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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-06-21
(54)【発明の名称】ゲノム編集のための組成物及び方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/09 20060101AFI20240614BHJP
C12N 15/11 20060101ALI20240614BHJP
C12M 1/00 20060101ALI20240614BHJP
【ＦＩ】
C12N15/09 100
C12N15/11 Z ZNA
C12M1/00 A
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023578194
(86)(22)【出願日】2022-06-24
(85)【翻訳文提出日】2024-02-07
(86)【国際出願番号】 EP2022067351
(87)【国際公開番号】W WO2022269037
(87)【国際公開日】2022-12-29
(31)【優先権主張番号】2106868
(32)【優先日】2021-06-25
(33)【優先権主張国・地域又は機関】FR
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】523475538
【氏名又は名称】クウィディタス エスエー
(74)【代理人】
【識別番号】100120891
【弁理士】
【氏名又は名称】林 一好
(74)【代理人】
【識別番号】100165157
【弁理士】
【氏名又は名称】芝 哲央
(74)【代理人】
【識別番号】100205659
【弁理士】
【氏名又は名称】齋藤 拓也
(74)【代理人】
【識別番号】100126000
【弁理士】
【氏名又は名称】岩池 満
(74)【代理人】
【識別番号】100185269
【弁理士】
【氏名又は名称】小菅 一弘
(72)【発明者】
【氏名】シェルボンノー フランソワ
【テーマコード（参考）】
4B029
【Ｆターム（参考）】
4B029AA23
4B029AA27
4B029BB01
4B029BB20
4B029CC01
4B029GA03
4B029GA08
4B029GB10
(57)【要約】
本発明は、トランスポザーゼの少なくとも２つの結合半部位を含む第１の一本鎖核酸分子と、トランスポザーゼの少なくとも１つの結合半部位を含む第２の一本鎖核酸分子と、を含有する、分子複合体に関する。複合体は、第１及び第２の一本鎖核酸が、トランスポザーゼの２つの二本鎖結合部位を規定するように、ワトソン・クリックによって規定される塩基相補性に従って対合しているようなものである。本発明は更に、特にＤＮＡ編集のための、複合体の使用に関する。
【選択図】図１０
【選択図】図１０
【特許請求の範囲】
【請求項1】
目的の核酸の相補配列の挿入を可能にするＡ配列を含むか、又は本質的にそれからなる第１の一本鎖核酸分子であって、前記Ａ配列が、５’で４０～６０ヌクレオチド長の第１のＡ／Ｔリッチ、特にＴリッチ配列に結合し、３’で４０～６０ヌクレオチド長の第２のＡ／Ｔリッチ、特にＴリッチ配列に結合し、前記第１及び第２のＡ／Ｔリッチ、特にＴリッチ配列が、それぞれ６～１２個のＧ／Ｃリッチヌクレオチドの第１及び第２のドメインを含み、前記第１のドメインの配列が、前記第２のドメインの配列に相補的であり、前記第１及び第２のドメインが、前記Ａ配列から１５～５２ヌクレオチドに位置付けられ、前記第１の分子が、その５’末端に、トランスポザーゼを認識するための５’から３’に配向された第１の配列と、その３’末端に、前記トランスポザーゼを認識するための少なくとも１つの第２の配列と、を含む、第１の一本鎖核酸分子と、
前記トランスポザーゼを認識するための前記第２の配列の少なくとも１つの相補配列をその５’末端に含むか、又は本質的にそれからなる第２の一本鎖核酸分子と、を含む、複合体であって、
前記第１及び第２の一本鎖核酸分子が、前記トランスポザーゼの２つの二本鎖結合部位を規定するように、ワトソン・クリックによって規定される塩基相補性に従って対合しているようなものである、複合体。
【請求項2】
前記Ａ配列が、目的の核酸の相補配列を含む、請求項１に記載の複合体。
【請求項3】
前記第１の分子が、その５’末端に、トランスポザーゼを認識するための５’から３’に配向された第１の配列と、その３’末端に、前記トランスポザーゼを認識するための５’から３’に配向された第２の配列と、を含み、前記第２の分子が、その５’末端に、前記トランスポザーゼを認識するための前記第１の配列の第１の相補配列と、それに続く、前記トランスポザーゼを認識するための前記第２の配列の第２の相補配列と、を含む、請求項１又は２に記載の複合体。
【請求項4】
前記第１の分子が、その５’末端に、トランスポザーゼを認識するための５’から３’に配向された第１の配列と、その３’末端に、前記トランスポザーゼを認識するための第２の配列と、それに続く、前記トランスポザーゼを認識するための前記第１の配列の第１の相補配列と、を含み、前記第２の分子が、その５’末端に、前記トランスポザーゼを認識するための前記第２の配列の相補配列を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項5】
前記トランスポザーゼが、細菌トランスポザーゼ、特にＴｎ５、Ｔｎ９、Ｔｎ１０又はＴｃ１／ｍａｒｉｎｅｒから選択されるトランスポザーゼである、請求項１～４のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項6】
前記第１の分子が、特に修飾ヌクレオチドを介して酵素とカップリングしている、請求項１～５のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項7】
前記第１の分子が、以下の配列：配列番号４３６、配列番号４４０、配列番号４４３、配列番号４４４、配列番号４４８、配列番号４４９、配列番号４５０、配列番号４５４、配列番号４５５、配列番号４５６、配列番号４５７、配列番号４５８、配列番号４６２、配列番号４６３、配列番号４６４、配列番号４６５、配列番号４６６及び配列番号６４１のうちの１つを含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項8】
前記複合体が第１及び第２の分子の対を含み、前記第１及び第２の分子が表２に規定される配列を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項9】
表４に規定される第１及び第２の分子３００対のうちの１つを含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項10】
目的の核酸の相補配列の挿入を可能にするＡ配列を含むか若しくは本質的にそれからなるか、又は目的の核酸の相補配列を含む第１の一本鎖核酸分子であって、前記相補配列が、５’で４０～６０ヌクレオチド長の第１のＴリッチ配列に結合し、３’で４０～６０ヌクレオチド長の第２のＴリッチ配列に結合し、前記第１及び第２のＴリッチ配列が、それぞれ６～１２個のＧ／Ｃリッチヌクレオチドの第１及び第２のドメインを含み、前記第１のドメインの配列が前記第２のドメインの配列に相補的であり、前記第１及び第２のドメインが前記Ａ配列から１５～５２ヌクレオチドに位置付けられ、前記第１の分子が、その５’末端に、トランスポザーゼを認識するための５’から３’に配向された少なくとも１つの第１の配列と、その３’末端に、前記トランスポザーゼを認識するための第２の配列と、を含む、第１の一本鎖核酸分子と、目的の核酸の相補配列の挿入を可能にするＢ配列を含むか若しくは本質的にそれからなるか、又は目的の核酸の相補配列を含む第２の一本鎖核酸分子であって、前記相補Ｂ配列が、５’で４０～６０ヌクレオチド長の第３のＴリッチ配列に結合し、３’で４０～６０ヌクレオチド長の第４のＴリッチ配列に結合し、前記第３及び第４のＴリッチ配列が、それぞれ６～１２個のＧ／Ｃリッチヌクレオチドの第３及び第４のドメインを含み、前記第３のドメインの配列が前記第４のドメインの配列に相補的であり、前記第３及び第４のドメインが前記Ｂ配列から１５～５２ヌクレオチドに位置付けられ、前記第２の分子が、その５’末端に、前記トランスポザーゼを認識するための５’から３’に配向された少なくとも１つの第１の配列と、その３’末端に、前記トランスポザーゼを認識するための前記第２の配列と、を含み、
前記Ｂ配列が目的の前記核酸の相補配列であり、前記Ａ配列が目的の前記核酸の目的の領域の５’に位置付けられ、前記Ｂ配列が目的の前記核酸の目的の前記領域の３’に位置付けられている、第２の一本鎖核酸分子と、
第３の一本鎖分子であって、
その５’部分において、前記第１の分子の前記トランスポザーゼを認識するための前記第２の配列の少なくとも１つの相補配列と、
その３’部分において、前記第２の分子の前記トランスポザーゼを認識するための前記第１の配列の少なくとも１つの相補配列と、を含む、第３の一本鎖分子と、
前記第１の分子の前記トランスポザーゼを認識するための前記第２の配列の相補配列と、一本鎖置換核酸分子の挿入を可能にする前記第２の分子の前記トランスポザーゼを認識するための前記第１の配列の前記相補配列との間に位置する領域と、を含む、集合体であって、
前記第１及び第３の一本鎖核酸分子が、前記トランスポザーゼの２つの二本鎖結合部位を規定するように、ワトソン・クリックによって規定される塩基相補性に従って対合しており、前記第２及び第３の一本鎖核酸分子が、前記トランスポザーゼの２つの二本鎖結合部位を規定するように、ワトソン・クリックによって規定される塩基相補性に従って対合している、集合体。
【請求項11】
表５に規定される第１及び第３の分子３００対のうちの１つを含む、請求項１０に記載の集合体。
【請求項12】
リコンビナーゼの発現を可能にする少なくとも１つのベクターと、請求項１０に記載の集合体の前記第１、第２及び第３の分子と、を含む、キット。
【請求項13】
核酸を操作するための、特に標的配列を目的の配列で置換するための、請求項１０に記載の集合体の使用であって、次のこと：ヒトの生殖系列遺伝的同一性を改変するための方法を含まないこと、かつ手術又は療法によって前記ヒト又は動物の身体を治療するための方法ではないことを条件とする、使用。
【請求項14】
ハイブリッド核酸分子を得るように、核酸分子の標的領域を別の核酸分子の目的の領域でインビトロで置換するための方法であって、請求項１０に記載の集合体を、前記標的領域を含む前記核酸と接触させることであって、
前記集合体が、
前記第１の分子の前記Ａ配列が、前記標的領域の５’にすぐ前記領域の相補配列を含み、
前記第１の分子の前記Ｂ配列が、前記標的領域の３’にすぐ前記領域の相補配列を含み、
前記第３の分子が、置換複合体を得るために、前記第１の分子の前記トランスポザーゼを認識するための前記第２の配列の相補配列と、前記第２の分子の前記トランスポザーゼを認識するための前記第１の配列の前記相補配列との間に位置する領域に目的の前記領域を含む、接触させることと、
組換え複合体を得るために、前記集合体に含まれる前記トランスポザーゼの前記二本鎖結合部位を認識するトランスポザーゼの存在下に前記置換複合体を配置することと、
前記標的領域の代わりに目的の前記領域を含む前記ハイブリッド核酸分子を得るために、組み合わせ複合体を組換えることと、を含み、
次のこと：ヒトの生殖系列遺伝的同一性を改変するための方法ではないこと、かつ手術又は療法によって前記ヒト又は動物の身体を治療するための方法ではないことを条件とする、方法。
【請求項15】
細胞のゲノムを編集するためのインビトロ又はエクスビボ方法であって、前記細胞の前記ゲノムの二本鎖ＤＮＡの特定の断片を目的の他の二本鎖ＤＮＡ断片で置換して、二本鎖ＤＮＡの前記特定の断片の代わりに目的の前記他の二本鎖ＤＮＡ断片を含む組換えハイブリッドゲノムを得ることを可能にするものであり、請求項１０に記載の第１の集合体を準備することであって、
前記第１の分子の前記Ａ配列が、前記特定の断片の５’に隣接領域の相補配列を含み、
前記第２の分子の前記Ｂ配列が、前記特定の断片の３’に隣接領域の相補配列を含み、
前記第３の分子が、前記第１の分子の前記トランスポザーゼを認識するための前記第２の配列の相補配列と、前記第２の分子の前記トランスポザーゼを認識するための前記第１の配列の前記相補配列との間に位置する領域の間に、前記特定の断片の鎖のうちの一方の配列を含む、請求項１０に記載の第１の集合体を準備することと、
任意選択で、請求項１０に記載の第２の集合体を準備することであって、
前記第２の集合体の前記第１の分子の前記相補領域の前記Ａ配列が、前記特定の断片の５’に隣接領域の相補配列を含み、
前記第２の集合体の前記第２の分子の前記相補領域の前記Ｂ配列が、前記特定の断片の３’に隣接領域の相補配列を含み、
前記第２の集合体の前記第３の分子が、前記第２の集合体の前記第１の分子の前記トランスポザーゼを認識するための前記第２の配列の相補配列と、前記第２の集合体の前記第２の分子の前記トランスポザーゼを認識するための前記第１の配列の前記相補配列との間に位置する領域の間に、前記第１の集合体の前記第３の配列に含まれる前記特定の断片の相補鎖の配列を含み、
前記第１の集合体の前記第１の分子のＡ領域に含まれる前記特定の断片の５’の隣接領域の前記相補配列が、前記第２の集合体の前記第１の分子のＡ領域に含まれる前記特定の断片の５’の隣接領域の前記相補配列に対して最大で９５％相補的であり、
前記第１の集合体の前記第１の分子のＢ領域に含まれる前記特定の断片の３’の隣接領域の前記相補配列が、前記第２の集合体の前記第１の分子のＢ領域に含まれる前記特定の断片の３’の隣接領域の前記相補配列に対して最大で９５％相補的である、請求項１０に記載の第２の集合体を準備することと、
組換え複合体を得るために、
編集される準備が整った細胞を得るために、前記細胞を前記組換え複合体と接触させることと、
編集された細胞を得るために、編集される準備が整った前記細胞において前記トランスポザーゼを発現させることと、
前記編集された細胞を選択することであって、前記編集された細胞のゲノムが、前記特定の二本鎖ＤＮＡ断片の代わりに、目的の前記他の二本鎖ＤＮＡ断片を含む、選択することと、を含み、
次のこと：ヒトの生殖系列遺伝的同一性を改変するための方法ではないこと、かつ手術又は療法によって前記ヒト又は動物の身体を治療するための方法ではないことを条件とする、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ゲノム編集のための組成物及び方法に関する。
【0002】
生細胞の遺伝情報を改変することの効果を理解したいという願望は、遺伝学の最初の工程にさかのぼる。
【0003】
第一に、従来の遺伝学は、特定の遺伝子部位を選択することによって、遺伝子改変及びそれから生じる表現型を理解しようと試みる。
【0004】
その後、生化学者は、実験生物における遺伝子変異の確率を増加させるために放射線及び化学的突然変異誘発剤を使用してきた。これらの方法は、非常に有用であるが、高価であり、遺伝物質に導入された改変の容易な制御を可能にしない。
【0005】
細胞修復又は宿主生物に対する防御のための分子生物学及び分子機構の知識は、多数の技術を開発することを可能にし、いわゆる逆遺伝学の開発を可能にし、その目的は、いわゆる従来の遺伝子スクリーニングの反対である。
【0006】
逆遺伝学は、得られる表現型効果を測定及び分析する目的で遺伝物質に変異を導入することを目的とする。
【0007】
ゲノム編集戦略は、ここ３０年にわたって進化しており、標的遺伝子改変の文脈における最新の革新及び改革は、ＣＲＩＳＰＲ／タンパク質９（Ｃａｓ９）関連ＣＲＩＳＰＲ系（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ－９）である。この点に関して、欧州特許第３１４４３９０ Ｂ１号及び米国特許第８６９７３５９ Ｂ１号の２つの特許を挙げることができ、両方ともこの技術を記載している。
【0008】
したがって、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ－９系は、それ自体を遺伝子改変のための参照ツールとして課している。しかしながら、このＣＲＩＳＰＲ改革は分子バサミに類似しており、エクソン全体の全組換えを可能にするのに十分ではない。
【0009】
より最近では、ＣＲＩＳＰＲ（トランスポゾンコードＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系）系によってコードされるトランスポザーゼは、ＣＲＩＳＰＲ技術の欠損に対する半応答である。実際、この技術は、トランスポゾンＴｎ７を介して標的化された組込みと、それに続くＣＲＩＳＰＲ技術によるゲノムへの配列の付加の両方を使用する。しかしながら、いかなる場合も、それは組換えではない。
【0010】
プライム編集技術は、ＣＲＩＳＰＲツールを逆転写酵素と関連付ける遺伝子置換の別の可能性である。ゲノム編集におけるこの最新の進化は、サイズに依存して、２つのＤＮＡ鎖のうちの一方の置換を可能にするが、これは依然として、細胞組込み及び修復系に固有であり、それらに付随する強い制限である。
【0011】
また、本発明は、特に、従来技術のこれらの欠点を克服することを目的とする。
【0012】
本発明の目的のうちの１つは、ゲノム編集を可能にする組換えツールを提供することである。
【0013】
本発明の別の目的は、この新たなツールが操作される配列のサイズに依存せず、この系がユーザによって制御され、かつ制御可能にすることである。
【0014】
本発明の更に別の目的は、制御され、かつ制限された様式でＤＮＡ修復系を使用して、ユーザの意思で、目的の分子の一本鎖又は二本鎖置換を可能にするツールを提供することである。
【0015】
本発明は、目的の核酸の相補配列の挿入を可能にするＡ配列を含むか、又は本質的にそれからなる第１の一本鎖核酸分子であって、
Ａ配列が、５’で４０～６０ヌクレオチド長の第１のＴリッチ配列に結合し、３’で４０～６０ヌクレオチド長の第２のＴリッチ配列に結合し、第１及び第２のＴリッチ配列が、それぞれ６～１２個のＧ／Ｃリッチヌクレオチドの第１及び第２のドメインを含み、第１のドメインの配列が、第２のドメインの配列に相補的であり、第１及び第２のドメインが、Ａ配列から１５～５２ヌクレオチドに位置付けられ、第１の分子が、その５’末端に、トランスポザーゼを認識するための５’から３’に配向された第１の配列と、その３’末端に、トランスポザーゼを認識するための少なくとも１つの第２の配列と、を含む、第１の一本鎖核酸分子に関する。
Ａ配列が、５’で４０～６０ヌクレオチド長の第１のＴリッチ配列に結合し、３’で４０～６０ヌクレオチド長の第２のＴリッチ配列に結合し、第１及び第２のＴリッチ配列が、それぞれ６～１２個のＧ／Ｃリッチヌクレオチドの第１及び第２のドメインを含み、第１のドメインの配列が、第２のドメインの配列に相補的であり、第１及び第２のドメインが、Ａ配列から１５～５２ヌクレオチドに位置付けられ、第１の分子が、その５’末端に、トランスポザーゼを認識するための５’から３’に配向された第１の配列と、その３’末端に、トランスポザーゼを認識するための少なくとも１つの第２の配列と、を含む、第１の一本鎖核酸分子に関する。
【0016】
また、本発明は、
目的の核酸の相補配列の挿入を可能にするＡ配列を含むか、又は本質的にそれからなる第１の一本鎖核酸分子であって、
Ａ配列が、５’で４０～６０ヌクレオチド長の第１のＡ／Ｔリッチ、特にＴリッチ配列に結合し、３’で４０～６０ヌクレオチド長の第２のＡ／Ｔリッチ、特にＴリッチ配列に結合し、第１及び第２のＡ／Ｔリッチ、特にＴリッチ配列が、それぞれ６～１２個のＧ／Ｃリッチヌクレオチドの第１及び第２のドメインを含み、第１のドメインの配列が、第２のドメインの配列に相補的であり、第１及び第２のドメインが、Ａ配列から１５～５２ヌクレオチドに位置付けられ、第１の分子が、その５’末端に、トランスポザーゼを認識するための５’から３’に配向された第１の配列と、その３’末端に、トランスポザーゼを認識するための少なくとも１つの第２の配列と、を含む、第１の一本鎖核酸分子と、
トランスポザーゼを認識するための第２の配列の少なくとも１つの相補配列をその５’末端に含むか、又は本質的にそれからなる第２の一本鎖核酸分子と、を含む、分子複合体であって、
第１及び第２の一本鎖核酸分子が、トランスポザーゼの２つの二本鎖結合部位を規定するように、ワトソン・クリックによって規定される塩基相補性に従って対合しているようなものである、分子複合体に関する。
目的の核酸の相補配列の挿入を可能にするＡ配列を含むか、又は本質的にそれからなる第１の一本鎖核酸分子であって、
Ａ配列が、５’で４０～６０ヌクレオチド長の第１のＡ／Ｔリッチ、特にＴリッチ配列に結合し、３’で４０～６０ヌクレオチド長の第２のＡ／Ｔリッチ、特にＴリッチ配列に結合し、第１及び第２のＡ／Ｔリッチ、特にＴリッチ配列が、それぞれ６～１２個のＧ／Ｃリッチヌクレオチドの第１及び第２のドメインを含み、第１のドメインの配列が、第２のドメインの配列に相補的であり、第１及び第２のドメインが、Ａ配列から１５～５２ヌクレオチドに位置付けられ、第１の分子が、その５’末端に、トランスポザーゼを認識するための５’から３’に配向された第１の配列と、その３’末端に、トランスポザーゼを認識するための少なくとも１つの第２の配列と、を含む、第１の一本鎖核酸分子と、
トランスポザーゼを認識するための第２の配列の少なくとも１つの相補配列をその５’末端に含むか、又は本質的にそれからなる第２の一本鎖核酸分子と、を含む、分子複合体であって、
第１及び第２の一本鎖核酸分子が、トランスポザーゼの２つの二本鎖結合部位を規定するように、ワトソン・クリックによって規定される塩基相補性に従って対合しているようなものである、分子複合体に関する。
【0017】
これは、本発明が、第１の一本鎖核酸分子及び第２の一本鎖核酸分子を含む分子複合体であって、第２の一本鎖核酸分子が、その５’末端に、トランスポザーゼを認識するための第２の配列の少なくとも１つの相補配列を含むか、又は本質的にそれからなり、
第１及び第２の一本鎖核酸分子が、トランスポザーゼの２つの二本鎖結合部位を規定するように、ワトソン・クリックによって規定される塩基相補性に従って対合しているようなものである、分子複合体に関することを意味する。
第１及び第２の一本鎖核酸分子が、トランスポザーゼの２つの二本鎖結合部位を規定するように、ワトソン・クリックによって規定される塩基相補性に従って対合しているようなものである、分子複合体に関することを意味する。
【0018】
本発明は、目的の核酸の領域を標的とすることができる特定の一本鎖ガイドの使用が、制御された「部位特異的」様式でトランスポザーゼを動員することを可能にし、したがってトランスポザーゼの組換え特性を使用して目的の分子中の配列を置換することを可能にするという、本発明者によってなされた予想外の観察に基づく。
【0019】
前述の分子複合体は、実際、本発明において規定される技術の基本単位である。この基本単位は、組換え、したがって配列置換が起こらなければならない特定の部位にリコンビナーゼを誘導するのに有用である。ＰＡＭ型（ＮＧＧ）配列の存在を必要とするＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系とは異なり、本明細書で規定される分子ツールは、その配列にかかわらず、任意の標的配列に対して使用され得る。
【0020】
したがって、前述の分子複合体は、以下によって完成される基本単位である。
標的配列の相同性領域、及び
標的配列の置換領域。
標的配列の相同性領域、及び
標的配列の置換領域。
【0021】
したがって、これは、以下に説明するツールの中間産物である。
【0022】
分子複合体は、２つの一本鎖核酸分子からなり、これは、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子又は混合ＲＮＡ及びＤＮＡ分子であり得る。
【0023】
これらの２つの分子は、ワトソン・クリックによって規定される核酸の塩基相補性に従って、互いに部分的に相補的であり、すなわち、アデニンはチミジン又はウラシルと対合し、シトシンはグアニンと対合し、逆もまた同様である。
【0024】
より具体的には、前述の複合体を形成する２つの分子はそれぞれ、トランスポザーゼの結合配列に対応する二本鎖分子の鎖のうちの一方の配列を含む。また、各一本鎖分子は、したがって、トランスポザーゼ結合「半配列」を含み、したがって、対応するトランスポザーゼと相互作用することができない。他方、複合体の２つの分子が一緒に相互作用する場合、本明細書において先に規定されたような塩基対形成によって、二本鎖分子がこのように形成され、トランスポザーゼの二本鎖結合部位を再構成し、したがって後者は形成された分子と相互作用することができる。
【0025】
第１の分子。
【0026】
複合体の第１の分子は、修飾されると、目的の核酸分子の目的の領域を特異的に標的とすることを可能にする核酸配列を含む分子である。この目的の配列は、選択された標的に従って系のユーザによって選択される。この目的の配列は、Ａ領域で複合体の第１の分子に挿入される。このＡ領域は、標的分子を標的とすることを可能にする配列が間に挿入される少なくとも２つの核酸に対応する。核酸の配向された構造（５’から３’への方向）を考慮すると、標的配列との対合を可能にするためには、目的の領域を標的とすることを可能にする配列が正しい方向に位置付けられることが重要である。
