特表 2024-522705 固体増殖培地に蛍光色素を直接添加することによって微生物を検出する方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-06-21

(54)【発明の名称】固体増殖培地に蛍光色素を直接添加することによって微生物を検出する方法

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/22 20060101AFI20240614BHJP

   C12N 1/00 20060101ALI20240614BHJP

   C12M 1/34 20060101ALI20240614BHJP

【ＦＩ】

C12Q1/22

C12N1/00 G

C12M1/34 B

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023577223

(86)(22)【出願日】2022-06-14

(85)【翻訳文提出日】2024-02-09

(86)【国際出願番号】 EP2022066238

(87)【国際公開番号】W WO2022263479

(87)【国際公開日】2022-12-22

(31)【優先権主張番号】21305813.4

(32)【優先日】2021-06-14

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(31)【優先権主張番号】21306443.9

(32)【優先日】2021-10-15

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】521367824

【氏名又は名称】ダイアミデックス

(74)【代理人】

【識別番号】100108453

【弁理士】

【氏名又は名称】村山 靖彦

(74)【代理人】

【識別番号】100110364

【弁理士】

【氏名又は名称】実広 信哉

(74)【代理人】

【識別番号】100133400

【弁理士】

【氏名又は名称】阿部 達彦

(72)【発明者】

【氏名】アレクサンドル・ミュレール

(72)【発明者】

【氏名】オドレイ・デュモン

(72)【発明者】

【氏名】サム・デュカン

【テーマコード（参考）】

4B029

4B063

4B065

【Ｆターム（参考）】

4B029AA03

4B029AA08

4B029BB01

4B029CC11

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4B065BC31

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4B065CA46

(57)【要約】

本発明は、目的の微生物又は微生物の群を検出する及び/又は数え上げる方法であって、a)容器中で、前記微生物又は微生物の群を含有すると疑われる試料を、前記微生物又は微生物の群の増殖を支持するために栄養素を含有する固体増殖培地と、及び少なくとも1つの蛍光色素と接触させる工程、b)前記微生物又は微生物の群の微小コロニーを形成するのに十分な条件下及び時間の間、前記容器をインキュベートする工程、並びにc)前記少なくとも1つの蛍光色素の蛍光シグナルを発する微小コロニーを検出する及び/又は数え上げる工程を含み、それによって、試料中に含有される前記微生物又は微生物の群を検出する、同定する及び/又は数え上げる方法に関する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

目的の微生物又は微生物の群を検出する又は数え上げる方法であって、
a)容器中で、前記微生物又は微生物の群を含有すると疑われる試料を、前記微生物又は微生物の群の増殖を支持するために栄養素を含有する固体増殖培地と、及び少なくとも1つの蛍光色素と接触させる工程、
b)前記微生物又は微生物の群の微小コロニーを形成するのに十分な条件下及び時間の間、前記容器をインキュベートする工程、及び
c)前記少なくとも1つの蛍光色素の蛍光シグナルを発する微小コロニーを検出する又は数え上げる工程
を含み、
それによって、試料中に含有される前記微生物又は微生物の群を検出する又は数え上げる方法。

【請求項2】

工程a)の前に、試料の微生物がメンブレンフィルター上で濃縮され、工程a)において前記メンブレン及び微生物が、固体増殖培地及び前記少なくとも1つの蛍光色素と接触される、請求項1に記載の方法。

【請求項3】

工程a)が、
a1)前記微生物又は微生物の群を含有すると疑われる試料を少なくとも1つの蛍光色素と接触させる工程、及び
a2)容器中で、前記試料を前記微生物又は微生物の群の増殖を支持するために栄養素を含有する固体増殖培地と接触させる工程
を含む場合があり、
工程a1)及びa2)が同時に、又は任意の順序で逐次実行される、請求項1に記載の方法。

【請求項4】

工程a1)が、工程a2)の前に実行される、請求項3に記載の方法。

【請求項5】

工程a2)の前に、試料の微生物がメンブレンフィルター上で濃縮される、請求項4に記載の方法。

【請求項6】

メンブレンフィルターが、混合セルロースエステル(MCE)、ポリビニリデンフルオリド(PVDF)、ニトロセルロース、ポリテトラフルオロエチレン、ポリカーボネート又はナイロンで作られている、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。

【請求項7】

メンブレンフィルターがMCE又はPVDFで作られている、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。

【請求項8】

メンブレンフィルターがMCEで作られている、請求項1から7のいずれか一項に記載の方法。

【請求項9】

メンブレンフィルターがPVDFで作られている、請求項1から7のいずれか一項に記載の方法。

【請求項10】

固体増殖培地が、前記微生物又は微生物の群に対して選択的である、請求項1から9のいずれか一項に記載の方法。

【請求項11】

前記少なくとも1つの蛍光色素が、キサンテンベースの色素、アクリジン色素、アントラセンベースの色素、クマリンベースの色素、シアニンベースの色素、ジピロメテンベースの色素、ナフタレンベースの色素、ピレンベースの色素、スクアラインベースの色素、スクアラインロタキサンベースの色素及び4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)及びそれらの組合せからなる群から選択される、請求項1から10のいずれか一項に記載の方法。

【請求項12】

前記少なくとも1つの蛍光色素が、キサンテンベースの色素、アントラセンベースの色素、クマリンベースの色素、シアニンベースの色素、ジピロメテンベースの色素、ナフタレンベースの色素、ピレンベースの色素、スクアラインベースの色素、スクアラインロタキサンベースの色素及び4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)及びそれらの組合せからなる群から選択される、請求項1から10のいずれか一項に記載の方法。

【請求項13】

前記少なくとも1つの蛍光色素が、キサンテンベースの色素、アントラセンベースの色素、クマリンベースの色素、シアニンベースの色素、ジピロメテンベースの色素、ナフタレンベースの色素、ピレンベースの色素、スクアラインベースの色素及びスクアラインロタキサンベースの色素及びそれらの組合せからなる群から選択される、請求項1から10のいずれか一項に記載の方法。

【請求項14】

前記少なくとも1つの蛍光色素が、MB660R、アクリジンオレンジ、DRAQ5、Cytrak Orange、Alexa Fluor 350、Pacific Blue、Cy5、好ましくは、スルホ-Cy5、Cy5.5、好ましくは、スルホ-Cy5.5、BODIPY 500/510、プロダン、Alexa Fluor 405、Cascade Blue、Seta 650、Seta 375、Setau 647、SeTau 488、Alexa Fluor 488、ATTO 647及びDAPI、それらの誘導体及びそれらの組合せからなる群から選択される、請求項1から13のいずれか一項に記載の方法。

【請求項15】

前記少なくとも1つの蛍光色素が、MB660R、DRAQ5、Cytrak Orange、Alexa Fluor 350、Pacific Blue、Cy5、好ましくは、スルホ-Cy5、Cy5.5、好ましくは、スルホ-Cy5.5、BODIPY 500/510、プロダン、Alexa Fluor 405、Cascade Blue、Seta 650、Seta 375、Setau 647、SeTau 488、Alexa Fluor 488及びATTO 647、それらの誘導体及びそれらの組合せからなる群から選択される、請求項1から13のいずれか一項に記載の方法。

【請求項16】

前記少なくとも1つの蛍光色素が、MB660R-DBCO、MB660R-酸、アクリジンオレンジ、DRAQ5、Cytrak Orange、Alexa Fluor 350 NHSエステル、Pacific Blue-NHSエステル、スルホ-Cy5酸、スルホ-Cy5.5酸、BODIPY 500/510、プロダン、Alexa Fluor 405-DBCO、Cascade Blue、Seta 650-DBCO、Seta 375-NHS、SeTau 647-マレイミド、SeTau 488-NHS、Alexa Fluor 488酸、Alexa Fluor 488-DBCO、ATTO 647酸及びDAPI、それらの誘導体及びそれらの組合せからなる群から選択される、請求項1から13のいずれか一項に記載の方法。

【請求項17】

前記少なくとも1つの蛍光色素が、MB660R-DBCO、MB660R-酸、DRAQ5、Cytrak Orange、Alexa Fluor 350 NHSエステル、Pacific Blue-NHSエステル、スルホ-Cy5酸、スルホ-Cy5.5酸、BODIPY 500/510、プロダン、Alexa Fluor 405-DBCO、Cascade Blue、Seta 650-DBCO、Seta 375-NHS、SeTau 647-マレイミド、SeTau 488-NHS、Alexa Fluor 488酸、Alexa Fluor 488-DBCO及びATTO 647酸、それらの誘導体及びそれらの組合せからなる群から選択される、請求項1から13のいずれか一項に記載の方法。

【請求項18】

前記少なくとも1つの蛍光色素が、DRAQ5、Alexa Fluor 350、Pacific blue、Cy5、好ましくは、スルホ-Cy5、BODIPY 500/510、プロダン、Alexa Fluor 405、Cascade blue、Seta 650、Setau 647、SeTau 488、MB 660R、Alexa Fluor 488、ATTO 647及びDAPI、それらの誘導体及びそれらの組合せからなる群から選択される、好ましくは、DRAQ5、Alexa Fluor 350-NHSエステル、Pacific blue-NHSエステル、スルホ-Cy5酸、BODIPY 500/510、プロダン、Alexa Fluor 405-DBCO、Cascade blue、Seta 650-DBCO、SeTau 488-NHS、SeTau 647-マレイミド、MB 660R-酸、MB 660R-DBCO、Alexa Fluor 488酸、Alexa Fluor 488-DBCO、ATTO 647酸及びDAPI及びそれらの組合せからなる群から選択される、請求項1から12のいずれか一項に記載の方法。

【請求項19】

前記少なくとも1つの蛍光色素が、DRAQ5、Alexa Fluor 350、Cy5、好ましくは、スルホ-Cy5、BODIPY 500/510、プロダン、Alexa Fluor 405、Seta 650、Setau 647、MB 660R、Alexa Fluor 488、ATTO 647及びDAPI、それらの誘導体及びそれらの組合せからなる群から選択される、好ましくは、DRAQ5、Alexa Fluor 350-NHSエステル、スルホ-Cy5酸、BODIPY 500/510、プロダン、Alexa Fluor 405-DBCO、Seta 650-DBCO、SeTau 647-マレイミド、MB 660R-酸、MB 660R-DBCO、Alexa Fluor 488酸、Alexa Fluor 488-DBCO、ATTO 647酸及びDAPI及びそれらの組合せからなる群から選択される、請求項1から12のいずれか一項に記載の方法。

【請求項20】

目的の微生物又は微生物の群が、
- 好熱性好酸性菌に属し、好ましくは、アリシクロバチルス・アシドテレストリス、アリシクロバチルス・アシドカルダリウス、アリシクロバチルス・アシディフィラス、アリシクロバチルス・シクロヘプタニカス、アリシクロバチルス・ヘスペリダム、アリシクロバチルス・ハーバリウス及びアリシクロバチルス・コンタミナンス及びそれらの組合せからなる群から選択される、並びに/又は
- 酢酸菌に属し、好ましくは、アセトバクター属、グルコノバクター属、グルコンアセトバクター属及びアサイア属及びそれらの組合せに属する細菌から選択される、並びに/又は
- 乳酸菌に属し、好ましくは、ラクトバチルス属及びワイセラ属及びそれらの組合せに属する細菌から選択され、並びに/又は
- 嫌気性菌に属し、好ましくは、クロストリジウム属及びキューティバクテリウム属の細菌及びそれらの組合せから選択され、並びに/又は
- 好気性中温性菌に属し、好ましくは、メチロバクテリウム属、シュードモナス属、バチルス属、エシェリキア属、スタフィロコッカス属、アシネトバクター属、クロノバクター属、クレブシエラ属、サルモネラ属、エンテロコッカス属、シゲラ属、コクリア属及びバークホルデリア属及びそれらの組合せから選択され、並びに/又は
- グラム陰性菌に属し、好ましくは、エシェリキア属及びシュードモナス属及びそれらの組合せから選択され、並びに/又は
- 従属栄養細菌の群に属し、好ましくは、アシネトバクター属、エロモナス属、ブレブンディモナス属、バークホルデリア属、シトロバクター属、エドワージエラ属、エンテロバクター属、エシェリキア属、オクロバクテリウム属、クレブシエラ属、メチロバクテリウム属、モラクセラ属、パンテア属、プロテウス属、シュードモナス属、ラルストニア属、サルモネラ属、セラチア属、シゲラ属、スフィンゴモナス属、ステノトロホモナス属、エルシニア属、バチルス属、エンテロコッカス属、ミクロコッカス属、スタフィロコッカス属及びそれらの組合せに属する細菌から選択され、並びに/又は
- 酵母及びカビの群に属し、好ましくは、カンジダ属、ザイゴサッカロミセス属、アスペルギルス属、サッカロミセス属、ゲオトリクム属及びペニシリウム属及びそれらの組合せから選択される、請求項1から19のいずれか一項に記載の方法。

【請求項21】

目的の微生物又は微生物の群が、
- 好熱性好酸性菌に属し、好ましくは、アリシクロバチルス・アシドテレストリス、アリシクロバチルス・アシドカルダリウス、アリシクロバチルス・アシディフィラス、アリシクロバチルス・シクロヘプタニカス、アリシクロバチルス・ヘスペリダム、アリシクロバチルス・ハーバリウス及びアリシクロバチルス・コンタミナンス及びそれらの組合せからなる群から選択され、並びに/又は、
- 酢酸菌に属し、好ましくは、アセトバクター属、グルコノバクター属、グルコンアセトバクター属及びアサイア属及びそれらの組合せに属する細菌から選択され、並びに/又は、
- 乳酸菌に属し、好ましくは、ラクトバチルス属及びワイセラ属及びそれらの組合せに属する細菌から選択され、並びに/又は、
- 嫌気性菌に属し、好ましくは、クロストリジウム属及びキューティバクテリウム属の細菌及びそれらの組合せから選択され、並びに/又は、
- 好気性中温性菌に属し、好ましくは、メチロバクテリウム属、シュードモナス属、バチルス属、エシェリキア属、スタフィロコッカス属、アシネトバクター属、クロノバクター属、クレブシエラ属、サルモネラ属、エンテロコッカス属、シゲラ属、コクリア属及びバークホルデリア属及びそれらの組合せから選択され、並びに/又は、
- グラム陰性菌に属し、好ましくは、エシェリキア属及びシュードモナス属及びそれらの組合せから選択され、並びに/又は、
- 酵母及びカビの群に属し、好ましくは、カンジダ属、ザイゴサッカロミセス属、アスペルギルス属、サッカロミセス属、ゲオトリクム属及びペニシリウム属及びそれらの組合せから選択される、請求項1から20のいずれか一項に記載の方法。

【請求項22】

目的の微生物又は微生物の群が、好ましくは、アリシクロバチルス・アシドテレストリス、アリシクロバチルス・アシドカルダリウス、アリシクロバチルス・アシディフィラス、アリシクロバチルス・シクロヘプタニカス、アリシクロバチルス・ヘスペリダム、アリシクロバチルス・ハーバリウス及びアリシクロバチルス・コンタミナンス及びそれらの組合せからなる群から選択される、好熱性好酸性菌の群に属する微生物に属するか、又はそれを含み、前記少なくとも1つの蛍光色素が、キサンテンベースの色素からなる群から選択される、好ましくは、MB660R、Alexa Fluor 488及びATTO647及びそれらの誘導体及び組合せからなる群から選択される、より好ましくは、MB660R-酸、MB660R-DBCO、Alexa Fluor 488酸、Alexa Fluor 488-DBCO及びATTO647酸及びそれらの組合せからなる群から選択される、請求項1から11のいずれか一項に記載の方法。

【請求項23】

前記少なくとも1つの蛍光色素が、キサンテンベースの色素からなる群から、好ましくは、MB660R及び誘導体からなる群から、より好ましくは、MB660R-酸及びMB660R-DBCOからなる群から選択される、更により好ましくは、MB660R-DBCOである、請求項22に記載の方法。

【請求項24】

目的の微生物又は微生物の群が、好ましくは、アセトバクター属、グルコノバクター属、グルコンアセトバクター属及びアサイア属及びそれらの組合せに属する細菌から選択され、より好ましくは、アセトバクター・アセチ、グルコノアセトバクター・リクファシエンス、グルコノバクター・オキシダンス及びアサイア・サイアメンシス及びそれらの組合せからなる群から選択される、酢酸菌(AAB)の群に属する微生物に属するか、又はそれを含み、前記少なくとも1つの蛍光色素が、キサンテンベースの色素及びDAPI及びそれらの組合せからなる群から選択される、好ましくは、Alexa Fluor 488、MB660R、ATTO647及びDAPI及びそれらの誘導体及び組合せからなる群から選択される、より好ましくは、Alexa Fluor 488酸、Alexa Fluor 488-DBCO、MB660R-酸、MB660R-DBCO、ATTO647酸及びDAPI及びそれらの組合せからなる群から選択される、請求項1から11のいずれか一項に記載の方法。

【請求項25】

前記少なくとも1つの蛍光色素が、キサンテンベースの色素からなる群から選択される、好ましくは、Alexa Fluor 488、MB660R及びATTO647及びそれらの誘導体及び組合せからなる群から選択される、より好ましくは、Alexa Fluor 488酸、Alexa Fluor 488-DBCO、MB660R-酸、MB660R-DBCO及びATTO647酸及びそれらの組合せからなる群から選択される、請求項24に記載の方法。

【請求項26】

前記少なくとも1つの蛍光色素が、MB660R及びATTO647及びそれらの誘導体及び組合せからなる群から選択される、好ましくは、MB660R-酸、MB660R-DBCO及びATTO647酸及びそれらの組合せからなる群から選択される、より好ましくは、MB660R-酸及びATTO647酸及びそれらの組合せからなる群から選択される、請求項24に記載の方法。

【請求項27】

目的の微生物又は微生物の群が、好ましくは、ラクトバチルス属及びワイセラ属及びそれらの組合せに属する細菌から選択される、より好ましくは、ラクトバチルス・カゼイ、ラクトバチルス・プランタルム及びワイセラ・コンフューザ及びそれらの組合せからなる群から選択される、乳酸菌(LAB)の群に属する微生物に属するか、又はそれを含み、前記少なくとも1つの蛍光色素が、キサンテンベースの色素及びDAPI及びそれらの組合せからなる群から選択される、好ましくは、Alexa Fluor 488、MB660R、ATTO647及びDAPI及びそれらの誘導体及び組合せからなる群から選択される、より好ましくは、Alexa Fluor 488酸、Alexa Fluor 488-DBCO、MB660R-酸、MB660R-DBCO及びATTO647酸及びそれらの組合せからなる群から選択される、請求項1から11のいずれか一項に記載の方法。

【請求項28】

前記少なくとも1つの蛍光色素が、Alexa Fluor 488、MB660R及びDAPI及びそれらの誘導体及び組合せからなる群から選択される、特に、Alexa Fluor 488酸、MB660R-酸及びDAPI及びそれらの組合せからなる群から選択される、好ましくは、キサンテンベースの色素からなる群から選択される、より好ましくは、Alexa Fluor 488酸及びMB660R-酸及びそれらの組合せからなる群から選択される、更により好ましくは、MB660R-酸である、請求項27に記載の方法。

【請求項29】

目的の微生物又は微生物の群が、好ましくは、クロストリジウム属及びキューティバクテリウム属の細菌及びそれらの組合せから選択され、より好ましくは、クロストリジウム・スポロゲネス及びキューティバクテリウム・アクネス及びそれらの組合せからなる群から選択される、嫌気性菌の群に属する微生物に属するか、又はそれを含み、前記少なくとも1つの蛍光色素が、キサンテンベースの色素、シアニンベースの色素及びDAPI及びそれらの組合せからなる群から選択される、好ましくは、MB660R、Cy5、好ましくは、スルホ-Cy5及びDAPI及びそれらの誘導体及び組合せからなる群から、より好ましくは、MB660R-DBCO、スルホ-Cy5酸及びDAPI及びそれらの組合せからなる群から選択される、請求項1から11のいずれか一項に記載の方法。

【請求項30】

前記少なくとも1つの蛍光色素が、キサンテンベースの色素及びシアニンベースの色素からなる群から選択される、好ましくは、MB660R及びCy5、好ましくは、スルホ-Cy5及びそれらの誘導体及び組合せからなる群から、より好ましくは、MB660R-DBCO及びスルホ-Cy5酸及びそれらの組合せからなる群から選択される、請求項29に記載の方法。

【請求項31】

前記少なくとも1つの蛍光色素が、MB660R-DBCO及びスルホ-Cy5酸を含む、請求項29に記載の方法。

【請求項32】

目的の微生物又は微生物の群が、好ましくは、メチロバクテリウム属、シュードモナス属、バチルス属、エシェリキア属、スタフィロコッカス属、アシネトバクター属、クロノバクター属、クレブシエラ属、サルモネラ属、エンテロコッカス属、シゲラ属、コクリア属及びバークホルデリア属及びそれらの組合せに属する細菌から選択され、より好ましくは、メチロバクテリウム・エキストロクエンス、緑膿菌、枯草菌、大腸菌、黄色ブドウ球菌、アシネトバクター・バウマンニ、クロノバクター・サカザキ、肺炎桿菌、ネズミチフス菌、フェカリス菌、ソンネ菌、コクリア・リゾフィラ及びセパシア菌及びそれらの組合せからなる群から選択される、好気性中温性菌(AMB)の群に属する微生物に属するか、又はそれを含み、前記少なくとも1つの蛍光色素が、キサンテンベースの色素、アクリジン色素、アントラセンベースの色素、クマリンベースの色素、シアニンベースの色素、ジピロメテンベースの色素、ナフタレンベースの色素、ピレンベースの色素、スクアラインベースの色素、スクアラインロタキサンベースの色素及びDAPI及びそれらの組合せからなる群から選択される、好ましくは、アクリジンオレンジ、DRAQ5、Cytrak orange、Alexa Fluor 350、Pacific Blue、Cy5、好ましくは、スルホ-Cy5、BODIPY色素、好ましくは、BODIPY 500/510、プロダン、Alexa Fluor 405、Cascade Blue、Seta色素、好ましくは、Seta 650又はSeta 375、SeTau色素、好ましくは、SeTau 647又はSeTau 488、Alexa Fluor 488、MB660R、ATTO647及びDAPI及びそれらの誘導体及び組合せからなる群から選択される、より好ましくは、アクリジンオレンジ、DRAQ5、Cytrak orange、Alexa Fluor 350-NHSエステル、Pacific Blue-NHSエステル、スルホ-Cy5酸、BODIPY 500/510、プロダン、Alexa Fluor 405-DBCO、Cascade Blue、Seta 650-DBCO、Seta 375-NHS、SeTau 647-マレイミド、SeTau 488-NHS、Alexa Fluor 488酸、Alexa Fluor 488-DBCO、MB660R-酸、MB660R-DBCO、ATTO647酸及びDAPI及びそれらの組合せからなる群から選択される、請求項1から11のいずれか一項に記載の方法。

【請求項33】

前記少なくとも1つの蛍光色素が、キサンテンベースの色素、アントラセンベースの色素、クマリンベースの色素、シアニンベースの色素、ジピロメテンベースの色素、ナフタレンベースの色素、ピレンベースの色素、スクアラインベースの色素及びスクアラインロタキサンベースの色素及びそれらの組合せからなる群から選択される、好ましくは、DRAQ5、Cytrak orange、Alexa Fluor 350、Pacific Blue、Cy5、好ましくは、スルホ-Cy5、BODIPY色素、好ましくは、BODIPY 500/510、プロダン、Alexa Fluor 405、Cascade Blue、Seta色素、好ましくは、Seta 650又はSeta 375、SeTau色素、好ましくは、SeTau 647又はSeTau 488、Alexa Fluor 488、MB660R及びATTO647及びそれらの誘導体及び組合せからなる群から選択される、より好ましくは、DRAQ5、Cytrak orange、Alexa Fluor 350-NHSエステル、Pacific Blue-NHSエステル、スルホ-Cy5酸、BODIPY 500/510、プロダン、Alexa Fluor 405-DBCO、Cascade Blue、Seta 650-DBCO、Seta 375-NHS、SeTau 647-マレイミド、SeTau 488-NHS、Alexa Fluor 488酸、Alexa Fluor 488-DBCO、MB660R-酸、MB660R-DBCO及びATTO647酸及びそれらの組合せからなる群から選択される、請求項32に記載の方法。

【請求項34】

前記少なくとも1つの蛍光色素が、キサンテンベースの色素からなる群から選択される、好ましくは、任意選択で、シアニンベースの色素、好ましくは、Cy5、特に、スルホ-Cy5からなる群から選択される蛍光色素と組み合わせたMB660R及び誘導体及びそれらの組合せからなる群から選択される、より好ましくは、任意選択で、スルホ-Cy5酸と組み合わせたMB660R-DBCOである、請求項32に記載の方法。

【請求項35】

目的の微生物又は微生物の群が、好ましくは、エシェリキア属、プロテウス属及びシュードモナス属及びそれらの組合せに属する細菌から選択され、より好ましくは、大腸菌、プロテウス・ミラビリス及び緑膿菌及びそれらの組合せから選択される、グラム陰性菌の群に属する微生物に属するか、又はそれを含み、前記少なくとも1つの蛍光色素が、キサンテンベースの色素、好ましくは、ローダミン色素、シアニンベースの色素及びDAPI及びそれらの組合せからなる群から選択される場合があり、好ましくは、Cy5、好ましくは、スルホ-Cy5、MB660R及びDAPI及びそれらの誘導体及び組合せからなる群から選択される、より好ましくは、スルホ-Cy5酸、MB660R-DBCO及びDAPI及びそれらの組合せからなる群から選択される、請求項1から11のいずれか一項に記載の方法。

【請求項36】

前記少なくとも1つの蛍光色素が、キサンテンベースの色素及びシアニンベースの色素及びそれらの組合せからなる群から選択される、好ましくは、Cy5、好ましくは、スルホ-Cy5、MB660R及びそれらの誘導体及び組合せからなる群から選択される、より好ましくは、スルホ-Cy5酸及びMB660R-DBCO及びそれらの組合せからなる群から選択される、請求項35に記載の方法。

【請求項37】

目的の微生物又は微生物の群が、好ましくは、エシェリキア属及びシュードモナス属及びそれらの組合せに属する細菌から選択され、より好ましくは、大腸菌及び緑膿菌及びそれらの組合せから選択される、グラム陰性菌の群に属する微生物に属するか、又はそれを含み、前記少なくとも1つの蛍光色素が、キサンテンベースの色素、好ましくは、ローダミン色素、ピレンベースの色素、クマリンベースの色素、シアニンベースの色素及びDAPI及びそれらの組合せからなる群から選択される、好ましくは、Cy5、好ましくは、スルホ-Cy5、Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 405、MB660R及びDAPI及びそれらの誘導体及び組合せからなる群から選択される、より好ましくは、スルホ-Cy5酸、Alexa Fluor 350-NHSエステル、Alexa Fluor 405-DBCO、MB660R-DBCO及びDAPI及びそれらの組合せからなる群から選択される、請求項1から15のいずれか一項に記載の方法。

【請求項38】

前記少なくとも1つの蛍光色素が、キサンテンベースの色素、好ましくは、ローダミン色素、ピレンベースの色素、クマリンベースの色素及びシアニンベースの色素及びそれらの組合せからなる群から選択される、好ましくは、Cy5、好ましくは、スルホ-Cy5、Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 405及びMB660R及びそれらの誘導体及び組合せからなる群から選択される、より好ましくは、スルホ-Cy5酸、Alexa Fluor 350-NHSエステル、Alexa Fluor 405-DBCO及びMB660R-DBCO及びそれらの組合せからなる群から選択される、請求項37に記載の方法。

【請求項39】

前記少なくとも1つの蛍光色素が、ピレンベースの色素、クマリンベースの色素及びそれらの組合せからなる群から選択される、好ましくは、Alexa Fluor 350及びAlexa Fluor 405及びそれらの誘導体及び組合せからなる群から選択される、より好ましくは、Alexa Fluor 350-NHSエステル、Alexa Fluor 405-DBCO及びそれらの組合せからなる群から選択される、請求項37に記載の方法。

【請求項40】

前記少なくとも1つの蛍光色素が、Alexa Fluor 350-NHSエステル及びAlexa Fluor 405-DBCOの組合せである、請求項37に記載の方法。

【請求項41】

前記少なくとも1つの蛍光色素が、キサンテンベースの色素及びシアニンベースの色素及びそれらの組合せからなる群から選択される、好ましくは、Cy5、好ましくは、スルホ-Cy5、MB660R及びそれらの誘導体及び組合せからなる群から選択される、より好ましくは、スルホ-Cy5酸及びMB660R-DBCO及びそれらの組合せからなる群から選択される、請求項37に記載の方法。

【請求項42】

目的の微生物又は微生物の群が、好ましくは、スタフィロコッカス属及びエンテロコッカス属及びそれらの組合せに属する細菌から選択され、より好ましくは、黄色ブドウ球菌及びフェカリス菌及びそれらの組合せから選択される、グラム陽性菌の群に属する微生物に属するか、又はそれを含み、前記少なくとも1つの蛍光色素が、キサンテンベースの色素、シアニンベースの色素及びDAPI及びそれらの組合せからなる群から選択される、好ましくは、Cy5、好ましくは、スルホ-Cy5、MB660R、DAPI並びにそれらの誘導体及び組合せからなる群から選択される、より好ましくは、スルホ-Cy5酸、MB660R-DBCO及びDAPI及びそれらの組合せからなる群から選択される、請求項1から11のいずれか一項に記載の方法。

【請求項43】

前記少なくとも1つの蛍光色素が、キサンテンベースの色素及びシアニンベースの色素及びそれらの組合せからなる群から選択される、好ましくは、Cy5、好ましくは、スルホ-Cy5及びMB660R及びそれらの誘導体及び組合せからなる群から選択される、より好ましくは、スルホ-Cy5酸及びMB660R-DBCO及びそれらの組合せからなる群から選択される、請求項42に記載の方法。

【請求項44】

目的の微生物又は微生物の群が、好ましくは、アシネトバクター属、エロモナス属、ブレブンディモナス属、バークホルデリア属、シトロバクター属、エドワージエラ属、エンテロバクター属、エシェリキア属、オクロバクテリウム属、クレブシエラ属、メチロバクテリウム属、モラクセラ属、パンテア属、プロテウス属、シュードモナス属、ラルストニア属、サルモネラ属、セラチア属、シゲラ属、スフィンゴモナス属、ステノトロホモナス属、エルシニア属、バチルス属、エンテロコッカス属、ミクロコッカス属、スタフィロコッカス属及びそれらの組合せに属する細菌から選択され、より好ましくは、アシネトバクター・バウマニー、エロモナス・ハイドロフィラ、ブレブンディモナス・ディミヌタ、セパシア菌、シトロバクター・フロインディー、エドワージエラ・タルダ、エンテロバクター・エロゲネス、大腸菌、オクロバクテリウム・アンスロピック、肺炎桿菌、メチロバクテリウム・エキストロクエンス、モラクセラ・オスロエンシス、パンテア・アグロメランス、プロテウス・ミラビリス、緑膿菌、シュードモナス・フルオレッセンス、ラルストニア・ピッケティ、ネズミチフス菌、セラチア・マルセセンス、ソンネ菌、スフィンゴモナス・パウシモビリス、ステノトロホモナス・マルトフィリア、エルシニア・エンテロコリチカ、枯草菌、フェカリス菌、ルテウス菌(コクリア・リゾフィラ)、黄色ブドウ球菌及びそれらの組合せから選択される、従属栄養細菌の群に属する微生物に属するか、又はそれを含み、前記少なくとも1つの蛍光色素が、アクリジン色素、キサンテンベースの色素、アントラセンベースの色素、クマリンベースの色素、シアニンベースの色素、ジピロメテンベースの色素、ナフタレンベースの色素、ピレンベースの色素、スクアラインベースの色素、スクアラインロタキサンベースの色素及びDAPI及びそれらの組合せからなる群から選択される、好ましくは、アクリジンオレンジ、DRAQ5、Cytrak orange、Alexa Fluor 350、Pacific Blue、Cy5、好ましくは、スルホ-Cy5、Cy5.5、好ましくは、スルホ-Cy5.5、BODIPY色素、好ましくは、BODIPY 500/510、プロダン、Alexa Fluor 405、Cascade Blue、Seta色素、好ましくは、Seta 650又はSeta 375、SeTau色素、好ましくは、SeTau 647又はSeTau 488、Alexa Fluor 488、MB660R、ATTO647及びDAPI及びそれらの誘導体及び組合せからなる群から選択される、より好ましくは、アクリジンオレンジ、DRAQ5、Cytrak orange、Alexa Fluor 350-NHSエステル、Pacific Blue-NHSエステル、スルホ-Cy5酸、スルホ-Cy5.5酸、BODIPY 500/510、プロダン、Alexa Fluor 405-DBCO、Cascade Blue、Seta 650-DBCO、Seta 375-NHS、SeTau 647-マレイミド、SeTau 488-NHS、Alexa Fluor 488酸、Alexa Fluor 488-DBCO、MB660R-酸、MB660R-DBCO、ATTO647酸及びDAPI及びそれらの組合せからなる群から選択される、請求項1から15のいずれか一項に記載の方法。

【請求項45】

前記少なくとも1つの蛍光色素が、キサンテンベースの色素、アントラセンベースの色素、クマリンベースの色素、シアニンベースの色素、ジピロメテンベースの色素、ナフタレンベースの色素、ピレンベースの色素、スクアラインベースの色素及びスクアラインロタキサンベースの色素及びそれらの組合せからなる群から選択される、好ましくは、DRAQ5、Cytrak orange、Alexa Fluor 350、Pacific Blue、Cy5、好ましくは、スルホ-Cy5、Cy5.5、好ましくは、スルホ-Cy5.5、BODIPY色素、好ましくは、BODIPY 500/510、プロダン、Alexa Fluor 405、Cascade Blue、Seta色素、好ましくは、Seta 650又はSeta 375、SeTau色素、好ましくは、SeTau 647又はSeTau 488、Alexa Fluor 488、MB660R及びATTO647及びそれらの誘導体及び組合せからなる群から選択される、より好ましくは、DRAQ5、Cytrak orange、Alexa Fluor 350-NHSエステル、Pacific Blue-NHSエステル、スルホ-Cy5酸、スルホ-Cy5.5酸、BODIPY 500/510、プロダン、Alexa Fluor 405-DBCO、Cascade Blue、Seta 650-DBCO、Seta 375-NHS、SeTau 647-マレイミド、SeTau 488-NHS、Alexa Fluor 488酸、Alexa Fluor 488-DBCO、MB660R-酸、MB660R-DBCO及びATTO647酸及びそれらの組合せからなる群から選択される、請求項44に記載の方法。

【請求項46】

目的の微生物又は微生物の群が、好ましくは、カンジダ属、ザイゴサッカロミセス属、アスペルギルス属、サッカロミセス属、ゲオトリクム属及びペニシリウム属及びそれらの組合せに属する真菌から選択され、より好ましくは、カンジダ・アルビカンス、ザイゴサッカロミセス・バイリー、アスペルギルス・ブラジリエンシス、サッカロミセス・セレビシエ、ジオトリクム・カンディダム、ペニシリウム・バリオティー、ペニシリウム・クリソゲナム及びそれらの組合せからなる群から選択される、酵母及びカビの群に属する微生物に属するか、又はそれを含み、前記少なくとも1つの蛍光色素が、アクリジン色素、キサンテンベースの色素からなる群から選択され、好ましくは、ローダミン色素、フルオレセイン色素及びカーボピロニンベースの色素、クマリンベースの色素、シアニンベースの色素、ジピロメテンベースの色素、ナフタレンベースの色素、ピレンベースの色素、スクアラインベースの色素、スクアラインロタキサンベースの色素及びDAPI及びそれらの組合せからなる群から選択される、好ましくは、アクリジンオレンジ、Alexa Fluor 350、Pacific Blue、Cy5、好ましくは、スルホ-Cy5、プロダン、Alexa Fluor 405、Cascade Blue、BODIPY 500/510、Seta色素、好ましくは、Seta 650、SeTau色素、好ましくは、SeTau 647又はSeTau 488、Alexa Fluor 488、MB660R及びDAPI及びそれらの誘導体及び組合せからなる群から選択される、より好ましくは、アクリジンオレンジ、Alexa Fluor 350-NHSエステル、Pacific Blue-NHSエステル、スルホ-Cy5酸、プロダン、Alexa Fluor 405-DBCO、Cascade Blue、BODIPY 500/510、Seta 650-DBCO、SeTau 647-マレイミド、SeTau 488-NHS、Alexa Fluor 488酸、MB660R-酸、MB660R-DBCO及びDAPI及びそれらの組合せからなる群から選択される、請求項1から11のいずれか一項に記載の方法。

【請求項47】

前記少なくとも1つの蛍光色素が、キサンテンベースの色素からなる群から選択される、好ましくは、ローダミン色素、フルオレセイン色素及びカーボピロニンベースの色素、クマリンベースの色素、シアニンベースの色素、ジピロメテンベースの色素、ナフタレンベースの色素、ピレンベースの色素、スクアラインベースの色素及びスクアラインロタキサンベースの色素及びそれらの組合せからなる群から選択される、好ましくは、Alexa Fluor 350、Pacific Blue、Cy5、好ましくは、スルホ-Cy5、プロダン、Alexa Fluor 405、Cascade Blue、BODIPY 500/510、Seta色素、好ましくは、Seta 650、SeTau色素、好ましくは、SeTau 647又はSeTau 488、Alexa Fluor 488及びMB660R及びそれらの誘導体及び組合せからなる群から選択される、より好ましくは、Alexa Fluor 350-NHSエステル、Pacific Blue-NHSエステル、スルホ-Cy5酸、プロダン、Alexa Fluor 405-DBCO、Cascade Blue、BODIPY 500/510、Seta 650-DBCO、SeTau 647-マレイミド、SeTau 488-NHS、Alexa Fluor 488酸、MB660R-酸及びMB660R-DBCO及びそれらの組合せからなる群から選択される、請求項46に記載の方法。

【請求項48】

前記少なくとも1つの蛍光色素が、キサンテンベースの色素からなる群から選択される、好ましくは、MB660R及び誘導体及びそれらの組合せからなる群から選択される、好ましくは、MB660R-DBCOである、請求項46に記載の方法。

【請求項49】

目的の微生物又は微生物の群が、好ましくは、好熱性好酸性菌(TAB)、酢酸菌(AAB)、乳酸菌(LAB)、嫌気性菌、好気性中温性菌、グラム陰性菌及びグラム陽性菌、従属栄養細菌及びそれらの組合せの群から選択される1つ又はいくつかの細菌、並びに好ましくは、酵母及びカビから選択される1つ又はいくつかのミクロ菌を含み、前記少なくとも1つの蛍光色素が、キサンテンベースの色素からなる群から選択される、好ましくは、ローダミン色素、フルオレセイン色素及びカーボピロニンベースの色素、クマリンベースの色素、シアニンベースの色素、ピレンベースの色素、スクアラインベースの色素及びスクアラインロタキサンベースの色素及びそれらの組合せからなる群から選択される、好ましくは、Alexa Fluor 350、Pacific blue、Cy5、好ましくは、スルホ-Cy5、Alexa Fluor 405、Cascade blue(商標)、Seta色素、好ましくは、Seta 650又はSeta 375、SeTau色素、好ましくは、SeTau 647及びSeTau 488、Alexa Fluor 488及びMB660R及びそれらの誘導体及び組合せからなる群から選択される、より好ましくは、Alexa Fluor 350-NHSエステル、Pacific blue(商標)-NHSエステル、スルホ-Cy5酸、Alexa Fluor 405-DBCO、Cascade blue、Seta 650-DBCO、Seta 375-NHS、SeTau 488-NHS、SeTau 647-マレイミド、Alexa Fluor 488酸、MB660R-酸及びMB660R-DBCO及びそれらの組合せからなる群から選択される、更により好ましくは、スルホ-Cy5酸及びMB660R-DBCO及びそれらの組合せからなる群から選択される、請求項1から11のいずれか一項に記載の方法。

【請求項50】

目的の微生物又は微生物の群が、好ましくは、好熱性好酸性菌(TAB)、酢酸菌(AAB)、乳酸菌(LAB)、嫌気性菌、好気性中温性菌、グラム陰性菌及びグラム陽性菌及びそれらの組合せの群から選択される1つ又はいくつかの細菌、並びに好ましくは、酵母及びカビから選択される1つ又はいくつかのミクロ菌を含み、前記少なくとも1つの蛍光色素が、キサンテンベースの色素からなる群から選択される、好ましくは、ローダミン色素、フルオレセイン色素及びカーボピロニンベースの色素、クマリンベースの色素、シアニンベースの色素、ピレンベースの色素、スクアラインベースの色素及びスクアラインロタキサンベースの色素及びそれらの組合せからなる群から選択される、好ましくは、Alexa Fluor 350、Cy5(商標)、好ましくは、スルホ-Cy5、Alexa Fluor 405、Seta色素、好ましくは、Seta 650又はSeta 375、SeTau色素、好ましくは、SeTau 647、Alexa Fluor 488及びMB660R及びそれらの誘導体及び組合せからなる群から選択される、より好ましくは、Alexa Fluor 350-NHSエステル、スルホ-Cy5酸、Alexa Fluor 405-DBCO、Seta 650-DBCO、Seta 375-NHS、SeTau 647-マレイミド、Alexa Fluor 488酸、MB660R-酸及びMB660R-DBCO及びそれらの組合せからなる群から選択される、更により好ましくは、スルホ-Cy5酸及びMB660R-DBCO及びそれらの組合せからなる群から選択される、請求項1から11のいずれか一項に記載の方法。

【請求項51】

目的の微生物又は微生物の群が、アスペルギルス・ブラジリエンシス、カンジダ・アルビカンス及び大腸菌及びそれらの組合せからなる群から選択される微生物に属するか、又はそれを含み、前記少なくとも1つの蛍光色素が、Bodipy 500/510、Alexa Fluor 350又はその誘導体、好ましくは、Alexa Fluor 350-NHSエステル、Pacific blue又はその誘導体、好ましくは、Pacific blue-NHSエステル、プロダン、Alexa Fluor 405又はその誘導体、好ましくは、Alexa Fluor 405-DBCO、Cascade Blue、Seta 650又はその誘導体、好ましくは、Seta 650-DBCO、Setau 488又はその誘導体、好ましくは、Setau 488-NHS、Setau 647又はその誘導体、好ましくは、Setau 647-マレイミド及びそれらの任意の組合せからなる群から選択される、請求項1から11のいずれか一項に記載の方法。

【請求項52】

工程b)後及び工程c)前に、メンブレンフィルターが固体増殖培地から取り外され、工程c)においてその上の微小コロニーが検出される及び/又は数え上げられる、請求項2から51のいずれか一項に記載の方法。

【請求項53】

工程c)において、蛍光顕微鏡又は固相血球計算器を使用して蛍光シグナルを発する微小コロニーを検出する及び/又は数え上げる、請求項1から52のいずれか一項に記載の方法。

【請求項54】

試料が少なくとも1つの目的の微生物を含有するか否かを決定することにおける、試料が無菌であるか否かを決定することにおける、又は試料の生物汚染度を決定することにおける、請求項1から53のいずれか一項に記載の方法の使用。

【請求項55】

請求項1から54のいずれか一項に記載の方法に従って目的の微生物又は微生物の群を検出する及び/又は数え上げるキットの使用であって、前記キットは、
(i)- 好ましくは、請求項11から19のいずれか一項に規定の少なくとも1つの蛍光色素、
及び任意選択で、
- 好ましくは、請求項6から9のいずれか一項に規定の少なくとも1つのメンブレンフィルター及び/又は
- 目的の微生物又は微生物の群の増殖を支持するために栄養素を含有する固体増殖培地を含む少なくとも1つの容器若しくは前記少なくとも1つの容器を得るために必要とされる材料、及び/又は
- 前記キットを使用するための使用説明書を提供するリーフレット、或いは
(ii)- 好ましくは、請求項11から19のいずれか一項に規定の少なくとも1つの蛍光色素、及び目的の微生物又は微生物の群の増殖を支持するために栄養素を含有する固体増殖培地を含む少なくとも1つの容器若しくは前記少なくとも1つの容器を得るために必要な材料、及び
任意選択で、
- 好ましくは、請求項6から9のいずれか一項に規定の少なくとも1つのメンブレンフィルター、及び/又は
- 前記キットを使用するための使用説明書を提供するリーフレット
を含む、使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、微生物学の分野、より詳しくは、試料中の目的の微生物又は微生物の群を迅速に検出する、任意選択で、数え上げる方法に関する。

【背景技術】

【0002】

微生物は、あらゆる環境、ヒト及び動物における消費又は使用のために設計されたあらゆる製品、例えば、食品、飲料、医療デバイス、医薬品又は化粧品を汚染する可能性がある。これらの微生物の存在は、製品の劣化又は腐敗だけでなく、ヒト又は動物によって消費又は投与される場合には疾患を引き起こす場合もある。これらの製品の安全性を確実にするために、正常使用条件下での汚染のリスクを調べ、それによって、中毒又は感染の激増を防ぐための微生物試験が必要である。特に、医療デバイス、製薬産業又は化粧品産業については、無菌性の必要性は極めて重要であり、製造のすべての段階で製品の潜在的な欠陥が生じうるので、サプライチェーン全体に沿って製品及び原材料の微生物的品質を検査することは重要である。

【0003】

当然、微生物はヒト又は動物に感染する可能性もあり、臨床診断において感染の原因となる微生物を検出及び/又は定量化することが必要である。例えば、尿路感染(UTI)の診断は、定量的尿培養によって実施できる。伝統的に、尿中の1,000個以上の細菌/mlの存在は重大な細菌尿を表し、UTIを示すと考えられている。

【0004】

すべてのこれらの産業及び臨床適用について、汚染の閾値及び使用される方法は、変わる場合がある。しかし、可能な限り早い段階で関連微生物の存在を明らかにすることは常に重要である。

【0005】

ルイ・パスツールの方法であるペトリ皿上での培養は、19世紀以来、微生物を同定し、計数する最も有効な方法であった。今日まで、この技術は、微生物を検出し、計数するために、多数の産業において依然として参照方法のままである。方法は単純である:試料から微生物を抽出し、それらを適した培地を含有する専用のペトリ皿上に置き、それらが目に見えるようになった時点でコロニーを計数する。この方法は、信頼できるものであるが、長い時間がかかるものである(標的微生物によっては最大数日)。

【0006】

アッセイの長さを短縮するために、より小さいサイズの微小コロニーを検出するために発色基質、蛍光発生基質又は蛍光若しくは放射標識抗体等の指示薬を使用することが提案された(例えば、国際特許出願WO96/14431、WO2013/050598、WO2008/118400)。しかし、これらの方法のほとんどについて、最適結果のために増殖段階と指示薬段階は、以下のように分離されなければならない:増殖を遅らせる有害な指示薬を中に含まない速い細胞増殖のための増殖段階と、より小さいサイズの微小コロニーが検出されることを有効に可能にする専用の着色及び同定のための指示薬段階。

【0007】

数年にわたって、特に、蛍光抗体又は蛍光発生基質によって標識することを使用する免疫学的方法、核酸増幅法又はフローサイトメトリー法に基づく培養非依存的アプローチを使用してアッセイに必要な時間を低減するために多数の他の試みが行われてきた。しかし、これらの方法は依然として費用がかかり、容易ではないワークフローを有し、高度に熟練した専門家及び/又は濃縮試料を必要とし、それらのほとんどについて、生存微生物と死滅微生物を区別することが極めて困難である。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0008】

【特許文献1】WO96/14431

【特許文献2】WO2013/050598

【特許文献3】WO2008/118400

【非特許文献】

【0009】

【非特許文献1】Ismail et al., Int J Environ Res Public Health. 2013 Nov 14;10(11):6169-83

【非特許文献2】Tim Sandle, September 2015. SOJ Microbiology & Infectious Diseases 3(2):1-8

