特表 2024-522756 ダブルノックアウトナチュラルキラー細胞

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-06-21

(54)【発明の名称】ダブルノックアウトナチュラルキラー細胞

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/10 20060101AFI20240614BHJP

   A61K 35/17 20150101ALI20240614BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240614BHJP

   A61P 35/02 20060101ALI20240614BHJP

   C12N 15/09 20060101ALN20240614BHJP

【ＦＩ】

C12N5/10

A61K35/17

A61P35/00

A61P35/02

C12N15/09 Z

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023577581

(86)(22)【出願日】2022-06-20

(85)【翻訳文提出日】2024-02-07

(86)【国際出願番号】 EP2022066768

(87)【国際公開番号】W WO2022263682

(87)【国際公開日】2022-12-22

(31)【優先権主張番号】21180268.1

(32)【優先日】2021-06-18

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(31)【優先権主張番号】2200116.8

(32)【優先日】2022-01-06

(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】520179578

【氏名又は名称】オーエヌケイ セラピューティクス リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100182084

【弁理士】

【氏名又は名称】中道 佳博

(72)【発明者】

【氏名】オドワイアー，マイケル エイモン ピーター

【テーマコード（参考）】

4B065

4C087

【Ｆターム（参考）】

4B065AA90X

4B065AA90Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065AC20

4B065BA01

4B065CA24

4B065CA44

4C087AA01

4C087AA02

4C087AA03

4C087BB37

4C087BB65

4C087CA04

4C087NA05

4C087NA14

4C087ZB26

4C087ZB27

(57)【要約】

ＮＫ細胞およびＮＫ細胞株は、それらの細胞障害性、増殖、代謝プロファイルおよび持続性を高めるように改変され、当該細胞およびその組成物は、癌の治療に用途を有する。改変されたＮＫ細胞およびＮＫ細胞株の製造は、ＣＩＳＨ遺伝子およびＣＤ３８遺伝子の両方の発現をノックアウトする遺伝子改変によるものである。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＣＩＳおよびＣＤ３８の機能が低下するように改変された、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞またはＮＫ細胞株。

【請求項2】

前記改変が、ＣＩＳＨおよびＣＤ３８の発現をノックダウンまたはノックアウトするためのものである、請求項１に記載のＮＫ細胞またはＮＫ細胞株。

【請求項3】

ＣＩＳ機能および／またはＣＩＳＨ発現が、前記改変がなされていない同じＮＫ細胞またはＮＫ細胞株と比較して少なくとも５０％低下している、先行する請求項のいずれかに記載のＮＫ細胞またはＮＫ細胞株。

【請求項4】

ＣＩＳ機能および／またはＣＩＳＨ発現が、前記改変がなされていない同じＮＫ細胞またはＮＫ細胞株と比較して少なくとも９０％低下している、先行する請求項のいずれかに記載のＮＫ細胞またはＮＫ細胞株。

【請求項5】

ＣＤ３８の機能および／または発現が、前記改変がなされていない同じＮＫ細胞またはＮＫ細胞株と比較して少なくとも５０％低下している、先行する請求項のいずれかに記載のＮＫ細胞またはＮＫ細胞株。

【請求項6】

ＣＤ３８の機能および／または発現が、前記改変がなされていない同じＮＫ細胞またはＮＫ細胞株と比較して少なくとも９０％低下している、先行する請求項のいずれかに記載のＮＫ細胞またはＮＫ細胞株。

【請求項7】

ＣＩＳＨおよびＣＤ３８の発現の両方がノックアウトされている、先行する請求項のいずれかに記載のＮＫ細胞またはＮＫ細胞株。

【請求項8】

ＩＬ－１５を発現するように改変されている、先行する請求項のいずれかに記載のＮＫ細胞またはＮＫ細胞株。

【請求項9】

野生型ＴＲＡＩＬ、またはＴＲＡＩＬ死受容体に対する親和性が上昇したＴＲＡＩＬ改変体を発現するようにさらに改変されている、先行する請求項のいずれかに記載のＮＫ細胞またはＮＫ細胞株。

【請求項10】

ＣＤ１９、ＣＤ３８、ＭＵＣ－１、ＣＬＬ－１、ＳＬＡＭＦ７またはＣＤ９６に対するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するようにさらに改変されている、先行する請求項のいずれかに記載のＮＫ細胞またはＮＫ細胞株。

【請求項11】

治療に使用するための、先行する請求項のいずれかに記載のＮＫ細胞またはＮＫ細胞株。

【請求項12】

癌の治療に使用するための、請求項１１に記載の使用のためのＮＫ細胞またはＮＫ細胞株。

【請求項13】

前記癌がＣＤ３８発現癌である、請求項１２に記載の使用のためのＮＫ細胞またはＮＫ細胞株。

【請求項14】

前記癌が、多発性骨髄腫、急性骨髄性白血病および急性リンパ芽球性白血病から選択される、請求項１２または１３に記載の使用のためのＮＫ細胞またはＮＫ細胞株。

【請求項15】

改変されたＮＫ細胞またはＮＫ細胞株を作製する方法であって、
ａ）ＣＩＳＨ遺伝子およびＣＤ３８遺伝子の発現を同時にノックアウトする工程と、必要に応じて、
ｂ）ＩＬ－１５遺伝子の発現をノックインする工程と
を含む方法。

【請求項16】

請求項１から１０のいずれかに記載のＮＫ細胞またはＮＫ細胞株を患者に投与することによって癌を治療する方法。

【請求項17】

前記癌はＣＤ３８発現癌である、請求項１６に記載の方法。

【請求項18】

前記癌が多発性骨髄腫、急性骨髄性白血病および急性リンパ芽球性白血病から選択される、請求項１６または１７に記載の方法。

【請求項19】

請求項１から１０のいずれかに記載のＮＫ細胞またはＮＫ細胞株を含む組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

（序論）
本発明は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞およびＮＫ細胞株を、より細胞傷害性の高い表現型を有するそれらの誘導体を産生するように改変することに関する。さらに、本発明は、改変されたＮＫ細胞およびＮＫ細胞株を製造する方法、当該細胞および細胞株を含む組成物、ならびに癌の治療における当該細胞、株および組成物の使用に関する。

【背景技術】

【0002】

典型的には、免疫細胞は、標的細胞の死をもたらす免疫応答を誘発する前に、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）を介して標的細胞が抗原を提示することを必要とする。これにより、ＭＨＣクラスＩを提示しない癌細胞が免疫応答の大部分を回避することができる。

【0003】

しかし、ＮＫ細胞は、ＭＨＣクラスＩの発現がない場合に、癌細胞を認識することができる。そのため、ＮＫ細胞は、癌に対する身体の防御において重要な役割を果たす。

【0004】

一方、特定の状況では、癌細胞は、ＮＫ細胞膜上の抑制性受容体に結合するリガンドの発現を通じて、ＮＫ細胞の細胞傷害活性を弱める能力を示す。癌に対する抵抗はこれらと他の因子との間のバランスを含み得る。

【0005】

この文脈において、細胞傷害性とは、免疫エフェクター細胞、例えばＮＫ細胞が、（例えば細胞溶解性化合物を放出することにより、あるいは癌細胞膜上の受容体を結合し、かつ当該癌細胞のアポトーシスを誘導することにより）癌細胞死を誘発する能力を指す。細胞傷害性は、細胞溶解性化合物の放出を誘発するシグナルだけでなく、それらの放出を抑制するシグナルによっても影響を受ける。したがって、細胞傷害性の上昇は、上記のように、癌細胞がＮＫの細胞傷害性活性を弱める可能性が低い状態で、癌細胞のより効率的な死滅をもたらす。

【0006】

サイトカイン誘導性ＳＨ２含有タンパク質（ＣＩＳ）の発現は、ある特定の成長サイトカインによって誘導され、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞においてシグナル伝達を行うインターロイキン－１５（ＩＬ－１５）の重要な負の調節因子である。ＣＩＳは、ＣＩＳＨ遺伝子によってコードされる。ＣＩＳ発現は、低サイトカイン濃度に維持された場合の複数の癌細胞株に対する細胞増殖の制限および細胞傷害活性の低下に関連する。したがって、ＮＫ細胞におけるＣＩＳＨ遺伝子の欠失によってＣＩＳ発現をノックアウトすることは、癌細胞に対するＮＫ細胞の細胞障害性に有益であることが最近報告されている（Zhuら、２０２０年“Metabolic Reprograming via Deletion of CISH in Human iPSC-Derived NK Cells Promotes In Vivo Persistence and Enhances Anti-tumor Activity” Cell: Vol. 27(2): pp. 224-237）。

