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特表2024-522852新規治療用送達部分及びその使用

書誌要約請求の範囲詳細な説明課題実施例実施するための形態図面の説明

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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-06-21

(54)【発明の名称】新規治療用送達部分及びその使用

(51)【国際特許分類】

C07H 21/00 20060101AFI20240614BHJP

A61K 31/7088 20060101ALI20240614BHJP

A61P 1/16 20060101ALI20240614BHJP

A61K 31/713 20060101ALI20240614BHJP

A61K 47/54 20170101ALI20240614BHJP

C12N 15/113 20100101ALI20240614BHJP

【ＦＩ】

C07H21/00

A61K31/7088

A61P1/16

A61K31/713

A61K47/54

C12N15/113 Z ZNA

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023579079

(86)(22)【出願日】2022-06-22

(85)【翻訳文提出日】2024-01-25

(86)【国際出願番号】 US2022034500

(87)【国際公開番号】W WO2022271806

(87)【国際公開日】2022-12-29

(31)【優先権主張番号】63/214,555

(32)【優先日】2021-06-24

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】594197872

【氏名又は名称】イーライリリーアンドカンパニー

(74)【代理人】

【識別番号】100092783

【弁理士】

【氏名又は名称】小林浩

(74)【代理人】

【識別番号】100095360

【弁理士】

【氏名又は名称】片山英二

(74)【代理人】

【識別番号】100103182

【弁理士】

【氏名又は名称】日野真美

(74)【代理人】

【識別番号】100139310

【弁理士】

【氏名又は名称】吉光真紀

(72)【発明者】

【氏名】アントネッリス，パトリックジョセフ

(72)【発明者】

【氏名】ラックナー，グレゴリーローレンス

(72)【発明者】

【氏名】ウィルソン，タカコ

【テーマコード（参考）】

4C057

4C076

4C086

【Ｆターム（参考）】

4C057BB02

4C057DD03

4C057MM01

4C076AA95

4C076CC16

4C076CC41

4C076DD69

4C076EE59

4C076FF63

4C086EA16

4C086MA01

4C086MA04

4C086NA03

4C086NA05

4C086ZA75

(57)【要約】

本発明は、疾患、好適には肝臓の疾患の治療に有用である、オリゴヌクレオチドの送達のための新規送達部分を含む新規化合物に関する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

Ｒにコンジュゲートされた式Ｉを含む化合物であって、

【化1】

式中、Ｒは、リンカーを介して式Ｉにコンジュゲートされていてもよく、Ｒは、アンチセンス鎖を含み、前記アンチセンス鎖が、目的の遺伝子に対する相補性領域を含み、前記アンチセンス鎖が、１５～４０ヌクレオチド長である、化合物。

【請求項2】

式Ｉが、リンカーを介してＲにコンジュゲートされている、請求項１に記載の化合物。

【請求項3】

前記リンカーが、接続点Ａ及びＢを有する式ＩＩのリンカーを含むか、又は前記リンカーが、接続点Ｃ及びＤを有する式ＩＩＩを含み、

【化2】

接続点Ａ又は接続点Ｃが、式Ｉにコンジュゲートされている、請求項２に記載の化合物。

【請求項4】

前記リンカーが、接続点Ｂ又は接続点Ｄにリン酸基を更に含み、前記リン酸基が、Ｒにコンジュゲートされている、請求項２又は３に記載の化合物。

【請求項5】

前記リンカーが、接続点Ｃ及びＤを有する式ＩＩＩのリンカーを含み、

【化3】

接続点Ｃが、式Ｉにコンジュゲートされている、請求項２～４のいずれか一項に記載の化合物。

【請求項6】

前記目的の遺伝子に対する前記相補性領域が、少なくとも１５連続ヌクレオチド長である、請求項１～５のいずれか一項に記載の化合物。

【請求項7】

Ｒが、センス鎖を更に含み、前記センス鎖及び前記アンチセンス鎖が、少なくとも１５ヌクレオチド長の相補性領域を形成する、請求項６に記載の化合物。

【請求項8】

式Ｉが、前記センス鎖又は前記アンチセンス鎖にコンジュゲートされている、請求項７に記載の化合物。

【請求項9】

式Ｉが、前記アンチセンス鎖にコンジュゲートされている、請求項７又は８に記載の化合物。

【請求項10】

式Ｉが、前記センス鎖にコンジュゲートされている、請求項７又は８に記載の化合物。

【請求項11】

式Ｉが、前記センス鎖の３’末端ヌクレオチドにコンジュゲートされている、請求項１０に記載の化合物。

【請求項12】

前記センス鎖及び前記アンチセンス鎖が、少なくとも１８ヌクレオチド長の相補性領域を形成する、請求項７～１１のいずれか一項に記載の化合物。

【請求項13】

前記アンチセンス鎖が、前記センス鎖と少なくとも１５ヌクレオチドの相補性領域を形成する、請求項７～１２のいずれか一項に記載の化合物。

【請求項14】

前記センス鎖及びアンチセンス鎖が、各々独立して、１８～２３ヌクレオチド長である、請求項７～１３のいずれか一項に記載の化合物。

【請求項15】

前記センス鎖及びアンチセンス鎖が、各々独立して、２１～２３ヌクレオチド長である、請求項７～１４のいずれか一項に記載の化合物。

【請求項16】

前記アンチセンス鎖が、２つのヌクレオチドの３’オーバーハングを含む、請求項７～１５のいずれか一項に記載の化合物。

【請求項17】

前記センス鎖又は前記アンチセンス鎖が、１つ以上の修飾ヌクレオチドを含む、請求項７～１６のいずれか一項に記載の化合物。

【請求項18】

前記１つ以上の修飾ヌクレオチドが、２’フルオロ修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アルキル修飾ヌクレオチド、又はＯ－メトキシエチル修飾ヌクレオチドである、請求項７～１７のいずれか一項に記載の化合物。

【請求項19】

前記センス鎖が、１つ以上の修飾ヌクレオチドを含み、前記センス鎖の前記ヌクレオチドの各々が、修飾ヌクレオチドである、請求項７～１８のいずれか一項に記載の化合物。

【請求項20】

前記アンチセンス鎖が、１つ以上の修飾ヌクレオチドを含み、前記アンチセンス鎖の前記ヌクレオチドの各々が、修飾ヌクレオチドである、請求項７～１９のいずれか一項に記載の化合物。

【請求項21】

前記センス鎖又は前記アンチセンス鎖が、１つ以上の修飾ヌクレオチド間連結を含む、請求項７～２０のいずれか一項に記載の化合物。

【請求項22】

前記１つ以上の修飾ヌクレオチド間連結が、ホスホロチオエート連結である、請求項７～２１のいずれか一項に記載の化合物。

【請求項23】

前記アンチセンス鎖の５’ヌクレオチドが、リン酸化されているか、又はリン酸アナログを含む、請求項７～２２のいずれか一項に記載の化合物。

【請求項24】

前記アンチセンス鎖の５’ヌクレオチドが、ビニルリン酸基を含む、請求項７～２３のいずれか一項に記載の化合物。

【請求項25】

前記センス鎖及び前記アンチセンス鎖が、ｓｉＲＮＡである、請求項７～２４のいずれか一項に記載の化合物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、疾患、好適には肝臓の疾患の治療に有用である、オリゴヌクレオチドの送達のための新規送達部分を含む新規化合物に関する。

【背景技術】

【0002】

オリゴヌクレオチドを含む化合物は、遺伝子調節不全に関与する多くの異なるタイプの疾患の個別化治療のために、配列特異的な様式で遺伝子を標的とすることを可能にする。オリゴヌクレオチドを含む化合物は、用いられるオリゴヌクレオチドの特定のタイプに依存して異なる作用機構を示す。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド（antisense oligonucleotide、ＡＳＯ）及び低分子干渉ＲＮＡ（small interfering RNA、ｓｉＲＮＡ）を含むＲＮＡ干渉（RNA interference、ＲＮＡｉ）化合物を使用して、遺伝子発現をノックダウンすることができる。対照的に、他のオリゴヌクレオチド含有化合物は、短鎖活性化ＲＮＡ（short activating RNA、ｓａＲＮＡ）などのオリゴヌクレオチドを使用して遺伝子を活性化し得る。オリゴヌクレオチドを患者の所望の組織に送達することによって、遺伝子発現を下方調節するか、上方調節するか、又は補正することができる。

【0003】

肝細胞上のアシアロ糖タンパク質受容体を標的とするためにＮ－アセチルガラクトサミン（N-acetylgalactosamine、ＧａｌＮＡｃ）を含む送達部分を使用する、オリゴヌクレオチドの送達は、所望の組織への送達のための１つの様式である。ＧａｌＮＡｃを含む例示的な化合物は、急性肝臓ポルフィリン症を治療するためにＡＬＡＳ１遺伝子を標的とする、ＦＤＡによって承認されたｓｉＲＮＡであるギボシランである。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0004】

そのような市販の化合物の存在にもかかわらず、肝臓又は他の組織へのオリゴヌクレオチドの送達のための代替又は改善された部分、及び送達部分と治療用ｓｉＲＮＡなどの１つ以上のオリゴヌクレオチドとを含む改善された治療用化合物を提供する必要性が依然として存在する。

【課題を解決するための手段】

【0005】

より具体的には、送達部分と１つ以上のオリゴヌクレオチドとを含む化合物を提供する必要性が存在し、そのような化合物は、改善された組織曝露、好適には改善された肝臓における曝露；改善された肝臓対腎臓曝露比、改善されたノックダウン；改善された耐久性応答；改善された薬物動態プロファイル、より少ないオフターゲット効果、改善された毒性プロファイル、改善された安全性プロファイル、及び／又は改善された合成プロセス、例えば、限定されないが、より少ない工程を有する合成プロセス、より少ない分解生成物を生成するプロセス、改善された安全性若しくは効能プロファイルを有する化合物を生成する合成プロセス、改善された収率を生成するプロセス、あるいはこれらの任意の組み合わせのうちの１つ以上を示す。

【発明を実施するための形態】

【0006】

一形態では、本発明は、式Ｉの送達部分を提供する。

【0007】

【化1】

【0008】

式Ｉを含む本明細書の化合物は、式Ｉ内の１個以上の原子の修飾若しくは付加若しくは欠失を有し得るか、又は化合物は、追加の部分を含み得る。例えば、式Ｉ中の１つ以上のアルキル鎖は、伸長若しくは短縮され得るか、又は式Ｉを含む化合物は、１つ以上のオリゴヌクレオチドを更に含み得る。式Ｉを含む本明細書の化合物は、例えば、典型的には３つのＧａｌＮＡｃ部分に結合するアシアロ糖タンパク質受容体（asialoglycoprotein receptor、ＡＳＰＧＲ）などの１つ以上のＮ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ、またＮ－ＧａｌＮＡｃ又はｇａｌｎａｃ）部分に対する受容体を有する細胞に１つ以上のオリゴヌクレオチドを送達するのに有用である。したがって、本明細書の式Ｉを含む化合物は、ＡＳＰＧＲを発現する肝細胞に優先的に結合し、それによって肝細胞への化合物の侵入を促進するために使用することができる。ＡＳＰＧＲはまた脂肪組織上にも存在するため、式Ｉの化合物を使用して、ＡＳＰＧＲを発現する脂肪細胞にオリゴヌクレオチドを送達することができる。

【0009】

一実施形態では、式Ｉを含む化合物であり、式中、Ｒは、結合した２つの水素分子を含む。別の実施形態では、式Ｉの化合物であり、式中、Ｒは、メチル基を含む。別の実施形態では、式Ｉであり、式中、Ｒは、保護基を含む。別の実施形態では、式Ｉであり、式中、Ｒは、１つ以上のオリゴヌクレオチドを含む化合物である。好適な更なる実施形態では、式Ｉを含む送達部分は、細胞外受容体ＡＳＰＧＲに結合し、肝臓組織を含む細胞へのオリゴヌクレオチドの侵入を可能にすることによって、１つ以上のオリゴヌクレオチドを肝臓組織に送達する。

【0010】

式Ｉを含む送達部分を使用して、診断又は治療目的でオリゴヌクレオチドを送達することができる。１つ以上のオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ若しくはＲＮＡヌクレオチド、又はＤＮＡ若しくはＲＮＡヌクレオシド、又はそれらの任意の組み合わせを含んでもよく、１つ以上、又は全ての修飾ヌクレオチド若しくは修飾結合を含み得る。

【0011】

本明細書のオリゴヌクレオチドは、遺伝子発現を調節するために、細胞中の特定のＤＮＡ又はＲＮＡ配列を標的とする、すなわち、それに結合又はアニールするように設計される。一実施形態では、式Ｉを含む化合物であり、式中、Ｒは、標的転写物の発現を減少させるためのオリゴヌクレオチドである。更なる実施形態では、式Ｉを含む化合物、Ｒは、タンパク質発現を更に減少させる標的転写物の発現を減少させるためのオリゴヌクレオチドである。別の実施形態では、標的転写物又は標的タンパク質の発現の減少は、約９９、９５、９０、８５、８０、７５、７０、６５、６０、５５、又は５０パーセントである。更なる実施形態では、発現の減少は、約３週間、約１ヶ月、約１ヶ月半、約２ヶ月、約３ヶ月、約４ヶ月、約５ヶ月、又は約６ヶ月間持続する。