【非特許文献3】Matsubara et al. 2002, Int J Syst Evol Microbiol 52, 1681-1685

【非特許文献4】Pettipher et al. 1997, Lett Appl Microbiol 24, 185-189

【非特許文献5】Pettipher et al. 2000, Food Austr 57, 293-295

【非特許文献6】Walls et al. 1998, Dairy Food Environ Sanit 18, 499-503

【非特許文献7】Rogosa et al. 1951, J Bacteriol 62, 132-133

【非特許文献8】De Man et al. 1960, J Appl Bacteriol 23, 30-35

【非特許文献9】Mitsuoka, 1978, Intestinal Bacteria and Health. Tokyo, Harcourt Brace Jovanovich Japan

【非特許文献10】Hartemink et al. 1997, J Microbiol Methods 29, 77-84

【非特許文献11】Lin et al. 2006, Food Microbiol 23, 74-81

【非特許文献12】Wickerham, 1939 J. Tropical Med. Hyg., 42, 176

【非特許文献13】MacFaddin J. F., 1985, Media for Isolation-Cultivation-Identification-Maintenance of Medical Bacteria, Vol. 1, Williams & Wilkins, Baltimore, Md

【非特許文献14】Glathe et al., Zentralbl Bakteriol Parasitenkd Infektionskr Hyg. 1968;122(1):3-21

【非特許文献15】Green and Gray. 1950. Wallerstein Lab. Commun. 12:43

【非特許文献16】Parfitt E. H. (1933) J. Dairy Sci. 16. 141-147

【非特許文献17】Sabouraud, R. (1892) Ann. Dermatol. Syphilol. 3:1061

【非特許文献18】Barnes et al. (1963) J. Appl. Bact. 26. 415-427

【非特許文献19】Brewer J. H., 1942, Science, 95:587

【非特許文献20】Ellner et al. Amer. J. Clin. Path.、29; 181-183 (1958)

【非特許文献21】Brewer and Lilley. 1949. December meeting of the Maryland Association of Medical and Public Health Laboratories

【非特許文献22】King and Metzger. 1968. Appl. Microbiol. 16:577-578

【非特許文献23】Taylor, 1965. Am. J. Clin. Pathol., 44:471-475

【非特許文献24】Edward, R. (2009) Mol. Cells 27(4): 391-396

【非特許文献25】Tim Sandle, September 2015. SOJ Microbiology & Infectious Diseases 3(2):1-8

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0010】

したがって、試料中の微生物を検出し、数え上げるための迅速で、高感度で、ユーザーフレンドリーで、費用効率の良い方法が依然として必要である。

【課題を解決するための手段】

【0011】

本明細書において本発明者らは、この必要性を満たす方法を提供する。

【0012】

第1の態様において、本発明は、目的の微生物又は微生物の群を検出する又は数え上げる方法であって、
a)容器中で、前記微生物又は微生物の群を含有すると疑われる試料を、前記微生物又は微生物の群の増殖を支持するために栄養素を含有する固体増殖培地と、及び少なくとも1つの蛍光色素と接触させる工程、
b)前記微生物又は微生物の群の微小コロニーを形成するのに十分な条件下及び時間の間、前記容器をインキュベートする工程、並びに
c)前記少なくとも1つの蛍光色素の蛍光シグナルを発する微小コロニーを検出する又は数え上げる工程
を含み、それによって、試料中に含有される前記微生物又は微生物の群を検出する又は数え上げる方法に関する。

【0013】

任意選択で、工程a)の前に、試料の微生物はメンブレンフィルター上で濃縮され、工程a)において前記メンブレン及び微生物は、固体増殖培地及び前記少なくとも1つの蛍光色素と接触される。

【0014】

工程a)は、
a1)前記微生物又は微生物の群を含有すると疑われる試料を少なくとも1つの蛍光色素と接触させる工程、及び
a2)容器中で、前記試料を前記微生物又は微生物の群の増殖を支持するために栄養素を含有する固体増殖培地と接触させる工程
を含む場合があり、
工程a1)及びa2)は同時に、又は任意の順序で逐次実行される。

【0015】

好ましくは、工程a1)は、工程a2)の前に実行される。

【0016】

任意選択で、工程a2)の前に、試料の微生物はメンブレンフィルター上で濃縮される。特に、試料は、工程a1)の前又は後に、好ましくは、工程a1)の後にメンブレンフィルター上で濃縮される場合がある。特に、前記少なくとも1つの蛍光色素は、試料の濾過の前又は後に試料と同一メンブレン上で濾過されうる。蛍光色素は、メンブレン上での濾過/濃度の前に試料に添加されうる、又は試料の濾過の前若しくは後に、好ましくは、試料の濾過の後に同一メンブレン上で濾過されうる。次いで、メンブレンフィルターは、前記増殖培地の表面上に置かれる場合がある。

【0017】

好ましくは、メンブレンフィルターは、混合セルロースエステル(MCE)、ポリビニリデンジフルオリド(PVDF)、ニトロセルロース、ポリテトラフルオロエチレン、ポリカーボネート又はナイロンで作られている、より好ましくは、MCE又はPVDFで作られている。

【0018】

固体増殖培地は、前記微生物又は微生物の群に対して選択的でありうる。

【0019】

前記少なくとも1つの蛍光色素は、キサンテンベースの色素、アクリジン色素、アントラセンベースの色素、クマリンベースの色素、シアニンベースの色素、ジピロメテンベースの色素、ナフタレンベースの色素、ピレンベースの色素、スクアラインベースの色素、スクアラインロタキサンベースの色素及び4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)及びそれらの組合せからなる群から選択されうる。好ましくは、前記少なくとも1つの蛍光色素は、MB660R、アクリジンオレンジ、DRAQ5、Cytrak Orange、Alexa Fluor 350、Pacific Blue、Cy5、好ましくは、スルホ-Cy5、Cy5.5、好ましくは、スルホ-Cy5.5、BODIPY 500/510、プロダン、Alexa Fluor 405、Cascade Blue、Seta 650、Seta 375、Setau 647、SeTau 488、Alexa Fluor 488、ATTO 647及びDAPI、それらの誘導体及びそれらの組合せからなる群から選択されうる。より詳しくは、前記少なくとも1つの蛍光色素は、MB660R-DBCO、MB660R-酸、アクリジンオレンジ、DRAQ5、Cytrak Orange、Alexa Fluor 350 NHSエステル、Pacific Blue-NHSエステル、スルホ-Cy5酸、スルホ-Cy5.5酸、BODIPY 500/510、プロダン、Alexa Fluor 405-DBCO、Cascade Blue、Seta 650-DBCO、Seta 375-NHS、SeTau 647-マレイミド、SeTau 488-NHS、Alexa Fluor 488-酸、Alexa Fluor 488-DBCO、ATTO 647-酸及びDAPI、それらの誘導体及びそれらの組合せからなる群から選択されうる。

【0020】

一部の実施形態では、前記少なくとも1つの蛍光色素は、アントラセンベースの色素、クマリンベースの色素、シアニンベースの色素、ジピロメテンベースの色素、ナフタレンベースの色素、ピレンベースの色素、スクアラインベースの色素、スクアラインロタキサンベースの色素、キサンテンベースの色素及び4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)及びそれらの組合せからなる群から選択されうる。好ましくは、前記少なくとも1つの蛍光色素は、DRAQ5(商標)、Alexa Fluor(商標)350、Cy5(商標)、好ましくは、スルホ-Cy5、BODIPY(商標)500/510、プロダン、Alexa Fluor(商標)405、Seta(商標)650、Setau(商標)647、MB(商標)660R、Alexa Fluor(商標)488、ATTO(商標)647及びDAPI、それらの誘導体及びそれらの組合せからなる群から選択される。より好ましくは、前記少なくとも1つの蛍光色素は、DRAQ5(商標)、Alexa Fluor(商標)350-NHSエステル、スルホ-Cy5酸、BODIPY(商標)500/510、プロダン、Alexa Fluor(商標)405-DBCO、Seta(商標)650-DBCO、SeTau(商標)647-マレイミド、MB(商標)660R-酸、MB(商標)660R-DBCO、Alexa Fluor(商標)488-酸、Alexa Fluor(商標)488-DBCO、ATTO(商標)647-酸及びDAPI及びそれらの組合せである。或いは、前記少なくとも1つの蛍光色素は、DRAQ5(商標)、Alexa Fluor(商標)350、Pacific blue(商標)、Cy5(商標)、好ましくは、スルホ-Cy5、BODIPY(商標)500/510、プロダン、Alexa Fluor(商標)405、Cascade blue(商標)、Seta(商標)650、Setau(商標)647、SeTau 488、MB(商標)660R、Alexa Fluor(商標)488、ATTO(商標)647及びDAPI、それらの誘導体及びそれらの組合せからなる群から選択されうる。より好ましくは、前記少なくとも1つの蛍光色素は、DRAQ5(商標)、Alexa Fluor(商標)350-NHSエステル、Pacific blue(商標)-NHSエステル、スルホ-Cy5酸、BODIPY(商標)500/510、プロダン、Alexa Fluor(商標)405-DBCO、Cascade blue(商標)、Seta(商標)650-DBCO、SeTau 488-NHS、SeTau(商標)647-マレイミド、MB(商標)660R-酸、MB(商標)660R-DBCO、Alexa Fluor(商標)488-酸、Alexa Fluor(商標)488-DBCO、ATTO(商標)647-酸及びDAPI及びそれらの組合せである。

【0021】

或いは、前記少なくとも1つの蛍光色素は、キサンテンベースの色素、アントラセンベースの色素、クマリンベースの色素、シアニンベースの色素、ジピロメテンベースの色素、ナフタレンベースの色素、ピレンベースの色素、スクアラインベースの色素及びスクアラインロタキサンベースの色素及びそれらの組合せからなる群から選択されうる。特に、前記少なくとも1つの蛍光色素は、MB660R、DRAQ5、Cytrak Orange、Alexa Fluor 350、Pacific Blue、Cy5、好ましくは、スルホ-Cy5、Cy5.5、好ましくは、スルホ-Cy5.5、BODIPY 500/510、プロダン、Alexa Fluor 405、Cascade Blue、Seta 650、Seta 375、Setau 647、SeTau 488、Alexa Fluor 488及びATTO 647、それらの誘導体及びそれらの組合せからなる群から選択されうる。より詳しくは、前記少なくとも1つの蛍光色素は、MB660R-DBCO、MB660R-酸、DRAQ5、Cytrak Orange、Alexa Fluor 350 NHSエステル、Pacific Blue-NHSエステル、スルホ-Cy5酸、スルホ-Cy5.5酸、BODIPY 500/510、プロダン、Alexa Fluor 405-DBCO、Cascade Blue、Seta 650-DBCO、Seta 375-NHS、SeTau 647-マレイミド、SeTau 488-NHS、Alexa Fluor 488-酸、Alexa Fluor 488-DBCO及びATTO 647-酸、それらの誘導体及びそれらの組合せからなる群から選択されうる。

【0022】

特に、目的の微生物又は微生物の群は、
- 好熱性好酸性菌に属する場合があり、好ましくは、アリシクロバチルス・アシドテレストリス(Alicyclobacillus acidoterrestris)、アリシクロバチルス・アシドカルダリウス(Alicyclobacillus acidocaldarius)、アリシクロバチルス・アシディフィラス(Alicyclobacillus acidiphilus)、アリシクロバチルス・シクロヘプタニカス(Alicyclobacillus cycloheptanicus)、アリシクロバチルス・ヘスペリダム(Alicyclobacillus hesperidum)、アリシクロバチルス・ハーバリウス(Alicyclobacillus herbarius)及びアリシクロバチルス・コンタミナンス(Alicyclobacillus contaminans)及びそれらの組合せからなる群から選択される、並びに/又は
- 酢酸菌に属する場合があり、好ましくは、アセトバクター属(Acetobacter)、グルコノバクター属(Gluconobacter)、グルコンアセトバクター属(Gluconacetobacter)及びアサイア属(Asaia)及びそれらの組合せに属する細菌から選択される、並びに/又は
- 乳酸菌に属する場合があり、好ましくは、ラクトバチルス属(Lactobacillus)及びワイセラ属(Weissella)及びそれらの組合せに属する細菌から選択され、並びに/又は
- 嫌気性菌に属する場合があり、好ましくは、クロストリジウム属(Clostridium)及びキューティバクテリウム属(Cutibacterium)の細菌及びそれらの組合せから選択される、並びに/又は
- 好気性中温性菌に属する場合があり、好ましくは、メチロバクテリウム属(Methylobacterium)、シュードモナス属(Pseudomonas)、バチルス属(Bacillus)、エシェリキア属(Escherichia)、スタフィロコッカス属(Staphylococcus)、アシネトバクター属(Acinetobacter)、クロノバクター属(Cronobacter)、クレブシエラ属(Klebsiella)、サルモネラ属(Salmonella)、エンテロコッカス属(Enterococcus)、リステリア属(Listeria)、シゲラ属(Shigella)、コクリア属(Kocuria)及びバークホルデリア属(Burkholderia)及びそれらの組合せから選択される、並びに/又は
- グラム陰性菌に属する場合があり、好ましくは、エシェリキア属及びシュードモナス属及びそれらの組合せから選択され、並びに/又は
- 酵母及びカビの群に属する場合があり、好ましくは、カンジダ属(Candida)、ザイゴサッカロミセス属(Zygosaccharomyces)、アスペルギルス属(Aspergillus)、サッカロミセス属(Saccharomyces)、ゲオトリクム属(Geotrichum)及びペニシリウム属(Penicillium)及びそれらの組合せから選択される、並びに/又は
- 好ましくは、アシネトバクター属、エロモナス属(Aeromonas)、ブレブンディモナス属(Brevundimonas)、バークホルデリア属、シトロバクター属(Citrobacter)、エドワージエラ属(Edwardsiella)、エンテロバクター属(Enterobacter)、エシェリキア属、オクロバクテリウム属(Ochrobactrum)、クレブシエラ属、メチロバクテリウム属、モラクセラ属(Moraxella)、パンテア属(Pantoea)、プロテウス属(Proteus)、シュードモナス属、ラルストニア属(Ralstonia)、サルモネラ属、セラチア属(Serratia)、シゲラ属、スフィンゴモナス属(Sphingomonas)、ステノトロホモナス属(Stenotrophomonas)、ビブリオ属(Vibrio)、エルシニア属(Yersinia)、バチルス属、エンテロコッカス属、ミクロコッカス属(Micrococcus)、スタフィロコッカス属及びそれらの組合せに属する細菌から選択される、従属栄養細菌の群に属する場合がある。

【0023】

好ましくは、本発明の方法において、
- 目的の微生物又は微生物の群は、好ましくは、アリシクロバチルス・アシドテレストリス、アリシクロバチルス・アシドカルダリウス、アリシクロバチルス・アシディフィラス、アリシクロバチルス・シクロヘプタニカス、アリシクロバチルス・ヘスペリダム、アリシクロバチルス・ハーバリウス及びアリシクロバチルス・コンタミナンス及びそれらの組合せからなる群から選択される、好熱性好酸性菌の群に属する微生物に属するか、又はそれを含み、前記少なくとも1つの蛍光色素は、キサンテンベースの色素からなる群から選択され、好ましくは、Alexa Fluor 488、MB660R及びATTO647及びそれらの誘導体及び組合せからなる群から選択され、より好ましくは、Alexa Fluor 488-酸、Alexa Fluor 488-DBCO、MB660R-酸、MB660R-DBCO及びATTO647-酸並びにそれらの組合せからなる群から選択される。好ましくは、前記少なくとも1つの蛍光色素は、キサンテンベースの色素からなる群から、好ましくは、MB660R及び誘導体からなる群から、より好ましくは、MB660R-酸及びMB660R-DBCOからなる群から選択され、更により好ましくは、MB660R-DBCOである、並びに/又は
- 目的の微生物又は微生物の群は、好ましくは、アセトバクター属、グルコノバクター属、グルコンアセトバクター属及びアサイア属及びそれらの組合せに属する細菌から選択され、より好ましくは、アセトバクター・アセチ(Acetobacter aceti)、グルコノアセトバクター・リクファシエンス(Gluconoacetobacter liquefaciens)、グルコノバクター・オキシダンス(Gluconobacter oxydans)及びアサイア・サイアメンシス(Asaia siamensis)及びそれらの組合せからなる群から選択される、酢酸菌(AAB)の群に属する微生物に属するか、又はそれを含み、前記少なくとも1つの蛍光色素は、キサンテンベースの色素及びDAPI及びそれらの組合せからなる群から選択され、好ましくは、Alexa Fluor 488、MB660R、ATTO647及びDAPI及びそれらの誘導体及び組合せからなる群から選択され、より好ましくは、Alexa Fluor 488-酸、Alexa Fluor 488-DBCO、MB660R-酸、MB660R-DBCO、ATTO647-酸及びDAPI及びそれらの組合せからなる群から選択される。好ましくは、前記少なくとも1つの蛍光色素は、キサンテンベースの色素からなる群から選択され、好ましくは、Alexa Fluor 488、MB660R及びATTO647及びそれらの誘導体及び組合せからなる群から選択され、より好ましくは、Alexa Fluor 488-酸、Alexa Fluor 488-DBCO、MB660R-酸、MB660R-DBCO及びATTO647-酸及びそれらの組合せからなる群から選択される。より好ましくは、前記少なくとも1つの蛍光色素は、MB660R及びATTO647及びそれらの誘導体及び組合せからなる群から選択され、好ましくは、MB660R-酸、MB660R-DBCO及びATTO647-酸及びそれらの組合せからなる群から選択され、より好ましくは、MB660R-酸及びATTO647-酸及びそれらの組合せからなる群から選択される、並びに/又は
- 目的の微生物又は微生物の群は、好ましくは、ラクトバチルス属及びワイセラ属及びそれらの組合せに属する細菌から選択され、より好ましくは、ラクトバチルス・カゼイ(Lactobacillus casei)、ラクトバチルス・プランタルム(Lactobacillus plantarum)及びワイセラ・コンフューザ(Weissella confusa)及びそれらの組合せからなる群から選択される、乳酸菌(LAB)の群に属する微生物に属するか、又はそれを含み、前記少なくとも1つの蛍光色素は、キサンテンベースの色素及びDAPI及びそれらの組合せからなる群から選択され、好ましくは、Alexa Fluor 488、MB660R、ATTO647及びDAPI及びそれらの誘導体及び組合せからなる群から選択され、より好ましくは、Alexa Fluor 488-酸、Alexa Fluor 488-DBCO、MB660R-酸、MB660R-DBCO及びATTO647-酸及びそれらの組合せからなる群から選択される。好ましくは、前記少なくとも1つの蛍光色素は、Alexa Fluor 488、MB660R及びDAPI及びそれらの誘導体及び組合せからなる群から選択され、特に、Alexa Fluor 488-酸、MB660R-酸及びDAPI及びそれらの組合せからなる群から選択され、好ましくは、キサンテンベースの色素からなる群から選択され、より好ましくは、Alexa Fluor 488-酸及びMB660R-酸及びそれらの組合せからなる群から選択され、更により好ましくは、MB660R-酸である、並びに/又は
- 目的の微生物又は微生物の群は、好ましくは、クロストリジウム属及びキューティバクテリウム属の細菌及びそれらの組合せから選択され、より好ましくは、クロストリジウム・スポロゲネス(Clostridium sporogenes)及びキューティバクテリウム・アクネス(Cutibacterium acnes)及びそれらの組合せからなる群から選択される、嫌気性菌の群に属する微生物に属するか、又はそれを含み、前記少なくとも1つの蛍光色素は、キサンテンベースの色素、シアニンベースの色素及びDAPI及びそれらの組合せからなる群から選択され、好ましくは、MB660R、Cy5(商標)、好ましくは、スルホ-Cy5及びDAPI及びそれらの誘導体及び組合せからなる群から、より好ましくは、MB660R-DBCO、スルホ-Cy5酸及びDAPI及びそれらの組合せからなる群から選択される。好ましくは、前記少なくとも1つの蛍光色素は、キサンテンベースの色素及びシアニンベースの色素からなる群から選択され、好ましくは、MB660R及びCy5、好ましくは、スルホ-Cy5及びそれらの誘導体及び組合せからなる群から、より好ましくは、MB660R-DBCO及びスルホ-Cy5酸及びそれらの組合せからなる群から選択される。より好ましくは、前記少なくとも1つの蛍光色素は、MB660R-DBCO及びスルホ-Cy5酸を含む、並びに/又は
- 目的の微生物又は微生物の群は、好ましくは、メチロバクテリウム属、シュードモナス属、バチルス属、エシェリキア属、スタフィロコッカス属、アシネトバクター属、クロノバクター属、クレブシエラ属、サルモネラ属、エンテロコッカス属、リステリア属、シゲラ属、コクリア属及びバークホルデリア属及びそれらの組合せに属する細菌から選択され、より好ましくは、メチロバクテリウム・エキストロクエンス(Methylobacterium extorquens)、緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)、枯草菌(Bacillus subtilis)、大腸菌(Escherichia coli)、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)、アシネトバクター・バウマンニ(Acinetobacter baumannii)、クロノバクター・サカザキ(Cronobacter sakazakii)、肺炎桿菌(Klebsiella pneumoniae)、ネズミチフス菌(Salmonella typhimurium)、フェカリス菌(Enterococcus faecalis)、リステリア・グレイ(Listeria grayi)、ソンネ菌(Shigella sonnei)、コクリア・リゾフィラ(Kocuria rhizophila)及びセパシア菌(Burkholderia cepacia)及びそれらの組合せからなる群から選択され、前記少なくとも1つの蛍光色素は、キサンテンベースの色素、アントラセンベースの色素、クマリンベースの色素、シアニンベースの色素、ジピロメテンベースの色素、ナフタレンベースの色素、ピレンベースの色素、スクアラインベースの色素、スクアラインロタキサンベースの色素及びDAPI及びそれらの組合せからなる群から選択され、好ましくは、DRAQ5(商標)、Alexa Fluor(商標)350、Pacific blue(商標)、Cy5(商標)、好ましくは、スルホ-Cy5、BODIPY(商標)色素、好ましくは、BODIPY 500/510、プロダン、Alexa Fluor(商標)405、Cascade blue(商標)、Seta色素、好ましくは、Seta 650、SeTau色素、好ましくは、SeTau 647及びSeTau 488、Alexa Fluor 488、MB660R、ATTO647及びDAPI及びそれらの誘導体及び組合せからなる群から選択され、より好ましくは、DRAQ5(商標)、Alexa Fluor(商標)350-NHSエステル、Pacific blue(商標)-NHSエステル、スルホ-Cy5-酸、BODIPY 500/510、プロダン、Alexa Fluor(商標)405-DBCO、Cascade blue(商標)、Seta 650-DBCO、SeTau 488-NHS、SeTau 647-マレイミド、Alexa Fluor 488-酸、Alexa Fluor 488-DBCO、MB660R-酸、MB660R-DBCO、ATTO647-酸及びDAPI及びそれらの組合せからなる群から選択される、好気性中温性菌(AMB)の群に属する微生物に属するか、又はそれを含み、並びに/又は
- 目的の微生物又は微生物の群は、好ましくは、メチロバクテリウム属、シュードモナス属、バチルス属、エシェリキア属、スタフィロコッカス属、アシネトバクター属、クロノバクター属、クレブシエラ属、サルモネラ属、エンテロコッカス属、シゲラ属、コクリア属及びバークホルデリア属及びそれらの組合せに属する細菌から選択され、より好ましくは、メチロバクテリウム・エキストロクエンス、緑膿菌、枯草菌、大腸菌、黄色ブドウ球菌、アシネトバクター・バウマンニ、クロノバクター・サカザキ、肺炎桿菌、ネズミチフス菌、フェカリス菌、ソンネ菌、コクリア・リゾフィラ及びセパシア菌及びそれらの組合せからなる群から選択され、前記少なくとも1つの蛍光色素は、キサンテンベースの色素、アクリジン色素、アントラセンベースの色素、クマリンベースの色素、シアニンベースの色素、ジピロメテンベースの色素、ナフタレンベースの色素、ピレンベースの色素、スクアラインベースの色素、スクアラインロタキサンベースの色素及びDAPI及びそれらの組合せからなる群から選択され、好ましくは、アクリジンオレンジ、DRAQ5、Cytrak orange、Alexa Fluor 350、Pacific Blue、Cy5、好ましくは、スルホ-Cy5、BODIPY色素、好ましくは、BODIPY 500/510、プロダン、Alexa Fluor 405、Cascade Blue、Seta色素、好ましくは、Seta 650又はSeta 375、SeTau色素、好ましくは、SeTau 647又はSeTau 488、Alexa Fluor 488、MB660R、ATTO647及びDAPI及びそれらの誘導体及び組合せからなる群から選択され、より好ましくは、アクリジンオレンジ、DRAQ5、Cytrak orange、Alexa Fluor 350-NHSエステル、Pacific Blue-NHSエステル、スルホ-Cy5-酸、BODIPY 500/510、プロダン、Alexa Fluor 405-DBCO、Cascade Blue、Seta 650-DBCO、Seta 375-NHS、SeTau 647-マレイミド、SeTau 488-NHS、Alexa Fluor 488-酸、Alexa Fluor 488-DBCO、MB660R-酸、MB660R-DBCO、ATTO647-酸及びDAPI及びそれらの組合せからなる群から選択される、好気性中温性菌(AMB)の群に属する微生物に属するか、又はそれを含む。好ましくは、前記少なくとも1つの蛍光色素は、キサンテンベースの色素、アントラセンベースの色素、クマリンベースの色素、シアニンベースの色素、ジピロメテンベースの色素、ナフタレンベースの色素、ピレンベースの色素、スクアラインベースの色素及びスクアラインロタキサンベースの色素及びそれらの組合せからなる群から選択され、好ましくは、DRAQ5、Cytrak orange、Alexa Fluor 350、Pacific Blue、Cy5、好ましくは、スルホ-Cy5、BODIPY色素、好ましくは、BODIPY 500/510、プロダン、Alexa Fluor 405、Cascade Blue、Seta色素、好ましくは、Seta 650又はSeta 375、SeTau色素、好ましくは、SeTau 647又はSeTau 488、Alexa Fluor 488、MB660R及びATTO647及びそれらの誘導体及び組合せからなる群から選択され、より好ましくは、DRAQ5、Cytrak orange、Alexa Fluor 350-NHSエステル、Pacific Blue-NHSエステル、スルホ-Cy5-酸、BODIPY 500/510、プロダン、Alexa Fluor 405-DBCO、Cascade Blue、Seta 650-DBCO、Seta 375-NHS、SeTau 647-マレイミド、SeTau 488-NHS、Alexa Fluor 488-酸、Alexa Fluor 488-DBCO、MB660R-酸、MB660R-DBCO及びATTO647-酸及びそれらの組合せからなる群から選択される。より好ましくは、前記少なくとも1つの蛍光色素は、キサンテンベースの色素からなる群から選択され、好ましくは、任意選択で、シアニンベースの色素、好ましくは、Cy5、特に、スルホ-Cy5からなる群から選択される蛍光色素と組み合わせた、MB660R及びそれらの誘導体及び組合せからなる群から選択され、より好ましくは、任意選択で、スルホ-Cy5-酸と組み合わせたMB660R-DBCOである、並びに/又は
- 目的の微生物又は微生物の群は、好ましくは、エシェリキア属、プロテウス属及びシュードモナス属及びそれらの組合せに属する細菌から選択され、より好ましくは、大腸菌、プロテウス・ミラビリス(Proteus mirabilis)及び緑膿菌及びそれらの組合せから選択される、グラム陰性菌の群に属する微生物に属するか、又はそれを含み、前記少なくとも1つの蛍光色素は、キサンテンベースの色素、好ましくは、ローダミン色素、シアニンベースの色素及びDAPI及びそれらの組合せからなる群から選択されうる、好ましくは、Cy5、好ましくは、スルホ-Cy5、MB660R及びDAPI及びそれらの誘導体及び組合せからなる群から選択され、より好ましくは、スルホ-Cy5-酸、MB660R-DBCO及びDAPI及びそれらの組合せからなる群から選択される。好ましくは、前記少なくとも1つの蛍光色素は、キサンテンベースの色素、シアニンベースの色素及びDAPI及びそれらの組合せからなる群から選択され、好ましくは、Cy5(商標)、好ましくは、スルホ-Cy5、MB660R、DAPI及びそれらの誘導体及び組合せからなる群から選択され、より好ましくは、スルホ-Cy5-酸、MB660R-DBCO及びDAPI及びそれらの組合せからなる群から選択される、並びに/又は
- 目的の微生物又は微生物の群は、好ましくは、エシェリキア属及びシュードモナス属及びそれらの組合せに属する細菌から選択され、より好ましくは、大腸菌及び緑膿菌及びそれらの組合せから選択される、グラム陰性菌の群に属する微生物に属するか、又はそれを含み、前記少なくとも1つの蛍光色素は、キサンテンベースの色素、好ましくは、ローダミン色素、ピレンベースの色素、クマリンベースの色素、シアニンベースの色素及びDAPI及びそれらの組合せからなる群から選択され、好ましくは、Cy5、好ましくは、スルホ-Cy5、Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 405、MB660R及びDAPI及びそれらの誘導体及び組合せからなる群から選択され、より好ましくは、スルホ-Cy5-酸、Alexa Fluor 350-NHSエステル、Alexa Fluor 405-DBCO、MB660R-DBCO及びDAPI及びそれらの組合せからなる群から選択される。好ましくは、前記少なくとも1つの蛍光色素は、キサンテンベースの色素、好ましくは、ローダミン色素、ピレンベースの色素、クマリンベースの色素及びシアニンベースの色素及びそれらの組合せからなる群から選択され、好ましくは、Cy5、好ましくは、スルホ-Cy5、Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 405及びMB660R及びそれらの誘導体及び組合せからなる群から選択され、より好ましくは、スルホ-Cy5-酸、Alexa Fluor 350-NHSエステル、Alexa Fluor 405-DBCO及びMB660R-DBCO及びそれらの組合せからなる群から選択される。より好ましくは、前記少なくとも1つの蛍光色素は、ピレンベースの色素、クマリンベースの色素及びそれらの組合せからなる群から選択され、好ましくは、Alexa Fluor 350及びAlexa Fluor 405及びそれらの誘導体及び組合せからなる群から選択され、より好ましくは、Alexa Fluor 350-NHSエステル、Alexa Fluor 405-DBCO及びそれらの組合せからなる群から選択される。更により好ましくは、前記少なくとも1つの蛍光色素は、Alexa Fluor 350-NHSエステル及びAlexa Fluor 405-DBCOの組合せである、並びに/又は
- 目的の微生物又は微生物の群は、好ましくは、スタフィロコッカス属及びエンテロコッカス属及びそれらの組合せに属する細菌から選択され、より好ましくは、黄色ブドウ球菌及びフェカリス菌及びそれらの組合せから選択される、グラム陽性菌の群に属する微生物に属するか、又はそれを含み、前記少なくとも1つの蛍光色素は、キサンテンベースの色素、シアニンベースの色素及びDAPI及びそれらの組合せからなる群から選択され、好ましくは、Cy5(商標)、好ましくは、スルホ-Cy5、MB660R、DAPI及びそれらの誘導体及び組合せからなる群から選択され、より好ましくは、スルホ-Cy5-酸、MB660R-DBCO及びDAPI及びそれらの組合せからなる群から選択される。好ましくは、前記少なくとも1つの蛍光色素は、キサンテンベースの色素及びシアニンベースの色素及びそれらの組合せからなる群から選択され、好ましくは、Cy5、好ましくは、スルホ-Cy5及びMB660R及びそれらの誘導体及び組合せからなる群から選択され、より好ましくは、スルホ-Cy5-酸及びMB660R-DBCO及びそれらの組合せからなる群から選択される、並びに/又は
- 目的の微生物又は微生物の群は、好ましくは、アシネトバクター属、エロモナス属、ブレブンディモナス属、バークホルデリア属、シトロバクター属、エドワージエラ属、エンテロバクター属、エシェリキア属、オクロバクテリウム属、クレブシエラ属、メチロバクテリウム属、モラクセラ属、パンテア属、プロテウス属、シュードモナス属、ラルストニア属、サルモネラ属、セラチア属、シゲラ属、スフィンゴモナス属、ステノトロホモナス属、ビブリオ属、エルシニア属、バチルス属、エンテロコッカス属、ミクロコッカス属、スタフィロコッカス属及びそれらの組合せに属する細菌から選択され、より好ましくは、アシネトバクター・バウマニー(Acinetobacter baumanii)、エロモナス・ハイドロフィラ(Aeromonas hydrophila)、ブレブンディモナス・ディミヌタ(Brevundimonas diminuta)、セパシア菌、シトロバクター・フロインディー(Citrobacter freundii)、エドワージエラ・タルダ(Edwardsiella tarda)、エンテロバクター・エロゲネス(Enterobacter aerogenes)、大腸菌、オクロバクテリウム・アンスロピック(Ochrobactrum anthropic)、肺炎桿菌、メチロバクテリウム・エキストロクエンス、モラクセラ・オスロエンシス(Moraxella osloensis)、パンテア・アグロメランス(Pantoea agglomerans)、プロテウス・ミラビリス、緑膿菌、シュードモナス・フルオレッセンス(Pseudomonas fluorescens)、ラルストニア・ピッケティ(Ralstonia pickettii)、ネズミチフス菌、セラチア・マルセセンス(Serratia marcescens)、ソンネ菌、スフィンゴモナス・パウシモビリス(Sphingomonas paucimobilis)、ステノトロホモナス・マルトフィリア(Stenotrophomonas maltophilia)、腸炎ビブリオ菌(Vibrio parahaemolyticus)、エルシニア・エンテロコリチカ(Yersinia enterocolitica)、枯草菌、フェカリス菌、ルテウス菌(Micrococcus luteus)(コクリア・リゾフィラ(kocuria rhizophila))、黄色ブドウ球菌及びそれらの組合せから選択され、前記少なくとも1つの蛍光色素は、クマリンベースの色素、シアニンベースの色素、ピレンベースの色素及びキサンテンベースの色素及びそれらの組合せからなる群から選択され、好ましくは、Alexa Fluor(商標)350、Cy5(商標)、好ましくは、スルホ-Cy5、Alexa Fluor(商標)405及びMB660R及びそれらの誘導体及び組合せからなる群から選択され、より好ましくは、Alexa Fluor(商標)350-NHSエステル、スルホ-Cy5-酸、Alexa Fluor(商標)405-DBCO及びMB660R-DBCO及びそれらの組合せからなる群から選択される、更により好ましくは、(i)MB660Rとスルホ-Cy5、好ましくは、MB660R-DBCOとスルホ-Cy5-酸の混合物、及び(ii)Alexa Fluor(商標)350とAlexa Fluor(商標)405、好ましくは、Alexa Fluor(商標)350-NHSエステルとAlexa Fluor(商標)405-DBCOの混合物からなる群から選択される、従属栄養細菌の群に属する微生物に属するか、又はそれを含み、並びに/又は
- 目的の微生物又は微生物の群は、好ましくは、アシネトバクター属、エロモナス属、ブレブンディモナス属、バークホルデリア属、シトロバクター属、エドワージエラ属、エンテロバクター属、エシェリキア属、オクロバクテリウム属、クレブシエラ属、メチロバクテリウム属、モラクセラ属、パンテア属、プロテウス属、シュードモナス属、ラルストニア属、サルモネラ属、セラチア属、シゲラ属、スフィンゴモナス属、ステノトロホモナス属、エルシニア属、バチルス属、エンテロコッカス属、ミクロコッカス属、スタフィロコッカス属及びそれらの組合せに属する細菌から選択され、より好ましくは、アシネトバクター・バウマニー、エロモナス・ハイドロフィラ、ブレブンディモナス・ディミヌタ、セパシア菌、シトロバクター・フロインディー、エドワージエラ・タルダ、エンテロバクター・エロゲネス、大腸菌、オクロバクテリウム・アンスロピック、肺炎桿菌、メチロバクテリウム・エキストロクエンス、モラクセラ・オスロエンシス、パンテア・アグロメランス、プロテウス・ミラビリス、緑膿菌、シュードモナス・フルオレッセンス、ラルストニア・ピッケティ、ネズミチフス菌、セラチア・マルセセンス、ソンネ菌、スフィンゴモナス・パウシモビリス、ステノトロホモナス・マルトフィリア、エルシニア・エンテロコリチカ、枯草菌、フェカリス菌、ルテウス菌(コクリア・リゾフィラ)、黄色ブドウ球菌及びそれらの組合せから選択され、前記少なくとも1つの蛍光色素は、アクリジン色素、キサンテンベースの色素、アントラセンベースの色素、クマリンベースの色素、シアニンベースの色素、ジピロメテンベースの色素、ナフタレンベースの色素、ピレンベースの色素、スクアラインベースの色素、スクアラインロタキサンベースの色素及びDAPI及びそれらの組合せからなる群から選択され、好ましくは、アクリジンオレンジ、DRAQ5、Cytrak orange、Alexa Fluor 350、Pacific Blue、Cy5、好ましくは、スルホ-Cy5、Cy5.5、好ましくは、スルホ-Cy5.5、BODIPY色素、好ましくは、BODIPY 500/510、プロダン、Alexa Fluor 405、Cascade Blue、Seta色素、好ましくは、Seta 650又はSeta 375、SeTau色素、好ましくは、SeTau 647又はSeTau 488、Alexa Fluor 488、MB660R、ATTO647及びDAPI及びそれらの誘導体及び組合せからなる群から選択され、より好ましくは、アクリジンオレンジ、DRAQ5、Cytrak orange、Alexa Fluor 350-NHSエステル、Pacific Blue-NHSエステル、スルホ-Cy5-酸、スルホ-Cy5.5-酸、BODIPY 500/510、プロダン、Alexa Fluor 405-DBCO、Cascade Blue、Seta 650-DBCO、Seta 375-NHS、SeTau 647-マレイミド、SeTau 488-NHS、Alexa Fluor 488-酸、Alexa Fluor 488-DBCO、MB660R-酸、MB660R-DBCO、ATTO647-酸及びDAPI及びそれらの組合せからなる群から選択される、従属栄養細菌の群に属する微生物に属するか、又はそれを含む。好ましくは、前記少なくとも1つの蛍光色素は、キサンテンベースの色素、アントラセンベースの色素、クマリンベースの色素、シアニンベースの色素、ジピロメテンベースの色素、ナフタレンベースの色素、ピレンベースの色素、スクアラインベースの色素及びスクアラインロタキサンベースの色素及びそれらの組合せからなる群から選択され、好ましくは、DRAQ5、Cytrak orange、Alexa Fluor 350、Pacific Blue、Cy5、好ましくは、スルホ-Cy5、Cy5.5、好ましくは、スルホ-Cy5.5、BODIPY色素、好ましくは、BODIPY 500/510、プロダン、Alexa Fluor 405、Cascade Blue、Seta色素、好ましくは、Seta 650又はSeta 375、SeTau色素、好ましくは、SeTau 647又はSeTau 488、Alexa Fluor 488、MB660R及びATTO647及びそれらの誘導体及び組合せからなる群から選択され、より好ましくは、DRAQ5、Cytrak orange、Alexa Fluor 350-NHSエステル、Pacific Blue-NHSエステル、スルホ-Cy5-酸、スルホ-Cy5.5-酸、BODIPY 500/510、プロダン、Alexa Fluor 405-DBCO、Cascade Blue、Seta 650-DBCO、Seta 375-NHS、SeTau 647-マレイミド、SeTau 488-NHS、Alexa Fluor 488-酸、Alexa Fluor 488-DBCO、MB660R-酸、MB660R-DBCO及びATTO647-酸及びそれらの組合せからなる群から選択される、並びに/又は
- 目的の微生物又は微生物の群は、好ましくは、カンジダ属、ザイゴサッカロミセス属、アスペルギルス属、サッカロミセス属、ゲオトリクム属及びペニシリウム属及びそれらの組合せに属する真菌から選択され、より好ましくは、カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)、ザイゴサッカロミセス・バイリー(Zygosaccharomyces bailii)、アスペルギルス・ブラジリエンシス(Aspergillus brasiliensis)、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、ジオトリクム・カンディダム(Geotrichum candidum)、ペニシリウム・バリオティー(Penicillium variotii)、ペニシリウム・クリソゲナム(Penicillium chrysogenum)及びそれらの組合せからなる群から選択される、酵母及びカビの群に属する微生物に属するか、又はそれを含み、前記少なくとも1つの蛍光色素は、アクリジン色素、キサンテンベースの色素からなる群から選択され、好ましくは、ローダミン色素、フルオレセイン色素及びカーボピロニンベースの色素、クマリンベースの色素、シアニンベースの色素、ジピロメテンベースの色素、ナフタレンベースの色素、ピレンベースの色素、スクアラインベースの色素、スクアラインロタキサンベースの色素及びDAPI及びそれらの組合せからなる群から選択され、好ましくは、アクリジンオレンジ、Alexa Fluor 350、Pacific Blue、Cy5、好ましくは、スルホ-Cy5、プロダン、Alexa Fluor 405、Cascade Blue、BODIPY 500/510、Seta色素、好ましくは、Seta 650、SeTau色素、好ましくは、SeTau 647又はSeTau 488、Alexa Fluor 488、MB660R及びDAPI及びそれらの誘導体及び組合せからなる群から選択され、より好ましくは、アクリジンオレンジ、Alexa Fluor 350-NHSエステル、Pacific Blue-NHSエステル、スルホ-Cy5-酸、プロダン、Alexa Fluor 405-DBCO、Cascade Blue、BODIPY 500/510、Seta 650-DBCO、SeTau 647-マレイミド、SeTau 488-NHS、Alexa Fluor 488-酸、MB660R-酸、MB660R-DBCO及びDAPI及びそれらの組合せからなる群から選択される。好ましくは、前記少なくとも1つの蛍光色素は、キサンテンベースの色素、クマリンベースの色素、シアニンベースの色素、ナフタレンベースの色素、ピレンベースの色素、スクアラインベースの色素、スクアラインロタキサンベースの色素及びDAPI及びそれらの組合せからなる群から選択され、好ましくは、Alexa Fluor(商標)350、Pacific blue(商標)、Cy5(商標)、好ましくは、スルホ-Cy5、プロダン、Alexa Fluor(商標)405、Cascade blue(商標)、Seta色素、好ましくは、Seta 650、SeTau色素、好ましくは、SeTau 647及びSeTau 488、Alexa Fluor 488、MB660R、ATTO647及びDAPI及びそれらの誘導体及び組合せからなる群から選択され、より好ましくは、Alexa Fluor(商標)350-NHSエステル、Pacific blue(商標)-NHSエステル、スルホ-Cy5-酸、プロダン、Alexa Fluor(商標)405-DBCO、Cascade blue(商標)、Seta 650-DBCO、SeTau 488-NHS、SeTau 647-マレイミド、Alexa Fluor 488-酸、MB660R-酸、MB660R-DBCO、ATTO647-酸及びDAPI及びそれらの組合せからなる群から選択される。より好ましくは、前記少なくとも1つの蛍光色素は、キサンテンベースの色素からなる群から選択され、好ましくは、MB660R及びそれらの誘導体及び組合せからなる群から選択され、好ましくは、MB660R-DBCOである、並びに/又は
- 目的の微生物又は微生物の群は、好ましくは、好熱性好酸性菌(TAB)、酢酸菌(AAB)、乳酸菌(LAB)、嫌気性菌、好気性中温性菌、グラム陰性菌及びグラム陽性菌の群及びそれらの組合せから選択される1つ又はいくつかの細菌、並びに好ましくは、酵母及びカビから選択される1つ又はいくつかのミクロ菌を含み、前記少なくとも1つの蛍光色素は、キサンテンベースの色素からなる群から選択され、好ましくは、ローダミン色素、フルオレセイン色素及びカーボピロニンベースの色素、クマリンベースの色素、シアニンベースの色素、ピレンベースの色素、スクアラインベースの色素及びスクアラインロタキサンベースの色素及びそれらの組合せからなる群から選択され、好ましくは、Alexa Fluor(商標)350、Pacific blue(商標)、Cy5(商標)、好ましくは、スルホ-Cy5、Alexa Fluor(商標)405、Cascade blue(商標)、Seta色素、好ましくは、Seta 650、SeTau色素、好ましくは、SeTau 647及びSeTau 488、Alexa Fluor 488及びMB660R及びそれらの誘導体及び組合せからなる群から選択され、より好ましくは、Alexa Fluor(商標)350-NHSエステル、Pacific blue(商標)-NHSエステル、スルホ-Cy5-酸、Alexa Fluor(商標)405-DBCO、Cascade blue(商標)、Seta 650-DBCO、SeTau 488-NHS、SeTau 647-マレイミド、Alexa Fluor 488-酸、MB660R-酸及びMB660R-DBCO及びそれらの組合せからなる群から選択され、更により好ましくは、スルホ-Cy5-酸及びMB660R-DBCO及びそれらの組合せからなる群から選択される。

【0024】

一部の実施形態では、目的の微生物又は微生物の群は、好ましくは、好熱性好酸性菌(TAB)、酢酸菌(AAB)、乳酸菌(LAB)、嫌気性菌、好気性中温性菌、グラム陰性菌及びグラム陽性菌、従属栄養細菌の群及びそれらの組合せから選択される1つ又はいくつかの細菌、並びに好ましくは、酵母及びカビから選択される1つ又はいくつかのミクロ菌を含み、前記少なくとも1つの蛍光色素は、キサンテンベースの色素からなる群から選択され、好ましくは、ローダミン色素、フルオレセイン色素及びカーボピロニンベースの色素、クマリンベースの色素、シアニンベースの色素、ピレンベースの色素、スクアラインベースの色素及びスクアラインロタキサンベースの色素及びそれらの組合せからなる群から選択され、好ましくは、Alexa Fluor 350、Pacific blue、Cy5、好ましくは、スルホ-Cy5、Alexa Fluor 405、Cascade blue(商標)、Seta色素、好ましくは、Seta 650又はSeta 375、SeTau色素、好ましくは、SeTau 647及びSeTau 488、Alexa Fluor 488及びMB660R及びそれらの誘導体及び組合せからなる群から選択され、より好ましくは、Alexa Fluor 350-NHSエステル、Pacific blue(商標)-NHSエステル、スルホ-Cy5-酸、Alexa Fluor 405-DBCO、Cascade blue、Seta 650-DBCO、Seta 375-NHS、SeTau 488-NHS、SeTau 647-マレイミド、Alexa Fluor 488-酸、MB660R-酸及びMB660R-DBCO及びそれらの組合せからなる群から選択され、更により好ましくは、スルホ-Cy5-酸及びMB660R-DBCO及びそれらの組合せからなる群から選択される。

【0025】

特に、目的の微生物又は微生物の群は、好気性中温性菌(AMB)の群に属する微生物に属するか、又はそれを含む場合があり、好ましくは、メチロバクテリウム属、シュードモナス属、バチルス属、エシェリキア属、スタフィロコッカス属、アシネトバクター属、クロノバクター属、クレブシエラ属、サルモネラ属、エンテロコッカス属、リステリア属、シゲラ属、コクリア属及びバークホルデリア属及びそれらの組合せに属する細菌から選択され、より好ましくは、メチロバクテリウム・エキストロクエンス、緑膿菌、枯草菌、大腸菌、黄色ブドウ球菌、アシネトバクター・バウマンニ、クロノバクター・サカザキ、肺炎桿菌、ネズミチフス菌、フェカリス菌、リステリア・グレイ、ソンネ菌、コクリア・リゾフィラ及びセパシア菌及びそれらの組合せからなる群から選択され、前記少なくとも1つの蛍光色素は、キサンテンベースの色素、アントラセンベースの色素、クマリンベースの色素、シアニンベースの色素、ジピロメテンベースの色素、ナフタレンベースの色素、ピレンベースの色素、スクアラインベースの色素、スクアラインロタキサンベースの色素及びDAPI及びそれらの組合せからなる群から選択される場合があり、好ましくは、DRAQ5(商標)、Alexa Fluor(商標)350、Cy5(商標)、好ましくは、スルホ-Cy5、BODIPY(商標)色素、好ましくは、BODIPY 500/510、プロダン、Alexa Fluor(商標)405、Seta色素、好ましくは、Seta 650、SeTau色素、好ましくは、SeTau 647、Alexa Fluor 488、MB660R、ATTO647及びDAPI及びそれらの誘導体及び組合せからなる群から選択され、より好ましくは、DRAQ5(商標)、Alexa Fluor(商標)350-NHSエステル、スルホ-Cy5-酸、BODIPY 500/510、プロダン、Alexa Fluor(商標)405-DBCO、Seta 650-DBCO、SeTau 647-マレイミド、Alexa Fluor 488-酸、Alexa Fluor 488-DBCO、MB660R-酸、MB660R-DBCO、ATTO647-酸及びDAPI及びそれらの組合せからなる群から選択される。