【0007】

しかし、特に癌細胞に対する細胞障害性および持続性を向上させた、代替的でかつ好ましく改良された細胞ベースの治療法が必要とされている。加えて、改変された治療用形態で細胞をより容易に診療所に持ち込むことができるように、迅速かつ高効率な細胞のトランスフェクションを実現することが望まれる。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0008】

本発明の目的は、より細胞障害性および／または持続性の高い表現型を有する癌細胞を標的とするＮＫ細胞およびＮＫ細胞株を提供することである。さらなる目的は、改変されたＮＫ細胞およびＮＫ細胞株を製造する方法、当該細胞または細胞株を含む組成物、ならびに、治療、具体的には癌の治療におけるそれらの使用を提供することである。より具体的な実施形態は、特定された癌の治療を提供することを目的とする。特定の実施形態は、ＮＫ細胞およびＮＫ細胞株の２つ以上の改変を組み合わせて、改変された細胞の細胞障害性および持続性を向上させることを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0009】

本明細書では、より細胞傷害性の高い表現型を有する改変されたＮＫ細胞およびＮＫ細胞株、ならびに当該細胞および細胞株を作製する方法が提供される。改変されたＮＫ細胞およびＮＫ細胞株の組成物、ならびに癌を治療するための当該組成物の使用も提供される。この文脈における細胞傷害性とは、上記のように、癌細胞の殺傷を指す。

【0010】

本発明は、ＣＩＳおよびＣＤ３８の機能が低下するように改変されたＮＫ細胞およびＮＫ細胞株を提供する。

【0011】

本発明によれば、全般的かつ特異的に、改変されたＮＫ細胞およびＮＫ細胞株を用いて、癌（例えば、血液癌）を治療する方法がさらに提供され、改変されたＮＫ細胞およびＮＫ細胞株は、ＣＩＳおよびＣＤ３８の機能が低下するように操作され、必要に応じて、１つ以上のチェックポイント抑制性受容体の発現の欠失に加えて、１つ以上のＴＲＡＩＬリガンドを発現し、１つ以上のキメラ抗原受容体を発現し、１つ以上の成長促進サイトカインを発現し、および／または１つ以上のＦｃ受容体を発現するように操作されている。

【0012】

本発明によって特に治療可能な疾患としては、癌、固形癌および血液癌、より具体的にはＣＤ３８発現癌が含まれる。特に、ヒトの腫瘍や癌を治療することができる。本明細書における腫瘍への言及は新生物への言及を含む。

【図面の簡単な説明】

【0013】

【図1】図１は、臍帯血由来ＮＫ細胞におけるＣＩＳＨおよびＣＤ３８のノックアウトの達成に関係する経時変化を示す一連のグラフである。

【図2】図２は、（１）未改変の対照ＮＫ細胞、（２）ＣＩＳＨノックアウトのみを有するＮＫ細胞、（３）ＣＤ３８ノックアウトのみを有するＮＫ細胞、および（４）ＣＩＳＨおよびＣＤ３８のダブルノックアウトを有するＮＫ細胞のＡＴＰ産生速度を示す。

【図3】図３は、（１）未改変の対照ＮＫ細胞、（２）ＣＩＳＨノックアウトのみを有するＮＫ細胞、（３）ＣＤ３８ノックアウトのみを有するＮＫ細胞、および（４）ＣＩＳＨおよびＣＤ３８のダブルノックアウトを有するＮＫ細胞の代謝プロファイルを示す。

【図4a】図４は、（１）未改変の対照ＮＫ細胞、（２）ＣＤ３８ノックアウトのみを有するＮＫ細胞、（３）ＣＩＳＨノックアウトのみを有するＮＫ細胞、ならびに（４）ＣＩＳＨおよびＣＤ３８のダブルノックアウトのみを有するかまたはダラツムマブまたはエロツズマブモノクローナル抗体を追加したＮＫ細胞を用いた、Ｉｎｃｕｙｔｅ（登録商標）による細胞傷害性アッセイ（図４ａ）およびフローサイトメトリーによる細胞傷害性アッセイ（図４ｂ）の結果を示す。

【図4b】図４は、（１）未改変の対照ＮＫ細胞、（２）ＣＤ３８ノックアウトのみを有するＮＫ細胞、（３）ＣＩＳＨノックアウトのみを有するＮＫ細胞、ならびに（４）ＣＩＳＨおよびＣＤ３８のダブルノックアウトのみを有するかまたはダラツムマブまたはエロツズマブモノクローナル抗体を追加したＮＫ細胞を用いた、Ｉｎｃｕｙｔｅ（登録商標）による細胞傷害性アッセイ（図４ａ）およびフローサイトメトリーによる細胞傷害性アッセイ（図４ｂ）の結果を示す。

【発明を実施するための形態】

【0014】

したがって、本発明は、ＣＩＳおよびＣＤ３８の機能が低下するように改変されたナチュラルキラー（ＮＫ）細胞またはＮＫ細胞株を提供する。

【0015】

併せて、本発明のＮＫ細胞およびＮＫ細胞株は、（文脈上別段の定めがない限り）ＮＫ細胞とも称される。好ましくは、ＮＫ細胞はヒトＮＫ細胞である。

【0016】

実施例において以下に詳細に記載されるように、ＮＫ細胞およびＮＫ細胞株は、それらの細胞傷害活性、特に癌に対する細胞傷害活性を高めるように遺伝子改変されている。したがって、この改変は、ＣＩＳＨおよびＣＤ３８の発現をノックダウンまたはノックアウトするようなものであることが好ましい。

【0017】

好ましくは、ＣＩＳの機能および／または発現は、改変がなされていない同じＮＫ細胞またはＮＫ細胞株（野生型ＮＫ細胞）と比較して少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、より好ましくは、少なくとも９９％低下している。

【0018】

好ましくは、ＣＤ３８の機能および／または発現は、改変がなされていない同じＮＫ細胞またはＮＫ細胞株（野生型ＮＫ細胞）と比較して少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９９％低下している。

【0019】

本発明に係るＮＫ細胞は、ＣＩＳおよびＣＤ３８の両方の発現がノックアウトされていることが特に好ましい。ＣＩＳＨおよび／またはＣＤ３８の遺伝子ノックアウトは、好ましくは、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集によるものである。

【0020】

本発明の好ましい特徴は、培養中の急速な成長および増殖に対する固有の能力が増大した、改変されたＮＫ細胞およびＮＫ細胞株を提供することである。これは、例えば、成長誘導サイトカインＩＬ－２および／またはＩＬ－１５を過剰発現するように細胞をトランスフェクトすることにより実現することができる。さらに、この任意の変更により、継続的に成長培地にサイトカインを補充することに対する費用対効果の高い代替手段が提供される。これらの細胞は、治療適用前に、後続の処理（例えば、分裂能力を低下させる）のために、顕著な量の細胞を調製するための中間体として使用され得る。

【0021】

したがって、本発明の改変されたＮＫ細胞は、ＩＬ－１５を発現するようにさらに改変されてもよく、あるいは、ＮＫ細胞が既に一定量のＩＬ－１５を発現している場合は、ＩＬ－１５を過剰発現するように改変されてもよい。

【0022】

本発明の大きな利点は、ＮＫ細胞の各改変が、共に作用して、効果、持続性および細胞障害性の高いエフェクター細胞を提供する方法にある。ＮＫ細胞におけるＣＩＳＨ発現をノックアウトすることにより、より障害性の高い表現型が有利となるように活性化受容体と抑制性受容体のバランスを改変するとともに、増殖が高まり、サイトカインが産生される一方で、ＮＫ細胞におけるＣＤ３８の発現をノックアウトすることにより、ＮＡＤ＋の利用可能性が高まり、それにより解糖が向上し、酸化ストレスに対する耐性が大きくなることが示されている。したがって、ＮＫ細胞におけるＣＩＳＨおよびＣＤ３８の両方のノックアウトを組み合わせることにより、自身の標的（例えば、癌細胞）に対する障害性がより高く、より持続的であり、かつ代謝の回復が早いエフェクターＮＫ細胞が提供される。

