤ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）並びにパーキンソン病（ＰＤ）、特にアルツハイマー病に関連する他の疾患から選択される。
【0068】
代替的な実施形態では、二重特異性結合分子、またはそれを含む医薬組成物は、他の疾患、例えば、脳腫瘍、多発性硬化症およびリソソーム蓄積症から選択された疾患の治療、予防、診断および／または予後予測において有用である。
【0069】
別の態様では、上記に列挙したような疾患の治療、予防、診断および／または予後予測の方法であって、二重特異性結合分子またはそれを含む医薬組成物の治療有効量などの一定量を、前記哺乳動物に投与することを含む方法が提供される。
【0070】
参照による組み込み
本出願において様々な刊行物が引用されるが、その各々は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本出願において様々な刊行物が引用されるが、その各々は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【0071】
【図1】図１は、本開示の二重特異性結合分子の１つの代替的実施形態の概略図であり、図中、一本鎖成分の各要素は、配列［ＬＣ－Ｌ１－ｓｃＢＭ－Ｌ２－ＬＣ］において存する。各重鎖ＨＣは、ＶＨ、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３免疫グロブリンドメインから成る。一本鎖成分は、第一の軽鎖ＬＣ（ここで前記ＬＣはＶＬおよびＣＬ免疫グロブリンドメインから成る）；第一のリンカーＬ１；ｓｃＦｖの形の一本鎖結合モジュール（ｓｃＢＭ）；第二のリンカーＬ２；および第二のＬＣ（第一のＬＣと同一である）から成る。
【図2】図２は、本開示の二重特異性結合分子の別の代替的実施形態の概略図であり、図中、一本鎖成分の各要素は、配列［ＬＣ－Ｌ１－ＬＣ－Ｌ２－ｓｃＢＭ］において存する。各重鎖ＨＣは、ＶＨ、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３免疫グロブリンドメインから成る。一本鎖成分は、第一の軽鎖ＬＣ（ここで前記ＬＣはＶＬおよびＣＬ免疫グロブリンドメインから成る）；第一のリンカーＬ１；第二のＬＣ（第一のＬＣと同一である）；第二のリンカーＬ２；およびｓｃＦｖの形の一本鎖結合モジュール（ｓｃＢＭ）から成る。
【図5A】図５は、実施例６に記載のＯｃｔｅｔ（登録商標）バイオレイヤー干渉法を使って測定された、表示された分子のｍＴｆＲ１結合を示す。Ａ）ｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．１；Ｂ）ｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．２；Ｃ）ｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．３；Ｄ）ｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．４；Ｅ）ｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．５；Ｆ）ｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－Ｉｇ．６；Ｇ）８Ｄ３Ｆａｂ；およびＨ）ｍＡｂ１５８ ＩｇＧ。
【図5B】図５は、実施例６に記載のＯｃｔｅｔ（登録商標）バイオレイヤー干渉法を使って測定された、表示された分子のｍＴｆＲ１結合を示す。Ａ）ｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．１；Ｂ）ｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．２；Ｃ）ｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．３；Ｄ）ｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．４；Ｅ）ｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．５；Ｆ）ｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－Ｉｇ．６；Ｇ）８Ｄ３Ｆａｂ；およびＨ）ｍＡｂ１５８ ＩｇＧ。
【図5C】図５は、実施例６に記載のＯｃｔｅｔ（登録商標）バイオレイヤー干渉法を使って測定された、表示された分子のｍＴｆＲ１結合を示す。Ａ）ｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．１；Ｂ）ｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．２；Ｃ）ｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．３；Ｄ）ｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．４；Ｅ）ｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．５；Ｆ）ｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－Ｉｇ．６；Ｇ）８Ｄ３Ｆａｂ；およびＨ）ｍＡｂ１５８ ＩｇＧ。
【図5D】図５は、実施例６に記載のＯｃｔｅｔ（登録商標）バイオレイヤー干渉法を使って測定された、表示された分子のｍＴｆＲ１結合を示す。Ａ）ｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．１；Ｂ）ｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．２；Ｃ）ｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．３；Ｄ）ｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．４；Ｅ）ｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．５；Ｆ）ｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－Ｉｇ．６；Ｇ）８Ｄ３Ｆａｂ；およびＨ）ｍＡｂ１５８ ＩｇＧ。
【図5E】図５は、実施例６に記載のＯｃｔｅｔ（登録商標）バイオレイヤー干渉法を使って測定された、表示された分子のｍＴｆＲ１結合を示す。Ａ）ｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．１；Ｂ）ｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．２；Ｃ）ｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．３；Ｄ）ｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．４；Ｅ）ｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．５；Ｆ）ｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－Ｉｇ．６；Ｇ）８Ｄ３Ｆａｂ；およびＨ）ｍＡｂ１５８ ＩｇＧ。
【図5F】図５は、実施例６に記載のＯｃｔｅｔ（登録商標）バイオレイヤー干渉法を使って測定された、表示された分子のｍＴｆＲ１結合を示す。Ａ）ｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．１；Ｂ）ｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．２；Ｃ）ｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．３；Ｄ）ｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．４；Ｅ）ｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．５；Ｆ）ｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－Ｉｇ．６；Ｇ）８Ｄ３Ｆａｂ；およびＨ）ｍＡｂ１５８ ＩｇＧ。
【図5G】図５は、実施例６に記載のＯｃｔｅｔ（登録商標）バイオレイヤー干渉法を使って測定された、表示された分子のｍＴｆＲ１結合を示す。Ａ）ｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．１；Ｂ）ｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．２；Ｃ）ｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．３；Ｄ）ｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．４；Ｅ）ｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．５；Ｆ）ｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－Ｉｇ．６；Ｇ）８Ｄ３Ｆａｂ；およびＨ）ｍＡｂ１５８ ＩｇＧ。
【図5H】図５は、実施例６に記載のＯｃｔｅｔ（登録商標）バイオレイヤー干渉法を使って測定された、表示された分子のｍＴｆＲ１結合を示す。Ａ）ｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．１；Ｂ）ｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．２；Ｃ）ｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．３；Ｄ）ｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．４；Ｅ）ｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．５；Ｆ）ｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－Ｉｇ．６；Ｇ）８Ｄ３Ｆａｂ；およびＨ）ｍＡｂ１５８ ＩｇＧ。
【図10】図１０は、１０ナノモル／ｋｇのｍＡｂ１５８ ＩｇＧ、ｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．１、またはｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．３の、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ雌マウスにおける静脈内（ｉｖ）投与後２４時間目の濃度を示す一連の箱ひげ図である。（Ａ）血漿中、（Ｂ）左脳半球のＴＢＳ－Ｔｒｉｔｏｎ抽出物、どちらもＭＳＤを使って分析した結果、および（Ｃ）それぞれの構築物についての脳対血漿中濃度比を示す。円は個々のデータ点を表し、バーは平均±ＳＤを表す。Ｔｕｋｅｙの事後解析（ポストホック）検定を伴う一元配置ＡＮＯＶＡを実施した。＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。
【図11】図１１は、ｍＡｂ１５８対照ＩｇＧ（左パネル）、ｍＡｂ１５８－ｓｃＬＣ－８Ｄ３－Ｉｇ．１（中央パネル）およびｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．３（右パネル）を使用した、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ野生型（ＷＴ）雌マウスにおける１０ナノモル／ｋｇの静脈内（ｉｖ）投与後２４ｈ目の、大脳皮質の免疫組織化学的（ＩＨＣ）解析からの一連の共焦点画像である。ｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．１およびｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．３は、脳の毛細血管（矢印）、実質および周囲の脳細胞（矢頭）において検出された。スケールバー：５０μｍ。
【図12A】図１２は、実施例６に記載のＯｃｔｅｔバイオレイヤー干渉法を使って測定した表示された分子によるｍＴｆＲ１結合を示す。Ａ）ｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．７；Ｂ）ｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．８；Ｃ）ｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．９；Ｄ）ｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．１０；Ｅ）ｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．１１；Ｆ）ｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－Ｉｇ．１２；Ｇ）ｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－Ｉｇ．１４；；Ｈ）ｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－Ｉｇ．１５；およびＩ）ｍＡｂ１５８。
【図12B】図１２は、実施例６に記載のＯｃｔｅｔバイオレイヤー干渉法を使って測定した表示された分子によるｍＴｆＲ１結合を示す。Ａ）ｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．７；Ｂ）ｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．８；Ｃ）ｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．９；Ｄ）ｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．１０；Ｅ）ｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．１１；Ｆ）ｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－Ｉｇ．１２；Ｇ）ｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－Ｉｇ．１４；；Ｈ）ｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－Ｉｇ．１５；およびＩ）ｍＡｂ１５８。
【図12C】図１２は、実施例６に記載のＯｃｔｅｔバイオレイヤー干渉法を使って測定した表示された分子によるｍＴｆＲ１結合を示す。Ａ）ｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．７；Ｂ）ｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．８；Ｃ）ｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．９；Ｄ）ｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．１０；Ｅ）ｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．１１；Ｆ）ｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－Ｉｇ．１２；Ｇ）ｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－Ｉｇ．１４；；Ｈ）ｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－Ｉｇ．１５；およびＩ）ｍＡｂ１５８。
