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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-06-21
(54)【発明の名称】改良されたＴ細胞受容体配列決定の方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/12 20060101AFI20240614BHJP
C12Q 1/6869 20180101ALI20240614BHJP
C12Q 1/6844 20180101ALN20240614BHJP
C12N 9/10 20060101ALN20240614BHJP
C12Q 1/6876 20180101ALN20240614BHJP
【ＦＩ】
C12N15/12 ZNA
C12Q1/6869 Z
C12Q1/6844 Z
C12N9/10
C12Q1/6876 Z
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023577594
(86)(22)【出願日】2022-06-17
(85)【翻訳文提出日】2024-02-08
(86)【国際出願番号】 US2022034005
(87)【国際公開番号】W WO2022266450
(87)【国際公開日】2022-12-22
(31)【優先権主張番号】63/212,286
(32)【優先日】2021-06-18
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】520032608
【氏名又は名称】パクト ファーマ インコーポレイテッド
【氏名又は名称原語表記】ＰＡＣＴ ＰＨＡＲＭＡ， ＩＮＣ．
(74)【代理人】
【識別番号】110002077
【氏名又は名称】園田・小林弁理士法人
(72)【発明者】
【氏名】ユエン， ベンジャミン ティー． ケー．
(72)【発明者】
【氏名】ナヤック， サパリャ
(72)【発明者】
【氏名】ポン， ソンミン
(72)【発明者】
【氏名】アン， ドゥ
(72)【発明者】
【氏名】マンデル－キャッシュマン， ステファニー
【テーマコード（参考）】
4B063
【Ｆターム（参考）】
4B063QA01
4B063QA13
4B063QA18
4B063QQ20
4B063QQ42
4B063QQ52
4B063QR08
4B063QR32
4B063QR35
4B063QR62
4B063QS24
(57)【要約】
本開示は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を配列決定および識別するための方法に関する。当該方法は、鋳型スイッチングオリゴヌクレオチド（ＴＳＯ）の使用を含み、ならびに、標準方法と比較して収量の向上および複雑さの低減をもたらす。
【選択図】図１Ａ
【選択図】図１Ａ
【特許請求の範囲】
【請求項1】
完全長Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）配列を含むデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を調製する方法であって、ａ）逆転写酵素がｃＤＮＡ配列を生成するのに十分な条件下において、リボ核酸（ＲＮＡ）分子を、ＴＣＲコード配列の３’にあるＲＮＡ分子の領域に対して相補的なｃＤＮＡ合成プライマー、鋳型スイッチングオリゴヌクレオチド（ＴＳＯ）、および逆転写酵素と組み合わせることによってＴＣＲ相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）配列を得ること；および
ｂ）ポリメラーゼが完全長ＴＣＲ配列を含むＤＮＡを生成するのに十分な条件下において、ｃＤＮＡを、ＴＳＯ配列へアニールする外側プライマーおよびＴＣＲ定常配列へアニールするプライマーを含む増幅プライマーの第１のセットならびにポリメラーゼと組み合わせることによって完全長ＴＣＲ配列を含むＤＮＡを調製すること、
を含む方法。
【請求項2】
さらに、完全長ＴＣＲ配列を含むＤＮＡを配列決定することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
ＲＮＡ分子が、Ｔ細胞を含む試料から抽出される、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
試料が、対象から収集される、請求項３に記載の方法。
【請求項5】
ｃＤＮＡ合成プライマーが、オリゴ－ｄＴプライマーである、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
オリゴ－ｄＴプライマーが、配列番号１または２に記載される配列を有するポリヌクレオチドを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項7】
ＴＳＯが、増幅プライマー部位、バーコード、およびユニーク分子識別子（ＵＭＩ）を含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
ＴＳＯが、配列番号３～５のいずれか１つに記載される配列を有するポリヌクレオチドを含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
逆転写酵素が、鋳型スイッチング逆転写酵素である、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項10】
外側プライマーが、配列番号６に記載される配列を有するポリヌクレオチドを含む、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項11】
内側プライマーが、配列番号１１に記載される配列を有するポリヌクレオチドを含む、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項12】
ＴＣＲ定常配列へアニールするプライマーが、配列番号７、８、１２、および１３に記載される配列を有するポリヌクレオチドを含む、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項13】
完全長ＴＣＲ配列を含むＤＮＡが、増幅プライマーの第２のセットを使用してさらに増幅され、プライマーの一方または両方が、バーコード配列を含む、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項14】
完全長ＴＣＲ受容体が、ＴＣＲα鎖および／またはＴＣＲβ鎖を含む、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項15】
完全長ＴＣＲ受容体が、ＴＣＲガンマ鎖および／またはＴＣＲデルタ鎖を含む、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項16】
ｂ）が、約２０秒から約９０秒の拡張フェーズを含む、請求項１から１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項17】
増幅プライマーが、約０．１μＭから約０．６μＭの濃度においてフォワードプライマーを含む、請求項１から１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項18】
請求項１から１７のいずれか一項に記載の方法によって作製されたｃＤＮＡライブラリー。
【請求項19】
完全長ＴＣＲ配列の核酸配列を決定するために単一Ｔ細胞を解析する方法であって、ａ）複数のＴ細胞を含む試料からの単一Ｔ細胞を選別すること；
ｂ）
ｉ．逆転写酵素がｃＤＮＡ配列を生成するのに十分な条件下において、リボ核酸（ＲＮＡ）分子を、ＴＣＲコード配列の３’にあるＲＮＡ分子の領域に対して相補的なｃＤＮＡ合成プライマー、鋳型スイッチングオリゴヌクレオチド（ＴＳＯ）、および逆転写酵素と組み合わせることによってＴＣＲ相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）配列を得ることと；
ｉｉ．ポリメラーゼが完全長ＴＣＲ配列を含むＤＮＡを生成するのに十分な条件下において、ｃＤＮＡを、ＴＳＯ配列へアニールする外側プライマーおよびＴＣＲ定常配列へアニールするプライマーを含む増幅プライマーの第１のセットならびにポリメラーゼと組み合わせることによって完全長ＴＣＲ配列を含むＤＮＡを調製することと
を含む、完全長ＴＣＲ配列を含むＤＮＡを調製すること；ならびに
ｃ）完全長ＴＣＲ配列を含むＤＮＡを配列決定すること
を含む、方法。
【請求項20】
試料が、対象から収集される、請求項１９に記載の方法。
【請求項21】
ｃＤＮＡ合成プライマーが、オリゴ－ｄＴプライマーである、請求項１９または２０に記載の方法。
【請求項22】
オリゴ－ｄＴプライマーが、配列番号１または２に記載される配列を有するポリヌクレオチドを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項23】
ＴＳＯが、増幅プライマー部位、識別タグ、およびユニーク分子識別子（ＵＭＩ）を含む、請求項１９から２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項24】
ＴＳＯが、配列番号３～５のいずれか１つに記載される配列を有するポリヌクレオチドを含む、請求項１９から２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項25】
逆転写酵素が、鋳型スイッチング逆転写酵素である、請求項１９から２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項26】
外側プライマーが、配列番号６のいずれか１つに記載される配列を有するポリヌクレオチドを含む、請求項１９から２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項27】
内側プライマーが、配列番号１１に記載される配列を有するポリヌクレオチドを含む、請求項１９から２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項28】
ＴＣＲ定常配列へアニールするプライマーが、配列番号７、８、１２、および１３のいずれか１つに記載される配列を有するポリヌクレオチドを含む、請求項１９から２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項29】
増幅プライマーが、バーコード配列を含む、請求項１９から２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項30】
完全長ＴＣＲ受容体が、ＴＣＲα鎖および／またはＴＣＲβ鎖を含む、請求項１９から２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項31】
完全長ＴＣＲ受容体が、ＴＣＲγ鎖および／またはＴＣＲδ鎖を含む、請求項１９から２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項32】
ｂ）が、約２０秒から約９０秒の拡張フェーズを含む、請求項１９から３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項33】
増幅プライマーが、約０．１μＭから約０．６μＭの濃度でフォワードプライマーを含む、請求項１９から３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項34】
単一Ｔ細胞の全トランスクリプトームを解析することをさらに含む、請求項１９から３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項35】
単一Ｔ細胞の体細胞変異または遺伝的多型を解析することをさらに含む、請求項１９から３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項36】
選別することが、試料を複数のペプチド／ＭＨＣ複合体と接触させることを含み、各ペプチド／ＭＨＣ複合体は、関連バーコードを含む、請求項１９から３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項37】
各ペプチド／ＭＨＣ複合体に関連するバーコードを配列決定することをさらに含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項38】
第１のペプチド／ＭＨＣ複合体に関連する第１のバーコードと第２のペプチド／ＭＨＣ複合体に関連する第２のバーコードとの比を決定することをさらに含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項39】
さらに、第１のバーコードと第２のバーコードの比に基づいてＴ細胞の抗原特異性を決定することを含む、請求項３８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本願は、２０２１年６月１８日に出願された米国仮出願第６３／２１２，２８６号に対する優先権を主張するものであり、なお、当該仮出願の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
本願は、２０２１年６月１８日に出願された米国仮出願第６３／２１２，２８６号に対する優先権を主張するものであり、なお、当該仮出願の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
【0002】
配列表
本願は、ＡＳＣＩＩフォーマットにおいて電子的に提出された配列表を含んでおり、なお、当該配列表は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。２０２２年６月１７日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは、０８７５２０＿０２５４＿ＳＬ．ｔｘｔと命名され、サイズは１３，６５７バイトである。
本願は、ＡＳＣＩＩフォーマットにおいて電子的に提出された配列表を含んでおり、なお、当該配列表は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。２０２２年６月１７日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは、０８７５２０＿０２５４＿ＳＬ．ｔｘｔと命名され、サイズは１３，６５７バイトである。
【0003】
本開示は、完全長Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）配列を含む相補的デオキシリボ核酸（ｃＤＮＡ）分子を調製するため、およびそれらのＴＣＲの核酸配列を特定するための方法を提供する。
【背景技術】
【0004】
完全長ＴＣＲ配列を正確に識別することは、様々な用途、例えば、これらに限定されるわけではないが、パーソナライズされた医療および養子細胞療法の開発など、にとって重要な工程であり、この場合、ＴＣＲの多様性の減少は、結果として、治療有効分子の識別の失敗を生じ得る。ＴＣＲをクローニングする従来の方法は、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）と、その後の、ＴＣＲα鎖のＶＪセグメントおよびＴＣＲβ鎖のＶＤＪセグメントを増幅するネステッドＰＣＲ反応の第１および第２のラウンドとの組み合わせに基づいている。これらのセグメントをインシリコにおいて解析することにより、完全長ＴＣＲ配列の再構築を可能にすることができる。しかしながら、この方式で再構築されたＴＣＲ配列のかなりの割合が、不明瞭な結果を示している。この不明瞭さは、例えば、増幅工程の際にＴＣＲ配列差異をマスクするネステッドプライマーの使用に関係づけることができる。したがって、正確な完全長ＴＣＲ配列を提供することができる、比較的安価でハイスループットの配列決定技術の開発が依然として必要とされている。
【発明の概要】
【0005】
本開示は、完全長ＴＣＲ配列を含むｃＤＮＡを調製するため、およびそれらのＴＣＲの核酸配列を特定するための方法を提供する。ある特定の非限定的な実施形態において、本開示は、完全長Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）配列を含むデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を調製するする方法を提供する。ある特定の実施形態において、当該方法は、逆転写酵素がｃＤＮＡ配列を生成するのに十分な条件下において、リボ核酸（ＲＮＡ）分子と、ＴＣＲコード配列の３’にあるＲＮＡ分子の領域に対して相補的なｃＤＮＡ合成プライマー、鋳型スイッチングオリゴヌクレオチド（ＴＳＯ）、および逆転写酵素とを組み合わせることによってＴＣＲ相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）配列を得ること；ならびに、ポリメラーゼが完全長ＴＣＲ配列を含むＤＮＡを生成するのに十分な条件下において、ｃＤＮＡと、ＴＳＯ配列にアニールする外側プライマーおよびＴＣＲ定常配列にアニールするプライマーを含む増幅プライマーの第１のセットならびにポリメラーゼとを組み合わせることによって完全長ＴＣＲ配列を含むＤＮＡを調製すること、を含む。ある特定の実施形態において、当該方法は、さらに、完全長ＴＣＲ配列を含むＤＮＡを配列決定することを含む。
【0006】
ある特定の実施形態において、ＲＮＡ分子は、Ｔ細胞を含む試料から抽出される。ある特定の実施形態において、試料は、対象から採取される。ある特定の実施形態において、ｃＤＮＡ合成プライマーは、オリゴ－ｄＴプライマーである。ある特定の実施形態において、オリゴ－ｄＴプライマーは、配列番号１または２に記載される配列を有するポリヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態において、ＴＳＯは、増幅プライマー部位、バーコード、およびユニーク分子識別子（ＵＭＩ）を含む。ある特定の実施形態において、ＴＳＯは、配列番号３～５のいずれか１つに記載される配列を有するポリヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態において、逆転写酵素は、鋳型スイッチング逆転写酵素である。
