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▶ サーモ フィニガン リミテッド ライアビリティ カンパニーの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-06-21
(54)【発明の名称】ＭＲＮＡキャッピング効率の定量的モニタリング方法
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/6806 20180101AFI20240614BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/6806 Z
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023577441
(86)(22)【出願日】2023-03-16
(85)【翻訳文提出日】2023-12-14
(86)【国際出願番号】 US2023064530
(87)【国際公開番号】W WO2023201161
(87)【国際公開日】2023-10-19
(31)【優先権主張番号】63/331,407
(32)【優先日】2022-04-15
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】501192059
【氏名又は名称】サーモ フィニガン リミテッド ライアビリティ カンパニー
(74)【代理人】
【識別番号】100094569
【弁理士】
【氏名又は名称】田中 伸一郎
(74)【代理人】
【識別番号】100103610
【弁理士】
【氏名又は名称】▲吉▼田 和彦
(74)【代理人】
【識別番号】100109070
【弁理士】
【氏名又は名称】須田 洋之
(74)【代理人】
【識別番号】100119013
【弁理士】
【氏名又は名称】山崎 一夫
(74)【代理人】
【識別番号】100123777
【弁理士】
【氏名又は名称】市川 さつき
(74)【代理人】
【識別番号】100111796
【弁理士】
【氏名又は名称】服部 博信
(74)【代理人】
【識別番号】100123766
【弁理士】
【氏名又は名称】松田 七重
(74)【代理人】
【識別番号】100136249
【弁理士】
【氏名又は名称】星野 貴光
(72)【発明者】
【氏名】ロス ロバート エル
(72)【発明者】
【氏名】ドゥ ミン
【テーマコード（参考）】
4B063
【Ｆターム（参考）】
4B063QA01
4B063QA11
4B063QQ53
4B063QQ62
4B063QR13
4B063QR14
4B063QR42
4B063QS17
4B063QS28
(57)【要約】
ｍＲＮＡキャッピング効率を定量する方法は、緩衝溶液中で、試料、酵素混合物及び同位体標準物質溶液を一緒にして、インキュベート混合物を生成する工程であって、酵素混合物が、非特異的一本鎖ヌクレアーゼ及び酸性ホスファターゼを含み、同位体標準物質が、同位体標識ｍ７Ｇ及び同位体標識２’－Ｏ－メチル化ヌクレオシドを含む、工程と、混合物をインキュベートする工程と、液体クロマトグラフィー－質量分析法を使用して混合物を分析し、キャッピング効率及び２－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ効率のうちの少なくとも１つを求める工程とを含む。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ヌクレアーゼＰ１及びサツマイモ酸性ホスファターゼを含む、酵素混合物と、同位体標識ｍ７Ｇ及び同位体標識２’－Ｏ－メチル化ヌクレオシド（Ａｍ、Ｇｍ、Ｃｍ又はＵｍ）を含む、標準物質混合物と、
を含む、ｍＲＮＡキャッピング効率を定量するためのキット。
【請求項2】
緩衝溶液を更に含む、請求項１に記載のキット。
【請求項3】
前記緩衝溶液が、ＺｎＣｌ2を含む、請求項２に記載のキット。
【請求項4】
前記緩衝溶液が、約０．０１ｍｍｏｌ～約９０ｍｍｏｌのＺｎＣｌ2濃度を有する、請求項３に記載のキット。
【請求項5】
前記緩衝溶液が、約１００ｍｍｏｌ未満の濃度の二価陽イオンを有する、請求項３に記載のキット。
【請求項6】
前記緩衝溶液が、約２～約７のｐＨを有する、請求項２に記載のキット。
【請求項7】
前記緩衝溶液が、約４～約６のｐＨを有する、請求項６に記載のキット。
【請求項8】
更に、前記酵素混合物が、ＲＮアーゼＴ１を更に含む、請求項１に記載のキット。
【請求項9】
前記酵素混合物が凍結乾燥粉末である、請求項１に記載のキット。
【請求項10】
前記標準物質混合物が、凍結乾燥粉末である、請求項１に記載のキット。
【請求項11】
前記同位体標識ｍ７Ｇ及び２’－Ｏ－メチル化ヌクレオシドが、重水素標識ｍ７Ｇ（Ｄ）及び重水素標識２’－Ｏ－メチル化ヌクレオシド（Ａｍ（Ｄ）、Ｇｍ（Ｄ）、Ｃｍ（Ｄ）又はＵｍ（Ｄ））を含む、請求項１に記載のキット。
【請求項12】
前記同位体標識ｍ７Ｇ及び前記同位体標識２’－Ｏ－メチル化ヌクレオシドが、Ｎ15標識されているか、又はＣ13標識されている、請求項１に記載のキット。
【請求項13】
前記標準物質混合物中の前記同位体標識ｍ７Ｇ及び前記同位体標識２’－Ｏ－メチル化ヌクレオシドが、約２：１～約１：２のモル比で存在する、請求項１に記載のキット。
【請求項14】
前記標準物質混合物が、等モル量の同位体標識ｍ７Ｇ及び同位体標識２’－Ｏ－メチル化ヌクレオシドを含む、請求項１３に記載のキット。
【請求項15】
非特異的一本鎖ヌクレアーゼ及び酸性ホスファターゼを含む、酵素混合物と、同位体標識ｍ７Ｇ及び同位体標識２’－Ｏ－メチル化ヌクレオシド（Ａｍ、Ｇｍ、Ｃｍ又はＵｍ）を含む、標準物質混合物と、
緩衝溶液と、
を含む、ｍＲＮＡキャッピング効率を定量するためのキット。
【請求項16】
前記非特異的一本鎖ヌクレアーゼがヌクレアーゼＰ１を含む、請求項１５に記載のキット。
【請求項17】
前記酸性ホスファターゼが、アデノシン一リン酸によって阻害されない、請求項１５に記載のキット。
【請求項18】
前記酸性ホスファターゼが、サツマイモ酸性ホスファターゼを含む、請求項１５に記載のキット。
【請求項19】
前記酵素混合物が、部位特異的一本鎖ＲＮＡエンドヌクレアーゼを含む、請求項１５に記載のキット。
【請求項20】
前記部位特異的一本鎖ＲＮＡエンドヌクレアーゼが、グアノシンのＲＮＡ３’を切断する、請求項１９に記載のキット。
【請求項21】
前記部位特異的一本鎖ＲＮＡエンドヌクレアーゼが、リボヌクレアーゼＴ１を含む、請求項１９に記載のキット。
【請求項22】
前記酵素混合物が、凍結乾燥粉末である、請求項１５に記載のキット。
【請求項23】
前記標準物質混合物が、凍結乾燥粉末である、請求項１５に記載のキット。
【請求項24】
前記同位体標識ｍ７Ｇ及び前記同位体標識２’－Ｏ－メチル化ヌクレオシドが、重水素標識ｍ７Ｇ（Ｄ）及び重水素標識２’－Ｏ－メチル化ヌクレオシド（Ａｍ（Ｄ）、Ｇｍ（Ｄ）、Ｃｍ（Ｄ）又はＵｍ（Ｄ））を含む、請求項１５に記載のキット。
【請求項25】
前記同位体標識ｍ７Ｇ及び前記同位体標識２’－Ｏ－メチル化ヌクレオシドが、Ｎ15標識されているか、又はＣ13標識されている、請求項１５に記載のキット。
【請求項26】
前記標準物質混合物中の前記同位体標識ｍ７Ｇ及び前記同位体標識２’－Ｏ－メチル化ヌクレオシドが、約２：１～約１：２のモル比で存在する、請求項１５に記載のキット。
【請求項27】
前記標準物質混合物が、等モル量の前記同位体標識ｍ７Ｇ及び前記同位体標識２’－Ｏ－メチル化ヌクレオシドを含む、請求項２６に記載のキット。
【請求項28】
前記緩衝溶液が、約０．００１ｍＭ～約９０ｍＭの濃度範囲のＺｎＣｌ2を含む、請求項１５に記載のキット。
【請求項29】
前記緩衝溶液が、約０．０５ｍＭ～約０．２ｍＭの濃度範囲のＺｎＣｌ2を含む、請求項２８に記載のキット。
【請求項30】
前記緩衝溶液が、約１００ｍＭ未満の二価陽イオンを含む、請求項２８に記載のキット。
【請求項31】
前記緩衝溶液が、約２～約７のｐＨを有する、請求項１５に記載のキット。
【請求項32】
前記緩衝溶液が、約４～約６のｐＨを有する、請求項３１に記載のキット。
【請求項33】
緩衝溶液中で試料、酵素混合物及び同位体標準物質溶液を一緒にして、インキュベート混合物を生成する工程であって、前記酵素混合物が、非特異的一本鎖ヌクレアーゼ及び酸性ホスファターゼを含み、前記同位体標準物質が、同位体標識ｍ７Ｇ及び同位体標識２’－Ｏ－メチル化ヌクレオシド（Ａｍ、Ｇｍ、Ｃｍ又はＵｍ）を含む、工程と、前記混合物をインキュベートする工程と、
液体クロマトグラフィー－質量分析法を使用して、前記混合物を分析し、キャッピング効率及び２’－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ効率の少なくとも１つを求める工程と、
を含む、ｍＲＮＡキャッピング効率を定量するための方法。
【請求項34】
前記混合物のインキュベートが、約３０℃～７０℃の温度で行われる、請求項３３に記載の方法。
【請求項35】
前記混合物のインキュベートが、約３５℃～４５℃の温度で行われる、請求項３４に記載の方法。
【請求項36】
前記非特異的一本鎖ヌクレアーゼが、ヌクレアーゼＰ１を含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項37】
前記酸性ホスファターゼが、アデノシン一リン酸によって阻害されない、請求項３３に記載の方法。
【請求項38】
前記酸性ホスファターゼが、サツマイモ酸性ホスファターゼを含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項39】
前記酵素混合物が、部位特異的一本鎖ＲＮＡエンドヌクレアーゼを更に含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項40】
前記部位特異的一本鎖ＲＮＡエンドヌクレアーゼが、グアノシンのＲＮＡ３’を切断する、請求項３９に記載の方法。
【請求項41】
前記部位特異的一本鎖ＲＮＡエンドヌクレアーゼが、リボヌクレアーゼＴ１を含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項42】
前記混合物のインキュベートが、約３０℃～５０℃の温度で行われる、請求項４１に記載の方法。
【請求項43】
凍結乾燥酵素混合物を前記試料緩衝溶液で溶解して、前記酵素混合物を得る工程を更に含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項44】
凍結乾燥標準物質混合物を前記試料緩衝溶液で溶解して、前記標準物質混合物を得る工程を更に含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項45】