【図12D】図１２は、実施例６に記載のＯｃｔｅｔバイオレイヤー干渉法を使って測定した表示された分子によるｍＴｆＲ１結合を示す。Ａ）ｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．７；Ｂ）ｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．８；Ｃ）ｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．９；Ｄ）ｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．１０；Ｅ）ｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．１１；Ｆ）ｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－Ｉｇ．１２；Ｇ）ｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－Ｉｇ．１４；；Ｈ）ｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－Ｉｇ．１５；およびＩ）ｍＡｂ１５８。
【図12E】図１２は、実施例６に記載のＯｃｔｅｔバイオレイヤー干渉法を使って測定した表示された分子によるｍＴｆＲ１結合を示す。Ａ）ｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．７；Ｂ）ｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．８；Ｃ）ｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．９；Ｄ）ｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．１０；Ｅ）ｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．１１；Ｆ）ｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－Ｉｇ．１２；Ｇ）ｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－Ｉｇ．１４；；Ｈ）ｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－Ｉｇ．１５；およびＩ）ｍＡｂ１５８。
【図12F】図１２は、実施例６に記載のＯｃｔｅｔバイオレイヤー干渉法を使って測定した表示された分子によるｍＴｆＲ１結合を示す。Ａ）ｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．７；Ｂ）ｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．８；Ｃ）ｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．９；Ｄ）ｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．１０；Ｅ）ｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．１１；Ｆ）ｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－Ｉｇ．１２；Ｇ）ｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－Ｉｇ．１４；；Ｈ）ｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－Ｉｇ．１５；およびＩ）ｍＡｂ１５８。
【図12G】図１２は、実施例６に記載のＯｃｔｅｔバイオレイヤー干渉法を使って測定した表示された分子によるｍＴｆＲ１結合を示す。Ａ）ｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．７；Ｂ）ｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．８；Ｃ）ｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．９；Ｄ）ｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．１０；Ｅ）ｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．１１；Ｆ）ｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－Ｉｇ．１２；Ｇ）ｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－Ｉｇ．１４；；Ｈ）ｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－Ｉｇ．１５；およびＩ）ｍＡｂ１５８。
【図12H】図１２は、実施例６に記載のＯｃｔｅｔバイオレイヤー干渉法を使って測定した表示された分子によるｍＴｆＲ１結合を示す。Ａ）ｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．７；Ｂ）ｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．８；Ｃ）ｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．９；Ｄ）ｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．１０；Ｅ）ｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．１１；Ｆ）ｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－Ｉｇ．１２；Ｇ）ｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－Ｉｇ．１４；；Ｈ）ｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－Ｉｇ．１５；およびＩ）ｍＡｂ１５８。
【図12I】図１２は、実施例６に記載のＯｃｔｅｔバイオレイヤー干渉法を使って測定した表示された分子によるｍＴｆＲ１結合を示す。Ａ）ｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．７；Ｂ）ｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．８；Ｃ）ｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．９；Ｄ）ｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．１０；Ｅ）ｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．１１；Ｆ）ｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－Ｉｇ．１２；Ｇ）ｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－Ｉｇ．１４；；Ｈ）ｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－Ｉｇ．１５；およびＩ）ｍＡｂ１５８。
【図13A】図１３は、実施例８に記載の間接ＥＬＩＳＡにより分析した、Ａβ１－４２に対する表示された分子の結合を示す一連の図である。Ａ）ｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．７、ｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．８、ｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．９、ｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．１１、ｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ８Ｄ３－Ｉｇ．１２およびｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－Ｉｇ．１５；Ｂ）ｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．１０、ｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－Ｉｇ．１２、ｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－Ｉｇ．１４およびｍＡｂ１５８。
【図13B】図１３は、実施例８に記載の間接ＥＬＩＳＡにより分析した、Ａβ１－４２に対する表示された分子の結合を示す一連の図である。Ａ）ｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．７、ｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．８、ｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．９、ｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．１１、ｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ８Ｄ３－Ｉｇ．１２およびｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－Ｉｇ．１５；Ｂ）ｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．１０、ｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－Ｉｇ．１２、ｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－Ｉｇ．１４およびｍＡｂ１５８。
【図15A】図１５は、実施例６に記載のＯｃｔｅｔバイオレイヤー干渉法を使って測定した、表示された分子によるｍＴｆＲ１結合を示す。Ａ）ｍＡｂＢ－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．２；Ｂ）ｍＡｂＢ－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．３；Ｃ）ｍＡｂＢ。
【図15B】図１５は、実施例６に記載のＯｃｔｅｔバイオレイヤー干渉法を使って測定した、表示された分子によるｍＴｆＲ１結合を示す。Ａ）ｍＡｂＢ－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．２；Ｂ）ｍＡｂＢ－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．３；Ｃ）ｍＡｂＢ。
【図15C】図１５は、実施例６に記載のＯｃｔｅｔバイオレイヤー干渉法を使って測定した、表示された分子によるｍＴｆＲ１結合を示す。Ａ）ｍＡｂＢ－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．２；Ｂ）ｍＡｂＢ－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．３；Ｃ）ｍＡｂＢ。
【図17A】図１７は、実施例１３に記載の表面プラズモン共鳴を用いて測定した、表示された分子によるＡβ結合を示す。Ａ）ｍＡｂＢ－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．１；Ｂ）ｍＡｂＢ－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．２；Ｃ）ｍＡｂＢ－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．３；Ｄ）ｍＡｂＢ。
【図17B】図１７は、実施例１３に記載の表面プラズモン共鳴を用いて測定した、表示された分子によるＡβ結合を示す。Ａ）ｍＡｂＢ－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．１；Ｂ）ｍＡｂＢ－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．２；Ｃ）ｍＡｂＢ－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．３；Ｄ）ｍＡｂＢ。
【図17C】図１７は、実施例１３に記載の表面プラズモン共鳴を用いて測定した、表示された分子によるＡβ結合を示す。Ａ）ｍＡｂＢ－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．１；Ｂ）ｍＡｂＢ－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．２；Ｃ）ｍＡｂＢ－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．３；Ｄ）ｍＡｂＢ。
【図17D】図１７は、実施例１３に記載の表面プラズモン共鳴を用いて測定した、表示された分子によるＡβ結合を示す。Ａ）ｍＡｂＢ－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．１；Ｂ）ｍＡｂＢ－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．２；Ｃ）ｍＡｂＢ－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．３；Ｄ）ｍＡｂＢ。
【図18】図１８は、５ｘＦＡＤマウスと野生型（ＷＴ）同腹子における、血漿中（左）および左脳半球のＴＢＳ－Ｔｒｉｔｏｎ抽出物中（中央）での（両者とも実施例１４に記載の通りＭＳＤを用いて分析した）ｍＡｂＢおよびｍＡｂＢ－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．１の４０ナノモル／ｋｇの静脈内（ｉｖ）投与後２４時間目の血漿中および脳内の結合分子濃度の箱ひげ図、並びに、各々の構築物と導入遺伝子（ｔｒａｎｓｇｅｎｅ）についての脳対血漿中濃度比（右）の箱ひげ図を示す。円は個々のデータ点を表し、バーは平均±ＳＤを表す。
【図19】図１９は、実施例１５に記載の５ｘＦＡＤマウス脳の矢状面における抗ｈＩｇＧ１二次抗体によって検出されたｉｖ投与抗体の脳内分布の広視野蛍光顕微鏡画像を示す。下部パネルは、Ａβ斑（プラーク）について共染色された（６Ｅ１０＋４Ｇ８の組み合わせにより検出）大脳皮質（ＣＴＸ）、海馬（ＨＣ）、および視床（ＴＨ）からの高倍率画像を示す。
【実施例】
【0072】
様々な例示的態様および実施形態を参照しながら本発明を説明してきたが、本発明の範囲から逸脱することなく、様々な変更を行うことができ、その要素の代わりに均等物で置換してもよいことは、当業者に理解されるであろう。加えて、その本質的な範囲から逸脱することなく、特定の状況または分子を本発明の教示に適合させるために多数の修正を行うこともできる。したがって、本発明は、任意の特定の実施形態に限定されるものではなく、本発明は、添付の特許請求の範囲に含まれるすべての実施形態を含むことが意図される。
