特表 2024-522850 遺伝子の発現をモジュレートするための組成物および方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-06-21

(54)【発明の名称】遺伝子の発現をモジュレートするための組成物および方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/113 20100101AFI20240614BHJP

   C12N 15/20 20060101ALI20240614BHJP

   C12N 15/17 20060101ALI20240614BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20240614BHJP

   A61P 19/02 20060101ALI20240614BHJP

   A61P 17/00 20060101ALI20240614BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20240614BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20240614BHJP

   A61K 31/713 20060101ALI20240614BHJP

   C12N 15/67 20060101ALN20240614BHJP

   A61K 38/20 20060101ALN20240614BHJP

   A61K 38/30 20060101ALN20240614BHJP

【ＦＩ】

C12N15/113 Z

C12N15/20

C12N15/17

A61K48/00

A61P19/02

A61P17/00

A61P29/00

A61P43/00 121

A61K31/713

C12N15/67 Z

A61K38/20

A61K38/30

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023579057

(86)(22)【出願日】2022-06-22

(85)【翻訳文提出日】2024-02-15

(86)【国際出願番号】 IB2022000358

(87)【国際公開番号】W WO2022269356

(87)【国際公開日】2022-12-29

(31)【優先権主張番号】63/213,829

(32)【優先日】2021-06-23

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】521265726

【氏名又は名称】ヴェルサメブ アーゲー

(74)【代理人】

【識別番号】110002077

【氏名又は名称】園田・小林弁理士法人

(72)【発明者】

【氏名】セルヴァラージ， ジャスティン アントニー

(72)【発明者】

【氏名】ザイデベェルド， クラース ピーテル

(72)【発明者】

【氏名】ヒルマン－ヴュルナー， ペトラ

(72)【発明者】

【氏名】メッツガー， フリードリヒ

【テーマコード（参考）】

4C084

4C086

【Ｆターム（参考）】

4C084AA13

4C084BA44

4C084DA16

4C084DB58

4C084MA02

4C084NA06

4C084NA14

4C084ZA89

4C084ZA96

4C084ZB11

4C084ZC75

4C086AA01

4C086AA02

4C086AA03

4C086EA16

4C086MA01

4C086MA04

4C086NA06

4C086NA14

4C086ZA89

4C086ZA96

4C086ZB11

4C086ZC75

(57)【要約】

本発明は、関心のある遺伝子をコードする第１のＲＮＡ配列と、１種または複数の標的ＲＮＡの発現をモジュレートする少なくとも２種の遺伝子エレメントを含む第２のＲＮＡ配列とを含む組み換えポリ核酸またはＲＮＡコンストラクトを含む、遺伝子の発現をモジュレートするための組成物および方法に関する。本明細書に記載される組み換えＲＮＡコンストラクトは、関心のある遺伝子をコードする第１のＲＮＡ配列と、少なくとも２種の遺伝子エレメントのうちの多くとも１種を含む相当する第２のＲＮＡ配列とを含む相当する組み換えＲＮＡコンストラクトによって誘導される免疫応答よりも低い、ヒト細胞における免疫応答を誘導する。疾患を治療することにおける、および２種以上の遺伝子の発現をモジュレートすることにおける、組成物の使用も本明細書に開示される。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

（ｉ）関心のある遺伝子をコードする第１のＲＮＡ配列と、
（ｉｉ）１種または複数の標的ＲＮＡの発現をモジュレートする少なくとも２種の遺伝子エレメントを含む第２のＲＮＡ配列と
を含む組み換えＲＮＡコンストラクトを含む組成物であって、
ヒト細胞と組み換えＲＮＡコンストラクトとを接触させることは、（ｉ）の第１のＲＮＡ配列と、少なくとも２種の遺伝子エレメントのうちの多くとも１種を含む（ｉｉ）の相当する第２のＲＮＡ配列とを含む相当する組み換えＲＮＡコンストラクトと接触したヒト細胞の免疫応答よりも低い免疫応答をもたらす、組成物。

【請求項2】

組み換えＲＮＡコンストラクトが、１つまたは複数のウリジンを含む、請求項１に記載の組成物。

【請求項3】

組み換えＲＮＡコンストラクトが、修飾されたウリジンを含まない、請求項１または２に記載の組成物。

【請求項4】

（ｉ）関心のある遺伝子をコードする第１のＲＮＡ配列と、
（ｉｉ）１種または複数の標的ＲＮＡの発現をモジュレートする少なくとも２種の遺伝子エレメントを含む第２のＲＮＡ配列と
を含む組み換えＲＮＡコンストラクトを含む組成物であって、
組み換えＲＮＡコンストラクトはヌクレオチドバリアントを含まない、組成物。

【請求項5】

（ｉ）関心のある遺伝子をコードする第１のＲＮＡ配列と、
（ｉｉ）１種または複数の標的ＲＮＡの発現をモジュレートする少なくとも２種の遺伝子エレメントを含む第２のＲＮＡ配列と
を含む組み換えＲＮＡコンストラクトを含む組成物であって、
組み換えＲＮＡコンストラクトは修飾されたウリジンを含まない、組成物。

【請求項6】

（ｉ）関心のある遺伝子をコードする第１のＲＮＡ配列と、
（ｉｉ）１種または複数の標的ＲＮＡの発現をモジュレートする少なくとも２種の遺伝子エレメントを含む第２のＲＮＡ配列と
を含む組み換えＲＮＡコンストラクトを含む組成物であって、
組み換えＲＮＡコンストラクトはＮ１－メチルシュードウリジンを含まない、組成物。

【請求項7】

（ｉ）関心のある遺伝子をコードする第１のＲＮＡ配列と、
（ｉｉ）１種または複数の標的ＲＮＡの発現をモジュレートする少なくとも２種の遺伝子エレメントを含む第２のＲＮＡ配列と
を含む組み換えＲＮＡコンストラクトを含む組成物であって、
組み換えＲＮＡコンストラクトは、非修飾のヌクレオチドまたは天然のヌクレオチドだけを含む、組成物。

【請求項8】

（ｉ）関心のある遺伝子をコードする第１のＲＮＡ配列と、
（ｉｉ）１種または複数の標的ＲＮＡの発現をモジュレートする少なくとも２種の遺伝子エレメントを含む第２のＲＮＡ配列と
を含む組み換えＲＮＡコンストラクトを含む組成物であって、
組み換えＲＮＡコンストラクトはウリジンを含み、
（ａ）組み換えＲＮＡコンストラクトによって含まれるすべてのウリジンは、非修飾もしくは天然のヌクレオチドであるか；または
（ｂ）組み換えＲＮＡコンストラクトによって含まれるウリジンの少なくとも１つは、非修飾のウリジンである、組成物。

【請求項9】

ヌクレオチドバリアントが、修飾されたウリジンを含む、請求項４に記載の組成物。

【請求項10】

修飾されたウリジンが、Ｎ１－メチルシュードウリジンを含む、請求項３、５、および９のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項11】

相当する組み換えＲＮＡコンストラクトが、１種または複数の標的ＲＮＡの発現をモジュレートする遺伝子エレメントのいずれも含まない、請求項１から３のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項12】

第２のＲＮＡ配列が、１種または複数の標的ＲＮＡの発現をモジュレートする少なくとも３種の遺伝子エレメントを含む、請求項１から１１のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項13】

第２のＲＮＡ配列が、１種または複数の標的ＲＮＡの発現をモジュレートする少なくとも６種の遺伝子エレメントを含む、請求項１から１２のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項14】

第１のＲＮＡ配列が、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）配列である、請求項１から１３のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項15】

第２のＲＮＡ配列の少なくとも２種の遺伝子エレメントのそれぞれが、二次構造を含む、請求項１から１４のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項16】

第２のＲＮＡ配列の少なくとも２種の遺伝子エレメントのそれぞれが、ヘアピン構造またはループ構造を含む、請求項１から１５のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項17】

第２のＲＮＡ配列の少なくとも２種の遺伝子エレメントのそれぞれが、短いまたは低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）である、請求項１から１６のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項18】

第２のＲＮＡ配列の少なくとも２種の遺伝子エレメントのそれぞれが、細胞内タンパク質によってプロセシングされるまたは切断される、請求項１から１７のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項19】

第２のＲＮＡ配列の少なくとも２種の遺伝子エレメントのそれぞれが、細胞の内因性タンパク質によってプロセシングされるまたは切断される、請求項１から１８のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項20】

第２のＲＮＡ配列の少なくとも２種の遺伝子エレメントのそれぞれが、内因性ＤＩＣＥＲによってプロセシングされるまたは切断される、請求項１から１９のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項21】

第２のＲＮＡ配列の少なくとも２種の遺伝子エレメントのそれぞれが、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を含む、請求項１から２０のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項22】

第２のＲＮＡ配列の少なくとも２種の遺伝子エレメントのそれぞれが、１種または複数の標的ＲＮＡに結合し得る、請求項１から２１のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項23】

免疫応答が、ヒトＴｏｌｌ様受容体７（ＴＬＲ７）免疫応答、インターフェロンアルファ／ベータ（ＩＦＮα／β）免疫応答、ヒトＴｏｌｌ様受容体３（ＴＬＲ３）免疫応答、ヒトＴｏｌｌ様受容体８（ＴＬＲ８）免疫応答、またはその任意の組み合わせである、請求項１から３または１１から２２のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項24】

ヒト細胞と組み換えＲＮＡコンストラクトとを接触させることが、ヒトＴｏｌｌ様受容体７（ＴＬＲ７）免疫原性アッセイに従って、相当する組み換えＲＮＡコンストラクトと接触したヒト細胞の免疫応答よりも低い免疫応答をもたらす、請求項１から３または１１から２３のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項25】

ヒトＴＬＲ７免疫原性アッセイが、ＮＦ－κＢおよび／またはＡＰ１の活性化を測定する、請求項２４に記載の組成物。

【請求項26】

ヒトＴＬＲ７免疫原性アッセイが、ＨＥＫ２９３細胞またはその誘導体において実施される、請求項２４または２５に記載の組成物。

【請求項27】

ＨＥＫ２９３細胞が、ｈＴＬＲ７およびレポーター遺伝子を発現するように操作されている、請求項２６に記載の組成物。

【請求項28】

レポーター遺伝子が、分泌型レポーター遺伝子である、請求項２７に記載の組成物。

【請求項29】

分泌型レポーター遺伝子が、分泌型胚性アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）である、請求項２８に記載の組成物。

【請求項30】

レポーター遺伝子が、１つまたは複数のＮＦ－κＢおよび／またはＡＰ１結合部位を有するプロモーターの制御下にある、請求項２７から２９のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項31】

プロモーターがＩＦＮ－β最小プロモーターである、請求項３０に記載の組成物。

【請求項32】

組み換えＲＮＡコンストラクトと接触したヒト細胞における免疫応答が、相当する組み換えＲＮＡコンストラクトと接触したヒト細胞における免疫応答よりも少なくとも１．５倍または少なくとも２倍低い、請求項２４から３１のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項33】

ヒト細胞と組み換えＲＮＡコンストラクトとを接触させることが、インターフェロンアルファ／ベータ（ＩＦＮα／β）免疫原性アッセイに従って、相当する組み換えＲＮＡコンストラクトと接触したヒト細胞の免疫応答よりも低い免疫応答をもたらす、請求項１から３または１１から２３のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項34】

ＩＦＮα／β免疫原性アッセイが、ＪＡＫ－ＳＴＡＴおよび／またはＩＳＧ３の活性化を測定する、請求項３３に記載の組成物。

【請求項35】

ＩＦＮα／β免疫原性アッセイが、ＨＥＫ２９３細胞またはその誘導体において実施される、請求項３３または３４に記載の組成物。

【請求項36】

ＨＥＫ２９３細胞が、ヒトＳＴＡＴ２および／またはＩＲＦ９遺伝子ならびにレポーター遺伝子を発現するように操作されている、請求項３５に記載の組成物。

【請求項37】

レポーター遺伝子が、分泌型レポーター遺伝子である、請求項３６に記載の組成物。

【請求項38】

分泌型レポーター遺伝子が、分泌型胚性アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）である、請求項３７に記載の組成物。

【請求項39】

レポーター遺伝子が、１つまたは複数のＳＴＡＴ２および／またはＩＲＦ９結合部位を有するプロモーターの制御下にある、請求項３６から３８のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項40】

プロモーターがＩＳＧ５４プロモーターである、請求項３９に記載の組成物。

【請求項41】

組み換えＲＮＡコンストラクトと接触したヒト細胞における免疫応答が、相当する組み換えＲＮＡコンストラクトと接触したヒト細胞における免疫応答よりも少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、または少なくとも１００倍低い、請求項３３から４０のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項42】

ヒト細胞と組み換えＲＮＡコンストラクトとを接触させることが、ヒトＴｏｌｌ様受容体３（ＴＬＲ３）免疫原性アッセイに従った実質的な免疫応答をもたらさない、請求項１から３または１１から２３のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項43】

ヒトＴＬＲ３免疫原性アッセイが、ＮＦ－κＢおよび／またはＡＰ１の活性化を測定する、請求項４２に記載の組成物。

【請求項44】

ヒトＴＬＲ３免疫原性アッセイが、ＨＥＫ２９３細胞またはその誘導体において実施される、請求項４２または４３に記載の組成物。

【請求項45】

ＨＥＫ２９３細胞が、ｈＴＬＲ３およびレポーター遺伝子を発現するように操作されている、請求項４４に記載の組成物。

【請求項46】

レポーター遺伝子が、分泌型レポーター遺伝子である、請求項４５に記載の組成物。

【請求項47】

分泌型レポーター遺伝子が、分泌型胚性アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）である、請求項４６に記載の組成物。

【請求項48】

レポーター遺伝子が、１つまたは複数のＮＦ－κＢおよび／またはＡＰ１結合部位を有するプロモーターの制御下にある、請求項４５から４７のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項49】

プロモーターがＩＦＮ－β最小プロモーターである、請求項４８に記載の組成物。

【請求項50】

ヒト細胞と組み換えＲＮＡコンストラクトとを接触させることが、ヒトＴｏｌｌ様受容体８（ＴＬＲ８）免疫原性アッセイに従って、相当する組み換えＲＮＡコンストラクトと接触したヒト細胞の免疫応答よりも低い免疫応答をもたらす、請求項１から３または１１から２３のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項51】

ヒトＴＬＲ８免疫原性アッセイが、ＮＦ－κＢ、ＡＰ１、および／またはＩＲＦの活性化を測定する、請求項５０に記載の組成物。

【請求項52】

ヒトＴＬＲ８免疫原性アッセイが、ＨＥＫ２９３細胞またはその誘導体において実施される、請求項５０または５１に記載の組成物。

【請求項53】

ＨＥＫ２９３細胞が、ｈＴＬＲ８およびレポーター遺伝子を発現するように操作されている、請求項５２に記載の組成物。

【請求項54】

レポーター遺伝子が、分泌型レポーター遺伝子である、請求項５３に記載の組成物。

【請求項55】

分泌型レポーター遺伝子が、分泌型胚性アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）である、請求項５４に記載の組成物。

【請求項56】

レポーター遺伝子が、１つまたは複数のＮＦ－κＢおよび／またはＡＰ１結合部位を有するプロモーターの制御下にある、請求項５３から５５のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項57】

プロモーターがＩＦＮ－β最小プロモーターである、請求項５６に記載の組成物。

【請求項58】

免疫応答が、細胞において炎症促進性サイトカインの発現を誘導する、請求項１から３または１１から２２のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項59】

炎症促進性サイトカインがインターロイキン６（ＩＬ－６）を含む、請求項５８に記載の組成物。

【請求項60】

細胞が、ヒト肺上皮癌細胞（Ａ５４９）またはヒト単球白血病細胞（ＴＨＰ－１）を含む、請求項５８または５９に記載の組成物。

【請求項61】

第２のＲＮＡ配列が、２、３、４、５、６種、またはそれより多くのｓｉＲＮＡを含み、２、３、４、５、６種、またはそれより多くのｓｉＲＮＡは、
（ｉ）異なる標的ＲＮＡ；
（ｉｉ）同じ標的ＲＮＡの異なる領域；
（ｉｉｉ）同じ標的ＲＮＡの同じ領域；または
（ｉｖ）その任意の組み合わせ
に結合し得るｓｉＲＮＡを含む、請求項２１から６０のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項62】

第２のＲＮＡ配列が、少なくとも３種のｓｉＲＮＡを含む、請求項６１に記載の組成物。

【請求項63】

第２のＲＮＡ配列が、少なくとも６種のｓｉＲＮＡを含む、請求項６１に記載の組成物。

【請求項64】

組み換えＲＮＡコンストラクトが、１種または複数のリンカーをさらに含む、請求項１から６３のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項65】

１種または複数のリンカーのそれぞれが、
式（Ｉ）：Ｘ_ｍＣＡＡＣＡＡＸ_ｎ
［式中、Ｘは任意のヌクレオチドであり、ｍは１～１２の整数であり、ｎは０～４の整数である］；および
式（ＩＩ）：Ｘ_ｐＴＣＣＣＸ_ｒ
［式中、Ｘは任意のヌクレオチドであり、ｐは０～１７の整数であり、ｒは０～１３の整数である］
からなる群から選択される構造を有する、請求項６４に記載の組成物。

【請求項66】

１種または複数のリンカーのそれぞれが、ＡＣＡＡＣＡＡを含む配列を含む、請求項６４に記載の組成物。

【請求項67】

１種または複数のリンカーのそれぞれが、（ａ）ＴＴＴＡＴＣＴＴＡＧＡＧＧＣＡＴＡＴＣＣＣＴＡＣＧＴＡＣＣＡＡＣＡＡもしくはＡＴＡＧＴＧＡＧＴＣＧＴＡＴＴＡＡＣＧＴＡＣＣＡＡＣＡＡではないか；または（ｂ）ＲＮＡｆｏｌｄウェブサーバーに従った二次構造を形成しない、請求項６４に記載の組成物。

【請求項68】

１種または複数のリンカーのそれぞれが、（ａ）第１のＲＮＡ配列と第２のＲＮＡ配列との間、（ｂ）第２のＲＮＡ配列の２、３、４、５、６種、もしくはそれより多くのｓｉＲＮＡのそれぞれの間、または（ｃ）（ａ）および（ｂ）の両方の間に存在する、請求項６４から６７のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項69】

１種または複数のリンカーのそれぞれが、配列番号２７、２８、８５～９５からなる群から独立して選択される配列を含む、請求項６４から６８のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項70】

関心のある遺伝子の発現がモジュレートされる、請求項１から６９のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項71】

関心のある遺伝子の発現が、組み換えＲＮＡコンストラクトを含む細胞において上方調節される、請求項７０に記載の組成物。

【請求項72】

関心のある遺伝子によってコードされるタンパク質の発現が、組み換えＲＮＡコンストラクトを含む細胞において上方調節される、請求項７０に記載の組成物。

【請求項73】

１種または複数の標的ＲＮＡの発現がモジュレートされる、請求項１から７２のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項74】

１種または複数の標的ＲＮＡの発現が、１種または複数の標的ＲＮＡの発現をモジュレートする遺伝子エレメントによって下方調節される、請求項７３に記載の組成物。

【請求項75】

１種または複数の標的ＲＮＡの発現をモジュレートする遺伝子エレメントが、関心のある遺伝子の発現を阻害しない、請求項１から７４のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項76】

関心のある遺伝子が、インターロイキン４（ＩＬ－４）およびインスリン様成長因子１（ＩＧＦ－１）からなる群から選択される、請求項１から７５のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項77】

１種または複数の標的ＲＮＡが、ノンコーディングＲＮＡまたはメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を含む、請求項１から７６のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項78】

１種または複数の標的ＲＮＡのそれぞれがノンコーディングＲＮＡである、請求項１から７７のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項79】

１種または複数の標的ＲＮＡのそれぞれがｍＲＮＡである、請求項１から７７のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項80】

標的ＲＮＡが、インターロイキン８（ＩＬ－８）、インターロイキン１ベータ（ＩＬ－１ベータ）、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ－アルファ）、インターロイキン１７（ＩＬ－１７）、またはその機能的バリアントを含むタンパク質をコードするｍＲＮＡである、請求項１から７７のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項81】

１種または複数の標的ＲＮＡの発現をモジュレートする遺伝子エレメントが、１種または複数の標的ＲＮＡのエクソンに結合する、請求項１から８０のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項82】

１種または複数の標的ＲＮＡの発現をモジュレートする遺伝子エレメントが、１種の標的ＲＮＡに特異的に結合する、請求項１から８１のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項83】

１種または複数の標的ＲＮＡの発現をモジュレートする遺伝子エレメントが、関心のある遺伝子のイントロン配列によってコードされないまたはそれから構成されない、請求項１から８２のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項84】

関心のある遺伝子が、ＲＮＡスプライシングなしで発現される、請求項１から８３のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項85】

第１のＲＮＡ配列が、第２のＲＮＡ配列の下流または３’に存在する、請求項１から８４のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項86】

第１のＲＮＡ配列が、第２のＲＮＡ配列の上流または５’に存在する、請求項１から８５のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項87】

ＲＮＡコンストラクトが、第１のＲＮＡ配列の上流または５’に内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を含む、請求項１から８６のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項88】

ポリ（Ａ）テール、５’キャップ、またはコザック配列をさらに含む、請求項１から８７のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項89】

第１のＲＮＡ配列および第２のＲＮＡ配列が、両方とも組み換えである、請求項１から８８のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項90】

ｓｉＲＮＡが、配列番号５７～７０から選択されるセンス鎖配列を含む、請求項１から８９のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項91】

細胞において２種以上の遺伝子の発現をモジュレートすることにおける使用のための、請求項１から９０のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項92】

請求項１から９０のいずれか一項に記載の組成物の治療的有効量、および薬学的に許容される添加物を含む、薬学的組成物。

【請求項93】

請求項１から９０のいずれか一項に記載の組成物をコードする組み換えポリ核酸コンストラクトを含む、ベクター。

【請求項94】

請求項１から９０のいずれか一項に記載の組成物、または請求項９３に記載のベクターを含む、細胞。

【請求項95】

請求項１から９０のいずれか一項に記載の組成物、または請求項９３に記載のベクターを細胞に導入することを含む、細胞において単一ＲＮＡ転写産物からｓｉＲＮＡおよびｍＲＮＡを同時に発現させる方法。

【請求項96】

請求項１から９０のいずれか一項に記載の組成物、または請求項９２に記載の薬学的組成物をそれを必要とする対象に投与することを含む、疾患または病状を治療する方法。

【請求項97】

疾患または病状が、皮膚疾患もしくは病状、または関節疾患もしくは病状を含む、請求項９６に記載の方法。

【請求項98】

皮膚疾患または病状が炎症性皮膚障害を含む、請求項９７に記載の方法。

【請求項99】

炎症性皮膚障害が乾癬を含む、請求項９８に記載の方法。

【請求項100】

関節疾患または病状が関節変性を含む、請求項９７に記載の方法。

【請求項101】

関節変性が、椎間板疾患（ＩＶＤＤ）または変形性関節症（ＯＡ）を含む、請求項１００に記載の方法。

【請求項102】

対象がヒトである、請求項９６から１０１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項103】

（ｉ）インスリン様成長因子１（ＩＧＦ－１）をコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）と、
（ｉｉ）インターロイキン－８（ＩＬ－８）ｍＲＮＡに結合し得る少なくとも２種の低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）と
を含む組み換えＲＮＡコンストラクトを含む組成物であって、
ヒト細胞と組み換えＲＮＡコンストラクトとを接触させることが、（ｉ）のＩＧＦ－１をコードするｍＲＮＡと、（ｉｉ）のＩＬ－８ ｍＲＮＡに結合し得る少なくとも２種のｓｉＲＮＡのうちの多くとも１種とを含む相当する組み換えＲＮＡコンストラクトと接触したヒト細胞の免疫応答よりも低い免疫応答をもたらす、組成物。

【請求項104】

（ｉ）インスリン様成長因子１（ＩＧＦ－１）をコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）と、
（ｉｉ）インターロイキン－１ベータ（ＩＬ－１ベータ）ｍＲＮＡに結合し得る少なくとも２種の低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）と
を含む組み換えＲＮＡコンストラクトを含む組成物であって、
ヒト細胞と組み換えＲＮＡコンストラクトとを接触させることが、（ｉ）のＩＧＦ－１をコードするｍＲＮＡと、（ｉｉ）のＩＬ－１ベータｍＲＮＡに結合し得る少なくとも２種のｓｉＲＮＡのうちの多くとも１種とを含む相当する組み換えＲＮＡコンストラクトと接触したヒト細胞の免疫応答よりも低い免疫応答をもたらす、組成物。

【請求項105】

組み換えＲＮＡコンストラクト：
（ｉ）インターロイキン－４（ＩＬ－４）をコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）と、
（ｉｉ）腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ－アルファ）ｍＲＮＡに結合し得る少なくとも２種の低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）と
を含む組成物であって、
ヒト細胞と組み換えＲＮＡコンストラクトとを接触させることが、（ｉ）のＩＬ－４をコードするｍＲＮＡと、（ｉｉ）のＴＮＦ－アルファｍＲＮＡに結合し得る少なくとも２種のｓｉＲＮＡのうちの多くとも１種とを含む相当する組み換えＲＮＡコンストラクトと接触したヒト細胞の免疫応答よりも低い免疫応答をもたらす、組成物。

【請求項106】

組み換えＲＮＡコンストラクト：
（ｉ）インターロイキン－４（ＩＬ－４）をコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）と、
（ｉｉ）腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ－アルファ）ｍＲＮＡおよびインターロイキン１７（ＩＬ－１７）に結合し得る少なくとも２種の低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）と
を含む組成物であって、
ヒト細胞と組み換えＲＮＡコンストラクトとを接触させることが、（ｉ）のＩＬ－４をコードするｍＲＮＡと、（ｉｉ）のＴＮＦ－アルファｍＲＮＡおよびＩＬ－１７ ｍＲＮＡに結合し得る少なくとも２種のｓｉＲＮＡのうちの多くとも１種とを含む相当する組み換えＲＮＡコンストラクトと接触したヒト細胞の免疫応答よりも低い免疫応答をもたらす、組成物。

【請求項107】

配列番号１～２４、４２、１２５、９７～１０８、１２１～１２２、および１２７～１２８からなる群から選択される核酸配列を含む組み換えポリ核酸コンストラクトを含む、組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年６月２３日に出願された米国仮出願第６３／２１３，８２９号の利益を主張するものであり、それは参照によりその全体として本明細書に組み入れられる。

【0002】

配列表
本出願は配列表を含有する。

【背景技術】

【0003】

数多くのヒト疾患および障害は、ある特定のタンパク質の、疾患または障害を有しないヒトにおけるこれらのタンパク質の発現レベルと比較して、より高くかつ／またはより低い発現レベルの組み合わせによって引き起こされる。単一コンストラクトを用いた、標的タンパク質の発現を選択的に増加させ得、別の異なる標的タンパク質の発現を減少させ得るＲＮＡ治療薬は、治療効果を有し得る。しかしながら、外因性ＲＮＡは、望ましくない自然免疫応答を誘発し得る。したがって、不要な自然免疫活性化を回避する低下した免疫原性を有するＲＮＡ治療薬を開発する必要がある。

【発明の概要】

【0004】

１種の組み換えポリ核酸またはＲＮＡコンストラクトを使用して、２種または３種以上のタンパク質の発現を同時にモジュレートするための組成物および方法が本明細書において提供される。例えば、本明細書において提供される組成物および方法を使用して、第１のタンパク質の発現を増加させ得、第２のタンパク質の発現を減少させ得る。例えば、本明細書において提供される組成物および方法を使用して、第１のタンパク質の発現を増加させ得、第２のタンパク質の発現を減少させ得、第３のタンパク質の発現を減少させ得る。

【0005】

一部の態様において、（ｉ）関心のある遺伝子をコードする第１のＲＮＡ配列と、（ｉｉ）１種または複数の標的ＲＮＡの発現をモジュレートする少なくとも２種の遺伝子エレメントを含む第２のＲＮＡ配列とを含む組み換えＲＮＡコンストラクトを含む組成物であって、ヒト細胞と組み換えＲＮＡコンストラクトとを接触させることは、（ｉ）の第１のＲＮＡ配列と、少なくとも２種の遺伝子エレメントのうちの多くとも１種を有する（ｉｉ）の相当する第２のＲＮＡ配列とを含む相当する組み換えＲＮＡコンストラクトと接触したヒト細胞の免疫応答よりも低い免疫応答をもたらす、組成物が本明細書において提供される。一部の実施形態において、組み換えＲＮＡコンストラクトは、１つまたは複数のウリジンを含む。一部の実施形態において、組み換えＲＮＡコンストラクトは、修飾されたウリジンを含まない。一部の実施形態において、ヌクレオチドバリアントは、修飾されたウリジンを含む。一部の実施形態において、修飾されたウリジンは、Ｎ１－メチルシュードウリジンを含む。

【0006】

一部の態様において、（ｉ）関心のある遺伝子をコードする第１のＲＮＡ配列と、（ｉｉ）１種または複数の標的ＲＮＡの発現をモジュレートする少なくとも２種の遺伝子エレメントを含む第２のＲＮＡ配列とを含む組み換えＲＮＡコンストラクトを含む組成物であって、組み換えＲＮＡコンストラクトはヌクレオチドバリアントを含まない、組成物が本明細書において提供される。

【0007】

一部の態様において、（ｉ）関心のある遺伝子をコードする第１のＲＮＡ配列と、（ｉｉ）１種または複数の標的ＲＮＡの発現をモジュレートする少なくとも２種の遺伝子エレメントを含む第２のＲＮＡ配列とを含む組み換えＲＮＡコンストラクトを含む組成物であって、組み換えＲＮＡコンストラクトは修飾されたウリジンを含まない、組成物が本明細書において提供される。

【0008】

一部の態様において、（ｉ）関心のある遺伝子をコードする第１のＲＮＡ配列と、（ｉｉ）１種または複数の標的ＲＮＡの発現をモジュレートする少なくとも２種の遺伝子エレメントを含む第２のＲＮＡ配列とを含む組み換えＲＮＡコンストラクトを含む組成物であって、組み換えＲＮＡコンストラクトはＮ１－メチルシュードウリジンを含まない、組成物が本明細書において提供される。

【0009】

一部の態様において、（ｉ）関心のある遺伝子をコードする第１のＲＮＡ配列と、（ｉｉ）１種または複数の標的ＲＮＡの発現をモジュレートする少なくとも２種の遺伝子エレメントを含む第２のＲＮＡ配列とを含む組み換えＲＮＡコンストラクトを含む組成物であって、組み換えＲＮＡコンストラクトは、非修飾のヌクレオチドまたは天然のヌクレオチドだけを含む、組成物が本明細書において提供される。

【0010】

一部の態様において、（ｉ）関心のある遺伝子をコードする第１のＲＮＡ配列と、（ｉｉ）１種または複数の標的ＲＮＡの発現をモジュレートする少なくとも２種の遺伝子エレメントを含む第２のＲＮＡ配列とを含む組み換えＲＮＡコンストラクトを含む組成物であって、組み換えＲＮＡコンストラクトはウリジンを含み、（ａ）組み換えＲＮＡコンストラクトによって含まれるすべてのウリジンは、非修飾もしくは天然のヌクレオチドであるか；または（ｂ）組み換えＲＮＡコンストラクトによって含まれるウリジンの少なくとも１つは非修飾のウリジンである、組成物が本明細書において提供される。

【0011】

一部の態様において、細胞において２種以上の遺伝子の発現をモジュレートすることにおける使用のための組成物が本明細書において提供される。一部の態様において、本明細書に記載される組成物のいずれか１種の治療的有効量、および薬学的に許容される添加物を含む薬学的組成物が本明細書において提供される。一部の態様において、本明細書に記載される組成物のいずれか１種をコードする組み換えポリ核酸コンストラクトを含むベクターが本明細書において提供される。一部の態様において、本明細書に記載される組成物のいずれか１種、または本明細書に記載されるベクターのいずれか１種を含む細胞が本明細書において提供される。

【0012】

一部の態様において、本明細書に記載される組成物のいずれか１種、または本明細書に記載されるベクターのいずれか１種を細胞に導入することを含む、細胞において単一ＲＮＡ転写産物からｓｉＲＮＡおよびｍＲＮＡを同時に発現させる方法が本明細書において提供される。

【0013】

一部の態様において、本明細書に記載される組成物のいずれか１種、または本明細書に記載される薬学的組成物のいずれか１種をそれを必要とする対象に投与することを含む、疾患または病状を治療する方法が本明細書において提供される。

【0014】

一部の態様において、（ｉ）インスリン様成長因子１（ＩＧＦ－１）をコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）と、（ｉｉ）インターロイキン－８（ＩＬ－８）ｍＲＮＡに結合し得る少なくとも２種の低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）とを含む組み換えＲＮＡコンストラクトを含む組成物であって、ヒト細胞と組み換えＲＮＡコンストラクトとを接触させることは、（ｉ）のＩＧＦ－１をコードするｍＲＮＡと、（ｉｉ）のＩＬ－８ ｍＲＮＡに結合し得る少なくとも２種のｓｉＲＮＡのうちの多くとも１種とを含む相当する組み換えＲＮＡコンストラクトと接触したヒト細胞の免疫応答よりも低い免疫応答をもたらす、組成物が本明細書において提供される。

【0015】

一部の態様において、（ｉ）インスリン様成長因子１（ＩＧＦ－１）をコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）と、（ｉｉ）インターロイキン－１ベータ（ＩＬ－１ベータ）ｍＲＮＡに結合し得る少なくとも２種の低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）とを含む組み換えＲＮＡコンストラクトを含む組成物であって、ヒト細胞と組み換えＲＮＡコンストラクトとを接触させることは、（ｉ）のＩＧＦ－１をコードするｍＲＮＡと、（ｉｉ）のＩＬ－１ベータｍＲＮＡに結合し得る少なくとも２種のｓｉＲＮＡのうちの多くとも１種とを含む相当する組み換えＲＮＡコンストラクトと接触したヒト細胞の免疫応答よりも低い免疫応答をもたらす、組成物が本明細書において提供される。

【0016】

一部の態様において、組み換えＲＮＡコンストラクト：（ｉ）インターロイキン－４（ＩＬ－４）をコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）と、（ｉｉ）腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ－アルファ）ｍＲＮＡに結合し得る少なくとも２種の低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）とを含む組成物であって、ヒト細胞と組み換えＲＮＡコンストラクトとを接触させることは、（ｉ）のＩＬ－４をコードするｍＲＮＡと、（ｉｉ）のＴＮＦ－アルファｍＲＮＡに結合し得る少なくとも２種のｓｉＲＮＡのうちの多くとも１種とを含む相当する組み換えＲＮＡコンストラクトと接触したヒト細胞の免疫応答よりも低い免疫応答をもたらす、組成物が本明細書において提供される。

【0017】

一部の態様において、組み換えＲＮＡコンストラクト：（ｉ）インターロイキン－４（ＩＬ－４）をコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）と、（ｉｉ）腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ－アルファ）ｍＲＮＡおよびインターロイキン１７（ＩＬ－１７）に結合し得る少なくとも２種の低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）とを含む組成物であって、ヒト細胞と組み換えＲＮＡコンストラクトとを接触させることは、（ｉ）のＩＬ－４をコードするｍＲＮＡと、（ｉｉ）のＴＮＦ－アルファｍＲＮＡおよびＩＬ－１７ ｍＲＮＡに結合し得る少なくとも２種のｓｉＲＮＡのうちの多くとも１種とを含む相当する組み換えＲＮＡコンストラクトと接触したヒト細胞の免疫応答よりも低い免疫応答をもたらす、組成物が本明細書において提供される。

【0018】

一部の態様において、配列番号１～２４、４２、１２５、９７～１０８、１２１～１２２、および１２７～１２８からなる群から選択される核酸配列を含む組み換えポリ核酸コンストラクトを含む組成物が本明細書において提供される。

【0019】

参照による組み入れ
本明細書において触れられるすべての刊行物、特許、および特許出願は、あたかもそれぞれ個々の刊行物、特許、または特許出願が、参照により組み入れられることを具体的にかつ個々に示されるのと同じ程度に、参照により本明細書に組み入れられる。

【0020】

本開示の特質は、添付の特許請求の範囲において特定性を有して明記される。本開示の特質および利点についてのよりよい理解は、本開示の原理が利用される例示的な実施形態を明記する以下の詳細な説明、および付属の図面を参照することにより獲得されるであろう。

【図面の簡単な説明】

【0021】

【図1】コンストラクト設計の概略図である。ポリ核酸（例えば、ＤＮＡ）コンストラクトは、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ結合、ならびに単一ＲＮＡ転写産物における関心のある遺伝子（例えば、ＩＧＦ－１またはＩＬ－４）およびｓｉＲＮＡの両方のｉｎ ｖｉｔｒｏ転写の成功のために、関心のある遺伝子配列の上流にＴ７プロモーター配列を含み得る。関心のある遺伝子のシグナルペプチドは、灰色のボックスで強調されている。ｍＲＮＡをｓｉＲＮＡにまたはｓｉＲＮＡをｓｉＲＮＡに接続するリンカーは、それぞれ水平の縞模様を有するボックスまたはチェックの縞模様を有するボックスで示されている。Ｔ７：Ｔ７プロモーター、ｓｉＲＮＡ：低分子干渉ＲＮＡ。

【図2A】修飾されたまたは非修飾の化合物（Ｃｐｄ．１～Ｃｐｄ．６；０．３μｇ／ウェル）を用いたトランスフェクションによる、ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ｈＴＬＲ７細胞におけるＮＦ－κＢ経路の活性化に関するプロットである。Ｘ軸は、ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ｈＴＬＲ７細胞を刺激するために使用された種々のコンストラクト試料を示す。Ｒ８４８をポジティブコントロールとして使用した。ｓｉＲＮＡ構造を有しないＩＬ－４ ｍＲＮＡを、比較（修飾されたおよび非修飾の）のために使用した。トランスフェクトされていない試料を、バックグラウンド（ＢＧ）コントロールとして使用した。Ｙ軸は、ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ｈＴＬＲ７細胞におけるＮＦ－κＢ経路の活性化レベルを示す、ＢＧ補正されたＯＤ_６２０を示す。データは、Ｃｐｄ．あたり４つの複製物の平均についての平均±標準誤差を表す。修飾を有するＣｐｄ．は黒色の棒として提示されており、非修飾のＣｐｄ．は点付きの棒として提示されている。

【図2B】修飾または非修飾の化合物（Ｃｐｄ．１～Ｃｐｄ．６；０．６μｇ／ウェル）をトランスフェクトされているヒト胎児性腎臓（ＨＥＫ２９３）細胞の上清による、ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ＩＦＮ－α／β細胞におけるＪＡＫ－ＳＴＡＴおよびＩＳＧ３経路の活性化に関するプロットである。Ｘ軸は、ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ＩＦＮ－α／β細胞を刺激するために使用された種々の試料を示す。ＩＦＮ－アルファをポジティブコントロールとして使用した。トランスフェクトされていないＨＥＫ２９３細胞の上清を、バックグラウンドコントロールとして使用した。Ｙ軸は、ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ＩＦＮ－α／β細胞におけるＪＡＫ－ＳＴＡＴおよびＩＳＧ３経路の活性化レベルを示す、ＢＧ補正されたＯＤ_６２０を示す。データは、Ｃｐｄ．あたり４つの複製物の平均についての平均±標準誤差を表す。修飾を有するＣｐｄ．は黒色の棒として提示されており、非修飾のＣｐｄ．は点付きの棒として提示されている。

【図3A】修飾されたまたは非修飾の化合物（Ｃｐｄ．４、Ｃｐｄ．６～Ｃｐｄ．９；０．３μｇ／ウェル）を用いたトランスフェクションによる、ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ｈＴＬＲ７細胞におけるＮＦ－κＢ経路の活性化に関するプロットである。トランスフェクトされていない試料を、バックグラウンド（ＢＧ）コントロールとして使用した。Ｒ８４８をポジティブコントロールとして使用した。Ｘ軸は、ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ｈＴＬＲ７細胞を刺激するために使用された種々のコンストラクト試料を示し、Ｙ軸は、ＮＦ－κＢ経路の活性化レベルを示すＯＤ_６２０（ＢＧ補正された）を示す。データは、Ｃｐｄ．あたり４つの複製物の平均についての平均±標準誤差を表す。修飾を有するＣｐｄ．は黒色の棒として提示されており、非修飾のＣｐｄ．は点付きの棒として提示されている。ｓｉＲＮＡ位置との関連でのＮＦ－κＢ経路活性化に関して、有意性（＊＊＊、＜０．００１）を、Ｃｐｄ．７非修飾（ｕｎｍｏｄ．）（５’位における１×ｓｉＲＮＡ）およびＣｐｄ．８非修飾（３’位における１×ｓｉＲＮＡ）についてのスチューデントｔ検定によって査定した。

【図3B】修飾されたまたは非修飾の化合物（Ｃｐｄ．４、Ｃｐｄ．６～Ｃｐｄ．９；０．３μｇ／ウェル）をトランスフェクトされているヒト胎児性腎臓（ＨＥＫ２９３）細胞の上清による、ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ＩＦＮ－α／β細胞におけるＪＡＫ－ＳＴＡＴおよびＩＳＧ３経路の活性化に関するプロットである。トランスフェクトされていないＨＥＫ２９３細胞の上清を、バックグラウンド（ＢＧ）コントロールとして使用した。ＩＦＮ－アルファをポジティブコントロールとして使用した。Ｘ軸は、ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ＩＦＮ－α／β細胞を刺激するために使用された種々の試料を示し、Ｙ軸は、ＪＡＫ－ＳＴＡＴおよびＩＳＧ３経路の活性化レベルを示すＯＤ_６２０（ＢＧ補正された）を示す。データは、Ｃｐｄ．あたり４つの複製物の平均についての平均±標準誤差を表す。修飾を有するＣｐｄ．は黒色の棒として提示されており、非修飾のＣｐｄ．は点付きの棒として提示されている。ｓｉＲＮＡ位置との関連でのＪＡＫ－ＳＴＡＴおよびＩＳＧ３経路活性化に関して、有意性（＊＊＊、＜０．００１）を、Ｃｐｄ．７非修飾およびＣｐｄ．８非修飾についてのスチューデントｔ検定によって査定した。

【図4A】修飾されたまたは非修飾の化合物（Ｃｐｄ．１０～Ｃｐｄ．１２；０．４５μｇ／ウェル）を用いたトランスフェクションによる、ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ｈＴＬＲ７細胞におけるＮＦ－κＢ経路の活性化に関するプロットである。トランスフェクトされていない試料を、バックグラウンドコントロールとして使用した。Ｒ８４８をポジティブコントロールとして使用した。Ｘ軸は、ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ｈＴＬＲ７細胞を刺激するために使用された種々のコンストラクト試料を示し、Ｙ軸は、ＮＦ－κＢ経路の活性化レベルを示すＯＤ_６２０（ＢＧ補正された）を示す。データは、Ｃｐｄ．あたり４つの複製物の平均についての平均±標準誤差を表す。修飾を有するＣｐｄ．は黒色の棒として提示されており、非修飾のＣｐｄ．は点付きの棒として提示されている。

【図4B】修飾されたまたは非修飾の化合物（Ｃｐｄ．１０～Ｃｐｄ．１２；０．６μｇ／ウェル）をトランスフェクトされているヒト胎児性腎臓（ＨＥＫ２９３）細胞の上清による、ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ＩＦＮ－α／β細胞におけるＪＡＫ－ＳＴＡＴおよびＩＳＧ３経路の活性化に関するプロットである。トランスフェクトされていないＨＥＫ２９３細胞の上清を、バックグラウンドコントロールとして使用した。ＩＦＮ－アルファをポジティブコントロールとして使用した。Ｘ軸は、ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ＩＦＮ－α／β細胞を刺激するために使用された種々の試料を示し、Ｙ軸は、ＪＡＫ－ＳＴＡＴおよびＩＳＧ３経路の活性化レベルを示すＯＤ_６２０（バックグラウンド補正された）を示す。データは、Ｃｐｄ．あたり４つの複製物の平均についての平均±標準誤差を表す。修飾を有するＣｐｄ．は黒色の棒として提示されており、非修飾のＣｐｄ．は点付きの棒として提示されている。

【図5A】修飾されたまたは非修飾の化合物（Ｃｐｄ．３、Ｃｐｄ．１３、およびＣｐｄ．１４；０．６μｇ／ウェル）を用いたトランスフェクションによる、ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ｈＴＬＲ３細胞におけるＮＦ－κＢおよびＡＰ－１シグナル伝達経路の活性化に関するプロットである。トランスフェクトされていない試料を、バックグラウンド（ＢＧ）コントロールとして使用した。ポリ（Ｉ：Ｃ）ＨＭＷをポジティブコントロールとして使用した。Ｘ軸は、ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ｈＴＬＲ３細胞を刺激するために使用された種々のコンストラクト試料を示し、Ｙ軸は、ＮＦ－κＢ／ＡＰ１経路の活性化レベルを示すＯＤ_６２０（ＢＧ補正された）を示す。データは、Ｃｐｄ．あたり８つの複製物の平均についての平均±標準誤差を表す。修飾を有するＣｐｄ．は黒色の棒として提示されており、非修飾のＣｐｄ．は点付きの棒として提示されている。ｓｉＲＮＡの存在または非存在との関連でのＴＬＲ３媒介性ＮＦ－κＢ／ＡＰ１活性化に関して、有意性（＊＊＊、＜０．００１）を、Ｃｐｄ．３非修飾対Ｃｐｄ．１３非修飾についてのスチューデントｔ検定によって査定した。ｓｉＲＮＡの存在または非存在との関連でのＴＬＲ３媒介性ＮＦ－κＢ／ＡＰ１活性化に関して、有意性（＊、＜０．０５）を、Ｃｐｄ．３非修飾対Ｃｐｄ．１４非修飾についてのスチューデントｔ検定によって査定した。

