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特表2024-522860新規なポリ－４－ヒドロキシブチレート及び１，４－ブタンジオール生産方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-06-21
(54)【発明の名称】新規なポリ－４－ヒドロキシブチレート及び１，４－ブタンジオール生産方法
(51)【国際特許分類】
C12P 7/18 20060101AFI20240614BHJP
C12N 9/10 20060101ALI20240614BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20240614BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20240614BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20240614BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240614BHJP
C12N 1/20 20060101ALI20240614BHJP
C12N 15/60 20060101ALI20240614BHJP
C12P 7/62 20220101ALI20240614BHJP
C12N 9/06 20060101ALN20240614BHJP
C12N 9/00 20060101ALN20240614BHJP
【ＦＩ】
C12P7/18 ZNA
C12N9/10
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
C12N1/20 A
C12N15/60
C12P7/62
C12N9/06 Z
C12N9/00
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023579221
(86)(22)【出願日】2022-06-24
(85)【翻訳文提出日】2024-01-19
(86)【国際出願番号】 KR2022009082
(87)【国際公開番号】W WO2022270991
(87)【国際公開日】2022-12-29
(31)【優先権主張番号】10-2021-0083270
(32)【優先日】2021-06-25
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】514199250
【氏名又は名称】シージェイ チェイルジェダング コーポレイション
(74)【代理人】
【識別番号】100105957
【弁理士】
【氏名又は名称】恩田 誠
(74)【代理人】
【識別番号】100068755
【弁理士】
【氏名又は名称】恩田 博宣
(74)【代理人】
【識別番号】100142907
【弁理士】
【氏名又は名称】本田 淳
(74)【代理人】
【識別番号】100152489
【弁理士】
【氏名又は名称】中村 美樹
(72)【発明者】
【氏名】キム、ソ ヒョン
(72)【発明者】
【氏名】イ、キョン－チャン
(72)【発明者】
【氏名】イム、ジェ ヒョン
(72)【発明者】
【氏名】ハ、ヒョ－ソク
(72)【発明者】
【氏名】チャン、ドン－ウン
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B064AC05
4B064AD31
4B064AD75
4B064CA02
4B064CA19
4B064DA20
4B065AA24X
4B065AA26X
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065BC03
4B065CA05
4B065CA12
(57)【要約】
本出願は、新規なポリ－４－ヒドロキシブチレート及び／又は１，４－ブタンジオール生産方法並びにポリ－４－ヒドロキシブチレート生産経路を利用する微生物に関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
（１）スクシニル－ｃｏＡ（ｓｕｃｃｉｎｙｌ－ｃｏＡ；ＳｕＣｏＡ）をスクシネートセミアルデヒド（ｓｕｃｃｉｎａｔｅ ｓｅｍｉａｌｄｅｈｙｄｅ；ＳＳＡ）に変換する段階；（２）スクシネートセミアルデヒド（ｓｕｃｃｉｎａｔｅ ｓｅｍｉａｌｄｅｈｙｄｅ；ＳＳＡ）を４－ヒドロキシブチレート（４－ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒａｔｅ；４ＨＢ）に変換する段階；
（３）４－ヒドロキシブチレート（４－ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒａｔｅ；４ＨＢ）を４－ヒドロキシブチリルｃｏＡ（４－ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒｙｌ ｃｏＡ；４ＨＢＣｏＡ）に変換する段階；
（４）二つ以上の４－ヒドロキシブチリルｃｏＡ（４－ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒｙｌ ｃｏＡ；４ＨＢＣｏＡ）を重合してポリ－４－ヒドロキシブチレート（ｐｏｌｙ－４－ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒａｔｅ；Ｐ４ＨＢ）を生産する段階；及び
（５）ポリ－４－ヒドロキシブチレートを１，４－ブタンジオールに分解する段階を含む１，４－ブタンジオール生産方法。
【請求項2】