【0023】

ＣＤ３８ノックアウト改変およびＣＩＳＨノックアウト改変のそれぞれによって達成される利点は、共に作用して、癌治療に有効性の高いＮＫ細胞を提供する。この主な理由は、改変されたＮＫ細胞のエフェクター機能は、癌の微小環境における変化に対してそれほど脆弱ではないからである。この一例としては、サイトカインに富む微小環境、すなわちＩＬ－１５が容易に利用可能な場所では、ＣＩＳＨノックアウトはＮＫ細胞の応答性を高める一方、サイトカインの乏しい微小環境、すなわちＩＬ－１５がほとんど利用できない場所では、ＣＤ３８ノックアウトは、低栄養微小環境であることをよく示す酸化ストレスに対するＮＫ細胞の耐性を高めるということが挙げられる。

【0024】

さらに、ＣＩＳＨ／ＣＤ３８ダブルノックアウトは、ＮＫ細胞のトランスフェクションを改善するのにも有利であることが示されている。本発明者らは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９によってＣＤ３８／ＣＩＳＨノックアウトを多重化することで、ＣＤ３８およびＣＩＳＨの発現を別々に独立してノックアウトする場合と比較して、トランスフェクション処理が大幅に迅速化することを示した。これは、各改変が順次にではなく同時になされるからだけではない。ＣＩＳＨおよびＣＤ３８を同時にノックアウトすることにより、各標的をそれぞれ個別にノックアウトする場合と比較して、両方の標的に対するタンパク質発現がより迅速に低下することが観察されている。

【0025】

本発明の他の実施形態では、ＴＲＡＩＬリガンドも発現または過剰発現するＮＫ細胞が提供される。好ましくは、ＴＲＡＩＬリガンドは変異体（改変体）ＴＲＡＩＬリガンドである。得られるＮＫ細胞は、ＴＲＡＩＬ受容体への結合の増加を示し、その結果、癌、特に固形癌、特に卵巣癌、乳癌および結腸直腸癌、ならびに血液癌、特に白血病に対する細胞傷害性の上昇を示す。この組み合わされた活性を有するＮＫ細胞は、癌転移の減少にも有効であり得る。

【0026】

ＴＲＡＩＬ変異体／改変体は、「デコイ」受容体に対する親和性が、デコイ受容体への野生型ＴＲＡＩＬの結合と比較して低い（または実質的に親和性を有しない）ことが好ましい。このようなデコイ受容体は、ＴＲＡＩＬリガンドに結合するが細胞死を開始する能力を持たず、場合によっては死シグナル伝達経路に拮抗するように作用するクラスのＴＲＡＩＬ受容体を表す。変異体／改変体ＴＲＡＩＬリガンドは、国際公開公報第２００９／０７７８５７号に従って調製されてもよい。

【0027】

変異体／改変体は、ＴＲＡＩＬ受容体（例えばＤＲ４およびＤＲ５）に対する親和性が別々に上昇していてもよい。野生型ＴＲＡＩＬは、典型的には、ＤＲ４に対して＞２ｎＭ、ＤＲ５に対して＞５ｎＭ、デコイ受容体ＤｃＲ１に対して＞２０ｎＭ（国際公開公報第２００９／０７７８５７号、表面プラズモン共鳴により測定）、またはＤＲ４に対して約５０～１００ｎＭ、ＤＲ５に対して１～１０ｎＭ、ＤｃＲ１に対して１７５～２２５ｎＭ（Ｔｒｕｎｅｈ、Ａ．ら、２０００年；等温滴定熱量測定およびＥＬＩＳＡで測定）のＫＤを有することが知られている。したがって、ＤＲ４に対する親和性の上昇は、それぞれ＜２ｎＭまたは＜５０ｎＭのＫＤとして適切に定義され、ＤＲ５に対する上昇した親和性は、それぞれ＜５ｎＭまたは＜１ｎＭのＫＤとして適切に定義される。デコイ受容体ＤｃＲ１に対する低下した親和性は、それぞれ、＞５０ｎＭまたは＞２２５ｎＭのＫＤとして適切に定義される。いずれの場合も、ＴＲＡＩＬ改変体／変異体によって示される親和性の上昇または低下は、野生型ＴＲＡＩＬによって示されるベースライン親和性に対するものである。親和性は、野生型ＴＲＡＩＬによって示される親和性と比較して、好ましくは少なくとも１０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも１００％、より好ましくは少なくとも１０００％上昇している。

【0028】

ＴＲＡＩＬ改変体は、好ましくは、ＤＲ４、ＤｃＲ１およびＤｃＲ２に対する親和性と比較して、ＤＲ５に対する親和性が上昇している。好ましくは、親和性は、ＤＲ４、ＤｃＲ１およびＤｃＲ２のうち１つまたはそれ以上よりも、ＤＲ５に対して少なくとも１．５倍、２倍、５倍、１０倍、１００倍、あるいは１，０００倍またはそれ以上でさえある。より好ましくは、親和性は、ＤＲ４、ＤｃＲ１およびＤｃＲ２のうち少なくとも２つ、好ましくはそれらのすべてよりも、ＤＲ５に対して少なくとも１．５倍、２倍、５倍、１０倍、１００倍、あるいは１０００倍またはそれ以上でさえある。

【0029】

ＴＲＡＩＬ改変体は、好ましくは、野生型ＴＲＡＩＬに対するその親和性と比較して、ＤＲ４およびＤＲ５の一方または両方に対する親和性が上昇している。好ましくは、親和性は、野生型ＴＲＡＩＬに対してよりも、ＤＲ４および／またはＤＲ５に対して、少なくとも１．５倍、２倍、５倍、１０倍、１００倍、あるいは１０００倍またはそれ以上でさえある。

【0030】

さらなる特定の実施形態は、ＴＲＡＩＬデコイ受容体に対する親和性が低下しているかまたは親和性を有しない変異ＴＲＡＩＬリガンドを発現するＮＫ細胞を含む。さらなる特定の実施形態は、ＴＲＡＩＬデコイ受容体に対する親和性が低下しているかまたは親和性を有さず、ＤＲ４および／またはＤＲ５に対する親和性が上昇している変異ＴＲＡＩＬリガンドを発現するＮＫ細胞を含む。

【0031】

結合親和性は、当該技術分野で公知である任意の適した方法に従って測定されてもよい。好ましくは、結合親和性は、表面プラズモン共鳴、等温滴定熱量測定またはＥＬＩＳＡを使用して測定される。

【0032】

特定の実施形態では、ＴＲＡＩＬ改変体は、１３１、１４９、１５９、１６０、１８９、１９１、１９３、１９５、１９９、２００、２０１、２０３、２０４、２１２、２１３、２１４、２１５、２１８、２４０、２５１、２６１、２６４、２６６、２６７、２６９および２７０からなる群から選択される位置において少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。

【0033】

特定の実施形態では、ＴＲＡＩＬ改変体は、Ｇ１３１Ｒ、Ｇ１３１Ｋ、Ｒ１４９Ｉ、Ｒ１４９Ｍ、Ｒ１４９Ｎ、Ｒ１４９Ｋ、Ｓ１５９Ｒ、Ｇ１６０Ｅ、Ｙ１８９Ａ、Ｙ１８９Ｑ、Ｒ１９１Ｋ、Ｑ１９３Ｈ、Ｑ１９３Ｋ、Ｑ１９３Ｓ、Ｑ１９３Ｒ、Ｅ１９５Ｒ、Ｎ１９９Ｖ、Ｎ１９９Ｒ、Ｎ１９９Ｈ、Ｔ２００Ｈ、Ｋ２０１Ｒ、Ｋ２０１Ｈ、Ｄ２０３Ａ、Ｋ２０４Ｅ、Ｋ２０４Ｄ、Ｋ２０４Ｙ、Ｋ２１２Ｒ、Ｙ２１３Ｗ、Ｔ２１４Ｒ、Ｓ２１５Ｄ、Ｓ２１５Ｅ、Ｓ２１５Ｈ、Ｓ２１５Ｋ、Ｓ２１５Ｄ、Ｄ２１８Ｈ、Ｄ２１８Ａ、Ｙ２４０Ａ、Ｋ２５１Ｄ、Ｋ２５１Ｅ、Ｋ２５１Ｑ、Ｔ２６１Ｌ、Ｈ２６４Ｒ、Ｉ２６６Ｌ、Ｄ２６７Ｑ、Ｄ２６９Ａ、Ｄ２６９ＨおよびＨ２７０Ｄからなる群から選択される少なくとも１つの置換を含む。

