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特表2024-522813マイクロバイオームの健康を促進するためのイベザポルスタットの使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-06-21
(54)【発明の名称】マイクロバイオームの健康を促進するためのイベザポルスタットの使用
(51)【国際特許分類】
A61K 31/5377 20060101AFI20240614BHJP
A61P 1/04 20060101ALI20240614BHJP
A61P 31/04 20060101ALI20240614BHJP
【ＦＩ】
A61K31/5377
A61P1/04
A61P31/04
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023578088
(86)(22)【出願日】2022-06-16
(85)【翻訳文提出日】2024-02-02
(86)【国際出願番号】 US2022033786
(87)【国際公開番号】W WO2022266318
(87)【国際公開日】2022-12-22
(31)【優先権主張番号】63/211,320
(32)【優先日】2021-06-16
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/236,972
(32)【優先日】2021-08-25
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/263,556
(32)【優先日】2021-11-04
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/264,052
(32)【優先日】2021-11-15
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】523474416
【氏名又は名称】アクルクス ファーマシューティカルズ、インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】110000855
【氏名又は名称】弁理士法人浅村特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】ギャレイ、ケビン
【テーマコード（参考）】
4C086
【Ｆターム（参考）】
4C086AA01
4C086CB07
4C086MA01
4C086MA04
4C086NA14
4C086ZA66
4C086ZB35
(57)【要約】
本発明は、腸内マイクロバイオームの健康を増大させるためにイベザポルスタットを使用する方法に関する。本発明は、Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染を治療すると同時に、Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染の再発の可能性を低減するか、またはＣ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染の再発を予防する方法を提供する。本発明はまた、腸内のアクチノバクテリア（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）および／またはファーミキューテス（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）の数を増加させることによって腸内マイクロバイオームの健康を増大させる方法を提供する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染を治療すると同時に、対象のＣ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染の再発の可能性を低減するか、または対象のＣ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染の再発を予防する方法であって、Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染に罹患している対象に有効量のイベザポルスタットを投与することを含み、前記有効量のイベザポルスタットの投与が、前記Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染を治療すると同時に、９０日以内のＣ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染の可能性を低減するか、または９０日以内のＣ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染の再発を予防する方法。
【請求項2】
イベザポルスタットの投与が、前記Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染の臨床的治癒が達成されるまで継続される、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
イベザポルスタットの投与が、前記Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染の臨床的治癒が達成された際に終了される、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
前記有効量のイベザポルスタットの投与が、３０日以内のＣ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染の可能性を低減するか、または３０日以内のＣ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染の再発を予防する、請求項１に記載の方法。
【請求項5】
Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染に罹患している対象においてアクチノバクテリア（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）の増殖を促進する方法であって、前記Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染を治療または予防するために有効量のイベザポルスタットを投与することを含み、
前記対象の腸内マイクロバイオーム内のアクチノバクテリア（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）の量が増加するか、またはプロテオバクテリア（Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）と比較してアクチノバクテリア（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）の割合が増加する方法。
【請求項6】
イベザポルスタットの投与が、前記Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染の臨床的治癒が達成されるまで継続される、請求項５に記載の方法。
【請求項7】
イベザポルスタットの投与が、前記Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染の臨床的治癒が達成された際に終了される、請求項５に記載の方法。
【請求項8】
腸内マイクロバイオームの健康を改善する方法であって、Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染に罹患している対象に有効量のイベザポルスタットを投与することを含み、
前記対象の腸内マイクロバイオーム内の細菌の門の割合が、前記イベザポルスタットの投与前の前記対象の腸内マイクロバイオームよりも健康なバランスに調整される方法。
【請求項9】
腸内マイクロバイオーム内のアクチノバクテリア（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）の量を増加させる方法であって、それを必要とする対象に有効量のイベザポルスタットを投与することを含み、
アクチノバクテリア（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）の量が、前記イベザポルスタットの投与前の前記腸内マイクロバイオーム内のアクチノバクテリア（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）の量よりも、前記腸内マイクロバイオーム内で多い方法。
【請求項10】
腸内マイクロバイオームの健康を改善する方法であって、それを必要とする対象に有効量のイベザポルスタットを投与することを含み、
前記対象の腸内マイクロバイオーム内の細菌の門の割合が、前記イベザポルスタットの投与前の前記対象の腸内マイクロバイオームよりも健康なバランスに調整される方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本明細書で言及されるすべての刊行物、特許および特許出願は、個々の刊行物、特許または特許出願が、参照によりその全体が組み込まれることが具体的かつ個別に示されている場合と同じ程度に、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【0002】
本発明は、腸内マイクロバイオームの健康を増大させるためにイベザポルスタットを使用する方法に関する。本発明は、クロストリジオイデス・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｏｉｄｅｓ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）（Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）；以前はクロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）として知られていた）感染（ＣＤＩ）を治療すると同時に、Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染の再発の可能性を低減するか、またはＣ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染の再発を予防する方法を提供する。本発明はまた、腸内のアクチノバクテリア（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）および／またはファーミキューテス（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）の数を増加させることによって腸内マイクロバイオームの健康を増大させる方法を提供する。
【背景技術】
【0003】
身体の粘膜表面は、多くの場合マイクロバイオームまたは微生物叢と呼ばれる複雑で特殊化した微生物群を含有する。（Ｍｕｌｌｉｓｈ ＢＨ，ｅｔ ａｌ．Ｆｒｏｎｔｌｉｎｅ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ２０２１；１２：１１８－１２７）。ヒトの消化管の微生物叢またはマイクロバイオームは、最大１００兆個の微生物からなると推定され、それらのほとんどは大腸に見出される。（Ｋａｃｈｒｉｍａｎｉｄｏｕ，Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ２０２０，８，２００）。消化管マイクロバイオームは多様であるが、健康な成人では、ファーミキューテス（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）（グラム陽性胞子形成生物）およびバクテロイデテス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ）（グラム陰性非胞子形成生物）の２つの主要な門に由来する細菌から主に構成される。これらの２つの門は、マイクロバイオームの約９０％を典型的に構成する。（Ｍｕｌｌｉｓｈ ＢＨ，ｅｔ ａｌ．Ｆｒｏｎｔｌｉｎｅ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ２０２１；１２：１１８－１２７）。
【0004】
ファーミキューテス（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）およびバクテロイデテス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ）に加えて、腸内マイクロバイオームは、アクチノバクテリア（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）、フソバクテリア（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉａ）、ベルコミクロビア（Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａ）およびプロテオバクテリア（Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）からも構成される。（Ｍｕｌｌｉｓｈ）。プロテオバクテリア（Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）門は、グラム陰性通性嫌気性菌から構成され、プロテオバクテリア（Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）門の一部のメンバーは健康な腸の一部であるが、この門はまた、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）および大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）などの一般的なグラム陰性病原性共生生物を含む。（Ｍｕｌｌｉｓｈ）。さらに、データ量の増加により、疾患の可能性のある微生物シグネチャーとしてプロテオバクテリア（Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）が示されている。（Ｒｉｚｚａｔｔｉ，Ｌ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．，”Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ：Ａ Ｃｏｍｍｏｎ Ｆａｃｔｏｒ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｄｉｓｅａｓｅｓ”，ＢｉｏＭｅｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，ｖｏｌ．２０１７，Ａｒｔｉｃｌｅ ＩＤ ９３５１５０７，７ ｐａｇｅｓ，２０１７．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１５５／２０１７／９３５１５０７）。アクチノバクテリア（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）は、小児では大きな割合で存在し、年齢とともに全体的な割合が一般に低下する（ファーミキューテス（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）およびアクチノバクテリア（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）に置き換えられる）。出生時に、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）および連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）などの通性嫌気性種は、乳児の腸に定着し、生後数日以内に嫌気性環境をもたらし、バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）（バクテロイデテス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ）門）およびビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）（アクチノバクテリア（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）門）などの厳密な嫌気性菌が増殖することを可能にする。（Ｍｕｅｌｌｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｆｅｂｒｕａｒｙ ２０１５，Ｖｏｌ．２１，Ｎｏ．２）。生後１年にわたって、環境および母乳または人工乳に乳児を曝露することによって、腸内マイクロバイオームは、成人の腸内マイクロバイオームに近似する成熟したバイオームに進化する。（Ｊａｎｇｉ ａｎｄ Ｌａｍｏｎｔ，ＪＰＧＮ，Ｖｏｌ．５１，Ｎｏ．１，Ｊｕｌｙ ２０１０）。
【0005】
腸内マイクロバイオームは複雑であり、宿主と相互に有益な関係を有する。この関係を通じて、マイクロバイオームは、腸および全身の免疫系を形成すること、健康な腸上皮を維持すること、食物からエネルギーを採取すること、ならびに病原体からの保護を含む多くの利益を宿主に提供する。（Ｍｕｌｌｉｓｈ）。マイクロバイオームの組成がその正常な多様性から変化すると、これらの有益な生理学的機能が破壊される。これは、ディスバイオシスと呼ばれる。（Ｍｕｌｌｉｓｈ）。腸内マイクロバイオームがディスバイオシスの状態にあると、マイクロバイオームには、有益な微生物（共生生物）が少なくなり、潜在的に有害な微生物（病原性共生生物）が多くなる。（Ｍｕｌｌｉｓｈ）。
【0006】
先の段落に記載される利点に加えて、腸内細菌は、２組の酵素の活性を介して抱合胆汁酸を代謝する。
【0007】
第１の組、胆汁塩加水分解酵素（ＢＳＨ）は、抱合タウリンまたは抱合グリシンを除去して、非抱合胆汁酸を生成する。非抱合後、一次胆汁酸は、７α－脱ヒドロキシル経路によってさらに代謝されて、二次胆汁酸を生成することができる。抱合および非抱合一次胆汁酸タウロコラート（ＴＣＡ）およびコラート（ＣＡ）はそれぞれＣ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）胞子の発芽を促進するが、二次胆汁酸、例えば、リトコラート（ＬＣＡ）およびデオキシコラート（ＤＣＡ）は、Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）の栄養生長を一般に阻害することが報告されている。（Ｑｉａｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔ Ｌｉｖｅｒ Ｐｈｙｓｉｏｌ３１９：Ｇ２２７－Ｇ２３７，２０２０）。
【0008】