【図5B】修飾されたまたは非修飾の化合物（Ｃｐｄ．３、Ｃｐｄ．１３、およびＣｐｄ．１４；０．６μｇ／ウェル）を用いたトランスフェクションによる、ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ｈＴＬＲ８細胞におけるＮＦ－κＢ／ＡＰ－１およびＩＲＦ媒介性シグナル伝達経路の活性化に関するプロットである。トランスフェクトされていない試料を、バックグラウンド（ＢＧ）コントロールとして使用した。Ｒ８４８をポジティブコントロールとして使用した。Ｘ軸は、ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ｈＴＬＲ８細胞を刺激するために使用された種々のコンストラクト試料を示し、Ｙ軸は、ＮＦ－κＢ／ＡＰ１およびＩＲＦ経路の活性化レベルを示すＯＤ_６２０（ＢＧ補正された）を示す。データは、Ｃｐｄ．あたり８つの複製物の平均についての平均±標準誤差を表す。修飾を有するＣｐｄ．は黒色の棒として提示されており、非修飾のＣｐｄ．は点付きの棒として提示されている。ｓｉＲＮＡの存在または非存在との関連でのＴＬＲ８媒介性ＮＦ－κＢ／ＡＰ１／ＩＲＦ活性化に関して、有意性（＊＊＊、＜０．００１）を、Ｃｐｄ．３非修飾対Ｃｐｄ．１３非修飾についてのスチューデントｔ検定によって査定した。ｓｉＲＮＡの存在または非存在との関連でのＴＬＲ３媒介性ＮＦ－κＢ／ＡＰ１／ＩＲＦ活性化に関して、有意性（＊、＜０．０５）を、Ｃｐｄ．３非修飾対Ｃｐｄ．１４非修飾についてのスチューデントｔ検定によって査定した。

【図6A】２４時間後の、修飾されたまたは非修飾の化合物（Ｃｐｄ．３、Ｃｐｄ．４、Ｃｐｄ．１３、およびＣｐｄ．１４；０．３μｇ／ウェル）のトランスフェクションに対する免疫応答としての、ヒト白色人種肺癌（Ａ５４９）細胞におけるＩＬ－６発現に関するプロットである。Ｘ軸は、Ａ５４９細胞におけるＩＬ－６発現を刺激するために使用された種々のコンストラクト試料を示し、Ｙ軸は、ヒトＩＬ－６レベル（ｐｇ／ｍＬ）を示す。データは、Ｃｐｄ．あたり８つの複製物の平均についての平均±標準誤差を表す。修飾を有するＣｐｄ．は黒色の棒として提示されており、非修飾のＣｐｄ．は点付きの棒として提示されている。ｓｉＲＮＡの存在または非存在との関連での免疫応答としてのＩＬ－６発現に関して、有意性（＊＊＊、＜０．００１）を、Ｃｐｄ．３非修飾およびＣｐｄ．１３非修飾についてのスチューデントｔ検定によって査定した。ｓｉＲＮＡの存在または非存在との関連での免疫応答としてのＩＬ－６発現に関して、有意性（＊＊＊、＜０．００１）を、Ｃｐｄ．４非修飾およびＣｐｄ．１４非修飾についてのスチューデントｔ検定によって査定した。

【図6B】修飾されたまたは非修飾の化合物（Ｃｐｄ．３、Ｃｐｄ．４、Ｃｐｄ．１３、およびＣｐｄ．１４；０．３μｇ／ウェル）をトランスフェクトされているヒト白色人種肺癌（Ａ５４９）細胞に由来する等価容量（２０μｌ）の上清による、ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ヒトＩＬ－６レポーター細胞におけるＳＴＡＴ－３経路の活性化に関するプロットである。トランスフェクトされていないＡ５４９細胞の上清（２０μｌ）を、バックグラウンド（ＢＧ）コントロールとして使用した。組み換えＩＬ－６（１００ｎｇ／ｍＬ）をポジティブコントロールとして使用した。Ｘ軸は、ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ヒトＩＬ－６レポーター細胞を刺激するために使用された種々の試料を示し、Ｙ軸は、ＳＴＡＴ－３経路の活性化レベルを示すＯＤ_６２０（ＢＧ補正された）を示す。データは、Ｃｐｄ．あたり８つの複製物の平均についての平均±標準誤差を表す。修飾を有するＣｐｄ．は黒色の棒として提示されており、非修飾のＣｐｄ．は点付きの棒として提示されている。ｓｉＲＮＡの存在または非存在との関連でのＳＴＡＴ３経路活性化に関して、有意性（＊＊、＜０．０１）を、Ｃｐｄ．３非修飾およびＣｐｄ．１３非修飾についてのスチューデントｔ検定によって査定した。ｓｉＲＮＡの存在または非存在との関連でのＳＴＡＴ３経路活性化に関して、有意性（＊＊＊、＜０．００１）を、Ｃｐｄ．４非修飾およびＣｐｄ．１４非修飾についてのスチューデントｔ検定によって査定した。

【図7A】２４時間後の、修飾されたまたは非修飾の化合物（Ｃｐｄ．３、Ｃｐｄ．４、Ｃｐｄ．１３、およびＣｐｄ．１４；０．３μｇ／ウェル）のトランスフェクションに対する免疫応答としての、ヒト血液単球（ＴＨＰ－１）細胞におけるＩＬ－６発現に関するプロットである。Ｘ軸は、ＴＨＰ－１細胞におけるＩＬ－６発現を刺激するために使用された種々のコンストラクト試料を示し、Ｙ軸は、ヒトＩＬ－６レベル（ｐｇ／ｍＬ）を示す。データは、Ｃｐｄ．あたり８つの複製物の平均についての平均±標準誤差を表す。修飾を有するＣｐｄ．は黒色の棒として提示されており、非修飾のＣｐｄ．は点付きの棒として提示されている。ｓｉＲＮＡの存在または非存在との関連での免疫応答としてのＩＬ－６発現に関して、有意性（＊＊＊、＜０．００１）を、Ｃｐｄ．３非修飾およびＣｐｄ．１３非修飾についてのスチューデントｔ検定によって査定した。ｓｉＲＮＡの存在または非存在との関連での免疫応答としてのＩＬ－６発現に関して、有意性（＊＊＊、＜０．００１）を、Ｃｐｄ．４非修飾およびＣｐｄ．１４非修飾についてのスチューデントｔ検定によって査定した。

【図7B】修飾されたまたは非修飾の化合物（Ｃｐｄ．３、Ｃｐｄ．４、Ｃｐｄ．１３、およびＣｐｄ．１４；０．３μｇ／ウェル）を逆トランスフェクトされているヒト血液単球（ＴＨＰ－１）細胞に由来する等価容量（２０μｌ）の上清による、ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ヒトＩＬ－６レポーター細胞におけるＳＴＡＴ－３経路の活性化に関するプロットである。トランスフェクトされていないＴＨＰ１細胞の上清を、バックグラウンド（ＢＧ）コントロールとして使用した。組み換えＩＬ－６（１００ｎｇ／ｍＬ）をポジティブコントロールとして使用した。Ｘ軸は、ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ヒトＩＬ－６レポーター細胞を刺激するために使用された種々の試料を示し、Ｙ軸は、ＳＴＡＴ－３経路の活性化レベルを示すＯＤ_６２０（ＢＧ補正された）を示す。データは、Ｃｐｄ．あたり８つの複製物の平均についての平均±標準誤差を表す。修飾を有するＣｐｄ．は黒色の棒として提示されており、非修飾のＣｐｄ．は点付きの棒として提示されている。ｓｉＲＮＡの存在または非存在との関連でのＳＴＡＴ３経路活性化に関して、有意性（＊＊＊、＜０．００１）を、Ｃｐｄ．３非修飾およびＣｐｄ．１３非修飾についてのスチューデントｔ検定によって査定した。ｓｉＲＮＡの存在または非存在との関連でのＳＴＡＴ３経路活性化に関して、有意性（＊＊＊、＜０．００１）を、Ｃｐｄ．４非修飾およびＣｐｄ．１４非修飾についてのスチューデントｔ検定によって査定した。

【発明を実施するための形態】

【0022】

詳細な説明
関心のある遺伝子をコードする少なくとも１種の核酸配列と、それぞれが、標的ＲＮＡの発現をモジュレートする遺伝子エレメントをコードするまたは含む少なくとも２種の核酸配列とを含む組み換えポリ核酸またはＲＮＡコンストラクトを含む、２種以上の遺伝子の発現をモジュレートするための組成物および方法が本明細書において提供される。本明細書に記載される組み換えポリ核酸またはＲＮＡコンストラクトを含む組成物と接触した１つまたは複数の細胞は、低下したレベルの自然免疫活性およびより低い免疫応答を有し得、１つまたは複数の細胞において２種以上の遺伝子の発現をモジュレートする効力を増加させ得る。

【0023】

本明細書において提供される組み換えポリ核酸またはＲＮＡコンストラクト組成物は、１種または複数のリンカーをさらに含み得る。１つの場合には、組み換えポリ核酸またはＲＮＡコンストラクトは、１種または複数の標的ＲＮＡの発現をモジュレートする少なくとも２種の遺伝子エレメントをコードするまたは含む核酸配列、および１種または複数のリンカーを含み得、リンカーは、１種または複数の標的ＲＮＡの発現をモジュレートする少なくとも２種の遺伝子エレメントのそれぞれの間に存在し得る。別の場合には、組み換えポリ核酸またはＲＮＡコンストラクトは、関心のある１種または複数の遺伝子をコードする核酸配列、および１種または複数のリンカーを含み得、リンカーは、関心のある１種または複数の遺伝子のそれぞれの間に存在し得る。一部の場合には、組み換えポリ核酸またはＲＮＡコンストラクトは、関心のある１種または複数の遺伝子をコードする核酸配列、１種または複数の標的ＲＮＡの発現をモジュレートする少なくとも２種の遺伝子エレメントをコードするまたは含む核酸配列、および１種または複数のリンカーを含み得、リンカーは、関心のある１種もしくは複数の遺伝子をコードする核酸配列と、１種もしくは複数の標的ＲＮＡの発現をモジュレートする少なくとも２種の遺伝子エレメントをコードするもしくは含む核酸配列との間、１種もしくは複数の標的ＲＮＡの発現をモジュレートする少なくとも２種の遺伝子エレメントのそれぞれの間、および／または関心のある１種もしくは複数の遺伝子のそれぞれの間に存在し得る。一部の実施形態において、本明細書に記載される組み換えポリ核酸またはＲＮＡコンストラクトは、１種または複数の標的ＲＮＡの発現をモジュレートする少なくとも３種の遺伝子エレメントを含み得る。一部の実施形態において、本明細書に記載される組み換えポリ核酸またはＲＮＡコンストラクトは、１種または複数の標的ＲＮＡの発現をモジュレートする少なくとも６種の遺伝子エレメントを含み得る。

【0024】

本明細書に記載される組み換えポリ核酸コンストラクトを含む、または本明細書に記載される組み換えＲＮＡコンストラクトをコードするベクターも本明細書において提供される。本明細書に記載される組み換えポリ核酸またはＲＮＡコンストラクト組成物またはベクターを含む細胞が本明細書において提供される。本明細書に記載される組み換えポリ核酸またはＲＮＡコンストラクト組成物は、薬学的組成物に製剤化され得る。並行して２種以上の遺伝子の発現をモジュレートする組成物および方法が本明細書においてさらに提供される。

【0025】

本明細書に記載される組成物または薬学的組成物をそれを必要とする対象に投与することを含む、疾患または病状を治療するための組成物および方法が本明細書において提供される。本明細書において提供される組み換えポリ核酸またはＲＮＡコンストラクト組成物は、第１のＲＮＡ配列および第２のＲＮＡ配列を含み得る。１つの例では、第１のＲＮＡ配列または第２のＲＮＡ配列は、１種または複数のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を含み得、ｍＲＮＡによってコードされるタンパク質のレベルを増加させ得る。別の例では、第１のＲＮＡ配列または第２のＲＮＡ配列は、標的ＲＮＡの発現をモジュレートする遺伝子エレメントであり得る。例えば、第１のＲＮＡ配列または第２のＲＮＡ配列は、１種または複数の標的ＲＮＡに結合し得る低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を含み得、標的ＲＮＡによってコードされるタンパク質のレベルを下方調節し得る。例えば、ｍＲＮＡおよび標的ＲＮＡは、本明細書に記載される遺伝子関連疾患および病状のものであり得る。

【0026】

別途定義されない限り、本明細書において使用されるすべての技術的および科学的用語は、本開示が属する技術分野における当業者によって共通して理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと同様のまたは等価の方法および材料が、本開示の実践または試験において使用され得るものの、適切な方法および材料が下で記載される。

【0027】

定義
様々な実施形態の徹底的な理解を提供するために、本説明についてのある特定の具体的な詳細が明記される。しかしながら、当業者であれば、本開示はこれらの詳細なしで実施され得ることを理解するであろう。別の場合には、実施形態の説明を不必要に分かりにくくすることを回避するために、周知の構造は詳細に示されていないまたは記載されていない。文脈が別途要しない限り、本明細書および後に続く特許請求の範囲を通して、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という単語、ならびに「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」等のその変形は、開かれた内包的な意味で、つまり「含むがそれらに限定されない」として捉えられるべきである。さらに、本明細書において提供される見出しは、単なる便宜上のものであり、主張される開示の範囲または意味を解釈するわけではない。

【0028】

本明細書および添付の特許請求の範囲において使用されるとき、「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」という単数形は、文脈が別途はっきりと述べていない限り、複数形の指示対象を含む。「または」という用語は、文脈が別途はっきりと述べていない限り、「および／または」を含むその意味で一般的に採用されることにも留意すべきである。本明細書において使用される「および／または」および「その任意の組み合わせ」という用語、ならびにそれらの文法的等価物は、互換可能に使用され得る。これらの用語は、任意の組み合わせが具体的に企図されることを伝え得る。例示的な目的のためだけに、以下の語句「Ａ、Ｂ、および／またはＣ」または「Ａ、Ｂ、Ｃ、またはその任意の組み合わせ」は、「個々にＡ；個々にＢ；個々にＣ；ＡおよびＢ；ＢおよびＣ；ＡおよびＣ；ならびにＡ、Ｂ、およびＣ」を意味し得る。「または」という用語は、文脈が離接的使用に具体的に言及しない限り、接続的にまたは離接的に使用され得る。

【0029】

「約」または「およそ」という用語は、当業者によって判定される特定の値に対して許容される誤差域内にあることを意味し得、それは、値がどのように測定されたまたは判定されたか、すなわち測定システムの限界に部分的に依存するであろう。例えば、「約」は、当技術分野における実践につき、１以内または１より大きい標準偏差を意味し得る。代替的に、「約」は、所与の値の最高２０％まで、最高１０％まで、最高５％まで、または最高１％までの域を意味し得る。代替的に、特に生物学的システムまたは過程に関して、該用語は、値の１桁以内、５倍以内、または２倍以内にあることを意味し得る。本出願および特許請求の範囲において特定の値が記載される場合、別途指定のない限り、特定の値に対して許容される誤差域内にあることを意味する「約」という用語が仮定されるべきである。

【0030】

本明細書および特許請求の範囲において使用されるとき、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」（ならびに、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」等、含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）の任意の形態）、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」（ならびに、「有する（ｈａｖｅ）」および「有する（ｈａｓ）」等、有する（ｈａｖｉｎｇ）の任意の形態）、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」（ならびに、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」および「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」等、含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）の任意の形態）、または「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」（ならびに、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」および「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」等、含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）の任意の形態）という単語は、内包的でありまたは非制約的であり、付加的な挙げられていない要素または方法工程を除外するわけではない。本明細書において論じられる任意の実施形態は、本開示の任意の方法または組成物に関して実行され得、逆もまた同様であることが企図される。さらに、本開示の組成物を使用して、本開示の方法を達成し得る。

【0031】

本明細書における「実施形態」、「ある特定の実施形態」、「好ましい実施形態」、「具体的な実施形態」、「一部の実施形態」、「一実施形態」、「１つの実施形態」、または「他の実施形態」への言及は、実施形態に関連して記載される特定の特質、構造、または特徴が、本開示の少なくとも一部の実施形態に含まれるが、必ずしもすべての実施形態に含まれるわけではないことを意味する。本開示についての理解を促すために、いくつかの用語および語句が下で定義される。

【0032】

本明細書において使用される「ＲＮＡ」という用語は、アミノ酸配列をコードするＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ等）、ならびにアミノ酸配列をコードしないＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ等）を含む。本明細書において使用されるＲＮＡは、コードＲＮＡ、すなわちアミノ酸配列をコードするＲＮＡであり得る。そのようなＲＮＡ分子は、ｍＲＮＡ（メッセンジャーＲＮＡ）とも称され、一本鎖ＲＮＡ分子である。本明細書において使用されるＲＮＡは、ノンコーディングＲＮＡ、すなわちアミノ酸配列をコードしないまたはタンパク質に翻訳されないＲＮＡであり得る。ノンコーディングＲＮＡは、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、短いまたは低分子ハーピン（ｈａｒｐｉｎ）ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ｐｉｗｉ相互作用ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）、および長いノンコーディングＲＮＡ（ＩｎｃＲＮＡ）を含み得るが、それらに限定されるわけではない。本明細書において使用されるｓｉＲＮＡは、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）領域、ヘアピン構造、ループ構造、またはその任意の組み合わせを含み得る。一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、少なくとも１つのｓｈＲＮＡ、少なくとも１つのｄｓＲＮＡ領域、または少なくとも１つのループ構造を含み得る。一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、ｄｓＲＮＡまたはｓｈＲＮＡからプロセシングされ得る。一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、ｓｈＲＮＡから、ＤＩＣＥＲ等の内因性タンパク質によってプロセシングされ得るまたは切断され得る。一部の実施形態において、ヘアピン構造またはループ構造は、ｓｉＲＮＡから切断され得るまたは除去され得る。例えば、ｓｈＲＮＡのヘアピン構造またはループ構造は、切断され得るまたは除去され得る。一部の実施形態において、本明細書に記載されるＲＮＡは、当業者に公知の合成的、化学的、もしくは酵素的方法論によって作製され得る、当業者に公知の組み換え技術によって作製され得る、または天然供給源から単離され得る、あるいはその任意の組み合わせによって作製され得る。ＲＮＡは、修飾されたもしくは非修飾のヌクレオチド、またはその混合物を含み得、例えばＲＮＡは、当技術分野において公知の化学的なおよび天然に存在するヌクレオシド修飾（例えば、本明細書においてメチルシュードウリジンとも称されるＮ^１－メチルシュードウリジン）を任意選択で含み得る。

【0033】

「核酸配列」、「ポリ核酸配列」、および「ヌクレオチド配列」という用語は、本明細書において互換可能に使用され、本明細書において同一の意味を有し、ＤＮＡまたはＲＮＡを指す。一部の実施形態において、核酸配列は、糖／ホスフェート骨格のホスホジエステル結合によって互いに共有結合的に連結されているヌクレオチド単量体を含むまたはそれからなるポリマーである。「核酸配列」、「ポリ核酸配列」、および「ヌクレオチド配列」という用語は、非修飾の核酸配列を包含し得、すなわち非修飾のヌクレオチドまたは天然のヌクレオチドを含む。「核酸配列」、「ポリ核酸配列」、および「ヌクレオチド配列」という用語は、塩基修飾された、糖修飾された、または骨格修飾された等のＤＮＡまたはＲＮＡ等、修飾された核酸配列も包含し得る。

【0034】

「天然のヌクレオチド」および「標準ヌクレオチド」という用語は、本明細書において互換可能に使用され、本明細書において同一の意味を有し、天然に存在するヌクレオチド塩基のアデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、ウラシル（Ｕ）、チミン（Ｔ）を指す。

【0035】

「非修飾のヌクレオチド」という用語は、天然に修飾されない、例えばｉｎ ｖｉｖｏでエピジェネティックにまたは翻訳後に修飾されない、天然のヌクレオチドを指すために本明細書において使用される。好ましくは、「非修飾のヌクレオチド」という用語は、天然に修飾されず、例えばｉｎ ｖｉｖｏでエピジェネティックにまたは翻訳後に修飾されず、化学修飾されない、例えばｉｎ ｖｉｔｒｏで化学修飾されない、天然のヌクレオチドを指すために本明細書において使用される。

【0036】

「修飾されたヌクレオチド」という用語は、エピジェネティックにまたは翻訳後に修飾されたヌクレオチド等の天然に修飾されたヌクレオチド、および化学修飾されたヌクレオチド、例えばｉｎ ｖｉｔｒｏで化学修飾されるヌクレオチドを指すために本明細書において使用される。

【0037】

組み換えＲＮＡコンストラクト
関心のある遺伝子をコードする少なくとも１種の核酸配列と、および／またはそれぞれが、標的ＲＮＡの発現をモジュレートする遺伝子エレメントを含む少なくとも２種の核酸配列とを含む組み換えＲＮＡコンストラクトを含む組成物が本明細書において提供される。一部の場合には、１種または複数の標的ＲＮＡの発現をモジュレートする遺伝子エレメント、例えばｓｉＲＮＡは、センスｓｉＲＮＡ鎖およびアンチセンスｓｉＲＮＡ鎖を含む核酸配列を含み得る。例えば、一部の場合には、組み換えＲＮＡコンストラクトは、１種または複数の標的ＲＮＡの発現をモジュレートする少なくとも１種の遺伝子エレメント、例えばｓｉＲＮＡのセンス鎖を含む核酸配列およびｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖を含む核酸配列等、少なくとも１種のｓｉＲＮＡを含み得る。本明細書に記載される１種または複数の標的ＲＮＡの発現をモジュレートする１種の遺伝子エレメント、例えば１種のｓｉＲＮＡとは、１種のセンス鎖ｓｉＲＮＡおよび１種のアンチセンス鎖ｓｉＲＮＡを指し得る。一部の場合には、組み換えＲＮＡコンストラクトは、１種または複数の標的ＲＮＡの発現をモジュレートする少なくとも２種の遺伝子エレメント、例えば少なくとも２種のｓｉＲＮＡを含み得る。例えば、組み換えＲＮＡコンストラクトは、１種または複数の標的ＲＮＡの発現をモジュレートする２、３、４、５、６、７、８、９、１０種、またはそれより多くの遺伝子エレメント、例えばｓｉＲＮＡのセンス鎖およびｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖を含む２、３、４、５、６、７、８、９、１０種、またはそれより多くのｓｉＲＮＡを含み得る。一部の実施形態において、組み換えＲＮＡコンストラクトは、１種または複数の標的ＲＮＡの発現をモジュレートする１～２０種の遺伝子エレメント、例えば１～２０種のｓｉＲＮＡを含み得る。一部の実施形態において、組み換えＲＮＡコンストラクトは、１種または複数の標的ＲＮＡの発現をモジュレートする少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９種、または少なくとも１０種の遺伝子エレメント、例えば少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９種、または少なくとも１０種のｓｉＲＮＡを含み得る。一部の実施形態において、組み換えＲＮＡコンストラクトは、１種または複数の標的ＲＮＡの発現をモジュレートする多くとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９種、または多くとも２０種の遺伝子エレメント、例えば多くとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９種、または多くとも２０種のｓｉＲＮＡを含み得る。一部の実施形態において、組み換えＲＮＡコンストラクトは、１種または複数の標的ＲＮＡの発現をモジュレートする多くとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９種、または多くとも２０種の遺伝子エレメント、例えば多くとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９種、または多くとも２０種のｓｉＲＮＡを含み得る。

【0038】

一部の実施形態において、組み換えＲＮＡコンストラクトは、１種または複数の標的ＲＮＡの発現をモジュレートする２種の遺伝子エレメント～１種または複数の標的ＲＮＡの発現をモジュレートする１０種の遺伝子エレメント、１種または複数の標的ＲＮＡの発現をモジュレートする３種の遺伝子エレメント～１種または複数の標的ＲＮＡの発現をモジュレートする１０種の遺伝子エレメント、１種または複数の標的ＲＮＡの発現をモジュレートする４種の遺伝子エレメント～１種または複数の標的ＲＮＡの発現をモジュレートする１０種の遺伝子エレメント、１種または複数の標的ＲＮＡの発現をモジュレートする５種の遺伝子エレメント～１種または複数の標的ＲＮＡの発現をモジュレートする１０種の遺伝子エレメント、１種または複数の標的ＲＮＡの発現をモジュレートする６種の遺伝子エレメント～１種または複数の標的ＲＮＡの発現をモジュレートする１０種の遺伝子エレメント、１種または複数の標的ＲＮＡの発現をモジュレートする７種の遺伝子エレメント～１種または複数の標的ＲＮＡの発現をモジュレートする１０種の遺伝子エレメント、１種または複数の標的ＲＮＡの発現をモジュレートする９種の遺伝子エレメント～１種または複数の標的ＲＮＡの発現をモジュレートする１０種の遺伝子エレメント、好ましくは、１種もしくは複数の標的ＲＮＡの発現をモジュレートする２種の遺伝子エレメント～１種もしくは複数の標的ＲＮＡの発現をモジュレートする６種の遺伝子エレメント、１種もしくは複数の標的ＲＮＡの発現をモジュレートする３種の遺伝子エレメント～１種もしくは複数の標的ＲＮＡの発現をモジュレートする６種の遺伝子エレメント、または１種もしくは複数の標的ＲＮＡの発現をモジュレートする４種の遺伝子エレメント～１種もしくは複数の標的ＲＮＡの発現をモジュレートする６種の遺伝子エレメントを含み得る。好ましい実施形態において、本明細書に記載される組み換えＲＮＡコンストラクトは、１種または複数の標的ＲＮＡの発現をモジュレートする少なくとも２種の遺伝子エレメントを含む。別の好ましい実施形態において、本明細書に記載される組み換えＲＮＡコンストラクトは、１種または複数の標的ＲＮＡの発現をモジュレートする少なくとも３種の遺伝子エレメントを含む。さらに別の好ましい実施形態において、本明細書に記載される組み換えＲＮＡコンストラクトは、１種または複数の標的ＲＮＡの発現をモジュレートする少なくとも６種の遺伝子エレメントを含む。例えば、組み換えＲＮＡコンストラクトは、２種のｓｉＲＮＡ～１０種のｓｉＲＮＡ、３種のｓｉＲＮＡ～１０種のｓｉＲＮＡ、４種のｓｉＲＮＡ～１０種のｓｉＲＮＡ、５種のｓｉＲＮＡ～１０種のｓｉＲＮＡ、６種のｓｉＲＮＡ～１０種のｓｉＲＮＡ、７種のｓｉＲＮＡ～１０種のｓｉＲＮＡ、９種のｓｉＲＮＡ～１０種のｓｉＲＮＡ、好ましくは、２種のｓｉＲＮＡ～６種のｓｉＲＮＡ、３種のｓｉＲＮＡ～６種のｓｉＲＮＡ、または４種のｓｉＲＮＡ～６種のｓｉＲＮＡを含み得る。好ましい実施形態において、本明細書に記載される組み換えＲＮＡコンストラクトは、少なくとも２種のｓｉＲＮＡを含む。別の好ましい実施形態において、本明細書に記載される組み換えＲＮＡコンストラクトは、少なくとも３種のｓｉＲＮＡを含む。さらに別の好ましい実施形態において、本明細書に記載される組み換えＲＮＡコンストラクトは、少なくとも６種のｓｉＲＮＡを含む。

【0039】

本明細書において提供される組み換えＲＮＡコンストラクト組成物は、１種または複数のリンカーをさらに含み得る。１つの場合には、組み換えＲＮＡコンストラクトは、１種または複数の標的ＲＮＡの発現をモジュレートする少なくとも２種の遺伝子エレメントを含む核酸配列、および１種または複数のリンカーを含み得、リンカーは、１種または複数の標的ＲＮＡの発現をモジュレートする少なくとも２種の遺伝子エレメントのそれぞれの間に存在し得る。別の場合には、組み換えＲＮＡコンストラクトは、関心のある１種または複数の遺伝子をコードする核酸配列、および１種または複数のリンカーを含み得、リンカーは、関心のある１種または複数の遺伝子のそれぞれの間に存在し得る。一部の場合には、組み換えＲＮＡコンストラクトは、関心のある１種または複数の遺伝子をコードする核酸配列、１種または複数の標的ＲＮＡの発現をモジュレートする少なくとも２種の遺伝子エレメントを含む核酸配列、および１種または複数のリンカーを含み得、リンカーは、関心のある１種もしくは複数の遺伝子をコードする核酸配列と、１種もしくは複数の標的ＲＮＡの発現をモジュレートする少なくとも２種の遺伝子エレメントを含む核酸配列との間；１種もしくは複数の標的ＲＮＡの発現をモジュレートする少なくとも２種の遺伝子エレメントのそれぞれの間；および／または関心のある１種もしくは複数の遺伝子のそれぞれの間に存在し得る。

【0040】

関心のある遺伝子をコードする少なくとも１種の核酸配列と、および／またはそれぞれが、標的ＲＮＡの発現をモジュレートする遺伝子エレメントを含む少なくとも２種の核酸配列とを含む組み換えＲＮＡコンストラクトを含む、２種以上の遺伝子の発現をモジュレートするための組成物が本明細書において提供される。関心のある遺伝子をコードする少なくとも１種の核酸配列と、および／またはそれぞれが、標的ＲＮＡの発現をモジュレートする遺伝子エレメントを含む少なくとも２種の核酸配列とを含む組み換えＲＮＡコンストラクトを含む、疾患または病状を治療するための組成物が本明細書においてさらに提供される。本明細書において提供される組み換えＲＮＡコンストラクト組成物は、第１のＲＮＡ配列および第２のＲＮＡ配列を含み得る。１つの例では、第１のＲＮＡ配列または第２のＲＮＡ配列は、１種または複数のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を含み得、ｍＲＮＡによってコードされるタンパク質のレベルを増加させ得る。別の例では、第１のＲＮＡ配列または第２のＲＮＡ配列は、標的ＲＮＡの発現をモジュレートする遺伝子エレメントであり得る。一部の実施形態において、標的ＲＮＡの発現をモジュレートする遺伝子エレメントは、１種または複数の標的ＲＮＡに結合し得る低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）であり得る。例えば、第１のＲＮＡ配列または第２のＲＮＡ配列は、１種または複数の標的ＲＮＡに結合し得るｓｉＲＮＡを含み得、標的ＲＮＡによってコードされるタンパク質のレベルを下方調節し得る。一部の場合には、標的ＲＮＡの発現をモジュレートする遺伝子エレメントは、関心のある遺伝子の発現を阻害しない。一部の場合には、ｍＲＮＡおよび標的ＲＮＡは、本明細書に記載される遺伝子関連疾患および病状のものであり得る。単一ＲＮＡ転写産物を使用して、並行して２種以上の遺伝子の発現をモジュレートする組成物および方法も本明細書において提供される。

【0041】

関心のある遺伝子と、ｓｉＲＮＡ等、別の遺伝子の発現を低下させる少なくとも２種の遺伝子エレメントとを含む組み換えポリ核酸またはＲＮＡコンストラクトであって、関心のある遺伝子、およびｓｉＲＮＡ等、別の遺伝子の発現を低下させる遺伝子エレメントは、図１に例示されるように５’から３’方向に、または３’から５’方向に連続的様式で存在し得る、組み換えポリ核酸またはＲＮＡコンストラクトが本明細書においてさらに提供される。１つの例では、図１に例示されるように、関心のある遺伝子（例えば、ＩＧＦ－１またはＩＬ－４）は、ｓｉＲＮＡ等、別の遺伝子の発現を低下させる遺伝子エレメントに対して５’またはその上流に存在し得、関心のある遺伝子は、リンカー（ｍＲＮＡからｓｉＲＮＡ／ｓｈＲＮＡへのリンカー、「スペーサー」とも称され得る）によってｓｉＲＮＡに連結され得る。別の例では、関心のある遺伝子は、ｓｉＲＮＡ等、別の遺伝子の発現を低下させる遺伝子エレメントに対して３’またはその下流に存在し得、ｓｉＲＮＡは、リンカー（ｓｉＲＮＡ／ｓｈＲＮＡからｍＲＮＡへのリンカー、「スペーサー」とも称され得る）によって関心のある遺伝子に連結され得る。本明細書において提供される組み換えポリ核酸またはＲＮＡコンストラクトは、１種より多くのｓｉＲＮＡを含み得、１種より多くのｓｉＲＮＡのそれぞれは、リンカー（ｓｉＲＮＡからｓｉＲＮＡへの、またはｓｈＲＮＡからｓｈＲＮＡへのリンカー）によって連結され得る。一部の実施形態において、ｍＲＮＡからｓｉＲＮＡへの（またはｓｉＲＮＡからｍＲＮＡへの）リンカーの配列、およびｓｉＲＮＡからｓｉＲＮＡへの（またはｓｈＲＮＡからｓｈＲＮＡへの）リンカーの配列は異なり得る。一部の実施形態において、ｍＲＮＡからｓｉＲＮＡ／ｓｈＲＮＡへの（またはｓｉＲＮＡ／ｓｈＲＮＡからｍＲＮＡへの）リンカーの配列、およびｓｉＲＮＡからｓｉＲＮＡへの（またはｓｈＲＮＡからｓｈＲＮＡへの）リンカーの配列は同じであり得る。本明細書において提供される組み換えポリ核酸またはＲＮＡコンストラクトは、関心のある１種より多くの遺伝子を含み得、関心のある１種より多くの遺伝子のそれぞれは、リンカー（ｍＲＮＡからｍＲＮＡへのリンカー）によって連結され得る。一部の場合には、関心のある遺伝子は、図１に示されるように、Ｎ末端にシグナルペプチド配列を含み得る。一部の場合には、関心のある遺伝子は、非修飾の（ＷＴ）シグナルペプチド配列または修飾されたシグナルペプチド配列を含み得る。本明細書において提供される組み換えポリ核酸コンストラクト（例えば、ＤＮＡコンストラクト）は、ＲＮＡポリメラーゼ結合のためのプロモーター配列も含み得る。例えば、ＤＮＡコンストラクトは、本明細書に記載されるＲＮＡコンストラクトを発現するために、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ結合のためのプロモーター配列を含み得る。例として、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ結合のためのＴ７プロモーターが図１に示される。一部の実施形態において、本明細書に記載されるＲＮＡコンストラクトは、プロモーター配列を含まなくてもよい。

【0042】

組み換えポリ核酸または組み換えＲＮＡとは、天然に存在せず、ｉｎ ｖｉｔｒｏで合成されるまたは操縦されるポリ核酸またはＲＮＡを指し得る。組み換えポリ核酸またはＲＮＡは、実験室において合成され得、酵素的制限消化、ライゲーション、クローニング、および／またはｉｎ ｖｉｔｒｏ転写等、ＤＮＡまたはＲＮＡの酵素的修飾を使用することによる組み換えＤＮＡまたはＲＮＡ技術を使用することによって調製され得る。組み換えポリ核酸は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで転写されてメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を産生し得、組み換えｍＲＮＡは単離され得、精製され得、細胞へのトランスフェクションに使用され得る。本明細書において使用される組み換えポリ核酸またはＲＮＡは、タンパク質、ポリペプチド、標的モチーフ、シグナルペプチド、および／または低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）等のノンコーディングＲＮＡをコードし得る。一部の実施形態において、適切な条件下で、組み換えポリ核酸またはＲＮＡは、細胞に組み入れられ得、細胞内で発現され得る。

【0043】

組み換えＲＮＡを含めた組み換えポリ核酸等の外因性核酸は、細胞に導入された場合に自然免疫応答を誘導し得る。外因性ＲＮＡは、細胞表面、エンドソーム、および細胞質の自然免疫受容体を含めた種々のタイプの自然免疫受容体によって認識され得る。エンドソーム自然免疫受容体は、ｔｏｌｌ様受容体３（ＴＬＲ３）、ＴＬＲ７、およびＴＬＲ８を含むが、それらに限定されるわけではない。細胞質自然免疫受容体の例は、レチノイン酸誘導性遺伝子１（ＲＩＧ１）、黒色腫分化関連遺伝子５（ＭＤＡ５）、ＮＯＤ様受容体、ピリンドメイン含有３（ＮＬＲＰ３）、ならびにヌクレオチド結合およびオリゴマー化ドメイン含有２（ＮＯＤ２）を含むが、それらに限定されるわけではない。ＴＬＲ３、ＲＩＧ１、およびＭＤＡ５は、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を認識し得、ＴＬＲ７およびＴＬＲ８は、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）およびＲＮＡ分解産物（例えば、ウリジンおよびグアノシン－ウリジンリッチな断片）を認識し得る。これらのＲＮＡ感知器（例えば、ＴＬＲ３、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＲＩＧ１、ＭＤＡ５、ＮＯＤ２等）は、インターフェロン制御因子（ＩＲＦ）媒介性シグナル伝達および核内因子κＢ（ＮＦ－κＢ）媒介性シグナル伝達を活性化して、Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ－α／β）および炎症促進性サイトカインの産生を増加させ得る、またはＮＬＲＰ３の場合には、インフラマソーム形成を開始し得、成熟のためにサイトカインをプロセシングする。そのため、より少ない自然免疫応答を誘導するポリ核酸およびＲＮＡ治療薬を開発することは、大いに興味深く重要である。本明細書に記載される組み換えポリ核酸または組み換えＲＮＡ組成物は、低下したレベルの自然免疫活性およびより低い免疫応答を有して、並行して２種以上の遺伝子をモジュレートする手段を提供し得る。

【0044】

関心のある少なくとも１種の遺伝子をコードする第１のＲＮＡ配列と、１種または複数の標的ＲＮＡの発現をモジュレートする少なくとも２種の遺伝子エレメントを含む第２のＲＮＡ配列とを含む組み換えＲＮＡコンストラクトを含む、２種以上の遺伝子の発現をモジュレートするための組成物および方法が本明細書において提供される。関心のある少なくとも１種の遺伝子をコードするＲＮＡ配列と、１種または複数の標的ＲＮＡの発現をモジュレートする少なくとも２種の遺伝子エレメントを含むＲＮＡ配列とを含む、本明細書に記載される組み換えＲＮＡコンストラクトは、関心のある少なくとも１種の遺伝子をコードするＲＮＡ配列と、１種または複数の標的ＲＮＡの発現をモジュレートする２種未満（例えば、０または１種）の遺伝子エレメントを含むＲＮＡ配列とを含む組み換えＲＮＡコンストラクトと比して、免疫応答を低下させるまたはより低いレベルの免疫応答を誘導することにおいて有利であり得る。例えば、細胞と本明細書に記載される組み換えＲＮＡコンストラクトとを接触させることは、関心のある遺伝子をコードする第１のＲＮＡ配列と、標的ＲＮＡの発現をモジュレートする多くとも１種の遺伝子エレメントを含む相当する第２のＲＮＡ配列とを含む相当する組み換えＲＮＡコンストラクトと接触した細胞の免疫応答よりも低い免疫応答をもたらし得る。一部の実施形態において、相当する組み換えＲＮＡコンストラクトは、標的ＲＮＡの発現をモジュレートする１種の遺伝子エレメントを含む第２のＲＮＡ配列を含み得る。一部の実施形態において、相当する組み換えＲＮＡコンストラクトは、標的ＲＮＡの発現をモジュレートするいかなる遺伝子エレメントも含まない第２のＲＮＡ配列を含み得る。一部の実施形態において、１つまたは複数の細胞は、ヒト起源のものである。

【0045】

本明細書に記載される免疫応答は、当技術分野において公知の任意の方法によって測定され得る。１つの例では、免疫応答は、サイトカインの分泌、ＤＣ活性化マーカーの発現、または適応免疫応答に対するアジュバントとして作用する能力を測定することによって査定され得る。別の例では、免疫応答は、当技術分野において公知の任意のキット、例えば市販のキットを使用して測定され得る。免疫応答を測定するための方法の詳細は、実施例に記載される。一部の実施形態において、本明細書に記載される免疫応答は、ヒト免疫応答である。一部の実施形態において、免疫応答は、ヒトＴＬＲ７免疫応答、ヒトＴＬＲ３免疫応答、もしくはＩＦＮα／β免疫応答、またはその任意の組み合わせである。一部の実施形態において、本明細書に記載される免疫応答は、ヒト免疫応答である。一部の実施形態において、免疫応答は、ヒトＴＬＲ７免疫応答、もしくはＩＦＮα／β免疫応答、またはその任意の組み合わせである。

【0046】

ヒトＴＬＲ７免疫応答は、ヒトＴＬＲ７免疫原性アッセイを使用することによって測定され得る。一部の実施形態において、ヒトＴＬＲ７免疫原性アッセイは、ヒトＴＬＲ７遺伝子およびレポーター遺伝子を発現するように操作されているＨＥＫ２９３細胞において実施され得る。一部の実施形態において、レポーター遺伝子は、分泌型レポーター遺伝子であり得る。例えば、分泌型レポーター遺伝子は、分泌型胚性アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）を含み得るが、それに限定されるわけではない。一部の実施形態において、レポーター遺伝子は、１つまたは複数のＮＦ－κＢおよび／または活性化因子タンパク質１（ＡＰ１）結合部位を有するプロモーターの制御下にあり得る。一部の実施形態において、プロモーターはＩＦＮ－β最小プロモーターである。一部の実施形態において、ヒトＴＬＲ７免疫原性アッセイは、ＮＦ－κＢおよび／またはＡＰ１の活性化を測定し得る。

【0047】

ヒトＴＬＲ３免疫応答は、ヒトＴＬＲ３免疫原性アッセイを使用することによって測定され得る。一部の実施形態において、ヒトＴＬＲ３免疫原性アッセイは、ヒトＴＬＲ３遺伝子およびレポーター遺伝子を発現するように操作されているＨＥＫ２９３細胞において実施され得る。一部の実施形態において、レポーター遺伝子は、分泌型レポーター遺伝子であり得る。例えば、分泌型レポーター遺伝子は、分泌型胚性アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）を含み得るが、それに限定されるわけではない。一部の実施形態において、レポーター遺伝子は、１つまたは複数のＮＦ－κＢおよび／またはＡＰ１結合部位を有するプロモーターの制御下にあり得る。一部の実施形態において、プロモーターはＩＦＮ－β最小プロモーターである。一部の実施形態において、ヒトＴＬＲ３免疫原性アッセイは、ＮＦ－κＢおよび／またはＡＰ１の活性化を測定し得る。

【0048】

ＩＦＮα／β免疫応答は、ＩＦＮα／β免疫原性アッセイを使用することによって測定され得る。一部の実施形態において、ＩＦＮα／β免疫原性アッセイは、ヒトシグナル伝達兼転写活性化因子２（ＳＴＡＴ２）遺伝子および／またはＩＲＦ９遺伝子ならびにレポーター遺伝子を発現するように操作されているＨＥＫ２９３細胞において実施され得る。一部の実施形態において、レポーター遺伝子は、分泌型レポーター遺伝子であり得る。例えば、分泌型レポーター遺伝子は、分泌型胚性アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）を含み得るが、それに限定されるわけではない。一部の実施形態において、レポーター遺伝子は、１つまたは複数のＳＴＡＴ２および／またはＩＲＦ９結合部位を有するプロモーターの制御下にあり得る。一部の実施形態において、プロモーターは、インターフェロン刺激遺伝子因子５４（ＩＳＧ５４）プロモーターである。一部の実施形態において、ＩＦＮα／β免疫原性アッセイは、ヤヌスキナーゼ（ＪＡＫ）－ＳＴＡＴおよび／またはＩＳＧ３の活性化を測定し得る。

