特表 2024-522795 操作されたポリメラーゼ

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-06-21

(54)【発明の名称】操作されたポリメラーゼ

(51)【国際特許分類】

   C12N 9/10 20060101AFI20240614BHJP

   C12N 15/54 20060101ALI20240614BHJP

   C12Q 1/6844 20180101ALI20240614BHJP

【ＦＩ】

C12N9/10 ZNA

C12N15/54

C12Q1/6844 Z

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023577945

(86)(22)【出願日】2022-06-17

(85)【翻訳文提出日】2024-02-14

(86)【国際出願番号】 US2022034021

(87)【国際公開番号】W WO2022266462

(87)【国際公開日】2022-12-22

(31)【優先権主張番号】17/705,043

(32)【優先日】2022-03-25

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/212,540

(32)【優先日】2021-06-18

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】17/705,011

(32)【優先日】2022-03-25

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】17/705,020

(32)【優先日】2022-03-25

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】523473143

【氏名又は名称】エレメント バイオサイエンシズ，インコーポレイティド

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本 健策

(72)【発明者】

【氏名】アンブローソ， マーク

(72)【発明者】

【氏名】ロペス， テイラー

(72)【発明者】

【氏名】クライン， マイケル

(72)【発明者】

【氏名】サーデ， バージニア

(72)【発明者】

【氏名】ケリンガー， マシュー

【テーマコード（参考）】

4B063

【Ｆターム（参考）】

4B063QR08

(57)【要約】

ポリメラーゼ触媒によるヌクレオチド伸長反応では、野生型ポリメラーゼ酵素と比較して、向上した熱安定性、３’修飾ヌクレオチドの向上した取り込み、及び改善したウラシル耐性を示す古細菌、原核生物、及び真核生物ポリメラーゼの操作されたバリアントが、本明細書に提供される。複合ポリメラーゼを形成し、結合複合体を形成し、三元複合体を形成するための操作されたポリメラーゼの使用、及び核酸配列決定反応を行うための使用も、提供される。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

操作されたポリメラーゼであって、
配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一であり、アミノ酸置換Ｄ１４１Ａ及びＥ１４３Ａを有するアミノ酸配列であって、前記操作されたポリメラーゼが、配列番号１のアミノ酸配列を有する野生型ポリメラーゼと比較して、鎖終結ヌクレオチド類似体を組み込む能力が増加している、前記アミノ酸配列を含む、前記操作されたポリメラーゼ。

【請求項2】

前記アミノ酸置換が、アミノ酸位置Ｌ４１６に追加の置換を更に含む、請求項１に記載の操作されたポリメラーゼ。

【請求項3】

前記追加の置換が、Ｌ４１６Ｓ、Ｌ４１６Ｉ、Ｌ４１６Ａ、Ｌ４１６Ｖ、またはＬ４１６Ｇである、請求項２に記載の操作されたポリメラーゼ。

【請求項4】

前記アミノ酸置換が、アミノ酸位置Ｙ４１７に追加の置換を更に含む、請求項１～３のいずれか１項に記載の操作されたポリメラーゼ。

【請求項5】

前記追加の置換が、Ｙ４１７Ａ、Ｙ４１７Ｔ、Ｙ４１７Ｇ、またはＹ４１７Ｓである、請求項２～４のいずれか１項に記載の操作されたポリメラーゼ。

【請求項6】

前記アミノ酸置換が、アミノ酸位置Ｐ４１８に追加の置換を更に含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の操作されたポリメラーゼ。

【請求項7】

前記追加の置換が、Ｐ４１８Ａ、Ｐ４１８Ｇ、またはＰ４１８Ｓである、請求項２～６のいずれか１項に記載の操作されたポリメラーゼ。

【請求項8】

前記アミノ酸置換が、アミノ酸位置Ｉ５２９に追加の置換を更に含む、請求項１～７のいずれか１項に記載の操作されたポリメラーゼ。

【請求項9】

前記追加の置換が、Ｉ５２９Ｈ、Ｉ５２９Ｔ、またはＩ５２９Ｌである、請求項２～８のいずれか１項に記載の操作されたポリメラーゼ。

【請求項10】

前記アミノ酸置換が、第１のアミノ酸位置Ｌ４１６に第１の追加の置換、及び第２のアミノ酸位置Ｙ４１７に第２の追加の置換を更に含む、請求項１～９のいずれか１項に記載の操作されたポリメラーゼ。

【請求項11】

前記第１の追加の置換が、Ｌ４１６Ｓ、Ｌ４１６Ｉ、Ｌ４１６Ａ、Ｌ４１６Ｖ、またはＬ４１６Ｇであり、前記第２の追加の置換が、Ｙ４１７Ａ、Ｙ４１７Ｔ、Ｙ４１７Ｇ、またはＹ４１７Ｓである、請求項１０に記載の操作されたポリメラーゼ。

【請求項12】

前記アミノ酸置換が、第３のアミノ酸位置Ｐ４１８に第３の追加の置換を更に含む、請求項１１に記載の操作されたポリメラーゼ。

【請求項13】

前記第３の追加の置換が、Ｐ４１８Ａ、Ｐ４１８Ｇ、またはＰ４１８Ｓである、請求項１２に記載の操作されたポリメラーゼ。

【請求項14】

前記アミノ酸置換が、第４のアミノ酸位置Ｉ５２９に第４の追加の置換を更に含む、請求項１０～１３のいずれか１項に記載の操作されたポリメラーゼ。

【請求項15】

前記第４の追加の置換が、Ｉ５２９Ｈ、Ｉ５２９Ｔ、またはＩ５２９Ｌである、請求項１４に記載の操作されたポリメラーゼ。

【請求項16】

前記アミノ酸置換が、アミノ酸位置Ｙ１０、Ｅ１４、Ｈ４８、Ｄ７５、Ｃ１０４、Ａ１１５、Ｃ１３０、Ｃ２６９、Ｄ３０５、Ｅ３２８、Ｌ４１６、Ｙ４１７、Ｐ４１８、Ａ４９３、Ｓ５００、Ｍ５０１、Ｒ５１５、Ｉ５２９、Ｎ５６７、Ａ５６８、Ｅ５６９、Ｓ５７７、Ｋ６１０、Ｎ６５７、Ｅ７００、Ｎ７０５、Ｓ７１７、Ｋ７６２、Ｇ７６３、Ｌ７６４、Ｇ７６５、Ｋ７６６、Ｑ７６７、及びＭ７６８から選択される１つ以上のアミノ酸位置に１つ以上の追加の置換を更に含む、請求項１～１５のいずれか１項に記載の操作されたポリメラーゼ。

【請求項17】

前記アミノ酸配列が、配列番号１２、１４、１８、２０、２７、３９、６６、７６、８５、８６、１１４、１１７、１１８、１２４、１２８、１２９、１３０、１３８、１６３、１６４、１８９、１９４、２０７、２２５、２３３、２３５、２８９、２９１、３１０、３１９、３２３、３３３、３５３、３４６、３６１、３６４、３６２、３６６、３９２、及び３９３から選択されるアミノ酸配列のうちの１つと少なくとも９０％同一である、請求項１～１６のいずれか１項に記載の操作されたポリメラーゼ。

【請求項18】

前記アミノ酸配列が、配列番号１２、１４、１８、２０、２７、３９、６６、７６、８５、８６、１１４、１１７、１１８、１２４、１２８、１２９、１３０、１３８、１６３、１６４、１８９、１９４、２０７、２２５、２３３、２３５、２８９、２９１、３１０、３１９、３２３、３３３、３５３、３４６、３６１、３６４、３６２、３６６、３９２、及び３９３から選択されるアミノ酸配列のうちの１つである、請求項１～１７のいずれか１項に記載の操作されたポリメラーゼ。

【請求項19】

前記アミノ酸配列が、配列番号１に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である、請求項１～１８のいずれか１項に記載の操作されたポリメラーゼ。

【請求項20】

前記アミノ酸配列が、配列番号１に記載のアミノ酸配列と少なくとも９１％同一である、請求項１～１９のいずれか１項に記載の操作されたポリメラーゼ。

【請求項21】

前記アミノ酸配列が、配列番号１に記載のアミノ酸配列と少なくとも９２％同一である、請求項１～２０のいずれか１項に記載の操作されたポリメラーゼ。

【請求項22】

前記アミノ酸配列が、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９３％同一である、請求項１～２１のいずれか１項に記載の操作されたポリメラーゼ。

【請求項23】

前記アミノ酸配列が、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９４％同一である、請求項１～２２のいずれか１項に記載の操作されたポリメラーゼ。

【請求項24】

前記アミノ酸配列が、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一である、請求項１～２３のいずれか１項に記載の操作されたポリメラーゼ。

【請求項25】

前記アミノ酸配列が、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９６％同一である、請求項１～２４のいずれか１項に記載の操作されたポリメラーゼ。

【請求項26】

前記アミノ酸配列が、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９７％同一である、請求項１～２５のいずれか１項に記載の操作されたポリメラーゼ。

【請求項27】

前記アミノ酸配列が、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９８％同一である、請求項１～２６のいずれか１項に記載の操作されたポリメラーゼ。

【請求項28】

前記アミノ酸配列が、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９９％同一である、請求項１～２７のいずれか１項に記載の操作されたポリメラーゼ。

【請求項29】

前記アミノ酸配列が、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９９．１％同一である、請求項１～２８のいずれか１項に記載の操作されたポリメラーゼ。

【請求項30】

前記アミノ酸配列が、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９９．２％同一である、請求項１～２９のいずれか１項に記載の操作されたポリメラーゼ。

【請求項31】

前記アミノ酸配列が、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９９．３％同一である、請求項１～３０のいずれか１項に記載の操作されたポリメラーゼ。

【請求項32】

前記アミノ酸配列が、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９９．４％同一である、請求項１～３１のいずれか１項に記載の操作されたポリメラーゼ。

【請求項33】

前記アミノ酸配列が、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９９．５％同一である、請求項１～３２のいずれか１項に記載の操作されたポリメラーゼ。

【請求項34】

前記アミノ酸配列が、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９９．６％同一である、請求項１～３３のいずれか１項に記載の操作されたポリメラーゼ。

【請求項35】

前記アミノ酸配列が、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９９．７％同一である、請求項１～３４のいずれか１項に記載の操作されたポリメラーゼ。

【請求項36】

前記アミノ酸配列が、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９９．８％同一である、請求項１～３５のいずれか１項に記載の操作されたポリメラーゼ。

【請求項37】

前記アミノ酸置換が、配列番号２７１のアミノ酸配列に特定されるパームドメイン内の追加の置換を更に含む、請求項１～３６のいずれか１項に記載の操作されたポリメラーゼ。

【請求項38】

前記アミノ酸置換が、配列番号２７３のアミノ酸配列に特定されるパームドメイン内の追加の置換を更に含む、請求項１～３７のいずれか１項に記載の操作されたポリメラーゼ。

【請求項39】

前記アミノ酸置換が、前記操作されたポリメラーゼの３’～５’エキソヌクレアーゼ活性を除去する、請求項１～３８のいずれか１項に記載の操作されたポリメラーゼ。

【請求項40】

前記操作されたポリメラーゼが、配列番号１のアミノ酸配列を有する野生型ポリメラーゼと比較して、増加した熱安定性を示す、請求項１～３９のいずれか１項に記載の操作されたポリメラーゼ。

【請求項41】

前記操作されたポリメラーゼが、配列番号１のアミノ酸配列を有する前記野生型ポリメラーゼと比較して、増加した取り込み率を示す、請求項１～４０のいずれか１項に記載の操作されたポリメラーゼ。

【請求項42】

前記増加した平均取り込み率が、配列番号１のアミノ酸配列を有する前記野生型ポリメラーゼの平均取り込み率の少なくとも５倍である、請求項１～４１のいずれか１項に記載の操作されたポリメラーゼ。

【請求項43】

前記増加した平均取り込み率が、配列番号１のアミノ酸配列を有する前記野生型ポリメラーゼの平均取り込み率の少なくとも１０倍である、請求項１～４２のいずれか１項に記載の操作されたポリメラーゼ。

【請求項44】

前記増加した平均取り込み率が、配列番号１のアミノ酸配列を有する前記野生型ポリメラーゼの平均取り込み率の少なくとも２０倍である、請求項１～４３のいずれか１項に記載の操作されたポリメラーゼ。

【請求項45】

前記増加した平均取り込み率が、配列番号１のアミノ酸配列を有する前記野生型ポリメラーゼの平均取り込み率の少なくとも５０倍である、請求項１～４４のいずれか１項に記載の操作されたポリメラーゼ。

【請求項46】

前記操作されたポリメラーゼが、配列番号１のアミノ酸配列を有する前記野生型ポリメラーゼと比較して、糖部分の２’位または３’位に鎖終結部分を含むヌクレオチド類似体の増加した取り込み率を示す、請求項１～４５のいずれか１項に記載の操作されたポリメラーゼ。

【請求項47】

前記操作されたポリメラーゼが、配列番号１のアミノ酸配列を有する前記野生型ポリメラーゼと比較して、増加したウラシル耐性を示す、請求項１～４６のいずれか１項に記載の操作されたポリメラーゼ。

【請求項48】

組成物であって、
請求項１～４７のいずれか１項に記載の１つ以上の操作されたポリメラーゼと、
１つ以上の核酸鋳型分子と、
３’伸長可能な末端を有するヌクレオチド重合開始部位を含む１つ以上の分子と、を含む、前記組成物。

【請求項49】

前記１つ以上の核酸鋳型分子が、線形核酸分子または環状核酸分子である、請求項４８に記載の組成物。

【請求項50】

前記１つ以上の核酸鋳型分子が、クローン増幅された鋳型分子を含む、請求項４８または４９のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項51】

前記１つ以上の核酸鋳型分子の各々が、関心対象の標的配列の１つのコピー、または関心対象の標的配列の２つ以上のタンデムコピーを有するコンカテマーを含む、請求項４８～５０のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項52】

ヌクレオチド重合開始部位を含む前記１つ以上の分子が、前記核酸鋳型分子の一部にハイブリダイズする核酸プライマーを含むか、またはヌクレオチド重合開始部位を含む前記１つ以上の分子が、前記核酸鋳型分子の自己プライミング末端部分を含む、請求項４８～５１のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項53】

前記１つ以上の操作されたポリメラーゼ、前記１つ以上の核酸鋳型分子、及び前記１つ以上のヌクレオチド重合開始部位が、１つ以上の複合ポリメラーゼを形成し、各複合ポリメラーゼが、
核酸二本鎖に結合した前記操作されたポリメラーゼを含み、前記二本鎖が、核酸プライマーにハイブリダイズする前記核酸鋳型分子のうちの１つを含む、請求項４８～５２のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項54】

前記１つ以上の核酸鋳型分子が、同じ関心対象の標的配列または異なる関心対象の標的配列を含む、請求項４８～５３のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項55】

前記１つ以上の複合ポリメラーゼが、多価分子を更に含み、前記多価分子が、
（ａ）コアと、
（ｂ）複数のヌクレオチドアームであって、各々が、
（ｉ）コア結合部分、
（ｉｉ）スペーサー、
（ｉｉｉ）リンカー、及び
（ｉｖ）ヌクレオチド単位を含む、前記複数のヌクレオチドアームと、を含む、請求項４８～５４のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項56】

前記コアが、前記コア結合部分を介して前記ヌクレオチドアームの各々に結合し、前記コア結合部分が、前記スペーサーに結合し、前記スペーサーが、前記リンカーに結合し、前記リンカーが、前記ヌクレオチド単位に結合する、請求項５５に記載の組成物。

【請求項57】

前記リンカーが、２～６個のサブユニットを有する脂肪族鎖、または２～６個のサブユニットを有するオリゴエチレングリコール鎖を含む、請求項５５または５６のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項58】

前記複数のヌクレオチドアームが、前記コア結合部分を介して前記コアに結合し、前記コアに結合した前記ヌクレオチドアームの各々が、同じ種類のヌクレオチド単位を有し、前記ヌクレオチド単位が、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、またはｄＵＴＰを含む、請求項５５～５７のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項59】

前記１つ以上の多価分子が、１つの種類の多価分子を含み、前記多価分子の各種類が、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、及びｄＵＴＰからなる群から選択される同じ種類のヌクレオチド単位を有する、請求項５５～５８のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項60】

前記１つ以上の多価分子が、２つ以上の種類の多価分子を含み、前記多価分子の各種類が、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、及びｄＵＴＰからなる群から選択される同じ種類のヌクレオチド単位を有する、請求項５５～５９のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項61】

前記１つ以上の多価分子中の少なくとも１つの多価分子が、フルオロフォアで標識される、請求項５５～６０のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項62】

前記１つ以上の複合ポリメラーゼが、複数のヌクレオチドを更に含み、前記複数のヌクレオチド中のヌクレオチドが、芳香族塩基、５炭素糖、及び１～１０個のリン酸基を含む、請求項５３～６１のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項63】

前記複数のヌクレオチドが、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、及びｄＵＴＰからなる群から選択される１つの種類のヌクレオチドを含む、請求項６２に記載の組成物。

【請求項64】

前記複数のヌクレオチドが、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、及び／またはｄＵＴＰからなる群から選択される２つ以上の種類のヌクレオチドを含む、請求項６２または６３のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項65】

前記複数のヌクレオチドのうちの少なくとも１つのヌクレオチドが、フルオロフォアで標識される、請求項６１～６４のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項66】

前記複数のヌクレオチドが、フルオロフォア標識を欠く、請求項６１～６４のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項67】

前記複数のヌクレオチド中の前記ヌクレオチドのうちの少なくとも１つが、糖基の３’炭素位に結合した除去可能な鎖終結部分を含み、前記除去可能な鎖終結部分が、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリル基、アリール基、ベンジル基、アジド（ａｚｉｄｅ）基、アジド（ａｚｉｄｏ）基、Ｏ－アジドメチル基、アミン基、アミド基、ケト基、イソシアネート基、リン酸基、チオ基、ジスルフィド基、炭酸基、尿素基、またはシリル基を含み、前記除去可能な鎖終結部分が、前記糖基上に伸長可能な３’ＯＨ部分を生成するために化学化合物を用いて開裂可能である、請求項６１～６６のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項68】

前記１つ以上の複合ポリメラーゼが、ポリメラーゼ触媒によるヌクレオチドの取り込みを阻害する複数の非触媒二価カチオンを更に含み、前記非触媒二価カチオンが、ストロンチウムまたはバリウムを含む、請求項５３～６７のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項69】

前記１つ以上の複合ポリメラーゼが、ポリメラーゼ触媒によるヌクレオチドの取り込みを促進する複数の触媒二価カチオンを更に含み、前記触媒二価カチオンが、マグネシウムまたはマンガンを含む、請求項５３～６８のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項70】

前記１つ以上の複合ポリメラーゼが、支持体に固定化されるか、または前記支持体上のコーティングに固定化される、請求項５３～６９のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項71】

前記支持体に固定化された前記１つ以上の複合ポリメラーゼの密度が、１ｍｍ^２当たり１０^２～１０^９である、請求項５３～７０のいずれか１項に記載の操作されたポリメラーゼ。

【請求項72】

前記１つ以上の固定化された複合ポリメラーゼが、前記支持体上の所定の部位に固定化されるか、または前記支持体上のランダムな部位に固定化される、請求項７０または７１のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項73】

前記コーティングが、少なくとも４つの分岐を有する分岐ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む少なくとも１つの親水性ポリマーコーティング層を含む、請求項７０～７２のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項74】

前記親水性ポリマーコーティングが、４５度以下の水接触角を有する、請求項７３に記載の組成物。

【請求項75】

前記１つ以上の固定化された複合ポリメラーゼが互いに流体連通して、前記支持体上の前記１つ以上の固定化された複合ポリメラーゼが、試薬の溶液と超並列方法で反応するように、前記試薬の溶液を前記支持体上に流すことを可能にする、請求項７０～７４のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項76】

前記１つ以上の複合ポリメラーゼが、第１及び第２の結合複合体を更に含み、
（１）前記第１の結合複合体が、第１の核酸プライマー、第１の操作されたポリメラーゼ、及びコンカテマー鋳型分子の第１の部分に結合し、それによって前記第１の結合複合体を形成する第１の多価分子を含み、前記多価分子の第１のヌクレオチド単位が、前記第１の操作されたポリメラーゼに結合し、
（２）前記第２の結合複合体が、第２の核酸プライマー、第２の操作されたポリメラーゼ、及び同じコンカテマー鋳型分子の第２の部分に結合し、それによって前記第２の結合複合体を形成する前記第１の多価分子を含み、前記第１の多価分子の第２のヌクレオチド単位が、前記第２の操作されたポリメラーゼに結合し、
前記第１及び第２の結合複合体が、同じ第１の多価分子を含み、親和性複合体を形成する、請求項５５～７６のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項77】

１つ以上の複合ポリメラーゼを形成する方法であって、
１つ以上の操作されたポリメラーゼを、（ｉ）１つ以上の核酸鋳型分子及び（ｉｉ）１つ以上の核酸プライマーと接触させて、前記１つ以上の複合ポリメラーゼを形成することを含み、前記複合ポリメラーゼのうちの少なくとも１つが、核酸二本鎖に結合した操作されたポリメラーゼを含み、前記核酸二本鎖が、核酸プライマーにハイブリダイズする核酸鋳型分子を含み、
前記１つ以上の操作されたポリメラーゼが、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一であり、置換Ａｓｐ１４１Ａｌａ及びＧｌｕ１４３Ａｌａを有するアミノ酸配列を含む、前記方法。

【請求項78】

前記１つ以上の核酸鋳型分子が、線形核酸分子、環状核酸分子、または線形核酸分子及び環状核酸分子の混合物である、請求項７７に記載の方法。

【請求項79】

前記１つ以上の核酸鋳型分子が、クローン増幅された鋳型分子を含む、請求項７７または７８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項80】

前記核酸分子のうちの少なくとも１つが、関心対象の標的配列のコピー、または関心対象の標的配列の２つ以上のタンデムコピーを有するコンカテマーを含む、請求項７７～７９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項81】

前記１つ以上の核酸分子が、複数の核酸分子であり、前記複数の核酸分子が、同じ関心対象の標的配列または異なる関心対象の標的配列を含む、請求項７７～８０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項82】

前記１つ以上の複合ポリメラーゼを１つ以上の多価分子と接触させることを更に含み、前記多価分子のうちの少なくとも１つが、
（ａ）コアと、
（ｂ）複数のヌクレオチドアームと、を含み、前記ヌクレオチドアームのうちの少なくとも１つが、
（ｉ）コア結合部分、
（ｉｉ）スペーサー、
（ｉｉｉ）リンカー、及び
（ｉｖ）ヌクレオチド単位を含み、
前記コアが、前記コア結合部分を介して前記ヌクレオチドアームのうちの前記少なくとも１つに結合し、前記スペーサーが、前記リンカーに結合し、前記リンカーが、前記ヌクレオチド単位に結合する、請求項７７～８１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項83】

前記リンカーが、２～６個のサブユニットを有する脂肪族鎖、または２～６個のサブユニットを有するオリゴエチレングリコール鎖を含む、請求項８２に記載の方法。

【請求項84】

前記複数のヌクレオチドアームが、同じ種類のヌクレオチド単位を有し、前記ヌクレオチド単位が、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、及びｄＵＴＰからなる群から選択される、請求項８２または８３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項85】

前記１つ以上の多価分子が、１つの種類の多価分子を含み、各多価分子が、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、及びｄＵＴＰからなる群から選択される同じ種類のヌクレオチド単位を含む、請求項８２～８５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項86】

前記１つ以上の多価分子が、２つ以上の種類の多価分子を含み、前記２つ以上の種類の多価分子が、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、及び／またはｄＵＴＰからなる群から選択される２つ以上の種類のヌクレオチド単位を含む、請求項８２～８５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項87】

前記１つ以上の多価分子中の少なくとも１つの多価分子が、フルオロフォアで標識される、請求項８２～８６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項88】

前記接触させることが、前記１つ以上の多価分子の相補的ヌクレオチド単位が、前記複合ポリメラーゼのうちの１つ以上に結合するのに好適な条件下で行われる、請求項８２～８８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項89】

前記１つ以上の複合ポリメラーゼを、ポリメラーゼ触媒によるヌクレオチドの取り込みを阻害する１つ以上の非触媒二価カチオンと接触させることを更に含み、前記非触媒二価カチオンが、ストロンチウムまたはバリウムを含む、請求項８２～８８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項90】

前記１つ以上の複合ポリメラーゼを１つ以上のヌクレオチド単位と接触させることを更に含み、前記ヌクレオチド単位のうちの少なくとも１つが、芳香族塩基、５炭素糖、及び１～１０個のリン酸基を含む、請求項７７～８９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項91】

前記１つ以上のヌクレオチド単位が、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、及びｄＵＴＰからなる群から選択される１つの種類のヌクレオチド単位を含む、請求項９０に記載の方法。

【請求項92】

前記１つ以上のヌクレオチド単位が、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、及び／またはｄＵＴＰからなる群から選択される２つ以上の種類のヌクレオチド単位の任意の組み合わせの混合物を含む、請求項９０に記載の方法。

【請求項93】

前記１つ以上のヌクレオチド単位のうちの少なくとも１つが、フルオロフォアで標識される、請求項９０～９２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項94】

前記１つ以上のヌクレオチド単位が、フルオロフォア標識を欠いている、請求項９０～９２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項95】

前記１つ以上のヌクレオチド単位のうちの少なくとも１つが、糖基の３’炭素位に結合した除去可能な鎖終結部分を含み、前記除去可能な鎖終結部分が、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリル基、アリール基、ベンジル基、アジド（ａｚｉｄｅ）基、アジド（ａｚｉｄｏ）基、Ｏ－アジドメチル基、アミン基、アミド基、ケト基、イソシアネート基、リン酸基、チオ基、ジスルフィド基、炭酸基、尿素基、またはシリル基を含み、前記除去可能な鎖終結部分が、前記糖基上に伸長可能な３’ＯＨ部分を生成するために化学化合物を用いて開裂可能である、請求項９０～９４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項96】

前記１つ以上の複合ポリメラーゼを１つ以上のヌクレオチド単位と前記接触させることが、前記１つ以上のヌクレオチド単位の相補的ヌクレオチド単位が、前記１つ以上の複合ポリメラーゼに結合するのに好適な条件下で行われる、請求項９０～９５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項97】

前記１つ以上の操作されたポリメラーゼが、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であり、置換Ａｓｐ１４１Ａｌａ及びＧｌｕ１４３Ａｌａを有するアミノ酸配列を含む、請求項７７～９６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項98】

前記１つ以上の複合ポリメラーゼを、ポリメラーゼ触媒によるヌクレオチドの取り込みを促進する１つ以上の触媒二価カチオンと接触させることを更に含み、前記触媒二価カチオンが、マグネシウムまたはマンガンを含む、請求項９０～９７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項99】

前記１つ以上の複合ポリメラーゼが、支持体に固定化されるか、または前記支持体上のコーティングに固定化される、請求項７７～９８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項100】

前記支持体に固定化された前記１つ以上の複合ポリメラーゼの密度が、１ｍｍ^２当たり１０^２～１０^９である、請求項９９に記載の方法。

【請求項101】

前記１つ以上の固定化された複合ポリメラーゼが、前記支持体上の所定の部位に固定化されるか、または前記支持体上のランダムな部位に固定化される、請求項９９または１００のいずれか１項に記載の方法。

【請求項102】

前記コーティングが、少なくとも４つの分岐を有する分岐ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む少なくとも１つの親水性ポリマーコーティング層を含む、請求項９９～１０１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項103】

前記親水性ポリマーコーティングが、４５度以下の水接触角を有する、請求項１０２に記載の方法。

【請求項104】

前記１つ以上の固定化された複合ポリメラーゼが互いに流体連通して、前記支持体上の前記１つ以上の固定化された複合ポリメラーゼが、試薬の溶液と超並列方法で反応するように、前記試薬の溶液を前記支持体上に流すことを可能にする、請求項９９～１０３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項105】

第１の結合複合体及び第２の結合複合体を形成することを更に含み、前記第１及び第２の結合複合体を形成することが、
ａ）第１の核酸プライマー、第１の操作されたポリメラーゼ、及び第１の多価分子をコンカテマー鋳型分子の第１の部分に結合し、それによって前記第１の結合複合体を形成することであって、前記第１の多価分子の第１のヌクレオチド単位が、前記第１の操作されたポリメラーゼに結合する、前記形成することと、
ｂ）第２の核酸プライマー、第２の操作されたポリメラーゼ、及び前記第１の多価分子を同じコンカテマー鋳型分子の第２の部分に結合し、それによって前記第２の結合複合体を形成することであって、前記第１の多価分子の第２のヌクレオチド単位が、前記第２の操作されたポリメラーゼに結合する、前記形成することと、を含み、
同じ多価分子を含む前記第１及び第２の結合複合体が、親和性複合体を形成する、請求項８２～１０４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項106】

核酸配列決定を実施するための方法であって、
（ａ）第１のセットの操作されたポリメラーゼを、（ｉ）複数の核酸鋳型分子、及び（ｉｉ）複数の核酸プライマーと接触させることであって、
前記接触させることが、前記操作されたポリメラーゼが核酸鋳型分子及び前記核酸プライマーに結合するのに好適な条件下で行われ、それによって、第１のセットの複合ポリメラーゼを形成し、前記第１のセットの複合ポリメラーゼの各々が、核酸二本鎖に結合した前記操作されたポリメラーゼを含み、
前記核酸二本鎖が、前記核酸プライマーのうちの１つにハイブリダイズする前記核酸鋳型分子のうちの１つを含み、
前記操作されたポリメラーゼが、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一であり、アミノ酸置換Ａｓｐ１４１Ａｌａ及びＧｌｕ１４３Ａｌａを有するアミノ酸配列を含む、前記接触させることと、
（ｂ）第１のセットの多価結合複合体を形成するために、前記第１のセットの複合ポリメラーゼを、複数の多価分子と接触させることであって、
前記複数の多価分子中の各多価分子が、複数のヌクレオチドアームに結合するコアを含み、
各ヌクレオチドアームが、ヌクレオチド単位に結合し、
前記接触させることが、
前記多価分子の相補的ヌクレオチド単位を前記第１のセットの複合ポリメラーゼのうちの少なくとも２つに結合し、それによって第１のセットの多価結合複合体を形成することと、
前記第１のセットの多価結合複合体の核酸プライマーへの各多価分子の相補的ヌクレオチドの取り込みを阻害することと、に好適な条件下で行われる、前記接触させることと、
（ｃ）前記第１セットの多価結合複合体を検出することと、
（ｄ）前記第１セットの多価結合複合体内の前記相補的ヌクレオチドのヌクレオチド塩基を識別し、それによって前記核酸鋳型分子の配列を決定することと、を含む、前記方法。

【請求項107】

（ｅ）前記第１のセットの多価結合複合体を解離することであって、前記解離することが、
前記第１のセットの操作されたポリメラーゼ及びそれらの結合した多価分子を除去することと、
前記複数の核酸二本鎖を保持することと、を含む、前記解離することと、
（ｆ）前記複数の前記保持した核酸二本鎖を、第２のセットの操作されたポリメラーゼが前記複数の前記保持した核酸二本鎖に結合し、それによって第２のセットの複合ポリメラーゼを形成するのに好適な条件下で、前記第２のセットの操作されたポリメラーゼと接触させることであって、
各複合ポリメラーゼが、核酸二本鎖に結合した第２の操作されたポリメラーゼを含み、
前記第２のセットの操作されたポリメラーゼが、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一であり、アミノ酸置換Ａｓｐ１４１Ａｌａ及びＧｌｕ１４３Ａｌａを有するアミノ酸配列を含む、前記接触させることと、
（ｇ）前記第２のセットの複合ポリメラーゼを複数のヌクレオチド単位と接触させることであって、
前記接触させることが、相補的ヌクレオチド単位を前記第２のセットの複合ポリメラーゼのうちの少なくとも２つに結合し、それによって複数のヌクレオチド結合複合体を形成させるのに好適な条件下で行われ、
前記条件が、前記ヌクレオチド結合複合体の前記プライマーへの前記結合した相補的ヌクレオチド単位のヌクレオチドの取り込みを促進するのに好適である、前記接触させることと、を更に含む、請求項１０６に記載の方法。

【請求項108】

（ｈ）前記複数のヌクレオチド結合複合体内の前記相補的ヌクレオチド単位を検出することを更に含む、請求項１０７に記載の方法。

【請求項109】

（ｉ）前記複数のヌクレオチド結合複合体内の前記相補的ヌクレオチド単位のヌクレオチド塩基を識別することを更に含む、請求項１０６～１０８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項110】

前記第１のセットの複合ポリメラーゼを、ステップ（ｂ）の前記複数の多価分子と前記接触させることが、ポリメラーゼ触媒によるヌクレオチドの取り込みを阻害する非触媒二価カチオンの存在下で行われ、前記非触媒二価カチオンが、ストロンチウムまたはバリウムを含む、請求項１０６～１０９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項111】

前記第２のセットの複合ポリメラーゼを、ステップ（ｇ）の前記複数のヌクレオチド単位と前記接触させることが、ポリメラーゼ触媒によるヌクレオチドの取り込みを促進する触媒二価カチオンの存在下で行われ、前記触媒二価カチオンが、マグネシウムまたはマンガンを含む、請求項１０７～１１０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項112】

ステップ（ａ）の前記複数の核酸鋳型分子が、クローン増幅された鋳型分子を含む、請求項１０６～１１１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項113】

ステップ（ａ）の前記複数の核酸鋳型分子中の前記核酸鋳型分子のうちの少なくとも１つが、関心対象の標的配列のコピーを含むか、または関心対象の標的配列の２つ以上のタンデムコピーを有するコンカテマーを含む、請求項１０６～１１２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項114】

ステップ（ａ）の前記複数の核酸鋳型分子が、同じ標的配列または異なる標的配列を含む、請求項１０６～１１３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項115】

前記多価分子のうちの少なくとも１つの前記ヌクレオチドアームのうちの少なくとも１つが、
（ｉ）コア結合部分、
（ｉｉ）スペーサー、及び
（ｉｉｉ）リンカー、を含み、
前記多価分子のうちの前記少なくとも１つの前記コアが、前記コア結合部分を介して前記ヌクレオチドアームのうちの少なくとも１つに結合し、前記スペーサーが、前記リンカーに結合し、前記リンカーが、前記ヌクレオチドアームのうちの前記少なくとも１つによって担持される前記ヌクレオチド単位に結合する、請求項１０６～１１４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項116】

前記リンカーが、２～６個のサブユニットを有する脂肪族鎖、または２～６個のサブユニットを有するオリゴエチレングリコール鎖を含む、請求項１１５に記載の方法。

【請求項117】

前記多価分子のうちの前記少なくとも１つの前記コアに結合した前記複数のヌクレオチドアームが、同じ種類のヌクレオチド単位を有し、前記ヌクレオチド単位が、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、及びｄＵＴＰからなる群から選択される、請求項１１５または１１６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項118】

前記複数の多価分子が、１つの種類の多価分子を含み、各多価分子が、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、及びｄＵＴＰからなる群から選択される１つの種類のヌクレオチド単位を含む、請求項１１５～１１７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項119】

前記複数の多価分子が、２つ以上の種類の多価分子を含み、前記２つ以上の種類の多価分子が、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、及び／またはｄＵＴＰから選択される２つ以上の種類のヌクレオチド単位を含む、請求項１１５～１１８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項120】

前記複数の多価分子中の少なくとも１つの多価分子が、フルオロフォアで標識される、請求項１０６～１１９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項121】

ステップ（ａ）及び（ｂ）における前記接触させることが、２５～７５℃の等温温度で行われる、請求項１０６～１２０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項122】

ステップ（ｃ）の前記検出すること及びステップ（ｄ）の前記識別することが、２５～７５℃の等温温度で行われる、請求項１０６～１２１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項123】

ステップ（ｇ）の前記複数のヌクレオチド単位のうちの少なくとも１つが、芳香族塩基、５炭素糖、及び１～１０個のリン酸基を含む、請求項１０７～１２３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項124】

ステップ（ｇ）の前記複数のヌクレオチド単位が、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、またはｄＵＴＰからなる群から選択される１つの種類のヌクレオチド単位を含むか、またはｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、及び／またはｄＵＴＰからなる群から選択される２つ以上の種類のヌクレオチド単位の任意の組み合わせの混合物を含む、請求項１０７～１２３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項125】

ステップ（ｇ）の前記複数のヌクレオチド単位のうちの少なくとも１つが、フルオロフォアで標識される、請求項１０７～１２４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項126】

ステップ（ｇ）の前記複数のヌクレオチド単位が、フルオロフォア標識を欠く、請求項１０７～１２５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項127】

ステップ（ｇ）の前記複数のヌクレオチド単位のうちの少なくとも１つが、糖基の３’炭素位に結合した除去可能な鎖終結部分を含み、前記除去可能な鎖終結部分が、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリル基、アリール基、ベンジル基、アジド（ａｚｉｄｅ）基、アジド（ａｚｉｄｏ）基、Ｏ－アジドメチル基、アミン基、アミド基、ケト基、イソシアネート基、リン酸基、チオ基、ジスルフィド基、炭酸基、尿素基、またはシリル基を含み、前記除去可能な鎖終結部分が、前記糖基上に伸長可能な３’ＯＨ部分を生成するために化学化合物を用いて開裂可能である、請求項１０７～１２６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項128】

ステップ（ａ）の前記第１のセットの複合ポリメラーゼが、支持体に固定化されるか、または前記支持体上のコーティングに固定化される、請求項１０６～１２７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項129】

前記支持体に固定化された前記第１のセットの複合ポリメラーゼの密度が、１ｍｍ^２当たり１０^２～１０^９である、請求項１２８に記載の方法。

【請求項130】

前記第１のセットの複合ポリメラーゼが、前記支持体上の所定の部位に固定化されるか、または前記支持体上のランダムな部位に固定化される、請求項１２８または１２９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項131】

前記コーティングが、少なくとも４つの分岐を有する分岐ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む少なくとも１つの親水性ポリマーコーティング層を含む、請求項１２８～１３０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項132】

前記親水性ポリマーコーティングが、４５度以下の水接触角を有する、請求項１３１に記載の方法。

【請求項133】

前記第１のセットの固定化された複合ポリメラーゼが互いに流体連通して、前記支持体上の前記第１のセットの固定化された第１の複合ポリメラーゼが、試薬の溶液と超並列方法で反応するように、前記試薬の溶液を前記支持体上に流すことを可能にする、請求項１２８～１３２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項134】

第１の結合複合体及び第２の結合複合体を形成することを更に含み、前記第１及び第２の結合複合体を形成することが、
ａ）第１の核酸プライマー、第１の操作されたポリメラーゼ、及び第１の多価分子をコンカテマー鋳型分子の第１の部分に結合し、それによって前記第１の結合複合体を形成することであって、前記第１の多価分子の第１のヌクレオチド単位が、前記第１の操作されたポリメラーゼに結合する、前記形成することと、
ｂ）第２の核酸プライマー、第２の操作されたポリメラーゼ、及び前記第１の多価分子を同じコンカテマー鋳型分子の第２の部分に結合し、それによって前記第２の結合複合体を形成することであって、前記第１の多価分子の第２のヌクレオチド単位が、前記第２の操作されたポリメラーゼに結合する、前記形成することと、を含み、
同じ多価分子を含む前記第１及び第２の結合複合体が、親和性複合体を形成する、請求項１０６～１３３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項135】

ステップ（ａ）の前記接触させることが、前記第１のセットの操作されたポリメラーゼ及び前記複数の核酸プライマーを、コンカテマー核酸鋳型分子の異なる部分と接触させて、同じコンカテマー鋳型分子上で、前記第１のセットの操作されたポリメラーゼから少なくとも第１及び第２の複合ポリメラーゼを形成することを含み、
ステップ（ｂ）の前記接触させることが、前記複数の多価分子からの単一の多価分子を第１及び第２の複合ポリメラーゼに結合するのに好適な条件下で、同じコンカテマー鋳型分子上の前記少なくとも第１及び第２の複合ポリメラーゼに接触させることを含み、
前記単一の多価分子の少なくとも第１のヌクレオチド単位が、前記第１の複合ポリメラーゼに結合し、
前記第１の複合ポリメラーゼが、前記コンカテマー鋳型分子の第１の部分にハイブリダイズして、それによって第１の結合複合体を形成する第１のプライマーを含み、前記単一の多価分子の少なくとも第２のヌクレオチド単位が、前記第２の複合ポリメラーゼに結合し、
前記第２の複合ポリメラーゼが、前記コンカテマー鋳型分子の第２の部分にハイブリダイズする第２のプライマーを含み、それによって第２の結合複合体を形成し、
ステップ（ｂ）の前記接触させることが、前記第１及び第２の結合複合体における前記結合した第１及び第２のヌクレオチド単位のポリメラーゼ触媒による取り込みを阻害するのに好適な条件下で行われ、
前記第１及び第２の結合複合体が、親和性複合体を形成する同じ多価分子に結合し、
ステップ（ｃ）の前記検出することが、同じコンカテマー鋳型分子上で前記第１及び第２の結合複合体を検出することを含み、
ステップ（ｄ）の前記識別することが、前記第１の結合複合体中の前記第１のヌクレオチド単位を識別し、それによって前記コンカテマー鋳型分子の前記第１の部分の配列を決定することと、前記第２の結合複合体中の前記第２のヌクレオチド単位を識別し、それによって前記コンカテマー鋳型分子の前記第２の部分の配列を決定することと、を含む、請求項１０６～１３４のいずれか１項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表を含み、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。２０２２年６月１５日に作成された当該ＡＳＣＩＩコピーは、５２２６９ＷＯ＿ＣＲＦ＿ｓｅｑｕｅｎｃｅｌｉｓｔｉｎｇという名前で、２，５８５，２６６バイトのサイズである。

【0002】

関連出願の相互参照
本出願は、２０２２年３月２５日に出願された米国特許出願第１７／７０５，０１１号、２０２２年３月２５日に出願された同第１７／７０５，０２０号、２０２２年３月２５日に出願された同第１７／７０５，０４３号、及び２０２１年６月１８日に出願された米国仮出願第６３／２１２，５４０号の利益及び優先権を主張し、これらの各々は、全ての目的のためにそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0003】

本出願を通して、様々な刊行物、特許、及び／または特許出願が、参照される。本開示が関連する最先端の技術をより完全に記載するために、刊行物、特許、及び／または特許出願の開示は、参照によりそれらの全体が本出願に組み込まれる。

【0004】

本開示は、改善された熱安定性のために操作され、ヌクレオチド類似体の改善された結合及び／またはヌクレオチド類似体の改善された結合及び取り込み、ならびに改善されたウラシル耐性を示す変異体ポリメラーゼを提供する。例示的なヌクレオチド類似体としては、３’鎖終結部分を含むヌクレオチドが挙げられる。変異体ポリメラーゼは、野生型ポリメラーゼと比較して、増加した取り込み率を示す。

【背景技術】

【0005】

次世代配列決定（ＮＧＳ）技術は、分子生物学的技術、分類学、農業科学、医学診断、及び新しい治療法の開発で使用されるシークエンシングデータを取得するための強力なツールとなっている。本開示は、標識されたまたは非標識された鎖終結ヌクレオチドを使用する任意の核酸配列決定方法を実施するのに有用である操作されたポリメラーゼを提供し、鎖終結ヌクレオチドは、糖３’位に３’－Ｏ－アジド基（または３’－Ｏ－メチルアジド基）または任意の他の種類の大型のブロック基を含む。例えば、操作されたポリメラーゼは、標識された多価分子及び非標識された鎖終結ヌクレオチドを使用して、親和性による配列決定法（ＳＢＡ）を実施するために使用することができる。更に、操作されたポリメラーゼは、標識された鎖終結ヌクレオチドを使用する合成による配列決定（ＳＢＳ）方法を実施するために、及び非標識された鎖終結ヌクレオチドを使用する結合による配列決定（ＳＢＢ）方法を実施するために使用することができる。

【0006】

ＤＮＡの鎖に単一のヌクレオチドの単独での添加は、容易に検出するのに十分なシグナルを生成しない。現在利用可能なＳＢＳ技術は、正確なベースコールを行うのに十分な感度を持つ検出方法と相まって、ヌクレオチド付加のノイズに対するシグナルを増加させることによって、この問題を克服している。最も商業的に成功したプラットフォームは、空間的に制約されたマトリックス中でモノクローナル鋳型ＤＮＡ増幅を使用して、イントロゲートする複数のコピーの配列を含む別個のＤＮＡアイランドを生成する。この増幅の結果は、全てのコピーへの単一のＤＮＡ塩基の添加が、シグナルノイズ問題を克服するのに十分な方法で検出モダリティを濃縮するような、ＤＮＡコピーの「コロニー」である。複数の空間的に制約された同一のコピーのＤＮＡの配列決定は、ＤＮＡコロニー内の全てのコピーが互いに対して同じ位置（Ｎ、Ｎ＋１、Ｎ＋２、Ｎ＋３など）に残ることを確実にするために、１つ及び１つのみのヌクレオチド塩基を付加することができることを確実にするために制御されたステップ機構への依存度を更に高める。

【0007】

ＳＢＳを実行するために必要な分子エンジンは、ＤＮＡポリメラーゼである。インビボでは、このクラスの酵素は、ＤＮＡ複製及びゲノムの完全性を維持することに関与している。天然条件下で、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（ｄＤｄＰ）は、５’から３’の方向に、ＤＮＡへのデオキシヌクレオチド三リン酸塩（ｄＮＴＰ）の付加を触媒し、プライマーＤＮＡ末端の３’ヒドロキシルと、入力ヌクレオチドの５’αホスフェートとの間にホスホジエステル結合を作製する。この化学反応は、正しい入力ｄＮＴＰと鋳型塩基との間の水素結合により、正しいＷａｔｓｏｎ－Ｃｒｉｃｋ塩基対に対して高い忠実度で生じる。この「正しい」塩基対合は、触媒アミノ酸を整列させてホスホジエステル結合形成を効率的に行う酵素の立体構造変化を誘導する。新たに添加されたｄＮＴＰはまた、ＤＮＡ鎖を更に伸長するために次の触媒ラウンドで使用される３’ＯＨを有する。

【0008】

単一のｄＮＴＰのみがＳＢＳサイクルごとにＤＮＡの増殖鎖に添加されることを確実にするために、可逆的に終結されたｄＮＴＰが使用される。これらの塩基は、ｄＮＴＰの３’ヒドロキシルへの修飾を含み、その後の取り込みラウンドを遮断する。商業的に最も成功した可逆的ターミネーターは、３’メチルアジドであるが、３’アミノアリル、及び３’オキシアミンを含む他のターミネーターもまた使用されている。これらの可逆的に終結されたｄＮＴＰの各々は、同じ方法で機能し、一旦取り込まれると、３’ヒドロキシルが存在しないため、嵩高い３’ブロックは、次のヌクレオチドの付加を阻害する。触媒に曝露すると、３’ブロックは反応して、次のサイクル中に新しいホスホジエステル結合を形成することができる３’ヒドロキシルを再生成する。有効であるが、これらの巨大な３’修飾は、ポリメラーゼにとっての課題を提示する。

【0009】

高忠実度ゲノム複製及び安定性に対する進化的必要性は、１０^４～１０^７の取り込み事象ごとに非Ｗａｔｓｏｎ－Ｃｒｉｃｋ塩基対のみを取り込むポリメラーゼをもたらした。ポリメラーゼはまた、多くの場合、細胞環境における膨大な過剰のヌクレオチドを区別する必要がある。ヌクレオチド間の区別は、典型的には、２’ヒドロキシルの存在がヌクレオチド結合部位でアミノ酸側鎖と立体的に衝突して、ヌクレオチド結合及び触媒作用に対して選択する立体ゲートを介して行われる。更に、ヌクレオチドの３’ヒドロキシルへの損傷または修飾もまた、生存不可能な３’ヒドロキシルを含有する塩基がＤＮＡ合成を阻害する鎖ターミネーターとして機能し得るため、酵素によって感知される。これらの望ましくない塩基の識別は、不適切なヌクレオチド基質がより弱い全体的な親和性で結合し、ホスホジエステル結合形成が１０^２～１０^４桁の速度でよりゆっくりと生じる動的経路を介して生じる。これは、結合形成のために触媒アミノ酸を適切に整列させる誘導フィットの欠如に起因する。その結果、自然に進化したポリメラーゼは、可逆的鎖ターミネーターヌクレオチドの取り込みが悪い。

【発明の概要】

【0010】

本開示は、改善された熱安定性のために操作され、ヌクレオチド類似体の改善された結合及び／またはヌクレオチド類似体の改善された結合及び取り込み、ならびに改善されたウラシル耐性を示す変異体ポリメラーゼを提供する。操作されたポリメラーゼは、様々な状況で使用し得、以下でより詳細に記載されるように、様々な特性を有し得る。

【0011】

本開示は、結合複合体（例えば、三元複合体）を提供し、各々がヌクレオチドを含む。本開示は、複数の三元複合体を提供し、各々が、核酸二本鎖及びヌクレオチドに結合する変異体または野生型ＤＮＡポリメラーゼを含み、核酸二本鎖は、核酸プライマーにハイブリダイズする核酸鋳型分子を含み、三元複合体において、ヌクレオチドは、核酸鋳型分子内の相補的ヌクレオチドの反対側の位置で核酸プライマーの３’末端に結合している。いくつかの実施形態において、三元複合体において、ヌクレオチドは、核酸二重鎖に結合し、ポリメラーゼ触媒による取り込みを受けていないか、またはヌクレオチドは、核酸二重鎖に結合し、ポリメラーゼ触媒による取り込みを受けている。いくつかの実施形態において、野生型ＤＮＡポリメラーゼは、配列番号１のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、変異体ＤＮＡポリメラーゼは、配列番号１と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含む。

【0012】

いくつかの実施形態において、変異体ＤＮＡポリメラーゼは、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ａｌｔｉａｒｃｈａｅａｌｅｓ古細菌からのものであり、配列番号２～２７４または２８８～３７５または及び３８５～３９７のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、変異体ポリメラーゼは、アミノ酸置換Ｄ１４１Ａ及びＥ１４３Ａ（Ａｓｐ１４１Ａｌａ及びＧｌｕ１４３Ａｌａ）を含む。いくつかの実施形態において、三元複合体は、核酸二本鎖からの変異体または野生型ポリメラーゼを解離することなく安定した状態を保ち（または低減された解離を示し）、安定した三元複合体は、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、または１秒を超える持続時間を示す。いくつかの実施形態において、複数の三元複合体は、複数の非触媒二価カチオンまたは複数の触媒二価カチオンを更に含む。いくつかの実施形態において、複数の非触媒二価カチオンは、ストロンチウム、バリウム、及び／またはカルシウムを含む。いくつかの実施形態において、触媒二価カチオンは、マグネシウム及び／またはマンガンを含む。

【0013】

いくつかの実施形態において、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ａｌｔｉａｒｃｈａｅａｌｅｓ古細菌からの変異体ポリメラーゼは、配列番号１、３９３、または３９１に対して、少なくとも８５％の配列同一性、少なくとも９０％の配列同一性、または少なくとも９５％の配列同一性、または少なくとも９６％の配列同一性、または少なくとも９７％の配列同一性、または少なくとも９８％の配列同一性、または少なくとも９９％の配列同一性、または少なくとも９９．１％の配列同一性、または少なくとも９９．２％の配列同一性、または少なくとも９９．３％の配列同一性、または少なくとも９９．４％の配列同一性、または少なくとも９９．５％の配列同一性、または少なくとも９９．６％の配列同一性、または少なくとも９９．７％の配列同一性、または少なくとも９９．８％の配列同一性、またはより高いパーセントの配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、変異体ＤＮＡポリメラーゼは、Ｌｅｕ４１６、Ｔｙｒ４１７、Ｐｒｏ４１８、Ａｌａ４９３、Ａｒｇ５１５、Ｉｌｅ５２９、及びＡｓｎ５６７からなる群から選択される２つ以上の位置のうちのいずれか１つまたはいずれかの組み合わせでアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態において、変異体ポリメラーゼは、エキソヌクレアーゼ－マイナス活性を付与することができるアミノ酸置換Ｄ１４１Ａ及びＥ１４３Ａを含む。いくつかの実施形態において、変異体ポリメラーゼは、野生型アミノ酸骨格配列（例えば、配列番号１または３９１）を有するポリメラーゼと比較して、望ましい特徴を示す。例えば、変異体ポリメラーゼは、増加した熱安定性（Ｔｍ）を示す。別の例では、変異体ポリメラーゼは、糖２’位及び／または３’糖位に鎖終結部分（例えば、ブロック部分）を含むヌクレオチド類似体の増加した取り込み率を示す。更に別の例では、変異体ポリメラーゼは、増加したウラシル耐性を示す。この段落に記載の１つ以上の特性は、本開示に記載の様々な実施形態における任意の例示的な変異体ポリメラーゼに現れ得る。この段落に記載の特性は、本開示を通して「例示的な変異体ポリメラーゼ特性」と称される。

【0014】

いくつかの実施形態において、ヌクレオチドを含む三元複合体において、複数の固定化された複合ポリメラーゼは、同じ関心対象の標的配列または異なる関心対象の標的配列を有する核酸鋳型分子を含む。

【0015】

いくつかの実施形態において、ヌクレオチドを含む三元複合体において、ヌクレオチドは、芳香族塩基、５炭素糖、及び１～１０個のリン酸基を含み、ヌクレオチドの芳香族塩基は、アデニン、グアニン、シトシン、チミン、またはウラシルを含む。ヌクレオチドは、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、またはｄＵＴＰを含む。ヌクレオチドは、フルオロフォアで標識することができる。ヌクレオチドは、フルオロフォアを欠き得る。

【0016】

いくつかの実施形態において、ヌクレオチドを含む三元複合体において、ヌクレオチドは、鎖終結部分を含む。いくつかの実施形態において、鎖終結部分は、開裂可能な部分を介して３’－ＯＨ糖位に結合され得る。いくつかの実施形態において、鎖終結部分は、プライマー伸長反応中の新生鎖における後続のヌクレオチド単位または遊離ヌクレオチドのポリメラーゼ触媒による取り込みを阻害することができる。いくつかの実施形態において、鎖終結部分は、糖がリボースまたはデオキシリボース糖部分を含む３’糖ヒドロキシル位に結合される。いくつかの実施形態において、鎖終結部分は、３’糖ヒドロキシル位から除去可能／開裂可能であり、ポリメラーゼ触媒によるヌクレオチドの取り込み反応において後続のヌクレオチドとともに伸長可能な３’ＯＨ糖基を有するヌクレオチドを生成する。いくつかの実施形態において、鎖終結部分は、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリル基、アリール基、ベンジル基、アジド（ａｚｉｄｅ）基、アミン基、アミド基、ケト基、イソシアネート基、リン酸基、チオ基、ジスルフィド基、炭酸基、尿素基、またはシリル基を含む。いくつかの実施形態において、鎖終結部分アルキル、アルケニル、アルキニル、及びアリルは、ピペリジンを用いたテトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）（Ｐｄ（ＰＰｈ_３）_４）を用いて、または２，３－ジクロロ－５，６－ジシアノ－１，４－ベンゾキノン（ＤＤＱ）を用いて開裂可能／除去可能であり、鎖終結部分アリール及びベンジルは、Ｈ２ Ｐｄ／Ｃを用いて開裂可能／除去可能であり、鎖終結部分アミン、アミド、ケト、イソシアネート、リン酸塩、チオ、ジスルフィドは、β－メルカプトエタノール、またはジチオトリトール（ＤＴＴ）を含むチオール試薬を用いて開裂可能／除去可能であり、鎖終結部分アミン、アミド、ケト、イソシアネート、リン酸塩、チオ、ジスルフィドは、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、ビス－スルホトリフェニルホスフィン（ＢＳ－ＴＰＰ）、またはトリ（ヒドロキシプロピル）ホスフィン（ＴＨＰＰ）を含むホスフィン試薬を用いて開裂可能／除去可能であり、鎖終結部分アミン、アミド、ケト、イソシアネート、リン酸塩、チオ、ジスルフィドは、４－ジメチルアミノピリジン（４－ＤＭＡＰ）を用いて開裂可能／除去可能であり、鎖終結部分炭酸塩は、ＭｅＯＨ中の炭酸カリウム（Ｋ_２ＣＯ_３）を用いて、ピリジン中のトリエチルアミンを用いて、または酢酸（ＡｃＯＨ）中のＺｎを用いて開裂可能／除去可能であり、鎖終結部分尿素及びシリルは、フッ化テトラブチルアンモニウム、ピリジン－ＨＦを用いて、フッ化アンモニウムを用いて、またはトリエチルアミントリヒドロフロリドを用いて開裂可能である。いくつかの実施形態において、鎖終結部分は、亜硝酸で開裂され得る。いくつかの実施形態において、鎖終結部分は、亜硝酸塩を含む溶液、例えば、亜硝酸塩と、酸、例えば、酢酸、硫酸、または硝酸との組み合わせを使用して開裂され得る。いくつかの更なる実施形態において、当該溶液は、有機酸を含み得る。この段落に記載の１つ以上の特性は、本開示に記載の様々な実施形態において、任意の例示的な鎖終結部分に現れ得る。この段落に記載される特性は、本開示を通して「鎖終結部分の実施形態」と称される。

【0017】

いくつかの実施形態において、ヌクレオチドを含む三元複合体において、ヌクレオチドは、開裂可能な部分を介して３’－ＯＨ糖位に結合する鎖終結部分を含み、鎖終結部分は、アジド（ａｚｉｄｅ）、アジド（ａｚｉｄｏ）、またはアジドメチル基を含む。例えば、いくつかの実施形態において、鎖終結部分は、３’－Ｏ－アジドまたは３’－Ｏ－アジドメチル基を含む。いくつかの実施形態において、鎖終結部分アジド（ａｚｉｄｅ）、アジド（ａｚｉｄｏ）、及びアジドメチル基は、誘導体化トリ－アルキルホスフィン部分、誘導体化トリ－アリールホスフィン部分、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、ビス－スルホトリフェニルホスフィン（ＢＳ－ＴＰＰ）、またはトリ（ヒドロキシプロイル）ホスフィン（ＴＨＰＰ）を含むホスフィン化合物を用いて開裂可能／除去可能であり、鎖終結部分アジド（ａｚｉｄｅ）、アジド（ａｚｉｄｏ）、及びアジドメチル基は、４－ジメチルアミノピリジン（４－ＤＭＡＰ）を用いて開裂可能／除去可能である。いくつかの実施形態において、システムにおいて、ヌクレオチド類似体は、３’－デオキシヌクレオチド、２’，３’－ジデオキシヌクレオチド、３’－メチル、３’－アジド、３’－アジドメチル、３’－Ｏ－アジドアルキル、３’－Ｏ－エチニル、３’－Ｏ－アミノアルキル、３’－Ｏ－フルオロアルキル、３’－フルオロメチル、３’－ジフルオロメチル、３’－トリフルオロメチル、３’－スルホニル、３’－マロニル、３’－アミノ、３’－Ｏ－アミノ、３’－スルフヒドラル、３’－アミノメチル、３’－エチル、３’ブチル、３’－ｔｅｒｔブチル、３’－フルオレニルメチルオキシカルボニル、３’ｔｅｒｔ－ブチルオキシカルボニル、３’－Ｏ－アルキルヒドロキシルアミノ基、３’－ホスホロチオート、及び３－Ｏ－ベンジル、またはそれらの誘導体からなる群から選択される鎖終結部分を含む。いくつかの実施形態において、３’－Ｏ－アミノ基、３’－Ｏ－アミノメチル基、３’－Ｏ－メチルアミノ基、またはそれらの誘導体のうちの１つ以上を含む鎖終結部分は、亜硝酸を利用する機構を介して、または亜硝酸を含む溶液を使用して、亜硝酸を用いて開裂され得る。いくつかの実施形態において、３’－Ｏ－アミノ基、３’－Ｏ－アミノメチル基、３’－Ｏ－メチルアミノ基、またはそれらの誘導体のうちの１つ以上を含む鎖終結部分は、亜硝酸塩を含む溶液を使用して開裂され得る。いくつかの実施形態において、例えば、亜硝酸塩は、酢酸、硫酸、または硝酸などの酸と組み合わせられ得るか、またはそれらと接触させ得る。いくつかの更なる実施形態において、例えば、亜硝酸塩は、例えば、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸、イソ酪酸などの有機酸と組み合わせられ得るか、またはそれらと接触させ得る。この語句はまた、基のサブセットを指す場合、「アジド（ａｚｉｄｅ）を含む鎖終結部分」、または「アジド（ａｚｉｄｏ）を含む鎖終結部分」、または「アジドメチルを含む鎖終結部分」として述べることができるが、依然としてこの段落に列挙される実施形態を含み得る。「鎖終結部分は、アジド（ａｚｉｄｅ）、アジド（ａｚｉｄｏ）、またはアジドメチル基を含む」という語句は、本開示を通して、この段落に記載の１つ以上の鎖終結部分特性のうちのいずれかを指すために使用される。

【0018】

いくつかの実施形態において、ヌクレオチドを含む三元複合体において、野生型または変異体ＤＮＡポリメラーゼは、蛍光標識され得るか、または蛍光標識され得ない。いくつかの実施形態において、野生型または変異体ＤＮＡポリメラーゼは、蛍光標識ＤＮＡポリメラーゼを含む。いくつかの実施形態において、野生型または変異体ＤＮＡポリメラーゼは、フルオロフォアを欠く。いくつかの実施形態において、ＤＮＡポリメラーゼは、蛍光標識ＤＮＡポリメラーゼを含み、ヌクレオチドは、フルオロフォアを欠く。いくつかの実施形態において、ＤＮＡポリメラーゼは、フルオロフォアを欠き、ヌクレオチドは、蛍光標識ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、ＤＮＡポリメラーゼは、蛍光標識ＤＮＡポリメラーゼを含み、ヌクレオチドは、蛍光標識ヌクレオチドを含む。この段落に記載の１つ以上の特性は、本開示に記載の様々な実施形態における任意の例示的なフルオロフォア分子に現れ得る。この段落で説明される特性は、本開示を通して「フルオロフォアの実施形態」と称される。

【0019】

いくつかの実施形態において、ヌクレオチドを含む三元複合体において、核酸鋳型分子は、様々な形態をとり得る。例えば、核酸鋳型分子は、線形核酸分子、環状核酸分子、または線形核酸分子と環状核酸分子の両方の混合物を含む。いくつかの実施形態において、核酸鋳型分子は、クローン増幅された鋳型分子を含む。いくつかの実施形態において、核酸鋳型分子は、関心対象の標的配列の１つのコピーを含む。いくつかの実施形態において、複数の核酸鋳型分子中の核酸鋳型分子は、同一の関心対象の標的配列または異なる関心対象の標的配列を含む。いくつかの実施形態において、核酸鋳型分子は、関心対象の標的配列（例えば、コンカテマー）の２つ以上のタンデムコピーを含む。いくつかの実施形態において、核酸鋳型分子は、少なくとも１つのウリジンヌクレオチドを含むか、またはウリジンヌクレオチドを欠く。この段落に記載の１つ以上の特性は、本開示に記載の様々な実施形態において、任意の核酸鋳型に現れ得る。この段落で説明される特性は、本開示を通して「核酸鋳型の実施形態」と称される。

【0020】

いくつかの実施形態において、ヌクレオチドを含む三元複合体において、複数の三元複合体が、固定化される。例えば、三元複合体は、支持体に固定化することができるか、または支持体上のコーティングに固定化することができる。いくつかの実施形態において、支持体上のコーティングは、少なくとも４つの分岐を有する分岐ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む少なくとも１つの親水性ポリマーコーティング層を含み、コーティングは、４５度以下の水接触角を有する。いくつかの実施形態において、支持体は、支持体上の化学基を介して少なくとも支持体の一部に共有結合した官能化ポリマーコーティング層、官能化ポリマーコーティングにグラフトされたオリゴヌクレオチドプライマー、ならびにプライマー及び官能化ポリマーコーティング上の水溶性保護コーティングを含む。いくつかの実施形態において、支持体に固定化された複数の三元複合体の密度は、１ｍｍ^２当たり１０^２～１０^６である。いくつかの実施形態において、複数の三元複合体は、支持体上の所定の部位に固定化される。いくつかの実施形態において、複数の三元複合体は、支持体上のランダムな部位に固定化される。いくつかの実施形態において、複数の固定化された三元複合体は互いに流体連通して、支持体上の複数の固定化された三元複合体が、試薬の溶液と超並列方法で反応するように、試薬の溶液を支持体上に流すことを可能にし、試薬は、可溶性プライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、ヌクレオチド、二価カチオン及び／または緩衝液を含む。この段落に記載の１つ以上の特性は、本開示に記載の様々な実施形態における任意の例示的な三元複合体に現れ得る。この段落で説明される特性は、本開示を通して「固定化の実施形態」と称される。

【0021】

本開示は、複数の結合複合体（例えば、複数の三元複合体）を提供し、各々が多価分子を含む。多価分子を含む複数の結合複合体または三元複合体は、結合複合体または三元複合体について上述したのと同じ特性のうちのいずれかを含み得る。いくつかの実施形態において、多価分子を含む三元複合体は、様々な形態をとり得る。例えば、多価分子を含む三元複合体において、複数の多価分子中の個々の多価分子は、（ａ）コアと、（ｂ）（ｉ）コア結合部分、（ｉｉ）ＰＥＧ部分を含むスペーサー、（ｉｉｉ）リンカー、及び（ｉｖ）ヌクレオチド単位を含む、複数のヌクレオチドアームと、を含み得、コアは、それらのコア結合部分を介して複数のヌクレオチドアームに結合し、スペーサーは、リンカーに結合し、リンカーは、ヌクレオチド単位に結合する。いくつかの実施形態において、コアは、ストレプトアビジン型またはアビジン型部分を含み、コア結合部分は、ビオチンを含む。いくつかの実施形態において、リンカーは、２～６個のサブユニットを有する脂肪族鎖、または２～６個のサブユニットを有するオリゴエチレングリコール鎖を含む。いくつかの実施形態において、リンカーは、芳香族部分を更に含む。例示的なスペーサーを図１６Ａ（上）に示し、例示的なリンカーを図１６Ａ（下）及び図１６Ｂに示す。例示的なヌクレオチドアームを図１５Ｂに示す。例示的な多価分子を、図１４Ａ、１４Ｂ、及び１５Ａに示す。いくつかの実施形態において、ヌクレオチド単位は、芳香族塩基、５－炭素糖、及び１～１０個のリン酸基を含む。いくつかの実施形態において、リンカーは、塩基を介してヌクレオチド単位に結合する。いくつかの実施形態において、コアに結合する複数のヌクレオチドアームは、同じ種類のヌクレオチド単位を有し、ヌクレオチド単位の種類は、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、及びｄＵＴＰからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、複数の多価分子は、１つの種類の多価分子を含み、複数の各多価分子は、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、及びｄＵＴＰからなる群から選択される同じ種類のヌクレオチド単位を有する。いくつかの実施形態において、複数の多価分子は、２つ以上の種類の多価分子の任意の組み合わせの混合物を含み、各種類が、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、及び／またはｄＵＴＰからなる群から選択されるヌクレオチド単位を有する。この段落に記載の１つ以上の特性は、本開示に記載の様々な実施形態における任意の例示的な多価分子に現れ得る。この段落に記載される特性は、本開示を通して「多価分子の実施形態」と称される。

【0022】

いくつかの実施形態において、多価分子を含む三元複合体において、複数の多価分子は、蛍光標識された多価分子を含む。いくつかの実施形態において、個々の蛍光標識多価分子のコアは、所与の多価分子中のヌクレオチドアームに結合するヌクレオチド単位に対応するフルオロフォアに結合する。いくつかの実施形態において、多価分子のヌクレオチドアームのうちの少なくとも１つは、フルオロフォアに結合するリンカー及び／またはヌクレオチド塩基を含み、所与のリンカーまたはヌクレオチド塩基に結合するフルオロフォアは、ヌクレオチドアームのヌクレオチド塩基（例えば、アデニン、グアニン、シトシン、チミン、またはウラシル）に対応する。いくつかの実施形態において、多価分子は、フルオロフォアを欠く。

【0023】

いくつかの実施形態において、多価分子を含む三元複合体において、複数の多価分子中の多価分子のうちの少なくとも１つは、開裂可能な部分を介して３’ＯＨ糖位に結合する鎖終結部分を有するヌクレオチド単位を含み、これは、上記の鎖終結部分の実施形態のうちのいずれかを含み得る。いくつかの実施形態において、鎖終結部分は、上記の潜在的特性のうちのいずれかを含む、アジド（ａｚｉｄｅ）、アジド（ａｚｉｄｏ）、またはアジドメチル基を含む。

【0024】

いくつかの実施形態において、多価分子を含む三元複合体において、野生型または変異体ＤＮＡポリメラーゼは、蛍光標識され得るか、または蛍光標識され得ない。いくつかの実施形態において、野生型または変異体ＤＮＡポリメラーゼは、上記のフルオロフォアの実施形態のうちのいずれをも含み得る。

【0025】

いくつかの実施形態において、多価分子を含む三元複合体において、核酸鋳型分子は、上記の潜在的特性のうちのいずれかを含む核酸鋳型の実施形態を含み得る。

【0026】

いくつかの実施形態において、多価分子を含む三元複合体において、上記の潜在的特性のうちのいずれかを含む、固定化の実施形態に従って固定化され得る。

【0027】

いくつかの実施形態において、多価分子を含む三元複合体において、複数の三元複合体は、第１及び第２の三元複合体に結合して、第１の親和性複合体を形成する単一の多価分子を含む少なくとも第１及び第２の三元複合体を含む。いくつかの実施形態において、第１の三元複合体は、コンカテマー鋳型分子の第１の部分にハイブリダイズする第１のプライマーに結合する第１のＤＮＡポリメラーゼ（例えば、第１の変異または野生型ＤＮＡポリメラーゼ）を含み、単一の多価分子の第１のヌクレオチド単位は、第１のプライマーに結合し、それによって第１の三元複合体を形成する。いくつかの実施形態において、第２の三元複合体は、同じコンカテマー鋳型分子の第２の部分にハイブリダイズする第２のプライマーに結合する第２のＤＮＡポリメラーゼ（例えば、第２の変異または野生型ＤＮＡポリメラーゼ）を含み、単一の多価分子の第２のヌクレオチド単位は、第２のプライマーに結合し、それによって第２の三元複合体を形成する。多価分子に結合する第１及び第２の三元複合体は、第１の親和性複合体を形成する。いくつかの実施形態において、第１及び／または第２の三元複合体は、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、または１秒を超える持続時間の間、解離することなく安定した状態を保つ。

【0028】

いくつかの実施形態において、多価分子を含む三元複合体において、第１の親和性複合体は、単一の多価分子が第１、第２、第３、及び第４の三元複合体に結合する少なくとも第３及び第４の三元複合体を更に含む。いくつかの実施形態において、第３の三元複合体は、コンカテマー鋳型分子の第３の部分にハイブリダイズする第３のプライマーに結合する第３のＤＮＡポリメラーゼ（例えば、第３の変異または野生型ＤＮＡポリメラーゼ）を含み、単一の多価分子の第３のヌクレオチド単位は、第３のプライマーに結合し、それによって第３の三元複合体を形成する。いくつかの実施形態において、第４の三元複合体は、同じコンカテマー鋳型分子の第４の部分にハイブリダイズする第４のプライマーに結合する第４のＤＮＡポリメラーゼ（例えば、第４の変異または野生型ＤＮＡポリメラーゼ）を含み、単一の多価分子の第４のヌクレオチド単位は、第４のプライマーに結合し、それによって第４の三元複合体を形成する。いくつかの実施形態において、多価分子に結合する第１、第２、及び第３の三元複合体は、第１の親和性複合体を形成する。いくつかの実施形態において、多価分子に結合する第１、第２、第３、及び第４の三元複合体は、第１の親和性複合体を形成する。いくつかの実施形態において、第３及び／または第４の三元複合体は、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、または１秒を超える持続時間の間、解離することなく安定した状態を保つ。

【0029】

本開示は、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ａｌｔｉａｒｃｈａｅａｌｅｓ古細菌からのＤＮＡポリメラーゼを使用して、ヌクレオチドを含む結合複合体（例えば、三元複合体）を形成する核酸配列決定方法を提供する。本開示は、核酸配列決定のための方法であって、（ａ）（ｉ）複数の野生型または変異体ＤＮＡポリメラーゼ、及び（ｉｉ）複数の核酸二本鎖であって、各々、核酸プライマーにハイブリダイズする核酸鋳型分子を含む、複数の核酸二本鎖を接触させることであって、接触させることは、複数の複合ポリメラーゼであって、各々、核酸二本鎖に結合する野生型または変異体ＤＮＡポリメラーゼを含む、複数の複合ポリメラーゼを形成するのに好適な条件下で行われ、複数の野生型ＤＮＡポリメラーゼは、配列番号１と１００％同一であるか、または複数の変異体ＤＮＡポリメラーゼは、配列番号１と少なくとも８５％同一である（例えば、配列番号２～２７４または２８８～３７５または３８５～３９７のアミノ酸配列のうちのいずれか１つと少なくとも８５％同一である）アミノ酸配列を含む、接触させることと、（ｂ）複数の複合ポリメラーゼを、（ｉｉｉ）複数のヌクレオチド、及び（ｉｖ）複数の触媒二価カチオンと接触させることであって、接触させることは、複数の三元複合体であって、各々、核酸二本鎖及びヌクレオチドに結合する野生型または変異体ＤＮＡポリメラーゼを含む複数の三元複合体を形成するのに好適な条件下で行われ、三元複合体において、ヌクレオチドは、核酸鋳型分子内の相補的ヌクレオチドの反対側の位置で、核酸プライマーの３’末端に結合し、条件は、核酸プライマーの３’末端に結合するヌクレオチドのポリメラーゼ触媒による取り込みを促進するのに好適である、接触させることと、（ｃ）複数の三元複合体を検出することと、（ｄ）複数の三元複合体における複数の取り込まれたヌクレオチドを識別することと、を含む、方法を提供する。いくつかの実施形態において、ステップ（ｂ）の個々の三元複合体において、ヌクレオチドは、核酸二重鎖に結合し、ポリメラーゼ触媒による取り込みを受けていないか、またはヌクレオチドは、核酸二重鎖に結合し、ポリメラーゼ触媒による取り込みを受けている。いくつかの実施形態において、三元複合体は、核酸二本鎖からの変異体または野生型ポリメラーゼを解離することなく安定した状態を保ち（または低減された解離を示し）、安定した三元複合体は、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、または１秒を超える持続時間を示す。いくつかの実施形態において、触媒二価カチオンは、マグネシウム及び／またはマンガンを含む。いくつかの実施形態において、複数の複合ポリメラーゼは、同じ関心対象の標的配列または異なる関心対象の標的配列を有する核酸鋳型分子を含む。いくつかの実施形態において、変異体ポリメラーゼは、アミノ酸置換Ｄ１４１Ａ及びＥ１４３Ａを含む。

【0030】

いくつかの実施形態において、ヌクレオチドを含む三元複合体を用いる核酸配列決定において、（ａ）（ｉ）複数の野生型または変異体ＤＮＡポリメラーゼ、及び（ｉｉ）複数の核酸二本鎖であって、各々、核酸プライマーにハイブリダイズする核酸鋳型分子を含む、核酸二本鎖を接触させることであって、接触させることは、複数の複合ポリメラーゼであって、各々、核酸二本鎖に結合する野生型または変異体ＤＮＡポリメラーゼを含む複数の複合ポリメラーゼを形成するのに好適な条件下で行われ、複数の野生型ＤＮＡポリメラーゼは、配列番号１と１００％同一であるか、または複数の変異体ＤＮＡポリメラーゼは、配列番号２～２７４または２８８～３７５または３８５～３９７と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含む、接触させることと、（ｂ）複数の複合ポリメラーゼを、（ｉｉｉ）複数のヌクレオチド、及び（ｉｖ）複数の非触媒二価カチオンと接触させることであって、接触させることは、複数の三元複合体を形成するのに好適な条件下で行われ、各々、核酸二本鎖及びヌクレオチドに結合する野生型または変異体ＤＮＡポリメラーゼを含み、三元複合体において、ヌクレオチドは、核酸鋳型分子内の相補的ヌクレオチドの反対側の位置で、核酸プライマーの３’末端に結合し、条件は、核酸プライマーの３’末端に結合するヌクレオチドのポリメラーゼ触媒による取り込みを阻害するのに好適である、接触させることと、（ｃ）複数の三元複合体を検出することと、（ｄ）複数の三元複合体における複数の結合したヌクレオチドを識別することと、を含む、方法を提供する。いくつかの実施形態において、非触媒二価カチオンは、ストロンチウム、バリウム、及び／またはカルシウムを含む。いくつかの実施形態において、複数の複合ポリメラーゼは、同じ関心対象の標的配列または異なる関心対象の標的配列を有する核酸鋳型分子を含む。いくつかの実施形態において、変異体ポリメラーゼは、アミノ酸置換Ｄ１４１Ａ及びＥ１４３Ａを含む。

【0031】

いくつかの実施形態において、ヌクレオチド単位を含み得る三元複合体を用いる核酸配列決定方法では。ヌクレオチド単位は、芳香族塩基、５－炭素糖（例えば、リボースまたはデオキシリボース）、及び１つ以上のリン酸基（例えば、１～１０個のリン酸基）を含み得、ヌクレオチドの芳香族塩基は、アデニン、グアニン、シトシン、チミン、またはウラシルを含む。いくつかの実施形態において、複数のヌクレオチドは、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、及びｄＵＴＰからなる群から選択される１つの種類のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、複数のヌクレオチドは、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、及び／またはｄＵＴＰからなる群から選択される２つ以上の種類のヌクレオチドの任意の組み合わせの混合物を含む。いくつかの実施形態において、複数のヌクレオチド中のヌクレオチドのうちの少なくとも１つは、フルオロフォアで標識される。いくつかの実施形態において、複数のヌクレオチドは、フルオロフォア標識を欠く。この段落に記載の１つ以上の特性は、本開示に記載の様々な実施形態における任意の例示的なヌクレオチド単位に現れ得る。この段落に記載の特性は、本開示を通して「例示的なヌクレオチド単位特性」と称される。

【0032】

いくつかの実施形態において、ヌクレオチドを含む三元複合体を用いる核酸配列決定方法では、複数のＤＮＡポリメラーゼは、蛍光標識され得るか、または蛍光標識され得ず、上記のフルオロフォアの実施形態のうちのいずれかを含み得る。いくつかの実施形態において、複数のＤＮＡポリメラーゼは、複数のヌクレオチドを含む。

【0033】

いくつかの実施形態において、ヌクレオチドを含む三元複合体を用いる核酸配列決定方法では、複数のヌクレオチドにおけるヌクレオチドのうちの少なくとも１つは、鎖終結部分を含み、上記の鎖終結部分の実施形態のうちのいずれかを含み得る。いくつかの実施形態において、鎖終結部分は、上記の潜在的特性のうちのいずれかを含む、アジド（ａｚｉｄｅ）、アジド（ａｚｉｄｏ）、またはアジドメチル基を含む。

【0034】

いくつかの実施形態において、ヌクレオチドを含む三元複合体を用いる核酸配列決定方法では、複数の核酸鋳型分子は、上記の潜在的特性のうちのいずれかを含む核酸鋳型の実施形態を含み得る。

【0035】

いくつかの実施形態において、ヌクレオチドを含む三元複合体を用いる核酸配列決定方法では、これは、上記の潜在的特性のうちのいずれかを含む、固定化の実施形態に従って固定化され得る。

【0036】

本開示は、多価分子を含む結合複合体（例えば、三元複合体）を用いる核酸配列決定方法を提供する。本開示は、核酸配列決定のための方法であって、（ａ）（ｉ）複数の野生型または変異体ＤＮＡポリメラーゼ、及び（ｉｉ）複数の核酸二本鎖であって、各々、核酸プライマーにハイブリダイズする核酸鋳型分子を含む、核酸二本鎖を接触させることであって、接触させることは、各々、核酸二本鎖に結合する変異ＤＮＡポリメラーゼを含む複数の複合ポリメラーゼを形成するのに好適な条件下で行われ、複数の野生型ＤＮＡポリメラーゼは、配列番号１と１００％同一であるか、または複数の変異体ＤＮＡポリメラーゼは、配列番号１と少なくとも８５％同一である（例えば、配列番号２～２７４または２８８～３７５または３８５～３９７のアミノ酸配列のうちのいずれか１つと少なくとも８５％同一である）アミノ酸配列を含む、接触させることと、（ｂ）複数の複合ポリメラーゼを、（ｉｉｉ）複数の多価分子、及び（ｉｖ）複数の非触媒二価カチオンと接触させることであって、複数の多価分子が、各々、複数のヌクレオチドアームに結合するコアを含み、各ヌクレオチドアームが、ヌクレオチド単位を含み、接触させることは、複数の三元複合体を形成するのに好適な条件下で行われ、各々、核酸二本鎖及び多価分子に結合する変異体ＤＮＡポリメラーゼを含み、三元複合体において、多価分子の１つのヌクレオチド単位は、核酸鋳型分子内の相補的ヌクレオチドの反対側の位置での核酸プライマーの３’末端に結合し、複数の三元複合体は、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、または１秒を超える持続時間の間、解離することなく安定した状態を保ち、接触させることは、多価分子の結合ヌクレオチド単位のポリメラーゼ触媒による取り込みを阻害するのに好適な条件下で行われる、接触させることと、（ｃ）複数の三元複合体を検出することと、（ｄ）複数の三元複合体における核酸プライマーの３’末端に結合する複数のヌクレオチド単位を識別し、それによって複数の核酸鋳型分子の配列を決定することと、を含む、方法を提供する。いくつかの実施形態において、変異体ポリメラーゼは、アミノ酸置換Ｄ１４１Ａ及びＥ１４３Ａを含む。

【0037】

更に別の例において、変異体ポリメラーゼは、上で考察した例示的な変異体ポリメラーゼの特性のうちの１つ以上の特性を示す。代替的または追加的に、変異体ポリメラーゼは、増加したウラシル耐性（例えば、配列番号３６１、３６２、３６３、３６４、３６６、３６７、３７４、または３７５のうちのいずれか、または配列番号３８５～３９７のうちのいずれか）を示す。いくつかの実施形態において、変異体ポリメラーゼは、アミノ酸置換Ｄ１４１Ａ及びＥ１４３Ａを含む。

【0038】

いくつかの実施形態において、多価分子を含む三元複合体を用いる核酸配列決定方法では、三元複合体は、核酸二本鎖からの変異または野生型ポリメラーゼを解離することなく安定した状態を保ち（または低減された解離を示し）、安定した三元複合体は、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、または１秒を超える持続時間を示す。いくつかの実施形態において、複数の非触媒二価カチオンは、ストロンチウム、バリウム、及び／またはカルシウムを含む。いくつかの実施形態において、複数の複合ポリメラーゼは、同じ関心対象の標的配列または異なる関心対象の標的配列を有する核酸鋳型分子を含む。

【0039】

いくつかの実施形態において、多価分子を含む三元複合体を用いる核酸配列決定方法では、三元複合体において、多価分子のヌクレオチド単位は、核酸二本鎖に結合され、ポリメラーゼ触媒による取り込みを受けていないか、またはヌクレオチド単位は、核酸二本鎖に結合され、ポリメラーゼ触媒による取り込みを受けている。

