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特表2024-522837酸化滅菌プロセスの有効性を決定するための生物学的指標および使用方法

書誌要約請求の範囲詳細な説明課題実施例実施するための形態図面の説明

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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-06-21

(54)【発明の名称】酸化滅菌プロセスの有効性を決定するための生物学的指標および使用方法

(51)【国際特許分類】

C12N 1/20 20060101AFI20240614BHJP

C12N 11/00 20060101ALI20240614BHJP

C12N 11/08 20200101ALI20240614BHJP

C07K 19/00 20060101ALI20240614BHJP

C07K 14/00 20060101ALI20240614BHJP

C12N 9/26 20060101ALI20240614BHJP

C12N 9/20 20060101ALI20240614BHJP

C12N 9/36 20060101ALI20240614BHJP

C12N 9/14 20060101ALI20240614BHJP

C07K 14/435 20060101ALI20240614BHJP

C12Q 1/06 20060101ALI20240614BHJP

【ＦＩ】

C12N1/20 Z

C12N11/00

C12N11/08

C07K19/00

C07K14/00

C12N9/26

C12N9/20

C12N9/36

C12N9/14

C07K14/435

C12N1/20 A

C12Q1/06

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023578838

(86)(22)【出願日】2022-06-30

(85)【翻訳文提出日】2024-02-20

(86)【国際出願番号】 IB2022056130

(87)【国際公開番号】W WO2023275830

(87)【国際公開日】2023-01-05

(31)【優先権主張番号】17/367,224

(32)【優先日】2021-07-02

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】521195423

【氏名又は名称】テラジーンエルエルシー

【氏名又は名称原語表記】ＴＥＲＲＡＧＥＮＥＬＬＣ

【住所又は居所原語表記】２５００３ＰｉｔｋｉｎＲｏａｄ－ＳｕｉｔｅＤ８００Ｓｐｒｉｎｇ，Ｔｅｘａｓ７７３８６（ＵＳ）

(74)【代理人】

【識別番号】110003971

【氏名又は名称】弁理士法人葛和国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】ロンバルディア，エステバン

(72)【発明者】

【氏名】ロベット，アドリアンジェズス

(72)【発明者】

【氏名】ラヴァシ，パブロ

(72)【発明者】

【氏名】ロドリゲス，カルロスエルネスト

【テーマコード（参考）】

4B033

4B063

4B065

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B033NA12

4B033NA45

4B033NB33

4B033ND05

4B033ND20

4B063QA01

4B063QA20

4B063QQ05

4B063QQ20

4B063QR48

4B063QR66

4B063QS40

4B063QX02

4B065AA01X

4B065AA15X

4B065AA19X

4B065AC15

4B065AC20

4B065BA24

4B065BB40

4B065BC42

4B065BD39

4B065CA46

4H045AA10

4H045AA30

4H045BA10

4H045BA50

4H045BA62

4H045CA11

4H045CA50

4H045EA50

(57)【要約】

酸化滅菌プロセスおよびその使用方法の有効性を決定するための生物学的指標。生物学的指標は、微生物胞子のセット、少なくとも１つの蛍光センサータンパク質、および培地を含み、蛍光センサータンパク質は、蛍光センサータンパク質が酸化滅菌プロセスにより変性状態にない場合は、光学的に検出可能なシグナルを、蛍光センサータンパク質が酸化滅菌プロセス後に変性状態にある場合は、別の光学的に検出可能なシグナルを生成することができる。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

酸化滅菌プロセスの有効性を決定するための生物学的指標であって、前記生物学的指標は、単一の容器内に、
微生物胞子のセット、
少なくとも１つの蛍光センサータンパク質、および
培地を含み、
少なくとも１つの蛍光センサータンパク質は、少なくとも１つの蛍光センサータンパク質が滅菌プロセスに起因して変性状態にないときに、光学的に検出可能なシグナルを生成することができ、
少なくとも１つの蛍光タンパク質はさらに、少なくとも１つのセンサータンパク質が酸化滅菌プロセス後に変性状態にあるとき、異なる光学的に検出可能なシグナルを生成することができ、前記差異は、少なくとも１つの蛍光センサータンパク質の触媒的活性から独立しており、培地は、微生物胞子のセットと接触させられ；および
前記培地は、酸化滅菌プロセスの後に存在する任意の生存可能な微生物生命の増殖、または加熱滅菌プロセスを誘導することができ；および
前記培地は、微生物増殖の存在下で光学的に検出可能な色のシフトを受けることができる比色成分を含む、
前記生物学的指標。

【請求項2】

酸化滅菌プロセスが、オゾン、酸素、過酸化水素、硫酸から選択される酸化剤を用いたプロセスである、請求項１に記載の生物学的指標。

【請求項3】

微生物胞子のセットが、細菌胞子である、請求項１または２に記載の生物学的指標。

【請求項4】

微生物胞子が、B.atrophaeus、B.subtilis、G.stearothermophilus、およびB.pumilusを含む群から選択される細菌に由来する胞子である、請求項３に記載の生物学的指標。

【請求項5】

微生物胞子のセットが、多孔質材料で作られた担体に埋め込まれている、請求項１～４のいずれか一項に記載の生物学的指標。

【請求項6】

微生物胞子のセットが、容器に埋め込まれている、請求項１～５のいずれか一項に記載の生物学的指標。

【請求項7】

微生物胞子のセットが、ポリプロピレン繊維材料、および高密度ポリエチレン繊維から選択される材料で作られた担体に埋め込まれている、請求項１～６のいずれか一項に記載の生物学的指標。