クロストリジオイデス・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｏｉｄｅｓ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染（ＣＤＩ）は、米国では、医療関連感染症の最も一般的な原因である。（Ｍａｇｉｌｌ ＳＳ，ｅｔ ａｌ．Ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ ｏｆ ｈｅａｌｔｈ ｃａｒｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｕ．Ｓ．ｈｏｓｐｉｔａｌｓ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ２０１８；３７９：１７３２－４４）。Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）は、時として健康な腸内マイクロバイオームの正常な成分であるが、マイクロバイオームがバランスを崩すと、Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）が増殖し、疾患（ＣＤＩとして知られている）を引き起こす可能性がある。Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）の定着後、この生物は、２つの重要なクロストリジウム毒素Ａ（ＴｃｄＡ）およびＢ（ＴｃｄＢ）という主な病原性因子を産生および放出する。（Ｋａｃｈｒｉｍａｎｉｄｏｕ，Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ２０２０，８，２００；ｄｏｉ：１０．３３９０／ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ８０２０２００）。ＴｃｄＡおよびＴｃｄＢは、ヒト腸上皮細胞に結合し、炎症、体液および粘膜分泌、ならびに腸粘膜への損傷の原因となる外毒素である。Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）は、軽度の下痢から、生命を脅かす重度の結腸穿孔および中毒性巨大結腸症に及ぶ広範囲の臨床症状を引き起こす。ＣＤＩでは、宿主マイクロバイオームが破壊されやすく、これは高リスク抗生物質の以前の使用によって通常引き起こされる。（Ｄａｖｉｓ ＭＬ，ｅｔ ａｌ．Ｍｕｌｔｉｃｅｎｔｒｅ ｄｅｒｉｖａｔｉｏｎ ａｎｄ ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｓｉｍｐｌｅ ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ ｉｎｄｅｘ ｆｏｒ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．（Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｎｆｅｃｔ ２０１８；２４：１１９０－４）。例えば、広域抗生物質による治療により、バクテロイデテス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ）のほぼ完全な喪失、ファーミキューテス（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）の減少、およびプロテオバクテリア（Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）の過剰増殖が起こり得る。これらの変化により、Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）胞子が発芽し、コロニーが増殖し、病原性になる可能性がある。（Ｍｕｌｌｉｓｈ）。Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）が活性化されると、疾患を引き起こす２つの毒素が結腸内で産生される。（Ｂｒｉｔｔｏｎ ＲＡ，ｅｔ ａｌ．Ｒｏｌｅ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ ｉｎ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｂｙ Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ２０１４；１４６：１５４７－５３）。
【0009】
Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）は、健康な新生児および乳児の約６０％～７０％に定着する。（Ｊａｎｇｉ ２０１０）。しかし、未だ完全には理解されていない理由から、これらの定着された乳児では、重度の下痢および大腸炎を起こしやすい年長児および成人とは対照的に、この嫌気性菌によって放出される強力な外毒素に由来する悪影響が示されない。この生物は、乳児期に、成人の場合と同様に、育児室または家庭環境内の環境汚染から獲得される。Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）の毒素産生性株は乳児の腸に定着することが多く、コロニー数は偽膜性大腸炎（ＣＤＩの重度の症状である）を有する成人に見られるものと同じくらい高い。（Ｊａｎｇｉ ２０１０）。乳児における無症候性の定着の１つの可能性のある理由が、ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）（アクチノバクテリア（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）門）およびラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）（ファーミキューテス（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）門）などの他の共生細菌叢の存在および競合であり得る。（Ｊａｎｇｉ ２０１０）。実際、Ｊａｎｇｉで報告されているように、ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）およびラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）はいずれも、特定のＣ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）株の増殖を阻害することができた。
【0010】
抗菌療法はＣＤＩ治療の顕著な特徴であるが、治療選択肢は限られている。従来から、メトロニダゾールはＣＤＩの治療に広く使用されてきたが、バンコマイシンと比較して許容できないほど高い失敗率、高い死亡率および累積毒性のために、もはや推奨されていない。（ＭｃＤｏｎａｌｄ ＬＣ，ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｐｒａｃｔｉｃｅ ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ｆｏｒ Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ａｄｕｌｔｓ ａｎｄ ｃｈｉｌｄｒｅｎ：２０１７ ｕｐｄａｔｅ ｂｙ ｔｈｅ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ（ＩＤＳＡ）ａｎｄ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ（ＳＨＥＡ）．Ｃｌｉｎ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ ２０１８；６６：９８７－９４；およびＳｔｅｖｅｎｓ ＶＷ，ｅｔ ａｌ．Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｎｅｓｓ ｏｆ ｖａｎｃｏｍｙｃｉｎ ａｎｄ ｍｅｔｒｏｎｉｄａｚｏｌｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅ ａｎｄ ｄｅａｔｈ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．ＪＡＭＡ Ｉｎｔｅｒｎ Ｍｅｄ ２０１７；１７７：５４６－５３）。
【0011】
現在、バンコマイシンまたはフィダキソマイシンのいずれかが、Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）を死滅させる能力のため、および臨床症状を解消するためにＣＤＩに推奨される抗生物質である。（Ｇｏｎｚａｌｅｓ－Ｌｕｎａ ＡＪ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｙｓｔｅｍｓ ｂｉｏｌｏｇｙ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｏｉｄｅｓ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｆａｉｌｕｒｅｓ ｏｆ ｆｅｃａｌ ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，Ａｎａｅｒｏｂｅ，ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ａｎａｅｒｏｂｅ．２０２１．１０２３８７）。バンコマイシンは、ＩＤＳＡ治療ガイドラインによって推奨されているが、高いＣＤＩ再発率に関連しており、近年、宿主微生物叢の深刻な破壊のために耐性が増加することが示されている。（Ｉｓａａｃ Ｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｈｏｒｔ－ａｎｄ ｌｏｎｇ－ｔｅｒｍ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｏｒａｌ ｖａｎｃｏｍｙｃｉｎ ｏｎ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ．Ｊ Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ ２０１７；７２：１２８－３６；およびＰｅｎｇ Ｚ，ｅｔ ａｌ．，Ｕｐｄａｔｅ ｏｎ ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｉｎ Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ：ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ａｎｄ ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ ｔｅｓｔｉｎｇ．（Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ２０１７；５５：１９９８－２００８）。バンコマイシンによる治療は、特徴的なプロテオバクテリア（Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）過剰増殖とともに、ファーミキューテス（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）、アクチノバクテリア（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）およびバクテロイデテス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ）のマイクロバイオーム多様性を低下させる。（Ｇａｒｅｙ ２０２０）。プロテオバクテリア（Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）過剰増殖は、多剤耐性（ＭＤＲ）グラム陰性生物による全身感染のリスクの顕著な増加に関連する。バンコマイシンは、高率のＣＤＩ再発に関連しており、患者の約２０～２５％に治療中止後に再発性感染が生じている。（Ｇｏｎｚａｌｅｓ－Ｌｕｎａ）。
【0012】
フィダキソマイシンは、バンコマイシンよりも狭い活性スペクトルを有し、治療過程にわたってディスバイオシスをあまり引き起こさない。バンコマイシンとは異なり、フィダキソマイシンはＣ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）胞子に結合し、栄養細胞の増殖を予防し、それにより、再発率は他の治療よりも約５０％低くなる。（Ｇｏｎｚａｌｅｓ－Ｌｕｎａ）。フィダキソマイシンでは再発率は低いが、ｒｐｏＢ遺伝子の変異を介して耐性が現れたという報告がある。（Ｇａｒｅｙ ２０２０）。選択された治療法にかかわらず、ＣＤＩ再発率はＣＤＩのその後の各エピソードとともに増加し、多くの場合、疾患を制御するために長期間の抗生物質が必要とされる。
【0013】
さらに、広域抗生物質治療は、二次胆汁酸の喪失をもたらすことが報告されている。（Ｑｉａｎ）。加えて、Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）再発性感染に罹患している患者では一次胆汁酸が増大するが、健常対象では二次胆汁酸が増大することが報告されている。（Ｑｉａｎ）。これらの結果は、二次胆汁酸を増加させる治療が再発性ＣＤＩの予防に有効であり得ることを示唆している。
【0014】
したがって、Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）に対する異なる作用機序を有する新たな治療法が緊急に必要とされている。実際、ＣＤＣは、新たなクラスの抗生物質が必要とされる優先病原体の「緊急」カテゴリーにＣ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）を列挙している。特に、さらなる治療を必要とせずにマイクロバイオームが再発に抵抗するための環境も提供するＣＤＩ治療が必要とされている。マイクロバイオームの健康を促進するＣＤＩ治療も必要とされている。
【発明の概要】
【0015】
本発明は、Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染を治療すると同時に、対象のＣ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染の再発の可能性を低減するか、または対象のＣ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染の再発を予防する方法であって、Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染に罹患している対象に有効量のイベザポルスタットを投与することを含み、有効量のイベザポルスタットの投与が、Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染を治療すると同時に、９０日以内のＣ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染の可能性を低減するか、または９０日以内のＣ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染の再発を予防する方法を提供する。イベザポルスタットの投与は、Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染の臨床的治癒が達成されるまで継続され得るか、またはＣ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染の臨床的治癒が達成された際に終了され得る。有効量のイベザポルスタットの投与は、３０日以内のＣ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染の可能性を低減し得るか、または３０日以内のＣ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染の再発を予防する。
【0016】
本発明はまた、Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染に罹患している対象においてアクチノバクテリア（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）の増殖を促進する方法であって、上記Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染を治療または予防するために有効量のイベザポルスタットを投与することを含み、対象の腸内マイクロバイオーム内のアクチノバクテリア（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）の量が増加するか、またはプロテオバクテリア（Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）と比較してアクチノバクテリア（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）の割合が増加する方法を提供する。イベザポルスタットの投与は、Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染の臨床的治癒が達成されるまで継続され得るか、またはＣ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染の臨床的治癒が達成された際に終了され得る。
【0017】
本発明は、腸内マイクロバイオームの健康を改善する方法であって、Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染に罹患している対象に有効量のイベザポルスタットを投与することを含み、対象の腸内マイクロバイオーム内の細菌の門の割合が、イベザポルスタットの投与前の対象の腸内マイクロバイオームよりも健康なバランスに調整される方法をさらに提供する。
【0018】
本発明は、腸内マイクロバイオーム内のアクチノバクテリア（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）の量を増加させる方法であって、それを必要とする対象に有効量のイベザポルスタットを投与することを含み、アクチノバクテリア（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）の量が、イベザポルスタットの投与前の腸内マイクロバイオーム内のアクチノバクテリア（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）の量よりも、腸内マイクロバイオーム内で多い方法をさらに提供する。
【0019】
本発明は、腸内マイクロバイオームの健康を改善する方法であって、それを必要とする対象に有効量のイベザポルスタットを投与することを含み、対象の腸内マイクロバイオーム内の細菌の門の割合が、イベザポルスタットの投与前の対象の腸内マイクロバイオームよりも健康なバランスに調整される方法をさらに提供する。
【図面の簡単な説明】
【0020】
【図1】Ｓｈａｎｎｏｎ’ｓ ｉｎｄｅｘを使用して決定した場合に、マイクロバイオーム内の種のアルファ多様性が、イベザポルスタット（ＡＣＸ３６２Ｅ）の投与時に顕著に低下しなかったことを示す。対照的に、細菌種の多様性は、１２５ｍｇのバンコマイシンの投与時に低下した。プラセボと標識された対象は、イベザポルスタットまたはバンコマイシンが投与されなかった健康な腸を有する対象である。各ボックスは、１０日間にわたる試験薬、または１３日間の試験期間でプラセボを投与された患者１例を表す。
【図2】３００ｍｇおよび４５０ｍｇのイベザポルスタットの投与ならびに１２５ｍｇのバンコマイシンから生じる、マイクロバイオームプロファイルに対する効果を示す。ＰＣｏＡ Ｂｒａｙ Ｃｕｒｔｉｓ Ｐｌｏｔを介してデータを提供する。図に見られるように、バンコマイシンと比較して異なるイベザポルスタットマイクロバイオームプロファイルが１０日間の投与後に同定された。