【0007】
ある特定の実施形態において、外側プライマーは、配列番号６に記載される配列を有するポリヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態において、内側プライマーは、配列番号１１に記載される配列を有するポリヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態において、ＴＣＲ定常配列にアニールするプライマーは、配列番号７、８、１２、および１３に記載される配列を有するポリヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態において、完全長ＴＣＲ配列を含むＤＮＡは、増幅プライマーの第２のセットを使用してさらに増幅され、この場合、プライマーの一方または両方は、バーコード配列を含む。ある特定の実施形態において、完全長ＴＣＲ受容体は、ＴＣＲα鎖および／またはＴＣＲβ鎖を含む。ある特定の実施形態において、完全長ＴＣＲ受容体は、ＴＣＲγ鎖および／またはＴＣＲδ鎖を含む。
【0008】
ある特定の実施形態において、当該方法は、約２０秒から約９０秒の拡張フェーズを含む。ある特定の実施形態において、増幅プライマーは、約０．１μＭから約０．６μＭの濃度においてフォワードプライマーを含む。
【0009】
ある特定の非限定的な実施形態において、本開示は、本明細書において開示される方法によって生成されたｃＤＮＡライブラリーも提供する。
【0010】
ある特定の非限定的な実施形態において、本開示は、さらに、完全長ＴＣＲ配列の核酸配列を決定するために単一Ｔ細胞を解析する方法を提供する。ある特定の実施形態において、当該方法は、複数のＴ細胞を含む試料からの単一Ｔ細胞を選別すること；逆転写酵素がｃＤＮＡ配列を生成するのに十分な条件下において、リボ核酸（ＲＮＡ）分子と、ＴＣＲコード配列の３’にあるＲＮＡ分子の領域に対して相補的なｃＤＮＡ合成プライマー、鋳型スイッチングオリゴヌクレオチド（ＴＳＯ）、および逆転写酵素を組み合わせることによってＴＣＲ相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）配列を得ることを含む、完全長ＴＣＲ配列を含むＤＮＡを調製すること；ならびにポリメラーゼが完全長ＴＣＲ配列を含むＤＮＡを生成するのに十分な条件下において、ｃＤＮＡと、ＴＳＯ配列へアニールする外側プライマーおよびＴＣＲ定常配列へアニールするプライマーを含む増幅プライマーの第１のセットならびにポリメラーゼとを組み合わせることによって完全長ＴＣＲ配列を含むＤＮＡを調製すること；ならびに、完全長ＴＣＲ配列を含むＤＮＡを配列決定すること、を含む。ある特定の実施形態において、試料は、対象から採取される。
【0011】
ある特定の実施形態において、ｃＤＮＡ合成プライマーは、オリゴ－ｄＴプライマーである。ある特定の実施形態において、オリゴ－ｄＴプライマーは、配列番号１または２に記載される配列を有するポリヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態において、ＴＳＯは、増幅プライマー部位、識別タグ、およびユニーク分子識別子（ＵＭＩ）を含む。ある特定の実施形態において、ＴＳＯは、配列番号３～５のいずれか１つに記載される配列を有するポリヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態において、逆転写酵素は、鋳型スイッチング逆転写酵素である。ある特定の実施形態において、外側プライマーは、配列番号６のいずれかに記載される配列を有するポリヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態において、内側プライマーは、配列番号１１に記載される配列を有するポリヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態において、ＴＣＲ定常配列にアニールするプライマーは、配列番号７、８、１２、および１３のいずれか１つに記載される配列を有するポリヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態において、増幅プライマーは、バーコード配列を含む。
【0012】
ある特定の実施形態において、完全長ＴＣＲ受容体は、ＴＣＲα鎖および／またはＴＣＲβ鎖を含む。ある特定の実施形態において、完全長ＴＣＲ受容体は、ＴＣＲγ鎖および／またはＴＣＲδ鎖を含む。ある特定の実施形態において、当該方法は、約２０秒から約９０秒の拡張フェーズを含む。ある特定の実施形態において、増幅プライマーは、約０．１μＭから約０．６μＭの濃度においてフォワードプライマーを含む。
【0013】
ある特定の実施形態において、当該方法は、さらに、単一Ｔ細胞の全トランスクリプトームを解析する工程を含む。ある特定の実施形態において、当該方法は、さらに、単一Ｔ細胞の体細胞変異または遺伝的多型を解析する工程を含む。
【0014】
ある特定の実施形態において、選別することは、試料を複数のペプチド／ＭＨＣ複合体と接触させること程を含み、この場合、各ペプチド／ＭＨＣ複合体は、関連バーコードを含む。ある特定の実施形態において、当該方法は、さらに、各ペプチド／ＭＨＣ複合体に関連するバーコードを配列決定することを含む。ある特定の実施形態において、当該方法は、さらに、第１のペプチド／ＭＨＣ複合体に関連する第１のバーコードと第２のペプチド／ＭＨＣ複合体に関連する第２のバーコードとの比を決定することを含む。ある特定の実施形態において、当該方法は、さらに、第１のバーコードと第２のバーコードの比に基づいてＴ細胞の抗原特異性を決定することを含む。
【図面の簡単な説明】
【0015】
【図1A】完全長ＴＣＲ転写物の配列を生成することに対する例示的ＳＭＡＲＴ－ＴＣＲ手法を示す図である。図１Ａは、ＴＣＲ ｍＲＮＡ鋳型から５’および３’増幅配列を含むｃＤＮＡを作り出すプロセスの概要を示している。
【図1B】完全長ＴＣＲ転写物の配列を生成することに対する例示的ＳＭＡＲＴ－ＴＣＲ手法を示す図である。図１Ｂは、図１Ａにおいて作り出されたｃＤＮＡからの完全長ＴＣＲ配列の増幅のためのプロセスの詳細な説明を示している。
【図2】ＳＭＡＲＴ－ＴＣＲ手法および従来の方法によって得られた、ＴＣＲ回収率、シグナル：ノイズ比、および平均ＮｅｏＩＤリードを示す図である。ＮｅｏＩＤ：ユニークｐＨＬＡ（ペプチド－ＨＬＡ）テトラマーを標識するユニークオリゴヌクレオチド配列。シグナル：ノイズ比：ユニークｐＨＬＡテトラマーのリードを異なるｐＨＬＡテトラマーのリードで除算することによって計算した、ｐＨＬＡに対するＴＣＲの特異性の推定値。臨床ｉｍＰＡＣＴ手法は、当技術分野において一般的に使用されるＴＣＲに対するネストされたマルチプレックスプライマー反応のコントロールセットである。
【図3】異なる実験条件においてＳＭＡＲＴ－ＴＣＲ手法によって得られた、ＴＣＲ回収率、シグナル：ノイズ比、および平均ＮｅｏＩＤリードを示す図である。臨床ＴＣＲ手法：当技術分野において一般的に使用されるＴＣＲに対するネストされたマルチプレックスプライマー反応のコントロールセットである。ＳＭＡＲＴ－ＴＣＲクリーンアップＲＴ：ＴＣＲ増幅（図１Ｂにおいて概説される）の前にＲＴ産物に対して為されたビーズ精製。ＳＭＡＲＴ－ＴＣＲ酵素スパイクイン：ＴＣＲ鋳型形成を促進するための、ＲＴ反応混合物への新しいポリメラーゼ酵素の追加。ＳＭＡＲＴ－ＴＣＲ １．５Ｘ ＮｅｏＩＤ：シグナル：ノイズ比およびＮｅｏＩＤリードを増加させるための、増加した量のＮｅｏＩＤプライマーの追加。ＳＭＡＲＴ－ＴＣＲ低拡張：より小さい産物形成（例えば、ＴＣＲまたはＮｅｏＩＤ産物）を促進するための、ＴＣＲ増幅のための拡張時間の減少。
【図4A-4B】ＴＣＲ回収率、シグナル：ノイズ比、および平均ＮｅｏＩＤリードに対する、拡張を下げることおよびプライマーの濃度を増加させることの効果を示す図である。図４Ａは、ＴＣＲ回収率を示している。図４Ｂは、シグナル：ノイズ比および平均ＮｅｏＩＤリードを示している。
【図5A-5B】２つの異なる試料（ＬＰ３５６およびＬＰ１６９）における、ＴＣＲ回収率、シグナル：ノイズ比、および平均ＮｅｏＩＤリードに対する、拡張を下げることおよびＮｅｏＩＤプライマーの濃度を増加させることの効果を示す図である。図５Ａは、ＴＣＲ回収率を示している。図５Ｂは、シグナル：ノイズ比および平均ＮｅｏＩＤリードを示している。ＮｅｏＩＤ：ユニークｐＨＬＡ（ペプチド－ＨＬＡ）テトラマーを標識するユニークオリゴヌクレオチド配列。シグナル：ノイズ比：ユニークｐＨＬＡテトラマーのリードを異なるｐＨＬＡテトラマーのリードで除算することによって計算した、ｐＨＬＡに対するＴＣＲの特異性の推定値。臨床ｉｍＰＡＣＴ手法：当技術分野において一般的に使用されるＴＣＲに対するネストされたマルチプレックスプライマー反応のコントロールセットである。ＳＭＡＲＴ－ＴＣＲ １．５ｘＮｅｏＩＤ ３分拡張は、３分への反応の拡張時間の減少と共にＮｅｏＩＤプライマーが増加される、ＳＭＡＲＴ－ＴＣＲプロセスにおけるバリエーションである。ＳＭＡＲＴ－ＴＣＲ ２ｘＮｅｏＩＤ １．５分拡張は、１．５分への反応の拡張時間の減少と共にＮｅｏＩＤプライマーが増加される、ＳＭＡＲＴ－ＴＣＲプロセスにおけるバリエーションである。ＳＭＡＲＴ－ＴＣＲ ２ｘＮｅｏＩＤ １．５分拡張 低５’プライマーは、ＮｅｏＩＤプライマーが、５’プライマー（図１Ｂにおいて概説される）および１．５分への反応の拡張時間の減少と共に増加される、ＳＭＡＲＴ－ＴＣＲプロセスにおけるバリエーションである。
【図6】ＳＭＡＲＴ－ＴＣＲ手法が、臨床ｉｍＰＡＣＴ手法に対して匹敵するＨＬＡ一致ｃｏｍＰＡＣＴ分配をもたらすことを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0016】
本開示は、完全長Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を含む相補的デオキシリボ核酸（ｃＤＮＡ）分子を調製するための方法および組成物を提供する。本開示は、一部において、ＴＣＲ遺伝子を配列決定し、その結果として、多重増幅およびディープシーケンシングを使用してＴ細胞をプロファイルするための試薬および方法の発見に基づいている。最後に、本開示は、本明細書において開示される方法および組成物を使用して養子細胞療法（例えば、Ｔ細胞産物）を作製する方法も提供する。本開示の非限定的な実施形態は、本説明および実施例によって説明される。限定するためではなく開示の明瞭さのために、詳細な説明は、以下のサブセクションに分割される：
１．定義；
２．ＤＮＡを調製する方法；
３．Ｔ細胞を解析する方法；
４．組成物およびキット；
５．Ｔ細胞産物；および
６．例示的実施形態
１．定義；
２．ＤＮＡを調製する方法；
３．Ｔ細胞を解析する方法；
４．組成物およびキット；
５．Ｔ細胞産物；および
６．例示的実施形態
【0017】
１．定義
特に定義されない限り、本明細書において使用される全ての技術用語および科学用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有する。以下の参考文献は、開示される本主題において使用される用語の多くについての一般的定義を当業者に提供する。Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ、ＬａｗおよびＭａｒｔｉｎ編、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、２０２０；Ａ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｈｉｎｅ編、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、２０１９；Ａ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、ＬａｗおよびＲｅｎｎｉｅ編、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、２０２０；Ｏｘｆｏｒｄ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｃａｍｍａｃｋ、Ａｔｗｏｏｄ、Ｃａｍｐｂｅｌｌ、Ｐａｒｉｓｈ、Ｓｍｉｔｈ、ＶｅｌｌａおよびＳｔｉｒｌｉｎｇ編、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、２００６；Ｐａｕｌ、Ｗｉｌｌｉａｍ．２０１３。Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ． Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ：Ｗｏｌｔｅｒｓ Ｋｌｕｗｅｒ Ｈｅａｌｔｈ／Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ；およびＷｏｎｇ、Ｌｅｅ－Ｊｕｎ Ｃ． ２０１３。Ｎｅｘｔ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ：Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｔｏ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ． Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ：ＳｐｒｉｎｇｅｒＬｉｎｋ。本明細書において使用される場合、下記の用語は、特に明記されない限り、以下においてそれらに属する意味を有する。
特に定義されない限り、本明細書において使用される全ての技術用語および科学用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有する。以下の参考文献は、開示される本主題において使用される用語の多くについての一般的定義を当業者に提供する。Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ、ＬａｗおよびＭａｒｔｉｎ編、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、２０２０；Ａ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｈｉｎｅ編、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、２０１９；Ａ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、ＬａｗおよびＲｅｎｎｉｅ編、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、２０２０；Ｏｘｆｏｒｄ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｃａｍｍａｃｋ、Ａｔｗｏｏｄ、Ｃａｍｐｂｅｌｌ、Ｐａｒｉｓｈ、Ｓｍｉｔｈ、ＶｅｌｌａおよびＳｔｉｒｌｉｎｇ編、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、２００６；Ｐａｕｌ、Ｗｉｌｌｉａｍ．２０１３。Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ． Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ：Ｗｏｌｔｅｒｓ Ｋｌｕｗｅｒ Ｈｅａｌｔｈ／Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ；およびＷｏｎｇ、Ｌｅｅ－Ｊｕｎ Ｃ． ２０１３。Ｎｅｘｔ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ：Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｔｏ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ． Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ：ＳｐｒｉｎｇｅｒＬｉｎｋ。本明細書において使用される場合、下記の用語は、特に明記されない限り、以下においてそれらに属する意味を有する。
【0018】
本明細書において説明される本発明の態様および実施形態は、態様および実施形態「を含む」、「からなる」、および「から実質的になる」を包含することは理解されたい。用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、米国特許法においてそれらに属する広い意味を有することが意図され、ならびに、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および同様のものを意味することができる。
【0019】
本明細書において使用される場合、単語「１つの（「ａ」または「ａｎ」）」の使用は、特許請求の範囲および／または本明細書において用語「含む（「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」）」と共に使用される場合、「１つ（「ｏｎｅ」）」を意味し得るが、「１つまたは複数（「ｏｎｅ ｏｒ ｍｏｒｅ」）」、「少なくとも１つ（「ａｔ ｌｅａｓｔ ｏｎｅ」）」、および「１つまたはそれ以上（「ｏｎｅ ｏｒ ｍｏｒｅ ｔｈａｎ ｏｎｅ」）」の意味とも一致する。
【0020】
明記されない限り、または文脈から明らかでない限り、本明細書に使用される場合、用語「約（ａｂｏｕｔ）」または「およそ（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」は、当技術分野における様々な一般公差以内、例えば、平均の２標準偏差以内として理解される。「約」は、言明される値の１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％、または０．０１％以内として理解することができる。あるいは、この用語は、値の１桁以内、好ましくは５倍以内、より好ましくは２倍以内を意味することができる。
【0021】