【請求項8】

少なくとも１つの蛍光センサータンパク質が、緑色蛍光タンパク質、青色蛍光タンパク質、シアン色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、オレンジ色蛍光タンパク質、およびそれらの組み合わせまたはキメラタンパク質から選択される、請求項１～７のいずれか一項に記載の生物学的指標。

【請求項9】

蛍光センサータンパク質が、リゾチーム、アミラーゼ、リパーゼ、ペプシン、グルコシダーゼ、ホスファターゼ、ガラクトシダーゼ、キモトリプシンおよびリパーゼから選択される非蛍光タンパク質を含むキメラタンパク質であり、ならびに、緑色蛍光タンパク質(GFPwt、EGFP、SFGFP、Emerald、avGFP、T-Saphire)、青色蛍光タンパク質(Sirius、Azurite、EBFP、EBFP2、mKalama1、TagGFP)、シアン色蛍光タンパク質(ECFP、Cerulean、CyPet、mTurquoise2、SCFP)、黄色蛍光タンパク質(YFP、シトリン、ヴィーナス、YPet、SYFP、トパーズ、mAmetrina)、赤色蛍光タンパク質(tdTomato、mPlum、DsRed、mCherry、mStrawberry、mRaspberry、mRuby)、ならびにオレンジ色蛍光タンパク質(mOrange、mKO、および mOrange2)を含む群から選択される蛍光タンパク質である、請求項１～８のいずれか一項に記載の生物学的指標。

【請求項10】

培地が０．０３ｇ／Ｌの比色成分を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の生物学的指標。

【請求項11】

培地の比色成分が、ブロモクレゾールパープル、ブロモクレゾールグリーン、フェノールレッド、チモールブルー、ブロモフェノールブルー、ブロモチモールブルー、６－クロロ－３－インドキシル－アルファ－Ｄ－グルコピラノシド、５－ブロモ－４－クロロ－３－インドリル α－Ｄ－グルコピラノシド、６－クロロ－３－インドキシル－ベータ－Ｄ－ガラクトピラノシド、５－ブロモ－４－クロロ－３－インドリル β－Ｄ－ガラクトピラノシド、および５－ブロモ－４－クロロ－３－インドキシルホスフェートおよびこれらの混合物から選択される、請求項１～１０のいずれか一項に記載の生物学的指標。

【請求項12】

培地が、微生物胞子とは別の容器に収められている、請求項１～１１のいずれか一項に記載の生物学的指標。

【請求項13】

培地のｐＨが、６～９である、請求項１～１２のいずれか一項に記載の生物学的指標。

【請求項14】

少なくとも１つの蛍光センサータンパク質および微生物胞子が、担体内の製剤として一緒に混合されている、請求項１～１３のいずれか一項に記載の生物学的指標。

【請求項15】

少なくとも１つのセンサータンパク質が、生物学的指標内でその内容物を放出するために破砕されることができる別のアンプルに収められている、請求項１～１４のいずれか一項に記載の生物学的指標。

【請求項16】

少なくとも１つの蛍光センサータンパク質が、生物学的指標内の担体に埋め込まれている、請求項１～１５のいずれか一項に記載の生物学的指標。

【請求項17】

自己完結型の生物学的指標を利用して、酸化滅菌プロセスの有効性を決定するための方法であって、前記生物学的指標は、単一の容器内に、
少なくとも１つの蛍光センサータンパク質であって、
少なくとも１つのセンサータンパク質が、酸化滅菌プロセスに起因して変性状態にないときに、光学的に検出可能なシグナルを生成することができ、
少なくとも１つの蛍光センサータンパク質はさらに、少なくとも１つのセンサータンパク質が酸化滅菌プロセス後に変性状態にあるとき、異なる光学的に検出可能なシグナルを生成することができ、前記差異は、少なくとも1つの蛍光センサータンパク質の触媒的活性から独立しており、培地は、微生物胞子のセットと接触させられ；および
前記培地は、酸化滅菌プロセスの後に存在する任意の生存可能な微生物生命の増殖、または加熱滅菌プロセスを誘導することができ；および
前記培地は、微生物増殖の存在下で光学的に検出可能な色のシフトを受けることができる比色成分を含み、
前記方法は、
ａ）生物学的指標を滅菌される対象材料と共に滅菌器内に配置すること、
ｂ）酸化滅菌プロセスを実行すること、
ｃ）生物学的指標をインキュベーター内に配置すること、
ｄ）インキュベーター内で生物学的指標をインキュベートしながら、蛍光強度の即時検出可能な変化について生物学的指標をスクリーニングすること、
ｅ）ステップｄ）中に実行されたスクリーニングに基づいて、酸化滅菌プロセスの有効性を決定すること、
ｆ）ステップｄ）で得られた生物学的指標のインキュベーションを延長すること、
ｇ）ステップｅ）で得られたインキュベートされた生物学的指標を光学的に検出可能な色変化についてスクリーニングすること、および
ｈ）ステップｇ）で得られた光学的に検出可能な変化に従って、酸化滅菌プロセスの有効性を決定すること
を含む、前記方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、過酸化水素を用いた滅菌プロセスなどの酸化滅菌プロセスの結果を決定するのに適した生物学的指標（biological indicators）に関する。

【背景技術】

【0002】

滅菌プロセスは、生存可能な生命体のない表面または物体（実験室または医療デバイス、機器または器具など）を提供することを目的としている。このようなプロセスは、ヘルスケア業界や幅広い科学研究活動などの環境で広く使用されている。

【0003】

このようなプロセスの中心的な側面は、滅菌された材料および／または表面の必要な使用条件を確実にするために、滅菌プロセスが成功したかどうかを決定する能力である。この目的のために、さまざまな程度の品質でいくつかの方法が採用されている。