前記同位体標識ｍ７Ｇ及び前記同位体標識２’－Ｏ－メチル化ヌクレオシドが、重水素標識ｍ７Ｇ（Ｄ）及び重水素標識２’－Ｏ－メチル化ヌクレオシド（Ａｍ（Ｄ）、Ｇｍ（Ｄ）、Ｃｍ（Ｄ）又はＵｍ（Ｄ））を含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項46】
前記同位体標識ｍ７Ｇ及び前記同位体標識２’－Ｏ－メチル化ヌクレオシドが、Ｎ15標識されているか、又はＣ13標識されている、請求項３３に記載の方法。
【請求項47】
前記標準物質混合物中の前記同位体標識ｍ７Ｇ及び前記同位体標識２’－Ｏ－メチル化ヌクレオシドが、約２：１～約１：２のモル比で存在する、請求項３３に記載の方法。
【請求項48】
前記標準物質混合物が、等モル量の同位体標識ｍ７Ｇ及び同位体標識２’－Ｏ－メチル化ヌクレオシドを含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項49】
インキュベート混合物が、約１．０ｎｍｏｌ～２０ｎｍｏｌとなる量の同位体標識ｍ７Ｇを含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項50】
インキュベート混合物が、約１．０ｎｍｏｌ～約２０ｎｍｏｌとなる量の同位体標識２’－Ｏ－メチル化ヌクレオシドを含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項51】
前記緩衝溶液が、約０．００１ｍＭ～約９０ｍＭの濃度範囲のＺｎＣｌ2を含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項52】
前記緩衝溶液が、約０．０５ｍＭ～約０．２ｍＭの濃度範囲のＺｎＣｌ2を含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項53】
前記インキュベート混合物が、１００ｍＭ未満の二価陽イオンを含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項54】
前記緩衝溶液が、約２～約７のｐＨを有する、請求項３３に記載の方法。
【請求項55】
前記緩衝溶液が、約４～約６のｐＨを有する、請求項５４に記載の方法。
【請求項56】
液体クロマトグラフィー－質量分析法を使用して前記混合物を分析する工程が、クロマトグラフィーカラムを使用して前記混合物を分離する工程と、質量分析計を使用してｍ／ｚ及び強度データを得る工程と、ｍ７Ｇ及び同位体標識ｍ７Ｇのピーク、２’－Ｏ－メチル化ヌクレオシド及び同位体標識２’－Ｏ－メチル化ヌクレオシドのピーク、又はそれらの両方を特定して積分する工程と、ｍ７Ｇ：同位体標識ｍ７Ｇピーク比、２’－Ｏ－メチル化ヌクレオシド：同位体標識２’－Ｏ－メチル化ヌクレオシドピーク比、又はそれらの両方を計算する工程と、前記ｍ７Ｇ：同位体標識ｍ７Ｇピーク比に基づいた前記キャッピング効率、前記２’－Ｏ－メチル化ヌクレオシド：同位体標識２’－Ｏ－メチル化ヌクレオシドピーク比に基づいた２－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ効率、又はそれらの両方を求める工程を更に含む、請求項３３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本開示は、概して、ｍＲＮＡキャッピング効率を定量的にモニタリングする方法を含めた、質量分析法の分野に関する。
【背景技術】
【0002】
序論
真核生物系では、非ミトコンドリアメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）は、逆方向７－メチルグアノシン（ｍ７Ｇ）（図１Ａ）によって５’末端においてキャッピングされており、これは、キャップ（０）（図２Ａ）と呼ばれる５’から５’への三リン酸連結基ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｎによって転写物に連結されている。一旦、転写物に付加されると、鎖中の第１のヌクレオチド（Ｎ）は、次いで、２’ヒドロキシル位置においてメチル化され、キャップ（１）構造であるｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｎｍを与える（図２Ｂ）。例えば、図１Ｂは、２’－Ｏ－メチルアデノシンを示している。あるいは、Ｎｍは、２’－Ｏ－メチルグアノシン（Ｇｍ）、２’－Ｏ－メチルシトシンＣｍ又は２’－Ｏ－メチルウリジン（Ｕｍ）であり得る。キャッピング及びポリアデニル化は、転写産物が、細胞内の生得的なエキソヌクレアーゼによる分解から抵抗する一助となる。５’から３’へのエキソヌクレアーゼを遮断することに加えて、５’キャップは、核から細胞質への輸送を促進し、リボソームドッキング複合体の決定因子として作用することによって翻訳開始プロセスを助ける。
真核生物系では、非ミトコンドリアメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）は、逆方向７－メチルグアノシン（ｍ７Ｇ）（図１Ａ）によって５’末端においてキャッピングされており、これは、キャップ（０）（図２Ａ）と呼ばれる５’から５’への三リン酸連結基ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｎによって転写物に連結されている。一旦、転写物に付加されると、鎖中の第１のヌクレオチド（Ｎ）は、次いで、２’ヒドロキシル位置においてメチル化され、キャップ（１）構造であるｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｎｍを与える（図２Ｂ）。例えば、図１Ｂは、２’－Ｏ－メチルアデノシンを示している。あるいは、Ｎｍは、２’－Ｏ－メチルグアノシン（Ｇｍ）、２’－Ｏ－メチルシトシンＣｍ又は２’－Ｏ－メチルウリジン（Ｕｍ）であり得る。キャッピング及びポリアデニル化は、転写産物が、細胞内の生得的なエキソヌクレアーゼによる分解から抵抗する一助となる。５’から３’へのエキソヌクレアーゼを遮断することに加えて、５’キャップは、核から細胞質への輸送を促進し、リボソームドッキング複合体の決定因子として作用することによって翻訳開始プロセスを助ける。
【0003】
スプライシング事象と呼ばれる転写物の更なる変化もまた、キャップ構造に依存する。遺伝子内領域又はイントロンと呼ばれる転写物の部分が除去され、切断された区域が再結合され、発現されるコード化領域（エキソン）が残る。このコード化領域は、５’及び３’の両側が、タンパク質に翻訳されないが翻訳に影響を及ぼすＲＮＡのストレッチである非翻訳領域によって挟まれている。次いで、成熟ｍＲＮＡ転写物は、５つの区域、５’キャップ、５’ＵＴＲ、コード化領域、３’ＵＴＲ及び最後にポリアデニル化尾部からなる（図３を参照されたい）。
【0004】
最近の出来事、特にＣＯＶＩＤパンデミックにより、ｍＲＮＡは、様々なｍＲＮＡベースのＣＯＶＩＤワクチンなどの有用な治療法として広く採用されてきた。インビトロ転写による非天然転写物の産生は、所望の治療機能を達成するために、精製後に修飾キャップ構造体の付加を必要とすることがある。修飾された５’キャップは、抗リバースキャップアナログ（ＡＲＣＡ）（米国特許第７，０７４，５９６号）、ＴｒｉＬｉｎｋ ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙのＣｌｅａｎＣａｐアナログ、又はワクシニアキャッピング酵素とそれに続くメチルトランスフェラーゼ反応によるものを含むことができる。転写物の産生は、反応結果及び収率を求めるために分析試験を必要とするが、転写物のサイズに起因して、質量分析法などによる直接測定は技術的に難題である。したがって、キャッピング効率及びメチル化効率を測定するための改善された技術が望まれる。
【発明の概要】
【0005】
第１の態様では、ｍＲＮＡキャッピング効率を定量するためのキットは、ヌクレアーゼＰ１及びサツマイモ酸性ホスファターゼを含む酵素混合物、並びに同位体標識ｍ７Ｇ及び同位体標識２’－Ｏ－メチル化ヌクレオシドを含む標準物質混合物（standard mixture）を含むことができる。様々な実施形態では、２’－Ｏ－メチル化ヌクレオシドは、Ａｍ、Ｇｍ、Ｕｍ又はＣｍとすることができる。
【0006】
第１の態様の様々な実施形態では、本キットは、緩衝溶液を更に含むことができる。特定の実施形態では、緩衝溶液は、約０．０１ｍｍｏｌ～約９０ｍｍｏｌのＺｎＣｌ2濃度などの、ＺｎＣｌ2を含むことができる。特定の実施形態では、緩衝溶液は、１００ｍｍｏｌ未満の濃度の二価陽イオンを有する。特定の実施形態では、緩衝溶液は、約４～約６などの、約２～約７のｐＨを有することができる。
【0007】
第１の態様の様々な実施形態では、酵素混合物は、ＲＮアーゼＴ１を更に含むことができる。
【0008】
第１の態様の様々な実施形態では、酵素混合物は、凍結乾燥粉末とすることができる。
【0009】
第１の態様の様々な実施形態では、標準物質混合物は、凍結乾燥粉末とすることができる。
【0010】
第１の態様の様々な実施形態では、同位体標識ｍ７Ｇ及び同位体標識２’－Ｏ－メチル化ヌクレオシドは、重水素標識ｍ７Ｇ（Ｄ）及び重水素標識２’－Ｏ－メチル化ヌクレオシドを含む。
【0011】
第１の態様の様々な実施形態では、同位体標識ｍ７Ｇ及び同位体標識２’－Ｏ－メチル化ヌクレオシドは、Ｎ15標識されているか、又はＣ13標識されている。
【0012】
第１の態様の様々な実施形態では、標準物質混合物中の同位体標識ｍ７Ｇ及び同位体標識２’－Ｏ－メチル化ヌクレオシドは、約２：１～約１：２のモル比で存在し得る。特定の実施形態では、標準物質混合物は、等モル量の同位体標識ｍ７Ｇ及び同位体標識２’－Ｏ－メチル化ヌクレオシドを含むことができる。
【0013】
第２の態様では、ｍＲＮＡキャッピング効率を定量するためのキットは、非特異的一本鎖ヌクレアーゼ及び酸性ホスファターゼを含む酵素混合物、同位体標識ｍ７Ｇ及び同位体標識２’－Ｏ－メチル化ヌクレオシドを含む標準物質混合物（standard mixture）、並びに緩衝溶液を含むことができる。
【0014】
第２の態様の様々な実施形態では、非特異的一本鎖ヌクレアーゼは、ヌクレアーゼＰ１を含むことができる。
【0015】
第２の態様の様々な実施形態では、酸性ホスファターゼは、アデノシン一リン酸によって阻害され得ない。
【0016】
第２の態様の様々な実施形態では、酸性ホスファターゼは、サツマイモ酸性ホスファターゼを含むことができる。
【0017】
第２の態様の様々な実施形態では、酵素混合物は、部位特異的一本鎖ＲＮＡエンドヌクレアーゼを含むことができる。
