特表 2024-522851 遺伝子の発現をモジュレートするための組成物および方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-06-21

(54)【発明の名称】遺伝子の発現をモジュレートするための組成物および方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/113 20100101AFI20240614BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20240614BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20240614BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20240614BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20240614BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20240614BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20240614BHJP

   A61P 17/06 20060101ALI20240614BHJP

   A61P 17/00 20060101ALI20240614BHJP

   A61P 21/00 20060101ALI20240614BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240614BHJP

   A61P 35/02 20060101ALI20240614BHJP

   A61K 31/7105 20060101ALI20240614BHJP

   A61K 31/713 20060101ALI20240614BHJP

   C12N 15/62 20060101ALN20240614BHJP

   C12N 15/67 20060101ALN20240614BHJP

   A61K 38/30 20060101ALN20240614BHJP

   A61K 38/20 20060101ALN20240614BHJP

【ＦＩ】

C12N15/113 Z ZNA

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

C12N15/63 Z

A61K48/00

A61P17/06

A61P17/00

A61P21/00

A61P35/00

A61P35/02

A61K31/7105

A61K31/713

C12N15/62

C12N15/67 Z

A61K38/30

A61K38/20

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023579058

(86)(22)【出願日】2022-06-22

(85)【翻訳文提出日】2024-02-15

(86)【国際出願番号】 IB2022000344

(87)【国際公開番号】W WO2022269349

(87)【国際公開日】2022-12-29

(31)【優先権主張番号】63/213,830

(32)【優先日】2021-06-23

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】521265726

【氏名又は名称】ヴェルサメブ アーゲー

(74)【代理人】

【識別番号】110002077

【氏名又は名称】園田・小林弁理士法人

(72)【発明者】

【氏名】セルヴァラージ， ジャスティン アントニー

(72)【発明者】

【氏名】ザイデベェルド， クラース ピーテル

(72)【発明者】

【氏名】ヒルマン－ヴュルナー， ペトラ

(72)【発明者】

【氏名】メッツガー， フリードリヒ

【テーマコード（参考）】

4B065

4C084

4C086

【Ｆターム（参考）】

4B065AA01X

4B065AA57X

4B065AA72X

4B065AA90X

4B065AA90Y

4B065AB01

4B065BA02

4B065CA44

4C084AA13

4C084BA44

4C084NA05

4C084NA14

4C084ZA89

4C084ZA94

4C084ZB26

4C084ZB27

4C084ZC75

4C086AA01

4C086AA02

4C086AA03

4C086EA16

4C086NA05

4C086NA14

4C086ZA89

4C086ZA94

4C086ZB26

4C086ZB27

4C086ZC75

(57)【要約】

本発明は、第１のＲＮＡ配列、第２のＲＮＡ配列、およびリンカーＲＮＡ配列を含む組み換えポリ核酸またはＲＮＡコンストラクトの組成物であって、リンカーＲＮＡは、第１のＲＮＡ配列と第２のＲＮＡ配列とを連結する、組成物に関する。加えて、組み換えＲＮＡコンストラクトの切断を増強するリンカーが記載される。疾患を治療することにおける、および２種以上の遺伝子の発現をモジュレートすることにおける、組成物の使用も本明細書に開示される。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

第１のＲＮＡ配列、第２のＲＮＡ配列、およびリンカーＲＮＡ配列を含む組み換えＲＮＡコンストラクトを含む組成物であって、
（ｉ）第１のＲＮＡ配列は、第１の低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）配列であり；
（ｉｉ）第２のＲＮＡ配列は、第２のｓｉＲＮＡ配列、または関心のある遺伝子（ＧＯＩ）をコードする第１のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）配列であり；
（ｉｉｉ）リンカーＲＮＡ配列は、第１のＲＮＡ配列と第２のＲＮＡ配列とを連結し、リンカーＲＮＡ配列は、
式（Ｉ）：Ｘ_ｍＣＡＡＣＡＡＸ_ｎ
［式中、Ｘは任意のヌクレオチドであり、ｍは１～１２の整数であり、ｎは０～４の整数である］；および
式（ＩＩ）：Ｘ_ｐＴＣＣＣＸ_ｒ
［式中、Ｘは任意のヌクレオチドであり、ｐは０～１７の整数であり、ｒは０～１３の整数である］
からなる群から選択される構造を有する、組成物。

【請求項2】

第１のＲＮＡ配列、第２のＲＮＡ配列、およびリンカーＲＮＡ配列を含む組み換えＲＮＡコンストラクトを含む組成物であって、
（ｉ）第１のＲＮＡ配列は、第１の低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）配列であり；
（ｉｉ）第２のＲＮＡ配列は、第２のｓｉＲＮＡ配列、または関心のある遺伝子（ＧＯＩ）をコードする第１のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）配列であり；
（ｉｉｉ）リンカーＲＮＡ配列は、第１のＲＮＡ配列と第２のＲＮＡ配列とを連結し、リンカーＲＮＡ配列は、ＡＣＡＡＣＡＡを含むまたはそれからなる、組成物。

【請求項3】

第１のＲＮＡ配列、第２のＲＮＡ配列、およびリンカーＲＮＡ配列を含む組み換えＲＮＡコンストラクトを含む組成物であって、
（ｉ）第１のＲＮＡ配列は、第１の低分子干渉（ｓｉＲＮＡ）配列であり；
（ｉｉ）第２のＲＮＡ配列は、第２のｓｉＲＮＡ配列、または関心のある遺伝子（ＧＯＩ）をコードする第１のメッセンジャー（ｍＲＮＡ）配列であり；
（ｉｉｉ）リンカーＲＮＡ配列は、第１のＲＮＡ配列と第２のＲＮＡ配列とを連結し、
（ａ）リンカーＲＮＡ配列は、ＴＴＴＡＴＣＴＴＡＧＡＧＧＣＡＴＡＴＣＣＣＴＡＣＧＴＡＣＣＡＡＣＡＡもしくはＡＴＡＧＴＧＡＧＴＣＧＴＡＴＴＡＡＣＧＴＡＣＣＡＡＣＡＡではないか；または
（ｂ）リンカーＲＮＡ配列は、ＲＮＡｆｏｌｄウェブサーバーに従った二次構造を形成しない、組成物。

【請求項4】

第２のＲＮＡ配列が第２のｓｉＲＮＡ配列である、請求項１から３のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項5】

リンカーＲＮＡ配列が、ＡＣＡＡＣＡＡ、ＡＴＣＣＣＴＡＣＧＴＡＣＣＡＡＣＡＡ、ＡＣＧＴＡＣＣＡＡＣＡＡ、ＴＣＣＣ、またはＡＣＡＡＣＡＡＴＣＣＣを含むまたはそれからなる、請求項４に記載の組成物。

【請求項6】

組み換えＲＮＡコンストラクトは、ＧＯＩをコードする第１のｍＲＮＡ配列をさらに含む、請求項４に記載の組成物。

【請求項7】

第２のＲＮＡ配列が、ＧＯＩをコードする第１のｍＲＮＡ配列である、請求項１から３のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項8】

リンカーＲＮＡ配列が、ＡＣＡＡＣＡＡ、ＡＴＡＧＴＧＡＧＴＣＧＴＡＴＴＡＴＣＣＣ、ＡＴＡＧＴＧＡＧＴＣＧＴＡＴＴＡＡＣＡＡＣＡＡＴＣＣＣ、ＡＴＡＧＴＧＡＧＴＣＧＴＡＴＴＡＡＣＡＡＣＡＡ、ＡＴＡＧＴＧＡＧＴＣＧＴＡＴＴＡＡＴＣＣＣＴＡＣＧＴＡＣＣＡＡＣＡＡ、またはＡＴＡＧＴＧＡＧＴＣＧＴＡＴＴＡＡＣＧＴＡＣＣＡＡＣＡＡを含むまたはそれからなる、請求項７に記載の組成物。

【請求項9】

組み換えＲＮＡコンストラクトが、ＧＯＩをコードする第２のｍＲＮＡ配列をさらに含む、請求項６から８のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項10】

組み換えＲＮＡコンストラクトが第２のｓｉＲＮＡ配列をさらに含む、請求項７から９のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項11】

組み換えＲＮＡコンストラクトが第３のｓｉＲＮＡ配列を含む、請求項４から６または１０のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項12】

組み換えＲＮＡコンストラクトが、４種、５種、またはそれより多くのｓｉＲＮＡ配列をさらに含む、請求項１１に記載の組成物。

【請求項13】

ｓｉＲＮＡ配列のそれぞれが、標的ＲＮＡに結合し、標的ＲＮＡの発現をモジュレートする、請求項１２に記載の組成物。

【請求項14】

ｓｉＲＮＡ配列のそれぞれが、
（ａ）異なる標的ＲＮＡ；
（ｂ）同じ標的ＲＮＡの異なる領域；
（ｃ）同じ標的ＲＮＡの同じ領域；または
（ｄ）その任意の組み合わせ
に結合し得る、請求項１３に記載の組成物。

【請求項15】

（ｃ）のｓｉＲＮＡ配列が同じである、請求項１４に記載の組成物。

【請求項16】

組み換えＲＮＡコンストラクトが、それぞれがＧＯＩをコードする３種、４種、５種、またはそれより多くのｍＲＮＡ配列を含む、請求項９から１５のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項17】

ｍＲＮＡ配列のそれぞれが、同じＧＯＩをコードする、請求項１６に記載の組成物。

【請求項18】

ｍＲＮＡ配列のそれぞれが、異なるＧＯＩをコードする、請求項１６に記載の組成物。

【請求項19】

ｓｉＲＮＡ配列間のリンカーＲＮＡ配列の長さが、約４～約２７ヌクレオチドである、請求項１から１８のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項20】

ｓｉＲＮＡ配列間のリンカーＲＮＡ配列の長さが、約４～約１８ヌクレオチドである、請求項１から１９のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項21】

ｍが１であり、ｎが０である、請求項１から２０のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項22】

ｓｉＲＮＡ配列間のリンカーＲＮＡ配列が、ＡＣＡＡＣＡＡＴＣＣＣである、請求項２に記載の組成物。

【請求項23】

リンカーＲＮＡ配列が、ＡＣＡＡＣＡＡである、請求項２に記載の組成物。

【請求項24】

リンカーＲＮＡ配列が、配列番号２３および６７～７５からなる群から選択される配列を含む、請求項１から２３のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項25】

リンカーＲＮＡ配列が、配列番号２３に従った配列を含むまたはそれからなる、請求項１から２４のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項26】

リンカーＲＮＡ配列が、配列番号６７に従った配列を含むかまたはそれからなる、請求項１から２５のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項27】

リンカーＲＮＡ配列が、配列番号６８に従った配列を含むかまたはそれからなる、請求項１から２６のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項28】

リンカーＲＮＡ配列が、配列番号６９に従った配列を含むかまたはそれからなる、請求項１から２７のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項29】

リンカーＲＮＡ配列が、配列番号７０に従った配列を含むかまたはそれからなる、請求項１から２８のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項30】

ｓｉＲＮＡによって標的にされる標的ＲＮＡの発現が、（ｉ）配列番号６８に従ったリンカーＲＮＡ配列を含む組み換えＲＮＡコンストラクトを使用した、ｓｉＲＮＡによって標的にされる標的ＲＮＡの発現、（ｉｉ）配列番号６９に従ったリンカーＲＮＡ配列を含む組み換えＲＮＡコンストラクトを使用した、ｓｉＲＮＡによって標的にされる標的ＲＮＡの発現、（ｉｉｉ）配列番号７０に従ったリンカーＲＮＡ配列を含む組み換えＲＮＡコンストラクトを使用した、ｓｉＲＮＡによって標的にされる標的ＲＮＡの発現、および／または（ｉｖ）配列番号２３に従ったリンカーＲＮＡ配列を含む組み換えＲＮＡコンストラクトを使用した、ｓｉＲＮＡによって標的にされる標的ＲＮＡの発現と比較して、配列番号６７に従ったリンカーＲＮＡ配列を含む組み換えＲＮＡコンストラクトを使用して、より低い、請求項２４から２９のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項31】

ＧＯＩをコードする第１のｍＲＮＡ配列の発現が、（ｉ）配列番号６７に従ったリンカーＲＮＡ配列を含む組み換えＲＮＡコンストラクトを使用した、ＧＯＩをコードする第１のｍＲＮＡ配列の発現、（ｉｉ）配列番号６８に従ったリンカーＲＮＡ配列を含む組み換えＲＮＡコンストラクトを使用した、ＧＯＩをコードする第１のｍＲＮＡ配列の発現、（ｉｉｉ）配列番号６９に従ったリンカーＲＮＡ配列を含む組み換えＲＮＡコンストラクトを使用した、ＧＯＩをコードする第１のｍＲＮＡ配列の発現、および／または（ｉｖ）配列番号２３に従ったリンカーＲＮＡ配列を含む組み換えＲＮＡコンストラクトを使用した、ＧＯＩをコードする第１のｍＲＮＡ配列の発現と比較して、配列番号７０に従ったリンカーＲＮＡ配列を含む組み換えＲＮＡコンストラクトを使用して、より高い、請求項２４から３０のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項32】

ｓｉＲＮＡによって標的にされる標的ＲＮＡの発現が、（ｉ）配列番号６９に従ったリンカーＲＮＡ配列を含む組み換えＲＮＡコンストラクトを使用した、ｓｉＲＮＡによって標的にされる標的ＲＮＡの発現、および／または（ｉｉ）配列番号７０に従ったリンカーＲＮＡ配列を含む組み換えＲＮＡコンストラクトを使用した、ｓｉＲＮＡによって標的にされる標的ＲＮＡの発現と比較して、配列番号２３に従ったリンカーＲＮＡ配列を含む組み換えＲＮＡコンストラクトを使用して、より低い、請求項２４から３１のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項33】

ＧＯＩをコードする第１のｍＲＮＡ配列の発現が、（ｉ）配列番号６７に従ったリンカーＲＮＡ配列を含む組み換えＲＮＡコンストラクトを使用した、ＧＯＩをコードする第１のｍＲＮＡ配列の発現、（ｉｉ）配列番号６８に従ったリンカーＲＮＡ配列を含む組み換えＲＮＡコンストラクトを使用した、ＧＯＩをコードする第１のｍＲＮＡ配列の発現、および／または（ｉｉｉ）配列番号６９に従ったリンカーＲＮＡ配列を含む組み換えＲＮＡコンストラクトを使用した、ＧＯＩをコードする第１のｍＲＮＡ配列の発現と比較して、配列番号２３に従ったリンカーＲＮＡ配列を含む組み換えＲＮＡコンストラクトを使用して、より高い、請求項２４から３２のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項34】

リンカーＲＮＡ配列が、ＧＯＩをコードする第１のｍＲＮＡ配列の所望の発現レベル、および／またはｓｉＲＮＡによって標的にされる標的ＲＮＡの所望の発現レベル、もしくはｓｉＲＮＡによって標的にされる標的ＲＮＡによってコードされるタンパク質の所望の発現レベルに基づいて選択される、請求項１から３３のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項35】

ＧＯＩの発現がモジュレートされる、請求項１から３４のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項36】

ＧＯＩの発現が、ＧＯＩによってコードされるタンパク質を発現させることによって上方調節される、請求項３５に記載の組成物。

【請求項37】

標的ＲＮＡの発現がモジュレートされる、請求項１から３６のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項38】

標的ＲＮＡの発現が、標的ＲＮＡに結合し得るｓｉＲＮＡ配列によって下方調節される、請求項３７に記載の組成物。

【請求項39】

標的ＲＮＡに結合し得るｓｉＲＮＡ配列が、ＧＯＩの発現を阻害しない、請求項１から３８のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項40】

ｓｉＲＮＡ配列間のＲＮＡリンカー配列が、ＲＮＡｆｏｌｄウェブサーバーに従った二次構造を形成しない、請求項１から３９のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項41】

ｓｉＲＮＡ配列が、ＲＮＡｆｏｌｄウェブサーバーに従った二次構造を形成する、請求項１から４０のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項42】

ｓｉＲＮＡ配列が、ヘアピン構造またはループ構造を含む、請求項４１に記載の組成物。

【請求項43】

ｓｉＲＮＡ配列が、１つまたは複数の短いまたは低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を含む、請求項１から４２のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項44】

組み換えＲＮＡコンストラクトが切断される、請求項１から４３のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項45】

組み換えＲＮＡコンストラクトが、細胞内タンパク質によって切断される、請求項４４に記載の組成物。

【請求項46】

組み換えＲＮＡコンストラクトが、内因性タンパク質によって切断される、請求項４４または４５に記載の組成物。

【請求項47】

組み換えＲＮＡコンストラクトが、内因性ＤＩＣＥＲによって切断される、請求項４４から４６のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項48】

組み換えＲＮＡコンストラクトの切断が、式（Ｉ）および式（ＩＩ）からなる群から選択される構造を有するリンカーを含まないＲＮＡコンストラクトの切断と比較して増強される、請求項４４から４７のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項49】

組み換えＲＮＡコンストラクトの切断が、ＡＣＡＡＣＡＡを含む配列を含むリンカーを含まないＲＮＡコンストラクトの切断と比較して増強される、請求項４４から４７のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項50】

組み換えＲＮＡコンストラクトの切断が、二次構造を形成するリンカーを含むＲＮＡコンストラクトの切断と比較して増強される、請求項４４から４７のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項51】

関心のある遺伝子の発現が、式（Ｉ）および式（ＩＩ）からなる群から選択される構造を有するリンカーを含まないＲＮＡコンストラクトからの関心のある遺伝子の発現と比較して増強される、請求項１から５０のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項52】

関心のある遺伝子の発現が、ＡＣＡＡＣＡＡを含む配列を含むリンカーを含まないＲＮＡコンストラクトからの関心のある遺伝子の発現と比較して増強される、請求項１から５１のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項53】

ＧＯＩが、インターロイキン４（ＩＬ－４）、インターロイキン２（ＩＬ－２）、インターロイキン１２（ＩＬ－１２）、またはインスリン様成長因子１（ＩＧＦ１）を含む、請求項１から５２のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項54】

標的ＲＮＡがノンコーディングＲＮＡである、請求項１から５３のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項55】

標的ＲＮＡがメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）である、請求項１から５３のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項56】

標的ＲＮＡが、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ－α）、アクチビン受容体様キナーゼ２（ＡＬＫ２）、血管内皮増殖因子Ａ（ＶＥＧＦＡ）、細胞骨髄球腫症（ｃ－Ｍｙｃ）、カーステンラット肉腫（ＫＲＡＳ）、プロテインキナーゼＢ－１（Ａｋｔ１）、Ａｋｔ２、およびＡｋｔ３からなる群から選択されるタンパク質をコードするｍＲＮＡである、請求項１から５３のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項57】

標的ＲＮＡに結合し得るｓｉＲＮＡ配列が、標的ＲＮＡのエクソンに結合する、請求項１から５６のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項58】

標的ＲＮＡに結合し得るｓｉＲＮＡ配列が、１種の標的ＲＮＡに特異的に結合する、請求項１から５７のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項59】

標的ＲＮＡに結合し得るｓｉＲＮＡ配列が、関心のある遺伝子のイントロン配列によってコードされないまたはそれから構成されない、請求項１から５８のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項60】

ＧＯＩが、ＲＮＡスプライシングなしで発現される、請求項１から５９のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項61】

第１のＲＮＡ配列が、第２のＲＮＡ配列の下流または３’に存在する、請求項１から６０のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項62】

ＲＮＡコンストラクトが、第２のＲＮＡ配列の下流または３’に内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を含む、請求項６１に記載の組成物。

【請求項63】

ＲＮＡコンストラクトが、第１のＲＮＡ配列のすぐ上流または５’に内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を含む、請求項６１または６２に記載の組成物。

【請求項64】

第１のＲＮＡ配列が、第２のＲＮＡ配列の上流または５’に存在する、請求項１から６０のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項65】

ＲＮＡコンストラクトが、第１のＲＮＡ配列の上流または５’に内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を含む、請求項６４に記載の組成物。

【請求項66】

ＲＮＡコンストラクトが、ポリ（Ａ）テール、５’キャップ、またはコザック配列をさらに含む、請求項１から６５のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項67】

第１のＲＮＡ配列および第２のＲＮＡ配列が、両方とも組み換えである、請求項１から６６のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項68】

ｓｉＲＮＡが、配列番号５０～５７および１２７～１３２からなる群から選択されるセンス鎖配列を含む、請求項１から６７のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項69】

細胞において２種以上の遺伝子の発現をモジュレートすることにおける使用のための、請求項１から６８のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項70】

請求項１から６８のいずれか一項に記載の組成物の治療的有効量、および薬学的に許容される添加物を含む、薬学的組成物。

【請求項71】

請求項１から６８のいずれか一項に記載の組成物を含む、細胞。

【請求項72】

請求項１から６８のいずれか一項に記載の組成物をコードする組み換えポリ核酸コンストラクトを含む、ベクター。

【請求項73】

請求項１から６８のいずれか一項に記載の組成物、または請求項７２に記載のベクターを細胞に導入することを含む、細胞において単一ＲＮＡ転写産物からｓｉＲＮＡおよびｍＲＮＡを産生する方法。

【請求項74】

細胞に、請求項１から６８のいずれか一項に記載の組成物、または請求項７２に記載のベクターを導入することを含む、タンパク質発現をモジュレートする方法であって、標的ＲＮＡによってコードされるタンパク質の発現は減少する、方法。

【請求項75】

細胞に、請求項１から６８のいずれか一項に記載の組成物、または請求項７２に記載のベクターを導入することを含む、タンパク質発現をモジュレートする方法であって、関心のある遺伝子（ＧＯＩ）によってコードされるタンパク質の発現は増加する、方法。

【請求項76】

細胞に、請求項１から６８のいずれか一項に記載の組成物、または請求項７２に記載のベクターを導入することを含む、タンパク質発現をモジュレートする方法であって、標的ＲＮＡによってコードされるタンパク質の発現は減少し、関心のある遺伝子（ＧＯＩ）によってコードされるタンパク質の発現は増加する、方法。

【請求項77】

請求項１から６８のいずれか一項に記載の組成物、または請求項７０に記載の薬学的組成物をそれを必要とする対象に投与することを含む、疾患または病状を治療する方法。

【請求項78】

疾患または病状が、皮膚疾患もしくは病状、または筋肉疾患もしくは病状を含む、請求項７７に記載の方法。

【請求項79】

皮膚疾患または病状が炎症性皮膚障害を含む、請求項７８に記載の方法。

【請求項80】

炎症性皮膚障害が乾癬を含む、請求項７９に記載の方法。

【請求項81】

筋肉疾患または病状が骨格筋障害を含む、請求項７８に記載の方法。

【請求項82】

骨格筋障害が進行性骨化性線維異形成症（ＦＯＰ）を含む、請求項８１に記載の方法。

【請求項83】

疾患または病状ががんを含む、請求項７７に記載の方法。

【請求項84】

がんが、膠芽細胞腫、ヒト舌扁平上皮癌、ヒト肺癌、またはヒト単球白血病を含む、請求項８３に記載の方法。

【請求項85】

対象がヒトである、請求項７７から８４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項86】

第１のＲＮＡ配列、第１のリンカーＲＮＡ配列、第２のＲＮＡ配列、および第２のリンカーＲＮＡ配列を含む組み換えＲＮＡコンストラクトを含む組成物であって、
（ｉ）第１のＲＮＡ配列は、インターロイキン４（ＩＬ－４）をコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）であり；
（ｉｉ）第２のＲＮＡ配列は、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ－α）ｍＲＮＡに結合し得る２種以上の低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を含み；
（ｉｉｉ）第１のリンカーＲＮＡ配列は、第１のＲＮＡ配列と第２のＲＮＡ配列との間に存在し；
（ｉｖ）第２のリンカーＲＮＡ配列は、２種以上のｓｉＲＮＡのそれぞれを連結し、配列番号２３に従った配列を含む、組成物。

【請求項87】

第１のＲＮＡ配列、第１のリンカーＲＮＡ配列、第２のＲＮＡ配列、および第２のリンカーＲＮＡ配列を含む組み換えＲＮＡコンストラクトを含む組成物であって、
（ｉ）第１のＲＮＡ配列は、インスリン様成長因子１（ＩＧＦ１）をコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）であり；
（ｉｉ）第２のＲＮＡ配列は、アクチビン受容体様キナーゼ２（ＡＬＫ２）ｍＲＮＡに結合し得る２種以上の低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を含み；
（ｉｉｉ）第１のリンカーＲＮＡ配列は、第１のＲＮＡ配列と第２のＲＮＡ配列との間に存在し；
（ｉｖ）第２のリンカーＲＮＡ配列は、２種以上のｓｉＲＮＡのそれぞれを連結し、配列番号２３に従った配列を含む、組成物。

【請求項88】

第１のＲＮＡ配列、第１のリンカーＲＮＡ配列、第２のＲＮＡ配列、および第２のリンカーＲＮＡ配列を含む組み換えＲＮＡコンストラクトを含む組成物であって、
（ｉ）第１のＲＮＡ配列は、インターロイキン２（ＩＬ－２）をコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）であり；
（ｉｉ）第２のＲＮＡ配列は、血管内皮増殖因子Ａ（ＶＥＧＦＡ）ｍＲＮＡに結合し得る２種以上の低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を含み；
（ｉｉｉ）第１のリンカーＲＮＡ配列は、第１のＲＮＡ配列と第２のＲＮＡ配列との間に存在し；
（ｉｖ）第２のリンカーＲＮＡ配列は、２種以上のｓｉＲＮＡのそれぞれを連結し、配列番号２３および６７～７０からなる群から選択される配列を含む、組成物。

【請求項89】

第１のＲＮＡ配列、第１のリンカーＲＮＡ配列、第２のＲＮＡ配列、および第２のリンカーＲＮＡ配列を含む組み換えＲＮＡコンストラクトを含む組成物であって、
（ｉ）第１のＲＮＡ配列は、インターロイキン１２（ＩＬ－１２）をコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）であり；
（ｉｉ）第２のＲＮＡ配列は、細胞骨髄球腫症（ｃ－Ｍｙｃ）、カーステンラット肉腫（ＫＲＡＳ）、プロテインキナーゼＢ－１（Ａｋｔ１）、Ａｋｔ２、および／またはＡｋｔ３のｍＲＮＡに結合し得る２種以上の低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を含み；
（ｉｉｉ）第１のリンカーＲＮＡ配列は、第１のＲＮＡ配列と第２のＲＮＡ配列との間に存在し；
（ｉｖ）第２のリンカーＲＮＡ配列は、２種以上のｓｉＲＮＡのそれぞれを連結し、配列番号２３に従った配列を含む、組成物。

【請求項90】

配列番号１～１８、および７６～１０８からなる群から選択される核酸配列を含む組み換えポリ核酸コンストラクトを含む、組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年６月２３日に出願された米国仮出願第６３／２１３，８３０号の利益を主張するものであり、それは参照によりその全体として本明細書に組み入れられる。

【0002】

配列表
本出願は配列表を含有する。

【背景技術】

【0003】

数多くのヒト疾患および障害は、ある特定のタンパク質の、疾患または障害を有しないヒトにおけるこれらのタンパク質の発現レベルと比較して、より高くかつ／またはより低い発現レベルの組み合わせによって引き起こされる。標的タンパク質の発現および／または分泌を増加させ、かつ１種または複数の他の異なる標的タンパク質の発現を減少させるコンビナトリアル療法は、治療効果を有し得る。例えば、１種または複数の標的遺伝子産物の産生を有効にかつ特異的に減少させ、並行して、他のものの産生を増加させる、皮膚疾患、筋肉疾患、またはがんに対する療法が必要とされる。

【発明の概要】

【0004】

１種の組み換えポリ核酸またはＲＮＡコンストラクトを使用して、２種以上のタンパク質または核酸配列の発現を同時にモジュレートするための組成物および方法が本明細書において提供される。

【0005】

一部の態様において、第１のＲＮＡ配列、第２のＲＮＡ配列、およびリンカーＲＮＡ配列を含む組み換えＲＮＡコンストラクトを含む組成物であって、（ｉ）第１のＲＮＡ配列は、第１の低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）配列であり；（ｉｉ）第２のＲＮＡ配列は、第２のｓｉＲＮＡ配列、または関心のある遺伝子（ＧＯＩ）をコードする第１のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）配列であり；（ｉｉｉ）リンカーＲＮＡ配列は、第１のＲＮＡ配列と第２のＲＮＡ配列とを連結し、リンカーＲＮＡ配列は、式（Ｉ）：Ｘ_ｍＣＡＡＣＡＡＸ_ｎ［式中、Ｘは任意のヌクレオチドであり、ｍは１～１２の整数であり、ｎは０～４の整数である］；および式（ＩＩ）：Ｘ_ｐＴＣＣＣＸ_ｒ［式中、Ｘは任意のヌクレオチドであり、ｐは０～１７の整数であり、ｒは０～１３の整数である］からなる群から選択される構造を有する、組成物が本明細書において提供される。

【0006】

一部の態様において、第１のＲＮＡ配列、第２のＲＮＡ配列、およびリンカーＲＮＡ配列を含む組み換えＲＮＡコンストラクトを含む組成物であって、（ｉ）第１のＲＮＡ配列は、第１の低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）配列であり；（ｉｉ）第２のＲＮＡ配列は、第２のｓｉＲＮＡ配列、または関心のある遺伝子（ＧＯＩ）をコードする第１のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）配列であり；（ｉｉｉ）リンカーＲＮＡ配列は、第１のＲＮＡ配列と第２のＲＮＡ配列とを連結し、リンカーＲＮＡ配列は、ＡＣＡＡＣＡＡを含むまたはそれからなる、組成物が本明細書において提供される。

【0007】

一部の態様において、第１のＲＮＡ配列、第２のＲＮＡ配列、およびリンカーＲＮＡ配列を含む組み換えＲＮＡコンストラクトを含む組成物であって、（ｉ）第１のＲＮＡ配列は、第１の低分子干渉（ｓｉＲＮＡ）配列であり；（ｉｉ）第２のＲＮＡ配列は、第２のｓｉＲＮＡ配列、または関心のある遺伝子（ＧＯＩ）をコードする第１のメッセンジャー（ｍＲＮＡ）配列であり；（ｉｉｉ）リンカーＲＮＡ配列は、第１のＲＮＡ配列と第２のＲＮＡ配列とを連結し、（ａ）リンカーＲＮＡ配列は、ＴＴＴＡＴＣＴＴＡＧＡＧＧＣＡＴＡＴＣＣＣＴＡＣＧＴＡＣＣＡＡＣＡＡもしくはＡＴＡＧＴＧＡＧＴＣＧＴＡＴＴＡＡＣＧＴＡＣＣＡＡＣＡＡではないか；または（ｂ）リンカーＲＮＡ配列は、ＲＮＡｆｏｌｄウェブサーバーに従った二次構造を形成しない、組成物が本明細書において提供される。

【0008】

一部の態様において、細胞において２種以上の遺伝子の発現をモジュレートすることにおける使用のための、本明細書に記載される組成物が本明細書において提供される。一部の態様において、本明細書に記載される組成物のいずれか１種の治療的有効量、および薬学的に許容される添加物を含む薬学的組成物が本明細書において提供される。一部の態様において、本明細書に記載される組成物のいずれか１種を含む細胞が本明細書において提供される。一部の態様において、本明細書に記載される組成物のいずれか１種をコードする組み換えポリ核酸コンストラクトを含むベクターが本明細書において提供される。

【0009】

一部の態様において、本明細書に記載される組成物のいずれか１種、または本明細書に記載されるベクターを細胞に導入することを含む、細胞において単一ＲＮＡ転写産物からｓｉＲＮＡおよびｍＲＮＡを産生する方法が本明細書において提供される。一部の態様において、細胞に、本明細書に記載される組成物のいずれか１種、または本明細書に記載されるベクターのいずれか１種を導入することを含む、タンパク質発現をモジュレートする方法であって、標的ＲＮＡによってコードされるタンパク質の発現は減少する、方法が本明細書において提供される。一部の態様において、細胞に、本明細書に記載される組成物のいずれか１種、または本明細書に記載されるベクターのいずれか１種を導入することを含む、タンパク質発現をモジュレートする方法であって、関心のある遺伝子（ＧＯＩ）によってコードされるタンパク質の発現は増加する、方法が本明細書において提供される。一部の態様において、細胞に、本明細書に記載される組成物のいずれか１種、または本明細書に記載されるベクターのいずれか１種を導入することを含む、タンパク質発現をモジュレートする方法であって、標的ＲＮＡによってコードされるタンパク質の発現は減少し、関心のある遺伝子（ＧＯＩ）によってコードされるタンパク質の発現は増加する、方法が本明細書において提供される。

【0010】

一部の態様において、本明細書に記載される組成物のいずれか１種、または本明細書に記載される薬学的組成物のいずれか１種をそれを必要とする対象に投与することを含む、疾患または病状を治療する方法が本明細書において提供される。

【0011】

一部の態様において、第１のＲＮＡ配列、第１のリンカーＲＮＡ配列、第２のＲＮＡ配列、および第２のリンカーＲＮＡ配列を含む組み換えＲＮＡコンストラクトを含む組成物であって、（ｉ）第１のＲＮＡ配列は、インターロイキン４（ＩＬ－４）をコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）であり；（ｉｉ）第２のＲＮＡ配列は、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ－α）ｍＲＮＡに結合し得る２種以上の低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を含み；（ｉｉｉ）第１のリンカーＲＮＡ配列は、第１のＲＮＡ配列と第２のＲＮＡ配列との間に存在し；（ｉｖ）第２のリンカーＲＮＡ配列は、２種以上のｓｉＲＮＡのそれぞれを連結し、配列番号２３に従った配列を含む、組成物が本明細書において提供される。

【0012】

一部の態様において、第１のＲＮＡ配列、第１のリンカーＲＮＡ配列、第２のＲＮＡ配列、および第２のリンカーＲＮＡ配列を含む組み換えＲＮＡコンストラクトを含む組成物であって、（ｉ）第１のＲＮＡ配列は、インスリン様成長因子１（ＩＧＦ１）をコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）であり；（ｉｉ）第２のＲＮＡ配列は、アクチビン受容体様キナーゼ２（ＡＬＫ２）ｍＲＮＡに結合し得る２種以上の低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を含み；（ｉｉｉ）第１のリンカーＲＮＡ配列は、第１のＲＮＡ配列と第２のＲＮＡ配列との間に存在し；（ｉｉｉ）第２のリンカーＲＮＡ配列は、２種以上のｓｉＲＮＡのそれぞれを連結し、配列番号２３に従った配列を含む、組成物が本明細書において提供される。

【0013】

一部の態様において、第１のＲＮＡ配列、第１のリンカーＲＮＡ配列、第２のＲＮＡ配列、および第２のリンカーＲＮＡ配列を含む組み換えＲＮＡコンストラクトを含む組成物であって、（ｉ）第１のＲＮＡ配列は、インターロイキン２（ＩＬ－２）をコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）であり；（ｉｉ）第２のＲＮＡ配列は、血管内皮増殖因子Ａ（ＶＥＧＦＡ）ｍＲＮＡに結合し得る２種以上の低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を含み；（ｉｉｉ）第１のリンカーＲＮＡ配列は、第１のＲＮＡ配列と第２のＲＮＡ配列との間に存在し；（ｉｖ）第２のリンカーＲＮＡ配列は、２種以上のｓｉＲＮＡのそれぞれを連結し、配列番号２３および６７～７０からなる群から選択される配列を含む、組成物が本明細書において提供される。

【0014】

一部の態様において、第１のＲＮＡ配列、第１のリンカーＲＮＡ配列、第２のＲＮＡ配列、および第２のリンカーＲＮＡ配列を含む組み換えＲＮＡコンストラクトを含む組成物であって、（ｉ）第１のＲＮＡ配列は、インターロイキン１２（ＩＬ－１２）をコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）であり；（ｉｉ）第２のＲＮＡ配列は、細胞骨髄球腫症（ｃ－Ｍｙｃ）、カーステンラット肉腫（ＫＲＡＳ）、プロテインキナーゼＢ－１（Ａｋｔ１）、Ａｋｔ２、および／またはＡｋｔ３のｍＲＮＡに結合し得る２種以上の低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を含み；（ｉｉｉ）第１のリンカーＲＮＡ配列は、第１のＲＮＡ配列と第２のＲＮＡ配列との間に存在し；（ｉｖ）第２のリンカーＲＮＡ配列は、２種以上のｓｉＲＮＡのそれぞれを連結し、配列番号２３に従った配列を含む、組成物が本明細書において提供される。

【0015】

一部の態様において、配列番号１～１８、および７６～１０８からなる群から選択される核酸配列を含む組み換えポリ核酸コンストラクトを含む組成物が本明細書において提供される。

【0016】

参照による組み入れ
本明細書において触れられるすべての刊行物、特許、および特許出願は、あたかもそれぞれ個々の刊行物、特許、または特許出願が、参照により組み入れられることを具体的にかつ個々に示されるのと同じ程度に、参照により本明細書に組み入れられる。

【0017】

本開示の特質は、添付の特許請求の範囲において特定性を有して明記される。本開示の特質および利点についてのよりよい理解は、本開示の原理が利用される例示的な実施形態を明記する以下の詳細な説明、および付属の図面を参照することにより獲得されるであろう。

【図面の簡単な説明】

【0018】

【図1】コンストラクト設計の概略図である。ポリ核酸（例えば、ＤＮＡ）コンストラクトは、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ結合、ならびに単一ＲＮＡ転写産物における関心のある遺伝子（例えば、ＩＧＦ－１またはＩＬ－４）およびｓｉＲＮＡの両方のｉｎ ｖｉｔｒｏ転写の成功のために、関心のある遺伝子配列の上流にＴ７プロモーター配列を含み得る。関心のある遺伝子のシグナルペプチドは、灰色のボックスで強調されている。ｍＲＮＡをｓｉＲＮＡにまたはｓｉＲＮＡをｓｉＲＮＡに接続するリンカーは、それぞれ水平の縞模様を有するボックスまたはチェックの縞模様を有するボックスで示されている。Ｔ７：Ｔ７プロモーター、ｓｉＲＮＡ：低分子干渉ＲＮＡ。

【図2A-2B】ＴＨＰ－１細胞における、事実上Ａ１－リンカーまたはＡ２リンカーに対する、ＥＬＩＳＡによって測定された、ＴＮＦ－α発現の干渉およびＩＬ－４タンパク質レベルの過剰発現に関するプロットである。図２Ａは、刺激されたＴＨＰ－１細胞における内因性のＴＮＦ－α発現における、それぞれＡ１－リンカーおよびＡ２－リンカーとともに、３’に３×ＴＮＦ－α標的化ｓｉＲＮＡを含む化合物１（Ｃｐｄ．１）および化合物２（Ｃｐｄ．２）についてのＲＮＡ干渉を示している。ＴＨＰ－１細胞を、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来リポ多糖類（１０μｇ／ｍＬ）およびＲ８４８（１μｇ／ｍＬ）で刺激し、その後にＣｐｄ．１、Ｃｐｄ．２、およびスクランブルｓｉＲＮＡ（ｓｃ－ｓｉＲＮＡ）のトランスフェクション（６００ｎｇ／ウェル）が続いた。トランスフェクトされていない試料をコントロールとして使用し、１００％に設定し、ＴＮＦ－αノックダウンのパーセントを算出した。データは、４つの複製物の平均についての平均±標準誤差を表す。Ｃｐｄ．１およびＣｐｄ．２の両方に関する有意性（＊＊＊、ｐ＜０．００１）を、コントロールと関連して、一方向ＡＮＯＶＡ、それに続くダネットの多重比較検定によって査定した。図２Ｂは、図１Ａにおいてと同じ細胞（ＴＨＰ－１）培養上清における、Ｃｐｄ．１およびＣｐｄ．２についてのＩＬ－４発現を示している。データは、４つの複製物の平均についての平均±標準誤差を表す。ＩＬ－４発現に関して、有意性（＊＊、＜０．０１）を、Ｃｐｄ．１およびＣｐｄ．２についてのスチューデントｔ検定によって査定した。

【図3A-3B】ＨＥＫ２９３細胞における、事実上Ａ１－リンカーまたはＡ２リンカーに対する、ＥＬＩＳＡによって測定された、ＴＮＦ－α発現の干渉およびＩＬ－４タンパク質レベルの過剰発現に関するプロットである。図３Ａは、ＨＥＫ２９３細胞におけるＴＮＦ－α過剰発現モデルにおける、それぞれＡ１－リンカーおよびＡ２－リンカーとともに、３’に３×ＴＮＦ－α標的化ｓｉＲＮＡを含むＣｐｄ．１およびＣｐｄ．２についてのＲＮＡ干渉を示している。ＨＥＫ２９３細胞に、ＴＮＦ－α ｍＲＮＡ（６００ｎｇ／ウェル）およびＣｐｄ．１またはＣｐｄ．２のいずれか（９００ｎｇ／ウェル）をコトランスフェクトした。ＴＮＦ－αレベルをＥＬＩＳＡによって算出する。トランスフェクトされていない試料をコントロールとして使用し、１００％に設定し、ＴＮＦ－αノックダウンのパーセントを算出した。データは、４つの複製物の平均についての平均±標準誤差を表す。Ｃｐｄ．１およびＣｐｄ．２の両方に関する有意性（＊＊、ｐ＜０．０１）を、コントロールと関連して、一方向ＡＮＯＶＡ、それに続くダネットの多重比較検定によって査定した。図３Ｂは、図２Ａにおいてと同じ細胞（ＨＥＫ２９３）培養上清における、Ｃｐｄ．１およびＣｐｄ．２についてのＩＬ－４発現を示している。データは、４つの複製物の平均についての平均±標準誤差を表す。ＩＬ－４発現に関して、有意性（＊、＜０．０５）を、Ｃｐｄ．１およびＣｐｄ．２についてのスチューデントｔ検定によって査定した。

【図4A-4D】Ａ５４９細胞およびＨＥＫ２９３細胞における、事実上Ａ１－リンカーまたはＡ２リンカーに対する、ＥＬＩＳＡによって測定されたＩＧＦ－１タンパク質レベル、およびｑＰＣＲによって査定されたＡＬＫ２発現の干渉に関するプロットである。図４Ａは、ＡＬＫ－２を内因的に発現する肺上皮細胞（Ａ５４９細胞）における、それぞれＡ１－リンカーおよびＡ２－リンカーとともに、３’に３×ＡＬＫ２標的化ｓｉＲＮＡを含むＣｐｄ．３およびＣｐｄ．４についてのＩＧＦ－１発現を示している。Ａ５４９細胞に、漸増ｎＭ濃度（０．６５、１．３３、２．７、５．４、および１０．８）のＣｐｄ．３またはＣｐｄ．４ ＲＮＡのいずれかをトランスフェクトした。データは、４つの複製物の平均についての平均±標準誤差を表す。Ｃｐｄ．３とＣｐｄ．４との間の有意性（＊＊＊、ｐ＜０．００１）を、二方向ＡＮＯＶＡ、それに続くテューキーの多重比較検定によって査定した。図４Ｂは、図３Ａにおいてと同じ細胞（Ａ５４９）培養溶解物におけるＡＬＫ２発現における、Ｃｐｄ．３およびＣｐｄ．４についてのＲＮＡ干渉を示している。ＡＬＫ２ ｍＲＮＡレベルを、相対的定量（１８ｓ遺伝子によって正規化された）によるｑＰＣＲによって算出した。トランスフェクトされていない試料をコントロールとして使用し、１００％に設定し、ＡＬＫ２ノックダウンのパーセントを算出した。ＡＬＫ２ ＲＮＡ干渉において、Ｃｐｄ．３とＣｐｄ．４との間に有意差は認められなかった。図４Ｃおよび図４Ｄは、それぞれＨＥＫ２９３細胞およびＡ５４９細胞における、Ｃｐｄ．３およびＣｐｄ．４についてのＩＧＦ－１発現を示している（１．３３ｎＭ／ウェル）。データは、１２個の複製物の平均についての平均±標準誤差を表す。ＩＧＦ－１発現に関して、有意性（＊、ＨＥＫ２９３において＜０．０５；＊＊＊、Ａ５４９細胞において＜０．００１）を、Ｃｐｄ．３およびＣｐｄ．４についてのスチューデントｔ検定によって査定した。