前記（１）～（４）は、スクシネートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ｓｕｃｃｉｎａｔｅ ｓｅｍｉａｌｄｅｈｙｄｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）、４－ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ（４－ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒｉｃ ａｃｉｄ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）、４－ヒドロキシブチリル－ｃｏＡトランスフェラーゼ（４－ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒｙｌ－ＣｏＡ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、及びポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）ポリメラーゼ（Ｐｏｌｙ（３－ｈｙｄｒｏｘｙａｌｋａｎｏａｔｅ） ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）からなる群から選択されるいずれか一つ以上のポリペプチド；前記ポリペプチド、これをコードするポリヌクレオチド、またはこれらの組合せを含む微生物；及びその培養物で構成される群から選択されるいずれか一つ以上を利用する、請求項１に記載の生産方法。
【請求項3】
前記生産方法は、ＴＣＡ経路をさらに含む、請求項１に記載の生産方法。
【請求項4】
前記ＴＣＡ経路は（ａ１）ピルベートをアセチル－ｃｏＡに変換する段階；
（ｂ１）アセチル－ｃｏＡ及びオキサロアセテートをシトレートに変換する段階；
（ｃ１）シトレートをイソシトレートに変換する段階；
（ｄ１）イソシトレートをα－ケトグルタレートに変換する段階；
（ｅ１）α－ケトグルタレートをスクシニル－ｃｏＡに変換する段階；及び
（ｆ１）ピルベートをオキサロアセテートに変換する段階で構成される群から選択されるいずれか一つ以上を含む、請求項３に記載の生産方法。
【請求項5】
前記生産方法は、（ｇ１）ホスホエノールピルベートをオキサロアセテートに変換する段階をさらに含む、請求項１に記載の生産方法。
【請求項6】
前記（ｇ１）は、ホスホエノールピルベートカルボキシラーゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｅｎｏｌｐｙｒｕｖａｔｅ ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ）ポリペプチド；前記ポリペプチド、これをコードするポリヌクレオチド、またはこれらの組合せを含む微生物；及びその培養物で構成される群から選択されるいずれか一つ以上を利用する、請求項５に記載の生産方法。
【請求項7】
前記生産方法は、（ｇ１）ホスホエノールピルベートをオキサロアセテートに変換する段階が強化された、請求項１に記載の生産方法。
【請求項8】
前記生産方法は、還元型ＴＣＡ経路（ｒｅｄｕｃｔｉｖｅ ＴＣＡ ｃｙｃｌｅ）をさらに含む、請求項１に記載の生産方法。
【請求項9】
前記還元型ＴＣＡ経路は、（ａ２）オキサロアセテートをマレートに変換する段階；（ｂ２）マレートをフマレートに変換する段階；
（ｃ２）フマレートをスクシネートに変換する段階；及び
（ｄ２）スクシネートをスクシニル－ｃｏＡに変換する段階からなる群から選択されるいずれか一つ以上を含む、請求項８に記載の生産方法。
【請求項10】
前記生産方法は、（ｅ２）ホスホエノールピルベートからピルベートに変換する段階が弱化された、請求項８に記載の生産方法。
【請求項11】
前記還元型ＴＣＡ経路は、下記（Ｉ）～（ＸＩＩ）からなる群から選択されるいずれか一つ以上により強化された、請求項８に記載の生産方法：（Ｉ）ピルビン酸キナーゼ（ｐｙｒｕｖａｔｅ ｋｉｎａｓｅ）弱化；
（ＩＩ）ホスホエノールピルベートカルボキシラーゼ（ＰＥＰ ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ）強化；
（ＩＩＩ）カルボニックアンヒドラーゼ（ｃａｒｂｏｎｉｃ ａｎｈｙｄｒａｓｅ）強化；
（ＩＶ）シトレートシンターゼ（ｃｉｔｒａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ）調節；
（Ｖ）ピルベートカルボキシラーゼ（ｐｙｒｕｖａｔｅ ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ）強化；
（ＶＩ）ＮＡＤ＋依存性マレートデヒドロゲナーゼ（ＮＡＤ＋－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｍａｌａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）弱化；
（ＶＩＩ）ＮＡＤＰ＋依存性マレートデヒドロゲナーゼ（ＮＡＤＰ＋－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｍａｌａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）弱化；
（ＶＩＩＩ）ホスホグルコン酸デヒドラターゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｕｃｏｎａｔｅ ｄｅｈｙｄｒａｔａｓｅ）弱化；
（ＩＸ）２－ケト－４－ヒドロキシグルタレートＫＤＰＧ：２－ケト－３－デオキシグルコネート６－ホスフェートアルドラーゼ（２－ｋｅｔｏ－４－ｈｙｄｒｏｘｙｇｌｕｔａｒａｔｅ：２－ｋｅｔｏ－３－ｄｅｏｘｙｇｌｕｃｏｎａｔｅ ６－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ；ＫＨＧ／ＫＤＰＧ ａｌｄｏｌａｓｅ）弱化；