【0004】

当技術分野で知られている生物学的指標は、一般的に、細菌胞子などの既知量の微生物胞子を、対象材料および／または表面と共に滅菌プロセスにかけることを含む。プロセスが完了した直後に、残っている生きている微生物および／または生存可能な微生物の存在を調査するためにテストが実行される。これらのテストで陰性の結果がもたらされた場合は、滅菌が効果的であったと決定され得る。

【0005】

より具体的な生物学的指標には、生存可能な形態の生命の存在を示すことが知られている特定の生化学的反応の発生を調査することが包含される。このような生化学的反応は、微生物生命または染料の色の変化に一般的に見られる酵素的および／または触媒的活性に関連している。

【0006】

特許出願US2015/0159192A1は、単離された酵素またはこのような酵素が内因性であるか遺伝子工学によって発現される微生物の使用を含む滅菌プロセスが成功したことを決定する方法を開示している。本開示による指標酵素は、ベータ－Ｄ－グルコシダーゼなどの胞子形成微生物に一般的に見られる酵素である。指標が滅菌プロセスに曝された後、滅菌の効果を評価するために酵素的活性テストが実行される。

【0007】

他の生物学的指標は、特定のレポーター遺伝子を発現することができる遺伝子操作された微生物の使用に基づいている。

【0008】

特許出願WO2018/071732A1は、蛍光についてスクリーニングするのに適したレポーター遺伝子（例えば、蛍光性タンパク質の発現に適したレポーター遺伝子）を発現することができる遺伝子操作された微生物を利用する生物学的指標を開示している。指標が滅菌プロセスにかけられた後、それは光学的に検出可能なシグナルについてスクリーニングされ、したがって、生存可能な微生物の存在または不在を証明する。

【0009】

同様に、特許出願WO2017/185738A1は、特定の蛍光性レポーター遺伝子を発現する遺伝子操作された微生物からの胞子の使用に基づく生物学的指標を開示している。滅菌プロセスの後、生存可能な微生物の存在を評価するために、指標は光学的に検出可能なシグナルについてスクリーニングされる。

【0010】

従来技術分野で知られている他の生物学的指標は、滅菌後の前記特定の酵素の酵素的活性をスクリーニングするために、特定の酵素の発現に適した遺伝子操作された微生物を提供することを含む。

【0011】

特許出願US2017/0292143A1は、加水分解によって蛍光を発するように設計された蛍光発生化合物を加水分解することができる特定の酵素（例えば、β－ラクタマーゼ）の発現に適した遺伝子操作された微生物を開示している。したがって、光学的に検出可能な蛍光シグナルは、生存可能な微生物の存在を示す。

【0012】

他の生物学的指標は、感染性因子の増殖に重要なタンパク質、および病原性または免疫原性タンパク質から選択される代理タンパク質のスクリーニングを採用している。

【0013】

特許出願US2017/0283847A1は、滅菌プロセス後の定義された代理タンパク質のスクリーニングに基づく生物学的指標を開示している。開示された方法は、対象タンパク質の存在を評価するために、ウエスタンブロット分析などの手順を必要とする。

【0014】

CA2667698C、US9717812B2、EP2456882B1、US10047334B2、US20140370535A1およびJP2014-060947Aによって開示されているように、同様の特性の他の生物学的指標もまた、滅菌後の効果的なスクリーニングを可能にするために、遺伝子組み換え微生物または突然変異体および／または標識タンパク質および／または酵素を使用する。

【0015】

従来技術の生物学的指標は、一般的に、製造および使用の両方について複雑で費用がかかり、非常に時間のかかる手順に依存し、生物学的指標自体および一般的な滅菌プロセスの全体的な費用に影響を与える。このような手順に基づく生物学的指標は、かなりのインキュベーションおよび／または読み出し時間を必要とし、これはまた、時間および資源のかなりの費用を示す。酵素的活性のスクリーニングのみに依存する生物学的指標は、使用される酵素の一般的に低い安定性によって制限される。酵素の構造や触媒的活性などの固有の特性は、指標の全体的な安定性およびシステムの効果に悪影響を及ぼす。さらに、酵素的活性をスクリーニングするためには、より長い期間が必要である。

【0016】

したがって、信頼性が高く費用効果が高く、インキュベーションおよび／または読み出し時間を短縮でき、費用のかかる手順および／または要件を伴わない生物学的指標の必要性が残っている。

【0017】

さらに、指標は、専用の装置が必要で、かなり時間がかかる、ウエスタンブロット分析、タンパク質アレイ分析、磁気分離分析、質量分析、ペプチド分析、クロマトグラフィー分析、またはガスクロマトグラフィー分析を含む開発段階を必要としないことが望ましい。

【0018】

一方で、生物学的指標が滅菌プロセスの結果を間接的に決定するための酵素的反応に依存しないという事実は、より信頼性の高い結果を提供する。酵素的反応は複雑な物理的および化学的現象であり、発生するためにはさまざまな好ましい条件が必要である。例えば、当業者に知られているように、酵素的活性は、酵素活性部位の構造および性質に大きく依存する。このような活性部位の特性、または酵素の周囲の環境条件の小さなバリエーションでさえ、反応を適切に実行する酵素の能力に重大な結果をもたらし得る。このようなバリエーションの可能性は、滅菌の成功を誤って示している可能性があるため、酵素的反応に依存する生物学的指標の重大な潜在的な欠陥を伴う。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0019】

本発明は、２つの単純で直接的なテスト、すなわち、蛍光強度テストおよび比色テストの結果のみに依存する。従来技術と比較して、全体的なプロセスの時間と費用効果を大幅に高いものにする。