【図5A-5C】ヒト舌細胞癌細胞（ＳＣＣ－４）における、事実上Ａ１－リンカーまたはＡ２リンカーに対する、ＥＬＩＳＡによって測定されたＩＧＦ－１タンパク質レベル、および顕微鏡によって査定された外因的に発現されたＴｕｒｂｏ ＧＦＰの干渉に関するプロットである。図５Ａは、Ａ１－リンカーおよびＡ２－リンカーとともに、３’に１×または２×Ｔｕｒｂｏ ＧＦＰ標的化ｓｉＲＮＡのいずれかを含むＣｐｄ．５～Ｃｐｄ．９についてのＩＧＦ－１発現を示している。ＳＣＣ４細胞に、０．３μｇのＴｕｒｂｏ ＧＦＰコードおよび３０ｎＭのＣｐｄ．５～Ｃｐｄ．９のうちの１種をコトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、ＩＧＦ－１レベルを、特異的ＥＬＩＳＡによって細胞培養上清において測定した。データは、４つの複製物の平均についての平均±標準誤差を表す。Ｃｐｄ．５に関する有意性（＊＊＊、ｐ＜０．００１）を、Ｃｐｄ．６と比較して、一方向ＡＮＯＶＡ、それに続くダネットの多重比較検定によって査定した。Ｃｐｄ．７およびＣｐｄ．８の両方に関する有意性（＊＊＊、ｐ＜０．００１）を、Ｃｐｄ．９と比較して、一方向ＡＮＯＶＡ、それに続くダネットの多重比較検定によって査定した。図５Ｂは、事実上Ｃｐｄ．５～Ｃｐｄ．９コトランスフェクションに対する、顕微鏡による外因的に発現されたＴｕｒｂｏ ＧＦＰ（３００ｎｇ／ウェル）の干渉を示している。３０ｎＭのスクランブルｓｉＲＮＡ（ｓｃ－ｓｉＲＮＡ）をネガティブコントロールとして使用した。図５Ｃは、Ｔｕｒｂｏ ＧＦＰ発現に関する、コントロール、ｓｃ．ｓｉＲＮＡ、Ｃｐｄ．５、およびＣｐｄ．６の代表的な顕微鏡画像を示している。Ｔｕｒｂｏ ＧＦＰ陽性細胞を、ＩｍａｇｅＪ分析ツールを使用してグレースケールに変換した（１ウェルからの代表的な図）。

【図6A】Ａ５４９細胞における、種々のリンカーを含む化合物（Ｃｐｄ．１０～Ｃｐｄ．１５；リンカーＡ１、Ａ２、Ｂ～Ｅ）によって誘導されたＩＬ－２の用量依存的分泌レベルを示したプロットである。細胞培養上清におけるＩＬ－２レベルを、トランスフェクションの２４時間後にＥＬＩＳＡによって測定した。Ｘ軸は、Ａ５４９細胞へのトランスフェクションに使用された各化合物の濃度（１、３、１０、および３０ｎＭ／ウェル）を示す。Ｙ軸は、細胞培養上清におけるＩＬ－２タンパク質レベル（ｐｇ／ｍＬ）についての測定結果を示している。データは、３つの複製物の平均についての平均±標準誤差を表す。

【図6B】Ａ５４９細胞における、種々のリンカーを含む化合物（Ｃｐｄ．１０～Ｃｐｄ．１５；リンカーＡ１、Ａ２、Ｂ～Ｅ）によって誘導された内因的に発現されたＶＥＧＦＡの用量依存的下方調節を示したプロットである。Ｘ軸は、Ａ５４９細胞へのトランスフェクションに使用された各化合物の濃度（１、３、１０、および３０ｎＭ／ウェル）を示す。トランスフェクトされていない細胞の上清におけるＶＥＧＦＡタンパク質レベルを１００％に設定した。Ｙ軸は、トランスフェクトされていない試料（基底レベル）に対して正規化されたＶＥＧＦＡレベルの下方調節を示す。データは、３つの複製物の平均についての平均±標準誤差を表す。

【図6C】１０ｎＭの濃度を有するＣｐｄ．１０～Ｃｐｄ．１５（リンカーＡ１、Ａ２、Ｂ～Ｅ）をトランスフェクトされたＡ５４９細胞におけるＩＬ－２レベルおよびＶＥＧＦＡレベルの比較のための表である。Ｃｐｄ．１１（Ａ２リンカー）およびＣｐｄ．１４（Ｅリンカー）をトランスフェクトされたＡ５４９細胞は、他の化合物をトランスフェクトされたＡ５４９細胞と比較して、１．５～２．５倍高いＩＬ－２レベルを示した。種々の化合物をトランスフェクトされたＡ５４９細胞は、等価のＶＥＧＦＡ下方調節を呈した。

【図7A】ＳＣＣ－４細胞における、種々のリンカーを含む化合物（Ｃｐｄ．１０～Ｃｐｄ．１５；リンカーＡ１、Ａ２、Ｂ～Ｅ）によって誘導されたＩＬ－２の用量依存的分泌レベルを示したプロットである。細胞培養上清におけるＩＬ－２レベルを、トランスフェクションの２４時間後にＥＬＩＳＡによって測定した。Ｘ軸は、ＳＣＣ－４細胞へのトランスフェクションに使用された各化合物の濃度（１、３、１０、および３０ｎＭ／ウェル）を示す。Ｙ軸は、細胞培養上清におけるＩＬ－２タンパク質レベル（ｐｇ／ｍＬ）についての測定結果を示している。データは、３つの複製物の平均についての平均±標準誤差を表す。

【図7B】ＳＣＣ－４細胞における、種々のリンカーを含む化合物（Ｃｐｄ．１０～Ｃｐｄ．１５；リンカーＡ１、Ａ２、Ｂ～Ｅ）によって誘導された内因的に発現されたＶＥＧＦＡの用量依存的下方調節を示したプロットである。Ｘ軸は、ＳＣＣ－４細胞へのトランスフェクションに使用された各化合物の濃度（１、３、１０、および３０ｎＭ／ウェル）を示す。トランスフェクトされていない細胞からのＶＥＧＦＡレベルを１００％に設定した。Ｙ軸は、トランスフェクトされていない試料（基底レベル）に対して正規化されたＶＥＧＦＡレベルの下方調節を示す。データは、３つの複製物の平均についての平均±標準誤差を表す。

【図7C】１０ｎＭの濃度を有するＣｐｄ．１０～Ｃｐｄ．１５（リンカーＡ１、Ａ２、Ｂ～Ｅ）をトランスフェクトされたＳＣＣ－４細胞におけるＩＬ－２レベルおよびＶＥＧＦＡレベルの比較のための表である。Ｃｐｄ．１１（Ａ２リンカー）およびＣｐｄ．１４（Ｅリンカー）をトランスフェクトされたＳＣＣ－４細胞は、他の化合物をトランスフェクトされたＳＣＣ－４細胞と比較して、１．２～２．５倍高いＩＬ－２レベルを示した。Ｃｐｄ．１２をトランスフェクトされたＳＣＣ－４細胞は、他の化合物をトランスフェクトされたＳＣＣ－４細胞と比較して、向上したＶＥＧＦＡ下方調節を呈した。

【図8A-8B】ヒト初代筋肉細胞（ＨＳＭＭ）における、事実上Ａ１－リンカーまたはＡ２リンカーに対する、ＥＬＩＳＡによって測定されたＩＧＦ－１タンパク質レベルに関するプロットである。図８Ａは、成長培地中で培養されているＨＳＭＭ細胞における、それぞれＡ１－リンカーおよびＡ２－リンカーとともに、３’に３×ＡＬＫ２標的化ｓｉＲＮＡを含むＣｐｄ．３およびＣｐｄ．４からのＩＧＦ－１発現を示している。図８Ｂは、分化培地中で培養されているＨＳＭＭ細胞における、Ｃｐｄ．３およびＣｐｄ．４からのＩＧＦ－１発現を示している。ＨＳＭＭ細胞に、漸増ｎＭ濃度（０．１、０．３、１、３、１０、および３０ｎＭ）のＣｐｄ．３またはＣｐｄ．４ ＲＮＡのいずれかをトランスフェクトした。データは、４つの複製物の平均についての平均±標準誤差を表す。Ｃｐｄ．３とＣｐｄ．４との間の有意性（＊＊＊、ｐ＜０．００１）を、二方向ＡＮＯＶＡ、それに続くテューキーの多重比較検定によって査定した。

【図9A】最高２４時間までの、Ａ－１７２細胞における、Ｃｐｄ．１６およびＣｐｄ．１７によって誘導されたＩＬ－１２の経時的分泌を示した図である。細胞培養上清におけるＩＬ－１２レベルを、トランスフェクションの０～２４時間後までＥＬＩＳＡによって測定した（１０ｎＭ／ウェル）。Ｘ軸は、トランスフェクション後の時間（時間）を示し、Ｙ軸は、細胞培養上清におけるＩＬ－１２タンパク質レベル（ｐｇ／ｍＬ）についての測定結果を示している。データは、３つの複製物の平均についての平均±標準誤差を表す。

【図9B】ｒｈＩＬ－１２、またはＣｐｄ．１６もしくはＣｐｄ．１７（０．３μｇ／ウェル）をトランスフェクトされているヒト胎児性腎臓（ＨＥＫ２９３）細胞の上清に由来するＩＬ－１２（０．００１ｎｇ～３００ｎｇ）によって誘導されかつＥＬＩＳＡによって定量された、ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ＩＬ－１２レポーター細胞におけるＳＴＡＴ４経路の用量依存的活性化を示したプロットである。Ｘ軸は、種々の濃度のＣｐｄ．１６もしくはＣｐｄ．１７由来ＩＬ－１２、またはｒｈＩＬ－１２を示す。Ｙ軸は、ｒｈＩＬ－１２に対して正規化されたＩＬ－１２シグナル伝達活性化を示す（ｒｈＩＬ－１２の最も低いＳＥＡＰ値を０に設定し、ｒｈＩＬ－１２の最も高いＳＥＡＰ値を１００％に設定した）。データは、用量あたり３つの複製物の平均についての平均±標準誤差を表す。

【図9C-9D】Ｃｐｄ．１６（図９Ｃ）またはＣｐｄ．１７（図９Ｄ）をトランスフェクトされたＡ１７２細胞における、ＫＲＡＳおよびｐａｎ－Ａｋｔ（Ａｋｔ１、Ａｋｔ２、およびＡｋｔ３）レベルの時間依存的下方調節を示したプロットである。ＫＲＡＳおよびｐａｎ－ＡｋｔのＲＮＡレベルを、トランスフェクションの最高２４時間後まで、技術的３重でｑＰＣＲによって細胞溶解物から測定した。Ｘ軸は、トランスフェクション後の時間（時間）を示す。Ｙ軸は、トランスフェクトされていない試料（基底レベル）に対して正規化されたＫＲＡＳおよびｐａｎ－Ａｋｔレベルの下方調節を示す。データは、３つの複製物の平均についての平均±標準誤差を表す。

【図9E-9F】Ｃｐｄ．１６（図９Ｅ）またはＣｐｄ．１７（図９Ｆ）をトランスフェクトされたＡ１７２細胞における、ｃ－Ｍｙｃレベルの時間依存的下方調節を示したプロットである。ｃ－ＭｙｃのＲＮＡレベルを、トランスフェクションの１２～２４時間後、技術的３重でｑＰＣＲによって細胞溶解物から測定した。Ｘ軸は、トランスフェクション後の時間（時間）を示す。Ｙ軸は、トランスフェクトされていない試料（基底レベル）に対して正規化されたｃ－Ｍｙｃレベルの下方調節を示す。データは、３つの複製物の平均についての平均±標準誤差を表す。

【発明を実施するための形態】

【0019】

詳細な説明
関心のある遺伝子をコードする少なくとも１種の核酸配列および／または、標的ＲＮＡの発現をモジュレートする遺伝子エレメントをコードするもしくは含む少なくとも１種の核酸配列を含む組み換えポリ核酸またはＲＮＡコンストラクトを含む、２種以上の遺伝子の発現をモジュレートするための組成物および方法が本明細書において提供される。本明細書において提供される組み換えポリ核酸またはＲＮＡコンストラクト組成物は、１種または複数のリンカーをさらに含み得る。１つの場合には、組み換えポリ核酸またはＲＮＡコンストラクトは、１種または複数の標的ＲＮＡの発現をモジュレートする１種または複数の遺伝子エレメントをコードするまたは含む核酸配列、および１種または複数のリンカーを含み得、リンカーは、１種または複数の標的ＲＮＡの発現をモジュレートする１種または複数の遺伝子エレメントのそれぞれの間に存在し得る。別の場合には、組み換えポリ核酸またはＲＮＡコンストラクトは、関心のある１種または複数の遺伝子をコードする核酸配列、および１種または複数のリンカーを含み得、リンカーは、関心のある１種または複数の遺伝子のそれぞれの間に存在し得る。一部の場合には、組み換えポリ核酸またはＲＮＡコンストラクトは、関心のある１種または複数の遺伝子をコードする核酸配列、１種または複数の標的ＲＮＡの発現をモジュレートする１種または複数の遺伝子エレメントをコードするまたは含む核酸配列、および１種または複数のリンカーを含み得、リンカーは、関心のある１種もしくは複数の遺伝子をコードする核酸配列と、１種もしくは複数の標的ＲＮＡの発現をモジュレートする１種または複数の遺伝子エレメントをコードするもしくは含む核酸配列との間、１種もしくは複数の標的ＲＮＡの発現をモジュレートする１種または複数の遺伝子エレメントのそれぞれの間、および／または関心のある１種もしくは複数の遺伝子のそれぞれの間に存在し得る。

【0020】

本明細書に記載される組み換えポリ核酸コンストラクトを含む、または本明細書に記載される組み換えＲＮＡコンストラクトをコードするベクターも本明細書において提供される。本明細書に記載される組み換えポリ核酸またはＲＮＡコンストラクト組成物またはベクターを含む細胞が本明細書において提供される。本明細書に記載される組み換えポリ核酸またはＲＮＡコンストラクト組成物は、薬学的組成物に製剤化され得る。並行して２種以上の遺伝子の発現をモジュレートする組成物および方法が本明細書においてさらに提供される。

【0021】

本明細書に記載される組成物または薬学的組成物をそれを必要とする対象に投与することを含む、疾患または病状を治療するための組成物および方法が本明細書において提供される。本明細書において提供される組み換えポリ核酸またはＲＮＡコンストラクト組成物は、第１のＲＮＡ配列、第２のＲＮＡ配列、およびリンカーＲＮＡ配列を含み得、リンカーＲＮＡ配列のリンカーは、第１のＲＮＡ配列と第２のＲＮＡ配列とを連結する。１つの例では、第１のＲＮＡ配列または第２のＲＮＡ配列は、１種または複数のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を含み得、ｍＲＮＡによってコードされるタンパク質のレベルを増加させ得る。別の例では、第１のＲＮＡ配列または第２のＲＮＡ配列は、標的ＲＮＡの発現をモジュレートする遺伝子エレメントであり得る。例えば、第１のＲＮＡ配列または第２のＲＮＡ配列は、１種または複数の標的ＲＮＡに結合し得る低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を含み得、標的ＲＮＡによってコードされるタンパク質のレベルを下方調節し得る。例えば、ｍＲＮＡおよび標的ＲＮＡは、本明細書に記載される遺伝子関連疾患および病状のものであり得る。

【0022】

別途定義されない限り、本明細書において使用されるすべての技術的および科学的用語は、本開示が属する技術分野における当業者によって共通して理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと同様のまたは等価の方法および材料が、本開示の実践または試験において使用され得るものの、適切な方法および材料が下で記載される。

【0023】

定義
様々な実施形態の徹底的な理解を提供するために、本説明についてのある特定の具体的な詳細が明記される。しかしながら、当業者であれば、本開示はこれらの詳細なしで実施され得ることを理解するであろう。別の場合には、実施形態の説明を不必要に分かりにくくすることを回避するために、周知の構造は詳細に示されていないまたは記載されていない。文脈が別途要しない限り、本明細書および後に続く特許請求の範囲を通して、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という単語、ならびに「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」等のその変形は、開かれた内包的な意味で、つまり「含むがそれらに限定されない」として捉えられるべきである。さらに、本明細書において提供される見出しは、単なる便宜上のものであり、主張される開示の範囲または意味を解釈するわけではない。

【0024】

本明細書および添付の特許請求の範囲において使用されるとき、「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」という単数形は、文脈が別途はっきりと述べていない限り、複数形の指示対象を含む。「または」という用語は、文脈が別途はっきりと述べていない限り、「および／または」を含むその意味で一般的に採用されることにも留意すべきである。本明細書において使用される「および／または」および「その任意の組み合わせ」という用語、ならびにそれらの文法的等価物は、互換可能に使用され得る。これらの用語は、任意の組み合わせが具体的に企図されることを伝え得る。例示的な目的のためだけに、以下の語句「Ａ、Ｂ、および／またはＣ」または「Ａ、Ｂ、Ｃ、またはその任意の組み合わせ」は、「個々にＡ；個々にＢ；個々にＣ；ＡおよびＢ；ＢおよびＣ；ＡおよびＣ；ならびにＡ、Ｂ、およびＣ」を意味し得る。「または」という用語は、文脈が離接的使用に具体的に言及しない限り、接続的にまたは離接的に使用され得る。

【0025】

「約」または「およそ」という用語は、当業者によって判定される特定の値に対して許容される誤差域内にあることを意味し得、それは、値がどのように測定されたまたは判定されたか、すなわち測定システムの限界に部分的に依存するであろう。例えば、「約」は、当技術分野における実践につき、１以内または１より大きい標準偏差を意味し得る。代替的に、「約」は、所与の値の最高２０％まで、最高１０％まで、最高５％まで、または最高１％までの域を意味し得る。代替的に、特に生物学的システムまたは過程に関して、該用語は、値の１桁以内、５倍以内、または２倍以内にあることを意味し得る。本出願および特許請求の範囲において特定の値が記載される場合、別途指定のない限り、特定の値に対して許容される誤差域内にあることを意味する「約」という用語が仮定されるべきである。

【0026】

本明細書および特許請求の範囲において使用されるとき、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」（ならびに、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」等、含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）の任意の形態）、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」（ならびに、「有する（ｈａｖｅ）」および「有する（ｈａｓ）」等、有する（ｈａｖｉｎｇ）の任意の形態）、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」（ならびに、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」および「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」等、含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）の任意の形態）、または「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」（ならびに、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」および「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」等、含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）の任意の形態）という単語は、内包的でありまたは非制約的であり、付加的な挙げられていない要素または方法工程を除外するわけではない。本明細書において論じられる任意の実施形態は、本開示の任意の方法または組成物に関して実行され得、逆もまた同様であることが企図される。さらに、本開示の組成物を使用して、本開示の方法を達成し得る。

【0027】

本明細書における「実施形態」、「ある特定の実施形態」、「好ましい実施形態」、「具体的な実施形態」、「一部の実施形態」、「一実施形態」、「１つの実施形態」、または「他の実施形態」への言及は、実施形態に関連して記載される特定の特質、構造、または特徴が、本開示の少なくとも一部の実施形態に含まれるが、必ずしもすべての実施形態に含まれるわけではないことを意味する。本開示についての理解を促すために、いくつかの用語および語句が下で定義される。

【0028】

本明細書において使用される「ＲＮＡ」という用語は、アミノ酸配列をコードするＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ等）、ならびにアミノ酸配列をコードしないＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ等）を含む。本明細書において使用されるＲＮＡは、コードＲＮＡ、すなわちアミノ酸配列をコードするＲＮＡであり得る。そのようなＲＮＡ分子は、ｍＲＮＡ（メッセンジャーＲＮＡ）とも称され、一本鎖ＲＮＡ分子である。本明細書において使用されるＲＮＡは、ノンコーディングＲＮＡ、すなわちアミノ酸配列をコードしないまたはタンパク質に翻訳されないＲＮＡであり得る。ノンコーディングＲＮＡは、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、短いまたは低分子ハーピン（ｈａｒｐｉｎ）ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ｐｉｗｉ相互作用ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）、および長いノンコーディングＲＮＡ（ＩｎｃＲＮＡ）を含み得るが、それらに限定されるわけではない。本明細書において使用されるｓｉＲＮＡは、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）領域、ヘアピン構造、ループ構造、またはその任意の組み合わせを含み得る。一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、少なくとも１つのｓｈＲＮＡ、少なくとも１つのｄｓＲＮＡ領域、または少なくとも１つのループ構造を含み得る。一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、ｄｓＲＮＡまたはｓｈＲＮＡからプロセシングされ得る。一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、ｓｈＲＮＡから、ＤＩＣＥＲ等の内因性タンパク質によってプロセシングされ得るまたは切断され得る。一部の実施形態において、ヘアピン構造またはループ構造は、ｓｉＲＮＡから切断され得るまたは除去され得る。例えば、ｓｈＲＮＡのヘアピン構造またはループ構造は、切断され得るまたは除去され得る。一部の実施形態において、本明細書に記載されるＲＮＡは、当業者に公知の合成的、化学的、もしくは酵素的方法論によって作製され得る、当業者に公知の組み換え技術によって作製され得る、または天然供給源から単離され得る、あるいはその任意の組み合わせによって作製され得る。ＲＮＡは、修飾されたもしくは非修飾のヌクレオチド、またはその混合物を含み得、例えばＲＮＡは、当技術分野において公知の化学的なおよび天然に存在するヌクレオシド修飾（例えば、本明細書においてメチルシュードウリジンとも称されるＮ^１－メチルシュードウリジン）を任意選択で含み得る。

【0029】

「核酸配列」、「ポリ核酸配列」、および「ヌクレオチド配列」という用語は、本明細書において互換可能に使用され、本明細書において同一の意味を有し、ＤＮＡまたはＲＮＡを指す。一部の実施形態において、核酸配列は、糖／ホスフェート骨格のホスホジエステル結合によって互いに共有結合的に連結されているヌクレオチド単量体を含むまたはそれからなるポリマーである。「核酸配列」、「ポリ核酸配列」、および「ヌクレオチド配列」という用語は、非修飾の核酸配列を包含し得、すなわち非修飾のヌクレオチドまたは天然のヌクレオチドを含む。「核酸配列」、「ポリ核酸配列」、および「ヌクレオチド配列」という用語は、塩基修飾された、糖修飾された、または骨格修飾された等のＤＮＡまたはＲＮＡ等、修飾された核酸配列も包含し得る。
「天然のヌクレオチド」および「標準ヌクレオチド」という用語は、本明細書において互換可能に使用され、本明細書において同一の意味を有し、天然に存在するヌクレオチド塩基のアデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、ウラシル（Ｕ）、チミン（Ｔ）を指す。

【0030】

「非修飾のヌクレオチド」という用語は、天然に修飾されない、例えばｉｎ ｖｉｖｏでエピジェネティックにまたは翻訳後に修飾されない、天然のヌクレオチドを指すために本明細書において使用される。好ましくは、「非修飾のヌクレオチド」という用語は、天然に修飾されず、例えばｉｎ ｖｉｖｏでエピジェネティックにまたは翻訳後に修飾されず、化学修飾されない、例えばｉｎ ｖｉｔｒｏで化学修飾されない、天然のヌクレオチドを指すために本明細書において使用される。

【0031】

「修飾されたヌクレオチド」という用語は、エピジェネティックにまたは翻訳後に修飾されたヌクレオチド等の天然に修飾されたヌクレオチド、および化学修飾されたヌクレオチド、例えばｉｎ ｖｉｔｒｏで化学修飾されるヌクレオチドを指すために本明細書において使用される。

【0032】

組み換えＲＮＡコンストラクト
関心のある遺伝子をコードする少なくとも１種の核酸配列と、および／または標的ＲＮＡの発現をモジュレートする遺伝子エレメントを含む少なくとも１種の核酸配列とを含む組み換えＲＮＡコンストラクトを含む組成物が本明細書において提供される。本明細書において提供される組み換えＲＮＡコンストラクト組成物は、１種または複数のリンカーをさらに含み得る。１つの場合には、組み換えＲＮＡコンストラクトは、１種または複数の標的ＲＮＡの発現をモジュレートする１種または複数の遺伝子エレメントを含む核酸配列、および１種または複数のリンカーを含み得、リンカーは、１種または複数の標的ＲＮＡの発現をモジュレートする１種または複数の遺伝子エレメントのそれぞれの間に存在し得る。別の場合には、組み換えＲＮＡコンストラクトは、関心のある１種または複数の遺伝子をコードする核酸配列、および１種または複数のリンカーを含み得、リンカーは、関心のある１種または複数の遺伝子のそれぞれの間に存在し得る。一部の場合には、組み換えＲＮＡコンストラクトは、関心のある１種または複数の遺伝子をコードする核酸配列、１種または複数の標的ＲＮＡの発現をモジュレートする１種または複数の遺伝子エレメントを含む核酸配列、および１種または複数のリンカーを含み得、リンカーは、関心のある１種もしくは複数の遺伝子をコードする核酸配列と、１種もしくは複数の標的ＲＮＡの発現をモジュレートする１種または複数の遺伝子エレメントを含む核酸配列との間；１種もしくは複数の標的ＲＮＡの発現をモジュレートする１種または複数の遺伝子エレメントのそれぞれの間；および／または関心のある１種もしくは複数の遺伝子のそれぞれの間に存在し得る。

【0033】

関心のある遺伝子をコードする少なくとも１種の核酸配列と、および／または標的ＲＮＡの発現をモジュレートする遺伝子エレメントを含む少なくとも１種の核酸配列とを含む組み換えＲＮＡコンストラクトを含む、２種以上の遺伝子の発現をモジュレートするための組成物が本明細書において提供される。関心のある遺伝子をコードする少なくとも１種の核酸配列と、および／または標的ＲＮＡの発現をモジュレートする遺伝子エレメントを含む少なくとも１種の核酸配列とを含む組み換えＲＮＡコンストラクトを含む、疾患または病状を治療するための組成物が本明細書においてさらに提供される。本明細書において提供される組み換えＲＮＡコンストラクト組成物は、第１のＲＮＡ配列、第２のＲＮＡ配列、およびリンカー配列を含み得、リンカー配列は、第１のＲＮＡ配列と第２のＲＮＡ配列とを連結する。１つの例では、第１のＲＮＡ配列または第２のＲＮＡ配列は、１種または複数のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を含み得、ｍＲＮＡによってコードされるタンパク質のレベルを増加させ得る。別の例では、第１のＲＮＡ配列または第２のＲＮＡ配列は、標的ＲＮＡの発現をモジュレートする遺伝子エレメントであり得る。一部の実施形態において、標的ＲＮＡの発現をモジュレートする遺伝子エレメントは、１種または複数の標的ＲＮＡに結合し得る低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）であり得る。例えば、第１のＲＮＡ配列または第２のＲＮＡ配列は、１種または複数の標的ＲＮＡに結合し得るｓｉＲＮＡを含み得、標的ＲＮＡによってコードされるタンパク質のレベルを下方調節し得る。一部の場合には、標的ＲＮＡの発現をモジュレートする遺伝子エレメントは、関心のある遺伝子の発現を阻害しない。一部の場合には、ｍＲＮＡおよび標的ＲＮＡは、本明細書に記載される遺伝子関連疾患および病状のものであり得る。単一ＲＮＡ転写産物を使用して、並行して２種以上の遺伝子の発現をモジュレートする組成物および方法も本明細書において提供される。

【0034】

関心のある遺伝子と、ｓｉＲＮＡ等、別の遺伝子の発現を低下させる遺伝子エレメントとを含む組み換えポリ核酸またはＲＮＡコンストラクトであって、関心のある遺伝子、およびｓｉＲＮＡ等、別の遺伝子の発現を低下させる遺伝子エレメントは、図１に例示されるように５’から３’方向に、または３’から５’方向に連続的様式で存在し得る、組み換えポリ核酸またはＲＮＡコンストラクトが本明細書においてさらに提供される。１つの例では、図１に例示されるように、関心のある遺伝子（例えば、ＩＧＦ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、またはＩＬ－４）は、ｓｉＲＮＡ等、別の遺伝子の発現を低下させる遺伝子エレメントに対して５’またはその上流に存在し得、関心のある遺伝子は、リンカー（ｍＲＮＡからｓｉＲＮＡ／ｓｈＲＮＡへのリンカー、「スペーサー」とも称され得る）によってｓｉＲＮＡに連結され得る。別の例では、関心のある遺伝子は、ｓｉＲＮＡ等、別の遺伝子の発現を低下させる遺伝子エレメントに対して３’またはその下流に存在し得、ｓｉＲＮＡは、リンカー（ｓｉＲＮＡ／ｓｈＲＮＡからｍＲＮＡへのリンカー、「スペーサー」とも称され得る）によって関心のある遺伝子に連結され得る。本明細書において提供される組み換えポリ核酸またはＲＮＡコンストラクトは、１種より多くのｓｉＲＮＡを含み得、１種より多くのｓｉＲＮＡのそれぞれは、リンカー（ｓｉＲＮＡからｓｉＲＮＡへのリンカー、またはｓｈＲＮＡからｓｈＲＮＡへのリンカー）によって連結され得る。一部の実施形態において、ｍＲＮＡからｓｉＲＮＡ／ｓｈＲＮＡへの（またはｓｉＲＮＡ／ｓｈＲＮＡからｍＲＮＡへの）リンカーの配列、およびｓｉＲＮＡからｓｉＲＮＡへの（またはｓｈＲＮＡからｓｈＲＮＡへの）リンカーの配列は異なり得る。一部の実施形態において、ｍＲＮＡからｓｉＲＮＡ／ｓｈＲＮＡへの（またはｓｉＲＮＡ／ｓｈＲＮＡからｍＲＮＡへの）リンカーの配列、およびｓｉＲＮＡからｓｉＲＮＡへの（またはｓｈＲＮＡからｓｈＲＮＡへの）リンカーの配列は同じであり得る。本明細書において提供される組み換えポリ核酸またはＲＮＡコンストラクトは、関心のある１種より多くの遺伝子を含み得、関心のある１種より多くの遺伝子のそれぞれは、リンカー（ｍＲＮＡからｍＲＮＡへのリンカー）によって連結され得る。一部の場合には、関心のある遺伝子は、図１に示されるように、Ｎ末端にシグナルペプチド配列を含み得る。一部の場合には、関心のある遺伝子は、非修飾の（ＷＴ）シグナルペプチド配列または修飾されたシグナルペプチド配列を含み得る。本明細書において提供される組み換えポリ核酸コンストラクト（例えば、ＤＮＡコンストラクト）は、ＲＮＡポリメラーゼ結合のためのプロモーター配列も含み得る。例えば、ＤＮＡコンストラクトは、本明細書に記載されるＲＮＡコンストラクトを発現するために、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ結合のためのプロモーター配列を含み得る。例として、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ結合のためのＴ７プロモーターが図１に示される。一部の実施形態において、本明細書に記載されるＲＮＡコンストラクトは、プロモーター配列を含まなくてもよい。

【0035】

組み換えポリ核酸または組み換えＲＮＡとは、天然に存在せず、ｉｎ ｖｉｔｒｏで合成されるまたは操縦されるポリ核酸またはＲＮＡを指し得る。組み換えポリ核酸またはＲＮＡは、実験室において合成され得、酵素的制限消化、ライゲーション、クローニング、および／またはｉｎ ｖｉｔｒｏ転写等、ＤＮＡまたはＲＮＡの酵素的修飾を使用することによる組み換えＤＮＡまたはＲＮＡ技術を使用することによって調製され得る。組み換えポリ核酸は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで転写されてメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を産生し得、組み換えｍＲＮＡは単離され得、精製され得、細胞へのトランスフェクションに使用され得る。本明細書において使用される組み換えポリ核酸またはＲＮＡは、タンパク質、ポリペプチド、標的モチーフ、シグナルペプチド、および／または低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）等のノンコーディングＲＮＡをコードし得る。一部の実施形態において、適切な条件下で、組み換えポリ核酸またはＲＮＡは、細胞に組み入れられ得、細胞内で発現され得る。

【0036】

標的ＲＮＡに結合し得るｓｉＲＮＡを含む１種または複数の核酸配列と、関心のある遺伝子をコードする１種または複数の核酸配列とを含む組み換えＲＮＡコンストラクトであって、標的ＲＮＡに結合し得るｓｉＲＮＡは、関心のある遺伝子によってコードされるイントロン配列の一部ではない、組み換えＲＮＡコンストラクトが本明細書において提供される。一部の場合には、関心のある遺伝子は、ＲＮＡスプライシングなしで発現される。一部の場合には、標的ＲＮＡに結合し得るｓｉＲＮＡは、関心のある遺伝子のイントロン配列によってコードされないまたはそれから構成されない。一部の場合には、標的ＲＮＡに結合し得るｓｉＲＮＡは、標的ＲＮＡのエクソンに結合する。一部の場合には、標的ＲＮＡに結合し得るｓｉＲＮＡは、１種の標的ＲＮＡに特異的に結合する。

【0037】

本明細書において提供される組み換えＲＮＡコンストラクトは、複数コピーの関心のある遺伝子を含み得、複数コピーの関心のある遺伝子のそれぞれは、同じタンパク質をコードする。関心のある複数の遺伝子を含む組み換えＲＮＡコンストラクトを含む組成物であって、関心のある複数の遺伝子のそれぞれは、異なるタンパク質をコードする、組成物も本明細書において提供される。本明細書において提供される組み換えＲＮＡコンストラクトは、複数の種のｓｉＲＮＡを含み得、複数の種のｓｉＲＮＡのそれぞれは、同じ標的ＲＮＡに結合し得る。一部の実施形態において、複数の種のｓｉＲＮＡのそれぞれは、同じ標的ＲＮＡの同じ領域に結合し得る。一部の実施形態において、複数の種のｓｉＲＮＡのそれぞれは、同じ標的ＲＮＡの異なる領域に結合し得る。一部の実施形態において、複数の種のｓｉＲＮＡの一部は、同じ標的ＲＮＡに結合し得、複数の種のｓｉＲＮＡの一部は、同じ標的ＲＮＡの異なる領域に結合し得る。複数の種のｓｉＲＮＡを含む組み換えＲＮＡコンストラクトであって、複数の種のｓｉＲＮＡのそれぞれは、異なる標的ＲＮＡに結合し得る、組み換えＲＮＡコンストラクトも本明細書において提供される。一部の実施形態において、標的ＲＮＡはノンコーディングＲＮＡである。一部の実施形態において、標的ＲＮＡはメッセンジャー（ｍＲＮＡ）である。

【0038】

第１のＲＮＡ配列、第２のＲＮＡ配列、およびリンカー配列を含む組み換えＲＮＡコンストラクトを含む組成物であって、第１のＲＮＡ配列および／または第２のＲＮＡ配列は、関心のある遺伝子、または標的ＲＮＡの発現をモジュレートする遺伝子エレメントをコードし得る、組成物が本明細書において提供される。１つの例では、第１のＲＮＡ配列または第２のＲＮＡ配列は、関心のある遺伝子をコードするｍＲＮＡであり得る。別の例では、第１のＲＮＡ配列または第２のＲＮＡ配列は、標的ＲＮＡに結合し得る低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）等、標的ＲＮＡの発現を低下させる遺伝子エレメントであり得る。

【0039】

本明細書において提供される組み換えＲＮＡコンストラクトは、関心のある遺伝子をコードする１種より多くの核酸配列を含み得る。例えば、組み換えＲＮＡコンストラクトは、関心のある遺伝子をコードする２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５種、またはそれより多くの核酸配列を含み得る。一部の場合には、２種以上の核酸配列のそれぞれは、関心のある同じ遺伝子をコードし得、関心のある同じ遺伝子によってコードされるｍＲＮＡは、ｓｉＲＮＡ標的ｍＲＮＡとは異なる。一部の場合には、２種以上の核酸配列のそれぞれは、関心のある異なる遺伝子をコードし得、関心のある異なる遺伝子によってコードされるｍＲＮＡは、同じＲＮＡコンストラクトに含まれるｓｉＲＮＡの標的ではない。一部の場合には、組み換えＲＮＡコンストラクトは、関心のある遺伝子をコードする３種以上の核酸配列を含み得、３種以上の核酸配列のそれぞれは、関心のある同じ遺伝子または関心のある異なる遺伝子をコードし得、関心のある同じまたは異なる遺伝子によってコードされるｍＲＮＡは、同じＲＮＡコンストラクトに含まれるｓｉＲＮＡの標的ではない。例えば、組み換えＲＮＡコンストラクトは、関心のある遺伝子をコードする４種の核酸配列を含み得、４種の核酸配列のうちの３種は、関心のある同じ遺伝子をコードし、４種の核酸配列のうちの１種は、関心のある異なる遺伝子をコードし、関心のある同じまたは異なる遺伝子によってコードされるｍＲＮＡは、同じＲＮＡコンストラクトに含まれるｓｉＲＮＡの標的ではない。

【0040】

本明細書において提供される組み換えＲＮＡコンストラクトは、本明細書に記載される疾患または病状と関連した遺伝子のＲＮＡを標的にする１種より多くのｓｉＲＮＡを含み得る。例えば、本明細書において提供される組み換えＲＮＡコンストラクトは、同じＲＮＡまたは異なるＲＮＡを標的にする１～１０種のｓｉＲＮＡを含み得る。一部の場合には、同じＲＮＡを標的にする１～１０種のｓｉＲＮＡのそれぞれは、同じ配列を含み得る、すなわち１～１０種のｓｉＲＮＡのそれぞれは、標的ＲＮＡの同じ領域に結合する。一部の場合には、同じＲＮＡを標的にする１～１０種のｓｉＲＮＡのそれぞれは、異なる配列を含み得る、すなわち１～１０種のｓｉＲＮＡのそれぞれは、標的ＲＮＡの異なる領域に結合する。例えば、本明細書において提供される組み換えＲＮＡコンストラクトは、１種のＲＮＡを標的にする３種のｓｉＲＮＡを含み得、３種のｓｉＲＮＡのそれぞれは、ＲＮＡの同じ領域を標的にする同じ核酸配列を含む。この例では、３種のｓｉＲＮＡのそれぞれは、エクソン１を標的にする同じ核酸配列を含み得る。別の例では、３種のｓｉＲＮＡのそれぞれは、ＲＮＡの異なる領域を標的にする異なる核酸配列を含み得る。この例では、３種のｓｉＲＮＡのうちの１種は、エクソン１を標的にする核酸配列を含み得、３種のｓｉＲＮＡのうちの別の１種は、エクソン２を標的にする核酸配列を含み得る、等。さらに別の例では、３種のｓｉＲＮＡのそれぞれは、異なるＲＮＡを標的にする異なる核酸配列を含み得る。すべての態様において、本明細書において提供される組み換えＲＮＡコンストラクトにおけるｓｉＲＮＡは、同じＲＮＡコンストラクト組成物におけるｍＲＮＡによって発現される、関心のある遺伝子の発現に影響を及ぼし得ない。一部の実施形態において、標的ＲＮＡはｍＲＮＡである。

【0041】

第１のＲＮＡ配列、第２のＲＮＡ配列、およびリンカーＲＮＡ配列を含む組み換えＲＮＡコンストラクトを含む組成物であって、リンカーＲＮＡ配列は、第１のＲＮＡ配列と第２のＲＮＡ配列とを連結する、組成物が本明細書において提供される。一部の場合には、本明細書に記載されるリンカーは、式（Ｉ）Ｘ_ｍＣＡＡＣＡＡＸ_ｎの構造［式中、Ｘは任意のヌクレオチドであり、ｍは１～１２の整数であり、ｎは０～４の整数である］を有し得る。一部の場合には、本明細書に記載されるリンカーは、式（ＩＩ）：Ｘ_ｐＴＣＣＣＸ_ｒの構造［式中、Ｘは任意のヌクレオチドであり、ｐは０～１７の整数であり、ｒは０～１３の整数である］を有し得る。１つの実施形態において、第１のＲＮＡ配列または第２のＲＮＡ配列は、１種または複数の標的ＲＮＡの発現をモジュレートする１種または複数の遺伝子エレメントを含み得、リンカーＲＮＡ配列は、１種または複数の標的ＲＮＡの発現をモジュレートする１種または複数の遺伝子エレメントのそれぞれを接続し得る（例えば、ｓｉＲＮＡからｓｉＲＮＡへのリンカー、またはｓｈＲＮＡからｓｈＲＮＡへのリンカー）。別の実施形態において、第１のＲＮＡ配列は、関心のある遺伝子をコードし得、第２のＲＮＡ配列は、１種または複数の標的ＲＮＡの発現をモジュレートする１種または複数の遺伝子エレメントを含み得、リンカーＲＮＡ配列は、関心のある遺伝子と、１種または複数の標的ＲＮＡの発現をモジュレートする１種または複数の遺伝子エレメントとを接続し得る（例えば、ｍＲＮＡからｓｉＲＮＡへのリンカー、ｓｉＲＮＡからｍＲＮＡへ、ｍＲＮＡからｓｈＲＮＡへのリンカー、またはｓｈＲＮＡからｍＲＮＡへのリンカー）。一部の実施形態において、ｍＲＮＡからｓｉＲＮＡ／ｓｈＲＮＡへの（またはｓｉＲＮＡ／ｓｈＲＮＡからｍＲＮＡへの）リンカーの配列、およびｓｉＲＮＡからｓｉＲＮＡへの（またはｓｈＲＮＡからｓｈＲＮＡへの）リンカーの配列は異なり得る。一部の実施形態において、ｍＲＮＡからｓｉＲＮＡ／ｓｈＲＮＡへの（またはｓｉＲＮＡ／ｓｈＲＮＡからｍＲＮＡへの）リンカーの配列、およびｓｉＲＮＡからｓｉＲＮＡへの（またはｓｈＲＮＡからｓｈＲＮＡへの）リンカーの配列は同じであり得る。一部の実施形態において、第１のＲＮＡ配列は、関心のある遺伝子をコードし得、第２のＲＮＡ配列は、１種または複数の標的ＲＮＡの発現をモジュレートする１種または複数の遺伝子エレメントを含み得、同じＲＮＡリンカー配列は、関心のある遺伝子と、１種または複数の標的ＲＮＡの発現をモジュレートする１種または複数の遺伝子エレメントとを（例えば、ｍＲＮＡからｓｉＲＮＡ／ｓｈＲＮＡへのリンカー、またはｓｉＲＮＡ／ｓｈＲＮＡからｍＲＮＡへのリンカー）、ならびに１種または複数の標的ＲＮＡの発現をモジュレートする１種または複数の遺伝子エレメントのそれぞれの間を（例えば、ｓｉＲＮＡ／ｓｈＲＮＡからｓｉＲＮＡ／ｓｈＲＮＡへのリンカー）を接続し得る。

【0042】

一部の実施形態において、リンカーの長さは、約４～約５０、約４～約４５、または約４～約４０、約４～約３５、または約４～約３０ヌクレオチドである。一部の実施形態において、リンカーの長さは、約４～約２７ヌクレオチドである。一部の実施形態において、リンカーの長さは、約４～約１８ヌクレオチドである。例えば、リンカーの長さは、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、約３０、約３１、約３２、約３３、約３４、約３５、約３６、約３７、約３８、約３９、約４０、約４１、約４２、約４３、約４４、約４５、約４６、約４７、約４８、約４９、または約５０ヌクレオチドである。一部の実施形態において、リンカーの長さは、多くとも約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、約３０、約３１、約３２、約３３、約３４、約３５、約３６、約３７、約３８、約３９、約４０、約４１、約４２、約４３、約４４、約４５、約４６、約４７、約４８、約４９、または多くとも約５０ヌクレオチドであり得る。一部の実施形態において、リンカーの長さは４ヌクレオチドである。一部の実施形態において、リンカーの長さは７ヌクレオチドである。一部の実施形態において、リンカーの長さは１１ヌクレオチドである。一部の実施形態において、リンカーの長さは１２ヌクレオチドである。一部の実施形態において、リンカーの長さは１８ヌクレオチドである。一部の実施形態において、リンカーの長さは１６ヌクレオチドである。一部の実施形態において、リンカーの長さは２０ヌクレオチドである。一部の実施形態において、リンカーの長さは２３ヌクレオチドである。一部の実施形態において、リンカーの長さは２７ヌクレオチドである。

【0043】

一部の場合には、本明細書に記載されるリンカーは、式（Ｉ）Ｘ_ｍＣＡＡＣＡＡＸ_ｎの構造［式中、Ｘは任意のヌクレオチドであり；ｍは１～１２の整数であり、ｎは０～４の整数であり；ｍは１であり、ｎは０である］を有し得る。一部の場合には、本明細書に記載されるリンカーは、ＣＡＡＣＡＡ（配列番号７１）、ＴＣＣＣ（配列番号６９）、またはＡＣＡＡＣＡＡ（配列番号２３）を含む配列を含み得る。一部の実施形態において、リンカーは、ＡＴＣＣＣＴＡＣＧＴＡＣＣＡＡＣＡＡ（配列番号６７）、ＡＣＧＴＡＣＣＡＡＣＡＡ（配列番号６８）、ＴＣＣＣ（配列番号６９）、ＡＣＡＡＣＡＡＴＣＣＣ（配列番号７０）、およびＡＣＡＡＣＡＡ（配列番号２３）からなる群から選択される配列を含み得る。一部の実施形態において、リンカーは、ＡＣＡＡＣＡＡ（配列番号２３）、ＡＴＡＧＴＧＡＧＴＣＧＴＡＴＴＡＴＣＣＣ（配列番号７２）、ＡＴＡＧＴＧＡＧＴＣＧＴＡＴＴＡＡＣＡＡＣＡＡＴＣＣＣ（配列番号７３）、ＡＴＡＧＴＧＡＧＴＣＧＴＡＴＴＡＡＣＡＡＣＡＡ（配列番号７４）、ＡＴＡＧＴＧＡＧＴＣＧＴＡＴＴＡＡＴＣＣＣＴＡＣＧＴＡＣＣＡＡＣＡＡ（配列番号７５）、またはＡＴＡＧＴＧＡＧＴＣＧＴＡＴＴＡＡＣＧＴＡＣＣＡＡＣＡＡ（配列番号２１）を含む配列を含み得る。一部の実施形態において、リンカーは、ＡＣＡＡＣＡＡ（配列番号２３）を含む配列を含み得る。一部の実施形態において、本明細書に記載されるリンカーは、配列番号２３、６７～７５からなる群から選択される配列を含み得る。一部の実施形態において、本明細書に記載されるリンカーは、ＴＴＴＡＴＣＴＴＡＧＡＧＧＣＡＴＡＴＣＣＣＴＡＣＧＴＡＣＣＡＡＣＡＡ（配列番号２２）を含む配列を含まなくてもよい。一部の実施形態において、本明細書に記載されるリンカーは、ＡＴＡＧＴＧＡＧＴＣＧＴＡＴＴＡＡＣＧＴＡＣＣＡＡＣＡＡ（配列番号２１）を含む配列を含まなくてもよい。一部の実施形態において、本明細書に記載されるリンカーは、ＴＴＴＡＴＣＴＴＡＧＡＧＧＣＡＴＡＴＣＣＣＴＡＣＧＴＡＣＣＡＡＣＡＡ（配列番号２２）またはＡＴＡＧＴＧＡＧＴＣＧＴＡＴＴＡＡＣＧＴＡＣＣＡＡＣＡＡ（配列番号２１）を含まない。