【0012】

当業者は、１つ以上のミスマッチがオリゴヌクレオチドと標的ヌクレオチド配列との間に存在し得、なおも遺伝子発現を調節するように機能し得ることを認識する。したがって、一実施形態では、オリゴヌクレオチドは、標的配列と９９、９８、９７、９６、９５、９４、９３、９２、９１、９０、８９、８８、８７、８６、８５、８４、８３、８２、８１、８０、７９、７８、７７、７６、７５、７４、７３、７２、７１、又は７０パーセントの同一性を有する。オリゴヌクレオチドはまた、５’又は３’末端のいずれかに１～１０、１～５、若しくは１～３、又は３、２、若しくは１残基のオーバーハングを有し得る。５’又は３’末端は、例えば、限定されないが、脱塩基残基又はリン酸基で更に修飾され得る。好適な修飾が、当技術分野で既知である。

【0013】

当業者は、糖残基、好適にはリボース上の２’－修飾が、その安定性及び半減期を増加させ得ることを認識する。これらの修飾としては、非修飾糖の２’ＯＨ基の代わりの２’フルオロ又は２’メトキシ修飾が挙げられるが、これらに限定されない。当業者は、オリゴヌクレオチドの骨格における変化もまた、その安定性及び半減期を増加させ得ることを認識する。これらの骨格修飾は、ホスホジエステル結合からホスホロチオエート（phosphorothioate、ＰＳ）結合への変化を含む。

【0014】

したがって、本明細書で使用される場合、オリゴヌクレオチド（又は本明細書で互換的に使用される多量体若しくはオリゴマー）は、本明細書で使用される場合、少なくとも４つのヌクレオチド又はヌクレオシド残基の鎖を意味し、修飾若しくは非修飾塩基及び／又は修飾若しくは非修飾結合を含み得る。ヌクレオチド残基は、ホスホジエステル結合又は修飾結合によって連結され得る（リン酸を欠く場合、残基は、典型的には、当技術分野で既知のようにヌクレオシドと呼ばれる）。ヌクレオチド又はヌクレオシド残基は、ピリミジン若しくはプリン環中の１個以上の原子、又は糖残基中の１個以上の原子、又は環－糖塩基間の結合の１個以上の原子で修飾され得る。修飾はまた、オリゴヌクレオチド鎖の５’又は３’末端で行われてもよく、文脈から明らかでない限り、本明細書ではオリゴヌクレオチドと称される。

【0015】

特定の実施形態では、１つ以上のオリゴヌクレオチドは、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子（短鎖とも呼ばれる）活性化ＲＮＡ（small activating RNA、ｓａＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（microRNA、ｍｉＲＮＡ）、短鎖ヘアピンＲＮＡ（short hairpin RNA、ｓｈＲＮＡ）、単一ガイドＲＮＡ（single guide RNA、ｓｇＲＮＡ）、又はアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）を含む。好適な実施形態では、１つ以上のオリゴヌクレオチドは、ｓｉＲＮＡを含む。別の好適な実施形態では、１つ以上のオリゴヌクレオチドは、センス鎖及びアンチセンス鎖を含むｓｉＲＮＡである。

【0016】

いくつかの実施形態では、Ｒは、リンカーを介して式Ｉにコンジュゲートされている。好適なリンカーは、当技術分野で既知である。一実施形態では、リンカーは、アルキル鎖、好適にはＣ_１～１０を含む。更なる実施形態では、リンカーは、リンカー１、式ＩＩとして以下に示される。別の実施形態では、リンカーは、ピペリジンを含む。更なる好適な実施形態では、リンカーは、リンカー２、式ＩＩＩとして以下に示される。

【0017】

【化2】

【0018】

一実施形態では、リンカー１（式ＩＩ）、接続点Ａ、又はリンカー２（式ＩＩＩ）、接続点Ｃは、式Ｉにコンジュゲートされている。一実施形態では、リンカー１、接続点Ａは、式Ｉにコンジュゲートされており、接続点Ｂは、Ｒにコンジュゲートされている。一実施形態では、リンカー２、接続点Ｃは、式Ｉにコンジュゲートされており、接続点Ｄは、Ｒにコンジュゲートされている。一実施形態では、リンカー１、接続点Ａは、式Ｉにコンジュゲートされており、接続点Ｂは、Ｒにコンジュゲートされているリン酸基にコンジュゲートされている。一実施形態では、リンカー２、接続点Ｃは、式Ｉにコンジュゲートされており、接続点Ｄは、Ｒにコンジュゲートされているリン酸基にコンジュゲートされている。

【0019】

当業者は、リンカーがオリゴヌクレオチドの５’若しくは３’末端上に存在し得るか、又は内部ヌクレオチド若しくはヌクレオシド塩基のうちの１つに結合され得ることを認識するであろう。当業者はまた、リンカーがオリゴヌクレオチドの５’又は３’末端に連結又はコンジュゲートされ得ることを認識するであろう。当業者はまた、リンカーを介するか否かにかかわらず、オリゴヌクレオチドの５’末端への送達部分、例えば、式Ｉを含む送達部分の配置が、Ａｇｏ２ローディングの潜在的な非効率的なローディング、又はＲＩＳＣ複合体活性の他の障害を克服する必要があり得ることを認識するであろう。例えば、センス鎖及びアンチセンス鎖を含むｓｉＲＮＡに連結又は直接コンジュゲートされた式Ｉを含む送達部分について、アンチセンス鎖の５’末端における送達部分の配置は、Ａｇｏ２ローディングについての困難を生じ、効率的なノックダウンを妨げる可能性がある。好適な実施形態では、１つ以上のオリゴヌクレオチドは、センス鎖及びアンチセンス鎖を含むｓｉＲＮＡを含み、式Ｉを含む送達部分は、センス鎖の３’末端に存在する。更なる実施形態では、式Ｉを含む送達部分は、リンカーを介してセンス鎖の３’末端にコンジュゲートされている。なお更なる実施形態では、リンカーは、環構造、好適にはピペリジン環を含む。なお更なる実施形態では、リンカーは、リンカー２を含む。

【0020】

したがって、一実施形態では、少なくとも１つのヌクレオチドのリボースが２’フルオロ基又は２’メトキシ基で修飾されている１つ以上のオリゴヌクレオチドを含む本明細書の化合物。別の実施形態では、１つ以上のオリゴヌクレオチドは、１つ以上の修飾又は置換ホスホジエステル結合を有する。更なる実施形態では、１つ以上の置換ホスホジエステル結合は、ＰＳ結合である。なおも更なる実施形態では、１つ以上のオリゴヌクレオチドは、２’フルオロ又は２’メトキシ基で修飾された少なくとも１つのヌクレオチドを含み、骨格は、１つ以上の修飾又は置換ホスホジエステル結合、好適にはＰＳ結合を有する。

【0021】

本明細書に開示される化合物の他の実施形態では、１つ以上のオリゴヌクレオチドは、センス鎖及びアンチセンス鎖を含むｓｉＲＮＡを含む。更なる実施形態では、センス鎖及びアンチセンス鎖は、各々１５～４０ヌクレオチド長である。別の実施形態では、センス鎖及びアンチセンス鎖はアニールし、任意選択で、１つ以上の５’若しくは３’ヌクレオチドオーバーハング、１つ以上の５’若しくは３’平滑末端、又は両方の組み合わせを含む。

【0022】

本明細書に開示される化合物の別の実施形態では、５’又は３’末端が更に修飾される。更なる実施形態では、アンチセンス鎖の５’末端は、任意選択で、リン酸化される。更なる実施形態では、アンチセンス鎖の５’末端のヌクレオチド又はヌクレオシドは、５’ビニルホスホネート修飾を含む。

【0023】

式Ｉ及び１つ以上のオリゴヌクレオチドを含む本明細書の化合物は、肝臓又は脂肪組織に関与する疾患の療法に有用である。一実施形態では、疾患の療法又は治療に使用するための、式Ｉ及び１つ以上のヌクレオチドを含む化合物を投与するための薬学的組成物である。一実施形態は、療法に使用するための、式Ｉ及び１つ以上のオリゴヌクレオチドを含む化合物、又はその薬学的組成物である。更なる実施形態は、療法が肝臓の疾患のためであるものである。代替の実施形態は、脂肪組織に関与する、例えば、脂肪細胞における遺伝子の調節不全に関与する疾患のためのものである。別の実施形態は、本明細書に開示される化合物、好適には有効量で投与される、好適には式Ｉ及び１つ以上のオリゴヌクレオチドを含む化合物、又は前述のいずれかの薬学的組成物を投与することを含む、肝疾患の治療の方法である。別の実施形態は、本明細書に開示される化合物、好適には肝疾患の治療のための医薬品の製造において使用するための、好適には式Ｉ及び１つ以上のオリゴヌクレオチドを含む化合物、又はその薬学的組成物である。

【0024】

別の実施形態では、以下の式ＩＶを含む化合物であり、

【0025】

【化3】

式中、Ｚは、固体支持体、樹脂、又はビーズである。

【0026】

本明細書に開示される薬学的組成物は、化合物及び組成物又は配合物の他の構成成分と適合性があり、患者に有害ではない１つ以上の担体、希釈剤、及び賦形剤を含む。薬学的組成物及びその調製のためのプロセスの例は、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：ＴｈｅＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＰｒａｃｔｉｃｅｏｆＰｈａｒｍａｃｙ」，Ｌｏｙｄ，Ｖ．，ｅｔａｌ．Ｅｄｓ．，２２^ｎｄＥｄ．，ＭａｃｋＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏ．，２０１２に見出すことができる。

【0027】

本明細書で使用される場合、「有効量」という用語は、障害又は疾患を治療するのに有効である量を指す。

【0028】

本明細書で使用される場合、「相補性領域」は、適切なハイブリダイゼーション条件下（例えば、リン酸緩衝液中、細胞中など）でヌクレオチドの２つの配列間のハイブリダイゼーションを可能にする逆平行ヌクレオチド配列に十分に相補的である核酸（例えば、ｄｓオリゴヌクレオチド）のヌクレオチド配列を意味する。いくつかの実施形態では、本明細書におけるオリゴヌクレオチドは、ｍＲＮＡ標的配列に相補的な領域を有する標的化配列を含む。

【0029】

式Ｉを含む送達部分は、以下の非限定的な合成工程及びスキームによって作製することができる。

【0030】

特定の略語は以下のように定義される：「１，２－ＤＣＥ」は、１，２－ジクロロエタンを指し、「ＤＣＭ」は、ジクロロメタンを指し、「ＤＩＥＡ」は、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミンを指し、「ＤＭＦ」は、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミドを指し、「ＤＭＡＰ」は、４－ジメチルアミノピリジンを指し、「ＤＭＴＣｌ」は、４，４’－ジメトキシトリチルクロリドを指し、「ＤＰＰ４」は、ジペプチジルペプチダーゼを指し、「ＥＤＣ」は、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドを指し、「ＥｔＯＡｃ」は、酢酸エチルを指し、「ＧａｌＮＡｃ」は、Ｎ－アセチルガラクトサミンを指し、「ＨＡＴＵ」は、１－［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］－１Ｈ－１，２，３－トリアゾロ［４，５－ｂ］ピリジニウム３－オキシドヘキサフルオロホスフェートを指し、「ＨＢＴＵ」は、Ｏ－（ベンゾトリアゾール－１－イル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェートを指し、「ＨＯＢｔ」は、１－ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物を指し、「ＨＰＲＴ」は、ヒポキサンチン－グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼを指し、「ＩＰＡ」は、イソプロパノール及びイソプロピルアルコールを指し、「ＬＤＨＡ」は、乳酸デヒドロゲナーゼ－Ａを指し、「ＭｅＣＮ」は、アセトニトリルを指し、「ＭｅＯＨ」は、メタノール及びメチルアルコールを指し、「ＭＷＣＯ」は、分子量カットオフを指し、「ＮＨＳ」は、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドを指し、「ＯＤ」は、光学密度を指し、「ＰＢＳ」は、リン酸緩衝生理食塩水を指し、「ＰｈＳｉＨ_３」は、フェニルシランを指し、「ＰＴＳ」は、携帯型エンドトキシン試験システムを指し、「ｓｉＲＮＡ」は、低分子干渉リボ核酸を指し、「ＴＥＡ」はトリエチルアミンを指し、「ＴＦＡ」は、トリフルオロ酢酸を指し、「ＴＨＦ」は、テトラヒドロフランを指し、「ＴＬＣ」は、細線クロマトグラフィーを指し、「ＴＭＰ」は、２，２，６，６－テトラメチルピペリジンを指す。