（Ｘ）アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ａｓｐａｒｔａｔｅ ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）弱化；
（ＸＩ）グルコース特異的ＰＴＳ酵素ＩＩＢＣコンポーネント（ｇｌｕｃｏｓｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＰＴＳ ｅｎｚｙｍｅ ＩＩＢＣ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）弱化；及び
（ＸＩＩ）重炭酸塩トランスポーター（ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ）強化。
【請求項12】
前記生産方法は、グリオキシレート経路をさらに含む、請求項１に記載の生産方法。
【請求項13】
前記グリオキシレート経路は（ａ３）イソシトレートをグリオキシレート及びスクシネートに変換する段階；
（ｂ３）グリオキシレート及びアセチル－ｃｏＡをマレート及びｃｏＡに変換する段階；
（ｃ３）シトレートをイソシトレートに変換する段階；
（ｄ３）ピルベートをオキサロアセテートに変換する段階；
（ｅ３）ホスホエノールピルベートをオキサロアセテートに変換する段階；
（ｆ３）オキサロアセテートをシトレートに変換する段階；
（ｇ３）マレートをフマレートに変換する段階；
（ｈ３）フマレートをスクシネートに変換する段階；及び
（ｉ３）スクシネートをスクシニル－ｃｏＡに変換する段階で構成される群からいずれか一つ以上をさらに含む、請求項１２に記載の生産方法。
【請求項14】
（ｊ３）α－ケトグルタレートをスクシニル－ｃｏＡに変換する段階が弱化された、請求項１３に記載の生産方法。
【請求項15】
（ｋ３）オキサロアセテートをマレートに変換する段階が弱化された、請求項１３に記載の生産方法。
【請求項16】
前記グリオキシレート経路は、（ｉ）～（ｖｉ）からなる群から選択されるいずれか一つ以上により強化された、請求項１３に記載の生産方法：（ｉ）シトレートシンターゼ（ｃｉｔｒａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ）強化；
（ｉｉ）イソシトレートデヒドロゲナーゼ（ｉｓｏｃｉｔｒａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）弱化；
（ｉｉｉ）イソシトレートリアーゼ（ｉｓｏｃｉｔｒａｔｅ ｌｙａｓｅ）強化；
（ｉｖ）イソシトレートデヒドロゲナーゼキナーゼ／ホスファターゼ（Ｉｓｏｃｉｔｒａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ｋｉｎａｓｅ／ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）強化；
（ｖ）マレートシンターゼＧ（ｍａｌａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ Ｇ）強化；及び
（ｖｉ）マレートシンターゼＡ（ｍａｌａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ Ａ）強化。
【請求項17】
スクシネートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、４－ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ、４－ヒドロキシブチリル－ｃｏＡトランスフェラーゼ、及びポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）ポリメラーゼポリペプチド、これをコードするポリヌクレオチド、またはこれらの組合せを含む微生物。
【請求項18】
前記スクシネートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、４－ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ、４－ヒドロキシブチリル－ｃｏＡトランスフェラーゼ、及びポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）ポリメラーゼで構成される群から選択されるいずれか一つ以上のポリペプチドは外来導入された、請求項１７に記載の微生物。
【請求項19】
前記スクシネートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ及び４－ヒドロキシブチリル－ｃｏＡトランスフェラーゼポリペプチドはクロストリジウム・クライベリ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｋｌｕｙｖｅｒｉ）由来であり、前記４－ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼポリペプチドはアラビドプシス・サリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）由来であり、前記ポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）ポリメラーゼはシュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）またはルストニア・ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ）由来である、請求項１７に記載の微生物。
【請求項20】
前記微生物は、ＴＣＡ経路を含む、請求項１７に記載の微生物。