【0026】

特に、目的の微生物又は微生物の群は、好ましくは、カンジダ属、ザイゴサッカロミセス属、アスペルギルス属、サッカロミセス属、ゲオトリクム属及びペニシリウム属及びそれらの組合せに属する真菌から選択され、より好ましくは、カンジダ・アルビカンス、ザイゴサッカロミセス・バイリー、アスペルギルス・ブラジリエンシス、サッカロミセス・セレビシエ、ジオトリクム・カンディダム、ペニシリウム・バリオティー、ペニシリウム・クリソゲナム及びそれらの組合せからなる群から選択され、前記少なくとも1つの蛍光色素は、キサンテンベースの色素、クマリンベースの色素、シアニンベースの色素、ナフタレンベースの色素、ピレンベースの色素、スクアラインベースの色素、スクアラインロタキサンベースの色素及びDAPI及びそれらの組合せからなる群から選択される場合があり、好ましくは、Alexa Fluor(商標)350、Cy5(商標)、好ましくは、スルホ-Cy5、プロダン、Alexa Fluor(商標)405、Seta色素、SeTau色素、Alexa Fluor 488、MB660R、ATTO647及びDAPI及びそれらの誘導体及び組合せからなる群から選択され、より好ましくは、Alexa Fluor(商標)350-NHSエステル、スルホ-Cy5-酸、プロダン、Alexa Fluor(商標)405-DBCO、Seta 650-DBCO、SeTau 647-マレイミド、Alexa Fluor 488-酸、MB660R-酸、MB660R-DBCO、ATTO647-酸及びDAPI及びそれらの組合せからなる群から選択される、酵母及びカビの群に属する微生物に属するか、又はそれを含む場合がある。

【0027】

特に、目的の微生物又は微生物の群は、好ましくは、エシェリキア属及びシュードモナス属及びそれらの組合せに属する細菌から選択され、より好ましくは、大腸菌及び緑膿菌及びそれらの組合せから選択される、グラム陰性菌の群に属する微生物に属するか、又はそれを含む場合があり、前記少なくとも1つの蛍光色素は、キサンテンベースの色素及びシアニンベースの色素及びそれらの組合せからなる群から選択される場合があり、好ましくは、Cy5(商標)、好ましくは、スルホ-Cy5、MB660R及びそれらの誘導体及び組合せからなる群から選択され、より好ましくは、スルホ-Cy5-酸及びMB660R-DBCO及びそれらの組合せからなる群から選択される。

【0028】

特に、目的の微生物又は微生物の群は、好ましくは、好熱性好酸性菌(TAB)、酢酸菌(AAB)、乳酸菌(LAB)、嫌気性菌、好気性中温性菌、グラム陰性菌及びグラム陽性菌の群及びそれらの組合せから選択される1つ又はいくつかの細菌、並びに好ましくは、酵母及びカビから選択される1つ又はいくつかのミクロ菌を含む場合があり、前記少なくとも1つの蛍光色素は、キサンテンベースの色素からなる群から選択される場合があり、好ましくは、ローダミン色素、フルオレセイン色素及びカーボピロニンベースの色素、クマリンベースの色素、シアニンベースの色素、ピレンベースの色素、スクアラインベースの色素及びスクアラインロタキサンベースの色素及びそれらの組合せからなる群から選択され、好ましくは、Alexa Fluor(商標)350、Cy5(商標)、好ましくは、スルホ-Cy5、Alexa Fluor(商標)405、Seta色素、好ましくは、Seta 650、SeTau色素、好ましくは、SeTau 647、Alexa Fluor 488及びMB660R及びそれらの誘導体及び組合せからなる群から選択され、より好ましくは、Alexa Fluor(商標)350-NHSエステル、スルホ-Cy5-酸、Alexa Fluor(商標)405-DBCO、Seta 650-DBCO、SeTau 647-マレイミド、Alexa Fluor 488-酸、MB660R-酸及びMB660R-DBCO及びそれらの組合せからなる群から選択され、更により好ましくは、スルホ-Cy5-酸及びMB660R-DBCO及びそれらの組合せからなる群から選択される。

【0029】

特に、目的の微生物又は微生物の群は、好熱性好酸性菌に属する場合があり、前記少なくとも1つの蛍光色素は、キサンテンベースの色素の群から選択される色素を含む場合があり、好ましくは、MB(商標)660R及びそれらの誘導体、より好ましくは、MB(商標)660R DBCOから選択される。

【0030】

特に、目的の微生物又は微生物の群は、アスペルギルス・ブラジリエンシス、カンジダ・アルビカンス及び大腸菌及びそれらの組合せからなる群から選択される微生物に属するか、又はそれを含む場合があり、前記少なくとも1つの蛍光色素は、Bodipy 500/510、Alexa Fluor 350又はそれらの誘導体、好ましくは、Alexa Fluor 350-NHSエステル、Pacific blue又はその誘導体、好ましくは、Pacific blue-NHSエステル、プロダン、Alexa Fluor 405又はそれらの誘導体、好ましくは、Alexa Fluor 405-DBCO、Cascade Blue、Seta 650又はそれらの誘導体、好ましくは、Seta 650-DBCO、Setau 488又はそれらの誘導体、好ましくは、Setau 488-NHS、Setau 647又はそれらの誘導体、好ましくは、Setau 647-マレイミド及びそれらの任意の組合せからなる群から選択される。

【0031】

試料の微生物が工程a)又は工程a2)の前にメンブレンフィルター上で濃縮される実施形態では、メンブレンフィルターは、工程b)の後及び工程c)の前に固体増殖培地から取り外される場合があり、その上の微小コロニーは、工程c)において検出及び/又は数え上げる場合がある。或いは、メンブレンフィルターは、工程c)を実施するために固体増殖培地上で維持される場合がある。

【0032】

好ましくは、工程c)において、蛍光顕微鏡又は固相血球計算器を使用して前記少なくとも1つの蛍光色素に対応する蛍光シグナルを発する微小コロニーを検出する及び/又は数え上げる。

【0033】

別の態様では、本発明はまた、試料が少なくとも1つの目的の微生物を含有するか否かを決定することにおける、試料が無菌であるか否かを決定することにおける、又は試料の生物汚染度を決定することにおける本発明の方法の使用に関する。

【0034】

別の態様では、本発明はまた、本発明の方法に従う、目的の微生物又は微生物の群を検出する及び/又は数え上げるためのキットの使用に関し、前記キットは、
(i)- 好ましくは、上記で定義されるような、少なくとも1つの蛍光色素、
及び任意選択で、
- 好ましくは、上記で定義されるような、少なくとも1つのメンブレンフィルター及び/又は
- 目的の微生物又は微生物の群の増殖を支持するために栄養素を含有する固体増殖培地を含む少なくとも1つの容器若しくは前記少なくとも1つの容器を得るために必要とされる材料、及び/又は
- 前記キットを使用するための使用説明書を提供するリーフレット、或いは
(ii)- 好ましくは、上記で定義されるような少なくとも1つの蛍光色素、及び目的の微生物又は微生物の群の増殖を支持するために栄養素を含有する固体増殖培地を含む少なくとも1つの容器若しくは前記少なくとも1つの容器を得るために必要な材料、及び
任意選択で、
- 好ましくは、上記で定義されるような少なくとも1つのメンブレンフィルター、及び/又は
- 前記キットを使用するための使用説明書を提供するリーフレット
を含む。

【図面の簡単な説明】

【0035】

【図1】A.アシドテレストリス(acidoterrestris)24時間、PVDFメンブレン、MB660R-DBCO 100μM、光力100%、ゲイン1、露光時間100ms

【図2】大腸菌17時間、MCE黒色メンブレン、Alexa Fluor(商標)350-NHSエステル 500μM、光力50%、ゲイン1、露光時間200ms

【図3】大腸菌17時間、PVDFメンブレン、Alexa Fluor(商標)350-NHSエステル150μM、光力20%、ゲイン1、露光時間200ms

【図4】大腸菌17時間、MCE黒色メンブレン、Alexa Fluor(商標)405-DBCO 500μM、光力50%、ゲイン1、露光時間200ms

【図5】大腸菌15時間、PVDFメンブレン、MB660R-DBCO 250μM、光力100%、ゲイン1、露光時間100ms

【図6】大腸菌18時間、MCE黒色メンブレン、スルホ-Cy5-酸 150μM、光力100%、ゲイン1、露光時間400ms

【図7】大腸菌18時間、PVDFメンブレン、スルホ-Cy5-酸 50μM、光力100%、ゲイン1、露光時間400ms

【図8】C.アルビカンス(albicans)21時間、PVDFメンブレン、MB660R-DBCO 250μM、光力100%、ゲイン1、露光時間100ms

【図9】A.ブラジリエンシス(brasiliensis)21時間、PVDFメンブレン、MB660R-DBCO 250μM、光力100%、ゲイン1、露光時間200ms

【図10】混合物C.アルビカンス(albicans)+A.ブラジリエンシス20時間、PVDFメンブレン、スルホ-Cy5-酸 50μM、光力100%、ゲイン1、露光時間400ms

【図11】混合物C.アルビカンス+A.ブラジリエンシス21時間、MCE黒色メンブレン、Alexa Fluor(商標)405-DBCO500μM、光力50%、ゲイン1、露光時間200ms

【図12】混合物C.アルビカンス+A.ブラジリエンシス21時間、MCE黒色メンブレン、Alexa Fluor(商標)350-NHSエステル 500μM、光力50%、ゲイン1、露光時間200ms

【図13】混合物C.アルビカンス+A.ブラジリエンシス21時間、PVDFメンブレン、Alexa Fluor(商標)350-NHSエステル 500μM、光力20%、ゲイン1、露光時間300ms

【図14】E.フェカリス(faecalis)+C.アルビカンス+A.ブラジリエンシス 24時間、TSA寒天プレート25℃、PVDFメンブレン、MB660R 100μM+スルホ-Cy5-酸 100μM、光力100%、ゲイン1、露光時間200ms

【図15】蛍光色素の構造。

【図16】蛍光色素を細菌と接触させるための異なる方法を使用する、枯草菌、黒色又は白色メンブレン、MB660R-DBCO (50μM)及びスルホ-Cy5-酸(50μM)。

【図17】アリシクロバチルス・アシドテレストリス、アリシクロバチルス・シクロヘプタニカス及びアリシクロバチルス・ハーバリウス、MB660R-DBCO、寒天培地上に置かれたメンブレン上又は直接寒天培地上(メンブレンを含まない)での検出。

【発明を実施するための形態】

【0036】

本発明者らは、本明細書において、微生物を、微小コロニーの早期検出を可能にするために蛍光色素の存在下で固形培地上で培養できることを実証した。実際、驚くべきことに、蛍光色素は大きな毒性を示さず、したがって、検出されるべき微生物の増殖に影響を及ぼさないということがわかった。微生物の増殖期の間のこれらの色素の存在によって、微小コロニー段階での微生物の極めて早期の検出及び計数が可能になる。特に、本発明者らは、この方法を使用して、UTI診断において関連する重要性のある好熱性好酸性(acidophile)菌(TAB)、酢酸菌(AAB)、乳酸菌(LAB)、嫌気性菌、好気性中温性菌、酵母、カビ及び細菌を迅速に検出する及び数え上げるだけでなく、試料の無菌性又は生物汚染度を評価することができることを示した。本発明者らによって開発された方法は、標準的な機器及び試薬を使用する費用効率の良い方法であり、実現するために高度に熟練した専門家を必要とせず、生存微生物と死滅微生物を区別することができる容易なワークフローを有しながら、他の方法よりも迅速な、より正確な結果を提供する。本方法は、したがって、目的の試料中の微生物を検出し、数え上げるための迅速で、高感度で、ユーザーフレンドリーで、費用効率の良い方法の必要性を満たす。

【0037】

したがって、第1の態様において、本発明は、目的の微生物又は微生物の群を検出する又は数え上げる方法であって、
a)容器中で、前記微生物又は微生物の群を含有すると疑われる試料を、前記微生物又は微生物の群の増殖を支持するために栄養素を含有する固体増殖培地と、及び少なくとも1つの蛍光色素と接触させる工程、
b)前記微生物又は微生物の群の微小コロニーを形成するのに十分な条件下及び時間の間、前記容器をインキュベートする工程、及び
c)前記少なくとも1つの蛍光色素の蛍光シグナルを発する微小コロニーを検出する又は数え上げる工程
を含み、それによって、試料中に含有される前記微生物又は微生物の群を検出する又は数え上げる方法に関する。

【0038】

本発明の方法を使用して、本方法の工程c)における微小コロニーの検出によって、試料中の微生物又は微生物の群を検出できる、すなわち、試料中に存在する微生物の存在を明らかにすることができる。試料中の微生物又は微生物の群を数え上げるためにも使用できる。この場合には、工程c)において検出される各微小コロニーは細胞分裂を起こした個々の細胞から生じるということが想定される。したがって、任意選択で、希釈又は濃縮係数を考慮して、微小コロニーの数を計数することによって、試料中の前記微生物の数を決定できる。本発明の方法を使用して、微生物又は微生物の群を同定することもできる。本明細書で使用される場合、「同定」という用語は、所与の微小コロニーの属及び種の決定を必ずしも必要としない。この用語は、分類学的群(任意のランクの)における、又は特定の群(例えば、好熱性好酸性菌、酢酸菌、乳酸菌、酵母又はカビ、好気性中温性菌、嫌気性菌)における微生物の分類を指す場合もある。

【0039】

本発明の方法の工程a)は、容器中で、微生物又は微生物の群を含有すると疑われる試料を、前記微生物又は微生物の群の増殖を支持するために栄養素を含有する固体増殖培地と、及び少なくとも1つの蛍光色素と接触させる工程を含む。

【0040】

工程a)は、
a1)前記微生物又は微生物の群を含有すると疑われる試料を少なくとも1つの蛍光色素と接触させる工程、及び
a2)容器中で、前記試料を前記微生物又は微生物の群の増殖を支持するために栄養素を含有する固体増殖培地と接触させる工程
を含む場合があり、
工程a1)及びa2)は同時に、又は任意の順序で逐次実行される。

【0041】

一部の実施形態では、工程a1)は、工程a2)の前に実行される。任意選択で、工程a2)の前に、試料の微生物は、メンブレンフィルター上で濃縮される。特に、試料は、工程a1)の前又は後に、好ましくは、工程a1)の後にメンブレンフィルター上で濃縮される場合がある。特に、前記少なくとも1つの蛍光色素は、試料の濾過の前又は後に試料と同一メンブレン上で濾過されうる。

【0042】

一部の特定の実施形態では、工程a1)及びa2)は、同時に実行される。

【0043】

本方法は、工程a)の前に、目的の微生物又は微生物の群を含有すると疑われる試料を提供することを更に含みうる。

【0044】

試料
試料は、液体(例えば、水、果汁、ビール、ワイン、生体液、例えば、尿)、固体(例えば、食物、医薬品又は化粧品、医療デバイス又は任意の固体表面)又は気体(例えば、空気)から得ることができる。試験されるべき製品/環境の形態に応じて、本発明の方法において試料を直接使用してもよく、予備工程に供してもよい。

【0045】

特に、試料は液体試料又は液化試料でありうる。本明細書で使用される場合、「液化試料」という用語は、固体試料から得られた液体試料を指す。一部の場合には、固体試料は、物理的及び/又は化学的処置によって液体培地に溶解又は懸濁される場合がある。微生物はまた、当業者に公知の任意の方法、例えば、ふき取り法、例えば、ワイプを使用する摩擦法、例えば、寒天接触法による印刷法、すすぎ若しくは浸漬法又は特にバイオフィルムを取り除くための超音波処理法を使用して種々の表面又はデバイスから抽出することができる(例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ismail et al., Int J Environ Res Public Health. 2013 Nov 14;10(11):6169-83を参照されたい)。

【0046】

液体試料は、懸濁された固体を含有する場合がある。しかし、必要に応じて、残存する懸濁された固体は、適した方法を使用して、好ましくは、微生物の喪失を最小にする方法を使用して、例えば、低速遠心分離又は適した孔径を使用する濾過によって液体培地から排除することができる。固体試料を懸濁するために使用された液体培地は、任意の適した溶媒、例えば、滅菌水、緩衝液溶液又は液体培養培地でありうる。

【0047】

任意選択で、液体又は液化試料は、任意の適した方法、例えば、遠心分離又は濾過を使用して、工程a)の前に希釈(例えば、段階希釈)又は濃縮されうる。

【0048】

本発明の方法において使用/分析される試料は、微生物で汚染されているか否かを決定しようとされる任意の試料でありうる。

【0049】

試料の例として、それだけには限らないが、生体試料(例えば、唾液の、鼻咽頭の、尿の、糞便の、血液の、血漿の、脳脊髄液の又は粘液の試料)、環境試料(例えば、住宅用水、市販の水又は工業用水、廃水、冷却水、ボイラー水、地下水、レクリエーション水、プロセス水、水処置ユニットの流出液、土壌又は他の環境材料)、医療デバイス又はその任意の一部、ヒト又は動物における消費のための食物又は飲料(例えば、乳製品、原材料、飲料水、果汁、ビール、ワイン、製品の組成物中に使用される水)、医薬品又は化粧品並びにこのような食物、飲料、医薬品又は化粧品の成分が挙げられる。

【0050】

メンブレンフィルター
一部の好ましい実施形態では、本方法は、工程a)の前に、メンブレンフィルター上で試料の微生物を濃縮することを更に含みうる。

【0051】

次いで、工程a)において、このメンブレンを以下に記載されるような固体増殖培地及び少なくとも1つの蛍光色素と接触させる。或いは、試料は、濾過の前に、又は濾過の後であるが固体増殖培地との接触の前に、前記少なくとも1つの蛍光色素と接触させる場合がある。特に、試料は前記少なくとも1つの蛍光色素と混合される場合があり、次いで、メンブレン上で濾過される場合があり、又は前記少なくとも1つの蛍光色素は、試料の濾過の前又は後に試料と同一のメンブレン上で濾過される場合がある。特に、蛍光色素は、メンブレン上での濾過/濃縮の前に試料に添加されうる、又は試料の濾過の前又は後に、好ましくは、試料の濾過の後に同一メンブレン上で濾過されうる。次いで、メンブレンフィルターは、前記増殖培地の表面上に置かれる場合がある。

【0052】

インキュベーションの間のフィルターを通る栄養素の通過によって、メンブレンの上面上での微小コロニーの形態の生物の増殖が可能となる。

【0053】

液体、液化試料又は気体試料は、試料中に含有される微生物を残すのに適した無菌メンブレンフィルター、通常標的微生物よりも小さい孔径を有する微量濾過メンブレンフィルターを使用して濾過/濃縮される場合がある。試料は、フィルター漏斗及び真空システムを使用してメンブレンに通される場合がある。好ましくは、メンブレンフィルターは、0.45μmよりも大きくない名目上の孔径、0.22μm～0.45μmの孔径を有する。フィルターの直径は、試料を濾過するために使用されるデバイス及び増殖培地を含有する容器のサイズに応じて変わりうる。例えば、容器は、90mm又は55mmの直径のペトリ皿である場合があり、メンブレンは、47mmの直径を有する場合がある。

【0054】

メンブレンフィルターは、任意の適した材料、例えば、混合セルロースエステル(MCE)、ポリビニリデンフルオリド(PVDF)、ポリエステルスルホン(PES)、ニトロセルロース、ポリテトラフルオロエチレン、ポリカーボネート又はナイロンで作製されうる。好ましくは、メンブレンフィルターは、混合セルロースエステル(MCE)、ポリビニリデンフルオリド(PVDF)、ニトロセルロース、ポリテトラフルオロエチレン、ポリカーボネート又はナイロンで作製される。より好ましくは、メンブレンフィルターは、混合セルロースエステル(MCE)又はポリビニリデンフルオリド(PVDF)で作製される。メンブレンフィルターは、白色である場合も、着色されている、例えば、黒色である場合もあり、及び/又はグリッドメンブレンである場合もある。

【0055】

濾過されるべき試料の容量は、試料の性質及び予測される微生物含量に応じて変わりうる。この容量は通常、1mL～1Lの間であり、当業者によって容易に調整されうる。

【0056】

微生物
本発明の方法によって、培養デバイス中で、特に、適した固体増殖培地上で増殖できるさまざまな微生物又は微生物の群、すなわち、培養可能な微生物を検出すること又は数え上げることが可能となる。

【0057】

本明細書で使用される場合、「微生物」という用語は、細菌、古細菌又はミクロ菌を指す。好ましくは、この用語は、細菌、酵母(すなわち、単細胞ミクロ菌)又はカビ(すなわち多細胞ミクロ菌及び糸状性ミクロ菌)を指す。特に、本発明の方法によって、生存微生物を検出すること又は数え上げることが可能となる。本明細書で使用される場合、「生存微生物」という用語は、適した液体培養培地中又は適した固体培養培地上でインキュベートされた場合に増殖可能である微生物を指す。実際、先行技術のいくつかの他の方法とは対照的に、本発明の方法は、死滅微生物又はその断片、例えば、DNA又は細胞断片を検出せず、これによって、生存微生物を明確に区別できる。

【0058】

本明細書で使用される場合、「微生物の群」という用語は、少なくとも2つの別個の微生物を含む群を指す。前記微生物は、細菌、古細菌及びミクロ菌及びそれらの組合せからなる群から選択されうる、好ましくは、細菌、酵母及びカビ及びそれらの組合せからなる群から選択されうる。特に、微生物の群は、2つ若しくはそれより多い細菌、2つ若しくはそれより多い真菌又は1つ若しくはそれより多い細菌及び1つ若しくはそれより多い真菌の混合物を含みうる。

【0059】

目的の微生物は、病原性又は非病原性微生物でありうる。好ましくは、微生物は、製品(例えば、食物、飲料、医療デバイス、医薬品又は化粧品)又は環境(例えば、スイミングプール、地下水)を劣化又は腐敗させることができる病原性微生物又は非病原性微生物である。

【0060】

一部の実施形態では、目的の微生物又は微生物の群は細菌である。細菌は、好気性、嫌気性又は通性嫌気性菌及びグラム陰性又はグラム陽性菌でありうる。

【0061】

特に、目的の微生物又は微生物の群は、好熱性好酸性菌(TAB)の群、酢酸菌(AAB)の群、乳酸菌(LAB)の群、嫌気性菌の群、好気性中温性菌の群、グラム陰性菌の群、グラム陽性菌の群、従属栄養細菌の群又はそれらの組合せに属する場合がある。より詳しくは、目的の微生物又は微生物の群は、好熱性好酸性菌(TAB)の群、酢酸菌(AAB)の群、乳酸菌(LAB)の群、嫌気性菌の群、好気性中温性菌の群、グラム陰性菌の群又はグラム陽性菌の群又はそれらの組合せに属する場合がある。

【0062】

一実施形態では、目的の微生物又は微生物の群は、好熱性好酸性菌(TAB)としても知られるアリシクロバチルス属(Alicyclobacillus)の種の群に属する。

【0063】

アリシクロバチルス属の種は、高温(最大70℃)で酸性条件において増殖できる胞子形成菌である。胞子は、通常の低温殺菌手順を生き残ることができ、結果として、これらの細菌は、果汁、果汁関連製品(濃縮物からの果汁、濃縮果汁、水抽出果汁、脱水/粉末化果汁、フルーツネクター及びフレーバー付き水のような果実製品を含むノンアルコール性又はアルコール性飲料)又はシロップの潜在的な腐敗生物である。通常、TABは有害ではないが、その株がスモーキーな風味及び匂いを有し、果汁を腐敗させる天然フェノール性化学物質であるグアヤコール又は他の不快な匂いの物質を産生する場合には、腐敗が生じる。最も一般的なグアヤコール産生TABとして、アリシクロバチルス・アシドテレストリスがある。

【0064】

好ましくは、アリシクロバチルス属の種の群に属する目的の微生物又は微生物の群は、アリシクロバチルス・アシドテレストリス、アリシクロバチルス・アシドカルダリウス、アリシクロバチルス・アシディフィラス、アリシクロバチルス・シクロヘプタニカス、アリシクロバチルス・ヘスペリダム、アリシクロバチルス・ハーバリウス及びアリシクロバチルス・コンタミナンス及びそれらの組合せからなる群から選択される。

【0065】

別の実施形態では、目的の微生物又は微生物の群は、酢酸菌(AAB)の群に属する。

【0066】

AABは、厳密に好気性の微生物であり、単一で、対又は鎖として存在しうる、カタラーゼ陽性及びオキシダーゼ陰性、楕円体～桿体の形態の細胞である。それらはまた、中温性微生物であり、その最適増殖温度は、25から30℃の間である。その増殖のための最適pHは、5.0～6.5であるが、それらはまたより低いpH値でも増殖できる。

【0067】

これらの細菌は、天然に広く存在し、酢等の食物及び飲料の製造において重要な役割を果たしている。しかし、他の発酵飲料、例えば、ワイン、サイダー、ビール及び他のソフトドリンクにおけるAABの望まれない増殖は、望ましくない酸味をもたらす。例証として、この群に属するグルコノバクター属の株は、ソフトドリンクの典型的なスポイラーであると考えられている。実際、これらの基質では、糖及びアルコールは不完全に酸化され、エタノールからの酢酸又はグルコースからのグルコン酸の生成等の有機酸の蓄積につながる。

【0068】

好ましくは、酢酸菌(AAB)の群に属する目的の微生物又は微生物の群は、アセトバクター属、アシドモナス属(Acidomonas)、アサイア属、グルコンアセトバクター属、グルコノバクター属、アメヤマエア属(Ameyamaea)、ボンベラ属(Bombella)、コメンサリバクター属(Commensalibacter)、エンドバクター属(Endobacter)、グラニュリバクター属(Granulibacter)、コマガタエイバクター属(Komagataeibacter)、コザキア属(Kozakia)、ネオアサイア属(Neoasaia)、ネオコマガタエア属(Neokomagataea)、ヌグエニバクター属(Nguyenibacter)、サッカリバクター属(Saccharibacter)、スワミナタニア属(Swaminathania)、スウィングシア属(Swingsia)及びタンチカロエニア属(Tanticharoenia)及びそれらの組合せに属する細菌から選択される。

【0069】

より好ましくは、酢酸菌(AAB)の群に属する目的の微生物又は微生物の群は、アセトバクター属に属する細菌、例えば、アセトバクター・パステウリアヌス(Acetobacter pasteurianus)、アセトバクター・マローラム(Acetobacter malorum)、アセトバクター・セレビシエ(Acetobacter cerevisiae)、アセトバクター・オエニ(Acetobacter oeni)、アセトバクター・ポモラム(Acetobacter pomorum)及びアセトバクター・アセチ、アサイア属、例えば、アサイア・ボゴレンシス(Asaia bogorensis)、アサイア・サイアメンシス、アサイア・クルングサペンシス(Asaia krungthepensis)及びアサイア・ランネンシス(Asaia lannaensis)、グルコンアセトバクター属、例えば、グルコノアセトバクター・リクファシエンス、グルコンアセトバクター・エンタニー(Gluconacetobacter entanii)及びグルコンアセトバクター・インターメディウス(Gluconacetobacter intermedius)、グルコノバクター属、例えば、グルコノバクター・オキシダンス及びそれらの組合せから選択される。

【0070】

更により好ましくは、酢酸菌(AAB)の群に属する目的の微生物又は微生物の群は、アセトバクター・アセチ、グルコノアセトバクター・リクファシエンス、グルコノバクター・オキシダンス及びアサイア・サイアメンシス及びそれらの組合せからなる群から選択される。

【0071】

別の実施形態では、目的の微生物又は微生物の群は、乳酸菌(LAB)の群に属する。

【0072】

この群の細菌は、食品工業において正の役割を果たすことが多いが、それらはまた、特に、ワイン及び低pHを有する、又は真空パックされている食物において重大な腐敗を引き起こす場合がある。更に、これらの細菌は、その増殖に好都合な条件がまたボツリヌス菌(Clostridium botulinum)、高度に病原性の細菌にも好都合であるので、指標と考えられることがある。これらの細菌は、不均一な群を形成するが、カタラーゼ陰性(一部の株はヘム依存性カタラーゼを産生できる)、非胞子形成性、厳密に発酵性、通性好気性及びグルコース発酵の主生成物として乳酸を生成するという共通点を有する。

【0073】

乳酸菌(LAB)の群に属する目的の微生物又は微生物の群は、好ましくは、ラクトバチルス属(例えば、ラクトバチルス・カゼイ、ラクトバチルス・プランタルム、ラクトバチルス・サケイ(Lactobacillus sakei)、ラクトバチルス・ブレビス(Lactobacillus brevis)、ラクトバチルス・リンドネリ(Lactobacillus lindneri)、ラクトバチルス・フルクチボランス(Lactobacillus fructivorans)、ラクトバチルス・アシドフィルス(Lactobacillus acidophilus))、ロイコノストック属(Leuconostoc)(例えば、ロイコノストック・ゲリダム(Leuconostoc gelidum)、ロイコノストック・ガシコミタツム(Leuconostoc gasicomitatum)及びロイコノストック・メセンテロイデス(Leuconostoc mesenteroides))、ぺディオコッカス属(Pediococcus)(例えば、ぺディオコッカス・ダムノーサス(Pediococcus damnosus)、ぺディオコッカス・アシディラクティシ(Pediococcus acidilactici)、ぺディオコッカス・ペントサセウス(Pediococcus pentosaceus)、ぺディオコッカス・パルブルス(Pediococcus parvulus)、ぺディオコッカス・イノピナツス(Pediococcus inopinatus)、ぺディオコッカス・ハロフィルス(Pediococcus halophilus)、ぺディオコッカス・デキストリニカス(Pediococcus dextrinicus)及びぺディオコッカス・ウリナエエクイ(Pediococcus urinaeequi))、ラクトコッカス属(Lactococcus)(例えば、ラクトコッカス・ピスチウム(Lactococcus piscium))、エンテロコッカス属(例えば、フェカリス菌及びエンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium))、カルノバクテリウム属(Carnobacterium)(例えば、カルノバクテリウム・ディバージェンス(Carnobacterium divergens)、カルノバクテリウム・マルタロマチカム(Carnobacterium maltaromaticum))、ストレプトコッカス属(Streptococcus)(例えば、ストレプトコッカス・ラクチス(Streptococcus lactis))及びワイセラ属(例えば、ワイセラ・コンフューザ、ワイセラ・ビリデスセンス(Weissella viridescens))及びそれらの組合せに属する細菌から選択される。

【0074】

より好ましくは、乳酸菌(LAB)の群に属する目的の微生物又は微生物の群は、ラクトバチルス属及びワイセラ属及びそれらの組合せに属する細菌から選択される。

【0075】

更により好ましくは、乳酸菌(LAB)の群に属する目的の微生物又は微生物の群は、ラクトバチルス・カゼイ、ラクトバチルス・プランタルム、ワイセラ・コンフューザ及びそれらの組合せからなる群から選択される。

【0076】

別の特定の実施形態では、目的の微生物又は微生物の群は、嫌気性菌の群に属する。

【0077】

嫌気性菌は、3つのカテゴリーに分類されうる:酸素の存在によって害される偏性嫌気性菌、増殖のために酸素を使用できないが、その存在を許容する耐気性生物及び酸素を用いずに増殖できるが、酸素が存在する場合にはそれを使用する通性嫌気性菌。ほとんどの病原性食物由来微生物は、通性嫌気性菌である。嫌気性菌、特にクロストリジウム属の細菌は、真空包装食品又は缶詰食品を腐敗させる可能性がある。嫌気性菌、特にキューティバクテリウム・アクネスは、体内インプラント及び手術デバイス上で生き残るその能力のために術後感染症に関与する可能性もある。

【0078】

嫌気性菌の群に属する目的の微生物又は微生物の群は、好ましくは、クロストリジウム属に属する細菌、例えば、クロストリジウム・スポロゲネス、クロストリジウム・アルギディカーニス(Clostridium algidicarnis)、クロストリジウム・フリゴリス(Clostridium frigoris)、クロストリジウム・ボウマニー(Clostridium bowmanii)、クロストリジウム・フリジディカルミス(Clostridium frigidicarmis)、クロストリジウム・ルミナンチム(Clostridium ruminantium)、クロストリジウム・エステルテティカム(Clostridium estertheticum)、クロストリジウム・ガシゲネス(Clostridium gasigenes)、クロストリジウム・パーフリンジェンス(Clostridium perfringens)又はボツリヌス菌、キューティバクテリウム属、例えば、キューティバクテリウム・アクネス及びブロコトリックス属(Brochothrix)、例えば、ブロコトリックス・サーモスファクタ(Brochothrix thermosphacta)及びそれらの組合せに属する細菌から選択される。

【0079】

より好ましくは、嫌気性菌の群に属する目的の微生物又は微生物の群は、クロストリジウム属又はキューティバクテリウム属及びそれらの組合せに属する細菌から、更により好ましくは、クロストリジウム・スポロゲネス及びキューティバクテリウム・アクネス及びそれらの組合せからなる群から選択される。

【0080】

別の実施形態では、目的の微生物又は微生物の群は、好気性中温性菌(AMB)の群に属する。好気性中温性菌は、中温性温度、すなわち、25℃から40℃の間で好気性に増殖する細菌である。好気性中温性菌を検出すること及び数え上げることは、食品、化粧品、医療デバイス及び非滅菌医薬製剤の品質制御のための重要な指標である。

【0081】

好気性中温性菌の群に属する目的の微生物又は微生物の群は、好ましくは、メチロバクテリウム属(例えば、メチロバクテリウム・エキストロクエンス)、シュードモナス属(例えば、緑膿菌)、バチルス属(例えば、枯草菌、バチルス・セレウス(Bacillus cereus))、エシェリキア属(例えば、大腸菌)、スタフィロコッカス属(例えば、黄色ブドウ球菌)、アシネトバクター属(例えば、アシネトバクター・バウマンニ)、クロノバクター属(例えば、クロノバクター・サカザキ)、クレブシエラ属(例えば、肺炎桿菌)、サルモネラ属(例えば、ネズミチフス菌)、エンテロコッカス属(例えば、フェカリス菌)、リステリア属(例えば、リステリア・グレイ、リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes))、シゲラ属(例えば、ソンネ菌)、ビブリオ属(例えば、腸炎ビブリオ菌、コレラ菌(Vibrio cholerae)、ビブリオ・バルニフィカス(Vibrio vulnificus))、カンピロバクター属(Campylobacter)(例えば、カンピロバクター・ジェジュニ(Campylobacter jejuni)、カンピロバクター・コリ(Campylobacter coli))、エルシニア属(例えば、エルシニア・エンテロコリチカ)、コクリア属(例えば、コクリア・リゾフィラ)及びバークホルデリア属(例えば、セパシア菌)及びそれらの組合せに属する細菌から選択される。

【0082】

より好ましくは、好気性中温性菌の群に属する目的の微生物又は微生物の群は、メチロバクテリウム属、シュードモナス属、バチルス属、エシェリキア属、スタフィロコッカス属、アシネトバクター属、クロノバクター属、クレブシエラ属、サルモネラ属、エンテロコッカス属、リステリア属、シゲラ属、コクリア属、バークホルデリア属及びそれらの組合せに属する細菌から選択される。好気性中温性菌の群に属する目的の微生物又は微生物の群は、より好ましくは、メチロバクテリウム属、シュードモナス属、バチルス属、エシェリキア属、スタフィロコッカス属、アシネトバクター属、クロノバクター属、クレブシエラ属、サルモネラ属、エンテロコッカス属、シゲラ属、コクリア属、バークホルデリア属及びそれらの組合せに属する細菌から選択されうる。

【0083】

更により好ましくは、好気性中温性菌の群に属する目的の微生物又は微生物の群は、メチロバクテリウム・エキストロクエンス、緑膿菌、枯草菌、大腸菌、黄色ブドウ球菌、アシネトバクター・バウマンニ、クロノバクター・サカザキ、肺炎桿菌、ネズミチフス菌、フェカリス菌、リステリア・グレイ、ソンネ菌、コクリア・リゾフィラ及びセパシア菌及びそれらの組合せからなる群から選択される。好気性中温性菌の群に属する目的の微生物又は微生物の群は、更により好ましくは、メチロバクテリウム・エキストロクエンス、緑膿菌、枯草菌、大腸菌、黄色ブドウ球菌、アシネトバクター・バウマンニ、クロノバクター・サカザキ、肺炎桿菌、ネズミチフス菌、フェカリス菌、ソンネ菌、コクリア・リゾフィラ及びセパシア菌及びそれらの組合せからなる群から選択される。

【0084】

別の実施形態では、目的の微生物又は微生物の群は、グラム陰性菌又はグラム陽性菌の群に属する。

【0085】

グラム陰性菌は、細胞質細胞内膜と細菌外膜の間に挟まれた薄いペプチドグリカン細胞壁から構成される細胞エンベロープを特徴とする。それらは、その外膜が、多数の抗生物質(ペニシリンを含む)、普通(内側の)細胞膜のペプチドグリカンに損傷を与えるであろう界面活性剤、及び自然免疫系の一部を形成する動物によって産生される抗菌酵素であるリゾチームからそれらを保護するので、重要な医療の挑戦である。更に、この膜の外葉は、これらの細菌が免疫細胞によって溶解されると、その脂質A成分が毒性反応を引き起こしうる複合リポ多糖類(LPS)を含む。それらは例えば、尿路感染のほとんどの症例に関与している。大腸菌は、最も一般的なグラム陰性病原体であるが、クレブシエラ属、クラミジア属(Chlamydia)、プロテウス属、シュードモナス属、エンテロバクター属、アシネトバクター属、セラチア属、ヘモフィルス属(Haemophilus)、エルシニア属及びサルモネラ属等の他のグラム陰性菌は、重要な重要性を有する。

【0086】

グラム陰性菌の群に属する目的の微生物又は微生物の群は、好ましくは、エシェリキア属(例えば、大腸菌)、クレブシエラ属(例えば、肺炎桿菌)、プロテウス属(例えば、プロテウス・ミラビリス)、クラミジア属(例えば、クラミジア・トラコマティス(Chlamydia trachomatis))、シュードモナス属(例えば、緑膿菌)、エンテロバクター属(例えば、エンテロバクター・フェカーリス(Enterobacter faecalis)及びエンテロバクター・エロゲネス)、アシネトバクター属(例えば、アシネトバクター・バウマンニ)、クロノバクター属(例えば、クロノバクター・サカザキ)、シゲラ属(例えば、ソンネ菌)、コクリア属(例えば、コクリア・リゾフィラ)、バークホルデリア属(例えば、セパシア菌)、セラチア属(例えば、セラチア・マルセセンス)、ヘモフィルス属(例えば、インフルエンザ菌)及びサルモネラ属(例えば、ネズミチフス菌)及びそれらの組合せに属する細菌から選択される。より好ましくは、グラム陰性菌の群に属する目的の微生物又は微生物の群は、エシェリキア属(例えば、大腸菌)、クレブシエラ属(例えば、肺炎桿菌)、プロテウス属(例えば、プロテウス・ミラビリス)、シュードモナス属(例えば、緑膿菌)、エンテロバクター属(例えば、エンテロバクター・フェカーリス及びエンテロバクター・エロゲネス)、アシネトバクター属(例えば、アシネトバクター・バウマンニ)、クロノバクター属(例えば、クロノバクター・サカザキ)、シゲラ属(例えば、ソンネ菌)、コクリア属(例えば、コクリア・リゾフィラ)、バークホルデリア属(例えば、セパシア菌)、セラチア属(例えば、セラチア・マルセセンス)及びサルモネラ属(例えば、ネズミチフス菌)及びそれらの組合せに属する細菌から選択され、特に、大腸菌、肺炎桿菌、プロテウス・ミラビリス、緑膿菌、エンテロバクター・エロゲネス、アシネトバクター・バウマンニ、クロノバクター・サカザキ、ソンネ菌、コクリア・リゾフィラ、セパシア菌、セラチア・マルセセンス及びネズミチフス菌から選択される。

【0087】

より詳しくは、グラム陰性菌の群に属する目的の微生物又は微生物の群は、エシェリキア属、プロテウス属及びシュードモナス属の細菌及びそれらの組合せから、より好ましくは、大腸菌、プロテウス・ミラビリス、緑膿菌及びそれらの組合せから選択されうる。更により詳しくは、グラム陰性菌の群に属する目的の微生物又は微生物の群は、エシェリキア属及びシュードモナス属の細菌及びそれらの組合せから、より好ましくは、大腸菌、緑膿菌及びそれらの組合せから、更により好ましくは、大腸菌細菌から選択されうる。

【0088】

特に、グラム陰性菌の群に属する目的の微生物又は微生物の群は、例えば、エシェリキア属、クレブシエラ属、エンテロバクター属及びサルモネラ属及びそれらの組合せ、より詳しくは、大腸菌、肺炎桿菌、エンテロバクター・エロゲネス及びネズミチフス菌及びそれらの組合せを含む腸内細菌科に属する場合がある。

【0089】

グラム陽性菌はまた、臨床的に関連している。特に、細菌性UTIにおいて単離されるグラム陽性菌の中で、スタフィロコッカス・サプロフィティカス(Staphylococcus saprophyticus)、黄色ブドウ球菌、フェカリス菌及びストレプトコッカス・アガラクティエ(Streptococcus agalactiae)が最も一般的なグラム陽性病原菌である。

【0090】

グラム陽性菌の群に属する目的の微生物又は微生物の群は、好ましくは、スタフィロコッカス属、エンテロコッカス属、ストレプトコッカス属及びそれらの組合せに属する細菌から選択される。より詳しくは、グラム陽性菌の群に属する目的の微生物又は微生物の群は、黄色ブドウ球菌及びフェカリス菌及びそれらの組合せから選択されうる。

【0091】

別の実施形態では、目的の微生物又は微生物の群は、従属栄養細菌、特に、通常製薬用水システム、つまり水道水(又は飲料水)、精製水、WFI(注射用水)から回収可能な従属栄養細菌の群に属する(例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Tim Sandle, September 2015. SOJ Microbiology & Infectious Diseases 3(2):1-8を参照されたい)。実際、水は製薬工業の重要な部分である。水は、他の使用の中でも、洗浄のために、水性無菌及び非無菌製剤の成分として、手の洗浄のために、オートクレーブへの蒸気供給として使用される。医薬製造におけるその重要性のために、水の微生物管理は非常に重要である。水は常に存在するため、各等級の製薬用水は、特に、適切に管理されていない場合には微生物汚染の潜在的な供給源である。医薬品には、3種類の水が存在する:a)水道水(又は飲料水)、b)精製水、c)WFI(注射用水)。これらの各々は、異なる等級のものであり、リストの下にいくほど微生物管理の見込みが増大する(すなわち、水道水に対するものよりもより厳しい制限が注射用水に適用される)。水道水は公益事業会社によって供給され、「飲用水」(飲料水)品質のものである。水システムのモニタリングからの結果は、所定のアラート及び作用レベルに対する従属栄養性微生物数から評価される。

【0092】

従属栄養細菌の群に属する目的の微生物又は微生物の群は、好ましくは、アシネトバクター属(例えば、アシネトバクター・バウマニー)、エロモナス属(例えば、エロモナス・ハイドロフィラ)、ブレブンディモナス属(例えば、ブレブンディモナス・ディミヌタ)、バークホルデリア属(例えば、セパシア菌)、シトロバクター属(例えば、シトロバクター・フロインディー)、エドワージエラ属(例えば、エドワージエラ・タルダ)、エンテロバクター属(例えば、エンテロバクター・エロゲネス)、エシェリキア属(例えば、大腸菌)、オクロバクテリウム属(例えば、オクロバクテリウム・アンスロピック)、クレブシエラ属(例えば、肺炎桿菌)、メチロバクテリウム属(例えば、メチロバクテリウム・エキストロクエンス)、モラクセラ属(例えば、モラクセラ・オスロエンシス)、パンテア属(例えば、パンテア・アグロメランス)、プロテウス属(例えば、プロテウス・ミラビリス)、シュードモナス属(例えば、緑膿菌、シュードモナス・フルオレッセンス)、ラルストニア属(例えば、ラルストニア・ピッケティ)、サルモネラ属(例えば、ネズミチフス菌)、セラチア属(例えば、セラチア・マルセセンス)、シゲラ属(例えば、ソンネ菌)、スフィンゴモナス属(例えば、スフィンゴモナス・パウシモビリス)、ステノトロホモナス属(例えば、ステノトロホモナス・マルトフィリア)、ビブリオ属(例えば、腸炎ビブリオ菌)、エルシニア属(例えば、エルシニア・エンテロコリチカ)、バチルス属(例えば、枯草菌)、エンテロコッカス属(例えば、フェカリス菌)、ミクロコッカス属(例えば、ルテウス菌(コクリア・リゾフィラ))、スタフィロコッカス属(例えば、黄色ブドウ球菌)及びそれらの組合せに属する細菌から選択される。より好ましくは、従属栄養細菌の群に属する目的の微生物又は微生物の群は、アシネトバクター属(例えば、アシネトバクター・バウマニー)、エロモナス属(例えば、エロモナス・ハイドロフィラ)、ブレブンディモナス属(例えば、ブレブンディモナス・ディミヌタ)、バークホルデリア属(例えば、セパシア菌)、シトロバクター属(例えば、シトロバクター・フロインディー)、エドワージエラ属(例えば、エドワージエラ・タルダ)、エンテロバクター属(例えば、エンテロバクター・エロゲネス)、エシェリキア属(例えば、大腸菌)、オクロバクテリウム属(例えば、オクロバクテリウム・アンスロピック)、クレブシエラ属(例えば、肺炎桿菌)、メチロバクテリウム属(例えば、メチロバクテリウム・エキストロクエンス)、モラクセラ属(例えば、モラクセラ・オスロエンシス)、パンテア属(例えば、パンテア・アグロメランス)、プロテウス属(例えば、プロテウス・ミラビリス)、シュードモナス属(例えば、緑膿菌、シュードモナス・フルオレッセンス)、ラルストニア属(例えば、ラルストニア・ピッケティ)、サルモネラ属(例えば、ネズミチフス菌)、セラチア属(例えば、セラチア・マルセセンス)、シゲラ属(例えば、ソンネ菌)、スフィンゴモナス属(例えば、スフィンゴモナス・パウシモビリス)、ステノトロホモナス属(例えば、ステノトロホモナス・マルトフィリア)、エルシニア属(例えば、エルシニア・エンテロコリチカ)、バチルス属(例えば、枯草菌)、エンテロコッカス属(例えば、フェカリス菌)、ミクロコッカス属(例えば、ルテウス菌(コクリア・リゾフィラ))、スタフィロコッカス属(例えば、黄色ブドウ球菌)及びそれらの組合せに属する細菌から選択される。