【0034】

特定の実施形態では、ＴＲＡＩＬ改変体は、Ｇ１３１Ｒ、Ｇ１３１Ｋ、Ｒ１４９Ｉ、Ｒ１４９Ｍ、Ｒ１４９Ｎ、Ｒ１４９Ｋ、Ｓ１５９Ｒ、Ｇ１６０Ｅ、Ｙ１８９Ａ、Ｙ１８９Ｑ、Ｒ１９１Ｋ、Ｑ１９３Ｈ、Ｑ１９３Ｋ、Ｑ１９３Ｓ、Ｑ１９３Ｒ、Ｅ１９５Ｒ、Ｎ１９９Ｖ、Ｎ１９９Ｒ、Ｎ１９９Ｈ、Ｔ２００Ｈ、Ｋ２０１Ｒ、Ｋ２０１Ｈ、Ｄ２０３Ａ、Ｋ２０４Ｅ、Ｋ２０４Ｄ、Ｋ２０４Ｙ、Ｋ２１２Ｒ、Ｙ２１３Ｗ、Ｔ２１４Ｒ、Ｓ２１５Ｄ、Ｓ２１５Ｅ、Ｓ２１５Ｈ、Ｓ２１５Ｋ、Ｓ２１５Ｄ、Ｄ２１８Ｈ、Ｄ２１８Ａ、Ｙ２４０Ａ、Ｋ２５１Ｄ、Ｋ２５１Ｅ、Ｋ２５１Ｑ、Ｔ２６１Ｌ、Ｈ２６４Ｒ、Ｉ２６６Ｌ、Ｄ２６７Ｑ、Ｄ２６９Ａ、Ｄ２６９ＨおよびＨ２７０Ｄからなる群から選択される少なくとも２つの置換を含む。

【0035】

特定の実施形態では、ＴＲＡＩＬ改変体は、Ｇ１３１Ｒ、Ｇ１３１Ｋ、Ｒ１４９Ｉ、Ｒ１４９Ｍ、Ｒ１４９Ｎ、Ｒ１４９Ｋ、Ｓ１５９Ｒ、Ｇ１６０Ｅ、Ｙ１８９Ａ、Ｙ１８９Ｑ、Ｒ１９１Ｋ、Ｑ１９３Ｈ、Ｑ１９３Ｋ、Ｑ１９３Ｓ、Ｑ１９３Ｒ、Ｅ１９５Ｒ、Ｎ１９９Ｖ、Ｎ１９９Ｒ、Ｎ１９９Ｈ、Ｔ２００Ｈ、Ｋ２０１Ｒ、Ｋ２０１Ｈ、Ｄ２０３Ａ、Ｋ２０４Ｅ、Ｋ２０４Ｄ、Ｋ２０４Ｙ、Ｋ２１２Ｒ、Ｙ２１３Ｗ、Ｔ２１４Ｒ、Ｓ２１５Ｄ、Ｓ２１５Ｅ、Ｓ２１５Ｈ、Ｓ２１５Ｋ、Ｓ２１５Ｄ、Ｄ２１８Ｈ、Ｄ２１８Ａ、Ｙ２４０Ａ、Ｋ２５１Ｄ、Ｋ２５１Ｅ、Ｋ２５１Ｑ、Ｔ２６１Ｌ、Ｈ２６４Ｒ、Ｉ２６６Ｌ、Ｄ２６７Ｑ、Ｄ２６９Ａ、Ｄ２６９ＨおよびＨ２７０Ｄからなる群から選択される少なくとも３つの置換を含む。

【0036】

特定の実施形態では、ＴＲＡＩＬ改変体のアミノ酸置換は、Ｇ１３１Ｒ、Ｇ１３１Ｋ、Ｒ１４９Ｉ、Ｒ１４９Ｍ、Ｒ１４９Ｎ、Ｒ１４９Ｋ、Ｓ１５９Ｒ、Ｇ１６０Ｅ、Ｙ１８９Ａ、Ｙ１８９Ｑ、Ｒ１９１Ｋ、Ｑ１９３Ｈ、Ｑ１９３Ｋ、Ｑ１９３Ｓ、Ｑ１９３Ｒ、Ｅ１９５Ｒ、Ｎ１９９Ｖ、Ｎ１９９Ｒ、Ｎ１９９Ｈ、Ｔ２００Ｈ、Ｋ２０１Ｒ、Ｋ２０１Ｈ、Ｄ２０３Ａ、Ｋ２０４Ｅ、Ｋ２０４Ｄ、Ｋ２０４Ｙ、Ｋ２１２Ｒ、Ｙ２１３Ｗ、Ｔ２１４Ｒ、Ｓ２１５Ｄ、Ｓ２１５Ｅ、Ｓ２１５Ｈ、Ｓ２１５Ｋ、Ｓ２１５Ｄ、Ｄ２１８Ｈ、Ｄ２１８Ａ、Ｙ２４０Ａ、Ｋ２５１Ｄ、Ｋ２５１Ｅ、Ｋ２５１Ｑ、Ｔ２６１Ｌ、Ｈ２６４Ｒ、Ｉ２６６Ｌ、Ｄ２６７Ｑ、Ｄ２６９Ａ、Ｄ２６９Ｈ、Ｈ２７０Ｄ、Ｔ２１４Ｒ／Ｅ１９５Ｒ、Ｔ２１４Ｒ／Ｄ２６９Ｈ、Ｙ１８９Ａ／Ｑ１９３Ｓ／Ｎ１９９Ｖ／Ｋ２０１Ｒ／Ｙ２１３Ｗ／Ｓ２１５Ｄ、Ｙ２１３Ｗ／Ｓ２１５Ｄ、Ｎ１９９Ｒ／Ｋ２０１Ｈ、Ｎ１９９Ｈ／Ｋ２０１Ｒ、Ｇ１３１Ｒ／Ｎ１９９Ｒ／Ｋ２０１Ｈ、Ｇ１３１Ｒ／Ｎ１９９Ｒ／Ｋ２０１Ｈ／Ｒ１４９Ｉ／Ｓ１５９Ｒ／Ｓ２１５Ｄ、Ｇ１３１Ｒ／Ｒ１４９Ｉ／Ｓ１５９Ｒ／Ｓ２１５Ｄ、Ｇ１３１Ｒ／Ｎ１９９Ｒ／Ｋ２０１Ｈ／Ｒ１４９Ｉ／Ｓ１５９Ｒ／Ｓ２１５Ｄ、Ｇ１３１Ｒ／Ｄ２１８Ｈ、Ｙ１８９Ｑ／Ｒ１９１Ｋ／Ｑ１９３Ｒ／Ｈ２６４Ｒ／Ｉ２６６Ｌ／Ｄ２６７Ｑ、Ｔ２６１Ｌ／Ｇ１６０Ｅ、Ｔ２６１Ｌ／Ｈ２７０Ｄ、Ｔ２６１Ｌ／Ｇ１６０Ｅ／Ｈ２７０ＤおよびＴ２６１Ｌ／Ｇ１６０Ｅ／Ｈ２７０Ｄ／Ｔ２００Ｈ（「／」の使用は複数のアミノ酸置換を示す）からなる群から選択される。

【0037】

特定の実施形態では、ＴＲＡＩＬ改変体のアミノ酸置換は、ＤＲ５に対する親和性が上昇した改変体に基づいて選択される。この種の置換は、Ｄ２６９Ｈ、Ｅ１９５Ｒ、Ｔ２１４Ｒ、Ｄ２６９Ｈ／Ｅ１９５Ｒ、Ｔ２１４Ｒ／Ｅ１９５Ｒ、Ｔ２１４Ｒ／Ｄ２６９Ｈ、Ｎ１９９Ｖ、Ｙ１８９Ａ／Ｑ１９３Ｓ／Ｎ１９９Ｖ／Ｋ２０１Ｒ／Ｙ２１３Ｗ／Ｓ２１５Ｄ、Ｙ２１３Ｗ／Ｓ２１５Ｄ、Ｄ２６９ＡおよびＹ２４０Ａからなる群から選択されてもよい。