【0044】

一部の場合には、ｔＲＮＡリンカーが使用され得る。ｔＲＮＡシステムは、生存生物にわたって進化的に保存され、内因性のＲＮａｓｅ ＰおよびＺを利用して、マルチシストロン性コンストラクトをプロセシングする（Ｄｏｎｇら、２０１６）。一部の場合には、本明細書に記載されるｔＲＮＡリンカーは、ＡＡＣＡＡＡＧＣＡＣＣＡＧＴＧＧＴＣＴＡＧＴＧＧＴＡＧＡＡＴＡＧＴＡＣＣＣＴＧＣＣＡＣＧＧＴＡＣＡＧＡＣＣＣＧＧＧＴＴＣＧＡＴＴＣＣＣＧＧＣＴＧＧＴＧＣＡ（配列番号３９）を含む核酸配列を含み得る。一部の場合には、ＡＴＡＧＴＧＡＧＴＣＧＴＡＴＴＡＡＣＧＴＡＣＣＡＡＣＡＡ（配列番号２１）を含む核酸配列を含むリンカーを使用して、第１のＲＮＡ配列と第２のＲＮＡ配列とを連結し得る。一部の実施形態において、ＴＴＴＡＴＣＴＴＡＧＡＧＧＣＡＴＡＴＣＣＣＴＡＣＧＴＡＣＣＡＡＣＡＡ（配列番号２２）を含む核酸配列を含むリンカーを使用して、１～２０種またはそれより多くのｓｉＲＮＡ種のそれぞれを接続し得る。

【0045】

一部の場合には、本明細書に記載されるリンカーは、二次構造を形成しなくてもよい。例えば、本明細書に記載されるリンカーは、本明細書において提供される組み換えＲＮＡコンストラクトの核酸配列に結合しなくてもよいまたは塩基対合しなくてもよい。一部の場合には、本明細書に記載されるリンカーは、リンカー配列内に二次構造を形成しなくてもよい。例えば、本明細書に記載されるリンカーは、リンカー配列内に塩基ペアリングを有しなくてもよい。一部の実施形態において、本明細書に記載されるインカー（ｉｎｋｅｒ）ＲＮＡ配列は、ＲＮＡｆｏｌｄウェブサーバーに従った二次構造を形成しない。一部の実施形態において、本明細書に記載されるｓｉＲＮＡ配列は、ＲＮＡｆｏｌｄウェブサーバーに従った二次構造を形成し得る。

【0046】

１～２０種またはそれより多くのｓｉＲＮＡ種を含む組み換えＲＮＡコンストラクト組成物であって、１～２０種またはそれより多くのｓｉＲＮＡ種のそれぞれは、式（Ｉ）：Ｘ_ｍＣＡＡＣＡＡＸ_ｎ［式中、Ｘは任意のヌクレオチドであり、ｍは１～１２の整数であり、ｎは０～４の整数である］；および式（ＩＩ）：Ｘ_ｐＴＣＣＣＸ_ｒ［式中、Ｘは任意のヌクレオチドであり、ｐは０～１７の整数であり、ｒは０～１３の整数である］からなる群から選択される構造を有するリンカーによって接続される、組み換えＲＮＡコンストラクト組成物が本明細書においてさらに提供される。

【0047】

一部の場合には、本明細書において提供される組み換えＲＮＡコンストラクトは切断され得る。例えば、本明細書において提供される組み換えＲＮＡコンストラクトは、細胞取り込みの後に内因的に切断され得る。一部の実施形態において、組み換えＲＮＡコンストラクトは、細胞内タンパク質または内因性タンパク質によって切断され得る。一部の実施形態において、組み換えＲＮＡコンストラクトは、ＤＩＣＥＲ、例えば内因性ＤＩＣＥＲによって切断され得る。一部の実施形態において、第１のＲＮＡ配列、第２のＲＮＡ配列、およびリンカーＲＮＡ配列を含む組み換えＲＮＡコンストラクトであって、リンカーＲＮＡ配列が第１のＲＮＡ配列と第２のＲＮＡ配列とを連結する組み換えＲＮＡコンストラクトは、第１のＲＮＡ配列と第２のＲＮＡ配列との間で切断され得る。一部の実施形態において、本明細書において提供される組み換えＲＮＡコンストラクトは、第１のＲＮＡ配列、第２のＲＮＡ配列、およびリンカーを含む。この実施形態において、第１のＲＮＡ配列または第２のＲＮＡ配列は、１種または複数の標的ＲＮＡの発現をモジュレートする１種または複数の遺伝子エレメントを含み得、組み換えＲＮＡコンストラクトは、１種または複数の標的ＲＮＡの発現をモジュレートする１種または複数の遺伝子エレメントのそれぞれの間で切断され得る。別の実施形態において、第１のＲＮＡ配列は、関心のある遺伝子をコードし得、第２のＲＮＡ配列は、１種または複数の標的ＲＮＡの発現をモジュレートする１種または複数の遺伝子エレメントを含み得、組み換えＲＮＡコンストラクトは、関心のある遺伝子と、１種または複数の標的ＲＮＡの発現をモジュレートする１種または複数の遺伝子エレメントとの間で切断され得る。一部の実施形態において、第１のＲＮＡ配列は、関心のある遺伝子をコードし得、第２のＲＮＡ配列は、１種または複数の標的ＲＮＡの発現をモジュレートする１種または複数の遺伝子エレメントを含み得、組み換えＲＮＡコンストラクトは、関心のある遺伝子と、１種もしくは複数の標的ＲＮＡの発現をモジュレートする１種または複数の遺伝子エレメントとの間、および／または１種もしくは複数の標的ＲＮＡの発現をモジュレートする１種または複数の遺伝子エレメントのそれぞれの間で切断され得る。

【0048】

一部の場合には、組み換えＲＮＡコンストラクトの切断は、本明細書に記載されるリンカーを含まない相当するＲＮＡコンストラクトの切断と比較して増強される。例えば、第１のＲＮＡ配列、第２のＲＮＡ配列、および本明細書に記載されるリンカーの１種または複数を含む組み換えＲＮＡコンストラクトの切断は、本明細書に記載されるリンカーを含まないＲＮＡコンストラクトの切断と比較して増強される。例えば、第１のＲＮＡ配列、第２のＲＮＡ配列、および本明細書に記載されるリンカーＲＮＡ配列を含む組み換えＲＮＡコンストラクトの切断は、式（Ｉ）：Ｘ_ｍＣＡＡＣＡＡＸ_ｎ［式中、Ｘは任意のヌクレオチドであり、ｍは１～１２の整数であり、ｎは０～４の整数である］；および式（ＩＩ）：Ｘ_ｐＴＣＣＣＸ_ｒ［式中、Ｘは任意のヌクレオチドであり、ｐは０～１７の整数であり、ｒは０～１３の整数である］からなる群から選択される構造を有しないリンカーを含むＲＮＡコンストラクトの切断と比較して増強される。例えば、第１のＲＮＡ配列、第２のＲＮＡ配列、および本明細書に記載されるリンカーＲＮＡ配列を含む組み換えＲＮＡコンストラクトの切断は、ＡＣＡＡＣＡＡ（配列番号２３）を含む配列を含まないリンカーを含むＲＮＡコンストラクトの切断と比較して増強される。例えば、第１のＲＮＡ配列、第２のＲＮＡ配列、および本明細書に記載されるリンカーＲＮＡ配列を含む組み換えＲＮＡコンストラクトの切断は、二次構造を形成するリンカーを含むＲＮＡコンストラクトの切断と比較して増強される。

【0049】

一部の場合には、本明細書において提供される組み換えＲＮＡコンストラクトからの関心のある遺伝子の発現は、本明細書に記載されるリンカーを含まない相当する組み換えＲＮＡコンストラクトからの関心のある遺伝子の発現と比較して増強される。例えば、第１のＲＮＡ配列、第２のＲＮＡ配列、および本明細書に記載されるリンカーＲＮＡ配列を含む組み換えＲＮＡコンストラクトからの関心のある遺伝子の発現は、本明細書に記載されるリンカーを含まないＲＮＡコンストラクトからの関心のある遺伝子の発現と比較して増強される。例えば、第１のＲＮＡ配列、第２のＲＮＡ配列、および本明細書に記載されるリンカーＲＮＡ配列を含む組み換えＲＮＡコンストラクトからの関心のある遺伝子の発現は、式（Ｉ）：Ｘ_ｍＣＡＡＣＡＡＸ_ｎ［式中、Ｘは任意のヌクレオチドであり、ｍは１～１２の整数であり、ｎは０～４の整数である］；および式（ＩＩ）：Ｘ_ｐＴＣＣＣＸ_ｒ［式中、Ｘは任意のヌクレオチドであり、ｐは０～１７の整数であり、ｒは０～１３の整数である］からなる群から選択される構造を有しないリンカーを含むＲＮＡコンストラクトからの関心のある遺伝子の発現と比較して増強される。例えば、第１のＲＮＡ配列、第２のＲＮＡ配列、および本明細書に記載されるリンカーＲＮＡ配列を含む組み換えＲＮＡコンストラクトからの関心のある遺伝子の発現は、ＡＣＡＡＣＡＡ（配列番号２３）を含む配列を含まないリンカーを含むＲＮＡコンストラクトからの関心のある遺伝子の発現と比較して増強される。例えば、第１のＲＮＡ配列、第２のＲＮＡ配列、および本明細書に記載されるリンカーＲＮＡ配列を含む組み換えＲＮＡコンストラクトからの関心のある遺伝子の発現は、ＡＴＣＣＣＴＡＣＧＴＡＣＣＡＡＣＡＡ（配列番号６７）を含む配列を含まないリンカーを含むＲＮＡコンストラクトからの関心のある遺伝子の発現と比較して増強される。例えば、第１のＲＮＡ配列、第２のＲＮＡ配列、および本明細書に記載されるリンカーＲＮＡ配列を含む組み換えＲＮＡコンストラクトからの関心のある遺伝子の発現は、ＡＣＧＴＡＣＣＡＡＣＡＡ（配列番号６８）を含む配列を含まないリンカーを含むＲＮＡコンストラクトからの関心のある遺伝子の発現と比較して増強される。例えば、第１のＲＮＡ配列、第２のＲＮＡ配列、および本明細書に記載されるリンカーＲＮＡ配列を含む組み換えＲＮＡコンストラクトからの関心のある遺伝子の発現は、ＴＣＣＣ（配列番号６９）を含む配列を含まないリンカーを含むＲＮＡコンストラクトからの関心のある遺伝子の発現と比較して増強される。例えば、第１のＲＮＡ配列、第２のＲＮＡ配列、および本明細書に記載されるリンカーＲＮＡ配列を含む組み換えＲＮＡコンストラクトからの関心のある遺伝子の発現は、ＡＣＡＡＣＡＡＴＣＣＣ（配列番号７０）を含む配列を含まないリンカーを含むＲＮＡコンストラクトからの関心のある遺伝子の発現と比較して増強される。例えば、第１のＲＮＡ配列、第２のＲＮＡ配列、および本明細書に記載されるリンカーＲＮＡ配列を含む組み換えＲＮＡコンストラクトからの関心のある遺伝子の発現は、二次構造を形成するリンカーを含むＲＮＡコンストラクトからの関心のある遺伝子の発現と比較して増強される。

【0050】

一部の場合には、本明細書に記載されるリンカーを含む組み換えＲＮＡコンストラクトからの関心のある遺伝子の発現は、本明細書に記載される別のリンカーを有する相当する組み換えＲＮＡコンストラクトからの関心のある遺伝子の発現と比較して増強され得る。例えば、第１のＲＮＡ配列、第２のＲＮＡ配列、および本明細書に記載されるＡ２－リンカーＲＮＡ配列を含む組み換えＲＮＡコンストラクトからの関心のある遺伝子の発現は、本明細書に記載される別のリンカー（例えば、Ｂ－リンカー、Ｃ－リンカー、Ｄ－リンカー、またはＥ－リンカー）を含むＲＮＡコンストラクトからの関心のある遺伝子の発現と比較して増強され得る。例えば、第１のＲＮＡ配列、第２のＲＮＡ配列、および本明細書に記載されるＢ－リンカーＲＮＡ配列を含む組み換えＲＮＡコンストラクトからの関心のある遺伝子の発現は、本明細書に記載される別のリンカー（例えば、Ａ２－リンカー、Ｃ－リンカー、Ｄ－リンカー、またはＥ－リンカー）を含むＲＮＡコンストラクトからの関心のある遺伝子の発現と比較して増強され得る。例えば、第１のＲＮＡ配列、第２のＲＮＡ配列、および本明細書に記載されるＣ－リンカーＲＮＡ配列を含む組み換えＲＮＡコンストラクトからの関心のある遺伝子の発現は、本明細書に記載される別のリンカー（例えば、Ａ２－リンカー、Ｂ－リンカー、Ｄ－リンカー、またはＥ－リンカー）を含むＲＮＡコンストラクトからの関心のある遺伝子の発現と比較して増強され得る。例えば、第１のＲＮＡ配列、第２のＲＮＡ配列、および本明細書に記載されるＤ－リンカーＲＮＡ配列を含む組み換えＲＮＡコンストラクトからの関心のある遺伝子の発現は、本明細書に記載される別のリンカー（例えば、Ａ２－リンカー、Ｂ－リンカー、Ｃ－リンカー、またはＥ－リンカー）を含むＲＮＡコンストラクトからの関心のある遺伝子の発現と比較して増強され得る。例えば、第１のＲＮＡ配列、第２のＲＮＡ配列、および本明細書に記載されるＥ－リンカーＲＮＡ配列を含む組み換えＲＮＡコンストラクトからの関心のある遺伝子の発現は、本明細書に記載される別のリンカー（例えば、Ａ２－リンカー、Ｂ－リンカー、Ｃ－リンカー、またはＤ－リンカー）を含むＲＮＡコンストラクトからの関心のある遺伝子の発現と比較して増強され得る。一部の実施形態において、Ａ２－リンカーは、ＡＣＡＡＣＡＡ（配列番号２３）を含む配列を含み得る。一部の実施形態において、Ｂリンカーは、ＡＴＣＣＣＴＡＣＧＴＡＣＣＡＡＣＡＡ（配列番号６７）を含む配列を含み得る。一部の実施形態において、Ｃ－リンカーは、ＡＣＧＴＡＣＣＡＡＣＡＡ（配列番号６８）を含む配列を含み得る。一部の実施形態において、Ｄ－リンカーは、ＴＣＣＣ（配列番号６９）を含む配列を含み得る。一部の実施形態において、Ｅ－リンカーは、ＡＣＡＡＣＡＡＴＣＣＣ（配列番号７０）を含む配列を含み得る。

【0051】

一部の実施形態において、関心のある遺伝子の発現のまたは組み換えＲＮＡコンストラクトの切断の相対的増加または増強は、少なくとも約１．３倍、約１．４倍、約１．５倍、約１．６倍、約１．７倍、約１．８倍、約１．９倍、約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約６倍、約７倍、約８倍、約９倍、１０倍、約１５倍、約１７倍、約１８倍、約１９倍、約２０倍、約２１倍、約２２倍、または少なくとも約２５倍である。一部の実施形態において、関心のある遺伝子の発現のまたは組み換えＲＮＡコンストラクトの切断の相対的増加は、約１．３倍～約３倍、約１．５倍～約４倍、約２倍～約５倍、約２倍～約１０倍、約２倍～約１５倍、約２倍～約１７倍、約２倍～約１８倍、約２倍～約１９倍、約２倍～約２０倍、約２倍～約２１倍、約２倍～約２２倍、約２倍～約２５倍、約２倍～約３０倍、約５倍～約１０倍、約５倍～約１５倍、約５倍～約１７倍、約５倍～約１８倍、約５倍～約１９倍、約５倍～約２０倍、約５倍～約２１倍、約５倍～約２２倍、約５倍～約２５倍、約５倍～約３０倍、約１０倍～約１５倍、約１０倍～約１７倍、約１０倍～約１８倍、約１０倍～約１９倍、約１０倍～約２０倍、約１０倍～約２１倍、約１０倍～約２２倍、約１０倍～約２５倍、約１０倍～約３０倍、約１５倍～約１７倍、約１５倍～約１８倍、約１５倍～約１９倍、約１５倍～約２０倍、約１５倍～約２１倍、約１５倍～約２２倍、約１５倍～約２５倍、約１５倍～約３０倍、約１７倍～約１８倍、約１７倍～約１９倍、約１７倍～約２０倍、約１７倍～約２１倍、約１７倍～約２２倍、約１７倍～約２５倍、約１７倍～約３０倍、約１８倍～約１９倍、約１８倍～約２０倍、約１８倍～約２１倍、約１８倍～約２２倍、約１８倍～約２５倍、約１８倍～約３０倍、約１９倍～約２０倍、約１９倍～約２１倍、約１９倍～約２２倍、約１９倍～約２５倍、約１９倍～約３０倍、約２０倍～約２１倍、約２０倍～約２２倍、約２０倍～約２５倍、約２０倍～約３０倍、約２１倍～約２２倍、約２１倍～約２５倍、約２１倍～約３０倍、約２２倍～約２５倍、約２２倍～約３０倍、または約２５倍～約３０倍である。一部の実施形態において、関心のある遺伝子の発現のまたは組み換えＲＮＡコンストラクトの切断の相対的増加は、約１．３倍、約１．４倍、約１．５倍、約１．６倍、約１．７倍、約１．８倍、約１．９倍、約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約６倍、約７倍、約８倍、約９倍、約１０倍、約１５倍、約１７倍、約１８倍、約１９倍、約２０倍、約２１倍、約２２倍、約２５倍、または約３０倍である。一部の実施形態において、関心のある遺伝子の発現のまたは組み換えＲＮＡコンストラクトの切断の相対的増加は、多くとも約２倍、約３倍、約５倍、約１０倍、約１５倍、約１７倍、約１８倍、約１９倍、約２０倍、約２１倍、約２２倍、約２５倍、または多くとも約３０倍である。

【0052】

一部の実施形態において、本明細書において提供される組み換えＲＮＡコンストラクトは、ネイキッドＲＮＡであり得る。一部の実施形態において、本明細書において提供される組み換えＲＮＡコンストラクトは、特に翻訳を向上させるために、５’キャップ、コザック配列、および／または内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、および／またはポリ（Ａ）テールをさらに含み得る。一部の場合には、組み換えＲＮＡコンストラクトは、当業者に公知の翻訳を促進する１種または複数の領域をさらに含み得る。５’キャップの非限定的な例は、アンチリバースＣＡＰアナログ、クリーンキャップ（Ｃｌｅａｎ Ｃａｐ）、Ｃａｐ０、Ｃａｐ１、Ｃａｐ２、またはロックド核酸キャップ（ＬＮＡキャップ）を含み得る。一部の場合には、５’キャップは、ｍ_２ ^{７，３’－Ｏ}Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ、ｍ７Ｇ、ｍ７Ｇ（５’）Ｇ、ｍ７ＧｐｐｐＧ、またはｍ７ＧｐｐｐＧｍを含み得る。一部の場合には、本明細書において提供される組み換えＲＮＡコンストラクトは、関心のある遺伝子をコードするＲＮＡ配列の上流または５’にＩＲＥＳを含み得る。一部の場合には、本明細書において提供される組み換えＲＮＡコンストラクトは、関心のある遺伝子をコードするＲＮＡ配列のすぐ上流または５’にＩＲＥＳを含み得る。一部の場合には、本明細書において提供される組み換えＲＮＡコンストラクトは、標的ＲＮＡの発現をモジュレートする少なくとも１種の遺伝子エレメントをコードするＲＮＡ配列の下流または３’にＩＲＥＳを含み得、標的ＲＮＡの発現をモジュレートする少なくとも１種の遺伝子エレメントをコードするＲＮＡ配列は、関心のある遺伝子をコードするＲＮＡ配列の上流に存在する。

【0053】

本明細書において提供される組み換えＲＮＡコンストラクトは、ポリ（Ａ）テールをさらに含み得る。一部の場合には、ポリ（Ａ）テールは、１～２２０塩基対のポリ（Ａ）を含む。例えば、ポリ（Ａ）テールは、１、３、５、８、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２０５、２１０、２１５、または２２０塩基対のポリ（Ａ）を含む。一部の実施形態において、ポリ（Ａ）テールは、１～２０、１～４０、１～６０、１～８０、１～１００、１～１２０、１～１４０、１～１６０、１～１８０、１～２００、１～２２０、２０～４０、２０～６０、２０～８０、２０～１００、２０～１２０、２０～１４０、２０～１６０、２０～１８０、２０～２００、２０～２２０、４０～６０、４０～８０、４０～１００、４０～１２０、４０～１４０、４０～１６０、４０～１８０、４０～２００、４０～２２０、６０～８０、６０～１００、６０～１２０、６０～１４０、６０～１６０、６０～１８０、６０～２００、６０～２２０、８０～１００、８０～１２０、８０～１４０、８０～１６０、８０～１８０、８０～２００、８０～２２０、１００～１２０、１００～１４０、１００～１６０、１００～１８０、１００～２００、１００～２２０、１２０～１４０、１２０～１６０、１２０～１８０、１２０～２００、１２０～２２０、１４０～１６０、１４０～１８０、１４０～２００、１４０～２２０、１６０～１８０、１６０～２００、１６０～２２０、１８０～２００、１８０～２２０、または２００～２２０塩基対のポリ（Ａ）を含む。一部の実施形態において、ポリ（Ａ）テールは、１、２０、４０、６０、８０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、または２２０塩基対のポリ（Ａ）を含む。一部の実施形態において、ポリ（Ａ）テールは、少なくとも１、２０、４０、６０、８０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、または少なくとも２００塩基対のポリ（Ａ）を含む。一部の実施形態において、ポリ（Ａ）テールは、多くとも２０、４０、６０、８０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、または多くとも２２０塩基対のポリ（Ａ）を含む。一部の実施形態において、ポリ（Ａ）テールは、１２０塩基対のポリ（Ａ）を含む。

【0054】

本明細書において提供される組み換えＲＮＡコンストラクトは、コザック配列をさらに含み得る。コザック配列とは、タンパク質翻訳開始部位として機能する核酸配列モチーフを指し得る。コザック配列は、文献において、例えば本明細書における参照によりその全体として本明細書に組み入れられる、Ｋｏｚａｋ，Ｍ．、Ｇｅｎｅ ２９９（１－２）：１～３４によって詳細に記載される。一部の実施形態において、本明細書に記載されるコザック配列は、ＧＣＣＡＣＣ（配列番号１９）を含む配列を含み得る。一部の実施形態において、本明細書において提供される組み換えＲＮＡコンストラクトは、核局在化シグナル（ＮＬＳ）をさらに含み得る。

【0055】

１つの態様において、本明細書に記載される組み換えＲＮＡコンストラクトは、ヌクレオチドバリアントを含まなくてもよい。一部の場合には、本明細書に記載される組み換えＲＮＡコンストラクトは、１つまたは複数のウリジンを含み得る。一部の場合には、本明細書に記載される組み換えＲＮＡコンストラクトは、修飾されたウリジンを含まなくてもよい。一部の場合には、本明細書に記載される組み換えＲＮＡコンストラクトは、１つまたは複数のＮ１－メチルシュードウリジンを含まなくてもよい。一部の実施形態において、組み換えＲＮＡコンストラクトに含まれる１つまたは複数のウリジンの９９％～１％、９８％～２％、９７％～３％、９６％～４％、９５％～２％、９４％～６％、９３％～７％、９２％～８％、９１％～９％、９０％～１０％、９７％～３％は非修飾である。一部の実施形態において、組み換えＲＮＡコンストラクトに含まれる１つまたは複数のウリジンの少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、または少なくとも９９．９％は非修飾である。一部の実施形態において、組み換えＲＮＡコンストラクトに含まれる１つまたは複数のウリジンの多くとも１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、または少なくとも９９．９％は修飾されている。１つの実施形態において、本明細書に記載される組み換えＲＮＡコンストラクトは、非修飾のヌクレオチドだけを含む。例えば、本明細書に記載される組み換えＲＮＡコンストラクトは、天然のヌクレオチドのみを含む。例えば、本明細書に記載される組み換えＲＮＡコンストラクトは、標準ヌクレオチドのみを含む。好ましい実施形態において、本明細書に記載される組み換えＲＮＡコンストラクトは、１つまたは複数のウリジンを含み、１つまたは複数のウリジンのすべては非修飾である。

【0056】

別の態様において、本明細書に記載される組み換えＲＮＡコンストラクトは、非標準的なヌクレオチド、非天然のヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ、および／または修飾されたヌクレオチドを含めた、１つまたは複数のヌクレオチドバリアントを含み得る。修飾されたヌクレオチドの例は、ジアミノプリン、５－フルオロウラシル、５－ブロモウラシル、５－クロロウラシル、５－ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン（ｘａｎｔｉｎｅ）、４－アセチルシトシン、５－（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５－カルボキシメチルアミノメチル－２－チオウリジン、５－カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、ベータ－Ｄ－ガラクトシルケウオシン、イノシン、Ｎ６－イソペンテニルアデニン、１－メチルグアニン、１－メチルイノシン、２，２－ジメチルグアニン、２－メチルアデニン、２－メチルグアニン、３－メチルシトシン、５－メチルシトシン、Ｎ６－メチルアデノシン、７－メチルグアニン、５－メチルアミノメチルウラシル、５－メトキシアミノメチル－２－チオウラシル、ベータ－Ｄ－マンノシルケウオシン、５’－メトキシカルボキシメチルウラシル、５－メトキシウラシル、２－メチルチオ－Ｎ６－イソペンテニルアデニン、ウラシル－５－オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン（ｗｙｂｕｔｏｘｏｓｉｎｅ）、シュードウラシル、ケウオシン、２－チオシトシン、５－メチル－２－チオウラシル、２－チオウラシル、４－チオウラシル、５－メチルウラシル、ウラシル－５－オキシ酢酸メチルエステル、５－メチル－２－チオウラシル、３－（３－アミノ－３－Ｎ－２－カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、２，６－ジアミノプリン、Ｎ１－メチルシュードウリジン等を含むが、それらに限定されるわけではない。一部の場合には、ヌクレオチドは、トリホスフェート部分の修飾を含めた、それらのホスフェート部分における修飾を含み得る。そのような修飾の非限定的な例は、より大きな長さ、およびチオール部分を用いた修飾のホスフェート鎖を含む。一部の実施形態において、ホスフェート鎖は、４、５、６、７、８、９、１０個、またはそれより多くのホスフェート部分を含み得る。一部の実施形態において、チオール部分は、アルファ－チオトリホスフェートおよびベータ－チオトリホスフェートを含み得るが、それらに限定されるわけではない。一部の実施形態において、本明細書に記載される組み換えＲＮＡコンストラクトは、５－メチルシトシンおよび／またはＮ６－メチルアデノシンを含まない。

【0057】

一部の場合には、本明細書に記載される組み換えＲＮＡコンストラクトは、塩基部分、糖部分、またはホスフェート骨格において修飾されていてもよい。例えば、修飾は、相補的ヌクレオチドと水素結合を形成するために典型的に使用可能である１つもしくは複数の原子における、および／または相補的ヌクレオチドと水素結合を典型的に形成し得ない１つもしくは複数の原子におけるものであり得る。一部の実施形態において、骨格修飾は、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホロアニラデート（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｎｉｌａｄａｔｅ）、ホスホロアミダート、およびホスホロジアミダート連結を含むが、それらに限定されるわけではない。ホスホロチオエート連結は、ホスフェート骨格における非架橋酸素の代わりに硫黄原子を用い、オリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ分解を遅延させる。ホスホロジアミダート連結（Ｎ３’→Ｐ５’）は、ヌクレアーゼ認識および分解を阻止するのを可能にする。一部の実施形態において、骨格修飾は、骨格構造におけるリンの代わりにペプチド結合、またはカルバメート、アミド、ならびに線状および環状炭化水素基を含めた結合基を有することを含む。例えば、Ｎ－（２－アミノエチル）－グリシン単位は、ペプチド核酸におけるペプチド結合によって連結され得る。修飾された骨格を有するオリゴヌクレオチドは、Ｍｉｃｋｌｅｆｉｅｌｄ、Ｂａｃｋｂｏｎｅ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ：ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｃｕｒｒ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、８（１０）：１１５７～７９、２００１、およびＬｙｅｒら、Ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ－ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．、１（３）：３４４～３５８、１９９９に概説される。

【0058】

本明細書において提供される組み換えＲＮＡコンストラクトは、修飾されたおよび非修飾のヌクレオチドの組み合わせを含み得る。一部の場合には、アデノシン－、グアノシン－、およびシチジン－含有ヌクレオチドは、非修飾であるか、または部分的に修飾されている。一部の場合には、修飾されたＲＮＡコンストラクトに関して、ウリジンヌクレオチドの１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％は修飾されていてもよい。一部の実施形態において、ウリジンヌクレオチドの５％～２５％は、組み換えＲＮＡコンストラクトにおいて修飾されている。修飾されたウリジンヌクレオチドの非限定的な例は、シュードウリジン、Ｎ^１－メチルシュードウリジン、またはＮ１－メチルシュード－ＵＴＰを含み得、当技術分野において公知の任意の修飾されたウリジンヌクレオチドが利用され得る。一部の実施形態において、組み換えＲＮＡコンストラクトは、修飾されたおよび非修飾のヌクレオチドの組み合わせを含有し得、ウリジンヌクレオチドの１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％は、シュードウリジン、Ｎ^１－メチルシュードウリジン、Ｎ１－メチルシュード－ＵＴＰ、または当技術分野において公知の任意の他の修飾されたウリジンヌクレオチドを含み得る。一部の実施形態において、組み換えＲＮＡコンストラクトは、修飾されたおよび非修飾のヌクレオチドの組み合わせを含有し得、ウリジンヌクレオチドの１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％は、Ｎ^１－メチルシュードウリジンを含み得る。

【0059】

本明細書において提供される組み換えＲＮＡコンストラクトは、コドン最適化されていてもよい。一般的に、コドン最適化とは、関心のある宿主細胞における発現のために、その宿主細胞の遺伝子においてより高頻度にまたは最も高頻度に使用されるコドンで、天然配列の少なくとも１種のコドン（例えば、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、５０種より多くの、またはそれより多くのコドン）を置き換えることによって核酸配列を改変し、一方で天然アミノ酸配列を維持する過程を指す。コドン使用法の表は、例えば「Ｃｏｄｏｎ Ｕｓａｇｅ Ｄａｔａｂａｓｅ」で容易に入手可能であり、これらの表は、いくつかのやり方で適応され得る。特定の宿主細胞における発現のために、好ましいＧｅｎｅ Ｆｏｒｇｅ（登録商標）（Ａｐｔａｇｅｎ、ＰＡ）およびＧｅｎｅＯｐｔｉｍｉｚｅｒ（登録商標）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒ、ＭＡ）等、特定の配列をコドン最適化するためのコンピューターアルゴリズムも入手可能である。一部の実施形態において、組み換えＲＮＡコンストラクトは、コドン最適化されていなくてもよい。

【0060】

一部の場合には、組み換えＲＮＡコンストラクトは、配列番号１～９および７６～８４からなる群から選択される配列を含む核酸配列を含み得る。

【0061】

ＲＮＡ干渉および低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）またはＲＮＡサイレンシングとは、標的ｍＲＮＡ分子を中和することによって、ＲＮＡ分子が遺伝子発現または翻訳を阻害する過程である。ＲＮＡｉ過程は、Ｍｅｌｌｏ＆Ｃｏｎｔｅ（２００４）Ｎａｔｕｒｅ ４３１、３３８～３４２、Ｍｅｉｓｔｅｒ＆Ｔｕｓｃｈｌ（２００４）Ｎａｔｕｒｅ ４３１、３４３～３４９、Ｈａｎｎｏｎ＆Ｒｏｓｓｉ（２００４）Ｎａｔｕｒｅ ４３１、３７１～３７８、およびＦｉｒｅ（２００７）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．４６、６９６６～６９８４に記載される。簡潔には、天然の過程において、反応は、ｄｓＲＮＡ特異的エンドヌクレアーゼＤｉｃｅｒによる、ヘアピン構造を有する低分子ｄｓＲＮＡ断片またはｓｉＲＮＡ（すなわち、ｓｈＲＮＡ）への、長い二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の切断とともに開始する。次いで、これらの低分子ｄｓＲＮＡ断片またはｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ誘導性サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に統合され、ＲＩＳＣを標的ｍＲＮＡ配列にガイドする。干渉の間、ｓｉＲＮＡ二重鎖はほどけ、アンチセンス鎖は、ＲＩＳＣと複合したままとどまって、ＲＩＳＣを標的ｍＲＮＡ配列へ導いて、分解および後続のタンパク質翻訳の抑制を誘導する。本発明の組み換えＲＮＡコンストラクトにおけるｓｉＲＮＡは、ヘアピンループ構造を含むことから、市販の合成ｓｉＲＮＡとは異なり、本発明におけるｓｉＲＮＡは、細胞の細胞質において内因性のＤｉｃｅｒおよびＲＩＳＣ経路を利用して、細胞取り込みの後に組み換えＲＮＡコンストラクト（例えば、ｍＲＮＡおよび２種以上のｓｉＲＮＡを含む組み換えＲＮＡコンストラクト）から切断され得、上で詳述される天然の過程をたどり得る。加えて、組み換えＲＮＡコンストラクトの残部（すなわち、ｍＲＮＡ）は、ＤｉｃｅｒによるｓｉＲＮＡの切断後に無傷の状態のままであることから、本発明の組み換えＲＮＡコンストラクトにおける関心のある遺伝子からの所望のタンパク質発現が実現される。

【0062】

標的ＲＮＡに結合し得るｓｉＲＮＡを含む少なくとも１種の核酸配列を含む組み換えＲＮＡコンストラクトを含む組成物が本明細書において提供される。一部の場合には、標的ＲＮＡはノンコーディングＲＮＡである。一部の場合には、標的ＲＮＡはｍＲＮＡである。一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、５’非翻訳領域において標的ｍＲＮＡに結合し得る。一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、３’非翻訳領域において標的ｍＲＮＡに結合し得る。一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、エクソンにおいて標的ｍＲＮＡに結合し得る。一部の実施形態において、組み換えＲＮＡコンストラクトは、センスｓｉＲＮＡ鎖を含む核酸配列を含み得る。一部の実施形態において、組み換えＲＮＡコンストラクトは、アンチセンスｓｉＲＮＡ鎖を含む核酸配列を含み得る。一部の実施形態において、組み換えＲＮＡコンストラクトは、センスｓｉＲＮＡ鎖を含む核酸配列およびアンチセンスｓｉＲＮＡ鎖を含む核酸配列を含み得る。本発明に含まれるｓｉＲＮＡの詳細は、参照により本明細書に組み入れられる、Ｃｈｅｎｇら（２０１８）Ｊ．Ｍａｔｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｂ．、６、４６３８～４６４４に記載される。

【0063】

例えば、一部の場合には、組み換えＲＮＡコンストラクトは、少なくとも１つの種またはコピーのｓｉＲＮＡ、すなわちｓｉＲＮＡのセンス鎖を含む核酸配列、およびｓｉＲＮＡのアンチ鎖を含む核酸配列を含み得る。本明細書に記載される１種または１つのコピーのｓｉＲＮＡとは、１種または１つのコピーのセンス鎖ｓｉＲＮＡおよび１種または１つのコピーのアンチセンス鎖ｓｉＲＮＡを指し得る。一部の場合には、組み換えＲＮＡコンストラクトは、１つより多くの種または１つより多くのコピーのｓｉＲＮＡ、例えば、ｓｉＲＮＡのセンス鎖およびｓｉＲＮＡのアンチ鎖を含む２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれより多くの種またはコピーのｓｉＲＮＡを含み得る。一部の実施形態において、組み換えＲＮＡコンストラクトは、１～２０種またはコピーのｓｉＲＮＡを含み得る。一部の実施形態において、組み換えＲＮＡコンストラクトは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９種、または少なくとも１０種またはコピーのｓｉＲＮＡを含み得る。一部の実施形態において、組み換えＲＮＡコンストラクトは、多くとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または多くとも２０の種またはコピーのｓｉＲＮＡを含み得る。一部の実施形態において、組み換えポリ核酸またはＲＮＡコンストラクトは、１～２、１～３、１～４、１～５、１～６、１～７、１～８、１～９、１～１０、２～３、２～４、２～５、２～６、２～７、２～８、２～９、２～１０、３～４、３～５、３～６、３～７、３～８、３～９、３～１０、４～５、４～６、４～７、４～８、４～９、４～１０、５～６、５～７、５～８、５～９、５～１０、６～７、６～８、６～９、６～１０、７～８、７～９、７～１０、８～９、８～１０、または９～１０の種またはコピーのｓｉＲＮＡを有する。一部の実施形態において、組み換えポリ核酸またはＲＮＡコンストラクトは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０の種またはコピーのｓｉＲＮＡを有する。一部の実施形態において、組み換えポリ核酸またはＲＮＡコンストラクトは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、または９の種またはコピーのｓｉＲＮＡを有する。一部の実施形態において、組み換えポリ核酸またはＲＮＡコンストラクトは、多くとも２、３、４、５、６、７、８、９、または１０の種またはコピーのｓｉＲＮＡを有する。一部の実施形態において、組み換えＲＮＡコンストラクトは、２種のｓｉＲＮＡ～１０種のｓｉＲＮＡ、３種のｓｉＲＮＡ～１０種のｓｉＲＮＡ、４種のｓｉＲＮＡ～１０種のｓｉＲＮＡ、５種のｓｉＲＮＡ～１０種のｓｉＲＮＡ、６種のｓｉＲＮＡ～１０種のｓｉＲＮＡ、７種のｓｉＲＮＡ～１０種のｓｉＲＮＡ、９種のｓｉＲＮＡ～１０種のｓｉＲＮＡ、好ましくは２種のｓｉＲＮＡ～６種のｓｉＲＮＡ、３種のｓｉＲＮＡ～６種のｓｉＲＮＡ、または４種のｓｉＲＮＡ～６種のｓｉＲＮＡを含み得る。

【0064】

１～２０種またはそれより多くのｓｉＲＮＡ種またはコピーを含む組み換えＲＮＡコンストラクトの組成物であって、１～２０種またはそれより多くのｓｉＲＮＡ種またはコピーのそれぞれは、標的ＲＮＡに結合し得る、組成物が本明細書において提供される。一部の実施形態において、標的ＲＮＡは、ｍＲＮＡまたはノンコーディングＲＮＡである。一部の場合には、ｓｉＲＮＡ種またはコピーのそれぞれは、同じ標的ＲＮＡに結合する。１つの場合には、ｓｉＲＮＡ種またはコピーのそれぞれは、同じ配列を含み得、同じ標的ＲＮＡの同じ領域または配列に結合し得る。例えば、組み換えＲＮＡコンストラクトは、１、２、３、４、５種、またはそれより多くのｓｉＲＮＡ種またはコピーを含み得、１、２、３、４、５種、またはそれより多くのｓｉＲＮＡ種またはコピーのそれぞれは、標的ＲＮＡの同じ領域を標的にする同じ配列を含む、すなわち、組み換えＲＮＡコンストラクトは、１、２、３、４、５種、またはそれより多くの冗長な種またはコピーのｓｉＲＮＡを含み得る。別の場合には、ｓｉＲＮＡ種またはコピーのそれぞれは、異なる配列を含み得、同じ標的ＲＮＡの異なる領域または配列に結合し得る。例えば、組み換えＲＮＡコンストラクトは、１、２、３、４、５種、またはそれより多くのｓｉＲＮＡ種またはコピーを含み得、１、２、３、４、５種、またはそれより多くのｓｉＲＮＡ種またはコピーのそれぞれは、同じ標的ＲＮＡの異なる領域を標的にする異なる配列を含み得る。この例では、１、２、３、４、５種、またはそれより多くのｓｉＲＮＡ種またはコピーのうちの１種のｓｉＲＮＡは、エクソン１を標的にし得、１、２、３、４、５種、またはそれより多くのｓｉＲＮＡ種またはコピーのうちの別のｓｉＲＮＡは、同じｍＲＮＡのエクソン２を標的にし得る、等。一部の場合には、組み換えＲＮＡコンストラクトは、同じ標的ＲＮＡの同じおよび異なる領域に結合し得る１、２、３、４、５種、またはそれより多くのｓｉＲＮＡ種またはコピーを含み得る。例えば、組み換えＲＮＡコンストラクトは、１、２、３、４、５種、またはそれより多くのｓｉＲＮＡ種またはコピーを含み得、１、２、３、４、５種、またはそれより多くのｓｉＲＮＡ種またはコピーのうちの２種は、同じ配列を含み得、標的ＲＮＡの同じ領域に結合し得、１、２、３、４、５種、またはそれより多くのｓｉＲＮＡ種またはコピーのうちの３種以上は、異なる配列を含み得、同じ標的ＲＮＡの異なる領域に結合し得る。一部の場合には、ｓｉＲＮＡ種またはコピーのそれぞれは、異なる標的ＲＮＡに結合する。一部の場合には、組み換えＲＮＡコンストラクトは、同じおよび異なる標的ＲＮＡに結合し得る１、２、３、４、５種、またはそれより多くのｓｉＲＮＡ種またはコピーを含み得る。例えば、組み換えＲＮＡコンストラクトは、１、２、３、４、５種、またはそれより多くのｓｉＲＮＡ種またはコピーを含み得、１、２、３、４、５種、またはそれより多くのｓｉＲＮＡ種またはコピーのうちの２種は、同じ標的ＲＮＡの同じまたは異なる領域に結合し得る配列を含み得、１、２、３、４、５種、またはそれより多くのｓｉＲＮＡ種またはコピーのうちの３種以上は、異なる標的ＲＮＡに結合し得る配列を含み得る。一部の実施形態において、標的ＲＮＡは、ｍＲＮＡおよび／またはノンコーディングＲＮＡであり得る。一部の場合には、ｓｉＲＮＡ種またはコピーのそれぞれは、異なる標的ＲＮＡに結合し得る同じ配列を含み得る。例えば、ｓｉＲＮＡ種またはコピーのそれぞれは、２種以上の標的ＲＮＡに共通のまたはそれによって共有される配列に結合し得る。例は、プロテインキナーゼＢ－１（Ａｋｔ１）、Ａｋｔ２、およびＡｋｔ３（ｐａｎ－Ａｋｔ３）に共通のまたはそれによって共有される配列に結合し得るｓｉＲＮＡ配列を含むが、それらに限定されるわけではない。