【図3】１２５ｍｇのバンコマイシン、３００ｍｇのイベザポルスタットおよび４５０ｍｇのイベザポルスタットの投与時の細菌門ごとのマイクロバイオームの組成を示す。プラセボと標識された対象は、イベザポルスタットまたはバンコマイシンが投与されなかった健康な腸を有する対象である。各ボックスは、１０日間にわたる試験薬、または１３日間の試験期間でプラセボを投与された患者１例を表す
【図4A】イベザポルスタットおよびバンコマイシンが投与された対象における１０日目と対比した０日目からのマイクロバイオーム変化の線形効果サイズアルゴリズム（ＬＥｆＳｅ）要約を示す。陰影は、ベースラインと比較して１０日目の細菌存在量の増加または減少を表す。
【図4B】イベザポルスタットおよびバンコマイシンが投与された対象における１０日目と対比した０日目からのマイクロバイオーム変化の線形効果サイズアルゴリズム（ＬＥｆＳｅ）要約を示す。陰影は、ベースラインと比較して１０日目の細菌存在量の増加または減少を表す。
【図6】Ｓｈａｎｎｏｎ’ｓ Ｅｎｔｒｏｐｙ（６Ａ）またはＳｉｍｐｓｏｎ’ｓ Ｉｎｄｅｘ（６Ｂ）によって測定した治療群ごとの経時的なアルファ多様性、およびベースライン（６Ｃ）で、または少なくとも５日間の治療（６Ｄ）後に測定したベータ多様性の要約的推定値を示す。
【図7】一次胆汁酸（７Ａ）および二次胆汁酸（７Ｂ）ならびに一次胆汁酸：二次胆汁酸（７Ｃ）の比の経時的な要約的変化を示す。値は、平均±標準誤差を表す。
【図8】ベースライン、治療の中間点、および治療終了時のＩＢＺ治療対象およびＶＡＮ治療対象から得られた胆汁酸濃度を示す。
【図9】イベザポルスタットの投与後の臨床的治癒および持続的臨床的治癒を示すイベザポルスタット試験結果を示す。
【図10】ＧＩ感染に対するイベザポルスタットＰＫ特性を示す。図に示すように、イベザポルスタットは、ＧＩ感染に対して理想的なＰＫ特性を有する。
【図11】ＣＣＦＡプレート上にプレーティングする前にタウロコラートによる４８時間の富化工程を受けたイベザポルスタットによって処理した試料を示す。
【図12A】Ｓｈａｎｎｏｎ Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｉｎｄｅｘによって測定したイベザポルスタットの投与後の経時的なアルファ多様性の要約的推定値を示す。図に示すように、イベザポルスタットではアルファ多様性が改善された。
【図12B】Ｉｎｖｅｒｓｅ Ｓｉｍｐｓｏｎ Ｉｎｄｅｘによって測定した、イベザポルスタットの投与後の経時的なアルファ多様性の要約的推定値を示す。図に示すように、イベザポルスタットではアルファ多様性が改善された。
【図13A】平均比例門存在量対抗生物質治療の日数を比較するチャートを示す。図に示すように、イベザポルスタット療法ではファーミキューテス（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）の割合の増加が観察され、ファーミキューテス（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）の最も一般的な増加した分類群はクロストリジアーレス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌｅｓ）である。
【図13B】平均比例綱存在量対抗生物質治療の日数を比較するチャートを示す。図に示すように、イベザポルスタット療法ではファーミキューテス（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）の割合の増加が観察され、ファーミキューテス（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）の最も一般的な増加した分類群はクロストリジアーレス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌｅｓ）である。
【図13C】平均比例目存在量対抗生物質治療の日数を比較するチャートを示す。図に示すように、イベザポルスタット療法ではファーミキューテス（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）の割合の増加が観察され、ファーミキューテス（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）の最も一般的な増加した分類群はクロストリジアーレス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌｅｓ）である。
【図13D】平均比例科存在量対抗生物質治療の日数を比較するチャートを示す。図に示すように、イベザポルスタット療法ではファーミキューテス（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）の割合の増加が観察され、ファーミキューテス（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）の最も一般的な増加した分類群はクロストリジアーレス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌｅｓ）である。
【図14A】一次胆汁酸に対するイベザポルスタットの効果による経時的な変化の要約を示す。
【図14B】二次胆汁酸に対するイベザポルスタットの効果による経時的な変化の要約を示す。
【図14C】二次胆汁酸対一次胆汁酸比を示す。値は、平均±標準誤差を表す。
【図15A】門ごとの分類群の相対存在量の対象特異的変化を示すチャートである。チャートは、４０日目までの追跡期間を伴う、イベザポルスタットを１０日間投与された患者１例を表す。
【図15B】綱ごとの分類群の相対存在量の対象特異的変化を示すチャートである。チャートは、４０日目までの追跡期間を伴う、イベザポルスタットを１０日間投与された患者１例を表す。
【図15C】目ごとの分類群の相対存在量の対象特異的変化を示すチャートである。チャートは、４０日目までの追跡期間を伴う、イベザポルスタットを１０日間投与された患者１例を表す。
【図15D】科ごとの分類群の相対存在量の対象特異的変化を示すチャートである。チャートは、４０日目までの追跡期間を伴う、イベザポルスタットを１０日間投与された患者１例を表す。
【発明を実施するための形態】
【0021】
腸内マイクロバイオームの健康を増大させるためにイベザポルスタットを使用する方法が本明細書に記載される。本発明は、Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染を治療すると同時に、Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染の再発の可能性を低減するか、またはＣ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染の再発を予防する方法を提供する。本発明はまた、腸内のアクチノバクテリア（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）の数を増加させること、および／またはマイクロバイオーム内の細菌の他の門と比較してアクチノバクテリア（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）の割合を増加させることによって、腸内マイクロバイオームの健康を増大させる方法を提供する。
【0022】
「Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染」または「ＣＤＩ」とは、Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）による宿主動物、例えば、哺乳動物の侵入を意味する。例えば、感染には、哺乳動物の体内もしくは体上に通常存在するＣ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）の過剰増殖、または哺乳動物の体内もしくは体上に通常存在しないＣ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）の増殖が含まれ得る。さらに一般的には、Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染は、Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）、またはＣ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）によって放出された毒素の存在が宿主動物に損傷を与えている任意の状況であり得る。動物は、過剰量のＣ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）が動物の体内もしくは体上に存在する場合、またはＣ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素の存在が動物の腸細胞もしくは他の組織に損傷を与えている場合、Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染に「罹患している」。一実施形態では、Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）の特定の属または種の数は、健康なマイクロバイオーム内に見られる数よりも少なくとも２、４、６または８ｌｏｇ高い。あるいは、Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）の数は、健康なマイクロバイオームと同じであり得るが、毒素を産生している。Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染の存在は、ＰＣＲ法を使用して、または毒素タンパク質を検出することができるＥＬＩＳＡアッセイを使用して、便内の毒素の存在によって、通常、毒素Ｂを産生する遺伝子を試験することによって特性評価され得る。
【0023】
「有効量」とは、有益なまたは所望の臨床的結果または生化学的結果をもたらすのに十分な量を意味する。有効量は、１回以上投与することができる。本発明の目的のために、有効量は、感染部位または潜在的な感染部位に投与された場合にＣ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染を治療または予防すると同時に、マイクロバイオーム内のアクチノバクテリア（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）および／またはファーミキューテス（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）の量および／または割合を増加させる、イベザポルスタットの量である。
【0024】
「投与」または「投与する」とは、１つ以上の単位用量のイベザポルスタットを動物、例えば、哺乳動物に与える方法（例えば、局所投与、経口投与、静脈内投与、腹腔内投与または筋肉内投与）を意味する。投与方法は、様々な要因、例えば、医薬組成物の成分、潜在的な感染部位または実際の感染部位、および実際の微生物感染の重症度に応じて異なり得る。
【0025】
「阻害する」とは、Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）細菌の細胞増殖速度を少なくとも８０％低下させることを意味する。特定の実施形態では、増殖は、９０％、９５％またはさらには９９％以上阻害され得る。阻害の程度は、例えば、インビトロ増殖アッセイによって、例えば、標準的な液体培養技術によって確認され得る。好適なＭＩＣ（最小阻害濃度）、例えば、＜１００μｇ／ｍｌ、さらに好ましくは＜１０μｇ／ｍｌでのコロニー形成の阻害が好ましい。
【0026】
「治療」とは、有益なまたは所望の臨床結果を得るための手法を意味する。本発明の目的のために、有益なまたは所望の臨床結果には、限定するものではないが、検出可能または検出不能を問わず、症状の緩和、疾患の程度の軽減、疾患の状態の安定化（すなわち悪化しない）、疾患の進行の遅延、疾患状態の改善または緩和、および寛解（部分的または全体的を問わず）が含まれる。「治療」は、治療的処置および予防的措置（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ ｍｅａｓｕｒｅ）または予防的措置（ｐｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅ ｍｅａｓｕｒｅ）の両方を指す。治療を必要とする者には、既に障害を有する者、ならびに障害を予防すべきおよび／または再発を予防すべき者が含まれる。疾患を「緩和する」とは、疾患状態の程度および／もしくは望ましくない臨床症状が軽減されること、ならびに／または進行の時間経過が、治療を行わない状況と比較して遅くなるかもしくは長くなることを意味する。
【0027】
「マイクロバイオーム」とは、特定の環境（身体、または身体の一部を含む）内の微生物を意味する。好ましくは、マイクロバイオームは腸内に位置する。
【0028】
「健康なマイクロバイオーム」は、理想化された（おそらく健康に関連する）組成物による、または望ましい機能的プロファイル（宿主への代謝的供給および栄養供給を含む）による生態学的安定性（すなわち、ストレス下での群落構造の変化に抵抗する能力、またはストレス関連の変化後にベースラインに迅速に戻る能力）に関して記載され得る。健康な成人のマイクロバイオームはまた、ファーミキュート（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅ）門またはバクテロイデテス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ）門の細菌種の大部分、ならびにアクチノバクテリア（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）門およびプロテオバクテリア（Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）門の少数を特徴とし得る。健康な新生児のマイクロバイオームは、バクテロイデテス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ）門およびアクチノバクテリア（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）門の細菌種の大部分を特徴とし得る。
【0029】
「腸内マイクロバイオームの健康を改善する」とは、マイクロバイオームの組成の大部分の割合がアクチノバクテリア（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）門、ファーミキュート（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅ）門またはバクテロイデテス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ）門由来の細菌種にされ、プロテオバクテリア（Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）門は少数であることを意味する。あるいは、腸内マイクロバイオームの健康を改善するとは、健康な新生児の腸内マイクロバイオームに存在するように、アクチノバクテリア（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）門の細菌種の割合を増加させることを意味し得る。対象は、Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染に罹患していてもよいか、またはＣ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染に罹患していなくてもよい。
【0030】
「Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染の可能性を低減する」とは、イベザポルスタットを投与することによって、イベザポルスタットを投与していない対象または患者集団と比較して、対象または患者集団がＣ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染を発症する可能性または割合が低下する（例えば、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％）予防的治療または治療を意味する。
【0031】
「臨床的治癒」とは、初期感染が解消されたことを意味する。これは、好ましくは、対象が治療を受けた後、診断の約１０～１２日後に測定される。
【0032】
「持続的臨床的治癒」とは、対象が臨床的治癒を有し、感染が再発しなかったことを意味する。これは、診断後３０～９０日目に測定される。
【0033】
「再発」とは、対象が臨床的治癒を有し、感染が３０～９０日以内に再び起こったことを意味する。
【0034】
健康な腸のマイクロバイオームは、門と呼ばれる主要な細菌群から構成される。ファーミキューテス（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）（グラム陽性胞子形成生物）およびバクテロイデテス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ）（グラム陰性非胞子形成生物）は、最も一般的であり、健康な成人の腸内マイクロバイオームの９０％超を一般に構成する。成人の腸内マイクロバイオームはまた、アクチノバクテリア（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）、フソバクテリア（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉａ）、ベルコミクロビア（Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａ）およびプロテオバクテリア（Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）を含有する。アクチノバクテリア（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）は、小児では大きな割合で存在し、年齢とともに全体的な割合が一般に低下する（ファーミキューテス（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）およびアクチノバクテリア（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）に置き換えられる）。プロテオバクテリア（Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）（グラム陰性通性嫌気性菌）は、健康なマイクロバイオームの２～５％を一般に構成する。マイクロバイオームの組成がその正常な多様性から変化すると、正常な生理学的機能が破壊される（ディスバイオシスと呼ばれる）。Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染に罹患している患者は、ディスバイオシスの状態にある。Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染を有する対象に関連するディスバイオシスには、プロテオバクテリア（Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）の割合の増加（多くの場合「異常発生」と呼ばれる）、ならびにファーミキューテス（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）およびバクテロイデテス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ）の数の減少が含まれる。