【0018】
第２の態様の様々な実施形態では、部位特異的一本鎖ＲＮＡエンドヌクレアーゼは、グアノシンのＲＮＡ３’を切断することができる。
【0019】
第２の態様の様々な実施形態では、部位特異的一本鎖ＲＮＡエンドヌクレアーゼは、リボヌクレアーゼＴ１を含むことができる。
【0020】
第２の態様の様々な実施形態では、酵素混合物は、凍結乾燥粉末とすることができる。
【0021】
第２の態様の様々な実施形態では、標準物質混合物は、凍結乾燥粉末とすることができる。
【0022】
第１の態様の様々な実施形態では、同位体標識ｍ７Ｇ及び同位体標識２’－Ｏ－メチル化ヌクレオシドは、重水素標識ｍ７Ｇ（Ｄ）及び重水素標識２’－Ｏ－メチル化ヌクレオシドを含む。
【0023】
第１の態様の様々な実施形態では、同位体標識ｍ７Ｇ及び同位体標識２’－Ｏ－メチル化ヌクレオシドは、Ｎ15標識されているか、又はＣ13標識されている。
【0024】
第２の態様の様々な実施形態では、標準物質混合物中の同位体標識ｍ７Ｇ及び同位体標識２’－Ｏ－メチル化ヌクレオシドは、約２：１～約１：２のモル比で存在し得る。特定の実施形態では、標準物質混合物は、等モル量の同位体標識ｍ７Ｇ及び同位体標識２’－Ｏ－メチル化ヌクレオシドを含むことができる。
【0025】
第２の態様の様々な実施形態では、緩衝溶液は、約０．０５ｍＭ～約０．２ｍＭなどの約０．００１ｍＭ～約９０ｍＭの濃度範囲のＺｎＣｌ2を含むことができる。特定の実施形態では、緩衝溶液は、１００ｍＭ未満の二価陽イオンを含むことができる。
【0026】
第２の態様の様々な実施形態では、緩衝溶液は、約４～約６などの、約２～約７のｐＨを有する。
【0027】
第３の態様では、ｍＲＮＡキャッピング効率を定量する方法は、緩衝溶液中で、試料、酵素混合物及び同位体標準物質溶液（isotopic standard solution）を一緒にして、インキュベート混合物を生成する工程であって、酵素混合物が、非特異的一本鎖ヌクレアーゼ及び酸性ホスファターゼを含み、同位体標準物質が、同位体標識ｍ７Ｇ及び同位体標識２’－Ｏ－メチル化ヌクレオシドを含む、工程と、混合物をインキュベートする工程と、液体クロマトグラフィー－質量分析法を使用して混合物を分析し、キャッピング効率及び２’－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ効率のうちの少なくとも１つを求める工程と、を含むことができる。
【0028】
第３の態様の様々な実施形態では、混合物をインキュベートする工程は、約３５℃～４５℃などの約３０℃～７０℃の温度で行うことができる。
【0029】
第３の態様の様々な実施形態では、非特異的一本鎖ヌクレアーゼは、ヌクレアーゼＰ１を含むことができる。
【0030】
第３の態様の様々な実施形態では、酸性ホスファターゼは、アデノシン一リン酸によって阻害され得ない。
【0031】
第３の態様の様々な実施形態では、酸性ホスファターゼは、サツマイモ酸性ホスファターゼを含むことができる。
【0032】
第３の態様の様々な実施形態では、酵素混合物は、部位特異的一本鎖ＲＮＡエンドヌクレアーゼを更に含むことができる。特定の実施形態では、部位特異的一本鎖ＲＮＡエンドヌクレアーゼは、グアノシンのＲＮＡ３’を切断することができる。特定の実施形態では、部位特異的一本鎖ＲＮＡエンドヌクレアーゼは、リボヌクレアーゼＴ１を含むことができる。更なる実施形態では、混合物をインキュベートする工程は、約３０℃～５０℃の温度で行うことができる。
【0033】
第３の態様の様々な実施形態では、インキュベート混合物は、約０．５～約２．０単位などの約０．５単位～約１０．０単位の部位特異的一本鎖ＲＮＡエンドヌクレアーゼを含むことができる。
【0034】
第３の態様の様々な実施形態では、本方法は、凍結乾燥した酵素混合物を試料緩衝溶液で溶解（solubilize）して、酵素混合物を得る工程を更に含むことができる。
【0035】
第３の態様の様々な実施形態では、本方法は、凍結乾燥した標準物質混合物を試料緩衝溶液で溶解（solubilize）して、標準物質混合物を得る工程を更に含むことができる。
【0036】
第３の態様の様々な実施形態では、インキュベート混合物は、約０．５単位～約２．０単位などの約０．５単位～約１０．０単位の酸性ホスファターゼを含むことができる。
【0037】
第３の態様の様々な実施形態では、インキュベート混合物は、約５単位～約２０単位などの約１単位～１００単位の非特異的一本鎖ヌクレアーゼを含むことができる。
【0038】
第３の態様の様々な実施形態では、同位体標識ｍ７Ｇ及び同位体標識２’－Ｏ－メチル化ヌクレオシドは、重水素標識ｍ７Ｇ（Ｄ）及び重水素標識２’－Ｏ－メチル化ヌクレオシドを含む。
【0039】
第３の態様の様々な実施形態では、同位体標識ｍ７Ｇ及び同位体標識２’－Ｏ－メチル化ヌクレオシドは、Ｎ15標識されているか、又はＣ13標識されている。
【0040】
第３の態様の様々な実施形態では、標準物質混合物中の同位体標識ｍ７Ｇ及び同位体標識２’－Ｏ－メチル化ヌクレオシドは、等モル量の同位体標識ｍ７Ｇ及び同位体標識２’－Ｏ－メチル化ヌクレオシドなどの、約２：１～約１：２のモル比で存在する。
【0041】
第３の態様の様々な実施形態では、インキュベート混合物は、約１．０ｎｍｏｌ～２０ｎｍｏｌとなる量の同位体標識ｍ７Ｇを含むことができる。特定の実施形態では、インキュベート混合物は、約１．０ｎｍｏｌ～約２０ｎｍｏｌとなる量の同位体標識２’－Ｏ－メチル化ヌクレオシドを含むことができる。
【0042】
第３の態様の様々な実施形態では、緩衝溶液は、約０．００１ｍＭ～約９０ｍＭの濃度範囲のＺｎＣｌ2を含むことができる。特定の実施形態では、緩衝溶液は、約０．０５ｍＭ～約０．２ｍＭの濃度範囲のＺｎＣｌ2を含むことができる。
【0043】
第３の態様の様々な実施形態では、インキュベート混合物は、１００ｍＭ未満の二価陽イオンを含むことができる。
【0044】
第３の態様の様々な実施形態では、緩衝溶液は、約４～約６などの、約２～約７のｐＨを有することができる。
【0045】
第３の態様の様々な実施形態では、液体クロマトグラフィー－質量分析法を使用して混合物を分析する工程は、クロマトグラフィーカラムを使用して混合物を分離する工程と、質量分析計を使用してｍ／ｚ及び強度データを得る工程と、ｍ７Ｇ及び同位体標識ｍ７Ｇのピーク、２’－Ｏ－メチル化ヌクレオシド及び同位体標識２’－Ｏ－メチル化ヌクレオシドのピーク、又はそれらの両方を特定して積分する工程と、ｍ７Ｇ：同位体標識ｍ７Ｇピーク比、２’－Ｏ－メチル化ヌクレオシド：同位体標識２’－Ｏ－メチル化ヌクレオシドピーク比、又はそれらの両方を計算する工程と、ｍ７Ｇ：同位体標識ｍ７Ｇピーク比に基づいたキャッピング効率、２’－Ｏ－メチル化ヌクレオシド：同位体標識２’－Ｏ－メチル化ヌクレオシドピーク比に基づいた２’－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ効率、又はそれらの両方を求める工程と、を更に含む。
ここで、本明細書において開示される原理、及びその利点のより完全な理解のために、添付の図面と併せて考慮される以下の説明が参照される。
ここで、本明細書において開示される原理、及びその利点のより完全な理解のために、添付の図面と併せて考慮される以下の説明が参照される。
【図面の簡単な説明】
【0046】
【図1A】７－メチルグアノシン及び２’－Ｏ－メチルアデノシンの化学構造を例示する略図である。
【図1B】７－メチルグアノシン及び２’－Ｏ－メチルアデノシンの化学構造を例示する略図である。
【図2A】キャップ（０）及びキャップ（１）の化学構造を例示する略図である。
【図2B】キャップ（０）及びキャップ（１）の化学構造を例示する略図である。
【図3】ｍＲＮＡの構造を例示する略図である。
【図4A】様々な実施形態による、重水素化７－メチルグアノシン及び重水素化２’－Ｏ－メチルアデノシンの化学構造を例示する略図である。
【図4B】様々な実施形態による、重水素化７－メチルグアノシン及び重水素化２’－Ｏ－メチルアデノシンの化学構造を例示する略図である。
【図5】様々な実施形態による、キャッピング効率及び２’－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ効率を求める方法のフロー図である。
【図6】様々な実施形態による、例示的なクロマトグラフィーシステムのブロック図である。
【図7】様々な実施形態による、例示的な質量分析法システムのブロック図である。
【0047】
図は必ずしも縮尺とおりに描かれておらず、図内の物体が互いに対する関係において必ずしも縮尺とおりに描かれていないことを理解されたい。図は、本明細書において開示された装置、システム、及び方法の様々な実施形態に対する明確さ及び理解をもたらすことを意図した図示である。可能なかぎり、同じ参照番号が、同じ又は同様の部品を指すように全図面を通じて使用される。更に、図面が、本発明の教示の範囲を決して限定することを意図するものではないことを理解されたい。
【発明を実施するための形態】
【0048】
イオン移動度増強の定性的及び定量的方法の実施形態は、本明細書に記載されている。
【0049】
本明細書において使用される節の見出しは、構成目的のためのものであって、記載される主題を多少なりとも限定するものと解釈されるべきでない。
【0050】
様々な実施形態のこの詳細な説明では、説明の目的のために、多くの特定の詳細が、開示された実施形態の全体的な理解を提供するために記載される。しかし、これらの様々な実施形態はこれらの特定の詳細の有無にかかわらず実行されてもよいことを当業者は理解するだろう。他の例では、構造及び装置はブロック図の形態で示されている。更に、方法が提示及び実行される具体的な順序は例示的なものであり、順序は変更されても依然として本明細書において開示される様々な実施形態の趣旨及び範囲内にとどまり得ることが企図されていることを、当業者であれば容易に理解することができる。
【0051】
それらに限定されるものではないが、特許、特許出願、記事、書籍、論文、及びインターネットウェブページを含んでいる、本出願で引用されたすべての文献及び同様の資料が、任意の目的でそれらの全体が参照によって明示的に組み込まれる。別段記載されないかぎり、本明細書において使用されるすべての技術及び科学用語は、本明細書において記載される様々な実施形態が属する当技術分野における当業者によって共通に理解されるものであるという意味を有する。
【0052】