【0031】

【化4】

【0032】

スキーム１の工程Ａは、１，２－ＤＣＥなどの溶媒中でトリフルオロメタンスルホン酸トリメチルを使用して化合物（１）を環化して、化合物（２）を得ることを示す。工程Ｂは、１，２－ＤＣＥなどの溶媒中でトリフルオロメタンスルホン酸トリメチルシリルを使用してヘキサ－５－エン－１－オールを化合物（２）に添加して化合物（３）を得ることを示す。工程Ｃに、塩化ルテニウム（ＩＩＩ）などの触媒と共に過ヨウ素酸ナトリウムなどの適切な酸化剤を使用して化合物（３）を酸化して化合物（４）を得ることを示す。

【0033】

【化5】

【0034】

スキーム２の工程Ａは、ＤＭＦなどの溶媒中でＤＩＥＡなどの適切な塩基と共にＨＢＴＵ及びＨＯＢｔを使用して化合物（５）とｔｅｒｔ－ブチルＮ－［２－［２－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニルアミノ）エチルアミノ］エチル］カルバメートとをアミドカップリングさせて化合物（６）を得ることを示す。工程Ｂは、ＴＨＦ及びＭｅＯＨ溶媒系中でＮａＯＨ水溶液などの塩基を使用して化合物（６）を塩基性加水分解して化合物（７）を得ることを示す。工程Ｃは、ＤＭＦなどの溶媒中でＤＩＥＡなどの適切な塩基と共にＨＡＴＵを使用して化合物（７）と１１－アミノウンデカン酸アリル塩酸塩とをアミドカップリングさせて化合物（８）を得ることを示す。工程Ｄは、ＤＣＭなどの溶媒中でＴＦＡにより化合物（８）を酸性脱保護して化合物（９）を得ることを示す。工程Ｅに、ＤＣＭなどの溶媒中でＥＤＣ及びＨＯＢｔを使用して化合物（９）と化合物（４）とをアミドカップリングさせて化合物（１０）を得ることを示す。工程Ｆは、ＤＣＭなどの溶媒中でテトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム及びＰｈＳｉＨ_３により化合物（１０）を脱保護して化合物（１１）を得ることを示す。工程Ｆは、ＤＣＭなどの溶媒中でＥＤＣを使用して化合物（１１）とＮＨＳとをカップリングさせて化合物（１２）を得ることを示す。

【0035】

【化6】

【0036】

スキーム３の工程Ａ～Ｃは、スキーム２の工程Ｃ～Ｅのものと本質的に類似しており、化合物（７）から出発して化合物（１３）、（１４）及び（１５）を得る。工程Ｄは、ＭｅＯＨなどの溶媒中でパラジウム炭素を使用して化合物（１５）を水素化して化合物（１６）を得ることを示す。工程Ｅは、スキーム２の工程Ｇの調製と本質的に類似しており、化合物（１７）を得る。

【0037】

【化7】

【0038】

スキーム４の工程Ａ～Ｉは、スキーム２及び３の方法に示すのと本質的に類似する方法を使用した一連のアミドカップリング及び脱保護から構成され、化合物（１８）から出発して化合物（２７）を得る。

【0039】

【化8】

【0040】

スキーム５の工程Ａ～Ｃは、スキーム４の工程Ｇ～Ｉに示すのと本質的に類似する方法を示し、化合物（２４）から出発して化合物（３０）を得る。

【0041】

【化9】

【0042】

スキーム６の工程Ａは、ＤＣＭなどの溶媒中でＤＩＥＡなどの適切な塩基と共にＤＭＴＣｌを使用して化合物（３１）を保護して化合物（３２）を得ることを示す。工程Ｂは、ＤＣＭなどの溶媒中でＴＭＰと共にＨＢＴＵ及びＨＯＢｔを使用して化合物（３２）とピペリジン－４－イルメタノールとをアミドカップリングさせて化合物（３３）を得ることを示す。工程Ｃに、化合物（３３）をＤＭＦ中の２０％ピペリジンで脱保護して化合物（３４）を得ることを示す。

【0043】

【化10】

【0044】

スキーム７の工程Ａは、本質的にスキーム２の工程Ａと類似しており、化合物（１６）と化合物（３４）とのカップリングから化合物（３５）を得る。工程Ｂは、ＤＣＭなどの適切な溶媒中でＴＥＡ及びＤＭＡＰの塩基系と共に化合物（３５）に無水コハク酸を添加することによって化合物（３６）を形成することを示す。工程Ｃは、ＭｅＣＮ及びＤＣＭなどの溶媒系中で２－（１Ｈ－ベンゾトリアゾール－１－イル）－１，１，３，３－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート及びＤＩＥＡなどの塩基を使用して樹脂に化合物（３６）をロードして、化合物（３７）を得ることを示す。

【0045】

調製１
（６，７－ジアセトキシ－２－メチル－５，６，７，７ａ－テトラヒドロ－３ａＨ－ピラノ［３，２－ｄ］オキサゾール－５－イル）酢酸メチル

【0046】

【化11】

【0047】

１，２－ＤＣＥ（４６ｍＬ）中の（５－アセトアミド－３，４，６－トリアセトキシ－テトラヒドロピラン－２－イル）酢酸メチル（９．００ｇ、２３．１ｍｍｏｌ）の溶液に、トリメチルシリルトリフルオロメタンスルホネート（６．５ｍＬ、３５ｍｍｏｌ）を添加する。混合物を５０℃に加熱し、１８時間撹拌する。この後、混合物をＤＣＭ（２００ｍＬ）で希釈し、飽和ＮａＨＣＯ_３水溶液２００ｍＬ及び飽和塩化ナトリウム水溶液２００ｍＬで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、真空中で濃縮する。得られた残留物を、０～１０％のＭｅＯＨ／ＤＣＭで溶出するシリカゲルフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、表題化合物（６．４３４ｇ、８４％）を得る。ＥＳ／ＭＳｍ／ｚ３３０（Ｍ＋Ｈ）。

【0048】

調製２
（５－アセトアミド－３，４－ジアセトキシ－６－ヘキサ－５－エノキシ－テトラヒドロピラン－２－イル）酢酸メチル

【0049】

【化12】

【0050】

１，２－ＤＣＥ（２３１ｍＬ）中の（６，７－ジアセトキシ－２－メチル－５，６，７，７ａ－テトラヒドロ－３ａＨ－ピラノ［３，２－ｄ］オキサゾール－５－イル）酢酸メチル（３０．４３ｇ、９２．４２ｍｍｏｌ）の溶液に、ヘキサ－５－エン－１－オール（２２．２ｍＬ、１８５ｍｍｏｌ）、続いて活性化粉末４Åモレキュラーシーブ（１５．６ｇ）を添加する。懸濁液を周囲温度で３０分間撹拌し、次いでトリメチルシリルトリフルオロメタンスルホネート（１９ｍＬ、１０１．９ｍｍｏｌ）を添加する。混合物を周囲温度で１８時間撹拌する。この後、溶液を珪藻土で濾過し、真空中で濃縮する。得られた残留物を、３０～１００％のＥｔＯＡｃ／ヘキサンで溶出するシリカゲルフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、表題化合物（３４．７６ｇ、８６％）を得る。ＥＳ／ＭＳｍ／ｚ４３０．４（Ｍ＋Ｈ）。

【0051】

調製３
５－［３－アセトアミド－４，５－ジアセトキシ－６－（アセトキシメチル）テトラヒドロピラン－２－イル］オキシペンタン酸

【0052】

【化13】

【0053】

ＭｅＣＮ（１７４ｍＬ）及びＤＣＭ（１７４ｍＬ）中の（５－アセトアミド－３，４－ジアセトキシ－６－ヘキス－５－エノキシ－テトラヒドロピラン－２－イル）酢酸メチル（３４．７６ｇ、８０．９３ｍｍｏｌ）の溶液を０℃に冷却する。過ヨウ素酸ナトリウム（２２．４ｇ、１０４．７ｍｍｏｌ）の溶液を添加し、撹拌を０℃で１０分間継続する。この後、塩化ルテニウム（ＩＩＩ）（２７０ｍｇ、１．３ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を周囲温度に加温しながら撹拌する。２時間撹拌した後、更なる過ヨウ素酸ナトリウム（６６ｇ、３０８．４ｍｍｏｌ）を添加し、撹拌を１８時間継続する。この後、混合物を３：１のＣＨ_３Ｃｌ：ＩＰＡ（２×５００ｍＬ）で抽出し、飽和塩化ナトリウム水溶液（１Ｌ）で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、真空中で濃縮する。得られた残留物を、０～４０％のＭｅＯＨ／ＤＣＭで溶出するシリカゲルフラッシュクロマトグラフィーによって精製して、表題化合物（２９．７５ｇ、８２％）を得る。ＥＳ／ＭＳｍ／ｚ４４８．４（Ｍ＋Ｈ）。

【0054】

調製４
ベンジル６－アミノヘキサノエート塩酸塩

【0055】

【化14】

【0056】

６－アミノヘキサン酸（５．００ｇ、３８．１ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（３８ｍＬ）懸濁液に、ベンジルアルコール（４７ｍＬ、４５３．７ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を０℃に冷却する。塩化チオニル（８．６ｍＬ、１２０ｍｍｏｌ）を滴下し、混合物を周囲温度に加温しながら１８時間撹拌する。この後、エーテル（１６６ｍＬ）を添加し、反応容器を－２０℃の冷凍庫に１時間移す。この後、固体沈殿物を濾過により回収して、表題化合物（８．５７ｇ、８１％）を得る。ＥＳ／ＭＳｍ／ｚ２２２（Ｍ＋Ｈ）。

【0057】

調製５
ベンジル１１－アミノウンデカノエート塩酸塩

【0058】

【化15】

【0059】

表題化合物を、調製４の方法と本質的に類似の様式で１１－アミノウンデカン酸から調製する。ＥＳ／ＭＳｍ／ｚ２９２．２（Ｍ＋Ｈ）。

【0060】

調製６
アリル１１－アミノウンデカノエート塩酸塩

【0061】

【化16】

【0062】

アリルアルコール（４２ｍＬ）中の１１－アミノウンデカン酸（９．００ｇ、４４．７ｍｍｏｌ）を容器に入れ、混合物を０℃に冷却する。塩化チオニル（６．５ｍＬ、８９．４ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を周囲温度に加温しながら１８時間撹拌する。この後、混合物を真空中で濃縮し、エーテル（２００ｍＬ）を残留物に添加して白色懸濁液を得る。混合物を周囲温度で１０分間撹拌し、固体沈殿物を濾過により回収して、生成物（１２．０ｇ、９７％）を得る。ＥＳ／ＭＳｍ／ｚ２４２．２（Ｍ＋Ｈ）。

【0063】

調製７
（２Ｓ）－３－［ビス（４－メトキシフェニル）－フェニル－メトキシ］－２－（９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシカルボニルアミノ）プロパン酸

【0064】

【化17】

【0065】

乾燥ＤＣＭ（４００ｍＬ）中の（２Ｓ）－２－（９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシカルボニルアミノ）－３－ヒドロキシ－プロパン酸（４０ｇ、０．１２２ｍｏｌ）の撹拌溶液に、不活性雰囲気下、０℃でＤＩＥＡ（６４ｍＬ、０．３６６ｍｏｌ）を添加する。これに、ＤＣＭ（２００ｍＬ）中のＤＭＴＣｌ（４９．６ｇ、０．１４６ｍｏｌ）の溶液をゆっくり添加する。混合物を周囲温度に加温し、１６時間撹拌する。この後、反応混合物を水（１２．５ｖｏｌ）で希釈し、ＤＣＭ（２５ｖｏｌ）で抽出する。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、真空中で濃縮する。得られた粗製物を１０％のＥｔＯＡｃ／ヘキサン（１２．５ｖｏｌ）で洗浄し、真空下で乾燥させて、表題化合物を淡褐色固体（６２ｇ、粗製物）として得る。この物質を更に精製することなく次の工程に用いた。ＴＬＣ：５％のＭｅＯＨ／ＣＨ_２Ｃｌ_２（Ｒ_ｆ：０．５）ＵＶ、２５４ｎＭ。

【0066】

調製８
９Ｈ－フルオレン－９－イルメチルＮ－［（１Ｓ）－１－［［ビス（４－メトキシフェニル）－フェニル－メトキシ］メチル］－２－［４－（ヒドロキシメチル）－１－ピペリジル］－２－オキソ－エチル］カルバメート