【0073】
本発明は、以下の非限定的な実施例によってさらに例示されるであろう。これらは、例示の目的でのみ提供され、本発明をいかなる方法でも限定することは意図されていない。当業者は、本質的に同じ結果をもたらすように変更または修正することができる、様々な重要でないパラメータを容易に認識するであろう。使用する数字（例えば量、温度など）に関する正確さを保証するように努力してきたが、いくらかの実験誤差や偏差が存在しうる。別段の指示がない限り、本発明の実施は、当業界の技術の範囲内において、従来のタンパク質化学、生化学、組換えＤＮＡ技術および薬理学の方法を使用する。かかる技術は、既存の文献に充分に説明されている。加えて、本明細書の特定のリンカー設計に適用されるタンパク質工学の方法は、本明細書に記載され本発明者らにより検討された他の構築物に、本開示の範囲内に含まれるように適用できることも、当業者には明白であろう。
【0074】
実施例１
プラスミドの作製およびタンパク質発現
タンパク質は、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＥｘｐｉＣＨＯＴＭ（商標））またはヒト胚腎細胞（Ｅｘｐｉ２９３ＦＴＭ（商標））（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）の一過性トランスフェクションによって発現せしめた。
プラスミドの作製およびタンパク質発現
タンパク質は、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＥｘｐｉＣＨＯＴＭ（商標））またはヒト胚腎細胞（Ｅｘｐｉ２９３ＦＴＭ（商標））（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）の一過性トランスフェクションによって発現せしめた。
【0075】
タンパク質の発現のために、ｐｃＤＮＡ３．４プラスミド（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を使用し、以下の機能性要素を含むように設計した：
・サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）由来のプロモーター要素、
・マウスκ軽鎖シグナル配列（ＳＳ）、
・発現させようとする遺伝子、および
・二重停止コドン、例えばＴＧＡ、ＴＡＡを用いた完全停止。
・サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）由来のプロモーター要素、
・マウスκ軽鎖シグナル配列（ＳＳ）、
・発現させようとする遺伝子、および
・二重停止コドン、例えばＴＧＡ、ＴＡＡを用いた完全停止。
【0076】
実施例２
本開示の例示的な二重特異性結合分子の全体的な設計およびアミノ酸配列
本実施例に記載の全ての結合分子は、同一の抗体重鎖（ＨＣ）を用いて設計した。より具体的には、重鎖は、Ａβプロトフィブリル結合抗体ｍＡｂ１５８からのマウスＶＨドメインと、それにカップリングされたＩｇＧ２サブクラスのマウスＣＨ１ドメイン、続いてヒトＩｇＧ１のＣＨ２－ＣＨ３部分を含み、全てｐｃＤＮＡ３．４プラスミド上にコードされている。換言すれば、重鎖は、マウスＶＨ－ＣＨ１部分（Ｆａｂ）とヒトＣＨ２－ＣＨ３部分（Ｆｃ）とを含むキメラ構成物である。完全重鎖アミノ酸配列は、配列番号７に与えられ、それは本明細書中では「ｍＡｂ１５８重鎖」と称される。
本開示の例示的な二重特異性結合分子の全体的な設計およびアミノ酸配列
本実施例に記載の全ての結合分子は、同一の抗体重鎖（ＨＣ）を用いて設計した。より具体的には、重鎖は、Ａβプロトフィブリル結合抗体ｍＡｂ１５８からのマウスＶＨドメインと、それにカップリングされたＩｇＧ２サブクラスのマウスＣＨ１ドメイン、続いてヒトＩｇＧ１のＣＨ２－ＣＨ３部分を含み、全てｐｃＤＮＡ３．４プラスミド上にコードされている。換言すれば、重鎖は、マウスＶＨ－ＣＨ１部分（Ｆａｂ）とヒトＣＨ２－ＣＨ３部分（Ｆｃ）とを含むキメラ構成物である。完全重鎖アミノ酸配列は、配列番号７に与えられ、それは本明細書中では「ｍＡｂ１５８重鎖」と称される。
【0077】
異なる構築物間の変動は、各々の一本鎖成分を通して達成され、連続ポリペプチド鎖の各要素間をつないで一本鎖成分を構築するために異なるリンカー長さを使用した。
【0078】
各々の試験した一本鎖成分では、２つの同一の抗体軽鎖ＬＣは、Ａβプロトフィブリル結合抗体ｍＡｂ１５８の軽鎖に由来し、そして各ＬＣは配列番号８のアミノ酸配列を有するκクラスのＶＬ－ＣＬ部分から成った。
【0079】
同じく試験した各々の一本鎖成分では、一本鎖結合モジュールｓｃＢＭがトランスフェリン受容体結合抗体８Ｄ３（Ｋｉｓｓｅｌ他（１９９８）、Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１０：６３－７２）由来でありかつ配列番号９のアミノ酸配列を有する、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）であった。８Ｄ３由来でありかつ構成物中に用いられるこのｓｃＦｖは、しばしば簡略化のため「８Ｄ３」と記述される。
【0080】
様々な試験構築物は、表１に与えられ、図１に描写されるフォーマット（ｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．１、ｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．２およびｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．３）、図２に描写されるフォーマット（ｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．４およびｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．５）またはいずれのｓｃＢＭ要素も持たない陰性対照（ｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－Ｉｇ．６）としてのいずれかに従って設計された。
【0081】
【表1】
【0082】
実施例３
設計した構築物の産生および精製
本開示の二重特異性結合分子および対照は、製造業者の指示に従って、チャイニーズハムスター卵巣細胞の一過性トランスフェクションによって発現せしめた（ＥｘｐｉＣＨＯ（商標）発現系；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）。重鎖プラスミドおよび軽鎖プラスミドの等モル比をトランスフェクション中に細胞に添加した。発現構築物を含む細胞培養上清を、３２００×ｇで１０分間遠心分離することにより、トランスフェクション後８～１０日目に収穫した。上清を精製まで凍結保存した。
設計した構築物の産生および精製
本開示の二重特異性結合分子および対照は、製造業者の指示に従って、チャイニーズハムスター卵巣細胞の一過性トランスフェクションによって発現せしめた（ＥｘｐｉＣＨＯ（商標）発現系；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）。重鎖プラスミドおよび軽鎖プラスミドの等モル比をトランスフェクション中に細胞に添加した。発現構築物を含む細胞培養上清を、３２００×ｇで１０分間遠心分離することにより、トランスフェクション後８～１０日目に収穫した。上清を精製まで凍結保存した。
【0083】
精製時に、発現構築物を含む凍結上清を解凍し、濾過した。濾過した上清を、ＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕＲｅ（登録商標）カラム（Ｃｙｔｉｖａ社）に適用し、続いてそれをＤＰＢＳ ｐＨ７．４で洗浄した。発現した結合分子を、０．７％ＨＡｃ（ｐＨ２．５）の適用によって溶出させ、続いて、試料を直ちにｐＨ７．５に中和した。精製した試料をさらにＤＰＢＳ ｐＨ７．４中でのサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ；ＨｉＬｏａｄ ２６／６００ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（登録商標）２００；Ｃｙｔｉｖａ社）にかけて仕上げた。ＳＥＣ精製された単量体構築物を、遠心濃縮器ＡｍｉｃｏｎＵｌｔｒａ（登録商標）（３０ ＭＷＣＯ（分子量カットオフ）、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）を使用して１０μＭに濃縮し、更なる分析用に－８０℃で保存した。各々の精製された発現構築物は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、サイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（登録商標）２００、Ｉｎｃｒｅａｓｅ３．２／３００；Ｃｙｔｉｖａ社）、エンドトキシン測定およびＵＶタンパク質測定を使用して特徴づけた。精製構築物の代表的なＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析の例を図３に示す。
【0084】
実施例４
抗原の産生および精製
組換えマウストランスフェリン受容体１（ｍＴｆＲ１）を、製造業者の教示に従って、ヒト胚腎臓細胞の一過性トランスフェクションによって産生した（Ｅｘｐｉ２９３Ｆ（商標）発現系；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）。発現プラスミドは、精製のためにＨｉｓ－ｔａｇに融合されたｍＴｆＲ１の細胞外ドメイン（アミノ酸８９～７６３；配列番号１６）を含んでいた。
抗原の産生および精製
組換えマウストランスフェリン受容体１（ｍＴｆＲ１）を、製造業者の教示に従って、ヒト胚腎臓細胞の一過性トランスフェクションによって産生した（Ｅｘｐｉ２９３Ｆ（商標）発現系；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）。発現プラスミドは、精製のためにＨｉｓ－ｔａｇに融合されたｍＴｆＲ１の細胞外ドメイン（アミノ酸８９～７６３；配列番号１６）を含んでいた。
【0085】
ｍＴｆＲ１タンパク質を前記濾過済の細胞培養上清から精製した。上清をＨｉｓ Ｔｒａｐ Ｅｘｃｅｌカラム（Ｃｙｔｉｖａ社）に適用し、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、２００ｍＭ ＮａＣｌおよび５ｍＭイミダゾールで洗浄した。タンパク質を２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、２００ｍＭ ＮａＣｌおよび５００ｍＭイミダゾールで溶出させ、続いて、ＨｉＰｒｅｐ（登録商標）２６／１０脱塩カラム（Ｃｙｔｉｖａ社）を使用してＤＰＢＳ（ｐＨ７．４）への緩衝液交換を行った。タンパク質を、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ（登録商標）遠心濃縮器（３０ＭＷＣＯ；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）を用いて濃縮した。精製後直ちに－８０℃でタンパク質を保存して、凝集を防いだ。タンパク質の分析による特性評価は、ＵＶタンパク質測定およびＳＤＳ－ＰＡＧＥによって行われ、精製が成功したことが結論付けられた。
【0086】
実施例５
マウストランスフェリン受容体への結合のＥＬＩＳＡ分析
特定の発現構成物のｍＴｆＲ１への結合は、間接ＥＬＩＳＡ法によって評価した（図４）。要するに、９６ウェルプレートの半領域（Ｃｏｒｎｉｎｇ製、＃３６９０）を、実施例４に記載の通り産生した１μｇ／ｍＬの組換えｍＴｆＲ１により、ＰＢＳ中で４℃にて一晩コーティングした。コーティングしたプレートを、Ｐｉｅｒｃｅタンパク不含ブロッキング溶液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、＃３７５７２）を使用して振盪しながら室温で１時間ブロックし、続いて０．１％ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０を含むＰＢＳ中で４回洗浄した。インキュベーション緩衝液（ＰＢＳ中１％ＢＳＡ、０．１％ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０）中の発現構築物の段階希釈液（１：３）を、室温で１時間インキュベートした。４回の洗浄工程に続いて、抗マウスＩｇＧ Ｆ（ａｂ′）２－ＨＲＰ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社、＃１１５－０３５－００６）を、インキュベーション緩衝液中１：１２５０希釈度において添加することにより（１ｈ、室温）、結合した被験構築物を検出した。４回の洗浄工程に続いて、Ｋ－Ｂｌｕｅ（登録商標）水性ＴＭＢ基質（Ｎｅｏｇｅｎ社、＃３３１１７７）を室温で１５分間ウェルに添加した後、０．５Ｍ Ｈ２ＳＯ４の１：１希釈を用いて反応を停止させた。４５０ｎｍの光学濃度を記録し（Ｓｐａｒｋ（登録商標）、Ｔｅｃａｎ社）、解析前にバックグラウンドシグナル（背景値）を差し引いた。図４は、間接ＥＬＩＳＡによって測定された、ｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．１、ｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．２およびｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．３に対するｍＴｆＲ１結合を示す。全てのｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－８Ｄ３変異体についてのｍＴｆＲ１に対する親和性は、一価８Ｄ３ Ｆａｂ対照（配列番号１７の軽鎖および配列番号１８の重鎖を有する）に匹敵する。
マウストランスフェリン受容体への結合のＥＬＩＳＡ分析
特定の発現構成物のｍＴｆＲ１への結合は、間接ＥＬＩＳＡ法によって評価した（図４）。要するに、９６ウェルプレートの半領域（Ｃｏｒｎｉｎｇ製、＃３６９０）を、実施例４に記載の通り産生した１μｇ／ｍＬの組換えｍＴｆＲ１により、ＰＢＳ中で４℃にて一晩コーティングした。コーティングしたプレートを、Ｐｉｅｒｃｅタンパク不含ブロッキング溶液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、＃３７５７２）を使用して振盪しながら室温で１時間ブロックし、続いて０．１％ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０を含むＰＢＳ中で４回洗浄した。インキュベーション緩衝液（ＰＢＳ中１％ＢＳＡ、０．１％ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０）中の発現構築物の段階希釈液（１：３）を、室温で１時間インキュベートした。４回の洗浄工程に続いて、抗マウスＩｇＧ Ｆ（ａｂ′）２－ＨＲＰ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社、＃１１５－０３５－００６）を、インキュベーション緩衝液中１：１２５０希釈度において添加することにより（１ｈ、室温）、結合した被験構築物を検出した。４回の洗浄工程に続いて、Ｋ－Ｂｌｕｅ（登録商標）水性ＴＭＢ基質（Ｎｅｏｇｅｎ社、＃３３１１７７）を室温で１５分間ウェルに添加した後、０．５Ｍ Ｈ２ＳＯ４の１：１希釈を用いて反応を停止させた。４５０ｎｍの光学濃度を記録し（Ｓｐａｒｋ（登録商標）、Ｔｅｃａｎ社）、解析前にバックグラウンドシグナル（背景値）を差し引いた。図４は、間接ＥＬＩＳＡによって測定された、ｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．１、ｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．２およびｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．３に対するｍＴｆＲ１結合を示す。全てのｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－８Ｄ３変異体についてのｍＴｆＲ１に対する親和性は、一価８Ｄ３ Ｆａｂ対照（配列番号１７の軽鎖および配列番号１８の重鎖を有する）に匹敵する。