本教示において議論されている温度、濃度、時間、圧力、流量、断面積などの前に暗黙の「約」が存在し、こうして、極めて小さい僅かな逸脱が本教示の範囲内にあることが理解されよう。本出願では、単数形の使用は、別段具体的に記載されないかぎり、複数形を含む。同様に、「備える／含む（comprise）」、「備える／含む（comprises）」、「備えている／含んでいる（comprising）」、「含有する（contain）」、「含有する（contains）」、「含有している（containing）」、「含む（include）」、「含む（includes）」、及び「含んでいる（including）」の使用は限定することを意図していない。前述の一般的な説明及び以下の詳細な説明は、例示的かつ説明的なものにすぎず、本教示を限定するものではないことを理解されたい。
【0053】
本明細書で使用する場合、「１つ（a）」又は「１つ（an）」は、「少なくとも１つ」又は「１つ以上」のことを指す場合もある。また、「又は」の使用は包括的なものであり、その結果「Ａ又はＢ」の成句は、「Ａ」が該当するとき、「Ｂ」が該当するとき、又は「Ａ」及び「Ｂ」の両方が該当するときに該当する。更に、文脈によって別段必要とされないかぎり、単数の用語は複数を含み、複数の用語は単数を含むものとする。
【0054】
「システム」は、各構成要素が全体内の少なくとも１つの他の構成要素と相互作用するか、又はそれと関連する全体を備えている、実際であれ抽象であれ、構成要素のセットを示す。
【0055】
転写物の産生は、反応結果及び収率を求めるための分析試験を必要とし得る。しかし、転写物のサイズのために、質量分析法などによる直接測定は、技術的に難題である。一層管理可能なサイズ範囲に転写物を消化させる酵素を使用する、２種の公開されている分析方法が開発された。最初のＣａｐＭａｐと命名されるものは、消化酵素であるヌクレアーゼＰ１を使用して、無傷の転写物をその個々の５’リン酸化ヌクレオチドに還元するものであり、キャップジヌクレオチドも生成することが報告されている。次に、消化混合物には、ＡＲＣＡジヌクレオチドがスパイクされ、多孔質グラファイト系炭素充填クロマトグラフィーカラム上で分離され、質量分析法によって分析される。２つの難題が、この方法で観察されており、１つ目は、消化酵素の制御であり、２つ目は、クロマトグラフィープラットフォームである。著者らが唯一の消化系として使用する酵素ヌクレアーゼＰ１が、５’一リン酸の産生をもたらすことは周知である。すべてのキャップ構造体は、５’から５’に向けて結合しており、ヌクレアーゼＰ１に曝露されると、ｍ７Ｇヌクレオチド、及び鎖中の最初のヌクレオチド、通常、２’－Ｏ－メチルアデノシンが切断されるが、他の２’－Ｏ－メチル化（mythelated）ヌクレオシドが可能である。第２に、多孔質グラファイト系炭素充填クロマトグラフィーカラムは、注入するにつれて分解することが知られており、再度コンディショニングする必要がある。要約すると、ＣＡＰＭＡＰ手法は、部分消化又は不良なクロマトグラフィーピークの積分のどちらかによって、不正確な測定値をもたらすおそれがある。
【0056】
第２の方法は、消化酵素であるＲＮアーゼＨを使用する。ＲＮアーゼＨは、ＲＮＡ：ＤＮＡ二本鎖ハイブリッドにおいて、Ｗａｔｓｏｎ－Ｃｒｉｃｋ ＲＮＡ：ＤＮＡ塩基対でＲＮＡ鎖を切断する。Ｂｅｖｅｒｌｙ（Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍ．；Ｄｅｌｌ，Ａ．；Ｐａｒｍａｒ，Ｐ．；Ｈｏｕｇｈｔｏｎ，Ｌ．Ｌａｂｅｌ－Ｆｒｅｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＭＲＮＡ Ｃａｐｐｉｎｇ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｕｓｉｎｇ ＲＮａｓｅ Ｈ Ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ ＬＣ－ＭＳ．Ａｎａｌ．Ｂｉｏａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２０１６，４０８（１８），５０２１－５０３０）によって公開されたこの方法は、転写物の５’末端に相補的な、約２５ｎｔ長のビオチン化分子プローブの設計を含む。プローブをｍＲＮＡの５’末端にアニーリングし、次いで、磁気ビーズに複合体形成させて、次に、ＲＮアーゼＨ消化に供される。切断された産物を磁石によって分離して洗浄し、ビーズ及びプローブから熱メタノール水で溶出し、乾燥させ、次に、ＬＣ－ＭＳによって分析する。結果は、キャッピングが起こったことを示すであろう。しかし、本方法の著者は、その回収率が、６０％未満であったことを認めている。更に、Ｂｅｖｅｒｌｙの論文中に参照されている市販の酵素であるＲＮアーゼＨ１に関する公開データは、一本鎖ＲＮＡ：ＤＮＡ塩基対において切断しないが、代わりに、キメラ塩基対より下流の鎖において、複数の切断産物を産生する。消化物を複製する場合、ＲＮＡ：ＤＮＡ塩基対から１～２つのヌクレオチド分、下流の鎖の３’切断末端を有する複数の異なるオリゴヌクレオチドを検出することが可能である。更に、ｍＲＮＡの５’末端の異なるヌクレオチド領域間の配列相同性のために、標的外ＲＮアーゼＨ切断産物もまた、高い存在量で検出され得る。
【0057】
キャッピング効率及びメチル化効率を決定する方法
５’キャッピング効率及び２’－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ効率の両方の直接測定に関する方法が、本明細書に記載されている。一定分量のｍＲＮＡに、既知量の、２’－Ｏ－メチルアデノシン（Ａｍ）、２’－Ｏ－メチルグアノシン（Ｇｍ）、２’－Ｏ－メチルシトシンＣｍ又は２’－Ｏ－メチルウリジン（Ｕｍ）などの同位体標識ｍ7Ｇ及び同位体標識２’－Ｏ－メチル化ヌクレオシドをスパイクすることができる。図４Ａは、メチル基ｍ7Ｇ（Ｄ）において３個の重水素原子により標識された同位体標識ｍ7Ｇを示す。同様に、図４Ｂは、メチル基Ａｍ（Ｄ）において、３個の重水素原子により標識されている同位体標識Ａｍを示している。次に、単一酵素消化を行い、ｍＲＮＡをその個々のヌクレオシドに還元することができる。次に、スパイクした消化物は、単一アンモニウムベースの緩衝系を使用してクロマトグラフィーにより分離して、質量分析法によって分析することができる。正確な定量は、重い対軽いｍ７Ｇ／２’Ｏ－メチル化ヌクレオシドのピーク面積の比較によって行うことができる。
５’キャッピング効率及び２’－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ効率の両方の直接測定に関する方法が、本明細書に記載されている。一定分量のｍＲＮＡに、既知量の、２’－Ｏ－メチルアデノシン（Ａｍ）、２’－Ｏ－メチルグアノシン（Ｇｍ）、２’－Ｏ－メチルシトシンＣｍ又は２’－Ｏ－メチルウリジン（Ｕｍ）などの同位体標識ｍ7Ｇ及び同位体標識２’－Ｏ－メチル化ヌクレオシドをスパイクすることができる。図４Ａは、メチル基ｍ7Ｇ（Ｄ）において３個の重水素原子により標識された同位体標識ｍ7Ｇを示す。同様に、図４Ｂは、メチル基Ａｍ（Ｄ）において、３個の重水素原子により標識されている同位体標識Ａｍを示している。次に、単一酵素消化を行い、ｍＲＮＡをその個々のヌクレオシドに還元することができる。次に、スパイクした消化物は、単一アンモニウムベースの緩衝系を使用してクロマトグラフィーにより分離して、質量分析法によって分析することができる。正確な定量は、重い対軽いｍ７Ｇ／２’Ｏ－メチル化ヌクレオシドのピーク面積の比較によって行うことができる。
【0058】
他の実施形態では、同位体標識標準物質は、同位体標識５’リン酸－ｍ7Ｇ及び同位体標識５’－リン酸－２’－Ｏ－メチル化ヌクレオチドを含むことができる。このシナリオでは、ホスファターゼは、同位体標識標準物質から５’リン酸を切断し、同位体標識メチル化ヌクレオシドにすることができる。
【0059】
質量分析法は、生体分子の直接測定に対してロバストかつ信頼性の高い応用であることが証明されている。液体基質又は固体基質から気相に生体分子をイオンとして遷移させることによって、このイオンの質量を検出して測定することができる。イオンを生成する方法の１つは、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）である。ＥＳＩによって生成した分子の定量は、標準曲線を使用して行うことができ、この場合、既知量の合成標準物質が必要であり、得られた結果をプロットし、傾きの式を使用して、試料中の標的の濃度を見出すことができる。標準曲線の生成により提起される難題は、主に、合成標準物質を見つけ出すこと／生成すること、及び標的試料のマトリックスに適合させることである。マトリックスの適合は、試料中の極性分子のすべてが表面電荷を奪い合うというＥＳＩの性質のため、重要である。このような電荷の奪い合いのために、試料中の測定される応答性が標準曲線の応答性を変化させて、測定誤差を引き起こすおそれがある。分子の一層正確な測定は、試料に同位体標識標準物質をスパイクすることによって行われる。この方法では、標的分子の合成標準物質が生成され、この場合、１個以上の原子が、その安定な同位体である、炭素の場合、Ｃ13、窒素の場合、Ｎ15、及び水素の場合、重水素（Ｄ）と置き換えられている。既知量の安定な同位体標識標準物質（ＳＩＬＳ）を試料にスパイクし、この試料を処理して取得する。ＳＩＬＳは、標的分子に構造的に同一であるので、検討下にある分子と同一の溶出プロファイルを有し、差異は、質量のシフトだけである。スパイクしたＳＩＬＳは、標的分子と同じイオン化荷電競争を受け、マトリックスを適合させるようとする場合に生じるおそれがある、いかなる測定誤差も回避することになろう。重いピークと軽いピークの面積比を採用することによって、標的分子の量が定量される。ＲＮＡヌクレオシド分析の場合、この手法に対する主要な妨げは、ＳＩＬＳの利用可能性であった。本明細書に記載されている手法は、内部標準として、細胞培養、ＲＮＡ精製及び試料の希釈を行うことなく、精製後の重標識ヌクレオシド分子しか使用しておらず、標的分子の正確な測定をもたらす。
【0060】
図５は、５’キャッピング効率及び／又は２’－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ効率を測定する方法５００を例示する。５０２において、ｍＲＮＡ試料には、同位体標識ｍ７Ｇ及び同位体標識２’－Ｏ－メチル化ヌクレオシドなどの、同位体標識標準物質をスパイクすることができる。様々な実施形態では、同位体標識ｍ７Ｇ及び２’－Ｏ－メチル化ヌクレオシドは、ｍ７Ｇ（Ｄ）及びＡｍ（Ｄ）などの重水素化標識されることができるか、又はＮ15若しくはＣ13により標識され得る。様々な実施形態では、同位体標識ｍ７Ｇ及び同位体標識２’－Ｏ－メチル化ヌクレオシドは、等モル量などの、約２：１～約１：２のモル比で存在し得る。標準物質の濃度は、インキュベート混合物中の同位体標識ｍ７Ｇの量が、約１．０ｎｍｏｌ～２０ｎｍｏｌとなり得、インキュベート混合物中の同位体標識２’－Ｏ－メチル化ヌクレオシドの量が、約１．０ｎｍｏｌ～約２０ｎｍｏｌとなり得るような濃度とすることができる。