【0067】

【化18】

【0068】

ＤＣＭ（７５０ｍＬ）中の（２Ｓ）－３－［ビス（４－メトキシフェニル）－フェニル－メトキシ］－２－（９Ｈ－フルオレン－９イルメトキシカルボニルアミノ）プロパン酸（６２ｇ、０．１０３ｍｏｌ）の撹拌溶液に、ＨＢＴＵ（７８．３ｇ、０．２０６ｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（２７．９ｇ、０．２０６ｍｏｌ）、及びピペリジン－４－イルメタノール（１５．４ｇ、０．１３４ｍｏｌ）、続いてＴＭＰ（１５ｍＬ、０．１１３ｍｏｌ）を不活性雰囲気下、０℃でゆっくり添加する。得られた反応混合物を周囲温度に加温し、４時間撹拌する。この後、反応混合物を水（８ｖｏｌ）で希釈し、ＤＣＭ（１５ｖｏｌ）で抽出する。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、真空中で濃縮する。得られた残留物を、２０～４０％のＥｔＯＡｃ／ヘキサン及び１％のＭｅＯＨ／ＤＣＭで溶出するシリカゲルフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、表題化合物（４０ｇ、２工程で５２％）を得る。^１ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ－ｄ_６）δ７．８８（ｂｒｄ、Ｊ＝７．５Ｈｚ、２Ｈ）、７．７９－７．５９（ｍ、３Ｈ）、７．４５－７．１２（ｍ、１３Ｈ）、６．９２－６．７６（ｍ、４Ｈ）、４．７９－４．４４（ｍ、２Ｈ）、４．３２（ｂｒｄ、Ｊ＝１１．４Ｈｚ、２Ｈ）、４．２０（ｂｒｓ、２Ｈ）、３．７１（ｓ、６Ｈ）、３．２１（ｂｒｓ、４Ｈ）、２．９９－２．７９（ｍ、１Ｈ）、２．６９（ｂｒｓ、２Ｈ）、１．８１－１．４３（ｍ、３Ｈ）、１．０８－０．７３（ｍ、２Ｈ）。

【0069】

調製９
（２Ｓ）－２－アミノ－３－［ビス（４－メトキシフェニル）－フェニル－メトキシ］－１－［４－（ヒドロキシメチル）－１－ピペリジル］プロパン－１－オン

【0070】

【化19】

【0071】

ＤＭＦ（４００ｍＬ）中の２０％ピペリジンの溶液を、不活性雰囲気下、０℃で９Ｈ－フルオレン－９－イルメチルＮ－［（１Ｓ）－１－［［ビス（４－メトキシフェニル）－フェニル－メトキシ］メチル］－２－［４－（ヒドロキシメチル）－１－ピペリジル］－２－オキソ－エチル］カルバメート（４０ｇ、０．０５５ｍｏｌ）にゆっくり添加する。得られた反応混合物を周囲温度で１時間撹拌する。この後、混合物を水（１５ｖｏｌ）で希釈し、ＥｔＯＡｃ（３０ｖｏｌ）で抽出する。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、真空中で濃縮する。得られた残留物を、１～８％のＭｅＯＨ／ＤＣＭで溶出するシリカゲルフラッシュクロマトグラフィーによって精製して、表題化合物を灰白色固体（１３ｇ、４７％）として得る。ＥＳ／ＭＳｍ／ｚ１００９．５（２Ｍ＋Ｈ）。

【0072】

調製１０
メチル（２Ｓ）－５－［ビス［２－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニルアミノ）エチル］アミノ］－２－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニルアミノ）－５－オキソ－ペンタノエート

【0073】

【化20】

【0074】

Ｓ－４－（（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アミノ）－５－メトキシ－５－オキソペンタン酸（７．００ｇ、２６．８ｍｍｏｌ）及びＨＯＢｔ（４．１６ｇ、３０．８ｍｍｏｌ）を入れたフラスコに、ＤＭＦ（１７９ｍＬ）及び（２－（１Ｈ－ベンゾトリアゾール－１－イル）－１，１，３，３－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（１１．７ｇ、３０．９ｍｍｏｌ）を添加する。ＤＩＥＡ（１４ｍＬ、８０．３ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を周囲温度で５分間撹拌する。この後、ｔｅｒｔ－ブチルＮ－［２－［２－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニルアミノ）エチルアミノ］エチル］カルバメート（８．９４ｇ、２９．５ｍｍｏｌ）を一度に添加し、撹拌を周囲温度で継続する。１８時間撹拌した後、混合物をＥｔＯＡｃ（４００ｍＬ）で希釈し、水（２×４００ｍＬ）及び飽和塩化ナトリウム水溶液（４００ｍＬ）で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、真空中で濃縮する。得られた残留物を、４０～１００％のＥｔＯＡｃ／ヘキサンで溶出するシリカゲルフラッシュクロマトグラフィーによって精製して、表題化合物（１３．０１ｇ、８９％）を得る。ＥＳ／ＭＳｍ／ｚ５４７．４０（Ｍ＋Ｈ）。

【0075】

調製１１
（２Ｓ）－５－［ビス［２－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニルアミノ）エチル］アミノ］－２－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニルアミノ）－５－オキソ－ペンタン酸

【0076】

【化21】

【0077】

フラスコに、メチル（２Ｓ）－５－［ビス［２－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニルアミノ）エチル］アミノ］－２－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニルアミノ）－５－オキソ－ペンタノエート（１３．０１ｇ、２３．８ｍｍｏｌ）、ＴＨＦ（１２０ｍＬ）、及びＭｅＯＨ（１２０ｍＬ）を入れる。１ＮＮａＯＨ（７１ｍＬ、７１ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を周囲温度で撹拌する。１時間後、混合物を真空中で濃縮し、水（３００ｍＬ）に再溶解する。５ＮＨＣｌ（１２ｍＬ）を添加してｐＨを４にする。混合物をＤＣＭ（３×３００ｍＬ）で抽出し、合わせた有機層を飽和塩化ナトリウム水溶液（１Ｌ）で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濃縮して、表題化合物（１２．４１ｇ、９８％）を得る。ＥＳ／ＭＳｍ／ｚ５３１．６０（Ｍ－Ｈ）。

【0078】

調製１２
アリル１１－［［（２Ｓ）－５－［ビス［２－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニルアミノ）エチル］アミノ］－２－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニルアミノ）－５－オキソ－ペンタノイル］アミノ］ウンデカノエート

【0079】

【化22】

【0080】

（２Ｓ）－５－［ビス［２－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニルアミノ）エチル］アミノ］－２－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニルアミノ）－５－オキソ－ペンタン酸（５００ｍｇ、０．９４ｍｍｏｌ）及びアリル１１－アミノウンデカノエートヒドロクロリド（３１３ｍｇ、１．１３ｍｍｏｌ）を入れたフラスコに、ＤＭＦ（６．２５ｍＬ）及び（１－［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］－１Ｈ－１，２，３－トリアゾロ［４，５－ｂ］ピリジニウム３－オキシドヘキサフルオロホスフェート（４２８ｍｇ、１．１２ｍｍｏｌ）を添加する。ＤＩＥＡ（０．５ｍＬ、３ｍｍｏｌ）を添加した後、混合物を周囲温度で１８時間撹拌する。この後、混合物をＥｔＯＡｃ（２００ｍＬ）で希釈し、水（３×２００ｍＬ）及び飽和塩化ナトリウム水溶液（２００ｍＬ）で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、真空中で濃縮する。得られた残留物を、４０～１００％のＥｔＯＡｃ／ヘキサンで溶出するシリカゲルフラッシュクロマトグラフィーによって精製して、表題化合物（６８７ｍｇ、９７％）を得る。^１ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ－ｄ６）δ７．７８－７．６４（ｍ、１Ｈ）、６．９８－６．７（ｍ、２Ｈ）、５．９６－５．８４（ｍ、１Ｈ）、５．３１－５．２５（ｍ、１Ｈ）、５．２３－５．１７（ｍ、１Ｈ）、４．５６－４．５０（ｍ、２Ｈ）、３．８８－３．６７（ｍ、１Ｈ）、３．３０－３．１９（ｍ、４Ｈ）、３．１１－２．９１（ｍ、６Ｈ）、２．３５－２．１２（ｍ、４Ｈ）、１．８８－１．６５（ｍ、２Ｈ）、１．５８－１．４７（ｍ、２Ｈ）、１．４６－１．３０（ｍ、３０Ｈ）、１．３０－１．１８（ｍ、１２Ｈ）。

【0081】

調製１３
アリル（Ｓ）－１１－（２－アミノ－５－（ビス（２－アミノエチル）アミノ）－５－オキソペンタンアミド）ウンデカノエート

【0082】

【化23】

【0083】

ＤＣＭ（１５ｍＬ）中のアリル１１－［［（２Ｓ）－５－［ビス［２－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニルアミノ）エチル］アミノ］－２－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニルアミノ）－５－オキソ－ペンタノイル］アミノ］ウンデカノエート（６８７ｍｇ、０．９１ｍｍｏｌ）の溶液に、ＴＦＡ（１５ｍＬ）を添加する。混合物を室温で撹拌する。１．５時間後、混合物を真空中で濃縮する。残留物をＭｅＯＨに溶解し、イオン交換カートリッジに充填する。カートリッジをＭｅＯＨ（１５０ｍＬ）で溶出し、続いて７ＮＮＨ_３／ＭｅＯＨ（１５０ｍＬ）で溶出する。塩基性画分を真空中で濃縮して、表題化合物（４１０ｍｇ、９９％）を得る。ＥＳ／ＭＳｍ／ｚ４５６．４（Ｍ＋Ｈ）。

【0084】

調製１４
アリル１１－［［（２Ｓ）－２－［５－［３－アセトアミド－４，５－ジアセトキシ－６－（アセトキシメチル）テトラヒドロピラン－２－イル］オキシペンタノイルアミノ］－５－［ビス［２－［５－［３－アセトアミド－４，５－ジアセトキシ－６－（アセトキシメチル）テトラヒドロピラン－２－イル］オキシペンタノイルアミノ］エチル］アミノ］－５－オキソ－ペンタノイル］アミノ］ウンデカノエート

【0085】

【化24】

【0086】

フラスコに、５－［３－アセトアミド－４，５－ジアセトキシ－６－（アセトキシメチル）テトラヒドロピラン－２－イル］オキシペンタン酸（４８９ｍｇ、１．０９ｍｍｏｌ）及びアリルＳ－１１－（２－アミノ－５－（ビス（２－アミノエチル）アミノ）－５－オキソペンタンアミド）ウンデカノエート（１５０ｍｇ、０．３３ｍｍｏｌ）を入れる。ＤＣＭ（３．３５ｍＬ）を添加し、続いて１－ヒドロキシベンゾトリアゾール一水和物（１６４ｍｇ、１．０７ｍｍｏｌ）及び１－（３－ジメチルアミノプロピル）－３－エチルカルボジイミド塩酸塩（２０６ｍｇ、１．０７ｍｍｏｌ）を添加する。混合物を周囲温度で１８時間撹拌する。この後、溶液をＥｔＯＡｃ（１００ｍＬ）で希釈し、飽和ＮａＨＣＯ_３（２×１００ｍＬ）、飽和ＮＨ_４Ｃｌ水溶液（１００ｍＬ）及び飽和塩化ナトリウム水溶液（１００ｍＬ）で洗浄する。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、真空中で濃縮する。得られた残留物を、０～１０％のＭｅＯＨ／ＤＣＭで溶出するシリカゲルフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、表題化合物（４２４ｍｇ、７４％）を得る。ＥＳ／ＭＳｍ／ｚ８７２．８０（Ｍ＋２Ｈ）／２。

【0087】

調製１５
１１－［［（２Ｓ）－２－［５－［３－アセトアミド－４，５－ジアセトキシ－６－（アセトキシメチル）テトラヒドロピラン－２－イル］オキシペンタノイルアミノ］－５－［ビス［２－［５－［３－アセトアミド－４，５－ジアセトキシ－６－（アセトキシメチル）テトラヒドロピラン－２－イル］オキシペンタノイルアミノ］エチル］アミノ］－５－オキソ－ペンタノイル］アミノ］ウンデカン酸

【0088】

【化25】

【0089】

ＤＣＭ（２ｍＬ）中のアリル１１－［［（２Ｓ）－２－［５－［３－アセトアミド－４，５－ジアセトキシ－６－（アセトキシメチル）テトラヒドロピラン－２－イル］オキシペンタノイルアミノ］－５－［ビス［２－［５－［３－アセトアミド－４，５－ジアセトキシ－６－（アセトキシメチル）テトラヒドロピラン－２－イル］オキシペンタノイルアミノ］エチル］アミノ］－５－オキソ－ペンタノイル］アミノ］ウンデカノエート（３５４ｍｇ、０．２０ｍｍｏｌ）の溶液に、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（２９ｍｇ、０．０２ｍｍｏｌ）、続いてＰｈＳｉＨ_３（５１ｕＬ、０．４１ｍｍｏｌ）を添加する。混合物を周囲温度で２時間撹拌し、その後、飽和ＮａＨＣＯ_３水溶液（１００ｍＬ）で希釈する。１ＮＮａＯＨ（１５ｍＬ）を添加してｐＨを約１０にする。水溶液をＤＣＭ（３×１００ｍＬ）で洗浄し、次いで濃ＨＣｌ（５ｍＬ）、次いで５ＮＨＣｌ水溶液（１５ｍＬ）で酸性化する。水層をＤＣＭ（１００ｍＬ）で抽出し、有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、真空中で濃縮する。得られた残留物を、０～２０％のＭｅＯＨ／ＤＣＭで溶出するシリカゲルフラッシュクロマトグラフィーによって精製して、表題化合物（１５１ｍｇ、４４％）を得る。ＥＳ／ＭＳｍ／ｚ８５２．６０（Ｍ＋２Ｈ）／２。