【0038】

特定の実施形態では、ＴＲＡＩＬ改変体のアミノ酸置換は、ＤＲ４に対する親和性が上昇した改変体に基づいて選択される。この種の置換は、Ｇ１３１Ｒ、Ｇ１３１Ｋ、Ｒ１４９Ｉ、Ｒ１４９Ｍ、Ｒ１４９Ｎ、Ｒ１４９Ｋ、Ｓ１５９Ｒ、Ｑ１９３Ｈ、Ｗ１９３Ｋ、Ｎ１９９Ｒ、Ｎ１９９Ｒ／Ｋ２０１Ｈ、Ｎ１９９Ｈ／Ｋ２０１Ｒ、Ｇ１３１Ｒ／Ｎ１９９Ｒ／Ｋ２０１Ｈ、Ｇ１３１Ｒ／Ｎ１９９Ｒ／Ｋ２０１Ｈ、Ｇ１３１Ｒ／Ｎ１９９Ｒ／Ｋ２０１Ｈ／Ｒ１４９Ｉ／Ｓ１５９Ｒ／Ｓ２１５Ｄ、Ｇ１３１Ｒ／Ｒ１４９Ｉ／Ｓ１５９Ｒ／Ｓ２１５Ｄ、Ｇ１３１Ｒ／Ｄ２１８Ｈ、Ｋ２０１Ｒ、Ｋ２０１Ｈ、Ｋ２０４Ｅ、Ｋ２０４Ｄ、Ｋ２０４Ｌ、Ｋ２０４Ｙ、Ｋ２１２Ｒ、Ｓ２１５Ｅ、Ｓ２１５Ｈ、Ｓ２１５Ｋ、Ｓ２１５Ｄ、Ｄ２１８Ｈ、Ｋ２５１Ｄ、Ｋ２５１Ｅ、Ｋ２５１ＱおよびＹ１８９Ｑ／Ｒ１９１Ｋ／Ｑ１９３Ｒ／Ｈ２６４Ｒ／Ｉ２６６Ｌ／Ｄ２６７Ｑからなる群から選択されてもよい。

【0039】

特定の実施形態では、ＴＲＡＩＬ改変体のアミノ酸置換は、ＴＲＡＩＬデコイ受容体に対する親和性が低下した改変体に基づいて選択される。この種の置換は、Ｔ２６１Ｌ、Ｈ２７０Ｄ、Ｔ２００Ｈ、Ｔ２６１Ｌ／Ｇ１６０Ｅ、Ｔ２６１Ｌ／Ｈ２７０Ｄ、Ｔ２６１Ｌ／Ｇ１６０Ｅ／Ｈ２７０Ｄ、Ｔ２６１Ｌ／Ｇ１６０Ｅ／Ｈ２７０Ｄ／Ｔ２００Ｈ、Ｄ２０３ＡおよびＤ２１８Ａからなる群から選択されてもよい。

【0040】

ＴＲＡＩＬまたはＴＲＡＩＬ改変体を発現する改変されたＮＫ細胞を使用する癌の治療は、癌細胞上のＴＲＡＩＬ死受容体の発現をアップレギュレートすることができる作用物質を患者に投与することにより、必要に応じて改善される。この作用物質は、改変されたＮＫ細胞の投与の前に、またはそれと組み合わせて、またはその後に投与されてもよい。しかし、作用物質は、改変されたＮＫ細胞を投与する前に投与することが好ましい。作用物質は、癌細胞上のＤＲ５の発現をアップレギュレートする。作用物質は、必要に応じて化学療法薬（例えば、プロテアソーム阻害剤。その１つはボルテゾミブである）であってもよく、癌上のＤＲ５発現をアップレギュレートできる低用量で投与されてもよい。ＤＲ５誘導剤の他の例としては、ゲフィチニブ、ピペルロングミン、ドキソルビシン、コハク酸α－トコフェリルおよびＨＤＡＣ阻害剤が挙げられる。

【0041】

本発明の特定の実施形態では、チェックポイント抑制性受容体の機能が低下するかまたは存在しないようにさらに改変されたＮＫ細胞が提供される。１つ以上のチェックポイント抑制性受容体遺伝子がノックダウン／アウトされたＮＫ細胞が製造されてもよい。好ましくは、これらの受容体は、特定のチェックポイント抑制性受容体である。さらに好ましくは、これらのチェックポイント抑制性受容体は、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ９６（ＴＡＣＴＩＬＥ）、ＣＤ１５２（ＣＴＬＡ４）、ＣＤ２２３（ＬＡＧ－３）、ＣＤ２７９（ＰＤ－１）、ＣＤ３２８（ＳＩＧＬＥＣ７）、ＳＩＧＬＥＣ９および／またはＴＩＭ－３のうちの１つ以上あるいはそれらのすべてである。他の実施形態では、１つ以上の抑制性受容体シグナル伝達経路が、ノックアウトされるかまたは機能の低下を示し、その結果、再び抑制性受容体機能が低下または欠如する、ＮＫ細胞が提供される。例えば、ＳＨＰ－１、ＳＨＰ－２、および／またはＳＨＩＰによって媒介されるシグナル伝達経路が、細胞の遺伝子改変によってノックアウトされる。

【0042】

ＮＫ細胞の活性化に続いてチェックポイント抑制性受容体が発現するため、チェックポイント抑制性受容体の機能は、他の抑制性受容体よりも低下させることが好ましい。ＫＩＲファミリーの大部分であるＮＫＧ２ＡやＬＩＲ－２などの通常のまたは「古典的な」抑制性受容体は、ＭＨＣクラスＩに結合し、そのため、自己標的化の問題の軽減に主に関与する。したがって、好ましくは、チェックポイント抑制性受容体はノックアウトされる。本発明に係るこれらの受容体の機能の低下または欠如は、癌細胞が免疫エフェクター機能を抑制することを防ぐ（さもなければ、受容体が完全に機能的であった場合に起こり得る）。したがって、本発明のこれらの実施形態の重要な利点は、癌細胞によるそれらの細胞傷害性活性の抑制の影響を受けにくいＮＫ細胞にあり、結果として、それらは癌治療に有用である。

【0043】

本明細書で用いる場合、抑制性受容体への言及は、免疫エフェクター細胞（例えばＮＫ細胞）の原形質膜上に発現される受容体を一般に指す。その相補的リガンドに結合すると、細胞内シグナルを生じ、当該免疫エフェクター細胞の細胞傷害性を低下させる原因となる。これらの抑制性受容体は、免疫エフェクター細胞の「休止」状態と「活性化」状態との両方で発現し、多くの場合、細胞および身体の組織に対する細胞傷害性反応を抑制する「自己寛容」メカニズムを免疫系に提供することに関連している。例としては、ＮＫ細胞上で発現し、身体の健康な細胞上で発現するＭＨＣクラスＩを認識する抑制性受容体ファミリー「ＫＩＲ」がある。

【0044】

また、本明細書で用いる場合、チェックポイント抑制性受容体は、通常、上記の抑制性受容体のサブセットと見なされる。しかし、他の抑制性受容体とは異なり、チェックポイント抑制性受容体は、免疫エフェクター細胞（例えばＮＫ細胞）の長期活性化および細胞傷害性の間、より高いレベルで発現する。この現象は、例えば炎症部位での慢性細胞傷害性を抑制するのに有用である。例としては、チェックポイント抑制性受容体ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４、ＣＤ９６が挙げられ、これらはすべてＮＫ細胞上で発現する。

【0045】

本発明では、ＭＨＣクラスＩに結合する抑制性受容体の機能を低下させないことが好ましい。

【0046】

本発明の改変された細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）も発現してもよい。膜結合ＣＡＲは、典型的には、標的配列（一般に抗体由来の一本鎖フラグメント（ｓｃＦｖ））を含み、かつ、通常、ヒンジ（立体障害の問題を克服するための）、スペーサー、膜貫通エレメントおよびシグナル伝達エンドドメインを含む。