【0061】
５０４では、酵素混合物を試料に添加することができる。酵素混合物は、ヌクレアーゼＰ１などの非特異的一本鎖ヌクレアーゼ、及びサツマイモ酸性ホスファターゼなどの酸性ホスファターゼを含むことができる。酸性ホスファターゼの重要な特徴とは、ヌクレアーゼＰ１によるｍＲＮＡの一リン酸への消化は、いくつかの酸性ホスファターゼを阻害することができるアデノシン一リン酸の産生をもたらすので、酸性ホスファターゼは、アデノシン一リン酸によって阻害されないことであり得る。場合により、酵素混合物は、グアノシンのＲＮＡ３’を切断するエンドヌクレアーゼなどの、部位特異的一本鎖ＲＮＡエンドヌクレアーゼを含むことができる。グアノシンのＲＮＡ３’を切断する部位特異的一本鎖ＲＮＡエンドヌクレアーゼの例は、ＲＮアーゼＴ１、ＲＮアーゼＮ１、ＲＮアーゼＳａ、Ｂａｒｎａｓｅ及び他の類似のエンドヌクレアーゼを含む。
【0062】
様々な実施形態では、酵素混合物は、約５単位～約２０単位などの、約１単位～約１００単位の非特異的一本鎖ヌクレアーゼが、ｍＲＮＡ試料に添加されるような、十分な非特異的一本鎖ヌクレアーゼを含むことができる。様々な実施形態では、酵素混合物は、約０．５単位～約２．０単位などの約０．５単位～約１０．０単位の酸性ホスファターゼをｍＲＮＡ試料に添加するような、十分な酸性ホスファターゼを含むことができる。様々な実施形態では、酵素混合物は、約０．５単位～約２．０単位などの、約０．５単位～約１０．０単位の部位特異的一本鎖ＲＮＡエンドヌクレアーゼが、ｍＲＮＡ試料に添加されるような、十分な部位特異的一本鎖ＲＮＡエンドヌクレアーゼ（存在する場合）を含むことができる。酵素を増量すると、完了するまでの時間を短縮することができ、当業者は、所望のインキュベート期間、好適な量の酵素を特定することができることが知られている。
【0063】
様々な実施形態では、ｍＲＮＡ試料、同位体標識標準物質及び／又は酵素混合物は、乾燥状態にあることができ、緩衝溶液を添加することによって再構成することができる。例えば、ｍＲＮＡ試料は、沈殿させることができ、酵素消化の妨げとなり得る、ｍＲＮＡの合成から塩及び溶媒を除去するなど、上清を除去することができる。更なる例では、同位体標識標準物質及び酵素混合物は、保存可能期間を延ばすためなど、凍結乾燥粉末として供給されることができる。代替として、標準物質又は酵素混合物は、必要に応じて解凍される凍結溶液とすることができる。様々な実施形態では、沈殿したｍＲＮＡは、指定量の緩衝溶液を用いて再構成することができ、酵素混合物及び同位体標識標準物質は、特定量で添加され得る。代替的に、特定量の酵素混合物及び同位体標識標準物質を沈殿したｍＲＮＡに加えることができ、ｍＲＮＡは、混合などにより再構成することができる。
【0064】
様々な実施形態では、緩衝溶液は、約０．０５ｍＭ～約０．２ｍＭの濃度範囲などの約０．００１ｍＭ～約９０ｍＭの濃度範囲のＺｎＣｌ2を含むことができる。更に、インキュベート混合物は、１００ｍＭ未満の二価陽イオンを含む。様々な実施形態では、緩衝溶液は、約４～約６のｐＨなどの、約２～約７のｐＨを有することができる。
【0065】
５０６では、ｍＲＮＡの酵素消化を行うことができる。様々な実施形態では、ｍＲＮＡ、同位体標識標準物質及び酵素混合物を含むインキュベート混合物は、約３０℃～約５０℃、更には約３５℃～約４５℃などの約３０℃～約７０℃の温度でインキュベートすることができる。酵素消化は、ｍＲＮＡを構成成分であるヌクレオチドに消化するヌクレアーゼに対して、及びヌクレオチドからリン酸を除去することによる、ヌクレオチドをヌクレオシドに変換する酸性ホスファターゼに対して、十分な時間、行われ得る。様々な実施形態では、酵素消化は、少なくとも約４５分間など、少なくとも約１時間など、少なくとも約４時間など、少なくとも約一晩（約１２～１６時間）などの、少なくとも約３０分間、行うことができる。一般に、酵素消化は、約１日間未満となり得る。
【0066】
５０８において、消化試料は、クロマトグラフィーにより分離することができ、５１０においてクロマトグラフィーにより分離した試料は、質量分析法によって分析することができる。これは、質量分析計を使用するｍ／ｚ及び強度データの取得、ｍ７Ｇ及び同位体標識ｍ７Ｇのピーク、及び／又は２’－Ｏ－メチル化ヌクレオシド及び同位体標識２’－Ｏ－メチル化ヌクレオシドのピーク同定並びに積分を含むことができる。更に、５１２では、キャッピング効率は、ｍ７Ｇ：同位体標識ｍ７Ｇのピーク比から求めることができ、２－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ効率は、２’－Ｏ－メチル化ヌクレオシド：同位体標識２’－Ｏ－メチル化ヌクレオシドのピーク比に基づいて求めることができる。
【0067】
酵素消化キット
様々な実施形態では、ｍＲＮＡキャッピング効率を定量するキットは、酵素混合物及び同位体標識標準物質混合物を含むことができる。酵素混合物及び同位体標識標準物質混合物は、緩衝溶液の添加により再構成することができる、凍結乾燥粉末とすることができる。他の実施形態では、酵素混合物及び同位体標識標準物質混合物は、凍結溶液などの溶液とすることができる。酵素混合物及び同位体標識標準物質混合物は、多数の反応に使用することができるバルク溶液よりもむしろ１回又は数回の反応にとって、単回使用向けの管などの少量で十分となり得るので有利となり得る。
様々な実施形態では、ｍＲＮＡキャッピング効率を定量するキットは、酵素混合物及び同位体標識標準物質混合物を含むことができる。酵素混合物及び同位体標識標準物質混合物は、緩衝溶液の添加により再構成することができる、凍結乾燥粉末とすることができる。他の実施形態では、酵素混合物及び同位体標識標準物質混合物は、凍結溶液などの溶液とすることができる。酵素混合物及び同位体標識標準物質混合物は、多数の反応に使用することができるバルク溶液よりもむしろ１回又は数回の反応にとって、単回使用向けの管などの少量で十分となり得るので有利となり得る。
【0068】
酵素混合物は、非特異的一本鎖ヌクレアーゼ及び酸性ホスファターゼを含むことができる。非特異的一本鎖ヌクレアーゼは、ヌクレアーゼＰ１を含むことができる。酸性ホスファターゼは、サツマイモ酸性ホスファターゼなどのアデノシン一リン酸によって阻害されない、酸性ホスファターゼとすることができる。酵素混合物は、グアノシンのＲＮＡ３’を切断する部位特異的一本鎖ＲＮＡエンドヌクレアーゼなどの、部位特異的一本鎖ＲＮＡエンドヌクレアーゼを含むことができる。様々な実施形態では、部位特異的一本鎖ＲＮＡエンドヌクレアーゼは、ＲＮアーゼＴ１、ＲＮアーゼＮ１、ＲＮアーゼＳａ、Ｂａｒｎａｓｅ及び他の類似のエンドヌクレアーゼを含むことができる。
【0069】
同位体標識標準物質混合物は、同位体標識ｍ７Ｇ及び２’－Ｏ－メチル化ヌクレオシドを含むことができる。一般に、同位体標識標準物質混合物は、標準物質の化合物に組み込まれている重い安定な同位体を含むことができる。重い安定な同位体の使用は、質量分光法における内部標準としてそれらの使用を可能にする、化合物の化学的性質を改変することなく、ｍ／ｚ電荷比をシフトすることができる。様々な実施形態では、同位体標識標準物質混合物は、同位体標識ｍ７Ｇ及び２’－Ｏ－メチル化ヌクレオシドを含むことができる。同位体標識ｍ７Ｇ及び２’－Ｏ－メチル化ヌクレオシドは、重水素標識され得る、Ｎ15標識され得る、Ｃ13標識され得る、Ｏ17標識され得る、Ｏ18標識され得る、又はそれらの任意の組み合わせであり得る。同位体標識標準物質混合物は、等モル量の同位体標識ｍ７Ｇ及び同位体標識２’－Ｏ－メチル化ヌクレオシドなどの、約２：１～約１：２のモル比で、同位体標識ｍ７Ｇ及び同位体標識２’－Ｏ－メチル化ヌクレオシドを含むことができる。
【0070】
他の実施形態では、同位体標識標準物質混合物は、同位体標識５’リン酸－ｍ7Ｇ及び同位体標識５’－リン酸－２’－Ｏ－メチル化ヌクレオチドを含むことができる。このシナリオでは、ホスファターゼは、同位体標識標準物質から５’リン酸を切断し、同位体標識メチル化ヌクレオシドにすることができる。
【0071】
本キットはまた、緩衝溶液も含むことができる。緩衝溶液は、約０．０１ｍｍｏｌ～約９０ｍｍｏｌの濃度などのＺｎＣｌ2を含むことができる。緩衝溶液は、１００ｍｍｏｌ未満の濃度の二価陽イオンを有することができる。緩衝溶液は、約４～約６などの、約２～約７のｐＨを有する。
【0072】
クロマトグラフィープラットフォーム
図６は、本発明の一態様による、液体クロマトグラフィーシステム６００を図示する。液体クロマトグラフィーシステム６００は、システム６００により溶媒をポンプ移送するための分析用ポンプ６０２を備える。システム６００は、分析される試料を含む試料レザーバー６０４を備える。システム６００は、分離カラム６０６及び検出器６０８を更に備える。システム６００はまた、制御装置６１０を備える。
図６は、本発明の一態様による、液体クロマトグラフィーシステム６００を図示する。液体クロマトグラフィーシステム６００は、システム６００により溶媒をポンプ移送するための分析用ポンプ６０２を備える。システム６００は、分析される試料を含む試料レザーバー６０４を備える。システム６００は、分離カラム６０６及び検出器６０８を更に備える。システム６００はまた、制御装置６１０を備える。
【0073】
液体クロマトグラフィーシステム６００は、試料レザーバー６０４から試料を回収するようなされている。次に、試料をシステムに導入することができる。
【0074】
液体クロマトグラフィーシステム１０００は、分離カラム６０６に試料を導入するように更になされている。
【0075】
システム６００はまた、分析フローによって、分離カラム６０６に試料を注入するようになされている。これは、分析用ポンプ６０２によって、試料を案内することによって行うことができる。分離カラム６０６は、分離カラム６０６内の保持時間に基づいた成分種に試料を分離することができる。分離カラム６０６による試料の分離後に、分離された構成成分は、検出器６０８によって検出することができる。一部の実施形態では、検出器６０８は、吸収検出器、屈折率検出器、蛍光検出器などの光学検出器とすることができる。他の実施形態では、検出器６０８は、導電性検出器又は電気化学検出器とすることができる。更に他の実施形態では、検出器６０８は、質量分析計とすることができる。
【0076】