【0040】

いくつかの実施形態において、多価分子を含む三元複合体を用いる核酸配列決定方法では、この方法は、親和性複合体を形成することを更に含み、（１）複数の野生型または変異体ＤＮＡポリメラーゼ及び複数の核酸プライマーを、コンカテマー核酸鋳型分子の異なる部分と接触させて、同じコンカテマー鋳型分子上に少なくとも第１及び第２の複合ポリメラーゼを形成するステップと、（２）複数の多価分子を、同じコンカテマー鋳型分子上の少なくとも第１及び第２の複合ポリメラーゼに、複数の多価分子からの単一の多価分子を第１及び第２の複合ポリメラーゼに結合するのに好適な条件下で接触させるステップであって、単一の多価分子の少なくとも第１のヌクレオチド単位は、コンカテマー鋳型分子の第１の部分にハイブリダイズし、それによって第１の三元複合体を形成する第１のプライマーを含む第１の複合ポリメラーゼに結合し、単一の多価分子の少なくとも第２のヌクレオチド単位は、コンカテマー鋳型分子の第２の部分にハイブリダイズし、それによって第２の三元複合体を形成する第２のプライマーを含む第２の複合ポリメラーゼに結合して、接触させることが、第１及び第２の三元複合体中の結合した第１及び第２のヌクレオチド単位のポリメラーゼ触媒による取り込みを阻害するのに好適な条件下で行われ、同じ多価分子に結合する第１及び第２の三元複合体が親和性複合体を形成する、接触させるステップと、（３）同じコンカテマー鋳型分子上で第１及び第２の三元複合体を検出するステップと、（４）第１の三元複合体中の第１のヌクレオチド単位を識別し、それによってコンカテマー鋳型分子の第１の部分の配列を決定し、第２の三元複合体中の第２のヌクレオチド単位を識別し、それによってコンカテマー鋳型分子の第２の部分の配列を決定するステップと、を含む。いくつかの実施形態において、親和性複合体を形成するための方法では、ステップ（４）の識別することは、第１の三元複合体中の第１のプライマーの３’末端に結合する第１のヌクレオチド単位を識別し、それによってコンカテマー鋳型分子の第１の部分の配列を決定することと、第２の三元複合体中の第２のプライマーの３’末端に結合する第２のヌクレオチド単位を識別し、それによってコンカテマー鋳型分子の第２の部分の配列を決定することと、を含む。

【0041】

いくつかの実施形態において、多価分子を含む三元複合体を用いる核酸配列決定方法では、多価分子は、上記の潜在的特性のうちのいずれかを含む、多価分子の実施形態のうちのいずれかを含み得る。

【0042】

いくつかの実施形態において、多価分子を含む三元複合体を用いる核酸配列決定方法では、多価分子は、蛍光標識され得るか、または蛍光標識され得ず、上記のフルオロフォアの実施形態のうちのいずれかを含み得る。いくつかの実施形態において、個々の多価分子のコアは、ヌクレオチドアームに結合するヌクレオチド単位に結合し、蛍光標識され得るか、または蛍光標識され得ず、上記のフルオロフォアの実施形態のうちのいずれかを含み得る。いくつかの実施形態において、多価分子のヌクレオチドアームのうちの少なくとも１つは、フルオロフォアに結合するリンカー及び／またはヌクレオチド塩基を含み、所与のリンカーまたはヌクレオチド塩基に結合するフルオロフォアは、ヌクレオチドアームのヌクレオチド塩基（例えば、アデニン、グアニン、シトシン、チミン、またはウラシル）に対応する。

【0043】

いくつかの実施形態において、多価分子を含む三元複合体を用いる核酸配列決定方法では、複数の多価分子中の多価分子のうちの少なくとも１つは、開裂可能な部分を介して３’ＯＨ糖位に結合する鎖終結部分を有するヌクレオチド単位を含み、これは、上記の鎖終結部分の実施形態のうちのいずれかを含み得る。いくつかの実施形態において、鎖終結部分は、上記の潜在的特性のうちのいずれかを含む、アジド（ａｚｉｄｅ）、アジド（ａｚｉｄｏ）、またはアジドメチル基を含む。

【0044】

いくつかの実施形態において、多価分子を含む三元複合体を用いる核酸配列決定方法では、複数のＤＮＡポリメラーゼは、蛍光標識ＤＮＡポリメラーゼを含む。いくつかの実施形態において、複数のＤＮＡポリメラーゼは、フルオロフォアを欠く。

【0045】

いくつかの実施形態において、多価分子を含む三元複合体を用いる核酸配列決定方法では、複数の核酸鋳型分子は、上記の潜在的特性のうちのいずれかを含む核酸鋳型の実施形態を含み得る。

【0046】

いくつかの実施形態において、多価分子を含む三元複合体を用いる核酸配列決定方法では、多価分子は、上記の潜在的特性のうちのいずれかを含む固定化の実施形態に従って固定化され得る。

【0047】

本開示は、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ａｌｔｉａｒｃｈａｅａｌｅｓ古細菌からのポリメラーゼ、多価分子、及びヌクレオチドを用いる二相核酸配列決定方法を提供する。本開示は、核酸配列決定のための方法であって、（ａ）（ｉ）複数の第１の野生型または変異体ＤＮＡポリメラーゼと、（ｉｉ）複数の核酸二本鎖であって、各々、核酸プライマーにハイブリダイズする核酸鋳型分子を含む、複数の核酸二本鎖と、を接触させることであって、接触させることは、複数の第１の複合ポリメラーゼ（各々、核酸二本鎖に結合する第１の野生型または変異体ＤＮＡポリメラーゼを含む）を形成するのに好適な条件下で行われ、複数の第１の野生型ＤＮＡポリメラーゼは、配列番号１と１００％同一であるアミノ酸配列を含むか、または複数の第１の変異体ＤＮＡポリメラーゼは、配列番号１と少なくとも８５％同一である（例えば、配列番号２～２７４または２８８～３７５または３８５～３９７のアミノ酸配列のうちのいずれか１つと少なくとも８５％同一である）アミノ酸配列を含む、接触させることと、（ｂ）複数の第１の複合ポリメラーゼを、（ｉｉｉ）複数の多価分子、及び（ｉｖ）複数の非触媒二価カチオンと接触させることであって、複数の多価分子は、各々、複数のヌクレオチドアームに結合するコアを含み、各ヌクレオチドアームは、ヌクレオチド単位を含み、接触させることは、複数の第１の三元複合体（各々、核酸二本鎖に結合する第１の野生型または変異体ＤＮＡポリメラーゼ、及び多価分子を含む）を形成するのに好適な条件下で行われ、第１の三元複合体では、多価分子のヌクレオチド単位は、核酸鋳型分子内の相補的ヌクレオチドの反対側の位置での核酸プライマーの３’末端に結合し、接触させることが、多価分子の結合したヌクレオチド単位のポリメラーゼ触媒による取り込みを阻害するのに好適な条件下で行われる、接触させることと、（ｃ）複数の第１の三元複合体を検出し、核酸プライマーの３’末端に結合するヌクレオチド単位を識別し、それによって核酸鋳型分子の配列を決定することと、（ｄ）複数の第１の野生型または変異体ポリメラーゼ及び複数の第１の三元複合体を除去することによって解離し、複数の核酸二重鎖を保持することと、（ｅ）ステップ（ｄ）の保持された核酸二重鎖を、（ｉ）複数の第２の野生型または変異体ＤＮＡポリメラーゼ、（ｉｉ）複数のヌクレオチド、及び（ｉｉｉ）複数の触媒二価カチオンと接触させることであって、複数の第２の野生型ＤＮＡポリメラーゼは、配列番号１と１００％同一であるアミノ酸配列を含むか、または、複数の第２の変異体ＤＮＡポリメラーゼは、配列番号１と少なくとも８５％同一である（例えば、配列番号２～２７４または２８８～３７５または３８５～３９７のアミノ酸配列のうちのいずれか１つと少なくとも８５％同一である）アミノ酸配列を含み、ステップ（ｅ）の接触が、複数の第２の三元複合体（各々、ステップ（ｄ）の保持された核酸二本鎖及びヌクレオチドに結合した第２の野生型または変異体ＤＮＡポリメラーゼを含む）を形成するのに好適な条件下で行われ、第２の三元複合体において、ヌクレオチドは、核酸鋳型分子内の相補的ヌクレオチドの反対側の位置で核酸プライマーの３’末端に結合し、条件は、核酸プライマーの３’末端に結合したヌクレオチドのポリメラーゼ触媒による取り込みを促進するのに好適である、接触させることと、（ｆ）複数の第２の三元複合体を検出し、第２の三元複合体内の取り込まれたヌクレオチドを識別することと、を含む、方法を提供する。いくつかの実施形態において、ステップ（ｆ）の検出することは、任意選択的である。いくつかの実施形態において、ステップ（ｆ）の識別することは、任意選択的である。いくつかの実施形態において、変異体ポリメラーゼは、アミノ酸置換Ｄ１４１Ａ及びＥ１４３Ａを含む。

【0048】

いくつかの実施形態において、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ａｌｔｉａｒｃｈａｅａｌｅｓ古細菌からのポリメラーゼを用いる二相核酸配列決定方法では、第１の三元複合体において、多価分子のヌクレオチド単位は、核酸二本鎖に結合し、ポリメラーゼ触媒による取り込みを受けていないか、またはヌクレオチド単位は、核酸二本鎖に結合し、ポリメラーゼ触媒による取り込みを受けている。いくつかの実施形態において、第２の三元複合体において、ヌクレオチドは、核酸二重鎖に結合し、ポリメラーゼ触媒による取り込みを受けていないか、またはヌクレオチドは、核酸二重鎖に結合し、ポリメラーゼ触媒による取り込みを受けている。

【0049】

いくつかの実施形態において、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ａｌｔｉａｒｃｈａｅａｌｅｓ古細菌からのポリメラーゼを用いる二相核酸配列決定方法では、第１の変異体ＤＮＡポリメラーゼは、例示的な変異体ポリメラーゼ特性に関連して上記の１つ以上の特性を含む。更に別の例では、第１の変異体ポリメラーゼは、増加したウラシル耐性（例えば、配列番号３６１、３６２、３６３、３６４、３６６、３６７、３７４、または３７５のうちのいずれか、または配列番号３８５～３９７のうちのいずれか）を示す。

【0050】

いくつかの実施形態において、第１の野生型または変異体ＤＮＡポリメラーゼは、蛍光標識ＤＮＡポリメラーゼを含む。いくつかの実施形態において、第１の野生型または変異体ＤＮＡポリメラーゼは、フルオロフォアを欠く。

【0051】

いくつかの実施形態において、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ａｌｔｉａｒｃｈａｅａｌｅｓ古細菌からのポリメラーゼを用いる二相核酸配列決定方法では、第２の変異体ＤＮＡポリメラーゼは、例示的な変異体ポリメラーゼ特性に関連して上記の１つ以上の特性を含む。更に別の例において、第２の変異体ポリメラーゼは、増加したウラシル耐性（例えば、配列番号３６１、３６２、３６３、３６４、３６６、３６７、３７４、または３７５のうちのいずれか、または配列番号３８５～３９７のうちのいずれか）を示す。

【0052】

いくつかの実施形態において、第２の野生型または変異体ＤＮＡポリメラーゼは、蛍光標識ＤＮＡポリメラーゼを含む。いくつかの実施形態において、第２の変異体ＤＮＡポリメラーゼは、フルオロフォアを欠く。

【0053】

いくつかの実施形態において、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ａｌｔｉａｒｃｈａｅａｌｅｓ古細菌からのポリメラーゼを用いる二相核酸配列決定方法では、ステップ（ｂ）の複数の非触媒二価カチオンは、ストロンチウム、バリウム、及び／またはカルシウムを含む。いくつかの実施形態において、ステップ（ｅ）の複数の触媒二価カチオンは、マグネシウム及び／またはマンガンを含む。いくつかの実施形態において、ステップ（ｂ）の複数の第１の三元複合体は、核酸二本鎖からの変異体または野生型ポリメラーゼを解離することなく安定した状態を保ち（または低減された解離を示し）、安定した三元複合体は、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、または１秒を超える持続時間を示す。いくつかの実施形態において、ステップ（ｅ）における複数の第２の三元複合体は、核酸二本鎖からの変異体または野生型ポリメラーゼを解離することなく安定した状態を保ち（または低減された解離を示し）、安定した三元複合体は、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、または１秒を超える持続時間を示す。

【0054】

いくつかの実施形態において、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ａｌｔｉａｒｃｈａｅａｌｅｓ古細菌からのポリメラーゼを使用する二相核酸配列決定方法は、（ｇ）複数の第２の野生型または変異体ＤＮＡポリメラーゼを除去し、ステップ（ｆ）の複数の核酸二本鎖を保持することと、（ｈ）ステップ（ｇ）の保持された核酸二本鎖を、複数の第１の野生型または変異体ＤＮＡポリメラーゼ、複数の多価分子、及び複数の非触媒二価カチオンと接触させることであって、接触させることが、別の複数の第１の三元複合体を形成するのに好適な条件下で行われ、接触させることが、多価分子の結合ヌクレオチド単位のポリメラーゼ触媒による取り込みを阻害するのに好適な条件下で行われる、接触させることと、（ｉ）ステップ（ｈ）で形成された複数の第１の三元複合体を検出し、核酸プライマーの３’末端に結合するヌクレオチド単位を識別し、それによって核酸鋳型分子の配列を決定することと、（ｊ）複数の第１の野生型または変異体ポリメラーゼ及び複数の多価分子を除去することによってステップ（ｈ）で形成された複数の第１の三元複合体を解離し、複数の核酸二本鎖を保持することと、（ｋ）ステップ（ｊ）の複数の保持された核酸二本鎖を、複数の第２の野生型または変異体ＤＮＡポリメラーゼ、複数のヌクレオチド、及び複数の触媒二価カチオンと接触させることであって、接触させることが、別の複数の第２の三元複合体を形成するのに好適な条件下で行われ、条件が、核酸プライマーの３’末端に結合したヌクレオチドのポリメラーゼ触媒による取り込みを促進するのに好適である、接触させることと、（ｌ）ステップ（ｋ）で形成された複数の第２の三元複合体を検出し、第２の三元複合体における複数の取り込まれたヌクレオチドを識別することと、（ｍ）ステップ（ｇ）～（ｌ）を少なくとも１回繰り返すことと、を更に含む。いくつかの実施形態において、ステップ（ｌ）の検出することは、任意選択的である。いくつかの実施形態において、ステップ（ｌ）の識別することは、任意選択的である。いくつかの実施形態において、ステップ（ｈ）の複数の第１の三元複合体は、核酸二本鎖からの変異体または野生型ポリメラーゼを解離することなく安定した状態を保ち（または低減された解離を示し）、安定した三元複合体は、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、または１秒を超える持続時間を示す。いくつかの実施形態において、ステップ（ｋ）の複数の第２の三元複合体は、核酸二本鎖からの変異体または野生型ポリメラーゼを解離することなく安定した状態を保ち（または低減された解離を示し）、安定した三元複合体は、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、または１秒を超える持続時間を示す。

【0055】

いくつかの実施形態において、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ａｌｔｉａｒｃｈａｅａｌｅｓ古細菌からのポリメラーゼを用いる二相核酸配列決定方法では、非触媒二価カチオンは、ストロンチウム、バリウム、及び／またはカルシウムを含み、触媒二価カチオンは、マグネシウムまたはマンガンを含む。

【0056】

いくつかの実施形態において、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ａｌｔｉａｒｃｈａｅａｌｅｓ古細菌からのポリメラーゼを用いる二相核酸配列決定方法は、（１）複数の野生型または変異体ＤＮＡポリメラーゼ及び複数の核酸プライマーを、コンカテマー核酸鋳型分子の異なる部分と接触させて、同じコンカテマー鋳型分子上に少なくとも第１及び第２の複合ポリメラーゼを形成するステップと、（２）複数の多価分子を、同じコンカテマー鋳型分子上の少なくとも第１及び第２の複合ポリメラーゼに、複数の多価分子からの単一の多価分子を第１及び第２の複合ポリメラーゼに結合するのに好適な条件下で接触させるステップであって、単一の多価分子の少なくとも第１のヌクレオチド単位は、コンカテマー鋳型分子の第１の部分にハイブリダイズし、それによって第１のコンカテマー三元複合体を形成する第１のプライマーを含む第１の複合ポリメラーゼに結合し、単一の多価分子の少なくとも第２のヌクレオチド単位は、コンカテマー鋳型分子の第２の部分にハイブリダイズし、それによって第２のコンカテマー三元複合体を形成する第２のプライマーを含む第２の複合ポリメラーゼに結合して、接触させることが、第１及び第２のコンカテマー三元複合体中の結合した第１及び第２のヌクレオチド単位のポリメラーゼ触媒による取り込みを阻害するのに好適な条件下で行われ、同じ多価分子に結合する第１及び第２のコンカテマー三元複合体が親和性複合体を形成する、接触させるステップと、（３）同じコンカテマー鋳型分子上で第１及び第２のコンカテマー三元複合体を検出するステップと、（４）第１のコンカテマー三元複合体中の第１のヌクレオチド単位を識別し、それによってコンカテマー鋳型分子の第１の部分の配列を決定し、第２のコンカテマー三元複合体中の第２のヌクレオチド単位を識別し、それによってコンカテマー鋳型分子の第２の部分の配列を決定するステップと、を含む、親和性複合体を形成することを更に含む。いくつかの実施形態において、ステップ（４）の識別することは、第１のコンカテマー三元複合体中の第１のプライマーの３’末端に結合し、それによってコンカテマー鋳型分子の第１の部分の配列を決定する第１のヌクレオチド単位を識別することと、第２のコンカテマー三元複合体中の第２のプライマーの３’末端に結合し、それによってコンカテマー鋳型分子の第２の部分の配列を決定する第２のヌクレオチド単位を識別することとを含む。

【0057】

いくつかの実施形態において、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ａｌｔｉａｒｃｈａｅａｌｅｓ古細菌からのポリメラーゼを用いる二相核酸配列決定方法では、上記の潜在的特性のうちのいずれかを含む、多価分子の実施形態のうちのいずれかを含み得る多価分子が存在し得る。潜在的特性のうちのいずれか。

【0058】

いくつかの実施形態において、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ａｌｔｉａｒｃｈａｅａｌｅｓ古細菌からのポリメラーゼを用いる二相核酸配列決定方法では、多価分子は、フルオロフォアを欠く。いくつかの実施形態において、多価分子は、フルオロフォアで標識される。いくつかの実施形態において、ステップ（ｂ）の複数の多価分子は、蛍光標識された多価分子であり、ステップ（ｃ）は、複数の第１の三元複合体からの蛍光シグナルを検出することと、核酸プライマーの３’末端に結合するヌクレオチド単位を識別し、それによって核酸鋳型分子の配列を決定することと、を含む。

【0059】

いくつかの実施形態において、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ａｌｔｉａｒｃｈａｅａｌｅｓ古細菌からのポリメラーゼを用いる二相核酸配列決定方法では、多価分子のヌクレオチド単位のうちの少なくとも１つは、開裂可能な部分を介して３’－ＯＨ糖位に結合する鎖終結部分を含み、これは、上記の鎖終結部分の実施形態のうちのいずれかを含み得る。いくつかの実施形態において、鎖終結部分は、上記の潜在的特性のうちのいずれかを含む、アジド（ａｚｉｄｅ）、アジド（ａｚｉｄｏ）、またはアジドメチル基を含む。いくつかの実施形態において、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ａｌｔｉａｒｃｈａｅａｌｅｓ古細菌からのポリメラーゼを用いる二相核酸配列決定方法では、ステップ（ｅ）及び／または（ｋ）のヌクレオチドは、上で考察した１つ以上の例示的なヌクレオチド単位特性を含むヌクレオチド単位を含む。いくつかの実施形態において、ステップ（ｅ）の複数のヌクレオチドは、フルオロフォアを欠く。いくつかの実施形態において、ステップ（ｅ）の複数のヌクレオチドのうちの少なくとも１つが、フルオロフォアで標識される。

【0060】

いくつかの実施形態において、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ａｌｔｉａｒｃｈａｅａｌｅｓ古細菌からのポリメラーゼを用いる二相核酸配列決定方法では、ステップ（ｅ）及び／または（ｋ）の複数のヌクレオチドは、開裂可能な部分を介して３’－ＯＨ糖位に結合する鎖終結部分を含み、これは、上記の鎖終結部分の実施形態のうちのいずれかを含み得る。いくつかの実施形態において、鎖終結部分は、上記の潜在的特性のうちのいずれかを含む、アジド（ａｚｉｄｅ）、アジド（ａｚｉｄｏ）、またはアジドメチル基を含む。

【0061】

いくつかの実施形態において、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ａｌｔｉａｒｃｈａｅａｌｅｓ古細菌からのポリメラーゼを用いる二相核酸配列決定方法では、ステップ（ｅ）の複数のヌクレオチドは、開裂可能な部分を介して３’ＯＨ糖位に結合する鎖終結部分を含み、ステップ（ｆ）は、核酸プライマーに取り込まれた鎖終結ヌクレオチドを開裂剤と接触させて鎖終結部分を除去し、それによって３’伸長可能な末端を有する複数の核酸プライマーを生成することを更に含む。

【0062】

いくつかの実施形態において、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ａｌｔｉａｒｃｈａｅａｌｅｓ古細菌からのポリメラーゼを用いる二相核酸配列決定方法では、複数の第２の野生型または変異体ＤＮＡポリメラーゼは、蛍光標識され得るか、または蛍光標識され得ず、上記のフルオロフォアの実施形態のうちのいずれかを含み得る。いくつかの実施形態において、複数の第２の野生型ＤＮＡポリメラーゼまたは変異体ＤＮＡポリメラーゼは、複数のヌクレオチドを含み、これらは、蛍光標識され得るか、または蛍光標識され得ず、上記のフルオロフォアの実施形態のうちのいずれかを含み得る。

【0063】

いくつかの実施形態において、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ａｌｔｉａｒｃｈａｅａｌｅｓ古細菌からのポリメラーゼを用いる二相核酸配列決定方法では、核酸鋳型分子を含み、核酸鋳型分子は、上記の潜在的特性のうちのいずれかを含む核酸鋳型の実施形態を含み得る。

【0064】

いくつかの実施形態において、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ａｌｔｉａｒｃｈａｅａｌｅｓ古細菌からのポリメラーゼを用いる二相核酸配列決定方法では、複数の第１の複合ポリメラーゼは、上記の潜在的特性のうちのいずれかを含む固定化の実施形態に従って固定化される。

【0065】

本開示は、組換え変異体９°Ｎ ＤＮＡポリメラーゼを提供する。本明細書内で使用される「組換え変異体９°Ｎ ＤＮＡ」は、本段落及び以下の段落に記載される特性のうちのいずれかを含み得る。例えば、組換え変異体９°Ｎ ＤＮＡは、配列番号２８０または２８１または２８２の骨格アミノ酸配列を含み得、以下を含む２つ以上のアミノ酸置換変異のうちの少なくとも１つまたは任意の組み合わせを有し得る：（１）位置４０８のロイシン（Ｌ）は、セリン（Ｓ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、バリン（Ｖ）、グリシン（Ｇ）、トレオニン（Ｔ）、アラニン（Ａ）、イソロイシン（Ｉ）、フェニルアラニン（Ｆ）、もしくはメチオニン（Ｍ）で置換され、（２）位置４０９のチロシン（Ｙ）は、アラニン（Ａ）、トレオニン（Ｔ）、セリン（Ｓ）、グリシン（Ｇ）、バリン（Ｖ）、イソロイシン（Ｉ）、もしくはチロシン（Ｙ）で置換され、（３）位置４１０のプロリン（Ｐ）は、グリシン（Ｇ）、セリン（Ｓ）、バリン（Ｖ）、システイン（Ｃ）、リシン（Ｋ）、イソロイシン（Ｉ）、トレオニン（Ｔ）、もしくはアラニン（Ａ）で置換され、（４）位置４８５のアラニン（Ａ）は、セリン（Ｓ）もしくはバリン（Ｖ）で置換され、（５）位置４９２のセリン（Ｓ）は、グリシン（Ｇ）で置換され、（６）位置５０７のリシン（Ｋ）は、ロイシン（Ｌ）、トレプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）、プロリン（Ｐ）、もしくはフェニルアラニン（Ｆ）で置換され、（７）位置５２１のイソロイシンは、ヒスチジン（Ｈ）、トレオニン（Ｔ）、バリン（Ｖ）、セリン（Ｓ）、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、ロイシン（Ｌ）、もしくはフェニルアラニン（Ｆ）で置換され、及び／または（８）位置５５９のリシン（Ｋ）は、アスパラギン酸（Ｄ）で置換される。いくつかの実施形態において、変異体９°Ｎ ＤＮＡポリメラーゼは、アミノ酸置換Ｄ１４１Ａ及びＥ１４３Ａを更に含む。

【0066】

いくつかの実施形態において、組換え変異体９°Ｎ ＤＮＡポリメラーゼは、配列番号２８０または２８１または２８２の骨格アミノ酸配列を含み、以下を含むアミノ酸置換変異の組み合わせを有する：（ｉ）位置４０８のロイシン（Ｌ）は、セリン（Ｓ）、フェニルアラニン（Ｆ）、またはチロシン（Ｙ）で置換され、（ｉｉ）位置４０９のチロシン（Ｙ）は、アラニン（Ａ）で置換され、位置４１０のプロリン（Ｐ）は、グリシン（Ｇ）で置換され、位置４８５のアラニン（Ａ）は、セリン（Ｓ）で置換され、位置５０７のリシン（Ｋ）は、ロイシン（Ｌ）で置換され、位置５２１のイソロイシンは、ヒスチジン（Ｈ）で置換され、位置５５９のリシン（Ｋ）は、アスパラギン酸（Ｄ）で置換される。配列番号２８０の骨格配列に基づき、置換変異Ｌ４０８Ｓ、Ｙ４０９Ａ、Ｐ４１８Ｇ、Ａ４８５Ｓ、Ｋ５０７Ｌ、Ｉ５２１Ｈ、及びＫ５５９Ｄ（配列番号３７６）を有する変異体９°Ｎ ＤＮＡポリメラーゼ。配列番号２８１の骨格配列に基づき、置換変異Ｌ４０８Ｓ、Ｙ４０９Ａ、Ｐ４１８Ｇ、Ａ４８５Ｓ、Ｋ５０７Ｌ、Ｉ５２１Ｈ、及びＫ５５９Ｄ（配列番号３７９）を有する変異体９°Ｎ ＤＮＡポリメラーゼ。配列番号２８２の骨格配列に基づき、置換変異Ｌ４０８Ｓ、Ｙ４０９Ａ、Ｐ４１８Ｇ、Ａ４８５Ｓ、Ｋ５０７Ｌ、Ｉ５２１Ｈ、及びＫ５５９Ｄ（配列番号３８２）を有する変異体９°Ｎ ＤＮＡポリメラーゼ。配列番号２８０の骨格配列に基づき、置換変異Ｌ４０８Ｆ、Ｙ４０９Ａ、Ｐ４１８Ｇ、Ａ４８５Ｓ、Ｋ５０７Ｌ、Ｉ５２１Ｈ、及びＫ５５９Ｄ（配列番号３７７）を有する変異体９°Ｎ ＤＮＡポリメラーゼ。配列番号２８１の骨格配列に基づき、置換変異Ｌ４０８Ｆ、Ｙ４０９Ａ、Ｐ４１８Ｇ、Ａ４８５Ｓ、Ｋ５０７Ｌ、Ｉ５２１Ｈ、及びＫ５５９Ｄ（配列番号３８０）を有する変異体９°Ｎ ＤＮＡポリメラーゼ。配列番号２８２の骨格配列に基づき、置換変異Ｌ４０８Ｆ、Ｙ４０９Ａ、Ｐ４１８Ｇ、Ａ４８５Ｓ、Ｋ５０７Ｌ、Ｉ５２１Ｈ、及びＫ５５９Ｄ（配列番号３８３）を有する変異体９°Ｎ ＤＮＡポリメラーゼ。いくつかの実施形態において、変異体９°Ｎ ＤＮＡポリメラーゼは、アミノ酸置換Ｄ１４１Ａ及びＥ１４３Ａを更に含む。

【0067】

いくつかの実施形態において、組換え変異体９°Ｎ ＤＮＡポリメラーゼは、配列番号２８０または２８１または２８２の骨格アミノ酸配列を含み、以下を含むアミノ酸置換変異の組み合わせを有する：（ｉ）位置４０８のロイシン（Ｌ）は、セリン（Ｓ）、フェニルアラニン（Ｆ）、またはチロシン（Ｙ）で置換され、（ｉｉ）位置４０９のチロシン（Ｙ）は、アラニン（Ａ）で置換され、位置４１０のプロリン（Ｐ）は、グリシン（Ｇ）で置換され、位置４８５のアラニン（Ａ）は、セリン（Ｓ）で置換され、位置４９２のセリン（Ｓ）は、グリシン（Ｇ）で置換され、位置５０７のリシン（Ｋ）は、ロイシン（Ｌ）で置換され、位置５２１のイソロイシンは、ヒスチジン（Ｈ）で置換され、位置５５９のリシン（Ｋ）は、アスパラギン酸（Ｄ）で置換される。配列番号２８０の骨格配列に基づき、置換変異Ｌ４０８Ｆ、Ｙ４０９Ａ、Ｐ４１８Ｇ、Ａ４８５Ｓ、Ｓ４９２Ｇ、Ｋ５０７Ｌ、Ｉ５２１Ｈ、及びＫ５５９Ｄ（配列番号３７８）を有する変異体９°Ｎ ＤＮＡポリメラーゼ。配列番号２８１の骨格配列に基づき、置換変異Ｌ４０８Ｆ、Ｙ４０９Ａ、Ｐ４１８Ｇ、Ａ４８５Ｓ、Ｓ４９２Ｇ、Ｋ５０７Ｌ、Ｉ５２１Ｈ、及びＫ５５９Ｄ（配列番号３８１）を有する変異体９°Ｎ ＤＮＡポリメラーゼ。配列番号２８２の骨格配列に基づき、置換変異Ｌ４０８Ｆ、Ｙ４０９Ａ、Ｐ４１８Ｇ、Ａ４８５Ｓ、Ｓ４９２Ｇ、Ｋ５０７Ｌ、Ｉ５２１Ｈ、及びＫ５５９Ｄ（配列番号３８４）を有する変異体９°Ｎ ＤＮＡポリメラーゼ。いくつかの実施形態において、変異体９°Ｎ ＤＮＡポリメラーゼは、アミノ酸置換Ｄ１４１Ａ及びＥ１４３Ａを更に含む。

【0068】

いくつかの実施形態において、組換え変異体９°Ｎ ＤＮＡポリメラーゼは、核酸鋳型分子と、３’伸長可能な末端を有するヌクレオチド重合開始部位とを更に含む。核酸鋳型分子は、上記の潜在的特性のうちのいずれかを含む、核酸鋳型の実施形態のうちのいずれかを含み得る。

【0069】

いくつかの実施形態において、組換え変異体９°Ｎ ＤＮＡポリメラーゼは、核酸鋳型分子と、３’伸長可能な末端を有するヌクレオチド重合開始部位と、少なくとも１つのヌクレオチドとを更に含み、少なくとも１つのヌクレオチドは、上で考察した１つ以上の例示的なヌクレオチド単位特性を含むヌクレオチド単位を含む。

【0070】

いくつかの実施形態において、組換え変異体９°Ｎ ＤＮＡポリメラーゼは、核酸プライマーにハイブリダイズする核酸鋳型分子に結合する組換え変異体９°Ｎ ＤＮＡポリメラーゼと、核酸鋳型分子内の相補的ヌクレオチドと反対側の位置で核酸プライマーの３’末端に結合する少なくとも１つのヌクレオチドとを含む三元複合体の一部である。いくつかの実施形態において、三元複合体において、ヌクレオチドは、核酸二重鎖に結合し、ポリメラーゼ触媒による取り込みを受けていないか、またはヌクレオチドは、核酸二重鎖に結合し、ポリメラーゼ触媒による取り込みを受けている。

【0071】

いくつかの実施形態において、組換え変異体９°Ｎ ＤＮＡポリメラーゼは、核酸鋳型分子と、３’伸長可能な末端を有するヌクレオチド重合開始部位と、フルオロフォアで標識される少なくとも１つのヌクレオチドまたは少なくとも１つのヌクレオチドがフルオロフォア標識を欠く少なくとも１つのヌクレオチドとを更に含む。

【0072】

いくつかの実施形態において、組換え変異体９°Ｎ ＤＮＡポリメラーゼは、核酸鋳型分子と、３’伸長可能な末端を有するヌクレオチド重合開始部位と、開裂可能な部分を介して３’－ＯＨ糖位に結合する鎖終結部分を含む少なくとも１つのヌクレオチドとを更に含み、これは上記の鎖終結部分の実施形態のうちのいずれかを含み得る。いくつかの実施形態において、鎖終結部分は、上記の潜在的特性のうちのいずれかを含む、アジド（ａｚｉｄｅ）、アジド（ａｚｉｄｏ）、またはアジドメチル基を含む。

【0073】

いくつかの実施形態において、組換え変異体９°Ｎ ＤＮＡポリメラーゼは、蛍光標識され得るか、または蛍光標識され得ず、上記のフルオロフォアの実施形態のうちのいずれかを含み得る、組換え変異体９°Ｎ ＤＮＡポリメラーゼを含む。いくつかの実施形態において、組換え変異体９°Ｎ ＤＮＡポリメラーゼは、少なくとも１つのヌクレオチドを含み、これは、蛍光標識され得るか、または蛍光標識され得ない。

【0074】

いくつかの実施形態において、組換え変異体９°Ｎ ＤＮＡポリメラーゼは、少なくとも１つの多価分子を更に含み、これは、上記の潜在的特徴のうちのいずれかを含む、多価分子の実施形態のうちのいずれかを含み得る。

【0075】

いくつかの実施形態において、組換え変異体９°Ｎ ＤＮＡポリメラーゼは、少なくとも１つの多価分子を更に含み、これは、上述のように、蛍光標識され得るか、または蛍光標識され得ず、少なくとも１つの蛍光標識された多価分子を含む。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの多価分子は、フルオロフォアで標識されたコアを含む。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの多価分子は、フルオロフォアに結合するリンカー及び／またはヌクレオチド単位を有する１つ以上のヌクレオチドアームを含む。いくつかの実施形態において、組換え変異体９°Ｎ ＤＮＡポリメラーゼは、フルオロフォアを欠く多価分子を更に含む。

【0076】

いくつかの実施形態において、組換え変異体９°Ｎ ＤＮＡポリメラーゼは、開裂可能な部分を介して３’－ＯＨ糖位に結合する鎖終結部分を有するヌクレオチド単位を含む少なくとも１つの多価分子を更に含み、これは、上記の鎖終結部分の実施形態のうちのいずれかを含み得る。いくつかの実施形態において、鎖終結部分は、上記の潜在的特性のうちのいずれかを含む、アジド（ａｚｉｄｅ）、アジド（ａｚｉｄｏ）、またはアジドメチル基を含む。

【0077】

いくつかの実施形態において、組換え変異体９°Ｎ ＤＮＡポリメラーゼは、蛍光標識され得るか、または蛍光標識され得ず、上記のフルオロフォアの実施形態のうちのいずれかを含み得るポリメラーゼを含む。いくつかの実施形態において、組換え変異体９°Ｎ ＤＮＡポリメラーゼは、ポリメラーゼを含み、蛍光標識され得るか、または蛍光標識され得ない少なくとも１つの多価分子を更に含み、上記のフルオロフォアの実施形態のうちのいずれかを含み得る。

【0078】

いくつかの実施形態において、組換え変異体９°Ｎ ＤＮＡポリメラーゼは、核酸鋳型分子と、３’伸長可能な末端を有するヌクレオチド重合開始部位と、ポリメラーゼ触媒によるヌクレオチドの取り込みを促進する複数の触媒二価カチオンとを更に含み、触媒二価カチオンは、マグネシウム及び／またはマンガンを含む。

【0079】

いくつかの実施形態において、組換え変異体９°Ｎ ＤＮＡポリメラーゼは、核酸鋳型分子と、３’伸長可能な末端を有するヌクレオチド重合開始部位と、ポリメラーゼ触媒によるヌクレオチドの取り込みを阻害する複数の非触媒二価カチオンとを更に含み、非触媒二価カチオンは、ストロンチウム、バリウム、及び／またはカルシウムを含む。

【0080】

いくつかの実施形態において、組換え変異体９°Ｎ ＤＮＡポリメラーゼは、複数の核酸鋳型分子及び複数のヌクレオチド重合開始部位に結合する複数の変異体ＤＮＡポリメラーゼを更に含み、これは、核酸二本鎖がオリゴヌクレオチドプライマーにハイブリダイズする核酸鋳型分子を含む場合、複数の複合変異体ＤＮＡポリメラーゼ（各々、核酸二本鎖に結合する変異体ＤＮＡポリメラーゼを含む）を形成する。いくつかの実施形態において、複数の複合変異体ＤＮＡポリメラーゼは、上記の潜在的特性のうちのいずれかを含む、固定化の実施形態に従って固定化される。

【0081】

本開示は、変異体９°Ｎ ＤＮＡポリメラーゼ及びヌクレオチドを用いる核酸配列決定方法を提供する。本開示は、核酸配列決定方法であって、（ａ）（ｉ）複数の変異体９°Ｎ ＤＮＡポリメラーゼ、及び（ｉｉ）複数の核酸二本鎖であって、各々、核酸プライマーにハイブリダイズする核酸鋳型分子を含む複数の核酸二本鎖を接触させることであって、接触させることは、複数の複合ポリメラーゼであって、各々、核酸二本鎖に結合する変異体９°Ｎ ＤＮＡポリメラーゼを含む複数の複合ポリメラーゼを形成するのに好適な条件下で行われる、接触させることと、（ｂ）複数の複合ポリメラーゼを、（ｉｉｉ）複数のヌクレオチド、及び（ｉｖ）複数の触媒または非触媒二価カチオンと接触させることであって、接触させることは、複数の三元複合体であって、各々、核酸二本鎖及びヌクレオチドに結合する変異体ＤＮＡポリメラーゼを含む複数の三元複合体を形成するのに好適な条件下で行われ、三元複合体において、ヌクレオチドは、核酸鋳型分子内の相補的ヌクレオチドの反対側の位置で、核酸プライマーの３’末端に結合し、条件は、核酸プライマーの３’末端に結合するヌクレオチドのポリメラーゼ触媒による取り込みを促進するのに好適であるか、または条件は、核酸プライマーの３’末端に結合するヌクレオチドのポリメラーゼ触媒による取り込みを阻害するのに好適である、接触させることと、（ｃ）複数の三元複合体を検出することと、（ｄ）複数の三元複合体における複数の取り込まれたヌクレオチドを識別することと、を含む、方法を提供する。先に記載される変異体ポリメラーゼの説明（例えば、変異体９°Ｎ ＤＮＡポリメラーゼについての上記の段落）も、ここに適用される。

【0082】

いくつかの実施形態において、変異体９°Ｎ ＤＮＡポリメラーゼ及びヌクレオチドを用いる配列決定方法では、複数の三元複合体は、核酸二本鎖からの変異体または野生型ポリメラーゼを解離することなく安定した状態を保ち（または低減された解離を示し）、安定した三元複合体は、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、または１秒を超える持続時間を示す。

【0083】

いくつかの実施形態において、変異体９°Ｎ ＤＮＡポリメラーゼ及びヌクレオチドを用いる配列決定方法では、ヌクレオチドは、核酸二本鎖に結合し、ポリメラーゼ触媒による取り込みを受けていないか、またはヌクレオチドは、核酸二本鎖に結合し、ポリメラーゼ触媒による取り込みを受けている。

【0084】

いくつかの実施形態において、変異体９°Ｎ ＤＮＡポリメラーゼ及びヌクレオチドを用いる配列決定方法では、複数の触媒二価カチオンは、マグネシウム及び／またはマンガンを含む。いくつかの実施形態において、変異体９°Ｎ ＤＮＡポリメラーゼ及びヌクレオチドを用いる配列決定方法では、複数の非触媒二価カチオンは、ストロンチウム、バリウム、及び／またはカルシウムを含む。

【0085】

いくつかの実施形態において、変異体９°Ｎ ＤＮＡポリメラーゼ及びヌクレオチドを用いる配列決定方法では、複数の変異体９°Ｎ ＤＮＡポリメラーゼは、複数の蛍光標識ポリメラーゼを含むか、または複数の変異体９°Ｎ ＤＮＡポリメラーゼは、フルオロフォアを欠く。

【0086】

いくつかの実施形態において、変異体９°Ｎ ＤＮＡポリメラーゼ及びヌクレオチドを用いる配列決定方法では、複数のヌクレオチド中の個々のヌクレオチドは、上で考察した１つ以上の例示的なヌクレオチド単位特性を含むヌクレオチド単位を含む。

【0087】

いくつかの実施形態において、変異体９°Ｎ ＤＮＡポリメラーゼ及びヌクレオチドを用いる配列決定方法では、これらは、蛍光標識され得るか、または蛍光標識され得ず、上記のフルオロフォアの実施形態のうちのいずれかを含み得る。

【0088】

いくつかの実施形態において、変異体９°Ｎ ＤＮＡポリメラーゼ及びヌクレオチドを用いる配列決定方法では、複数のヌクレオチド中のヌクレオチドの少なくとも１つは、開裂可能な部分を介して３’－ＯＨ糖位に結合する鎖終結部分を含み、これは、上記の鎖終結部分の実施形態のうちのいずれかを含み得る。いくつかの実施形態において、鎖終結部分は、上記の潜在的特性のうちのいずれかを含む、アジド（ａｚｉｄｅ）、アジド（ａｚｉｄｏ）、またはアジドメチル基を含む。

【0089】

いくつかの実施形態において、変異体９°Ｎ ＤＮＡポリメラーゼ及びヌクレオチドを用いる配列決定方法では、複数の核酸鋳型分子は、上記の潜在的特性のうちのいずれかを含む核酸鋳型の実施形態を含み得る。

【0090】

いくつかの実施形態において、変異体９°Ｎ ＤＮＡポリメラーゼ及びヌクレオチドを用いる配列決定方法では、複数の複合ポリメラーゼは、上記の潜在的特性のうちのいずれかを含む、固定化の実施形態に従って固定化される。

【0091】

本開示は、変異体９°Ｎ ＤＮＡポリメラーゼ及び多価分子を用いる配列決定方法を提供し、これらの各々は、先に記載されており、それらの説明も本明細書に適用される。

【0092】

いくつかの実施形態において、変異体９°Ｎ ＤＮＡポリメラーゼ及び多価分子を用いる配列決定方法では、複数の三元複合体は、核酸二本鎖からの変異体または野生型ポリメラーゼを解離することなく安定した状態を保ち（または低減された解離を示し）、安定した三元複合体は、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、または１秒を超える持続時間を示す。

【0093】

いくつかの実施形態において、変異体９°Ｎ ＤＮＡポリメラーゼ及び多価分子を用いる配列決定方法では、三元複合体において、多価分子のヌクレオチド単位は、核酸二本鎖に結合し、ポリメラーゼ触媒による取り込みを受けていないか、またはヌクレオチド単位は、核酸二本鎖に結合し、ポリメラーゼ触媒による取り込みを受けている。

【0094】

いくつかの実施形態において、親和性複合体を形成することを更に含む、変異体９°Ｎ ＤＮＡポリメラーゼ及び多価分子を用いる配列決定方法では、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ａｌｔｉａｒｃｈａｅａｌｅｓからのポリメラーゼを用いる二相核酸配列決定方法について前述したものと同様のステップ（ステップ（１）～（４））を含んだ、親和性複合体を形成するための方法は、親和性複合体を形成することを更に含み、これらのステップは、（ａ）複数の変異体９°Ｎ ＤＮＡポリメラーゼ及び複数の核酸プライマーを、コンカテマー核酸鋳型分子の異なる部分と接触させて、同じコンカテマー鋳型分子上に少なくとも第１及び第２の複合ポリメラーゼを形成するステップと、（ｂ）複数の多価分子を、同じコンカテマー鋳型分子上の少なくとも第１及び第２の複合ポリメラーゼに、複数の多価分子からの単一の多価分子を第１及び第２の複合ポリメラーゼに結合するのに好適な条件下で接触させるステップであって、単一の多価分子の少なくとも第１のヌクレオチド単位は、コンカテマー鋳型分子の第１の部分にハイブリダイズし、それによって第１の三元複合体を形成する第１のプライマーを含む第１の複合ポリメラーゼに結合し、単一の多価分子の少なくとも第２のヌクレオチド単位は、コンカテマー鋳型分子の第２の部分にハイブリダイズし、それによって第２の三元複合体を形成する第２のプライマーを含む第２の複合ポリメラーゼに結合して、接触させることが、第１及び第２の三元複合体（それぞれ）中の結合した第１及び第２のヌクレオチド単位のポリメラーゼ触媒による取り込みを阻害するのに好適な条件下で行われ、同じ多価分子に結合する第１及び第２の三元複合体が親和性複合体を形成する、接触させるステップと、（ｃ）同じコンカテマー鋳型分子上で第１及び第２の三元複合体を検出するステップと、（ｄ）第１の三元複合体中の第１のヌクレオチド単位を識別し、それによってコンカテマー鋳型分子の第１の部分の配列を決定し、第２の三元複合体中の第２のヌクレオチド単位を識別し、それによってコンカテマー鋳型分子の第２の部分の配列を決定するステップと、を含む。いくつかの実施形態において、ステップ（ｄ）の識別することは、第１の三元複合体中の第１のプライマーの３’末端に結合し、それによってコンカテマー鋳型分子の第１の部分の配列を決定する第１のヌクレオチド単位を識別することと、第２の三元複合体中の第２のプライマーの３’末端に結合し、それによってコンカテマー鋳型分子の第２の部分の配列を決定する第２のヌクレオチド単位を識別することとを含む。

【0095】

いくつかの実施形態において、変異体９°Ｎ ＤＮＡポリメラーゼ及び多価分子を用いる配列決定方法では、非触媒二価カチオンは、ストロンチウム、バリウム、及び／またはカルシウムを含む。

【0096】

いくつかの実施形態において、変異体９°Ｎ ＤＮＡポリメラーゼ及び多価分子を用いる配列決定方法では、個々の多価分子は、上記の潜在的特性のうちのいずれかを含む、多価分子の実施形態のうちのいずれかを含み得る。

【0097】

いくつかの実施形態において、変異体９°Ｎ ＤＮＡポリメラーゼ及び多価分子を用いる配列決定方法では、複数の多価分子は、蛍光標識され得るか、または蛍光標識され得ず、上記のフルオロフォアの実施形態のうちのいずれかを含み得る。

【0098】

いくつかの実施形態において、変異体９°Ｎ ＤＮＡポリメラーゼ及び多価分子を用いる配列決定方法では、複数の多価分子中の多価分子のうちの少なくとも１つは、開裂可能な部分を介して３’－ＯＨ糖位に結合する鎖終結部分を有するヌクレオチド単位を含み、これは、上記の鎖終結部分の実施形態のうちのいずれかを含み得る。いくつかの実施形態において、鎖終結部分は、上記の潜在的特性のうちのいずれかを含む、アジド（ａｚｉｄｅ）、アジド（ａｚｉｄｏ）、またはアジドメチル基を含む。

【0099】

いくつかの実施形態において、変異体９°Ｎ ＤＮＡポリメラーゼ及び多価分子を用いる配列決定方法では、これらのうちのいずれかが、蛍光標識され得るか、または蛍光標識され得ず、上記のフルオロフォアの実施形態のうちのいずれかを含み得る。

【0100】

いくつかの実施形態において、変異体９°Ｎ ＤＮＡポリメラーゼ及び多価分子を用いる配列決定方法では、複数の核酸鋳型分子は、上記の潜在的特性のうちのいずれかを含む核酸鋳型の実施形態を含み得る。

【0101】

いくつかの実施形態において、変異体９°Ｎ ＤＮＡポリメラーゼ及び多価分子を用いる配列決定方法では、複数の複合ポリメラーゼは、上記の潜在的特性のうちのいずれかを含む、固定化の実施形態に従って固定化される。

【0102】

本開示は、変異体９°Ｎ ＤＮＡポリメラーゼ、多価分子、及びヌクレオチドを用いる二相核酸配列決定方法を提供する。本開示は、核酸配列決定方法であって、（ａ）（ｉ）複数の第１の変異体９°Ｎ ＤＮＡポリメラーゼと、（ｉｉ）複数の核酸二本鎖（各々、核酸プライマーにハイブリダイズする核酸鋳型分子を含む）を接触させることであって、接触させることは、複数の第１の複合ポリメラーゼ（各々、核酸二本鎖に結合する第１の変異体９°Ｎ ＤＮＡポリメラーゼを含む）を形成するのに好適な条件下で行われる、接触させることと、（ｂ）複数の第１の複合ポリメラーゼを、（ｉｉｉ）複数の多価分子、及び（ｉｖ）複数の非触媒二価カチオンと接触させることであって、複数の多価分子は各々、複数のヌクレオチドアームに結合するコアを含み、各ヌクレオチドアームは、ヌクレオチド単位を含み、接触させることは、複数の第１の三元複合体であって、各々、核酸二本鎖に結合する第１の変異体９°Ｎ ＤＮＡポリメラーゼ、及び多価分子を含む複数の第１の三元複合体を形成するのに好適な条件下で行われ、第１の三元複合体では、多価分子のヌクレオチド単位は、核酸鋳型分子内の相補的ヌクレオチドの反対側の位置での核酸プライマーの３’末端に結合し、接触させることが、多価分子の結合したヌクレオチド単位のポリメラーゼ触媒による取り込みを阻害するのに好適な条件下で行われる、接触させることと、（ｃ）複数の第１の三元複合体を検出し、核酸プライマーの３’末端に結合するヌクレオチド単位を識別し、それによって核酸鋳型分子の配列を決定することと、（ｄ）複数の第１の変異体９°Ｎポリメラーゼ及び複数の多価分子を除去することによって複数の第１の三元複合体を解離し、複数の核酸二重鎖を保持することと、（ｅ）ステップ（ｄ）の保持された核酸二重鎖を、（ｉ）複数の第２の変異体９°Ｎ ＤＮＡポリメラーゼ、（ｉｉ）複数のヌクレオチド、及び（ｉｉｉ）複数の触媒二価カチオンと接触させることであって、ステップ（ｅ）の接触が、複数の第２の三元複合体であって、各々、ステップ（ｄ）の保持された核酸二本鎖及びヌクレオチドに結合した第２の変異体９°Ｎ ＤＮＡポリメラーゼを含む複数の第２の三元複合体を形成するのに好適な条件下で行われ、第２の三元複合体において、ヌクレオチドは、核酸鋳型分子内の相補的ヌクレオチドの反対側の位置で核酸プライマーの３’末端に結合し、条件は、核酸プライマーの３’末端に結合したヌクレオチドのポリメラーゼ触媒による取り込みを促進するのに好適である、接触させることと、（ｆ）複数の第２の三元複合体を検出し、第２の三元複合体内の取り込まれたヌクレオチドを識別することと、を含む、方法を提供する。いくつかの実施形態において、ステップ（ｆ）の検出することは、任意選択的である。いくつかの実施形態において、ステップ（ｆ）の識別することは、任意選択的である。いくつかの実施形態において、非触媒二価カチオンは、ストロンチウム、バリウム、及び／またはカルシウムを含み、触媒二価カチオンは、マグネシウムまたはマンガンを含む。

【0103】

いくつかの実施形態において、変異体９°Ｎポリメラーゼを用いる二相核酸配列決定方法は、（ｇ）複数の第２の変異体９°Ｎ ＤＮＡポリメラーゼを除去し、ステップ（ｆ）の複数の核酸二本鎖を保持することと、（ｈ）ステップ（ｇ）の保持された核酸二本鎖を、複数の第１の変異体９°Ｎ ＤＮＡポリメラーゼ、複数の多価分子、及び複数の非触媒二価カチオンと接触させることであって、接触させることが、別の複数の第１の三元複合体を形成するのに好適な条件下で行われ、接触させることが、多価分子の結合ヌクレオチド単位のポリメラーゼ触媒による取り込みを阻害するのに好適な条件下で行われる、接触させることと、（ｉ）ステップ（ｈ）で形成された複数の第１の三元複合体を検出し、核酸プライマーの３’末端に結合するヌクレオチド単位を識別し、それによって核酸鋳型分子の配列を決定することと、（ｊ）複数の第１の変異体９°Ｎポリメラーゼ及び複数の多価分子を除去することによってステップ（ｈ）で形成された複数の第１の三元複合体を解離し、複数の核酸二本鎖を保持することと、（ｋ）ステップ（ｊ）の複数の保持された核酸二本鎖を、複数の第２の変異体９°Ｎ ＤＮＡポリメラーゼ、複数のヌクレオチド、及び複数の触媒二価カチオンと接触させることであって、接触させることが、別の複数の第２の三元複合体を形成するのに好適な条件下で行われ、条件が、核酸プライマーの３’末端に結合したヌクレオチドのポリメラーゼ触媒による取り込みを促進するのに好適である、接触させることと、（ｌ）ステップ（ｋ）で形成された複数の第２の三元複合体を検出し、第２の三元複合体における複数の取り込まれたヌクレオチドを識別することと、（ｍ）ステップ（ｇ）～（ｌ）を少なくとも１回繰り返すことと、を含む、方法を更に含む。いくつかの実施形態において、ステップ（ｌ）の検出することは、任意選択的である。いくつかの実施形態において、ステップ（ｌ）の識別することは、任意選択的である。いくつかの実施形態において、非触媒二価カチオンは、ストロンチウム、バリウム、及び／またはカルシウムを含み、触媒二価カチオンは、マグネシウムまたはマンガンを含む。

【0104】

いくつかの実施形態において、変異体９°Ｎポリメラーゼを用いる二相核酸配列決定方法では、そのいずれかを前述のように突然変異させることができる。

【0105】

いくつかの実施形態において、変異体９°Ｎポリメラーゼを用いる二相核酸配列決定方法では、複数の第１の変異体９°Ｎ ＤＮＡポリメラーゼは、核酸二本鎖からの第１の変異体９°Ｎ ＤＮＡポリメラーゼを解離することなく安定した状態を保つ（または低減された解離を示す）、ステップ（ｂ）における複数の第１の三元複合体を形成し、安定した三元複合体は、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、または１秒を超える持続時間を示す。

【0106】

いくつかの実施形態において、変異体９°Ｎポリメラーゼを用いる二相核酸配列決定方法では、複数の第２の変異体９°Ｎ ＤＮＡポリメラーゼは、核酸二本鎖からの第１の変異体９°Ｎ ＤＮＡポリメラーゼを解離することなく安定した状態を保つ（または低減された解離を示す）、ステップ（ｅ）における複数の第１の三元複合体を形成し、安定した三元複合体は、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、または１秒を超える持続時間を示す。

【0107】

いくつかの実施形態において、変異体９°Ｎポリメラーゼを用いる二相核酸配列決定方法は、第１の三元複合体において、多価分子のヌクレオチド単位が核酸二重鎖に結合し、ポリメラーゼ触媒による取り込みを受けていないか、またはヌクレオチド単位が核酸二重鎖に結合し、ポリメラーゼ触媒による取り込みを受けている。いくつかの実施形態において、第２の三元複合体において、ヌクレオチドは、核酸二重鎖に結合し、ポリメラーゼ触媒による取り込みを受けていないか、またはヌクレオチドは、核酸二重鎖に結合し、ポリメラーゼ触媒による取り込みを受けている。

【0108】

いくつかの実施形態において、変異体９°Ｎポリメラーゼを用いる二相核酸配列決定方法では、本方法は、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ａｌｔｉａｒｃｈａｅａｌｅｓからのポリメラーゼに関して前述の親和性複合体を形成することを更に含み、同様のステップ（ステップ（１）～（４））を含み、（ａ）複数の野生型または変異体ＤＮＡポリメラーゼ及び複数の核酸プライマーをコンカテマー核酸鋳型分子の異なる部分と接触させて、同じコンカテマー鋳型分子上の少なくとも第１及び第２の複合ポリメラーゼを形成するステップと、（ｂ）複数の多価分子を、同じコンカテマー鋳型分子上の少なくとも第１及び第２の複合ポリメラーゼに、複数の多価分子からの単一の多価分子を第１及び第２の複合ポリメラーゼに結合するのに好適な条件下で接触させるステップであって、単一の多価分子の少なくとも第１のヌクレオチド単位は、コンカテマー鋳型分子の第１の部分にハイブリダイズし、それによって第１のコンカテマー三元複合体を形成する第１のプライマーを含む第１の複合ポリメラーゼに結合し、単一の多価分子の少なくとも第２のヌクレオチド単位は、コンカテマー鋳型分子の第２の部分にハイブリダイズし、それによって第２のコンカテマー三元複合体を形成する第２のプライマーを含む第２の複合ポリメラーゼに結合して、接触させるステップが、第１及び第２のコンカテマー三元複合体中の結合した第１及び第２のヌクレオチド単位のポリメラーゼ触媒による取り込みを阻害するのに好適な条件下で行われ、同じ多価分子に結合する第１及び第２のコンカテマー三元複合体が親和性複合体を形成する、接触させるステップと、（ｃ）同じコンカテマー鋳型分子上で第１及び第２のコンカテマー三元複合体を検出するステップと、（ｄ）第１のコンカテマー三元複合体中の第１のヌクレオチド単位を識別し、それによってコンカテマー鋳型分子の第１の部分の配列を決定し、第２のコンカテマー三元複合体中の第２のヌクレオチド単位を識別し、それによってコンカテマー鋳型分子の第２の部分の配列を決定するステップと、を含む。いくつかの実施形態において、ステップ（ｄ）の識別することは、第１のコンカテマー三元複合体中の第１のプライマーの３’末端に結合し、それによってコンカテマー鋳型分子の第１の部分の配列を決定する第１のヌクレオチド単位を識別することと、第２のコンカテマー三元複合体中の第２のプライマーの３’末端に結合し、それによってコンカテマー鋳型分子の第２の部分の配列を決定する第２のヌクレオチド単位を識別することと、を含む。

【0109】

いくつかの実施形態において、変異体９°Ｎポリメラーゼを用いる二相核酸配列決定方法では、複数の第１の変異体９°Ｎ ＤＮＡポリメラーゼは、複数の蛍光標識された第１の変異体９°Ｎ ＤＮＡポリメラーゼを含む。いくつかの実施形態において、複数の第１の変異体９°Ｎ ＤＮＡポリメラーゼは、フルオロフォアを欠く。いくつかの実施形態において、複数の第２の変異体９°Ｎ ＤＮＡポリメラーゼは、複数の蛍光標識された第１の変異体９°Ｎ ＤＮＡポリメラーゼを含む。いくつかの実施形態において、複数の第２の変異体９°Ｎ ＤＮＡポリメラーゼは、フルオロフォアを欠く。

【0110】

いくつかの実施形態において、変異体９°Ｎポリメラーゼを用いる二相核酸配列決定方法では、多価分子は、上記の潜在的特性のうちのいずれかを含む、多価分子の実施形態のうちのいずれかを含み得る。

【0111】

いくつかの実施形態において、変異体９°Ｎポリメラーゼを用いる二相核酸配列決定方法では、複数の多価分子は、複数の蛍光標識された多価分子を含む。いくつかの実施形態において、複数の中の個々の多価分子のコアは、ヌクレオチドアームに結合するヌクレオチド単位に対応するフルオロフォアに結合する。いくつかの実施形態において、多価分子のヌクレオチドアームのうちの少なくとも１つは、フルオロフォアに結合するリンカー及び／またはヌクレオチド塩基を含み、所与のリンカーまたはヌクレオチド塩基に結合するフルオロフォアは、ヌクレオチドアームのヌクレオチド塩基（例えば、アデニン、グアニン、シトシン、チミン、またはウラシル）に対応する。いくつかの実施形態において、ステップ（ｂ）の複数の多価分子は、蛍光標識された多価分子であり、ステップ（ｃ）は、複数の第１の三元複合体からの蛍光シグナルを検出することと、核酸プライマーの３’末端に結合するヌクレオチド単位を識別し、それによって核酸鋳型分子の配列を決定することと、を含む。いくつかの実施形態において、複数の多価分子は、フルオロフォアを欠く。

【0112】

いくつかの実施形態において、変異体９°Ｎポリメラーゼを用いる二相核酸配列決定方法では、複数の１つ以上の多価分子のヌクレオチド単位のうちの少なくとも１つは、開裂可能な部分を介して３’－ＯＨ糖位に結合する鎖終結部分を含み、これは、上記の鎖終結部分の実施形態のうちのいずれかを含み得る。いくつかの実施形態において、鎖終結部分は、上記の潜在的特性のうちのいずれかを含む、アジド（ａｚｉｄｅ）、アジド（ａｚｉｄｏ）、またはアジドメチル基を含む。

【0113】

いくつかの実施形態において、変異体９°Ｎポリメラーゼを用いる二相核酸配列決定方法では、複数のヌクレオチド中の個々のヌクレオチドは、上で考察した１つ以上の例示的なヌクレオチド単位特性を含むヌクレオチド単位を含む。

【0114】

いくつかの実施形態において、変異体９°Ｎポリメラーゼを用いる二相核酸配列決定方法では、複数のヌクレオチド中のヌクレオチドのうちの少なくとも１つは、蛍光標識ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、複数のヌクレオチドは、フルオロフォア標識を欠く。

【0115】

いくつかの実施形態において、変異体９°Ｎポリメラーゼを用いる二相核酸配列決定方法では、複数の第２の変異体９°Ｎ ＤＮＡポリメラーゼは、蛍光標識され得るか、または蛍光標識され得ず、上記のフルオロフォアの実施形態のうちのいずれかを含み得る。いくつかの実施形態において、複数のポリメラーゼは、１つ以上のヌクレオチドを含み、これらのうちのいずれかは、蛍光標識され得るか、または蛍光標識され得ず、上記のフルオロフォアの実施形態のうちのいずれかを含み得る。

【0116】

いくつかの実施形態において、変異体９°Ｎポリメラーゼを用いる二相核酸配列決定方法では、複数のヌクレオチドにおけるヌクレオチドのうちの少なくとも１つは、開裂可能な部分を介して３’－ＯＨ糖位に結合する鎖終結部分を含み、これは、上記の鎖終結部分の実施形態のうちのいずれかを含み得る。いくつかの実施形態において、鎖終結部分は、上記の潜在的特性のうちのいずれかを含む、アジド（ａｚｉｄｅ）、アジド（ａｚｉｄｏ）、またはアジドメチル基を含む。

【0117】

いくつかの実施形態において、変異体９°Ｎポリメラーゼを用いる二相核酸配列決定方法では、ステップ（ｅ）の複数のヌクレオチドは、開裂可能な部分を介して３’ＯＨ糖位に結合する鎖終結部分を含み、ステップ（ｆ）は、核酸プライマーに取り込まれた鎖終結ヌクレオチドを開裂剤と接触させて鎖終結部分を除去し、それによって３’伸長可能な末端を有する複数の核酸プライマーを生成することを更に含む。

【0118】

いくつかの実施形態において、変異体９°Ｎポリメラーゼを用いる二相核酸配列決定方法では、複数の核酸鋳型分子は、上記の潜在的特性のうちのいずれかを含む核酸鋳型の実施形態を含み得る。

【0119】

いくつかの実施形態において、変異体９°Ｎポリメラーゼを用いる二相核酸配列決定方法では、複数の第１の複合ポリメラーゼは、上記の潜在的特性のうちのいずれかを含む固定化の実施形態に従って固定化される。

【0120】

本特許または出願書類は、カラーで作成された少なくとも１つの図面を含む。カラーの図（複数可）を含むこの特許または特許出願の公報のコピーは、要求及び必要な費用の支払いにより米国特許商標庁によって提供される。

【0121】

本明細書に開示される組成物及び方法の新規利点及び特性は、添付の特許請求の範囲に詳細に述べられる。本開示の組成物及び方法の特性及び利点のより良好な理解は、例示的な実施形態を記載する以下の詳細な説明及び付属の図面を参照することにより得られる。

【図面の簡単な説明】

【0122】

【図1】様々なヌクレオチド濃度の３’メチルアジドｄＣＴＰの存在下でのＣａｎｄｉｄａｔｕｓ Ａｌｔｉａｒｃｈａｅａｌｅｓ古細菌からの精製された野生型及び変異体ＤＮＡポリメラーゼの生成物の形成速度を比較するグラフである。グラフは、配列番号１０５、１２９、１３０、１３４、１４１、１４９、１５１、及び１５５のアミン酸配列を有する変異体ポリメラーゼに関するデータを示す。

【0123】

【図2】Ｂｓｔポリメラーゼ（例えば、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓからのＤＮＡポリメラーゼＩ）の変異体による３’－メチルアジドヌクレオチドの相対取り込みの割合（％）を示すグラフである。

【0124】

【図3A】（図３Ａ～図３Ｈとして提示される８つのシート）は、表１（８つのシート）であり、４２℃での伸長ポリヌクレオチド鎖のＮ＋１位における３’メチルアジドヌクレオチドの取り込みにおけるＣａｎｄｉｄａｔｕｓ Ａｌｔｉａｒｃｈａｅａｌｅｓ古細菌からのＤＮＡポリメラーゼの野生型（配列番号１）及び変異体バリアント（配列番号２～１５７）の相対的な取り込み活性を記載する。バリアントは、発現株から除去された溶解物中に存在する。表１に記載される変異体ポリメラーゼ（配列番号２～１５７）の全ては、遺伝子型がこれらの置換変異を表１に列挙しない場合でも、置換変異Ｄ１４１Ａ及びＥ１４３Ａを含む。

【図3B】（図３Ａ～図３Ｈとして提示される８つのシート）は、表１（８つのシート）であり、４２℃での伸長ポリヌクレオチド鎖のＮ＋１位における３’メチルアジドヌクレオチドの取り込みにおけるＣａｎｄｉｄａｔｕｓ Ａｌｔｉａｒｃｈａｅａｌｅｓ古細菌からのＤＮＡポリメラーゼの野生型（配列番号１）及び変異体バリアント（配列番号２～１５７）の相対的な取り込み活性を記載する。バリアントは、発現株から除去された溶解物中に存在する。表１に記載される変異体ポリメラーゼ（配列番号２～１５７）の全ては、遺伝子型がこれらの置換変異を表１に列挙しない場合でも、置換変異Ｄ１４１Ａ及びＥ１４３Ａを含む。

【図3C】（図３Ａ～図３Ｈとして提示される８つのシート）は、表１（８つのシート）であり、４２℃での伸長ポリヌクレオチド鎖のＮ＋１位における３’メチルアジドヌクレオチドの取り込みにおけるＣａｎｄｉｄａｔｕｓ Ａｌｔｉａｒｃｈａｅａｌｅｓ古細菌からのＤＮＡポリメラーゼの野生型（配列番号１）及び変異体バリアント（配列番号２～１５７）の相対的な取り込み活性を記載する。バリアントは、発現株から除去された溶解物中に存在する。表１に記載される変異体ポリメラーゼ（配列番号２～１５７）の全ては、遺伝子型がこれらの置換変異を表１に列挙しない場合でも、置換変異Ｄ１４１Ａ及びＥ１４３Ａを含む。

【図3D】（図３Ａ～図３Ｈとして提示される８つのシート）は、表１（８つのシート）であり、４２℃での伸長ポリヌクレオチド鎖のＮ＋１位における３’メチルアジドヌクレオチドの取り込みにおけるＣａｎｄｉｄａｔｕｓ Ａｌｔｉａｒｃｈａｅａｌｅｓ古細菌からのＤＮＡポリメラーゼの野生型（配列番号１）及び変異体バリアント（配列番号２～１５７）の相対的な取り込み活性を記載する。バリアントは、発現株から除去された溶解物中に存在する。表１に記載される変異体ポリメラーゼ（配列番号２～１５７）の全ては、遺伝子型がこれらの置換変異を表１に列挙しない場合でも、置換変異Ｄ１４１Ａ及びＥ１４３Ａを含む。

【図3E】（図３Ａ～図３Ｈとして提示される８つのシート）は、表１（８つのシート）であり、４２℃での伸長ポリヌクレオチド鎖のＮ＋１位における３’メチルアジドヌクレオチドの取り込みにおけるＣａｎｄｉｄａｔｕｓ Ａｌｔｉａｒｃｈａｅａｌｅｓ古細菌からのＤＮＡポリメラーゼの野生型（配列番号１）及び変異体バリアント（配列番号２～１５７）の相対的な取り込み活性を記載する。バリアントは、発現株から除去された溶解物中に存在する。表１に記載される変異体ポリメラーゼ（配列番号２～１５７）の全ては、遺伝子型がこれらの置換変異を表１に列挙しない場合でも、置換変異Ｄ１４１Ａ及びＥ１４３Ａを含む。

【図3F】（図３Ａ～図３Ｈとして提示される８つのシート）は、表１（８つのシート）であり、４２℃での伸長ポリヌクレオチド鎖のＮ＋１位における３’メチルアジドヌクレオチドの取り込みにおけるＣａｎｄｉｄａｔｕｓ Ａｌｔｉａｒｃｈａｅａｌｅｓ古細菌からのＤＮＡポリメラーゼの野生型（配列番号１）及び変異体バリアント（配列番号２～１５７）の相対的な取り込み活性を記載する。バリアントは、発現株から除去された溶解物中に存在する。表１に記載される変異体ポリメラーゼ（配列番号２～１５７）の全ては、遺伝子型がこれらの置換変異を表１に列挙しない場合でも、置換変異Ｄ１４１Ａ及びＥ１４３Ａを含む。

【図3G】（図３Ａ～図３Ｈとして提示される８つのシート）は、表１（８つのシート）であり、４２℃での伸長ポリヌクレオチド鎖のＮ＋１位における３’メチルアジドヌクレオチドの取り込みにおけるＣａｎｄｉｄａｔｕｓ Ａｌｔｉａｒｃｈａｅａｌｅｓ古細菌からのＤＮＡポリメラーゼの野生型（配列番号１）及び変異体バリアント（配列番号２～１５７）の相対的な取り込み活性を記載する。バリアントは、発現株から除去された溶解物中に存在する。表１に記載される変異体ポリメラーゼ（配列番号２～１５７）の全ては、遺伝子型がこれらの置換変異を表１に列挙しない場合でも、置換変異Ｄ１４１Ａ及びＥ１４３Ａを含む。

【図3H】（図３Ａ～図３Ｈとして提示される８つのシート）は、表１（８つのシート）であり、４２℃での伸長ポリヌクレオチド鎖のＮ＋１位における３’メチルアジドヌクレオチドの取り込みにおけるＣａｎｄｉｄａｔｕｓ Ａｌｔｉａｒｃｈａｅａｌｅｓ古細菌からのＤＮＡポリメラーゼの野生型（配列番号１）及び変異体バリアント（配列番号２～１５７）の相対的な取り込み活性を記載する。バリアントは、発現株から除去された溶解物中に存在する。表１に記載される変異体ポリメラーゼ（配列番号２～１５７）の全ては、遺伝子型がこれらの置換変異を表１に列挙しない場合でも、置換変異Ｄ１４１Ａ及びＥ１４３Ａを含む。

【0125】

【図4A】表２であり、４２℃での伸長ポリヌクレオチド鎖のＮ＋１位における３’メチルアジドヌクレオチドの取り込みにおける、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ａｌｔｉａｒｃｈａｅａｌｅｓ古細菌からのＤＮＡポリメラーゼの変異体バリアント（配列番号１５８～２５５）の相対取り込み活性を記載する。バリアントは、発現株から除去された溶解物中に存在する。表２に記載される変異体ポリメラーゼ（配列番号１５８～２５５）の全ては、遺伝子型がこれらの置換変異を表２に列挙しない場合でも、置換変異Ｄ１４１Ａ及びＥ１４３Ａを含む。

【図4B】表２であり、４２℃での伸長ポリヌクレオチド鎖のＮ＋１位における３’メチルアジドヌクレオチドの取り込みにおける、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ａｌｔｉａｒｃｈａｅａｌｅｓ古細菌からのＤＮＡポリメラーゼの変異体バリアント（配列番号１５８～２５５）の相対取り込み活性を記載する。バリアントは、発現株から除去された溶解物中に存在する。表２に記載される変異体ポリメラーゼ（配列番号１５８～２５５）の全ては、遺伝子型がこれらの置換変異を表２に列挙しない場合でも、置換変異Ｄ１４１Ａ及びＥ１４３Ａを含む。

【図4C】表２であり、４２℃での伸長ポリヌクレオチド鎖のＮ＋１位における３’メチルアジドヌクレオチドの取り込みにおける、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ａｌｔｉａｒｃｈａｅａｌｅｓ古細菌からのＤＮＡポリメラーゼの変異体バリアント（配列番号１５８～２５５）の相対取り込み活性を記載する。バリアントは、発現株から除去された溶解物中に存在する。表２に記載される変異体ポリメラーゼ（配列番号１５８～２５５）の全ては、遺伝子型がこれらの置換変異を表２に列挙しない場合でも、置換変異Ｄ１４１Ａ及びＥ１４３Ａを含む。

【図4D】表２であり、４２℃での伸長ポリヌクレオチド鎖のＮ＋１位における３’メチルアジドヌクレオチドの取り込みにおける、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ａｌｔｉａｒｃｈａｅａｌｅｓ古細菌からのＤＮＡポリメラーゼの変異体バリアント（配列番号１５８～２５５）の相対取り込み活性を記載する。バリアントは、発現株から除去された溶解物中に存在する。表２に記載される変異体ポリメラーゼ（配列番号１５８～２５５）の全ては、遺伝子型がこれらの置換変異を表２に列挙しない場合でも、置換変異Ｄ１４１Ａ及びＥ１４３Ａを含む。

【図4E】表２であり、４２℃での伸長ポリヌクレオチド鎖のＮ＋１位における３’メチルアジドヌクレオチドの取り込みにおける、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ａｌｔｉａｒｃｈａｅａｌｅｓ古細菌からのＤＮＡポリメラーゼの変異体バリアント（配列番号１５８～２５５）の相対取り込み活性を記載する。バリアントは、発現株から除去された溶解物中に存在する。表２に記載される変異体ポリメラーゼ（配列番号１５８～２５５）の全ては、遺伝子型がこれらの置換変異を表２に列挙しない場合でも、置換変異Ｄ１４１Ａ及びＥ１４３Ａを含む。

【0126】

【図5A】表３であり、４２℃での伸長ポリヌクレオチド鎖のＮ＋１位における３’メチルアジドヌクレオチドの取り込みにおける、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ａｌｔｉａｒｃｈａｅａｌｅｓ古細菌からのＤＮＡポリメラーゼの変異体バリアント（配列番号２８８～３７５及び３８５～３９０及び３９４～３９７）の相対取り込み活性を記載する。バリアントは、発現株から除去された溶解物中に存在する。アミノ酸配列配列番号３５３、３５４、及び３８６を有する変異体ポリメラーゼは、切断型変異体であり、切断部位は、アスタリスク（＊）で示される。表３に記載される変異体ポリメラーゼ（配列番号２８８～３７５及び３８５～３９０）の全ては、遺伝子型がこれらの置換変異を表３に記載されていない場合でも、置換変異Ｄ１４１Ａ及びＥ１４３Ａを含む。

【図5B】表３であり、４２℃での伸長ポリヌクレオチド鎖のＮ＋１位における３’メチルアジドヌクレオチドの取り込みにおける、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ａｌｔｉａｒｃｈａｅａｌｅｓ古細菌からのＤＮＡポリメラーゼの変異体バリアント（配列番号２８８～３７５及び３８５～３９０及び３９４～３９７）の相対取り込み活性を記載する。バリアントは、発現株から除去された溶解物中に存在する。アミノ酸配列配列番号３５３、３５４、及び３８６を有する変異体ポリメラーゼは、切断型変異体であり、切断部位は、アスタリスク（＊）で示される。表３に記載される変異体ポリメラーゼ（配列番号２８８～３７５及び３８５～３９０）の全ては、遺伝子型がこれらの置換変異を表３に記載されていない場合でも、置換変異Ｄ１４１Ａ及びＥ１４３Ａを含む。

【図5C】表３であり、４２℃での伸長ポリヌクレオチド鎖のＮ＋１位における３’メチルアジドヌクレオチドの取り込みにおける、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ａｌｔｉａｒｃｈａｅａｌｅｓ古細菌からのＤＮＡポリメラーゼの変異体バリアント（配列番号２８８～３７５及び３８５～３９０及び３９４～３９７）の相対取り込み活性を記載する。バリアントは、発現株から除去された溶解物中に存在する。アミノ酸配列配列番号３５３、３５４、及び３８６を有する変異体ポリメラーゼは、切断型変異体であり、切断部位は、アスタリスク（＊）で示される。表３に記載される変異体ポリメラーゼ（配列番号２８８～３７５及び３８５～３９０）の全ては、遺伝子型がこれらの置換変異を表３に記載されていない場合でも、置換変異Ｄ１４１Ａ及びＥ１４３Ａを含む。

【図5D】表３であり、４２℃での伸長ポリヌクレオチド鎖のＮ＋１位における３’メチルアジドヌクレオチドの取り込みにおける、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ａｌｔｉａｒｃｈａｅａｌｅｓ古細菌からのＤＮＡポリメラーゼの変異体バリアント（配列番号２８８～３７５及び３８５～３９０及び３９４～３９７）の相対取り込み活性を記載する。バリアントは、発現株から除去された溶解物中に存在する。アミノ酸配列配列番号３５３、３５４、及び３８６を有する変異体ポリメラーゼは、切断型変異体であり、切断部位は、アスタリスク（＊）で示される。表３に記載される変異体ポリメラーゼ（配列番号２８８～３７５及び３８５～３９０）の全ては、遺伝子型がこれらの置換変異を表３に記載されていない場合でも、置換変異Ｄ１４１Ａ及びＥ１４３Ａを含む。

【図5E】表３であり、４２℃での伸長ポリヌクレオチド鎖のＮ＋１位における３’メチルアジドヌクレオチドの取り込みにおける、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ａｌｔｉａｒｃｈａｅａｌｅｓ古細菌からのＤＮＡポリメラーゼの変異体バリアント（配列番号２８８～３７５及び３８５～３９０及び３９４～３９７）の相対取り込み活性を記載する。バリアントは、発現株から除去された溶解物中に存在する。アミノ酸配列配列番号３５３、３５４、及び３８６を有する変異体ポリメラーゼは、切断型変異体であり、切断部位は、アスタリスク（＊）で示される。表３に記載される変異体ポリメラーゼ（配列番号２８８～３７５及び３８５～３９０）の全ては、遺伝子型がこれらの置換変異を表３に記載されていない場合でも、置換変異Ｄ１４１Ａ及びＥ１４３Ａを含む。

【0127】

【図6A】表４であり、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ ａｌｔｉａｒｃｈａｅａｌｅｓ古細菌からのＤＮＡポリメラーゼにおける様々なアミノ酸置換変異（配列番号１に対する）、ならびに９°Ｎ ＤＮＡポリメラーゼ（配列番号２８０に対する）、ＶＥＮＴ ＤＮＡポリメラーゼ（配列番号２８３に対する）、ＤＥＥＰ ＶＥＮＴ ＤＮＡポリメラーゼ（配列番号２８４に対する）、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ（配列番号２７５に対する）、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（配列番号２８５に対する）、及びＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｂｙｓｓｉ ＤＮＡポリメラーゼ（配列番号２８６に対する）における同等のアミノ酸置換変異を記載する。

【図6B】表４であり、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ ａｌｔｉａｒｃｈａｅａｌｅｓ古細菌からのＤＮＡポリメラーゼにおける様々なアミノ酸置換変異（配列番号１に対する）、ならびに９°Ｎ ＤＮＡポリメラーゼ（配列番号２８０に対する）、ＶＥＮＴ ＤＮＡポリメラーゼ（配列番号２８３に対する）、ＤＥＥＰ ＶＥＮＴ ＤＮＡポリメラーゼ（配列番号２８４に対する）、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ（配列番号２７５に対する）、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（配列番号２８５に対する）、及びＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｂｙｓｓｉ ＤＮＡポリメラーゼ（配列番号２８６に対する）における同等のアミノ酸置換変異を記載する。

【図6C】表４であり、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ ａｌｔｉａｒｃｈａｅａｌｅｓ古細菌からのＤＮＡポリメラーゼにおける様々なアミノ酸置換変異（配列番号１に対する）、ならびに９°Ｎ ＤＮＡポリメラーゼ（配列番号２８０に対する）、ＶＥＮＴ ＤＮＡポリメラーゼ（配列番号２８３に対する）、ＤＥＥＰ ＶＥＮＴ ＤＮＡポリメラーゼ（配列番号２８４に対する）、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ（配列番号２７５に対する）、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（配列番号２８５に対する）、及びＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｂｙｓｓｉ ＤＮＡポリメラーゼ（配列番号２８６に対する）における同等のアミノ酸置換変異を記載する。

【0128】

【図7A】Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ ａｌｔｉａｒｃｈａｅａｌｅｓ古細菌からの野生型ＤＮＡポリメラーゼ（配列番号１に対して）と９°Ｎ ＤＮＡポリメラーゼ（配列番号２８０に対して）との間のアミノ酸配列アラインメントである。

【図7B】Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ ａｌｔｉａｒｃｈａｅａｌｅｓ古細菌からの野生型ＤＮＡポリメラーゼ（配列番号１に対して）と９°Ｎ ＤＮＡポリメラーゼ（配列番号２８０に対して）との間のアミノ酸配列アラインメントである。

【0129】

【図8A】Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ ａｌｔｉａｒｃｈａｅａｌｅｓ古細菌からの野生型ＤＮＡポリメラーゼ（配列番号１に対して）とＶＥＮＴ ＤＮＡポリメラーゼ（配列番号２８３に対して）との間のアミノ酸配列アラインメントである。

【図8B】Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ ａｌｔｉａｒｃｈａｅａｌｅｓ古細菌からの野生型ＤＮＡポリメラーゼ（配列番号１に対して）とＶＥＮＴ ＤＮＡポリメラーゼ（配列番号２８３に対して）との間のアミノ酸配列アラインメントである。

【図8C】Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ ａｌｔｉａｒｃｈａｅａｌｅｓ古細菌からの野生型ＤＮＡポリメラーゼ（配列番号１に対して）とＶＥＮＴ ＤＮＡポリメラーゼ（配列番号２８３に対して）との間のアミノ酸配列アラインメントである。

【0130】

【図9A】Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ ａｌｔｉａｒｃｈａｅａｌｅｓ古細菌からの野生型ＤＮＡポリメラーゼ（配列番号１に対して）とＤＥＥＰ ＶＥＮＴ ＤＮＡポリメラーゼ（配列番号２８４に対して）との間のアミノ酸配列アラインメントである。

【図9B】Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ ａｌｔｉａｒｃｈａｅａｌｅｓ古細菌からの野生型ＤＮＡポリメラーゼ（配列番号１に対して）とＤＥＥＰ ＶＥＮＴ ＤＮＡポリメラーゼ（配列番号２８４に対して）との間のアミノ酸配列アラインメントである。

【0131】

【図10A】Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ ａｌｔｉａｒｃｈａｅａｌｅｓ古細菌からの野生型ＤＮＡポリメラーゼ（配列番号１に対して）とＧｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ（配列番号２７５に対して）との間のアミノ酸配列アラインメントである。

【図10B】Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ ａｌｔｉａｒｃｈａｅａｌｅｓ古細菌からの野生型ＤＮＡポリメラーゼ（配列番号１に対して）とＧｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ（配列番号２７５に対して）との間のアミノ酸配列アラインメントである。

【0132】

【図11A】Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ ａｌｔｉａｒｃｈａｅａｌｅｓ古細菌からの野生型ＤＮＡポリメラーゼ（配列番号１に対して）とＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（配列番号２８５に対して）との間のアミノ酸配列アラインメントである。

【図11B】Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ ａｌｔｉａｒｃｈａｅａｌｅｓ古細菌からの野生型ＤＮＡポリメラーゼ（配列番号１に対して）とＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（配列番号２８５に対して）との間のアミノ酸配列アラインメントである。

【0133】

【図12A】Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ ａｌｔｉａｒｃｈａｅａｌｅｓ古細菌からの野生型ＤＮＡポリメラーゼ（配列番号１に対して）と、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｂｙｓｓｉポリメラーゼ（配列番号２８６に対して）との間のアミノ酸配列アラインメントである。