【0049】

一部の実施形態において、ヒト細胞と本明細書に記載される組み換えＲＮＡコンストラクトとを接触させることは、本明細書に記載されるヒトＴＬＲ７免疫原性アッセイに従って、１種または複数の標的ＲＮＡの発現をモジュレートする多くとも１種の遺伝子エレメントを含む相当する組み換えＲＮＡコンストラクトと接触したヒト細胞の免疫応答よりも低い免疫応答をもたらし得る。一部の実施形態において、ヒト細胞と本明細書に記載される組み換えＲＮＡコンストラクトとを接触させることは、本明細書に記載されるヒトＴＬＲ３免疫原性アッセイに従って、１種または複数の標的ＲＮＡの発現をモジュレートする多くとも１種の遺伝子エレメントを含む相当する組み換えＲＮＡコンストラクトと接触したヒト細胞の免疫応答よりも低い免疫応答をもたらし得る。一部の実施形態において、ヒト細胞と本明細書に記載される組み換えＲＮＡコンストラクトとを接触させることは、本明細書に記載されるＩＦＮα／β免疫原性アッセイに従って、１種または複数の標的ＲＮＡの発現をモジュレートする多くとも１種の遺伝子エレメントを含む相当する組み換えＲＮＡコンストラクトと接触したヒト細胞の免疫応答よりも低い免疫応答をもたらし得る。一部の実施形態において、組み換えＲＮＡコンストラクトと接触したヒト細胞における免疫応答は、１種または複数の標的ＲＮＡの発現をモジュレートする多くとも１種の遺伝子エレメントを含む相当する組み換えＲＮＡコンストラクトと接触したヒト細胞における免疫応答よりも、少なくとも約１．１倍、約１．２倍、約１．３倍、約１．４倍、約１．５倍、約１．６倍、約１．７倍、約１．８倍、約１．９倍、約２．０倍、約２．１倍、約２．２倍、約２．３倍、約２．４倍、約２．５倍、約２．６倍、約２．７倍、約２．８倍、約２．９倍、約３．０倍、約３．１倍、約３．２倍、約３．３倍、約３．４倍、約３．５倍、約３．６倍、約３．７倍、約３．８倍、約３．９倍、約４．０倍、約４．１倍、約４．２倍、約４．３倍、約４．４倍、約４．５倍、約４．６倍、約４．７倍、約４．８倍、約４．９倍、約５．０倍、約１０倍、約１５倍、約２０倍、約２５倍、約３０倍、約３５倍、約４０倍、約４５倍、約５０倍、約５５倍、約６０倍、約６５倍、約７０倍、約７５倍、約８０倍、約８５倍、約９０倍、約９５倍、約１００倍、約１０５倍、約１１０倍、約１１５倍、約１２０倍、約１２５倍、約１３０倍、約１３５倍、約１４０倍、約１４５倍、または少なくとも約１５０倍低くあり得る。一部の実施形態において、組み換えＲＮＡコンストラクトと接触したヒト細胞における免疫応答は、１種または複数の標的ＲＮＡの発現をモジュレートする多くとも１種の遺伝子エレメントを含む相当する組み換えＲＮＡコンストラクトと接触したヒト細胞における免疫応答よりも、約１．１倍～約１０倍、約１．５倍～約１５倍、約２．０倍～約２０倍、約２．５倍～約２５倍、約３．０倍～約３０倍、約３．５倍～約３５倍、約４．０倍～約４０倍、約４．５倍～約４５倍、約５．０倍～約５０倍、約５．５倍～約５５倍、約６．０倍～約６０倍、約６．５倍～約６５倍、約７．０倍～約７０倍、約７．５倍～約７５倍、約８．０倍～約８０倍、約８．５倍～約８５倍、約９．０倍～約９０倍、約９．５倍～約９５倍、約１０倍～約１００倍、約１５倍～約１５０倍、約２０倍～約２００倍、約２５倍～約２５０倍、約３０倍～約３００倍、約３５倍～約３５０倍、約４０倍～約４００倍、約４５倍～約４５０倍、または約５０倍～約５００倍低くあり得る。一部の実施形態において、本明細書に記載される組み換えＲＮＡコンストラクトと接触したヒト細胞における免疫応答は、１種または複数の標的ＲＮＡの発現をモジュレートする多くとも１種の遺伝子エレメントを含む相当する組み換えＲＮＡコンストラクトと接触したヒト細胞における免疫応答と比較して、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または少なくとも９９．９％低下する。

【0050】

一部の場合には、本明細書に記載される組み換えＲＮＡコンストラクトは、本明細書に記載される任意の方法によって測定されるいかなる検出可能な免疫応答も誘発しない可能性がある。例えば、ヒト細胞と本明細書に記載される組み換えＲＮＡコンストラクトとを接触させることは、本明細書に記載される免疫原性アッセイ（例えば、ヒトＴＬＲ３免疫原性アッセイ、ヒトＴＬＲ７免疫原性アッセイ、またはＩＦＮα／β免疫原性アッセイ等）に従った実質的な免疫応答をもたらさない可能性がある。

【0051】

第１のＲＮＡ配列および第２のＲＮＡ配列を含む組み換えＲＮＡコンストラクトを含む組成物であって、第１のＲＮＡ配列および／または第２のＲＮＡ配列は、関心のある遺伝子、または標的ＲＮＡの発現をモジュレートする遺伝子エレメントをコードし得る、組成物が本明細書において提供される。１つの例では、第１のＲＮＡ配列または第２のＲＮＡ配列は、関心のある遺伝子をコードするｍＲＮＡであり得る。別の例では、第１のＲＮＡ配列または第２のＲＮＡ配列は、標的ＲＮＡに結合し得る低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）等、標的ＲＮＡの発現を低下させる遺伝子エレメントであり得る。一部の実施形態において、標的ＲＮＡに結合し得るｓｉＲＮＡは、関心のある遺伝子によってコードされるイントロン配列の一部ではない。一部の場合には、関心のある遺伝子は、ＲＮＡスプライシングなしで発現される。一部の場合には、標的ＲＮＡに結合し得るｓｉＲＮＡは、関心のある遺伝子のイントロン配列によってコードされないまたはそれから構成されない。一部の場合には、標的ＲＮＡに結合し得るｓｉＲＮＡは、標的ＲＮＡのエクソンに結合する。一部の場合には、標的ＲＮＡに結合し得るｓｉＲＮＡは、１種の標的ＲＮＡに特異的に結合する。

【0052】

本明細書において提供される組み換えＲＮＡコンストラクトは、複数コピーの関心のある遺伝子を含み得、複数コピーの関心のある遺伝子のそれぞれは、同じタンパク質をコードする。関心のある複数の遺伝子を含む組み換えＲＮＡコンストラクトを含む組成物であって、関心のある複数の遺伝子のそれぞれは、異なるタンパク質をコードする、組成物も本明細書において提供される。一部の実施形態において、本明細書において提供される組み換えＲＮＡコンストラクトは、同じタンパク質をコードする複数コピーの関心のある遺伝子と、そのそれぞれが、異なるタンパク質をコードする関心のある複数の遺伝子との組み合わせを含み得る。

【0053】

本明細書において提供される組み換えＲＮＡコンストラクトは、関心のある遺伝子をコードする１種より多くの核酸配列を含み得る。例えば、組み換えＲＮＡコンストラクトは、関心のある遺伝子をコードする２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５種、またはそれより多くの核酸配列を含み得る。一部の場合には、２種以上の核酸配列のそれぞれは、関心のある同じ遺伝子をコードし得、関心のある同じ遺伝子によってコードされるｍＲＮＡは、ｓｉＲＮＡ標的ｍＲＮＡとは異なる。一部の場合には、２種以上の核酸配列のそれぞれは、関心のある異なる遺伝子をコードし得、関心のある異なる遺伝子によってコードされるｍＲＮＡは、同じＲＮＡコンストラクトに含まれるｓｉＲＮＡの標的ではない。一部の場合には、組み換えＲＮＡコンストラクトは、関心のある遺伝子をコードする３種以上の核酸配列を含み得、３種以上の核酸配列のそれぞれは、関心のある同じ遺伝子または関心のある異なる遺伝子をコードし得、関心のある同じまたは異なる遺伝子によってコードされるｍＲＮＡは、同じＲＮＡコンストラクトに含まれるｓｉＲＮＡの標的ではない。例えば、組み換えＲＮＡコンストラクトは、関心のある遺伝子をコードする４種の核酸配列を含み得、４種の核酸配列のうちの３種は、関心のある同じ遺伝子をコードし、４種の核酸配列のうちの１種は、関心のある異なる遺伝子をコードし、関心のある同じまたは異なる遺伝子によってコードされるｍＲＮＡは、同じＲＮＡコンストラクトに含まれるｓｉＲＮＡの標的ではない。

【0054】

本明細書において提供される組み換えＲＮＡコンストラクトは、複数の種のｓｉＲＮＡを含み得、複数の種のｓｉＲＮＡのそれぞれは、同じ標的ＲＮＡに結合し得る。一部の実施形態において、複数の種のｓｉＲＮＡのそれぞれは、同じ標的ＲＮＡの同じ領域に結合し得る。一部の実施形態において、複数の種のｓｉＲＮＡのそれぞれは、同じ標的ＲＮＡの異なる領域に結合し得る。一部の実施形態において、複数の種のｓｉＲＮＡの一部は、同じ標的ＲＮＡに結合し得、複数の種のｓｉＲＮＡの一部は、同じ標的ＲＮＡの異なる領域に結合し得る。複数の種のｓｉＲＮＡを含む組み換えＲＮＡコンストラクトであって、複数の種のｓｉＲＮＡのそれぞれは、異なる標的ＲＮＡに結合し得る、組み換えＲＮＡコンストラクトも本明細書において提供される。一部の実施形態において、標的ＲＮＡはノンコーディングＲＮＡである。一部の実施形態において、標的ＲＮＡはメッセンジャー（ｍＲＮＡ）である。

【0055】

本明細書において提供される組み換えＲＮＡコンストラクトは、本明細書に記載される疾患または病状と関連した遺伝子のＲＮＡを標的にする少なくとも２種のｓｉＲＮＡを含み得る。例えば、本明細書において提供される組み換えＲＮＡコンストラクトは、同じＲＮＡまたは異なるＲＮＡを標的にする２～１０種のｓｉＲＮＡを含み得る。一部の場合には、同じＲＮＡを標的にする２～１０種のｓｉＲＮＡのそれぞれは、同じ配列を含み得る、すなわち２～１０種のｓｉＲＮＡのそれぞれは、標的ＲＮＡの同じ領域に結合する。一部の場合には、同じＲＮＡを標的にする２～１０種のｓｉＲＮＡのそれぞれは、異なる配列を含み得る、すなわち２～１０種のｓｉＲＮＡのそれぞれは、標的ＲＮＡの異なる領域に結合する。例えば、本明細書において提供される組み換えＲＮＡコンストラクトは、１種のＲＮＡを標的にする３種のｓｉＲＮＡを含み得、３種のｓｉＲＮＡのそれぞれは、ＲＮＡの同じ領域を標的にする同じ核酸配列を含む。この例では、３種のｓｉＲＮＡのそれぞれは、エクソン１を標的にする同じ核酸配列を含み得る。別の例では、３種のｓｉＲＮＡのそれぞれは、ＲＮＡの異なる領域を標的にする異なる核酸配列を含み得る。この例では、３種のｓｉＲＮＡのうちの１種は、エクソン１を標的にする核酸配列を含み得、３種のｓｉＲＮＡのうちの別の１種は、エクソン２を標的にする核酸配列を含み得る、等。さらに別の例では、３種のｓｉＲＮＡのそれぞれは、異なるＲＮＡを標的にする異なる核酸配列を含み得る。すべての態様において、本明細書において提供される組み換えＲＮＡコンストラクトにおけるｓｉＲＮＡは、同じＲＮＡコンストラクト組成物におけるｍＲＮＡによって発現される、関心のある遺伝子の発現に影響を及ぼし得ない。一部の実施形態において、本明細書において提供される組み換えＲＮＡコンストラクトは、１種または複数の標的ＲＮＡに結合し得る６種のｓｉＲＮＡを含み得る。一部の実施形態において、標的ＲＮＡはｍＲＮＡである。

【0056】

リンカーをさらに含み得る組み換えＲＮＡコンストラクトを含む組成物が本明細書において提供される。一部の場合には、本明細書に記載されるリンカーは、式（Ｉ）Ｘ_ｍＣＡＡＣＡＡＸ_ｎの構造［式中、Ｘは任意のヌクレオチドであり、ｍは１～１２の整数であり、ｎは０～４の整数である］を有し得る。一部の場合には、本明細書に記載されるリンカーは、式（ＩＩ）：Ｘ_ｐＴＣＣＣＸ_ｒの構造［式中、Ｘは任意のヌクレオチドであり、ｐは０～１７の整数であり、ｒは０～１３の整数である］を有し得る。１つの実施形態において、第１のＲＮＡ配列または第２のＲＮＡ配列は、１種または複数の標的ＲＮＡの発現をモジュレートする少なくとも２種の遺伝子エレメントを含み得、リンカーＲＮＡ配列は、１種または複数の標的ＲＮＡの発現をモジュレートする少なくとも２種の遺伝子エレメントのそれぞれを接続し得る（例えば、ｓｉＲＮＡからｓｉＲＮＡへのリンカー、またはｓｈＲＮＡからｓｈＲＮＡへのリンカー）。別の実施形態において、第１のＲＮＡ配列は、関心のある遺伝子をコードし得、第２のＲＮＡ配列は、１種または複数の標的ＲＮＡの発現をモジュレートする少なくとも２種の遺伝子エレメントを含み得、リンカーＲＮＡ配列は、関心のある遺伝子と、１種または複数の標的ＲＮＡの発現をモジュレートする少なくとも２種の遺伝子エレメントとを接続し得る（例えば、ｍＲＮＡからｓｉＲＮＡへのリンカー、ｓｉＲＮＡからｍＲＮＡへ、ｍＲＮＡからｓｈＲＮＡへのリンカー、またはｓｈＲＮＡからｍＲＮＡへのリンカー）。一部の実施形態において、ｍＲＮＡからｓｉＲＮＡ／ｓｈＲＮＡへの（またはｓｉＲＮＡ／ｓｈＲＮＡからｍＲＮＡへの）リンカーの配列、およびｓｉＲＮＡからｓｉＲＮＡへの（またはｓｈＲＮＡからｓｈＲＮＡへの）リンカーの配列は異なり得る。一部の実施形態において、ｍＲＮＡからｓｉＲＮＡ／ｓｈＲＮＡへの（またはｓｉＲＮＡ／ｓｈＲＮＡからｍＲＮＡへの）リンカーの配列、およびｓｉＲＮＡからｓｉＲＮＡへの（またはｓｈＲＮＡからｓｈＲＮＡへの）リンカーの配列は同じであり得る。一部の実施形態において、第１のＲＮＡ配列は、関心のある遺伝子をコードし得、第２のＲＮＡ配列は、１種または複数の標的ＲＮＡの発現をモジュレートする少なくとも２種の遺伝子エレメントを含み得、同じＲＮＡリンカー配列は、関心のある遺伝子と、１種または複数の標的ＲＮＡの発現をモジュレートする少なくとも２種の遺伝子エレメントとを（例えば、ｍＲＮＡからｓｉＲＮＡ／ｓｈＲＮＡへのリンカー、またはｓｉＲＮＡ／ｓｈＲＮＡからｍＲＮＡへのリンカー）、ならびに１種または複数の標的ＲＮＡの発現をモジュレートする少なくとも２種の遺伝子エレメントのそれぞれの間を（例えば、ｓｉＲＮＡ／ｓｈＲＮＡからｓｉＲＮＡ／ｓｈＲＮＡへのリンカー）を接続し得る。

【0057】

一部の実施形態において、リンカーの長さは、約４～約５０、約４～約４５、または約４～約４０、約４～約３５、または約４～約３０ヌクレオチドである。一部の実施形態において、リンカーの長さは、約４～約２７ヌクレオチドである。一部の実施形態において、リンカーの長さは、約４～約１８ヌクレオチドである。例えば、リンカーの長さは、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、約３０、約３１、約３２、約３３、約３４、約３５、約３６、約３７、約３８、約３９、約４０、約４１、約４２、約４３、約４４、約４５、約４６、約４７、約４８、約４９、または約５０ヌクレオチドである。一部の実施形態において、リンカーの長さは、多くとも約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、約３０、約３１、約３２、約３３、約３４、約３５、約３６、約３７、約３８、約３９、約４０、約４１、約４２、約４３、約４４、約４５、約４６、約４７、約４８、約４９、または多くとも約５０ヌクレオチドであり得る。一部の実施形態において、リンカーの長さは４ヌクレオチドである。一部の実施形態において、リンカーの長さは７ヌクレオチドである。一部の実施形態において、リンカーの長さは１１ヌクレオチドである。一部の実施形態において、リンカーの長さは１２ヌクレオチドである。一部の実施形態において、リンカーの長さは１８ヌクレオチドである。

【0058】

一部の場合には、本明細書に記載されるリンカーは、式（Ｉ）Ｘ_ｍＣＡＡＣＡＡＸ_ｎの構造［式中、Ｘは任意のヌクレオチドであり；ｍは１～１２の整数であり、ｎは０～４の整数であり；ｍは１であり、ｎは０である］を有し得る。一部の場合には、本明細書に記載されるリンカーは、ＣＡＡＣＡＡ（配列番号９１）、ＴＣＣＣ（配列番号８９）、またはＡＣＡＡＣＡＡ（配列番号８５）を含む配列を含み得る。一部の実施形態において、リンカーは、ＡＴＣＣＣＴＡＣＧＴＡＣＣＡＡＣＡＡ（配列番号８７）、ＡＣＧＴＡＣＣＡＡＣＡＡ（配列番号８８）、ＴＣＣＣ（配列番号８９）、ＡＣＡＡＣＡＡＴＣＣＣ（配列番号９０）、およびＡＣＡＡＣＡＡ（配列番号８５）からなる群から選択される配列を含み得る。一部の実施形態において、リンカーは、ＡＣＡＡＣＡＡ（配列番号８５）、ＡＴＡＧＴＧＡＧＴＣＧＴＡＴＴＡＴＣＣＣ（配列番号９２）、ＡＴＡＧＴＧＡＧＴＣＧＴＡＴＴＡＡＣＡＡＣＡＡＴＣＣＣ（配列番号９３）、ＡＴＡＧＴＧＡＧＴＣＧＴＡＴＴＡＡＣＡＡＣＡＡ（配列番号９４）、ＡＴＡＧＴＧＡＧＴＣＧＴＡＴＴＡＡＴＣＣＣＴＡＣＧＴＡＣＣＡＡＣＡＡ（配列番号９５）、またはＡＴＡＧＴＧＡＧＴＣＧＴＡＴＴＡＡＣＧＴＡＣＣＡＡＣＡＡ（配列番号２７）を含む配列を含み得る。一部の実施形態において、リンカーは、ＡＣＡＡＣＡＡ（配列番号８５）を含む配列を含み得る。一部の実施形態において、本明細書に記載されるリンカーは、配列番号２７、２８、８５～９５からなる群から選択される配列を含み得る。一部の実施形態において、本明細書に記載されるリンカーは、ＴＴＴＡＴＣＴＴＡＧＡＧＧＣＡＴＡＴＣＣＣＴＡＣＧＴＡＣＣＡＡＣＡＡ（配列番号２８）を含む配列を含まなくてもよい。一部の実施形態において、本明細書に記載されるリンカーは、ＡＴＡＧＴＧＡＧＴＣＧＴＡＴＴＡＡＣＧＴＡＣＣＡＡＣＡＡ（配列番号２７）を含む配列を含まなくてもよい。一部の実施形態において、本明細書に記載されるリンカーは、ＴＴＴＡＴＣＴＴＡＧＡＧＧＣＡＴＡＴＣＣＣＴＡＣＧＴＡＣＣＡＡＣＡＡ（配列番号２８）またはＡＴＡＧＴＧＡＧＴＣＧＴＡＴＴＡＡＣＧＴＡＣＣＡＡＣＡＡ（配列番号２７）を含まない。

【0059】

一部の場合には、ｔＲＮＡリンカーが使用され得る。ｔＲＮＡシステムは、生存生物にわたって進化的に保存され、内因性のＲＮａｓｅ ＰおよびＺを利用して、マルチシストロン性コンストラクトをプロセシングする（Ｄｏｎｇら、２０１６）。一部の場合には、本明細書に記載されるｔＲＮＡリンカーは、ＡＡＣＡＡＡＧＣＡＣＣＡＧＴＧＧＴＣＴＡＧＴＧＧＴＡＧＡＡＴＡＧＴＡＣＣＣＴＧＣＣＡＣＧＧＴＡＣＡＧＡＣＣＣＧＧＧＴＴＣＧＡＴＴＣＣＣＧＧＣＴＧＧＴＧＣＡ（配列番号９６）を含む核酸配列を含み得る。一部の場合には、ＡＴＡＧＴＧＡＧＴＣＧＴＡＴＴＡＡＣＧＴＡＣＣＡＡＣＡＡ（配列番号２７）を含む核酸配列を含むリンカーを使用して、第１のＲＮＡ配列と第２のＲＮＡ配列とを連結し得る。一部の実施形態において、ＴＴＴＡＴＣＴＴＡＧＡＧＧＣＡＴＡＴＣＣＣＴＡＣＧＴＡＣＣＡＡＣＡＡ（配列番号２８）を含む核酸配列を含むリンカーを使用して、１～２０種またはそれより多くのｓｉＲＮＡ種のそれぞれを接続し得る。

【0060】

一部の場合には、本明細書に記載されるリンカーは、二次構造を形成しなくてもよい。例えば、本明細書に記載されるリンカーは、本明細書において提供される組み換えＲＮＡコンストラクトの核酸配列に結合しなくてもよいまたは塩基対合しなくてもよい。一部の実施形態において、本明細書に記載されるインカー（ｉｎｋｅｒ）ＲＮＡ配列は、ＲＮＡｆｏｌｄウェブサーバーに従った二次構造を形成しない。一部の実施形態において、本明細書に記載されるｓｉＲＮＡ配列は、ＲＮＡｆｏｌｄウェブサーバーに従った二次構造を形成し得る。

【0061】

１～２０種またはそれより多くのｓｉＲＮＡ種を含む組み換えＲＮＡコンストラクト組成物であって、１～２０種またはそれより多くのｓｉＲＮＡ種のそれぞれは、式（Ｉ）：Ｘ_ｍＣＡＡＣＡＡＸ_ｎ［式中、Ｘは任意のヌクレオチドであり、ｍは１～１２の整数であり、ｎは０～４の整数である］；および式（ＩＩ）：Ｘ_ｐＴＣＣＣＸ_ｒ［式中、Ｘは任意のヌクレオチドであり、ｐは０～１７の整数であり、ｒは０～１３の整数である］からなる群から選択される構造を有するリンカーによって接続される、組み換えＲＮＡコンストラクト組成物が本明細書においてさらに提供される。

【0062】

一部の場合には、本明細書において提供される組み換えＲＮＡコンストラクトは切断され得る。例えば、本明細書において提供される組み換えＲＮＡコンストラクトは、細胞取り込みの後に内因的に切断され得る。一部の実施形態において、組み換えＲＮＡコンストラクトは、細胞内タンパク質または内因性タンパク質によって切断され得る。一部の実施形態において、組み換えＲＮＡコンストラクトは、ＤＩＣＥＲ、例えば内因性ＤＩＣＥＲによって切断され得る。一部の実施形態において、第１のＲＮＡ配列、第２のＲＮＡ配列、およびリンカーＲＮＡ配列を含む組み換えＲＮＡコンストラクトであって、リンカーＲＮＡ配列が第１のＲＮＡ配列と第２のＲＮＡ配列とを連結する組み換えＲＮＡコンストラクトは、第１のＲＮＡ配列と第２のＲＮＡ配列との間で切断され得る。一部の実施形態において、本明細書において提供される組み換えＲＮＡコンストラクトは、第１のＲＮＡ配列、第２のＲＮＡ配列、およびリンカーを含む。この実施形態において、第１のＲＮＡ配列または第２のＲＮＡ配列は、１種または複数の標的ＲＮＡの発現をモジュレートする少なくとも２種の遺伝子エレメントを含み得、組み換えＲＮＡコンストラクトは、１種または複数の標的ＲＮＡの発現をモジュレートする少なくとも２種の遺伝子エレメントのそれぞれの間で切断され得る。別の実施形態において、第１のＲＮＡ配列は、関心のある遺伝子をコードし得、第２のＲＮＡ配列は、１種または複数の標的ＲＮＡの発現をモジュレートする少なくとも２種の遺伝子エレメントを含み得、組み換えＲＮＡコンストラクトは、関心のある遺伝子と、１種または複数の標的ＲＮＡの発現をモジュレートする少なくとも２種の遺伝子エレメントとの間で切断され得る。一部の実施形態において、第１のＲＮＡ配列は、関心のある遺伝子をコードし得、第２のＲＮＡ配列は、１種または複数の標的ＲＮＡの発現をモジュレートする少なくとも２種の遺伝子エレメントを含み得、組み換えＲＮＡコンストラクトは、関心のある遺伝子と、１種もしくは複数の標的ＲＮＡの発現をモジュレートする少なくとも２種の遺伝子エレメントとの間、および／または１種もしくは複数の標的ＲＮＡの発現をモジュレートする少なくとも２種の遺伝子エレメントのそれぞれの間で切断され得る。

【0063】

一部の場合には、組み換えＲＮＡコンストラクトの切断は、本明細書に記載されるリンカーを含まない相当するＲＮＡコンストラクトの切断と比較して増強される。例えば、第１のＲＮＡ配列、第２のＲＮＡ配列、および本明細書に記載されるリンカーの１種または複数を含む組み換えＲＮＡコンストラクトの切断は、本明細書に記載されるリンカーを含まないＲＮＡコンストラクトの切断と比較して増強される。例えば、第１のＲＮＡ配列、第２のＲＮＡ配列、および本明細書に記載されるリンカーＲＮＡ配列を含む組み換えＲＮＡコンストラクトの切断は、式（Ｉ）：Ｘ_ｍＣＡＡＣＡＡＸ_ｎ［式中、Ｘは任意のヌクレオチドであり、ｍは１～１２の整数であり、ｎは０～４の整数である］；および式（ＩＩ）：Ｘ_ｐＴＣＣＣＸ_ｒ［式中、Ｘは任意のヌクレオチドであり、ｐは０～１７の整数であり、ｒは０～１３の整数である］からなる群から選択される構造を有しないリンカーを含むＲＮＡコンストラクトの切断と比較して増強される。例えば、第１のＲＮＡ配列、第２のＲＮＡ配列、および本明細書に記載されるリンカーＲＮＡ配列を含む組み換えＲＮＡコンストラクトの切断は、ＡＣＡＡＣＡＡ（配列番号８５）を含む配列を含まないリンカーを含むＲＮＡコンストラクトの切断と比較して増強される。例えば、第１のＲＮＡ配列、第２のＲＮＡ配列、および本明細書に記載されるリンカーＲＮＡ配列を含む組み換えＲＮＡコンストラクトの切断は、二次構造を形成するリンカーを含むＲＮＡコンストラクトの切断と比較して増強される。

【0064】

一部の場合には、本明細書において提供される組み換えＲＮＡコンストラクトからの関心のある遺伝子の発現は、本明細書に記載されるリンカーを含まない相当する組み換えＲＮＡコンストラクトからの関心のある遺伝子の発現と比較して増強される。例えば、第１のＲＮＡ配列、第２のＲＮＡ配列、および本明細書に記載されるリンカーＲＮＡ配列を含む組み換えＲＮＡコンストラクトからの関心のある遺伝子の発現は、本明細書に記載されるリンカーを含まないＲＮＡコンストラクトからの関心のある遺伝子の発現と比較して増強される。例えば、第１のＲＮＡ配列、第２のＲＮＡ配列、および本明細書に記載されるリンカーＲＮＡ配列を含む組み換えＲＮＡコンストラクトからの関心のある遺伝子の発現は、式（Ｉ）：Ｘ_ｍＣＡＡＣＡＡＸ_ｎ［式中、Ｘは任意のヌクレオチドであり、ｍは１～１２の整数であり、ｎは０～４の整数である］；および式（ＩＩ）：Ｘ_ｐＴＣＣＣＸ_ｒ［式中、Ｘは任意のヌクレオチドであり、ｐは０～１７の整数であり、ｒは０～１３の整数である］からなる群から選択される構造を有しないリンカーを含むＲＮＡコンストラクトからの関心のある遺伝子の発現と比較して増強される。例えば、第１のＲＮＡ配列、第２のＲＮＡ配列、および本明細書に記載されるリンカーＲＮＡ配列を含む組み換えＲＮＡコンストラクトからの関心のある遺伝子の発現は、ＡＣＡＡＣＡＡ（配列番号８５）を含む配列を含まないリンカーを含むＲＮＡコンストラクトからの関心のある遺伝子の発現と比較して増強される。例えば、第１のＲＮＡ配列、第２のＲＮＡ配列、および本明細書に記載されるリンカーＲＮＡ配列を含む組み換えＲＮＡコンストラクトからの関心のある遺伝子の発現は、二次構造を形成するリンカーを含むＲＮＡコンストラクトからの関心のある遺伝子の発現と比較して増強される。

【0065】

一部の実施形態において、関心のある遺伝子の発現のまたは組み換えＲＮＡコンストラクトの切断の相対的増加または増強は、少なくとも約１．３倍、約１．４倍、約１．５倍、約１．６倍、約１．７倍、約１．８倍、約１．９倍、約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約６倍、約７倍、約８倍、約９倍、約１０倍、約１５倍、約１７倍、約１８倍、約１９倍、約２０倍、約２１倍、約２２倍、または少なくとも約２５倍である。一部の実施形態において、関心のある遺伝子の発現のまたは組み換えＲＮＡコンストラクトの切断の相対的増加は、約１．３倍～約３倍、約１．５倍～約４倍、約２倍～約５倍、約２倍～約１０倍、約２倍～約１５倍、約２倍～約１７倍、約２倍～約１８倍、約２倍～約１９倍、約２倍～約２０倍、約２倍～約２１倍、約２倍～約２２倍、約２倍～約２５倍、約２倍～約３０倍、約５倍～約１０倍、約５倍～約１５倍、約５倍～約１７倍、約５倍～約１８倍、約５倍～約１９倍、約５倍～約２０倍、約５倍～約２１倍、約５倍～約２２倍、約５倍～約２５倍、約５倍～約３０倍、約１０倍～約１５倍、約１０倍～約１７倍、約１０倍～約１８倍、約１０倍～約１９倍、約１０倍～約２０倍、約１０倍～約２１倍、約１０倍～約２２倍、約１０倍～約２５倍、約１０倍～約３０倍、約１５倍～約１７倍、約１５倍～約１８倍、約１５倍～約１９倍、約１５倍～約２０倍、約１５倍～約２１倍、約１５倍～約２２倍、約１５倍～約２５倍、約１５倍～約３０倍、約１７倍～約１８倍、約１７倍～約１９倍、約１７倍～約２０倍、約１７倍～約２１倍、約１７倍～約２２倍、約１７倍～約２５倍、約１７倍～約３０倍、約１８倍～約１９倍、約１８倍～約２０倍、約１８倍～約２１倍、約１８倍～約２２倍、約１８倍～約２５倍、約１８倍～約３０倍、約１９倍～約２０倍、約１９倍～約２１倍、約１９倍～約２２倍、約１９倍～約２５倍、約１９倍～約３０倍、約２０倍～約２１倍、約２０倍～約２２倍、約２０倍～約２５倍、約２０倍～約３０倍、約２１倍～約２２倍、約２１倍～約２５倍、約２１倍～約３０倍、約２２倍～約２５倍、約２２倍～約３０倍、または約２５倍～約３０倍である。一部の実施形態において、関心のある遺伝子の発現のまたは組み換えＲＮＡコンストラクトの切断の相対的増加は、約１．３倍、約１．４倍、約１．５倍、約１．６倍、約１．７倍、約１．８倍、約１．９倍、約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約６倍、約７倍、約８倍、約９倍、約１０倍、約１５倍、約１７倍、約１８倍、約１９倍、約２０倍、約２１倍、約２２倍、約２５倍、または約３０倍である。一部の実施形態において、関心のある遺伝子の発現のまたは組み換えＲＮＡコンストラクトの切断の相対的増加は、多くとも約２倍、約３倍、約５倍、約１０倍、約１５倍、約１７倍、約１８倍、約１９倍、約２０倍、約２１倍、約２２倍、約２５倍、または約３０倍である。

【0066】

一部の実施形態において、本明細書において提供される組み換えＲＮＡコンストラクトは、ネイキッドＲＮＡであり得る。一部の実施形態において、本明細書において提供される組み換えＲＮＡコンストラクトは、特に翻訳を向上させるために、５’キャップ、コザック配列、および／または内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、および／またはポリ（Ａ）テールをさらに含み得る。一部の場合には、組み換えＲＮＡコンストラクトは、当業者に公知の翻訳を促進する１種または複数の領域をさらに含み得る。５’キャップの非限定的な例は、アンチリバースＣＡＰアナログ、クリーンキャップ（Ｃｌｅａｎ Ｃａｐ）、Ｃａｐ０、Ｃａｐ１、Ｃａｐ２、またはロックド核酸キャップ（ＬＮＡキャップ）を含み得る。一部の場合には、５’キャップは、ｍ_２ ^{７，３’－Ｏ}Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ、ｍ７Ｇ、ｍ７Ｇ（５’）Ｇ、ｍ７ＧｐｐｐＧ、またはｍ７ＧｐｐｐＧｍを含み得る。一部の場合には、本明細書において提供される組み換えＲＮＡコンストラクトは、関心のある遺伝子をコードするＲＮＡ配列の上流または５’にＩＲＥＳを含み得る。一部の場合には、本明細書において提供される組み換えＲＮＡコンストラクトは、関心のある遺伝子をコードするＲＮＡ配列のすぐ上流または５’にＩＲＥＳを含み得る。一部の場合には、本明細書において提供される組み換えＲＮＡコンストラクトは、標的ＲＮＡの発現をモジュレートする少なくとも１種の遺伝子エレメントをコードするＲＮＡ配列の下流または３’にＩＲＥＳを含み得、標的ＲＮＡの発現をモジュレートする少なくとも１種の遺伝子エレメントをコードするＲＮＡ配列は、関心のある遺伝子をコードするＲＮＡ配列の上流に存在する。

【0067】

本明細書において提供される組み換えＲＮＡコンストラクトは、ポリ（Ａ）テールをさらに含み得る。一部の場合には、ポリ（Ａ）テールは、１～２２０塩基対のポリ（Ａ）を含む。例えば、ポリ（Ａ）テールは、１、３、５、８、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２０５、２１０、２１５、または２２０塩基対のポリ（Ａ）を含む。一部の実施形態において、ポリ（Ａ）テールは、１～２０、１～４０、１～６０、１～８０、１～１００、１～１２０、１～１４０、１～１６０、１～１８０、１～２００、１～２２０、２０～４０、２０～６０、２０～８０、２０～１００、２０～１２０、２０～１４０、２０～１６０、２０～１８０、２０～２００、２０～２２０、４０～６０、４０～８０、４０～１００、４０～１２０、４０～１４０、４０～１６０、４０～１８０、４０～２００、４０～２２０、６０～８０、６０～１００、６０～１２０、６０～１４０、６０～１６０、６０～１８０、６０～２００、６０～２２０、８０～１００、８０～１２０、８０～１４０、８０～１６０、８０～１８０、８０～２００、８０～２２０、１００～１２０、１００～１４０、１００～１６０、１００～１８０、１００～２００、１００～２２０、１２０～１４０、１２０～１６０、１２０～１８０、１２０～２００、１２０～２２０、１４０～１６０、１４０～１８０、１４０～２００、１４０～２２０、１６０～１８０、１６０～２００、１６０～２２０、１８０～２００、１８０～２２０、または２００～２２０塩基対のポリ（Ａ）を含む。一部の実施形態において、ポリ（Ａ）テールは、１、２０、４０、６０、８０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、または２２０塩基対のポリ（Ａ）を含む。一部の実施形態において、ポリ（Ａ）テールは、少なくとも１、２０、４０、６０、８０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、または少なくとも２００塩基対のポリ（Ａ）を含む。一部の実施形態において、ポリ（Ａ）テールは、多くとも２０、４０、６０、８０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、または多くとも２２０塩基対のポリ（Ａ）を含む。一部の実施形態において、ポリ（Ａ）テールは、１２０塩基対のポリ（Ａ）を含む。

【0068】

本明細書において提供される組み換えＲＮＡコンストラクトは、コザック配列をさらに含み得る。コザック配列とは、タンパク質翻訳開始部位として機能する核酸配列モチーフを指し得る。コザック配列は、文献において、例えば本明細書における参照によりその全体として本明細書に組み入れられる、Ｋｏｚａｋ，Ｍ．、Ｇｅｎｅ ２９９（１－２）：１～３４によって詳細に記載される。一部の実施形態において、本明細書に記載されるコザック配列は、ＧＣＣＡＣＣ（配列番号２５）を含む配列を含み得る。一部の実施形態において、本明細書において提供される組み換えＲＮＡコンストラクトは、核局在化シグナル（ＮＬＳ）をさらに含み得る。

【0069】

１つの態様において、本明細書に記載される組み換えＲＮＡコンストラクトは、ヌクレオチドバリアントを含まなくてもよい。一部の場合には、本明細書に記載される組み換えＲＮＡコンストラクトは、１つまたは複数のウリジンを含み得る。一部の場合には、本明細書に記載される組み換えＲＮＡコンストラクトは、修飾されたウリジンを含まなくてもよい。一部の場合には、本明細書に記載される組み換えＲＮＡコンストラクトは、１つまたは複数のＮ１－メチルシュードウリジンを含まなくてもよい。一部の実施形態において、組み換えＲＮＡコンストラクトに含まれる１つまたは複数のウリジンの９９％～１％、９８％～２％、９７％～３％、９６％～４％、９５％～２％、９４％～６％、９３％～７％、９２％～８％、９１％～９％、９０％～１０％、９７％～３％は非修飾である。一部の実施形態において、組み換えＲＮＡコンストラクトに含まれる１つまたは複数のウリジンの少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、または少なくとも９９．９％は非修飾である。一部の実施形態において、組み換えＲＮＡコンストラクトに含まれる１つまたは複数のウリジンの多くとも１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、または少なくとも９９．９％は修飾されている。１つの実施形態において、本明細書に記載される組み換えＲＮＡコンストラクトは、非修飾のヌクレオチドだけを含む。例えば、本明細書に記載される組み換えＲＮＡコンストラクトは、天然のヌクレオチドのみを含む。例えば、本明細書に記載される組み換えＲＮＡコンストラクトは、標準ヌクレオチドのみを含む。好ましい実施形態において、本明細書に記載される組み換えＲＮＡコンストラクトは、１つまたは複数のウリジンを含み、１つまたは複数のウリジンのすべては非修飾である。別の態様において、本明細書に記載される組み換えＲＮＡコンストラクトは、非標準的なヌクレオチド、非天然のヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ、および／または修飾されたヌクレオチドを含めた、１つまたは複数のヌクレオチドバリアントを含み得る。修飾されたヌクレオチドの例は、ジアミノプリン、５－フルオロウラシル、５－ブロモウラシル、５－クロロウラシル、５－ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン（ｘａｎｔｉｎｅ）、４－アセチルシトシン、５－（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５－カルボキシメチルアミノメチル－２－チオウリジン、５－カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、ベータ－Ｄ－ガラクトシルケウオシン、イノシン、Ｎ６－イソペンテニルアデニン、１－メチルグアニン、１－メチルイノシン、２，２－ジメチルグアニン、２－メチルアデニン、２－メチルグアニン、３－メチルシトシン、５－メチルシトシン、Ｎ６－メチルアデノシン、７－メチルグアニン、５－メチルアミノメチルウラシル、５－メトキシアミノメチル－２－チオウラシル、ベータ－Ｄ－マンノシルケウオシン、５’－メトキシカルボキシメチルウラシル、５－メトキシウラシル、２－メチルチオ－Ｎ６－イソペンテニルアデニン、ウラシル－５－オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン（ｗｙｂｕｔｏｘｏｓｉｎｅ）、シュードウラシル、ケウオシン、２－チオシトシン、５－メチル－２－チオウラシル、２－チオウラシル、４－チオウラシル、５－メチルウラシル、ウラシル－５－オキシ酢酸メチルエステル、５－メチル－２－チオウラシル、３－（３－アミノ－３－Ｎ－２－カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、２，６－ジアミノプリン、Ｎ１－メチルシュードウリジン等を含むが、それらに限定されるわけではない。一部の場合には、ヌクレオチドは、トリホスフェート部分の修飾を含めた、それらのホスフェート部分における修飾を含み得る。そのような修飾の非限定的な例は、より大きな長さ、およびチオール部分を用いた修飾のホスフェート鎖を含む。一部の実施形態において、ホスフェート鎖は、４、５、６、７、８、９、１０個、またはそれより多くのホスフェート部分を含み得る。一部の実施形態において、チオール部分は、アルファ－チオトリホスフェートおよびベータ－チオトリホスフェートを含み得るが、それらに限定されるわけではない。一部の実施形態において、本明細書に記載される組み換えＲＮＡコンストラクトは、５－メチルシトシンおよび／またはＮ６－メチルアデノシンを含まない。

【0070】

一部の場合には、本明細書に記載される組み換えＲＮＡコンストラクトは、塩基部分、糖部分、またはホスフェート骨格において修飾されていてもよい。例えば、修飾は、相補的ヌクレオチドと水素結合を形成するために典型的に使用可能である１つもしくは複数の原子における、および／または相補的ヌクレオチドと水素結合を典型的に形成し得ない１つもしくは複数の原子におけるものであり得る。一部の実施形態において、骨格修飾は、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホロアニラデート（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｎｉｌａｄａｔｅ）、ホスホロアミダート、およびホスホロジアミダート連結を含むが、それらに限定されるわけではない。ホスホロチオエート連結は、ホスフェート骨格における非架橋酸素の代わりに硫黄原子を用い、オリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ分解を遅延させる。ホスホロジアミダート連結（Ｎ３’→Ｐ５’）は、ヌクレアーゼ認識および分解を阻止するのを可能にする。一部の実施形態において、骨格修飾は、骨格構造におけるリンの代わりにペプチド結合、またはカルバメート、アミド、ならびに線状および環状炭化水素基を含めた結合基を有することを含む。例えば、Ｎ－（２－アミノエチル）－グリシン単位は、ペプチド核酸におけるペプチド結合によって連結され得る。修飾された骨格を有するオリゴヌクレオチドは、Ｍｉｃｋｌｅｆｉｅｌｄ、Ｂａｃｋｂｏｎｅ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ：ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｃｕｒｒ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、８（１０）：１１５７～７９、２００１、およびＬｙｅｒら、Ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ－ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．、１（３）：３４４～３５８、１９９９に概説される。

【0071】

本明細書において提供される組み換えＲＮＡコンストラクトは、修飾されたおよび非修飾のヌクレオチドの組み合わせを含み得る。一部の場合には、アデノシン－、グアノシン－、およびシチジン－含有ヌクレオチドは、非修飾であるか、または部分的に修飾されている。一部の場合には、修飾されたＲＮＡコンストラクトに関して、ウリジンヌクレオチドの１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％は修飾されていてもよい。一部の実施形態において、ウリジンヌクレオチドの５％～２５％は、組み換えＲＮＡコンストラクトにおいて修飾されている。修飾されたウリジンヌクレオチドの非限定的な例は、シュードウリジン、Ｎ^１－メチルシュードウリジン、またはＮ１－メチルシュード－ＵＴＰを含み得、当技術分野において公知の任意の修飾されたウリジンヌクレオチドが利用され得る。一部の実施形態において、組み換えＲＮＡコンストラクトは、修飾されたおよび非修飾のヌクレオチドの組み合わせを含有し得、ウリジンヌクレオチドの１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％は、シュードウリジン、Ｎ^１－メチルシュードウリジン、Ｎ１－メチルシュード－ＵＴＰ、または当技術分野において公知の任意の他の修飾されたウリジンヌクレオチドを含み得る。一部の実施形態において、組み換えＲＮＡコンストラクトは、修飾されたおよび非修飾のヌクレオチドの組み合わせを含有し得、ウリジンヌクレオチドの１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％は、Ｎ^１－メチルシュードウリジンを含み得る。

【0072】

本明細書において提供される組み換えＲＮＡコンストラクトは、コドン最適化されていてもよい。一般的に、コドン最適化とは、関心のある宿主細胞における発現のために、その宿主細胞の遺伝子においてより高頻度にまたは最も高頻度に使用されるコドンで、天然配列の少なくとも１種のコドン（例えば、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、５０種より多くの、またはそれより多くのコドン）を置き換えることによって核酸配列を改変し、一方で天然アミノ酸配列を維持する過程を指す。コドン使用法の表は、例えば「Ｃｏｄｏｎ Ｕｓａｇｅ Ｄａｔａｂａｓｅ」で容易に入手可能であり、これらの表は、いくつかのやり方で適応され得る。特定の宿主細胞における発現のために、好ましいＧｅｎｅ Ｆｏｒｇｅ（登録商標）（Ａｐｔａｇｅｎ、ＰＡ）およびＧｅｎｅＯｐｔｉｍｉｚｅｒ（登録商標）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒ、ＭＡ）等、特定の配列をコドン最適化するためのコンピューターアルゴリズムも入手可能である。一部の実施形態において、組み換えＲＮＡコンストラクトは、コドン最適化されていなくてもよい。