様々な実施形態では、分離カラム６０６は、固定相媒体が充填されたチューブから一般になる。固定相媒体は、化合物がカラムを移動するのにかかる時間（保持時間）に影響し得る。この影響は、試料の個々の構成成分が、それらの個々の保持時間に基づいて分離され得るよう、異なる化合物に対して異なり得る。多孔質物質、イオン性物質、極性物質、非極性物質などを含めた、多数の固定相媒体が存在する。多孔質物質は、分子のサイズ、及び分子が多孔質物質内に進入する能力に基づいて、保持時間に影響を及ぼし得る。イオン性物質は、イオン性物質と化合物との間の電荷の引力又は反発に基づいて保持時間に影響を及ぼし得る。極性物質及び非極性物質は、化合物の疎水性又は親水性に基づいた保持時間に影響を及ぼすことができる。
【0077】
様々な実施形態では、ヌクレオチド及びヌクレオシドは、逆相分離を使用して分離することができ、疎水性の非極性固定相物質が、有機溶媒への極性の割合に応じて、様々な疎水性を有する移動相と共に使用される。例えば、Ｃ１８カラムは、酢酸アンモニウム又はギ酸アンモニウム緩衝系と共に使用されて、ヌクレオシドを分離することができる。特定の実施形態では、約５のｐＨにおける、５ｍＭの酢酸アンモニウムの水性移動相を使用することができ、アセトニトリル（最大で約４０％）又はメタノール（最大で約５０％）の濃度を向上させたグラジエントを使用して、ヌクレオシドを分離することができる。好適なカラム及び緩衝系は、当業者に明白であり、本開示の範囲内にある。
【0078】
他の実施形態では、ヌクレオチド及びヌクレオシドは、親水性固定相物質がアセトニトリルなどの疎水性移動相と共に使用される、親水性相互作用液体クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）を使用して分離することができる。好適なカラム及び緩衝系は、当業者に明白であり、本開示の範囲内にある。
【0079】
質量分析法プラットフォーム
質量分析法プラットフォーム７００の様々な実施形態は、図７のブロック図に示されている構成要素を含むことができる。様々な実施形態では、質量分析法プラットフォーム７００は、システム６００の検出器６０８として動作することができる。様々な実施形態では、図７の要素は、質量分析法プラットフォーム７００に組み込むことができる。様々な実施形態によれば、質量分析計７００は、イオン源７０２、質量分析器７０４、イオン検出器７０６及び制御装置７０８を含むことができる。
質量分析法プラットフォーム７００の様々な実施形態は、図７のブロック図に示されている構成要素を含むことができる。様々な実施形態では、質量分析法プラットフォーム７００は、システム６００の検出器６０８として動作することができる。様々な実施形態では、図７の要素は、質量分析法プラットフォーム７００に組み込むことができる。様々な実施形態によれば、質量分析計７００は、イオン源７０２、質量分析器７０４、イオン検出器７０６及び制御装置７０８を含むことができる。
【0080】
様々な実施形態では、イオン源７０２は、試料から複数のイオンを発生させる。イオン源は、以下に限定されないが、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化（ＭＡＬＤＩ）源、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）源、大気圧化学イオン化（ＡＰＣＩ）源、大気圧光イオン化源（ＡＰＰＩ）、誘導結合型プラズマ（ＩＣＰ）源、電子イオン化源、化学イオン化源、光イオン化源、グロー放電イオン化源、熱スプレーイオン化源などを含むことができる。
【0081】
様々な実施形態では、質量分析器７０４は、イオンの質量対電荷比に基づいて、イオンを分離することができる。例えば、質量分析器７０４は、四重極質量フィルター分析器、四重極イオントラップ分析器、飛行時間型（ＴＯＦ）分析器、静電トラップ（例えば、オービトラップ）質量分析器、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴（ＦＴ－ＩＣＲ）質量分析器などを含むことができる。様々な実施形態では、質量分析器７０４はまた、衝突誘起解離（ＣＩＤ）、電子移動解離（ＥＴＤ）、電子捕捉解離（ＥＣＤ）、光誘起解離（ＰＩＤ）、表面誘起解離（ＳＩＤ）などを使用して、イオンをフラグメント化し、更に、質量対電荷比に基づいて、フラグメント化されたイオンを分離するように構成され得る。
【0082】
様々な実施形態では、イオン検出器７０６は、イオンを検出することができる。例えば、イオン検出器７０６は、電子増倍器、ファラデーカップなどを含むことができる。質量分析装置を出たイオンは、イオン検出器によって検出することができる。様々な実施形態では、イオン検出器は、定量的となり得、こうして、イオンの正確な量を求めることができる。
【0083】
様々な実施形態では、制御装置７０８は、イオン源７０２、質量分析器７０４及びイオン検出器７０６と通信することができる。例えば、制御装置７０８は、イオン源を構成し、又はイオン源を有効／無効にすることができる。更に、制御装置７０８は、検出する特定の質量範囲を選択するよう、質量分析器７０４を構成することができる。更に、制御装置７０８が、利得を調節するなどによって、イオン検出器７０６の感度を調節することができる。更に、制御装置７０８は、検出されるイオンの極性に基づいて、イオン検出器７０６の極性を調節することができる。例えば、イオン検出器７０６は、陽イオンを検出するよう構成され得るか、又は陰イオンを検出するよう構成され得る。
【0084】
本教示を様々な実施形態と併せて記載するが、本教示をかかる実施形態に限定することを意図していない。むしろ、本教示は、当業者が理解するように、様々な代替物、変形物、及び等価物を包含する。
【0085】
更に、様々な実施形態の記載において、本明細書は、方法及び／又はプロセスを特定の順序の工程として提示している場合がある。しかし、本方法又はプロセスが本明細書に記載された工程の特定の順序に依拠しないかぎりにおいて、本方法又はプロセスは、記載された工程の特定の順序に限定されるべきではない。当業者であれば理解するように、工程の他の順序が可能であり得る。したがって、本明細書に記載された工程の特定の順序を、請求項における限定として解釈すべきではない。加えて、本方法及び／又はプロセスを対象とする特許請求の範囲は、書かれた順序でのそれらの工程の実行に限定されるべきではなく、順序は変更されてもよく、依然として様々な実施形態の趣旨及び範囲内にとどまり得ることを当業者であれば容易に理解することができる。
【図1A】
【図1B】
【図2A】
【図2B】
【図3】
【図4A】
【図4B】
【図5】
【図6】
【図7】
【手続補正書】
【提出日】2023-12-20
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
緩衝溶液中で、キャッピングされたｍＲＮＡ試料、酵素混合物及び同位体標準物質溶液を一緒にして、インキュベート混合物を生成する工程であって、前記酵素混合物が、非特異的一本鎖ヌクレアーゼ及び酸性ホスファターゼを含み、前記同位体標準物質が、同位体標識ｍ７Ｇ及び同位体標識２’－Ｏ－メチル化ヌクレオシド（Ａｍ、Ｇｍ、Ｃｍ又はＵｍ）を含む、工程と、前記混合物をインキュベートする工程と、
液体クロマトグラフィー－質量分析法を使用して、前記混合物を分析し、キャッピング効率及び２’－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ効率の少なくとも１つを求める工程と、
を含む、ｍＲＮＡキャッピング効率を定量するための方法。
【請求項2】
前記混合物のインキュベートが、約３０℃～７０℃の温度で行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記混合物のインキュベートが、約３５℃～４５℃の温度で行われる、請求項２に記載の方法。
【請求項4】
前記非特異的一本鎖ヌクレアーゼが、ヌクレアーゼＰ１を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項5】
前記酸性ホスファターゼが、アデノシン一リン酸によって阻害されない、請求項１に記載の方法。
【請求項6】
前記酸性ホスファターゼが、サツマイモ酸性ホスファターゼを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項7】
前記酵素混合物が、部位特異的一本鎖ＲＮＡエンドヌクレアーゼを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項8】
前記部位特異的一本鎖ＲＮＡエンドヌクレアーゼが、グアノシンのＲＮＡ３’を切断する、請求項７に記載の方法。
【請求項9】
前記部位特異的一本鎖ＲＮＡエンドヌクレアーゼが、リボヌクレアーゼＴ１を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項10】
前記混合物のインキュベートが、約３０℃～５０℃の温度で行われる、請求項９に記載の方法。
【請求項11】
凍結乾燥酵素混合物を前記試料緩衝溶液で溶解して、前記酵素混合物を得る工程を更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項12】
凍結乾燥標準物質混合物を前記試料緩衝溶液で溶解して、前記標準物質混合物を得る工程を更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項13】
前記同位体標識ｍ７Ｇ及び前記同位体標識２’－Ｏ－メチル化ヌクレオシドが、重水素標識ｍ７Ｇ（Ｄ）及び重水素標識２’－Ｏ－メチル化ヌクレオシド（Ａｍ（Ｄ）、Ｇｍ（Ｄ）、Ｃｍ（Ｄ）又はＵｍ（Ｄ））を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項14】
前記同位体標識ｍ７Ｇ及び前記同位体標識２’－Ｏ－メチル化ヌクレオシドが、Ｎ15標識されているか、又はＣ13標識されている、請求項１に記載の方法。
【請求項15】
前記標準物質混合物中の前記同位体標識ｍ７Ｇ及び前記同位体標識２’－Ｏ－メチル化ヌクレオシドが、約２：１～約１：２のモル比で存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項16】
前記標準物質混合物が、等モル量の同位体標識ｍ７Ｇ及び同位体標識２’－Ｏ－メチル化ヌクレオシドを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項17】
インキュベート混合物が、約１．０ｎｍｏｌ～２０ｎｍｏｌとなる量の同位体標識ｍ７Ｇを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項18】