【0047】

ＣＡＲは、ＭＵＣ－１、ＣＤ３８、ＣＤ９６、ＣＬＬ－１、ＳＬＡＭＦ７およびＣＤ１９から選択される抗原に結合する標的領域を好ましくは含む。

【0048】

異常にグリコシル化されたＭＵＣ－１に結合することが知られている配列の例を標的配列として使用することができ、当該配列は、５Ｅ５、ＳＭ３およびＨＭＦＧ２を含み、本発明のＣＡＲに適切に組み込まれる。好ましくは、ＣＡＲはＨＭＦＧ２配列を含む。しかし、異常にグリコシル化されたＭＵＣ－１を標的とするためのさらなる配列を、従来技術で公知であるスクリーニング方法により同定してもよく、親和性の高い配列を用いて、ＭＵＣ－１を標的とするＣＡＲ－ＮＫ細胞を製造することができる。

【0049】

ＣＤ３８に結合することが知られる配列の例を標的配列として使用してもよく、当該配列は、ダラツムマブ、イサツキシマブおよび国際公開第２０１８／１０４５６２号に開示されるものを含み、本発明のＣＡＲに適切に組み込まれる。ＣＤ３８ ＣＡＲは、ＣＤ３８に対するダラツムマブの親和性と比較して、ＣＤ３８に対する親和性が低下していること好ましい。好ましくは、この低下した親和性は、ダラツムマブの親和性と比較して、少なくとも１０％、少なくとも２５％、より好ましくは少なくとも４５％低下している。好ましくは、さらに、この低下した親和性は、ダラツムマブの親和性と比較して、９０％以下、７５％以下、より好ましくは５５％以下である。

【0050】

本発明のＮＫ細胞で使用されるＣＡＲは、１つ以上のＮＫ細胞共刺激ドメイン、例えば、ＣＤ２８、ＣＤ１３４／ＯＸ４０、４－１ＢＢ／ＣＤ１３７、ＣＤ３ζ／ＣＤ２４７、ＤＡＰ１２またはＤＡＰ１０を含むか、またはそれに連結されてもよい。したがって、標的細胞上のその抗原へのＣＡＲの結合は、改変されたＮＫ細胞における細胞傷害性シグナルを促進する。

【0051】

本発明に係るＮＫ細胞はまた、分裂不能となるように処理されるかまたは前処理されてもよい。これにより、患者の循環における寿命が例えばＴ細胞と比較してさらに短くなり、上記のリスクがさらに軽減されるとともに、患者の腫瘍を形成する傾向が減少するかまたはなくなる。

【0052】

本発明のＮＫ細胞は、治療、特に患者の癌の治療に使用するためのものである。癌は、適切には、ＣＤ３８を発現する癌である。好ましくは、癌は、骨髄腫、白血病または固形癌である。

【0053】

ＮＫ細胞耐性癌は、概して、当技術分野で周知である（Pardoll, D.M. Immunity (2015) 42: 605-606）。ＮＫ細胞を介した殺傷に対する癌細胞の感受性は、いくつかの要因によって決定される。癌細胞のリガンドと相互作用するＮＫ細胞の膜受容体を介して大部分が送達される正と負のシグナルのバランスが存在する。多くの場合、ＮＫ細胞による殺傷に対して癌が感受性であるか抵抗性であるかを決定するのは、これらの受容体に対するリガンドの発現のバランスである（Yokoyama、W.M. Immunol Res (2005) 32: 317-325）。

【0054】

ＮＫ媒介性細胞傷害性に対する癌感受性は、一般には次のカテゴリーのうち１つに分類されると考えられている。すなわち、高耐性、耐性、感受性、および高感受性である。実験室においては、細胞傷害性アッセイによって、ＮＫ細胞媒介性細胞傷害性に対する感受性について癌細胞がスクリーニングされ得る。次いで、各カテゴリーは、特定のエフェクター：ターゲット（Ｅ：Ｔ）比で、特定の時間、ＮＫ細胞への曝露中に殺滅された癌細胞の割合に対応するものとして理解される。

【0055】

本発明の例では、最大５：１のＥ：Ｔ比で最大１５時間ＮＫ細胞とインキュベートした後に癌細胞の≦２５％が死滅すれば、癌はＮＫ細胞媒介殺傷に対して高耐性であるとされる。好ましくは、ＮＫ細胞はＫＨＹＧ－１細胞である。

【0056】

本発明の例では、最大５：１のＥ：Ｔ比で最大１５時間ＮＫ細胞とインキュベートした後に癌細胞の≦５０％が死滅すれば、癌はＮＫ細胞媒介性殺傷に対して耐性であるとされる。好ましくは、ＮＫ細胞はＫＨＹＧ－１細胞である。

【0057】

本発明の例では、最大５：１のＥ：Ｔ比で最大１５時間ＮＫ細胞とインキュベートした後に癌細胞の＞５０％が死滅すれば、癌はＮＫ細胞媒介性殺傷に対して感受性であるとされる。好ましくは、ＮＫ細胞はＫＨＹＧ－１細胞である。

【0058】

本発明の例では、最大５：１のＥ：Ｔ比で最大１５時間ＮＫ細胞とインキュベートした後に癌細胞の≧７５％が死滅すれば、癌はＮＫ細胞媒介性殺傷に対して高感受性であるとされる。好ましくは、ＮＫ細胞はＫＨＹＧ－１細胞である。

【0059】

遺伝子改変されたＮＫ細胞の調製では、改変は、細胞がＮＫ細胞に分化する前に行われてもよい。例えば、多能性幹細胞（例えばｉＰＳＣ）を遺伝子改変した後、分化させて、細胞傷害性が上昇した遺伝子改変されたＮＫ細胞を製造してもよい。

【0060】

本発明の任意の特徴は、上記のＮＫ細胞およびＮＫ細胞株にさらなる改変を提供することを含み、例えば、Ｆｃ受容体（サブタイプおよび誘導体を含む、ＣＤ１６、ＣＤ３２またはＣＤ６４であり得る）は、細胞の表面で発現される。使用時、これらの細胞は、抗体で被覆された癌細胞の認識の増加と細胞傷害性応答の活性化の改善とを示し得る。

【0061】

本発明のさらなる任意の特徴は、身体の特定の標的領域によりよくホーミングするように、改変されたＮＫ細胞およびＮＫ細胞株を適合させることを含む。本発明のＮＫ細胞は、特定の癌細胞位置に対して標的されてもよい。血液癌の治療のための好ましい実施形態では、本発明のＮＫエフェクターは、骨髄にホーミングするように適合されている。特定のＮＫ細胞は、フコシル化および／またはシアル化によって骨髄にホーミングするように改変される。これは、適切なフコシルトランスフェラーゼおよび／またはシアリルトランスフェラーゼをそれぞれ発現するようにＮＫ細胞を遺伝改変することによって行われてもよい。腫瘍部位へのＮＫエフェクター細胞のホーミングの増加は、腫瘍血管系の破壊、例えばメトロノーム化学療法によるか、または血管新生を標的とする薬物（Ｍｅｌｅｒｏら、２０１４年）を使用して、癌血管を介してＮＫ細胞浸潤を正常化することによっても可能とされ得る。

【0062】

本発明は、上述のようなＮＫ細胞を含む組成物をさらに提供する。

【0063】

本発明は、
ａ）ＣＩＳＨ遺伝子の発現をノックアウトする工程と、
ｂ）ＣＤ３８遺伝子の発現をノックアウトする工程と、必要に応じて、
ｃ）ＩＬ－１５遺伝子の発現をノックインする工程とを好ましくは含む、上述のようなＮＫ細胞を作製する方法をさらに提供する。

【0064】

好ましくは、ＣＩＳＨ遺伝子およびＣＤ３８遺伝子は、同時にノックアウトされる。

【0065】

本明細書において上記および以下に記載される改変されたＮＫ細胞、ＮＫ細胞株およびそれらの組成物は、癌、特にヒトの癌の治療（例えば、血液細胞の癌または固形癌の治療）に適している。ＮＫ細胞およびその誘導体は、好ましくはヒトＮＫ細胞である。ヒトの治療には、ヒトＮＫ細胞を使用することが好ましい。本発明はまた、有効量のＮＫ細胞またはそれを含む組成物を投与することを含む、ヒトの癌を治療する方法を提供する。