【0073】

一部の場合には、組み換えＲＮＡコンストラクトは、配列番号１～１２および９７～１０８からなる群から選択される配列を含む核酸配列を含み得る。

【0074】

ＲＮＡ干渉および低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）またはＲＮＡサイレンシングとは、標的ｍＲＮＡ分子を中和することによって、ＲＮＡ分子が遺伝子発現または翻訳を阻害する過程である。ＲＮＡｉ過程は、Ｍｅｌｌｏ＆Ｃｏｎｔｅ（２００４）Ｎａｔｕｒｅ ４３１、３３８～３４２、Ｍｅｉｓｔｅｒ＆Ｔｕｓｃｈｌ（２００４）Ｎａｔｕｒｅ ４３１、３４３～３４９、Ｈａｎｎｏｎ＆Ｒｏｓｓｉ（２００４）Ｎａｔｕｒｅ ４３１、３７１～３７８、およびＦｉｒｅ（２００７）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．４６、６９６６～６９８４に記載される。簡潔には、天然の過程において、反応は、ｄｓＲＮＡ特異的エンドヌクレアーゼＤｉｃｅｒによる、ヘアピン構造を有する低分子ｄｓＲＮＡ断片またはｓｉＲＮＡ（すなわち、ｓｈＲＮＡ）への、長い二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の切断とともに開始する。次いで、これらの低分子ｄｓＲＮＡ断片またはｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ誘導性サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に統合され、ＲＩＳＣを標的ｍＲＮＡ配列にガイドする。干渉の間、ｓｉＲＮＡ二重鎖はほどけ、アンチセンス鎖は、ＲＩＳＣと複合したままとどまって、ＲＩＳＣを標的ｍＲＮＡ配列へ導いて、分解および後続のタンパク質翻訳の抑制を誘導する。本発明の組み換えＲＮＡコンストラクトにおけるｓｉＲＮＡは、ヘアピンループ構造を含み得ることから、市販の合成ｓｉＲＮＡとは異なり、本発明におけるｓｉＲＮＡは、細胞の細胞質において内因性のＤｉｃｅｒおよびＲＩＳＣ経路を利用して、組み換えＲＮＡコンストラクト（例えば、ｍＲＮＡおよび少なくとも２種のｓｉＲＮＡを含む組み換えＲＮＡコンストラクト）から切断され得、上で詳述される天然の過程をたどり得る。加えて、組み換えＲＮＡコンストラクトの残部（すなわち、ｍＲＮＡ）は、ＤｉｃｅｒによるｓｉＲＮＡの切断後に無傷の状態のままであることから、本発明の組み換えＲＮＡコンストラクトにおける関心のある遺伝子からの所望のタンパク質発現が実現される。

【0075】

それぞれが、１種または複数の標的ＲＮＡの発現をモジュレートする遺伝子エレメントを含む少なくとも２種の核酸配列を含む組み換えＲＮＡコンストラクトを含む組成物が本明細書において提供される。一部の場合には、１種または複数の標的ＲＮＡの発現をモジュレートする遺伝子エレメントは、標的ＲＮＡに結合し得るｓｉＲＮＡであり得る。一部の場合には、標的ＲＮＡに結合し得るｓｉＲＮＡを含む少なくとも１種の核酸配列を含む組み換えＲＮＡコンストラクトを含む組成物が本明細書において提供される。一部の場合には、標的ＲＮＡはノンコーディングＲＮＡである。一部の場合には、標的ＲＮＡはｍＲＮＡである。一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、５’非翻訳領域において標的ｍＲＮＡに結合し得る。一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、３’非翻訳領域において標的ｍＲＮＡに結合し得る。一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、エクソンにおいて標的ｍＲＮＡに結合し得る。

【0076】

一部の実施形態において、組み換えＲＮＡコンストラクトは、センスｓｉＲＮＡ鎖を含む核酸配列を含み得る。一部の実施形態において、組み換えＲＮＡコンストラクトは、アンチセンスｓｉＲＮＡ鎖を含む核酸配列を含み得る。一部の実施形態において、組み換えＲＮＡコンストラクトは、センスｓｉＲＮＡ鎖を含む核酸配列およびアンチセンスｓｉＲＮＡ鎖を含む核酸配列を含み得る。本発明に含まれるｓｉＲＮＡの詳細は、参照により本明細書に組み入れられる、Ｃｈｅｎｇら（２０１８）Ｊ．Ｍａｔｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｂ．、６、４６３８～４６４４に記載される。

【0077】

一部の場合には、１種または複数の標的ＲＮＡの発現をモジュレートする遺伝子エレメント、例えばｓｉＲＮＡは、センスｓｉＲＮＡ鎖およびアンチセンスｓｉＲＮＡ鎖を含む核酸配列を含み得る。例えば、一部の場合には、組み換えＲＮＡコンストラクトは、少なくとも１種のｓｉＲＮＡ、すなわち、ｓｉＲＮＡのセンス鎖を含む核酸配列およびｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖を含む核酸配列を含み得る。本明細書に記載される１種のｓｉＲＮＡとは、１種のセンス鎖ｓｉＲＮＡおよび１種のアンチセンス鎖ｓｉＲＮＡを指し得る。一部の場合には、組み換えＲＮＡコンストラクトは、１種より多くのｓｉＲＮＡ、例えばｓｉＲＮＡのセンス鎖およびｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖を含む２、３、４、５、６、７、８、９、１０種、またはそれより多くのｓｉＲＮＡを含み得る。一部の実施形態において、組み換えＲＮＡコンストラクトは、１～２０種のｓｉＲＮＡを含み得る。一部の実施形態において、組み換えＲＮＡコンストラクトは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９種、または少なくとも１０種のｓｉＲＮＡを含み得る。一部の実施形態において、組み換えＲＮＡコンストラクトは、多くとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９種、または多くとも２０種のｓｉＲＮＡを含み得る。一部の実施形態において、組み換えＲＮＡコンストラクトは、２種のｓｉＲＮＡ～１０種のｓｉＲＮＡ、３種のｓｉＲＮＡ～１０種のｓｉＲＮＡ、４種のｓｉＲＮＡ～１０種のｓｉＲＮＡ、５種のｓｉＲＮＡ～１０種のｓｉＲＮＡ、６種のｓｉＲＮＡ～１０種のｓｉＲＮＡ、７種のｓｉＲＮＡ～１０種のｓｉＲＮＡ、９種のｓｉＲＮＡ～１０種のｓｉＲＮＡ、好ましくは２種のｓｉＲＮＡ～６種のｓｉＲＮＡ、３種のｓｉＲＮＡ～６種のｓｉＲＮＡ、または４種のｓｉＲＮＡ～６種のｓｉＲＮＡを含み得る。好ましい実施形態において、本明細書に記載される組み換えＲＮＡコンストラクトは、少なくとも２種のｓｉＲＮＡを含む。別の好ましい実施形態において、本明細書に記載される組み換えＲＮＡコンストラクトは、少なくとも３種のｓｉＲＮＡを含む。さらに別の好ましい実施形態において、本明細書に記載される組み換えＲＮＡコンストラクトは、少なくとも６種のｓｉＲＮＡを含む。

【0078】

１～２０種またはそれより多くのｓｉＲＮＡ種を含む組み換えＲＮＡコンストラクトの組成物であって、１～２０種またはそれより多くのｓｉＲＮＡ種のそれぞれは、標的ＲＮＡに結合し得る、組成物が本明細書において提供される。一部の実施形態において、標的ＲＮＡは、ｍＲＮＡまたはノンコーディングＲＮＡである。一部の場合には、ｓｉＲＮＡ種のそれぞれは、同じ標的ＲＮＡに結合する。１つの場合には、ｓｉＲＮＡ種のそれぞれは、同じ配列を含み得、同じ標的ＲＮＡの同じ領域または配列に結合し得る。例えば、組み換えＲＮＡコンストラクトは、１、２、３、４、５、６種、またはそれより多くのｓｉＲＮＡ種を含み得、１、２、３、４、５、６種、またはそれより多くのｓｉＲＮＡ種のそれぞれは、標的ＲＮＡの同じ領域を標的にする同じ配列を含む、すなわち、組み換えＲＮＡコンストラクトは、１、２、３、４、５、６種、またはそれより多くの冗長な種のｓｉＲＮＡを含み得る。別の場合には、ｓｉＲＮＡ種のそれぞれは、異なる配列を含み得、同じ標的ＲＮＡの異なる領域または配列に結合し得る。例えば、組み換えＲＮＡコンストラクトは、１、２、３、４、５、６種、またはそれより多くのｓｉＲＮＡ種を含み得、１、２、３、４、５、６種、またはそれより多くのｓｉＲＮＡ種のそれぞれは、同じ標的ＲＮＡの異なる領域を標的にする異なる配列を含み得る。この例では、１、２、３、４、５、６種、またはそれより多くのｓｉＲＮＡ種のうちの１種のｓｉＲＮＡは、エクソン１を標的にし得、１、２、３、４、５、６種、またはそれより多くのｓｉＲＮＡ種のうちの別のｓｉＲＮＡは、同じｍＲＮＡのエクソン２を標的にし得る、等。一部の場合には、組み換えＲＮＡコンストラクトは、同じ標的ＲＮＡの同じおよび異なる領域に結合し得る１、２、３、４、５、６種、またはそれより多くのｓｉＲＮＡ種を含み得る。例えば、組み換えＲＮＡコンストラクトは、１、２、３、４、５、６種、またはそれより多くのｓｉＲＮＡ種を含み得、１、２、３、４、５、６種、またはそれより多くのｓｉＲＮＡ種のうちの２種は、同じ配列を含み得、標的ＲＮＡの同じ領域に結合し得、１、２、３、４、５、６種、またはそれより多くのｓｉＲＮＡ種のうちの３種以上は、異なる配列を含み得、同じ標的ＲＮＡの異なる領域に結合し得る。一部の場合には、ｓｉＲＮＡ種のそれぞれは、異なる標的ＲＮＡに結合する。一部の場合には、組み換えＲＮＡコンストラクトは、同じおよび異なる標的ＲＮＡに結合し得る１、２、３、４、５、６種、またはそれより多くのｓｉＲＮＡ種を含み得る。例えば、組み換えＲＮＡコンストラクトは、１、２、３、４、５、６種、またはそれより多くのｓｉＲＮＡ種を含み得、１、２、３、４、５、６種、またはそれより多くのｓｉＲＮＡ種のうちの２種は、同じ標的ＲＮＡの同じまたは異なる領域に結合し得る配列を含み得、１、２、３、４、５、６種、またはそれより多くのｓｉＲＮＡ種のうちの３種以上は、異なる標的ＲＮＡに結合し得る配列を含み得る。一部の実施形態において、標的ＲＮＡは、ｍＲＮＡおよび／またはノンコーディングＲＮＡであり得る。

【0079】

１～２０種またはそれより多くのｓｉＲＮＡ種を含む組み換えＲＮＡコンストラクトの組成物であって、１～２０種またはそれより多くのｓｉＲＮＡ種のそれぞれは、本明細書に記載されるリンカーによって接続される、組成物が本明細書において提供される。一部の場合には、リンカーは非切断性リンカーであり得る。一部の場合には、リンカーは、自己切断性リンカー等の切断性リンカーであり得る。一部の場合には、リンカーは、タンパク質、例えば細胞内または内因性タンパク質によって切断され得る。一部の場合には、リンカーは、式（Ｉ）：Ｘ_ｍＣＡＡＣＡＡＸ_ｎ［式中、Ｘは任意のヌクレオチドであり、ｍは１～１２の整数であり、ｎは０～４の整数である］；および式（ＩＩ）：Ｘ_ｐＴＣＣＣＸ_ｒ［式中、Ｘは任意のヌクレオチドであり、ｐは０～１７の整数であり、ｒは０～１３の整数である］からなる群から選択される構造を有する。一部の場合には、リンカーは、ＡＣＡＡＣＡＡ（配列番号８５）、ＡＴＣＣＣＴＡＣＧＴＡＣＣＡＡＣＡＡ（配列番号８７）、ＡＣＧＴＡＣＣＡＡＣＡＡ（配列番号８８）、ＴＣＣＣ（配列番号８９）、またはＡＣＡＡＣＡＡＴＣＣＣ（配列番号９０）を含む配列を含み得る。一部の実施形態において、リンカーは、ＡＣＡＡＣＡＡ（配列番号８５）、ＡＴＡＧＴＧＡＧＴＣＧＴＡＴＴＡＴＣＣＣ（配列番号９２）、ＡＴＡＧＴＧＡＧＴＣＧＴＡＴＴＡＡＣＡＡＣＡＡＴＣＣＣ（配列番号９３）、ＡＴＡＧＴＧＡＧＴＣＧＴＡＴＴＡＡＣＡＡＣＡＡ（配列番号９４）、ＡＴＡＧＴＧＡＧＴＣＧＴＡＴＴＡＡＴＣＣＣＴＡＣＧＴＡＣＣＡＡＣＡＡ（配列番号９５）、またはＡＴＡＧＴＧＡＧＴＣＧＴＡＴＴＡＡＣＧＴＡＣＣＡＡＣＡＡ（配列番号２７）を含む配列を含み得る。一部の実施形態において、リンカーは、ＡＣＡＡＣＡＡ（配列番号８５）を含む配列を含み得る。一部の実施形態において、リンカーは、ＴＴＴＡＴＣＴＴＡＧＡＧＧＣＡＴＡＴＣＣＣＴＡＣＧＴＡＣＣＡＡＣＡＡ（配列番号２８）、またはＡＴＡＧＴＧＡＧＴＣＧＴＡＴＴＡＡＣＧＴＡＣＣＡＡＣＡＡ（配列番号２７）を含む配列を含まない。

【0080】

一部の場合には、リンカーの長さは、約４～約５０、約４～約４５、または約４～約４０、約４～約３５、または約４～約３０ヌクレオチドである。一部の実施形態において、リンカーの長さは、約４～約２７ヌクレオチドである。一部の実施形態において、リンカーの長さは、約４～約１８ヌクレオチドである。例えば、リンカーの長さは、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、約３０、約３１、約３２、約３３、約３４、約３５、約３６、約３７、約３８、約３９、約４０、約４１、約４２、約４３、約４４、約４５、約４６、約４７、約４８、約４９、または約５０ヌクレオチドである。一部の実施形態において、リンカーの長さは、多くとも約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、約３０、約３１、約３２、約３３、約３４、約３５、約３６、約３７、約３８、約３９、約４０、約４１、約４２、約４３、約４４、約４５、約４６、約４７、約４８、約４９、または多くとも約５０ヌクレオチドであり得る。一部の実施形態において、リンカーの長さは４ヌクレオチドである。一部の実施形態において、リンカーの長さは７ヌクレオチドである。一部の実施形態において、リンカーの長さは１１ヌクレオチドである。一部の実施形態において、リンカーの長さは１２ヌクレオチドである。一部の実施形態において、リンカーの長さは１８ヌクレオチドである。

【0081】

一部の場合には、リンカーは、式（Ｉ）Ｘ_ｍＣＡＡＣＡＡＸ_ｎの構造［式中、Ｘは任意のヌクレオチドであり；ｍは１～１２の整数であり、ｎは０～４の整数であり；ｍは１であり、ｎは０である］を有し得る。一部の場合には、リンカーは、ＣＡＡＣＡＡ（配列番号９１）、ＴＣＣＣ（配列番号８９）、またはＡＣＡＡＣＡＡ（配列番号８５）を含む配列を含み得る。一部の実施形態において、リンカーは、ＡＴＣＣＣＴＡＣＧＴＡＣＣＡＡＣＡＡ（配列番号８７）、ＡＣＧＴＡＣＣＡＡＣＡＡ（配列番号８８）、ＴＣＣＣ（配列番号８９）、ＡＣＡＡＣＡＡＴＣＣＣ（配列番号９０）、およびＡＣＡＡＣＡＡ（配列番号８５）からなる群から選択される配列を含み得る。一部の実施形態において、リンカーは、ＡＣＡＡＣＡＡ（配列番号８５）、ＡＴＡＧＴＧＡＧＴＣＧＴＡＴＴＡＴＣＣＣ（配列番号９２）、ＡＴＡＧＴＧＡＧＴＣＧＴＡＴＴＡＡＣＡＡＣＡＡＴＣＣＣ（配列番号９３）、ＡＴＡＧＴＧＡＧＴＣＧＴＡＴＴＡＡＣＡＡＣＡＡ（配列番号９４）、ＡＴＡＧＴＧＡＧＴＣＧＴＡＴＴＡＡＴＣＣＣＴＡＣＧＴＡＣＣＡＡＣＡＡ（配列番号９５）、またはＡＴＡＧＴＧＡＧＴＣＧＴＡＴＴＡＡＣＧＴＡＣＣＡＡＣＡＡ（配列番号２７）を含む配列を含み得る。一部の実施形態において、リンカーは、ＡＣＡＡＣＡＡ（配列番号８５）を含む配列を含み得る。一部の実施形態において、リンカーは、配列番号２７、２８、８５～９５からなる群から選択される配列を含み得る。

【0082】

一部の場合には、リンカーはｔＲＮＡリンカーであり得る。ｔＲＮＡシステムは、生存生物にわたって進化的に保存され、内因性のＲＮａｓｅ ＰおよびＺを利用して、マルチシストロン性コンストラクトをプロセシングする（Ｄｏｎｇら、２０１６）。一部の実施形態において、ｔＲＮＡリンカーは、ＡＡＣＡＡＡＧＣＡＣＣＡＧＴＧＧＴＣＴＡＧＴＧＧＴＡＧＡＡＴＡＧＴＡＣＣＣＴＧＣＣＡＣＧＧＴＡＣＡＧＡＣＣＣＧＧＧＴＴＣＧＡＴＴＣＣＣＧＧＣＴＧＧＴＧＣＡ（配列番号９６）を含む核酸配列を含み得る。一部の実施形態において、ＴＴＴＡＴＣＴＴＡＧＡＧＧＣＡＴＡＴＣＣＣＴＡＣＧＴＡＣＣＡＡＣＡＡ（配列番号２８）を含む核酸配列を含むリンカーを使用して、１～２０種またはそれより多くのｓｉＲＮＡ種のそれぞれを接続し得る。

【0083】

一部の場合には、その標的ｍＲＮＡへのｓｉＲＮＡの特異的結合は、標的ｍＲＮＡの正常な機能への干渉をもたらし、標的ｍＲＮＡによってコードされるタンパク質の発現レベル、機能、および／または活性のモジュレーション、例えば下方調節につながり、特異的結合が望まれる条件下における、すなわちｉｎ ｖｉｖｏアッセイまたは治療的処置の場合には生理的条件下における、およびｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイの場合にはアッセイが実施される条件下における、非標的核酸配列へのｓｉＲＮＡの非特異的結合を回避する十分な程度の相補性がある。

【0084】

本明細書において使用されるタンパク質とは、１つまたは複数のペプチドまたはポリペプチドを典型的に含む分子を指し得る。ペプチドまたはポリペプチドとは、典型的に、ペプチド結合によって連結されたアミノ酸残基の鎖である。ペプチドは、通常、２～５０個のアミノ酸残基を含む。ポリペプチドは、通常、５０個より多くのアミノ酸残基を含む。タンパク質は、典型的に、タンパク質がその生物学的機能を発揮するために要され得る３次元形態に折り畳まれる。本明細書において使用されるタンパク質は、タンパク質の断片、タンパク質の機能的バリアント、および融合タンパク質を含み得る。本明細書において使用される機能的バリアントとは、完全長分子、その断片、またはそのバリアントを指し得る。例えば、バリアント分子は、タンパク質配列の場合には１つもしくは複数のアミノ酸の、または核酸配列の場合には１つもしくは複数のヌクレオチドの、挿入、欠失、および／または置換によって改変された配列を含み得る。例えば、バリアント分子は、機能獲得型または機能喪失型の変異体を含むがそれらに限定されない変異体タンパク質を含み得るまたはコードし得る。断片は、ＤＮＡもしくはＲＮＡのような核酸分子、またはタンパク質の完全長配列のより短い部分であり得る。したがって、断片は、典型的に、完全長配列内の相当する一続きと同一である配列を含む。一部の実施形態において、配列の断片は、断片が由来する完全長ヌクレオチドまたはアミノ酸配列の少なくとも５％～少なくとも８０％を含み得る。一部の実施形態において、タンパク質は哺乳動物タンパク質であり得る。一部の実施形態において、タンパク質はヒトタンパク質であり得る。一部の実施形態において、タンパク質は、細胞から分泌されたタンパク質であり得る。一部の実施形態において、タンパク質は、細胞膜上のタンパク質であり得る。一部の実施形態において、本明細書において言及されるタンパク質は、分泌され、免疫学的反応にしばしば関わる、細胞表面上の受容体を介して標的細胞シグナル伝達のモジュレーターとして局所的にもしくは全身的に作用するタンパク質、またはウイルス感染に関わる他の宿主タンパク質であり得る。関心のある遺伝子によってコードされるタンパク質を含めた、本発明の文脈において有用なタンパク質のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、当技術分野において公知であり、文献において入手可能である。例えば、関心のある遺伝子によってコードされるタンパク質を含めた、本発明の文脈において有用なタンパク質のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔデータベースにおいて入手可能である。

【0085】

標的ｍＲＮＡの発現をモジュレートするための、標的ｍＲＮＡに結合し得るｓｉＲＮＡを含む組み換えＲＮＡコンストラクトの組成物が本明細書において提供される。一部の場合には、標的ｍＲＮＡの発現（例えば、標的ｍＲＮＡによってコードされるタンパク質のレベル）は、標的ｍＲＮＡに結合し得るｓｉＲＮＡによって下方調節される。一部の実施形態において、標的ｍＲＮＡの発現は、標的ｍＲＮＡに結合し得るｓｉＲＮＡによって阻害される。本明細書に記載される、標的ｍＲＮＡの発現の阻害または下方調節は、標的ｍＲＮＡからのタンパク質の翻訳に干渉するための標的ｍＲＮＡへの干渉を指し得るがそれに限定されるわけではなく；ゆえに、標的ｍＲＮＡの発現の阻害または下方調節は、標的ｍＲＮＡに結合し得るｓｉＲＮＡを含む組み換えＲＮＡコンストラクトの非存在下における標的ｍＲＮＡから発現されるタンパク質のレベルと比較した、標的ｍＲＮＡから発現されるタンパク質の減少したレベルを指し得るがそれに限定されるわけではない。タンパク質発現のレベルは、当技術分野において周知の任意の方法を使用することによって測定され得、これらは、ウェスタンブロッティング、フローサイトメトリー、ＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、および様々なプロテオミクス手法を含むが、それらに限定されるわけではない。ポリペプチドを測定するまたは検出する例示的方法は、ＥＬＩＳＡ等のイムノアッセイである。このタイプのタンパク質定量は、特異的抗原を捕捉し得る抗体、および捕捉された抗原を検出し得る二次抗体に基づき得る。ポリペプチドの検出および／または測定のための例示的アッセイは、Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．およびＬａｎｅ，Ｄ．Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、（１９８８）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓに記載される。

【0086】

１種または複数の標的ｍＲＮＡに結合し得るｓｉＲＮＡを含む少なくとも２種の核酸配列と、関心のある遺伝子をコードする少なくとも１種の核酸配列とを含む組み換えＲＮＡコンストラクトを含む組成物であって、標的ｍＲＮＡは、関心のある遺伝子によってコードされるｍＲＮＡとは異なる、組成物が本明細書において提供される。１種または複数の標的ｍＲＮＡに結合し得るｓｉＲＮＡを含む少なくとも２種の核酸配列と、関心のある遺伝子をコードする少なくとも１種の核酸配列とを含む組み換えＲＮＡコンストラクトを含む組成物であって、ｓｉＲＮＡは、関心のある遺伝子の発現に影響を及ぼさない、組成物が本明細書において提供される。一部の場合には、ｓｉＲＮＡは、関心のある遺伝子によってコードされるｍＲＮＡに結合し得ない。一部の場合には、ｓｉＲＮＡは、関心のある遺伝子の発現を阻害しない。一部の場合には、ｓｉＲＮＡは、関心のある遺伝子の発現を下方調節しない。本明細書に記載される、関心のある遺伝子の発現を阻害することまたは下方調節することは、組み換えＲＮＡコンストラクトからのタンパク質の翻訳に干渉することを指し得るがそれに限定されるわけではなく；ゆえに、関心のある遺伝子の発現を阻害することまたは下方調節することは、標的ｍＲＮＡに結合し得るｓｉＲＮＡを含む組み換えＲＮＡコンストラクトの非存在下において発現されるタンパク質のレベルと比較した、タンパク質の減少したレベルを指し得るがそれに限定されるわけではない。タンパク質発現のレベルは、当技術分野において周知の任意の方法を使用することによって測定され得、これらは、ウェスタンブロッティング、フローサイトメトリー、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、および様々なプロテオミクス手法を含むが、それらに限定されるわけではない。ポリペプチドを測定するまたは検出する例示的方法は、ＥＬＩＳＡ等のイムノアッセイである。このタイプのタンパク質定量は、特異的抗原を捕捉し得る抗体、および捕捉された抗原を検出し得る二次抗体に基づき得る。ポリペプチドの検出および／または測定のための例示的アッセイは、Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．およびＬａｎｅ，Ｄ．Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、（１９８８）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓに記載される。

【0087】

１種または複数の標的ｍＲＮＡに結合し得るｓｉＲＮＡを含む少なくとも２種の核酸配列を含む組み換えＲＮＡコンストラクトを含む組成物が本明細書において提供される。ｓｉＲＮＡが結合し得る標的ｍＲＮＡの非限定的な例のリストは、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ－アルファまたはＴＮＦ－α）、インターロイキン８（ＩＬ－８）、インターロイキン１ベータ（ＩＬ－１ベータ）、インターロイキン１７（ＩＬ－１７）、Ｔｕｒｂｏ緑色蛍光性タンパク質（Ｔｕｒｂｏ ＧＦＰ）、またはその機能的バリアントを含む遺伝子のｍＲＮＡを含む。一部の実施形態において、Ｔｕｒｂｏ ＧＦＰ配列は、海生カイアシ類ポンテリーナ・プルマーテ（Ｐｏｎｔｅｌｌｉｎａ ｐｌｕｍａｔｅ）に由来し得る。本明細書において使用される機能的バリアントとは、完全長分子、その断片、またはそのバリアントを指し得る。例えば、バリアント分子は、タンパク質配列の場合には１つもしくは複数のアミノ酸の、または核酸配列の場合には１つもしくは複数のヌクレオチドの、挿入、欠失、および／または置換によって改変された配列を含み得る。

【0088】

一部の実施形態において、ＴＮＦ－アルファは、配列番号４０に列挙された配列を含む。一部の実施形態において、ＩＬ－８は、配列番号３７に列挙された配列を含む。一部の実施形態において、ＩＬ－１ベータは、配列番号３８に列挙された配列を含む。一部の実施形態において、ＩＬ－１７は、配列番号３９に列挙された配列を含む。一部の実施形態において、Ｔｕｒｂｏ ＧＦＰは、配列番号４１に列挙された配列を含む。

【0089】

一部の態様において、ｓｉＲＮＡは、配列番号５７～７０から選択される配列によってコードされるセンス鎖を含む。一部の態様において、ｓｉＲＮＡは、配列番号７１～８４から選択される配列によってコードされるアンチセンス鎖を含む。一部の態様において、ｓｉＲＮＡは、配列番号５７～７０から選択される配列によってコードされるセンス鎖、および配列番号７１～８４から選択される配列によってコードされる相当するアンチセンス鎖を含む。

【0090】

関心のある遺伝子
関心のある遺伝子をコードする１つまたは複数のコピーの核酸配列を含む組み換えＲＮＡコンストラクトが本明細書において提供される。例えば、組み換えＲＮＡコンストラクトは、関心のある遺伝子をコードする１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、またはそれより多くのコピーの核酸配列を含み得る。一部の場合には、関心のある遺伝子をコードする１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、またはそれより多くのコピーの核酸配列のそれぞれは、関心のある同じ遺伝子をコードする。一部の場合には、組み換えＲＮＡコンストラクトは、サイトカインをコードする１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、またはそれより多くのコピーの核酸配列を含み得る。

【0091】

関心のある遺伝子をコードする２つ以上のコピーの核酸配列を含む組み換えＲＮＡコンストラクトであって、２種以上の核酸配列のそれぞれは、関心のある異なる遺伝子をコードし得る、組み換えＲＮＡコンストラクトも本明細書において提供される。一部の場合には、関心のある異なる遺伝子をコードする２種以上の核酸配列のそれぞれは、分泌タンパク質をコードする核酸配列を含み得る。一部の場合には、関心のある異なる遺伝子をコードする２種以上の核酸配列のそれぞれは、サイトカイン、例えばインターロイキン４（ＩＬ－４）をコードする核酸配列を含み得る。一部の実施形態において、関心のある異なる遺伝子をコードする２種以上の核酸配列のそれぞれは、異なる分泌タンパク質をコードし得る。一部の場合には、関心のある異なる遺伝子をコードする２種以上の核酸のそれぞれは、インスリン様成長因子１（ＩＧＦ－１）をコードする核酸配列を含み得る。本明細書に記載されるリンカーを含む組み換えＲＮＡコンストラクトが本明細書においてさらに提供される。一部の実施形態において、リンカーは、関心のある遺伝子をコードする２種以上の核酸配列のそれぞれを接続し得る。一部の場合には、リンカーは非切断性リンカーであり得る。一部の場合には、リンカーは切断性リンカーであり得る。一部の場合には、リンカーは自己切断性リンカーであり得る。一部の場合には、リンカーは、タンパク質、例えば細胞内タンパク質または内因性タンパク質によって切断され得る。一部の場合には、リンカーは、式（Ｉ）：Ｘ_ｍＣＡＡＣＡＡＸ_ｎ［式中、Ｘは任意のヌクレオチドであり、ｍは１～１２の整数であり、ｎは０～４の整数である］；および式（ＩＩ）：Ｘ_ｐＴＣＣＣＸ_ｒ［式中、Ｘは任意のヌクレオチドであり、ｐは０～１７の整数であり、ｒは０～１３の整数である］からなる群から選択される。一部の場合には、リンカーは、ＡＣＡＡＣＡＡ（配列番号８５）を含む配列を含む。一部の実施形態において、リンカーは、配列番号２７、２８、８５～９５からなる群から選択される。

【0092】

リンカーの他の例は、柔軟性のあるリンカー、Ｔ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｅ２Ａ、またはＦ２Ａ等の２Ａペプチドリンカー（または２Ａ自己切断性ペプチド）、およびｔＲＮＡリンカー等を含むが、それらに限定されるわけではない。ｔＲＮＡシステムは、生存生物にわたって進化的に保存され、内因性のＲＮａｓｅ ＰおよびＺを利用して、マルチシストロン性コンストラクトをプロセシングする（Ｄｏｎｇら、２０１６）。一部の実施形態において、ｔＲＮＡリンカーは、ＡＡＣＡＡＡＧＣＡＣＣＡＧＴＧＧＴＣＴＡＧＴＧＧＴＡＧＡＡＴＡＧＴＡＣＣＣＴＧＣＣＡＣＧＧＴＡＣＡＧＡＣＣＣＧＧＧＴＴＣＧＡＴＴＣＣＣＧＧＣＴＧＧＴＧＣＡ（配列番号９６）を含む核酸配列を含み得る。

【0093】

関心のある遺伝子の発現をモジュレートするための、関心のある遺伝子をコードするＲＮＡを含む組み換えＲＮＡコンストラクトが本明細書において提供される。例えば、関心のある遺伝子のｍＲＮＡによってコードされるタンパク質の発現はモジュレートされ得る。例えば、関心のある遺伝子の発現は、組み換えＲＮＡコンストラクトにおける関心のある遺伝子のｍＲＮＡによってコードされるタンパク質を発現させることによって上方調節される。例えば、関心のある遺伝子の発現は、組み換えＲＮＡコンストラクトにおける関心のある遺伝子のｍＲＮＡによってコードされるタンパク質のレベルを増加させることによって上方調節される。タンパク質発現のレベルは、当技術分野において周知の任意の方法を使用することによって測定され得、これらは、ウェスタンブロッティング、フローサイトメトリー、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、および様々なプロテオミクス手法を含むが、それらに限定されるわけではない。ポリペプチドを測定するまたは検出する例示的方法は、ＥＬＩＳＡ等のイムノアッセイである。このタイプのタンパク質定量は、特異的抗原を捕捉し得る抗体、および捕捉された抗原を検出し得る二次抗体に基づき得る。ポリペプチドの検出および／または測定のための例示的アッセイは、Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．およびＬａｎｅ，Ｄ．Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、（１９８８）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓに記載される。

【0094】

関心のある遺伝子をコードするＲＮＡを含む組み換えＲＮＡコンストラクトであって、関心のある遺伝子は関心のあるタンパク質をコードする、組み換えＲＮＡコンストラクトが本明細書において提供される。一部の場合には、関心のあるタンパク質は治療用タンパク質である。一部の場合には、関心のあるタンパク質はヒト起源のものであり、すなわちヒトタンパク質である。一部の場合には、関心のある遺伝子は分泌タンパク質をコードする。一部の実施形態において、関心のある遺伝子はインスリン様成長因子１（ＩＧＦ－１）をコードする。一部の実施形態において、関心のあるタンパク質はＩＧＦ－１である。一部の場合には、関心のある遺伝子はサイトカインをコードする。一部の実施形態において、サイトカインはインターロイキンを含む。一部の実施形態において、関心のあるタンパク質は、インターロイキン４（ＩＬ－４）またはその機能的バリアントである。

【0095】

一部の場合には、関心のある遺伝子をコードする核酸配列を含む組み換えＲＮＡコンストラクトは、ヒトインスリン様成長因子１（ＩＧＦ－１）をコードする核酸配列を含み得る。一部の場合には、本明細書において使用されるＩＧＦ－１とは、ヒトＩＧＦ－１の天然配列（Ｕｎｉｐｒｏｔデータベース：Ｐ０５０１９、およびＧｅｎｂａｎｋデータベースにおける：ＮＭ＿００１１１１２８５．３）、断片、またはその機能的バリアントを指し得る。１つの実施形態において、組み換えＲＮＡコンストラクトは、ＩＧＦ－１をコードする核酸配列を含むネイキッドＲＮＡであり得る。この実施形態において、組み換えＲＮＡコンストラクトは、成熟ヒトＩＧＦ－１をコードする核酸配列を含み得る。ヒトＩＧＦ－１をコードする天然ＤＮＡ配列は、コドン最適化され得る。ヒトＩＧＦ－１の天然配列は、２１個のアミノ酸（ヌクレオチド１～６３）を有するシグナルペプチド、２７個のアミノ酸（ヌクレオチド６４～１４４）を有するプロ－ペプチド、７０個のアミノ酸（ヌクレオチド１４５～３５４）を有する成熟ヒトＩＧＦ－１、および７７個のアミノ酸（ヌクレオチド３５５～５８５）を有するＥ－ペプチドを含む。一部の実施形態において、組み換えＲＮＡコンストラクトは、ＩＧＦ－１のプロ－ペプチド（プロ－ドメインとも呼ばれる）をコードする核酸配列、ＩＧＦ－１の成熟タンパク質をコードする核酸配列、またはＩＧＦ－１のＥ－ペプチド（Ｅ－ドメインとも呼ばれる）（すなわち、カルボキシル末端伸長を有するＩＧＦ－１）を含み得る。一部の実施形態において、組み換えＲＮＡコンストラクトは、ＩＧＦ－１のＥ－ペプチドをコードする核酸配列を含まない。一部の実施形態において、組み換えＲＮＡコンストラクトは、ＩＧＦ－１のプロ－ペプチドをコードする核酸配列、ＩＧＦ－１の成熟タンパク質をコードする核酸配列、および脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）のシグナルペプチドをコードする核酸配列を含み得る。一部の実施形態において、ＩＧＦ－１はヒトＩＧＦ－１である。

【0096】

一部の実施形態において、組み換えＲＮＡコンストラクトは、２７個のアミノ酸を有する、ＩＧＦ－１の、好ましくはヒトＩＧＦ－１のプロ－ペプチドをコードする核酸配列、および成熟ＩＧＦ－１、好ましくは７０個のアミノ酸を有する成熟ヒトＩＧＦ－１をコードする核酸配列を含み得、好ましくはＩＧＦ－１のＥ－ペプチドをコードするヌクレオチド配列を含まず、好ましくはＩＧＦ－１のヒトＥ－ペプチドをコードする核酸配列を含まない。一部の実施形態において、組み換えＲＮＡコンストラクトは、２７個のアミノ酸を有する、ＩＧＦ－１の、好ましくはヒトＩＧＦ－１のプロ－ペプチドをコードする核酸配列、成熟ＩＧＦ－１、好ましくは７０個のアミノ酸を有する成熟ヒトＩＧＦ－１をコードする核酸配列、および脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）のシグナルペプチドをコードする核酸配列を含み得る。一部の実施形態において、組み換えＲＮＡコンストラクトは、ＩＧＦ－１のＥ－ペプチドをコードする核酸配列を含まず、より好ましくはＩＧＦ－１のヒトＥ－ペプチドをコードする核酸配列を含まない。

【0097】

一部の実施形態において、本明細書において提供される組み換えＲＮＡコンストラクトは、２７個のアミノ酸を有する、ヒトＩＧＦ－１のプロ－ペプチドをコードする核酸配列、および７０個のアミノ酸を有する成熟ヒトＩＧＦ－１をコードする核酸配列を含み得、好ましくはヒトＩＧＦ－１のＥ－ペプチドをコードする核酸配列を含まず、２７個のアミノ酸を有する、ヒトＩＧＦ－１のプロ－ペプチドをコードする核酸配列、および７０個のアミノ酸を有する成熟ヒトＩＧＦ－１をコードする核酸配列、およびＥ－ペプチドをコードする核酸配列は、ＵｎｉｐｒｏｔデータベースにおいてＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ０５０１９と称される。一部の実施形態において、本明細書に記載されるＩＧＦ－１は、配列番号３４または配列番号３６を含むアミノ酸配列を有し得る。

【0098】

一部の場合には、本明細書において提供される組み換えＲＮＡコンストラクトは、ＩＧＦ－１をコードするｍＲＮＡを含み得る。一部の実施形態において、ＩＧＦ－１をコードするｍＲＮＡとは、２７個のアミノ酸を有する、ヒトＩＧＦ－１のプロ－ペプチドをコードするヌクレオチド配列、および／または７０個のアミノ酸を有する成熟ヒトＩＧＦ－１をコードするヌクレオチド配列を含むｍＲＮＡを指し得る。ヒトＩＧＦ－１のプロ－ペプチドをコードするヌクレオチド配列、および成熟ヒトＩＧＦ－１をコードするヌクレオチド配列は、コドン最適化され得る。一部の場合には、本明細書において提供される組み換えＲＮＡコンストラクトは、１コピーのＩＧＦ－１ ｍＲＮＡを含み得る。一部の場合には、本明細書において提供される組み換えＲＮＡコンストラクトは、２コピー以上のＩＧＦ－１ ｍＲＮＡを含み得る。

【0099】

一部の場合には、本明細書において使用されるインターロイキン４（ＩＬ－４）またはＩＬ－４とは、ヒトＩＬ－４の天然配列（Ｕｎｉｐｒｏｔデータベース：Ｐ０５１１２、およびＧｅｎｂａｎｋデータベースにおける：ＮＭ＿０００５８９．４）、断片、またはその機能的バリアントを指し得る。ヒトＩＬ－４をコードする天然ＤＮＡ配列は、コドン最適化され得る。ヒトＩＬ－４の天然配列は、２４個のアミノ酸（ヌクレオチド１～７２）を有するシグナルペプチド、および１５３個のアミノ酸（ヌクレオチド７３～４５９）を有する成熟ヒトＩＬ－４を含む。一部の実施形態において、シグナルペプチドは、非修飾のＩＬ－４シグナルペプチドである。一部の実施形態において、シグナルペプチドは、少なくとも１つのアミノ酸の挿入、欠失、および／または置換によって改変されたＩＬ－４シグナルペプチドである。一部の実施形態において、本明細書において使用されるインターロイキン４（ＩＬ－４）またはＩＬ－４とは、成熟ヒトＩＬ－４を指し得る。一部の実施形態において、成熟タンパク質とは、該タンパク質を発現しかつ分泌する細胞において、小胞体において合成され、ゴルジ装置を介して分泌されるタンパク質を指し得る。一部の実施形態において、成熟ＩＬ－４とは、ＩＬ－４を発現しかつ分泌する細胞において、小胞体において合成され、ゴルジ装置を介して分泌されるＩＬ－４タンパク質を指し得る。一部の実施形態において、成熟ヒトＩＬ－４とは、ヒトＩＬ－４を発現しかつ分泌するヒト細胞において、小胞体において合成され、ゴルジ装置を介して分泌されるＩＬ－４タンパク質を指し得、通常、配列番号３１に示されるヌクレオチドによってコードされるアミノ酸を含有する。一部の実施形態において、本明細書に記載されるＩＬ－４は、配列番号３２または配列番号４２を含むアミノ酸配列を有し得る。

【0100】

ＩＬ－４をコードするｍＲＮＡとは、１５３個のアミノ酸を有する、ヒトＩＬ－４のプロ－ペプチドをコードするヌクレオチド配列、または１２９個のアミノ酸を有する成熟ヒトＩＬ－４をコードするヌクレオチド配列を含むｍＲＮＡを指し得る。ヒトＩＬ－４のプロ－ペプチドをコードするヌクレオチド配列、および成熟ヒトＩＬ－４をコードするヌクレオチド配列は、コドン最適化され得る。一部の場合には、本明細書において提供される組み換えＲＮＡコンストラクトは、１コピーのＩＬ－４ ｍＲＮＡを含み得る。一部の場合には、本明細書において提供される組み換えＲＮＡコンストラクトは、２コピー以上のＩＬ－４ ｍＲＮＡを含み得る。

【0101】

標的モチーフ
標的モチーフを含む組み換えＲＮＡコンストラクトを含む組成物が本明細書において提供される。本明細書において使用される標的モチーフまたは標的化モチーフとは、細胞質またはサイトゾルを除いた、細胞膜、細胞外コンパートメント、または細胞内コンパートメントの任意の部分に運命付けられる、新たに合成されたポリペプチドまたはタンパク質に存在する任意の短いペプチドを指し得る。一部の実施形態において、ペプチドとは、典型的には、近接アミノ酸残基のα－アミノおよびカルボキシル基の間のペプチド結合によって、一方からもう一方に接続された一連のアミノ酸残基を指し得る。細胞内コンパートメントは、核、核小体、エンドソーム、プロテアソーム、リボソーム、染色質、核膜、核孔、エキソソーム、メラノソーム、ゴルジ装置、ペルオキシソーム、小胞体（ＥＲ）、リソソーム、中心体、微小管、ミトコンドリア、葉緑体、マイクロフィラメント、中間フィラメント、または原形質膜等の細胞内オルガネラを含むが、それらに限定されるわけではない。一部の実施形態において、シグナルペプチドは、シグナル配列、標的化シグナル、局在化シグナル、局在化配列、輸送ペプチド、リーダー配列、またはリーダーペプチドと称され得る。一部の実施形態において、標的モチーフは、関心のある遺伝子をコードする核酸配列に動作可能に連結される。一部の実施形態において、「動作可能に連結された」という用語は、２種以上の核酸配列間の機能的関係性、例えば転写配列に対する転写制御配列またはシグナル配列の機能的関係性を指し得る。例えば、標的モチーフ、または標的モチーフをコードする核酸は、それが、コード配列によってコードされるポリペプチドを、細胞膜、細胞内、または細胞外コンパートメントに標的化することに関与するプレタンパク質として発現される場合、コード配列に動作可能に連結されている。例えば、シグナルペプチド、またはシグナルペプチドをコードする核酸は、それが、コード配列によってコードされるポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現される場合、コード配列に動作可能に連結されている。例えば、プロモーターは、それがコード配列の転写を刺激するまたはモジュレートする場合、動作可能に連結されている。標的モチーフの非限定的な例は、シグナルペプチド、核局在化シグナル（ＮＬＳ）、核小体局在化シグナル（ＮｏＬＳ）、リソソーム標的化シグナル、ミトコンドリア標的化シグナル、ペルオキシソーム標的化シグナル、微小管先端局在化シグナル（ＭｔＬＳ）、エンドソーム標的化シグナル、葉緑体標的化シグナル、ゴルジ標的化シグナル、小胞体（ＥＲ）標的化シグナル、プロテアソーム標的化シグナル、膜標的化シグナル、膜貫通標的化シグナル、中心体局在化シグナル（ＣＬＳ）、またはタンパク質を、細胞膜、細胞外コンパートメント、もしくは細胞内コンパートメントのある特定の部分に標的化する任意の他のシグナルを含む。

【0102】

シグナルペプチドとは、分泌経路へ運命付けられる、新たに合成されたタンパク質のＮ末端に存在する任意の短いペプチドである。本発明のシグナルペプチドは、１０～４０個のアミノ酸長であり得る。シグナルペプチドは、関心のあるタンパク質のＮ末端に、または関心のあるタンパク質のプロ－タンパク質形態のＮ末端に位置付けられ得る。シグナルペプチドは、真核生物起源のものであり得る。一部の実施形態において、シグナルペプチドは、哺乳動物タンパク質であり得る。一部の実施形態において、シグナルペプチドは、ヒトタンパク質であり得る。一部の場合には、シグナルペプチドは、同種シグナルペプチド（すなわち、同じタンパク質由来）または異種シグナルペプチド（すなわち、異なるタンパク質由来または合成シグナルペプチド）であり得る。一部の場合には、シグナルペプチドは、タンパク質の天然に存在するシグナルペプチド、または改変されたシグナルペプチドであり得る。