本明細書において使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」および「核酸」は、相互互換的に使用され、ならびに、ヌクレオチドのポリマーを含む任意の化合物および／または物質を包含する。各ヌクレオチドは、塩基、具体的には、プリンまたはピリミジン塩基（すなわち、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、またはウラシル（Ｕ））、糖（すなわち、デオキシリボースまたはリボース）、ならびにホスフェート基で構成される。多くの場合、核酸分子は、塩基の配列によって説明され、それにより、当該塩基は、核酸分子の一次構造（線形構造）を表す。塩基の配列は、典型的には、５’から３’へ表される。ポリヌクレオチドは、任意のＤＮＡ（これらに限定されるわけではないが、ｃＤＮＡ、ｓｓＤＮＡ、およびｄｓＤＮＡなど）および任意のＲＮＡ（これらに限定されるわけではないが、ｓｓＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、およびｍＲＮＡなど）を意味し、さらに、ＤＮＡおよびＲＮＡの合成型ならびにこれらの分子の２つ以上を含む混合ポリマーを包含する。ポリヌクレオチドは、直鎖状または環状であり得る。さらに、用語ポリヌクレオチドは、センス鎖およびアンチセンス鎖の両方、ならびに一本鎖形態および二本鎖形態を包含する。ポリヌクレオチドは、天然に存在するヌクレオチドまたは天然に存在しないヌクレオチドを含むことができる。天然に存在しないヌクレオチドの例としては、誘導化された糖もしくはリン酸骨格結合または化学的に改変された残基を有する改変されたヌクレオチド塩基が挙げられる。ポリヌクレオチドは、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ ｖｉｖｏでの本発明のポリペプチドの直接発現のためのベクターとして好適なＤＮＡおよびＲＮＡ分子を包含する。
【0022】
本明細書において相互互換的に使用される用語「ポリペプチド」および「タンパク質」は、少なくとも２つのアミノ酸の連結から形成される分子を意味する。１つのアミノ酸残基とその隣のアミノ酸残基の間の連結は、アミド結合であり、場合によってペプチド結合と呼ばれる。ポリペプチドは、当技術分野において既知の好適な方法、例えば、天然源からの単離、組換え発現システムでの発現、化学合成、または酵素合成など、によって得ることができる。この用語は、１つまたは複数のアミノ酸残基が対応する天然に存在するアミノ酸の人工化学的類似物であるアミノ酸ポリマーならびに天然に存在するアミノ酸ポリマーおよび天然に存在しないアミノ酸ポリマーに適用することができる。
【0023】
用語「パーセント配列同一性」は、２つ以上の核酸またはポリペプチド配列との関連において、以下において説明される配列比較アルゴリズムのうちの１つ（例えば、ＢＬＡＳＴＰおよびＢＬＡＳＴＮまたは当業者に利用可能な他のアルゴリズム）を使用するかまたは目視確認によって測定した場合に、最大の一致に対して比較およびアラインメントされる場合に同じである、指定された割合のヌクレオチドまたはアミノ酸残基を有する２つ以上の配列またはサブ配列を意味する。用途に応じて、「パーセント配列同一性」は、比較される配列の領域、例えば、機能的領域にわたって、存在することができ、あるいは択一的に、比較される２つの配列の完全長にわたって存在することができる。配列比較のため、典型的には、１つの配列が、試験配列が比較される参照配列として機能する。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験配列および参照配列がコンピュータにインプットされ、必要であれば、サブ配列の座標が指定され、ならびに、配列アルゴリズムプログラムパラメーターが指定される。配列比較アルゴリズムは、次いで、指定されたプログラムパラメーターに基づいて、参照配列と比較して、試験配列に対するパーセント配列同一性を計算する。比較のための配列の最適なアラインメントは、例えば、Ｓｍｉｔｈ ＆ Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所的相同性アルゴリズムによって、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ＆ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． ４８：４４３（１９７０）の相同性アラインメントアルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ ＆ Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４（１９８８）の類似法に対する調査によって、これらのアルゴリズム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．， Ｍａｄｉｓｏｎ， Ｗｉｓ．におけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）のコンピュータ化実装によって、あるいは目視確認によって（概して、以下のＡｕｓｕｂｅｌらを参照されたい）、実施することができる。パーセント配列同一性および配列類似性を決定するために好適なアルゴリズムの一例は、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． ２１５：４０３～４１０（１９９０）に記載されるＢＬＡＳＴアルゴリズムである。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアは、全米バイオテクノロジー情報センター（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を通じて公的に利用可能である。
【0024】
用語「プライマー」は、本明細書に使用される場合、概して、ポリヌクレオチド鋳型によってデュプレックスを形成する際に、核酸合成の開始点として機能することができ、ならびに拡張されたデュプレックスが形成されるように鋳型に沿って３’末端から拡張することができる、天然または合成のオリゴヌクレオチド分子を意味する。拡張プロセスの際に加えられるヌクレオチドの配列は、鋳型ポリヌクレオチドの配列によって決定され得る。プライマーは、ポリメラーゼによって拡張される。プライマーは、概して、プライマー拡張産物の合成におけるそれらの使用に適合する長さであり、通常、長さが約８から約１００ヌクレオチドの間の範囲である。「プライマー」は、鋳型に対して相補的であり、ならびに、核酸合成のプロセスにおいて鋳型に対して相補的な３’末端において結合された共有結合した塩基の追加によって拡張される、ポリメラーゼによる合成の開始のためのプライマー／鋳型複合体を与えるための鋳型との水素結合形成またはハイブリダイズによる複合体である。
【0025】
用語「増幅すること（ａｍｐｌｉｆｙｉｎｇ）」または「増幅（ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）」は、本明細書に使用される場合、概して、鋳型核酸の一方または両方の鎖に対して相補的である核酸分子を合成するプロセスを意味する。核酸分子を増幅することは、鋳型核酸を変性すること、プライマーの溶融温度未満の温度においてプライマーを鋳型核酸にアニールすること、ならびにプライマーから酵素的に延長して増幅産物を生成することを含み得る。ある特定の実施形態において、変性、アニール、および延長の工程は、増幅産物の量が増加するように、複数回実施される。増幅は、典型的には、デオキシリボヌクレオシド三リン酸、ポリメラーゼ酵素および適切なバッファー、ならびに／あるいはポリメラーゼ酵素の最適な活性のための補助因子の存在を必要とする。用語「増幅産物」は、本明細書において定義される増幅プロセスから生成される核酸を意味する。
【0026】
用語「配列決定（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）」は、本明細書に使用される場合、概して、１つまたは複数のポリヌクレオチドにおけるヌクレオチド塩基の配列を決定するための方法および技術を意味する。ポリヌクレオチドは、例えば、核酸分子例えば、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）、ならびにそのバリアントまたは誘導体（例えば、一本鎖ＤＮＡ）など、であり得る。配列決定は、現在利用可能な様々なシステム、例えば、これらに限定されるわけではないが、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＰａｃＢｉｏ（登録商標））、Ｏｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ（登録商標）、またはＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ（登録商標））などによる配列決定システムよって実施することができる。あるいは、またはさらに、配列決定は、核酸増幅、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（例えば、デジタルＰＣＲ、定量的ＰＣＲ、またはリアルタイムＰＣＲ）、または等温増幅を使用して実施され得る。そのようなシステムは、対象によって提供される試料からシステムによって生成された、対象（例えば、ヒト）の遺伝情報に対応する複数の生の遺伝子データを提供し得る。ある特定の実施形態において、そのようなシステムは、シーケンシングリード（本明細書では「リード」とも呼ばれる）を提供する。リードは、配列決定された核酸分子の配列に対応する核酸塩基の鎖を含み得る。用語「シーケンシングリード存在量（ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｅａｄ ａｂｕｎｄａｎｃｅ）」は、本明細書に使用される場合、概して、特定の配列またはヌクレオチドが配列リードのコレクションにおいて観察される回数を意味する。用語「配列決定」は、本明細書に使用される場合、概して、ポリヌクレオチドにおける連続したヌクレオチドの同一性（例えば、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも５０、少なくとも１００、または少なくとも２００以上の連続したヌクレオチドの同一性）が得られる方法を意味する。
【0027】
用語「次世代シーケンシング（ｎｅｘｔ－ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）」または「ハイスループットシーケンシング（ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）」は、本明細書に使用される場合、概して、並列化シーケンシング・バイ・シンセシスまたはシーケンシング・バイ・ライゲーションプラットフォームを意味する。次世代シーケンシング法の非限定的な例としては、ナノポアシーケンシング法、電子検出法（ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ－ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ－ｂａｓｅｄ ｍｅｔｈｏｄ）、または単一分子蛍光法（ｓｉｎｇｌｅ－ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ－ｂａｓｅｄ ｍｅｔｈｏｄ）が挙げられる。
【0028】
本明細書において使用される場合、「ポリメラーゼ」は、鋳型としてＤＮＡまたはＲＮＡを使用したヌクレオチド鎖へのヌクレオチド単位の追加によってポリヌクレオチド合成を触媒する酵素を意味する。この用語は、天然において生じる完全な酵素、あるいは単離された活性触媒ドメインまたは断片のいずれかを意味する。ある特定の実施形態において、ポリメラーゼは、熱安定性であり得る。「熱安定性ポリメラーゼ」は、例えば大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）由来のヌクレオチドポリメラーゼと比較して熱に対して比較的安定であり、ならびにヌクレオシド三リン酸の鋳型依存性重合を触媒する、酵素である。「熱安定性ポリメラーゼ」は、ＰＣＲにおいて使用される反復される加熱および冷却サイクルに供されたときに、重合のための酵素活性およびエキソヌクレアーゼ活性を維持する。ある特定の実施形態において、ポリメラーゼは、「ＤＮＡポリメラーゼ」であり得る。ある特定の実施形態において、ＤＮＡポリメラーゼは、「高忠実度ＤＮＡポリメラーゼ（ｈｉｇｈ－ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）」である。例えば、これらに限定されるわけではないが、ポリメラーゼは、ＰＲＩＭＥ ＳＴＡＲ ＧＸＬポリメラーゼＩ、ＡＤＶＡＮＴＡＧＥ ＨＤ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、Ｑ５（登録商標）Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、ＰＨＵＳＩＯＮ（登録商標）Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、ＰＬＡＴＩＮＵＭ（登録商標）Ｔａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ、ＫＡＰＡ ＨｉＦｉ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、またはＫＯＤ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅであり得る。
【0029】
本明細書において使用される場合、用語「逆転写酵素」は、ＲＮＡ鋳型からのＤＮＡの形成を触媒する酵素を意味する。ある特定の実施形態において、逆転写酵素は、ＲＮＡ鋳型からの第一鎖（ｆｉｒｓｔ－ｓｔｒａｎｄ）ｃＤＮＡ合成のために使用することができるＤＮＡポリメラーゼである。ＲＮＡ鋳型は、これらに限定されるわけではないが、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、ウイルスＲＮＡ、全ＲＮＡなどであり得る。ある特定の実施形態において、例えば、これらに限定されるわけではないが、逆転写酵素は、鋳型スイッチング逆転写酵素、例えば、マウス白血病ウイルス逆転写酵素など、を意味する。
【0030】
用語「アダプター（ａｄａｐｔｏｒ）」、「アダプター（ａｄａｐｔｅｒ）」、および「タグ」は、同じ意味で使用され得る。アダプターまたはタグは、任意の手法、例えば、ライゲーション、ハイブリダイゼーション、または他の手法など、によって、「タグ付けをされる」ポリヌクレオチド配列に結合させることができる。
【0031】
用語「バーコード」、「バーコード配列」、「ＮｅｏＩＤ」、または「分子バーコード」は、本明細書に使用される場合、概して、分子、例えば、核酸分子またはタンパク質分子についての情報を運ぶかまたは運ぶことが可能な標識、または識別子を意味する。ある特定の実施形態において、バーコードは、分子の一部、例えば、より大きな核酸配列に含まれるユニークヌクレオチド構成または配列であり得る。ある特定の実施形態において、バーコードは、分子（例えば、より大きなタンパク質）に取り付けられたタグであり得る。ある特定の実施形態において、バーコードは、ユニークであり得る。ある特定の非限定的な実施形態において、バーコードは、ポリヌクレオチドバーコード；ランダム核酸および／またはアミノ酸配列；ならびに合成核酸および／またはアミノ酸配列を含むことができる。ある特定の非限定的な実施形態において、バーコードは、試料の配列決定の前、その際、および／またはその後に、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）試料の断片に加えることができる。バーコードは、対応する分子に取り付けられた場合にバーコードの配列によってその分子の識別を表す、個々のシーケンシングリードの識別および／または定量化を可能にすることができる。
【0032】
本明細書において使用される場合、用語「ユニーク分子識別子」は、配列決定の際にエラー修正および増加した正確性を提供する分子バーコードのタイプを意味する。ＵＭＩの使用は、偽陽性バリアント細胞の割合を減少させ、ならびに、バリアント検出の感度を増加させる。ＵＭＩのインシリコ解析は、高水準の正確性を有する結果を提供することができ、ならびにユニークリードを報告し、潜在的エラーを取り除くことができる。ＵＭＩに関するさらなる詳細は、Ｉｓｌａｍら、Ｎａｔｕｒｅ ｍｅｔｈｏｄｓ １１．２ （２０１４）： １６３に見出すことができ、なお、当該文献は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
【0033】
本明細書において使用される場合、用語「鋳型スイッチングオリゴヌクレオチド（ｔｅｍｐｌａｔｅ－ｓｗｉｔｃｈｉｎｇ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）」または「ＴＳＯ」（「鋳型スイッチオリゴヌクレオチド（ｔｅｍｐｌａｔｅ ｓｗｉｔｃｈ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）」とも呼ばれる）は、核酸重合反応の際にポリメラーゼが初期鋳型（例えば、本明細書において説明される鋳型ｍＲＮＡ）から切り替えることができるオリゴヌクレオチド鋳型を意味する。ＴＳＯは、改変されるかそうでなければ天然に存在しない１つまたは複数のヌクレオチド（またはその類似物）を含み得る。例えば、これらに限定されるわけではないが、鋳型スイッチングオリゴヌクレオチドは、１つまたは複数のヌクレオチド類似物（例えば、ＬＮＡ、ＦＡＮＡ、２’－０－メチルリボヌクレオチド、２’－フルオロリボヌクレオシド、または同様のもの）、結合改変（例えば、ホスホロチオエート、３’－３’および５’－５’逆転結合）、５’および／または３’末端改変（例えば、５’および／または３’アミノ、ビオチン、ＤＩＧ、ホスフェート、チオール、染料、クェンチャーなど）、１つまたは複数の蛍光標識されたヌクレオチド、あるいは鋳型スイッチングオリゴヌクレオチドに所望の機能を提供する任意の他の特徴を含み得る。
【0034】