【0090】

調製１６
（２，５－ジオキソピロリジン－１－イル）１１－［［（２Ｓ）－２－［５－［３－アセトアミド－４，５－ジアセトキシ－６－（アセトキシメチル）テトラヒドロピラン－２－イル］オキシペンタノイルアミノ］－５－［ビス［２－［５－［３－アセトアミド－４，５－ジアセトキシ－６－（アセトキシメチル）テトラヒドロピラン－２－イル］オキシペンタノイルアミノ］エチル］アミノ］－５－オキソ－ペンタノイル］アミノ］ウンデカノエート

【0091】

【化26】

【0092】

反応用バイアルに、１１－［［（２Ｓ）－２－［５－［３－アセトアミド－４，５－ジアセトキシ－６－（アセトキシメチル）テトラヒドロピラン－２－イル］オキシペンタノイルアミノ］－５－［ビス［２－［５－［３－アセトアミド－４，５－ジアセトキシ－６－（アセトキシメチル）テトラヒドロピラン－２－イル］オキシペンタノイルアミノ］エチル］アミノ］－５－オキソ－ペンタノイル］アミノ］ウンデカン酸（５０ｍｇ、０．０３ｍｍｏｌ）、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（５ｍｇ、０．０４ｍｍｏｌ）、及び１－（３－ジメチルアミノプロピル）－３－エチルカルボジイミド塩酸塩（８ｍｇ、０．０４ｍｍｏｌ）を添加する。ＤＣＭ（０．３ｍＬ）を添加し、混合物を周囲温度で撹拌する。１８時間後、混合物をシリカゲルカートリッジに直接ロードし、粗混合物を０～１０％のＭｅＯＨ／ＤＣＭで溶出するシリカゲルフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、表題化合物（４９ｍｇ、９３％）を得る。ＥＳ／ＭＳｍ／ｚ９０１．４０（Ｍ＋２Ｈ）／２。

【0093】

調製１７
ベンジル６－［［（２Ｓ）－５－［ビス［２－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニルアミノ）エチル］アミノ］－２－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニルアミノ）－５－オキソ－ペンタノイル］アミノ］ヘキサノエート

【0094】

【化27】

【0095】

表題化合物を、（２Ｓ）－５－［ビス［２－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニルアミノ）エチル］アミノ］－２－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニルアミノ）－５－オキソ－ペンタン酸及びベンジル６－アミノヘキサノエート塩酸塩から、調製１０の方法と本質的に類似の様式で調製する。ＥＳ／ＭＳｍ／ｚ７３６．４０（Ｍ＋Ｈ）。

【0096】

調製１８
ベンジル６－［［（２Ｓ）－２－アミノ－５－［ビス（２－アミノエチル）アミノ］－５－オキソ－ペンタノイル］アミノ］ヘキサノエートトリス（トリフルオロ酢酸）

【0097】

【化28】

【0098】

ＤＣＭ（１０５ｍＬ）中のベンジル６－［［（２Ｓ）－５－［ビス［２－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニルアミノ）エチル］アミノ］－２－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニルアミノ）－５－オキソ－ペンタノイル］アミノ］ヘキサノエート（１５．４７ｇ、２１．０２ｍｍｏｌ）の溶液に、ＴＦＡ（１６ｍＬ、２１０．２ｍｍｏｌ）を添加する。混合物を周囲温度で２４時間撹拌する。この後、更なるＴＦＡ（１６ｍＬ、２１０．２ｍｍｏｌ）を添加し、撹拌を更に２時間継続する。この後、混合物を真空中で濃縮する。得られた残留物をトルエン（２×３０ｍＬ）と共沸する。得られた油を真空オーブン中４０℃で４時間更に乾燥させて、表題化合物（２８．０８ｇ、残留トルエンを考慮して５８％純度、９９＋％）を得る。ＥＳ／ＭＳｍ／ｚ４３６．４０（Ｍ＋Ｈ）。化合物を７０ｍＬのＤＭＦに溶解して０．３Ｍ溶液を作製し、これを次の工程で使用する。

【0099】

調製１９
ベンジル６－［［（２Ｓ）－２－［５－［３－アセトアミド－４，５－ジアセトキシ－６－（アセトキシメチル）テトラヒドロピラン－２－イル］オキシペンタノイルアミノ］－５－［ビス［２－［５－［３－アセトアミド－４，５－ジアセトキシ－６－（アセトキシメチル）テトラヒドロピラン－２－イル］オキシペンタノイルアミノ］エチル］アミノ］－５－オキソ－ペンタノイル］アミノ］ヘキサノエート

【0100】

【化29】

【0101】

表題化合物を、５－［３－アセトアミド－４，５－ジアセトキシ－６－（アセトキシメチル）テトラヒドロピラン－２－イル］オキシペンタン酸及びベンジル６－［［（２Ｓ）－２－アミノ－５－［ビス（２－アミノエチル）アミノ］－５－オキソ－ペンタノイル］アミノ］ヘキサノエートトリストリフルオロ酢酸から、調製１０の方法と本質的に類似の様式で調製する。ＥＳ／ＭＳｍ／ｚ８６２（Ｍ＋２Ｈ）／２。

【0102】

調製２０
６－［［（２Ｓ）－２－［５－［３－アセトアミド－４，５－ジアセトキシ－６－（アセトキシメチル）テトラヒドロピラン－２－イル］オキシペンタノイルアミノ］－５－［ビス［２－［５－［３－アセトアミド－４，５－ジアセトキシ－６－（アセトキシメチル）テトラヒドロピラン－２－イル］オキシペンタノイルアミノ］エチル］アミノ］－５－オキソ－ペンタノイル］アミノ］ヘキサン酸

【0103】

【化30】

【0104】

パラジウム炭素（１．９０ｇ、０．８９ｍｍｏｌ、５質量％、５０％湿潤）を丸底フラスコに入れ、容器を排気し、窒素で３回再充填する。ＭｅＯＨ（１７８ｍＬ）中のベンジル６－［［（２Ｓ）－２－［５－［３－アセトアミド－４，５－ジアセトキシ－６－（アセトキシメチル）テトラヒドロピラン－２－イル］オキシペンタノイルアミノ］－５－［ビス［２－［５－［３－アセトアミド－４，５－ジアセトキシ－６－（アセトキシメチル）テトラヒドロピラン－２－イル］オキシペンタノイルアミノ］エチル］アミノ］－５－オキソ－ペンタノイル］アミノ］ヘキサノエート（１５．４１ｇ、８．９４ｍｍｏｌ）の溶液をシリンジを介して添加する。フラスコを排気し、１ａｔｍの水素で再充填し、混合物を周囲温度で１ａｔｍの水素下で１８時間撹拌する。この後、混合物を珪藻土を通して濾過し、濾液を真空中で濃縮して、表題化合物（１３．８５ｇ、９５％）を得る。ＥＳ／ＭＳｍ／ｚ８１７．２（Ｍ＋２Ｈ）／２。

【0105】

調製２１
（２，５－ジオキソピロリジン－１－イル）６－［［（２Ｓ）－２－［５－［３－アセトアミド－４，５－ジアセトキシ－６－（アセトキシメチル）テトラヒドロピラン－２－イル］オキシペンタノイルアミノ］－５－［ビス［２－［５－［３－アセトアミド－４，５－ジアセトキシ－６－（アセトキシメチル）テトラヒドロピラン－２－イル］オキシペンタノイルアミノ］エチル］アミノ］－５－オキソ－ペンタノイル］アミノ］ヘキサノエート

【0106】

【化31】

【0107】

表題化合物を、６－［［（２Ｓ）－２－［５－［３－アセトアミド－４，５－ジアセトキシ－６－（アセトキシメチル）テトラヒドロピラン－２－イル］オキシペンタノイルアミノ］－５－［ビス［２－［５－［３－アセトアミド－４，５－ジアセトキシ－６－（アセトキシメチル）テトラヒドロピラン－２－イル］オキシペンタノイルアミノ］エチル］アミノ］－５－オキソ－ペンタノイル］アミノ］ヘキサン酸から、調製１６の方法と本質的に類似の様式で調製する。ＥＳ／ＭＳｍ／ｚ８６６．２０（Ｍ＋２Ｈ）／２。

【0108】

調製２２
ベンジル（２Ｓ）－５－［ビス［２－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニルアミノ）エチル］アミノ］－２－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニルアミノ）－５－オキソ－ペンタノエート

【0109】

【化32】

【0110】

表題化合物を、ｔｅｒｔ－ブチルＮ－［２－［２－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニルアミノ）エチルアミノ］エチル］カルバメート及び（４Ｓ）－５－ベンジルオキシ－４－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニルアミノ）－５－オキソ－ペンタン酸から、調製１２の方法と本質的に類似の様式で調製する。ＥＳ／ＭＳｍ／ｚ６２３．６（Ｍ＋Ｈ）。

【0111】

調製２３
ベンジル（２Ｓ）－２－アミノ－５－［ビス（２－アミノエチル）アミノ］－５－オキソ－ペンタノエートトリス（トリフルオロ酢酸）塩

【0112】

【化33】

【0113】

表題化合物を、ベンジル（２Ｓ）－５－［ビス［２－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニルアミノ）エチル］アミノ］－２－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニルアミノ）－５－オキソ－ペンタノエートから、調製１８の方法と本質的に類似の様式で調製する。ＥＳ／ＭＳｍ／ｚ３２３．２（Ｍ＋Ｈ）。

【0114】

調製２４
ベンジル（２Ｓ）－５－［ビス［２－［５－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニルアミノ）ペンタノイルアミノ］エチル］アミノ］－２－［５－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニルアミノ）ペンタノイルアミノ］－５－オキソ－ペンタノエート

【0115】

【化34】

【0116】

表題化合物を、５－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニルアミノ）ペンタン酸及びベンジル（２Ｓ）－２－アミノ－５－［ビス（２－アミノエチル）アミノ］－５－オキソ－ペンタノエートトリス（トリフルオロ酢酸）塩から、調製１０の方法と本質的に類似の様式で調製する。ＥＳ／ＭＳｍ／ｚ９２０．６（Ｍ＋Ｈ）。

【0117】

調製２５
ベンジル（２Ｓ）－２－（５－アミノペンタノイルアミノ）－５－［ビス［２－（５－アミノペンタノイルアミノ）エチル］アミノ］－５－オキソ－ペンタノエートトリス（トリフルオロ酢酸）塩

【0118】

【化35】

【0119】

表題化合物を、ベンジル（２Ｓ）－５－［ビス［２－［５－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニルアミノ）ペンタノイルアミノ］エチル］アミノ］－２－［５－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニルアミノ）ペンタノイルアミノ］－５－オキソ－ペンタノエートから、調製１８の方法と本質的に類似の様式で調製する。ＥＳ／ＭＳｍ／ｚ６２０．４（Ｍ＋Ｈ）。

【0120】

調製２６
ベンジル（２Ｓ）－２－［５－［５－［３－アセトアミド－４，５－ジアセトキシ－６－（アセトキシメチル）テトラヒドロピラン－２－イル］オキシペンタノイルアミノ］ペンタノイルアミノ］－５－［ビス［２－［５－［５－［３－アセトアミド－４，５－ジアセトキシ－６－（アセトキシメチル）テトラヒドロピラン－２－イル］オキシペンタノイルアミノ］ペンタノイルアミノ］エチル］アミノ］－５－オキソ－ペンタノエート

【0121】

【化36】

【0122】

表題化合物を、５－［３－アセトアミド－４，５－ジアセトキシ－６－（アセトキシメチル）テトラヒドロピラン－２－イル］オキシペンタン酸及びベンジル（２Ｓ）－２－（５－アミノペンタノイルアミノ）－５－［ビス［２－（５－アミノペンタノイルアミノ）エチル］アミノ］－５－オキソ－ペンタノエートトリス（トリフルオロ酢酸）塩から、調製１０の方法と本質的に類似の様式で調製する。ＥＳ／ＭＳｍ／ｚ９５４．８０（Ｍ＋２Ｈ）／２。

【0123】

調製２７
（２Ｓ）－２－［５－［５－［３－アセトアミド－４，５－ジアセトキシ－６－（アセトキシメチル）テトラヒドロピラン－２－イル］オキシペンタノイルアミノ］ペンタノイルアミノ］－５－［ビス［２－［５－［５－［３－アセトアミド－４，５－ジアセトキシ－６－（アセトキシメチル）テトラヒドロピラン－２－イル］オキシペンタノイルアミノ］ペンタノイルアミノ］エチル］アミノ］－５－オキソ－ペンタン酸