【0103】

標的モチーフを含む組み換えＲＮＡコンストラクトを含む組成物であって、標的モチーフは、（ａ）関心のある遺伝子によってコードされるタンパク質とは異種の標的モチーフ；（ｂ）関心のある遺伝子によってコードされるタンパク質とは異種の標的モチーフであって、関心のある遺伝子によってコードされるタンパク質とは異種の標的モチーフは、少なくとも１つのアミノ酸の挿入、欠失、および／または置換によって改変されている、標的モチーフ；（ｃ）関心のある遺伝子によってコードされるタンパク質と同種の標的モチーフ；（ｄ）関心のある遺伝子によってコードされるタンパク質と同種の標的モチーフであって、関心のある遺伝子によってコードされるタンパク質と同種の標的モチーフは、少なくとも１つのアミノ酸の挿入、欠失、および／または置換によって改変されている、標的モチーフ；ならびに（ｅ）天然には標的モチーフの機能を有しない天然に存在するアミノ酸配列であって、天然に存在するアミノ酸配列は、少なくとも１つのアミノ酸の挿入、欠失、および／または置換によって任意選択で改変されている、天然に存在するアミノ酸配列、からなる群から選択され得る、組成物が本明細書において提供される。

【0104】

標的モチーフを含む組み換えＲＮＡコンストラクトを含む組成物であって、標的モチーフはシグナルペプチドである、組成物が本明細書において提供される。一部の実施形態において、シグナルペプチドは、（ａ）関心のある遺伝子によってコードされるタンパク質とは異種のシグナルペプチド；（ｂ）関心のある遺伝子によってコードされるタンパク質とは異種のシグナルペプチドであって、関心のある遺伝子によってコードされるタンパク質とは異種のシグナルペプチドは、タンパク質が酸化還元酵素ではないという条件で、少なくとも１つのアミノ酸の挿入、欠失、および／または置換によって改変されている、シグナルペプチド；（ｃ）関心のある遺伝子によってコードされるタンパク質と同種のシグナルペプチド；（ｄ）関心のある遺伝子によってコードされるタンパク質と同種のシグナルペプチドであって、関心のある遺伝子によってコードされるタンパク質と同種のシグナルペプチドは、少なくとも１つのアミノ酸の挿入、欠失、および／または置換によって改変されている、シグナルペプチド；ならびに（ｅ）天然にはシグナルペプチドの機能を有しない天然に存在するアミノ酸配列であって、天然に存在するアミノ酸配列は、少なくとも１つのアミノ酸の挿入、欠失、および／または置換によって任意選択で改変されている、天然に存在するアミノ酸配列、からなる群から選択される。一部の場合には、シグナルペプチドのＮ末端のアミノ酸１～９は、２より高い平均疎水性スコアを有する。

【0105】

一部の場合には、本明細書において使用される、関心のある遺伝子によってコードされるタンパク質とは異種の標的モチーフ、または関心のある遺伝子によってコードされるタンパク質とは異種のシグナルペプチドとは、タンパク質の天然に存在する標的モチーフまたはシグナルペプチドとは異なる、天然に存在する標的モチーフまたはシグナルペプチドを指し得る。例えば、標的モチーフまたはシグナルペプチドは、関心のある遺伝子に由来しない。通常、所与のタンパク質とは異種の標的モチーフまたはシグナルペプチドは、所与のタンパク質とは関係しない別のタンパク質由来の標的モチーフまたはシグナルペプチドである。例えば、所与のタンパク質とは異種の標的モチーフまたはシグナルペプチドは、所与のタンパク質の標的モチーフまたはシグナルペプチドのアミノ酸配列と５０％、６０％、７０％、８０％、９０％を上回って、または９５％を上回って異なるアミノ酸配列を有する。異種配列は、同じ生物体に由来し得るものの、それらは、天然に（天然には）、同じｍＲＮＡに等、同じ核酸分子に存在しない。タンパク質とは異種の標的モチーフまたはシグナルペプチド、および標的モチーフまたはシグナルペプチドがそれに対して異種であるタンパク質は、同じまたは異なる起源のものであり得る。一部の実施形態において、それらは真核生物起源のものである。一部の実施形態において、それらは、同じ真核生物生物体のものである。一部の実施形態において、それらは哺乳動物起源のものである。一部の実施形態において、それらは、同じ哺乳動物生物体のものである。一部の実施形態において、それらはヒト起源である。例えば、ＲＮＡコンストラクトは、ヒトＩＬ－４遺伝子、および別のヒトタンパク質のシグナルペプチドをコードする核酸配列を含み得る。一部の実施形態において、ＲＮＡコンストラクトは、タンパク質とは異種のシグナルペプチドを含み得、シグナルペプチドおよびタンパク質は、同じ起源のもの、すなわちヒト起源のものである。

【0106】

一部の場合には、本明細書において使用される、関心のある遺伝子によってコードされるタンパク質と同種の標的モチーフ、または関心のある遺伝子によってコードされるタンパク質と同種のシグナルペプチドとは、タンパク質の天然に存在する標的モチーフまたはシグナルペプチドを指し得る。タンパク質と同種の標的モチーフまたはシグナルペプチドは、それが天然に存在することから、タンパク質の遺伝子によってコードされる標的モチーフまたはシグナルペプチドである。タンパク質と同種の標的モチーフまたはシグナルペプチドは、通常、真核生物起源のものである。一部の実施形態において、タンパク質と同種の標的モチーフまたはシグナルペプチドは、哺乳動物起源のものである。一部の実施形態において、タンパク質と同種の標的モチーフまたはシグナルペプチドは、ヒト起源のものである。

【0107】

一部の場合には、本明細書において使用される、天然には標的モチーフの機能を有しない天然に存在するアミノ酸配列、または天然にはシグナルペプチドの機能を有しない天然に存在するアミノ酸配列とは、天然に存在し、天然に存在するいかなる標的モチーフまたはシグナルペプチドのアミノ酸配列とも同一でないアミノ酸配列を指し得る。天然には標的モチーフまたはシグナルペプチドの機能を有しない天然に存在するアミノ酸配列は、１０～５０個のアミノ酸長であり得る。一部の実施形態において、天然には標的モチーフまたはシグナルペプチドの機能を有しない天然に存在するアミノ酸配列は、真核生物起源のものであり、真核生物起源のいかなる標的モチーフまたはシグナルペプチドとも同一でない。一部の実施形態において、天然には標的モチーフまたはシグナルペプチドの機能を有しない天然に存在するアミノ酸配列は、哺乳動物起源のものであり、哺乳動物起源のいかなる標的モチーフまたはシグナルペプチドとも同一でない。一部の実施形態において、天然には標的モチーフまたはシグナルペプチドの機能を有しない天然に存在するアミノ酸配列は、ヒト起源のものであり、天然に存在するヒト起源のいかなる標的モチーフまたはシグナルペプチドとも同一でない。天然には標的モチーフまたはシグナルペプチドの機能を有しない天然に存在するアミノ酸配列は、通常、タンパク質のコード配列のアミノ酸配列である。本明細書において使用される「天然に存在する」、「天然の」、および「天然には」という用語は、等価の意味を有する。

【0108】

一部の場合には、本明細書において使用されるシグナルペプチドのＮ末端のアミノ酸１～９とは、シグナルペプチドのアミノ酸配列のＮ末端の最初の９個のアミノ酸を指し得る。類似的に、本明細書において使用されるシグナルペプチドのＮ末端のアミノ酸１～７とは、シグナルペプチドのアミノ酸配列のＮ末端の最初の７個のアミノ酸を指し得、シグナルペプチドのＮ末端のアミノ酸１～５とは、シグナルペプチドのアミノ酸配列のＮ末端の最初の５個のアミノ酸を指し得る。

【0109】

一部の場合には、少なくとも１つのアミノ酸の挿入、欠失、および／または置換によって改変されたアミノ酸配列とは、アミノ酸配列内に少なくとも１つのアミノ酸のアミノ酸置換、挿入、および／または欠失を含むアミノ酸配列を指し得る。例えば、関心のある遺伝子によってコードされるタンパク質とは異種の標的モチーフは、少なくとも１つのアミノ酸の挿入、欠失、および／もしくは置換によって改変され、または関心のある遺伝子によってコードされるタンパク質とは異種のシグナルペプチドは、本明細書において使用されるように、少なくとも１つのアミノ酸の挿入、欠失、および／もしくは置換によって改変され、その天然に存在するアミノ酸配列内に少なくとも１つのアミノ酸のアミノ酸置換、挿入、および／または欠失を含む、タンパク質とは異種の天然に存在する標的モチーフまたはシグナルペプチドのアミノ酸配列を指し得る。例えば、関心のある遺伝子によってコードされるタンパク質と同種の標的モチーフは、少なくとも１つのアミノ酸の挿入、欠失、および／もしくは置換によって改変され、または関心のある遺伝子によってコードされるタンパク質と同種のシグナルペプチドは、本明細書において使用されるように、少なくとも１つのアミノ酸の挿入、欠失、および／もしくは置換によって改変され、その天然に存在するアミノ酸配列内に少なくとも１つのアミノ酸のアミノ酸置換、挿入、および／または欠失を含む、タンパク質と同種の天然に存在する標的モチーフまたはシグナルペプチドを指し得る。一部の実施形態において、天然に存在するアミノ酸配列は、少なくとも１つのアミノ酸の挿入、欠失、および／または置換によって改変され得、天然に存在するアミノ酸配列は、その天然に存在するアミノ酸配列内に少なくとも１つのアミノ酸のアミノ酸置換、挿入、および／または欠失を含み得る。アミノ酸置換または置換とは、別のアミノ酸での、アミノ酸またはポリペプチド配列における特定の位置でのアミノ酸の置き換えを指し得る。例えば、置換Ｒ３４Ｋとは、３４位におけるアルギニン（ＡｒｇまたはＲ）がリジン（ＬｙｓまたはＫ）で置き換えられているポリペプチドを指す。先行する例に関して、３４Ｋは、リジン（ＬｙｓまたはＫ）での、３４位におけるアミノ酸の置換を示す。一部の実施形態において、複数の置換は、典型的にスラッシュによって分離される。例えば、Ｒ３４Ｋ／Ｌ３８Ｖとは、置換Ｒ３４ＫおよびＬ３８Ｖを含むバリアントを指す。アミノ酸挿入または挿入とは、アミノ酸またはポリペプチド配列における特定の位置でのアミノ酸の付加を指し得る。例えば、挿入－３４とは、３４位における挿入を指定する。アミノ酸欠失または欠失とは、アミノ酸またはポリペプチド配列における特定の位置でのアミノ酸の除去を指し得る。例えば、Ｒ３４－とは、３４位におけるアルギニン（ＡｒｇまたはＲ）の欠失を指定する。

【0110】

一部の場合には、欠失したアミノ酸は、－０．８、－０．７、－０．６、－０．５、－０．４、－０．３、－０．２、－０．１、０、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８を下回る、または１．９を下回る疎水性スコアを有するアミノ酸である。一部の場合には、置換するアミノ酸は、置換されたアミノ酸の疎水性スコアよりも高い疎水性スコアを有するアミノ酸である。例えば、置換するアミノ酸は、２．８以上または３．８以上の疎水性スコアを有するアミノ酸である。一部の場合には、挿入されたアミノ酸は、２．８以上または３．８以上の疎水性スコアを有するアミノ酸である。

【0111】

一部の場合には、本明細書に記載されるアミノ酸配列は、１～１５個のアミノ酸挿入、欠失、および／または置換を含み得る。一部の実施形態において、本明細書に記載されるアミノ酸配列は、１～７個のアミノ酸挿入、欠失、および／または置換を含み得る。一部の場合には、本明細書に記載されるアミノ酸配列は、アミノ酸挿入、欠失、および／または置換を含まなくてもよい。一部の場合には、本明細書に記載されるアミノ酸配列は、標的モチーフまたはシグナルペプチドのアミノ酸配列のＮ末端のアミノ酸１～３０の中に、１～１５個のアミノ酸挿入、欠失、および／または置換を含み得る。一部の実施形態において、本明細書に記載されるアミノ酸配列は、標的モチーフまたはシグナルペプチドのアミノ酸配列のＮ末端のアミノ酸１～３０の中に、１～９個のアミノ酸挿入、欠失、および／または置換を含み得る。一部の場合には、本明細書に記載されるアミノ酸配列は、標的モチーフまたはシグナルペプチドのアミノ酸配列のＮ末端のアミノ酸１～２０の中に、１～１５個のアミノ酸挿入、欠失、および／または置換を含み得る。一部の実施形態において、本明細書に記載されるアミノ酸配列は、標的モチーフまたはシグナルペプチドのアミノ酸配列のＮ末端のアミノ酸１～２０の中に、１～９個のアミノ酸挿入、欠失、および／または置換を含み得る。一部の場合には、本明細書に記載されるアミノ酸配列の少なくとも１つのアミノ酸は、欠失および／または置換によって任意選択で改変され得る。

【0112】

一部の場合には、改変されたシグナルペプチドのアミノ酸配列のＮ末端の最初の９個のアミノ酸の平均疎水性スコアは、改変なしのシグナルペプチドと比較して、１．０単位以上増加する。一部の場合には、疎水性（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ）スコアまたは疎水性（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃｉｔｙ）スコアは、本明細書においてハイドロパシースコアと同義的に使用され得、Ｋｙｔｅ－Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ尺度に従って算出される、アミノ酸の疎水性の程度を指し得る（Ｋｙｔｅ Ｊ．、Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ Ｒ．Ｆ．；Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５～１３２（１９８２））。Ｋｙｔｅ－Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ尺度に従ったアミノ酸疎水性スコアは、以下のとおりである：

【0113】

【0114】

一部の場合には、アミノ酸配列の平均疎水性スコアは、アミノ酸の数で割った、アミノ酸配列のアミノ酸のそれぞれについてのＫｙｔｅ－Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ尺度に従った疎水性スコアを足すことによって算出され得る。例えば、シグナルペプチドのアミノ酸配列のＮ末端のアミノ酸１～９の平均疎水性スコアは、９で割った、９個のアミノ酸のそれぞれについての疎水性スコアを足すことによって算出され得る。

【0115】

極性は、Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ極性指数（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ Ｊ．Ｍ．、Ｅｌｉｅｚｅｒ Ｎ．、Ｓｉｍｈａ Ｒ．；Ｊ．Ｔｈｅｏｒ．Ｂｉｏｌ．２１：１７０～２０１（１９６８））に従って算出される。一部の実施形態において、アミノ酸配列の平均極性は、アミノ酸の数で割った、アミノ酸配列のアミノ酸のそれぞれについてのＺｉｍｍｅｒｍａｎ極性指数に従って算出された極性値を足すことによって算出され得る。例えば、シグナルペプチドのアミノ酸配列のＮ末端のアミノ酸１～９の平均極性は、９で割った、Ｎ末端のアミノ酸１～９の９個のアミノ酸のそれぞれについての平均極性を足すことによって算出され得る。Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ極性指数に従ったアミノ酸の極性は、以下のとおりである：

【0116】

【0117】

一部の場合には、インスリン様成長因子１（ＩＧＦ－１）の天然に存在するシグナルペプチドは、１つまたは複数の置換、欠失、および／または挿入によって改変され得、ＩＧＦ－１の天然に存在するシグナルペプチドは、ＵｎｉｐｒｏｔデータベースにおいてＰ０５０１９としてのおよびＧｅｎｂａｎｋデータベースにおいてＮＭ＿００１１１１２８５．３としてのＩＧＦ－１アミノ酸配列のアミノ酸１～２０を指す。一部の場合には、ＩＧＦ－１シグナルペプチドのアミノ酸配列は、Ｇ２Ｌ、Ｋ３－、Ｓ５Ｌ、Ｔ９Ｌ、Ｑ１０Ｌ、およびＣ１５－からなる群から選択される１つまたは複数の置換、欠失、および／または挿入によって改変され得る。一部の場合には、ＩＧＦ－１の天然に存在するシグナルペプチドは、別のタンパク質のシグナルペプチドで置き換えられ得る。一部の場合には、ＩＧＦ－１の天然に存在するシグナルペプチドは、別のタンパク質の天然に存在するシグナルペプチドで置き換えられ得る。例えば、ＩＧＦ－１の天然に存在するシグナルペプチドは、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）の天然に存在するシグナルペプチドで置き換えられ得る。一部の実施形態において、野生型（ＷＴ）ＩＧＦ－１シグナルペプチドアミノ酸配列は、配列番号４９を含む配列を含む。一部の場合には、改変されたＩＧＦ－１シグナルペプチドは、配列番号４５に示されるＤＮＡ配列によってコードされる配列番号４４を含む配列を含むアミノ酸配列を有する。一部の実施形態において、改変されたＩＧＦ－１シグナルペプチドは、別のタンパク質由来のシグナルペプチドを含み得る。一部の場合には、改変されたＩＧＦ－１シグナルペプチドは、配列番号５２に示されるＤＮＡ配列によってコードされる配列番号５１を含む配列を含むアミノ酸配列を有する。

【0118】

配列番号４４
Ｍｅｔ－Ｌｅｕ－Ｉｌｅ－Ｌｅｕ－Ｌｅｕ－Ｌｅｕ－Ｐｒｏ－Ｌｅｕ－Ｌｅｕ－Ｌｅｕ－Ｐｈｅ－Ｌｙｓ－Ｃｙｓ－Ｐｈｅ－Ｃｙｓ－Ａｓｐ－Ｐｈｅ－Ｌｅｕ－Ｌｙｓ

【0119】

配列番号４５
ＡＴＧＣＴＧＡＴＴＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＣＣＣＴＧＣＴＧＣＴＧＴＴＣＡＡＧＴＧＣＴＴＣＴＧＣＧＡＣＴＴＣＣＴＧＡＡＡ

【0120】

配列番号５１
ＭＴＩＬＦＬＴＭＶＩＳＹＦＧＣＭＫＡ

【0121】

配列番号５２
ＡＴＧＡＣＣＡＴＣＣＴＧＴＴＴＣＴＧＡＣＡＡＴＧＧＴＣＡＴＣＡＧＣＴＡＣＴＴＣＧＧＣＴＧＣＡＴＧＡＡＧＧＣＣ

【0122】

一部の場合には、ＩＧＦ－１のプロ－ペプチドは改変され得る。一部の実施形態において、天然にはシグナルペプチドの機能を有しない、ＩＧＦ－１のプロ－ペプチドの天然に存在するアミノ酸配列（ＵｎｉｐｒｏｔデータベースＰ０５０１９として）は、プロ－ペプチドのＮ末端における隣接する２２～３１の１０個のアミノ酸残基（ＶＫＭＨＴＭＳＳＳＨ（配列番号４８））の欠失によって改変され、配列番号４５に示されるＤＮＡ配列によってコードされる配列番号４６に示されるアミノ酸配列を好ましくは有する。

【0123】

配列番号４６
Ｍｅｔ－Ｌｅｕ－Ｐｈｅ－Ｔｙｒ－Ｌｅｕ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ｃｙｓ－Ｌｅｕ－Ｌｅｕ－Ｔｈｒ－Ｐｈｅ－Ｔｈｒ－Ｓｅｒ－Ｓｅｒ－Ａｌａ－Ｔｈｒ－Ａｌａ

【0124】

配列番号４７
ＡＴＧＣＴＧＴＴＣＴＡＴＣＴＧＧＣＣＣＴＧＴＧＣＣＴＧＣＴＧＡＣＣＴＴＴＡＣＣＡＧＣＴＣＴＧＣＴＡＣＣＧＣＣ

【0125】

一部の場合には、ＩＧＦ－１のプロ－ペプチドをコードする核酸配列、および成熟ＩＧＦ－１をコードする核酸配列を含むが、ＩＧＦ－１のＥ－ペプチドをコードする核酸配列を含まないｍＲＮＡは、２７個のアミノ酸を有する、ヒトＩＧＦ－１のプロ－ペプチドをコードするヌクレオチド配列、および７０個のアミノ酸を有する成熟ヒトＩＧＦ－１をコードするヌクレオチド配列を含むが、ヒトＩＧＦ－１のＥ－ペプチドをコードするヌクレオチド配列を含まない、すなわちＥａ－、Ｅｂ－、またはＥｃ－ドメインをコードするヌクレオチド配列を含まないｍＲＮＡを指し得る。２７個のアミノ酸を有する、ヒトＩＧＦ－１のプロ－ペプチドをコードするヌクレオチド配列、および７０個のアミノ酸を有する成熟ヒトＩＧＦ－１をコードするヌクレオチド配列は、コドン最適化され得る。

【0126】

一部の場合には、インターロイキン４（ＩＬ－４）の天然に存在するシグナルペプチドは、１つまたは複数の置換、欠失、および／または挿入によって改変され得、ＩＬ－４の天然に存在するシグナルペプチドは、ＵｎｉｐｒｏｔデータベースにおいてＰ０５１１２としてのおよびＧｅｎｂａｎｋデータベースにおいてＮＭ＿０００５８９．４としてのＩＬ－４アミノ酸配列のアミノ酸１～２４を指す。一部の場合には、野生型（ＷＴ）ＩＬ－４シグナルペプチドアミノ酸配列は、配列番号５３に示される配列を含む。一部の場合には、ＷＴ ＩＬ－４シグナルペプチドは、配列番号５４に示されるＤＮＡ配列によってコードされる。一部の場合には、改変されたＩＬ－４シグナルペプチドは、配列番号５５に示される配列を含むアミノ酸配列を有する。一部の場合には、改変されたＩＬ－４シグナルペプチドは、配列番号５６に示されるＤＮＡ配列によってコードされる。

【0127】

リンカー
一部の態様において、第１のＲＮＡ配列、第２のＲＮＡ配列、およびリンカーＲＮＡ配列を含む組み換えＲＮＡコンストラクトを含む組成物であって、（ｉ）第１のＲＮＡ配列は、第１の低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）配列であり；（ｉｉ）第２のＲＮＡ配列は、第２のｓｉＲＮＡ配列、または関心のある遺伝子（ＧＯＩ）をコードする第１のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）配列であり；（ｉｉｉ）リンカーＲＮＡ配列は、第１のＲＮＡ配列と第２のＲＮＡ配列とを連結し、リンカーＲＮＡ配列は、式（Ｉ）：Ｘ_ｍＣＡＡＣＡＡＸ_ｎ［式中、Ｘは任意のヌクレオチドであり、ｍは１～１２の整数であり、ｎは０～４の整数である］；および式（ＩＩ）：Ｘ_ｐＴＣＣＣＸ_ｒ［式中、Ｘは任意のヌクレオチドであり、ｐは０～１７の整数であり、ｒは０～１３の整数である］からなる群から選択される構造を有する、組成物が本明細書において提供される。

【0128】

一部の態様において、第１のＲＮＡ配列、第２のＲＮＡ配列、およびリンカーＲＮＡ配列を含む組み換えＲＮＡコンストラクトを含む組成物であって、（ｉ）第１のＲＮＡ配列は、第１の低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）配列であり；（ｉｉ）第２のＲＮＡ配列は、第２のｓｉＲＮＡ配列、または関心のある遺伝子（ＧＯＩ）をコードする第１のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）配列であり；（ｉｉｉ）リンカーＲＮＡ配列は、第１のＲＮＡ配列と第２のＲＮＡ配列とを連結し、リンカーＲＮＡ配列は、ＡＣＡＡＣＡＡを含む配列を含む、組成物が本明細書において提供される。

【0129】

一部の態様において、第１のＲＮＡ配列、第２のＲＮＡ配列、およびリンカーＲＮＡ配列を含む組み換えＲＮＡコンストラクトを含む組成物であって、（ｉ）第１のＲＮＡ配列は、第１の低分子干渉（ｓｉＲＮＡ）配列であり；（ｉｉ）第２のＲＮＡ配列は、第２のｓｉＲＮＡ配列、または関心のある遺伝子（ＧＯＩ）をコードする第１のメッセンジャー（ｍＲＮＡ）配列であり；（ｉｉｉ）リンカーＲＮＡ配列は、第１のＲＮＡ配列と第２のＲＮＡ配列とを連結し、（ａ）リンカーＲＮＡ配列は、ＴＴＴＡＴＣＴＴＡＧＡＧＧＣＡＴＡＴＣＣＣＴＡＣＧＴＡＣＣＡＡＣＡＡもしくはＡＴＡＧＴＧＡＧＴＣＧＴＡＴＴＡＡＣＧＴＡＣＣＡＡＣＡＡではないか；または（ｂ）リンカーＲＮＡ配列は、ＲＮＡｆｏｌｄウェブサーバーに従った二次構造を形成しない、組成物が本明細書において提供される。

【0130】

一部の実施形態において、第２のＲＮＡ配列は、第２のｓｉＲＮＡ配列である。一部の実施形態において、リンカーＲＮＡ配列は、ＡＣＡＡＣＡＡ、ＡＴＣＣＣＴＡＣＧＴＡＣＣＡＡＣＡＡ、ＡＣＧＴＡＣＣＡＡＣＡＡ、ＴＣＣＣ、またはＡＣＡＡＣＡＡＴＣＣＣを含む。一部の実施形態において、組み換えＲＮＡコンストラクトは、ＧＯＩをコードする第１のｍＲＮＡ配列をさらに含む。一部の実施形態において、第２のＲＮＡ配列は、ＧＯＩをコードする第１のｍＲＮＡ配列である。

【0131】

一部の実施形態において、リンカーＲＮＡ配列は、ＡＣＡＡＣＡＡ、ＡＴＡＧＴＧＡＧＴＣＧＴＡＴＴＡＴＣＣＣ、ＡＴＡＧＴＧＡＧＴＣＧＴＡＴＴＡＡＣＡＡＣＡＡＴＣＣＣ、ＡＴＡＧＴＧＡＧＴＣＧＴＡＴＴＡＡＣＡＡＣＡＡ、ＡＴＡＧＴＧＡＧＴＣＧＴＡＴＴＡＡＴＣＣＣＴＡＣＧＴＡＣＣＡＡＣＡＡ、またはＡＴＡＧＴＧＡＧＴＣＧＴＡＴＴＡＡＣＧＴＡＣＣＡＡＣＡＡを含む。

【0132】

一部の実施形態において、組み換えＲＮＡコンストラクトは、ＧＯＩをコードする第２のｍＲＮＡ配列をさらに含む。一部の実施形態において、組み換えＲＮＡコンストラクトは、第２のｓｉＲＮＡ配列をさらに含む。一部の実施形態において、組み換えＲＮＡコンストラクトは、第３のｓｉＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態において、組み換えＲＮＡコンストラクトは、４種、５種、またはそれより多くのｓｉＲＮＡ配列をさらに含む。一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡ配列のそれぞれは、標的ＲＮＡに結合し、標的ＲＮＡの発現をモジュレートする。

【0133】

一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡ配列のそれぞれは、（ａ）異なる標的ＲＮＡ；（ｂ）同じ標的ＲＮＡの異なる領域；（ｃ）同じ標的ＲＮＡの同じ領域；または（ｄ）その任意の組み合わせ、に結合し得る。一部の実施形態において、（ｃ）のｓｉＲＮＡ配列は同じである。一部の実施形態において、組み換えＲＮＡコンストラクトは、それぞれがＧＯＩをコードする３種、４種、５種、またはそれより多くのｍＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態において、ｍＲＮＡ配列のそれぞれは、同じＧＯＩをコードする。一部の実施形態において、ｍＲＮＡ配列のそれぞれは、異なるＧＯＩをコードする。

【0134】

一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡ配列間のリンカーＲＮＡ配列の長さは、約４～約２７ヌクレオチドである。一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡ配列間のリンカーＲＮＡ配列の長さは、約４～約１８ヌクレオチドである。一部の実施形態において、ｍは１であり、ｎは０である。一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡ配列間のリンカーＲＮＡ配列は、ＡＣＡＡＣＡＡＴＣＣＣである。一部の実施形態において、リンカーＲＮＡ配列は、ＡＣＡＡＣＡＡである。一部の実施形態において、リンカーＲＮＡ配列は、配列番号８５、８７～９５からなる群から選択される配列を含む。一部の実施形態において、リンカーＲＮＡ配列は、配列番号８５に従った配列を含む。

【0135】

一部の実施形態において、ＧＯＩの発現はモジュレートされる。一部の実施形態において、ＧＯＩの発現は、ＧＯＩによってコードされるタンパク質を発現させることによって上方調節される。一部の実施形態において、標的ＲＮＡの発現はモジュレートされる。一部の実施形態において、標的ＲＮＡの発現は、標的ＲＮＡに結合し得るｓｉＲＮＡ配列によって下方調節される。一部の実施形態において、標的ＲＮＡに結合し得るｓｉＲＮＡ配列は、ＧＯＩの発現を阻害しない。

【0136】

一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡ配列間のＲＮＡリンカー配列は、ＲＮＡｆｏｌｄウェブサーバーに従った二次構造を形成しない。一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡ配列は、ＲＮＡｆｏｌｄウェブサーバーに従った二次構造を形成する。

【0137】

一部の実施形態において、組み換えＲＮＡコンストラクトは切断される。一部の実施形態において、組み換えＲＮＡコンストラクトは、細胞内タンパク質によって切断される。一部の実施形態において、組み換えＲＮＡコンストラクトは、内因性タンパク質によって切断される。一部の実施形態において、組み換えＲＮＡコンストラクトは、内因性ＤＩＣＥＲによって切断される。

【0138】

一部の実施形態において、組み換えＲＮＡコンストラクトの切断は、式（Ｉ）および式（ＩＩ）からなる群から選択される構造を有するリンカーを含まないＲＮＡコンストラクトの切断と比較して増強される。一部の実施形態において、組み換えＲＮＡコンストラクトの切断は、ＡＣＡＡＣＡＡを含む配列を含むリンカーを含まないＲＮＡコンストラクトの切断と比較して増強される。一部の実施形態において、組み換えＲＮＡコンストラクトの切断は、二次構造を形成するリンカーを含むＲＮＡコンストラクトの切断と比較して増強される。

【0139】

一部の実施形態において、関心のある遺伝子の発現は、式（Ｉ）および式（ＩＩ）からなる群から選択される構造を有するリンカーを含まないＲＮＡコンストラクトからの関心のある遺伝子の発現と比較して増強される。一部の実施形態において、関心のある遺伝子の発現は、ＡＣＡＡＣＡＡを含む配列を含むリンカーを含まないＲＮＡコンストラクトからの関心のある遺伝子の発現と比較して増強される。

【0140】

一部の態様において、配列番号１～２４および９７～１０８からなる群から選択される核酸配列を含む組み換えポリ核酸コンストラクトを含む組成物が本明細書において提供される。

【0141】

発現ベクター、およびＲＮＡコンストラクトの産生
本明細書に記載される組み換えＲＮＡコンストラクトをコードする組み換えポリ核酸コンストラクトを含む組成物が本明細書において提供される。第１のＲＮＡ配列および第２のＲＮＡ配列を含む組み換えＲＮＡコンストラクトをコードする組み換えポリ核酸コンストラクトを含む組成物が本明細書において提供される。一部の場合には、第１のＲＮＡ配列または第２のＲＮＡ配列は、関心のある遺伝子をコードし得る。一部の実施形態において、第１のＲＮＡ配列または第２のＲＮＡ配列は、関心のある遺伝子をコードするｍＲＮＡであり得る。一部の場合には、第１のＲＮＡ配列または第２のＲＮＡ配列は、１種または複数の標的ＲＮＡの発現をモジュレートする少なくとも２種の遺伝子エレメントを含み得る。一部の実施形態において、第１のＲＮＡ配列または第２のＲＮＡ配列は、それぞれが標的ＲＮＡに結合し得る少なくとも２種のｓｉＲＮＡを含み得る。例えば、関心のある遺伝子をコードするｍＲＮＡは、ＩＬ－４またはＩＧＦ－１のｍＲＮＡであり得る。例えば、標的ＲＮＡは、ＴＮＦ－アルファ、ＩＬ－１７、ＩＬ－８、ＩＬ－１ベータ、またはＴｕｒｂｏ ＧＦＰのｍＲＮＡであり得る。

【0142】

関連した態様において、組み換えＲＮＡコンストラクトをコードする組み換えポリ核酸コンストラクトは、２、３、４、５種、またはそれより多くのｓｉＲＮＡ種をコードし得る。関連した態様において、組み換えＲＮＡコンストラクトをコードする組み換えポリ核酸コンストラクトは、標的ｍＲＮＡに向けられた２種のｓｉＲＮＡ種をコードし得る。関連した態様において、組み換えＲＮＡコンストラクトをコードする組み換えポリ核酸コンストラクトは、それぞれが標的ｍＲＮＡに向けられた３種のｓｉＲＮＡをコードし得る。関連した態様において、ｓｉＲＮＡ種のそれぞれは、同じ配列、異なる配列、またはその組み合わせを含み得る。例えば、組み換えＲＮＡコンストラクトをコードする組み換えポリ核酸コンストラクトは、それぞれが、標的ｍＲＮＡの同じ領域または配列に向けられた３種のｓｉＲＮＡをコードし得る。例えば、組み換えＲＮＡコンストラクトをコードする組み換えポリ核酸コンストラクトは、それぞれが、標的ｍＲＮＡの異なる領域または配列に向けられた３種のｓｉＲＮＡをコードし得る。一部の態様において、組み換えＲＮＡコンストラクトをコードする組み換えポリ核酸コンストラクトは、３種のｓｉＲＮＡ種をコードし得、３種のｓｉＲＮＡ種のそれぞれは、異なる標的ｍＲＮＡに向けられる。一部の実施形態において、標的ｍＲＮＡは、ＴＮＦ－アルファｍＲＮＡ、ＩＬ－８ ｍＲＮＡ、ＩＬ－１７ ｍＲＮＡ、Ｔｕｒｂｏ ＧＦＰ ｍＲＮＡ、またはＩＬ－１ベータｍＲＮＡであり得る。関連した態様において、組み換えポリ核酸コンストラクトは、配列番号１３～２４からなる群から選択される配列を含み得る。

【0143】

本明細書に記載されるポリ核酸コンストラクトは、ＤＮＡ鎖を化学合成することによる、ＰＣＲによる、またはギブソン・アセンブリ法による等、当技術分野において公知の任意の方法によって獲得され得る。化学合成、またはＰＣＲ法の組み合わせ、またはギブソン・アセンブリ法によってポリ核酸コンストラクトを構築する利点は、融合タンパク質が宿主細胞において高いレベルで発現されることを確実にするように、コドンが最適化され得ることである。コドン最適化とは、関心のある宿主細胞における発現のために、その宿主細胞の遺伝子においてより高頻度にまたは最も高頻度に使用されるコドンで、天然配列の少なくとも１種のコドン（例えば、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、５０種より多くの、またはそれより多くのコドン）を置き換えることによって核酸配列を改変し、一方で天然アミノ酸配列を維持する過程を指し得る。コドン使用法の表は、例えば「Ｃｏｄｏｎ Ｕｓａｇｅ Ｄａｔａｂａｓｅ」で容易に入手可能であり、これらの表は、いくつかのやり方で適応され得る。特定の宿主細胞における発現のために、Ｇｅｎｅ Ｆｏｒｇｅ（登録商標）（Ａｐｔａｇｅｎ、ＰＡ）およびＧｅｎｅＯｐｔｉｍｉｚｅｒ（登録商標）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒ、ＭＡ）等、特定の配列をコドン最適化するためのコンピューターアルゴリズムも入手可能である。獲得され次第、ポリヌクレオチドは適切なベクターに組み入れられ得る。本明細書において使用されるベクターとは、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏにおける核酸の取り込み、増殖、発現、または伝達のための、天然に存在するまたは合成的に作出されたコンストラクト、例えばプラスミド、ミニサークル、ファージミド、コスミド、人工染色体／ミニ染色体、バクテリオファージ、バキュロウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、単純ヘルペスウイルス、バクテリオファージ等のウイルスを指し得る。ベクターを構築するために使用される方法は、当業者に周知であり、様々な刊行物に記載される。特に、プロモーター、エンハンサー、終結およびポリアデニル化シグナル、選択マーカー、複製の起点、ならびにスプライシングシグナル等の機能的および制御的成分の説明を含めた、適切なベクターを構築するための手法は、当業者に公知である。多様なベクターが当技術分野において周知であり、一部は、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、Ｃａｌｉｆ．；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆ．；Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；またはＩｎｖｉｖｏｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．等の会社から市販されている。ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写のためのベクターの非限定的な例は、ｐＴ７ＣＦＥ１－ＣＨｉｓ、ｐＭＸ（ｐＭＡ－Ｔ、ｐＭＡ－ＲＱ、ｐＭＣ、ｐＭＫ、ｐＭＳ、ｐＭＺ等）、ｐＥＶＬ、ｐＳＰ７３、ｐＳＰ７２、ｐＳＰ６４、およびｐＧＥＭ（ｐＧＥＭ（登録商標）－４Ｚ、ｐＧＥＭ（登録商標）－５Ｚｆ（＋）、ｐＧＥＭ（登録商標）－１１Ｚｆ（＋）、ｐＧＥＭ（登録商標）－９Ｚｆ（－）、ｐＧＥＭ（登録商標）－３Ｚｆ（＋／－）、ｐＧＥＭ（登録商標）－７Ｚｆ（＋／－）等）を含む。一部の場合には、組み換えポリ核酸コンストラクトはＤＮＡであり得る。

【0144】

本明細書に記載されるポリ核酸コンストラクトは、環状または線状であり得る。例えば、環状ポリ核酸コンストラクトは、ｐＭＸ、ｐＭＡ－Ｔ、ｐＭＡ－ＲＱ、またはｐＴ７ＣＦＥ１－ＣＨｉｓ等のベクターシステムを含み得る。例えば、線状ポリ核酸コンストラクトは、ｐＥＶＬ等の線状ベクター、または線状化ベクターを含み得る。一部の場合には、組み換えポリ核酸コンストラクトは、プロモーターをさらに含み得る。一部の場合には、プロモーターは、第１のＲＮＡ配列および第２のＲＮＡ配列をコードする配列の上流またはそれに対して５’に存在し得る。プロモーターの非限定的な例は、Ｔ３、Ｔ７、ＳＰ６、Ｐ６０、Ｓｙｎ５、およびＫＰ３４を含み得る。一部の場合には、本明細書において提供される組み換えポリ核酸コンストラクトは、ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡ（配列番号２６）を含む配列を含むＴ７プロモーターを含み得る。一部の場合には、組み換えポリ核酸コンストラクトは、コザック配列をコードする配列をさらに含む。コザック配列とは、タンパク質翻訳開始部位として機能する核酸配列モチーフを指し得る。コザック配列は、文献において、例えば本明細書における参照によりその全体として本明細書に組み入れられる、Ｋｏｚａｋ，Ｍ．、Ｇｅｎｅ ２９９（１－２）：１～３４によって詳細に記載される。一部の実施形態において、組み換えポリ核酸コンストラクトは、ＧＣＣＡＣＣ（配列番号２５）を含む配列を含むコザック配列をコードする配列を含む。一部の場合には、本明細書に記載される組み換えポリ核酸コンストラクトは、コドン最適化されていてもよい。

【0145】

それぞれが、１種または複数の標的ＲＮＡに結合し得るｓｉＲＮＡをコードする少なくとも２種の核酸配列と、関心のある遺伝子をコードする１種または複数の核酸配列とを含む、本明細書に記載されるＲＮＡコンストラクトをコードする組み換えポリ核酸コンストラクトを含む組成物であって、標的ＲＮＡに結合し得るｓｉＲＮＡは、関心のある遺伝子によってコードされるイントロン配列の一部ではない、組成物が本明細書において提供される。一部の場合には、関心のある遺伝子は、ＲＮＡスプライシングなしで発現される。一部の場合には、標的ＲＮＡに結合し得るｓｉＲＮＡは、関心のある遺伝子のイントロン配列によってコードされないまたはそれから構成されない。一部の場合には、標的ＲＮＡに結合し得るｓｉＲＮＡは、標的ＲＮＡのエクソンに結合する。一部の場合には、標的ＲＮＡに結合し得るｓｉＲＮＡは、１種の標的ＲＮＡに特異的に結合する。一部の場合には、組み換えポリ核酸コンストラクトは、配列番号１３～２４からなる群から選択される配列を含む核酸配列を含み得る。

【0146】

本明細書に記載されるＲＮＡコンストラクト組成物を産生する方法が本明細書において提供される。例えば、組み換えＲＮＡコンストラクトは、ＲＮＡポリメラーゼに対するプロモーター、関心のある遺伝子をコードする少なくとも１種の核酸配列、１種または複数の標的ｍＲＮＡに結合し得るｓｉＲＮＡをコードする少なくとも２種の核酸配列、およびポリ（Ａ）テールをコードする核酸配列、を含むポリ核酸コンストラクトからのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写によって産生され得る。ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写反応は、ＲＮＡポリメラーゼ、ヌクレオチドトリホスフェートの混合物（ＮＴＰ）、および／またはキャッピング酵素をさらに含み得る。ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写を使用してＲＮＡを産生すること、ならびに転写ＲＮＡを単離することおよび精製することについての詳細は、当技術分野において周知であり、例えばＢｅｃｋｅｒｔ＆Ｍａｓｑｕｉｄａ（（２０１１）Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ＲＮＡ ｂｙ Ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ．ＲＮＡ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ）、第７０３巻．Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ）に見出され得る。ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写産物キットの非限定的なリストは、ＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ（商標）Ｔ３転写キット、ＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ Ｔ７キット、ＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ（商標）ＳＰ６転写キット、ＭＡＸＩｓｃｒｉｐｔ（商標）Ｔ３転写キット、ＭＡＸＩｓｃｒｉｐｔ（商標）Ｔ７転写キット、ＭＡＸＩｓｃｒｉｐｔ（商標）ＳＰ６転写キット、ＭＡＸＩｓｃｒｉｐｔ（商標）Ｔ７／Ｔ３転写キット、ＭＡＸＩｓｃｒｉｐｔ（商標）ＳＰ６／Ｔ７転写キット、ｍＭＥＳＳＡＧＥ ｍＭＡＣＨＩＮＥ（商標）Ｔ３転写キット、ｍＭＥＳＳＡＧＥ ｍＭＡＣＨＩＮＥ（商標）Ｔ７転写キット、ｍＭＥＳＳＡＧＥ ｍＭＡＣＨＩＮＥ（商標）ＳＰ６転写キット、ＭＥＧＡｓｈｏｒｔｓｃｒｉｐｔ（商標）Ｔ７転写キット、ＨｉＳｃｒｉｂｅ（商標）Ｔ７ Ｈｉｇｈ Ｙｉｅｌｄ ＲＮＡ合成キット、ＨｉＳｃｒｉｂｅ（商標）Ｔ７ Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ転写キット、ＡｍｐｌｉＳｃｒｉｂｅ（商標）Ｔ７－Ｆｌａｓｈ（商標）転写キット、ＡｍｐｌｉＳｃｒｉｂｅ（商標）Ｔ７ Ｈｉｇｈ Ｙｉｅｌｄ転写キット、ＡｍｐｌｉＳｃｒｉｂｅ（商標）Ｔ７－Ｆｌａｓｈ（商標）ビオチン－ＲＮＡ転写キット、Ｔ７転写キット、ＨｉｇｈＹｉｅｌｄ Ｔ７ ＲＮＡ合成キット、ＤｕｒａＳｃｒｉｂｅ（登録商標）Ｔ７転写キット等を含む。

【0147】

ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写反応は、転写バッファーシステム、ヌクレオチドトリホスフェート（ＮＴＰ）、およびＲＮａｓｅ阻害剤をさらに含み得る。一部の実施形態において、転写バッファーシステムは、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）およびマグネシウムイオンを含み得る。ＮＴＰは、天然に存在するまたは天然に存在しない（修飾された）ＮＴＰであり得る。天然に存在しない（修飾された）ＮＴＰの非限定的な例は、Ｎ^１－メチルシュードウリジン、シュードウリジン、Ｎ^１－エチルシュードウリジン、Ｎ^１－メトキシメチルシュードウリジン、Ｎ^１－プロピルシュードウリジン、２－チオウリジン、４－チオウリジン、５－メトキシウリジン、５－メチルウルジン（ｍｅｔｈｙｌｕｒｄｉｎｅ）、５－カルボキシメチルエステルウリジン、５－ホルミルウリジン、５－カルボキシウリジン、５－ヒドロキシウリジン、５－ブロモウリジン、５－ヨードウリジン、５，６－ジヒドロウリジン、６－アザウリジン、チエノウリジン、３－メチルウリジン、１－カルボキシメチル－シュードウリジン、４－チオ－１－メチル－シュードウリジン、２－チオ－１－メチル－シュードウリジン、ジヒドロウリジン、ジヒドロシュードウリジン、２－メトキシウリジン、２－メトキシ－４－チオ－ウリジン、４－メトキシ－シュードウリジン、４－メトキシ－２－チオ－シュードウリジン、５－メチルシチジン、５－メトキシシチジン、５－ヒドロキシメチルシチジン、５－ホルミルシチジン、５－カルボキシシチジン、５－ヒドロキシシチジン、５－ヨードシチジン、５－ブロモシチジン、２－チオシチジン、５－アザシチジン、シュードイソシチジン、３－メチル－シチジン、Ｎ^４－アセチルシチジン、５－ホルミルシチジン、Ｎ^４－メチルシチジン、５－ヒドロキシメチルシチジン、１－メチル－シュードイソシチジン、４－メトキシ－シュードイソシチジン、および４－メトキシ－１－メチル－シュードイソシチジン、Ｎ^１－メチルアデノシン、Ｎ^６－メチルアデノシン、Ｎ^６－メチル－２－アミノアデノシン、Ｎ^６－イソペンテニルアデノシン、Ｎ^６，Ｎ^６－ジメチルアデノシン、７－メチルアデニン、２－メチルチオ－アデニン、ならびに２－メトキシ－アデニンを含む。ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの非限定的な例は、Ｔ３、Ｔ７、ＳＰ６、Ｐ６０、Ｓｙｎ５、およびＫＰ３４ ＲＮＡポリメラーゼを含む。一部の実施形態において、ＲＮＡポリメラーゼは、Ｔ３ ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ、Ｐ６０ ＲＮＡポリメラーゼ、Ｓｙｎ５ ＲＮＡポリメラーゼ、およびＫＰ３４ ＲＮＡポリメラーゼからなる群から選択される。