【0065】

１～２０種またはそれより多くのｓｉＲＮＡ種を含む組み換えＲＮＡコンストラクトの組成物であって、１～２０種またはそれより多くのｓｉＲＮＡ種のそれぞれは、本明細書に記載されるリンカーによって接続される、組成物が本明細書において提供される。一部の場合には、リンカーは非切断性リンカーであり得る。一部の場合には、リンカーは、自己切断性リンカー等の切断性リンカーであり得る。一部の場合には、リンカーは、タンパク質、例えば細胞内または内因性タンパク質によって切断され得る。一部の場合には、リンカーは、式（Ｉ）：Ｘ_ｍＣＡＡＣＡＡＸ_ｎ［式中、Ｘは任意のヌクレオチドであり、ｍは１～１２の整数であり、ｎは０～４の整数である］；および式（ＩＩ）：Ｘ_ｐＴＣＣＣＸ_ｒ［式中、Ｘは任意のヌクレオチドであり、ｐは０～１７の整数であり、ｒは０～１３の整数である］からなる群から選択される構造を有する。一部の場合には、リンカーは、ＡＣＡＡＣＡＡ（配列番号２３）、ＡＴＣＣＣＴＡＣＧＴＡＣＣＡＡＣＡＡ（配列番号６７）、ＡＣＧＴＡＣＣＡＡＣＡＡ（配列番号６８）、ＴＣＣＣ（配列番号６９）、またはＡＣＡＡＣＡＡＴＣＣＣ（配列番号７０）を含む配列を含み得る。一部の実施形態において、リンカーは、ＡＣＡＡＣＡＡ（配列番号２３）、ＡＴＡＧＴＧＡＧＴＣＧＴＡＴＴＡＴＣＣＣ（配列番号７２）、ＡＴＡＧＴＧＡＧＴＣＧＴＡＴＴＡＡＣＡＡＣＡＡＴＣＣＣ（配列番号７３）、ＡＴＡＧＴＧＡＧＴＣＧＴＡＴＴＡＡＣＡＡＣＡＡ（配列番号７４）、ＡＴＡＧＴＧＡＧＴＣＧＴＡＴＴＡＡＴＣＣＣＴＡＣＧＴＡＣＣＡＡＣＡＡ（配列番号７５）、またはＡＴＡＧＴＧＡＧＴＣＧＴＡＴＴＡＡＣＧＴＡＣＣＡＡＣＡＡ（配列番号２１）を含む配列を含み得る。一部の実施形態において、リンカーは、ＡＣＡＡＣＡＡ（配列番号２３）を含む配列を含む。一部の実施形態において、リンカーは、ＴＴＴＡＴＣＴＴＡＧＡＧＧＣＡＴＡＴＣＣＣＴＡＣＧＴＡＣＣＡＡＣＡＡ（配列番号２２）、またはＡＴＡＧＴＧＡＧＴＣＧＴＡＴＴＡＡＣＧＴＡＣＣＡＡＣＡＡ（配列番号２１）を含む配列を含まない。

【0066】

一部の場合には、リンカーの長さは、約４～約５０、約４～約４５、または約４～約４０、約４～約３５、または約４～約３０ヌクレオチドである。一部の実施形態において、リンカーの長さは、約４～約２７ヌクレオチドである。一部の実施形態において、リンカーの長さは、約４～約１８ヌクレオチドである。例えば、リンカーの長さは、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、約３０、約３１、約３２、約３３、約３４、約３５、約３６、約３７、約３８、約３９、約４０、約４１、約４２、約４３、約４４、約４５、約４６、約４７、約４８、約４９、または約５０ヌクレオチドである。一部の実施形態において、リンカーの長さは、多くとも約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、約３０、約３１、約３２、約３３、約３４、約３５、約３６、約３７、約３８、約３９、約４０、約４１、約４２、約４３、約４４、約４５、約４６、約４７、約４８、約４９、または多くとも約５０ヌクレオチドであり得る。一部の実施形態において、リンカーの長さは４ヌクレオチドである。一部の実施形態において、リンカーの長さは７ヌクレオチドである。一部の実施形態において、リンカーの長さは１１ヌクレオチドである。一部の実施形態において、リンカーの長さは１２ヌクレオチドである。一部の実施形態において、リンカーの長さは１８ヌクレオチドである。

【0067】

一部の場合には、リンカーは、式（Ｉ）Ｘ_ｍＣＡＡＣＡＡＸ_ｎの構造［式中、Ｘは任意のヌクレオチドであり；ｍは１～１２の整数であり、ｎは０～４の整数であり；ｍは１であり、ｎは０である］を有し得る。一部の場合には、リンカーは、ＣＡＡＣＡＡ（配列番号７１）、ＴＣＣＣ（配列番号６９）、またはＡＣＡＡＣＡＡ（配列番号２３）を含む配列を含み得る。一部の実施形態において、リンカーは、ＡＴＣＣＣＴＡＣＧＴＡＣＣＡＡＣＡＡ（配列番号６７）、ＡＣＧＴＡＣＣＡＡＣＡＡ（配列番号６８）、ＴＣＣＣ（配列番号６９）、ＡＣＡＡＣＡＡＴＣＣＣ（配列番号７０）、およびＡＣＡＡＣＡＡ（配列番号２３）からなる群から選択される配列を含み得る。一部の実施形態において、リンカーは、ＡＣＡＡＣＡＡ（配列番号２３）を含む配列を含み得る。一部の実施形態において、リンカーは、ＡＣＡＡＣＡＡ（配列番号２３）、ＡＴＡＧＴＧＡＧＴＣＧＴＡＴＴＡＴＣＣＣ（配列番号７２）、ＡＴＡＧＴＧＡＧＴＣＧＴＡＴＴＡＡＣＡＡＣＡＡＴＣＣＣ（配列番号７３）、ＡＴＡＧＴＧＡＧＴＣＧＴＡＴＴＡＡＣＡＡＣＡＡ（配列番号７４）、ＡＴＡＧＴＧＡＧＴＣＧＴＡＴＴＡＡＴＣＣＣＴＡＣＧＴＡＣＣＡＡＣＡＡ（配列番号７５）、またはＡＴＡＧＴＧＡＧＴＣＧＴＡＴＴＡＡＣＧＴＡＣＣＡＡＣＡＡ（配列番号２１）を含む配列を含み得る。一部の実施形態において、リンカーは、配列番号２３、６７～７５からなる群から選択される配列を含み得る。

【0068】

一部の場合には、リンカーはｔＲＮＡリンカーであり得る。ｔＲＮＡシステムは、生存生物にわたって進化的に保存され、内因性のＲＮａｓｅ ＰおよびＺを利用して、マルチシストロン性コンストラクトをプロセシングする（Ｄｏｎｇら、２０１６）。一部の実施形態において、ｔＲＮＡリンカーは、ＡＡＣＡＡＡＧＣＡＣＣＡＧＴＧＧＴＣＴＡＧＴＧＧＴＡＧＡＡＴＡＧＴＡＣＣＣＴＧＣＣＡＣＧＧＴＡＣＡＧＡＣＣＣＧＧＧＴＴＣＧＡＴＴＣＣＣＧＧＣＴＧＧＴＧＣＡ（配列番号３９）を含む核酸配列を含み得る。一部の実施形態において、ＴＴＴＡＴＣＴＴＡＧＡＧＧＣＡＴＡＴＣＣＣＴＡＣＧＴＡＣＣＡＡＣＡＡ（配列番号２２）を含む核酸配列を含むリンカーを使用して、１～２０種またはそれより多くのｓｉＲＮＡ種のそれぞれを接続し得る。

【0069】

一部の場合には、その標的ｍＲＮＡへのｓｉＲＮＡの特異的結合は、標的ｍＲＮＡの正常な機能への干渉をもたらし、標的ｍＲＮＡによってコードされるタンパク質の発現レベル、機能、および／または活性のモジュレーション、例えば下方調節につながり、特異的結合が望まれる条件下における、すなわちｉｎ ｖｉｖｏアッセイまたは治療的処置の場合には生理的条件下における、およびｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイの場合にはアッセイが実施される条件下における、非標的核酸配列へのｓｉＲＮＡの非特異的結合を回避する十分な程度の相補性がある。

【0070】

一部の場合には、本明細書において提供される組み換えＲＮＡコンストラクト由来のｓｉＲＮＡによる、標的ｍＲＮＡによってコードされるタンパク質の発現レベル、機能、および／または活性の下方調節は、本明細書に記載されるリンカーを含まない相当する組み換えＲＮＡコンストラクト由来のｓｉＲＮＡによる、標的ｍＲＮＡによってコードされるタンパク質の発現レベル、機能、および／または活性の下方調節と比較して増強され得る。例えば、第１のＲＮＡ配列、第２のＲＮＡ配列、および本明細書に記載されるリンカーＲＮＡ配列を含む組み換えＲＮＡコンストラクト由来のｓｉＲＮＡによる、標的ｍＲＮＡによってコードされるタンパク質の発現レベル、機能、および／または活性の下方調節は、本明細書に記載されるリンカーを含まないＲＮＡコンストラクト由来のｓｉＲＮＡによる、標的ｍＲＮＡによってコードされるタンパク質の発現レベル、機能、および／または活性の下方調節と比較して増強され得る。例えば、第１のＲＮＡ配列、第２のＲＮＡ配列、および本明細書に記載されるリンカーＲＮＡ配列を含む組み換えＲＮＡコンストラクト由来のｓｉＲＮＡによる、標的ｍＲＮＡによってコードされるタンパク質の発現レベル、機能、および／または活性の下方調節は、式（Ｉ）：Ｘ_ｍＣＡＡＣＡＡＸ_ｎ［式中、Ｘは任意のヌクレオチドであり、ｍは１～１２の整数であり、ｎは０～４の整数である］；および式（ＩＩ）：Ｘ_ｐＴＣＣＣＸ_ｒ［式中、Ｘは任意のヌクレオチドであり、ｐは０～１７の整数であり、ｒは０～１３の整数である］からなる群から選択される構造を有しないリンカーを含むＲＮＡコンストラクト由来のｓｉＲＮＡによる、標的ｍＲＮＡによってコードされるタンパク質の発現レベル、機能、および／または活性の下方調節と比較して増強され得る。例えば、第１のＲＮＡ配列、第２のＲＮＡ配列、および本明細書に記載されるリンカーＲＮＡ配列を含む組み換えＲＮＡコンストラクト由来のｓｉＲＮＡによる、標的ｍＲＮＡによってコードされるタンパク質の発現レベル、機能、および／または活性の下方調節は、ＡＣＡＡＣＡＡ（配列番号２３）を含む配列を含まないリンカーを含むＲＮＡコンストラクト由来のｓｉＲＮＡによる、標的ｍＲＮＡによってコードされるタンパク質の発現レベル、機能、および／または活性の下方調節と比較して増強され得る。例えば、第１のＲＮＡ配列、第２のＲＮＡ配列、および本明細書に記載されるリンカーＲＮＡ配列を含む組み換えＲＮＡコンストラクト由来のｓｉＲＮＡによる、標的ｍＲＮＡによってコードされるタンパク質の発現レベル、機能、および／または活性の下方調節は、ＡＴＣＣＣＴＡＣＧＴＡＣＣＡＡＣＡＡ（配列番号６７）を含む配列を含まないリンカーを含むＲＮＡコンストラクト由来のｓｉＲＮＡによる、標的ｍＲＮＡによってコードされるタンパク質の発現レベル、機能、および／または活性の下方調節と比較して増強され得る。例えば、第１のＲＮＡ配列、第２のＲＮＡ配列、および本明細書に記載されるリンカーＲＮＡ配列を含む組み換えＲＮＡコンストラクト由来のｓｉＲＮＡによる、標的ｍＲＮＡによってコードされるタンパク質の発現レベル、機能、および／または活性の下方調節は、ＡＣＧＴＡＣＣＡＡＣＡＡ（配列番号６８）を含む配列を含まないリンカーを含むＲＮＡコンストラクト由来のｓｉＲＮＡによる、標的ｍＲＮＡによってコードされるタンパク質の発現レベル、機能、および／または活性の下方調節と比較して増強され得る。例えば、第１のＲＮＡ配列、第２のＲＮＡ配列、および本明細書に記載されるリンカーＲＮＡ配列を含む組み換えＲＮＡコンストラクト由来のｓｉＲＮＡによる、標的ｍＲＮＡによってコードされるタンパク質の発現レベル、機能、および／または活性の下方調節は、ＴＣＣＣ（配列番号６９）を含む配列を含まないリンカーを含むＲＮＡコンストラクト由来のｓｉＲＮＡによる、標的ｍＲＮＡによってコードされるタンパク質の発現レベル、機能、および／または活性の下方調節と比較して増強され得る。例えば、第１のＲＮＡ配列、第２のＲＮＡ配列、および本明細書に記載されるリンカーＲＮＡ配列を含む組み換えＲＮＡコンストラクト由来のｓｉＲＮＡによる、標的ｍＲＮＡによってコードされるタンパク質の発現レベル、機能、および／または活性の下方調節は、ＡＣＡＡＣＡＡＴＣＣＣ（配列番号７０）を含む配列を含まないリンカーを含むＲＮＡコンストラクト由来のｓｉＲＮＡによる、標的ｍＲＮＡによってコードされるタンパク質の発現レベル、機能、および／または活性の下方調節と比較して増強され得る。

【0071】

一部の場合には、本明細書に記載されるリンカーを含む組み換えＲＮＡコンストラクト由来のｓｉＲＮＡによる、標的ｍＲＮＡによってコードされるタンパク質の発現レベル、機能、および／または活性の下方調節は、本明細書に記載される別のリンカーを有する相当する組み換えＲＮＡコンストラクト由来のｓｉＲＮＡによる、標的ｍＲＮＡによってコードされるタンパク質の発現レベル、機能、および／または活性の下方調節と比較して増強され得る。例えば、第１のＲＮＡ配列、第２のＲＮＡ配列、および本明細書に記載されるＡ２－リンカーＲＮＡ配列を含む組み換えＲＮＡコンストラクト由来のｓｉＲＮＡによる、標的ｍＲＮＡによってコードされるタンパク質の発現レベル、機能、および／または活性の下方調節は、本明細書に記載される別のリンカー（例えば、Ｂ－リンカー、Ｃ－リンカー、Ｄ－リンカー、またはＥ－リンカー）を含むＲＮＡコンストラクト由来のｓｉＲＮＡによる、標的ｍＲＮＡによってコードされるタンパク質の発現レベル、機能、および／または活性の下方調節と比較して増強され得る。例えば、第１のＲＮＡ配列、第２のＲＮＡ配列、および本明細書に記載されるＢ－リンカーＲＮＡ配列を含む組み換えＲＮＡコンストラクト由来のｓｉＲＮＡによる、標的ｍＲＮＡによってコードされるタンパク質の発現レベル、機能、および／または活性の下方調節は、本明細書に記載される別のリンカー（例えば、Ａ２－リンカー、Ｃ－リンカー、Ｄ－リンカー、またはＥ－リンカー）を含むＲＮＡコンストラクト由来のｓｉＲＮＡによる、標的ｍＲＮＡによってコードされるタンパク質の発現レベル、機能、および／または活性の下方調節と比較して増強され得る。例えば、第１のＲＮＡ配列、第２のＲＮＡ配列、および本明細書に記載されるＣ－リンカーＲＮＡ配列を含む組み換えＲＮＡコンストラクト由来のｓｉＲＮＡによる、標的ｍＲＮＡによってコードされるタンパク質の発現レベル、機能、および／または活性の下方調節は、本明細書に記載される別のリンカー（例えば、Ａ２－リンカー、Ｂ－リンカー、Ｄ－リンカー、またはＥ－リンカー）を含むＲＮＡコンストラクト由来のｓｉＲＮＡによる、標的ｍＲＮＡによってコードされるタンパク質の発現レベル、機能、および／または活性の下方調節と比較して増強され得る。例えば、第１のＲＮＡ配列、第２のＲＮＡ配列、および本明細書に記載されるＤ－リンカーＲＮＡ配列を含む組み換えＲＮＡコンストラクト由来のｓｉＲＮＡによる、標的ｍＲＮＡによってコードされるタンパク質の発現レベル、機能、および／または活性の下方調節は、本明細書に記載される別のリンカー（例えば、Ａ２－リンカー、Ｂ－リンカー、Ｃ－リンカー、またはＥ－リンカー）を含むＲＮＡコンストラクト由来のｓｉＲＮＡによる、標的ｍＲＮＡによってコードされるタンパク質の発現レベル、機能、および／または活性の下方調節と比較して増強され得る。例えば、第１のＲＮＡ配列、第２のＲＮＡ配列、および本明細書に記載されるＥ－リンカーＲＮＡ配列を含む組み換えＲＮＡコンストラクト由来のｓｉＲＮＡによる、標的ｍＲＮＡによってコードされるタンパク質の発現レベル、機能、および／または活性の下方調節は、本明細書に記載される別のリンカー（例えば、Ａ２－リンカー、Ｂ－リンカー、Ｃ－リンカー、またはＤ－リンカー）を含むＲＮＡコンストラクト由来のｓｉＲＮＡによる、標的ｍＲＮＡによってコードされるタンパク質の発現レベル、機能、および／または活性の下方調節と比較して増強され得る。一部の実施形態において、Ａ２－リンカーは、ＡＣＡＡＣＡＡ（配列番号２３）を含む配列を含み得る。一部の実施形態において、Ｂリンカーは、ＡＴＣＣＣＴＡＣＧＴＡＣＣＡＡＣＡＡ（配列番号６７）を含む配列を含み得る。一部の実施形態において、Ｃ－リンカーは、ＡＣＧＴＡＣＣＡＡＣＡＡ（配列番号６８）を含む配列を含み得る。一部の実施形態において、Ｄ－リンカーは、ＴＣＣＣ（配列番号６９）を含む配列を含み得る。一部の実施形態において、Ｅ－リンカーは、ＡＣＡＡＣＡＡＴＣＣＣ（配列番号７０）を含む配列を含み得る。

【0072】

本明細書において使用されるタンパク質とは、１つまたは複数のペプチドまたはポリペプチドを典型的に含む分子を指し得る。ペプチドまたはポリペプチドとは、典型的に、ペプチド結合によって連結されたアミノ酸残基の鎖である。ペプチドは、通常、２～５０個のアミノ酸残基を含む。ポリペプチドは、通常、５０個より多くのアミノ酸残基を含む。タンパク質は、典型的に、タンパク質がその生物学的機能を発揮するために要され得る３次元形態に折り畳まれる。本明細書において使用されるタンパク質は、タンパク質の断片、タンパク質のバリアント、および融合タンパク質を含み得る。本明細書において使用される機能的バリアントとは、完全長分子、その断片、またはそのバリアントを指し得る。例えば、バリアント分子は、タンパク質配列の場合には１つもしくは複数のアミノ酸の、または核酸配列の場合には１つもしくは複数のヌクレオチドの、挿入、欠失、および／または置換によって改変された配列を含み得る。例えば、バリアント分子は、機能獲得型または機能喪失型の変異体を含むがそれらに限定されない変異体タンパク質を含み得るまたはコードし得る。断片は、ＤＮＡもしくはＲＮＡのような核酸分子、またはタンパク質の完全長配列のより短い部分であり得る。したがって、断片は、典型的に、完全長配列内の相当する一続きと同一である配列を含む。一部の実施形態において、配列の断片は、断片が由来する完全長ヌクレオチドまたはアミノ酸配列の少なくとも５％～少なくとも８０％を含み得る。一部の実施形態において、タンパク質は哺乳動物タンパク質であり得る。一部の実施形態において、タンパク質はヒトタンパク質であり得る。一部の実施形態において、タンパク質は、細胞から分泌されたタンパク質であり得る。一部の実施形態において、タンパク質は、細胞膜上のタンパク質であり得る。一部の実施形態において、本明細書において言及されるタンパク質は、分泌され、免疫学的反応にしばしば関わる、細胞表面上の受容体を介して標的細胞シグナル伝達のモジュレーターとして局所的にもしくは全身的に作用するタンパク質、またはウイルス感染に関わる他の宿主タンパク質であり得る。関心のある遺伝子によってコードされるタンパク質を含めた、本発明の文脈において有用なタンパク質のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、当技術分野において公知であり、文献において入手可能である。例えば、関心のある遺伝子によってコードされるタンパク質を含めた、本発明の文脈において有用なタンパク質のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔデータベースにおいて入手可能である。

【0073】

標的ｍＲＮＡの発現をモジュレートするための、標的ｍＲＮＡに結合し得るｓｉＲＮＡを含む組み換えＲＮＡコンストラクトの組成物が本明細書において提供される。一部の場合には、標的ｍＲＮＡの発現（例えば、標的ｍＲＮＡによってコードされるタンパク質のレベル）は、標的ｍＲＮＡに結合し得るｓｉＲＮＡによって下方調節される。一部の実施形態において、標的ｍＲＮＡの発現は、標的ｍＲＮＡに結合し得るｓｉＲＮＡによって阻害される。本明細書に記載される、標的ｍＲＮＡの発現の阻害または下方調節は、標的ｍＲＮＡからのタンパク質の翻訳に干渉するための標的ｍＲＮＡへの干渉を指し得るがそれに限定されるわけではなく；ゆえに、標的ｍＲＮＡの発現の阻害または下方調節は、標的ｍＲＮＡに結合し得るｓｉＲＮＡを含む組み換えＲＮＡコンストラクトの非存在下における標的ｍＲＮＡから発現されるタンパク質のレベルと比較した、標的ｍＲＮＡから発現されるタンパク質の減少したレベルを指し得るがそれに限定されるわけではない。タンパク質発現のレベルは、当技術分野において周知の任意の方法を使用することによって測定され得、これらは、ウェスタンブロッティング、フローサイトメトリー、ＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、および様々なプロテオミクス手法を含むが、それらに限定されるわけではない。ポリペプチドを測定するまたは検出する例示的方法は、ＥＬＩＳＡ等のイムノアッセイである。このタイプのタンパク質定量は、特異的抗原を捕捉し得る抗体、および捕捉された抗原を検出し得る二次抗体に基づき得る。ポリペプチドの検出および／または測定のための例示的アッセイは、Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．およびＬａｎｅ，Ｄ．Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、（１９８８）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓに記載される。

【0074】

標的ｍＲＮＡに結合し得るｓｉＲＮＡを含む少なくとも１種の核酸配列と、関心のある遺伝子をコードする少なくとも１種の核酸配列とを含む組み換えＲＮＡコンストラクトを含む組成物であって、標的ｍＲＮＡは、関心のある遺伝子によってコードされるｍＲＮＡとは異なる、組成物が本明細書において提供される。標的ｍＲＮＡに結合し得るｓｉＲＮＡを含む少なくとも１種の核酸配列と、関心のある遺伝子をコードする少なくとも１種の核酸配列とを含む組み換えＲＮＡコンストラクトを含む組成物であって、ｓｉＲＮＡは、関心のある遺伝子の発現に影響を及ぼさない、組成物が本明細書において提供される。一部の場合には、ｓｉＲＮＡは、関心のある遺伝子によってコードされるｍＲＮＡに結合し得ない。一部の場合には、ｓｉＲＮＡは、関心のある遺伝子の発現を阻害しない。一部の場合には、ｓｉＲＮＡは、関心のある遺伝子の発現を下方調節しない。本明細書に記載される、関心のある遺伝子の発現を阻害することまたは下方調節することは、組み換えＲＮＡコンストラクトからのタンパク質の翻訳に干渉することを指し得るがそれに限定されるわけではなく；ゆえに、関心のある遺伝子の発現を阻害することまたは下方調節することは、標的ｍＲＮＡに結合し得るｓｉＲＮＡを含む組み換えＲＮＡコンストラクトの非存在下において発現されるタンパク質のレベルと比較した、タンパク質の減少したレベルを指し得るがそれに限定されるわけではない。タンパク質発現のレベルは、当技術分野において周知の任意の方法を使用することによって測定され得、これらは、ウェスタンブロッティング、フローサイトメトリー、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、および様々なプロテオミクス手法を含むが、それらに限定されるわけではない。ポリペプチドを測定するまたは検出する例示的方法は、ＥＬＩＳＡ等のイムノアッセイである。このタイプのタンパク質定量は、特異的抗原を捕捉し得る抗体、および捕捉された抗原を検出し得る二次抗体に基づき得る。ポリペプチドの検出および／または測定のための例示的アッセイは、Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．およびＬａｎｅ，Ｄ．Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、（１９８８）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓに記載される。

【0075】

標的ｍＲＮＡに結合し得るｓｉＲＮＡを含む少なくとも１種の核酸配列を含む組み換えＲＮＡコンストラクトを含む組成物が本明細書において提供される。ｓｉＲＮＡが結合し得る標的ｍＲＮＡの非限定的な例のリストは、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ－アルファまたはＴＮＦ－α）、アクチビン受容体様キナーゼ２（ＡＬＫ２）、Ｔｕｒｂｏ緑色蛍光性タンパク質（Ｔｕｒｂｏ ＧＦＰ）、血管内皮増殖因子Ａ（ＶＥＧＦＡ）、細胞骨髄球腫症（ｃ－Ｍｙｃ）、カーステンラット肉腫（ＫＲＡＳ）、プロテインキナーゼＢ－１（Ａｋｔ１）、プロテインキナーゼＢ－２（Ａｋｔ２）、プロテインキナーゼＢ－３（Ａｋｔ３）、またはその機能的バリアントを含む遺伝子のｍＲＮＡを含む。一部の実施形態において、Ｔｕｒｂｏ ＧＦＰ配列は、海生カイアシ類ポンテリーナ・プルマーテ（Ｐｏｎｔｅｌｌｉｎａ ｐｌｕｍａｔｅ）に由来し得る。本明細書において使用される機能的バリアントとは、完全長分子、その断片、またはそのバリアントを指し得る。例えば、バリアント分子は、タンパク質配列の場合には１つもしくは複数のアミノ酸の、または核酸配列の場合には１つもしくは複数のヌクレオチドの、挿入、欠失、および／または置換によって改変された配列を含み得る。

【0076】

一部の実施形態において、本明細書に記載される組み換えＲＮＡコンストラクトは、１種または複数のｓｉＲＮＡをコードし得または含み得、１種または複数のｓｉＲＮＡのそれぞれは、異なるｍＲＮＡに結合し得る。例えば、組み換えＲＮＡコンストラクトは、少なくとも３種のｓｉＲＮＡをコードし得または含み得、３種のｓｉＲＮＡのそれぞれは、異なるｍＲＮＡに結合し得る。一部の実施形態において、組み換えＲＮＡコンストラクトは、少なくとも３種のｓｉＲＮＡをコードし得または含み得、少なくとも３種のｓｉＲＮＡのうちの１種はｃ－Ｍｙｃに結合し、少なくとも３種のｓｉＲＮＡのうちの１種はＫＲＡＳに結合し、少なくとも３種のｓｉＲＮＡのうちの１種は、Ａｋｔ１、Ａｋｔ２、および／またはＡｋｔ３に結合する。一部の実施形態において、組み換えＲＮＡコンストラクトは、少なくとも３種のｓｉＲＮＡをコードし得または含み得、少なくとも３種のｓｉＲＮＡのうちの１種はｃ－Ｍｙｃに結合し、少なくとも３種のｓｉＲＮＡのうちの１種はＫＲＡＳに結合し、少なくとも３種のｓｉＲＮＡのうちの１種は、ｐａｎ－Ａｋｔ（Ａｋｔ１、Ａｋｔ２、およびＡｋｔ３）に結合する。

【0077】

一部の実施形態において、ＴＮＦ－アルファは、配列番号３２に列挙された配列を含む。一部の実施形態において、ＡＬＫ２は、配列番号３３に列挙された配列を含む。一部の実施形態において、Ｔｕｒｂｏ ＧＦＰは、配列番号３４に列挙された配列を含む。一部の実施形態において、ＶＥＧＦＡは、配列番号１１５に列挙された配列を含む。一部の実施形態において、ｃ－Ｍｙｃは、配列番号１２２に列挙された配列を含む。一部の実施形態において、ＫＲＡＳは、配列番号１２３に列挙された配列を含む。一部の実施形態において、Ａｋｔ１は、配列番号１２４に列挙された配列を含む。一部の実施形態において、Ａｋｔ２は、配列番号１２５に列挙された配列を含む。一部の実施形態において、Ａｋｔ３は、配列番号１２６に列挙された配列を含む。

【0078】

一部の態様において、ｓｉＲＮＡは、配列番号５０～５７、および１２７～１３２からなる群から選択される配列によってコードされるセンス鎖を含む。一部の態様において、ｓｉＲＮＡは、配列番号５８～６５、および１３３～１３８からなる群から選択される配列によってコードされるアンチセンス鎖を含む。一部の態様において、ｓｉＲＮＡは、配列番号５０～５７、および１２７～１３２からなる群から選択される配列によってコードされるセンス鎖、ならびに配列番号５８～６５、および１３３～１３８からなる群から選択される配列によってコードされる相当するアンチセンス鎖を含む。

【0079】

関心のある遺伝子
関心のある遺伝子をコードする１つまたは複数のコピーの核酸配列を含む組み換えＲＮＡコンストラクトが本明細書において提供される。例えば、組み換えＲＮＡコンストラクトは、関心のある遺伝子をコードする１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、またはそれより多くのコピーの核酸配列を含み得る。一部の場合には、関心のある遺伝子をコードする１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、またはそれより多くのコピーの核酸配列のそれぞれは、関心のある同じ遺伝子をコードする。一部の場合には、組み換えＲＮＡコンストラクトは、サイトカインをコードする１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、またはそれより多くのコピーの核酸配列を含み得る。

【0080】

関心のある遺伝子をコードする２つ以上のコピーの核酸配列を含む組み換えＲＮＡコンストラクトであって、２種以上の核酸配列のそれぞれは、関心のある異なる遺伝子をコードし得る、組み換えＲＮＡコンストラクトも本明細書において提供される。一部の場合には、関心のある異なる遺伝子をコードする２種以上の核酸配列のそれぞれは、分泌タンパク質をコードする核酸配列を含み得る。一部の場合には、関心のある異なる遺伝子をコードする２種以上の核酸配列のそれぞれは、サイトカイン、例えばインターロイキン４（ＩＬ－４）、インターロイキン２（ＩＬ－２）、またはインターロイキン１２（ＩＬ－１２）をコードする核酸配列を含み得る。一部の実施形態において、関心のある異なる遺伝子をコードする２種以上の核酸配列のそれぞれは、異なる分泌タンパク質をコードし得る。一部の場合には、関心のある異なる遺伝子をコードする２種以上の核酸のそれぞれは、インスリン様成長因子１（ＩＧＦ－１）をコードする核酸配列を含み得る。本明細書に記載されるリンカーを含む組み換えＲＮＡコンストラクトが本明細書においてさらに提供される。一部の実施形態において、リンカーは、関心のある遺伝子をコードする２種以上の核酸配列のそれぞれを接続し得る。一部の場合には、リンカーは非切断性リンカーであり得る。一部の場合には、リンカーは切断性リンカーであり得る。一部の場合には、リンカーは自己切断性リンカーであり得る。一部の場合には、リンカーは、タンパク質、例えば細胞内タンパク質または内因性タンパク質によって切断され得る。一部の場合には、リンカーは、式（Ｉ）：Ｘ_ｍＣＡＡＣＡＡＸ_ｎ［式中、Ｘは任意のヌクレオチドであり、ｍは１～１２の整数であり、ｎは０～４の整数である］；および式（ＩＩ）：Ｘ_ｐＴＣＣＣＸ_ｒ［式中、Ｘは任意のヌクレオチドであり、ｐは０～１７の整数であり、ｒは０～１３の整数である］からなる群から選択される。一部の場合には、リンカーは、ＡＣＡＡＣＡＡ（配列番号２３）を含む配列を含む。一部の実施形態において、リンカーは、配列番号２３、６７～７５からなる群から選択される。

【0081】

リンカーの他の例は、柔軟性のあるリンカー、Ｔ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｅ２Ａ、またはＦ２Ａ等の２Ａペプチドリンカー（または２Ａ自己切断性ペプチド）、およびｔＲＮＡリンカー等を含むが、それらに限定されるわけではない。ｔＲＮＡシステムは、生存生物にわたって進化的に保存され、内因性のＲＮａｓｅ ＰおよびＺを利用して、マルチシストロン性コンストラクトをプロセシングする（Ｄｏｎｇら、２０１６）。一部の実施形態において、ｔＲＮＡリンカーは、ＡＡＣＡＡＡＧＣＡＣＣＡＧＴＧＧＴＣＴＡＧＴＧＧＴＡＧＡＡＴＡＧＴＡＣＣＣＴＧＣＣＡＣＧＧＴＡＣＡＧＡＣＣＣＧＧＧＴＴＣＧＡＴＴＣＣＣＧＧＣＴＧＧＴＧＣＡ（配列番号３９）を含む核酸配列を含み得る。

【0082】

関心のある遺伝子の発現をモジュレートするための、関心のある遺伝子をコードするＲＮＡを含む組み換えＲＮＡコンストラクトが本明細書において提供される。例えば、関心のある遺伝子のｍＲＮＡによってコードされるタンパク質の発現はモジュレートされ得る。例えば、関心のある遺伝子の発現は、組み換えＲＮＡコンストラクトにおける関心のある遺伝子のｍＲＮＡによってコードされるタンパク質を発現させることによって上方調節される。例えば、関心のある遺伝子の発現は、組み換えＲＮＡコンストラクトにおける関心のある遺伝子のｍＲＮＡによってコードされるタンパク質のレベルを増加させることによって上方調節される。タンパク質発現のレベルは、当技術分野において周知の任意の方法を使用することによって測定され得、これらは、ウェスタンブロッティング、フローサイトメトリー、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、および様々なプロテオミクス手法を含むが、それらに限定されるわけではない。ポリペプチドを測定するまたは検出する例示的方法は、ＥＬＩＳＡ等のイムノアッセイである。このタイプのタンパク質定量は、特異的抗原を捕捉し得る抗体、および捕捉された抗原を検出し得る二次抗体に基づき得る。ポリペプチドの検出および／または測定のための例示的アッセイは、Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．およびＬａｎｅ，Ｄ．Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、（１９８８）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓに記載される。

【0083】

関心のある遺伝子をコードするＲＮＡを含む組み換えＲＮＡコンストラクトであって、関心のある遺伝子は関心のあるタンパク質をコードする、組み換えＲＮＡコンストラクトが本明細書において提供される。一部の場合には、関心のあるタンパク質は治療用タンパク質である。一部の場合には、関心のあるタンパク質はヒト起源のものであり、すなわちヒトタンパク質である。一部の場合には、関心のある遺伝子は分泌タンパク質をコードする。一部の実施形態において、関心のある遺伝子はインスリン様成長因子１（ＩＧＦ－１）をコードする。一部の実施形態において、関心のあるタンパク質はＩＧＦ－１である。一部の場合には、関心のある遺伝子はサイトカインをコードする。一部の実施形態において、サイトカインはインターロイキンを含む。一部の実施形態において、関心のあるタンパク質は、インターロイキン４（ＩＬ－４）またはその機能的バリアントである。一部の実施形態において、関心のあるタンパク質は、インターロイキン２（ＩＬ－２）またはその機能的バリアントである。一部の実施形態において、関心のあるタンパク質は、インターロイキン１２（ＩＬ－１２）またはその機能的バリアントである。

【0084】

一部の場合には、関心のある遺伝子をコードする核酸配列を含む組み換えＲＮＡコンストラクトは、ヒトインスリン様成長因子１（ＩＧＦ－１）をコードする核酸配列を含み得る。一部の場合には、本明細書において使用されるＩＧＦ－１とは、ヒトＩＧＦ－１の天然配列（Ｕｎｉｐｒｏｔデータベース：Ｐ０５０１９、およびＧｅｎｂａｎｋデータベースにおける：ＮＭ＿００１１１１２８５．３）、断片、またはその機能的バリアントを指し得る。１つの実施形態において、組み換えＲＮＡコンストラクトは、ＩＧＦ－１をコードする核酸配列を含むネイキッドＲＮＡであり得る。この実施形態において、組み換えＲＮＡコンストラクトは、成熟ヒトＩＧＦ－１をコードする核酸配列を含み得る。ヒトＩＧＦ－１をコードする天然ＤＮＡ配列は、コドン最適化され得る。ヒトＩＧＦ－１の天然配列は、２１個のアミノ酸（ヌクレオチド１～６３）を有するシグナルペプチド、２７個のアミノ酸（ヌクレオチド６４～１４４）を有するプロ－ペプチド、７０個のアミノ酸（ヌクレオチド１４５～３５４）を有する成熟ヒトＩＧＦ－１、および７７個のアミノ酸（ヌクレオチド３５５～５８５）を有するＥ－ペプチドを含む。一部の実施形態において、組み換えＲＮＡコンストラクトは、ＩＧＦ－１のプロ－ペプチド（プロ－ドメインとも呼ばれる）をコードする核酸配列、ＩＧＦ－１の成熟タンパク質をコードする核酸配列、またはＩＧＦ－１のＥ－ペプチド（Ｅ－ドメインとも呼ばれる）（すなわち、カルボキシル末端伸長を有するＩＧＦ－１）を含み得る。一部の実施形態において、組み換えＲＮＡコンストラクトは、ＩＧＦ－１のＥ－ペプチドをコードする核酸配列を含まない。一部の実施形態において、組み換えＲＮＡコンストラクトは、ＩＧＦ－１のプロ－ペプチドをコードする核酸配列、ＩＧＦ－１の成熟タンパク質をコードする核酸配列、および脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）のシグナルペプチドをコードする核酸配列を含み得る。一部の実施形態において、ＩＧＦ－１はヒトＩＧＦ－１である。

【0085】

一部の実施形態において、組み換えＲＮＡコンストラクトは、２７個のアミノ酸を有する、ＩＧＦ－１の、好ましくはヒトＩＧＦ－１のプロ－ペプチドをコードする核酸配列、および成熟ＩＧＦ－１、好ましくは７０個のアミノ酸を有する成熟ヒトＩＧＦ－１をコードする核酸配列を含み得、好ましくはＩＧＦ－１のＥ－ペプチドをコードするヌクレオチド配列を含まず、好ましくはＩＧＦ－１のヒトＥ－ペプチドをコードする核酸配列を含まない。一部の実施形態において、組み換えＲＮＡコンストラクトは、２７個のアミノ酸を有する、ＩＧＦ－１の、好ましくはヒトＩＧＦ－１のプロ－ペプチドをコードする核酸配列、成熟ＩＧＦ－１、好ましくは７０個のアミノ酸を有する成熟ヒトＩＧＦ－１をコードする核酸配列、および脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）のシグナルペプチドをコードする核酸配列を含み得る。一部の実施形態において、組み換えＲＮＡコンストラクトは、ＩＧＦ－１のＥ－ペプチドをコードする核酸配列を含まず、より好ましくはＩＧＦ－１のヒトＥ－ペプチドをコードする核酸配列を含まない。

【0086】

一部の実施形態において、本明細書において提供される組み換えＲＮＡコンストラクトは、２７個のアミノ酸を有する、ヒトＩＧＦ－１のプロ－ペプチドをコードする核酸配列、および７０個のアミノ酸を有する成熟ヒトＩＧＦ－１をコードする核酸配列を含み得、好ましくはヒトＩＧＦ－１のＥ－ペプチドをコードする核酸配列を含まず、２７個のアミノ酸を有する、ヒトＩＧＦ－１のプロ－ペプチドをコードする核酸配列、および７０個のアミノ酸を有する成熟ヒトＩＧＦ－１をコードする核酸配列、およびＥ－ペプチドをコードする核酸配列は、ＵｎｉｐｒｏｔデータベースにおいてＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ０５０１９と称される。一部の実施形態において、本明細書に記載されるＩＧＦ－１は、配列番号２９または配列番号３１を含むアミノ酸配列を有し得る。

【0087】

一部の場合には、本明細書において提供される組み換えＲＮＡコンストラクトは、ＩＧＦ－１をコードするｍＲＮＡを含み得る。一部の実施形態において、ＩＧＦ－１をコードするｍＲＮＡとは、２７個のアミノ酸を有する、ヒトＩＧＦ－１のプロ－ペプチドをコードするヌクレオチド配列、および／または７０個のアミノ酸を有する成熟ヒトＩＧＦ－１をコードするヌクレオチド配列を含むｍＲＮＡを指し得る。ヒトＩＧＦ－１のプロ－ペプチドをコードするヌクレオチド配列、および成熟ヒトＩＧＦ－１をコードするヌクレオチド配列は、コドン最適化され得る。一部の場合には、本明細書において提供される組み換えＲＮＡコンストラクトは、１コピーのＩＧＦ－１ ｍＲＮＡを含み得る。一部の場合には、本明細書において提供される組み換えＲＮＡコンストラクトは、２コピー以上のＩＧＦ－１ ｍＲＮＡを含み得る。

【0088】

一部の場合には、本明細書において使用されるインターロイキン４（ＩＬ－４）またはＩＬ－４とは、ヒトＩＬ－４の天然配列（Ｕｎｉｐｒｏｔデータベース：Ｐ０５１１２、およびＧｅｎｂａｎｋデータベースにおける：ＮＭ＿０００５８９．４）、断片、またはその機能的バリアントを指し得る。ヒトＩＬ－４をコードする天然ＤＮＡ配列は、コドン最適化され得る。ヒトＩＬ－４の天然配列は、２４個のアミノ酸（ヌクレオチド１～７２）を有するシグナルペプチド、および１５３個のアミノ酸（ヌクレオチド７３～４５９）を有する成熟ヒトＩＬ－４を含む。一部の実施形態において、シグナルペプチドは、非修飾のＩＬ－４シグナルペプチドである。一部の実施形態において、シグナルペプチドは、少なくとも１つのアミノ酸の挿入、欠失、および／または置換によって改変されたＩＬ－４シグナルペプチドである。一部の実施形態において、本明細書において使用されるインターロイキン４（ＩＬ－４）またはＩＬ－４とは、成熟ヒトＩＬ－４を指し得る。一部の実施形態において、成熟タンパク質とは、該タンパク質を発現しかつ分泌する細胞において、小胞体において合成され、ゴルジ装置を介して分泌されるタンパク質を指し得る。一部の実施形態において、成熟ＩＬ－４とは、ＩＬ－４を発現しかつ分泌する細胞において、小胞体において合成され、ゴルジ装置を介して分泌されるＩＬ－４タンパク質を指し得る。一部の実施形態において、成熟ヒトＩＬ－４とは、ヒトＩＬ－４を発現しかつ分泌するヒト細胞において、小胞体において合成され、ゴルジ装置を介して分泌されるＩＬ－４タンパク質を指し得、通常、配列番号２６に示されるヌクレオチドによってコードされるアミノ酸を含有する。一部の実施形態において、本明細書に記載されるＩＬ－４は、配列番号２７を含むアミノ酸配列を有し得る。

【0089】

ＩＬ－４をコードするｍＲＮＡとは、１５３個のアミノ酸を有する、ヒトＩＬ－４のプロ－ペプチドをコードするヌクレオチド配列、または１２９個のアミノ酸を有する成熟ヒトＩＬ－４をコードするヌクレオチド配列を含むｍＲＮＡを指し得る。ヒトＩＬ－４のプロ－ペプチドをコードするヌクレオチド配列、および成熟ヒトＩＬ－４をコードするヌクレオチド配列は、コドン最適化され得る。一部の場合には、本明細書において提供される組み換えＲＮＡコンストラクトは、１コピーのＩＬ－４ ｍＲＮＡを含み得る。一部の場合には、本明細書において提供される組み換えＲＮＡコンストラクトは、２コピー以上のＩＬ－４ ｍＲＮＡを含み得る。

【0090】

一部の場合には、本明細書において使用されるインターロイキン２（ＩＬ－２）またはＩＬ－２とは、ヒトＩＬ－２の天然配列（Ｕｎｉｐｒｏｔデータベース：Ｐ６０５６８またはＱ０ＧＫ４３、およびＧｅｎｂａｎｋデータベースにおける：ＮＭ＿０００５８６．３）、断片、またはその機能的バリアントを指し得る。ヒトＩＬ－２をコードする天然ＤＮＡ配列は、コドン最適化され得る。ヒトＩＬ－２の天然配列は、２０個のアミノ酸（ヌクレオチド１～６０）を有するシグナルペプチド、および１３３個のアミノ酸（ヌクレオチド６１～４５９）を有する成熟ヒトＩＬ－２からなり得る。一部の実施形態において、シグナルペプチドは、非修飾のＩＬ－２シグナルペプチドである。一部の実施形態において、シグナルペプチドは、少なくとも１つのアミノ酸の挿入、欠失、および／または置換によって改変されたＩＬ－２シグナルペプチドである。一部の実施形態において、ＩＬ－２のシグナルペプチドは、配列番号１１２を含む配列を含み得る。一部の実施形態において、本明細書において使用されるインターロイキン２（ＩＬ－２）またはＩＬ－２とは、成熟ヒトＩＬ－２を指し得る。一部の実施形態において、成熟タンパク質とは、該タンパク質を発現しかつ分泌する細胞において、小胞体において合成され、ゴルジ装置を介して分泌されるタンパク質を指し得る。一部の実施形態において、成熟ＩＬ－２とは、ＩＬ－２を発現しかつ分泌する細胞において、小胞体において合成され、ゴルジ装置を介して分泌されるＩＬ－２タンパク質を指し得る。一部の実施形態において、成熟ヒトＩＬ－２とは、ヒトＩＬ－２を発現しかつ分泌するヒト細胞において、小胞体において合成され、ゴルジ装置を介して分泌されるＩＬ－２タンパク質を指し得、通常、配列番号１１１に示されるヌクレオチドによってコードされるアミノ酸を含有する。一部の実施形態において、本明細書に記載されるＩＬ－２断片は、少なくとも部分的に機能的であり得る、すなわち、野生型または完全長ＩＬ－２と比較して同様のまたはより低いレベルでＩＬ－２活性を果たし得る。一部の実施形態において、本明細書に記載されるＩＬ－２断片は、完全に機能的であり得る、すなわち、野生型または完全長ＩＬ－２と比較して同じレベルでＩＬ－２活性を果たし得る。一部の実施形態において、ＩＬ－２バリアント、ＩＬ－２突然変異タンパク質、またはＩＬ－２変異体は、少なくとも１つのアミノ酸の挿入、欠失、および／または置換によって改変されたＩＬ－２アミノ酸配列を含み得る。一部の実施形態において、ＩＬ－２バリアント、ＩＬ－２突然変異タンパク質、またはＩＬ－２変異体は、少なくとも部分的に機能的であり得る、すなわち、野生型ＩＬ－２と比較して同様のまたはより低いレベルでＩＬ－２活性を果たし得る。一部の実施形態において、ＩＬ－２バリアント、ＩＬ－２突然変異タンパク質、またはＩＬ－２変異体は、完全に機能的であり得る、すなわち、野生型ＩＬ－２と比較して同じレベルでＩＬ－２活性を果たし得る。一部の実施形態において、ＩＬ－２バリアント、ＩＬ－２突然変異タンパク質、またはＩＬ－２変異体は、野生型ＩＬ－２と比較してより高いレベルでＩＬ－２活性を果たし得る。一部の実施形態において、本明細書に記載されるＩＬ－２は、配列番号１０９または１１０を含むアミノ酸配列を有し得る。一部の実施形態において、ＩＬ－２は、ＩＬ－２断片、ＩＬ－２バリアント、ＩＬ－２突然変異タンパク質、またはＩＬ－２変異体を含み得る。