用語「Ｔ細胞受容体」または「ＴＣＲ」は、本明細書に使用される場合、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔリンパ球の膜表面上に発現するポリペプチドを意味する。ＴＣＲは、抗原提示細胞の表面上の自己主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子に結合したペプチドの認識のための免疫システムの成分として機能する抗原受容体である。ＴＣＲは、２つのジスルフィド結合膜貫通ポリペプチド鎖αおよびβあるいはγおよびδのヘテロ二量体であり得る。これら４つのＴＣＲポリペプチド鎖のそれぞれは、複数の不連続な遺伝子セグメントを含む異なる遺伝子座によってコードされる。これらは、可変（Ｖ）領域遺伝子セグメント、接合（Ｊ）領域（ｊｏｉｎｉｎｇ （Ｊ） ｒｅｇｉｏｎ）遺伝子セグメント、および定常（Ｃ）領域遺伝子セグメントを含む。βおよびδ鎖は、多様性（Ｄ）遺伝子（ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ （Ｄ） ｇｅｎｅ）セグメントと称される追加のエレメントを含む。可変領域は、ＴＣＲが結合特異性を有する特定の抗原およびＭＨＣ分子の決定に貢献する。用語ＴＣＲは、本明細書に使用される場合、単独の鎖または接合された両方鎖の、個別に４つのポリペプチド鎖のそれぞれ、ならびにその生物学的に活性な断片、例えば、水溶液に可溶な断片など、を含む。生物学的に活性な断片は、特定の抗原に対して特異性を伴って結合する能力を維持し得る。
【0035】
本明細書において使用される場合、「ＮｅｏＴＣＲ」は、例えば遺伝子編集方法などによってＴ細胞に導入される外因性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を意味する。
【0036】
「Ｔ細胞産物」は、本明細書に使用される場合、外因性ＴＣＲを含む１つまたは複数のＴ細胞を含む組成物を意味する。ある特定の実施形態において、Ｔ細胞産物は、自己精密ゲノム編集（ｇｅｎｏｍｅ－ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）ＣＤ８＋および／またはＣＤ４＋Ｔ細胞を含む。標的化されたＤＮＡ媒介性非ウイルス精密ゲノム編集手法を使用することにより、内因性ＴＣＲの発現は、腫瘍排他的抗原を標的にする辺縁ＣＤ８＋Ｔ細胞から単離された患者特異的外因性ＴＣＲによって排除および置換される。ある特定の実施形態において、結果として得られる操作されたＣＤ８＋またはＣＤ４＋Ｔ細胞は、天然発現レベルおよび天然ＴＣＲ機能において、それらの天然配列の表面に外因性ＴＣＲを発現する。外因性ＴＣＲ外部結合ドメインおよび細胞質シグナル伝達ドメインの配列は、天然ＣＤ８＋Ｔ細胞から単離されたＴＣＲから変更されない。ＮｅｏＴＣＲ遺伝子発現の調整は、ＮｅｏＴＣＲ遺伝子カセットがゲノムに統合される位置の上流に位置された天然内因性ＴＣＲプロモーターによって駆動される。この手法により、ＮｅｏＴＣＲの発現の天然レベルが、非刺激の抗原活性化Ｔ細胞状態において観察される。
【0037】
用語「内因性」は、本明細書に使用される場合、通常は細胞または組織において発現される核酸分子またはポリヌクレオチドを意味する。
【0038】
用語「外因性」は、本明細書に使用される場合、細胞内に内因的に存在しない核酸分子またはポリヌクレオチドを意味する。したがって、用語「外因性」は、細胞において発現される任意の組換え核酸分子またはポリペプチド、例えば、外来性の、異種の、および過剰発現された核酸分子およびポリペプチドなど、を包含するであろう。「外因性」核酸によって、天然の野生型細胞に存在しない核酸が意味され、例えば、外因性核酸は、配列、位置（ｐｏｓｉｔｉｏｎ）／配置（ｌｏｃａｔｉｏｎ）、または両方において内因性核酸と異なり得る。明瞭化のため、外因性核酸は、その天然の内因性核酸に対して同じまたは異なる配列を有し得；それは、遺伝子操作によって細胞それ自体またはその前駆細胞に導入され得、ならびに、場合により、代替のコントロール配列、例えば、非天然プロモーターまたは分泌配列など、に連結され得る。
【0039】
本明細書において使用される場合、用語「抗原ペプチド」は、ＭＨＣクラス１またはＭＨＣクラス２の結合溝に結合されるかまたは結合することができるペプチド（例えば、９量体、１０量体など）を意味する。
【0040】
本明細書において使用される場合、用語「ペプチド／ＭＨＣ複合体」は、ＭＨＣタンパク質および抗原ペプチドを含む機能性分子を意味する。ある特定の実施形態において、ＭＨＣタンパク質は、ＭＨＣクラスＩタンパク質であり得る。ある特定の実施形態において、ペプチド／ＭＨＣ複合体は、ＭＨＣタンパク質、β－２ミクログロブリン、および抗原ペプチドを含む。ある特定の実施形態において、ＭＨＣタンパク質は、ＭＨＣクラスＩＩタンパク質であり得る。
【0041】
２．ｃＤＮＡを調製する方法
本開示は、完全長ＴＣＲ配列を含むｃＤＮＡの調製を改善するための組成物および方法、ならびにそれらのＴＣＲの完全長核酸配列を決定する際での使用を提供する。
本開示は、完全長ＴＣＲ配列を含むｃＤＮＡの調製を改善するための組成物および方法、ならびにそれらのＴＣＲの完全長核酸配列を決定する際での使用を提供する。
【0042】
図１Ａおよび１Ｂは、本開示の主題のある特定の実施形態を例示している。例えば、ある特定の実施形態において、最初に、図１Ａにおいて識別されたｍＲＮＡ転写物が、ＴＣＲ発現細胞を含む試料、例えば、単一Ｔ細胞から抽出される。そのようなｍＲＮＡ転写物の集団は、完全長ＴＣＲ配列を含むであろう。ある特定の実施形態において、ｍＲＮＡ転写物は、工程２において例示されるようにｃＤＮＡ－ＲＮＡ中間体を生成するために、ｃＤＮＡ合成プライマーおよび逆転写酵素と組み合わされる。ｃＤＮＡ合成プライマーは、ＴＣＲのコード配列に対して、下流において、すなわち、ｍＲＮＡ転写物の３’末端に向かって、存在する任意の配列を含むことができ、その一方で、ある特定の実施形態において、ｃＤＮＡ合成プライマーは、オリゴ－ｄＴオリゴヌクレオチドである。ある特定の実施形態において、オリゴ－ｄＴオリゴヌクレオチドは、配列番号１または２に記載される配列を有するポリヌクレオチドを含む。配列番号１および２は、下記に提供される。
ＡＡＧＣＡＧＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＧＣＡＧＡＧＴＡＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＶＮ［配列番号１］
ＡＡＧＣＡＧＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＧＣＡＧＡＧＴＡＣＮＮＮＮＮＮＮＮＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＶＮ［配列番号２］
ＡＡＧＣＡＧＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＧＣＡＧＡＧＴＡＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＶＮ［配列番号１］
ＡＡＧＣＡＧＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＧＣＡＧＡＧＴＡＣＮＮＮＮＮＮＮＮＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＶＮ［配列番号２］
【0043】
ある特定の実施形態において、第２の逆転写酵素反応は、完全長ＴＣＲ配列を含むｃＤＮＡを生成するために、ｃＤＮＡ－ＲＮＡ中間体をＴＳＯと組み合わせることによって行われる。ある特定の実施形態において、ならびに図１Ａの工程３に示されるように、ＴＳＯは、逆転写酵素によってｃＤＮＡ分子の３’末端に組み込まれたシトシンヌクレオチドの非鋳型化ストレッチにハイブリダイズすることができる。そのようなｃＤＮＡへのＴＳＯのハイブリダイゼーションは、逆転写酵素によるさらなる拡張のための鋳型を提供し、それにより、図１Ａの工程４において示されるように、さらに拡張されたｃＤＮＡ分子にＴＳＯの補体を組み入れる。
【0044】
ある特定の実施形態において、ｃＤＮＡ合成プライマーおよび／またはＴＳＯは、増幅プライマー部位を含むことができる。ある特定の実施形態において、ｃＤＮＡ合成プライマーおよび／またはＴＳＯは、識別タグ、例えば、バーコードなど、を含むことができる。ある特定の実施形態において、ｃＤＮＡ合成プライマーおよび／またはＴＳＯは、ユニーク分子識別子（ＵＭＩ）を含むことができる。ある特定の実施形態において、ＴＳＯは、配列番号３～５のいずれか１つに記載される配列を有するポリヌクレオチドを含む。配列番号３～５は、下記に提供される。
ＡＡＧＣＡＧＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＧＣＡＧＡＧＴＡＣＡＴｒＧｒＧ＋Ｇ［配列番号３］
／５Ｂｉｏｓｇ／ＡＡＧＣＡＧＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＧＣＡＧＡＧＴＡＣＡＴｒＧｒＧ＋Ｇ［配列番号４］
ＡＧＡＧＡＣＡＧＡＡＧＣＡＧＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＧＣＡＧＡＧＴＡＣＡＴＮＮＮＮＮＮＮＮｒＧｒＧ＋Ｇ［配列番号５］
ＡＡＧＣＡＧＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＧＣＡＧＡＧＴＡＣＡＴｒＧｒＧ＋Ｇ［配列番号３］
／５Ｂｉｏｓｇ／ＡＡＧＣＡＧＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＧＣＡＧＡＧＴＡＣＡＴｒＧｒＧ＋Ｇ［配列番号４］
ＡＧＡＧＡＣＡＧＡＡＧＣＡＧＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＧＣＡＧＡＧＴＡＣＡＴＮＮＮＮＮＮＮＮｒＧｒＧ＋Ｇ［配列番号５］
【0045】
ある特定の実施形態において、逆転写酵素は、鋳型スイッチング活性を有する。ある特定の実施形態において、逆転写酵素は、鋳型（例えば、ＲＮＡ）の５’末端に達した後に、いくらかの非鋳型化ヌクレオチドを加えることができる。ある特定の実施形態において、逆転写酵素は、野生型モロニーマウス白血病ウイルスまたはそのバリアントである。例えば、これらに限定されるわけではないが、逆転写酵素は、ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴＩＩ（登録商標）、ＰＯＷＥＲＳＣＲＩＰＴ（登録商標）、またはＳＭＡＲＴＳＣＲＩＰＴ（登録商標）であり得る。
【0046】
図１Ｂに示されるように、逆転写の後に、ｃＤＮＡをプライマーの第１のセットおよびＤＮＡポリメラーゼと組み合わせることにより、配列決定のための完全長ＴＣＲを得ることができる。
【0047】
ある特定の実施形態において、図１Ｂにおいて概説されるｃＤＮＡの増幅は、ＰＣＲの複数のラウンドを含むことができる。ある特定の実施形態において、増幅プライマーの異なるセットを用いることができる。ある特定の実施形態において、増幅プライマーの異なるセットは、ｃＤＮＡ分子における異なる部分またはそれから得られる増幅産物にハイブリダイズすることができ、ならびに／あるいは、異なる配列、例えば、ＵＭＩまたは他のタイプのバーコードおよび／または増幅配列を含むことができる。
【0048】
例えば、これらに限定されるわけではないが、本開示のある特定の実施形態は、完全長ＴＣＲ配列を含む第１のＰＣＲ産物を生成する第１のＰＣＲ反応（ＰＣＲ１）を含むであろう。プライマーの第１のセットは、ＴＳＯの外側増幅プライマー部位、例えば、外側プライマー、にアニールするフォワードプライマー、ならびにＴＣＲ定常配列にアニールするリバースプライマーを含むことができる。ある特定の実施形態において、外側プライマーは、ＴＳＯの外側増幅結合部位にアニールする。ある特定の実施形態において、外側プライマーは、ＴＳＯにアニールする。ある特定の実施形態において、外側プライマーは、ＴＣＲ可変領域の上流にある領域にアニールする。例えば、これらに限定されるわけではないが、外側プライマーは、図１Ｂにおいて「Ｌ」として設計されたＴＣＲリーダー配列にアニールする。ある特定の実施形態において、外側プライマーは、配列番号６のいずれか１つに記載される配列を有するポリヌクレオチドを含むかまたはそれからなる。
【0049】
ある特定の実施形態において、リバースプライマーは、ＴＲＡＣ配列またはＴＲＢＣ配列にアニールする。ある特定の実施形態において、リバースプライマーは、ＴＣＲα配列の保存配列にアニールする。ある特定の実施形態において、リバースプライマーは、ＴＣＲβ配列の保存配列にアニールする。ある特定の実施形態において、リバースプライマーは、ＴＣＲαおよびＴＣＲβ配列の保存配列にアニールする。例えば、これらに限定されるわけではないが、リバースプライマーは、ＴＲＢＣ１およびＴＲＢＣ２遺伝子の両方にアニールする。ある特定の実施形態において、リバースプライマーは、ＴＲＡＣ配列の川下に位置される領域にアニールする。ある特定の実施形態において、リバースプライマーは、ＴＲＢＣ配列の川下に位置される領域にアニールする。ある特定の実施形態において、リバースプライマーは、ＴＣＲα配列のＶ－Ｊ－Ｃ接合領域の下流に位置される領域にアニールする。例えば、これらに限定されるわけではないが、リバースプライマーは、ＴＣＲα配列のＶ－Ｊ－Ｃ接合領域の約２００ｂｐ下流に位置される領域にアニールする。ある特定の実施形態において、リバースプライマーは、ＴＣＲβ配列のＶ－Ｄ－Ｊ－Ｃ接合領域の下流に位置される領域にアニールする。例えば、これらに限定されるわけではないが、リバースプライマーは、ＴＣＲβ配列のＶ－Ｄ－Ｊ－Ｃ接合領域の約２００ｂｐ下流に位置される領域にアニールする。ある特定の実施形態において、リバースプライマーは、配列番号７または８のいずれか１つに記載される配列を有するポリヌクレオチドを含むかまたはそれからなる。配列番号６～８は、下記に提供される。
ＡＡＧＣＡＧＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＧＣＡＧＡＧＴ［配列番号６］
ＧＣＣＡＣＡＧＣＡＣＴＧＴＴＧＣＴＣＴＴＧＡＡＧＴＣＣ［配列番号７］
ＣＣＡＣＣＡＧＣＴＣＡＧＣＴＣＣＡＣＧＴＧ［配列番号８］
ＡＡＧＣＡＧＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＧＣＡＧＡＧＴ［配列番号６］
ＧＣＣＡＣＡＧＣＡＣＴＧＴＴＧＣＴＣＴＴＧＡＡＧＴＣＣ［配列番号７］
ＣＣＡＣＣＡＧＣＴＣＡＧＣＴＣＣＡＣＧＴＧ［配列番号８］
【0050】
ある特定の実施形態において、第１のＰＣＲ反応（ＰＣＲ１）は、さらに、ＮｅｏＩＤ配列を含む第１のＰＣＲ産物を生成する。プライマーの第１のセットは、ＮｅｏＩＤ配列に隣接する領域にアニールするフォワードプライマーおよびリバースプライマーを含むことができる。ある特定の実施形態において、プライマーは、配列番号９および１０に記載される配列を有するポリヌクレオチドを含むかまたはそれからなる。配列番号９および１０は、下記に提供される。
ＣＴＣＧＣＣＡＣＧＴＣＧＧＣＴＡＴＣＣＴＧ［配列番号９］
ＧＡＧＧＴＣＧＣＴＧＴＡＧＣＴＴＧＣＴＣＡＣＧ［配列番号１０］
ＣＴＣＧＣＣＡＣＧＴＣＧＧＣＴＡＴＣＣＴＧ［配列番号９］
ＧＡＧＧＴＣＧＣＴＧＴＡＧＣＴＴＧＣＴＣＡＣＧ［配列番号１０］
【0051】
ある特定の実施形態において、第１のＰＣＲ産物が得られた後、第２および第３のＰＣＲ反応（それぞれＰＣＲ２およびＰＣＲ３）を行うことができる。ある特定の実施形態において、第２のＰＣＲは、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、および／またはＮｅｏＩＤ配列の増幅を含む。ある特定の実施形態において、第２のＰＣＲは、第１のＰＣＲ産物をプライマーの第２のセットと組み合わせて第２のＰＣＲ産物を生成することを含む。プライマーの第２のセットは、ＴＳＯの内側増幅プライマー部位、例えば、内側プライマー、にアニールするフォワードプライマーならびにＴＣＲ定常配列にアニールするリバースプライマーを含む。ある特定の実施形態において、内側プライマーは、ＴＳＯアダプター配列にアニールする。ある特定の実施形態において、内側プライマーは、ＴＳＯにアニールする。ある特定の実施形態において、内側プライマーは、ＴＳＯの下流およびＴＣＲ可変領域の上流の領域にアニールする。例えば、これらに限定されるわけではないが、内側プライマーは、ＴＣＲリーダー配列にアニールする。ある特定の実施形態において、内側プライマーは、アダプター配列を含む。ある特定の非限定的な実施形態において、アダプター配列は、ＴＣＲ鋳型に対して非相同のポリヌクレオチドである。ある特定の実施形態において、アダプター配列は、さらなる増幅、例えばＰＣＲ３、のための結合部位であり得る。ある特定の実施形態において、内側プライマーは、配列番号１１に記載される配列を有するポリヌクレオチドを含むかまたはそれからなる。ある特定の実施形態において、リバースプライマーは、ＴＲＡＣ配列またはＴＲＢＣ配列にアニールする。ある特定の実施形態において、リバースプライマーは、ＴＣＲα配列の保存配列にアニールする。ある特定の実施形態において、リバースプライマーは、ＴＣＲβ配列の保存配列にアニールする。ある特定の実施形態において、リバースプライマーは、ＴＣＲαおよびＴＣＲβ配列の保存配列にアニールする。ある特定の実施形態において、リバースプライマーは、ＴＲＡＣ配列の川下にある領域にアニールする。ある特定の実施形態において、リバースプライマーは、ＴＲＢＣ配列の川下に位置される領域にアニールする。ある特定の実施形態において、リバースプライマーは、ＴＣＲα配列のＶ－Ｊ－Ｃ接合領域の下流に位置される領域にアニールする。ある特定の実施形態において、リバースプライマーは、ＴＣＲβ配列のＶ－Ｄ－Ｊ－Ｃ接合領域の下流に位置される領域にアニールする。ある特定の実施形態において、予備プライマーは、ＰＣＲ１において使用されるリバースプライマーの結合領域の上流に位置される領域にアニールする。ある特定の実施形態において、リバースプライマーは、アダプター配列を含む。ある特定の非限定的な実施形態において、アダプター配列は、ＴＣＲ鋳型に対して非相同のポリヌクレオチドである。ある特定の実施形態において、アダプター配列は、さらなる増幅、例えばＰＣＲ３、のための結合部位であり得る。ある特定の実施形態において、リバースプライマーは、配列番号７～８のいずれか１つに記載される配列を有するポリヌクレオチドを含むかまたはそれからなる。ある特定の実施形態において、リバースプライマーは、配列番号１２～１３に記載される配列を有するポリヌクレオチドを含むかまたはそれからなる。配列番号１１～１３は、下記に提供される。