【0020】

第１の側面では、本発明は、酸化滅菌プロセスの有効性を決定するための自己完結型の生物学的指標に関し、特定のインキュベーション時間後の即時の蛍光シグナル検出と比色テストの両方を採用する。

【0021】

したがって、本出願の目的は、以下を含む可撓性容器を含む、酸化滅菌プロセスの有効性を決定するためのデバイスである。
ａ）微生物胞子のセット、
ｂ）少なくとも１つの蛍光センサータンパク質、
ｃ）培地、および
ｄ）拡張読み出し確認用のｐＨ指標または比色成分。

【0022】

少なくとも１つの蛍光センサータンパク質は、少なくとも１つのセンサータンパク質が酸化滅菌プロセスにより変性状態にないとき、光学的に検出可能なシグナル、すなわち蛍光シグナルを生成することができ、そして、さらに、少なくとも１つの蛍光センサータンパク質が酸化滅菌プロセス後に変性状態にあるとき、少なくとも１つの蛍光センサータンパク質の三次元構造および環境の極性に応じて、異なる光学的に検出可能なシグナル、すなわち、異なる強度を有するシグナルなどの異なる蛍光シグナルを生成することができる。有利には、この差異は、少なくとも１つの蛍光センサータンパク質の触媒活性および微生物胞子のセットと接触させられる培地とは無関係である。

【0023】

培地は、酸化滅菌プロセス後に存在するあらゆる生存可能な微生物の増殖を誘導することができ、微生物の増殖の存在下で光学的に検出可能な色の変化を受けることができる比色成分を含む。

【0024】

本発明の実施形態において、酸化滅菌プロセスは、オゾン、酸素、過酸化水素および硫酸から選択される酸化剤を使用するプロセスである。好ましくは、酸化滅菌プロセスは過酸化水素滅菌プロセスである。

【0025】

本発明の一実施形態において、ａ）における微生物胞子のセットは細菌胞子である。

【0026】

本発明の好ましい実施形態において、ａ）における微生物胞子のセットは、B.atrophaeus、B.subtilis、G.stearothermophilus、およびB.pumilusを含む群から選択される細菌胞子である。

【0027】

本発明の好ましい実施形態において、微生物胞子は担体に埋め込まれている。

【0028】

本発明の別の好ましい実施形態において、蛍光センサータンパク質もまた、担体に埋め込まれている。

【0029】

発明の別の実施形態において、蛍光センサータンパク質は、緑色蛍光タンパク質(GFPwt、EGFP、SFGFP、Emerald、avGFP、T-Saphire)、青色蛍光タンパク質(Sirius、Azurite、EBFP、EBFP2、mKalama1、TagGFP)、シアン色蛍光タンパク質(ECFP、Cerulean、CyPet、mTurquoise2、SCFP)、黄色蛍光タンパク質(YFP、シトリン、ヴィーナス、YPet、SYFP、トパーズ、mAmetrina)、赤色蛍光タンパク質(tdTomato、mPlum、DsRed、mCherry、mStrawberry、mRaspberry、mRuby)、ならびにオレンジ色蛍光タンパク質(mOrange、mKO、および mOrange2)を含む群から選択される。

【0030】

さらに、これらの蛍光タンパク質のキメラタンパク質、ならびに、フィブリン、エラスチン、カゼイン、コラーゲン、アクチン、ケラチン、アルブミンなどの非蛍光タンパク質に融合した蛍光タンパク質を含むキメラタンパク質、ならびに、リゾチーム、アミラーゼ、リパーゼ、ペプシン、グルコシダーゼ、ホスファターゼ、ガラクトシダーゼ、キモトリプシン、リパーゼなどの酵素も使用でき得るが、触媒的活性とは関係なく、構造上の特徴に起因する。

【0031】

本発明の好ましい実施形態において、培地は、破壊可能なアンプルに収められている。

【0032】

本発明の別の実施形態において、培地成分は、細菌学的ペプトン、酵母エキス、およびＬ－バリンを含む。

【0033】

本発明の好ましい実施形態において、培地は、比色成分を含む。

【0034】

本発明の実施形態において、培地の比色成分は、ブロモクレゾールパープル、ブロモクレゾールグリーン、フェノールレッド、チモールブルー、ブロモフェノールブルー、ブロモチモールブルー、６－クロロ－３－インドキシル－アルファ－Ｄ－グルコピラノシド、５－ブロモ－４－クロロ－３－インドリル α－Ｄ－グルコピラノシド、６－クロロ－３－インドキシル－ベータ－Ｄ－ガラクトピラノシド、５－ブロモ－４－クロロ－３－インドリル β－Ｄ－ガラクトピラノシド、５－ブロモ－４－クロロ－３－インドキシルホスフェートを含む群から選択される。

【0035】

本発明のさらにより好ましい実施形態において、蛍光センサータンパク質と微生物胞子は、担体内の製剤として一緒に混合される。

【0036】

本発明の好ましい実施形態において、破壊可能なアンプルは、熱膨張係数が低い材料、好ましくはホウケイ酸ガラスで作られている。

【0037】

本発明の第２の側面では、別の目的は、本発明の前記生物学的指標の使用方法であり、前記使用方法は、一般的に以下を含む；
ａ）生物学的指標を滅菌される対象材料と共に滅菌器内に配置すること、
ｂ）酸化滅菌プロセスを実行すること、
ｃ）生物学的指標をインキュベーター内に配置すること、
ｄ）インキュベーター内で生物学的指標をインキュベートしながら、蛍光強度の即時検出可能な変化について生物学的指標をスクリーニングすること、
ｅ）ステップｄ）中に実行されたスクリーニングに基づいて、酸化滅菌プロセスの有効性を決定すること、
ｆ）ステップｄ）で得られた生物学的指標のインキュベーションを延長すること、
ｇ）ステップｅ）で得られたインキュベートされた生物学的指標を光学的に検出可能な色変化についてスクリーニングすること、および
ｈ）ステップｇ）で得られた光学的に検出可能な変化に従って、酸化滅菌プロセスの有効性を決定すること。