【0148】

本明細書に記載される転写ＲＮＡは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写反応混合物から単離され得、精製され得る。例えば、転写ＲＮＡは、カラム精製を使用して単離され得、精製され得る。ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写反応混合物から転写ＲＮＡを単離することおよび精製することについての詳細は、当技術分野において周知であり、任意の市販のキットが使用され得る。ＲＮＡ精製キットの非限定的なリストは、ＭＥＧＡｃｌｅａｒキット、Ｍｏｎａｒｃｈ（登録商標）ＲＮＡ Ｃｌｅａｎｕｐキット、ＥａｓｙＰｕｒｅ（登録商標）ＲＮＡ精製キット、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）ＲＮＡ Ｃｌｅａｎ－ｕｐ等を含む。

【0149】

治療的適用
疾患または病状の治療において有用な組成物が本明細書において提供される。一部の態様において、組成物は、疾患または病状を治療するまたは阻止するのに十分な量で存在するまたは投与される。一部の態様において、本明細書に記載される組成物または薬学的組成物をそれを必要とする対象に投与することを含む、疾患または病状を治療する方法が本明細書において提供される。一部の態様において、それを必要とする対象における疾患または病状を治療する方法における使用のための、本明細書に記載される組成物または薬学的組成物が本明細書において提供される。一部の態様において、それを必要とする対象における疾患または病状を治療するための医薬の製造のための、本明細書に記載される組成物または薬学的組成物の使用が本明細書において提供される。一部の実施形態において、疾患または病状は、皮膚疾患もしくは病状、または関節疾患もしくは病状を含む。一部の実施形態において、皮膚疾患または病状は炎症性皮膚障害を含む。一部の実施形態において、炎症性皮膚障害は乾癬を含む。一部の実施形態において、関節変性は、椎間板疾患（ＩＶＤＤ）または変形性関節症（ＯＡ）を含む。関心のある遺伝子をコードする第１のＲＮＡ配列と、１種または複数の標的ＲＮＡの発現をモジュレートする少なくとも２種の遺伝子エレメントを含む第２のＲＮＡ配列とを含む組み換えポリ核酸またはＲＮＡコンストラクト組成物であって、ヒト細胞と組み換えＲＮＡコンストラクトとを接触させることは、関心のある遺伝子をコードする第１のＲＮＡ配列と、１種または複数の標的ＲＮＡの発現をモジュレートする少なくとも２種の遺伝子エレメントのうちの多くとも１種を含む相当する第２のＲＮＡ配列とを含む相当する組み換えＲＮＡコンストラクトと接触したヒト細胞の免疫応答よりも低い免疫応答をもたらす、組み換えポリ核酸またはＲＮＡコンストラクト組成物が本明細書において提供される。一部の場合には、第１のＲＮＡ配列または第２のＲＮＡ配列は、関心のある遺伝子をコードし得る。一部の実施形態において、関心のある遺伝子は、ＩＬ－４またはＩＧＦ－１を含み得る。一部の場合には、第１のＲＮＡ配列または第２のＲＮＡ配列は、本明細書に記載される疾患または病状と関連した遺伝子の発現を低下させ得る少なくとも２種の遺伝子エレメントを含み得る。一部の実施形態において、疾患または病状と関連した遺伝子の発現を低下させ得る遺伝子エレメントは、ＴＮＦ－アルファｍＲＮＡまたは機能的バリアントを標的にするｓｉＲＮＡを含み得る。一部の実施形態において、疾患または病状と関連した遺伝子の発現を低下させ得る遺伝子エレメントは、ＩＬ－８ ｍＲＮＡまたは機能的バリアントを標的にするｓｉＲＮＡを含み得る。一部の実施形態において、疾患または病状と関連した遺伝子の発現を低下させ得る遺伝子エレメントは、ＩＬ－１ベータｍＲＮＡまたは機能的バリアントを標的にするｓｉＲＮＡを含み得る。一部の実施形態において、疾患または病状と関連した遺伝子の発現を低下させ得る遺伝子エレメントは、ＩＬ－１７ ｍＲＮＡまたは機能的バリアントを標的にするｓｉＲＮＡを含み得る。

【0150】

本明細書に記載される任意の組み換えＲＮＡコンストラクト組成物、および薬学的に許容される添加物を含む薬学的組成物も本明細書において提供される。薬学的組成物とは、それを必要とする対象に投与されるべき１種または複数の薬学的に許容される添加物と一緒に医薬品有効成分の治療的有効量を含む混合物または溶液を表し得る。「薬学的に許容される」という用語は、一般的に安全であり、非毒性であり、生物学的にもそれ以外の点でも非所望でなく、獣医学的ならびにヒト薬学的使用に許容される薬学的組成物を調製することにおいて有用である材料の性質を表す。「薬学的に許容される」という用語は、化合物の生物活性または特性を破棄せず、比較的非毒性である、担体または希釈剤等の材料を指し得る、すなわち、材料は、非所望の生物学的効果を引き起こすことなく、またはそれが含有される組成物の成分のいずれとも有害な様式で相互作用することなく、個体に投与され得る。薬学的に許容される添加物とは、薬学的製品を製剤化することにおいて使用される崩壊剤、結合剤、充填剤、溶媒、バッファー、等張化剤、安定剤、抗酸化剤、界面活性剤、担体、希釈剤、添加物、防腐剤、または潤滑剤等、治療活性を有せず、投与される対象に非毒性である、薬学的組成物における任意の薬学的に許容される構成成分を表し得る。薬学的組成物は、生物体への化合物の投与を促し得、薬学的に使用され得る調製物への活性化合物のプロセシングを促す１種または複数の薬学的に許容される不活性構成成分を使用して従来的様式で製剤化され得る。適正な製剤化は、選定される投与の経路に依存し、薬学的組成物の概要は、参照により本明細書に組み入れられる、例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ、第１９編（Ｅａｓｔｏｎ、Ｐａ．：Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、１９９５）；Ｈｏｏｖｅｒ，Ｊｏｈｎ Ｅ．、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ １９７５；Ｌｉｂｅｒｍａｎ，Ｈ．Ａ．およびＬａｃｈｍａｎ，Ｌ．編、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｃｋｅｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．、１９８０；ならびにＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ、第７編（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ １９９９）に見出され得る。一部の実施形態において、薬学的組成物は、疾患組織または疾患細胞への注射のための水溶液に活性物質（例えば、本明細書に記載される組み換えポリ核酸またはＲＮＡコンストラクト）を溶解することによって製剤化され得る。一部の実施形態において、薬学的組成物は、疾患組織または疾患細胞への直接注射のための水溶液に活性物質（例えば、本明細書に記載される組み換えポリ核酸またはＲＮＡコンストラクト）を溶解することによって製剤化され得る。

【0151】

本明細書に記載されるポリ核酸コンストラクトまたは組み換えＲＮＡコンストラクト組成物または薬学的組成物の治療的有効量を対象に投与することを含む、それを必要とする対象における疾患または病状を治療する方法も本明細書において提供される。本明細書において使用される「有効量」または「治療的有効量」という用語は、治療されている疾患または病状の症状の１つまたは複数をある程度軽減するであろう、投与されている薬剤または化合物の十分な量を指す；例えば、疾患の１つもしくは複数の兆候、症状、もしくは原因の低下および／もしくは緩和、または生物学的システムの任意の他の所望の変更。例えば、治療的使用のための「有効量」とは、１つまたは複数の病徴の臨床的に有意な減少を提供する薬剤の量であり得る。適当な「有効な」量は、個々の症例において、用量漸増調査等の手法を使用して判定され得る。

【0152】

本明細書において使用される「治療する」、「治療すること」、または「治療」という用語は、疾患もしくは病状の少なくとも１つの症状を緩和すること、鎮めること、もしくは改善すること、付加的な症状を阻止すること、疾患もしくは病状を阻害すること、例えば疾患もしくは病状の発症を停止させること、疾患もしくは病状を軽減すること、疾患もしくは病状の後退を引き起こすこと、疾患もしくは病状によって引き起こされた病状を軽減すること、または予防的にかつ／もしくは治療的に疾患もしくは病状の症状を食い止めることを含む。一部の実施形態において、疾患または病状を治療することは、疾患組織または疾患細胞のサイズを低下させることを含む。一部の実施形態において、対象における疾患または病状を治療することは、対象の生存期間を増加させることを含む。一部の実施形態において、疾患または病状を治療することは、疾患の重症度を低下させることもしくは改善すること、疾患の発生を遅延させること、疾患の進行を阻害すること、対象に対する入院期間もしくは入院期間の長さを低下させること、対象の生活の質を向上させること、疾患と関連した症状の数を低下させること、疾患と関連した症状の重症度を低下させることもしくは改善すること、疾患と関連した症状の継続期間を低下させること、疾患と関連した症状の再発を阻止すること、疾患の症状の発症もしくは発生を阻害すること、または疾患と関連した症状の進行を阻害することを含む。

【0153】

一部の場合には、対象は哺乳動物を包含し得る。哺乳動物の例は、哺乳動物綱の任意のメンバー：ヒト、非ヒト霊長類、例えばチンパンジー、ならびに他の類人猿およびサル種；ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタ等の家畜；ウサギ、イヌ、およびネコ等の家庭用動物；ラット、マウス、およびモルモット等のげっ歯類を含めた実験室用動物を含むが、それらに限定されるわけではない。一部の場合には、哺乳動物はヒトである。一部の場合には、対象は動物であり得る。一部の場合には、動物は、人間および非ヒト動物を含み得る。１つの実施形態において、非ヒト動物は、哺乳動物、例えばラットまたはマウス等のげっ歯類であり得る。別の実施形態において、非ヒト動物はマウスであり得る。一部の場合には、対象は哺乳動物である。一部の場合には、対象はヒトである。一部の場合には、対象は、成人、子ども、または幼児である。一部の場合には、対象は伴侶動物である。一部の場合には、対象は、ネコ、イヌ、またはげっ歯類である。一部の場合には、対象は、イヌまたはネコである。

【0154】

一部の態様において、関心のある遺伝子をコードするｍＲＮＡ、および標的ｍＲＮＡに結合し得る少なくとも２種のｓｉＲＮＡを含む、本明細書に記載される組み換えＲＮＡコンストラクト組成物または薬学的組成物を対象に投与することを含む、対象における疾患または病状を治療する方法が本明細書において提供される。一部の実施形態において、標的ｍＲＮＡは、ＴＮＦ－アルファ、ＩＬ－１ベータ、ＩＬ－８、ＩＬ－１７、Ｔｕｒｂｏ ＧＦＰ、またはその機能的バリアントのｍＲＮＡを含む。一部の実施形態において、関心のある遺伝子をコードするｍＲＮＡは、ＩＧＦ－１またはその機能的バリアントをコードする。一部の実施形態において、関心のある遺伝子をコードするｍＲＮＡはサイトカインをコードする。一部の実施形態において、サイトカインは、ＩＬ－４またはその機能的バリアントである。

【0155】

一部の態様において、対象における疾患または病状を治療する方法であって、方法は、ＩＧＦ－１をコードするｍＲＮＡ、およびＩＬ－８のｍＲＮＡに結合し得るｓｉＲＮＡを含む、本明細書に記載される組み換えＲＮＡコンストラクト組成物または薬学的組成物を対象に投与することを含む、方法が本明細書において提供される。一部の態様において、対象における疾患または病状を治療する方法であって、方法は、ＩＧＦ－１をコードするｍＲＮＡ、およびＩＬ－１ベータのｍＲＮＡに結合し得るｓｉＲＮＡを含む、本明細書に記載される組み換えＲＮＡコンストラクト組成物または薬学的組成物を対象に投与することを含む、方法が本明細書において提供される。一部の態様において、対象における疾患または病状を治療する方法であって、方法は、ＩＬ－４をコードするｍＲＮＡ、およびＴＮＦ－アルファのｍＲＮＡに結合し得るｓｉＲＮＡを含む、本明細書に記載される組み換えＲＮＡ組成物または薬学的組成物を対象に投与することを含む、方法が本明細書において提供される。一部の態様において、対象における疾患または病状を治療する方法であって、方法は、ＩＬ－４をコードするｍＲＮＡ、およびＩＬ－１７のｍＲＮＡに結合し得るｓｉＲＮＡを含む、本明細書に記載される組み換えＲＮＡコンストラクト組成物または薬学的組成物を対象に投与することを含む、方法が本明細書において提供される。一部の態様において、対象における疾患または病状を治療する方法であって、方法は、ＩＬ－４をコードするｍＲＮＡ、ＴＮＦ－アルファのｍＲＮＡに結合し得るｓｉＲＮＡ、およびＩＬ－１７のｍＲＮＡに結合し得るｓｉＲＮＡを含む、本明細書に記載される組み換えＲＮＡコンストラクト組成物または薬学的組成物を対象に投与することを含む、方法が本明細書において提供される。一部の実施形態において、疾患または病状は、皮膚疾患もしくは病状、または関節疾患もしくは病状を含む。一部の実施形態において、皮膚疾患または病状は炎症性皮膚障害を含む。一部の実施形態において、炎症性皮膚障害は乾癬を含む。一部の実施形態において、関節疾患または病状は関節変性を含む。一部の実施形態において、関節変性は、椎間板疾患（ＩＶＤＤ）または変形性関節症（ＯＡ）を含む。

【0156】

一部の態様において、それを必要とする対象に投与される組成物または薬学的組成物は、（ｉ）ＩＬ－４をコードするｍＲＮＡと；（ｉｉ）ＴＮＦ－アルファｍＲＮＡに結合し得る少なくとも２種のｓｉＲＮＡとを含む組み換えポリ核酸コンストラクトまたはＲＮＡコンストラクトを含む。関連した態様において、組み換えポリ核酸コンストラクトまたはＲＮＡコンストラクトは、少なくとも２、３、４、５、６種、またはそれより多くのｓｉＲＮＡをコードし得るまたは含み得る。関連した態様において、組み換えポリ核酸コンストラクトまたはＲＮＡコンストラクトは、ＴＮＦ－アルファｍＲＮＡに向けられた２種のｓｉＲＮＡを含み得る。関連した態様において、組み換えポリ核酸コンストラクトまたはＲＮＡコンストラクトは、それぞれがＴＮＦ－アルファｍＲＮＡに向けられた３種のｓｉＲＮＡを含み得る。関連した態様において、少なくとも３種のｓｉＲＮＡのそれぞれは、同じであり得る、異なり得る、またはその組み合わせであり得る。関連した態様において、組み換えポリ核酸コンストラクトまたはＲＮＡコンストラクトは、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、または配列番号１０５（Ｃｐｄ．４～Ｃｐｄ．９）に明記される配列を含み得る。関連した態様において、組み換えポリ核酸コンストラクトは、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、または配列番号２１（Ｃｐｄ．４～Ｃｐｄ．９）に明記される配列を含み得る。

【0157】

一部の態様において、それを必要とする対象に投与される組成物または薬学的組成物は、（ｉ）ＩＧＦ－１をコードするｍＲＮＡと；（ｉｉ）ＩＬ－８ ｍＲＮＡに結合し得る少なくとも２種のｓｉＲＮＡとを含む組み換えポリ核酸コンストラクトまたはＲＮＡコンストラクトを含む。関連した態様において、組み換えポリ核酸コンストラクトまたはＲＮＡコンストラクトは、少なくとも２、３、４、５、６種、またはそれより多くのｓｉＲＮＡをコードし得るまたは含み得る。関連した態様において、組み換えポリ核酸コンストラクトまたはＲＮＡコンストラクトは、ＩＬ－８ ｍＲＮＡに向けられた２種のｓｉＲＮＡを含み得る。関連した態様において、組み換えポリ核酸コンストラクトまたはＲＮＡコンストラクトは、それぞれがＩＬ－８ ｍＲＮＡに向けられた３種のｓｉＲＮＡを含み得る。関連した態様において、少なくとも３種のｓｉＲＮＡのそれぞれは、同じであり得る、異なり得る、またはその組み合わせであり得る。関連した態様において、組み換えポリ核酸コンストラクトまたはＲＮＡコンストラクトは、配列番号１、配列番号２、配列番号９７、または配列番号９８（Ｃｐｄ．１またはＣｐｄ．２）に明記される配列を含み得る。関連した態様において、組み換えポリ核酸コンストラクトは、配列番号１３または配列番号１４（Ｃｐｄ．１またはＣｐｄ．２）に明記される配列を含み得る。

【0158】

一部の態様において、それを必要とする対象に投与される組成物または薬学的組成物は、（ｉ）ＩＧＦ－１をコードするｍＲＮＡと；（ｉｉ）ＩＬ－１ベータｍＲＮＡに結合し得る少なくとも２種のｓｉＲＮＡとを含む組み換えポリ核酸コンストラクトまたはＲＮＡコンストラクトを含む。関連した態様において、組み換えポリ核酸コンストラクトまたはＲＮＡコンストラクトは、少なくとも２、３、４、５、６種、またはそれより多くのｓｉＲＮＡをコードし得るまたは含み得る。関連した態様において、組み換えポリ核酸コンストラクトまたはＲＮＡコンストラクトは、ＩＬ－１ベータｍＲＮＡに向けられた２種のｓｉＲＮＡを含み得る。関連した態様において、組み換えポリ核酸コンストラクトまたはＲＮＡコンストラクトは、それぞれがＩＬ－１ベータｍＲＮＡに向けられた３種のｓｉＲＮＡを含み得る。関連した態様において、少なくとも３種のｓｉＲＮＡのそれぞれは、同じであり得る、異なり得る、またはその組み合わせであり得る。関連した態様において、組み換えポリ核酸コンストラクトまたはＲＮＡコンストラクトは、配列番号３または配列番号９９（Ｃｐｄ．３）に明記される配列を含み得る。関連した態様において、組み換えポリ核酸コンストラクトは、配列番号１５（Ｃｐｄ．３）に明記される配列を含み得る。

【0159】

一部の態様において、それを必要とする対象に投与される組成物または薬学的組成物は、（ｉ）ＩＬ－４をコードするｍＲＮＡと；（ｉｉ）ＩＬ－１７ ｍＲＮＡに結合し得る少なくとも２種のｓｉＲＮＡとを含む組み換えポリ核酸コンストラクトまたはＲＮＡコンストラクトを含む。関連した態様において、組み換えポリ核酸コンストラクトまたはＲＮＡコンストラクトは、少なくとも２、３、４、５、６種、またはそれより多くのｓｉＲＮＡをコードし得るまたは含み得る。関連した態様において、組み換えポリ核酸コンストラクトまたはＲＮＡコンストラクトは、ＩＬ－１７ ｍＲＮＡに向けられた２種のｓｉＲＮＡを含み得る。関連した態様において、組み換えポリ核酸コンストラクトまたはＲＮＡコンストラクトは、それぞれがＩＬ－１７ ｍＲＮＡに向けられた３種のｓｉＲＮＡを含み得る。関連した態様において、少なくとも３種のｓｉＲＮＡのそれぞれは、同じであり得る、異なり得る、またはその組み合わせであり得る。関連した態様において、組み換えポリ核酸コンストラクトまたはＲＮＡコンストラクトは、配列番号４または配列番号１００（Ｃｐｄ．４）に明記される配列を含み得る。関連した態様において、組み換えポリ核酸コンストラクトは、配列番号１６（Ｃｐｄ．４）に明記される配列を含み得る。

【0160】

一部の態様において、それを必要とする対象に投与される組成物または薬学的組成物は、（ｉ）ＩＬ－４をコードするｍＲＮＡと；（ｉｉ）ＴＮＦ－アルファｍＲＮＡに結合し得る少なくとも２種のｓｉＲＮＡと；および（ｉｉｉ）ＩＬ－１７ ｍＲＮＡに結合し得る少なくとも２種のｓｉＲＮＡとを含む組み換えポリ核酸コンストラクトまたはＲＮＡコンストラクトを含む。関連した態様において、組み換えポリ核酸コンストラクトまたはＲＮＡコンストラクトは、少なくとも２、３、４、５、６種、またはそれより多くのｓｉＲＮＡをコードし得るまたは含み得る。関連した態様において、組み換えポリ核酸コンストラクトまたはＲＮＡコンストラクトは、ＴＮＦ－アルファｍＲＮＡに向けられた２種のｓｉＲＮＡ、およびＩＬ－１７ ｍＲＮＡに向けられた２種のｓｉＲＮＡを含み得る。関連した態様において、組み換えポリ核酸コンストラクトまたはＲＮＡコンストラクトは、それぞれがＴＮＦ－アルファｍＲＮＡまたはＩＬ－１７ ｍＲＮＡに向けられた３種のｓｉＲＮＡを含み得る。関連した態様において、少なくとも３種のｓｉＲＮＡのそれぞれは、同じであり得る、異なり得る、またはその組み合わせであり得る。関連した態様において、組み換えポリ核酸コンストラクトまたはＲＮＡコンストラクトは、それぞれがＴＮＦ－アルファｍＲＮＡまたはＩＬ－１７ ｍＲＮＡに向けられた６種のｓｉＲＮＡを含み得る。関連した態様において、組み換えポリ核酸コンストラクトまたはＲＮＡコンストラクトは、３種がＴＮＦ－アルファｍＲＮＡに向けられ、３種がＩＬ－１７ ｍＲＮＡに向けられた、６種のｓｉＲＮＡを含み得る。関連した態様において、組み換えポリ核酸コンストラクトまたはＲＮＡコンストラクトは、配列番号４または配列番号１００（Ｃｐｄ．４）に明記される配列を含み得る。関連した態様において、組み換えポリ核酸コンストラクトは、配列番号１６（Ｃｐｄ．４）に明記される配列を含み得る。

【0161】

一部の態様において、それを必要とする対象に投与される組成物または薬学的組成物は、（ｉ）ＩＧＦ－１ ｍＲＮＡと；（ｉｉ）Ｔｕｒｂｏ ＧＦＰ ｍＲＮＡに結合し得る少なくとも１種のｓｉＲＮＡとを含む組み換えポリ核酸コンストラクトまたはＲＮＡコンストラクトを含む。関連した態様において、組み換えポリ核酸コンストラクトまたはＲＮＡコンストラクトは、少なくとも１、２、３、４、５、６種、またはそれより多くのｓｉＲＮＡをコードし得るまたは含み得る。関連した態様において、組み換えポリ核酸コンストラクトまたはＲＮＡコンストラクトは、Ｔｕｒｂｏ ＧＦＰ ｍＲＮＡに向けられた１種のｓｉＲＮＡを含み得る。関連した態様において、組み換えポリ核酸コンストラクトまたはＲＮＡコンストラクトは、それぞれがＴｕｒｂｏ ＧＦＰ ｍＲＮＡに向けられた２種または３種のｓｉＲＮＡを含み得る。関連した態様において、少なくとも２種または少なくとも３種のｓｉＲＮＡのそれぞれは、同じであり得る、異なり得る、またはその組み合わせであり得る。関連した態様において、組み換えポリ核酸コンストラクトまたはＲＮＡコンストラクトは、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１０６、配列番号１０７、または配列番号１０８（Ｃｐｄ．１０～Ｃｐｄ．１２）に明記される配列を含み得る。関連した態様において、組み換えポリ核酸コンストラクトは、配列番号２２、配列番号２３、または配列番号２４（Ｃｐｄ．１０～Ｃｐｄ．１２）に明記される配列を含み得る。

【0162】

本明細書に記載される組み換えＲＮＡコンストラクト組成物は、併用療法として投与され得る。２種以上の治療剤または療法を用いた併用療法は、異なる作用のメカニズムによって働く薬剤および療法を使用し得る。異なる作用のメカニズムを有する薬剤または療法を使用した併用療法は、相加的なまたは相乗的な効果をもたらし得る。併用療法は、単剤療法において使用されるよりも低い用量の各薬剤を可能にし得、それによって、有毒な副作用を低下させかつ／または薬剤の治療指数を増加させる。併用療法は、耐性疾患細胞が生じるであろう可能性を減少させ得る。一部の場合には、併用療法は、免疫応答に影響を及ぼす（例えば、応答を増強するまたは活性化する）治療剤または療法、および疾患細胞に影響を及ぼす（例えば、阻害するまたは殺傷する）治療剤を含む。一部の場合には、併用療法は、（ｉ）本明細書に記載される組み換えＲＮＡ組成物または薬学的組成物；および（ｉｉ）本明細書に記載される疾患に対する、当技術分野において公知の１種または複数の付加的な療法を含み得る。一部の実施形態において、本明細書に記載される組み換えＲＮＡ組成物または薬学的組成物は、併用療法のため１種または複数の付加的な療法の投与の前に、それと同時に、および／または後に、疾患または病状を有する対象に投与され得る。一部の実施形態において、１種または複数の付加的な療法は、１、２、３種、またはそれより多くの付加的な治療剤または療法を含み得る。

【0163】

本明細書に記載される組成物および薬学的組成物は、当技術分野において公知の任意の適切な方法を使用して対象に投与され得る。本発明における使用のための適切な製剤、および送達の方法は、当技術分野において一般的に周知である。例えば、本明細書に記載される組成物は、非経口的に、静脈内に、皮内に、筋肉内に、結腸に（ｃｏｌｏｎｉｃａｌｌｙ）、直腸に、または腹腔内に、を含めた、多様なやり方で対象に投与され得る。一部の実施形態において、本明細書に記載される組成物は、対象の腹腔内注射、筋肉内注射、皮下注射、または静脈内注射によって投与される。一部の実施形態において、本明細書に記載される組成物は、非経口的に、静脈内に、筋肉内に、または経口的に投与され得る。一部の実施形態において、本明細書に記載される組成物は、疾患組織または細胞への注射を介して投与され得る。一部の実施形態において、本明細書に記載される組成物は、疾患組織または細胞への注射のための水溶液として投与され得る。

【0164】

本明細書に記載される組成物および薬学的組成物のいずれかは、取扱説明書と一緒に提供され得る。取扱説明書は、本発明に従って本明細書に記載される疾患または障害（例えば、頭頸部がん等のがん）をどのように治療する（または阻止する）のか、当業者または主治医のための手引きを含み得る。一部の実施形態において、取扱説明書は、それぞれ、本明細書に記載される送達／投与の様態、および送達／投与レジメンに関する手引き（例えば、送達／投与の経路、投薬量レジメン、送達／投与の時間、送達／投与の頻度等）を含み得る。一部の実施形態において、取扱説明書は、どのように本発明の組成物が投与されるもしくは注射されるべきであり、かつ／または投与もしくは注射のために調製されるかという説明書を含み得る。原則として、それぞれ送達／投与の様態および送達／投与レジメンに関して本明細書における他の箇所に記載されているものは、取扱説明書におけるそれぞれの説明書として含まれ得る。

【0165】

本明細書に記載される組成物および薬学的組成物は、遺伝子療法において使用され得る。ある特定の実施形態において、本明細書に記載される組み換えポリ核酸またはＲＮＡコンストラクトを含む組成物は、遺伝子療法ベクターにおいて細胞に送達され得る。遺伝子療法ベクターおよび遺伝子送達の方法は、当技術分野において周知である。これらの方法の非限定的な例は、細胞への送達後にエピソーム性または組み込み型ゲノムのいずれかを有する、ＤＮＡおよびＲＮＡウイルスを含めたウイルスベクター送達システム、ＤＮＡプラスミド、ネイキッド核酸、および送達ビヒクルと複合した核酸を含めた非ウイルスベクター送達システム、トランスポゾンシステム（宿主ゲノムへの送達および組み込みのための；Ｍｏｒｉａｒｉｔｙら（２０１３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ４１（８）、ｅ９２、Ａｒｏｎｏｖｉｃｈら、（２０１１）Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．２０（Ｒ１）、Ｒ１４～Ｒ２０）、レトロウイルス媒介性ＤＮＡ移入（例えば、モロニーマウス白血病ウイルス、脾臓壊死ウイルス、レトロウイルス、例えばラウス肉腫ウイルス、ハーベイ肉腫ウイルス、トリ白血病ウイルス、テナガザル白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、アデノウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルス、および乳房腫瘍ウイルス；例えば、Ｋａｙら（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６２、１１７～１１９、Ａｎｄｅｒｓｏｎ（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６、８０８～８１３を参照されたい）、ならびにアデノウイルス、ヘルペスウイルス、パルボウイルス、およびアデノ随伴ウイルスを含めたＤＮＡウイルス媒介性ＤＮＡ移入（例えば、Ａｌｉら（１９９４）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １、３６７～３８４）を含む。ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス、アデノウイルスウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス、および単純ヘルペスウイルスベクターも含むが、それらに限定されるわけではない。宿主ゲノムへの組み込みの能力があるベクターは、レトロウイルスまたはレンチウイルスを含むが、それらに限定されるわけではない。

【0166】

一部の実施形態において、本明細書に記載される組み換えポリ核酸またはＲＮＡコンストラクトを含む組成物は、直接ＤＮＡ移入を介して細胞に送達され得る（Ｗｏｌｆｆら（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７、１４６５～１４６８）。組み換えポリ核酸またはＲＮＡコンストラクトは、細胞を一時的に透過処理する、細胞膜の穏やかな機械的分断の後に細胞に送達され得る。そのような膜の穏やかな機械的分断は、小さな開口部を通じて細胞を優しく押し破ることによって遂行され得る（Ｓｈａｒｅｉら、ＰＬＯＳ ＯＮＥ（２０１５）１０（４）、ｅ０１１８８０３）。別の実施形態において、本明細書に記載される組み換えポリ核酸またはＲＮＡコンストラクトを含む組成物は、リポソーム媒介性ＤＮＡ移入を介して細胞に送達され得る（例えば、Ｇａｏ＆Ｈｕａｎｇ（１９９１）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１７９、２８０～２８５、Ｃｒｙｓｔａｌ（１９９５）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．１、１５～１７、Ｃａｐｌｅｎら（１９９５）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．３、３９～４６）。リポソームは、閉鎖された脂質二重層または凝集体の生成によって形成される多様な単一のおよび多層状の脂質ビヒクルを包含し得る。組み換えポリ核酸またはＲＮＡコンストラクトは、リポソームの水性内部にカプセル化され得る、リポソームの脂質二重層内に散在される、リポソームおよびオリゴヌクレオチドの両方と結び付いている連結分子を介してリポソームに付着される、リポソーム内に封入される、またはリポソームと複合され得る。

【0167】

遺伝子発現のモジュレーション
本明細書に記載される任意の組み換えポリ核酸またはＲＮＡコンストラクトを含む組成物を細胞に導入することを含む、細胞において単一ＲＮＡ転写産物からｍＲＮＡおよび少なくとも２種のｓｉＲＮＡを発現させる方法が本明細書において提供される。関心のある遺伝子をコードする第１のＲＮＡ配列と、１種または複数の標的ＲＮＡの発現をモジュレートする少なくとも２種の遺伝子エレメントを含む第２のＲＮＡ配列とをコードするまたは含む組み換えポリ核酸またはＲＮＡコンストラクトを含む組成物を細胞に導入することを含む、細胞において２種以上の遺伝子の発現をモジュレートする方法であって、１種または複数の標的ＲＮＡの発現をモジュレートする少なくとも２種の遺伝子エレメントは、標的メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）に結合し得る低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を含み、標的ｍＲＮＡは、関心のある遺伝子によってコードされるｍＲＮＡとは異なり、それによって、単一ＲＮＡ転写産物からの標的ｍＲＮＡおよび関心のある遺伝子の発現をモジュレートする、方法が本明細書においてさらに提供される。一部の場合には、本明細書において使用されるポリ核酸、遺伝子、ＤＮＡ、またはＲＮＡの発現とは、ポリ核酸、遺伝子、ＤＮＡ、またはＲＮＡの転写および／または翻訳を指し得る。一部の場合には、本明細書において使用される、ポリ核酸、関心のある遺伝子等の遺伝子、ＤＮＡ、または標的ｍＲＮＡ等のＲＮＡの発現をモジュレートすること、増加させること、上方調節すること、減少させること、または下方調節することは、ポリ核酸、関心のある遺伝子等の遺伝子、ＤＮＡ、または標的ｍＲＮＡ等のＲＮＡの転写および／または翻訳に影響を及ぼすことによって、ポリ核酸、関心のある遺伝子等の遺伝子、ＤＮＡ、または標的ｍＲＮＡ等のＲＮＡによってコードされるタンパク質のレベルをモジュレートすること、増加させること、上方調節すること、減少させること、下方調節することを指し得る。一部の場合には、ポリ核酸、関心のある遺伝子等の遺伝子、ＤＮＡ、または標的ｍＲＮＡ等のＲＮＡの発現を阻害することは、ポリ核酸、関心のある遺伝子等の遺伝子、ＤＮＡ、または標的ｍＲＮＡ等のＲＮＡによってコードされるタンパク質のレベルが低下するまたは消失するように、ポリ核酸、関心のある遺伝子等の遺伝子、ＤＮＡ、または標的ｍＲＮＡ等のＲＮＡの転写および／または翻訳に影響を及ぼすことを指し得る。

【0168】

例えば、関心のある遺伝子をコードする第１のＲＮＡ配列と、１種または複数の標的ＲＮＡの発現をモジュレートする少なくとも２種の遺伝子エレメントを含む第２のＲＮＡ配列とをコードするまたは含む組み換えポリ核酸またはＲＮＡコンストラクトを含む組成物を細胞に導入することを含む、細胞において２種以上の遺伝子の発現をモジュレートする方法であって、第１のＲＮＡ配列はＩＬ－４をコードし、第２のＲＮＡ配列は、ＴＮＦ－アルファｍＲＮＡに結合し得る低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）をコードし、それによって、単一ＲＮＡ転写産物からのＴＮＦ－アルファｍＲＮＡおよびＩＬ－４の発現をモジュレートする、方法が本明細書において提供される。

【0169】

例えば、関心のある遺伝子をコードする第１のＲＮＡ配列と、１種または複数の標的ＲＮＡの発現をモジュレートする少なくとも２種の遺伝子エレメントを含む第２のＲＮＡ配列とをコードするまたは含む組み換えポリ核酸またはＲＮＡコンストラクトを含む組成物を細胞に導入することを含む、細胞において２種以上の遺伝子の発現をモジュレートする方法であって、第１のＲＮＡ配列はＩＧＦ－１をコードし、第２のＲＮＡ配列は、ＩＬ－８ ｍＲＮＡに結合し得る低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）をコードし、それによって、単一ＲＮＡ転写産物からのＩＬ－８ ｍＲＮＡおよびＩＧＦ－１の発現をモジュレートする、方法が本明細書において提供される。

【0170】

例えば、関心のある遺伝子をコードする第１のＲＮＡ配列と、１種または複数の標的ＲＮＡの発現をモジュレートする少なくとも２種の遺伝子エレメントを含む第２のＲＮＡ配列とをコードするまたは含む組み換えポリ核酸またはＲＮＡコンストラクトを含む組成物を細胞に導入することを含む、細胞において２種以上の遺伝子の発現をモジュレートする方法であって、第１のＲＮＡ配列はＩＧＦ－１をコードし、第２のＲＮＡ配列は、ＩＬ－１ベータｍＲＮＡに結合し得る低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）をコードし、それによって、単一ＲＮＡ転写産物からのＩＬ－１ベータｍＲＮＡおよびＩＧＦ－１の発現をモジュレートする、方法が本明細書において提供される。

【0171】

例えば、関心のある遺伝子をコードする第１のＲＮＡ配列と、１種または複数の標的ＲＮＡの発現をモジュレートする少なくとも２種の遺伝子エレメントを含む第２のＲＮＡ配列とをコードするまたは含む組み換えポリ核酸またはＲＮＡコンストラクトを含む組成物を細胞に導入することを含む、細胞において２種以上の遺伝子の発現をモジュレートする方法であって、第１のＲＮＡ配列はＩＬ－４をコードし、第２のＲＮＡ配列は、ＩＬ－１７ ｍＲＮＡに結合し得る低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）をコードし、それによって、単一ＲＮＡ転写産物からのＩＬ－１７ ｍＲＮＡおよびＩＬ－４の発現をモジュレートする、方法が本明細書において提供される。

【0172】

例えば、関心のある遺伝子をコードする第１のＲＮＡ配列と、１種または複数の標的ＲＮＡの発現をモジュレートする少なくとも２種の遺伝子エレメントを含む第２のＲＮＡ配列とをコードするまたは含む組み換えポリ核酸またはＲＮＡコンストラクトを含む組成物を細胞に導入することを含む、細胞において２種以上の遺伝子の発現をモジュレートする方法であって、第１のＲＮＡ配列はＩＬ－４をコードし、第２のＲＮＡ配列は、ＴＮＦ－アルファｍＲＮＡに結合し得る低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、およびＩＬ－１７ ｍＲＮＡに結合し得るｓｉＲＮＡをコードし、それによって、単一ＲＮＡ転写産物からのＴＮＦ－アルファｍＲＮＡ、ＩＬ－１７ ｍＲＮＡ、およびＩＬ－４の発現をモジュレートする、方法が本明細書において提供される。

【0173】

例えば、第１のＲＮＡ配列、第２のＲＮＡ配列、およびリンカーＲＮＡ配列をコードするまたは含む組み換えポリ核酸またはＲＮＡコンストラクトを含む組成物を細胞に導入することを含む、細胞において２種以上の遺伝子の発現をモジュレートする方法であって、リンカーＲＮＡ配列は、第１のＲＮＡ配列と第２のＲＮＡ配列とを連結し、第１のＲＮＡ配列はＩＧＦ－１をコードし、第２のＲＮＡ配列は、Ｔｕｒｂｏ ＧＦＰ ｍＲＮＡに結合し得る低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）をコードし、それによって、単一ＲＮＡ転写産物からのＴｕｒｂｏ ＧＦＰ ｍＲＮＡおよびＩＧＦ－１の発現をモジュレートする、方法が本明細書において提供される。

【0174】

関心のある遺伝子をコードする第１のＲＮＡ配列と、１種または複数の標的ＲＮＡの発現をモジュレートする少なくとも２種の遺伝子エレメントを含む第２のＲＮＡ配列とを含む組み換えポリ核酸またはＲＮＡコンストラクトを含む組成物を細胞に導入することを含む、細胞において２種以上の遺伝子の発現をモジュレートする方法であって、第１のＲＮＡはＩＬ－４をコードし、第２のＲＮＡは、ＴＮＦ－アルファｍＲＮＡに結合し得る低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）をコードし；ＩＬ－４およびＴＮＦ－アルファの発現は同時にモジュレートされる、すなわち、ＩＬ－４の発現は上方調節され、ＴＮＦ－アルファの発現は同時に下方調節される、方法が本明細書において提供される。関連した態様において、組み換えポリ核酸またはＲＮＡコンストラクトは、少なくとも２、３、４、５、６種、またはそれより多くのｓｉＲＮＡをコードし得るまたは含み得る。関連した態様において、組み換えポリ核酸またはＲＮＡコンストラクトは、それぞれがＴＮＦ－アルファｍＲＮＡの同じ領域に向けられた３種のｓｉＲＮＡをコードし得るまたは含み得る。関連した態様において、組み換えポリ核酸またはＲＮＡコンストラクトは、それぞれがＴＮＦ－アルファｍＲＮＡの異なる領域に向けられた３種のｓｉＲＮＡをコードし得るまたは含み得る。関連した態様において、少なくとも３種のｓｉＲＮＡのそれぞれは、同じもの、異なるもの、またはその組み合わせに向けられ得る。関連した態様において、組み換えＲＮＡコンストラクトは、配列番号４～９または１００～１０５（Ｃｐｄ．４～Ｃｐｄ．９）に示される配列を含み得る。関連した態様において、組み換えポリ核酸コンストラクトは、配列番号１６～２１（Ｃｐｄ．４～Ｃｐｄ．９）に示される配列を含み得る。

【0175】

関心のある遺伝子をコードする第１のＲＮＡ配列と、１種または複数の標的ＲＮＡの発現をモジュレートする少なくとも２種の遺伝子エレメントを含む第２のＲＮＡ配列とを含む組み換えポリ核酸またはＲＮＡコンストラクトを含む組成物を細胞に導入することを含む、細胞において２種以上の遺伝子の発現をモジュレートする方法であって、第１のＲＮＡはＩＧＦ－１をコードし、第２のＲＮＡは、ＩＬ－８ ｍＲＮＡに結合し得る低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）をコードし；ＩＧＦ－１およびＩＬ－８の発現は同時にモジュレートされる、すなわち、ＩＧＦ－１の発現は上方調節され、ＩＬ－８の発現は同時に下方調節される、方法も本明細書において提供される。関連した態様において、組み換えポリ核酸またはＲＮＡコンストラクトは、少なくとも２、３、４、５、６種、またはそれより多くのｓｉＲＮＡをコードし得るまたは含み得る。関連した態様において、組み換えポリ核酸またはＲＮＡコンストラクトは、それぞれがＩＬ－８ ｍＲＮＡの同じ領域に向けられた３種のｓｉＲＮＡをコードし得るまたは含み得る。関連した態様において、組み換えポリ核酸またはＲＮＡコンストラクトは、それぞれがＩＬ－８ ｍＲＮＡの異なる領域に向けられた３種のｓｉＲＮＡをコードし得るまたは含み得る。関連した態様において、少なくとも３種のｓｉＲＮＡのそれぞれは、同じもの、異なるもの、またはその組み合わせに向けられ得る。関連した態様において、組み換えＲＮＡコンストラクトは、配列番号１（Ｃｐｄ．１）、配列番号９７（Ｃｐｄ．１）、配列番号２（Ｃｐｄ．２）、または配列番号９８（Ｃｐｄ．２）を含む配列を含み得る。関連した態様において、組み換えポリ核酸コンストラクトは、配列番号１３（Ｃｐｄ．１）または配列番号１４（Ｃｐｄ．２）を含む配列を含み得る。

【0176】

関心のある遺伝子をコードする第１のＲＮＡ配列と、１種または複数の標的ＲＮＡの発現をモジュレートする少なくとも２種の遺伝子エレメントを含む第２のＲＮＡ配列とを含む組み換えポリ核酸またはＲＮＡコンストラクトを含む組成物を細胞に導入することを含む、細胞において２種以上の遺伝子の発現をモジュレートする方法であって、第１のＲＮＡはＩＧＦ－１をコードし、第２のＲＮＡは、ＩＬ－１ベータｍＲＮＡに結合し得る低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）をコードし；ＩＧＦ－１およびＩＬ－１ベータの発現は同時にモジュレートされる、すなわち、ＩＧＦ－１の発現は上方調節され、ＩＬ－１ベータの発現は同時に下方調節される、方法も本明細書において提供される。関連した態様において、組み換えポリ核酸またはＲＮＡコンストラクトは、少なくとも２、３、４、５、６種、またはそれより多くのｓｉＲＮＡをコードし得るまたは含み得る。関連した態様において、組み換えポリ核酸またはＲＮＡコンストラクトは、それぞれがＩＬ－１ベータｍＲＮＡの同じ領域に向けられた３種のｓｉＲＮＡをコードし得るまたは含み得る。関連した態様において、組み換えポリ核酸またはＲＮＡコンストラクトは、それぞれがＩＬ－１ベータｍＲＮＡの異なる領域に向けられた３種のｓｉＲＮＡをコードし得るまたは含み得る。関連した態様において、少なくとも３種のｓｉＲＮＡのそれぞれは、同じもの、異なるもの、またはその組み合わせに向けられ得る。関連した態様において、組み換えポリ核酸コンストラクトまたは組み換えＲＮＡコンストラクトは、配列番号３または配列番号９９（Ｃｐｄ．３）を含む配列を含み得る。関連した態様において、組み換えポリ核酸コンストラクトは、配列番号１５（Ｃｐｄ．３）を含む配列を含み得る。