【図12B】Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ ａｌｔｉａｒｃｈａｅａｌｅｓ古細菌からの野生型ＤＮＡポリメラーゼ（配列番号１に対して）と、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｂｙｓｓｉポリメラーゼ（配列番号２８６に対して）との間のアミノ酸配列アラインメントである。

【0134】

【図13A】Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ ａｌｔｉａｒｃｈａｅａｌｅｓ古細菌からの野生型ＤＮＡポリメラーゼ（配列番号１に対して）とＲＢ６９ポリメラーゼ（配列番号２８７に対して）との間のアミノ酸配列アラインメントである。

【図13B】Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ ａｌｔｉａｒｃｈａｅａｌｅｓ古細菌からの野生型ＤＮＡポリメラーゼ（配列番号１に対して）とＲＢ６９ポリメラーゼ（配列番号２８７に対して）との間のアミノ酸配列アラインメントである。

【0135】

【図14A】複数のヌクレオチドアームに結合する一般的なコアを含む多価分子の概略図である。

【0136】

【図14B】複数のヌクレオチドアームに結合するデンドリマーコアを含む多価分子の概略図である。

【0137】

【図15A】複数のヌクレオチドアームに結合するコアを含む多価分子の概略図であり、ヌクレオチドアームは、ビオチン、スペーサー、リンカー、及びヌクレオチド単位を含む。

【0138】

【図15B】コア結合部分、スペーサー、リンカー、及びヌクレオチド単位を含むヌクレオチドアームの概略図である。

【0139】

【図16A】例示的なスペーサーの化学構造、及び１１原子リンカー、１６原子リンカー、２３原子リンカー、及びＮ３リンカーを含む様々な例示的なリンカーの化学構造を示す。

【0140】

【図16B】リンカー１～９を含む様々な例示的なリンカーの化学構造を示す。

【0141】

【図17A】ヌクレオチド単位に連結／結合する様々な例示的なリンカーの化学構造を示す。

【0142】

【図17B】ヌクレオチド単位に連結／結合する様々な例示的なリンカーの化学構造を示す。

【0143】

【図17C】ヌクレオチド単位に連結／結合する様々な例示的なリンカーの化学構造を示す。

【0144】

【図18】例示的なヌクレオチドアームの化学構造を示す。この実施例では、ヌクレオチド単位は、ピリミジン塩基の５位またはプリン塩基の７位でプロパルギルアミン結合を介してリンカーに接続される。このヌクレオチドアームは、例示的なビオチン化ヌクレオチドアームを示す。

【0145】

【図19】３’メチルアジドｄＣＴＰの存在下でのＣａｎｄｉｄａｔｕｓ Ａｌｔｉａｒｃｈａｅａｌｅｓ古細菌からの精製された野生型及び変異体ＤＮＡポリメラーゼの生成物の形成速度を比較する棒グラフである。グラフは、配列番号３９、２９７、２７、１６４、または２２５のアミノ酸配列を有する変異体ポリメラーゼに関するデータを示す。

【0146】

【図20】操作れたポリメラーゼ（例えば、配列番号２７）を使用してフローセルに固定化されたポロニー上のプライマー伸長反応の結果を示す一連のグラフであり、伸長生成物の長さは、キャピラリー電気泳動によってモニタリングされた。

【発明を実施するための形態】

【0147】

定義：
本明細書に提供される見出しは、本開示の様々な態様の制限ではなく、その態様は、本明細書を全体として参照することにより理解することができる。

【0148】

別段の定義がない限り、本明細書で使用される技術用語及び科学用語は、別段の定義がない限り、当業者により一般に理解される意味を有する。一般に、本明細書に記載の分子生物学、核酸化学、タンパク質化学、遺伝学、微生物学、トランスジェニック細胞産生、及びハイブリダイゼーションの技術に関連する用語は、当該技術分野で周知であり、一般的に使用される。本明細書に記載の技法及び手順は、一般に、当該技術分野で周知の従来の方法に従って、ならびに本明細書全体を通して引用及び考察される様々な一般的でより具体的な参考文献に記載されるとおりに実施される。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｔｈｉｒｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．２０００）を参照されたい。Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（１９９２）も参照されたい。本明細書に関連する命名法、ならびに本明細書に記載される実験手順及び技術は、当該技術分野において周知かつ一般的に使用されるものである。

【0149】

本明細書の文脈で別段の要求がない限り、単数形の用語は、複数形を含むものとし、複数形の用語は、単数形を含むものとする。単数形の「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」、ならびに任意の単語の単数使用は、１つの指示対象に明示的及び明確に限定されない限り、複数の指示対象を含む。

【0150】

代替用語（例えば、「または」）の使用は、代替物の１つもしくは両方、またはそれらの任意の組み合わせのいずれかを意味すると理解される。

【0151】

本明細書で使用される「及び／または」という用語は、他のものの有無にかかわらず、指定された特性または構成要素の各々の特定の開示を意味するものとする。例えば、本明細書の「Ａ及び／またはＢ」などの語句で使用される「及び／または」という用語は、「Ａ及びＢ」、「ＡまたはＢ」、「Ａ」（Ａのみ）、及び「Ｂ」（Ｂのみ）を含むことが意図される。同様に、「Ａ、Ｂ、及び／またはＣ」などの語句で使用される「及び／または」という用語は、以下の態様：「Ａ、Ｂ、及びＣ」、「Ａ、Ｂ、またはＣ」、「ＡまたはＣ」、「ＡまたはＢ」、「ＢまたはＣ」、「Ａ及びＢ」、「Ｂ及びＣ」、「Ａ及びＣ」、「Ａ」（Ａのみ）、「Ｂ」（Ｂのみ）、及び「Ｃ」（Ｃのみ）の各々を包含することが意図される。

【0152】

本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ（を含む）」、「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ（を含む）」、「ｈａｖｉｎｇ（を有する）」及び「ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ（を含有する）」という用語、ならびに本明細書で使用されるそれらの文法的バリアントは、リスト内の１つの項目または複数の項目が、記載された項目に置換または追加され得る他の項目を除外しないように、非限定的であることが意図される。態様が「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ（を含む）」という言語を用いて本明細書に記載される場合、そうでなければ、「ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ（～からなる）」及び／または「ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ（本質的に～からなる）」という意味において記載される類似の態様もまた提供されることが理解される。

【0153】

本明細書で使用される場合、「約」及び「およそ」という用語は、当業者によって決定される特定の値または組成物に対する許容される誤差範囲内にある値または組成物を指し、それは、その値または組成物がどのように測定または決定されるか、すなわち、測定システムの限界に一部依存する。例えば、「ａｂｏｕｔ（約）」または「ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ（およそ）」は、当該技術分野での習慣に従って１または１を超える標準偏差内にあることを意味し得る。代替的に、「ａｂｏｕｔ（約）」または「ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ（およそ）」は、測定システムの限界に応じて、１０％まで（すなわち、±１０％）またはそれ以上の範囲を意味し得る。例えば、約５ｍｇは、４．５ｍｇ～５．５ｍｇの間の任意の数を含むことができる。更に、特に生体系または生体過程に関して、この用語は、１桁まで、または値の最大５倍までを意味し得る。特定の値または組成物が本開示で提供される場合、別段の記載がない限り、「ａｂｏｕｔ（約）」または「ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ（およそ）」の意味は、その特定の値または組成物について許容される誤差範囲内であると想定されるべきである。また、値の範囲及び／またはサブ範囲が提供される場合、範囲及び／またはサブ範囲は、範囲及び／またはサブ範囲のエンドポイントを含むことができる。

【0154】

「ペプチド」、「ポリペプチド」、及び「タンパク質」という用語ならびに本明細書で使用される他の関連用語は、同義的に使用され、アミノ酸のポリマーを指し、任意の特定の長さに限定されない。ポリペプチドは、天然及び非天然アミノ酸を含み得る。ポリペプチドとしては、組換え型または化学合成型が挙げられる。また、ポリペプチドには、タンパク質分解切断、リボソームスキッピングによる切断、ヒドロキシル化、メチル化、脂質化、アセチル化、ＳＵＭＯ化、ユビキチン化、グリコシル化、リン酸化、及び／またはジスルフィド結合形成などの翻訳後修飾をまだ受けていない前駆体分子も含まれる。これらの用語は、タンパク質配列の天然及び人工タンパク質、タンパク質断片及びポリペプチド類似体（変異タンパク質、バリアント、キメラタンパク質、及び融合タンパク質など）、ならびに翻訳後、またはそうでなければ共有結合的もしくは非共有結合的に修飾されたタンパク質を包含する。

【0155】

「ポリメラーゼ」及びそのバリアントという用語は、本明細書で使用される場合、ヌクレオチド（その類似体を含む）の核酸鎖への重合を触媒することができる任意の酵素を含む。典型的には、必ずしもそうではないが、そのようなヌクレオチド重合は、鋳型依存的な様式で生じ得る。典型的には、ポリメラーゼは、ヌクレオチド結合及び／またはヌクレオチド重合の触媒作用が起こり得る１つ以上の活性部位を含む。いくつかの実施形態において、ポリメラーゼは、例えば、３’～５’エキソヌクレアーゼ活性または５’～３’エキソヌクレアーゼ活性などの他の酵素活性を含む。いくつかの実施形態において、ポリメラーゼは、鎖置換活性を有する。ポリメラーゼは、限定されないが、天然に存在するポリメラーゼ及びその任意のサブユニット及び切断、変異体ポリメラーゼ、バリアントポリメラーゼ、組換え、融合またはそうでなければ操作されたポリメラーゼ、化学修飾ポリメラーゼ、合成分子またはアセンブリ、ならびにヌクレオチド重合を触媒する能力を保持する任意の類似体、誘導体、またはそれらの断片（例えば、触媒活性断片）を含むことができる。いくつかの実施形態において、ポリメラーゼは、細胞から単離され得るか、または組換えＤＮＡ技術もしくは化学合成方法を使用して生成され得る。いくつかの実施形態において、ポリメラーゼは、原核生物、真核生物、ウイルス、またはファージ生物で発現され得る。いくつかの実施形態において、ポリメラーゼは、翻訳後修飾タンパク質またはそれらの断片であり得る。ポリメラーゼは、原核生物、真核生物、ウイルス、またはファージに由来し得る。ポリメラーゼは、ＤＮＡ誘導ＤＮＡポリメラーゼ及びＲＮＡ誘導ＤＮＡポリメラーゼを含む。

【0156】

本明細書で使用される場合、「忠実度」という用語は、鋳型依存性ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ重合の精度を指す。ＤＮＡポリメラーゼの忠実度は、典型的には、エラー率（不正確なヌクレオチド、すなわち、鋳型ヌクレオチドに相補的でないヌクレオチドを取り込む頻度）によって測定される。ＤＮＡ重合の正確性または忠実度は、ＤＮＡポリメラーゼのポリメラーゼ活性及び３’～５’エキソヌクレアーゼ活性の両方によって維持される。

【0157】

本明細書で使用される場合、「結合複合体」という用語は、核酸二本鎖、ポリメラーゼ、及び多価分子の遊離ヌクレオチドまたはヌクレオチド単位を一緒に結合することによって形成される複合体を指し、ここで、核酸二本鎖は、核酸プライマーにハイブリダイズする核酸鋳型分子を含む。結合複合体では、遊離ヌクレオチドまたはヌクレオチド単位は、核酸鋳型分子内の相補的ヌクレオチドの反対側の位置で核酸プライマーの３’末端に結合され得るか、または結合され得ない。「三元複合体」は、核酸二重鎖、ポリメラーゼ、及び多価分子の遊離ヌクレオチドまたはヌクレオチド単位を一緒に結合することによって形成される結合複合体の一例であり、遊離ヌクレオチドまたはヌクレオチド単位は、核酸鋳型分子内の相補的ヌクレオチドと反対側の位置で（核酸二重鎖の一部として）核酸プライマーの３’末端に結合される。

【0158】

「持続時間」という用語及び関連用語は、結合複合体が、成分のうちのいずれも解離することなく安定した状態を保つ時間の長さを指し、結合複合体の成分は、核酸鋳型及び核酸プライマー、ポリメラーゼ、多価分子のヌクレオチド単位または遊離（例えば、非結合）ヌクレオチドを含む。ヌクレオチド単位または遊離ヌクレオチドは、鋳型分子中のヌクレオチド残基に相補的であり得るか、または非相補的であり得る。ヌクレオチド単位または遊離ヌクレオチドは、核酸鋳型分子内の相補的ヌクレオチド残基の反対側の位置で核酸プライマーの３’末端に結合することができる。持続時間は、結合複合体の安定性及び結合相互作用の強度を示す。持続時間は、結合複合体の開始及び／または持続時間を観察することによって、例えば、結合複合体の標識された成分からのシグナルを観察することによって測定することができる。例えば、１つ以上のヌクレオチドを含む標識されたヌクレオチドまたは標識された試薬は、結合複合体中に存在してもよく、したがって、結合複合体の持続時間中に標識からのシグナルが検出されることを可能にする。１つの例示的な標識は、蛍光標識である。結合複合体（例えば、三元複合体）は、ポリメラーゼ、鋳型分子、プライマー及び／またはヌクレオチド単位もしくはヌクレオチドのうちのいずれかの間の相互作用の解離を引き起こす条件にさらされるまで安定した状態を保つ。例えば、解離条件は、結合複合体を、洗剤、ＥＤＴＡ、及び／または水のうちのいずれか１つまたはいずれかの組み合わせと接触させることを含む。いくつかの実施形態において、結合複合体は、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、または１秒を超える持続時間の間、解離することなく安定した状態を保つ。

【0159】

「核酸」、「ポリヌクレオチド」、及び「オリゴヌクレオチド」という用語ならびに本明細書で使用される他の関連用語は、同義的に使用され、ヌクレオチドのポリマーを指し、任意の特定の長さに限定されない。核酸としては、組換え型及び化学合成型が挙げられる。核酸としては、ＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）、ＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）、ヌクレオチド類似体を使用して生成されたＤＮＡまたはＲＮＡの類似体（例えば、ペプチド核酸及び天然に存在しないヌクレオチド類似体）、ならびにＤＮＡ及びＲＮＡを含有するキメラ型が挙げられる。核酸は、一本鎖または二本鎖であり得る。核酸は、ヌクレオチドのポリマーを含み、ヌクレオチドは、天然または非天然塩基及び／または糖を含む。核酸は、天然に存在するヌクレオシド間結合、例えば、ホスホジエステル結合を含む。核酸は、ホスホロチオエート、ホスホロチオレート、またはペプチド核酸（ＰＮＡ）結合を含む、非天然ヌクレオシド間結合を含む。いくつかの実施形態において、核酸は、１つの種類のポリヌクレオチドまたは２つ以上の異なる種類のポリヌクレオチドの混合物を含む。

【0160】

本明細書で使用される「プライマー」という用語及び関連する用語は、ＤＮＡ及び／またはＲＮＡポリヌクレオチド鋳型とハイブリダイズし、二本鎖分子を形成することができる天然または合成のうちのいずれかのオリゴヌクレオチドを指す。プライマーは、任意の長さを有し得るが、典型的には、４～５０ヌクレオチドの範囲である。典型的なプライマーは、５’末端及び３’末端を含む。プライマーの３’末端は、ポリメラーゼ媒介プライマー伸長反応におけるヌクレオチド重合開始部位として機能する３’ＯＨ部分を含むことができる。代替的に、プライマーの３’末端は、３’ＯＨ部分を欠くことができるか、またはポリメラーゼ媒介反応においてヌクレオチド重合を阻害する末端３’ブロック基を含むことができる。プライマーの長さに沿った任意の１つのヌクレオチド、または１つを超えるヌクレオチドは、検出可能なレポーター部分で標識することができる。プライマーは、溶液中（例えば、可溶性プライマー）であり得るか、または支持体（例えば、捕捉プライマー）に固定化され得る。

【0161】

「鋳型核酸」、「鋳型ポリヌクレオチド」、「標的核酸」、「標的ポリヌクレオチド」、「鋳型鎖」、及び他の変形は、相補的な核酸鎖を生成するための基礎核酸分子として機能する核酸鎖を指す。鋳型核酸の配列は、相補鎖の配列に部分的または完全に相補的であり得る。鋳型核酸は、天然に存在する源、組換え型から得ることができるか、または任意の種類の核酸類似体を含むように化学的に合成することができる。鋳型核酸は、直鎖、環状、または他の形態であり得る。鋳型核酸は、染色体、ゲノム、オルガネラ（例えば、ミトコンドリア、葉緑体、またはリボソーム）、組換え分子、クローニング、増幅、ｃＤＮＡ、前駆体ｍＲＮＡもしくはｍＲＮＡなどのＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、新鮮な凍結パラフィン包埋組織から得られた全ゲノムＤＮＡ、針生検、無細胞循環ＤＮＡ、または任意の種類の核酸ライブラリを含む任意の形態で単離され得る。鋳型核酸分子は、原核生物、真核生物（例えば、ヒト、植物、及び動物）、真菌、ならびにウイルス；細胞；組織；正常または罹患細胞または組織、血液、尿、血清、リンパ液、腫瘍、唾液、肛門及び膣分泌物、羊水試料、汗、ならびに精液を含む体液；環境試料；培養試料；または組換え分子生物学もしくは化学合成方法を使用して調製される合成核酸分子を含む、任意の源から単離され得る。鋳型核酸は、配列決定及び組成分析を含む核酸分析に供され得る。

【0162】

核酸分子に関して使用される場合、「ハイブリダイズする（ｈｙｂｒｉｄｉｚｅ）」または「ハイブリダイズする（ｈｙｂｒｉｄｉｚｉｎｇ）」、または「ハイブリダイゼーション」という用語または他の関連用語は、二本鎖核酸を形成するための２つの異なる核酸間の水素結合を指す。ハイブリダイゼーションはまた、二本鎖領域を有する自己ハイブリダイゼーション分子を形成するために、単一の核酸分子の２つの異なる領域間の水素結合も含む。ハイブリダイゼーションは、二本鎖二本鎖（ｄｕｐｌｅｘ ｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄ）核酸、または核酸分子内の二本鎖領域を形成するためのＷａｔｓｏｎ－ＣｒｉｃｋまたはＨｏｏｇｓｔｅｉｎ結合を含むことができる。二本鎖核酸、または単一の核酸の２つの異なる領域は、完全に相補的であり得るか、または部分的に相補的であり得る。相補的核酸鎖は、それらの全長にわたって互いにハイブリダイズする必要はない。相補的塩基対合は、標準的なＡ－ＴまたはＣ－Ｇ塩基対合であり得るか、または他の形態の塩基対合相互作用であり得る。二本鎖核酸は、ミスマッチ塩基対合ヌクレオチドを含むことができる。

【0163】

「ヌクレオチド」という用語及び関連用語は、芳香族塩基、５つの炭素糖（例えば、リボースまたはデオキシリボース）、及び少なくとも１つのリン酸基を含む分子を指す。カノニカルまたは非カノニカルヌクレオチドは、用語の使用と一致する。いくつかの実施形態において、リン酸塩は、一リン酸塩、二リン酸塩、または三リン酸塩、または対応するリン酸塩類似体を含む。いくつかの実施形態において、ヌクレオチドは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のリン酸基を含む。「ヌクレオシド」という用語は、芳香族塩基及び糖を含む分子を指す。

【0164】

ヌクレオチド（及びヌクレオシド）は、典型的には、天然に存在する、置換された、修飾された、または操作されたバリアント、またはそれらの類似体を含む、核酸中に一般的に見られる、置換または非置換の窒素含有親ヘテロ芳香族環を含むヘテロ環状塩基を含む。ヌクレオチド（またはヌクレオシド）の塩基は、適切な相補的塩基とＷａｔｓｏｎ－Ｃｒｉｃｋ及び／またはＨｏｏｇｓｔｅｉｎ水素結合を形成することができる。例示的な塩基としては、例えば、２－アミノプリン、２，６－ジアミノプリン、アデニン（Ａ）、エテノアデニン、Ｎ^６－Δ^２－イソペンテニルアデニン（６ｉＡ）、Ｎ^６－Δ^２－イソペンテニル－２－メチルチオアデニン（２ｍｓ６ｉＡ）、Ｎ^６－メチルアデニン、グアニン（Ｇ）、イソグアニン、Ｎ^２－ジメチルグアニン（ｄｍＧ）、７－メチルグアニン（７ｍＧ）、２－チオピリミジン、６－チオグアニン（６ｓＧ）、ヒポキサンチン及びＯ^６－メチルグアニン；７－デアザデニン（７－デアザ－Ａ）及び７－デアザグアニン（７－デアザ－Ｇ）などの７－デアザ－プリン；シトシン（Ｃ）、５－プロピニルシトシン、イソシトシン、チモシン（Ｔ）、４－チオチミン（４ｓＴ）、５，６－ジヒドロチルチミン、Ｏ^４－メチルチミン、ウラシル（Ｕ）、４－チオウラシル（４ｓＵ）、及び５，６－ジヒドロウロウラシル（ジヒドラシル；Ｄ）；ニトロインドール及び４－メチルインドールなどのインドール；ニトロピロールなどのピロール；ネブラリン；イノシン；ヒドロキシメチルシトシン；５－メチルシトシン（ｍｅｔｈｙｃｙｔｏｓｉｎｅ）；塩基（Ｙ）；ならびにメチル化、グリシル化、及びアシル化塩基部分などのプリン及びピリミジンが挙げられるが、これらに限定されない。更なる例示的な塩基は、Ｆａｓｍａｎ，１９８９，ｉｎ“Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”，ｐｐ．３８５－３９４，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，Ｆｌａに見出され得る。

【0165】

ヌクレオチド（及びヌクレオシド）は、典型的には、糖部分、例えば、炭素環式部分（Ｆｅｒｒａｒｏ ａｎｄ Ｇｏｔｏｒ ２０００Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．１００：４３１９－４８）、非環式部分（Ｍａｒｔｉｎｅｚ，ｅｔ ａｌ．，１９９９ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２７：１２７１－１２７４、Ｍａｒｔｉｎｅｚ，ｅｔ ａｌ．，１９９７ Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ ｖｏｌ．７：３０１３－３０１６）、及び他の糖部分（Ｊｏｅｎｇ，ｅｔ ａｌ．，１９９３Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３６：２６２７－２６３８、Ｋｉｍ，ｅｔ ａｌ．，１９９３Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３６：３０－７、Ｅｓｃｈｅｎｍｏｓｓｅｒ １９９９ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８４：２１１８－２１２４及び米国特許第５，５５８，９９１号）を含む。糖部分は、リボシル、２’－デオキシリボシル、３’－デオキシリボシル、２’，３’－ジデオキシリボシル、２’，３’－ジデヒドロジデオキシリボシル、２’－アルコキシリボシル、２’－アジドリボシル、２’－アミノリボシル、２’－フルオリボシル、２’－メルカプトリボキシル、２’－アルキルトリボシル、３’－アルコキシリボシル、３’－アジドリボシル、３’－アミノリボシル、３’－フルオリボシル、３’－メルカプトリボキシル、３’－アルキルトリボシルカルボシル、非環式、または他の修飾糖を含む。

【0166】

いくつかの実施形態において、ヌクレオチドは、１つ、２つ、または３つのリン原子の鎖を含み、その鎖は、典型的には、エステルまたはホスホラミド結合を介して糖部分の５’炭素に結合する。いくつかの実施形態において、ヌクレオチドは、リン原子が介在するＯ、Ｓ、ＮＨ、メチレン、またはエチレンと一緒に連結されるリン鎖を有する類似体である。いくつかの実施形態において、鎖内のリン原子は、Ｏ、Ｓ、またはＢＨ_３を含む置換側基を含む。いくつかの実施形態において、鎖は、ホスホロアミデート、ホスホロチオエート、ホスホルジチオエート、及びＯ－メチルホスホロアミダイト基を含む類似体で置換されたホスフェート基を含む。

【0167】

核酸に関して使用される場合、「伸長する（ｅｘｔｅｎｄ）」、「伸長する（ｅｘｔｅｎｄｉｎｇ）」、「伸長」、及び他のバリアントという用語は、１つ以上のヌクレオチドの核酸分子への取り込みを指す。ヌクレオチドの取り込みは、核酸鎖の末端３’ＯＨ末端への１つ以上のヌクレオチドの重合を含み、核酸鎖の伸長をもたらす。ヌクレオチドの取り込みは、天然ヌクレオチド及び／またはヌクレオチド類似体を用いて行うことができる。典型的には、必ずしもそうではないが、ヌクレオチドの取り込みは、鋳型依存的な様式で生じる。ＤＮＡポリメラーゼまたはＲＮＡポリメラーゼによって触媒されるプライマー伸長を含む、核酸分子を伸長する任意の好適な方法が、使用され得る。

【0168】

「レポーター部分（ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｍｏｉｅｔｙ）」、「レポーター部分（ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｍｏｉｅｔｉｅｓ）」という用語または関連用語は、検出可能なシグナルを生成する、または生成させる化合物を指す。レポーター部分は、「標識」と呼ばれることもある。発光、光発光、電気発光、生物発光、化学発光、蛍光、リン光、発色団、放射性同位体、電気化学、質量分析、ラマン、ハプテン、親和性タグ、原子、または酵素を含む、任意の好適なレポーター部分が、使用され得る。レポーター部分は、化学的または物理的変化（例えば、熱、光、電気的、ｐＨ、塩濃度、酵素活性、または近接事象）に起因する検出可能なシグナルを生成する。近接事象には、２つのレポーター部分が互いに近づいたり、互いに会合したり、互いに結合したりすることが含まれる。同じ反応または異なる反応において異なるレポーター部分の存在をモニタリングすることができるように、各々が他のレポーター部分と区別することができる波長で励起放射線を吸収及び／または蛍光を発するようにレポーター部分を選択することは、当業者に周知である。スペクトル的に異なる放出プロファイルを有するか、または最小限の重複スペクトル放出プロファイルを有する２つ以上の異なるレポーター部分を選択することができる。レポーター部分は、ヌクレオチド、ヌクレオシド、核酸、酵素（例えば、ポリメラーゼまたは逆転写酵素）、または支持体（例えば、表面）に連結（例えば、作動可能に連結）することができる。

【0169】

レポーター部分（または標識）は、蛍光標識またはフルオロフォアを含む。蛍光標識またはフルオロフォアとして機能し得る例示的な蛍光部分としては、フルオレセイン及びフルオレセイン誘導体、例えば、カルボキシフルオレセイン、テトラクロロフルオレセイン、ヘキサクロロフルオレセイン、カルボキシナプトフルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ＮＨＳ－フルオレセイン、ヨードアセトアミドフルオレセイン、フルオレセインマレイミド、ＳＡＭＳＡ－フルオレセイン、フルオレセインチオセミカルバジド、カルボヒドラジノメチルチオアセチル－アミノフルオレセイン、ローダミン及びローダミン誘導体、例えば、ＴＲＩＴＣ、ＴＭＲ、リサミンローダミン、テキサスレッド、ローダミンＢ、ローダミン６Ｇ、ローダミン１０、ＮＨＳ－ローダミン、ＴＭＲ－ヨードアセトアミド、リサミンローダミンＢスルホニルクロライド、リサミンローダミンＢスルホニルヒドラジン、テキサスレッドスルホニルクロライド、テキサスレッドヒドラジド、クマリン及びクマリン誘導体、例えば、ＡＭＣＡ、ＡＭＣＡ－ＮＨＳ、ＡＭＣＡ－スルホ－ＮＨＳ、ＡＭＣＡ－ＨＰＤＰ、ＤＣＩＡ、ＡＭＣＥ－ヒドラジド、ＢＯＤＩＰＹ及び誘導体、例えば、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ Ｃ３－ＳＥ、ＢＯＤＩＰＹ ５３０／５５０ Ｃ３、ＢＯＤＩＰＹ ５３０／５５０ Ｃ３－ＳＥ、ＢＯＤＩＰＹ ５３０／５５０ Ｃ３ヒドラジド、ＢＯＤＩＰＹ ４９３／５０３ Ｃ３ヒドラジド、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ Ｃ３ヒドラジド、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ ＩＡ、ＢＯＤＩＰＹ ５３０／５５１ ＩＡ、Ｂｒ－ＢＯＤＩＰＹ ４９３／５０３、Ｃａｓｃａｄｅ Ｂｌｕｅ及び誘導体、例えば、Ｃａｓｃａｄｅ Ｂｌｕｅアセチルアジド、Ｃａｓｃａｄｅ Ｂｌｕｅカダベリン、Ｃａｓｃａｄｅ Ｂｌｕｅエチレンジアミン、Ｃａｓｃａｄｅ Ｂｌｕｅヒドラジド、Ｌｕｃｉｆｅｒ Ｙｅｌｌｏｗ及び誘導体、例えば、Ｌｕｃｉｆｅｒ Ｙｅｌｌｏｗヨードアセトアミド、Ｌｕｃｉｆｅｒ ＹｅｌｌｏｗＣＨ、シアニン及び誘導体、例えば、インドリウム系シアニン色素、ベンゾ－インドリウム系シアニン色素、ピリジウム系シアニン色素、チオゾリウム系シアニン色素、キノリニウム系シアニン色素、イミダゾリウム系シアニン色素、Ｃｙ３、Ｃｙ５、ランタニドキレート及び誘導体、例えば、ＢＣＰＤＡ、ＴＢＰ、ＴＭＴ、ＢＨＨＣＴ、ＢＣＯＴ、ユーロピウムキレート、テルビウムキレート、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ色素、ＤｙＬｉｇｈｔ色素、Ａｔｔｏ色素、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ Ｒｅｄ色素、ＣＡＬ Ｆｌｏｕｒ色素、ＪＯＥ、及びそれらの誘導体、Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ色素、ＷｅｌｌＲＥＤ色素、ＩＲＤ色素、フィコエリスリン及びフィコビリン色素、Ｍａｌａｃｈｉｔｅ ｇｒｅｅｎ、スチルベン、ＤＥＧ色素、ＮＲ色素、近赤外線色素、及びＨａｕｇｌａｎｄ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ，（Ｅｕｇｅｎｅ，Ｏｒｅｇ．）６ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｌａｋｏｗｉｃｚ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ，２ｎｄ Ｅｄ．，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９９）、またはＨｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎに記載のものなどの当該技術分野で既知の他のもの、またはそれらの任意の誘導体、またはそれらの任意の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。シアニン色素は、スルホン化された形態または非スルホン化された形態のいずれかで存在し得、２つの窒素原子間のポリメチン架橋によって分離される２つのインドレニン、ベンゾ－インドリウム、ピリジウム、チオゾリウム、及び／またはキノリニウム基からなる。市販のシアニンフルオロフォアとしては、例えば、Ｃｙ３（１－［６－（２，５－ジオキソピロリジン－１－イルオキシ）－６－オキソヘキシル］－２－（３－｛１－［６－（２，５－ジオキソピロリジン－１－イルオキシ）－６－オキソヘキシル］－３，３－ジメチル－１，３－ジヒドロ－２Ｈ－インドール－２－イリデン｝プロパ－１－エン－１－イル）－３，３－ジメチル－３Ｈ－インドリウムまたは１－［６－（２，５－ジオキソピロリジン－１－イルオキシ）－６－オキソヘキシル］－２－（３－｛１－［６－（２，５－ジオキソピロリジン－１－イルオキシ）－６－オキソヘキシル］－３，３－ジメチル－５－スルホ－１，３－ジヒドロ－２Ｈ－インドール－２－イリデン｝プロパ－１－エン－１－イル）－３，３－ジメチル－３Ｈ－インドリウム－５－スルホネート）、Ｃｙ５（１－（６－（（２，５－ジオキソピロリジン－１－イル）オキシ）－６－オキソヘキシル）－２－（（１Ｅ，３Ｅ）－５－（（Ｅ）－１－（６－（（２，５－ジオキソピロリジン－１－イル）オキシ）－６－オキソヘキシル）－３，３－ジメチル－５－インドリン－２－イリデン）ペンタ－１，３－ジエン－１－イル）－３，３－ジメチル－３Ｈ－インドール－１－イウムまたは１－（６－（（２，５－ジオキソピロリジン－１－イル）オキシ）－６－オキソヘキシル）－２－（（１Ｅ，３Ｅ）－５－（（Ｅ）－１－（６－（（２，５－ジオキソピロリジン－１－イル）オキシ）－６－オキソヘキシル）－３，３－ジメチル－５－スルホインドリン－２－イリデン）ペンタ－１，３－ジエン－１－イル）－３，３－ジメチル－３Ｈ－インドール－１－イウム－５－スルホネート）、及びＣｙ７（１－（５－カルボキシペンチル）－２－［（１Ｅ，３Ｅ，５Ｅ，７Ｚ）－７－（１－エチル－１，３－ジヒドロ－２Ｈ－インドール－２－イリデン）ヘプタ－１，３，５－トリエン－１－イル］－３Ｈ－インドリウムまたは１－（５－カルボキシペンチル）－２－［（１Ｅ，３Ｅ，５Ｅ，７Ｚ）－７－（１－エチル－５－スルホ－１，３－ジヒドロ－２Ｈ－インドール－２－イリデン）ヘプタ－１，３，５－トリエン－１－イル］－３Ｈ－インドリウム－５－スルホネート）が挙げられ、ここで「Ｃｙ」は「シアニン」を表し、最初の数字は２つのインドレニン基の間の炭素原子の数を識別する。インドレニンではなくオキサゾール誘導体であるＣｙ２、及びベンゾ誘導体化Ｃｙ３．５、Ｃｙ５．５、及びＣｙ７．５は、この規則の例外である。

【0170】

いくつかの実施形態において、レポーター部分は、単一の励起及び画像化ステップの下で複数の分類を行うことができるように、ＦＲＥＴ対であり得る。本明細書で使用される場合、ＦＲＥＴは、励起交換（Ｆｏｒｓｔｅｒ）移行、または電子交換（Ｄｅｘｔｅｒ）移行を含み得る。

【0171】

「連結した（ｌｉｎｋｅｄ）」、「結合した（ｊｏｉｎｅｄ）」、「結合した（ａｔｔａｃｈｅｄ）」、及びそれらのバリアントという用語は、特定の手順での使用に耐えるのに十分な安定性を有する化合物または分子の任意の組み合わせ間の任意のタイプの融合、結合、接着、または会合を含む。手順は、ヌクレオチド一過性結合、ヌクレオチドの取り込み、デブロッキング、洗浄、除去、流動、検出、画像化、及び／または特定を含むことができるが、これらに限定されない。そのような連結は、例えば、共有結合、イオン結合、水素結合、双極子－双極子結合、親水性結合、疎水性結合、または親和性結合、ファンデルワールス力を伴う結合または会合、機械的結合などを含むことができる。いくつかの実施形態において、そのような連結は、例えば、一本鎖または二本鎖の線形核酸分子の末端を一緒に連結して環状分子を形成するように、分子内に生じる。いくつかの実施形態において、そのような連結は、核酸分子と固体表面との連結、タンパク質と検出可能なレポーター部分との連結、ヌクレオチドと検出可能なレポーター部分との連結などを含むが、これらに限定されない、異なる分子の組み合わせ間、または分子と非分子との間で生じ得る。連結のいくつかの例は、例えば、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．，“Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ”，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（２００８）、Ａｓｌａｍ，Ｍ．，Ｄｅｎｔ，Ａ．，“Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ：Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｏｕｐｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”，Ｌｏｎｄｏｎ：Ｍａｃｍｉｌｌａｎ（１９９８）、Ａｓｌａｍ，Ｍ．，Ｄｅｎｔ，Ａ．，“Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ：Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｏｕｐｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”，Ｌｏｎｄｏｎ：Ｍａｃｍｉｌｌａｎ（１９９８）で見出され得る。

【0172】

本明細書で使用される「作動可能に連結された」及び「作動可能に結合された」という用語または関連する用語は、構成要素の並置を指す。並置された構成要素は、共有結合で連結することができる。例えば、２つの核酸成分を酵素的にライゲーションすることができ、その際、２つの成分を結合する連結は、ホスホジエステル連結からなる。第１の核酸成分及び第２の核酸成分は、一緒に連結することができ、第１の核酸成分は、第２の核酸成分に機能を付与することができる。例えば、プライマー結合配列と関心対象の配列との間の連結は、プライマーに結合することができる部分を有する核酸ライブラリ分子を形成する。別の例において、導入遺伝子（例えば、関心対象のポリペプチドまたは核酸配列をコードする核酸）は、連結がベクターに含まれる導入遺伝子配列の発現または機能を可能にするベクターにライゲーションされ得る。いくつかの実施形態において、導入遺伝子は、導入遺伝子の発現に影響を与える宿主細胞調節配列（例えば、プロモーター配列）に作動可能に連結される。いくつかの実施形態において、ベクターは、プロモーター配列、エンハンサー、転写及び／または翻訳開始配列、転写及び／または翻訳終結配列、ポリペプチド分泌シグナル配列などを含む少なくとも１つの宿主細胞調節配列を含む。いくつかの実施形態において、宿主細胞調節配列は、導入遺伝子のレベル、タイミング、及び／または位置の発現を制御する。

【0173】

いくつかの実施形態において、支持体は、固体、半固体、または両方の組み合わせである。いくつかの実施形態において、支持体は、多孔質、半多孔質、非多孔質、または多孔質の任意の組み合わせである。いくつかの実施形態において、支持体は、実質的に平面、凹面、凸面、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。いくつかの実施形態において、支持体は、例えばキャピラリーまたはキャピラリーの内面を含む円筒形であり得る。

【0174】

いくつかの実施形態において、支持体の表面は、実質的に平滑であり得る。いくつかの実施形態において、支持体は、隆起、エッチング、細孔、三次元足場、またはそれらの任意の組み合わせを含む、規則的または不規則にテクスチャを有し得る。

【0175】

いくつかの実施形態において、支持体は、球形、半球形、円筒形、バレル形、トロイダル形、円盤形、ロッド状、円錐形、三角形、立方体、多角形、管状、またはワイヤー状を含む任意の形状を有するビーズを含む。

【0176】

支持体は、ガラス、溶融シリカ、シリコン、ポリマー（例えば、ポリスチレン（ＰＳ）、マクロ多孔質ポリスチレン（ＭＰＰＳ）、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリエチレン（ＰＥ）、高密度ポリエチレン（ＨＤＰＥ）、環状オレフィンポリマー（ＣＯＰ）、環状オレフィンコポリマー（ＣＯＣ）、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ））、またはそれらの任意の組み合わせを含むが、これらに限定されない任意の材料から製造され得る。ガラス基板及びプラスチック基板の両方の様々な組成物が、企図される。

【0177】

いくつかの実施形態において、支持体の表面は、１つ以上の化合物でコーティングされ、支持体上に不動態化層を生成する。いくつかの実施形態において、支持体は、支持体上の改善された核酸ハイブリダイゼーション及び増幅性能を可能にする低い非特異的結合表面を含む。一般に、支持体は、共有結合または非共有結合している低化学修飾層、例えば、シラン層、ポリマーフィルム、及び複数の核酸鋳型分子を支持体に固定化するために使用され得る１つ以上の共有結合または非共有結合しているオリゴヌクレオチドの１つ以上の層を含み得る。

【0178】

いくつかの実施形態において、表面コーティングの親水性の程度（または水溶液との「濡れ性」）は、例えば、小さな水滴が表面に配置され、表面との接触角が、例えば、光学張力計を使用して測定される水接触角の測定によって評価され得る。いくつかの実施形態において、静止接触角が、決定され得る。いくつかの実施形態において、前進接触角または後退接触角が、決定され得る。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される親水性の低結合支持体の水接触角は、約０度から約３０度の範囲であり得る。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される親水性の低結合支持体の水接触角は、５０度、４０度、３０度、２５度、２０度、１８度、１６度、１４度、１２度、１０度、８度、６度、４度、２度、または１度以下であり得る。多くの場合、接触角は、４０度以下である。当業者は、本開示の所与の親水性、低結合性支持体の表面が、この範囲内の任意の場所の値を有する水接触角を示し得ることを認識するであろう。

【0179】

本開示は、支持体に固定化された複数の（例えば、２つ以上の）核酸鋳型を提供する。いくつかの実施形態において、固定化された複数の核酸鋳型は、同じ配列を有するか、または異なる配列を有する。いくつかの実施形態において、複数の核酸鋳型内の個々の核酸鋳型分子は、支持体上の異なる部位に固定化される。いくつかの実施形態において、複数の核酸鋳型内の２つ以上の個々の核酸鋳型分子が、支持体上の部位に固定化される。いくつかの実施形態において、支持体は、アレイに配置された複数の部位を含む。「アレイ」という用語は、一連の部位を形成するために、支持体上の所定の配置にある複数の部位を含む支持体を指す。部位は、離散的であり、格子間領域によって分離され得る。いくつかの実施形態において、支持体上の所定の部位は、行または列の一次元に配置することができるか、または行及び列の二次元に配置することができる。いくつかの実施形態において、複数の所定の部位は、組織化された様式で支持体上に配置される。いくつかの実施形態において、複数の所定の部位は、直線、六角形パターン、グリッドパターン、反射対称性を有するパターン、回転対称性を有するパターンなどを含む、任意の組織化されたパターンにおいて配置される。部位の異なるペア間のピッチは、同じであり得るか、または異なり得る。いくつかの実施形態において、支持体は、核酸鋳型アレイを形成するために、１ｍｍ^２当たり約１０^２～１０^１５個の部位の表面密度で複数の部位に固定化された核酸鋳型分子を有し得る。いくつかの実施形態において、支持体は、少なくとも１０^２個の部位、少なくとも１０^３個の部位、少なくとも１０^４個の部位、少なくとも１０^５個の部位、少なくとも１０^６個の部位、少なくとも１０^７個の部位、少なくとも１０^８個の部位、少なくとも１０^９個の部位、少なくとも１０^１０個の部位、少なくとも１０^１１個の部位、少なくとも１０^１２個の部位、少なくとも１０^１３個の部位、少なくとも１０^１４個の部位、少なくとも１０^１５個の部位、またはそれ以上を含み、これらの部位は、支持体上の所定の配置にある。いくつかの実施形態において、支持体上の複数の所定の部位（例えば、１０^２～１０^１５個の部位またはそれ以上）を核酸鋳型で固定化されて、核酸鋳型アレイを形成する。いくつかの実施形態において、固定化された表面捕捉プライマーへのハイブリダイゼーションによって複数の所定の部位に固定化される核酸鋳型、または核酸鋳型は、表面捕捉プライマーに共有結合している。いくつかの実施形態において、複数の所定の部位で固定化され、例えば、１０^２～１０^１５個の部位またはそれ以上で固定化される核酸鋳型。いくつかの実施形態において、支持体上の複数の部位に固定化された核酸鋳型は、線形もしくは環状核酸鋳型分子、または線形分子と環状分子の両方の混合物を含む。いくつかの実施形態において、固定化された核酸鋳型は、クローン増幅されて、複数の所定の部位において固定化された核酸ポロニーを生成する。いくつかの実施形態において、個々の固定化核酸鋳型分子は、関心対象の標的配列の１つのコピーを含むか、または関心対象の標的配列の２つ以上のタンデムコピーを有するコンカテマーを含む。

【0180】

いくつかの実施形態において、支持体上のランダムな配置にある複数の部位を含む支持体は、本明細書において、その上にランダムに配置される部位を有する支持体と称される。支持体上でランダムに配置された部位の配置は、事前に決定されていない。複数のランダムに配置された部位は、無秩序及び／または予測不可能な方法で支持体上に配列される。いくつかの実施形態において、支持体は、少なくとも１０^２個の部位、少なくとも１０^３個の部位、少なくとも１０^４個の部位、少なくとも１０^５個の部位、少なくとも１０^６個の部位、少なくとも１０^７個の部位、少なくとも１０^８個の部位、少なくとも１０^９個の部位、少なくとも１０^１０個の部位、少なくとも１０^１１個の部位、少なくとも１０^１２個の部位、少なくとも１０^１３個の部位、少なくとも１０^１４個の部位、少なくとも１０^１５個の部位、またはそれ以上を含み、これらの部位は、支持体上にランダムに配置される。いくつかの実施形態において、支持体上の複数のランダムに配置される部位（例えば、１０^２～１０^１５個の部位またはそれ以上）を核酸鋳型で固定化されて、核酸鋳型で固定化された支持体を形成する。いくつかの実施形態において、固定化された表面捕捉プライマーへのハイブリダイゼーションによって複数のランダムに配置される部位に固定化される核酸鋳型、または核酸鋳型は、表面捕捉プライマーに共有結合している。いくつかの実施形態において、複数のランダムに配置される部位で固定化される、例えば、１０^２～１０^１５個の部位またはそれ以上で固定化される核酸鋳型。いくつかの実施形態において、支持体上の複数の部位で固定化される核酸鋳型は、上記に列挙される潜在的特性のうちのいずれかを含む核酸鋳型の実施形態を含み得、いくつかの実施形態において、固定化された核酸鋳型は、クローン増幅されて、複数のランダムに配置される部位において固定化された核酸ポロニーを生成する。

【0181】

いくつかの実施形態において、支持体上の所定のまたはランダムな部位に固定化された核酸鋳型分子に関して、支持体上の複数の固定化された核酸鋳型分子は互いに流体連通して、試薬（例えば、ポリメラーゼ、多価分子、ヌクレオチド、二価カチオン及び／または緩衝液などを含む酵素）の溶液を支持体上に流すことを可能にし、その結果、支持体上の複数の固定化された核酸鋳型分子を超並列方法で試薬と反応させることができる。いくつかの実施形態において、複数の固定化された核酸鋳型分子の流体連通を使用して、ヌクレオチド結合アッセイを実施し、及び／または複数の固定化された核酸鋳型分子上でヌクレオチド重合反応（例えば、プライマー伸長もしくは配列決定）を実施し、ならびに超並列配列決定のための検出及び画像化を実施することができる。いくつかの実施形態において、「固定化された」という用語及び関連用語は、核酸分子または酵素が共有結合または非共有結合相互作用を介して支持体に直接結合されるか、または核酸分子または酵素が支持体上のコーティングに結合される、所定の位置またはランダムな配置で支持体に結合される核酸分子または酵素（例えば、ポリメラーゼ）を指す。

【0182】

本明細書で使用される場合、「配列決定」という用語及びそのバリアントは、典型的には、核酸鋳型分子内の少なくともいくつかのヌクレオチド（それらの核酸塩基成分を含む）の同一性を決定することによって、核酸鎖から配列情報を取得することを含む。いくつかの実施形態において、核酸分子の所与の領域を「配列決定」は、配列決定される領域内の各ヌクレオチド及び全てのヌクレオチドを識別することを含むが、いくつかの実施形態において、「配列決定」は、領域内の一部のヌクレオチドのみの同一性が決定される一方で、一部のヌクレオチドの同一性がはっきりしないままであるか、または誤って決定される方法を含む。任意の好適な配列決定方法が、使用され得る。例示的な実施形態において、配列決定は、無標識またはイオンベースの配列決定方法を含むことができる。いくつかの実施形態において、配列決定は、標識または染料含有ヌクレオチドまたは蛍光ベースのヌクレオチド配列決定方法を含むことができる。いくつかの実施形態において、配列決定は、ポロニーベースの配列決定またはブリッジ配列決定方法を含むことができる。いくつかの実施形態において、配列決定には、合成による配列、ハイブリダイゼーションによる配列、または結合による配列の手順を用いる、超並列した配列決定プラットフォームを含む。超並列した合成による配列の手順の例としては、ポロニー配列決定、パイロ配列決定（例えば、４５４ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓから、米国特許第７，２１１，３９０号、同第７，２４４，５５９号、及び同第７，２６４，９２９号）、鎖ターミネーター配列決定（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａから、米国特許第７，５６６，５３７号、Ｂｅｎｔｌｅｙ ２００６ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １６：５４５－５５２、及びＢｅｎｔｌｅｙ，ｅｔ ａｌ．，２００８ Ｎａｔｕｒｅ ４５６：５３－５９、イオン感受性配列決定（例えば、Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔから）、プローブアンカーライゲーション配列決定（例えば、Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）、ＤＮＡナノボール配列決定、ナノ細孔ＤＮＡ配列決定が挙げられる。単一分子配列決定の例としては、Ｈｅｌｉｓｃｏｐｅ単一分子配列決定、及び単一分子リアルタイム（ＳＭＲＴ）配列決定が挙げられる。ハイブリダイゼーションによる配列の例としては、ＳＯＬｉＤ配列決定（例えば、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから、ＷＯ２００６／０８４１３２）が挙げられる。結合による配列決定の例としては、Ｏｍｎｉｏｍｅ配列決定（例えば、米国特許第１０，２４６，７４４号）が挙げられる。

【0183】

操作されたポリメラーゼ
本開示は、アミノ酸置換及び／または切断型アミノ酸配列を有する変異体ポリメラーゼ、変異体ポリメラーゼをコードする核酸、ならびに変異体ポリメラーゼを含むシステム及びキットを含む組成物を提供する。変異体ポリメラーゼを使用する方法であって、核酸二本鎖を結合するための方法、相補的ヌクレオチドを結合するための方法、または相補的ヌクレオチド単位を有する多価分子を結合するための方法、相補的ヌクレオチドを取り込むための方法、または相補的ヌクレオチド単位を取り込むための方法、プライマーを伸長するための方法、及び核酸配列決定方法が、本明細書において更に提供され、本方法は、本明細書に記載の変異体ポリメラーゼのうちのいずれかを使用する。変異体ポリメラーゼは、野生型ポリメラーゼと比較して、ヌクレオチド類似体の増加した取り込みを含む所望の特徴を示すように操作される。一実施形態において、変異体ポリメラーゼは、最近識別された新規のＢファミリー及びＡファミリーポリメラーゼの指向進化に由来するポリペプチドまたはその断片を含み、変異体ポリメラーゼは、正しいＷａｔｓｏｎ－Ｃｒｉｃｋ塩基対合のための高い識別を維持しながら、それらの特異性の改善を示す。１つの例示的なポリメラーゼ酵素は、２０１８年に最初に識別されたＣａｎｄｉｄａｔｕｓ ａｌｔｉａｒｃｈａｅａｌｅｓ古細菌種（例えば、配列番号１または３９１）に由来する。この酵素は、９°Ｎ、Ｐｆｕ、ＶＥＮＴ、ＤＥＥＰ ＶＥＮＴ、及びＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｂｙｓｓｉと４２％未満の配列同一性を含み、極端な進化的分岐を示し、これは、９°Ｎ、Ｐｆｕ、ＶＥＮＴ、ＤＥＥＰ ＶＥＮＴ、及びＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｂｙｓｓｉポリメラーゼが高温（例えば、９５℃超）で熱安定性を有する一方で、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ ａｌｔｉａｒｃｈａｅａｌｅｓ古細菌ポリメラーゼが約６８℃の最適触媒温度を有する低温（例えば、７５℃未満）で熱安定性を有するという事実によって更に証明され得る。７５℃未満の温度で活性を示す別の例示的なポリメラーゼ酵素は、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（例えば、配列番号２７５）に由来する。Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ ａｌｔｉａｒｃｈａｅａｌｅｓ古細菌ポリメラーゼは、約２５～５０℃、または約４５～７５℃、または約６５～７５℃の温度範囲でヌクレオチド結合及び取り込み活性を示す。Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ ａｌｔｉａｒｃｈａｅａｌｅｓ古細菌ポリメラーゼは、約６５～７５℃の温度範囲で最適なヌクレオチド結合及び取り込み活性を示す。Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ ａｌｔｉａｒｃｈａｅａｌｅｓ古細菌ポリメラーゼは、適度に熱安定性のあるポリメラーゼ（例えば、中熱ポリメラーゼ）である。１つ以上の変異を有するＣａｎｄｉｄａｔｕｓ ａｌｔｉａｒｃｈａｅａｌｅｓ古細菌配列骨格を有する操作されたポリメラーゼは、約２５～５０℃、または約４５～７５℃、または約５０～６５℃、または約５０～６０℃の温度範囲でヌクレオチド結合、ヌクレオチド単位結合、ヌクレオチドの取り込み、ヌクレオチド単位取り込み、及び／または核酸配列決定反応を行うために使用することができる。例えば、９°Ｎ、Ｐｆｕ、ＶＥＮＴ、ＤＥＥＰ ＶＥＮＴ、及びＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｂｙｓｓｉポリメラーゼなどの熱安定性ポリメラーゼは、典型的な循環ステップが９０～９５℃を超える温度またはより高い温度で行われるＰＣＲ反応に使用するのに好適である。当業者は、本明細書に記載の熱安定性ポリメラーゼが、例えば、約２５～５０℃、または約４５～７５℃などのより低い温度範囲で行われる、ヌクレオチド結合、ヌクレオチドの取り込み、及び／または核酸配列決定反応に使用するのに好適ではあり得ないことを理解するであろう。

【0184】

ポリメラーゼは、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、鋳型非依存性ポリメラーゼ、逆転写酵素、またはヌクレオチドの取り込みを触媒することができる他の酵素を含む。古細菌ポリメラーゼは、多くの場合、好熱性生物に由来し、したがって、熱安定性または耐熱性酵素のクラスを表すことができる。したがって、古細菌ポリメラーゼに由来するポリペプチド骨格は、高温への繰り返しの曝露、緩衝条件の変化などによる分解に対する熱安定性が向上した酵素またはその他の耐性が向上した酵素の適用によって改善され得る用途のために、可逆的なターミネーターヌクレオチド（核酸伸長を防ぐ除去可能な化学基）の取り込みを更に強化するための望ましいタンパク質工学的標的を提供する。

【0185】

Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ ａｌｔｉａｒｃｈａｅａｌｅｓ古細菌配列骨格を有し、１つ以上の変異を含む操作されたポリメラーゼが、野生型ポリメラーゼと比較して、ヌクレオチド類似体の増加した取り込み率を示すという驚くべき発見をした。野生型Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ ａｌｔｉａｒｃｈａｅａｌｅｓ古細菌ポリメラーゼと比較して、操作されたポリメラーゼのうちのいくつかは、３’鎖終結基を有するヌクレオチド類似体への増加した結合親和性、ウラシル含有鋳型分子の反対側にｄＡＴＰヌクレオチドを取り込む改善した能力（例えば、ウラシル耐性変異体ポリメラーゼ）、多価分子の相補的ヌクレオチド単位に結合する改善した能力、及び最大約７５℃までの増加した熱安定性を含む、１つ以上の望ましい特徴を示した。Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ骨格（例えば、Ｂｓｔポリメラーゼ）に基づき、変異体配列を含む操作されたポリメラーゼが、ヌクレオチド類似体の改善された取り込みを示すことも示す。

【0186】

本開示は、標識されたまたは非標識された鎖終結ヌクレオチドを使用する任意の核酸配列決定方法を実施するのに有用である操作されたポリメラーゼを提供し、鎖終結ヌクレオチドは、糖３’位に３’－Ｏ－アジド基（または３’－Ｏ－メチルアジド基）または任意の他の種類の大型のブロック基を含む。例えば、操作されたポリメラーゼは、標識された多価分子及び非標識された鎖終結ヌクレオチドを使用して、親和性による配列決定法（ＳＢＡ）を実施するために使用することができる。更に、操作されたポリメラーゼは、標識された鎖終結ヌクレオチドを使用する合成による配列決定（ＳＢＳ）方法を実施するために、及び非標識された鎖終結ヌクレオチドを使用する結合による配列決定（ＳＢＢ）方法を実施するために使用することができる。

【0187】

ＤＮＡの親和性による配列決定（ＳＢＡ）は、理想的には、（ａ）ｎ＋１塩基の検出を必要とし、標的核酸配列の２つ以上のコピー、当該標的核酸配列の１つ以上の領域に相補的な２つ以上のプライマー核酸分子、及び２つ以上のポリメラーゼを必要とし、ポリマーヌクレオチドコンジュゲートが２つ以上のヌクレオチド部分を含む当該組成物中の当該ポリマーヌクレオチドコンジュゲートと当該標的核酸配列の当該２つ以上のコピーとの間に多価結合複合体が形成されることを可能にするのに十分な条件下で、当該組成物を多価分子（例えば、ポリマーヌクレオチドコンジュゲート）と接触させる２つ以上のポリメラーゼを必要とし、検出基質は、その後、洗浄され、（ｂ）単一の取り込みのみが生じるように、非標識ヌクレオチドの構造的修飾（「ブロック基」）が、単一のヌクレオチドの取り込みを確実にするために必要であるが、ポリヌクレオチド鎖へのいかなる更なるヌクレオチドの取り込みも防ぐ。次いで、ブロック基は、配列決定されるＤＮＡの完全性を妨げない反応条件下で、除去可能でなければならない。次いで、配列決定サイクルは、次の多価ポリメラーゼコンジュゲートＤＮＡ複合体などのＮ＋１検出を続行することができる。実用的用途であるために、親和性ステップは、（ａ）３０秒超の画像化をするのに十分に長く持続する安定した基質と、（ｂ）複数の配列決定サイクルを容易にするために、プロセス全体が、高収率で非常に特異的な化学的及び酵素的ステップからなるべきであるステッピングステップとの両方を必要とする。

【0188】

ＤＮＡの合成による配列決定（ＳＢＳ）は、理想的には、配列決定されるオリゴヌクレオチドの反対側の正しい相補的ヌクレオチドの制御された（すなわち一度に１つ）取り込みを必要とする。これにより、各ヌクレオチド残基が一度に１つ配列決定するように、複数のサイクルでヌクレオチドを追加することによって正確な配列決定が可能になり、したがって、非制御の一連の取り込みが発生することを防ぐ。取り込まれたヌクレオチドは、標識部分の除去及びその後の次の配列決定ラウンドの前に、それに結合した適切な標識を使用して読み取られる。単一の取り込みのみが生じることを確実にするために、配列決定ヌクレオチドの構造的修飾（「ブロック基」）は、単一のヌクレオチドの取り込みを確実にするために必要であるが、その後、ポリヌクレオチド鎖へのいかなる更なるヌクレオチドの取り込みも防ぐ。次いで、ブロック基は、配列決定されるＤＮＡの完全性を妨げない反応条件下で、除去可能でなければならない。次いで、配列決定サイクルは、次のブロックされ、標識されたヌクレオチドの取り込みを続行することができる。実用的用途であるために、複数の配列決定サイクルを容易にするために、プロセス全体は、高収率で非常に特異的な化学的及び酵素的ステップからなるべきである。

【0189】

配列決定による結合（ＳＢＢ）は、（ａ）プライミングされた鋳型核酸を、三元複合体安定化条件下で少なくとも２つの別個の混合物と順次接触させるステップであって、少なくとも２つの別個の混合物は、各々、ポリメラーゼ及びヌクレオチドを含み、それによって、順次接触させるステップは、三元複合体安定化条件下で、プライミングされた鋳型核酸が、鋳型における第１、第２、及び第３の塩基の種類塩基の種類のヌクレオチド同族体を用いて接触されるプライミングされた鋳型核酸をもたらす、順次接触させるステップと、（ｂ）少なくとも２つの別個の混合物を調べて、三元複合体が形成されたかどうかを決定するステップと、（ｃ）プライミングされた鋳型核酸分子の次の正しいヌクレオチドを識別するステップであって、次の正しいヌクレオチドは、三元複合体がステップ（ｂ）で検出された場合、第１、第２、または第３の塩基の種類の同族体として識別され、次の正しいヌクレオチドは、ステップ（ｂ）での三元複合体の不在に基づいて、第４の塩基の種類のヌクレオチド同族体であると推定される、識別するステップと、（ｄ）次の正しいヌクレオチドを、ステップ（ｂ）の後、プライミングされた鋳型核酸を添加し、それによって伸長プライマーを産生するステップと、（ｅ）伸長プライマーを含むプライミングされた鋳型核酸のためのステップ（ａ）～（ｄ）を繰り返すステップと、を含む、核酸の配列決定するための方法を必要とする。

【0190】

本明細書に記載のポリペプチドは、ポリメラーゼ活性などの酵素活性を有するポリペプチドを含むが、これらに限定されず、しばしばファミリーとして記載される。多くの場合、ポリメラーゼは、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、鋳型非依存性ポリメラーゼ、逆転写酵素、またはヌクレオチド結合及びヌクレオチドの取り込み（例えば、プライマー伸長）が可能な他の酵素である。多くのＤＮＡポリメラーゼが、当該技術分野で既知であり、そのような酵素は、場合によっては、本明細書に記載の組成物を生成するために変異される。ＤＮＡポリメラーゼファミリーのメンバーは、多くの場合、他の既知のＤＮＡポリメラーゼファミリーメンバーに対するポリメラーゼ活性、活性部位構造、ドメインホモロジー／機能、または配列ホモロジーの観点から定義される。例えば、ＤＮＡポリメラーゼとしては、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼＩＩ、またはＤＮＡポリメラーゼファミリーの他のメンバーが挙げられるが、これらに限定されない。既知の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼとしては、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｐｆｕポリメラーゼ、及び９°Ｎポリメラーゼ、またはＤＮＡポリメラーゼファミリーの他のメンバーが挙げられる。野生型ＤＮＡポリメラーゼは、真核生物、原核生物、またはウイルス起源などの任意の数の起源から得られるか、得られ得、いくつかの実施形態において、本開示の目的のために、古細菌起源から得られるか、得られ得る。いくつかの実施形態において、配列番号１～２７４及び２８８～３７５及び３８５～３９７のうちのいずれかのアミノ酸配列を含むポリメラーゼは、ＤＮＡポリメラーゼファミリーのメンバーである。

【0191】

本明細書では、配列番号１または３９１と少なくとも８５％の同一性、及び配列番号１または３９１の残基に従って番号付けられたポリペプチド配列の位置４０３、４０５、４０６、４１４、４１５、４１６、４１７、４１８、４６８、４９３、４９５、４９９、５０１、５０２、５０７、５１５、５２９、及び／または５６７で少なくとも１つの変異を有する配列を含むポリペプチドが、更に提供される。場合によっては、本明細書に記載のポリペプチドは、配列番号１または３９１と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、または９９．８％の同一性を有する配列を含む。場合によっては、本明細書に記載のポリペプチドは、配列番号１または３９１と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、または９９．８％の同一性を有する配列、ならびに配列番号１の番号付けに従って位置４０３、４０５、４０６、４１４、４１５、４１６、４１７、４１８、４６８、４９３、４９５、４９９、５０１、５０２、５０７、５１５、５２９、及び／または５６７で少なくとも１つの変異を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、配列番号１または２～２６８または２８８～３７５または３８５～３９７のうちのいずれかと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、または９９．８％の同一性を有し、配列番号１、３９３、または３９１の位置４０３、４０５、４０６、４１４、４１５、４１６、４１７、４１８、４６８、４９３、４９５、４９９、５０１、５０２、５０７、５１５、５２９、及び／または５６７のうちの１つ以上に類似する位置で少なくとも１つの変異を有するポリペプチドが、本明細書に開示される。

【0192】

本明細書では、配列番号１または３９１と少なくとも８５％の同一性、ならびに配列番号１または３９１の残基に従って番号付けられたポリペプチド配列の位置Ｇ４０３、Ｈ４０５、Ｄ４０６、Ｒ４１４、Ｓ４１５、Ｌ４１６、Ｙ４１７、Ｐ４１８、Ｒ４６８、Ａ４９３、Ｋ４９５、Ｎ４９９、Ｍ５０１、Ｙ５０２、Ｆ５０７、Ｒ５１５、Ｉ５２９、及び／またはＮ５６７で少なくとも１つの変異を有する配列を含む、ポリペプチドが、更に提供される。場合によっては、本明細書に記載のポリペプチドは、配列番号１または３９１と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、または９９．８％の同一性を有する配列を含む。場合によっては、このポリペプチドはまた、配列番号１、３９３、または３９１の番号付けに従って位置Ｇ４０３、Ｈ４０５、Ｄ４０６、Ｒ４１４、Ｓ４１５、Ｌ４１６、Ｙ４１７、Ｐ４１８、Ｒ４６８、Ａ４９３、Ｋ４９５、Ｎ４９９、Ｍ５０１、Ｙ５０２、Ｆ５０７、Ｒ５１５、Ｉ５２９、及び／またはＮ５６７で少なくとも１つの変異を有する。いくつかの実施形態において、配列番号１または２～２６８または２８８～３７５または３８５～３９７と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、または９９．８％の同一性を有し、配列番号１または３９１の位置Ｇ４０３、Ｈ４０５、Ｄ４０６、Ｒ４１４、Ｓ４１５、Ｌ４１６、Ｙ４１７、Ｐ４１８、Ｒ４６８、Ａ４９３、Ｋ４９５、Ｎ４９９、Ｍ５０１、Ｙ５０２、Ｆ５０７、Ｒ５１５、Ｉ５２９、及び／またはＮ５６７のうちの１つ以上に類似する位置で少なくとも１つの変異を有するポリペプチドが、本明細書に開示される。いくつかの実施形態において、変異体ポリペプチドは、配列番号１、３９３、または３９１のアミノ酸残基に従って番号付けられたポリペプチド配列の位置（複数可）Ｄ９、Ｙ１０、Ｉ１１、Ｅ１４、Ｅ２７、Ｆ３７、Ｍ４１、Ｈ４８、Ｐ４５、Ｌ５０、Ｋ５１、Ｑ５４、Ｋ５８、Ｋ６１、Ｉ６３、Ｉ６８、Ｅ７３、Ｄ７５、Ｅ７７、Ｍ８４、Ｑ８７、Ｖ９１、Ｇ９６、Ｅ１０２、Ｋ１０５、Ｖ１０７、Ａ１１５、Ｅ１１６、Ｌ１２４、Ｐ１２６、Ｎ１３２、Ｍ１４２、Ｒ１７０、Ｅ１７９、Ｄ１９１、Ｅ２０５、Ｋ２２５、Ｖ２３９、Ｒ２５６、Ｉ２７２、Ｅ２９１、Ｄ３０５、Ｅ３０８、Ｅ３１０、Ｅ３２８、Ｉ３４３、Ｔ３４４、Ｓ３７２、Ｅ４３４、Ｙ４４８、Ｖ４６５、Ｒ４６７、Ｇ４７４、Ｎ４８０、Ｒ４８３、Ｄ４８８、Ａ４９８、Ｓ５００、Ｍ５０１、Ｙ５０２、Ｒ５０９、Ｅ５１６、Ｓ５２０、Ｋ５３８、Ｆ５３９、Ｄ５６０、Ｖ５６４、Ｍ５６５、Ａ５６８、Ｅ５６９、Ｄ５７３、Ｋ５７４、Ｓ５７７、Ｅ５７８、Ｅ５８１、Ｍ５８３、Ｋ６１０、Ｔ６１８、Ｄ６３６、Ｎ６５７、Ｔ６７５、Ｋ６８２、Ｖ６８９、Ｅ７００、Ｎ７０５、Ｓ７１７、Ｅ７３０、Ｓ７４６、Ｅ７５８、Ｋ７６２、Ｇ７６３、Ｌ７６４、Ｇ７６５、Ｋ７６６、Ｑ７６７、及び／またはＦ７７３で少なくとも１つの変異を更に含む。

【0193】

本開示は、野生型ポリメラーゼと比較して、ヌクレオチド類似体の結合及び識別の増加した能力及びヌクレオチド類似体の改善された取り込みを示す、ポリメラーゼ酵素に関連する変異体ポリペプチドを含む組成物及び方法を提供する。ヌクレオチド類似体には、例えば、糖２’または３’位に結合した鎖終結基を含むヌクレオチドが含まれる。鎖終結基は、アジド（ａｚｉｄｅ）、アジド（ａｚｉｄｏ）、もしくはアジドメチル基、または別の種類の鎖終結基を含む。操作されたＤＮＡポリメラーゼは、配列番号１または３９１のアミノ酸配列を有する野生型ポリメラーゼと比較して、ヌクレオチド類似体の増加した取り込み率を示す。表１（図３Ａ～図３Ｈ）に示されるデータは、ヌクレオチド類似体の増加した取り込み率を示す多数の例示的な変異体ポリメラーゼを提供する。

【0194】

本開示は、配列番号１または３９１のアミノ酸配列を有する野生型ポリメラーゼと比較して、増加した熱安定性を有する変異体ポリメラーゼ酵素を含む組成物及び方法を提供する。

【0195】

本開示は、ウラシル含有核酸鋳型分子の配列決定のために使用することができる変異体ポリメラーゼ酵素を含む組成物及び方法を提供する。変異体ポリメラーゼは、核酸鋳型分子内のウラシル塩基の反対側の位置で核酸プライマーの３’末端にｄＡＴＰを取り込むための増加した能力を有するウラシル耐性を示すことができる。変異体ポリメラーゼはまた、核酸鋳型分子内のウラシル塩基と反対側の位置で多価分子のアデニン担持ヌクレオチド単位に結合し得る。ウラシル耐性を示す例示的な変異体ポリメラーゼは、配列番号３６１、３６２、３６３、３６４、３６６、３６７、３７４、または３７５のうちのいずれか１つ、または配列番号３８５～３９７のうちのいずれかのアミノ酸配列を含む。

【0196】

本明細書に記載のポリメラーゼにおける変異は、ポリペプチド内に存在するアミノ酸残基に対する１つ以上の変化を様々に含む。付加、置換、または欠失は全て、変異体ポリペプチドを生成するために使用される変異の例である。いくつかの実施形態において、置換は、１つのアミノ酸の代替アミノ酸との交換を含み、そのような代替アミノ酸は、サイズ、形状、コンフォメーション、または化学構造に関して元のアミノ酸とは異なる。いくつかの実施形態において、変異は、保存的または非保存的である。保存的変異は、類似の化学特性を有するアミノ酸とのアミノ酸の置換を含む。付加は、多くの場合、ポリペプチドのＮ末端、Ｃ末端、または内部位置に１つ以上のアミノ酸の挿入を含む。場合によっては、付加は、融合ポリペプチドを含み、１つ以上の追加のポリペプチドが、ポリペプチドに接続される。いくつかの実施形態において、かかる追加のポリペプチドは、追加の活性を有するドメイン、または追加の機能（例えば、発現の改善、精製の補助、溶解性の改善、固体支持体への結合、または他の機能）を有する配列を含む。多くの場合、本明細書に記載のポリペプチドは、１つ以上の非アミノ酸基を含む。融合ポリペプチドは、任意選択的に、１つ以上のタンパク質を接続するアミノ酸または他の化学リンカーを含む。任意の数の変異は、本明細書に記載のポリペプチドまたはポリペプチドの部分、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、５０、または５０を超える変異に導入され得る。

【0197】

いくつかの実施形態において、ドメイン全体（定義された機能を有するポリペプチドの部分）が、他のポリペプチドからのドメインに付加されるか、欠失されるか、または置換される。例示的なドメインとしては、ＤＮＡ／ＲＮＡ結合ドメイン、ヌクレオチド結合ドメイン、ヌクレアーゼドメイン、核局在化ドメインなどの細胞内局在化ドメイン、または他のドメインが挙げられる。いくつかの実施形態において、本開示の方法及び組成物は、スペーサーもしくは標識として機能し、及び／またはＳＮＡＰタグ、アビジン部分、ストレプトアビジン部分、エピトープタグ、蛍光タンパク質、親和性タグ、金属結合（すなわち、Ｈｉｓ６（配列番号３９８）もしくはポリヒスチジンタグ）などのリンカーの付着を提供する、ドメインの付着を含む。いくつかの実施形態において、１つ以上の変異は、触媒部位または結合ドメインに存在する。例えば、ポリペプチドは、配列番号１に開示される核酸結合ドメインを含む。ドメインは、場合によっては、例えば、配列番号１の位置３５４～７７３での残基、または代替的に、残基２４９～２５３、３９２～３９６、５９８～６０１、６１３～６１５、６７３～６７６、及び／または６８１～６８３を含む、ＤＮＡまたはＲＮＡ結合部位を含む。そのような部位は、配列番号１に対する他の配列のアラインメントの後に類似の位置に見出すことができる（例えば、図７Ａ～図７Ｂ、図８Ａ～図８Ｃ、図９Ａ～図９Ｂ、図１０Ａ～図１０Ｂ、図１１Ａ～図１１Ｂ、図１２Ａ～図１２Ｂ、及び図１３Ａ～図１３Ｂを参照されたい）。いくつかの実施形態において、ドメインは、配列番号１の位置１～１３５、１３６～３４７、３４８～４５４、４５５～５０４、５０５～６２４、または６２５～７７３での残基を含むポリメラーゼドメイン、またはそれらの位置等価物を含む（例えば、図６Ａ～図６Ｃの表４、及び図７Ａ～図７Ｂ、図８Ａ～図８Ｃ、図９Ａ～図９Ｂ、図１０Ａ～図１０Ｂ、図１１Ａ～図１１Ｂ、図１２Ａ～図１２Ｂ、及び図１３Ａ～図１３Ｂを参照されたい）。場合によっては、ポリペプチドは、活性部位を含む。ポリペプチドの活性部位は、配列番号１の残基Ｄ４１２、Ｄ５４７、及び／またはＤ５４９、またはそれらの位置等価物を含み得る（例えば、図６Ａ～図６Ｃの表４、及び図７Ａ～図７Ｂ、図８Ａ～図８Ｃ、図９Ａ～図９Ｂ、図１０Ａ～図１０Ｂ、図１１Ａ～図１１Ｂ、図１２Ａ～図１２Ｂ、及び図１３Ａ～図１３Ｂを参照されたい）。そのような部位は、しばしば、他のドメイン内の類似の位置に見出され（例えば、比較のために２つ以上の配列を整列させることによって識別され）、そのようなドメインを含むポリペプチドは、本明細書に記載の方法及び組成物と一致する。

【0198】

本明細書で使用される場合、アミノ酸残基または配列位置を「取り囲む」という用語は、命名された残基から離れた１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２もしくはそれ以上の残基からの残基、すなわち、命名された残基からＮ末端またはＣ末端での残基での置換、欠失、挿入、または翻訳後修飾のような修飾を含み、それを取り込む、当技術分野における通常の意味を有する。いくつかの文脈では、当業者に理解されるように、命名された残基からの１２個を超える残基または配列位置ＮまたはＣ末端は、配列または構造（すなわち、３次元）文脈に基づいて命名された残基を「取り囲む」とみなすことができる。

【0199】

本明細書に記載の残基の置換または修飾はまた、ヒドロキシプロリン、Ｎ－ホルミルメチオニン、セレノメチオニン、セレノシステイン、ホスホチロシン、ホスホヒスチジンなどを含むが、これらに限定されない、当該技術分野で既知の非標準アミノ酸を取り込み得るか、または含み得ることが理解される。本明細書に記載の変異、修飾、切断、置換などは、当該技術分野、特に分子生物学及び／またはタンパク質工学の技術分野で既知であるような任意の方法によって行われ得る。かかる方法は、変異原性及び／または部分的に変性したプライマーを使用した部位特異的変異原性、インビトロ遺伝子組み立て、遺伝子編集（例えば、ＣＲＩＳＰＲまたは関連方法による）などを含み得る。本明細書に記載の変異体または操作されたタンパク質は、当該技術分野で既知であるような任意のかかる手段によって、更に発現、単離、及び／または精製され得る。関連する方法は、Ｇｒｅｅｎ，Ｍ．ａｎｄ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第４版）に記載されており、これは、参照によりその全体が、特に組換え、修飾、改変、及び操作された遺伝子配列を修飾、導入、及び発現させるための方法、ならびに操作されたタンパク質を抽出、単離、及び／または精製するための方法の開示に関して本明細書に組み込まれる。

【0200】

本明細書に開示されるポリペプチドは、野生型酵素と比較して、より高い熱安定性、より高い３’－Ｏ－アジドメチル誘導体化ヌクレオシドの取り込み率、及び／または増加したウラシル耐性を示すヌクレオチドポリメラーゼとして機能することが示されている。本明細書に開示されるポリペプチドは、複製または合成中の核酸の伸長のために使用され得るか、または例えば、取り込み不能またはブロックされたヌクレオチドの使用によってヌクレオチド付加部位に捕捉され得るか、または必要な塩もしくは補因子が存在しない条件下で使用することができる。本明細書に開示されるポリペプチドは、例えば、ポリヌクレオチド配列決定用途、例えば、合成による配列決定及び結合用途による配列決定に利用され得る。

【0201】

本開示は、典型的には、ヌクレオチド類似体の改善された取り込みを示す複製ポリメラーゼを含む、ファミリーＢポリメラーゼのアミノ酸配列骨格を含む操作されたＤＮＡポリメラーゼを提供する。ファミリーＢ型ポリメラーゼの例としては、ファミリーＢ古細菌ＤＮＡポリメラーゼ及びＰｈｉ２９ポリメラーゼが挙げられる。いくつかの実施形態において、操作されたＤＮＡポリメラーゼは、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ、またはＣａｎｄｉｄａｔｕｓから選択され得るファミリーＢ古細菌ＤＮＡポリメラーゼを含む。いくつかの実施形態において、操作されたＤＮＡポリメラーゼは、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ａｌｔｉａｒｃｈａｅａｌｅｓ古細菌ＤＮＡポリメラーゼ、９°Ｎポリメラーゼ（ＴＨＥＲＭＩＮＡＴＯＲポリメラーゼを含む）、ＶＥＮＴポリメラーゼ、ＤＥＥＰ ＶＥＮＴポリメラーゼ、Ｐｆｕポリメラーゼ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｂｙｓｓｉポリメラーゼ、またはＲＢ６９ポリメラーゼからのアミノ酸配列骨格を含む。いくつかの実施形態において、操作されたＤＮＡポリメラーゼは、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ（例えば、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）を含むファミリーＡ型ポリメラーゼのアミノ酸配列骨格に基づくことができる。

【0202】

操作されたＤＮＡポリメラーゼは、関心対象のＤＮＡポリメラーゼ（例えば、野生型または変異体ポリメラーゼ）のアミノ酸配列に１つ以上の変異を導入することによって設計及び調製することができ、結果として生じる操作されたポリメラーゼの表現型を決定することができる。２つ以上の変異部位のうちのいずれか１つまたはいずれかの組み合わせは、１つの種類のポリメラーゼから、第２の種類のポリメラーゼにおける位置等価部位に移すことができる。例えば、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ａｌｔｉａｒｃｈａｅａｌｅｓ古細菌ＤＮＡポリメラーゼからの２つ以上の変異部位のうちのいずれか１つまたはいずれかの組み合わせを、９°Ｎポリメラーゼ（ＴＨＥＲＭＩＮＡＴＯＲポリメラーゼを含む）、ＶＥＮＴポリメラーゼ、ＤＥＥＰ ＶＥＮＴポリメラーゼ、Ｐｆｕポリメラーゼ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｂｙｓｓｉポリメラーゼ、及び／またはＲＢ６９ポリメラーゼの位置等価部位に導入することができる（例えば、図６Ａ～図６Ｃの表４を参照されたい）。変異は、２つ以上のアミノ酸の置換、挿入、欠失、及び／または切断のうちのいずれか１つまたはいずれかの組み合わせを含む。

【0203】

残基の機能的等価物は、配列内の類似の位置（例えば、配列アラインメント）及び／または酵素（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ）の三次元構造を占め、既知の酵素内の既知のアミノ酸残基と実質的に同じ機能を果たす１つ以上のアミノ酸残基を含む。機能的に等価なアミノ酸置換は、別のポリペプチドで同じ機能的役割を有する塩基性ポリペプチドの特定の位置に１つ以上のアミノ酸残基を含む。機能的に等価なアミノ酸置換は、保存的及び／または非保存的アミノ酸置換のうちのいずれか１つまたはいずれかの組み合わせを含む。図６Ａ～６Ｃの表４は、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ａｌｔｉａｒｃｈａｅａｌｅｓ古細菌ＤＮＡポリメラーゼ及び機能的に等価なアミノ酸部位、例えば、９°Ｎ ＤＮＡポリメラーゼ（配列番号２８０または２８１に対する）、ＴＨＥＲＭＩＮＡＴＯＲ（配列番号２８２に対する）、ＶＥＮＴ ＤＮＡポリメラーゼ（配列番号２８３に対する）、ＤＥＥＰ ＶＥＮＴ ＤＮＡポリメラーゼ（配列番号２８４に対する）、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（配列番号２８５に対する）、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｂｙｓｓｉ ＤＮＡポリメラーゼ（配列番号２８６に対する）、及びＧｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ（配列番号２７５に対する）における部位でのアミノ酸残基の例を列挙する。

【0204】

野生型ポリペプチド配列は、しばしば、タンパク質または酵素工学が変異ポリペプチドを生成するための出発点である。いくつかの実施形態において、変異ポリペプチドは、少なくとも１つのアミノ酸残基によって野生型ポリペプチドとは異なる。しばしば、変異ポリペプチドは、少なくとも１つのアミノ酸残基によって最も近い野生型ポリペプチドとは異なる。いくつかの実施形態において、変異ポリペプチドは、少なくとも２つのアミノ酸残基によって野生型ポリペプチドとは異なる。いくつかの実施形態において、変異ポリペプチドは、少なくとも３つ、４つ、５つ、または少なくとも６つのアミノ酸残基によって野生型ポリペプチドとは異なる。しばしば、野生型配列は、野生型配列内の少なくとも１つの変異を含むポリペプチドをアラインメントすることによって識別される、最も近い野生型配列である。いくつかの実施形態において、野生型ポリペプチド配列は、天然に存在するポリペプチドの配列を含む。

【0205】

アミノ酸置換は、ポリペプチド内の選択された位置のアミノ酸残基を、類似のサイズ、形状、コンフォメーション、化学構造、電荷、及び／または疎水性などの類似のまたは異なる生化学的特性を有する異なるアミノ酸に置き換えることを指す。アミノ酸置換は、保存的または非保存的アミノ酸置換であり得る。いくつかの実施形態において、ポリペプチド内の選択された位置のアミノ酸残基は、極性側鎖を有するアミノ酸で置き換えることができる。極性側鎖を有するアミノ酸の例としては、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、ヒスチジン、リシン、セリン、及びトレオニンが挙げられる。いくつかの実施形態において、ポリペプチド内の選択された位置のアミノ酸残基は、非極性側鎖を有するアミノ酸で置き換えることができる。非極性側鎖を有するアミノ酸の例としては、アラニン、システイン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリフィック、トリプトファン、チロシン、及びバリンが挙げられる。いくつかの実施形態において、ポリペプチド内の選択された位置のアミノ酸残基は、疎水性側鎖を有するアミノ酸で置き換えることができる。疎水性側鎖を有するアミノ酸の例としては、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、チロシン、及びトリプトファンが挙げられる。いくつかの実施形態において、ポリペプチド内の選択された位置のアミノ酸残基は、非荷電側鎖を有するアミノ酸で置き換えることができる。非荷電側鎖を有するアミノ酸の例としては、グリシン、セリン、システイン、アスパラギン、グルタミン、チロシン、及びトレオニンが挙げられる。いくつかの実施形態において、ポリペプチド内の選択された位置のアミノ酸残基は、正に荷電した側鎖を有するアミノ酸で置き換えることができる。正に荷電した側鎖を有するアミノ酸の例としては、アルギニン、ヒスチジン、及びリシンが挙げられる。いくつかの実施形態において、ポリペプチド内の選択された位置のアミノ酸残基は、負に荷電した側鎖を有するアミノ酸で置き換えることができる。負に荷電した側鎖を有するアミノ酸の例としては、アスパラギン酸及びグルタミン酸が挙げられる。