【0038】

本発明の方法の実施形態において、ステップａ）およびｂ）において、生物学的指標は、対象材料と並んで、滅菌器内に配置される。

【0039】

本発明の方法の好ましい実施形態において、インキュベーターは、TerrageneインキュベーターリーダーBionova（登録商標）（IC10/20FRまたはIC10/20FRLCD）またはMiniBioインキュベーターから選択される。

【0040】

本発明の方法の別の実施形態において、ステップｃ）において、事前調製された利用可能なインキュベーターは、５５～６５℃、好ましくは５８～６２℃の範囲の温度、さらにより好ましくは６０℃に設定される。

【0041】

本発明の方法の一実施形態において、ステップｃ）において、生物学的指標は、インキュベーター内に配置される直前にアンプルが破砕される。

【0042】

本発明の方法の一実施形態において、ステップｄ）の間に、生物学的指標は、滅菌直後およびインキュベーションの開始中に、蛍光強度の変化についてスクリーニングされる。

【0043】

本発明の方法の一実施形態において、ステップｇ）の間に、酸化滅菌プロセスの有効性は、ステップｄ）およびｇ）の両方から得られた結果に従って決定される。ステップｄ）またはｆ）のいずれかで陽性の結果が出た場合は、滅菌プロセスが不完全または失敗していることを示している。

【図面の簡単な説明】

【0044】

【図1】図１は、さまざまな酸化剤濃度における蛍光タンパク質の蛍光強度を示している。

【0045】

【図2】図２は、さまざまな注入時間における蛍光タンパク質の蛍光強度を示している。

【0046】

【図3】図３は、本発明の生物学的指標の概略側面図を示している。

【発明を実施するための形態】

【0047】

本発明により提供される生物学的指標は自己完結型のデバイスであり、これは、微生物胞子のセット、１以上の蛍光センサータンパク質、および培地が単一の可撓性容器内に収められていることを意味し、これは、操作に起因する汚染の可能性を回避するのに役立つ。それでもなお、滅菌プロセスが完了した後にのみこれらの２つの要素を接触させる必要起因するため、培地は、可撓性容器に収められている破壊可能なアンプル内で、微生物胞子のセットから分離される。

【0048】

本発明の一実施形態において、生物学的指標は、図３に図式化されたような、可撓性容器を密封するためのキャップ２、キャップオリフィス１、容器チューブ３、培地を含むアンプル４、および微生物胞子を含む担体５を含む、可撓性容器を含む。

【0049】

特定の実施形態において、可撓性容器は、透明のポリプロピレンチューブである。

【0050】

別の実施形態において、可撓性容器は、容器を密封するために押し下げられ得る可動式キャップを備える。

【0051】

他の実施形態において、微生物胞子は、可撓性容器内に収められている担体に埋め込まれる。

【0052】

特定の実施形態において、微生物胞子は、ポリプロピレン繊維材料、高密度ポリエチレン繊維などの多孔質材料で作られた担体、またはポリプロピレン容器自体に埋め込まれている。

【0053】

好ましい実施形態において、高密度ポリエチレン繊維担体は、５５～８０ｇ／ｍ^２のグラム量を有する一枚の紙である。

【0054】

本発明の一実施形態において、アンプルは、ホウケイ酸ガラス、好ましくはガラスなどの熱膨張係数が低い壊れやすい材料で作られており、０．５から０．９ｍｌの培地を含む。

【0055】

好ましい実施形態において、培地は、０．８～１．２ｇ／Ｌの細菌学的ペプトン、０．８～１．２ｇ／Ｌの酵母エキス、ならびに０．４～０．６ｇ／ＬのＬ－バリンを含む。

【0056】

好ましい実施形態において、培地は、比色成分として０．０３ｇ／Ｌのブロモクレゾールパープル指標を含む。前記培地は、７～９、好ましくは約８．５の調整されたｐＨを有し、特に好ましい実施形態において、ｐＨは水酸化ナトリウムで調整される。

【0057】

いくつかの実施形態において、少なくとも１つの蛍光センサータンパク質の変性の結果としての蛍光強度の変化の検出は、蛍光強度を検出するデバイスまたは蛍光光度計によって達成され得る。

【0058】

本発明の好ましい実施形態において、生物学的指標の取り扱いおよび動きを最小限にするために、蛍光光度計がインキュベーターへ組み込まれている。このようにして、蛍光強度の変化の検出は、蛍光の読み出しを取得するための追加の手順を必要とせずに、同じインキュベーター内で直接行うことができる。

【0059】

いくつかの実施形態において、比色テストの結果としての色の変化の検出は、直接の視覚的観察によって、またはその後の画像分析を伴うカメラによって達成され得る。

【0060】

１つの蛍光センサータンパク質もまた、担体に収められ得る。

【0061】

胞子を備えた担体に収められている一方、少なくとも１つの蛍光センサータンパク質、および胞子は、滅菌される対象材料と同じ条件（酸化剤の濃度、時間、温度）に曝される。

【0062】

担体で存在する蛍光センサータンパク質の量は、５～１００μｇの範囲、好ましくは２５μｇである。

【0063】

前記少なくとも１つの蛍光センサータンパク質は、緑色蛍光タンパク質(GFPwt、EGFP、SFGFP、Emerald、avGFP、T-Saphire)、青色蛍光タンパク質(Sirius、Azurite、EBFP、EBFP2、mKalama1、TagGFP)、シアン色蛍光タンパク質(ECFP、Cerulean、CyPet、mTurquoise2、SCFP)、黄色蛍光タンパク質(YFP、シトリン、ヴィーナス、YPet、SYFP、トパーズ、mAmetrina)、赤色蛍光タンパク質(tdTomato、mPlum、DsRed、mCherry、mStrawberry、mRaspberry、mRuby)、ならびにオレンジ色蛍光タンパク質(mOrange、mKO、および mOrange2)を含む群から選択される。