ＡＣＴＣＧＣＧＡＧＧＧＡＣＧＴＧＡＡＧＣＮ（４－３０）ＡＡＧＣＡＧＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＧＣＡＧＡＧＴ［配列番号１１］
ＧＡＣＡＡＡＡＣＴＧＴＧＣＴＡＧＡＣＡＴＧＡＧＧ［配列番号１２］
ＣＡＧＧＧＡＡＧＡＡＧＣＣＴＧＴＧＧＣＣＡＧＧ［配列番号１３］
ＡＣＴＣＧＣＧＡＧＧＧＡＣＧＴＧＡＡＧＣＮ（４－３０）ＡＡＧＣＡＧＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＧＣＡＧＡＧＴ［配列番号１１］
ＧＡＣＡＡＡＡＣＴＧＴＧＣＴＡＧＡＣＡＴＧＡＧＧ［配列番号１２］
ＣＡＧＧＧＡＡＧＡＡＧＣＣＴＧＴＧＧＣＣＡＧＧ［配列番号１３］
【0052】
ある特定の実施形態において、第２のＰＣＲ反応（ＰＣＲ２）は、さらに、ＮｅｏＩＤ配列を含む第２のＰＣＲ産物を生成する。プライマーの第２のセットは、ＮｅｏＩＤ鋳型上にネストされたフォワードプライマーおよびリバースプライマーを含むことができる。ある特定の実施形態において、プライマーは、アダプター配列を含む。ある特定の実施形態において、アダプター配列は、さらなる増幅、例えばＰＣＲ３、のための結合部位であり得る。ある特定の実施形態において、プライマーは、配列番号１４および１５に記載される配列を有するポリヌクレオチドを含むかまたはそれからなる。配列番号１４および１５は、下記に提供される。
ＣＣＡＧＧＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣＮ（４－３０）ＣＡＣＧＴＣＧＧＣＴＡＴＣＣＴＧＡＴＣＧＧＡＴＧＡＡＧＣＡＧＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＧＣＡＧＡＧＴ［配列番号１４］
ＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣＡＧＧＡＮ（４－３０）ＣＧＣＴＧＴＡＧＣＴＴＧＣＴＣＡＣＧＴＣＣＡＧ［配列番号１５］
ＣＣＡＧＧＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣＮ（４－３０）ＣＡＣＧＴＣＧＧＣＴＡＴＣＣＴＧＡＴＣＧＧＡＴＧＡＡＧＣＡＧＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＧＣＡＧＡＧＴ［配列番号１４］
ＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣＡＧＧＡＮ（４－３０）ＣＧＣＴＧＴＡＧＣＴＴＧＣＴＣＡＣＧＴＣＣＡＧ［配列番号１５］
【0053】
ある特定の実施形態において、第３のＰＣＲ反応（ＰＣＲ３）は、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、および／またはＮｅｏＩＤ配列を増幅することを含む。ある特定の実施形態において、第３のＰＣＲは、第２のＰＣＲ産物をプライマーの第３のセットと組み合わせて第３のＰＣＲ産物を生成することを含む。プライマーの第３のセットは、フォワードプライマーを含む。ある特定の実施形態において、フォワードプライマーは、ＴＳＯアダプター配列にアニールする。ある特定の実施形態において、フォワードプライマーは、ＴＳＯにアニールする。ある特定の実施形態において、フォワードプライマーは、ＴＳＯの川下に位置される領域にアニールする。例えば、これらに限定されるわけではないが、フォワードプライマーは、ＴＣＲリーダー配列にアニールする。ある特定の実施形態において、フォワードプライマーは、内側プライマーのアダプター配列にアニールする。例えば、これらに限定されるわけではないが、フォワードプライマーは、第２のＴＣＲ反応において使用される内側プライマーのアダプター配列にアニールする。ある特定の実施形態において、フォワードプライマーは、５’にアダプター配列を含む。ある特定の実施形態において、５’におけるアダプター配列は、ＤＮＡ配列決定システムに適合性である。ＤＮＡ配列決定システムに適合性であるアダプター配列の非限定的な例としては、Ｐ７アダプターが挙げられる。ある特定の実施形態において、フォワードプライマーは、バーコードを含む。バーコードの非限定的な例としては、ｉ７バーコードが挙げられる。ある特定の実施形態において、フォワードプライマーは、ＮｅｏＩＤ配列の第２のＰＣＲ増幅の際に加えられるアダプターにアニールする。ＮｅｏＩＤ配列の増幅のためのフォワードプライマーに関する追加情報は、実施例セクションに見出すことができる。ある特定の実施形態において、フォワードプライマーは、配列番号１８および１９に記載される配列を有するポリヌクレオチドを含むかまたはそれからなる。プライマーの第３のセットは、リバースプライマーも含む。ある特定の実施形態において、リバースプライマーは、ＴＲＡＣ配列またはＴＲＢＣ配列にアニールする。ある特定の実施形態において、リバースプライマーは、ＴＣＲα配列の保存配列にアニールする。ある特定の実施形態において、リバースプライマーは、ＴＣＲβ配列の保存配列にアニールする。ある特定の実施形態において、リバースプライマーは、ＴＣＲαおよびＴＣＲβ配列の保存配列にアニールする。ある特定の実施形態において、リバースプライマーは、ＴＲＡＣ配列の川下に位置される領域にアニールする。ある特定の実施形態において、リバースプライマーは、ＴＲＢＣ配列の川下に位置される領域にアニールする。ある特定の実施形態において、リバースプライマーは、ＴＣＲα配列のＶ－Ｊ－Ｃ接合領域の下流に位置される領域にアニールする。ある特定の実施形態において、リバースプライマーは、ＴＣＲβ配列のＶ－Ｄ－Ｊ－Ｃ接合領域の下流に位置される領域にアニールする。ある特定の実施形態において、予備プライマーは、ＰＣＲ１において使用されるリバースプライマーの結合領域の上流に位置される領域にアニールする。ある特定の実施形態において、予備プライマーは、ＰＣＲ２において使用されるリバースプライマーの結合領域の上流に位置される領域にアニールする。ある特定の実施形態において、リバースプライマーは、５’にアダプター配列を含む。ある特定の実施形態において、５’におけるアダプター配列は、ＤＮＡ配列決定システムに適合性である。ＤＮＡ配列決定システムに適合性であるアダプター配列の非限定的な例としては、Ｐ５アダプターが挙げられる。ある特定の実施形態において、フォワードプライマーは、バーコードを含む。バーコードの非限定的な例としては、ｉ５バーコードが挙げられる。ある特定の実施形態において、リバースプライマーは、ＮｅｏＩＤ配列の第２のＰＣＲ増幅の際に加えられるアダプターにアニールする。ＮｅｏＩＤ配列の増幅のためのリバースプライマーに関する追加情報は、実施例セクションに見出すことができる。ある特定の実施形態において、リバースプライマーは、配列番号１６、１７、および２０に記載される配列を有するポリヌクレオチドを含むかまたはそれからなる。
【0054】
ある特定の実施形態において、第４および第５のＰＣＲ反応（それぞれＰＣＲ４およびＰＣＲ５）は、それぞれ、第３および第４のＰＣＲ産物を使用して実施することができる。第４のＰＣＲは、第３のＰＣＲ産物をプライマーの第４のセットと組み合わせることによりアダプター配列を加えることよって実施することができ、それにより、配列決定アウトプット、または配列決定効率、例えば、ハイスループットシーケンシング（そのようなアダプター配列は、先行の工程のいずれかに組み入れることができるが）など、を向上させ得る。ある特定の実施形態において、第５のＰＣＲは、第４のＰＣＲ産物をプライマーの第４のセットと組み合わせることによりアダプター配列を加えることよって実施することができ、それにより、配列決定リーディング、例えば、ハイスループットシーケンシング（再び、そのようなアダプターは、先行の工程のいずれかに加えることができるが）など、を向上させることができる。プライマーの第４のセットは、第２および第３のＰＣＲ産物の５’配列にアニールするフォワードプライマーならびに第２および第３のＰＣＲ産物のＴＣＲ定常配列にアニールするリバースプライマーを含むことができる。
【0055】
ある特定の実施形態において、本明細書において説明される増幅工程の１つまたは複数におけるＤＮＡポリメラーゼは、約０．００１単位／μｌから約１０単位／μｌの最終濃度である。ある特定の実施形態において、ＤＮＡポリメラーゼは、約０．００１単位／μｌから約１単位／μｌの最終濃度である。ある特定の実施形態において、ＤＮＡポリメラーゼは、約０．００１単位／μｌから約０．１単位／μｌの最終濃度である。ある特定の実施形態において、ＤＮＡポリメラーゼは、約０．０１単位／μｌから約１単位／μｌの最終濃度である。ある特定の実施形態において、ＤＮＡポリメラーゼは、約０．０１単位／μｌから約０．１単位／μｌの最終濃度である。ある特定の実施形態において、ＤＮＡポリメラーゼは、約０．０２単位／μｌから約０．０８単位／μｌの最終濃度である。ある特定の実施形態において、本明細書において説明される増幅工程の１つまたは複数におけるＤＮＡポリメラーゼは、反応に加えることができる。例えば、これらに限定されるわけではないが、酵素活性および／またはＴＣＲ回収が低いように思われる場合、追加のＤＮＡポリメラーゼを、反応に補うことができる。
【0056】
ある特定の実施形態において、当該方法は、約０．０２単位／μｌの最終濃度において、ＤＮＡポリメラーゼを含む第１のＰＣＲ反応（ＰＣＲ１）を含む。ある特定の実施形態において、当該方法は、約０．０４単位／μｌの最終濃度において、ＤＮＡポリメラーゼを含む第２のＰＣＲ反応（ＰＣＲ２）を含む。ある特定の実施形態において、当該方法は、約０．０４単位／μｌの最終濃度において、ＤＮＡポリメラーゼを含む第３のＰＣＲ反応（ＰＣＲ３）を含む。ある特定の実施形態において、当該方法は、約０．０４単位／μｌの最終濃度において、ＤＮＡポリメラーゼを含む第４のＰＣＲ反応（ＰＣＲ４）を含む。ある特定の実施形態において、当該方法は、約０．０４単位／μｌの最終濃度において、ＤＮＡポリメラーゼを含む第５のＰＣＲ反応（ＰＣＲ５）を含む。
【0057】
ある特定の実施形態において、第１、第２、第３、第４、および第５のＰＣＲ反応は、拡張工程を含む。ある特定の実施形態において、第１のＰＣＲ（ＰＣＲ１）の拡張工程は、約９０秒から約６分の時間を有する。ある特定の実施形態において、第２のＰＣＲ（ＰＣＲ２）の拡張工程は、約２０秒から約１分の時間を有する。ある特定の実施形態において、第３のＰＣＲ（ＰＣＲ３）の拡張工程は、約２０秒から約１分の時間を有する。ある特定の実施形態において、第４のＰＣＲ（ＰＣＲ４）の拡張工程は、約２０秒から約１分の時間を有する。ある特定の実施形態において、第５のＰＣＲ（ＰＣＲ５）の拡張工程は、約２０秒から約１分の時間を有する。
【0058】
ある特定の実施形態において、本明細書において開示される反応のいずれかのプライマーは、約０．０１μＭから約１μＭの濃度を有することができる。ある特定の実施形態において、当該方法は、約０．０１μＭから約１μＭの濃度においてフォワードプライマーを有する第１のＰＣＲ（ＰＣＲ１）を含む。ある特定の実施形態において、当該方法は、約０．０１μＭから約１μＭの濃度においてリバースプライマーを有する第１のＰＣＲ（ＰＣＲ１）を含む。ある特定の実施形態において、当該方法は、約０．０１μＭから約１μＭの濃度においてフォワードプライマーを有する第２のＰＣＲ（ＰＣＲ２）を含む。ある特定の実施形態において、当該方法は、約０．０１μＭから約１μＭの濃度においてリバースプライマーを有する第２のＰＣＲ（ＰＣＲ２）を含む。ある特定の実施形態において、当該方法は、約０．０１μＭから約１μＭの濃度においてフォワードプライマーを有する第３のＰＣＲ（ＰＣＲ３）を含む。ある特定の実施形態において、当該方法は、約０．１μＭの濃度においてフォワードプライマーを有する第３のＰＣＲ（ＰＣＲ３）を含む。ある特定の実施形態において、当該方法は、約０．０１μＭから約１μＭの濃度においてリバースプライマーを有する第３のＰＣＲ（ＰＣＲ３）を含む。ある特定の実施形態において、当該方法は、約０．３μＭの濃度においてフォワードプライマーを有する第３のＰＣＲ（ＰＣＲ３）を含む。ある特定の実施形態において、当該方法は、約０．０１μＭから約１μＭの濃度においてフォワードプライマーを有する第４のＰＣＲ（ＰＣＲ４）を含む。ある特定の実施形態において、当該方法は、約０．０１μＭから約１μＭの濃度においてリバースプライマーを有する第４のＰＣＲ（ＰＣＲ４）を含む。ある特定の実施形態において、当該方法は、約０．０１μＭから約１μＭの濃度においてフォワードプライマーを有する第５のＰＣＲ（ＰＣＲ５）を含む。ある特定の実施形態において、当該方法は、約０．１μＭの濃度においてフォワードプライマーを有する第５のＰＣＲ（ＰＣＲ５）を含む。ある特定の実施形態において、当該方法は、約０．０１μＭから約１μＭの濃度においてリバースプライマーを有する第５のＰＣＲ（ＰＣＲ５）を含む。ある特定の実施形態において、当該方法は、約０．３μＭの濃度においてフォワードプライマーを有する第５のＰＣＲ（ＰＣＲ５）を含む。
【0059】
ある特定の実施形態において、当該方法は、次世代シーケンシング法によって配列決定することができる第３、第４、および第５のＰＣＲの産物を含む。本開示の主題内において使用することができるシーケンシングプラットフォームの非限定的な例としては、Ｒｏｃｈｅ ＧＳ ２０、Ｒｏｃｈｅ ＧＳ ＦＬＸ、Ｓｏｌｅｘａプラットフォーム、Ｓｕｐｐｏｒｔｅｄ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｌｉｇａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ（ＳＯＬｉＤ）プラットフォーム、ＨｅｌｉＳｃｏｐｅプラットフォーム、およびＯｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓプラットフォームが挙げられる。ある特定の実施形態において、当該方法は、ＴＣＲα配列およびＴＣＲβ配列のリードを得ることを含む。
【0060】
３．Ｔ細胞を解析する方法
本開示は、単一分子、例えばＴ細胞、を解析するための組成物および方法を提供する。Ｔ細胞およびＴＣＲレパートリーの理解は、パーソナライズされたオーダーメイドの療法、例えば、養子細胞移入、を改善するために有用であり得る。ある特定の実施形態において、本開示は、試料からのＴ細胞を選別することを含む。ある特定の実施形態において、Ｔ細胞を含む試料は、対象から採取される。試料は、Ｔ細胞を含む体液または組織の任意の試料であり得る。体液または組織の非限定的な例としては、血液、胸腺、脾臓、リンパ節、骨髄、腫瘍生検、または炎症性病変生検が挙げられる。ある特定の実施形態において、試料は、病理学的な部位から採取することができる。例えば、これらに限定されるわけではないが、試料は、腫瘍組織から収集することができる。ある特定の実施形態において、試料は、対象から採取された細胞、ならびにｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養において増殖した後の細胞を含み得る。
本開示は、単一分子、例えばＴ細胞、を解析するための組成物および方法を提供する。Ｔ細胞およびＴＣＲレパートリーの理解は、パーソナライズされたオーダーメイドの療法、例えば、養子細胞移入、を改善するために有用であり得る。ある特定の実施形態において、本開示は、試料からのＴ細胞を選別することを含む。ある特定の実施形態において、Ｔ細胞を含む試料は、対象から採取される。試料は、Ｔ細胞を含む体液または組織の任意の試料であり得る。体液または組織の非限定的な例としては、血液、胸腺、脾臓、リンパ節、骨髄、腫瘍生検、または炎症性病変生検が挙げられる。ある特定の実施形態において、試料は、病理学的な部位から採取することができる。例えば、これらに限定されるわけではないが、試料は、腫瘍組織から収集することができる。ある特定の実施形態において、試料は、対象から採取された細胞、ならびにｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養において増殖した後の細胞を含み得る。
【0061】
ある特定の実施形態において、Ｔ細胞は、試料から単離され選別される。ある特定の実施形態において、Ｔ細胞は、容器の別々の場所へと選別することができる。例えば、これらに限定されるわけではないが、Ｔ細胞は、マルチウェルプレート（例えば、３８４ウェルプレート）またはマイクロウェルアレイ、キャピラリーまたは管（例えば、０．２ｍＬ管）、あるいはマイクロ流体デバイスのチャンバーにおいて選別することができる。ある特定の実施形態において、Ｔ細胞は、細胞を空間的に分離するエマルション滴において選別することができる。例えば、これらに限定されるわけではないが、Ｔ細胞は、フローサイトメーターを使用して選別することができる。ある特定の実施形態において、Ｔ細胞は、選別する前に標識することができる。ある特定の実施形態において、Ｔ細胞は、Ｔ細胞タンパク質に特異的に結合する抗体（例えば、抗ＣＤ３抗体）によって標識することができる。ある特定の実施形態において、Ｔ細胞は、Ｔ細胞サブタイプ（例えば、ＣＤ８ Ｔ細胞、ＣＤ４ Ｔ細胞など）を分類するために、複数の試薬で標識することができる。ある特定の実施形態において、試料内のＴ細胞のサブセットは、単一細胞として別々の場所（例えば、別々のエマルション滴）に選別することができる。例えば、ＣＤ３＋／ＣＤ８＋のサブセットは、本明細書において開示される方法を実施するために選別することができる。ある特定の実施形態において、Ｔ細胞は、国際ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０２０／０１７８８７号、ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０２５４１５号、およびＰＣＴ／ＵＳ２０２０／０５４７３２に記載されるように選別され、なお、これらの出願のそれぞれは、参照により本明細書に組み入れられる。
【0062】