【0124】

【化37】

【0125】

丸底フラスコにパラジウム炭素（４６７ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌ、５質量％、５０％湿潤）を入れ、フラスコを排気し、窒素で３回再充填する。ＭｅＯＨ（４４ｍＬ）中のベンジル（２Ｓ）－２－［５－［５－［３－アセトアミド－４，５－ジアセトキシ－６－（アセトキシメチル）テトラヒドロピラン－２－イル］オキシペンタノイルアミノ］ペンタノイルアミノ］－５－［ビス［２－［５－［５－［３－アセトアミド－４，５－ジアセトキシ－６－（アセトキシメチル）テトラヒドロピラン－２－イル］オキシペンタノイルアミノ］ペンタノイルアミノ］エチル］アミノ］－５－オキソ－ペンタノエート（４．１９ｇ、２．２０ｍｍｏｌ）の溶液をシリンジを介して添加し、続いて３滴の酢酸を添加する。フラスコを排気し、１ａｔｍの水素で再充填し、混合物を周囲温度で１ａｔｍの水素下で撹拌する。２時間後、混合物を珪藻土を通して濾過し、濾液を真空中で濃縮して、表題化合物（３．９９ｇ、９９＋％）を得る。ＥＳ／ＭＳｍ／ｚ９０９．６（Ｍ＋２Ｈ）／２。

【0126】

調製２８
ベンジル６－［［（２Ｓ）－２－［５－［５－［３－アセトアミド－４，５－ジアセトキシ－６－（アセトキシメチル）テトラヒドロピラン－２－イル］オキシペンタノイルアミノ］ペンタノイルアミノ］－５－［ビス［２－［５－［５－［３－アセトアミド－４，５－ジアセトキシ－６－（アセトキシメチル）テトラヒドロピラン－２－イル］オキシペンタノイルアミノ］ペンタノイルアミノ］エチル］アミノ］－５－オキソ－ペンタノイル］アミノ］ヘキサノエート

【0127】

【化38】

【0128】

表題化合物を、（２Ｓ）－２－［５－［５－［３－アセトアミド－４，５－ジアセトキシ－６－（アセトキシメチル）テトラヒドロピラン－２－イル］オキシペンタノイルアミノ］ペンタノイルアミノ］－５－［ビス［２－［５－［５－［３－アセトアミド－４，５－ジアセトキシ－６－（アセトキシメチル）テトラヒドロピラン－２－イル］オキシペンタノイルアミノ］ペンタノイルアミノ］エチル］アミノ］－５－オキソ－ペンタン酸及びベンジル６－アミノヘキサノエート塩酸塩から、調製１０の方法と本質的に類似の様式で調製する。ＥＳ／ＭＳｍ／ｚ１０１１．６（Ｍ＋２Ｈ）／２。

【0129】

調製２９
６－［［（２Ｓ）－２－［５－［５－［３－アセトアミド－４，５－ジアセトキシ－６－（アセトキシメチル）テトラヒドロピラン－２－イル］オキシペンタノイルアミノ］ペンタノイルアミノ］－５－［ビス［２－［５－［５－［３－アセトアミド－４，５－ジアセトキシ－６－（アセトキシメチル）テトラヒドロピラン－２－イル］オキシペンタノイルアミノ］ペンタノイルアミノ］エチル］アミノ］－５－オキソ－ペンタノイル］アミノ］ヘキサン酸

【0130】

【化39】

【0131】

丸底フラスコにパラジウム炭素（２４ｍｇ、０．０１ｍｍｏｌ、５質量％、５０％湿潤）を入れ、フラスコを排気し、窒素で再充填する。ＭｅＯＨ（２．２ｍＬ）中のベンジル６－［［（２Ｓ）－２－［５－［５－［３－アセトアミド－４，５－ジアセトキシ－６－（アセトキシメチル）テトラヒドロピラン－２－イル］オキシペンタノイルアミノ］ペンタノイルアミノ］－５－［ビス［２－［５－［５－［３－アセトアミド－４，５－ジアセトキシ－６－（アセトキシメチル）テトラヒドロピラン－２－イル］オキシペンタノイルアミノ］ペンタノイルアミノ］エチル］アミノ］－５－オキソ－ペンタノイル］アミノ］ヘキサノエート（２２２ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ）の溶液をシリンジを介して添加し、続いて３滴の酢酸を添加する。フラスコを排気し、１ａｔｍの水素で再充填し、混合物を周囲温度で１ａｔｍの水素下で撹拌する。５時間後、フラスコを窒素でパージし、混合物を珪藻土で濾過する。濾液を真空中で濃縮して、表題化合物（１８０ｍｇ、８５％）を得る。ＥＳ／ＭＳｍ／ｚ９６６．２（Ｍ＋２Ｈ）／２。

【0132】

調製３０
（２，５－ジオキソピロリジン－１－イル）６－［［（２Ｓ）－２－［５－［５－［３－アセトアミド－４，５－ジアセトキシ－６－（アセトキシメチル）テトラヒドロピラン－２－イル］オキシペンタノイルアミノ］ペンタノイルアミノ］－５－［ビス［２－［５－［５－［３－アセトアミド－４，５－ジアセトキシ－６－（アセトキシメチル）テトラヒドロピラン－２－イル］オキシペンタノイルアミノ］ペンタノイルアミノ］エチル］アミノ］－５－オキソ－ペンタノイル］アミノ］ヘキサノエート

【0133】

【化40】

【0134】

表題化合物を、６－［［（２Ｓ）－２－［５－［５－［３－アセトアミド－４，５－ジアセトキシ－６－（アセトキシメチル）テトラヒドロピラン－２－イル］オキシペンタノイルアミノ］ペンタノイルアミノ］－５－［ビス［２－［５－［５－［３－アセトアミド－４，５－ジアセトキシ－６－（アセトキシメチル）テトラヒドロピラン－２－イル］オキシペンタノイルアミノ］ペンタノイルアミノ］エチル］アミノ］－５－オキソ－ペンタノイル］アミノ］ヘキサン酸から、調製１６の方法と本質的に類似の様式で調製する。ＥＳ／ＭＳｍ／ｚ１０１４．６（Ｍ＋２Ｈ）／２。

【0135】

調製３１
ベンジル１１－［［（２Ｓ）－２－［５－［５－［３－アセトアミド－４，５－ジアセトキシ－６－（アセトキシメチル）テトラヒドロピラン－２－イル］オキシペンタノイルアミノ］ペンタノイルアミノ］－５－［ビス［２－［５－［５－［３－アセトアミド－４，５－ジアセトキシ－６－（アセトキシメチル）テトラヒドロピラン－２－イル］オキシペンタノイルアミノ］ペンタノイルアミノ］エチル］アミノ］－５－オキソ－ペンタノイル］アミノ］ウンデカノエート

【0136】

【化41】

【0137】

表題化合物を、（２Ｓ）－２－［５－［５－［３－アセトアミド－４，５－ジアセトキシ－６－（アセトキシメチル）テトラヒドロピラン－２－イル］オキシペンタノイルアミノ］ペンタノイルアミノ］－５－［ビス［２－［５－［５－［３－アセトアミド－４，５－ジアセトキシ－６－（アセトキシメチル）テトラヒドロピラン－２－イル］オキシペンタノイルアミノ］ペンタノイルアミノ］エチル］アミノ］－５－オキソ－ペンタン酸及びベンジル１１－アミノデカノエート塩酸塩から、調製１０の方法と本質的に類似の様式で調製する。ＥＳ／ＭＳｍ／ｚ１０４６．６（Ｍ＋２Ｈ）／２。

【0138】

調製３２
１１－［［（２Ｓ）－２－［５－［５－［３－アセトアミド－４，５－ジアセトキシ－６－（アセトキシメチル）テトラヒドロピラン－２－イル］オキシペンタノイルアミノ］ペンタノイルアミノ］－５－［ビス［２－［５－［５－［３－アセトアミド－４，５－ジアセトキシ－６－（アセトキシメチル）テトラヒドロピラン－２－イル］オキシペンタノイルアミノ］ペンタノイルアミノ］エチル］アミノ］－５－オキソ－ペンタノイル］アミノ］ウンデカン酸

【0139】

【化42】

【0140】

丸底フラスコにパラジウム炭素（３５ｍｇ、０．０２ｍｍｏｌ、５質量％、５０％湿潤）を添加し、フラスコを排気し、窒素で３回再充填する。ベンジル１１－［［（２Ｓ）－２－［５－［５－［３－アセトアミド－４，５－ジアセトキシ－６－（アセトキシメチル）テトラヒドロピラン－２－イル］オキシペンタノイルアミノ］ペンタノイルアミノ］－５－［ビス［２－［５－［５－［３－アセトアミド－４，５－ジアセトキシ－６－（アセトキシメチル）テトラヒドロピラン－２－イル］オキシペンタノイルアミノ］ペンタノイルアミノ］エチル］アミノ］－５－オキソ－ペンタノイル］アミノ］ウンデカノエート（２８５ｍｇ、８０％純粋、０．１１ｍｍｏｌ）の溶液をシリンジを介して添加する。容器を排気し、１ａｔｍの水素で再充填し、次いで混合物を周囲温度で１ａｔｍの水素下で撹拌する。３時間撹拌した後、フラスコを窒素でパージし、混合物を珪藻土で濾過する。濾液を濃縮して、表題化合物（２１３ｍｇ、純度７９％、７７％）を得る。ＥＳ／ＭＳｍ／ｚ１００１．２０（Ｍ＋２Ｈ）／２。

【0141】

調製３３
（２，５－ジオキソピロリジン－１－イル）１１－［［（２Ｓ）－２－［５－［５－［３－アセトアミド－４，５－ジアセトキシ－６－（アセトキシメチル）テトラヒドロピラン－２－イル］オキシペンタノイルアミノ］ペンタノイルアミノ］－５－［ビス［２－［５－［５－［３－アセトアミド－４，５－ジアセトキシ－６－（アセトキシメチル）テトラヒドロピラン－２－イル］オキシペンタノイルアミノ］ペンタノイルアミノ］エチル］アミノ］－５－オキソ－ペンタノイル］アミノ］ウンデカノエート

【0142】

【化43】

【0143】

表題化合物を、１１－［［（２Ｓ）－２－［５－［５－［３－アセトアミド－４，５－ジアセトキシ－６－（アセトキシメチル）テトラヒドロピラン－２－イル］オキシペンタノイルアミノ］ペンタノイルアミノ］－５－［ビス［２－［５－［５－［３－アセトアミド－４，５－ジアセトキシ－６－（アセトキシメチル）テトラヒドロピラン－２－イル］オキシペンタノイルアミノ］ペンタノイルアミノ］エチル］アミノ］－５－オキソ－ペンタノイル］アミノ］ウンデカン酸から、調製１６の方法と本質的に類似の様式で調製する。ＥＳ／ＭＳｍ／ｚ１０５０（Ｍ＋２Ｈ）／２

【0144】

調製３４
［５－アセトアミド－６－［５－［２－［［（４Ｓ）－４－［５－［３－アセトアミド－４，５－ジアセトキシ－６－（アセトキシメチル）テトラヒドロピラン－２－イル］オキシペンタノイルアミノ］－５－［［６－［［（１Ｓ）－１－［［ビス（４－メトキシフェニル）－フェニル－メトキシ］メチル］－２－［４－（ヒドロキシメチル）－１－ピペリジル］－２－オキソ－エチル］アミノ］－６－オキソ－ヘキシル］アミノ］－５－オキソ－ペンタノイル］－［２－［５－［３－アセトアミド－４，５－ジアセトキシ－６－（アセトキシメチル）テトラヒドロピラン－２－イル］オキシペンタノイルアミノ］エチル］アミノ］エチルアミノ］－５－オキソ－ペントキシ］－３，４－ジアセトキシテトラヒドロピラン－２－イル］酢酸メチル

【0145】

【化44】

【0146】

表題化合物を、６－［［（２Ｓ）－２－［５－［３－アセトアミド－４，５－ジアセトキシ－６－（アセトキシメチル）テトラヒドロピラン－２－イル］オキシペンタノイルアミノ］－５－［ビス［２－［５－［３－アセトアミド－４，５－ジアセトキシ－６－（アセトキシメチル）テトラヒドロピラン－２－イル］オキシペンタノイルアミノ］エチル］アミノ］－５－オキソ－ペンタノイル］アミノ］ヘキサン酸及び（２Ｓ）－２－アミノ－３－［ビス（４－メトキシフェニル）－フェニル－メトキシ］－１－［４－（ヒドロキシメチル）－１－ピペリジル］プロパン－１－オンから、調製１０の方法と本質的に類似の様式で調製する。ＥＳ／ＭＳｍ／ｚ１０５９．２（Ｍ－２Ｈ）／２。