【0206】

本開示は、配列番号１または３９１の骨格アミノ酸配列を含み、Ｆ２２、Ｅ２６、Ｖ３４、Ａ３５、Ｋ５２、Ｋ５８、Ｉ７２、Ｅ７９、Ｍ８４、Ｃ１０４、Ｉ１１２、Ｃ１３０、Ｅ１５０、Ｓ１６２、Ｃ２６９、Ｉ２７２、Ｒ２９６、Ｐ３３５、Ｇ３５５、Ｒ３５９、Ｅ３７０、Ｄ３８１、Ｇ４０３、Ｈ４０５、Ｄ４０６、Ｒ４１４、Ｓ４１５、Ｌ４１６、Ｙ４１７、Ｐ４１８、Ｄ４３９、Ｓ４４０、Ｓ４４３、Ｃ４５０、Ｒ４６８、Ｋ４７３、Ｖ４８９、Ｑ４９２、Ａ４９３、Ｌ４９４、Ｋ４９５、Ｌ４９６、Ｎ４９９、Ｍ５０１、Ｙ５０２、Ｆ５０７、Ｃ５１４、Ｒ５１５、Ｃ５１７、Ｔ５２２、Ｉ５２９、Ｎ５６７、Ｅ５６９、Ｓ５７７、Ｒ６０８、Ｋ６１０、Ｌ６１１、Ｄ６２２、Ｋ６３３、Ｖ６５１、Ｄ６５３、Ｔ６６０、Ａ６６９、Ｑ６７３、Ｔ６８３、Ｒ６９７、Ｓ７１７、Ｒ７２３、Ｉ７５０、Ｌ７５１、及び／またはＥ７６０を含む１つ以上の位置でアミノ酸置換変異を有するＣａｎｄｉｄａｔｕｓ Ａｌｔｉａｒｃｈａｅａｌｅｓ古細菌から変異体ポリメラーゼを提供する。いくつかの実施形態において、アミノ酸置換変異はまた、位置Ｄ１４１及びＥ１４３を含むことができる。いくつかの実施形態において、変異体ポリメラーゼは、配列番号１、３９３、または３９１の残基に従って番号付けられたポリペプチド配列の位置Ｄ９、Ｙ１０、Ｉ１１、Ｅ１４、Ｅ２７、Ｆ３７、Ｍ４１、Ｐ４５、Ｈ４８、Ｌ５０、Ｋ５１、Ｑ５４、Ｋ６１、Ｉ６３、Ｉ６８、Ｅ７３、Ｄ７５、Ｅ７７、Ｍ８４、Ｑ８７、Ｖ９１、Ｇ９６、Ｅ１０２、Ｋ１０５、Ｖ１０７、Ａ１１５、Ｅ１１６、Ｌ１２４、Ｐ１２６、Ｎ１３２、Ｍ１４２、Ｒ１７０、Ｅ１７９、Ｄ１９１、Ｅ２０５、Ｋ２２５、Ｖ２３９、Ｒ２５６、Ｉ２７２、Ｅ２９１、Ｄ３０５、Ｅ３０８、Ｅ３１０、Ｅ３２８、Ｉ３４３、Ｔ３４４、Ｓ３７２、Ｅ４３４、Ｙ４４８、Ｖ４６５、Ｒ４６７、Ｇ４７４、Ｎ４８０、Ｒ４８３、Ｄ４８８、Ａ４９８、Ｓ５００、Ｙ５０２、Ｒ５０９、Ｅ５１６、Ｓ５２０、Ｋ５３８、Ｆ５３９、Ｄ５６０、Ｖ５６４、Ｍ５６５、Ａ５６８、Ｄ５７３、Ｋ５７４、Ｅ５７８、Ｅ５８１、Ｍ５８３、Ｄ６８０、Ｔ６１８、Ｄ６３６、Ｎ６５７、Ｔ６７５、Ｅ６８０、Ｋ６８２、Ｖ６８９、Ｅ７００、Ｎ７０５、Ｓ７１７、Ｅ７３０、Ｓ７４６、Ｅ７５８、Ｋ７６２、Ｇ７６３、Ｌ７６４、Ｇ７６５、Ｋ７６６、Ｑ７６７、及び／またはＦ７７３で少なくとも１つの変異を更に含む。いくつかの実施形態において、変異体ポリメラーゼは、配列番号３９１に示される配列ＱＧＳＹＴ（単一の文字コード）を含むＣ末端に追加のアミノ酸を更に含む。

【0207】

いくつかの実施形態において、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ａｌｔｉａｒｃｈａｅａｌｅｓ古細菌からの変異体ポリメラーゼは、Ｆ２２Ｌ、Ｅ２６Ｇ、Ｖ３４Ｉ、Ａ３５Ｅ、Ａ３５Ｔ、Ｋ５８Ｍ、Ｉ７２Ｆ、Ｅ７９Ｋ、Ｅ７９Ｖ、Ｍ８４Ｔ、Ｃ１０４Ｓ、Ｉ１１２Ｆ、Ｃ１３０Ｓ、Ｃ１３０Ｒ、Ｅ１５０Ｋ、Ｓ１６２Ｓ、Ｃ２６９Ｓ、Ｃ２６９Ｖ、Ｉ２７２Ｎ、Ｐ３３５Ｑ、Ｇ３５５Ｓ、Ｅ３７０Ｄ、Ｄ３８１Ｙ、Ｇ４０３Ａ、Ｈ４０５Ｐ、Ｈ４０５Ｓ、Ｄ４０６Ｈ、Ｒ４１４Ｓ、Ｓ４１５Ａ、Ｓ４１５Ｇ、Ｓ４１５Ｖ、Ｌ４１６Ｖ、Ｌ４１６Ｇ、Ｌ４１６Ｔ、Ｌ４１６Ａ、Ｌ４１６Ｓ、Ｌ４１６Ｉ、Ｌ４１６Ｆ、Ｌ４１６Ｙ、Ｌ４１６Ｍ、Ｙ４１７Ｔ、Ｙ４１７Ｓ、Ｙ４１７Ｇ、Ｙ４１７Ａ、Ｙ４１７Ｖ、Ｙ４１７Ｉ、Ｐ４１８Ｓ、Ｐ４１８Ｇ、Ｐ４１８Ｖ、Ｐ４１８Ｃ、Ｐ４１８Ｋ、Ｐ４１８Ｉ、Ｐ４１８Ｔ、Ｐ４１８Ａ、Ｄ４３９Ｓ、Ｓ４４０Ｎ、Ｓ４４３Ｎ、Ｃ４５０Ｓ、Ｒ４６８Ａ、Ｒ４６８Ｖ、Ｒ４６８Ｓ、Ｒ４６８Ｋ、Ｒ４６８Ｈ、Ｒ４６８Ｇ、Ｋ４７３Ａ、Ｖ４８９Ｉ、Ｑ４９２Ｒ、４９２Ｃ、Ｑ４９２Ｆ、Ｑ４９２Ａ、Ｑ４９２Ｇ、Ａ４９３Ｖ、Ａ４９３Ｓ、Ｌ４９４Ｖ、Ｋ４９５Ｇ、Ｋ４９５Ａ、Ｋ４９５Ｑ、Ｋ４９５Ｓ、Ｋ４９５Ｖ、Ｌ４９６Ａ、Ｌ４９６Ｇ、Ｌ４９６Ｓ、Ｌ４９６Ｒ、Ｌ４９６Ｈ、Ｌ４９６Ｎ、Ｌ４９６Ｉ、Ｌ４９６Ｍ、Ｌ４９６Ｃ、Ｌ４９６Ｙ、Ｎ４９９Ｇ、Ｎ４９９Ａ、Ｎ４９９Ｓ、Ｎ４９９Ｖ、Ｍ５０１Ｉ、Ｙ５０２Ｔ、Ｙ５０２Ｖ、Ｙ５０２Ｓ、Ｙ５０２Ｒ、Ｙ５０２Ｇ、Ｙ５０２Ｎ、Ｙ５０２Ａ、Ｙ５０２Ｑ、Ｙ５０２Ｐ、Ｙ５０２Ｈ、Ｙ５０２Ｆ、Ｆ５０７Ｓ、Ｃ５１４Ｓ、Ｒ５１５Ｌ、Ｒ５１５Ｗ、Ｒ５１５Ｙ、Ｒ５１５Ｐ、Ｒ５１５Ｆ、Ｃ５１７Ｓ、Ｔ５２２Ｓ、Ｔ５２２Ａ、Ｉ５２９Ｈ、Ｉ５２９Ｔ、Ｉ５２９Ｖ、Ｉ５２９Ｓ、Ｉ５２９Ｇ、Ｉ５２９Ａ、Ｉ５２９Ｌ、Ｉ５２９Ｆ、Ｎ５６７Ｄ、Ｅ５６９Ｇ、Ｓ５７７Ｉ、Ｒ６０８Ｋ、Ｋ６１０Ｅ、Ｌ６１１Ｓ、Ｄ６２２Ｔ、Ｋ６３３Ｒ、Ｖ６５１Ｍ、Ｄ６５３Ｇ、Ｔ６６０Ｓ、Ｔ６８３Ａ、Ａ６６９Ｄ、Ｑ６７３Ｉ、Ｒ６９７Ｇ、Ｓ７１７Ｇ、Ｒ７２３Ｈ、Ｉ７５０Ｖ、Ｌ７５１Ｍ、及び／またはＥ７６０Ｇを含む２つ以上のアミノ酸置換のうちのいずれか１つまたは任意の組み合わせを有する配列番号１または３９１のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、アミノ酸置換変異はまた、Ｄ１４１Ａ及びＥ１４３Ａを含むことができる。いくつかの実施形態において、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ ａｌｔｉａｒｃｈａｅａｌｅｓ古細菌からの変異体ポリメラーゼは、Ｄ９Ｎ、Ｙ１０Ｆ、Ｉ１１Ｆ、Ｅ１４Ｋ、Ｅ１４Ｇ、Ｅ２７Ｒ、Ｆ３７Ｓ、Ｍ４１Ｌ、Ｐ４５Ｓ、Ｈ４８Ｒ、Ｌ５０Ｐ、Ｋ５１Ｒ、Ｑ５４Ｌ、Ｋ５８Ｒ、Ｋ６１Ｅ、Ｉ６３Ｔ、Ｉ６３Ｖ、Ｉ６８Ｖ、Ｅ７３Ｋ、Ｄ７５Ｎ、Ｅ７７Ｇ、Ｍ８４Ｌ、Ｑ８７Ｈ、Ｖ９１Ｑ、Ｇ９６Ｓ、Ｅ１０２Ｒ、Ｋ１０５Ｒ、Ｖ１０７Ｉ、Ａ１１５Ｖ、Ｅ１１６Ｇ、Ｌ１２４Ｑ、Ｐ１２６Ｓ、Ｎ１３２Ｓ、Ｍ１４２Ｌ、Ｒ１７０Ｈ、Ｅ１７９Ｒ、Ｄ１９１Ｇ、Ｅ２０５Ｋ、Ｋ２２５Ｅ、Ｖ２３９Ｉ、Ｒ２５６Ｈ、Ｒ２５６Ｋ、Ｉ２７２Ｖ、Ｅ２９１Ｒ、Ｄ３０５Ｎ、Ｅ３０８Ｒ、Ｅ３１０Ｒ、Ｅ３２８Ｑ、Ｉ３４３Ｖ、Ｔ３４４Ｉ、Ｓ３７２Ｎ、Ｅ４３４Ｒ、Ｙ４４８Ｈ、Ｖ４６５Ｍ、Ｒ４６７Ｃ、Ｇ４７４Ｓ、Ｇ４７４Ｄ、Ｎ４８０Ｉ、Ｒ４８３Ｈ、Ｄ４８８Ｎ、Ａ４９８Ｇ、Ｓ５００Ｇ、Ｍ５０１Ｖ、Ｙ５０２Ｆ、Ｒ５０９Ｈ、Ｅ５１６Ｇ、Ｓ５２０Ｎ、Ｓ５２０Ｇ、Ｋ５３８Ｒ、Ｆ５３９Ｙ、Ｄ５６０Ｇ、Ｄ５６０Ｅ、Ｖ５６４Ｉ、Ｍ５６５Ｖ、Ａ５６８Ｖ、Ｄ５７３Ｎ、Ｋ５７４Ｒ、Ｅ５７８Ｎ、Ｅ５８１Ｇ、Ｍ５８３Ｋ、Ｔ６１８Ａ、Ｄ６３６Ｇ、Ｎ６５７Ｄ、Ｔ６７５Ａ、Ｅ６８０Ｄ、Ｋ６８２Ｉ、Ｖ６８９Ａ、Ｅ７００Ｋ、Ｎ７０５Ｄ、Ｎ７０５Ｓ、Ｓ７１７Ｎ、Ｅ７３０Ｒ、Ｓ７４６Ｃ、Ｅ７５８Ｒ、Ｋ７６２Ｒ、Ｇ７６３Ｖ、Ｇ７６３Ｓ、Ｌ７６４Ｗ、Ｇ７６５Ａ、Ｋ７６６Ｓ、Ｑ７６７Ｋ、及び／またはＦ７７３Ｓを含む、（配列番号１、３９３、または３９１の番号付けに従って）２つ以上のアミノ酸置換のうちのいずれか１つまたは任意の組み合わせを更に含む。いくつかの実施形態において、変異体ポリメラーゼは、配列番号３９１に示される配列ＱＧＳＹＴ（単一の文字コード）を含むＣ末端に追加のアミノ酸を更に含む。

【0208】

より大きなポリペプチドのセグメントまたは部分が、本明細書に更に記載される。任意選択的に、セグメントは、特に本明細書に記載の逆転写酵素ドメインまたはポリメラーゼドメインとの関連で、ヌクレオチドの取り込み及び核酸伸長活性などの触媒活性を有する。配列番号１～３９１の任意のサブセットに由来するセグメントのうちのいずれか１つと、Ｎ末端またはＣ末端の少なくとも１つの追加の残基（例えば、＋１残基）とを含むポリペプチドが、本明細書に記載される。

【0209】

いくつかの実施形態において、Ｎ末端及びＣ末端の両方が、少なくとも１つの追加の残基、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、または１００超の追加の残基を有する。例えば、隣接Ｎ末端アスパラギン酸、隣接Ｃ末端アルギニン、またはそれらの組み合わせなどの配列番号１及び２～３９１（＋１残基）のうちのいずれか、または配列番号１に対する配列番号１及び２～３９１のうちのいずれかのアラインメントによって識別された残基などの追加の残基を含むポリペプチドであって、配列番号１を含むポリペプチドに寄与する単一の変異残基または他の残基を説明する、ポリペプチドが、本明細書に記載される。例えば、隣接Ｎ末端グルタミン、隣接Ｃ末端ヒスチジン、またはそれらの組み合わせなどの配列番号１及び２～３９１（＋１残基）のうちのいずれか、または配列番号１に対する配列番号１及び２～３９１のうちのいずれかのアラインメントによって識別された残基などの追加の残基を含むポリペプチドであって、配列番号１を含むポリペプチドに寄与する単一の変異残基または他の残基を説明する、ポリペプチドが、本明細書に記載される。例えば、隣接Ｎ末端バリン、隣接Ｃ末端システイン、またはそれらの組み合わせなどの配列番号１及び２～３９１（＋１残基）のうちのいずれか、または配列番号１に対する配列番号１及び２～３９１のうちのいずれかのアラインメントによって識別された残基などの追加の残基を含むポリペプチドであって、配列番号１を含むポリペプチドに寄与する単一の変異残基または他の残基を説明する、ポリペプチドが、本明細書に記載される。例えば、隣接Ｎ末端トレオニン、隣接Ｃ末端システイン、またはそれらの組み合わせなどの配列番号１及び２～３９１（＋１残基）のうちのいずれか、または配列番号１に対する配列番号１及び２～３９１のうちのいずれかのアラインメントによって識別された残基などの追加の残基を含むポリペプチドであって、配列番号１を含むポリペプチドに寄与する単一の変異残基または他の残基を説明する、ポリペプチドが、本明細書に記載される。例えば、隣接Ｎ末端アスパラギン酸、隣接Ｃ末端ロイシン、またはそれらの組み合わせなどの配列番号１及び２～３９１（＋１残基）のうちのいずれか、または配列番号１に対する配列番号１及び２～３９１のうちのいずれかのアラインメントによって識別された残基などの追加の残基を含むポリペプチドであって、配列番号１を含むポリペプチドに寄与する単一の変異残基または他の残基を説明する、ポリペプチドが、本明細書に記載される。例えば、隣接Ｎ末端アスパラギン酸、隣接Ｃ末端アルギニン、またはそれらの組み合わせなどの配列番号１及び２～３９１（＋１残基）のうちのいずれか、または配列番号１に対する配列番号１及び２～３９１のうちのいずれかのアラインメントによって識別された残基などの追加の残基を含むポリペプチドであって、配列番号１を含むポリペプチドに寄与する単一の変異残基または他の残基を説明する、ポリペプチドが、本明細書に記載される。例えば、隣接Ｎ末端トレオニン、隣接Ｃ末端トレオニン、またはそれらの組み合わせなどの配列番号１及び２～３９１（＋１残基）のうちのいずれか、または配列番号１に対する配列番号１及び２～３９１のうちのいずれかのアラインメントによって識別された残基などの追加の残基を含むポリペプチドであって、配列番号１を含むポリペプチドに寄与する単一の変異残基または他の残基を説明する、ポリペプチドが、本明細書に記載される。例えば、隣接Ｎ末端トレオニン、隣接Ｃ末端アスパラギン、またはそれらの組み合わせなどの配列番号１及び２～３９１（＋１残基）のうちのいずれか、または配列番号１に対する配列番号１及び２～３９１のうちのいずれかのアラインメントによって識別された残基などの追加の残基を含むポリペプチドであって、配列番号１を含むポリペプチドに寄与する単一の変異残基または他の残基を説明する、ポリペプチドが、本明細書に記載される。例えば、隣接Ｎ末端トレオニン、隣接Ｃ末端セリン、またはそれらの組み合わせなどの配列番号１及び２～３９１（＋１残基）のうちのいずれか、または配列番号１に対する配列番号１及び２～３９１のうちのいずれかのアラインメントによって識別された残基などの追加の残基を含むポリペプチドであって、配列番号１を含むポリペプチドに寄与する単一の変異残基または他の残基を説明する、ポリペプチドが、本明細書に記載される。

【0210】

本開示は、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓからのポリメラーゼ（例えば、配列番号２７５～２７９）を提供する。いくつかの実施形態において、本開示は、配列番号２７５の位置３１４、３３２、３３４、３６８、３８１、３８５、４１７、４３４、４５４、４７１、５２８、６０１、６１５、６３５、６４９、６５４、６５５、６５６、６５７、６５８、６５９、６６５、６８０、６８２、７０２、７０６、７０７、７１０、７１４、７５８、７６０、及び／または８２９でまたはその周辺で、１つ以上の変異、例えば、置換、欠失、もしくは挿入を有する１つ以上のポリペプチドを提供する。配列番号２７５と少なくとも８５％の同一性を有し、配列番号２７５の残基に従って番号付けられたポリペプチド配列の位置３１４、３３２、３３４、３６８、３８１、３８５、４１７、４３４、４５４、４７１、５２８、６０１、６１５、６３５、６４９、６５４、６５５、６５６、６５７、６５８、６５９、６６５、６８０、６８２、７０２、７０６、７０７、７１０、７１４、７５８、７６０、及び／または８２９で少なくとも１つの変異を有する配列を含むポリペプチドが、更に提供される。場合によっては、本明細書に記載のポリペプチドは、配列番号２７５と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、または９９．８％の同一性を有する配列を含む。場合によっては、本明細書に記載のポリペプチドは、配列番号２７５と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、または９９．８％の同一性を有する配列、ならびに配列番号２７５の番号付けに従って位置３１４、３３２、３３４、３６８、３８１、３８５、４１７、４３４、４５４、４７１、５２８、６０１、６１５、６３５、６４９、６５４、６５５、６５６、６５７、６５８、６５９、６６５、６８０、６８２、７０２、７０６、７０７、７１０、７１４、７５８、７６０、及び／または８２９での少なくとも１つの変異を含む。

【0211】

いくつかの実施形態において、配列番号１～２５７、２８８～３７５、及び３８５～３９７のうちのいずれかと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、または９９．８％の同一性を有し、配列番号１の位置４０３、４０５、４０６、４１４、４１５、４１６、４１７、４１８、４６８、４９３、４９５、４９９、５０１、５０２、５０７、及び／または５２９のうちの１つ以上に類似する位置で少なくとも１つの変異を有するポリペプチドが、本明細書に開示される。

【0212】

本明細書では、配列番号２７５と少なくとも８５％の同一性を有し、配列番号２７５の残基に従って番号付けられたポリペプチド配列の位置Ｒ６１５、Ｙ６５４、Ｓ６５５、Ｑ６５６、Ｉ６５７、Ｅ６５８、Ｌ６５９、Ｄ６８０、Ｈ６８２、Ｒ７０２、Ｋ７０６、Ａ７０７、Ｆ７１０、Ｙ７１４、Ｈ８２９、Ｄ３１４、Ｉ３３２、Ｉ３３４、Ｋ３６８、Ｋ３８１、Ｉ３８５、Ｋ４１７、Ｋ４３４、Ｉ４５４、Ｄ４７１、Ｉ５２８、Ｋ６０１、Ｋ６３５、Ｉ６４９、Ｉ６６５、Ｋ７５８、及び／またはＫ７６０で少なくとも１つまたはそれ以上の変異を有する配列を含むポリペプチドが、更に提供される。場合によっては、本明細書に記載のポリペプチドは、配列番号２７５と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、または９９．８％の同一性を有する配列を含む。

【0213】

本明細書に記載する例示的なポリペプチド変異体を、表１（図３Ａ～３Ｈ）、表２（図４Ａ～図４Ｅ）、及び表３（図５Ａ～図５Ｅ）に列挙する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のポリペプチドは、配列番号１または３９１と少なくとも８５％の同一性を有し、表１（図３Ａ～図３Ｈ）、表２（図４Ａ～図４Ｅ）、または表３（図５Ａ～図５Ｅ）に示される変異のうちの少なくとも１つを更に示す、配列を有する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のポリペプチドは、配列番号１または２～２７４または２８８～３７５または３８５～３９７のうちのいずれかに対して、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％またはそれ以上の配列同一性と実質的な同一性、またはその配列同一性の同一性を有し、表１（図３Ａ～３Ｈ）、表２（図４Ａ～図４Ｅ）または表３（図５Ａ～図５Ｅ）に示される変異のうちの少なくとも１つを更に示す、配列を有する。本明細書で企図され、開示される追加のポリペプチドは、表１（図３Ａ～図３Ｈ）、表２（図４Ａ～図４Ｅ）、または表３（図５Ａ～図５Ｅ）の位置のうちの少なくとも１つに類似する位置で少なくとも１つの変異を有し、表１（図３Ａ～図３Ｈ）、表２（図４Ａ～図４Ｅ）、または表３（図５Ａ～図５Ｅ）に示される位置の全てまで含み、場合によっては、相同位置に表１（図３Ａ～３Ｈ）、表２（図４Ａ～図４Ｅ）、または表３（図５Ａ～図５Ｅ）に示される変異のうちの１つ以上を有するポリペプチドになる、ＤＮＡポリメラーゼドメインを含む。

【0214】

表１、２、及び３は、異なる記号における、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ａｌｔｉａｒｃｈａｅａｌｅｓ古細菌からの野生型（配列番号１）ＤＮＡポリメラーゼに対する様々な変異体バリアントの相対的な取り込み活性を表す。記号「０」は、実験データに基づいて、変異体バリアントが、野生型と比較して、有意でない取り込み活性を有するか、または取り込み活性において有意な増強を有しないことを表す。記号「＋」は、実験データに基づいて、変異体バリアントが、野生型と比較して、取り込み活性においてある程度の増強を有することを表す。記号「＋＋」は、実験データに基づいて、変異体バリアントが、野生型と比較して、取り込み活性において高度な増強を有することを表す。

【0215】

いくつかの実施形態において、１つ以上の変異体バリアントは、増加した平均取り込み率が、配列番号１のアミノ酸配列を有する野生型ポリメラーゼの平均取り込み率の少なくとも５倍であることを示す。いくつかの実施形態において、１つ以上の変異体バリアントは、増加した平均取り込み率が、配列番号１のアミノ酸配列を有する野生型ポリメラーゼの平均取り込み率の少なくとも１０倍であることを示す。いくつかの実施形態において、１つ以上の変異体バリアントは、増加した平均取り込み率が、配列番号１のアミノ酸配列を有する野生型ポリメラーゼの平均取り込み率の少なくとも２０倍であることを示す。いくつかの実施形態において、１つ以上の変異体バリアントは、増加した平均取り込み率が、配列番号１のアミノ酸配列を有する野生型ポリメラーゼの平均取り込み率の少なくとも５０倍であることを示す。

【0216】

本開示は、結合及び／またはヌクレオチド類似体を取り込むことを改善するためにある特定のドメインで変異される、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ａｌｔｉａｒｃｈａｅａｌｅｓ古細菌からのポリメラーゼを提供する。例えば、配列番号２６９～２７４を参照されたい。

【0217】

例えば、配列番号２６９のアミノ酸配列を含むＮ末端ドメインは、１つ以上の位置Ｙ１０、Ｋ５８、Ｖ９１、Ｃ１０４、及び／またはＣ１３０で変異させることができる。いくつかの実施形態において、配列番号２６９のアミノ酸配列を含むドメインは、２つ以上のアミノ酸置換Ｙ１０Ｆ、Ｙ１０Ａ、Ｙ１０Ｖ、Ｙ１０Ｉ、Ｙ１０Ｌ、Ｙ１０Ｍ、Ｙ１０Ｗ、Ｋ５８Ｍ、Ｖ９１Ｑ、Ｖ９１Ａ、Ｖ９１Ｉ、Ｖ９１Ｌ、Ｖ９１Ｍ、Ｖ９１Ｆ、Ｖ９１Ｙ、Ｖ９１Ｗ、Ｖ９１Ｓ、Ｖ９１Ｔ、Ｖ９１Ｎ、Ｃ１０４Ｓ、Ｃ１３０Ｓ、及び／またはＣ１３０Ｒのうちのいずれか１つまたはいずれかの組み合わせを含む。

【0218】

配列番号２７０のアミノ酸配列を含むエキソヌクレアーゼドメインは、１つ以上の位置Ｄ１４１、Ｅ１４３、Ｃ２６９、及び／またはＰ３３５Ｑで変異させることができる。いくつかの実施形態において、配列番号２７０のアミノ酸配列を含むドメインは、２つ以上のアミノ酸置換Ｄ１４１Ａ、Ｅ１４３Ａ、Ｃ２６９Ｓ、及び／またはＰ３３５のうちのいずれか１つまたはいずれかの組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、アミノ酸置換変異は、３’から５’エキソヌクレアーゼ活性（例えば、校正活性）をノックアウトするためにＤ１４１Ａ及びＥ１４３Ａを含むことができる。

【0219】

いくつかの実施形態において、配列番号２７１のアミノ酸配列を含むパーム（１）ドメイン（例えば、第１のパームドメイン）は、１つ以上の位置Ｇ３５５、Ｅ３７０、Ｄ３８１、Ｇ４０３、Ｈ４０５、Ｄ４０６、Ｒ４１４、Ｓ４１５、Ｌ４１６、Ｙ４１７、Ｐ４１８、Ｄ４３９、Ｓ４４０、Ｓ４４３、及び／またはＣ４５０で変異させることができる。いくつかの実施形態において、配列番号２７１のアミノ酸配列を含むドメイン（例えば、第１のパームドメイン）は、２つ以上のアミノ酸置換Ｇ３５５Ｓ、Ｅ３７０、Ｄ３８１Ｙ、Ｇ４０３Ａ、Ｈ４０５Ｐ、Ｈ４０５Ｓ、Ｄ４０６Ｈ、Ｒ４１４Ｓ、Ｓ４１５Ａ、Ｌ４１６Ｖ、Ｌ４１６Ｇ、Ｌ４１６Ｔ、Ｌ４１６Ａ、Ｌ４１６Ｓ、Ｌ４１６Ｉ、Ｌ４１６Ｆ、Ｌ４１６Ｙ、Ｌ４１６Ｍ、Ｙ４１７Ｔ、Ｙ４１７Ｓ、Ｙ４１７Ｇ、Ｙ４１７Ａ、Ｙ４１７Ｖ、Ｙ４１７Ｉ、Ｐ４１８Ｓ、Ｐ４１８Ｇ、Ｐ４１８Ｖ、Ｐ４１８Ｃ、Ｐ４１８Ｋ、Ｐ４１８Ｉ、Ｐ４１８Ｔ、Ｐ４１８Ａ、Ｄ４３９Ｓ、Ｓ４４０Ｎ、Ｓ４４３Ｎ、及び／またはＣ４５０Ｓのうちのいずれか１つまたはいずれかの組み合わせを含む。

【0220】

いくつかの実施形態において、配列番号２７２のアミノ酸配列を含むフィンガードメイン（例えば、フィンガードメイン）は、１つ以上の位置Ｒ４６８、Ｋ４７３、Ｖ４８９、Ｑ４９２、Ａ４９３、Ｌ４９４、Ｋ４９５、Ｎ４９９、Ｍ５０１、及び／またはＹ５０２で変異させることができる。いくつかの実施形態において、配列番号２７２のアミノ酸配列を含むドメイン（例えば、フィンガードメイン）は、２つ以上のアミノ酸置換Ｒ４６８Ａ、Ｒ４６８Ｖ、Ｒ４６８Ｓ、Ｒ４６８Ｋ、Ｒ４６８Ｈ、Ｒ４６８Ｇ、Ｋ４７３Ａ、Ｖ４８９Ｉ、Ｑ４９２Ｒ、Ｑ４９２Ｃ、Ｑ４９２Ｆ、Ｑ４９２Ａ、Ｑ４９２Ｇ、Ａ４９３Ｖ、Ａ４９３Ｓ、Ｌ４９４Ｖ、Ｋ４９５Ｇ、Ｋ４９５Ａ、Ｋ４９５Ｑ、Ｋ４９５Ｓ、Ｋ４９５Ｖ、Ｎ４９９Ｇ、Ｎ４９９Ａ、Ｎ４９９Ｓ、Ｎ４９９Ｖ、Ｍ５０１Ｉ、Ｙ５０２Ｔ、Ｙ５０２Ｖ、Ｙ５０２Ｓ、Ｙ５０２Ｒ、Ｙ５０２Ｇ、Ｙ５０２Ｎ、Ｙ５０２Ａ、Ｙ５０２Ｑ、Ｙ５０２Ｐ、Ｙ５０２Ｈ、及び／またはＹ５０２Ｆのうちのいずれか１つまたはいずれかの組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、配列番号２７２のアミノ酸配列を含むドメイン（例えば、フィンガードメイン）は、２つ以上のアミノ酸置換Ｇ４７４Ｓ、Ｇ４７４Ｄ、Ｎ４８０Ｉ、Ｒ４８３Ｈ、Ｄ４８８Ｎ、Ａ４９８Ｇ、Ｓ５００Ｇ、Ｍ５０１Ｖ、及び／またはＹ５０２Ｆのうちのいずれか１つまたはいずれかの組み合わせを更に含む。

【0221】

いくつかの実施形態において、配列番号２７３のアミノ酸配列を含むパーム（２）ドメイン（例えば、第２のパームドメイン）は、１つ以上の位置及び／またはＦ５０７、Ｃ５１４、Ｒ５１５、Ｃ５１７、Ｉ５２９、Ｎ５６７、Ｅ５６９、Ｓ５７７、Ｒ６０８、Ｋ６１０、及び／またはＬ６１１で変異させることができる。いくつかの実施形態において、配列番号２７３のアミノ酸配列を含むドメイン（例えば、第２のパームドメイン）は、２つ以上のアミノ酸置換Ｆ５０７Ｓ、Ｃ５１４Ｓ、Ｒ５１５Ｌ、Ｒ５１５Ｗ、Ｒ５１５Ｙ、Ｒ５１５Ｐ、Ｒ５１５Ｆ、Ｃ５１７Ｓ、Ｉ５２９Ｈ、Ｉ５２９Ｔ、Ｉ５２９Ｖ、Ｉ５２９Ｓ、Ｉ５２９Ｇ、Ｉ５２９Ａ、Ｉ５２９Ｌ、Ｉ５２９Ｆ、Ｎ５６７Ｄ、Ｅ５６９Ｇ、Ｓ５７７Ｉ、Ｒ６０８Ｋ、Ｋ６１０Ｅ、Ｌ６１１Ｓ及び／またはＤ６２２のうちのいずれか１つまたはいずれかの組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、配列番号２７３のアミノ酸配列を含むドメイン（例えば、第２のパームドメイン）は、２つ以上のアミノ酸置換Ｅ５１６Ｇ、Ｓ５２０Ｎ、Ｓ５２０Ｇ、Ｋ５３８Ｒ、Ｆ５３９Ｙ、Ｄ５６０Ｇ、Ｄ５６０Ｅ、Ｖ５６４Ｉ、Ｍ５６５Ｖ、Ａ５６８Ｖ、Ｄ５７３Ｎ、Ｋ５７４Ｒ、Ｅ５７８Ｎ、Ｅ５８１Ｇ、Ｍ５８３Ｋ、及び／またはＤ６２２Ｔのうちのいずれか１つまたはいずれかの組み合わせを更に含む。

【0222】

いくつかの実施形態において、配列番号２７４のアミノ酸配列を含む親指ドメイン（例えば、親指ドメイン）は、１つ以上の位置Ｖ６５１、Ｄ６５３、Ａ６６９、Ｑ６７３、Ｅ６８０、Ｒ６９７、Ｓ７１７、Ｒ７２３、Ｉ７５０、及び／またはＥ７６０で変異させることができる。いくつかの実施形態において、配列番号２７４のアミノ酸配列を含むドメイン（例えば、親指ドメイン）は、２つ以上のアミノ酸置換Ｖ６５１Ｍ、Ｄ６５３Ｇ、Ｅ６８０Ｄ、Ａ６６９Ｄ、Ｑ６７３Ｉ、Ｒ６９７Ｇ、Ｓ７１７Ｇ、Ｒ７２３Ｈ、Ｉ７５０Ｖ、及び／またはＥ７６０Ｇのうちのいずれか１つまたはいずれかの組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、配列番号２７４のアミノ酸配列を含むドメイン（例えば、親指ドメイン）は、２つ以上のアミノ酸置換Ｄ６３６Ｇ、Ｔ６７５Ａ、Ｋ６８２Ｉ、Ｖ６８９Ａ、Ｎ７０５Ｄ、Ｓ７１７Ｎ、Ｅ７３０Ｒ、Ｓ７４６Ｃ、及び／またはＥ７５８Ｒのうちのいずれか１つまたはいずれかの組み合わせを更に含む。

【0223】

本開示は、ヌクレオチド類似体の取り込み率を増加させるために２つ以上の位置で変異されるＣａｎｄｉｄａｔｕｓ Ａｌｔｉａｒｃｈａｅａｌｅｓ古細菌からのポリメラーゼを提供する。いくつかの実施形態において、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ａｌｔｉａｒｃｈａｅａｌｅｓ古細菌からの変異体ポリメラーゼは、Ｌ４１６、Ｙ４１７、Ｐ４１８、Ａ４９３、及び／またはＩ５２９からなる群から選択される１つ以上のアミノ酸置換変異を有する配列番号１または３９１のアミノ酸配列を含む（例えば、表１（図３Ａ～図３Ｈ）、表２（図４Ａ～図４Ｅ）、または表３（図５Ａ～図５Ｅ）を参照されたい）。いくつかの実施形態において、位置Ｌ４１６のアミノ酸置換変異は、非極性アミノ酸または極性非荷電アミノ酸を含む。いくつかの実施形態において、位置Ｌ４１６のアミノ酸置換変異は、バリン、グリシン、トレオニン、アラニン、セリン、イソロイシン、ロイシン、フェニルアラニン、チロシン、またはメチオニンを含む。いくつかの実施形態において、位置Ｙ４１７のアミノ酸置換変異は、非極性アミノ酸または極性非荷電アミノ酸を含む。いくつかの実施形態において、位置Ｙ４１７のアミノ酸置換変異は、トレオニン、セリン、グリシン、アラニン、バリン、イソロイシン、またはチロシンを含む。いくつかの実施形態において、位置Ｐ４１８のアミノ酸置換変異は、極性非荷電アミノ酸、非極性アミノ酸、または正に荷電したアミノ酸を含む。いくつかの実施形態において、位置Ｐ４１８のアミノ酸置換変異は、セリン、グリシン、バリン、システイン、リシン、イソロイシン、トレオニン、またはプロリンを含む。いくつかの実施形態において、位置Ａ４９３のアミノ酸置換変異は、非極性アミノ酸または極性非荷電アミノ酸を含む。いくつかの実施形態において、位置Ａ４９３のアミノ酸置換変異は、バリンまたはセリンを含む。いくつかの実施形態において、位置Ｉ５２９のアミノ酸置換変異は、正に荷電したアミノ酸、極性非荷電アミノ酸、または非極性アミノ酸を含む。いくつかの実施形態において、位置Ｉ５２９のアミノ酸置換変異は、ヒスチジン、トレオニン、バリン、セリン、グリシン、アラニン、ロイシン、フェニルアラニンを含む。いくつかの実施形態において、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ａｌｔｉａｒｃｈａｅａｌｅｓ古細菌からの変異体ポリメラーゼは、位置Ｌ４１６Ｓ、Ｙ４１７Ａ、Ｐ４１８Ｇ、Ａ４９３Ｓ、及びＩ５２９Ｈのアミノ酸置換変異を有する配列番号１または３９１のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ａｌｔｉａｒｃｈａｅａｌｅｓ古細菌からの変異体ポリメラーゼは、位置Ｌ４１６Ｆ、Ｙ４１７Ａ、Ｐ４１８Ｇ、Ａ４９３Ｓ、及びＩ５２９Ｈのアミノ酸置換変異を有する配列番号１のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、アミノ酸置換変異はまた、Ｄ１４１Ａ及びＥ１４３Ａを含むことができる。

【0224】

いくつかの実施形態において、本開示によるポリペプチドは、単一点変異（例えば、表１（図３Ａ～図３Ｈ）、表２（図４Ａ～図４Ｅ）、または表３（図５Ａ～図５Ｅ）を参照されたい）を含み得る。いくつかの実施形態において、配列番号１または３９１における単一点変異は、Ｇ４０３Ａ、Ｈ４０５Ｐ、Ｈ４０５Ｓ、Ｄ４０６Ｈ、Ｒ４１４Ｓ、Ｓ４１５Ａ、Ｓ４１５Ｇ、Ｓ４１５Ｖ、Ｌ４１６Ｖ、Ｌ４１６Ｇ、Ｌ４１６Ｔ、Ｌ４１６Ａ、Ｌ４１６Ｓ、Ｌ４１６Ｉ、Ｌ４１６Ｌ、Ｙ４１７Ｔ、Ｙ４１７Ｓ、Ｙ４１７Ｇ、Ｙ４１７Ａ、Ｙ４１７Ｖ、Ｙ４１７Ｉ、Ｐ４１８Ｓ、Ｐ４１８Ｇ、Ｐ４１８Ｖ、Ｐ４１８Ｃ、Ｐ４１８Ｋ、Ｐ４１８Ｉ、Ｐ４１８Ｔ、Ｒ４６８Ａ、Ｒ４６８Ｖ、Ｒ４６８Ｓ、Ｒ４６８Ｋ、Ｒ４６８Ｈ、Ｒ４６８Ｇ、Ａ４９３Ｖ、Ｋ４９５Ｇ、Ｋ４９５Ａ、Ｋ４９５Ｑ、Ｋ４９５Ｓ、Ｋ４９５Ｖ、Ｎ４９９Ｇ、Ｎ４９９Ａ、Ｎ４９９Ｓ、Ｎ４９９Ｖ、Ｓ５００Ｇ、Ｍ５０１Ｉ、Ｙ５０２Ｔ、Ｙ５０２Ｖ、Ｙ５０２Ｓ、Ｙ５０２Ｒ、Ｙ５０２Ｇ、Ｙ５０２Ｎ、Ｙ５０２Ａ、Ｙ５０２Ｑ、Ｙ５０２Ｐ、Ｙ５０２Ｈ、Ｙ５０２Ｆ、Ｆ５０７Ｓ、Ｉ５２９Ｈ、Ｉ５２９Ｔ、Ｉ５２９Ｖ、Ｉ５２９Ｓ、Ｉ５２９Ｇ、Ｉ５２９Ａ、Ｉ５２９Ｌ、及び／またはＩ５２９Ｆのうちの１つ以上、またはそれらの任意の組み合わせを含み得る。いくつかの実施形態において、配列番号１または３９１における単一点変異は、Ｙ５０２Ｖ、Ｙ５０２Ｓ、Ｙ５０２Ｑ、Ｙ５０２Ｐ、Ｙ５０２Ｈ、Ｙ５０２Ｇ、Ｙ５０２、Ｙ５０２Ａ、Ｓ４１５Ｖ、Ｓ４１５Ｇ、Ｓ４１５Ａ、Ｒ４６８Ｖ、Ｒ４６８Ｓ、Ｒ４６８Ｋ、Ｒ４６８Ｈ、Ｒ４６８Ｇ、Ｒ４６８Ａ、Ｒ４１４Ｓ、Ｌ４１６Ｖ、Ｌ４１６Ｓ、Ｌ４１６Ａ、Ｉ５２９Ｖ、Ｉ５２９Ｓ、Ｉ５２９Ｈ、Ｉ５２９Ｇ、Ｉ５２９Ａ、Ｉ５２９Ｈ、またはそれらの任意の組み合わせのうちの１つ以上を含み得る。

【0225】

いくつかの実施形態において、本開示によるポリペプチドは、配列番号１または３９１のアミノ酸配列を含み、多重変異、例えば、表１（図３Ａ～図３Ｈ）、表２（図４Ａ～図４Ｅ）、または表３（図５Ａ～図５Ｅ）を参照されたい）、例えば、Ｇ４０３Ａ、Ｈ４０５Ｐ、Ｈ４０５Ｓ、Ｄ４０６Ｈ、Ｒ４１４Ｓ、Ｓ４１５Ａ、Ｓ４１５Ｇ、Ｓ４１５Ｖ、Ｌ４１６Ｖ、Ｌ４１６Ｇ、Ｌ４１６Ｔ、Ｌ４１６Ａ、Ｌ４１６Ｓ、Ｌ４１６Ｉ、Ｌ４１６Ｌ、Ｙ４１７Ｔ、Ｙ４１７Ｓ、Ｙ４１７Ｇ、Ｙ４１７Ａ、Ｙ４１７Ｖ、Ｙ４１７Ｉ、Ｐ４１８Ｓ、Ｐ４１８Ｇ、Ｐ４１８Ｖ、Ｐ４１８Ｃ、Ｐ４１８Ｋ、Ｐ４１８Ｉ、Ｐ４１８Ｔ、Ｒ４６８Ａ、Ｒ４６８Ｖ、Ｒ４６８Ｓ、Ｒ４６８Ｋ、Ｒ４６８Ｈ、Ｒ４６８Ｇ、Ａ４９３Ｖ、Ｋ４９５Ｇ、Ｋ４９５Ａ、Ｋ４９５Ｑ、Ｋ４９５Ｓ、Ｋ４９５Ｖ、Ｎ４９９Ｇ、Ｎ４９９Ａ、Ｎ４９９Ｓ、Ｎ４９９Ｖ、Ｍ５０１Ｉ、Ｙ５０２Ｔ、Ｙ５０２Ｖ、Ｙ５０２Ｓ、Ｙ５０２Ｒ、Ｙ５０２Ｇ、Ｙ５０２Ｎ、Ｙ５０２Ａ、Ｙ５０２Ｑ、Ｙ５０２Ｐ、Ｙ５０２Ｈ、Ｙ５０２Ｆ、Ｆ５０７Ｓ、Ｉ５２９Ｈ、Ｉ５２９Ｔ、Ｉ５２９Ｖ、Ｉ５２９Ｓ、Ｉ５２９Ｇ、Ｉ５２９Ａ、Ｉ５２９Ｌ、及び／またはＩ５２９Ｆのうちの２つ以上、またはそれらの任意の組み合わせの変異を含み得る。

【0226】

いくつかの実施形態において、本開示によるポリペプチドは、配列番号１または３９１のアミノ酸配列を含み、二重変異（例えば、表１（図３Ａ～図３Ｈ）、表２（図４Ａ～図４Ｅ）、または表３（図５Ａ～図５Ｅ）を参照されたい）を有し、例えば、Ｙ４１７Ｖ＿Ｐ４１８Ｖ、Ｙ４１７Ｖ＿Ｐ４１８Ｓ、Ｙ４１７Ｖ＿Ｐ４１８Ａ、Ｙ４１７Ｔ＿Ｐ４１８Ｋ、Ｙ４１７Ｓ＿Ｐ４１８Ｓ、Ｙ４１７Ｓ＿Ｐ４１８Ｇ、Ｙ４１７Ｓ＿Ｐ４１８Ａ、Ｙ４１７Ｇ＿Ｐ４１８Ｖ、Ｙ４１７Ｇ＿Ｐ４１８Ｓ、Ｙ４１７Ｇ＿Ｐ４１８Ｇ、Ｙ４１７Ｇ＿Ｐ４１８Ｃ、Ｙ４１７Ｇ＿Ｐ４１８Ａ、Ｙ４１７Ａ＿Ｐ４１８Ｖ、Ｙ４１７Ａ＿Ｐ４１８Ｓ、Ｙ４１７Ａ＿Ｐ４１８Ｇ、Ｙ４１７Ａ＿Ｐ４１８Ａ、Ｓ４１５Ｖ＿Ｙ４１７Ｓ、Ｓ４１５Ｖ＿Ｙ４１７Ａ、Ｓ４１５Ｖ＿Ｐ４１８Ｖ、Ｓ４１５Ｖ＿Ｐ４１８Ｓ、Ｓ４１５Ｖ＿Ｐ４１８Ｇ、Ｓ４１５Ｖ＿Ｌ４１６Ｖ、Ｓ４１５Ｖ＿Ｌ４１６Ｓ、Ｓ４１５Ｇ＿Ｙ４１７Ｖ、Ｓ４１５Ｇ＿Ｙ４１７Ｓ、Ｓ４１５Ｇ＿Ｐ４１８Ｖ、Ｓ４１５Ｇ＿Ｐ４１８Ｓ、Ｓ４１５Ｇ＿Ｐ４１８Ｇ、Ｓ４１５Ｇ＿Ｐ４１８Ａ、Ｓ４１５Ｇ＿Ｌ４１６Ｖ、Ｓ４１５Ｇ＿Ｌ４１６Ｓ、Ｓ４１５Ｇ＿Ｌ４１６Ｇ、Ｓ４１５Ｇ＿Ｌ４１６Ａ、Ｓ４１５Ａ＿Ｙ４１７Ｇ、Ｓ４１５Ａ＿Ｙ４１７Ａ、Ｓ４１５Ａ＿Ｐ４１８Ｇ、Ｓ４１５Ａ＿Ｌ４１６Ｓ、Ｌ４１６Ｖ＿Ｐ４１８Ｓ、Ｌ４１６Ｖ＿Ｐ４１８Ｇ、Ｌ４１６Ｓ＿Ｙ４１７Ｇ、Ｌ４１６Ｓ＿Ｙ４１７Ａ、Ｌ４１６Ｓ＿Ｐ４１８Ｖ、Ｌ４１６Ｓ＿Ｐ４１８Ｇ、Ｌ４１６Ｇ＿Ｙ４１７Ｇ、Ｌ４１６Ｇ＿Ｙ４１７Ａ、Ｌ４１６Ｇ＿Ｐ４１８Ｇ、Ｌ４１６Ｇ＿Ｐ４１８Ａ、Ｌ４１６Ａ＿Ｙ４１７Ｓ、Ｌ４１６Ａ＿Ｐ４１８Ｓ、Ｌ４１６Ａ＿Ｐ４１８Ｇ、及び／またはＬ４１６Ａ＿Ｐ４１８Ａのうちの１つ以上、またはそれらの任意の組み合わせを含み得る。

【0227】

いくつかの実施形態において、本開示によるポリペプチドは、配列番号１または３９１のアミノ酸配列を含み、三重変異を有し得る。いくつかの例示的な実施形態において、三重変異（例えば、表１（図３Ａ～図３Ｈ）、表２（図４Ａ～図４Ｅ）、または表３（図５Ａ～図５Ｅ）を参照されたい）は、Ｙ４１７Ｖ＿Ｐ４１８Ｖ＿Ｙ５０２Ｓ、Ｙ４１７Ｖ＿Ｐ４１８Ｇ＿Ｙ５０２Ｇ、Ｙ４１７Ｖ＿Ｐ４１８Ａ＿Ｙ５０２Ｒ、Ｙ４１７Ｓ＿Ｐ４１８Ｖ＿Ｙ５０２Ｒ、Ｙ４１７Ｓ＿Ｐ４１８Ｇ＿Ｙ５０２Ｓ、Ｙ４１７Ｇ＿Ｐ４１８Ｇ＿Ｙ５０２Ｖ、Ｙ４１７Ｇ＿Ｐ４１８Ａ＿Ｙ５０２Ｎ、Ｙ４１７Ｇ＿Ｐ４１８Ａ＿Ｙ５０２Ｇ、Ｙ４１７Ａ＿Ｐ４１８Ｓ＿Ｙ５０２Ｒ、Ｇ４０３Ａ＿Ｈ４０５Ｓ＿Ｄ４０６Ｈ、Ａ４９３Ｖ＿Ｋ４９５Ｖ＿Ｎ４９９Ｓ、Ａ４９３Ｖ＿Ｋ４９５Ｖ＿Ｎ４９９Ｇ、Ａ４９３Ｖ＿Ｋ４９５Ｖ＿Ｎ４９９Ａ、Ａ４９３Ｖ＿Ｋ４９５Ｓ＿Ｎ４９９Ｖ、Ａ４９３Ｖ＿Ｋ４９５Ｓ＿Ｎ４９９Ｓ、Ａ４９３Ｖ＿Ｋ４９５Ｓ＿Ｎ４９９Ｇ、Ａ４９３Ｖ＿Ｋ４９５Ｑ＿Ｎ４９９Ｖ、Ａ４９３Ｖ＿Ｋ４９５Ｑ＿Ｎ４９９Ｇ、Ａ４９３Ｖ＿Ｋ４９５Ｑ＿Ｎ４９９Ａ、Ａ４９３Ｖ＿Ｋ４９５Ｇ＿Ｎ４９９Ｖ、Ａ４９３Ｖ＿Ｋ４９５Ｇ＿Ｎ４９９Ｓ、Ａ４９３Ｖ＿Ｋ４９５Ｇ＿Ｎ４９９Ｇ、Ａ４９３Ｖ＿Ｋ４９５Ｇ＿Ｎ４９９Ａ、Ａ４９３Ｖ＿Ｋ４９５Ａ＿Ｎ４９９Ｇ、Ａ４９３Ｖ＿Ｋ４９５Ａ＿Ｎ４９９Ａ、Ａ４９３Ｖ＿Ｋ４９５Ｓ＿Ｎ４９９Ｇ、Ｌ４１６Ａ＿Ｙ４１７Ａ＿Ｐ４１８Ａ、Ｌ４１６Ａ＿Ｙ４１７Ａ＿Ｐ４１８Ｇ、Ｌ４１６Ａ＿Ｙ４１７Ａ＿Ｐ４１８Ｉ、Ｌ４１６Ａ＿Ｙ４１７Ｓ＿Ｐ４１８Ａ、Ｌ４１６Ａ＿Ｙ４１７Ｓ＿Ｐ４１８Ｇ、Ｌ４１６Ａ＿Ｙ４１７Ｓ＿Ｐ４１８Ｓ、Ｌ４１６Ｇ＿Ｙ４１７Ｇ＿Ｐ４１８Ｇ、Ｌ４１６Ｉ＿Ｙ４１７Ａ＿Ｐ４１８Ｇ、Ｌ４１６Ｉ＿Ｙ４１７Ａ＿Ｐ４１８Ｓ、Ｌ４１６Ｉ＿Ｙ４１７Ｇ＿Ｐ４１８Ａ、Ｌ４１６Ｉ＿Ｙ４１７Ｉ＿Ｐ４１８Ｖ、Ｌ４１６Ｓ＿Ｙ４１７Ａ＿Ｐ４１８Ｇ、Ｌ４１６Ｓ＿Ｙ４１７Ｇ＿Ｐ４１８Ａ、Ｌ４１６Ｔ＿Ｙ４１７Ａ＿Ｐ４１８Ａ、Ｌ４１６Ｔ＿Ｙ４１７Ｇ＿Ｐ４１８Ａ、Ｌ４１６Ｖ＿Ｙ４１７Ａ＿Ｐ４１８Ａ、Ｌ４１６Ｖ＿Ｙ４１７Ｇ＿Ｐ４１８Ｇ、Ｌ４１６Ｉ＿Ｙ４１７Ｓ＿Ｐ４１８Ｓ、及び／またはＬ４１６Ｖ＿Ｙ４１７Ｖ＿Ｐ４１８Ｇのうちの１つ以上、またはそれらの任意の組み合わせを含み得る。

【0228】

いくつかの実施形態において、本開示によるポリペプチドは、配列番号１または３９１のアミノ酸配列を含み、四重変異（例えば、（図３Ａ～図３Ｈ）、表２（図４Ａ～図４Ｅ）、または表３（図５Ａ～図５Ｅ）を参照されたい）を有し得る。いくつかの例示的な実施形態において、四重変異は、Ｈ４０５Ｐ＿Ａ４９３Ｖ＿Ｋ４９５Ｇ＿Ｎ４９９Ａ、Ａ４９３Ｖ＿Ｋ４９５Ｓ＿Ｎ４９９Ａ＿Ｙ５０２Ｔ、Ａ４９３Ｖ＿Ｋ４９５Ｑ＿Ｎ４９９Ｇ＿Ｆ５０７Ｓ、Ａ４９３Ｖ＿Ｋ４９５Ｇ＿Ｎ４９９Ｇ＿Ｍ５０１Ｉ、Ｌ４１６Ａ＿Ｙ４１７Ａ＿Ｐ４１８Ａ＿Ｉ５２９Ｌ、Ｌ４１６Ａ＿Ｙ４１７Ａ＿Ｐ４１８Ａ＿Ｉ５２９Ｈ、Ｌ４１６Ａ＿Ｙ４１７Ａ＿Ｐ４１８Ｓ＿Ｉ５２９Ｈ、Ｌ４１６Ａ＿Ｙ４１７Ｇ＿Ｐ４１８Ａ＿Ｉ５２９Ｈ、Ｌ４１６Ａ＿Ｙ４１７Ｇ＿Ｐ４１８Ｇ＿Ｉ５２９Ｈ、Ｌ４１６Ａ＿Ｙ４１７Ｇ＿Ｐ４１８Ｓ＿Ｉ５２９Ｈ、Ｌ４１６Ｇ＿Ｙ４１７Ｔ＿Ｐ４１８Ｓ＿Ｉ５２９Ｈ、Ｌ４１６Ｉ＿Ｙ４１７Ａ＿Ｐ４１８Ａ＿Ｉ５２９Ｌ、Ｌ４１６Ｉ＿Ｙ４１７Ａ＿Ｐ４１８Ｇ＿Ｉ５２９Ｆ、Ｌ４１６Ｉ＿Ｙ４１７Ａ＿Ｐ４１８Ｓ＿Ｉ５２９Ｈ、Ｌ４１６Ｉ＿Ｙ４１７Ｇ＿Ｐ４１８Ａ＿Ｉ５２９Ｌ、Ｌ４１６Ｉ＿Ｙ４１７Ｓ＿Ｐ４１８Ｇ＿Ｉ５２９Ｈ、Ｌ４１６Ｌ＿Ｙ４１７Ｙ＿Ｐ４１８Ｐ＿Ｉ５２９Ｈ、Ｌ４１６Ｓ＿Ｙ４１７Ａ＿Ｐ４１８Ｇ＿Ｉ５２９Ｈ、Ｌ４１６Ｓ＿Ｙ４１７Ａ＿Ｐ４１８Ｇ＿Ｉ５２９Ｆ、Ｌ４１６Ｓ＿Ｙ４１７Ａ＿Ｐ４１８Ｔ＿Ｉ５２９Ｈ、Ｌ４１６Ｓ＿Ｙ４１７Ｇ＿Ｐ４１８Ｇ＿Ｉ５２９Ｈ、Ｌ４１６Ｓ＿Ｙ４１７Ｇ＿Ｐ４１８Ｖ＿Ｉ５２９Ｈ、Ｌ４１６Ｔ＿Ｙ４１７Ａ＿Ｐ４１８Ａ＿Ｉ５２９Ｈ、Ｌ４１６Ｔ＿Ｙ４１７Ａ＿Ｐ４１８Ｇ＿Ｉ５２９Ｈ、Ｌ４１６Ｔ＿Ｙ４１７Ｇ＿Ｐ４１８Ａ＿Ｉ５２９Ｈ、Ｌ４１６Ｖ＿Ｙ４１７Ａ＿Ｐ４１８Ａ＿Ｉ５２９Ｈ、Ｌ４１６Ｖ＿Ｙ４１７Ａ＿Ｐ４１８Ｇ＿Ｉ５２９Ｓ、Ｌ４１６Ｖ＿Ｙ４１７Ａ＿Ｐ４１８Ｇ＿Ｉ５２９Ｔ、Ｌ４１６Ｖ＿Ｙ４１７Ａ＿Ｐ４１８Ｇ＿Ｉ５２９Ｈ、Ｌ４１６Ｖ＿Ｙ４１７Ａ＿Ｐ４１８Ｓ＿Ｉ５２９、Ｌ４１６Ｖ＿Ｙ４１７Ｇ＿Ｐ４１８Ａ＿Ｉ５２９Ｈ、Ｌ４１６Ｖ＿Ｙ４１７Ｇ＿Ｐ４１８Ｇ＿Ｉ５２９Ｈ、Ｌ４１６Ｖ＿Ｙ４１７Ｇ＿Ｐ４１８Ｓ＿Ｉ５２９Ｈ、及び／またはＬ４１６Ｖ＿Ｙ４１７Ｔ＿Ｐ４１８Ｓ＿Ｉ５２９Ｈのうちの１つ以上、またはそれらの任意の組み合わせを含み得る。

【0229】

いくつかの実施形態において、本開示の組成物及び方法は、本明細書に開示される、酵素の熱安定性及び／または酵素が修飾基質、例えば３’もしくは５’修飾基質を受容する能力に影響を及ぼし得る１つ以上の変異を含む。いくつかの実施形態において、当該変異（複数可）は、配列番号１、３９３、または３９１の位置４０３、４０５、４０６、４１４、４１５、４１６、４１７、４１８、４６８、４９３、４９５、４９９、５０１、５０２、５０７、５１５、５２９、及び／または５６７のうちの１つ以上、またはそれらの任意の組み合わせ、またはそれらのホモログもしくはオーソログで、またはそれらを取り囲む位置もしくは場所で、１つ以上の置換、欠失、または挿入を含み得る。いくつかの実施形態において、当該変異（複数可）は、１９個の他の天然アミノ酸（すなわち、Ｗ、Ｉ、Ｍ、Ｐ、Ｆ、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｈ、Ｒ、Ｋ、Ｄ、Ｎ、Ｙ、Ｃ、Ｓ、Ｔ、もしくはＱ）または当業者に既知の非天然アミノ酸との当該残基の置換を含み得る。

【0230】

本明細書に開示される３’または５’修飾基質。いくつかの実施形態において、当該変異（複数可）は、配列番号１、３９３、または３９１の位置４０３、またはそれらの任意の組み合わせ、またはそれらのホモログもしくはオーソログで、またはそれらを取り囲む位置もしくは場所で、１つ以上の置換、欠失、または挿入を含み得る。いくつかの実施形態において、当該変異（複数可）は、２０個の天然アミノ酸（すなわち、Ｗ、Ｉ、Ｍ、Ｐ、Ｆ、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｈ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｄ、Ｎ、Ｙ、Ｃ、Ｓ、Ｔ、もしくはＱ）または当業者に既知の非天然アミノ酸との当該残基の置換を含み得る。いくつかの実施形態において、当該変異（複数可）は、置換Ｇ４０３Ａを含み得る。いくつかの実施形態において、当該変異（複数可）は、配列番号１、３９３、または３９１の位置４０５、またはそれらの任意の組み合わせ、またはそれらのホモログもしくはオーソログで、またはそれらを取り囲む位置もしくは場所で、１つ以上の置換、欠失、または挿入を含み得る。いくつかの実施形態において、当該変異（複数可）は、置換Ｈ４０５ＰまたはＨ４０５Ｓを含み得る。いくつかの実施形態において、当該変異（複数可）は、配列番号１、３９３、または３９１の位置４０６、またはそれらの任意の組み合わせ、またはそれらのホモログもしくはオーソログで、またはそれらを取り囲む位置もしくは場所で、１つ以上の置換、欠失、または挿入を含み得る。いくつかの実施形態において、当該変異（複数可）は、置換Ｄ４０６Ｈを含み得る。いくつかの実施形態において、当該変異（複数可）は、配列番号１、３９３、または３９１の位置４１４、またはそれらの任意の組み合わせ、またはそれらのホモログもしくはオーソログで、またはそれらを取り囲む位置もしくは場所で、１つ以上の置換、欠失、または挿入を含み得る。いくつかの実施形態において、当該変異（複数可）は、置換Ｒ４１４Ｓを含み得る。いくつかの実施形態において、当該変異（複数可）は、配列番号１、３９３、または３９１の位置４１５、またはそれらの任意の組み合わせ、またはそれらのホモログもしくはオーソログで、またはそれらを取り囲む位置もしくは場所で、１つ以上の置換、欠失、または挿入を含み得る。いくつかの実施形態において、当該変異（複数可）は、置換Ｓ４１５Ａ、Ｓ４１５Ｇ、またはＳ４１５Ｖを含み得る。いくつかの実施形態において、当該変異（複数可）は、配列番号１、３９３、または３９１の位置４１６、またはそれらの任意の組み合わせ、またはそれらのホモログもしくはオーソログで、またはそれらを取り囲む位置もしくは場所で、１つ以上の置換、欠失、または挿入を含み得る。いくつかの実施形態において、当該変異（複数可）は、置換Ｌ４１６Ｖ、Ｌ４１６Ｇ、Ｌ４１６Ｔ、Ｌ４１６Ａ、またはＬ４１６Ｓを含み得る。いくつかの実施形態において、当該変異（複数可）は、配列番号１、３９３、または３９１の位置４１７、またはそれらの任意の組み合わせ、またはそれらのホモログもしくはオーソログで、またはそれらを取り囲む位置もしくは場所で、１つ以上の置換、欠失、または挿入を含み得る。いくつかの実施形態において、当該変異（複数可）は、置換Ｙ４１７Ｔ、Ｙ４１７Ｓ、Ｙ４１７Ｇ、Ｙ４１７Ａ、Ｙ４１７Ｖ、またはＹ４１７Ｉを含み得る。いくつかの実施形態において、当該変異（複数可）は、配列番号１、３９３、または３９１の位置４１８、またはそれらの任意の組み合わせ、またはそれらのホモログもしくはオーソログで、またはそれらを取り囲む位置もしくは場所で、１つ以上の置換、欠失、または挿入を含み得る。いくつかの実施形態において、当該変異（複数可）は、置換Ｐ４１８Ｓ、Ｐ４１８Ｇ、Ｐ４１８Ｖ、Ｐ４１８Ｃ、Ｐ４１８Ｋ、Ｐ４１８Ｉ、またはＰ４１８Ｔを含み得る。いくつかの実施形態において、当該変異（複数可）は、配列番号１、３９３、または３９１の位置４６８、またはそれらの任意の組み合わせ、またはそれらのホモログもしくはオーソログで、またはそれらを取り囲む位置もしくは場所で、１つ以上の置換、欠失、または挿入を含み得る。いくつかの実施形態において、当該変異（複数可）は、置換Ｒ４６８Ａ、Ｒ４６８Ｖ、Ｒ４６８Ｓ、Ｒ４６８Ｋ、Ｒ４６８Ｈ、またはＲ４６８Ｇを含み得る。いくつかの実施形態において、当該変異（複数可）は、配列番号１、３９３、または３９１の位置４９３、またはそれらの任意の組み合わせ、またはそれらのホモログもしくはオーソログで、またはそれらを取り囲む位置もしくは場所で、１つ以上の置換、欠失、または挿入を含み得る。いくつかの実施形態において、当該変異（複数可）は、置換Ａ４９３ＶまたはＡ４９３Ｓを含み得る。いくつかの実施形態において、当該変異（複数可）は、配列番号１、３９３、または３９１の位置４９５、またはそれらの任意の組み合わせ、またはそれらのホモログもしくはオーソログで、またはそれらを取り囲む位置もしくは場所で、１つ以上の置換、欠失、または挿入を含み得る。いくつかの実施形態において、当該変異（複数可）は、置換Ｋ４９５Ｇ、Ｋ４９５Ａ、Ｋ４９５Ｑ、Ｋ４９５Ｓ、またはＫ４９５Ｖを含み得る。いくつかの実施形態において、当該変異（複数可）は、配列番号１、３９３、または３９１の位置４９９、またはそれらの任意の組み合わせ、またはそれらのホモログもしくはオーソログで、またはそれらを取り囲む位置もしくは場所で、１つ以上の置換、欠失、または挿入を含み得る。いくつかの実施形態において、当該変異（複数可）は、置換Ｎ４９９Ｇ、Ｎ４９９Ａ、Ｎ４９９Ｓ、またはＮ４９９Ｖを含み得る。いくつかの実施形態において、当該変異（複数可）は、配列番号１、３９３、または３９１の位置５０１、またはそれらの任意の組み合わせ、またはそれらのホモログもしくはオーソログで、またはそれらを取り囲む位置もしくは場所で、１つ以上の置換、欠失、または挿入を含み得る。いくつかの実施形態において、当該変異（複数可）は、置換Ｍ５０１Ｉを含み得る。いくつかの実施形態において、当該変異（複数可）は、配列番号１、３９３、または３９１の位置５０２、またはそれらの任意の組み合わせ、またはそれらのホモログもしくはオーソログで、またはそれらを取り囲む位置もしくは場所で、１つ以上の置換、欠失、または挿入を含み得る。いくつかの実施形態において、当該変異（複数可）は、置換Ｙ５０２Ｔ、Ｙ５０２Ｖ、Ｙ５０２Ｓ、Ｙ５０２Ｒ、Ｙ５０２Ｇ、Ｙ５０２Ｎ、Ｙ５０２Ａ、Ｙ５０２Ｑ、Ｙ５０２Ｐ、Ｙ５０２Ｈ、またはＹ５０２Ｆを含み得る。いくつかの実施形態において、当該変異（複数可）は、配列番号１、３９３、または３９１の位置５０７、またはそれらの任意の組み合わせ、またはそれらのホモログもしくはオーソログで、またはそれらを取り囲む位置もしくは場所で、１つ以上の置換、欠失、または挿入を含み得る。いくつかの実施形態において、当該変異（複数可）は、置換Ｆ５０７Ｓを含み得る。いくつかの実施形態において、当該変異（複数可）は、配列番号１、３９３、または３９１の位置５１５、またはそれらの任意の組み合わせ、またはそれらのホモログもしくはオーソログで、またはそれらを取り囲む位置もしくは場所で、１つ以上の置換、欠失、または挿入を含み得る。いくつかの実施形態において、当該変異（複数可）は、置換Ｒ５１５Ｌ、Ｒ５１５Ｗ、Ｒ５１５Ｙ、Ｒ５１５Ｐ、またはＲ５１５Ｆを含み得る。いくつかの実施形態において、当該変異（複数可）は、配列番号１、３９３、または３９１の位置５２９、またはそれらの任意の組み合わせ、またはそれらのホモログもしくはオーソログで、またはそれらを取り囲む位置もしくは場所で、１つ以上の置換、欠失、または挿入を含み得る。いくつかの実施形態において、当該変異（複数可）は、置換Ｉ５２９Ｈ、Ｉ５２９Ｔ、Ｉ５２９Ｖ、Ｉ５２９Ｓ、Ｉ５２９Ｇ、Ｉ５２９Ａ、Ｉ５２９Ｌ、またはＩ５２９Ｆを含み得る。いくつかの実施形態において、当該変異（複数可）は、配列番号１、３９３、または３９１の位置５６７、またはそれらの任意の組み合わせ、またはそれらのホモログもしくはオーソログで、またはそれらを取り囲む位置もしくは場所で、１つ以上の置換、欠失、または挿入を含み得る。いくつかの実施形態において、当該変異（複数可）は、置換Ｎ５６７Ｄを含み得る。いくつかの実施形態において、当該変異は、位置４０３、４０５、４０６、４１４、４１５、４１６、４１７、４１８、４６８、４９３、４９５、４９９、５０１、５０２、５０７、５１５、５２９、及び／または５６７のうちのいずれか、またはそれらの任意の組み合わせで、またはそれらを取り囲む位置もしくは場所で、１つ以上の置換、欠失、もしくは挿入のような、他の位置で１つ以上の変異と組み合わせられ得る。いくつかの実施形態において、本開示の組成物及び方法は、本明細書に開示される、酵素の熱安定性及び／または酵素が修飾基質、例えば３’もしくは５’修飾基質を受容する能力に影響を及ぼし得る１つ以上の変異を含む。いくつかの実施形態において、当該変異（複数可）は、配列番号１、３９３、または３９１の位置４０５、またはそれらの任意の組み合わせ、またはそれらのホモログもしくはオーソログで、またはそれらを取り囲む位置もしくは場所で、１つ以上の置換、欠失、または挿入を含み得る。いくつかの実施形態において、当該変異（複数可）は、２０個の天然アミノ酸（すなわち、Ｗ、Ｉ、Ｍ、Ｐ、Ｆ、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｈ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｄ、Ｎ、Ｙ、Ｃ、Ｓ、Ｔ、もしくはＱ）または当業者に既知の非天然アミノ酸との当該残基の置換を含み得る。いくつかの実施形態において、当該変異（複数可）は、置換Ｈ４０５ＰまたはＨ４０５Ｓを含み得る。いくつかの実施形態において、当該変異は、位置４０３、４０６、４１４、４１５、４１６、４１７、４１８、４６８、４９３、４９５、４９９、５０１、５０２、５０７、５１５、５２９、及び／または５６７のうちのいずれか、またはそれらの任意の組み合わせで、またはそれらを取り囲む位置もしくは場所で、１つ以上の置換、欠失、または挿入のような、他の位置で１つ以上の変異と組み合わせられ得る。

【0231】

いくつかの実施形態において、本開示の組成物及び方法は、本明細書に開示される、酵素の熱安定性及び／または酵素が修飾基質、例えば３’もしくは５’修飾基質を受容する能力に影響を及ぼし得る１つ以上の変異を含む。いくつかの実施形態において、当該変異（複数可）は、配列番号１、３９３、または３９１の位置４０６、またはそれらの任意の組み合わせ、またはそれらのホモログもしくはオーソログで、またはそれらを取り囲む位置もしくは場所で、１つ以上の置換、欠失、または挿入を含み得る。いくつかの実施形態において、当該変異（複数可）は、２０個の天然アミノ酸（すなわち、Ｗ、Ｉ、Ｍ、Ｐ、Ｆ、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｈ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｄ、Ｎ、Ｙ、Ｃ、Ｓ、Ｔ、もしくはＱ）または当業者に既知の非天然アミノ酸との当該残基の置換を含み得る。いくつかの実施形態において、当該変異（複数可）は、置換Ｄ４０６Ｈを含み得る。いくつかの実施形態において、当該変異は、位置４０３、４０５、４１４、４１５、４１６、４１７、４１８、４６８、４９３、４９５、４９９、５０１、５０２、５０７、５１５、５２９、及び／または５６７のうちのいずれか、またはそれらの任意の組み合わせで、またはそれらを取り囲む位置もしくは場所で、１つ以上の置換、欠失、または挿入のような、他の位置で１つ以上の変異と組み合わせられ得る。

【0232】

いくつかの実施形態において、本開示の組成物及び方法は、本明細書に開示される、酵素の熱安定性及び／または酵素が修飾基質、例えば３’もしくは５’修飾基質を受容する能力に影響を及ぼし得る１つ以上の変異を含む。いくつかの実施形態において、当該変異（複数可）は、配列番号１、３９３、または３９１の位置４１４、またはそれらの任意の組み合わせ、またはそれらのホモログもしくはオーソログで、またはそれらを取り囲む位置もしくは場所で、１つ以上の置換、欠失、または挿入を含み得る。いくつかの実施形態において、当該変異（複数可）は、２０個の天然アミノ酸（すなわち、Ｗ、Ｉ、Ｍ、Ｐ、Ｆ、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｈ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｄ、Ｎ、Ｙ、Ｃ、Ｓ、Ｔ、もしくはＱ）または当業者に既知の非天然アミノ酸との当該残基の置換を含み得る。いくつかの実施形態において、当該変異（複数可）は、置換Ｒ４１４Ｓを含み得る。いくつかの実施形態において、当該変異は、位置４０３、４０５、４０６、４１５、４１６、４１７、４１８、４６８、４９３、４９５、４９９、５０１、５０２、５０７、５１５、５２９、及び／または５６７のうちのいずれか、またはそれらの任意の組み合わせで、またはそれらを取り囲む位置もしくは場所で、１つ以上の置換、欠失、または挿入のような、他の位置で１つ以上の変異と組み合わせられ得る。

【0233】

いくつかの実施形態において、本開示の組成物及び方法は、本明細書に開示されるような酵素の熱安定性及び／または酵素が修飾基質、例えば３’もしくは５’修飾基質を受容する能力に影響を及ぼし得る１つ以上の変異を含む。いくつかの実施形態において、当該変異（複数可）は、配列番号１、３９３、または３９１の位置４１５、またはそれらの任意の組み合わせ、またはそれらのホモログもしくはオーソログで、またはそれらを取り囲む位置もしくは場所で、１つ以上の置換、欠失、または挿入を含み得る。いくつかの実施形態において、当該変異（複数可）は、２０個の天然アミノ酸（すなわち、Ｗ、Ｉ、Ｍ、Ｐ、Ｆ、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｈ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｄ、Ｎ、Ｙ、Ｃ、Ｓ、Ｔ、もしくはＱ）または当業者に既知の非天然アミノ酸との当該残基の置換を含み得る。いくつかの実施形態において、当該変異（複数可）は、置換Ｓ４１５Ａ、Ｓ４１５Ｇ、またはＳ４１５Ｖを含み得る。いくつかの実施形態において、当該変異は、位置４０３、４０５、４０６、４１４、４１６、４１７、４１８、４６８、４９３、４９５、４９９、５０１、５０２、５０７、５１５、５２９、及び／または５６７のうちのいずれか、またはそれらの任意の組み合わせで、またはそれらを取り囲む位置もしくは場所で、１つ以上の置換、欠失、または挿入のような、他の位置で１つ以上の変異と組み合わせられ得る。

【0234】

いくつかの実施形態において、本開示の組成物及び方法は、本明細書に開示されるような酵素の熱安定性及び／または酵素が修飾基質、例えば３’もしくは５’修飾基質を受容する能力に影響を及ぼし得る１つ以上の変異を含む。いくつかの実施形態において、当該変異（複数可）は、配列番号１、３９３、または３９１の位置４１６、またはそれらの任意の組み合わせ、またはそれらのホモログもしくはオーソログで、またはそれらを取り囲む位置もしくは場所で、１つ以上の置換、欠失、または挿入を含み得る。いくつかの実施形態において、当該変異（複数可）は、２０個の天然アミノ酸（すなわち、Ｗ、Ｉ、Ｍ、Ｐ、Ｆ、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｈ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｄ、Ｎ、Ｙ、Ｃ、Ｓ、Ｔ、もしくはＱ）または当業者に既知の非天然アミノ酸との当該残基の置換を含み得る。いくつかの実施形態において、当該変異（複数可）は、置換Ｌ４１６Ｖ、Ｌ４１６Ｇ、Ｌ４１６Ｔ、Ｌ４１６Ａ、Ｌ４１６Ｓ、Ｌ４１６Ｉ、またはＬ４１６Ｌを含み得る。いくつかの実施形態において、当該変異は、位置４０３、４０５、４０６、４１４、４１５、４１７、４１８、４６８、４９３、４９５、４９９、５０１、５０２、５０７、５１５、５２９、及び／または５６７のうちのいずれか、またはそれらの任意の組み合わせで、またはそれらを取り囲む位置もしくは場所で、１つ以上の置換、欠失、または挿入のような、他の位置で１つ以上の変異と組み合わせられ得る。

【0235】

いくつかの実施形態において、本開示の組成物及び方法は、本明細書に開示されるような酵素の熱安定性及び／または酵素が修飾基質、例えば３’もしくは５’修飾基質を受容する能力に影響を及ぼし得る１つ以上の変異を含む。いくつかの実施形態において、当該変異（複数可）は、配列番号１、３９３、または３９１の位置４１７、またはそれらの任意の組み合わせ、またはそれらのホモログもしくはオーソログで、またはそれらを取り囲む位置もしくは場所で、１つ以上の置換、欠失、または挿入を含み得る。いくつかの実施形態において、当該変異（複数可）は、２０個の天然アミノ酸（すなわち、Ｗ、Ｉ、Ｍ、Ｐ、Ｆ、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｈ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｄ、Ｎ、Ｙ、Ｃ、Ｓ、Ｔ、もしくはＱ）または当業者に既知の非天然アミノ酸との当該残基の置換を含み得る。いくつかの実施形態において、当該変異（複数可）は、置換Ｙ４１７Ｔ、Ｙ４１７Ｓ、Ｙ４１７Ｇ、Ｙ４１７Ａ、Ｙ４１７Ｖ、Ｙ４１７Ｉ、またはＹ４１７Ｙを含み得る。いくつかの実施形態において、当該変異は、位置４０３、４０５、４０６、４１４、４１５、４１６、４１８、４６８、４９３、４９５、４９９、５０１、５０２、５０７、５１５、５２９、及び／または５６７のうちのいずれか、またはそれらの任意の組み合わせで、またはそれらを取り囲む位置もしくは場所で、１つ以上の置換、欠失、または挿入のような、他の位置で１つ以上の変異と組み合わせられ得る。

【0236】

いくつかの実施形態において、本開示の組成物及び方法は、本明細書に開示されるような酵素の熱安定性及び／または酵素が修飾基質、例えば３’もしくは５’修飾基質を受容する能力に影響を及ぼし得る１つ以上の変異を含む。いくつかの実施形態において、当該変異（複数可）は、配列番号１、３９３、または３９１の位置４１８、またはそれらの任意の組み合わせ、またはそれらのホモログもしくはオーソログで、またはそれらを取り囲む位置もしくは場所で、１つ以上の置換、欠失、または挿入を含み得る。いくつかの実施形態において、当該変異（複数可）は、２０個の天然アミノ酸（すなわち、Ｗ、Ｉ、Ｍ、Ｐ、Ｆ、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｈ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｄ、Ｎ、Ｙ、Ｃ、Ｓ、Ｔ、もしくはＱ）または当業者に既知の非天然アミノ酸との当該残基の置換を含み得る。いくつかの実施形態において、当該変異（複数可）は、置換Ｐ４１８Ｓ、Ｐ４１８Ｇ、Ｐ４１８Ｖ、Ｐ４１８Ｃ、Ｐ４１８Ｋ、Ｐ４１８Ｉ、Ｐ４１８Ｔ、またはＰ４１８Ｐを含み得る。いくつかの実施形態において、当該変異は、位置４０３、４０５、４０６、４１４、４１５、４１６、４１７、４６８、４９３、４９５、４９９、５０１、５０２、５０７、５１５、５２９、及び／または５６７のうちのいずれか、またはそれらの任意の組み合わせで、またはそれらを取り囲む位置もしくは場所で、１つ以上の置換、欠失、または挿入のような、他の位置で１つ以上の変異と組み合わせられ得る。

【0237】

いくつかの実施形態において、本開示の組成物及び方法は、本明細書に開示されるような酵素の熱安定性及び／または酵素が修飾基質、例えば３’もしくは５’修飾基質を受容する能力に影響を及ぼし得る１つ以上の変異を含む。いくつかの実施形態において、当該変異（複数可）は、配列番号１、３９３、または３９１の位置４６８、またはそれらの任意の組み合わせ、またはそれらのホモログもしくはオーソログで、またはそれらを取り囲む位置もしくは場所で、１つ以上の置換、欠失、または挿入を含み得る。いくつかの実施形態において、当該変異（複数可）は、２０個の天然アミノ酸（すなわち、Ｗ、Ｉ、Ｍ、Ｐ、Ｆ、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｈ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｄ、Ｎ、Ｙ、Ｃ、Ｓ、Ｔ、もしくはＱ）または当業者に既知の非天然アミノ酸との当該残基の置換を含み得る。いくつかの実施形態において、当該変異（複数可）は、置換Ｒ４６８Ａ、Ｒ４６８Ｖ、Ｒ４６８Ｓ、Ｒ４６８Ｋ、Ｒ４６８Ｈ、またはＲ４６８Ｇを含み得る。いくつかの実施形態において、当該変異は、位置４０３、４０５、４０６、４１４、４１５、４１６、４１７、４１８、４９３、４９５、４９９、５０１、５０２、５０７、５１５、５２９、及び／または５６７のうちのいずれか、またはそれらの任意の組み合わせで、またはそれらを取り囲む位置もしくは場所で、１つ以上の置換、欠失、または挿入のような、他の位置で１つ以上の変異と組み合わせられ得る。

【0238】

いくつかの実施形態において、本開示の組成物及び方法は、本明細書に開示されるような酵素の熱安定性及び／または酵素が修飾基質、例えば３’もしくは５’修飾基質を受容する能力に影響を及ぼし得る１つ以上の変異を含む。いくつかの実施形態において、当該変異（複数可）は、配列番号１、３９３、または３９１の位置４９３、またはそれらの任意の組み合わせ、またはそれらのホモログもしくはオーソログで、またはそれらを取り囲む位置もしくは場所で、１つ以上の置換、欠失、または挿入を含み得る。いくつかの実施形態において、当該変異（複数可）は、２０個の天然アミノ酸（すなわち、Ｗ、Ｉ、Ｍ、Ｐ、Ｆ、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｈ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｄ、Ｎ、Ｙ、Ｃ、Ｓ、Ｔ、もしくはＱ）または当業者に既知の非天然アミノ酸との当該残基の置換を含み得る。いくつかの実施形態において、当該変異（複数可）は、置換Ａ４９３ＶまたはＡ４９３Ｓを含み得る。いくつかの実施形態において、当該変異は、位置４０３、４０５、４０６、４１４、４１５、４１６、４１７、４１８、４６８、４９５、４９９、５０１、５０２、５０７、５１５、５２９、及び／または５６７のうちのいずれか、またはそれらの任意の組み合わせで、またはそれらを取り囲む位置もしくは場所で、１つ以上の置換、欠失、または挿入のような、他の位置で１つ以上の変異と組み合わせられ得る。

【0239】

いくつかの実施形態において、本開示の組成物及び方法は、本明細書に開示されるような酵素の熱安定性及び／または酵素が修飾基質、例えば３’もしくは５’修飾基質を受容する能力に影響を及ぼし得る１つ以上の変異を含む。いくつかの実施形態において、当該変異（複数可）は、配列番号１、３９３、または３９１の位置４９５、またはそれらの任意の組み合わせ、またはそれらのホモログもしくはオーソログで、またはそれらを取り囲む位置もしくは場所で、１つ以上の置換、欠失、または挿入を含み得る。いくつかの実施形態において、当該変異（複数可）は、２０個の天然アミノ酸（すなわち、Ｗ、Ｉ、Ｍ、Ｐ、Ｆ、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｈ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｄ、Ｎ、Ｙ、Ｃ、Ｓ、Ｔ、もしくはＱ）または当業者に既知の非天然アミノ酸との当該残基の置換を含み得る。いくつかの実施形態において、当該変異（複数可）は、置換Ｋ４９５Ｇ、Ｋ４９５Ａ、Ｋ４９５Ｑ、Ｋ４９５Ｓ、またはＫ４９５Ｖを含み得る。いくつかの実施形態において、当該変異は、位置４０３、４０５、４０６、４１４、４１５、４１６、４１７、４１８、４６８、４９３、４９９、５０１、５０２、５０７、５１５、５２９、及び／または５６７のうちのいずれか、またはそれらの任意の組み合わせで、またはそれらを取り囲む位置もしくは場所で、１つ以上の置換、欠失、または挿入のような、他の位置で１つ以上の変異と組み合わせられ得る。