【0091】

ＩＬ－２をコードするｍＲＮＡとは、１５３個のアミノ酸を有する、ヒトＩＬ－２のプロ－ペプチドをコードするヌクレオチド配列、または１３３個のアミノ酸を有する成熟ヒトＩＬ－２をコードするヌクレオチド配列を含むｍＲＮＡを指し得る。ヒトＩＬ－２のプロ－ペプチドをコードするヌクレオチド配列、および成熟ヒトＩＬ－２をコードするヌクレオチド配列は、コドン最適化され得る。一部の場合には、本明細書において提供される組み換えＲＮＡコンストラクトは、１コピーのＩＬ－２ ｍＲＮＡを含み得る。一部の場合には、本明細書において提供される組み換えＲＮＡコンストラクトは、２コピー以上のＩＬ－２ ｍＲＮＡを含み得る。

【0092】

一部の場合には、本明細書において使用されるインターロイキン１２（ＩＬ－１２）またはＩＬ－１２とは、ヒトＩＬ－１２アルファの天然配列（Ｕｎｉｐｒｏｔデータベース：Ｐ２９４５９、およびＧｅｎｂａｎｋデータベースにおける：ＮＭ＿０００８８２．３）、ヒトＩＬ－１２ベータの天然配列（Ｕｎｉｐｒｏｔデータベース：Ｐ２９４６０、およびＧｅｎｂａｎｋデータベースにおける：ＮＭ＿００２１８７．２）、その断片、またはその機能的バリアントを指し得る。ヒトＩＬ－１２をコードする天然ＤＮＡ配列は、コドン最適化され得る。ヒトＩＬ－１２アルファの天然配列は、配列番号１１６に示されるように、２２個のアミノ酸を有するシグナルペプチド、および１９７個のアミノ酸を有する成熟ヒトＩＬ－１２からなり得る。一部の実施形態において、シグナルペプチドは、非修飾のＩＬ－１２アルファシグナルペプチドである。一部の実施形態において、シグナルペプチドは、少なくとも１つのアミノ酸の挿入、欠失、および／または置換によって改変されたＩＬ－１２アルファシグナルペプチドである。ヒトＩＬ－１２ベータの天然配列は、配列番号１１９に示されるように、２２個のアミノ酸を有するシグナルペプチド、および３０６個のアミノ酸を有する成熟ヒトＩＬ－１２からなり得る。一部の実施形態において、シグナルペプチドは、非修飾のＩＬ－１２ベータシグナルペプチドである。一部の実施形態において、シグナルペプチドは、少なくとも１つのアミノ酸の挿入、欠失、および／または置換によって改変されたＩＬ－１２ベータシグナルペプチドである。

【0093】

一部の実施形態において、本明細書において使用されるインターロイキン１２（ＩＬ－１２）またはＩＬ－１２とは、成熟ヒトＩＬ－１２アルファを指し得る。一部の実施形態において、本明細書において使用されるインターロイキン１２（ＩＬ－１２）またはＩＬ－１２とは、成熟ヒトＩＬ－１２ベータを指し得る。一部の実施形態において、成熟タンパク質とは、該タンパク質を発現しかつ分泌する細胞において、小胞体において合成され、ゴルジ装置を介して分泌されるタンパク質を指し得る。一部の実施形態において、成熟ＩＬ－１２とは、ＩＬ－１２を発現しかつ分泌する細胞において、小胞体において合成され、ゴルジ装置を介して分泌されるＩＬ－１２アルファタンパク質を指し得る。一部の実施形態において、成熟ＩＬ－１２とは、ＩＬ－１２を発現しかつ分泌する細胞において、小胞体において合成され、ゴルジ装置を介して分泌されるＩＬ－１２ベータタンパク質を指し得る。一部の実施形態において、成熟ヒトＩＬ－１２とは、ヒトＩＬ－１２を発現しかつ分泌するヒト細胞において、小胞体において合成され、ゴルジ装置を介して分泌されるＩＬ－１２アルファタンパク質を指し得、通常、配列番号１１８に示されるヌクレオチドによってコードされるアミノ酸を含有する。一部の実施形態において、成熟ヒトＩＬ－１２とは、ヒトＩＬ－１２を発現しかつ分泌するヒト細胞において、小胞体において合成され、ゴルジ装置を介して分泌されるＩＬ－１２ベータタンパク質を指し得、通常、配列番号１２１に示されるヌクレオチドによってコードされるアミノ酸を含有する。

【0094】

一部の実施形態において、ＩＬ－１２アルファは、ＩＬ－１２アルファ断片、ＩＬ－１２アルファバリアント、ＩＬ－１２アルファ突然変異タンパク質、またはＩＬ－１２アルファ変異体を含み得る。一部の実施形態において、本明細書に記載されるＩＬ－１２アルファ断片は、少なくとも部分的に機能的であり得る、すなわち、野生型または完全長ＩＬ－１２アルファと比較して同様のまたはより低いレベルでＩＬ－１２アルファ活性を果たし得る。一部の実施形態において、本明細書に記載されるＩＬ－１２アルファ断片は、完全に機能的であり得る、すなわち、野生型または完全長ＩＬ－１２アルファと比較して同じレベルでＩＬ－１２アルファ活性を果たし得る。一部の実施形態において、ＩＬ－１２アルファバリアント、ＩＬ－１２アルファ突然変異タンパク質、またはＩＬ－１２アルファ変異体は、少なくとも１つのアミノ酸の挿入、欠失、および／または置換によって改変されたＩＬ－１２アルファアミノ酸配列を含み得る。一部の実施形態において、ＩＬ－１２アルファバリアント、ＩＬ－１２アルファ突然変異タンパク質、またはＩＬ－１２アルファ変異体は、少なくとも部分的に機能的であり得る、すなわち、野生型ＩＬ－１２アルファと比較して同様のまたはより低いレベルでＩＬ－１２アルファ活性を果たし得る。一部の実施形態において、ＩＬ－１２アルファバリアント、ＩＬ－１２アルファ突然変異タンパク質、またはＩＬ－１２アルファ変異体は、完全に機能的であり得る、すなわち、野生型ＩＬ－１２アルファと比較して同じレベルでＩＬ－１２アルファ活性を果たし得る。一部の実施形態において、ＩＬ－１２アルファバリアント、ＩＬ－１２アルファ突然変異タンパク質、またはＩＬ－１２アルファ変異体は、野生型ＩＬ－１２アルファと比較してより高いレベルでＩＬ－１２アルファ活性を果たし得る。

【0095】

一部の実施形態において、ＩＬ－１２ベータは、ＩＬ－１２ベータ断片、ＩＬ－１２ベータバリアント、ＩＬ－１２ベータ突然変異タンパク質、またはＩＬ－１２ベータ変異体を含み得る。一部の実施形態において、本明細書に記載されるＩＬ－１２ベータ断片は、少なくとも部分的に機能的であり得る、すなわち、野生型または完全長ＩＬ－１２ベータと比較して同様のまたはより低いレベルでＩＬ－１２ベータ活性を果たし得る。一部の実施形態において、本明細書に記載されるＩＬ－１２ベータ断片は、完全に機能的であり得る、すなわち、野生型または完全長ＩＬ－１２ベータと比較して同じレベルでＩＬ－１２ベータ活性を果たし得る。一部の実施形態において、ＩＬ－１２ベータバリアント、ＩＬ－１２ベータ突然変異タンパク質、またはＩＬ－１２ベータ変異体は、少なくとも１つのアミノ酸の挿入、欠失、および／または置換によって改変されたＩＬ－１２ベータアミノ酸配列を含み得る。一部の実施形態において、ＩＬ－１２ベータバリアント、ＩＬ－１２ベータ突然変異タンパク質、またはＩＬ－１２ベータ変異体は、少なくとも部分的に機能的であり得る、すなわち、野生型ＩＬ－１２ベータと比較して同様のまたはより低いレベルでＩＬ－１２ベータ活性を果たし得る。一部の実施形態において、ＩＬ－１２ベータバリアント、ＩＬ－１２ベータ突然変異タンパク質、またはＩＬ－１２ベータ変異体は、完全に機能的であり得る、すなわち、野生型ＩＬ－１２ベータと比較して同じレベルでＩＬ－１２ベータ活性を果たし得る。一部の実施形態において、ＩＬ－１２ベータバリアント、ＩＬ－１２ベータ突然変異タンパク質、またはＩＬ－１２ベータ変異体は、野生型ＩＬ－１２ベータと比較してより高いレベルでＩＬ－１２ベータ活性を果たし得る。

【0096】

ＩＬ－１２をコードするｍＲＮＡとは、２１９個のアミノ酸を有する、ヒトＩＬ－１２アルファのプロペプチドをコードするヌクレオチド配列、または１９７個のアミノ酸を有する成熟ヒトＩＬ－１２アルファをコードするヌクレオチド配列を含むｍＲＮＡを指し得る。ヒトＩＬ－１２アルファのプロペプチドをコードするヌクレオチド配列、および成熟ヒトＩＬ－１２をコードするヌクレオチド配列は、コドン最適化され得る。ＩＬ－１２をコードするｍＲＮＡとは、３２８個のアミノ酸を有する、ヒトＩＬ－１２ベータのプロペプチドをコードするヌクレオチド配列、または３０６個のアミノ酸を有する成熟ヒトＩＬ－１２ベータをコードするヌクレオチド配列を含むｍＲＮＡを指し得る。ヒトＩＬ－１２ベータのプロペプチドをコードするヌクレオチド配列、および成熟ヒトＩＬ－１２をコードするヌクレオチド配列は、コドン最適化され得る。一部の場合には、本明細書において提供される組み換えＲＮＡコンストラクトは、１コピーのＩＬ－１２ ｍＲＮＡを含み得る。一部の場合には、本明細書において提供される組み換えＲＮＡコンストラクトは、２コピー以上のＩＬ－１２ ｍＲＮＡを含み得る。

【0097】

標的モチーフ
標的モチーフを含む組み換えＲＮＡコンストラクトを含む組成物が本明細書において提供される。本明細書において使用される標的モチーフまたは標的化モチーフとは、細胞質またはサイトゾルを除いた、細胞膜、細胞外コンパートメント、または細胞内コンパートメントの任意の部分に運命付けられる、新たに合成されたポリペプチドまたはタンパク質に存在する任意の短いペプチドを指し得る。一部の実施形態において、ペプチドとは、典型的には、近接アミノ酸残基のα－アミノおよびカルボキシル基の間のペプチド結合によって、一方からもう一方に接続された一連のアミノ酸残基を指し得る。細胞内コンパートメントは、核、核小体、エンドソーム、プロテアソーム、リボソーム、染色質、核膜、核孔、エキソソーム、メラノソーム、ゴルジ装置、ペルオキシソーム、小胞体（ＥＲ）、リソソーム、中心体、微小管、ミトコンドリア、葉緑体、マイクロフィラメント、中間フィラメント、または原形質膜等の細胞内オルガネラを含むが、それらに限定されるわけではない。一部の実施形態において、シグナルペプチドは、シグナル配列、標的化シグナル、局在化シグナル、局在化配列、輸送ペプチド、リーダー配列、またはリーダーペプチドと称され得る。一部の実施形態において、標的モチーフは、関心のある遺伝子をコードする核酸配列に動作可能に連結される。一部の実施形態において、「動作可能に連結された」という用語は、２種以上の核酸配列間の機能的関係性、例えば転写配列に対する転写制御配列またはシグナル配列の機能的関係性を指し得る。例えば、標的モチーフ、または標的モチーフをコードする核酸は、それが、コード配列によってコードされるポリペプチドを、細胞膜、細胞内、または細胞外コンパートメントに標的化することに関与するプレタンパク質として発現される場合、コード配列に動作可能に連結されている。例えば、シグナルペプチド、またはシグナルペプチドをコードする核酸は、それが、コード配列によってコードされるポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現される場合、コード配列に動作可能に連結されている。例えば、プロモーターは、それがコード配列の転写を刺激するまたはモジュレートする場合、動作可能に連結されている。標的モチーフの非限定的な例は、シグナルペプチド、核局在化シグナル（ＮＬＳ）、核小体局在化シグナル（ＮｏＬＳ）、リソソーム標的化シグナル、ミトコンドリア標的化シグナル、ペルオキシソーム標的化シグナル、微小管先端局在化シグナル（ＭｔＬＳ）、エンドソーム標的化シグナル、葉緑体標的化シグナル、ゴルジ標的化シグナル、小胞体（ＥＲ）標的化シグナル、プロテアソーム標的化シグナル、膜標的化シグナル、膜貫通標的化シグナル、中心体局在化シグナル（ＣＬＳ）、またはタンパク質を、細胞膜、細胞外コンパートメント、もしくは細胞内コンパートメントのある特定の部分に標的化する任意の他のシグナルを含む。

【0098】

シグナルペプチドとは、分泌経路へ運命付けられる、新たに合成されたタンパク質のＮ末端に存在する任意の短いペプチドである。本発明のシグナルペプチドは、１０～４０個のアミノ酸長であり得る。シグナルペプチドは、関心のあるタンパク質のＮ末端に、または関心のあるタンパク質のプロ－タンパク質形態のＮ末端に位置付けられ得る。シグナルペプチドは、真核生物起源のものであり得る。一部の実施形態において、シグナルペプチドは、哺乳動物タンパク質であり得る。一部の実施形態において、シグナルペプチドは、ヒトタンパク質であり得る。一部の場合には、シグナルペプチドは、同種シグナルペプチド（すなわち、同じタンパク質由来）または異種シグナルペプチド（すなわち、異なるタンパク質由来または合成シグナルペプチド）であり得る。一部の場合には、シグナルペプチドは、タンパク質の天然に存在するシグナルペプチド、または改変されたシグナルペプチドであり得る。

【0099】

標的モチーフを含む組み換えＲＮＡコンストラクトを含む組成物であって、標的モチーフは、（ａ）関心のある遺伝子によってコードされるタンパク質とは異種の標的モチーフ；（ｂ）関心のある遺伝子によってコードされるタンパク質とは異種の標的モチーフであって、関心のある遺伝子によってコードされるタンパク質とは異種の標的モチーフは、少なくとも１つのアミノ酸の挿入、欠失、および／または置換によって改変されている、標的モチーフ；（ｃ）関心のある遺伝子によってコードされるタンパク質と同種の標的モチーフ；（ｄ）関心のある遺伝子によってコードされるタンパク質と同種の標的モチーフであって、関心のある遺伝子によってコードされるタンパク質と同種の標的モチーフは、少なくとも１つのアミノ酸の挿入、欠失、および／または置換によって改変されている、標的モチーフ；ならびに（ｅ）天然には標的モチーフの機能を有しない天然に存在するアミノ酸配列であって、天然に存在するアミノ酸配列は、少なくとも１つのアミノ酸の挿入、欠失、および／または置換によって任意選択で改変されている、天然に存在するアミノ酸配列、からなる群から選択され得る、組成物が本明細書において提供される。

【0100】

標的モチーフを含む組み換えＲＮＡコンストラクトを含む組成物であって、標的モチーフはシグナルペプチドである、組成物が本明細書において提供される。一部の実施形態において、シグナルペプチドは、（ａ）関心のある遺伝子によってコードされるタンパク質とは異種のシグナルペプチド；（ｂ）関心のある遺伝子によってコードされるタンパク質とは異種のシグナルペプチドであって、関心のある遺伝子によってコードされるタンパク質とは異種のシグナルペプチドは、タンパク質が酸化還元酵素ではないという条件で、少なくとも１つのアミノ酸の挿入、欠失、および／または置換によって改変されている、シグナルペプチド；（ｃ）関心のある遺伝子によってコードされるタンパク質と同種のシグナルペプチド；（ｄ）関心のある遺伝子によってコードされるタンパク質と同種のシグナルペプチドであって、関心のある遺伝子によってコードされるタンパク質と同種のシグナルペプチドは、少なくとも１つのアミノ酸の挿入、欠失、および／または置換によって改変されている、シグナルペプチド；ならびに（ｅ）天然にはシグナルペプチドの機能を有しない天然に存在するアミノ酸配列であって、天然に存在するアミノ酸配列は、少なくとも１つのアミノ酸の挿入、欠失、および／または置換によって任意選択で改変されている、天然に存在するアミノ酸配列、からなる群から選択される。一部の場合には、シグナルペプチドのＮ末端のアミノ酸１～９は、２より高い平均疎水性スコアを有する。

【0101】

一部の場合には、本明細書において使用される、関心のある遺伝子によってコードされるタンパク質とは異種の標的モチーフ、または関心のある遺伝子によってコードされるタンパク質とは異種のシグナルペプチドとは、タンパク質の天然に存在する標的モチーフまたはシグナルペプチドとは異なる、天然に存在する標的モチーフまたはシグナルペプチドを指し得る。例えば、標的モチーフまたはシグナルペプチドは、関心のある遺伝子に由来しない。通常、所与のタンパク質とは異種の標的モチーフまたはシグナルペプチドは、所与のタンパク質とは関係しない別のタンパク質由来の標的モチーフまたはシグナルペプチドである。例えば、所与のタンパク質とは異種の標的モチーフまたはシグナルペプチドは、所与のタンパク質の標的モチーフまたはシグナルペプチドのアミノ酸配列と５０％、６０％、７０％、８０％、９０％を上回って、または９５％を上回って異なるアミノ酸配列を有する。異種配列は、同じ生物体に由来し得るものの、それらは、天然に（天然には）、同じｍＲＮＡに等、同じ核酸分子に存在しない。タンパク質とは異種の標的モチーフまたはシグナルペプチド、および標的モチーフまたはシグナルペプチドがそれに対して異種であるタンパク質は、同じまたは異なる起源のものであり得る。一部の実施形態において、それらは真核生物起源のものである。一部の実施形態において、それらは、同じ真核生物生物体のものである。一部の実施形態において、それらは哺乳動物起源のものである。一部の実施形態において、それらは、同じ哺乳動物生物体のものである。一部の実施形態において、それらはヒト起源である。例えば、ＲＮＡコンストラクトは、ヒトＩＬ－４遺伝子、および別のヒトタンパク質のシグナルペプチドをコードする核酸配列を含み得る。一部の実施形態において、ＲＮＡコンストラクトは、タンパク質とは異種のシグナルペプチドを含み得、シグナルペプチドおよびタンパク質は、同じ起源のもの、すなわちヒト起源のものである。

【0102】

一部の場合には、本明細書において使用される、関心のある遺伝子によってコードされるタンパク質と同種の標的モチーフ、または関心のある遺伝子によってコードされるタンパク質と同種のシグナルペプチドとは、タンパク質の天然に存在する標的モチーフまたはシグナルペプチドを指し得る。タンパク質と同種の標的モチーフまたはシグナルペプチドは、それが天然に存在することから、タンパク質の遺伝子によってコードされる標的モチーフまたはシグナルペプチドである。タンパク質と同種の標的モチーフまたはシグナルペプチドは、通常、真核生物起源のものである。一部の実施形態において、タンパク質と同種の標的モチーフまたはシグナルペプチドは、哺乳動物起源のものである。一部の実施形態において、タンパク質と同種の標的モチーフまたはシグナルペプチドは、ヒト起源のものである。

【0103】

一部の場合には、本明細書において使用される、天然には標的モチーフの機能を有しない天然に存在するアミノ酸配列、または天然にはシグナルペプチドの機能を有しない天然に存在するアミノ酸配列とは、天然に存在し、天然に存在するいかなる標的モチーフまたはシグナルペプチドのアミノ酸配列とも同一でないアミノ酸配列を指し得る。天然には標的モチーフまたはシグナルペプチドの機能を有しない天然に存在するアミノ酸配列は、１０～５０個のアミノ酸長であり得る。一部の実施形態において、天然には標的モチーフまたはシグナルペプチドの機能を有しない天然に存在するアミノ酸配列は、真核生物起源のものであり、真核生物起源のいかなる標的モチーフまたはシグナルペプチドとも同一でない。一部の実施形態において、天然には標的モチーフまたはシグナルペプチドの機能を有しない天然に存在するアミノ酸配列は、哺乳動物起源のものであり、哺乳動物起源のいかなる標的モチーフまたはシグナルペプチドとも同一でない。一部の実施形態において、天然には標的モチーフまたはシグナルペプチドの機能を有しない天然に存在するアミノ酸配列は、ヒト起源のものであり、天然に存在するヒト起源のいかなる標的モチーフまたはシグナルペプチドとも同一でない。天然には標的モチーフまたはシグナルペプチドの機能を有しない天然に存在するアミノ酸配列は、通常、タンパク質のコード配列のアミノ酸配列である。本明細書において使用される「天然に存在する」、「天然の」、および「天然には」という用語は、等価の意味を有する。

【0104】

一部の場合には、本明細書において使用されるシグナルペプチドのＮ末端のアミノ酸１～９とは、シグナルペプチドのアミノ酸配列のＮ末端の最初の９個のアミノ酸を指し得る。類似的に、本明細書において使用されるシグナルペプチドのＮ末端のアミノ酸１～７とは、シグナルペプチドのアミノ酸配列のＮ末端の最初の７個のアミノ酸を指し得、シグナルペプチドのＮ末端のアミノ酸１～５とは、シグナルペプチドのアミノ酸配列のＮ末端の最初の５個のアミノ酸を指し得る。

【0105】

一部の場合には、少なくとも１つのアミノ酸の挿入、欠失、および／または置換によって改変されたアミノ酸配列とは、アミノ酸配列内に少なくとも１つのアミノ酸のアミノ酸置換、挿入、および／または欠失を含むアミノ酸配列を指し得る。例えば、関心のある遺伝子によってコードされるタンパク質とは異種の標的モチーフは、少なくとも１つのアミノ酸の挿入、欠失、および／もしくは置換によって改変され、または関心のある遺伝子によってコードされるタンパク質とは異種のシグナルペプチドは、本明細書において使用されるように、少なくとも１つのアミノ酸の挿入、欠失、および／もしくは置換によって改変され、その天然に存在するアミノ酸配列内に少なくとも１つのアミノ酸のアミノ酸置換、挿入、および／または欠失を含む、タンパク質とは異種の天然に存在する標的モチーフまたはシグナルペプチドのアミノ酸配列を指し得る。例えば、関心のある遺伝子によってコードされるタンパク質と同種の標的モチーフは、少なくとも１つのアミノ酸の挿入、欠失、および／もしくは置換によって改変され、または関心のある遺伝子によってコードされるタンパク質と同種のシグナルペプチドは、本明細書において使用されるように、少なくとも１つのアミノ酸の挿入、欠失、および／もしくは置換によって改変され、その天然に存在するアミノ酸配列内に少なくとも１つのアミノ酸のアミノ酸置換、挿入、および／または欠失を含む、タンパク質と同種の天然に存在する標的モチーフまたはシグナルペプチドを指し得る。一部の実施形態において、天然に存在するアミノ酸配列は、少なくとも１つのアミノ酸の挿入、欠失、および／または置換によって改変され得、天然に存在するアミノ酸配列は、その天然に存在するアミノ酸配列内に少なくとも１つのアミノ酸のアミノ酸置換、挿入、および／または欠失を含み得る。アミノ酸置換または置換とは、別のアミノ酸での、アミノ酸またはポリペプチド配列における特定の位置でのアミノ酸の置き換えを指し得る。例えば、置換Ｒ３４Ｋとは、３４位におけるアルギニン（ＡｒｇまたはＲ）がリジン（ＬｙｓまたはＫ）で置き換えられているポリペプチドを指す。先行する例に関して、３４Ｋは、リジン（ＬｙｓまたはＫ）での、３４位におけるアミノ酸の置換を示す。一部の実施形態において、複数の置換は、典型的にスラッシュによって分離される。例えば、Ｒ３４Ｋ／Ｌ３８Ｖとは、置換Ｒ３４ＫおよびＬ３８Ｖを含むバリアントを指す。アミノ酸挿入または挿入とは、アミノ酸またはポリペプチド配列における特定の位置でのアミノ酸の付加を指し得る。例えば、挿入－３４とは、３４位における挿入を指定する。アミノ酸欠失または欠失とは、アミノ酸またはポリペプチド配列における特定の位置でのアミノ酸の除去を指し得る。例えば、Ｒ３４－とは、３４位におけるアルギニン（ＡｒｇまたはＲ）の欠失を指定する。

【0106】

一部の場合には、欠失したアミノ酸は、－０．８、－０．７、－０．６、－０．５、－０．４、－０．３、－０．２、－０．１、０、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８を下回る、または１．９を下回る疎水性スコアを有するアミノ酸である。一部の場合には、置換するアミノ酸は、置換されたアミノ酸の疎水性スコアよりも高い疎水性スコアを有するアミノ酸である。例えば、置換するアミノ酸は、２．８以上または３．８以上の疎水性スコアを有するアミノ酸である。一部の場合には、挿入されたアミノ酸は、２．８以上または３．８以上の疎水性スコアを有するアミノ酸である。

【0107】

一部の場合には、本明細書に記載されるアミノ酸配列は、１～１５個のアミノ酸挿入、欠失、および／または置換を含み得る。一部の実施形態において、本明細書に記載されるアミノ酸配列は、１～７個のアミノ酸挿入、欠失、および／または置換を含み得る。一部の場合には、本明細書に記載されるアミノ酸配列は、アミノ酸挿入、欠失、および／または置換を含まなくてもよい。一部の場合には、本明細書に記載されるアミノ酸配列は、標的モチーフまたはシグナルペプチドのアミノ酸配列のＮ末端のアミノ酸１～３０の中に、１～１５個のアミノ酸挿入、欠失、および／または置換を含み得る。一部の実施形態において、本明細書に記載されるアミノ酸配列は、標的モチーフまたはシグナルペプチドのアミノ酸配列のＮ末端のアミノ酸１～３０の中に、１～９個のアミノ酸挿入、欠失、および／または置換を含み得る。一部の場合には、本明細書に記載されるアミノ酸配列は、標的モチーフまたはシグナルペプチドのアミノ酸配列のＮ末端のアミノ酸１～２０の中に、１～１５個のアミノ酸挿入、欠失、および／または置換を含み得る。一部の実施形態において、本明細書に記載されるアミノ酸配列は、標的モチーフまたはシグナルペプチドのアミノ酸配列のＮ末端のアミノ酸１～２０の中に、１～９個のアミノ酸挿入、欠失、および／または置換を含み得る。一部の場合には、本明細書に記載されるアミノ酸配列の少なくとも１つのアミノ酸は、欠失および／または置換によって任意選択で改変され得る。

【0108】

一部の場合には、改変されたシグナルペプチドのアミノ酸配列のＮ末端の最初の９個のアミノ酸の平均疎水性スコアは、改変なしのシグナルペプチドと比較して、１．０単位以上増加する。一部の場合には、疎水性（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ）スコアまたは疎水性（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃｉｔｙ）スコアは、本明細書においてハイドロパシースコアと同義的に使用され得、Ｋｙｔｅ－Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ尺度に従って算出される、アミノ酸の疎水性の程度を指し得る（Ｋｙｔｅ Ｊ．、Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ Ｒ．Ｆ．；Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５～１３２（１９８２））。Ｋｙｔｅ－Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ尺度に従ったアミノ酸疎水性スコアは、以下のとおりである：

【0109】

【0110】

一部の場合には、アミノ酸配列の平均疎水性スコアは、アミノ酸の数で割った、アミノ酸配列のアミノ酸のそれぞれについてのＫｙｔｅ－Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ尺度に従った疎水性スコアを足すことによって算出され得る。例えば、シグナルペプチドのアミノ酸配列のＮ末端のアミノ酸１～９の平均疎水性スコアは、９で割った、９個のアミノ酸のそれぞれについての疎水性スコアを足すことによって算出され得る。

【0111】

極性は、Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ極性指数（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ Ｊ．Ｍ．、Ｅｌｉｅｚｅｒ Ｎ．、Ｓｉｍｈａ Ｒ．；Ｊ．Ｔｈｅｏｒ．Ｂｉｏｌ．２１：１７０～２０１（１９６８））に従って算出される。一部の実施形態において、アミノ酸配列の平均極性は、アミノ酸の数で割った、アミノ酸配列のアミノ酸のそれぞれについてのＺｉｍｍｅｒｍａｎ極性指数に従って算出された極性値を足すことによって算出され得る。例えば、シグナルペプチドのアミノ酸配列のＮ末端のアミノ酸１～９の平均極性は、９で割った、Ｎ末端のアミノ酸１～９の９個のアミノ酸のそれぞれについての平均極性を足すことによって算出され得る。Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ極性指数に従ったアミノ酸の極性は、以下のとおりである：

【0112】

【0113】

一部の場合には、インスリン様成長因子１（ＩＧＦ－１）の天然に存在するシグナルペプチドは、１つまたは複数の置換、欠失、および／または挿入によって改変され得、ＩＧＦ－１の天然に存在するシグナルペプチドは、ＵｎｉｐｒｏｔデータベースにおいてＰ０５０１９としてのおよびＧｅｎｂａｎｋデータベースにおいてＮＭ＿００１１１１２８５．３としてのＩＧＦ－１アミノ酸配列のアミノ酸１～２０を指す。一部の場合には、ＩＧＦ－１シグナルペプチドのアミノ酸配列は、Ｇ２Ｌ、Ｋ３－、Ｓ５Ｌ、Ｔ９Ｌ、Ｑ１０Ｌ、およびＣ１５－からなる群から選択される１つまたは複数の置換、欠失、および／または挿入によって改変され得る。一部の実施形態において、野生型（ＷＴ）ＩＧＦ－１シグナルペプチドアミノ酸配列は、配列番号４６を含む配列を含む。一部の場合には、改変されたＩＧＦ－１シグナルペプチドは、配列番号４２に示されるＤＮＡ配列によってコードされる配列番号４１を含む配列を含むアミノ酸配列を有する。一部の場合には、改変されたＩＧＦ－１シグナルペプチドは、配列番号４９に示されるＤＮＡ配列によってコードされる配列番号４８を含む配列を含むアミノ酸配列を有する。

【0114】

配列番号４１
Ｍｅｔ－Ｌｅｕ－Ｉｌｅ－Ｌｅｕ－Ｌｅｕ－Ｌｅｕ－Ｐｒｏ－Ｌｅｕ－Ｌｅｕ－Ｌｅｕ－Ｐｈｅ－Ｌｙｓ－Ｃｙｓ－Ｐｈｅ－Ｃｙｓ－Ａｓｐ－Ｐｈｅ－Ｌｅｕ－Ｌｙｓ

【0115】

配列番号４２
ＡＴＧＣＴＧＡＴＴＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＣＣＣＴＧＣＴＧＣＴＧＴＴＣＡＡＧＴＧＣＴＴＣＴＧＣＧＡＣＴＴＣＣＴＧＡＡＡ

【0116】

配列番号４８
ＭＴＩＬＦＬＴＭＶＩＳＹＦＧＣＭＫＡ

【0117】

配列番号４９
ＡＴＧＡＣＣＡＴＣＣＴＧＴＴＴＣＴＧＡＣＡＡＴＧＧＴＣＡＴＣＡＧＣＴＡＣＴＴＣＧＧＣＴＧＣＡＴＧＡＡＧＧＣＣ

【0118】

一部の場合には、ＩＧＦ－１のプロ－ペプチドは改変され得る。一部の実施形態において、天然にはシグナルペプチドの機能を有しない、ＩＧＦ－１のプロ－ペプチドの天然に存在するアミノ酸配列（ＵｎｉｐｒｏｔデータベースＰ０５０１９として）は、プロ－ペプチドのＮ末端における隣接する２２～３１の１０個のアミノ酸残基（ＶＫＭＨＴＭＳＳＳＨ（配列番号４５））の欠失によって改変され、配列番号４４に示されるＤＮＡ配列によってコードされる配列番号４３に示されるアミノ酸配列を好ましくは有する。

【0119】

配列番号４３
Ｍｅｔ－Ｌｅｕ－Ｐｈｅ－Ｔｙｒ－Ｌｅｕ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ｃｙｓ－Ｌｅｕ－Ｌｅｕ－Ｔｈｒ－Ｐｈｅ－Ｔｈｒ－Ｓｅｒ－Ｓｅｒ－Ａｌａ－Ｔｈｒ－Ａｌａ

【0120】

配列番号４４
ＡＴＧＣＴＧＴＴＣＴＡＴＣＴＧＧＣＣＣＴＧＴＧＣＣＴＧＣＴＧＡＣＣＴＴＴＡＣＣＡＧＣＴＣＴＧＣＴＡＣＣＧＣＣ

【0121】

一部の場合には、ＩＧＦ－１のプロ－ペプチドをコードする核酸配列、および成熟ＩＧＦ－１をコードする核酸配列を含むが、ＩＧＦ－１のＥ－ペプチドをコードする核酸配列を含まないｍＲＮＡは、２７個のアミノ酸を有する、ヒトＩＧＦ－１のプロ－ペプチドをコードするヌクレオチド配列、および７０個のアミノ酸を有する成熟ヒトＩＧＦ－１をコードするヌクレオチド配列を含むが、ヒトＩＧＦ－１のＥ－ペプチドをコードするヌクレオチド配列を含まない、すなわちＥａ－、Ｅｂ－、またはＥｃ－ドメインをコードするヌクレオチド配列を含まないｍＲＮＡを指し得る。２７個のアミノ酸を有する、ヒトＩＧＦ－１のプロ－ペプチドをコードするヌクレオチド配列、および７０個のアミノ酸を有する成熟ヒトＩＧＦ－１をコードするヌクレオチド配列は、コドン最適化され得る。

【0122】

一部の場合には、インターロイキン４（ＩＬ－４）の天然に存在するシグナルペプチドは、１つまたは複数の置換、欠失、および／または挿入によって改変され得、ＩＬ－４の天然に存在するシグナルペプチドは、ＵｎｉｐｒｏｔデータベースにおいてＰ０５１１２としてのおよびＧｅｎｂａｎｋデータベースにおいてＮＭ＿０００５８９．４としてのＩＬ－４アミノ酸配列のアミノ酸１～２４を指す。一部の場合には、ＩＬ－４シグナルペプチドのアミノ酸配列は、１種または複数のアミノ酸残基の１つまたは複数の置換、欠失、および／または挿入によって改変され得る。

【0123】

一部の場合には、インターロイキン２（ＩＬ－２）の天然に存在するシグナルペプチドは、１つまたは複数の置換、欠失、および／または挿入によって改変され得、ＩＬ－２の天然に存在するシグナルペプチドは、ＵｎｉｐｒｏｔデータベースにおいてＰ６０５６８またはＱ０ＧＫ４３としてのおよびＧｅｎｂａｎｋデータベースにおいてＮＭ＿０００５８６．３としてのＩＬ－２アミノ酸配列のアミノ酸１～２０を指す。一部の場合には、ＩＬ－２シグナルペプチドのアミノ酸配列は、Ｙ２Ｌ、Ｒ３Ｋ、Ｒ３－、Ｍ４Ｌ、Ｑ５Ｌ、Ｓ８Ｌ、Ｓ８Ａ、－１３Ａ、Ｌ１４Ｔ、Ｌ１６Ａ、Ｖ１７－、およびＶ１７Ａからなる群から選択される１つまたは複数の置換、欠失、および／または挿入によって改変され得る。一部の場合には、野生型（ＷＴ）ＩＬ－２シグナルペプチドは、配列番号１１３を含むＤＮＡ配列によってコードされる。一部の場合には、改変されたＩＬ－２シグナルペプチドは、配列番号１１２を含む配列を含むアミノ酸配列を有する。一部の場合には、改変されたＩＬ－２シグナルペプチドは、配列番号１１４を含むＤＮＡ配列によってコードされる（Ｙ２Ｌ／Ｒ３－／Ｍ４Ｌ／Ｑ５Ｌ／Ｓ８Ａ／－Ａ１３／Ｌ１４Ｔ／Ｌ１６ＡおよびＶ１７Ａ）。

【0124】

一部の場合には、インターロイキン１２（ＩＬ－１２）の天然に存在するシグナルペプチドは、１つまたは複数の置換、欠失、および／または挿入によって改変され得、ＩＬ－１２の天然に存在するシグナルペプチドは、ＧｅｎｂａｎｋデータベースにおいてＮＭ＿０００８８２．４としてのまたはＧｅｎｂａｎｋデータベースにおいてＮＭ＿００２１８７．２としてのＩＬ－１２アミノ酸配列のアミノ酸１～２２を指す。一部の場合には、ＩＬ－１２シグナルペプチドのアミノ酸配列は、１種または複数のアミノ酸残基の１つまたは複数の置換、欠失、および／または挿入によって改変され得る。

【0125】

発現ベクター、およびＲＮＡコンストラクトの産生
本明細書に記載される組み換えＲＮＡコンストラクトをコードする組み換えポリ核酸コンストラクトを含む組成物が本明細書において提供される。第１のＲＮＡ配列、第２のＲＮＡ配列、およびリンカーＲＮＡ配列を含む組み換えＲＮＡコンストラクトをコードする組み換えポリ核酸コンストラクトを含む組成物であって、リンカーＲＮＡ配列は、第１のＲＮＡ配列と第２のＲＮＡ配列とを接続する、組成物が本明細書において提供される。一部の場合には、リンカーは、式（Ｉ）：Ｘ_ｍＣＡＡＣＡＡＸ_ｎ［式中、Ｘは任意のヌクレオチドであり、ｍは１～１２の整数であり、ｎは０～４の整数である］；および式（ＩＩ）：Ｘ_ｐＴＣＣＣＸ_ｒ［式中、Ｘは任意のヌクレオチドであり、ｐは０～１７の整数であり、ｒは０～１３の整数である］からなる群から独立して選択される構造を有する。一部の場合には、リンカーは、ＡＣＡＡＣＡＡ（配列番号２３）を含む配列を含み得る。一部の場合には、第１のＲＮＡ配列または第２のＲＮＡ配列は、関心のある遺伝子をコードし得る。一部の実施形態において、第１のＲＮＡ配列または第２のＲＮＡ配列は、関心のある遺伝子をコードするｍＲＮＡであり得る。一部の場合には、第１のＲＮＡ配列または第２のＲＮＡ配列は、標的ＲＮＡの発現をモジュレートする１種または複数の遺伝子エレメントを含み得る。一部の実施形態において、第１のＲＮＡ配列または第２のＲＮＡ配列は、それぞれが標的ＲＮＡに結合し得る１種または複数のｓｉＲＮＡを含み得る。例えば、関心のある遺伝子をコードするｍＲＮＡは、ＩＬ－４、ＩＬ－２、ＩＬ－１２またはＩＧＦ－１のｍＲＮＡであり得る。例えば、標的ＲＮＡは、ＴＮＦ－アルファｍＲＮＡ、ＡＬＫ２ ｍＲＮＡ、Ｔｕｒｂｏ ＧＦＰ ｍＲＮＡ、ＶＥＧＦＡ ｍＲＮＡ、ｃ－Ｍｙｃ ｍＲＮＡ、ＫＲＡＳ ｍＲＮＡ、Ａｋｔ１ ｍＲＮＡ、Ａｋｔ２ ｍＲＮＡ、またはＡｋｔ３ ｍＲＮＡであり得る。

【0126】

関連した態様において、組み換えＲＮＡコンストラクトをコードする組み換えポリ核酸コンストラクトは、１、２、３、４、５種、またはそれより多くのｓｉＲＮＡ種をコードし得る。関連した態様において、組み換えＲＮＡコンストラクトをコードする組み換えポリ核酸コンストラクトは、標的ｍＲＮＡに向けられた１種のｓｉＲＮＡ種をコードし得る。関連した態様において、組み換えＲＮＡコンストラクトをコードする組み換えポリ核酸コンストラクトは、それぞれが標的ｍＲＮＡに向けられた３種のｓｉＲＮＡをコードし得る。関連した態様において、ｓｉＲＮＡ種のそれぞれは、同じ配列、異なる配列、またはその組み合わせを含み得る。例えば、組み換えＲＮＡコンストラクトをコードする組み換えポリ核酸コンストラクトは、それぞれが、標的ｍＲＮＡの同じ領域または配列に向けられた３種のｓｉＲＮＡをコードし得る。例えば、組み換えＲＮＡコンストラクトをコードする組み換えポリ核酸コンストラクトは、それぞれが、標的ｍＲＮＡの異なる領域または配列に向けられた３種のｓｉＲＮＡをコードし得る。一部の態様において、組み換えＲＮＡコンストラクトをコードする組み換えポリ核酸コンストラクトは、３種のｓｉＲＮＡ種をコードし得、３種のｓｉＲＮＡ種のそれぞれは、異なる標的ｍＲＮＡに向けられる。一部の実施形態において、標的ｍＲＮＡは、ＴＮＦ－アルファ、ＡＬＫ２、Ｔｕｒｂｏ ＧＦＰ ｍＲＮＡ、ＶＥＧＦＡ ｍＲＮＡ、ｃ－Ｍｙｃ ｍＲＮＡ、ＫＲＡＳ ｍＲＮＡ、Ａｋｔ１ ｍＲＮＡ、Ａｋｔ２ ｍＲＮＡ、またはＡｋｔ３ ｍＲＮＡであり得る。関連した態様において、組み換えポリ核酸コンストラクトは、配列番号１０～１８および９３～１００からなる群から選択される配列を含み得る。

【0127】

本明細書に記載されるポリ核酸コンストラクトは、ＤＮＡ鎖を化学合成することによる、ＰＣＲによる、またはギブソン・アセンブリ法による等、当技術分野において公知の任意の方法によって獲得され得る。化学合成、またはＰＣＲ法の組み合わせ、またはギブソン・アセンブリ法によってポリ核酸コンストラクトを構築する利点は、融合タンパク質が宿主細胞において高いレベルで発現されることを確実にするように、コドンが最適化され得ることである。コドン最適化とは、関心のある宿主細胞における発現のために、その宿主細胞の遺伝子においてより高頻度にまたは最も高頻度に使用されるコドンで、天然配列の少なくとも１種のコドン（例えば、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、５０種より多くの、またはそれより多くのコドン）を置き換えることによって核酸配列を改変し、一方で天然アミノ酸配列を維持する過程を指し得る。コドン使用法の表は、例えば「Ｃｏｄｏｎ Ｕｓａｇｅ Ｄａｔａｂａｓｅ」で容易に入手可能であり、これらの表は、いくつかのやり方で適応され得る。特定の宿主細胞における発現のために、Ｇｅｎｅ Ｆｏｒｇｅ（登録商標）（Ａｐｔａｇｅｎ、ＰＡ）およびＧｅｎｅＯｐｔｉｍｉｚｅｒ（登録商標）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒ、ＭＡ）等、特定の配列をコドン最適化するためのコンピューターアルゴリズムも入手可能である。獲得され次第、ポリヌクレオチドは適切なベクターに組み入れられ得る。本明細書において使用されるベクターとは、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏにおける核酸の取り込み、増殖、発現、または伝達のための、天然に存在するまたは合成的に作出されたコンストラクト、例えばプラスミド、ミニサークル、ファージミド、コスミド、人工染色体／ミニ染色体、バクテリオファージ、バキュロウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、単純ヘルペスウイルス、バクテリオファージ等のウイルスを指し得る。ベクターを構築するために使用される方法は、当業者に周知であり、様々な刊行物に記載される。特に、プロモーター、エンハンサー、終結およびポリアデニル化シグナル、選択マーカー、複製の起点、ならびにスプライシングシグナル等の機能的および制御的成分の説明を含めた、適切なベクターを構築するための手法は、当業者に公知である。多様なベクターが当技術分野において周知であり、一部は、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、Ｃａｌｉｆ．；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆ．；Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；またはＩｎｖｉｖｏｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．等の会社から市販されている。ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写のためのベクターの非限定的な例は、ｐＴ７ＣＦＥ１－ＣＨｉｓ、ｐＭＸ（ｐＭＡ－Ｔ、ｐＭＡ－ＲＱ、ｐＭＣ、ｐＭＫ、ｐＭＳ、ｐＭＺ等）、ｐＥＶＬ、ｐＳＰ７３、ｐＳＰ７２、ｐＳＰ６４、およびｐＧＥＭ（ｐＧＥＭ（登録商標）－４Ｚ、ｐＧＥＭ（登録商標）－５Ｚｆ（＋）、ｐＧＥＭ（登録商標）－１１Ｚｆ（＋）、ｐＧＥＭ（登録商標）－９Ｚｆ（－）、ｐＧＥＭ（登録商標）－３Ｚｆ（＋／－）、ｐＧＥＭ（登録商標）－７Ｚｆ（＋／－）等）を含む。一部の場合には、組み換えポリ核酸コンストラクトはＤＮＡであり得る。