【0035】
イベザポルスタットは、２－（（３，４－ジクロロベンジル）アミノ）－７－（２－モルホリノエチル）－１，７－ジヒドロ－６Ｈ－プリン－６－オンである。１，７－ジヒドロ－６Ｈ－プリン－６－オン化合物の合成手順、および細菌増殖の阻害におけるそれらの使用は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，９２６，７６３号および米国特許第８，７９６，２９２号に開示されている。イベザポルスタットは、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩＣ阻害剤である。イベザポルスタットは、Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染の治療に有用な抗菌活性の抗グラム陽性スペクトルを有する。イベザポルスタットの作用機序は、Ｇ＋Ｃ含有量が低い（ＧおよびＣ ＤＮＡ塩基がＡおよびＴ塩基よりも少ない）グラム陽性菌、主にＣ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）を含むファーミキューテス（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）を標的とする。ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩＣ酵素は、Ｇ＋Ｃ含有量が低いグラム陽性菌の複製に必須であるため、Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）などのファーミキューテス（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）に対して選択的であるが、アクチノバクテリア（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）またはバクテロイデテス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ）などの他の宿主微生物叢に対しては不活性である。
【0036】
イベザポルスタットの投与は、Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染について現在推奨されている治療であるバンコマイシンの投与と比較して、明らかに異なるマイクロバイオームプロファイルをもたらす。例えば、バンコマイシン治療対象では望ましくないプロテオバクテリア（Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）の数および割合が増大しているのと比較して、イベザポルスタット治療対象では、望ましいアクチノバクテリア（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）門およびファーミキュート（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅ）門の割合が増大していることが認められた。プロテオバクテリア（Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）過剰増殖は、ＭＤＲグラム陰性生物による全身感染のリスクの顕著な増加に関連する。したがって、イベザポルスタットは、バンコマイシンとは対照的に望ましいアクチノバクテリア（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）およびファーミキューテス（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）の集団に害を及ぼさないだけでなく、イベザポルスタットは、マイクロバイオームに存在するアクチノバクテリア（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）およびファーミキューテス（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）の数および／または割合を予想外に増加させる。図３および図４を参照されたい。アクチノバクテリア（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）およびファーミキューテス（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）などの健康な細菌の増殖を促進し、プロテオバクテリア（Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）の増加を引き起こさないことによって、イベザポルスタットはまた、Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染の再発の可能性を予防または低減するマイクロバイオームを提供する。
【0037】
イベザポルスタットは、インビボまたはインビトロでの投与に適した生物学的に適合性の形態でヒトまたは動物対象に投与するための医薬組成物に製剤化され得る。したがって、本発明は、賦形剤と混合した、本発明の化合物を含む医薬組成物を提供する。
【0038】
本発明は、Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染に罹患している対象に有効量のイベザポルスタットを投与することによって、Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染を治療すると同時に、対象のＣ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染の再発の可能性を低減するか、または対象のＣ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染の再発を予防する方法を提供する。有効量のイベザポルスタットの投与は、Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染を治療すると同時に、３０～９０日以内のＣ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染の可能性を低減するか、または３０～９０日以内のＣ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染の再発を予防する。好ましくは、イベザポルスタットの投与は、Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染が臨床的に治癒するまで継続されてもよい。好ましくは、イベザポルスタットの投与は、臨床的治癒が達成されると終了され得る。
【0039】
本発明は、Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染に罹患している対象においてアクチノバクテリア（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）の増殖を促進する方法であって、Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染を治療または予防するために有効量のイベザポルスタットを投与することを含む方法をさらに提供する。対象の腸内マイクロバイオーム内のアクチノバクテリア（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）の量が増加するか、またはアクチノバクテリア（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）の割合が増加する。イベザポルスタットの投与は、Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染の臨床的治癒が達成されるまで継続される。好ましくは、イベザポルスタットの投与は、Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）の臨床的治癒が達成された際に終了される。イベザポルスタットの投与後のアクチノバクテリア（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）の割合は、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％増加し得る。
【0040】
本発明は、腸内マイクロバイオームの健康を改善する方法であって、Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染に罹患している対象に有効量のイベザポルスタットを投与することを含む方法をさらに提供する。対象の腸内マイクロバイオーム内の細菌の門の割合は、イベザポルスタットの投与前の対象の腸内マイクロバイオームよりも健康なバランスに調整される。例えば、アクチノバクテリア（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）の割合は、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％増加し得る。
【0041】
本発明はまた、腸内マイクロバイオーム内のアクチノバクテリア（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）の量を増加させる方法であって、それを必要とする対象に有効量のイベザポルスタットを投与することを含み、アクチノバクテリア（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）の量が、イベザポルスタットの投与前の腸内マイクロバイオーム内のアクチノバクテリア（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）の量よりも、腸内マイクロバイオーム内で多い方法を提供する。対象は、Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染に罹患している必要はない。本発明はまた、腸内マイクロバイオームの健康を改善する方法であって、それを必要とする対象に有効量のイベザポルスタットを投与することを含み、対象の腸内マイクロバイオーム内の細菌の門の割合が、イベザポルスタットの投与前の人の腸内マイクロバイオームよりも健康なバランスに調整される方法を提供する。対象は、Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染に罹患している必要はない。
【0042】
図１に示すように、マイクロバイオーム内の細菌種のアルファ多様性は、イベザポルスタットの投与時に顕著に低下しなかった。対照的に、細菌種の多様性は、バンコマイシンの投与時に低下した。プラセボと標識された対象は、イベザポルスタットまたはバンコマイシンが投与されなかった健康な腸を有する対象である。プラセボと比較した場合、イベザポルスタットの投与は、マイクロバイオームの多様性を顕著に低下させなかった。細菌多様性の低下は、Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染の再発が経時的に予測されることから望ましくない。図２に示すように、３００ｍｇおよび４５０ｍｇのイベザポルスタットの投与から生じるマイクロバイオームプロファイルは、１０日間にわたる１２５ｍｇのバンコマイシンから生じるマイクロバイオームプロファイルとは異なっていた。
【0043】
図３に示すように、バンコマイシンを投与すると、プロテオバクテリア（Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）が増加し、これにより、マイクロバイオームの健康およびバランスが低下し、Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染の再発の可能性が増加する。対照的に、３００ｍｇのイベザポルスタットを投与すると、他の細菌門と比較して、マイクロバイオーム内のアクチノバクテリア（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）が増加した。４５０ｍｇのイベザポルスタットを投与しても、他の細菌門と比較して、アクチノバクテリア（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）が増加した。いずれの用量でのイベザポルスタットの投与も、バンコマイシンの投与時に見られるプロテオバクテリア（Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）の増加をもたらさなかった。
【0044】
小児は、生後すぐに、様々な細菌種への曝露によって腸内マイクロバイオームを発達させ始める。乳児期初期に、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）および連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）などの通性嫌気性種は、乳児の腸に定着し、生後数日以内に嫌気性環境をもたらし、バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）（バクテロイデテス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ）門）およびビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）（アクチノバクテリア（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）門）などの厳密な嫌気性菌が増殖することを可能にする。また、健康な新生児および乳児の約６０％～７０％には、Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）が定着しており、ＣＤＩに罹患している症候性成人と同程度に高い定着数を有することが多い。これらの乳児は、この定着からいかなる症状も典型的に経験しない。本発明の方法は、多量のアクチノバクテリア（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）を含む健康な早期乳児腸内マイクロバイオームによく似た腸内マイクロバイオームをもたらす。アクチノバクテリア（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）門の細菌群であるビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）は、Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）株の増殖を阻害する。したがって、本発明による方法は、ＣＤＩの再発の可能性を予防または低減する腸内マイクロバイオームをもたらす。
【0045】
イベザポルスタットは、理想的な抗Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）抗生物質の以下の３つの重要な基準を満たす。イベザポルスタットは、最小限の全身吸収によって高い結腸濃度を達成する。イベザポルスタットは、Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）に対して強力な活性を有するが、経口バンコマイシンとは対照的に、腸内マイクロバイオームの破壊は最小限である。イベザポルスタットは、腸内胆汁酸代謝に対して潜在的に有益な効果を示す。
【0046】
本発明の方法によれば、イベザポルスタットは、当業者によって理解されるように、選択された投与経路に応じて様々な形態で対象または患者に投与され得る。ヒトまたは動物の使用のために、イベザポルスタットは、経口、頬側、直腸および膣経路によって、または局所投与によって投与され、それに応じて製剤化された医薬組成物である。好ましくは、イベザポルスタットは、経口剤形で投与される。限定するものではないが、経口投与の場合、組成物は、例えば、錠剤、カプセル、顆粒、液体溶液および懸濁剤の形態であり得る。組成物はまた、坐剤または浣腸によって投与され得る。
【0047】
イベザポルスタットは、上記のように、単独で、または薬学的に許容される賦形剤と組み合わせて、動物、好ましくはヒトに投与され得、その割合は、化合物の溶解性および化学的性質、選択された投与経路、ならびに標準的な製薬慣行によって決定される。イベザポルスタットは、成人または小児に投与され得る。本発明の化合物および／または本発明の化合物を含む組成物の投与量は、多くの要因、例えば、投与様式；レシピエントの年齢、健康状態および体重；症状の性質および程度；治療の頻度、およびもしあれば併用治療の種類；ならびに治療される動物における化合物のクリアランス速度に応じて変動し得る。当業者であれば、上記の要因に基づいて適切な投与量を決定することができる。本発明の化合物は、臨床応答に応じて必要に応じて調整され得る好適な投与量で最初に投与され得る。一般に、本発明の化合物は、約０．１～１０％ｗ／ｖの化合物を含有する生理学的緩衝水溶液中で、または錠剤もしくはカプセルなどの固体剤形で提供され得る。一般的な用量範囲は、１日当たり約０．０１ｍｇ／ｋｇ体重～約１ｇ／ｋｇ体重である。イベザポルスタットの経口投与量は、約１０ｍｇ～１０００ｍｇ／日、好ましくは１００ｍｇ～９００ｍｇ／日、さらに好ましくは約１５０、３００、６００または９００ｍｇ／日の量を含み得る。
【0048】
例
前述の説明および例は、本発明を例示するために単に記載されており、限定することを意図するものではない。本発明の趣旨および実体を組み込んだ記載される実施形態の改変が当業者に想起され得るため、本発明は、特許請求の範囲およびその均等物の範囲内のすべての変形例を含むように広く解釈されるべきである。
前述の説明および例は、本発明を例示するために単に記載されており、限定することを意図するものではない。本発明の趣旨および実体を組み込んだ記載される実施形態の改変が当業者に想起され得るため、本発明は、特許請求の範囲およびその均等物の範囲内のすべての変形例を含むように広く解釈されるべきである。
【0049】
例１：
第Ｉ相健常ボランティア試験のためのマイクロバイオーム試験：