【0087】
実施例６
マウストランスフェリン受容体への結合のバイオレイヤー干渉分析
発現構成物のｍＴｆＲ１への結合は、バイオレイヤー干渉法（Ｏｃｔｅｔ ＲＥＤ３８４、ＦｏｒｔｅＢｉо社）によって評価した。高精度ストレプトアビジンセンサに、連続した二段階で以下をロードした：最初に２０μｇ／ｍＬのビオチン化ヒトホロ型トランスフェリン（Ｓｉｇｍａ社）を用いて１８０秒間、次に、実施例４に記載の通り作製された２０μｇ／ｍＬの組換えｍＴｆＲ１を用いて１８０秒間適用した。その後、ロードセンサへの試料の会合を１２０秒間測定し、続いて解離を３００秒間測定した。結合は、ｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．１およびｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．２については１７．５μｇ／ｍＬに希釈した試料、そしてｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．３については１８μｇ／ｍＬに希釈した試料、そして８Ｄ３Ｆａｂについては４．９μｇ／ｍＬに希釈した試料（それぞれの結合分子１００ｎＭに相当する）を用いて分析した。緩衝液試料からのレスポンスを差し引いた。全ての試料を１×カイネティクス緩衝液（ＦｏｒｔｅＢｉｏ社）中に希釈した。ベースラインおよび解離工程についても同じ緩衝液を使用した。得られた結合曲線を図５に示す。この図は、ｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．１、ｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．２、ｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－ｌｇ．３、ｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．４およびｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．５が全て、ホロ型トランスフェリンとｍＴｆＲ１との複合体に結合することを示す。ＴｆＲ１結合モジュールを欠いているｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－Ｉｇ．６は、ホロ型トランスフェリンとｍＴｆＲ１との複合体に結合しない。対照として、８Ｄ３ Ｆａｂおよび抗体ｍＡｂ１５８ ＩｇＧを実験に含めた。
マウストランスフェリン受容体への結合のバイオレイヤー干渉分析
発現構成物のｍＴｆＲ１への結合は、バイオレイヤー干渉法（Ｏｃｔｅｔ ＲＥＤ３８４、ＦｏｒｔｅＢｉо社）によって評価した。高精度ストレプトアビジンセンサに、連続した二段階で以下をロードした：最初に２０μｇ／ｍＬのビオチン化ヒトホロ型トランスフェリン（Ｓｉｇｍａ社）を用いて１８０秒間、次に、実施例４に記載の通り作製された２０μｇ／ｍＬの組換えｍＴｆＲ１を用いて１８０秒間適用した。その後、ロードセンサへの試料の会合を１２０秒間測定し、続いて解離を３００秒間測定した。結合は、ｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．１およびｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．２については１７．５μｇ／ｍＬに希釈した試料、そしてｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．３については１８μｇ／ｍＬに希釈した試料、そして８Ｄ３Ｆａｂについては４．９μｇ／ｍＬに希釈した試料（それぞれの結合分子１００ｎＭに相当する）を用いて分析した。緩衝液試料からのレスポンスを差し引いた。全ての試料を１×カイネティクス緩衝液（ＦｏｒｔｅＢｉｏ社）中に希釈した。ベースラインおよび解離工程についても同じ緩衝液を使用した。得られた結合曲線を図５に示す。この図は、ｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．１、ｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．２、ｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－ｌｇ．３、ｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．４およびｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．５が全て、ホロ型トランスフェリンとｍＴｆＲ１との複合体に結合することを示す。ＴｆＲ１結合モジュールを欠いているｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－Ｉｇ．６は、ホロ型トランスフェリンとｍＴｆＲ１との複合体に結合しない。対照として、８Ｄ３ Ｆａｂおよび抗体ｍＡｂ１５８ ＩｇＧを実験に含めた。
【0088】
実施例７
細胞への結合および細胞による取込み
ＴｆＲ１によって媒介される結合および取込みは、不死化マウス脳毛細血管内皮細胞（ｃＥＮＤ）（ＡＢＭ社、＃Ｔ０２９０）において測定された。
細胞への結合および細胞による取込み
ＴｆＲ１によって媒介される結合および取込みは、不死化マウス脳毛細血管内皮細胞（ｃＥＮＤ）（ＡＢＭ社、＃Ｔ０２９０）において測定された。
【0089】
ペレットをＰＢＳ中に再懸濁させ、１ウェル当たり２００，０００個の細胞をＵ字型底の９６ウェルＣｏｒｎｉｎｇプレートに播種し、フローサイトメトリー染色を行った。次いで、細胞をＰＢＳで洗浄し、１００ｎＭのｍＡｂ１５８－８Ｄ３構成物であるｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．１、ｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．２およびｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．３、対照８Ｄ３ ＩｇＧ（配列番号１７の軽鎖、配列番号１９の重鎖）またはマウスＩｇＧ対照のうちの１つと共に、４℃にて４５分間インキュベートした。一次インキュベーション後、細胞を氷冷ＰＢＳで２回洗浄し、そしてｍＡｂ１５８－８Ｄ３構築物を、蛍光標識二次抗マウスＩｇＧ－ＰＥ抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、５５０５８９）を使って捕捉した。インキュベーション後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、２００μＬのＰＢＳ中に再懸濁した。ＢＤ ＦＡＣＳＬｙｒｉｃ（商標）フローサイトメーターシステム（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）において細胞を取得し、ＦＣＳ Ｅｘｐｒｅｓｓ（商標）ソフトウェア（ＤｅＮｏｖｏ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いて試料を分析した。測定された平均蛍光強度は図６に表示され、これは、二重特異性結合分子構築物が、細胞表面上に発現されたｍＴｆＲ１に結合することを示している。
【0090】
構築物の内在化／取り込みの測定のために、ｃＥＮＤ細胞をＴ７５細胞培養フラスコ中で２～３日間、＞８０％コンフルエンス（集密度）にまで培養した。ＴｒｙｐＩＥ試薬を用いて細胞を採取し、１５００ｒｐｍで５分間遠心分離することによって新鮮な細胞培地で洗浄した。細胞をＤＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ社）中に再懸濁し、９６ウェルＵ字底プレート中３００，０００個の細胞／ウェルの密度に播種した。細胞を、１００ｎＭのｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．１、ｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．２、ｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．３、または陽性対照（二価８Ｄ３ ＩｇＧ）で３７℃、５％ＣＯ２にて１時間処理したか、または未処理のままであった。次いで、細胞を氷冷ＰＢＳで２回洗浄し、ＢＤ Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ（商標）試薬（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を使用して、内在化構築物にアクセスするために透過処理した。細胞を１％ＢＤ Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈ（商標）緩衝液中の抗マウスＩｇＧ－ＰＥで室温にて４５分間染色した。染色後、細胞を１％ＢＤ Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈ（商標）緩衝液で２回洗浄した。最後に、細胞をＰＢＳ中に再懸濁し、ＢＤ ＦＡＣＳＬｙｒｉｃ（商標）フローサイトメトリーを用いて取得した。ＦＣＳ Ｅｘｐｒｅｓｓ（商標）ソフトウェアを使用して、試料をＰＥ陽性集団について解析した。ｍＴｆＲ１媒介取込みの指標である、陽性細胞の百分率が、図７に表示される。
【0091】
まとめると、これらの結果は、二重特異性結合分子ｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．１、ｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．２およびｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．３が、ｃＥＮＤ細胞上のｍＴｆＲ１に結合し、かつ二価の８Ｄ３ ＩｇＧよりも高比率で内在化されることを実証した。
【0092】
実施例８
アミロイドβ（Ａβ１－４２）への結合のＥＬＩＳＡ測定
ｍＡｂ１５８ＩｇＧおよびｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－８Ｄ３構築物のＡβ１－４２への結合を、間接ＥＬＩＳＡによって評価した。９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社、＃３６９０）の半領域を、０．５μｇ／ｍＬの組換えＡβ１－４２（配列番号２０）でコーティングし、そして実施例５においてｍＴｆＲ１について説明したとおりに解析を行った。その結果を図８に示す。全ての被験構築物によるＡβ１－４２への結合が、未修飾のｍＡｂ１５８ＩｇＧ対照による結合と同等であったことを実証しており、Ａβ１－４２への結合が、一本鎖結合モジュール（ｓｃＢＭ）を含む一本鎖成分を有する二重特異性フォーマットにおいて維持されることを実証した。
アミロイドβ（Ａβ１－４２）への結合のＥＬＩＳＡ測定
ｍＡｂ１５８ＩｇＧおよびｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－８Ｄ３構築物のＡβ１－４２への結合を、間接ＥＬＩＳＡによって評価した。９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社、＃３６９０）の半領域を、０．５μｇ／ｍＬの組換えＡβ１－４２（配列番号２０）でコーティングし、そして実施例５においてｍＴｆＲ１について説明したとおりに解析を行った。その結果を図８に示す。全ての被験構築物によるＡβ１－４２への結合が、未修飾のｍＡｂ１５８ＩｇＧ対照による結合と同等であったことを実証しており、Ａβ１－４２への結合が、一本鎖結合モジュール（ｓｃＢＭ）を含む一本鎖成分を有する二重特異性フォーマットにおいて維持されることを実証した。
【0093】
実施例９
プラズマ中の発現構築物の安定性
二重特異性結合分子ｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．１およびｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．３の血漿中安定性は、イムノブロット（ウェスタンブロット）によって測定した。二重特異性結合分子をＣ５７ＢＬ／６マウス血漿またはＰＢＳ中で３７℃にて０時間、１時間、２４時間および１６８時間インキュベートした（血漿中またはＰＢＳ中に１：1０希釈された、１．５μｇ結合分子）。試料を凍結―解凍を２回繰り返し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびウェスタンブロットに供した。手短に言えば、０．３８μｇ（２．５μＬ）の血漿／ＰＢＳ試料を、ＲＩＰＡ緩衝液およびＬＤＳ試料緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、ＮＰ０００７）で希釈し、ＮｕＰＡＧＥＴＭ（商標）４～１２％ビス－トリスゲル（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、ＡＰ０３２９）に装填した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびニトロセルロース膜（ＢｉｏＲａｄ社、＃１７０４１５８）への移行に続いて、ヤギ抗ヒトＩｇＧ－ＩＲＤｙｅ（登録商標）８００ＣＷ二次抗体（ＬＩ－ＣＯＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、＃９２６－３２２３２）によって検出した。結果を図９に示す。二重特異性結合分子は、血漿とＰＢＳとの間のわずかな移動度シフトを伴って、期待分子量約１７５ｋＤａで検出された。ウェスタンブロット分析は、ｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．１およびｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．３が少なくとも７日間の期間に渡って、マウス血漿中インビトロで安定であることを示した。
プラズマ中の発現構築物の安定性