【0177】

関心のある遺伝子をコードする第１のＲＮＡ配列と、１種または複数の標的ＲＮＡの発現をモジュレートする少なくとも２種の遺伝子エレメントを含む第２のＲＮＡ配列とを含む組み換えポリ核酸またはＲＮＡコンストラクトを含む組成物を細胞に導入することを含む、細胞において２種以上の遺伝子の発現をモジュレートする方法であって、第１のＲＮＡはＩＬ－４をコードし、第２のＲＮＡは、ＩＬ－１７ ｍＲＮＡに結合し得る低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）をコードし；ＩＬ－４およびＩＬ－１７の発現は同時にモジュレートされる、すなわち、ＩＬ－４の発現は上方調節され、ＩＬ－１７の発現は同時に下方調節される、方法も本明細書において提供される。関連した態様において、組み換えポリ核酸またはＲＮＡコンストラクトは、少なくとも２、３、４、５、６種、またはそれより多くのｓｉＲＮＡをコードし得るまたは含み得る。関連した態様において、組み換えポリ核酸またはＲＮＡコンストラクトは、それぞれがＩＬ－１７ ｍＲＮＡの同じ領域に向けられた３種のｓｉＲＮＡをコードし得るまたは含み得る。関連した態様において、組み換えポリ核酸またはＲＮＡコンストラクトは、それぞれがＩＬ－１７ ｍＲＮＡの異なる領域に向けられた３種のｓｉＲＮＡをコードし得るまたは含み得る。関連した態様において、少なくとも３種のｓｉＲＮＡのそれぞれは、同じもの、異なるもの、またはその組み合わせに向けられ得る。関連した態様において、組み換えＲＮＡコンストラクトは、配列番号４または配列番号１００（Ｃｐｄ．４）を含む配列を含み得る。関連した態様において、組み換えポリ核酸コンストラクトは、配列番号１６（Ｃｐｄ．４）を含む配列を含み得る。

【0178】

関心のある遺伝子をコードする第１のＲＮＡ配列と、１種または複数の標的ＲＮＡの発現をモジュレートする少なくとも２種の遺伝子エレメントを含む第２のＲＮＡ配列とを含む組み換えポリ核酸またはＲＮＡコンストラクトを含む組成物を細胞に導入することを含む、細胞において２種以上の遺伝子の発現をモジュレートする方法であって、第１のＲＮＡはＩＬ－４をコードし、第２のＲＮＡは、ＴＮＦ－アルファｍＲＮＡに結合し得る低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、およびＩＬ－１７ ｍＲＮＡに結合し得るｓｉＲＮＡをコードし；ＩＬ－４、ＴＮＦ－アルファ、およびＩＬ－１７の発現は同時にモジュレートされる、すなわち、ＩＬ－４の発現は上方調節され、同時に、ＴＮＦ－アルファおよびＩＬ－１７の発現は下方調節される、方法も本明細書において提供される。関連した態様において、組み換えポリ核酸またはＲＮＡコンストラクトは、少なくとも２、３、４、５、６種、またはそれより多くのｓｉＲＮＡをコードし得るまたは含み得る。関連した態様において、組み換えポリ核酸またはＲＮＡコンストラクトは、それぞれがＴＮＦ－アルファｍＲＮＡの同じ領域に向けられた３種のｓｉＲＮＡをコードし得るまたは含み得る。関連した態様において、組み換えポリ核酸またはＲＮＡコンストラクトは、それぞれがＩＬ－１７ ｍＲＮＡの同じ領域に向けられた３種のｓｉＲＮＡをコードし得るまたは含み得る。関連した態様において、組み換えポリ核酸またはＲＮＡコンストラクトは、それぞれがＴＮＦ－アルファおよび／またはＩＬ－１７ ｍＲＮＡの異なる領域に向けられた３種のｓｉＲＮＡをコードし得るまたは含み得る。関連した態様において、少なくとも３種のｓｉＲＮＡのそれぞれは、同じもの、異なるもの、またはその組み合わせに向けられ得る。関連した態様において、組み換えポリ核酸またはＲＮＡコンストラクトは、６種のｓｉＲＮＡをコードし得または含み得、６種のｓｉＲＮＡのうちの３種は、ＴＮＦ－アルファの異なる領域に向けられ、他の６種のｓｉＲＮＡは、ＩＬ－１７ ｍＲＮＡの異なる領域に向けられる。関連した態様において、組み換えＲＮＡコンストラクトは、配列番号４または配列番号１００（Ｃｐｄ．４）を含む配列を含み得る。関連した態様において、組み換えポリ核酸コンストラクトは、配列番号１６（Ｃｐｄ．４）を含む配列を含み得る。

【0179】

第１のＲＮＡ配列、第２のＲＮＡ配列、およびリンカーＲＮＡ配列を含む組み換えポリ核酸またはＲＮＡコンストラクトを含む組成物を細胞に導入することを含む、細胞において２種以上の遺伝子の発現をモジュレートする方法であって、リンカーＲＮＡ配列は、第１のＲＮＡ配列と第２のＲＮＡ配列とを連結し、第１のＲＮＡはＩＧＦ－１をコードし、第２のＲＮＡは、Ｔｕｒｂｏ ＧＦＰ ｍＲＮＡに結合し得る低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）をコードし：ＩＧＦ－１およびＴｕｒｂｏ ＧＦＰの発現は同時にモジュレートされる、すなわち、ＩＧＦ－１の発現は上方調節され、Ｔｕｒｂｏ ＧＦＰの発現は同時に下方調節される、方法も本明細書において提供される。関連した態様において、組み換えポリ核酸またはＲＮＡコンストラクトは、少なくとも１、２、３、４、５、６種、またはそれより多くのｓｉＲＮＡをコードし得るまたは含み得る。関連した態様において、組み換えポリ核酸またはＲＮＡコンストラクトは、それぞれがＴｕｒｂｏ ＧＦＰ ｍＲＮＡの同じ領域に向けられた３種のｓｉＲＮＡをコードし得るまたは含み得る。関連した態様において、組み換えポリ核酸またはＲＮＡコンストラクトは、それぞれがＴｕｒｂｏ ＧＦＰ ｍＲＮＡの異なる領域に向けられた３種のｓｉＲＮＡをコードし得るまたは含み得る。関連した態様において、少なくとも３種のｓｉＲＮＡのそれぞれは、同じもの、異なるもの、またはその組み合わせに向けられ得る。関連した態様において、組み換えＲＮＡコンストラクトは、配列番号１０～１２および１０６～１０８（Ｃｐｄ．１０～Ｃｐｄ．１２）からなる群から選択される配列を含み得る。関連した態様において、組み換えポリ核酸コンストラクトは、配列番号２２～２４（Ｃｐｄ．１０～Ｃｐｄ．１２）からなる群から選択される配列を含み得る。

【0180】

関心のある遺伝子（例えば、ＩＬ－４またはＩＧＦ－１）をコードする第１のＲＮＡ配列と、１種または複数の標的ＲＮＡの発現をモジュレートする少なくとも２種の遺伝子エレメントを含む第２のＲＮＡ配列とをコードするまたは含む組み換えポリ核酸またはＲＮＡコンストラクトを含む組成物を細胞に導入することを含む、細胞において２種以上の遺伝子の発現を上方調節するおよび下方調節する方法であって、第２のＲＮＡは、標的ｍＲＮＡ（例えば、ＴＮＦ－アルファ ＩＬ－８、ＩＬ－１７、Ｔｕｒｂｏ ＧＦＰ、またはＩＬ－１ベータ）に結合し得る低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）をコードし；標的ｍＲＮＡは、関心のある遺伝子によってコードされるｍＲＮＡとは異なり、標的ｍＲＮＡの発現は下方調節され、関心のある遺伝子の発現は同時に上方調節される、方法が本明細書において提供される。一部の実施形態において、標的ｍＲＮＡの発現は、標的ｍＲＮＡに結合し得るｓｉＲＮＡによって下方調節される。一部の実施形態において、関心のある遺伝子の発現は、関心のある遺伝子によってコードされるｍＲＮＡまたはタンパク質を発現させることによって上方調節される。

【0181】

例示的な実施形態
一部の態様において、（ｉ）関心のある遺伝子をコードする第１のＲＮＡ配列と、（ｉｉ）１種または複数の標的ＲＮＡの発現をモジュレートする少なくとも２種の遺伝子エレメントを含む第２のＲＮＡ配列とを含む組み換えＲＮＡコンストラクトを含む組成物であって、ヒト細胞と組み換えＲＮＡコンストラクトとを接触させることは、（ｉ）の第１のＲＮＡ配列と、少なくとも２種の遺伝子エレメントのうちの多くとも１種を有する（ｉｉ）の相当する第２のＲＮＡ配列とを含む相当する組み換えＲＮＡコンストラクトと接触したヒト細胞の免疫応答よりも低い免疫応答をもたらす、組成物が本明細書において提供される。一部の実施形態において、組み換えＲＮＡコンストラクトは、１つまたは複数のウリジンを含む。一部の実施形態において、組み換えＲＮＡコンストラクトは、修飾されたウリジンを含まない。

【0182】

一部の態様において、（ｉ）関心のある遺伝子をコードする第１のＲＮＡ配列と、（ｉｉ）１種または複数の標的ＲＮＡの発現をモジュレートする少なくとも２種の遺伝子エレメントを含む第２のＲＮＡ配列とを含む組み換えＲＮＡコンストラクトを含む組成物であって、組み換えＲＮＡコンストラクトはヌクレオチドバリアントを含まない、組成物が本明細書において提供される。一部の実施形態において、ヌクレオチドバリアントは、修飾されたウリジンを含む。一部の実施形態において、修飾されたウリジンは、Ｎ１－メチルシュードウリジンを含む。

【0183】

一部の態様において、（ｉ）関心のある遺伝子をコードする第１のＲＮＡ配列と、（ｉｉ）１種または複数の標的ＲＮＡの発現をモジュレートする少なくとも２種の遺伝子エレメントを含む第２のＲＮＡ配列とを含む組み換えＲＮＡコンストラクトを含む組成物であって、組み換えＲＮＡコンストラクトは修飾されたウリジンを含まない、組成物が本明細書において提供される。

【0184】

一部の態様において、（ｉ）関心のある遺伝子をコードする第１のＲＮＡ配列と、（ｉｉ）１種または複数の標的ＲＮＡの発現をモジュレートする少なくとも２種の遺伝子エレメントを含む第２のＲＮＡ配列とを含む組み換えＲＮＡコンストラクトを含む組成物であって、組み換えＲＮＡコンストラクトはＮ１－メチルシュードウリジンを含まない、組成物が本明細書において提供される。

【0185】

一部の態様において、（ｉ）関心のある遺伝子をコードする第１のＲＮＡ配列と、（ｉｉ）１種または複数の標的ＲＮＡの発現をモジュレートする少なくとも２種の遺伝子エレメントを含む第２のＲＮＡ配列とを含む組み換えＲＮＡコンストラクトを含む組成物であって、組み換えＲＮＡコンストラクトは、非修飾のヌクレオチドまたは天然のヌクレオチドだけを含む、組成物が本明細書において提供される。

【0186】

一部の態様において、（ｉ）関心のある遺伝子をコードする第１のＲＮＡ配列と、（ｉｉ）１種または複数の標的ＲＮＡの発現をモジュレートする少なくとも２種の遺伝子エレメントを含む第２のＲＮＡ配列とを含む組み換えＲＮＡコンストラクトを含む組成物であって、組み換えＲＮＡコンストラクトはウリジンを含み、（ａ）組み換えＲＮＡコンストラクトによって含まれるすべてのウリジンは、非修飾もしくは天然のヌクレオチドであるか；または（ｂ）組み換えＲＮＡコンストラクトによって含まれるウリジンの少なくとも１つは非修飾のウリジンである、組成物が本明細書において提供される。

【0187】

一部の実施形態において、相当する組み換えＲＮＡコンストラクトは、１種または複数の標的ＲＮＡの発現をモジュレートする遺伝子エレメントのいずれも含まない。一部の実施形態において、第２のＲＮＡ配列は、１種または複数の標的ＲＮＡの発現をモジュレートする少なくとも３種の遺伝子エレメントを含む。一部の実施形態において、第２のＲＮＡ配列は、１種または複数の標的ＲＮＡの発現をモジュレートする少なくとも６種の遺伝子エレメントを含む。一部の実施形態において、第２のＲＮＡ配列は、１種または複数の標的ＲＮＡの発現をモジュレートする少なくとも２種または少なくとも４種の遺伝子エレメントを含む。一部の実施形態において、第２のＲＮＡ配列は、１種または複数の標的ＲＮＡの発現をモジュレートする２種もしくは４種、またはそれより多くの遺伝子エレメントを含む。

【0188】

一部の実施形態において、第１のＲＮＡ配列は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）配列である。一部の実施形態において、第２のＲＮＡ配列の少なくとも２種の遺伝子エレメントのそれぞれは、二次構造を含む。一部の実施形態において、第２のＲＮＡ配列の少なくとも２種の遺伝子エレメントのそれぞれは、ヘアピン構造またはループ構造を含む。一部の実施形態において、第２のＲＮＡ配列の少なくとも２種の遺伝子エレメントのそれぞれは、短いまたは低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）である。一部の実施形態において、第２のＲＮＡ配列の少なくとも２種の遺伝子エレメントのそれぞれは、細胞内タンパク質によってプロセシングされるまたは切断される。一部の実施形態において、第２のＲＮＡ配列の少なくとも２種の遺伝子エレメントのそれぞれは、細胞の内因性タンパク質によってプロセシングされるまたは切断される。一部の実施形態において、第２のＲＮＡ配列の少なくとも２種の遺伝子エレメントのそれぞれは、内因性Ｄｉｃｅｒによってプロセシングされるまたは切断される。一部の実施形態において、第２のＲＮＡ配列の少なくとも２種の遺伝子エレメントのそれぞれは、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を含む。一部の実施形態において、第２のＲＮＡ配列の少なくとも２種の遺伝子エレメントのそれぞれは、１種または複数の標的ＲＮＡに結合し得る。一部の実施形態において、第２のＲＮＡ配列は、１種または複数の標的ＲＮＡの発現をモジュレートする少なくとも２種または少なくとも４種のｓｉＲＮＡを含む。一部の実施形態において、第２のＲＮＡ配列は、１種または複数の標的ＲＮＡの発現をモジュレートする２種もしくは４種、またはそれより多くのｓｉＲＮＡを含む。

【0189】

一部の実施形態において、免疫応答は、ヒトＴｏｌｌ様受容体７（ＴＬＲ７）免疫応答、インターフェロンアルファ／ベータ（ＩＦＮα／β）免疫応答、ヒトＴｏｌｌ様受容体３（ＴＬＲ３）免疫応答、ヒトＴｏｌｌ様受容体８（ＴＬＲ８）免疫応答、またはその任意の組み合わせである。一部の実施形態において、ヒト細胞と組み換えＲＮＡコンストラクトとを接触させることは、ヒトＴｏｌｌ様受容体７（ＴＬＲ７）免疫原性アッセイに従って、相当する組み換えＲＮＡコンストラクトと接触したヒト細胞の免疫応答よりも低い免疫応答をもたらす。一部の実施形態において、ヒトＴＬＲ７免疫原性アッセイは、ＮＦ－κＢおよび／またはＡＰ１の活性化を測定する。一部の実施形態において、ヒトＴＬＲ７免疫原性アッセイは、ＨＥＫ２９３細胞またはその誘導体において実施される。一部の実施形態において、ＨＥＫ２９３細胞は、ｈＴＬＲ７およびレポーター遺伝子を発現するように操作されている。一部の実施形態において、レポーター遺伝子は、分泌型レポーター遺伝子である。一部の実施形態において、分泌型レポーター遺伝子は、分泌型胚性アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）である。一部の実施形態において、レポーター遺伝子は、１つまたは複数のＮＦ－κＢおよび／またはＡＰ１結合部位を有するプロモーターの制御下にある。一部の実施形態において、プロモーターはＩＦＮ－β最小プロモーターである。一部の実施形態において、組み換えＲＮＡコンストラクトと接触したヒト細胞における免疫応答は、相当する組み換えＲＮＡコンストラクトと接触したヒト細胞における免疫応答よりも少なくとも１．５倍または少なくとも２倍低い。

【0190】

一部の実施形態において、ヒト細胞と組み換えＲＮＡコンストラクトとを接触させることは、インターフェロンアルファ／ベータ（ＩＦＮα／β）免疫原性アッセイに従って、相当する組み換えＲＮＡコンストラクトと接触したヒト細胞の免疫応答よりも低い免疫応答をもたらす。一部の実施形態において、ＩＦＮα／β免疫原性アッセイは、ＪＡＫ－ＳＴＡＴおよび／またはＩＳＧ３の活性化を測定する。一部の実施形態において、ＩＦＮα／β免疫原性アッセイは、ＨＥＫ２９３細胞またはその誘導体において実施される。一部の実施形態において、ＨＥＫ２９３細胞は、ヒトＳＴＡＴ２および／またはＩＲＦ９遺伝子ならびにレポーター遺伝子を発現するように操作されている。一部の実施形態において、レポーター遺伝子は、分泌型レポーター遺伝子である。一部の実施形態において、分泌型レポーター遺伝子は、分泌型胚性アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）である。一部の実施形態において、レポーター遺伝子は、１つまたは複数のＳＴＡＴ２および／またはＩＲＦ９結合部位を有するプロモーターの制御下にある。一部の実施形態において、プロモーターはＩＳＧ５４プロモーターである。一部の実施形態において、組み換えＲＮＡコンストラクトと接触したヒト細胞における免疫応答は、相当する組み換えＲＮＡコンストラクトと接触したヒト細胞における免疫応答よりも少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、または少なくとも１００倍低い。

【0191】

一部の実施形態において、ヒト細胞と組み換えＲＮＡコンストラクトとを接触させることは、ヒトＴｏｌｌ様受容体３（ＴＬＲ３）免疫原性アッセイに従った実質的な免疫応答をもたらさない。一部の実施形態において、ヒトＴＬＲ３免疫原性アッセイは、ＮＦ－κＢおよび／またはＡＰ１の活性化を測定する。一部の実施形態において、ヒトＴＬＲ３免疫原性アッセイは、ＨＥＫ２９３細胞またはその誘導体において実施される。一部の実施形態において、ＨＥＫ２９３細胞は、ｈＴＬＲ３およびレポーター遺伝子を発現するように操作されている。一部の実施形態において、レポーター遺伝子は、分泌型レポーター遺伝子である。一部の実施形態において、分泌型レポーター遺伝子は、分泌型胚性アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）である。一部の実施形態において、レポーター遺伝子は、１つまたは複数のＮＦ－κＢおよび／またはＡＰ１結合部位を有するプロモーターの制御下にある。一部の実施形態において、プロモーターはＩＦＮ－β最小プロモーターである。

【0192】

一部の実施形態において、ヒト細胞と組み換えＲＮＡコンストラクトとを接触させることは、ヒトＴｏｌｌ様受容体８（ＴＬＲ８）免疫原性アッセイに従って、相当する組み換えＲＮＡコンストラクトと接触したヒト細胞の免疫応答よりも低い免疫応答をもたらす。一部の実施形態において、ヒトＴＬＲ８免疫原性アッセイは、ＮＦ－κＢ、ＡＰ１、および／またはＩＲＦの活性化を測定する。一部の実施形態において、ヒトＴＬＲ８免疫原性アッセイは、ＨＥＫ２９３細胞またはその誘導体において実施される。一部の実施形態において、ＨＥＫ２９３細胞は、ｈＴＬＲ８およびレポーター遺伝子を発現するように操作されている。一部の実施形態において、レポーター遺伝子は、分泌型レポーター遺伝子である。一部の実施形態において、分泌型レポーター遺伝子は、分泌型胚性アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）である。一部の実施形態において、レポーター遺伝子は、１つまたは複数のＮＦ－κＢおよび／またはＡＰ１結合部位を有するプロモーターの制御下にある。一部の実施形態において、プロモーターはＩＦＮ－β最小プロモーターである。

【0193】

一部の実施形態において、免疫応答は、細胞において炎症促進性サイトカインの発現を誘導する。一部の実施形態において、炎症促進性サイトカインはインターロイキン６（ＩＬ－６）を含む。一部の実施形態において、細胞は、ヒト肺上皮癌細胞（Ａ５４９）またはヒト単球白血病細胞（ＴＨＰ－１）を含む。

【0194】

一部の実施形態において、第２のＲＮＡ配列は、２、３、４、５、６種、またはそれより多くのｓｉＲＮＡを含み、２、３、４、５、６種、またはそれより多くのｓｉＲＮＡは、（ｉ）異なる標的ＲＮＡ；（ｉｉ）同じ標的ＲＮＡの異なる領域；（ｉｉｉ）同じ標的ＲＮＡの同じ領域；または（ｉｖ）その任意の組み合わせ、に結合し得るｓｉＲＮＡを含む。一部の実施形態において、第２のＲＮＡ配列は、少なくとも３種のｓｉＲＮＡを含む。一部の実施形態において、第２のＲＮＡ配列は、少なくとも６種のｓｉＲＮＡを含む。

【0195】

一部の実施形態において、組み換えＲＮＡコンストラクトは、１種または複数のリンカーをさらに含む。一部の実施形態において、１種または複数のリンカーのそれぞれは、式（Ｉ）：Ｘ_ｍＣＡＡＣＡＡＸ_ｎ［式中、Ｘは任意のヌクレオチドであり、ｍは１～１２の整数であり、ｎは０～４の整数である］；および式（ＩＩ）：Ｘ_ｐＴＣＣＣＸ_ｒ［式中、Ｘは任意のヌクレオチドであり、ｐは０～１７の整数であり、ｒは０～１３の整数である］からなる群から選択される構造を有する。一部の実施形態において、１種または複数のリンカーのそれぞれは、ＡＣＡＡＣＡＡを含む配列を含む。一部の実施形態において、１種または複数のリンカーのそれぞれは、（ａ）ＴＴＴＡＴＣＴＴＡＧＡＧＧＣＡＴＡＴＣＣＣＴＡＣＧＴＡＣＣＡＡＣＡＡもしくはＡＴＡＧＴＧＡＧＴＣＧＴＡＴＴＡＡＣＧＴＡＣＣＡＡＣＡＡではないか；または（ｂ）ＲＮＡｆｏｌｄウェブサーバーに従った二次構造を形成しない。一部の実施形態において、１種または複数のリンカーのそれぞれは、（ａ）第１のＲＮＡ配列と第２のＲＮＡ配列との間、（ｂ）第２のＲＮＡ配列の２、３、４、５、６種、もしくはそれより多くのｓｉＲＮＡのそれぞれの間、または（ｃ）（ａ）および（ｂ）の両方の間に存在する。一部の実施形態において、１種または複数のリンカーのそれぞれは、配列番号２７、２８、８５～９５からなる群から独立して選択される配列を含む。

【0196】

一部の実施形態において、関心のある遺伝子の発現はモジュレートされる。一部の実施形態において、関心のある遺伝子の発現は、組み換えＲＮＡコンストラクトを含む細胞において上方調節される。一部の実施形態において、関心のある遺伝子によってコードされるタンパク質の発現は、組み換えＲＮＡコンストラクトを含む細胞において上方調節される。

【0197】

一部の実施形態において、１種または複数の標的ＲＮＡの発現はモジュレートされる。一部の実施形態において、１種または複数の標的ＲＮＡの発現は、１種または複数の標的ＲＮＡの発現をモジュレートする遺伝子エレメントによって下方調節される。一部の実施形態において、１種または複数の標的ＲＮＡの発現をモジュレートする遺伝子エレメントは、関心のある遺伝子の発現を阻害しない。

【0198】

一部の実施形態において、関心のある遺伝子は、インターロイキン４（ＩＬ－４）およびインスリン様成長因子１（ＩＧＦ－１）からなる群から選択される。一部の実施形態において、１種または複数の標的ＲＮＡは、ノンコーディングＲＮＡまたはメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を含む。一部の実施形態において、１種または複数の標的ＲＮＡのそれぞれはノンコーディングＲＮＡである。一部の実施形態において、１種または複数の標的ＲＮＡのそれぞれはｍＲＮＡである。一部の実施形態において、標的ＲＮＡは、インターロイキン８（ＩＬ－８）、インターロイキン１ベータ（ＩＬ－１ベータ）、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ－アルファ）、インターロイキン１７（ＩＬ－１７）、またはその機能的バリアントを含むタンパク質をコードするｍＲＮＡである。

【0199】

一部の実施形態において、１種または複数の標的ＲＮＡの発現をモジュレートする遺伝子エレメントは、１種または複数の標的ＲＮＡのエクソンに結合する。一部の実施形態において、１種または複数の標的ＲＮＡの発現をモジュレートする遺伝子エレメントは、１種の標的ＲＮＡに特異的に結合する。一部の実施形態において、１種または複数の標的ＲＮＡの発現をモジュレートする遺伝子エレメントは、関心のある遺伝子のイントロン配列によってコードされないまたはそれから構成されない。一部の実施形態において、関心のある遺伝子は、ＲＮＡスプライシングなしで発現される。

【0200】

一部の実施形態において、第１のＲＮＡ配列は、第２のＲＮＡ配列の下流または３’に存在する。一部の実施形態において、第１のＲＮＡ配列は、第２のＲＮＡ配列の上流または５’に存在する。一部の実施形態において、ＲＮＡコンストラクトは、第１のＲＮＡ配列の上流または５’に内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を含む。

【0201】

一部の実施形態において、本明細書に記載される組成物は、ポリ（Ａ）テール、５’キャップ、またはコザック配列をさらに含む。一部の実施形態において、第１のＲＮＡ配列および第２のＲＮＡ配列は、両方とも組み換えである。一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、配列番号５７～７０から選択されるセンス鎖配列を含む。

【0202】

一部の態様において、細胞において２種以上の遺伝子の発現をモジュレートすることにおける使用のための組成物が本明細書において提供される。一部の態様において、本明細書に記載される組成物のいずれか１種の治療的有効量、および薬学的に許容される添加物を含む薬学的組成物が本明細書において提供される。一部の態様において、本明細書に記載される組成物のいずれか１種をコードする組み換えポリ核酸コンストラクトを含むベクターが本明細書において提供される。一部の態様において、本明細書に記載される組成物のいずれか１種、または本明細書に記載されるベクターのいずれか１種を含む細胞が本明細書において提供される。

【0203】

一部の態様において、本明細書に記載される組成物のいずれか１種、または本明細書に記載されるベクターのいずれか１種を細胞に導入することを含む、細胞において単一ＲＮＡ転写産物からｓｉＲＮＡおよびｍＲＮＡを同時に発現させる方法が本明細書において提供される。

【0204】

一部の態様において、本明細書に記載される組成物のいずれか１種、または本明細書に記載される薬学的組成物のいずれか１種をそれを必要とする対象に投与することを含む、疾患または病状を治療する方法が本明細書において提供される。

【0205】

一部の実施形態において、疾患または病状は、皮膚疾患もしくは病状、または関節疾患もしくは病状を含む。一部の実施形態において、皮膚疾患または病状は炎症性皮膚障害を含む。一部の実施形態において、炎症性皮膚障害は乾癬を含む。一部の実施形態において、関節疾患または病状は関節変性を含む。一部の実施形態において、関節変性は、椎間板疾患（ＩＶＤＤ）または変形性関節症（ＯＡ）を含む。一部の実施形態において、対象はヒトである。

【0206】

一部の態様において、（ｉ）インスリン様成長因子１（ＩＧＦ－１）をコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）と、（ｉｉ）インターロイキン－８（ＩＬ－８）ｍＲＮＡに結合し得る少なくとも２種の低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）とを含む組み換えＲＮＡコンストラクトを含む組成物であって、ヒト細胞と組み換えＲＮＡコンストラクトとを接触させることは、（ｉ）のＩＧＦ－１をコードするｍＲＮＡと、（ｉｉ）のＩＬ－８ ｍＲＮＡに結合し得る少なくとも２種のｓｉＲＮＡのうちの多くとも１種とを含む相当する組み換えＲＮＡコンストラクトと接触したヒト細胞の免疫応答よりも低い免疫応答をもたらす、組成物が本明細書において提供される。

【0207】

一部の態様において、（ｉ）インスリン様成長因子１（ＩＧＦ－１）をコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）と、（ｉｉ）インターロイキン－１ベータ（ＩＬ－１ベータ）ｍＲＮＡに結合し得る少なくとも２種の低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）とを含む組み換えＲＮＡコンストラクトを含む組成物であって、ヒト細胞と組み換えＲＮＡコンストラクトとを接触させることは、（ｉ）のＩＧＦ－１をコードするｍＲＮＡと、（ｉｉ）のＩＬ－１ベータｍＲＮＡに結合し得る少なくとも２種のｓｉＲＮＡのうちの多くとも１種とを含む相当する組み換えＲＮＡコンストラクトと接触したヒト細胞の免疫応答よりも低い免疫応答をもたらす、組成物が本明細書において提供される。

【0208】

一部の態様において、組み換えＲＮＡコンストラクト：（ｉ）インターロイキン－４（ＩＬ－４）をコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）と、（ｉｉ）腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ－アルファ）ｍＲＮＡに結合し得る少なくとも２種の低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）とを含む組成物であって、ヒト細胞と組み換えＲＮＡコンストラクトとを接触させることは、（ｉ）のＩＬ－４をコードするｍＲＮＡと、（ｉｉ）のＴＮＦ－アルファｍＲＮＡに結合し得る少なくとも２種のｓｉＲＮＡのうちの多くとも１種とを含む相当する組み換えＲＮＡコンストラクトと接触したヒト細胞の免疫応答よりも低い免疫応答をもたらす、組成物が本明細書において提供される。

【0209】

一部の態様において、組み換えＲＮＡコンストラクト：（ｉ）インターロイキン－４（ＩＬ－４）をコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）と、（ｉｉ）腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ－アルファ）ｍＲＮＡおよびインターロイキン１７（ＩＬ－１７）に結合し得る少なくとも２種の低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）とを含む組成物であって、ヒト細胞と組み換えＲＮＡコンストラクトとを接触させることは、（ｉ）のＩＬ－４をコードするｍＲＮＡと、（ｉｉ）のＴＮＦ－アルファｍＲＮＡおよびＩＬ－１７ ｍＲＮＡに結合し得る少なくとも２種のｓｉＲＮＡのうちの多くとも１種とを含む相当する組み換えＲＮＡコンストラクトと接触したヒト細胞の免疫応答よりも低い免疫応答をもたらす、組成物が本明細書において提供される。

【0210】

一部の態様において、（ｉ）インスリン様成長因子１（ＩＧＦ－１）をコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）と、（ｉｉ）インターロイキン－８（ＩＬ－８）ｍＲＮＡに結合し得る少なくとも２種の低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）とを含む組み換えＲＮＡコンストラクトを含む組成物であって、組み換えＲＮＡコンストラクトはヌクレオチドバリアントを含まない、組成物が本明細書において提供される。

【0211】

一部の態様において、（ｉ）インスリン様成長因子１（ＩＧＦ－１）をコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）と、（ｉｉ）インターロイキン－８（ＩＬ－８）ｍＲＮＡに結合し得る少なくとも２種の低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）とを含む組み換えＲＮＡコンストラクトを含む組成物であって、組み換えＲＮＡコンストラクトは修飾されたウリジンを含まない、組成物が本明細書において提供される。

【0212】

一部の態様において、（ｉ）インスリン様成長因子１（ＩＧＦ－１）をコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）と、（ｉｉ）インターロイキン－８（ＩＬ－８）ｍＲＮＡに結合し得る少なくとも２種の低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）とを含む組み換えＲＮＡコンストラクトを含む組成物であって、組み換えＲＮＡコンストラクトはＮ１－メチルシュードウリジンを含まない、組成物が本明細書において提供される。

【0213】

一部の態様において、（ｉ）インスリン様成長因子１（ＩＧＦ－１）をコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）と、（ｉｉ）インターロイキン－８（ＩＬ－８）ｍＲＮＡに結合し得る少なくとも２種の低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）とを含む組み換えＲＮＡコンストラクトを含む組成物であって、組み換えＲＮＡコンストラクトはウリジンを含み、（ａ）組み換えＲＮＡコンストラクトによって含まれるすべてのウリジンは、非修飾もしくは天然のヌクレオチドであるか；または（ｂ）組み換えＲＮＡコンストラクトによって含まれるウリジンの少なくとも１つは非修飾のウリジンである、組成物が本明細書において提供される。

【0214】

一部の態様において、（ｉ）インスリン様成長因子１（ＩＧＦ－１）をコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）と、（ｉｉ）インターロイキン－１ベータ（ＩＬ－１ベータ）ｍＲＮＡに結合し得る少なくとも２種の低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）とを含む組み換えＲＮＡコンストラクトを含む組成物であって、組み換えＲＮＡコンストラクトはヌクレオチドバリアントを含まない、組成物が本明細書において提供される。

【0215】

一部の態様において、（ｉ）インスリン様成長因子１（ＩＧＦ－１）をコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）と、（ｉｉ）インターロイキン－１ベータ（ＩＬ－１ベータ）ｍＲＮＡに結合し得る少なくとも２種の低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）とを含む組み換えＲＮＡコンストラクトを含む組成物であって、組み換えＲＮＡコンストラクトは修飾されたウリジンを含まない、組成物が本明細書において提供される。

【0216】

一部の態様において、（ｉ）インスリン様成長因子１（ＩＧＦ－１）をコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）と、（ｉｉ）インターロイキン－１ベータ（ＩＬ－１ベータ）ｍＲＮＡに結合し得る少なくとも２種の低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）とを含む組み換えＲＮＡコンストラクトを含む組成物であって、組み換えＲＮＡコンストラクトはＮ１－メチルシュードウリジンを含まない、組成物が本明細書において提供される。

【0217】

一部の態様において、（ｉ）インスリン様成長因子１（ＩＧＦ－１）をコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）と、（ｉｉ）インターロイキン－１ベータ（ＩＬ－１ベータ）ｍＲＮＡに結合し得る少なくとも２種の低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）とを含む組み換えＲＮＡコンストラクトを含む組成物であって、組み換えＲＮＡコンストラクトはウリジンを含み、（ａ）組み換えＲＮＡコンストラクトによって含まれるすべてのウリジンは、非修飾もしくは天然のヌクレオチドであるか；または（ｂ）組み換えＲＮＡコンストラクトによって含まれるウリジンの少なくとも１つは非修飾のウリジンである、組成物が本明細書において提供される。

【0218】

一部の態様において、組み換えＲＮＡコンストラクト：（ｉ）インターロイキン－４（ＩＬ－４）をコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）と、（ｉｉ）腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ－アルファ）ｍＲＮＡに結合し得る少なくとも２種の低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）とを含む組成物であって、組み換えＲＮＡコンストラクトはヌクレオチドバリアントを含まない、組成物が本明細書において提供される。

【0219】

一部の態様において、組み換えＲＮＡコンストラクト：（ｉ）インターロイキン－４（ＩＬ－４）をコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）と、（ｉｉ）腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ－アルファ）ｍＲＮＡに結合し得る少なくとも２種の低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）とを含む組成物であって、組み換えＲＮＡコンストラクトは修飾されたウリジンを含まない、組成物が本明細書において提供される。

【0220】

一部の態様において、組み換えＲＮＡコンストラクト：（ｉ）インターロイキン－４（ＩＬ－４）をコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）と、（ｉｉ）腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ－アルファ）ｍＲＮＡに結合し得る少なくとも２種の低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）とを含む組成物であって、組み換えＲＮＡコンストラクトはＮ１－メチルシュードウリジンを含まない、組成物が本明細書において提供される。

【0221】

一部の態様において、組み換えＲＮＡコンストラクト：（ｉ）インターロイキン－４（ＩＬ－４）をコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）と、（ｉｉ）腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ－アルファ）ｍＲＮＡに結合し得る少なくとも２種の低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）とを含む組成物であって、組み換えＲＮＡコンストラクトはウリジンを含み、（ａ）組み換えＲＮＡコンストラクトによって含まれるすべてのウリジンは、非修飾もしくは天然のヌクレオチドであるか；または（ｂ）組み換えＲＮＡコンストラクトによって含まれるウリジンの少なくとも１つは非修飾のウリジンである、組成物が本明細書において提供される。

【0222】

一部の態様において、組み換えＲＮＡコンストラクト：（ｉ）インターロイキン－４（ＩＬ－４）をコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）と、（ｉｉ）腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ－アルファ）ｍＲＮＡおよびインターロイキン１７（ＩＬ－１７）に結合し得る少なくとも２種の低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）とを含む組成物であって、組み換えＲＮＡコンストラクトはヌクレオチドバリアントを含まない、組成物が本明細書において提供される。

【0223】

一部の態様において、組み換えＲＮＡコンストラクト：（ｉ）インターロイキン－４（ＩＬ－４）をコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）と、（ｉｉ）腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ－アルファ）ｍＲＮＡおよびインターロイキン１７（ＩＬ－１７）に結合し得る少なくとも２種の低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）とを含む組成物であって、組み換えＲＮＡコンストラクトは修飾されたウリジンを含まない、組成物が本明細書において提供される。

【0224】

一部の態様において、組み換えＲＮＡコンストラクト：（ｉ）インターロイキン－４（ＩＬ－４）をコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）と、（ｉｉ）腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ－アルファ）ｍＲＮＡおよびインターロイキン１７（ＩＬ－１７）に結合し得る少なくとも２種の低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）とを含む組成物であって、組み換えＲＮＡコンストラクトはＮ１－メチルシュードウリジンを含まない、組成物が本明細書において提供される。

【0225】

一部の態様において、組み換えＲＮＡコンストラクト：（ｉ）インターロイキン－４（ＩＬ－４）をコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）と、（ｉｉ）腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ－アルファ）ｍＲＮＡおよびインターロイキン１７（ＩＬ－１７）に結合し得る少なくとも２種の低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）とを含む組成物であって、組み換えＲＮＡコンストラクトはウリジンを含み、（ａ）組み換えＲＮＡコンストラクトによって含まれるすべてのウリジンは、非修飾もしくは天然のヌクレオチドであるか；または（ｂ）組み換えＲＮＡコンストラクトによって含まれるウリジンの少なくとも１つは非修飾のウリジンである、組成物が本明細書において提供される。

【0226】

一部の態様において、配列番号１～２４、４２、１２５、９７～１０８、１２１～１２２、および１２７～１２８からなる群から選択される核酸配列を含む組み換えポリ核酸コンストラクトを含む組成物が本明細書において提供される。

【0227】

好ましい実施形態において、第１のＲＮＡ配列によってコードされる関心のある遺伝子は、インターロイキン２（ＩＬ－２）ではなく、第２のＲＮＡ配列によって含まれる少なくとも２種の遺伝子エレメントによってモジュレートされる１種または複数の標的ＲＮＡは、血管内皮増殖因子Ａ（ＶＥＧＦＡ）、ＶＥＧＦＡのアイソフォーム、ＭＨＣクラスＩ鎖関連配列Ａ（ＭＩＣＡ）、またはＭＨＣクラスＩ鎖関連配列Ｂ（ＭＩＣＢ）ではない。

【0228】

好ましい実施形態において、第１のＲＮＡ配列によってコードされる関心のある遺伝子は、インターロイキン２（ＩＬ－２）、その断片、またはその機能的バリアントではなく、第２のＲＮＡ配列によって含まれる少なくとも２種の遺伝子エレメントによってモジュレートされる１種または複数の標的ＲＮＡは、血管内皮増殖因子Ａ（ＶＥＧＦＡ）、ＶＥＧＦＡのアイソフォーム、ＭＨＣクラスＩ鎖関連配列Ａ（ＭＩＣＡ）、ＭＨＣクラスＩ鎖関連配列Ｂ（ＭＩＣＢ）、その断片、またはその機能的バリアントではない。

【実施例】

【0229】

これらの実施例は、例示的目的のためのみに提供されるものであり、本明細書において提供される特許請求の範囲を限定するものではない。

【0230】

実施例１：コンストラクト設計、配列、および合成

【0231】

コンストラクト設計

【0232】

ｓｉＲＮＡおよび関心のある遺伝子の両方とも、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写によって生成された単一転写産物から同時に発現される（表１；配列番号１～１２および９７～１０８）。ＩＬ－４およびＩＧＦ－１コード配列は、ホモサピエンス（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）を起源とし、結果として生じるアミノ酸配列の変化は、ＩＬ－４（ｈＩＬ－４：ＮＰ＿０００５８０．１；配列番号３１および３２；Ｃｐｄ．４～Ｃｐｄ．９）、およびＩＧＦ－１コンストラクトの一部（Ｃｐｄ．１０～Ｃｐｄ．１３；ＩＧＦ－１：ＮＰ＿０００６０９．１）に対して導入されなかった。トランスフェクトされた細胞からのｍＲＮＡ誘導性ＩＧＦ－１（ＮＰ＿０００６０９．１）の分泌を増加させるために、内因性のＩＧＦ－１プレ－ドメイン（シグナルペプチド；配列番号３３および３４）を、Ｃｐｄ．１～Ｃｐｄ．４ ｍＲＮＡコンストラクトにおいて、ＢＤＮＦ（ＮＰ＿７３３９３１．１；配列番号３５および３６）シグナルペプチド（ＢＤＮＦ－プロ－ＩＧＦ－１）によって交換した。さらに、コンストラクトは、７０個のアミノ酸を有する成熟ヒトＩＧＦ－１の全コード配列をコードする配列を含有した（配列番号３５および３６）。Ｃ末端Ｅ－ドメインは、コンストラクトに付加されなかった。ＩＬ－８（ＮＭ＿０００５８４．３；配列番号３７）、ＩＬ－１ベータ（ＮＭ＿０００５７６．２；配列番号３８）、ＩＬ－１７（ＮＭ＿００２１９０．２；配列番号３９）、およびＴＮＦ－アルファ（ＮＭ＿０００５９４．３；配列番号４０）に対するｓｉＲＮＡ標的配列は、ホモサピエンス（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）を起源とし、配列の変化は導入されなかった。Ｔｕｒｂｏ ＧＦＰ配列は、海生カイアシ類ポンテリーナ・プルマーテ（Ｐｏｎｔｅｌｌｉｎａ ｐｌｕｍａｔｅ）に由来した（配列番号４１）。ｓｉＲＮＡ構造を有するおよびｓｉＲＮＡ構造を有しないｍＲＮＡを比較するために、最適化されたシグナルペプチドを有するＩＬ－４分子を使用した（配列番号４２および４３）。

【0233】

ポリ核酸コンストラクトは、コザック配列（５’ＧＣＣＡＣＣ３’；配列番号２５）を含み得る。加えて、ポリ核酸コンストラクトは、ＲＮＡポリメラーゼ結合、ならびに単一転写産物における関心のある遺伝子およびｓｉＲＮＡの両方のｉｎ ｖｉｔｒｏ転写の成功のために、関心のある遺伝子配列の上流にＴ７プロモーター配列（５’ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡ３’；配列番号２６）を含み得る。代替的プロモーター、例えばＳＰ６、Ｔ３、Ｐ６０、Ｓｙｎ５、およびＫＰ３４が使用され得る。Ｔ７プロモーター、関心のある遺伝子、およびｓｉＲＮＡ配列に隣接するように設計されたプライマーを使用して、転写鋳型をＰＣＲによって生成して、ｍＲＮＡを産生する。リバースプライマーは、ｍＲＮＡに１２０ｂｐ長のポリ（Ａ）テールを付加するために、一続きのチミジン（Ｔ）塩基（１２０）を含む。ポリヌクレオチドまたはＲＮＡコンストラクトの一部は、Ｃｈｅｎｇら（２０１８）Ｊ．Ｍａｔｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｂ．、６、４６３８～４６４４に記載されるｓｉＲＮＡ設計を含むように操作され、異なるＲＮＡセグメントを接続する（関心のある遺伝子ｍＲＮＡをｓｉＲＮＡに（配列番号２７）、またはｓｉＲＮＡをｓｉＲＮＡに（配列番号２８））リンカーとともに、ｓｉＲＮＡ配列の上流または下流に関心のある１種または複数の遺伝子をさらに含む。組み換えコンストラクトは、同じまたは異なる標的ｍＲＮＡを標的にする１種より多くのｓｉＲＮＡ配列をコードし得るまたは含み得る。同じように、コンストラクトは、関心のある２種以上の遺伝子の核酸配列を含み得る。

【0234】

コンストラクト合成

【0235】

表１に示されるコンストラクト（化合物ＩＤ番号Ｃｐｄ．１～Ｃｐｄ．１４）を、コドン最適化（ＧｅｎｅＯｐｔｉｍｉｚｅｒアルゴリズム）を用いて、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含有するｐＭＡ－ＲＱプラスミド骨格ベクターにおいてＧｅｎｅＡｒｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって合成した。表１は、各化合物（Ｃｐｄ．）に関して、相当するｍＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ標的）へのｓｉＲＮＡ結合により下方調節される対象となるタンパク質、化合物におけるｓｉＲＮＡ位置、化合物におけるｓｉＲＮＡの数、関心のある遺伝子、およびそれぞれの適応症を示している。各コンストラクトの配列は表２に示されており、表の下に示されるように注釈を付されている（配列番号１～１２、４２、１２５、９７～１０８、および１２１～１２２）。各コンストラクトのプラスミド骨格配列は表３に示されており、化合物配列は、太字でかつ下線が引かれている（配列番号１３～２４および１２７～１２８）。

