特表 2024-522692 カチオン性脂質及びその組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-06-21

(54)【発明の名称】カチオン性脂質及びその組成物

(51)【国際特許分類】

   C07C 229/16 20060101AFI20240614BHJP

   A61K 9/51 20060101ALI20240614BHJP

   A61K 47/18 20170101ALI20240614BHJP

   A61K 47/34 20170101ALI20240614BHJP

   A61K 31/7088 20060101ALI20240614BHJP

   A61K 31/713 20060101ALI20240614BHJP

   A61K 31/7105 20060101ALI20240614BHJP

   A61K 31/711 20060101ALI20240614BHJP

   A61K 47/28 20060101ALI20240614BHJP

   A61K 47/24 20060101ALI20240614BHJP

   A61K 47/26 20060101ALI20240614BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20240614BHJP

   A61P 7/06 20060101ALI20240614BHJP

   A61P 7/00 20060101ALI20240614BHJP

   A61P 3/06 20060101ALI20240614BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240614BHJP

   A61P 3/00 20060101ALI20240614BHJP

   A61P 1/16 20060101ALI20240614BHJP

   A61P 17/00 20060101ALI20240614BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20240614BHJP

   A61P 25/16 20060101ALI20240614BHJP

   A61P 25/28 20060101ALI20240614BHJP

   A61P 25/14 20060101ALI20240614BHJP

   A61P 21/04 20060101ALI20240614BHJP

   A61P 27/02 20060101ALI20240614BHJP

   A61P 39/04 20060101ALI20240614BHJP

   C12N 15/113 20100101ALI20240614BHJP

   C12N 15/864 20060101ALI20240614BHJP

【ＦＩ】

C07C229/16 CSP

A61K9/51

A61K47/18

A61K47/34

A61K31/7088

A61K31/713

A61K31/7105

A61K31/711

A61K47/28

A61K47/24

A61K47/26

A61P43/00

A61P7/06

A61P7/00

A61P43/00 105

A61P3/06

A61P35/00

A61P3/00

A61P1/16

A61P17/00

A61P25/00

A61P25/16

A61P25/28

A61P25/14

A61P21/04

A61P27/02

A61P39/04

C12N15/113 Z ZNA

C12N15/864 100Z

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023577160

(86)(22)【出願日】2022-06-14

(85)【翻訳文提出日】2024-01-16

(86)【国際出願番号】 US2022033334

(87)【国際公開番号】W WO2022266032

(87)【国際公開日】2022-12-22

(31)【優先権主張番号】63/210,204

(32)【優先日】2021-06-14

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】520068043

【氏名又は名称】ジェネレーション バイオ カンパニー

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本 健策

(72)【発明者】

【氏名】スタントン， マシュー ジー．

(72)【発明者】

【氏名】ノルティング， バート

(72)【発明者】

【氏名】ミルステッド， アンドリュー

【テーマコード（参考）】

4C076

4C086

4H006

【Ｆターム（参考）】

4C076AA65

4C076BB01

4C076BB13

4C076BB15

4C076BB16

4C076BB21

4C076BB25

4C076BB27

4C076BB29

4C076CC01

4C076CC09

4C076CC10

4C076CC14

4C076CC16

4C076CC18

4C076CC21

4C076CC26

4C076CC27

4C076CC29

4C076CC50

4C076DD49

4C076DD63

4C076DD68

4C076DD70

4C076EE23

4C076FF04

4C076FF31

4C076FF68

4C086AA01

4C086AA02

4C086EA16

4C086MA02

4C086MA03

4C086MA05

4C086MA07

4C086MA10

4C086MA41

4C086NA05

4C086NA10

4C086NA11

4C086NA12

4C086NA13

4C086ZA02

4C086ZA15

4C086ZA16

4C086ZA18

4C086ZA33

4C086ZA51

4C086ZA55

4C086ZA75

4C086ZA89

4C086ZA94

4C086ZB21

4C086ZB26

4C086ZC02

4C086ZC21

4C086ZC33

4C086ZC37

4H006AA01

4H006AB68

4H006BT12

4H006BU32

(57)【要約】

本明細書では、式Ｉ又はＩａを有するカチオン性脂質、

及びその薬学的に許容される塩が提供され、式中、Ｒ’、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^６ａ、Ｒ^６ｂ、Ｘ、及びｎが、本明細書で定義されるとおりである。本明細書では、式Ｉ又はＩａを有するカチオン性脂質及びカプシド不含非ウイルスベクター（例えば、ｃｅＤＮＡ）を含む、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）組成物もまた提供される。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一態様では、これらのＬＮＰは、カプシド不含非ウイルスＤＮＡベクターを目的の標的部位（例えば、細胞、組織、器官等）に送達するように使用され得る。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

式Ｉで表されるカチオン性脂質、

【化31】

又はその薬学的に許容される塩であって、式中、
Ｒ’が、存在しないか、水素、又はＣ_１～Ｃ_３アルキルであるが、但し、Ｒ’が水素又はＣ_１～Ｃ_３アルキルである場合、Ｒ’、Ｒ^１、及びＲ^２が全て結合している窒素原子が、プロトン化されていることを条件とし、
Ｒ^１及びＲ^２が、各々独立して、水素又はＣ_１～Ｃ_３アルキルであり、
Ｒ^３が、Ｃ_３～Ｃ_１０アルキレン又はＣ_３～Ｃ_１０アルケニレンであり、
Ｒ^４が、Ｃ_１～Ｃ_１６非分岐アルキル、Ｃ_２～Ｃ_１６非分岐アルケニル、又は

【化32】

であり、式中、
Ｒ^４ａ及びＲ^４ｂが、各々独立して、Ｃ_１～Ｃ_１６非分岐アルキル又はＣ_２～Ｃ_１６非分岐アルケニルであり、
Ｒ^５が、存在しないか、Ｃ_１～Ｃ_８アルキレン、又はＣ_２～Ｃ_８アルケニレンであり、
Ｒ^６ａ及びＲ^６ｂが、各々独立して、Ｃ_７～Ｃ_１４アルキル又はＣ_７～Ｃ_１４アルケニルであり、
Ｘが、－ＯＣ（＝Ｏ）－、－ＳＣ（＝Ｏ）－、－ＯＣ（＝Ｓ）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｓ－、－Ｓ－Ｓ－、－Ｃ（Ｒ^ａ）＝Ｎ－、
－Ｎ＝Ｃ（Ｒ^ａ）－、－Ｃ（Ｒ^ａ）＝ＮＯ－、－Ｏ－Ｎ＝Ｃ（Ｒ^ａ）－、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ^ａ－、－ＮＲ^ａＣ（＝Ｏ）－、－ＮＲ^ａＣ（＝Ｏ）ＮＲ^ａ－、
－ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ－、－ＯＳｉ（Ｒ^ａ）_２Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）（ＣＲ^ａ _２）Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、又はＯＣ（＝Ｏ）（ＣＲ^ａ _２）Ｃ（＝Ｏ）－であり、式中、
Ｒ^ａが、各出現に対して、独立して、水素又はＣ_１～Ｃ_６アルキルであり、
ｎが、１、２、３、４、５、及び６から選択される整数である、カチオン性脂質、又はその薬学的に許容される塩。

【請求項2】

Ｘが、－ＯＣ（＝Ｏ）－、－ＳＣ（＝Ｏ）－、－ＯＣ（＝Ｓ）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｓ－、又は－Ｓ－Ｓ－である、請求項１に記載のカチオン性脂質、又はその薬学的に許容される塩。

【請求項3】

前記脂質が、式ＩＩで表されるか、

【化33】

又はその薬学的に許容される塩であり、式中、ｎが、１、２、３、及び４から選択される整数である、請求項１又は２に記載のカチオン性脂質。

【請求項4】

前記脂質が、式ＩＩＩで表されるか、

【化34】

又はその薬学的に許容される塩である、請求項１～３のいずれか一項に記載のカチオン性脂質。

【請求項5】

Ｒ^１及びＲ^２が、各々独立して、水素、Ｃ_１～Ｃ_２アルキル、又はＣ_２～Ｃ_３アルケニルである、請求項１～４のいずれか一項に記載のカチオン性脂質、又はその薬学的に許容される塩。

【請求項6】

Ｒ’、Ｒ^１、及びＲ^２が、各々独立して、水素又はＣ_１～Ｃ_２アルキルである、請求項１～５のいずれか一項に記載のカチオン性脂質、又はその薬学的に許容される塩。

【請求項7】

前記脂質が、式ＩＶで表されるか、

【化35】

又はその薬学的に許容される塩である、請求項１～６のいずれか一項に記載のカチオン性脂質。

【請求項8】

Ｒ^５が、存在しないか、又はＣ_１～Ｃ_８アルキレンである、請求項１～７のいずれか一項に記載のカチオン性脂質、又はその薬学的に許容される塩。

【請求項9】

Ｒ^５が、存在しないか、又はＣ_２アルキレンである、請求項１～８のいずれか一項に記載のカチオン性脂質、又はその薬学的に許容される塩。

【請求項10】

前記脂質が、式Ｖで表されるか、

【化36】

又はその薬学的に許容される塩である、請求項１～９のいずれか一項に記載のカチオン性脂質。

【請求項11】

Ｒ^４が、Ｃ_１～Ｃ_１４非分岐アルキル、Ｃ_２～Ｃ_１４非分岐アルケニル、又は

【化37】

であり、式中、Ｒ^４ａ及びＲ^４ｂが、各々独立して、Ｃ_１～Ｃ_１２非分岐アルキル若しくはＣ_２～Ｃ_１２非分岐アルケニルである、請求項１～１０のいずれか一項に記載のカチオン性脂質、又はその薬学的に許容される塩。

【請求項12】

Ｒ^４が、Ｃ_２～Ｃ_１２非分岐アルキル又はＣ_２～Ｃ_１２非分岐アルケニルである、請求項１～１１のいずれか一項に記載のカチオン性脂質、又はその薬学的に許容される塩。

【請求項13】

Ｒ^４が、Ｃ_５～Ｃ_１２非分岐アルキルである、請求項１～１２のいずれか一項に記載のカチオン性脂質、又はその薬学的に許容される塩。

【請求項14】

Ｒ^４が、Ｃ_６非分岐アルキル、Ｃ_７非分岐アルキル、Ｃ_８非分岐アルキル、Ｃ_９非分岐アルキル、Ｃ_１０非分岐アルキル、Ｃ_１１非分岐アルキル、又はＣ_１２非分岐アルキルである、請求項１～１３のいずれか一項に記載のカチオン性脂質、又はその薬学的に許容される塩。

【請求項15】

Ｒ^４が、Ｃ_９非分岐アルキルである、請求項１～１４のいずれか一項に記載のカチオン性脂質、又はその薬学的に許容される塩。

【請求項16】

Ｒ^３が、Ｃ_３～Ｃ_８アルキレン又はＣ_３～Ｃ_８アルケニレンである、請求項１～１５のいずれか一項に記載のカチオン性脂質、又はその薬学的に許容される塩。

【請求項17】

Ｒ^３が、Ｃ_３～Ｃ_７アルキレンである、請求項１～１６のいずれか一項に記載のカチオン性脂質、又はその薬学的に許容される塩。

【請求項18】

Ｒ^３が、Ｃ_７アルキレンである、請求項１～１７のいずれか一項に記載のカチオン性脂質、又はその薬学的に許容される塩。

【請求項19】

Ｒ^３が、Ｃ_５アルキレンである、請求項１～１８のいずれか一項に記載のカチオン性脂質、又はその薬学的に許容される塩。

【請求項20】

Ｒ^６ａ及びＲ^６ｂが、各々独立して、Ｃ_７～Ｃ_１２アルキル又はＣ_７～Ｃ_１２アルケニルである、請求項１～１９のいずれか一項に記載のカチオン性脂質、又はその薬学的に許容される塩。

【請求項21】

Ｒ^６ａ及びＲ^６ｂが、各々独立して、Ｃ_７アルキル、Ｃ_８アルキル、Ｃ_９アルキル、Ｃ_１０アルキル、Ｃ_１１アルキル、Ｃ_１２アルキル、Ｃ_８アルケニル、Ｃ_１０アルケニル、Ｃ_１１アルケニル、又はＣ_１２アルケニルである、請求項１～２０のいずれか一項に記載のカチオン性脂質、又はその薬学的に許容される塩。

【請求項22】

Ｒ^６ａ及びＲ^６ｂが、各々独立して、Ｃ_７アルキル、Ｃ_８アルキル、Ｃ_９アルキル、Ｃ_１０アルキル、Ｃ_１１アルキル、又はＣ_１２アルキルである、請求項１～２１のいずれか一項に記載のカチオン性脂質、又はその薬学的に許容される塩。

【請求項23】

Ｒ^６ａ及びＲ^６ｂが、互いに等しい数の炭素原子を含有する、請求項１～２２のいずれか一項に記載のカチオン性脂質、又はその薬学的に許容される塩。

【請求項24】

Ｒ^６ａ及びＲ^６ｂが、同じである、請求項１～２３のいずれか一項に記載のカチオン性脂質、又はその薬学的に許容される塩。

【請求項25】

Ｒ^６ａ及びＲ^６ｂが、両方ともＣ_７アルキル、又はＣ_８アルキル、又はＣ_９アルキル、又はＣ_１０アルキル、又はＣ_１１アルキル、又はＣ_１２アルキルである、請求項１～２４のいずれか一項に記載のカチオン性脂質、又はその薬学的に許容される塩。

【請求項26】

Ｒ^６ａ及びＲ^６ｂが、両方ともＣ_８アルキルである、請求項１～２５のいずれか一項に記載のカチオン性脂質、又はその薬学的に許容される塩。

【請求項27】

Ｒ^６ａ及びＲ^６ｂが、両方ともＣ_９アルキルである、請求項１～２５のいずれか一項に記載のカチオン性脂質、又はその薬学的に許容される塩。

【請求項28】

Ｒ^６ａ及びＲ^６ｂが、両方ともＣ_１０アルキルである、請求項１～２５のいずれか一項に記載のカチオン性脂質、又はその薬学的に許容される塩。

【請求項29】

Ｒ^６ａ及びＲ^６ｂが、両方ともＣ_１１アルキルである、請求項１～２５のいずれか一項に記載のカチオン性脂質、又はその薬学的に許容される塩。

【請求項30】

Ｒ^６ａ及びＲ^６ｂが、両方ともＣ_１２アルキルである、請求項１～２５のいずれか一項に記載のカチオン性脂質、又はその薬学的に許容される塩。

【請求項31】

Ｒ^６ａ及びＲ^６ｂが、各々、互いとは異なる数の炭素原子を含有する、請求項１～２２のいずれか一項に記載のカチオン性脂質、又はその薬学的に許容される塩。

【請求項32】

Ｒ’が、存在しない、請求項１～３１のいずれか一項に記載のカチオン性脂質、又はその薬学的に許容される塩。

【請求項33】

前記脂質が、以下であるか、

【化38】

【化39】

【化40】

又はその薬学的に許容される塩である、請求項１に記載のカチオン性脂質。

【請求項34】

請求項１～３３のいずれか一項に記載のカチオン性脂質、又はその薬学的に許容される塩と、治療用核酸と、を含む、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）。

【請求項35】

前記治療用核酸が、前記脂質内に封入されている、請求項３４に記載の脂質ナノ粒子。

【請求項36】

前記治療用核酸が、ミニ遺伝子、プラスミド、ミニサークル、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、リボザイム、ｃｅＤＮＡ、ミニストリング、ｄｏｇｇｙｂｏｎｅ（商標）、プロテロメア閉端ＤＮＡ、又はダンベル直鎖状ＤＮＡ、ダイサー基質ｄｓＲＮＡ、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、非対称干渉ＲＮＡ（ａｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ＤＮＡウイルスベクター、ウイルスＲＮＡベクター、非ウイルスベクター、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項３４又は３５に記載の脂質ナノ粒子。

【請求項37】

前記治療用核酸が、閉端ＤＮＡ（ｃｅＤＮＡ）である、請求項３４～３６のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。

【請求項38】

ステロールを更に含む、請求項３４～３６のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。

【請求項39】

前記ステロールが、コレステロール又はベータ－シトステロールである、請求項３８に記載の脂質ナノ粒子。

【請求項40】

非カチオン性脂質を更に含む、請求項３４～３９のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。

【請求項41】

前記非カチオン性脂質が、ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－ホスホエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、ジオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン４－（Ｎ－マレイミドメチル）－シクロヘキサン－１－カルボキシレート（ＤＯＰＥ－ｍａｌ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジミリストイルホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジステアロイル－ホスファチジル－エタノールアミン（ＤＳＰＥ）、モノメチル－ホスファチジルエタノールアミン（１６－Ｏ－モノメチルＰＥ等）、ジメチル－ホスファチジルエタノールアミン（１６－Ｏ－ジメチルＰＥ等）、１８－１－トランスＰＥ、１－ステアロイル－２－オレオイル－ホスファチジエタノールアミン（ＳＯＰＥ）、水素化ダイズホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）、卵ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルセリン（ＤＯＰＳ）、スフィンゴミエリン（ＳＭ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルグリセロール（ＤＭＰＧ）、ジステアロイルホスファチジルグリセロール（ＤＳＰＧ）、ジエルコイルホスファチジルコリン（ＤＥＰＣ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルグリセロール（ＰＯＰＧ）、ジエライドイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＥＰＥ）、１，２－ジラウロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＬＰＥ）、１，２－ジフィタノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＰＨｙＰＥ）、レシチン、ホスファチジルエタノールアミン、リソレシチン、リソホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、スフィンゴミエリン、卵スフィンゴミエリン（ＥＳＭ）、セファリン、カルジオリピン、ホスファチジカシド、セレブロシド、ジセチルホスフェート、リソホスファチジルコリン、ジリノレオイルホスファチジルコリン、及びそれらの混合物からなる群から選択される、請求項４０に記載の脂質ナノ粒子。

【請求項42】

前記非カチオン性脂質が、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、及びジオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）からなる群から選択される、請求項４０又は４１に記載の脂質ナノ粒子。

【請求項43】

少なくとも１つのＰＥＧ化脂質を更に含む、請求項３４～４２のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。

【請求項44】

前記少なくとも１つのＰＥＧ化脂質が、ＰＥＧ－ジラウリルオキシプロピル、ＰＥＧ－ジミリスチルオキシプロピル、ＰＥＧ－ジパルミチルオキシプロピル、ＰＥＧ－ジステアリルオキシプロピル、１－（モノメトキシ－ポリエチレングリコール）－２，３－ジミリストイルグリセロール－ＰＥＧ（ＤＭＧ－ＰＥＧ）、ジステアロイル－ｒａｃ－グリセロール－ＰＥＧ（ＤＳＧ－ＰＥＧ）、
ＰＥＧ－ジラウリルグリセロール、ＰＥＧ－ジパルミトイルグリセロール、ＰＥＧ－ジステリルグリセロール、ＰＥＧ－ジラウリルグリカミド、ＰＥＧ－ジミリスチルグリカミド、ＰＥＧ－ジパルミトイルグリカミド、ＰＥＧ－ジステリルグリカミド、（１－［８’－（コレスト－５－エン－３［ベータ］－オキシ）カルボキサミド－３’，６’－ジオキサオクタニル］カルバモイル－［オメガ］－メチル－ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ－コレステロール）、３，４－ジテトラデコキシルベンジル－［オメガ］－メチル－ポリ（エチレングリコール）エーテル（ＰＥＧ－ＤＭＢ）、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）］（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ）、及び１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－ポリ（エチレングリコール）－ヒドロキシル（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ－ＯＨ）からなる群から選択される、請求項４３に記載の脂質ナノ粒子。

【請求項45】

前記少なくとも１つのＰＥＧ化脂質が、ＤＭＧ－ＰＥＧ、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ－ＯＨ、ＤＳＧ－ＰＥＧ、又はそれらの組み合わせである、請求項４３又は４４に記載の脂質ナノ粒子。

【請求項46】

前記少なくとも１つのＰＥＧ化脂質が、ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００－ＯＨ、ＤＳＧ－ＰＥＧ２０００、又はそれらの組み合わせである、請求項４３～４５のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。

【請求項47】

組織特異的標的化リガンドを更に含む、請求項３４～４６のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。

【請求項48】

前記組織特異的標的化リガンドが、Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）又はＧａｌＮＡｃ誘導体である、請求項４７に記載の脂質ナノ粒子。

【請求項49】

前記組織特異的標的化リガンドが、前記少なくとも１つのＰＥＧ化脂質に共有結合して、ＰＥＧ化脂質コンジュゲートを形成する、請求項４７又は４８に記載の脂質ナノ粒子。

【請求項50】

前記ＰＥＧ化脂質コンジュゲートが、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００に共有結合したテトラ－アンテナリーＧａｌＮＡｃを含む、請求項４９に記載の脂質ナノ粒子。

【請求項51】

前記カチオン性脂質が、約３０％～約８０％のモルパーセンテージで存在する、請求項３４～５０のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。

【請求項52】

前記ステロールが、約２０％～約５０％のモルパーセンテージで存在する、請求項３８～５１のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。

【請求項53】

前記非カチオン性脂質が、約２％～約２０％のモルパーセンテージで存在する、請求項４０～５２のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。

【請求項54】

前記少なくとも１つのＰＥＧ化脂質が、約２．１％～約１０％のモルパーセンテージで存在する、請求項４３～５３のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。

【請求項55】

前記ＰＥＧ化脂質コンジュゲートが、約０．１％～約１０％のモルパーセンテージで存在する、請求項４９～５４のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。

【請求項56】

ステロール、非カチオン性脂質、ＰＥＧ化脂質、及びＰＥＧ化脂質コンジュゲートを更に含む、請求項３４に記載の脂質ナノ粒子。

【請求項57】

パルミチン酸デキサメタゾンを更に含む、請求項３４～５６のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。

【請求項58】

前記粒子が、約１０：１～約４０：１の全脂質対ｃｅＤＮＡ比を有する、請求項３４～５７のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。

【請求項59】

前記ナノ粒子が、約４０ｎｍ～約１２０ｎｍの範囲の直径を有する、請求項３４～５８のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。

【請求項60】

前記ナノ粒子が、約１００ｎｍ未満の直径を有する、請求項３４～５９のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。

【請求項61】

前記ナノ粒子が、約６０ｎｍ～約８０ｎｍの直径を有する、請求項３４～６０のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。

【請求項62】

前記ｃｅＤＮＡが、閉端直鎖状二重鎖ＤＮＡである、請求項３４～６１のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。

【請求項63】

前記ｃｅＤＮＡが、発現カセットを含み、前記発現カセットが、プロモーター配列及び導入遺伝子を含む、請求項６２に記載の脂質ナノ粒子。

【請求項64】

前記発現カセットが、ポリアデニル化配列を含む、請求項６３に記載の脂質ナノ粒子。

【請求項65】

前記ｃｅＤＮＡが、前記発現カセットの５’又は３’末端のいずれかに隣接する少なくとも１つの逆位末端反復（ＩＴＲ）を含む、請求項６２～６４のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。

【請求項66】

前記発現カセットが、２つのＩＴＲに隣接し、前記２つのＩＴＲが、１つの５’ＩＴＲ及び１つの３’ＩＴＲを含む、請求項６５に記載の脂質ナノ粒子。

【請求項67】

前記発現カセットが、３’末端でＩＴＲ（３’ＩＴＲ）に連結している、請求項６５に記載の脂質ナノ粒子。

【請求項68】

前記発現カセットが、５’末端でＩＴＲ（５’ＩＴＲ）に連結している、請求項６５に記載の脂質ナノ粒子。

【請求項69】

前記少なくとも１つのＩＴＲが、ＡＡＶ血清型に由来するＩＴＲであり、ガチョウウイルスのＩＴＲに由来し、Ｂ１９ウイルスＩＴＲに由来し、パルボウイルスからの野生型ＩＴＲである、請求項６５に記載の脂質ナノ粒子。

【請求項70】

前記ＡＡＶ血清型が、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、及びＡＡＶ１２から構成される群から選択される、請求項６９に記載の脂質ナノ粒子。

【請求項71】

前記５’ＩＴＲ及び前記３’ＩＴＲのうちの少なくとも１つが、野生型ＡＡＶ ＩＴＲである、請求項６６～７０のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。

【請求項72】

前記５’ＩＴＲ及び前記３’ＩＴＲのうちの少なくとも１つが、修飾型又は変異型ＩＴＲである、請求項６６～７１のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。

【請求項73】

前記５’ＩＴＲ及び前記３’ＩＴＲが、対称である、請求項６６～７２のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。

【請求項74】

前記５’ＩＴＲ及び前記３’ＩＴＲが、非対称である、請求項６６～７３のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。

【請求項75】

前記ｃｅＤＮＡが、５’ＩＴＲと前記発現カセットとの間にスペーサー配列を更に含む、請求項６６～７４のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。

【請求項76】

前記ｃｅＤＮＡが、３’ＩＴＲと前記発現カセットとの間にスペーサー配列を更に含む、請求項６６～７５のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。

【請求項77】

前記スペーサー配列が、少なくとも５塩基対の長さである、請求項７５又は７６に記載の脂質ナノ粒子。

【請求項78】

前記ｃｅＤＮＡが、ニック又はギャップを有する、請求項３７～７７のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。

【請求項79】

前記ｃｅＤＮＡが、ＣＥＬｉＤ、ＤＮＡベースのミニサークル、ＭＩＤＧＥ、ミニストリングＤＮＡ、発現カセットの前記５’及び３’末端にＩＴＲの２つのヘアピン構造を含むダンベル型の直鎖状二重鎖閉端ＤＮＡ、又はｄｏｇｇｙｂｏｎｅ（商標）ＤＮＡである、請求項３７～７８のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。

【請求項80】

請求項１～３４のいずれか一項に記載のカチオン性脂質又は請求項３４～７９のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子と、薬学的に許容される賦形剤と、を含む、医薬組成物。

【請求項81】

対象における遺伝性障害を治療する方法であって、有効量の請求項３４～７９のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子、又は有効量の請求項８０に記載の医薬組成物を、前記対象に投与することを含む、方法。

【請求項82】

前記対象が、ヒトである、請求項８１に記載の方法。

【請求項83】

前記遺伝性障害が、鎌状赤血球貧血症、メラノーマ、血友病Ａ（凝固因子ＶＩＩＩ（ＦＶＩＩＩ）欠損症）及び血友病Ｂ（凝固因子ＩＸ（ＦＩＸ）欠損症）、嚢胞性線維症（ＣＦＴＲ）、家族性高コレステロール血症（ＬＤＬ受容体欠損症）、肝芽細胞腫、ウィルソン病、フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）、先天性肝性ポルフィリン症、遺伝性肝代謝障害、レッシュナイハン症候群、鎌状赤血球貧血症、サラセミア、色素性乾皮症、ファンコニ貧血、網膜色素変性症、毛細血管拡張性運動失調症、ブルーム症候群、網膜芽細胞腫、ムコ多糖蓄積症（例えば、ハーラー症候群（ＭＰＳ Ｉ型）、シャイエ症候群（ＭＰＳ Ｉ Ｓ型）、ハーラー・シャイエ症候群（ＭＰＳ Ｉ Ｈ－Ｓ型）、ハンター症候群（ＭＰＳ ＩＩ型）、サンフィリッポＡ、Ｂ、Ｃ、及びＤ型（ＭＰＳ ＩＩＩ Ａ、Ｂ、Ｃ、及びＤ型）、モルキオＡ及びＢ型（ＭＰＳ ＩＶＡ及びＭＰＳ ＩＶＢ）、マロトー・ラミー症候群（ＭＰＳ ＶＩ型）、スライ症候群（ＭＰＳ ＶＩＩ型）、ヒアルロニダーゼ欠損症（ＭＰＳ ＩＸ型））、ニーマン・ピック病Ａ／Ｂ、Ｃ１及びＣ２型、ファブリー病、シンドラー病、ＧＭ２－ガングリオシドーシスＩＩ型（サンドホフ病）、テイ・サックス病、異染性白質ジストロフィー、クラッベ病、ムコリピドーシスＩ、ＩＩ／ＩＩＩ及びＩＶ型、シアリドーシスＩ及びＩＩ型、グリコーゲン蓄積症Ｉ及びＩＩ型（ポンペ病）、ゴーシェ病Ｉ、ＩＩ及びＩＩＩ型、シスチン症、バッテン病、アスパルチルグルコサミン尿症、サラ病、ダノン病（ＬＡＭＰ－２欠損症）、リソソーム酸性リパーゼ（ＬＡＬ）欠損症、神経セロイドリポフスチン症（ＣＬＮ１－８、ＩＮＣＬ、及びＬＩＮＣＬ）、スフィンゴリピドーシス、ガラクトシアリドーシス、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、脊髄小脳失調症、脊髄性筋萎縮症、フリードライヒ運動失調症、デュシェンヌ筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、ベッカー筋ジストロフィー（ＢＭＤ）、ジストロフィー表皮水疱症（ＤＥＢ）、エクトヌクレオチドピロホスファターゼ１欠損症、乳児期の全身性動脈石灰化（ＧＡＣＩ）、レーバー先天性黒内障、シュタルガルト黄斑ジストロフィー（ＡＢＣＡ４）、オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）欠損症、アッシャー症候群、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、アルファ－１アンチトリプシン欠損症、進行性家族性肝内胆汁うっ滞（ＰＦＩＣ）Ｉ型（ＡＴＰ８Ｂ１欠損症）、ＩＩ型（ＡＢＣＢ１１）、ＩＩＩ型（ＡＢＣＢ４）、又はＩＶ型（ＴＪＰ２）、並びにカテプシンＡ欠損症からなる群から選択される、請求項８１又は８２に記載の方法。

【請求項84】

前記遺伝性障害が、血友病Ａである、請求項８３に記載の方法。

【請求項85】

前記遺伝性障害が、血友病Ｂである、請求項８３に記載の方法。

【請求項86】

前記遺伝性障害が、フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）である、請求項８３に記載の方法。

【請求項87】

前記遺伝性障害が、ウィルソン病である、請求項８３に記載の方法。

【請求項88】

前記遺伝性障害が、ゴーシェ病Ｉ、ＩＩ、及びＩＩＩ型である、請求項８３に記載の方法。

【請求項89】

前記遺伝性障害が、シュタルガルト黄斑ジストロフィーである、請求項８３に記載の方法。

【請求項90】

前記遺伝性障害が、ＬＣＡ１０である、請求項８３に記載の方法。

【請求項91】

前記遺伝性障害が、アッシャー症候群である、請求項８３に記載の方法。

【請求項92】

前記遺伝性障害が、滲出型ＡＭＤである、請求項８３に記載の方法。

【請求項93】

前記遺伝性障害が、ジストロフィー表皮水疱症（ＤＥＢ）である、請求項８３に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

（関連出願の相互参照）
本出願は、２０２１年６月１４日に出願された米国仮出願第６３／２１０，２０４号に対する優先権を主張し、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【背景技術】

【0002】

遺伝子療法は、異常な遺伝子発現プロファイルによって引き起こされる遺伝性障害又は後天性疾患のいずれかに罹患している患者についての臨床成績を向上することを目的とする。疾患を治療するための薬物として治療用核酸を患者の細胞に送達する様々な種類の遺伝子療法がこれまでに開発されてきた。

【0003】

患者の標的細胞への修復遺伝子の導入及び発現は、操作されたウイルス遺伝子送達ベクター、及び潜在的にプラスミド、ミニ遺伝子、オリゴヌクレオチド、ミニサークル、又は様々な閉端ＤＮＡの使用を含む、多くの方法を介して実行され得る。利用可能な多くのウイルス由来ベクター（例えば、組換えレトロウイルス、組換えレンチウイルス、組換えアデノウイルス等）の中で、組換えアデノ随伴ウイルス（recombinant adeno-associated virus、ｒＡＡＶ）は、遺伝子療法において汎用的、かつ比較的安全なベクターとして受け入れられている。しかしながら、アデノ随伴ベクター等のウイルスベクターは、免疫原性が高く、特に再投与に関して有効性を損なう可能性のある体液性免疫及び細胞性免疫を誘発し得る。

【0004】

非ウイルス遺伝子送達は、ウイルス形質導入に関連する特定の不利な点、特にベクター粒子を形成するウイルス構造タンパク質に対する体液性及び細胞性免疫応答、並びに任意のデノボウイルス遺伝子発現に起因する不利な点を回避する。非ウイルス送達技術の利点の中には、担体としての脂質ナノ粒子（lipid nanoparticle、ＬＮＰ）の使用がある。ＬＮＰは、ウイルス遺伝子療法に関連する顕著な毒性をもたらす体液性及び細胞性免疫応答を回避することができるＬＮＰ成分としてカチオン性脂質を設計することを可能にする独自の機会を提供する。

【0005】

カチオン性脂質は、概して、カチオン性アミン部分、典型的には１つ又は２つの脂肪族炭化水素鎖（すなわち、飽和又は不飽和であり得る水性尾部）を有する疎水性ドメイン、及びカチオン性アミン部分と疎水性ドメインとを連結するリンカー又は生分解性基から構成される。カチオン性アミン部分及びポリアニオン核酸は静電的に相互作用して、正に帯電したリポソーム又は脂質膜構造を形成する。したがって、細胞への取り込みが促進され、核酸が細胞に送達される。

【0006】

いくつかの広く使用されているカチオン性脂質は、ＣＬｉｎＤＭＡ、ＤＬｉｎＤＭＡ（ＤＯＤＡＰ）、及びＤＯＴＡＰである。これらの脂質は、リボ核酸（ｓｉＲＮＡ又はｍＲＮＡ）送達のために用いられてきたが、より高い用量での毒性とともに最適以下の送達効率に悩まされている。現在のカチオン性脂質の欠点を考慮して、毒性の低減とともに効力の増強を示すだけでなく、薬物動態並びに細胞取り込み及び脂質担体からの核酸放出等の細胞内動態を改善する脂質足場を提供する必要がある。

【発明の概要】

【0007】

本開示において提供されるカチオン性脂質は、生分解性基を含有する１つの疎水性尾部と、生分解性基を含有しない疎水性尾部と、を含む。本開示に提供される例示的な脂質のいくつかは、末端部で分岐して２つの分岐脂肪族炭化水素鎖を形成する疎水性尾部と、分岐しない疎水性尾部と、を含む。本発明者らは、本開示のカチオン性脂質が満足のいく収率及び純度で合成され得ることを見出した。本発明者らはまた、本開示のカチオン性脂質が、治療用核酸を担持するための脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）として製剤化された場合、核酸内の導入遺伝子インサートの持続性のある優れた、かつ安定したインビボ発現を提供し、十分に忍容性があることを見出した。更に、理論に束縛されることを望むものではないが、本発明者らは、分岐疎水性尾部における末端分岐脂肪族炭化水素鎖の長さ（すなわち、炭素原子の数）、非分岐疎水性尾部の長さと、並びに分解性基と分岐疎水性尾部との間の距離との間の微妙な相互作用が、とりわけ、ＬＮＰ組成物の優れた封入効率、発現レベル、及びインビボ忍容性を達成するために重要であると考える。

【0008】

したがって、一態様では、本明細書では、式Ｉ又はＩａで表されるカチオン性脂質、

【0009】

【化1】

並びにその薬学的に許容される塩が提供され、式中、Ｒ’、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^６ａ、Ｒ^６ｂ、Ｘ、及びｎは、それぞれ、式Ｉ又はＩａの各々について本明細書で定義されるとおりである。

【0010】

本明細書に記載のカチオン性脂質、又はその薬学的に許容される塩、及び薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物も提供される。

【0011】

本開示の別の態様は、本明細書に記載のカチオン性脂質、又はその薬学的に許容される塩、及び核酸を含む脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を含む組成物に関する。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、核酸は、ＬＮＰに封入されている。特定の実施形態では、核酸は、閉端ＤＮＡ（closed-ended DNA、ｃｅＤＮＡ）である。

【0012】

本開示の更なる態様は、開示されるカチオン性脂質又は本明細書に記載の組成物を使用して、対象における遺伝性障害を治療する方法に関する。

【図面の簡単な説明】

【0013】

上記に簡単に要約され、以下により詳細に論じられる本開示の実施形態は、添付の図面に描かれた本開示の例示的な実施形態を参照することによって理解することができる。しかしながら、添付の図面は、本開示の典型的な実施形態のみを示し、したがって、本開示は他の等しく有効な実施形態を認めることができるため、範囲を限定するものとみなされるべきではない。

【図1】前臨床研究において観察されたように、参照脂質Ａ（陽性対照）を用いて製剤化されたＬＮＰ１及びＰＢＳ（陰性対照）と比較した、各々脂質６を用いて製剤化された脂質ナノ粒子ＬＮＰ２、ＬＮＰ３、及びＬＮＰ４を送達ビヒクルとして用いることによって達成された、４日目のｃｅＤＮＡ－ルシフェラーゼ発現を示す（投与量＝０．２５ｍｇ／ｋｇ）。

【図2A】前臨床研究において観察されたように、参照脂質Ａ（陽性対照）を用いて製剤化されたＬＮＰ５、ＭＣ３を用いて製剤化されたＬＮＰ６、及び参照脂質Ｂ（陽性対照）を用いて製剤化されたＬＮＰ７、及びＰＢＳ（陰性対照）と比較した、それぞれ脂質７、脂質１１、及び脂質１を用いて製剤化された脂質ナノ粒子ＬＮＰ８、ＬＮＰ９、及びＬＮＰ１０を送達ビヒクルとして用いることによって達成された、総フラックスによって測定された４日目のｃｅＤＮＡ－ルシフェラーゼ発現を示す棒グラフである（投与量＝０．５ｍｇ／ｋｇ）。

【図2B】同じ研究におけるマウスの０日目～４日目の経時的な体重変化を示す。

【発明を実施するための形態】

【0014】

本開示は、非ウイルスベクター（例えば、閉端ＤＮＡ）又は合成ウイルスベクター等の治療用核酸（therapeutic nucleic acid、ＴＮＡ）を送達するための脂質ベースのプラットフォームを提供し、これは、細胞に取り込まれることができ、高レベルの発現を維持することができる。例えば、ウイルスベクターベースの遺伝子療法に関連する免疫原性は、既存のバックグラウンド免疫のために治療できる患者の数を制限し、かつ各患者の有効レベルまで滴定するための、又は長期にわたって効果を維持するため患者の再投与を妨げてきた。更に、他の核酸モダリティは、免疫応答のカスケードを誘発する生来のＤＮＡ又はＲＮＡセンシングメカニズムのために免疫原性に大きく悩まされている。既存の免疫が欠けているため、本明細書に記載のＴＮＡ脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）は、必要に応じて、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、合成ウイルスベクター、又はｃｅＤＮＡ等のＴＮＡの追加用量を可能にし、組織成長に応じて後続の用量を必要とし得る小児集団を含む患者アクセスを更に拡大させる。更に、特に、１つ以上の三級アミノ基を含む脂質組成物、及びジスルフィド結合を含むＴＮＡ脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）は、ＴＮＡ（例えば、ｃｅＤＮＡ）のより効率的な送達、より良好な忍容性、及び改善された安全性プロファイルを提供することが本開示の発見である。本明細書中に記載するＴＮＡ脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）は、ウイルスカプシド内の空間によって課されるパッケージングの制約がないため、理論的には、ＴＮＡ脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）の唯一のサイズ制限は、宿主細胞の発現（例えば、ＤＮＡ複製、又はＲＮＡ翻訳）効率に存在する。