ある特定の実施形態において、Ｔ細胞は、ペプチド／ＭＨＣ複合体を使用して選別される。ある特定の実施形態において、ペプチド／ＭＨＣ複合体は、抗原ペプチド、β２－ミクログロブリン、およびＭＨＣクラスＩ重鎖を含む。ある特定の実施形態において、ペプチド／ＭＨＣ複合体は、バーコードまたはＮｅｏＩＤによって標識される。ある特定の実施形態において、ペプチド／ＭＨＣ複合体は、国際特許公開番号ＷＯ２０１９／１９５３１０に記載されるように、ｃｏｍＰＡＣＴポリペプチドであり、なお、当該仮出願の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
【0063】
ある特定の実施形態において、Ｔ細胞は、分子、例えばＲＮＡなど、を解放するために溶解される。Ｔ細胞を溶解する方法の非限定的な例としては、浸透圧衝撃、熱溶解、機械的溶解、化学的溶解、または光溶解が挙げられる。
【0064】
ある特定の実施形態において、本開示は、試料から核酸分子、例えば、ＲＮＡ分子、を単離する方法を含む。ある特定の非限定的な実施形態において、核酸分子の単離は、フェノール／クロロホルム抽出、エタノール沈殿、電気泳動、および／またはクロマトグラフィーによって実施することができる。
【0065】
ある特定の実施形態において、本開示の単一Ｔ細胞を解析するための方法は、本明細書のセクション２において説明される方法のいずれかを含む。
【0066】
ある特定の実施形態において、本開示の単一Ｔ細胞を解析する方法は、Ｔ細胞の全トランスクリプトーム解析のための方法を含む。「全トランスクリプトーム解析」は、本明細書に使用される場合、試料、例えば、単一Ｔ細胞、のトランスクリプトームの全てまたは一部の評価を意味する。ある特定の実施形態において、全トランスクリプトーム解析は、様々なＰＣＲまたは非ＰＣＲベースの方法を使用した転写物の増幅を含む。例えば、転写物、例えば、ｍＲＮＡ、ｍｉｃｒｏ－ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、およびそれらの任意の組み合わせは、複数のＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ分子など、に結合する１つまたは複数のユニバーサルプライマーを使用して増幅することができる。
【0067】
ある特定の実施形態において、本開示は、抗原ペプチドに対して特異的な単一Ｔ細胞を解析する方法を提供する。本明細書において開示される方法のある特定の実施形態において、Ｔ細胞は、最初に、ＮｅｏＩＤを含むペプチド／ＭＨＣ複合体を使用して選別される。ある特定の実施形態において、Ｔ細胞は、本明細書のセクション２において説明される方法のいずれかによって解析される。ある特定の実施形態において、本開示の単一Ｔ細胞を解析する方法は、ＴＣＲα配列、ＴＣＲβ配列、およびＮｅｏＩＤを配列決定することを含む。ある特定の実施形態において、本開示の方法は、さらに、偽陽性Ｔ細胞（例えば、抗原ペプチドに対して特異的でないＴ細胞）の除去を含む。例えば、これらに限定されるわけではないが、偽陽性Ｔ細胞は、選別されたＴ細胞に結合したＮｅｏＩＤの配列解析によって除去することができる。同じＮｅｏＩＤの複数コピーの存在は、非特異的に結合したＮｅｏＩＤと比較して、高い比率の特異的ＮｅｏＩＤバーコード種をもたらす。これは、結果として、より高いシグナル対ノイズＮｅｏＩＤ比（例えば、Ｓ／Ｎ比）を生じるであろう。ある特定の実施形態において、Ｓ／Ｎ比は、閾値を超える。ある特定の実施形態において、閾値は、約１０である。ある特定の実施形態において、非特異的Ｔ細胞は、比較的等しい数の異なるペプチド／ＭＨＣ複合体に結合し、結果として、異なるＮｅｏＩＤのより低い比を生じるであろう。ある特定の実施形態において、非特異的Ｔ細胞は、閾値未満（例えば、約１０の閾値未満）のＳ／Ｎ比を有するであろう。
【0068】
ある特定の実施形態において、選別されたＴ細胞は、２つの異なるペプチド／ＭＨＣ複合体を認識することができる。この場合、計算されたシグナル対ノイズＮｅｏＩＤ比は、閾値未満（例えば、約１０の閾値未満）であり得る。ある特定の実施形態において、第１のシグナル対ノイズＮｅｏＩＤ比（Ｓ／Ｎ１）および第２のシグナル対ノイズＮｅｏＩＤ比（Ｓ／Ｎ２）を計算することができる。
【0069】
ある特定の実施形態において、Ｓ／Ｎ１は、最も高いシグナルを２番目に高いシグナルで割ったものである。ある特定の実施形態において、Ｓ／Ｎ２は、あるペプチド／ＭＨＣ複合体における最も高いシグナルを、異なるペプチド／ＭＨＣ複合体における最も高いシグナルで割ったものである。ある特定の実施形態において、異なるペプチド／ＭＨＣ複合体における最も高いシグナルは、試料の２番目に高いシグナルではない。
【0070】
４．組成物およびキット
本開示は、本明細書において開示される方法を実施するための組成物も提供する。ある特定の実施形態において、本開示は、酵素、プライマー、バッファー、塩、および他の成分を含む。例えば、これらに限定されるわけではないが、組成物は、１つまたは複数のコントロール（例えば、ポジティブまたはネガティブコントロール）、逆転写酵素、ＴＳＯ、ｄＮＴＰ、バッファーおよび補助因子（例えば、塩、金属補助因子など）、１つまたは複数の酵素安定化成分（例えば、ＤＴＴ）、ならびに任意の他の所望の反応混合物成分を含み得る。ある特定の実施形態において、組成物は、１つまたは複数の反応管に存在し得る。
本開示は、本明細書において開示される方法を実施するための組成物も提供する。ある特定の実施形態において、本開示は、酵素、プライマー、バッファー、塩、および他の成分を含む。例えば、これらに限定されるわけではないが、組成物は、１つまたは複数のコントロール（例えば、ポジティブまたはネガティブコントロール）、逆転写酵素、ＴＳＯ、ｄＮＴＰ、バッファーおよび補助因子（例えば、塩、金属補助因子など）、１つまたは複数の酵素安定化成分（例えば、ＤＴＴ）、ならびに任意の他の所望の反応混合物成分を含み得る。ある特定の実施形態において、組成物は、１つまたは複数の反応管に存在し得る。
【0071】
本開示は、本明細書において開示される方法を実施するためのキットも提供する。ある特定の実施形態において、キットは、完全長ＴＣＲ配列を含むｃＤＮＡを調製するために使用することができる。ある特定の非限定的な実施形態において、本明細書において開示されるキットは、ｃＤＮＡ合成プライマー、例えば、オリゴ－ｄＴ、逆転写酵素、ｄＮＴＰ、バッファーおよび補助因子、プライマー、ＴＳＯ、１つまたは複数の酵素安定化成分（例えば、ＤＴＴ）、ならびに／あるいは配列決定を実施するための任意の他の試薬を含むことができる。ある特定の実施形態において、キットは、核酸源からＲＮＡを単離するための試薬を含む。
【0072】
主題のキットの成分は、別々の容器に存在し得るか、または複数の成分が、あ容器に存在し得る。例えば、これらに限定されるわけではないが、ｃＤＮＡ合成プライマーおよび逆転写酵素バッファーは、別々の容器において提供され得るか、または単一の容器において提供され得る。ある特定の実施形態において、１つまたは複数のキット成分は、成分が即座に使用でき、ならびに室温において簡便に貯蔵され得るように、凍結乾燥形態において提供される。
【0073】
上記において言及した成分に加えて、主題のキットは、さらに、例えば主題の方法を実践するためにキットの成分を使用するための取扱説明書を含み得る。主題の方法を実践するための取扱説明書は、概して、好適な記録媒体に記録される。例えば、取扱説明書は、紙またはプラスチックなどの物質上に印刷され得る。例えば、これらに限定されるわけではないが、取扱説明書は、キットまたはその成分の容器の標識（すなわち、包装または副包装に関連付けられた）などにおける添付文書としてキット中に存在し得る。ある特定の実施形態において、取扱説明書は、リモートソースから利用可能であり、例えば、ウェブサイトからダウンロードされる。
【0074】
５．Ｔ細胞産物
ある特定の実施形態において、その全体が本明細書に組み入れられるＰＣＴ／ＵＳ２０２０／１７８８７およびＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０２５４１５に記載される遺伝子編集技術およびＴＣＲ単離技術を使用することにより、本明細書において開示される方法によって識別されるＴＣＲは（上記のセクション２および３を参照されたい）、外因性ＴＣＲ（例えば、ＮｅｏＴＣＲ）を発現するように正確に操作されたゲノムによって、がんを有する同じ対象に由来する自己ＣＤ８＋およびＣＤ４＋Ｔ細胞においてクローニングすることができる。換言すると、腫瘍特異的であるかまたはがん患者において識別される、本明細書において開示される方法によって識別されたＴＣＲは、がん患者のＴ細胞に挿入される。本明細書において開示される方法によって識別されたＴ細胞発現性ＴＣＲは、次いで、Ｔ細胞の大部分がＴ記憶幹細胞およびＴ中央記憶表現型を示すような、「若い」Ｔ細胞表現型を保存する方式において拡張される。
ある特定の実施形態において、その全体が本明細書に組み入れられるＰＣＴ／ＵＳ２０２０／１７８８７およびＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０２５４１５に記載される遺伝子編集技術およびＴＣＲ単離技術を使用することにより、本明細書において開示される方法によって識別されるＴＣＲは（上記のセクション２および３を参照されたい）、外因性ＴＣＲ（例えば、ＮｅｏＴＣＲ）を発現するように正確に操作されたゲノムによって、がんを有する同じ対象に由来する自己ＣＤ８＋およびＣＤ４＋Ｔ細胞においてクローニングすることができる。換言すると、腫瘍特異的であるかまたはがん患者において識別される、本明細書において開示される方法によって識別されたＴＣＲは、がん患者のＴ細胞に挿入される。本明細書において開示される方法によって識別されたＴ細胞発現性ＴＣＲは、次いで、Ｔ細胞の大部分がＴ記憶幹細胞およびＴ中央記憶表現型を示すような、「若い」Ｔ細胞表現型を保存する方式において拡張される。
【0075】
これらの「若い」または「より若い」または分化のより少ないＴ細胞表現型は、改良された移植可能性および注入後の長期の持続性を付与すると説明される。したがって、「若い」Ｔ細胞を含むこれらのＴ細胞産物の投与は、改良された移植可能性、注入後の長期の持続性、および身体中の腫瘍細胞を根絶するためのエフェクターＴ細胞への急速な分化によって、がんを有する患者に恩恵をもたらす可能性を有する。
【0076】
ある特定の実施形態において、これらのＴ細胞産物（例えば、本明細書において開示される方法によって識別される外因性ＴＣＲを含む）の製造プロセスは、ガイドＲＮＡ配列に結合したＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ヌクレアーゼのデュアルリボ核タンパク質種のエレクトロポレーションを伴い、この場合、それぞれの種は、ゲノムＴＣＲα遺伝子座およびゲノムＴＣＲβ遺伝子座を標的にする。Ｔ細胞産物の総合的評価および精密なゲノム編集プロセスは、ＮｅｏＴＣＲ産物が注入によって患者に戻した後に良好な耐容性を示すであろうことを示している。
【0077】
本明細書において説明されるゲノム編集手法は、固形腫瘍および液性腫瘍を患う患者のためのパーソナライズされた養子細胞療法のために本明細書において開示される方法によって識別された特注のＴ細胞発現性ＴＣＲの非常に効率的な作製を可能にする。さらに、この編集方法は、Ｔ細胞における使用に制限されず、ナチュラルキラー細胞および造血幹細胞を含む他の一次細胞タイプにも首尾よく適用された。本明細書において開示される方法によって識別されるＴＣＲを使用してＴ細胞産物を作製するために使用される方法に関する追加情報は、国際特許公開番号ＷＯ２０１９／０８９６１０に見出すことができる。
【0078】
６．例示的実施形態
Ａ１．ある特定の非限定的な実施形態において、本開示は、完全長Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）配列を含むデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を調製する方法であって、ａ）逆転写酵素がｃＤＮＡ配列を生成するのに十分な条件下において、リボ核酸（ＲＮＡ）分子を、ＴＣＲコード配列の３’にあるＲＮＡ分子の領域に対して相補的なｃＤＮＡ合成プライマー、鋳型スイッチングオリゴヌクレオチド（ＴＳＯ）、および逆転写酵素と組み合わせることによってＴＣＲ相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）配列を得ること；ならびにｂ）ポリメラーゼが完全長ＴＣＲ配列を含むＤＮＡを生成するのに十分な条件下において、ｃＤＮＡを、ＴＳＯ配列へアニールする外側プライマーおよびＴＣＲ定常配列へアニールするプライマーを含む増幅プライマーの第１のセットならびにポリメラーゼと組み合わせることによって完全長ＴＣＲ配列を含むＤＮＡを調製すること、を含む方法が提供される。
Ａ１．ある特定の非限定的な実施形態において、本開示は、完全長Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）配列を含むデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を調製する方法であって、ａ）逆転写酵素がｃＤＮＡ配列を生成するのに十分な条件下において、リボ核酸（ＲＮＡ）分子を、ＴＣＲコード配列の３’にあるＲＮＡ分子の領域に対して相補的なｃＤＮＡ合成プライマー、鋳型スイッチングオリゴヌクレオチド（ＴＳＯ）、および逆転写酵素と組み合わせることによってＴＣＲ相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）配列を得ること；ならびにｂ）ポリメラーゼが完全長ＴＣＲ配列を含むＤＮＡを生成するのに十分な条件下において、ｃＤＮＡを、ＴＳＯ配列へアニールする外側プライマーおよびＴＣＲ定常配列へアニールするプライマーを含む増幅プライマーの第１のセットならびにポリメラーゼと組み合わせることによって完全長ＴＣＲ配列を含むＤＮＡを調製すること、を含む方法が提供される。
【0079】
Ａ２．さらに、完全長ＴＣＲ配列を含むＤＮＡを配列決定することを含む、Ａ１に記載の先述の方法。
【0080】
Ａ３．ＲＮＡ分子がＴ細胞を含む試料から抽出される、Ａ１に記載の先述の方法。
【0081】
Ａ４．試料が対象から採取される、Ａ３に記載の先述の方法。
【0082】
Ａ５．ｃＤＮＡ合成プライマーがオリゴ－ｄＴプライマーである、Ａ１～Ａ４のいずれか１つに記載の先述の方法。
【0083】
Ａ６．オリゴ－ｄＴプライマーが配列番号１または２に記載される配列を有するポリヌクレオチドを含む、Ａ５に記載の先述の方法。
【0084】
Ａ７．ＴＳＯが、増幅プライマー部位、バーコード、およびユニーク分子識別子（ＵＭＩ）を含む、Ａ１～Ａ６に記載の先述の方法。
【0085】
Ａ８．ＴＳＯが、配列番号３～５のいずれか１つに記載される配列を有するポリヌクレオチドを含む、Ａ１～Ａ７に記載の先述の方法。
【0086】
Ａ９．逆転写酵素が、鋳型スイッチング逆転写酵素である、Ａ１～Ａ８に記載の先述の方法。
【0087】
Ａ１０．外側プライマーが、配列番号６に記載される配列を有するポリヌクレオチドを含む、Ａ１～Ａ９のいずれか１つに記載の先述の方法。
【0088】
Ａ１１．内側プライマーが、配列番号１１に記載される配列を有するポリヌクレオチドを含む、Ａ１～Ａ１０のいずれか１つに記載の先述の方法。
【0089】
Ａ１２．ＴＣＲ定常配列にアニールするプライマーが、配列番号７、８、１２、および１３に記載される配列を有するポリヌクレオチドを含む、Ａ１～Ａ１１のいずれか１つに記載の先述の方法。
【0090】
Ａ１３．完全長ＴＣＲ配列を含むＤＮＡが、増幅プライマーの第２のセットを使用してさらに増幅され、プライマーの一方または両方が、バーコード配列を含む、Ａ１～Ａ１２のいずれか１つに記載の先述の方法。
【0091】
Ａ１４．完全長ＴＣＲ受容体が、ＴＣＲα鎖および／またはＴＣＲβ鎖を含む、Ａ１～Ａ１３のいずれか１つに記載の先述の方法。
【0092】
Ａ１５．完全長ＴＣＲ受容体が、ＴＣＲγ鎖および／またはＴＣＲδ鎖を含む、Ａ１～Ａ１３のいずれか１つに記載の先述の方法。
【0093】
Ａ１６．ｂ）が、約２０秒から約９０秒の拡張フェーズを含む、Ａ１～Ａ１５のいずれか１つに記載の先述の方法。
【0094】
Ａ１７．増幅プライマーが、約０．１μＭから約０．６μＭの濃度においてフォワードプライマーを含む、Ａ１～Ａ１６のいずれか１つに記載の先述の方法。
【0095】
Ｂ１．ある特定の非限定的な実施形態において、本開示は、Ａ１～Ａ１７のいずれか１つに記載の先述の方法によって作製されたｃＤＮＡライブラリーを提供する。
【0096】
Ｃ１．ある特定の非限定的な実施形態において、本開示は、完全長ＴＣＲ配列の核酸配列を決定するために単一Ｔ細胞を解析する方法であって、ａ）複数のＴ細胞を含む試料からの単一Ｔ細胞を選別すること；ｂ）完全長ＴＣＲ配列を含むＤＮＡを調製すること；およびｃ）完全長ＴＣＲ配列を含むＤＮＡを配列決定すること、を含む方法を提供する。
【0097】
Ｃ２．完全長ＴＣＲ配列を含むＤＮＡを調製することが、ｉ）逆転写酵素がｃＤＮＡ配列を生成するのに十分な条件下において、リボ核酸（ＲＮＡ）分子を、ＴＣＲコード配列の３’にあるＲＮＡ分子の領域に対して相補的なｃＤＮＡ合成プライマー、鋳型スイッチングオリゴヌクレオチド（ＴＳＯ）、および逆転写酵素と組み合わせることによってＴＣＲ相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）配列を得ること；ならびにｉｉ）ポリメラーゼが完全長ＴＣＲ配列を含むＤＮＡを生成するのに十分な条件下において、ｃＤＮＡを、ＴＳＯ配列へアニールする外側プライマーおよびＴＣＲ定常配列へアニールするプライマーを含む増幅プライマーの第１のセットならびにポリメラーゼと組み合わせることによって完全長ＴＣＲ配列を含むＤＮＡを調製すること、を含む、Ｃ１に記載の先述の方法。
【0098】
Ｃ３．試料が、対象から収集される、Ｃ１またはＣ２に記載の先述の方法。
【0099】
Ｃ４．ｃＤＮＡ合成プライマーが、オリゴ－ｄＴプライマーである、Ｃ１～Ｃ３のいずれか１つに記載の先述の方法。
【0100】
Ｃ５．オリゴ－ｄＴプライマーが、配列番号１または２に記載される配列を有するポリヌクレオチドを含む、Ｃ４に記載の先述の方法。