【0027】
また、有利には、Ａ領域は、配向された挿入を促進するために制限酵素を認識する１つ以上の部位を含む。以下の部位のうちの１つ以上がＡ領域に存在し得る。
【0028】
【表1(01)】
【0029】
【表1(02)】
【0030】
【表1(03)】
【0031】
【表1(04)】
【0032】
【表1(05)】
【0033】
【表1(06)】
【0034】
明らかに、第１の分子の化学合成の文脈において、標的領域を標的とすることを可能にする配列のクローニング（又は挿入）部位を有する必要はなく、むしろ、正確に配向された配列を提供するために十分な注意を払う必要がある。しかしながら、これはもちろん可能である。
【0035】
第１の分子は更に、構造のある特定の柔軟性を可能にするために、Ａ領域のいずれかの側において、Ａ／Ｔリッチ配列からなり、又はＲＮＡの場合には、Ａ／Ｕリッチ配列からなる。Ａ／Ｔリッチ又はＡ／Ｕリッチは、本発明において、配列を構成するヌクレオチドの総数に対して、５０％を超えるＡ若しくはＴ、又はＵ、好ましくは５０％を超えるＴ若しくはＵを含む配列を意味すると理解される。Ａ領域のいずれかの側のこれらの配列は、１０ヌクレオチド～６０ヌクレオチドの範囲のヌクレオチドサイズを有する。
【0036】
Ａ領域に隣接するこれらの配列の柔軟性は、多数のＡ、Ｔ又はＵ塩基の存在に起因して、おそらく複合体がまだ標的分子を認識していない場合であっても、十分に制御されていないリコンビナーゼを介した組換えを可能にする効果を有し得る。
【0037】
また、この問題を克服するために、ＧＣリッチ配列が、Ａ領域に隣接するＡ／Ｔリッチ配列、特にＴリッチ配列、又はＡ／Ｕリッチ配列の各々に導入される。これらのＧ／Ｃリッチ領域は、６～１２ヌクレオチドからなり、Ｃ又はＧ塩基の量は、Ｇ／Ｃリッチ配列に含まれるヌクレオチドの５０％を超える。
【0038】
第１の分子の構造を安定化させるために、かつ、本明細書において先に記載されたように、不注意な組換えを防ぐために、Ｇ／Ｃリッチ領域は、Ａ領域の末端から１５～５２ヌクレオチドに位置付けられる。
【0039】
より明確にするために、Ａ領域が３つのヌクレオチド（中央ヌクレオチドが０位に対応する）からなる場合、Ａ／Ｔリッチ領域又はＡ／Ｕリッチ領域は、左側の－２位及び右側の＋２位から始まる。したがって、Ｇ／Ｃリッチ領域は、左側では－１７位～－５４位に位置付けられ、右側では＋１７位～＋５４位に位置付けられる。
【0040】
別の重要な要素：Ａ領域の右側（又は５’）のＧ／Ｃリッチ配列は、Ａ領域の右側（又は３’）のＧ／Ｃリッチ領域に対して必然的に相補的である（ワトソン・クリック対合則に従う）。また、第１の一本鎖分子は、Ｇ／Ｃリッチ領域でそれ自体と対合し、第１の分子のＡ領域に挿入される領域の相補的標的配列との相互作用がない限り、トランスポザーゼによる任意の組換えを防止する。
【0041】
最後に、第１の分子は、その５’末端にトランスポザーゼに結合するための第１の部位に対応する配列を含み、その３’末端にトランスポザーゼに結合するための第２の部位を含む。
【0042】
第１の結合部位及び第２の結合部位は有利には同じであり、とりわけ両方ともトランスポザーゼの二本鎖結合部位の同じ鎖に対応する。これは、第１の分子の５’領域に存在する第１のトランスポザーゼ結合部位のみが、３’領域に存在するトランスポザーゼ結合部位と一体的に、したがって安定に対合することができることを意味する。
【0043】
第１の結合部位及び第２の結合部位は有利には同じであるが、各々が二本鎖トランスポザーゼ結合部位の異なる鎖に対応する。また、例えば、第１のトランスポザーゼ結合部位がセンス鎖に対応する場合、第２のトランスポザーゼ結合部位は相補鎖の配列に対応する。次いで、２つの立体配置のいずれかを有することが可能である：ｉ）相補鎖に対応する第２の結合部位が３’から５’方向に配向される（この場合、第１のトランスポザーゼ結合部位と対合して二本鎖部位を形成することができる）か、又はｉｉ）相補鎖に対応する第２の結合部位が５’から３’への方向に配向される（この場合、それらの配向が相補的でないために、第１のトランスポザーゼ結合配列と対合することができない）。上記の場合ｉ）において、第１の一本鎖分子が第１及び第２の結合部位でそれ自体と対合する場合、２つの二本鎖トランスポザーゼ結合部位を形成するように第２の分子と対合するために利用可能な一本鎖相補領域がもはや存在しないので、前述の複合体を形成することは不可能である。
【0044】
また、第１の分子は、Ａ部分に標的領域の相補配列を欠いている場合、又はそのような標的配列を含むがこの標的配列と相互作用しない（対合しない）場合、互いに対合するＧ／Ｃリッチ領域に対応する領域を除いて分子全体が一本鎖である三次元構造を形成する。
【0045】
【0046】
第２の分子。
【0047】
前述の複合体の第２の分子は、第１の分子よりも単純である。第２の分子は、その５’部分に、第１の分子の３’部分に存在するトランスポザーゼに結合するための部位に相補的であるトランスポザーゼ結合部位を含む。したがって、複合体が形成される場合、第１の分子の３’に位置する（一本鎖）トランスポザーゼ結合半部位は、第２の分子の５’に位置する（一本鎖）トランスポザーゼ結合半部位と対合して、二本鎖トランスポザーゼ結合部位、トランスポザーゼが結合することができる二本鎖部位を形成することができる。
【0048】
第２の分子の３’部分には、第１の分子のＡ領域に類似した領域があり、この領域は、目的の標的分子の代わりに挿入される配列に対応する特定の配列を受容することを可能にする。以下は、この置換を可能にする第２の分子を調製する方法のより詳細な説明である。
【0049】
複合体
第１の分子と第２の分子から形成される複合体を［図３］に模式的に示す。
第１の分子と第２の分子から形成される複合体を［図３］に模式的に示す。
【0050】
複合体は、第１の分子と第２の分子とがトランスポザーゼ結合半部位を介して対合している場合に、複合体がトランスポザーゼ二量体（組換えを可能にする機能的二量体）を結合することができるようなものである。
【0051】
また、第１又は第２の分子のうちのいずれか一方は、第１の分子の５’に位置するトランスポザーゼ結合半部位の相補配列を更に含む。第１の分子の５’に位置するトランスポザーゼ結合部位のこの相補領域は、第１の分子の５’若しくは３’に、又は更には第２の分子の５’に、好ましくは第１の分子の３’に位置するトランスポザーゼ結合部位の相補配列の５’に位置し得る。
【0052】
本発明では、「第１及び第２の一本鎖核酸分子が、トランスポザーゼの２つの二本鎖結合部位を規定するように、ワトソン・クリックによって規定される塩基相補性に従って対合しているようなものである」。第１の分子は、その５’領域に少なくとも１つのトランスポザーゼ結合半部位を含み、その３’領域に少なくとも１つのトランスポザーゼ結合半部位を含み、第２の分子もまた、少なくとも１つのトランスポザーゼ結合半部位を含むので、これは、
＊第１の分子が、その５’領域に、第１のトランスポザーゼ結合部位の第１の配列及び第１のトランスポザーゼ結合部位の第１の配列の相補配列を含み、その３’部分に、第２のトランスポザーゼ結合部位の第２の配列を含み、
＊第２の分子が、第２のトランスポザーゼ結合部位の第２の配列の相補配列を含むか、
又は
＊第１の分子が、その５’領域に第１のトランスポザーゼ結合部位の第１の配列を含み、その３’部分に第２のトランスポザーゼ結合部位の第２の配列及び第１のトランスポザーゼ結合部位の第１の配列の相補配列を含み、
＊第２の分子が、第２のトランスポザーゼ結合部位の第２の配列の相補配列を含むか、
又は
＊第１の分子が、その５’領域に第１のトランスポザーゼ結合部位の第１の配列を含み、その３’部分に第２のトランスポザーゼ結合部位の第２の配列を含み、
＊第２の分子が、第１のトランスポザーゼ結合部位の第１の配列の相補配列、及び第２のトランスポザーゼ結合部位の第２の配列の相補配列を含むので、
第１の分子と第２の分子との間の対合中に、２つの完全な部位が形成されることを意味する。
＊第１の分子が、その５’領域に、第１のトランスポザーゼ結合部位の第１の配列及び第１のトランスポザーゼ結合部位の第１の配列の相補配列を含み、その３’部分に、第２のトランスポザーゼ結合部位の第２の配列を含み、
＊第２の分子が、第２のトランスポザーゼ結合部位の第２の配列の相補配列を含むか、
又は
＊第１の分子が、その５’領域に第１のトランスポザーゼ結合部位の第１の配列を含み、その３’部分に第２のトランスポザーゼ結合部位の第２の配列及び第１のトランスポザーゼ結合部位の第１の配列の相補配列を含み、
＊第２の分子が、第２のトランスポザーゼ結合部位の第２の配列の相補配列を含むか、
又は
＊第１の分子が、その５’領域に第１のトランスポザーゼ結合部位の第１の配列を含み、その３’部分に第２のトランスポザーゼ結合部位の第２の配列を含み、
＊第２の分子が、第１のトランスポザーゼ結合部位の第１の配列の相補配列、及び第２のトランスポザーゼ結合部位の第２の配列の相補配列を含むので、
第１の分子と第２の分子との間の対合中に、２つの完全な部位が形成されることを意味する。
【0053】
使用される用語「少なくとも」、及び分子がトランスポザーゼ認識部位を形成する配列を「含む」という事実は、当業者が結合部位を形成する半配列の位置を選択することを可能にし、その結果、最終的に、複合体が形成される場合、２つの完全な部位が再構成される。
【0054】
３つの選択肢（そのうちの２つを以下に詳述する）を［図４］に概略的に示す。
【0055】
有利には、本発明は、Ａ配列が目的の核酸の相補配列を含む、前述の複合体に関する。
【0056】
上記のように、Ａ領域は、目的の核酸の相補配列を含み得る。より詳細には、上記複合体の第１の分子のＡ領域に含まれる配列は、目的の分子の配列の５’又は３’の配列に相補的であり、その結果、この複合体は、核酸分子のこの領域を特異的に認識し、この複合体が、Ａ領域に含まれる配列に相補的な領域に相補的な領域に隣接領域を置換することを可能にする。
【0057】
換言すれば、本発明は、有利には、
目的の核酸の相補配列の挿入を可能にするＡ配列を含むか、又は本質的にそれからなる第１の一本鎖核酸分子であって、相補Ａ配列が、５’で４０～６０ヌクレオチド長の第１のＡ／Ｔリッチ、特にＴリッチ配列に結合し、３’で４０～６０ヌクレオチド長の第２のＡ／Ｔリッチ、特にＴリッチ配列に結合し、第１及び第２のＡ／Ｔリッチ、特にＴリッチ配列が、それぞれ６～１２個のＧ／Ｃリッチヌクレオチドの第１及び第２のドメインを含み、第１のドメインの配列が第２のドメインの配列に相補的であり、第１及び第２のドメインがＡ配列から１５～５２ヌクレオチドに位置付けられ、第１の分子が、その５’末端に、トランスポザーゼを認識するための５’から３’に配向された第１の配列と、その３’末端に、トランスポザーゼを認識するための少なくとも１つの第２の配列と、を含む、第１の一本鎖核酸分子と、
トランスポザーゼを認識するための第２の配列の少なくとも１つの相補配列をその５’末端に含むか、又は本質的にそれからなる第２の一本鎖核酸分子と、を含む、前述の複合体であって、
第１及び第２の一本鎖核酸分子が、トランスポザーゼの２つの二本鎖結合部位を規定するように、ワトソン・クリックによって規定される塩基相補性に従って対合している、前述の複合体に関する。
目的の核酸の相補配列の挿入を可能にするＡ配列を含むか、又は本質的にそれからなる第１の一本鎖核酸分子であって、相補Ａ配列が、５’で４０～６０ヌクレオチド長の第１のＡ／Ｔリッチ、特にＴリッチ配列に結合し、３’で４０～６０ヌクレオチド長の第２のＡ／Ｔリッチ、特にＴリッチ配列に結合し、第１及び第２のＡ／Ｔリッチ、特にＴリッチ配列が、それぞれ６～１２個のＧ／Ｃリッチヌクレオチドの第１及び第２のドメインを含み、第１のドメインの配列が第２のドメインの配列に相補的であり、第１及び第２のドメインがＡ配列から１５～５２ヌクレオチドに位置付けられ、第１の分子が、その５’末端に、トランスポザーゼを認識するための５’から３’に配向された第１の配列と、その３’末端に、トランスポザーゼを認識するための少なくとも１つの第２の配列と、を含む、第１の一本鎖核酸分子と、
トランスポザーゼを認識するための第２の配列の少なくとも１つの相補配列をその５’末端に含むか、又は本質的にそれからなる第２の一本鎖核酸分子と、を含む、前述の複合体であって、
第１及び第２の一本鎖核酸分子が、トランスポザーゼの２つの二本鎖結合部位を規定するように、ワトソン・クリックによって規定される塩基相補性に従って対合している、前述の複合体に関する。
【0058】
有利な一実施形態では、本発明は、第１の分子が、その５’末端に、トランスポザーゼを認識するための５’から３’に配向された第１の配列と、その３’末端に、トランスポザーゼを認識するための５’から３’に配向された第２の配列と、を含み、
第２の分子が、その５’末端に、トランスポザーゼを認識するための第１の配列の第１の相補配列と、それに続く、トランスポザーゼを認識するための第２の配列の第２の相補配列と、を含む、前述の複合体に関する。
第２の分子が、その５’末端に、トランスポザーゼを認識するための第１の配列の第１の相補配列と、それに続く、トランスポザーゼを認識するための第２の配列の第２の相補配列と、を含む、前述の複合体に関する。
【0059】
本発明の複合体のこの有利な実施形態において、第１の分子は、５’位に第１のトランスポザーゼ認識配列と、３’位に第２のトランスポザーゼ認識配列と、を含む。次に、第２の分子は、５’位に、第１の分子の第１のトランスポザーゼ認識配列の第１の相補配列と、それに続く、第１の分子の第２のトランスポザーゼ認識配列の第２の相補配列と、を含む。また、複合体の各分子は、２つのトランスポザーゼ結合半部位を含み、その結果、複合体が形成されると、すなわち、第１の分子が第２の分子と対合すると、２つの隣接する二本鎖トランスポザーゼ結合部位が形成され、次いでトランスポザーゼ二量体がそれに結合することができる。
【0060】
［図５］は、この実施形態を概略的に示す。
【0061】
有利には、本発明は、第１の分子が、その５’末端に、トランスポザーゼを認識するための５’から３’に配向された第１の配列と、その３’末端に、トランスポザーゼを認識するための第２の配列と、それに続く、トランスポザーゼを認識するための第１の配列の第１の相補配列と、を含み、
第２の分子が、その５’末端に、トランスポザーゼを認識するための第２の配列の相補配列を含む、前述の複合体に関する。
第２の分子が、その５’末端に、トランスポザーゼを認識するための第２の配列の相補配列を含む、前述の複合体に関する。
【0062】
本発明の複合体のこの有利な実施形態において、第１の分子は、５’位に第１のトランスポザーゼ認識配列及び３’位に第２のトランスポザーゼ認識配列を含み、後者のすぐ後に、第１の分子の５’に位置するトランスポザーゼ認識配列の第１の相補配列が続く。次に、第２の分子は、５’位に、第１の分子の第２のトランスポザーゼ認識配列の第２の相補配列を含む。
【0063】
また、この実施形態では、第１の分子は、第１の分子の５’の第１の認識配列と分子の３’の第１の認識配列とを対合させることによって、トランスポザーゼ認識二本鎖結合部位を再形成することができる。次に、第１の分子の３’にある第２の認識配列及び第２の分子の５’に位置する第２の相補的トランスポザーゼ認識配列を用いて第２の二本鎖トランスポザーゼ結合部位を再構成するために、第２の分子を第１の分子と対合させなければならない。
【0064】
図６Ｂは、この実施形態を概略的に示す。
【0065】
第１の分子が５’に第１のトランスポザーゼ認識部位の第１の相補配列と、それに続く、第１のトランスポザーゼ認識部位と、を含む、本発明による複合体の別の有利な実施形態を想定することも可能である。更に、第１の分子は、３’に第２のトランスポザーゼ認識部位を含む。次に、第２の分子は、前述の実施形態に関して変化しないままである。
【0066】
本明細書において、第１の分子の５’部分は、第１の認識部位及び直接隣接する相補配列によって、対合によって二本鎖トランスポザーゼ認識部位を再構成するように、それ自体の上に折り畳まれる。この実施形態は、［図７］に示されている。
【0067】
第１の分子が５’に第１のトランスポザーゼ部位の第１の相補配列を含み、その直後に第１のトランスポザーゼを認識するための第１の部位を含む、追加の同様の実施形態が存在する。
【0068】
有利には、上記トランスポザーゼは、トランスポゾンＴｎ５のトランスポザーゼ、トランスポゾンＴｎ９のトランスポザーゼ、トランスポゾンＴｎ１０、Ｔｎ９０３、Ｔｎ６０２のトランスポザーゼ、又は更にトランスポゾンＴｃ１のトランスポザーゼ、又はより一般的にはｍａｒｉｎｅｒトランスポゾンスーパーファミリーのトランスポザーゼから選択される細菌型トランスポザーゼである。
【0069】
本発明の文脈において使用することができるトランスポザーゼの他の例は、ビブリオ・ハーベイ（Ｖｉｂｒｉｏ ｈａｒｖｅｙｉ）トランスポザーゼ（Ａｇｉｌｅｎｔによって特徴付けられ、製品ＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ ＱＸＴにおいて使用されるトランスポザーゼ）、ＭｕｔＡトランスポザーゼ並びに末端配列Ｒ１及びＲ２を含むＭｕトランスポザーゼ認識部位、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）トランスポゾンＴｎ５５２のトランスポザーゼ、トランスポゾンＴｎ７のトランスポザーゼ、Ｔｎ／Ｏ及びＩＳ１０トランスポザーゼ、トランスポゾンＴｎ３のトランスポザーゼである。
【0070】
Ｔｎ５トランスポザーゼが最もよく知られている。これはトランスポゾンＴｎ５のＴｎｐ遺伝子によってコードされる。トランスポザーゼは、その標的配列に結合するトランスポザーゼ二量体を形成することによって転位を開始する。この複合体に関連して、トランスポザーゼは、次いで、４つのホスホリル転移反応（ＤＮＡ切断、ＤＮＡヘアピン形成、ヘアピン分解及び標的ＤＮＡへの鎖転移）を触媒し、トランスポゾンのその新たなＤＮＡ部位への組込みをもたらす。これは、「タグメンテーション」として知られるものである。
【0071】
本発明は、このタグメンテーション原理に基づいている。トランスポザーゼのタグメンテーション特性を使用することによって、前述の複合体によって、１つの配列を別の配列に標的化された様式で挿入することが可能である。
【0072】
また、本発明の文脈において、トランスポザーゼについて言及される場合、前述のトランスポザーゼのうちの１つ、すなわち、トランスポゾンＴｎ５、Ｔｎ９、Ｔｎ１０又はＴｃ１／ｍａｒｉｎｅｒのトランスポザーゼ（又はそれらの転位若しくはタグメンテーション活性を増加させるように変異させたトランスポザーゼ）について言及されている。
【0073】
本発明において、第１の分子と第３の分子により形成される複合体に結合するトランスポザーゼと、第２の分子と第３の分子により形成される複合体に結合するトランスポザーゼを同時に用いる場合、トランスポゾンＴｎ５とＴｎ１０に由来するトランスポザーゼの対が好ましい。
【0074】
１つの有利な実施形態において、本発明は、前述の複合体の第１の分子の発現を可能にするベクターと、前述の第２の分子の発現を可能にするベクターと、を含む、キットに関する。
【0075】
このキットに関連して、ベクターは、好ましくは、宿主細胞（原核細胞及び／又は真核細胞）における複製を可能にするための全ての要素を有し、かつ前述の複合体の第１又は第２の分子の発現を可能にするための要素を有する二本鎖ＤＮＡの環状分子である。
【0076】
第１の分子及び第２の分子が一本鎖ＤＮＡ分子の形態でなければならない場合、第１及び第２の分子の各々の配列は、二本鎖ＤＮＡからの一本鎖ＤＮＡの合成を可能にする配列の制御下にある。これは、例えば、ファージミド型ベクターに含まれるｆ１バクテリオファージの複製起点配列の場合である。したがって、ｆ１配列を活性化するのに必要な全ての遺伝子を有する補助相Ｍ１３の存在下で、ベクターは二本鎖プラスミドＤＮＡから一本鎖ＤＮＡを産生する。
【0077】
したがって、キットは、前述の複合体を形成する第１及び第２の分子のうちの一方又は他方の配列を各々含む２つの独立したベクター、又は２つの配列を含むが互いに遺伝的に単離された単一のベクターのいずれかを含むことができる。
【0078】
前述のキットはまた、転位を可能にするトランスポザーゼなどの他の要素を含んでもよい。
【0079】
有利には、前述の複合体は、第１及び第２のトランスポザーゼ認識配列が、以下の配列のうちの１つを有するＴｎ５トランスポザーゼを認識するための配列であるようなものである：
－ＣＴＧｔＣＴＣＴＴａｔａＣＡｃＡｔｃＴ（配列番号１）、
－ＣＴＧＡＣＴＣＴＴａｔａＣＡＣＡａｇＴ（配列番号３）、及び
－ＣＴＧｔＣＴＣＴＴｇａｔＣＡｇＡＴＣＴ（配列番号５）。
－ＣＴＧｔＣＴＣＴＴａｔａＣＡｃＡｔｃＴ（配列番号１）、
－ＣＴＧＡＣＴＣＴＴａｔａＣＡＣＡａｇＴ（配列番号３）、及び
－ＣＴＧｔＣＴＣＴＴｇａｔＣＡｇＡＴＣＴ（配列番号５）。
【0080】
結果として、対応する相補配列は以下の通りである：
－ＡｇａＴｇＴＧｔａｔＡＡＧＡＧａＣＡＧ（配列番号２）、
－ＡｃｔＴＧＴＧｔａｔＡＡＧＡＧＴＣＡＧ（配列番号４）、及び
－ＡＧＡＴｃＴＧａｔｃＡＡＧＡＧａＣＡＧ（配列番号６）。
－ＡｇａＴｇＴＧｔａｔＡＡＧＡＧａＣＡＧ（配列番号２）、
－ＡｃｔＴＧＴＧｔａｔＡＡＧＡＧＴＣＡＧ（配列番号４）、及び
－ＡＧＡＴｃＴＧａｔｃＡＡＧＡＧａＣＡＧ（配列番号６）。
【0081】
他のトランスポザーゼ認識配列は以下の通りである：
Ｔｎ５ＭＥｒｅｖ、
５’－［ｐｈｏｓ］ＣＴＧＴＣＴＣＴＴＡＴＡＣＡＣＡＴＣＴ－３’（配列番号１１）
Ｔｎ５ＭＥ－Ａ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＦＣ－１２１－１０３０）、
５’－ＴＣＧＴＣＧＧＣＡＧＣＧＴＣＡＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＡＧＡＧＡＣＡＧ－３’、（配列番号１２）
及びＴｎ５ＭＥ－Ｂ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＦＣ－１２１－１０３１）、
５’－ＧＴＣＴＣＧＴＧＧＧＣＴＣＧＧＡＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＡＧＡＧＡＣＡＧ－３’（配列番号１３）
Ｔｎ５ＭＥｒｅｖ、
５’－［ｐｈｏｓ］ＣＴＧＴＣＴＣＴＴＡＴＡＣＡＣＡＴＣＴ－３’（配列番号１１）
Ｔｎ５ＭＥ－Ａ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＦＣ－１２１－１０３０）、
５’－ＴＣＧＴＣＧＧＣＡＧＣＧＴＣＡＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＡＧＡＧＡＣＡＧ－３’、（配列番号１２）
及びＴｎ５ＭＥ－Ｂ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＦＣ－１２１－１０３１）、
５’－ＧＴＣＴＣＧＴＧＧＧＣＴＣＧＧＡＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＡＧＡＧＡＣＡＧ－３’（配列番号１３）
【0082】
更なる配列は以下の通りである。
配列番号ｉのセンス配列
配列番号ｉ＋１のアンチセンス配列、
ｉは２６９～４２４の範囲である。
配列番号ｉのセンス配列
配列番号ｉ＋１のアンチセンス配列、
ｉは２６９～４２４の範囲である。
【0083】