【0240】

いくつかの実施形態において、本開示の組成物及び方法は、本明細書に開示されるような酵素の熱安定性及び／または酵素が修飾基質、例えば３’もしくは５’修飾基質を受容する能力に影響を及ぼし得る１つ以上の変異を含む。いくつかの実施形態において、当該変異（複数可）は、配列番号１、３９３、または３９１の位置４９９、またはそれらの任意の組み合わせ、またはそれらのホモログもしくはオーソログで、またはそれらを取り囲む位置もしくは場所で、１つ以上の置換、欠失、または挿入を含み得る。いくつかの実施形態において、当該変異（複数可）は、２０個の天然アミノ酸（すなわち、Ｗ、Ｉ、Ｍ、Ｐ、Ｆ、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｈ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｄ、Ｎ、Ｙ、Ｃ、Ｓ、Ｔ、もしくはＱ）または当業者に既知の非天然アミノ酸との当該残基の置換を含み得る。いくつかの実施形態において、当該変異（複数可）は、置換Ｎ４９９Ｇ、Ｎ４９９Ａ、Ｎ４９９Ｓ、またはＮ４９９Ｖを含み得る。いくつかの実施形態において、当該変異は、位置４０３、４０５、４０６、４１４、４１５、４１６、４１７、４１８、４６８、４９３、４９５、５０１、５０２、５０７、５１５、５２９、及び／または５６７のうちのいずれか、またはそれらの任意の組み合わせで、またはそれらを取り囲む位置もしくは場所で、１つ以上の置換、欠失、または挿入のような、他の位置で１つ以上の変異と組み合わせられ得る。

【0241】

いくつかの実施形態において、本開示の組成物及び方法は、本明細書に開示されるような酵素の熱安定性及び／または酵素が修飾基質、例えば３’もしくは５’修飾基質を受容する能力に影響を及ぼし得る１つ以上の変異を含む。いくつかの実施形態において、当該変異（複数可）は、配列番号１、３９３、または３９１の位置５０１、またはそれらの任意の組み合わせ、またはそれらのホモログもしくはオーソログで、またはそれらを取り囲む位置もしくは場所で、１つ以上の置換、欠失、または挿入を含み得る。いくつかの実施形態において、当該変異（複数可）は、２０個の天然アミノ酸（すなわち、Ｗ、Ｉ、Ｍ、Ｐ、Ｆ、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｈ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｄ、Ｎ、Ｙ、Ｃ、Ｓ、Ｔ、もしくはＱ）または当業者に既知の非天然アミノ酸との当該残基の置換を含み得る。いくつかの実施形態において、当該変異（複数可）は、置換Ｍ５０１Ｉを含み得る。いくつかの実施形態において、当該変異は、位置４０３、４０５、４０６、４１４、４１５、４１６、４１７、４１８、４６８、４９３、４９５、４９９、５０２、５０７、５１５、５２９、及び／または５６７のうちのいずれか、またはそれらの任意の組み合わせで、またはそれらを取り囲む位置もしくは場所で、１つ以上の置換、欠失、または挿入のような、他の位置で１つ以上の変異と組み合わせられ得る。

【0242】

いくつかの実施形態において、本開示の組成物及び方法は、本明細書に開示されるような酵素の熱安定性及び／または酵素が修飾基質、例えば３’もしくは５’修飾基質を受容する能力に影響を及ぼし得る１つ以上の変異を含む。いくつかの実施形態において、当該変異（複数可）は、配列番号１、３９３、または３９１の位置５０２、またはそれらの任意の組み合わせ、またはそれらのホモログもしくはオーソログで、またはそれらを取り囲む位置もしくは場所で、１つ以上の置換、欠失、または挿入を含み得る。いくつかの実施形態において、当該変異（複数可）は、２０個の天然アミノ酸（すなわち、Ｗ、Ｉ、Ｍ、Ｐ、Ｆ、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｈ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｄ、Ｎ、Ｙ、Ｃ、Ｓ、Ｔ、もしくはＱ）または当業者に既知の非天然アミノ酸との当該残基の置換を含み得る。いくつかの実施形態において、当該変異（複数可）は、置換Ｙ５０２Ｔ、Ｙ５０２Ｖ、Ｙ５０２Ｓ、Ｙ５０２Ｒ、Ｙ５０２Ｇ、Ｙ５０２Ｎ、Ｙ５０２Ａ、Ｙ５０２Ｑ、Ｙ５０２Ｐ、Ｙ５０２Ｈ、またはＹ５０２Ｆを含み得る。いくつかの実施形態において、当該変異は、位置４０３、４０５、４０６、４１４、４１５、４１６、４１７、４１８、４６８、４９３、４９５、４９９、５０１、５０７、５１５、５２９、及び／または５６７のうちのいずれか、またはそれらの任意の組み合わせで、またはそれらを取り囲む位置もしくは場所で、１つ以上の置換、欠失、または挿入のような、他の位置で１つ以上の変異と組み合わせられ得る。

【0243】

いくつかの実施形態において、本開示の組成物及び方法は、本明細書に開示されるような酵素の熱安定性及び／または酵素が修飾基質、例えば３’もしくは５’修飾基質を受容する能力に影響を及ぼし得る１つ以上の変異を含む。いくつかの実施形態において、当該変異（複数可）は、配列番号１、３９３、または３９１の位置５０７、またはそれらの任意の組み合わせ、またはそれらのホモログもしくはオーソログで、またはそれらを取り囲む位置もしくは場所で、１つ以上の置換、欠失、または挿入を含み得る。いくつかの実施形態において、当該変異（複数可）は、２０個の天然アミノ酸（すなわち、Ｗ、Ｉ、Ｍ、Ｐ、Ｆ、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｈ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｄ、Ｎ、Ｙ、Ｃ、Ｓ、Ｔ、もしくはＱ）または当業者に既知の非天然アミノ酸との当該残基の置換を含み得る。いくつかの実施形態において、当該変異（複数可）は、置換Ｆ５０７Ｓを含み得る。いくつかの実施形態において、当該変異は、位置４０３、４０５、４０６、４１４、４１５、４１６、４１７、４１８、４６８、４９３、４９５、４９９、５０１、５０２、５１５、５２９、及び／または５６７のうちのいずれか、またはそれらの任意の組み合わせで、またはそれらを取り囲む位置もしくは場所で、１つ以上の置換、欠失、または挿入のような、他の位置で１つ以上の変異と組み合わせられ得る。

【0244】

いくつかの実施形態において、本開示の組成物及び方法は、本明細書に開示されるような酵素の熱安定性及び／または酵素が修飾基質、例えば３’もしくは５’修飾基質を受容する能力に影響を及ぼし得る１つ以上の変異を含む。いくつかの実施形態において、当該変異（複数可）は、配列番号１、３９３、または３９１の位置５１５、またはそれらの任意の組み合わせ、またはそれらのホモログもしくはオーソログで、またはそれらを取り囲む位置もしくは場所で、１つ以上の置換、欠失、または挿入を含み得る。いくつかの実施形態において、当該変異（複数可）は、２０個の天然アミノ酸（すなわち、Ｗ、Ｉ、Ｍ、Ｐ、Ｆ、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｈ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｄ、Ｎ、Ｙ、Ｃ、Ｓ、Ｔ、もしくはＱ）または当業者に既知の非天然アミノ酸との当該残基の置換を含み得る。いくつかの実施形態において、当該変異（複数可）は、置換Ｒ５１５Ｌ、Ｒ５１５Ｗ、Ｒ５１５Ｙ、Ｒ５１５Ｐ、またはＲ５１５Ｆを含み得る。いくつかの実施形態において、当該変異は、位置４０３、４０５、４０６、４１４、４１５、４１６、４１７、４１８、４６８、４９３、４９５、４９９、５０１、５０２、５０７、５２９、及び／または５６７のうちのいずれか、またはそれらの任意の組み合わせで、またはそれらを取り囲む位置もしくは場所で、１つ以上の置換、欠失、または挿入のような、他の位置で１つ以上の変異と組み合わせられ得る。

【0245】

いくつかの実施形態において、本開示の組成物及び方法は、本明細書に開示されるような酵素の熱安定性及び／または酵素が修飾基質、例えば３’もしくは５’修飾基質を受容する能力に影響を及ぼし得る１つ以上の変異を含む。いくつかの実施形態において、当該変異（複数可）は、配列番号１、３９３、または３９１の位置５２９、またはそれらの任意の組み合わせ、またはそれらのホモログもしくはオーソログで、またはそれらを取り囲む位置もしくは場所で、１つ以上の置換、欠失、または挿入を含み得る。いくつかの実施形態において、当該変異（複数可）は、２０個の天然アミノ酸（すなわち、Ｗ、Ｉ、Ｍ、Ｐ、Ｆ、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｈ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｄ、Ｎ、Ｙ、Ｃ、Ｓ、Ｔ、もしくはＱ）または当業者に既知の非天然アミノ酸との当該残基の置換を含み得る。いくつかの実施形態において、当該変異（複数可）は、置換Ｉ５２９Ｈ、Ｉ５２９Ｔ、Ｉ５２９Ｖ、Ｉ５２９Ｓ、Ｉ５２９Ｇ、Ｉ５２９Ａ、Ｉ５２９Ｌ、またはＩ５２９Ｆを含み得る。いくつかの実施形態において、当該変異は、位置４０３、４０５、４０６、４１４、４１５、４１６、４１７、４１８、４６８、４９３、４９５、４９９、５０１、５０２、５０７、５１５、及び／または５６７のうちのいずれか、またはそれらの任意の組み合わせで、またはそれらを取り囲む位置もしくは場所で、１つ以上の置換、欠失、または挿入のような、他の位置で１つ以上の変異と組み合わせられ得る。

【0246】

いくつかの実施形態において、本開示の組成物及び方法は、本明細書に開示されるような酵素の熱安定性及び／または酵素が修飾基質、例えば３’もしくは５’修飾基質を受容する能力に影響を及ぼし得る１つ以上の変異を含む。いくつかの実施形態において、当該変異（複数可）は、配列番号１、３９３、または３９１の位置５６７、またはそれらの任意の組み合わせ、またはそれらのホモログもしくはオーソログで、またはそれらを取り囲む位置もしくは場所で、１つ以上の置換、欠失、または挿入を含み得る。いくつかの実施形態において、当該変異（複数可）は、２０個の天然アミノ酸（すなわち、Ｗ、Ｉ、Ｍ、Ｐ、Ｆ、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｈ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｄ、Ｎ、Ｙ、Ｃ、Ｓ、Ｔ、もしくはＱ）または当業者に既知の非天然アミノ酸との当該残基の置換を含み得る。いくつかの実施形態において、当該変異（複数可）は、置換Ｎ５６７Ｄを含み得る。いくつかの実施形態において、当該変異は、位置４０３、４０５、４０６、４１４、４１５、４１６、４１７、４１８、４６８、４９３、４９５、４９９、５０１、５０２、５０７、５１５、及び／または５２９のうちのいずれか、またはそれらの任意の組み合わせで、またはそれらを取り囲む位置もしくは場所で、１つ以上の置換、欠失、または挿入のような、他の位置で１つ以上の変異と組み合わせられ得る。

【0247】

いくつかの実施形態において、本方法及び組成物は、増加した熱安定性、及び特に３’ブロックヌクレオチドなどの非標準ヌクレオチドの取り込みに対する増加した耐性を有するポリメラーゼバリアントを提供する。いくつかの実施形態において、本開示の方法及び組成物は、配列番号２～２７４または２８８～３７５または３８５～３９７に対して、１００％、少なくとも９９．８％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．１％、少なくとも９９％、少なくとも９８％、少なくとも９７％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６５％、少なくとも６０％、少なくとも５５％、または少なくとも５０％の配列同一性を有する１つ以上のポリペプチドを含み、本開示の方法及び組成物は、配列番号２～２７４または２８８～３７５または３８５～３９７のうちのいずれかに対して、１００％、少なくとも９９．８％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．１％、少なくとも９９％、少なくとも９８％、少なくとも９７％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６５％、少なくとも６０％、少なくとも５５％、または少なくとも５０％の配列同一性を有する１つ以上のポリペプチドを含む。いくつかの実施形態において、本開示の方法及び組成物は、配列番号２～２７４または２８８～３７５または３８５～３９７のうちのいずれかに対して、１００％、少なくとも９９．８％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．１％、少なくとも９９％、少なくとも９８％、少なくとも９７％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６５％、少なくとも６０％、少なくとも５５％、または少なくとも５０％の配列同一性を有し、Ｒ６１５Ｋ、Ｙ６５４Ａ、Ｙ６５４Ｄ、Ｙ６５４Ｅ、Ｙ６５４Ｆ、Ｙ６５４Ｇ、Ｓ６５５Ａ、Ｓ６５５Ｇ、Ｓ６５５Ｖ、Ｑ６５６Ａ、Ｑ６５６Ｇ、Ｑ６５６Ｎ、Ｑ６５６Ｓ、Ｑ６５６Ｖ、Ｉ６５７Ａ、Ｉ６５７Ｇ、Ｉ６５７Ｓ、Ｉ６５７Ｖ、Ｅ６５８Ａ、Ｅ６５８Ｄ、Ｅ６５８Ｇ、Ｅ６５８Ｓ、Ｅ６５８Ｖ、Ｌ６５９Ａ、Ｌ６５９Ｇ、Ｌ６５９Ｐ、Ｌ６５９Ｓ、Ｌ６５９Ｖ、Ｄ６８０Ａ、Ｄ６８０Ｇ、Ｄ６８０Ｉ、Ｄ６８０Ｌ、Ｄ６８０Ｎ、Ｄ６８０Ｓ、Ｄ６８０Ｖ、Ｈ６８２Ａ、Ｈ６８２Ｇ、Ｈ６８２Ｎ、Ｈ６８２Ｑ、Ｈ６８２Ｓ、Ｈ６８２Ｖ、Ｒ７０２Ａ、Ｒ７０２Ｇ、Ｒ７０２Ｈ、Ｒ７０２Ｋ、Ｒ７０２Ｓ、Ｒ７０２Ｖ、Ｋ７０６Ｈ、Ｋ７０６Ｋ、Ｋ７０６Ｒ、Ａ７０７Ｇ、Ａ７０７Ｓ、Ａ７０７Ｔ、Ｆ７１０Ａ、Ｆ７１０Ｄ、Ｆ７１０Ｅ、Ｆ７１０Ｇ、Ｆ７１０Ｑ、Ｆ７１０Ｓ、Ｆ７１０Ｔ、Ｆ７１０Ｖ、Ｙ７１４Ａ、Ｙ７１４Ｄ、Ｙ７１４Ｅ、Ｙ７１４Ｆ、Ｙ７１４Ｇ、Ｙ７１４Ｓ、Ｙ７１４Ｗ、Ｈ８２９Ａ、及び／またはＨ８２９Ｇから選択される１つ以上の変異、またはそれらの任意の組み合わせを有する、１つ以上のポリペプチドを含む。

【0248】

いくつかの実施形態において、本方法及び組成物は、３’ブロックヌクレオチドなどの非標準ヌクレオチドの取り込みに対する増加した耐性、及び特に増強した耐熱性を有するポリメラーゼバリアントを提供する。いくつかの実施形態において、本開示の方法及び組成物は、配列番号２～２７４または２８８～３７５または３８５～３９７において、１００％、少なくとも９９．８％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．１％、少なくとも９９％、少なくとも９８％、少なくとも９７％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６５％、少なくとも６０％、少なくとも５５％、または少なくとも５０％の配列同一性を有する１つ以上のポリペプチドを含み、本開示の方法及び組成物は、配列番号２～２７４または２８８～３７５または３８５～３９７のうちのいずれかに対して、１００％、少なくとも９９．８％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．１％、少なくとも９９％、少なくとも９８％、少なくとも９７％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６５％、少なくとも６０％、少なくとも５５％、または少なくとも５０％の配列同一性を有する１つ以上のポリペプチドを含む。いくつかの実施形態において、本開示の方法及び組成物は、配列番号２～２７４または２８８～３７５または３８５～３９７のうちのいずれかに対して、１００％、少なくとも９９．８％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．１％、少なくとも９９％、少なくとも９８％、少なくとも９７％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６５％、少なくとも６０％、少なくとも５５％、または少なくとも５０％の配列同一性を有し、Ｄ３１４Ｅ、Ｉ３３２Ｌ、Ｉ３３４Ｌ、Ｋ３６８Ｒ、Ｋ３８１Ｒ、Ｉ３８５Ｌ、Ｋ４１７Ｒ、Ｋ４３４Ｒ、Ｉ４５４Ｌ、Ｄ４７１Ｅ、Ｉ５２８Ｌ、Ｋ６０１Ｒ、Ｋ６３５Ｒ、Ｉ６４９Ｌ、Ｉ６６５Ｌ、Ｋ７５８Ｒ、及び／またはＫ７６０Ｒから選択される１つ以上の変異、またはそれらの任意の組み合わせを有する、１つ以上のポリペプチドを含む。

【0249】

いくつかの実施形態において、本方法及び組成物は、増加した熱安定性、及び特に３’ブロックヌクレオチドなどの非標準ヌクレオチドの取り込みに対する増加した耐性を有するポリメラーゼバリアントを提供する。いくつかの実施形態において、本開示の方法及び組成物は、配列番号２～２７４または２８８～３７５または３８５～３９７に対して、１００％、少なくとも９９．８％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．１％、少なくとも９９％、少なくとも９８％、少なくとも９７％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６５％、少なくとも６０％、少なくとも５５％、または少なくとも５０％の配列同一性を有する１つ以上のポリペプチドを含み、本開示の方法及び組成物は、配列番号２～２７４または２８８～３７５または３８５～３９７のうちのいずれかに対して、１００％、少なくとも９９．８％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．１％、少なくとも９９％、少なくとも９８％、少なくとも９７％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６５％、少なくとも６０％、少なくとも５５％、または少なくとも５０％の配列同一性を有する１つ以上のポリペプチドを含む。いくつかの実施形態において、本開示の方法及び組成物は、配列番号２～２７４または２８８～３７５または３８５～３９７のうちのいずれかに対して、１００％、少なくとも９９．８％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．１％、少なくとも９９％、少なくとも９８％、少なくとも９７％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６５％、少なくとも６０％、少なくとも５５％、または少なくとも５０％の配列同一性を有し、Ｒ６１５Ｋ、Ｙ６５４Ａ、Ｙ６５４Ｄ、Ｙ６５４Ｅ、Ｙ６５４Ｆ、Ｙ６５４Ｇ、Ｓ６５５Ａ、Ｓ６５５Ｇ、Ｓ６５５Ｖ、Ｑ６５６Ａ、Ｑ６５６Ｇ、Ｑ６５６Ｎ、Ｑ６５６Ｓ、Ｑ６５６Ｖ、Ｉ６５７Ａ、Ｉ６５７Ｇ、Ｉ６５７Ｓ、Ｉ６５７Ｖ、Ｅ６５８Ａ、Ｅ６５８Ｄ、Ｅ６５８Ｇ、Ｅ６５８Ｓ、Ｅ６５８Ｖ、Ｌ６５９Ａ、Ｌ６５９Ｇ、Ｌ６５９Ｐ、Ｌ６５９Ｓ、Ｌ６５９Ｖ、Ｄ６８０Ａ、Ｄ６８０Ｇ、Ｄ６８０Ｉ、Ｄ６８０Ｌ、Ｄ６８０Ｎ、Ｄ６８０Ｓ、Ｄ６８０Ｖ、Ｈ６８２Ａ、Ｈ６８２Ｇ、Ｈ６８２Ｎ、Ｈ６８２Ｑ、Ｈ６８２Ｓ、Ｈ６８２Ｖ、Ｒ７０２Ａ、Ｒ７０２Ｇ、Ｒ７０２Ｈ、Ｒ７０２Ｋ、Ｒ７０２Ｓ、Ｒ７０２Ｖ、Ｋ７０６Ｈ、Ｋ７０６Ｋ、Ｋ７０６Ｒ、Ａ７０７Ｇ、Ａ７０７Ｓ、Ａ７０７Ｔ、Ｆ７１０Ａ、Ｆ７１０Ｄ、Ｆ７１０Ｅ、Ｆ７１０Ｇ、Ｆ７１０Ｑ、Ｆ７１０Ｓ、Ｆ７１０Ｔ、Ｆ７１０Ｖ、Ｙ７１４Ａ、Ｙ７１４Ｄ、Ｙ７１４Ｅ、Ｙ７１４Ｆ、Ｙ７１４Ｇ、Ｙ７１４Ｓ、Ｙ７１４Ｗ、Ｈ８２９Ａ、Ｈ８２９Ｇ Ｄ３１４Ｅ、Ｉ３３２Ｌ、Ｉ３３４Ｌ、Ｋ３６８Ｒ、Ｋ３８１Ｒ、Ｉ３８５Ｌ、Ｋ４１７Ｒ、Ｋ４３４Ｒ、Ｉ４５４Ｌ、Ｄ４７１Ｅ、Ｉ５２８Ｌ、Ｋ６０１Ｒ、Ｋ６３５Ｒ、Ｉ６４９Ｌ、Ｉ６６５Ｌ、Ｋ７５８Ｒ、及び／またはＫ７６０Ｒから選択される１つ以上の変異、またはそれらの任意の組み合わせを有する、１つ以上のポリペプチドを含む。

【0250】

本開示は、増加した熱安定性を示す切断ポリペプチド、例えば、配列番号３５３または３５４のアミノ酸配列を有するポリメラーゼである、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ａｌｔｉａｒｃｈａｅａｌｅｓ古細菌からのポリメラーゼを提供する。

【0251】

本開示は、ヌクレオチド類似体の取り込み率を増加させるために２つ以上の位置で変異されるＣａｎｄｉｄａｔｕｓ Ａｌｔｉａｒｃｈａｅａｌｅｓ古細菌からのポリメラーゼを提供する。いくつかの実施形態において、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ａｌｔｉａｒｃｈａｅａｌｅｓ古細菌からの変異体ポリメラーゼは、Ｌ４１６、Ｙ４１７、Ｐ４１８、Ａ４９３、及び／またはＩ５２９からなる群から選択される１つ以上のアミノ酸置換変異を有する配列番号１または３９１のアミノ酸配列を含み、Ｋ５８、Ｒ５１５、Ｎ５６７、Ｅ５６９、Ｓ５７７、Ｋ６１０、及び／またはＳ７１７からなる群から選択される１つ以上のアミノ酸置換変異も含む。いくつかの実施形態において、位置Ｋ５８のアミノ酸置換変異は、極性非荷電アミノ酸を含む。いくつかの実施形態において、位置Ｋ５８のアミノ酸置換変異は、メチオニンを含む。いくつかの実施形態において、位置Ｒ５１５のアミノ酸置換変異は、非極性アミノ酸または極性非荷電アミノ酸を含む。いくつかの実施形態において、位置Ｒ５１５のアミノ酸置換変異は、ロイシン、トリプトファン、チロシン、プロリン、またはフェニルアラニンを含む。いくつかの実施形態において、位置Ｎ５６７のアミノ酸置換変異は、負に荷電したアミノ酸を含む。いくつかの実施形態において、位置Ｎ５６７のアミノ酸置換変異は、アスパラギン酸を含む。いくつかの実施形態において、位置Ｅ５６９のアミノ酸置換変異は、非極性アミノ酸を含む。いくつかの実施形態において、位置Ｅ５６９のアミノ酸置換変異は、グリシンを含む。いくつかの実施形態において、位置Ｓ５７７のアミノ酸置換変異は、非極性アミノ酸を含む。いくつかの実施形態において、位置Ｓ５７７のアミノ酸置換変異は、イソロイシンを含む。いくつかの実施形態において、位置Ｋ６１０のアミノ酸置換変異は、負に荷電したアミノ酸を含む。いくつかの実施形態において、位置Ｋ６１０のアミノ酸置換変異は、グルタミン酸を含む。いくつかの実施形態において、位置Ｓ７１７のアミノ酸置換変異は、非極性アミノ酸を含む。いくつかの実施形態において、位置Ｓ７１７のアミノ酸置換変異は、グリシンを含む。いくつかの実施形態において、アミノ酸置換変異はまた、Ｄ１４１Ａ及びＥ１４３Ａを含むことができる。

【0252】

本開示は、配列番号１または３９１を含む野生型ポリメラーゼと比較して、ヌクレオチド類似体の取り込み率を増加させるために２つ以上の位置で変異させる、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ａｌｔｉａｒｃｈａｅａｌｅｓ古細菌からのポリメラーゼを提供する。いくつかの実施形態において、変異体ポリメラーゼは、配列番号１または３９１のアミノ酸配列を有する野生型ポリメラーゼと比較して、増加した熱安定性を示す。例えば、変異体ポリメラーゼは、約２５～５０℃または約４５～７５℃の温度範囲において、増加した熱安定性を示す。いくつかの実施形態において、変異体ポリメラーゼは、配列番号１または２～２７４または２８８～３７５または３８５～３９７のうちのいずれかに対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％同一であるか、またはより高いレベルの配列同一性であるアミノ酸配列を含む。変異体ポリメラーゼは、この段落に記載される特徴のうちのいずれかを含み得る。例えば、いくつかの実施形態において、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ａｌｔｉａｒｃｈａｅａｌｅｓ古細菌からの変異体ポリメラーゼは、配列番号１、３９３、または３９１に対して、少なくとも８５％の配列同一性、少なくとも９０％の配列同一性、または少なくとも９５％の配列同一性、または少なくとも９６％の配列同一性、または少なくとも９７％の配列同一性、または少なくとも９８％の配列同一性、または少なくとも９９．８％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．１％、少なくとも９９％の配列同一性であるか、またはより高いパーセントの配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、変異体ＤＮＡポリメラーゼは、Ｌｅｕ４１６、Ｔｙｒ４１７、Ｐｒｏ４１８、Ａｌａ４９３、Ａｒｇ５１５、Ｉｌｅ５２９、及びＡｓｎ５６７からなる群から選択される２つ以上の位置のうちのいずれか１つまたはいずれかの組み合わせでアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態において、変異体ポリメラーゼは、エキソヌクレアーゼ－マイナス活性を付与することができるアミノ酸置換Ｄ１４１Ａ及びＥ１４３Ａを含む。いくつかの実施形態において、変異体ポリメラーゼは、野生型アミノ酸骨格配列（例えば、配列番号１または３９１）を有するポリメラーゼと比較して、望ましい特徴を示す。例えば、変異体ポリメラーゼは、増加した熱安定性（Ｔｍ）を示す。別の例では、変異体ポリメラーゼは、糖２’位及び／または３’糖位に鎖終結部分（例えば、ブロック部分）を含むヌクレオチド類似体の増加した取り込み率を示す。更に別の例では、変異体ポリメラーゼは、増加したウラシル耐性を示す。この段落に記載の１つ以上の特性は、本開示に記載の様々な実施形態における任意の例示的な変異体ポリメラーゼに現れ得る。この段落に記載の特性は、本開示を通して「例示的な変異体ポリメラーゼ特性」と称される。

【0253】

本開示は、ヌクレオチド類似体の取り込み率を増加させるために１つ以上の位置で変異されるＣａｎｄｉｄａｔｕｓ Ａｌｔｉａｒｃｈａｅａｌｅｓ古細菌からのポリメラーゼを提供する。いくつかの実施形態において、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ａｌｔｉａｒｃｈａｅａｌｅｓ古細菌からの変異体ポリメラーゼは、配列番号２～２７４または２８８～３７５または３８５～３９７のアミノ酸配列のうちのいずれか１つに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0254】

本開示は、１つ以上の位置で変異される９°Ｎ ＤＮＡポリメラーゼ及びＴＨＥＲＭＩＮＡＴＯＲポリメラーゼを含む古細菌ファミリーＢ ＤＮＡポリメラーゼを提供する。いくつかの実施形態において、変異体９°Ｎ及びＴＨＥＲＭＩＮＡＴＯＲポリメラーゼは、位置Ｙ７、Ｔ５５、Ｖ１０６、Ｄ１３２、Ｉ２６４、Ｙ２９１、Ｐ３２８、Ｓ３４８、Ｌ３５２、Ｋ３６３、Ｅ３７４、Ｇ３９５、Ｗ３９７、Ｄ３９８、Ｒ４０６、Ｓ４０７、Ｌ４０８、Ｙ４０９、Ｐ４１０、Ｙ４３１、Ｄ４３２、Ｐ４３５、Ｃ４４２、Ｒ４６０、Ｒ４６５、Ｙ４８１、Ｒ４８４、Ａ４８５、Ｉ４８６、Ｋ４８７、Ｉ４８８、Ｎ４９１、Ｆ４９３、Ｙ４９４、Ｙ４９９、Ｃ５０６、Ｋ５０７、Ｃ５０９、Ｉ５２１、Ｋ５５９、Ｋ５６１、Ｐ５６９、Ｅ６００、Ｋ６０２、Ｉ６０３、Ｄ６１４、Ｖ６４３、Ｅ６４５、Ｖ６６１、Ｑ６６５、Ｒ６８９、Ｒ７０９、Ｉ７１５、Ｉ７４４、及び／またはＤ７５４で１つ以上のアミノ酸置換変異を含む、配列番号２８０、２８１、または２８２に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、またはより高い割合の配列同一性を含む。いくつかの実施形態において、配列番号２８０の１つ以上のアミノ酸置換は、それぞれ、配列番号１～２７４または２８８～３７５または３８５～３９７のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣａｎｄｉｄａｔｕｓ Ａｌｔｉａｒｃｈａｅａｌｅｓ古細菌ポリメラーゼの位置Ｙ７、Ｋ５８、Ｃ１０４、Ｃ１３０、Ｃ２６９、Ｒ２９６、Ｐ３３５、Ｇ３５５、Ｒ３５９、Ｅ３７０、Ｄ３８１、Ｇ４０３、Ｈ４０５、Ｄ４０６、Ｒ４１４、Ｓ４１５、Ｌ４１６、Ｙ４１７、Ｐ４１８、Ｄ４３９、Ｓ４４０、Ｓ４４３、Ｃ４５０、Ｒ４６８、Ｋ４７３、Ｖ４８９、Ｑ４９２、Ａ４９３、Ｌ４９４、Ｋ４９５、Ｌ４９６、Ｎ４９９、Ｓ５００、Ｍ５０１、Ｙ５０２、Ｆ５０７、Ｃ５１４、Ｒ５１５、Ｃ５１７、Ｉ５２９、Ｎ５６７、Ｅ５６９、Ｓ５７７、Ｒ６０８、Ｋ６１０、Ｌ６１１、Ｄ６２２、Ｖ６５１、Ｄ６５３、Ａ６６９、Ｑ６７３、Ｒ６９７、Ｓ７１７、Ｒ７２３、Ｉ７５０、及びＥ７６０でアミノ酸置換と位置的に等価である。いくつかの実施形態において、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ａｌｔｉａｒｃｈａｅａｌｅｓ古細菌ポリメラーゼ及び９°Ｎポリメラーゼ、ＶＥＮＴポリメラーゼ、ＤＥＥＰ ＶＥＮＴポリメラーゼ、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓポリメラーゼ、Ｐｆｕポリメラーゼ、及びＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｂｙｓｓｉポリメラーゼの位置的に等価なアミノ酸位置を、図６Ａ～図６Ｃに示される表４に列挙する。また、図７Ａ～図７Ｂ、図８Ａ～図８Ｃ、図９Ａ～図９Ｂ、図１０Ａ～図１０Ｂ、図１１Ａ～図１１Ｂ、図１２Ａ～図１２Ｂ、及び図１３Ａ～図１３Ｂの配列アラインメントも参照されたい。

【0255】

本開示は、１つ以上の位置で変異される９°Ｎ ＤＮＡポリメラーゼを含む古細菌ファミリーＢ ＤＮＡポリメラーゼを提供する。いくつかの実施形態において、変異体９°Ｎ ＤＮＡポリメラーゼは、位置Ｙ７、Ｔ５５、Ｖ１０６、Ｄ１３２、Ｉ２６４、Ｙ２９１、Ｐ３２８、Ｓ３４８、Ｌ３５２、Ｋ３６３、Ｅ３７４、Ｇ３９５、Ｗ３９７、Ｄ３９８、Ｒ４０６、Ｓ４０７、Ｌ４０８、Ｙ４０９、Ｐ４１０、Ｙ４３１、Ｄ４３２、Ｐ４３５、Ｃ４４２、Ｒ４６０、Ｒ４６５、Ｙ４８１、Ｒ４８４、Ａ４８５、Ｉ４８６、Ｋ４８７、Ｉ４８８、Ｎ４９１、Ｆ４９３、Ｙ４９４、Ｙ４９９、Ｃ５０６、Ｋ５０７、Ｃ５０９、Ｉ５２１、Ｋ５５９、Ｋ５６１、Ｐ５６９、Ｅ６００、Ｋ６０２、Ｉ６０３、Ｄ６１４、Ｖ６４３、Ｅ６４５、Ｖ６６１、Ｑ６６５、Ｄ６７２、Ｒ６８９、Ｒ７０９、Ｉ７１５、Ｉ７４４、及び／またはＤ７５４で１つ以上のアミノ酸置換変異を含む、配列番号２８０に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、またはより高い割合の配列同一性を含む。いくつかの実施形態において、位置１２９のアミノ酸は、メチオニンまたはアラニンであり得る。いくつかの実施形態において、配列番号２８０の１つ以上のアミノ酸置換は、それぞれ、配列番号１～２７４または２８８～３７５または３８５～３９７のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣａｎｄｉｄａｔｕｓ Ａｌｔｉａｒｃｈａｅａｌｅｓ古細菌ポリメラーゼの位置Ｋ５８、Ｃ１０４、Ｃ１３０、Ｃ２６９、Ｒ２９６、Ｐ３３５、Ｇ３５５、Ｒ３５９、Ｅ３７０、Ｄ３８１、Ｇ４０３、Ｈ４０５、Ｄ４０６、Ｒ４１４、Ｓ４１５、Ｌ４１６、Ｙ４１７、Ｐ４１８、Ｄ４３９、Ｓ４４０、Ｓ４４３、Ｃ４５０、Ｒ４６８、Ｋ４７３、Ｖ４８９、Ｑ４９２、Ａ４９３、Ｌ４９４、Ｋ４９５、Ｌ４９６、Ｎ４９９、Ｓ５００、Ｍ５０１、Ｙ５０２、Ｆ５０７、Ｃ５１４、Ｒ５１５、Ｃ５１７、Ｉ５２９、Ｎ５６７、Ｅ５６９、Ｓ５７７、Ｒ６０８、Ｋ６１０、Ｌ６１１、Ｄ６２２、Ｖ６５１、Ｄ６５３、Ａ６６９、Ｑ６７３、Ｒ６９７、Ｓ７１７、Ｒ７２３、Ｉ７５０、及びＥ７６０でアミノ酸置換と位置的に等価である。いくつかの実施形態において、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ａｌｔｉａｒｃｈａｅａｌｅｓ古細菌ポリメラーゼ及び９°Ｎポリメラーゼの位置的に等価なアミノ酸位置を、図６Ａ～図６Ｃに示される表４に列挙する。また、図７Ａ～図７Ｃの配列アラインメントも参照されたい。

【0256】

本開示は、１つ以上の位置で変異される９°Ｎ ＤＮＡポリメラーゼを含む古細菌ファミリーＢ ＤＮＡポリメラーゼを提供する。いくつかの実施形態において、変異体９°Ｎ ＤＮＡポリメラーゼは、位置Ｙ７、Ｔ５５、Ｖ１０６、Ｄ１３２、Ｉ２６４、Ｙ２９１、Ｐ３２８、Ｓ３４８、Ｌ３５２、Ｋ３６３、Ｅ３７４、Ｇ３９５、Ｗ３９７、Ｄ３９８、Ｒ４０６、Ｓ４０７、Ｌ４０８、Ｙ４０９、Ｐ４１０、Ｙ４３１、Ｄ４３２、Ｐ４３５、Ｃ４４２、Ｒ４６０、Ｒ４６５、Ｙ４８１、Ｒ４８４、Ａ４８５、Ｉ４８６、Ｋ４８７、Ｉ４８８、Ｎ４９１、Ｆ４９３、Ｙ４９４、Ｙ４９９、Ｃ５０６、Ｋ５０７、Ｃ５０９、Ｉ５２１、Ｋ５５９、Ｋ５６１、Ｐ５６９、Ｅ６００、Ｋ６０２、Ｉ６０３、Ｄ６１４、Ｖ６４３、Ｅ６４５、Ｖ６６１、Ｑ６６５、Ｄ６７２、Ｒ６８９、Ｒ７０９、Ｉ７１５、Ｉ７４４、及び／またはＤ７５４で１つ以上のアミノ酸置換変異を含む、配列番号２８１に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、またはより高い割合の配列同一性を含む。いくつかの実施形態において、位置１２９のアミノ酸は、メチオニンまたはアラニンであり得る。いくつかの実施形態において、配列番号２８１の１つ以上のアミノ酸置換は、それぞれ、配列番号１～２７４または２８８～３７５または３８５～３９７のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣａｎｄｉｄａｔｕｓ Ａｌｔｉａｒｃｈａｅａｌｅｓ古細菌ポリメラーゼの位置Ｋ５８、Ｃ１０４、Ｃ１３０、Ｃ２６９、Ｒ２９６、Ｐ３３５、Ｇ３５５、Ｒ３５９、Ｅ３７０、Ｄ３８１、Ｇ４０３、Ｈ４０５、Ｄ４０６、Ｒ４１４、Ｓ４１５、Ｌ４１６、Ｙ４１７、Ｐ４１８、Ｄ４３９、Ｓ４４０、Ｓ４４３、Ｃ４５０、Ｒ４６８、Ｋ４７３、Ｖ４８９、Ｑ４９２、Ａ４９３、Ｌ４９４、Ｋ４９５、Ｌ４９６、Ｎ４９９、Ｓ５００、Ｍ５０１、Ｙ５０２、Ｆ５０７、Ｃ５１４、Ｒ５１５、Ｃ５１７、Ｉ５２９、Ｎ５６７、Ｅ５６９、Ｓ５７７、Ｒ６０８、Ｋ６１０、Ｌ６１１、Ｄ６２２、Ｖ６５１、Ｄ６５３、Ａ６６９、Ｑ６７３、Ｒ６９７、Ｓ７１７、Ｒ７２３、Ｉ７５０、及びＥ７６０でアミノ酸置換と位置的に等価である。いくつかの実施形態において、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ａｌｔｉａｒｃｈａｅａｌｅｓ古細菌ポリメラーゼ及び９°Ｎポリメラーゼの位置的に等価なアミノ酸位置を、図６Ａ～図６Ｃに示される表４に列挙する。また、図７Ａ～図７Ｂの配列アラインメントも参照されたい。

【0257】

本開示は、１つ以上の位置で変異されるＴＨＥＲＭＩＮＡＴＯＲ ＤＮＡポリメラーゼを含む古細菌ファミリーＢ ＤＮＡポリメラーゼを提供する。いくつかの実施形態において、変異体ＴＨＥＲＭＩＮＡＴＯＲポリメラーゼは、位置Ｙ７、Ｔ５５、Ｖ１０６、Ｄ１３２、Ｉ２６４、Ｙ２９１、Ｐ３２８、Ｓ３４８、Ｌ３５２、Ｋ３６３、Ｅ３７４、Ｇ３９５、Ｗ３９７、Ｄ３９８、Ｒ４０６、Ｓ４０７、Ｌ４０８、Ｙ４０９、Ｐ４１０、Ｙ４３１、Ｄ４３２、Ｐ４３５、Ｃ４４２、Ｒ４６０、Ｒ４６５、Ｙ４８１、Ｒ４８４、Ａ４８５、Ｉ４８６、Ｋ４８７、Ｉ４８８、Ｎ４９１、Ｆ４９３、Ｙ４９４、Ｙ４９９、Ｃ５０６、Ｋ５０７、Ｃ５０９、Ｉ５２１、Ｋ５５９、Ｋ５６１、Ｐ５６９、Ｅ６００、Ｋ６０２、Ｉ６０３、Ｄ６１４、Ｖ６４３、Ｅ６４５、Ｖ６６１、Ｑ６６５、Ｄ６７２、Ｒ６８９、Ｒ７０９、Ｉ７１５、Ｉ７４４、及び／またはＤ７５４で１つ以上のアミノ酸置換変異を含む、配列番号２８２に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、またはより高い割合の配列同一性を含む。いくつかの実施形態において、位置１２９のアミノ酸は、メチオニンまたはアラニンであり得る。いくつかの実施形態において、配列番号２８２の１つ以上のアミノ酸置換は、それぞれ、配列番号１～２７４または２８８～３７５または３８５～３９７のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣａｎｄｉｄａｔｕｓ Ａｌｔｉａｒｃｈａｅａｌｅｓ古細菌ポリメラーゼの位置Ｋ５８、Ｃ１０４、Ｃ１３０、Ｃ２６９、Ｒ２９６、Ｐ３３５、Ｇ３５５、Ｒ３５９、Ｅ３７０、Ｄ３８１、Ｇ４０３、Ｈ４０５、Ｄ４０６、Ｒ４１４、Ｓ４１５、Ｌ４１６、Ｙ４１７、Ｐ４１８、Ｄ４３９、Ｓ４４０、Ｓ４４３、Ｃ４５０、Ｒ４６８、Ｋ４７３、Ｖ４８９、Ｑ４９２、Ａ４９３、Ｌ４９４、Ｋ４９５、Ｌ４９６、Ｎ４９９、Ｓ５００、Ｍ５０１、Ｙ５０２、Ｆ５０７、Ｃ５１４、Ｒ５１５、Ｃ５１７、Ｉ５２９、Ｎ５６７、Ｅ５６９、Ｓ５７７、Ｒ６０８、Ｋ６１０、Ｌ６１１、Ｄ６２２、Ｖ６５１、Ｄ６５３、Ａ６６９、Ｑ６７３、Ｒ６９７、Ｓ７１７、Ｒ７２３、Ｉ７５０、及びＥ７６０でアミノ酸置換と位置的に等価である。いくつかの実施形態において、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ａｌｔｉａｒｃｈａｅａｌｅｓ古細菌ポリメラーゼ及びＴＨＥＲＭＩＮＡＴＯＲポリメラーゼの位置的に等価なアミノ酸位置は、図６Ａ～図６Ｃに示される表４に列挙される９°Ｎポリメラーゼの位置に対応する。また、図７Ａ～図７Ｂの配列アラインメントも参照されたい。

【0258】

本開示は、１つ以上の位置で変異されるＶＥＮＴ ＤＮＡポリメラーゼを含む古細菌ファミリーＢ ＤＮＡポリメラーゼを提供する。いくつかの実施形態において、変異体ＶＥＮＴ ＤＮＡポリメラーゼは、位置Ｙ７、Ｋ６１、Ｖ１０６、Ｄ１３２、Ｖ２６６、Ｇ２９３、Ｐ３３０、Ｓ３５０、Ｌ３５４、Ａ３６５、Ｅ３７６、Ｇ３９８、Ｗ４００、Ｅ４０１、Ｒ４０９、Ｓ４１０、Ｌ４１１、Ｙ４１２、Ｐ４１３、Ｙ４３４、Ｄ４３５、Ｐ４３８、Ｃ４４５、Ｒ４６３、Ｋ４６８、Ｙ４８４、Ｒ４８７、Ａ４８８、Ｉ４８９、Ｋ４９０、Ｌ４９１、Ｎ４９４、Ｉ４９６、Ｙ１０３５、Ｙ１０４０、Ｓ１０４７、Ｋ１０４８、Ｃ１０５０、Ｉ１０６２、Ｋ１４９０、Ｋ１４９２、Ｓ１５００、Ｅ１５３１、Ｒ１５３３、Ｉ１５３４、Ｄ１５４５、Ｖ１５７４、Ｄ１５７６、Ｖ１５９２、Ｑ１５９６、Ｄ１６０４、Ｒ１６２０、Ｋ１６４０、Ｉ１６４６、Ｉ１６７５、及び／またはＤ１６８５で１つ以上のアミノ酸置換変異を含む、配列番号２８３に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、またはより高い割合の配列同一性を含む。いくつかの実施形態において、配列番号２８３の１つ以上のアミノ酸置換は、それぞれ、配列番号１～２７４または２８８～３７５または３８５～３９７のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣａｎｄｉｄａｔｕｓ Ａｌｔｉａｒｃｈａｅａｌｅｓ古細菌ポリメラーゼの位置Ｋ５８、Ｃ１０４、Ｃ１３０、Ｃ２６９、Ｒ２９６、Ｐ３３５、Ｇ３５５、Ｒ３５９、Ｅ３７０、Ｄ３８１、Ｇ４０３、Ｈ４０５、Ｄ４０６、Ｒ４１４、Ｓ４１５、Ｌ４１６、Ｙ４１７、Ｐ４１８、Ｄ４３９、Ｓ４４０、Ｓ４４３、Ｃ４５０、Ｒ４６８、Ｋ４７３、Ｖ４８９、Ｑ４９２、Ａ４９３、Ｌ４９４、Ｋ４９５、Ｌ４９６、Ｎ４９９、Ｓ５００、Ｍ５０１、Ｙ５０２、Ｆ５０７、Ｃ５１４、Ｒ５１５、Ｃ５１７、Ｉ５２９、Ｎ５６７、Ｅ５６９、Ｓ５７７、Ｒ６０８、Ｋ６１０、Ｌ６１１、Ｄ６２２、Ｖ６５１、Ｄ６５３、Ａ６６９、Ｑ６７３、Ｒ６９７、Ｓ７１７、Ｒ７２３、Ｉ７５０、及びＥ７６０でアミノ酸置換と位置的に等価である。いくつかの実施形態において、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ａｌｔｉａｒｃｈａｅａｌｅｓ古細菌ポリメラーゼ及びＶＥＮＴポリメラーゼの位置的に等価なアミノ酸位置を、図６Ａ～図６Ｃに示される表４に列挙する。また、図８Ａ～図８Ｃの配列アラインメントも参照されたい。

【0259】

本開示は、１つ以上の位置で変異されるＤＥＥＰ ＶＥＮＴ ＤＮＡポリメラーゼを含む古細菌ファミリーＢ ＤＮＡポリメラーゼを提供する。いくつかの実施形態において、変異体ＤＥＥＰ ＶＥＮＴ ＤＮＡポリメラーゼは、位置Ｙ７、Ｋ６１、Ｖ１０６、Ｄ１３２、Ｉ２６４、Ｙ２９１、Ｐ３２８、Ｓ３４８、Ｌ３５２、Ｅ３６３、Ｅ３７４、Ｇ３９６、Ｗ３９８、Ｅ３９９、Ｒ４０７、Ｓ４０８、Ｌ４０９、Ｙ４１０、Ｐ４１１、Ｙ４３２、Ｄ４３３、Ｐ４３６、Ｃ４４３、Ｒ４６１、Ｒ４６６、Ｙ４８２、Ｒ４８５、Ａ４８６、Ｉ４８７、Ｋ４８８、Ｉ４８９、Ｎ４９２、Ｉ４９４、Ｙ１０３２、Ｙ１０３７、Ｃ１０４４、Ｋ１０４５、Ｃ１０４７、Ｉ１０５９、Ｋ１０９７、Ｌ１０９９、Ａ１１０７、Ｅ１１３８、Ｋ１１４０、Ｉ１１４１、Ｄ１１５２、Ｖ１１８１、Ｅ１１８３、Ｖ１１９９、Ｑ１２０３、Ｅ１２１０、Ｒ１２２７、Ｐ１２４７、Ｉ１２５３、Ｉ１２８２、及び／またはＤ１２９２で１つ以上のアミノ酸置換変異を含む、配列番号２８４に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、またはより高い割合の配列同一性を含む。いくつかの実施形態において、配列番号２８４の１つ以上のアミノ酸置換は、それぞれ、配列番号１～２７４または２８８～３７５または３８５～３９７のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣａｎｄｉｄａｔｕｓ Ａｌｔｉａｒｃｈａｅａｌｅｓ古細菌ポリメラーゼの位置Ｋ５８、Ｃ１０４、Ｃ１３０、Ｃ２６９、Ｒ２９６、Ｐ３３５、Ｇ３５５、Ｒ３５９、Ｅ３７０、Ｄ３８１、Ｇ４０３、Ｈ４０５、Ｄ４０６、Ｒ４１４、Ｓ４１５、Ｌ４１６、Ｙ４１７、Ｐ４１８、Ｄ４３９、Ｓ４４０、Ｓ４４３、Ｃ４５０、Ｒ４６８、Ｋ４７３、Ｖ４８９、Ｑ４９２、Ａ４９３、Ｌ４９４、Ｋ４９５、Ｌ４９６、Ｎ４９９、Ｓ５００、Ｍ５０１、Ｙ５０２、Ｆ５０７、Ｃ５１４、Ｒ５１５、Ｃ５１７、Ｉ５２９、Ｎ５６７、Ｅ５６９、Ｓ５７７、Ｒ６０８、Ｋ６１０、Ｌ６１１、Ｄ６２２、Ｖ６５１、Ｄ６５３、Ａ６６９、Ｑ６７３、Ｒ６９７、Ｓ７１７、Ｒ７２３、Ｉ７５０、及びＥ７６０でアミノ酸置換と位置的に等価である。いくつかの実施形態において、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ａｌｔｉａｒｃｈａｅａｌｅｓ古細菌ポリメラーゼ及びＤＥＥＰ ＶＥＮＴポリメラーゼの位置的に等価なアミノ酸位置を、図６Ａ～図６Ｃに示される表４に列挙する。また、図９Ａ～図９Ｃの配列アラインメントも参照されたい。

【0260】

本開示は、１つ以上の位置で変異されるＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼを含む古細菌ファミリーＢ ＤＮＡポリメラーゼを提供する。いくつかの実施形態において、変異体Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼは、位置Ｙ７、Ｋ６１、Ｖ１０６、Ｅ１５０、Ｉ２６４、Ｙ２９１、Ｐ３２８、Ｓ３４８、Ｌ３５２、Ｅ３６３、Ｅ３７４、Ｇ３９６、Ｗ３９８、Ｅ３９９、Ｒ４０７、Ｓ４０８、Ｌ４０９、Ｙ４１０、Ｐ４１１、Ｙ４３２、Ｄ４３３、Ｐ４３６、Ｃ４４３、Ｒ４６１、Ｔ４６６、Ｙ４８２、Ｋ４８５、Ａ４８６、Ｉ４８７、Ｋ４８８、Ｌ４８９、Ｎ４９２、Ｆ４９４、Ｙ４９５、Ｙ５００、Ｃ５０７、Ｋ５０８、Ｃ５１０、Ｉ５２２、Ｋ５６０、Ｌ５６２、Ｓ５７０、Ｅ６０１、Ｋ６０３、Ｖ６０４、Ｄ６１５、Ｖ６４４、Ｅ６４６、Ａ６６２、Ｑ６６６、Ｅ６７３、Ｋ６９０、Ｐ７１０、Ｉ７１６、Ｉ７４５、及び／またはＤ７５５で１つ以上のアミノ酸置換変異を含む、配列番号２８５に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、またはより高い割合の配列同一性を含む。いくつかの実施形態において、配列番号２８５の１つ以上のアミノ酸置換は、それぞれ、配列番号１～２７４または２８８～３７５または３８５～３９７のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣａｎｄｉｄａｔｕｓ Ａｌｔｉａｒｃｈａｅａｌｅｓ古細菌ポリメラーゼの位置Ｋ５８、Ｃ１０４、Ｃ１３０、Ｃ２６９、Ｒ２９６、Ｐ３３５、Ｇ３５５、Ｒ３５９、Ｅ３７０、Ｄ３８１、Ｇ４０３、Ｈ４０５、Ｄ４０６、Ｒ４１４、Ｓ４１５、Ｌ４１６、Ｙ４１７、Ｐ４１８、Ｄ４３９、Ｓ４４０、Ｓ４４３、Ｃ４５０、Ｒ４６８、Ｋ４７３、Ｖ４８９、Ｑ４９２、Ａ４９３、Ｌ４９４、Ｋ４９５、Ｌ４９６、Ｎ４９９、Ｓ５００、Ｍ５０１、Ｙ５０２、Ｆ５０７、Ｃ５１４、Ｒ５１５、Ｃ５１７、Ｉ５２９、Ｎ５６７、Ｅ５６９、Ｓ５７７、Ｒ６０８、Ｋ６１０、Ｌ６１１、Ｄ６２２、Ｖ６５１、Ｄ６５３、Ａ６６９、Ｑ６７３、Ｒ６９７、Ｓ７１７、Ｒ７２３、Ｉ７５０、及びＥ７６０でアミノ酸置換と位置的に等価である。いくつかの実施形態において、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ａｌｔｉａｒｃｈａｅａｌｅｓ古細菌ポリメラーゼ及びＰｆｕポリメラーゼの位置的に等価なアミノ酸位置を、図６Ａ～図６Ｃに示される表４に列挙する。また、図１１Ａ～図１１Ｂの配列アラインメントも参照されたい。

【0261】

本開示は、１つ以上の位置で変異されるＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｂｙｓｓｉ ＤＮＡポリメラーゼを含む古細菌ファミリーＢ ＤＮＡポリメラーゼを提供する。いくつかの実施形態において、変異体Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｂｙｓｓｉ ＤＮＡポリメラーゼは、位置Ｙ７、Ｋ６１、Ｖ１０６、Ｎ１３２、Ｉ２６４、Ｙ２９１、Ｐ３２８、Ｓ３４８、Ｌ３５２、Ｅ３６３、Ｅ３７４、Ｇ３９６、Ｗ３９８、Ｅ３９９、Ｒ４０７、Ｓ４０８、Ｌ４０９、Ｙ４１０、Ｐ４１１、Ｙ４３２、Ｄ４３３、Ｐ４３６、Ｃ４４３、Ｒ４６１、Ｋ４６６、Ｙ４８２、Ｒ４８５、Ａ４８６、Ｉ４８７、Ｋ４８８、Ｉ４８９、Ｎ４９２、Ｙ４９４、Ｙ４９５、Ｙ５００、Ｃ５０７、Ｋ５０８、Ｃ５１０、Ｉ５２２、Ｋ５５９、Ｌ５６１、Ｓ５６９、Ｅ６００、Ｋ６０２、Ｉ６０３、Ｄ６１４、Ｖ６４３、Ｅ６４５、Ｖ６６１、Ｑ６６５、Ｅ６７２、Ｋ６８９、Ｐ７０９、Ｉ７１５、Ｉ７４４、及び／またはＤ７５４で１つ以上のアミノ酸置換変異を含む、配列番号２８６に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、またはより高い割合の配列同一性を含む。いくつかの実施形態において、配列番号２８６の１つ以上のアミノ酸置換は、それぞれ、配列番号２～２７４または２８８～３７５または３８５～３９７のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣａｎｄｉｄａｔｕｓ Ａｌｔｉａｒｃｈａｅａｌｅｓ古細菌ポリメラーゼの位置Ｋ５８、Ｃ１０４、Ｃ１３０、Ｃ２６９、Ｒ２９６、Ｐ３３５、Ｇ３５５、Ｒ３５９、Ｅ３７０、Ｄ３８１、Ｇ４０３、Ｈ４０５、Ｄ４０６、Ｒ４１４、Ｓ４１５、Ｌ４１６、Ｙ４１７、Ｐ４１８、Ｄ４３９、Ｓ４４０、Ｓ４４３、Ｃ４５０、Ｒ４６８、Ｋ４７３、Ｖ４８９、Ｑ４９２、Ａ４９３、Ｌ４９４、Ｋ４９５、Ｌ４９６、Ｎ４９９、Ｓ５００、Ｍ５０１、Ｙ５０２、Ｆ５０７、Ｃ５１４、Ｒ５１５、Ｃ５１７、Ｉ５２９、Ｎ５６７、Ｅ５６９、Ｓ５７７、Ｒ６０８、Ｋ６１０、Ｌ６１１、Ｄ６２２、Ｖ６５１、Ｄ６５３、Ａ６６９、Ｑ６７３、Ｒ６９７、Ｓ７１７、Ｒ７２３、Ｉ７５０、及びＥ７６０でアミノ酸置換と位置的に等価である。いくつかの実施形態において、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ａｌｔｉａｒｃｈａｅａｌｅｓ古細菌ポリメラーゼ及びＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｂｙｓｓｉポリメラーゼの位置的に等価なアミノ酸位置を、図６Ａ～図６Ｃに示される表４に列挙する。また、図１２Ａ～図１２Ｂの配列アラインメントも参照されたい。

【0262】

本開示は、１つ以上の位置で変異されるＧｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼを含む古細菌ファミリーＡ ＤＮＡポリメラーゼを提供する。いくつかの実施形態において、変異体Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼは、位置Ｇ１０、Ｄ５９、Ａ９７、Ｑ１２３、Ｓ２４０、Ｇ２７７、Ｅ３２５、Ｇ３４２、Ｒ３４３、Ｅ３４９、Ａ３５９、Ｇ３８４、Ｅ３８６、Ｌ３８７、Ｌ３９４、Ｌ３９５、Ｌ３９６、Ａ３９７、Ａ３９８、Ｅ４２０、Ａ４２１、Ｓ４２４、Ｋ４３１、Ｋ４５０、Ｗ４５５、Ｋ４７６、Ｑ４７９、Ｐ４８０、Ｌ４８１、Ａ４８２、Ａ４８３、Ａ４８６、Ｍ４８８、Ｅ４８９、Ｖ４９３、Ｇ５０４、Ｓ５０５、Ｌ５０７、Ｎ５２７、Ｎ５７３、Ｌ５７５、Ｓ５８５、Ｅ６３２、Ｒ６３４、Ｋ６３５、Ｄ６４７、Ｉ６８９、Ｈ６９１、Ａ７０７、Ｇ７１１、Ｄ７１８、Ｐ７４４、Ｙ７７２、Ｓ７９９、Ｖ８２８、及び／またはＥ８４０で１つ以上のアミノ酸置換変異を含む、配列番号２７５に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、またはより高い割合の配列同一性を含む。いくつかの実施形態において、配列番号２７５の１つ以上のアミノ酸置換は、それぞれ、配列番号１～２７４または２８８～３７５または３８５～３９７のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣａｎｄｉｄａｔｕｓ Ａｌｔｉａｒｃｈａｅａｌｅｓ古細菌ポリメラーゼの位置Ｋ５８、Ｃ１０４、Ｃ１３０、Ｃ２６９、Ｒ２９６、Ｐ３３５、Ｇ３５５、Ｒ３５９、Ｅ３７０、Ｄ３８１、Ｇ４０３、Ｈ４０５、Ｄ４０６、Ｒ４１４、Ｓ４１５、Ｌ４１６、Ｙ４１７、Ｐ４１８、Ｄ４３９、Ｓ４４０、Ｓ４４３、Ｃ４５０、Ｒ４６８、Ｋ４７３、Ｖ４８９、Ｑ４９２、Ａ４９３、Ｌ４９４、Ｋ４９５、Ｌ４９６、Ｎ４９９、Ｓ５００、Ｍ５０１、Ｙ５０２、Ｆ５０７、Ｃ５１４、Ｒ５１５、Ｃ５１７、Ｉ５２９、Ｎ５６７、Ｅ５６９、Ｓ５７７、Ｒ６０８、Ｋ６１０、Ｌ６１１、Ｄ６２２、Ｖ６５１、Ｄ６５３、Ａ６６９、Ｑ６７３、Ｒ６９７、Ｓ７１７、Ｒ７２３、Ｉ７５０、及びＥ７６０でアミノ酸置換と位置的に等価である。いくつかの実施形態において、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ａｌｔｉａｒｃｈａｅａｌｅｓ古細菌ポリメラーゼ及びＧｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓポリメラーゼの位置的に等価なアミノ酸位置を、図６Ａ～図６Ｃに示される表４に列挙する。また、図１０Ａ～図１０Ｂの配列アラインメントも参照されたい。

【0263】

本開示は、検出可能なレポーター部分に作動可能に連結されたポリメラーゼを提供する。本明細書に記載のポリメラーゼのうちのいずれかは、本明細書に記載の任意のポリメラーゼの野生型または変異体アミノ酸配列骨格を有するポリメラーゼを含む、検出可能なレポーター部分で標識することができ、これには、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ａｌｔｉａｒｃｈａｅａｌｅｓ古細菌ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、配列番号１～２７４または２８８～３７５または３８５～３９７のうちのいずれか）、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、配列番号２７５～２７９）、９°Ｎ ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、配列番号２８０及び２８１）、ＴＨＥＲＭＩＮＡＴＯＲ ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、配列番号２８２）、ＶＥＮＴ ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、配列番号２８３）、ＤＥＥＰ ＶＥＮＴ ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、配列番号２８４）、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、配列番号２８５）、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｂｙｓｓｉ ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、配列番号２８６）、及びＲＢ６９ ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、配列番号２８７）が含まれる。いくつかの実施形態において、検出可能なレポーター部分は、化学的または物理的変化（例えば、熱、光、電気的、ｐＨ、塩濃度、酵素活性、またはＦＲＥＴなどの近接事象）に起因する検出可能なシグナルを生成する。いくつかの実施形態において、検出可能なレポーター部分は、発光部分、蛍光部分、または消光剤を含む。いくつかの実施形態において、検出可能な部分は、ＦＲＥＴドナーまたはアクセプターとして作用する蛍光部分を含む。検出可能なレポーター部分は、Ｎ末端、Ｃ末端、または任意の内部位置でポリメラーゼに結合することができる。検出可能なレポーター部分は、ポリメラーゼが核酸鋳型分子、核酸プライマー、またはヌクレオチドに結合する能力を妨げない方法でポリメラーゼに結合する。検出可能なレポーター部分は、ヌクレオチドの取り込みを含むポリメラーゼの触媒活性を妨げない方法でポリメラーゼに結合する。

【0264】

本開示は、親和性精製、切断、または可溶化のための２つ以上の外因性アミノ酸配列のうちのいずれか１つまたはいずれかの組み合わせに作動可能に連結される、本明細書に記載のＤＮＡポリメラーゼのうちのいずれかを含む組換え融合ポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態において、組換え融合ポリペプチドは、本明細書に記載の野生型及び変異体ポリメラーゼのうちのいずれか、ならびに本明細書に記載の表４（図６Ａ～図６Ｃ）に示される部位に対して位置的に等価な変異部位である部位で置換変異を有するポリメラーゼを含み、これには、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ａｌｔｉａｒｃｈａｅａｌｅｓ古細菌ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、配列番号１～２７４または２８８～３７５または３８５～３９７のうちのいずれか）、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、配列番号２７５～２７９）、９°Ｎ ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、配列番号２８０及び２８１）、ＴＨＥＲＭＩＮＡＴＯＲ ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、配列番号２８２）、ＶＥＮＴ ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、配列番号２８３）、ＤＥＥＰ ＶＥＮＴ ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、配列番号２８４）、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、配列番号２８５）、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｂｙｓｓｉ ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、配列番号２８６）、及びＲＢ６９ ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、配列番号２８７）のアミノ酸配列骨格配列を有するポリメラーゼが含まれる。

【0265】

いくつかの実施形態において、組換え融合ポリペプチドは、少なくとも１つの親和性精製タグ配列に対してそれらのＮ末端及び／またはＣ末端（複数可）で作動可能に連結される、本明細書に記載の野生型及び変異体ポリメラーゼのうちのいずれかを含み、親和性精製タグ配列（複数可）は、ヒスチジンタグ（例えば、ヘキサ－ヒスチジンタグ（配列番号３９８））、ＦＬＡＧタグ、Ｔ７タグ、Ｓｔｒｅｐ ＩＩタグ、Ｓタグ（例えば、膵臓リボヌクレアーゼＡ由来）、ＨＡタグ（例えば、ヒトインフルエンザヘマグルチニンタンパク質由来）及び／またはｃ－Ｍｙｃタグを含む。

【0266】

いくつかの実施形態において、組換え融合ポリペプチドは、少なくとも１つのポリペプチド切断配列に対してそれらのＮ末端及び／またはＣ末端（複数可）で作動可能に連結される、本明細書に記載の野生型及び変異体ポリメラーゼのうちのいずれかを含むか、またはポリペプチド切断配列は、親和性タグ配列とポリメラーゼ配列のＮ末端またはＣ末端との間に配置することができる。いくつかの実施形態において、ポリペプチド切断配列は、プロテアーゼまたは還元条件で認識及び切断することができる。いくつかの実施形態において、ポリペプチド切断配列は、トロンビン切断配列、ＴＥＶ切断配列（例えば、ＡｃＴＥＶ及びＰｒｏＴＥＶを含むｔｏｂａｃｃｏ ｅｔｃｈウイルスから）、第Ｘａ因子切断配列、エンテロキナーゼ切断配列、及びＳＵＭＯ切断配列（例えば、Ｕｌｐ１、Ｓｅｎｐ２、及びＳＵＭＯｓｔａｒを含む小ユビキチン様修飾）を含む。

【0267】

いくつかの実施形態において、組換え融合ポリペプチドは、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、小ユビキチン様修飾因子（ＳＵＭＯ）、及びグルタチオンＳ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）を含む、可溶化を改善するための少なくとも１つの外因性アミノ酸配列に対してＮ末端及び／またはＣ末端（複数可）で作動可能に連結される、本明細書に記載の野生型及び変異体ポリメラーゼのうちのいずれかを含む。

【0268】

ポリメラーゼを含むシステム
本開示は、１つ以上の変異体ポリメラーゼと、自己プライミング３’末端を有する少なくとも１つの核酸鋳型分子と、を含むシステムを提供する。いくつかの実施形態において、１つ以上の変異体ポリメラーゼは、自己プライミング３’末端を有する少なくとも１つの核酸鋳型分子に結合してもしなくてもよい。いくつかの実施形態において、鋳型分子の自己プライミング３’末端は、ヌクレオチド重合のための開始部位を提供する。いくつかの実施形態において、変異体ポリメラーゼは、上で考察した１つ以上の例示的な変異体ポリメラーゼの特性を含む。

【0269】

本開示は、１つ以上の変異体ポリメラーゼと、少なくとも１つの核酸鋳型分子と、少なくとも１つの核酸プライマーと、を含むシステムを提供する。いくつかの実施形態において、１つ以上の変異体ポリメラーゼは、少なくとも１つの核酸鋳型分子及び少なくとも１つの核酸プライマーに結合してもしなくてもよい。いくつかの実施形態において、プライマーは、ヌクレオチド重合のための開始部位を提供する。いくつかの実施形態において、プライマーは、ポリメラーゼ触媒によるヌクレオチドの取り込み反応のための３’伸長可能な末端を含むか、またはプライマーは、３’伸長不可能な末端を含む。いくつかの実施形態において、核酸鋳型分子は、少なくとも１つのウリジンヌクレオチドを含むか、またはウリジンヌクレオチドを欠く。いくつかの実施形態において、変異体ポリメラーゼは、上で考察した１つ以上の例示的な変異体ポリメラーゼの特性を含む。

【0270】

いくつかの実施形態において、本システムは、核酸二本鎖に結合した１つ以上の変異体ポリメラーゼを含み、各々、核酸プライマーにハイブリダイズする核酸鋳型を含み、それによって複合ポリメラーゼを形成する。いくつかの実施形態において、プライマーは、ヌクレオチド重合のための開始部位を提供する。いくつかの実施形態において、変異体ポリメラーゼは、自己プライミング３’末端を有する核酸鋳型分子に結合して、別個のプライマー分子を欠く複合ポリメラーゼを形成する。いくつかの実施形態において、核酸鋳型分子は、少なくとも１つのウリジンヌクレオチドを含むか、またはウリジンヌクレオチドを欠く。いくつかの実施形態において、変異体ポリメラーゼは、上で考察した１つ以上の例示的な変異体ポリメラーゼの特性を含む。

【0271】

いくつかの実施形態において、システムは、１つ以上の変異体ポリメラーゼ、少なくとも１つの核酸鋳型分子、及びヌクレオチド重合のための開始部位を含み、変異体ポリメラーゼは、溶液中にあり、核酸鋳型分子は、溶液中にあり、開始部位（例えばプライマー）は、溶液中にある。いくつかの実施形態において、システムは、１つ以上の変異体ポリメラーゼ、少なくとも１つの核酸鋳型分子、及びヌクレオチド重合のための開始部位を含み、システムは、溶液中にある変異体ポリメラーゼ、溶液中にあるかもしくは支持体に固定化された核酸鋳型分子、ならびに溶液中にあるかもしくは支持体に固定化された開始部位（例えば、プライマー）の任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、システムは、１つ以上の変異体ポリメラーゼ、少なくとも１つの核酸鋳型分子、及びヌクレオチド重合のための開始部位を含み、システムは、溶液中にある変異体ポリメラーゼ、溶液中にあるかもしくは支持体に固定化された核酸鋳型分子、ならびに溶液中にあるかもしくは支持体に固定化された開始部位（例えば、プライマー）の任意の組み合わせを含む。

【0272】

システムにおけるいくつかの実施形態において、変異体ポリメラーゼは、配列番号１または３９１のアミノ酸配列を有する野生型ポリメラーゼと比較して、増加した熱安定性を示す。例えば、変異体ポリメラーゼは、約２５～５０℃または約４５～７５℃の温度範囲で増加した熱安定性を示す。

【0273】

システムにおけるいくつかの実施形態において、変異体ポリメラーゼは、配列番号１または３９１を含む野生型ポリメラーゼと比較して、ヌクレオチド類似体の増加した取り込み率を示し、ヌクレオチド類似体は、糖２’位及び／または３’糖位に鎖終結部分（例えば、ブロック部分）を含む。

【0274】

いくつかの実施形態において、システムは、１つ以上の変異体ポリメラーゼと、複数の核酸二本鎖と、を含み、各々、核酸プライマーにハイブリダイズする核酸鋳型を含む。いくつかの実施形態において、１つ以上のポリメラーゼ及び核酸二本鎖は、複数のヌクレオチドを更に含む。１つ以上の変異体ポリメラーゼは、核酸二本鎖に結合していても、結合してもしなくてもよい。１つ以上の変異体ポリメラーゼは、ヌクレオチドのうちの１つに結合してもしなくてもよい。いくつかの実施形態において、１つまたは変異体ポリメラーゼは、核酸プライマーにハイブリダイズする核酸鋳型を含む核酸二本鎖に結合し、それによって複合ポリメラーゼを形成し、システムは、複数のヌクレオチドを更に含む。いくつかの実施形態において、変異体ポリメラーゼは、上で考察した１つ以上の例示的な変異体ポリメラーゼの特性を含む。

【0275】

システムにおけるいくつかの実施形態において、ヌクレオチドは、取り込まれることなく、複合ポリメラーゼに結合することができる。いくつかの実施形態において、相補的ヌクレオチドは、ポリメラーゼ触媒による取り込みを受けることなく、複合ポリメラーゼに結合し、相補的ヌクレオチドが鋳型鎖内の相補的ヌクレオチドと反対側の位置でプライマーの３’末端に結合する三元複合体を形成することができる。

【0276】

システムにおけるいくつかの実施形態において、複数のヌクレオチドのうちの少なくとも１つのヌクレオチドは、塩基、糖、及び少なくとも１つのリン酸基を含む。例えば、ヌクレオチド単位は、芳香族塩基、５－炭素糖（例えば、リボースまたはデオキシリボース）、及び１つ以上のリン酸基（例えば、１～１０個のリン酸基）を含み得、ヌクレオチドの芳香族塩基は、アデニン、グアニン、シトシン、チミン、またはウラシルを含む。いくつかの実施形態において、複数のヌクレオチドは、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、及びｄＵＴＰからなる群から選択される１つの種類のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、複数のヌクレオチドは、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、及び／またはｄＵＴＰからなる群から選択される２つ以上の種類のヌクレオチドの任意の組み合わせの混合物を含む。いくつかの実施形態において、複数のヌクレオチド中のヌクレオチドのうちの少なくとも１つは、フルオロフォアで標識される。いくつかの実施形態において、複数のヌクレオチドは、フルオロフォア標識を欠く。この段落に記載の１つ以上の特性は、本開示に記載の様々な実施形態における任意の例示的なヌクレオチド単位に現れ得る。この段落に記載の特性は、本開示を通して「例示的なヌクレオチド単位特性」と称される。

【0277】

いくつかの実施形態において、システムにおいて、複数のヌクレオチドの少なくとも１つのヌクレオチドが、１つ、２つ、または３つのリン原子の鎖を含み、その鎖は、典型的には、エステルまたはホスホラミド結合を介して糖部分の５’炭素に結合する。いくつかの実施形態において、複数の中の少なくとも１つのヌクレオチドは、リン原子が介在するＯ、Ｓ、ＮＨ、メチレン、またはエチレンと一緒に連結されるリン鎖を有する類似体である。いくつかの実施形態において、鎖内のリン原子は、Ｏ、Ｓ、またはＢＨ_３を含む置換側基を含む。いくつかの実施形態において、鎖は、ホスホロアミデート、ホスホロチオエート、ホスホルジチオエート、及びＯ－メチルホスホロアミダイト基を含む類似体で置換されたホスフェート基を含む。

【0278】

いくつかの実施形態において、システムにおいて、複数のヌクレオチドのうちの少なくとも１つのヌクレオチドは、糖２’位、糖３’位、または糖２’及び３’位に鎖終結部分（例えば、ブロック部分）を有するヌクレオチド類似体を含む。いくつかの実施形態において、鎖終結部分は、プライマー伸長反応中の新生鎖における後続のヌクレオチド単位または遊離ヌクレオチドのポリメラーゼ触媒による取り込みを阻害することができる。いくつかの実施形態において、鎖終結部分は、糖がリボースまたはデオキシリボース糖部分を含む３’糖ヒドロキシル位に結合される。いくつかの実施形態において、鎖終結部分は、３’糖ヒドロキシル位から除去可能／開裂可能であり、ポリメラーゼ触媒によるヌクレオチドの取り込み反応において後続のヌクレオチドとともに伸長可能な３’ＯＨ糖基を有するヌクレオチドを生成する。いくつかの実施形態において、鎖終結部分は、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリル基、アリール基、ベンジル基、アジド（ａｚｉｄｅ）基、アミン基、アミド基、ケト基、イソシアネート基、リン酸基、チオ基、ジスルフィド基、炭酸基、尿素基、またはシリル基を含む。いくつかの実施形態において、鎖終結部分は、例えば、鎖終結部分を化学薬品、ｐＨ変化、光または熱と反応させることによって、ヌクレオチドから開裂可能／除去可能である。いくつかの実施形態において、鎖終結部分アルキル、アルケニル、アルキニル、及びアリルは、ピペリジンを有するテトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）（Ｐｄ（ＰＰｈ_３）_４）、または２，３－ジクロロ－５，６－ジシアノ－１，４－ベンゾ－キノン（ＤＤＱ）を用いて開裂可能である。いくつかの実施形態において、鎖終結部分アリール及びベンジルは、Ｈ２ Ｐｄ／Ｃを用いて開裂可能である。いくつかの実施形態において、鎖終結部分アミン、アミド、ケト、イソシアネート、リン酸塩、チオ、ジスルフィドは、ホスフィン、またはβ－メルカプトエタノールもしくはジチオトリトール（ＤＴＴ）を含むチオール基を用いて開裂可能である。いくつかの実施形態において、鎖終結部分炭酸塩は、ＭｅＯＨ中の炭酸カリウム（Ｋ_２ＣＯ_３）、ピリジン中のトリエチルアミン、または酢酸（ＡｃＯＨ）中のＺｎを用いて開裂可能である。いくつかの実施形態において、鎖終結部分尿素及びシリルは、テトラブチルアンモニウムフルオリド、ピリジン－ＨＦ、フッ化アンモニウム、またはトリエチルアミントリヒドロフルオリドを用いて開裂可能である。鎖終結部分を含むヌクレオチド類似体のこの段落に記載の１つ以上の特性は、本開示に記載の様々な実施形態において、任意の例示的なヌクレオチド類似体に現れ得る。この段落に記載のヌクレオチド類似体の特性は、本開示を通して「例示的なヌクレオチド類似体特性」と称される。同様に、この段落に記載の１つ以上の鎖終結部分の特性は、本開示に記載の様々な実施形態において、任意の例示的な鎖終結部分に現れ得る。「鎖終結部分の実施形態」という語句は、本開示を通して、この段落に記載の１つ以上の鎖終結部分の特性のうちのいずれかを指すために使用される。

【0279】

いくつかの実施形態において、システムにおいて、複数のヌクレオチドの少なくとも１つのヌクレオチドは、糖２’位、糖３’位、または糖２’及び３’位に鎖終結部分（例えば、ブロック部分）を有するターミネーターヌクレオチド類似体を含む。いくつかの実施形態において、鎖終結部分はアジド（ａｚｉｄｅ）、アジド（ａｚｉｄｏ）、またはアジドメチル基を含む。いくつかの実施形態において、鎖終結部分は、３’－Ｏ－アジドまたは３’－Ｏ－アジドメチル基を含む。いくつかの実施形態において、鎖終結部分アジド（ａｚｉｄｅ）、アジド（ａｚｉｄｏ）、及びアジドメチル基は、ホスフィン化合物を用いて開裂可能／除去可能である。いくつかの実施形態において、ホスフィン化合物は、誘導体化トリアルキルホスフィン部分または誘導体化トリアリールホスフィン部分を含む。いくつかの実施形態において、ホスフィン化合物は、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）またはビススルホトリフェニルホスフィン（ＢＳ－ＴＰＰ）またはトリ（ヒドロキシプロイル）ホスフィン（ＴＨＰＰ）を含む。いくつかの実施形態において、開裂剤は、４－ジメチルアミノピリジン（４－ＤＭＡＰ）を含む。いくつかの実施形態において、システムにおいて、ヌクレオチド類似体は、３’－デオキシヌクレオチド、２’，３’－ジデオキシヌクレオチド、３’－メチル、３’－アジド、３’－アジドメチル、３’－Ｏ－アジドアルキル、３’－Ｏ－エチニル、３’－Ｏ－アミノアルキル、３’－Ｏ－フルオロアルキル、３’－フルオロメチル、３’－ジフルオロメチル、３’－トリフルオロメチル、３’－スルホニル、３’－マロニル、３’－アミノ、３’－Ｏ－アミノ、３’－スルフヒドラル、３’－アミノメチル、３’－エチル、３’ブチル、３’－ｔｅｒｔブチル、３’－フルオレニルメチルオキシカルボニル、３’ｔｅｒｔ－ブチルオキシカルボニル、３’－Ｏ－アルキルヒドロキシルアミノ基、３’－ホスホロチオート、及び３－Ｏ－ベンジル、またはそれらの誘導体からなる群から選択される鎖終結部分を含む。この段落に記載の１つ以上の特性は、本開示に記載の様々な実施形態において、アジド（ａｚｉｄｅ）、アジド（ａｚｉｄｏ）、またはアジドメチル基を含む任意の鎖終結部分に現れ得る。「鎖終結部分は、アジド（ａｚｉｄｅ）、アジド（ａｚｉｄｏ）、またはアジドメチル基を含む」という語句は、本開示を通して、この段落に記載の１つ以上の鎖終結部分特性のうちのいずれかを指すために使用される。

【0280】

いくつかの実施形態において、システムにおいて、複数のヌクレオチドは、検出可能なレポーター部分、例えば、フルオロフォアを欠く複数のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、システムにおいて、複数のヌクレオチドは、検出可能なレポーター部分で標識された複数のヌクレオチドを含む。検出可能なレポーター部分は、フルオロフォアを含む。いくつかの実施形態において、フルオロフォアは、ヌクレオチド塩基に結合する。いくつかの実施形態において、フルオロフォアは、塩基から開裂可能／除去可能であるリンカーによってヌクレオチド塩基に結合する。

【0281】

いくつかの実施形態において、システムにおいて、塩基上の開裂可能なリンカーは、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリル基、アリール基、ベンジル基、アジド（ａｚｉｄｅ）基、アミン基、アミド基、ケト基、イソシアネート基、リン酸基、チオ基、ジスルフィド基、炭酸基、尿素基、またはシリル基を含む開裂可能な部分を含む。いくつかの実施形態において、塩基上の開裂可能なリンカーは、開裂可能な部分を化学薬品、ｐＨ変化、光または熱と反応させることによって、塩基から開裂可能／除去可能である。いくつかの実施形態において、開裂可能な部分アルキル、アルケニル、アルキニル、及びアリルは、ピペリジンを有するテトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）（Ｐｄ（ＰＰｈ_３）_４）、または２，３－ジクロロ－５，６－ジシアノ－１，４－ベンゾ－キノン（ＤＤＱ）を用いて開裂可能である。いくつかの実施形態において、開裂可能な部分アリール及びベンジルは、Ｈ２ Ｐｄ／Ｃを用いて開裂可能である。いくつかの実施形態において、開裂可能な部分アミン、アミド、ケト、イソシアネート、リン酸塩、チオ、ジスルフィドは、ホスフィン、またはβ－メルカプトエタノールもしくはジチオトリトール（ＤＴＴ）を含むチオール基を用いて開裂可能である。いくつかの実施形態において、開裂可能な部分炭酸塩は、ＭｅＯＨ中の炭酸カリウム（Ｋ_２ＣＯ_３）、ピリジン中のトリエチルアミン、または酢酸（ＡｃＯＨ）中のＺｎを用いて開裂可能である。いくつかの実施形態において、開裂可能な部分尿素及びシリルは、テトラブチルアンモニウムフルオリド、ピリジン－ＨＦ、フッ化アンモニウム、またはトリエチルアミントリヒドロフルオリドを用いて開裂可能である。

【0282】

いくつかの実施形態において、システムにおいて、塩基上の開裂可能なリンカーは、アジド（ａｚｉｄｅ）、アジド（ａｚｉｄｏ）、またはアジドメチル基を含む開裂可能な部分を含む。いくつかの実施形態において、開裂可能な部分アジド（ａｚｉｄｅ）、アジド（ａｚｉｄｏ）、及びアジドメチル基は、ホスフィン化合物を用いて開裂可能／除去可能である。いくつかの実施形態において、ホスフィン化合物は、誘導体化トリアルキルホスフィン部分または誘導体化トリアリールホスフィン部分を含む。いくつかの実施形態において、ホスフィン化合物は、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）またはビススルホトリフェニルホスフィン（ＢＳ－ＴＰＰ）またはトリ（ヒドロキシプロイル）ホスフィン（ＴＨＰＰ）を含む。いくつかの実施形態において、開裂剤は、４－ジメチルアミノピリジン（４－ＤＭＡＰ）を含む。

【0283】

いくつかの実施形態において、システムにおいて、鎖終結部分（例えば、糖２’及び／または糖３’位）ならびに塩基上の開裂可能なリンカーは、同じまたは異なる開裂可能な部分を有する。いくつかの実施形態において、鎖終結部分（例えば、糖２’及び／または糖３’位）ならびに塩基に連結された検出可能なレポーター部分は、同じ化学薬品を用いて化学的に開裂可能／除去可能である。いくつかの実施形態において、鎖終結部分（例えば、糖２’及び／または糖３’位）及び塩基に連結された検出可能なレポーター部分は、異なる化学薬品を用いて化学的に開裂可能／除去可能である。

【0284】

いくつかの実施形態において、システムは、１つ以上の変異体ポリメラーゼと、核酸二本鎖と、を含み、各々、核酸プライマーにハイブリダイズする核酸鋳型を含む。いくつかの実施形態において、１つ以上のポリメラーゼ及び核酸二本鎖は、複数の多価分子を更に含む。１つ以上の変異体ポリメラーゼは、核酸二本鎖に結合していても、結合してもしなくてもよい。１つ以上の変異体ポリメラーゼは、多価分子のうちの１つ以上に結合してもしなくてもよい。いくつかの実施形態において、１つまたは変異体ポリメラーゼは、核酸プライマーにハイブリダイズする核酸鋳型を含む核酸二本鎖に結合し、それによって複合ポリメラーゼを形成し、システムは、複数の多価分子を更に含む。いくつかの実施形態において、変異体ポリメラーゼは、上で考察した１つ以上の例示的な変異体ポリメラーゼの特性を含む。