二重特異性結合分子ｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．１およびｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．３の血漿中安定性は、イムノブロット（ウェスタンブロット）によって測定した。二重特異性結合分子をＣ５７ＢＬ／６マウス血漿またはＰＢＳ中で３７℃にて０時間、１時間、２４時間および１６８時間インキュベートした（血漿中またはＰＢＳ中に１：1０希釈された、１．５μｇ結合分子）。試料を凍結―解凍を２回繰り返し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびウェスタンブロットに供した。手短に言えば、０．３８μｇ（２．５μＬ）の血漿／ＰＢＳ試料を、ＲＩＰＡ緩衝液およびＬＤＳ試料緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、ＮＰ０００７）で希釈し、ＮｕＰＡＧＥＴＭ（商標）４～１２％ビス－トリスゲル（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、ＡＰ０３２９）に装填した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびニトロセルロース膜（ＢｉｏＲａｄ社、＃１７０４１５８）への移行に続いて、ヤギ抗ヒトＩｇＧ－ＩＲＤｙｅ（登録商標）８００ＣＷ二次抗体（ＬＩ－ＣＯＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、＃９２６－３２２３２）によって検出した。結果を図９に示す。二重特異性結合分子は、血漿とＰＢＳとの間のわずかな移動度シフトを伴って、期待分子量約１７５ｋＤａで検出された。ウェスタンブロット分析は、ｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．１およびｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．３が少なくとも７日間の期間に渡って、マウス血漿中インビトロで安定であることを示した。
【0094】
実施例１０
ｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－８Ｄ３構築物のインビボでの脳内取込み
インビボでのｍＴｆＲ１媒介脳内取込みを評価するために、二重特異性結合分子ｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．１およびｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．３、並びにｍＡｂ１５８ ＩｇＧ（キメラｌｇＧ１、ヒトＦｃ）を、１０ナノモル／ｋｇの等モル量（それぞれ１．８２ｍｇ／ｋｇ、１．７８ｍｇ／ｋｇおよび１．５０ｍｇ／ｋｇに相当）で、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ雌マウス（構築物あたりｎ＝３～５匹のマウス）に静脈内（ｉｖ）注射した。血漿および脳内曝露は、投与後２４時間目に評価した。イソフルランを用いて動物を麻酔し、末梢血試料を軌道叢からＢＤ Ｍｉｃｒｏｔａｉｎｅｒ（登録商標）のＫ２ＥＤＴＡ採血管に採取した。試料を反転させ、２４００×ｇで４℃にて１０分間遠心分離した。血漿を抽出し、エッペンドルフ管に移し、－８０℃で凍結した。血液サンプリング後、直ちに動物の腹部を切開し、カニューレ（２１ゲージ）を心臓の左心室に挿入した。右心房に小さな切開を作り、最小５０ｍＬの冷ＰＢＳでの経心臓的灌流を行った。還流後、脳を抽出し、嗅球を除去した。大脳を左半球と右半球に分離し、左半球から小脳を取り外した後、左半球の重さを秤量し、ドライアイス上で凍結し、注入した構築物の更なる調製とＭｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）ベースのアッセイを用いた更なる調製と濃度分析を行うまで－８０℃で保存した。無傷の小脳が付随する右半球は、４％ホルムアルデヒド中に置き、４℃で２４時間保存し、その後、それらを冷ＰＢＳ中ですすぎ、冷３０％ショ糖／ＰＢＳ溶液に移し、更なる免疫組織化学（ＩＨＣ）処理のために４℃で保存した。
ｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－８Ｄ３構築物のインビボでの脳内取込み
インビボでのｍＴｆＲ１媒介脳内取込みを評価するために、二重特異性結合分子ｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．１およびｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．３、並びにｍＡｂ１５８ ＩｇＧ（キメラｌｇＧ１、ヒトＦｃ）を、１０ナノモル／ｋｇの等モル量（それぞれ１．８２ｍｇ／ｋｇ、１．７８ｍｇ／ｋｇおよび１．５０ｍｇ／ｋｇに相当）で、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ雌マウス（構築物あたりｎ＝３～５匹のマウス）に静脈内（ｉｖ）注射した。血漿および脳内曝露は、投与後２４時間目に評価した。イソフルランを用いて動物を麻酔し、末梢血試料を軌道叢からＢＤ Ｍｉｃｒｏｔａｉｎｅｒ（登録商標）のＫ２ＥＤＴＡ採血管に採取した。試料を反転させ、２４００×ｇで４℃にて１０分間遠心分離した。血漿を抽出し、エッペンドルフ管に移し、－８０℃で凍結した。血液サンプリング後、直ちに動物の腹部を切開し、カニューレ（２１ゲージ）を心臓の左心室に挿入した。右心房に小さな切開を作り、最小５０ｍＬの冷ＰＢＳでの経心臓的灌流を行った。還流後、脳を抽出し、嗅球を除去した。大脳を左半球と右半球に分離し、左半球から小脳を取り外した後、左半球の重さを秤量し、ドライアイス上で凍結し、注入した構築物の更なる調製とＭｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）ベースのアッセイを用いた更なる調製と濃度分析を行うまで－８０℃で保存した。無傷の小脳が付随する右半球は、４％ホルムアルデヒド中に置き、４℃で２４時間保存し、その後、それらを冷ＰＢＳ中ですすぎ、冷３０％ショ糖／ＰＢＳ溶液に移し、更なる免疫組織化学（ＩＨＣ）処理のために４℃で保存した。
【0095】
脳内濃度測定のために、凍結大脳左半球を氷上で解凍し、自動ビーズ均質化法によってＴＢＳ中でホモジナイズした。ホモジネートに０．５％の最終濃度にＴｒｉｔｏｎ（登録商標）を加えた後、１６０００×ｇで遠心分離し、その後上清を収集した。
【0096】
ｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．１、ｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．３およびｍＡｂ１５８ ＩｇＧの脳内および血漿濃度を、ＭＳＤプラットフォームを使用して決定した。標準９６ウェルＭＳＤプレート（ＭＳＤ社、＃Ｌ１５ＸＡ－３）を、１×ＰＢＳ－ＴＷＥＥＮ（登録商標）（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、＃０９－９４００－１００）中に希釈した０．５μｇ／ｍＬヤギ抗ヒトＩｇＧＦｃのγフラグメント特異的抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎо Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｅｕｒｏｐｅ Ｌｔｄ、＃１０９－００５－０９８）を使って、５０μＬ／ウェルの容量でコーティングした。４℃で一晩インキュベートした後、プレートを１×ＰＢＳ－ＴＷＥＥＮ（登録商標）（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、＃０９－９４１０－１００）で４回洗浄し、ＢｌｏｃｋｅｒＡ（ＭＳＤ社、＃Ｒ９３ＢＡ－４）でブロックした。１：４希釈段階において８３ｐＭから０．０２ｐＭまでの範囲に渡って試料および対応する標準物質をＢｌｏｃｋｅｒＡ中に希釈し、そして５０μＬ／ウェルの容量で二重複製にて添加した。室温で９００ｒｐｍにて２時間インキュベートした後、ウェルを４回洗浄した。ＢｌｏｃｋｅｒＡ中０．５μｇ／ｍＬに希釈されたスルホ－ＴＡＧ結合抗マウス抗体（ＭＳＤ社、Ｒ３２ＡＣ－１）５０μＬを、各ウェルに加え、プレートを室温でさらに１時間、９００ｒｐｍで攪拌しながらインキュベートした。４回洗浄後、１５０μＬの２×ＭＳＤ読み取り緩衝液（ＭＳＤ社、Ｒ９２ＴＣ）を各ウェルに添加し、プレートをＭＳＤのＳＥＣＴＯＲ（登録商標）撮像装置で読み取った。試料中の分析対象（アナライト）の濃度を、ＭＳＤワークベンチソフトウェアを用いて、４ＰＬ（４パラメータ・ロジスティック）曲線適合アルゴリズムおよび標準曲線に対する１／Ｙ２曲線重みを使って評価した。Ｔｕｋｅｙの事後解析（ｐоｓｔ ｈоｃ）検定を伴う一元配置ＡＮＯＶＡを使ってＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（バージョン９．０．０）において統計解析を実施した。
【0097】
その結果を図１０に示す。図１０Ａに示すように、２つのｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇフォーマットの血漿濃度は、投与後２４時間目におけるｍＡｂ１５８ ＩｇＧの血漿濃度よりも十分低かった。ｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇフォーマットは、ｍＴｆＲ１関連のクリアランスの寄与のために、通常の（野生型の）ＩｇＧに比較して血漿からより迅速にクリアランスされると思われることから、血漿データ間の差異が予測される。より低い血漿濃度にもかかわらず、投与後２４時間で、ｍＡｂ１５８ ＩｇＧと比較して有意に高い脳内濃度（図１０Ｂ、ｐ＜０．０００１）がｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．１およびｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．３の両方について観察された。２４時間後のｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．１およびｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．３の脳対血漿中濃度比はまた、ｍＡｂ１５８ ＩｇＧとの比較において、血漿に対比した脳内暴露が有意に増強されたことも示した（図１０Ｃ、ｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．１：ｐ＜０．０００１；ｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．３：ｐ＜０．０００１）。まとめると、このデータは、被験二重特異性結合分子の高い脳内濃度をもたらし、ｍＴｆＲ１媒介性ＢＢＢ輸送（の達成）を支持している。
【0098】
ｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．１およびｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．３のＢＢＢトランスサイトーシスおよび脳内取り込みは、定性ＩＨＣ分析によってさらに支持された。簡潔には、厚さ２０μｍの冠状脳切片を、クライオスタット（Ｍｉｃｒｏｍ ＨＭ ５００ ＯＭ）を使用したＰＢＳ灌流後の大脳半球から取得した。各切断面は、Ｓｕｐｅｒｆｒｏｓｔ（登録商標）ｐｌｕｓスライド（Ｍｅｎｚｅｌ－Ｇｌａｓｅｒ、＃Ｊ１８００ＡＭＮＺ）上に収集され、ＩＨＣ前に風乾した。脳切片をＰＢＳ（ｐＨ７．４）で１５分間洗浄し、ブロッキング緩衝液（ＰＢＳ中５％ＢＳＡ、０．２５％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）－Ｘ）中で室温にて２時間インキュベートした。静脈内（ｉｖ）投与した構築物を可視化するために、脳切片を、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、＃Ａ１１０１３）に結合された二次ヤギ抗ヒトＩｇＧ（重鎖および軽鎖特異的）と共に、室温で９０分間インキュベートし、続いてＰＢＳ中で３×１５分間洗浄した。脳毛細血管を可視化するために、ウサギ抗コラーゲンＩＶ抗体（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社、＃２１５０－１４７０）を適用し、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５６８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、＃Ａ－１１０１１）に結合された二次アフィニティー精製済ヤギ抗ウサギＩｇＧ（重鎖および軽鎖特異的）により検出した（データは示していない）。スライドを画像診断分析のためにＦｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ（登録商標）－Ｇ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、＃００－４９５８－０２）とともに装填した。大脳皮質からの共焦点画像を、ＨＣ ＰＬ ＡＰＯ ４０×／１．２５ＧＬＹＣ（グリセリン液浸）ｍоｔＣＯＲＲ（補正環付）ＣＳ２対象レンズ（ライカ社、＃１１５０６４２３）を装備したライカ社のＳｔｅｌｌａｒｉｓ（登録商標）５共焦点撮像システムを使ってキャプチャーした。２０４８×２０４８ピクセルの分解能で単一共焦点平面像を、１ＡＵ（ＡｉｒｙＵｎｉｔ；エアリー単位）のピンホール設定で６００Ｈｚにて取得した。
【0099】
最小のＩＨＣシグナルは、ｍＡｂ１５８ ＩｇＧを注入した動物からの脳切片において検出された（図１１、左パネル）。対照的に、ｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．１およびｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．３を投与した動物においては、高められた実質シグナルと免疫染色された脳細胞とともに、脳毛細血管において明確なＩＨＣシグナルが観察された（図１１、中央および右パネル）。この結果は、ｍＴｆＲ１媒介係合およびＢＢＢを通過するトランスサイトーシスを示している。まとめると、ＭＳＤとＩＨＣ解析は、ｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．１およびＩｇ．３二重特異性結合分子が、対照のｍＡｂ１５８ ＩｇＧに対比して強化された脳内曝露を付与することを実証する。
【0100】
実施例１１
追加のｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－８Ｄ３構築物の設計および特徴付け
本実施例に記載の全ての結合分子は、実施例２と同じ抗体ＩｇＧ１重鎖（ＨＣ）、すなわち配列番号７を用いて作製した。
追加のｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－８Ｄ３構築物の設計および特徴付け
本実施例に記載の全ての結合分子は、実施例２と同じ抗体ＩｇＧ１重鎖（ＨＣ）、すなわち配列番号７を用いて作製した。
【0101】
異なるリンカー長を使用して連続ポリペプチド鎖の要素を連結することにより一本鎖成分を創製し、それぞれの一本鎖成分を通して異なる構成物間に変動を構築した。本実施例に記載の全ての結合分子は、実施例２と同じＬＣ、すなわち配列番号８を使用して設計された。
【0102】
本実施例に提供する異なる構築物は、実施例２に記載のものと同じ一本鎖結合モジュールｓｃＢＭ、すなわち配列番号９（ｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．７、ｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．８、ｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．９、ｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．１０、ｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．１１、およびｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．１２中に存在する）、または同じく８Ｄ３に由来するが重鎖と軽鎖の順序が逆である一本鎖結合モジュールｓｃＢＭ、配列番号２１（ｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．１３、ｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．１４およびｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．１５中に存在する）のいずれかを含んでいた。