【0093】

より詳しくは、従属栄養細菌の群に属する目的の微生物又は微生物の群は、好ましくは、アシネトバクター・バウマニー、エロモナス・ハイドロフィラ、ブレブンディモナス・ディミヌタ、セパシア菌、シトロバクター・フロインディー、エドワージエラ・タルダ、エンテロバクター・エロゲネス、大腸菌、オクロバクテリウム・アンスロピック、肺炎桿菌、メチロバクテリウム・エキストロクエンス、モラクセラ・オスロエンシス、パンテア・アグロメランス、プロテウス・ミラビリス、緑膿菌、シュードモナス・フルオレッセンス、ラルストニア・ピッケティ、ネズミチフス菌、セラチア・マルセセンス、ソンネ菌、スフィンゴモナス・パウシモビリス、ステノトロホモナス・マルトフィリア、腸炎ビブリオ菌、エルシニア・エンテロコリチカ、枯草菌、フェカリス菌、ルテウス菌(コクリア・リゾフィラ)、黄色ブドウ球菌及びそれらの組合せから選択される。更により詳しくは、従属栄養細菌の群に属する目的の微生物又は微生物の群は、アシネトバクター・バウマニー、エロモナス・ハイドロフィラ、ブレブンディモナス・ディミヌタ、セパシア菌、シトロバクター・フロインディー、エドワージエラ・タルダ、エンテロバクター・エロゲネス、大腸菌、オクロバクテリウム・アンスロピック、肺炎桿菌、メチロバクテリウム・エキストロクエンス、モラクセラ・オスロエンシス、パンテア・アグロメランス、プロテウス・ミラビリス、緑膿菌、シュードモナス・フルオレッセンス、ラルストニア・ピッケティ、ネズミチフス菌、セラチア・マルセセンス、ソンネ菌、スフィンゴモナス・パウシモビリス、ステノトロホモナス・マルトフィリア、エルシニア・エンテロコリチカ、枯草菌、フェカリス菌、ルテウス菌(コクリア・リゾフィラ)、黄色ブドウ球菌及びそれらの組合せから選択されうる。

【0094】

特に、目的の微生物又は微生物の群は、アリシクロバチルス属(例えば、アリシクロバチルス・アシドテレストリス、アリシクロバチルス・アシドカルダリウス、アリシクロバチルス・アシディフィラス、アリシクロバチルス・シクロヘプタニカス、アリシクロバチルス・ヘスペリダム、アリシクロバチルス・ハーバリウス、アリシクロバチルス・コンタミナンス)、アセトバクター属(例えば、アセトバクター・アセチ)、グルコノアセトバクター属(例えば、グルコノアセトバクター・リクファシエンス)、グルコノバクター属(例えば、グルコノバクター・オキシダンス)、アサイア属(例えば、アサイア・サイアメンシス)、ラクトバチルス属(例えば、ラクトバチルス・カゼイ、ラクトバチルス・プランタルム)、ワイセラ属(例えば、ワイセラ・コンフューザ)、クロストリジウム属(例えば、クロストリジウム・スポロゲネス)、キューティバクテリウム属(例えば、キューティバクテリウム・アクネス)、メチロバクテリウム属(例えば、メチロバクテリウム・エキストロクエンス)、シュードモナス属(例えば、緑膿菌)、バチルス属(例えば、枯草菌)、エシェリキア属(例えば、大腸菌)、スタフィロコッカス属(例えば、黄色ブドウ球菌)、アシネトバクター属(例えば、アシネトバクター・バウマンニ)、クロノバクター属(例えば、クロノバクター・サカザキ)、クレブシエラ属(例えば、肺炎桿菌)、サルモネラ属(例えば、ネズミチフス菌)、エンテロコッカス属(例えば、フェカリス菌)、リステリア属(例えば、リステリア・グレイ)、シゲラ属(例えば、ソンネ菌)、ミクロコッカス属(コクリア属とも名付けられた)(例えば、ルテウス菌(コクリア・リゾフィラ))、バークホルデリア属(例えば、セパシア菌)、エロモナス属(例えば、エロモナス・ハイドロフィラ)、ブレブンディモナス属(例えば、ブレブンディモナス・ディミヌタ)、シトロバクター属(例えば、シトロバクター・フロインディー)、エドワージエラ属(例えば、エドワージエラ・タルダ)、エンテロバクター属(例えば、エンテロバクター・エロゲネス)、オクロバクテリウム属(例えば、オクロバクテリウム・アンスロピック)、モラクセラ属(例えば、モラクセラ・オスロエンシス)、パンテア属(例えば、パンテア・アグロメランス)、プロテウス属(例えば、プロテウス・ミラビリス)、ラルストニア属(例えば、ラルストニア・ピッケティ)、セラチア属(例えば、セラチア・マルセセンス)、スフィンゴモナス属(例えば、スフィンゴモナス・パウシモビリス)、ステノトロホモナス属(例えば、ステノトロホモナス・マルトフィリア)、ビブリオ属(例えば、腸炎ビブリオ菌)、エルシニア属(例えば、エルシニア・エンテロコリチカ)及びそれらの組合せに属する細菌からなる群から選択されうる。より詳しくは、目的の微生物又は微生物の群は、アリシクロバチルス属(例えば、アリシクロバチルス・アシドテレストリス、アリシクロバチルス・アシドカルダリウス、アリシクロバチルス・アシディフィラス、アリシクロバチルス・シクロヘプタニカス、アリシクロバチルス・ヘスペリダム、アリシクロバチルス・ハーバリウス、アリシクロバチルス・コンタミナンス)、アセトバクター属(例えば、アセトバクター・アセチ)、グルコノアセトバクター属(例えば、グルコノアセトバクター・リクファシエンス)、グルコノバクター属(例えば、グルコノバクター・オキシダンス)、アサイア属(例えば、アサイア・サイアメンシス)、ラクトバチルス属(例えば、ラクトバチルス・カゼイ、ラクトバチルス・プランタルム)、ワイセラ属(例えば、ワイセラ・コンフューザ)、クロストリジウム属(例えば、クロストリジウム・スポロゲネス)、キューティバクテリウム属(例えば、キューティバクテリウム・アクネス)、メチロバクテリウム属(例えば、メチロバクテリウム・エキストロクエンス)、シュードモナス属(例えば、緑膿菌)、バチルス属(例えば、枯草菌)、エシェリキア属(例えば、大腸菌)、スタフィロコッカス属(例えば、黄色ブドウ球菌)、アシネトバクター属(例えば、アシネトバクター・バウマンニ)、クロノバクター属(例えば、クロノバクター・サカザキ)、クレブシエラ属(例えば、肺炎桿菌)、サルモネラ属(例えば、ネズミチフス菌)、エンテロコッカス属(例えば、フェカリス菌)、シゲラ属(例えば、ソンネ菌)、ミクロコッカス属(コクリア属とも名付けられた)(例えば、ルテウス菌(コクリア・リゾフィラ))、バークホルデリア属(例えば、セパシア菌)、エロモナス属(例えば、エロモナス・ハイドロフィラ)、ブレブンディモナス属(例えば、ブレブンディモナス・ディミヌタ)、シトロバクター属(例えば、シトロバクター・フロインディー)、エドワージエラ属(例えば、エドワージエラ・タルダ)、エンテロバクター属(例えば、エンテロバクター・エロゲネス)、オクロバクテリウム属(例えば、オクロバクテリウム・アンスロピック)、モラクセラ属(例えば、モラクセラ・オスロエンシス)、パンテア属(例えば、パンテア・アグロメランス)、プロテウス属(例えば、プロテウス・ミラビリス)、ラルストニア属(例えば、ラルストニア・ピッケティ)、セラチア属(例えば、セラチア・マルセセンス)、スフィンゴモナス属(例えば、スフィンゴモナス・パウシモビリス)、ステノトロホモナス属(例えば、ステノトロホモナス・マルトフィリア)、エルシニア属(例えば、エルシニア・エンテロコリチカ)及びそれらの組合せに属する細菌からなる群から選択されうる。

【0095】

より詳しくは、目的の微生物又は微生物の群は、アリシクロバチルス・アシドテレストリス、アリシクロバチルス・アシドカルダリウス、アリシクロバチルス・アシディフィラス、アリシクロバチルス・シクロヘプタニカス、アリシクロバチルス・ヘスペリダム、アリシクロバチルス・ハーバリウス、アリシクロバチルス・コンタミナンス、アセトバクター・アセチ、グルコノアセトバクター・リクファシエンス、グルコノバクター・オキシダンス、アサイア・サイアメンシス、ラクトバチルス・カゼイ、ラクトバチルス・プランタルム、ワイセラ・コンフューザ、クロストリジウム・スポロゲネス、キューティバクテリウム・アクネス、メチロバクテリウム・エキストロクエンス、緑膿菌、枯草菌、大腸菌、黄色ブドウ球菌、アシネトバクター・バウマンニ、クロノバクター・サカザキ、肺炎桿菌、ネズミチフス菌、フェカリス菌、リステリア・グレイ、ソンネ菌、コクリア・リゾフィラ及びセパシア菌、エロモナス・ハイドロフィラ、ブレブンディモナス・ディミヌタ、シトロバクター・フロインディー、エドワージエラ・タルダ、エンテロバクター・エロゲネス、オクロバクテリウム・アンスロピック、モラクセラ・オスロエンシス、パンテア・アグロメランス、プロテウス・ミラビリス、ラルストニア・ピッケティ、セラチア・マルセセンス、スフィンゴモナス・パウシモビリス、ステノトロホモナス・マルトフィリア、腸炎ビブリオ菌、エルシニア・エンテロコリチカ及びそれらの組合せからなる群から選択されうる。更により詳しくは、目的の微生物又は微生物の群は、アリシクロバチルス・アシドテレストリス、アリシクロバチルス・アシドカルダリウス、アリシクロバチルス・アシディフィラス、アリシクロバチルス・シクロヘプタニカス、アリシクロバチルス・ヘスペリダム、アリシクロバチルス・ハーバリウス、アリシクロバチルス・コンタミナンス、アセトバクター・アセチ、グルコノアセトバクター・リクファシエンス、グルコノバクター・オキシダンス、アサイア・サイアメンシス、ラクトバチルス・カゼイ、ラクトバチルス・プランタルム、ワイセラ・コンフューザ、クロストリジウム・スポロゲネス、キューティバクテリウム・アクネス、メチロバクテリウム・エキストロクエンス、緑膿菌、枯草菌、大腸菌、黄色ブドウ球菌、アシネトバクター・バウマンニ、クロノバクター・サカザキ、肺炎桿菌、ネズミチフス菌、フェカリス菌、ソンネ菌、コクリア・リゾフィラ及びセパシア菌、エロモナス・ハイドロフィラ、ブレブンディモナス・ディミヌタ、シトロバクター・フロインディー、エドワージエラ・タルダ、エンテロバクター・エロゲネス、オクロバクテリウム・アンスロピック、モラクセラ・オスロエンシス、パンテア・アグロメランス、プロテウス・ミラビリス、ラルストニア・ピッケティ、セラチア・マルセセンス、スフィンゴモナス・パウシモビリス、ステノトロホモナス・マルトフィリア、エルシニア・エンテロコリチカ及びそれらの組合せからなる群から選択されうる。

【0096】

或いは、目的の微生物又は微生物の群は、アリシクロバチルス属(例えば、アリシクロバチルス・アシドテレストリス、アリシクロバチルス・アシドカルダリウス、アリシクロバチルス・アシディフィラス、アリシクロバチルス・シクロヘプタニカス、アリシクロバチルス・ヘスペリダム、アリシクロバチルス・ハーバリウス、アリシクロバチルス・コンタミナンス)、アセトバクター属(例えば、アセトバクター・アセチ)、グルコノアセトバクター属(例えば、グルコノアセトバクター・リクファシエンス)、グルコノバクター属(例えば、グルコノバクター・オキシダンス)、アサイア属(例えば、アサイア・サイアメンシス)、ラクトバチルス属(例えば、ラクトバチルス・カゼイ、ラクトバチルス・プランタルム)、ワイセラ属(例えば、ワイセラ・コンフューザ)、クロストリジウム属(例えば、クロストリジウム・スポロゲネス)、キューティバクテリウム属(例えば、キューティバクテリウム・アクネス)、メチロバクテリウム属(例えば、メチロバクテリウム・エキストロクエンス)、シュードモナス属(例えば、緑膿菌)、バチルス属(例えば、枯草菌)、エシェリキア属(例えば、大腸菌)、スタフィロコッカス属(例えば、黄色ブドウ球菌)、アシネトバクター属(例えば、アシネトバクター・バウマンニ)、クロノバクター属(例えば、クロノバクター・サカザキ)、クレブシエラ属(例えば、肺炎桿菌)、サルモネラ属(例えば、ネズミチフス菌)、エンテロコッカス属(例えば、フェカリス菌)、リステリア属(例えば、リステリア・グレイ)、シゲラ属(例えば、ソンネ菌)、コクリア属(例えば、コクリア・リゾフィラ)、バークホルデリア属(例えば、セパシア菌)及びそれらの組合せに属する細菌からなる群から選択されうる。目的の微生物又は微生物の群はまた、アリシクロバチルス属(例えば、アリシクロバチルス・アシドテレストリス、アリシクロバチルス・アシドカルダリウス、アリシクロバチルス・アシディフィラス、アリシクロバチルス・シクロヘプタニカス、アリシクロバチルス・ヘスペリダム、アリシクロバチルス・ハーバリウス、アリシクロバチルス・コンタミナンス)、アセトバクター属(例えば、アセトバクター・アセチ)、グルコノアセトバクター属(例えば、グルコノアセトバクター・リクファシエンス)、グルコノバクター属(例えば、グルコノバクター・オキシダンス)、アサイア属(例えば、アサイア・サイアメンシス)、ラクトバチルス属(例えば、ラクトバチルス・カゼイ、ラクトバチルス・プランタルム)、ワイセラ属(例えば、ワイセラ・コンフューザ)、クロストリジウム属(例えば、クロストリジウム・スポロゲネス)、キューティバクテリウム属(例えば、キューティバクテリウム・アクネス)、メチロバクテリウム属(例えば、メチロバクテリウム・エキストロクエンス)、シュードモナス属(例えば、緑膿菌)、バチルス属(例えば、枯草菌)、エシェリキア属(例えば、大腸菌)、スタフィロコッカス属(例えば、黄色ブドウ球菌)、アシネトバクター属(例えば、アシネトバクター・バウマンニ)、クロノバクター属(例えば、クロノバクター・サカザキ)、クレブシエラ属(例えば、肺炎桿菌)、サルモネラ属(例えば、ネズミチフス菌)、エンテロコッカス属(例えば、フェカリス菌)、シゲラ属(例えば、ソンネ菌)、コクリア属(例えば、コクリア・リゾフィラ)、バークホルデリア属(例えば、セパシア菌)及びそれらの組合せに属する細菌からなる群から選択されうる。より詳しくは、目的の微生物又は微生物の群は、アリシクロバチルス・アシドテレストリス、アリシクロバチルス・アシドカルダリウス、アリシクロバチルス・アシディフィラス、アリシクロバチルス・シクロヘプタニカス、アリシクロバチルス・ヘスペリダム、アリシクロバチルス・ハーバリウス、アリシクロバチルス・コンタミナンス、アセトバクター・アセチ、グルコノアセトバクター・リクファシエンス、グルコノバクター・オキシダンス、アサイア・サイアメンシス、ラクトバチルス・カゼイ、ラクトバチルス・プランタルム、ワイセラ・コンフューザ、クロストリジウム・スポロゲネス、キューティバクテリウム・アクネス、メチロバクテリウム・エキストロクエンス、緑膿菌、枯草菌、大腸菌、黄色ブドウ球菌、アシネトバクター・バウマンニ、クロノバクター・サカザキ、肺炎桿菌、ネズミチフス菌、フェカリス菌、リステリア・グレイ、ソンネ菌、コクリア・リゾフィラ及びセパシア菌及びそれらの組合せからなる群から選択されうる。目的の微生物又は微生物の群はまた、アリシクロバチルス・アシドテレストリス、アリシクロバチルス・アシドカルダリウス、アリシクロバチルス・アシディフィラス、アリシクロバチルス・シクロヘプタニカス、アリシクロバチルス・ヘスペリダム、アリシクロバチルス・ハーバリウス、アリシクロバチルス・コンタミナンス、アセトバクター・アセチ、グルコノアセトバクター・リクファシエンス、グルコノバクター・オキシダンス、アサイア・サイアメンシス、ラクトバチルス・カゼイ、ラクトバチルス・プランタルム、ワイセラ・コンフューザ、クロストリジウム・スポロゲネス、キューティバクテリウム・アクネス、メチロバクテリウム・エキストロクエンス、緑膿菌、枯草菌、大腸菌、黄色ブドウ球菌、アシネトバクター・バウマンニ、クロノバクター・サカザキ、肺炎桿菌、ネズミチフス菌、フェカリス菌、ソンネ菌、コクリア・リゾフィラ及びセパシア菌及びそれらの組合せからなる群から選択されうる。

【0097】

一部の他の実施形態では、目的の微生物又は微生物の群は、ミクロ菌、特に、酵母又はカビである。酵母及びカビは、食物、ワイン、飲料、化粧品又は医薬製剤等の種々の製品の劣化を引き起こしうる。特に、それらは事実上いつでもいかなる種類の食物にも侵入し、増殖することができ、それらは、収穫前の畑にある、保存の間の穀物、木の実、豆及び果実等の作物に侵入する。それらはまた、加工された食物、食物混合物上で増殖し、乳製品における、具体的には、チーズ等の発酵酪農食物及び低水分製品における重要な腐敗生物である。食物の5～10%が、真菌汚染のために無駄になり、処分されなければならないと推定されている。好ましくは、本発明の方法によって検出されるべき、又は数え上げられるべき真菌は、子嚢菌門(Ascomycota)に属する、より好ましくは、サッカロミケス綱(Saccharomycetes)又は不完全菌綱(Deuteromycetes)に属する。

【0098】

一実施形態では、目的の微生物又は微生物の群は、カンジダ属(例えば、カンジダ・アルビカンス)、ザイゴサッカロミセス属(例えば、ザイゴサッカロミセス・バイリー)、アスペルギルス属(例えば、アスペルギルス・ブラジリエンシス)、ゲオトリクム属(ゲオトリクム・カンディダム(Geotrichum candidum))、サッカロミセス属(例えば、サッカロミセス・セレビシエ)及びペニシリウム属(例えば、ペニシリウム・バリオティー、ペニシリウム・クリソゲナム)及びそれらの組合せに属する真菌からなる群から選択される。好ましくは、目的の微生物又は微生物の群は、カンジダ・アルビカンス、ザイゴサッカロミセス・バイリー、アスペルギルス・ブラジリエンシス、サッカロミセス・セレビシエ、ジオトリクム・カンディダム、ペニシリウム・バリオティー及びペニシリウム・クリソゲナム及びそれらの組合せからなる群から選択される。

【0099】

特に、目的の微生物又は微生物の群は、アリシクロバチルス属(例えば、アリシクロバチルス・アシドテレストリス、アリシクロバチルス・アシドカルダリウス、アリシクロバチルス・アシディフィラス、アリシクロバチルス・シクロヘプタニカス、アリシクロバチルス・ヘスペリダム、アリシクロバチルス・ハーバリウス、アリシクロバチルス・コンタミナンス)、アセトバクター属(例えば、アセトバクター・アセチ)、グルコノアセトバクター属(例えば、グルコノアセトバクター・リクファシエンス)、グルコノバクター属(例えば、グルコノバクター・オキシダンス)、アサイア属(例えば、アサイア・サイアメンシス)、ラクトバチルス属(例えば、ラクトバチルス・カゼイ、ラクトバチルス・プランタルム)、ワイセラ属(例えば、ワイセラ・コンフューザ)、クロストリジウム属(例えば、クロストリジウム・スポロゲネス)、キューティバクテリウム属(例えば、キューティバクテリウム・アクネス)、メチロバクテリウム属(例えば、メチロバクテリウム・エキストロクエンス)、シュードモナス属(例えば、緑膿菌)、バチルス属(例えば、枯草菌)、エシェリキア属(例えば、大腸菌)、スタフィロコッカス属(例えば、黄色ブドウ球菌)、アシネトバクター属(例えば、アシネトバクター・バウマンニ)、クロノバクター属(例えば、クロノバクター・サカザキ)、クレブシエラ属(例えば、肺炎桿菌)、サルモネラ属(例えば、ネズミチフス菌)、エンテロコッカス属(例えば、フェカリス菌)、リステリア属(例えば、リステリア・グレイ)、シゲラ属(例えば、ソンネ菌)、コクリア属(例えば、コクリア・リゾフィラ)、バークホルデリア属(例えば、セパシア菌)、エロモナス属(例えば、エロモナス・ハイドロフィラ)、ブレブンディモナス属(例えば、ブレブンディモナス・ディミヌタ)、シトロバクター属(例えば、シトロバクター・フロインディー)、エドワージエラ属(例えば、エドワージエラ・タルダ)、エンテロバクター属(例えば、エンテロバクター・エロゲネス)、オクロバクテリウム属(例えば、オクロバクテリウム・アンスロピック)、モラクセラ属(例えば、モラクセラ・オスロエンシス)、パンテア属(例えば、パンテア・アグロメランス)、プロテウス属(例えば、プロテウス・ミラビリス)、ラルストニア属(例えば、ラルストニア・ピッケティ)、セラチア属(例えば、セラチア・マルセセンス)、スフィンゴモナス属(例えば、スフィンゴモナス・パウシモビリス)、ステノトロホモナス属(例えば、ステノトロホモナス・マルトフィリア)、ビブリオ属(例えば、腸炎ビブリオ菌)、エルシニア属(例えば、エルシニア・エンテロコリチカ)に属する細菌、並びにカンジダ属(例えば、カンジダ・アルビカンス)、ザイゴサッカロミセス属(例えば、ザイゴサッカロミセス・バイリー)、アスペルギルス属(例えば、アスペルギルス・ブラジリエンシス)、ゲオトリクム属(ゲオトリクム・カンディダム)、サッカロミセス属(例えば、サッカロミセス・セレビシエ)及びペニシリウム属(例えば、ペニシリウム・バリオティー、ペニシリウム・クリソゲナム)及びそれらの組合せに属する真菌からなる群から選択されうる。目的の微生物又は微生物の群はまた、アリシクロバチルス属(例えば、アリシクロバチルス・アシドテレストリス、アリシクロバチルス・アシドカルダリウス、アリシクロバチルス・アシディフィラス、アリシクロバチルス・シクロヘプタニカス、アリシクロバチルス・ヘスペリダム、アリシクロバチルス・ハーバリウス、アリシクロバチルス・コンタミナンス)、アセトバクター属(例えば、アセトバクター・アセチ)、グルコノアセトバクター属(例えば、グルコノアセトバクター・リクファシエンス)、グルコノバクター属(例えば、グルコノバクター・オキシダンス)、アサイア属(例えば、アサイア・サイアメンシス)、ラクトバチルス属(例えば、ラクトバチルス・カゼイ、ラクトバチルス・プランタルム)、ワイセラ属(例えば、ワイセラ・コンフューザ)、クロストリジウム属(例えば、クロストリジウム・スポロゲネス)、キューティバクテリウム属(例えば、キューティバクテリウム・アクネス)、メチロバクテリウム属(例えば、メチロバクテリウム・エキストロクエンス)、シュードモナス属(例えば、緑膿菌)、バチルス属(例えば、枯草菌)、エシェリキア属(例えば、大腸菌)、スタフィロコッカス属(例えば、黄色ブドウ球菌)、アシネトバクター属(例えば、アシネトバクター・バウマンニ)、クロノバクター属(例えば、クロノバクター・サカザキ)、クレブシエラ属(例えば、肺炎桿菌)、サルモネラ属(例えば、ネズミチフス菌)、エンテロコッカス属(例えば、フェカリス菌)、シゲラ属(例えば、ソンネ菌)、コクリア属(例えば、コクリア・リゾフィラ)、バークホルデリア属(例えば、セパシア菌)、エロモナス属(例えば、エロモナス・ハイドロフィラ)、ブレブンディモナス属(例えば、ブレブンディモナス・ディミヌタ)、シトロバクター属(例えば、シトロバクター・フロインディー)、エドワージエラ属(例えば、エドワージエラ・タルダ)、エンテロバクター属(例えば、エンテロバクター・エロゲネス)、オクロバクテリウム属(例えば、オクロバクテリウム・アンスロピック)、モラクセラ属(例えば、モラクセラ・オスロエンシス)、パンテア属(例えば、パンテア・アグロメランス)、プロテウス属(例えば、プロテウス・ミラビリス)、ラルストニア属(例えば、ラルストニア・ピッケティ)、セラチア属(例えば、セラチア・マルセセンス)、スフィンゴモナス属(例えば、スフィンゴモナス・パウシモビリス)、ステノトロホモナス属(例えば、ステノトロホモナス・マルトフィリア)、エルシニア属(例えば、エルシニア・エンテロコリチカ)に属する細菌、並びにカンジダ属(例えば、カンジダ・アルビカンス)、ザイゴサッカロミセス属(例えば、ザイゴサッカロミセス・バイリー)、アスペルギルス属(例えば、アスペルギルス・ブラジリエンシス)、ゲオトリクム属(ゲオトリクム・カンディダム)、サッカロミセス属(例えば、サッカロミセス・セレビシエ)及びペニシリウム属(例えば、ペニシリウム・バリオティー、ペニシリウム・クリソゲナム)及びそれらの組合せに属する真菌からなる群から選択されうる。

【0100】

より詳しくは、目的の微生物又は微生物の群は、アリシクロバチルス・アシドテレストリス、アリシクロバチルス・アシドカルダリウス、アリシクロバチルス・アシディフィラス、アリシクロバチルス・シクロヘプタニカス、アリシクロバチルス・ヘスペリダム、アリシクロバチルス・ハーバリウス、アリシクロバチルス・コンタミナンス、アセトバクター・アセチ、グルコノアセトバクター・リクファシエンス、グルコノバクター・オキシダンス、アサイア・サイアメンシス、ラクトバチルス・カゼイ、ラクトバチルス・プランタルム、ワイセラ・コンフューザ、クロストリジウム・スポロゲネス、キューティバクテリウム・アクネス、メチロバクテリウム・エキストロクエンス、緑膿菌、枯草菌、大腸菌、黄色ブドウ球菌、アシネトバクター・バウマンニ、クロノバクター・サカザキ、肺炎桿菌、ネズミチフス菌、フェカリス菌、リステリア・グレイ、ソンネ菌、コクリア・リゾフィラ、セパシア菌、エロモナス・ハイドロフィラ、ブレブンディモナス・ディミヌタ、シトロバクター・フロインディー、エドワージエラ・タルダ、エンテロバクター・エロゲネス、オクロバクテリウム・アンスロピック、モラクセラ・オスロエンシス、パンテア・アグロメランス、プロテウス・ミラビリス、ラルストニア・ピッケティ、セラチア・マルセセンス、スフィンゴモナス・パウシモビリス、ステノトロホモナス・マルトフィリア、腸炎ビブリオ菌、エルシニア・エンテロコリチカ、カンジダ・アルビカンス、ザイゴサッカロミセス・バイリー、アスペルギルス・ブラジリエンシス、サッカロミセス・セレビシエ、ジオトリクム・カンディダム、ペニシリウム・バリオティー及びペニシリウム・クリソゲナム及びそれらの組合せからなる群から選択されうる。目的の微生物又は微生物の群はまた、アリシクロバチルス・アシドテレストリス、アリシクロバチルス・アシドカルダリウス、アリシクロバチルス・アシディフィラス、アリシクロバチルス・シクロヘプタニカス、アリシクロバチルス・ヘスペリダム、アリシクロバチルス・ハーバリウス、アリシクロバチルス・コンタミナンス、アセトバクター・アセチ、グルコノアセトバクター・リクファシエンス、グルコノバクター・オキシダンス、アサイア・サイアメンシス、ラクトバチルス・カゼイ、ラクトバチルス・プランタルム、ワイセラ・コンフューザ、クロストリジウム・スポロゲネス、キューティバクテリウム・アクネス、メチロバクテリウム・エキストロクエンス、緑膿菌、枯草菌、大腸菌、黄色ブドウ球菌、アシネトバクター・バウマンニ、クロノバクター・サカザキ、肺炎桿菌、ネズミチフス菌、フェカリス菌、ソンネ菌、コクリア・リゾフィラ、セパシア菌、エロモナス・ハイドロフィラ、ブレブンディモナス・ディミヌタ、シトロバクター・フロインディー、エドワージエラ・タルダ、エンテロバクター・エロゲネス、オクロバクテリウム・アンスロピック、モラクセラ・オスロエンシス、パンテア・アグロメランス、プロテウス・ミラビリス、ラルストニア・ピッケティ、セラチア・マルセセンス、スフィンゴモナス・パウシモビリス、ステノトロホモナス・マルトフィリア、エルシニア・エンテロコリチカ、カンジダ・アルビカンス、ザイゴサッカロミセス・バイリー、アスペルギルス・ブラジリエンシス、サッカロミセス・セレビシエ、ジオトリクム・カンディダム、ペニシリウム・バリオティー及びペニシリウム・クリソゲナム及びそれらの組合せからなる群から選択されうる。

【0101】

或いは、目的の微生物又は微生物の群は、アリシクロバチルス属(例えば、アリシクロバチルス・アシドテレストリス、アリシクロバチルス・アシドカルダリウス、アリシクロバチルス・アシディフィラス、アリシクロバチルス・シクロヘプタニカス、アリシクロバチルス・ヘスペリダム、アリシクロバチルス・ハーバリウス、アリシクロバチルス・コンタミナンス)、アセトバクター属(例えば、アセトバクター・アセチ)、グルコノアセトバクター属(例えば、グルコノアセトバクター・リクファシエンス)、グルコノバクター属(例えば、グルコノバクター・オキシダンス)、アサイア属(例えば、アサイア・サイアメンシス)、ラクトバチルス属(例えば、ラクトバチルス・カゼイ、ラクトバチルス・プランタルム)、ワイセラ属(例えば、ワイセラ・コンフューザ)、クロストリジウム属(例えば、クロストリジウム・スポロゲネス)、キューティバクテリウム属(例えば、キューティバクテリウム・アクネス)、メチロバクテリウム属(例えば、メチロバクテリウム・エキストロクエンス)、シュードモナス属(例えば、緑膿菌)、バチルス属(例えば、枯草菌)、エシェリキア属(例えば、大腸菌)、スタフィロコッカス属(例えば、黄色ブドウ球菌)、アシネトバクター属(例えば、アシネトバクター・バウマンニ)、クロノバクター属(例えば、クロノバクター・サカザキ)、クレブシエラ属(例えば、肺炎桿菌)、サルモネラ属(例えば、ネズミチフス菌)、エンテロコッカス属(例えば、フェカリス菌)、リステリア属(例えば、リステリア・グレイ)、シゲラ属(例えば、ソンネ菌)、コクリア属(例えば、コクリア・リゾフィラ)、バークホルデリア属(例えば、セパシア菌)に属する細菌、並びにカンジダ属(例えば、カンジダ・アルビカンス)、ザイゴサッカロミセス属(例えば、ザイゴサッカロミセス・バイリー)、アスペルギルス属(例えば、アスペルギルス・ブラジリエンシス)、ゲオトリクム属(ゲオトリクム・カンディダム)、サッカロミセス属(例えば、サッカロミセス・セレビシエ)及びペニシリウム属(例えば、ペニシリウム・バリオティー、ペニシリウム・クリソゲナム)及びそれらの組合せに属する真菌からなる群から選択されうる。目的の微生物又は微生物の群はまた、アリシクロバチルス属(例えば、アリシクロバチルス・アシドテレストリス、アリシクロバチルス・アシドカルダリウス、アリシクロバチルス・アシディフィラス、アリシクロバチルス・シクロヘプタニカス、アリシクロバチルス・ヘスペリダム、アリシクロバチルス・ハーバリウス、アリシクロバチルス・コンタミナンス)、アセトバクター属(例えば、アセトバクター・アセチ)、グルコノアセトバクター属(例えば、グルコノアセトバクター・リクファシエンス)、グルコノバクター属(例えば、グルコノバクター・オキシダンス)、アサイア属(例えば、アサイア・サイアメンシス)、ラクトバチルス属(例えば、ラクトバチルス・カゼイ、ラクトバチルス・プランタルム)、ワイセラ属(例えば、ワイセラ・コンフューザ)、クロストリジウム属(例えば、クロストリジウム・スポロゲネス)、キューティバクテリウム属(例えば、キューティバクテリウム・アクネス)、メチロバクテリウム属(例えば、メチロバクテリウム・エキストロクエンス)、シュードモナス属(例えば、緑膿菌)、バチルス属(例えば、枯草菌)、エシェリキア属(例えば、大腸菌)、スタフィロコッカス属(例えば、黄色ブドウ球菌)、アシネトバクター属(例えば、アシネトバクター・バウマンニ)、クロノバクター属(例えば、クロノバクター・サカザキ)、クレブシエラ属(例えば、肺炎桿菌)、サルモネラ属(例えば、ネズミチフス菌)、エンテロコッカス属(例えば、フェカリス菌)、シゲラ属(例えば、ソンネ菌)、コクリア属(例えば、コクリア・リゾフィラ)、バークホルデリア属(例えば、セパシア菌)に属する細菌、並びにカンジダ属(例えば、カンジダ・アルビカンス)、ザイゴサッカロミセス属(例えば、ザイゴサッカロミセス・バイリー)、アスペルギルス属(例えば、アスペルギルス・ブラジリエンシス)、ゲオトリクム属(ゲオトリクム・カンディダム)、サッカロミセス属(例えば、サッカロミセス・セレビシエ)及びペニシリウム属(例えば、ペニシリウム・バリオティー、ペニシリウム・クリソゲナム)及びそれらの組合せに属する真菌からなる群から選択されうる。より詳しくは、目的の微生物又は微生物の群は、アリシクロバチルス・アシドテレストリス、アリシクロバチルス・アシドカルダリウス、アリシクロバチルス・アシディフィラス、アリシクロバチルス・シクロヘプタニカス、アリシクロバチルス・ヘスペリダム、アリシクロバチルス・ハーバリウス、アリシクロバチルス・コンタミナンス、アセトバクター・アセチ、グルコノアセトバクター・リクファシエンス、グルコノバクター・オキシダンス、アサイア・サイアメンシス、ラクトバチルス・カゼイ、ラクトバチルス・プランタルム、ワイセラ・コンフューザ、クロストリジウム・スポロゲネス、キューティバクテリウム・アクネス、メチロバクテリウム・エキストロクエンス、緑膿菌、枯草菌、大腸菌、黄色ブドウ球菌、アシネトバクター・バウマンニ、クロノバクター・サカザキ、肺炎桿菌、ネズミチフス菌、フェカリス菌、リステリア・グレイ、ソンネ菌、コクリア・リゾフィラ、セパシア菌、カンジダ・アルビカンス、ザイゴサッカロミセス・バイリー、アスペルギルス・ブラジリエンシス、サッカロミセス・セレビシエ、ジオトリクム・カンディダム、ペニシリウム・バリオティー及びペニシリウム・クリソゲナム及びそれらの組合せからなる群から選択されうる。目的の微生物又は微生物の群はまた、アリシクロバチルス・アシドテレストリス、アリシクロバチルス・アシドカルダリウス、アリシクロバチルス・アシディフィラス、アリシクロバチルス・シクロヘプタニカス、アリシクロバチルス・ヘスペリダム、アリシクロバチルス・ハーバリウス、アリシクロバチルス・コンタミナンス、アセトバクター・アセチ、グルコノアセトバクター・リクファシエンス、グルコノバクター・オキシダンス、アサイア・サイアメンシス、ラクトバチルス・カゼイ、ラクトバチルス・プランタルム、ワイセラ・コンフューザ、クロストリジウム・スポロゲネス、キューティバクテリウム・アクネス、メチロバクテリウム・エキストロクエンス、緑膿菌、枯草菌、大腸菌、黄色ブドウ球菌、アシネトバクター・バウマンニ、クロノバクター・サカザキ、肺炎桿菌、ネズミチフス菌、フェカリス菌、ソンネ菌、コクリア・リゾフィラ、セパシア菌、カンジダ・アルビカンス、ザイゴサッカロミセス・バイリー、アスペルギルス・ブラジリエンシス、サッカロミセス・セレビシエ、ジオトリクム・カンディダム、ペニシリウム・バリオティー及びペニシリウム・クリソゲナム及びそれらの組合せからなる群から選択されうる。

【0102】

好ましい実施形態では、本発明の方法は、目的の微生物の群を検出する又は数え上げるために使用される。
特に、微生物の群は、
- 上記で定義されるような好熱性好酸性菌(TAB)の群から選択される、すなわち、アリシクロバチルス属に属する2つ若しくはそれより多い微生物、好ましくは、アリシクロバチルス・アシドテレストリス、アリシクロバチルス・アシドカルダリウス、アリシクロバチルス・アシディフィラス、アリシクロバチルス・シクロヘプタニカス、アリシクロバチルス・ヘスペリダム、アリシクロバチルス・ハーバリウス及びアリシクロバチルス・コンタミナンス及びそれらの組合せからなる群から選択される2つ若しくはそれより多い微生物、又は
- 上記で定義されるような酢酸菌(AAB)の群から選択される、好ましくは、アセトバクター属、アシドモナス属、アサイア属、グルコンアセトバクター属、グルコノバクター属、アメヤマエア属、ボンベラ属、コメンサリバクター属、エンドバクター属、グラニュリバクター属、コマガタエイバクター属、コザキア属、ネオアサイア属、ネオコマガタエア属、ヌグエニバクター属、サッカリバクター属、スワミナタニア属、スウィングシア属及びタンチカロエニア属及びそれらの組合せに属する細菌から選択される、より好ましくは、アセトバクター属、グルコノバクター属、グルコンアセトバクター属及びアサイア属及びそれらの組合せに属する細菌から選択される、更により好ましくは、アセトバクター・アセチ、グルコノアセトバクター・リクファシエンス、グルコノバクター・オキシダンス及びアサイア・サイアメンシス及びそれらの組合せからなる群から選択される2つ若しくはそれより多い微生物、又は
- 上記で定義されるような乳酸菌(LAB)の群から選択される、好ましくは、ラクトバチルス属、ロイコノストック属、ペディオコッカス属、ラクトコッカス属、エンテロコッカス属、カルノバクテリウム属、ストレプトコッカス属及びワイセラ属及びそれらの組合せに属する細菌から選択される、より好ましくは、ラクトバチルス属及びワイセラ属及びそれらの組合せに属する細菌から選択される、更により好ましくは、ラクトバチルス・カゼイ、ラクトバチルス・プランタルム及びワイセラ・コンフューザ及びそれらの組合せからなる群から選択される2つ若しくはそれより多い微生物、又は
- 嫌気性菌の群から選択される、好ましくは、クロストリジウム属及びキューティバクテリウム属の細菌及びそれらの組合せから選択される、より好ましくは、クロストリジウム・スポロゲネス及びキューティバクテリウム・アクネス及びそれらの組合せからなる群から選択される2つ若しくはそれより多い微生物、又は
- 上記で定義されるような好気性中温性菌(AMB)の群から選択される、好ましくは、メチロバクテリウム属、シュードモナス属、バチルス属、エシェリキア属、スタフィロコッカス属、アシネトバクター属、クロノバクター属、クレブシエラ属、サルモネラ属、エンテロコッカス属、リステリア属、シゲラ属、コクリア属及びバークホルデリア属及びそれらの組合せに属する細菌から選択される、より好ましくは、メチロバクテリウム・エキストロクエンス、緑膿菌、枯草菌、大腸菌、黄色ブドウ球菌、アシネトバクター・バウマンニ、クロノバクター・サカザキ、肺炎桿菌、ネズミチフス菌、フェカリス菌、リステリア・グレイ、ソンネ菌、コクリア・リゾフィラ及びセパシア菌及びそれらの組合せからなる群から選択される、更により好ましくは、メチロバクテリウム・エキストロクエンス、緑膿菌、枯草菌、大腸菌、黄色ブドウ球菌、アシネトバクター・バウマンニ、クロノバクター・サカザキ、肺炎桿菌、ネズミチフス菌、フェカリス菌、ソンネ菌、コクリア・リゾフィラ及びセパシア菌及びそれらの組合せからなる群から選択される2つ若しくはそれより多い微生物、又は
- 上記で定義されるようなグラム陰性菌の群から選択される、好ましくは、エシェリキア属、プロテウス属及びシュードモナス属及びそれらの組合せに属する細菌から選択される、より好ましくは、大腸菌、プロテウス・ミラビリス及び緑膿菌及びそれらの組合せから選択される、更により好ましくは、エシェリキア属及びシュードモナス属及びそれらの組合せに属する細菌から選択される、特に、大腸菌及び緑膿菌及びそれらの組合せから選択される2つ若しくはそれより多い微生物、又は
- 上記で定義されるようなグラム陽性菌の群から選択される、好ましくは、スタフィロコッカス属、エンテロコッカス属、ストレプトコッカス属及びそれらの組合せに属する細菌から選択される、より好ましくは、黄色ブドウ球菌及びフェカリス菌及びそれらの組合せから選択される2つ若しくはそれより多い微生物、又は
- 上記で定義されるような従属栄養細菌の細菌の群から選択される、好ましくは、アシネトバクター属、エロモナス属、ブレブンディモナス属、バークホルデリア属、シトロバクター属、エドワージエラ属、エンテロバクター属、エシェリキア属、オクロバクテリウム属、クレブシエラ属、メチロバクテリウム属、モラクセラ属、パンテア属、プロテウス属、シュードモナス属、ラルストニア属、サルモネラ属、セラチア属、シゲラ属、スフィンゴモナス属、ステノトロホモナス属、ビブリオ属、エルシニア属、バチルス属、エンテロコッカス属、ミクロコッカス属、スタフィロコッカス属及びそれらの組合せに属する細菌から選択される、より好ましくは、アシネトバクター・バウマニー、エロモナス・ハイドロフィラ、ブレブンディモナス・ディミヌタ、セパシア菌、シトロバクター・フロインディー、エドワージエラ・タルダ、エンテロバクター・エロゲネス、大腸菌、オクロバクテリウム・アンスロピック、肺炎桿菌、メチロバクテリウム・エキストロクエンス、モラクセラ・オスロエンシス、パンテア・アグロメランス、プロテウス・ミラビリス、緑膿菌、シュードモナス・フルオレッセンス、ラルストニア・ピッケティ、ネズミチフス菌、セラチア・マルセセンス、ソンネ菌、スフィンゴモナス・パウシモビリス、ステノトロホモナス・マルトフィリア、腸炎ビブリオ菌、エルシニア・エンテロコリチカ、枯草菌、フェカリス菌、ルテウス菌(コクリア・リゾフィラ)、黄色ブドウ球菌及びそれらの組合せから選択される、更により好ましくは、アシネトバクター・バウマニー、エロモナス・ハイドロフィラ、ブレブンディモナス・ディミヌタ、セパシア菌、シトロバクター・フロインディー、エドワージエラ・タルダ、エンテロバクター・エロゲネス、大腸菌、オクロバクテリウム・アンスロピック、肺炎桿菌、メチロバクテリウム・エキストロクエンス、モラクセラ・オスロエンシス、パンテア・アグロメランス、プロテウス・ミラビリス、緑膿菌、シュードモナス・フルオレッセンス、ラルストニア・ピッケティ、ネズミチフス菌、セラチア・マルセセンス、ソンネ菌、スフィンゴモナス・パウシモビリス、ステノトロホモナス・マルトフィリア、エルシニア・エンテロコリチカ、枯草菌、フェカリス菌、ルテウス菌(コクリア・リゾフィラ)、黄色ブドウ球菌及びそれらの組合せから選択される2つ若しくはそれより多い微生物、又は
- 好熱性好酸性菌(TAB)、酢酸菌(AAB)、乳酸菌(LAB)、嫌気性菌、好気性中温性菌、グラム陰性菌及びグラム陽性菌、従属栄養細菌及びそれらの組合せの上記で定義されるような群から選択される、好ましくは、好熱性好酸性菌(TAB)、酢酸菌(AAB)、乳酸菌(LAB)、嫌気性菌、好気性中温性菌、グラム陰性菌及びグラム陽性菌及びそれらの組合せの上記で定義されるような群から選択される2つ若しくはそれより多い微生物、又は
- 上記で定義されるような酵母及びカビから選択される、好ましくは、カンジダ属、ザイゴサッカロミセス属、アスペルギルス属、サッカロミセス属、ゲオトリクム属及びペニシリウム属及びそれらの組合せに属する真菌から選択される、より好ましくは、カンジダ・アルビカンス、ザイゴサッカロミセス・バイリー、アスペルギルス・ブラジリエンシス、サッカロミセス・セレビシエ、ジオトリクム・カンディダム、ペニシリウム・バリオティー、ペニシリウム・クリソゲナム及びそれらの組合せからなる群から選択される2つ若しくはそれより多い微生物、又は
- 好熱性好酸性菌(TAB)、酢酸菌(AAB)、乳酸菌(LAB)、嫌気性菌、好気性中温性菌、グラム陰性菌及びグラム陽性菌、従属栄養細菌、酵母及びカビ及びそれらの組合せの上記で定義されるような群から選択される、好ましくは、好熱性好酸性菌(TAB)、酢酸菌(AAB)、乳酸菌(LAB)、嫌気性菌、好気性中温性菌、グラム陰性菌及びグラム陽性菌、酵母及びカビ及びそれらの組合せの上記で定義されるような群から選択される2つ若しくはそれより多い微生物
を含みうる。

【0103】

特に、本発明の方法によって検出されるべき、又は数え上げられるべき微生物の群は、
- 好ましくは、好熱性好酸性菌(TAB)、酢酸菌(AAB)、乳酸菌(LAB)、嫌気性菌、好気性中温性菌、グラム陰性菌及びグラム陽性菌、従属栄養細菌及びそれらの組合せの上記で定義されるような群から選択される1つ又はいくつかの細菌、並びに
- 好ましくは、上記で定義されるような酵母及びカビから選択される1つ又はいくつかのミクロ菌
を含みうる。

【0104】

好ましくは、本発明の方法によって検出されるべき、又は数え上げられるべき微生物の群は、
- 好ましくは、好熱性好酸性菌(TAB)、酢酸菌(AAB)、乳酸菌(LAB)、嫌気性菌、好気性中温性菌、グラム陰性菌及びグラム陽性菌及びそれらの組合せの上記で定義されるような群から選択される1つ又はいくつかの細菌、並びに
- 好ましくは、上記で定義されるような酵母及びカビから選択される1つ又はいくつかのミクロ菌
を含みうる。

【0105】

本発明の方法によって検出されるべき、又は数え上げられるべき微生物又は微生物の群は、試料の性質に応じて変わる場合がある。

【0106】

例えば:
- 果汁、果汁関連製品又はシロップから得られた試料は、好熱性好酸性菌を含有すると疑われる可能性がある、
- 真空包装食品又は缶詰食品から得られた試料は、嫌気性菌を含有すると疑われる可能性がある、
- 医薬品原材料から得られた試料は、特にバチルス属由来の中温性好気性細菌、特にクロストリジウム属由来の嫌気性菌、又はペニシリウム属及びアスペルギルス属の真菌等の真菌を含有すると疑われる可能性がある、
- 化粧品から得られた試料は、好気性中温性菌、特に緑膿菌、黄色ブドウ球菌、大腸菌及びバチルス種を含有すると疑われる可能性がある、並びに
- 医療デバイス又は尿(すなわち、UTI診断のための)から得られた試料は、グラム陰性菌、特に大腸菌、緑膿菌、アシネトバクター・バウマニー、プロテウス・ミラビリス又は肺炎桿菌又はグラム陽性菌、特に黄色ブドウ球菌又はフェカリス菌を含有すると疑われる可能性がある、並びに
- 製薬用水システムから得られた試料は、特に、アシネトバクター属、エロモナス属、ブレブンディモナス属、バークホルデリア属、シトロバクター属、エドワージエラ属、エンテロバクター属、エシェリキア属、オクロバクテリウム属、クレブシエラ属、メチロバクテリウム属、モラクセラ属、パンテア属、プロテウス属、シュードモナス属、ラルストニア属、サルモネラ属、セラチア属、シゲラ属、スフィンゴモナス属、ステノトロホモナス属、ビブリオ属、エルシニア属、バチルス属、エンテロコッカス属、ミクロコッカス属、スタフィロコッカス属及びそれらの組合せに属する細菌から選択される、好ましくは、アシネトバクター属、エロモナス属、ブレブンディモナス属、バークホルデリア属、シトロバクター属、エドワージエラ属、エンテロバクター属、エシェリキア属、オクロバクテリウム属、クレブシエラ属、メチロバクテリウム属、モラクセラ属、パンテア属、プロテウス属、シュードモナス属、ラルストニア属、サルモネラ属、セラチア属、シゲラ属、スフィンゴモナス属、ステノトロホモナス属、エルシニア属、バチルス属、エンテロコッカス属、ミクロコッカス属、スタフィロコッカス属及びそれらの組合せに属する細菌から選択される、より好ましくは、アシネトバクター・バウマニー、エロモナス・ハイドロフィラ、ブレブンディモナス・ディミヌタ、セパシア菌、シトロバクター・フロインディー、エドワージエラ・タルダ、エンテロバクター・エロゲネス、大腸菌、オクロバクテリウム・アンスロピック、肺炎桿菌、メチロバクテリウム・エキストロクエンス、モラクセラ・オスロエンシス、パンテア・アグロメランス、プロテウス・ミラビリス、緑膿菌、シュードモナス・フルオレッセンス、ラルストニア・ピッケティ、ネズミチフス菌、セラチア・マルセセンス、ソンネ菌、スフィンゴモナス・パウシモビリス、ステノトロホモナス・マルトフィリア、腸炎ビブリオ菌、エルシニア・エンテロコリチカ、枯草菌、フェカリス菌、ルテウス菌(コクリア・リゾフィラ)、黄色ブドウ球菌及びそれらの組合せから選択される、更により好ましくは、アシネトバクター・バウマニー、エロモナス・ハイドロフィラ、ブレブンディモナス・ディミヌタ、セパシア菌、シトロバクター・フロインディー、エドワージエラ・タルダ、エンテロバクター・エロゲネス、大腸菌、オクロバクテリウム・アンスロピック、肺炎桿菌、メチロバクテリウム・エキストロクエンス、モラクセラ・オスロエンシス、パンテア・アグロメランス、プロテウス・ミラビリス、緑膿菌、シュードモナス・フルオレッセンス、ラルストニア・ピッケティ、ネズミチフス菌、セラチア・マルセセンス、ソンネ菌、スフィンゴモナス・パウシモビリス、ステノトロホモナス・マルトフィリア、エルシニア・エンテロコリチカ、枯草菌、フェカリス菌、ルテウス菌(コクリア・リゾフィラ)、黄色ブドウ球菌及びそれらの組合せから選択される、上記で定義されるような従属栄養細菌を含有すると疑われる可能性がある。