【0101】
Ｃ６．ＴＳＯが、増幅プライマー部位、識別タグ、およびユニーク分子識別子（ＵＭＩ）を含む、Ｃ１～Ｃ５のいずれか１つに記載の先述の方法。
【0102】
Ｃ７．ＴＳＯが、配列番号３～５のいずれか１つに記載される配列を有するポリヌクレオチドを含む、Ｃ１～Ｃ６のいずれか１つに記載の先述の方法。
【0103】
Ｃ８．逆転写酵素が、鋳型スイッチング逆転写酵素である、Ｃ１～Ｃ７のいずれか１つに記載の先述の方法。
【0104】
Ｃ９．外側プライマーが、配列番号６のいずれか１つに記載される配列を有するポリヌクレオチドを含む、Ｃ１～Ｃ８のいずれか１つに記載の先述の方法。
【0105】
Ｃ１０．内側プライマーが、配列番号１１に記載される配列を有するポリヌクレオチドを含む、Ｃ１～Ｃ９のいずれか１つに記載の先述の方法。
【0106】
Ｃ１１．ＴＣＲ定常配列へアニールするプライマーが、配列番号７、８、１２、および１３のいずれか１つに記載される配列を有するポリヌクレオチドを含む、Ｃ１～Ｃ１０のいずれか１つに記載の先述の方法。
【0107】
Ｃ１２．増幅プライマーが、バーコード配列を含む、Ｃ１～Ｃ１１のいずれか１つに記載の先述の方法。
【0108】
Ｃ１３．完全長ＴＣＲ受容体が、ＴＣＲα鎖および／またはＴＣＲβ鎖を含む、Ｃ１～Ｃ１２のいずれか１つに記載の先述の方法。
【0109】
Ｃ１４．完全長ＴＣＲ受容体が、ＴＣＲγ鎖および／またはＴＣＲδ鎖を含む、Ｃ１～Ｃ１２のいずれか１つに記載の先述の方法。
【0110】
Ｃ１５．ｂ）が、約２０秒から約９０秒の拡張フェーズを含む、Ｃ１～Ｃ１４のいずれか１つに記載の先述の方法。
【0111】
Ｃ１６．増幅プライマーが、約０．１μＭから約０．６μＭの濃度においてフォワードプライマーを含む、Ｃ１～Ｃ１５のいずれか１つに記載の先述の方法。
【0112】
Ｃ１７．さらに、単一Ｔ細胞の全トランスクリプトームを解析することを含む、Ｃ１～Ｃ１６のいずれか１つに記載の先述の方法。
【0113】
Ｃ１８．さらに、単一Ｔ細胞の体細胞変異または遺伝的多型を解析することを含む、Ｃ１～Ｃ１７のいずれか１つに記載の先述の方法。
【0114】
Ｃ１９．選別が、試料を複数のペプチド／ＭＨＣ複合体と接触させることを含み、各ペプチド／ＭＨＣ複合体は、関連バーコードを含む、Ｃ１～Ｃ１８のいずれか１つに記載の先述の方法。
【0115】
Ｃ２０．さらに、各ペプチド／ＭＨＣ複合体に関連するバーコードを配列決定することを含む、Ｃ１９に記載の先述の方法。
【0116】
Ｃ２１．さらに、第１のペプチド／ＭＨＣ複合体に関連する第１のバーコードと第２のペプチド／ＭＨＣ複合体に関連する第２のバーコードとの比を決定することを含む、Ｃ２０に記載の先述の方法。
【0117】
Ｃ２２．さらに、第１のバーコードと第２のバーコードの比に基づいてＴ細胞の抗原特異性を決定することを含む、Ｃ２１に記載の先述の方法。
【実施例】
【0118】
本開示の主題は、制限ではなく本開示の主題の例として提供される、以下の実施例を参照することによってより良く理解されるであろう。
【0119】
実施例１
ＴＣＲをクローニングするための従来の方法は、リバース転写ＰＣＲと、その後の、ＴＣＲα鎖のＶＪセグメントおよびＴＣＲβ鎖のＶＤＪセグメントを増幅するネステッドＰＣＲ反応の第１および第２のラウンドとの組み合わせに基づいている。これらのセグメントは、次いで、完全長ＴＣＲの再構築を可能にするために、インシリコにおいて解析される。しかしながら、これらの方法は、使用が限定される。下記の表に示されるように、ＴＣＲクローニングのおよそ１２％が、不明瞭な結果を示している。この不明瞭さは、増幅工程の際のある特定の変動をマスクすることができるプライマーの特徴に関連し得た。したがって、この制限を克服することは重要である。
ＴＣＲをクローニングするための従来の方法は、リバース転写ＰＣＲと、その後の、ＴＣＲα鎖のＶＪセグメントおよびＴＣＲβ鎖のＶＤＪセグメントを増幅するネステッドＰＣＲ反応の第１および第２のラウンドとの組み合わせに基づいている。これらのセグメントは、次いで、完全長ＴＣＲの再構築を可能にするために、インシリコにおいて解析される。しかしながら、これらの方法は、使用が限定される。下記の表に示されるように、ＴＣＲクローニングのおよそ１２％が、不明瞭な結果を示している。この不明瞭さは、増幅工程の際のある特定の変動をマスクすることができるプライマーの特徴に関連し得た。したがって、この制限を克服することは重要である。
【0120】
材料および方法：
細胞選別。細胞を、Ｔ細胞表現型およびペプチド／ＭＨＣ複合体への結合に基づいて選別した。細胞を、下記の表において説明される溶解バッファーの入った９６ウェルプレートへと選別した。細胞選別のための方法に関する追加情報は、国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０／１７８８７に見出すことができ、なお、当該特許出願の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
細胞選別。細胞を、Ｔ細胞表現型およびペプチド／ＭＨＣ複合体への結合に基づいて選別した。細胞を、下記の表において説明される溶解バッファーの入った９６ウェルプレートへと選別した。細胞選別のための方法に関する追加情報は、国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０／１７８８７に見出すことができ、なお、当該特許出願の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
【0121】
ＳＭＡＲＴ－ＴＣＲ、工程１：逆転写（ＲＴ）。
【0122】
ＲＴ反応を開始する前に、細胞および選別試薬（ｓｏｒｔｉｎｇ ｒｅａｇｅｎｔ）（上記のセクション「細胞選別」において説明されるような）を含む混合物を、加熱された蓋を備えるサーモサイクラー上に位置し、下記の表に詳述されるようにインキュベートした。
【0123】
それぞれのＲＴ反応に対して、下記の成分を単一ＰＣＲ反応に加えた。
【0124】
下記の表に詳述されるように、各反応物を加熱された蓋を備えるサーモサイクラーにおいてインキュベートした。
【0125】
ＳＭＡＲＴ－ＴＣＲ、工程２：ＰＣＲ増幅１。各反応に対して、ＴＳＯ配列においてアニールする５’増幅プライマーおよびＴＣＲの定常領域においてアニールする３’増幅プライマーを使用して、第１のＰＣＲ増幅を実施した。第１のＰＣＲ（ＰＣＲ１）において、各反応を下記のように調製した。
【0126】
Ｓ０００９およびａ００１７プライマーを、ＮｅｏＩＤのフランキング（一方は５’および一方は３’）配列を標的にするように設計した。ａ０００１およびａ０００３プライマーを、ＴＣＲ定常領域に結合するように設計した（ａ０００１は、ＴＣＲα定常領域に結合し、ａ０００３は、ＴＣＲβ定常領域に結合する）。ｓＰ２３９を、ＲＴ工程に導入されたＴＳＯ配列に結合するように設計した（ｓＰ２３８）。プライマー配列は、下記に提供される。
ｓＰ２３９：ＡＡＧＣＡＧＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＧＣＡＧＡＧＴ［配列番号６］
ａ０００１：ＧＣＣＡＣＡＧＣＡＣＴＧＴＴＧＣＴＣＴＴＧＡＡＧＴＣＣ［配列番号７］
ａ０００３：ＣＣＡＣＣＡＧＣＴＣＡＧＣＴＣＣＡＣＧＴＧ［配列番号８］
Ｓ０００９：ＣＴＣＧＣＣＡＣＧＴＣＧＧＣＴＡＴＣＣＴＧ［配列番号９］
ａ００１７：ＧＡＧＧＴＣＧＣＴＧＴＡＧＣＴＴＧＣＴＣＡＣＧ［配列番号１０］
ｓＰ２３９：ＡＡＧＣＡＧＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＧＣＡＧＡＧＴ［配列番号６］
ａ０００１：ＧＣＣＡＣＡＧＣＡＣＴＧＴＴＧＣＴＣＴＴＧＡＡＧＴＣＣ［配列番号７］
ａ０００３：ＣＣＡＣＣＡＧＣＴＣＡＧＣＴＣＣＡＣＧＴＧ［配列番号８］
Ｓ０００９：ＣＴＣＧＣＣＡＣＧＴＣＧＧＣＴＡＴＣＣＴＧ［配列番号９］
ａ００１７：ＧＡＧＧＴＣＧＣＴＧＴＡＧＣＴＴＧＣＴＣＡＣＧ［配列番号１０］
【0127】
下記の表に詳述されるように、各反応物を加熱された蓋を備えるサーモサイクラーにおいてインキュベートした。
【0128】
ＳＭＡＲＴ－ＴＣＲ、工程３：ＰＣＲ増幅２。ＴＣＲの定常領域上においてアニールするネステッド５’増幅配列プライマーおよび３’プライマーを使用することによって、ＰＣＲ１産物をさらに増幅するために、第２のＰＣＲを実施した。第２のＰＣＲにおいて、標的がＴＣＲαもしくはＴＣＲβ配列またはＮｅｏＩＤ配列であるかどうかにかかわらず、異なる条件およびプライマーを使用した。ＴＣＲα増幅に対して、各反応を下記のように調製した。
【0129】
ｓＰ２５９プライマーを、ＰＣＲ１工程からのＴＳＯ配列にアニールするように（ｓＰ２３９）、ならびに５’末端（配列番号１１のＮによって示される）に小さいアダプター配列を加えるように設計した。アダプター配列は、第３のＰＣＲ増幅工程の際にフォワードプライマーのための結合部位として機能するであろう。ＴＲＡＣ＿Ｐｒｉｍｅｒ２は、わずかに５’（内向きにネストされた）からＰＣＲ１工程で使用されるａ０００１プライマーまでのＴＣＲα定常領域に結合する。プライマー配列は、下記に提供される。
ｓＰ２５９：ＡＣＴＣＧＣＧＡＧＧＧＡＣＧＴＧＡＡＧＣＮ（４－３０）ＡＡＧＣＡＧＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＧＣＡＧＡＧＴ［配列番号１１］
ＴＲＡＣ＿Ｐｒｉｍｅｒ２：ＧＡＣＡＡＡＡＣＴＧＴＧＣＴＡＧＡＣＡＴＧＡＧＧ［配列番号１２］
ｓＰ２５９：ＡＣＴＣＧＣＧＡＧＧＧＡＣＧＴＧＡＡＧＣＮ（４－３０）ＡＡＧＣＡＧＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＧＣＡＧＡＧＴ［配列番号１１］
ＴＲＡＣ＿Ｐｒｉｍｅｒ２：ＧＡＣＡＡＡＡＣＴＧＴＧＣＴＡＧＡＣＡＴＧＡＧＧ［配列番号１２］
【0130】
ＴＣＲβ増幅に対して、各反応を下記のように調製した。
【0131】
ａＰ００４２プライマーを、わずかに５’（内向きにネストされた）からＰＣＲ１工程で使用されるａ０００３プライマーまでのＴＣＲβ定常領域に結合するように設計した。プライマー配列は、下記に提供される。
ａＰ００４２：ＣＡＧＧＧＡＡＧＡＡＧＣＣＴＧＴＧＧＣＣＡＧＧ［配列番号１３］
ａＰ００４２：ＣＡＧＧＧＡＡＧＡＡＧＣＣＴＧＴＧＧＣＣＡＧＧ［配列番号１３］
【0132】
ＴＣＲαおよびＴＣＲβ増幅のために、各反応物を、下記の表に詳述されるように、加熱された蓋を備えるサーモサイクラーにおいてインキュベートした。
【0133】
ＮｅｏＩＤ増幅のために、各反応物を下記のように調製した。
【0134】
Ｓ００１０を、第１のＰＣＲ工程におけるＳ０００９の元の結合部位からＮｅｏＩＤ鋳型上のわずかに３’（ネストされた）の領域にアニールするように設計した。ａＰ００４３を、第１のＰＣＲ工程におけるａ００１７の元の結合部位からＮｅｏＩＤ鋳型上のわずかに５’（ネストされた）の領域に結合するように設計した。Ｓ００１０およびａＰ００４３の両方は、小さなアダプター配列から、第３のＰＣＲ増幅の際にプライマー結合部位として機能するであろう５’末端（Ｓ００１０の場合）または３’末端（ａＰ００４３の場合）までを含んだ。プライマー配列は、下記に提供される。
Ｓ００１０：ＣＣＡＧＧＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣＮ（４－３０）ＣＡＣＧＴＣＧＧＣＴＡＴＣＣＴＧＡＴＣＧＧＡＴＧＡＡＧＣＡＧＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＧＣＡＧＡＧＴ［配列番号１４］
ａＰ００４３：ＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣＡＧＧＡＮ（４－３０）ＣＧＣＴＧＴＡＧＣＴＴＧＣＴＣＡＣＧＴＣＣＡＧ［配列番号１５］
Ｓ００１０：ＣＣＡＧＧＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣＮ（４－３０）ＣＡＣＧＴＣＧＧＣＴＡＴＣＣＴＧＡＴＣＧＧＡＴＧＡＡＧＣＡＧＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＧＣＡＧＡＧＴ［配列番号１４］
ａＰ００４３：ＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣＡＧＧＡＮ（４－３０）ＣＧＣＴＧＴＡＧＣＴＴＧＣＴＣＡＣＧＴＣＣＡＧ［配列番号１５］
【0135】
ＮｅｏＩＤ増幅のために、各反応物を、下記の表に詳述されるように、加熱された蓋を備えたサーモサイクラーにおいてインキュベートした。
【0136】
ＳＭＡＲＴ－ＴＣＲ、工程４：ＰＣＲ増幅３－シーケンシングアダプターの追加。
シーケンシングアダプターおよびインデックスプライマーを、ＰＣＲ増幅２における増幅された産物に加えた。ＰＣＲ増幅２において得られるＰＣＲ産物（ＰＣＲ２産物）へのアダプター追加のために、反応物を、下記のように調製した。
シーケンシングアダプターおよびインデックスプライマーを、ＰＣＲ増幅２における増幅された産物に加えた。ＰＣＲ増幅２において得られるＰＣＲ産物（ＰＣＲ２産物）へのアダプター追加のために、反応物を、下記のように調製した。
【0137】
ＴＣＲαおよびＴＣＲβのためのＰＣＲ３バーコードプライマーは、２種類のプライマーの混合物を含んだ。フォワードプライマーを、第２のＰＣＲ増幅の際に加えられたアダプター配列に結合するように（ｓＰ２５９）、ならびに、十分に特異的なバーコード（ｉ７バーコード）およびＩｌｌｕｍｉｎａ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ－ｒｅａｄｙ Ｐ７配列を加えるように設計した。リバースプライマーを、ネステッドインＴＣＲ定常領域（ＴＲＡＣ＿Ｐｒｉｍｅｒ２配列またはａＰ００４２配列からの配列５’）に結合するように、ならびに、十分に特異的なバーコード（ｉ５バーコード）およびＩｌｌｕｍｉｎａ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ－ｒｅａｄｙ Ｐ５配列を加えるように設計した。
【0138】
ＮｅｏＩＤプライマーに対して、フォワードプライマーを、第２のＰＣＲ増幅（Ｓ００１０）の際に加えられる５’アダプター配列に結合するように設計し、ならびにリバースプライマーを、第２のＰＣＲ増幅（ａＰ００４３）の際に加えられる３’アダプター配列に結合するように設計した。ＮｅｏＩＤフォワードプライマーは、十分に特異的なバーコード（ｉ７バーコード）ならびにＩｌｌｕｍｉｎａ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ－ｒｅａｄｙ Ｐ７配列を含んだ。ＮｅｏＩＤリバースプライマーは、十分に特異的なバーコード（ｉ５バーコード）ならびにＩｌｌｕｍｉｎａ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ－ｒｅａｄｙ Ｐ５配列を含んだ。第三ラウンドのＰＣＲプライマーにおいて使用されるプライマーの一般構造を、下記に提供する。
ＴＣＲα定常領域のリバースプライマー：ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣ［ｉ５バーコード］ＴＣＧＴＣＧＧＣＡＧＣＧＴＣＡＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＡＧＡＧＡＣＡＧＮ（４－３０）ＡＣＧＧＣＡＧＧＧＴＣＡＧＧＧＴＴＣＴＧ［配列番号１６］
ＴＣＲβ定常領域のリバースプライマー：ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣ［ｉ５バーコード］ＴＣＧＴＣＧＧＣＡＧＣＧＴＣＡＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＡＧＡＧＡＣＡＧＮ（４－３０）ＡＧＣＧＡＣＣＴＣＧＧＧＴＧＧＧＡＡＣ［配列番号１７］
ＴＣＲαおよびＴＣＲβのフォワードプライマー：ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡＧＡＴ［ｉ７バーコード］ＧＴＣＴＣＧＴＧＧＧＣＴＣＧＧＡＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＡＧＡＧＡＣＡＧＮ（４－３０）ＡＣＴＣＧＣＧＡＧＧＧＡＣＧＴＧＡＡＧＣ［配列番号１８］
ＮｅｏＩＤのフォワードプライマー：ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡＧＡＴ［ｉ７バーコード］ＧＴＣＴＣＧＴＧＧＧＣＴＣＧＧＡＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＡＧＡＧＡＣＡＧＮ（４－３０）ＣＣＡＧＧＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣ［配列番号１９］
ＮｅｏＩＤのリバースプライマー：ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣ［ｉ５バーコード］ＴＣＧＴＣＧＧＣＡＧＣＧＴＣＡＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＡＧＡＧＡＣＡＧＮ（４－３０）ＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣＡＧＧＡ［配列番号２０］
ＴＣＲα定常領域のリバースプライマー：ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣ［ｉ５バーコード］ＴＣＧＴＣＧＧＣＡＧＣＧＴＣＡＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＡＧＡＧＡＣＡＧＮ（４－３０）ＡＣＧＧＣＡＧＧＧＴＣＡＧＧＧＴＴＣＴＧ［配列番号１６］
ＴＣＲβ定常領域のリバースプライマー：ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣ［ｉ５バーコード］ＴＣＧＴＣＧＧＣＡＧＣＧＴＣＡＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＡＧＡＧＡＣＡＧＮ（４－３０）ＡＧＣＧＡＣＣＴＣＧＧＧＴＧＧＧＡＡＣ［配列番号１７］