【0103】
異なる被験構築物は表２に提示されるが、ｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．１３、ｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．１４およびｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．１５は、重鎖可変領域と軽鎖可変領域の順序が逆転しているｓｃＢＭを有していたこと以外、図１に描写されるフォーマットに従って設計された。
【0104】
【表2】
【0105】
二重特異性結合分子は、実施例３に記載されている通りに発現させ精製した。
【0106】
発現構築物のｍＴｆＲ１への結合は、実施例６に記載のものと同様に評価したが、ただし装填工程の間の濃度が１０μｇ／ｍＬであり、装填工程の持続時間が２００秒および３００秒であり、分析対象（アナライト）の濃度が５０ｎＭであった。得られた結合曲線は、図１２に示される。全ての被験構築物はｍＴｆＲ１に結合した（図１２Ａ～１２Ｈ）。ｓｃＢＭを持たない抗体ｍＡｂ１５８は、陰性対照として実験に含められた（図１２Ｉ）。
【0107】
特定の発現構築物のＡβ１－４２への結合は、実施例８に記載したのと同様に間接ＥＬＩＳＡによって評価した。その結果は図１３に示され、全ての被験構築物によるＡβ１－４２への結合が、８Ｄ３ ｓｃＢＭを欠く未修飾ｍＡｂ１５８対照による結合と同等であることを実証した。実験は、Ａβ１－４２への結合が、標準抗体構造のＦａｂアームによって二重特異性フォーマットで維持されることを実証した。
【0108】
実施例１２
選択した構築物についてのＴｆＲ１への一価結合の検証
マウスＴｆＲ１に対するｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．８の一価結合相互作用を、表面プラズモン共鳴法（Ｂｉａｃｏｒｅ８Ｋ、Ｃｙｔｉｖａ社）を用いて測定した。Ｃｍ５センサーチップ（Ｃｙｔｉｖａ社、＃ＢＲ１００３９９）に、製造業者の教示に従って、アミンカップリングキットタイプ２（Ｃｙｔｉｖａ社、＃ＢＲ１００６３３）を使って３μｇ／ｍＬのｍＴｆＲ１を固定した。５０ｎＭの分析対象（アナライト）で始まるＨＢＳ－ＥＰ＋（Ｃｙｔｉｖａ社、＃ＢＲ１００６６９）中の一連の２倍希釈液を、前記固定化リガンド上に二重複製にて注入し、７０μＬ／ｍＬの流速で１６０秒の接触時間に続いて１０００秒の解離時間を用いるシングルサイクル・カイネティクス法を使って、相互作用を測定した。
選択した構築物についてのＴｆＲ１への一価結合の検証
マウスＴｆＲ１に対するｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．８の一価結合相互作用を、表面プラズモン共鳴法（Ｂｉａｃｏｒｅ８Ｋ、Ｃｙｔｉｖａ社）を用いて測定した。Ｃｍ５センサーチップ（Ｃｙｔｉｖａ社、＃ＢＲ１００３９９）に、製造業者の教示に従って、アミンカップリングキットタイプ２（Ｃｙｔｉｖａ社、＃ＢＲ１００６３３）を使って３μｇ／ｍＬのｍＴｆＲ１を固定した。５０ｎＭの分析対象（アナライト）で始まるＨＢＳ－ＥＰ＋（Ｃｙｔｉｖａ社、＃ＢＲ１００６６９）中の一連の２倍希釈液を、前記固定化リガンド上に二重複製にて注入し、７０μＬ／ｍＬの流速で１６０秒の接触時間に続いて１０００秒の解離時間を用いるシングルサイクル・カイネティクス法を使って、相互作用を測定した。
【0109】
得られたセンサーグラムは図１４に示され、これはｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．８、すなわち本開示に係る結合分子が、ｍＴｆＲ１に一価で結合することを確証する。対照として、一価８Ｄ３Ｆａｂを、標準の二価８Ｄ３ ｈＩｇＧと比較した。図は明らかに、一価８Ｄ３ Ｆａｂに比較した８Ｄ３ ｈＩｇＧの二価結合プロファイルを示している。
【0110】
実施例１３
本開示に係るさらなる二重特異性結合分子の設計および特徴付け
本実施例に記載の結合分子は、先行実施例で使用したｍＡｂ１５８由来の異なるＡβ結合抗体から出発して設計した。
本開示に係るさらなる二重特異性結合分子の設計および特徴付け
本実施例に記載の結合分子は、先行実施例で使用したｍＡｂ１５８由来の異なるＡβ結合抗体から出発して設計した。
【0111】
本実験の二重特異性結合分子の重鎖（ＨＣ）は、本明細書でｍＡｂＢと称されるＡβ結合抗体由来のマウスＶＨドメインを含み、そのＶＨドメインはヒトＣＨ１－ＣＨ３部分（ｍＡｂＢ－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．１およびｍＡｂＢ－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．２）に、またはマウスＣＨ１とヒトＣＨ２－ＣＨ３（ｍＡｂＢ－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．３）に連結されている。換言すると、重鎖は、マウスＶＨ部分とヒトＣＨ１－ＣＨ３部分とを含むか、またはマウスＶＨ－ＣＨ１部分とヒトＣＨ２－ＣＨ３部分とを含む、キメラ構築物であった。
【0112】
各被験一本鎖成分中、２つの同一の抗体軽鎖ＬＣは、Ａβ結合抗体ｍＡｂＢの軽鎖のマウスＶＬドメインと、それに連結されたκクラスのヒトＣＬ部分（ｍＡｂＢ－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．１およびｍＡｂＢ－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．２）またはそれに連結されたマウスＣＬ部分（ｍＡｂＢ－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．３）とから誘導された。
【0113】
本実施例で提示される全ての異なる構築物は、実施例２のものと同じ一本鎖結合モジュールｓｃＢＭ、すなわち配列番号９を含んだ。
【0114】
様々な被験構築物が表３に与えられ、それは図１に示されたフォーマットに従って設計された。
【0115】
【表3】
【0116】
二重特異性結合分子ｍＡｂＢ－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．１、ｍＡｂＢ－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．２およびｍＡｂＢ－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．３を、実施例３に記載のとおりに発現させ精製した。
【0117】
発現構築物のｍＴｆＲ１への結合は、本質的にバイオレイヤー干渉法（Ｏｃｔｅｔ）については実施例６に記載のように、そして表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ）については実施例１２に記載のように評価した。
【0118】
ｍＴｆＲ１への結合のＯｃｔｅｔ測定からの代表的な結果は、二重特異性結合分子ｍＡｂＢ－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．２およびｍＡｂＢ－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．３について、並びに陰性対照ｍＡｂＢ、すなわちいずれのＴｆＲ１結合モジュールも含まない標準抗体フォーマットとしてのｍＡｂＢについて、図１５に示されている。
【0119】
ｍＴｆＲ１への結合のＢｉａｃｏｒｅ ＳＣＫ測定からの代表的な結果は、二重特異性結合分子ｍＡｂＢ－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．１について図１６に示されている。
【0120】
発現構築物のＡβへの結合は、標準手順に従ってＢｉａｃｏｒｅ ８Ｋ装置（Ｃｙｔｉｖａ社）を使用して評価した。ＣＭ５チップ上に固定化された結合分子を用いるシングルサイクル・カイネティクス法（ＳＣＫ）を使用して、標的への結合を測定した。測定のために、５μｇ／ｍＬの分析対象（アナライト）結合分子をチップ上に固定した 次いで、２５０ｎＭで始まる５段階の２倍希釈を使用して、Ａβ標的をチップ上に注入した。サイクル間の表面の再生は、３０μＬの１０ｍＭグリシン－ＨＣｌ（ｐＨ１．７）を注入することによって実施した。結合データを１：１相互作用モデルにフィッティングした。１×ＨＢＳ－ＥＰ＋（Ｃｙｔｉｖａ社、カタログ番号ＢＲ１００６６９）を用いて結合分子および標的抗原を希釈した。実験は２５℃にて実施した。
【0121】
Ａβに結合するＢｉａｃｏｒｅ ＳＣＫ測定からの代表的な結果が図１７に示されている。それらのＡβ標的へのｍＡｂＢ－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．１、ｍＡｂＢ－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．２およびｍＡｂＢ－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．３の結合をＢｉａｃｏｒｅによって評価したところ、標準ＩｇＧフォーマットでのｍＡｂＢの結合と同等であることが分かった。
【0122】
実施例１４
本開示の二重特異性結合分子によるインビボでの標的結合
標的係合をインビボでさらに評価するために、実施例１３に記載のように産生したｍＡｂＢおよびｍＡｂＢ－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．１を、Ｂ６ＳＪＬ－Ｔｇ ５ｘＦＡＤマウス（Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔｅｒｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）において検討した。５ｘＦＡＤマウスモデルは、ヒトＡＰＰおよびＰＳＥＮ１導入遺伝子〔ＡＰＰ中にスウェーデン型（Ｋ６７０Ｎ／Ｍ６７１Ｌ）、フロリダ型（Ｉ７１６Ｖ）およびロンドン型（Ｖ７１７Ｉ）突然変異、およびＰＳＥＮ１のＭ１４６ＬとＬ２８６Ｖ突然変異を含む、合計５つのＡＤ関連突然変異を有する〕を発現しているマウスを用いるアルツハイマー病（ＡＤ）モデルである。７～８箇月齢の５ｘＦＡＤマウスおよび野生型（ＷＴ）同腹子に、等モル量の４０ナノモル／ｋｇのｍＡｂＢおよびｍＡｂＢ－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．１（それぞれ５．８ｍｇ／ｋｇおよび７．０ｍｇ／ｋｇに相当）を静脈内（ｉｖ）注射した。それぞれの結合分子への血漿および脳曝露を５ｘＦＡＤマウスとＷＴマウスの両方において、並びに脳実質Ａβ斑（プラーク）への結合を５ｘＦＡＤマウスにおいて、それぞれ投与後２４時間目に評価した。末梢血試料を心臓穿刺によって全動物からＭｉｎｉＣｏｌｌｅｃｔ（登録商標）Ｋ２ＥＤＴＡチューブ中に採取した。試料を反転させ、２４００×ｇで４℃にて１０分間遠心分離した。血漿を抽出し、ＬｏＢｉｎｄ（商標）エッペンドルフ管に移し、－８０℃で凍結した。血液サンプリングの直後に、０．９％生理食塩水と４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ；ｐＨ７．４）または０．９％生理食塩水のみを用いて、それぞれ脳免疫組織化学（ＩＨＣ）または抗体暴露分析のために、動物を灌流させた。灌流後、大脳を抽出し、嗅球を除去した。大脳を左半球と右半球に分離し、そして生理食塩水のみを灌流させた動物の場合には左半球から小脳を除去し、その後、左半球の重さを秤量し、ドライアイス上で即座に凍結させ、－８０℃で保存した後、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）プラットフォームを用いて更なる濃度測定を行った。大脳右半球と、生理食塩水とＰＦＡの両方を灌流させた動物の場合には無傷の小脳が付随する左半球を、新たに調製した４％ＰＦＡ（ｐＨ７．４）中に室温で２時間浸漬することにより後固定し、その後、それらを冷ＰＢＳ中ですすぎ、１５％ショ糖／ＰＢＳに移し、チューブの底に沈むまで４℃にて保存した。各半球体をクリオモルド（プラスチック製包埋皿）に移し、ＯＣＴ培地中で包埋し、ドライアイスで冷却したイソペンタン中で凍結し、－８０℃で貯蔵した。
本開示の二重特異性結合分子によるインビボでの標的結合
標的係合をインビボでさらに評価するために、実施例１３に記載のように産生したｍＡｂＢおよびｍＡｂＢ－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．１を、Ｂ６ＳＪＬ－Ｔｇ ５ｘＦＡＤマウス（Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔｅｒｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）において検討した。５ｘＦＡＤマウスモデルは、ヒトＡＰＰおよびＰＳＥＮ１導入遺伝子〔ＡＰＰ中にスウェーデン型（Ｋ６７０Ｎ／Ｍ６７１Ｌ）、フロリダ型（Ｉ７１６Ｖ）およびロンドン型（Ｖ７１７Ｉ）突然変異、およびＰＳＥＮ１のＭ１４６ＬとＬ２８６Ｖ突然変異を含む、合計５つのＡＤ関連突然変異を有する〕を発現しているマウスを用いるアルツハイマー病（ＡＤ）モデルである。７～８箇月齢の５ｘＦＡＤマウスおよび野生型（ＷＴ）同腹子に、等モル量の４０ナノモル／ｋｇのｍＡｂＢおよびｍＡｂＢ－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．１（それぞれ５．８ｍｇ／ｋｇおよび７．０ｍｇ／ｋｇに相当）を静脈内（ｉｖ）注射した。それぞれの結合分子への血漿および脳曝露を５ｘＦＡＤマウスとＷＴマウスの両方において、並びに脳実質Ａβ斑（プラーク）への結合を５ｘＦＡＤマウスにおいて、それぞれ投与後２４時間目に評価した。末梢血試料を心臓穿刺によって全動物からＭｉｎｉＣｏｌｌｅｃｔ（登録商標）Ｋ２ＥＤＴＡチューブ中に採取した。試料を反転させ、２４００×ｇで４℃にて１０分間遠心分離した。血漿を抽出し、ＬｏＢｉｎｄ（商標）エッペンドルフ管に移し、－８０℃で凍結した。血液サンプリングの直後に、０．９％生理食塩水と４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ；ｐＨ７．４）または０．９％生理食塩水のみを用いて、それぞれ脳免疫組織化学（ＩＨＣ）または抗体暴露分析のために、動物を灌流させた。灌流後、大脳を抽出し、嗅球を除去した。大脳を左半球と右半球に分離し、そして生理食塩水のみを灌流させた動物の場合には左半球から小脳を除去し、その後、左半球の重さを秤量し、ドライアイス上で即座に凍結させ、－８０℃で保存した後、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）プラットフォームを用いて更なる濃度測定を行った。大脳右半球と、生理食塩水とＰＦＡの両方を灌流させた動物の場合には無傷の小脳が付随する左半球を、新たに調製した４％ＰＦＡ（ｐＨ７．４）中に室温で２時間浸漬することにより後固定し、その後、それらを冷ＰＢＳ中ですすぎ、１５％ショ糖／ＰＢＳに移し、チューブの底に沈むまで４℃にて保存した。各半球体をクリオモルド（プラスチック製包埋皿）に移し、ＯＣＴ培地中で包埋し、ドライアイスで冷却したイソペンタン中で凍結し、－８０℃で貯蔵した。