【0066】

必要とする患者に活性剤およびそれらの組み合わせを送達するための様々な投与経路が当業者に知られている。改変されたＮＫ細胞の投与は、例えば腹腔内経路を介するなど、全身的または局所的であり得る。他の実施形態では、活性剤はより直接的に投与される。したがって、投与は腫瘍内に直接行うことができ、特に固形腫瘍に適している。

【0067】

ＮＫ細胞は、一般に、本発明の方法、使用および組成物に適していると考えられている。本明細書の特定の例で使用される細胞のように、ＮＫ細胞は、癌細胞株から得られたＮＫ細胞であり得る。有利には、ＮＫ細胞（好ましくは、（例えばそれを死滅させかつ／または分裂不能にすることにより）その腫瘍形成性を低下させるように処理された）が血液癌細胞株から得られ、血液癌を治療するために本発明の方法で使用することができる。

【0068】

癌由来のＮＫ細胞を治療的使用に対してより許容できるものとするために、当該細胞は、一般に、患者に腫瘍を形成する傾向を低減するかまたは無くすように、何らかの方法で処理または前処理される。実施例で使用される特定の改変されたＮＫ細胞株は、分裂不能にされているため安全である。すなわち、当該細胞株は、照射されており、その殺傷能力を保持するが、約３～４日以内に死亡する。したがって、特定の細胞および細胞株は、例えば照射の結果として、増殖することができない。本明細書の方法で使用する潜在的なＮＫ細胞の処理としては、それらがインビボで分裂して腫瘍を形成するのを防ぐための照射、および腫瘍形成性を低下させるための遺伝子改変（例えば、インビボで細胞が分裂して腫瘍を形成するのを防ぐように活性化され得る、自殺遺伝子をコードする配列を挿入することによる）が挙げられる。自殺遺伝子は、次にその遺伝子を発現している細胞で細胞死を引き起こす外因性（例えば循環性）作用物質によってオンとされ得る。さらなる選択肢は、治療の特定のＮＫ細胞を標的とするモノクローナル抗体の使用である。例えば、ＣＤ５２は、ＫＨＹＧ－１細胞上で発現し、このマーカーへのモノクローナル抗体の結合は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）およびＫＨＹＧ－１細胞死を引き起こす。

【0069】

Ｓｕｃｋら、２００６により公開された文献で説明されているように、癌由来のＮＫ細胞および細胞株は、Ｇａｍｍａｃｅｌｌ ３０００ Ｅｌａｎなどの照射装置を使用して容易に照射できる。セシウム１３７の線源を用いて放射線の線量が制御され、例えば１Ｇｙ～５０Ｇｙの線量応答曲線を用いて、上昇した細胞傷害性の利益を維持しつつ細胞の増殖能を排除するための最適線量を決定することができる。これは、放射線の各線量が投与された後に細胞傷害性について細胞をアッセイすることによって実現される。

【0070】

照射されたＮＫ細胞株を養子細胞免疫療法に使用することには、十分に確立された自系またはＭＨＣ適合性のＴ細胞アプローチを上回る大きな利点がある。第一に、増殖性の高いＮＫ細胞株を使用することで、改変されたＮＫ細胞株の増殖がより容易に、かつ商業レベルで達成できるようになる。次に、細胞を患者に投与する前に、改変されたＮＫ細胞株の照射を行うことができる。これらの照射された細胞は、それらの有用な細胞傷害性を保持するものであるが、寿命が限られており、よって、改変されたＴ細胞とは異なり、長期間にわたって循環して永続的な副作用を引き起こすことはない。

【0071】

さらに、同種の改変されたＮＫ細胞およびＮＫ細胞株を使用することで、患者のＭＨＣクラスＩ発現細胞は、自己ＮＫ細胞傷害性応答に対して可能であるのと同じようにはＮＫ細胞傷害性応答を抑制することができなくなる。癌細胞殺傷に同種のＮＫ細胞および細胞株を使用することは、前述のＧＶＬ効果の恩恵を受ける。そして、Ｔ細胞とは異なり、同種のＮＫ細胞および細胞株はＧＶＨＤの発症を刺激しないため、養子細胞免疫療法による癌の治療の好ましい選択肢ともなる。

【実施例】

【0072】

さまざまな癌細胞に対してより高い細胞傷害活性を示すように改変されたＮＫ細胞の製造に関連して、本発明をより詳細かつ具体的に説明する。

【0073】

抑制性受容体機能のノックアウト／ノックダウンおよびＴＲＡＩＬ／変異体ＴＲＡＩＬのノックインの関連例については、国際公開第２０１７／０１７１８４号（同文献の内容は参照により本明細書に援用される）を参照する。

【0074】

ＣＤ３８ ＣＡＲ発現の関連例については、国際公開第２０１８／１０４５６２号（同文献の内容は参照により本明細書に援用される）を参照する。

【0075】

ＭＵＣ－１ ＣＡＲ発現の関連例については、国際公開第２０１９／１０１９９８号（同文献の内容は参照により本明細書に援用される）を参照する。

【0076】

以下、添付図面を参照し、本発明を具体的な実施形態で説明する。

【0077】

実施例１－ＮＫ細胞におけるＣＩＳＨ／ＣＤ３８のダブルノックアウトのための設計プロトコル
ＣＩＳおよびＣＤ３８の機能を除去したＮＫ細胞を以下のように調製する。ｇＲＮＡ構築物を、ＮＫ細胞中のＣＩＳ（ＣＩＳＨ）およびＣＤ３８をコードする内因性遺伝子を標的とするように設計および調製する。次いで、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ゲノム編集を使用して、標的遺伝子をノックアウトする。

【0078】

ＣＩＳＨ遺伝子およびＣＤ３８遺伝子の両方について合計３つのｇＲＮＡ候補を選択し、一次増殖ＮＫ細胞におけるそれらの切断効率を求める。ＭａｘＣｙｔｅ（登録商標）ＧＴを用いて、細胞にｇＲＮＡ：Ｃａｓ９リボ核蛋白質（ＲＮＰ）複合体をエレクトロポレーションし、次いで、フローサイトメトリーによってＣＩＳＨおよびＣＤ３８のノックアウトを分析する。インビトロミスマッチ検出アッセイを用いて、ｇＲＮＡの切断活性も求める。Ｔ７Ｅ１エンドヌクレアーゼは、不完全にマッチしたＤＮＡを認識して切断し、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９トランスフェクションおよび非相同末端結合（ＮＨＥＪ）の後に、親のＣＩＳＨ遺伝子／ＣＤ３８遺伝子を変異遺伝子と比較することを可能にする。

【0079】

一次ＮＫ細胞、ＮＫ細胞株またはＣＤ３４＋前駆細胞（例えば、後続のＮＫ細胞への分化およびＮＫ細胞の増殖のためのｉＰＳＣ）においてＣＩＳＨ／ＣＤ３８をノックアウトするためのさらなる実験のために、ノックアウト効率が最も高いｇＲＮＡを選択する。ＣＩＳＨ／ＣＤ３８のノックアウトは、フローサイトメトリーによるアッセイによって決定する。

【0080】

実施例２－ＮＫ細胞におけるＣＩＳＨおよびＣＤ３８のノックアウト
（材料）
１．臍帯血由来濃縮ＮＫ細胞。
２．ＮＫ－ＭＡＣＳ培地、プレミアムグレードＩＬ－１５、抗ＣＤ３８－ＰＥ、抗ＣＤ３ ＶｉｏＢｌｕｅ、抗ＣＤ５６ＶＢ５１５、Ｉｎｓｉｄｅ Ｓｔａｉｎ Ｋｉｔ、ＭＡＣＳｑｕａｎｔ １６（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）。
３．ヒト血清アルブミン（シグマ）。
４．ＣＩＳＨ、ＣＤ３８およびＣａｓ９組換えタンパク質用の遺伝子ノックアウトキットＶ２（Ｓｙｎｔｈｅｇｏ）。
５．Ｃｌｏｕｄｚ（商標）細胞活性化キット（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）。
６．抗ＣＩＳＨ抗体（Ｄ４Ｄ９）（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）。
７．エレクトロポレーション緩衝液（ＥＢ緩衝液）、ＯＣ－１００Ｘ２処理アセンブリ（ＰＡ）、ＭａｘＣｙｔｅ ＡＴｘエレクトロポレーションシステム（Ｍａｘｃｙｔｅ）。
８．ソル・コーテフ（ヒドロコルチゾン）（Ｐｆｉｚｅｒ）。
９．フィコール（Ｃｙｔｉｖａ）。