背景：健康な腸のマイクロバイオームは、門と呼ばれる２つの主要な細菌群から構成される。ファーミキューテス（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）（グラム陽性胞子形成生物）およびバクテロイデテス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ）（グラム陰性非胞子形成生物）が最も一般的である。第３の門であるプロテオバクテリア（Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）（グラム陰性通性嫌気性菌）は、低存在量で存在するが、健康なマイクロバイオームの２～５％を一般に構成する。第４の門であるアクチノバクテリア（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）は、小児では大きな割合で存在し、年齢とともに全体的な割合が一般に低下する（ファーミキューテス（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）およびアクチノバクテリア（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）に置き換えられる）。Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染に罹患している患者は、ディスバイオシスの状態にあり、そのような患者では、多くの場合、プロテオバクテリア（Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）の割合が増加しており、例えば、プロテオバクテリア（Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）が過剰であるか、または「プロテオバクテリア（Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）異常発生」であり、ファーミキューテス（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）およびバクテロイデテス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ）の数が減少している。
第Ｉ相健常ボランティア試験のためのマイクロバイオーム試験：
背景：健康な腸のマイクロバイオームは、門と呼ばれる２つの主要な細菌群から構成される。ファーミキューテス（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）（グラム陽性胞子形成生物）およびバクテロイデテス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ）（グラム陰性非胞子形成生物）が最も一般的である。第３の門であるプロテオバクテリア（Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）（グラム陰性通性嫌気性菌）は、低存在量で存在するが、健康なマイクロバイオームの２～５％を一般に構成する。第４の門であるアクチノバクテリア（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）は、小児では大きな割合で存在し、年齢とともに全体的な割合が一般に低下する（ファーミキューテス（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）およびアクチノバクテリア（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）に置き換えられる）。Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染に罹患している患者は、ディスバイオシスの状態にあり、そのような患者では、多くの場合、プロテオバクテリア（Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）の割合が増加しており、例えば、プロテオバクテリア（Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）が過剰であるか、または「プロテオバクテリア（Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）異常発生」であり、ファーミキューテス（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）およびバクテロイデテス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ）の数が減少している。
【0050】
イベザポルスタット試験：第Ｉ相健常ボランティア試験およびショットガンメタゲノムシーケンシングから得られた便試料を使用して、１０日間にわたるイベザポルスタットによる治療が、バンコマイシンを投与されている対象と比較して、対象に顕著に異なるマイクロバイオームプロファイルをもたらすことが実証された。その差は、バンコマイシン処置治療ではプロテオバクテリア（Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）の割合が増大しているのに対比して、イベザポルスタット治療対象ではアクチノバクテリア（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）門およびファーミキュート（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅ）門の割合が増大していたことであった。
【0051】
方法および材料
材料：一次胆汁酸コラート（ＣＡ）およびケノデオキシコラート（ＣＤＣＡ）、抱合一次胆汁酸グリココラート（ＧＣＡ）、タウロコラート（ＴＣＡ）、グリコケノデオキシコラート（ＧＣＤＣＡ）およびタウロケノデオキシコラート（ＴＣＤＣＡ）、二次胆汁酸リトコラート（ＬＣＡ）、デオキシコラート（ＤＣＡ）、ウルソデオキシコラート（ＵＤＣＡ）およびヒオデオキシコラート（ＨＤＣＡ）、ならびに抱合二次胆汁酸グリコリトコラート（ＧＬＣＡ）、タウロリトコラート（ＴＬＣＡ）、グリコデオキシコラート（ＧＤＣＡ）およびタウロデオキシコラート（ＴＤＣＡ）の標準は、Ｓｉｇｍａから購入した。
材料：一次胆汁酸コラート（ＣＡ）およびケノデオキシコラート（ＣＤＣＡ）、抱合一次胆汁酸グリココラート（ＧＣＡ）、タウロコラート（ＴＣＡ）、グリコケノデオキシコラート（ＧＣＤＣＡ）およびタウロケノデオキシコラート（ＴＣＤＣＡ）、二次胆汁酸リトコラート（ＬＣＡ）、デオキシコラート（ＤＣＡ）、ウルソデオキシコラート（ＵＤＣＡ）およびヒオデオキシコラート（ＨＤＣＡ）、ならびに抱合二次胆汁酸グリコリトコラート（ＧＬＣＡ）、タウロリトコラート（ＴＬＣＡ）、グリコデオキシコラート（ＧＤＣＡ）およびタウロデオキシコラート（ＴＤＣＡ）の標準は、Ｓｉｇｍａから購入した。
【0052】
臨床試験の説明：３０±８歳の対象２２例（女性：３３％）を登録した。各々患者６例にバンコマイシン、イベザポルスタット３００ｍｇまたはイベザポルスタット４５０ｍｇのいずれかを投与し、さらに４例にプラセボを投与した。記載されるように、１日４回１２５ｍｇが投与されるバンコマイシン比較アームおよびプラセボを用いた、漸増用量のイベザポルスタット（３００または４５０ｍｇを１日２回投与）の近年の第Ｉ相健常ボランティア試験の一部として、便試料を連日採取した。（Ｇａｒｅｙ ＫＷ，ｅｔ ａｌ．Ａ ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ，ｄｏｕｂｌｅ－ｂｌｉｎｄ，ｐｌａｃｅｂｏ－ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ，ｓｉｎｇｌｅ ａｎｄ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ａｓｃｅｎｄｉｎｇ ｄｏｓｅ Ｐｈａｓｅ １ ｓｔｕｄｙ ｔｏ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ ｔｈｅ ｓａｆｅｔｙ，ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ ｆｏｏｄ ａｎｄ ｆａｅｃａｌ ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｉｂｅｚａｐｏｌｓｔａｔ ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ ｏｒａｌｌｙ ｔｏ ｈｅａｌｔｈｙ ｓｕｂｊｅｃｔｓ．Ｊ Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ ２０２０；７５（１２）：３６３５－３６４３．ＤＯＩ：１０．１０９３／ｊａｃ／ｄｋａａ３６４．）施設内審査委員会の承認を得（Ｍｉｄｌａｎｄｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ｂｏａｒｄ ＩＲＢ ＃２２２２２０１７０３８３）、全ボランティアが、試験手順を行う前にインフォームドコンセント用紙に署名した。この分析では、イベザポルスタット３００もしくは４５０ｍｇを１日２回、バンコマイシン１２５ｍｇを１日４回、またはプラセボを１０日間投与された対象から、入手可能であれば、０（ベースライン）から１３日目、および３０日目の追跡期間のために便試料を連日採取した。便試料を－８０°Ｃで直ちに凍結した後、分析のためにドライアイスを用いてＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｈｏｕｓｔｏｎに輸送した。
【0053】
便ＤＮＡ抽出およびショットガンメタゲノムシーケンシング：以前に記載されているように、ＱｉａＣｕｂｅ自動ＤＮＡ抽出システムでＤＮＡｅａｓｙ Ｐｏｗｅｒ Ｓｏｉｌ Ｐｒｏ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号１２８８－１００）を使用して便ＤＮＡを抽出した。（Ｇａｒｅｙ ＫＷ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ ２０２０；７５（１２）：３６３５－３６４３．ＤＯＩ：１０．１０９３／ｊａｃ／ｄｋａａ３６４．）ＤＮＡライブラリー調製のためのＮｅｘｔｅｒａ ＤＮＡ Ｆｌｅｘ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔと、シーケンシングのためのＩｌｌｕｍｉｎａ ＮｅｘｔＳｅｑ ５００プラットフォームとを使用して、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｈｏｕｓｔｏｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｎｄ Ｇｅｎｅ Ｅｄｉｔｉｎｇ Ｃｏｒｅ（Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ ＵＳＡ）でショットガンメタゲノムシーケンシングを行った。ＣＬＣ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈバージョン１２（Ｑｉａｇｅｎ）をメタゲノムアセンブリと、存在量表の作成とに使用した。
【0054】
便試料からの胆汁酸の抽出：便試料を分注および秤量し（約１０～約１５０ｍｇの範囲）、各アリコートをボルテックスおよび超音波処理によって内部標準（ＬＣＡ－ｄ５およびＣＡ－ｄ５、２００μｇ／Ｌ）を含有する１００％メタノール１ｍｌと十分に混合した。混合物を４°Ｃで一晩置き、１０，０００ｇで３分間遠心分離し、上清を新しいチューブに移し、純水によって１０倍に希釈した。続いて、希釈した上清を、予めコンディショニングしたＳｅｐ－Ｐａｋ Ｃ１８ Ｃｌａｓｓｉｃ ＣａｒｔｒｉｄｇｅまたはＷａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐ Ｏａｓｉｓ ＨＬＢ ９６－ｗｅｌｌ Ｐｌａｔｅ（Ｗａｔｅｒｓ，ＵＳＡ）にアプライした。５％メタノールによって洗浄した後、胆汁酸画分を１００％メタノールによって溶出した。溶出液を窒素下で乾燥させ、２ｍｌのメタノール／水（１：１、ｖｏｌ／ｖｏｌ）に再懸濁し、その後の分析まで－２０°Ｃで保存した。
【0055】
胆汁酸分析：以前に記載された方法から適合されたＱＴＲＡＰ ５５００質量分析計（Ｓｃｉｅｘ，Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）を用いて行われた標的化液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ－ＭＳ）を使用して、胆汁酸を定量した。（Ｓｃｈｅｒｅｒ Ｍ，ｅｔ ａｌ．Ｒａｐｉｄ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｉｌｅ ａｃｉｄｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｉｎ ｓｅｒｕｍ ｂｙ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ－ｔａｎｄｅｍ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ．Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ Ｂ Ａｎａｌｙｔ Ｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｍｅｄ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ ２００９；８７７（３０）：３９２０－５．ＤＯＩ：１０．１０１６／ｊ．ｊｃｈｒｏｍｂ．２００９．０９．０３８．）要約すると、Ｃ１８カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ，Ｔｏｒｒａｎｃｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて、２つの移動相（溶媒Ａ：１０ｍＭ酢酸アンモニウムおよび０．１％（ｗｔ／ｖｏｌ）水酸化アンモニウム（ｐＨ９）を含むメタノール－水（１：１、ｖｏｌ／ｖｏｌ）；溶媒Ｂ：１０ｍＭ酢酸アンモニウムおよび０．１％（ｗｔ／ｖｏｌ）水酸化アンモニウム（ｐＨ９））を含むメタノールを使用する勾配法により、同様の質量および化学構造の胆汁酸間のクロマトグラフィー分離を行った。胆汁酸の非標識標準および安定同位体標識標準を使用して作成した標準曲線から、各タイプの胆汁酸の定量を計算した。対応する試料重量によって胆汁酸濃度を正規化した。
【0056】
統計分析
Ｒソフトウェアを使用して、細菌分類群およびアルファ多様性の対象特異的変化および要約的変化を生成した。線形回帰モデルを構築して、全試料の少なくとも５パーセントに存在する分類群に対して正規化する、バンコマイシンまたはイベザポルスタットが投与された対象について、経時的な門、綱、目および科レベルでの比例的な分類群差を評価した。また、線形回帰モデルを構築して、バンコマイシンまたはイベザポルスタットが投与された対象について、経時的なアルファ多様性尺度（Ｓｈａｎｎｏｎ、ＳｉｍｐｓｏｎおよびＰｉｅｌｏｕｓ）の連日の変化を評価した。線形効果サイズ（ＬＥｆＳｅ）アルゴリズムを使用して、ベースラインと１０日目の試料との間の微生物叢組成の有意差を可視化および同定した。（Ｓｅｇａｔａ Ｎ，ｅｔ ａｌ．Ｍｅｔａｇｅｎｏｍｉｃ ｂｉｏｍａｒｋｅｒ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ａｎｄ ｅｘｐｌａｎａｔｉｏｎ．Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ ２０１１；１２（６）：Ｒ６０．ＤＯＩ：１０．１１８６／ｇｂ－２０１１－１２－６－ｒ６０．）線形回帰モデルを構築して、バンコマイシンまたはイベザポルスタットが投与された対象から得られた経時的な一次胆汁酸および二次胆汁酸の変化ならびに経時的な一次胆汁酸：二次胆汁酸の比を評価した。線形回帰モデルではいずれも、ベースライン値として、対象の年齢、体重および性別について制御したプラセボ結果を使用した。全統計分析に、ＳＡＳ Ｖｅｒｓ ９．４（Ｓａｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｃａｒｙ ＮＣ）またはＲを使用した。目的ごとの複数の分析を説明するために、誤検出率を制限すると特に明記しない限り、ｐ＜０．００５という低いｐ値を統計学的に有意であると考えた。（Ｋｏｒｔｈａｕｅｒ Ｋ，ｅｔ ａｌ．Ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ｇｕｉｄｅ ｔｏ ｍｅｔｈｏｄｓ ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ ｆａｌｓｅ ｄｉｓｃｏｖｅｒｉｅｓ ｉｎ ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ ２０１９；２０（１）：１１８．ＤＯＩ：１０．１１８６／ｓ１３０５９－０１９－１７１６－１．）
Ｒソフトウェアを使用して、細菌分類群およびアルファ多様性の対象特異的変化および要約的変化を生成した。線形回帰モデルを構築して、全試料の少なくとも５パーセントに存在する分類群に対して正規化する、バンコマイシンまたはイベザポルスタットが投与された対象について、経時的な門、綱、目および科レベルでの比例的な分類群差を評価した。また、線形回帰モデルを構築して、バンコマイシンまたはイベザポルスタットが投与された対象について、経時的なアルファ多様性尺度（Ｓｈａｎｎｏｎ、ＳｉｍｐｓｏｎおよびＰｉｅｌｏｕｓ）の連日の変化を評価した。線形効果サイズ（ＬＥｆＳｅ）アルゴリズムを使用して、ベースラインと１０日目の試料との間の微生物叢組成の有意差を可視化および同定した。（Ｓｅｇａｔａ Ｎ，ｅｔ ａｌ．Ｍｅｔａｇｅｎｏｍｉｃ ｂｉｏｍａｒｋｅｒ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ａｎｄ ｅｘｐｌａｎａｔｉｏｎ．Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ ２０１１；１２（６）：Ｒ６０．ＤＯＩ：１０．１１８６／ｇｂ－２０１１－１２－６－ｒ６０．）線形回帰モデルを構築して、バンコマイシンまたはイベザポルスタットが投与された対象から得られた経時的な一次胆汁酸および二次胆汁酸の変化ならびに経時的な一次胆汁酸：二次胆汁酸の比を評価した。線形回帰モデルではいずれも、ベースライン値として、対象の年齢、体重および性別について制御したプラセボ結果を使用した。全統計分析に、ＳＡＳ Ｖｅｒｓ ９．４（Ｓａｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｃａｒｙ ＮＣ）またはＲを使用した。目的ごとの複数の分析を説明するために、誤検出率を制限すると特に明記しない限り、ｐ＜０．００５という低いｐ値を統計学的に有意であると考えた。（Ｋｏｒｔｈａｕｅｒ Ｋ，ｅｔ ａｌ．Ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ｇｕｉｄｅ ｔｏ ｍｅｔｈｏｄｓ ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ ｆａｌｓｅ ｄｉｓｃｏｖｅｒｉｅｓ ｉｎ ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ ２０１９；２０（１）：１１８．ＤＯＩ：１０．１１８６／ｓ１３０５９－０１９－１７１６－１．）
【0057】
アルファ多様性およびベータ多様性