【0123】
脳内濃度測定のために、凍結した左半球を氷上で解凍し、自動ビーズ均質化法によってＴＢＳ中でホモジナイズした。ホモジネートに０．５％の最終Ｔｒｉｔｏｎ濃度になるまでビーズを加えた後、１６０００×ｇで遠心分離し、その後で上清を回収した。
【0124】
ｍＡｂＢおよびｍＡｂＢ－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．１の脳および血漿中濃度は、ＭＳＤプラットフォームを使用して決定した。１×ＰＢＳ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、＃０９－９４００－１００）中に希釈したヤギ抗ヒトＩｇＧ（０．５μｇ／ｍＬ、Ｆｃγ特異的抗体、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎо Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｅｕｒｏｐｅ Ｌｔｄ、＃１０９－００５－０９８）がコーティングされた、標準９６ウェルＭＳＤプレート（ＭＳＤ社、＃Ｌ１５ＸＡ－３）においてサンドイッチ設定を使用した。プレートをＢｌｏｃｋｅｒＡ（ＭＳＤ社、＃Ｒ９３ＢＡ－４）中で１時間ブロックした後、試料および標準物質と共に２時間インキュベートした。マウス抗ヒトＩｇＧ１（０．５μｇ／ｍＬ、Ｍａｂｔｅｃｈ社、＃３８５０－１－１０００）の１時間インキュベーション工程に続いて、ＳＵＬＦＯ－ＴＡＧ結合抗マウス抗体（０．５μｇ／ｍＬ、ＭＳＤ社、＃Ｒ３２ＡＣ－１）の１時間インキュベーション工程を含めた。ＭＳＤ読み取り緩衝液（ＭＳＤ社、＃Ｒ９２ＴＣ）をウェルに添加した後、ＭＳＤ社のＳＥＣＴＯＲ（登録商標）撮像装置においてプレートを読み取った。各インキュベーション工程の間に、１×ＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎ（登録商標）（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、＃０９－９４１０－１００）中での４回の洗浄を実施した。コーティング抗体を除いたすべての結合分子は、ＢｌоｃｋｅｒＡ中に希釈した。
【0125】
結果を図１８に示す。８Ｄ３ ｓｃＢＭを有するｍＡｂである、ｍＡｂＢ－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．１の二重特異性結合分子は、従来の抗体フォーマットでのｍＡｂＢと比較して、より低い血漿曝露を示すが、脳曝露はより高い。さらに、ｍＡｂＢ－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．１は、より高い、脳対血漿比（Ｂ：Ｐ比）を提供する。
【0126】
実施例１５
本開示の二重特異性結合分子によるインビボ結合の免疫組織化学分析
本開示の結合分子ｍＡｂＢ－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．１による、血液脳関門を通過するトランスサイトーシスおよびＡβ標的への結合を、トランスジェニックマウスモデル５ｘＦＡＤ中でのＩＨＣによりさらに評価した。
本開示の二重特異性結合分子によるインビボ結合の免疫組織化学分析
本開示の結合分子ｍＡｂＢ－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．１による、血液脳関門を通過するトランスサイトーシスおよびＡβ標的への結合を、トランスジェニックマウスモデル５ｘＦＡＤ中でのＩＨＣによりさらに評価した。
【0127】
要約すれば、クライオスタット（低温保持装置）（Ｌｅｉｃａ社ＣＭ１９５０またはＣｒｙｏＳｔａｒ社ＮＸ７０）を使って、５ｘＦＡＤマウスから厚さ１０μｍの脳の矢状面切片を取得した。切片の収集は、正中線から横方向に約０．５０ｍｍレベルで開始し、そして半球全体に及んだ。切片は－２０℃で保存した。
【0128】
非特異的結合を、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）－１００／ＰＢＳ中のＭＯＭブロッキング試薬（ＭＫＢ－２２１３、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）で６０分間ブロックし、次いでＰＢＳ中ですすいだ。アミロイド斑（プラーク）を一次抗体６Ｅ１０（Ｂｉｏｚｙｍ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ｂ８０３００１、１：１０００）および４Ｇ８（Ｂｉｏｚｙｍ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ｂ８００７０１、１：５００）を用いて、ＭＯＭ希釈液中で４℃にて一晩標識した。ヒトＩｇＧ鎖を含む静脈内投与した構築物を、抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒＴＭ（商標）６４７（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｃｈ社、７０９－６０５－１４９）によって検出し、２つの一次ｍＩｇＧ抗体を、ロバ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）二次抗体ＤｙＬｉｇｈｔＴＭ（商標）５５０標識（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、ＳＡ５－１０１６７）によって可視化した。細胞核をＤＡＰＩで標識した。スライドをＭｏｗｉｏｌＴＭ（商標）（マウント剤）中に設置し、Ｚｅｉｓｓ社ＡｘｉｏｃａｍＴＭ（商標）５０６ｍоｎоおよび日立製３ＣＣＤ ＨＶ－Ｆ２０２ＳＣＬカメラおよびＺｅｉｓｓＴＭ（商標）ＺＥＮ３．３ソフトウェアを装備している、高開口率レンズを有するＺｅｉｓｓ自動顕微鏡ＡｘｉｏＳｃａｎ Ｚ１スキャナで、切片を撮像した。
【0129】
視床における斑（プラーク）の数および共局在化の自動ＩＨＣ分析（Ｎ＝５マウス／処置）は、富士フィルム社ＩｍａｇｅＪ〔ｖ１．５３ｃ；Ｓｃｈｉｎｄｅｌｉｎ他（２０１２）、Ｎａｔ．Ｍｅｔｈ．９（７）：６７６－６８２〕において共局在化閾値＆粒子解析（Ｃｏｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ ＆ Ａｎａｌｙｚｅ Ｐａｒｔｉｃｌｅ）プラグインを使用して実施した。統計的分析は、Ｔｕｋｅｙの事後解析（ｐоｓｔ ｈｏｃ）検定を用いて一元配置ＡＮＯＶＡを使用して実施した。
【0130】
結果は、図１９および２０に示される。８Ｄ３ ｓｃＢＭを有するｍＡｂＢである、ｍＡｂＢ－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．１の二重特異性結合分子は、従来の抗体フォーマットにおけるｍＡｂＢと比較して、はるかに強い標的係合を示す。矢印は、ｍＡｂＢ－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．１およびｍＡｂＢが、それぞれｈＩｇＧ染色に基づいて脳内の標的に到達した（６Ｅ１０／４Ｇ８染色に基づく）ことを示す。ｈＩｇＧ染色は、ｍＡｂＢに見られるものに比較して、ｍＡｂＢ－ｓｃＬｃ－８Ｄ３－Ｉｇ．１についてはるかに広範囲でかつ強力であった。
【0131】
実施例１６
本開示の更なる二重特異性結合分子の設計および特徴付け
本実施例に記載する結合分子は、以前に研究した結合分子と同様に設計されたが、異なる一本鎖結合モジュールｓｃＢＭを使用して設計された。
本開示の更なる二重特異性結合分子の設計および特徴付け
本実施例に記載する結合分子は、以前に研究した結合分子と同様に設計されたが、異なる一本鎖結合モジュールｓｃＢＭを使用して設計された。
【0132】
この実験の二重特異性結合分子の重鎖（ＨＣ）は、ヒトＣＨ１－ＣＨ３部分に連結された、ｍＡｂ１５８由来のマウスＶＨドメインを含んだ。完全な重鎖アミノ酸配列は、配列番号３３に与えられる。
【0133】
２つの同一の抗体軽鎖ＬＣは、κクラスのヒトＣＬ部分に連結された、ｍＡｂ１５８の軽鎖のＶＬドメインから誘導された。各ＬＣのアミノ酸配列は、配列番号３４により示される。
【0134】
本実施例で使用する一本鎖結合モジュールｓｃＢＭは、トランスフェリン受容体結合抗体１５Ｇ１１－１（Ｙｕ他（２０１４）Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．６（２６１）：２６１ｒａ１５４）に由来し、かつ配列番号３５のアミノ酸配列を有する、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）であった。
【0135】
被験構築物は、図１に描写されるフォーマットに従って設計され、そのリンカー配列を含めて表４に提示される。
【0136】
【表4】
【0137】
二重特異性結合分子ｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－１５Ｇ１１－１－Ｉｇ．１は、実施例３に記載のとおりに発現させ精製した。
【0138】
ｎＴｆＲ１への結合は、ｈＴｆＲ１を固定化に使用し、３ＭのＭｇＣｌ２を再生に用いたこと以外は、実施例１２に記載した通りに評価した。結果は図２１に示され、この結果は、発現変異体のｈＴｆＲ１に対する親和性が、１５Ｇ１１－１ Ｆａｂ対照のものと同等であることを実証した。
【0139】
発現構成物のＡβ１－４２への結合は、実施例８に記載の間接ＥＬＩＳＡによって評価した。その結果は図２２に示され、ｍＡｂ１５８－ｓｃＬｃ－１５Ｇ１１－１－Ｉｇ．１によるＡβ１－４２への結合が、未修飾のｍＡｂ１５８対照による結合と同等であることを実証した。
【0140】
実施形態の項目別リスト
［１］二重特異性結合分子であって、以下の３本のポリペプチド鎖：
（Ａ）哺乳動物の脳内に存在する第一の標的に対して親和性を有するモノクローナル抗体に由来する２本の同一の抗体重鎖（ＨＣ）と、
（Ｂ）連続ポリペプチド鎖中に以下の５つの要素：
ｉ）前記第一の標的に対して親和性を有する前記モノクローナル抗体に由来する２つの同一の抗体軽鎖（ＬＣ）；
ｉｉ）血液脳関門を通過する二重特異性結合分子の輸送を媒介する第二の標的に対して親和性を有する１つの一本鎖結合モジュール（ｓｃＢＭ）；および
ｉｉｉ）２つのアミノ酸リンカーＬ１およびＬ２
を含む１本の一本鎖成分と
を含んで成り、
ここで前記軽鎖（ＬＣ）と前記一本鎖結合モジュール（ｓｃＢＭ）とが、前記リンカーＬ１およびＬ２によって分離されており、それによってＮ末端からＣ末端まで以下：
［ＬＣ－Ｌ１－ｓｃＢＭ－Ｌ２－ＬＣ］、
［ＬＣ－Ｌ１－ＬＣ－Ｌ２－ｓｃＢＭ］、および
［ｓｃＢＭ－Ｌ１－ＬＣ－Ｌ２－ＬＣ］
から成る群より選択される配列を形成している、前記二重特異性結合分子。
［２］前記一本鎖成分中のＮ末端からＣ末端までの前記要素の配列が、
［ＬＣ－Ｌ１－ｓｃＢＭ－Ｌ２－ＬＣ］および
［ＬＣ－Ｌ１－ＬＣ－Ｌ２－ｓｃＢＭ］
から成る群より選択される、項目１に記載の二重特異性結合分子。
［３］前記一本鎖成分中のＮ末端からＣ末端までの前記要素の配列が、［ＬＣ－Ｌ１－ｓｃＢＭ－Ｌ２－ＬＣ］である、項目２に記載の二重特異性結合分子。
［４］前記一本鎖成分中のＮ末端からＣ末端までの前記要素の配列が、［ＬＣ－Ｌ１－ＬＣ－Ｌ２－ｓｃＢＭ］である、項目２に記載の二重特異性結合分子。
［５］前記第一の標的が、アミロイドβペプチドまたはその誘導体もしくはそのフラグメント、α－シヌクレインまたはその誘導体もしくはフラグメント、ＴＡＲ ＤＮＡ結合タンパク質４３（ＴＤＰ－４３）またはその誘導体もしくはフラグメント、骨髄細胞上に発現されるトリガー受容体２（ＴＲＥＭ２）、β－セクレターゼ１（ＢＡＣＥ１）、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）、ハンチンチン、トランスサイレチン、Ｐ－セクレターゼ１、上皮成長因子、上皮成長因子受容体２、タウ、リン酸化タウまたはそのフラグメント、アポリポタンパク質Ｅ４、ＣＤ２０、プリオンタンパク質、ロイシンリッチリピートキナーゼ２、パーキン（ｐａｒｋｉｎ）、プレセニリン２、γセクレターゼ、死受容体６、 アミロイドβ前駆体タンパク質、ｐ７５ニューロトロフィン受容体、ニューレグリンおよびカスパーゼ６から成る群より選択される、前記先行項目のいずれかに記載の二重特異性結合分子。
［６］前記第一の標的が、アミロイドβペプチドまたはその誘導体もしくはフラグメント、α－シヌクレインまたはその誘導体もしくはフラグメント、ＴＡＲ ＤＮＡ結合タンパク質４３（ＴＤＰ－４３）またはその誘導体もしくはフラグメント、骨髄細胞上に発現されるトリガー受容体２（ＴＲＥＭ２）、タウ、リン酸化タウまたはそのフラグメント、およびアポリポタンパク質Ｅ４から成る群より選択される、項目５に記載の二重特異性結合分子。
［７］前記第一の標的が、アミロイドβペプチドまたはその誘導体もしくはフラグメント、α－シヌクレインまたはその誘導体もしくはフラグメント、およびＴＡＲ ＤＮＡ結合タンパク質４３（ＴＤＰ－４３）またはその誘導体もしくはフラグメントから成る群より選択される、項目６に記載の二重特異性結合分子。
［８］前記第一の標的に対して親和性を有する前記モノクローナル抗体が、レカネマブ、ガンテネルマブ、アデュカヌマブ、ドナネマブ、ＰＢＤ－Ｃ０６およびＫＨＫ６６４０から成る群から選択される抗Ａβ抗体である、前記先行項目のいずれかに記載の二重特異性結合分子。
［９］前記第一の標的に対して親和性を有する前記モノクローナル抗体が、抗α－シヌクレイン抗体ＡＢＢＶ０８０５である、項目１～７のいずれか一項に記載の二重特異性結合分子。
［１０］前記ｓｃＢＭが、ｓｃＦｖ、ｓｃＦａｂ、ＶＨＨおよびＶＮＡＲから成る群より選択されるタイプのものである、前記先行項目のいずれかに記載の二重特異性結合分子。
［１１］前記ｓｃＢＭが、ｓｃＦｖおよびｓｃＦａｂから成る群より選択される、項目１０に記載の二重特異性結合分子。
［１２］前記ｓｃＢＭがｓｃＦｖである、項目１１に記載の二重特異性結合分子。
［１３］前記ｓｃＢＭがｓｃＦａｂである、項目１１に記載の二重特異性結合分子。
［１４］前記第二の標的が、トランスフェリン受容体１（ＴｆＲ１）、インスリン受容体（ＩｎｓＲ）、インスリン様成長因子１受容体（ＩＧＦ－１Ｒ）、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質８（Ｌｒｐ８）、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質１（Ｌｒｐ１）、ＣＤ９８、膜貫通タンパク質５０Ａ（ＴＭＥＭ５０Ａ）、グルコース輸送体１（Ｇｌｕｔｌ）、ベイシジン（ＢＳＧ）およびヘパリン結合上皮成長因子様成長因子から成る群より選択される、前記先行項目のいずれかに記載の二重特異性結合分子。
［１５］前記第二の標的が、トランスフェリン受容体１（ＴｆＲ１）、インスリン受容体（ＩｎｓＲ）、インスリン様成長因子１受容体（ＩＧＦ－１Ｒ）および低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質８（Ｌｒｐ８）から成る群より選択される、項目１４に記載の二重特異性結合分子。
［１６］前記第二の標的がトランスフェリン受容体１である、項目１５に記載の二重特異性結合分子。
［１７］前記アミノ酸リンカーＬ１およびＬ２の少なくとも一方がフレキシブルリンカーである、前記先行項目のいずれかに記載の二重特異性結合分子。
［１８］前記アミノ酸リンカーＬ１およびＬ２の両方がフレキシブルリンカーである、項目１７に記載の二重特異性結合分子。
［１９］前記フレキシブルリンカーが、グリシン、セリン、アラニンおよび／またはスレオニン残基を含む、項目１７～１８のいずれか一項に記載の二重特異性結合分子。