インキュベート混合物が、約１．０ｎｍｏｌ～約２０ｎｍｏｌとなる量の同位体標識２’－Ｏ－メチル化ヌクレオシドを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項19】
前記緩衝溶液が、約０．００１ｍＭ～約９０ｍＭの濃度範囲のＺｎＣｌ2を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項20】
前記緩衝溶液が、約０．０５ｍＭ～約０．２ｍＭの濃度範囲のＺｎＣｌ2を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項21】
前記インキュベート混合物が、１００ｍＭ未満の二価陽イオンを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項22】
前記緩衝溶液が、約２～約７のｐＨを有する、請求項１に記載の方法。
【請求項23】
前記緩衝溶液が、約４～約６のｐＨを有する、請求項２２に記載の方法。
【請求項24】
液体クロマトグラフィー－質量分析法を使用して前記混合物を分析する工程が、クロマトグラフィーカラムを使用して前記混合物を分離する工程と、質量分析計を使用してｍ／ｚ及び強度データを得る工程と、ｍ７Ｇ及び同位体標識ｍ７Ｇのピーク、２’－Ｏ－メチル化ヌクレオシド及び同位体標識２’－Ｏ－メチル化ヌクレオシドのピーク、又はそれらの両方を特定して積分する工程と、ｍ７Ｇ：同位体標識ｍ７Ｇピーク比、２’－Ｏ－メチル化ヌクレオシド：同位体標識２’－Ｏ－メチル化ヌクレオシドピーク比、又はそれらの両方を計算する工程と、前記ｍ７Ｇ：同位体標識ｍ７Ｇピーク比に基づいた前記キャッピング効率、前記２’－Ｏ－メチル化ヌクレオシド：同位体標識２’－Ｏ－メチル化ヌクレオシドピーク比に基づいた２－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ効率、又はそれらの両方を求める工程を更に含む、請求項１に記載の方法。
【手続補正2】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0085】
更に、様々な実施形態の記載において、本明細書は、方法及び／又はプロセスを特定の順序の工程として提示している場合がある。しかし、本方法又はプロセスが本明細書に記載された工程の特定の順序に依拠しないかぎりにおいて、本方法又はプロセスは、記載された工程の特定の順序に限定されるべきではない。当業者であれば理解するように、工程の他の順序が可能であり得る。したがって、本明細書に記載された工程の特定の順序を、請求項における限定として解釈すべきではない。加えて、本方法及び／又はプロセスを対象とする特許請求の範囲は、書かれた順序でのそれらの工程の実行に限定されるべきではなく、順序は変更されてもよく、依然として様々な実施形態の趣旨及び範囲内にとどまり得ることを当業者であれば容易に理解することができる。
本発明のまた別の態様は、以下のとおりであってもよい。
〔１〕ヌクレアーゼＰ１及びサツマイモ酸性ホスファターゼを含む、酵素混合物と、
同位体標識ｍ７Ｇ及び同位体標識２’－Ｏ－メチル化ヌクレオシド（Ａｍ、Ｇｍ、Ｃｍ又はＵｍ）を含む、標準物質混合物と、
を含む、ｍＲＮＡキャッピング効率を定量するためのキット。
〔２〕緩衝溶液を更に含む、前記〔１〕に記載のキット。
〔３〕前記緩衝溶液が、ＺｎＣｌ 2 を含む、前記〔２〕に記載のキット。
〔４〕前記緩衝溶液が、約０．０１ｍｍｏｌ～約９０ｍｍｏｌのＺｎＣｌ 2 濃度を有する、前記〔３〕に記載のキット。
〔５〕前記緩衝溶液が、約１００ｍｍｏｌ未満の濃度の二価陽イオンを有する、前記〔３〕に記載のキット。
〔６〕前記緩衝溶液が、約２～約７のｐＨを有する、前記〔２〕に記載のキット。
〔７〕前記緩衝溶液が、約４～約６のｐＨを有する、前記〔６〕に記載のキット。
〔８〕更に、前記酵素混合物が、ＲＮアーゼＴ１を更に含む、前記〔１〕に記載のキット。
〔９〕前記酵素混合物が凍結乾燥粉末である、前記〔１〕に記載のキット。
〔１０〕前記標準物質混合物が、凍結乾燥粉末である、前記〔１〕に記載のキット。
〔１１〕前記同位体標識ｍ７Ｇ及び２’－Ｏ－メチル化ヌクレオシドが、重水素標識ｍ７Ｇ（Ｄ）及び重水素標識２’－Ｏ－メチル化ヌクレオシド（Ａｍ（Ｄ）、Ｇｍ（Ｄ）、Ｃｍ（Ｄ）又はＵｍ（Ｄ））を含む、前記〔１〕に記載のキット。
〔１２〕前記同位体標識ｍ７Ｇ及び前記同位体標識２’－Ｏ－メチル化ヌクレオシドが、Ｎ 15 標識されているか、又はＣ 13 標識されている、前記〔１〕に記載のキット。
〔１３〕前記標準物質混合物中の前記同位体標識ｍ７Ｇ及び前記同位体標識２’－Ｏ－メチル化ヌクレオシドが、約２：１～約１：２のモル比で存在する、前記〔１〕に記載のキット。
〔１４〕前記標準物質混合物が、等モル量の同位体標識ｍ７Ｇ及び同位体標識２’－Ｏ－メチル化ヌクレオシドを含む、前記〔１３〕に記載のキット。
〔１５〕非特異的一本鎖ヌクレアーゼ及び酸性ホスファターゼを含む、酵素混合物と、
同位体標識ｍ７Ｇ及び同位体標識２’－Ｏ－メチル化ヌクレオシド（Ａｍ、Ｇｍ、Ｃｍ又はＵｍ）を含む、標準物質混合物と、
緩衝溶液と、
を含む、ｍＲＮＡキャッピング効率を定量するためのキット。
〔１６〕前記非特異的一本鎖ヌクレアーゼがヌクレアーゼＰ１を含む、前記〔１５〕に記載のキット。
〔１７〕前記酸性ホスファターゼが、アデノシン一リン酸によって阻害されない、前記〔１５〕に記載のキット。
〔１８〕前記酸性ホスファターゼが、サツマイモ酸性ホスファターゼを含む、前記〔１５〕に記載のキット。
〔１９〕前記酵素混合物が、部位特異的一本鎖ＲＮＡエンドヌクレアーゼを含む、前記〔１５〕に記載のキット。
〔２０〕前記部位特異的一本鎖ＲＮＡエンドヌクレアーゼが、グアノシンのＲＮＡ３’を切断する、前記〔１９〕に記載のキット。
〔２１〕前記部位特異的一本鎖ＲＮＡエンドヌクレアーゼが、リボヌクレアーゼＴ１を含む、前記〔１９〕に記載のキット。
〔２２〕前記酵素混合物が、凍結乾燥粉末である、前記〔１５〕に記載のキット。
〔２３〕前記標準物質混合物が、凍結乾燥粉末である、前記〔１５〕に記載のキット。
〔２４〕前記同位体標識ｍ７Ｇ及び前記同位体標識２’－Ｏ－メチル化ヌクレオシドが、重水素標識ｍ７Ｇ（Ｄ）及び重水素標識２’－Ｏ－メチル化ヌクレオシド（Ａｍ（Ｄ）、Ｇｍ（Ｄ）、Ｃｍ（Ｄ）又はＵｍ（Ｄ））を含む、前記〔１５〕に記載のキット。
〔２５〕前記同位体標識ｍ７Ｇ及び前記同位体標識２’－Ｏ－メチル化ヌクレオシドが、Ｎ 15 標識されているか、又はＣ 13 標識されている、前記〔１５〕に記載のキット。
〔２６〕前記標準物質混合物中の前記同位体標識ｍ７Ｇ及び前記同位体標識２’－Ｏ－メチル化ヌクレオシドが、約２：１～約１：２のモル比で存在する、前記〔１５〕に記載のキット。
〔２７〕前記標準物質混合物が、等モル量の前記同位体標識ｍ７Ｇ及び前記同位体標識２’－Ｏ－メチル化ヌクレオシドを含む、前記〔２６〕に記載のキット。
〔２８〕前記緩衝溶液が、約０．００１ｍＭ～約９０ｍＭの濃度範囲のＺｎＣｌ 2 を含む、前記〔１５〕に記載のキット。
〔２９〕前記緩衝溶液が、約０．０５ｍＭ～約０．２ｍＭの濃度範囲のＺｎＣｌ 2 を含む、前記〔２８〕に記載のキット。
〔３０〕前記緩衝溶液が、約１００ｍＭ未満の二価陽イオンを含む、前記〔２８〕に記載のキット。
〔３１〕前記緩衝溶液が、約２～約７のｐＨを有する、前記〔１５〕に記載のキット。
〔３２〕前記緩衝溶液が、約４～約６のｐＨを有する、前記〔３１〕に記載のキット。
〔３３〕緩衝溶液中で試料、酵素混合物及び同位体標準物質溶液を一緒にして、インキュベート混合物を生成する工程であって、前記酵素混合物が、非特異的一本鎖ヌクレアーゼ及び酸性ホスファターゼを含み、前記同位体標準物質が、同位体標識ｍ７Ｇ及び同位体標識２’－Ｏ－メチル化ヌクレオシド（Ａｍ、Ｇｍ、Ｃｍ又はＵｍ）を含む、工程と、
前記混合物をインキュベートする工程と、
液体クロマトグラフィー－質量分析法を使用して、前記混合物を分析し、キャッピング効率及び２’－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ効率の少なくとも１つを求める工程と、
を含む、ｍＲＮＡキャッピング効率を定量するための方法。
〔３４〕前記混合物のインキュベートが、約３０℃～７０℃の温度で行われる、前記〔３３〕に記載の方法。
〔３５〕前記混合物のインキュベートが、約３５℃～４５℃の温度で行われる、前記〔３４〕に記載の方法。
〔３６〕前記非特異的一本鎖ヌクレアーゼが、ヌクレアーゼＰ１を含む、前記〔３３〕に記載の方法。
〔３７〕前記酸性ホスファターゼが、アデノシン一リン酸によって阻害されない、前記〔３３〕に記載の方法。
〔３８〕前記酸性ホスファターゼが、サツマイモ酸性ホスファターゼを含む、前記〔３３〕に記載の方法。
〔３９〕前記酵素混合物が、部位特異的一本鎖ＲＮＡエンドヌクレアーゼを更に含む、前記〔３３〕に記載の方法。
〔４０〕前記部位特異的一本鎖ＲＮＡエンドヌクレアーゼが、グアノシンのＲＮＡ３’を切断する、前記〔３９〕に記載の方法。
〔４１〕前記部位特異的一本鎖ＲＮＡエンドヌクレアーゼが、リボヌクレアーゼＴ１を含む、前記〔３９〕に記載の方法。
〔４２〕前記混合物のインキュベートが、約３０℃～５０℃の温度で行われる、前記〔４１〕に記載の方法。
〔４３〕凍結乾燥酵素混合物を前記試料緩衝溶液で溶解して、前記酵素混合物を得る工程を更に含む、前記〔３３〕に記載の方法。
〔４４〕凍結乾燥標準物質混合物を前記試料緩衝溶液で溶解して、前記標準物質混合物を得る工程を更に含む、前記〔３３〕に記載の方法。
〔４５〕前記同位体標識ｍ７Ｇ及び前記同位体標識２’－Ｏ－メチル化ヌクレオシドが、重水素標識ｍ７Ｇ（Ｄ）及び重水素標識２’－Ｏ－メチル化ヌクレオシド（Ａｍ（Ｄ）、Ｇｍ（Ｄ）、Ｃｍ（Ｄ）又はＵｍ（Ｄ））を含む、前記〔３３〕に記載の方法。
〔４６〕前記同位体標識ｍ７Ｇ及び前記同位体標識２’－Ｏ－メチル化ヌクレオシドが、Ｎ 15 標識されているか、又はＣ 13 標識されている、前記〔３３〕に記載の方法。
〔４７〕前記標準物質混合物中の前記同位体標識ｍ７Ｇ及び前記同位体標識２’－Ｏ－メチル化ヌクレオシドが、約２：１～約１：２のモル比で存在する、前記〔３３〕に記載の方法。
〔４８〕前記標準物質混合物が、等モル量の同位体標識ｍ７Ｇ及び同位体標識２’－Ｏ－メチル化ヌクレオシドを含む、前記〔４７〕に記載の方法。
〔４９〕インキュベート混合物が、約１．０ｎｍｏｌ～２０ｎｍｏｌとなる量の同位体標識ｍ７Ｇを含む、前記〔３３〕に記載の方法。
〔５０〕インキュベート混合物が、約１．０ｎｍｏｌ～約２０ｎｍｏｌとなる量の同位体標識２’－Ｏ－メチル化ヌクレオシドを含む、前記〔４９〕に記載の方法。