【0147】

調製３５
４－［［１－［（２Ｓ）－２－［６－［［（２Ｓ）－２－［５－［３－アセトアミド－４，５－ジアセトキシ－６－（アセトキシメチル）テトラヒドロピラン－２－イル］オキシペンタノイルアミノ］－５－［ビス［２－［５－［３－アセトアミド－４，５－ジアセトキシ－６－（アセトキシメチル）テトラヒドロピラン－２－イル］オキシペンタノイルアミノ］エチル］アミノ］－５－オキソ－ペンタノイル］アミノ］ヘキサノイルアミノ］－３－［ビス（４－メトキシフェニル）－フェニル－メトキシ］プロパノイル］－４－ピペリジル］メトキシ］－４－オキソ－ブタン酸

【0148】

【化45】

【0149】

ＤＣＭ（１１ｍＬ）中の［５－アセトアミド－６－［５－［２－［［（４Ｓ）－４－［５－［３－アセトアミド－４，５－ジアセトキシ－６－（アセトキシメチル）テトラヒドロピラン－２－イル］オキシペンタノイルアミノ］－５－［［６－［［（１Ｓ）－１－［［ビス（４－メトキシフェニル）－フェニル－メトキシ］メチル］－２－［４－（ヒドロキシメチル）－１－ピペリジル］－２－オキソ－エチル］アミノ］－６－オキソ－ヘキシル］アミノ］－５－オキソ－ペンタノイル］－［２－［５－［３－アセトアミド－４，５－ジアセトキシ－６－（アセトキシメチル）テトラヒドロピラン－２－イル］オキシペンタノイルアミノ］エチル］アミノ］エチルアミノ］－５－オキソ－ペントキシ］－３，４－ジアセトキシ－テトラヒドロピラン－２－イル］酢酸メチル（１．１９４ｇ、０．５６ｍｍｏｌ）の溶液に、コハク酸無水物（１１３ｍｇ、１．１３ｍｍｏｌ）、ＴＥＡ（０．４ｍＬ、３ｍｍｏｌ）及びＤＭＡＰ（２１３ｍｇ、１．６９ｍｍｏｌ）を添加する。混合物を周囲温度で１時間撹拌する。この後、混合物を飽和ＮＨ_４Ｃｌ（２００ｍＬ）で希釈し、ＤＣＭ（３×２００ｍＬ）及び３：１ＣＨＣｌ_３：ＩＰＡ（２００ｍＬ）で抽出する。有機層を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、真空中で濃縮する。得られた残留物を、０～４０％のＭｅＯＨ／ＤＣＭで溶出するシリカゲルフラッシュクロマトグラフィーにより精製し、得られた生成物を真空オーブン内で４０℃で３時間乾燥させて、表題化合物（１．０８１ｇ、８６％）を得る。ＥＳ／ＭＳｍ／ｚ１１０９．６０（Ｍ－２Ｈ）／２。

【0150】

調製３６
樹脂ローディング

【0151】

【化46】

【0152】

ＭｅＣＮ（６ｍＬ）及びＤＣＭ（１ｍＬ）中の４－［［１－［（２Ｓ）－２－［６－［［（２Ｓ）－２－［５－［３－アセトアミド－４，５－ジアセトキシ－６－（アセトキシメチル）テトラヒドロピラン－２－イル］オキシペンタノイルアミノ］－５－［ビス［２－［５－［３－アセトアミド－４，５－ジアセトキシ－６－（アセトキシメチル）テトラヒドロピラン－２－イル］オキシペンタノイルアミノ］エチル］アミノ］－５－オキソ－ペンタノイル］アミノ］ヘキサノイルアミノ］－３－［ビス（４－メトキシフェニル）－フェニル－メトキシ］プロパノイル］－４－ピペリジル］メトキシ］－４－オキソ－酪酸（１．００ｇ、０．６１ｍｍｏｌ）の溶液を樹脂ローディングカートリッジに移す。容器に、２－（１Ｈ－ベンゾトリアゾール－１－イル）－１，１，３，３－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（３８６ｍｇ、０．９７ｍｍｏｌ）及びＤＩＥＡ（０．２５ｍＬ、０．４８ｍｍｏｌ）を添加し、カートリッジを周囲温度で５分間振盪する。この後、１０００Å ＬＣＡＡ制御細孔ガラス樹脂（５．３９ｇ、９０μｍｏｌ／ｇローディング、ＣｈｅｍＧｅｎｅｓから購入）を添加し、混合物を周囲温度で１８時間振盪する。この後、カートリッジを吸引により排液し、樹脂をＤＣＭ（１０ｍＬ）と共に１０分間振盪することにより洗浄する。カートリッジを排液し、洗浄及び排液手順を１０％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ（１０ｍＬ）及びＥｔ_２Ｏ（１０ｍＬ）で繰り返す。排液後、無水酢酸（６．４ｍＬ）、ピリジン（２０ｍＬ）及びＴＥＡ（０．２２ｍＬ）の溶液を添加し、カートリッジを２時間振盪する。この後、カートリッジを排液し、上記の洗浄及び排液手順を、ＤＣＭ（１０ｍＬ）、１０％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ（１０ｍＬ）及びジエチルエーテル（１０ｍＬ）を用いて繰り返す。排液後、樹脂を真空下で３０分間乾燥させる。樹脂ローディングを、標準的なトリチルアッセイを使用して測定する。樹脂ローディングは、３４．７μｍｏｌ／ｇと算出された。

【0153】

調製３７
２－［２－［［（２Ｓ）－２－［５－［５－［３－アセトアミド－４，５－ジアセトキシ－６－（アセトキシメチル）テトラヒドロピラン－２－イル］オキシペンタノイルアミノ］ペンタノイルアミノ］－５－［ビス［２－［５－［５－［３－アセトアミド－４，５－ジアセトキシ－６－（アセトキシメチル）テトラヒドロピラン－２－イル］オキシペンタノイルアミノ］ペンタノイルアミノ］エチル］アミノ］－５－オキソ－ペンタノイル］アミノ］エトキシ］酢酸ベンジル

【0154】

【化47】

【0155】

表題化合物を、（２Ｓ）－２－［５－［５－［３－アセトアミド－４，５－ジアセトキシ－６－（アセトキシメチル）テトラヒドロピラン－２－イル］オキシペンタノイルアミノ］ペンタノイルアミノ］－５－［ビス［２－［５－［５－［３－アセトアミド－４，５－ジアセトキシ－６－（アセトキシメチル）テトラヒドロピラン－２－イル］オキシペンタノイルアミノ］ペンタノイルアミノ］エチル］アミノ］－５－オキソ－ペンタン酸及び２－（２－アミノエトキシ）酢酸ベンジル塩酸塩から、調製１０の方法と本質的に類似の様式で調製する。ＥＳ／ＭＳｍ／ｚ１００５．２（Ｍ＋２Ｈ／２）。

【0156】

調製３８
２－［２－［［（２Ｓ）－２－［５－［５－［３－アセトアミド－４，５－ジアセトキシ－６－（アセトキシメチル）テトラヒドロピラン－２－イル］オキシペンタノイルアミノ］ペンタノイルアミノ］－５－［ビス［２－［５－［５－［３－アセトアミド－４，５－ジアセトキシ－６－（アセトキシメチル）テトラヒドロピラン－２－イル］オキシペンタノイルアミノ］ペンタノイルアミノ］エチル］アミノ］－５－オキソ－ペンタノイル］アミノ］エトキシ］酢酸

【0157】

【化48】

【0158】

２－［２－［［（２Ｓ）－２－［５－［５－［３－アセトアミド－４，５－ジアセトキシ－６－（アセトキシメチル）テトラヒドロピラン－２－イル］オキシペンタノイルアミノ］ペンタノイルアミノ］－５－［ビス［２－［５－［５－［３－アセトアミド－４，５－ジアセトキシ－６－（アセトキシメチル）テトラヒドロピラン－２－イル］オキシペンタノイルアミノ］ペンタノイルアミノ］エチル］アミノ］－５－オキソ－ペンタノイル］アミノ］エトキシ］酢酸ベンジル（０．１２０ｍｍｏｌ、２４０ｍｇ）をＭｅＯＨ（１２．０ｍＬ）中の５％Ｐｄ／Ｃ（１．１７ｍｍｏｌ、１２４ｍｇ）と混合する。混合物をＰａｒｒ振盪機（周囲温度、１０ｐｓｉ）で４８分間水素化し、珪藻土で濾過し、真空中で濃縮して、表題化合物を灰色固体として得る（１８７ｍｇ、８２％）。ＥＳ／ＭＳｍ／ｚ９６０．０（Ｍ＋２Ｈ／２）。

【0159】

調製３９
（２，３，５，６－テトラフルオロフェニル）２－［２－［［（２Ｓ）－２－［５－［５－［３－アセトアミド－４，５－ジアセトキシ－６－（アセトキシメチル）テトラヒドロピラン－２－イル］オキシペンタノイルアミノ］ペンタノイルアミノ］－５－［ビス［２－［５－［５－［３－アセトアミド－４，５－ジアセトキシ－６－（アセトキシメチル）テトラヒドロピラン－２－イル］オキシペンタノイルアミノ］ペンタノイルアミノ］エチル］アミノ］－５－オキソ－ペンタノイル］アミノ］エトキシ］酢酸

【0160】

【化49】

【0161】

ＤＣＭ（３．０ｍＬ）中の２－［２－［［（２Ｓ）－２－［５－［５－［３－アセトアミド－４，５－ジアセトキシ－６－（アセトキシメチル）テトラヒドロピラン－２－イル］オキシペンタノイルアミノ］ペンタノイルアミノ］－５－［ビス［２－［５－［５－［３－アセトアミド－４，５－ジアセトキシ－６－（アセトキシメチル）テトラヒドロピラン－２－イル］オキシペンタノイルアミノ］ペンタノイルアミノ］エチル］アミノ］－５－オキソ－ペンタノイル］アミノ］エトキシ］酢酸（０．０９６ｍｍｏｌ、１８４ｍｇ）及びＤＩＥＡ（０．７６５ｍｍｏｌ、１４０μＬ）に、（２，３，５，６－テトラフルオロフェニル）２，２，２－トリフルオロ酢酸（０．３８３ｍｍｏｌ、１００ｍｇ）を混合物に滴下する。混合物を周囲温度で１６時間撹拌する。反応混合物を０％～５０％のＭｅＯＨ／ＤＣＭで溶出するシリカゲルフラッシュクロマトグラフィーによって直接精製して、表題化合物を黄褐色固体（１９７ｍｇ、９９％）として得る。ＥＳ／ＭＳｍ／ｚ１０３４．０（Ｍ＋２Ｈ／２）。

【0162】

調製４０
２－［２－［２－［２－［［（２Ｓ）－２－［５－［５－［３－アセトアミド－４，５－ジアセトキシ－６－（アセトキシメチル）テトラヒドロピラン－２－イル］オキシペンタノイルアミノ］ペンタノイルアミノ］－５－［ビス［２－［５－［５－［３－アセトアミド－４，５－ジアセトキシ－６－（アセトキシメチル）テトラヒドロピラン－２－イル］オキシペンタノイルアミノ］ペンタノイルアミノ］エチル］アミノ］－５－オキソ－ペンタノイル］アミノ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］酢酸ベンジル

【0163】

【化50】

【0164】

表題化合物を、（２Ｓ）－２－［５－［５－［３－アセトアミド－４，５－ジアセトキシ－６－（アセトキシメチル）テトラヒドロピラン－２－イル］オキシペンタノイルアミノ］ペンタノイルアミノ］－５－［ビス［２－［５－［５－［３－アセトアミド－４，５－ジアセトキシ－６－（アセトキシメチル）テトラヒドロピラン－２－イル］オキシペンタノイルアミノ］ペンタノイルアミノ］エチル］アミノ］－５－オキソ－ペンタン酸及び２－［２－［２－（２－アミノエトキシ）エトキシ］エトキシ］酢酸ベンジル塩酸塩から、調製１０の方法と本質的に類似の様式で調製する。ＥＳ／ＭＳｍ／ｚ１０４９．０（Ｍ＋２Ｈ／２）。

【0165】

調製４１
２－［２－［２－［２－［［（２Ｓ）－２－［５－［５－［３－アセトアミド－４，５－ジアセトキシ－６－（アセトキシメチル）テトラヒドロピラン－２－イル］オキシペンタノイルアミノ］ペンタノイルアミノ］－５－［ビス［２－［５－［５－［３－アセトアミド－４，５－ジアセトキシ－６－（アセトキシメチル）テトラヒドロピラン－２－イル］オキシペンタノイルアミノ］ペンタノイルアミノ］エチル］アミノ］－５－オキソ－ペンタノイル］アミノ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］酢酸