［２０］前記リンカーが、（ＧｎＳｍ）ｐおよび（ＳｎＧｍ）ｐから選択された一般式を有し、ここで、独立にｎ＝１～７、ｍ＝０～７、ｎ＋ｍ≦８およびｐ＝１～１０である、項目１９に記載の二重特異性結合分子。
［２１］前記アミノ酸リンカーＬ１およびＬ２の少なくとも一方が、１０～５０アミノ酸残基、例えば１０～３０アミノ酸残基の長さ、１５～２５アミノ酸残基、または１０～２０アミノ酸の長さのものである、前記先行項目のいずれかに記載の二重特異性結合分子。
［２２］前記アミノ酸リンカーＬ１およびＬ２の両方が、１０～５０アミノ酸残基、例えば１０～３０アミノ酸残基の長さ、１５～２５アミノ酸残基、または１０～２０アミノ酸の長さのものである、項目２１に記載の二重特異性結合分子。
［２３］前記アミノ酸リンカーＬ１およびＬ２が同じ長さである、前記先行項目のいずれかに記載の二重特異性結合分子。
［２４］前記アミノ酸リンカーＬ１およびＬ２が異なる長さである、項目１～２２のいずれか一項に記載の二重特異性結合分子。
［２５］前記アミノ酸リンカーＬ１が、前記アミノ酸リンカーＬ２よりも長い、項目２４に記載の二重特異性結合分子。
［２６］前記アミノ酸リンカーＬ２が、前記アミノ酸リンカーＬ１よりも長い、項目２４に記載の二重特異性結合分子。
［２７］先行項目のいずれかに記載の二重特異性結合分子と、薬学的に許容される担体または賦形剤とを含む、医薬組成物。
［２８］治療処置または予防処置における使用などの、処置において用いるための項目１～２６のいずれか一項に記載の二重特異性結合分子または項目２７に記載の組成物。
［２９］インビボ診断またはインビボ予後予測において用いるための、項目１～２６のいずれか一項に記載の二重特異性結合分子または項目２７に記載の組成物。
［３０］前記治療、予防、インビボ診断またはインビボ予後予測が、神経変性疾患に関するものであり、例えばアルツハイマー病およびＡβタンパク質凝集に関連する他の疾患、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）、レビー小体認知症（ＬＢＤ）、ダウン症候群（ＤＳ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、前頭型認知症、タウオパチー、全身性アミロイドーシス、アテローム性動脈硬化、パーキンソン病（ＰＤ）、パーキンソン病認知症（ＰＤＤ）、アルツハイマー病のレビー小体変異体、多系統萎縮症、精神病、統合失調症、クロイツフェルト・ヤコブ病、ハンチントン病、家族性アミロイド神経疾患から選択される疾患に関するものである、項目２８～２９のいずれか一項に記載の使用のための二重特異性結合分子または組成物。
［３１］前記治療、予防、インビボ診断またはインビボ予後予測が、アルツハイマー病およびＡβタンパク質凝集に関連する他の疾患、レビー小体型認知症（ＬＢＤ）、ダウン症候群（ＤＳ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、前頭型認知症、タウオパチー、パーキンソン病（ＰＤ）、パーキンソン病認知症（ＰＤＤ）およびアルツハイマー病のレビー小体変性症から選択される疾患に関するものである、項目３０に記載の使用のための二重特異性結合分子または組成物。
［３２］前記治療、予防、インビボ診断またはインビボ予後予測が、アルツハイマー病およびＡβタンパク質凝集に関連する他の疾患、レビー小体型認知症（ＬＢＤ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）およびパーキンソン病（ＰＤ）から選択される疾患に関するものである、項目３１に記載の使用のための二重特異性結合分子または組成物。
［３３］前記治療、予防、インビボ診断またはインビボ予後予測が、アルツハイマー病に関するものである、項目３２に記載の使用のための二重特異性結合分子または組成物。
［３４］前記治療、予防、インビボ診断またはインビボ予後予測が、脳腫瘍、多発性硬化症およびリソソーム蓄積症から選択された疾患に関するものである、項目２８～２９のいずれか一項に記載の二重特異性結合分子または組成物。
［３５］疾患を有しているかまたは発症するリスクのある哺乳動物の治療または予防処置方法であって、項目１～２６のいずれか一項に記載の二重特異性結合分子または項目２７に記載の組成物の治療有効量を該哺乳動物に投与することを含む方法。
［３６］前記疾患が、神経変性疾患、例えば、項目３０～３３のいずれか一項に定義されるような神経変性疾患である、項目３５に記載の方法。
［３７］前記疾患が項目３４において定義されるような疾患である、項目３５に記載の方法。
［１］二重特異性結合分子であって、以下の３本のポリペプチド鎖：
（Ａ）哺乳動物の脳内に存在する第一の標的に対して親和性を有するモノクローナル抗体に由来する２本の同一の抗体重鎖（ＨＣ）と、
（Ｂ）連続ポリペプチド鎖中に以下の５つの要素：
ｉ）前記第一の標的に対して親和性を有する前記モノクローナル抗体に由来する２つの同一の抗体軽鎖（ＬＣ）；
ｉｉ）血液脳関門を通過する二重特異性結合分子の輸送を媒介する第二の標的に対して親和性を有する１つの一本鎖結合モジュール（ｓｃＢＭ）；および
ｉｉｉ）２つのアミノ酸リンカーＬ１およびＬ２
を含む１本の一本鎖成分と
を含んで成り、
ここで前記軽鎖（ＬＣ）と前記一本鎖結合モジュール（ｓｃＢＭ）とが、前記リンカーＬ１およびＬ２によって分離されており、それによってＮ末端からＣ末端まで以下：
［ＬＣ－Ｌ１－ｓｃＢＭ－Ｌ２－ＬＣ］、
［ＬＣ－Ｌ１－ＬＣ－Ｌ２－ｓｃＢＭ］、および
［ｓｃＢＭ－Ｌ１－ＬＣ－Ｌ２－ＬＣ］
から成る群より選択される配列を形成している、前記二重特異性結合分子。
［２］前記一本鎖成分中のＮ末端からＣ末端までの前記要素の配列が、
［ＬＣ－Ｌ１－ｓｃＢＭ－Ｌ２－ＬＣ］および
［ＬＣ－Ｌ１－ＬＣ－Ｌ２－ｓｃＢＭ］
から成る群より選択される、項目１に記載の二重特異性結合分子。
［３］前記一本鎖成分中のＮ末端からＣ末端までの前記要素の配列が、［ＬＣ－Ｌ１－ｓｃＢＭ－Ｌ２－ＬＣ］である、項目２に記載の二重特異性結合分子。
［４］前記一本鎖成分中のＮ末端からＣ末端までの前記要素の配列が、［ＬＣ－Ｌ１－ＬＣ－Ｌ２－ｓｃＢＭ］である、項目２に記載の二重特異性結合分子。
［５］前記第一の標的が、アミロイドβペプチドまたはその誘導体もしくはそのフラグメント、α－シヌクレインまたはその誘導体もしくはフラグメント、ＴＡＲ ＤＮＡ結合タンパク質４３（ＴＤＰ－４３）またはその誘導体もしくはフラグメント、骨髄細胞上に発現されるトリガー受容体２（ＴＲＥＭ２）、β－セクレターゼ１（ＢＡＣＥ１）、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）、ハンチンチン、トランスサイレチン、Ｐ－セクレターゼ１、上皮成長因子、上皮成長因子受容体２、タウ、リン酸化タウまたはそのフラグメント、アポリポタンパク質Ｅ４、ＣＤ２０、プリオンタンパク質、ロイシンリッチリピートキナーゼ２、パーキン（ｐａｒｋｉｎ）、プレセニリン２、γセクレターゼ、死受容体６、 アミロイドβ前駆体タンパク質、ｐ７５ニューロトロフィン受容体、ニューレグリンおよびカスパーゼ６から成る群より選択される、前記先行項目のいずれかに記載の二重特異性結合分子。
［６］前記第一の標的が、アミロイドβペプチドまたはその誘導体もしくはフラグメント、α－シヌクレインまたはその誘導体もしくはフラグメント、ＴＡＲ ＤＮＡ結合タンパク質４３（ＴＤＰ－４３）またはその誘導体もしくはフラグメント、骨髄細胞上に発現されるトリガー受容体２（ＴＲＥＭ２）、タウ、リン酸化タウまたはそのフラグメント、およびアポリポタンパク質Ｅ４から成る群より選択される、項目５に記載の二重特異性結合分子。
［７］前記第一の標的が、アミロイドβペプチドまたはその誘導体もしくはフラグメント、α－シヌクレインまたはその誘導体もしくはフラグメント、およびＴＡＲ ＤＮＡ結合タンパク質４３（ＴＤＰ－４３）またはその誘導体もしくはフラグメントから成る群より選択される、項目６に記載の二重特異性結合分子。
［８］前記第一の標的に対して親和性を有する前記モノクローナル抗体が、レカネマブ、ガンテネルマブ、アデュカヌマブ、ドナネマブ、ＰＢＤ－Ｃ０６およびＫＨＫ６６４０から成る群から選択される抗Ａβ抗体である、前記先行項目のいずれかに記載の二重特異性結合分子。
［９］前記第一の標的に対して親和性を有する前記モノクローナル抗体が、抗α－シヌクレイン抗体ＡＢＢＶ０８０５である、項目１～７のいずれか一項に記載の二重特異性結合分子。
［１０］前記ｓｃＢＭが、ｓｃＦｖ、ｓｃＦａｂ、ＶＨＨおよびＶＮＡＲから成る群より選択されるタイプのものである、前記先行項目のいずれかに記載の二重特異性結合分子。
［１１］前記ｓｃＢＭが、ｓｃＦｖおよびｓｃＦａｂから成る群より選択される、項目１０に記載の二重特異性結合分子。
［１２］前記ｓｃＢＭがｓｃＦｖである、項目１１に記載の二重特異性結合分子。
［１３］前記ｓｃＢＭがｓｃＦａｂである、項目１１に記載の二重特異性結合分子。
［１４］前記第二の標的が、トランスフェリン受容体１（ＴｆＲ１）、インスリン受容体（ＩｎｓＲ）、インスリン様成長因子１受容体（ＩＧＦ－１Ｒ）、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質８（Ｌｒｐ８）、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質１（Ｌｒｐ１）、ＣＤ９８、膜貫通タンパク質５０Ａ（ＴＭＥＭ５０Ａ）、グルコース輸送体１（Ｇｌｕｔｌ）、ベイシジン（ＢＳＧ）およびヘパリン結合上皮成長因子様成長因子から成る群より選択される、前記先行項目のいずれかに記載の二重特異性結合分子。
［１５］前記第二の標的が、トランスフェリン受容体１（ＴｆＲ１）、インスリン受容体（ＩｎｓＲ）、インスリン様成長因子１受容体（ＩＧＦ－１Ｒ）および低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質８（Ｌｒｐ８）から成る群より選択される、項目１４に記載の二重特異性結合分子。
［１６］前記第二の標的がトランスフェリン受容体１である、項目１５に記載の二重特異性結合分子。
［１７］前記アミノ酸リンカーＬ１およびＬ２の少なくとも一方がフレキシブルリンカーである、前記先行項目のいずれかに記載の二重特異性結合分子。
［１８］前記アミノ酸リンカーＬ１およびＬ２の両方がフレキシブルリンカーである、項目１７に記載の二重特異性結合分子。
［１９］前記フレキシブルリンカーが、グリシン、セリン、アラニンおよび／またはスレオニン残基を含む、項目１７～１８のいずれか一項に記載の二重特異性結合分子。
［２０］前記リンカーが、（ＧｎＳｍ）ｐおよび（ＳｎＧｍ）ｐから選択された一般式を有し、ここで、独立にｎ＝１～７、ｍ＝０～７、ｎ＋ｍ≦８およびｐ＝１～１０である、項目１９に記載の二重特異性結合分子。
［２１］前記アミノ酸リンカーＬ１およびＬ２の少なくとも一方が、１０～５０アミノ酸残基、例えば１０～３０アミノ酸残基の長さ、１５～２５アミノ酸残基、または１０～２０アミノ酸の長さのものである、前記先行項目のいずれかに記載の二重特異性結合分子。
［２２］前記アミノ酸リンカーＬ１およびＬ２の両方が、１０～５０アミノ酸残基、例えば１０～３０アミノ酸残基の長さ、１５～２５アミノ酸残基、または１０～２０アミノ酸の長さのものである、項目２１に記載の二重特異性結合分子。
［２３］前記アミノ酸リンカーＬ１およびＬ２が同じ長さである、前記先行項目のいずれかに記載の二重特異性結合分子。
［２４］前記アミノ酸リンカーＬ１およびＬ２が異なる長さである、項目１～２２のいずれか一項に記載の二重特異性結合分子。
［２５］前記アミノ酸リンカーＬ１が、前記アミノ酸リンカーＬ２よりも長い、項目２４に記載の二重特異性結合分子。
［２６］前記アミノ酸リンカーＬ２が、前記アミノ酸リンカーＬ１よりも長い、項目２４に記載の二重特異性結合分子。
［２７］先行項目のいずれかに記載の二重特異性結合分子と、薬学的に許容される担体または賦形剤とを含む、医薬組成物。
［２８］治療処置または予防処置における使用などの、処置において用いるための項目１～２６のいずれか一項に記載の二重特異性結合分子または項目２７に記載の組成物。
［２９］インビボ診断またはインビボ予後予測において用いるための、項目１～２６のいずれか一項に記載の二重特異性結合分子または項目２７に記載の組成物。
［３０］前記治療、予防、インビボ診断またはインビボ予後予測が、神経変性疾患に関するものであり、例えばアルツハイマー病およびＡβタンパク質凝集に関連する他の疾患、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）、レビー小体認知症（ＬＢＤ）、ダウン症候群（ＤＳ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、前頭型認知症、タウオパチー、全身性アミロイドーシス、アテローム性動脈硬化、パーキンソン病（ＰＤ）、パーキンソン病認知症（ＰＤＤ）、アルツハイマー病のレビー小体変異体、多系統萎縮症、精神病、統合失調症、クロイツフェルト・ヤコブ病、ハンチントン病、家族性アミロイド神経疾患から選択される疾患に関するものである、項目２８～２９のいずれか一項に記載の使用のための二重特異性結合分子または組成物。
［３１］前記治療、予防、インビボ診断またはインビボ予後予測が、アルツハイマー病およびＡβタンパク質凝集に関連する他の疾患、レビー小体型認知症（ＬＢＤ）、ダウン症候群（ＤＳ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、前頭型認知症、タウオパチー、パーキンソン病（ＰＤ）、パーキンソン病認知症（ＰＤＤ）およびアルツハイマー病のレビー小体変性症から選択される疾患に関するものである、項目３０に記載の使用のための二重特異性結合分子または組成物。
［３２］前記治療、予防、インビボ診断またはインビボ予後予測が、アルツハイマー病およびＡβタンパク質凝集に関連する他の疾患、レビー小体型認知症（ＬＢＤ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）およびパーキンソン病（ＰＤ）から選択される疾患に関するものである、項目３１に記載の使用のための二重特異性結合分子または組成物。
［３３］前記治療、予防、インビボ診断またはインビボ予後予測が、アルツハイマー病に関するものである、項目３２に記載の使用のための二重特異性結合分子または組成物。
［３４］前記治療、予防、インビボ診断またはインビボ予後予測が、脳腫瘍、多発性硬化症およびリソソーム蓄積症から選択された疾患に関するものである、項目２８～２９のいずれか一項に記載の二重特異性結合分子または組成物。
［３５］疾患を有しているかまたは発症するリスクのある哺乳動物の治療または予防処置方法であって、項目１～２６のいずれか一項に記載の二重特異性結合分子または項目２７に記載の組成物の治療有効量を該哺乳動物に投与することを含む方法。
［３６］前記疾患が、神経変性疾患、例えば、項目３０～３３のいずれか一項に定義されるような神経変性疾患である、項目３５に記載の方法。
［３７］前記疾患が項目３４において定義されるような疾患である、項目３５に記載の方法。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図5D】
【図5E】
【図5F】
【図5G】
【図5H】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12A】
【図12B】
【図12C】
【図12D】
【図12E】
【図12F】
【図12G】
【図12H】
【図12I】
【図13A】
【図13B】
【図14】
【図15A】
【図15B】
【図15C】
【図16】
【図17A】
【図17B】
【図17C】
【図17D】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【配列表】
【国際調査報告】