これは、例えば、以下のそれぞれのセンス配列及びアンチセンス配列対が考慮されることを意味する：配列番号２６９及び配列番号２７０、配列番号：２７１及び配列番号：２７２、配列番号：２７３及び配列番号：２７４、配列番号：２７５及び配列番号：２７６、配列番号：２７７及び配列番号：２７８、配列番号：２７９及び配列番号：２８０、配列番号：２８１及び配列番号：２８２、配列番号：２８３及び配列番号：２８４、配列番号：２８５及び配列番号：２８６、配列番号：２８７及び配列番号：２８８、配列番号：２８９及び配列番号：２９０、配列番号：２９１及び配列番号：２９２、配列番号：２９３及び配列番号：２９４、配列番号：２９５及び配列番号：２９６、配列番号：２９７及び配列番号：２９８、配列番号：２９９及び配列番号：３００、配列番号：３０１及び配列番号：３０２、配列番号：３０３及び配列番号：３０４、配列番号：３０５及び配列番号：３０６、配列番号：３０７及び配列番号：３０８、配列番号：３０９及び配列番号：３１０、配列番号：３１１及び配列番号：３１２、配列番号：３１３及び配列番号：３１４、配列番号：３１５及び配列番号：３１６、配列番号：３１７及び配列番号：３１８、配列番号：３１９及び配列番号：３２０、配列番号：３２１及び配列番号：３２２、配列番号：３２３及び配列番号：３２４、配列番号：３２５及び配列番号：３２６、配列番号：３２７及び配列番号：３２８、配列番号：３２９及び配列番号：３３０、配列番号：３３１及び配列番号：３３２、配列番号：３３３及び配列番号：３３４、配列番号：３３５及び配列番号：３３６、配列番号：３３７及び配列番号：３３８、配列番号：３３９及び配列番号：３４０、配列番号：３４１及び配列番号：３４２、配列番号：３４３及び配列番号：３４４、配列番号：３４５及び配列番号：３４６、配列番号：３４７及び配列番号：３４８、配列番号：３４９及び配列番号：３５０、配列番号：３５１及び配列番号：３５２、配列番号：３５３及び配列番号：３５４、配列番号：３５５及び配列番号：３５６、配列番号：３５７及び配列番号：３５８、配列番号：３５９及び配列番号：３６０、配列番号：３６１及び配列番号：３６２、配列番号：３６３及び配列番号：３６４、配列番号：３６５及び配列番号：３６６、配列番号：３６７及び配列番号：３６８、配列番号：３６９及び配列番号：３７０、配列番号：３７１及び配列番号：３７２、配列番号：３７３及び配列番号：３７４、配列番号：３７５及び配列番号：３７６、配列番号：３７７及び配列番号：３７８、配列番号：３７９及び配列番号：３８０、配列番号：３８１及び配列番号：３８２、配列番号：３８３及び配列番号：３８４、配列番号：３８５及び配列番号：３８６、配列番号：３８７及び配列番号：３８８、配列番号：３８９及び配列番号：３９０、配列番号：３９１及び配列番号：３９２、配列番号：３９３及び配列番号：３９４、配列番号：３９５及び配列番号：３９６、配列番号：３９７及び配列番号：３９８、配列番号：３９９及び配列番号：４００、配列番号：４０１及び配列番号：４０２、配列番号：４０３及び配列番号：４０４、配列番号：４０５及び配列番号：４０６、配列番号：４０７及び配列番号：４０８、配列番号：４０９及び配列番号：４１０、配列番号：４１１及び配列番号：４１２、配列番号：４１３及び配列番号：４１４、配列番号：４１５及び配列番号：４１６、配列番号：４１７及び配列番号：４１８、配列番号：４１９及び配列番号：４２０、配列番号：４２１及び配列番号：４２２、配列番号：４２３及び配列番号：４２４、
【0084】
有利には、第１の分子の第１のＧ／Ｃリッチドメインは、以下の配列
【0085】
【表2】
【0086】
第１及び第２のＧ／Ｃリッチドメインはまた、以下の配列
【0087】
【表3】
【0088】
他のＧ／Ｃリッチドメイン配列は、以下の通りであり得る：
配列ＧＧＴＣＧＣ（配列番号４２７）の第１のＧ／Ｃリッチドメイン及び配列ＧＣＧＡＣＣ（配列番号４２８）の第２のＣ／Ｃリッチドメイン。
配列ＧＧＴＣＧＣ（配列番号４２７）の第１のＧ／Ｃリッチドメイン及び配列ＧＣＧＡＣＣ（配列番号４２８）の第２のＣ／Ｃリッチドメイン。
【0089】
これらの実施例は説明のためにのみ与えられ、本発明の範囲を限定するものではない。
【0090】
有利な一実施形態では、複合体の第１の分子のＡ／Ｔリッチ配列は、Ａ若しくはＴから本質的になるか、又はＡ若しくはＴから構成される。
【0091】
更により有利には、複合体の第１の分子のＡ／Ｔリッチ配列はＴからなる。
【0092】
更により有利には、前述の複合体は、第１の分子に対応する以下の配列を含むようなものである：
【0093】
【表4】
【0094】
第１のトランスポザーゼ結合部位は隣接して示され、第２のトランスポザーゼ結合部位は下線付きで示される。
【0095】
更により有利には、前述の複合体は、第２の分子に対応する以下の配列を含むようなものである：
【0096】
【表5】
【0097】
第１のトランスポザーゼ結合部位は隣接して示され、第２のトランスポザーゼ結合部位は下線付きで示される。
【0098】
有利には、前述の複合体は、第１の分子に対応する以下の配列を含むようなものである：
【0099】
【表6】
【0100】
第１のトランスポザーゼ結合部位及び第２のトランスポザーゼ結合部位の相補配列は下線付きで示され、第１のトランスポザーゼ結合部位はイタリック体及び下線付きで示される。
【0101】
この実施形態において、前述の複合体は、第２の分子に対応する以下の配列を含むようなものである：
【0102】
【表7】
【0103】
第２のトランスポザーゼ結合部位の相補配列は下線付きで示されている。
【0104】
有利には、本発明は以下の複合体に関する：
－以下の配列の第１の分子
５’－ＴＧＣＡＧＣＴＧＲ１ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＧＧＣＧＡＴＣＧＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＸＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＧＣＧＡＴＣＧＣＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＧＡＴＡＣＡＴＧＴＴＴＲ２ＣＴＧＴＡＡＧＣ－３’（配列番号４３６）
式中、Ｒ１は、５’－ＣＴＧｔＣＴＣＴＴａｔａＣＡｃＡｔｃＴ（配列番号１）であり、
Ｒ２は、５’－ＡｇａＴｇＴＧｔａｔＡＡＧＡＧａＣＡＧ（配列番号２）であり、
Ｘは、標的領域の認識を可能にする配列に対応する
かつ、
－以下の配列を含む第２の分子：
５’－Ｒ２ＣＡＧＣＴＧＣＡＧＡＣＡＡＡＧＣＴＴＡＣＡＧＲ１ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴｃａｔａｔｇｃｃａａｇｔＹ－３’配列番号４３７）
式中、Ｒ１は、５’－ＣＴＧｔＣＴＣＴＴａｔａＣＡｃＡｔｃＴ（配列番号１）であり、
Ｒ２は、５’－ＡｇａＴｇＴＧｔａｔＡＡＧＡＧａＣＡＧ（配列番号２）であり、
Ｙは、ヌクレオチドなし、又は標的領域の置換配列に対応する。
－以下の配列の第１の分子
５’－ＴＧＣＡＧＣＴＧＲ１ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＧＧＣＧＡＴＣＧＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＸＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＧＣＧＡＴＣＧＣＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＧＡＴＡＣＡＴＧＴＴＴＲ２ＣＴＧＴＡＡＧＣ－３’（配列番号４３６）
式中、Ｒ１は、５’－ＣＴＧｔＣＴＣＴＴａｔａＣＡｃＡｔｃＴ（配列番号１）であり、
Ｒ２は、５’－ＡｇａＴｇＴＧｔａｔＡＡＧＡＧａＣＡＧ（配列番号２）であり、
Ｘは、標的領域の認識を可能にする配列に対応する
かつ、
－以下の配列を含む第２の分子：
５’－Ｒ２ＣＡＧＣＴＧＣＡＧＡＣＡＡＡＧＣＴＴＡＣＡＧＲ１ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴｃａｔａｔｇｃｃａａｇｔＹ－３’配列番号４３７）
式中、Ｒ１は、５’－ＣＴＧｔＣＴＣＴＴａｔａＣＡｃＡｔｃＴ（配列番号１）であり、
Ｒ２は、５’－ＡｇａＴｇＴＧｔａｔＡＡＧＡＧａＣＡＧ（配列番号２）であり、
Ｙは、ヌクレオチドなし、又は標的領域の置換配列に対応する。
【0105】
これは、複合体が以下の配列の分子からなることを意味する
５’－ＴＧＣＡＧＣＴＧＣＴＧｔＣＴＣＴＴａｔａＣＡｃＡｔｃＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＧＧＣＧＡＴＣＧＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＸＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＧＣＧＡＴＣＧＣＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＧＡＴＡＣＡＴＧＴＴＴＡｇａＴｇＴＧｔａｔＡＡＧＡＧａＣＡＧ ＣＴＧＴＡＡＧＣ－３’（配列番号４３８）
及び
５’－ＡｇａＴｇＴＧｔａｔＡＡＧＡＧａＣＡＧＣＡＧＣＴＧＣＡＧＡＣＡＡＡＧＣＴＴＡＣＡＧＣＴＧｔＣＴＣＴＴａｔａＣＡｃＡｔｃＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴｃａｔａｔｇｃｃａａｇｔＹ－３’（配列番号４３９）
又は、Ｘ及びＹは本明細書において先に規定した通りである。
５’－ＴＧＣＡＧＣＴＧＣＴＧｔＣＴＣＴＴａｔａＣＡｃＡｔｃＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＧＧＣＧＡＴＣＧＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＸＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＧＣＧＡＴＣＧＣＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＧＡＴＡＣＡＴＧＴＴＴＡｇａＴｇＴＧｔａｔＡＡＧＡＧａＣＡＧ ＣＴＧＴＡＡＧＣ－３’（配列番号４３８）
及び
５’－ＡｇａＴｇＴＧｔａｔＡＡＧＡＧａＣＡＧＣＡＧＣＴＧＣＡＧＡＣＡＡＡＧＣＴＴＡＣＡＧＣＴＧｔＣＴＣＴＴａｔａＣＡｃＡｔｃＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴｃａｔａｔｇｃｃａａｇｔＹ－３’（配列番号４３９）
又は、Ｘ及びＹは本明細書において先に規定した通りである。
【0106】
有利には、本発明は以下の複合体に関する：
－以下の配列の第１の分子
－以下の配列の第１の分子
【0107】
【表8】
Ｒ２は、５’－ＡｇａＴｇＴＧｔａｔＡＡＧＡＧａＣＡＧ（配列番号２）であり、
Ｘは、標的領域の認識を可能にする配列に対応する
かつ、
－以下の配列を含む第２の分子：
【0108】
【表9】
Ｒ２は、５’－ＡｇａＴｇＴＧｔａｔＡＡＧＡＧａＣＡＧ（配列番号２）であり、
Ｙは、ヌクレオチドなし、又は標的領域の置換配列に対応する。
【0109】
有利には、本発明は以下の複合体に関する：
－以下の配列の第１の分子
５’－ＴＧＣＡＧＣＴＧＲ２ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＧＧＣＧＡＴＣＧＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＸＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＧＣＧＡＴＣＧＣＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＧＡＴＡＣＡＴＧＴＴＴＲ２ＣＴＧＴＡＡＧＣ－３’（配列番号６４３）
式中、Ｒ１は、５’－ＣＴＧｔＣＴＣＴＴａｔａＣＡｃＡｔｃＴ（配列番号１）であり、
Ｒ２は、５’－ＡｇａＴｇＴＧｔａｔＡＡＧＡＧａＣＡＧ（配列番号２）であり、
Ｘは、標的領域の認識を可能にする配列に対応する
かつ、
－以下の配列を含む第２の分子：
５’－Ｒ１ＣＡＧＣＴＧＣＡＧＡＣＡＡＡＧＣＴＴＡＣＡＧＲ１ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴｃａｔａｔｇｃｃａａｇｔＹ－３’配列番号６４４）
式中、Ｒ１は、５’－ＣＴＧｔＣＴＣＴＴａｔａＣＡｃＡｔｃＴ（配列番号１）であり、
Ｒ２は、５’－ＡｇａＴｇＴＧｔａｔＡＡＧＡＧａＣＡＧ（配列番号２）であり、
Ｙは、ヌクレオチドなし、又は標的領域の置換配列に対応する。
－以下の配列の第１の分子
５’－ＴＧＣＡＧＣＴＧＲ２ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＧＧＣＧＡＴＣＧＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＸＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＧＣＧＡＴＣＧＣＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＧＡＴＡＣＡＴＧＴＴＴＲ２ＣＴＧＴＡＡＧＣ－３’（配列番号６４３）
式中、Ｒ１は、５’－ＣＴＧｔＣＴＣＴＴａｔａＣＡｃＡｔｃＴ（配列番号１）であり、
Ｒ２は、５’－ＡｇａＴｇＴＧｔａｔＡＡＧＡＧａＣＡＧ（配列番号２）であり、
Ｘは、標的領域の認識を可能にする配列に対応する
かつ、
－以下の配列を含む第２の分子：
５’－Ｒ１ＣＡＧＣＴＧＣＡＧＡＣＡＡＡＧＣＴＴＡＣＡＧＲ１ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴｃａｔａｔｇｃｃａａｇｔＹ－３’配列番号６４４）
式中、Ｒ１は、５’－ＣＴＧｔＣＴＣＴＴａｔａＣＡｃＡｔｃＴ（配列番号１）であり、
Ｒ２は、５’－ＡｇａＴｇＴＧｔａｔＡＡＧＡＧａＣＡＧ（配列番号２）であり、
Ｙは、ヌクレオチドなし、又は標的領域の置換配列に対応する。
【0110】
有利には、本発明は以下の複合体に関する：
－以下の配列の第１の分子
－以下の配列の第１の分子
【0111】
【表10】
Ｒ２は、５’－ＡｇａＴｇＴＧｔａｔＡＡＧＡＧａＣＡＧ（配列番号２）であり、
Ｘは、標的領域の認識を可能にする配列に対応する
かつ、
－以下の配列を含む第２の分子：
【0112】
【表11】
Ｒ２は、５’－ＡｇａＴｇＴＧｔａｔＡＡＧＡＧａＣＡＧ（配列番号２）であり、
Ｙは、ヌクレオチドなし、又は標的領域の置換配列に対応する。
【0113】
有利には、前述の複合体は、以下の配列対からなる。
【0114】
【表12(01)】
【0115】
【表12(02)】
【0116】
【表12(03)】
【0117】
【表12(04)】
【0118】
【表12(05)】
【0119】
【表12(06)】
【0120】
【表12(07)】
【0121】
【表12(08)】
【0122】
【表12(09)】
【0123】
【表12(10)】
【0124】
【表12(11)】
【0125】
【表12(12)】
【0126】
【表12(13)】
【0127】
【表12(14)】
【0128】
【表12(15)】
【0129】
【表12(16)】
【0130】
【表12(17)】
【0131】
換言すれば、本発明は、有利には、第１及び第２の分子の対を含む前述の複合体であって、第１及び第２の分子が以下のそれぞれの配列を含む、複合体に関する：
配列番号４４０及び配列番号４４１（式中、Ｒ１は配列番号ｎの配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の偶数であり、Ｒ２は配列番号ｎ＋１の配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の、Ｒ１と同じ偶数である）、
配列番号４４０及び配列番号４４１（式中、Ｒ１は配列番号ｎの配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の奇数であり、Ｒ２は配列番号ｎ－１の配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の、Ｒ１と同じ奇数である）、
配列番号４４０及び配列番号４４２（式中、Ｒ１は配列番号ｎの配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の偶数であり、Ｒ２は配列番号ｎ＋１の配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の、Ｒ１と同じ偶数である）、
配列番号４４０及び配列番号４４２（式中、Ｒ１は配列番号ｎの配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の奇数であり、Ｒ２は配列番号ｎ－１の配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の、Ｒ１と同じ奇数である）、
配列番号４４０及び配列番号４４３（式中、Ｒ１は配列番号ｎの配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の偶数であり、Ｒ２は配列番号ｎ＋１の配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の、Ｒ１と同じ偶数である）、
配列番号４４０及び配列番号４４３（式中、Ｒ１は配列番号ｎの配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の奇数であり、Ｒ２は配列番号ｎ－１の配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の、Ｒ１と同じ奇数である）、
配列番号４４４及び配列番号４４５（式中、Ｒ１は配列番号ｎの配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の偶数であり、Ｒ２は配列番号ｎ＋１の配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の、Ｒ１と同じ偶数である）、
配列番号４４４及び配列番号４４５（式中、Ｒ１は配列番号ｎの配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の奇数であり、Ｒ２は配列番号ｎ－１の配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の、Ｒ１と同じ奇数である）、
配列番号４４４及び配列番号４４６（式中、Ｒ１は配列番号ｎの配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の偶数であり、Ｒ２は配列番号ｎ＋１の配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の、Ｒ１と同じ偶数である）、
配列番号４４４及び配列番号４４６（式中、Ｒ１は配列番号ｎの配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の奇数であり、Ｒ２は配列番号ｎ－１の配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の、Ｒ１と同じ奇数である）、
配列番号４４４及び配列番号４４７（式中、Ｒ１は配列番号ｎの配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の偶数であり、Ｒ２は配列番号ｎ＋１の配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の、Ｒ１と同じ偶数である）、
配列番号４４４及び配列番号４４７（式中、Ｒ１は配列番号ｎの配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の奇数であり、Ｒ２は配列番号ｎ－１の配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の、Ｒ１と同じ奇数である）、
配列番号４４８及び配列番号４４５（式中、Ｒ１は配列番号ｎの配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の偶数であり、Ｒ２は配列番号ｎ＋１の配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の、Ｒ１と同じ偶数である）、
配列番号４４８及び配列番号４４５（式中、Ｒ１は配列番号ｎの配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の奇数であり、Ｒ２は配列番号ｎ－１の配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の、Ｒ１と同じ奇数である）、
配列番号４４８及び配列番号４４６（式中、Ｒ１は配列番号ｎの配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の偶数であり、Ｒ２は配列番号ｎ＋１の配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の、Ｒ１と同じ偶数である）、
配列番号４４８及び配列番号４４６（式中、Ｒ１は配列番号ｎの配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の奇数であり、Ｒ２は配列番号ｎ－１の配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の、Ｒ１と同じ奇数である）、
配列番号４４８及び配列番号４４７（式中、Ｒ１は配列番号ｎの配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の偶数であり、Ｒ２は配列番号ｎ＋１の配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の、Ｒ１と同じ偶数である）、
配列番号４４８及び配列番号４４７（式中、Ｒ１は配列番号ｎの配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の奇数であり、Ｒ２は配列番号ｎ－１の配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の、Ｒ１と同じ奇数である）、
配列番号４４９及び配列番号４４５（式中、Ｒ１は配列番号ｎの配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の偶数であり、Ｒ２は配列番号ｎ＋１の配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の、Ｒ１と同じ偶数である）、
配列番号４４９及び配列番号４４５（式中、Ｒ１は配列番号ｎの配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の奇数であり、Ｒ２は配列番号ｎ－１の配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の、Ｒ１と同じ奇数である）、
配列番号４４９及び配列番号４４６（式中、Ｒ１は配列番号ｎの配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の偶数であり、Ｒ２は配列番号ｎ＋１の配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の、Ｒ１と同じ偶数である）、
配列番号４４９及び配列番号４４６（式中、Ｒ１は配列番号ｎの配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の奇数であり、Ｒ２は配列番号ｎ－１の配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の、Ｒ１と同じ奇数である）、
配列番号４４９及び配列番号４４７（式中、Ｒ１は配列番号ｎの配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の偶数であり、Ｒ２は配列番号ｎ＋１の配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の、Ｒ１と同じ偶数である）、
配列番号４４９及び配列番号４４７（式中、Ｒ１は配列番号ｎの配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の奇数であり、Ｒ２は配列番号ｎ－１の配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の、Ｒ１と同じ奇数である）、
配列番号４５０及び配列番号４５１（式中、Ｒ１は配列番号ｎの配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の偶数であり、Ｒ２は配列番号ｎ＋１の配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の、Ｒ１と同じ偶数である）、
配列番号４５０及び配列番号４５１（式中、Ｒ１は配列番号ｎの配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の奇数であり、Ｒ２は配列番号ｎ－１の配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の、Ｒ１と同じ奇数である）、
配列番号４５０及び配列番号４５２（式中、Ｒ１は配列番号ｎの配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の偶数であり、Ｒ２は配列番号ｎ＋１の配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の、Ｒ１と同じ偶数である）、
配列番号４５０及び配列番号４５２（式中、Ｒ１は配列番号ｎの配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の奇数であり、Ｒ２は配列番号ｎ－１の配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の、Ｒ１と同じ奇数である）、
配列番号４５０及び配列番号４５３（式中、Ｒ１は配列番号ｎの配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の偶数であり、Ｒ２は配列番号ｎ＋１の配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の、Ｒ１と同じ偶数である）、