【0015】

特に希少疾患における療法の開発における最大のハードルの１つは、多数の個々の病態である。地球上で約３億５０００万人が希少障害を抱えて生活しており、国立衛生研究所は、希少障害を、診断されたヒトが２０万人未満の障害又は病態と定義している。これらの希少障害の約８０パーセントは遺伝的起源であり、それらの約９５パーセントはＦＤＡによって承認された治療（ｒａｒｅｄｉｓｅａｓｅｓ．ｉｎｆｏ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｄｉｓｅａｓｅｓ／ｐａｇｅｓ／３１／ｆａｑｓ－ａｂｏｕｔ－ｒａｒｅ－ｄｉｓｅａｓｅｓ）を有しない。本明細書に記載されるＴＮＡ脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）の利点の中には、ＴＮＡの特定のモダリティで治療することができる複数の疾患、特に多くの遺伝性障害又は疾患の治療の現在の状態を有意義に変更することができる希少な単一遺伝子疾患に迅速に適応することができるアプローチを提供することにある。

【0016】

Ｉ．定義
「アルキル」という用語は、飽和、直鎖（すなわち、非分岐）又は分岐鎖炭化水素の一価ラジカルを指す。アルキルが非分岐、例えばＣ_１～Ｃ_１６非分岐アルキルであることが具体的に記載されていない限り、本明細書で使用される「アルキル」という用語は、分岐及び非分岐アルキル基の両方に適用される。例示的なアルキル基としては、Ｃ_１～Ｃ_１６非分岐アルキル、Ｃ_７～Ｃ_１２アルキル、Ｃ_７～Ｃ_１１アルキル、Ｃ_８～Ｃ_１０アルキル、Ｃ_２～Ｃ_１４非分岐アルキル、Ｃ_２～Ｃ_１２非分岐アルキル、Ｃ_２～Ｃ_１０非分岐アルキル、Ｃ_２～Ｃ_７非分岐アルキル、Ｃ_１～Ｃ_６アルキル、Ｃ_１～Ｃ_４アルキル、Ｃ_１～Ｃ_３アルキル、Ｃ_１～Ｃ_２アルキル、Ｃ_７非分岐アルキル、Ｃ_８非分岐アルキル、Ｃ_９非分岐アルキル、Ｃ_１０非分岐アルキル、Ｃ_１１非分岐アルキル、Ｃ_８アルキル、Ｃ_１０アルキル、Ｃ_１２アルキル、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、２－メチル－１－ブチル、３－メチル－２－ブチル、２－メチル－１－ペンチル、３－メチル－１－ペンチル、４－メチル－１－ペンチル、２－メチル－２－ペンチル、３－メチル－２－ペンチル、４－メチル－２－ペンチル、２，２－ジメチル－１－ブチル、３，３－ジメチル－１－ブチル、２－エチル－１－ブチル、ブチル、イソブチル、ｔ－ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デカニル、ウンデカニル、ドデカニル、トリデカニル、テトラデカニル、ペンタデカニル、ヘキサデカニル、ヘプタデカニル、オクタデカニル、ノナデカニル、エイコサニル等が挙げられるが、これらに限定されない。

【0017】

「アルキレン」という用語は、飽和、直鎖、又は分岐鎖炭化水素の二価ラジカルを指す。アルキレンが非分岐、例えば、Ｃ_３～Ｃ_１０非分岐アルキレン及びＣ_１～Ｃ_８アルキレンであることが具体的に記載されていない限り、本明細書で使用される「アルキレン」という用語は、分岐及び非分岐アルキレン基の両方に適用される。例示的なアルキレン基としては、Ｃ_３～Ｃ_９アルキレン、Ｃ_３～Ｃ_８アルキレン、Ｃ_１～Ｃ_８アルキレン、Ｃ_１～Ｃ_６アルキレン、Ｃ_１～Ｃ_４アルキレン、Ｃ_２～Ｃ_８アルキレン、Ｃ_３～Ｃ_７アルキレン、Ｃ_５～Ｃ_７アルキレン、Ｃ_７アルキレン、Ｃ_５アルキレン、及び上記の例示的なアルキル基のいずれかに対応するアルキレンが挙げられるが、これらに限定されない。

【0018】

「アルケニル」という用語は、１つ以上（例えば、１つ又は２つ）の炭素－炭素二重結合を有する直鎖又は分岐鎖炭化水素の一価ラジカルを指し、アルケニルラジカルは、「シス」及び「トランス」配向、又は別の命名法による、「Ｅ」及び「Ｚ」配向を有するラジカルを含む。アルケニルが非分岐、例えばＣ_２～Ｃ_１６非分岐アルケニルであることが具体的に記載されていない限り、本明細書で使用される「アルケニル」という用語は、分岐及び非分岐アルケニル基の両方に適用される。例示的なアルケニル基としては、Ｃ_２～Ｃ_１６非分岐アルケニル、Ｃ_７～Ｃ_１６アルケニル、Ｃ_８～Ｃ_１４アルケニル、Ｃ_２～Ｃ_１４非分岐アルケニル、Ｃ_２～Ｃ_１２非分岐アルケニル、Ｃ_２～Ｃ_１０非分岐アルケニル、Ｃ_２～Ｃ_７非分岐アルケニル、Ｃ_２～Ｃ_６アルケニル、Ｃ_２～Ｃ_４アルケニル、Ｃ_２～Ｃ_３アルケニル、Ｃ_８アルケニル、Ｃ_１０アルケニル、Ｃ_１２アルケニル、及び２個以上の炭素原子を含有する上記の例示的なアルキル基のいずれかに対応するアルケニルが挙げられるが、これらに限定されない。

【0019】

「アルケニレン」という用語は、１つ以上（例えば、１つ又は２つ）の炭素－炭素二重結合を有する直鎖又は分岐鎖炭化水素の二価ラジカルを指し、アルケニルラジカルは、「シス」及び「トランス」配向、又は代替的な命名法による、「Ｅ」及び「Ｚ」配向を有するラジカルを含む。アルケニレンが非分岐、例えば、Ｃ_３～Ｃ_１０非分岐アルキレンであることが具体的に記載されていない限り、本明細書で使用される「アルケニレン」という用語は、分岐及び非分岐アルケニレン基の両方に適用される。例示的なアルケニレン基としては、Ｃ_３～Ｃ_９アルケニレン、Ｃ_３～Ｃ_８アルケニレン、Ｃ_２～Ｃ_８アルケニレン、Ｃ_２～Ｃ_６アルケニレン、Ｃ_３～Ｃ_７アルケニレン、Ｃ_５～Ｃ_７アルケニレン、Ｃ_２～Ｃ_４アルケニレン、Ｃ_１～Ｃ_８アルキレン、Ｃ_２～Ｃ_８アルキレン、Ｃ_３～Ｃ_７アルキレン、Ｃ_５～Ｃ_７アルキレン、Ｃ_７アルキレン、Ｃ_５アルキレン、及び２個以上の炭素原子を含有する上記の例示的なアルキル基のいずれかに対応するアルケニルが挙げられるが、これらに限定されない。

【0020】

本明細書で使用される「薬学的に許容される塩」という用語は、本発明のカチオン性脂質の薬学的に許容される有機又は無機の塩を指す。例示的な塩としては、硫酸塩、クエン酸塩、酢酸塩、シュウ酸塩、塩化物、臭化物、ヨウ化物、硝酸塩、重硫酸塩、リン酸塩、酸性リン酸塩、イソニコチン酸塩、乳酸塩、サリチル酸塩、酸性クエン酸塩、酒石酸塩、オレイン酸塩、タンニン酸塩、パントテン酸塩、酸性酒石酸塩、アスコルビン酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、ゲンチシン酸塩、フマル酸塩、グルコン酸塩、グルクロン酸塩、糖酸塩、ギ酸塩、安息香酸塩、グルタミン酸塩、メタンスルホン酸塩「メシレート」、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ－トルエンスルホン酸塩、パモエート（すなわち、１，１’－メチレン－ビス－（２－ヒドロキシ－３－ナフトエート））塩、アルカリ金属（例えば、ナトリウム及びカリウム）塩、アルカリ土類金属（例えば、マグネシウム）塩、及びアンモニウム塩が挙げられるが、これらに限定されない。薬学的に許容される塩は、酢酸イオン、コハク酸イオン又は他の対イオン等の別の分子の包含を含み得る。対イオンは、親化合物の電荷を安定化させる任意の有機又は無機部分であり得る。更に、薬学的に許容される塩は、その構造中に２つ以上の荷電原子を有し得る。複数の荷電原子が薬学的に許容される塩の一部である場合、複数の対イオンを有することができる。したがって、薬学的に許容される塩は、１つ以上の荷電原子及び／又は１つ以上の対イオンを有することができる。

【0021】

本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、「約」という用語は、量、時間的持続時間等の測定可能な値を指す場合、開示された方法を実施するのに適切であるように指定の値から±２０％又は±１０％、又は±５％、又は±１％、又は±０．５％、また更により好ましくは±０．１％の変動を包含することを意味する。

【0022】

本明細書で使用される場合、「含む（comprise）」、「含む（comprising）」、及び「含む（comprises）」、並びに「から構成された（comprised of）」は、「含む（include）」、「含む（including）」、「含む（includes）」、又は「含有する（contain）」、「含有する（containing）」、「含有する（contains）」と同義であることを意味し、例えば、構成要素に続くものの存在を指定する包括的又は自由形式の用語であり、当該技術分野において既知であるか、又はそこに開示されている、追加の、引用されていない構成要素、特徴、エレメント、メンバー、ステップの存在を除外又は排除しない。

【0023】

「からなる」という用語は、実施形態の説明において列挙されていないいずれのエレメントも除いた、本明細書に記載される組成物、方法、プロセス、及びそれらのそれぞれの構成要素を指す。

【0024】

本明細書で使用される場合、「から本質的になる」という用語は、所与の実施形態に必要なエレメントを指す。この用語は、本発明の実施形態の基本的かつ新規又は機能的な特徴に物質的に影響を及ぼさない追加のエレメントの存在を許容する。

【0025】

本明細書で使用される場合、「投与」、「投与する」という用語及びそのバリアントは、組成物又は薬剤（例えば、核酸、特にｃｅＤＮＡ）を対象に導入することを指し、１つ以上の組成物又は薬剤の同時で連続的な導入を含む。組成物又は薬剤の対象への導入は、経口、肺、鼻腔内、非経口（静脈内、筋肉内、腹腔内、又は皮下）、直腸、リンパ管内、腫瘍内、又は局所を含む任意の好適な経路による。投与には、自己管理及び他者による投与が含まれる。投与は、任意の好適な経路によって実行され得る。好適な投与経路は、組成物又は薬剤がその意図された機能を遂行することを可能にする。例えば、好適な経路が静脈内である場合、組成物は、組成物又は薬剤を対象の静脈に導入することによって投与される。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一態様では、「投与」は、治療的投与を指す。

【0026】

本明細書で使用される場合、「抗治療用核酸免疫応答」、「抗転移ベクター免疫応答」、「治療用核酸に対する免疫応答」、「転移ベクターに対する免疫応答」等の句は、その起源がウイルス性又は非ウイルス性の治療用核酸に対する任意の望ましくない免疫応答を指すことを意味する。本明細書の態様及び実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、望ましくない免疫応答は、ウイルス転移ベクター自体に対する抗原特異的免疫応答である。本明細書の態様及び実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、免疫応答は、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、又は二本鎖ＲＮＡであり得る転移ベクターに特異的である。他の実施形態では、免疫応答は、転移ベクターの配列に特異的である。他の実施形態では、免疫応答は、転移ベクターのＣｐＧ含有量に特異的である。

【0027】

本明細書で使用される場合、「担体」及び「賦形剤」という用語は、互換的に使用され、任意かつ全ての溶媒、分散媒、ビヒクル、コーティング、希釈剤、抗細菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤、緩衝液、担体溶液、懸濁液、コロイド等を含むことを意味する。薬学的に活性な物質に対するそのような媒質及び薬剤の使用は、当該技術分野において周知である。補充的活性成分を組成物に組み込むこともできる。「薬学的に許容される」という語句は、宿主に投与された場合に、毒性反応、アレルギー性反応、又は同様の不都合な反応を生じない分子実体及び組成物を指す。

【0028】

本明細書で使用される場合、「ｃｅＤＮＡ」という用語は、合成又はその他の非ウイルス遺伝子導入のためのカプシド不含閉端直鎖状二本鎖（double stranded、ｄｓ）二重鎖ＤＮＡを指すことを意味する。ｃｅＤＮＡの詳細な説明は、２０１７年３月３日に出願された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０２０８２８号に記載されており、その全体の内容は、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。細胞ベースの方法を使用して様々な逆位末端反復（inverted terminal repeat、ＩＴＲ）配列及び構成を含むｃｅＤＮＡの産生のためのある特定の方法は、２０１８年９月７日に出願された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０４９９９６号及び２０１８年１２月６日に出願された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０６４２４２号の実施例１に記載されており、その各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。様々なＩＴＲ配列及び構成を含む合成ｃｅＤＮＡベクターの産生のためのある特定の方法は、例えば、２０１９年１月１８日に出願された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／１４１２２号に記載されており、その全体の内容は、参照により本明細書に組み込まれる。本明細書で使用される場合、「ｃｅＤＮＡベクター」及び「ｃｅＤＮＡ」という用語は互換的に使用される。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態によれば、ｃｅＤＮＡは、閉端直鎖状二重鎖（closed-ended linear duplex、ＣＥＬｉＤ）ＣＥＬｉＤ ＤＮＡである。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態によれば、ｃｅＤＮＡは、ＤＮＡベースのミニサークルである。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態によれば、ｃｅＤＮＡは、最小限の免疫学的に定義された遺伝子発現（minimalistic immunological-defined gene expression、ＭＩＤＧＥ）ベクターである。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態によれば、ｃｅＤＮＡは、ミニストリング（ministring）ＤＮＡである。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態によれば、ｃｅＤＮＡは、発現カセットの５’及び３’末端にＩＴＲの２つのヘアピン構造を含むダンベル型の直鎖状二重鎖閉端ＤＮＡである。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態によれば、ｃｅＤＮＡは、ｄｏｇｇｙｂｏｎｅ（商標）ＤＮＡである。

【0029】

本明細書で使用される場合、「ｃｅＤＮＡ－バクミド」という用語は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいてプラスミドとして伝播することができる分子間二重鎖としてｃｅＤＮＡゲノムを含み、それによりバキュロウイルスのシャトルベクターとして作動し得る、感染性バキュロウイルスゲノムを指すことを意味する。

【0030】

本明細書で使用される場合、「ｃｅＤＮＡ－バキュロウイルス」という用語は、バキュロウイルスゲノム内の分子間二重鎖としてｃｅＤＮＡゲノムを含むバキュロウイルスを指すことを意味する。

【0031】

本明細書で使用される場合、「ｃｅＤＮＡ－バキュロウイルス感染昆虫細胞」及び「ｃｅＤＮＡ－ＢＩＩＣ」という用語は、互換的に使用され、ｃｅＤＮＡ－バキュロウイルスに感染した無脊椎動物宿主細胞（昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９細胞）が挙げられるが、これに限定されない）を指すことを意味する。

【0032】

本明細書で使用される場合、「ｃｅＤＮＡゲノム」という用語は、少なくとも１つの逆位末端反復領域を更に組み込む発現カセットを指すことを意味する。ｃｅＤＮＡゲノムは、１つ以上のスペーサー領域を更に含み得る。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡゲノムは、ＤＮＡの分子間二重鎖ポリヌクレオチドとして、プラスミド又はウイルスゲノムに組み込まれる。

【0033】

本明細書で使用される場合、「ＤＮＡ調節配列」、「制御エレメント」、及び「調節エレメント」という用語は、本明細書で交換可能に使用され、プロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、ターミネーター、タンパク質分解シグナル等の転写及び翻訳制御配列を指すことを意味し、これらは非コード配列（例えば、ＤＮＡ標的化ＲＮＡ）又はコード配列（例えば、部位特異的修飾ポリペプチド若しくはＣａｓ９／Ｃｓｎ１ポリペプチド）の転写を提供及び／若しくは調節し、かつ／又はコードされたポリペプチドの翻訳を調節する。

【0034】

本明細書で使用される場合、「外因性」という用語は、その天然源以外の細胞中に存在する物質を指すことを意味する。本明細書で使用される「外因性」という用語は、通常見られず、核酸又はポリペプチドをそのような細胞又は生物に導入することが望まれる、人間の手が関与するプロセスによって細胞又は生物等の生物系に導入された核酸（例えば、ポリペプチドをコードする核酸）又はポリペプチドを指し得る。代替的に、「外因性」とは、それが比較的少量で見られ、細胞又は生物における核酸又はポリペプチドの量を増加させること、例えば、異所性発現又はレベルをもたらすことが望まれる、人間の手が関与するプロセスによって細胞又は生物等の生物系に導入された核酸又はポリペプチドを指し得る。これとは対照的に、本明細書で使用される場合、「内因性」という用語は、生物系又は細胞に対して天然である物質を指す。

【0035】

本明細書で使用される場合、「発現」という用語は、ＲＮＡ及びタンパク質、また必要に応じて、例えば、転写、転写処理、翻訳及びタンパク質の折りたたみ、修飾及び処理を含むがこれらに限定されない分泌タンパク質の産生に関与する細胞プロセスを指すことを意味する。本明細書で使用される場合、「発現産物」という語句は、遺伝子（例えば、導入遺伝子）から転写されたＲＮＡ、及び遺伝子から転写されたｍＲＮＡの翻訳によって得られたポリペプチドを含む。

【0036】

本明細書で使用される場合、「発現ベクター」という用語は、ベクター上の転写調節配列に連結された配列からのＲＮＡ又はポリペプチドの発現を指示するベクターを指すことを意味する。発現される配列は、多くの場合、宿主細胞に対して異種であるが、必ずしもそうではない。発現ベクターは、追加のエレメントを含むことができ、例えば、発現ベクターは、２つの複製系を有することができるため、それを２つの生物、例えば発現の場合はヒト細胞、並びにクローニング及び増幅の場合は原核生物宿主で維持することができる。発現ベクターは、組換えベクターであってもよい。

【0037】

本明細書で使用される場合、「発現カセット」及び「発現ユニット」という用語は、互換的に使用され、ＤＮＡベクター、例えば、合成ＡＡＶベクターの導入遺伝子の転写を指示するのに十分なプロモーター又は他のＤＮＡ調節配列に操作可能に連結される異種ＤＮＡ配列を指すことを意味する。好適なプロモーターには、例えば、組織特異的プロモーターが含まれる。プロモーターは、ＡＡＶ起源でもあり得る。

【0038】

本明細書で使用される場合、「隣接する」という用語は、別の核酸配列に対するある核酸配列の相対位置を指すことを意味する。一般に、配列ＡＢＣにおいて、ＢはＡ及びＣに隣接している。配列Ａ×Ｂ×Ｃについても同様である。したがって、隣接する配列は、隣接される配列の前又は後に続くが、隣接される配列と連続している、又はすぐ隣である必要はない。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、隣接するという用語は、直鎖状一本鎖合成ＡＡＶベクターの各末端における末端反復を指す。

【0039】

本明細書で使用される場合、「遺伝子」という用語は、インビトロ又はインビボでの所与のＲＮＡ又はタンパク質の発現に関連する核酸の任意のセグメントを指すために広く使用される。したがって、遺伝子には、発現されたＲＮＡ（通常はポリペプチドコード配列を含む）をコードする領域、及び、多くの場合、それらの発現に必要な調節配列が含まれる。遺伝子は、目的の供給源からのクローニング又は既知の若しくは予測された配列情報からの合成を含む、様々な供給源から得ることができ、特に所望のパラメータを有するように設計された配列を含んでもよい。

【0040】

本明細書で使用される場合、「遺伝性疾患」又は「遺伝性障害」という語句は、特に出生時から存在する状態を含むゲノム中の１つ以上の異常によって部分的又は完全に、直接的又は間接的に引き起こされる疾患又は欠損症を指すことを意味する。異常は、遺伝子における変異、挿入、又は欠失であり得る。異常は、遺伝子のコード配列又はその調節配列に影響を与える可能性がある。

【0041】

本明細書で使用される場合、「異種」という用語は、それぞれ天然の核酸又はタンパク質には見られないヌクレオチド又はポリペプチド配列を指すことを意味する。異種核酸配列は、天然に存在する核酸配列（又はそのバリアント）に（例えば、遺伝子操作によって）連結されて、キメラポリペプチドをコードするキメラヌクレオチド配列を生成し得る。異種核酸配列は、バリアントポリペプチドに（例えば、遺伝子操作によって）連結されて、融合バリアントポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を生成し得る。

【0042】

本明細書で使用される場合、「宿主細胞」という用語は、本開示の核酸治療薬による形質転換、トランスフェクション、形質導入等を受けやすい任意の細胞型を指す。非限定的な例として、宿主細胞は、単離された初代細胞、多能性幹細胞、ＣＤ３４^＋細胞、誘導多能性幹細胞、又は不死化細胞株（例えば、ＨｅｐＧ２細胞）のいずれかであり得る。代替的に、宿主細胞は、組織、器官、又は生物におけるインサイチュ又はインビボの細胞であり得る。更に、宿主細胞は、例えば、哺乳動物対象（例えば、遺伝子療法を必要とするヒト患者）の標的細胞であり得る。

【0043】

本明細書に記載される場合、「誘導性プロモーター」は、誘導因子若しくは誘導剤の存在下、それによって影響される場合、又はそれによって接触される場合に、転写活性を開始又は強化することによって特徴付けられるものを指すことを意味する。本明細書で使用される場合、「誘導因子」又は「誘導剤」は、内因性であり得るか、又は誘導性プロモーターからの転写活性を誘導することにおいて活性であるような方式で投与される、通常は外因性の化合物又はタンパク質であり得る。本明細書の態様及び実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、誘導因子又は誘導剤、すなわち、化学物質、化合物、又はタンパク質は、それ自体が核酸配列の転写又は発現の結果であり得（すなわち、誘導因子は、別の構成成分又はモジュールによって発現される誘導因子タンパク質であり得る）、それ自体が制御下又は誘導性プロモーターであり得る。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、誘導性プロモーターは、リプレッサー等のある特定の薬剤の不在下で誘導される。誘導性プロモーターの例としては、テトラサイクリン、メタロチオニン、エクジソン、哺乳動物ウイルス（例えば、アデノウイルス後期プロモーター、及びマウス乳腺腫瘍ウイルスの長い末端反復（mouse mammary tumor virus long terminal repeat、ＭＭＴＶ－ＬＴＲ））、並びに他のステロイド応答性プロモーター、ラパマイシン応答性プロモーター等が挙げられるが、これらに限定されない。

【0044】

本明細書で使用される場合、「インビトロ」という用語は、細胞抽出物等の無傷膜を有する細胞の存在を必要としないアッセイ及び方法を指すことを意味し、非細胞系、例えば細胞抽出物等の細胞又は細胞系を含まない媒質にプログラム可能な合成生物的回路を導入することを指し得る。

【0045】

本明細書で使用される場合、「インビボ」という用語は、多細胞動物等の生物中又は生物内で起こるアッセイ又はプロセスを指すことを意味する。本明細書に記載される態様のうちのいくつかでは、方法又は使用は、細菌等の単細胞生物が使用されるときに「インビボで」起こると言われ得る。「エクスビボ」という用語は、多細胞動物又は植物、例えば、とりわけ外植片、培養細胞（一次細胞及び細胞株を含む）、形質転換細胞株、及び抽出組織又は細胞（血液細胞を含む）の体外に無傷膜を有する生細胞を使用して実施される方法及び使用を指す。

【0046】

本明細書で使用される場合、「脂質」という用語は、脂肪酸のエステルを含むがこれに限定されない有機化合物の群を指すことを意味し、水中で乏しい可溶性を有するが、概して多くの有機溶媒に可溶性であることを特徴とする。それらは、通常、少なくとも３つのクラス：（１）脂肪及び油並びにワックスを含む「単純脂質」、（２）リン脂質及び糖脂質を含む「複合脂質」、並びに（３）ステロイド等の「誘導脂質」に分類される。リン脂質の代表的な例としては、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン、リソホスファチジルコリン、リソホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン、及びジリノレオイルホスファチジルコリンが挙げられるが、これらに限定されない。スフィンゴ脂質、スフィンゴ糖脂質ファミリー、ジアシルグリセロール、及びβ－アシルオキシ酸等、リンを欠く他の化合物も両親媒性脂質と呼ばれる群に含まれる。追加的に、上記の両親媒性脂質は、トリグリセリド及びステロールを含む他の脂質と混合することができる。

【0047】

本明細書で使用される場合、「封入される」という用語は、核酸（例えば、ＡＳＯ、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｃｅＤＮＡ、ウイルスベクター）等の活性剤又は治療剤を、完全封入、部分封入、又はその両方で提供する脂質粒子を指すことを意味する。好ましい実施形態では、核酸は脂質粒子内に完全に封入される（例えば、核酸を含有する脂質粒子を形成するため）。

【0048】

本明細書で使用される場合、「脂質粒子」又は「脂質ナノ粒子」という用語は、核酸治療薬（ＴＮＡ）等の治療剤を目的の標的部位（例えば、細胞、組織、器官等）に送達するために使用され得る脂質製剤を指すことを意味する（「ＴＮＡ脂質粒子」、「ＴＮＡ脂質ナノ粒子」又は「ＴＮＡ ＬＮＰ」と称される）。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、本発明の脂質粒子は、１つ以上の治療用核酸を含有するＬＮＰであり、ＬＮＰは、典型的には、カチオン性脂質、ステロール、非カチオン性脂質、及び任意選択で、粒子の凝集を防止するＰＥＧ化脂質、更に任意選択で、ＬＮＰを目的の標的部位に送達するための組織特異的標的化リガンドから構成される。他の好ましい実施形態では、治療用核酸等の治療剤を粒子の脂質部分に封入し、それにより酵素分解から保護することができる。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、ＬＮＰは、核酸（例えば、ｃｅＤＮＡ）と、本明細書に記載のカチオン性脂質とともに製剤化されたＬＮＰとを含む。

【0049】

本明細書で使用される場合、「イオン化可能な脂質」という用語は、脂質が生理学的ｐＨ（例えば、ｐＨ７．４）以下で正に帯電し、第２のｐＨ、好ましくは生理学的ｐＨ以上で中性であるように、少なくとも１つのプロトン化可能又は脱プロトン化可能基を有する脂質、例えばカチオン性脂質を指すことを意味する。ｐＨの関数としてのプロトンの付加又は除去は平衡プロセスであり、荷電又は中性脂質への言及は優勢種の性質を指し、全ての脂質が荷電又は中性の形態で存在する必要はないことは、当業者によって理解されるであろう。一般に、カチオン性脂質は、約４～約７の範囲のプロトン化可能な基のｐＫａを有する。したがって、本明細書で使用される「カチオン性」という用語は、本発明の脂質のイオン化（又は荷電）形態及び中性形態の両方を包含する。

【0050】

本明細書で使用される場合、「中性脂質」という用語は、選択されたｐＨで非荷電又は中性の双性イオン形態のいずれかで存在する任意の脂質種を指すことを意味する。生理学的ｐＨでは、そのような脂質には、例えば、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミド、スフィンゴミエリン、セファリン、コレステロール、セレブロシド、及びジアシルグリセロールが含まれる。

【0051】

本明細書で使用される場合、「アニオン性脂質」という用語は、生理学的ｐＨで負に荷電するあらゆる脂質を指す。これらの脂質には、ホスファチジルグリセロール、カルジオリピン、ジアシルホスファチジルセリン、ジアシルホスファチジン酸、Ｎ－ドデカノイルホスファチジルエタノールアミン、Ｎ－スクシニルホスファチジルエタノールアミン、Ｎ－グルタリルホスファチジルエタノールアミン、リジルホスファチジルグリセロール、パルミトイルオレオイルホスファチジルグリセロール（palmitoyloleyolphosphatidylglycerol、ＰＯＰＧ）、及び中性脂質と結合した他のアニオン性修飾基が挙げられるが、これらに限定されない。

【0052】

本明細書で使用される場合、「非カチオン性脂質」という用語は、任意の両親媒性脂質、及び任意の他の中性脂質又はアニオン性脂質を指すことを意味する。

【0053】

本明細書で使用される場合、「有機脂質溶液」という用語は、全体又は一部に脂質を有する有機溶媒を含む組成物を指すことを意味する。

【0054】

本明細書で使用される場合、「リポソーム」という用語は、水性外部から分離された内部水性体積を封入する球形構成で組み立てられた脂質分子を指すことを意味する。リポソームは、少なくとも１つの脂質二層を有する小胞である。リポソームは、典型的に、製剤開発の文脈において薬物／治療薬送達のための担体として使用される。それらは、細胞膜と融合し、その脂質構造を再位置付けすることによって作用して、薬物又は活性製剤成分を送達する。そのような送達のためのリポソーム組成物は、典型的には、リン脂質、特にホスファチジルコリン基を有する化合物で構成されるが、これらの組成物はまた、他の脂質を含んでもよい。

【0055】

本明細書で使用される場合、「局所送達」という用語は、干渉ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）等の活性剤の、生物内の標的部位への直接の送達を指すことを意味する。例えば、薬剤は、腫瘍等の疾患部位、又は炎症部位等の他の標的部位、又は肝臓、心臓、膵臓、腎臓等の標的器官への直接注射によって局所的に送達することができる。

【0056】

本明細書で使用される場合、「ｎｅＤＮＡ」又は「ニックの入ったｃｅＤＮＡ」という用語は、オープンリーディングフレーム（例えば、発現されるプロモーター及び導入遺伝子）の５’上流のステム領域又はスペーサー領域に２～１００塩基対のニック又はギャップを有する閉端ＤＮＡを指すことを意味する。

【0057】

本明細書で使用される場合、「核酸」という用語は、一本鎖又は二本鎖のいずれかの形態で少なくとも２つのヌクレオチド（すなわち、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド）を含むポリマーを指すことを意味し、ＤＮＡ、ＲＮＡ、及びそれらのハイブリッドを含む。ＤＮＡは、例えば、アンチセンス分子、プラスミドＤＮＡ、ＤＮＡ－ＤＮＡ二重鎖、事前に凝縮されたＤＮＡ、ＰＣＲ産物、ベクター（Ｐ１、ＰＡＣ、ＢＡＣ、ＹＡＣ、人工染色体）、発現カセット、キメラ配列、染色体ＤＮＡ、又はこれらの群の誘導体及び組み合わせの形態であり得る。ＤＮＡは、ミニサークル、プラスミド、バクミド、ミニ遺伝子、ミニストリングＤＮＡ（直鎖状の共有結合的に閉じたＤＮＡベクター）、閉端直鎖状二重鎖ＤＮＡ（ＣＥＬｉＤ又はｃｅＤＮＡ）、ｄｏｇｇｙｂｏｎｅ（商標）ＤＮＡ、ダンベル型ＤＮＡ、最小限の免疫学的に定義された遺伝子発現（ＭＩＤＧＥ）－ベクター、ウイルスベクター又は非ウイルスベクターの形態であり得る。ＲＮＡは、低分子干渉ＲＮＡ（small interfering RNA、ｓｉＲＮＡ）、ダイサー基質ｄｓＲＮＡ、低分子ヘアピンＲＮＡ（small hairpin RNA、ｓｈＲＮＡ）、非対称干渉ＲＮＡ（asymmetrical interfering RNA、ａｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（microRNA、ｍｉＲＮＡ）、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ウイルスＲＮＡ（viral RNA、ｖＲＮＡ）、及びそれらの組み合わせの形態であり得る。核酸としては、既知のヌクレオチド類似体又は修飾型骨格残基若しくは連結を含有する核酸が挙げられ、これらは、合成、天然に存在する、及び天然に存在しないものであり、参照核酸と同様の結合特性を有する。そのような類似体及び／又は修飾残基の例としては、ホスホロチオエート、ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー（モルホリノ）、ホスホルアミデート、メチルホスホネート、キラルメチルホスホネート、２’－Ｏ－メチルリボヌクレオチド、ロックド核酸（ＬＮＡ（商標））、及びペプチド核酸（ＰＮＡ）が挙げられる。具体的に限定されない限り、この用語は、参照核酸と同様の結合特性を有する天然ヌクレオチドの既知の類似体を含有する核酸を包含する。別途明記しない限り、特定の核酸配列はまた、その保存的修飾型バリアント（例えば、縮重コドン置換）、対立遺伝子、オルソログ、ＳＮＰ、及び相補的配列、同様に、明示的に示された配列を暗黙的に包含する。

【0058】

本明細書で使用される場合、「核酸治療薬」、「治療用核酸」及び「ＴＮＡ」という語句は、交換可能に使用され、疾患又は障害を治療するための治療剤の活性成分として核酸を使用する治療の任意のモダリティを指す。本明細書で使用される場合、これらの語句は、ＲＮＡベースの治療薬及びＤＮＡベースの治療薬を指す。ＲＮＡベースの治療薬の非限定的な例としては、ｍＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ及びオリゴヌクレオチド、リボザイム、アプタマー、干渉ＲＮＡ（interfering RNA、ＲＮＡｉ）、ダイサー基質ｄｓＲＮＡ、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、非対称干渉ＲＮＡ（ａｉＲＮＡ）、及びマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）が挙げられる。ＤＮＡベースの治療薬の非限定的な例としては、ミニサークルＤＮＡ、ミニ遺伝子、ウイルスＤＮＡ（例えば、レンチウイルス若しくはＡＡＶゲノム）又は非ウイルスＤＮＡベクター、閉端直鎖状二重鎖ＤＮＡ（ｃｅＤＮＡ／ＣＥＬｉＤ）、プラスミド、バクミド、ｄｏｇｇｙｂｏｎｅ（商標）ＤＮＡベクター、最小限の免疫学的に定義された遺伝子発現（ＭＩＤＧＥ）－ベクター、非ウイルスミニストリングＤＮＡベクター（直鎖状の共有結合的に閉じたＤＮＡベクター）、及びダンベル型ＤＮＡ最小ベクター（「ダンベルＤＮＡ」）が挙げられる。本明細書で使用される場合、「ＴＮＡ ＬＮＰ」という用語は、上記のように、ＴＮＡの少なくとも１つを含有する脂質粒子を指す。

【0059】

本明細書で使用される場合、「ヌクレオチド」は、糖デオキシリボース（ＤＮＡ）又はリボース（ＲＮＡ）、塩基、及びリン酸基を含む。ヌクレオチドは、リン酸基を介してともに連結している。

【0060】

本明細書で使用される場合、「操作可能に連結された」とは、そのように記載された構成要素が、それらが意図された様式で機能することを許可する関係にある並列を指すことを意味する。例えば、プロモーターがその転写又は発現に影響を与える場合、プロモーターは、コード配列に操作可能に連結されている。プロモーターは、それが調節する核酸配列の発現を駆動する、又は転写を駆動すると言うことができる。「操作可能に連結された」、「作動可能に位置付けられた」、「作動可能に連結された」、「制御下」、及び「転写制御下」という語句は、プロモーターが、核酸配列に関して正しい機能的位置及び／又は配向にあり、その配列の転写開始及び／又は発現を制御するように調節することを示す。本明細書で使用される場合、「逆位プロモーター」は、核酸配列が逆配向にあるプロモーターを指し、それによりコード鎖であったものは、今は非コード鎖であり、逆も同様である。逆位プロモーター配列を様々な実施形態で使用して、スイッチの状態を調節することができる。加えて、様々な実施形態では、プロモーターをエンハンサーと併せて使用することができる。

【0061】

本明細書で使用される場合、「プロモーター」という用語は、タンパク質又はＲＮＡをコードする異種標的遺伝子であり得る、核酸配列の転写を駆動することによって、別の核酸配列の発現を調節する任意の核酸配列を指すことを意味する。プロモーターは、構成的、誘導性、抑制性、組織特異性、又はそれらの任意の組み合わせであり得る。プロモーターは、核酸配列の残りの転写の開始及び速度が制御される、核酸配列の制御領域である。プロモーターはまた、ＲＮＡポリメラーゼ及び他の転写因子等の調節タンパク質及び分子が結合し得る、遺伝子エレメントを含有し得る。プロモーター配列内では、転写開始部位、同様に、ＲＮＡポリメラーゼの結合に関与するタンパク質結合ドメインが見出されるであろう。真核生物プロモーターは、必ずしもそうではないが、多くの場合、「ＴＡＴＡ」ボックス及び「ＣＡＴ」ボックスを含有する。誘導性プロモーターを含む様々なプロモーターを使用して、本明細書に開示される合成ＡＡＶベクター中の導入遺伝子の発現を駆動することができる。プロモーター配列は、その３’末端で転写開始部位によって結合され、バックグラウンドより上で検出可能なレベルで転写を開始するのに必要な最小数の塩基又はエレメントを含むように上流（５’配向）に伸びる。