【0236】

【0237】

【0238】

【0239】

実施例２：ＲＮＡコンストラクトのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写およびデータ分析

【0240】

Ｃｐｄ．１～Ｃｐｄ．１４をコードするｐＭＡ－ＲＱ／ｐＭＡ－Ｔベクターを使用して、ＰＣＲベースのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写を行ってｍＲＮＡを産生する。表４におけるフォワードおよびリバースプライマー（配列番号２９および３０）を使用したＰＣＲによって、転写鋳型を生成した。１２０ｂｐポリ（Ａ）テールをもたらす鋳型において、ポリ（Ａ）テールをコードした。ｓｉＲＮＡ隣接領域のそれぞれの配列を考慮して、最適化を必要に応じて行って特異的増幅を達成した。最適化は、１）ベクターのプラスミドＤＮＡの量を減少させること、２）ＤＮＡポリメラーゼを変化させること（Ｑ５ホットスタートポリメラーゼ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、３）ＰＣＲの各サイクルに対して、変性時間（３０秒間から１０秒間へ）および伸長時間（４５秒間／ｋｂから１０秒間／ｋｂへ）を低下させること、４）ＰＣＲの各サイクルに対して、アニーリングを増加させること（１０秒間から３０秒間へ）、ならびに５）ＰＣＲの各サイクルに対して、最終伸長時間を増加させること（最高１５分間まで）を含む。加えて、非特異的プライマー結合を回避するために、融解試薬を含めた、ＰＣＲ反応混合物を氷上で調製し、ＰＣＲサイクルの数を２５回に低下させた。

【0241】

ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写に関しては、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ（ＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔキット、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を３７℃で２時間使用した。合成されたＲＮＡを、１００％Ｎ１－メチルシュード－ＵＴＰ（修飾されたＲＮＡ）を用いて化学修飾して免疫原性を低下させた、または標準ＵＴＰ（非修飾のＲＮＡ）を使用して非修飾であった。すべての合成されたＲＮＡを、５’末端でアンチリバースＣＡＰアナログ（ＡＲＣＡ；［ｍ_２ ^{７，３’－Ｏ}Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ］）を用いて共転写的にキャッピングした（Ｊｅｎａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）。ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写の後、ＲＮＡを、ＭＥＧＡｃｌｅａｒキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してカラム精製し、Ｎａｎｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ－Ｎ６０（Ｉｍｐｌｅｎ）を使用して定量した。

【0242】

【0243】

ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写を使用して、Ｃｐｄ．１～Ｃｐｄ．１４をＲＮＡコンストラクトとして作出し、免疫原性モジュレーションについて様々なｉｎ ｖｉｔｒｏモデルにおいて試験した。

【0244】

コンストラクトの分子量の判定を、以下のように実施した。各配列に存在する各塩基（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、またはＮ１－ＵＴＰ）の総数を判定し、該数にそれぞれの分子量（例えば、Ａ：３４７．２ｇ／ｍｏｌ；Ｃ ３２３．２ｇ／ｍｏｌ；Ｇ ３６３．２ｇ／ｍｏｌ；Ｎ１－ＵＴＰ：３３８．２ｇ／ｍｏｌ）を掛けることによって、各コンストラクトの分子量を各配列から判定した。各塩基に対して獲得された全重量と８１７．４ｇ／ｍｏｌのＡＲＣＡ分子量との合計によって、分子量を判定した。各コンストラクトの分子量を使用して、ナノモル（ｎＭ）濃度まで、各ウェルにおけるトランスフェクションに使用されるＲＮＡの量を算出した。ＱＵＡＮＴＩ－Ｂｌｕｅ（商標）を使用し、６２０ｎｍにおける光学濃度（Ｏ．Ｄ．）を読み取って、ＳＥＡＰ活性を査定した。トランスフェクトされていない細胞の上清をバックグラウンドコントロールとして使用し、試験された試料における獲得されたＯ．Ｄ．値から差し引いた。データを、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ８（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＵＳＡ）を使用して分析した。スチューデントｔ検定を使用して統計分析を行って、群間の有意差を比較した。

【0245】

実施例３：免疫原性アッセイ

【0246】

ＮＦ－κＢ活性化に関するＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ｈＴＬＲ７免疫原性アッセイ

【0247】

２種の異なる細胞株において実施される修飾されたＲＮＡおよび非修飾のＲＮＡを有する種々の化合物の免疫原性は、免疫原性の主要な経路を表す。第１のアッセイは、ＮＦ－κＢ／ＡＰ１の活性化をモニターすることによってヒトＴＬＲ７（ｈＴＬＲ７）の活性化を調査するために設計されているＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ｈＴＬＲ７（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ、カタログコード：ｈｋｂ－ｈｔｌｒ７）細胞を利用する。エンドソームＴＬＲ７受容体は、一本鎖ＲＮＡにおけるウリジンおよびグアノシン塩基を検出し、抗ウイルス応答としての免疫反応を引き出す。これらの細胞は、ヒト胎児性腎臓ＨＥＫ２９３細胞株に由来し、５つのＮＦ－κＢおよびＡＰ－１結合部位を有するＩＦＮ－β最小プロモーターの制御下でｈＴＬＲ７および分泌型胚性アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）レポーター遺伝子を発現するように操作されている。ＴＬＲ７活性化があり次第、ＳＥＡＰは産生され、細胞培養上清においてＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）検出細胞培地を用いてリアルタイムで判定され得る。ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ｈＴＬＲ７細胞の刺激を、修飾されたまたは非修飾の化合物（Ｃｐｄ．１～Ｃｐｄ．１２；０．３～０．４５μｇ／ウェル）の直接トランスフェクションによって達成した。

【0248】

ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ｈＴＬＲ７細胞を、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を補給されたダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）中で維持した。抗生物質ブラストサイジン（１０μｇ／ｍＬ）およびゼオシン（１００μｇ／ｍＬ）を培地に添加して、ｈＴＬＲ７およびＳＥＡＰ導入遺伝子プラスミドを含有する細胞を選択した。トランスフェクションの前に、細胞を９６ウェル培養プレートに４０，０００個細胞／ウェルで播種し、５％ＣＯ_２を含有する加湿された大気中にて３７℃で２４時間インキュベートした。細胞を、トランスフェクションの前に＜８０％の培養密度に達するように、１０％のＦＢＳを含有するＤＭＥＭ成長培地中で成長させた。その後、ＨＥＫ－２９３細胞に、１：１ｗ／ｖのＲＮＡ対Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ比を用いて、メーカーの説明書に従ってＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、０．３～０．４５μｇ／ウェルの特異的ＲＮＡコンストラクトをトランスフェクトした。１００μｌのＤＭＥＭを除去し、５０μｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭ、ならびにＯｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中５０μｌのＲＮＡおよびＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００複合体で置き換えた。５時間後、培地を新鮮な成長培地によって置き換え、プレートを、５％ＣＯ_２を含有する加湿された大気中にて３７℃で２４時間インキュベートした。Ｒ８４８（レシキモド；１μｇ／ｍｌ；Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ、カタログコード：ｔｌｒｌ－ｒ８４８）ｈＴＬＲ７アゴニストを、ポジティブコントロールとして使用した。２４時間のインキュベーションの後、ＳＥＡＰ活性を、ＱＵＡＮＴＩ－Ｂｌｕｅ（商標）（２０μｌ細胞培養上清＋１８０μｌ ＱＵＡＮＴＩ－Ｂｌｕｅ（商標）溶液）を使用し、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ ｉ３マルチモードプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ）において６２０ｎｍにおける光学濃度（Ｏ．Ｄ．）を読み取って査定した。トランスフェクトされていない試料を、バックグラウンドコントロールとして使用した。

【0249】

ＩＳＧＦ３経路の活性化をモニターするＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ＩＦＮ－α／β細胞免疫原性アッセイ

【0250】

ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ＩＦＮ－α／β細胞（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ、カタログコード：ｈｋｂ－ｉｆｎａｂ）は、Ｉ型インターフェロンによって誘導されるＪＡＫ－ＳＴＡＴおよびＩＳＧ３の活性化を調査するために設計されている。Ｉ型ＩＦＮの活性化は、それが主要なＲＮＡ感知器によって検出されることから、ＩＶＴ ｍＲＮＡの主たる免疫原性経路である。ＨＥＫ２９３細胞を、ヒトＳＴＡＴ２およびＩＲＦ９遺伝子を安定に発現してＩ型ＩＦＮシグナル伝達経路を活性化するように操作した。ＩＦＮ経路の活性化は、ＩＳＧ５４プロモーターの制御下にあるＳＥＡＰの分泌、および細胞培養上清におけるその後続の検出につながった。ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ＩＦＮ－α／β細胞を、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を補給されたダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）中で維持した。抗生物質ブラストサイジン（１０μｇ／ｍＬ）およびゼオシン（１００μｇ／ｍＬ）を培地に添加して、ＳＴＡＴ２、ＩＲＦ９、およびＳＥＡＰ導入遺伝子プラスミドを含有する細胞を選択した。トランスフェクションの前に、細胞を９６ウェル培養プレートに４０，０００個細胞／ウェルで播種し、５％ＣＯ_２を含有する加湿された大気中にて３７℃で２４時間インキュベートした。細胞を、刺激の前に＜８０％の培養密度に達するように、１０％のＦＢＳを含有するＤＭＥＭ成長培地中で成長させた。ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ＩＦＮ－α／β細胞の刺激を、下に詳細を有して、修飾されたおよび非修飾の化合物（Ｃｐｄ．１～Ｃｐｄ．１２；０．３～０．６μｇ／ウェル）を以前にトランスフェクトされた２０μｌ ＨＥＫ２９３細胞上清に由来する組み換えＩＦＮ－α（１μｇ／ｍｌ）またはＩＦＮ－α／βによって達成した。

【0251】

ヒト胎児性腎細胞２９３（ＨＥＫ２９３Ｔ；ＡＴＣＣ、ＣＲＬ－１５７３、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ、ＵＳＡ）を、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を補給されたダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）中で維持した。トランスフェクションの前に、細胞を９６ウェル培養プレートに２０，０００または４０，０００個細胞／ウェルで播種し、５％ＣＯ_２を含有する加湿された大気中にて３７℃で２４時間インキュベートした。細胞を、トランスフェクションの前に＜８０％の培養密度に達するように、１０％のＦＢＳを含有するＤＭＥＭ成長培地中で成長させた。その後、ＨＥＫ２９３細胞に、１：１ｗ／ｖのＲＮＡ対Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ比を用いて、メーカーの説明書に従ってＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、修飾されたおよび非修飾のＲＮＡ化合物（Ｃｐｄ．１～Ｃｐｄ．１２；０．３～０．６μｇ／ウェル）をトランスフェクトした。１００μｌのＤＭＥＭを除去し、５０μｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭ、ならびにＯｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中５０μｌのＲＮＡおよびＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００複合体で置き換えた。５時間後、培地を新鮮な成長培地によって置き換え、プレートを、５％ＣＯ_２を含有する加湿された大気中にて３７℃で２４時間インキュベートした。細胞培養上清（２０μｌ）を回収し、ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ＩＦＮ－α／β細胞の培地に添加して、ＪＡＫ－ＳＴＡＴおよびＩＳＧ３経路の刺激を通じて、分泌されたＩＦＮ活性を測定した。組み換えヒトＩＦＮ－α１０（１μｇ／ｍｌ）をポジティブコントロールとして使用した（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ、カタログコード：ｒｃｙｃ－ｈｉｆｎａ１０）。２時間のインキュベーションの後、ＳＥＡＰ活性を、ＱＵＡＮＴＩ－Ｂｌｕｅ（商標）（２０μｌ細胞培養上清＋１８０μｌ ＱＵＡＮＴＩ－Ｂｌｕｅ（商標）溶液）を使用し、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ ｉ３マルチモードプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ）において６２０ｎｍにおける光学濃度（Ｏ．Ｄ．）を読み取って査定した。トランスフェクトされていない試料を、バックグラウンドコントロールとして使用し、試験された試料における獲得されたＯ．Ｄ．値から差し引いた。

【0252】

結果

【0253】

Ｃｐｄ．１～Ｃｐｄ．６の免疫原性評価

【0254】

修飾されたまたは非修飾の化合物（Ｃｐｄ．１～Ｃｐｄ．６；０．３μｇ／ウェル）の直接トランスフェクションによる、ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ｈＴＬＲ７細胞におけるＮＦ－κＢ経路の活性化を、実験的に確認した。ポジティブコントロールとして使用されたｈＴＬＲ７アゴニストであるＲ８４８（レシキモド；１μｇ／ｍｌ）は、予想どおり高レベル（Ｏ．Ｄ．＞２）のＴＬＲ７活性化を誘導した。修飾されたおよび非修飾のＣｐｄ．１～Ｃｐｄ．６に関する、ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ｈＴＬＲ７細胞を使用した免疫原性アッセイは、Ｎ１－メチルシュード－ＵＴＰでの化学修飾が、それらの非修飾の対応物と比較して、免疫活性化を有意に減じることを実証した（＊＊、Ｐ＜０．０１；図２Ａ）。３×ｓｉＲＮＡ（Ｃｐｄ．２、Ｃｐｄ．３、Ｃｐｄ．５、およびＣｐｄ．６）または６×ｓｉＲＮＡ（Ｃｐｄ．４）を有する非修飾の化合物は、ｓｉＲＮＡを有しない非修飾の化合物（ＩＬ－４ ｍＲＮＡのみ）または１×ｓｉＲＮＡを有するＣｐｄ．１と比較して、低下したｈＴＬＲ７活性化を示した（＊＊＊、Ｐ＜０．００１；図２Ａ）。同じように、修飾されたまたは非修飾のＣｐｄ．１～Ｃｐｄ．６（０．６μｇ）を以前にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞の上清に由来する組み換えＩＦＮ－α（１μｇ／ｍｌ）またはＩＦＮ－α／βを用いたＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ＩＦＮ－α／β細胞の刺激を、ポジティブコントロールとしてＩＦＮαを用いて実験的に確認した。ｈＴＬＲ７活性化と一致して、修飾された化合物は、それらの非修飾の対応物と比較して、ＩＦＮα／β経路の有意に低下した活性化を示した（＊＊＊、Ｐ＜０．００１；図２Ｂ）。アッセイは、３×または６×ｓｉＲＮＡを有する非修飾の化合物（Ｃｐｄ．２～Ｃｐｄ．６）をトランスフェクトされた細胞の上清が、ｓｉＲＮＡを有しない非修飾の化合物または１×ｓｉＲＮＡを有するＣｐｄ．１と比較して、ＪＡＫ－ＳＴＡＴおよびＩＳＧ３経路の減少した活性化を呈示することを明らかにした（＊＊＊、Ｐ＜０．００１；図２Ｂ）。加えて、ＩＬ－４の下流またはそれに対して３’に存在する、ＴＮＦ－アルファを標的にする３×ｓｉＲＮＡを有するＣｐｄ．５は、ＩＬ－４の上流またはそれに対して５’に存在する、ＴＮＦ－アルファを標的にする３×ｓｉＲＮＡを有するＣｐｄ．６と比較して、有意な様式で免疫原性を引き下げた（＊、Ｐ＜０．０５；図２Ｂ）。要約すると、両アッセイは、強力に低下したｉｎ ｖｉｔｒｏ免疫原性を実証し、非修飾の化合物の潜在的により良好な安全性プロファイルを提供した。

【0255】

Ｃｐｄ．６～Ｃｐｄ．９およびＣｐｄ．４の免疫原性評価

【0256】

Ｃｐｄ．６～Ｃｐｄ．９およびＣｐｄ．４は、ＴＮＦ－アルファを標的にする漸増数のｓｉＲＮＡとともに、ＩＬ－４をコードするｍＲＮＡを有するコンストラクトである。Ｃｐｄ．７およびＣｐｄ．８は、それぞれ、ＩＬ－４コード配列に対して５’（または上流）および３’（または下流）に１×ｓｉＲＮＡを含有する。Ｃｐｄ．６は、Ａ１リンカーとともに３×ｓｉＲＮＡを含有し、一方でＣｐｄ．９は、Ａ２リンカーとともに３×ｓｉＲＮＡを含む。Ｃｐｄ．４は、６×ｓｉＲＮＡ（ＴＮＦ－アルファを標的にする３×、およびＩＬ－１７を標的にする３×）を含有する。修飾されたまたは非修飾のＣｐｄ．６～Ｃｐｄ．９およびＣｐｄ．４の直接トランスフェクション（０．３μｇ／ウェル）を用いたＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ｈＴＬＲ７細胞の刺激は、２４時間後のトランスフェクトされた細胞におけるＳＥＡＰ分泌によって測定される、ＮＦ－κＢ経路の様々な活性化レベルを呈示した。修飾された化合物は、すべての試験されたコンストラクトに関して、低下した免疫原性を呈示した（＊＊＊、Ｐ＜０．００１；図３Ａ）。ＩＬ－４コード配列に対して５’（またはその上流）に存在する１×ｓｉＲＮＡを有する非修飾のＣｐｄ．７は、免疫原性が高いことが見出されたものの、ＩＬ－４に対して３’（またはその下流）に同じｓｉＲＮＡを再配置することは、ＮＦ－κＢ経路活性化の３倍の減衰をもたらした（＊＊＊、Ｐ＜０．００１；図３Ａ）。Ｃｐｄ．６、Ｃｐｄ．９、およびＣｐｄ．４における３×または６×ｓｉＲＮＡの付加は、ｈＴＬＲ７結合から逃れるために、ＲＮＡコンストラクトに対して修飾された塩基を使用する必要性を排除した（図３Ａ）。ポジティブコントロールＲ８４８は、予想どおり高レベルのＴＬＲ７活性化を誘導した。漸増数のｓｉＲＮＡ（Ｃｐｄ．６もしくはＣｐｄ．９における３×、またはＣｐｄ．４における６×）を有する非修飾の化合物をトランスフェクトされた細胞培養物の上清を使用した、ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ＩＦＮ－α／β細胞におけるＣｐｄ．６～Ｃｐｄ．８およびＣｐｄ．４の免疫原性査定は、ＩＦＮシグナル伝達のレベルが、１×ｓｉＲＮＡを有する非修飾の化合物（Ｃｐｄ．７およびＣｐｄ．８；図３Ａ）をトランスフェクトされた細胞培養物の上清を使用したことと比較して、検出不能であることを示した。ｈＴＲＬ７活性化に関して観察されたように、化合物における１×ｓｉＲＮＡの位置の変更（関心のある遺伝子の５’から３’へ）は、４倍低下した免疫原性を引き起こした（＊＊＊、Ｐ＜０．００１；図３Ｂ）。要約すると、両アッセイは、非修飾の化合物の免疫活性化のｓｉＲＮＡコピー数依存的（例えば、ｓｉＲＮＡの数）減衰を実証した。

【0257】

Ｃｐｄ．１０～Ｃｐｄ．１２の免疫原性評価

【0258】

Ｃｐｄ．１０～Ｃｐｄ．１２は、ＩＧＦ－１コードｍＲＮＡ、およびＴｕｒｂｏ ＧＦＰを標的にする漸増数（それぞれ１×、２×、および３×）のｓｉＲＮＡを有するコンストラクトである。ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ｈＴＬＲ７細胞における非修飾のＣｐｄ．１０～Ｃｐｄ．１２の免疫刺激は、図４Ａに示されるように、ＳＥＡＰ分泌によって測定される、ＮＦ－κＢ経路の活性化の用量依存的（コンストラクトにおけるｓｉＲＮＡの数）低下を呈示した（＊＊＊、Ｐ＜０．００１）。同じように、ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ＩＦＮ－α／β細胞におけるＣｐｄ．９～Ｃｐｄ．１１の免疫原性査定は、ＩＦＮシグナル伝達の用量依存的（コンストラクトにおけるｓｉＲＮＡの数）減少を示した（図４Ｂ）。要約すると、少なくとも２×ｓｉＲＮＡを有する化合物は、ｈＴＬＲ７活性化のレベルを中程度に低下させ、ＩＦＮシグナル伝達を有意に低下させる。

【0259】

ＮＦ－κＢ／ＡＰ－１活性化に関するＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ｈＴＬＲ３免疫原性アッセイ

【0260】

組み合わせコンストラクト（ｍＲＮＡ＋ｓｉＲＮＡ）は、より短いｄｓＲＮＡ構造（約２０ヌクレオチド）を有するヘアピンループを所有し、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）モチーフを検出するエンドソームＴＬＲ３リガンドを通じて不要な免疫応答を潜在的に誘導し得る。エンドソームＴＬＲ３受容体はｄｓＲＮＡを検出し、抗微生物応答としての免疫反応を引き出す。ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ｈＴＬＲ３（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ、カタログコードｈｋｂ－ｈｔｌｒ３）細胞は、ＮＦ－κＢ／ＡＰ１シグナル伝達カスケードの活性化をモニターすることによってヒトＴＬＲ３（ｈＴＬＲ３）の活性化を調査するために設計されている。これらの細胞は、ヒト胎児性腎臓ＨＥＫ２９３細胞株に由来し、ＮＦ－ｋＢおよびＡＰ－１誘導性プロモーターの制御下でｈＴＬＲ３および分泌型胚性アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）レポーター遺伝子を発現するように操作されている。ＴＬＲ３活性化があり次第、ＳＥＡＰは産生され、細胞培養上清においてＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）検出細胞培地を用いてリアルタイムで判定され得る。ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ｈＴＬＲ３細胞の刺激を、修飾されたまたは非修飾の化合物（Ｃｐｄ．３、Ｃｐｄ．１３、およびＣｐｄ．１４；０．６μｇ／ウェル）の直接トランスフェクションによって達成した。

【0261】

ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ｈＴＬＲ３細胞を、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を補給されたダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）中で維持した。抗生物質ブラストサイジン（１０μｇ／ｍＬ）およびゼオシン（１００μｇ／ｍＬ）を培地に添加して、ｈＴＬＲ３およびＳＥＡＰ導入遺伝子プラスミドを含有する細胞を選択した。トランスフェクションの前に、細胞を９６ウェル培養プレートに４０，０００個細胞／ウェルで播種し、５％ＣＯ_２を含有する加湿された大気中にて３７℃で２４時間インキュベートした。細胞を、トランスフェクションの前に＜８０％の培養密度に達するように、１０％のＦＢＳを含有するＤＭＥＭ成長培地中で成長させた。その後、ＨＥＫ－２９３細胞に、１：１ｗ／ｖのＲＮＡ対Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ比を用いて、メーカーの説明書に従ってＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、０．６μｇ／ウェルの特異的ＲＮＡコンストラクトをトランスフェクトした。１００μｌのＤＭＥＭを除去し、９０μｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭ、ならびにＯｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中１０μｌのＲＮＡおよびＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００複合体で置き換えた。プレートを、５％ＣＯ_２を含有する加湿された大気中にて３７℃で２４時間インキュベートした。ポリ（Ｉ：Ｃ）ＨＭＷ（１μｇ／ｍｌ；Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ、カタログコード：ｔｌｒｌ－ｐｉｃ）を、ポジティブコントロールとして使用した。２４時間のインキュベーションの後、ＳＥＡＰ活性を、ＱＵＡＮＴＩ－Ｂｌｕｅ（商標）（２０μｌ細胞培養上清＋１８０μｌ ＱＵＡＮＴＩ－Ｂｌｕｅ（商標）溶液）を使用し、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ ｉ３マルチモードプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ）において６２０ｎｍにおける光学濃度（Ｏ．Ｄ．）を読み取って査定した。トランスフェクトされていない試料を、バックグラウンドコントロールとして使用した。

【0262】

結果

【0263】

Ｃｐｄ．３、Ｃｐｄ．１３、およびＣｐｄ．１４の免疫原性評価

【0264】

修飾されたまたは非修飾の化合物（Ｃｐｄ．３およびＣｐｄ．１３；０．６μｇ／ウェル）の直接トランスフェクションによる、ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ｈＴＬＲ３細胞におけるＮＦ－κＢ／ＡＰ１経路の活性化を、実験的に確認した。ポジティブコントロールとして使用されたｈＴＬＲ３アゴニストであるポリ（Ｉ：Ｃ）ＨＭＷ（１μｇ／ｍｌ）は、予想どおり高レベル（Ｏ．Ｄ．＞１．９５）のＴＬＲ３活性化を誘導した。エンドソームＴＬＲ３リガンドは、感知するウリジン（Ｕ）またはグアノシン（Ｇ）モチーフではなくｄｓＲＮＡに向くことから、修飾されたおよび非修飾のＣｐｄ．３、Ｃｐｄ．１３、およびＣｐｄ．１４に関する、ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ｈＴＬＲ３細胞を使用した免疫原性アッセイは、Ｎ１－メチルシュード－ＵＴＰでの化学修飾が、それらの非修飾の対応物と比較して、ＴＬＲ３活性化に対していかなる影響も有しないことを実証した。ＩＧＦ－１とともにＩＬ－１ベータを標的にする３×ｓｉＲＮＡを有する非修飾のＣｐｄ．３は、ｓｉＲＮＡを有しない非修飾の化合物Ｃｐｄ．１３（＊＊＊、Ｐ＜０．００１；図５Ａ）またはＣｐｄ．１４（＊、Ｐ＜０．０５；図５Ａ）と比較して、有意に低下したｈＴＬＲ３活性化を示した。同様に、非修飾のＣｐｄ．３における３×ｓｉＲＮＡの存在は、修飾されたＣｐｄ．３と比較して、ＴＬＲ８媒介性免疫活性化を減じた（＊＊＊、Ｐ＜０．００１；図５Ｂ）。

【0265】

ＮＦ－κＢ／ＡＰ－１／ＩＲＦ活性化に関するＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ｈＴＬＲ８免疫原性アッセイ

【0266】

ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ｈＴＬＲ８（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ、カタログコードｈｋｂ－ｈｔｌｒ８）細胞は、ＮＦ－κＢ／ＡＰ１／ＩＲＦシグナル伝達カスケードの活性化をモニターすることによってヒトＴＬＲ８（ｈＴＬＲ８）の活性化を調査するために設計されている。エンドソームＴＬＲ８受容体は、一本鎖ＲＮＡにおけるウリジンおよびグアノシンモチーフを検出し、抗ウイルス応答としての免疫反応を引き出す。ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ｈＴＬＲ８細胞は、ヒト胎児性腎臓ＨＥＫ２９３細胞株に由来し、５つのＮＦ－κＢおよびＡＰ－１結合部位を有するＩＦＮ－β最小プロモーターの制御下でｈＴＬＲ８および分泌型胚性アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）レポーター遺伝子を発現するように操作されている。ＴＬＲ８活性化があり次第、ＳＥＡＰは産生され、細胞培養上清においてＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）検出細胞培地を用いてリアルタイムで判定され得る。ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ｈＴＬＲ７細胞の刺激を、修飾されたまたは非修飾の化合物（Ｃｐｄ．３、Ｃｐｄ．１３、およびＣｐｄ．１４；０．６μｇ／ウェル）の直接トランスフェクションによって達成した。

【0267】

ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ｈＴＬＲ８細胞を、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を補給されたダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）中で維持した。抗生物質ブラストサイジン（１０μｇ／ｍＬ）およびゼオシン（１００μｇ／ｍＬ）を培地に添加して、ｈＴＬＲ８およびＳＥＡＰ導入遺伝子プラスミドを含有する細胞を選択した。トランスフェクションの前に、細胞を９６ウェル培養プレートに４０，０００個細胞／ウェルで播種し、５％ＣＯ_２を含有する加湿された大気中にて３７℃で２４時間インキュベートした。細胞を、トランスフェクションの前に＜８０％の培養密度に達するように、１０％のＦＢＳを含有するＤＭＥＭ成長培地中で成長させた。その後、ＨＥＫ－２９３細胞に、１：１ｗ／ｖのＲＮＡ対Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ比を用いて、メーカーの説明書に従ってＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、０．６μｇ／ウェルの特異的ＲＮＡコンストラクトをトランスフェクトした。１００μｌのＤＭＥＭを除去し、９０μｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭ、ならびにＯｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中１０μｌのＲＮＡおよびＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００複合体で置き換えた。プレートを、５％ＣＯ_２を含有する加湿された大気中にて３７℃で２４時間インキュベートした。Ｒ８４８（レシキモド；１μｇ／ｍｌ；Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ、カタログコード：ｔｌｒｌ－ｒ８４８）ｈＴＬＲ７／８アゴニストを、ポジティブコントロールとして使用した。２４時間のインキュベーションの後、ＳＥＡＰ活性を、ＱＵＡＮＴＩ－Ｂｌｕｅ（商標）（２０μｌ細胞培養上清＋１８０μｌ ＱＵＡＮＴＩ－Ｂｌｕｅ（商標）溶液）を使用し、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ ｉ３マルチモードプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ）において６２０ｎｍにおける光学濃度（Ｏ．Ｄ．）を読み取って査定した。トランスフェクトされていない試料を、バックグラウンドコントロールとして使用した。

【0268】

結果

【0269】

Ｃｐｄ．３、Ｃｐｄ．１３、およびＣｐｄ．１４の免疫原性評価

【0270】

修飾されたまたは非修飾の化合物（Ｃｐｄ．３およびＣｐｄ．１３；０．６μｇ／ウェル）の直接トランスフェクションによる、ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ｈＴＬＲ８細胞におけるＮＦ－κＢ／ＡＰ１／ＩＲＦ経路の活性化を、実験的に確認した。ポジティブコントロールとして使用されたｈＴＬＲ７／８アゴニストであるＲ８４８（１μｇ／ｍｌ）は、ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ｈＴＬＲ７細胞に関してとは異なり、中程度レベルのＴＬＲ８活性化（Ｏ．Ｄ．＞０．４５）を誘導した。修飾されたおよび非修飾のＣｐｄ．３、Ｃｐｄ．１３、およびＣｐｄ．１４に関する、ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ｈＴＬＲ８細胞を使用した免疫原性アッセイは、Ｎ１－メチルシュード－ＵＴＰでの化学修飾が、それらの非修飾の対応物と比較して、ＴＬＲ８活性化に対していかなる影響も有しないことを実証した。ＴＬＲ８リガンドは、ウリジン（Ｕ）モチーフを検出することが公知であるものの、修飾されたおよび非修飾のコンストラクトに関して観察されたＴＬＲ８活性化に差はなかった。このことは、ＴＬＲ８の結合アフィニティーが、ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ｈＴＬＲ８細胞においてグアノシンモチーフ特異的であることが観察されるという報告によって説明され得る（Ｈｕら、Ｂｉｏｏｒｇ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ．２０１８年１月１日；２６（１）：７７～８３）。ＩＧＦ－１とともにＩＬ－１ベータを標的にする３×ｓｉＲＮＡを有する非修飾のＣｐｄ．３は、ｓｉＲＮＡを有しない非修飾の化合物、すなわちＣｐｄ．１３（＊＊＊、Ｐ＜０．００１；図５Ｂ）またはＣｐｄ．１４（＊、Ｐ＜０．０５；図５Ｂ）と比較して、有意に低下したｈＴＬＲ８活性化を示した。同様に、非修飾のＣｐｄ．３における３×ｓｉＲＮＡの存在は、修飾されたＣｐｄ．３と比較して、ＴＬＲ８媒介性免疫活性化を減じた（＊＊＊、Ｐ＜０．００１；図５Ｂ）。

【0271】

Ａ５４９細胞における内因性のＩＬ－６発現を刺激することによる免疫原性査定

【0272】

ヒト肺上皮癌細胞（Ａ５４９；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ＃６０１２８０４）細胞を、ｍＲＮＡの直接トランスフェクションがあり次第の、インターロイキン６（ＩＬ－６）の内因性発現をモニターすることによって、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写されたｍＲＮＡ（ＩＶＴ ｍＲＮＡ）に対する免疫応答を調査するために利用した。ＩＶＴ ｍＲＮＡに対する免疫原性の刺激は、ＲＮＡ感知器（例えば、ＴＬＲ、ＰＫＲ）によって誘発され、ＩＶＴ ｍＲＮＡに対する免疫活性化において中心的役割を果たす、ＩＬ－６を含めたいくつかの炎症促進性サイトカインの発現を誘導する。Ａ５４９細胞を、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（ＦＢＳ、ＶＷＲ、カタログ＃９７０６８－０９１）を補給されたダルベッコ改変イーグル培地高グルコース（ＤＭＥＭ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）中で維持した。トランスフェクションの前に、Ａ５４９細胞を９６ウェル培養プレートに１０，０００個細胞／ウェルで播種し、５％ＣＯ_２を含有する加湿された大気中にて３７℃で２４時間インキュベートした。次いで、細胞を、トランスフェクションの前に＜７０％の培養密度に達するように、１０％のＦＢＳを含有するＤＭＥＭ成長培地中で成長させた。その後、Ａ５４９細胞に、１：１ｗ／ｖのｍＲＮＡ対Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ比を用いて、メーカーの説明書に従ってＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、特異的ｍＲＮＡコンストラクト（０．３μｇ）をトランスフェクトした。１００μｌのＤＭＥＭを除去し、５０μｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を各ウェルに添加し、その後にＯｐｔｉ－ＭＥＭ中５０μｌのｍＲＮＡおよびＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００複合体が続いた。５時間のインキュベーションの後、培地を新鮮な成長培地によって置き換え、プレートを、５％ＣＯ_２を含有する加湿された大気中にて３７℃で２４時間インキュベートした。細胞培養上清を回収して、ＥＬＩＳＡ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ＃８８７０６６）を使用して分泌されたヒトＩＬ－６を測定した。

【0273】

結果

【0274】

Ｃｐｄ．３、Ｃｐｄ．４、Ｃｐｄ．１３、およびＣｐｄ．１４の免疫原性評価

【0275】

修飾されたまたは非修飾の化合物（Ｃｐｄ．３、Ｃｐｄ．４、Ｃｐｄ．１３、およびＣｐｄ．１４；０．３μｇ／ウェル）の直接トランスフェクションによる、Ａ５４９細胞におけるＩＬ－６の内因性発現を、実験的に確認した。修飾されたまたは非修飾のＲＮＡ化合物をトランスフェクトされた細胞間のＩＬ－６レベルの明白な差（図６Ａ）は、Ｎ１－メチルシュード－ＵＴＰでの化学修飾が、Ａ５４９細胞において免疫活性化を減じることを実証した。修飾された化合物に関して、ｓｉＲＮＡ構造の存在（Ｃｐｄ．３における３×；Ｃｐｄ．４における６×）は、ｓｉＲＮＡを有しないそれぞれの化合物と比べて、ＩＬ－６レベルを有意にさらに低下させた（例えば、Ｃｐｄ．３対Ｃｐｄ．１３（＊＊、＜０．０１）；Ｃｐｄ．４対Ｃｐｄ．１４（＊＊＊、＜０．００１）を参照されたい）。ＩＬ－６レベルの顕著な低下が、ｓｉＲＮＡの存在または非存在との関連で、非修飾の化合物に対して認められた。ＩＧＦ－１とともにＩＬ－１ベータを標的にする３×ｓｉＲＮＡを有する非修飾のＣｐｄ．３は、ｓｉＲＮＡを有せずＩＧＦ－１を含む非修飾の化合物、すなわちＣｐｄ．１３と比較して、有意に低下したＩＬ－６レベルを示した（＊＊＊、Ｐ＜０．００１；図６Ａ）。同様に、非修飾のＣｐｄ．４におけるＩＬ－４ ｍＲＮＡに加えた６×ｓｉＲＮＡ（ＴＮＦ－アルファを標的にする３×、およびＩＬ－１７を標的にする３×）の存在は、ｓｉＲＮＡを有せずＩＬ－４コードｍＲＮＡを含む非修飾のＣｐｄ．１４と比較して、減少したＩＬ－６レベルを実証した（＊＊＊、Ｐ＜０．００１；図６Ａ）。非修飾のＣｐｄ．３（３×）およびＣｐｄ．４（６×）の比較は、ｓｉＲＮＡの増加がＩＬ－６刺激を減少させることを示している（＊、Ｐ＜０．０５；図６Ａ）。

【0276】

ＴＨＰ－１細胞における内因性のＩＬ－６発現を刺激することによる免疫原性査定

【0277】

ヒト単球白血病細胞株ＴＨＰ－１（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ＃８８０８１２０１）を、ｍＲＮＡの直接トランスフェクションがあり次第の、ＩＬ－６の内因性発現をモニターすることによって、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写されたｍＲＮＡ（ＩＶＴ ｍＲＮＡ）に対する免疫応答を調査するために利用した。ＩＶＴ ｍＲＮＡに対する免疫原性の刺激は、ＲＮＡ感知器（例えば、ＴＬＲ、ＰＫＲ）によって誘発され、ＩＶＴ ｍＲＮＡに対する免疫活性化において中心的役割を果たす、ＩＬ－６を含めたいくつかの炎症促進性サイトカインの発現を誘導する。ＴＨＰ－１細胞を、成長培地（１０％ＦＢＳおよび２ｍＭグルタミンを補給されたＲＰＭＩ １６４０）中で維持した。細胞を９６ウェル細胞培養プレートに４０，０００個のＴＨＰ－１細胞で播種し、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭａｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、特異的ｍＲＮＡ（０．３μｇ／ウェル）を逆トランスフェクトした。プレートを、５％ＣＯ_２を含有する加湿された大気中にて３７℃で２４時間インキュベートした。トランスフェクション後、細胞培養上清を回収し、ＥＬＩＳＡ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ＃８８７０６６）を使用してヒトＩＬ－６について定量した。

【0278】

結果

【0279】

Ｃｐｄ．３、Ｃｐｄ．４、Ｃｐｄ．１３、およびＣｐｄ．１４の免疫原性評価

【0280】

修飾されたまたは非修飾の化合物（Ｃｐｄ．３、Ｃｐｄ．４、Ｃｐｄ．１３、およびＣｐｄ．１４；０．３μｇ／ウェル）の直接トランスフェクションによる、ＴＨＰ－１細胞におけるＩＬ－６の内因性発現を実験的に確認したが、しかしながら、発現レベルは、Ａ５４９細胞における発現レベルと比較して低かった。Ａ５４９細胞と同様に、修飾されたおよび非修飾のＲＮＡ化合物の間に、ＩＬ－６レベルの差が認められた（図７Ａ）。ＩＬ－６レベルの有意な低下が、ｓｉＲＮＡの存在または非存在との関連で、非修飾の化合物に関して観察された。ＩＧＦ－１ ｍＲＮＡとともに、ＩＬ－１ベータを標的にする３×ｓｉＲＮＡを有する非修飾のＣｐｄ．３は、ＩＧＦ－１ ｍＲＮＡだけを含む非修飾の化合物、すなわちＣｐｄ．１３と比較して、有意に低下したＩＬ－６レベルを示した（＊＊＊、Ｐ＜０．００１；図７Ａ）。同様に、非修飾のＣｐｄ．４におけるＩＬ－４ ｍＲＮＡに加えた６×ｓｉＲＮＡ（ＴＮＦ－アルファを標的にする３×、およびＩＬ－１７を標的にする３×）の存在は、ｓｉＲＮＡを有せずＩＬ－４コードｍＲＮＡを含む非修飾のＣｐｄ．１４と比較して、減少したＩＬ－６レベルを実証した（＊＊＊、Ｐ＜０．００１；図７Ａ）。

【0281】

ＳＴＡＴ－３活性化に関するＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ＩＬ－６レポーターアッセイ

【0282】

Ａ５４９およびＴＨＰ－１ ｉｎ ｖｉｔｒｏモデルにおける分泌されたＩＬ－６の機能活性を、ＳＴＡＴ－３経路の活性化をモニターすることによってＩＬ－６シグナル伝達を調査するために設計されているＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ＩＬ－６レポーター細胞（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ、カタログコード：ｈｋｂ－ｉｌ６）において試験した。ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ＩＬ－６細胞は、ヒト胎児性腎臓ＨＥＫ２９３細胞株に由来し、ＩＬ－６受容体（ＩＬ－６Ｒ）およびシグナル伝達転写活性化因子３（ＳＴＡＴ３）を発現するように操作されている。ＩＬ－６シグナル伝達は、４つのＳＴＡＴ３結合部位に融合されたＩＦＮ－β最小プロモーターの制御下で分泌型胚性アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）を発現するレポーター遺伝子によって検出される。ＩＬ－６刺激があり次第、ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ＩＬ－６細胞は、ＳＴＡＴ３の活性化を誘発し、それに続くＳＥＡＰの分泌は、細胞培養上清においてＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）検出細胞培地を用いてリアルタイムで判定され得る。ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ＩＬ－６細胞の刺激を、下に詳細を有して、Ｃｐｄ．３、Ｃｐｄ．４、Ｃｐｄ．１３、またはＣｐｄ．１４（０．３μｇ／ウェル）をトランスフェクトされているＡ５４９細胞またはＴＨＰ－１細胞の細胞培養上清に由来する等価容量（２０μｌ）のＩＬ－６によって達成した。

【0283】

ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ＩＬ－６細胞を、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を補給されたダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）中で維持した。抗生物質ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ（培地を用いて１：２５０希釈）を培地に添加して、ＩＬ６Ｒ、ＳＴＡＴ３、およびＳＥＡＰ導入遺伝子プラスミドを含有する細胞を選択した。トランスフェクションの前に、細胞を９６ウェル培養プレートに４０，０００個細胞／ウェルで播種し、５％ＣＯ_２を含有する加湿された大気中にて３７℃で２４時間インキュベートした。細胞を、トランスフェクションの前に＜８０％の培養密度に達するように、１０％のＦＢＳを含有するＤＭＥＭ成長培地中で成長させた。Ｃｐｄ．３、Ｃｐｄ．４、Ｃｐｄ．１３、またはＣｐｄ．１４（０．３μｇ／ウェル）をトランスフェクトされているＡ５４９細胞およびＴＨＰ－１細胞由来の等価容量（２０μｌ）の細胞培養上清を回収し、ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ＩＬ－６細胞の培地に添加して、ＩＬ－６受容体動員、それに続くＳＴＡＴ３経路活性化を測定した。ｒｈＩＬ－６（１００ｎｇ／ｍＬ）をポジティブコントロールとして使用した。２４時間のインキュベーションの後、ＳＥＡＰ活性を、ＱＵＡＮＴＩ－Ｂｌｕｅ（商標）（２０μｌ細胞培養上清＋１８０μｌ ＱＵＡＮＴＩ－Ｂｌｕｅ（商標）溶液）を使用し、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ ｉ３マルチモードプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ）において６２０ｎｍにおける光学濃度（Ｏ．Ｄ．）を読み取って査定した。トランスフェクトされていない試料を、バックグラウンドコントロールとして使用し、試験された試料における獲得されたＯ．Ｄ．値から差し引いた。

【0284】

結果

【0285】

Ｃｐｄ．３、Ｃｐｄ．４、Ｃｐｄ．１３、およびＣｐｄ．１４の免疫原性評価

【0286】

ｒｈＩＬ－６、または修飾されたもしくは非修飾のＣｐｄ．３、Ｃｐｄ．４、Ｃｐｄ．１３、もしくはＣｐｄ．１４をトランスフェクトされているＡ５４９もしくはＴＨＰ－１細胞の細胞培養上清に由来するＩＬ－６を用いたＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ＩＬ－６細胞の刺激は、ＳＥＡＰ産生がすべての試料において観察されたことから、機能的であった（図６Ｂおよび７Ｂ）。予想どおり、Ｎ１－メチルシュードウリジンで修飾されたＲＮＡ化合物をトランスフェクトされたＡ５４９およびＴＨＰ－１細胞に由来する上清は、非修飾の化合物をトランスフェクトされたＡ５４９およびＴＨＰ－１細胞に由来する上清と比較して、より低いＳＴＡＴ－３シグナル伝達を誘導した（図６Ｂおよび７Ｂ）。ＩＧＦ－１ ｍＲＮＡとともに、ＩＬ－１ベータを標的にする３×ｓｉＲＮＡを有する非修飾のＣｐｄ．３をトランスフェクトされたＡ５４９およびＴＨＰ－１細胞に由来する上清は、ＩＧＦ－１ ｍＲＮＡだけを含む非修飾の化合物、すなわちＣｐｄ．１３をトランスフェクトされたＡ５４９およびＴＨＰ－１細胞に由来する上清と比較して、有意に低下したＩＬ－６シグナル伝達を示した（図６Ｂおよび７Ｂ）。同じように、非修飾のＣｐｄ．４におけるＩＬ－４ ｍＲＮＡに加えた６×ｓｉＲＮＡ（ＴＮＦ－アルファを標的にする３×、およびＩＬ－１７を標的にする３×）の存在は、Ａ５４９およびＴＨＰ－１の両細胞に由来する上清に関して、ｓｉＲＮＡを有せずＩＬ－４コードｍＲＮＡを含む非修飾のＣｐｄ．１４と比較して、減少したＩＬ－６媒介性ＳＴＡＴ３活性化を実証した（＊＊＊、Ｐ＜０．００１；図６Ｂおよび７Ｂ）。非修飾のＣｐｄ．３（３×）およびＣｐｄ．４（６×）の比較は、３×から６×へのｓｉＲＮＡの数の増加が、ＩＬ－６媒介性免疫活性化を減少させることを示している（Ａ５４９細胞、＊、Ｐ＜０．０５；図６Ｂ；ＴＨＰ－１細胞、＊＊、Ｐ＜０．０１；図７Ｂ）。

【0287】

本明細書に記載される実施例および実施形態は、単なる例示的目的のものであり、当業者に示唆される様々な改変または変化は、本出願の精神および権限、ならびに添付の特許請求の範囲の内に含まれるべきである。

【図1】

【図2A】

【図2B】

【図3A】

【図3B】

【図4A】

【図4B】

【図5A】

【図5B】

【図6A】

【図6B】

【図7A】

【図7B】

【配列表】

2024522850000001.app

【国際調査報告】