アルファ多様性およびベータ多様性：試料内の細菌種の多様性に関するアルファ多様性試験に対して、試料間の多様性の差に関するベータ多様性試験。Ｇｏｎｚａｌｅｓ－Ｌｕｎａ（Ｓｙｓｔｅｍｓ ｂｉｏｌｏｇｙ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｏｉｄｅｓ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｆａｉｌｕｒｅｓ ｏｆ ｆｅｃａｌ ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．Ａｎａｅｒｏｂｅ ２０２１：１０２３８７．ＤＯＩ：１０．１０１６／ｊ．ａｎａｅｒｏｂｅ．２０２１．１０２３８７）に記載されている方法を使用して、イベザポルスタットが投与された健常対象由来の試料のアルファ多様性およびベータ多様性を評価し、バンコマイシンが投与された対象と比較した。
アルファ多様性およびベータ多様性：試料内の細菌種の多様性に関するアルファ多様性試験に対して、試料間の多様性の差に関するベータ多様性試験。Ｇｏｎｚａｌｅｓ－Ｌｕｎａ（Ｓｙｓｔｅｍｓ ｂｉｏｌｏｇｙ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｏｉｄｅｓ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｆａｉｌｕｒｅｓ ｏｆ ｆｅｃａｌ ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．Ａｎａｅｒｏｂｅ ２０２１：１０２３８７．ＤＯＩ：１０．１０１６／ｊ．ａｎａｅｒｏｂｅ．２０２１．１０２３８７）に記載されている方法を使用して、イベザポルスタットが投与された健常対象由来の試料のアルファ多様性およびベータ多様性を評価し、バンコマイシンが投与された対象と比較した。
【0058】
１６ＳリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）遺伝子シーケンシング：Ｇｏｎｚａｌｅｓ－Ｌｕｎａ ２０２１に記載されているように、１６Ｓ ｒＲＮＡシーケンシングを行って、微生物分類を特性評価した。１試料当たり最小１５，０００個のリードとともにＩｌｌｕｍｉｎａベースのシーケンシングプラットフォームを使用して、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のＶ３－Ｖ４領域をシーケンシングして、腸内マイクロバイオーム群落構造を評価した。少なくとも９７％の類似性を有する品質フィルタリングした配列リードをＯｐｅｒａｔｉｏｎａｌ Ｔａｘｏｎｏｍｉｃ Ｕｎｉｔ（ＯＴＵ）にクラスタリングし、ＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴ＋パッケージｖ２．８．１ ２０１８を使用してＮＣＢＩ １６Ｓ ｒＲＮＡ配列データベース（公開日２０１８年９月１日）に対して検索することによって、各ＯＴＵからの代表的な配列に種レベルで分類学的同一性を割り当てた。種の豊富さ、および系統発生的距離がα多様性を表し、Ｂｒａｙ－ＣｕｒｔｉｓおよびＷｅｉｇｈｔｅｄ Ｕｎｉｆｒａｃがβ多様性を表すＱＩＩＭＥ ｖ１．９．０を使用して微生物多様性指数を計算した。結果を視覚化するために、ＲプラットフォームおよびＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ７．０（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用した。
【0059】
ショットガンメタゲノムシーケンシング：マイクロバイオーム機能遺伝子の分析のためのＩｌｌｕｍｉｎａベースのプラットフォームを使用して、１６Ｓ ｒＲＮＡシーケンシングに以前に使用した糞便試料から抽出したＤＮＡをショットガンメタゲノムシーケンシングした。ＨＵＭＡｎＮ２ ｖ０．１１．２パイプラインを使用して、ショットガンメタゲノムの機能的遺伝子プロファイリングを行った。３５ 前処理工程では、シーケンシングリードの品質フィルタリングを行い、続いて、コンタミナント宿主（ヒト）リードのスクリーニングおよび除去を行った。デフォルトのカットオフ設定で生の配列データのフィルタリングおよびトリミングにＴｒｉｍｍｏｍａｔｉｃ ｖ０．３８を使用した。ｂｏｗｔｉｅ２アルゴリズムを使用してペアエンドモードでヒトゲノムデータベースに対してリードを検索し、それらがデータベースにマッピングされた場合は破棄した。遺伝子ファミリープロファイルを得るために、ｂｏｗｔｉｅ２を使用してヌクレオチドデータベース（ＣｈｏｃｏＰｈｌＡｎ）に対してこれらの品質管理したメタゲノム配列を最初に検索し、次いで、ｄｉａｍｏｎｄを使用してタンパク質データベース（ＵｎｉＲｅｆ９０）に対して検索した。ＵｎｉＲｅｆ９０を使用して、同定された全遺伝子ファミリーをアノテーションし、ＭｅｔａＣｙｃ識別子を使用して経路をアノテーションした。遺伝子ファミリープロファイルを用いてα多様性およびβ多様性を生成した。
【0060】
アルファ多様性分析の結果を図１に示す。図では、プロットの一番上の行は、バンコマイシン治療を受けている対象を表す。プロットの２番目の行は、３００ｍｇのイベザポルスタット治療を受けている対象を表す。また、プロットの３番目の行は、４５０ｍｇのイベザポルスタット治療を受けている対象を表す。４番目の行は、プラセボを投与されている対象を表す。この図に見られるように、イベザポルスタットによる治療は、バンコマイシンと比較して、治療の経過中に、バイオームのアルファ多様性の全体的な変化を少なくする。
【0061】
ベータ多様性分析の結果を図２に示す。図では、左側のプロットは、治療前の対象におけるベースライン多様性を示している。右側のプロットは、バンコマイシンまたはイベザポルスタットのいずれかを投与されている対象のベータ多様性を示す。イベザポルスタットを投与されている対象は、同じｙ軸の周りに留まるベータ多様性を有するのに対して、バンコマイシン対象は、はるかに異なるベータ多様性を示している。この試験の結果は、腸の多様性が、バンコマイシンと比較してイベザポルスタットの投与後に異なることを実証している。
【0062】
マイクロバイオーム分析
Ｇｏｎｚａｌｅｓ－Ｌｕｎａ（Ｓｙｓｔｅｍｓ ｂｉｏｌｏｇｙ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｏｉｄｅｓ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｆａｉｌｕｒｅｓ ｏｆ ｆｅｃａｌ ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．Ａｎａｅｒｏｂｅ ２０２１：１０２３８７．ＤＯＩ：１０．１０１６／ｊ．ａｎａｅｒｏｂｅ．２０２１．１０２３８７）およびＳｅｇａｔａ ｅｔ ａｌ．（Ｍｅｔａｇｅｎｏｍｉｃ ｂｉｏｍａｒｋｅｒ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ａｎｄ ｅｘｐｌａｎａｔｉｏｎ．Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ ２０１１；１２（６）：Ｒ６０．ＤＯＩ：１０．１１８６／ｇｂ－２０１１－１２－６－ｒ６０）に記載されている方法を使用して、イベザポルスタットまたはバンコマイシン治療のいずれかを受けている健常対象のマイクロバイオームを分析した。
Ｇｏｎｚａｌｅｓ－Ｌｕｎａ（Ｓｙｓｔｅｍｓ ｂｉｏｌｏｇｙ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｏｉｄｅｓ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｆａｉｌｕｒｅｓ ｏｆ ｆｅｃａｌ ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．Ａｎａｅｒｏｂｅ ２０２１：１０２３８７．ＤＯＩ：１０．１０１６／ｊ．ａｎａｅｒｏｂｅ．２０２１．１０２３８７）およびＳｅｇａｔａ ｅｔ ａｌ．（Ｍｅｔａｇｅｎｏｍｉｃ ｂｉｏｍａｒｋｅｒ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ａｎｄ ｅｘｐｌａｎａｔｉｏｎ．Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ ２０１１；１２（６）：Ｒ６０．ＤＯＩ：１０．１１８６／ｇｂ－２０１１－１２－６－ｒ６０）に記載されている方法を使用して、イベザポルスタットまたはバンコマイシン治療のいずれかを受けている健常対象のマイクロバイオームを分析した。
【0063】
上記のシーケンシングを使用して、本発明者らは、イベザポルスタットまたはバンコマイシンのいずれかを投与されている対象における細菌門の経時的変化を分析した。この分析の結果を図３に示す。この分析の結果から明らかなように、バンコマイシンによる治療は、プロテオバクテリア（Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）を「異常発生」させる（プロットでは濃い灰色で示されている）。また、この分析から明らかなのは、イベザポルスタットによる治療の方が高い割合のアクチノバクテリア（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）をもたらすことである。
【0064】
本発明者らは、メタゲノム分析に特に焦点を当てた高次元な綱比較を可能にする線形判別分析効果サイズ（ＬＥｆＳｅ）法を使用して、イベザポルスタットまたはバンコマイシンのいずれかによって治療した健常ボランティアからのデータを分析した。この方法は、Ｓｅｇａｔａ ｅｔ ａｌ．（Ｍｅｔａｇｅｎｏｍｉｃ ｂｉｏｍａｒｋｅｒ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ａｎｄ ｅｘｐｌａｎａｔｉｏｎ．Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ ２０１１；１２（６）：Ｒ６０．ＤＯＩ：１０．１１８６／ｇｂ－２０１１－１２－６－ｒ６０）に記載されている。この分析の結果を図４に示す。図は、イベザポルスタットまたはバンコマイシンのいずれかが投与された対象における０日目対１０日目のマイクロバイオームの変化を示す。陰影は、ベースラインと比較して１０日目の細菌存在量の減少、または存在量の増加を表す。ＬＥｆＳｅプロットで明らかなように、イベザポルスタットでは、１０日目のバンコマイシンと比較して、治療の１０日目でマイクロバイオーム全体に対する変化がはるかに少ない。
【0065】
ベースライン微生物叢は、いずれの試験群についてもベースライン（０日目の試料）で差がなかった。イベザポルスタット、バンコマイシンまたはプラセボが投与された対象に関する個々の門およびＳｈａｎｎｏｎ’ｓ ｉｎｄｅｘアルファ多様性の経時的な連日の変化を図１および図３に示す。個々の門間の差は明らかであった。ただし、一般に、バンコマイシンが投与された対象ではプロテオバクテリア（Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）またはフソバクテリア（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉａ）の割合が増加したのに対して、イベザポルスタットが投与された対象ではアクチノバクテリア（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）の割合が一定して増加した。一般に、イベザポルスタットまたはバンコマイシンのいずれかを投与されている個々の対象の治療では、プラセボと比較してアルファ多様性が低下した。経時的なアルファ多様性変化の統計分析を以下の表１に示す。３つの別個のアルファ多様性指数（Ｓｈａｎｎｏｎ、ＳｉｍｐｓｏｎおよびＰｉｅｌｏｕｓ）を使用すると、イベザポルスタット４５０ｍｇおよびバンコマイシンは、プラセボと比較して、アルファ多様性の統計学的に有意な変化を経時的に示した。イベザポルスタット３００ｍｇは、プラセボと比較して統計学的に有意な変化を示さなかった。治療群ごとの経時的なアルファ多様性変化（Ｓｈａｎｎｏｎ）の要約的測定を図６に示す。ベータ多様性の変化により、微生物叢が試験群間で有意に異なることが確認された（図６）。主座標分析を使用すると、ベースライン試料は全試験群で類似していたが、各クラスターの９５％信頼を表す明確な楕円は、いずれかの用量のイベザポルスタット試料またはプラセボ試料と比較してバンコマイシン治療対象について有意に異なっていた。ＬＥｆＳｅアルゴリズムによって生成した、治療終了と比較したベースラインでの分岐図を図４に示す。バンコマイシンは、ガンマプロテオバクテリア（Ｇａｍｍａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）の割合が増加したことを除いて、ほとんどの分類群の割合が有意に低いことを含めて、マイクロバイオームに対してさらに広範囲の効果を有した。イベザポルスタットは、クロストリジアーレス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌｅｓ）の割合の減少、ならびにエンテロバクテリアセエ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、およびビフィドバクテリアシエ（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）の特定の種の割合の増加を示した。門、綱、目および科レベルでの細菌分類群の変化を以下の表２に示す。
【表1】
【表2-1】
【表2-2】
【0066】
胆汁酸分析
イベザポルスタットの使用に関連する胆汁酸の変化をさらに分析するために、Ｓｃｈｅｒｅｒ Ｍ，ｅｔ ａｌ．（Ｒａｐｉｄ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｉｌｅ ａｃｉｄｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｉｎ ｓｅｒｕｍ ｂｙ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ－ｔａｎｄｅｍ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ．Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ Ｂ Ａｎａｌｙｔ Ｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｍｅｄ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ ２００９；８７７（３０）：３９２０－５．ＤＯＩ：１０．１０１６／ｊ．ｊｃｈｒｏｍｂ．２００９．０９．０３８）およびＱｉａｎ Ｘ ｅｔ ａｌ．（Ｒｉｄｉｎｉｌａｚｏｌｅ，ａ ｎａｒｒｏｗ ｓｐｅｃｔｒｕｍ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ ｆｏｒ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｏｉｄｅｓ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，ｅｎｈａｎｃｅｓ ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｂｉｌｅ ａｃｉｄｓ．Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔ Ｌｉｖｅｒ Ｐｈｙｓｉｏｌ ２０２０；３１９（２）：Ｇ２２７－Ｇ２３７．ＤＯＩ：１０．１１５２／ａｊｐｇｉ．０００４６．２０２０）の発表されたデータに基づいて、この試験のためにＬＣ－ＭＳ－ＭＳ法を開発した。
イベザポルスタットの使用に関連する胆汁酸の変化をさらに分析するために、Ｓｃｈｅｒｅｒ Ｍ，ｅｔ ａｌ．（Ｒａｐｉｄ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｉｌｅ ａｃｉｄｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｉｎ ｓｅｒｕｍ ｂｙ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ－ｔａｎｄｅｍ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ．Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ Ｂ Ａｎａｌｙｔ Ｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｍｅｄ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ ２００９；８７７（３０）：３９２０－５．ＤＯＩ：１０．１０１６／ｊ．ｊｃｈｒｏｍｂ．２００９．０９．０３８）およびＱｉａｎ Ｘ ｅｔ ａｌ．（Ｒｉｄｉｎｉｌａｚｏｌｅ，ａ ｎａｒｒｏｗ ｓｐｅｃｔｒｕｍ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ ｆｏｒ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｏｉｄｅｓ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，ｅｎｈａｎｃｅｓ ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｂｉｌｅ ａｃｉｄｓ．Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔ Ｌｉｖｅｒ Ｐｈｙｓｉｏｌ ２０２０；３１９（２）：Ｇ２２７－Ｇ２３７．ＤＯＩ：１０．１１５２／ａｊｐｇｉ．０００４６．２０２０）の発表されたデータに基づいて、この試験のためにＬＣ－ＭＳ－ＭＳ法を開発した。
【0067】
胆汁酸分析には１７個のベースライン試料、１７日間の５つの試料、および１４日間の１０個の試料が利用可能であった。各薬物および期間に関する胆汁酸の濃度を図８に示す。ベースライン試料は全試験群について同様であり、（＞９５％）の二次胆汁酸を主に含んでいた。全試験薬への曝露により、一次胆汁酸は増加し、二次胆汁酸は減少した（図７）。対象の背景因子について制御する線形回帰分析を使用すると、バンコマイシンは、一次胆汁酸および一次胆汁酸：二次胆汁酸比の有意な増加に関連していた。同様の効果がイベザポルスタット４５０ｍｇで認められたが、これらの結果は統計学的に有意ではなかった（上記の表１）。
【0068】
この分析の結果を図５Ａおよび図５Ｂに示す。左のプロットは、イベザポルスタットまたはバンコマイシンのいずれかによる治療の経過中の一次胆汁酸の変化を示す。右のプロットは、イベザポルスタットまたはバンコマイシンのいずれかによる治療の経過中の二次胆汁酸の変化を示す。これらの結果から明らかなように、バンコマイシンによる治療は、一次胆汁酸の大きな増加を引き起こすとともに、二次胆汁酸の大きな減少も引き起こす。対照的に、イベザポルスタットは、一次胆汁酸の量に顕著な変化を引き起こさず、二次胆汁酸の同じ大きな減少を引き起こさない。
【0069】
微生物叢と胆汁酸変化との相関