【0128】

本明細書に記載されるポリ核酸コンストラクトは、環状または線状であり得る。例えば、環状ポリ核酸コンストラクトは、ｐＭＸ、ｐＭＡ－Ｔ、ｐＭＡ－ＲＱ、またはｐＴ７ＣＦＥ１－ＣＨｉｓ等のベクターシステムを含み得る。例えば、線状ポリ核酸コンストラクトは、ｐＥＶＬ等の線状ベクター、または線状化ベクターを含み得る。一部の場合には、組み換えポリ核酸コンストラクトは、プロモーターをさらに含み得る。一部の場合には、プロモーターは、第１のＲＮＡ配列および第２のＲＮＡ配列をコードする配列の上流またはそれに対して５’に存在し得る。プロモーターの非限定的な例は、Ｔ３、Ｔ７、ＳＰ６、Ｐ６０、Ｓｙｎ５、およびＫＰ３４を含み得る。一部の場合には、本明細書において提供される組み換えポリ核酸コンストラクトは、ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡ（配列番号２０）を含む配列を含むＴ７プロモーターを含み得る。一部の場合には、組み換えポリ核酸コンストラクトは、コザック配列をコードする配列をさらに含む。コザック配列とは、タンパク質翻訳開始部位として機能する核酸配列モチーフを指し得る。コザック配列は、文献において、例えば本明細書における参照によりその全体として本明細書に組み入れられる、Ｋｏｚａｋ，Ｍ．、Ｇｅｎｅ ２９９（１－２）：１～３４によって詳細に記載される。一部の実施形態において、組み換えポリ核酸コンストラクトは、ＧＣＣＡＣＣ（配列番号１９）を含む配列を含むコザック配列をコードする配列を含む。一部の場合には、本明細書に記載される組み換えポリ核酸コンストラクトは、コドン最適化されていてもよい。

【0129】

標的ＲＮＡに結合し得るｓｉＲＮＡをコードする１種または複数の核酸配列と、関心のある遺伝子をコードする１種または複数の核酸配列とを含む、本明細書に記載されるＲＮＡコンストラクトをコードする組み換えポリ核酸コンストラクトを含む組成物であって、標的ＲＮＡに結合し得るｓｉＲＮＡは、関心のある遺伝子によってコードされるイントロン配列の一部ではない、組成物が本明細書において提供される。一部の場合には、関心のある遺伝子は、ＲＮＡスプライシングなしで発現される。一部の場合には、標的ＲＮＡに結合し得るｓｉＲＮＡは、関心のある遺伝子のイントロン配列によってコードされないまたはそれから構成されない。一部の場合には、標的ＲＮＡに結合し得るｓｉＲＮＡは、標的ｍＲＮＡのエクソンに結合する。一部の場合には、標的ＲＮＡに結合し得るｓｉＲＮＡは、１種の標的ＲＮＡに特異的に結合する。一部の場合には、組み換えポリ核酸コンストラクトは、配列番号１０～１８および１０１～１０８からなる群から選択される配列を含む核酸配列を含み得る。

【0130】

本明細書に記載されるＲＮＡコンストラクト組成物を産生する方法が本明細書において提供される。例えば、組み換えＲＮＡコンストラクトは、ＲＮＡポリメラーゼに対するプロモーター、関心のある遺伝子をコードする少なくとも１種の核酸配列、標的ｍＲＮＡに結合し得るｓｉＲＮＡをコードする少なくとも１種の核酸配列、およびポリ（Ａ）テールをコードする核酸配列、を含むポリ核酸コンストラクトからのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写によって産生され得る。ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写反応は、ＲＮＡポリメラーゼ、ヌクレオチドトリホスフェートの混合物（ＮＴＰ）、および／またはキャッピング酵素をさらに含み得る。ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写を使用してＲＮＡを産生すること、ならびに転写ＲＮＡを単離することおよび精製することについての詳細は、当技術分野において周知であり、例えばＢｅｃｋｅｒｔ＆Ｍａｓｑｕｉｄａ（（２０１１）Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ＲＮＡ ｂｙ Ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ．ＲＮＡ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ）、第７０３巻．Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ）に見出され得る。ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写産物キットの非限定的なリストは、ＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ（商標）Ｔ３転写キット、ＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ Ｔ７キット、ＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ（商標）ＳＰ６転写キット、ＭＡＸＩｓｃｒｉｐｔ（商標）Ｔ３転写キット、ＭＡＸＩｓｃｒｉｐｔ（商標）Ｔ７転写キット、ＭＡＸＩｓｃｒｉｐｔ（商標）ＳＰ６転写キット、ＭＡＸＩｓｃｒｉｐｔ（商標）Ｔ７／Ｔ３転写キット、ＭＡＸＩｓｃｒｉｐｔ（商標）ＳＰ６／Ｔ７転写キット、ｍＭＥＳＳＡＧＥ ｍＭＡＣＨＩＮＥ（商標）Ｔ３転写キット、ｍＭＥＳＳＡＧＥ ｍＭＡＣＨＩＮＥ（商標）Ｔ７転写キット、ｍＭＥＳＳＡＧＥ ｍＭＡＣＨＩＮＥ（商標）ＳＰ６転写キット、ＭＥＧＡｓｈｏｒｔｓｃｒｉｐｔ（商標）Ｔ７転写キット、ＨｉＳｃｒｉｂｅ（商標）Ｔ７ Ｈｉｇｈ Ｙｉｅｌｄ ＲＮＡ合成キット、ＨｉＳｃｒｉｂｅ（商標）Ｔ７ Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ転写キット、ＡｍｐｌｉＳｃｒｉｂｅ（商標）Ｔ７－Ｆｌａｓｈ（商標）転写キット、ＡｍｐｌｉＳｃｒｉｂｅ（商標）Ｔ７ Ｈｉｇｈ Ｙｉｅｌｄ転写キット、ＡｍｐｌｉＳｃｒｉｂｅ（商標）Ｔ７－Ｆｌａｓｈ（商標）ビオチン－ＲＮＡ転写キット、Ｔ７転写キット、ＨｉｇｈＹｉｅｌｄ Ｔ７ ＲＮＡ合成キット、ＤｕｒａＳｃｒｉｂｅ（登録商標）Ｔ７転写キット等を含む。

【0131】

ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写反応は、転写バッファーシステム、ヌクレオチドトリホスフェート（ＮＴＰ）、およびＲＮａｓｅ阻害剤をさらに含み得る。一部の実施形態において、転写バッファーシステムは、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）およびマグネシウムイオンを含み得る。ＮＴＰは、天然に存在するまたは天然に存在しない（修飾された）ＮＴＰであり得る。天然に存在しない（修飾された）ＮＴＰの非限定的な例は、Ｎ^１－メチルシュードウリジン、シュードウリジン、Ｎ^１－エチルシュードウリジン、Ｎ^１－メトキシメチルシュードウリジン、Ｎ^１－プロピルシュードウリジン、２－チオウリジン、４－チオウリジン、５－メトキシウリジン、５－メチルウルジン（ｍｅｔｈｙｌｕｒｄｉｎｅ）、５－カルボキシメチルエステルウリジン、５－ホルミルウリジン、５－カルボキシウリジン、５－ヒドロキシウリジン、５－ブロモウリジン、５－ヨードウリジン、５，６－ジヒドロウリジン、６－アザウリジン、チエノウリジン、３－メチルウリジン、１－カルボキシメチル－シュードウリジン、４－チオ－１－メチル－シュードウリジン、２－チオ－１－メチル－シュードウリジン、ジヒドロウリジン、ジヒドロシュードウリジン、２－メトキシウリジン、２－メトキシ－４－チオ－ウリジン、４－メトキシ－シュードウリジン、４－メトキシ－２－チオ－シュードウリジン、５－メチルシチジン、５－メトキシシチジン、５－ヒドロキシメチルシチジン、５－ホルミルシチジン、５－カルボキシシチジン、５－ヒドロキシシチジン、５－ヨードシチジン、５－ブロモシチジン、２－チオシチジン、５－アザシチジン、シュードイソシチジン、３－メチル－シチジン、Ｎ^４－アセチルシチジン、５－ホルミルシチジン、Ｎ^４－メチルシチジン、５－ヒドロキシメチルシチジン、１－メチル－シュードイソシチジン、４－メトキシ－シュードイソシチジン、および４－メトキシ－１－メチル－シュードイソシチジン、Ｎ^１－メチルアデノシン、Ｎ^６－メチルアデノシン、Ｎ^６－メチル－２－アミノアデノシン、Ｎ^６－イソペンテニルアデノシン、Ｎ^６，Ｎ^６－ジメチルアデノシン、７－メチルアデニン、２－メチルチオ－アデニン、ならびに２－メトキシ－アデニンを含む。ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの非限定的な例は、Ｔ３、Ｔ７、ＳＰ６、Ｐ６０、Ｓｙｎ５、およびＫＰ３４ ＲＮＡポリメラーゼを含む。一部の実施形態において、ＲＮＡポリメラーゼは、Ｔ３ ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ、Ｐ６０ ＲＮＡポリメラーゼ、Ｓｙｎ５ ＲＮＡポリメラーゼ、およびＫＰ３４ ＲＮＡポリメラーゼからなる群から選択される。

【0132】

本明細書に記載される転写ＲＮＡは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写反応混合物から単離され得、精製され得る。例えば、転写ＲＮＡは、カラム精製を使用して単離され得、精製され得る。ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写反応混合物から転写ＲＮＡを単離することおよび精製することについての詳細は、当技術分野において周知であり、任意の市販のキットが使用され得る。ＲＮＡ精製キットの非限定的なリストは、ＭＥＧＡｃｌｅａｒキット、Ｍｏｎａｒｃｈ（登録商標）ＲＮＡ Ｃｌｅａｎｕｐキット、ＥａｓｙＰｕｒｅ（登録商標）ＲＮＡ精製キット、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）ＲＮＡ Ｃｌｅａｎ－ｕｐ等を含む。

【0133】

治療的適用
疾患または病状の治療において有用な組成物が本明細書において提供される。一部の態様において、組成物は、疾患または病状を治療するまたは阻止するのに十分な量で存在するまたは投与される。一部の態様において、本明細書に記載される組成物または薬学的組成物をそれを必要とする対象に投与することを含む、疾患または病状を治療する方法が本明細書において提供される。一部の態様において、それを必要とする対象における疾患または病状を治療する方法における使用のための、本明細書に記載される組成物または薬学的組成物が本明細書において提供される。一部の態様において、それを必要とする対象における疾患または病状を治療するための医薬の製造のための、本明細書に記載される組成物または薬学的組成物の使用が本明細書において提供される。一部の実施形態において、疾患または病状は、皮膚疾患または病状を含む。一部の実施形態において、皮膚疾患または病状は炎症性皮膚障害を含む。一部の実施形態において、炎症性皮膚障害は乾癬を含む。一部の実施形態において、疾患または病状は、筋肉疾患または病状を含む。一部の実施形態において、筋肉疾患または病状は骨格筋障害を含む。一部の実施形態において、骨格筋障害は進行性骨化性線維異形成症（ＦＯＰ）を含む。一部の実施形態において、疾患または病状はがんを含む。一部の実施形態において、がんは、膠芽細胞腫、ヒト舌扁平上皮癌、ヒト肺癌、またはヒト単球白血病を含む。第１のＲＮＡ配列、第２のＲＮＡ配列、およびリンカーＲＮＡ配列を含む組み換えポリ核酸またはＲＮＡコンストラクト組成物であって、リンカーＲＮＡ配列は、第１のＲＮＡ配列と第２のＲＮＡ配列とを連結する、組み換えポリ核酸またはＲＮＡコンストラクト組成物が本明細書において提供される。一部の場合には、第１のＲＮＡ配列または第２のＲＮＡ配列は、関心のある遺伝子をコードし得る。一部の実施形態において、関心のある遺伝子は、ＩＬ－４、ＩＬ－２、ＩＬ－１２またはＩＧＦ－１を含み得る。一部の場合には、第１のＲＮＡ配列または第２のＲＮＡ配列は、本明細書に記載される疾患または病状と関連した遺伝子の発現を低下させ得る遺伝子エレメントを含み得る。一部の実施形態において、疾患または病状と関連した遺伝子の発現を低下させ得る遺伝子エレメントは、ＴＮＦ－アルファｍＲＮＡまたは機能的バリアントを標的にするｓｉＲＮＡを含み得る。一部の実施形態において、疾患または病状と関連した遺伝子の発現を低下させ得る遺伝子エレメントは、ＡＬＫ２ ｍＲＮＡまたは機能的バリアントを標的にするｓｉＲＮＡを含み得る。一部の実施形態において、疾患または病状と関連した遺伝子の発現を低下させ得る遺伝子エレメントは、ＶＥＧＦＡ ｍＲＮＡまたは機能的バリアントを標的にするｓｉＲＮＡを含み得る。一部の実施形態において、疾患または病状と関連した遺伝子の発現を低下させ得る遺伝子エレメントは、ｃ－Ｍｙｃ ｍＲＮＡまたは機能的バリアントを標的にするｓｉＲＮＡを含み得る。一部の実施形態において、疾患または病状と関連した遺伝子の発現を低下させ得る遺伝子エレメントは、ＫＲＡＳ ｍＲＮＡまたは機能的バリアントを標的にするｓｉＲＮＡを含み得る。一部の実施形態において、疾患または病状と関連した遺伝子の発現を低下させ得る遺伝子エレメントは、Ａｋｔ１ ｍＲＮＡまたは機能的バリアントを標的にするｓｉＲＮＡを含み得る。一部の実施形態において、疾患または病状と関連した遺伝子の発現を低下させ得る遺伝子エレメントは、Ａｋｔ２ ｍＲＮＡまたは機能的バリアントを標的にするｓｉＲＮＡを含み得る。一部の実施形態において、疾患または病状と関連した遺伝子の発現を低下させ得る遺伝子エレメントは、Ａｋｔ３ ｍＲＮＡまたは機能的バリアントを標的にするｓｉＲＮＡを含み得る。

【0134】

本明細書に記載される任意の組み換えＲＮＡコンストラクト組成物、および薬学的に許容される添加物を含む薬学的組成物も本明細書において提供される。薬学的組成物とは、それを必要とする対象に投与されるべき１種または複数の薬学的に許容される添加物と一緒に医薬品有効成分の治療的有効量を含む混合物または溶液を表し得る。「薬学的に許容される」という用語は、一般的に安全であり、非毒性であり、生物学的にもそれ以外の点でも非所望でなく、獣医学的ならびにヒト薬学的使用に許容される薬学的組成物を調製することにおいて有用である材料の性質を表す。「薬学的に許容される」という用語は、化合物の生物活性または特性を破棄せず、比較的非毒性である、担体または希釈剤等の材料を指し得る、すなわち、材料は、非所望の生物学的効果を引き起こすことなく、またはそれが含有される組成物の成分のいずれとも有害な様式で相互作用することなく、個体に投与され得る。薬学的に許容される添加物とは、薬学的製品を製剤化することにおいて使用される崩壊剤、結合剤、充填剤、溶媒、バッファー、等張化剤、安定剤、抗酸化剤、界面活性剤、担体、希釈剤、添加物、防腐剤、または潤滑剤等、治療活性を有せず、投与される対象に非毒性である、薬学的組成物における任意の薬学的に許容される構成成分を表し得る。薬学的組成物は、生物体への化合物の投与を促し得、薬学的に使用され得る調製物への活性化合物のプロセシングを促す１種または複数の薬学的に許容される不活性構成成分を使用して従来的様式で製剤化され得る。適正な製剤化は、選定される投与の経路に依存し、薬学的組成物の概要は、参照により本明細書に組み入れられる、例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ、第１９編（Ｅａｓｔｏｎ、Ｐａ．：Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、１９９５）；Ｈｏｏｖｅｒ，Ｊｏｈｎ Ｅ．、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ １９７５；Ｌｉｂｅｒｍａｎ，Ｈ．Ａ．およびＬａｃｈｍａｎ，Ｌ．編、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｃｋｅｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．、１９８０；ならびにＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ、第７編（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ １９９９）に見出され得る。一部の実施形態において、薬学的組成物は、疾患組織または疾患細胞への注射のための水溶液に活性物質（例えば、本明細書に記載される組み換えポリ核酸またはＲＮＡコンストラクト）を溶解することによって製剤化され得る。一部の実施形態において、薬学的組成物は、疾患組織または疾患細胞への直接注射のための水溶液に活性物質（例えば、本明細書に記載される組み換えポリ核酸またはＲＮＡコンストラクト）を溶解することによって製剤化され得る。

【0135】

本明細書に記載されるポリ核酸コンストラクトまたは組み換えＲＮＡコンストラクト組成物または薬学的組成物の治療的有効量を対象に投与することを含む、それを必要とする対象における疾患または病状を治療する方法も本明細書において提供される。本明細書において使用される「有効量」または「治療的有効量」という用語は、治療されている疾患または病状の症状の１つまたは複数をある程度軽減するであろう、投与されている薬剤または化合物の十分な量を指す；例えば、疾患の１つもしくは複数の兆候、症状、もしくは原因の低下および／もしくは緩和、または生物学的システムの任意の他の所望の変更。例えば、治療的使用のための「有効量」とは、１つまたは複数の病徴の臨床的に有意な減少を提供する薬剤の量であり得る。適当な「有効な」量は、個々の症例において、用量漸増調査等の手法を使用して判定され得る。

【0136】

本明細書において使用される「治療する」、「治療すること」、または「治療」という用語は、疾患もしくは病状の少なくとも１つの症状を緩和すること、鎮めること、もしくは改善すること、付加的な症状を阻止すること、疾患もしくは病状を阻害すること、例えば疾患もしくは病状の発症を停止させること、疾患もしくは病状を軽減すること、疾患もしくは病状の後退を引き起こすこと、疾患もしくは病状によって引き起こされた病状を軽減すること、または予防的にかつ／もしくは治療的に疾患もしくは病状の症状を食い止めることを含む。一部の実施形態において、疾患または病状を治療することは、疾患組織または疾患細胞のサイズを低下させることを含む。一部の実施形態において、対象における疾患または病状を治療することは、対象の生存期間を増加させることを含む。一部の実施形態において、疾患または病状を治療することは、疾患の重症度を低下させることもしくは改善すること、疾患の発生を遅延させること、疾患の進行を阻害すること、対象に対する入院期間もしくは入院期間の長さを低下させること、対象の生活の質を向上させること、疾患と関連した症状の数を低下させること、疾患と関連した症状の重症度を低下させることもしくは改善すること、疾患と関連した症状の継続期間を低下させること、疾患と関連した症状の再発を阻止すること、疾患の症状の発症もしくは発生を阻害すること、または疾患と関連した症状の進行を阻害することを含む。一部の実施形態において、がんを治療することは、腫瘍のサイズを低下させること、またはがんを有する患者の生存期間を増加させることを含む。

【0137】

一部の場合には、対象は哺乳動物を包含し得る。哺乳動物の例は、哺乳動物綱の任意のメンバー：ヒト、非ヒト霊長類、例えばチンパンジー、ならびに他の類人猿およびサル種；ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタ等の家畜；ウサギ、イヌ、およびネコ等の家庭用動物；ラット、マウス、およびモルモット等のげっ歯類を含めた実験室用動物を含むが、それらに限定されるわけではない。一部の場合には、哺乳動物はヒトである。一部の場合には、対象は動物であり得る。一部の場合には、動物は、人間および非ヒト動物を含み得る。１つの実施形態において、非ヒト動物は、哺乳動物、例えばラットまたはマウス等のげっ歯類であり得る。別の実施形態において、非ヒト動物はマウスであり得る。一部の場合には、対象は哺乳動物である。一部の場合には、対象はヒトである。一部の場合には、対象は、成人、子ども、または幼児である。一部の場合には、対象は伴侶動物である。一部の場合には、対象は、ネコ、イヌ、またはげっ歯類である。一部の場合には、対象は、イヌまたはネコである。

【0138】

一部の態様において、関心のある遺伝子をコードするｍＲＮＡ、および標的ｍＲＮＡに結合し得るｓｉＲＮＡを含む、本明細書に記載される組み換えＲＮＡコンストラクト組成物または薬学的組成物を対象に投与することを含む、対象における疾患または病状を治療する方法が本明細書において提供される。一部の実施形態において、標的ｍＲＮＡは、ＴＮＦ－アルファ、ＡＬＫ２、ＶＥＧＦＡ、ｃ－Ｍｙｃ、ＫＲＡＳ、Ａｋｔ１、Ａｋｔ２、Ａｋｔ３、またはその機能的バリアントのｍＲＮＡを含む。一部の実施形態において、関心のある遺伝子をコードするｍＲＮＡは、ＩＧＦ－１またはその機能的バリアントをコードする。一部の実施形態において、関心のある遺伝子をコードするｍＲＮＡはサイトカインをコードする。一部の実施形態において、サイトカインは、ＩＬ－４またはその機能的バリアントである。一部の実施形態において、サイトカインは、ＩＬ－２またはその機能的バリアントである。一部の実施形態において、関心のある遺伝子をコードするｍＲＮＡはサイトカインをコードする。一部の実施形態において、サイトカインは、ＩＬ－１２またはその機能的バリアントである。

【0139】

一部の態様において、対象における疾患または病状を治療する方法であって、方法は、ＩＬ－４をコードするｍＲＮＡ、およびＴＮＦ－アルファのｍＲＮＡに結合し得るｓｉＲＮＡを含む、本明細書に記載される組み換えＲＮＡ組成物または薬学的組成物を対象に投与することを含む、方法が本明細書において提供される。一部の態様において、対象における疾患または病状を治療する方法であって、方法は、ＩＧＦ－１をコードするｍＲＮＡ、およびＡＬＫ２のｍＲＮＡに結合し得るｓｉＲＮＡを含む、本明細書に記載される組み換えＲＮＡコンストラクト組成物または薬学的組成物を対象に投与することを含む、方法が本明細書において提供される。一部の態様において、対象における疾患または病状を治療する方法であって、方法は、ＩＬ－２をコードするｍＲＮＡ、およびＶＥＧＦＡのｍＲＮＡに結合し得るｓｉＲＮＡを含む、本明細書に記載される組み換えＲＮＡコンストラクト組成物または薬学的組成物を対象に投与することを含む、方法が本明細書において提供される。一部の態様において、対象における疾患または病状を治療する方法であって、方法は、ＩＬ－１２をコードするｍＲＮＡ、ならびにｃ－Ｍｙｃ、ＫＲＡＳ、Ａｋｔ１、Ａｋｔ２、および／またはＡｋｔ２のｍＲＮＡに結合し得るｓｉＲＮＡを含む、本明細書に記載される組み換えＲＮＡコンストラクト組成物または薬学的組成物を対象に投与することを含む、方法が本明細書において提供される。一部の態様において、対象における疾患または病状を治療する方法であって、方法は、ＩＬ－１２をコードするｍＲＮＡ、ならびにｃ－Ｍｙｃ、ＫＲＡＳ、Ａｋｔ１、Ａｋｔ２、およびＡｋｔ２のｍＲＮＡに結合し得るｓｉＲＮＡを含む、本明細書に記載される組み換えＲＮＡコンストラクト組成物または薬学的組成物を対象に投与することを含む、方法が本明細書において提供される。一部の実施形態において、疾患または病状は、皮膚疾患もしくは病状、筋肉疾患もしくは病状、またはがんを含む。一部の実施形態において、疾患または病状は、皮膚疾患もしくは病状、または筋肉疾患もしくは病状を含む。一部の実施形態において、皮膚疾患または病状は炎症性皮膚障害を含む。一部の実施形態において、炎症性皮膚障害は乾癬を含む。一部の実施形態において、筋肉疾患または病状は骨格筋障害を含む。一部の実施形態において、骨格筋障害は進行性骨化性線維異形成症（ＦＯＰ）を含む。一部の実施形態において、疾患または病状はがんを含む。一部の実施形態において、がんは、膠芽細胞腫、ヒト舌扁平上皮癌、ヒト肺癌、またはヒト単球白血病を含む。

【0140】

一部の態様において、それを必要とする対象に投与される組成物または薬学的組成物は、（ｉ）ＩＬ－４ ｍＲＮＡと；（ｉｉ）ＴＮＦ－アルファｍＲＮＡに結合し得る少なくとも１種のｓｉＲＮＡとを含む組み換えポリ核酸コンストラクトまたはＲＮＡコンストラクトを含む。関連した態様において、組み換えポリ核酸コンストラクトまたはＲＮＡコンストラクトは、少なくとも１、２、３、４、５、６種、またはそれより多くのｓｉＲＮＡをコードし得るまたは含み得る。関連した態様において、組み換えポリ核酸コンストラクトまたはＲＮＡコンストラクトは、ＴＮＦ－アルファｍＲＮＡに向けられた１種のｓｉＲＮＡをコードし得るまたは含み得る。関連した態様において、組み換えポリ核酸コンストラクトまたはＲＮＡコンストラクトは、それぞれがＴＮＦ－アルファｍＲＮＡに向けられた３種のｓｉＲＮＡをコードし得るまたは含み得る。関連した態様において、少なくとも３種のｓｉＲＮＡのそれぞれは、同じであり得る、異なり得る、またはその組み合わせであり得る。関連した態様において、組み換えＲＮＡコンストラクトは、配列番号１、配列番号２、配列番号７６または配列番号７７（Ｃｐｄ．１またはＣｐｄ．２）に明記される配列を含み得る。関連した態様において、組み換えポリ核酸コンストラクトは、配列番号１０または配列番号１１（Ｃｐｄ．１またはＣｐｄ．２）に明記される配列を含み得る。

【0141】

一部の態様において、それを必要とする対象に投与される組成物または薬学的組成物は、（ｉ）ＩＧＦ－１ ｍＲＮＡと；（ｉｉ）ＡＬＫ２ ｍＲＮＡに結合し得る少なくとも１種のｓｉＲＮＡとを含む組み換えポリ核酸コンストラクトまたはＲＮＡコンストラクトを含む。関連した態様において、組み換えポリ核酸コンストラクトまたはＲＮＡコンストラクトは、少なくとも１、２、３、４、５、６種、またはそれより多くのｓｉＲＮＡをコードし得るまたは含み得る。関連した態様において、組み換えポリ核酸コンストラクトまたはＲＮＡコンストラクトは、ＡＬＫ２ ｍＲＮＡに向けられた１種のｓｉＲＮＡをコードし得るまたは含み得る。関連した態様において、組み換えポリ核酸コンストラクトまたはＲＮＡコンストラクトは、それぞれがＡＬＫ２ ｍＲＮＡに向けられた３種のｓｉＲＮＡをコードし得るまたは含み得る。関連した態様において、少なくとも３種のｓｉＲＮＡのそれぞれは、同じであり得る、異なり得る、またはその組み合わせであり得る。関連した態様において、組み換えＲＮＡコンストラクトは、配列番号３、配列番号４、配列番号７８、または配列番号７９（Ｃｐｄ．３またはＣｐｄ．４）に明記される配列を含み得る。関連した態様において、組み換えポリ核酸コンストラクトは、配列番号１２、または配列番号１３（Ｃｐｄ．３またはＣｐｄ．４）に明記される配列を含み得る。

【0142】

一部の態様において、それを必要とする対象に投与される組成物または薬学的組成物は、（ｉ）ＩＧＦ－１ ｍＲＮＡと；（ｉｉ）Ｔｕｒｂｏ ＧＦＰ ｍＲＮＡに結合し得る少なくとも１種のｓｉＲＮＡとを含む組み換えポリ核酸コンストラクトまたはＲＮＡコンストラクトを含む。関連した態様において、組み換えポリ核酸コンストラクトまたはＲＮＡコンストラクトは、少なくとも１、２、３、４、５、６種、またはそれより多くのｓｉＲＮＡをコードし得るまたは含み得る。関連した態様において、組み換えポリ核酸コンストラクトまたはＲＮＡコンストラクトは、Ｔｕｒｂｏ ＧＦＰ ｍＲＮＡに向けられた１種のｓｉＲＮＡをコードし得るまたは含み得る。関連した態様において、組み換えポリ核酸コンストラクトまたはＲＮＡコンストラクトは、それぞれがＴｕｒｂｏ ＧＦＰ ｍＲＮＡに向けられた３種のｓｉＲＮＡをコードし得るまたは含み得る。関連した態様において、少なくとも３種のｓｉＲＮＡのそれぞれは、同じであり得る、異なり得る、またはその組み合わせであり得る。関連した態様において、組み換えＲＮＡコンストラクトは、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、または配列番号８４（Ｃｐｄ．５～Ｃｐｄ．９）に明記される配列を含み得る。関連した態様において、組み換えポリ核酸コンストラクトは、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、または配列番号１８（Ｃｐｄ．５～Ｃｐｄ．９）に明記される配列を含み得る。

【0143】

一部の態様において、それを必要とする対象に投与される組成物または薬学的組成物は、（ｉ）ＩＬ－２ ｍＲＮＡと；（ｉｉ）ＶＥＧＦＡ ｍＲＮＡに結合し得る少なくとも１種のｓｉＲＮＡとを含む組み換えポリ核酸コンストラクトまたはＲＮＡコンストラクトを含む。関連した態様において、組み換えポリ核酸コンストラクトまたはＲＮＡコンストラクトは、少なくとも１、２、３、４、５、６種、またはそれより多くのｓｉＲＮＡをコードし得るまたは含み得る。関連した態様において、組み換えポリ核酸コンストラクトまたはＲＮＡコンストラクトは、ＶＥＧＦＡ ｍＲＮＡに向けられた１種のｓｉＲＮＡをコードし得るまたは含み得る。関連した態様において、組み換えポリ核酸コンストラクトまたはＲＮＡコンストラクトは、それぞれがＶＥＧＦＡ ｍＲＮＡに向けられた３種のｓｉＲＮＡをコードし得るまたは含み得る。関連した態様において、少なくとも３種のｓｉＲＮＡのそれぞれは、同じであり得る、異なり得る、またはその組み合わせであり得る。関連した態様において、組み換えＲＮＡコンストラクトは、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、または配列番号１０６（Ｃｐｄ．１０、Ｃｐｄ．１１、Ｃｐｄ．１２、Ｃｐｄ．１３、Ｃｐｄ．１４、またはＣｐｄ．１５）に明記される配列を含み得る。関連した態様において、組み換えポリ核酸コンストラクトは、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、または配列番号９８（Ｃｐｄ．１０、Ｃｐｄ．１１、Ｃｐｄ．１２、Ｃｐｄ．１３、Ｃｐｄ．１４、またはＣｐｄ．１５）に明記される配列を含み得る。

【0144】

一部の態様において、それを必要とする対象に投与される組成物または薬学的組成物は、（ｉ）ＩＬ－１２ ｍＲＮＡと；（ｉｉ）ｃ－Ｍｙｃ、ＫＲＡＳ、Ａｋｔ１、Ａｋｔ２、および／またはＡｋｔ３ ｍＲＮＡに結合し得る少なくとも１種のｓｉＲＮＡとを含む組み換えポリ核酸コンストラクトまたはＲＮＡコンストラクトを含む。関連した態様において、組み換えポリ核酸コンストラクトまたはＲＮＡコンストラクトは、少なくとも１、２、３、４、５、６種、またはそれより多くのｓｉＲＮＡをコードし得るまたは含み得る。関連した態様において、組み換えポリ核酸コンストラクトまたはＲＮＡコンストラクトは、ｃ－Ｍｙｃ、ＫＲＡＳ、Ａｋｔ１、Ａｋｔ２、および／またはＡｋｔ３ ｍＲＮＡに向けられた１種のｓｉＲＮＡをコードし得るまたは含み得る。関連した態様において、組み換えポリ核酸コンストラクトまたはＲＮＡコンストラクトは、それぞれがｃ－Ｍｙｃ、ＫＲＡＳ、Ａｋｔ１、Ａｋｔ２、および／またはＡｋｔ３ ｍＲＮＡに向けられた３種のｓｉＲＮＡをコードし得るまたは含み得る。関連した態様において、少なくとも３種のｓｉＲＮＡのそれぞれは、同じであり得る、異なり得る、またはその組み合わせであり得る。関連した態様において、組み換えポリ核酸またはＲＮＡコンストラクトは、それぞれが、ｃ－Ｍｙｃ、ＫＲＡＳ、Ａｋｔ１、Ａｋｔ２、およびＡｋｔ３ ｍＲＮＡから選択される１種のｍＲＮＡに向けられた少なくとも３種のｓｉＲＮＡをコードし得るまたは含み得る。関連した態様において、組み換えポリ核酸またはＲＮＡコンストラクトは、それぞれが、ｃ－Ｍｙｃ、ＫＲＡＳ、ｐａｎ－Ａｋｔ（すなわち、Ａｋｔ１、Ａｋｔ２、およびＡｋｔ３に結合する）ｍＲＮＡから選択される１種のｍＲＮＡに向けられた少なくとも３種のｓｉＲＮＡをコードし得るまたは含み得る。関連した態様において、組み換えＲＮＡコンストラクトは、配列番号９１、配列番号９２、配列番号１０７、または配列番号１０８（Ｃｐｄ．１６またはＣｐｄ．１７）に明記される配列を含み得る。関連した態様において、組み換えポリ核酸コンストラクトは、配列番号１００または配列番号１０１（Ｃｐｄ．１６またはＣｐｄ．１７）に明記される配列を含み得る。

【0145】

本明細書に記載される組み換えＲＮＡコンストラクト組成物は、併用療法として投与され得る。２種以上の治療剤または療法を用いた併用療法は、異なる作用のメカニズムによって働く薬剤および療法を使用し得る。異なる作用のメカニズムを有する薬剤または療法を使用した併用療法は、相加的なまたは相乗的な効果をもたらし得る。併用療法は、単剤療法において使用されるよりも低い用量の各薬剤を可能にし得、それによって、有毒な副作用を低下させかつ／または薬剤の治療指数を増加させる。併用療法は、耐性疾患細胞が生じるであろう可能性を減少させ得る。一部の場合には、併用療法は、免疫応答に影響を及ぼす（例えば、応答を増強するまたは活性化する）治療剤または療法、および疾患細胞に影響を及ぼす（例えば、阻害するまたは殺傷する）治療剤を含む。一部の場合には、併用療法は、（ｉ）本明細書に記載される組み換えＲＮＡ組成物または薬学的組成物；および（ｉｉ）本明細書に記載される疾患に対する、当技術分野において公知の１種または複数の付加的な療法を含み得る。一部の実施形態において、本明細書に記載される組み換えＲＮＡ組成物または薬学的組成物は、併用療法のため１種または複数の付加的な療法の投与の前に、それと同時に、および／または後に、疾患または病状を有する対象に投与され得る。一部の実施形態において、１種または複数の付加的な療法は、１、２、３種、またはそれより多くの付加的な治療剤または療法を含み得る。

【0146】

本明細書に記載される組成物および薬学的組成物は、当技術分野において公知の任意の適切な方法を使用して対象に投与され得る。本発明における使用のための適切な製剤、および送達の方法は、当技術分野において一般的に周知である。例えば、本明細書に記載される組成物は、非経口的に、静脈内に、皮内に、筋肉内に、結腸に（ｃｏｌｏｎｉｃａｌｌｙ）、直腸に、または腹腔内に、を含めた、多様なやり方で対象に投与され得る。一部の実施形態において、本明細書に記載される組成物は、対象の腹腔内注射、筋肉内注射、皮下注射、または静脈内注射によって投与される。一部の実施形態において、本明細書に記載される組成物は、非経口的に、静脈内に、筋肉内に、または経口的に投与され得る。一部の実施形態において、本明細書に記載される組成物は、疾患組織または細胞への注射を介して投与され得る。一部の実施形態において、本明細書に記載される組成物は、疾患組織または細胞への注射のための水溶液として投与され得る。

【0147】

本明細書に記載される組成物および薬学的組成物のいずれかは、取扱説明書と一緒に提供され得る。取扱説明書は、本発明に従って本明細書に記載される疾患または障害（例えば、がん）をどのように治療する（または阻止する）のか、当業者または主治医のための手引きを含み得る。一部の実施形態において、取扱説明書は、それぞれ、本明細書に記載される送達／投与の様態、および送達／投与レジメンに関する手引き（例えば、送達／投与の経路、投薬量レジメン、送達／投与の時間、送達／投与の頻度等）を含み得る。一部の実施形態において、取扱説明書は、どのように本発明の組成物が投与されるもしくは注射されるべきであり、かつ／または投与もしくは注射のために調製されるかという説明書を含み得る。原則として、それぞれ送達／投与の様態および送達／投与レジメンに関して本明細書における他の箇所に記載されているものは、取扱説明書におけるそれぞれの説明書として含まれ得る。

【0148】

本明細書に記載される組成物および薬学的組成物は、遺伝子療法において使用され得る。ある特定の実施形態において、本明細書に記載される組み換えポリ核酸またはＲＮＡコンストラクトを含む組成物は、遺伝子療法ベクターにおいて細胞に送達され得る。遺伝子療法ベクターおよび遺伝子送達の方法は、当技術分野において周知である。これらの方法の非限定的な例は、細胞への送達後にエピソーム性または組み込み型ゲノムのいずれかを有する、ＤＮＡおよびＲＮＡウイルスを含めたウイルスベクター送達システム、ＤＮＡプラスミド、ネイキッド核酸、および送達ビヒクルと複合した核酸を含めた非ウイルスベクター送達システム、トランスポゾンシステム（宿主ゲノムへの送達および組み込みのための；Ｍｏｒｉａｒｉｔｙら（２０１３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ４１（８）、ｅ９２、Ａｒｏｎｏｖｉｃｈら、（２０１１）Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．２０（Ｒ１）、Ｒ１４～Ｒ２０）、レトロウイルス媒介性ＤＮＡ移入（例えば、モロニーマウス白血病ウイルス、脾臓壊死ウイルス、レトロウイルス、例えばラウス肉腫ウイルス、ハーベイ肉腫ウイルス、トリ白血病ウイルス、テナガザル白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、アデノウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルス、および乳房腫瘍ウイルス；例えば、Ｋａｙら（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６２、１１７～１１９、Ａｎｄｅｒｓｏｎ（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６、８０８～８１３を参照されたい）、ならびにアデノウイルス、ヘルペスウイルス、パルボウイルス、およびアデノ随伴ウイルスを含めたＤＮＡウイルス媒介性ＤＮＡ移入（例えば、Ａｌｉら（１９９４）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １、３６７～３８４）を含む。ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス、アデノウイルスウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス、および単純ヘルペスウイルスベクターも含むが、それらに限定されるわけではない。宿主ゲノムへの組み込みの能力があるベクターは、レトロウイルスまたはレンチウイルスを含むが、それらに限定されるわけではない。

【0149】

一部の実施形態において、本明細書に記載される組み換えポリ核酸またはＲＮＡコンストラクトを含む組成物は、直接ＤＮＡ移入を介して細胞に送達され得る（Ｗｏｌｆｆら（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７、１４６５～１４６８）。組み換えポリ核酸またはＲＮＡコンストラクトは、細胞を一時的に透過処理する、細胞膜の穏やかな機械的分断の後に細胞に送達され得る。そのような膜の穏やかな機械的分断は、小さな開口部を通じて細胞を優しく押し破ることによって遂行され得る（Ｓｈａｒｅｉら、ＰＬＯＳ ＯＮＥ（２０１５）１０（４）、ｅ０１１８８０３）。別の実施形態において、本明細書に記載される組み換えポリ核酸またはＲＮＡコンストラクトを含む組成物は、リポソーム媒介性ＤＮＡ移入を介して細胞に送達され得る（例えば、Ｇａｏ＆Ｈｕａｎｇ（１９９１）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１７９、２８０～２８５、Ｃｒｙｓｔａｌ（１９９５）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．１、１５～１７、Ｃａｐｌｅｎら（１９９５）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．３、３９～４６）。リポソームは、閉鎖された脂質二重層または凝集体の生成によって形成される多様な単一のおよび多層状の脂質ビヒクルを包含し得る。組み換えポリ核酸またはＲＮＡコンストラクトは、リポソームの水性内部にカプセル化され得る、リポソームの脂質二重層内に散在される、リポソームおよびオリゴヌクレオチドの両方と結び付いている連結分子を介してリポソームに付着される、リポソーム内に封入される、またはリポソームと複合され得る。

【0150】

遺伝子発現のモジュレーション
本明細書に記載される任意の組み換えポリ核酸またはＲＮＡコンストラクトを含む組成物を細胞に導入することを含む、細胞において単一ＲＮＡ転写産物からｓｉＲＮＡおよびｍＲＮＡを発現させる方法が本明細書において提供される。第１のＲＮＡ配列、第２のＲＮＡ配列、およびリンカーＲＮＡ配列をコードするまたは含む組み換えポリ核酸またはＲＮＡコンストラクトを含む組成物を細胞に導入することを含む、細胞において２種以上の遺伝子の発現をモジュレートする方法であって、リンカーＲＮＡは、第１のＲＮＡ配列と第２のＲＮＡ配列とを連結し、第１のＲＮＡ配列は、関心のある遺伝子をコードし；第２のＲＮＡ配列は、標的メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）に結合し得る低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）をコードし、標的ｍＲＮＡは、関心のある遺伝子によってコードされるｍＲＮＡとは異なり、それによって、単一ＲＮＡ転写産物からの標的ｍＲＮＡおよび関心のある遺伝子の発現をモジュレートする、方法が本明細書においてさらに提供される。一部の場合には、本明細書において使用されるポリ核酸、遺伝子、ＤＮＡ、またはＲＮＡの発現とは、ポリ核酸、遺伝子、ＤＮＡ、またはＲＮＡの転写および／または翻訳を指し得る。一部の場合には、本明細書において使用される、ポリ核酸、関心のある遺伝子等の遺伝子、ＤＮＡ、または標的ｍＲＮＡ等のＲＮＡの発現をモジュレートすること、増加させること、上方調節すること、減少させること、または下方調節することは、ポリ核酸、関心のある遺伝子等の遺伝子、ＤＮＡ、または標的ｍＲＮＡ等のＲＮＡの転写および／または翻訳に影響を及ぼすことによって、ポリ核酸、関心のある遺伝子等の遺伝子、ＤＮＡ、または標的ｍＲＮＡ等のＲＮＡによってコードされるタンパク質のレベルをモジュレートすること、増加させること、上方調節すること、減少させること、下方調節することを指し得る。一部の場合には、ポリ核酸、関心のある遺伝子等の遺伝子、ＤＮＡ、または標的ｍＲＮＡ等のＲＮＡの発現を阻害することは、ポリ核酸、関心のある遺伝子等の遺伝子、ＤＮＡ、または標的ｍＲＮＡ等のＲＮＡによってコードされるタンパク質のレベルが低下するまたは消失するように、ポリ核酸、関心のある遺伝子等の遺伝子、ＤＮＡ、または標的ｍＲＮＡ等のＲＮＡの転写および／または翻訳に影響を及ぼすことを指し得る。

【0151】

例えば、関心のある遺伝子をコードする第１のＲＮＡ配列、第２のＲＮＡ配列、およびリンカーＲＮＡ配列をコードするまたは含む組み換えポリ核酸またはＲＮＡコンストラクトを含む組成物を細胞に導入することを含む、細胞において２種以上の遺伝子の発現をモジュレートする方法であって、リンカーＲＮＡ配列は、第１のＲＮＡ配列と第２のＲＮＡ配とを連結し、第１のＲＮＡ配列はＩＬ－４をコードし、第２のＲＮＡ配列は、ＴＮＦ－アルファｍＲＮＡに結合し得る低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）をコードし、それによって、単一ＲＮＡ転写産物からのＴＮＦ－アルファｍＲＮＡおよびＩＬ－４の発現をモジュレートする、方法が本明細書において提供される。

【0152】

例えば、関心のある遺伝子をコードする第１のＲＮＡ配列、第２のＲＮＡ配列、およびリンカーＲＮＡ配列をコードするまたは含む組み換えポリ核酸またはＲＮＡコンストラクトを含む組成物を細胞に導入することを含む、細胞において２種以上の遺伝子の発現をモジュレートする方法であって、リンカーＲＮＡ配列は、第１のＲＮＡ配列と第２のＲＮＡ配列とを連結し、第１のＲＮＡ配列はＩＧＦ－１をコードし、第２のＲＮＡ配列は、ＡＬＫ２ ｍＲＮＡに結合し得る低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）をコードし、それによって、単一ＲＮＡ転写産物からのＡＬＫ２ ｍＲＮＡおよびＩＧＦ－１の発現をモジュレートする、方法が本明細書において提供される。