【0107】

本発明の方法を使用できる各分野(例えば、医薬品、化粧品、食物及び飲料、環境分析、診断等)について、当業者は、どの微生物が試料中に含有されると疑われる可能性があるかを承知しており、したがって、本発明の方法をこれらの微生物に適応させることができる。

【0108】

増殖培地
本発明の方法の工程a)において、容器中で、試料を、目的の微生物又は微生物の群の増殖を支持するために栄養素を含有する固体増殖培地と接触させる。

【0109】

本明細書で使用される場合、「増殖培地」又は「培養培地」という用語は、本発明の状況内で微生物又は微生物の群の増殖のために使用される栄養素培地を指す。増殖培地は、個々の化学物質から合成され、そのため正確な分子組成が公知である定義された培地又は未知の割合の多数の化学種の混合物からなるいくつかの複合成分、例えば、酵母エキス又はカゼイン加水分解物を含む定義されていない培地でありうる。

【0110】

本発明の方法において使用される増殖培地は、非選択的増殖培地又は選択的増殖培地でありうる。非選択的増殖培地は、細菌増殖のための一般的な培地である、例えば、真菌増殖のためのトリプトンソイ寒天(TSA)、例えば、サブローデキストロース寒天(SDA)又は細菌及び真菌両方の増殖のための、例えば、Reasonerの2A寒天(R2A)。非選択的培地は通常、多種多様な微生物の増殖を支持するために必要な栄養素を含有する。選択的増殖培地は、選択された微生物のみの増殖のために使用される培地である。実際、選択的培地の組成は、ある特定の特性、例えば、抗生物質耐性又はある特定の代謝生成物、例えば、アミノ酸を合成する能力を有する細胞の増殖を確実にする。この培地は、したがって、試料中に存在する可能性がある非標的微生物を上回って、標的微生物の増殖に好都合である環境を提供する。

【0111】

「固体増殖培地」又は「固体培養培地」という表現は、本明細書で使用される場合、微生物がその表面に微小コロニーを形成することを可能にする増殖培地、例えば、ゲル様外観を有するか、又はゲルの形態である培地を指し、ゲルは、相互接続した粒子の多孔性ネットワークが液体培地の体積に広がり、栄養素が培地を通って拡散し、微生物にとって利用可能になるコロイド系である。好ましくは、固体増殖培地は、本明細書で使用される場合、液体増殖培地に十分な量のゲル化剤、例えば、寒天、アガロース、アルギネート、カラゲナン、セルロース、ゼラチン、ペクチン及びそれらの組合せを添加することによって調製される。通常、固体増殖培地は、ゲル化剤、好ましくは、寒天を0.5%～3%、好ましくは、1%～2.5%の濃度で含有する。好ましくは、本発明の方法において使用される固体増殖培地は、寒天増殖培地である。

【0112】

固体増殖培地は、容器中に注がれる。この容器(contained)は、微生物培養に適応した任意の無菌容器、特に、従来のペトリプレートでありうる。

【0113】

増殖培地の選択は本質的に、目的の微生物又は微生物の群に応じて変わる。しかし、この選択はまた、適用分野(例えば、医薬品、化粧品、食物及び飲料、環境分析、診断等)及びこの分野において使用される標準方法に応じて変わる場合がある。例証として、ノンアルコール性飲料から得られた試料から酵母、カビ、乳酸菌及び酢酸菌を同時に検出するために、IFU微生物学的方法(IFU Microbiological Method)2は、オレンジセラム寒天(OSA)培地を推奨している。他方、製薬工業では生物汚染度試験のために、R2A又はTSA培地が推奨されている。同様に、いくつかの適用は、特定の微生物又は特定の微生物の群のみを検出するための選択培地(例えば、グラム陰性菌によって引き起こされたUTIを診断するための尿試料の分析のためのマッコンキー寒天培地)を必要とし、一方で、他の適用、例えば、無菌性試験又は生物汚染度試験は通常、できるだけ多くの微生物を検出する、又は数え上げるために非選択培地を必要とする。もちろん、以下に説明されるように、条件及びインキュベーションの時間も、方法の選択性又は非選択性において役割を果たす。当業者ならば、これらのパラメータを容易に考慮して、適した増殖培地を選択できる。

【0114】

好熱性好酸性菌の増殖を支持するのに適した増殖培地の例として、それだけには限らないが、YSG(酵母-デンプン-グルコース)寒天(Matsubara et al. 2002, Int J Syst Evol Microbiol 52, 1681-1685)、PDA(ジャガイモデキストロース寒天;Pettipher et al. 1997, Lett Appl Microbiol 24, 185-189)、OSA(オレンジセラム寒天;Pettipher et al. 2000, Food Austr 57, 293-295)、K寒天(Walls et al. 1998, Dairy Food Environ Sanit 18, 499-503)、BAT(バチルス・アシドテレストリス)寒天が挙げられる。好ましくは、好熱性好酸性菌の増殖を支持するために使用される増殖培地は、IFU標準法番号12に従う好熱性好酸性菌の検出のために推奨される増殖培地である。

【0115】

乳酸菌の増殖を支持するのに適した増殖培地の例として、それだけには限らないが、Rogosa寒天(Rogosa et al. 1951, J Bacteriol 62, 132-133)、MRS (De Man、Rogosa及びSharpe)寒天培地(De Man et al. 1960, J Appl Bacteriol 23, 30-35)、乳酸桿菌(Lactobacilli)選択寒天(Mitsuoka, 1978, Intestinal Bacteria and Health. Tokyo, Harcourt Brace Jovanovich Japan)、LAMVAB(Hartemink et al. 1997, J Microbiol Methods 29, 77-84)、TSA-BCP及びPCA-BCP(Trypticase Soy Agar and Plate Count Agar with BromoCresol Purple; Lin et al. 2006, Food Microbiol 23, 74-81)又はRaka Ray寒天が挙げられる。好ましくは、乳酸菌の増殖を支持するために使用される増殖培地は、IFU標準法番号5に従う乳酸菌の検出のために推奨される増殖培地である。

【0116】

酵母又はカビの増殖を支持するのに適した増殖培地の例として、それだけには限らないが、YM(酵母エキス麦芽エキス)及びYMG(酵母エキス麦芽エキスグルコース)寒天培地(Wickerham, 1939 J. Tropical Med. Hyg., 42, 176)、OSA(オレンジセラム寒天)、PDA(ジャガイモデキストロース寒天)、トマトジュース寒天(MacFaddin J. F., 1985, Media for Isolation-Cultivation-Identification-Maintenance of Medical Bacteria, Vol. 1, Williams & Wilkins, Baltimore, Md)、MEA(麦芽エキス寒天)培地、グルコースペプトン寒天(Glathe et al., Zentralbl Bakteriol Parasitenkd Infektionskr Hyg. 1968;122(1):3-21)、Wallerstein栄養素寒天(Green and Gray. 1950. Wallerstein Lab. Commun. 12:43)、Wort寒天(Parfitt E. H. (1933) J. Dairy Sci. 16. 141-147)及びサブローデキストロース寒天(Sabouraud, R. (1892) Ann. Dermatol. Syphilol. 3:1061)が挙げられる。特に、YM及びYMG寒天培地は、ほとんどの細菌及び他の酸不耐性生物の増殖を阻止しながら、酵母、カビ又は他の酸耐性又は好酸性生物(すなわち、3～4の範囲のpHを有する酸性天然環境において増殖可能な)を培養するのに有用な低pHを有する選択増殖培地である。好ましくは、酵母又はカビの増殖を支持するために使用される増殖培地は、USP61標準、BS EN ISO 16212-2017標準又はIFU標準法番号3及び4に従う酵母又はカビの検出のために推奨される増殖培地である。

【0117】

酢酸菌の増殖を支持するのに適した増殖培地の例として、それだけには限らないが、YM(酵母エキス麦芽エキス)寒天培地、YMG(酵母エキス麦芽エキスグルコース)寒天培地、GYC(グルコース酵母エキス炭酸カルシウム、10%グルコース、1.0%酵母エキス、2.0%炭酸カルシウム、1.5%寒天、pH6.8)寒天培地、YPE(酵母エキス-ペプトン-エタノール)寒天培地、YPG(酵母エキスポリぺプトングリセロール)、YPM/YPS(酵母エキスポリぺプトンマンニトール又はソルビトール)寒天培地、YPGD(酵母エキスポリぺプトングルコース)寒天培地が挙げられる。

【0118】

好気性中温性菌の増殖を支持するのに適した増殖培地の例として、それだけには限らないが、TSA(トリプトンソイ寒天)培地、PCA(プレートカウント寒天)培地、R2A(Reasonerの2A寒天)培地、SCDA(ダイズカゼインダイジェスト寒天)、FTM(流体チオグリコール酸培地)寒天培地が挙げられる。特に、TSA及びPCA培地は、試料の生存細菌増殖を評価するためによく使用される非選択的増殖培地であり、R2A培地は、普通、飲料水に存在する細菌の増殖に適応した培養培地である。好ましくは、好気性中温性菌の増殖を支持するために使用される増殖培地は、USP61標準又はBS EN ISO 21149-2017標準に従う好気性中温性菌の検出のために推奨される増殖培地である。

【0119】

嫌気性菌の増殖を支持するのに適した増殖培地の例として、それだけには限らないが、任意選択で、脱繊維素化ヒツジ血液を補給した、TSA(トリプトンソイ寒天)培地、強化クロストリジアル寒天(Barnes et al. (1963) J. Appl. Bact. 26. 415-427)、嫌気性寒天(Brewer J. H., 1942, Science, 95:587)、コロンビア寒天(Ellner et al. Amer. J. Clin. Path.、29; 181-183 (1958))が挙げられる。一部の実施形態では、嫌気性菌の増殖を支持するために使用される増殖培地は、ISO 7937:2004又はISO 14189:2013標準に従う嫌気性菌の検出のために、特にクロストリジウム・パーフリンジェンスの検出のために推奨される増殖培地でありうる。

【0120】

グラム陽性菌の増殖を支持するのに適した増殖培地の例として、それだけには限らないが、MSA(マンニトール塩寒天)培地又はフェニルエチルアルコール寒天(Brewer and Lilley. 1949. December meeting of the Maryland Association of Medical and Public Health Laboratories)が挙げられる。

【0121】

グラム陰性菌の増殖を支持するのに適した増殖培地の例として、それだけには限らないが、マッコンキー寒天培地、ヘクトンエンテリック寒天(King and Metzger. 1968. Appl. Microbiol. 16:577-578)又はXLD(キシロース-リジン-デソキシコール酸)寒天(Taylor, 1965. Am. J. Clin. Pathol., 44:471-475)が挙げられる。特に、マッコンキー寒天培地は、胆汁酸塩及びクリスタルバイオレットを含有し、これらは、多数のグラム陽性菌の増殖に干渉し、グラム陰性菌、特に、腸内細菌科の増殖に好都合である。一部の実施形態では、グラム陰性菌の増殖を支持するために使用される増殖培地は、ISO 21528:2017標準に従う腸内細菌科に属するグラム陰性菌の検出のために推奨される増殖培地でありうる。

【0122】

細菌及び真菌の増殖を支持するのに適した増殖培地の例として、それだけには限らないが、Reasonerの2A寒天(R2A)、トリプトン酵母エキス寒天又はオレンジセラム寒天が挙げられる。好ましくは、すべての微生物(細菌、酵母及びカビ)の増殖を支持するために使用される増殖培地は、IFU標準法番号2又はISO 6222:1999標準に従う、培養可能な微生物(総カウント)を数え上げるために推奨される増殖培地である。

【0123】

任意選択で、培地の選択性を増大するために、抗生物質、pH指示薬、選択的増殖阻害剤等の1つ又はいくつかの追加の選択成分を培地に添加することができる。

【0124】

これらの増殖培地のすべてが当業者に周知であり、市販されているか又は容易に調製される。

【0125】

蛍光色素
本発明の方法の工程a)では、試料を、上記のような固体増殖培地とだけでなく、少なくとも1つの蛍光色素とも接触させる。

【0126】

本明細書で使用される場合、「蛍光色素」、「フルオロフォア」又は「フルオロクロム」という用語は、同義的に使用され、光励起の際に再発光できる化合物を指す。通常、フルオロフォアは、ある特定の波長範囲(励起スペクトル)の光を吸収し、より長い波長範囲(発光スペクトル)で再発光し、それぞれの励起及び発光最大を有する。この用語は、蛍光特性を示すために化学修飾を全く必要としない化合物を指す。特に、前記少なくとも1つの蛍光色素は、蛍光発生基質、すなわち、微生物の酵素又は酵素の群との反応後に蛍光物質を生成する基質ではない。更に、前記少なくとも1つの蛍光色素は、微生物又は微生物の群を特異的に認識できる機能的部分、例えば、抗体に連結されない。好ましくは、本発明の方法において使用される蛍光色素は、目的の微生物の増殖を制限しない、すなわち、目的の微生物の増殖は、蛍光色素の存在によって大きく影響を受けない。好ましくは、前記少なくとも1つの蛍光色素は、例えば、リポソーム又は脂質小胞中に被包されない。好ましくは、前記少なくとも1つの蛍光色素は、DNA及び/又はRNAインターカレート剤ではない。好ましくは、前記少なくとも1つの蛍光色素は、スルホローダミンB、ヘキスト色素、ローダミンB、ニュートラルレッド、ブロモチモールブルー、エオシン、メチレンブルー、アンホテリシンBでも、ナイルレッドでもない。

【0127】

本発明の方法では、試料は、1つ又はいくつかの蛍光色素と接触される場合がある。好ましくは、本方法において使用される各蛍光色素は、少なくとも1つの目的の微生物を染色できる。一部の実施形態では、いくつかの蛍光色素が使用され、各蛍光色素は、目的の微生物のうち1つ又はいくつかを染色でき、すべての目的の微生物は、これらの蛍光色素のうち少なくとも1つによって染色される。本発明の方法において使用される蛍光色素は、膜透過性蛍光色素であり、微生物の内側を染色する場合があり、又は微生物の外表面で吸着されるだけである場合がある。

【0128】

当業者は、検出されるべき微生物又は微生物の群に応じて1つ又はいくつかの蛍光色素を選択できる。

【0129】

特に、当業者は、実験の節に記載されるような目的の微生物を染色する蛍光色素の能力を評価できる。手短には、前記微生物の培養物は0.45μmのメンブレンフィルター、例えば、MCE又はPVDFメンブレン上で濾過され、前記濾過メンブレンは、前記微生物の増殖を支持するのに適した固体増殖培地上の試験されるべき蛍光色素の液滴上に堆積される。前記培地は、前記微生物の微小コロニーを形成するのに十分な条件下、及び時間の間インキュベートされる。蛍光シグナルを発する微小コロニーの検出は、前記微生物を検出するために蛍光色素を本発明の方法において使用できることを示す。微生物の群が検出されなければならない場合には、当業者は、すべての目的の微生物の検出を可能にする適した組合せを決定するまで、同一又は異なる蛍光色素を用いて、この群の各微生物についてこのアッセイを反復してもよい。

【0130】

一実施形態では、試料は、アクリジン色素、例えば、アクリジンオレンジ、アントラセンベースの色素、例えば、アントラキノン色素、クマリンベースの色素、シアニンベースの色素、例えば、シアニン、インドカルボシアニン、オキサカルボシアニン、チアカルボシアニン及びメロシアニン色素、ジピロメテンベースの色素、ナフタレンベースの色素、ピレンベースの色素、キサンテンベースの色素、例えば、フルオレセイン色素、エオシン色素、ローダミン色素及びカーボピロニン色素、スクアラインベースの色素、スクアラインロタキサンベースの色素及び4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)及びそれらの組合せからなる群から選択される少なくとも1つの蛍光色素と接触される。好ましくは、試料は、アントラセンベースの色素、例えば、アントラキノン色素、クマリンベースの色素、シアニンベースの色素、例えば、シアニン、インドカルボシアニン、オキサカルボシアニン、チアカルボシアニン及びメロシアニン色素、ジピロメテンベースの色素、ナフタレンベースの色素、ピレンベースの色素、キサンテンベースの色素、例えば、フルオレセイン色素、エオシン色素、ローダミン色素及びカーボピロニン色素、スクアラインベースの色素、スクアラインロタキサンベースの色素及び4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)及びそれらの組合せからなる群から選択される少なくとも1つの蛍光色素と接触される。

【0131】

特に、前記少なくとも1つの蛍光色素は、
- アクリジン色素、特に、アクリジンオレンジ、
- アントラセンベースの色素、特に、DRAQ5(商標)(例えば、1,5-ビス(2-(ジ-メチルアミノ)エチルアミノ)-4,8-ジヒドロキシアントラセン-9,10-ジオン)、CyTRAK Orange(商標)(Edward, R. (2009) Mol. Cells 27(4): 391-396;CAS登録番号1195771-25-5)及びそれらの誘導体、
- クマリンベースの色素、特に、Alexa Fluor(商標)350(例えば、7-アミノ-3-[2-(2,5-ジオキソピロリジン-1-イル)オキシ-2-オキソエチル]-4-メチル-2-オキソクロメン-6-スルホン酸)、Pacific blue(商標)(例えば、6,8-ジフルオロ-7-ヒドロキシ-2-オキソクロメン-3-カルボン酸)及びそれらの誘導体、
- シアニンベースの色素、特に、スルホン化及び非スルホン化形態を含むCy5(商標)又はCy5.5(商標)、好ましくは、スルホン化形態、例えば、スルホン化Cy5(商標)(例えば、スルホ-Cy5酸、図15)又はスルホン化Cy5.5(商標)(例えば、スルホ-Cy5.5酸、図15)、ヨードシアニングリーン(例えば、ナトリウム;4-[(2Z)-2-[(2E,4E,6E)-7-[1,1-ジメチル-3-(4-スルホナトブチル)ベンゾ[e]インドール-3-イウム-2-イル]ヘプタ-2,4,6-トリエニリデン]-1,1-ジメチルベンゾ[e]インドール-3-イル]ブタン-1-スルホネート)及びそれらの誘導体、
- ジピロメテンベースの色素、特に、BODIPY(商標)色素(コア構造4,4-ジフルオロ-4-ボラ-3a,4a-ジアザ-s-インダセンをベースとする)、例えば、BODIPY(商標)500/510(例えば、12-(2,2-ジフルオロ-12-メチル-1-アザ-3-アゾニア-2-ボラヌイダトリシクロ[7.3.0.03,7]ドデカ-3,5,7,9,11-ペンタエン-4-イル)ドデカン酸)及びそれらの誘導体、
- ナフタレンベースの色素、特に、プロダン(6-プロピオニル-2-ジメチアミノナフタレン)及びそれらの誘導体、
- ピレンベースの色素、特に、Alexa Fluor(商標)405(例えば、8-[2-[4-(2,5-ジオキソピロリジン-1-イル)オキシカルボニルピペリジン-1-イル]-2-オキソエトキシ]ピレン-1,3,6-トリスルホネート;トリエチルアザニウム)、Cascade blue(商標)(例えば、[4-[[4-(ジエチルアミノ)フェニル]-[4-(エチルアミノ)ナフタレン-2-イル]メチリデン]シクロヘキサ-2,5-ジエン-1-イリデン]-ジエチルアザニウム)及びそれらの誘導体、
- スクアラインベースの色素、特に、Seta色素、例えば、Seta 650(CAS登録番号2043938-22-1)、Seta 375(CAS登録番号2043938-18-5)及びそれらの誘導体、
- スクアラインロタキサンベースの色素、特に、SeTau色素、例えば、SeTau 647(例えば、SeTau 647 Di-NHS、CAS登録番号1442086-02-3)、SeTau 488(例えば、SeTau-488-NHS、Seta Biomedicals、製品番号K9-3152、分子量:1642.73、λ_Ab最大[nm]:486;ε[M^-1 cm^-1]:59000;λ_Em最大[nm]:532; QY[%]:27)及びそれらの誘導体、
- キサンテンベースの色素、特に、ローダミン色素、例えば、MB(商標)660R (例えば、MB(商標)660R酸、図15を参照されたい)、ROX(カルボキシ-X-ローダミン)、TAMRA(カルボキシテトラメチルローダミン)、TEX(商標)615(CAS登録番号1209486-62-3)及びそれらの誘導体、フルオレセイン色素、例えば、Alexa Fluor(商標)488(例えば、Alexa Fluor(商標)488酸、図15を参照されたい)、6-FAM(6-カルボキシフルオレセイン)、HEX(ヘキサクロロフルオレセイン)、JOE(6-カルボキシ-4',5'-ジクロロ-2',7'-ジメトキシフルオレセイン)、MAX(CAS登録番号1610888-25-9)、TET(テトラクロロフルオレセイン)及びSUN(例えば、図15を参照されたい)及びそれらの誘導体及びカーボピロニンベースの色素、例えば、ATTO(商標)647(例えば、ATTO(商標)647酸、図15を参照されたい)及びそれらの誘導体、
並びに4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)、
並びにそれらの組合せ
からなる群から選択されうる。

【0132】

より詳しくは、前記少なくとも1つの蛍光色素は、
- アントラセンベースの色素、特に、DRAQ5(商標)、CyTRAK Orange(商標)及びそれらの誘導体、
- クマリンベースの色素、特に、Alexa Fluor(商標)350、Pacific blue(商標)及びそれらの誘導体、
- シアニンベースの色素、特に、スルホン化及び非スルホン化形態を含むCy5(商標)又はCy5.5(商標)、好ましくは、スルホン化形態、例えば、スルホン化Cy5(商標)又はスルホン化Cy5.5(商標)、ヨードシアニングリーン及びそれらの誘導体、
- ジピロメテンベースの色素、特に、BODIPY(商標)色素、例えば、BODIPY(商標)500/510及びそれらの誘導体、
- ナフタレンベースの色素、特に、プロダン及びそれらの誘導体、
- ピレンベースの色素、特に、Alexa Fluor(商標)405、Cascade blue(商標)及びそれらの誘導体、
- スクアラインベースの色素、特に、Seta色素、例えば、Seta 650、Seta 375及びそれらの誘導体、
- スクアラインロタキサンベースの色素、特に、SeTau色素、例えば、SeTau 647、SeTau 488及びそれらの誘導体、
- キサンテンベースの色素、特に、ローダミン色素、例えば、MB(商標)660R、ROX、TAMRA、TEX(商標)615及びそれらの誘導体、フルオレセイン色素、例えば、Alexa Fluor(商標)488、6-FAM、HEX、JOE、MAX、TET及びSUN及びそれらの誘導体及びカーボピロニンベースの色素、例えば、ATTO(商標)647及びそれらの誘導体、
並びに4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)、
並びにそれらの組合せ
からなる群から選択されうる。

【0133】

より詳しくは、前記少なくとも1つの蛍光色素は、アントラセンベースの色素、クマリンベースの色素、シアニンベースの色素、ジピロメテンベースの色素、ナフタレンベースの色素、ピレンベースの色素、スクアラインベースの色素、スクアラインロタキサンベースの色素、キサンテンベースの色素及び4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)及びそれらの組合せからなる群から選択されうる。更により詳しくは、前記少なくとも1つの蛍光色素は、アントラセンベースの色素、クマリンベースの色素、シアニンベースの色素、ジピロメテンベースの色素、ナフタレンベースの色素、ピレンベースの色素、スクアラインベースの色素、スクアラインロタキサンベースの色素及びキサンテンベースの色素及びそれらの組合せからなる群から選択されうる。

【0134】

特定の実施形態では、前記少なくとも1つの蛍光色素は、アクリジンオレンジ、DRAQ5(商標)、Cytrak Orange、Alexa Fluor(商標)350、Pacific Blue、Cy5(商標)、好ましくは、スルホ-Cy5(商標)、CY5.5、好ましくは、スルホ-Cy5.5、BODIPY(商標)500/510、プロダン、Alexa Fluor(商標)405、Cascade Blue、Seta(商標)650、Seta(商標)375、Setau(商標)647、SeTau 488、MB(商標)660R、Alexa Fluor(商標)488、ATTO(商標)647及びDAPI、それらの誘導体及びそれらの組合せからなる群から選択されうる。

【0135】

別の特定の実施形態では、前記少なくとも1つの蛍光色素は、DRAQ5(商標)、Alexa Fluor(商標)350、Pacific Blue、Cy5(商標)、好ましくは、スルホ-Cy5(商標)、BODIPY(商標)500/510、プロダン、Alexa Fluor(商標)405、Cascade Blue、Seta(商標)650、Setau(商標)647、SeTau 488、MB(商標)660R、Alexa Fluor(商標)488、ATTO(商標)647及びDAPI、それらの誘導体及びそれらの組合せからなる群から選択されうる。

【0136】

別の特定の実施形態では、前記少なくとも1つの蛍光色素は、DRAQ5(商標)、Alexa Fluor(商標)350、Cy5(商標)、好ましくは、スルホ-Cy5(商標)、BODIPY(商標)500/510、プロダン、Alexa Fluor(商標)405、Seta(商標)650、Setau(商標)647、MB(商標)660R、Alexa Fluor(商標)488、ATTO(商標)647及びDAPI、それらの誘導体及びそれらの組合せからなる群から選択されうる。

【0137】

別の特定の実施形態では、前記少なくとも1つの蛍光色素は、DRAQ5(商標)、Cytrak Orange、Alexa Fluor(商標)350、Pacific Blue、Cy5(商標)、好ましくは、スルホ-Cy5(商標)、CY5.5、好ましくは、スルホ-Cy5.5、BODIPY(商標)500/510、プロダン、Alexa Fluor(商標)405、Cascade Blue、Seta(商標)650、Seta(商標)375、Setau(商標)647、SeTau 488、MB(商標)660R、Alexa Fluor(商標)488、ATTO(商標)647及びDAPI、それらの誘導体及びそれらの組合せからなる群から選択されうる。

【0138】

別の特定の実施形態では、前記少なくとも1つの蛍光色素は、アクリジンオレンジ、DRAQ5(商標)、Cytrak Orange、Alexa Fluor(商標)350、Pacific Blue、Cy5(商標)、好ましくは、スルホ-Cy5(商標)、CY5.5、好ましくは、スルホ-Cy5.5、BODIPY(商標)500/510、プロダン、Alexa Fluor(商標)405、Cascade Blue、Seta(商標)650、Seta(商標)375、Setau(商標)647、SeTau 488、MB(商標)660R、Alexa Fluor(商標)488及びATTO(商標)647、それらの誘導体及びそれらの組合せからなる群から選択されうる。

【0139】

別の特定の実施形態では、前記少なくとも1つの蛍光色素は、DRAQ5(商標)、Cytrak Orange、Alexa Fluor(商標)350、Pacific Blue、Cy5(商標)、好ましくは、スルホ-Cy5(商標)、CY5.5、好ましくは、スルホ-Cy5.5、BODIPY(商標)500/510、プロダン、Alexa Fluor(商標)405、Cascade Blue、Seta(商標)650、Seta(商標)375、Setau(商標)647、SeTau 488、MB(商標)660R、Alexa Fluor(商標)488及びATTO(商標)647、それらの誘導体及びそれらの組合せからなる群から選択されうる。

【0140】

本明細書で使用される場合、「誘導体」という用語は、前記親化合物のコア構造(すなわち、色素の色又は吸収/発光波長を規定する芳香環骨格、例えば、アントラセン、クマリン、シアニン、ジピロメテン、ナフタレン、ピレン、スクアライン、スクアラインロタキサン、キサンテン、ローダミン、フルオレセイン又はカーボピロニン色素のコア構造)を含み、1つ又はいくつかの化学修飾のために、例えば、置換基における修飾のために前記親化合物とは異なっている蛍光化合物を指す。例えば、誘導体は、少なくとも1つの置換基の別の置換基による置き換えによって、少なくとも1つの置換基の欠失によって、少なくとも1つの置換基の付加及びそれらの組合せによって親化合物とは異なる場合がある。例えば、水素は、ハロゲン、例えば、フッ素又は塩素によって置き換えられる場合があり、ヒドロキシル基(-OH)は、カルボン酸部分(-COOH)によって置き換えられる場合があり、又はカルボン酸部分は、水素で置換される場合がある。得られる誘導体がフルオロフォアであり、本発明の方法を実行するのに適しているという条件で、任意の種類の置換基修飾が企図されうる。

【0141】

好ましくは、蛍光色素の誘導体は、エステル誘導体、特に、NHSエステル(スクシンイミジルエステル)誘導体、TFPエステル(テトラフルオロフェニルエステル)誘導体、STP(4-スルホ-2,3,5,6-テトラフルオロフェノール、ナトリウム塩)エステル誘導体又はスルホ-NHSエステル誘導体、カルボン酸誘導体、ジベンゾシクロオクチン(DBCO)誘導体、テトラジン誘導体、ヒドラジド誘導体、アジド誘導体、トランス-シクロオクテン(TCO)誘導体、アルキン誘導体、マレイミド誘導体からなる群から選択される。より好ましくは、蛍光色素の誘導体は、カルボン酸誘導体、ジベンゾシクロオクチン(DBCO)誘導体、NHSエステル誘導体及びマレイミド誘導体からなる群から選択される。

【0142】

より特定の実施形態では、前記少なくとも1つの蛍光色素は、DRAQ5(商標)、Alexa Fluor(商標)350 NHSエステル、Pacific Blue-NHSエステル、スルホ-Cy5酸、BODIPY(商標)500/510、プロダン、Alexa Fluor(商標)405-DBCO、Cascade Blue、Seta(商標)650-DBCO、SeTau 488-NHS、SeTau(商標)647-マレイミド、MB(商標)660R-酸、MB(商標)660R-DBCO、Alexa Fluor(商標)488-酸、Alexa Fluor(商標)488-DBCO、ATTO(商標)647-酸及びDAPI及びそれらの組合せからなる群から選択される。

【0143】

別のより特定の実施形態では、前記少なくとも1つの蛍光色素は、DRAQ5(商標)、Alexa Fluor(商標)350 NHSエステル、スルホ-Cy5酸、BODIPY(商標)500/510、プロダン、Alexa Fluor(商標)405-DBCO、Seta(商標)650-DBCO、SeTau(商標)647-マレイミド、MB(商標)660R-酸、MB(商標)660R-DBCO、Alexa Fluor(商標)488-酸、Alexa Fluor(商標)488-DBCO、ATTO(商標)647-酸及びDAPI及びそれらの組合せからなる群から選択される。

【0144】

別のより特定の実施形態では、前記少なくとも1つの蛍光色素は、アクリジンオレンジ、DRAQ5(商標)、Cytrak Orange、Alexa Fluor(商標)350 NHSエステル、Pacific Blue-NHSエステル、スルホ-Cy5酸、スルホ-Cy5.5酸、好ましくは、スルホ-Cy5.5、BODIPY(商標)500/510、プロダン、Alexa Fluor(商標)405-DBCO、Cascade Blue、Seta(商標)650-DBCO、Seta 375-NHS、SeTau(商標)647-マレイミド、SeTau 488-NHS、MB(商標)660R-酸、MB(商標)660R-DBCO、Alexa Fluor(商標)488-酸、Alexa Fluor(商標)488-DBCO、ATTO(商標)647-酸及びDAPI、それらの誘導体及びそれらの組合せからなる群から選択されうる。

【0145】

別のより特定の実施形態では、前記少なくとも1つの蛍光色素は、DRAQ5(商標)、Cytrak Orange、Alexa Fluor(商標)350 NHSエステル、Pacific Blue-NHSエステル、スルホ-Cy5酸、スルホ-Cy5.5酸、好ましくは、スルホ-Cy5.5、BODIPY(商標)500/510、プロダン、Alexa Fluor(商標)405-DBCO、Cascade Blue、Seta(商標)650-DBCO、Seta 375-NHS、SeTau(商標)647-マレイミド、SeTau 488-NHS、MB(商標)660R-酸、MB(商標)660R-DBCO、Alexa Fluor(商標)488-酸、Alexa Fluor(商標)488-DBCO、ATTO(商標)647-酸及びDAPI、それらの誘導体及びそれらの組合せからなる群から選択されうる。

【0146】

別のより特定の実施形態では、前記少なくとも1つの蛍光色素は、アクリジンオレンジ、DRAQ5(商標)、Cytrak Orange、Alexa Fluor(商標)350 NHSエステル、Pacific Blue-NHSエステル、スルホ-Cy5酸、スルホ-Cy5.5酸、好ましくは、スルホ-Cy5.5、BODIPY(商標)500/510、プロダン、Alexa Fluor(商標)405-DBCO、Cascade Blue、Seta(商標)650-DBCO、Seta 375-NHS、SeTau(商標)647-マレイミド、SeTau 488-NHS、MB(商標)660R-酸、MB(商標)660R-DBCO、Alexa Fluor(商標)488-酸、Alexa Fluor(商標)488-DBCO及びATTO(商標)647-酸、それらの誘導体及びそれらの組合せからなる群から選択されうる。

【0147】

別のより特定の実施形態では、前記少なくとも1つの蛍光色素は、DRAQ5(商標)、Cytrak Orange、Alexa Fluor(商標)350 NHSエステル、Pacific Blue-NHSエステル、スルホ-Cy5酸、スルホ-Cy5.5酸、好ましくは、スルホ-Cy5.5、BODIPY(商標)500/510、プロダン、Alexa Fluor(商標)405-DBCO、Cascade Blue、Seta(商標)650-DBCO、Seta 375-NHS、SeTau(商標)647-マレイミド、SeTau 488-NHS、MB(商標)660R-酸、MB(商標)660R-DBCO、Alexa Fluor(商標)488-酸、Alexa Fluor(商標)488-DBCO及びATTO(商標)647-酸、それらの誘導体及びそれらの組合せからなる群から選択されうる。

【0148】

好ましくは、本発明の方法において、試料は、1、2、3又は4つの蛍光色素と、より好ましくは、1つ又は2つの蛍光色素と接触される。

【0149】

一部の実施形態では、前記少なくとも1つの蛍光色素は、アクリジンオレンジ-DAPI、アクリジンオレンジ-Seta 375-NHS、アクリジンオレンジ-MB660R酸、アクリジンオレンジ-Alexa Fluor 350-NHSエステル、アクリジンオレンジ-Pacific Blue-NHSエステル、アクリジンオレンジ-スルホCy5-酸、アクリジンオレンジ-BODIPY、アクリジンオレンジ-プロダン、アクリジンオレンジ-Alexa Fluor 405-DBCO、アクリジンオレンジ-Cascade blue、アクリジンオレンジ-Alexa Fluor 488酸、DRAQ5-Alexa Fluor 350-NHSエステル、DRAQ5-Pacific Blue-NHSエステル、DRAQ5-スルホCy5酸、DRAQ5-BODIPY 500/510、DRAQ5-プロダン、DRAQ5-Alexa Fluor 405-DBCO、DRAQ5-Cascade blue、DRAQ5-Seta 650-DBCO、DRAQ5-SeTau 647-マレイミド、DRAQ5-MB660R-酸、DRAQ5-MB660R-DBCO、DRAQ5-ATTO647酸、Cytrak orange-Alexa Fluor 350-NHSエステル、Cytrak orange-Pacific Blue-NHSエステル、Cytrak orange-スルホCy5酸、Cytrak orange-BODIPY 500/510、Cytrak orange-プロダン、Cytrak orange-Alexa Fluor 405-DBCO、Cytrak orange-Cascade blue、Seta 375-NHS-Alexa Fluor 350-NHSエステル、Seta 375-NHS-Pacific Blue-NHSエステル、Seta 375-NHS-スルホCy5酸、Seta 375-NHS-BODIPY 500/510、Seta 375-NHS-プロダン、Seta 375-NHS-Alexa Fluor 405-DBCO、Seta 375-NHS-Cascade blue、Alexa Fluor 488酸-Alexa Fluor 350-NHSエステル、Alexa Fluor 488酸-Pacific Blue-NHSエステル、Alexa Fluor 488酸-スルホCy5酸、Alexa Fluor 488酸-BODIPY 500/510、Alexa Fluor 488酸-プロダン、Alexa Fluor 488酸-Alexa Fluor 405-DBCO、Alexa Fluor 488酸-Cascade blue、MB660R-酸-Alexa Fluor 350-NHSエステル、MB660R-酸-Pacific Blue-NHSエステル、MB660R-酸-スルホCy5酸、MB660R-酸-BODIPY 500/510、MB660R-酸-プロダン、MB660R-酸-Alexa Fluor 405-DBCO、MB660R-酸-Cascade blue、MB660R-酸-Seta 650-DBCO、MB660R-酸-SeTau 647-マレイミド、MB660R-DBCO-Alexa Fluor 350-NHSエステル、MB660R-DBCO-Pacific Blue-NHSエステル、MB660R-DBCO-スルホCy5酸、MB660R-DBCO-BODIPY 500/510、MB660R-DBCO-プロダン、MB660R-DBCO-Alexa Fluor 405-DBCO、MB660R-DBCO-Cascade blue、MB660R-DBCO-Seta 650-DBCO、MB660R-DBCO-SeTau 647-マレイミド、ATTO647酸-スルホCy5酸、ATTO647酸-Seta 650-DBCO、ATTO647酸-SeTau 647-マレイミド、ATTO647酸- MB660R-酸、ATTO647酸- MB660R-DBCO、スルホCy5.5酸-スルホCy5酸、スルホCy5酸-Seta 650-DBCO、スルホCy5酸-SeTau 647-マレイミド及びSeta 650-DBCO-SeTau 647-マレイミドからなる群から選択される、好ましくは、アクリジンオレンジ-Seta 375-NHS、アクリジンオレンジ-MB660R酸、アクリジンオレンジ-Alexa Fluor 350-NHSエステル、アクリジンオレンジ-Pacific Blue-NHSエステル、アクリジンオレンジ-スルホCy5酸、アクリジンオレンジ-BODIPY、アクリジンオレンジ-プロダン、アクリジンオレンジ-Alexa Fluor 405-DBCO、アクリジンオレンジ-Cascade blue、アクリジンオレンジ-Alexa Fluor 488酸、DRAQ5-Alexa Fluor 350-NHSエステル、DRAQ5-Pacific Blue-NHSエステル、DRAQ5-スルホCy5酸、DRAQ5-BODIPY 500/510、DRAQ5-プロダン、DRAQ5-Alexa Fluor 405-DBCO、DRAQ5-Cascade blue、DRAQ5-Seta 650-DBCO、DRAQ5-SeTau 647-マレイミド、DRAQ5-MB660R-酸、DRAQ5-MB660R-DBCO、DRAQ5-ATTO647酸、Cytrak orange-Alexa Fluor 350-NHSエステル、Cytrak orange-Pacific Blue-NHSエステル、Cytrak orange-スルホCy5酸、Cytrak orange-BODIPY 500/510、Cytrak orange-プロダン、Cytrak orange-Alexa Fluor 405-DBCO、Cytrak orange-Cascade blue、Seta 375-NHS-Alexa Fluor 350-NHSエステル、Seta 375-NHS-Pacific Blue-NHSエステル、Seta 375-NHS-スルホCy5酸、Seta 375-NHS-BODIPY 500/510、Seta 375-NHS-プロダン、Seta 375-NHS-Alexa Fluor 405-DBCO、Seta 375-NHS-Cascade blue、Alexa Fluor 488酸-Alexa Fluor 350-NHSエステル、Alexa Fluor 488酸-Pacific Blue-NHSエステル、Alexa Fluor 488酸-スルホCy5酸、Alexa Fluor 488酸-BODIPY 500/510、Alexa Fluor 488酸-プロダン、Alexa Fluor 488酸-Alexa Fluor 405-DBCO、Alexa Fluor 488酸-Cascade blue、MB660R-酸-Alexa Fluor 350-NHSエステル、MB660R-酸-Pacific Blue-NHSエステル、MB660R-酸-スルホCy5酸、MB660R-酸-BODIPY 500/510、MB660R-酸-プロダン、MB660R-酸-Alexa Fluor 405-DBCO、MB660R-酸-Cascade blue、MB660R-酸-Seta 650-DBCO、MB660R-酸-SeTau 647-マレイミド、MB660R-DBCO-Alexa Fluor 350-NHSエステル、MB660R-DBCO-Pacific Blue-NHSエステル、MB660R-DBCO-スルホCy5酸、MB660R-DBCO-BODIPY 500/510、MB660R-DBCO-プロダン、MB660R-DBCO-Alexa Fluor 405-DBCO、MB660R-DBCO-Cascade blue、MB660R-DBCO-Seta 650-DBCO、MB660R-DBCO-SeTau 647-マレイミド、ATTO647酸-スルホCy5酸、ATTO647酸-Seta 650-DBCO、ATTO647酸- SeTau 647-マレイミド、ATTO647酸- MB660R-酸、ATTO647酸- MB660R-DBCO、スルホCy5.5酸-スルホCy5酸、スルホCy5酸-Seta 650-DBCO、スルホCy5酸-SeTau 647-マレイミド及びSeta 650-DBCO-SeTau 647-マレイミドからなる群から選択される組合せである。

【0150】

特定の実施形態では、目的の微生物又は微生物の群は、好ましくは、アリシクロバチルス・アシドテレストリス、アリシクロバチルス・アシドカルダリウス、アリシクロバチルス・アシディフィラス、アリシクロバチルス・シクロヘプタニカス、アリシクロバチルス・ヘスペリダム、アリシクロバチルス・ハーバリウス及びアリシクロバチルス・コンタミナンス及びそれらの組合せからなる群から選択される、上記で定義されるような好熱性好酸性菌(TAB)の群に属する、すなわち、アリシクロバチルス属に属する微生物に属するか、又はそれを含み、前記少なくとも1つの蛍光色素は、キサンテンベースの色素からなる群から選択される、好ましくは、ローダミン色素、フルオレセイン色素及びカーボピロニンベースの色素及びそれらの組合せからなる群から選択される、より好ましくは、Alexa Fluor 488、MB660R及びATTO647及びそれらの誘導体及び組合せからなる群から選択される、更により好ましくは、Alexa Fluor 488酸、Alexa Fluor 488-DBCO、MB660R-酸、MB660R-DBCO及びATTO647酸及びそれらの組合せからなる群から選択される。特定の好ましい実施形態では、目的の微生物又は微生物の群は、好ましくは、アリシクロバチルス・アシドテレストリス、アリシクロバチルス・アシドカルダリウス、アリシクロバチルス・アシディフィラス、アリシクロバチルス・シクロヘプタニカス、アリシクロバチルス・ヘスペリダム、アリシクロバチルス・ハーバリウス及びアリシクロバチルス・コンタミナンス及びそれらの組合せからなる群から選択される、上記で定義されるような好熱性好酸性菌(TAB)の群に属する、すなわち、アリシクロバチルス属に属する微生物に属するか、又はそれを含み、前記少なくとも1つの蛍光色素は、MB660R及びそれらの誘導体からなる群から選択される、好ましくは、MB660R-酸及びMB660R-DBCO及びそれらの組合せからなる群から選択される、より好ましくは、MB660R-DBCOである。

【0151】

別の特定の実施形態では、目的の微生物又は微生物の群は、好ましくは、アセトバクター属、アシドモナス属、アサイア属、グルコンアセトバクター属、グルコノバクター属、アメヤマエア属、ボンベラ属、コメンサリバクター属、エンドバクター属、グラニュリバクター属、コマガタエイバクター属、コザキア属、ネオアサイア属、ネオコマガタエア属、ヌグエニバクター属、サッカリバクター属、スワミナタニア属、スウィングシア属及びタンチカロエニア属及びそれらの組合せに属する細菌から選択される、より好ましくは、アセトバクター属、グルコノバクター属、グルコンアセトバクター属及びアサイア属及びそれらの組合せに属する細菌から選択される、更により好ましくは、アセトバクター・アセチ、グルコノアセトバクター・リクファシエンス、グルコノバクター・オキシダンス及びアサイア・サイアメンシス及びそれらの組合せからなる群から選択される、上記で定義されるような酢酸菌(AAB)の群に属する微生物に属するか、又はそれを含み、前記少なくとも1つの蛍光色素は、キサンテンベースの色素からなる群から選択される、好ましくは、ローダミン色素、フルオレセイン色素、カーボピロニンベースの色素及びDAPI及びそれらの組合せからなる群から選択される、より好ましくは、Alexa Fluor 488、MB660R、ATTO647及びDAPI及びそれらの誘導体及び組合せからなる群から選択される、更により好ましくは、Alexa Fluor 488酸、Alexa Fluor 488-DBCO、MB660R-酸、MB660R-DBCO、ATTO647酸及びDAPI及びそれらの組合せからなる群から選択される。好ましくは、前記少なくとも1つの蛍光色素は、Alexa Fluor 488、MB660R及びATTO647及びそれらの誘導体及び組合せからなる群から選択される、より好ましくは、Alexa Fluor 488酸、Alexa Fluor 488-DBCO、MB660R-酸、MB660R-DBCO及びATTO647酸及びそれらの組合せからなる群から選択される。

【0152】

特定の好ましい実施形態では、目的の微生物又は微生物の群は、好ましくは、アセトバクター属、グルコノバクター属、グルコンアセトバクター属及びアサイア属及びそれらの組合せに属する細菌から選択される、更により好ましくは、アセトバクター・アセチ、グルコノアセトバクター・リクファシエンス、グルコノバクター・オキシダンス及びアサイア・サイアメンシス及びそれらの組合せからなる群から選択される、上記で定義されるような酢酸菌(AAB)の群に属する微生物に属するか、又はそれを含み、前記少なくとも1つの蛍光色素は、Alexa Fluor 488、MB660R及びATTO647及びそれらの誘導体及び組合せからなる群から選択される、好ましくは、Alexa Fluor 488酸、MB660R-酸及びATTO647酸及びそれらの組合せからなる群から選択される、より好ましくは、MB660R及びATTO647及びそれらの誘導体及び組合せからなる群から選択される、特に、MB660R-酸及びATTO647酸及びそれらの組合せからなる群から選択される。