科分類群と一次胆汁酸濃度および二次胆汁酸濃度との相関を表３に示す。エンテロバクテリアセエ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）は一次胆汁酸濃度と最も高く相関し（ｒ：０．６３；ｐ＜０．０００１）、ルミノコッカシエ（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）は一次胆汁酸濃度と負に相関した（ｒ：－０．３７；ｐ＝０．００２５）。また、ルミノコッカシエ（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）は、二次胆汁酸濃度と正に相関した（ｒ：０．４４；ｐ＝０．０００２）。シュードモナダシエ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ）も、二次胆汁酸濃度と正に相関した（ｒ：０．３８；ｐ＝０．００１７）。
科分類群と一次胆汁酸濃度および二次胆汁酸濃度との相関を表３に示す。エンテロバクテリアセエ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）は一次胆汁酸濃度と最も高く相関し（ｒ：０．６３；ｐ＜０．０００１）、ルミノコッカシエ（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）は一次胆汁酸濃度と負に相関した（ｒ：－０．３７；ｐ＝０．００２５）。また、ルミノコッカシエ（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）は、二次胆汁酸濃度と正に相関した（ｒ：０．４４；ｐ＝０．０００２）。シュードモナダシエ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ）も、二次胆汁酸濃度と正に相関した（ｒ：０．３８；ｐ＝０．００１７）。
【表3】
【0070】
この試験における重要なメタゲノム所見は、両抗生物質によりクロストリジア（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ）綱が一定して減少したが、イベザポルスタット治療対象ではアクチノバクテリア（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）綱が拡大し、バンコマイシン治療対象ではガンマプロテオバクテリア（Ｇａｍｍａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）綱、エンテロバクテラレス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒａｌｅｓ）目およびエンテロバクテリアセエ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）科が拡大したことであった。ファーミキュート（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅ）門内では、バンコマイシンはまた、桿菌（Ｂａｃｉｌｌｉ）綱分類群の割合の増加に関連していた。
【0071】
例２：
ＣＤＩのためのイベザポルスタットの第２ａ相臨床試験から得られたマイクロバイオームデータ
第２相臨床試験：
第２相臨床試験は、ＣＤＩの治療におけるイベザポルスタットを評価するようにデザインされている。
ＣＤＩのためのイベザポルスタットの第２ａ相臨床試験から得られたマイクロバイオームデータ
第２相臨床試験：
第２相臨床試験は、ＣＤＩの治療におけるイベザポルスタットを評価するようにデザインされている。
【0072】
この試験の第２ａ相は、米国の試験センターからの対象１０例の非盲検コホートであった。このコホートでは、毒素ＥＩＡ＋を介して診断された軽度／中等度のＣ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）によって引き起こされた下痢を有する患者１０例を、１０日間にわたって１日２回、イベザポルスタット４５０ｍｇを経口的に用いて治療した。全患者を２８±２日間にわたって再発について追跡した。治療の経過中、および追跡期間時に便を採取した。Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）培養およびマイクロバイオームの変化について、患者の糞便試料を評価した。この試験では、１２日目に１００％の臨床的治癒および３８日目に１００％の持続的臨床的治癒が実証された。好ましいマイクロバイオームの変化には、治療中のアクチノバクテリア（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）門およびファーミキューテス（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）門の種の過剰増殖が含まれた。これらの所見から、胆汁酸代謝に対する有益な効果が実証され、さらに、マイクロバイオームの効果が、低い再発率を含む有益な患者転帰の前兆となり得ることが裏付けられる。
【0073】
感染は１００％排除され、感染の再発はなく（１００％）、有害事象プロファイルは許容可能であった。
【0074】
方法：
安全性評価
安全性評価には、ＡＥ評価、身体検査、バイタルサイン、臨床検査（化学、血液学および尿検査）および心電図検査を含めた。全対象について、ＡＥの性質、頻度および重症度を含む安全性エンドポイントを記録した。ＡＥを、登録時から始めて各来院時に評価し、Ｍｅｄｉｃａｌ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｆｏｒ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ（ＭｅｄＤＲＡバージョン１５．０）に従って分類した。ＡＥ重症度（軽度、中程度または重度）および因果関係（試験薬と無関係であるか、場合により関連しているか、またはおそらく関連している）を各拠点の治験責任医師が評価した。
安全性評価
安全性評価には、ＡＥ評価、身体検査、バイタルサイン、臨床検査（化学、血液学および尿検査）および心電図検査を含めた。全対象について、ＡＥの性質、頻度および重症度を含む安全性エンドポイントを記録した。ＡＥを、登録時から始めて各来院時に評価し、Ｍｅｄｉｃａｌ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｆｏｒ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ（ＭｅｄＤＲＡバージョン１５．０）に従って分類した。ＡＥ重症度（軽度、中程度または重度）および因果関係（試験薬と無関係であるか、場合により関連しているか、またはおそらく関連している）を各拠点の治験責任医師が評価した。
【0075】
ＰＫ評価
１、５および１０日目の最初の連日のイベザポルスタット投与の２および４時間後に血漿レベルを測定した。ベースライン時、および１～１０日目の連日のイベザポルスタット投与時に糞便試料を採取した。血漿および糞便濃度をＡｌｔａＳｃｉｅｎｃｅｓ（Ｌａｖａｌ，Ｑｕｅｂｅｃ，Ｃａｎａｄａ）がアッセイし、ＰＫ分析をＬｅａｒｎ ａｎｄ Ｃｏｎｆｉｒｍ Ｉｎｃ．（Ｍｏｎｔｒｅａｌ，Ｑｕｅｂｅｃ，Ｃａｎａｄａ）が行った。
１、５および１０日目の最初の連日のイベザポルスタット投与の２および４時間後に血漿レベルを測定した。ベースライン時、および１～１０日目の連日のイベザポルスタット投与時に糞便試料を採取した。血漿および糞便濃度をＡｌｔａＳｃｉｅｎｃｅｓ（Ｌａｖａｌ，Ｑｕｅｂｅｃ，Ｃａｎａｄａ）がアッセイし、ＰＫ分析をＬｅａｒｎ ａｎｄ Ｃｏｎｆｉｒｍ Ｉｎｃ．（Ｍｏｎｔｒｅａｌ，Ｑｕｅｂｅｃ，Ｃａｎａｄａ）が行った。
【0076】
微生物学
Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）増殖のために、選択的 サイクロセリン－セフォキシチンフルクトース寒天（ＣＣＦＡ）上、３７°Ｃ、嫌気条件下で４８時間にわたって便試料を培養した。（Ｇｏｎｚａｌｅｓ－Ｌｕｎａ）。増殖および形態に基づいて単離体をＣ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）であると決定し、Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素およびｔｐｉ遺伝子についてＰＣＲによって確認した。以前に記載されたようにＰＣＲに基づくリボタイピング法を使用して、Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）を菌株分類した。（Ｇｏｎｚａｌｅｓ－Ｌｕｎａ ＡＪ，Ｃａｒｌｓｏｎ ＴＪ，Ｄｏｔｓｏｎ ＫＭ，ｅｔ ａｌ．ＰＣＲ ｒｉｂｏｔｙｐｅｓ ｏｆ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｏｉｄｅｓ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ ａｃｒｏｓｓ Ｔｅｘａｓ ｆｒｏｍ ２０１１ ｔｏ ２０１８ ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｅｍｅｒｇｅｎｃｅ ｏｆ ｒｉｂｏｔｙｐｅ ２５５．Ｅｍｅｒｇ Ｍｉｃｒｏｂｅｓ Ｉｎｆｅｃｔ ２０２０；９（１）：３４１－７．）０．１％タウロコール酸ナトリウムＢｒａｉｎ Ｈｅａｒｔ Ｉｎｆｕｓｉｏｎ（ＢＨＩ）培地中のブロス微量希釈によって、イベザポルスタットについて最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）を決定した。（Ｂｅｇｕｍ Ｋ，Ｂａｓｓｅｒｅｓ Ｅ，Ｍｉｒａｎｄａ Ｊ，ｅｔ ａｌ．Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ｏｍａｄａｃｙｃｌｉｎｅ，ａ Ｎｅｗ Ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ Ａｎａｌｏｇ，ａｎｄ Ｃｏｍｐａｒａｔｏｒｓ ａｇａｉｎｓｔ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｏｉｄｅｓ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ ２０２０；６４（８）．）
Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）増殖のために、選択的 サイクロセリン－セフォキシチンフルクトース寒天（ＣＣＦＡ）上、３７°Ｃ、嫌気条件下で４８時間にわたって便試料を培養した。（Ｇｏｎｚａｌｅｓ－Ｌｕｎａ）。増殖および形態に基づいて単離体をＣ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）であると決定し、Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素およびｔｐｉ遺伝子についてＰＣＲによって確認した。以前に記載されたようにＰＣＲに基づくリボタイピング法を使用して、Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）を菌株分類した。（Ｇｏｎｚａｌｅｓ－Ｌｕｎａ ＡＪ，Ｃａｒｌｓｏｎ ＴＪ，Ｄｏｔｓｏｎ ＫＭ，ｅｔ ａｌ．ＰＣＲ ｒｉｂｏｔｙｐｅｓ ｏｆ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｏｉｄｅｓ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ ａｃｒｏｓｓ Ｔｅｘａｓ ｆｒｏｍ ２０１１ ｔｏ ２０１８ ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｅｍｅｒｇｅｎｃｅ ｏｆ ｒｉｂｏｔｙｐｅ ２５５．Ｅｍｅｒｇ Ｍｉｃｒｏｂｅｓ Ｉｎｆｅｃｔ ２０２０；９（１）：３４１－７．）０．１％タウロコール酸ナトリウムＢｒａｉｎ Ｈｅａｒｔ Ｉｎｆｕｓｉｏｎ（ＢＨＩ）培地中のブロス微量希釈によって、イベザポルスタットについて最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）を決定した。（Ｂｅｇｕｍ Ｋ，Ｂａｓｓｅｒｅｓ Ｅ，Ｍｉｒａｎｄａ Ｊ，ｅｔ ａｌ．Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ｏｍａｄａｃｙｃｌｉｎｅ，ａ Ｎｅｗ Ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ Ａｎａｌｏｇ，ａｎｄ Ｃｏｍｐａｒａｔｏｒｓ ａｇａｉｎｓｔ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｏｉｄｅｓ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ ２０２０；６４（８）．）
【0077】
マイクロバイオームおよび胆汁酸の評価
イベザポルスタット投与中は連日、ならびにＥＯＴ後２、１０、２０および２８日目に、マイクロバイオーム分析のための糞便試料を採取した。指示に従って、ＱＩＡｃｕｂｅ自動ＤＮＡ抽出システム（Ｑｉａｇｅｎ）で、Ｑｉａｇｅｎ ＤＮｅａｓｙ ＰｏｗｅｒＳｏｉｌ Ｐｒｏ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号１２８８８－１００）を介して便ＤＮＡ抽出を行った。ＭｉＳｅｑシステム（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のＶ１－Ｖ３領域をシーケンシングすることによって、マイクロバイオームの特性評価を行った。（Ｆａｄｒｏｓｈ ＤＷ，Ｍａ Ｂ，Ｇａｊｅｒ Ｐ，ｅｔ ａｌ．Ａｎ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｄｕａｌ－ｉｎｄｅｘｉｎｇ ａｐｐｒｏａｃｈ ｆｏｒ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ １６Ｓ ｒＲＮＡ ｇｅｎｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｏｎ ｔｈｅ Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ ｐｌａｔｆｏｒｍ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ ２０１４；２（１）：６；Ｗａｌｋｅｒ ＪＮ，Ｈａｎｓｏｎ ＢＭ，Ｐｉｎｋｎｅｒ ＣＬ，ｅｔ ａｌ．Ｉｎｓｉｇｈｔｓ ｉｎｔｏ ｔｈｅ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ ｏｆ Ｂｒｅａｓｔ Ｉｍｐｌａｎｔｓ ａｎｄ Ｐｅｒｉｐｒｏｓｔｈｅｔｉｃ Ｔｉｓｓｕｅ ｉｎ Ｂｒｅａｓｔ Ｉｍｐｌａｎｔ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ａｎａｐｌａｓｔｉｃ Ｌａｒｇｅ Ｃｅｌｌ Ｌｙｍｐｈｏｍａ．Ｓｃｉ Ｒｅｐ ２０１９；９（１）：１０３９３．）バーコード化プライマーを使用して各試料を増幅し、これにより、各個々の試料ライブラリーにタグ付けされた固有の配列識別子が得られた。ＰＣＲの前にゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を正規化し、プールの前にＰＣＲ産物を正規化した。Ｉｌｌｕｍｉｎａベースのシーケンシングにより、１試料当たり１５，０００を超えるリードが得られた。以前に記載された方法から適合されたＱＴＲＡＰ ５５００質量分析計（Ｓｃｉｅｘ，Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）を用いて行われた標的化液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ－ＭＳ）を使用して、胆汁酸を定量した。（Ｓｃｈｅｒｅｒ Ｍ，Ｇｎｅｗｕｃｈ Ｃ，Ｓｃｈｍｉｔｚ Ｇ，Ｌｉｅｂｉｓｃｈ Ｇ．Ｒａｐｉｄ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｉｌｅ ａｃｉｄｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｉｎ ｓｅｒｕｍ ｂｙ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ－ｔａｎｄｅｍ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ．Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ Ｂ Ａｎａｌｙｔ Ｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｍｅｄ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ ２００９；８７７（３０）：３９２０－５．）対応する便試料重量によって胆汁酸レベルを正規化した。
イベザポルスタット投与中は連日、ならびにＥＯＴ後２、１０、２０および２８日目に、マイクロバイオーム分析のための糞便試料を採取した。指示に従って、ＱＩＡｃｕｂｅ自動ＤＮＡ抽出システム（Ｑｉａｇｅｎ）で、Ｑｉａｇｅｎ ＤＮｅａｓｙ ＰｏｗｅｒＳｏｉｌ Ｐｒｏ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号１２８８８－１００）を介して便ＤＮＡ抽出を行った。ＭｉＳｅｑシステム（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のＶ１－Ｖ３領域をシーケンシングすることによって、マイクロバイオームの特性評価を行った。（Ｆａｄｒｏｓｈ ＤＷ，Ｍａ Ｂ，Ｇａｊｅｒ Ｐ，ｅｔ ａｌ．Ａｎ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｄｕａｌ－ｉｎｄｅｘｉｎｇ ａｐｐｒｏａｃｈ ｆｏｒ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ １６Ｓ ｒＲＮＡ ｇｅｎｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｏｎ ｔｈｅ Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ ｐｌａｔｆｏｒｍ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ ２０１４；２（１）：６；Ｗａｌｋｅｒ ＪＮ，Ｈａｎｓｏｎ ＢＭ，Ｐｉｎｋｎｅｒ ＣＬ，ｅｔ ａｌ．Ｉｎｓｉｇｈｔｓ ｉｎｔｏ ｔｈｅ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ ｏｆ Ｂｒｅａｓｔ Ｉｍｐｌａｎｔｓ ａｎｄ Ｐｅｒｉｐｒｏｓｔｈｅｔｉｃ Ｔｉｓｓｕｅ ｉｎ Ｂｒｅａｓｔ Ｉｍｐｌａｎｔ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ａｎａｐｌａｓｔｉｃ Ｌａｒｇｅ Ｃｅｌｌ Ｌｙｍｐｈｏｍａ．Ｓｃｉ Ｒｅｐ ２０１９；９（１）：１０３９３．）バーコード化プライマーを使用して各試料を増幅し、これにより、各個々の試料ライブラリーにタグ付けされた固有の配列識別子が得られた。ＰＣＲの前にゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を正規化し、プールの前にＰＣＲ産物を正規化した。Ｉｌｌｕｍｉｎａベースのシーケンシングにより、１試料当たり１５，０００を超えるリードが得られた。以前に記載された方法から適合されたＱＴＲＡＰ ５５００質量分析計（Ｓｃｉｅｘ，Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）を用いて行われた標的化液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ－ＭＳ）を使用して、胆汁酸を定量した。（Ｓｃｈｅｒｅｒ Ｍ，Ｇｎｅｗｕｃｈ Ｃ，Ｓｃｈｍｉｔｚ Ｇ，Ｌｉｅｂｉｓｃｈ Ｇ．Ｒａｐｉｄ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｉｌｅ ａｃｉｄｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｉｎ ｓｅｒｕｍ ｂｙ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ－ｔａｎｄｅｍ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ．Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ Ｂ Ａｎａｌｙｔ Ｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｍｅｄ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ ２００９；８７７（３０）：３９２０－５．）対応する便試料重量によって胆汁酸レベルを正規化した。