配列番号４５０及び配列番号４５３（式中、Ｒ１は配列番号ｎの配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の奇数であり、Ｒ２は配列番号ｎ－１の配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の、Ｒ１と同じ奇数である）、
配列番号４５４及び配列番号４５１（式中、Ｒ１は配列番号ｎの配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の偶数であり、Ｒ２は配列番号ｎ＋１の配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の、Ｒ１と同じ偶数である）、
配列番号４５４及び配列番号４５１（式中、Ｒ１は配列番号ｎの配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の奇数であり、Ｒ２は配列番号ｎ－１の配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の、Ｒ１と同じ奇数である）、
配列番号４５４及び配列番号４５２（式中、Ｒ１は配列番号ｎの配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の偶数であり、Ｒ２は配列番号ｎ＋１の配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の、Ｒ１と同じ偶数である）、
配列番号４５４及び配列番号４５２（式中、Ｒ１は配列番号ｎの配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の奇数であり、Ｒ２は配列番号ｎ－１の配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の、Ｒ１と同じ奇数である）、
配列番号４５４及び配列番号４５３（式中、Ｒ１は配列番号ｎの配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の偶数であり、Ｒ２は配列番号ｎ＋１の配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の、Ｒ１と同じ偶数である）、
配列番号４５４及び配列番号４５３（式中、Ｒ１は配列番号ｎの配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の奇数であり、Ｒ２は配列番号ｎ－１の配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の、Ｒ１と同じ奇数である）、
配列番号４５５及び配列番号４５１（式中、Ｒ１は配列番号ｎの配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の偶数であり、Ｒ２は配列番号ｎ＋１の配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の、Ｒ１と同じ偶数である）、
配列番号４５５及び配列番号４５１（式中、Ｒ１は配列番号ｎの配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の奇数であり、Ｒ２は配列番号ｎ－１の配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の、Ｒ１と同じ奇数である）、
配列番号４５５及び配列番号４５２（式中、Ｒ１は配列番号ｎの配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の偶数であり、Ｒ２は配列番号ｎ＋１の配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の、Ｒ１と同じ偶数である）、
配列番号４５５及び配列番号４５２（式中、Ｒ１は配列番号ｎの配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の奇数であり、Ｒ２は配列番号ｎ－１の配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の、Ｒ１と同じ奇数である）、
配列番号４５５及び配列番号４５３（式中、Ｒ１は配列番号ｎの配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の偶数であり、Ｒ２は配列番号ｎ＋１の配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の、Ｒ１と同じ偶数である）、
配列番号４５５及び配列番号４５３（式中、Ｒ１は配列番号ｎの配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の奇数であり、Ｒ２は配列番号ｎ－１の配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の、Ｒ１と同じ奇数である）、
配列番号４５６及び配列番号４５１（式中、Ｒ１は配列番号ｎの配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の偶数であり、Ｒ２は配列番号ｎ＋１の配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の、Ｒ１と同じ偶数である）、
配列番号４５６及び配列番号４５１（式中、Ｒ１は配列番号ｎの配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の奇数であり、Ｒ２は配列番号ｎ－１の配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の、Ｒ１と同じ奇数である）、
配列番号４５６及び配列番号４５２（式中、Ｒ１は配列番号ｎの配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の偶数であり、Ｒ２は配列番号ｎ＋１の配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の、Ｒ１と同じ偶数である）、
配列番号４５６及び配列番号４５２（式中、Ｒ１は配列番号ｎの配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の奇数であり、Ｒ２は配列番号ｎ－１の配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の、Ｒ１と同じ奇数である）、
配列番号４５６及び配列番号４５３（式中、Ｒ１は配列番号ｎの配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の偶数であり、Ｒ２は配列番号ｎ＋１の配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の、Ｒ１と同じ偶数である）、
配列番号４５６及び配列番号４５３（式中、Ｒ１は配列番号ｎの配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の奇数であり、Ｒ２は配列番号ｎ－１の配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の、Ｒ１と同じ奇数である）、
配列番号４５７及び配列番号４５１（式中、Ｒ１は配列番号ｎの配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の偶数であり、Ｒ２は配列番号ｎ＋１の配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の、Ｒ１と同じ偶数である）、
配列番号４５７及び配列番号４５１（式中、Ｒ１は配列番号ｎの配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の奇数であり、Ｒ２は配列番号ｎ－１の配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の、Ｒ１と同じ奇数である）、
配列番号４５７及び配列番号４５２（式中、Ｒ１は配列番号ｎの配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の偶数であり、Ｒ２は配列番号ｎ＋１の配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の、Ｒ１と同じ偶数である）、
配列番号４５７及び配列番号４５２（式中、Ｒ１は配列番号ｎの配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の奇数であり、Ｒ２は配列番号ｎ－１の配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の、Ｒ１と同じ奇数である）、
配列番号４５７及び配列番号４５３（式中、Ｒ１は配列番号ｎの配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の偶数であり、Ｒ２は配列番号ｎ＋１の配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の、Ｒ１と同じ偶数である）、
配列番号４５７及び配列番号４５３（式中、Ｒ１は配列番号ｎの配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の奇数であり、Ｒ２は配列番号ｎ－１の配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の、Ｒ１と同じ奇数である）、
配列番号４５８及び配列番号４５９（式中、Ｒ１は配列番号ｎの配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の偶数であり、Ｒ２は配列番号ｎ＋１の配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の、Ｒ１と同じ偶数である）、
配列番号４５８及び配列番号４５９（式中、Ｒ１は配列番号ｎの配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の奇数であり、Ｒ２は配列番号ｎ－１の配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の、Ｒ１と同じ奇数である）、
配列番号４５８及び配列番号４６０（式中、Ｒ１は配列番号ｎの配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の偶数であり、Ｒ２は配列番号ｎ＋１の配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の、Ｒ１と同じ偶数である）、
配列番号４５８及び配列番号４６０（式中、Ｒ１は配列番号ｎの配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の奇数であり、Ｒ２は配列番号ｎ－１の配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の、Ｒ１と同じ奇数である）、
配列番号４５８及び配列番号４６１（式中、Ｒ１は配列番号ｎの配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の偶数であり、Ｒ２は配列番号ｎ＋１の配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の、Ｒ１と同じ偶数である）、
配列番号４５８及び配列番号４６１（式中、Ｒ１は配列番号ｎの配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の奇数であり、Ｒ２は配列番号ｎ－１の配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の、Ｒ１と同じ奇数である）、
配列番号４６２及び配列番号４５９（式中、Ｒ１は配列番号ｎの配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の偶数であり、Ｒ２は配列番号ｎ＋１の配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の、Ｒ１と同じ偶数である）、
配列番号４６２及び配列番号４５９（式中、Ｒ１は配列番号ｎの配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の奇数であり、Ｒ２は配列番号ｎ－１の配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の、Ｒ１と同じ奇数である）、
配列番号４６２及び配列番号４６０（式中、Ｒ１は配列番号ｎの配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の偶数であり、Ｒ２は配列番号ｎ＋１の配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の、Ｒ１と同じ偶数である）、
配列番号４６２及び配列番号４６０（式中、Ｒ１は配列番号ｎの配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の奇数であり、Ｒ２は配列番号ｎ－１の配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の、Ｒ１と同じ奇数である）、
配列番号４６２及び配列番号４６１（式中、Ｒ１は配列番号ｎの配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の偶数であり、Ｒ２は配列番号ｎ＋１の配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の、Ｒ１と同じ偶数である）、
配列番号４６２及び配列番号４６１（式中、Ｒ１は配列番号ｎの配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の奇数であり、Ｒ２は配列番号ｎ－１の配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の、Ｒ１と同じ奇数である）、
配列番号４６３及び配列番号４５９（式中、Ｒ１は配列番号ｎの配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の偶数であり、Ｒ２は配列番号ｎ＋１の配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の、Ｒ１と同じ偶数である）、
配列番号４６３及び配列番号４５９（式中、Ｒ１は配列番号ｎの配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の奇数であり、Ｒ２は配列番号ｎ－１の配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の、Ｒ１と同じ奇数である）、
配列番号４６３及び配列番号４６０（式中、Ｒ１は配列番号ｎの配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の偶数であり、Ｒ２は配列番号ｎ＋１の配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の、Ｒ１と同じ偶数である）、
配列番号４６３及び配列番号４６０（式中、Ｒ１は配列番号ｎの配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の奇数であり、Ｒ２は配列番号ｎ－１の配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の、Ｒ１と同じ奇数である）、
配列番号４６３及び配列番号４６１（式中、Ｒ１は配列番号ｎの配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の偶数であり、Ｒ２は配列番号ｎ＋１の配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の、Ｒ１と同じ偶数である）、
配列番号４６３及び配列番号４６１（式中、Ｒ１は配列番号ｎの配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の奇数であり、Ｒ２は配列番号ｎ－１の配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の、Ｒ１と同じ奇数である）、
配列番号４６４及び配列番号４５９（式中、Ｒ１は配列番号ｎの配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の偶数であり、Ｒ２は配列番号ｎ＋１の配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の、Ｒ１と同じ偶数である）、
配列番号４６４及び配列番号４５９（式中、Ｒ１は配列番号ｎの配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の奇数であり、Ｒ２は配列番号ｎ－１の配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の、Ｒ１と同じ奇数である）、
配列番号４６４及び配列番号４６０（式中、Ｒ１は配列番号ｎの配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の偶数であり、Ｒ２は配列番号ｎ＋１の配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の、Ｒ１と同じ偶数である）、
配列番号４６４及び配列番号４６０（式中、Ｒ１は配列番号ｎの配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の奇数であり、Ｒ２は配列番号ｎ－１の配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の、Ｒ１と同じ奇数である）、
配列番号４６４及び配列番号４６１（式中、Ｒ１は配列番号ｎの配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の偶数であり、Ｒ２は配列番号ｎ＋１の配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の、Ｒ１と同じ偶数である）、
配列番号４６４及び配列番号４６１（式中、Ｒ１は配列番号ｎの配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の奇数であり、Ｒ２は配列番号ｎ－１の配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の、Ｒ１と同じ奇数である）、
配列番号４６５及び配列番号４５９（式中、Ｒ１は配列番号ｎの配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の偶数であり、Ｒ２は配列番号ｎ＋１の配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の、Ｒ１と同じ偶数である）、
配列番号４６５及び配列番号４５９（式中、Ｒ１は配列番号ｎの配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の奇数であり、Ｒ２は配列番号ｎ－１の配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の、Ｒ１と同じ奇数である）、
配列番号４６５及び配列番号４６０（式中、Ｒ１は配列番号ｎの配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の偶数であり、Ｒ２は配列番号ｎ＋１の配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の、Ｒ１と同じ偶数である）、
配列番号４６５及び配列番号４６０（式中、Ｒ１は配列番号ｎの配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の奇数であり、Ｒ２は配列番号ｎ－１の配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の、Ｒ１と同じ奇数である）、
配列番号４６５及び配列番号４６１（式中、Ｒ１は配列番号ｎの配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の偶数であり、Ｒ２は配列番号ｎ＋１の配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の、Ｒ１と同じ偶数である）、
配列番号４６５及び配列番号４６１（式中、Ｒ１は配列番号ｎの配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の奇数であり、Ｒ２は配列番号ｎ－１の配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の、Ｒ１と同じ奇数である）、
配列番号４６６及び配列番号４５９（式中、Ｒ１は配列番号ｎの配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の偶数であり、Ｒ２は配列番号ｎ＋１の配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の、Ｒ１と同じ偶数である）、
配列番号４６６及び配列番号４５９（式中、Ｒ１は配列番号ｎの配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の奇数であり、Ｒ２は配列番号ｎ－１の配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の、Ｒ１と同じ奇数である）、
配列番号４６６及び配列番号４６０（式中、Ｒ１は配列番号ｎの配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の偶数であり、Ｒ２は配列番号ｎ＋１の配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の、Ｒ１と同じ偶数である）、
配列番号４６６及び配列番号４６０（式中、Ｒ１は配列番号ｎの配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の奇数であり、Ｒ２は配列番号ｎ－１の配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の、Ｒ１と同じ奇数である）、
配列番号４６６及び配列番号４６１（式中、Ｒ１は配列番号ｎの配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の偶数であり、Ｒ２は配列番号ｎ＋１の配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の、Ｒ１と同じ偶数である）、
配列番号４６６及び配列番号４６１（式中、Ｒ１は配列番号ｎの配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の奇数であり、Ｒ２は配列番号ｎ－１の配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の、Ｒ１と同じ奇数である）。
配列番号４４０及び配列番号４４１（式中、Ｒ１は配列番号ｎの配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の偶数であり、Ｒ２は配列番号ｎ＋１の配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の、Ｒ１と同じ偶数である）、
配列番号４４０及び配列番号４４１（式中、Ｒ１は配列番号ｎの配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の奇数であり、Ｒ２は配列番号ｎ－１の配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の、Ｒ１と同じ奇数である）、
配列番号４４０及び配列番号４４２（式中、Ｒ１は配列番号ｎの配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の偶数であり、Ｒ２は配列番号ｎ＋１の配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の、Ｒ１と同じ偶数である）、
配列番号４４０及び配列番号４４２（式中、Ｒ１は配列番号ｎの配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の奇数であり、Ｒ２は配列番号ｎ－１の配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の、Ｒ１と同じ奇数である）、
配列番号４４０及び配列番号４４３（式中、Ｒ１は配列番号ｎの配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の偶数であり、Ｒ２は配列番号ｎ＋１の配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の、Ｒ１と同じ偶数である）、