【0153】

別の特定の実施形態では、目的の微生物又は微生物の群は、好ましくは、ラクトバチルス属、ロイコノストック属、ペディオコッカス属、ラクトコッカス属、エンテロコッカス属、カルノバクテリウム属、ストレプトコッカス属及びワイセラ属及びそれらの組合せに属する細菌から選択される、より好ましくは、ラクトバチルス属及びワイセラ属及びそれらの組合せに属する細菌から選択される、更により好ましくは、ラクトバチルス・カゼイ、ラクトバチルス・プランタルム及びワイセラ・コンフューザ及びそれらの組合せからなる群から選択される、上記で定義されるような乳酸菌(LAB)の群に属する微生物に属するか、又はそれを含み、前記少なくとも1つの蛍光色素は、キサンテンベースの色素からなる群から選択される、好ましくは、ローダミン色素、フルオレセイン色素、カーボピロニンベースの色素及びDAPI及びそれらの組合せからなる群から選択される、より好ましくは、Alexa Fluor 488、MB660R、ATTO647及びDAPI及びそれらの誘導体及び組合せからなる群から選択される、更により好ましくは、Alexa Fluor 488酸、Alexa Fluor 488-DBCO、MB660R-酸、MB660R-DBCO及びATTO647酸及びそれらの組合せからなる群から選択される。特定の好ましい実施形態では、目的の微生物又は微生物の群は、好ましくは、ラクトバチルス属及びワイセラ属及びそれらの組合せに属する細菌から選択される、更により好ましくは、ラクトバチルス・カゼイ、ラクトバチルス・プランタルム及びワイセラ・コンフューザ及びそれらの組合せからなる群から選択される、上記で定義されるような乳酸菌(LAB)の群に属する微生物に属するか、又はそれを含み、前記少なくとも1つの蛍光色素は、Alexa Fluor 488、MB660R、ATTO647及びDAPI及びそれらの誘導体及び組合せからなる群から選択される、好ましくは、Alexa Fluor 488酸、Alexa Fluor 488-DBCO、MB660R-酸、MB660R-DBCO、ATTO647酸及びDAPI及びそれらの組合せからなる群から選択される。好ましい実施形態では、前記少なくとも1つの蛍光色素は、Alexa Fluor 488、MB660R及びDAPI及びそれらの誘導体及び組合せからなる群から選択される、好ましくは、Alexa Fluor 488酸、MB660R-酸及びDAPI及びそれらの組合せからなる群から選択される、より好ましくは、Alexa Fluor 488酸及びMB660R-酸及びそれらの組合せからなる群から選択される、更により好ましくは、MB660R-酸である。別の好ましい実施形態では、前記少なくとも1つの蛍光色素は、Alexa Fluor 488及びMB660R及びそれらの誘導体及び組合せからなる群から選択される、好ましくは、Alexa Fluor 488酸及びMB660R-酸及びそれらの組合せからなる群から選択される。

【0154】

別の特定の実施形態では、目的の微生物又は微生物の群は、好ましくは、クロストリジウム属及びキューティバクテリウム属の細菌及びそれらの組合せから選択される、より好ましくは、クロストリジウム・スポロゲネス及びキューティバクテリウム・アクネス及びそれらの組合せからなる群から選択される、嫌気性菌の群に属する微生物に属するか、又はそれを含み、前記少なくとも1つの蛍光色素は、キサンテンベースの色素、好ましくは、ローダミン色素、シアニンベースの色素及びDAPI及びそれらの組合せからなる群から選択される、好ましくは、MB660R、Cy5(商標)、好ましくは、スルホ-Cy5及びDAPI及びそれらの誘導体及び組合せからなる群から、より好ましくは、MB660R-DBCO、スルホ-Cy5酸及びDAPI及びそれらの組合せからなる群から選択される。特に、この実施形態では、前記少なくとも1つの蛍光色素は、MB660R及びCy5(商標)の組合せ、好ましくは、スルホ-Cy5、特に、MB660R-DBCO及びスルホ-Cy5酸の組合せでありうる。

【0155】

別の特定の実施形態では、目的の微生物又は微生物の群は、好ましくは、メチロバクテリウム属、シュードモナス属、バチルス属、エシェリキア属、スタフィロコッカス属、アシネトバクター属、クロノバクター属、クレブシエラ属、サルモネラ属、エンテロコッカス属、リステリア属、シゲラ属、コクリア属及びバークホルデリア属及びそれらの組合せに属する細菌から選択される、より好ましくは、メチロバクテリウム・エキストロクエンス、緑膿菌、枯草菌、大腸菌、黄色ブドウ球菌、アシネトバクター・バウマンニ、クロノバクター・サカザキ、肺炎桿菌、ネズミチフス菌、フェカリス菌、リステリア・グレイ、ソンネ菌、コクリア・リゾフィラ及びセパシア菌及びそれらの組合せからなる群から選択される、上記で定義されるような好気性中温性菌(AMB)の群に属する微生物に属するか、又はそれを含み、前記少なくとも1つの蛍光色素は、キサンテンベースの色素からなる群から選択される、好ましくは、ローダミン色素、フルオレセイン色素及びカーボピロニンベースの色素、アントラセンベースの色素、クマリンベースの色素、シアニンベースの色素、ジピロメテンベースの色素、ナフタレンベースの色素、ピレンベースの色素、スクアラインベースの色素、スクアラインロタキサンベースの色素及びDAPI及びそれらの組合せからなる群から選択される、好ましくは、DRAQ5(商標)、Alexa Fluor(商標)350、Pacific Blue、Cy5(商標)、好ましくは、スルホ-Cy5、BODIPY(商標)色素、好ましくは、BODIPY 500/510、プロダン、Alexa Fluor(商標)405、Cascade Blue、Seta色素、好ましくは、Seta 650、SeTau色素、好ましくは、SeTau 647又はSeTau 488、Alexa Fluor 488、MB660R、ATTO647及びDAPI及びそれらの誘導体及び組合せからなる群から選択される、より好ましくは、DRAQ5(商標)、Alexa Fluor(商標)350-NHSエステル、Pacific Blue-NHSエステル、スルホ-Cy5酸、BODIPY 500/510、プロダン、Alexa Fluor(商標)405-DBCO、Cascade Blue、Seta 650-DBCO、SeTau 647-マレイミド、SeTau 488-NHS、Alexa Fluor 488酸、Alexa Fluor 488-DBCO、MB660R-酸、MB660R-DBCO、ATTO647酸及びDAPI及びそれらの組合せからなる群から選択される。特に、前記少なくとも1つの蛍光色素は、DRAQ5(商標)、Alexa Fluor(商標)350、Cy5(商標)、好ましくは、スルホ-Cy5、BODIPY(商標)色素、好ましくは、BODIPY 500/510、プロダン、Alexa Fluor(商標)405、Seta色素、好ましくは、Seta 650、SeTau色素、好ましくは、SeTau 647、Alexa Fluor 488、MB660R、ATTO647及びDAPI及びそれらの誘導体及び組合せからなる群から選択されうる、より好ましくは、DRAQ5(商標)、Alexa Fluor(商標)350-NHSエステル、スルホ-Cy5酸、BODIPY 500/510、プロダン、Alexa Fluor(商標)405-DBCO、Seta 650-DBCO、SeTau 647-マレイミド、Alexa Fluor 488酸、Alexa Fluor 488-DBCO、MB660R-酸、MB660R-DBCO、ATTO647酸及びDAPI及びそれらの組合せからなる群から選択される。

【0156】

より詳しくは、目的の微生物又は微生物の群は、好ましくは、メチロバクテリウム属、シュードモナス属、バチルス属、エシェリキア属、スタフィロコッカス属、アシネトバクター属、クロノバクター属、クレブシエラ属、サルモネラ属、エンテロコッカス属、シゲラ属、コクリア属及びバークホルデリア属及びそれらの組合せに属する細菌から選択される、より好ましくは、メチロバクテリウム・エキストロクエンス、緑膿菌、枯草菌、大腸菌、黄色ブドウ球菌、アシネトバクター・バウマンニ、クロノバクター・サカザキ、肺炎桿菌、ネズミチフス菌、フェカリス菌、ソンネ菌、コクリア・リゾフィラ及びセパシア菌及びそれらの組合せからなる群から選択される、上記で定義されるような好気性中温性菌(AMB)の群に属する微生物に属するか、又はそれを含む場合があり、前記少なくとも1つの蛍光色素は、アクリジン色素、キサンテンベースの色素からなる群から選択される、好ましくは、ローダミン色素、フルオレセイン色素及びカーボピロニンベースの色素、アントラセンベースの色素、クマリンベースの色素、シアニンベースの色素、ジピロメテンベースの色素、ナフタレンベースの色素、ピレンベースの色素、スクアラインベースの色素、スクアラインロタキサンベースの色素及びDAPI及びそれらの組合せからなる群から選択される、好ましくは、アクリジンオレンジ、DRAQ5(商標)、Cytrak orange、Alexa Fluor(商標)350、Pacific Blue、Cy5(商標)、好ましくは、スルホ-Cy5、Cy5.5(商標)、好ましくは、スルホ-Cy5.5、BODIPY(商標)色素、好ましくは、BODIPY 500/510、プロダン、Alexa Fluor(商標)405、Cascade Blue、Seta色素、好ましくは、Seta 650又はSeta 375、SeTau色素、好ましくは、SeTau 647又はSeTau 488、Alexa Fluor 488、MB660R、ATTO647及びDAPI及びそれらの誘導体及び組合せからなる群から選択される、より好ましくは、アクリジンオレンジ、DRAQ5(商標)、Cytrak orange、Alexa Fluor(商標)350-NHSエステル、Pacific Blue-NHSエステル、スルホ-Cy5酸、スルホ-Cy5.5酸、BODIPY 500/510、プロダン、Alexa Fluor(商標)405-DBCO、Cascade Blue、Seta 650-DBCO、Seta 375-NHS、SeTau 647-マレイミド、SeTau 488-NHS、Alexa Fluor 488酸、Alexa Fluor 488-DBCO、MB660R-酸、MB660R-DBCO、ATTO647酸及びDAPI及びそれらの組合せからなる群から選択される。特に、前記少なくとも1つの蛍光色素は、DRAQ5(商標)、Cytrak orange、Alexa Fluor(商標)350、Pacific Blue、Cy5(商標)、好ましくは、スルホ-Cy5、Cy5.5(商標)、好ましくは、スルホ-Cy5.5、BODIPY(商標)色素、好ましくは、BODIPY 500/510、プロダン、Alexa Fluor(商標)405、Cascade Blue、Seta色素、好ましくは、Seta 650又はSeta 375、SeTau色素、好ましくは、SeTau 647又はSeTau 488、Alexa Fluor 488、MB660R及びATTO647及びそれらの誘導体及び組合せからなる群から選択されうる、より好ましくは、DRAQ5(商標)、Cytrak orange、Alexa Fluor(商標)350-NHSエステル、Pacific Blue-NHSエステル、スルホ-Cy5酸、スルホ-Cy5.5酸、BODIPY 500/510、プロダン、Alexa Fluor(商標)405-DBCO、Cascade Blue、Seta 650-DBCO、Seta 375-NHS、SeTau 647-マレイミド、SeTau 488-NHS、Alexa Fluor 488酸、Alexa Fluor 488-DBCO、MB660R-酸、MB660R-DBCO及びATTO647酸及びそれらの組合せからなる群から選択される。

【0157】

好ましい実施形態では、目的の微生物又は微生物の群は、好ましくは、メチロバクテリウム属、シュードモナス属、バチルス属、エシェリキア属、スタフィロコッカス属、アシネトバクター属、クロノバクター属、クレブシエラ属、サルモネラ属、エンテロコッカス属、シゲラ属、コクリア属及びバークホルデリア属及びそれらの組合せに属する細菌から選択される、より好ましくは、メチロバクテリウム・エキストロクエンス、緑膿菌、枯草菌、大腸菌、黄色ブドウ球菌、アシネトバクター・バウマンニ、クロノバクター・サカザキ、肺炎桿菌、ネズミチフス菌、フェカリス菌、ソンネ菌、コクリア・リゾフィラ及びセパシア菌及びそれらの組合せからなる群から選択される、上記で定義されるような好気性中温性菌(AMB)の群に属する微生物に属するか、又はそれを含む場合があり、前記少なくとも1つの蛍光色素は、任意選択で、Cy5(商標)、好ましくは、スルホ-Cy5からなる群から選択される蛍光色素と組み合わせた、MB660R及びそれらの誘導体及び組合せからなる群から選択される。好ましくは、前記少なくとも1つの蛍光色素は、任意選択で、スルホ-Cy5酸と組み合わせたMB660R-DBCOである。

【0158】

別の特定の実施形態では、目的の微生物又は微生物の群は、好ましくは、エシェリキア属及びシュードモナス属及びそれらの組合せに属する細菌から選択され、より好ましくは、大腸菌及び緑膿菌及びそれらの組合せから選択される、上記で定義されるようなグラム陰性菌の群に属する微生物に属するか、又はそれを含み、前記少なくとも1つの蛍光色素は、キサンテンベースの色素、好ましくは、ローダミン色素、ピレンベースの色素、クマリンベースの色素、シアニンベースの色素及びDAPI及びそれらの組合せからなる群から選択される、好ましくは、Cy5(商標)、好ましくは、スルホ-Cy5、Alexa Fluor(商標)350、Alexa Fluor(商標)405、MB660R及びDAPI及びそれらの誘導体及び組合せからなる群から選択される、より好ましくは、スルホ-Cy5酸、Alexa Fluor(商標)350-NHSエステル、Alexa Fluor(商標)405-DBCO、MB660R-DBCO及びDAPI及びそれらの組合せからなる群から選択される。更により好ましくは、前記少なくとも1つの蛍光色素は、Cy5(商標)、好ましくは、スルホ-Cy5、Alexa Fluor(商標)350、Alexa Fluor(商標)405及びMB660R及びそれらの誘導体及び組合せからなる群から選択される、より好ましくは、スルホ-Cy5酸、Alexa Fluor(商標)350-NHSエステル、Alexa Fluor(商標)405-DBCO及びMB660R-DBCO及びそれらの組合せからなる群から選択される。

【0159】

より詳しくは、前記少なくとも1つの蛍光色素は、キサンテンベースの色素、好ましくは、ローダミン色素及びシアニンベースの色素及びそれらの組合せからなる群から選択される場合があり、好ましくは、Cy5(商標)、好ましくは、スルホ-Cy5、MB660R及びそれらの誘導体及び組合せからなる群から選択される、より好ましくは、スルホ-Cy5酸及びMB660R-DBCO及びそれらの組合せからなる群から選択される。或いは、前記少なくとも1つの蛍光色素は、ピレンベースの色素、クマリンベースの色素及びそれらの組合せからなる群から選択される場合があり、好ましくは、Alexa Fluor(商標)350及びAlexa Fluor(商標)405及びそれらの誘導体及び組合せからなる群から選択される、より好ましくは、Alexa Fluor(商標)350-NHSエステル、Alexa Fluor(商標)405-DBCO及びそれらの組合せからなる群から選択される。特に、前記少なくとも1つの蛍光色素は、Alexa Fluor(商標)350-NHSエステル、Alexa Fluor(商標)405-DBCOの組合せでありうる。

【0160】

別の特定の実施形態では、目的の微生物又は微生物の群は、好ましくは、エシェリキア属、プロテウス属及びシュードモナス属及びそれらの組合せに属する細菌から選択される、より好ましくは、大腸菌、プロテウス・ミラビリス及び緑膿菌及びそれらの組合せから選択される、上記で定義されるようなグラム陰性菌の群に属する微生物に属するか、又はそれを含み、前記少なくとも1つの蛍光色素は、キサンテンベースの色素、好ましくは、ローダミン色素、シアニンベースの色素及びDAPI及びそれらの組合せからなる群から選択される場合があり、好ましくは、Cy5(商標)、好ましくは、スルホ-Cy5、MB660R及びDAPI及びそれらの誘導体及び組合せからなる群から選択される、より好ましくは、スルホ-Cy5酸、MB660R-DBCO及びDAPI及びそれらの組合せからなる群から選択される。より詳しくは、前記少なくとも1つの蛍光色素は、キサンテンベースの色素、好ましくは、ローダミン色素及びシアニンベースの色素及びそれらの組合せからなる群から選択される場合があり、好ましくは、Cy5(商標)、好ましくは、スルホ-Cy5、MB660R及びそれらの誘導体及び組合せからなる群から選択される、より好ましくは、スルホ-Cy5酸及びMB660R-DBCO及びそれらの組合せからなる群から選択される。

【0161】

別の特定の実施形態では、目的の微生物又は微生物の群は、好ましくは、スタフィロコッカス属及びエンテロコッカス属及びそれらの組合せに属する細菌から選択される、より好ましくは、黄色ブドウ球菌及びフェカリス菌及びそれらの組合せから選択される、上記で定義されるようなグラム陽性菌の群に属する微生物に属するか、又はそれを含み、前記少なくとも1つの蛍光色素は、キサンテンベースの色素、好ましくは、ローダミン色素、シアニンベースの色素及びDAPI及びそれらの組合せからなる群から選択される場合があり、好ましくは、Cy5(商標)、好ましくは、スルホ-Cy5、MB660R及びDAPI及びそれらの誘導体及び組合せからなる群から選択される、より好ましくは、スルホ-Cy5酸、MB660R-DBCO及びDAPI及びそれらの組合せからなる群から選択される。より詳しくは、前記少なくとも1つの蛍光色素は、キサンテンベースの色素、好ましくは、ローダミン色素及びシアニンベースの色素及びそれらの組合せからなる群から選択される場合があり、好ましくは、Cy5(商標)、好ましくは、スルホ-Cy5、MB660R及びそれらの誘導体及び組合せからなる群から選択される、より好ましくは、スルホ-Cy5酸及びMB660R-DBCO及びそれらの組合せからなる群から選択される。

【0162】

別の特定の実施形態では、目的の微生物又は微生物の群は、好ましくは、エシェリキア属、プロテウス属、シュードモナス属、スタフィロコッカス属及びエンテロコッカス属及びそれらの組合せに属する細菌から選択される、より好ましくは、大腸菌、プロテウス・ミラビリス、緑膿菌、黄色ブドウ球菌及びフェカリス菌及びそれらの組合せから選択される、上記で定義されるようなグラム陽性又は陰性菌の群に属する微生物に属するか、又はそれを含み、前記少なくとも1つの蛍光色素は、キサンテンベースの色素、好ましくは、ローダミン色素、シアニンベースの色素及びDAPI及びそれらの組合せからなる群から選択される場合があり、好ましくは、Cy5(商標)、好ましくは、スルホ-Cy5、MB660R及びDAPI及びそれらの誘導体及び組合せからなる群から選択される、より好ましくは、スルホ-Cy5酸、MB660R-DBCO及びDAPI及びそれらの組合せからなる群から選択される。より詳しくは、前記少なくとも1つの蛍光色素は、キサンテンベースの色素、好ましくは、ローダミン色素及びシアニンベースの色素及びそれらの組合せからなる群から選択される場合があり、好ましくは、Cy5(商標)、好ましくは、スルホ-Cy5、MB660R及びそれらの誘導体及び組合せからなる群から選択される、より好ましくは、スルホ-Cy5酸及びMB660R-DBCO及びそれらの組合せからなる群から選択される。

【0163】

別の特定の実施形態では、目的の微生物又は微生物の群は、好ましくは、アシネトバクター属、エロモナス属、ブレブンディモナス属、バークホルデリア属、シトロバクター属、エドワージエラ属、エンテロバクター属、エシェリキア属、オクロバクテリウム属、クレブシエラ属、メチロバクテリウム属、モラクセラ属、パンテア属、プロテウス属、シュードモナス属、ラルストニア属、サルモネラ属、セラチア属、シゲラ属、スフィンゴモナス属、ステノトロホモナス属、エルシニア属、バチルス属、エンテロコッカス属、ミクロコッカス属及びスタフィロコッカス属及びそれらの組合せに属する細菌から選択される、より好ましくは、アシネトバクター・バウマニー、エロモナス・ハイドロフィラ、ブレブンディモナス・ディミヌタ、セパシア菌、シトロバクター・フロインディー、エドワージエラ・タルダ、エンテロバクター・エロゲネス、大腸菌、オクロバクテリウム・アンスロピック、肺炎桿菌、メチロバクテリウム・エキストロクエンス、モラクセラ・オスロエンシス、パンテア・アグロメランス、プロテウス・ミラビリス、緑膿菌、シュードモナス・フルオレッセンス、ラルストニア・ピッケティ、ネズミチフス菌、セラチア・マルセセンス、ソンネ菌、スフィンゴモナス・パウシモビリス、ステノトロホモナス・マルトフィリア、エルシニア・エンテロコリチカ、枯草菌、フェカリス菌、ルテウス菌(コクリア・リゾフィラ)、黄色ブドウ球菌及びそれらの組合せから選択される、上記で定義されるような従属栄養細菌の群に属する微生物に属するか、又はそれを含み、前記少なくとも1つの蛍光色素は、アクリジン色素、キサンテンベースの色素からなる群から選択される、好ましくは、ローダミン色素、フルオレセイン色素及びカーボピロニンベースの色素、アントラセンベースの色素、クマリンベースの色素、シアニンベースの色素、ジピロメテンベースの色素、ナフタレンベースの色素、ピレンベースの色素、スクアラインベースの色素、スクアラインロタキサンベースの色素及びDAPI及びそれらの組合せからなる群から選択される、好ましくは、アクリジンオレンジ、DRAQ5(商標)、Cytrak orange、Alexa Fluor(商標)350、Pacific Blue、Cy5(商標)、好ましくは、スルホ-Cy5、Cy5.5(商標)、好ましくは、スルホ-Cy5.5、BODIPY(商標)色素、好ましくは、BODIPY 500/510、プロダン、Alexa Fluor(商標)405、Cascade Blue、Seta色素、好ましくは、Seta 650又はSeta 375、SeTau色素、好ましくは、SeTau 647又はSeTau 488、Alexa Fluor 488、MB660R、ATTO647及びDAPI及びそれらの誘導体及び組合せからなる群から選択される、より好ましくは、アクリジンオレンジ、DRAQ5(商標)、Cytrak orange、Alexa Fluor(商標)350-NHSエステル、Pacific Blue-NHSエステル、スルホ-Cy5酸、スルホ-Cy5.5酸、BODIPY 500/510、プロダン、Alexa Fluor(商標)405-DBCO、Cascade Blue、Seta 650-DBCO、Seta 375-NHS、SeTau 647-マレイミド、SeTau 488-NHS、Alexa Fluor 488酸、Alexa Fluor 488-DBCO、MB660R-酸、MB660R-DBCO、ATTO647酸及びDAPI及びそれらの組合せからなる群から選択される。

【0164】

特に、前記少なくとも1つの蛍光色素は、DRAQ5(商標)、Cytrak orange、Alexa Fluor(商標)350、Pacific Blue、Cy5(商標)、好ましくは、スルホ-Cy5、Cy5.5(商標)、好ましくは、スルホ-Cy5.5、BODIPY(商標)色素、好ましくは、BODIPY 500/510、プロダン、Alexa Fluor(商標)405、Cascade Blue、Seta色素、好ましくは、Seta 650又はSeta 375、SeTau色素、好ましくは、SeTau 647又はSeTau 488、Alexa Fluor 488、MB660R及びATTO647及びそれらの誘導体及び組合せからなる群から選択されうる、より好ましくは、DRAQ5(商標)、Cytrak orange、Alexa Fluor(商標)350-NHSエステル、Pacific Blue-NHSエステル、スルホ-Cy5酸、スルホ-Cy5.5酸、BODIPY 500/510、プロダン、Alexa Fluor(商標)405-DBCO、Cascade Blue、Seta 650-DBCO、Seta 375-NHS、SeTau 647-マレイミド、SeTau 488-NHS、Alexa Fluor 488酸、Alexa Fluor 488-DBCO、MB660R-酸、MB660R-DBCO及びATTO647酸及びそれらの組合せからなる群から選択される。

【0165】

好ましい実施形態では、目的の微生物又は微生物の群は、好ましくは、アシネトバクター属、エロモナス属、ブレブンディモナス属、バークホルデリア属、シトロバクター属、エドワージエラ属、エンテロバクター属、エシェリキア属、オクロバクテリウム属、クレブシエラ属、メチロバクテリウム属、モラクセラ属、パンテア属、プロテウス属、シュードモナス属、ラルストニア属、サルモネラ属、セラチア属、シゲラ属、スフィンゴモナス属、ステノトロホモナス属、エルシニア属、バチルス属、エンテロコッカス属、ミクロコッカス属及びスタフィロコッカス属及びそれらの組合せに属する細菌から選択され、より好ましくは、アシネトバクター・バウマニー、エロモナス・ハイドロフィラ、ブレブンディモナス・ディミヌタ、セパシア菌、シトロバクター・フロインディー、エドワージエラ・タルダ、エンテロバクター・エロゲネス、大腸菌、オクロバクテリウム・アンスロピック、肺炎桿菌、メチロバクテリウム・エキストロクエンス、モラクセラ・オスロエンシス、パンテア・アグロメランス、プロテウス・ミラビリス、緑膿菌、シュードモナス・フルオレッセンス、ラルストニア・ピッケティ、ネズミチフス菌、セラチア・マルセセンス、ソンネ菌、スフィンゴモナス・パウシモビリス、ステノトロホモナス・マルトフィリア、エルシニア・エンテロコリチカ、枯草菌、フェカリス菌、ルテウス菌(コクリア・リゾフィラ)、黄色ブドウ球菌及びそれらの組合せから選択される、上記で定義されるような従属栄養細菌の群に属する微生物に属するか、又はそれを含み、前記少なくとも1つの蛍光色素は、i)Alexa Fluor 350又はその誘導体及びAlexa Fluor 405又はその誘導体の組合せ、並びに(ii)好ましくは、AF350-NHSエステル及びAF405-DBCOの組合せ並びにMB660R-DBCO及びスルホ-Cy5酸の組合せから選択されるMB660R又はその誘導体及びスルホ-Cy5又はその誘導体の組合せからなる群から選択される。

【0166】

別の特定の実施形態では、目的の微生物又は微生物の群は、好ましくは、カンジダ属、ザイゴサッカロミセス属、アスペルギルス属、サッカロミセス属、ゲオトリクム属及びペニシリウム属及びそれらの組合せに属する真菌から選択される、より好ましくは、カンジダ・アルビカンス、ザイゴサッカロミセス・バイリー、アスペルギルス・ブラジリエンシス、サッカロミセス・セレビシエ、ジオトリクム・カンディダム、ペニシリウム・バリオティー、ペニシリウム・クリソゲナム及びそれらの組合せからなる群から選択される、上記で定義されるような酵母及びカビの群に属する微生物に属するか、又はそれを含み、前記少なくとも1つの蛍光色素は、アクリジン色素、キサンテンベースの色素からなる群から選択される、好ましくは、ローダミン色素、フルオレセイン色素及びカーボピロニンベースの色素、クマリンベースの色素、シアニンベースの色素、ジピロメテンベースの色素、ナフタレンベースの色素、ピレンベースの色素、スクアラインベースの色素、スクアラインロタキサンベースの色素及びDAPI及びそれらの組合せからなる群から選択される、好ましくは、アクリジンオレンジ、Alexa Fluor(商標)350、Pacific Blue、Cy5(商標)、好ましくは、スルホ-Cy5、プロダン、Alexa Fluor(商標)405、Cascade Blue、BODIPY 500/510、Seta色素、好ましくは、Seta 650、SeTau色素、好ましくは、SeTau 647又はSeTau 488、Alexa Fluor 488、MB660R及びDAPI及びそれらの誘導体及び組合せからなる群から選択される、より好ましくは、アクリジンオレンジ、Alexa Fluor(商標)350-NHSエステル、Pacific Blue-NHSエステル、スルホ-Cy5酸、プロダン、Alexa Fluor(商標)405-DBCO、Cascade Blue、BODIPY 500/510、Seta 650-DBCO、SeTau 647-マレイミド、SeTau 488-NHS、Alexa Fluor 488酸、MB660R-酸、MB660R-DBCO及びDAPI及びそれらの組合せからなる群から選択される。より詳しくは、前記少なくとも1つの蛍光色素は、キサンテンベースの色素からなる群から選択されうる、好ましくは、ローダミン色素、フルオレセイン色素及びカーボピロニンベースの色素、クマリンベースの色素、シアニンベースの色素、ナフタレンベースの色素、ピレンベースの色素、スクアラインベースの色素、スクアラインロタキサンベースの色素及びDAPI及びそれらの組合せからなる群から選択される、好ましくは、Alexa Fluor(商標)350、Cy5(商標)、好ましくは、スルホ-Cy5、プロダン、Alexa Fluor(商標)405、Seta色素、好ましくは、Seta 650、SeTau色素、好ましくは、SeTau 647、Alexa Fluor 488、MB660R、ATTO647及びDAPI及びそれらの誘導体及び組合せからなる群から選択される、より好ましくは、Alexa Fluor(商標)350-NHSエステル、スルホ-Cy5酸、プロダン、Alexa Fluor(商標)405-DBCO、Seta 650-DBCO、SeTau 647-マレイミド、Alexa Fluor 488酸、MB660R-酸、MB660R-DBCO、ATTO647酸及びDAPI及びそれらの組合せからなる群から選択される。更により詳しくは、前記少なくとも1つの蛍光色素は、キサンテンベースの色素からなる群から選択されうる、好ましくは、ローダミン色素、フルオレセイン色素及びカーボピロニンベースの色素、クマリンベースの色素、シアニンベースの色素、ナフタレンベースの色素、ピレンベースの色素、スクアラインベースの色素、スクアラインロタキサンベースの色素及びDAPI及びそれらの組合せからなる群から選択される、好ましくは、Alexa Fluor(商標)350、Cy5(商標)、好ましくは、スルホ-Cy5、プロダン、Alexa Fluor(商標)405、Seta色素、好ましくは、Seta 650、SeTau色素、好ましくは、SeTau 647、Alexa Fluor 488、MB660R及びDAPI及びそれらの誘導体及び組合せからなる群から選択される、より好ましくは、Alexa Fluor(商標)350-NHSエステル、スルホ-Cy5酸、プロダン、Alexa Fluor(商標)405-DBCO、Seta 650-DBCO、SeTau 647-マレイミド、Alexa Fluor 488酸、MB660R-酸、MB660R-DBCO及びDAPI及びそれらの組合せからなる群から選択される。

【0167】

別の特定の実施形態では、目的の微生物又は微生物の群は、好ましくは、カンジダ属、ザイゴサッカロミセス属、アスペルギルス属、サッカロミセス属、ゲオトリクム属及びペニシリウム属及びそれらの組合せに属する真菌から選択される、より好ましくは、カンジダ・アルビカンス、ザイゴサッカロミセス・バイリー、アスペルギルス・ブラジリエンシス、サッカロミセス・セレビシエ、ジオトリクム・カンディダム、ペニシリウム・バリオティー、ペニシリウム・クリソゲナム及びそれらの組合せからなる群から選択される、上記で定義されるような酵母及びカビの群に属する微生物に属するか、又はそれを含み、前記少なくとも1つの蛍光色素は、キサンテンベースの色素からなる群から選択される、好ましくは、ローダミン色素、フルオレセイン色素及びカーボピロニンベースの色素、クマリンベースの色素、シアニンベースの色素、ジピロメテンベースの色素、ナフタレンベースの色素、ピレンベースの色素、スクアラインベースの色素及びスクアラインロタキサンベースの色素及びそれらの組合せからなる群から選択される、好ましくは、Alexa Fluor(商標)350、Pacific Blue、Cy5(商標)、好ましくは、スルホ-Cy5、プロダン、Alexa Fluor(商標)405、Cascade Blue、BODIPY 500/510、Seta色素、好ましくは、Seta 650、SeTau色素、好ましくは、SeTau 647又はSeTau 488、Alexa Fluor 488及びMB660R及びそれらの誘導体及び組合せからなる群から選択される、より好ましくは、Alexa Fluor(商標)350-NHSエステル、Pacific Blue-NHSエステル、スルホ-Cy5酸、プロダン、Alexa Fluor(商標)405-DBCO、Cascade Blue、BODIPY 500/510、Seta 650-DBCO、SeTau 647-マレイミド、SeTau 488-NHS、Alexa Fluor 488酸、MB660R-酸及びMB660R-DBCO及びそれらの組合せからなる群から選択される。

【0168】

好ましい実施形態では、目的の微生物又は微生物の群は、好ましくは、カンジダ属、ザイゴサッカロミセス属、アスペルギルス属、サッカロミセス属、ゲオトリクム属及びペニシリウム属及びそれらの組合せに属する真菌から選択される、より好ましくは、カンジダ・アルビカンス、ザイゴサッカロミセス・バイリー、アスペルギルス・ブラジリエンシス、サッカロミセス・セレビシエ、ジオトリクム・カンディダム、ペニシリウム・バリオティー、ペニシリウム・クリソゲナム及びそれらの組合せからなる群から選択される、上記で定義されるような酵母及びカビの群に属する微生物に属するか、又はそれを含み、前記少なくとも1つの蛍光色素は、MB660R及び誘導体及びそれらの組合せからなる群から選択される、より好ましくは、MB660R-DBCOである。

【0169】

別の特定の実施形態では、目的の微生物又は微生物の群は、
- 好ましくは、好熱性好酸性菌(TAB)、酢酸菌(AAB)、乳酸菌(LAB)、嫌気性菌、好気性中温性菌、グラム陰性菌及びグラム陽性菌及びそれらの組合せの上記で定義されるような群から選択される1つ又はいくつかの細菌、並びに
- 好ましくは、上記で定義されるような酵母及びカビから選択される1つ又はいくつかのミクロ菌
を含み、
前記少なくとも1つの蛍光色素は、キサンテンベースの色素からなる群から選択される、好ましくは、ローダミン色素、フルオレセイン色素及びカーボピロニンベースの色素、クマリンベースの色素、シアニンベースの色素、ピレンベースの色素、スクアラインベースの色素及びスクアラインロタキサンベースの色素及びそれらの組合せからなる群から選択される、好ましくは、Alexa Fluor(商標)350、Cy5(商標)、好ましくは、スルホ-Cy5、Alexa Fluor(商標)405、Seta色素、好ましくは、Seta 650、SeTau色素、好ましくは、SeTau 647、Alexa Fluor 488及びMB660R及びそれらの誘導体及び組合せからなる群から選択される、より好ましくは、Alexa Fluor(商標)350-NHSエステル、スルホ-Cy5酸、Alexa Fluor(商標)405-DBCO、Seta 650-DBCO、SeTau 647-マレイミド、Alexa Fluor 488酸、MB660R-酸及びMB660R-DBCO及びそれらの組合せからなる群から選択される、更により好ましくは、スルホ-Cy5酸及びMB660R-DBCO及びそれらの組合せからなる群から選択される。特に、前記少なくとも1つの蛍光色素は、スルホ-Cy5酸及びMB660R-DBCOの組合せでありうる。

【0170】

好ましくは、この実施形態では、目的の微生物又は微生物の群は、アリシクロバチルス属(例えば、アリシクロバチルス・アシドテレストリス、アリシクロバチルス・アシドカルダリウス、アリシクロバチルス・アシディフィラス、アリシクロバチルス・シクロヘプタニカス、アリシクロバチルス・ヘスペリダム、アリシクロバチルス・ハーバリウス、アリシクロバチルス・コンタミナンス)、アセトバクター属(例えば、アセトバクター・アセチ)、グルコノアセトバクター属(例えば、グルコノアセトバクター・リクファシエンス)、グルコノバクター属(例えば、グルコノバクター・オキシダンス)、アサイア属(例えば、アサイア・サイアメンシス)、ラクトバチルス属(例えば、ラクトバチルス・カゼイ、ラクトバチルス・プランタルム)、ワイセラ属(例えば、ワイセラ・コンフューザ)、クロストリジウム属(例えば、クロストリジウム・スポロゲネス)、キューティバクテリウム属(例えば、キューティバクテリウム・アクネス)、メチロバクテリウム属(例えば、メチロバクテリウム・エキストロクエンス)、シュードモナス属(例えば、緑膿菌)、バチルス属(例えば、枯草菌)、エシェリキア属(例えば、大腸菌)、スタフィロコッカス属(例えば、黄色ブドウ球菌)、アシネトバクター属(例えば、アシネトバクター・バウマンニ)、クロノバクター属(例えば、クロノバクター・サカザキ)、クレブシエラ属(例えば、肺炎桿菌)、サルモネラ属(例えば、ネズミチフス菌)、エンテロコッカス属(例えば、フェカリス菌)、リステリア属(例えば、リステリア・グレイ)、シゲラ属(例えば、ソンネ菌)、コクリア属(例えば、コクリア・リゾフィラ)、バークホルデリア属(例えば、セパシア菌)に属する細菌、並びにカンジダ属(例えば、カンジダ・アルビカンス)、ザイゴサッカロミセス属(例えば、ザイゴサッカロミセス・バイリー)、アスペルギルス属(例えば、アスペルギルス・ブラジリエンシス)、ゲオトリクム属(ゲオトリクム・カンディダム)、サッカロミセス属(例えば、サッカロミセス・セレビシエ)及びペニシリウム属(例えば、ペニシリウム・バリオティー、ペニシリウム・クリソゲナム)及びそれらの組合せに属する真菌からなる群から選択される。

【0171】

より好ましくは、この実施形態では、目的の微生物又は微生物の群は、アリシクロバチルス・アシドテレストリス、アリシクロバチルス・アシドカルダリウス、アリシクロバチルス・アシディフィラス、アリシクロバチルス・シクロヘプタニカス、アリシクロバチルス・ヘスペリダム、アリシクロバチルス・ハーバリウス、アリシクロバチルス・コンタミナンス、アセトバクター・アセチ、グルコノアセトバクター・リクファシエンス、グルコノバクター・オキシダンス、アサイア・サイアメンシス、ラクトバチルス・カゼイ、ラクトバチルス・プランタルム、ワイセラ・コンフューザ、クロストリジウム・スポロゲネス、キューティバクテリウム・アクネス、メチロバクテリウム・エキストロクエンス、緑膿菌、枯草菌、大腸菌、黄色ブドウ球菌、アシネトバクター・バウマンニ、クロノバクター・サカザキ、肺炎桿菌、ネズミチフス菌、フェカリス菌、リステリア・グレイ、ソンネ菌、コクリア・リゾフィラ、セパシア菌、カンジダ・アルビカンス、ザイゴサッカロミセス・バイリー、アスペルギルス・ブラジリエンシス、サッカロミセス・セレビシエ、ジオトリクム・カンディダム、ペニシリウム・バリオティー及びペニシリウム・クリソゲナム及びそれらの組合せからなる群から選択される。

【0172】

より好ましくは、この実施形態では、目的の微生物又は微生物の群は、ワイセラ属(例えば、ワイセラ・コンフューザ)、キューティバクテリウム属(例えば、キューティバクテリウム・アクネス)、メチロバクテリウム属(例えば、メチロバクテリウム・エキストロクエンス)、エンテロコッカス属(例えば、フェカリス菌)に属する細菌、並びにカンジダ属(例えば、カンジダ・アルビカンス)及びアスペルギルス属(例えば、アスペルギルス・ブラジリエンシス)及びそれらの組合せに属する真菌からなる群から選択される、特に、ワイセラ・コンフューザ、キューティバクテリウム・アクネス、メチロバクテリウム・エキストロクエンス、フェカリス菌、カンジダ・アルビカンス及びアスペルギルス・ブラジリエンシス及びそれらの組合せからなる群から選択される。

【0173】

別の特定の実施形態では、目的の微生物又は微生物の群は、
- 好ましくは、好熱性好酸性菌(TAB)、酢酸菌(AAB)、乳酸菌(LAB)、嫌気性菌、好気性中温性菌、グラム陰性菌及びグラム陽性菌、従属栄養細菌及びそれらの組合せの上記で定義されるような群から選択される1つ又はいくつかの細菌、並びに
- 好ましくは、上記で定義されるような酵母及びカビから選択される1つ又はいくつかのミクロ菌
を含み、
前記少なくとも1つの蛍光色素は、キサンテンベースの色素からなる群から選択される、好ましくは、ローダミン色素、フルオレセイン色素及びカーボピロニンベースの色素、クマリンベースの色素、シアニンベースの色素、ピレンベースの色素、スクアラインベースの色素及びスクアラインロタキサンベースの色素及びそれらの組合せからなる群から選択される、好ましくは、Alexa Fluor(商標)350、Pacific blue(商標)、Cy5(商標)、好ましくは、スルホ-Cy5、Alexa Fluor(商標)405、Cascade blue(商標)、Seta色素、好ましくは、Seta 650、SeTau色素、好ましくは、SeTau 647又はSeTau 488、Alexa Fluor 488及びMB660R及びそれらの誘導体及び組合せからなる群から選択される、より好ましくは、Alexa Fluor(商標)350-NHSエステル、Pacific blue(商標)-NHSエステル、スルホ-Cy5酸、Alexa Fluor(商標)405-DBCO、Cascade blue(商標)、Seta 650-DBCO、SeTau 488-NHS、SeTau 647-マレイミド、Alexa Fluor 488酸、MB660R-酸及びMB660R-DBCO及びそれらの組合せからなる群から選択される、更により好ましくは、スルホ-Cy5酸及びMB660R-DBCO及びそれらの組合せからなる群から選択される。特に、前記少なくとも1つの蛍光色素は、スルホ-Cy5酸及びMB660R-DBCOの組合せでありうる。

【0174】

好ましくは、この実施形態では、目的の微生物又は微生物の群は、アリシクロバチルス属(例えば、アリシクロバチルス・アシドテレストリス、アリシクロバチルス・アシドカルダリウス、アリシクロバチルス・アシディフィラス、アリシクロバチルス・シクロヘプタニカス、アリシクロバチルス・ヘスペリダム、アリシクロバチルス・ハーバリウス、アリシクロバチルス・コンタミナンス)、アセトバクター属(例えば、アセトバクター・アセチ)、グルコノアセトバクター属(例えば、グルコノアセトバクター・リクファシエンス)、グルコノバクター属(例えば、グルコノバクター・オキシダンス)、アサイア属(例えば、アサイア・サイアメンシス)、ラクトバチルス属(例えば、ラクトバチルス・カゼイ、ラクトバチルス・プランタルム)、ワイセラ属(例えば、ワイセラ・コンフューザ)、クロストリジウム属(例えば、クロストリジウム・スポロゲネス)、キューティバクテリウム属(例えば、キューティバクテリウム・アクネス)、メチロバクテリウム属(例えば、メチロバクテリウム・エキストロクエンス)、シュードモナス属(例えば、緑膿菌)、バチルス属(例えば、枯草菌)、エシェリキア属(例えば、大腸菌)、スタフィロコッカス属(例えば、黄色ブドウ球菌)、アシネトバクター属(例えば、アシネトバクター・バウマンニ)、クロノバクター属(例えば、クロノバクター・サカザキ)、クレブシエラ属(例えば、肺炎桿菌)、サルモネラ属(例えば、ネズミチフス菌)、エンテロコッカス属(例えば、フェカリス菌)、リステリア属(例えば、リステリア・グレイ)、シゲラ属(例えば、ソンネ菌)、コクリア属(例えば、コクリア・リゾフィラ)、バークホルデリア属(例えば、セパシア菌)、エロモナス属(例えば、エロモナス・ハイドロフィラ)、ブレブンディモナス属(例えば、ブレブンディモナス・ディミヌタ)、シトロバクター属(例えば、シトロバクター・フロインディー)、エドワージエラ属(例えば、エドワージエラ・タルダ)、エンテロバクター属(例えば、エンテロバクター・エロゲネス)、オクロバクテリウム属(例えば、オクロバクテリウム・アンスロピック)、モラクセラ属(例えば、モラクセラ・オスロエンシス)、パンテア属(例えば、パンテア・アグロメランス)、プロテウス属(例えば、プロテウス・ミラビリス)、ラルストニア属(例えば、ラルストニア・ピッケティ)、セラチア属(例えば、セラチア・マルセセンス)、スフィンゴモナス属(例えば、スフィンゴモナス・パウシモビリス)、ステノトロホモナス属(例えば、ステノトロホモナス・マルトフィリア)、ビブリオ属(例えば、腸炎ビブリオ菌)、エルシニア属(例えば、エルシニア・エンテロコリチカ)及びそれらの組合せに属する細菌からなる群から選択される。

【0175】

より好ましくは、この実施形態では、目的の微生物又は微生物の群は、アリシクロバチルス・アシドテレストリス、アリシクロバチルス・アシドカルダリウス、アリシクロバチルス・アシディフィラス、アリシクロバチルス・シクロヘプタニカス、アリシクロバチルス・ヘスペリダム、アリシクロバチルス・ハーバリウス、アリシクロバチルス・コンタミナンス、アセトバクター・アセチ、グルコノアセトバクター・リクファシエンス、グルコノバクター・オキシダンス、アサイア・サイアメンシス、ラクトバチルス・カゼイ、ラクトバチルス・プランタルム、ワイセラ・コンフューザ、クロストリジウム・スポロゲネス、キューティバクテリウム・アクネス、メチロバクテリウム・エキストロクエンス、緑膿菌、枯草菌、大腸菌、黄色ブドウ球菌、アシネトバクター・バウマンニ、クロノバクター・サカザキ、肺炎桿菌、ネズミチフス菌、フェカリス菌、リステリア・グレイ、ソンネ菌、コクリア・リゾフィラ、セパシア菌、エロモナス・ハイドロフィラ、ブレブンディモナス・ディミヌタ、シトロバクター・フロインディー、エドワージエラ・タルダ、エンテロバクター・エロゲネス、オクロバクテリウム・アンスロピック、モラクセラ・オスロエンシス、パンテア・アグロメランス、プロテウス・ミラビリス、ラルストニア・ピッケティ、セラチア・マルセセンス、スフィンゴモナス・パウシモビリス、ステノトロホモナス・マルトフィリア、腸炎ビブリオ菌、エルシニア・エンテロコリチカ、カンジダ・アルビカンス、ザイゴサッカロミセス・バイリー、アスペルギルス・ブラジリエンシス、サッカロミセス・セレビシエ、ジオトリクム・カンディダム、ペニシリウム・バリオティー及びペニシリウム・クリソゲナム及びそれらの組合せからなる群から選択される。

【0176】

更により好ましくは、この実施形態では、目的の微生物又は微生物の群は、アリシクロバチルス・アシドテレストリス、アリシクロバチルス・アシドカルダリウス、アリシクロバチルス・アシディフィラス、アリシクロバチルス・シクロヘプタニカス、アリシクロバチルス・ヘスペリダム、アリシクロバチルス・ハーバリウス、アリシクロバチルス・コンタミナンス、アセトバクター・アセチ、グルコノアセトバクター・リクファシエンス、グルコノバクター・オキシダンス、アサイア・サイアメンシス、ラクトバチルス・カゼイ、ラクトバチルス・プランタルム、ワイセラ・コンフューザ、クロストリジウム・スポロゲネス、キューティバクテリウム・アクネス、メチロバクテリウム・エキストロクエンス、緑膿菌、枯草菌、大腸菌、黄色ブドウ球菌、アシネトバクター・バウマンニ、クロノバクター・サカザキ、肺炎桿菌、ネズミチフス菌、フェカリス菌、ソンネ菌、コクリア・リゾフィラ、セパシア菌、エロモナス・ハイドロフィラ、ブレブンディモナス・ディミヌタ、シトロバクター・フロインディー、エドワージエラ・タルダ、エンテロバクター・エロゲネス、オクロバクテリウム・アンスロピック、モラクセラ・オスロエンシス、パンテア・アグロメランス、プロテウス・ミラビリス、ラルストニア・ピッケティ、セラチア・マルセセンス、スフィンゴモナス・パウシモビリス、ステノトロホモナス・マルトフィリア、エルシニア・エンテロコリチカ、カンジダ・アルビカンス、ザイゴサッカロミセス・バイリー、アスペルギルス・ブラジリエンシス、サッカロミセス・セレビシエ、ジオトリクム・カンディダム、ペニシリウム・バリオティー及びペニシリウム・クリソゲナム及びそれらの組合せからなる群から選択される。

【0177】

- 微生物がTable 1(表1)に定義される微生物Aであるか、又は目的の微生物の群がTable 1(表1)に定義される微生物Aを含み、
- 前記少なくとも1つの蛍光色素がTable 1(表1)に定義される蛍光色素Bである
本発明の方法の任意の実施形態が本明細書において開示される。