【0153】

例えば、第１のＲＮＡ配列、第２のＲＮＡ配列、およびリンカーＲＮＡ配列をコードするまたは含む組み換えポリ核酸またはＲＮＡコンストラクトを含む組成物を細胞に導入することを含む、細胞において２種以上の遺伝子の発現をモジュレートする方法であって、リンカーＲＮＡ配列は、第１のＲＮＡ配列と第２のＲＮＡ配列とを連結し、第１のＲＮＡ配列はＩＧＦ－１をコードし、第２のＲＮＡ配列は、Ｔｕｒｂｏ ＧＦＰ ｍＲＮＡに結合し得る低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）をコードし、それによって、単一ＲＮＡ転写産物からのＴｕｒｂｏ ＧＦＰ ｍＲＮＡおよびＩＧＦ－１の発現をモジュレートする、方法が本明細書において提供される。

【0154】

例えば、第１のＲＮＡ配列、第２のＲＮＡ配列、およびリンカーＲＮＡ配列をコードするまたは含む組み換えポリ核酸またはＲＮＡコンストラクトを含む組成物を細胞に導入することを含む、細胞において２種以上の遺伝子の発現をモジュレートする方法であって、リンカーＲＮＡ配列は、第１のＲＮＡ配列と第２のＲＮＡ配列とを連結し、第１のＲＮＡ配列はＩＬ－２をコードし、第２のＲＮＡ配列は、ＶＥＧＦＡ ｍＲＮＡに結合し得る低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）をコードし、それによって、単一ＲＮＡ転写産物からのＶＥＧＦＡ ｍＲＮＡおよびＩＬ－２の発現をモジュレートする、方法が本明細書において提供される。

【0155】

例えば、第１のＲＮＡ配列、第２のＲＮＡ配列、およびリンカーＲＮＡ配列をコードするまたは含む組み換えポリ核酸またはＲＮＡコンストラクトを含む組成物を細胞に導入することを含む、細胞において２種以上の遺伝子の発現をモジュレートする方法であって、リンカーＲＮＡ配列は、第１のＲＮＡ配列と第２のＲＮＡ配列とを連結し、第１のＲＮＡ配列はＩＬ－１２をコードし、第２のＲＮＡ配列は、ｃ－Ｍｙｃ、ＫＲＡＳ、Ａｋｔ１、Ａｋｔ２、および／またはＡｋｔ３ ｍＲＮＡに結合し得る低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）をコードし、それによって、単一ＲＮＡ転写産物からのＶＥＧＦＡ ｍＲＮＡおよびＩＬ－１２の発現をモジュレートする、方法が本明細書において提供される。一部の実施形態において、第２のＲＮＡ配列は、それぞれがｃ－Ｍｙｃ、ＫＲＡＳ、Ａｋｔ１、Ａｋｔ２、および／またはＡｋｔ３ ｍＲＮＡに結合し得る１種または複数の低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）をコードし得、それによって、単一ＲＮＡ転写産物からのＶＥＧＦＡ ｍＲＮＡおよびＩＬ－１２の発現をモジュレートする。一部の実施形態において、第２のＲＮＡ配列は、１種または複数の低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）をコードし得、１種または複数のｓｉＲＮＡのそれぞれは、ｃ－Ｍｙｃ、ＫＲＡＳ、Ａｋｔ１、Ａｋｔ２、およびＡｋｔ３ ｍＲＮＡから選択される１種のｍＲＮＡに結合し得る。一部の実施形態において、第２のＲＮＡ配列は、１種または複数の低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）をコードし得、１種または複数のｓｉＲＮＡのそれぞれは、ｃ－Ｍｙｃ、ＫＲＡＳ、ｐａｎ－Ａｋｔ（すなわち、Ａｋｔ１、Ａｋｔ２、およびＡｋｔ３に結合する）ｍＲＮＡから選択される１種のｍＲＮＡに結合し得る。

【0156】

第１のＲＮＡ配列、第２のＲＮＡ配列、およびリンカーＲＮＡ配列を含む組み換えポリ核酸またはＲＮＡコンストラクトを含む組成物を細胞に導入することを含む、細胞において２種以上の遺伝子の発現をモジュレートする方法であって、リンカーＲＮＡ配列は、第１のＲＮＡ配列と第２のＲＮＡ配列とを連結し、第１のＲＮＡはＩＬ－４をコードし、第２のＲＮＡは、ＴＮＦ－アルファｍＲＮＡに結合し得る低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）をコードし；ＩＬ－４およびＴＮＦ－アルファの発現は同時にモジュレートされる、すなわち、ＩＬ－４の発現は上方調節され、ＴＮＦ－アルファの発現は同時に下方調節される、方法が本明細書において提供される。関連した態様において、組み換えポリ核酸またはＲＮＡコンストラクトは、少なくとも１、２、３、４、５、６種、またはそれより多くのｓｉＲＮＡをコードし得るまたは含み得る。関連した態様において、組み換えポリ核酸またはＲＮＡコンストラクトは、それぞれがＴＮＦ－アルファｍＲＮＡの同じ領域に向けられた３種のｓｉＲＮＡをコードし得るまたは含み得る。関連した態様において、組み換えＲＮＡコンストラクトは、配列番号１、配列番号２、配列番号７６、または配列番号７７（Ｃｐｄ．１またはＣｐｄ．２）を含む配列を含み得る。関連した態様において、組み換えポリ核酸コンストラクトは、配列番号１０または配列番号１１（Ｃｐｄ．１またはＣｐｄ．２）を含む配列を含み得る。

【0157】

第１のＲＮＡ配列、第２のＲＮＡ配列、およびリンカーＲＮＡ配列を含む組み換えポリ核酸またはＲＮＡコンストラクトを含む組成物を細胞に導入することを含む、細胞において２種以上の遺伝子の発現をモジュレートする方法であって、リンカーＲＮＡ配列は、第１のＲＮＡ配列と第２のＲＮＡ配列とを連結し、第１のＲＮＡはＩＧＦ－１をコードし、第２のＲＮＡは、ＡＬＫ２ ｍＲＮＡに結合し得る低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）をコードし；ＩＧＦ－１およびＡＬＫ２の発現は同時にモジュレートされる、すなわち、ＩＧＦ－１の発現は上方調節され、ＡＬＫ２の発現は同時に下方調節される、方法も本明細書において提供される。関連した態様において、組み換えポリ核酸またはＲＮＡコンストラクトは、少なくとも１、２、３、４、５、６種、またはそれより多くのｓｉＲＮＡをコードし得るまたは含み得る。関連した態様において、組み換えポリ核酸またはＲＮＡコンストラクトは、それぞれがＡＬＫ２ ｍＲＮＡの同じ領域に向けられた３種のｓｉＲＮＡをコードし得るまたは含み得る。関連した態様において、組み換えポリ核酸またはＲＮＡコンストラクトは、それぞれがＡＬＫ２ ｍＲＮＡの異なる領域に向けられた３種のｓｉＲＮＡをコードし得るまたは含み得る。関連した態様において、少なくとも３種のｓｉＲＮＡのそれぞれは、同じもの、異なるもの、またはその組み合わせに向けられ得る。関連した態様において、組み換えＲＮＡコンストラクトは、配列番号３、配列番号４、配列番号７８または配列番号７９（Ｃｐｄ．３またはＣｐｄ．４）を含む配列を含み得る。関連した態様において、組み換えポリ核酸コンストラクトは、配列番号１２または配列番号１３（Ｃｐｄ．３またはＣｐｄ．４）を含む配列を含み得る。

【0158】

第１のＲＮＡ配列、第２のＲＮＡ配列、およびリンカーＲＮＡ配列を含む組み換えポリ核酸またはＲＮＡコンストラクトを含む組成物を細胞に導入することを含む、細胞において２種以上の遺伝子の発現をモジュレートする方法であって、リンカーＲＮＡ配列は、第１のＲＮＡ配列と第２のＲＮＡ配列とを連結し、第１のＲＮＡはＩＧＦ－１をコードし、第２のＲＮＡは、Ｔｕｒｂｏ ＧＦＰ ｍＲＮＡに結合し得る低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）をコードし；ＩＧＦ－１およびＴｕｒｂｏ ＧＦＰの発現は同時にモジュレートされる、すなわち、ＩＧＦ－１の発現は上方調節され、同時に、Ｔｕｒｂｏ ＧＦＰの発現は下方調節される、方法も本明細書において提供される。関連した態様において、組み換えポリ核酸またはＲＮＡコンストラクトは、少なくとも１、２、３、４、５、６種、またはそれより多くのｓｉＲＮＡをコードし得るまたは含み得る。関連した態様において、組み換えポリ核酸またはＲＮＡコンストラクトは、それぞれがＴｕｒｂｏ ＧＦＰ ｍＲＮＡの同じ領域に向けられた３種のｓｉＲＮＡをコードし得るまたは含み得る。関連した態様において、組み換えポリ核酸またはＲＮＡコンストラクトは、それぞれがＴｕｒｂｏ ＧＦＰ ｍＲＮＡの異なる領域に向けられた３種のｓｉＲＮＡをコードし得るまたは含み得る。関連した態様において、少なくとも３種のｓｉＲＮＡのそれぞれは、同じもの、異なるもの、またはその組み合わせに向けられ得る。関連した態様において、組み換えＲＮＡコンストラクトは、配列番号５～９および８０～８４（Ｃｐｄ．５～Ｃｐｄ．９）からなる群から選択される配列を含み得る。関連した態様において、組み換えポリ核酸コンストラクトは、配列番号１４～１８（Ｃｐｄ．５～Ｃｐｄ．９）からなる群から選択される配列を含み得る。

【0159】

第１のＲＮＡ配列、第２のＲＮＡ配列、およびリンカーＲＮＡ配列を含む組み換えポリ核酸またはＲＮＡコンストラクトを含む組成物を細胞に導入することを含む、細胞において２種以上の遺伝子の発現をモジュレートする方法であって、リンカーＲＮＡ配列は、第１のＲＮＡ配列と第２のＲＮＡ配列とを連結し、第１のＲＮＡはＩＬ－２をコードし、第２のＲＮＡは、ＶＥＧＦＡ ｍＲＮＡに結合し得る低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）をコードし：ＩＬ－２およびＶＥＧＦＡの発現は同時にモジュレートされる、すなわち、ＩＬ－２の発現は上方調節され、ＶＥＧＦＡの発現は同時に下方調節される、方法も本明細書において提供される。関連した態様において、組み換えポリ核酸またはＲＮＡコンストラクトは、少なくとも１、２、３、４、５、６種、またはそれより多くのｓｉＲＮＡをコードし得るまたは含み得る。関連した態様において、組み換えポリ核酸またはＲＮＡコンストラクトは、それぞれがＶＥＧＦＡ ｍＲＮＡの同じ領域に向けられた３種のｓｉＲＮＡをコードし得るまたは含み得る。関連した態様において、組み換えポリ核酸またはＲＮＡコンストラクトは、それぞれがＶＥＧＦＡ ｍＲＮＡの異なる領域に向けられた３種のｓｉＲＮＡをコードし得るまたは含み得る。関連した態様において、少なくとも３種のｓｉＲＮＡのそれぞれは、同じもの、異なるもの、またはその組み合わせに向けられ得る。関連した態様において、組み換えＲＮＡコンストラクトは、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、または配列番号１０６（Ｃｐｄ．１０、Ｃｐｄ．１１、Ｃｐｄ．１２、Ｃｐｄ．１３、Ｃｐｄ．１４、またはＣｐｄ．１５）を含む配列を含み得る。関連した態様において、組み換えポリ核酸コンストラクトは、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、または配列番号９８（Ｃｐｄ．１０、Ｃｐｄ．１１、Ｃｐｄ．１２、Ｃｐｄ．１３、Ｃｐｄ．１４、またはＣｐｄ．１５）を含む配列を含み得る。

【0160】

第１のＲＮＡ配列、第２のＲＮＡ配列、およびリンカーＲＮＡ配列を含む組み換えポリ核酸またはＲＮＡコンストラクトを含む組成物を細胞に導入することを含む、細胞において２種以上の遺伝子の発現をモジュレートする方法であって、リンカーＲＮＡ配列は、第１のＲＮＡ配列と第２のＲＮＡ配列とを連結し、第１のＲＮＡはＩＬ－１２をコードし、第２のＲＮＡは、ｃ－Ｍｙｃ、ＫＲＡＳ、Ａｋｔ１、Ａｋｔ２、および／またはＡｋｔ３ ｍＲＮＡに結合し得る低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）をコードし；ＩＬ－１２、ならびにｃ－Ｍｙｃ、ＫＲＡＳ、Ａｋｔ１、Ａｋｔ２、および／またはＡｋｔ３の発現は同時にモジュレートされる、すなわち、ＩＬ－１２の発現は上方調節され、同時に、ｃ－Ｍｙｃ、ＫＲＡＳ、Ａｋｔ１、Ａｋｔ２、および／またはＡｋｔ３の発現は下方調節される、方法も本明細書において提供される。一部の実施形態において、ＩＬ－１２の発現は上方調節され、同時に、ｃ－Ｍｙｃ、ＫＲＡＳ、Ａｋｔ１、Ａｋｔ２、およびＡｋｔ３の発現は下方調節される。関連した態様において、組み換えポリ核酸またはＲＮＡコンストラクトは、少なくとも１、２、３、４、５、６種、またはそれより多くのｓｉＲＮＡをコードし得るまたは含み得る。関連した態様において、組み換えポリ核酸またはＲＮＡコンストラクトは、それぞれがｃ－Ｍｙｃ、ＫＲＡＳ、Ａｋｔ１、Ａｋｔ２、および／またはＡｋｔ３ ｍＲＮＡの同じ領域に向けられた３種のｓｉＲＮＡをコードし得るまたは含み得る。関連した態様において、組み換えポリ核酸またはＲＮＡコンストラクトは、それぞれがｃ－Ｍｙｃ、ＫＲＡＳ、Ａｋｔ１、Ａｋｔ２、および／またはＡｋｔ３ ｍＲＮＡの異なる領域に向けられた３種のｓｉＲＮＡをコードし得るまたは含み得る。関連した態様において、少なくとも３種のｓｉＲＮＡのそれぞれは、同じもの、異なるもの、またはその組み合わせに向けられ得る。関連した態様において、組み換えポリ核酸またはＲＮＡコンストラクトは、それぞれが、ｃ－Ｍｙｃ、ＫＲＡＳ、Ａｋｔ１、Ａｋｔ２、およびＡｋｔ３ ｍＲＮＡから選択される１種のｍＲＮＡに向けられた少なくとも３種のｓｉＲＮＡをコードし得るまたは含み得る。関連した態様において、組み換えポリ核酸またはＲＮＡコンストラクトは、それぞれが、ｃ－Ｍｙｃ、ＫＲＡＳ、ｐａｎ－Ａｋｔ（すなわち、Ａｋｔ１、Ａｋｔ２、およびＡｋｔ３に結合する）ｍＲＮＡから選択される１種のｍＲＮＡに向けられた少なくとも３種のｓｉＲＮＡをコードし得るまたは含み得る。関連した態様において、組み換えＲＮＡコンストラクトは、配列番号９１、配列番号９２、配列番号１０７、または配列番号１０８（Ｃｐｄ．１６またはＣｐｄ．１７）を含む配列を含み得る。関連した態様において、組み換えポリ核酸コンストラクトは、配列番号１００または配列番号１０１（Ｃｐｄ．１６またはＣｐｄ．１７）を含む配列を含み得る。

【0161】

第１のＲＮＡ配列、第２のＲＮＡ配列、およびリンカーＲＮＡ配列をコードするまたは含む組み換えポリ核酸またはＲＮＡコンストラクトを含む組成物を細胞に導入することを含む、細胞において２種以上の遺伝子の発現を上方調節するおよび下方調節する方法であって、リンカーＲＮＡ配列は、第１のＲＮＡ配列と第２のＲＮＡ配列とを連結し、第１のＲＮＡは、関心のある遺伝子（例えば、ＩＬ－４、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、またはＩＧＦ－１）をコードし、第２のＲＮＡは、標的ｍＲＮＡ（例えば、ＴＮＦ－アルファ、ＡＬＫ２、Ｔｕｒｂｏ ＧＦＰ、ＶＥＧＦＡ、ｃ－Ｍｙｃ、ＫＲＡＳ、Ａｋｔ１、Ａｋｔ２、またはＡｋｔ３）に結合し得る低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）をコードし；標的ｍＲＮＡは、関心のある遺伝子によってコードされるｍＲＮＡとは異なり、標的ｍＲＮＡの発現は下方調節され、関心のある遺伝子の発現は同時に上方調節される、方法が本明細書において提供される。一部の実施形態において、標的ｍＲＮＡの発現は、標的ｍＲＮＡに結合し得るｓｉＲＮＡによって下方調節される。一部の実施形態において、関心のある遺伝子の発現は、関心のある遺伝子によってコードされるｍＲＮＡまたはタンパク質を発現させることによって上方調節される。

【0162】

例示的な実施形態
一部の態様において、第１のＲＮＡ配列、第２のＲＮＡ配列、およびリンカーＲＮＡ配列を含む組み換えＲＮＡコンストラクトを含む組成物であって、（ｉ）第１のＲＮＡ配列は、第１の低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）配列であり；（ｉｉ）第２のＲＮＡ配列は、第２のｓｉＲＮＡ配列、または関心のある遺伝子（ＧＯＩ）をコードする第１のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）配列であり；（ｉｉｉ）リンカーＲＮＡ配列は、第１のＲＮＡ配列と第２のＲＮＡ配列とを連結し、リンカーＲＮＡ配列は、式（Ｉ）：Ｘ_ｍＣＡＡＣＡＡＸ_ｎ［式中、Ｘは任意のヌクレオチドであり、ｍは１～１２の整数であり、ｎは０～４の整数である］；および式（ＩＩ）：Ｘ_ｐＴＣＣＣＸ_ｒ［式中、Ｘは任意のヌクレオチドであり、ｐは０～１７の整数であり、ｒは０～１３の整数である］からなる群から選択される構造を有する、組成物が本明細書において提供される。

【0163】

一部の態様において、第１のＲＮＡ配列、第２のＲＮＡ配列、およびリンカーＲＮＡ配列を含む組み換えＲＮＡコンストラクトを含む組成物であって、（ｉ）第１のＲＮＡ配列は、第１の低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）配列であり；（ｉｉ）第２のＲＮＡ配列は、第２のｓｉＲＮＡ配列、または関心のある遺伝子（ＧＯＩ）をコードする第１のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）配列であり；（ｉｉｉ）リンカーＲＮＡ配列は、第１のＲＮＡ配列と第２のＲＮＡ配列とを連結し、リンカーＲＮＡ配列は、ＡＣＡＡＣＡＡを含むまたはそれからなる、組成物が本明細書において提供される。

【0164】

一部の態様において、第１のＲＮＡ配列、第２のＲＮＡ配列、およびリンカーＲＮＡ配列を含む組み換えＲＮＡコンストラクトを含む組成物であって、（ｉ）第１のＲＮＡ配列は、第１の低分子干渉（ｓｉＲＮＡ）配列であり；（ｉｉ）第２のＲＮＡ配列は、第２のｓｉＲＮＡ配列、または関心のある遺伝子（ＧＯＩ）をコードする第１のメッセンジャー（ｍＲＮＡ）配列であり；（ｉｉｉ）リンカーＲＮＡ配列は、第１のＲＮＡ配列と第２のＲＮＡ配列とを連結し、（ａ）リンカーＲＮＡ配列は、ＴＴＴＡＴＣＴＴＡＧＡＧＧＣＡＴＡＴＣＣＣＴＡＣＧＴＡＣＣＡＡＣＡＡもしくはＡＴＡＧＴＧＡＧＴＣＧＴＡＴＴＡＡＣＧＴＡＣＣＡＡＣＡＡではないか；または（ｂ）リンカーＲＮＡ配列は、ＲＮＡｆｏｌｄウェブサーバーに従った二次構造を形成しない、組成物が本明細書において提供される。

【0165】

一部の実施形態において、第２のＲＮＡ配列は、第２のｓｉＲＮＡ配列である。一部の実施形態において、リンカーＲＮＡ配列は、ＡＣＡＡＣＡＡ、ＡＴＣＣＣＴＡＣＧＴＡＣＣＡＡＣＡＡ、ＡＣＧＴＡＣＣＡＡＣＡＡ、ＴＣＣＣ、またはＡＣＡＡＣＡＡＴＣＣＣを含むまたはそれからなる。一部の実施形態において、組み換えＲＮＡコンストラクトは、ＧＯＩをコードする第１のｍＲＮＡ配列をさらに含む。一部の実施形態において、第２のＲＮＡ配列は、ＧＯＩをコードする第１のｍＲＮＡ配列である。

【0166】

一部の実施形態において、リンカーＲＮＡ配列は、ＡＣＡＡＣＡＡ、ＡＴＡＧＴＧＡＧＴＣＧＴＡＴＴＡＴＣＣＣ、ＡＴＡＧＴＧＡＧＴＣＧＴＡＴＴＡＡＣＡＡＣＡＡＴＣＣＣ、ＡＴＡＧＴＧＡＧＴＣＧＴＡＴＴＡＡＣＡＡＣＡＡ、ＡＴＡＧＴＧＡＧＴＣＧＴＡＴＴＡＡＴＣＣＣＴＡＣＧＴＡＣＣＡＡＣＡＡ、またはＡＴＡＧＴＧＡＧＴＣＧＴＡＴＴＡＡＣＧＴＡＣＣＡＡＣＡＡを含むまたはそれからなる。

【0167】

一部の実施形態において、組み換えＲＮＡコンストラクトは、ＧＯＩをコードする第２のｍＲＮＡ配列をさらに含む。一部の実施形態において、組み換えＲＮＡコンストラクトは、第２のｓｉＲＮＡ配列をさらに含む。一部の実施形態において、組み換えＲＮＡコンストラクトは、第３のｓｉＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態において、組み換えＲＮＡコンストラクトは、４種、５種、またはそれより多くのｓｉＲＮＡ配列をさらに含む。一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡ配列のそれぞれは、標的ＲＮＡに結合し、標的ＲＮＡの発現をモジュレートする。

【0168】

一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡ配列のそれぞれは、（ａ）異なる標的ＲＮＡ；（ｂ）同じ標的ＲＮＡの異なる領域；（ｃ）同じ標的ＲＮＡの同じ領域；または（ｄ）その任意の組み合わせ、に結合し得る。一部の実施形態において、（ｃ）のｓｉＲＮＡ配列は同じである。一部の実施形態において、組み換えＲＮＡコンストラクトは、それぞれがＧＯＩをコードする３種、４種、５種、またはそれより多くのｍＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態において、ｍＲＮＡ配列のそれぞれは、同じＧＯＩをコードする。一部の実施形態において、ｍＲＮＡ配列のそれぞれは、異なるＧＯＩをコードする。

【0169】

一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡ配列間のリンカーＲＮＡ配列の長さは、約４～約２７ヌクレオチドである。一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡ配列間のリンカーＲＮＡ配列の長さは、約４～約１８ヌクレオチドである。一部の実施形態において、ｍは１であり、ｎは０である。一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡ配列間のリンカーＲＮＡ配列は、ＡＣＡＡＣＡＡＴＣＣＣである。一部の実施形態において、リンカーＲＮＡ配列は、ＡＣＡＡＣＡＡである。一部の実施形態において、リンカーＲＮＡ配列は、配列番号２３および６７～７５からなる群から選択される配列を含む。一部の実施形態において、リンカーＲＮＡ配列は、配列番号２３に従った配列を含むまたはそれからなる。一部の実施形態において、リンカーＲＮＡ配列は、配列番号６７に従った配列を含むまたはそれからなる。一部の実施形態において、リンカーＲＮＡ配列は、配列番号６８に従った配列を含むまたはそれからなる。一部の実施形態において、リンカーＲＮＡ配列は、配列番号６９に従った配列を含むまたはそれからなる。一部の実施形態において、リンカーＲＮＡ配列は、配列番号７０に従った配列を含むまたはそれからなる。

【0170】

一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡによって標的にされる標的ＲＮＡの発現は、（ｉ）配列番号６８に従ったリンカーＲＮＡ配列を含む組み換えＲＮＡコンストラクトを使用した、ｓｉＲＮＡによって標的にされる標的ＲＮＡの発現、（ｉｉ）配列番号６９に従ったリンカーＲＮＡ配列を含む組み換えＲＮＡコンストラクトを使用した、ｓｉＲＮＡによって標的にされる標的ＲＮＡの発現、（ｉｉｉ）配列番号７０に従ったリンカーＲＮＡ配列を含む組み換えＲＮＡコンストラクトを使用した、ｓｉＲＮＡによって標的にされる標的ＲＮＡの発現、および／または（ｉｖ）配列番号２３に従ったリンカーＲＮＡ配列を含む組み換えＲＮＡコンストラクトを使用した、ｓｉＲＮＡによって標的にされる標的ＲＮＡの発現と比較して、配列番号６７に従ったリンカーＲＮＡ配列を含む組み換えＲＮＡコンストラクトを使用して、より低い。

【0171】

一部の実施形態において、ＧＯＩをコードする第１のｍＲＮＡ配列の発現は、（ｉ）配列番号６７に従ったリンカーＲＮＡ配列を含む組み換えＲＮＡコンストラクトを使用した、ＧＯＩをコードする第１のｍＲＮＡ配列の発現、（ｉｉ）配列番号６８に従ったリンカーＲＮＡ配列を含む組み換えＲＮＡコンストラクトを使用した、ＧＯＩをコードする第１のｍＲＮＡ配列の発現、（ｉｉｉ）配列番号６９に従ったリンカーＲＮＡ配列を含む組み換えＲＮＡコンストラクトを使用した、ＧＯＩをコードする第１のｍＲＮＡ配列の発現、および／または（ｉｖ）配列番号２３に従ったリンカーＲＮＡ配列を含む組み換えＲＮＡコンストラクトを使用した、ＧＯＩをコードする第１のｍＲＮＡ配列の発現と比較して、配列番号７０に従ったリンカーＲＮＡ配列を含む組み換えＲＮＡコンストラクトを使用して、より高い。

【0172】

一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡによって標的にされる標的ＲＮＡの発現は、（ｉ）配列番号６８に従ったリンカーＲＮＡ配列を含む組み換えＲＮＡコンストラクトを使用した、ｓｉＲＮＡによって標的にされる標的ＲＮＡの発現、（ｉｉ）配列番号６９に従ったリンカーＲＮＡ配列を含む組み換えＲＮＡコンストラクトを使用した、ｓｉＲＮＡによって標的にされる標的ＲＮＡの発現、および／または（ｉｉｉ）配列番号７０に従ったリンカーＲＮＡ配列を含む組み換えＲＮＡコンストラクトを使用した、ｓｉＲＮＡによって標的にされる標的ＲＮＡの発現と比較して、配列番号２３に従ったリンカーＲＮＡ配列を含む組み換えＲＮＡコンストラクトを使用して、より低い。

【0173】

一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡによって標的にされる標的ＲＮＡの発現は、（ｉ）配列番号６９に従ったリンカーＲＮＡ配列を含む組み換えＲＮＡコンストラクトを使用した、ｓｉＲＮＡによって標的にされる標的ＲＮＡの発現、および／または（ｉｉ）配列番号７０に従ったリンカーＲＮＡ配列を含む組み換えＲＮＡコンストラクトを使用した、ｓｉＲＮＡによって標的にされる標的ＲＮＡの発現と比較して、配列番号２３に従ったリンカーＲＮＡ配列を含む組み換えＲＮＡコンストラクトを使用して、より低い。

【0174】

一部の実施形態において、ＧＯＩをコードする第１のｍＲＮＡ配列の発現は、（ｉ）配列番号６７に従ったリンカーＲＮＡ配列を含む組み換えＲＮＡコンストラクトを使用した、ＧＯＩをコードする第１のｍＲＮＡ配列の発現、（ｉｉ）配列番号６８に従ったリンカーＲＮＡ配列を含む組み換えＲＮＡコンストラクトを使用した、ＧＯＩをコードする第１のｍＲＮＡ配列の発現、および／または（ｉｉｉ）配列番号６９に従ったリンカーＲＮＡ配列を含む組み換えＲＮＡコンストラクトを使用した、ＧＯＩをコードする第１のｍＲＮＡ配列の発現と比較して、配列番号２３に従ったリンカーＲＮＡ配列を含む組み換えＲＮＡコンストラクトを使用して、より高い。

【0175】

一部の実施形態において、リンカーＲＮＡ配列は、ＧＯＩをコードする第１のｍＲＮＡ配列の所望の発現レベル、および／またはｓｉＲＮＡによって標的にされる標的ＲＮＡの所望の発現レベル、もしくはｓｉＲＮＡによって標的にされる標的ＲＮＡによってコードされるタンパク質の所望の発現レベルに基づいて選択される。

【0176】

一部の実施形態において、ＧＯＩの発現はモジュレートされる。一部の実施形態において、ＧＯＩの発現は、ＧＯＩによってコードされるタンパク質を発現させることによって上方調節される。一部の実施形態において、標的ＲＮＡの発現はモジュレートされる。一部の実施形態において、標的ＲＮＡの発現は、標的ＲＮＡに結合し得るｓｉＲＮＡ配列によって下方調節される。一部の実施形態において、標的ＲＮＡに結合し得るｓｉＲＮＡ配列は、ＧＯＩの発現を阻害しない。

【0177】

一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡ配列間のＲＮＡリンカー配列は、ＲＮＡｆｏｌｄウェブサーバーに従った二次構造を形成しない。一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡ配列は、ＲＮＡｆｏｌｄウェブサーバーに従った二次構造を形成する。一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡ配列は、ヘアピン構造またはループ構造を含む。一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡ配列は、１つまたは複数の短いまたは低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を含む。

【0178】

一部の実施形態において、組み換えＲＮＡコンストラクトは切断される。一部の実施形態において、組み換えＲＮＡコンストラクトは、細胞内タンパク質によって切断される。一部の実施形態において、組み換えＲＮＡコンストラクトは、内因性タンパク質によって切断される。一部の実施形態において、組み換えＲＮＡコンストラクトは、内因性ＤＩＣＥＲによって切断される。

【0179】

一部の実施形態において、組み換えＲＮＡコンストラクトの切断は、式（Ｉ）および式（ＩＩ）からなる群から選択される構造を有するリンカーを含まないＲＮＡコンストラクトの切断と比較して増強される。一部の実施形態において、組み換えＲＮＡコンストラクトの切断は、ＡＣＡＡＣＡＡを含む配列を含むリンカーを含まないＲＮＡコンストラクトの切断と比較して増強される。一部の実施形態において、組み換えＲＮＡコンストラクトの切断は、二次構造を形成するリンカーを含むＲＮＡコンストラクトの切断と比較して増強される。

【0180】

一部の実施形態において、関心のある遺伝子の発現は、式（Ｉ）および式（ＩＩ）からなる群から選択される構造を有するリンカーを含まないＲＮＡコンストラクトからの関心のある遺伝子の発現と比較して増強される。一部の実施形態において、関心のある遺伝子の発現は、ＡＣＡＡＣＡＡを含む配列を含むリンカーを含まないＲＮＡコンストラクトからの関心のある遺伝子の発現と比較して増強される。

【0181】

一部の実施形態において、ＧＯＩは、インターロイキン４（ＩＬ－４）、インターロイキン２（ＩＬ－２）、インターロイキン１２（ＩＬ－１２）、またはインスリン様成長因子１（ＩＧＦ１）を含む。一部の実施形態において、標的ＲＮＡはノンコーディングＲＮＡである。一部の実施形態において、標的ＲＮＡはメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）である。一部の実施形態において、標的ＲＮＡは、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ－α）、アクチビン受容体様キナーゼ２（ＡＬＫ２）、血管内皮増殖因子Ａ（ＶＥＧＦＡ）、細胞骨髄球腫症（ｃ－Ｍｙｃ）、カーステンラット肉腫（ＫＲＡＳ）、プロテインキナーゼＢ－１（Ａｋｔ１）、Ａｋｔ２、およびＡｋｔ３からなる群から選択されるタンパク質をコードするｍＲＮＡである。

【0182】

一部の実施形態において、標的ＲＮＡに結合し得るｓｉＲＮＡ配列は、標的ＲＮＡのエクソンに結合する。一部の実施形態において、標的ＲＮＡに結合し得るｓｉＲＮＡ配列は、１種の標的ＲＮＡに特異的に結合する。一部の実施形態において、標的ＲＮＡに結合し得るｓｉＲＮＡ配列は、関心のある遺伝子のイントロン配列によってコードされないまたはそれから構成されない。一部の実施形態において、ＧＯＩは、ＲＮＡスプライシングなしで発現される。

【0183】

一部の実施形態において、第１のＲＮＡ配列は、第２のＲＮＡ配列の下流または３’に存在する。一部の実施形態において、ＲＮＡコンストラクトは、第２のＲＮＡ配列の下流または３’に内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を含む。一部の実施形態において、ＲＮＡコンストラクトは、第１のＲＮＡ配列のすぐ上流または５’に内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を含む。一部の実施形態において、第１のＲＮＡ配列は、第２のＲＮＡ配列の上流または５’に存在する。一部の実施形態において、ＲＮＡコンストラクトは、第１のＲＮＡ配列の上流または５’に内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を含む。

【0184】

一部の実施形態において、ＲＮＡコンストラクトは、ポリ（Ａ）テール、５’キャップ、またはコザック配列をさらに含む。一部の実施形態において、第１のＲＮＡ配列および第２のＲＮＡ配列は、両方とも組み換えである。一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、配列番号５０～５７および１２７～１３２からなる群から選択されるセンス鎖配列を含む。

【0185】

一部の態様において、細胞において２種以上の遺伝子の発現をモジュレートすることにおける使用のための組成物が本明細書において提供される。一部の態様において、本明細書に記載される組成物のいずれか１種の治療的有効量、および薬学的に許容される添加物を含む薬学的組成物が本明細書において提供される。一部の態様において、本明細書に記載される組成物のいずれか１種を含む細胞が本明細書において提供される。一部の態様において、本明細書に記載される組成物のいずれか１種をコードする組み換えポリ核酸コンストラクトを含むベクターが本明細書において提供される。

【0186】

一部の態様において、本明細書に記載される組成物のいずれか１種、または本明細書に記載されるベクターを細胞に導入することを含む、細胞において単一ＲＮＡ転写産物からｓｉＲＮＡおよびｍＲＮＡを産生する方法が本明細書において提供される。一部の態様において、細胞に、本明細書に記載される組成物のいずれか１種、または本明細書に記載されるベクターのいずれか１種を導入することを含む、タンパク質発現をモジュレートする方法であって、標的ＲＮＡによってコードされるタンパク質の発現は減少する、タンパク質発現をモジュレートする方法が本明細書において提供される。一部の態様において、細胞に、本明細書に記載される組成物のいずれか１種、または本明細書に記載されるベクターのいずれか１種を導入することを含む、タンパク質発現をモジュレートする方法であって、関心のある遺伝子（ＧＯＩ）によってコードされるタンパク質の発現は増加する、タンパク質発現をモジュレートする方法が本明細書において提供される。一部の態様において、細胞に、本明細書に記載される組成物のいずれか１種、または本明細書に記載されるベクターのいずれか１種を導入することを含む、タンパク質発現をモジュレートする方法であって、標的ＲＮＡによってコードされるタンパク質の発現は減少し、関心のある遺伝子（ＧＯＩ）によってコードされるタンパク質の発現は増加する、タンパク質発現をモジュレートする方法が本明細書において提供される。

【0187】

一部の態様において、本明細書に記載される組成物のいずれか１種、または本明細書に記載される薬学的組成物のいずれか１種をそれを必要とする対象に投与することを含む、疾患または病状を治療する方法が本明細書において提供される。

【0188】

一部の実施形態において、疾患または病状は、皮膚疾患もしくは病状、または筋肉疾患もしくは病状を含む。一部の実施形態において、皮膚疾患または病状は炎症性皮膚障害を含む。一部の実施形態において、炎症性皮膚障害は乾癬を含む。一部の実施形態において、筋肉疾患または病状は骨格筋障害を含む。一部の実施形態において、骨格筋障害は進行性骨化性線維異形成症（ＦＯＰ）を含む。一部の実施形態において、疾患または病状はがんを含む。一部の実施形態において、がんは、膠芽細胞腫、ヒト舌扁平上皮癌、ヒト肺癌、またはヒト単球白血病を含む。一部の実施形態において、対象はヒトである。

【0189】

一部の態様において、第１のＲＮＡ配列、第１のリンカーＲＮＡ配列、第２のＲＮＡ配列、および第２のリンカーＲＮＡ配列を含む組み換えＲＮＡコンストラクトを含む組成物であって、（ｉ）第１のＲＮＡ配列は、インターロイキン４（ＩＬ－４）をコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）であり；（ｉｉ）第２のＲＮＡ配列は、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ－α）ｍＲＮＡに結合し得る２種以上の低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を含み；（ｉｉｉ）第１のリンカーＲＮＡ配列は、第１のＲＮＡ配列と第２のＲＮＡ配列との間に存在し；（ｉｖ）第２のリンカーＲＮＡ配列は、２種以上のｓｉＲＮＡのそれぞれを連結し、配列番号２３に従った配列を含む、組成物が本明細書において提供される。

【0190】

一部の態様において、第１のＲＮＡ配列、第１のリンカーＲＮＡ配列、第２のＲＮＡ配列、および第２のリンカーＲＮＡ配列を含む組み換えＲＮＡコンストラクトを含む組成物であって、（ｉ）第１のＲＮＡ配列は、インスリン様成長因子１（ＩＧＦ１）をコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）であり；（ｉｉ）第２のＲＮＡ配列は、アクチビン受容体様キナーゼ２（ＡＬＫ２）ｍＲＮＡに結合し得る２種以上の低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を含み；（ｉｉｉ）第１のリンカーＲＮＡ配列は、第１のＲＮＡ配列と第２のＲＮＡ配列との間に存在し；（ｉｖ）第２のリンカーＲＮＡ配列は、２種以上のｓｉＲＮＡのそれぞれを連結し、配列番号２３に従った配列を含む、組成物が本明細書において提供される。

【0191】

一部の態様において、第１のＲＮＡ配列、第１のリンカーＲＮＡ配列、第２のＲＮＡ配列、および第２のリンカーＲＮＡ配列を含む組み換えＲＮＡコンストラクトを含む組成物であって、（ｉ）第１のＲＮＡ配列は、インターロイキン２（ＩＬ－２）をコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）であり；（ｉｉ）第２のＲＮＡ配列は、血管内皮増殖因子Ａ（ＶＥＧＦＡ）ｍＲＮＡに結合し得る２種以上の低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を含み；（ｉｉｉ）第１のリンカーＲＮＡ配列は、第１のＲＮＡ配列と第２のＲＮＡ配列との間に存在し；（ｉｖ）第２のリンカーＲＮＡ配列は、２種以上のｓｉＲＮＡのそれぞれを連結し、配列番号２３および６７～７０からなる群から選択される配列を含む、組成物が本明細書において提供される。

【0192】

一部の態様において、第１のＲＮＡ配列、第１のリンカーＲＮＡ配列、第２のＲＮＡ配列、および第２のリンカーＲＮＡ配列を含む組み換えＲＮＡコンストラクトを含む組成物であって、（ｉ）第１のＲＮＡ配列は、インターロイキン１２（ＩＬ－１２）をコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）であり；（ｉｉ）第２のＲＮＡ配列は、細胞骨髄球腫症（ｃ－Ｍｙｃ）、カーステンラット肉腫（ＫＲＡＳ）、プロテインキナーゼＢ－１（Ａｋｔ１）、Ａｋｔ２、および／またはＡｋｔ３のｍＲＮＡに結合し得る２種以上の低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を含み；（ｉｉｉ）第１のリンカーＲＮＡ配列は、第１のＲＮＡ配列と第２のＲＮＡ配列との間に存在し；（ｉｖ）第２のリンカーＲＮＡ配列は、２種以上のｓｉＲＮＡのそれぞれを連結し、配列番号２３に従った配列を含む、組成物が本明細書において提供される。

【0193】

一部の態様において、配列番号１～１８および７６～１０８からなる群から選択される核酸配列を含む組み換えポリ核酸コンストラクトを含む組成物が本明細書において提供される。

【実施例】

【0194】

これらの実施例は、例示的目的のためのみに提供されるものであり、本明細書において提供される特許請求の範囲を限定するものではない。

【0195】

実施例１：コンストラクト設計、配列、および合成

【0196】

コンストラクト設計

【0197】

ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写によって生成された単一転写産物からｓｉＲＮＡおよび関心のある遺伝子の両方を同時に発現するように、コンストラクトを設計した（表１；配列番号１～９および７６～８４）。ＩＬ－４およびＩＧＦ－１コード配列は、ホモサピエンス（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）を起源とし、結果として生じるアミノ酸配列の変化は、ＩＬ－４（ｈＩＬ４：ＮＰ＿０００５８０．１；配列番号２６および２７）に対して導入されなかった。トランスフェクトされた細胞からのｍＲＮＡ誘導性ＩＧＦ－１（ＮＰ＿０００６０９．１）の分泌を増加させるために、内因性のＩＧＦ－１プレ－ドメイン（シグナルペプチド；配列番号２８および２９）を、ｍＲＮＡコンストラクトにおいて、ＢＤＮＦ（ＮＰ＿７３３９３１．１；配列番号３０および３１）シグナルペプチド（ＢＤＮＦ－プロ－ＩＧＦ－１）によって交換した。さらに、コンストラクトは、７０個のアミノ酸を有する成熟ヒトＩＧＦ－１の全コード配列をコードする配列を含有した（配列番号３０および３１）。Ｃ末端Ｅ－ドメインは、コンストラクトに付加されなかった。ＴＮＦ－アルファ（ＮＭ＿０００５９４．３；配列番号３２）およびＡＬＫ２（ＮＭ＿００１１０５．４；配列番号３３）に対するｓｉＲＮＡ標的配列は、ホモサピエンス（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）を起源とし、配列の変化は導入されなかった。Ｔｕｒｂｏ ＧＦＰ配列は、海生カイアシ類ポンテリーナ・プルマーテ（Ｐｏｎｔｅｌｌｉｎａ ｐｌｕｍａｔｅ）に由来した（配列番号３４）。

【0198】

ポリ核酸コンストラクトは、コザック配列（５’ＧＣＣＡＣＣ３’；配列番号１９）を含み得る。加えて、ポリ核酸コンストラクトは、ＲＮＡポリメラーゼ結合、ならびに単一転写産物における関心のある遺伝子およびｓｉＲＮＡの両方のｉｎ ｖｉｔｒｏ転写の成功のために、関心のある遺伝子配列の上流にＴ７プロモーター配列（５’ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡ３’；配列番号２０）を含み得る。代替的プロモーター、例えばＳＰ６、Ｔ３、Ｐ６０、Ｓｙｎ５、およびＫＰ３４が使用され得る。Ｔ７プロモーター、関心のある遺伝子、およびｓｉＲＮＡ配列に隣接するように設計されたプライマーを使用して、転写鋳型をＰＣＲによって生成して、ｍＲＮＡを産生した。リバースプライマーは、ｍＲＮＡに１２０ｂｐ長のポリ（Ａ）テールを付加するために、一続きのチミジン（Ｔ）塩基（１２０）を含む。ポリヌクレオチドまたはＲＮＡコンストラクトの一部は、Ｃｈｅｎｇら（２０１８）Ｊ．Ｍａｔｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｂ．、６、４６３８～４６４４に記載されるｓｉＲＮＡ設計を含むように操作され、以降Ａ１－リンカーと称される、異なるＲＮＡセグメントを接続する（関心のある遺伝子ｍＲＮＡをｓｉＲＮＡに（配列番号２１）、またはｓｉＲＮＡをｓｉＲＮＡに（配列番号２２））リンカーとともに、ｓｉＲＮＡ配列の上流に関心のある１種または複数の遺伝子をさらに含む。一部のコンストラクトにおいて、以降Ａ２－リンカー（配列番号２３）と称される、異なるＲＮＡセグメントを接続する（例えば、関心のある遺伝子をコードするｍＲＮＡとｓｉＲＮＡとを接続する、およびｓｉＲＮＡとｓｉＲＮＡとを接続する）ように、新規のリンカー配列を設計した。組み換えコンストラクトは、同じまたは異なる標的ｍＲＮＡを標的にする１種より多くのｓｉＲＮＡ配列をコードし得るまたは含み得る。同じように、コンストラクトは、関心のある２種以上の遺伝子の核酸配列を含み得る。