配列番号４４０及び配列番号４４３（式中、Ｒ１は配列番号ｎの配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の奇数であり、Ｒ２は配列番号ｎ－１の配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の、Ｒ１と同じ奇数である）、
配列番号４４４及び配列番号４４５（式中、Ｒ１は配列番号ｎの配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の偶数であり、Ｒ２は配列番号ｎ＋１の配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の、Ｒ１と同じ偶数である）、
配列番号４４４及び配列番号４４５（式中、Ｒ１は配列番号ｎの配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の奇数であり、Ｒ２は配列番号ｎ－１の配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の、Ｒ１と同じ奇数である）、
配列番号４４４及び配列番号４４６（式中、Ｒ１は配列番号ｎの配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の偶数であり、Ｒ２は配列番号ｎ＋１の配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の、Ｒ１と同じ偶数である）、
配列番号４４４及び配列番号４４６（式中、Ｒ１は配列番号ｎの配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の奇数であり、Ｒ２は配列番号ｎ－１の配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の、Ｒ１と同じ奇数である）、
配列番号４４４及び配列番号４４７（式中、Ｒ１は配列番号ｎの配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の偶数であり、Ｒ２は配列番号ｎ＋１の配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の、Ｒ１と同じ偶数である）、
配列番号４４４及び配列番号４４７（式中、Ｒ１は配列番号ｎの配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の奇数であり、Ｒ２は配列番号ｎ－１の配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の、Ｒ１と同じ奇数である）、
配列番号４４８及び配列番号４４５（式中、Ｒ１は配列番号ｎの配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の偶数であり、Ｒ２は配列番号ｎ＋１の配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の、Ｒ１と同じ偶数である）、
配列番号４４８及び配列番号４４５（式中、Ｒ１は配列番号ｎの配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の奇数であり、Ｒ２は配列番号ｎ－１の配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の、Ｒ１と同じ奇数である）、
配列番号４４８及び配列番号４４６（式中、Ｒ１は配列番号ｎの配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の偶数であり、Ｒ２は配列番号ｎ＋１の配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の、Ｒ１と同じ偶数である）、
配列番号４４８及び配列番号４４６（式中、Ｒ１は配列番号ｎの配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の奇数であり、Ｒ２は配列番号ｎ－１の配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の、Ｒ１と同じ奇数である）、
配列番号４４８及び配列番号４４７（式中、Ｒ１は配列番号ｎの配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の偶数であり、Ｒ２は配列番号ｎ＋１の配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の、Ｒ１と同じ偶数である）、
配列番号４４８及び配列番号４４７（式中、Ｒ１は配列番号ｎの配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の奇数であり、Ｒ２は配列番号ｎ－１の配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の、Ｒ１と同じ奇数である）、
配列番号４４９及び配列番号４４５（式中、Ｒ１は配列番号ｎの配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の偶数であり、Ｒ２は配列番号ｎ＋１の配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の、Ｒ１と同じ偶数である）、
配列番号４４９及び配列番号４４５（式中、Ｒ１は配列番号ｎの配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の奇数であり、Ｒ２は配列番号ｎ－１の配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の、Ｒ１と同じ奇数である）、
配列番号４４９及び配列番号４４６（式中、Ｒ１は配列番号ｎの配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の偶数であり、Ｒ２は配列番号ｎ＋１の配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の、Ｒ１と同じ偶数である）、
配列番号４４９及び配列番号４４６（式中、Ｒ１は配列番号ｎの配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の奇数であり、Ｒ２は配列番号ｎ－１の配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の、Ｒ１と同じ奇数である）、
配列番号４４９及び配列番号４４７（式中、Ｒ１は配列番号ｎの配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の偶数であり、Ｒ２は配列番号ｎ＋１の配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の、Ｒ１と同じ偶数である）、
配列番号４４９及び配列番号４４７（式中、Ｒ１は配列番号ｎの配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の奇数であり、Ｒ２は配列番号ｎ－１の配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の、Ｒ１と同じ奇数である）、
配列番号４５０及び配列番号４５１（式中、Ｒ１は配列番号ｎの配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の偶数であり、Ｒ２は配列番号ｎ＋１の配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の、Ｒ１と同じ偶数である）、
配列番号４５０及び配列番号４５１（式中、Ｒ１は配列番号ｎの配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の奇数であり、Ｒ２は配列番号ｎ－１の配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の、Ｒ１と同じ奇数である）、
配列番号４５０及び配列番号４５２（式中、Ｒ１は配列番号ｎの配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の偶数であり、Ｒ２は配列番号ｎ＋１の配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の、Ｒ１と同じ偶数である）、
配列番号４５０及び配列番号４５２（式中、Ｒ１は配列番号ｎの配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の奇数であり、Ｒ２は配列番号ｎ－１の配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の、Ｒ１と同じ奇数である）、
配列番号４５０及び配列番号４５３（式中、Ｒ１は配列番号ｎの配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の偶数であり、Ｒ２は配列番号ｎ＋１の配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の、Ｒ１と同じ偶数である）、
配列番号４５０及び配列番号４５３（式中、Ｒ１は配列番号ｎの配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の奇数であり、Ｒ２は配列番号ｎ－１の配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の、Ｒ１と同じ奇数である）、
配列番号４５４及び配列番号４５１（式中、Ｒ１は配列番号ｎの配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の偶数であり、Ｒ２は配列番号ｎ＋１の配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の、Ｒ１と同じ偶数である）、
配列番号４５４及び配列番号４５１（式中、Ｒ１は配列番号ｎの配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の奇数であり、Ｒ２は配列番号ｎ－１の配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の、Ｒ１と同じ奇数である）、
配列番号４５４及び配列番号４５２（式中、Ｒ１は配列番号ｎの配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の偶数であり、Ｒ２は配列番号ｎ＋１の配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の、Ｒ１と同じ偶数である）、
配列番号４５４及び配列番号４５２（式中、Ｒ１は配列番号ｎの配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の奇数であり、Ｒ２は配列番号ｎ－１の配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の、Ｒ１と同じ奇数である）、
配列番号４５４及び配列番号４５３（式中、Ｒ１は配列番号ｎの配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の偶数であり、Ｒ２は配列番号ｎ＋１の配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の、Ｒ１と同じ偶数である）、
配列番号４５４及び配列番号４５３（式中、Ｒ１は配列番号ｎの配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の奇数であり、Ｒ２は配列番号ｎ－１の配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の、Ｒ１と同じ奇数である）、
配列番号４５５及び配列番号４５１（式中、Ｒ１は配列番号ｎの配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の偶数であり、Ｒ２は配列番号ｎ＋１の配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の、Ｒ１と同じ偶数である）、
配列番号４５５及び配列番号４５１（式中、Ｒ１は配列番号ｎの配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の奇数であり、Ｒ２は配列番号ｎ－１の配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の、Ｒ１と同じ奇数である）、
配列番号４５５及び配列番号４５２（式中、Ｒ１は配列番号ｎの配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の偶数であり、Ｒ２は配列番号ｎ＋１の配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の、Ｒ１と同じ偶数である）、
配列番号４５５及び配列番号４５２（式中、Ｒ１は配列番号ｎの配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の奇数であり、Ｒ２は配列番号ｎ－１の配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の、Ｒ１と同じ奇数である）、
配列番号４５５及び配列番号４５３（式中、Ｒ１は配列番号ｎの配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の偶数であり、Ｒ２は配列番号ｎ＋１の配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の、Ｒ１と同じ偶数である）、
配列番号４５５及び配列番号４５３（式中、Ｒ１は配列番号ｎの配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の奇数であり、Ｒ２は配列番号ｎ－１の配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の、Ｒ１と同じ奇数である）、
配列番号４５６及び配列番号４５１（式中、Ｒ１は配列番号ｎの配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の偶数であり、Ｒ２は配列番号ｎ＋１の配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の、Ｒ１と同じ偶数である）、
配列番号４５６及び配列番号４５１（式中、Ｒ１は配列番号ｎの配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の奇数であり、Ｒ２は配列番号ｎ－１の配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の、Ｒ１と同じ奇数である）、
配列番号４５６及び配列番号４５２（式中、Ｒ１は配列番号ｎの配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の偶数であり、Ｒ２は配列番号ｎ＋１の配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の、Ｒ１と同じ偶数である）、
配列番号４５６及び配列番号４５２（式中、Ｒ１は配列番号ｎの配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の奇数であり、Ｒ２は配列番号ｎ－１の配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の、Ｒ１と同じ奇数である）、
配列番号４５６及び配列番号４５３（式中、Ｒ１は配列番号ｎの配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の偶数であり、Ｒ２は配列番号ｎ＋１の配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の、Ｒ１と同じ偶数である）、
配列番号４５６及び配列番号４５３（式中、Ｒ１は配列番号ｎの配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の奇数であり、Ｒ２は配列番号ｎ－１の配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の、Ｒ１と同じ奇数である）、
配列番号４５７及び配列番号４５１（式中、Ｒ１は配列番号ｎの配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の偶数であり、Ｒ２は配列番号ｎ＋１の配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の、Ｒ１と同じ偶数である）、
配列番号４５７及び配列番号４５１（式中、Ｒ１は配列番号ｎの配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の奇数であり、Ｒ２は配列番号ｎ－１の配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の、Ｒ１と同じ奇数である）、
配列番号４５７及び配列番号４５２（式中、Ｒ１は配列番号ｎの配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の偶数であり、Ｒ２は配列番号ｎ＋１の配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の、Ｒ１と同じ偶数である）、
配列番号４５７及び配列番号４５２（式中、Ｒ１は配列番号ｎの配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の奇数であり、Ｒ２は配列番号ｎ－１の配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の、Ｒ１と同じ奇数である）、
配列番号４５７及び配列番号４５３（式中、Ｒ１は配列番号ｎの配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の偶数であり、Ｒ２は配列番号ｎ＋１の配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の、Ｒ１と同じ偶数である）、
配列番号４５７及び配列番号４５３（式中、Ｒ１は配列番号ｎの配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の奇数であり、Ｒ２は配列番号ｎ－１の配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の、Ｒ１と同じ奇数である）、
配列番号４５８及び配列番号４５９（式中、Ｒ１は配列番号ｎの配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の偶数であり、Ｒ２は配列番号ｎ＋１の配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の、Ｒ１と同じ偶数である）、
配列番号４５８及び配列番号４５９（式中、Ｒ１は配列番号ｎの配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の奇数であり、Ｒ２は配列番号ｎ－１の配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の、Ｒ１と同じ奇数である）、
配列番号４５８及び配列番号４６０（式中、Ｒ１は配列番号ｎの配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の偶数であり、Ｒ２は配列番号ｎ＋１の配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の、Ｒ１と同じ偶数である）、
配列番号４５８及び配列番号４６０（式中、Ｒ１は配列番号ｎの配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の奇数であり、Ｒ２は配列番号ｎ－１の配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の、Ｒ１と同じ奇数である）、
配列番号４５８及び配列番号４６１（式中、Ｒ１は配列番号ｎの配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の偶数であり、Ｒ２は配列番号ｎ＋１の配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の、Ｒ１と同じ偶数である）、
配列番号４５８及び配列番号４６１（式中、Ｒ１は配列番号ｎの配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の奇数であり、Ｒ２は配列番号ｎ－１の配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の、Ｒ１と同じ奇数である）、
配列番号４６２及び配列番号４５９（式中、Ｒ１は配列番号ｎの配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の偶数であり、Ｒ２は配列番号ｎ＋１の配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の、Ｒ１と同じ偶数である）、
配列番号４６２及び配列番号４５９（式中、Ｒ１は配列番号ｎの配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の奇数であり、Ｒ２は配列番号ｎ－１の配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の、Ｒ１と同じ奇数である）、
配列番号４６２及び配列番号４６０（式中、Ｒ１は配列番号ｎの配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の偶数であり、Ｒ２は配列番号ｎ＋１の配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の、Ｒ１と同じ偶数である）、
配列番号４６２及び配列番号４６０（式中、Ｒ１は配列番号ｎの配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の奇数であり、Ｒ２は配列番号ｎ－１の配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の、Ｒ１と同じ奇数である）、
配列番号４６２及び配列番号４６１（式中、Ｒ１は配列番号ｎの配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の偶数であり、Ｒ２は配列番号ｎ＋１の配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の、Ｒ１と同じ偶数である）、
配列番号４６２及び配列番号４６１（式中、Ｒ１は配列番号ｎの配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の奇数であり、Ｒ２は配列番号ｎ－１の配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の、Ｒ１と同じ奇数である）、
配列番号４６３及び配列番号４５９（式中、Ｒ１は配列番号ｎの配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の偶数であり、Ｒ２は配列番号ｎ＋１の配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の、Ｒ１と同じ偶数である）、
配列番号４６３及び配列番号４５９（式中、Ｒ１は配列番号ｎの配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の奇数であり、Ｒ２は配列番号ｎ－１の配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の、Ｒ１と同じ奇数である）、
配列番号４６３及び配列番号４６０（式中、Ｒ１は配列番号ｎの配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の偶数であり、Ｒ２は配列番号ｎ＋１の配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の、Ｒ１と同じ偶数である）、
配列番号４６３及び配列番号４６０（式中、Ｒ１は配列番号ｎの配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の奇数であり、Ｒ２は配列番号ｎ－１の配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の、Ｒ１と同じ奇数である）、