【0078】
有効性評価
主要な有効性転帰尺度は、ＥＯＴ前の２４時間の期間内の下痢の解消として定義され、ＥＯＴ後少なくとも４８時間維持された、ＥＯＴでの臨床的治癒とした。ＳＣＣは、ＥＯＴ後２８（±２）日以内にＣＤＩが再発しない臨床的治癒と定義した。
主要な有効性転帰尺度は、ＥＯＴ前の２４時間の期間内の下痢の解消として定義され、ＥＯＴ後少なくとも４８時間維持された、ＥＯＴでの臨床的治癒とした。ＳＣＣは、ＥＯＴ後２８（±２）日以内にＣＤＩが再発しない臨床的治癒と定義した。
【0079】
統計分析
少なくとも１用量のイベザポルスタットを投与されている患者のｉｎｔｅｎｔ－ｔｏ－ｔｒｅａｔ解析を行った。有効性、安全性／忍容性、およびＳＡＳバージョン９．４ソフトウェア（ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｉｎｃ Ｃａｒｙ，ＮＣ，ＵＳＡ）を使用して生成したＰＫデータについて、記述統計を計算した。Ｒソフトウェアバージョン４．１．１（Ｒ Ｃｏｒｅ Ｔｅａｍ ２０２１，Ｖｉｅｎｎａ，Ａｕｓｔｒｉａ）を使用して、マイクロバイオーム要約的プロットおよびデータ視覚化を作成した。（Ｒ Ｃｏｒｅ Ｔｅａｍ（２０１３）．Ｒ：Ａ ｌａｎｇｕａｇｅ ａｎｄ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ ｆｏｒ ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ．Ｒ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ，Ｖｉｅｎｎａ，Ａｕｓｔｒｉａ．）Ｓｈａｎｎｏｎ Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ＩｎｄｅｘおよびＩｎｖｅｒｓｅ Ｓｉｍｐｓｏｎ Ｉｎｄｅｘを使用して、ＶｅｇａｎＲパッケージバージョン２．４－２を用いて、各試料のアルファ多様性を評価した。線形回帰モデルを使用して、治療中または治療後と比較したベースラインでのアルファ多様性（Ｓｈａｎｎｏｎ Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ＩｎｄｅｘおよびＩｎｖｅｒｓｅ Ｓｉｍｐｓｏｎ Ｉｎｄｅｘ）および胆汁酸の差を比較した。試験期間中に少なくとも１パーセントの比例的変化を伴う分類群に関する線形回帰モデルを使用して、１０日間の投与間隔にわたる細菌分類群の比例的変化を計算した。ｐ値＜０．０５を有意と考えた。
少なくとも１用量のイベザポルスタットを投与されている患者のｉｎｔｅｎｔ－ｔｏ－ｔｒｅａｔ解析を行った。有効性、安全性／忍容性、およびＳＡＳバージョン９．４ソフトウェア（ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｉｎｃ Ｃａｒｙ，ＮＣ，ＵＳＡ）を使用して生成したＰＫデータについて、記述統計を計算した。Ｒソフトウェアバージョン４．１．１（Ｒ Ｃｏｒｅ Ｔｅａｍ ２０２１，Ｖｉｅｎｎａ，Ａｕｓｔｒｉａ）を使用して、マイクロバイオーム要約的プロットおよびデータ視覚化を作成した。（Ｒ Ｃｏｒｅ Ｔｅａｍ（２０１３）．Ｒ：Ａ ｌａｎｇｕａｇｅ ａｎｄ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ ｆｏｒ ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ．Ｒ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ，Ｖｉｅｎｎａ，Ａｕｓｔｒｉａ．）Ｓｈａｎｎｏｎ Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ＩｎｄｅｘおよびＩｎｖｅｒｓｅ Ｓｉｍｐｓｏｎ Ｉｎｄｅｘを使用して、ＶｅｇａｎＲパッケージバージョン２．４－２を用いて、各試料のアルファ多様性を評価した。線形回帰モデルを使用して、治療中または治療後と比較したベースラインでのアルファ多様性（Ｓｈａｎｎｏｎ Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ＩｎｄｅｘおよびＩｎｖｅｒｓｅ Ｓｉｍｐｓｏｎ Ｉｎｄｅｘ）および胆汁酸の差を比較した。試験期間中に少なくとも１パーセントの比例的変化を伴う分類群に関する線形回帰モデルを使用して、１０日間の投与間隔にわたる細菌分類群の比例的変化を計算した。ｐ値＜０．０５を有意と考えた。
【0080】
第２ａ相臨床試験の結果：
第２ａ相データでは、イベザポルスタットによる治療の３日目までに結腸Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）が完全に根絶したこと、ならびに治療中および治療後の健康な腸内微生物叢、アクチノバクテリア（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）門種およびファーミキュート（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅ）門種の過剰増殖が観察されたことが実証された。さらに、データでは、７α－脱ヒドロキシル経路を介して一次胆汁酸を二次胆汁酸に代謝することが知られているクロストリジアーレス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌｅｓ）目分類群を含む健康な微生物叢の割合が増加したことが実証された。（Ｒｉｄｌｏｎ ＪＭ，Ｋａｎｇ ＤＪ，Ｈｙｌｅｍｏｎ ＰＢ．Ｂｉｌｅ ｓａｌｔ ｂｉｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ ｂｙ ｈｕｍａｎ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｂａｃｔｅｒｉａ．Ｊ Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ ２００６；４７（２）：２４１－５９）。これらのデータは、Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）に対する定着耐性と相関する、イベザポルスタット療法中およびイベザポルスタット療法後の二次胆汁酸濃度の増加を示している。さらに、一次胆汁酸の減少と、二次胆汁酸対一次胆汁酸の比の好ましい増加とは、イベザポルスタットがバンコマイシンと比較した場合にＣＤＩ再発の可能性を低減し得ることを示している。
第２ａ相データでは、イベザポルスタットによる治療の３日目までに結腸Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）が完全に根絶したこと、ならびに治療中および治療後の健康な腸内微生物叢、アクチノバクテリア（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）門種およびファーミキュート（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅ）門種の過剰増殖が観察されたことが実証された。さらに、データでは、７α－脱ヒドロキシル経路を介して一次胆汁酸を二次胆汁酸に代謝することが知られているクロストリジアーレス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌｅｓ）目分類群を含む健康な微生物叢の割合が増加したことが実証された。（Ｒｉｄｌｏｎ ＪＭ，Ｋａｎｇ ＤＪ，Ｈｙｌｅｍｏｎ ＰＢ．Ｂｉｌｅ ｓａｌｔ ｂｉｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ ｂｙ ｈｕｍａｎ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｂａｃｔｅｒｉａ．Ｊ Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ ２００６；４７（２）：２４１－５９）。これらのデータは、Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）に対する定着耐性と相関する、イベザポルスタット療法中およびイベザポルスタット療法後の二次胆汁酸濃度の増加を示している。さらに、一次胆汁酸の減少と、二次胆汁酸対一次胆汁酸の比の好ましい増加とは、イベザポルスタットがバンコマイシンと比較した場合にＣＤＩ再発の可能性を低減し得ることを示している。
【0081】
患者
４９（±１５）歳（５０％女性；１００％白色人種；８０％ヒスパニック系またはラテンアメリカ系民族）の患者１０例を登録した。全患者１０例にイベザポルスタットを投与し、全患者１０例が試験を完了した。治療開始前の２４時間以内の未形成排便数の中央値は４であった（範囲：３～１０）。患者１０例のうち２例が、イベザポルスタットを開始する前に、２４時間未満のメトロニダゾールまたはバンコマイシンのいずれかの抗生物質治療を受けていた。登録前または登録後に入院した患者はいなかった。
４９（±１５）歳（５０％女性；１００％白色人種；８０％ヒスパニック系またはラテンアメリカ系民族）の患者１０例を登録した。全患者１０例にイベザポルスタットを投与し、全患者１０例が試験を完了した。治療開始前の２４時間以内の未形成排便数の中央値は４であった（範囲：３～１０）。患者１０例のうち２例が、イベザポルスタットを開始する前に、２４時間未満のメトロニダゾールまたはバンコマイシンのいずれかの抗生物質治療を受けていた。登録前または登録後に入院した患者はいなかった。
【0082】
安全性
ＡＥの要約を表４に示す。患者１０例のうち４例に７件のＡＥが報告され、これらの事象のうち４件が１例の対象に発生した。いずれの事象も重篤なＡＥではなかった。ＡＥの重症度は、軽度（ｎ＝２）、中等度（ｎ＝４）および重度（ｎ＝１；薬物に関連しない片頭痛）であった。最も一般的なＡＥは、頭痛（ｎ＝２）または悪心（ｎ＝２）であった。悪心の両エピソードは、治験責任医師によって試験薬と「おそらく関連している」とみなされた。これらのＡＥには治療は必要ではなく、ＡＥにより試験薬スケジュールの変更、または投与の中止は必要とされなかった。全ＡＥが試験の終了までに解消した。
ＡＥの要約を表４に示す。患者１０例のうち４例に７件のＡＥが報告され、これらの事象のうち４件が１例の対象に発生した。いずれの事象も重篤なＡＥではなかった。ＡＥの重症度は、軽度（ｎ＝２）、中等度（ｎ＝４）および重度（ｎ＝１；薬物に関連しない片頭痛）であった。最も一般的なＡＥは、頭痛（ｎ＝２）または悪心（ｎ＝２）であった。悪心の両エピソードは、治験責任医師によって試験薬と「おそらく関連している」とみなされた。これらのＡＥには治療は必要ではなく、ＡＥにより試験薬スケジュールの変更、または投与の中止は必要とされなかった。全ＡＥが試験の終了までに解消した。
【0083】
ＰＫ結果
投与後２～４時間のイベザポルスタット血漿レベルは２３３～５７８ｎｇ／ｍＬの範囲であり、投与後２時間の期間（範囲：２３４～２９９ｎｇ／ｍＬ）と比較して、投与後４時間の期間（範囲：３７３～５７８ｎｇ／ｍＬ）の方が高い濃度が観察された。治療３日目までに、イベザポルスタット便中濃度は平均４１６±４９４μｇ／ｇ便であり、治療８～１０日目までに＞１，０００μｇ／ｇ便に増加した。濃度は、ＥＯＴの２日後に平均５３５±７４８μｇ／ｇ便であった。３８日目に採取した４つの便試料のうち３つでは、イベザポルスタットの便中濃度は検出可能であり続けた（１３６±１６１μｇ／ｇ便）。便全体および血漿ＰＫデータを図１０に示す。イベザポルスタットは、１ｕｇ／ｍＬを超えない高い便中濃度および血漿中濃度を達成した。
投与後２～４時間のイベザポルスタット血漿レベルは２３３～５７８ｎｇ／ｍＬの範囲であり、投与後２時間の期間（範囲：２３４～２９９ｎｇ／ｍＬ）と比較して、投与後４時間の期間（範囲：３７３～５７８ｎｇ／ｍＬ）の方が高い濃度が観察された。治療３日目までに、イベザポルスタット便中濃度は平均４１６±４９４μｇ／ｇ便であり、治療８～１０日目までに＞１，０００μｇ／ｇ便に増加した。濃度は、ＥＯＴの２日後に平均５３５±７４８μｇ／ｇ便であった。３８日目に採取した４つの便試料のうち３つでは、イベザポルスタットの便中濃度は検出可能であり続けた（１３６±１６１μｇ／ｇ便）。便全体および血漿ＰＫデータを図１０に示す。イベザポルスタットは、１ｕｇ／ｍＬを超えない高い便中濃度および血漿中濃度を達成した。
【0084】
微生物学的結果
微生物学試験のために７つのベースライン便試料が利用可能であり、そのうち６つ（８６％）では毒素産生性Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）が増殖した。他の全採取日（７～９試料／日の範囲）から得られた便試料では、Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）は増殖しなかった。同定されたリボタイプには、Ｆ０７８－１２６（ｎ＝２）、Ｆ０１４－０２０（ｎ＝２）、Ｆ１０６（ｎ＝１）およびＦＰ４３５（ｎ＝１）が含まれた。イベザポルスタットのＭＩＣは、０．２５（ｎ＝１）、０．５（ｎ＝３）または１．０（ｎ＝１）ｕｇ／ｍＬであった。
微生物学試験のために７つのベースライン便試料が利用可能であり、そのうち６つ（８６％）では毒素産生性Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）が増殖した。他の全採取日（７～９試料／日の範囲）から得られた便試料では、Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）は増殖しなかった。同定されたリボタイプには、Ｆ０７８－１２６（ｎ＝２）、Ｆ０１４－０２０（ｎ＝２）、Ｆ１０６（ｎ＝１）およびＦＰ４３５（ｎ＝１）が含まれた。イベザポルスタットのＭＩＣは、０．２５（ｎ＝１）、０．５（ｎ＝３）または１．０（ｎ＝１）ｕｇ／ｍＬであった。
【0085】
マイクロバイオームおよび胆汁酸の結果
Ｉｎｖｅｒｓｅ Ｓｉｍｐｓｏｎ ＩｎｄｅｘおよびＳｈａｎｎｏｎ Ｉｎｄｅｘの両方を使用すると、ベースライン試料からアルファ多様性の急速な増加が認められた（図１２）。ベースラインと比較して、Ｉｎｖｅｒｓｅ Ｓｉｍｐｓｏｎ Ｉｎｄｅｘ多様性は、イベザポルスタット療法中に０．１４±０．０５６ポイント増加し（ｐ＝０．０１７）、ＥＯＴ後に０．２２±０．１０ポイント増加した（ｐ＝０．００３３）。
Ｉｎｖｅｒｓｅ Ｓｉｍｐｓｏｎ ＩｎｄｅｘおよびＳｈａｎｎｏｎ Ｉｎｄｅｘの両方を使用すると、ベースライン試料からアルファ多様性の急速な増加が認められた（図１２）。ベースラインと比較して、Ｉｎｖｅｒｓｅ Ｓｉｍｐｓｏｎ Ｉｎｄｅｘ多様性は、イベザポルスタット療法中に０．１４±０．０５６ポイント増加し（ｐ＝０．０１７）、ＥＯＴ後に０．２２±０．１０ポイント増加した（ｐ＝０．００３３）。
【0086】
Ｓｈａｎｎｏｎ Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｉｎｄｅｘを使用して、同様の結果が観察された。多様性は、ベースラインと比較して、イベザポルスタット療法中に０．９８±０．４８ポイント増加し（ｐ＝０．０４９）、治療完了後に１．７±０．８７ポイント増加した（ｐ＝０．０４３）。イベザポルスタット療法中およびイベザポルスタット療法後の分類群の変化を図１３に示す。最も一般的には、バクテロイディア（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｉａ）綱分類群（－１０．０±４．８％）およびフラボバクテリアシエ（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）科分類群（－８．８±４．８％）の割合の低下に起因して、バクテロイデテス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ）門の比例的減少が観察された（－１０．０±４．８％；ｐ＝０．０４３）。最も一般的には、ラクノスピラシエ（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ）（＋１２．７±６．０％）およびルミノコッカシエ（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）（＋２．８±２．７％）の割合の増加に起因して、ファーミキューテス（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）門の割合の増加が観察された（＋１４．７±５．４％；ｐ＝０．００９）。他のファーミキューテス（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）は割合が低下し、最も顕著にはバチラレス（Ｂａｃｉｌｌａｌｅｓ）（－４．４±２．３％）目分類群およびラクトバチラレス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｌｅｓ）（－３．７±２．２％）目分類群であった。個々の患者の存在量表を図１５に示す。
【0087】
胆汁酸分析の結果を図１４に示す。ベースラインと比較して、便内の総一次酸は、治療中に４０．１±９．６ｎｇ／ｍｇ便減少し（ｐ＝０．０００２）、治療完了後に４０．５±１４．１ｎｇ／ｍｇ便減少した（ｐ＝０．００６６）。ベースラインと比較して、総二次胆汁酸は、治療中に６５．６±１４６．７ｎｇ／ｍｇ便増加し（ｐ＝０．６６）、治療完了後に９７．５±２１５．４ｎｇ／ｍｇ便増加した（ｐ＝０．６５）。
【表4】
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5A】
【図5B】
【図6A】
【図6B】
【図6C】
【図6D】
【図7A】
【図7B】
【図7C】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12A】
【図12B】
【図13A】
【図13B】
【図13C】
【図13D】
【図14A】
【図14B】
【図14C】
【図15A】
【図15B】
【図15C】
【図15D】
【国際調査報告】