【0178】

試料が濾過メンブレン上で濾過される実施形態では、前記濾過メンブレンは、好ましくは、Table 1(表1)で定義されるメンブレンCである。

【0179】

Table 1(表1)の微生物、蛍光色素及び任意選択で、メンブレンの各組合せが具体的に開示されている。したがって、例証として、任意選択で、PVDFメンブレン上での濾過後に試料中のアリシクロバチルス・アシドテレストリスを検出する又は数え上げるためのAlexa Fluor 488酸の使用、又は任意選択で、MCEメンブレン上での濾過後に試料中のアセトバクター・アセチを検出する又は数え上げるためのDAPIの使用が本明細書において具体的に開示される。

【0180】

【表1A】

【0181】

【表1B】

【0182】

【表1C】

【0183】

【表1D】

【0184】

【表1E】

【0185】

一部の実施形態では、目的の微生物又は微生物の群は、アリシクロバチルス・アシドテレストリス、アリシクロバチルス・アシディフィラス、アセトバクター・アセチ、グルコノアセトバクター・リクファシエンス、グルコノバクター・オキシダンス、アサイア・サイアメンシス、ラクトバチルス・カゼイ、ラクトバチルス・プランタルム、ワイセラ・コンフューザ、ザイゴサッカロミセス・バイリー、アスペルギルス・ブラジリエンシス、サッカロミセス・セレビシエ、大腸菌及び黄色ブドウ球菌及びそれらの組合せからなる群から選択される微生物に属するか、又はそれを含み、前記少なくとも1つの蛍光色素は、Alexa Fluor 488又はその誘導体、好ましくは、Alexa Fluor 488酸である。

【0186】

一部の実施形態では、目的の微生物又は微生物の群は、アリシクロバチルス・アシドテレストリス、アリシクロバチルス・アシディフィラス、アセトバクター・アセチ、グルコノアセトバクター・リクファシエンス、アサイア・サイアメンシス、ラクトバチルス・カゼイ、ラクトバチルス・プランタルム及び大腸菌及びそれらの組合せからなる群から選択される微生物に属するか、又はそれを含み、前記少なくとも1つの蛍光色素は、Alexa Fluor 488又はその誘導体、好ましくは、Alexa Fluor 488-DBCOである。

【0187】

一部の実施形態では、目的の微生物又は微生物の群は、アリシクロバチルス・アシドテレストリス、アリシクロバチルス・アシドカルダリウス、アリシクロバチルス・アシディフィラス、アリシクロバチルス・シクロヘプタニカス、アリシクロバチルス・ヘスペリダム、アリシクロバチルス・ハーバリウス、アリシクロバチルス・コンタミナンス、アセトバクター・アセチ、グルコノアセトバクター・リクファシエンス、グルコノバクター・オキシダンス、アサイア・サイアメンシス、ラクトバチルス・カゼイ、ラクトバチルス・プランタルム、ワイセラ・コンフューザ、ザイゴサッカロミセス・バイリー、アスペルギルス・ブラジリエンシス、カンジダ・アルビカンス、サッカロミセス・セレビシエ、ペニシリウム・バリオティー、ペニシリウム・クリソゲナム、ゲオトリクム・カンディダム、キューティバクテリウム・アクネス、クロストリジウム・スポロゲネス、メチロバクテリウム・エキストロクエンス、緑膿菌、枯草菌、大腸菌、黄色ブドウ球菌、アシネトバクター・バウマンニ、クロノバクター・サカザキ、肺炎桿菌、ネズミチフス菌、フェカリス菌、ソンネ菌、コクリア・リゾフィラ、セパシア菌、ラルストニア・ピッケティ、ブレブンディモナス・ディミヌタ、エロモナス・ハイドロフィラ、シュードモナス・フルオレッセンス、シトロバクター・フロインディー、エンテロバクター・エロゲネス、パンテア・アグロメランス、ステノトロホモナス・マルトフィリア、セラチア・マルセセンス、エルシニア・エンテロコリチカ、エドワージエラ・タルダ、モラクセラ・オスロエンシス、オクロバクテリウム・アンスロピ、プロテウス・ミラビリス、スフィンゴモナス・パウシモビリス及びネズミチフス菌及びそれらの組合せからなる群から選択される微生物に属するか、又はそれを含み、前記少なくとも1つの蛍光色素は、MB660R又はその誘導体、好ましくは、MB660R-酸及び/又はMB660R-DBCOである。

【0188】

一部の実施形態では、目的の微生物又は微生物の群は、アリシクロバチルス・アシドテレストリス、アリシクロバチルス・アシディフィラス、アリシクロバチルス・シクロヘプタニカス、アリシクロバチルス・ヘスペリダム、アリシクロバチルス・ハーバリウス、アリシクロバチルス・コンタミナンス、アセトバクター・アセチ、グルコノアセトバクター・リクファシエンス、グルコノバクター・オキシダンス、アサイア・サイアメンシス、ラクトバチルス・カゼイ、ラクトバチルス・プランタルム、ワイセラ・コンフューザ、ザイゴサッカロミセス・バイリー、アスペルギルス・ブラジリエンシス、サッカロミセス・セレビシエ、大腸菌及び黄色ブドウ球菌及びそれらの組合せからなる群から選択される微生物に属するか、又はそれを含み、前記少なくとも1つの蛍光色素は、MB660R又はその誘導体、好ましくは、MB660R-酸である。

【0189】

一部の実施形態では、目的の微生物又は微生物の群は、アリシクロバチルス・アシドテレストリス、アリシクロバチルス・アシドカルダリウス、アリシクロバチルス・アシディフィラス、アリシクロバチルス・シクロヘプタニカス、アリシクロバチルス・ヘスペリダム、アリシクロバチルス・ハーバリウス、アリシクロバチルス・コンタミナンス、アセトバクター・アセチ、グルコノアセトバクター・リクファシエンス、グルコノバクター・オキシダンス、ラクトバチルス・プランタルム、ワイセラ・コンフューザ、ザイゴサッカロミセス・バイリー、アスペルギルス・ブラジリエンシス、カンジダ・アルビカンス、サッカロミセス・セレビシエ、ペニシリウム・バリオティー、ペニシリウム・クリソゲナム、ゲオトリクム・カンディダム、キューティバクテリウム・アクネス、クロストリジウム・スポロゲネス、メチロバクテリウム・エキストロクエンス、緑膿菌、枯草菌、大腸菌、黄色ブドウ球菌、アシネトバクター・バウマンニ、クロノバクター・サカザキ、肺炎桿菌、ネズミチフス菌、フェカリス菌、ソンネ菌、コクリア・リゾフィラ、セパシア菌、ラルストニア・ピッケティ、ブレブンディモナス・ディミヌタ、エロモナス・ハイドロフィラ、シュードモナス・フルオレッセンス、シトロバクター・フロインディー、エンテロバクター・エロゲネス、パンテア・アグロメランス、ステノトロホモナス・マルトフィリア、セラチア・マルセセンス、エルシニア・エンテロコリチカ、エドワージエラ・タルダ、モラクセラ・オスロエンシス、オクロバクテリウム・アンスロピ、プロテウス・ミラビリス、スフィンゴモナス・パウシモビリス及びネズミチフス菌及びそれらの組合せからなる群から選択される微生物に属するか、又はそれを含み、前記少なくとも1つの蛍光色素は、MB660R又はその誘導体、好ましくは、MB660R-DBCOである。任意選択で、前記少なくとも1つの蛍光色素は、Cy5、好ましくは、スルホCy-5又はその誘導体、好ましくは、スルホCy5酸を更に含む。

【0190】

一部の実施形態では、目的の微生物又は微生物の群は、アリシクロバチルス・アシドテレストリス、アリシクロバチルス・アシドカルダリウス、アリシクロバチルス・アシディフィラス、アリシクロバチルス・シクロヘプタニカス、アリシクロバチルス・ヘスペリダム、アリシクロバチルス・ハーバリウス、アリシクロバチルス・コンタミナンス、アセトバクター・アセチ、グルコノアセトバクター・リクファシエンス、グルコノバクター・オキシダンス、ラクトバチルス・プランタルム、ワイセラ・コンフューザ、ザイゴサッカロミセス・バイリー、アスペルギルス・ブラジリエンシス、カンジダ・アルビカンス、サッカロミセス・セレビシエ、ペニシリウム・バリオティー、ペニシリウム・クリソゲナム、ゲオトリクム・カンディダム、メチロバクテリウム・エキストロクエンス、緑膿菌、枯草菌、大腸菌、黄色ブドウ球菌、アシネトバクター・バウマンニ、クロノバクター・サカザキ、肺炎桿菌、ネズミチフス菌、フェカリス菌、ソンネ菌、コクリア・リゾフィラ及びセパシア菌及びそれらの組合せからなる群から選択される微生物に属するか、又はそれを含み、前記少なくとも1つの蛍光色素は、MB660R又はその誘導体、好ましくは、MB660R-DBCOである。

【0191】

一部の実施形態では、目的の微生物又は微生物の群は、キューティバクテリウム・アクネス、クロストリジウム・スポロゲネス、アシネトバクター・バウマンニ、肺炎桿菌、ソンネ菌、セパシア菌、ラルストニア・ピッケティ、ブレブンディモナス・ディミヌタ、エロモナス・ハイドロフィラ、シュードモナス・フルオレッセンス、シトロバクター・フロインディー、エンテロバクター・エロゲネス、パンテア・アグロメランス、ステノトロホモナス・マルトフィリア、セラチア・マルセセンス、エルシニア・エンテロコリチカ、エドワージエラ・タルダ、モラクセラ・オスロエンシス、オクロバクテリウム・アンスロピ、プロテウス・ミラビリス、スフィンゴモナス・パウシモビリス及びネズミチフス菌及びそれらの組合せからなる群から選択される微生物に属するか、又はそれを含み、前記少なくとも1つの蛍光色素は、MB660R又はその誘導体及びCy5、好ましくは、スルホCy-5又はその誘導体の組合せ、好ましくは、MB660R-DBCO及びスルホCy5酸の組合せである。

【0192】

一部の実施形態では、目的の微生物又は微生物の群は、アリシクロバチルス・アシドテレストリス、アリシクロバチルス・アシディフィラス、アセトバクター・アセチ、グルコノアセトバクター・リクファシエンス、グルコノバクター・オキシダンス、アサイア・サイアメンシス、ラクトバチルス・プランタルム、ワイセラ・コンフューザ、大腸菌及び黄色ブドウ球菌及びそれらの組合せからなる群から選択される微生物に属するか、又はそれを含み、前記少なくとも1つの蛍光色素は、ATTO647又はその誘導体、好ましくは、ATTO647酸である。

【0193】

一部の実施形態では、目的の微生物又は微生物の群は、アセトバクター・アセチ、グルコノアセトバクター・リクファシエンス、グルコノバクター・オキシダンス、ラクトバチルス・カゼイ、ラクトバチルス・プランタルム、ワイセラ・コンフューザ、ザイゴサッカロミセス・バイリー、サッカロミセス・セレビシエ、クロストリジウム・スポロゲネス、メチロバクテリウム・エキストロクエンス、緑膿菌、大腸菌、黄色ブドウ球菌、肺炎桿菌、フェカリス菌、セパシア菌及びプロテウス・ミラビリス及びそれらの組合せからなる群から選択される微生物に属するか、又はそれを含み、前記少なくとも1つの蛍光色素はDAPIである。

【0194】

一部の実施形態では、目的の微生物又は微生物の群は、アスペルギルス・ブラジリエンシス、カンジダ・アルビカンス、メチロバクテリウム・エキストロクエンス、緑膿菌、枯草菌、大腸菌、黄色ブドウ球菌、アシネトバクター・バウマンニ、セパシア菌、ラルストニア・ピッケティ、ブレブンディモナス・ディミヌタ及びエロモナス・ハイドロフィラ及びそれらの組合せからなる群から選択される微生物に属するか、又はそれを含み、前記少なくとも1つの蛍光色素は、Alexa Fluor 350又はその誘導体、好ましくは、Alexa Fluor 350-NHSエステルである。任意選択で、前記少なくとも1つの蛍光色素は、Alexa Fluor 405又はその誘導体、好ましくは、Alexa Fluor 405-DBCOを更に含む。

【0195】

一部の実施形態では、目的の微生物又は微生物の群は、アスペルギルス・ブラジリエンシス、カンジダ・アルビカンス、キューティバクテリウム・アクネス、クロストリジウム・スポロゲネス、メチロバクテリウム・エキストロクエンス、緑膿菌、枯草菌、大腸菌、黄色ブドウ球菌、アシネトバクター・バウマンニ、肺炎桿菌、フェカリス菌、ソンネ菌、セパシア菌、ラルストニア・ピッケティ、ブレブンディモナス・ディミヌタ、エロモナス・ハイドロフィラ、シュードモナス・フルオレッセンス、シトロバクター・フロインディー、エンテロバクター・エロゲネス、パンテア・アグロメランス、ステノトロホモナス・マルトフィリア、セラチア・マルセセンス、エルシニア・エンテロコリチカ、エドワージエラ・タルダ、モラクセラ・オスロエンシス、オクロバクテリウム・アンスロピ、プロテウス・ミラビリス、スフィンゴモナス・パウシモビリス及びネズミチフス菌及びそれらの組合せからなる群から選択される微生物に属するか、又はそれを含み、前記少なくとも1つの蛍光色素は、Cy5、好ましくは、スルホ-Cy5又はその誘導体、好ましくは、スルホCy5酸である。任意選択で、前記少なくとも1つの蛍光色素は、MB660R又はその誘導体、好ましくは、MB660R-DBCOを更に含む。

【0196】

一部の実施形態では、目的の微生物又は微生物の群は、アスペルギルス・ブラジリエンシス、カンジダ・アルビカンス、メチロバクテリウム・エキストロクエンス、緑膿菌、枯草菌、大腸菌、黄色ブドウ球菌及びフェカリス菌及びそれらの組合せからなる群から選択される微生物に属するか、又はそれを含み、前記少なくとも1つの蛍光色素は、Cy5、好ましくは、スルホ-Cy5又はその誘導体、好ましくは、スルホCy5酸である。

【0197】

一部の実施形態では、目的の微生物又は微生物の群は、大腸菌に属するか、又はそれを含み、前記少なくとも1つの蛍光色素は、Cy5.5、好ましくは、スルホ-Cy5.5又はその誘導体、好ましくは、スルホCy5.5酸である。

【0198】

一部の実施形態では、目的の微生物又は微生物の群は、アスペルギルス・ブラジリエンシス、カンジダ・アルビカンス、メチロバクテリウム・エキストロクエンス、緑膿菌、枯草菌、大腸菌、黄色ブドウ球菌、アシネトバクター・バウマンニ、セパシア菌、ラルストニア・ピッケティ、ブレブンディモナス・ディミヌタ及びエロモナス・ハイドロフィラ及びそれらの組合せからなる群から選択される微生物に属するか、又はそれを含み、前記少なくとも1つの蛍光色素は、Alexa Fluor 405又はその誘導体、好ましくは、Alexa Fluor 405-DBCOである。任意選択で、前記少なくとも1つの蛍光色素は、Alexa Fluor 350又はその誘導体、好ましくは、Alexa Fluor 350-NHSエステルを更に含む。

【0199】

一部の実施形態では、目的の微生物又は微生物の群は、アスペルギルス・ブラジリエンシス及び大腸菌及びそれらの組合せからなる群から選択される微生物に属するか、又はそれを含み、前記少なくとも1つの蛍光色素はアクリジンオレンジである。

【0200】

一部の実施形態では、目的の微生物又は微生物の群は、アスペルギルス・ブラジリエンシス、カンジダ・アルビカンス及び大腸菌及びそれらの組合せからなる群から選択される微生物に属するか、又はそれを含み、前記少なくとも1つの蛍光色素は、Bodipy 500/510、Alexa Fluor 350又はその誘導体、好ましくは、Alexa Fluor 350-NHSエステル、Pacific blue又はその誘導体、好ましくは、Pacific blue-NHSエステル、プロダン、Alexa Fluor 405又はその誘導体、好ましくは、Alexa Fluor 405-DBCO、Cascade Blue、Seta 650又はその誘導体、好ましくは、Seta 650-DBCO、Setau 488又はその誘導体、好ましくは、Setau 488-NHS、Setau 647又はその誘導体、好ましくは、Setau 647-マレイミド及びそれらの任意の組合せからなる群から選択される。

【0201】

一部の実施形態では、目的の微生物又は微生物の群は、カンジダ・アルビカンス及び大腸菌及びそれらの組合せからなる群から選択される微生物に属するか、又はそれを含み、前記少なくとも1つの蛍光色素は、Seta 375又はその誘導体、好ましくは、Seta 375-NHSである。

【0202】

一部の実施形態では、目的の微生物又は微生物の群は、大腸菌及びフェカリス菌及びそれらの組合せからなる群から選択される微生物に属するか、又はそれを含み、前記少なくとも1つの蛍光色素はDRAQ5である。

【0203】

一部の実施形態では、目的の微生物又は微生物の群は、大腸菌に属するか、又はそれを含み、前記少なくとも1つの蛍光色素はCytrak Orangeである。

【0204】

蛍光色素を含む溶液は、前記培地を容器(contained)中に注ぎ入れる前に増殖培地中に組み込むことができる、又は固体増殖培地の表面に注ぐ又は画線することができる。好ましくは、蛍光色素を、前記増殖培地を試料と接触させる前又は後に固体増殖培地の表面に注ぐ又は画線する。工程a)の前に試料がメンブレンフィルター上で濃縮されている実施形態では、蛍光色素を固体増殖培地の表面上に注ぐ(均一に又は液滴として)ことができ、次いで、メンブレンフィルターを前記増殖培地の表面上に置き、それによって、増殖培地及び蛍光色素の両方を接触させることができる。或いは、蛍光色素をメンブレン上での濾過/濃縮の前に試料に添加することができる、又は試料の濾過の前若しくは後に、好ましくは、試料の濾過後に同一メンブレン上で濾過することができる。次いで、メンブレンフィルターを前記増殖培地の表面上に置くことができる。

【0205】

各蛍光色素の濃度及び容量は、当業者によって容易に調整されうる。通常、蛍光色素は、1μM～1mMの範囲の、好ましくは、1μM～500μMの範囲の、好ましくは、5μM～250μMの範囲の濃度で使用される。蛍光色素が固体増殖培地の表面上に注がれ、次いで、メンブレンフィルター(47mm)が前記増殖培地の表面上に置かれる実施形態では、蛍光色素を含有する液滴の容量は通常、100μLから300μLの間、好ましくは、150μLから200μLの間である。

【0206】

インキュベーションの条件及び時間
本発明の方法の工程b)では、上記で定義されるような試料、増殖培地及び少なくとも1つの蛍光色素を含む容器が、目的の微生物又は微生物の群の微小コロニーを形成するのに十分な条件下で、及び時間の間インキュベートされる。したがって、微生物の増殖は、蛍光色素の存在下で実施される。

【0207】

本明細書で使用される場合、「微小コロニー」という用語は、微生物に応じて数時間又は数日間増殖した、裸眼では不可視であるか、又はかろうじて可視であるコロニーを指す。通常、微小コロニーのサイズは、500μm未満、好ましくは、10μm～200μmの間である。

【0208】

微小コロニーを得るために必要なインキュベーション時間は、微生物に、特に微生物の生成時間に応じて変わる。このインキュベーション時間は、目的の微生物又は微生物の群及び生成時間に影響を及ぼすパラメータ、例えば、温度及び増殖培地の種類に応じて当業者によって容易に調整できる。通常、インキュベーション時間は、3時間～96時間の範囲である。増殖培地又はメンブレンフィルターの表面は、インキュベーション時間を調整するために1つ又はそれより多い特定の波長で蛍光顕微鏡又は別の適したシステムを使用して増殖について定期的に顕微鏡によってモニタリングできる。

【0209】

同様に、インキュベーションの条件、特に、雰囲気及び温度条件もまた、前記微生物に応じて変わる。これらの条件は、目的の微生物又は微生物の群に好都合である、及び/又は他の微生物による汚染を制限するように適応させることができる。

【0210】

特に、インキュベーションは、好気性、半好気性(通常、2から10%の間の酸素)又は嫌気性条件下で実施されうる。半好気性又は嫌気性条件では、二酸化炭素の濃度をカプノフィル微生物に好都合であるように、通常、1から20%の間の二酸化炭素の値に到達するように上げることができる。

【0211】

温度は、通常、15℃から50℃の間、好ましくは、20℃から45℃の間の範囲である。しかし、好極限性微生物は15℃未満の又は50℃より高い温度で培養されうる。インキュベーション温度は、目的の微生物又は微生物の群に応じて当業者によって容易に調整されうる。好熱性微生物、例えば、TABは、普通、37℃から48℃の間、好ましくは、約45℃で培養される。中温性微生物は普通、30℃から40℃の間、好ましくは、約35℃で培養される。酢酸菌(Acid acetic bacteria)及びミクロ菌は普通、20℃から30℃の間、好ましくは、約25℃で培養される。乳酸菌は普通、20℃から40℃の間、好ましくは、約30℃で培養される。

【0212】

目的の微生物又は微生物の群が好熱性好酸性菌に属する実施形態では、インキュベーション時間は、好ましくは、少なくとも20時間、より好ましくは、20時間から30時間の間、更により好ましくは、約24時間であり、温度は、好ましくは、少なくとも40℃、より好ましくは、40℃から50℃の間、更により好ましくは、約45℃である。

【0213】

目的の微生物又は微生物の群が酢酸菌に属する実施形態では、インキュベーション時間は、好ましくは、少なくとも35時間、より好ましくは、35時間から72時間の間、更により好ましくは、約48時間であり、温度は、好ましくは、少なくとも20℃、より好ましくは、20℃から30℃の間、更により好ましくは、約25℃である。

【0214】

目的の微生物又は微生物の群が乳酸菌に属する実施形態では、インキュベーション時間は、好ましくは、少なくとも20時間、より好ましくは、20時間から48時間の間、更により好ましくは、約24時間であり、温度は、好ましくは、少なくとも20℃、より好ましくは、20℃から40℃の間、更により好ましくは、約30℃である。

【0215】

目的の微生物又は微生物の群が好気性中温性菌に属する実施形態では、インキュベーション時間は、好ましくは、少なくとも8時間、より好ましくは、10時間から36時間の間、更により好ましくは、10時間から24時間の間であり、温度は、好ましくは、少なくとも25℃、より好ましくは、25℃から40℃の間、更により好ましくは、約35℃である。しかし、一部の中温性細菌、例えば、メチロバクテリウム・エキストロクエンスは、より長いインキュベーション時間、例えば、最大96時間を必要とする場合がある。

【0216】

目的の微生物又は微生物の群が、嫌気性菌に属する実施形態では、インキュベーション時間は、好ましくは、少なくとも10時間、より好ましくは、20時間から72時間の間、更により好ましくは、20時間から24時間の間であり、温度は、好ましくは、少なくとも20℃、より好ましくは、20℃から45℃の間、更により好ましくは、約37℃である。しかし、一部の嫌気性菌、例えば、キューティバクテリウム・アクネスは、より長いインキュベーション時間、例えば、最大96時間を必要とする場合がある。

【0217】

目的の微生物又は微生物の群が上記で定義されるような従属栄養細菌に属する実施形態では、インキュベーション時間は、好ましくは、少なくとも8時間、より好ましくは、14時間から48時間の間、更により好ましくは、24時間から42時間の間であり、温度は、好ましくは、20℃から37℃の間、より好ましくは、32℃から37℃の間、更により好ましくは、約32.5℃である。しかし、一部の従属栄養細菌、例えば、メチロバクテリウム・エキストロクエンスは、より長いインキュベーション時間、例えば、22.5℃で最大96時間を必要とする場合がある。

【0218】

目的の微生物又は微生物の群がミクロ菌に属する実施形態では、インキュベーション時間は、好ましくは、少なくとも20時間、より好ましくは、30時間から50時間の間、更により好ましくは、30時間及び40時間の間であり、温度は、好ましくは、少なくとも20℃、より好ましくは、20℃から35℃の間、更により好ましくは、約25℃である。

【0219】

当然、目的の微生物の群が異なる群に属する微生物を含む場合には、インキュベーション時間並びに温度は、各微生物の増殖を可能にするように調整されなければならない。

【0220】

一部の実施形態では、特に、方法が試料の無菌性を評価するために使用される場合には、試料中に存在する任意の微生物の増殖を検出するためにインキュベーション時間が延長される場合がある。通常、このような場合には、容器は、少なくとも48時間、又は更に少なくとも72時間の間インキュベートされうる。

【0221】

検出
本発明の方法の工程c)では、上記で定義されるような増殖培地の表面又はメンブレンフィルターの表面で形成され、少なくとも1つの蛍光色素の蛍光シグナルを発する微小コロニーが検出される、及び/又は数え上げられる。

【0222】

蛍光シグナルを発する微小コロニーは、当業者に公知の任意の方法を使用して検出される及び/又は数え上げられる。特に、微小コロニーは、蛍光固相血球計算器若しくは顕微鏡を使用して、好ましくは、自動化固相血球計算器若しくは顕微鏡、又は蛍光発光を検出するのに適した任意の他のイメージングシステムを使用して検出されうる、及び/又は数え上げられうる。培養デバイス中の蛍光シグナルを発する微生物の微小コロニーを計数するための自動化システムは、当技術分野で公知である。このような自動化システムは、一般に、イメージングシステム、コロニー数を決定するための画像解析アルゴリズム並びにコロニー数データ及び画像を表示し、任意選択で、保存し、操作するためのデータ管理システムを含む。例として、DIAMIDEX社によって販売されている微小コロニー半自動化カウンターMICAは、微生物を微小コロニーのその早期段階で蛍光定量的に検出及びカウントできる。

【0223】

工程b)がメンブレンフィルター上で実行され、したがって、微小コロニーがメンブレンフィルターの表面上で増殖する一部の実施形態では、前記フィルターが工程b)後及び工程c)前に固体増殖培地から取り外される場合があり、工程c)においてその上の微小コロニーが検出される及び/又は数え上げられる。この工程は、任意選択にとどまり、メンブレンフィルターの表面上の微小コロニーは、インキュベーション容器中で直接検出できる、及び/又は数え上げることができる。

【0224】

少なくとも1つの微小コロニーの検出は、試料中に目的の微生物が存在することを示す。

【0225】

更に、工程c)において検出される各微小コロニーは、細胞分裂を起こした個々の細胞から生じるということが想定される。したがって、任意選択で、希釈又は濃縮係数を考慮して、微小コロニーの数を計数することによって、試料中の目的の微生物の数を決定できる。

【0226】

選択的特徴、例えば、選択的増殖培地、選択的インキュベーションパラメータ等の使用に応じて。本発明の方法はまた、試料中の微生物の同定を可能にしうる。特に、微小コロニーの検出によって、特定の分類学的群又は機能的群(例えば、好熱性好酸性菌、酢酸菌、乳酸菌、グラム陰性菌、酵母又はカビ、好気性中温性菌、嫌気性菌等)に属する微生物の存在が明らかにされうる。

【0227】

本発明の方法は、酵素活性又は代謝産物の検出、免疫化学的マーカーを使用するアッセイ、特異的染色、抗生物質を含む特定の微生物の同定及び/又は検出にとって特異的な試験又は試薬を含む生化学アッセイ等、検出された微小コロニーの微生物を更に特徴付けるために、工程c)後に更なる工程を含む場合がある。

【0228】

本発明の方法の使用
本発明はまた、試料中の目的の任意の微生物又は微生物の群を検出する、又は数え上げるための、特に、試料中の好熱性好酸性(acidophile)菌(TAB)、酢酸菌(AAB)、乳酸菌(LAB)、嫌気性菌、好気性中温性菌(AMB)、酵母及びカビ、グラム陽性又はグラム陰性菌、従属栄養細菌又はそれらの任意の組合せを検出する、又は数え上げるための、好ましくは、試料中の好熱性好酸性(acidophile)菌(TAB)、酢酸菌(AAB)、乳酸菌(LAB)、嫌気性菌、好気性中温性菌(AMB)、酵母及びカビ、グラム陽性又はグラム陰性菌又はそれらの任意の組合せを検出する、又は数え上げるための本発明の方法の使用に関する。

【0229】

本発明はまた、試料が、少なくとも1つの目的の微生物、特に、好熱性好酸性(acidophile)菌(TAB)、酢酸菌(AAB)、乳酸菌(LAB)、嫌気性菌、好気性中温性菌、酵母及びカビ、グラム陽性又はグラム陰性菌、従属栄養細菌又はそれらの任意の組合せに属する少なくとも1つの微生物、好ましくは、好熱性好酸性(acidophile)菌(TAB)、酢酸菌(AAB)、乳酸菌(LAB)、嫌気性菌、好気性中温性菌、酵母及びカビ、グラム陽性又はグラム陰性菌又はそれらの任意の組合せに属する少なくとも1つの微生物を含有するか否かを決定することにおける本発明の方法の使用に関する。

【0230】

本発明の方法に関連するすべての実施形態はまた、この態様において企図される。

【0231】

本発明はまた、試料が無菌であるか否かを決定することにおける本発明の方法の使用に関する。

【0232】

本明細書で使用される場合、「無菌」という用語は、目的の任意の微生物が試料中に存在しないことを指す。適用分野(例えば、医薬品、化粧品、食物及び飲料、環境分析、診断等)及び標準方法に応じて、無菌性試験において検討されるべき微生物は変わる場合がある。しかし、通常、本発明の方法は、試料中に含有される可能性がある微生物の最大の検出に好都合であるように設計される。

【0233】

この態様では、本発明の方法は、目的の微生物又は微生物の群を検出するために使用され、前記目的の微生物又は微生物の群が存在しないことは、試料が無菌であることを示し、前記目的の微生物又は微生物の群の検出は、試料が無菌ではないことを示した。

【0234】

このような適用のために、増殖培地は通常、非選択的培地、例えば、R2A又はTSAである。通常、培養物は、20℃から40℃の間、好ましくは、約35℃の温度で少なくとも72時間の間インキュベートされる。増殖培地及び培養の条件は、適用分野(例えば、医薬品分野、水分析等)に従って、及びこの分野において推奨される標準方法に従って大きく変わる場合がある。当業者は、これらのパラメータを考慮して本発明の方法を容易に調整できる。

【0235】

必要に応じて、異なる微生物又は微生物の群を検出するために、例えば、異なる増殖培地、インキュベーション条件、蛍光色素等を使用して本発明の方法を反復してもよい。

【0236】

好ましくは、このような適用のために、試料は、キサンテンベースの色素からなる群から選択される、好ましくは、ローダミン色素、フルオレセイン色素及びカーボピロニンベースの色素、クマリンベースの色素、シアニンベースの色素、ピレンベースの色素、スクアラインベースの色素及びスクアラインロタキサンベースの色素及びそれらの組合せからなる群から選択される少なくとも1つの蛍光色素と、好ましくは、Alexa Fluor(商標)350、Pacific blue(商標)、Cy5(商標)、好ましくは、スルホ-Cy5、Alexa Fluor(商標)405、Cascade blue(商標)、Seta色素、好ましくは、Seta 650又はSeta 375、SeTau色素、好ましくは、SeTau 647又はSeTau 488、Alexa Fluor 488及びMB660R及びそれらの誘導体及び組合せからなる群から選択される少なくとも1つの蛍光色素と、更により好ましくは、Alexa Fluor(商標)350-NHSエステル、Pacific blue(商標)-NHSエステル、スルホ-Cy5酸、Alexa Fluor(商標)405-DBCO、Cascade blue(商標)、Seta 650-DBCO、Seta 375-NHS、SeTau 647-マレイミド、SeTau 488-NHS、Alexa Fluor 488酸、MB660R-酸及びMB660R-DBCO及びそれらの組合せからなる群から選択される少なくとも1つの蛍光色素と接触される。特に、前記少なくとも1つの蛍光色素は、Alexa Fluor(商標)350、Pacific blue(商標)、Cy5(商標)、好ましくは、スルホ-Cy5、Alexa Fluor(商標)405、Cascade blue(商標)、Seta色素、好ましくは、Seta 650、SeTau色素、好ましくは、SeTau 647又はSeTau 488、Alexa Fluor 488及びMB660R、並びにそれらの誘導体及び組合せからなる群から選択されうる、好ましくは、Alexa Fluor(商標)350-NHSエステル、Pacific blue(商標)-NHSエステル、スルホ-Cy5酸、Alexa Fluor(商標)405-DBCO、Cascade blue(商標)、Seta 650-DBCO、SeTau 647-マレイミド、SeTau 488-NHS、Alexa Fluor 488酸、MB660R-酸及びMB660R-DBCO及びそれらの組合せからなる群から選択される。

【0237】

特に、前記少なくとも1つの蛍光色素は、Alexa Fluor(商標)350、Cy5(商標)、好ましくは、スルホ-Cy5、Alexa Fluor(商標)405、Seta色素、好ましくは、Seta 650、SeTau色素、好ましくは、SeTau 647、Alexa Fluor 488及びMB660R及びそれらの誘導体及び組合せからなる群から選択される場合があり、好ましくは、Alexa Fluor(商標)350-NHSエステル、スルホ-Cy5酸、Alexa Fluor(商標)405-DBCO、Seta 650-DBCO、SeTau 647-マレイミド、Alexa Fluor 488酸、MB660R-酸及びMB660R-DBCO及びそれらの組合せからなる群から選択される。

【0238】

より詳しくは、前記少なくとも1つの蛍光色素は、キサンテンベースの色素及びシアニンベースの色素の組合せ、好ましくは、Cy5(商標)、好ましくは、スルホ-Cy5又はその誘導体及びMB(商標)660R又はその誘導体の組合せ、より好ましくは、MB(商標)660R DBCO及びスルホ-Cy5酸の組合せでありうる。

【0239】

一部の実施形態では、前記少なくとも1つの蛍光色素は、アクリジンオレンジ-DAPI、アクリジンオレンジ-Seta 375-NHS、アクリジンオレンジ-MB660R酸、アクリジンオレンジ-Alexa Fluor 350-NHSエステル、アクリジンオレンジ-Pacific Blue-NHSエステル、アクリジンオレンジ-スルホCy5酸、アクリジンオレンジ-BODIPY、アクリジンオレンジ-プロダン、アクリジンオレンジ-Alexa Fluor 405-DBCO、アクリジンオレンジ-Cascade blue、アクリジンオレンジ-Alexa Fluor 488酸、DRAQ5-Alexa Fluor 350-NHSエステル、DRAQ5-Pacific Blue-NHSエステル、DRAQ5-スルホCy5酸、DRAQ5-BODIPY 500/510、DRAQ5-プロダン、DRAQ5-Alexa Fluor 405-DBCO、DRAQ5-Cascade blue、DRAQ5-Seta 650-DBCO、DRAQ5-SeTau 647-マレイミド、DRAQ5-MB660R-酸、DRAQ5-MB660R-DBCO、DRAQ5-ATTO647酸、Cytrak orange-Alexa Fluor 350-NHSエステル、Cytrak orange-Pacific Blue-NHSエステル、Cytrak orange-スルホCy5酸、Cytrak orange-BODIPY 500/510、Cytrak orange-プロダン、Cytrak orange-Alexa Fluor 405-DBCO、Cytrak orange-Cascade blue、Seta 375-NHS-Alexa Fluor 350-NHSエステル、Seta 375-NHS-Pacific Blue-NHSエステル、Seta 375-NHS-スルホCy5酸、Seta 375-NHS-BODIPY 500/510、Seta 375-NHS-プロダン、Seta 375-NHS-Alexa Fluor 405-DBCO、Seta 375-NHS-Cascade blue、Alexa Fluor 488酸-Alexa Fluor 350-NHSエステル、Alexa Fluor 488酸-Pacific Blue-NHSエステル、Alexa Fluor 488酸-スルホCy5酸、Alexa Fluor 488酸-BODIPY 500/510、Alexa Fluor 488酸-プロダン、Alexa Fluor 488酸-Alexa Fluor 405-DBCO、Alexa Fluor 488酸-Cascade blue、MB660R-酸-Alexa Fluor 350-NHSエステル、MB660R-酸-Pacific Blue-NHSエステル、MB660R-酸-スルホCy5酸、MB660R-酸-BODIPY 500/510、MB660R-酸-プロダン、MB660R-酸-Alexa Fluor 405-DBCO、MB660R-酸-Cascade blue、MB660R-酸-Seta 650-DBCO、MB660R-酸-SeTau 647-マレイミド、MB660R-DBCO-Alexa Fluor 350-NHSエステル、MB660R-DBCO-Pacific Blue-NHSエステル、MB660R-DBCO-スルホCy5酸、MB660R-DBCO-BODIPY 500/510、MB660R-DBCO-プロダン、MB660R-DBCO-Alexa Fluor 405-DBCO、MB660R-DBCO-Cascade blue、MB660R-DBCO-Seta 650-DBCO、MB660R-DBCO-SeTau 647-マレイミド、ATTO647酸-スルホCy5酸、ATTO647酸-Seta 650-DBCO、ATTO647酸- SeTau 647-マレイミド、ATTO647酸-MB660R-酸、ATTO647酸- MB660R-DBCO、スルホCy5.5酸-スルホCy5酸、スルホCy5酸-Seta 650-DBCO、スルホCy5酸-SeTau 647-マレイミド及びSeta 650-DBCO-SeTau 647-マレイミドからなる群から選択される、好ましくは、アクリジンオレンジ-Seta 375-NHS、アクリジンオレンジ-MB660R酸、アクリジンオレンジ-Alexa Fluor 350-NHSエステル、アクリジンオレンジ-Pacific Blue-NHSエステル、アクリジンオレンジ-スルホCy5酸、アクリジンオレンジ-BODIPY、アクリジンオレンジ-プロダン、アクリジンオレンジ-Alexa Fluor 405-DBCO、アクリジンオレンジ-Cascade blue、アクリジンオレンジ-Alexa Fluor 488酸、DRAQ5-Alexa Fluor 350-NHSエステル、DRAQ5-Pacific Blue-NHSエステル、DRAQ5-スルホCy5酸、DRAQ5-BODIPY 500/510、DRAQ5-プロダン、DRAQ5-Alexa Fluor 405-DBCO、DRAQ5-Cascade blue、DRAQ5-Seta 650-DBCO、DRAQ5-SeTau 647-マレイミド、DRAQ5-MB660R-酸、DRAQ5-MB660R-DBCO、DRAQ5-ATTO647酸、Cytrak orange-Alexa Fluor 350-NHSエステル、Cytrak orange-Pacific Blue-NHSエステル、Cytrak orange-スルホCy5酸、Cytrak orange-BODIPY 500/510、Cytrak orange-プロダン、Cytrak orange-Alexa Fluor 405-DBCO、Cytrak orange-Cascade blue、Seta 375-NHS-Alexa Fluor 350-NHSエステル、Seta 375-NHS-Pacific Blue-NHSエステル、Seta 375-NHS-スルホCy5酸、Seta 375-NHS-BODIPY 500/510、Seta 375-NHS-プロダン、Seta 375-NHS-Alexa Fluor 405-DBCO、Seta 375-NHS-Cascade blue、Alexa Fluor 488酸-Alexa Fluor 350-NHSエステル、Alexa Fluor 488酸-Pacific Blue-NHSエステル、Alexa Fluor 488酸-スルホCy5酸、Alexa Fluor 488酸-BODIPY 500/510、Alexa Fluor 488酸-プロダン、Alexa Fluor 488酸-Alexa Fluor 405-DBCO、Alexa Fluor 488酸-Cascade blue、MB660R-酸-Alexa Fluor 350-NHSエステル、MB660R-酸-Pacific Blue-NHSエステル、MB660R-酸-スルホCy5酸、MB660R-酸-BODIPY 500/510、MB660R-酸-プロダン、MB660R-酸-Alexa Fluor 405-DBCO、MB660R-酸-Cascade blue、MB660R-酸-Seta 650-DBCO、MB660R-酸-SeTau 647-マレイミド、MB660R-DBCO-Alexa Fluor 350-NHSエステル、MB660R-DBCO-Pacific Blue-NHSエステル、MB660R-DBCO-スルホCy5酸、MB660R-DBCO-BODIPY 500/510、MB660R-DBCO-プロダン、MB660R-DBCO-Alexa Fluor 405-DBCO、MB660R-DBCO-Cascade blue、MB660R-DBCO-Seta 650-DBCO、MB660R-DBCO-SeTau 647-マレイミド、ATTO647酸-スルホCy5酸、ATTO647酸-Seta 650-DBCO、ATTO647酸-SeTau 647-マレイミド、ATTO647酸-MB660R-酸、ATTO647酸-MB660R-DBCO、スルホCy5.5酸-スルホCy5酸、スルホCy5酸-Seta 650-DBCO、スルホCy5酸-SeTau 647-マレイミド及びSeta 650-DBCO-SeTau 647-マレイミドからなる群から選択される組合せである。

【0240】

この態様では、本発明の方法と関連するすべての実施形態も企図される。

【0241】

本発明はまた、試料の生物汚染度を決定することにおける本発明の方法の使用に関する。

【0242】

本明細書で使用される場合、「生物汚染度」という用語は、試料中に存在する目的の生存微生物の数を指す。適用分野(例えば、医薬品、化粧品、食物及び飲料、環境分析、診断等)及び標準方法に応じて、生物汚染度試験において検討されるべき微生物は変わる場合がある。しかし、通常、本発明の方法は、試料中に含有される可能性がある微生物の最大の検出に好都合であるように設計される。

【0243】

この態様では、本発明の方法は、目的の微生物又は微生物の群を検出する及び数え上げるために使用され、前記目的の微生物又は微生物の群を数え上げることは、試料の生物汚染度を評価するために使用される。

【0244】

このような適用のために、増殖培地は通常、非選択的培地、例えば、R2A、TSA又はSDA寒天である。通常、培養物は、20℃から40℃の間、好ましくは、約35℃の温度で少なくとも30時間の間インキュベートされる。増殖培地及び培養の条件は、適用分野(例えば、医薬品分野、水分析等)に従って、及びこの分野において推奨される標準方法に従って大きく変わる場合がある。当業者は、これらのパラメータを考慮して本発明の方法を容易に調整できる。

【0245】

必要に応じて、異なる微生物又は微生物の群を検出する、及び数え上げるために、例えば、異なる増殖培地、インキュベーション条件、蛍光色素等を使用して本発明の方法を反復してもよい。

【0246】

好ましくは、このような適用のために、試料は、キサンテンベースの色素からなる群から選択される、好ましくは、ローダミン色素、フルオレセイン色素及びカーボピロニンベースの色素、クマリンベースの色素、シアニンベースの色素、ピレンベースの色素、スクアラインベースの色素及びスクアラインロタキサンベースの色素及びそれらの組合せからなる群から選択される少なくとも1つの蛍光色素と、より好ましくは、Alexa Fluor(商標)350、Pacific blue(商標)、Cy5(商標)、好ましくは、スルホ-Cy5、Alexa Fluor(商標)405、Cascade blue(商標)、Seta色素、好ましくは、Seta 650又はSeta 375、SeTau色素、好ましくは、SeTau 647又はSeTau 488、Alexa Fluor 488及びMB660R及びそれらの誘導体及び組合せからなる群から選択される少なくとも1つの蛍光色素と、更により好ましくは、Alexa Fluor(商標)350-NHSエステル、Pacific blue(商標)-NHSエステル、スルホ-Cy5酸、Alexa Fluor(商標)405-DBCO、Cascade blue(商標)、Seta 650-DBCO、Seta 375-NHS、SeTau 647-マレイミド、SeTau 488-NHS、Alexa Fluor 488酸、MB660R-酸及びMB660R-DBCO及びそれらの組合せからなる群から選択される少なくとも1つの蛍光色素と接触される。より詳しくは、前記少なくとも1つの蛍光色素は、Alexa Fluor(商標)350、Pacific blue(商標)、Cy5(商標)、好ましくは、スルホ-Cy5、Alexa Fluor(商標)405、Cascade blue(商標)、Seta色素、好ましくは、Seta 650、SeTau色素、好ましくは、SeTau 647又はSeTau 488、Alexa Fluor 488及びMB660R及びそれらの誘導体及び組合せからなる群から選択される場合があり、更により好ましくは、少なくとも1つの蛍光色素は、Alexa Fluor(商標)350-NHSエステル、Pacific blue(商標)-NHSエステル、スルホ-Cy5酸、Alexa Fluor(商標)405-DBCO、Cascade blue(商標)、Seta 650-DBCO、SeTau 647-マレイミド、SeTau 488-NHS、Alexa Fluor 488酸、MB660R-酸及びMB660R-DBCO及びそれらの組合せからなる群から選択される。

【0247】

特に、前記少なくとも1つの蛍光色素は、Alexa Fluor(商標)350、Cy5(商標)、好ましくは、スルホ-Cy5、Alexa Fluor(商標)405、Seta色素、好ましくは、Seta 650、SeTau色素、好ましくは、SeTau 647、Alexa Fluor 488及びMB660R及びそれらの誘導体及び組合せからなる群から選択される場合があり、好ましくは、Alexa Fluor(商標)350-NHSエステル、スルホ-Cy5酸、Alexa Fluor(商標)405-DBCO、Seta 650-DBCO、SeTau 647-マレイミド、Alexa Fluor 488酸、MB660R-酸及びMB660R-DBCO及びそれらの組合せからなる群から選択される。より詳しくは、前記少なくとも1つの蛍光色素は、キサンテンベースの色素及びシアニンベースの色素の組合せ、好ましくは、Cy5(商標)、好ましくは、スルホ-Cy5又はその誘導体及びMB(商標)660R又はその誘導体の組合せ、より好ましくは、MB(商標)660R DBCO及びスルホ-Cy5酸の組合せでありうる。任意選択で、1つ又はいくつかの追加の蛍光色素、特に、アントラセンベースの色素、ジピロメテンベースの色素及びナフタレンベースの色素及びそれらの組合せからなる群から選択される、好ましくは、DRAQ5(商標)、BODIPY(商標)色素、好ましくは、BODIPY 500/510及びプロダン及びそれらの誘導体及び組合せからなる群から選択される、より好ましくは、DRAQ5(商標)、BODIPY 500/510及びプロダン及びそれらの組合せからなる群から選択される1つ又はいくつかの追加の蛍光色素を、上記で定義されるような前記少なくとも1つの蛍光色素に追加することができる。