〔５１〕前記緩衝溶液が、約０．００１ｍＭ～約９０ｍＭの濃度範囲のＺｎＣｌ 2 を含む、前記〔３３〕に記載の方法。
〔５２〕前記緩衝溶液が、約０．０５ｍＭ～約０．２ｍＭの濃度範囲のＺｎＣｌ 2 を含む、前記〔５１〕に記載の方法。
〔５３〕前記インキュベート混合物が、１００ｍＭ未満の二価陽イオンを含む、前記〔３３〕に記載の方法。
〔５４〕前記緩衝溶液が、約２～約７のｐＨを有する、前記〔３３〕に記載の方法。
〔５５〕前記緩衝溶液が、約４～約６のｐＨを有する、前記〔５４〕に記載の方法。
〔５６〕液体クロマトグラフィー－質量分析法を使用して前記混合物を分析する工程が、クロマトグラフィーカラムを使用して前記混合物を分離する工程と、質量分析計を使用してｍ／ｚ及び強度データを得る工程と、ｍ７Ｇ及び同位体標識ｍ７Ｇのピーク、２’－Ｏ－メチル化ヌクレオシド及び同位体標識２’－Ｏ－メチル化ヌクレオシドのピーク、又はそれらの両方を特定して積分する工程と、ｍ７Ｇ：同位体標識ｍ７Ｇピーク比、２’－Ｏ－メチル化ヌクレオシド：同位体標識２’－Ｏ－メチル化ヌクレオシドピーク比、又はそれらの両方を計算する工程と、前記ｍ７Ｇ：同位体標識ｍ７Ｇピーク比に基づいた前記キャッピング効率、前記２’－Ｏ－メチル化ヌクレオシド：同位体標識２’－Ｏ－メチル化ヌクレオシドピーク比に基づいた２－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ効率、又はそれらの両方を求める工程を更に含む、前記〔３３〕に記載の方法。
本発明のまた別の態様は、以下のとおりであってもよい。
〔１〕ヌクレアーゼＰ１及びサツマイモ酸性ホスファターゼを含む、酵素混合物と、
同位体標識ｍ７Ｇ及び同位体標識２’－Ｏ－メチル化ヌクレオシド（Ａｍ、Ｇｍ、Ｃｍ又はＵｍ）を含む、標準物質混合物と、
を含む、ｍＲＮＡキャッピング効率を定量するためのキット。
〔２〕緩衝溶液を更に含む、前記〔１〕に記載のキット。
〔３〕前記緩衝溶液が、ＺｎＣｌ 2 を含む、前記〔２〕に記載のキット。
〔４〕前記緩衝溶液が、約０．０１ｍｍｏｌ～約９０ｍｍｏｌのＺｎＣｌ 2 濃度を有する、前記〔３〕に記載のキット。
〔５〕前記緩衝溶液が、約１００ｍｍｏｌ未満の濃度の二価陽イオンを有する、前記〔３〕に記載のキット。
〔６〕前記緩衝溶液が、約２～約７のｐＨを有する、前記〔２〕に記載のキット。
〔７〕前記緩衝溶液が、約４～約６のｐＨを有する、前記〔６〕に記載のキット。
〔８〕更に、前記酵素混合物が、ＲＮアーゼＴ１を更に含む、前記〔１〕に記載のキット。
〔９〕前記酵素混合物が凍結乾燥粉末である、前記〔１〕に記載のキット。
〔１０〕前記標準物質混合物が、凍結乾燥粉末である、前記〔１〕に記載のキット。
〔１１〕前記同位体標識ｍ７Ｇ及び２’－Ｏ－メチル化ヌクレオシドが、重水素標識ｍ７Ｇ（Ｄ）及び重水素標識２’－Ｏ－メチル化ヌクレオシド（Ａｍ（Ｄ）、Ｇｍ（Ｄ）、Ｃｍ（Ｄ）又はＵｍ（Ｄ））を含む、前記〔１〕に記載のキット。
〔１２〕前記同位体標識ｍ７Ｇ及び前記同位体標識２’－Ｏ－メチル化ヌクレオシドが、Ｎ 15 標識されているか、又はＣ 13 標識されている、前記〔１〕に記載のキット。
〔１３〕前記標準物質混合物中の前記同位体標識ｍ７Ｇ及び前記同位体標識２’－Ｏ－メチル化ヌクレオシドが、約２：１～約１：２のモル比で存在する、前記〔１〕に記載のキット。
〔１４〕前記標準物質混合物が、等モル量の同位体標識ｍ７Ｇ及び同位体標識２’－Ｏ－メチル化ヌクレオシドを含む、前記〔１３〕に記載のキット。
〔１５〕非特異的一本鎖ヌクレアーゼ及び酸性ホスファターゼを含む、酵素混合物と、
同位体標識ｍ７Ｇ及び同位体標識２’－Ｏ－メチル化ヌクレオシド（Ａｍ、Ｇｍ、Ｃｍ又はＵｍ）を含む、標準物質混合物と、
緩衝溶液と、
を含む、ｍＲＮＡキャッピング効率を定量するためのキット。
〔１６〕前記非特異的一本鎖ヌクレアーゼがヌクレアーゼＰ１を含む、前記〔１５〕に記載のキット。
〔１７〕前記酸性ホスファターゼが、アデノシン一リン酸によって阻害されない、前記〔１５〕に記載のキット。
〔１８〕前記酸性ホスファターゼが、サツマイモ酸性ホスファターゼを含む、前記〔１５〕に記載のキット。
〔１９〕前記酵素混合物が、部位特異的一本鎖ＲＮＡエンドヌクレアーゼを含む、前記〔１５〕に記載のキット。
〔２０〕前記部位特異的一本鎖ＲＮＡエンドヌクレアーゼが、グアノシンのＲＮＡ３’を切断する、前記〔１９〕に記載のキット。
〔２１〕前記部位特異的一本鎖ＲＮＡエンドヌクレアーゼが、リボヌクレアーゼＴ１を含む、前記〔１９〕に記載のキット。
〔２２〕前記酵素混合物が、凍結乾燥粉末である、前記〔１５〕に記載のキット。
〔２３〕前記標準物質混合物が、凍結乾燥粉末である、前記〔１５〕に記載のキット。
〔２４〕前記同位体標識ｍ７Ｇ及び前記同位体標識２’－Ｏ－メチル化ヌクレオシドが、重水素標識ｍ７Ｇ（Ｄ）及び重水素標識２’－Ｏ－メチル化ヌクレオシド（Ａｍ（Ｄ）、Ｇｍ（Ｄ）、Ｃｍ（Ｄ）又はＵｍ（Ｄ））を含む、前記〔１５〕に記載のキット。
〔２５〕前記同位体標識ｍ７Ｇ及び前記同位体標識２’－Ｏ－メチル化ヌクレオシドが、Ｎ 15 標識されているか、又はＣ 13 標識されている、前記〔１５〕に記載のキット。
〔２６〕前記標準物質混合物中の前記同位体標識ｍ７Ｇ及び前記同位体標識２’－Ｏ－メチル化ヌクレオシドが、約２：１～約１：２のモル比で存在する、前記〔１５〕に記載のキット。
〔２７〕前記標準物質混合物が、等モル量の前記同位体標識ｍ７Ｇ及び前記同位体標識２’－Ｏ－メチル化ヌクレオシドを含む、前記〔２６〕に記載のキット。
〔２８〕前記緩衝溶液が、約０．００１ｍＭ～約９０ｍＭの濃度範囲のＺｎＣｌ 2 を含む、前記〔１５〕に記載のキット。
〔２９〕前記緩衝溶液が、約０．０５ｍＭ～約０．２ｍＭの濃度範囲のＺｎＣｌ 2 を含む、前記〔２８〕に記載のキット。
〔３０〕前記緩衝溶液が、約１００ｍＭ未満の二価陽イオンを含む、前記〔２８〕に記載のキット。
〔３１〕前記緩衝溶液が、約２～約７のｐＨを有する、前記〔１５〕に記載のキット。
〔３２〕前記緩衝溶液が、約４～約６のｐＨを有する、前記〔３１〕に記載のキット。
〔３３〕緩衝溶液中で試料、酵素混合物及び同位体標準物質溶液を一緒にして、インキュベート混合物を生成する工程であって、前記酵素混合物が、非特異的一本鎖ヌクレアーゼ及び酸性ホスファターゼを含み、前記同位体標準物質が、同位体標識ｍ７Ｇ及び同位体標識２’－Ｏ－メチル化ヌクレオシド（Ａｍ、Ｇｍ、Ｃｍ又はＵｍ）を含む、工程と、
前記混合物をインキュベートする工程と、
液体クロマトグラフィー－質量分析法を使用して、前記混合物を分析し、キャッピング効率及び２’－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ効率の少なくとも１つを求める工程と、
を含む、ｍＲＮＡキャッピング効率を定量するための方法。
〔３４〕前記混合物のインキュベートが、約３０℃～７０℃の温度で行われる、前記〔３３〕に記載の方法。
〔３５〕前記混合物のインキュベートが、約３５℃～４５℃の温度で行われる、前記〔３４〕に記載の方法。
〔３６〕前記非特異的一本鎖ヌクレアーゼが、ヌクレアーゼＰ１を含む、前記〔３３〕に記載の方法。
〔３７〕前記酸性ホスファターゼが、アデノシン一リン酸によって阻害されない、前記〔３３〕に記載の方法。
〔３８〕前記酸性ホスファターゼが、サツマイモ酸性ホスファターゼを含む、前記〔３３〕に記載の方法。
〔３９〕前記酵素混合物が、部位特異的一本鎖ＲＮＡエンドヌクレアーゼを更に含む、前記〔３３〕に記載の方法。
〔４０〕前記部位特異的一本鎖ＲＮＡエンドヌクレアーゼが、グアノシンのＲＮＡ３’を切断する、前記〔３９〕に記載の方法。
〔４１〕前記部位特異的一本鎖ＲＮＡエンドヌクレアーゼが、リボヌクレアーゼＴ１を含む、前記〔３９〕に記載の方法。
〔４２〕前記混合物のインキュベートが、約３０℃～５０℃の温度で行われる、前記〔４１〕に記載の方法。
〔４３〕凍結乾燥酵素混合物を前記試料緩衝溶液で溶解して、前記酵素混合物を得る工程を更に含む、前記〔３３〕に記載の方法。
〔４４〕凍結乾燥標準物質混合物を前記試料緩衝溶液で溶解して、前記標準物質混合物を得る工程を更に含む、前記〔３３〕に記載の方法。
〔４５〕前記同位体標識ｍ７Ｇ及び前記同位体標識２’－Ｏ－メチル化ヌクレオシドが、重水素標識ｍ７Ｇ（Ｄ）及び重水素標識２’－Ｏ－メチル化ヌクレオシド（Ａｍ（Ｄ）、Ｇｍ（Ｄ）、Ｃｍ（Ｄ）又はＵｍ（Ｄ））を含む、前記〔３３〕に記載の方法。
〔４６〕前記同位体標識ｍ７Ｇ及び前記同位体標識２’－Ｏ－メチル化ヌクレオシドが、Ｎ 15 標識されているか、又はＣ 13 標識されている、前記〔３３〕に記載の方法。
〔４７〕前記標準物質混合物中の前記同位体標識ｍ７Ｇ及び前記同位体標識２’－Ｏ－メチル化ヌクレオシドが、約２：１～約１：２のモル比で存在する、前記〔３３〕に記載の方法。
〔４８〕前記標準物質混合物が、等モル量の同位体標識ｍ７Ｇ及び同位体標識２’－Ｏ－メチル化ヌクレオシドを含む、前記〔４７〕に記載の方法。
〔４９〕インキュベート混合物が、約１．０ｎｍｏｌ～２０ｎｍｏｌとなる量の同位体標識ｍ７Ｇを含む、前記〔３３〕に記載の方法。
〔５０〕インキュベート混合物が、約１．０ｎｍｏｌ～約２０ｎｍｏｌとなる量の同位体標識２’－Ｏ－メチル化ヌクレオシドを含む、前記〔４９〕に記載の方法。
〔５１〕前記緩衝溶液が、約０．００１ｍＭ～約９０ｍＭの濃度範囲のＺｎＣｌ 2 を含む、前記〔３３〕に記載の方法。
〔５２〕前記緩衝溶液が、約０．０５ｍＭ～約０．２ｍＭの濃度範囲のＺｎＣｌ 2 を含む、前記〔５１〕に記載の方法。
〔５３〕前記インキュベート混合物が、１００ｍＭ未満の二価陽イオンを含む、前記〔３３〕に記載の方法。
〔５４〕前記緩衝溶液が、約２～約７のｐＨを有する、前記〔３３〕に記載の方法。
〔５５〕前記緩衝溶液が、約４～約６のｐＨを有する、前記〔５４〕に記載の方法。
〔５６〕液体クロマトグラフィー－質量分析法を使用して前記混合物を分析する工程が、クロマトグラフィーカラムを使用して前記混合物を分離する工程と、質量分析計を使用してｍ／ｚ及び強度データを得る工程と、ｍ７Ｇ及び同位体標識ｍ７Ｇのピーク、２’－Ｏ－メチル化ヌクレオシド及び同位体標識２’－Ｏ－メチル化ヌクレオシドのピーク、又はそれらの両方を特定して積分する工程と、ｍ７Ｇ：同位体標識ｍ７Ｇピーク比、２’－Ｏ－メチル化ヌクレオシド：同位体標識２’－Ｏ－メチル化ヌクレオシドピーク比、又はそれらの両方を計算する工程と、前記ｍ７Ｇ：同位体標識ｍ７Ｇピーク比に基づいた前記キャッピング効率、前記２’－Ｏ－メチル化ヌクレオシド：同位体標識２’－Ｏ－メチル化ヌクレオシドピーク比に基づいた２－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ効率、又はそれらの両方を求める工程を更に含む、前記〔３３〕に記載の方法。
【国際調査報告】