【0199】

コンストラクト合成

【0200】

表１に示されるコンストラクト（化合物ＩＤ番号Ｃｐｄ．１～Ｃｐｄ．１７）を、ＧｅｎｅＯｐｔｉｍｉｚｅｒアルゴリズムを使用して、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）に対するコドン最適化を用いて、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含有する、ＧｅｎｅＡｒｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によるｐＭＡ－ＲＱプラスミド骨格ベクターにおいて、またはＧｅｎｅＷｉｚ、ＣｈｉｎａによるｐＵＣ－ＧＷ－Ｋａｎ骨格ベクターにおいて合成する。表１は、各化合物（Ｃｐｄ．）に関して、相当するｍＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ標的）へのｓｉＲＮＡ結合により下方調節される対象となるタンパク質、化合物におけるｓｉＲＮＡ位置、化合物におけるｓｉＲＮＡの数、関心のある遺伝子、およびそれぞれの適応症を示している。各コンストラクトの配列は表２および表６に示されており、表の下に示されるように注釈を付されている（配列番号１～９、８５～９２、７６～８４、および８５～９２）。各コンストラクトのプラスミド骨格配列は表３に示されており、化合物配列は、太字でかつ下線が引かれている（配列番号１０～１８および９３～１００）。

【0201】

【0202】

【0203】

【0204】

実施例２：ＲＮＡコンストラクトのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写およびデータ分析

【0205】

Ｃｐｄ．１～Ｃｐｄ．１７をコードするｐＭＡ－ＲＱ／ｐＵＣ－ＧＷ－Ｋａｎベクターを使用して、ＰＣＲベースのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写を行ってＲＮＡコンストラクトを産生した。表４におけるフォワードおよびリバースプライマー（配列番号２４および２５）を使用したＰＣＲによって、転写鋳型を生成した。１２０ｂｐポリ（Ａ）テールをもたらす鋳型において、ポリ（Ａ）テールをコードした。ｓｉＲＮＡ隣接領域のそれぞれの配列を考慮して、最適化を必要に応じて行って特異的増幅を達成した。最適化は、１）ベクターのプラスミドＤＮＡの量を減少させること、２）ＤＮＡポリメラーゼを変化させること（Ｑ５ホットスタートポリメラーゼ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、３）ＰＣＲの各サイクルに対して、変性時間（３０秒間から１０秒間へ）および伸長時間（４５秒間／ｋｂから１０秒間／ｋｂへ）を低下させること、４）ＰＣＲの各サイクルに対して、アニーリングを増加させること（１０秒間から３０秒間へ）、ならびに５）ＰＣＲの各サイクルに対して、最終伸長時間を増加させること（最高１５分間まで）を含む。加えて、非特異的プライマー結合を回避するために、融解試薬を含めた、ＰＣＲ反応混合物を氷上で調製し、ＰＣＲサイクルの数を２５回に低下させた。

【0206】

ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写に関しては、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ（ＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔキット、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を３７℃で２時間使用した。合成されたＲＮＡを、１００％Ｎ１－メチルシュード－ＵＴＰを用いて化学修飾して、５’末端でアンチリバースＣＡＰアナログ（ＡＲＣＡ；［ｍ_２ ^{７，３’－Ｏ}Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ］）を用いて共転写的にキャッピングした（Ｊｅｎａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）。免疫原性を測定する非修飾のＲＮＡを作出するために、Ｎ１－メチルシュード－ＵＴＰの代わりに標準ｄＵＴＰを使用した。ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写の後、ＲＮＡコンストラクトを、ＭＥＧＡｃｌｅａｒキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してカラム精製し、Ｎａｎｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ－Ｎ６０（Ｉｍｐｌｅｎ）を使用して定量した。

【0207】

【0208】

ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写を使用して、Ｃｐｄ．１～Ｃｐｄ．１７をＲＮＡコンストラクト（２００～５００μｇ）として作出し、ＩＬ－４、ＩＧＦ１、ＩＬ－２、およびＩＬ－１２発現、ならびにＴＮＦ－アルファ、ＡＬＫ２、Ｔｕｒｂｏ－ＧＦＰ、ＶＥＧＦＡ、ｃ－Ｍｙｃ、ＫＲＡＳ、Ａｋｔ１、Ａｋｔ２、およびＡｋｔ３下方調節と並行したＩＬ－４、ＩＧＦ１、ＩＬ－２、およびＩＬ－１２過剰発現のコンビナトリアル効果について、下で指定される様々なｉｎ ｖｉｔｒｏモデルにおいて試験した。

【0209】

コンストラクトの分子量の判定を、以下のように実施した。各配列に存在する各塩基（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、またはＮ１－ＵＴＰ）の総数を判定し、該数にそれぞれの分子量（例えば、Ａ：３４７．２ｇ／ｍｏｌ；Ｃ ３２３．２ｇ／ｍｏｌ；Ｇ ３６３．２ｇ／ｍｏｌ；Ｎ１－ＵＴＰ：３３８．２ｇ／ｍｏｌ）を掛けることによって、各コンストラクトの分子量を各配列から判定した。各塩基に対して獲得された全重量と８１７．４ｇ／ｍｏｌのＡＲＣＡ分子量との合計によって、分子量を判定した。各コンストラクトの分子量を使用して、ナノモル（ｎＭ）濃度まで、各ウェルにおけるトランスフェクションに使用されるＲＮＡの量を算出した。

【0210】

データを、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ８（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＵＳＡ）を使用して分析した。標準物質または試料におけるＥＬＩＳＡを使用したタンパク質レベルの推定に関しては、ブランクの平均吸収度値を、標準物質または試料の平均吸収度から差し引いた。メーカーのプロトコールに従って４パラメーター非線形回帰を使用して、標準曲線を作出しかつプロットした。各試料におけるタンパク質の濃度を判定するために、種々のタンパク質の濃度を標準曲線から内挿した。試料の最終タンパク質濃度を、希釈係数での掛け算によって算出した。統計分析を、スチューデントｔ検定または一方向ＡＮＯＶＡ、それに続くダネットの多重比較検定を使用することによって行った。

【0211】

実施例３：ＴＨＰ－１細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏトランスフェクション、およびＴＨＰ－１細胞における内因性のＴＮＦ－アルファ発現モデル

【0212】

ＴＨＰ－１細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏトランスフェクション

【0213】

ヒト単球白血病細胞株ＴＨＰ－１（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ＃８８０８１２０１）を、成長培地（１０％ＦＢＳおよび２ｍＭグルタミンを補給されたＲＰＭＩ １６４０）中で維持した。細胞を、トランスフェクションの７２時間前に、９６ウェル細胞培養プレートに３０，０００個のＴＨＰ－１細胞で播種し、成長培地に希釈された５０ｎＭのホルボール１２－ミリステート１３－アセテート（ＰＭＡ）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ＃Ｐ８１３９）で活性化した。細胞に、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、特異的ＲＮＡコンストラクト（６００ｎｇ／ウェル）およびスクランブルｓｉＲＮＡ（６００ｎｇ／ウェル；Ｓｉｇｍａ、カタログ＃ＳＩＣ００２）をトランスフェクトした。１００μｌのＤＭＥＭを各ウェルから除去し、５０μｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ならびにＯｐｔｉ－ＭＥＭ中５０μｌのＲＮＡおよびＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００複合体で置き換えた。５時間後、培地を、５０ｎＭ ＰＭＡを補給された新鮮な成長培地で置き換え、プレートを、５％ＣＯ_２を含有する加湿された大気中にて３７℃で２４時間インキュベートした。

【0214】

ＴＨＰ－１細胞における内因性のＴＮＦ－アルファ発現モデル

【0215】

ＴＨＰ－１細胞におけるＴＮＦ－アルファの内因性の分泌に関しては、ＴＨＰ－１細胞を、１μｇ／ｍＬ最終濃度のＲ８４８（ＴＬＲ７／８アゴニスト；Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）とともに、１０μｇ／ｍＬ最終濃度の大腸菌由来リポ多糖類（ＬＰＳ－Ｌ４３９１；Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）で刺激し、９０分間インキュベートした。ＴＮＦ－アルファの誘導性産生は、乾癬において観察される生理的条件に相当する。刺激の後、５０μｌの培地を除去し、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ中にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００と複合した特異的ＲＮＡコンストラクト（Ｃｐｄ．１およびＣｐｄ．２）を含有するトランスフェクション複合体で置き換え、５％ＣＯ_２を含有する加湿された大気中にて３７℃で２４時間インキュベートした。トランスフェクションの後、細胞培養上清を回収し、ＥＬＩＳＡによってＴＮＦ－アルファ（下方調節する標的遺伝子）およびＩＬ－４（過剰発現する関心のある遺伝子）について定量した。トランスフェクトされていないが刺激された試料におけるＴＮＦ－アルファレベルを、コントロールとして使用し、１００％に設定し、ＴＮＦ－アルファノックダウンのパーセントを算出した。

【0216】

結果

【0217】

ＴＮＦ－アルファの下方調節における、Ｃｐｄ．１（Ａ１－リンカーとともに、３’においてＴＮＦ－アルファを標的にする３×ｓｉＲＮＡ、およびＩＬ－４コード配列を含む）およびＣｐｄ．２（Ａ２－リンカーとともに、３’においてＴＮＦ－アルファを標的にする３×ｓｉＲＮＡ、およびＩＬ－４コード配列を含む）の効果を、内因性のＴＮＦ－アルファ分泌を誘導するために１０μｇ／ｍＬ ＬＰＳおよび１μｇ／ｍＬ Ｒ８４８で刺激されたＴＨＰ－１細胞において評価した。確立されたＴＨＰ－１モデルは、乾癬の生理的免疫条件を模倣する。図２Ａにおいて実証されるように、Ｃｐｄ．１およびＣｐｄ．２は、ＴＨＰ－１細胞において内因性のＴＮＦ－アルファ発現の発現（＞８０％）を下方調節した（Ｐ＜０．００１）。同じ細胞培養上清をＩＬ－４発現について測定し、ＩＬ－４発現が損なわれないことを確認した（図２Ｂ）。図２Ｂに示されるように、Ｃｐｄ．２によるＩＬ－４発現のレベルは、Ｃｐｄ．１によるＩＬ－４発現のレベルよりも２．５倍高いことが認められる（Ｐ＜０．０１）。

【0218】

実施例４：ＨＥＫ－２９３のｉｎ ｖｉｔｒｏトランスフェクション、およびＨＥＫ－２９３細胞におけるＴＮＦ－アルファ過剰発現モデル

【0219】

ＨＥＫ－２９３細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏトランスフェクション

【0220】

ヒト胎児性腎細胞２９３（ＨＥＫ－２９３；ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１５７３）を、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（ＦＢＳ）およびペニシリン－ストレプトマイシン－アンホテリシンＢ混合物（８８２０８７、Ｂｉｏｚｙｍ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を補給されたダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｂｉｏｃｈｒｏｍ）中で維持した。トランスフェクションの前に、細胞を９６ウェル培養プレートに２０，０００個細胞／ウェルで播種し、５％ＣＯ_２を含有する加湿された大気中にて３７℃で２４時間インキュベートした。細胞を、トランスフェクションの前に＜６０％の培養密度に達するように、抗生物質なしで１０％のＦＢＳを含有するＤＭＥＭ成長培地中で成長させた。その後、ＨＥＫ－２９３細胞に、１：１ｗ／ｖのＲＮＡ対Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ比を用いて、メーカーの説明書に従ってＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、様々な濃度（６００～１５００ｎｇ）を有する特異的ＲＮＡコンストラクト（ＴＮＦ－アルファｍＲＮＡ、Ｃｐｄ．１、またはＣｐｄ．２）をトランスフェクトした。１００μｌのＤＭＥＭを除去し、５０μｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭ、ならびにＯｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中５０μｌのＲＮＡおよびＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００複合体で置き換えた。５時間後、培地を新鮮な培地によって置き換え、プレートを、５％ＣＯ_２を含有する加湿された大気中にて３７℃で２４時間インキュベートした。

【0221】

ＨＥＫ－２９３細胞におけるＴＮＦ－アルファ過剰発現モデル

【0222】

ＨＥＫ－２９３細胞におけるＣｐｄ．１およびＣｐｄ．２についてのＴＮＦ－アルファＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）およびＩＬ－４発現の同時効果を査定するために、ＴＮＦ－アルファｍＲＮＡトランスフェクション（６００ｎｇ／ウェル）を使用して、ＴＮＦ－アルファ過剰発現モデルを確立した。ＴＮＦ－アルファ下方調節および同時ＩＬ－４発現における、ＴＮＦ－アルファ標的化ｓｉＲＮＡを含有するＣｐｄ．１およびＣｐｄ．２の能力を査定するために、細胞に、Ｃｐｄ．１およびＣｐｄ．２（９００ｎｇ／ウェル）、ならびにＴＮＦ－アルファｍＲＮＡ（６００ｎｇ／ウェル）をコトランスフェクトした。トランスフェクションの後、細胞を、５％ＣＯ_２を含有する加湿された大気中にて３７℃で２４時間インキュベートし、その後に、同じ細胞培養上清における、ＥＬＩＳＡによるＴＮＦ－アルファ（下方調節する標的遺伝子）およびＩＬ－４（過剰発現する関心のある遺伝子）の定量が続いた。トランスフェクトされていない試料におけるＴＮＦ－アルファレベルを、コントロールとして使用し、１００％に設定し、ＴＮＦ－アルファノックダウンのパーセントを算出した。

【0223】

結果

【0224】

それぞれＡ１－リンカーまたはＡ２－リンカーのいずれかを有する、ＴＮＦ－アルファ標的化ｓｉＲＮＡおよびＩＬ－４タンパク質コード配列を含むＣｐｄ．１およびＣｐｄ．２を、外因的に送達されたＴＮＦ－アルファｍＲＮＡ（６００ｎｇ／ウェル）を有するＨＥＫ－２９３細胞において、同時のＴＮＦ－アルファ下方調節およびＩＬ－４発現について試験した（９００ｎｇ／ウェル）。図３Ａに示されるように、Ｃｐｄ．１およびＣｐｄ．２の両方とも、未処理のコントロールと比較して、ＴＮＦ－アルファレベルを最高８０％下方調節した（Ｐ＜０．０１）。加えて、図３Ｂに示されるように、Ｃｐｄ．２によるＩＬ－４発現のレベルは、Ｃｐｄ．１によるＩＬ－４発現のレベルよりも１．６倍高かった（Ｐ＜０．０５）。

【0225】

実施例５：Ａ５４９細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏトランスフェクション、およびＡ５４９細胞における内因性のＡＬＫ２発現モデル

【0226】

Ａ５４９細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏトランスフェクション

【0227】

Ａ５４９細胞は、ヒト肺癌に由来する典型的な肺胞ＩＩ型（ＡＴＩＩ）細胞である。Ａ５４９細胞は、内因性のＡＬＫ２ ＲＮＡ転写産物（進行性骨化性線維異形成症、ＦＯＰに対する治療標的）を中程度のレベルで発現することから、Ａ５４９細胞を使用して、ＩＧＦ－１発現を測定することと並行して、ＡＬＫ２ ｍＲＮＡを分解することにおけるＣｐｄ．３およびＣｐｄ．４の効果を調査した。Ａ５４９細胞（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｂｕｃｈｓ Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ、カタログ＃６０１２８０４）を、１０％ＦＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ；カタログ＃１０５００－０６４）を補給されたダルベッコ改変イーグル培地高グルコース（ＤＭＥＭ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｂｕｃｈｓ Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ、カタログ＃Ｄ０８２２）で維持した。Ｃｐｄ．３およびＣｐｄ．４活性を査定するために、トランスフェクションの２４時間前に、Ａ５４９細胞を常用成長培地に１０，０００個細胞／ウェルの密度で播いた。その後、細胞に、メーカーの説明書に従ってＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（ｗｗｗ．ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ．ｃｏｍ）を使用して、漸増濃度のＣｐｄ．３およびＣｐｄ．４（０．６５、１．３３、２．７、５．４、および１０．８ｎＭ）をトランスフェクトした。１００μｌのＤＭＥＭを除去し、５０μｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭ（ｗｗｗ．ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ．ｃｏｍ）を各ウェルに添加し、その後にＯｐｔｉ－ＭＥＭ中５０μｌのＲＮＡおよびＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００複合体が続いた。５時間のインキュベーションの後、培地を新鮮な成長培地によって置き換え、プレートを、５％ＣＯ_２を含有する加湿された大気中にて３７℃で２４時間インキュベートし、その後に、ＥＬＩＳＡによるＩＧＦ－１定量、ならびにＳＹＢＲ １－Ｓｔｅｐ Ｃｅｌｌｓ ｔｏ ＣＴキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ；カタログ＃Ａ２５５９９）を使用した、ヒトＡＬＫ２ ｍＲＮＡを標的にするプライマー（フォワードプライマー：５’－ＧＡＣＧＴＧＧＡＧＴＡＴＧＧＣＡＣＴＡＴＣＧ－３’、およびリバースプライマー：５’－ＣＡＣＴＣＣＡＡＣＡＧＴＧＴＡＡＴＣＴＧＧＣＧ－３’；それぞれ配列番号３５および３６）を用いたｑＰＣＲを使用した相対的定量によるＡＬＫ２ ｍＲＮＡが続いた。ヒト１８Ｓ ｒＲＮＡを参照コントロールとして使用した（フォワードプライマー：５’－ＡＣＣＣＧＴＴＧＡＡＣＣＣＣＡＴＴＣＧＴＧＡ－３’、およびリバースプライマー：５’－ＧＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＣＣＡＴＣＣＡＡＴＣＧＧ－３’；それぞれ配列番号３７および３８）。

【0228】

結果

【0229】

用量応答結果は、Ａ５４９細胞において、ＩＧＦ－１発現に対するＣｐｄ．４におけるＡ２－リンカーの効果が、Ｃｐｄ．３におけるＡ１－リンカーよりも有意に高いことを示した（図４Ａ；Ｐ＜０．００１）。同じ細胞培養溶解物において、残存ＡＬＫ－２発現に対するＣｐｄ．３およびＣｐｄ．４のＲＮＡ干渉を、相対的定量によって査定した。図４Ｂにおいて実証されるように、Ｃｐｄ．３およびＣｐｄ．４の両方とも、内因性のＡＬＫ２ ＲＮＡ転写産物発現を最高７５％等しく下方調節した。

【0230】

１．３３ｎＭ／ウェルに関する１２個の複製物を用いたＡ５４９細胞における分析において、Ｃｐｄ．４処理細胞は、Ｃｐｄ．３と比較して、１．５倍高いＩＧＦ－１発現および分泌を示した（図４Ｄ、Ｐ＜０．００１）。別の細胞タイプにおけるＩＧＦ－１発現におけるＡ２－リンカーの効果を確認するために、同じ実験（１．３３ｎＭ／ウェル、１２個の複製物）を、実施例４に記載されるようにＨＥＫ２９３細胞において行った。結果は、Ｃｐｄ．４で処理された細胞からのＩＧＦ－１発現および分泌のレベルが、Ｃｐｄ．３によるものよりも１．８倍高いことを示している（図４Ｃ、Ｐ＜０．０５）。

【0231】

実施例６：ＳＣＣ－４細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏトランスフェクション、ならびにＴｕｒｂｏ ＧＦＰ過剰発現モデルにおけるＳＣＣ－４細胞におけるＩＧＦ１分泌およびＴｕｒｂｏ ＧＦＰ下方調節のコンビナトリアル効果

【0232】

ＳＣＣ－４細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏトランスフェクション

【0233】

ヒト舌扁平上皮癌（ＳＣＣ－４；Ｓｉｇｍａ、カタログ＃８９０６２００２ ＣＲＬ－１５７３）細胞を、ＨＡＭ Ｆ１２（１：１）＋２ｍＭグルタミン＋１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）＋０．４μｇ／ｍｌヒドロコルチゾンを補給されたダルベッコ改変イーグル高グルコース培地（ＤＭＥＭ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈｔ）中で維持した。トランスフェクションの前に、細胞を９６ウェル培養プレートに１５，０００個細胞／ウェルで播種し、５％ＣＯ_２を含有する加湿された大気中にて３７℃で２４時間インキュベートした。細胞を、トランスフェクションの前に＜７０％の培養密度に達するように、ＤＭＥＭ／ＨＡＭ Ｆ－１２成長培地中で成長させた。その後、ＳＣＣ－４細胞に、メーカーの説明書に従ってＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、Ｔｕｒｂｏ ＧＦＰ過剰発現モデルを確立するためのＴｕｒｂｏ ＧＦＰ ｍＲＮＡ（０．３μｇ）、ならびにＩＧＦ－１タンパク質コードＲＮＡ配列と、Ｔｕｒｂｏ ＧＦＰに対する１×または２×ｓｉＲＮＡとを含む特異的ＲＮＡコンストラクト（Ｃｐｄ．５～Ｃｐｄ．９、３０ｎＭ／ウェル）をコトランスフェクトした。ユニバーサルスクランブルｓｉＲＮＡ（Ｓｉｇｍａ、カタログ＃ＳＩＣ００２）をコントロールとして使用した（３０ｎＭ／ウェル）。ＲＮＡ対Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ比は１：１ｗ／ｖであった。１００μｌのＤＭＥＭを除去し、５０μｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭ、ならびにＯｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中５０μｌのＲＮＡおよびＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００複合体で置き換えた。５時間後、培地を、ＦＢＳを有しない新鮮な成長培地によって置き換え、プレートを、５％ＣＯ_２を含有する加湿された大気中にて３７℃で２４時間インキュベートした。トランスフェクトされていない試料におけるＴｕｒｂｏ ＧＦＰ陽性細胞を、コントロールとして使用し、０％に設定し、Ｔｕｒｂｏ ＧＦＰノックダウンのパーセントを算出した。

【0234】

結果

【0235】

ＩＧＦ－１発現に対するリンカーＡ１（Ｃｐｄ．５、Ｃｐｄ．７、およびＣｐｄ．８）およびＡ２（Ｃｐｄ．６およびＣｐｄ．９）の効果を、ＳＣＣ－４細胞において査定した。データは、Ａ２－リンカーを含有するＣｐｄ．６およびＣｐｄ．９が、それらのＡ１－リンカー対応物と比較して、１．８倍～２．２倍高いＩＧＦ１レベルの増加を示したことを実証する（図５Ａ；Ｐ＜０．００１）。Ａ２リンカーと比較したＡ１リンカーのＩＧＦ－１レベルの低下に関して、ｓｉＲＮＡの数（１×または２×ｓｉＲＮＡ）およびｓｉＲＮＡ配列差（Ｃｐｄ．７は、２回繰り返された同じｓｉＲＮＡ配列を有し、一方でＣｐｄ．８は、２種の異なるｓｉＲＮＡ配列を有する）において、差は示されなかった。すべての試験されたコンストラクトは、完全なＴｕｒｂｏ ＧＦＰ下方調節をもたらした（９８～９９％；図４Ｂ）。図４Ｃは、グレースケールでの、Ｔｕｒｂｏ ＧＦＰ発現に関する、コントロール、ｓｃ．ｓｉＲＮＡ、Ｃｐｄ．５、およびＣｐｄ．６についての代表的な顕微鏡画像を示している。

【0236】

実施例７：Ａ５４９細胞におけるＩＬ－２発現および内因性のＶＥＧＦＡ下方調節に関する、種々のリンカーを有する化合物（Ｃｐｄ．１０～Ｃｐｄ．１５）についての比較分析

【0237】

Ａ５４９細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏトランスフェクション

【0238】

Ａ５４９細胞を、上で記載されるように培養し、トランスフェクトした。実験におけるＦＢＳ由来ＶＥＧＦＡ効果を回避するために、成長培地はＦＢＳを含有しなかった。Ａ５４９細胞を、これらの細胞はｉｎ ｖｉｔｒｏでＶＥＧＦＡを最高５０～１００ｎｇ／ｍＬ内因的に発現することから、使用した。同時のＶＥＧＦＡ ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）およびＩＬ－２発現に対する種々のリンカー（Ａ１、Ａ２、Ｂ～Ｅ）の影響を評価するために、Ａ５４９細胞に漸増濃度（１、３、１０、および３０ｎＭ）のＣｐｄ．１０～Ｃｐｄ．１５をトランスフェクトした。次いで、細胞を、５％ＣＯ_２を含有する加湿された大気中にて３７℃で２４時間インキュベートし、その後に、特異的ＥＬＩＳＡを使用することによる、同じ細胞培養上清に存在するＶＥＧＦＡ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ＃ＫＨＧ０１１２）およびＩＬ－２（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ＃８８７０２５）の定量が続いた。トランスフェクトされていない細胞からのＶＥＧＦＡレベルを１００％に設定し、ＶＥＧＦＡレベルの下方調節を、トランスフェクトされていない試料（基底レベル）に対して正規化した。

【0239】

結果

【0240】

ＩＬ－２発現に対するリンカーＡ１（Ｃｐｄ．１０）、Ａ２（Ｃｐｄ．１１）、Ｂ（Ｃｐｄ．１２）、Ｃ（Ｃｐｄ．１３）、Ｄ（Ｃｐｄ．１４）、およびＥ（Ｃｐｄ．１５）の効果を、Ａ５４９細胞において査定した。データは、Ａ２－リンカーを含有するＣｐｄ．１１およびＥ－リンカーを含有するＣｐｄ．１５をトランスフェクトされた細胞が、他のリンカーをトランスフェクトされた細胞と比較して、増加したＩＬ－２レベル（１．５倍～２．５倍高い）を示したことを実証する（図６Ａおよび６Ｃ）。内因性のＶＥＧＦＡ発現の阻害に対するリンカーの効果を査定するために、用量応答調査をＡ５４９細胞において実施した。種々のリンカーを有する化合物（１０ｎＭおよび３０ｎＭ濃度）をトランスフェクトされた細胞は、完全なＶＥＧＦＡ下方調節（９８～９９％）を呈した（図６Ｂおよび６Ｃ）。しかしながら、Ｂ－リンカーを含有するＣｐｄ．１２は、３ｎＭ濃度で６５％のＶＥＧＦＡ下方調節というより高い力価を示し、一方でＣｐｄ．１０（Ａ１；５０％）、Ｃｐｄ．１１（Ａ２；４０％）、Ｃｐｄ．１３（Ｃ；３９％）、Ｃｐｄ．１４（Ｄ；４６％）、およびＣｐｄ．１５（Ｅ；３１％）は、ＶＥＧＦＡ下方調節における低下した力価を明らかにした。向上したＶＥＧＦＡ下方調節（３０％）の同様の傾向が、他のリンカーを有する化合物と比較して、Ｃｐｄ．１２（Ｂ－リンカーを含有する）に関して１ｎＭ濃度で認められた。それにもかかわらず、Ｃｐｄ．１２からのＩＬ－２発現は、３ｎＭ濃度のＣｐｄ．１１およびＣｐｄ．１５と比較したＩＬ－２発現よりも約９倍低かった（図６Ａ）。

【0241】

実施例８：ＳＣＣ－４細胞におけるＩＬ－２発現および内因性のＶＥＧＦＡ下方調節に関する、種々のリンカーを有する化合物（Ｃｐｄ．１０～Ｃｐｄ．１５）についての比較分析

【0242】

ＳＣＣ－４細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏトランスフェクション

【0243】

ＳＣＣ－４細胞を、上で記載されるように培養し、トランスフェクトした。実験におけるＦＢＳ由来ＶＥＧＦＡ効果を回避するために、成長培地はＦＢＳを含有しなかった。ＳＣＣ－４細胞を、これらの細胞はｉｎ ｖｉｔｒｏでＶＥＧＦＡを最高８００ｎｇ／ｍＬ内因的に発現することから、使用した。同時のＶＥＧＦＡ ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）およびＩＬ－２発現に対する種々のリンカー（Ａ１、Ａ２、Ｂ～Ｅ）の影響を評価するために、ＳＣＣ－４細胞に漸増濃度（１、３、１０、および３０ｎＭ）のＣｐｄ．１０～Ｃｐｄ．１５をトランスフェクトした。次いで、細胞を、５％ＣＯ_２を含有する加湿された大気中にて３７℃で２４時間インキュベートし、その後に、特異的ＥＬＩＳＡを使用することによる、同じ細胞培養上清に存在するＶＥＧＦＡ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ＃ＫＨＧ０１１２）およびＩＬ－２（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ＃８８７０２５）の定量が続いた。トランスフェクトされていない細胞からのＶＥＧＦＡレベルを１００％に設定し、ＶＥＧＦＡレベルの下方調節を、トランスフェクトされていない試料（基底レベル）に対して正規化した。

【0244】

結果

【0245】

ＩＬ－２発現に対するリンカーＡ１（Ｃｐｄ．１０）、Ａ２（Ｃｐｄ．１１）、Ｂ（Ｃｐｄ．１２）、Ｃ（Ｃｐｄ．１３）、Ｄ（Ｃｐｄ．１４）、およびＥ（Ｃｐｄ．１５）の効果を、ＳＣＣ－４細胞において査定した。Ａ５４９細胞と同様に、Ａ２－リンカーを含有するＣｐｄ．１１およびＥ－リンカーを含有するＣｐｄ．１５をトランスフェクトされた細胞は、他のリンカーをトランスフェクトされた細胞と比較して、増加したＩＬ－２レベル（１．２倍～２．５倍高い）を示した（図７Ａおよび７Ｃ）。Ｂ－リンカーを含有するＣｐｄ．１２は、３ｎＭ濃度で、Ａ２－リンカーを含有するＣｐｄ．１１（１４９１５ｐｇ／ｍＬ対３０３６１ｐｇ／ｍＬ）およびＥ－リンカーを含有するＣｐｄ．１５（１４９１５ｐｇ／ｍＬ対３４１２７ｐｇ／ｍＬ）と比較して、減少したＩＬ－２レベルをもたらした。ＳＣＣ－４細胞における内因性のＶＥＧＦＡ発現阻害の査定は、Ｂ－リンカーを含有するＣｐｄ．１２が、１０ｎＭ濃度で７２％のＶＥＧＦＡ下方調節というより高い力価を示すことを明らかにし、一方でＣｐｄ．１０（Ａ１；５２％）、Ｃｐｄ．１１（Ａ２；４０％）、Ｃｐｄ．１３（Ｃ；４７％）、Ｃｐｄ．１４（Ｄ；３８％）、およびＣｐｄ．１５（Ｅ；３４％）は、ＶＥＧＦＡ下方調節における低下した力価を明らかにした。種々のリンカーを有するすべての化合物は、３０ｎＭ濃度で等価レベルのＶＥＧＦＡ下方調節（８０～９０％）を呈した（図７Ｂ）。

【0246】

実施例９：初代ＨＳＭＭ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏトランスフェクション、および種々のリンカーを有する化合物からのＩＧＦ－１発現の査定

【0247】

ＨＳＭＭ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏトランスフェクション

【0248】

成人ヒト骨格筋筋芽細胞（ＨＳＭＭ、ＣＣ－２５８０、Ｌｏｎｚａ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）細胞は、通常の健常ドナーの上腕または脚筋から単離された初代骨格筋細胞である。ＨＳＭＭ細胞は、進行性骨化性線維異形成症（ＦＯＰ）疾患に対する疾患関連細胞タイプである。タンパク質発現に対するＡ１およびＡ２リンカーの影響を、精選された（ｃｕｒａｔｅｄ）細胞株に加えて、初代細胞において評価した。ＨＳＭＭ細胞を、Ｓｋｅｌｅｔａｌ Ｍｕｓｃｌｅ－２ ＳｉｎｇｌｅＱｕｏｔｓキット（ＳｋＧＭキット、ＣＣ－３２４４、Ｌｏｎｚａ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を補給された、Ｓｋｅｌｅｔａｌ Ｍｕｓｃｌｅ－２基礎培地（ＳｋＢＭ、ＣＣ－３２４６、Ｌｏｎｚａ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を含有する骨格成長培地（ＳｋＧＭ）中で維持した。分化培地（成長培地＋２％熱活性化ウマ血清；２６０５０－０７０、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）の添加は、初代筋芽細胞を、ＦＯＰに関連する多核筋管に分化させる。Ｃｐｄ．３およびＣｐｄ．４活性を査定するために、トランスフェクションの２４時間前に、ＨＳＭＭ細胞を、９６ウェル細胞培養プレートに１０，０００個細胞／ウェルを用いて播いた。細胞を、ＳｋＧＭ成長培地（ＧＭ）または分化培地（ＤＭ）中で成長させた。その後、細胞に、メーカーの説明書に従ってＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００を使用して、漸増濃度のＣｐｄ．３およびＣｐｄ．４（０．１、０．３、１、３、１０、および３０ｎＭ）をトランスフェクトした。１００μｌのＳｋＧＭを除去し、５０μｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭ（ｗｗｗ．ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ．ｃｏｍ）を各ウェルに添加し、その後にＯｐｔｉ－ＭＥＭ中５０μｌのＲＮＡおよびＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００複合体が続いた。５時間のインキュベーションの後、培地を新鮮な成長培地によって置き換え、プレートを、５％ＣＯ_２を含有する加湿された大気中にて３７℃で２４時間インキュベートし、その後に、細胞培養上清におけるＥＬＩＳＡによるＩＧＦ－１定量が続いた（Ｍｅｄｉａｇｎｏｓｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ；カタログ＃Ｅ２０）。

【0249】

結果

【0250】

用量応答結果は、ＨＳＭＭ成長培地中で培養されたＨＳＭＭ細胞において、ＩＧＦ－１発現に対するＣｐｄ．４におけるＡ２－リンカーの効果が、Ｃｐｄ．３におけるＡ１－リンカーの効果よりも有意に高いことを示した（図８Ａ；Ｐ＜０．００１；１０ｎＭにおけるＣｍａｘは、５７ｎｇ／ｍＬ対２３ｎｇ／ｍＬである）。分化したＨＳＭＭにおけるＩＧＦ－１発現におけるＡ１－リンカーと比したＡ２－リンカーの効果を、分化培地中で培養されたＨＳＭＭ細胞において行い、結果は、Ａ２－リンカーを含有するＣｐｄ．４で処理された細胞からのＩＧＦ－１発現および分泌のレベルが、１０ｎＭ濃度で、Ａ１－リンカーを含有するＣｐｄ．３で処理された細胞からのＩＧＦ－１発現および分泌のレベルよりも２倍高いことを示している（図８Ｂ、Ｐ＜０．００１）。

【0251】

実施例１０：ｉｎ ｖｉｔｒｏ膠芽細胞腫がんモデルＡ１７２細胞における、サイトカイン発現および複数のｓｉＲＮＡ標的のＲＮＡ干渉に対するＡ１およびＡ２リンカーの経時的効果

【0252】

Ａ１７２細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏトランスフェクション

【0253】

ヒト膠芽細胞腫細胞株（Ａ１７２；ＥＣＡＣＣ、カタログ＃８８０６２４２８）は、５３歳男性から取り出された膠芽細胞腫に由来した。Ａ１７２細胞を、１０％ＦＢＳおよび２ｍＭグルタミンを補給されたＲＰＭＩ １６４０培地中で維持した。トランスフェクションの前に、細胞を９６ウェル培養プレートに２０，０００個細胞／ウェルで播種し、５％ＣＯ_２を含有する加湿された大気中にて３７℃で２４時間インキュベートした。細胞を、トランスフェクションの前に＜７０％の培養密度に達するように、ＲＰＭＩ成長培地中で成長させた。その後、Ａ１７２細胞に、１：１ｗ／ｖのＲＮＡ対Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ比を用いて、メーカーの説明書に従ってＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、１０ｎＭの濃度を有するＣｐｄ．１６（Ａ１リンカー；ＩＬ－１２ ｍＲＮＡ＋１×ｃ－Ｍｙｃ ｓｉＲＮＡ＋１×ＫＲＡＳ ｓｉＲＮＡ＋１×ｐａｎ－Ａｋｔ ｓｉＲＮＡ）およびＣｐｄ．１７（Ａ２リンカー；ＩＬ－１２ ｍＲＮＡ＋１×ｃ－Ｍｙｃ ｓｉＲＮＡ＋１×ＫＲＡＳ ｓｉＲＮＡ＋１×ｐａｎ－Ａｋｔ ｓｉＲＮＡ）をトランスフェクトした。１００μｌのＲＰＭＩを除去し、９０μｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ、カタログ＃３１９８５－０７０）、ならびにＯｐｔｉ－ＭＥＭ中１０μｌのＲＮＡおよびＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００複合体で置き換えた。６時間後、培地を新鮮な成長培地によって置き換え、プレートを、５％ＣＯ_２を含有する加湿された大気中にて３７℃で２４時間インキュベートした。経時的査定に関しては、図９Ａに指定されるように、試料を０～２４時間から回収した。ＥＬＩＳＡを実施して、細胞培養上清に存在するヒトＩＬ－１２ｐ７０（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ＃８８－７１２６）レベルを定量した。それぞれの細胞溶解物も処理して、Ｃｅｌｌｓ－ｔｏ－ＣＴ（商標）１－Ｓｔｅｐ Ｐｏｗｅｒ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ＃Ａ２５５９９）およびプライマー（プライマー配列詳細は、表５に列挙される）を使用したＲＴ－ｑＰＣＲによる、トランスフェクトされていない試料に対する相対的定量によって、ｓｉＲＮＡ標的遺伝子（ｃ－Ｍｙｃ、ＫＲＡＳ、Ａｋｔ１、Ａｋｔ２、およびＡｋｔ３のＲＮＡ存在量を測定した。ヒト１８ｓ ｒＲＮＡを参照コントロールとして使用した。１フェーズ減衰（ｏｎｅ ｐｈａｓｅ ｄｅｃａｙ）分析をＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ｖ．９．２において実施して、トランスフェクション後の標的遺伝子のｓｉＲＮＡの半減期を算出した。

【0254】

【0255】

結果

【0256】

ｃ－Ｍｙｃを標的にする１×ｓｉＲＮＡ、ＫＲＡＳを標的にする１×ｓｉＲＮＡ、およびｐａｎ－Ａｋｔ（Ａｋｔ１、Ａｋｔ２、およびＡｋｔ３）を標的にする１×ｓｉＲＮＡとともに、ＩＬ－１２ ｍＲＮＡを含むＣｐｄ．１６（Ａ１－リンカー）およびＣｐｄ．１７（Ａ２－リンカー）の経時的効果を、Ａ１７２細胞に１０ｎＭのＣｐｄ．１６またはＣｐｄ．１７をトランスフェクトすることによって、Ａ１７２細胞においてＩＬ－１２発現および同時の標的遺伝子の下方調節について評価した。データは、図９Ａに示されるように、試験されたすべての時点で、Ｃｐｄ．１７（Ａ２－リンカー）をトランスフェクトされた細胞が、Ｃｐｄ．１６（Ａ１－リンカー）をトランスフェクトされた細胞よりも高いレベルのＩＬ－１２タンパク質（１．４～４倍）を発現することを実証する。同じ細胞溶解物において、ｃ－Ｍｙｃ、ＫＲＡＳ、およびｐａｎ－Ａｋｔ（Ａｋｔ１、Ａｋｔ２、およびＡｋｔ３）ＲＮＡ転写産物に対するＣｐｄ．１６およびＣｐｄ．１７のＲＮＡ干渉も査定した。図９Ｃ～９Ｄにおいて実証されるように、Ｃｐｄ．１６およびＣｐｄ．１７の両方とも、２４時間の時点で、内因性のＡｋｔ－１、Ａｋｔ－２、Ａｋｔ－３、およびＫＲＡＳを＞９５％下方調節した。１フェーズ分析は、Ａ１－リンカーを有するＣｐｄ．１６が、Ａ２－リンカーよりも１または２時間早く標的遺伝子のＲＮＡ干渉を達成する（ｔ_１／２：１．７～２．３ｈ対２．２～３．４ｈ）が、Ａ２－リンカーを有するＣｐｄ．１７と比較して、低下したレベルのＩＬ－１２を発現することを明らかにした。Ｃｐｄ．１６およびＣｐｄ．１７によって標的にされるｃ－ＭｙｃのＲＮＡ干渉は１２時間後に観察され、内因性のｃ－Ｍｙｃ ｍＲＮＡを最高２４時間まで持続的に減少させた（２７％対２１％）。３種すべてのＡｋｔ遺伝子（Ａｋｔ１、Ａｋｔ２、およびＡｋｔ３）を標的にするｐａｎ－Ａｋｔ ｓｉＲＮＡの設計は成功し、実験的に立証され、同様の配列を有する複数の遺伝子を標的にする特異的ｓｉＲＮＡを設計することの実現可能性を実証した。

【0257】

実施例１１：ＳＴＡＴ４活性化に関する、ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ｈＩＬ－１２レポーターアッセイにおける、Ａ１－およびＡ２－リンカーを有する化合物に由来するＩＬ－１２の機能的分析

【0258】

ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ｈＩＬ－１２レポーターアッセイ

【0259】

Ａ１－リンカーを有するＣｐｄ．１６およびＡ２－リンカーを有するＣｐｄ．１７に由来するＩＬ－１２の機能活性を、ＳＴＡＴ－４経路の活性化をモニターすることによってヒトＩＬ－１２受容体の活性化を調査するために設計されている、ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ｈＩＬ－１２レポーター細胞（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ、カタログコード：ｈｋｂ－ｉｌ１２）において試験した。これらの細胞は、ヒト胎児性腎臓ＨＥＫ２９３細胞株に由来し、完全に機能的なＩＬ－１２シグナル伝達カスケードを達成するために、ヒトＪＡＫ２およびＳＴＡＴ４遺伝子と一緒に、ヒトＩＬ－１２Ｒβ１およびＩＬ－２Ｒβ２遺伝子を発現するように操作されている。加えて、ＳＴＡＴ４誘導性ＳＥＡＰレポーター遺伝子を導入した。ＩＬ－１２活性化、それに続くＳＴＡＴ４があり次第、産生されたＳＥＡＰは、細胞培養上清においてＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）検出細胞培地を用いてリアルタイムで判定され得る。ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ｈＩＬ－１２細胞の刺激を、下に詳細を有して、組み換えヒトＩＬ－１２（ｒｈＩＬ－１２）、またはＣｐｄ．１６もしくはＣｐｄ．１７（０．３μｇ／ウェル）をトランスフェクトされているＨＥＫ２９３細胞の細胞培養上清に由来するＩＬ－１２によって達成した。

【0260】

ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ｈＩＬ－２細胞を、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を補給されたダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）中で維持した。抗生物質ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ（培地を用いて１：２５０希釈）を培地に添加して、ＩＬ－１２Ｒβ１、ＩＬ－２Ｒβ２、ＳＴＡＴ４、およびＳＥＡＰ導入遺伝子プラスミドを含有する細胞を選択した。刺激の前に、細胞を９６ウェル培養プレートに４０，０００個細胞／ウェルで播種し、５％ＣＯ_２を含有する加湿された大気中にて３７℃で２４時間インキュベートした。細胞を、刺激の前に＜８０％の培養密度に達するように、１０％のＦＢＳを含有するＤＭＥＭ成長培地中で成長させた。ＨＥＫ２９３細胞培養上清に由来する規定濃度（０．００１～３００ｎｇ）のＩＬ－１２を回収し、２０μｌの培地に希釈し、ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ｈＩＬ－１２細胞の培地に添加して、ＩＬ－１２受容体動員、それに続くＳＴＡＴ４経路活性化を測定した。ｒｈＩＬ－１２、またはＣｐｄ．１６およびＣｐｄ．１７に由来するＩＬ－１２（０．００１～３００ｎｇ）を並行して試験した。２時間のインキュベーションの後、ＳＥＡＰ活性を、ＱＵＡＮＴＩ－Ｂｌｕｅ（商標）（２０μｌ細胞培養上清＋１８０μｌ ＱＵＡＮＴＩ－Ｂｌｕｅ（商標）溶液）を使用し、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ ｉ３マルチモードプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ）において６２０ｎｍにおける光学濃度（Ｏ．Ｄ．）を読み取って査定した。トランスフェクトされていない試料を、バックグラウンドコントロールとして使用し、試験された試料における獲得されたＯ．Ｄ．値から差し引いた。

【0261】

結果

【0262】

ｒｈＩＬ－１２、またはＣｐｄ．１６（Ａ１－リンカー）もしくはＣｐｄ．１７（Ａ２－リンカー）をトランスフェクトされているＨＥＫ２９３細胞の細胞培養上清に由来するＩＬ－１２を用いたＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ｈＩＬ－１２細胞の刺激は、３種すべての試験された化合物が、同様の用量依存的形式でＳＥＡＰ産生を誘導したことから、機能的であった。ＩＬ－１２機能性に対して、リンカー依存的影響は観察されなかった（図９Ｂ）。要約すると、Ｃｐｄ．１６およびＣｐｄ．１７に由来するＩＬ－１２は機能的であり、ｒｈＩＬ－２と同様に、ＩＬ－１２シグナル伝達カスケードを誘導し得る。

【0263】

本明細書に記載される実施例および実施形態は、単なる例示的目的のものであり、当業者に示唆される様々な改変または変化は、本出願の精神および権限、ならびに添付の特許請求の範囲の内に含まれるべきである。

【0264】

【図1】

【図2A-2B】

【図3A-3B】

【図4A-4D】

【図5A-5C】

【図6A】

【図6B】

【図6C】

【図7A】

【図7B】

【図7C】

【図8A-8B】

【図9A】

【図9B】

【図9C-9D】

【図9E-9F】

【配列表】

2024522851000001.app

【国際調査報告】