【0064】

キメラタンパク質、すなわち融合タンパク質は、これらの蛍光タンパク質、または、フィブリン、エラスチン、カゼイン、コラーゲン、アクチン、ケラチン、アルブミンなどの非蛍光タンパク質に融合した蛍光タンパク質を含むキメラタンパク質を任意の数だけ含み、そして、リゾチーム、アミラーゼ、リパーゼ、ペプシン、グルコシダーゼ、ホスファターゼ、ガラクトシダーゼ、キモトリプシン、リパーゼなどの酵素も使用できる。これらの非蛍光タンパク質は、触媒的活性とは関係なく、構造上の特徴に従って選択される。

【0065】

GFPなどの蛍光タンパク質の蛍光は、「適切に折りたたまれた」タンパク質構造に直接関係している。GFPの場合、天然の、つまり非変性の構造では、セリン65、チロシン66、およびグリシン67によって形成される蛍光トリペプチドは移動が制限されており、大部分の水から排除される。これらの蛍光GFPタンパク質が変性した場合にのみ、発色団の回転自由度が増加し、さらに水分子による攻撃を受け、蛍光現象の消光につながる。

【0066】

オゾン、酸素、過酸化水素、硫酸などの酸化剤は反応性が高く、主にタンパク質のシステイン残基を標的とする。これらの酸化剤のいずれかが十分に高い濃度で存在すると、露出した高分子が受ける酸化ストレスにより不可逆的な損傷が生じ、その結果、高分子の三次元構造が変性する。

【0067】

本発明で使用される少なくとも１つの蛍光センサータンパク質は、一般に酸化剤、特に過酸化水素に感受性である。その三次元構造は、曝露および濃度などの過酸化水素滅菌プロセスの条件に密接に関連している。前記条件への曝露時間もまた、三次元構造に影響を与える重要な要因である。

【0068】

特定の実施形態において、蛍光センサータンパク質は、特定の蛍光高分子を発現する遺伝子操作された微生物などの微生物によって合成され得る。

【0069】

これらの蛍光センサータンパク質を合成する遺伝子操作された微生物の非限定的な例としては、B.アトロファウス、B.ズブチリス、G.ステアロサーモフィルス、およびB.プミルスを含む。これらの微生物は一般的に、胞子形成プロセス中に蛍光センサータンパク質を発現できる複製プラスミドで改変される。このようにして、蛍光センサータンパク質は胞子タンパク質の一部となり、滅菌プロセス中に酸化剤と接触することになる。前記少なくとも１つの蛍光センサータンパク質は、緑色蛍光タンパク質(GFPwt、EGFP、SFGFP、Emerald、avGFP、T-Saphire)、青色蛍光タンパク質(Sirius、Azurite、EBFP、EBFP2、mKalama1、TagGFP)、シアン色蛍光タンパク質(ECFP、Cerulean、CyPet、mTurquoise2、SCFP)、黄色蛍光タンパク質(YFP、シトリン、ヴィーナス、YPet、SYFP、トパーズ、mAmetrina)、赤色蛍光タンパク質(tdTomato、mPlum、DsRed、mCherry、mStrawberry、mRaspberry、mRuby)、ならびにオレンジ色蛍光タンパク質(mOrange、mKO、および mOrange2)を含む群から選択される。

【0070】

図1は、CASP50フラッシュデバイスで、さまざまな過酸化水素濃度で200秒間曝露した後の25μgの凍結乾燥ECFPの蛍光強度を示している。詳細な過酸化水素濃度は、機器の負荷溶液に対応する。曝露直後、凍結乾燥したタンパク質を、ｐＨ8.5の0.015％トリス塩基緩衝液1ｍＬに再懸濁した。励起については420～450nm、発光については470～490nmの波長に設定した蛍光光度計を用いて、7秒間のインキュベーション中に蛍光を測定した。過酸化水素濃度ごとに10本のチューブを評価した。黒い点は平均値を表す。ボックスには、登録された最大値と最小値が含まれる。内側のバーは標準偏差を表す。滅菌していない状態も示されている。過酸化水素濃度が増加すると、測定される蛍光は低くなる。具体的には、市販の滅菌器で使用される55%に近い、より高い濃度では、蛍光強度がより急激に減少する。

【0071】

図2は、CASP50フラッシュデバイスで5%v/v濃度の過酸化水素を使用した、異なる注入時間後の25μgの凍結乾燥ECFPの蛍光強度を示している。曝露直後に、凍結乾燥タンパク質をｐＨ8.5の0.015％トリス塩基緩衝液１ｍＬに再懸濁した。励起波長を420～450nm、発光波長を470～490nmに設定した蛍光計を使用して、7秒間のインキュベーション中に蛍光を測定した。過酸化水素濃度ごとに10本のチューブを評価した。黒い点は平均値を表す。ボックスには、登録された最大値と最小値が含まれる。内側のバーは標準偏差を表す。滅菌していない状態も示されている。時間が経過するにつれて、測定される蛍光は低くなる。