ＴＣＲαおよびＴＣＲβのフォワードプライマー：ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡＧＡＴ［ｉ７バーコード］ＧＴＣＴＣＧＴＧＧＧＣＴＣＧＧＡＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＡＧＡＧＡＣＡＧＮ（４－３０）ＡＣＴＣＧＣＧＡＧＧＧＡＣＧＴＧＡＡＧＣ［配列番号１８］
ＮｅｏＩＤのフォワードプライマー：ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡＧＡＴ［ｉ７バーコード］ＧＴＣＴＣＧＴＧＧＧＣＴＣＧＧＡＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＡＧＡＧＡＣＡＧＮ（４－３０）ＣＣＡＧＧＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣ［配列番号１９］
ＮｅｏＩＤのリバースプライマー：ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣ［ｉ５バーコード］ＴＣＧＴＣＧＧＣＡＧＣＧＴＣＡＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＡＧＡＧＡＣＡＧＮ（４－３０）ＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣＡＧＧＡ［配列番号２０］
【0139】
ＴＣＲαおよびＴＣＲβ増幅（ＰＣＲ３）に対して、各反応物を、下記の表に詳述されるように、加熱された蓋を備えるサーモサイクラーにおいてインキュベートした。
【0140】
ＮｅｏＩＤ増幅（ＰＣＲ３）のために、下記の表に詳述されるように、各反応物を加熱された蓋を備えるサーモサイクラーにおいてインキュベートした。
【0141】
ＳＭＡＲＴ－ＴＣＲ、工程５：ＤＮＡ精製。
ＰＣＲ増幅３からのＰＣＲ産物をプールし、アガロース電気泳動によって分離した。ＴＣＲαおよびＴＣＲβ配列は、およそ６５０～７５０ｂｐの分子量を示し、その一方で、ＮｅｏＩＤは、２００ｂｐの分子量を示した。識別されたバンドを切断し、精製のために処理した。精製されたＤＮＡを定量化し、ならびにさらなる処理のために濃縮した。
ＰＣＲ増幅３からのＰＣＲ産物をプールし、アガロース電気泳動によって分離した。ＴＣＲαおよびＴＣＲβ配列は、およそ６５０～７５０ｂｐの分子量を示し、その一方で、ＮｅｏＩＤは、２００ｂｐの分子量を示した。識別されたバンドを切断し、精製のために処理した。精製されたＤＮＡを定量化し、ならびにさらなる処理のために濃縮した。
【0142】
ＳＭＡＲＴ－ＴＣＲ、工程６：配列決定およびデータ解析。
次いで、精製および濃縮されたＤＮＡを、ＥＱ－００５ Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｍｉｎｉ－Ｓｅｑ（登録商標）システムを使用して、ライブラリー作成および配列決定のためにさらに処理した。ＴＣＲα、ＴＣＲβ、およびＮｅｏＩＤのリードを、カスタムコンピュータパイプラインによってインシリコにおいて解析した。簡潔に説明すると、ＴＣＲ候補を識別するために、細胞は、ＴＣＲαおよびＴＣＲβ鎖を含まなければならない。次いで、ＮｅｏＩＤのシグナル対ノイズ（Ｓ／Ｎ）解析を実施し、１０以上のＮｅｏＩＤ Ｓ／Ｎ比を有するＴＣＲαおよびＴＣＲβ鎖を伴う細胞のみを選択した。ＮｅｏＩＤは、ユニークｐＨＬＡ（ペプチド－ＨＬＡ）テトラマーを標識するユニークオリゴヌクレオチド配列を意味する。異なるｐＨＬＡテトラマーのリードで除算したユニークｐＨＬＡテトラマーのリードの比は、Ｓ／Ｎ比を与え、それは、ｐＨＬＡに対するＴＣＲの特異性の推定する方法である。
次いで、精製および濃縮されたＤＮＡを、ＥＱ－００５ Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｍｉｎｉ－Ｓｅｑ（登録商標）システムを使用して、ライブラリー作成および配列決定のためにさらに処理した。ＴＣＲα、ＴＣＲβ、およびＮｅｏＩＤのリードを、カスタムコンピュータパイプラインによってインシリコにおいて解析した。簡潔に説明すると、ＴＣＲ候補を識別するために、細胞は、ＴＣＲαおよびＴＣＲβ鎖を含まなければならない。次いで、ＮｅｏＩＤのシグナル対ノイズ（Ｓ／Ｎ）解析を実施し、１０以上のＮｅｏＩＤ Ｓ／Ｎ比を有するＴＣＲαおよびＴＣＲβ鎖を伴う細胞のみを選択した。ＮｅｏＩＤは、ユニークｐＨＬＡ（ペプチド－ＨＬＡ）テトラマーを標識するユニークオリゴヌクレオチド配列を意味する。異なるｐＨＬＡテトラマーのリードで除算したユニークｐＨＬＡテトラマーのリードの比は、Ｓ／Ｎ比を与え、それは、ｐＨＬＡに対するＴＣＲの特異性の推定する方法である。
【0143】
結果：
本明細書において開示されるＳＭＡＲＴ－ＴＣＲプロトコルの性能特性を決定するために、従来のネステッドＰＣＲ手法（本明細書の以下において「臨床ｉｍＰＡＣＴ手法」）とＳＭＡＲＴ－ＴＣＲプロトコルとの間の比較を実施した。図２に示されるように、ＳＭＡＲＴ－ＴＣＲプロトコルは、ｉｍＰＡＣＴプロトコルと比較して、より高いＴＣＲ回収率、より低いＳ／Ｎ比、および減少したＮｅｏＩＤリードカウントを示した。
本明細書において開示されるＳＭＡＲＴ－ＴＣＲプロトコルの性能特性を決定するために、従来のネステッドＰＣＲ手法（本明細書の以下において「臨床ｉｍＰＡＣＴ手法」）とＳＭＡＲＴ－ＴＣＲプロトコルとの間の比較を実施した。図２に示されるように、ＳＭＡＲＴ－ＴＣＲプロトコルは、ｉｍＰＡＣＴプロトコルと比較して、より高いＴＣＲ回収率、より低いＳ／Ｎ比、および減少したＮｅｏＩＤリードカウントを示した。
【0144】
Ｓ／Ｎ比およびＮｅｏＩＤリードカウントを改善するために、ＳＭＡＲＴ－ＴＣＲプロトコルのいくつかの工程を、下記の表に従って変更した。
【0145】
図３に示されるように、ＮｅｏＩＤプライマーの量を増加することおよび拡張時間を減少させることは、ＳＭＡＲＴ－ＴＣＲプロトコルと比較して、Ｓ／Ｎ比およびＮｅｏＩＤリードカウントを向上させたが、その一方で、精製および酵素量の増加は、Ｓ／Ｎ比またはＮｅｏＩＤリードカウントを実質的に増加させなかった。
【0146】
次に、拡張時間の減少およびＮｅｏＩＤプライマーの濃度の増加が一緒に、ＴＣＲ配列のより良い回収をもたらすか否かを決定した。いかなる特定の理論に束縛されることを望むわけではないが、拡張時間の減少は、より長い拡張時間を必要とする他の競合する転写物を排除し得る。驚くべきことに、図４Ａおよび４Ｂに示されるように、この手法は、より良いＴＣＲ回収率（図４Ａ）ならびに、従来の拡張時間およびＮｅｏＩＤプライマー濃度でのＳＭＡＲＴ－ＴＣＲプロトコルと比較して著しく向上したＳ／Ｎ比およびＮｅｏＩＤリードカウント（図４Ｂ）をもたらした。
【0147】
この手法は、ヒト対象（ＬＰ３５６およびＬＰ１６９）から得られた一次細胞において再現された。さらに、ＮｅｏＩＤプライマーの量の増加および拡張時間の減少に対して、工程２での５’プライマーの量を減少させることによってＳＭＡＲＴ－ＴＣＲプロトコルを変更した（ＰＣＲ１）。図５Ａおよび５Ｂに示されるように、この新規の手法は、ＴＣＲ回収率（図５Ａ）、Ｓ／Ｎ比およびＮｅｏＩＤリードカウント（図５Ｂ）を著しく増加させた。
【0148】
最後に、ＳＭＡＲＴ－ＴＣＲプロトコルが、臨床ｉｍＰＡＣＴ手法と比較して匹敵するＨＬＡ一致ｃｏｍＰＡＣＴ分配をもたらすことが確認された（図６）。全体的に、これらのデータは、拡張時間の減少、ＮｅｏＩＤプライマー濃度の増加、および／または５’プライマー濃度の減少、を伴う差異を含む、ＳＭＡＲＴ－ＴＣＲプロトコルの予想外の優れた品質を実証している。本明細書において説明されるように、この方法は、配列がデータベースにあるか否かにかかわらず、高品質で偏りのないＴ細胞受容体の配列を提供することができる。さらに、この方法は、同じ試料からの抗原特異性の識別を可能にし、ならびに、任意のパーソナライズされた医療パイプラインに容易に適合させることができる。
【0149】
実施例２
本明細書および実施例１において開示される方法において、代替のプライマーを使用することができる。第１の選択肢（オプションＡ）において、ＴＳＯ（ｓＰ２３８）およびオリゴ－ｄＴにおけるＤＮＡ配列の一部は同じである（例えば、配列番号１～５）。あるいは（オプションＢ）、ＴＳＯおよびオリゴ－ｄＴにおけるＤＮＡ配列は異なっている。
本明細書および実施例１において開示される方法において、代替のプライマーを使用することができる。第１の選択肢（オプションＡ）において、ＴＳＯ（ｓＰ２３８）およびオリゴ－ｄＴにおけるＤＮＡ配列の一部は同じである（例えば、配列番号１～５）。あるいは（オプションＢ）、ＴＳＯおよびオリゴ－ｄＴにおけるＤＮＡ配列は異なっている。
【0150】
オプションＢにおいて、異なるオリゴ－ｄＴ配列の使用は、工程２におけるフォワードプライマー（ｓＰ２３９）および工程３におけるフォワードプライマー（ｓＰ２５９）の非結合効果を減少させる。オプションＢにおいて、ｓＰ２３８、ｓＰ２３９、およびｓＰ２５９は、同時に使用され、その場合、下記のオリゴ－ｄＴ配列のいずれかを取り替える。そのようなシナリオにおいて、下記の配列が使用される。
Ｓ－オリゴ－ｄＴ：ＡＣＧＡＧＣＡＴＣＡＧＣＡＧＣＡＴＡＣＧＡＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＶＮ［配列番号２１］
Ｗ－オリゴ－ｄＴ：ＡＴＴＣＴＡＧＡＧＧＣＣＧＡＧＧＣＧＧＣＣＧＡＣＡＴＧＮＮＮＮＮＮＮＮＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＶＮ［配列番号２２］
Ｎ－オリゴ－ｄＴ：ＡＣＴＡＴＣＴＡＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣＮＮＮＮＮＮＮＮＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＶＮ［配列番号２３］
Ｂ－オリゴ－ｄＴ：ＡＣＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴＮＮＮＮＮＮＮＮＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＶＮ［配列番号２４］
Ｋ－オリゴ－ｄＴ：ＴＡＧＡＧＧＣＣＧＡＧＧＣＧＧＣＣＧＡＣＡＴＧＮＮＮＮＮＮＮＮＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＶＮ［配列番号２５］
Ｓ－オリゴ－ｄＴ：ＡＣＧＡＧＣＡＴＣＡＧＣＡＧＣＡＴＡＣＧＡＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＶＮ［配列番号２１］
Ｗ－オリゴ－ｄＴ：ＡＴＴＣＴＡＧＡＧＧＣＣＧＡＧＧＣＧＧＣＣＧＡＣＡＴＧＮＮＮＮＮＮＮＮＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＶＮ［配列番号２２］
Ｎ－オリゴ－ｄＴ：ＡＣＴＡＴＣＴＡＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣＮＮＮＮＮＮＮＮＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＶＮ［配列番号２３］
Ｂ－オリゴ－ｄＴ：ＡＣＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴＮＮＮＮＮＮＮＮＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＶＮ［配列番号２４］
Ｋ－オリゴ－ｄＴ：ＴＡＧＡＧＧＣＣＧＡＧＧＣＧＧＣＣＧＡＣＡＴＧＮＮＮＮＮＮＮＮＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＶＮ［配列番号２５］
【0151】
ＴＳＯの主要配列、工程２のフォワードプライマー、および工程３のフォワードプライマーがある程度重なる限り、代替のＴＳＯおよびフォワードプライマー配列は、上記のオリゴ－ｄＴ配列のいずれかと相互互換的に使用される。ＴＳＯおよびフォワードプライマーは、オリゴ－ｄＴ配列に対して上記において印刷された文字に一致する文字によってグループ分けされる。各反応におけるＴＳＯおよびフォワードプライマーは、同じ文字からであり、ＤＮＡ配列においてある程度の重なりを共有する。
Ｓ－ＴＳＯ：／５ＢｉｏｓＧ／ＡＧＡＧＡＣＡＧＡＴＴＧＣＧＣＡＡＴＧＮＮＮＮＮＮＮＮｒＧｒＧｒＧ［配列番号２６］
Ｓ３－ＰＣＲ１－フォワードプライマー：ＡＧＡＧＡＣＡＧＡＴＴＧＣＧＣＡＡＴＧ［配列番号２７］
Ｓ３－ＰＣＲ２－フォワードプライマー：ＡＣＴＣＧＣＧＡＧＧＧＡＣＧＴＧＡＡＧＣ ＡＧＡＧＡＣＡＧＡＴＴＧＣＧＣＡＡＴＧ［配列番号２８］
Ｗ－ＴＳＯ：／５ＢｉｏｓＧ／ＡＴＴＣＴＡＧＡＧＧＣＣＧＡＧＧＣＧＧＣＣＧＡＣＡＴＧｒＧｒＧｒＧ［配列番号２９］
Ｗ－ＰＣＲ１－フォワードプライマー：ＡＴＴＣＴＡＧＡＧＧＣＣＧＡＧＧＣＧＧＣＣＧＡＣＡＴＧ［配列番号３０］
Ｗ－ＰＣＲ２－フォワードプライマー：ＡＣＴＣＧＣＧＡＧＧＧＡＣＧＴＧＡＡＧＣＮ（４－３０）ＡＴＴＣＴＡＧＡＧＧＣＣＧＡＧＧＣＧＧＣＣＧＡＣＡＴＧ［配列番号３１］
Ｎ－ＴＳＯ：／５ＢｉｏｓＧ／ＡＣＴＡＴＣＴＡＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣｒＧｒＧｒＧ［配列番号３２］
Ｎ－ＰＣＲ１－フォワードプライマー：ＡＣＴＡＴＣＴＡＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣ［配列番号３３］
Ｎ－ＰＣＲ２－フォワードプライマー：ＡＣＴＣＧＣＧＡＧＧＧＡＣＧＴＧＡＡＧＣＮ（４－３０）ＡＣＴＡＴＣＴＡＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣ［配列番号３４］
Ｂ－ＴＳＯ：／５ＢｉｏｓＧ／ＡＣＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴｒＧｒＧｒＧ［配列番号３５］
Ｂ－ＰＣＲ１－フォワードプライマー：ＡＣＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴ［配列番号３６］
Ｂ－ＰＣＲ２－フォワードプライマー：ＡＣＴＣＧＣＧＡＧＧＧＡＣＧＴＧＡＡＧＣＡＣＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴ［配列番号３７］
Ｋ－ＴＳＯ：／５ＢｉｏｓＧ／ＴＡＧＡＧＧＣＣＧＡＧＧＣＧＧＣＣＧＡＣＡＴＧｒＧｒＧｒＧ［配列番号３８］
Ｋ－ＰＣＲ１－フォワードプライマー：ＴＡＧＡＧＧＣＣＧＡＧＧＣＧＧＣＣＧＡＣＡＴＧ ［配列番号３９］
Ｋ－ＰＣＲ２－フォワードプライマー：ＡＣＴＣＧＣＧＡＧＧＧＡＣＧＴＧＡＡＧＣＴＡＧＡＧＧＣＣＧＡＧＧＣＧＧＣＣＧＡＣＡＴＧ［配列番号４０］
Ｓ－ＴＳＯ：／５ＢｉｏｓＧ／ＡＧＡＧＡＣＡＧＡＴＴＧＣＧＣＡＡＴＧＮＮＮＮＮＮＮＮｒＧｒＧｒＧ［配列番号２６］
Ｓ３－ＰＣＲ１－フォワードプライマー：ＡＧＡＧＡＣＡＧＡＴＴＧＣＧＣＡＡＴＧ［配列番号２７］
Ｓ３－ＰＣＲ２－フォワードプライマー：ＡＣＴＣＧＣＧＡＧＧＧＡＣＧＴＧＡＡＧＣ ＡＧＡＧＡＣＡＧＡＴＴＧＣＧＣＡＡＴＧ［配列番号２８］
Ｗ－ＴＳＯ：／５ＢｉｏｓＧ／ＡＴＴＣＴＡＧＡＧＧＣＣＧＡＧＧＣＧＧＣＣＧＡＣＡＴＧｒＧｒＧｒＧ［配列番号２９］
Ｗ－ＰＣＲ１－フォワードプライマー：ＡＴＴＣＴＡＧＡＧＧＣＣＧＡＧＧＣＧＧＣＣＧＡＣＡＴＧ［配列番号３０］
Ｗ－ＰＣＲ２－フォワードプライマー：ＡＣＴＣＧＣＧＡＧＧＧＡＣＧＴＧＡＡＧＣＮ（４－３０）ＡＴＴＣＴＡＧＡＧＧＣＣＧＡＧＧＣＧＧＣＣＧＡＣＡＴＧ［配列番号３１］
Ｎ－ＴＳＯ：／５ＢｉｏｓＧ／ＡＣＴＡＴＣＴＡＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣｒＧｒＧｒＧ［配列番号３２］
Ｎ－ＰＣＲ１－フォワードプライマー：ＡＣＴＡＴＣＴＡＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣ［配列番号３３］
Ｎ－ＰＣＲ２－フォワードプライマー：ＡＣＴＣＧＣＧＡＧＧＧＡＣＧＴＧＡＡＧＣＮ（４－３０）ＡＣＴＡＴＣＴＡＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣ［配列番号３４］
Ｂ－ＴＳＯ：／５ＢｉｏｓＧ／ＡＣＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴｒＧｒＧｒＧ［配列番号３５］
Ｂ－ＰＣＲ１－フォワードプライマー：ＡＣＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴ［配列番号３６］
Ｂ－ＰＣＲ２－フォワードプライマー：ＡＣＴＣＧＣＧＡＧＧＧＡＣＧＴＧＡＡＧＣＡＣＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴ［配列番号３７］
Ｋ－ＴＳＯ：／５ＢｉｏｓＧ／ＴＡＧＡＧＧＣＣＧＡＧＧＣＧＧＣＣＧＡＣＡＴＧｒＧｒＧｒＧ［配列番号３８］
Ｋ－ＰＣＲ１－フォワードプライマー：ＴＡＧＡＧＧＣＣＧＡＧＧＣＧＧＣＣＧＡＣＡＴＧ ［配列番号３９］
Ｋ－ＰＣＲ２－フォワードプライマー：ＡＣＴＣＧＣＧＡＧＧＧＡＣＧＴＧＡＡＧＣＴＡＧＡＧＧＣＣＧＡＧＧＣＧＧＣＣＧＡＣＡＴＧ［配列番号４０］
【0152】
本発明は、何らかの長さにおいて、およびいくつかの説明された実施形態に関する何らかの特殊性において、説明されたが、任意のそのような特殊性または実施形態または任意の特定の実施形態に限定されることを意図するものではなく、従来技術の観点からクレームの最も広い可能な解釈を提供し、結果として、本発明の意図される範囲を実質的に包含するために添付されたクレームに対する参照として解釈されるべきである。
【0153】
本明細書において言及された全ての刊行物、特許出願、特許、およびその他の参考文献は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。本明細書と相反する場合には、定義を含めて本明細書が優先する。さらに、セクション見出し、材料、方法、および実施例は、例証に過ぎず、限定を意図するものではない。
【図1A】
【図1B】
【図2】
【図3】
【図4A-4B】
【図5A-5B】
【図6】
【配列表】
【国際調査報告】