【0166】

【化51】

【0167】

２－［２－［２－［２－［［（２Ｓ）－２－［５－［５－［３－アセトアミド－４，５－ジアセトキシ－６－（アセトキシメチル）テトラヒドロピラン－２－イル］オキシペンタノイルアミノ］ペンタノイルアミノ］－５－［ビス［２－［５－［５－［３－アセトアミド－４，５－ジアセトキシ－６－（アセトキシメチル）テトラヒドロピラン－２－イル］オキシペンタノイルアミノ］ペンタノイルアミノ］エチル］アミノ］－５－オキソ－ペンタノイル］アミノ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］酢酸ベンジル（０．１１８ｍｍｏｌ、２４７ｍｇ）を、ＭｅＯＨ（１２．０ｍＬ）中の５％のＰｄ／Ｃ（１．１７ｍｍｏｌ、１２４ｍｇ）と混合する。混合物をＰａｒｒ振盪機（周囲温度、１０ｐｓｉ）で１時間水素化し、珪藻土で濾過し、真空中で濃縮して、表題化合物を灰色固体として得る（２２７ｍｇ、９６％）。ＥＳ／ＭＳｍ／ｚ１００４．０（Ｍ＋２Ｈ／２）。

【0168】

調製４２
（２，３，５，６－テトラフルオロフェニル）２－［２－［２－［２－［［（２Ｓ）－２－［５－［５－［３－アセトアミド－４，５－ジアセトキシ－６－（アセトキシメチル）テトラヒドロピラン－２－イル］オキシペンタノイルアミノ］ペンタノイルアミノ］－５－［ビス［２－［５－［５－［３－アセトアミド－４，５－ジアセトキシ－６－（アセトキシメチル）テトラヒドロピラン－２－イル］オキシペンタノイルアミノ］ペンタノイルアミノ］エチル］アミノ］－５－オキソ－ペンタノイル］アミノ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］酢酸

【0169】

【化52】

【0170】

ＤＣＭ（３．０ｍＬ）中の２－［２－［２－［２－［［（２Ｓ）－２－［５－［５－［３－アセトアミド－４，５－ジアセトキシ－６－（アセトキシメチル）テトラヒドロピラン－２－イル］オキシペンタノイルアミノ］ペンタノイルアミノ］－５－［ビス［２－［５－［５－［３－アセトアミド－４，５－ジアセトキシ－６－（アセトキシメチル）テトラヒドロピラン－２－イル］オキシペンタノイルアミノ］ペンタノイルアミノ］エチル］アミノ］－５－オキソ－ペンタノイル］アミノ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］酢酸（０．１１１ｍｍｏｌ、２２２ｍｇ）及びＤＩＥＡ（０．８８３ｍｍｏｌ、１５４μＬ）に、（２，３，５，６－テトラフルオロフェニル）２，２，２－トリフルオロ酢酸（０．４４３ｍｍｏｌ、１１６ｍｇ）を混合物に滴下する。混合物を周囲温度で１６時間撹拌する。反応混合物を、０％～５０％のＭｅＯＨ／ＤＣＭで溶出するシリカゲルフラッシュクロマトグラフィーにより直接精製して、表題化合物を黄褐色固体（１７４ｍｇ、７３％）として得る。ＥＳ／ＭＳｍ／ｚ１０７８．２（Ｍ＋２Ｈ／２）。

【0171】

実施例１
コンジュゲーションプロトコル
ＧａｌＮＡｃコンジュゲートセンス鎖の合成のために、３’Ｃ６－ＮＨ_２官能基を有するセンス鎖を、標準的なホスホラミダイト化学を使用して最初に合成する。ＧａｌＮＡｃリガンド－ＮＨＳエステルのストック溶液（アセトニトリル中１０ｍｍｏｌ／Ｌ；１当量）を調製する。ホウ酸緩衝液（１０％ｖ／ｖ；２０倍）をエッペンドルフチューブ中のオリゴヌクレオチドＣ６－ＮＨ_２センス鎖に添加し、次いでＧａｌＮＡｃリガンド（５当量）を添加する。混合物を周囲温度で１６時間振盪する。この後、混合物を１５ｍＬのファルコンチューブに移し、水酸化アンモニウム（２８質量％）を添加し、混合物を周囲温度で２時間振盪する。次いで、アンモニアを真空中で除去する。残留物をイオン交換クロマトグラフィーによって精製する。条件：溶媒Ａ：１５％のＭｅＣＮ／２０ｍＭのＮａＨ_２ＰＯ_４、溶媒Ｂ：１５％のＭｅＣＮ／２０ｍＭのＮａＨ_２ＰＯ_４、１ＭのＮａＢｒ；８ｍＬ／分で５ＣＶにわたって３５～５５％のＢ、カラム温度６０℃。所望の画分をプールし、エッペンドルフ遠心分離又は脱塩カラムを使用するスピン濾過によって脱塩する。脱塩後、材料を回収し、ＯＤ及び体積を測定して、濃度を得る。

【0172】

あるいは、ＧａｌＮＡｃリガンドを微孔性ポリスチレン樹脂又は制御細孔ガラス上に固定化し、５’－ＣＥβ－シアノエチル）ホスホラミダイトを用いた確立された固相オリゴヌクレオチド合成法を使用して合成することによって、コンジュゲーションをセンス鎖の５’位に対して行う。

【0173】

あるいは、ＧａｌＮＡｃリガンドを好適なホスホラミダイトに変換し、標準的なホスホラミダイト化学を使用してセンス鎖の５’位に送達する。

【0174】

実施例２：アニーリング
センス鎖及びアンチセンス鎖のｓｉＲＮＡ二重鎖を生成するために、以下の手順を行う。オリゴヌクレオチドセンス鎖－ＧａｌＮＡｃコンジュゲートを含むファルコンチューブに、対応するアンチセンスオリゴヌクレオチド（１当量）を添加し、１０秒間ボルテックスした後、１００ＫＭＷＣＯＡｍｉｃｏｎフィルターユニットを通してスピン濾過して、微粒子を除去する。濾液を回収し、Ｇｅｎｅｖａｃエバポレータで真空中で濃縮する。残留物を１倍ＰＢＳで再構成し、０．２μフィルターで濾過し、ＯＤ及び体積を測定して、濃度を得る。

【0175】

Ｅｎｄｏｓａｆｅ（登録商標）－ｎｅｘｇｅｎＰＴＳ装置で、カブトガニ変形細胞溶解物を使用してエンドトキシン試験を行う。

【0176】

【表1】

【0177】

実施例３：ＧａｌＮＡｃ官能化ＣＰＧを使用するオリゴ合成の一般的手順
ホスホラミダイト化学を使用するＭｅｒｍａｄｅ１２装置でオリゴ合成を実施する。センス鎖を、予め官能化されたＧａｌＮＡｃ固体支持体から合成し、アンチセンス鎖を、オリゴ配列の第１のヌクレオチドを予めロードした標準的な支持体を使用して合成する。オリゴを、濃縮水酸化アンモニウム溶液（２８質量％）を使用して切断及び脱保護し、上記の条件を使用するイオン交換クロマトグラフィーによって精製する。脱塩、アニーリング、及びエンドトキシン試験を上記のように実施する。

【0178】

【表2】

【0179】

重要事項－［Ｐｈｏｓ］は、リン酸化５’残基を示し、ｍは、ｍの直後に記載されるヌクレオチド／ヌクレオシド塩基上のリボース上の２’Ｏ－Ｍｅ基を示し、ｆは、ｆの直後に記載されるヌクレオチド／ヌクレオシド塩基上のリボース上の２’フルオロ基を示し、^＊は、ホスホロチオエート（ＰＳ）である修飾結合を示す。

【0180】

実施例４

【0181】

【表3】

【0182】

実施例５

【0183】

【表4】

【0184】

実施例６：生物学的アッセイ
インビボでのＧａｌＮＡｃ－ＬＤＨＡｓｉＲＮＡコンジュゲート遺伝子ノックダウンの評価
動物
全ての動物を、１２時間／１２時間の明／暗サイクルで温度制御された施設（２４℃）に個々に収容する。動物プロトコルは、ＥｌｉＬｉｌｌｙ及びＣｏｍＩｐａｎｙＩＡＣＵＣによって承認されている。雄の約８週齢のＣ５７ＢＬ／６マウス（Ｅｎｖｉｇｏ）を秤量し、１群当たり６匹の動物の処置群に体重によって無作為化する。動物を、皮下注射を介してＰＢＳ又はｓｉＲＮＡコンジュゲートのいずれかで処置する。投与の１４日後、動物を屠殺し、肝臓組織を迅速に解剖し、液体窒素中で急速冷凍する。

【0185】

ＲＮＡ単離及びリアルタイム定量的ＲＴ－ＰＣＲ
全ＲＮＡを、ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ａｍｂｉｏｎ）及びＰｕｒｅＬｉｎｋＰｒｏ９６全ＲＮＡ精製キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して肝臓試料から単離する。１マイクログラムのＲＮＡを使用して、Ｈｉｇｈ－ＣａｐａｃｉｔｙｃＤＮＡＲｅｖｅｒｓｅＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎキット（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用してｃＤＮＡを合成する。定量的リアルタイムＰＣＲを、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ７ＦｌｅｘＲｅａｌ－ＴｉｍｅＰＣＲシステム（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で行う。ＣＴ値をＲＰＬＰ０（Ｍｍ０１９７４４７４＿ｇＨ、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に対して正規化し、ＬＤＨＡ（Ｍｍ０３６４６７３８＿ｇＩ、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）の相対発現をΔΔＣＴ法によって計算する。相対発現をビヒクル処置動物に対して正規化することによって、倍数変化を計算する。

【0186】

【表5】

【0187】

【表6】

【0188】

ＧａｌＮＡｃ－ＬＤＨＡｓｉＲＮＡ２４時間組織曝露スクリーニング
動物
全ての動物を、１２時間／１２時間の明／暗サイクルで温度制御された施設（２４℃）に個々に収容する。動物プロトコルは、ＥｌｉＬｉｌｌｙａｎｄＣｏｍｐａｎｙＩＡＣＵＣによって承認されている。雄の約８週齢のＣ５７ＢＬ／６マウス（Ｅｎｖｉｇｏ）を秤量し、１群当たり５匹の動物の処置群に体重によって無作為化する。動物を、皮下注射を介してＰＢＳビヒクル又はｓｉＲＮＡコンジュゲートのいずれかで処置する。投与の２４時間後、動物を屠殺し、血漿試料を心臓穿刺出血によって収集し、肝臓／腎臓組織を迅速に解剖し、液体窒素中で急速冷凍する。ｓｉＲＮＡ及び代謝産物の組織濃度を、ＰＮＡハイブリダイゼーション及び蛍光検出と合わせた陰イオン交換高速液体クロマトグラフィー分析によって決定する。

【0189】

【表7】

【0190】

【表8】

【0191】

実施例７：マウス遺伝子のインビトロノックダウン
マウス初代肝細胞（Mouse primary hepatocyte、ＭＰＨ）を新たに単離し、ウェル当たり１５ｋでＣｏｒｎｉｎｇプレート上に播種し、ＰＢＳ中のｓｉＲＮＡコンジュゲートを各ウェルに添加する。用量応答実験を、マウス初代肝細胞において１０００、３３３、１１１、３７、１２、４、１．３７、０．４６、０．１５、０．０５、及び０．０１７ｎＭの最終ＧａｌＮＡｃでコンジュゲートされた二重鎖濃度を使用して行う。

【0192】

ＺｙｍｏＲｅｓｅａｒｃｈからのＱｕｉｃｋ－ＲＮＡ９６キットを使用して、プレーティングされた細胞からＲＮＡを直接単離する。最終的に精製及び溶出されたＲＮＡは、直ちに使用されるか、又は凍結保存される。ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎからのＦａｓｔＡｄｖａｎｃｅｄＲＴＭａｓｔｅｒＭｉｘ及びＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ７ＦｌｅｘＲｅａｌ－ＴｉｍｅＰＣＲＳｙｓｔｅｍ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、精製されたＲＮＡからｃＤＮＡを合成し、３７℃で３０分間、９５℃で５分間インキュベートし、４℃で保持する。ｃＤＮＡを使用して、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ７ＦｌｅｘＲｅａｌ－ＴｉｍｅＰＣＲＳｙｓｔｅｍ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用するＲｅａｌＴｉｍｅＰＣＲを、以下のパラメータ：５０℃で２分間、９５℃で１０分間、９５℃で１５秒間を４０サイクル、及び６０℃で１分間を使用して行う：。

【0193】

以下のマウス標的遺伝子ＨＰＲＴ、ＬＤＨＡ、及びＤＰＰ４（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）についてのＲＴ－ＰＣＲアッセイの結果、並びにＩＣ５０計算を表８に示す。ノックダウンレベルは、ビヒクル単独と比較した相対的ノックダウンを表し、マウスＲｐｌｐ０（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に対して更に正規化して、試料間で比較する。ＸＬＦｉｔを使用する４パラメータフィットモデルを使用して、ＩＣ_５０を計算する。これらの結果は、本明細書に開示される送達部分の効果的なノックダウンを実証し、３つの異なる遺伝子の８０～９７％のノックダウンを伴う。

【0194】

【表9】