【0062】

プロモーターは、所与の遺伝子又は配列のコードセグメント及び／又はエキソンの上流に位置する５’非コード配列を単離することによって取得され得る、遺伝子又は配列と天然に関連するものであり得る。このようなプロモーターは、「内因性」と呼ばれ得る。同様に、本明細書の態様及び実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、エンハンサーは、その配列の下流又は上流のいずれかに位置する、核酸配列と天然に関連するものであり得る。本明細書の態様及び実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、コード核酸セグメントは、「組換えプロモーター」又は「異種プロモーター」の制御下で位置付けられ、これらの両方は、その自然環境において操作可能に連結されたコードされた核酸配列と通常は関連しないプロモーターを指す。同様に、「組換え又は異種エンハンサー」は、その自然環境において所与の核酸配列と通常は関連しないエンハンサーを指す。そのようなプロモーター又はエンハンサーは、他の遺伝子のプロモーター又はエンハンサー、任意の他の原核、ウイルス、又は真核細胞から単離されたプロモーター又はエンハンサー、及び「天然に存在」しない合成プロモーター又はエンハンサーを含み得、すなわち、異なる転写調節領域の異なるエレメント、及び／又は当該技術分野において既知である遺伝子操作の方法を通じて発現を変更する変異を含み得る。プロモーター及びエンハンサーの核酸配列を合成的に産生することに加えて、プロモーター配列は、本明細書に開示される合成生物的回路及びモジュールに関して、ＰＣＲを含む組換えクローニング及び／又は核酸増幅技術を使用して産生され得る（例えば、米国特許第４，６８３，２０２号、米国特許第５，９２８，９０６号を参照されたく、各々はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）。更に、ミトコンドリア、クロロプラスト等の非核性細胞小器官内の配列の転写及び／又は発現を配向する制御配列が同様に用いられ得ることが企図される。

【0063】

本明細書で使用される場合、「Ｒｅｐ結合部位」（Rep binding site、「ＲＢＳ」）及び「Ｒｅｐ結合エレメント」（Rep binding element、「ＲＢＥ」）は、交換可能に使用され、Ｒｅｐタンパク質（例えば、ＡＡＶ Ｒｅｐ７８又はＡＡＶ Ｒｅｐ６８）の結合部位を指すことを意味し、Ｒｅｐタンパク質による結合時に、Ｒｅｐタンパク質が、ＲＢＳを組み込む配列上でその部位特異的エンドヌクレアーゼ活性を実施することを可能にする。ＲＢＳ配列及びその逆相補体は、一緒に単一ＲＢＳを形成する。ＲＢＳ配列は、当該技術分野において周知であり、例えば、ＡＡＶ２において同定されたＲＢＳ配列である５’－ＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣ－３’を含む。

【0064】

本明細書で使用される場合、「組換えベクター」という語句は、異種核酸配列を含むベクター、又はインビボで発現することができる「導入遺伝子」を指すことを意味する。本明細書に記載されるベクターは、本明細書の態様及び実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、他の好適な組成物及び療法と組み合わせることができることを理解されたい。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、ベクターは、エピソームである。好適なエピソームベクターの使用は、対象における目的のヌクレオチドを高コピー数の染色体外ＤＮＡに維持し、それによって染色体組み込みの潜在的な影響を排除する手段を提供する。

【0065】

本明細書で使用される場合、「レポーター」という用語は、検出可能な読み出しを提供するために使用可能なタンパク質を指すことを意味する。レポーターは、一般に、蛍光、色、又は発光等の測定可能なシグナルを産生する。レポータータンパク質コード配列は、細胞又は生物中の存在が容易に観察されるタンパク質をコードする。

【0066】

本明細書で使用される場合、「センス」及び「アンチセンス」という用語は、ポリヌクレオチド上の構造エレメントの配向を指すことを意味する。エレメントのセンスバージョン及びアンチセンスバージョンは、互いの逆相補体である。

【0067】

本明細書で使用される場合、「配列同一性」という用語は、２つのヌクレオチド配列間の関連性を指すことを意味する。本開示の目的のために、２つのデオキシリボヌクレオチド配列間の配列同一性の程度は、ＥＭＢＯＳＳパッケージのＮｅｅｄｌｅプログラム（ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｏｐｅｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｓｕｉｔｅ，Ｒｉｃｅ ｅｔ ａｌ．，２０００、上記）、好ましくはバージョン３．０．０以降において実装されるように、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０、上記）を使用して決定される。使用される任意選択のパラメータは、ギャップオープンペナルティ１０、ギャップ拡張ペナルティ０．５、及びＥＤＮＡＦＵＬＬ（ＮＣＢＩ ＮＵＣ４．４のＥＭＢＯＳＳバージョン）置換マトリックスである。「最長同一性」とラベル付けされたＮｅｅｄｌｅの出力（－ｎｏｂｒｉｅｆオプションを使用して取得される）は、同一性パーセントとして使用され、次のように計算される：（同一のデオキシリボヌクレオチド×１００）／（アラインメントの長さ－アラインメントにおけるギャップの総数）。アラインメントの長さは、好ましくは少なくとも１０ヌクレオチド、好ましくは少なくとも２５ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも５０ヌクレオチド、最も好ましくは少なくとも１００ヌクレオチドである。

【0068】

本明細書で使用される場合、「スペーサー領域」という用語は、ベクター又はゲノム内の機能的エレメントを分離する介在配列を指すことを意味する。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、ＡＡＶスペーサー領域は、最適機能性のための所望の処理で２つの機能的エレメントを保持する。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、スペーサー領域は、ベクター又はゲノムの遺伝的安定性を提供するか、又は増大させる。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、スペーサー領域は、クローニング部位及び塩基対の設計番号のギャップに便利な位置を提供することによって、ゲノムの容易な遺伝子操作を促進する。例えば、ある特定の態様では、いくつかの制限エンドヌクレアーゼ部位を含むオリゴヌクレオチド「ポリリンカー」若しくは「ポリクローニング部位」、又は既知のタンパク質（例えば、転写因子）結合部位を有しないように設計された非オープンリーディングフレーム配列をベクター又はゲノム中に位置付けて、シス作用性因子を分離することができ、例えば、６ｍｅｒ、１２ｍｅｒ、１８ｍｅｒ、２４ｍｅｒ、４８ｍｅｒ、８６ｍｅｒ、１７６ｍｅｒ等を挿入する。

【0069】

本明細書で使用される場合、「対象」という用語は、本発明による治療用核酸での予防的治療を含む治療が提供される、ヒト又は動物を指すことを意味する。通常、動物は、限定されないが、霊長類、げっ歯類、飼育動物、又は狩猟動物等の脊椎動物である。霊長類としては、チンパンジー、カニクイザル、クモザル、及びマカク、例えば、アカゲザルが挙げられるが、これらに限定されない。げっ歯類としては、マウス、ラット、ウッドチャック、フェレット、ウサギ、及びハムスターが挙げられる。飼育動物及び狩猟動物としては、ウシ、ウマ、ブタ、シカ、バイソン、バッファロー、ネコ種、例えば、飼いネコ、イヌ種、例えば、イヌ、キツネ、オオカミ、トリ種、例えば、ニワトリ、エミュー、ダチョウ、並びに魚、例えば、マス、ナマズ、及びサケが挙げられるが、これらに限定されない。本明細書に記載される態様のある特定の実施形態では、対象は、哺乳動物、例えば、霊長類又はヒトである。対象は、男性又は女性であり得る。追加的に、対象は、幼児又は子供であり得る。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、対象は、新生児又は胎児対象であり得、例えば、対象は、子宮内に存在する。好ましくは、対象は、哺乳動物である。哺乳動物は、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、又はウシであり得るが、これらの例に限定されない。ヒト以外の哺乳動物は、疾患及び障害の動物モデルを代表する対象として有利に使用され得る。加えて、本明細書に記載される方法及び組成物は、飼育動物及び／又はペットに使用され得る。ヒト対象は、任意の年齢、性別、人種、又は民族群、例えば、コーカサス人（白人）、アジア人、アフリカ人、黒人、アフリカ系アメリカ人、アフリカ系ヨーロッパ人、ラテンアメリカ系、中東系等であり得る。本明細書の態様及び実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、対象は、臨床設定において患者又は他の対象であり得る。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、対象は、治療を既に受けている。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、対象は、胚、胎児、新生児、幼児、子供、青年、又は成人である。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、対象は、ヒト胎児、ヒト新生児、ヒト幼児、ヒト子供、ヒト青年、又はヒト成人である。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、対象は、動物胚、又は非ヒト胚若しくは非ヒト霊長類胚である。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、対象は、ヒト胚である。

【0070】

本明細書で使用される場合、「必要とする対象」という語句は、語句の文脈及び使用法が別段の指示をしない限り、（ｉ）記載された発明に従ってＴＮＡ脂質粒子（若しくはＴＮＡ脂質粒子を含む医薬組成物）を投与される予定であり、（ｉｉ）記載された本発明に従ってＴＮＡ脂質粒子（若しくはＴＮＡ脂質粒子を含む医薬組成物）を受けているか、又は（ｉｉｉ）記載された発明に従ってＴＮＡ脂質粒子（若しくはＴＮＡ脂質粒子を含む薬学的組成物）を受けた、対象を指す。

【0071】

本明細書で使用される場合、「抑制する」、「減少する」、「妨害する」、「阻害する」及び／又は「低減する」という用語（並びに同様の用語）は、一般に、天然、予想若しくは平均に対して、又は対照条件に対して、直接的又は間接的に、濃度、レベル、機能、活性、又は挙動を低減する行為を指す。

【0072】

本明細書で使用される場合、「合成ＡＡＶベクター」及び「ＡＡＶベクターの合成産生」という用語は、完全に無細胞環境でのＡＡＶベクター及びその合成産生方法を指すことを意味する。

【0073】

本明細書で使用される場合、「全身送達」という用語は、生物内での干渉ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）等の活性剤の広範な生体内分布をもたらす脂質粒子の送達を指すことを意味する。投与技術によっては、特定の薬剤の全身送達にいたることもあれば、そうでないものもある。全身送達とは、有用な量、好ましくは治療量の薬剤が身体のほとんどの部分にさらされることを意味する。広範な生体内分布を得るには、一般に、薬剤が、投与部位より遠位の疾患部位に到達する前に（初回通過器官（肝臓、肺等）によって、又は急速な非特異的細胞結合によって）急速に分解又は排出されないような血液寿命が必要である。脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）の全身送達は、例えば静脈内、皮下、及び腹腔内を含む、当技術分野で既知の任意の手段によることができる。好ましい実施形態では、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）の全身送達は、静脈内送達による。

【0074】

本明細書で使用される場合、「末端分解部位」及び「ＴＲＳ」という用語は、本明細書で交換可能に使用され、Ｒｅｐが、細胞ＤＮＡポリメラーゼ、例えばＤＮＡ ｐｏｌデルタ又はＤＮＡ ｐｏｌイプシロンを介してＤＮＡ伸長の基質として役立つ３’－ＯＨを生成する５’チミジンとのチロシン－ホスホジエステル結合を形成する領域を指すことを意味される。代替的に、Ｒｅｐ－チミジン複合体は、配位ライゲーション反応に関与し得る。

【0075】

本明細書で使用される場合、活性剤（例えば、本明細書に記載されるＴＮＡ脂質粒子）の「治療量」、「治療有効量」、「効果的な量」、「有効量」又は「薬学的有効量」という用語は交換可能に使用され、治療の意図された利益又は効果、例えば、治療用核酸の非存在下で検出される発現レベルと比較した標的配列の発現の阻害を提供するのに十分な量を指す。標的遺伝子又は標的配列の発現を測定するための好適なアッセイは、例えば、ドットブロット、ノーザンブロット、インサイチュハイブリダイゼーション、ＥＬＩＳＡ、免疫沈降、酵素機能、同様に当業者に既知の表現型アッセイ等の、当業者に既知の技法を使用するタンパク質又はＲＮＡレベルの検査を含む。投与量レベルは、傷害の種類、年齢、体重、性別、患者の病状、病状の重症度、投与経路、及び用いられる特定の活性剤を含む、多様な因子に基づく。したがって、投与計画は、大きく異なる可能性があるが、標準的な方法を使用して医師によって常套的に決定され得る。追加的に、「治療量」、「治療有効量」及び「薬学的有効量」という用語は、記載された本発明の組成物の予防的（prophylactic）又は予防的（preventative）量を含む。記載された発明の予防的（prophylactic）又は予防的（preventative）用途において、医薬組成物又は薬剤は、疾患、障害又は状態の生化学的、組織学的及び／又は行動症状、その合併症、並びに疾患、障害又は状態の発症中に現れる中間の病理学的表現型を含む、疾患、障害又は状態に罹患しやすい患者、又はそうでなければそのリスクがある患者に、リスクを排除若しくは低減するか、重症度を減少させるか、又は疾患、障害若しくは状態の発症を遅らせるのに十分な量で投与される。一態様では、「治療量」、「有効量」、「治療有効量」、及び「薬学的有効量」は、記載の本発明の組成物の予防的（prophylactic）又は予防的（preventative）量を含まない。いくつかの医学的判断によれば、最大用量、すなわち最高の安全用量を使用することが一般に好ましい。「用量」及び「投与量」という用語は、本明細書では交換可能に使用される。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一態様では、「治療量」、「治療有効量」及び「薬学的有効量」は、非予防的（non-prophylactic）又は非予防的（non-preventative）用途を指す。

【0076】

本明細書で使用される場合、「治療効果」という用語は、治療の結果を指し、その結果は、望ましくかつ有益であると判断される。治療効果としては、直接的又は間接的に、疾患症状の阻止、低減、又は排除を挙げることができる。治療効果としてはまた、直接的又は間接的に、疾患症状の進行の阻止、低減、又は排除を挙げることができる。

【0077】

本明細書に記載される任意の治療剤について、治療有効量は、予備的なインビトロ研究及び／又は動物モデルから最初に決定することができる。治療有効用量はまた、ヒトのデータから決定することができる。適用される用量は、投与された化合物の相対的な生物学的利用能及び効力に基づいて調整することができる。上記の方法及び他の周知の方法に基づいて最大の効力を達成するように用量を調整することは、当業者の能力の範囲内である。参照により本明細書に組み込まれる、Ｇｏｏｄｍａｎ ａｎｄ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，１０ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＭｃＧｒａｗ－Ｈｉｌｌ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）（２００１）の第１章に見出され得る治療有効性を決定するための一般原則を以下に要約する。

【0078】

薬物動態学的原理は、許容できない副作用を最小限に抑えながら、望ましい程度の治療効果を得るために投与計画を変更するための基礎を提供する。薬物の血漿濃度を測定でき、治療濃度域に関連している状況では、投与量の変更に関する追加のガイダンスを入手することができる。

【0079】

本明細書で使用される場合、「治療する」、「治療すること」、及び／又は「治療」という用語は、状態の進行を抑制する、阻害する、遅らせる、若しくは逆転させる、状態の臨床症状を改善する、又は臨床症状の出現を防ぐ、有益な若しくは望ましい臨床結果を得ることを含む。治療することは、以下：（ａ）障害の重症度を低減すること、（ｂ）治療される障害に特徴的な症状の発症を制限すること、（ｃ）治療される障害に特徴的な症状の悪化を制限すること、（ｄ）以前に障害を有していた患者において障害の再発を制限すること、及び（ｅ）以前に障害に対して無症候性であった患者において症状の再発を制限すること、のうちの１つ以上を達成することを更に指す。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一態様では、「治療する」、「治療すること」、及び／又は「治療」という用語は、状態の進行を抑制する、阻害する、遅らせる、若しくは逆行させること、又は状態の臨床症状を改善することを含む。

【0080】

薬理学的及び／又は生理学的効果等の有益な又は所望の臨床結果は、疾患、障害又は状態の素因を有する可能性があるが、疾患の症状をまだ経験していないか、若しくは呈していない対象において疾患、障害又は状態が発生するのを防ぐこと（予防的治療）、疾患、障害又は状態の症状の緩和、疾患、障害又は状態の程度の減少、疾患、障害又は状態の安定化（すなわち、悪化させない）、疾患、障害又は状態の蔓延を防ぐこと、疾患、障害又は状態の進行を遅らせる又は遅くすること、疾患、障害又は状態の改善又は軽減、及びそれらの組み合わせ、同様に治療を受けていない場合に予想される生存と比較して生存を延長することを含むが、これらに限定されない。

【0081】

本明細書で使用される場合、「ベクター」又は「発現ベクター」という用語は、別のＤＮＡセグメント、すなわち、「インサート」、「導入遺伝子」、又は「発現カセット」が、細胞において結合されたセグメント（「発現カセット」）の発現又は複製をもたらすために、結合され得るプラスミド、バクミド、ファージ、ウイルス、ビリオン、又はコスミド等のレプリコンを指すことを意味する。ベクターは、宿主細胞への送達のために、又は異なる宿主細胞間の移動のために設計された核酸構築物であり得る。本明細書で使用される場合、ベクターは、最終的な形態でウイルス起源、又は非ウイルス起源であり得る。しかしながら、本開示の目的のために、「ベクター」は、一般に、合成ＡＡＶベクター又はニックの入ったｃｅＤＮＡベクターを指す。したがって、「ベクター」という用語は、適切な制御エレメントと関連する場合に複製することができ、遺伝子配列を細胞に移すことができる任意の遺伝的エレメントを包含する。本明細書の態様及び実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、ベクターは、組換えベクター又は発現ベクターであり得る。

【0082】

本明細書に開示される本発明の代替エレメント又は実施形態の群化は、限定として解釈されるべきではない。各群のメンバーは、個別に、又は群の他のメンバー又は本明細書で見られる他のエレメントとの任意の組み合わせで参照及び主張することができる。群の１つ以上のメンバーは、利便性及び／又は特許性の理由から、群に含まれるか、又は群から削除することができる。そのような任意の包含又は削除が発生した場合、本明細書では、明細書が修正された群を含むとみなされ、したがって添付の特許請求の範囲で使用されている全てのマーカッシュ群の記述を満たす。

【0083】

態様のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、本明細書に記載される開示は、人間のクローン化プロセス、人間の生殖細胞系列の遺伝的同一性を修正するプロセス、産業若しくは商業目的でのヒト胚の使用、又は人間若しくは動物にいかなる実質的な医学的利益ももたらすことなく苦しみを引き起こす可能性が高い動物、及びそのようなプロセスから生じる動物の遺伝的同一性を修正するためのプロセスに関係しない。

【0084】

本明細書では、本発明の様々な態様の説明内で他の用語が定義されている。

【0085】

ＩＩ．脂質
第１の実施形態では、式Ｉで表されるカチオン性脂質、

【0086】

【化2】

又はその薬学的に許容される塩であって、式中、
Ｒ’が、存在しないか、水素、又はＣ_１～Ｃ_３アルキルであるが、但し、Ｒ’が水素又はＣ_１～Ｃ_３アルキルである場合、Ｒ’、Ｒ^１、及びＲ^２が全て結合している窒素原子が、プロトン化されていることを条件とし、
Ｒ^１及びＲ^２が、各々独立して、水素又はＣ_１～Ｃ_３アルキルであり、
Ｒ^３が、Ｃ_３～Ｃ_１０アルキレン又はＣ_３～Ｃ_１０アルケニレンであり、
Ｒ^４が、Ｃ_１～Ｃ_１６非分岐アルキル、Ｃ_２～Ｃ_１６非分岐アルケニル、又は

【0087】

【化3】

であり、式中、
Ｒ^４ａ及びＲ^４ｂが、各々独立して、Ｃ_１～Ｃ_１６非分岐アルキル又はＣ_２～Ｃ_１６非分岐アルケニルであり、
Ｒ^５が、存在しないか、Ｃ_１～Ｃ_６アルキレン、又はＣ_２～Ｃ_６アルケニレンであり、
Ｒ^６ａ及びＲ^６ｂが、各々独立して、Ｃ_７～Ｃ_１４アルキル又はＣ_７～Ｃ_１４アルケニルであり、
Ｘが、－ＯＣ（＝Ｏ）－、－ＳＣ（＝Ｏ）－、－ＯＣ（＝Ｓ）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｓ－、－Ｓ－Ｓ－、－Ｃ（Ｒ^ａ）＝Ｎ－、
－Ｎ＝Ｃ（Ｒ^ａ）－、－Ｃ（Ｒ^ａ）＝ＮＯ－、－Ｏ－Ｎ＝Ｃ（Ｒ^ａ）－、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ^ａ－、－ＮＲ^ａＣ（＝Ｏ）－、－ＮＲ^ａＣ（＝Ｏ）ＮＲ^ａ－、
－ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ－、－ＯＳｉ（Ｒ^ａ）_２Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）（ＣＲ^ａ _２）Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、又はＯＣ（＝Ｏ）（ＣＲ^ａ _２）Ｃ（＝Ｏ）－であり、式中、
Ｒ^ａが、各出現に対して、独立して、水素又はＣ_１～Ｃ_６アルキルであり、
ｎが、１、２、３、４、５、及び６から選択される整数である、カチオン性脂質、又はその薬学的に許容される塩が、提供される。

【0088】

第２の実施形態では、第１の実施形態に記載のカチオン性脂質、又はその薬学的に許容される塩において、Ｘは、－ＯＣ（＝Ｏ）－、－ＳＣ（＝Ｏ）－、－ＯＣ（＝Ｓ）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｓ－、又は－Ｓ－Ｓ－であり、他の全ての残りの変数が、式Ｉ又は第１の実施形態について記載されているとおりである。

【0089】

第３の実施形態では、本開示のカチオン性脂質は、式ＩＩで表されるか、

【0090】

【化4】

又はその薬学的に許容される塩であり、式中、ｎが、１、２、３、及び４から選択される整数であり、他の全ての残りの変数が、式Ｉ又は第１又は第２の実施形態に記載されているとおりである。代替的な第３の実施形態では、ｎが、１、２、及び３から選択される整数であり、他の全ての残りの変数が、式Ｉ又は第１又は第２の実施形態に記載されているとおりである。

【0091】

第４の実施形態では、本開示のカチオン性脂質は、式ＩＩＩで表されるか、

【0092】

【化5】

又はその薬学的に許容される塩であり、他の全ての残りの変数が、式Ｉ、式ＩＩ、又は第１～第３の実施形態のいずれか１つについて記載されているとおりである。

【0093】

第５の実施形態では、第１の実施形態に記載のカチオン性脂質、又はその薬学的に許容される塩において、Ｒ^１及びＲ^２が、各々独立して、水素、若しくはＣ_１～Ｃ_２アルキル、若しくはＣ_２～Ｃ_３アルケニルであるか、又はＲ’、Ｒ^１、及びＲ^２が、各々独立して、水素、Ｃ_１～Ｃ_２アルキルであり、他の全ての残りの変数が、式Ｉ、式ＩＩ、又は第１～第４の実施形態のいずれか１つについて記載されているとおりである。

【0094】

第６の実施形態では、本開示のカチオン性脂質は、式ＩＶで表されるか、

【0095】

【化6】

又はその薬学的に許容される塩であり、他の全ての残りの変数が、式Ｉ、式ＩＩ、式ＩＩＩ又は第１～第５の実施形態のいずれか１つについて記載されているとおりである。

【0096】

第７の実施形態では、式Ｉ、式ＩＩ、式ＩＩＩ、式ＩＶ、若しくは第１～第６の実施形態のいずれか１つに記載のカチオン性脂質、又はその薬学的に許容される塩において、Ｒ^５が、存在しないか、若しくは_１～Ｃ_８アルキレンであるか、又はＲ^５が、存在しないか、Ｃ_１～Ｃ_６アルキレン、若しくはＣ_２～Ｃ_６アルケニレンであるか、又はＲ^５が、存在しないか、Ｃ_１～Ｃ_４アルキレン、若しくはＣ_２～Ｃ_４アルケニレンであるか、又はＲ^５が存在しないか、又はＲ^５が、Ｃ_６アルキレン、Ｃ_５アルキレン、Ｃ_４アルキレン、Ｃ_３アルキレン、Ｃ_２アルキレン、Ｃ_１アルキレン、Ｃ_６アルケニレン、Ｃ_５アルケニレン、Ｃ_４アルケニレン、Ｃ_３アルケニレン、若しくはＣ_２アルケニレンであり、他の全ての残りの変数が、式Ｉ、式ＩＩ、式ＩＩＩ、式ＩＶ、又は第１～第６の実施形態のいずれか１つについて記載されているとおりである。

【0097】

第８の実施形態では、本開示のカチオン性脂質は、式Ｖで表されるか、

【0098】

【化7】

又はその薬学的に許容される塩であり、他の全ての残りの変数が、式Ｉ、式ＩＩ、式ＩＩＩ、式ＩＶ又は第１～第７の実施形態のいずれか１つについて記載されているとおりである。

【0099】

第９の実施形態では、式Ｉ、式ＩＩ、式ＩＩＩ、式ＩＶ、式Ｖ、若しくは第１～第８の実施形態のいずれか１つに記載のカチオン性脂質、又はその薬学的に許容される塩において、Ｒ^４が、Ｃ_１～Ｃ_１４非分岐アルキル、Ｃ_２～Ｃ_１４非分岐アルケニル、若しくは

【0100】

【化8】

であり、式中、Ｒ^４ａ及びＲ^４ｂが、各々独立して、Ｃ_１～Ｃ_１２非分岐アルキルあるいはＣ_２～Ｃ_１２非分岐アルケニルであるか、又はＲ^４が、Ｃ_２～Ｃ_１２非分岐アルキル若しくはＣ_２～Ｃ_１２非分岐アルケニルであるか、又はＲ^４が、Ｃ_５～Ｃ_１２非分岐アルキル若しくはＣ_５～Ｃ_１２非分岐アルケニルであるか、又はＲ^４が、Ｃ_１６非分岐アルキル、Ｃ_１５非分岐アルキル、Ｃ_１４非分岐アルキル、Ｃ_１３非分岐アルキル、Ｃ_１２非分岐アルキル、Ｃ_１１非分岐アルキル、Ｃ_１０非分岐アルキル、Ｃ_９非分岐アルキル、Ｃ_８非分岐アルキル、Ｃ_７非分岐アルキル、Ｃ_６非分岐アルキル、Ｃ_５非分岐アルキル、Ｃ_４非分岐アルキル、Ｃ_３非分岐アルキル、Ｃ_２非分岐アルキル、Ｃ_１非分岐アルキル、Ｃ_１６非分岐アルケニル、Ｃ_１５非分岐アルケニル、Ｃ_１４非分岐アルケニル、Ｃ_１３非分岐アルケニル、Ｃ_１２非分岐アルケニル、Ｃ_１１非分岐アルケニル、Ｃ_１０非分岐アルケニル、Ｃ_９非分岐アルケニル、Ｃ_８非分岐アルケニル、Ｃ_７非分岐アルケニル、Ｃ_６非分岐アルケニル、Ｃ_５非分岐アルケニル、Ｃ_４非分岐アルケニル、Ｃ_３非分岐アルケニル、若しくはＣ_２アルケニルであるか、又はＲ^４が、

【0101】

【化9】

であり、Ｒ^４ａ及びＲ^４ｂが、それぞれ独立して、Ｃ_２～Ｃ_１０非分岐アルキル若しくはＣ_２～Ｃ_１０非分岐アルケニルであるか、又はＲ^４が、

【0102】

【化10】

であり、式中、Ｒ^４ａ及びＲ^４ｂが、それぞれ独立して、Ｃ_１６非分岐アルキル、Ｃ_１５非分岐アルキル、Ｃ_１４非分岐アルキル、Ｃ_１３非分岐アルキル、Ｃ_１２非分岐アルキル、Ｃ_１１非分岐アルキル、Ｃ_１０非分岐アルキル、Ｃ_９非分岐アルキル、Ｃ_８非分岐アルキル、Ｃ_７非分岐アルキル、Ｃ_６非分岐アルキル、Ｃ_５非分岐アルキル、Ｃ_４非分岐アルキル、Ｃ_３非分岐アルキル、Ｃ_２アルキル、Ｃ_１アルキル、Ｃ_１６非分岐アルケニル、Ｃ_１５非分岐アルケニル、Ｃ_１４非分岐アルケニル、Ｃ_１３非分岐アルケニル、Ｃ_１２非分岐アルケニル、Ｃ_１１非分岐アルケニル、Ｃ_１０非分岐アルケニル、Ｃ_９非分岐アルケニル、Ｃ_８非分岐アルケニル、Ｃ_７非分岐アルケニル、Ｃ_６非分岐アルケニル、Ｃ_５非分岐アルケニル、Ｃ_４非分岐アルケニル、Ｃ_３非分岐アルケニル、若しくはＣ_２アルケニルであり、全ての他の残りの変数が、式Ｉ、式ＩＩ、式ＩＩＩ、式ＩＶ、式Ｖ又は実施形態１～８のいずれか１つについて記載されているとおりである。

【0103】

第１０の実施形態では、式Ｉ、式ＩＩ、式ＩＩＩ、式ＩＶ、式Ｖ、若しくは第１～第９の実施形態のいずれか１つに記載のカチオン性脂質、又はその薬学的に許容される塩において、Ｒ^３が、Ｃ_３～Ｃ_８アルキレンあるいはＣ_３～Ｃ_８アルケニレン、Ｃ_３～Ｃ_７アルキレンあるいはＣ_３～Ｃ_７アルケニレン、若しくはＣ_３～Ｃ_５アルキレンあるいはＣ_３～Ｃ_５アルケニレンであるか、又はＲ^３が、Ｃ_８アルキレン、あるいはＣ_７アルキレン、あるいはＣ_６アルキレン、あるいはＣ_５アルキレン、あるいはＣ_４アルキレン、あるいはＣ_３アルキレン、あるいはＣ_１アルキレン、若しくはＣ_８アルケニレン、あるいはＣ_７アルケニレン、あるいはＣ_６アルケニレン、あるいはＣ_５アルケニレン、あるいはＣ_４アルケニレン、あるいはＣ_３アルケニレンであり、他の全ての残りの変数が、式Ｉ、式ＩＩ、式ＩＩＩ、式ＩＶ、式Ｖ、又は第１～第９の実施形態のいずれか１つについて記載されているとおりである。

【0104】

第１１の実施形態では、式Ｉ、式ＩＩ、式ＩＩＩ、式ＩＶ、式Ｖ、若しくは第１～第１０の実施形態のいずれか１つに記載のカチオン性脂質、又はその薬学的に許容される塩において、Ｒ^６ａ及びＲ^６ｂが、各々独立して、Ｃ_７～Ｃ_１２アルキル若しくはＣ_７～Ｃ_１２アルケニルであるか、又はＲ^６ａ及びＲ^６ｂが、各々独立して、Ｃ_８～Ｃ_１０アルキル若しくはＣ_８～Ｃ_１０アルケニルであるか、又はＲ^６ａ及びＲ^６ｂが、各々独立して、Ｃ_１２アルキル、Ｃ_１１アルキル、Ｃ_１０アルキル、Ｃ_９アルキル、Ｃ_８アルキル、Ｃ_７アルキル、Ｃ_１２アルケニル、Ｃ_１１アルケニル、Ｃ_１０アルケニル、Ｃ_９アルケニル、Ｃ_８アルケニル、若しくはＣ_７アルケニルであり、他の全ての残りの変数が、式Ｉ、式ＩＩ、式ＩＩＩ、式ＩＶ、式Ｖ、又は第１～第１０の実施形態のいずれか１つについて記載されているとおりである。

【0105】

第１２の実施形態では、式Ｉ、式ＩＩ、式ＩＩＩ、式ＩＶ、式Ｖ、若しくは第１～第１１の実施形態のいずれか１つに記載のカチオン性脂質、又はその薬学的に許容される塩において、Ｒ^６ａ及びＲ^６ｂが、互いに等しい数の炭素原子を含有するか、又はＲ^６ａ及びＲ^６ｂが同じであるか、又はＲ^６ａ及びＲ^６ｂが、両方ともＣ_１２アルキル、Ｃ_１１アルキル、Ｃ_１０アルキル、Ｃ_９アルキル、Ｃ_８アルキル、Ｃ_７アルキル、Ｃ_１２アルケニル、Ｃ_１１アルケニル、Ｃ_１０アルケニル、Ｃ_９アルケニル、Ｃ_８アルケニル、若しくはＣ_７アルケニルであり、他の全ての残りの変数が、式Ｉ、式ＩＩ、式ＩＩＩ、式ＩＶ、式Ｖ、又は第１～第１１の実施形態のいずれか１つについて記載されているとおりである。

【0106】

第１３の実施形態では、式Ｉ、式ＩＩ、式ＩＩＩ、式ＩＶ、式Ｖ、若しくは第１～第１２の実施形態のいずれか１つに記載のカチオン性脂質、又はその薬学的に許容される塩において、Ｒ^６ａ及びＲ^６ｂが、第１～第１２の実施形態のいずれか１つで定義されるように、各々、互いとは異なる数の炭素原子を含有するか、又は炭素原子の数Ｒ^６ａ及びＲ^６ｂは、１個若しくは２個の炭素原子だけ異なるか、又は、炭素原子の数Ｒ^６ａ及びＲ^６ｂは、１個の炭素原子だけ異なるか、又はＲ^６ａがＣ_７アルキルであり、Ｒ^６ａがＣ_８アルキルであり、Ｒ^６ａがＣ_８アルキルであり、Ｒ^６ａがＣ_７アルキルであり、Ｒ^６ａがＣ_８アルキルであり、Ｒ^６ａがＣ_９アルキルであり、Ｒ^６ａがＣ_９アルキルであり、Ｒ^６ａがＣ_８アルキルであり、Ｒ^６ａがＣ_９アルキルであり、Ｒ^６ａがＣ_１０アルキルであり、Ｒ^６ａがＣ_１０アルキルであり、Ｒ^６ａがＣ_９アルキルであり、Ｒ^６ａがＣ_１０アルキルであり、Ｒ^６ａがＣ_１１アルキルであり、Ｒ^６ａがＣ_１１アルキルであり、Ｒ^６ａがＣ_１０アルキルであり、Ｒ^６ａがＣ_１１アルキルであり、Ｒ^６ａがＣ_１２アルキルであり、Ｒ^６ａがＣ_１２アルキルであり、Ｒ^６ａがＣ_１１アルキルであり、Ｒ^６ａがＣ_７アルキルであり、Ｒ^６ａがＣ_９アルキルであり、Ｒ^６ａがＣ_９アルキルであり、Ｒ^６ａがＣ_７アルキルであり、Ｒ^６ａがＣ_８アルキルであり、Ｒ^６ａがＣ_１０アルキルであり、Ｒ^６ａがＣ_１０アルキルであり、Ｒ^６ａがＣ_８アルキルであり、Ｒ^６ａがＣ_９アルキルであり、Ｒ^６ａがＣ_１１アルキルであり、Ｒ^６ａがＣ_１１アルキルであり、Ｒ^６ａがＣ_９アルキルであり、Ｒ^６ａがＣ_１０アルキルであり、Ｒ^６ａがＣ_１２アルキルであり、Ｒ^６ａがＣ_１２アルキルであり、Ｒ^６ａがＣ_１０アルキル等であり、他の全ての残りの変数が、式Ｉ、式ＩＩ、式ＩＩＩ、式ＩＶ、式Ｖ又は第１～第１２の実施形態のいずれか１つについて記載されているとおりである。

【0107】

第１４の実施形態では、式Ｉ、式ＩＩ、式ＩＩＩ、式ＩＶ、式Ｖ、若しくは第１～第１３の実施形態のいずれか１つに記載のカチオン性脂質、又はその薬学的に許容される塩において、Ｒ’は、存在せず、他の全ての残りの変数が、式Ｉ又は第１～第１３の実施形態のいずれか１つについて記載されているとおりである。いくつかの態様では、式Ｉ、式ＩＩ、式ＩＩＩ、式ＩＶ、式Ｖ又は第１～第１４の実施形態のいずれか１つに記載のカチオン性脂質において、Ｒ’が水素又はＣ_１～Ｃ_６アルキルであり、Ｒ’、Ｒ^１、及びＲ^２が全て結合している窒素原子は、窒素原子が正に帯電しているという点でプロトン化されている。

【0108】

いくつかの態様では、式Ｉ、式ＩＩ、式ＩＩＩ、式ＩＶ、式Ｖ、又は第１～第１４の実施形態のいずれか１つに記載のカチオン性脂質において、Ｒ’、Ｒ^１、及びＲ^２が各々、Ｃ_１～Ｃ_６アルキルであり、Ｒ’、Ｒ^１、及びＲ^２が、それらに結合している窒素原子と一緒に、四級アンモニウムカチオン又は四級アミンを形成する。

【0109】

第１５の実施形態では、式Ｉａで表されるカチオン性脂質、

【0110】

【化11】

又はその薬学的に許容される塩であって、式中、
Ｒ’が、存在しないか、又はＣ_１～Ｃ_３アルキルであり、
Ｒ^１及びＲ^２が、各々独立して、水素又はＣ_１～Ｃ_３アルキルであり、
Ｒ^３が、Ｃ_３～Ｃ_１０アルキレン又はＣ_３～Ｃ_１０アルケニレンであり、
Ｒ^４が、Ｃ_１～Ｃ_１６非分岐アルキル又はＣ_２～Ｃ_１６非分岐アルケニルであり、
Ｒ^５が、存在しないか、Ｃ_１～Ｃ_６アルキレン、又はＣ_２～Ｃ_６アルケニレンであり、
Ｒ^６ａ及びＲ^６ｂが、各々独立して、Ｃ_７～Ｃ_１４アルキル又はＣ_７～Ｃ_１４アルケニルであり、
Ｘが、－ＯＣ（＝Ｏ）－、－ＳＣ（＝Ｏ）－、－ＯＣ（＝Ｓ）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｓ－、－Ｓ－Ｓ－、－Ｃ（Ｒ^ａ）＝Ｎ－、
－Ｎ＝Ｃ（Ｒ^ａ）－、－Ｃ（Ｒ^ａ）＝ＮＯ－、－Ｏ－Ｎ＝Ｃ（Ｒ^ａ）－、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ^ａ－、－ＮＲ^ａＣ（＝Ｏ）－、－ＮＲ^ａＣ（＝Ｏ）ＮＲ^ａ－、
－ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ－、－ＯＳｉ（Ｒ^ａ）_２Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）（ＣＲ^ａ _２）Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、又はＯＣ（＝Ｏ）（ＣＲ^ａ _２）Ｃ（＝Ｏ）－であり、式中、
Ｒ^ａが、各出現に対して、独立して、水素又はＣ_１～Ｃ_６アルキルであり、
ｎが、１、２、３、４、５、及び６から選択される整数である、カチオン性脂質、又はその薬学的に許容される塩が、提供される。

【0111】

第１６の実施形態では、第１５の実施形態に記載のカチオン性脂質、又はその薬学的に許容される塩において、Ｘは、－ＯＣ（＝Ｏ）－、－ＳＣ（＝Ｏ）－、－ＯＣ（＝Ｓ）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｓ－、又は－Ｓ－Ｓ－であり、他の全ての残りの変数が、式Ｉａ又は第１５の実施形態について記載されているとおりである。

【0112】

第１７の実施形態では、本開示のカチオン性脂質は、式ＩＩａで表されるか、

【0113】

【化12】

又はその薬学的に許容される塩であり、式中、ｎが、１、２、３、及び４から選択される整数であり、他の全ての残りの変数が、式Ｉａ又は第１～第１６の実施形態のいずれか１つについて記載されているとおりである。代替的な第３の実施形態では、ｎが、１、２、及び３から選択される整数であり、他の全ての残りの変数が、式Ｉａ、又は第１５若しくは第１６の実施形態について記載されているとおりである。