配列番号４６３及び配列番号４６１（式中、Ｒ１は配列番号ｎの配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の偶数であり、Ｒ２は配列番号ｎ＋１の配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の、Ｒ１と同じ偶数である）、
配列番号４６３及び配列番号４６１（式中、Ｒ１は配列番号ｎの配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の奇数であり、Ｒ２は配列番号ｎ－１の配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の、Ｒ１と同じ奇数である）、
配列番号４６４及び配列番号４５９（式中、Ｒ１は配列番号ｎの配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の偶数であり、Ｒ２は配列番号ｎ＋１の配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の、Ｒ１と同じ偶数である）、
配列番号４６４及び配列番号４５９（式中、Ｒ１は配列番号ｎの配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の奇数であり、Ｒ２は配列番号ｎ－１の配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の、Ｒ１と同じ奇数である）、
配列番号４６４及び配列番号４６０（式中、Ｒ１は配列番号ｎの配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の偶数であり、Ｒ２は配列番号ｎ＋１の配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の、Ｒ１と同じ偶数である）、
配列番号４６４及び配列番号４６０（式中、Ｒ１は配列番号ｎの配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の奇数であり、Ｒ２は配列番号ｎ－１の配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の、Ｒ１と同じ奇数である）、
配列番号４６４及び配列番号４６１（式中、Ｒ１は配列番号ｎの配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の偶数であり、Ｒ２は配列番号ｎ＋１の配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の、Ｒ１と同じ偶数である）、
配列番号４６４及び配列番号４６１（式中、Ｒ１は配列番号ｎの配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の奇数であり、Ｒ２は配列番号ｎ－１の配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の、Ｒ１と同じ奇数である）、
配列番号４６５及び配列番号４５９（式中、Ｒ１は配列番号ｎの配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の偶数であり、Ｒ２は配列番号ｎ＋１の配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の、Ｒ１と同じ偶数である）、
配列番号４６５及び配列番号４５９（式中、Ｒ１は配列番号ｎの配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の奇数であり、Ｒ２は配列番号ｎ－１の配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の、Ｒ１と同じ奇数である）、
配列番号４６５及び配列番号４６０（式中、Ｒ１は配列番号ｎの配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の偶数であり、Ｒ２は配列番号ｎ＋１の配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の、Ｒ１と同じ偶数である）、
配列番号４６５及び配列番号４６０（式中、Ｒ１は配列番号ｎの配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の奇数であり、Ｒ２は配列番号ｎ－１の配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の、Ｒ１と同じ奇数である）、
配列番号４６５及び配列番号４６１（式中、Ｒ１は配列番号ｎの配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の偶数であり、Ｒ２は配列番号ｎ＋１の配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の、Ｒ１と同じ偶数である）、
配列番号４６５及び配列番号４６１（式中、Ｒ１は配列番号ｎの配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の奇数であり、Ｒ２は配列番号ｎ－１の配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の、Ｒ１と同じ奇数である）、
配列番号４６６及び配列番号４５９（式中、Ｒ１は配列番号ｎの配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の偶数であり、Ｒ２は配列番号ｎ＋１の配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の、Ｒ１と同じ偶数である）、
配列番号４６６及び配列番号４５９（式中、Ｒ１は配列番号ｎの配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の奇数であり、Ｒ２は配列番号ｎ－１の配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の、Ｒ１と同じ奇数である）、
配列番号４６６及び配列番号４６０（式中、Ｒ１は配列番号ｎの配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の偶数であり、Ｒ２は配列番号ｎ＋１の配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の、Ｒ１と同じ偶数である）、
配列番号４６６及び配列番号４６０（式中、Ｒ１は配列番号ｎの配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の奇数であり、Ｒ２は配列番号ｎ－１の配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の、Ｒ１と同じ奇数である）、
配列番号４６６及び配列番号４６１（式中、Ｒ１は配列番号ｎの配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の偶数であり、Ｒ２は配列番号ｎ＋１の配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の、Ｒ１と同じ偶数である）、
配列番号４６６及び配列番号４６１（式中、Ｒ１は配列番号ｎの配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の奇数であり、Ｒ２は配列番号ｎ－１の配列のうちのいずれか１つであり、ｎは２６９～４２４の範囲の、Ｒ１と同じ奇数である）。
【0132】
有利には、本発明は、以下の表４の第１及び第２の分子３００対のうちの１つを含む、前述の複合体に関する。
【0133】
【表13(01)】
【0134】
【表13(02)】
【0135】
【表13(03)】
【0136】
【表13(04)】
【0137】
【表13(05)】
【0138】
【表13(06)】
【0139】
【表13(07)】
【0140】
別の態様では、本発明は、
目的の核酸の相補配列の挿入を可能にするＡ配列を含むか若しくは本質的にそれからなるか、又は目的の核酸の相補配列を含む第１の一本鎖核酸分子であって、相補Ａ配列が、５’で４０～６０ヌクレオチド長の第１のＡ／Ｔリッチ、特にＴリッチ配列に結合し、３’で４０～６０ヌクレオチド長の第２のＡ／Ｔリッチ、特にＴリッチ配列に結合し、第１及び第２のＡ／Ｔリッチ、特にＴリッチ配列が、それぞれ６～１２個のＧ／Ｃリッチヌクレオチドの第１及び第２のドメインを含み、第１のドメインの配列が第２のドメインの配列に相補的であり、第１及び第２のドメインがＡ配列から１５～５２ヌクレオチドに位置付けられ、第１の分子が、その５’末端に、トランスポザーゼを認識するための５’から３’に配向された第１の配列と、その３’末端に、トランスポザーゼを認識するための少なくとも１つの第２の配列と、を含む、第１の一本鎖核酸分子と、
目的の核酸の相補配列の挿入を可能にするＢ配列を含むか若しくは本質的にそれからなるか、又は目的の核酸の相補配列を含む第２の一本鎖核酸分子であって、相補Ｂ配列が、５’で４０～６０ヌクレオチド長の第３のＴリッチ配列に結合し、３’で４０～６０ヌクレオチド長の第４のＴリッチ配列に結合し、第３及び第４のＴリッチ配列が、それぞれ６～１２個のＧ／Ｃリッチヌクレオチドの第３及び第４のドメインを含み、第３のドメインの配列が第４のドメインの配列に相補的であり、第３及び第４のドメインがＢ配列から１５～５２ヌクレオチドに位置付けられ、第２の分子が、その５’末端に、トランスポザーゼを認識するための５’から３’に配向された少なくとも１つの第１の配列と、その３’末端に、トランスポザーゼを認識するための第２の配列と、を含み、
Ｂ配列が目的の核酸の相補配列であり、Ａ配列が目的の核酸の目的の領域の５’に位置付けられ、Ｂ配列が目的の核酸の目的の領域の３’に位置付けられている、第２の一本鎖核酸分子と、
第３の一本鎖分子であって、
その５’部分において、第１の分子のトランスポザーゼを認識するための第２の配列の少なくとも１つの相補配列と、
その３’部分において、（第２の分子の）トランスポザーゼを認識するための第１の配列の少なくとも１つの相補配列と、を含む、第３の一本鎖分子と、
（第１の分子の）トランスポザーゼを認識するための第２の配列の相補配列と、置換核酸分子（一本鎖）の挿入を可能にする（第２の分子の）トランスポザーゼを認識するための第１の配列の相補配列との間に位置する領域と、を含む、集合体であって、
第１及び第３の一本鎖核酸分子が、トランスポザーゼの２つの二本鎖結合部位を規定するように、ワトソン及びクリックによって規定される塩基相補性に従って対合しており、第２及び第３の一本鎖核酸分子が、トランスポザーゼの２つの二本鎖結合部位を規定するように、ワトソン及びクリックによって規定される塩基相補性に従って対合している、集合体に関する。
目的の核酸の相補配列の挿入を可能にするＡ配列を含むか若しくは本質的にそれからなるか、又は目的の核酸の相補配列を含む第１の一本鎖核酸分子であって、相補Ａ配列が、５’で４０～６０ヌクレオチド長の第１のＡ／Ｔリッチ、特にＴリッチ配列に結合し、３’で４０～６０ヌクレオチド長の第２のＡ／Ｔリッチ、特にＴリッチ配列に結合し、第１及び第２のＡ／Ｔリッチ、特にＴリッチ配列が、それぞれ６～１２個のＧ／Ｃリッチヌクレオチドの第１及び第２のドメインを含み、第１のドメインの配列が第２のドメインの配列に相補的であり、第１及び第２のドメインがＡ配列から１５～５２ヌクレオチドに位置付けられ、第１の分子が、その５’末端に、トランスポザーゼを認識するための５’から３’に配向された第１の配列と、その３’末端に、トランスポザーゼを認識するための少なくとも１つの第２の配列と、を含む、第１の一本鎖核酸分子と、
目的の核酸の相補配列の挿入を可能にするＢ配列を含むか若しくは本質的にそれからなるか、又は目的の核酸の相補配列を含む第２の一本鎖核酸分子であって、相補Ｂ配列が、５’で４０～６０ヌクレオチド長の第３のＴリッチ配列に結合し、３’で４０～６０ヌクレオチド長の第４のＴリッチ配列に結合し、第３及び第４のＴリッチ配列が、それぞれ６～１２個のＧ／Ｃリッチヌクレオチドの第３及び第４のドメインを含み、第３のドメインの配列が第４のドメインの配列に相補的であり、第３及び第４のドメインがＢ配列から１５～５２ヌクレオチドに位置付けられ、第２の分子が、その５’末端に、トランスポザーゼを認識するための５’から３’に配向された少なくとも１つの第１の配列と、その３’末端に、トランスポザーゼを認識するための第２の配列と、を含み、
Ｂ配列が目的の核酸の相補配列であり、Ａ配列が目的の核酸の目的の領域の５’に位置付けられ、Ｂ配列が目的の核酸の目的の領域の３’に位置付けられている、第２の一本鎖核酸分子と、
第３の一本鎖分子であって、
その５’部分において、第１の分子のトランスポザーゼを認識するための第２の配列の少なくとも１つの相補配列と、
その３’部分において、（第２の分子の）トランスポザーゼを認識するための第１の配列の少なくとも１つの相補配列と、を含む、第３の一本鎖分子と、
（第１の分子の）トランスポザーゼを認識するための第２の配列の相補配列と、置換核酸分子（一本鎖）の挿入を可能にする（第２の分子の）トランスポザーゼを認識するための第１の配列の相補配列との間に位置する領域と、を含む、集合体であって、
第１及び第３の一本鎖核酸分子が、トランスポザーゼの２つの二本鎖結合部位を規定するように、ワトソン及びクリックによって規定される塩基相補性に従って対合しており、第２及び第３の一本鎖核酸分子が、トランスポザーゼの２つの二本鎖結合部位を規定するように、ワトソン及びクリックによって規定される塩基相補性に従って対合している、集合体に関する。
【0141】
したがって、前述の集合体は、本明細書において先に記載された分子複合体を含む。また、分子複合体について本明細書において先に記載された全ての実施形態及び技術的詳細は、必要な変更を加えて前述の集合体に適用される。
【0142】
本発明のこの態様において、目的の核酸に含まれる配列を選択された配列で正確に置換することを可能にする、３つの分子の集合体が記載される。
【0143】
本発明による集合体は、上述の複合体に基づいており、この複合体には、第１の分子に類似した第３の分子が付加されている。［図８］は、本発明による集合体を概略的に示す。
【0144】
複合体の第１の分子は集合体の第１の分子に対応し、複合体の第２の分子は集合体の第３の分子に対応し、集合体の第３の分子が加えられ、集合体又は複合体の第１の分子と構造的に類似している。
【0145】
本発明による集合体は、３つの分子が正しく対合している場合、２対のトランスポザーゼ認識二本鎖結合部位：
第１の分子と第３の分子とのハイブリダイゼーションによって得られる第１の対、及び
第２の分子と第３の分子とのハイブリダイゼーションによって得られる第２の対
を含む。
第１の分子と第３の分子とのハイブリダイゼーションによって得られる第１の対、及び
第２の分子と第３の分子とのハイブリダイゼーションによって得られる第２の対
を含む。
【0146】
集合体の第１の分子に含まれるＡ配列は、第２の分子に含まれるＢ配列に相補的な核酸の同じ鎖に相補的である。換言すれば、第１の分子に含まれるＡ配列及び第２の分子に含まれるＢ配列は、２つの配列Ａ及びＢが同じ配列を認識しないので、同じ核酸と同時にハイブリダイズし得る。
【0147】
所見を更に明確にするために、本発明において規定される集合体の関心は、第１の分子及び第２の分子（両方とも本明細書において先に規定されたようなものである）を提案することであり、それぞれの配列Ａ及びＢは、一方については、目的の核酸の標的配列の５’に位置する配列を認識し得、他方については、目的の核酸の同じ標的配列の３’に位置する配列を認識し得るようなものである。したがって、配列Ａ及びＢは、目的の核酸分子の、置換しようとする目的の配列に隣接する領域に相補的である。
【0148】
したがって、目的の第１及び第２の分子は、置換される配列に隣接するために、目的の分子を特異的に標的とするのに必須である。
【0149】
次に、集合体の第３の分子は、置換配列を含む核酸分子を提供する分子である。
【0150】
機構的観点から、本発明による集合体は、その３つの分子からなるようなものであり、第１及び第２の分子は、それらのＧ／Ｃリッチ領域が対合するように空間的に構造的に組織化されている。
【0151】
第３の分子のいずれかの側、すなわち５’及び３’のいずれかの側において、第１及び第２の分子とのハイブリダイゼーションにより、トランスポザーゼに結合するための部位の２つの対は、トランスポザーゼが存在する場合、トランスポザーゼ二量体が集合体に結合することを可能にする。
【0152】
第１の分子のトランスポザーゼ結合部位は、第２の分子のトランスポザーゼ結合部位と同じであっても、異なっていてもよいことに留意されたい。結合配列が同じである場合、第３の分子の５’におけるトランスポザーゼ（第３の分子の５’部分と第１の分子とのハイブリダイゼーションによる）、及び第３の分子の３’におけるトランスポザーゼ（第３の分子の３’部分と第２の分子とのハイブリダイゼーションによる）は同じである。また、例として、結合部位が全てＴｎ５トランスポザーゼに対する結合部位である場合、集合体は２つのＴｎ５トランスポザーゼ二量体と会合する。
【0153】
第１の分子及び第２の分子の結合部位が同じトランスポザーゼを認識しないことも可能である。この場合、本明細書において先に示した集合体の規定によれば、第３の分子の５’部分は、第１の分子とのハイブリダイゼーションによって、第１のトランスポザーゼに結合するための２つの二本鎖部位を形成し、第３の分子の３’部分は、第２の分子とのハイブリダイゼーションによって、第２のトランスポザーゼに結合するための２つの二本鎖部位を形成する。
【0154】
次に、２つのトランスポザーゼ二量体に連結された前述の集合体が、その５’部分が集合体の第１の分子のＡ配列に相補的であり、その３’部分が集合体の第２の分子のＢ配列に相補的である目的の核酸分子の存在下にもたらされる場合、目的の核酸分子は、上記の領域Ａ及びＢで集合体と対合する。この相互作用は、集合体の第１及び第２の分子の各々の２つのＧ／Ｃリッチ配列の相互作用を破壊するという結果を有する。したがって、第３の分子及び目的の核酸分子は、空間において互いに接近して移動し、トランスポザーゼは、それらのタグメンテーション活性を発揮することができ、その結果、配列Ａ及びＢの相補配列によって隣接された目的の分子の配列が、５’及び３’においてトランスポザーゼに結合するための半部位間に位置する集合体の第３の分子の配列によって置換される。
【0155】
本発明において、一本鎖ＤＮＡ分子を形成するために、集合体の第１分子、第２分子及び第３分子は、有利には、デオキシリボヌクレオチドからなる分子である。
【0156】
更により有利には、集合体の第１の分子、第２の分子及び第３の分子はハイブリッドＤＮＡ／ＲＮＡ分子であり、分子の「骨格」はＤＮＡであり、目的の核酸分子の認識配列Ａ及びＢ並びに第３の分子の中心領域はＲＮＡである。これは、本発明を可能にする配列置換がＲＮＡ分子に対して直接行われる場合に特に有利である。
【0157】
［図９］－Ａは、対象分子と本発明による集合体との相互作用を示す。
【0158】
有利には、本発明は、第１の分子若しくは第２の分子、又は両方の分子が、特に修飾ヌクレオチドを介して酵素とカップリングしている、前述の複合体に関する。この酵素は、目的の分子の置換を促進することが意図される。この酵素は、
ヘリカーゼ（スーパーコイルであるか、又は更にはヒストンなどのタンパク質と会合している二本鎖分子の二本鎖を解離させる（ｏｐｅｎｉｎｇ）ことができる酵素）、
トポイソメラーゼ（一時的切断を生成することによってＤＮＡのトポロジー構造に作用する酵素）、
ヌクレオチドのリン酸５’末端と別のヌクレオチドのＯＨ ３’末端との間にホスホジエステル連結を形成することを可能にするリガーゼ、
特にワトソン・クリックモデルに従って逆平行相補鎖をコピーすることによって、開始部位である遊離ＯＨ ３’から５’から３’に方向に核酸分子を合成するポリメラーゼ
であり得る。
ヘリカーゼ（スーパーコイルであるか、又は更にはヒストンなどのタンパク質と会合している二本鎖分子の二本鎖を解離させる（ｏｐｅｎｉｎｇ）ことができる酵素）、
トポイソメラーゼ（一時的切断を生成することによってＤＮＡのトポロジー構造に作用する酵素）、
ヌクレオチドのリン酸５’末端と別のヌクレオチドのＯＨ ３’末端との間にホスホジエステル連結を形成することを可能にするリガーゼ、
特にワトソン・クリックモデルに従って逆平行相補鎖をコピーすることによって、開始部位である遊離ＯＨ ３’から５’から３’に方向に核酸分子を合成するポリメラーゼ
であり得る。
【0159】
本発明の範囲内で企図される配列置換を可能にするのに必要な全ての酵素材料を有するために、酵素のうちの２つ以上を組み合わせることも可能である。
【0160】
特定の一態様では、集合体の第１の分子は、その５’部分に、より正確には第１のトランスポザーゼ結合部位とＡ領域との間に、１つ以上の修飾ヌクレオチドを含有することができる。同様に、集合体の第３の分子は、その３’部分に、より正確には第１のトランスポザーゼ結合部位と３領域との間に、１つ以上の修飾ヌクレオチドを含有することができる。
【0161】
この修飾ヌクレオチドは、特に、置換された炭素鎖を、タンパク質タグ、又はストレプトアビジン若しくはビオチンなどの特定の相互作用を可能にする分子でグラフトすることによって修飾される。
【0162】
次いで、このような改変は、この集合体の第１の分子に、タグメンテーション及び配列置換を促進するために有用であり得る酵素を特異的に結合させることを可能にする。例えば、二本鎖分子の二本鎖を解離させるのに有用なビオチン化ヘリカーゼ（又は逆に、ストレプトアビジン及びビオチン化ヌクレオチドにグラフトされたヘリカーゼ）をグラフトすることを可能にするストレプトアビジングラフトを有することが特に有利である。組換え鎖を３’側に接続するために、ビオチン化リガーゼ（又はストレプトアビジンとカップリングしたリガーゼ）によるグラフティングを企図することも可能である。
【0163】
オリゴヌクレオチドを集合体の第１の分子又は第２の分子と会合させて、オリゴヌクレオチドが第１又は第２の分子の所定の領域上で対合するようにすることも可能である。次いで、このオリゴヌクレオチドは、有利には、本明細書において先に説明したようなグラフト分子とカップリングしている。
【0164】
上記集合体は、例えば、一本鎖ＤＮＡ分子又はＲＮＡ上の配列の置換などの一本鎖配列置換に適している。
【0165】
二本鎖分子の２つの鎖を置換するために、前述の集合体のうちの２つを使用することが有用であり、これらの２つの集合体は、
第１の集合体が、本明細書において先に規定された第１、第２及び第３の分子を含み、
第２の集合体が、第４、第５、及び第６の配列を含み、
その結果：
第３及び第６の配列が各々、置換配列の鎖を含み、これらの配列がワトソン・クリック対合に従って相補的であり、
第１及び第４の配列が、Ａ領域及びＡ’領域（Ａ’領域は、第１の分子のＡ領域の第４の分子の等価物である）において、置換される領域の５’部分及び置換される領域の相補鎖の３’部分をそれぞれ認識する配列を含み、
第２及び第５の配列が、Ｂ領域及びＢ’領域（Ｂ’領域は、第２の分子のＢ領域の第５の分子の等価物である）において、置換される領域の３’部分及び置換される領域の相補鎖の５’部分をそれぞれ認識する配列を含む
ようなものである。
第１の集合体が、本明細書において先に規定された第１、第２及び第３の分子を含み、
第２の集合体が、第４、第５、及び第６の配列を含み、
その結果：
第３及び第６の配列が各々、置換配列の鎖を含み、これらの配列がワトソン・クリック対合に従って相補的であり、
第１及び第４の配列が、Ａ領域及びＡ’領域（Ａ’領域は、第１の分子のＡ領域の第４の分子の等価物である）において、置換される領域の５’部分及び置換される領域の相補鎖の３’部分をそれぞれ認識する配列を含み、
第２及び第５の配列が、Ｂ領域及びＢ’領域（Ｂ’領域は、第２の分子のＢ領域の第５の分子の等価物である）において、置換される領域の３’部分及び置換される領域の相補鎖の５’部分をそれぞれ認識する配列を含む
ようなものである。
【0166】
次に、この二重複合体又はこの二重集合体を、［図１０］－Ａに示す。
【0167】
有利には、本発明は、以下の表５の第１及び第３の分子３００対のうちの１つを含む、前述の集合体に関する。
【0168】
【表14(01)】
【0169】
【表14(02)】
【0170】
【表14(03)】
【0171】
【表14(04)】
【0172】
【表14(05)】
【0173】
【表14(06)】
【0174】
【表14(07)】
【0175】
更に別の態様では、本発明は、リコンビナーゼの発現を可能にする少なくとも１つのベクターと、本明細書において先に規定された集合体の第１、第２及び第３の分子と、を含む、キット又はセットに関する。
【0176】
このキットは、集合体の３つの分子を含む１つの容器、又はいくつかの別々の容器のいずれかからなる。
【0177】
上記キットに含まれるトランスポザーゼは、複合体の第１の分子と第３の分子、及び／又は複合体の第２の分子と第３の分子との相互作用によって形成される結合部位を認識することができるトランスポザーゼである。
【0178】
複合体が２つの異なるトランスポザーゼに対する２つの結合部位を含有するようなものである場合、キットは、各々がトランスポザーゼのうちの１つをコードする２つの異なるベクターを含む。