【0072】

図１に示すように、過酸化水素滅菌プロセスが通常実行される濃度、つまり５５％では、タンパク質の三次元構造の変化に起因して、蛍光の変化が観察される。高い濃度は、センサータンパク質のより徹底的かつ広範囲の変性を引き起こす。この相互作用は、構造的に無傷のタンパク質との以前の相互作用よりも実質的に低い蛍光シグナルをもたらす。

【0073】

当業者は、高酸化剤濃度に曝されたタンパク質の三次元構造の変化が、同じ曝露を受ける微生物の死に必然的に関連していることを認識するであろう（微生物の構成タンパク質のすべてまたは大部分が変性している場合、微生物の生命は持続不可能であるため）。そのため、本発明の蛍光センサータンパク質の蛍光の三次元構造および結果的な損失の変化は、微生物胞子を包含する任意の生きている微生物の死を示している。

【0074】

したがって、本発明の生物学的指標において、センサータンパク質の変性は、微生物胞子の死と直接相関している。その結果、センサータンパク質の変性に起因する蛍光の変化は、生物学的指標に収められている胞子集団の死の予測を保証する。

【0075】

これらの特定の現象への生物学的指標の依存は、即時または瞬間的な結果を可能にする。したがって、必要に応じて、酸化滅菌プロセスの有効性の決定は、長いインキュベーション時間または費用のかかる手順に投資する必要なしに瞬間的に利用可能である。この場合、酵素触媒的活性のための時間は必要ない。酵素的反応を測定するのとは対照的に、酸化剤濃度に曝されたタンパク質の三次元構造における検出可能な変化率を瞬間的に測定することができる。

【0076】

先に述べたように、蛍光センサータンパク質は、非蛍光タンパク質を含むキメラタンパク質であってもよく、非蛍光タンパク質は、リゾチーム、アミラーゼ、リパーゼ、ペプシン、グルコシダーゼ、ホスファターゼ、ガラクトシダーゼ、キモトリプシンおよびリパーゼから選択され、蛍光タンパク質は、緑色蛍光タンパク質(GFPwt、EGFP、SFGFP、Emerald、avGFP、T-Saphire)、青色蛍光タンパク質(Sirius、Azurite、EBFP、EBFP2、mKalama1、TagGFP)、シアン色蛍光タンパク質(ECFP、Cerulean、CyPet、mTurquoise2、SCFP)、黄色蛍光タンパク質(YFP、シトリン、ヴィーナス、YPet、SYFP、トパーズ、mAmetrina)、赤色蛍光タンパク質(tdTomato、mPlum、DsRed、mCherry、mStrawberry、mRaspberry、mRuby)、ならびにオレンジ色蛍光タンパク質(mOrange、mKO、および mOrange2)を含む群から選択される。蛍光タンパク質は、当業者に周知の方法により、例えば、大腸菌などの改変された発現宿主によって転写融合体として生成されることにより、非蛍光タンパク質に関連、すなわち融合、結合、または連結され得る。

【0077】

容器の上部は、滅菌剤を透過するポリプロピレン繊維や高密度ポリエチレン繊維などの材料と、横方向の開口部を備えたポリプロピレンキャップとで構成されている。このデバイスは、添付の図３を参照して詳細に説明されている。

【0078】

好ましくは、すべての要素は、組み立てる前に、エチレンオキシド８００ｍｇ／ｍＬで２時間滅菌される。次に、前記要素は、無菌状態で組み立てられ、胞子含有担体は、同様に無菌状態で組み立てられる前に、胞子が植菌される。

【0079】

生物学的指標の使用方法を以下に説明し、非限定的な実施例を用いて説明する。

【0080】

本発明の方法は、以下を含む。
生物学的指標が、滅菌器内で滅菌される対象材料と共に配置される、第１のステップ、
酸化滅菌プロセスが５０℃～６０℃で実行される、第２のステップ、
生物学的指標が、５５～６５℃、好ましくは５８～６２℃、さらにより好ましくは６０℃の範囲の温度に設定された、事前に条件付けされたインキュベーター内に配置され、生物学的指標がインキュベーター内に配置された直前にアンプルを破砕することによってアンプルを壊す、第３のステップ、
事前に条件付けされたインキュベーターでの生物学的指標のインキュベーションが進行している間に、事前に条件付けされたインキュベーター内に配置された直後に、生物学的指標が蛍光強度の光学的に検出可能な変化についてスクリーニングされる、第４のステップ、
酸化滅菌プロセスの有効性が、第４のステップの蛍光強度スクリーニング結果に従って決定される、第５のステップ、
生物学的指標が、５５～６５℃、好ましくは５８～６２℃の範囲の温度、さらにより好ましくは６０℃で２４時間～１６８時間インキュベートされる、第６のステップ、
第６のステップで得られた培地が比色成分で読み出され、光学的に検出可能な色の変化を２４～１６８時間スクリーニングする、第７のステップ、および
酸化滅菌プロセスの有効性が、第７のステップの比色スクリーニングの結果に従って決定される、最後のステップ
を含む。

【0081】

本発明の方法の特定の実施形態において、生物学的指標は、滅菌される材料と共に入れられる。生物学的指標は、滅菌器内の位置と温度に関連して、それが対象と同じ滅菌条件を確実に受けるように、滅菌される対象材料のほかに滅菌器の内部に配置される。

【0082】

別の特定の実施形態において、生物学的指標は、滅菌剤にアクセスしにくいと考えられている領域に配置されている。続いて、通常の方法で参加滅菌プロセスが実行される。このステップの間、生物学的指標容器のキャップは緩んでいる、つまり、チューブはキャップによって完全に密封されていない。特定の実施形態において、滅菌は４０℃～６０℃で実行される。酸化滅菌プロセスが終了した後、生物学的指標は、室温に達するまで放冷される。インキュベーターは、読み出しと検出のステップのために事前に条件付けされる。