【0114】

第１８の実施形態では、本開示のカチオン性脂質は、式ＩＩＩａで表されるか、

【0115】

【化13】

又はその薬学的に許容される塩であり、他の全ての残りの変数が、式Ｉａ、式ＩＩａ、又は第１５、第１６、若しくは第１７の実施形態について記載されているとおりである。

【0116】

第１９の実施形態では、第１の実施形態に記載のカチオン性脂質、又はその薬学的に許容される塩において、Ｒ^１及びＲ^２が、各々独立して、水素、若しくはＣ_１～Ｃ_２アルキル、若しくはＣ_２～Ｃ_３アルケニルであるか、又はＲ’、Ｒ^１、及びＲ^２が、各々独立して、水素、Ｃ_１～Ｃ_２アルキルであり、他の全ての残りの変数が、式Ｉａ、式ＩＩａ、又は第１～第１８の実施形態について記載されているとおりである。

【0117】

第２０の実施形態では、本開示のカチオン性脂質は、式ＩＶａで表されるか、

【0118】

【化14】

又はその薬学的に許容される塩であり、他の全ての残りの変数が、式Ｉａ、式ＩＩａ、式ＩＩＩａ、又は第１５、第１６、第１７、第１８、若しくは第１９の実施形態のいずれか１つについて記載されているとおりである。

【0119】

第２１の実施形態では、式Ｉａ、式ＩＩａ、式ＩＩＩａ、式ＩＶａ、若しくは第１～第２０の実施形態のいずれか１つに記載のカチオン性脂質、又はその薬学的に許容される塩において、Ｒ^５が、存在しないか、若しくは_１～Ｃ_８アルキレンであるか、又はＲ^５が、存在しないか、Ｃ_１～Ｃ_６アルキレン、若しくはＣ_２～Ｃ_６アルケニレンであるか、又はＲ^５が、存在しないか、Ｃ_１～Ｃ_４アルキレン、若しくはＣ_２～Ｃ_４アルケニレンであるか、又はＲ^５が存在しないか、又はＲ^５が、Ｃ_６アルキレン、Ｃ_５アルキレン、Ｃ_４アルキレン、Ｃ_３アルキレン、Ｃ_２アルキレン、Ｃ_１アルキレン、Ｃ_６アルケニレン、Ｃ_５アルケニレン、Ｃ_４アルケニレン、Ｃ_３アルケニレン、若しくはＣ_２アルケニレンであり、他の全ての残りの変数が、式Ｉａ、式ＩＩａ、式ＩＩＩａ、式ＩＶａ、又は第１５、第１６、第１７、第１８、第１９、若しくは第２０の実施形態のいずれか１つについて記載されているとおりである。

【0120】

第２２の実施形態では、本開示のカチオン性脂質が、式Ｖａで表されるか、

【0121】

【化15】

又はその薬学的に許容される塩であり、他の全ての残りの変数が、式Ｉａ、式ＩＩａ、式ＩＩＩａ、式ＩＶａ、又は第１５、第１６、第１７、第１８、第１９、第２０、若しくは第２１の実施形態のいずれか１つについて記載されているとおりである。

【0122】

第２３の実施形態では、式Ｉａ、式ＩＩａ、式ＩＩＩａ、式ＩＶａ、式Ｖａ、若しくは第１～第２２の実施形態のいずれか１つに記載のカチオン性脂質、又はその薬学的に許容される塩において、Ｒ^４が、Ｃ_１～Ｃ_１４非分岐アルキル若しくはＣ_２～Ｃ_１４非分岐アルケニルであるか、又はＲ^４が、Ｃ_２～Ｃ_１２非分岐アルキル若しくはＣ_２～Ｃ_１２非分岐アルケニルであるか、又はＲ^４が、Ｃ_５～Ｃ_１２非分岐アルキル若しくはＣ_５～Ｃ_１２非分岐アルケニルであるか、又はＲ^４が、Ｃ_１６非分岐アルキル、Ｃ_１５非分岐アルキル、Ｃ_１４非分岐アルキル、Ｃ_１３非分岐アルキル、Ｃ_１２非分岐アルキル、Ｃ_１１非分岐アルキル、Ｃ_１０非分岐アルキル、Ｃ_９非分岐アルキル、Ｃ_８非分岐アルキル、Ｃ_７非分岐アルキル、Ｃ_６非分岐アルキル、Ｃ_５非分岐アルキル、Ｃ_４非分岐アルキル、Ｃ_３非分岐アルキル、Ｃ_２非分岐アルキル、Ｃ_１非分岐アルキル、Ｃ_１６非分岐アルケニル、Ｃ_１５非分岐アルケニル、Ｃ_１４非分岐アルケニル、Ｃ_１３非分岐アルケニル、Ｃ_１２非分岐アルケニル、Ｃ_１１非分岐アルケニル、Ｃ_１０非分岐アルケニル、Ｃ_９非分岐アルケニル、Ｃ_８非分岐アルケニル、Ｃ_７非分岐アルケニル、Ｃ_６非分岐アルケニル、Ｃ_５非分岐アルケニル、Ｃ_４非分岐アルケニル、Ｃ_３非分岐アルケニル、若しくはＣ_２アルケニルであり、他の全ての残りの変数が、式Ｉａ、式ＩＩａ、式ＩＩＩａ、式ＩＶａ、式Ｖａ、又は第１５、第１６、第１７、第１８、第１９、第２０、第２１、若しくは第２２の実施形態のいずれか１つについて記載されているとおりである。

【0123】

第２４の実施形態では、式Ｉａ、式ＩＩａ、式ＩＩＩａ、式ＩＶａ、式Ｖａ、若しくは第１～第２３の実施形態のいずれか１つに記載のカチオン性脂質、又はその薬学的に許容される塩において、Ｒ^３が、Ｃ_３～Ｃ_８アルキレンあるいはＣ_３～Ｃ_８アルケニレン、Ｃ_３～Ｃ_７アルキレンあるいはＣ_３～Ｃ_７アルケニレン、若しくはＣ_３～Ｃ_５アルキレンあるいはＣ_３～Ｃ_５アルケニレンであるか、又はＲ^３が、Ｃ_８アルキレン、あるいはＣ_７アルキレン、あるいはＣ_６アルキレン、あるいはＣ_５アルキレン、あるいはＣ_４アルキレン、あるいはＣ_３アルキレン、あるいはＣ_１アルキレン、若しくはＣ_８アルケニレン、あるいはＣ_７アルケニレン、あるいはＣ_６アルケニレン、あるいはＣ_５アルケニレン、あるいはＣ_４アルケニレン、あるいはＣ_３アルケニレンであり、他の全ての残りの変数が、式Ｉａ、式ＩＩａ、式ＩＩＩａ、式ＩＶａ、式Ｖａ、又は第１５、第１６、第１７、第１８、第１９、第２０、第２１、第２２、若しくは第２３の実施形態のいずれか１つについて記載されているとおりである。

【0124】

第２５の実施形態では、式Ｉａ、式ＩＩａ、式ＩＩＩａ、式ＩＶａ、式Ｖａ、若しくは第１～第２４の実施形態のいずれか１つに記載のカチオン性脂質、又はその薬学的に許容される塩において、Ｒ^６ａ及びＲ^６ｂが、各々独立して、Ｃ_７～Ｃ_１２アルキル若しくはＣ_７～Ｃ_１２アルケニルであるか、又はＲ^６ａ及びＲ^６ｂが、各々独立して、Ｃ_８～Ｃ_１０アルキル若しくはＣ_８～Ｃ_１０アルケニルであるか、又はＲ^６ａ及びＲ^６ｂが、各々独立して、Ｃ_１２アルキル、Ｃ_１１アルキル、Ｃ_１０アルキル、Ｃ_９アルキル、Ｃ_８アルキル、Ｃ_７アルキル、Ｃ_１２アルケニル、Ｃ_１１アルケニル、Ｃ_１０アルケニル、Ｃ_９アルケニル、Ｃ_８アルケニル、若しくはＣ_７アルケニルであり、他の全ての残りの変数が、式Ｉａ、式ＩＩａ、式ＩＩＩａ、式ＩＶａ、式Ｖａ、又は第１５、第１６、第１７、第１８、第１９、第２０、第２１、第２２、第２３、若しくは第２４の実施形態のいずれか１つについて記載されているとおりである。

【0125】

第２６の実施形態では、式Ｉａ、式ＩＩａ、式ＩＩＩａ、式ＩＶａ、式Ｖａ、若しくは第１～第２５の実施形態のいずれか１つに記載のカチオン性脂質、又はその薬学的に許容される塩において、Ｒ^６ａ及びＲ^６ｂが、互いに等しい数の炭素原子を含有するか、又はＲ^６ａ及びＲ^６ｂが同じであるか、又はＲ^６ａ及びＲ^６ｂが、両方ともＣ_１２アルキル、Ｃ_１１アルキル、Ｃ_１０アルキル、Ｃ_９アルキル、Ｃ_８アルキル、Ｃ_７アルキル、Ｃ_１２アルケニル、Ｃ_１１アルケニル、Ｃ_１０アルケニル、Ｃ_９アルケニル、Ｃ_８アルケニル、若しくはＣ_７アルケニルであり、他の全ての残りの変数が、式Ｉａ、式ＩＩａ、式ＩＩＩａ、式ＩＶａ、式Ｖａ、又は第１５、第１６、第１７、第１８、第１９、第２０、第２１、第２２、第２３、第２４、若しくは第２５の実施形態のいずれか１つについて記載されているとおりである。

【0126】

第２７の実施形態では、式Ｉａ、式ＩＩａ、式ＩＩＩａ、式ＩＶａ、式Ｖａ、若しくは第１～第２６の実施形態のいずれか１つに記載のカチオン性脂質、又はその薬学的に許容される塩において、Ｒ^６ａ及びＲ^６ｂが、第１～第２６の実施形態のいずれか１つで定義されるように、各々、互いとは異なる数の炭素原子を含有するか、又は炭素原子の数Ｒ^６ａ及びＲ^６ｂは、１個若しくは２個の炭素原子だけ異なるか、又は、炭素原子の数Ｒ^６ａ及びＲ^６ｂは、１個の炭素原子だけ異なるか、又はＲ^６ａがＣ_７アルキルであり、Ｒ^６ａがＣ_８アルキルであり、Ｒ^６ａがＣ_８アルキルであり、Ｒ^６ａがＣ_７アルキルであり、Ｒ^６ａがＣ_８アルキルであり、Ｒ^６ａがＣ_９アルキルであり、Ｒ^６ａがＣ_９アルキルであり、Ｒ^６ａがＣ_８アルキルであり、Ｒ^６ａがＣ_９アルキルであり、Ｒ^６ａがＣ_１０アルキルであり、Ｒ^６ａがＣ_１０アルキルであり、Ｒ^６ａがＣ_９アルキルであり、Ｒ^６ａがＣ_１０アルキルであり、Ｒ^６ａがＣ_１１アルキルであり、Ｒ^６ａがＣ_１１アルキルであり、Ｒ^６ａがＣ_１０アルキルであり、Ｒ^６ａがＣ_１１アルキルであり、Ｒ^６ａがＣ_１２アルキルであり、Ｒ^６ａがＣ_１２アルキルであり、Ｒ^６ａがＣ_１１アルキルであり、Ｒ^６ａがＣ_７アルキルであり、Ｒ^６ａがＣ_９アルキルであり、Ｒ^６ａがＣ_９アルキルであり、Ｒ^６ａがＣ_７アルキルであり、Ｒ^６ａがＣ_８アルキルであり、Ｒ^６ａがＣ_１０アルキルであり、Ｒ^６ａがＣ_１０アルキルであり、Ｒ^６ａがＣ_８アルキルであり、Ｒ^６ａがＣ_９アルキルであり、Ｒ^６ａがＣ_１１アルキルであり、Ｒ^６ａがＣ_１１アルキルであり、Ｒ^６ａがＣ_９アルキルであり、Ｒ^６ａがＣ_１０アルキルであり、Ｒ^６ａがＣ_１２アルキルであり、Ｒ^６ａがＣ_１２アルキルであり、Ｒ^６ａがＣ_１０アルキル等であり、他の全ての残りの変数が、式Ｉａ、式ＩＩａ、式ＩＩＩａ、式ＩＶａ、式Ｖａ、又は第１５、第１６、第１７、第１８、第１９、第２０、第２１、第２２、第２３、第２４、第２５、若しくは第２６の実施形態のいずれか１つに記載のとおりである。

【0127】

第２８の実施形態では、式Ｉａ、式ＩＩａ、式ＩＩＩａ、式ＩＶａ、式Ｖａ、若しくは第１～第２７の実施形態のいずれか１つに記載のカチオン性脂質、又はその薬学的に許容される塩において、Ｒ’は、存在せず、他の全ての残りの変数が、式Ｉａ、又は第１５、第１６、第１７、第１８、第１９、第２０、第２１、第２２、第２３、第２４、第２５、第２６、若しくは第２７の実施形態のいずれか１つについて記載されているとおりである。

【0128】

第２９の実施形態では、式Ｉａ、式ＩＩａ、式ＩＩＩａ、式ＩＶａ、式Ｖａ、若しくは第１～第２８の実施形態のいずれか１つに記載のカチオン性脂質、又はその薬学的に許容される塩において、Ｒ’は、存在せず、Ｒ’、Ｒ^１、及びＲ^２が全て結合している窒素原子は、脂質が生理学的条件、例えば、約７．４以下のｐＨ、例えば、約７．４のｐＨで存在する場合にプロトン化され、他の全ての残りの変数が、式Ｉａ、又は第１５、第１６、第１７、第１８、第１９、第２０、第２１、第２２、第２３、第２４、第２５、第２６、第２７、若しくは第２８の実施形態のいずれか１つについて記載されているとおりである。

【0129】

第３０の実施形態では、式Ｉａ、式ＩＩａ、式ＩＩＩａ、式ＩＶａ、式Ｖａ、若しくは第１～第２９の実施形態のいずれか１つに記載のカチオン性脂質、又はその薬学的に許容される塩において、Ｒ’は、存在せず、Ｒ’、Ｒ^１、及びＲ^２が全て結合している窒素原子は、脂質が水溶液中に存在する場合にプロトン化され、他の全ての残りの変数が、式Ｉａ、又は第１５、第１６、第１７、第１８、第１９、第２０、第２１、第２２、第２３、第２４、第２５、第２６、第２７、第２８、若しくは第２９の実施形態のいずれか１つについて記載されているとおりである。

【0130】

第３１の実施形態では、式Ｉａ、式ＩＩａ、式ＩＩＩａ、式ＩＶａ、式Ｖａ、若しくは第１～第３０の実施形態のいずれか１つに記載のカチオン性脂質、又はその薬学的に許容される塩において、Ｒ’は、存在せず、Ｒ’、Ｒ^１、及びＲ^２が全て結合している窒素原子は、脂質が約７．４以下のｐＨで存在する場合にプロトン化され、他の全ての残りの変数が、式Ｉａ、又は第１５、第１６、第１７、第１８、第１９、第２０、第２１、第２２、第２３、第２４、第２５、第２６、第２７、第２８、第２９、若しくは第３０の実施形態のいずれか１つについて記載されているとおりである。

【0131】

第３２の実施形態では、式Ｉａ、式ＩＩａ、式ＩＩＩａ、式ＩＶａ、式Ｖａ、若しくは第１～第３１の実施形態のいずれか１つに記載のカチオン性脂質、又はその薬学的に許容される塩において、Ｒ’は、存在せず、Ｒ’、Ｒ^１、及びＲ^２が全て結合している窒素原子は、脂質が水溶液中に約７．４以下のｐＨ（例えば、約７．４のｐＨ）で存在する場合にプロトン化され、他の全ての残りの変数が、式Ｉａ、又は第１５、第１６、第１７、第１８、第１９、第２０、第２１、第２２、第２３、第２４、第２５、第２６、第２７、第２８、第２９、第３０、若しくは第３１の実施形態のいずれか１つについて記載されているとおりである。

【0132】

第３３の実施形態では、式Ｉａ、式ＩＩａ、式ＩＩＩａ、式ＩＶａ、式Ｖａ、若しくは第１～第３２の実施形態のいずれか１つに記載のカチオン性脂質、又はその薬学的に許容される塩において、Ｒ’、Ｒ^１、及びＲ^２は、それらに結合している窒素原子と一緒に、四級アンモニウムカチオン又は四級アミンを形成し、他の全ての残りの変数が、式Ｉａ、又は第１５、第１６、第１７、第１８、第１９、第２０、第２１、第２２、第２３、第２４、第２５、第２６、第２７、第２８、第２９、第３０、第３１、若しくは第３２の実施形態のいずれか１つについて記載されているとおりである。

【0133】

いくつかの実施形態では、式Ｉａ、式ＩＩａ、式ＩＩＩａ、式ＩＶａ、式Ｖａ、又は第１５、第１６、第１７、第１８、第１９、第２０、第２１、第２２、第２３、第２４、第２５、第２６、第２７、第２８、第２９、第３０、第３１、第３２、若しくは第３３の実施形態のいずれか１つに記載のカチオン性脂質において、Ｒ’は、水素又はＣ_１～Ｃ_６アルキルであり、Ｒ’、Ｒ^１、及びＲ^２が全て結合している窒素原子は、窒素原子が正に帯電している場合にプロトン化される。

【0134】

いくつかの実施形態では、式Ｉａ、式ＩＩａ、式ＩＩＩａ、式ＩＶａ、式Ｖａ、又は第１５、第１６、第１７、第１８、第１９、第２０、第２１、第２２、第２３、第２４、第２５、第２６、第２７、第２８、第２９、第３０、第３１、第３２、若しくは第３３の実施形態のいずれか１つに記載のカチオン性脂質において、Ｒ’、Ｒ^１、及びＲ^２は各々、Ｃ^１～Ｃ_６アルキルであり、Ｒ’、Ｒ^１、及びＲ^２は、それらに結合している窒素原子と一緒に、四級アンモニウムカチオン又は四級アミンを形成する。

【0135】

一実施形態では、本開示のカチオン性脂質、又は式Ｉ若しくはＩａのカチオン性脂質は、

【0136】

【化16】

【0137】

【化17】

【0138】

【化18】

又はその薬学的に許容される塩である。

【0139】

更に、式Ｉ、式ＩＩ、式ＩＩＩ、式ＩＶ、式Ｖ、式Ｉａ、式ＩＩａ、式ＩＩＩａ、式ＩＶａ、式Ｖａの脂質、若しくはその薬学的に許容される塩（例えば、四級アンモニウム塩）、又は本明細書に開示される例示的な脂質のうちのいずれかは、例えば、アセトニトリル（ＣＨ_３ＣＮ）及びクロロホルム（ＣＨＣｌ_３）中のクロロメタン（ＣＨ_３Ｃｌ）で処理することによって、四級アミン又は四級アンモニウムカチオンを含む対応する脂質に変換されてもよく、すなわち、Ｒ’、Ｒ^１及びＲ^２は、各Ｃ_１～Ｃ_６アルキル（全て本開示において企図される）である。このような脂質中の四級アンモニウムカチオンは、それらの溶液のｐＨとは無関係に永久的に帯電している。

【0140】

いくつかの実施形態では、脂質１、脂質２、脂質３、脂質４、脂質５、脂質６、脂質７、脂質８、脂質９、脂質１０、又は脂質１１のいずれかの窒素原子は、脂質が生理学的条件、例えば、約７．４以下のｐＨ、例えば、約７．４のｐＨで存在する場合にプロトン化される。

【0141】

いくつかの実施形態では、脂質１、脂質２、脂質３、脂質４、脂質５、脂質６、脂質７、脂質８、脂質９、脂質１０、又は脂質１１のいずれかの窒素原子は、脂質が水溶液中に存在する場合にプロトン化される。

【0142】

いくつかの実施形態では、脂質１、脂質２、脂質３、脂質４、脂質５、脂質６、脂質７、脂質８、脂質９、脂質１０、又は脂質１１のいずれかの窒素原子は、脂質が約７．４以下のｐＨ（例えば、約７．４のｐＨ）で存在する場合にプロトン化される。

【0143】

いくつかの実施形態では、脂質１、脂質２、脂質３、脂質４、脂質５、脂質６、脂質７、脂質８、脂質９、脂質１０、又は脂質１１のいずれかの窒素原子は、脂質が水溶液中に約７．４以下のｐＨ（例えば、約７．４のｐＨ）で存在する場合にプロトン化される。

【0144】

ＩＩＩ．脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）
核酸の送達ビヒクルとしてのＬＮＰ
本明細書に記載のカチオン性脂質と、カプシド不含非ウイルスベクター又は治療用核酸（ＴＮＡ）（例えば、ｃｅＤＮＡ）とを含む脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）、又はその薬学的組成物は、目的の標的部位（例えば、細胞、組織、器官等）にカプシド不含非ウイルスＤＮＡベクターを送達するために使用され得る。したがって、本開示の別の態様は、本明細書に記載される１つ以上のカチオン性脂質又はその薬学的に許容される塩と、治療用核酸（ＴＮＡ）とを含む脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）に関する。

【0145】

カチオン性脂質は、典型的に、核酸カーゴ、例えばｃｅＤＮＡを低ｐＨで凝縮させるため、及び膜会合及び膜融合性を駆動するために用いられる。一般に、カチオン性脂質は、四級アミンを含む脂質を形成するために、正に帯電した、又は例えばｐＨ６．５以下の酸性条件下でプロトン化される少なくとも１つのアミノ基を含む脂質である。

【0146】

本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、脂質ナノ粒子において、本明細書に提供されるカチオン性脂質又はその薬学的に許容される塩は、約３０％～約８０％、例えば、約３５％～約８０％、約４０％～約８０％、約４５％～約８０％、約５０％～約８０％、約５５％～約８０％、約６０％～約８０％、約６５％～約８０％、約７０％～約８０％、約７５％～約８０％、３０％～約７５％、約３５％～約７５％、約４０％～約７５％、約４５％～約７５％、約５０％～約７５％、約５５％～約７５％、約６０％～約７５％、約６５％～約７５％、約７０％～約７５％、３０％～約７０％、約３５％～約７０％、約４０％～約７０％、約４５％～約７０％、約５０％～約７０％、約５５％～約７０％、約６０％～約７０％、約６５％～約７０％、約３０％～約６５％、約３５％～約６５％、約４０％～約６５％、約４５％～約６５％、約５０％～約６５％、約５５％～約６５％、約６０％～約６５％、約３０％～約６０％、約３５％～約６０％、約４０％～約６０％、約４５％～約６０％、約５０％～約６０％、約５５％～約６０％、約３０％～約５５％、約３５％～約５５％、約４０％～約５５％、約４５％～約５５％、約５０％～約５５％、約３０％～約５０％、約３５％～約５０％、約４０％～約５０％、約４５％～約５０％、約３０％～約４５％、約３５％～約４５％、約４０％～約４５％、約３０％～約４０％、又は約３５％～約４０％のモルパーセンテージで提供される。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、脂質ナノ粒子において、本明細書に提供されるカチオン性脂質又はその薬学的に許容される塩は、４０％～約６０％、又は約４５％～約６０％、又は約４５％～約５５％、又は約４５％～約５０％、又は約５０％～約５５％、又は約４０％～約５０％、例えば、これらに限定されないが、約４０％、約４１％、約４２％、約４３％、約４４％、約４５％、約４６％、約４７％、約４８％、約４９％、約５０％、約５１％、約５２％、約５３％、約５４％、約５５％、約５６％、約５７％、約５８％、約５９％、又は約６０％のモルパーセンテージで存在する。

【0147】

ステロール
本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、本明細書に記載のよりカチオン性の脂質、又はその薬学的に許容される塩、及びＴＮＡに加えて、本明細書に記載のＬＮＰは、脂質粒子の膜完全性及び安定性を提供するために、少なくとも１つのステロールを更に含む。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、脂質粒子に使用することができる例示的なステロールは、コレステロール又はその誘導体である。コレステロール誘導体の非限定的な例としては、５α－コレスタノール、５β－コプロスタノール、コレステリル－（２’－ヒドロキシ）－エチルエーテル、コレステリル－（４’－ヒドロキシ）－ブチルエーテル、及び６－ケトコレスタノール等の極性類似体、５α－コレスタン、コレステノン、５α－コレスタノン、５β－コレスタノン、及びコレステリルデカノエート等の非極性類似体、並びにそれらの混合物が挙げられる。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、コレステロール誘導体は、コレステリル－（４’－ヒドロキシ）－ブチルエーテル等の極性類似体である。本明細書の態様及び実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、コレステロール誘導体は、コレステリルヘミスクシネート（ＣＨＥＭＳ）である。

【0148】

例示的なコレステロール誘導体は、国際公開第２００９／１２７０６０号及び米国特許出願公開第ＵＳ２０１０／０１３０５８８号に記載されており、これらの両方の内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。

【0149】

更なる例示的なステロールとしては、ベータシトステロール、カンペステロール、スチグマステロール、エルゴステロール、ブラシカステロール、ロペオール（lopeol）、シクロアルテノール、及びそれらの誘導体が挙げられる。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、脂質粒子に使用することができる例示的なステロールは、ベータシトステロールである。

【0150】

本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、脂質ナノ粒子中で、ステロールは、約２０％～約５０％、例えば、約２５％～約５０％、約３０％～約５０％、約３５％～約５０％、約４０％～約５０％、約４５％～約５０％、約２０％～約４５％、約２５％～約４５％、約３０％～約４５％、約３５％～約４５％、約４０％～約４５％、約２０％～約４０％、約２５％～約４０％、約３０％～約４０％、約３５％～約４０％、約２０％～約３５％、約２５％～約３５％、約３０％～約３５％、約２０％～約３０％、又は約２５％～約３５％のモルパーセンテージで存在する。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、脂質ナノ粒子において、ステロールは、約３５％～約４５％、又は約４０％～約４５％、又は約３５％～約４０％、例えば、これらに限定されないが、約３５％、約３６％、約３７％、約３８％、約３９％、約４０％、約４１％、約４２％、約４３％、約４４％、又は約４５％のモルパーセンテージで存在する。

【0151】

非カチオン性脂質
本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、本明細書に記載される脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）は、少なくとも１つの非カチオン性脂質を更に含む。非カチオン性脂質は、構造脂質としても知られており、膜の完全性及び脂質粒子の安定性を提供するために、膜融合性を増加させ、形成中のＬＮＰの安定性も増加させる働きをし得る。非イオン化可能な脂質としては、両親媒性脂質、中性脂質、及びアニオン性脂質が挙げられる。したがって、非カチオン性脂質は、中性の非電荷、双性イオン性、又はアニオン性脂質であり得る。

【0152】

例示的な非カチオン性脂質としては、ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－ホスホエタノールアミン、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、ジオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン４－（Ｎ－マレイミドメチル）－シクロヘキサン－１－カルボキシレート（ＤＯＰＥ－ｍａｌ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジミリストイルホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジステアロイル－ホスファチジル－エタノールアミン（ＤＳＰＥ）、モノメチル－ホスファチジルエタノールアミン（１６－Ｏ－モノメチルＰＥ等）、ジメチル－ホスファチジルエタノールアミン（１６－Ｏ－ジメチルＰＥ等）、１８－１－トランスＰＥ、１－ステアロイル－２－オレオイル－ホスファチジエタノールアミン（ＳＯＰＥ）、水素化ダイズホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）、卵ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルセリン（ＤＯＰＳ）、スフィンゴミエリン（ＳＭ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルグリセロール（ＤＭＰＧ）、ジステアロイルホスファチジルグリセロール（ＤＳＰＧ）、ジエルコイルホスファチジルコリン（ＤＥＰＣ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルグリセロール（ＰＯＰＧ）、ジエライドイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＥＰＥ）、１，２－ジラウロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＬＰＥ）、１，２－ジフィタノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＰＨｙＰＥ）、レシチン、ホスファチジルエタノールアミン、リソレシチン、リソホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、スフィンゴミエリン、卵スフィンゴミエリン（egg sphingomyelin、ＥＳＭ）、セファリン、カルジオリピン、ホスファチジカシド、セレブロシド、ジセチルホスフェート、リソホスファチジルコリン、ジリノレオイルホスファチジルコリン、又はそれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。他のジアシルホスファチジルコリン及びジアシルホスファチジルエタノールアミンリン脂質もまた使用され得ることを理解されたい。これらの脂質中のアシル基は、好ましくは、Ｃ_１０～Ｃ_２４炭素鎖を有する脂肪酸に由来するアシル基、例えば、ラウロイル、ミリストイル、パルミトイル、ステアロイル、又はオレオイルである。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、非カチオン性脂質は、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、及びジオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）から選択されるいずれか１つ以上である。

【0153】

脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）中での使用に好適な非カチオン性脂質の他の例としては、例えば、ステアリルアミン、ドデシルアミン、ヘキサデシルアミン、パルミチン酸アセチル、リシノール酸グリセロール、ステアリン酸ヘキサデシル、ミリスチン酸イソプロピル、両性アクリル系ポリマー、トリエタノールアミン－硫酸ラウリル、アルキル－アリールサルフェートポリエチルオキシル化脂肪酸アミド、ジオクタデシルジメチル臭化アンモニウム、セラミド、スフィンゴミエリン等の非亜リン脂質が挙げられる。

【0154】

追加の例示的な非カチオン性脂質は、国際公開第２０１７／０９９８２３号及び米国特許出願公開第ＵＳ２０１８／００２８６６４号に記載されており、これらの両方の内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。

【0155】

本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、脂質ナノ粒子において、非カチオン性脂質は、約２％～約２０％、例えば、約３％～約２０％、約５％～約２０％、約７％～約２０％、約８％～約２０％、約１０％～約２０％、約１２％～約２０％、約１３％～約２０％、約１５％～約２０％、約１７％～約２０％、約１８％～約２０％、約２％～約１８％、約３％～約１８％、約５％～約１８％、約７％～約１８％、約８％～約１８％、約１０％～約１８％、約１２％～約１８％、約１３％～約１８％、約１５％～約１８％、約１７％～約１８％、約２％～約１７％、約３％～約１７％、約５％～約１７％、約７％～約１７％、約８％～約１７％、約１０％～約１７％、約１２％～約１７％、約１３％～約１７％、約１５％～約１７％、約２％～約１５％、約３％～約１５％、約５％～約１５％、約７％～約１５％、約８％～約１５％、約１０％～約１５％、約１２％～約１５％、約１３％～約１５％、約２％～約１３％、約３％～約１３％、約５％～約１３％、約７％～約１３％、約８％～約１３％、約１０％～約１３％、約１２％～約１３％、約２％～約１２％、約３％～約１２％、約５％～約１２％、約７％～約１２％、約８％～約１２％、約１０％～約１２％、約２％～約１０％、約３％～約１０％、約５％～約１０％、約７％～約１０％、約８％～約１０％、約２％～約８％、約３％～約８％、約５％～約８％、約７％～約８％、約２％～約７％、約３％～約７％、約５％～約７％、約２％～約５％、約３％～約５％、又は約２％～約３％のモルパーセンテージで存在する。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、脂質ナノ粒子において、非カチオン性脂質は、約５％～約１５％、約７％～約１５％、約８％～約１５％、約１０％～約１５％、約１２％～約１５％、約１３％～約１５％、５％～約１３％、約７％～約１３％、約８％～約１３％、約１０％～約１３％、約１２％～約１３％、約５％～約１２％、約７％～約１２％、約８％～約１２％、約１０％～約１２％、約５％～約１０％、約７％～約１０％、約８％～約１０％、約５％～約８％、約７％～約８％、又は約５％～約７％、例えば、これらに限定されないが、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、約１１％、約１１％、約１２％、約１３％、約１４％、又は約１５％のモルパーセンテージで存在する。

【0156】

ＰＥＧ化脂質
本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、本明細書に記載される脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）は、少なくとも１つの（例えば、１つ、２つ、又は３つの）ＰＥＧ化脂質を更に含む。ＰＥＧ化脂質は、１つ以上のポリエチレングリコール（polyethylene glycol、ＰＥＧ）ポリマー鎖に共有結合又は非共有結合している、本明細書で定義される脂質であり、したがって、コンジュゲート脂質のクラスである。一般に、ＰＥＧ化脂質は、粒子の凝集を阻害し、かつ／又は立体安定化を提供するために、ＬＮＰに組み込まれる。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、脂質は、１つ以上のＰＥＧポリマー鎖に共有結合している。

【0157】

ＰＥＧ化脂質における使用に好適なＰＥＧ分子としては、約５００～約１０，０００、又は約１，０００～約７，５００、又は約１，０００～約５，０００、又は約２，０００～約５，０００、又は約２，０００～約４，０００、又は約２，０００～約３，５００、又は約２，０００～約３，０００の分子量を有するものが挙げられるが、これらに限定されず、例えば、ＰＥＧ２０００、ＰＥＧ２５００、ＰＥＧ３０００、ＰＥＧ３３５０、ＰＥＧ３５００、及びＰＥＧ４０００が挙げられるが、これらに限定されない。

【0158】

１つ以上のＰＥＧ鎖が連結される脂質は、ステロール、非カチオン性脂質、又はリン脂質であり得る。例示的なＰＥＧ化脂質としては、ＰＥＧ－ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）（１－（モノメトキシ－ポリエチレングリコール）－２，３－ジミリストイルグリセロール（ＰＥＧ－ＤＭＧ）等）、ＰＥＧ－ジアルキルオキシプロピル（ＤＡＡ）、ＰＥＧ－リン脂質、ＰＥＧ－セラミド（Ｃｅｒ）、ＰＥＧ化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ－ＰＥ）、ＰＥＧコハク酸ジアシルグリセロール（ＰＥＧＳ－ＤＡＧ）（４－０－（２’，３’－ジ（テトラデカノイルオキシ）プロピル－１－０－（ｗ－メトキシ（ポリエトキシ）エチル）ブタンジオエート（ＰＥＧ－Ｓ－ＤＭＧ）等）、ＰＥＧジアルコキシプロピルカルバム、Ｎ－（カルボニル－メトキシポリエチレングリコール２０００）－１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミンナトリウム塩、又はそれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。追加の例示的なＰＥＧ化脂質は、例えば、米国特許第５，８８５，６１３号及び同第６，２８７，５９１号、並びに米国特許出願公開第ＵＳ２００３／００７７８２９号、同第ＵＳ２００３／００７７８２９号、同第ＵＳ２００５／０１７５６８２号、同第ＵＳ２００８／００２００５８号、同第ＵＳ２０１１／０１１７１２５号、同第ＵＳ２０１０／０１３０５８８号、同第ＵＳ２０１６／０３７６２２４号、及び同第ＵＳ２０１７／０１１９９０４号に記載されており、これらの各々の内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。

【0159】

本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、本明細書に提供される脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）中の少なくとも１つのＰＥＧ化脂質は、ＰＥＧ－ジラウリルオキシプロピル；ＰＥＧ－ジミリスチルオキシプロピル、ＰＥＧ－ジパルミチルオキシプロピル、ＰＥＧ－ジステアリルオキシプロピル、１－（モノメトキシ－ポリエチレングリコール）－２，３－ジミリストイルグリセロール－ＰＥＧ（ＤＭＧ－ＰＥＧ）、ジステアロイル－ｒａｃ－グリセロール－ＰＥＧ（ＤＳＧ－ＰＥＧ）、ＰＥＧ－ジラウリルグリセロール、ＰＥＧ－ジパルミトイルグリセロール、ＰＥＧ－ジステリルグリセロール、ＰＥＧ－ジラウリルグリカミド、ＰＥＧ－ジミリスチルグリカミド、ＰＥＧ－ジパルミトイルグリカミド、ＰＥＧ－ジステリルグリカミド、（１－［８’－（コレスト－５－エン－３［ベータ］－オキシ）カルボキサミド－３’，６’－ジオキサオクタニル］カルバモイル－［オメガ］－メチル－ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ－コレステロール）；３，４－ジテトラデコキシルベンジル－［オメガ］－メチル－ポリ（エチレングリコール）エーテル（ＰＥＧ－ＤＭＢ）、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）］（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ）、及び１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－ポリ（エチレングリコール）－ヒドロキシル（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ－ＯＨ）からなる群から選択される。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、少なくとも１つのＰＥＧ化脂質は、ＤＭＧ－ＰＥＧ、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ－ＯＨ、ＤＳＧ－ＰＥＧ、又はそれらの組み合わせである。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、少なくとも１つのＰＥＧ化脂質は、ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００－ＯＨ、ＤＳＧ－ＰＥＧ２０００、又はそれらの組み合わせである。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、本明細書に提供される脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）は、ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００及びＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００を含む。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、本明細書に提供される脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）は、ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００及びＤＳＧ－ＰＥＧ２０００を含む。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、本明細書に提供される脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）は、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００及びＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００－ＯＨを含む。

【0160】

本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、脂質ナノ粒子において、少なくとも１つのＰＥＧ化脂質は、合計で、約１％～１０％、例えば、約１．５％～約１０％、約２％～約１０％、約２．５％～約１０％、約３％～約１０％、約３．５％～約１０％、約４％～約１０％、約４．５％～約１０％、約５％～約１０％、約５．５％～約１０％、約６％～約１０％、約６．５％～約１０％、約７％～約１０％、約７．５％～約１０％、約８％～約１０％、約８．５％～約１０％、約９％～約１０％、約９．５％～約１０％、約１％～約５％、約１．５％～約５％、約２％～約５％、約２．５％～約５％、約３％～約５％、約３．５％～約５％、約４％～約５％、約４．５％～約５％、約１％～約４％、約１．５％～約４％、約２％～約４％、約２．５％～約４％、約３％～約４％、約３．５％～約４％、約１％～約３．５％、約１．５％～約３．５％、約２％～約３．５％、約２．５％～約３．５％、約３％～約３．５％、約１％～約３％、約１．５％～約３％、約２％～約３％、約２．５％～約３％、約１％～約２．５％、約１．５％～約２．５％、約２％～約２．５％、約１％～約２％、約１．５％～約２％、又は約１％～約１．５％のモルパーセンテージで存在する。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、脂質ナノ粒子において、少なくとも１つのＰＥＧ化脂質は、合計で、約１％～約２％、約１．５％～約２％、又は約１％～約１．５％、例えば、これらに限定されないが、約１％、約１．１％、約１．２％、約１．３％、約１．４％、約１．５％、約１．６％、約１．７％、約１．８％、約１．９％、又は約２％のモルパーセンテージで存在する。