【0248】

一部の実施形態では、前記少なくとも1つの蛍光色素は、アクリジンオレンジ-DAPI、アクリジンオレンジ-Seta 375-NHS、アクリジンオレンジ-MB660R酸、アクリジンオレンジ-Alexa Fluor 350-NHSエステル、アクリジンオレンジ-Pacific Blue-NHSエステル、アクリジンオレンジ-スルホCy5酸、アクリジンオレンジ-BODIPY、アクリジンオレンジ-プロダン、アクリジンオレンジ-Alexa Fluor 405-DBCO、アクリジンオレンジ-Cascade blue、アクリジンオレンジ-Alexa Fluor 488酸、DRAQ5-Alexa Fluor 350-NHSエステル、DRAQ5-Pacific Blue-NHSエステル、DRAQ5-スルホCy5酸、DRAQ5-BODIPY 500/510、DRAQ5-プロダン、DRAQ5-Alexa Fluor 405-DBCO、DRAQ5-Cascade blue、DRAQ5-Seta 650-DBCO、DRAQ5-SeTau 647-マレイミド、DRAQ5-MB660R-酸、DRAQ5-MB660R-DBCO、DRAQ5-ATTO647酸、Cytrak orange-Alexa Fluor 350-NHSエステル、Cytrak orange-Pacific Blue-NHSエステル、Cytrak orange-スルホCy5酸、Cytrak orange-BODIPY 500/510、Cytrak orange-プロダン、Cytrak orange-Alexa Fluor 405-DBCO、Cytrak orange-Cascade blue、Seta 375-NHS-Alexa Fluor 350-NHSエステル、Seta 375-NHS-Pacific Blue-NHSエステル、Seta 375-NHS-スルホCy5酸、Seta 375-NHS-BODIPY 500/510、Seta 375-NHS-プロダン、Seta 375-NHS-Alexa Fluor 405-DBCO、Seta 375-NHS-Cascade blue、Alexa Fluor 488酸-Alexa Fluor 350-NHSエステル、Alexa Fluor 488酸-Pacific Blue-NHSエステル、Alexa Fluor 488酸-スルホCy5酸、Alexa Fluor 488酸-BODIPY 500/510、Alexa Fluor 488酸-プロダン、Alexa Fluor 488酸-Alexa Fluor 405-DBCO、Alexa Fluor 488酸-Cascade blue、MB660R-酸-Alexa Fluor 350-NHSエステル、MB660R-酸-Pacific Blue-NHSエステル、MB660R-酸-スルホCy5酸、MB660R-酸-BODIPY 500/510、MB660R-酸-プロダン、MB660R-酸-Alexa Fluor 405-DBCO、MB660R-酸-Cascade blue、MB660R-酸-Seta 650-DBCO、MB660R-酸-SeTau 647-マレイミド、MB660R-DBCO-Alexa Fluor 350-NHSエステル、MB660R-DBCO-Pacific Blue-NHSエステル、MB660R-DBCO-スルホCy5酸、MB660R-DBCO-BODIPY 500/510、MB660R-DBCO-プロダン、MB660R-DBCO-Alexa Fluor 405-DBCO、MB660R-DBCO-Cascade blue、MB660R-DBCO-Seta 650-DBCO、MB660R-DBCO-SeTau 647-マレイミド、ATTO647酸-スルホCy5酸、ATTO647酸-Seta 650-DBCO、ATTO647酸-SeTau 647-マレイミド、ATTO647酸-MB660R-酸、ATTO647酸-MB660R-DBCO、スルホCy5.5酸-スルホCy5酸、スルホCy5酸-Seta 650-DBCO、スルホCy5酸-SeTau 647-マレイミド及びSeta 650-DBCO-SeTau 647-マレイミドからなる群から選択される、好ましくは、アクリジンオレンジ-Seta 375-NHS、アクリジンオレンジ-MB660R酸、アクリジンオレンジ-Alexa Fluor 350-NHSエステル、アクリジンオレンジ-Pacific Blue-NHSエステル、アクリジンオレンジ-スルホCy5酸、アクリジンオレンジ-BODIPY、アクリジンオレンジ-プロダン、アクリジンオレンジ-Alexa Fluor 405-DBCO、アクリジンオレンジ-Cascade blue、アクリジンオレンジ-Alexa Fluor 488酸、DRAQ5-Alexa Fluor 350-NHSエステル、DRAQ5-Pacific Blue-NHSエステル、DRAQ5-スルホCy5酸、DRAQ5-BODIPY 500/510、DRAQ5-プロダン、DRAQ5-Alexa Fluor 405-DBCO、DRAQ5-Cascade blue、DRAQ5-Seta 650-DBCO、DRAQ5-SeTau 647-マレイミド、DRAQ5-MB660R-酸、DRAQ5-MB660R-DBCO、DRAQ5-ATTO647酸、Cytrak orange-Alexa Fluor 350-NHSエステル、Cytrak orange-Pacific Blue-NHSエステル、Cytrak orange-スルホCy5酸、Cytrak orange-BODIPY 500/510、Cytrak orange-プロダン、Cytrak orange-Alexa Fluor 405-DBCO、Cytrak orange-Cascade blue、Seta 375-NHS-Alexa Fluor 350-NHSエステル、Seta 375-NHS-Pacific Blue-NHSエステル、Seta 375-NHS-スルホCy5酸、Seta 375-NHS-BODIPY 500/510、Seta 375-NHS-プロダン、Seta 375-NHS-Alexa Fluor 405-DBCO、Seta 375-NHS-Cascade blue、Alexa Fluor 488酸-Alexa Fluor 350-NHSエステル、Alexa Fluor 488酸-Pacific Blue-NHSエステル、Alexa Fluor 488酸-スルホCy5酸、Alexa Fluor 488酸-BODIPY 500/510、Alexa Fluor 488酸-プロダン、Alexa Fluor 488酸-Alexa Fluor 405-DBCO、Alexa Fluor 488酸-Cascade blue、MB660R-酸-Alexa Fluor 350-NHSエステル、MB660R-酸-Pacific Blue-NHSエステル、MB660R-酸-スルホCy5酸、MB660R-酸-BODIPY 500/510、MB660R-酸-プロダン、MB660R-酸-Alexa Fluor 405-DBCO、MB660R-酸-Cascade blue、MB660R-酸-Seta 650-DBCO、MB660R-酸-SeTau 647-マレイミド、MB660R-DBCO-Alexa Fluor 350-NHSエステル、MB660R-DBCO-Pacific Blue-NHSエステル、MB660R-DBCO-スルホCy5酸、MB660R-DBCO-BODIPY 500/510、MB660R-DBCO-プロダン、MB660R-DBCO-Alexa Fluor 405-DBCO、MB660R-DBCO-Cascade blue、MB660R-DBCO-Seta 650-DBCO、MB660R-DBCO-SeTau 647-マレイミド、ATTO647酸-スルホCy5酸、ATTO647酸-Seta 650-DBCO、ATTO647酸-SeTau 647-マレイミド、ATTO647酸-MB660R-酸、ATTO647酸- MB660R-DBCO、スルホCy5.5酸-スルホCy5酸、スルホCy5酸-Seta 650-DBCO、スルホCy5酸-SeTau 647-マレイミド及びSeta 650-DBCO-SeTau 647-マレイミドからなる群から選択される組合せである。

【0249】

この態様では、本発明の方法と関連するすべての実施形態も企図される。

【0250】

キット及びその使用
本発明は更に、
- 上記で定義されるような少なくとも1つの蛍光色素、
及び任意選択で、
- 上記で定義されるような少なくとも1つのメンブレンフィルター
を含むキットに関する。

【0251】

キットは、
- 目的の微生物若しくは微生物の群の増殖を支持するために栄養素を含有する固体増殖培地を含む少なくとも1つの容器、若しくは前記少なくとも1つの容器を得るために必要とされる材料、及び/又は
- 前記キットを使用するための使用説明書を提供するリーフレット
を更に含む場合がある。

【0252】

特定の実施形態では、本発明のキットは、
- 上記で定義されるような少なくとも1つの蛍光色素、及び
- 上記で定義されるような少なくとも1つのメンブレンフィルター、
及び任意選択で、目的の微生物若しくは微生物の群の増殖を支持するために栄養素を含有する固体増殖培地、若しくは前記少なくとも1つの容器を得るために必要とされる材料を含む少なくとも1つの容器、及び/又は前記キットを使用するための使用説明書を提供するリーフレット
を含む。

【0253】

別の特定の実施形態では、本発明のキットは、
- 好ましくは、上記で定義されるような少なくとも1つの蛍光色素、及び目的の微生物若しくは微生物の群の増殖を支持するために栄養素を含有する固体増殖培地を含む少なくとも1つの容器、又は前記少なくとも1つの容器を得るために必要とされる材料、並びに
任意選択で、
- 好ましくは、上記で定義されるような少なくとも1つのメンブレンフィルター、並びに/又は
- 前記キットを使用するための使用説明書を提供するリーフレット
を含む。

【0254】

この態様では、本発明の方法に関連するすべての実施形態も企図される。

【0255】

本発明はまた、上記のような本発明の方法に従う、目的の微生物又は微生物の群を検出する、又は数え上げるための本発明に従うキットの使用に関する。この態様では、本発明の方法に関連するすべての実施形態も企図される。

【0256】

本記載に引用されたすべての参考文献は、参照により本出願に組み込まれる。本発明の他の特徴及び利点は、制限としてではなく例証の目的のために与えられる以下の実施例においてより明確になろう。

【実施例】

【0257】

アスペルギルス・ブラジリエンシス及びキューティバクテリウム・アクネスを除いて、すべての株を、事前に定量化した低温保存ストックからNaCl 0.9%で希釈して、実験条件あたり規定量の微生物を得、各細菌調製物を0.45μmのPVDF又はMCEメンブレン(47mm)上で濾過した。

【0258】

A.ブラジリエンシス及びC.アクネについては、正確な数の微生物を含有するBiomerieux社製のBioBalls(登録商標)(BioBall(登録商標) Multishot 550 アスペルギルス・ブラジリエンシスSKU数:56001;BioBall(登録商標) Multishot プロピオニバクテリウム・アクネ(Propionibacterrium acnes)(キューティバクテリウム・アクネスの以前の名称、株DSM 1897)SKU数:416600)をNaCl 0.9%で希釈して、実験条件あたり規定量の微生物を得、各細菌調製物を0.45μmのPVDF又はMCEメンブレン(47mm)上で濾過した。

【0259】

(実施例1)
好熱性好酸性菌(TAB)の検出
この実施例では、アリシクロバチルス・アシドテレストリスATCC(登録商標)49025(商標)、アリシクロバチルス・アシドカルダリウスATCC(登録商標)27009(商標)、アリシクロバチルス・アシディフィラスDSM 14558、アリシクロバチルス・シクロヘプタニカスATCC(登録商標)49028(商標)、アリシクロバチルス・ヘスペリダムDSM 12766、アリシクロバチルス・ハーバリウスDSM 13609及びアリシクロバチルス・コンタミナンスDSM 17975を含むアリシクロバチルス属細菌のいくつかの株を使用した。

【0260】

Alexa Fluor 488酸(50μM)、Alexa Fluor 488-DBCO(50μM)、MB660R-酸(250μM)、MB660R-DBCO(250μM)及びATTO647酸(5μM)からなる群から選択される蛍光色素の150μLを、BAT寒天プレート(酵母エキス2g/l、D(+)グルコース5g/l、塩化カルシウム0.25066g/l、硫酸マグネシウム0.5g/l、硫酸アンモニウム0.2g/l、リン酸二水素カリウム3g/l、硫酸亜鉛0.00018g/l、硫酸銅0.00016g/l、硫酸マンガン0.00015g/l、モリブデン酸ナトリウム二水和物0.0003g/l、寒天18g/l、pH値3.8～4.2)に堆積させた。各寒天プレートは、1滴の蛍光色素を含んでいた。

【0261】

次いで、濾過メンブレンを各寒天プレート上の蛍光色素液滴の上に堆積させた。次いで、45℃で48時間インキュベートしたA.アシドカルダリウス及びA.コンタミナンス(contaminans)を除いて、プレートを45℃で24時間インキュベートした。

【0262】

インキュベーション後、微小コロニー半自動化カウンター(MICA、DIAMIDEX社、光力100%、ゲイン1、露光時間100及び400ms)を使用して微小コロニーを検出した。

【0263】

試験した条件及び結果は、Table 2(表2)に提示されている。

【0264】

【表2】

【0265】

(実施例2)
酢酸菌(AAB)の検出
この実施例において使用される酢酸細菌株は、アセトバクター・アセチATCC(登録商標)15973(商標)、グルコノアセトバクター・リクファシエンスATCC(登録商標)14835(商標)、アサイア・サイアメンシスDSM 15972及びグルコノバクター・オキシダンスATCC(登録商標)19357(商標)である。

【0266】

DAPI(50μM)、Alexa Fluor 488酸(50μM)、Alexa Fluor 488-DBCO(50μM)、MB660R-酸(250μM)、MB660R-DBCO(250μM)及びATTO647酸(5μM)からなる群から選択される蛍光色素の150μLを、YM寒天プレート(グルコース10g/L、麦芽エキス3g/L、ペプトン5g/L、酵母エキス3g/L、寒天15g/L、pH値6.2±0.2)に堆積させた。各寒天プレートは、1滴の蛍光色素を含んでいた。

【0267】

次いで、濾過メンブレンを各寒天プレート上の蛍光色素液滴の上に堆積させた。次いで、プレートを25℃で72時間インキュベートした。

【0268】

インキュベーション後、微小コロニー半自動化カウンター(MICA、DIAMIDEX社、Cy5光力100%、ゲイン1、露光時間、MB660R-DBCO及びATTO647酸について200ms、AF488酸について300ms、MB660R-酸について400ms、AF488-DBCOについて600ms、DAPIについては、UV光力12%、ゲイン1、露光時間400ms)を使用して微小コロニーを検出した。

【0269】

試験した条件及び結果は、Table 3(表3)に提示されている。

【0270】

【表3】

【0271】

(実施例3)
乳酸菌(LAB)の検出
この実施例において使用される乳酸細菌株は、ラクトバチルス・プランタルムATCC(登録商標)8014(商標)、ワイセラ・コンフューザATCC(登録商標) 10881(商標)及びラクトバチルス・カゼイATCC(登録商標)393(商標)である。

【0272】

DAPI(50μM)、Alexa Fluor 488酸(50μM)、Alexa Fluor 488-DBCO(50μM)、MB660R-酸(250μM)、MB660R-DBCO(250μM)及びATTO647酸(5μM)からなる群から選択される蛍光色素の150μLを、MRS寒天プレート(クエン酸水素二アンモニウム2g/L、リン酸水素二カリウム2g/L、D(+)-グルコース20g/L、硫酸マグネシウム0.1g/L、硫酸マンガン0.05g/L、肉エキス5g/L、酢酸ナトリウム5g/L、ユニバーサルペプトン10g/L、酵母エキス5g/L、寒天12g/L、pH値5.7)に堆積させた。各寒天プレートは、1滴の蛍光色素を含んでいた。

【0273】

次いで、濾過メンブレンを各寒天プレート上の蛍光色素液滴の上に堆積させた。次いで、プレートを30℃で48時間インキュベートした。

【0274】

インキュベーション後、微小コロニー半自動化カウンター(MICA、DIAMIDEX社、Cy5光力100%、ゲイン1、露光時間、MB660R-DBCO及びATTO647酸について200ms、AF488酸について300ms、MB660R-酸について400ms、AF488-DBCOについて600ms、35%のUV光力を用いて行ったL.カゼイ(casei)を除いて、DAPIについて、UV光力12%、ゲイン1、露光時間100ms)を使用して微小コロニーを検出した。

【0275】

試験した条件及び結果は、Table 4(表4)に提示されている。

【0276】

【表4】

【0277】

(実施例4)
嫌気性菌の検出
この実施例において使用される嫌気性細菌株は、クロストリジウム・スポロゲネスATCC 19404及びキューティバクテリウム・アクネスATCC 6919である。

【0278】

200μLのDAPI(50μM)を、TSA寒天プレート(トリプトン15g/L、Sojaパパイン消化(papainic)ペプトン5g/L、塩化ナトリウム5g/L、寒天15g/L、pH値7.3±0.2)上に堆積させ、C.スポロゲネスについては150μlのスルホ-Cy5酸(100μM)及びMB660R-DBCO(100μM)の混合物をTSA寒天プレート上に、C.アクネスについては、5%ヒツジ血液(カゼイン12g/Lの膵臓消化物、動物組織のペプシン消化物5g/L、酵母エキス3g/L、ビーフエキス3g/L、コーンスターチ1g/L、塩化ナトリウム5g/L、寒天13.5g/L、脱繊維素化ヒツジ血液5%、pH値pH7.3±0.2)を補給したコロンビア寒天プレート上に堆積させた。各寒天プレートは、1滴の蛍光色素を含んでいた。

【0279】

次いで、濾過メンブレンを各寒天プレート上の蛍光色素液滴の上に堆積させた。次いで、クロストリジウム・スポロゲネスを含むプレートを、嫌気性条件において35℃で、DAPI染色のための15時間からMB660R-DBCO及びスルホ-Cy5酸染色のための24時間の間インキュベートした。キューティバクテリウム・アクネスを含むプレートは、嫌気性条件において35℃で96時間インキュベートした。

【0280】

インキュベーション後、微小コロニー半自動化カウンター(MICA、DIAMIDEX社、スルホ-Cy5酸及びMB660R-DBCOの混合物について、Cy5光力100%、ゲイン1、露光時間200ms、DAPIについて、UV光力12%、ゲイン1、露光時間400ms)を使用して微小コロニーを検出した。

【0281】

試験した条件及び結果は、Table 5(表5)に提示されている。

【0282】

【表5】

【0283】

(実施例5)
好気性中温性菌の検出
この実施例において使用される中温性細菌株は、緑膿菌ATCC(登録商標)9027、枯草菌ATCC(登録商標)6633(商標)、大腸菌ATCC(登録商標)8739(商標)、黄色ブドウ球菌ATCC(登録商標)6538(商標)、アシネトバクター・バウマンニATCC 19606、クロノバクター・サカザキATCC(登録商標)29544(商標)、肺炎桿菌ATCC(登録商標)13883(商標)、ネズミチフス菌ATCC(登録商標)13311(商標)、フェカリス菌ATCC(商標)29212(商標)、ソンネ菌ATCC(登録商標)25931(商標)、コクリア・リゾフィラATCC(登録商標)9341(商標)、メチロバクテリウム・エキストロクエンスATCC 43645及びセパシア菌ATCC(登録商標)25608(商標)である。

【0284】

アクリジンオレンジ(40μM)、Cytrak Orange(50μM)、DRAQ5(125μM)、AF350-NHSエステル(50μM)、Pacific Blue-NHSエステル(10μM)、スルホ-Cy5酸(150μM)、スルホ-Cy5.5酸(50μM)、BODIPY 500/510(PVDFメンブレン上で10μM及びMCEメンブレン上で150μM)、Seta 375-NHS(5μM)、プロダン(PVDFメンブレン上で15μM及びMCEメンブレン上で50μM)、AF405-DBCO(50μM)、Cascade Blue(1μM)、Seta 650-DBCO(100μM)、SeTau 488-NHS(50μM)、SeTau 647-マレイミド(100μM)、DAPI(50μM)、Alexa Fluor 488酸(50μM)、Alexa Fluor 488-DBCO(50μM)、MB660R-酸(250μM)、MB660R-DBCO(250μM)及びATTO647酸(5μM)からなる群から選択される蛍光色素の150μLを、枯草菌、アシネトバクター・バウマンニ、クロノバクター・サカザキ、肺炎桿菌、ネズミチフス菌、フェカリス菌、ソンネ菌及びコクリア・リゾフィラについてTSA寒天プレート及びPCA寒天プレート(トリプトン5g/L、酵母エキス2.5g/L、デキストロース1g/L、寒天15g/L、pH値7.0±0.2)上に、又はメチロバクテリウム・エキストロクエンス、緑膿菌、大腸菌、黄色ブドウ球菌及びセパシア菌についてTSA寒天プレート上に堆積させた。各寒天プレートは、1滴の蛍光色素を含んでいた。

【0285】

次いで、濾過メンブレンを各寒天プレート上の蛍光色素液滴の上に堆積させた。次いで、プレートを、PCA及びTSAプレート上のクロノバクター・サカザキについて、及びTSAプレート上の肺炎桿菌について35℃で11時間、PCAプレート上の肺炎桿菌について、PCA及びTSAプレート上の枯草菌、アシネトバクター・バウマンニ、ネズミチフス菌、フェカリス菌、ソンネ菌、コクリア・リゾフィラについて及びTSAプレート上の緑膿菌について18時間、TSAプレート上のセパシア菌について24時間及びTSAプレート上のメチロバクテリウム・エキストロクエンスについて96時間インキュベートした。

【0286】

インキュベーション後、微小コロニー半自動化カウンター(MICA、DIAMIDEX社、DAPI:UV光力12% ゲイン1 露光時間200ms;MB660R-DBCO、MB660R-酸、ATTO647酸:CY5 光力100% ゲイン1 露光時間200及び500ms;AF488酸及びAF488-DBCO:FITC光力100% ゲイン1 露光時間200及び400ms;スルホ-Cy5酸、Seta-650 DBCO:CY5光力100% ゲイン1 露光時間50ms及び400ms;AF350-NHSエステル、AF405-DBCO:UV光力:20%又は50% ゲイン1 露光時間100ms及び400ms;SeTau 647-マレイミド:CY5光力100% ゲイン1 露光時間50ms及び200ms;プロダン:UV光力100%又は50% ゲイン1 露光時間100ms及び400ms;BODIPY 500/510及びSeTau 488-NHS(50μM):FITC光力100% ゲイン1 露光時間50ms及び200ms;DRAQ5:CY5光力100% ゲイン1 露光時間200ms及び400ms;Cascade Blue及びPacific Blue-NHSエステル:UV光力100%又は50% ゲイン1 露光時間50ms及び200ms;Seta 375-NHS:UV光力100% ゲイン1 露光時間200ms;スルホ-Cy5.5酸:CY5.5 光力20% ゲイン1 露光時間50ms;アクリジンオレンジ:CY5光力100% ゲイン1 露光時間400ms;Cytrak Orange:FITC光力7% ゲイン1 露光時間400msを使用して、微小コロニーを検出した。

【0287】

試験した条件及び結果は、Table 6(表6)に提示されている。

【0288】

【表6A】

【0289】

【表6B】

【0290】

(実施例6)
酵母及びカビの検出
この実施例において使用される酵母及びカビの株は、アスペルギルス・ブラジリエンシスATCC(登録商標)16404(商標)、ペニシリウム・バリオティーATCC 18502、ペニシリウム・クリソゲナムATCC(登録商標)10106(商標)、カンジダ・アルビカンスATCC(登録商標)10231(商標)、ゲオトリクム・カンディダム、サッカロミセス・セレビシエATCC(登録商標)9763(商標)及びザイゴサッカロミセス・バイリーDSM 70492である。

【0291】

MB660R-DBCO(250μM)、Alexa Fluor 488酸(50μM)、MB660R-酸(250μM)又はATTO647酸(5μM)、Seta 375-NHS(5μM)の200μl、アクリジンオレンジ(40μM)、BODIPY 500/510(PVDFメンブレン上での10μM及びMCEメンブレン上での150μM)の150μL又はDAPI(50μM)の250μlを、ザイゴサッカロミセス・バイリー、サッカロミセス・セレビシエ及びアスペルギルス・ブラジリエンシスについては、YM寒天プレート(グルコース10g/L、麦芽エキス3g/L、ペプトン5g/L、酵母エキス3g/L、寒天15g/L、pH値6.2±0.2)又はSDA寒天プレート(カゼインの膵臓消化物5g/L、動物組織のペプシン消化物5g/L、デキストロース40g/L、寒天15g/L、pH値5.6±0.2)上に、及びカンジダ・アルビカンス、ペニシリウム・バリオティー及びペニシリウム・クリソゲナムについて、SDA寒天プレート上に堆積させた。各寒天プレートは、1滴の蛍光色素を含んでいた。次いで、濾過メンブレンを各寒天プレート上の蛍光色素液滴の上に堆積させた。次いで、プレートを25℃で39時間インキュベートした。

【0292】

AF350-NHSエステル(50μM)、Pacific Blue-NHSエステル(10μM)、スルホ-Cy5酸(150μM)、プロダン(PVDFメンブレン上で15μM及びMCEメンブレン上で50μM)、AF405-DBCO(50μM)、Cascade Blue(1μM)、Seta 650-DBCO(100μM)、SeTau 488-NHS(50μM)、SeTau 647-マレイミド(100μM)からなる群から選択される蛍光色素の150μLを、SDA寒天プレート上に堆積させた。各寒天プレートは、1滴の蛍光色素を含んでいた。次いで、濾過メンブレンを各寒天プレート上の蛍光色素液滴の上に堆積させた。次いで、プレートを35℃で21時間インキュベートした。

【0293】

インキュベーション後、微小コロニー半自動化カウンター(MICA、DIAMIDEX社、DAPI:光力12% ゲイン1 露光時間200ms;MB660R-DBCO、MB660R-酸、ATTO647酸:CY5光力100% ゲイン1 露光時間200及び500ms;AF488酸:FITC光力100% ゲイン1 露光時間200及び400ms;スルホ-Cy5酸、Seta-650 DBCO:CY5 光力100% ゲイン1 露光時間50ms及び400ms;AF350-NHSエステル、AF405-DBCO:UV光力:50%又は20% ゲイン1 露光時間100ms及び400ms;SeTau 488-NHS:FITC光力100% ゲイン1 露光時間50ms及び200ms;SeTau 647-マレイミド:CY5光力100% ゲイン1 露光時間50ms及び200ms;プロダン:UV光力100%又は50% ゲイン1 露光時間100ms及び400ms;Cascade Blue及びPacific Blue-NHSエステル:UV光力100%又は50% ゲイン1 露光時間50ms及び200ms;Seta 375-NHS:UV光力100% ゲイン1 露光時間200ms;アクリジンオレンジ:CY5光力100% ゲイン1 露光時間400ms;BODIPY 500/510:FITC光力100% ゲイン1 露光時間50ms及び200ms)を使用して、微小コロニーを検出した。

【0294】

試験した条件及び結果は、Table 7(表7)に提示されている。

【0295】

【表7A】

【0296】

【表7B】

【0297】

C.アルビカンス及びA.ブラジリエンシスを含む混合培養物を、0.45μmのPVDF又はMCEメンブレン(47mm)上で濾過した。AF350-NHSエステル(50μM)、スルホ-Cy5酸(150μM)、AF405-DBCO(50μM)、Seta 650-DBCO(100μM)又はSeTau 647-マレイミド(100μM)からなる群から選択される蛍光色素の150μLを、SDA寒天プレート上に堆積させた。各寒天プレートは、1滴の蛍光色素を含んでいた。次いで、濾過メンブレンを各寒天プレート上の蛍光色素液滴の上に堆積させた。次いで、プレートを35℃で21時間インキュベートした。インキュベーション後、微小コロニー半自動化カウンター(MICA、DIAMIDEX社、スルホ-Cy5酸、Seta-650 DBCO:CY5 光力100% ゲイン1 露光時間50ms及び400ms;AF350-NHSエステル、AF405-DBCO:UV光力:50%又は20% ゲイン1 露光時間100ms及び400ms;SeTau 647-マレイミド:CY5光力100% ゲイン1 露光時間50ms及び200ms)を使用して微小コロニーを検出した。

【0298】

結果は、以下のTable 8(表8)及び図10～13に提示されている。

【0299】

【表8】

【0300】

(実施例7)
UTI診断におけるグラム陰性菌の検出
この実施例において使用されるグラム陰性菌は、大腸菌ATCC(登録商標)8739(商標)である。

【0301】

200μLのMB660R-DBCO(100μM)及びスルホ-Cy5酸(100μM)の混合物を、Mac Conkey寒天プレート(ペプトン20g/L、ラクトース10g/L、胆汁酸塩1.5g/L、クリスタルバイオレット0.001g/L、ニュートラルレッド0.05g/L、塩化ナトリウム5g/L、寒天15g/L、pH値7.1+/-0.2)上に堆積させた。各寒天プレートは、色素の混合物の1滴を含んでいた。

【0302】

次いで、濾過メンブレンを各寒天プレート上の蛍光色素液滴の上に堆積させた。次いで、プレートを35℃で8時間インキュベートした。

【0303】

インキュベーション後、微小コロニー半自動化カウンター(MICA、DIAMIDEX社、光力100%、ゲイン1、露光時間200ms)を使用して、微小コロニーを検出した。

【0304】

各条件において、大腸菌コロニーを標識し、検出した。

【0305】

(実施例8)
微生物(細菌、酵母及びカビ)の総数
この実施例において使用される株は、キューティバクテリウム・アクネスATCC(登録商標)6919(商標)、メチロバクテリウム・エキストロクエンスATCC(登録商標)43645(商標)、フェカリス菌ATCC(登録商標)29212(商標)、アスペルギルス・ブラジリエンシスATCC(登録商標)16404(商標)、カンジダ・アルビカンスATCC(登録商標)10231(商標)及びワイセラ・コンフューザATCC(登録商標)10881(商標)である。

【0306】

フェカリス菌、アスペルギルス・ブラジリエンシス及びカンジダ・アルビカンスを含む混合培養物を、0.45μmのPVDFメンブレン(47mm)上で濾過した。混合物について、MB660R-DBCO(100μM)及びスルホ-Cy5酸(100μM)の混合物の150μLを、TSA又はSDA寒天プレート上に堆積させた。各寒天プレートは、色素の混合物の1滴を含んでいた。次いで、濾過メンブレンを各寒天プレート上の蛍光色素液滴の上に堆積させた。次いで、プレートを、TSAプレートについては35℃で24時間、SDAプレートについては25℃でインキュベートした。インキュベーション後、微小コロニー半自動化カウンター(MICA、DIAMIDEX社、Cy5光力100%、ゲイン1、露光時間50及び200ms)を使用して微小コロニーを検出した。

【0307】

アスペルギルス・ブラジリエンシス及びカンジダ・アルビカンスを含む混合培養物及びワイセラ・コンフューザの培養物を、0.45μmのPVDFメンブレン(47mm)上で濾過した。これらの培養物について、150μLのMB660R-DBCO(100μM)及びスルホ-Cy5酸(100μM)の混合物を、OSAプレート(カゼインペプトン10g/L、リン酸水素二カリウム3g/L、D(+)-グルコース4g/L、オレンジエキス5g/L、酵母エキス3g/L、寒天17g/L、pH値5.5±0.2)上に堆積させた。各寒天プレートは、色素の混合物の1滴を含んでいた。次いで、濾過メンブレンを各寒天プレート上の蛍光色素液滴の上に堆積させた。次いで、プレートを30℃で24時間インキュベートした。インキュベーション後、微小コロニー半自動化カウンター(MICA、DIAMIDEX社、Cy5 光力100%、ゲイン1、露光時間200ms)を使用して微小コロニーを検出した。

【0308】

メチロバクテリウム・エキストロクエンスの培養物を、0.45μmのPVDFメンブレン(47mm)上で濾過した。この培養物について、150μLのMB660R-DBCO (100μM)及びスルホ-Cy5酸(100μM)の混合物を、TSA又はR2A寒天プレート(カゼイン酸加水分解物0.5g/L、デキストロース0.5g/L、リン酸二カリウム0.3g/L、硫酸マグネシウム0.024g/L、プロテオースペプトン0.5g/L、ピルビン酸ナトリウム0.3g/L、デンプン、可溶性0.5g/L、酵母エキス0.5g/L、寒天15g/L、pH値7.2±0.2)上に堆積させた。各寒天プレートは、色素の混合物の1滴を含んでいた。次いで、濾過メンブレンを各寒天プレート上の蛍光色素液滴の上に堆積させた。次いで、プレートを25℃で96時間インキュベートした。

【0309】

キューティバクテリウム・アクネスの培養物を0.45μmのPVDFメンブレン(47mm)上で濾過した。この培養について、150μLのMB660R-DBCO (100μM)及びスルホ-Cy5酸(100μM)の混合物を、TSA上に堆積させた。各寒天プレートは、色素の混合物の1滴を含んでいた。次いで、濾過メンブレンを各寒天プレート上の蛍光色素液滴の上に堆積させた。次いで、プレートを、35℃、5% CO₂で96時間インキュベートした。

【0310】

インキュベーション後、微小コロニー半自動化カウンター(MICA、DIAMIDEX社、CY5 光力100%、ゲイン1 露光時間50ms及び200ms)を使用して、微小コロニーを検出した。

【0311】

結果は、Table 9(表9)に提示されている。

【0312】

【表9】

【0313】

(実施例9)
本発明の方法及び蛍光色素を用いない方法の比較
この実施例において使用される株は、大腸菌ATCC(登録商標)8739(商標)、アスペルギルス・ブラジリエンシスATCC(登録商標)16404(商標)及びカンジダ・アルビカンスATCC(登録商標)10231(商標)である。

【0314】

DRAQ5(125μM)、AF350-NHSエステル(50μM)、スルホ-Cy5酸(150μM)、BODIPY 500/510(10μM)、プロダン(PVDFメンブレン上での15μM及びMCEメンブレン上での50μM)、AF405-DBCO(50μM)、Seta 650-DBCO(100μM)又はSeTau 647-マレイミド(100μM)からなる群から選択される蛍光色素の150μLを、大腸菌についてはTSA寒天プレート上に、及びアスペルギルス・ブラジリエンシス及びカンジダ・アルビカンスについてはSDA寒天プレート上に堆積させた。次いで、濾過メンブレンを各寒天プレート上の蛍光色素液滴の上に堆積させた。次いで、プレートを大腸菌については35℃で18時間、アスペルギルス・ブラジリエンシス及びカンジダ・アルビカンスについては35℃で21時間インキュベートした。インキュベーション後、微小コロニー半自動化カウンター(MICA、DIAMIDEX社、スルホ-Cy5酸、Seta-650 DBCO:CY5光力100% ゲイン1 露光時間50ms及び400ms;AF350-NHSエステル、AF405-DBCO:UV光力:50%又は20% ゲイン1 露光時間100ms及び400ms;SeTau 647-マレイミド:CY5光力100% ゲイン1 露光時間50ms及び200ms;プロダン:UV光力100%又は50% ゲイン1 露光時間100ms及び400ms;BODIPY 500/510:FITC光力100% ゲイン1 露光時間50ms及び200ms;DRAQ5:CY5光力100% ゲイン1 露光時間200ms及び400ms)を使用して、微小コロニーを検出した。

【0315】

本発明の方法を用いて得られた結果と、標準法を用いて得られた結果を比較するために、この実施例において使用された株(大腸菌ATCC(登録商標)8739(商標)、アスペルギルス・ブラジリエンシスATCC(登録商標)16404(商標)及びカンジダ・アルビカンスATCC(登録商標)10231(商標))を、0.45μmのMCEメンブレン(47mm)上で濾過した。次いで、濾過メンブレンを大腸菌についてはTSA上に、又はアスペルギルス・ブラジリエンシス及びカンジダ・アルビカンスについてはSDA寒天プレート上に堆積させた。次いで、プレートを35℃で3～4日インキュベートした。インキュベーション後、コロニーを肉眼で計数した。

【0316】

結果は、Table 10(表10)に提示されている。

【0317】

【表10】

【0318】

この表に示されるように、本発明の方法によって、標準法よりも微生物をより早く検出すること並びにより正確に数え上げることが可能になる。

【0319】

(実施例10)
精製水及び製薬用水システムに関与する微生物を数え上げること
水は、製薬工業の重要な部分である。水は、他の使用の中でも、洗浄のために、水性無菌及び非無菌製品の成分として、手の洗浄のために、及びオートクレーブへの蒸気供給として使用される。医薬製造におけるその重要性のために、水の微生物管理は非常に重要である。水は常に存在するため、各等級の製薬用水は、特に、適切に管理されていない場合には微生物汚染の潜在的な供給源である。

【0320】

医薬品には、3種類の水が存在する:
a)水道水(又は飲料水)、
b)精製水、
c)WFI(注射用水)。

【0321】

これらの各々は、異なる等級のものであり、リストの下にいくほど微生物管理の見込みが増大する(すなわち、水道水に対するものよりもより厳しい制限が注射用水に適用される)。水道水は公益事業会社によって供給され、「飲用水」(飲料水)品質のものである。水システムのモニタリングからの結果は、所定のアラート及び作用レベルに対する従属栄養性微生物数から評価される。

【0322】

水の微生物学的検査について、検査方法は0.45μmフィルターの使用によるメンブレン濾過であった。フィルターをR2A寒天上に置き、水道水については14日間20～25℃、及び精製水及びWFIについては5日間30～35℃の温度管理法(regime)に供する。これらの異なる管理法の理由は、欧州薬局方でGMP施設に対して、記載された温度及び時間の使用が求められていることである。水道水については、医薬品施設は、培養条件を選択することができる。最適培養条件を選択することは、使用する最適な温度、時間及び培養培地に関する微生物学における古典的なジレンマに関連する。R2Aは、低レベル栄養素を用いて配合され、その結果、より高い割合の従属栄養細菌を検出するであろう。その理屈は、水中の細菌は栄養素が枯渇した条件下にあるので、それらは、それらの一般的な条件により密接に一致するように調製された増殖培地で増殖する可能性がより高いということであった。

【0323】

54140試料が収集され、試験された15年の再調査期間(2000年～2014年)をカバーするメタデータ研究が実施され、製薬用水システムから回収可能な通常の培養可能な微生物の再調査を提示した(Tim Sandle, September 2015. SOJ Microbiology & Infectious Diseases 3(2):1-8)。

【0324】

このメタデータ分析及び薬莢法の推奨に従って、微生物のリストを試験した。この実施例において使用したグラム陰性菌は、アシネトバクター・バウマニーATCC 19606、エロモナス・ハイドロフィラATCC 35654、ブレブンディモナス・ディミヌタATCC 19146、セパシア菌ATCC 25608、シトロバクター・フロインディーATCC 8090、エドワージエラ・タルダATCC 15947、大腸菌ATCC 8739、エンテロバクター・エロゲネスATCC 35028、オクロバクテリウム・アンスロピCIP 82.115、肺炎桿菌ATCC 13883、メチロバクテリウム・エキストロクエンスCIP 106787、モラクセラ・オスロエンシスATCC 19976、パンテア・アグロメランスATCC 27155、プロテウス・ミラビリスATCC 29906、緑膿菌ATCC 10145、シュードモナス・フルオレッセンスATCC 13525、ラルストニア・ピッケティATCC 27511、ネズミチフス菌ATCC 13311、セラチア・マルセセンスATCC 13880、ソンネ菌ATCC 25931、スフィンゴモナス・パウシモビリスATCC 29837、ステノトロホモナス・マルトフィリアATCC 13637、エルシニア・エンテロコリチカATCC 9610であった。グラム陽性菌は、枯草菌ATCC 6633、フェカリス菌ATCC 19433、黄色ブドウ球菌ATCC 6538である。試験された酵母及びカビは、アスペルギルス・ブラジリエンシスATCC(登録商標)16404(商標)及びカンジダ・アルビカンスATCC(登録商標)10231(商標)であった。この選択は、水道水システム微生物汚染菌の少なくとも84%、精製水システム汚染菌の77%及び医薬品WFIシステムの最も一般的な汚染菌を対象とする。

【0325】

150μLのMB660R-DBCO(100μM)及びスルホ-Cy5酸(100μM)の混合物を、Reasonerの2A寒天(R2A)プレート(酵母エキス0.5g/L、プロテオースペプトン0.5g/L、カゼイン加水分解物0.5g/L、グルコース0.5g/L、デンプン0.5g/L、リン酸水素二カリウム0.3g/L、硫酸マグネシウム無水物0.024g/L、ピルビン酸ナトリウム0.3g/L、寒天15.0g/L、最終pH7.2±0.2)、TSA寒天プレート(トリプトン15g/L、Sojaパパイン消化ペプトン5g/L、塩化ナトリウム5g/L、寒天15g/L、pH値7.3±0.2)又はSDA寒天プレート(カゼインの膵臓消化物5g/L、動物組織のペプシン消化物5g/L、デキストロース40g/L、寒天15g/L、pH値5.6±0.2)上に堆積させた。或いは、150μlのAF350-NHSエステル(150μM)及びAF405-DBCO(150μM)の混合物を微生物の同一セット上に同一条件で堆積させた。各寒天プレートは、色素の混合物の1滴を含んでいた。

【0326】

各微生物培養物を0.45μmのPVDF又はMCEメンブレン(47mm)上で濾過した。次いで、各メンブレンを各寒天プレート上の蛍光色素の液滴の上に堆積させた。次いで、プレートを、微小コロニー半自動化カウンター(MICA、DIAMIDEX社、MB660R-DBCO及びスルホ-Cy5酸が使用される場合:Cy5光力100%、ゲイン1、露光時間100及び200ms; AF350-NHSエステル及びAF405-DBCOが使用される場合:UV光力100%、ゲイン1、露光時間50及び100ms)を用いてメンブレン上にスパイクされたすべての微小コロニーを数え上げるのに必要な最小の時間の間32.5℃でインキュベートした。結果は以下のTable 11(表11)及びTable 12(表12)に提示されている。

【0327】

【表11】

【0328】

【表12】

【0329】

(実施例11)
フルオロクロムの混合物を用いる染色方法
濾過の前の細菌培養物への蛍光色素の添加
枯草菌ATCC 6633を事前に定量化した低温保存ストックからNaCl 0.9%で希釈して、実験条件あたり規定数の微生物を得た。10mlのNaCl 0.9%の最終容量中の懸濁液にMB660R-DBCO (50μM)及びスルホ-Cy5酸(50μM)の混合物を添加した。得られた懸濁液を白色又は黒色MCEメンブレン上で濾過し、微生物をTSAプレート(トリプトン15g/L、Sojaパパイン消化ペプトン5g/L、塩化ナトリウム5g/L、寒天15g/L、pH値7.3±0.2)上、32.5℃で16時間増殖させた。

【0330】

寒天培地における蛍光色素の組込み
150μlのMB660R-DBCO (50μM)及びスルホ-Cy5酸(50μM)によって構成された混合物を、TSAプレート(トリプトン15g/L、Sojaパパイン消化ペプトン5g/L、塩化ナトリウム5g/L、寒天15g/L、pH値7.3±0.2)の表面上に画線し、又は添加し、混合してTSA寒天培地を融解し、その後、前記培地をプレート上に注いだ。寒天プレートを4℃で12日間維持した。実験当日、枯草菌ATCC 6633を事前に定量化した低温保存ストックからNaCl 0.9%で希釈して、実験条件あたり規定数の微生物を得た。得られた懸濁液を白色MCEメンブレン上で濾過し、微生物を、フルオロクロムの混合物が組み込まれたTSAプレート上、32.5℃で16時間増殖させた。

【0331】

メンブレンと寒天培地の間に堆積した蛍光色素
枯草菌ATCC 6633を事前に定量化した低温保存ストックからNaCl 0.9%で希釈して、実験条件あたり規定数の微生物を得た。得られた懸濁液を白色又は黒色MCEメンブレン上で濾過した。150μlのMB660R-DBCO(50μM)及びスルホ-Cy5酸(50μM)によって構成された混合物を、TSA寒天プレート上に堆積させた。次いで、濾過メンブレンを各寒天プレート上の蛍光色素液滴の上に堆積させ、微生物をTSAプレート上、32.5℃で16時間増殖させた。

【0332】

各プロトコールについて、インキュベーション後、微小コロニー半自動化カウンター(MICA、DIAMIDEX社、スルホ-Cy5酸及びMB660R-DBCO:CY5光力10%～20% ゲイン1 露光時間50ms及び100ms)を使用して微小コロニーを検出した。

【0333】

これらの方法の各々は、微生物の効率的な染色及び検出を可能にする。これらの実験の結果は、図16に例証されている。

【0334】

(実施例12)
寒天培地からの連絡切断を回避する検出方法
この実施例では、アリシクロバチルス・アシドテレストリスATCC(登録商標)49025(商標)、アリシクロバチルス・シクロヘプタニカスATCC(登録商標)49028(商標)及びアリシクロバチルス・ハーバリウスDSM 13609を含むアリシクロバチルス属細菌のいくつかの株を使用した。株を事前に定量化した低温保存ストックからNaCl 0.9%で希釈して、実験条件あたり規定数の微生物を得た。

【0335】

プロトコール1:寒天培地上に置かれたメンブレン上で検出を行った。
150μLの蛍光色素MB660R-DBCO(100μM)を、BAT寒天プレート(酵母エキス2g/l、D(+)グルコース5g/l、塩化カルシウム0.25066g/l、硫酸マグネシウム0.5g/l、硫酸アンモニウム0.2g/l、リン酸二水素カリウム3g/l、硫酸亜鉛0.00018g/l、硫酸銅0.00016g/l、硫酸マンガン0.00015g/l、モリブデン酸ナトリウム二水和物0.00030g/l、寒天18g/l、pH値3.8～4.2)上に堆積させた。各寒天プレートは1滴の蛍光色素を含んでいた。アリシクロバチルス・シクロヘプタニカス及びアリシクロバチルス・ハーバリウスをPVDF濾過メンブレン上で濾過した。次いで、メンブレンを、各寒天プレート上の蛍光色素の液滴の上に堆積させた。

【0336】

プロトコール2:検出を寒天培地上で直接的に行った。

【0337】

精製水で希釈されたA.アシドテレストリスを含有する250μlの液滴及び12.5μLの蛍光色素MB660R-DBCO(250μM)を、寒天培地の表面上に画線した。次いで、プレートを45℃で24時間インキュベートした。

【0338】

各プロトコールについて、インキュベーション後、微小コロニー半自動化カウンター(MICA、DIAMIDEX社、寒天培地上のメンブレンで行われた検出について光力100%、ゲイン1、露光時間100;寒天培地上での直接的な検出について光力100%、ゲイン1、露光時間50)を使用して微小コロニーを検出した。

【0339】

これら2つのプロトコールによって、微生物の効率的な染色及び検出が可能となる。これらの実験の結果は、図17において例証されている。

【0340】

(実施例13)
単純性及び複雑性UTIに関与する細菌を数え上げること
単純性及び複雑性両方のUTIの最も一般的な原因物質は、大腸菌である。単純性UTIに関与する物質については、有病率において大腸菌に、肺炎桿菌、スタフィロコッカス・サプロフィティカス、フェカリス菌、B群ストレプトコッカス属(GBS)、プロテウス・ミラビリス、緑膿菌、黄色ブドウ球菌及びカンジダ属の種が続く。複雑性UTIについては、原因物質の有病率の順序は、最も一般的な大腸菌に続いて、エンテロコッカス属の種、肺炎桿菌、カンジダ属の種、黄色ブドウ球菌、P.ミラビリス、緑膿菌及びGBSである。

【0341】

この実施例において使用されたグラム陰性菌は、大腸菌ATCC(登録商標)8739(商標)、肺炎桿菌ATCC(登録商標)13883(商標)及びP.ミラビリスATCC(登録商標)29906(商標)であった。グラム陽性菌は、フェカリス菌ATCC(登録商標)19433(商標)及び黄色ブドウ球菌ATCC(登録商標)6538(商標)であった。この選択は、単純性及び複雑性UTIの89%を対象とする。

【0342】

150μLのMB660R-DBCO(100μM)及びスルホ-Cy5酸(100μM)の混合物を、グラム陽性菌及びP.ミラビリスについてはTSA寒天プレート(トリプトン15g/L、Sojaパパイン消化ペプトン5g/L、塩化ナトリウム5g/L、寒天15g/L、pH値7.3±0.2)又はコロンビア血液寒天培地プレート(ペプトン23g/l、デンプン1g/l、塩化ナトリウム5g/l、ヒツジ血液50ml/l、寒天14g/l、pH値7.3±0.2)上に、及び大腸菌群(大腸菌及び肺炎桿菌)についてはTSA寒天プレート、コロンビア血液寒天培地プレート又はマッコンキー寒天プレート(ペプトン20g/L、ラクトース10g/L、胆汁酸塩1.5g/L、クリスタルバイオレット0.001g/L、ニュートラルレッド0.05g/L、塩化ナトリウム5.0g/L、寒天15.0g/L、pH値7.1+/-0.2)上に堆積させた。或いは、DAPI(50μM)の150μlを同一セットの微生物上で同一条件で堆積させた。各寒天プレートは、色素の混合物の1滴を含んでいた。

【0343】

各細菌を事前に定量化した低温保存ストックから希釈して、実験条件あたり規定数の微生物を得た。得られた懸濁液を、PVDF又はMCEメンブレン上で濾過した。

【0344】

次いで、濾過メンブレンを各寒天プレート上の蛍光色素液滴の上に堆積させた。次いで、プレートを、微小コロニー半自動化カウンター(MICA、DIAMIDEX社、MB660R-DBCO及びスルホ-Cy5酸:Cy5光力100%、ゲイン1、露光時間100及び200ms;DAPI:UV光力100%、ゲイン1、露光時間50及び100ms)を用いてメンブレン上にスパイクされたすべての微小コロニーを数え上げるのに必要な最小の時間の間37℃でインキュベートした。

【0345】

【表13】

【0346】

Table 13(表13)に示されるように、単純性UTIの75%及び複雑性UTIの65%の原因となる大腸菌を、本発明の方法を用いてTSA寒天プレート上で6時間未満で、コロンビア寒天プレート上で7時間30未満で、及びマッコンキー寒天プレート上で10時間未満で数え上げることができる。更に、単純性及び複雑性UTIに関与する最も流行している微生物を、TSA寒天プレートコロンビア血液寒天培地プレート及びマッコンキー寒天プレート上で11時間未満で数え上げることができる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15-1】

【図15-2】

【図16】

【図17】

【国際調査報告】