【0179】
キットはまた、本明細書において先に議論されたように、他の酵素（例えば、ヘリカーゼ又はリガーゼ）を更に含み得る。
【0180】
本発明によるキットは、有利には、本明細書において先に規定された２つの集合体を形成するのに必要なものを含む。
【0181】
本発明はまた、核酸操作のための、特に標的配列を目的の配列で置換するための、本明細書において先に規定された集合体の使用に関する。前述の使用は、特に、次のこと：ヒトの生殖系列遺伝的同一性を改変するための方法を含まないこと、かつ／又は手術若しくは療法によってヒト若しくは動物の身体を治療するための方法ではないことを条件とする。
【0182】
本明細書において先に説明したように、前述の集合体は、トランスポザーゼタグメンテーション特性を使用することによって、標的領域を特異的に標的とし、それを目的の配列で置換することを可能にする。
【0183】
本発明による集合体は、異なる生物において、例えば、遺伝的に改変された植物を得るための植物において、又はヒト疾患のモデルを作製するための動物において、又は薬物を試験することを可能にする生きた治療ツールにおいて、標的遺伝子改変（及び特に、遺伝子又は非コード配列の置換）を行うのに特に有利である。
【0184】
更に、本発明は、薬物として、より具体的には遺伝子治療薬として使用するための、特に核酸修飾に関連する疾患を治療又は予防するための前述の集合体に関する。
【0185】
前述の集合体は特定の配列の置換を可能にするので、置換、欠失又は挿入などの改変によって変異遺伝子を特異的に認識する第１及び第２の分子を設計すること、並びに変異遺伝子の参照野生型配列を含む第３の分子を設計することが可能である。
【0186】
また、適切なトランスポザーゼの存在下で、変異遺伝子の配列を野生型配列で置換することが可能であり、したがって、遺伝子の変異によって引き起こされる疾患に罹患している個体を治療することが可能である。
【0187】
本発明はまた、核酸修飾に関連する疾患を治療又は予防するための薬剤を製造するための、上記複合体の使用に関する。
【0188】
いくつかの態様では、これらの薬物は、ヒトの生殖系列同一性を改変することを意図しておらず、動物において不当な苦痛を与えることも意図していない。
【0189】
本発明は更に、ハイブリッド核酸分子を得るように、核酸分子の標的領域を別の核酸分子の目的の領域で置換するための、特にインビトロの方法であって、
本明細書において規定された集合体を、標的領域を含む核酸と接触させることであって、
集合体は、第１の分子のＡ配列が、標的領域の５’にすぐ領域の相補配列を含み、
第１の分子のＢ配列が、標的領域の３’にすぐ領域の相補配列を含み、
第３の分子が、置換複合体を得るために、第１の分子のトランスポザーゼを認識するための第２の配列の相補配列と、第２の分子のトランスポザーゼを認識するための第１の配列の相補配列との間に位置する領域に目的の領域を含むようなものである、接触させることと、
組換え複合体を得るために、集合体に含まれるトランスポザーゼの二本鎖結合部位を認識するトランスポザーゼの存在下に置換複合体を配置することと、
標的領域の代わりに目的の領域を含むハイブリッド核酸分子を得るために、組み合わせ複合体を組換えることと、を含む、方法に関する。
本明細書において規定された集合体を、標的領域を含む核酸と接触させることであって、
集合体は、第１の分子のＡ配列が、標的領域の５’にすぐ領域の相補配列を含み、
第１の分子のＢ配列が、標的領域の３’にすぐ領域の相補配列を含み、
第３の分子が、置換複合体を得るために、第１の分子のトランスポザーゼを認識するための第２の配列の相補配列と、第２の分子のトランスポザーゼを認識するための第１の配列の相補配列との間に位置する領域に目的の領域を含むようなものである、接触させることと、
組換え複合体を得るために、集合体に含まれるトランスポザーゼの二本鎖結合部位を認識するトランスポザーゼの存在下に置換複合体を配置することと、
標的領域の代わりに目的の領域を含むハイブリッド核酸分子を得るために、組み合わせ複合体を組換えることと、を含む、方法に関する。
【0190】
置換、すなわちトランスポザーゼによるタグメンテーションの間、置換断片の３’末端は、置換された配列の直後の配列の５’末端にホスホジエステル結合によって結合することに留意されたい。このライゲーションは、タグメンテーション中に起こる。
【0191】
逆に、置換された配列の直前に位置する配列の３’末端と置換鎖の５’末端は互いに結合しない。また、置換を終結させるために、リガーゼを使用して、これらの２つの末端を接続することが必要である。
【0192】
置換部位において、置換分子は、トランスポザーゼ認識配列によって３’及び５’に隣接することにも留意されたい。
【0193】
一本鎖標的の置換機構を［図９］に示す。
【0194】
第１の工程において、標的配列の５’部分の相補領域、標的配列の３’部分の相補領域、及び目的の配列をそれぞれ含む第１、第２及び第３の分子からなる集合体は、第１の分子のＧ／Ｃリッチな相補領域が互いに対合し、第２の分子のＧ／Ｃリッチな相補領域が一緒に対合するように、空間において組織化される（［図９］）－Ａ）。
【0195】
標的配列の存在下で、第１及び第２の分子にそれぞれ含まれる標的配列の５’部分及び３’部分の相補領域は、それらのそれぞれの相補領域と対合して、標的分子及び集合体の３つの分子を含む４分子複合体を形成する。第１及び第２の分子とそれらの標的との間の相互作用（又は対合）は、Ｇ／Ｃリッチ領域の相互作用を破壊する効果を有し、その結果、トランスポザーゼ二量体が位置付けられているトランスポザーゼ結合部位が標的分子に空間的に近接して位置付けられる。次いで、トランスポザーゼは、それらの活性を発揮し、［図９］－Ｂに示すように、標的分子及び目的の分子の両方を（２つの結合部位の間で）切断することができる。
【0196】
したがって、タグメンテーションは、
第３の分子の３’末端が、標的配列の３’の領域においてトランスポザーゼによって生成された遊離５’末端に結合する
ように行われる。この結合は、２つの末端のライゲーションによる共有結合であり、
第３の分子の５’末端は、標的配列の５’の領域においてトランスポザーゼによって生成された遊離３’末端の反対側にもたらされる。トランスポザーゼによって、標的配列の５’の領域に９塩基対の欠失が生じる（［図９］－Ｃの点線の円によって示されている）。最初の標的配列の５’及び３’の領域間に位置する目的の配列を有する分子全体を回収するために、ライゲーションが必要である。
第３の分子の３’末端が、標的配列の３’の領域においてトランスポザーゼによって生成された遊離５’末端に結合する
ように行われる。この結合は、２つの末端のライゲーションによる共有結合であり、
第３の分子の５’末端は、標的配列の５’の領域においてトランスポザーゼによって生成された遊離３’末端の反対側にもたらされる。トランスポザーゼによって、標的配列の５’の領域に９塩基対の欠失が生じる（［図９］－Ｃの点線の円によって示されている）。最初の標的配列の５’及び３’の領域間に位置する目的の配列を有する分子全体を回収するために、ライゲーションが必要である。
【0197】
タグメンテーションから得られる最終分子は、５’から３’への方向に、９塩基対が部分的に欠失した最初の標的配列の５’領域の一部、それに続く第２のトランスポザーゼ結合配列、それに続く目的の配列それ自体、それに続く第１のトランスポザーゼ結合配列、及び最後に最初の標的配列の５’領域の一部分からなる。
【0198】
更に別の態様では、本発明は、細胞のゲノムの二本鎖ＤＮＡの特定の断片を目的の他の二本鎖ＤＮＡ断片で置換して、二本鎖ＤＮＡの特定の断片の代わりに目的の他の二本鎖ＤＮＡ断片を含む組換えハイブリッドゲノムを得ることを可能にする、細胞のゲノムを編集するための、特にインビトロ又はエクスビボの方法であって、
本明細書において先に規定された第１の集合体を準備することであって、
第１の分子のＡ配列が、特定の断片の５’に隣接領域の相補配列を含み、
第２の分子のＢ配列が、特定の断片の３’に隣接領域の相補配列を含み、
第３の分子が、第１の分子のトランスポザーゼを認識するための第２の配列の相補配列と、第２の分子のトランスポザーゼを認識するための第１の配列の相補配列との間に位置する領域の間に、特定の断片の鎖のうちの一方の配列を含む、第１の集合体を準備することと、
任意選択で、本明細書において先に規定された第２の集合体を準備することであって、
第２の集合体の第１の分子の相補領域のＡ配列が、特定の断片の５’に隣接領域の相補配列を含み、
第２の集合体の第２の分子の相補領域のＢ配列が、特定の断片の３’に隣接領域の相補配列を含み、
第２の集合体の第３の分子が、第２の集合体の第１の分子のトランスポザーゼを認識するための第２の配列の相補配列と、第２の集合体の第２の分子のトランスポザーゼを認識するための第１の配列の相補配列との間に位置する領域の間に、第１の集合体の第３の配列に含まれる特定の断片の相補鎖の配列を含み、
第１の集合体の第１の分子のＡ領域に含まれる特定の断片の５’の隣接領域の相補配列が、第２の集合体の第１の分子のＡ領域に含まれる特定の断片の５’の隣接領域の相補配列に対して最大で９５％相補的であり、
第１の集合体の第１の分子のＢ領域に含まれる特定の断片の３’の隣接領域の相補配列が、第２の集合体の第１の分子のＢ領域に含まれる特定の断片の３’の隣接領域の相補配列に対して最大で９５％相補的である、第２の集合体を準備することと、
組換え複合体を得るために、
編集される準備が整った細胞を得るために、細胞を組換え複合体と接触させることと、
編集された細胞を得るために、編集される準備が整った細胞においてトランスポザーゼを発現させることと、
編集された細胞を選択することであって、編集された細胞のゲノムが、特定の二本鎖ＤＮＡ断片の代わりに、目的の他の二本鎖ＤＮＡ断片を含む、選択することと、を含み、
次のこと：ヒトの生殖系列遺伝的同一性を改変するための方法ではないこと、かつ手術又は療法によってヒト又は動物の身体を治療するための方法ではないことを条件とする、方法に関する。
本明細書において先に規定された第１の集合体を準備することであって、
第１の分子のＡ配列が、特定の断片の５’に隣接領域の相補配列を含み、
第２の分子のＢ配列が、特定の断片の３’に隣接領域の相補配列を含み、
第３の分子が、第１の分子のトランスポザーゼを認識するための第２の配列の相補配列と、第２の分子のトランスポザーゼを認識するための第１の配列の相補配列との間に位置する領域の間に、特定の断片の鎖のうちの一方の配列を含む、第１の集合体を準備することと、
任意選択で、本明細書において先に規定された第２の集合体を準備することであって、
第２の集合体の第１の分子の相補領域のＡ配列が、特定の断片の５’に隣接領域の相補配列を含み、
第２の集合体の第２の分子の相補領域のＢ配列が、特定の断片の３’に隣接領域の相補配列を含み、
第２の集合体の第３の分子が、第２の集合体の第１の分子のトランスポザーゼを認識するための第２の配列の相補配列と、第２の集合体の第２の分子のトランスポザーゼを認識するための第１の配列の相補配列との間に位置する領域の間に、第１の集合体の第３の配列に含まれる特定の断片の相補鎖の配列を含み、
第１の集合体の第１の分子のＡ領域に含まれる特定の断片の５’の隣接領域の相補配列が、第２の集合体の第１の分子のＡ領域に含まれる特定の断片の５’の隣接領域の相補配列に対して最大で９５％相補的であり、
第１の集合体の第１の分子のＢ領域に含まれる特定の断片の３’の隣接領域の相補配列が、第２の集合体の第１の分子のＢ領域に含まれる特定の断片の３’の隣接領域の相補配列に対して最大で９５％相補的である、第２の集合体を準備することと、
組換え複合体を得るために、
編集される準備が整った細胞を得るために、細胞を組換え複合体と接触させることと、
編集された細胞を得るために、編集される準備が整った細胞においてトランスポザーゼを発現させることと、
編集された細胞を選択することであって、編集された細胞のゲノムが、特定の二本鎖ＤＮＡ断片の代わりに、目的の他の二本鎖ＤＮＡ断片を含む、選択することと、を含み、
次のこと：ヒトの生殖系列遺伝的同一性を改変するための方法ではないこと、かつ手術又は療法によってヒト又は動物の身体を治療するための方法ではないことを条件とする、方法に関する。
【0199】
有利には、本発明は、細胞のゲノムを編集するための方法であって、細胞のゲノムの二本鎖ＤＮＡの特定の断片を目的の他の二本鎖ＤＮＡ断片で置換して、二本鎖ＤＮＡの特定の断片の代わりに目的の他の二本鎖ＤＮＡ断片を含む組換えハイブリッドゲノムを得ることを可能にするものであり、
本明細書において先に規定された第１の集合体を準備することであって、
第１の分子のＡ配列が、特定の断片の５’に隣接領域の相補配列を含み、
第２の分子のＢ配列が、特定の断片の３’に隣接領域の相補配列を含み、
第３の分子が、第１の分子のトランスポザーゼを認識するための第２の配列の相補配列と、第２の分子のトランスポザーゼを認識するための第１の配列の相補配列との間に位置する領域の間に、特定の断片の鎖のうちの一方の配列を含む、第１の集合体を準備することと、
本明細書において先に規定された第２の集合体を準備することであって、
第２の集合体の第１の分子の相補領域のＡ配列が、特定の断片の５’に隣接領域の相補配列を含み、
第２の集合体の第２の分子の相補領域のＢ配列が、特定の断片の３’に隣接領域の相補配列を含み、
第２の集合体の第３の分子が、第２の集合体の第１の分子のトランスポザーゼを認識するための第２の配列の相補配列と、第２の集合体の第２の分子のトランスポザーゼを認識するための第１の配列の相補配列との間に位置する領域の間に、第１の集合体の第３の配列に含まれる特定の断片の相補鎖の配列を含み、
第１の集合体の第１の分子のＡ領域に含まれる特定の断片の５’の隣接領域の相補配列が、第２の集合体の第１の分子のＡ領域に含まれる特定の断片の５’の隣接領域の相補配列に対して最大で９５％相補的であり、
第１の集合体の第１の分子のＢ領域に含まれる特定の断片の３’の隣接領域の相補配列が、第２の集合体の第１の分子のＢ領域に含まれる特定の断片の３’の隣接領域の相補配列に対して最大で９５％相補的である、第２の集合体を準備することと、
組換え複合体を得るために、
編集される準備が整った細胞を得るために、細胞を組換え複合体と接触させることと、
編集された細胞を得るために、編集される準備が整った細胞においてトランスポザーゼを発現させることと、
編集された細胞を選択することであって、編集された細胞のゲノムが、特定の二本鎖ＤＮＡ断片の代わりに、目的の他の二本鎖ＤＮＡ断片を含む、選択することと、を含み、
次のこと：ヒトの生殖系列遺伝的同一性を改変するための方法ではないこと、かつ手術又は療法によってヒト又は動物の身体を治療するための方法ではないことを条件とする、方法に関する。
本明細書において先に規定された第１の集合体を準備することであって、
第１の分子のＡ配列が、特定の断片の５’に隣接領域の相補配列を含み、
第２の分子のＢ配列が、特定の断片の３’に隣接領域の相補配列を含み、
第３の分子が、第１の分子のトランスポザーゼを認識するための第２の配列の相補配列と、第２の分子のトランスポザーゼを認識するための第１の配列の相補配列との間に位置する領域の間に、特定の断片の鎖のうちの一方の配列を含む、第１の集合体を準備することと、
本明細書において先に規定された第２の集合体を準備することであって、
第２の集合体の第１の分子の相補領域のＡ配列が、特定の断片の５’に隣接領域の相補配列を含み、
第２の集合体の第２の分子の相補領域のＢ配列が、特定の断片の３’に隣接領域の相補配列を含み、
第２の集合体の第３の分子が、第２の集合体の第１の分子のトランスポザーゼを認識するための第２の配列の相補配列と、第２の集合体の第２の分子のトランスポザーゼを認識するための第１の配列の相補配列との間に位置する領域の間に、第１の集合体の第３の配列に含まれる特定の断片の相補鎖の配列を含み、
第１の集合体の第１の分子のＡ領域に含まれる特定の断片の５’の隣接領域の相補配列が、第２の集合体の第１の分子のＡ領域に含まれる特定の断片の５’の隣接領域の相補配列に対して最大で９５％相補的であり、
第１の集合体の第１の分子のＢ領域に含まれる特定の断片の３’の隣接領域の相補配列が、第２の集合体の第１の分子のＢ領域に含まれる特定の断片の３’の隣接領域の相補配列に対して最大で９５％相補的である、第２の集合体を準備することと、
組換え複合体を得るために、
編集される準備が整った細胞を得るために、細胞を組換え複合体と接触させることと、
編集された細胞を得るために、編集される準備が整った細胞においてトランスポザーゼを発現させることと、
編集された細胞を選択することであって、編集された細胞のゲノムが、特定の二本鎖ＤＮＡ断片の代わりに、目的の他の二本鎖ＤＮＡ断片を含む、選択することと、を含み、
次のこと：ヒトの生殖系列遺伝的同一性を改変するための方法ではないこと、かつ手術又は療法によってヒト又は動物の身体を治療するための方法ではないことを条件とする、方法に関する。
【0200】
このゲノム編集方法が、本明細書において先に記載された単一分子を置換し、本明細書において先に記載された集合体を使用するための方法に基づく限りにおいて、全ての先に記載された特徴及び全ての変異体が、本明細書において必要な変更を加えて適用される。
【0201】
本発明のこの態様では、考慮された集合体（第１又は第２）の第１の分子は、常に、考慮された集合体の第３の分子の５’に位置付けられていることに留意されたい。
【0202】
また、第１の集合体の第１の分子は、第２の集合体の第２の分子の「上」に位置し、逆もまた同様である。また、前述の５’から３’への配向は、標的配列に対して目的の配列を正確に位置付けることを可能にする。
【0203】
ゲノム編集は、細胞のゲノムを高精度で改変することからなる。遺伝子を不活性化すること、標的変異を導入すること、特定の変異を修正すること、又は新たな遺伝子を挿入することが可能である。この遺伝子操作技術は、ホスホジエステル結合で核酸を切断することができるヌクレアーゼ（本明細書ではトランスポザーゼ）を伴う。
【0204】
本発明に関連して、先に説明したように、本発明による集合体の第１及び第２の分子は、第３の配列に含まれる目的の配列でそれを置換するために、標的領域に隣接するように標的領域に集合体を位置付けることを可能にする。
【0205】
二本鎖分子を編集する文脈では、標的分子の２本の鎖を同時に置き換えて本発明による２つの集合体を有するようにするために、各集合体が標的分子の２本の鎖のうちの一方を特異的に標的とすることが必要である。
【0206】
第１の集合体の第１の分子のＡ配列に含まれる相補配列は、第２の集合体の第１の分子のＡ配列に含まれる相補配列に相補的ではないことに留意されたい。同様に、第１の集合体の第２の分子のＢ配列は、第２の集合体の第２の分子のＢ配列に含まれる相補配列に相補的ではない。
【0207】
更に、第１の集合体の第１の分子のＡ配列に含まれる相補配列が、第１の集合体の第２の分子のＢ配列に含まれる相補配列に対してずれている（これらの２つの分子は、一方が他方の「上」にある）ことが有利である。これは、これらの相補配列を認識するための領域が最大で９５％であることを意味する。換言すれば、Ａ配列及びＢ配列に含まれる相補配列が２０ヌクレオチドを含む場合、相補配列は、最大１９ヌクレオチドが互いに相補的であるにすぎない。
【0208】
しかしながら、これらの相補領域の相互相補性は可能な限り低いことが好ましく、又は更にはそれらが相互に相補的でないことが好ましい。
【0209】
これらの所見を明確に説明するために、標的配列の５’部分が４０ヌクレオチドを含むと考えられる場合、第１の集合体の第１の分子のＡ配列に含まれる相補領域が最初の２０ヌクレオチドに相補的であるのに対して、第２の集合体の第２の分子のＢ配列に含まれる相補領域は、標的配列の５’部分の相補配列の最後の２０ヌクレオチドに相補的であることが適切である。
【0210】
このオフセットは、配列配向がそれを可能にしない場合であっても、目的の配列のいかなる不正確な配向も回避する。
【0211】
タグメンテーション工程の順序及び結果を［図１０］に記載する。
【0212】
最終分子を得るために、そしてタグメンテーション後の５’において９塩基対が欠失していることに起因して、細胞が修復系を動員化して、特に、その３’末端がタグメンテーション中に結合された相補鎖をコピーするＤＮＡポリメラーゼを使用することによって、ホールを充填することが必要である。
【図面の簡単な説明】
【0213】
本発明は、以下の実施例及び図面を読めばより良く理解されるであろう。
【図9】［図９］は、一本鎖分子の標的配列を目的の配列で置換する、ある特定の工程の順序の模式図である。 Ａ：不対標的分子及び集合体を表す。 Ｂ：対合した標的分子及び集合体を表す。トランスポザーゼは点線で示され、切断はハサミで示される。集合体の第３の分子上の切断は、分子のいずれかの側の２つのトランスポザーゼ結合部位間で行われる（２つの切断）ことに留意されたい。 Ｃ：タグメンテーションから生じる分子を表す。置換された領域の５’における９塩基の欠失を点線で示す。
【図10】［図１０］は、二本鎖分子の標的配列を、それ自体が二本鎖である目的の配列で置換する、ある特定の工程の順序の模式図である。 Ａ：不対標的分子及び集合体を表す。 Ｂ：対合した標的分子及び集合体を表す。トランスポザーゼは点線で示され、切断はハサミで示される。集合体の第３の分子上の切断は、分子のいずれかの側の２つのトランスポザーゼ結合部位間で行われる（２つの切断）ことに留意されたい。 Ｃ：タグメンテーションから生じる分子を表す。置換された領域の５’における９塩基の欠失を点線で示す。
【図11】［図１１］は、本発明によるタグメンテーションを示すアガロースゲルを示す。ａ．３つの試料群を含むアガロースゲル；ｍＣｈｅｒｒｙ－ＣＤ９プラスミドを用いた、異なるトランスポザーゼ複合体（陰性対照、Ｔｎ５ ＷＴ、Ｔｎ５ Ｍｅ及びＴｎ５ ＤＲＥＡＭＴ、すなわち本発明による）の試験、ＨＥＫ ２９３Ｔ全ｍＲＮＡのＰＣＲ増幅、及びｍＣｈｅｒｒｙ－ＣＤ９プラスミドをトランスフェクトしたＨＥＫ ２９３Ｔ全ｍＲＮＡのＰＣＲ増幅（ＰＣＲ＋／－対照の付加）。ｂ．ｍＣｈｅｒｒｙ－ＣＤ９プラスミド上で１０倍濃縮された異なるトランスポザーゼミックス（ａを参照）のアガロースゲル。
【図12】［図１２］は、Ｔｎ５ ＤＲＥＡＭＴミックスについて、陽性増幅バンド（ゲル［図１０］ａ）のサンガー配列決定の結果を示す。得られた配列（配列番号４２９）及び対応するクロマトグラムを提示する。＊＊はＧＦＰ挿入ゾーンを示す。ＧＦＰ配列に隣接し、ｍＣｈｅｒｒｙ配列に下線が引かれている。
【図13】［図１３］は、３つの試料群を含むアガロースゲル；ｍＣｈｅｒｒｙ－ＣＤ９プラスミドを用いた、異なるトランスポザーゼ複合体（陰性対照、Ｔｎ５ ＷＴ、Ｔｎ５ Ｍｅ及びＴｎ５ ＤＲＥＡＭＴ）の試験、ＨＥＫ ２９３Ｔ全ｃＤＮＡのＰＣＲ増幅、及びｍＣｈｅｒｒｙ－ＣＤ９プラスミドをトランスフェクトしたＨＥＫ ２９３Ｔ全ｃＤＮＡのＰＣＲ増幅（ＰＣＲ＋／－対照の付加）を示す。
【図14】［図１４］は、Ｔｎ５ ＤＲＥＡＭＴミックスについて、陽性増幅バンド（ゲル［図１３］）のサンガー配列決定の結果を示す。得られた配列（配列番号４３０）及び対応するクロマトグラムを提示する。＊＊はＧＦＰ挿入ゾーンを示す。ＣＤ９配列が隣接している。
【図15】［図１５］は、３つの試料群を含むアガロースゲルを示す。ｍＣｈｅｒｒｙ－ＣＤ９プラスミドを用いた、異なるトランスポザーゼ複合体（陰性対照、Ｔｎ５ ＷＴ、Ｔｎ５ Ｍｅ及びＴｎ５ ＤＲＥＡＭＴ）の試験、ＨＥＫ ２９３Ｔ全ｃＤＮＡのＰＣＲ増幅、及びｍＣｈｅｒｒｙ－ＣＤ９プラスミドをトランスフェクトしたＨＥＫ ２９３Ｔ全ｃＤＮＡのＰＣＲ増幅（ＰＣＲ＋／－対照の付加）を示す。
【図16】［図１６］は、Ｔｎ５ ＤＲＥＡＭＴミックスについて、陽性増幅バンド（ゲル［図１５］）のサンガー配列決定の結果を示す。得られた配列（配列番号４３１）及び対応するクロマトグラムを提示する。＊＊はＧＦＰ挿入ゾーンを示す。ＣＤ９配列が隣接している。
【図17】［図１７］は、ｍＣｈｅｒｒｙ－ＣＤ９プラスミド上の「新規設計」ＵＶＲＤ－ｍＳＡ／Ｔｎ５／ＤＲＥＡＭＴ複合体の試験を示す。ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞へのｍＣｈｅｒｒｙ－ＣＤ９プラスミドの注入（トランスフェクション）及びその後のＤＲＥＡＭＴ技術は、目に見える色の変化（図に示されるように、赤から緑）を検索する。
【実施例】
【0214】
実施例１－インビトロでの本発明の実施。
この実施例の目的は、本発明による集合体が、一本鎖核酸分子（ＲＮＡ又はｃＤＮＡ）の配列を目的の配列で容易かつ特異的に置換することを可能にすることを示すことである。
この実施例の目的は、本発明による集合体が、一本鎖核酸分子（ＲＮＡ又はｃＤＮＡ）の配列を目的の配列で容易かつ特異的に置換することを可能にすることを示すことである。
【0215】
この実施例において、目的は、ｍＣｈｅｒｒｙ－ＣＤ９の配列をＧＦＰの配列で置換することである。
－ｍＣｈｅｒｒｙ－ＣＤ９を標的とする組換え集合体を調製すること。
－ｍＣｈｅｒｒｙ－ＣＤ９を標的とする組換え集合体を調製すること。
【0216】