【0161】

本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、脂質ナノ粒子において、少なくとも１つのＰＥＧ化脂質は、合計で、約２．１％～約１０％、例えば、約２．５％～約１０％、約３％～約１０％、約３．５％～約１０％、約４％～約１０％、約４．５％～約１０％、約５％～約１０％、約５．５％～約１０％、約６％～約１０％、約６．５％～約１０％、約７％～約１０％、約７．５％～約１０％、約８％～約１０％、約８．５％～約１０％、約９％～約１０％、約９．５％～約１０％、約２．１％～約７％、約２．５％～約７％、約３％～約７％、約３．５％～約７％、約４％～約７％、約４．５％～約７％、約５％～約７％、約５．５％～約７％、約６％～約７％、約６．５％～約７％、約２．１％～約５％、約２．５％～約５％、約３％～約５％、約３．５％～約５％、約４％～約５％、約４．５％～約５％、約２．１％～約４％、約２．５％～約４％、約３％～約４％、約３．５％～約４％、約２．１％～約３．５％、約２．５％～約３．５％、約３％～約３．５％、約２．１％～約３％、約２．５％～約３％、又は約２．１％～約２．５％のモルパーセンテージで存在する。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、脂質ナノ粒子において、少なくとも１つのＰＥＧ化脂質は、合計で、約２．１％～約５％、約２．５％～約５％、約３％～約５％、約３．５％～約５％、約４％～約５％、約４．５％～約５％、約２．１％～約４％、約２．５％～約４％、約３％～約４％、約３．５％～約４％、約２．１％～約３．５％、約２．５％～約３．５％、約３％～約３．５％、約２．１％～約３％、約２．５％～約３％、又は約２．１％～約２．５％、例えば、これらに限定されないが、約２．１％、約２．２％、約２．３％、約２．４％、約２．５％、約２．６％、約２．７％、約２．８％、約２．９％、約３％、約３．１％、約３．２％、約３．３％、約３．４％、約３．５％、約３．６％、約３．７％、約３．８％、約３．９％、約４％、約４．１％、約４．２％、約４．３％、約４．４％、約４．５％、約４．６％、約４．７％、約４．８％、約４．９％、又は約５％のモルパーセンテージで存在する。

【0162】

組織特異的標的化リガンド及びＰＥＧ化脂質コンジュゲート
本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、本明細書に記載の脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）は、目的の標的部位へのＬＮＰの送達を補助、増強、及び／又は増加させる目的で、少なくとも１つの組織特異的標的化リガンドを更に含む。リガンドは、ペプチド、タンパク質、抗体、グリカン、糖、核酸、脂質、又は前述のいずれかを含むコンジュゲート等の任意の生体分子であり得、これは、ある特定の細胞及び組織に独特であるレセプター又は表面抗原を認識する。

【0163】

本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、少なくとも１つの組織特異的標的化リガンドは、Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）又はＧａｌＮＡｃ誘導体である。「ＧａｌＮＡｃ誘導体」という用語は、修飾ＧａｌＮＡｃ、官能化ＧａｌＮＡｃ、及びＧａｌＮＡｃコンジュゲートを包含し、ここで、１つ以上のＧａｌＮＡｃ分子（天然又は修飾）が、１つ以上の官能基又は１つ以上のクラスの例示的な生体分子、例えば、これらに限定されないが、ペプチド、タンパク質、抗体、グリカン、糖、核酸、脂質等）に共有結合している。１つ以上のＧａｌＮＡｃ分子が結合され得る生体分子自体は、典型的には、安定性の増加及び／又は凝集の阻害を助ける。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、ＧａｌＮＡｃ等の組織特異的標的リガンドと、リガンドがコンジュゲートされる生体分子とのモル比は、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、及び１：１０である。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、ＧａｌＮＡｃ等の組織特異的標的リガンドと、リガンドがコンジュゲートされる生体分子とのモル比は、１：１（例えば、モノ－アンテナリーＧａｌＮＡｃ）、２：１（ビ－アンテナリーＧａｌＮＡｃ）、３：１（トリ－アンテナリーＧａｌＮＡｃ）、及び４：１（テトラアンテナリーＧａｌＮＡｃ）である。コンジュゲート化ＧａｌＮＡｃ、例えばトリ－アンテナリーＧａｌＮＡｃ（ＧａｌＮＡｃ３）又はテトラ－アンテナリーＧａｌＮＡｃ（ＧａｌＮＡｃ４）は、当技術分野で公知のように合成することができ（国際公開第２０１７／０８４９８７号及び国際公開第２０１３／１６６１２１号を参照されたい）、当該技術分野において周知のように脂質又はＰＥＧに化学的にコンジュゲートすることができる（Ｒｅｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（２００１）「Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｐｐｅｒ Ｓｉｚｅ Ｌｉｍｉｔ ｆｏｒ Ｕｐｔａｋｅ ａｎｄ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｏｆ Ｌｉｇａｎｄｓ ｂｙ ｔｈｅ Ａｓｉａｌｏｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｏｎ Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ ｉｎ Ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ Ｖｉｖｏ」２７６：３７５５７７－３７５８４を参照されたい）。

【0164】

本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、組織特異的標的化リガンドは、本明細書で定義及び記載されるＰＥＧ化脂質に共有結合して、ＰＥＧ化脂質コンジュゲートを形成する。例示的なＰＥＧ化脂質は上に記載されており、ＰＥＧ－ジラウリルオキシプロピル、ＰＥＧ－ジミリスチルオキシプロピル、ＰＥＧ－ジパルミチルオキシプロピル、ＰＥＧ－ジステアリルオキシプロピル、１－（モノメトキシ－ポリエチレングリコール）－２，３－ジミリストイルグリセロール（ＤＭＧ－ＰＥＧ）、ＰＥＧ－ジラウリルグリセロール、ＰＥＧ－ジパルミトイルグリセロール、ＰＥＧ－ジステリルグリセロール、ＰＥＧ－ジラウリルグリカミド、ＰＥＧ－ジミリスチルグリカミド、ＰＥＧ－ジパルミトイルグリカミド、ＰＥＧ－ジステリルグリカミド、（１－［８’－（コレスト－５－エン－３［ベータ］－オキシ）カルボキサミド－３’，６’－ジオキサオクタニル］カルバモイル－［オメガ］－メチル－ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ－コレステロール）、３，４－ジテトラデコキシルベンジル－［オメガ］－メチル－ポリ（エチレングリコール）エーテル（ＰＥＧ－ＤＭＢ）、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ［メトキシ（ポリエチレングリコール）（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ）、及び１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－ポリ（エチレングリコール）－ヒドロキシル（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ－ＯＨ）を含む。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、本明細書に提供される脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）は、ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００及びＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００を含む。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、組織特異的標的化リガンドは、ＧａｌＮＡｃ又はＧａｌＮＡｃ誘導体に共有結合されている。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、ＰＥＧ化脂質コンジュゲートは、モノ－、ビ－、トリ－、又はテトラ－アンテナリーＧａｌＮＡｃ－ＤＳＰＥ－ＰＥＧである。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、ＰＥＧ化脂質コンジュゲートは、モノ－、ビ－、トリ－、又はテトラ－アンテナリーＧａｌＮＡｃ－ＤＳＧ－ＰＥＧである。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、ＰＥＧ化脂質コンジュゲートは、モノ－、ビ－、トリ－、又はテトラ－アンテナリーＧａｌＮＡｃ－ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００である。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、ＰＥＧ化脂質コンジュゲートは、モノ－、ビ－、トリ－、又はテトラ－アンテナリーＧａｌＮＡｃ－ＤＳＧ－ＰＥＧ２０００である。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、ＰＥＧ化脂質コンジュゲートは、トリ－アンテナリーＧａｌＮＡｃ－ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００である。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、ＰＥＧ化脂質コンジュゲートは、トリ－アンテナリーＧａｌＮＡｃ－ＤＳＧ－ＰＥＧ２０００である。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、ＰＥＧ化脂質コンジュゲートは、テトラ－アンテナリーＧａｌＮＡｃ－ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００である。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、ＰＥＧ化脂質コンジュゲートは、テトラ－アンテナリーＧａｌＮＡｃ－ＤＳＧ－ＰＥＧ２０００である。

【0165】

本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、脂質ナノ粒子において、ＰＥＧ化脂質コンジュゲートは、約０．１％～約１０％、例えば、約０．２％～約１０％、約０．３％～約１０％、約０．４％～約１０％、約０．５％～約１０％、約０．６％～約１０％、約０．７％～約１０％、約０．８％～約１０％、約０．９％～約１０％、約１％～約１０％、約１．５％～約１０％、約２％～約１０％、約２．５％～約１０％、約３％～約１０％、約３．５％～約１０％、約４％～約１０％、約４．５％～約１０％、約５％～約１０％、約５．５％～約１０％、約６％～約１０％、約６．５％～約１０％、約７％～約１０％、約７．５％～約１０％、約８％～約１０％、約８．５％～約１０％、約９％～約１０％、約９．５％～約１０％、約０．１％～約５％、約０．２％～約５％、約０．３％～約５％、約０．４％～約５％、約０．５％～約５％、約０．６％～約５％、約０．７％～約５％、約０．８％～約５％、約０．９％～約１０％、約１％～約５％、約１．５％～約５％、約２％～約５％、約２．５％～約５％、約３％～約５％、約３．５％～約５％、約４％～約５％、約４．５％～約５％、約０．１％～約３％、約０．２％～約３％、約０．３％～約３％、約０．４％～約３％、約０．５％～約３％、約０．６％～約３％、約０．７％～約３％、約０．８％～約３％、約０．９％～約３％、約１％～約３％、約１．５％～約３％、約２％～約３％、約２．５％～約３％、約０．１％～約２％、約０．２％～約２％、約０．３％～約２％、約０．４％～約２％、約０．５％～約２％、約０．６％～約２％、約０．７％～約２％、約０．８％～約２％、約０．９％～約２％、約１％～約２％、約１．５％～約２％、約０．１％～約１．５％、０．２％～約１．５％、約０．３％～約１．５％、約０．４％～約１．５％、約０．５％～約１．５％、約０．６％～約１．５％、約０．７％～約１．５％、約０．８％～約１．５％、約０．９％～約１．５％、約１％～約１．５％、約０．１％～約１％、０．２％～約１％、約０．３％～約１％、約０．４％～約１％、約０．５％～約１％、約０．６％～約１％、約０．７％～約１％、約０．８％～約１％、又は約０．９％～約１％のモルパーセンテージで存在する。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、脂質ナノ粒子において、ＰＥＧ化脂質コンジュゲートは、約０．１％～約１．５％、約０．２％～約１．５％、約０．３％～約１．５％、約０．４％～約１．５％、約０．５％～約１．５％、約０．６％～約１．５％、約０．７％～約１．５％、約０．８％～約１．５％、約０．９％～約１．５％、約１％～約１．５％、約０．１％～約１％、約０．２％～約１％、約０．３％～約１％、約０．４％～約１％、約０．５％～約１％、約０．６％～約１％、約０．７％～約１％、約０．８％～約１％、又は約０．９％～約１％、例えば、これらに限定されないが、約０．１％、約０．２％、約０．３％、約０．４％、約０．５％、約０．６％、約０．７％、約０．８％、約０．９％、約１％、約１．１％、約１．２％、約１．３％、約１．４％、又は約１．５％のモルパーセンテージで存在する。

【0166】

脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）の他の成分
コンジュゲート化脂質等のＬＮＰの更なる成分もまた、本開示において企図される。例示的な複合脂質としては、ポリオキサゾリン（ＰＯＺ）－脂質コンジュゲート、ポリアミド－脂質コンジュゲート（ＡＴＴＡ－脂質コンジュゲート等）、カチオン性－ポリマー脂質（cationic-polymer lipid、ＣＰＬ）コンジュゲート、及びそれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。

【0167】

更に、本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、本明細書に記載される脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）は、例えば、ＬＮＰ内への共封入によって、又は治療用核酸若しくは上記のＬＮＰの成分のいずれか１つへのコンジュゲーションによって、免疫調節化合物を更に含む。デキサメタゾン又は修飾されたデキサメタゾン等の免疫調節化合物は、免疫応答を最小限に抑えるのに役立ち得る。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、本明細書に記載の脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）は、デキサメタゾンパルミチン酸エステルを更に含む。

【0168】

本明細書の態様及び実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、カチオン性脂質に加えて、脂質ナノ粒子は、ｃｅＤＮＡ等の核酸カーゴを凝縮及び／又は封入するための薬剤を含む。このような薬剤は、本明細書では、凝縮剤又は封入剤とも称される。制限なしに、核酸を凝縮及び／又は封入するための当該技術分野で既知の任意の化合物は、それが非融合性である限り使用することができる。言い換えれば、薬剤は、ｃｅＤＮＡ等の核酸カーゴを凝縮及び／又は封入することができるが、融合活性をほとんど又はまったく有しない。理論に拘束されることを望まないが、凝縮剤は、ｃｅＤＮＡ等の核酸を凝縮／封入しない場合、いくらかの融合活性を有する可能性があるが、当該凝縮剤で形成された脂質ナノ粒子を封入する核酸は、非融合性であり得る。

【0169】

全脂質対核酸比
一般に、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）は、最終粒子が、約１０：１～６０：１、例えば、約１５：１～約６０：１、約２０：１～約６０：１、約２５：１～約６０：１、約３０：１～約６０：１、約３５：１～約６０：１、約４０：１～約６０：１、約４５：１～約６０：１、約５０：１～約６０：１、約５５：１～約６０：１、約１０：１～約５５：１、約１５：１～約５５：１、約２０：１～約５５：１、約２５：１～約５５：１、約３０：１～約５５：１、約３５：１～約５５：１、約４０：１～約５５：１、約４５：１～約５５：１、約５０：１～約５５：１、約１０：１～約５０：１、約１５：１～約５０：１、約２０：１～約５０：１、約２５：１～約５０：１、約３０：１～約５０：１、約３５：１～約５０：１、約４０：１～約５０：１、約４５：１～約５０：１、約１０：１～約４５：１、約１５：１～約４５：１、約２０：１～約４５：１、約２５：１～約４５：１、約３０：１～約４５：１、約３５：１～約４５：１、約４０：１～約４５：１、約１０：１～約４０：１、約１５：１～約４０：１、約２０：１～約４０：１、約２５：１～約４０：１、約３０：１～約４０：１、約３５：１～約４０：１、約１０：１～約３５：１、約１５：１～約３５：１、約２０：１～約３５：１、約２５：１～約３５：１、約３０：１～約３５：１、約１０：１～約３０：１、約１５：１～約３０：１、約２０：１～約３０：１、約２５：１～約３０：１、約１０：１～約２５：１、約１５：１～約２５：１、約２０：１～約２５：１、約１０：１～約２０：１、約１５：１～約２０：１、又は約１０：１～約１５：１の全脂質対治療用核酸（質量若しくは重量）比を有するように調製される。

【0170】

脂質及び核酸の量を調整して、所望のＮ／Ｐ比（すなわち、正に帯電可能なポリマーアミン（Ｎ＝窒素）基の負に帯電した核酸ホスフェート（Ｐ）基に対する比）、例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、又はそれ以上のＮ／Ｐ比を提供することができる。一般に、脂質粒子製剤の全体脂質含有量は、約５ｍｇ／ｍｌ～約３０ｍｇ／ｍＬの範囲であり得る。

【0171】

脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）のサイズ
本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態によれば、ＬＮＰは、約４０ｎｍ～約１２０ｎｍ、例えば、約４５ｎｍ～約１２０ｎｍ、約５０ｎｍ～約１２０ｎｍ、約５５ｎｍ～約１２０ｎｍ、約６０ｎｍ～約１２０ｎｍ、約６５ｎｍ～約１２０ｎｍ、約７０ｎｍ～約１２０ｎｍ、約７５ｎｍ～約１２０ｎｍ、約８０ｎｍ～約１２０ｎｍ、約８５ｎｍ～約１２０ｎｍ、約９０ｎｍ～約１２０ｎｍ、約９５ｎｍ～約１２０ｎｍ、約１００ｎｍ～約１２０ｎｍ、約１０５ｎｍ～約１２０ｎｍ、約１１０ｎｍ～約１２０ｎｍ、約１１５ｎｍ～約１２０ｎｍ、約４０ｎｍ～約１１０ｎｍ、約４５ｎｍ～約１１０ｎｍ、約５０ｎｍ～約１１０ｎｍ、約５５ｎｍ～約１１０ｎｍ、約６０ｎｍ～約１１０ｎｍ、約６５ｎｍ～約１１０ｎｍ、約７０ｎｍ～約１１０ｎｍ、約７５ｎｍ～約１１０ｎｍ、約８０ｎｍ～約１１０ｎｍ、約８５ｎｍ～約１１０ｎｍ、約９０ｎｍ～約１１０ｎｍ、約９５ｎｍ～約１１０ｎｍ、約１００ｎｍ～約１１０ｎｍ、約１０５ｎｍ～約１１０ｎｍ、約４０ｎｍ～約１００ｎｍ、約４５ｎｍ～約１００ｎｍ、約５０ｎｍ～約１００ｎｍ、約５５ｎｍ～約１００ｎｍ、約６０ｎｍ～約１００ｎｍ、約６５ｎｍ～約１００ｎｍ、約７０ｎｍ～約１００ｎｍ、約７５ｎｍ～約１００ｎｍ、約８０ｎｍ～約１００ｎｍ、約８５ｎｍ～約１００ｎｍ、約９０ｎｍ～約１００ｎｍ、又は約９５ｎｍ～約１００ｎｍの範囲の直径を有する。

【0172】

本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態によれば、ＬＮＰは、約１００ｎｍ未満、例えば、約４０ｎｍ～約９０ｎｍ、約４５ｎｍ～約９０ｎｍ、約５０ｎｍ～約９０ｎｍ、約５５ｎｍ～約９０ｎｍ、約６０ｎｍ～約９０ｎｍ、約６５ｎｍ～約９０ｎｍ、約７０ｎｍ～約９０ｎｍ、約７５ｎｍ～約９０ｎｍ、約８０ｎｍ～約９０ｎｍ、約８５ｎｍ～約９０ｎｍ、約４０ｎｍ～約８５ｎｍ、約４５ｎｍ～約８５ｎｍ、約５０ｎｍ～約８５ｎｍ、約５５ｎｍ～約８５ｎｍ、約６０ｎｍ～約８５ｎｍ、約６５ｎｍ～約８５ｎｍ、約７０ｎｍ～約８５ｎｍ、約７５ｎｍ～約８５ｎｍ、約８０ｎｍ～約８５ｎｍ、約４０ｎｍ～約８０ｎｍ、約４５ｎｍ～約８０ｎｍ、約５０ｎｍ～約８０ｎｍ、約５５ｎｍ～約８０ｎｍ、約６０ｎｍ～約８０ｎｍ、約６５ｎｍ～約８０ｎｍ、約７０ｎｍ～約８０ｎｍ、約７５ｎｍ～約８０ｎｍ、約４０ｎｍ～約７５ｎｍ、約４５ｎｍ～約７５ｎｍ、約５０ｎｍ～約７５ｎｍ、約５５ｎｍ～約７５ｎｍ、約６０ｎｍ～約７５ｎｍ、約６５ｎｍ～約７５ｎｍ、約７０ｎｍ～約７５ｎｍ、約４０ｎｍ～約７０ｎｍ、約４５ｎｍ～約７０ｎｍ、約５０ｎｍ～約７０ｎｍ、約５５ｎｍ～約７０ｎｍ、約６０ｎｍ～約７０ｎｍ、又は約６５ｎｍ～約７０ｎｍの直径を有する。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、ＬＮＰは、約６０ｎｍ～約８５ｎｍ、約６５ｎｍ～約８５ｎｍ、約７０ｎｍ～約８５ｎｍ、約７５ｎｍ～約８５ｎｍ、約８０ｎｍ～約８５ｎｍ、約６０ｎｍ～約８０ｎｍ、約６５ｎｍ～約８０ｎｍ、約７０ｎｍ～約８０ｎｍ、約７５ｎｍ～約８０ｎｍ、約６０ｎｍ～約７５ｎｍ、約６５ｎｍ～約７５ｎｍ、約７０ｎｍ～約７５ｎｍ、約６０ｎｍ～約７０ｎｍ、又は約６５ｎｍ～約７０ｎｍ、例えば、これらに限定されないが、約６０ｍｍ、約６１ｍｍ、約６２ｍｍ、約６３ｍｍ、約６４ｍｍ、約６５ｍｍ、約６６ｍｍ、約６７ｍｍ、約６８ｍｍ、約６９ｍｍ、約７０ｍｍ、約７１ｍｍ、約７２ｍｍ、約７３ｍｍ、約７４ｍｍ、約７５ｍｍ、約７６ｍｍ、約７７ｍｍ、約７８ｍｍ、約７９ｍｍ、約８０ｍｍ、約８１ｍｍ、約８２ｍｍ、約８３ｍｍ、約８４ｍｍ、又は約８５ｍｍの直径を有する。

【0173】

本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）サイズは、例えば、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ，ＵＫ）システムを使用して準弾性光散乱によって決定することができる。

【0174】

カチオン性脂質、ステロール、非カチオン性脂質、ＰＥＧ化脂質、及び任意選択で組織特異的標的化リガンドを含むＬＮＰ
本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態によれば、本明細書に提供される脂質ナノ粒子は、本明細書に記載される少なくとも１つのカチオン性脂質、少なくとも１つのステロール、少なくとも１つの非カチオン性脂質、及び少なくとも１つのＰＥＧ化脂質を含む。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、本明細書に提供される脂質ナノ粒子は、本明細書に記載される少なくとも１つのカチオン性脂質、少なくとも１つのステロール、少なくとも１つの非カチオン性脂質、及び少なくとも１つのＰＥＧ化脂質から本質的になる。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、本明細書に提供される脂質ナノ粒子は、本明細書に記載される少なくとも１つのカチオン性脂質、少なくとも１つのステロール、少なくとも１つの非カチオン性脂質、及び少なくとも１つのＰＥＧ化脂質からなる。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、カチオン性脂質：ステロール：非カチオン性脂質：ＰＥＧ化脂質のモル比は、約４８（±５）：１０（±３）：４１（±５）：２（±２）、例えば、約４７．５：１０．０：４０．７：１．８、又は約４７．５：１０．０：４０．７：３．０である。

【0175】

本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態によれば、本明細書に提供される脂質ナノ粒子は、本明細書に記載される少なくとも１つのカチオン性脂質、少なくとも１つのステロール、少なくとも１つの非カチオン性脂質、少なくとも１つのＰＥＧ化脂質、及び組織特異的標的化リガンドを含む。本明細書における態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、組織特異的標的化リガンドは、ＧａｌＮａｃである。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、本明細書に提供される脂質ナノ粒子は、本明細書に記載される少なくとも１つのカチオン性脂質、少なくとも１つのステロール、少なくとも１つの非カチオン性脂質、少なくとも１つのＰＥＧ化脂質、及び組織特異的標的化リガンドから本質的になる。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、本明細書に提供される脂質ナノ粒子は、本明細書に記載される少なくとも１つのカチオン性脂質、少なくとも１つのステロール、少なくとも１つの非カチオン性脂質、少なくとも１つのＰＥＧ化脂質、及び組織特異的標的化リガンドからなる。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、組織特異的標的化リガンドは、ＰＥＧ化脂質にコンジュゲートして、ＰＥＧ化脂質コンジュゲートを形成する。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、ＰＥＧ化脂質コンジュゲートは、モノ－、ビ－、トリ－、又はテトラ－アンテナリーＧａｌＮＡｃ－ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００である。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、ＰＥＧ化脂質コンジュゲートは、テトラ－アンテナリーＧａｌＮＡｃ－ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００である。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、カチオン性脂質：ステロール：非カチオン性脂質：ＰＥＧ化脂質：ＰＥＧ化脂質コンジュゲートのモル比は、約４８（±５）：１０（±３）：４１（±５）：２（±２）、１．５（±１）、例えば、４７．５：１０．０：４０．２：１．８：０．５又は４７．５：１０．０：３９．５；２．５：０．５である。

【0176】

ＩＶ． 治療用核酸（ＴＮＡ）
本開示は、治療用核酸（ＴＮＡ）を送達するための脂質ベースのプラットフォームを提供する。ＲＮＡベースの治療薬の非限定的な例は、ｍＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ及びオリゴヌクレオチド、リボザイム、アプタマー、干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）、ダイサー基質ｄｓＲＮＡ、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、非対称干渉ＲＮＡ（ａｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を含む。ＤＮＡベースの治療薬の非限定的な例は、ミニサークルＤＮＡ、ミニ遺伝子、ウイルス性ＤＮＡ（例えば、レンチウイルス又はＡＡＶゲノム）若しくは非ウイルス性合成ＤＮＡベクター、閉端直鎖状の二重鎖ＤＮＡ（ｃｅＤＮＡ／ＣＥＬｉＤ）、プラスミド、バクミド、ｄｏｇｇｙｂｏｎｅ（商標）ＤＮＡベクター、最小限度に免疫学的に定義された遺伝子発現（ＭＩＤＧＥ）ベクター、非ウイルス性ミニストリングＤＮＡベクター（直鎖状の共有結合性閉鎖ＤＮＡベクター）、又はダンベル形ＤＮＡミニマルベクター（「ダンベルＤＮＡ」）を含む。したがって、本開示の態様は、一般に、ＴＮＡを含むイオン化可能な脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）を提供する。

【0177】

ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）と呼ばれるプロセスを通じて特定のタンパク質の細胞内レベルを下方調節することができるｓｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡもまた、本発明によって核酸治療薬であると企図される。ｓｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡが宿主細胞の細胞質に導入された後、これらの二本鎖ＲＮＡ構築物はＲＩＳＣと呼ばれるタンパク質に結合することができる。ｓｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡのセンス鎖はＲＩＳＣ複合体によって除去される。ＲＩＳＣ複合体は、相補的ｍＲＮＡと結合すると、ｍＲＮＡを切断し、切断された鎖を放出する。ＲＮＡｉは、対応するタンパク質の下方調節をもたらすｍＲＮＡの特異的破壊を誘導することによるものである。

【0178】

タンパク質へのｍＲＮＡ翻訳を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）及びリボザイムは、核酸治療薬となり得る。アンチセンス構築物の場合、これらの一本鎖デオキシ核酸は、標的タンパク質ｍＲＮＡの配列に相補的な配列を有し、ワトソン－クリック塩基対合によってｍＲＮＡに結合することができる。この結合は、標的ｍＲＮＡの翻訳を防ぎ、かつ／又はｍＲＮＡ転写物のＲＮａｓｅＨ分解を誘起する。その結果、アンチセンスオリゴヌクレオチドは作用の特異性（すなわち、特定の疾患関連タンパク質の下方調節）を高めた。

【0179】

本明細書に提供される方法及び組成物のいずれにおいても、治療用核酸（ＴＮＡ）は治療用ＲＮＡであり得る。当該治療用ＲＮＡは、ｍＲＮＡ翻訳の阻害剤、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）の薬剤、触媒的に活性なＲＮＡ分子（リボザイム）、転移ＲＮＡ（ｔｒａｎｓｆｅｒ ＲＮＡ、ｔＲＮＡ）、又はｍＲＮＡ転写物（ＡＳＯ）、タンパク質若しくは他の分子リガンドに結合するＲＮＡ（アプタマー）であり得る。本明細書に提供される方法のいずれにおいても、ＲＮＡｉの薬剤は、二本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、短鎖干渉ＲＮＡ、低分子ヘアピンＲＮＡ、又は三重らせん形成オリゴヌクレオチドであり得る。

【0180】

本明細書に提供される方法組成物のいずれにおいても、治療用核酸（ＴＮＡ）は、閉端二本鎖ＤＮＡ（例えば、ｃｅＤＮＡ、ＣＥＬｉＤ、直鎖状の共有結合的に閉じたＤＮＡ（「ミニストリング」）、ｄｏｇｇｙｂｏｎｅ（商標）、プロテロメア閉端ＤＮＡ、ダンベル直鎖状ＤＮＡ、プラスミド、ミニサークル等）等の治療用ＤＮＡである。本開示のいくつかの実施形態は、導入遺伝子（例えば、治療用核酸）を発現することができる閉端直鎖状二重鎖（ｃｅＤＮＡ）を含む方法及び組成物に基づく。本明細書に記載されるようなｃｅＤＮＡベクターは、ウイルスカプシド内の限定空間によって課されるパッケージング制約を有しない。ｃｅＤＮＡベクターは、原核細胞的に産生されたプラスミドＤＮＡベクターに対する可変の真核細胞的に産生された代替物を表す。

【0181】

ｃｅＤＮＡベクターは、好ましくは、非連続的な構造ではなく直鎖状で連続的な構造を有する。直鎖状で連続的な構造は、細胞エンドヌクレアーゼによる攻撃に対してより安定であると同時に、組換えられて変異誘発を引き起こす可能性が低いと考えられる。したがって、直鎖状で連続的な構造のｃｅＤＮＡベクターは、好ましい実施形態である。連続的な直鎖状の一本鎖分子内二重鎖ｃｅＤＮＡベクターは、ＡＡＶカプシドタンパク質をコードする配列なしに、終端に共有結合している可能性がある。これらのｃｅＤＮＡベクターは、細菌起源の環状二重鎖核酸分子であるプラスミド（本明細書に記載されるｃｅＤＮＡプラスミドを含む）とは構造的に異なる。プラスミドの相補鎖は、変性に続いて分離されて２つの核酸分子を産生することができるが、反対に、ｃｅＤＮＡベクターは、相補鎖を有するが、単一ＤＮＡ分子であり、したがって変性された場合でも単一分子のままである。本明細書の態様及び実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、プラスミドとは異なり、原核細胞タイプのＤＮＡ塩基メチル化なしに産生され得る。したがって、ｃｅＤＮＡベクター及びｃｅＤＮＡ－プラスミドは、構造（特に、直鎖状対環状）並びにこれらの異なる対象物を産生及び精製するために使用される方法の両方に関して、またｃｅＤＮＡ－プラスミドの場合は原核細胞タイプ及びｃｅＤＮＡベクターの場合は真核細胞タイプのものである、それらのＤＮＡメチル化に関して異なる。

【0182】

共有結合性閉端を有する非ウイルス性カプシド不含ｃｅＤＮＡ分子（ｃｅＤＮＡ）が本明細書で提供される。これらの非ウイルスカプシド不含ｃｅＤＮＡ分子は、２つの異なる逆位末端反復（ＩＴＲ）配列の間に位置付けられた異種遺伝子（例えば、導入遺伝子、特に治療用導入遺伝子）を含有する発現構築物（例えば、ｃｅＤＮＡ－プラスミド、ｃｅＤＮＡ－バクミド、ｃｅＤＮＡ－バキュロウイルス又は統合型細胞株）からの許容宿主細胞中で産生され得、ＩＴＲは、互いに関して異なる。本明細書の態様及び実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、ＩＴＲのうちの１つは、野生型ＩＴＲ配列と比較して、欠失、挿入、及び／又は置換によって修飾されており（例えば、ＡＡＶ ＩＴＲ）、ＩＴＲのうちの少なくとも１つは、機能的末端分解部位（terminal resolution site、ＴＲＳ）及びＲｅｐ結合部位を含む。ｃｅＤＮＡベクターは、好ましくは、発現カセット等の分子の少なくとも一部分にわたって二重鎖、例えば、自己相補的である（例えば、ｃｅＤＮＡは、二本鎖環状分子ではない）。ｃｅＤＮＡベクターは、共有結合性閉端を有し、したがって、例えば、３７℃で１時間超エキソヌクレアーゼ消化（例えば、エキソヌクレアーゼＩ又はエキソヌクレアーゼＩＩＩ）に対して耐性である。

【0183】

本明細書の態様及び実施形態のうちのいずれかの一態様では、ｃｅＤＮＡベクターは、５’から３’方向に、第１のアデノ関連ウイルス（adeno-associated virus、ＡＡＶ）逆位末端反復（ＩＴＲ）、目的のヌクレオチド配列（例えば、本明細書に記載される発現カセット）、及び第２のＡＡＶ ＩＴＲを含む。本明細書の態様及び実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、第１のＩＴＲ（５’ＩＴＲ）及び第２のＩＴＲ（３’ＩＴＲ）は、互いに対して非対称であり、すなわち、それらは、互いに異なる三次元空間構成を有する。例示的な実施形態として、第１のＩＴＲは、野生型ＩＴＲであり得、第２のＩＴＲは、変異型又は修飾型ＩＴＲであり得るか、又はその逆であり、第１のＩＴＲは、変異型又は修飾型ＩＴＲであり得、第２のＩＴＲは、野生型ＩＴＲであり得る。本明細書の態様及び実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、第１のＩＴＲ及び第２のＩＴＲは、両方とも修飾されているが、異なる配列であるか、又は異なる修飾を有するか、又は同一の修飾型ＩＴＲではなく、異なる三次元空間構成を有する。言い換えると、非対称ＩＴＲを有するｃｅＤＮＡベクターは、ＷＴ－ＩＴＲに対する１つのＩＴＲにおける任意の変化が他のＩＴＲに反映されないＩＴＲを有するか、又は代替的に、非対称ＩＴＲが修飾された非対称ＩＴＲ対を有する場合、互いに対して異なる配列及び異なる三次元形状を有し得る。

【0184】

本明細書の態様及び実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、５’から３’方向に、第１のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆位末端反復（ＩＴＲ）、目的のヌクレオチド配列（例えば、本明細書に記載される発現カセット）、及び第２のＡＡＶ ＩＴＲを含み、第１のＩＴＲ（５’ＩＴＲ）及び第２のＩＴＲ（３’ＩＴＲ）は、互いに対して対称又は実質的に対称であり、すなわち、ｃｅＤＮＡベクターは、対称の三次元空間構成を有するＩＴＲ配列を含み得、それによりそれらの構造は、幾何学的空間で同じ形状であるか、又は三次元空間で同じＡ、Ｃ－Ｃ’、Ｂ－Ｂ’ループを有する。そのような実施形態では、対称のＩＴＲ対、又は実質的に対称のＩＴＲ対は、野生型ＩＴＲではない修飾型ＩＴＲ（例えば、ｍｏｄ－ＩＴＲ）であり得る。ｍｏｄ－ＩＴＲ対は、野生型ＩＴＲからの１つ以上の修飾を有し、互いに逆相補（逆位）である同じ配列を有し得る。本明細書の態様及び実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、修飾型ＩＴＲ対は、本明細書で定義されるように実質的に対称であり、すなわち、修飾型ＩＴＲ対は、異なる配列を有し得るが、対応する又は同じ対称な三次元形状を有し得る。本明細書の態様及び実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、対称のＩＴＲ、又は実質的に対称のＩＴＲは、本明細書に記載されるように野生型（ＷＴ－ＩＴＲ）であり得る。すなわち、両方のＩＴＲが野生型配列を有するが、必ずしも同じＡＡＶ血清型のＷＴ－ＩＴＲである必要はない。本明細書の態様及び実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、一方のＷＴ－ＩＴＲは、１つのＡＡＶ血清型に由来し得、他方のＷＴ－ＩＴＲは、異なるＡＡＶ血清型に由来し得る。そのような実施形態では、ＷＴ－ＩＴＲ対は、本明細書で定義されるように実質的に対称であり、すなわち、それらは、対称的な三次元空間構成を維持しながら、１つ以上の保存的ヌクレオチド修飾を有することができる。

【0185】

本明細書に提供される野生型又は変異型又は他の方法で修飾型ＩＴＲ配列は、ｃｅＤＮＡベクターの産生のために発現構築物（例えば、ｃｅＤＮＡ－プラスミド、ｃｅＤＮＡ－バクミド、ｃｅＤＮＡ－バキュロウイルス）に含まれるＤＮＡ配列を表す。したがって、ｃｅＤＮＡ－プラスミド又は他の発現構築物から産生されたｃｅＤＮＡベクター中に実際に含有されるＩＴＲ配列は、産生プロセス中に起こる天然に存在する変化（例えば、複製エラー）の結果として、本明細書に提供されるＩＴＲ配列に対して同一であっても同一でなくてもよい。

【0186】

本明細書の態様及び実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、治療用核酸配列である導入遺伝子を有する発現カセットを含む本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクターは、導入遺伝子の発現を可能にするか又は制御する１つ以上の調節配列に作動可能に連結され得る。本明細書の態様及び実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、ポリヌクレオチドは、第１のＩＴＲ配列及び第２のＩＴＲ配列を含み、目的のヌクレオチド配列は、第１及び第２のＩＴＲ配列によって隣接され、第１及び第２のＩＴＲ配列は、互いに対して非対称であるか、又は互いに対して対称である。

【0187】

本明細書の態様及び実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、発現カセットは、２つのＩＴＲ間に位置し、導入遺伝子に操作可能に連結されたプロモーター、転写後調節エレメント、並びにポリアデニル化及び終結シグナルのうちの１つ以上をこの順に含む。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、プロモーターは、調節可能－誘導性又は抑制性である。プロモーターは、導入遺伝子の転写を促進する任意の配列であり得る。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、プロモーターは、ＣＡＧプロモーター又はそのバリアントである。転写後調節エレメントは、導入遺伝子の発現を調整する配列であり、非限定的な例として、治療用核酸配列である導入遺伝子の発現を強化する三次構造を作成する任意の配列である。

【0188】

本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、転写後調節エレメントは、ＷＰＲＥを含む。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、ポリアデニル化及び終結シグナルは、ＢＧＨｐｏｌｙＡを含む。当該技術分野において既知の任意のシス調節エレメント、又はその組み合わせ、例えば、ＳＶ４０後期ポリＡシグナル上流エンハンサー配列（upstream enhancer sequence、ＵＳＥ）又は他の転写後処理エレメント（単純ヘルペスウイルス又はＢ型肝炎ウイルス（hepatitis B virus、ＨＢＶ）のチミジンキナーゼ遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない）が追加として使用され得る。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、５’～３’方向の発現カセット長は、ＡＡＶビリオン中でカプシド化されることが知られている最大長を超える。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、長さは、４．６ｋｂ超、又は５ｋｂ超、又は６ｋｂ超、又は７ｋｂ超である。様々な発現カセットが、本明細書に例示される。

【0189】

本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、発現カセットは、４０００ヌクレオチド超、例えば、約５０００ヌクレオチド、約１０，０００ヌクレオチド、若しくは約２０，０００ヌクレオチド、若しくは約３０，０００ヌクレオチド、若しくは約４０，０００ヌクレオチド、若しくは約５０，０００ヌクレオチド、又は約４０００～１０，０００ヌクレオチド、若しくは１０，０００～５０，０００ヌクレオチドの任意の範囲、又は５０，０００ヌクレオチド超を含み得る。