【0081】

（プロトコル）
臍帯血単核細胞（ＣＢＭＣ）をフィコール法によって単離し、１０％ヒト血清アルブミン、ＣＤ２／ＮＫｐ４６ミクロスフェア（Ｃｌｏｕｄｚ（商標））、抗ＣＤ３、抗ＣＤ１６、ＩＬ－１５およびヒドロコルチゾンを含むＮＫ－ＭＡＣＳ培地中で１５日間濃縮した。

【0082】

抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ５６抗体で染色することによるＦＡＣＳ（ＭＡＣＳｑｕａｎｔ １６）分析によって、ＮＫ細胞の９０％を超える濃縮が確認された。ＣＢＮＫ細胞を、Ｍａｘｃｙｔｅエレクトロポレーション緩衝液（ＥＢ緩衝液）を用いて、３００×ｇで１０分間、２回洗浄し、７５μｌのＥＢ緩衝液中で５百万個の細胞を取り出した。

【0083】

マルチガイドＲＮＡ（ＣＩＳＨ、ＣＤ３８用ｓｇＲＮＡ）の凍結乾燥混合物を、ヌクレアーゼを含まないＴＥ緩衝液中に溶解させて２００μＭのストックを得た。１２００ｐｍｏｌのｓｇＲＮＡを１６０ｐｍｏｌのＣａｓ９と７．５：１の比率で混合した。ＥＢ緩衝液を用いて容積を２５μｌに調整し、室温にて１０分間インキュベートし、ＲＮＰ複合体を形成した。

【0084】

２５μｌのＲＮＰ複合体を７５μｌのＣＢＮＫ細胞と混合し、ＯＣ－１００Ｘ２処理アセンブリに移した。ＮＫ５プロトコルを使用して細胞をエレクトロポレーションし、室温にて１５分間静置した。

【0085】

以下の４つの異なる条件を試験した。ａ）ＣＤ３８ ＲＮＰのみ、ｂ）ＣＩＳＨ ＲＮＰのみ、ｃ）ＣＤ３８ ＲＮＰ＋ＣＩＳＨ ＲＮＰ、およびｄ）対照としてＲＮＰ無し。

【0086】

エレクトロポレーションした細胞を、１０％のＡＢおよび２０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１５を含むＮＫ－ＭＡＣＳ培地に入れてＧｒｅｘ６ウェルプレートに移し、３７℃にて５％ＣＯ_２インキュベータ中で１３日間インキュベートした。次いで、ＣＤ３８ノックアウトおよびＣＩＳＨノックアウトについて３日～４日おきに細胞を分析した。抗ＣＤ３８による染色を用いてＣＤ３８の表面発現を分析し、Ｉｎｓｉｄｅ Ｓｔａｉｎ Ｋｉｔおよび抗ＣＩＳＨ抗体を用いてＣＩＳＨの細胞内発現を分析した。

【0087】

ＮＫ細胞におけるＣＤ３８およびＣＩＳＨの両方の発現のノックアウトが成功したことが観察された。

【0088】

ＮＫ細胞は、（１）未改変の対照ＮＫ細胞、（２）ＣＩＳＨノックアウトのみを有するＮＫ細胞、および（３）ＣＤ３８ノックアウトのみを有するＮＫ細胞と比較して、優れた持続性および優れた代謝プロファイルを示した。これらの知見は、ＣＩＳＨ／ＣＤ３８ダブルノックアウトＮＫ細胞が多くのシナリオ、特に癌治療において有利であることを示している。

【0089】

さらに、図１から理解されるように、ＣＩＳＨ／ＣＤ３８ノックアウトを成功させるためのトランスフェクション効率は、これらの遺伝子ノックアウトをＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を介して多重化することによって高められる。

【0090】

ＣＤ３８／ＣＩＳＨ多重ノックアウトを用いたトランスフェクションからたった１日で、ＣＩＳＨ＋ＮＫ細胞の数は、ＣＩＳＨノックアウトのみを受けた対照ＮＫ細胞におけるものと比較して、およそ５０％よりも大きく低減した。この差は、８日目までにおよそ３０％低減し、その後、１３日目までにおよそ１５％再び低減した。

【0091】

ＣＤ３８発現の場合、ＣＤ３８／ＣＩＳＨ多重ノックアウトを用いたトランスフェクションからたった８日で、ＣＤ３８＋ＮＫ細胞の数は、ＣＤ３８ノックアウトのみを受けた対照ＮＫ細胞におけるものと比較して、およそ１５％よりも大きく低減した。この差もまた、１３日目までにおよそ同じとなることが分かった。

【0092】

実施例３－ＣＩＳＨ／ＣＤ３８ダブルノックアウトＮＫ細胞の代謝プロファイルの改善
実施例２の材料およびプロトコルに従い、ＣＩＳＨ／ＣＤ３８ダブルノックアウトを有するＮＫ細胞を調製した。

【0093】

図２から分かるように、ＣＩＳＨ／ＣＤ３８ノックアウトを有するＮＫ細胞は、（１）未改変の対照ＮＫ細胞、（２）ＣＩＳＨノックアウトのみを有するＮＫ細胞、および（３）ＣＤ３８ノックアウトのみを有するＮＫ細胞と比較して、向上したＡＴＰ産生速度を示した。

【0094】

図３を参照すると、（１）未改変の対照ＮＫ細胞、（２）ＣＩＳＨノックアウトのみを有するＮＫ細胞、（３）ＣＤ３８ノックアウトのみを有するＮＫ細胞、および（４）ＣＩＳＨ／ＣＤ３８ノックアウトを有するＮＫ細胞のそれぞれの細胞外酸性化速度（ＥＣＡＲ）および酸素消費速度（ＯＣＲ）が測定されている。図３は、ＣＩＳＨ／ＣＤ３８ダブルノックアウトを有するＮＫ細胞は、好気性（ミトコンドリア）呼吸活性（その尺度はＯＣＲである）および解糖系呼吸活性（その尺度はＥＣＡＲである）がいずれもより高いため、（１）未改変の対照ＮＫ細胞、（２）ＣＩＳＨノックアウトのみを有するＮＫ細胞、および（３）ＣＤ３８ノックアウトのみを有するＮＫ細胞よりもエネルギーの高い代謝プロファイルを示すことを示している。

【0095】

実施例４－ＣＩＳＨ／ＣＤ３８ダブルノックアウトＮＫ細胞の細胞傷害性の改善
実施例２の材料およびプロトコルに従い、ＣＩＳＨ／ＣＤ３８ダブルノックアウトを有するＮＫ細胞を調製した。

【0096】

図４ａおよび図４ｂから分かるように、ＣＩＳＨ／ＣＤ３８ノックアウトを有するＮＫ細胞は、Ｉｎｃｕｙｔｅ（登録商標）による細胞傷害性アッセイ（図４ａ）およびフローサイトメトリーによる細胞傷害性アッセイ（図４ｂ）において細胞障害特性を示した。多発性骨髄腫標的細胞に対するＮＫ細胞のみの細胞傷害性、またはダラツムマブモノクローナル抗体もしくはエロツズマブモノクローナル抗体を追加した場合の細胞傷害性を、示された３：１のエフェクター：ターゲット（Ｅ：Ｔ）比で、異なるＮＫ細胞を用いて分析した。試験は、（１）未改変の対照ＮＫ細胞、（２）ＣＤ３８ノックアウトのみを有するＮＫ細胞、（３）ＣＩＳＨノックアウトのみを有するＮＫ細胞、（４）ＣＤ３８／ＣＩＳＨノックアウトを有するＮＫ細胞、および（５）ＮＫ細胞の非存在下（標的細胞、対照）を使用して行った。ＣＤ３８／ＣＩＳＨノックアウトを有するＮＫ細胞は、顕著な細胞障害性を示した。

【0097】

したがって、本発明は、細胞障害性が上昇したＮＫ細胞およびＮＫ細胞株、ならびに癌治療におけるこれらの細胞の使用を提供するものである。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4a】

【図4b】

【国際調査報告】