【0285】

本システムのいくつかの実施形態において、複数の多価分子の少なくとも１つの多価分子は、（ａ）コアと、（ｂ）複数のヌクレオチドアームであって、（ｉ）コア結合部分と、（ｉｉ）ＰＥＧ部分を含むスペーサーと、（ｉｉｉ）リンカーと、（ｉｖ）ヌクレオチド単位とを含む、複数のヌクレオチドアームと、を含み、コアは複数のヌクレオチドアームに結合し、スペーサーはリンカーに結合し、リンカーはヌクレオチド単位に結合する。いくつかの実施形態において、ヌクレオチド単位は、塩基、糖、及び少なくとも１つのリン酸基を含み、リンカーは、塩基を介してヌクレオチド単位に結合する。例示的なスペーサーを図１６Ａ（上）に示す。様々な例示的なリンカーを図１６Ａ（下）及び図１６Ｂに示す。ヌクレオチド単位に連結／結合する様々なリンカーの例を図１７Ａ～１７Ｃに示し、ピリミジン塩基の５位置またはプリン塩基の７位置がプロパルギルアミン結合を介してリンカーに結合する（図１８も参照されたい）。いくつかの実施形態において、コアは、ストレプトアビジン型またはアビジン型部分を含み、コア結合部分は、ビオチンを含む。いくつかの実施形態において、リンカーは、２～６個のサブユニットを有する脂肪族鎖、または２～６個のサブユニットを有するオリゴエチレングリコール鎖を含む。いくつかの実施形態において、リンカーは、芳香族部分を更に含む。いくつかの実施形態において、リンカーは、脂肪族鎖またはオリゴエチレングリコール鎖を含み、両方のリンカー鎖は、２～６個のサブユニットを有する。いくつかの実施形態において、リンカーは、芳香族部分も含む。例示的なスペーサーを図１６Ａ（上）に示し、例示的なリンカーを図１６Ａ（下）及び図１６Ｂに示す。例示的なヌクレオチドアームを図１５Ｂに示す。例示的な多価分子を、図１４Ａ、１４Ｂ、及び１５Ａに示す。いくつかの実施形態において、ヌクレオチド単位は、芳香族塩基、５炭素糖、及び１～１０個のリン酸基を含む。いくつかの実施形態において、リンカーは、塩基を介してヌクレオチド単位に結合する。いくつかの実施形態において、コアに結合する複数のヌクレオチドアームは、同じ種類のヌクレオチド単位を有し、ヌクレオチド単位の種類は、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、及びｄＵＴＰからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、複数の多価分子は、１つの種類の多価分子を含み、複数の各多価分子は、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、及びｄＵＴＰからなる群から選択される同じ種類のヌクレオチド単位を有する。いくつかの実施形態において、複数の多価分子は、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ及び／またはｄＵＴＰからなる群から選択されるヌクレオチド単位を有する２つ以上の種類の多価分子の任意の組み合わせの混合物を含む。この段落に記載の１つ以上の特性は、本開示に記載の様々な実施形態における任意の例示的な多価分子に現れ得る。この段落に記載される特性は、本開示を通して「多価分子の実施形態」と称される。

【0286】

システムにおけるいくつかの実施形態において、ヌクレオチドアームは、ヌクレオチドアームのヌクレオチド単位が、遊離ヌクレオチドと同様の方法でポリメラーゼ酵素と相互作用することができるように設計される。ヌクレオチドアームのヌクレオチド単位は、核酸鋳型及び核酸プライマー（例えば、ヌクレオチド会合）と複合体化されたポリメラーゼに結合することができる。ヌクレオチド単位はまた、複合ポリメラーゼから解離し、同じ複合ポリメラーゼに再結合するか、または多価分子に近接する異なる複合ポリメラーゼに結合することができる。多価分子は、複数のヌクレオチドアームを含むため、単一の多価分子のヌクレオチド単位は、同時に複数の複合ポリメラーゼに結合することができる。多価分子は、ヌクレオチド結合反応におけるシグナルを増強することができるヌクレオチドの局所濃度を効果的に増加させる。

【0287】

システムにおけるいくつかの実施形態において、多価分子のヌクレオチド単位は、取り込まれることなく、複合ポリメラーゼに結合することができる。いくつかの実施形態において、多価分子の相補的ヌクレオチド単位は、ポリメラーゼ触媒による取り込みを受けることなく、複合ポリメラーゼに結合し、相補的ヌクレオチドが鋳型鎖内の相補的ヌクレオチドと反対側の位置でプライマーの３’末端に結合することができる。

【0288】

システムにおけるいくつかの実施形態において、多価分子のヌクレオチド単位は、複合ポリメラーゼに結合し、（例えば、ポリメラーゼと複合体化された）伸長可能なプライマーの３’末端に取り込むことによってプライマー伸長を受けることができ、プライマー伸長をもたらす。ヌクレオチド単位が糖３’ＯＨを含む場合、その後のヌクレオチドを新生の伸長プライマーに取り込むことができる。ヌクレオチド単位が、ブロック基で置換された糖３’ＯＨを含む場合、その後のヌクレオチドが新生の伸長プライマー鎖に取り込まれるのをブロックする。（多価分子の）ヌクレオチド単位は、鋳型鎖内の相補的ヌクレオチドの反対側にある位置でプライマーの３’末端に結合することができる。ヌクレオチド単位は、ポリメラーゼ触媒による反応においてヌクレオチドの取り込みを受け、それによってプライマーを１つのヌクレオチドだけ伸長することができる。

【0289】

システムにおけるいくつかの実施形態において、多価分子のコア単位は、異なる種類のヌクレオチド単位を担持する異なる多価分子との区別を可能にする方法で、検出可能なレポーター部分（例えば、フルオロフォア）で標識することができる。例えば、第１の多価分子のコア単位は、第１のフルオロフォアで標識され、第１の多価分子は、ｄＧＴＰヌクレオチド単位を有する複数のヌクレオチドアームを含む。第２の多価分子のコア単位は、（第１のフルオロフォアとは異なる）第２のフルオロフォアで標識され、第２の多価分子は、ｄＡＴＰヌクレオチド単位を有する複数のヌクレオチドアームを含む。ヌクレオチド単位の結合及び取り込み事象を検出することができ、ヌクレオチド単位の特異的塩基（多価分子の一部として）は、コア上の検出可能なレポーター部分の検出及び識別に基づいて識別することができる。

【0290】

システムにおけるいくつかの実施形態において、多価分子のコアは、異なる種類のヌクレオチド単位を担持する異なる多価分子との区別を可能にする方法で、検出可能なレポーター部分（例えば、フルオロフォア）で標識することができる。例えば、第１の多価分子のコアは、第１のフルオロフォアで標識され、第１の多価分子は、ｄＧＴＰヌクレオチド単位を有する複数のヌクレオチドアームを含む。第２の多価分子のコアは、（第１のフルオロフォアとは異なる）第２のフルオロフォアで標識され、第２の多価分子は、ｄＡＴＰヌクレオチド単位を有する複数のヌクレオチドアームを含む。ヌクレオチド単位の結合及び取り込み事象を検出することができ、ヌクレオチド単位の特異的塩基（多価分子の一部として）は、第１及び第２のコア上の検出可能なレポーター部分の検出及び識別に基づいて識別することができる。

【0291】

システムにおけるいくつかの実施形態において、多価分子のヌクレオチドアームの少なくとも１つのリンカーは、異なる種類のヌクレオチド単位を担持する異なる多価分子との区別を可能にする方法で、検出可能なレポーター部分（例えば、フルオロフォア）で標識することができる。例えば、第１の多価分子の少なくとも１つのリンカーは、第１のフルオロフォアで標識され、第１の多価分子は、ｄＧＴＰヌクレオチド単位を有する複数のヌクレオチドアームを含む。第２の多価分子の少なくとも１つのリンカーは、（第１のフルオロフォアとは異なる）第２のフルオロフォアで標識され、第２の多価分子は、ｄＡＴＰヌクレオチド単位を有する複数のヌクレオチドアームを含む。ヌクレオチド単位の結合及び取り込み事象を検出することができ、ヌクレオチド単位の特異的塩基（多価分子の一部として）は、第１及び第２のリンカー上の検出可能なレポーター部分の検出及び識別に基づいて識別することができる。

【0292】

システムにおけるいくつかの実施形態において、多価分子のヌクレオチドアームの少なくとも１つのヌクレオチド単位（例えば、ヌクレオ塩基）は、異なる種類のヌクレオチド単位を担持する異なる多価分子との区別を可能にする方法で、検出可能なレポーター部分（例えば、フルオロフォア）で標識することができる。例えば、第１の多価分子の少なくとも１つのヌクレオチド単位は、第１のフルオロフォアで標識され、第１の多価分子は、ｄＧＴＰヌクレオチド単位を有する複数のヌクレオチドアームを含む。第２の多価分子の少なくとも１つのヌクレオチド単位は、（第１のフルオロフォアとは異なる）第２のフルオロフォアで標識され、第２の多価分子は、ｄＡＴＰヌクレオチド単位を有する複数のヌクレオチドアームを含む。ヌクレオチド単位の結合及び取り込み事象を検出することができ、ヌクレオチド単位の特異的塩基（多価分子の一部として）は、第１及び第２のヌクレオチド単位上の検出可能なレポーター部分の検出及び識別に基づいて識別することができる。

【0293】

システムにおけるいくつかの実施形態において、多価分子のヌクレオチドアームに結合する少なくとも１つのヌクレオチド単位は、異なる種類のヌクレオチド単位を担持する異なる多価分子との区別を可能にする方法で、検出可能なレポーター部分（例えば、フルオロフォア）で標識することができる。例えば、第１の多価分子のヌクレオチド単位は、第１のフルオロフォアで標識され、第１の多価分子は、ｄＧＴＰヌクレオチド単位を有する複数のヌクレオチドアームを含む。第２の多価分子のヌクレオチド単位は、（第１のフルオロフォアとは異なる）第２のフルオロフォアで標識され、第２の多価分子は、ｄＡＴＰヌクレオチド単位を有する複数のヌクレオチドアームを含む。ヌクレオチド単位の結合及び取り込み事象を検出することができ、ヌクレオチド単位の特異的塩基（多価分子の一部として）は、ヌクレオチド単位上の検出可能なレポーター部分の検出及び識別に基づいて識別することができる。

【0294】

いくつかの実施形態において、システムにおいて、複数の多価分子の個々の多価分子は、複数のヌクレオチドアームに結合するコアを含み、複数のヌクレオチドアームは、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、及びｄＵＴＰからなる群から選択される同じ種類のヌクレオチド単位を有する。

【0295】

いくつかの実施形態において、システムにおいて、複数の多価分子の少なくとも１つの多価分子は、１つ、２つ、または３つのリン原子の鎖を有するヌクレオチド単位を含み、その鎖は、典型的には、エステルまたはホスホラミド結合を介して糖部分の５’炭素に結合する。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのヌクレオチド単位は、リン原子が介在するＯ、Ｓ、ＮＨ、メチレン、またはエチレンと一緒に連結されるリン鎖を有する類似体である。いくつかの実施形態において、鎖内のリン原子は、Ｏ、Ｓ、またはＢＨ_３を含む置換側基を含む。いくつかの実施形態において、鎖は、ホスホロアミデート、ホスホロチオエート、ホスホルジチオエート、及びＯ－メチルホスホロアミダイト基を含む類似体で置換されたホスフェート基（例えば、１～１０のリン酸基）を含む。

【0296】

いくつかの実施形態において、システムにおいて、複数の多価分子中の個々の多価分子は、複数のヌクレオチドアームに結合するコアを含み、個々のヌクレオチドアームは、糖２’位、糖３’位、または糖２’及び３’位に鎖終結部分（例えば、ブロック部分）を有するヌクレオチド単位を含む。

【0297】

いくつかの実施形態において、システムにおいて、複数の多価分子中の少なくとも１つの多価分子は、上で考察した１つ以上の例示的なヌクレオチド類似体特性を含むヌクレオチド類似体を含むヌクレオチド単位を含む。

【0298】

いくつかの実施形態において、システムにおいて、複数の多価分子中の少なくとも１つの多価分子は、糖２’位、糖３’位、または糖２’及び３’位に鎖終結部分（例えば、ブロック部分）を有するターミネーターヌクレオチド類似体を含むヌクレオチド単位を含む。鎖終結部分は、上記の鎖終結部分の実施形態のうちのいずれかを含み得る開裂可能な部分を介して３’－ＯＨ糖位に結合することができる。いくつかの実施形態において、鎖終結部分は、上記の潜在的特性のうちのいずれかを含む、アジド（ａｚｉｄｅ）、アジド（ａｚｉｄｏ）、またはアジドメチル基を含む。

【0299】

いくつかの実施形態において、システムにおいて、複数の多価分子中の少なくとも１つの多価分子は、複数のヌクレオチドアームに結合するコアを含み、コアは、検出可能なレポーター部分で標識される。いくつかの実施形態において、検出可能なレポーター部分は、フルオロフォアを含む。所与のコアに結合するフルオロフォアは、ヌクレオチドアームのヌクレオチド塩基（例えば、アデニン、グアニン、シトシン、チミン、またはウラシル）に対応する。

【0300】

いくつかの実施形態において、システムにおいて、複数の多価分子中の少なくとも１つの多価分子は、ヌクレオチドアームに結合するヌクレオチド単位を含み、リンカー及び／またはヌクレオチド単位は、検出可能なレポーター部分で標識される。いくつかの実施形態において、検出可能なレポーター部分は、フルオロフォアを含む。所与のリンカーまたはヌクレオチド塩基に結合するフルオロフォアは、ヌクレオチドアームのヌクレオチド塩基（例えば、アデニン、グアニン、シトシン、チミン、またはウラシル）に対応する。

【0301】

いくつかの実施形態において、システムにおいて、コアは、ストレプトアビジン型またはアビジン型部分を含み、コア結合部分は、ビオチンを含む。いくつかの実施形態において、コアは、アビジンタンパク質、ならびに少なくとも１つのビオチン部分に結合することができる任意の誘導体、類似体、及び他の非天然形態のアビジンを含むストレプトアビジン型またはアビジン型部分を含む。アビジン部分の他の形態としては、天然及び組換えアビジン及びストレプトアビジン、ならびに誘導体化分子、例えば、非グリコシル化アビジン及び切断ストレプトアビジンが挙げられる。例えば、アビジン部分は、アビジンの脱グリコシル化形態、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ（例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｖｉｄｉｎｉｉ）によって産生される細菌ストレプトアビジン、ならびに誘導体化形態、例えば、Ｎ－アシルアビジン、例えば、Ｎ－アセチル、Ｎ－フタリル、及びＮ－スクシニルアビジン、ならびに市販の製品ＥｘｔｒＡｖｉｄｉｎ（商標）、Ｃａｐｔａｖｉｄｉｎ（商標）、Ｎｅｕｔｒａｖｉｄｉｎ（商標）、及びＮｅｕｔｒａｌｉｔｅ Ａｖｉｄｉｎ（商標）を含む。一般的なコアが複数のヌクレオチドアームにコンジュゲートされる例示的な多価分子を、図１４Ａに示す。多価分子の例示的な設計を図１５Ａに示し、これは、複数のヌクレオチドアームに結合した（ａｔｔａｃｈｅｄ）／結合した（ｂｏｕｎｄ）コア（例えば、ストレプトアビジンコア）を示し、ヌクレオチドアームは、コア結合部分（例えば、ビオチン）、スペーサー、リンカー、及びヌクレオチド単位を含む。ビオチン、スペーサー、リンカー、及びヌクレオチド単位を含む例示的なビオチン化ヌクレオチドアームを図１５Ｂに示す。

【0302】

いくつかの実施形態において、システムは、核酸二本鎖に結合した１つ以上の変異体ポリメラーゼを含み、各々、核酸プライマーにハイブリダイズする核酸鋳型を含み、それによって複合ポリメラーゼを形成し、このシステムは、少なくとも１つのカチオンを更に含む。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのカチオンは、ストロンチウム、バリウム、ナトリウム、マグネシウム、カリウム、マンガン、カルシウム、リチウム、ニッケル、及びコバルトからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、カチオンは、ポリメラーゼ触媒によるヌクレオチドの取り込みを促進する触媒二価カチオンを含み、触媒二価カチオンは、マグネシウムまたはマンガンを含む。いくつかの実施形態において、カチオンは、ポリメラーゼ触媒によるヌクレオチドの取り込みを阻害する非触媒二価カチオンを含み、非触媒二価カチオンは、ストロンチウム、バリウム、及び／またはカルシウムを含む。

【0303】

いくつかの実施形態において、システムは、核酸二本鎖に結合した１つ以上の変異体ポリメラーゼを含み、各々、核酸プライマーにハイブリダイズする核酸鋳型分子を含み、それによって複合ポリメラーゼを形成する。いくつかの実施形態において、核酸鋳型分子は、線形核酸分子、または環状核酸分子、または線形核酸分子と環状核酸分子の両方の混合物を含む。いくつかの実施形態において、複数の核酸鋳型分子中の核酸鋳型分子は、同一の関心対象の標的配列または異なる関心対象の標的配列を含む。いくつかの実施形態において、核酸鋳型は、潜在的特性分子のうちのいずれも、増幅された核酸分子を含む。いくつかの実施形態において、核酸鋳型分子は、クローン増幅された鋳型分子または単一の核酸鋳型分子を含む。いくつかの実施形態において、核酸鋳型分子は、関心対象の標的配列の１つのコピーを含む。いくつかの実施形態において、核酸鋳型分子は、関心対象の標的配列（例えば、コンカテマー）の２つ以上のタンデムコピーを含む。いくつかの実施形態において、核酸鋳型分子は、少なくとも１つのウリジンヌクレオチドを含むか、またはウリジンヌクレオチドを欠く。いくつかの実施形態において、プライマーは、ヌクレオチド重合のための開始部位を提供する。いくつかの実施形態において、核酸プライマーは、伸長可能な３’末端または伸長不可能な３’末端を含む。いくつかの実施形態において、変異体ポリメラーゼは、上で考察した１つ以上の例示的な変異体ポリメラーゼの特性を含む。

【0304】

システムにおけるいくつかの実施形態において、複合ポリメラーゼは、支持体に固定化され、核酸鋳型、核酸プライマー、及び／またはポリメラーゼのうちのいずれも支持体に固定化される。いくつかの実施形態において、システムは、支持体に固定化された複数の複合ポリメラーゼを含む。いくつかの実施形態において、約１０^２～１０^１５個の複合ポリメラーゼは、支持体上の異なる部位において支持体に固定化される。いくつかの実施形態において、複数の複合ポリメラーゼは、支持体上の所定の部位（例えば、位置）に固定化される。いくつかの実施形態において、複数の複合ポリメラーゼは、支持体上のランダムな部位（例えば、位置）に固定化される。いくつかの実施形態において、複数の固定化された複合ＤＮＡポリメラーゼは、互いに流体連通して、試薬（例えば、ポリメラーゼ、多価分子、ヌクレオチド、及び／または二価カチオンなどを含む酵素）の溶液を支持体上に流すことを可能にし、その結果、支持体上の複数の固定化された複合ポリメラーゼを超並列方法で試薬の溶液と反応させることができる。

【0305】

いくつかの実施形態において、システムにおいて、支持体は、平面または非平面の支持体を含む。支持体は、固体または半固体であり得る。いくつかの実施形態において、支持体は、多孔質、半多孔質、または非多孔質であり得る。いくつかの実施形態において、支持体の表面は、１つ以上の化合物でコーティングされ、支持体上に不動態化層を生成することができる。いくつかの実施形態において、不動態化層は、多孔質または半多孔質層を形成する。いくつかの実施形態において、核酸プライマーまたは鋳型、またはポリメラーゼを不動態化層に結合して、プライマー、鋳型、及び／またはポリメラーゼを支持体に固定化することができる。いくつかの実施形態において、支持体は、支持体上の改善された核酸ハイブリダイゼーション及び増幅性能を可能にする低い非特異的結合表面を含む。一般に、支持体は、共有結合または非共有結合している低化学修飾層、例えば、シラン層、ポリマーフィルム、及び複数の核酸鋳型分子を支持体に固定化するために使用することができる１つ以上の共有結合または非共有結合しているオリゴヌクレオチドの１つ以上の層を含み得る。いくつかの実施形態において、支持体は、支持体上の化学基を介して少なくとも支持体の一部に共有結合した官能化ポリマーコーティング層、官能化ポリマーコーティングにグラフトされたプライマー、ならびにプライマー及び官能化ポリマーコーティング上の水溶性保護コーティングを含むことができる。いくつかの実施形態において、官能化ポリマーコーティングは、ポリ（Ｎ－（５－アジドアセト－アミジルペンチル）アクリルアミド－ｃｏ－アクリルアミド（ＰＡＺＡＭ）を含む。いくつかの実施形態において、支持体は、少なくとも１つの親水性ポリマーコーティング層、及び複数のオリゴヌクレオチドのうちの少なくとも１つの層を有する表面コーティングを含む。親水性ポリマーコーティング層は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含むことができる。親水性ポリマーコーティング層は、少なくとも４つの分岐を有する分岐ＰＥＧを含むことができる。いくつかの実施形態において、低非特異的結合コーティングは、４５度以下の水接触角を有する。

【0306】

いくつかの実施形態において、システムにおいて、複数の複合ＤＮＡポリメラーゼは、第１及び第２の結合複合体、ならびに親和性複合体を形成する多価分子を更に含み、（ｉ）第１の結合複合体が、第１の核酸プライマー、第１のＤＮＡポリメラーゼ、及びコンカテマー鋳型分子の第１の部分に結合し、それによって第１の結合複合体を形成する第１の多価分子を含み、多価分子の第１のヌクレオチド単位が、第１のＤＮＡポリメラーゼに結合し、（ｉｉ）第２の結合複合体が、第２の核酸プライマー、第２のＤＮＡポリメラーゼ、及び同じコンカテマー鋳型分子の第２の部分に結合し、それによって第２の結合複合体を形成する第１の多価分子を含み、多価分子の第２のヌクレオチド単位は、第２のＤＮＡポリメラーゼに結合し、同じ多価分子を含む第１及び第２の結合複合体は、親和性複合体を形成する。いくつかの実施形態において、第１のポリメラーゼは、本明細書に記載の任意の野生型または変異体ポリメラーゼを含む。いくつかの実施形態において、第２のポリメラーゼは、本明細書に記載の任意の野生型または変異体ポリメラーゼを含む。コンカテマー鋳型分子は、関心対象の配列のタンデム反復配列と、少なくとも１つのユニバーサル配列決定プライマー結合部位と、を含む。第１及び第２の核酸プライマーは、コンカテマー鋳型分子に沿って配列決定プライマー結合部位に結合することができる。

【0307】

いくつかの実施形態において、システムにおいて、複数の複合ＤＮＡポリメラーゼは、第１及び第２の結合複合体、ならびに親和性複合体を形成する多価分子を更に含み、（ｉ）第１の結合複合体が、第１の核酸プライマー、第１のＤＮＡポリメラーゼ、及び第１の鋳型分子に結合し、それによって第１の結合複合体を形成する第１の多価分子を含み、多価分子の第１のヌクレオチド単位が、第１のＤＮＡポリメラーゼに結合し、（ｉｉ）第２の結合複合体が、第２の核酸プライマー、第２のＤＮＡポリメラーゼ、及び第２の鋳型分子に結合し、それによって第２の結合複合体を形成する第１の多価分子を含み、多価分子の第２のヌクレオチド単位は、第２のＤＮＡポリメラーゼに結合し、同じ多価分子を含む第１及び第２の結合複合体は、親和性複合体を形成する。いくつかの実施形態において、第１のポリメラーゼは、本明細書に記載の任意の野生型または変異体ポリメラーゼを含む。いくつかの実施形態において、第２のポリメラーゼは、本明細書に記載の任意の野生型または変異体ポリメラーゼを含む。いくつかの実施形態において、第１及び第２の鋳型分子は、クローン増幅された鋳型分子である。いくつかの実施形態において、第１及び第２の鋳型分子は、互いに近接して局在化されている。例えば、クローン増幅された第１及び第２の鋳型分子は、ブリッジ増幅を介して生成され、支持体上の同じ位置または特性に固定化される線形鋳型分子を含む。第１及び第２の鋳型分子は、関心対象の配列と、少なくとも１つのユニバーサル配列決定プライマー結合部位と、を含む。第１及び第２の核酸プライマーは、それぞれ、第１及び第２の鋳型分子上の配列決定プライマー結合部位に結合することができる。

【0308】

いくつかの実施形態において、システムは、（ａ）１つ以上の変異体ポリメラーゼ、（ｂ）核酸鋳型分子、（ｃ）３’伸長可能な末端または３’伸長不可能な末端を有する核酸プライマー、及び（ｄ）複数のヌクレオチドまたは複数の多価分子を含む反応混合物を含む。いくつかの実施形態において、１つ以上の変異体ポリメラーゼは、核酸鋳型分子に結合していない。いくつかの実施形態において、１つ以上の変異体ポリメラーゼは、核酸プライマーに結合していない。いくつかの実施形態において、１つ以上の変異体ポリメラーゼは、核酸プライマーにハイブリダイズする核酸鋳型を含む核酸二本鎖に結合し、それによって複合ポリメラーゼを形成する。いくつかの実施形態において、核酸鋳型分子は、少なくとも１つのウリジンヌクレオチドを含むか、またはウリジンヌクレオチドを欠く。いくつかの実施形態において、複数のヌクレオチドは、少なくとも１つのウリジンヌクレオチドを含むか、またはウリジンヌクレオチドを欠く。いくつかの実施形態において、変異体ポリメラーゼは、上で考察した１つ以上の例示的な変異体ポリメラーゼの特性を含む。

【0309】

いくつかの実施形態において、反応混合物は、（ｅ１）少なくとも１つのヌクレオチドを複合ポリメラーゼに結合させることを可能にするか、または少なくとも１つの多価分子を複合ポリメラーゼに結合させることを可能にするが、非触媒性二価カチオンが、ポリメラーゼ触媒による取り込みを阻害する、少なくとも１つの非触媒性二価カチオンを更に含む。いくつかの実施形態において、非触媒二価カチオンは、ストロンチウム、バリウム、及び／またはカルシウムを含む。

【0310】

いくつかの実施形態において、反応混合物は、（ｅ２）少なくとも１つのヌクレオチドを複合ポリメラーゼに結合させることを可能にするか、または少なくとも１つの多価分子を複合ポリメラーゼに結合させることを可能にする少なくとも１つの触媒二価カチオンを更に含み、触媒二価カチオンは、ポリメラーゼ触媒による取り込みを促進する。いくつかの実施形態において、触媒二価カチオンは、マグネシウム及び／またはマンガンを含む。いくつかの実施形態において、核酸鋳型及び核酸プライマーは、溶液中にある。いくつかの実施形態において、核酸鋳型及び／または核酸プライマーは、支持体に固定化されるか、または支持体上のコーティングに固定化される。

【0311】

システムにおけるいくつかの実施形態において、反応混合物は、ヌクレオチド結合反応（または多価分子結合反応）を行う際に使用するのに好適である。いくつかの実施形態において、反応混合物は、ヌクレオチドの取り込み反応（または多価分子のヌクレオチド単位の取り込み反応）を行う際の使用に好適である。いくつかの実施形態において、反応混合物は、ヌクレオチドが伸長可能なプライマーの３’末端に取り込まれる（または多価分子のヌクレオチド単位が伸長可能なプライマーの３’末端に取り込まれる）プライマー伸長反応を行う際の使用に好適である。

【0312】

いくつかの実施形態において、システムは、少なくとも第１及び第２の複合ポリメラーゼを有する複数の複合ポリメラーゼを含み、（ａ）第１の複合ポリメラーゼは、第１の核酸プライマーにハイブリダイズする第１の核酸鋳型分子を含む第１の核酸二重鎖に結合する第１の変異体ポリメラーゼを含み、（ｂ）第２の複合ポリメラーゼは、第２の核酸プライマーにハイブリダイズする第２の核酸鋳型分子を含む第２の核酸二重鎖に結合する第２の変異体ポリメラーゼを含む。いくつかの実施形態において、第１及び第２の核酸鋳型分子は、同じまたは異なる配列を含む。いくつかの実施形態において、第１及び第２の核酸鋳型分子は、クローン増幅される。いくつかの実施形態において、第１及び／または第２の核酸鋳型分子は、少なくとも１つのウリジンヌクレオチドを含むか、またはウリジンヌクレオチドを欠く。いくつかの実施形態において、第１及び第２のプライマーは、伸長可能な３’末端または伸長不可能な３’末端を含む。いくつかの実施形態において、変異体ポリメラーゼは、上で考察した１つ以上の例示的な変異体ポリメラーゼの特性を含む。

【0313】

システムにおけるいくつかの実施形態において、複数の複合ポリメラーゼ（第１及び第２の複合ポリメラーゼを含む）は、支持体に固定化される。いくつかの実施形態において、複数の複合ポリメラーゼの密度は、１ｍｍ^２当たり約１０^２～１０^１５個の複合ポリメラーゼを含み、これらは、支持体に固定化される。システムにおけるいくつかの実施形態において、第１及び第２の核酸鋳型分子は、支持体上の異なる部位に固定化される。いくつかの実施形態において、支持体は、アレイに配置された複数の部位を含む。いくつかの実施形態において、支持体上の部位は、行または列の一次元に配置されるか、または行及び列の二次元に配置される。いくつかの実施形態において、複数の部位は、ランダムまたは組織化された様式、または両方の組み合わせで支持体上に配置される。いくつかの実施形態において、複数の部位は、直線または六角形のパターンを含む任意のパターンで配置される。いくつかの実施形態において、支持体は、１ｍｍ^２当たり約１０^２～１０^１５個の部位またはそれ以上を含み、これらは、核酸鋳型で固定化されて、核酸鋳型アレイを形成する。いくつかの実施形態において、複数の部位で固定化された核酸鋳型、例えば、核酸鋳型分子は、１ｍｍ^２当たり約１０^２～１０^１５個の部位またはそれ以上で固定化され、固定化された核酸鋳型は、クローン増幅されて、複数の部位で固定化された核酸ポロニーを生成する。いくつかの実施形態において、支持体上に固定化された複数の核酸鋳型分子は、互いに流体連通して、試薬（例えば、複数の酵素（例えば、ポリメラーゼ）、複数のヌクレオチド、及び／または複数の多価分子）の溶液を支持体上に流すことを可能にし、その結果、支持体上に固定化された複数の核酸鋳型分子を超並列方法で複数の試薬と反応させることができる。いくつかの実施形態において、支持体上に固定化された複数の核酸ポロニーの流体連通を使用して、ヌクレオチド結合アッセイを実施し、及び／またはヌクレオチドの取り込みアッセイ（例えば、プライマー伸長または配列決定）を本質的に同時に複数の核酸ポロニー上で実施することができる。いくつかの実施形態において、支持体上に固定化された複数の核酸ポロニーの流体連通を使用して、超並列配列決定のための検出及び画像化を実施することができる。いくつかの実施形態において、「固定化された」という用語及び関連用語は、共有結合または非共有結合相互作用を介して支持体に直接結合されるか、または支持体上のコーティングに結合される核酸分子または酵素を指す。いくつかの実施形態において、コーティングは、４５度以下の水接触角を有する低非特異的結合コーティングを含む。

【0314】

キット
本開示は、本明細書に記載の変異体ポリメラーゼを含むキットを提供する。いくつかの実施形態において、変異体ポリメラーゼは、上で考察した１つ以上の例示的な変異体ポリメラーゼの特性を含む。いくつかの実施形態において、変異体ポリメラーゼは、上で考察した１つ以上の例示的な変異体ポリメラーゼの特性を含む。いくつかの実施形態において、キットは、少なくとも１つのカチオンを更に含む。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのカチオンは、ストロンチウム、バリウム、ナトリウム、マグネシウム、カリウム、マンガン、カルシウム、リチウム、ニッケル、及びコバルトからなる群から選択される。

【0315】

いくつかの実施形態において、キットは、伸長可能な３’末端または伸長不可能な３’末端を有する複数の核酸プライマーを更に含む。いくつかの実施形態において、プライマーのうちの少なくとも１つは、支持体に固定され得る。いくつかの実施形態において、固定化プライマー（例えば、キャプチャプライマー）を使用して、核酸鋳型にハイブリダイズすることができる。いくつかの実施形態において、プライマーのうちの少なくとも１つは、鋳型分子に付加されたアダプター配列（例えば、ユニバーサルアダプター配列）にハイブリダイズすることができる配列決定プライマーを含む。

【0316】

いくつかの実施形態において、キットは、上記のような複数のヌクレオチド単位を更に含む。

【0317】

いくつかの実施形態において、システムまたはキットにおいて、複数のヌクレオチドの少なくとも１つのヌクレオチドが、１つ、２つ、または３つのリン原子の鎖を含み、その鎖は、典型的には、エステルまたはホスホラミド結合を介して糖部分の５’炭素に結合することができる。いくつかの実施形態において、複数の中の少なくとも１つのヌクレオチドは、リン原子が介在するＯ、Ｓ、ＮＨ、メチレン、またはエチレンと一緒に連結されるリン鎖を有する類似体である。いくつかの実施形態において、鎖内のリン原子は、Ｏ、Ｓ、またはＢＨ_３を含む置換側基を含む。いくつかの実施形態において、鎖は、ホスホロアミデート、ホスホロチオエート、ホスホルジチオエート、及びＯ－メチルホスホロアミダイト基を含む類似体で置換されたホスフェート基を含む。

【0318】

いくつかの実施形態において、システムまたはキットにおいて、複数のヌクレオチドのうちの少なくとも１つのヌクレオチドは、ターミネーターヌクレオチド類似体を含み、上で考察した１つ以上の例示的なヌクレオチド類似体特性を含む。

【0319】

いくつかの実施形態において、システムまたはキットにおいて、複数のヌクレオチドのうちの少なくとも１つのヌクレオチドは、糖２’位、糖３’位、または糖２’及び３’位に鎖終結部分（例えば、ブロック部分）を有するターミネーターヌクレオチド類似体を含む。鎖終結部分は、上記の鎖終結部分の実施形態のうちのいずれかを含み得る開裂可能な部分を介して３’－ＯＨ糖位に結合することができる。いくつかの実施形態において、鎖終結部分は、上記の潜在的特性のうちのいずれかを含む、アジド（ａｚｉｄｅ）、アジド（ａｚｉｄｏ）、またはアジドメチル基を含む。

【0320】

いくつかの実施形態において、システムまたはキットにおいて、複数のヌクレオチドは、検出可能なレポーター部分で標識された複数のヌクレオチドを含むが、検出可能なレポーター部分も欠くことができる。検出可能なレポーター部分は、フルオロフォアを含む。いくつかの実施形態において、フルオロフォアは、ヌクレオチド塩基に結合する。いくつかの実施形態において、フルオロフォアは、塩基から開裂可能／除去可能であるリンカーによってヌクレオチド塩基に結合する。

【0321】

いくつかの実施形態において、キットにおいて、鎖終結部分（例えば、糖２’及び／または糖３’位）ならびに塩基上の開裂可能なリンカーは、同じまたは異なる開裂可能な部分を有する。いくつかの実施形態において、鎖終結部分（例えば、糖２’及び／または糖３’位）ならびに塩基に連結された検出可能なレポーター部分は、同じ化学薬品で化学的に開裂可能／除去可能である。いくつかの実施形態において、鎖終結部分（例えば、糖２’及び／または糖３’位）及び塩基に連結された検出可能なレポーター部分は、異なる化学薬品を用いて化学的に開裂可能／除去可能である。

【0322】

本開示は、配列番号１～２６８または２８８～３７５または３８５～３９７のうちのいずれかに対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％同一である、またはより高いレベルの配列同一性であるアミノ酸配列を含む、少なくとも１つの変異体ポリメラーゼを含むキットまたはシステムを提供し、キットは、上記の潜在的特性のうちのいずれかを含む、多価分子の実施形態のうちのいずれかを含み得る、複数の多価分子を更に含む。

【0323】

いくつかの実施形態において、システムまたはキットにおいて、複数の多価分子の少なくとも１つの多価分子は、１つ、２つ、または３つのリン原子の鎖を有するヌクレオチド単位を含み、その鎖は、典型的には、エステルまたはホスホラミド結合を介して糖部分の５’炭素に結合する。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのヌクレオチド単位は、リン原子が介在するＯ、Ｓ、ＮＨ、メチレン、またはエチレンと一緒に連結されるリン鎖を有する類似体である。いくつかの実施形態において、鎖内のリン原子は、Ｏ、Ｓ、またはＢＨ_３を含む置換側基を含む。いくつかの実施形態において、鎖は、ホスホロアミデート、ホスホロチオエート、ホスホルジチオエート、及びＯ－メチルホスホロアミダイト基を含む類似体で置換されたホスフェート基を含む。

【0324】

いくつかの実施形態において、システムまたはキットにおいて、複数の多価分子中の個々の多価分子は、複数のヌクレオチドアームに結合するコアを含み、個々のヌクレオチドアームは、糖２’位、糖３’位、または糖２’及び３’位に鎖終結部分（例えば、ブロック部分）を有するヌクレオチド単位を含む。

【0325】

いくつかの実施形態において、システムまたはキットにおいて、複数の多価分子中の少なくとも１つの多価分子は、上で考察した１つ以上の例示的なヌクレオチド類似体特性を含むターミネーターヌクレオチド類似体を含むヌクレオチド単位を含む。

【0326】

いくつかの実施形態において、システムまたはキットにおいて、複数の多価分子中の少なくとも１つの多価分子は、糖２’位、糖３’位、または糖２’及び３’位に鎖終結部分（例えば、ブロック部分）を有するターミネーターヌクレオチド類似体を含むヌクレオチド単位を含む。鎖終結部分は、上記の鎖終結部分の実施形態のうちのいずれかを含み得る開裂可能な部分を介して３’－ＯＨ糖位に結合することができる。いくつかの実施形態において、鎖終結部分は、上記の潜在的特性のうちのいずれかを含む、アジド（ａｚｉｄｅ）、アジド（ａｚｉｄｏ）、またはアジドメチル基を含む。

【0327】

いくつかの実施形態において、システムまたはキットにおいて、複数の多価分子中の少なくとも１つの多価分子は、複数のヌクレオチドアームに結合するコアを含み、コアは、検出可能なレポーター部分で標識される。いくつかの実施形態において、検出可能なレポーター部分は、フルオロフォアを含む。いくつかの実施形態において、キットにおいて、複数の多価分子中の少なくとも１つの多価分子は、複数のヌクレオチドアームに結合されたコアを含み、多価分子の少なくとも１つのヌクレオチドアームは、検出可能なレポーター部分で標識されるリンカー及び／または塩基を含む。いくつかの実施形態において、検出可能なレポーター部分は、フルオロフォアを含む。

【0328】

いくつかの実施形態において、システムまたはキットにおいて、個々の多価分子は、アビジン様部分を有するコアを含み、コア結合部分は、ビオチンを含む。いくつかの実施形態において、コアは、アビジンタンパク質、ならびに少なくとも１つのビオチン部分に結合することができる任意の誘導体、類似体、及び他の非天然形態のアビジンを含むストレプトアビジン型またはアビジン型部分を含む。アビジン部分の他の形態としては、天然及び組換えアビジン及びストレプトアビジン、ならびに誘導体化分子、例えば、非グリコシル化アビジン及び切断ストレプトアビジンが挙げられる。例えば、アビジン部分は、アビジンの脱グリコシル化形態、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ（例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｖｉｄｉｎｉｉ）によって産生される細菌ストレプトアビジン、ならびに誘導体化形態、例えば、Ｎ－アシルアビジン、例えば、Ｎ－アセチル、Ｎ－フタリル、及びＮ－スクシニルアビジン、ならびに市販の製品ＥｘｔｒＡｖｉｄｉｎ（商標）、Ｃａｐｔａｖｉｄｉｎ（商標）、Ｎｅｕｔｒａｖｉｄｉｎ（商標）、及びＮｅｕｔｒａｌｉｔｅ Ａｖｉｄｉｎ（商標）を含む。

【0329】

いくつかの実施形態において、システムまたはキットにおいて、少なくとも１つの変異体ポリメラーゼ、カチオン、プライマー、複数のヌクレオチド及び／または複数の多価分子を含む１つ以上の容器を含む。変異体ポリメラーゼ、カチオン、プライマー、及び／または複数のヌクレオチドは、任意の組み合わせで組み合わせることができ、単一の容器に含めることができるか、または別個の容器、もしくはそれらの任意の組み合わせに含めることができる。変異体ポリメラーゼ、カチオン、プライマー、及び／または複数の多価分子は、任意の組み合わせで組み合わせることができ、単一の容器に含めることができ、または別個の容器、もしくはそれらの任意の組み合わせに含めることができる。

【0330】

キットは、ヌクレオチド結合反応、ヌクレオチドの取り込み反応、及び／または複数のヌクレオチドを使用する核酸配列決定反応を行うためのキットの使用説明書を含むことができる。このキットは、多価分子結合反応、多価分子の取り込み反応、及び／または複数の多価分子を使用する核酸配列決定反応を行うためのキットの使用説明書を含むことができる。

【0331】

変異体ポリメラーゼ、ベクター、及び宿主細胞をコードする核酸
本開示は、配列番号２～２７４または２８８～３７５または３８５～３９７のうちのいずれかに対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％同一、またはより高いレベルの配列同一性であるアミノ酸配列を含む、本明細書に記載の変異体ポリメラーゼのうちのいずれかをコードする核酸を提供する。

【0332】

本開示は、配列番号２～２７４または２８８～３７５または３８５～３９７のうちのいずれかに対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％同一、またはより高いレベルの配列同一性であるアミノ酸配列を含む、本明細書に記載の変異体ポリメラーゼのうちのいずれかをコードする、少なくとも１つの核酸（例えば、トランス遺伝子）に作動可能に連結されるベクターを提供する。いくつかの実施形態において、ベクターは、プロモーター配列、エンハンサー、転写及び／または翻訳開始配列、転写及び／または翻訳終結配列、ポリペプチド分泌シグナル配列などを含む少なくとも１つの宿主細胞調節配列を含む。プロモーター配列は、構成的または誘導的プロモーター配列であり得る。いくつかの実施形態において、ベクター内のプロモーター配列は、変異体ポリメラーゼをコードする少なくとも１つの核酸に作動可能に連結されて、宿主細胞による変異体ポリメラーゼの発現を制御し得る。いくつかの実施形態において、ベクターは、発現ベクターを含む。

【0333】

本開示は、配列番号２～２７４または２８８～３７５または３８５～３９７のうちのいずれかに対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％同一、またはより高いレベルの配列同一性であるアミノ酸配列を含む、本明細書に記載の変異体ポリメラーゼのうちのいずれかをコードする、少なくとも１つの核酸（例えば、トランス遺伝子）に作動可能に連結されるベクター（例えば、発現ベクター）を保有する宿主細胞を提供する。いくつかの実施形態において、ベクターは、変異体ポリメラーゼをコードする少なくとも１つの核酸に作動可能に連結されるプロモーター配列を含み、プロモーター配列は、宿主細胞による変異体ポリメラーゼの発現を制御する。

【0334】

本開示は、複数の宿主細胞を提供し、複数の宿主細胞中の個々の宿主細胞は、配列番号２～２７４または２８８～３７５または３８５～３９７のうちのいずれかに対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％同一またはより高いレベルの配列同一性であるアミノ酸配列を含む、本明細書に記載の変異体ポリメラーゼのうちのいずれかをコードする少なくとも１つの核酸（例えば、トランス遺伝子）に作動可能に連結されるベクター（例えば、発現ベクター）を保有する。いくつかの実施形態において、ベクターは、変異体ポリメラーゼをコードする少なくとも１つの核酸に作動可能に連結されるプロモーター配列を含み、プロモーター配列は、宿主細胞による変異体ポリメラーゼの発現を制御する。

【0335】

方法
本開示は、複数の変異体ポリメラーゼを調製するための方法であって、配列番号２～２７４または２８８～３７５または３８５～３９７のうちのいずれかに対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％同一、またはより高いレベルの配列同一性を有する、本明細書に記載の変異体ポリメラーゼのうちのいずれかをコードする少なくとも１つの核酸（例えば、トランス遺伝子）に作動可能に連結されるベクター（例えば、発現ベクター）を保有する、複数の宿主細胞を培養することを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態において、宿主細胞中のベクターは、変異体ポリメラーゼをコードする少なくとも１つの核酸に作動可能に連結されるプロモーター配列を含み、プロモーター配列は、宿主細胞による変異体ポリメラーゼの発現を制御する。いくつかの実施形態において、複数の宿主細胞は、複数の宿主細胞による複数の変異体ポリメラーゼを発現するのに好適な条件下で培養される。いくつかの実施形態において、本方法は、複数の宿主細胞から複数の変異体ポリメラーゼを回収すること（例えば、単離／濃縮すること）を更に含む。

【0336】

修飾ヌクレオチドを核酸鎖に取り込むための組成物及び方法が、本明細書に提供される。ポリメラーゼは、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、鋳型非依存性ポリメラーゼ、逆転写酵素、またはヌクレオチド伸長可能な他の酵素を様々に含む。野生型ＤＮＡポリメラーゼは、一般に、糖の３’位への修飾などのある特定の種類のヌクレオチド修飾を許容しない。この特性は、野生型ＤＮＡポリメラーゼが、配列決定などの用途のための可逆的または不可逆的ターミネーター（核酸伸長を防ぐ除去可能な化学基）の取り込みを容易にするために、有意に修飾されることを必要とする。修飾されたヌクレオチドを取り込む変異体ポリメラーゼを用いた配列決定する方法が、本明細書に更に提供される。更に、操作されたＤＮＡポリメラーゼの使用は、酵素の耐熱性または酵素がより高い温度で機能する能力を犠牲にすることなく、伸長する核酸鎖に修飾ヌクレオチドを取り込むことができる酵素の開発を可能にする。この特性は、ＤＮＡポリメラーゼが、古細菌ポリメラーゼ骨格、より具体的には、好熱性または耐熱性古細菌のＤＮＡポリメラーゼ配列に由来する骨格に基づいて操作される場合、特に増強される。操作されたポリメラーゼは、本明細書に記載の１つ以上のポリメラーゼの形態をとり得る。

【0337】

熱安定性及び／または高忠実度が操作されたＤＮＡポリメラーゼは、等温配列決定または伸長技術において有用であり得る。等温技術は、とりわけ、ＳＤＡ、ＬＡＭＰ、ＳＭＡＰ、ＩＣＡＮ、ＳＭＡＲＴを含み、本明細書に開示される追加の技術を更に含み得る。これらの技術では、伸長反応は、例えば、鎖置換反応を使用して一定温度で進行するか、またはいくつかの追加の例示的な実施形態において、プライミングされた一本鎖鋳型、特にプライミングされた多価鋳型を含むプライミングされた一本鎖鋳型から伸長する。いくつかの実施形態において、操作されたＤＮＡポリメラーゼは、鎖置換能力を有する。増幅依存性の方法では、サンプル、プライマー、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼ、及び基質の混合物を一定温度でインキュベートすることによって、単一のステップで等温増幅を完了することができる。これは、必要なステップの数を減らし、熱ランプステップを排除し、各配列決定または伸長サイクルの合計サイクル時間を短縮し、同時に、各サイクルに必要な反応時間を短縮する。増幅を伴わない方法では、等温方法は、温度上昇または主要な構成要素または試薬への追加の熱応力に起因する時間の損失なしに、配列決定サイクル中の新生核酸鎖の結合、検出、及び伸長を可能にする。

【0338】

本開示の方法及び組成物に従って使用することができるＤＮＡポリメラーゼには、ウイルス、細菌、古細菌、及び真核生物のポリメラーゼ、ならびにそれらのホモログ及びオーソログが含まれる。いくつかの実施形態において、ＤＮＡポリメラーゼとしては、古細菌ＤＮＡポリメラーゼ、例えば、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ ａｌｔｉａｒｃｈａｅａｌｅｓ古細菌ＤＮＡポリメラーゼ、ならびにそれらのホモログ及びオーソログ、ならびにそれらの操作、変異、及び／または切断されたバリアント、原核生物ＤＮＡポリメラーゼ、例えば、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓポリメラーゼ（例えば、Ｂｓｔポリメラーゼ）、ならびにそれらのホモログ及びオーソログ、ならびにそれらの操作、変異、及び／または切断されたバリアント、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｓｈｉｂａｔａｅ及びＳｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ Ｄｐｏ４ポリメラーゼ、を含むＳｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｓｐ．Ｄｐｏ４ポリメラーゼ、ならびに関連するＹファミリーポリメラーゼ、ならびにそれらのホモログ及びオーソログ、ならびにそれらの操作、変異、及び／または切断されたバリアント、他の熱安定性ポリメラーゼ、例えば、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ、ならびにそれらのホモログ及びオーソログ、ならびにそれらの操作、変異、及び／または切断されたバリアント、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ、ならびにそれらのホモログ及びオーソログ、ならびにそれらの操作、変異、及び／または切断されたバリアント、及び／または真核性ＤＮＡポリメラーゼ、例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＰｏｌＢまたはＨｏｍｏ Ｓａｐｉｅｎｓ ＰｏｌＢまたは他の真核性Ｘファミリーポリメラーゼ、ならびにそれらのホモログ及びオーソログ、ならびにそれらの操作、変異、及び／または切断されたバリアントが挙げられるが、これらに限定されない。他のＤＮＡポリメラーゼ及び相同またはオーソロガスポリメラーゼは、当該技術分野で既知であり、本開示内で明示的に企図される。

【0339】

増強した耐熱性を有する変異ポリペプチドを含む組成物及び方法が、本明細書に提供される。いくつかの実施形態において、そのような変異ポリペプチドは、ポリメラーゼ活性（例えば、変異核酸ポリメラーゼ）を有する。いくつかの実施形態において、耐熱性は、最も近い野生型酵素、例えば、最も近い野生型酵素配列を含む野生型酵素と比較して、増加したＴｍ、分解に対する耐性、及び／または機能的活性（例えば、ヌクレオチドの取り込み）を高温で維持する能力を含む。いくつかの実施形態において、変異体ポリメラーゼは、最も近い野生型酵素と比較して、約１、２、５、１０、１５、２０、２５、または約３０℃増加するＴｍを含む。いくつかの実施形態において、変異体ポリペプチドは、最も近い野生型酵素と比較して、少なくとも１、２、５、１０、１５、２０、２５、または少なくとも３０℃増加するＴｍを含む。変異体ポリメラーゼは、しばしば、最も近い野生型酵素と比較して、少なくとも１～１０℃、５～１５℃、４～２０℃、２～１０℃、４～１５℃、２０～３０℃、１０～６０℃、または２５～３５℃増加するＴｍ値を含む。いくつかの実施形態において、ポリメラーゼ活性は、ｋ_ｃａｔ、ｋ_ｃａｔ／Ｋ_ｍ、または所与の期間の取り込まれたヌクレオチドの収率を含む。いくつかの実施形態において、ポリメラーゼ活性は、いくつかの実施形態において、ｋ_ｃａｔ、ｋ_ｃａｔ／Ｋ_ｍ、または所与の期間の取り込まれた修飾ヌクレオチド、例えば３’－Ｏ－アジドメチル修飾ヌクレオチドの収率を含む。いくつかの実施形態において、高温で機能する変異体ポリメラーゼは、未修飾ヌクレオチドを利用して、より低温で機能する最も近い野生型酵素の最適活性の少なくとも９９％、９８％、９５％、９０％、８５％、または少なくとも８０％維持する。例えば、約３７℃で機能する変異体ポリメラーゼは、未修飾ヌクレオチドを利用する最も近い野生型酵素の最適活性の少なくとも９９％、９８％、９５％、９０％、８５％、または少なくとも８０％維持する。いくつかの実施形態において、約４２℃で機能する変異体ポリメラーゼは、未修飾ヌクレオチドを利用する最も近い野生型酵素の最適活性の少なくとも９９％、９８％、９５％、９０％、８５％、または少なくとも８０％維持する。いくつかの実施形態において、約５５℃で機能する変異体ポリメラーゼは、未修飾ヌクレオチドを利用する最も近い野生型酵素の最適活性の少なくとも９９％、９８％、９５％、９０％、８５％、または少なくとも８０％維持する。いくつかの実施形態において、約６０℃で機能する変異体ポリメラーゼは、未修飾ヌクレオチドを利用する最も近い野生型酵素の最適活性の少なくとも９９％、９８％、９５％、９０％、８５％、または少なくとも８０％維持する。いくつかの実施形態において、少なくとも５０℃で機能する変異体ポリメラーゼは、未修飾ヌクレオチドを利用する最も近い野生型酵素の最適活性の少なくとも９９％、９８％、９５％、９０％、８５％、または少なくとも８０％維持する。いくつかの実施形態において、少なくとも６０℃で機能する変異体ポリメラーゼは、未修飾ヌクレオチドを利用する最も近い野生型酵素の最適活性の少なくとも９９％、９８％、９５％、９０％、８５％、または少なくとも８０％維持する。いくつかの実施形態において、３７～９５℃で機能する変異体ポリメラーゼは、未修飾ヌクレオチドを利用する最も近い野生型酵素の最適活性の少なくとも９９％、９８％、９５％、９０％、８５％、または少なくとも８０％維持する。いくつかの実施形態において、３７～９５℃、３７～６０℃、３７～５５℃、３７～４２℃、４０～６０℃、５０～８０℃、４２～５５℃、５５～６０℃、５５～９５℃、６０～９５℃、または４０～８０℃で機能する変異体ポリメラーゼは、未修飾ヌクレオチドを利用する最も近い野生型酵素の最適活性の少なくとも９９％、９８％、９５％、９０％、８５％、または少なくとも８０％維持する。いくつかの実施形態において、４２～９５℃で機能する変異体ポリメラーゼは、未修飾ヌクレオチドを利用する最も近い野生型酵素の最適活性の少なくとも９９％、９８％、９５％、９０％、８５％、または少なくとも８０％維持する。いくつかの実施形態において、４０～８０℃で機能する変異体ポリメラーゼは、未修飾ヌクレオチドを利用する最も近い野生型酵素の最適活性の少なくとも９９％、９８％、９５％、９０％、８５％、または少なくとも８０％維持する。いくつかの実施形態において、３７～５５℃で機能する変異体ポリメラーゼは、未修飾ヌクレオチドを利用する最も近い野生型酵素の最適活性の少なくとも９９％、９８％、９５％、９０％、８５％、または少なくとも８０％維持する。いくつかの実施形態において、５０～９５℃で機能する変異体ポリメラーゼは、未修飾ヌクレオチドを利用する最も近い野生型酵素の最適活性の少なくとも９９％、９８％、９５％、９０％、８５％、または少なくとも８０％維持する。いくつかの実施形態において、６０～９５℃で機能する変異体ポリメラーゼは、未修飾ヌクレオチドを利用する最も近い野生型酵素の最適活性の少なくとも９９％、９８％、９５％、９０％、８５％、または少なくとも８０％維持する。

【0340】

いくつかの実施形態において、変異体ポリメラーゼは、少なくとも３７℃の温度で機能する最も近い関連野生型配列と比較して増加したｋ_ｃａｔを有する。いくつかの実施形態において、変異体ポリメラーゼは、少なくとも４２℃の温度で機能する最も近い関連野生型配列と比較して増加したｋ_ｃａｔを有する。いくつかの実施形態において、変異体ポリメラーゼは、少なくとも５５℃の温度で機能する最も近い関連野生型配列と比較して増加したｋ_ｃａｔを有する。いくつかの実施形態において、変異体ポリメラーゼは、少なくとも６０℃の温度で機能する最も近い関連野生型配列と比較して増加したｋ_ｃａｔを有する。いくつかの実施形態において、変異体ポリメラーゼは、少なくとも８０℃の温度で機能する最も近い関連野生型配列と比較して増加したｋ_ｃａｔを有する。いくつかの実施形態において、変異体ポリメラーゼは、少なくとも９０℃の温度で機能する最も近い関連野生型配列と比較して増加したｋ_ｃａｔを有する。いくつかの実施形態において、変異体ポリメラーゼは、３７～９５℃、３７～６０℃、３７～５５℃、３７～４２℃、４０～６０℃、５０～８０℃、４２～５５℃、５５～６０℃、５５～９５℃、６０～９５℃、または４０～８０℃の温度で機能する最も近い関連野生型配列と比較して増加したｋ_ｃａｔを有する。いくつかの実施形態において、変異体ポリメラーゼは、３７～５５℃の温度で機能する最も近い関連野生型配列と比較して増加したｋ_ｃａｔを有する。いくつかの実施形態において、変異体ポリメラーゼは、３５～８０℃の温度で機能する最も近い関連野生型配列と比較して増加したｋ_ｃａｔを有する。

【0341】

例えば、鎖終結部分（例えば、ブロック基／部分）を有する糖２’及び／または３’位で修飾された修飾ヌクレオチドを取り込むための増加した能力を示す酵素に関する変異ポリペプチドを含む組成物及び方法が、本明細書に提供される。例示的な修飾ヌクレオチドには、核酸合成中、当該ヌクレオチド（しばしば「ターミネーター」ヌクレオチドと称される）の取り込み後に、成長する核酸鎖へのそのような追加の（例えば、その後の）ヌクレオチドの取り込みを低減または阻害するための任意の修飾が含まれる。鎖終結部分は、上記の鎖終結部分の実施形態の潜在的特性のうちのいずれかを含み得る。３’修飾または「ターミネーター」ヌクレオチドの他の形態が可能である。いくつかの実施形態において、本開示は、少なくとも１つのヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体が、糖２’または３’位で修飾されていないヌクレオチドである、当該組成物を提供する。

【0342】

いくつかの実施形態において、本開示は、任意の特定の動作順序に関係なく、１）同一の配列の２つ以上の反復を含む標的核酸と、当該標的核酸の１つ以上の領域に相補的な２つ以上のプライマー核酸と、２つ以上のポリメラーゼ分子と、を含む組成物を提供するステップと、２）当該組成物を、当該ポリマー－ヌクレオチドコンジュゲートとステップ（ａ）の組成物との間に結合複合体を形成するのに十分な条件下で、ポリマー－ヌクレオチドコンジュゲートを含む多価結合組成物と接触させるステップであって、ポリマー－ヌクレオチドコンジュゲートが、ヌクレオチドの２つ以上のコピー及び任意選択的に１つ以上の検出可能な標識を含む、接触させるステップと、３）当該結合複合体を検出し、それによって標的核酸ポリマーにおける当該ヌクレオチドの同一性を確立するステップと、を含む、標的核酸におけるヌクレオチドの同一性を決定する方法における、本明細書に開示される操作されたポリメラーゼバリアントを利用する方法を提供する。いくつかの更なる実施形態において、本開示は、標的核酸がＤＮＡである、及び／または標的核酸が、例えば、ローリングサークル増幅、ブリッジ増幅、ヘリカーゼ依存性増幅、等温ブリッジ増幅、ローリングサークル多重置換増幅（ＲＣＡ／ＭＤＡ）、及び／またはリコンビナーゼベースの複製もしくは増幅方法などの、ＤＮＡ複製または増幅の任意の一般的に実施される方法によって複製されている、当該方法を提供する。いくつかの更なる実施形態において、本開示は、検出可能な標識が蛍光標識である、及び／または複合体を検出することが蛍光測定を含む、当該方法を提供する。いくつかの更なる実施形態において、本開示は、多価結合組成物が１つの種類のポリマーヌクレオチドコンジュゲートを含み、多価結合組成物が２つ以上の種類のポリマーヌクレオチドコンジュゲートを含む、及び／または２つ以上の種類のポリマーヌクレオチドコンジュゲートの各種類が異なる種類のヌクレオチドを含む、当該方法を提供する。いくつかの実施形態において、本開示は、結合複合体がブロックヌクレオチドを更に含み、特にブロックヌクレオチドが３’－Ｏ－アジドメチル、３’－Ｏ－アルキルヒドロキシルアミノ、または３’－Ｏ－メチルヌクレオチドを含む、当該方法を提供する。いくつかの更なる実施形態において、本開示は、接触させることが、ストロンチウムイオン、バリウムイオン、マグネシウムイオン、及び／またはカルシウムイオンの存在下で行われる、当該方法を提供する。いくつかの実施形態において、本開示は、ポリメラーゼ分子が、変異、化学修飾、または必要なイオンもしくは補因子の非存在によって触媒的に不活性にされた場合など、ポリメラーゼ分子が触媒的に不活性である、当該方法を提供する。いくつかの実施形態において、本開示はまた、ポリメラーゼ分子が触媒的に活性である、及び／または結合複合体がブロックされたヌクレオチドを含まない、当該方法も提供する。いくつかの実施形態において、本開示は、結合複合体が約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、または１秒を超える持続時間を有する、当該方法を提供する。いくつかの実施形態において、本開示は、結合複合体が約０．１～０．２５秒、もしくは約０．２５～０．５秒、もしくは約０．５～０．７５秒、もしくは約０．７５～１秒、もしくは約１～２秒、もしくは約２～３秒、もしくは約３～４秒、もしくは約４～５秒を超える持続時間を有する、及び／または本方法が１５℃以上、２０℃以上、２５℃以上、３５℃以上、３７℃以上、４２℃以上、５５℃以上、６０℃以上、もしくは７２℃以上、または前述のうちのいずれかによって定義される範囲内で実施されるかまたは実施され得る、当該方法を提供する。結合複合体は、ポリメラーゼ、鋳型分子、プライマー、及び／またはヌクレオチド単位もしくはヌクレオチドのうちのいずれかの間の相互作用の解離を引き起こす条件にさらされるまで安定した状態を保ち得る。例えば、解離条件は、結合複合体を、洗剤、ＥＤＴＡ、及び／または水のうちのいずれか１つまたはいずれかの組み合わせと接触させることを含む。いくつかの実施形態において、本開示は、結合複合体が、検出ステップにおいて２０を超えるコントラストノイズ比を示す表面上に堆積されるか、それに結合するか、またはそれにハイブリダイズされる、当該方法を提供する。いくつかの実施形態において、本開示は、組成物が極性非プロトン性溶媒を取り込んだ緩衝条件下で堆積される、当該方法を提供する。いくつかの実施形態において、本開示は、接触させることが、当該ヌクレオチドが当該標的核酸の次の塩基に相補的であるときに当該結合複合体を安定化し、当該ヌクレオチドが当該標的核酸の当該次の塩基に相補的でないときに当該結合複合体を不安定化する条件下で行われる、当該方法を提供する。

【0343】

いくつかの実施形態において、本開示は、当該ポリマーヌクレオチドコンジュゲート（例えば、多価分子）が複数の分岐を有するポリマーを含み、当該第１のヌクレオチドの当該複数のコピーが当該分岐に結合し（図１４Ａ及び１４Ｂならびに１５Ａを参照）、特に当該第１のポリマーが、星型、櫛型、架橋、ボトルブラシ型、またはデンドリマー構成を有する、当該方法を提供する。いくつかの実施形態において、本開示は、当該ポリマーヌクレオチドコンジュゲートが、アビジン、ビオチン、親和性タグ、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される１つ以上の結合基を含む、当該方法を提供する。いくつかの実施形態において、本開示は、（ａ）の組成物とポリマーヌクレオチドコンジュゲートとの間に形成される当該結合複合体を不安定化して、当該ポリマーヌクレオチドコンジュゲートを除去する解離ステップを更に含む、当該方法を提供する。いくつかの実施形態において、本開示は、標的核酸の当該次の塩基に相補的であるヌクレオチドを当該プライマー核酸に取り込むための伸長ステップを更に含み、任意選択的に、伸長ステップが当該解離ステップとしてまたはその後に現在生じる、当該方法を提供する。

【0344】

いくつかの実施形態において、本開示は、ヌクレオチド（例えば、多価分子）の２つ以上の分岐及び２つ以上のコピーを有する分岐ポリマーを含む組成物を提供し、当該ヌクレオチドは、第１の複数の当該分岐またはアームに結合し、任意選択的に、１つ以上の相互作用部分は、第２の複数の当該分岐またはアームに結合する。いくつかの実施形態において、当該組成物は、ポリマー上に１つ以上の標識を更に含み得る。いくつかの実施形態において、本開示は、ヌクレオシドがポリマー当たり少なくとも４つのヌクレオチドの表面密度を有する、当該組成物を提供する。いくつかの実施形態において、本開示は、ポリメラーゼ反応中に伸長した核酸鎖への取り込みを防ぐように修飾されたヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体を含むか、または取り込む、当該組成物を提供する。いくつかの実施形態において、当該組成物は、ポリメラーゼ反応中に伸長した核酸鎖への取り込みを防ぐように可逆的に修飾されたヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体を含み得るか、または取り込み得る。いくつかの実施形態において、本開示は、１つ以上の標識が、蛍光標識、ＦＲＥＴドナー、及び／またはＦＲＥＴアクセプターを含む、当該組成物を提供する。いくつかの実施形態において、当該組成物は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６個またはそれ以上の分岐またはアーム、または２、４、８、１６、３２、６４個またはそれ以上の分岐またはアームを含み得る。いくつかの実施形態において、分岐またはアームは、中央部分から放射状に放射し得る。いくつかの実施形態において、当該組成物は、１つ以上の相互作用部分を含み得、その相互作用部分は、アビジンまたはストレプトアビジン、ビオチン部分、親和性タグ、酵素、抗体、ミニボディ、受容体、または他のタンパク質、非タンパク質タグ、金属親和性タグ、またはそれらの任意の組み合わせを含み得る。いくつかの実施形態において、本開示は、ポリマーが、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリ酢酸ビニル、ポリ乳酸、またはポリグリコール酸を含む、当該組成物を提供する。いくつかの実施形態において、本開示は、ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体が、リンカーを介して分岐またはアームに結合し、特にリンカーがＰＥＧを含み、ＰＥＧ部分が約１Ｋ、約２Ｋ、約３Ｋ、約４Ｋ、約５Ｋ、約１０Ｋ、約１５Ｋ、約２０Ｋ、約５０Ｋ、約１００Ｋ、約１５０Ｋ、または約２００Ｋ、または約２００Ｋを超える平均分子量を有する、当該組成物を提供する。いくつかの実施形態において、本開示は、リンカーがＰＥＧを含み、ＰＥＧ部分が約５Ｋ～約２０Ｋの平均分子量を有する、当該組成物を提供する。いくつかの実施形態において、本開示は、少なくとも１つのヌクレオチドもしくはヌクレオチド類似体が、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオシド、もしくはリボヌクレオシドを含む、及び／またはヌクレオチドもしくはヌクレオチド類似体が、ヌクレオチドもしくはヌクレオチド類似体の５’末端を介してリンカーにコンジュゲートされる、当該組成物を提供する。いくつかの実施形態において、本開示は、ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体のうちの１つが、デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、チミジン、デオキシウリジン、デオキシシチジン、アデノシン、グアノシン、５－メチル－ウリジン、及び／またはシチジンを含み、リンカーの長さが１～１，０００ｎｍである、当該組成物を提供する。いくつかの実施形態において、本開示は、少なくとも１つのヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体が、ポリメラーゼ反応または配列決定反応中に伸長を阻害するように修飾されたヌクレオチドであり、例えば、少なくとも１つのヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体が、３’ヒドロキシル基を欠くヌクレオチドであり、３’位にブロック基を含有するように修飾されたヌクレオチド、及び／または３’－Ｏ－アジド基、３’－Ｏ－アジドメチル基、３’－Ｏ－アルキルヒドロキシルアミノ基、３’－ホスホロチオエート基、３’－Ｏ－マロニル基、もしくは３’－Ｏ－ベンジル基で修飾されたヌクレオチドである、当該組成物を提供する。いくつかの実施形態において、本開示は、少なくとも１つのヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体が、３’位で修飾されていないヌクレオチドである、当該組成物を提供する。

【0345】

いくつかの実施形態において、本開示は、任意の特定の順序に関係なく、１）変異体ポリメラーゼと、鋳型鎖と、鋳型鎖に少なくとも部分的に相補的な相補鎖とを含む核酸分子とを提供するステップと、２）核酸分子を１つ以上の核酸結合組成物と接触させるステップと、３）核酸結合組成物の核酸分子への結合を検出するステップと、４）当該核酸分子の当該相補鎖に取り込まれる末端ヌクレオチドの同一性を決定するステップと、を含む、核酸分子の配列を決定する方法を提供する。いくつかの実施形態において、本開示は、当該末端ヌクレオチドを当該相補鎖に取り込むことと、１つ以上の追加の反復のための当該接触、検出、及び取り込むステップを繰り返し、それによって当該核酸分子の当該鋳型鎖の配列を決定することと、を更に含む、当該方法を提供する。いくつかの実施形態において、本開示は、当該核酸分子は、固体支持体に繋留され、特に、固体支持体は、ガラスまたはポリマー基質、少なくとも１つの親水性ポリマーコーティング層、及び少なくとも１つの親水性ポリマーコーティング層に結合した複数のオリゴヌクレオチド分子を含む、当該方法を提供する。いくつかの実施形態において、本開示は、少なくとも１つの親水性ポリマーコーティング層がＰＥＧを含み、及び／または少なくとも１つの親水性ポリマー層が少なくとも８つの分岐を有する分岐状親水性ポリマーを含む実施形態を更に含む、当該方法を提供する。いくつかの実施形態において、本開示は、複数のオリゴヌクレオチド分子が、少なくとも５００個の分子／ｍｍ^２、少なくとも１，０００個の分子／ｍｍ^２、少なくとも５，０００個の分子／ｍｍ^２、少なくとも１０，０００個の分子／ｍｍ^２、少なくとも２０，０００個の分子／ｍｍ^２、少なくとも５０，０００個の分子／ｍｍ^２、少なくとも１００，０００個の分子／ｍｍ^２、または少なくとも５００，０００個の分子／ｍｍ^２の表面密度で存在する、当該方法を提供する。いくつかの実施形態において、本開示は、当該核酸分子が固体支持体上でクローン増幅されている、当該方法を提供する。いくつかの実施形態において、本開示は、クローン増幅が、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、多重置換増幅（ＭＤＡ）、転写媒介増幅（ＴＭＡ）、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、リアルタイムＳＤＡ、ブリッジ増幅、等温ブリッジ増幅、ローリングサークル増幅、円－円増幅、ヘリカーゼ依存性増幅、リコンビナーゼ依存性増幅、一本鎖結合（ＳＳＢ）タンパク質依存性増幅、またはそれらの任意の組み合わせの使用を含む、当該方法を提供する。いくつかの実施形態において、本開示は、１つ以上の核酸結合組成物が、フルオロフォアで標識され、検出するステップが、蛍光画像の使用を含む、ならびに特に蛍光画像が二波長励起／四波長放射蛍光画像を含む、当該方法を提供する。いくつかの実施形態において、本開示は、４つの異なる核酸結合組成物であって、各々、異なるヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体を含む、４つの異なる核酸結合組成物を使用して、末端ヌクレオチドの同一性を決定し、４つの異なる核酸結合組成物は、それぞれ別々のフルオロフォアで標識され、検出するステップは、４つのフルオロフォア全てを励起するのに十分な波長での同時または単一の励起と、それぞれのフルオロフォアを各々検出するのに十分な波長での蛍光発光の画像化とを含む、当該方法を提供する。いくつかの実施形態において、本開示は、４つの異なる核酸結合組成物であって、各々、異なるヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体を含む４つの異なる核酸結合組成物を使用して、末端ヌクレオチドの同一性を決定し、４つの異なる核酸結合組成物は、それぞれ、Ｃｙ３または励起もしくは放出特性が類似した染料もしくはフルオロフォア、Ｃｙ３．５または励起もしくは放出特性が類似した染料もしくはフルオロフォア、Ｃｙ５または励起もしくは放出特性が類似した染料もしくはフルオロフォア、ならびにＣｙ５．５または励起もしくは放出特性が類似した染料もしくはフルオロフォアで標識され、検出するステップは、５３２ｎｍ、５６８ｎｍ、及び６３３ｎｍの任意の２つでの同時励起、ならびにそれぞれ、約５７０ｎｍ、５９２ｎｍ、６７０ｎｍ、及び７０２ｎｍでの蛍光放出の画像化を含む、及び／または蛍光画像が二重波長励起／二重波長放出の蛍光画像を含む、当該方法を提供する。いくつかの実施形態において、本開示は、４つの異なる核酸結合組成物であって、各々、異なるヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体を含む、４つの異なる核酸結合組成物を使用して、末端ヌクレオチドの同一性を決定し、１つ、２つ、３つ、または４つの異なる核酸結合組成物は、それぞれ、各々、異なるフルオロフォアまたはフルオロフォアのセットで標識され、検出するステップは、１つ、２つ、３つ、または４つのフルオロフォアまたはフルオロフォアのセットを励起するのに十分な波長での同時または単一の励起と、それぞれのフルオロフォアを各々検出するのに十分な波長での蛍光発光の画像化と、を含む、当該方法を提供する。いくつかの実施形態において、本開示は、３つの異なる核酸結合組成物であって、各々、異なるヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体を含む、３つの異なる核酸結合組成物を使用して、末端ヌクレオチドの同一性を決定し、１つ、２つ、または３つの異なる核酸結合組成物は、それぞれ、各々、異なるフルオロフォアまたはフルオロフォアのセットで標識され、検出するステップは、１つ、２つ、または３つのフルオロフォアまたはフルオロフォアのセットを励起するのに十分な波長での同時の励起と、それぞれのフルオロフォアを各々検出するのに十分な波長での蛍光発光の画像化と、を含み、第４のヌクレオチドの検出が、「暗い」または非標識スポットまたは標的ヌクレオチドの位置を参照して決定されるか、または決定可能である、当該方法を提供する。いくつかの実施形態において、本開示は、多価結合組成物が３つの種類のポリマーヌクレオチドコンジュゲートからなり、３つの種類のポリマーヌクレオチドコンジュゲートの各種類が異なる種類のヌクレオチドを含む、当該方法を提供する。いくつかの実施形態において、本開示は、結合複合体の検出が、非結合または溶液媒介性ポリマーヌクレオチドコンジュゲートの不在下で行われる、当該方法を提供する。

【0346】

いくつかの実施形態において、本開示は、４つの異なる核酸結合組成物または３つの異なる核酸結合組成物であって、各々、異なるヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体を含む、４つの異なる核酸結合組成物または３つの異なる核酸結合組成物を使用して、末端ヌクレオチドの同一性を決定し、４つまたは３つの異なる核酸結合組成物のうちの１つが第１のフルオロフォアで標識され、１つが第２のフルオロフォアで標識され、１つが第１及び第２のフルオロフォアの両方で標識され、ならびに１つが標識されていないかまたは不在であり、検出するステップが第１の励起波長及び第２の励起波長での同時励起を含み、ならびに画像が第１の蛍光放出波長及び第２の蛍光放出波長で得られる、当該方法を提供する。いくつかの実施形態において、本開示は、第１のフルオロフォアがＣｙ３または励起もしくは放出特性が類似した染料もしくはフルオロフォアであり、第２のフルオロフォアがＣｙ５または励起もしくは放出特性が類似した染料もしくはフルオロフォアであり、第１の励起波長が５３２ｎｍまたは５６８ｎｍであり、第２の励起波長が６３３ｎｍであり、第１の蛍光放出波長が約５７０ｎｍであり、第２の蛍光放出波長が約６７０ｎｍである、当該方法を提供する。いくつかの実施形態において、本開示は、検出ラベルが、単一の励起及び画像化ステップの下で複数の分類を行うことができるように、ＦＲＥＴ対の１つ以上の部分を含むことができる、当該方法を提供する。いくつかの実施形態において、本開示は、接触、検出、ならびに取り込み／伸長ステップを含む配列決定反応サイクルが、３０分未満、２０分未満、または１０分未満で実行される、当該方法を提供する。いくつかの実施形態において、本開示は、配列決定の実行にわたるベースコール精度の平均Ｑスコアが、３０以上、及び／または４０以上である、当該方法を提供する。いくつかの実施形態において、本開示は、識別された末端ヌクレオチドの少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％が、３０を超える及び／または４０以上のＱスコアを有する、当該方法を提供する。いくつかの実施形態において、本開示は、本明細書において識別される末端ヌクレオチドの少なくとも９５％が、３０を超えるＱスコアを有する、当該方法を提供する。

【0347】

いくつかの実施形態において、本開示は、任意選択的に、本明細書において開示される操作されたポリメラーゼバリアント、本明細書において開示される１つ以上の核酸結合組成物を含む試薬、及び緩衝液を提供する。例えば、いくつかの実施形態において、本開示は、試薬を提供し、当該試薬は、１つ、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上の核酸結合組成物を含み、各核酸結合組成物は、単一の種類のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、本開示の試薬は、１つ、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上の核酸結合組成物を含み、各核酸結合組成物は、単一の種類のヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体を含み、当該ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体は、それぞれ、ＡＴＰ、ＡＤＰ、ＡＭＰ、ｄＡＴＰ、ｄＡＤＰ、及びｄＡＭＰからなる群からの１つ以上、ＴＴＰ、ＴＤＰ、ＴＭＰ、ｄＴＴＰ、ｄＴＤＰ、ｄＴＭＰ、ＵＴＰ、ＵＤＰ、ＵＭＰ、ｄＵＴＰ、ｄＵＤＰ、及びｄＵＭＰからなる群からの１つ以上、ＣＴＰ、ＣＤＰ、ＣＭＰ、ｄＣＴＰ、ｄＣＤＰ、及びｄＣＭＰからなる群からの１つ以上、ならびにＧＴＰ、ＧＤＰ、ＧＭＰ、ｄＧＴＰ、ｄＧＤＰ、及びｄＧＭＰからなる群からの１つ以上に対応し得る。いくつかの他の例またはいくつかの更なる例では、本開示は、１つ、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上の核酸結合組成物を含むか、または更に含む試薬を提供し、各核酸結合組成物は、単一の種類のヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体を含み、当該ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体は、それぞれ、ＡＴＰ、ＡＤＰ、ＡＭＰ、ｄＡＴＰ、ｄＡＤＰ、ｄＡＭＰ、ＴＴＰ、ＴＤＰ、ＴＭＰ、ｄＴＴＰ、ｄＴＤＰ、ｄＴＭＰ、ＵＴＰ、ＵＤＰ、ＵＭＰ、ｄＵＴＰ、ｄＵＤＰ、ｄＵＭＰ、ＣＴＰ、ＣＤＰ、ＣＭＰ、ｄＣＴＰ、ｄＣＤＰ、ｄＣＭＰ、ＧＴＰ、ＧＤＰ、ＧＭＰ、ｄＧＴＰ、ｄＧＤＰ、及びｄＧＭＰからなる群からなる１つ以上に対応し得る。

【0348】

いくつかの実施形態において、本開示は、本明細書において開示されるポリメラーゼバリアント、本明細書において開示される核酸結合組成物、及び／または本明細書において開示される試薬を含む、本明細書において開示される方法（複数可）を実施するためのシステムを提供する。いくつかの実施形態において、システムは、当該繋留された核酸分子と当該核酸結合組成物及び／または当該試薬との連続的な接触を繰り返し実行するように、ならびに１つ以上の核酸分子への核酸結合組成物の結合の検出のために構成される。

【0349】

いくつかの実施形態において、本開示は、本明細書に開示される操作されたポリメラーゼバリアントを含み、粒子を更に含み、当該粒子は、複数の酵素またはタンパク質結合基質を含み、酵素またはタンパク質結合基質は、１つ以上の酵素またはタンパク質と結合して、１つ以上の結合複合体を形成し、当該結合は、１つ以上の結合複合体の位置、存在、または持続性の観察によってモニタリングまたは識別され得る、組成物を提供する。いくつかの実施形態において、当該粒子は、ポリマー、分岐ポリマー、デンドリマー、リポソーム、ミセル、ナノ粒子、または量子ドットを含み得る。いくつかの実施形態において、当該基質は、ヌクレオチド、ヌクレオシド、ヌクレオチド類似体、またはヌクレオシド類似体を含み得る。いくつかの実施形態において、酵素またはタンパク質結合基質は、ポリメラーゼと結合することができる薬剤を含み得る。いくつかの実施形態において、酵素またはタンパク質は、ポリメラーゼ、特に本明細書に開示されるような操作されたポリメラーゼバリアントを含み得る。いくつかの実施形態において、１つ以上の結合複合体の位置、存在、または持続性の当該観察は、蛍光検出を含み得る。いくつかの実施形態において、本開示は、本明細書において開示されるような複数の異なる粒子を含む組成物を提供し、各粒子は、単一の種類のヌクレオシドまたはヌクレオシド類似体を含み、各ヌクレオシドまたはヌクレオシド類似体は、検出可能に異なる放射または励起波長の蛍光標識と会合する。いくつかの実施形態において、本開示は、粒子上に１つ以上の標識を更に含む、当該組成物を提供する。いくつかの実施形態において、本開示は、ヌクレオシドまたはヌクレオシド類似体が少なくとも４個のヌクレオシドまたはヌクレオシド類似体の表面密度を有する、当該組成物を提供する。いくつかの実施形態において、本開示は、ヌクレオシドまたはヌクレオシド類似体が、１μｍ^２当たり０．００１～１，０００，０００、１μｍ^２当たり０．０１～１，０００，０００、１μｍ^２当たり０．１～１，０００，０００、１μｍ^２当たり１～１，０００，０００、１μｍ^２当たり１０～１，０００，０００、１μｍ^２当たり１００～１，０００，０００、１μｍ^２当たり１，０００～１，０００，０００、１μｍ^２当たり１，０００～１００，０００、１μｍ^２当たり１０，０００～１００，０００、または１μｍ^２当たり５０，０００～１００，０００、または前述の値のうちの任意の２つによって定義される範囲内の表面密度を有する、当該組成物を提供する。いくつかの実施形態において、本開示は、ヌクレオシドまたはヌクレオシド類似体がヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体内に存在する、当該組成物を提供する。いくつかの実施形態において、本開示は、組成物が、ポリメラーゼ反応中に伸長した核酸鎖への取り込みを防ぐように修飾されたヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体を含むか、または取り込む、当該組成物を提供する。いくつかの実施形態において、本開示は、組成物が、ポリメラーゼ反応中に伸長核酸鎖への取り込みを防ぐように可逆的に修飾されたヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体を含むか、または取り込む、当該組成物を提供する。いくつかの実施形態において、本開示は、１つ以上の標識が、蛍光標識、ＦＲＥＴドナー、及び／またはＦＲＥＴアクセプターを含む、当該組成物を提供する。いくつかの実施形態において、本開示は、基質がリンカーを介して粒子に結合する、当該組成物を提供する。いくつかの実施形態において、本開示は、少なくとも１つのヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体が、ポリメラーゼ反応または配列決定反応中に伸長を阻害するように修飾されたヌクレオチド、例えば、３’ヒドロキシル基を欠くヌクレオチド、３’位にブロック基を含有するように修飾されたヌクレオチド、３’－Ｏ－アジド基、３’－Ｏ－アジドメチル基、３’－Ｏ－アルキルヒドロキシルアミノ基、３’－ホスホロチオエート基、３’－Ｏ－マロニル基、もしくは３’－Ｏ－ベンジル基で修飾されていないヌクレオチド、及び／または３’位で修飾されていないヌクレオチドである、当該組成物を提供する。