【0190】

本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、発現カセットはまた、内部リボソームエントリー部位（internal ribosome entry site、ＩＲＥＳ）及び／又は２Ａエレメントを含み得る。シス調節エレメントとしては、プロモーター、リボスイッチ、インスレーター、ｍｉｒ調節エレメント、転写後調節エレメント、組織及び細胞型特異的プロモーター、並びにエンハンサーが挙げられるが、これらに限定されない。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、ＩＴＲは、導入遺伝子のプロモーターとして作用し得る。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、導入遺伝子の発現を調節するための追加の構成成分、例えば、導入遺伝子の発現を制御及び調節するための調節スイッチを含み、所望であれば、ｃｅＤＮＡベクターを含む細胞の制御された細胞死を可能にするキルスイッチである調節スイッチを含み得る。

【0191】

本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、カプシド不含であり、第１のＩＴＲ、発現可能な導入遺伝子カセット及び第２のＩＴＲをこの順にコードするプラスミドから取得され得、第１及び／又は第２のＩＴＲ配列のうちの少なくとも１つは、対応する野生型ＡＡＶ２ ＩＴＲ配列に関して変異する。

【0192】

本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクターは、治療目的（例えば、医療、診断、若しくは獣医学的使用）又は免疫原性ポリペプチドに使用される。

【0193】

発現カセットは、治療用核酸配列である任意の導入遺伝子を含むことができる。ある特定の実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、１つ以上のポリペプチド、ペプチド、リボザイム、ペプチド核酸、ｓｉＲＮＡ、ＲＮＡｉｓ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アンチセンスポリヌクレオチド、抗体、抗原結合断片、又はそれらの任意の組み合わせを含む、対象における任意の目的の遺伝子を含む。

【0194】

本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクターの発現カセット、発現構築物、又はドナー配列で提供される配列は、宿主細胞についてコドン最適化することができる。本明細書で使用される場合、「最適化されたコドン」又は「コドン最適化」という用語は、目的の脊椎動物、例えばマウス又はヒトの細胞中の発現強化のために、少なくとも１つ、２つ以上、又は相当数の未変性配列（例えば、原核細胞配列）のコドンを、その脊椎動物の遺伝子中でより頻繁に又は最も頻繁に使用されるコドンと置き換えることによって、核酸配列を修飾するプロセスを指す。様々な種は、特定のアミノ酸のある特定のコドンに対して特定の偏向を呈する。

【0195】

典型的に、コドン最適化は、元の翻訳されたタンパク質のアミノ酸配列を変更しない。最適化されたコドンは、例えば、ＡｐｔａｇｅｎのＧｅｎｅ Ｆｏｒｇｅ（登録商標）コドン最適化及びカスタム遺伝子合成プラットフォーム（Ａｐｔａｇｅｎ，Ｉｎｃ．，２１９０ Ｆｏｘ Ｍｉｌｌ Ｒｄ．Ｓｕｉｔｅ ３００，Ｈｅｒｎｄｏｎ，Ｖａ．２０１７１）又は別の公開データベースを使用して決定することができる。

【0196】

多くの生物は、特定のコドンを使用して、成長するペプチド鎖における特定のアミノ酸の挿入をコードする偏向を示す。生物間のコドン使用頻度の違いであるコドン優先又はコドン偏向は、遺伝暗号の縮退によってもたらされ、多くの生物の間で十分に文書化されている。コドン偏向は、メッセンジャーＲＮＡ（messenger RNA、ｍＲＮＡ）の翻訳効率と相関関係があることが多く、とりわけ、翻訳されるコドンの特性及び特定のトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）分子の可用性に依存すると考えられている。細胞内の選択されたｔＲＮＡの優勢は、一般にペプチド合成で最も頻繁に使用されるコドンの反映である。したがって、コドン最適化に基づいて、所与の生物における最適な遺伝子発現のために遺伝子を調整することができる。

【0197】

多種多様な動物、植物、及び微生物種で利用可能な多数の遺伝子配列を考えると、コドン使用頻度の相対頻度を計算することが可能である（Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．「Ｃｏｄｏｎ ｕｓａｇｅ ｔａｂｕｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄａｔａｂａｓｅｓ：ｓｔａｔｕｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｙｅａｒ ２０００」Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２８：２９２（２０００））。

【0198】

逆位末端反復（ＩＴＲ）
本明細書に記載されるように、ｃｅＤＮＡベクターは、共有結合性末端（直鎖状で連続的な非カプシド構造）を有する相補的ＤＮＡの連続鎖から形成されたカプシド不含直鎖状二重鎖ＤＮＡ分子であり、異なるか、又は互いに対して非対称である５’逆位末端反復（ＩＴＲ）配列及び３’ＩＴＲ配列を含む。ＩＴＲのうち少なくとも１つは、機能的末端分解部位及び複製タンパク質結合部位（replication protein binding site、ＲＰＳ）（複製タンパク質結合部位（replicative protein binding site）と呼ばれることもある）、例えば、Ｒｅｐ結合部位を含む。一般に、ｃｅＤＮＡベクターは、少なくとも１つの修飾型ＡＡＶ逆位末端反復配列（ＩＴＲ）、すなわち、他のＩＴＲに対する欠失、挿入、及び／又は置換、並びに発現可能な導入遺伝子を含有する。

【0199】

本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、ＩＴＲのうちの少なくとも１つは、ＡＡＶ ＩＴＲ、例えば、野生型ＡＡＶ ＩＴＲである。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、ＩＴＲのうちの少なくとも１つは、他のＩＴＲに対する修飾型ＩＴＲであり、すなわち、ｃｅＤＮＡは、互いに対して非対称であるＩＴＲを含む。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、ＩＴＲのうちの少なくとも１つは、非機能的ＩＴＲである。

【0200】

本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、（１）シス調節エレメント、プロモーター及び少なくとも１つの導入遺伝子を含む発現カセット、又は、（２）少なくとも１つの導入遺伝子に操作可能に連結されたプロモーター、及び（３）当該発現カセットに隣接する２つの自己相補的配列、例えば、ＩＴＲを含み、ｃｅＤＮＡベクターはカプシドタンパク質と会合していない。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、ＡＡＶゲノム中で見出される２つの自己相補的配列を含み、少なくとも１つは、操作的Ｒｅｐ結合エレメント（Rep-binding element、ＲＢＥ）及びＡＡＶの末端分解部位（ＴＲＳ）又はＲＢＥの機能的バリアント、及び導入遺伝子に作動可能に連結された１つ以上のシス調節エレメントを含む。本明細書の態様及び実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、導入遺伝子の発現を調節するための追加の構成成分、例えば、導入遺伝子の発現を制御及び調節するための調節スイッチを含み、ｃｅＤＮＡベクターを含む細胞の制御された細胞死を可能にするキルスイッチである調節スイッチを含み得る。

【0201】

本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれか一実施形態では、２つの自己相補的配列は、任意の既知のパルボウイルス、例えばＡＡＶ（例えば、ＡＡＶ１～ＡＡＶ１２）等のディペンドウイルスからのＩＴＲ配列であり得る。ヘアピン二次構造形成を可能にする可変パリンドローム配列に加えて、５’－ＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣ－３’等のＲｅｐ結合部位（ＲＢＳ）及び末端分解部位（ＴＲＳ）を保持する修飾型ＡＡＶ２ ＩＴＲ配列を含むが、これらに限定されない任意のＡＡＶ血清型を使用することができる。本明細書の態様及び実施形態のうちのいずれかの一部の実施形態では、ＩＴＲは合成であってもよい。本明細書の態様及び実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、合成ＩＴＲは、２つ以上のＡＡＶ血清型からのＩＴＲ配列に基づいている。別の実施形態では、合成ＩＴＲは、ＡＡＶベース配列を含まない。更に別の実施形態では、合成ＩＴＲは、上記のＩＴＲ構造を保存するが、わずかなＡＡＶ源配列を有するか、又は全く有しない。いくつかの態様では、合成ＩＴＲは、野生型Ｒｅｐ若しくは特定血清型のＲｅｐと優先的に相互作用し得るか、又は場合によっては、野生型Ｒｅｐによって認識されず、変異型Ｒｅｐによってのみ認識される。本明細書の態様及び実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、ＩＴＲは、ヘアピン二次構造形成を可能にする可変パリンドローム配列に加えて、５’－ＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣ－３’等の機能性Ｒｅｐ結合部位（ＲＢＳ）及び末端分解部位（ＴＲＳ）を保持する合成ＩＴＲ配列である。いくつかの例では、修飾型ＩＴＲ配列は、ＲＢＳ、ＴＲＳの配列、並びに野生型ＡＡＶ２ ＩＴＲの対応する配列からの１つのＩＴＲヘアピン二次構造の末端ループ部分を形成するＲｅｐ結合エレメントの構造及び位置を保持する。ｃｅＤＮＡベクターで使用するための例示的なＩＴＲ配列は、表２～９、１０Ａ及び１０Ｂ、配列番号２、５２、１０１～４４９及び５４５～５４７に開示され、部分的なＩＴＲ配列は、２０１８年９月７日に出願された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０４９９９６号の図２６Ａ～図２６Ｂに示される。本明細書の態様及び実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、２０１８年９月７日に出願された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０４９９９６号の表２、３、４、５、６、７、８、９、１０Ａ、及び１０Ｂのうちのいずれか１つ以上に示されるＩＴＲ配列又はＩＴＲ部分配列における修飾のいずれかに対応するＩＴＲにおける修飾を伴うＩＴＲを含み得る。

【0202】

本明細書の態様及び実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、シス調節エレメントの特定の組み合わせを更に含む発現構築物から産生され得る。シス調節エレメントとしては、プロモーター、リボスイッチ、インスレーター、ｍｉｒ調節エレメント、転写後調節エレメント、組織及び細胞型特異的プロモーター、並びにエンハンサーが挙げられるが、これらに限定されない。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、ＩＴＲは、導入遺伝子のプロモーターとして作用し得る。本明細書の態様及び実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、導入遺伝子の発現を調節するための追加成分、例えば、２０１８年９月７日に出願された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０４９９９６号に記載される調節スイッチを含み、導入遺伝子、又はｃｅＤＮＡベクターを含む細胞を殺傷し得るキルスイッチの発現を調節する。

【0203】

本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、発現カセットはまた、導入遺伝子の発現を増加させるために、転写後エレメントを含み得る。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、ウッドチャック肝炎ウイルス（ＷＨＰ）転写後調節エレメント（Woodchuck Hepatitis Virus posttranscriptional regulatory element、ＷＰＲＥ）を使用して、導入遺伝子の発現を増加させる。他の転写後処理エレメント、例えば、単純ヘルペスウイルス又はＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）のチミジンキナーゼ遺伝子からの転写後エレメントを使用することができる。分泌配列は、導入遺伝子、例えば、ＶＨ－０２及びＶＫ－Ａ２６配列に連結され得る。発現カセットは、例えば、ウシＢＧＨｐＡ若しくはウイルスＳＶ４０ｐＡから単離された天然配列、又は合成配列等の、当該技術分野において既知のポリアデニル化配列又はその変形を含み得る。いくつかの発現カセットはまた、ＳＶ４０後期ポリＡシグナル上流エンハンサー（ＵＳＥ）配列を含み得る。ＵＳＥは、ＳＶ４０ｐＡ又は異種ポリＡシグナルと組み合わせて使用され得る。

【0204】

２０１８年９月７日に出願され、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０５００４２号の図１Ａ～図１Ｃは、非限定の例示的なｃｅＤＮＡベクター、又はｃｅＤＮＡプラスミドの対応する配列の概略図を示し、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。ｃｅＤＮＡベクターは、カプシド不含であり、第１のＩＴＲ、発現可能な導入遺伝子カセット、及び第２のＩＴＲをこの順にコードするプラスミドから取得され得、第１及び／又は第２のＩＴＲ配列のうちの少なくとも１つは、対応する野生型ＡＡＶ２ ＩＴＲ配列に関して変異する。発現可能な導入遺伝子カセットは、好ましくは、エンハンサー／プロモーター、ＯＲＦレポーター（導入遺伝子）、転写後調節エレメント（例えば、ＷＰＲＥ）、並びにポリアデニル化及び終結シグナル（例えば、ＢＧＨポリＡ）のうちの１つ以上をこの順序で含む。

【0205】

プロモーター
上記のものを含む好適なプロモーターは、ウイルスに由来し得るため、ウイルスプロモーターと称され得るか、又はそれらは、原核生物又は真核生物を含む任意の生物に由来し得る。好適なプロモーターを使用して、任意のＲＮＡポリメラーゼ（例えば、ｐｏｌ Ｉ、ｐｏｌ ＩＩ、ｐｏｌ ＩＩＩ）によって発現を駆動することができる。例示的なプロモーターとしては、ＳＶ４０初期プロモーター、マウス乳房腫瘍ウイルスの長い末端反復配列（long terminal repeat、ＬＴＲ）プロモーター；アデノウイルス主要後期プロモーター（adenovirus major late promoter、Ａｄ ＭＬＰ）；単純ヘルペスウイルス（herpes simplex virus、ＨＳＶ）プロモーター、サイトメガロウイルス（cytomegalovirus、ＣＭＶ）プロモーター、例えば、ＣＭＶ最初期プロモーター領域（ＣＭＶＴＥ）、ラウス肉腫ウイルス（rous sarcoma virus、ＲＳＶ）プロモーター、ヒトＵ６小核プロモーター（Ｕ６、例えば、（Ｍｉｙａｇｉｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２０，４９７－５００（２００２））、増強されたＵ６プロモーター（例えば、Ｘｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２００３ Ｓｅｐ．１；３１（１７））、ヒトＨ１プロモーター（Ｈ１）、ＣＡＧプロモーター、ヒトアルファ１－アンチトリプシン（human alpha l-antitrypsin、ＨＡＡＴ）プロモーター（例えば、その他同種のもの）が挙げられる。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、これらのプロモーターは、それらの下流イントロン含有端で変更されて、１つ以上のヌクレアーゼ切断部位を含む。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、ヌクレアーゼ切断部位を含有するＤＮＡは、プロモーターＤＮＡに対して外来である。

【0206】

本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、プロモーターは、１つ以上の特定の転写調節配列を含むことにより、発現を更に増強する、並びに／又はその空間的発現及び／若しくは時間的発現を変更することができる。プロモーターはまた、転写の開始部位から数千塩基対も離れて位置し得る遠位エンハンサー又はリプレッサーエレメントを含み得る。プロモーターは、ウイルス、細菌、真菌、植物、昆虫、及び動物を含む供給源に由来し得る。プロモーターは、発現が起こる細胞、組織若しくは器官に関して、又は発現が起こる発達段階に関して、又は生理学的ストレス、病原体、金属イオン、若しくは誘導剤等の外部刺激に応答して、構成的又は示差的に遺伝子成分の発現を調節し得る。プロモーターの代表的な例としては、バクテリオファージＴ７プロモーター、バクテリオファージＴ３プロモーター、ＳＰ６プロモーター、ｌａｃオペレータープロモーター、ｔａｃプロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ＲＳＶ－ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶ ＩＥプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター又はＳＶ４０後期プロモーター及びＣＭＶ ＩＥプロモーター、並びに以下に列挙されるプロモーターが挙げられる。そのようなプロモーター及び／又はエンハンサーは、目的の任意の遺伝子、例えば、治療用タンパク質）の発現に使用できる。例えば、ベクターは、治療用タンパク質をコードする核酸配列に操作可能に連結されるプロモーターを含み得る。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、治療用タンパク質コード配列に操作可能に連結されたプロモーターは、シミアンウイルス４０（simian virus 40、ＳＶ４０）由来のプロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルス（mouse mammary tumor virus、ＭＭＴＶ）プロモーター、ヒト免疫不全ウイルス（human immunodeficiency virus、ＨＩＶ）プロモーター、例えば、ウシ免疫不全ウイルス（bovine immunodeficiency virus、ＢＩＶ）の長い末端反復（ＬＴＲ）プロモーター、モロニーウイルスプロモーター、トリ白血病ウイルス（avian leukosis virus、ＡＬＶ）プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、例えば、ＣＭＶ最初期プロモーター、エプスタインバーウイルス（Epstein Barr virus、ＥＢＶ）プロモーター、又はラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーターであり得る。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、プロモーターはまた、ヒトユビキチンＣ（human ubiquitin C、ｈＵｂＣ）、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチン、又はヒトメタロチオネイン等のヒト遺伝子からのプロモーターであってもよい。プロモーターはまた、天然又は合成の、組織特異的プロモーター、例えば、肝臓特異的プロモーター、例えば、ヒトアルファ１－抗トリプシン（ＨＡＡＴ）又はトランスサイレチン（transthyretin、ＴＴＲ）であり得る。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、肝臓への送達は、肝細胞の表面上に存在する低密度リポタンパク質（low-density lipoprotein、ＬＤＬ）受容体を介して、肝細胞へのｃｅＤＮＡベクターを含む組成物の内因性ＡｐｏＥ特異的標的を使用して達成され得る。

【0207】

本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、使用されるプロモーターは、治療用タンパク質をコードする遺伝子のネイティブプロモーターである。治療用タンパク質をコードするそれぞれの遺伝子のプロモーター及び他の調節配列は既知であり、特徴付けられている。使用されるプロモーター領域は、当技術分野において既知のエンハンサー（例えば、Ｓｅｒｐｉｎエンハンサー）等の１つ以上の追加の調節配列（例えば、天然）を更に含んでもよい。

【0208】

本発明に従って使用するための好適なプロモーターの非限定例としては、例えば、ＣＡＧプロモーター、ＨＡＡＴプロモーター、ヒトＥＦ１－αプロモーター、又はＥＦ１－αプロモーター及びラットＥＦ１－αプロモーターの断片が挙げられる。

【0209】

ポリアデニル化配列
ポリアデニル化配列をコードする配列は、ｃｅＤＮＡベクターから発現されたｍＲＮＡを安定化するため、及び核輸送及び翻訳を助けるために、ｃｅＤＮＡベクター中に含まれ得る。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、ポリアデニル化配列を含まない。他の実施形態では、ベクターは、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０以上のアデニンジヌクレオチドを含む。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、ポリアデニル化配列は、約４３ヌクレオチド、約４０～５０ヌクレオチド、約４０～５５ヌクレオチド、約４５～５０ヌクレオチド、約３５～５０ヌクレオチド、又はその間の任意の範囲を含む。

【0210】

本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、ｃｅＤＮＡは、２つの異なる逆位末端反復配列（ＩＴＲ）（例えば、ＡＡＶ ＩＴＲ）の間に作動可能に位置付けられた異種核酸をコードするベクターポリヌクレオチドから取得可能であり、ＩＴＲのうちの少なくとも１つは、末端分解部位及び複製タンパク質結合部位（ＲＰＳ）、例えば、Ｒｅｐ結合部位（例えば、ｗｔ ＡＡＶ ＩＴＲ）を含み、ＩＴＲのうちの１つは、他のＩＴＲ、例えば機能的ＩＴＲに関する欠失、挿入、及び／又は置換を含む。

【0211】

本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、宿主細胞はウイルスカプシドタンパク質を発現せず、ポリヌクレオチドベクターテンプレートは任意のウイルスカプシドコード配列を欠いている。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、ポリヌクレオチドベクターテンプレートは、ＡＡＶカプシド遺伝子を欠いているが、他のウイルスのカプシド遺伝子も欠いている）。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、核酸分子はまた、ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質コード配列を欠いている。したがって、本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、本発明の核酸分子は、機能的なＡＡＶキャップ及びＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子の両方を欠いている。

【0212】

本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、修飾型ＩＴＲを有さない。

【0213】

本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、本明細書に開示される（又は、２０１８年９月７日に出願された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０４９９９６号において）調節スイッチを含む。

【0214】

Ｖ．ｃｅＤＮＡベクターの産生
本明細書で定義される非対称ＩＴＲ対又は対称ＩＴＲ対を含む本明細書に記載のｃｅＤＮＡベクターの産生のための方法は、２０１８年９月７日に出願された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０４９９９６号のセクションＩＶに記載されており、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。本明細書に記載されるように、ｃｅＤＮＡベクターは、例えば、プロセスであって、ａ）ポリヌクレオチド発現構築物テンプレート（例えば、ｃｅＤＮＡ－プラスミド、ｃｅＤＮＡ－バクミド、及び／又はｃｅＤＮＡ－バキュロウイルス）を内包する宿主細胞（例えば、昆虫細胞）の集団をインキュベートするステップであって、Ｒｅｐタンパク質の存在下では、宿主細胞内のｃｅＤＮＡベクターの産生を誘導するために効果的な条件下、かつそのために十分な時間にわたってウイルスカプシドコード配列を欠いており、宿主細胞が、ウイルスカプシドコード配列を含まない、インキュベートするステップと、ｂ）ｃｅＤＮＡベクターを宿主細胞から採取し、単離するステップと、を含む、プロセスによって取得され得る。Ｒｅｐタンパク質の存在は、修飾型ＩＴＲを有するベクターポリヌクレオチドの複製を誘導して、宿主細胞中でｃｅＤＮＡベクターを産生する。

【0215】

但し、ウイルス粒子（例えば、ＡＡＶビリオン）は発現されない。したがって、ＡＡＶ又は他のウイルスベースベクターにおいて天然に課されるもの等のサイズ制限はない。

【0216】

宿主細胞から単離されたｃｅＤＮＡベクターの存在は、宿主細胞から単離されたＤＮＡをｃｅＤＮＡベクター上に単一認識部位を有する制限酵素で消化すること、並びに消化されたＤＮＡ材料を非変性ゲル上で分析して、直鎖状かつ非連続的なＤＮＡと比較して特徴的な直鎖状かつ連続的なＤＮＡのバンドの存在を確認することによって確認され得る。

【0217】

本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、本発明は、例えば、Ｌｅｅ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｐｌｏｓ Ｏｎｅ ８（８）：ｅ６９８７９に記載されているように、非ウイルス性ＤＮＡベクターの産生において、ＤＮＡベクターポリヌクレオチド発現テンプレート（ｃｅＤＮＡテンプレート）をそれら自体のゲノムに安定して組み込んでいる宿主細胞株の使用を提供する。好ましくは、Ｒｅｐは、約３のＭＯＩで宿主細胞に付加される。宿主細胞株が哺乳動物細胞株、例えば、ＨＥＫ２９３細胞である場合、細胞株は、安定して組み込まれたポリヌクレオチドベクターテンプレートを有し得、ヘルペスウイルス等の第２のベクターを使用して、Ｒｅｐタンパク質を細胞に導入することができ、Ｒｅｐ及びヘルパーウイルスの存在下でのｃｅＤＮＡの切除及び増幅を可能にする。

【0218】

本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクターを作製するために使用される宿主細胞は、昆虫細胞であり、バキュロウイルスは、Ｒｅｐタンパク質をコードするポリヌクレオチドと、ｃｅＤＮＡの非ウイルスＤＮＡベクターポリヌクレオチド発現構築物テンプレートとを両方送達するために使用される。本明細書の態様及び実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、宿主細胞は、Ｒｅｐタンパク質を発現するように操作されている。

【0219】

次いで、ｃｅＤＮＡベクターは、宿主細胞から採取され、単離される。本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクターを細胞から採取及び収集するための時間は、ｃｅＤＮＡベクターの高収率産生を達成するために選択され、最適化され得る。例えば、採取時間は、細胞生存率、細胞形態論、細胞増殖等を考慮して選択され得る。本明細書の態様及び実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、十分な条件下で細胞は増殖し、ｃｅＤＮＡベクターを産生するためのバキュロウイルス感染から十分な時間が経過した後、但し細胞のほとんどがバキュロウイルスの毒性のために死滅し始める前に採取される。ＤＮＡベクターは、Ｑｉａｇｅｎ Ｅｎｄｏ－Ｆｒｅｅプラスミドキット等のプラスミド精製キットを使用して単離され得る。プラスミド単離のために開発された他の方法もまた、ＤＮＡベクターに対して適合され得る。一般に、任意の核酸精製方法が採用され得る。

【0220】

ＤＮＡベクターは、ＤＮＡの精製のための当業者に既知の任意の手段によって精製され得る。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターはＤＮＡ分子として精製される。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、エクソソーム又は微小粒子として精製される。ｃｅＤＮＡベクターの存在は、細胞から単離されたベクターＤＮＡをＤＮＡベクター上に単一認識部位を有する制限酵素で消化すること、並びにゲル電気泳動を使用し、消化されたＤＮＡ材料及び未消化のＤＮＡ材料の両方を分析して、直鎖状かつ非連続的なＤＮＡと比較して特徴的な直鎖状かつ連続的なＤＮＡのバンドの存在を確認することによって確認され得る。

【0221】

ＶＩ． 脂質粒子の調製
脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）は、ＴＮＡ（例えば、ｃｅＤＮＡ）及び脂質の混合時に自発的に形成することができる。所望の粒子サイズ分布に応じて、得られたナノ粒子混合物は、例えば、Ｌｉｐｅｘ Ｅｘｔｒｕｄｅｒ（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｌｉｐｉｄｓ，Ｉｎｃ）等のサーモバレル押出機を使用して、膜（例えば、１００ｎｍカットオフ）を通して押し出すことができる。場合によっては、押し出しステップは省略することができる。エタノール除去及び同時緩衝液交換は、例えば、透析又はタンジェンシャルフロー濾過によって達成され得る。

【0222】

一般に、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）は、当該技術分野において既知の任意の方法によって形成することができる。例えば、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）は、例えば、米国特許出願公開第ＵＳ２０１３／００３７９７７号、同第ＵＳ２０１０／００１５２１８号、同第ＵＳ２０１３／０１５６８４５号、同第ＵＳ２０１３／０１６４４００号、同第ＵＳ２０１２／０２２５１２９号、及び同第ＵＳ２０１０／０１３０５８８号に記載されている方法によって調製することができ、これらの各々の内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）は、連続混合法、直接希釈プロセス、又はインライン希釈プロセスを使用して調製することができる。直接希釈及びインライン希釈プロセスを使用して脂質ナノ粒子を調製するための装置のプロセス及び装置は、米国特許出願公開第２００７／００４２０３１号に記載されており、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。段階希釈プロセスを使用して脂質ナノ粒子を調製するためのプロセス及び装置は、米国特許出願公開第ＵＳ２００４／０１４２０２５号に記載されており、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0223】

本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）は、衝突ジェットプロセスによって調製することができる。一般に、粒子は、アルコール（例えば、エタノール）に溶解した脂質を、緩衝液、例えば、クエン酸緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液、酢酸ナトリウム及び塩化マグネシウム緩衝液、リンゴ酸緩衝液、リンゴ酸及び塩化ナトリウム緩衝液、又はクエン酸ナトリウム及び塩化ナトリウム緩衝液に溶解したｃｅＤＮＡと混合することによって形成される。ｃｅＤＮＡに対する脂質の混合比は、約４５～５５％の脂質及び約６５～４５％のｃｅＤＮＡであり得る。

【0224】

脂質溶液は、アルコール、例えばエタノール中に、５～３０ｍｇ／ｍＬ、よりおそらく５～１５ｍｇ／ｍＬ、最もおそらく９～１２ｍｇ／ｍＬの全脂質濃度で、開示されたカチオン性脂質、非カチオン性脂質（例えば、ＤＳＰＣ、ＤＯＰＥ、及びＤＯＰＣ等のリン脂質）、１つ以上のＰＥＧ化脂質、及びステロール（例えば、コレステロール）を含有することができる。脂質溶液において、脂質のモル比は、カチオン性脂質について約２５～９８％、例えば、約３５～６５％の範囲であり得、非イオン性脂質について約０～１５％、例えば約０～１２％の範囲であり得、ＰＥＧ化脂質については約０～１５％、例えば約１～６％の範囲であり得、ステロールンについては約０～７５％、例えば約３０～５０％の範囲であり得る。

【0225】

ｃｅＤＮＡ溶液は、３．５～５の範囲のｐＨを有する、緩衝溶液中に０．３～１．０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは、０．３～０．９ｍｇ／ｍＬの濃度範囲でｃｅＤＮＡを含むことができる。

【0226】

ＬＮＰを形成するために、１つの例示的であるが非限定的な実施形態では、２つの液体は、約１５～４０℃、好ましくは約３０～４０℃の範囲の温度に加熱され、次いで、例えば、衝突ジェットミキサーにおいて混合され、即座にＬＮＰを形成する。混合流量は、１０～６００ｍＬ／分の範囲であり得る。チューブＩＤは、０．２５～１．０ｍｍの範囲を有し、１０～６００ｍＬ／分の全流量であり得る。流量とチューブＩＤとの組み合わせは、ＬＮＰの粒子サイズを３０ｎｍ～２００ｎｍに制御する効果を有し得る。次いで、溶液を、より高いｐＨで、１：１～１：３の体積：体積、好ましくは約１：２の体積：体積の範囲の混合比で緩衝溶液と混合することができる。必要に応じて、この緩衝溶液は、１５～４０℃又は３０～４０℃の範囲の温度になり得る。次いで、混合されたＬＮＰは、アニオン交換濾過ステップを受けることができる。アニオン交換の前に、混合されたＬＮＰを一定期間、例えば、３０分～２時間インキュベートすることができる。インキュベーション中の温度は、１５～４０℃又は３０～４０℃の範囲の温度になり得る。インキュベーション後、アニオン交換分離ステップを含む０．８μｍフィルター等のフィルターで溶液を濾過する。このプロセスでは、１ｍｍのＩＤ～５ｍｍのＩＤの範囲のチューブＩＤ及び１０～２０００ｍＬ／分の流量を使用できる。

【0227】

形成後、ＬＮＰを濃縮し、限外濾過プロセスを介して限界濾過することができ、このプロセスでは、アルコールが除去され、緩衝液が最終的な緩衝溶液、例えば、約ｐＨ７、例えば約ｐＨ６．９、約ｐＨ７．０、約ｐＨ７．１、約ｐＨ７．２、約ｐＨ７．３、又は約ｐＨ７．４のリン酸緩衝生理食塩水（phosphate buffered saline、ＰＢＳ）と交換される。

【0228】

限外濾過プロセスでは、膜の公称分子量カットオフ範囲が３０～５００ｋＤのタンジェンシャルフロー濾過フォーマット（tangential flow filtration format、ＴＦＦ）を使用できる。膜フォーマットは中空糸又はフラットシートカセットである。適切な分子量カットオフのＴＦＦプロセスでは、保持液にＬＮＰを保持することができ、濾液又は透過液はアルコール、クエン酸緩衝液及び最終緩衝液の廃棄物を含有する。ＴＦＦプロセスは、初期濃度が１～３ｍｇ／ｍＬのｃｅＤＮＡ濃度になる複数ステップのプロセスである。濃縮後、ＬＮＰ溶液を最終緩衝液に対して１０～２０容量で限界濾過し、アルコールを除去して緩衝液交換を実施する。次いで、材料を更に１～３倍に濃縮することができる。濃縮されたＬＮＰ溶液は滅菌濾過できる。

【0229】

ＶＩＩ． 薬学的組成物及び製剤
本明細書では、ＴＮＡ脂質粒子と、薬学的に許容される担体又は賦形剤と、を含む、薬学的組成物もまた提供される。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、本発明は更に、本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかのいずれかの実施形態に記載のカチオン性脂質、又は本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかのいずれかの実施形態に記載の脂質ナノ粒子、及び薬学的に許容される賦形剤を含む薬学的組成物に関する。

【0230】

一般に、本発明の脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）は、意図した治療効果を提供するように選択された平均直径を有する。

【0231】

脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）の意図した使用に応じて、構成成分の割合は変化し得、特定の製剤の送達効率は、例えば、エンドソーム放出パラメータ（endosomal release parameter、ＥＲＰ）アッセイを使用して測定され得る。

【0232】

本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、ｃｅＤＮＡは、粒子の脂質部分と複合され得るか、又は脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）の脂質位置に封入され得る。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、ｃｅＤＮＡは、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）の脂質位置に完全に封入され得、それによって例えば水溶液中のヌクレアーゼによる分解からそれを保護する。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）中のｃｅＤＮＡは、３７℃で少なくとも約２０、３０、４５、又は６０分間のヌクレアーゼへの脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）の曝露後に実質的に分解されない。本明細書の態様及び実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）中のｃｅＤＮＡは、３７℃で少なくとも約３０、約４５、若しくは約６０分、又は少なくとも約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１２、約１４、約１６、約１８、約２０、約２２、約２４、約２６、約２８、約３０、約３２、約３４、若しくは約３６時間の血清中の粒子のインキュベーション後に実質的に分解されない。

【0233】

本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）は、対象、例えばヒト等の哺乳動物に対して実質的に非毒性である。

【0234】

本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、本開示の治療用核酸を含む医薬組成物は、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）に製剤化され得る。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、治療用核酸を含む脂質粒子は、開示されたカチオン性脂質から形成することができる。いくつかの他の実施形態では、治療用核酸を含む脂質粒子は、非カチオン性脂質から形成され得る。好ましい実施形態では、本発明の脂質粒子は、核酸を含有する脂質粒子であり、これは、ｍＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ及びオリゴヌクレオチド、リボザイム、アプタマー、干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）、ダイサー基質ｄｓＲＮＡ、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、非対称干渉ＲＮＡ（ａｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ミニサークルＤＮＡ、ミニ遺伝子、ウイルス性ＤＮＡ（例えば、レンチウイルス若しくはＡＡＶゲノム）又は非ウイルス性合成ＤＮＡベクター、閉端直鎖状二重鎖ＤＮＡ（ｃｅＤＮＡ／ＣＥＬｉＤ）、プラスミド、バクミド、ｄｏｇｇｙｂｏｎｅ（商標）ＤＮＡベクター、最小限の免疫学的に定義された遺伝子発現（ＭＩＤＧＥ）ベクター、非ウイルス性ミニストリングＤＮＡベクター（直鎖状共有結合性閉鎖ＤＮＡベクター）、又はダンベル型ＤＮＡ最小ベクター（「ダンベルＤＮＡ」）からなる群から選択される治療用核酸を含む開示されたカチオン性脂質から形成される。

【0235】

別の好ましい実施形態では、本発明の脂質粒子は核酸含有脂質粒子であり、これは非カチオン性脂質、及び任意選択で粒子の凝集を防止するＰＥＧ化脂質又はコンジュゲートされた脂質の他の形態から形成される。

【0236】

本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、脂質粒子製剤は水溶液である。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）製剤は、凍結乾燥粉末である。

【0237】

いくつかの態様によれば、本開示は、１つ以上の薬学的賦形剤を更に含む脂質粒子製剤を提供する。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）製剤は、スクロース、トリス、トレハロース、及び／又はグリシンを更に含む。

【0238】

本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、本明細書に開示される脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）は、対象の細胞、組織、又は器官へのインビボ送達のために対象に投与するのに好適な医薬組成物に組み込まれ得る。典型的に、医薬組成物は、本明細書に開示されるＴＮＡ脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）及び薬学的に許容される担体を含む。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、本開示のＴＮＡ脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）は、治療的投与（例えば、非経口投与）の所望の経路に適した医薬組成物に組み込むことができる。高圧静脈内又は動脈内注入を介した受動組織形質導入、同様に、核内微量注射若しくは細胞質内注射等の細胞内注射もまた、企図される。治療目的のための医薬組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、分散液、リポソーム、又は高ｃｅＤＮＡベクター濃度に好適な他の秩序構造として製剤化され得る。無菌の注射可能な溶液は、適切な緩衝液中の必要量のｃｅＤＮＡベクター化合物を、必要に応じて、上記で列挙した成分のうちの１つ又は組み合わせと組み込み、濾過滅菌によって調製され得る。

【0239】

本明細書に開示される脂質粒子は、局所、全身、羊膜内、くも膜下腔内、頭蓋内、動脈内、静脈内、リンパ内、腹腔内、皮下、気管、組織内（例えば、筋肉内、心臓内、肝内、腎臓内、脳内）、くも膜下腔内、膀胱内、結膜（例えば、眼窩外、眼窩内、眼窩後、網膜内、網膜下、脈絡膜、脈絡膜下、間質内、房内、及び硝子体内）、蝸牛内、並びに粘膜（例えば、経口、直腸、経鼻）投与に好適な薬学的組成物に組み込むことができる。高圧静脈内又は動脈内注入を介した受動組織形質導入、同様に、核内微量注射若しくは細胞質内注射等の細胞内注射もまた、企図される。

【0240】

ＴＮＡ脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）を含む薬学的に活性な組成物は、核酸中の導入遺伝子をレシピエントの細胞に送達するように製剤化され得、その中の導入遺伝子の治療的発現をもたらす。この組成物はまた、薬学的に許容される担体を含み得る。

【0241】

治療目的のための医薬組成物は、典型的に、無菌であり、製造及び貯蔵の条件下で安定している。組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、分散液、リポソーム、又は高ｃｅＤＮＡベクター濃度に好適な他の秩序構造として製剤化され得る。無菌の注射可能な溶液は、適切な緩衝液中の必要量のｃｅＤＮＡベクター化合物を、必要に応じて、上記で列挙した成分のうちの１つ又は組み合わせと組み込み、濾過滅菌によって調製され得る。

【0242】

本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）は、少なくとも１つの脂質二層を有する固体コア粒子である。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）は、非二層構造、すなわち非ラメラ（すなわち、非二層）形態を有する。無制限に、非二層形態としては、例えば、三次元チューブ、棒、立方対称性等が挙げられ得る。脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）の非ラメラ形態（すなわち、非二層構造）は、当業者に既知であり、当業者によって使用される分析技法を使用して決定され得る。そのような技法としては、低温透過型電子顕微鏡（Cryo-Transmission Electron Microscopy、「Ｃｒｙｏ－ＴＥＭ」）、示差走査熱量計（Differential Scanning calorimetry、「ＤＳＣ」）、Ｘ線回折等が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、脂質粒子の形態（ラメラ対非ラメラ）は、例えば、米国特許出願公開第２０１０／０１３０５８８号に記載されているＣｒｙｏ－ＴＥＭ分析を使用して容易に評価され、特徴付けられ得、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0243】

本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、非ラメラ形態を有する脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）は、高電子密度である。

【0244】

本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、本開示は、単一ラメラ構造又は多ラメラ構造のいずれかである脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）を提供する。いくつかの態様では、本開示は、多胞体粒子及び／又は発泡ベース粒子を含む脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）製剤を提供する。脂質構成成分の組成物及び濃度を制御することによって、コンジュゲートされた脂質が脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）外で交換する速度、順に脂質ナノ粒子が膜融合性になる速度を制御することができる。加えて、例えば、ｐＨ、温度、又はイオン強度を含む他の変数を使用して、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）が膜融合性になる速度を変化及び／又は制御することができる。脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）が膜融合性になる速度を制御するために使用され得る他の方法は、本開示に基づいて当業者に明らかとなるであろう。コンジュゲートされた脂質の組成物及び濃度を制御することによって、脂質粒径を制御することができることも明らかとなるであろう。