【0083】

好ましい実施形態において、インキュベーターは、統合されたセンサーによって蛍光強度を測定することができる。本発明のさらにより好ましい実施形態において、インキュベーターは、TerrageneインキュベーターリーダーBionova(登録商標)IC10/20FR、IC10/20FRLDまたはMiniBioインキュベーターからなる群から選択される。インキュベーターは、５５～６５℃、好ましくは５８～６２℃の範囲の温度、さらにより好ましくは６０℃に設定される。所望の温度に達したら、キャップを押してチューブを密封し、アンプルを破砕し、生物学的指標を事前調製されたインキュベーター内部に配置する。アンプルが破砕されると、生物学的指標の異なる成分が接触する。インキュベーターが目的の温度に達する前にアンプルを壊してはいけない。

【0084】

インキュベーター内部に配置された直後に、処理された生物学的指標は瞬間的に検出可能な蛍光シグナルをもたらす。一般に、励起と発光に使用される波長は、指標における蛍光センサータンパク質によって異なる。

【0085】

本発明の特定の実施形態において、蛍光値が（タンパク質構造の不可逆的な変更により）劇的に変化する場合、効果的な滅菌が証明される。０～１２０秒のインキュベーション後、蛍光強度の重要な変化が検出された場合、これは、滅菌が効果的であり、センサータンパク質の三次元構造に十分に影響を及ぼし、蛍光発光を変化させたことを意味する。

【0086】

２４～１６８時間の比色テストを実行するために、５５～６５℃、５８～６２℃の範囲の温度、または６０℃でのインキュベーションにより、微生物胞子が増殖し続ける。本発明の特定の実施形態において、滅菌が効果的でなかった場合、微生物胞子は生存可能であり、したがって増殖し、それにより培地は色を変化させる。この現象は、当技術分野でよく知られているように、微生物生命の成長によって引き起こされる、様々な媒体ｐＨまたは比色成分を伴う代謝酵素活性に起因する。

【0087】

滅菌有効性は、光学的に観察された蛍光の変化と、光学的に観察された培地の変化の両方によって決定される。特定の実施形態において、陽性対照を使用して、色の変化および蛍光の存在を観察および比較する必要がある。

【0088】

実施例
実施例１
この実施例は、生物学的指標の予測を評価するために、亜致死曝露を行うことができる、CASP50フラッシュデバイスを使用して実行された。

【0089】

市場で現在入手可能な最速の指標であるBIONOVA BT96生物学的指標を、比較データを得るために、本発明の生物学的指標と共に実施例中のテストに使用した。

【0090】

IC10/20FRLCDインキュベーターを使用して高速読み出しが得られた。拡張時間の読み出し（７日間）が、６０℃で相対湿度８０％の湿度チャンバーで実行された。

【0091】

本発明の生物学的指標のアンプルに収められている培地は、１ｇ／Ｌの細菌学的ペプトン、１ｇ／Ｌの酵母エキスおよび０．５ｇ／ＬのＬ－バリンから成る。

【0092】

本発明の20個の生物学的指標および20個の対照指標試験を、特定の曝露時間ごとに実行した。

【0093】

本発明の生物学的指標を用いた蛍光読み出しは、本発明の方法に従って、０～２０秒以内に実行された。20個のサンプルの平均蛍光値を以下の表に示します。アンプルには培地の比色成分としてブロモクレゾールパープルが含まれていた。

【0094】

アンプルと共に、２．５ｘ１０^６ＣＦＵのGeobacillus stearothermophillus ATCC 7953胞子および蛍光センサータンパク質としてEBFP 5μgを含む担体をチューブ内部に配置した。注入時間を増加させた曝露サイクルは、本発明の方法に従って、5%v/v過酸化水素濃度で行われた。

【表1】

【0095】

実施例２
本明細書に示されるバリエーションを除いて、実施例１の条件が複製された。

【0096】

アンプルには、培地の比色成分としてブロモクレゾールパープルが包含されていた。

【0097】

アンプルと一緒に、蛍光センサータンパク質がチューブの内側に置かれているため、担体は、2.5x106CFUのGeobacillus stearothermophillus ATCC 7953胞子および50μgのmCherryを含む。本発明の方法に従って、注入時間を増加させた曝露サイクルが、５％ｖ／ｖの過酸化水素濃度で実施された。

【表2】

【0098】

実施例３
ここに示す変更を除いて、実施例１の条件を再現した。

【0099】

アンプルには、培地の比色成分として5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリルβ-D-ガラクトピラノシドが包含されていた。

【0100】

アンプルと共に、２．５ｘ１０^６ＣＦＵのGeobacillus stearothermophillus ATCC 7953胞子および蛍光センサータンパク質として YFP 100μgを含む担体をチューブ内部に配置した。本発明の方法に従って、注入時間を増加させた曝露サイクルが５％ｖ／ｖの過酸化水素濃度で実行された。

【表3】

【0101】

実施例４
本明細書に示されるバリエーションを除いて、実施例１の条件が複製された。

【0102】

ブロモチモールブルーを包含したアンプルを培地の比色成分として使用した。

【0103】

アンプルと共に、２．５ｘ１０^６ＣＦＵのGeobacillus stearothermophillus ATCC 7953胞子と蛍光センサータンパク質としてECFP ７５μgを含む担体をチューブ内部に配置した。本発明の方法に従って、注入時間を増加させた曝露サイクルが、５％ｖ／ｖの過酸化水素濃度で行われた。

【表4】