【0350】

いくつかの実施形態において、本開示は、順序に関係なく、１）鋳型鎖及び鋳型鎖に少なくとも部分的に相補的な相補鎖を含む核酸分子を提供するステップと、２）本明細書に開示される操作されたポリメラーゼバリアントと、１つ以上の核酸結合組成物とを接触させるステップと、３）核酸結合組成物の核酸分子への結合を検出するステップと、４）当該核酸分子の当該相補鎖に取り込まれる末端ヌクレオチドの同一性を決定するステップと、を含む、核酸分子の配列を決定する方法を提供する。いくつかの実施形態において、当該方法は、当該末端ヌクレオチドを当該相補鎖に取り込むことと、１つ以上の追加の反復のための当該接触、検出、及び取り込むステップを繰り返し、それによって当該核酸分子の当該鋳型鎖の配列を決定することと、を更に含み得る。いくつかの実施形態において、本開示は、当該核酸分子が固体支持体上でクローン増幅されている、当該方法を提供する。いくつかの実施形態において、本開示は、クローン増幅が、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、多重置換増幅（ＭＤＡ）、転写媒介増幅（ＴＭＡ）、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、リアルタイムＳＤＡ、ブリッジ増幅、等温ブリッジ増幅、ローリングサークル増幅、円－円増幅、ヘリカーゼ依存性増幅、リコンビナーゼ依存性増幅、一本鎖結合（ＳＳＢ）タンパク質依存性増幅、またはそれらの任意の組み合わせの使用を含む、当該方法を提供する。いくつかの実施形態において、本開示は、接触、検出、及び取り込みステップを含む配列決定反応サイクルが、３０分未満、２０分未満、または１０分未満で実行される、当該方法を提供する。いくつかの実施形態において、本開示は、配列決定の実行にわたるベースコール精度の平均Ｑスコアが、３０以上、または４０以上である、当該方法を提供する。いくつかの実施形態において、本開示は、識別された末端ヌクレオチドの少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％が、３０を超える、または４０を超えるＱスコアを有する、当該方法を提供する。いくつかの実施形態において、本開示は、識別された末端ヌクレオチドの少なくとも９５％が、３０を超えるＱスコアを有する、当該方法を提供する。

【0351】

いくつかの実施形態において、本開示は、本明細書に開示される１つ以上の操作されたポリメラーゼバリアントと、任意選択的に、本明細書に開示される１つ以上の多価核酸結合組成物と、を含む試薬を提供する。

【0352】

いくつかの実施形態において、本開示は、本明細書に開示される組成物のうちのいずれか、及び／または本明細書に開示される試薬のうちのいずれか、１つ以上の緩衝液、ならびにそれらの使用説明書を含むキットを提供する。

【0353】

いくつかの実施形態において、本開示は、表面に結合した、または表面と会合した標識核酸複合体のコントラストノイズ比（ＣＮＲ）を増加させるのに使用するための、本明細書に開示される組成物または試薬を提供する。

【0354】

いくつかの実施形態において、本開示は、表面に結合した、または表面と会合した標識核酸複合体からのシグナルの持続時間の制御を確立または維持するのに使用するための、本明細書に開示される組成物または試薬を提供する。

【0355】

いくつかの実施形態において、本開示は、表面に結合した、または表面と会合した標識核酸複合体からの蛍光、発光、電気、電気化学、比色、放射性、磁気、または電磁シグナルの持続時間の制御を確立または維持するのに使用するための、本明細書に開示される組成物または試薬を提供する。

【0356】

いくつかの実施形態において、本開示は、核酸配列決定及び／または遺伝子型決定アプリケーションの特異性、精度、または読み取り長さを増加させるために、または結合、合成による配列決定、単一分子配列決定、もしくはアンサンブル配列決定方法によって使用するために、本明細書に開示される組成物または試薬を提供する。

【0357】

本明細書に開示される標的核酸の配列を決定する方法は、ａ）配列決定される鋳型鎖及び伸長されるプライマー鎖を含む二本鎖または部分的に二本鎖の標的核酸分子を、開示される核酸結合組成物のうちの１つ以上及び操作されたポリメラーゼバリアントのうちの１つ以上と接触させることと、ｂ）核酸結合組成物の核酸分子への結合を検出し、それによって当該核酸分子上の当該１つ以上の核酸結合組成物のうちの１つの存在及び相補鎖に取り込まれる次のヌクレオチド（すなわち、Ｎ＋１または末端ヌクレオチド）の同一性を決定することと、を含む。

【0358】

配列決定方法は、Ｎ＋１または末端ヌクレオチドをプライマー鎖に取り込むことと、次いで、１つ以上の追加の反復のための接触、検出、及び取り込むステップを繰り返し、それによって核酸分子の鋳型鎖の配列を決定することとを更に含み得る。三元結合複合体を検出するステップの後、プライミングされた標的核酸のプライミングされた鎖を１つの塩基に対して伸長してから、別のラウンドの分析を行う。プライミングされた標的核酸は、多価結合組成物中のポリマーに結合しているコンジュゲートしたヌクレオチドを使用して、または多価結合組成物が除去された後に提供される非コンジュゲートもしくは非繋留の遊離ヌクレオチドを使用して伸長され得る。

【0359】

プライミングされた標的核酸の伸長は、鎖上のブロックされたヌクレオチド（例えば、３’ブロックされたヌクレオチド）または触媒不活性であるポリメラーゼの使用に起因して、防止または阻害され得る。ポリマーヌクレオチドコンジュゲート中のヌクレオチドが、核酸の伸長を防ぐブロック基を有する場合、ヌクレオチドの取り込みは、ブロック基を当該ヌクレオチドから除去することによって（例えば、当該ヌクレオチドをそのポリマー、分岐ポリマー、デンドリマー、粒子などから分離することによって）達成され得る。プライミングされた標的核酸の伸長が、触媒的に不活性であるポリメラーゼの使用のために阻害される場合、ヌクレオチドの取り込みは、金属イオンなどの補因子または活性化剤の提供によって達成され得る。

【0360】

三元複合体の検出は、ヌクレオチド残基の取り込みの前、同時に、または取り込まれた後に達成される。いくつかの実施形態において、プライミングされた標的核酸は、ポリメラーゼ及び／または核酸結合部分の結合のための複数のプライミングされた位置を有する標的核酸を含み得る。いくつかの実施形態において、複数のポリメラーゼは、例えば標的核酸分子内の複数の部位において、単一の標的核酸分子に結合し得る。いくつかの実施形態において、複数のポリメラーゼは、複数のヌクレオチドを含む本明細書に開示される多価結合組成物に結合し得る。いくつかの実施形態において、標的核酸分子は、同一の配列の複数のコピーを含む核酸分子を生成するために、鎖置換合成、ローリングサークル増幅、クエリ配列の複数のコピーの連結もしくは融合、または当該技術分野で既知であるか、または本明細書の他の場所に開示される他のそのような方法の生成物であり得る。したがって、いくつかの実施形態において、複数のポリメラーゼは、クエリ配列の複数の同一または実質的に同一のコピーを含む標的核酸内の複数の同一または実質的に同一の位置で結合し得る。いくつかの実施形態において、当該複数のポリメラーゼは、次いで、１つ以上の多価結合複合体との相互作用に関与し得るが、いくつかの実施形態において、標的核酸内の結合部位の数は、少なくとも２つであり、ならびにポリマーヌクレオチドコンジュゲートなどの粒子ヌクレオチドコンジュゲート上に存在するヌクレオチドまたは基質部分の数もまた、２以上である。

【0361】

いくつかの実施形態において、本明細書に開示される組成物及び方法は、合成及び／または配列決定反応中の新生核酸鎖の伸長に使用され得る操作されたポリメラーゼバリアント、ならびに配列決定反応中の１つ以上の塩基の検出に使用され得る操作されたポリメラーゼバリアントを提供する。いくつかの実施形態において、本開示は、３’修飾ヌクレオチドを伸長する核酸鎖に取り込むこと、新生核酸鎖を伸長すること、及び／または伸長する核酸鎖内の特定の塩基を検出または識別することにおける、開示されたポリメラーゼバリアントの使用を提供する。

【0362】

多価結合組成物を他の要素と組み合わせて提供して、例えば、核酸配列中の特定の位置でヌクレオチドの識別を提供するために、最適化されたシグナルを提供することが有利であり得る。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される組成物は、低バックグラウンド結合または低レベルのタンパク質結合、特に親水性またはポリマーコーティングされた表面を提供する表面と組み合わせて提供される。代表的な表面は、例えば、２０１９年３月２５日に出願された米国特許出願第１６／３６３，８４２号に見出すことができ、その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0363】

いくつかの実施形態において、核酸分子は、例えば、鋳型鎖のアダプター核酸配列または固体支持体に繋留されているプライマー核酸配列へのハイブリダイゼーションによって、固体支持体の表面に繋留されている。いくつかの実施形態において、固体支持体は、ガラス、融着シリカ、シリコン、またはポリマー基質を含む。いくつかの実施形態において、固体支持体は、１つ以上の親水性ポリマー層（例えば、ＰＥＧ層）を含む低非特異性結合コーティングを含み、親水性ポリマー層のうちの少なくとも１つは、分岐ポリマー分子（例えば、４、８、１６、または３２個の分岐を含む分岐ＰＥＧ分子）を含む。いくつかの実施形態において、低非特異的結合コーティングは、４５度以下の水接触角を有する。

【0364】

固体支持体は、１μｍ^２当たり約１，０００プライマー分子から１μｍ^２当たり約１，０００，０００プライマー分子の範囲の表面密度で、少なくとも１つの親水性ポリマー層に繋留されたオリゴヌクレオチドアダプターまたはプライマーを含む。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドプライマーの表面密度は、１μｍ^２当たり少なくとも１，０００、少なくとも１０，０００、少なくとも１００，０００、少なくとも１，０００，０００分子であり得る。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドプライマーの表面密度は、１μｍ^２当たり最大１，０００，０００、最大１００，０００、最大１０，０００、または最大１，０００分子であり得る。この段落に記載の下限値及び上限値のうちのいずれかを組み合わせて、本開示に含まれる範囲を形成され得、例えば、いくつかの実施形態において、プライマーの表面密度は、１μｍ^２当たり約１０，０００個の分子から１μｍ^２当たり約１００，０００個の分子の範囲であり得る。当業者は、プライマー分子の表面密度が、この範囲内の任意の値、例えば、１μｍ^２当たり約４５５，０００分子を有し得ることを認識するであろう。

【0365】

当業者は、一連の反復配列決定反応において、時折、１つ以上の部位が所与のサイクル中にヌクレオチドを取り込むことができず、したがって、１つ以上の部位が伸長する核酸鎖の大部分と同期化されないことを認識するであろう。配列決定シグナルが標的核酸の単一のコピーで生じる反応に由来する条件下では、これらの取り込みの失敗は、出力配列に別個のエラーをもたらす。本開示の目的は、配列決定反応におけるこのタイプのエラーを低減するための方法を提供することである。更なる例については、三元ポリメラーゼ複合体の早期解離時に再結合の増加した確率を提供することによって、伸長する鎖に取り込むことが可能な多価基質の使用は、塩基が取り込まれていない「スキップ」サイクルの頻度を低減することができる。したがって、いくつかの実施形態において、本開示は、単独で、または本明細書に開示される多価基質と組み合わせて、本明細書に開示される操作されたポリメラーゼバリアントの使用を企図する。本開示は、本明細書に開示される１つ以上の操作されたポリメラーゼバリアントと、ヌクレオシド部分が遊離または可逆的に修飾された５’リン酸塩、二リン酸塩、または三リン酸塩部分を有するヌクレオチド内に含まれ、ヌクレオチドが不安定または開裂可能な結合を介して本明細書に開示される粒子またはポリマーに接続される１つ以上の多価結合基質と、を含む実施形態を明示的に企図する。いくつかの実施形態において、本開示は、本明細書に開示される操作されたポリメラーゼバリアント及び／または多価基質の使用の結果としてのスキップされた取り込みによる固有のエラー率の低減を企図する。

【0366】

本開示はまた、所与の配列からの、またはそれに関連する配列決定シグナルが、標的配列の複数のコピーを含有する定義可能な領域に由来する、またはそれに由来する配列決定反応も企図する。標的配列の複数のコピーを取り込む配列決定方法は、定義された領域内に複数の同時配列決定反応の存在によりシグナルを増幅することができ、各々が独自のシグナルを提供するという利点を有する。定義された領域内の複数の信号の存在はまた、多数の正しいベースコールからの信号が少数のスキップされたまたは誤ったベースコールからの信号を圧倒することができるという事実によって、任意の単一のスキップされたサイクルの影響も低減させる。本開示は、以前のサイクルでスキップされ得る部位での取り込みを提供するために、伸長反応中、または伸長サイクルの別個の部分中に、遊離非標識ヌクレオチドを含めることを更に企図する。例えば、取り込みサイクルの間、またはその後に、非標識ブロックヌクレオチドは、それらがスキップされた部位に取り込まれ得るように添加され得る。非標識ブロックヌクレオチドは、特定のサイクル中に存在する、または存在していた多価結合基質（複数可）に結合するヌクレオチドと同じ種類（複数可）であり得るか、または、１、２、３、４またはそれよりも多くの種類の非標識ブロックヌクレオチドの混合物が、含まれ得る。

【0367】

各配列決定サイクルが完全に進行すると、定義された領域内の各反応は、同一のシグナルを提供する。しかしながら、本明細書の他の箇所に記載されるように、一連の反復配列決定反応では、時折、１つ以上の部位が所与のサイクル中にヌクレオチドを取り込むことができず、したがって、１つ以上の部位が伸長する核酸鎖の大部分と同期化されない。「位相する」と称されるこの問題は、シグナルが１つ以上のサイクルをスキップした部位からのスプリアスシグナルで汚染されると、配列決定シグナルの分解をもたらす。これは、同様に、ベース識別における誤りの可能性を生じさせる。複数のサイクルを通るスキップされたサイクルの進行性劣化はまた、各サイクルによる配列決定シグナルの進行性劣化によって、有効な読み取りの長さを低減させる。位相エラーを低減させるための方法、及び／または配列決定反応における読み取りの長さを改善するための方法を提供することが、本開示の更なる目的である。

【0368】

配列決定方法は、標的配列の複数の連結または非連結コピーを含む標的核酸または複数の標的核酸を、本明細書に記載の多価結合組成物と接触させることを含むことができる。当該標的核酸、または標的配列の複数の連結または非連結コピーを含む複数の標的核酸を、１つ以上の粒子－ヌクレオチドコンジュゲートと接触させることは、所与の配列決定サイクルでイントロゲートする正しいヌクレオチドの実質的に増加した局所濃度を提供し得、したがって、不適切な取り込みまたは位相した核酸鎖（すなわち、１つ以上のスキップされたサイクルを有した伸長する核酸鎖）からのシグナルを抑制し得る。

【0369】

核酸配列情報を得る方法は、当該鋳型核酸または複数の標的核酸が、標的配列の複数の連結または非連結コピーを含む標的核酸または複数の標的核酸を、１つ以上の粒子ヌクレオチドコンジュゲートと接触させることを含むことができる。いくつかの実施形態において、この方法は、遊離ヌクレオチド、標識された遊離ヌクレオチド、タンパク質もしくはペプチドに結合したヌクレオチド、または標識されたタンパク質もしくはペプチドに結合したヌクレオチドを含む一価リガンドを使用して観察される平均読み取りの長さと比較して、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、５０％、７５％、１００％、１５０％、２００％、３００％、またはそれ以上の平均読み取りの長さの増加をもたらす。いくつかの実施形態において、この方法は、野生型ポリメラーゼまたは現在利用可能なポリメラーゼバリアント、遊離ヌクレオチド、標識された遊離ヌクレオチド、タンパク質もしくはペプチド結合ヌクレオチド、または標識されたタンパク質もしくはペプチド結合ヌクレオチドを含む一価リガンドを使用して観察される平均読み取りの長さと比較して、１０ＮＴ、２０ＮＴ、２５ＮＴ、３０ＮＴ、５０ＮＴ、７５ＮＴ、１００ＮＴ、１２５ＮＴ、１５０ＮＴ、２００ＮＴ、２５０ＮＴ、３００ＮＴ、３５０ＮＴ、４００ＮＴ、５００ＮＴ、またはそれ以上の平均読み取りの長さの増加をもたらす。

【0370】

核酸配列情報を得る方法は、当該標的核酸または複数の標的核酸が、標的配列の複数の連結または非連結コピーを含む標的核酸または複数の標的核酸を、１つ以上の操作されたポリメラーゼバリアントと、任意選択的に１つ以上の粒子ヌクレオチドコンジュゲートと接触させることを含むことができる。この方法は、塩基の誤認、存在しない塩基の報告、または正しい塩基の報告が行われないことの減少によって示されるように、配列決定のエラー率の減少をもたらす。いくつかの実施形態において、当該配列決定のエラー率の減少は、野生型酵素もしくは現在利用可能な酵素、または遊離ヌクレオチド、標識された遊離ヌクレオチド、タンパク質もしくはペプチド結合ヌクレオチド、または標識されたタンパク質もしくはペプチド結合ヌクレオチドを含む一価リガンドを使用して観察されるエラー率と比較して、５％、１０％、１５％、２０％ ２５％、５０％、７５％、１００％、１５０％、２００％、またはそれ以上の減少を含み得る。

【0371】

配列決定のための操作されたポリメラーゼバリアントの使用は、より正確な塩基読み出しを提供する。核酸配列決定のための開示される組成物及び方法は、約２０～約５０の範囲の配列決定の実行にわたる塩基読み出し精度の平均Ｑスコアを提供する。いくつかの実施形態において、平均Ｑスコアは、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、または少なくとも５０である。当業者は、平均Ｑスコアがこの範囲内、例えば、約３２の任意の値を有し得ることを認識するであろう。

【0372】

いくつかの実施形態において、核酸配列決定のための開示される組成物及び方法は、識別される末端（またはＮ＋１）ヌクレオチドの少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％に対して３０を超えるＱスコアを提供する。いくつかの実施形態において、核酸配列決定のための開示される組成物及び方法は、識別される末端（またはＮ＋１）ヌクレオチドの少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％に対して３５を超えるＱスコアを提供する。いくつかの実施形態において、核酸配列決定のための開示される組成物及び方法は、識別される末端（またはＮ＋１）ヌクレオチドの少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％に対して４０を超えるＱスコアを提供する。いくつかの実施形態において、核酸配列決定のための開示される組成物及び方法は、識別される末端（またはＮ＋１）ヌクレオチドの少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％に対して４５を超えるＱスコアを提供する。いくつかの実施形態において、核酸配列決定のための開示される組成物及び方法は、識別される末端（またはＮ＋１）ヌクレオチドの少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％に対して５０を超えるＱスコアを提供する。

【0373】

開示される低非特異的結合支持体及び関連する核酸ハイブリダイゼーション及び増幅方法は、当業者に既知の様々な異なる細胞、組織、または試料タイプのうちのいずれかに由来する核酸分子の分析に使用され得る。例えば、核酸は、真核生物（動物、植物、真菌、原生生物など）、古細菌、または真正細菌に由来する、細胞または１つ以上の種類の細胞を含む組織試料から抽出され得る。場合によっては、核酸は、原核細胞、または接着性もしくは非接着性真核細胞などの真核細胞から抽出され得る。核酸は、例えば、一次または不死化齧歯類、ブタ、ネコ、イヌ、ウシ、ウマ、霊長類、またはヒト細胞株から様々に抽出される。核酸は、様々な異なる細胞、臓器、または組織タイプ（例えば、白血球、赤血球、血小板、上皮細胞、内皮細胞、ニューロン、グリア細胞、星状細胞、線維芽細胞、骨格筋細胞、平滑筋細胞、配偶子、または心臓、肺、脳、肝臓、腎臓、脾臓、膵臓、胸腺、膀胱、胃、結腸、もしくは小腸からの細胞）のうちのいずれかから抽出され得る。核酸は、正常または健康な細胞から抽出され得る。代替的にまたは組み合わせて、酸は、がん細胞などの疾患のある細胞から、または宿主に感染している病原性細胞から抽出される。いくつかの核酸は、細胞型の異なるサブセット、例えば、免疫細胞（Ｔ細胞、細胞傷害性（キラー）Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、アルファベータＴ細胞、ガンマデルタＴ細胞、Ｔ細胞前駆細胞、Ｂ細胞、Ｂ細胞前駆細胞、リンパ球幹細胞、骨髄前駆細胞、リンパ球、顆粒球、ナチュラルキラー細胞、形質細胞、記憶細胞、好中球、好酸球、好塩基球、肥満細胞、単球、樹状細胞、及び／またはマクロファージ、またはそれらの任意の組み合わせ）、未分化ヒト幹細胞、分化誘導されたヒト幹細胞、希少細胞（例えば、循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）、循環上皮細胞、循環内皮細胞、循環子宮内膜細胞、骨髄細胞、前駆細胞、泡沫細胞、間葉細胞、またはトロホブラスト）から抽出され得る。他の細胞が、企図され、本明細書の開示と一致する。

【0374】

いくつかの実施形態において、本開示は、任意の特定の動作順序に関係なく、１）同一の配列の２つ以上の反復を含む標的核酸と、当該標的核酸の１つ以上の領域に相補的な２つ以上のプライマー核酸と、２つ以上のポリメラーゼ分子と、を含む組成物を提供するステップであって、当該ポリメラーゼ分子が、本明細書に開示されるような１つ以上の操作されたポリメラーゼバリアントを含み得る、提供するステップと、２）当該組成物を、ポリマー－ヌクレオチドコンジュゲートとステップ（ａ）の組成物との間に結合複合体を形成するのに十分な条件下で、当該ポリマー－ヌクレオチドコンジュゲートを含む多価結合組成物と接触させるステップであって、ポリマー－ヌクレオチドコンジュゲートが、ヌクレオチドの２つ以上のコピー及び任意選択的に１つ以上の検出可能な標識を含む、接触させるステップと、３）当該結合複合体を検出し、それによって標的核酸ポリマーにおける当該ヌクレオチドの同一性を確立するステップと、を含む、標的核酸におけるヌクレオチドの同一性を決定する方法を提供する。いくつかの更なる実施形態において、本開示は、標的核酸がＤＮＡである、及び／または標的核酸が、例えば、ローリングサークル増幅、ブリッジ増幅、ヘリカーゼ依存性増幅、等温ブリッジ増幅、ローリングサークル多重置換増幅（ＲＣＡ／ＭＤＡ）、及び／またはリコンビナーゼベースの複製もしくは増幅方法などの、ＤＮＡ複製または増幅の任意の一般的に実施される方法によって複製されている、当該方法を提供する。いくつかの更なる実施形態において、本開示は、検出可能な標識が蛍光標識である、及び／または複合体を検出することが蛍光測定を含む、当該方法を提供する。いくつかの更なる実施形態において、本開示は、多価結合組成物が１つの種類のポリマーヌクレオチドコンジュゲートを含み、多価結合組成物が２つ以上の種類のポリマーヌクレオチドコンジュゲートを含む、及び／または２つ以上の種類のポリマーヌクレオチドコンジュゲートの各種類が異なる種類のヌクレオチドを含む、当該方法を提供する。いくつかの実施形態において、本開示は、結合複合体がブロックヌクレオチドを更に含み、特にブロックヌクレオチドが３’－Ｏ－アジドメチル、３’－Ｏ－アルキルヒドロキシルアミノ、または３’－Ｏ－メチルヌクレオチドである、当該方法を提供する。いくつかの更なる実施形態において、本開示は、接触させることが、ストロンチウムイオン、バリウムイオン、マグネシウムイオン、及び／またはカルシウムイオンの存在下で行われる、当該方法を提供する。いくつかの実施形態において、本開示は、ポリメラーゼ分子が、変異、化学修飾、または必要なイオンもしくは補因子の非存在によって触媒的に不活性にされた場合など、ポリメラーゼ分子が触媒的に不活性である、当該方法を提供する。いくつかの実施形態において、本開示はまた、ポリメラーゼ分子が触媒的に活性である、及び／または結合複合体がブロックされたヌクレオチドを含まない、当該方法も提供する。いくつかの実施形態において、本開示は、結合複合体が約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、もしくは２秒を超える持続時間を有する、及び／または本方法が１５℃以上、２０℃以上、２５℃以上、３５℃以上、３７℃以上、４２℃以上、５５℃以上、６０℃以上、もしくは７２℃以上、または前述のうちのいずれかによって定義される範囲内で実施されるか、または実施され得る、当該方法を提供する。いくつかの実施形態において、本開示は、結合複合体が、検出ステップにおいて２０を超えるコントラストノイズ比を示す表面上に堆積されるか、それに結合するか、またはそれにハイブリダイズされる、当該方法を提供する。いくつかの実施形態において、本開示は、組成物が極性非プロトン性溶媒を取り込んだ緩衝条件下で堆積される、当該方法を提供する。いくつかの実施形態において、本開示は、接触させることが、当該ヌクレオチドが当該標的核酸の次の塩基に相補的であるときに当該結合複合体を安定化し、当該ヌクレオチドが当該標的核酸の当該次の塩基に相補的でないときに当該結合複合体を不安定化する条件下で行われる、当該方法を提供する。いくつかの実施形態において、本開示は、当該ポリマーヌクレオチドコンジュゲートが複数の分岐を有するポリマーを含み、当該第１のヌクレオチドの当該複数のコピーが当該分岐に結合し、特に当該第１のポリマーが、星型、櫛型、架橋、ボトルブラシ型、またはデンドリマー構成を有する、当該方法を提供する。いくつかの実施形態において、本開示は、当該ポリマーヌクレオチドコンジュゲートが、アビジン、ビオチン、親和性タグ、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される１つ以上の結合基を含む、当該方法を提供する。いくつかの実施形態において、本開示は、（ａ）の組成物とポリマーヌクレオチドコンジュゲートとの間に形成される当該結合複合体を不安定化して、当該ポリマーヌクレオチドコンジュゲートを除去する解離ステップを更に含む、当該方法を提供する。いくつかの実施形態において、本開示は、標的核酸の当該次の塩基に相補的であるヌクレオチドを当該プライマー核酸に取り込むための伸長ステップを更に含み、任意選択的に、伸長ステップが当該解離ステップとしてまたはその後に現在生じる、当該方法を提供する。いくつかの実施形態において、本開示は、ヌクレオチドの２つ以上の分岐及び２つ以上のコピーを有する分岐ポリマーを含む組成物を提供し、当該ヌクレオチドは、第１の複数の当該分岐またはアームに結合し、任意選択的に、１つ以上の相互作用部分は、第２の複数の当該分岐またはアームに結合する。いくつかの実施形態において、当該組成物は、ポリマー上に１つ以上の標識を更に含み得る。いくつかの実施形態において、本開示は、ヌクレオシドがポリマー当たり少なくとも４つのヌクレオチドの表面密度を有する、当該組成物を提供する。いくつかの実施形態において、本開示は、後続のヌクレオチド（またはヌクレオチド類似体）がポリメラーゼ反応中に伸長した核酸鎖への取り込みを防ぐように修飾されたヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体を含むか、または取り込むことを含む、当該組成物を提供する。いくつかの実施形態において、当該組成物は、後続のヌクレオチド（またはヌクレオチド類似体）がポリメラーゼ反応中に伸長した核酸鎖への取り込みを可能にするように可逆的に修飾されたヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体を含み得るか、または取り込み得る。いくつかの実施形態において、本開示は、１つ以上の標識が、蛍光標識、ＦＲＥＴドナー、及び／またはＦＲＥＴアクセプターを含む、当該組成物を提供する。いくつかの実施形態において、当該組成物は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６個またはそれ以上の分岐またはアーム、または２、４、８、１６、３２、６４個またはそれ以上の分岐またはアームを含み得る。いくつかの実施形態において、分岐またはアームは、中央部分から放射状に放射し得る。いくつかの実施形態において、当該組成物は、１つ以上の相互作用部分を含み得、その相互作用部分は、アビジンまたはストレプトアビジン、ビオチン部分、親和性タグ、酵素、抗体、ミニボディ、受容体、または他のタンパク質、非タンパク質タグ、金属親和性タグ、またはそれらの任意の組み合わせを含み得る。いくつかの実施形態において、本開示は、ポリマーが、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリ酢酸ビニル、ポリ乳酸、またはポリグリコール酸を含む、当該組成物を提供する。いくつかの実施形態において、本開示は、ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体が、リンカーを介して分岐またはアームに結合し、特にリンカーがＰＥＧを含み、ＰＥＧ部分が約１Ｋ、約２Ｋ、約３Ｋ、約４Ｋ、約５Ｋ、約１０Ｋ、約１５Ｋ、約２０Ｋ、約５０Ｋ、約１００Ｋ、約１５０Ｋ、または約２００Ｋ、または約２００Ｋを超える平均分子量を有する、当該組成物を提供する。いくつかの実施形態において、本開示は、リンカーがＰＥＧを含み、ＰＥＧ部分が約５Ｋ～約２０Ｋの平均分子量を有する、当該組成物を提供する。いくつかの実施形態において、本開示は、少なくとも１つのヌクレオチドもしくはヌクレオチド類似体が、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオシド、もしくはリボヌクレオシドを含む、及び／またはヌクレオチドもしくはヌクレオチド類似体が、ヌクレオチドもしくはヌクレオチド類似体の５’末端を介してリンカーにコンジュゲートされる、当該組成物を提供する。いくつかの実施形態において、本開示は、ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体のうちの１つが、デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、チミジン、デオキシウリジン、デオキシシチジン、アデノシン、グアノシン、５－メチル－ウリジン、及び／またはシチジンを含み、リンカーの長さが１～１，０００ｎｍである、当該組成物を提供する。いくつかの実施形態において、本開示は、少なくとも１つのヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体が、ポリメラーゼ反応または配列決定反応中に伸長を阻害するように修飾されたヌクレオチドであり、例えば、少なくとも１つのヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体が、３’ヒドロキシル基を欠くヌクレオチドであり、３’位にブロック基を含有するように修飾されたヌクレオチド、及び／または３’－Ｏ－アジド基、３’－Ｏ－アジドメチル基、３’－Ｏ－アルキルヒドロキシルアミノ基、３’－ホスホロチオエート基、３’－Ｏ－マロニル基、もしくは３’－Ｏ－ベンジル基で修飾されたヌクレオチドである、当該組成物を提供する。いくつかの実施形態において、本開示は、少なくとも１つのヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体が、３’位で修飾されていないヌクレオチドである、当該組成物を提供する。

【0375】

いくつかの実施形態において、ブロック基は、１つ以上のヌクレオチドに結合し得る。例えば、糖３’ＯＨ位を閉塞、除去、または保護することは、情報が損失しないように、単一の塩基対を超えるＤＮＡプライマー鋳型の不注意な伸長を防止する。成功した３’ブロックグループの基準は、一般的に次のように概説されている：１）ポリメラーゼ酵素は、伸長する核酸鎖に３’ブロック基を運ぶｄＮＴＰを正確かつ効率的に取り込むべきであり、２）迅速かつ完全な非ブロック化のための穏やかな条件が利用可能であるべきであり、３）ポリメラーゼは、３’基の非ブロック化の際に合成を再開始または再開することができるべきである。

【0376】

いくつかの実施形態において、３’ブロック基は、鋳型に依存した様式で取り込まれ、迅速に非ブロック化して伸長可能な３’ＯＨ基を得ることができる基を含む。代表的なブロック基として、例えば、エステル及びエーテルが挙げられる。他の代表的な３’ブロック基としては、－Ｆ、－ＮＨ_２、－ＯＣＨ_３、－Ｎ_３、－ＰＯ_３、－ＮＨＣＯＣＨ_３、２－ニトロベンゼン炭酸塩、２，４－ジニトロベンゼンスルフェニル、及びテトラヒドロフラニルエーテルが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、有用なブロック基の特性は、本明細書に開示される複数の例示的なブロック基とともに示されている、取り込み及び鎖終結を含む。追加の例示的なブロック基は、低級（１～４個の炭素）アルカン酸及び置換された低級アルカン酸エステル、例えば、ホルミル、アセチル、イソプロパノイル、α－フルオロ及びα－クロアセチルエステルなど；アルキルエーテル、リン酸ブロック基などのエーテルブロック基；２－ニトロベンジルなどの炭酸ブロック基；２－４－ジニトロベンゼンスフレニル、及びテテラヒドロチオフラニルエーテルブロッキング基）を含み得る。更なる例示的なブロック基としては、ＭＯＭ（ＣＨ_２ＯＣＨ_３）及びアリル（ＣＨ_２－ＣＨ＝ＣＨ_２）が挙げられるが、これらに限定されず、これらは高収率で切断され得る。

【0377】

本開示はまた、核酸分子を標識する方法も企図し、この方法は、核酸分子にヌクレオチドまたはヌクレオシド分子を取り込むことを含み、ヌクレオチドまたはヌクレオシド分子は、開裂可能なリンカーを介して検出可能な標識に連結される塩基を有する。いくつかの実施形態において、取り込むステップは、末端トランスフェラーゼ、ポリメラーゼ、または逆転写酵素を介して達成され得る。いくつかの実施形態において、塩基は、プリンまたはピリミジンであり得る。いくつかの実施形態において、塩基は、デアザプリンであり得る。いくつかの実施形態において、ヌクレオチドまたはヌクレオシド分子は、リボースまたはデオキシリボース糖部分を有することができる。いくつかの実施形態において、リボースまたはデオキシリボース糖は、２’または３’酸素原子を介して結合した保護基を含むことができる。いくつかの実施形態において、保護基を除去して、３’－ＯＨ基を露出させることができる。いくつかの実施形態において、分子は、デオキシリボヌクレオチド三リン酸であり得る。いくつかの実施形態において、検出可能な標識は、フルオロフォア、発色団、電気化学標識、またはスピン標識であり得る。いくつかの実施形態において、リンカーは、酸に不安定なリンカー、光解離性リンカーであり得るか、またはジスルフィド結合を含有し得る。いくつかの実施形態において、検出可能な標識及び／または開裂可能なリンカーは、第２のヌクレオチドまたはヌクレオシドの核酸分子への取り込みを防ぐのに十分なサイズまたは化学的性質であり得る。

【0378】

本開示は、複数の複合ポリメラーゼを形成するための方法を提供し、複数の変異体ポリメラーゼを、（ｉ）複数の核酸鋳型分子及び（ｉｉ）複数の核酸プライマーと、複数の変異体ポリメラーゼを複数の核酸鋳型分子及び複数の核酸プライマーに結合するのに好適な条件下で接触させ、それによって複数の複合ポリメラーゼ（各々、核酸二本鎖に結合した変異体ポリメラーゼを含む）を形成し、核酸二本鎖は、核酸プライマーにハイブリダイズする核酸鋳型分子を含む、ステップ（ａ）を含む。いくつかの実施形態において、複数の変異体ポリメラーゼは、ＤＮＡポリメラーゼを含む。いくつかの実施形態において、複数の変異体ポリメラーゼは、本明細書に記載の複数の組換え変異体ポリメラーゼを含む。いくつかの実施形態において、変異体ポリメラーゼは、上で考察した１つ以上の例示的な変異体ポリメラーゼの特性を含む。いくつかの実施形態において、変異体ＤＮＡポリメラーゼは、配列番号１を含む野生型ポリメラーゼと比較して、約２５～５０℃または約４５～７５℃の温度範囲で増加した熱安定性を示す。

【0379】

いくつかの実施形態において、複数の複合ポリメラーゼを形成するための方法では、プライマーは、３’伸長可能な末端または３’伸長不可能な末端を含む。いくつかの実施形態において、複数の核酸鋳型分子は、上記の潜在的特性のうちのいずれかを含む核酸鋳型の実施形態を含み得る。

【0380】

いくつかの実施形態において、複数の複合ポリメラーゼを形成するための方法では、複数の核酸鋳型分子及び／または複数の核酸プライマーは、溶液中にあるか、または支持体に固定化される。いくつかの実施形態において、複数の核酸鋳型分子及び／または複数の核酸プライマーが支持体に固定化される場合、組換え変異体ポリメラーゼとの結合は、複数の固定化された複合ポリメラーゼを生成する。いくつかの実施形態において、複数の核酸鋳型分子及び／または核酸プライマーは、支持体上の１０^２～１０^１５個の異なる部位に固定化される。いくつかの実施形態において、複数の鋳型分子及び核酸プライマーと複数の組換え変異体ポリメラーゼとの結合は、支持体上の１０^２～１０^１５個の異なる部位に固定化された複数の複合ポリメラーゼを生成する。いくつかの実施形態において、支持体上の複数の固定化された複合ポリメラーゼは、事前に決定された部位または支持体上のランダムな部位に固定化される。いくつかの実施形態において、複数の固定化された複合ポリメラーゼは、互いに流体連通して、試薬（例えば、ポリメラーゼ、多価分子、ヌクレオチド、及び／または二価カチオンを含む酵素）の溶液を支持体上に流すことを可能にし、その結果、支持体上の複数の固定化された複合ポリメラーゼを超並列方法で試薬の溶液と反応させる。

【0381】

いくつかの実施形態において、複数の複合ポリメラーゼを形成するための方法は、一般に、（ａ）複数の変異体ポリメラーゼを、（ｉ）複数の核酸鋳型分子と、（ｉｉ）複数の核酸プライマーと接触させて、複数の複合ポリメラーゼを形成することと、（ｂ１）複数の複合ポリメラーゼを、複数の多価分子と接触させて、複数の多価複合ポリメラーゼを形成することと、を含む。いくつかの実施形態において、本方法は、ステップ（ｃ１）：複合ポリメラーゼに結合する多価分子を検出することを更に含む。いくつかの実施形態において、本方法は、ステップ（ｄ１）：複合ポリメラーゼに結合する多価分子の相補的ヌクレオチド単位を識別することを更に含む。

【0382】

いくつかの実施形態において、複数の複合ポリメラーゼを形成するための方法は、ステップ（ｂ１）：複数の複合ポリメラーゼを、複数の多価分子と接触させることを更に含み、複数の中の個々の多価分子は、複数のヌクレオチドアームに結合するコアを含み、各ヌクレオチドアームは、ヌクレオチド（例えば、ヌクレオチド単位）に結合する。いくつかの実施形態において、複合ポリメラーゼへの多価分子の相補的ヌクレオチド単位の結合は、複数の多価複合ポリメラーゼを形成する。いくつかの実施形態において、ステップ（ｂ１）の接触させることは、多価分子中の少なくとも１つの相補的ヌクレオチド単位を複合ポリメラーゼのうちの少なくとも１つに結合するのに好適な条件下で行われる。いくつかの実施形態において、条件は、複数の多価複合ポリメラーゼのプライマーへの相補的ヌクレオチド単位の取り込みを阻害するのに好適である。いくつかの実施形態において、ステップ（ｂ１）の接触させることは、多価分子のうちの少なくとも１つのヌクレオチドを複合ポリメラーゼのうちの少なくとも１つに結合するのに好適な条件下で行われるが、結合したヌクレオチドは、核酸プライマーの３’末端に取り込まない。

【0383】

いくつかの実施形態において、複数の複合ポリメラーゼを形成するための方法では、複数の多価分子中の個々の多価分子は、上記の潜在的特性のうちのいずれかを含む、多価分子の実施形態のうちのいずれかを含み得る。

【0384】

いくつかの実施形態において、複数の複合ポリメラーゼを形成するための方法では、複数の複合ポリメラーゼと複数の多価分子との結合は、少なくとも１つの親和性複合体を形成し、本方法は、以下のステップ：（ａ）第１の核酸プライマー、第１のＤＮＡポリメラーゼ、及び第１の多価分子をコンカテマー鋳型分子の第１の部分に結合し、それによって第１の結合複合体を形成するステップであって、第１の多価分子の第１のヌクレオチド単位が、第１のＤＮＡポリメラーゼに結合する、形成するステップと、（ｂ）第２の核酸プライマー、第２のＤＮＡポリメラーゼ、及び第１の多価分子を同じコンカテマー鋳型分子の第２の部分に結合し、それによって第２の結合複合体を形成するステップであって、第１の多価分子の第２のヌクレオチド単位は、第２のＤＮＡポリメラーゼに結合し、同じ多価分子を含む第１及び第２の結合複合体は、親和性複合体を形成する、形成するステップと、を含む。いくつかの実施形態において、第１のポリメラーゼは、本明細書に記載の任意の野生型または変異体ポリメラーゼを含む。いくつかの実施形態において、第２のポリメラーゼは、本明細書に記載の任意の野生型または変異体ポリメラーゼを含む。コンカテマー鋳型分子は、関心対象の配列のタンデム反復配列と、少なくとも１つのユニバーサル配列決定プライマー結合部位と、を含む。第１及び第２の核酸プライマーは、コンカテマー鋳型分子に沿って配列決定プライマー結合部位に結合することができる。

【0385】

いくつかの実施形態において、複数の複合ポリメラーゼを形成するための方法では、複数の複合ポリメラーゼと複数の多価分子との結合は、少なくとも１つの親和性複合体を形成し、本方法は、以下のステップ：（ａ）第１の核酸プライマー、第１のＤＮＡポリメラーゼ、及び第１の多価分子を第１の鋳型分子に結合し、それによって第１の結合複合体を形成するステップであって、第１の多価分子の第１のヌクレオチド単位が、第１のＤＮＡポリメラーゼに結合する、形成するステップと、（ｂ）第２の核酸プライマー、第２のＤＮＡポリメラーゼ、及び第１の多価分子を第２の鋳型分子に結合し、それによって第２の結合複合体を形成するステップであって、第１の多価分子の第２のヌクレオチド単位は、第２のＤＮＡポリメラーゼに結合し、同じ多価分子を含む第１及び第２の結合複合体は、親和性複合体を形成する、形成するステップと、を含む。いくつかの実施形態において、第１のポリメラーゼは、本明細書に記載の任意の野生型または変異体ポリメラーゼを含む。いくつかの実施形態において、第２のポリメラーゼは、本明細書に記載の任意の野生型または変異体ポリメラーゼを含む。いくつかの実施形態において、第１及び第２の鋳型分子は、クローン増幅された鋳型分子である。いくつかの実施形態において、第１及び第２の鋳型分子は、互いに近接して局在化されている。例えば、クローン増幅された第１及び第２の鋳型分子は、ブリッジ増幅を介して生成され、支持体上の同じ位置または特性に固定化される線形鋳型分子を含む。第１及び第２の鋳型分子は、関心対象の配列と、少なくとも１つのユニバーサル配列決定プライマー結合部位と、を含む。第１及び第２の核酸プライマーは、それぞれ、第１及び第２の鋳型分子上の配列決定プライマー結合部位に結合することができる。

【0386】

いくつかの実施形態において、複数の複合ポリメラーゼを形成するための方法では、複数の多価分子中の多価分子中の少なくとも１つは、検出可能なレポーター部分で標識される。いくつかの実施形態において、検出可能なレポーター部分は、フルオロフォアを含む。いくつかの実施形態において、多価分子のコアは、フルオロフォアで標識され、多価分子の所与のコアに結合するフルオロフォアは、ヌクレオチドアームのヌクレオチド塩基（例えば、アデニン、グアニン、シトシン、チミン、またはウラシル）に対応する。いくつかの実施形態において、多価分子のヌクレオチドアームの少なくとも１つは、フルオロフォアに結合するリンカー及び／またはヌクレオチド塩基を含み、所与のリンカーまたはヌクレオチド塩基に結合するフルオロフォアは、ヌクレオチドアームのヌクレオチド塩基（例えば、アデニン、グアニン、シトシン、チミン、またはウラシル）に対応する。

【0387】

いくつかの実施形態において、複数の複合ポリメラーゼを形成するための方法では、複数の多価分子は、各々が、ヌクレオチド類似体（例えば、ヌクレオチド類似体単位）で結合した複数のヌクレオチドアームを有する少なくとも１つの多価分子を含み、ヌクレオチド類似体は、糖２’及び／または３’位に鎖終結部分を含む。いくつかの実施形態において、複数の多価分子は、各々が、鎖終結部分を欠くヌクレオチド単位に結合した複数のヌクレオチドアームを含む少なくとも１つの多価分子を含む。

【0388】

いくつかの実施形態において、複数の複合ポリメラーゼを形成するための方法では、ステップ（ｂ１）の接触させることは、ストロンチウム、バリウム、ナトリウム、マグネシウム、カリウム、マンガン、カルシウム、リチウム、ニッケル、及びコバルトからなる群から選択される少なくとも１つのカチオンの存在下で行われる。いくつかの実施形態において、ステップ（ｂ１）の接触させることは、ストロンチウム、バリウム、及び／またはカルシウムの存在下で行われる。

【0389】

いくつかの実施形態において、複数の複合ポリメラーゼを形成するための方法では、ステップ（ａ）の接触させることは、約２５～５１℃の温度範囲から選択される一定温度で行われる。いくつかの実施形態において、ステップ（ｂ１）の接触させることは、約２５～５１℃の温度範囲から選択される一定温度で行われる。いくつかの実施形態において、ステップ（ａ）及び（ｂ１）の接触させることは、約２５～５１℃の温度範囲（例えば、等温温度）から選択される一定温度で行われる。

【0390】

いくつかの実施形態において、複数の複合ポリメラーゼを形成するための方法は、ステップ（ｃ１）：複合ポリメラーゼに結合する多価分子を検出することを更に含む。いくつかの実施形態において、検出することは、複合ポリメラーゼに結合する多価分子を検出することを含み、多価分子の相補的ヌクレオチド単位は、プライマーに結合するが、相補的ヌクレオチド単位の取り込みは、阻害される。いくつかの実施形態において、多価分子は、検出可能なレポーター部分で標識されて検出を可能にする。いくつかの実施形態において、標識された多価分子は、多価分子のコア、リンカー、及び／またはヌクレオチド単位の塩基に結合したフルオロフォアを含む。

【0391】

いくつかの実施形態において、複数の複合ポリメラーゼを形成するための方法は、ステップ（ｄ１）：複合ポリメラーゼに結合する多価分子の相補的ヌクレオチド単位を識別することを更に含む。いくつかの実施形態において、多価分子の相補的ヌクレオチド単位を識別することは、核酸鋳型の配列を決定するために使用することができる。いくつかの実施形態において、多価分子は、複数の複合ポリメラーゼに結合する相補的ヌクレオチド単位（例えば、ヌクレオチド塩基アデニン、グアニン、シトシン、チミン、またはウラシル）の識別を可能にするために、ヌクレオチドアームに結合した特定のヌクレオチド単位に対応する検出可能なレポーター部分で標識される。いくつかの実施形態において、ステップ（ｃ１）の検出すること及びステップ（ｄ１）の識別することは、核酸鋳型分子の配列を決定するために使用することができる。

【0392】

いくつかの実施形態において、複数の複合ポリメラーゼを形成するための方法は、一般に、（ａ）複数の変異体ポリメラーゼを、（ｉ）複数の核酸鋳型分子と、（ｉｉ）複数の核酸プライマーと接触させて、複数の複合ポリメラーゼを形成することと、（ｂ２）複数の複合ポリメラーゼを、複数のヌクレオチドと接触させて、複数のヌクレオチド複合ポリメラーゼを形成することと、を含む。いくつかの実施形態において、本方法は、ステップ（ｃ２）：ヌクレオチド複合ポリメラーゼのプライマーに取り込まれる相補的ヌクレオチドを検出することを更に含む。いくつかの実施形態において、本方法は、ステップ（ｄ２）：ヌクレオチド複合ポリメラーゼのプライマーに取り込まれる相補的ヌクレオチドの塩基を識別することを更に含む。

【0393】

いくつかの実施形態において、複数の複合ポリメラーゼを形成するための方法は、ステップ（ｂ２）：ステップ（ａ）の複数の複合ポリメラーゼを、複数のヌクレオチドからの相補的ヌクレオチドを、複数の複合ポリメラーゼからの複合ポリメラーゼに結合するのに好適な条件下で、複数のヌクレオチドと接触させ、それによってヌクレオチド複合ポリメラーゼを形成することを更に含む。いくつかの実施形態において、ステップ（ｂ２）の接触させることは、結合した相補的ヌクレオチドのヌクレオチド複合ポリメラーゼのプライマーへの取り込みを促進するのに好適な条件下で行われ、それによって複数のヌクレオチド複合ポリメラーゼを形成する。いくつかの実施形態において、ステップ（ｂ２）においてプライマーの３’末端にヌクレオチドを取り込むことは、プライマー伸長反応を含む。いくつかの実施形態において、ステップ（ｂ２）の接触させることは、ストロンチウム、バリウム、ナトリウム、マグネシウム、カリウム、マンガン、カルシウム、リチウム、ニッケル、及びコバルトからなる群から選択される少なくとも１つのカチオンの存在下で行われる。いくつかの実施形態において、ステップ（ｂ２）の接触させることは、マグネシウム及び／またはマンガンの存在下で行われる。いくつかの実施形態において、複数の中の個々のヌクレオチドは、上で考察した１つ以上の例示的なヌクレオチド単位の特性を含むヌクレオチド単位を含む。いくつかの実施形態において、複数のヌクレオチドは、天然ヌクレオチド（例えば、非類似体ヌクレオチド）またはヌクレオチド類似体を含む。いくつかの実施形態において、複数のヌクレオチド中の個々のヌクレオチドは、２’及び／または３’糖位に結合した鎖終結部分を含む。いくつかの実施形態において、複数のヌクレオチドは、除去可能であるか、または除去不可能である２’及び／または３’鎖終結部分を含む。いくつかの実施形態において、鎖終結部分は、上記の潜在的特性のうちのいずれかを含む、アジド（ａｚｉｄｅ）、アジド（ａｚｉｄｏ）、またはアジドメチル基を含む。いくつかの実施形態において、アジド（ａｚｉｄｅ）、アジド（ａｚｉｄｏ）、またはアジドメチル基は、ホスフィン化合物を用いてヌクレオチドから除去可能である。当業者であれば、他の除去可能な鎖終結部分が可能であることを認識するであろう。いくつかの実施形態において、複数のヌクレオチドは、検出可能なレポーター部分で標識された複数のヌクレオチドを含む。検出可能なレポーター部分は、フルオロフォアを含む。いくつかの実施形態において、フルオロフォアは、ヌクレオチド塩基に結合する。いくつかの実施形態において、フルオロフォアは、塩基から開裂可能／除去可能であるか、または塩基から除去可能ではないリンカーによってヌクレオチド塩基に結合する。いくつかの実施形態において、複数の中のヌクレオチドのうちの少なくとも１つは、検出可能なレポーター部分で標識されない。いくつかの実施形態において、ヌクレオチドに結合する特定の検出可能なレポーター部分（例えば、フルオロフォア）は、ヌクレオチド塩基（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、またはｄＵＴＰ）に対応して、ヌクレオチド塩基の検出及び識別を可能にすることができる。

【0394】

いくつかの実施形態において、複数の複合ポリメラーゼを形成するための方法では、ステップ（ａ）の接触させることは、約２５～５１℃の温度範囲から選択される一定温度で行われる。いくつかの実施形態において、ステップ（ｂ２）の接触させることは、約２５～５１℃の温度範囲から選択される一定温度で行われる。いくつかの実施形態において、ステップ（ａ）及び（ｂ２）の接触させることは、約２５～５１℃の温度範囲（例えば、等温温度）から選択される一定温度で行われる。

【0395】

いくつかの実施形態において、複数の複合ポリメラーゼを形成するための方法は、ステップ（ｃ２）：ヌクレオチド複合ポリメラーゼのプライマーに取り込まれる相補的ヌクレオチドを検出することを更に含む。いくつかの実施形態において、複数のヌクレオチドは、検出可能なレポーター部分で標識されて検出を可能にする。

【0396】

いくつかの実施形態において、複数の複合ポリメラーゼを形成するための方法は、ステップ（ｄ２）：ヌクレオチド複合ポリメラーゼのプライマーの３’末端に取り込まれる相補的ヌクレオチドの塩基を識別することを更に含む。いくつかの実施形態において、ステップ（ｃ２）の検出すること及びステップ（ｄ２）の識別することは、核酸鋳型分子の配列を決定するために使用することができる。

【0397】

代替的に、複数の複合ポリメラーゼを形成するための方法は、ステップ（ｂ２）：ステップ（ａ）の複数の複合ポリメラーゼを、複数のヌクレオチドからの相補的ヌクレオチドを、複数の複合ポリメラーゼからの複合ポリメラーゼに結合するのに好適な条件下で、複数のヌクレオチドと接触させ、それによってヌクレオチド複合ポリメラーゼを形成することを更に含む。いくつかの実施形態において、ステップ（ｂ２）の接触させることは、ヌクレオチド結合を促進するが、ヌクレオチド複合ポリメラーゼのプライマーの３’末端への結合した相補的ヌクレオチドの取り込みを阻害するのに好適な条件下で行われる。いくつかの実施形態において、ステップ（ｂ２）の接触させることは、ストロンチウム、バリウム、ナトリウム、マグネシウム、カリウム、マンガン、カルシウム、リチウム、ニッケル、及びコバルトからなる群から選択される少なくとも１つのカチオンの存在下で行われる。複数の複合ポリメラーゼは、少なくとも２つの別個の混合物と順次接触させることができ、各混合物は、操作されたポリメラーゼ及びヌクレオチドを含む。接触させることは、鋳型内の第１、第２、及び第３の塩基の種類のための同族体と安定した三元複合体を形成するのに好適な条件下で行われる。本方法は、ステップ（ｃ３）である三元複合体が形成されたかどうかを決定するために少なくとも２つの別々の混合物を調べることを更に含む。本方法は、ステップ（ｄ３）であるプライミングされた鋳型核酸分子の次の正しいヌクレオチドを識別することを更に含み、三元複合体がステップ（ｃ３）で検出された場合、次の正しいヌクレオチドは、第１、第２、または第３の塩基の種類の同族体として識別され、ステップ（ｃ３）での三元複合体の不在に基づいて、次の正しいヌクレオチドは、第４の塩基の種類のヌクレオチド同族体であると推定される。本方法は、ステップ（ｅ３）であるステップ（ｃ３）の後にプライミングされた鋳型核酸のプライマーに次の正しいヌクレオチドを添加し、それによって伸長されたプライマーを生成することと、ステップ（ｆ３）である伸長したプライマーを含むプライミングされた鋳型核酸においてステップ（ａ）～（ｅ３）を繰り返すことと、を更に含む。

【0398】

いくつかの実施形態において、複数の複合ポリメラーゼを形成するための方法では、ステップ（ｂ１）の複数の多価分子中の少なくとも１つの多価分子は、上記の潜在的特性のうちのいずれかを含む、多価分子の実施形態のうちのいずれかを具現化し得る。

【0399】

いくつかの実施形態において、複数の複合ポリメラーゼを形成するための方法では、ステップ（ｂ１）の複数の多価分子中の少なくとも１つの多価分子は、１つ、２つ、または３つのリン原子の鎖を有するヌクレオチド単位を含み、その鎖は、典型的には、エステルまたはホスホラミド結合を介して糖部分の５’炭素に結合する。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのヌクレオチド単位は、リン原子が介在するＯ、Ｓ、ＮＨ、メチレン、またはエチレンと一緒に連結されるリン鎖を有する類似体である。いくつかの実施形態において、鎖内のリン原子は、Ｏ、Ｓ、またはＢＨ_３を含む置換側基を含む。いくつかの実施形態において、鎖は、ホスホロアミデート、ホスホロチオエート、ホスホルジチオエート、及びＯ－メチルホスホロアミダイト基を含む類似体で置換されたホスフェート基を含む。

【0400】

いくつかの実施形態において、複数の複合ポリメラーゼを形成するための方法では、ステップ（ｂ１）の複数の多価分子中の個々の多価分子は、複数のヌクレオチドアームに結合するコアを含み、個々のヌクレオチドアームは、糖２’位、糖３’位、または糖２’及び３’位に鎖終結部分（例えば、ブロック部分）を有するヌクレオチド単位を含む。

【0401】

いくつかの実施形態において、複数の複合ポリメラーゼを形成するための方法では、ステップ（ｂ１）の複数の多価分子中の少なくとも１つの多価分子は、上で考察した１つ以上の例示的なヌクレオチド類似体特性を含むターミネーターヌクレオチド類似体を含むヌクレオチド単位を含む。

【0402】

いくつかの実施形態において、複数の複合ポリメラーゼを形成するための方法では、ステップ（ｂ１）の複数の多価分子中の少なくとも１つの多価分子は、糖２’位、糖３’位、または糖２’及び３’位に鎖終結部分（例えば、ブロック部分）を有するターミネーターヌクレオチド類似体を含むヌクレオチド単位を含む。鎖終結部分は、上記の鎖終結部分の実施形態のうちのいずれかを含み得る開裂可能な部分を介して３’－ＯＨ糖位に結合することができる。いくつかの実施形態において、鎖終結部分は、上記の潜在的特性のうちのいずれかを含む、アジド（ａｚｉｄｅ）、アジド（ａｚｉｄｏ）、またはアジドメチル基を含む。

【0403】

いくつかの実施形態において、複数の複合ポリメラーゼを形成するための方法では、ステップ（ｂ１）の複数の多価分子中の少なくとも１つの多価分子は、複数のヌクレオチドアームに結合するコアを含み、コアは、検出可能なレポーター部分で標識される。いくつかの実施形態において、検出可能なレポーター部分は、フルオロフォアを含む。いくつかの実施形態において、多価分子に結合する特定の検出可能なレポーター部分（例えば、フルオロフォア）は、ヌクレオチド単位の塩基（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、またはｄＵＴＰ）に対応して、ヌクレオチド塩基の検出及び識別を可能にすることができる。いくつかの実施形態において、多価分子のヌクレオチドアームのうちの少なくとも１つは、フルオロフォアに結合するリンカー及び／またはヌクレオチド塩基を含み、所与のリンカーまたはヌクレオチド塩基に結合するフルオロフォアは、ヌクレオチドアームのヌクレオチド塩基（例えば、アデニン、グアニン、シトシン、チミン、またはウラシル）に対応する。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの多価分子は、フルオロフォアを欠く。

【0404】

いくつかの実施形態において、複数の複合ポリメラーゼを形成するための方法では、ステップ（ｂ１）の複数の多価分子中の多価分子の少なくとも１つのヌクレオチドアームは、検出可能なレポーター部分に結合するヌクレオチド単位を有する。いくつかの実施形態において、検出可能なレポーター部分は、ヌクレオチド塩基に結合する。いくつかの実施形態において、検出可能なレポーター部分は、フルオロフォアを含む。いくつかの実施形態において、多価分子に結合する特定の検出可能なレポーター部分（例えば、フルオロフォア）は、ヌクレオチド単位の塩基（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、またはｄＵＴＰ）に対応して、ヌクレオチド塩基の検出及び識別を可能にすることができる。

【0405】

いくつかの実施形態において、複数の複合ポリメラーゼを形成するための方法では、ステップ（ｂ１）の多価分子のコアは、アビジン様部分を含み、コア結合部分は、ビオチンを含む。いくつかの実施形態において、コアは、アビジンタンパク質、ならびに少なくとも１つのビオチン部分に結合することができる任意の誘導体、類似体、及び他の非天然形態のアビジンを含むストレプトアビジン型またはアビジン型部分を含む。アビジン部分の他の形態としては、天然及び組換えアビジン及びストレプトアビジン、ならびに誘導体化分子、例えば、非グリコシル化アビジン及び切断ストレプトアビジンが挙げられる。例えば、アビジン部分は、アビジンの脱グリコシル化形態、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ（例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｖｉｄｉｎｉｉ）によって産生される細菌ストレプトアビジン、ならびに誘導体化形態、例えば、Ｎ－アシルアビジン、例えば、Ｎ－アセチル、Ｎ－フタリル、及びＮ－スクシニルアビジン、ならびに市販の製品ＥｘｔｒＡｖｉｄｉｎ（商標）、Ｃａｐｔａｖｉｄｉｎ（商標）、Ｎｅｕｔｒａｖｉｄｉｎ（商標）、及びＮｅｕｔｒａｌｉｔｅ Ａｖｉｄｉｎ（商標）を含む。

【0406】

いくつかの実施形態において、複数の複合ポリメラーゼを形成するための方法では、ステップ（ｂ２）の複数のヌクレオチドのうちの少なくとも１つのヌクレオチドは、塩基、糖、及び少なくとも１つのリン酸基を含む。いくつかの実施形態において、複数の中の少なくとも１つのヌクレオチドは、上で考察した１つ以上の例示的なヌクレオチド単位の特性を含むヌクレオチド単位を含む。いくつかの実施形態において、複数の中の少なくとも１つのヌクレオチドは、ヌクレオチド類似体ではない。いくつかの実施形態において、複数の中の少なくとも１つのヌクレオチドは、ヌクレオチド類似体を含む。

【0407】

いくつかの実施形態において、複数の複合ポリメラーゼを形成するための方法では、ステップ（ｂ２）の複数のヌクレオチドのうちの少なくとも１つのヌクレオチドは、１つ、２つ、または３つのリン原子の鎖を含み、この鎖は、典型的には、エステルまたはホスホラミド結合を介して糖部分の５’炭素に結合する。いくつかの実施形態において、複数の中の少なくとも１つのヌクレオチドは、リン原子が介在するＯ、Ｓ、ＮＨ、メチレン、またはエチレンと一緒に連結されるリン鎖を有する類似体である。いくつかの実施形態において、鎖内のリン原子は、Ｏ、Ｓ、またはＢＨ_３を含む置換側基を含む。いくつかの実施形態において、鎖は、ホスホロアミデート、ホスホロチオエート、ホスホルジチオエート、及びＯ－メチルホスホロアミダイト基を含む類似体で置換されたホスフェート基を含む。

【0408】

いくつかの実施形態において、複数の複合ポリメラーゼを形成するための方法では、ステップ（ｂ２）の複数のヌクレオチドのうちの少なくとも１つのヌクレオチド。ヌクレオチドは、上で考察した１つ以上の例示的なヌクレオチド類似体特性を含むターミネーターヌクレオチド類似体の形態をとり得る。

【0409】

いくつかの実施形態において、複数の複合ポリメラーゼを形成するための方法では、ステップ（ｂ２）の複数のヌクレオチドのうちの少なくとも１つのヌクレオチドは、糖２’位、糖３’位、または糖２’及び３’位に鎖終結部分（例えば、ブロック部分）を有するターミネーターヌクレオチド類似体を含み、これは、上記の鎖終結部分の実施形態のうちのいずれかを含み得る。いくつかの実施形態において、鎖終結部分は、上記の潜在的特性のうちのいずれかを含む、アジド（ａｚｉｄｅ）、アジド（ａｚｉｄｏ）、またはアジドメチル基を含む。

【0410】

いくつかの実施形態において、複数の複合ポリメラーゼを形成するための方法では、ステップ（ｂ２）の複数のヌクレオチドのうちの少なくとも１つのヌクレオチドは、検出可能なレポーター部分を含む。いくつかの実施形態において、ステップ（ｂ２）の複数のヌクレオチドのうちの少なくとも１つのヌクレオチドは、標識されたヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、検出可能なレポーター部分は、フルオロフォアを含む。いくつかの実施形態において、フルオロフォアは、ヌクレオチド塩基に結合する。いくつかの実施形態において、フルオロフォアは、塩基から開裂可能／除去可能であるリンカーによってヌクレオチド塩基に結合する。いくつかの実施形態において、複数の中のヌクレオチドのうちの少なくとも１つは、検出可能なレポーター部分で標識されない。いくつかの実施形態において、ヌクレオチドに結合する特定の検出可能なレポーター部分（例えば、フルオロフォア）は、ヌクレオチド塩基（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、またはｄＵＴＰ）に対応して、ヌクレオチド塩基の検出及び識別を可能にすることができる。

【0411】

いくつかの実施形態において、複数の複合ポリメラーゼを形成するための方法では、ステップ（ｂ２）の複数のヌクレオチドのうちの少なくとも１つのヌクレオチドは、上で考察した１つ以上の例示的なヌクレオチド類似体特性を含む末端ヌクレオチド類似体を含む。

【0412】

いくつかの実施形態において、複数の複合ポリメラーゼを形成するための方法では、ステップ（ｂ２）の複数のヌクレオチドのうちの少なくとも１つのヌクレオチドは、アジド（ａｚｉｄｅ）、アジド（ａｚｉｄｏ）、またはアジドメチル基を含む開裂可能な部分を含む、塩基上の開裂可能なリンカーを含む。いくつかの実施形態において、開裂可能な部分アジド（ａｚｉｄｅ）、アジド（ａｚｉｄｏ）、及びアジドメチル基は、ホスフィン化合物を用いて開裂可能／除去可能である。いくつかの実施形態において、ホスフィン化合物は、誘導体化トリアルキルホスフィン部分または誘導体化トリアリールホスフィン部分を含む。いくつかの実施形態において、ホスフィン化合物は、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）またはビススルホトリフェニルホスフィン（ＢＳ－ＴＰＰ）またはトリ（ヒドロキシプロイル）ホスフィン（ＴＨＰＰ）を含む。いくつかの実施形態において、開裂剤は、４－ジメチルアミノピリジン（４－ＤＭＡＰ）を含む。

【0413】

いくつかの実施形態において、複数の複合ポリメラーゼを形成するための方法では、ステップ（ｂ２）の複数のヌクレオチドのうちの少なくとも１つのヌクレオチドは、糖２’及び／または糖３’位に鎖終結部分、ならびに塩基上の開裂可能なリンカーを含み、糖上の鎖終結部分及び塩基上の開裂可能なリンカーは、同じまたは異なる開裂可能な部分を有する。いくつかの実施形態において、鎖終結部分（例えば、糖２’及び／または糖３’位）ならびに塩基に連結された検出可能なレポーター部分は、同じ化学薬品で化学的に開裂可能／除去可能である。いくつかの実施形態において、鎖終結部分（例えば、糖２’及び／または糖３’位）及び塩基に連結された検出可能なレポーター部分は、異なる化学薬品を用いて化学的に開裂可能／除去可能である。

【0414】

いくつかの実施形態において、複数の複合ポリメラーゼを形成するための方法では、ステップ（ａ）の支持体は、平面または非平面の支持体を含む。支持体は、固体または半固体であり得る。いくつかの実施形態において、支持体は、多孔質、半多孔質、または非多孔質であり得る。いくつかの実施形態において、支持体の表面は、１つ以上の化合物でコーティングされ、支持体上に不動態化層を生成することができる。いくつかの実施形態において、不動態化層は、多孔質または半多孔質層を形成する。いくつかの実施形態において、核酸プライマー、鋳型及び／またはポリメラーゼを不動態化層に結合して、プライマー、鋳型、及び／またはポリメラーゼを支持体に固定化することができる。いくつかの実施形態において、支持体は、支持体上の改善された核酸ハイブリダイゼーション及び増幅性能を可能にする低い非特異的結合表面を含む。一般に、支持体は、共有結合または非共有結合している低化学修飾層、例えば、シラン層、ポリマーフィルム、及び複数の核酸鋳型分子を支持体に固定化するために使用することができる１つ以上の共有結合または非共有結合しているオリゴヌクレオチドの１つ以上の層を含み得る。いくつかの実施形態において、支持体は、支持体上の化学基を介して少なくとも支持体の一部に共有結合した官能化ポリマーコーティング層、官能化ポリマーコーティングにグラフトされたプライマー、ならびにプライマー及び官能化ポリマーコーティング上の水溶性保護コーティングを含むことができる。いくつかの実施形態において、官能化ポリマーコーティングは、ポリ（Ｎ－（５－アジドアセトアミジルペンチル）アクリルアミド－ｃｏ－アクリルアミド（ＰＡＺＡＭ）を含む。いくつかの実施形態において、支持体は、少なくとも１つの親水性ポリマーコーティング層、及び複数のオリゴヌクレオチドのうちの少なくとも１つの層を有する表面コーティングを含む。親水性ポリマーコーティング層は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含むことができる。親水性ポリマーコーティング層は、少なくとも４つの分岐を有する分岐ＰＥＧを含むことができる。いくつかの実施形態において、支持体は、４５度以下の水接触角を有する低非特異的結合コーティングを含む。いくつかの実施形態において、支持体に固定化された、または支持体上のコーティングに固定化された複数の複合ポリメラーゼの密度は、１ｍｍ^２当たり約１０^２～１０^６、または１ｍｍ^２当たり約１０^６～１０^９、または１ｍｍ^２当たり約１０^９～１０^１２、または１ｍｍ^２当たり約１０^１２～１０^１５である。いくつかの実施形態において、複数の複合ポリメラーゼは、支持体に固定化されるか、または支持体上の所定の部位で支持体上のコーティング（または支持体上のコーティング）に固定化されるか、または支持体上のランダムな部位での支持体上のコーティング（または支持体上のコーティング）に固定化される。本開示は、変異体ポリメラーゼをヌクレオチドに結合するための方法であって、（ａ）変異体ポリメラーゼを、（ｉ）核酸鋳型分子、及び（ｉｉ）核酸プライマーに接触させることであって、接触させることは、変異体ポリメラーゼを核酸プライマーにハイブリダイズする核酸鋳型分子に結合するのに好適な条件下で行われ、核酸プライマーにハイブリダイズする核酸鋳型分子が核酸二本鎖を形成する、接触させることを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態において、変異体ポリメラーゼは、組換え変異体ポリメラーゼを含む。いくつかの実施形態において、プライマーは、３’伸長可能な末端または３’伸長不可能な末端を含む。いくつかの実施形態において、変異体ポリメラーゼは、例示的な変異体ポリメラーゼの特性に関連して上記に列挙される１つ以上の特性を含む。

【0415】

いくつかの実施形態において、変異体ポリメラーゼをヌクレオチドに結合させるための方法は、（ｂ）変異体ポリメラーゼを、少なくとも１つのヌクレオチドを核酸二本鎖に結合する変異体ポリメラーゼに結合するのに好適な条件下で、複数のヌクレオチドと接触させることを更に含む。いくつかの実施形態において、変異体ポリメラーゼは、ストロンチウム、バリウム、ナトリウム、マグネシウム、カリウム、マンガン、カルシウム、リチウム、ニッケル、及びコバルトからなる群から選択される少なくとも１つのカチオンの存在下で、複数のヌクレオチドと接触させる。いくつかの実施形態において、ステップ（ｂ）の接触させることは、ストロンチウム、バリウム、及び／またはカルシウムの存在下で行われる。いくつかの実施形態において、変異体ポリメラーゼに結合する少なくとも１つのヌクレオチドは、伸長可能なまたは伸長不可能なプライマーの３’末端に取り込まない。いくつかの実施形態において、複数のヌクレオチドは、糖２’または３’位に鎖終結部分を有する少なくとも１つのヌクレオチド類似体を含む。いくつかの実施形態において、複数のヌクレオチドは、鎖終結部分を欠く少なくとも１つのヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、本方法は、（ｃ）ポリメラーゼに結合するがプライマーの３’末端に取り込まれていない少なくとも１つのヌクレオチドを検出することを更に含む。いくつかの実施形態において、本方法は、（ｄ）ポリメラーゼに結合するがプライマーの３’末端に取り込まれていない少なくとも１つのヌクレオチドを識別することを更に含む。

【0416】

本開示は、ヌクレオチド、核酸鋳型分子の配列、または変異体ポリメラーゼを取り込むか、または変異体ポリメラーゼを結合するための方法であって、（ａ）変異体ポリメラーゼを、（ｉ）核酸鋳型分子及び（ｉｉ）核酸プライマーに接触させることを含み、接触させることは、変異体ポリメラーゼを、核酸プライマーにハイブリダイズする核酸鋳型分子に結合するのに好適な条件下で行われ、核酸プライマーにハイブリダイズする核酸鋳型分子が核酸二本鎖を形成する、方法を提供する。いくつかの実施形態において、変異体ポリメラーゼは、本明細書に記載の特性を含む組換え変異体ポリメラーゼを含む。いくつかの実施形態において、変異体ポリメラーゼは、上で考察した１つ以上の例示的な変異体ポリメラーゼの特性を含む。いくつかの実施形態において、プライマーは、３’伸長可能な末端を含む。

【0417】

いくつかの実施形態において、ヌクレオチドを取り込むための方法は、（ｂ）変異体ポリメラーゼを、少なくとも１つのヌクレオチドを核酸二本鎖に結合する変異体ポリメラーゼに結合するのに好適な条件下で、複数のヌクレオチドと接触させることを更に含む。いくつかの実施形態において、変異体ポリメラーゼは、ストロンチウム、バリウム、ナトリウム、マグネシウム、カリウム、マンガン、カルシウム、リチウム、ニッケル、及びコバルトからなる群から選択される少なくとも１つのカチオンの存在下で、複数のヌクレオチドと接触させる。いくつかの実施形態において、ステップ（ｂ）の接触させることは、ストロンチウム、バリウム、及び／またはカルシウムの存在下で行われる。いくつかの実施形態において、複数のヌクレオチドは、糖２’または３’位に鎖終結部分を有する少なくとも１つのヌクレオチド類似体を含む。いくつかの実施形態において、複数のヌクレオチドは、鎖終結部分を欠く少なくとも１つのヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、本方法は、（ｃ）少なくとも１つのヌクレオチドを取り込むのに好適な条件下で、少なくとも１つのヌクレオチドを伸長可能なプライマーの３’末端に取り込むことを更に含む。いくつかの実施形態において、変異体ポリメラーゼに結合するヌクレオチド及びヌクレオチドを取り込むのに好適な条件は、同じであっても異なっていてもよい。いくつかの実施形態において、ヌクレオチドを取り込むのに好適な条件は、ストロンチウム、バリウム、ナトリウム、マグネシウム、カリウム、マンガン、カルシウム、リチウム、ニッケル、及びコバルトからなる群から選択される少なくとも１つのカチオンを含む。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのヌクレオチドは、変異体ポリメラーゼに結合し、伸長可能なプライマーの３’末端に取り込む。いくつかの実施形態において、ステップ（ｃ）においてプライマーの３’末端にヌクレオチドを取り込むことは、プライマー伸長反応を含む。いくつかの実施形態において、本方法は、（ｄ）ステップ（ｃ）の伸長可能なプライマーの３’末端に少なくとも１つのヌクレオチドを取り込むことを少なくとも１回繰り返すことを更に含む。いくつかの実施形態において、本方法は、ステップ（ｃ）及び／または（ｄ）において少なくとも１つの取り込まれたヌクレオチドを検出することを更に含む。いくつかの実施形態において、本方法は、ステップ（ｃ）及び／または（ｄ）において少なくとも１つの取り込まれたヌクレオチドを識別することを更に含む。いくつかの実施形態において、核酸鋳型分子の配列は、変異体ポリメラーゼに結合するヌクレオチドを検出及び識別することによって決定することができる。いくつかの実施形態において、核酸鋳型分子の配列は、プライマーの３’末端に取り込まれるヌクレオチドを検出及び識別することによって決定することができる。

【0418】

本開示は、核酸鋳型分子の配列を決定するための方法であって、（ａ）変異体ポリメラーゼを、（ｉ）核酸鋳型分子及び（ｉｉ）核酸プライマーに接触させることを含み、接触させることは、変異体ポリメラーゼを、核酸プライマーにハイブリダイズする核酸鋳型分子に結合するのに好適な条件下で行われ、核酸プライマーにハイブリダイズする核酸鋳型分子が核酸二本鎖を形成する、方法を提供する。いくつかの実施形態において、変異体ポリメラーゼは、組換え変異体ポリメラーゼを含む。いくつかの実施形態において、変異体ポリメラーゼは、例示的な変異体ポリメラーゼの特性に関連して上記に列挙される１つ以上の特性を含む。

【0419】

いくつかの実施形態において、核酸鋳型分子の配列を決定するための方法は、（ｂ）変異体ポリメラーゼを、少なくとも１つのヌクレオチドを核酸二本鎖に結合する変異体ポリメラーゼに結合するのに好適な条件下で、複数のヌクレオチドと接触させることを更に含む。いくつかの実施形態において、変異体ポリメラーゼは、ストロンチウム、バリウム、ナトリウム、マグネシウム、カリウム、マンガン、カルシウム、リチウム、ニッケル、及びコバルトからなる群から選択される少なくとも１つのカチオンの存在下で、複数のヌクレオチドと接触させる。いくつかの実施形態において、ステップ（ｂ）の接触させることは、ストロンチウム、バリウム、及び／またはカルシウムの存在下で行われる。いくつかの実施形態において、複数のヌクレオチドは、糖２’または３’位に鎖終結部分を有する少なくとも１つのヌクレオチド類似体を含む。いくつかの実施形態において、複数のヌクレオチドは、鎖終結部分を欠く少なくとも１つのヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、本方法は、（ｃ）少なくとも１つのヌクレオチドを取り込むのに好適な条件下で、少なくとも１つのヌクレオチドを伸長可能なプライマーの３’末端に取り込むことを更に含む。いくつかの実施形態において、変異体ポリメラーゼに結合するヌクレオチド及びヌクレオチドを取り込むのに好適な条件は、同じであっても異なっていてもよい。いくつかの実施形態において、ヌクレオチドを取り込むのに好適な条件は、ストロンチウム、バリウム、ナトリウム、マグネシウム、カリウム、マンガン、カルシウム、リチウム、ニッケル、及びコバルトからなる群から選択される少なくとも１つのカチオンを含む。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのヌクレオチドは、変異体ポリメラーゼに結合し、伸長可能なプライマーの３’末端に取り込む。いくつかの実施形態において、ステップ（ｃ）においてプライマーの３’末端にヌクレオチドを取り込むことは、プライマー伸長反応を含む。いくつかの実施形態において、本方法は、（ｄ）ステップ（ｃ）の伸長可能なプライマーの３’末端に少なくとも１つのヌクレオチドを取り込むことを少なくとも１回繰り返すことを更に含む。いくつかの実施形態において、複数のヌクレオチドは、検出可能なレポーター部分で標識された複数のヌクレオチドを含む。検出可能なレポーター部分は、フルオロフォアを含んでも含まなくてもよい。いくつかの実施形態において、フルオロフォアは、ヌクレオチド塩基に結合する。いくつかの実施形態において、フルオロフォアは、塩基から開裂可能／除去可能であるリンカーによってヌクレオチド塩基に結合する。いくつかの実施形態において、複数の中のヌクレオチドのうちの少なくとも１つは、検出可能なレポーター部分で標識されない。いくつかの実施形態において、ヌクレオチドに結合する特定の検出可能なレポーター部分（例えば、フルオロフォア）は、ヌクレオチド塩基（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、またはｄＵＴＰ）に対応して、ヌクレオチド塩基の検出及び識別を可能にすることができる。いくつかの実施形態において、本方法は、ステップ（ｃ）及び／または（ｄ）において少なくとも１つの取り込まれたヌクレオチドを検出することを更に含む。いくつかの実施形態において、本方法は、ステップ（ｃ）及び／または（ｄ）において少なくとも１つの取り込まれたヌクレオチドを識別することを更に含む。いくつかの実施形態において、核酸鋳型分子の配列は、変異体ポリメラーゼに結合するヌクレオチドを検出及び識別し、それによって核酸鋳型の配列を決定することによって決定することができる。いくつかの実施形態において、核酸鋳型分子の配列は、プライマーの３’末端に取り込まれるヌクレオチドを検出及び識別し、それによって核酸鋳型の配列を決定することによって決定することができる。

【0420】

いくつかの実施形態において、核酸鋳型の配列を決定するための方法では、核酸二本鎖に結合する複数のポリメラーゼは、少なくとも第１及び第２の複合ポリメラーゼを有する複数の複合ポリメラーゼを含み、（ａ）第１の複合ポリメラーゼは、第１の核酸プライマーにハイブリダイズする第１の核酸鋳型を含む第１の核酸二重鎖に結合する第１の変異体ポリメラーゼを含み、（ｂ）第２の複合ポリメラーゼは、第２の核酸プライマーにハイブリダイズする第２の核酸鋳型を含む第２の核酸二重鎖に結合する第２の変異体ポリメラーゼを含み、（ｃ）第１及び第２の核酸鋳型は、異なる配列を含み、（ｄ）第１及び第２の核酸鋳型は、クローン増幅され、（ｅ）第１及び第２のプライマーは、伸長可能な３’末端または伸長不可能な３’末端を含み、（ｆ）複数の複合ポリメラーゼは、支持体に固定化される。いくつかの実施形態において、複数の複合ポリメラーゼの密度は、１ｍｍ^２当たり約１０^２～１０^１５個の複合ポリメラーゼであり、これらは、支持体に固定化される。

【0421】

いくつかの実施形態において、ヌクレオチドを結合するための方法、及びヌクレオチドを組み込むための方法、及びヌクレオチドを使用して核酸鋳型を配列決定するための方法では、複数のヌクレオチドのうちの少なくとも１つのヌクレオチドは、塩基、糖、及び少なくとも１つのリン酸基を含む。いくつかの実施形態において、複数の中の少なくとも１つのヌクレオチドは、上で考察した１つ以上の例示的なヌクレオチド単位の特性を含むヌクレオチド単位を含む。いくつかの実施形態において、複数の中の少なくとも１つのヌクレオチドは、ヌクレオチド類似体ではない。いくつかの実施形態において、複数の中の少なくとも１つのヌクレオチドは、ヌクレオチド類似体を含む。

【0422】

いくつかの実施形態において、ヌクレオチドを結合するための方法、及びヌクレオチドを取り込むための方法、ならびに核酸鋳型を配列決定するための方法では、複数のヌクレオチドのうちの少なくとも１つのヌクレオチドは、１つ、２つ、または３つのリン原子の鎖を含み、その鎖は、典型的には、エステルまたはホスホラミド結合を介して糖部分の５’炭素に結合する。いくつかの実施形態において、複数の中の少なくとも１つのヌクレオチドは、リン原子が介在するＯ、Ｓ、ＮＨ、メチレン、またはエチレンと一緒に連結されるリン鎖を有する類似体である。いくつかの実施形態において、鎖内のリン原子は、Ｏ、Ｓ、またはＢＨ_３を含む置換側基を含む。いくつかの実施形態において、鎖は、ホスホロアミデート、ホスホロチオエート、ホスホルジチオエート、及びＯ－メチルホスホロアミダイト基を含む類似体で置換されたホスフェート基を含む。

【0423】

いくつかの実施形態において、ヌクレオチドを結合するための方法、及びヌクレオチドを取り込むための方法、及び核酸鋳型を配列決定するための方法では、複数のヌクレオチドのうちの少なくとも１つのヌクレオチドは、上で考察した１つ以上の例示的なヌクレオチド類似体特性を含むターミネーターヌクレオチド類似体を含む。

【0424】

いくつかの実施形態において、ヌクレオチドを結合するための方法、及びヌクレオチドを取り込むための方法、及び核酸鋳型を配列決定するための方法では、複数のヌクレオチドのうちの少なくとも１つのヌクレオチドは、糖２’位、糖３’位、または糖２’及び３’位に鎖終結部分（例えば、ブロック部分）を有するターミネーターヌクレオチド類似体を含む。鎖終結部分は、上記の鎖終結部分の実施形態のうちのいずれかを含み得る開裂可能な部分を介して３’－ＯＨ糖位に結合することができる。いくつかの実施形態において、鎖終結部分は、上記の潜在的特性のうちのいずれかを含む、アジド（ａｚｉｄｅ）、アジド（ａｚｉｄｏ）、またはアジドメチル基を含む。

【0425】

いくつかの実施形態において、ヌクレオチドを結合するための方法、及びヌクレオチドを取り込むための方法、及び核酸鋳型を配列決定するための方法では、複数のヌクレオチドは、検出可能なレポーター部分で標識された複数のヌクレオチドを含む。検出可能なレポーター部分は、フルオロフォアを含む。いくつかの実施形態において、フルオロフォアは、ヌクレオチド塩基に結合する。いくつかの実施形態において、フルオロフォアは、塩基から開裂可能／除去可能であるリンカーによってヌクレオチド塩基に結合する。いくつかの実施形態において、複数の中のヌクレオチドのうちの少なくとも１つは、検出可能なレポーター部分で標識されない。いくつかの実施形態において、ヌクレオチドに結合する特定の検出可能なレポーター部分（例えば、フルオロフォア）は、ヌクレオチド塩基（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、またはｄＵＴＰ）に対応して、ヌクレオチド塩基の検出及び識別を可能にすることができる。

【0426】

いくつかの実施形態において、ヌクレオチドを結合するための方法、及びヌクレオチドを取り込むための方法、及び核酸鋳型を配列決定するための方法では、塩基上の開裂可能なリンカーである鎖終結部分は、上記の鎖終結部分の実施形態のうちのいずれかを含み得る開裂可能な部分を介して３’－ＯＨ糖位に結合することができる。いくつかの実施形態において、鎖終結部分は、上記の潜在的特性のうちのいずれかを含む、アジド（ａｚｉｄｅ）、アジド（ａｚｉｄｏ）、またはアジドメチル基を含む。いくつかの実施形態において、ヌクレオチドを結合するための方法、及びヌクレオチドを取り込むための方法、及び核酸鋳型を配列決定するための方法では、塩基上の開裂可能なリンカーは、アジド（ａｚｉｄｅ）、アジド（ａｚｉｄｏ）、またはアジドメチル基を含む開裂可能な部分を含む。鎖終結部分は、上記の鎖終結部分の実施形態のうちのいずれかを含み得る開裂可能な部分を介して３’－ＯＨ糖位に結合することができる。