【0245】

本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、製剤化されたカチオン性脂質のｐＫａは、核酸の送達のためのＬＮＰの有効性と相関させることができる（Ｊａｙａｒａｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ （２０１２），５１（３４），８５２９－８５３３、Ｓｅｍｐｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２８，１７２－１７６（２０１０）を参照されたい（これらはいずれも、参照によりその全体が組み込まれる））。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、ｐＫａの好ましい範囲は、約５～約８である。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、ｐＫａの好ましい範囲は、約６～約７である。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、好ましいｐＫａは、約６．５である。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、カチオン性脂質のｐＫａは、２－（ｐ－トルイジノ）－６－ナフタレンスルホン酸（ＴＮＳ）の蛍光に基づくアッセイを使用し、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）中で決定され得る。

【0246】

本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）中のｃｅＤＮＡの封入は、核酸と会合したときに蛍光を強化した色素を使用する、膜不透過性蛍光色素排除アッセイ、例えばＯｌｉｇｒｅｅｎ（登録商標）アッセイ又はＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（登録商標）アッセイを実施することによって決定され得る。一般に、封入は、脂質粒子製剤に色素を添加し、得られた蛍光を測定し、それを少量の非イオン性界面活性剤の添加時に観察される蛍光と比較することによって決定される。脂質二層の界面活性剤媒介性崩壊は、封入されたｃｅＤＮＡを放出し、それが膜不透過性色素と相互作用することを可能にする。ｃｅＤＮＡの封入は、Ｅ＝（Ｉｏ－Ｉ）／Ｉｏとして計算することができ、Ｉ及びＩｏは、界面活性剤の添加前及び添加後の蛍光強度を指す。

【0247】

単位投与量
本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、薬学的組成物は、単位剤形で提供することができる。単位剤形は、典型的に、薬学的組成物の１つ以上の投与経路に適合されるであろう。本明細書の態様及び実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、単位剤形は、吸入による投与に適合されている。本明細書の態様及び実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、単位剤形は、吸入器による投与に適合されている。本明細書の態様及び実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、単位剤形は、噴霧器による投与に適合されている。本明細書の態様及び実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、単位剤形は、エアロゾル化器による投与に適合されている。本明細書の態様及び実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、単位剤形は、経口投与のため、頬側投与のため、又は舌下投与のために適合されている。本明細書の態様及び実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、単位剤形は、静脈内、筋肉内、又は皮下投与に適合されている。本明細書の態様及び実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、単位剤形は、髄腔内又は脳室内投与に適合されている。本明細書の態様及び実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、薬学的組成物は、局所投与用に製剤化されている。単一剤形を産生するために担体材料と組み合わされ得る活性成分の量は、一般に、治療効果をもたらす化合物の量となるであろう。

【0248】

ＶＩＩＩ．治療方法
本明細書に記載の脂質ナノ粒子及び方法（例えば、本明細書に記載のＴＮＡ脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子））を使用して、宿主細胞に核酸配列（例えば、治療用核酸配列）を導入することができる。本明細書の態様及び実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、ＴＮＡ ＬＮＰ（例えば、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクター脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子））を使用する宿主細胞への核酸配列の導入を、治療された患者からの適切なバイオマーカーでモニタリングして、遺伝子発現を評価することができる。

【0249】

本明細書に提供されるＬＮＰ組成物を使用して、様々な目的のために導入遺伝子（核酸配列）を送達することができる。本明細書の態様及び実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、ｃｅＤＮＡベクター（例えば、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクター脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子））は、例えば、エクスサイチュ、インビトロ及びインビボの適用、方法論、診断手順、及び／又は遺伝子療法計画を含む、様々な方法で使用することができる。

【0250】

本明細書では、治療有効量のＴＮＡ ＬＮＰ（例えば、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクター脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子））を、任意選択で薬学的に許容される担体とともに、治療を必要とする対象の標的細胞（例えば、肝細胞、筋細胞、腎細胞、神経細胞、又は他の罹患した細胞型）に導入することを含む、対象における疾患又は障害を治療する方法が提供される。実装されるＴＮＡ ＬＮＰ（例えば、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクター脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子））は、疾患を治療するために有用な目的のヌクレオチド配列を含む。特に、ＴＮＡは、対象に導入されたときに、外因性ＤＮＡ配列によってコードされる所望のポリペプチド、タンパク質、又はオリゴヌクレオチドの転写を指示することができる制御エレメントに操作可能に連結された所望の外因性ＤＮＡ配列を含み得る。ＴＮＡ ＬＮＰ（例えば、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクター脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子））は、本明細書に記載され、当該技術分野において既知の任意の好適な経路を介して投与することができる。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、標的細胞は、ヒト対象内にある。

【0251】

本明細書では、診断有効量若しくは治療有効量のＴＮＡ ＬＮＰ（本明細書に記載の例えばｃｅＤＮＡベクターリピド粒子（例えば、リピドナノ粒子））を、それを必要とする対象に提供する方法であって、それを必要とする対象の組織又は臓器に、ある量のＴＮＡ ＬＮＰ（例えば、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクター脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子））を提供することと、ＴＮＡ ＬＮＰからの導入遺伝子の発現を可能にするのに有効な時間の間、診断有効量若しくは治療有効量の、ＴＮＡ ＬＮＰ（例えば、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクターリピド粒子（例えば、脂質ナノ粒子））によって発現されるタンパク質、ペプチド、核酸を対象に提供することと、を含む、方法が提供される。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、対象はヒトである。

【0252】

本明細書では、対象における疾患、障害、機能不全、傷害、異常状態、又は外傷のうちの少なくとも１つ以上の症状を診断、予防、治療、又は改善するための方法が提供される。一般に、この方法は、ＴＮＡ ＬＮＰ（例えば、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクター脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子））を、それを必要とする対象に、対象の疾患、障害、機能不全、傷害、異常状態、又は外傷の１つ以上の症状を診断、予防、治療、又は改善するのに十分な量及び時間にわたって投与するステップを少なくとも含む。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、対象はヒトである。

【0253】

本明細書では、疾患又は疾患状態の１つ以上の症状を治療するためのツールとしてＴＮＡ ＬＮＰを使用するための方法が提供される。欠陥遺伝子が知られているいくつかの遺伝性疾患が存在し、典型的に、通常は一般に劣性的に遺伝される酵素の欠乏状態と、調節又は構造タンパク質に関与し得るが、典型的に常に優性的に遺伝されるとは限らない不均衡状態との２つのクラスに分類される。欠乏状態の疾患の場合、ＴＮＡ ＬＮＰ（例えば、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクター脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子））を使用し、導入遺伝子を送達して、置換療法のために正常な遺伝子を罹患した組織に運び入れるとともに、本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、アンチセンス変異を使用して、疾患の動物モデルを創り出すことができる。不均衡疾患状態の場合、ＴＮＡ ＬＮＰ（例えば、ｃｅＤＮＡベクター脂質粒子）を使用して、モデルシステムにおいて疾患状態を創り出すことができ、次いでこれを使用して、その疾患状態に反作用するように試みることができる。したがって、本明細書に開示されるＴＮＡ ＬＮＰ（例えば、ｃｅＤＮＡベクター脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子））及び方法は、遺伝子疾患の治療を可能にする。本明細書で使用される場合、疾患状態は、疾患を引き起こす、又はそれをより重篤にする欠乏又は不均衡を部分的又は全体的に修繕することによって治療される。

【0254】

一般に、上記の説明に従ってＴＮＡ ＬＮＰ（例えば、ｃｅＤＮＡベクター脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子））を使用して任意の導入遺伝子を送達して、遺伝子発現に関する任意の障害に関連する症状を治療、予防、又は改善することができる。例示的な疾患状態としては、嚢胞性線維症（及び他の肺の疾患）、血友病Ａ、血友病Ｂ、サラセミア、貧血症及び他の血液障害、ＡＩＤＳ、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、てんかん及び他の神経障害、がん、糖尿病、筋ジストロフィー（例えば、デュシェンヌ型、ベッカー型）、ハーラー病、アデノシンデアミナーゼ欠損症、代謝障害、網膜変性疾患（及び他の眼の疾患）、ミトコンドリオパチー（例えば、レーバー遺伝性視神経症（Leber's hereditary optic neuropathy、ＬＨＯＮ）、リー症候群、及び亜急性硬化性脳炎）、ミオパチー（例えば、顔面肩甲上腕型ミオパチー（ＦＳＨＤ）及び心筋症）、固形臓器（例えば、脳、肝臓、腎臓、心臓）の疾患等が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、本明細書に開示されるようなｃｅＤＮＡベクターは、代謝障害（例えば、オルニチントランスカルバミラーゼ欠損症）を有する個人の治療において有利に使用され得る。

【0255】

本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、本明細書に記載されるＴＮＡ ＬＮＰを使用して、遺伝子又は遺伝子産物中の変異によって引き起こされる疾患又は障害を治療、改善、及び／又は予防することができる。ＴＮＡ ＬＮＰ（例えば、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクター脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子））で治療することができる例示的な疾患又は障害としては、代謝性疾患又は障害（例えば、ファブリー病、ゴーシェ病、フェニルケトン尿症（phenylketonuria、ＰＫＵ）、糖原病）；尿素サイクル疾患又は障害（例えば、オルニチントランスカルバミラーゼ（ornithine transcarbamylase、ＯＴＣ）欠損症）；リソソーム蓄積症又は障害（例えば、異染性白質ジストロフィー（metachromatic leukodystrophy、ＭＬＤ）、ＩＩ型ムコ多糖症（ＭＰＳＩＩ；ハンター症候群））；肝臓の疾患又は障害（例えば、進行性家族性肝内胆汁うっ滞（progressive familial intrahepatic cholestasis、ＰＦＩＣ）；血液疾患又は障害（例えば、血友病Ａ及びＢ、サラセミア、並びに貧血）；がん及び腫瘍、並びに遺伝性疾患又は障害（例えば、嚢胞性線維症）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0256】

本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、ＴＮＡ ＬＮＰ（例えば、ｃｅＤＮＡベクター脂質粒子）を用いて、導入遺伝子（例えば、ホルモン又は増殖因子をコードする導入遺伝子）の発現レベルを調節することが望ましい状況において、異種ヌクレオチド配列を送達することができる。

【0257】

本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、ＴＮＡ ＬＮＰ（例えば、ｃｅＤＮＡベクター脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子））を使用して、疾患又は障害をもたらす遺伝子産物の異常なレベル及び／又は機能（例えば、タンパク質中の不在又は欠損）を訂正することができる。ＴＮＡ ＬＮＰ（例えば、ｃｅＤＮＡベクター脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子））は、機能的タンパク質を産生し、かつ／又はタンパク質のレベルを修復して、タンパク質中の不在若しくは欠損によって引き起こされる特定の疾患若しくは障害から生じる症状を緩和若しくは低減するか、又は利益を付与することができる。例えば、ＯＴＣ欠損症の治療は、機能的ＯＴＣ酵素を産生することによって達成することができ、血友病Ａ及びＢの治療は、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、及び第Ｘ因子のレベルを改変することによって達成することができ、ＰＫＵの治療は、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ酵素のレベルを改変することによって達成することができ、ファブリー病又はゴーシェ病の治療は、機能的なアルファガラクトシダーゼ又はベータグルコセレブロシダーゼをそれぞれ産生することによって達成することができ、ＭＦＤ又はＭＰＳＩＩの治療は、それぞれ、機能的アリールスルファターゼＡ又はイズロン酸－２－スルファターゼを産生することによって達成することができ、嚢胞性線維症の治療は、機能的嚢胞性線維症膜貫通調節因子を産生することによって達成することができ、糖原病の治療は、機能的なＧ６Ｐａｓｅ機能を回復させることによって達成することができ、ＰＦＩＣの治療は、機能的なＡＴＰ８Ｂ１、ＡＢＣＢ１１、ＡＢＣＢ４、又はＴＪＰ２遺伝子を産生することによって達成することができる。

【0258】

本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、ＴＮＡ ＬＮＰ（例えば、ｃｅＤＮＡベクター脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子））を使用して、インビトロ又はインビボで細胞にＲＮＡベースの治療薬を提供することができる。ＲＮＡベースの治療薬の例としては、ｍＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ及びオリゴヌクレオチド、リボザイム、アプタマー、干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）、ダイサー基質ｄｓＲＮＡ、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、非対称干渉ＲＮＡ（ａｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、ＴＮＡ ＬＮＰ（例えば、ｃｅＤＮＡベクター脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子））を使用して、インビトロ又はインビボで細胞にアンチセンス核酸を提供することができる。例えば、導入遺伝子が、ＲＮＡｉ分子である場合、標的細胞中のアンチセンス核酸又はＲＮＡｉの発現は、細胞による特定のタンパク質の発現を減少させる。したがって、ＲＮＡｉ分子又はアンチセンス核酸である導入遺伝子を投与して、それを必要とする対象における特定のタンパク質の発現を減少させることができる。アンチセンス核酸をインビトロで細胞に投与して、細胞生理学を調節する、例えば、細胞又は組織培養系を最適化することもできる。

【0259】

本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、ＴＮＡ ＬＮＰ（例えば、ｃｅＤＮＡベクター脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子））を使用して、インビトロ又はインビボで細胞にＤＮＡベースの治療薬を提供することができる。ＤＮＡベースの治療剤の例としては、ミニサークルＤＮＡ、ミニ遺伝子、ウイルスＤＮＡ（例えば、レンチウイルス又はＡＡＶゲノム）又は非ウイルス合成ＤＮＡベクター、閉端直鎖状二本鎖ＤＮＡ（ｃｅＤＮＡ／ＣＥＬｉＤ）、プラスミド、バクミド、ｄｏｇｇｙｂｏｎｅ（商標）ＤＮＡベクター、最小限の免疫学的に定義された遺伝子発現（ＭＩＤＧＥ）－ベクター、非ウイルスミニストリングＤＮＡベクター（直鎖状の共有結合的に閉じたＤＮＡベクター）、又はダンベル型ＤＮＡ最小ベクター（「ダンベルＤＮＡ」）が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、ｃｅＤＮＡベクター（例えば、ｃｅＤＮＡベクター脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子））を使用して、インビトロ又はインビボで細胞にミニサークルを提供することができる。例えば、導入遺伝子が、ミニサークルＤＮＡである場合、標的細胞中のミニサークルＤＮＡの発現は、細胞による特定のタンパク質の発現を減少させる。したがって、ミニサークルＤＮＡである導入遺伝子を投与して、それを必要とする対象における特定のタンパク質の発現を減少させることができる。ミニサークルＤＮＡをインビトロで細胞に投与して、細胞生理学を調節する、例えば、細胞又は組織培養系を最適化することもできる。

【0260】

本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、発現カセットを含むＴＮＡベクターによってコードされる例示的な導入遺伝子としては、Ｘ、リソソーム酵素（例えば、テイ・サックス病に関連するヘキソサミニダーゼＡ、又はハンター症候群／ＭＰＳ ＩＩに関連するイズロネートスルファターゼ）、エリスロポエチン、アンジオスタチン、エンドスタチン、スーパーオキシドジスムターゼ、グロビン、レプチン、カタラーゼ、チロシンヒドロキシラーゼ、並びにサイトカイン（例えば、インターフェロン、β－インターフェロン、インターフェロン－γ、インターロイキン－２、インターロイキン－４、インターロイキン１２、顆粒球－マクロファージコロニー刺激因子、リンホトキシン等）、ペプチド増殖因子及びホルモン（例えば、ソマトトロピン、インスリン、インスリン様増殖因子１及び２、血小板由来増殖因子（platelet derived growth factor、ＰＤＧＦ）、上皮増殖因子（epidermal growth factor、ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（fibroblast growth factor、ＦＧＦ）、神経増殖因子（nerve growth factor、ＮＧＦ）、神経栄養因子－３及び４、脳由来神経栄養因子（brain-derived neurotrophic factor、ＢＤＮＦ）、グリア由来増殖因子（glial derived growth factor、ＧＤＮＦ）、形質転換増殖因子－ａ及び－ｂ等）、受容体（例えば、腫瘍壊死因子受容体）が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの例示的な実施形態では、導入遺伝子は、１つ以上の所望の標的に特異的なモノクローナル抗体をコードする。いくつかの例示的な実施形態では、２つ以上の導入遺伝子が、ｃｅＤＮＡベクターによってコードされる。いくつかの例示的な実施形態では、導入遺伝子は、目的の２つの異なるポリペプチドを含む融合タンパク質をコードする。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、導入遺伝子は、本明細書で定義されるように、全長抗体又は抗体断片を含む、抗体をコードする。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、抗体は、本明細書に定義されるように、抗原結合ドメイン又は免疫グロブリン可変ドメイン配列である。他の例示的な導入遺伝子配列は、自殺遺伝子産物（チミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ、ジフテリア毒素、チトクロームＰ４５０、オキシシチジンキナーゼ、及び腫瘍壊死因子）、がん療法において使用される薬物に対する耐性を付与するタンパク質、及び腫瘍抑制因子遺伝子産物をコードする。

【0261】

本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、対象（例えば、ヒト）における遺伝性障害を治療する方法を提供し、この方法は、本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかに記載される、有効量の脂質ナノ粒子又はその薬学的組成物を対象に投与することを含む。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、遺伝性障害は、鎌状赤血球貧血症、メラノーマ、血友病Ａ（凝固因子ＶＩＩＩ（ＦＶＩＩＩ）欠損症）及び血友病Ｂ（凝固因子ＩＸ（ＦＩＸ）欠損症）、嚢胞性線維症（ＣＦＴＲ）、家族性高コレステロール血症（ＬＤＬ受容体欠損症）、肝芽細胞腫、ウィルソン病、フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）、先天性肝性ポルフィリン症、遺伝性肝代謝障害、レッシュナイハン症候群、鎌状赤血球貧血症、サラセミア、色素性乾皮症、ファンコニ貧血、網膜色素変性症、毛細血管拡張性運動失調症、ブルーム症候群、網膜芽細胞腫、ムコ多糖蓄積症（例えば、ハーラー症候群（ＭＰＳ Ｉ型）、シャイエ症候群（ＭＰＳ Ｉ Ｓ型）、ハーラー・シャイエ症候群（ＭＰＳ Ｉ Ｈ－Ｓ型）、ハンター症候群（ＭＰＳ ＩＩ型）、サンフィリッポＡ、Ｂ、Ｃ、及びＤ型（ＭＰＳ ＩＩＩ Ａ、Ｂ、Ｃ、及びＤ型）、モルキオＡ及びＢ型（ＭＰＳ ＩＶＡ及びＭＰＳ ＩＶＢ）、マロトー・ラミー症候群（ＭＰＳ ＶＩ型）、スライ症候群（ＭＰＳ ＶＩＩ型）、ヒアルロニダーゼ欠損症（ＭＰＳ ＩＸ型））、ニーマン・ピック病Ａ／Ｂ、Ｃ１及びＣ２型、ファブリー病、シンドラー病、ＧＭ２－ガングリオシドーシスＩＩ型（サンドホフ病）、テイ・サックス病、異染性白質ジストロフィー、クラッベ病、ムコリピドーシスＩ、ＩＩ／ＩＩＩ及びＩＶ型、シアリドーシスＩ及びＩＩ型、グリコーゲン蓄積症Ｉ及びＩＩ型（ポンペ病）、ゴーシェ病Ｉ、ＩＩ及びＩＩＩ型、シスチン症、バッテン病、アスパルチルグルコサミン尿症、サラ病、ダノン病（ＬＡＭＰ－２欠損症）、リソソーム酸性リパーゼ（Lysosomal Acid Lipase、ＬＡＬ）欠損症、神経セロイドリポフスチン症（ＣＬＮ１－８、ＩＮＣＬ、及びＬＩＮＣＬ）、スフィンゴリピドーシス、ガラクトシアリドーシス、筋萎縮性側索硬化症（amyotrophic lateral sclerosis、ＡＬＳ）、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、脊髄小脳失調症、脊髄性筋萎縮症、フリードライヒ運動失調症、デュシェンヌ筋ジストロフィー（Duchenne muscular dystrophy、ＤＭＤ）、ベッカー筋ジストロフィー（Becker muscular dystrophy、ＢＭＤ）、ジストロフィー表皮水疱症（dystrophic epidermolysis bullosa、ＤＥＢ）、エクトヌクレオチドピロホスファターゼ１欠損症、乳児期の全身性動脈石灰化（generalized arterial calcification of infancy、ＧＡＣＩ）、レーバー先天性黒内障、シュタルガルト黄斑ジストロフィー（ＡＢＣＡ４）、オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）欠損症、アッシャー症候群、加齢黄斑変性（age-related macular degeneration、ＡＭＤ）、アルファ－１アンチトリプシン欠損症、進行性家族性肝内胆汁うっ滞（ＰＦＩＣ）Ｉ型（ＡＴＰ８Ｂ１欠損症）、ＩＩ型（ＡＢＣＢ１１）、ＩＩＩ型（ＡＢＣＢ４）、又はＩＶ型（ＴＪＰ２）、並びにカテプシンＡ欠損症からなる群から選択される。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、遺伝性障害は血友病Ａである。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、遺伝性障害は血友病Ｂであり、本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、遺伝性障害はフェニルケトン尿症（ＰＫＵ）である。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、遺伝性障害はウィルソン病である。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、遺伝性障害は、ゴーシェ病Ｉ型、ＩＩ型及びＩＩＩ型である。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、遺伝性障害はシュタルガルト黄斑ジストロフィーである。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、遺伝性障害はＬＣＡ１０である。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、遺伝性障害はアッシャー症候群である。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、遺伝性障害は滲出型ＡＭＤである。

【0262】

本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、本開示は、対象（例えば、ヒト）における遺伝性障害を治療するための医薬品の製造のための、本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかに記載の脂質ナノ粒子又はその医薬組成物の使用に関する。例示的な遺伝性障害は、上記のとおりである。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、医薬品によって治療される遺伝性障害は、シュタルガルト黄斑ジストロフィーである。本明細書における態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、医薬品によって治療される遺伝性障害は、ＬＣＡ１０である。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、医薬品によって治療される遺伝性障害は、アッシャー症候群である。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、医薬品によって治療される遺伝性障害は、滲出型ＡＭＤである。

【0263】

本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、本開示は、対象（例えば、ヒト）における遺伝性障害の治療で使用するための、本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかに記載の脂質ナノ粒子又はその医薬組成物に関する。例示的な遺伝性障害は、上記のとおりである。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、上記使用によって治療される遺伝性障害は、シュタルガルト黄斑ジストロフィーである。本明細書における態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、上記使用によって治療される遺伝性障害は、ＬＣＡ１０である。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、上記の使用によって治療される遺伝性障害は、アッシャー症候群である。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、上記の使用によって治療される遺伝性障害は、滲出型ＡＭＤである。

【0264】

投与
本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、ＴＮＡ ＬＮＰ（例えば、本明細書に記載のｃｅＤＮＡベクター脂質粒子）は、インビボでの細胞の形質導入のために生物に投与することができる。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、ＴＮＡ ＬＮＰ（例えば、ｃｅＤＮＡベクター脂質粒子）は、エクスビボでの細胞の形質導入のために生物に投与することができる。

【0265】

一般に、投与は、分子を血液又は組織細胞と最終的に接触させるために通常使用される経路のうちのいずれかによるものである。そのような核酸を投与する好適な方法は、当業者によって利用可能かつ周知であり、特定の組成物を投与するために２つ以上の経路が使用され得るが、特定の経路は、多くの場合、別の経路よりもより即時的であり、より効果的な反応を提供し得る。ＴＮＡ ＬＮＰ（例えば、ｃｅＤＮＡベクター脂質粒子）の例示的な投与形態としては、経口、直腸、経粘膜、鼻腔内、吸入（例えば、エアロゾルを介した）、頬側（例えば、舌下）、膣、髄腔内、眼内、経皮、内皮内、子宮内（又は卵内）、非経口（例えば、静脈内、皮下、皮内、頭蓋内、筋肉内（骨格、横隔膜、及び／又は心筋への投与を含む）、胸膜内、脳内、及び動脈内）、局所（例えば、気道表面を含む皮膚及び粘膜表面への、並びに経皮投与）、リンパ内等、並びに直接組織又は器官注射（例えば、肝臓、眼、骨格筋、心筋、横隔膜、筋肉、若しくは脳への）が挙げられる。

【0266】

ＴＮＡ ＬＮＰ様ｃｅＤＮＡベクター（例えば、ｃｅＤＮＡ ＬＮＰ）の投与は、脳、骨格筋、平滑筋、心臓、横隔膜、気道上皮、肝臓、腎臓、脾臓、膵臓、皮膚、及び眼からなる群から選択される部位を含むが、これらに限定されない、対象の任意の部位に対して行われ得る。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、ｃｅＤＮＡ ＬＮＰの投与はまた、腫瘍に対するものであり得る（例えば、腫瘍若しくはリンパ節内又はその付近の）。任意の所与の症例における最も好適な経路は、治療、改善、及び／又は予防される病態の性質及び重症度、並びに使用されている特定のｃｅＤＮＡ ＬＮＰの性質に依存するであろう。追加的に、ｃｅＤＮＡは、単一のベクター、又は複数のｃｅＤＮＡベクター（例えば、ｃｅＤＮＡカクテル）中に２つ以上の導入遺伝子を投与することを可能にする。

【0267】

本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、ｃｅＤＮＡ ＬＮＰの骨格筋への投与としては、肢（例えば、上腕、下腕、上肢、及び／又は下肢）、腰、首、頭（例えば、舌）、咽頭、腹部、骨盤／会陰、及び／又は指の骨格筋への投与が挙げられるが、これらに限定されない。ｃｅＤＮＡベクター（例えば、ｃｅＤＮＡベクター脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子））は、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内、四肢灌流（任意選択で、脚及び／若しくは腕の単離された四肢灌流、例えば、Ａｒｒｕｄａ ｅｔ ａｌ．，（２００５）Ｂｌｏｏｄ １０５：３４５８－３４６４を参照）並びに／又は直接筋肉内注入によって骨格筋に送達され得る。特定の実施形態では、ｃｅＤＮＡ ＬＮＰは、対象（例えば、ＤＭＤ等の筋ジストロフィーを有する対象）に、四肢灌流、任意選択で単離された四肢灌流（例えば、静脈内又は動脈内投与による）によって投与される。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、ｃｅＤＮＡ ＬＮＰは、「流体力学的」技術を用いることなく投与することができる。

【0268】

ＴＮＡ ＬＮＰ（例えば、ｃｅＤＮＡ ＬＮＰ）の心筋への投与としては、左心房、右心房、左心室、右心室、及び／又は中隔への投与が挙げられる。ＴＮＡ ＬＮＰ（例えば、ｃｅＤＮＡ ＬＮＰ）は、静脈内投与、大動脈内投与等の動脈内投与、直接心臓注射（例えば、左心房、右心房、左心室、右心室への）、及び／又は冠動脈灌流によって心筋に送達され得る。横隔膜筋への投与は、静脈内投与、動脈内投与、及び／又は腹腔内投与を含む任意の好適な方法によって行われ得る。平滑筋への投与は、静脈内投与、動脈内投与、及び／又は腹腔内投与を含む任意の好適な方法によって行われ得る。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、投与は、平滑筋内、その付近、及び／又はその上に存在する内皮細胞に対して行われ得る。

【0269】

本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、ＴＮＡ ＬＮＰ（例えば、ｃｅＤＮＡ ＬＮＰ）は、骨格筋、横隔膜筋及び／又は心筋に投与される（例えば、筋ジストロフィー又は心臓病（例えば、ＰＡＤ又はうっ血性心不全）を治療、改善、及び／又は予防するために。

【0270】

ＴＮＡ ＬＮＰ（例えば、ｃｅＤＮＡ ＬＮＰ）は、ＣＮＳ（例えば、脳又は眼）に投与することができる。ＴＮＡ ＬＮＰ（例えば、ｃｅＤＮＡ ＬＮＰ）は、脊髄、脳幹（延髄、脳橋）、中脳（視床下部、視床、視床上部、脳下垂体、黒質、松果体）、小脳、終脳（線条体、後頭葉、側頭葉、頭頂葉、及び前頭葉、皮質、基底核、海馬、及び偏桃体（ｐｏｒｔａａｍｙｇｄａｌａ）を含む大脳）、辺縁系、新皮質、線条体、大脳、並びに下丘中に導入されてもよい。ＴＮＡ ＬＮＰ（例えば、ｃｅＤＮＡ ＬＮＰ）はまた、網膜、角膜、及び／又は視神経等の眼の異なる領域に投与され得る。ＴＮＡ ＬＮＰ（例えば、ｃｅＤＮＡ ＬＮＰ）は、（例えば、腰椎穿刺によって）脳脊髄液に送達され得る。ＴＮＡ ＬＮＰ（例えば、ｃｅＤＮＡベクター脂質粒子）は、更に、血液脳関門が撹乱された状況（例えば、脳腫瘍又は脳梗塞）において、ＣＮＳに血管内投与され得る。

【0271】

本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、ＴＮＡ ＬＮＰ（例えば、ｃｅＤＮＡ ＬＮＰ）は、当該技術分野において既知の任意の経路によってＣＮＳの所望の領域に投与され得、髄腔内、眼内、脳内、脳室内、静脈内（例えば、マンニトール等の糖の存在下）、鼻腔内、耳内、眼内（例えば、硝子体内、網膜下、前房）、及び眼周囲（例えば、テノン下領域）送達、並びに運動ニューロンへの逆行性送達を伴う筋肉内送達を含むが、これらに限定されない。

【0272】

本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態によれば、ＴＮＡ ＬＮＰ（例えば、ｃｅＤＮＡ ＬＮＰ）は、ＣＮＳ中の所望の領域又は区画への直接注射（例えば、定位的注入）によって、液体製剤中で投与される。他の実施形態によれば、ＴＮＡ ＬＮＰ（例えば、ｃｅＤＮＡ ＬＮＰ）は、所望の領域への局所適用によって、又はエアロゾル製剤の鼻腔内投与によって提供され得る。眼への投与は、液滴の局所適用によって行われてもよい。更なる代替例として、ｃｅＤＮＡベクターは、固体の徐放性製剤として投与され得る（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第７，２０１，８９８号を参照されたい）。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、ＴＮＡ ＬＮＰ（例えば、ｃｅＤＮＡ ＬＮＰ）を、逆行性輸送に使用して、運動ニューロンが関与する疾患及び障害（例えば、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、脊髄性筋萎縮症（spinal muscular atrophy、ＳＭＡ）等）を治療、改善、及び／又は予防することができる。例えば、ＴＮＡ ＬＮＰ（例えば、ｃｅＤＮＡ ＬＮＰ）は、筋組織に送達され、そこからニューロン中に移動し得る。

【0273】

本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、適切なレベルの発現が達成されるまで、治療用製品の反復投与を行うことができる。したがって、本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、治療用核酸を複数回投与及び再投与することができる。例えば、治療用核酸は、０日目に投与することができる。０日目の初回治療に続いて、治療用核酸を用いた初回治療の約１週間、約２週間、約３週間、約４週間、約５週間、約６週間、約７週間、約８週間、又は約３ヶ月、約４ヶ月、約５ヶ月、約６ヶ月、約７ヶ月、約８ヶ月、約９ヶ月、約１０ヶ月、約１１ヶ月、又は約１年、約２年、約３年、約４年、約５年、約６年、約７年、約８年、約９年、約１０年、約１１年、約１２年、約１３年、約１４年、約１５年、約１６年、約１７年、約１８年、約１９年、約２０年、約２１年、約２２年、約２３年、約２４年、約２５年、約２６年、約２７年、約２８年、約２９年、約３０年、約３１年、約３２年、約３３年、約３４年、約３５年、約３６年、約３７年、約３８年、約３９年、約４０年、約４１年、約４２年、約４３年、約４４年、約４５年、約４６年、約４７年、約４８年、約４９年又は約５０年後に、２回目の投薬（再投与）を実施することができる。

【0274】

本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、１つ以上の追加の化合物も含めることができる。それらの化合物は、別々に投与され得るか、又は追加の化合物は、本発明の脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）中に含まれ得る。言い換えれば、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）は、ＴＮＡに加えて他の化合物、又は少なくとも第１のものとは異なる第２のＴＮＡを含有し得る。無制限に、他の追加の化合物は、小さい又は大きい有機又は無機分子、単糖類、二糖類、三糖類、オリゴ糖類、多糖類、ペプチド、タンパク質、ペプチド類似体及びそれらの誘導体、ペプチド模倣体、核酸、核酸類似体及び誘導体、生体物質から作製される抽出物、又はそれらの任意の組み合わせからなる群から選択され得る。

【0275】

本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、１つ以上の追加の化合物は、治療剤であり得る。治療剤は、治療目的に好適な任意のクラスから選択され得る。したがって、治療剤は、治療目的に好適な任意のクラスから選択され得る。治療剤は、所望の治療目的及び生物作用に従って選択され得る。例えば、本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、ＬＮＰ内のＴＮＡが、がんを治療するために有用である場合、追加の化合物は、抗がん剤（例えば、化学療法剤、標的がん療法（小分子、抗体、又は抗体－薬物コンジュゲートを含むが、これらに限定されない）であり得る。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、ＴＮＡを含有するＬＮＰが、感染症を治療するために有用である場合、追加の化合物は、抗微生物剤（例えば、抗生物質又は抗ウイルス化合物）であり得る。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、ＴＮＡを含有するＬＮＰが、免疫疾患又は障害を治療するために有用である場合、追加の化合物は、免疫応答を調節する化合物（例えば、免疫抑制剤、免疫刺激性化合物、又は１つ以上の特定の免疫経路を調節する化合物）であり得る。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、異なるタンパク質又は異なる化合物（治療薬等）をコードするＴＮＡ等の、異なる化合物を含有する異なる脂質粒子の異なるカクテルを、本発明の組成物及び方法で使用することができる。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、追加の化合物は、免疫調節剤である。例えば、追加の化合物は、免疫抑制剤である。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、追加の化合物は、免疫刺激性化合物である。

【実施例】

【0276】

以下の実施例は、限定ではない例証によって提供される。本開示で企図される脂質は、以下に記載される一般的な合成方法を使用して設計及び合成することができることが当業者によって理解されるであろう。

【0277】

実施例１：一般的な合成
式Ｉの脂質を設計し、以下のスキーム１に示される同様の合成方法を使用して合成した。スキーム１で示される化合物中の全ての変数、すなわち、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^６ａ、Ｒ^６ｂ、Ｘ、及びｎは、式Ｉで定義されるとおりである。Ｒ^ｘは、定義されるとおりＲ^４であるが、脂肪族鎖において１個少ない炭素原子を有する。

【0278】

【化19】

【0279】

本開示のモノエステル脂質、すなわち、式Ｉ（式中Ｘが、－Ｃ（＝Ｏ））－である）を設計し、以下のスキーム２に示される同様の合成方法を使用して合成した。スキーム１で示される化合物中の全ての変数、すなわち、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^６ａ、Ｒ^６ｂ、Ｘ、及びｎは、式Ｉで定義されるとおりである。Ｒ^ｘは、定義されるとおりＲ^４であるが、脂肪族鎖において１個少ない炭素原子を有する。

【0280】

【化20】

【0281】

スキーム１及びスキーム２
スキーム１及びスキーム２を参照すると、ステップ１において、ジクロロメタン（dichloromethane、ＤＣＭ）中の酸２の撹拌溶液に、４－ジメチルアミノピリジン（dimethylaminopyridine、ＤＭＡＰ）、続いて１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide、ＥＤＣＩ）を添加した。得られた混合物を、窒素（Ｎ_２）雰囲気下、室温で１５分間撹拌した。次いで、化合物１を滴下し、混合物を一晩撹拌した。翌日、反応物をＤＣＭで希釈し、水及びブラインで洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウム（Ｎａ_２ＳＯ_４）上で乾燥させ、蒸発乾固した。粗生成物を、溶離液としてＤＣＭ中の０～１０％メタノールを使用するシリカゲルカラムクロマトグラフィによって精製した。所望の化合物を含有する画分をプールし、蒸発させて、化合物３（０．７８ｇ、５４％）を得た。

【0282】

ステップ２において、テトラヒドロフラン（tetrahydrofuran、ＴＨＦ）中の３の溶液に、水素化アルミニウムリチウム（ＬｉＡｌＨ_４）を添加した。反応混合物を５０℃で一晩加熱した。翌日、反応物を０℃に冷却し、水を滴下してクエンチした。続いて、反応物を、セライトを通して濾過して、粗生成物４を得た。生成物を更に精製することなく次のステップで使用した。

【0283】

ステップ３において、化合物５又は５’（国際公開第２０１７／０４９２４５号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている手順に従って合成された）をジメチルホルムアミド／メタノール混合物ＤＭＦ：ＭｅＯＨ（１：１）に溶解し、４を添加した。反応物を室温で一晩撹拌した。生成物を酢酸エチル（ethyl acetate、ＥｔＯＡｃ）で抽出し、有機層を飽和重炭酸ナトリウム水溶液（ＮａＨＣＯ_３（水溶液））及びブラインで洗浄し、無水Ｎａ_２ＳＯ_４上で乾燥させた。溶媒を真空下で蒸発させ、溶離液としてＤＣＭ中の０～１０％メタノールを使用するカラムクロマトグラフィによって精製して、式Ｉのカチオン性脂質を得た。

【0284】

化合物５又は５’は、以下のスキーム３に示される手順に従って代替的に合成され得る。Ｒ^ｙは、定義されるとおりＲ^５であるが、脂肪族鎖において１個少ない炭素原子を有する。

【0285】

【化21】

【0286】

スキーム３を参照して、９－ヘプタデカノン６テトラヒドロフラン（無水）の氷冷溶液に、ニートの無水リン酸溶液７を滴下した。反応物を３０分間撹拌し、続いてＮａＨを少しずつ添加した。反応混合物を還流し、０℃に冷却し、水でクエンチし、エーテルで抽出した。有機層を水、ブラインで数回洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、濃縮した。粗生成物をカラムクロマトグラフィによって精製し、７．１ｇ（収率９３％）の純粋物８を提供した。