以下を収容する２つの別々のチューブを準備すること：
チューブ１（１０μＬ）について：
＋ｍＣｈｅｒｒｙの配列を認識するための配列をＡ領域に含む、１０μＭのループＡオリゴヌクレオチド（第１の分子）；
＋制限半部位を３’に含む、１０μＭのオリゴヌクレオチドＡ（第３の分子）
＋リバースＢＳＰＥｉ Ｆｒａｇオリゴ（１０μＭ）
チューブ２（１０μＬ）について、
＋ＣＤ９の配列を認識するための配列をＢ領域に含む、１０μＭのループＢオリゴヌクレオチド（第２の分子）；
＋制限半部位を３’に含む、１０μＭのオリゴヌクレオチドＡ（第３の分子）
＋ＮｄｅＩ Ｆｒａｇオリゴ（１０μＭ）。
チューブ１（１０μＬ）について：
＋ｍＣｈｅｒｒｙの配列を認識するための配列をＡ領域に含む、１０μＭのループＡオリゴヌクレオチド（第１の分子）；
＋制限半部位を３’に含む、１０μＭのオリゴヌクレオチドＡ（第３の分子）
＋リバースＢＳＰＥｉ Ｆｒａｇオリゴ（１０μＭ）
チューブ２（１０μＬ）について、
＋ＣＤ９の配列を認識するための配列をＢ領域に含む、１０μＭのループＢオリゴヌクレオチド（第２の分子）；
＋制限半部位を３’に含む、１０μＭのオリゴヌクレオチドＡ（第３の分子）
＋ＮｄｅＩ Ｆｒａｇオリゴ（１０μＭ）。
【0217】
次いで、２本のチューブを９５℃に５分間加熱し、次いで室温で１時間放置する。
【0218】
室温になったら、制限部位の消化を可能にするために、チューブの内容物を酵素ＮｄｅＩ又は酵素ＢＳＰＥｉのいずれかの存在下に置く。
【0219】
次いで、消化産物をＰＣＲ精製キット（溶出量２０μＬ）で精製する。
【0220】
並行して、５’及び３’にＮｄｅ Ｉ及びＢＳＰＥｉ制限部位を有するように、ＧＦＰをコードする配列を増幅する。次に、ＰＣＲ産物を２つの制限酵素で消化し、消化産物をＰＣＲ精製キット（溶出量２０μＬ）で精製する。
【0221】
次いで、チューブ１及び２の内容物を、Ｔ４ファージのリガーゼ（４μＬ、すなわち１００Ｕ）の存在下で、５μＬのＴ４緩衝液（１０倍）及び１μＬのｄｄＨ２０と共に、（増幅及び消化）ＧＦＰ断片と合わせて、５０μＬの総反応体積とする。
【0222】
次いで、この溶液を室温で１時間放置し、次いで、ゲル精製を行って、１キロベース（ｋｂ）より大きく、その５’末端及び３’末端に２つの一本鎖分子（集合体の第１の分子及び第２の分子）を含む最大のＧＦＰ断片を単離して、組換え複合体を形成する。
【0223】
次いで、組換え複合体は、トランスポザーゼ二量体と共にインキュベートされる準備が整う。
【0224】
対照において、各々１０μＭのＭｅＡ及びＭｅＢオリゴヌクレオチドを、ＭＥＲｅｖ断片（Ｓ．Ｐｉｃｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ ２０１４に以前に記載された）：
Ｔｎ５ＭＥｒｅｖ、
５’－［ｐｈｏｓ］ＣＴＧＴＣＴＣＴＴＡＴＡＣＡＣＡＴＣＴ－３’（配列番号１１）
Ｔｎ５ＭＥ－Ａ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＦＣ－１２１－１０３０）、
５’－ＴＣＧＴＣＧＧＣＡＧＣＧＴＣＡＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＡＧＡＧＡＣＡＧ－３’、（配列番号１２）
及びＴｎ５ＭＥ－Ｂ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＦＣ－１２１－１０３１）、
５’－ＧＴＣＴＣＧＴＧＧＧＣＴＣＧＧＡＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＡＧＡＧＡＣＡＧ－３’（配列番号１３）
を用いて、９５℃で５分間対合させた後、周囲温度で１時間放置することによって調製した。これらのオリゴは、タグメンテーション反応の陽性対照として有用である。
Ｔｎ５ＭＥｒｅｖ、
５’－［ｐｈｏｓ］ＣＴＧＴＣＴＣＴＴＡＴＡＣＡＣＡＴＣＴ－３’（配列番号１１）
Ｔｎ５ＭＥ－Ａ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＦＣ－１２１－１０３０）、
５’－ＴＣＧＴＣＧＧＣＡＧＣＧＴＣＡＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＡＧＡＧＡＣＡＧ－３’、（配列番号１２）
及びＴｎ５ＭＥ－Ｂ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＦＣ－１２１－１０３１）、
５’－ＧＴＣＴＣＧＴＧＧＧＣＴＣＧＧＡＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＡＧＡＧＡＣＡＧ－３’（配列番号１３）
を用いて、９５℃で５分間対合させた後、周囲温度で１時間放置することによって調製した。これらのオリゴは、タグメンテーション反応の陽性対照として有用である。
【0225】
Ｔｎ５トランスポザーゼの作製に関して、以下の刊行物：Ｓ．Ｐｉｃｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｏｍｅ ｒｅｓ ２０１４．の推奨を用いて、Ｔｎ５トランスポザーゼを作製する。
【0226】
次いで、２つの先の調製物、組換え複合体及び陽性対照オリゴを、以下のプロトコルを介してＴｎ５トランスポザーゼの作製と混合した：
０．１２５体積の組換え複合体又は対照オリゴの１０μＭ溶液（又はいわゆるＷＴ野生型Ｔｎ５については透析緩衝液（Ｓ．Ｐｉｃｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｏｍｅ，２０１４参照）のみ）＋０．４体積の１００％グリセロール溶液＋０．２４体積の透析緩衝液（Ｓ．Ｐｉｃｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｏｍｅ ｒｅｓ ２０１４参照）＋０．３６体積のＴｎ５溶液。
０．１２５体積の組換え複合体又は対照オリゴの１０μＭ溶液（又はいわゆるＷＴ野生型Ｔｎ５については透析緩衝液（Ｓ．Ｐｉｃｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｏｍｅ，２０１４参照）のみ）＋０．４体積の１００％グリセロール溶液＋０．２４体積の透析緩衝液（Ｓ．Ｐｉｃｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｏｍｅ ｒｅｓ ２０１４参照）＋０．３６体積のＴｎ５溶液。
【0227】
次いで、反応物を３０分かけて４５℃から３７℃にし、サーモサイクラー中で４分毎に１℃ずつ低下させる。
【0228】
同時に、本発明による技術を試験するために、いくつかの標的を作製した。
【0229】
ｍＣｈｅｒｒｙ－ＣＤ９プラスミドを陰性対照として使用し、並びにｍＣｈｅｒｒｙ－ＣＤ９ベクターを用いて、リポフェクタミン３０００によって予めトランスフェクトしたＨＥＫ ２９３Ｔ細胞に由来するｍＲＮＡ及びｃＤＮＡのライブラリーを作製した。
【0230】
ＨＥＫ細胞のトランスフェクション及び目視検査（ｍＣｈｅｒｒｙの発現による赤色膜）から４８時間後、ｍＲＮＡの全集団を抽出し、ｃＤＮＡに逆転写させる。
【0231】
次いで、これらのｍＲＮＡ又はｃＤＮＡライブラリーを、ＤＲＥＡＭＴ技術の本発明者らの「試験管内」試験のために使用する。
【0232】
本発明による技術を特徴付け、試験するために、異なるｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ及びプラスミド標的を、以下のものと接触させた：
Ｔｎ５ ＷＴ二量体：オリゴを含まない、
Ｔｎ５ Ｍｅ：Ｍｅオリゴ（陽性対照）を含む、及び
Ｔｎ５複合体：本発明による集合体を含む。
Ｔｎ５ ＷＴ二量体：オリゴを含まない、
Ｔｎ５ Ｍｅ：Ｍｅオリゴ（陽性対照）を含む、及び
Ｔｎ５複合体：本発明による集合体を含む。
【0233】
ｍＣｈｅｒｒｙ－ＣＤ９プラスミド及びｍＣｈｅｒｒｙ－ＣＤ９のトランスフェクションを伴う又は伴わないｍＲＮＡ又はｃＤＮＡライブラリーの３種類の標的を試験した。
【0234】
二本鎖又は一本鎖ＤＮＡ／ＲＮＡ溶液を、以下の反応により活性化されたＴｎ５の異なる溶液と接触させた：
１倍又は１０倍濃度のＴｎ５ ＷＴ、Ｔｎ５ Ｍｅ、Ｔｎ５複合体溶液又は同体積のｄｄＨ２０＋５００ｎｇのｍＣｈｅｒｒｙ－ＣＤ９プラスミド又は２μＬのｃＤＮＡ若しくはｍＲＮＡ
＋５倍タグメンテーション緩衝液（１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ、５０ｍＭ ＭｇＣｌ２、４０％ＰＥＧ ３５００）
＋ｄｄＨ２０（適量２０μＬ）。
１倍又は１０倍濃度のＴｎ５ ＷＴ、Ｔｎ５ Ｍｅ、Ｔｎ５複合体溶液又は同体積のｄｄＨ２０＋５００ｎｇのｍＣｈｅｒｒｙ－ＣＤ９プラスミド又は２μＬのｃＤＮＡ若しくはｍＲＮＡ
＋５倍タグメンテーション緩衝液（１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ、５０ｍＭ ＭｇＣｌ２、４０％ＰＥＧ ３５００）
＋ｄｄＨ２０（適量２０μＬ）。
【0235】
各タグメンテーション反応を、サーモサイクラーにおいて５５℃で７分間行い、次いで、０．５μＬのプロテイナーゼＫ溶液（２０μｇ／μＬ）を、７分間５５℃の第２のインキュベーション温度の前に添加して、トランスポザーゼを不活性化させる。
【0236】
したがって、［図１１］に示されるように、ＧＦＰの３’末端の沈降（ライゲーション）をｍＣｈｅｒｒｙ標的配列に対して行った。
【0237】
［図１１］のアガロースゲル上で、ｍＣｈｅｒｒｙ－ＣＤ９プラスミド（Ｄａｖｉｄｓｏｎ Ｌａｂ）を、２つの濃度（１倍及び１０倍）のＴｎ５溶液と接触させた。予想通り、高濃度（１０倍）で、Ｔｎ５ ＷＴミックス及びＴｎ５ Ｍｅ陽性対照は、プラスミドの分解（スメア、プラスミドバンドの消失）によって示される、それらのタグメンテーションを行った。
【0238】
更に、予想通り、集合体単独では、アガロースゲル上でのＤＮＡバンドの保存（［図１１］）によって示されるタグメンテーション（プラスミド分解）を行うことができなかった［なぜなら、それは、Ｔｎ５分子を放出し、タグメンテーションを可能にするｍＣｈｅｒｒｙ－ＣＤ９標的と対合するために、プラスミドの二本鎖ＤＮＡの二本鎖を解離させるための分子（ヘリカーゼ）を含まないからである］。このデータは、組換えられる鎖を標的一本鎖（本明細書ではｍＣｈｅｒｒｙ－ＣＤ９ ｍＲＮＡ断片）と対合させることによってのみそれらのタグメンテーション活性を発揮することができるＴｎ５複合体二量体を制限することによって結論付けることを可能にする。
【0239】
同じ濃度のＴｎ５溶液（１倍）を、２μＬのｍＲＮＡライブラリー（正常な又はｍＣｈｅｒｒｙ－ＣＤ９をトランスフェクトしたＨＥＫ ２９３Ｔ細胞に由来する）と共に使用した。次いで、ｍＣｈｅｒｒｙフォワードプライマー及びＧＦＰフォワードプライマーを用いてＰＣＲを行った（表３参照）。
【0240】
表３：ＰＣＲ反応及びプラスミド構築に使用したオリゴ
【0241】
【表15】
【0242】
予想通り、ｍＣｈｅｒｒｙ－ＣＤ９ベクターのトランスフェクションを伴わない細胞から得られたｍＲＮＡライブラリーについては、シグナルは検出されなかった。更に、陰性対照（ｍＲＮＡ断片単独、ｍＲＮＡ＋Ｔｎ５ ＷＴ、ｍＲＮＡ＋Ｔｎ５ Ｍｅ）及びｍＣｈｅｒｒｙ－ＣＤ９のトランスフェクションを伴うｍＲＮＡライブラリーの試料についても同様に増幅は検出されなかった。それにもかかわらず、この同じバッチの試料を残して、ｍＣｈｅｒｒｙ－ＣＤ９のＧＦＰ配列による置換に対応する試料（Ｔｎ５複合体）について、正しい分子量約１ｋｂで明確なバンドが検出された（［図１１］）。このバンドは、ＧＦＰ ３’末端（センス鎖）の挿入を伴うｍＣｈｅｒｒｙ ３’末端（アンチセンスｍＲＮＡ）の切断、又は言い換えれば、３’から５’への方向でのｍＣｈｅｒｒｙ ｍＲＮＡアンチセンス鎖のＧＦＰセンス鎖へのライゲーションを強調する。
【0243】
増幅産物を配列決定し、得られた配列を［図１２］に提示する。予想通り、ＧＦＰ ３’側へのｍＣｈｅｒｒｙの増幅が、ライゲーションによって接続された２つの配列の検出と共に検出された。この配列決定のクロマトグラムは、標的配列から１０ｂｐの沈降ゾーン（タグメンテーション）を明確に示す（［図１２］）。
【0244】
同じ分析を、今回は、ｃＤＮＡセンス鎖の３’側：ＣＤ９へのライゲーションのための設計を変更することによって繰り返した（［図１２］）。したがって、ｍＣｈｅｒｒｙ－ＣＤ９トランスフェクションを用いて本発明による集合体（Ｔｎ５複合体）と接触させたｃＤＮＡライブラリーについて、約１ｋｂ程度の予想されるバンドを示す増幅ゲルを用いても同じ結果が得られ（［図１３］）、得られた断片の配列決定を行った（［図１４］）。予想通り、この配列決定により、標的配列から５ｂｐにあるＧＦＰ ５’側センス鎖の複数の配列を有する沈降ｃＤＮＡ（ＧＦＰセンス配列の３’でのライゲーション、［図１４］）のＣＤ９センス鎖の配列を同定することが可能になった。
【0245】
実施例２－インセルロ（ｉｎ ｃｅｌｌｕｌｏ）での本発明の実施。
これらの有望な結果によって強化されて、Ｔｎ５プラスミド及び二本鎖解離（ｓｔｒａｎｄ ｏｐｅｎｉｎｇ）タンパク質、単量体ストレプトアビジンと融合するＵＶＲＤ細菌ヘリカーゼのプラスミド（ＵＶＲＤ－ｍＳＡプラスミド）の集合体の直接トランスフェクションに適合するバージョンを得るために設計が改変され、その結果、後者は、予めビオチン化されたオリゴを介して集合体の分子のうちの１つにインサイチュで結合される。これを行うために、配置をより容易にし、設計の１００％に近い制御（Ｂｅａｃｏｎサルコファガス（ｓａｒｃｏｐｈａｇｕｓ）系によって制限されないＴｎ５二量体の減少、したがって関連する「オフターゲット」の可能性の減少）を可能にするために、集合体の新たなバージョンを開発した。したがって、この「新規設計集合体」のために、以前と同じタイプのプロトコルを、ある特定の主要な変更を加えて実行した。実際の設計に関して、ループｎＤＲＥＡＭＴ Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤオリゴ（Ｔｎ５二量体当たり１つ、及び４つの標的領域のタグメンテーションのための標的当たり１つ－完全二本鎖置換）は、トランスポザーゼへの結合のための３つの配列を含んで、より長い。これは、ｍＣｈｅｒｒｙ－ＣＤ９標的断片（ｎＤＲＥＡＭＴ Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤオリゴ）を置換するためのＧＦＰ断片に連結されたトランスポザーゼへの結合のための最後の配列の単純な付加による、迅速かつ制御された対合を可能にする。更に、他のｎＤＲＥＡＭＴ Ｂｉｏ Ａ及びＢオリゴ（ビオチン化オリゴ）を添加して、ＵＶＲＤ－ｍＳＡ融合タンパク質との集合体のインセルロアセンブリを可能にする。
これらの有望な結果によって強化されて、Ｔｎ５プラスミド及び二本鎖解離（ｓｔｒａｎｄ ｏｐｅｎｉｎｇ）タンパク質、単量体ストレプトアビジンと融合するＵＶＲＤ細菌ヘリカーゼのプラスミド（ＵＶＲＤ－ｍＳＡプラスミド）の集合体の直接トランスフェクションに適合するバージョンを得るために設計が改変され、その結果、後者は、予めビオチン化されたオリゴを介して集合体の分子のうちの１つにインサイチュで結合される。これを行うために、配置をより容易にし、設計の１００％に近い制御（Ｂｅａｃｏｎサルコファガス（ｓａｒｃｏｐｈａｇｕｓ）系によって制限されないＴｎ５二量体の減少、したがって関連する「オフターゲット」の可能性の減少）を可能にするために、集合体の新たなバージョンを開発した。したがって、この「新規設計集合体」のために、以前と同じタイプのプロトコルを、ある特定の主要な変更を加えて実行した。実際の設計に関して、ループｎＤＲＥＡＭＴ Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤオリゴ（Ｔｎ５二量体当たり１つ、及び４つの標的領域のタグメンテーションのための標的当たり１つ－完全二本鎖置換）は、トランスポザーゼへの結合のための３つの配列を含んで、より長い。これは、ｍＣｈｅｒｒｙ－ＣＤ９標的断片（ｎＤＲＥＡＭＴ Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤオリゴ）を置換するためのＧＦＰ断片に連結されたトランスポザーゼへの結合のための最後の配列の単純な付加による、迅速かつ制御された対合を可能にする。更に、他のｎＤＲＥＡＭＴ Ｂｉｏ Ａ及びＢオリゴ（ビオチン化オリゴ）を添加して、ＵＶＲＤ－ｍＳＡ融合タンパク質との集合体のインセルロアセンブリを可能にする。
【0246】
以下のオリゴマーを２つの別々のチューブ１及び２中で混合した：チューブ１（１０μＬ）については、ｎＤＲＥＡＭＴ Ａ及びＣループ（１０μＭ）＋ｎＤＲＥＡＭＴ Ａ及びＣオリゴ（１０μＭ）＋ｎＤＲＥＡＭＴ Ｂｉｏ Ａオリゴ（１０μＭ）、チューブ２ １０μｌ）については、ｎＤＲＥＡＭＴ Ｂ及びＤループ（１０μＭ）＋ｎＤＲＥＡＭＴ Ｂ及びＤオリゴ（１０μＭ）＋ｎＤＲＥＡＭＴ Ｂｉｏ Ｂオリゴ（１０μＭ）。次いで、２つのチューブを９５℃に５分間加熱し、次いで室温で１時間放置し、次いで各チューブを対応する制限酵素で消化し、ＰＣＲ精製キット（溶出量２０μＬ）で精製する。
【0247】
同時に、５’において制限酵素ＮｄｅＩ及び３’において制限酵素ＢＳＰＥｉ（ＰＣＲ後に消化された制限部位構造を有するオリゴ）の配列に隣接する末端として含むＧＦＰの増幅配列を増幅し、次いで、対応する制限酵素で消化し、２０μＬの体積で溶出するＰＣＲ精製キットによって精製した。
【0248】
次いで、チューブ１及び２の内容物を、増幅及び消化されたＧＦＰ ｎｅｏ断片、Ｔ４リガーゼの溶液（４μＬ又は１００Ｕ）、５μＬのＴ４緩衝液（１０倍）及び１μＬのｄｄＨ２０と混合して、５０μＬの総反応体積にする。溶液を室温で１時間放置し、次いでゲル精製を行って、１ｋｂより大きく、その５’及び３’末端に４つのサルコファガスＡ、Ｂ、Ｃ及びＤを含む最大のＧＦＰ断片を単離する。次いで、５’及び３’末端に位置付けられたその４つのサルコファガスを有するＧＦＰ置換断片は、トランスポザーゼ二量体を受容する準備が整う（［図１５］）。
【0249】
この系を細胞レベルで試験する前に、新たな設計を、ｍＣｈｅｒｒｙ－ＣＤ９標的ｃＤＮＡ（センス鎖）のＣＤ９側へのＧＦＰ ３’側ライゲーション（センス鎖）を用いて、以前と同じ一連の実験を介して試験した。したがって、ＧＦＰフォワード及びＣＤ９リバースＰＣＲプライマーによる増幅後に、０．５ｋｂ程度の予想されるバンド（［図１５］）を伴って、以前と同じタイプの結果が得られた（残りの陰性対照は全て検出不能である）。このバンドのサンガー配列決定後、予想通り、元の標的配列（［図１６］）の２つの塩基内で、その３’末端（［図１６］）でのＧＦＰの多重配列のライゲーションにより、５’から３’への方向でのＣＤ９断片の検出を行った。
【0250】
この新たな設計のこの陽性検証の後、ｍＣｈｅｒｒｙ－ＣＤ９を発現するＨＥＫ ２９３Ｔ細胞におけるインサイチュ試験を行った。この目的のために、Ｔｎ５トランスポザーゼ及びＵＶＲＤ－ｍＳＡタンパク質のための２つの細胞内タンパク質発現プラスミドを作製した。Ｔｎ５プラスミドについては、ＰＴＸＢ１－Ｔｎ５プラスミド（Ｓ．Ｐｉｃｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ ２０１４）を介してＰＣＲによってＴｎ５配列を増幅した。キチンビーズとの結合及び自己切断によってＴｎ５トランスポザーゼの精製を可能にし、Ｔｎ５タンパク質上にタグの要素を残さないインテインテールタグ（Ｓ．Ｐｉｃｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ ２０１４）を停止コドンで置換したことに留意されたい。全体を、ｍＣｈｅｒｒｙ－ＣＤ９プラスミド（Ｄａｖｉｄｓｏｎ Ｌａｂ）のｍＣｈｅｒｒｙ－ＣＤ９断片の代わりに、ＢＭＴ１及びＥｃｏＲ１制限酵素を介してクローニングし、最終的にＣＭＶ－Ｔｎ５プロモータープラスミドを得た。５’にＢＭＴ１制限部位及び３’にＥｃｏＲ１制限部位を付加したｐＲＳＥＴ－ｍＳＡプラスミド（Ｓｈｅｌｄｏｎ Ｐａｒｋ Ｌａｂ）（表１）を介して、ｍＳＡ断片のＰＣＲ増幅を行った（表１）。第１のクローニング工程を、ＢＭ１及びＥｃｏＲ１酵素を介してｍＣｈｅｒｒｙ－ＣＤ９プラスミドにおいて行い、ｍＣｈｅｒｒｙ－ＣＤ９断片をｍＳＡ断片で置換して、ＣＭＶ－ｍＳＡプロモータープラスミドを得た。ＵＶＲＤ断片について、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細菌のｃＤＮＡライブラリーを生成した（ＤＨ５α）。ＵＶＲＤ ｃＤＮＡのＰＣＲ増幅を、正確なオリゴヌクレオチド（表１）を用いて行った。５’側には、クローニングのためのＢＭＴ１配列及びＫｏｚａｃ配列などの通常の要素が見出されるが、完全な複合体＋Ｔｎ５＋ＵＶＲＤ－ｍＳＡ複合体を細胞核に移入させるためのＮＬＳ移入配列も見出される。３’では、柔軟な部分（ＧＧＧＳｘ３型ポリグリシンテール）が付加され、ｍＳＡ ５’配列の一端は、ＰＭｉＩ ｍＳＡ ５’配列に含まれる正確な制限酵素に付加された。次いで、第２のクローニング工程を、ＢＭＴ１及びＰＭｉＩ制限酵素を用いて行い、ＵＶＲＤ配列の５’での付加を可能にし、そしてＣＭＶ－ＵＶＲＤ－ｍＳＡプロモーター型の最終プラスミドを得た。
【0251】
ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞のトランスフェクションを、ｍＣｈｅｒｒｙ－ＣＤ９プラスミドを用いてリポフェクタミン３０００によって行った。２４時間待機し、細胞膜上の赤色シグナルを共焦点顕微鏡で確認した後、３つの化合物：ＣＭＶ－Ｔｎ５及びＣＭＶ－ＵＶＲＤ－ｍＳＡプラスミド及び新規設計複合体を細胞にトランスフェクトした。この完全な複合体は、ＣＭＶ－ＧＦＰ配列での、４つの標的（標的の４つ組（ｑｕａｄｒｕｐｌｅｔ ｏｆ ｔａｒｇｅｔｓ）；２つのｍＣｈｅｒｒｙ側及び２つのＣＤ９側）間に位置する配列の二本鎖置換を可能にする。したがって、この実験によって、赤色膜シグナルの減少又は赤色膜シグナルの緑色細胞質シグナルによる置換さえも予想された。
【0252】
予想され、［図１７］に提示されるように、本発明による技術による第２のトランスフェクションから５日後に、緑色細胞が検出された。
【0253】
これらの細胞を、サイトメトリーによる細胞選別によって単離し、ＣＭＶ－ＧＦＰ断片がＣＭＶ－ｍＣｈｅｒｒｙ－ＣＤ９プラスミドのｍＣｈｅｒｒｙ－ＣＤ９部分に置き換わったことを知った上で、この新たなＣＭＶ－ＧＦＰプラスミドは、ＮｅｏＲ／ＫａｎＲ細胞株を作製するための抗生物質選択配列を含むはずである。トランスフェクションの６日より後に、これらのまだ緑色の細胞を、２ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を含む培地に入れ、１４日間毎日交換し、次いで０．５ｍｇ／ｍｌの濃度で３ヶ月間維持した。
【0254】
予想通り、トランスフェクション後１９日目に新たなＧＦＰ＋緑色細胞株が得られ、これは凍結及び解凍サイクルを繰り返したにもかかわらず非常に安定であった（［図１７］参照）。
【0255】
この結果をインサイチュでより確実に再確認するために、安定なＨＥＫ ２９３Ｔ赤色膜細胞株を、ＣＭＶ－ｍＣｈｅｒｒｙ－ＣＤ９プラスミドでのトランスフェクション及び以前のような２ｍｇ／ｍｌのＧ４１８での処理によって作製した。２週間の処理後、ＨＥＫ ２９３Ｔ赤色膜細胞株を得た。
【0256】
この細胞株を、前述の技術を用いて以前のようにトランスフェクトした。トランスフェクションの３日後、最初の緑色細胞が現れ始めた（［図１８］参照）。トランスフェクションの１４日後、ある特定の緑色細胞群を同定し、更なる分析のために単離した（［図１８］参照）。
【0257】
これらの細胞を単離した後、ｃＤＮＡライブラリーを得るために、トランスフェクションの１８日後にこれらの細胞を用いて逆転写を行った。
【0258】
次いで、ＧＦＰ配列をＰＣＲによって増幅し、次いで、増幅された断片をサンガー法に従って配列決定した。
【0259】
予想通り、配列データベース（ＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴ）との比較による分析の後、ｍＣｈｅｒｒｙ－ＣＤ９配列を置換する理論上のＧＦＰ断片と非常に近い類似性が見出される［図１９］。加えて、ほぼ１ヶ月後、得られた緑色細胞は、強い緑色シグナルを伴って安定なままである（［図１８］）。これらの結果は、膜の赤から細胞質の緑への色の変化によって示されるＧＦＰ置換配列によるｍＣｈｅｒｒｙ－ＣＤ９標的配列の置換を可能にする、本発明による技術の有効性をインセルロで確認する。この色の変化は、新規設計＋Ｔｎ５＋ＵＶＲＤ－ｍＳＡ複合体（ＵＶＲＤのＮ－Ｔｅｒｍ配列上にＮＬＳを有する）の核内移行、２つの５’及び３’側ヘリカーゼによって行われるＤＮＡ鎖の二本鎖解離、４つの所望の標的点（ｍＣｈｅｒｒｙ側に２つ及びＣＤ９側に２つ）での対合、並びに本発明による技術によるｍＣｈｅｒｒｙ－ＣＤ９配列のＣＭＶ－ＧＦＰ断片による置換を検証することを可能にする。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【配列表】
【国際調査報告】