【0427】

いくつかの実施形態において、ヌクレオチドを結合するための方法、及びヌクレオチドを取り込むための方法、及び核酸鋳型を配列決定するための方法では、鎖終結部分（例えば、糖２’及び／または糖３’位）、ならびに塩基上の開裂可能なリンカーは、同じまたは異なる開裂可能な部分を有する。いくつかの実施形態において、鎖終結部分は、上記の潜在的特性のうちのいずれかを含む、アジド（ａｚｉｄｅ）、アジド（ａｚｉｄｏ）、またはアジドメチル基を含む。

【0428】

いくつかの実施形態において、ヌクレオチドを結合するための方法、及びヌクレオチドを取り込むための方法、及びヌクレオチドを使用して核酸鋳型を配列決定するための方法では、変異体ポリメラーゼは、核酸プライマーにハイブリダイズする核酸鋳型を含む核酸二本鎖に結合し、それによって複合ポリメラーゼを形成し、核酸鋳型は、クローン増幅された鋳型分子または単一の核酸鋳型分子を含む。いくつかの実施形態において、核酸プライマーは、伸長可能な３’末端または伸長不可能な３’末端を含む。いくつかの実施形態において、核酸鋳型、核酸プライマー、及び／またはポリメラーゼのうちのいずれかは、支持体に固定化される。

【0429】

いくつかの実施形態において、ヌクレオチドを結合するための方法、及びヌクレオチドを取り込むための方法、及び核酸鋳型を配列決定するための方法では、支持体は、平面または非平面の支持体を含む。支持体は、固体または半固体であり得る。いくつかの実施形態において、支持体は、多孔質、半多孔質、または非多孔質であり得る。いくつかの実施形態において、支持体の表面は、１つ以上の化合物でコーティングされ、支持体上に不動態化層を生成することができる。いくつかの実施形態において、不動態化層は、多孔質または半多孔質層を形成する。いくつかの実施形態において、核酸プライマーまたは鋳型、またはポリメラーゼを不動態化層に結合して、プライマー、鋳型、及び／またはポリメラーゼを支持体に固定化することができる。いくつかの実施形態において、支持体は、支持体上の改善された核酸ハイブリダイゼーション及び増幅性能を可能にする低い非特異的結合表面を含む。一般に、支持体は、共有結合または非共有結合している低化学修飾層、例えば、シラン層、ポリマーフィルム、及び複数の核酸鋳型分子を支持体に固定化するために使用することができる１つ以上の共有結合または非共有結合しているオリゴヌクレオチドの１つ以上の層を含み得る。いくつかの実施形態において、支持体は、支持体上の化学基を介して少なくとも支持体の一部に共有結合した官能化ポリマーコーティング層、官能化ポリマーコーティングにグラフトされたプライマー、ならびにプライマー及び官能化ポリマーコーティング上の水溶性保護コーティングを含むことができる。いくつかの実施形態において、官能化ポリマーコーティングは、ポリ（Ｎ－（５－アジドアセトアミジルペンチル）アクリルアミド－ｃｏ－アクリルアミド（ＰＡＺＡＭ）を含む。いくつかの実施形態において、支持体は、少なくとも１つの親水性ポリマーコーティング層、及び複数のオリゴヌクレオチドのうちの少なくとも１つの層を有する表面コーティングを含む。親水性ポリマーコーティング層は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含むことができる。親水性ポリマーコーティング層は、少なくとも４つの分岐を有する分岐ＰＥＧを含むことができる。いくつかの実施形態において、支持体は、４５度以下の水接触角を有する低非特異的結合コーティングを含む。

【0430】

本開示は、１つ以上の核酸鋳型分子の配列を決定するための方法であって、（ａ）複数の第１の変異体ポリメラーゼを、（ｉ）複数の核酸鋳型分子及び（ｉｉ）複数の核酸プライマーに接触させることを含み、接触させることは、複数の第１の変異体ＤＮＡポリメラーゼを複数の核酸鋳型分子及び複数の核酸プライマーに結合するのに好適な条件下で行われ、それによって複数の第１の複合ポリメラーゼであって、各々が、核酸二本鎖に結合する第１の変異体ＤＮＡポリメラーゼを含む複数の第１の複合ポリメラーゼを形成し、核酸二本鎖は、核酸プライマーにハイブリダイズする核酸鋳型分子を含む、方法を提供する。いくつかの実施形態において、複数の第１の変異体ポリメラーゼは、組換え変異体ポリメラーゼを含む。いくつかの実施形態において、複数の第１の変異体ポリメラーゼは、ＤＮＡポリメラーゼを含む。いくつかの実施形態において、変異体ポリメラーゼは、上で考察した１つ以上の例示的な変異体ポリメラーゼの特性を含む。

【0431】

いくつかの実施形態において、１つ以上の核酸鋳型分子の配列を決定するための方法では、プライマーは、３’伸長可能な末端または３’伸長不可能な末端を含む。いくつかの実施形態において、複数の核酸鋳型分子は、上記の潜在的特性のうちのいずれかを含む核酸鋳型の実施形態を含み得る。

【0432】

いくつかの実施形態において、複数の核酸鋳型分子及び／または複数の核酸プライマーは、溶液中にあるか、または支持体に固定化される。いくつかの実施形態において、複数の核酸鋳型分子及び／または複数の核酸プライマーが支持体に固定化される場合、第１の組換え変異体ポリメラーゼとの結合は、複数の固定化された第１の複合ポリメラーゼを生成する。いくつかの実施形態において、複数の核酸鋳型分子及び／または核酸プライマーは、支持体上の１０^２～１０^１５個の異なる部位に固定化される。いくつかの実施形態において、複数の鋳型分子及び核酸プライマーと複数の第１の組換え変異体ポリメラーゼとの結合は、支持体上の１０^２～１０^１５個の異なる部位に固定化される複数の第１の複合ポリメラーゼを生成する。いくつかの実施形態において、支持体上の複数の固定化された第１の複合ポリメラーゼは、事前に決定された部位または支持体上のランダムな部位に固定化される。いくつかの実施形態において、複数の固定化された第１の複合ポリメラーゼは、互いに流体連通して、試薬（例えば、ポリメラーゼ、多価分子、ヌクレオチド、及び／または二価カチオンを含む酵素）の溶液を支持体上に流すことを可能にし、その結果、支持体上の複数の固定化された複合ポリメラーゼを超並列方法で試薬の溶液と反応させる。

【0433】

いくつかの実施形態において、１つ以上の核酸鋳型分子の配列を決定するための方法は、ステップ（ｂ）：複数の第１の複合ポリメラーゼを複数の多価分子と接触させて、複数の多価複合ポリメラーゼを形成することを更に含む。いくつかの実施形態において、複数の多価分子中の個々の多価分子は、複数のヌクレオチドアームに結合するコアを含み、各ヌクレオチドアームは、ヌクレオチド（例えば、ヌクレオチド単位）に結合する。いくつかの実施形態において、ステップ（ｂ）の接触させることは、多価分子の相補的ヌクレオチド単位を複数の第１の複合ポリメラーゼのうちの少なくとも２つに結合し、それによって複数の多価複合ポリメラーゼを形成するのに好適な条件下で行われる。いくつかの実施形態において、条件は、複数の多価複合ポリメラーゼのプライマーへの相補的ヌクレオチド単位の取り込みを阻害するのに好適である。いくつかの実施形態において、複数の多価分子は、複数のヌクレオチドアームを有する少なくとも１つの多価分子であって、各々が、ヌクレオチド類似体（例えば、ヌクレオチド類似体単位）で結合する少なくとも１つの多価分子を含み、ヌクレオチド類似体は、糖２’及び／または３’位に鎖終結部分を含む。いくつかの実施形態において、複数の多価分子は、複数のヌクレオチドアームを含む少なくとも１つの多価分子を含み、各々が、鎖終結部分を欠くヌクレオチド単位に結合する。いくつかの実施形態において、複数の多価分子中の多価分子中の少なくとも１つは、検出可能なレポーター部分で標識される。いくつかの実施形態において、検出可能なレポーター部分は、フルオロフォアを含む。いくつかの実施形態において、ステップ（ｂ）の接触させることは、ストロンチウム、バリウム、ナトリウム、マグネシウム、カリウム、マンガン、カルシウム、リチウム、ニッケル、及びコバルトからなる群から選択される少なくとも１つのカチオンの存在下で行われる。いくつかの実施形態において、ステップ（ｂ）の接触させることは、ストロンチウム、バリウム、及び／またはカルシウムの存在下で行われる。

【0434】

いくつかの実施形態において、１つ以上の核酸鋳型分子の配列を決定するための方法、または複数の複合ポリメラーゼを形成するための方法は、ステップ（ｃ）：複数の多価複合ポリメラーゼを検出することを更に含む。いくつかの実施形態において、検出することは、複合ポリメラーゼに結合する多価分子を検出することを含み、多価分子の相補的ヌクレオチド単位は、プライマーに結合するが、相補的ヌクレオチド単位の取り込みは、阻害される。いくつかの実施形態において、多価分子は、検出可能なレポーター部分で標識されて検出を可能にする。いくつかの実施形態において、標識された多価分子は、多価分子のコア及び／またはヌクレオチド単位の塩基に結合するフルオロフォアを含む。

【0435】

いくつかの実施形態において、１つ以上の核酸鋳型分子の配列を決定するための方法、または複数の複合ポリメラーゼを形成するための方法は、ステップ（ｄ）：複数の第１の複合ポリメラーゼに結合する相補的ヌクレオチド単位の塩基を識別し、それによって核酸鋳型の配列を決定することを更に含む。いくつかの実施形態において、多価分子は、複数の第１の複合ポリメラーゼに結合する相補的ヌクレオチド単位（例えば、ヌクレオチド塩基アデニン、グアニン、シトシン、チミン、またはウラシル）の識別を可能にするために、ヌクレオチドアームに結合する特定のヌクレオチド単位に対応する検出可能なレポーター部分で標識される。

【0436】

いくつかの実施形態において、１つ以上の核酸鋳型分子の配列を決定するための方法、または複数の複合ポリメラーゼを形成するための方法では、

【0437】

いくつかの実施形態において、１つ以上の核酸鋳型分子の配列を決定するための方法では、本方法は、複数の第１の複合ポリメラーゼを複数の多価分子と結合させて、少なくとも１つの親和性複合体を形成することを含み、本方法は、（ａ）複数のＤＮＡポリメラーゼ及び複数の核酸プライマー（第１及び第２のプライマーを含む）を第１及び第２の鋳型分子と接触させて、第１及び第２の鋳型分子上に、それぞれ、少なくとも第１及び第２の複合ポリメラーゼを形成するステップと、（ｂ）複数の多価分子を、少なくとも第１及び第２の複合ポリメラーゼに、複数の多価分子からの単一の多価分子を第１及び第２の複合ポリメラーゼに結合するのに好適な条件下で接触させるステップであって、単一の多価分子の少なくとも第１のヌクレオチド単位は、第１の鋳型分子にハイブリダイズする第１のプライマーを含む第１の複合ポリメラーゼに結合し、それによって第１の結合複合体（第１の三元複合体）を形成し、単一の多価分子の少なくとも第２のヌクレオチド単位は、第２の鋳型分子にハイブリダイズする第２のプライマーを含む第２の複合ポリメラーゼに結合し、それによって第２の結合複合体（第２の三元複合体）を形成し、接触させることが、第１及び第２の結合複合体中の結合した第１及び第２のヌクレオチド単位のポリメラーゼ触媒による取り込みを阻害するのに好適な条件下で行われ、同じ多価分子に結合する第１及び第２の結合複合体が親和性複合体を形成する、接触させるステップと、（ｃ）第１及び第２の鋳型分子上の第１及び第２の結合複合体をそれぞれ検出するステップと、（ｄ）第１の結合複合体中の第１のヌクレオチド単位を識別し、それによって第１の鋳型分子の配列を決定し、第２の結合複合体中の第２のヌクレオチド単位を識別し、それによって第２の鋳型分子の配列を決定するステップと、を含む。いくつかの実施形態において、複数のＤＮＡポリメラーゼは、本明細書に記載の任意の野生型または変異体ポリメラーゼを含む。第１及び第２の鋳型分子は、クローン増幅された鋳型分子である。いくつかの実施形態において、第１及び第２の鋳型分子は、互いに近接して局在化されている。例えば、クローン増幅された第１及び第２の鋳型分子は、ブリッジ増幅を介して生成され、支持体上の同じ位置または特性に固定化される線形鋳型分子を含む。第１及び第２の鋳型分子は、関心対象の配列と、少なくとも１つのユニバーサル配列決定プライマー結合部位と、を含む。第１及び第２の核酸プライマーは、それぞれ、第１及び第２の鋳型分子上の配列決定プライマー結合部位に結合することができる。

【0438】

いくつかの実施形態において、１つ以上の核酸鋳型分子の配列を決定するための方法は、ステップ（ｅ）：複数の多価複合ポリメラーゼを解離し、複数の第１の変異体ＤＮＡポリメラーゼ及びそれらの結合した多価分子を除去し、複数の核酸二本鎖を保持することを更に含む。

【0439】

いくつかの実施形態において、１つ以上の核酸鋳型分子の配列を決定するための方法は、ステップ（ｆ）：ステップ（ｅ）の複数の保持された核酸二重鎖を、複数の第２の組換え変異体ＤＮＡポリメラーゼと接触させることであって、接触させることは、複数の第２の変異体ＤＮＡポリメラーゼを複数の保持された核酸二重鎖に結合させるのに好適な条件下で行われ、それによって複数の第２の複合ポリメラーゼであって、各々が、核酸二重鎖に結合した第２の変異体ＤＮＡポリメラーゼを含む、複数の第２の複合ポリメラーゼを形成する、接触させることを更に含む。いくつかの実施形態において、変異体ポリメラーゼは、上で考察した１つ以上の例示的な変異体ポリメラーゼの特性を含む。

【0440】

いくつかの実施形態において、ステップ（ａ）の複数の第１の変異体ポリメラーゼは、ステップ（ｆ）の複数の第２の変異体ポリメラーゼとしてアミノ酸配列と１００％同一であるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態において、ステップ（ａ）の複数の第１の変異体ポリメラーゼは、ステップ（ｆ）の複数の第２の変異体ポリメラーゼのアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有する。

【0441】

いくつかの実施形態において、１つ以上の核酸鋳型分子の配列を決定するための方法は、ステップ（ｇ）：複数の第２の複合ポリメラーゼを複数のヌクレオチドと接触させることであって、接触させることは、複数のヌクレオチドからの相補的ヌクレオチドを第２の複合ポリメラーゼのうちの少なくとも２つに結合するのに好適な条件下で行われ、それによって複数のヌクレオチド複合ポリメラーゼを形成する、接触させることを更に含む。いくつかの実施形態において、ステップ（ｇ）の接触させることは、結合した相補的ヌクレオチドのヌクレオチド複合ポリメラーゼのプライマーへの取り込みを促進するのに好適な条件下で行われ、それによって複数のヌクレオチド複合ポリメラーゼを形成する。いくつかの実施形態において、ステップ（ｇ）においてプライマーの３’末端にヌクレオチドを取り込むことは、プライマー伸長反応を含む。いくつかの実施形態において、ステップ（ｇ）の接触させることは、ストロンチウム、バリウム、ナトリウム、マグネシウム、カリウム、マンガン、カルシウム、リチウム、ニッケル、及びコバルトからなる群から選択される少なくとも１つのカチオンの存在下で行われる。いくつかの実施形態において、ステップ（ｇ）の接触させることは、マグネシウム及び／またはマンガンの存在下で行われる。いくつかの実施形態において、複数のヌクレオチドは、天然ヌクレオチド（例えば、非類似体ヌクレオチド）またはヌクレオチド類似体を含む。いくつかの実施形態において、複数のヌクレオチドは、除去可能であるか、または除去不可能である２’及び／または３’鎖終結部分を含む。いくつかの実施形態において、複数のヌクレオチドは、検出可能なレポーター部分で標識された複数のヌクレオチドを含む。検出可能なレポーター部分は、フルオロフォアを含む。いくつかの実施形態において、フルオロフォアは、ヌクレオチド塩基に結合する。いくつかの実施形態において、フルオロフォアは、塩基から開裂可能／除去可能であるか、または塩基から除去可能ではないリンカーによってヌクレオチド塩基に結合する。いくつかの実施形態において、複数の中のヌクレオチドのうちの少なくとも１つは、検出可能なレポーター部分で標識されない。いくつかの実施形態において、ヌクレオチドに結合する特定の検出可能なレポーター部分（例えば、フルオロフォア）は、ヌクレオチド塩基（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、またはｄＵＴＰ）に対応して、ヌクレオチド塩基の検出及び識別を可能にすることができる。

【0442】

いくつかの実施形態において、１つ以上の核酸鋳型分子の配列を決定するための方法は、ステップ（ｈ）：ヌクレオチド複合ポリメラーゼのプライマーに取り込まれる相補的ヌクレオチドを検出することを更に含む。いくつかの実施形態において、複数のヌクレオチドは、検出可能なレポーター部分で標識されて検出を可能にする。いくつかの実施形態において、１つ以上の核酸鋳型分子の配列を決定するための方法では、検出ステップは、省略される。

【0443】

いくつかの実施形態において、１つ以上の核酸鋳型分子の配列を決定するための方法は、ステップ（ｉ）：ヌクレオチド複合ポリメラーゼのプライマーに取り込まれる相補的ヌクレオチドの塩基を識別することを更に含む。いくつかの実施形態において、ステップ（ｉ）における取り込まれた相補的ヌクレオチドの識別は、ステップ（ｄ）における複数の第１の複合ポリメラーゼに結合する多価分子の相補的ヌクレオチドの同一性を確認するために使用することができる。いくつかの実施形態において、ステップ（ｉ）の識別は、核酸鋳型分子の配列を決定するために使用することができる。いくつかの実施形態において、１つ以上の核酸鋳型分子の配列を決定するための方法では、識別ステップは、省略される。

【0444】

いくつかの実施形態において、１つ以上の核酸鋳型分子の配列を決定するための方法は、ステップ（ｊ）：ステップ（ｇ）が、複数の第２の複合ポリメラーゼを、２’及び／または３’鎖終結部分を有する少なくとも１つのヌクレオチドを含む複数のヌクレオチドと接触させることによって行われる場合、取り込まれたヌクレオチドから鎖終結部分を除去することを更に含む。

【0445】

いくつかの実施形態において、１つ以上の核酸鋳型分子の配列を決定するための方法は、ステップ（ｋ）：ステップ（ａ）～（ｊ）を少なくとも１回繰り返すことを更に含む。いくつかの実施形態において、核酸鋳型分子の配列は、変異体ポリメラーゼに結合するが、ステップ（ｃ）及び（ｄ）においてプライマーの３’末端に取り込まない多価分子を検出及び識別することによって決定することができる。いくつかの実施形態において、核酸鋳型分子の配列は、ステップ（ｈ）及び（ｉ）でプライマーの３’末端に取り込むヌクレオチドを検出及び識別することによって決定（または確認）することができる。

【0446】

いくつかの実施形態において、１つ以上の核酸鋳型分子の配列を決定するための方法では、ステップ（ｂ）の複数の多価分子中の少なくとも１つの多価分子は、上記の潜在的特性のうちのいずれかを含む、多価分子の実施形態のうちのいずれかを具体化し得る。

【0447】

いくつかの実施形態において、１つ以上の核酸鋳型分子の配列を決定する方法では、ステップ（ｂ）の複数の多価分子中の少なくとも１つの多価分子は、１つ、２つ、または３つのリン原子の鎖を有するヌクレオチド単位を含み、その鎖は、典型的には、エステルまたはホスホラミド結合を介して糖部分の５’炭素に結合する。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのヌクレオチド単位は、リン原子が介在するＯ、Ｓ、ＮＨ、メチレン、またはエチレンと一緒に連結されるリン鎖を有する類似体である。いくつかの実施形態において、鎖内のリン原子は、Ｏ、Ｓ、またはＢＨ_３を含む置換側基を含む。いくつかの実施形態において、鎖は、ホスホロアミデート、ホスホロチオエート、ホスホルジチオエート、及びＯ－メチルホスホロアミダイト基を含む類似体で置換されたホスフェート基を含む。

【0448】

いくつかの実施形態において、１つ以上の核酸鋳型分子の配列を決定する方法では、ステップ（ｂ）の複数の多価分子中の個々の多価分子は、複数のヌクレオチドアームに結合するコアを含み、個々のヌクレオチドアームは、糖２’位、糖３’位、または糖２’及び３’位に鎖終結部分（例えば、ブロック部分）を有するヌクレオチド単位を含む。

【0449】

いくつかの実施形態において、１つ以上の核酸鋳型分子の配列を決定するための方法では、ステップ（ｂ）の複数の多価分子中の少なくとも１つの多価分子は、上で考察した１つ以上の例示的なヌクレオチド類似体特性を含むターミネーターヌクレオチド類似体を含むヌクレオチド単位を含む。

【0450】

いくつかの実施形態において、１つ以上の核酸鋳型分子の配列を決定するための方法では、ステップ（ｂ）の複数の多価分子中の少なくとも１つの多価分子は、糖２’位、糖３’位、または糖２’及び３’位に鎖終結部分（例えば、ブロック部分）を有するターミネーターヌクレオチド類似体を含むヌクレオチド単位を含む。いくつかの実施形態において、鎖終結部分は、上記の鎖終結部分の実施形態のうちのいずれかを含み得る開裂可能な部分を介して３’－ＯＨ糖位に結合する。いくつかの実施形態において、鎖終結部分は、上記の潜在的特性のうちのいずれかを含む、アジド（ａｚｉｄｅ）、アジド（ａｚｉｄｏ）、またはアジドメチル基を含む。

【0451】

いくつかの実施形態において、１つ以上の核酸鋳型分子の配列を決定するための方法では、ステップ（ｂ）の複数の多価分子中の少なくとも１つの多価分子は、複数のヌクレオチドアームに結合するコアを含み、コアは、検出可能なレポーター部分で標識される。いくつかの実施形態において、検出可能なレポーター部分は、フルオロフォアを含む。いくつかの実施形態において、多価分子に結合する特定の検出可能なレポーター部分（例えば、フルオロフォア）は、ヌクレオチド単位の塩基（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、またはｄＵＴＰ）に対応して、ヌクレオチド塩基の検出及び識別を可能にすることができる。いくつかの実施形態において、多価分子のヌクレオチドアームの少なくとも１つは、フルオロフォアに結合するリンカー及び／またはヌクレオチド塩基を含み、所与のリンカーまたはヌクレオチド塩基に結合するフルオロフォアは、ヌクレオチドアームのヌクレオチド塩基（例えば、アデニン、グアニン、シトシン、チミン、またはウラシル）に対応する。

【0452】

いくつかの実施形態において、１つ以上の核酸鋳型分子の配列を決定するための方法では、ステップ（ｂ）の複数の多価分子中の多価分子の少なくとも１つのヌクレオチドアームは、検出可能なレポーター部分に結合するヌクレオチド単位を有する。いくつかの実施形態において、検出可能なレポーター部分は、ヌクレオチド塩基に結合する。いくつかの実施形態において、検出可能なレポーター部分は、フルオロフォアを含む。いくつかの実施形態において、多価分子に結合する特定の検出可能なレポーター部分（例えば、フルオロフォア）は、ヌクレオチド単位の塩基（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、またはｄＵＴＰ）に対応して、ヌクレオチド塩基の検出及び識別を可能にすることができる。

【0453】

いくつかの実施形態において、１つ以上の核酸鋳型分子の配列を決定するための方法では、ステップ（ｂ）の多価分子のコアは、アビジン様部分を含み、コア結合部分は、ビオチンを含む。いくつかの実施形態において、コアは、アビジンタンパク質、ならびに少なくとも１つのビオチン部分に結合することができる任意の誘導体、類似体、及び他の非天然形態のアビジンを含むストレプトアビジン型またはアビジン型部分を含む。アビジン部分の他の形態としては、天然及び組換えアビジン及びストレプトアビジン、ならびに誘導体化分子、例えば、非グリコシル化アビジン及び切断ストレプトアビジンが挙げられる。例えば、アビジン部分は、アビジンの脱グリコシル化形態、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ（例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｖｉｄｉｎｉｉ）によって産生される細菌ストレプトアビジン、ならびに誘導体化形態、例えば、Ｎ－アシルアビジン、例えば、Ｎ－アセチル、Ｎ－フタリル、及びＮ－スクシニルアビジン、ならびに市販の製品ＥｘｔｒＡｖｉｄｉｎ（商標）、Ｃａｐｔａｖｉｄｉｎ（商標）、Ｎｅｕｔｒａｖｉｄｉｎ（商標）、及びＮｅｕｔｒａｌｉｔｅ Ａｖｉｄｉｎ（商標）を含む。

【0454】

いくつかの実施形態において、１つ以上の核酸鋳型分子の配列を決定するための方法では、ステップ（ａ）～（ｊ）の各々は、約２５～７５℃の温度範囲から選択される温度で行われる。いくつかの実施形態において、ステップ（ａ）及び（ｂ）の接触させることは、約２５～７５℃の温度範囲（例えば、等温温度）から選択される一定温度で行われる。いくつかの実施形態において、ステップ（ｃ）及び（ｄ）の検出及び識別することは、約２５～７５℃の温度範囲（例えば、等温温度）から選択される一定温度で行われる。いくつかの実施形態において、ステップ（ｅ）の解離することは、約２５～７５℃の温度範囲（例えば、等温温度）から選択される一定温度で行われる。いくつかの実施形態において、ステップ（ｆ）及び（ｇ）の接触させることは、約２５～７５℃の温度範囲（例えば、等温温度）から選択される一定温度で行われる。いくつかの実施形態において、ステップ（ｈ）及び（ｉ）の検出及び識別することは、約２５～７５℃の温度範囲（例えば、等温温度）から選択される一定温度で行われる。いくつかの実施形態において、ステップ（ｊ）の除去することは、約２５～７５℃の温度範囲（例えば、等温温度）から選択される一定温度で行われる。いくつかの実施形態において、ステップ（ａ）～（ｊ）は、約２５～７５℃の温度範囲（例えば、等温温度）から選択される一定温度で行われる。

【0455】

いくつかの実施形態において、１つ以上の核酸鋳型分子の配列を決定するための方法では、ステップ（ｇ）の複数のヌクレオチドのうちの少なくとも１つのヌクレオチドは、塩基、糖、及び少なくとも１つのリン酸基を含む。いくつかの実施形態において、複数の中の少なくとも１つのヌクレオチドは、上で考察した１つ以上の例示的なヌクレオチド単位の特性を含むヌクレオチド単位を含む。いくつかの実施形態において、複数の中の少なくとも１つのヌクレオチドは、ヌクレオチド類似体ではない。いくつかの実施形態において、複数の中の少なくとも１つのヌクレオチドは、ヌクレオチド類似体を含む。

【0456】

いくつかの実施形態において、１つ以上の核酸鋳型分子の配列を決定するための方法では、ステップ（ｇ）の複数のヌクレオチドのうちの少なくとも１つのヌクレオチドは、１つ、２つ、または３つのリン原子の鎖を含み、この鎖は、典型的には、エステルまたはホスホラミド結合を介して糖部分の５’炭素に結合する。いくつかの実施形態において、複数の中の少なくとも１つのヌクレオチドは、リン原子が介在するＯ、Ｓ、ＮＨ、メチレン、またはエチレンと一緒に連結されるリン鎖を有する類似体である。いくつかの実施形態において、鎖内のリン原子は、Ｏ、Ｓ、またはＢＨ_３を含む置換側基を含む。いくつかの実施形態において、鎖は、ホスホロアミデート、ホスホロチオエート、ホスホルジチオエート、及びＯ－メチルホスホロアミダイト基を含む類似体で置換されたホスフェート基を含む。

【0457】

いくつかの実施形態において、１つ以上の核酸鋳型分子の配列を決定するための方法では、ステップ（ｇ）の複数のヌクレオチド中の少なくとも１つのヌクレオチドは、上で考察した１つ以上の例示的なヌクレオチド類似体特性を含むターミネーターヌクレオチド類似体を含む。

【0458】

いくつかの実施形態において、１つ以上の核酸鋳型分子の配列を決定するための方法では、ステップ（ｇ）の複数のヌクレオチド中の少なくとも１つのヌクレオチドは、糖２’位、糖３’位、または糖２’及び３’位に鎖終結部分（例えば、ブロック部分）を有するターミネーターヌクレオチド類似体を含む。鎖終結部分は、上記の鎖終結部分の実施形態のうちのいずれかを含み得る開裂可能な部分を介して３’－ＯＨ糖位に結合することができる。いくつかの実施形態において、鎖終結部分は、上記の潜在的特性のうちのいずれかを含む、アジド（ａｚｉｄｅ）、アジド（ａｚｉｄｏ）、またはアジドメチル基を含む。

【0459】

いくつかの実施形態において、１つ以上の核酸鋳型分子の配列を決定するための方法では、ステップ（ｇ）の複数のヌクレオチド中の少なくとも１つのヌクレオチドは、検出可能なレポーター部分（例えば、少なくとも１つの標識ヌクレオチド）を含む。検出可能なレポーター部分は、フルオロフォアを含む。いくつかの実施形態において、フルオロフォアは、ヌクレオチド塩基に結合する。いくつかの実施形態において、フルオロフォアは、塩基から開裂可能／除去可能であるリンカーによってヌクレオチド塩基に結合する。いくつかの実施形態において、複数の中のヌクレオチドのうちの少なくとも１つは、検出可能なレポーター部分で標識されない。いくつかの実施形態において、ヌクレオチドに結合する特定の検出可能なレポーター部分（例えば、フルオロフォア）は、ヌクレオチド塩基（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、またはｄＵＴＰ）に対応して、ヌクレオチド塩基の検出及び識別を可能にすることができる。

【0460】

いくつかの実施形態において、１つ以上の核酸鋳型分子の配列を決定するための方法では、ステップ（ｇ）の複数のヌクレオチド中の少なくとも１つのヌクレオチドは、開裂可能な部分を介して３’－ＯＨ糖位に結合する鎖終結部分を有することを含む、塩基上の開裂可能なリンカーを含み、これは、上述の鎖終結部分の実施形態のうちのいずれかを含み得る。いくつかの実施形態において、鎖終結部分は、上記の潜在的特性のうちのいずれかを含む、アジド（ａｚｉｄｅ）、アジド（ａｚｉｄｏ）、またはアジドメチル基を含む。

【0461】

いくつかの実施形態において、１つ以上の核酸鋳型分子の配列を決定するための方法では、支持体は、平面または非平面支持体を含む。支持体は、固体または半固体であり得る。いくつかの実施形態において、支持体は、多孔質、半多孔質、または非多孔質であり得る。いくつかの実施形態において、支持体の表面は、１つ以上の化合物でコーティングされ、支持体上に不動態化層を生成することができる。いくつかの実施形態において、不動態化層は、多孔質または半多孔質層を形成する。いくつかの実施形態において、核酸プライマー、鋳型及び／またはポリメラーゼを不動態化層に結合して、プライマー、鋳型、及び／またはポリメラーゼを支持体に固定化することができる。いくつかの実施形態において、支持体は、支持体上の改善された核酸ハイブリダイゼーション及び増幅性能を可能にする低い非特異的結合表面を含む。一般に、支持体は、共有結合または非共有結合している低化学修飾層、例えば、シラン層、ポリマーフィルム、及び複数の核酸鋳型分子を支持体に固定化するために使用することができる１つ以上の共有結合または非共有結合しているオリゴヌクレオチドの１つ以上の層を含み得る。いくつかの実施形態において、支持体は、支持体上の化学基を介して少なくとも支持体の一部に共有結合した官能化ポリマーコーティング層、官能化ポリマーコーティングにグラフトされたプライマー、ならびにプライマー及び官能化ポリマーコーティング上の水溶性保護コーティングを含むことができる。いくつかの実施形態において、官能化ポリマーコーティングは、ポリ（Ｎ－（５－アジドアセトアミジルペンチル）アクリルアミド－ｃｏ－アクリルアミド（ＰＡＺＡＭ）を含む。いくつかの実施形態において、支持体は、少なくとも１つの親水性ポリマーコーティング層、及び複数のオリゴヌクレオチドのうちの少なくとも１つの層を有する表面コーティングを含む。親水性ポリマーコーティング層は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含むことができる。親水性ポリマーコーティング層は、少なくとも４つの分岐を有する分岐ＰＥＧを含むことができる。いくつかの実施形態において、支持体は、４５度以下の水接触角を有する低非特異的結合コーティングを含む。いくつかの実施形態において、支持体に固定化された、または支持体上のコーティングに固定化された複数の第１の複合ポリメラーゼの密度は、１ｍｍ^２当たり約１０^２～１０^６、または１ｍｍ^２当たり約１０^６～１０^９、または１ｍｍ^２当たり約１０^９～１０^１２である。いくつかの実施形態において、複数の第１の複合ポリメラーゼは、支持体に固定化されるか、支持体上の所定の部位（または支持体上のコーティング）で支持体上のコーティングに固定化されるか、または支持体上のランダムな部位（または支持体上のコーティング）で支持体上のコーティングに固定化される。

【実施例】

【0462】

以下の実施例は、例示的であることを意味し、本開示の実施形態を更に理解するために使用することができ、本教示の範囲を何ら限定するものと解釈されるべきではない。

【0463】

実施例１：変異体ポリメラーゼの明確な溶解物調製

【0464】

変異体ポリメラーゼを、部位特異的変異誘発を使用して調製した。変異体ポリメラーゼの変異部位を、表１（図３Ａ～図３Ｈ）、表２（図４Ａ～図４Ｅ）、及び表３（図５Ａ～図５Ｅ）に列挙する。

【0465】

変異体ポリメラーゼのうちの１つをコードする核酸に作動可能に連結された発現ベクターを保有する宿主細胞を、調製した。宿主細胞を、変異体ポリメラーゼを発現するのに好適な条件下で培養した。宿主細胞をプレート形式で増殖させ、発現後に遠心分離した。細胞ペレットを、緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、１０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４））中のリゾチームで処理することによって溶解し、再び遠心分離した。上清をＰＣＲプレートに移し、６０℃で３０分間熱ショックした。次いで、熱ショックを与えた溶解物を遠心分離によって浄化し、上清をヌクレオチドの取り込みアッセイのための新しいプレートに移した。

【0466】

実施例２：ヌクレオチドの取り込みアッセイ

【0467】

Ａｔｔｏ染料標識ＤＮＡ鋳型を使用して、ＤＮＡ二本鎖を調製した。標識したＤＮＡ鋳型を、反応緩衝液（Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、ＮａＣｌ、ＥＤＴＡ）中のプライマーでアニールした。二本鎖を、浄化した溶解物（実施例１に記載）と混合し、４２℃に平衡化させた。ヌクレオチドの取り込み反応は、鋳型上の次の塩基に対応する３’メチルアジドヌクレオチド（例えば、ｄＣＴＰ－Ｎ３）の追加で開始した。反応を４２℃で３０秒間進め、ＥＤＴＡ及びホルムアミドでクエンチした。ｎ＋１対ｎの分析を、キャピラリー電気泳動によって行った。

【0468】

４２℃での伸長ポリヌクレオチド鎖のＮ＋１位における３’メチルアジドヌクレオチドの取り込みにおける、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ ａｌｔｉａｒｃｈａｅａｌｅｓ古細菌からのＤＮＡポリメラーゼのバリアントの相対活性を、表１（図３Ａ～図３Ｈ）、表２（図４Ａ～図４Ｅ）、及び表３（図５Ａ～図５Ｅ）に記載する。

【0469】

結果を、表１（図３Ａ～図３Ｈ）、表２（図４Ａ～図４Ｅ）、及び表３（図５Ａ～図５Ｅに示す。表１（図３Ａ～図３Ｈ）では、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ａｌｔｉａｒｃｈａｅａｌｅｓ古細菌からの野生型ポリメラーゼは、＃１（例えば、配列番号１）と示された。Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ａｌｔｉａｒｃｈａｅａｌｅｓ古細菌からの変異体ポリメラーゼクローンは、＃２～８０（例えば、それぞれ配列番号２～８０、表１の図３Ａ～図３Ｈも参照）と示され、以下の変異を含有した：２：Ｙ５０２Ｖ、３：Ｙ５０２Ｓ、４：Ｙ５０２Ｑ、５：Ｙ５０２Ｐ、６：Ｙ５０２Ｈ、７：Ｙ５０２Ｇ、８：Ｙ５０２Ｆ、９：Ｙ５０２Ａ、１０：Ｓ４１５Ｖ、１１：Ｓ４１５Ｇ、１２：Ｓ４１５Ａ、１３：Ｒ４６８Ｖ、１４：Ｒ４６８Ｓ、１５：Ｒ４６８Ｋ、１６：Ｒ４６８Ｈ、１７：Ｒ４６８Ｇ、１８：Ｒ４６８Ａ、１９：Ｒ４１４Ｓ、２０：Ｌ４１６Ｖ、２１：Ｌ４１６Ｓ、２２：Ｌ４１６Ａ、２３：Ｉ５２９Ｖ、２４：Ｉ５２９Ｓ、２５：Ｉ５２９Ｈ、２６：Ｉ５２９Ｇ、２７：Ｉ５２９Ａ、２８：Ｙ４１７Ｖ＿Ｐ４１８Ｖ、２９：Ｙ４１７Ｖ＿Ｐ４１８Ｓ、３０：Ｙ４１７Ｖ＿Ｐ４１８Ａ、３１：Ｙ４１７Ｔ＿Ｐ４１８Ｋ、３２：Ｙ４１７Ｓ＿Ｐ４１８Ｓ、３３：Ｙ４１７Ｓ＿Ｐ４１８Ｇ、３４：Ｙ４１７Ｓ＿Ｐ４１８Ａ、３５：Ｙ４１７Ｇ＿Ｐ４１８Ｖ、３６：Ｙ４１７Ｇ＿Ｐ４１８Ｓ、３７：Ｙ４１７Ｇ＿Ｐ４１８Ｇ、３８：Ｙ４１７Ｇ＿Ｐ４１８Ｃ、３９：Ｙ４１７Ｇ＿Ｐ４１８Ａ、４０：Ｙ４１７Ａ＿Ｐ４１８Ｖ、４１：Ｙ４１７Ａ＿Ｐ４１８Ｓ、４２：Ｙ４１７Ａ＿Ｐ４１８Ｇ、４３：Ｙ４１７Ａ＿Ｐ４１８Ａ、４４：Ｓ４１５Ｖ＿Ｙ４１７Ｓ、４５：Ｓ４１５Ｖ＿Ｙ４１７Ａ、４６：Ｓ４１５Ｖ＿Ｐ４１８Ｖ、４７：Ｓ４１５Ｖ＿Ｐ４１８Ｓ、４８：Ｓ４１５Ｖ＿Ｐ４１８Ｇ、４９：Ｓ４１５Ｖ＿Ｌ４１６Ｖ、５０：Ｓ４１５Ｖ＿Ｌ４１６Ｓ、５１：Ｓ４１５Ｇ＿Ｙ４１７Ｖ、５２：Ｓ４１５Ｇ＿Ｙ４１７Ｓ、５３：Ｓ４１５Ｇ＿Ｐ４１８Ｖ、５４：Ｓ４１５Ｇ＿Ｐ４１８Ｓ、５５：Ｓ４１５Ｇ＿Ｐ４１８Ｇ、５６：Ｓ４１５Ｇ＿Ｐ４１８Ａ、５７：Ｓ４１５Ｇ＿Ｌ４１６Ｖ、５８：Ｓ４１５Ｇ＿Ｌ４１６Ｓ、５９：Ｓ４１５Ｇ＿Ｌ４１６Ｇ、６０：Ｓ４１５Ｇ＿Ｌ４１６Ａ、６１：Ｓ４１５Ａ＿Ｙ４１７Ｇ、６２：Ｓ４１５Ａ＿Ｙ４１７Ａ、６３：Ｓ４１５Ａ＿Ｐ４１８Ｇ、６４：Ｓ４１５Ａ＿Ｌ４１６Ｓ、６５：Ｌ４１６Ｖ＿Ｐ４１８Ｓ、６６：Ｌ４１６Ｖ＿Ｐ４１８Ｇ、６７：Ｌ４１６Ｓ＿Ｙ４１７Ｇ、６８：Ｌ４１６Ｓ＿Ｙ４１７Ａ、６９：Ｌ４１６Ｓ＿Ｐ４１８Ｖ、７０：Ｌ４１６Ｓ＿Ｐ４１８Ｇ、７１：Ｌ４１６Ｇ＿Ｙ４１７Ｇ、７２：Ｌ４１６Ｇ＿Ｙ４１７Ａ、７３：Ｌ４１６Ｇ＿Ｐ４１８Ｇ、７４：Ｌ４１６Ｇ＿Ｐ４１８Ａ、７５：Ｌ４１６Ａ＿Ｙ４１７Ｓ、７６：Ｌ４１６Ａ＿Ｐ４１８Ｓ、７７：Ｌ４１６Ａ＿Ｐ４１８Ｇ、７８：Ｌ４１６Ａ＿Ｐ４１８Ａ、７９：Ｙ４１７Ｖ＿Ｐ４１８Ｖ＿Ｙ５０２Ｓ、８０：Ｙ４１７Ｖ＿Ｐ４１８Ｇ＿Ｙ５０２Ｇ。

【0470】

表１（図３Ａ～図３Ｈ）において、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ａｌｔｉａｒｃｈａｅａｌｅｓ古細菌からの変異体ポリメラーゼクローンは、＃８１～１５７（例えば、それぞれ、配列番号８１～１５７）と示され、以下の変異を含有した：８１：Ｙ４１７Ｖ＿Ｐ４１８Ａ＿Ｙ５０２Ｒ、８２：Ｙ４１７Ｓ＿Ｐ４１８Ｖ＿Ｙ５０２Ｒ、８３：Ｙ４１７Ｓ＿Ｐ４１８Ｇ＿Ｙ５０２Ｓ、８４：Ｙ４１７Ｇ＿Ｐ４１８Ｇ＿Ｙ５０２Ｖ、８５：Ｙ４１７Ｇ＿Ｐ４１８Ａ＿Ｙ５０２Ｎ、８６：Ｙ４１７Ｇ＿Ｐ４１８Ａ＿Ｙ５０２Ｇ、８７：Ｙ４１７Ａ＿Ｐ４１８Ｓ＿Ｙ５０２Ｒ、８８：Ｇ４０３Ａ＿Ｈ４０５Ｓ＿Ｄ４０６Ｈ、８９：Ａ４９３Ｖ＿Ｋ４９５Ｖ＿Ｎ４９９Ｓ、９０：Ａ４９３Ｖ＿Ｋ４９５Ｖ＿Ｎ４９９Ｇ、９１：Ａ４９３Ｖ＿Ｋ４９５Ｖ＿Ｎ４９９Ａ、９２：Ａ４９３Ｖ＿Ｋ４９５Ｓ＿Ｎ４９９Ｖ、９３：Ａ４９３Ｖ＿Ｋ４９５Ｓ＿Ｎ４９９Ｓ、９４：Ａ４９３Ｖ＿Ｋ４９５Ｓ＿Ｎ４９９Ｇ、９５：Ａ４９３Ｖ＿Ｋ４９５Ｑ＿Ｎ４９９Ｖ、９６：Ａ４９３Ｖ＿Ｋ４９５Ｑ＿Ｎ４９９Ｇ、９７：Ａ４９３Ｖ＿Ｋ４９５Ｑ＿Ｎ４９９Ａ、９８：Ａ４９３Ｖ＿Ｋ４９５Ｇ＿Ｎ４９９Ｖ、９９：Ａ４９３Ｖ＿Ｋ４９５Ｇ＿Ｎ４９９Ｓ、１００：Ａ４９３Ｖ＿Ｋ４９５Ｇ＿Ｎ４９９Ｇ、１０１：Ａ４９３Ｖ＿Ｋ４９５Ｇ＿Ｎ４９９Ａ、１０２：Ａ４９３Ｖ＿Ｋ４９５Ａ＿Ｎ４９９Ｇ、１０３：Ａ４９３Ｖ＿Ｋ４９５Ａ＿Ｎ４９９Ａ、１０４：Ａ４９３Ｖ＿Ｋ４９５Ｓ＿Ｎ４９９Ｇ、１０５：Ｌ４１６Ａ＿Ｙ４１７Ａ＿Ｐ４１８Ａ、１０６：Ｌ４１６Ａ＿Ｙ４１７Ａ＿Ｐ４１８Ｇ、１０７：Ｌ４１６Ａ＿Ｙ４１７Ａ＿Ｐ４１８Ｉ、１０８：Ｌ４１６Ａ＿Ｙ４１７Ｓ＿Ｐ４１８Ａ、１０９：Ｌ４１６Ａ＿Ｙ４１７Ｓ＿Ｐ４１８Ｇ、１１０：Ｌ４１６Ａ＿Ｙ４１７Ｓ＿Ｐ４１８Ｓ、１１１：Ｌ４１６Ｇ＿Ｙ４１７Ｇ＿Ｐ４１８Ｇ、１１２：Ｌ４１６Ｉ＿Ｙ４１７Ａ＿Ｐ４１８Ｇ、１１３：Ｌ４１６Ｉ＿Ｙ４１７Ａ＿Ｐ４１８Ｓ、１１４：Ｌ４１６Ｉ＿Ｙ４１７Ｇ＿Ｐ４１８Ａ、１１５：Ｌ４１６Ｉ＿Ｙ４１７Ｉ＿Ｐ４１８Ｖ、１１６：Ｌ４１６Ｓ＿Ｙ４１７Ａ＿Ｐ４１８Ｇ、１１７：Ｌ４１６Ｓ＿Ｙ４１７Ｇ＿Ｐ４１８Ａ、１１８：Ｌ４１６Ｔ＿Ｙ４１７Ａ＿Ｐ４１８Ａ、１１９：Ｌ４１６Ｔ＿Ｙ４１７Ｇ＿Ｐ４１８Ａ、１２０：Ｌ４１６Ｖ＿Ｙ４１７Ａ＿Ｐ４１８Ａ、１２１：Ｌ４１６Ｖ＿Ｙ４１７Ｇ＿Ｐ４１８Ｇ、１２２：Ｌ４１６Ｉ＿Ｙ４１７Ｓ＿Ｐ４１８Ｓ、１２３：Ｌ４１６Ｖ＿Ｙ４１７Ｖ＿Ｐ４１８Ｇ、１２４：Ｈ４０５Ｐ＿Ａ４９３Ｖ＿Ｋ４９５Ｇ＿Ｎ４９９Ａ、１２５：Ａ４９３Ｖ＿Ｋ４９５Ｓ＿Ｎ４９９Ａ＿Ｙ５０２Ｔ、１２６：Ａ４９３Ｖ＿Ｋ４９５Ｑ＿Ｎ４９９Ｇ＿Ｆ５０７Ｓ、１２７：Ａ４９３Ｖ＿Ｋ４９５Ｇ＿Ｎ４９９Ｇ＿Ｍ５０１Ｉ、１２８：Ｌ４１６Ａ＿Ｙ４１７Ａ＿Ｐ４１８Ａ＿Ｉ５２９Ｌ、１２９：Ｌ４１６Ａ＿Ｙ４１７Ａ＿Ｐ４１８Ａ＿Ｉ５２９Ｈ、１３０：Ｌ４１６Ａ＿Ｙ４１７Ａ＿Ｐ４１８Ｓ＿Ｉ５２９Ｈ、１３１：Ｌ４１６Ａ＿Ｙ４１７Ｇ＿Ｐ４１８Ａ＿Ｉ５２９Ｈ、１３２：Ｌ４１６Ａ＿Ｙ４１７Ｇ＿Ｐ４１８Ｇ＿Ｉ５２９Ｈ、１３３：Ｌ４１６Ａ＿Ｙ４１７Ｇ＿Ｐ４１８Ｓ＿Ｉ５２９Ｈ、１３４：Ｌ４１６Ｇ＿Ｙ４１７Ｔ＿Ｐ４１８Ｓ＿Ｉ５２９Ｈ、１３５：Ｌ４１６Ｉ＿Ｙ４１７Ａ＿Ｐ４１８Ａ＿Ｉ５２９Ｌ、１３６：Ｌ４１６Ｉ＿Ｙ４１７Ａ＿Ｐ４１８Ｇ＿Ｉ５２９Ｆ、１３７：Ｌ４１６Ｉ＿Ｙ４１７Ａ＿Ｐ４１８Ｓ＿Ｉ５２９Ｈ、１３８：Ｌ４１６Ｉ＿Ｙ４１７Ｇ＿Ｐ４１８Ａ＿Ｉ５２９Ｌ、１３９：Ｌ４１６Ｉ＿Ｙ４１７Ｓ＿Ｐ４１８Ｇ＿Ｉ５２９Ｈ、１４０：Ｌ４１６Ｌ＿Ｙ４１７Ｙ＿Ｐ４１８Ｐ＿Ｉ５２９Ｈ、１４１：Ｌ４１６Ｓ＿Ｙ４１７Ａ＿Ｐ４１８Ｇ＿Ｉ５２９Ｈ、１４２：Ｌ４１６Ｓ＿Ｙ４１７Ａ＿Ｐ４１８Ｇ＿Ｉ５２９Ｆ、１４３：Ｌ４１６Ｓ＿Ｙ４１７Ａ＿Ｐ４１８Ｔ＿Ｉ５２９Ｈ、１４４：Ｌ４１６Ｓ＿Ｙ４１７Ｇ＿Ｐ４１８Ｇ＿Ｉ５２９Ｈ、１４５：Ｌ４１６Ｓ＿Ｙ４１７Ｇ＿Ｐ４１８Ｖ＿Ｉ５２９Ｈ、１４６：Ｌ４１６Ｔ＿Ｙ４１７Ａ＿Ｐ４１８Ａ＿Ｉ５２９Ｈ、１４７：Ｌ４１６Ｔ＿Ｙ４１７Ａ＿Ｐ４１８Ｇ＿Ｉ５２９Ｈ、１４８：Ｌ４１６Ｔ＿Ｙ４１７Ｇ＿Ｐ４１８Ａ＿Ｉ５２９Ｈ、１４９：Ｌ４１６Ｖ＿Ｙ４１７Ａ＿Ｐ４１８Ａ＿Ｉ５２９Ｈ、１５０：Ｌ４１６Ｖ＿Ｙ４１７Ａ＿Ｐ４１８Ｇ＿Ｉ５２９Ｓ、１５１：Ｌ４１６Ｖ＿Ｙ４１７Ａ＿Ｐ４１８Ｇ＿Ｉ５２９Ｔ、１５２：Ｌ４１６Ｖ＿Ｙ４１７Ａ＿Ｐ４１８Ｇ＿Ｉ５２９Ｈ、１５３：Ｌ４１６Ｖ＿Ｙ４１７Ａ＿Ｐ４１８Ｓ＿Ｉ５２９Ｈ、１５４：Ｌ４１６Ｖ＿Ｙ４１７Ｇ＿Ｐ４１８Ａ＿Ｉ５２９Ｈ、１５５：Ｌ４１６Ｖ＿Ｙ４１７Ｇ＿Ｐ４１８Ｇ＿Ｉ５２９Ｈ、１５６：Ｌ４１６Ｖ＿Ｙ４１７Ｇ＿Ｐ４１８Ｓ＿Ｉ５２９Ｈ、１５７：Ｌ４１６Ｖ＿Ｙ４１７Ｔ＿Ｐ４１８Ｓ＿Ｉ５２９Ｈ。

【0471】

表２（図４Ａ～図４Ｅ）において、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ａｌｔｉａｒｃｈａｅａｌｅｓ古細菌からの変異体ポリメラーゼクローンは、＃１５８～２５５（例えば、配列番号１５８～２５５）と示され、以下の変異を含有した：１５８：Ｙ５０２Ｉ、１５９：Ｌ４１６Ａ＿Ｙ４１７Ｇ＿Ｐ４１８Ａ、１６０：Ｌ４１６Ｉ＿Ｙ４１７Ａ＿Ｐ４１８Ａ、１６１：Ｌ４１６Ｖ＿Ｙ４１７Ａ＿Ｐ４１８Ｇ、１６２：Ｌ４１６Ａ＿Ｙ４１７Ａ＿Ｐ４１８Ｓ、１６３：Ｌ４１６Ｉ＿Ｙ４１７Ｓ＿Ｐ４１８Ｇ、１６４：Ｌ４１６Ｖ＿Ｙ４１７Ａ＿Ｐ４１８Ｓ、１６５：Ｌ４１６Ａ＿Ｙ４１７Ｉ＿Ｐ４１８Ｔ、１６６：Ｌ４１６Ｓ＿Ｙ４１７Ｇ＿Ｐ４１８Ｖ、１６７：Ｌ４１６Ｓ＿Ｙ４１７Ｇ＿Ｐ４１８Ｇ、１６８：Ｌ４１６Ｖ＿Ｙ４１７Ｇ＿Ｐ４１８Ａ、１６９：Ｌ４１６Ａ＿Ｙ４１７Ａ＿Ｐ４１８Ｖ、１７０：Ｌ４１６Ｖ＿Ｙ４１７Ｔ＿Ｐ４１８Ｉ、１７１：Ｌ４１６Ｖ＿Ｙ４１７Ｖ＿Ｐ４１８Ａ、１７２：Ｓ４１５Ｖ＿Ｙ４１７Ａ＿Ａ４９３Ｖ＿Ｋ４９５Ｇ＿Ｎ４９９Ｓ、１７３：Ｈ４０５Ｐ＿Ａ４９３Ｖ＿Ｋ４９５Ｖ＿Ｎ４９９Ａ、１７４：Ａ４９３Ｖ＿Ｋ４９５Ｓ＿Ｎ４９９Ｇ＿Ｆ５０７Ｓ、１７５：Ｌ４１６Ｓ＿Ｙ４１７Ａ＿Ｐ４１８Ｇ＿Ｉ５２９Ｈ＿Ｒ６０８Ｋ、１７６：Ｌ４１６Ｓ＿Ｙ４１７Ａ＿Ｐ４１８Ｇ＿Ｉ５２９Ｈ＿Ｋ４７３Ａ、１７７：Ｌ４１６Ｓ＿Ｙ４１７Ａ＿Ｐ４１８Ｇ＿Ｉ５２９Ｈ＿Ｌ４９６Ａ、１７８：Ｌ４１６Ｓ＿Ｙ４１７Ａ＿Ｐ４１８Ｇ＿Ｉ５２９Ｈ＿Ｖ４８９Ｉ、１７９：Ｌ４１６Ｓ＿Ｙ４１７Ａ＿Ｐ４１８Ｇ＿Ｉ５２９Ｈ＿Ｒ５１５Ｌ、１８０：Ｌ４１６Ｓ＿Ｙ４１７Ａ＿Ｐ４１８Ｇ＿Ｉ５２９Ｈ＿Ａ４９３Ｓ、１８１：Ｌ４１６Ｓ＿Ｙ４１７Ａ＿Ｐ４１８Ｇ＿Ｉ５２９Ｈ＿Ｄ６２２Ｔ、１８２：Ｌ４１６Ｓ＿Ｙ４１７Ａ＿Ｐ４１８Ｇ＿Ｉ５２９Ｈ＿Ｑ４９２Ｒ、１８３：Ｌ４１６Ｓ＿Ｙ４１７Ａ＿Ｐ４１８Ｇ＿Ｉ５２９Ｈ＿Ｑ６７３Ｉ、１８４：Ｌ４１６Ｓ＿Ｙ４１７Ａ＿Ｐ４１８Ｇ＿Ｉ５２９Ｈ＿Ａ４９３Ｓ＿Ｄ６２２Ｔ、１８５：Ｌ４１６Ｓ＿Ｙ４１７Ａ＿Ｐ４１８Ｇ＿Ｉ５２９Ｈ＿Ａ４９３Ｓ＿Ｑ４９２Ｒ、１８６：Ｌ４１６Ｓ＿Ｙ４１７Ａ＿Ｐ４１８Ｇ＿Ｉ５２９Ｈ＿Ｋ４７３Ａ＿Ｌ４９６Ａ、１８７：Ｌ４１６Ｓ＿Ｙ４１７Ａ＿Ｐ４１８Ｇ＿Ｉ５２９Ｈ＿Ｋ４７３Ａ＿Ｑ４９２Ｒ、１８８：Ｌ４１６Ｓ＿Ｙ４１７Ａ＿Ｐ４１８Ｇ＿Ｉ５２９Ｈ＿Ｋ４７３Ａ＿Ｒ５１５Ｌ、１８９：Ｌ４１６Ｓ＿Ｙ４１７Ａ＿Ｐ４１８Ｇ＿Ｉ５２９Ｈ＿Ｌ４９６Ａ＿Ａ４９３Ｓ＿Ｑ４９２Ｒ、１９０：Ｌ４１６Ｓ＿Ｙ４１７Ａ＿Ｐ４１８Ｇ＿Ｉ５２９Ｈ＿Ｌ４９６Ａ＿Ａ４９３Ｓ＿Ｖ４８９Ｉ、１９１：Ｌ４１６Ｓ＿Ｙ４１７Ａ＿Ｐ４１８Ｇ＿Ｉ５２９Ｈ＿Ｌ４９６Ａ＿Ｒ５１５Ｌ、１９２：Ｌ４１６Ｓ＿Ｙ４１７Ａ＿Ｐ４１８Ｇ＿Ｉ５２９Ｈ＿Ｌ４９６Ａ＿Ｖ４８９Ｉ、１９３：Ｌ４１６Ｓ＿Ｙ４１７Ａ＿Ｐ４１８Ｇ＿Ｉ５２９Ｈ＿Ｑ４９２Ｒ＿Ｐ３３５Ｑ、１９４：Ｌ４１６Ｓ＿Ｙ４１７Ａ＿Ｐ４１８Ｇ＿Ｉ５２９Ｈ＿Ｑ４９２Ｒ＿Ｑ６７３Ｉ、１９５：Ｌ４１６Ｓ＿Ｙ４１７Ａ＿Ｐ４１８Ｇ＿Ｉ５２９Ｈ＿Ｒ５１５Ｌ＿Ｑ４９２Ｒ、１９６：Ｌ４１６Ｓ＿Ｙ４１７Ａ＿Ｐ４１８Ｇ＿Ｉ５２９Ｈ＿Ｒ５１５Ｌ＿Ｑ６７３Ｉ、１９７：Ｌ４１６Ｓ＿Ｙ４１７Ａ＿Ｐ４１８Ｇ＿Ｉ５２９Ｈ＿Ｒ６０８Ｋ＿Ａ４９３Ｓ、１９８：Ｌ４１６Ｓ＿Ｙ４１７Ａ＿Ｐ４１８Ｇ＿Ｉ５２９Ｈ＿Ｒ６０８Ｋ＿Ｌ４９６Ａ、１９９：Ｌ４１６Ｓ＿Ｙ４１７Ａ＿Ｐ４１８Ｇ＿Ｉ５２９Ｈ＿Ｒ６０８Ｋ＿Ｑ４９２Ｒ、２００：Ｌ４１６Ｓ＿Ｙ４１７Ａ＿Ｐ４１８Ｇ＿Ｉ５２９Ｈ＿Ｖ４８９Ｉ＿Ａ４９３Ｓ、２０１：Ｌ４１６Ｓ＿Ｙ４１７Ａ＿Ｐ４１８Ｇ＿Ｉ５２９Ｈ＿Ｖ４８９Ｉ＿Ｑ４９２Ｒ、２０２：Ｌ４１６Ｓ＿Ｙ４１７Ａ＿Ｐ４１８Ｇ＿Ｉ５２９Ｈ＿Ｖ４８９Ｉ＿Ｒ５１５Ｌ、２０３：Ｌ４１６Ｓ＿Ｙ４１７Ａ＿Ｐ４１８Ｇ＿Ｉ５２９Ｈ＿Ａ４９３Ｓ＿Ｒ５１５Ｌ、２０４：Ｌ４１６Ｓ＿Ｙ４１７Ａ＿Ｐ４１８Ｇ＿Ａ４９３Ｓ＿Ｉ５２９Ｈ＿Ｋ６１０Ｅ、２０５：Ｌ４１６Ｓ＿Ｙ４１７Ａ＿Ｐ４１８Ｇ＿Ｉ５２９Ｈ＿Ａ４９３Ｓ＿Ｌ４９６Ｇ、２０６：Ｌ４１６Ｓ＿Ｙ４１７Ａ＿Ｐ４１８Ｇ＿Ｉ５２９Ｈ＿Ａ４９３Ｓ＿Ｒ５１５Ｌ＿Ｌ６１１Ｓ、２０７：Ｌ４１６Ｓ＿Ｙ４１７Ａ＿Ｐ４１８Ｇ＿Ｉ５２９Ｈ＿Ａ４９３Ｓ＿Ｌ４９６Ｓ＿Ｄ４３９Ｓ、２０８：Ｌ４１６Ｓ＿Ｙ４１７Ａ＿Ｐ４１８Ｇ＿Ｉ５２９Ｈ＿Ａ４９３Ｓ＿Ｒ５１５Ｗ、２０９：Ｌ４１６Ｓ＿Ｙ４１７Ａ＿Ｐ４１８Ｇ＿Ｉ５２９Ｈ＿Ａ４９３Ｓ＿Ｌ４９６Ａ、２１０：Ｌ４１６Ｓ＿Ｙ４１７Ａ＿Ｐ４１８Ｇ＿Ｉ５２９Ｈ＿Ａ４９３Ｓ＿Ｑ４９２Ｃ＿Ｌ４９６Ｒ、２１１：Ｌ４１６Ｓ＿Ｙ４１７Ａ＿Ｐ４１８Ｇ＿Ｉ５２９Ｈ＿Ａ４９３Ｓ＿Ｒ７２３Ｈ、２１２：Ｌ４１６Ｓ＿Ｙ４１７Ａ＿Ｐ４１８Ｇ＿Ｉ５２９Ｈ＿Ａ４９３Ｓ＿Ｄ６５３Ｇ＿Ａ６６９Ｄ＿Ｓ７１７Ｇ＿Ｉ７５０Ｖ、２１３：Ｌ４１６Ｓ＿Ｙ４１７Ａ＿Ｐ４１８Ｇ＿Ｉ５２９Ｈ＿Ａ４９３Ｓ＿Ｌ４９６Ｓ、２１４：Ｌ４１６Ｓ＿Ｙ４１７Ａ＿Ｐ４１８Ｇ＿Ｉ５２９Ｈ＿Ａ４９３Ｓ＿Ｒ５１５Ｙ、２１５：Ｌ４１６Ｓ＿Ｙ４１７Ａ＿Ｐ４１８Ｇ＿Ｉ５２９Ｈ＿Ａ４９３Ｓ＿Ｑ４９２Ｇ＿Ｌ４９６Ａ、２１６：Ｌ４１６Ｓ＿Ｙ４１７Ａ＿Ｐ４１８Ｇ＿Ｉ５２９Ｈ＿Ａ４９３Ｓ＿Ｓ４４３Ｎ＿Ｑ４９２Ｆ、２１７：Ｌ４１６Ｓ＿Ｙ４１７Ａ＿Ｐ４１８Ｇ＿Ｉ５２９Ｈ＿Ａ４９３Ｓ＿Ｒ６９７Ｇ、２１８：Ｌ４１６Ｓ＿Ｙ４１７Ａ＿Ｐ４１８Ｇ＿Ｉ５２９Ｈ＿Ａ４９３Ｓ＿Ｌ４９６Ｈ、２１９：Ｌ４１６Ｓ＿Ｙ４１７Ａ＿Ｐ４１８Ｇ＿Ｉ５２９Ｈ＿Ａ４９３Ｓ＿Ｑ４９２Ａ＿Ｌ４９６Ｓ、２２０：Ｌ４１６Ｓ＿Ｙ４１７Ａ＿Ｐ４１８Ｇ＿Ｉ５２９Ｈ＿Ａ４９３Ｓ＿Ｌ４９４Ｖ＿Ｌ４９６Ｎ、２２１：Ｌ４１６Ｓ＿Ｙ４１７Ａ＿Ｐ４１８Ｇ＿Ｉ５２９Ｈ＿Ａ４９３Ｓ＿Ｖ６５１Ｍ、２２２：Ｌ４１６Ｓ＿Ｙ４１７Ａ＿Ｐ４１８Ｇ＿Ａ４９３Ｓ＿Ｉ５２９Ｈ＿Ｅ５６９Ｇ、２２３：Ｌ４１６Ｓ＿Ｙ４１７Ａ＿Ｐ４１８Ｇ＿Ｉ５２９Ｈ＿Ａ４９３Ｓ＿Ｒ５１５Ｌ＿Ｓ７１７Ｇ、２２４：Ｌ４１６Ｓ＿Ｙ４１７Ａ＿Ｐ４１８Ｇ＿Ｉ５２９Ｈ＿Ａ４９３Ｓ＿Ｓ７１７Ｇ、２２５：Ｌ４１６Ｓ＿Ｙ４１７Ａ＿Ｐ４１８Ｇ＿Ｉ５２９Ｈ＿Ａ４９３Ｓ＿Ｒ５１５Ｌ＿Ｎ５６７Ｄ、２２６：Ｌ４１６Ｓ＿Ｙ４１７Ａ＿Ｐ４１８Ｇ＿Ｉ５２９Ｈ＿Ａ４９３Ｓ＿Ｌ４９６Ｒ、２２７：Ｌ４１６Ｓ＿Ｙ４１７Ａ＿Ｐ４１８Ｇ＿Ｉ５２９Ｈ＿Ａ４９３Ｓ＿Ｑ４９２Ｇ、２２８：Ｌ４１６Ｓ＿Ｙ４１７Ａ＿Ｐ４１８Ｇ＿Ｉ５２９Ｈ＿Ａ４９３Ｓ＿Ｒ５１５Ｌ＿Ｓ５７７Ｉ、２２９：Ｌ４１６Ｓ＿Ｙ４１７Ａ＿Ｐ４１８Ｇ＿Ａ４９３Ｓ＿Ｉ５２９Ｈ＿Ｋ５８Ｍ、２３０：Ｌ４１６Ｓ＿Ｙ４１７Ａ＿Ｐ４１８Ｇ＿Ｉ５２９Ｈ＿Ａ４９３Ｓ＿Ｒ５１５Ｐ、２３１：Ｌ４１６Ｓ＿Ｙ４１７Ａ＿Ｐ４１８Ｇ＿Ｉ５２９Ｈ＿Ａ４９３Ｓ＿Ｑ４９２Ｇ＿Ｌ４９６Ｉ、２３２：Ｌ４１６Ｓ＿Ｙ４１７Ａ＿Ｐ４１８Ｇ＿Ｉ５２９Ｈ＿Ａ４９３Ｓ＿Ｌ４９６Ｎ、２３３：Ｌ４１６Ｓ＿Ｙ４１７Ａ＿Ｐ４１８Ｇ＿Ｉ５２９Ｈ＿Ａ４９３Ｓ＿Ｒ５１５Ｆ、２３４：Ｌ４１６Ｓ＿Ｙ４１７Ａ＿Ｐ４１８Ｇ＿Ｉ５２９Ｈ＿Ａ４９３Ｓ＿Ｄ３８１Ｙ＿Ｑ４９２Ｒ＿Ｌ４９６Ｍ、２３５：Ｌ４１６Ｓ＿Ｙ４１７Ａ＿Ｐ４１８Ｇ＿Ｉ５２９Ｈ＿Ａ４９３Ｓ＿Ｓ４４３Ｎ、２３６：Ｌ４１６Ｓ＿Ｙ４１７Ａ＿Ｐ４１８Ｇ＿Ｉ５２９Ｈ＿Ａ４９３Ｓ＿Ｅ３７０Ｄ、２３７：Ｌ４１６Ｓ＿Ｙ４１７Ａ＿Ｐ４１８Ｇ＿Ｉ５２９Ｈ＿Ａ４９３Ｓ＿Ｅ７６０Ｇ、２３８：Ｌ４１６Ｓ＿Ｙ４１７Ａ＿Ｐ４１８Ｇ＿Ｉ５２９Ｈ＿Ａ４９３Ｓ＿Ｑ４９２Ｔ＿Ｌ４９６Ｓ、２３９：Ｌ４１６Ｓ＿Ｙ４１７Ａ＿Ｐ４１８Ｇ＿Ｉ５２９Ｈ＿Ａ４９３Ｓ＿Ｌ４９６Ｃ、２４０：Ｌ４１６Ｓ＿Ｙ４１７Ａ＿Ｐ４１８Ｇ＿Ｉ５２９Ｈ＿Ａ４９３Ｓ＿Ｌ４９６Ｉ、２４１：Ｌ４１６Ｓ＿Ｙ４１７Ａ＿Ｐ４１８Ｇ＿Ｉ５２９Ｈ＿Ａ４９３Ｓ＿Ｌ４９６Ｙ、２４２：Ｌ４１６Ｓ＿Ｙ４１７Ａ＿Ｐ４１８Ｇ＿Ｉ５２９Ｈ＿Ａ４９３Ｓ＿Ｇ３５５Ｓ＿Ｓ４４０Ｎ＿Ｒ５１５Ｌ、２４３：Ｌ４１６Ｓ＿Ｙ４１７Ａ＿Ｐ４１８Ｇ＿Ｉ５２９Ｈ＿Ａ４９３Ｓ＿Ｑ４９２Ｌ＿Ｌ４９６Ｍ、２４４：Ｌ４１６Ｆ＿Ｙ４１７Ａ＿Ｐ４１８Ｇ＿Ａ４９３Ｓ＿Ｉ５２９Ｈ＿Ｒ５１５Ｌ＿Ｎ５６７Ｄ、２４５：Ｌ４１６Ｙ＿Ｙ４１７Ａ＿Ｐ４１８Ｇ＿Ａ４９３Ｓ＿Ｉ５２９Ｈ＿Ｒ５１５Ｌ＿Ｎ５６７Ｄ、２４６：Ｌ４１６Ｓ＿Ｙ４１７Ｔ＿Ｐ４１８Ｇ＿Ｉ５２９Ｈ＿Ａ４９３Ｓ＿Ｒ５１５Ｌ＿Ｎ５６７Ｄ、２４７：Ｌ４１６Ｍ＿Ｙ４１７Ａ＿Ｐ４１８Ｇ＿Ａ４９３Ｓ＿Ｉ５２９Ｈ＿Ｒ５１５Ｌ＿Ｎ５６７Ｄ、２４８：Ｌ４１６Ａ＿Ｙ４１７Ａ＿Ｐ４１８Ｇ＿Ｉ５２９Ｈ＿Ａ４９３Ｓ＿Ｒ５１５Ｌ＿Ｎ５６７Ｄ、２４９：Ｌ４１６Ｓ＿Ｙ４１７Ａ＿Ｐ４１８Ｇ＿Ｉ５２９Ｈ＿Ａ４９３Ｓ＿Ｒ５１５Ｌ＿Ｎ５６７Ｄ＿Ｃ１０４Ｓ、２５０：Ｌ４１６Ｓ＿Ｙ４１７Ａ＿Ｐ４１８Ｇ＿Ｉ５２９Ｈ＿Ａ４９３Ｓ＿Ｒ５１５Ｌ＿Ｎ５６７Ｄ＿Ｃ５１４Ｓ、２５１：Ｌ４１６Ｓ＿Ｙ４１７Ａ＿Ｐ４１８Ｇ＿Ｉ５２９Ｈ＿Ａ４９３Ｓ＿Ｒ５１５Ｌ＿Ｎ５６７Ｄ＿Ｃ１３０Ｓ、２５２：Ｌ４１６Ｓ＿Ｙ４１７Ａ＿Ｐ４１８Ｇ＿Ｉ５２９Ｈ＿Ａ４９３Ｓ＿Ｒ５１５Ｌ＿Ｎ５６７Ｄ＿Ｃ１３０Ｒ、２５３：Ｌ４１６Ｓ＿Ｙ４１７Ａ＿Ｐ４１８Ｇ＿Ｉ５２９Ｈ＿Ａ４９３Ｓ＿Ｒ５１５Ｌ＿Ｎ５６７Ｄ＿Ｃ４５０Ｓ、２５４：Ｌ４１６Ｓ＿Ｙ４１７Ａ＿Ｐ４１８Ｇ＿Ｉ５２９Ｈ＿Ａ４９３Ｓ＿Ｒ５１５Ｌ＿Ｎ５６７Ｄ＿Ｃ５１７Ｓ、２５５：Ｌ４１６Ｓ＿Ｙ４１７Ａ＿Ｐ４１８Ｇ＿Ｉ５２９Ｈ＿Ａ４９３Ｓ＿Ｒ５１５Ｌ＿Ｎ５６７Ｄ＿Ｃ２６９Ｓ。

【0472】

実施例３：Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓからの変異体ポリメラーゼ

【0473】

変異Ｒ６１５Ｋ、Ｙ６５４Ａ、Ｙ６５４Ｄ、Ｙ６５４Ｅ、Ｙ６５４Ｆ、Ｙ６５４Ｇ、Ｓ６５５Ａ、Ｓ６５５Ｇ、Ｓ６５５Ｖ、Ｑ６５６Ａ、Ｑ６５６Ｇ、Ｑ６５６Ｎ、Ｑ６５６Ｓ、Ｑ６５６Ｖ、Ｉ６５７Ａ、Ｉ６５７Ｇ、Ｉ６５７Ｓ、Ｉ６５７Ｖ、Ｅ６５８Ａ、Ｅ６５８Ｄ、Ｅ６５８Ｇ、Ｅ６５８Ｓ、Ｅ６５８Ｖ、Ｌ６５９Ａ、Ｌ６５９Ｇ、Ｌ６５９Ｐ、Ｌ６５９Ｓ、Ｌ６５９Ｖ、Ｄ６８０Ａ、Ｄ６８０Ｇ、Ｄ６８０Ｉ、Ｄ６８０Ｌ、Ｄ６８０Ｎ、Ｄ６８０Ｓ、Ｄ６８０Ｖ、Ｈ６８２Ａ、Ｈ６８２Ｇ、Ｈ６８２Ｎ、Ｈ６８２Ｑ、Ｈ６８２Ｓ、Ｈ６８２Ｖ、Ｒ７０２Ａ、Ｒ７０２Ｇ、Ｒ７０２Ｈ、Ｒ７０２Ｋ、Ｒ７０２Ｓ、Ｒ７０２Ｖ、Ｋ７０６Ｈ、Ｋ７０６Ｋ、Ｋ７０６Ｒ、Ａ７０７Ｇ、Ａ７０７Ｓ、Ａ７０７Ｔ、Ｆ７１０Ａ、Ｆ７１０Ｄ、Ｆ７１０Ｅ、Ｆ７１０Ｇ、Ｆ７１０Ｑ、Ｆ７１０Ｓ、Ｆ７１０Ｔ、Ｆ７１０Ｖ、Ｙ７１４Ａ、Ｙ７１４Ｄ、Ｙ７１４Ｅ、Ｙ７１４Ｆ、Ｙ７１４Ｇ、Ｙ７１４Ｓ、Ｙ７１４Ｗ、Ｈ８２９Ａ、Ｈ８２９Ｇ、Ｄ３１４Ｅ、Ｉ３３２Ｌ、Ｉ３３４Ｌ、Ｋ３６８Ｒ、Ｋ３８１Ｒ、Ｉ３８５Ｌ、Ｋ４１７Ｒ、Ｋ４３４Ｒ、Ｉ４５４Ｌ、Ｄ４７１Ｅ、Ｉ５２８Ｌ、Ｋ６０１Ｒ、Ｋ６３５Ｒ、Ｉ６４９Ｌ、Ｉ６６５Ｌ、Ｋ７５８Ｒ、及びＫ７６０Ｒは、Ｂｓｔポリメラーゼ（例えば、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）において個別にまたは様々な組み合わせのいずれかで作製された。代表的なＢｓｔバリアントによる３’－アジドメチルヌクレオチドの取り込みの改善を、図２に示す。

【0474】

実施例４：反応速度

【0475】

精製された酵素を、４２℃の反応緩衝液中で、鋳型位置にｄＧを含有するアニールされた基質ＤＮＡと過剰にプレインキュベートした。反応は、正しいｄＣＴＰ－３’－Ｏ－メチルアジドヌクレオチドの添加によって開始し、進行させた。様々な時点で、反応をサンプリングし、ＥＤＴＡ及びホルムアミドの添加によってクエンチして、反応を停止させた。クエンチしたサンプルを、キャピラリー電気泳動によって分析した。生成物の形成対時間を、指数方程式に当てはめて、見かけの反応速度を求めた。野生型酵素（配列番号１）を、配列番号３９、２９７、２７、１６４、または２２５のアミノ酸配列を有する操作させた酵素と比較する、結果を、図１９に示す。

【0476】

実施例５：プライマー伸長反応

【0477】

フローセルは、増幅されたポロニーのフィールドを空間的に分離し、個別に含むように調製した。制御された様式で、適切な緩衝液、操作されたポリメラーゼ（例えば、配列番号２７）、ｄＮＴＰ－３’－Ｏ－メチルアジド、及び触媒金属を含有する伸長混合物を、増幅したポロニーと反応させて、理想的には、Ｎ個の長さの配列決定プライマーの３’末端に単一のヌクレオチドを組み込むようにした。反応は、溶液を除去し、広範囲に洗浄することにより停止した。次いで、Ｎ＋１の伸長生成物に対応するブロックされた配列決定プライマーを、切断試薬と反応させて、メチルアジドブロッキング基を除去し、伸長可能な３’ＯＨ基を再生した。切断後、増幅したポロニーを、広範囲に洗浄して、任意の微量の切断試薬を除去した。増幅されたポロニーの各空間的に分離されたフィールドがＮ＋１、Ｎ＋４、Ｎ＋６、Ｎ＋８に伸長されるように、このプロセスを２、４、６、８回繰り返した。次いで、伸長した配列決定プライマーを除去し、キャピラリー電気泳動によって分析した。結果を図２０に示す。

【0478】

実施例６：多価分子及びヌクレオチドを使用した配列決定

【0479】

２段階の配列決定反応は、その上に固定化された複数のコンカテマー鋳型分子（例えば、固定化されたポロニー）を有するフローセル上で実施した。

【0480】

第１段階の配列決定反応は、複数の可溶性配列決定プライマーを、フローセルに固定化されたコンカテマー鋳型分子にハイブリダイズして、固定化されたプライマー－コンカテマー二本鎖を形成することによって実施した。複数の第１の配列決定ポリメラーゼを、フローセル上に流し（例えば、固定化されたプライマー－コンカテマー二本鎖に接触させる）、配列決定ポリメラーゼを二本鎖に結合させるのに好適な条件下でインキュベートして、複合ポリメラーゼを形成した。例示的な第１の配列決定ポリメラーゼは、配列番号１～２７４または２８８～３７５または３８５～３９７のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。蛍光標識された多価分子の混合物（例えば、約２０～１００ｎＭの異なる濃度で）を、非触媒カチオン（例えば、ストロンチウム、バリウム、及び／またはカルシウム）を含む緩衝液の存在下でフローセル上に流し、多価分子の相補的ヌクレオチド単位を複合ポリメラーゼに結合するのに好適な条件下でインキュベートして、ヌクレオチド単位のポリメラーゼ触媒による取り込みなしに親和性複合体を形成した。蛍光標識された多価分子を、それらのコアで標識した。複合ポリメラーゼを洗浄した。複合ポリメラーゼに結合したままの蛍光標識多価分子の画像を得た。洗剤を含む緩衝液で洗浄することによって、固定化されたコンカテマー（保持された二本鎖）にハイブリダイズする配列決定プライマーを保持しつつ、第１の配列決定ポリメラーゼ及び多価分子を除去した。

【0481】

第１の段階の配列決定反応は、コンカテマー鋳型分子（例えば、ポロニー）上に複数の親和性複合体を形成するのに好適であった。例えば、第１の段階の配列決定反応は、（ａ）第１の核酸プライマー、第１のポリメラーゼ、及び第１の多価分子をコンカテマー鋳型分子の第１の部分に結合し、それによって第１の結合複合体を形成することであって、第１の多価分子の第１のヌクレオチド単位が、第１のポリメラーゼに結合する、形成することと、（ｂ）第２の核酸プライマー、第２のポリメラーゼ、及び第１の多価分子を同じコンカテマー鋳型分子の第２の部分に結合し、それによって第２の結合複合体を形成することであって、第１の多価分子の第２のヌクレオチド単位は、第２のポリメラーゼに結合し、同じ多価分子を含む第１及び第２の結合複合体は、第１の親和性複合体を形成する、形成することと、を含んだ。

【0482】

第２の段階の配列決定反応は、保持された二本鎖を複数の第２の配列決定ポリメラーゼと接触させて、複合ポリメラーゼを形成することによって実施した。例示的な第２の配列決定ポリメラーゼは、配列番号１～２７４または２８８～３７５または３８５～３９７のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。非標識ヌクレオチド類似体（例えば、３’Ｏ－メチルアジドヌクレオチド）の混合物（例えば、約１～５ｕＭの異なる濃度で）を、触媒カチオン（例えば、マグネシウム及び／またはマンガン）を含む緩衝液の存在下で複合ポリメラーゼに添加し、相補的ヌクレオチドを複合ポリメラーゼに結合し、ヌクレオチドのポリメラーゼ触媒による取り込みを促進して新生の伸長した配列決定プライマーを生成するのに好適な条件下でインキュベートした。複合ポリメラーゼを洗浄した。画像は取得されなかった。取り込まれた非標識ヌクレオチド類似体を、３’Ｏ－メチルアジド基を除去し、伸長可能な３’ＯＨ基を生成する開裂試薬と反応させた。

【0483】

代替的な第２の段階の配列決定反応では、蛍光標識されたヌクレオチド類似体（例えば、３’Ｏ－メチルアジドヌクレオチド）の混合物（例えば、約１～５ｕＭ）を、触媒カチオン（例えば、マグネシウム及び／またはマンガン）を含む緩衝液の存在下で複合ポリメラーゼに添加し、相補的ヌクレオチドを複合ポリメラーゼに結合し、ヌクレオチドのポリメラーゼ触媒による取り込みを促進して新生の伸長した配列決定プライマーを生成するのに好適な条件下でインキュベートした。複合ポリメラーゼを洗浄した。複合ポリメラーゼの一部として、取り込まれた蛍光標識ヌクレオチド類似体の画像を得た。取り込まれた蛍光標識ヌクレオチド類似体を、３’Ｏ－メチルアジド基を除去し、伸長可能な３’ＯＨ基を生成する開裂試薬と反応させた。

【0484】

洗剤を含む緩衝液で洗浄することによって、コンカテマー（保持された二重鎖）にハイブリダイズする新生の伸長した配列決定プライマーを保持しつつ、第２の配列決定ポリメラーゼを除去した。反復する配列決定反応は、第１の段階及び第２の段階の配列決定反応の複数サイクルを実施して、伸長した順方向配列決定プライマー鎖を生成することによって実施した。３６サイクルの配列決定の実行から得られた例示的な位相率を図２０に示す。

【図1】

【図2】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図3D】

【図3E】

【図3F】

【図3G】

【図3H】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図4D】

【図4E】

【図5A】

【図5B】

【図5C】

【図5D】

【図5E】

【図6A】

【図6B】

【図6C】

【図7A】

【図7B】

【図8A】

【図8B】

【図8C】

【図9A】

【図9B】

【図10A】

【図10B】

【図11A】

【図11B】

【図12A】

【図12B】

【図13A】

【図13B】

【図14A】

【図14B】

【図15A】

【図15B】

【図16A】

【図16B】

【図17A】

【図17B】

【図17C】

【図18】

【図19】

【図20】

【配列表】

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【国際調査報告】