【0287】

化合物８をＥｔＯＡｃ／ＭｅＯＨ混合物に溶解し、湿った１０％Ｐｄ／Ｃ触媒を使用してＨ_２での還元に供した。きれいに変換して化合物９を提供した。

【0288】

化合物９（ＴＨＦを冷却し、ＬｉＡｌＨ_４を滴下した。反応混合物を一晩撹拌したままにし、室温に加温し、次いでＴＨＦ／Ｈ_２Ｏ混合物（体積で１：１）を使用してクエンチした。反応混合物をＥｔＯＡｃで抽出し、セライトを通して濾過した。有機相を水、ブラインで２回洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、濃縮した。カラムクロマトグラフィ（ＣＨ_２Ｃｌ_２－ＥｔＯＡｃ）によって精製して、化合物１０を提供した。

【0289】

化合物１０及びアルカノン酸１１をＤＣＭ中に溶解し、次いでＤＭＡＰ及びＥＤＣＩをこの溶液に室温で添加した。一晩撹拌した後、反応物を水でクエンチし、ＤＣＭで希釈し、ＮａＨＣＯ_３（飽和水溶液）及びブラインで洗浄した。有機相をＮａ_２ＳＯ_４上で乾燥させ、濃縮した。カラムクロマトグラフィ精製（ヘキサン－ＥｔＯＡｃ）によって、３．８ｇの化合物５又は５’を提供した。

【0290】

実施例２：脂質６の合成
脂質６を合成するための手順は、スキーム４を参照して以下に記載され、また以下に提供される。

【0291】

【化22】

【0292】

ステップ１：Ｎ－（２－（ジメチルアミノ）エチル）ノナンアミド（３ａ）の合成
６０ｍＬのＤＣＭ中のノナン酸（２ａ）（１．０ｇ、６．３ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、ＤＭＡＰ（０．９１ｇ、７．５ｍｍｏｌ）、続いてＥＤＣＩ（１．４４ｇ、７．５ｍｍｏｌ）を添加した。得られた混合物を、Ｎ_２雰囲気下、室温で１５分間撹拌した。次いで、Ｎ^１，Ｎ^１－ジメチルエタン－１，２－ジアミン（１ａ）（０．６６ｇ、７．５ｍｍｏｌ）を滴下し、混合物を一晩撹拌した。翌日、反応物をＤＣＭで希釈し、Ｈ_２Ｏ及びブラインで洗浄した。有機層を無水Ｎａ_２ＳＯ_４上で乾燥させ、蒸発乾固した。粗生成物を、溶離液としてＤＣＭ中の０～１０％メタノールを使用するシリカゲルカラムクロマトグラフィによって精製した。所望の化合物を含有する画分をプールし、蒸発させて、３ａ（０．７８ｇ、５４％）を得た。

【0293】

ステップ２：Ｎ^１，Ｎ^１－ジメチル－Ｎ２－ノニルエタン－１，２－ジアミン（４ａ）の合成
ＴＨＦ中３ａ（０．７８ｇ、３．４ｍｍｏｌ）の溶液に、ＬｉＡｌＨ_４を添加した。反応混合物を５０℃で一晩加熱した。翌日、反応物を０℃に冷却し、水を滴下してクエンチした。続いて、反応物を、セライトを通して濾過して、粗生成物４ａ（０．６ｇ、８２％）を得た。生成物を更に精製することなく次のステップで使用した。

【0294】

ステップ３：ヘプタデカン－９－イル８－（（２－（ジメチルアミノ）エチル）（ノニル）アミノ）オクタノエート又は脂質６の合成
化合物５ａ（国際公開第２０１７／０４９２４５号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている手順に従って合成された）（０．６ｇ、１．３ｍｍｏｌ）を、２０ｍＬのＤＭＦ：ＭｅＯＨ（１：１）に溶解し、４ａ（０．３５ｇ、１．５ｍｍｏｌ）を添加した。反応物を室温で一晩撹拌した。生成物をＥｔＯＡｃ（２００ｍＬ）で抽出し、有機層を飽和ＮａＨＣＯ_３（水溶液）及びブラインで洗浄し、無水Ｎａ_２ＳＯ_４上で乾燥させた。溶媒を真空下で蒸発させ、溶離液としてＤＣＭ中の０～１０％メタノールを使用するカラムクロマトグラフィによって精製して、脂質６（０．０６２ｇ、１０％）を得た。^１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，クロロホルム－ｄ）δ ４．８５（ｑｕｉｎｔ，Ｊ＝６．２Ｈｚ，１Ｈ），２．５７－２．４８（ｍ，２Ｈ），２．４３－２．３２（ｍ，６Ｈ），２．３１－２．２５（ｍ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ），２．２３（ｓ，６Ｈ），１．６６－１．３４（ｍ，８Ｈ），１．２４（ｓ，４７Ｈ），０．８６（ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，９Ｈ）．
実施例３：脂質１の合成
脂質１を合成するための手順は、スキーム５を参照して以下に記載され、また以下に提供される。

【0295】

【化23】

【0296】

スキーム５のステップ１及び２は、実施例２に記載のとおりである。

【0297】

ヘニコサン－１１－イル８－ブロモオクタノエート（５ｂ）の合成
２５０ｍＬのジクロロメタン（ＤＣＭ）中のヘニコサン－１１－オール（１０．０ｇ、３２．０ｍｍｏｌ）及び８－ブロモオクタン酸（７．１ｇ、４４．８ｍｍｏｌ）（両方とも市販されている）の撹拌溶液に、ＥＤＣＩ（６．１ｇ、３２．１ｍｍｏｌ）、続いてＤＭＡＰ（３９２ｍｇ、３．２１ｍｍｏｌ）を添加した。得られた混合物をＮ_２雰囲気下、室温で一晩撹拌し続けた。翌日、反応物をＤＣＭで希釈し、ＮａＨＣＯ_３（２５０ｍＬ）水溶液及びブラインで洗浄した。有機層を無水Ｎａ_２ＳＯ_４上で乾燥させ、蒸発乾固した。粗生成物を、溶離液としてヘキサン中の０～１０％ＥｔＯＡｃを使用するシリカゲルカラムクロマトグラフィによって精製した。所望の化合物を含有する画分をプールし、蒸発させて、５ｂ（６．３ｇ、３８％）を得た。１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，クロロホルム－ｄ）δ ４．８４－４．８８（ｍ，１Ｈ），３．３９（ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，２Ｈ），２．２８（ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，２Ｈ），１．８０－１．８９（ｍ，２Ｈ），１．２５－１．６２（ｍ，４３Ｈ），０．８６（ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，６Ｈ）．
ステップ３：ヘニコサン－１１－イル８－（（２－（ジメチルアミノ）エチル）（ノニル）アミノ）オクタノエート又は脂質１の合成
化合物５ｂ（４．３４ｇ、８．４１ｍｍｏｌ）を５．０ｍＬのＤＭＦ：ＭｅＯＨ（１：１）に溶解し、４ａ（２．０ｇ、９．３５ｍｍｏｌ）を添加した。反応物を室温で一晩撹拌した。溶媒を真空下で蒸発させ、溶離液としてＤＣＭ中の０～１０％メタノールを使用するカラムクロマトグラフィによって残留物を精製して、脂質１（３３０ｍｇ、１１％）を得た。^１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，クロロホルム－ｄ）δ ４．８４－４．９３ ｍ，１Ｈ），３．５１－３．５５（ｍ，４Ｈ），２．９８－３．０３（ｍ，４Ｈ），２．８３（ｓ，６Ｈ），２．２６（ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，２Ｈ），１．４８－１．７７（ｍ，８Ｈ），１．２３－１．４４（ｍ，５７Ｈ），０．８６（ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，９Ｈ）．
実施例４：脂質３の合成
脂質３を合成するための手順は、スキーム６を参照して以下に記載され、また以下に提供される。

【0298】

【化24】

【0299】

スキーム６のステップ１及び２は、実施例３に記載のとおりである。

【0300】

ペンタコサン－１３－イル８－ブロモオクタノエート（５ｃ）の合成
ヘニコサン－１１－イル８－ブロモオクタノエート（５ｂ）の合成について上記と同様の手順を使用して、出発材料ヘニコサン－１１－オールを市販のペンタコサン－１３－オールで置換することによって化合物５ｃを合成した。

【0301】

ステップ３：ペンタコサン－１３－イル８－（（２－（ジメチルアミノ）エチル）（ノニル）アミノ）オクタノエート又は脂質３の合成
脂質１の合成について上記と同様の手順を使用して、出発材料５ｂを化合物５ｃで置換することによって脂質３を調製した。

【0302】

実施例５：脂質７の合成
脂質７を合成するための手順は、スキーム７を参照して以下に記載され、また以下に提供される。

【0303】

【化25】

【0304】

ステップ１：Ｎ－（２－（ジメチルアミノ）エチル）ヘプタンアミド（３ｂ）の合成
２０ｍＬのＤＣＭ中のエナント酸（２ｂ）（７．０ｇ、８０ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、ＥＤＣＩ（２０ｇ、１０４ｍｍｏｌ）を添加した。得られた混合物を、Ｎ_２雰囲気下、室温で１５分間撹拌した。次いで、１０ｍＬのＤＣＭに溶解した１ａ（７．１ｇ、８０ｍｍｏｌ）を添加し、続いてＤＭＡＰ（０．３ｇ、２．５ｍｍｏｌ）を添加し、一晩撹拌し続けた。翌日、反応物をＤＣＭで希釈し、Ｈ_２Ｏ及びブラインで洗浄した。有機層を無水Ｎａ_２ＳＯ_４上で乾燥させ、蒸発乾固した。粗生成物を、溶離液としてＤＣＭ中の０～１０％メタノールを使用するシリカゲルカラムクロマトグラフィによって精製した。所望の化合物を含有する画分をプールし、蒸発させて、化合物３ｂ（９．５ｇ、５９％）を得た。^１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，クロロホルム－ｄ）δ ６．０（ｂｒｏａｄ ｓ，１Ｈ），３．３（ｄｄ，２Ｈ），２．４（ｄｄ，Ｊ＝６，２Ｈ），２．２（ｓ，６Ｈ），２．１６（ｄｄ，Ｊ＝６，２Ｈ），１．９－１．５（ｍ，４Ｈ），１．３－１．２（ｍ，７Ｈ），０８７（ｔ，３Ｈ）。

【0305】

ステップ２：Ｎ^１－ヘプチル－Ｎ^２，Ｎ^２－ジメチルエタン－１，２－ジアミン（４ｂ）の合成
ＴＨＦ（８０ｍＬ）中の３ｂ（３ｇ、１５ｍｍｏｌ）の溶液に、０℃でＴＨＦ中のＬｉＡｌＨ_４ ２ Ｍ（１５ｍＬ、３０ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を一晩還流加熱した。翌日、反応物を０℃に冷却し、水（３ｍＬ）を滴下してクエンチした。続いて、反応物を、セライトを通して濾過して、粗生成物４ｂを得た。粗生成物を、溶離液としてＤＣＭ中の０～１０％メタノール／ＮＨ_３（０．１％）を使用するシリカゲルカラムクロマトグラフィによって精製した。所望の化合物を含有する画分をプールし、蒸発させて、４ｂ（１．３ｇ、４６％）を得た。^１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，クロロホルム－ｄ）δ ２．６７（ｄｄ，Ｊ＝６，２Ｈ），２．５９（ｄｄ，Ｊ＝７，２Ｈ），２．４０（ｄｄ，Ｊ＝６，２Ｈ），２．２０（ｓ，６Ｈ），１．５０－１．４０（ｍ，３Ｈ），１．３０－１．１５（ｍ，９Ｈ），０．８７（ｔ，３Ｈ）．ＭＳ実測値１８７．２［Ｍ＋Ｈ］^＋、計算値１８６．３（［Ｃ_１１Ｈ_２６Ｎ_２］について）。

【0306】

ステップ３：ヘプタデカン－９－イル８－（（２－（ジメチルアミノ）エチル）（へプチル）アミノ）オクタノエート又は脂質７の合成
化合物５ａ（６ｇ、１３ｍｍｏｌ）を２０ｍＬのＤＭＦ：ＭｅＯＨ（１：１）に溶解し、４ｂ（２．６５ｇ、１４ｍｍｏｌ）を添加した。反応物を室温で一晩撹拌した。溶媒を真空下で蒸発させ、溶離液としてＤＣＭ中の０～１０％メタノールを使用するカラムクロマトグラフィによって精製して、脂質７（０．５ｇ、６％）を得た。^１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，クロロホルム－ｄ）δ ４．８５（ｑｕｉｎｔ，Ｊ＝６．２Ｈｚ，１Ｈ），３．１０－２．９０（ｍ，２Ｈ），２．８８－２．８０（ｍ，６Ｈ），２．４３（ｓ，６Ｈ），２．２７（ｄｄ，２Ｈ），１．６７－１．３４（ｍ，８Ｈ），１．３０－１．２（ｍ，４５Ｈ），０．８６（ｔ，９Ｈ）．ＭＳ実測値５６７．５［Ｍ＋Ｈ］^＋、計算値５６６．６（［Ｃ_３６Ｈ_７４Ｎ_２Ｏ_２］について）。

【0307】

実施例６：脂質１０の合成
脂質１０を合成するための手順は、スキーム８を参照して以下に記載され、また以下に提供される。

【0308】

【化26】

【0309】

ステップ１：Ｎ－（２－（ジメチルアミノ）エチル）ウンデカンアミド（３ｃ）の合成
２５０ｍＬのＤＣＭ中のウンデカン酸（２ｃ）（５．２７ｇ、２８．３ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、ＤＭＡＰ（４．４９ｇ、３６．８ｍｍｏｌ）、続いてＥＤＣＩ（６．３ｇ、３６．０ｍｍｏｌ）を添加した。得られた混合物を、Ｎ_２雰囲気下、室温で１５分間撹拌した。次いで、１ａ（３．０３ｇ、３４．４ｍｍｏｌ）を滴下し、一晩撹拌し続けた。翌日、反応物をＤＣＭで希釈し、Ｈ_２Ｏ及びブラインで洗浄した。有機層を無水Ｎａ_２ＳＯ_４上で乾燥させ、蒸発乾固した。粗生成物を、溶離液としてＤＣＭ中の０～１０％メタノールを使用するシリカゲルカラムクロマトグラフィによって精製した。所望の化合物を含有する画分をプールし、蒸発させて、３（６．９４ｇ、収率９５％）を得た。^１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，クロロホルム－ｄ）δ ｐｐｍ：３．２５－３．３５（ｍ，２Ｈ），２．３８－２．４４（ｍ，２Ｈ），２．２２（ｓ，６Ｈ），２．１２－２．２２（ｍ，２Ｈ），１．５５－１．６２（ｍ，２Ｈ），１．１８－１．３２（ｂｒ ｓ，１４Ｈ），０．８０－０．９０（ｍ，３Ｈ）。

【0310】

ステップ２：Ｎ^１，Ｎ^１－ジメチル－Ｎ^２－ウンデシルエタン－１，２－ジアミン（４ｃ）の合成
９０ｍＬのＴＨＦ中の３ｃ（５．９７ｇ、２３．３ｍｍｏｌ）の氷冷溶液に、ＴＨＦ中の２３．３ｍＬの２ Ｎ ＬｉＡｌＨ_４（４６．６ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を８０℃で一晩撹拌した。反応物を０℃に冷却し、水を滴下してクエンチした。続いて、反応物を、セライトを通して濾過し、濾液を濃縮し、クロマトグラフィ（ＤＭＣ－ＭｅＯＨ－ＮＨ_３）によって精製して、４．２ｇの化合物４ｃ（４．２ｇ、収率７５％）を得た。^１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，クロロホルム－ｄ）δ：２．６６（ｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，２Ｈ），２．５８（ｔ，Ｊ＝７．１４Ｈｚ，２Ｈ），２．４０（ｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，２Ｈ），２．２１（ｓ，６Ｈ），１．４２－１．５４（ｍ，２Ｈ），１．４１－１．５４（ｍ，１６Ｈ），１．２４（０．８６（ｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，３Ｈ）。

【0311】

ステップ３：脂質１０のヘニコサン－１１－イル８－（（２－（ジメチルアミノ）エチル）（ノニル）アミノ）オクタノエートの合成
化合物５ａ（０．９１ｇ、２．０ｍｍｏｌ）を５０ｍＬのＥｔＯＨに溶解し、４ｃ（１．６ｇ、７．０ｍｍｏｌ）を添加した。反応物を６５～７５℃で一晩撹拌した。反応混合物を濃縮し、溶離液としてＤＣＭ－ＭｅＯＨ－ＮＨ_３を使用するカラムクロマトグラフィによって精製して、脂質１０（１４２ｍｇ、１２％）を得た。^１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ｄｍｓｏ－ｄ_６）δ：４．７０－４．８２（ｍ，１Ｈ），２．９０－３．０（ｍ，２Ｈ），２．７８－２．８８（ｍ，２Ｈ），２．５２－２．６２（ｍ，１０Ｈ），２．２０－２．３０（ｍ，２Ｈ），１．５５－１．３５（ｍ，１０Ｈ），１．１５－１．３５（ｍ，４６Ｈ），０．７５－０．９０（９Ｈ）．ＭＳ実測値６２３．６［Ｍ＋Ｈ］^＋、計算値６２２．６（精密質量）（［Ｃ_４０Ｈ_８２Ｎ_２Ｏ_２］について）。

【0312】

実施例７：脂質１１の合成
脂質１１を合成するための手順は、スキーム９を参照して以下に記載され、また以下に提供される。

【0313】

【化27】

【0314】

スキーム９のステップ１及び２は、実施例３に記載のとおりである。

【0315】

ステップ３：３－オクチルウンデシル６－（（２－（ジメチルアミノ）エチル）（ノニル）アミノ）ヘキサノエート又はＬｉｐｉｄ１１の合成
化合物５ｄ（１．３６ｇ、２．９５ｍｍｏｌ－以下に記載の合成）を１３ｍＬのＥｔＯＨに溶解し、４ａ（１．２１ｇ、５．８９ｍｍｏｌ）を添加した。反応物を６５～７５℃で一晩撹拌した。反応混合物を濃縮し、溶離液としてＤＣＭ－ＭｅＯＨ－ＮＨ_３を使用するカラムクロマトグラフィによって２回精製して、脂質１１（１４２ｍｇ、１２％）を得た。^１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ｄｍｓｏ－ｄ_６）δ：４．０２（ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，２Ｈ），２．９０－３．００（ｍ，２Ｈ），２．７５－２．８５（ｍ，２Ｈ），２．６１（ｓ，６Ｈ），２．５０－２．６０（ｍ，４Ｈ），２．２７（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，２Ｈ），１．１５－１．６０（ｍ，５３Ｈ），０．８０－０．９０（ｍ，９Ｈ）．ＭＳ実測値５９５．２［Ｍ＋Ｈ］^＋、計算値５９４．６１（精密質量）（［Ｃ_３８Ｈ_７８Ｎ_２Ｏ_２］について）。

【0316】

エチル３－オクチルウンデク－２－エノエート（８ａ）の合成
２００ｍＬのＴＨＦ（無水）中の９－ヘプタデカノン（６ａ、５．９８ｇ、２３．５ｍｍｏｌ）の氷冷溶液に、ニートのエチル２－（ジエトキシホスホリル）アセテート（７ａ）（４０．０ｇ、１７８ｍｍｏｌ）を滴下した。反応物を３０分間撹拌し、続いてＮａＨ（６．２５ｇ、１５７ｍｍｏｌ、油中６０％）を少しずつ添加した。反応混合物を１８時間還流し、０℃に冷却し、水３００ｍＬでクエンチし、エーテルで抽出した。有機層を水、ブラインで数回洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、濃縮した。粗生成物をカラムクロマトグラフィによって精製し、７．１ｇ（収率９３％）の純粋物８ａを提供した。^１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ｄ－クロロホルム）δ ｐｐｍ：５．６０（ｓ，１Ｈ），４．１４（ｑ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，２Ｈ），２．６０－２．５４（ｍ，２Ｈ），２．１２－２．０８（ｍ，２Ｈ），１．５０－１．２０（ｍ，２７Ｈ），０．９５－０．８２（ｍ，６Ｈ）。

【0317】

エチル３－オクチルウンデカノエート（９ａ）の合成
化合物９ａ（７．０５ｇ、２１．７ｍｍｏｌ）を２２０ｍＬのＥｔＯＡｃ及び１００ｍＬのＭｅＯＨに溶解し、１．２ｇの湿った１０％Ｐｄ／Ｃ触媒を使用してＨ_２（１気圧）での還元に供した。きれいな変換によって、７．０ｇ（収率９９％）の化合物７を提供した。^１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ｄ－クロロホルム）δ（ｐｐｍ），Ｊ（Ｈｚ）：４．１２（ｑ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，２Ｈ），２．２０（ｄ，Ｊ＝６．９，２Ｈ），１．９０－１．８０（ｍ，１Ｈ），１．３５－１．２０（ｍ，３３Ｈ），１．９０－１．８１（ｍ，６Ｈ）。

【0318】

３－オクチルウンデカン－１－オール（１０ａ）の合成
化合物９ａ（７．０ｇ、２１．４ｍｍｏ）を１６ｍＬのＴＨＦに溶解し、０℃に冷却し、ＬｉＡｌＨ_４（１６ｍＬ、ＴＨＦ中２Ｍ、３２．２ｍｍｏｌ）を滴下した。反応混合物を一晩撹拌したままにし、室温に加温し、次いで３０ｍＬのＴＨＦ／Ｈ_２Ｏ混合物（体積で１：１）の添加によって０℃でクエンチした。反応混合物をＥｔＯＡｃで抽出し、セライトを通して濾過した。有機相を水、ブラインで２回洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、濃縮した。カラムクロマトグラフィ（ＣＨ_２Ｃｌ_２－ＥｔＯＡｃ）によって精製して、６．０ｇの化合物１０ａを収率９７％で提供した。^１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ｄ－クロロホルム）δ ｐｐｍ：３．６６（ｔ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，２Ｈ），１．５１（ｍ，２Ｈ），１．４１（ｂｒ ｓ，１Ｈ），１．１０－１．２９（ｍ，２９Ｈ），１．８１－１．９０（ｍ，６Ｈ）．

【0319】

３－オクチルウンデシル６－ブロモヘキサノエート（５ｄ）の合成
化合物１０ａ（３．５ｇ、１２．３ｍｍｏｌ）及び１１ａ（２．９ｇ、１４．９ｍｍｏｌ－市販）を２５ｍＬのジクロロメタンに溶解し、次いでＤＭＡＰ（１９０ｍｇ、１．５５ｍｍｏｌ）及びＥＤＣＩ（２．９５ｇ、１５．４ｍｍｏｌ）を室温でこの溶液に添加した。一晩撹拌した後、反応物を水でクエンチし、ジクロロメタンで希釈し、ＮａＨＣＯ_３（飽和水溶液）及びブラインで洗浄した。有機相をＮａ_２ＳＯ_４上で乾燥させ、濃縮した。カラムクロマトグラフィ精製（ヘキサン－ＥｔＯＡｃ）によって、３．８ｇの化合物５ｄを収率６７％で提供した。^１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ｄ－クロロホルム）δ ｐｐｍ：４．０８（ｔ，Ｊ＝７．１４Ｈｚ，２Ｈ），３．４０（ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，２Ｈ），２．３０（ｔ，Ｊ＝７．１４Ｈｚ，２Ｈ），１．９２－１．８０（ｍ，２Ｈ），１．７０－１．２０（ｍ，３６Ｈ），１．９２－１．８０（ｍ，６Ｈ）

【0320】

実施例８：四級アミン又は四級アンモニウムカチオンを含むカチオン性脂質の合成
上記の脂質１～１１及び式Ｉの脂質の各々は、アセトニトリル（ＣＨ_３ＣＮ）及びクロロホルム（ＣＨＣｌ_３）中のクロロメタン（ＣＨ_３Ｃｌ）で処理することによって、四級アミン又は四級アンモニウムカチオンを含むその対応する脂質に変換することができる。

【0321】

実施例９：脂質ナノ粒子の調製
脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を、約１０：１～３０：１の全脂質対ｃｅＤＮＡの重量比で調製した。手短に言えば、本開示のカチオン性脂質、非カチオン性脂質（例えば、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ））、膜融合性をもたらすための構成成分（ステロール等、例えば、コレステロール）、及び複合脂質分子（ＰＥＧ化脂質コンジュゲート等）、例えば、１－（モノメトキシ－ポリエチレングリコール）－２，３－ジミリストイルグリセロール（２０００（「ＰＥＧ－ＤＭＧ」）の平均ＰＥＧ分子量を有する）を、例えば、４７．５：１０．０：４０．７：１．８、４７．５：１０．０：３９．５：３．０、又は４７．５：１０．０：４０．２：２．３のモル比でアルコール（例えば、エタノール）に可溶化した。ｃｅＤＮＡを緩衝溶液で所望の濃度に希釈した。例えば、ｃｅＤＮＡを、酢酸ナトリウム、酢酸ナトリウム及び塩化マグネシウム、クエン酸、リンゴ酸、又はリンゴ酸及び塩化ナトリウムを含む緩衝溶液中の０．１ｍｇ／ｍｌ～０．２５ｍｇ／ｍｌの濃度に希釈した。一例では、ｃｅＤＮＡを１０～５０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ４）で０．２ｍｇ／ｍＬに希釈した。アルコール脂質溶液をｃｅＤＮＡ水溶液と、例えばシリンジポンプ又は衝突ジェットミキサーを使用して、約１：５～１：３（体積／体積）の比で、１０ｍｌ／分を超える全流量で混合した。一例では、アルコール脂質溶液をｃｅＤＮＡ水溶液と約１：３（体積／体積）の比で１２ｍｌ／分の流量で混合した。アルコールを除去し、緩衝液を透析によってＰＢＳに置き換えた。代替的に、緩衝液を、遠心分離管を使用してＰＢＳと置き換えた。アルコール除去及び同時緩衝液交換は、例えば、透析又はタンジェンシャルフロー濾過によって達成された。得られた脂質ナノ粒子を、０．２μｍ孔無菌フィルターで濾過する。

【0322】

ある研究では、参照脂質Ａ、ＤＳＰＣ、コレステロール、及びＤＭＧ－ＰＥＧ２０００（モル比４７．５：１０．０：４０．７：１．８）を含む脂質溶液を対照として使用して、例示的なｃｅＤＮＡを含む脂質ナノ粒子を調製した。いくつかの研究では、Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）のような組織特異的標的リガンドが、参照脂質Ａ、参照脂質Ｂ、ＭＣ３、又は本開示のカチオン性脂質を含む製剤に含まれていた。ＭＣ３は、（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）－ヘプタトリアコンタ－６，９，２８，３１－テトラエン－１９－イル－４－（ジメチルアミノ）ブタノエートであり、ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡとも呼ばれ、以下の構造を有する。

【0323】

【化28】

【0324】

トリ－アンテナリーＧａｌＮＡｃ（ＧａｌＮＡｃ３）又はテトラ－アンテナリーＧａｌＮＡｃ（ＧａｌＮＡｃ４）等のＧａｌＮＡｃリガンドは、当該技術分野で既知のように合成することができ（国際公開第２０１７／０８４９８７号及び国際公開第２０１３／１６６１２１号を参照されたい）及び当該技術分野において周知のように脂質又はＰＥＧに化学的にコンジュゲートすることができる（Ｒｅｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（２００１）「Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｐｐｅｒ Ｓｉｚｅ Ｌｉｍｉｔ ｆｏｒ Ｕｐｔａｋｅ ａｎｄ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｏｆ Ｌｉｇａｎｄｓ ｂｙ ｔｈｅ Ａｓｉａｌｏｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｏｎ Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ ｉｎ Ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ Ｖｉｖｏ」２７６：３７５５７７－３７５８４を参照されたい）。緩衝溶液中のｃｅＤＮＡの水溶液を調製した。脂質溶液及びｃｅＤＮＡ溶液を、１：３（ｖ／ｖ）の脂質対ｃｅＤＮＡの比、１２ｍＬ／分の全流量で、ＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｅｒ上でインハウス手順を使用して混合した。

【0325】

【表1A】

【0326】

【表1B】

Ｎｏ．＝番号、ＩＶ＝静脈内、ＲＯＡ＝投与経路、ＬＮＰ＝脂質ナノ粒子、ＩＶＩＳ＝インビボ撮像セッション、ＢＷ＝体重

【0327】

【表2A】

ＤＳＰＣ＝ジステアロイルホスファチジルコリン、Ｃｈｏｌ＝コレステロール、ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００＝１－（モノメトキシ－ポリエチレングリコール）－２，３－ジミリストイルグリセロール（ＰＥＧ_２０００－ＤＭＧ）、ＧａｌＮＡｃ＝Ｎ－アセチルガラクトサミン、ＧａｌＮＡｃ４＝テトラアンテナリーＧａｌＮＡｃ

【0328】

【表2B】

ＤＳＰＣ＝ジステアロイルホスファチジルコリン、Ｃｈｏｌ＝コレステロール、ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００＝１－（モノメトキシ－ポリエチレングリコール）－２，３－ジミリストイルグリセロール（ＰＥＧ_２０００－ＤＭＧ）、ＧａｌＮＡｃ＝Ｎ－アセチルガラクトサミン、ＧａｌＮＡｃ４＝テトラアンテナリーＧａｌＮＡｃ

【0329】

参照脂質Ａ、参照脂質Ｂ、及びＭＣ３を含むＬＮＰを陽性対照として使用した。

【0330】

実施例１０：脂質ナノ粒子の前臨床インビボ研究
マウスにおけるＬＮＰを配合したｃｅＤＮＡ－ルシフェラーゼのインビボ発現及び忍容性を評価するために、前臨床研究を実行した。これらのＬＮＰは、陽性対照として参照脂質Ａ、参照脂質Ｂ、若しくはＭＣ３、又は本開示のカチオン性脂質のいずれかを含んでいた。これらの前臨床試験に含まれる試験デザイン及び手順は、以下のとおりである。

【0331】

材料及び方法
種（数、性別、年齢）：ＣＤ－１マウス雄、研究１では到着時に約４週齢、研究２では約６～８週齢。

【0332】

ケージサイドでの観察：ケージサイドでの観察を毎日行った。

【0333】

臨床観察：研究１及び研究２の両方において、０、１、２、３、４、及び７日目（安楽死前）に臨床観察を行った。例外毎に追加の観察を行った。全ての動物の体重を、適用可能な場合、上記と同じ日に記録した。必要に応じて、追加の体重を記録した。

【0334】

用量投与：試験品（ＬＮＰ：ｃｅＤＮＡ－Ｌｕｃ）を、外側尾静脈への静脈内投与によって、全ての群に０日目に５ｍＬ／ｋｇの体積で投与した。用量レベルは、研究１では０．２５ｍｇ／ｋｇ、研究２では０．５ｍｇ／ｋｇであった。

【0335】

インライフ撮像：４日目に、全ての動物に２．５ｍＬ／ｋｇの腹腔内（intraperitoneal、ＩＰ）注射を介して１５０ｍｇ／ｋｇ（６０ｍｇ／ｍＬ）のルシフェリンを投与した。各ルシフェリン投与後≦１５分。以下に説明するインビボ撮像プロトコルに従って全ての動物にＩＶＩＳ撮像セッションを行った。

【0336】

インビボ撮像プロトコル
●ルシフェリンストック粉末を表示上－２０℃で保存した。
●製剤化されたルシフェリンを１ｍＬのアリコート、２～８℃で保存して、光から保護した。
●製剤化されたルシフェリンは、２～８℃で最大３週間安定であり、光から保護され、室温（room temperature、ＲＴ）で約１２時間安定であった。
●ルシフェリンをＰＢＳに十分な容量で６０ｍｇ／ｍＬの目標濃度に溶解し、必要に応じて５ＭのＮａＯＨ（約０．５μｌ／ｍｇルシフェリン）及びＨＣｌ（約０．５μｌ／ｍｇルシフェリン）でｐＨ＝７．４に調整した。
●少なくとも約５０％の超過分を含め、プロトコルに従って適切な量を調製した。

【0337】

注射及び撮像
●動物の被毛を剃った（必要に応じて）。
●プロトコルに従って、腹腔内を介して６０ｍｇ／ｍＬのＰＢＳ中の１５０ｍｇ／ｋｇのルシフェリンを注射した。
●撮像は、投与直後又は投与後最大１５分行った。
●撮像セッション中に動物を麻酔するために、イソフルラン気化器を１～３％（通常は２．５％）に設定した。
●撮像セッションのためのイソフルラン麻酔：
○動物をイソフルランチャンバーに入れ、イソフルランが有効になるまで約２～３分待った。
○ＩＶＩＳ機器の側面の麻酔レベルが「オン」の位置にあることを確認した。
○動物をＩＶＩＳ機器に入れた。

【0338】

最高感度の設定で所望の取得プロトコルを行った。

【0339】

結果及び考察
研究１
研究１を、ＬＮＰ－ｃｅＤＮＡ－ルシフェラーゼ組成物を０．２５ｍｇ／ｋｇの用量でマウスに投与した場合の、本開示の例示的な脂質、すなわち、脂質６のＬＮＰとして製剤化される能力、並びにインビボ発現及び忍容性を評価する目的で実施した。

【0340】

原則として、０．１５以下の多分散指数（polydispersity index、ＰＤＩ）は、形成されたＬＮＰのサイズの均一性が良好であることを示し、９０％の封入効率（encapsulation efficiency、ＥＥ）は、満足のいく封入率であることを示す。各々脂質６を用いて製剤化されたが、様々なＤＭＧ－ＰＥＧ２０００量及び適宜調整されたコレステロール量を用いて製剤化されたＬＮＰ２、ＬＮＰ３、及びＬＮＰ４は、０．１未満である優れたＰＤＩ値及び９５％を超えるＥＥ値を示した。

【0341】

図１に示すように、ＬＮＰ２、ＬＮＰ３、及びＬＮＰ４（すなわち、カチオン性脂質として脂質６及び核酸カーゴとしてｃｅＤＮＡ－ルシフェラーゼを含むＬＮＰ）は、参照脂質Ａ及びｃｅＤＮＡ－ルシフェラーゼを用いて製剤化されたＬＮＰ１の発現と同等である良好なインビボルシフェラーゼ発現レベルを４日目に示した。

【0342】

研究２
研究２は、ＬＮＰ－ｃｅＤＮＡ－ルシフェラーゼ組成物を０．５ｍｇ／ｋｇの用量でマウスに投与した場合の、本開示のいくつかの例示的な脂質、すなわち、脂質１、脂質７、及び脂質１１のＬＮＰ（すなわち、それぞれＬＮＰ１０、及びＬＮＰ８、及びＬＮＰ９）として製剤化される能力、並びにインビボ発現及び忍容性を評価する目的で実施した。本発明のこれらのＬＮＰ組成物の発現及び忍容性もまた、参照脂質Ａ、参照脂質Ｂ、及びＭＣ３（全て式（Ｉ）脂質とは異なる頭部基を有する）を用いて製剤化されたＬＮＰ組成物と比較した。全てのＬＮＰ組成物は、満足な封入効率及び多分散指数で製剤化された。

【0343】

図２Ａに示すように、ＬＮＰ８、ＬＮＰ９、及びＬＮＰ１０（すなわち、それぞれ脂質７、脂質１１、及び脂質１を含むＬＮＰ）は、４日目に良好なインビボルシフェラーゼ発現レベルを示した。注目すべきことに、それぞれ脂質７及び脂質１１を用いて製剤化されたＬＮＰ８及びＬＮＰ９のルシフェラーゼ発現レベルは、ＭＣ３を用いて製剤化されたＬＮＰ６のルシフェラーゼ発現レベルよりも高かった。更に、図２Ｂは、研究１において適用された用量レベルの２倍である０．５ｍｇ／ｋｇであっても、本開示のカチオン性脂質を用いて各々製剤化されたＬＮＰ８、ＬＮＰ９、及びＬＮＰ１０は全て、処置後４日目までに完全体重回復を達成したことを示し、それによって、これらのＬＮＰ組成物がマウスにおいて十分に忍容されたことを示す。

【0344】

参考文献及び均等物
本出願全体を通して引用される；参考文献、発行された特許、公開された特許出願、及び同時係属中の特許出願を含む全ての特許及び他の刊行物は、例えば、本明細書に記載される技術に関連して使用され得る、そのような刊行物に記載される方法論を説明及び開示する目的で、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。これらの出版物は、本出願の出願日より前のそれらの開示のためにのみ提供されている。この点に関するいかなるものも、発明者が先行発明のおかげで、又はいかなる他の理由のためにもそのような開示に先行する権利がないことを認めるものとして解釈されるべきではない。日付に関する全ての記述又はこれらの文書の内容に関する表現は、出願人が入手できる情報に基づいており、これらの文書の日付又は内容の正確さに関するいかなる承認も構成するものではない。

【0345】

本開示の実施形態の説明は、網羅的であること、又は本開示を開示された正確な形態に限定することを意図したものではない。本開示の特定の実施形態及び実施例が、例示の目的で本明細書で説明されているが、当業者が認識するように、本開示の範囲内で様々な同等の修正が可能である。例えば、方法のステップ又は機能は、所与の順序で提示されるが、代替的な実施形態は、異なる順序で機能を実施してもよく、又は機能は実質的に同時に実施されてもよい。本明細書で提供される開示の教示は、必要に応じて他の手順又は方法に適用することができる。本明細書に記載される様々な実施形態は、更なる実施形態を提供するために組み合わせることができる。本開示の態様は、必要に応じて、上記の参照文献及び出願の組成物、機能、及び概念を用いて本開示の更なる実施形態を提供するように修正することができる。更に、生物学的機能の同等性の考慮により、種類又は量の生物学的又は化学的作用に影響を与えることなく、タンパク質構造にいくつかの変更を加えることができる。詳細な説明に照らして、これらの変更及び他の変更を本開示に加えることができる。そのような修正は全て、添付の特許請求の範囲内に含まれることが意図されている。

【0346】

前述の実施形態のうちのいずれかの特定のエレメントは、他の実施形態のエレメントと組み合わせるか、又は置き換えることができる。更に、本開示のある特定の実施形態に関連する利点が、これらの実施形態の文脈で説明されたが、他の実施形態もそのような利点を示し得、全ての実施形態が本開示の範囲内にあるために必ずしもそのような利点を示す必要はない。

【0347】

本明細書に記載される技術は、以下の実施例によって更に説明されており、決してこれらを更に限定するものと解釈されるべきではない。本発明は、本明細書に記載される特定の方法論、プロトコル、及び試薬等にいかなる様式でも限定されず、そのようなものとして変化し得ることを理解されたい。本明細書で使用される用語法は、特定の実施形態のみを説明する目的のためであり、単に特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を限定することを意図されない。

【図1】

【図2A】

【図2B】

【配列表】

2024522692000001.app

【国際調査報告】