【請求項21】
前記微生物は、ピルベートデヒドロゲナーゼ、シトレートシンターゼ、アコニターゼ、イソシトレートデヒドロゲナーゼ、α－ケトグルタレートデヒドロゲナーゼ、及びピルベートカルボキシラーゼからなる群から選択されるいずれか一つ以上のポリペプチド、これをコードするポリヌクレオチド、またはこれらの組合せを含む、請求項１７に記載の微生物。
【請求項22】
前記微生物は、還元型ＴＣＡ経路を含む、請求項１７に記載の微生物。
【請求項23】
前記微生物は、下記（Ｉ）～（ＸＩＩ）からなる群から選択されるいずれか一つ以上を含む、請求項１７に記載の微生物：（Ｉ）ピルビン酸キナーゼ弱化；
（ＩＩ）ホスホエノールピルベートカルボキシラーゼ強化；
（ＩＩＩ）カルボニックアンヒドラーゼ強化；
（ＩＶ）シトレートシンターゼ調節；
（Ｖ）ピルベートカルボキシラーゼ強化；
（ＶＩ）ＮＡＤ＋依存性マレートデヒドロゲナーゼ弱化；
（ＶＩＩ）ＮＡＤＰ＋依存性マレートデヒドロゲナーゼ弱化；
（ＶＩＩＩ）ホスホグルコン酸デヒドラターゼ弱化；
（ＩＸ）２－ケト－４－ヒドロキシグルタレートＫＤＰＧ：２－ケト－３－デオキシグルコネート６－ホスフェートアルドラーゼ弱化；
（Ｘ）アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ弱化；
（ＸＩ）グルコース特異的ＰＴＳ酵素ＩＩＢＣコンポーネント弱化；及び
（ＸＩＩ）重炭酸塩トランスポーター強化。
【請求項24】
前記微生物は、グリオキシレート経路を含む、請求項１７に記載の微生物。
【請求項25】
前記微生物は、下記（ｉ）～（ｖｉ）からなる群から選択されるいずれか一つ以上を含む、請求項１７に記載の微生物：（ｉ）シトレートシンターゼ強化；
（ｉｉ）イソシトレートデヒドロゲナーゼ弱化；
（ｉｉｉ）イソシトレートリアーゼ強化；
（ｉｖ）イソシトレートデヒドロゲナーゼキナーゼ／ホスファターゼ強化；
（ｖ）マレートシンターゼＧ強化；及び
（ｖｉ）マレートシンターゼＡ強化。
【請求項26】
前記微生物は、１，４－ブタンジオール生産に利用される、請求項１７に記載の微生物。
【請求項27】
前記微生物は、ポリ－４－ヒドロキシブチレート生産用である、請求項１７に記載の微生物。
【請求項28】
前記微生物は、コリネバクテリウム属またはエシェリキア属である、請求項１７に記載の微生物。
【請求項29】
前記微生物は、窒素、硫黄、リン、及びマグネシウムで構成される群から選択されるいずれか一つ以上の栄養素制限の条件でもポリ－４－ヒドロキシブチレート生産能がある、請求項１７に記載の微生物。
【請求項30】
前記微生物は、プロモーター活性を有する配列番号４５で示されるヌクレオチド配列を含む、請求項１７に記載の微生物。
【請求項31】
前記プロモーター活性を有する配列番号４５で示されるヌクレオチド配列の目的遺伝子は、ホスホエノールピルベートカルボキシラーゼをコードするポリヌクレオチドである、請求項３０に記載の微生物。
【請求項32】
請求項１７～３１のいずれか一項に記載の微生物を培養する段階を含むポリ－４－ヒドロキシブチレート生産方法。
【請求項33】
前記生産方法は、前記微生物または培地からポリ－４－ヒドロキシブチレートを回収する段階を含む、請求項３２に記載のポリ－４－ヒドロキシブチレート生産方法。
【請求項34】
前記微生物を培養する段階は、窒素、硫黄、リン、及びマグネシウムで構成される群から選択されるいずれか一つ以上の栄養素を制限した培地で微生物を培養する段階を含む、請求項３２に記載の生産方法。
【請求項35】
請求項１７～３１のいずれか一項に記載の微生物を培養する段階；前記微生物または培地からポリ－４－ヒドロキシブチレートを回収する段階；及び
ポリ－４－ヒドロキシブチレートを１，４－ブタンジオールに分解する段階を含む１，４－ブタンジオール生産方法。
【請求項36】
前記ポリ－４－ヒドロキシブチレートを１，４－ブタンジオールに分解する段階は、熱分解、水素化、またはこれらの組合せである、請求項３５に記載の１，４－ブタンジオール生産方法。
【請求項37】
請求項１７に記載の微生物またはその培養物を含むポリ－４－ヒドロキシブチレート生産用組成物。
【請求項38】
請求項１７に記載の微生物またはその培養物のポリ－４－ヒドロキシブチレート生産への使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本出願は、新規なポリ－４－ヒドロキシブチレート及び／又は１，４－ブタンジオール生産方法並びにポリ－４－ヒドロキシブチレート生産経路を利用する微生物に関する。
【背景技術】
【0002】
１，４－ブタンジオールを生産するために、高効率生産微生物及び発酵工程技術の開発のための様々な研究が行われている。微生物を用いた１，４－ブタンジオール生産は、概して４－ヒドロキシブチルアルデヒド生成反応を伴うが（特許文献１）、４－ヒドロキシブチルアルデヒドはアルデヒドの一種として微生物に有害な短所がある。
【0003】
また、現在まで知らされたバイオ１，４－ブタンジオール生産技術の一つであり、１，４－ブタンジオール直接発酵でブドウ糖において発酵を通じて１，４－ブタンジオールを微生物から直接生産する方法であるが、１，４－ブタンジオール自体の微生物に対する毒性により生産性に制約がある。したがって、効果的なポリ－４－ヒドロキシブチレート及び／又は１，４－ブタンジオールの生産能の増加のための研究が依然として必要なのが実情である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0004】
【特許文献1】米国特許第９１２１０４２号明細書
【特許文献2】米国特許第９０８４４６７号明細書
【特許文献3】国際公開第２０１４０５８６５５号
【特許文献4】韓国公開特許第１０－２０２０－０１３６８１３号公報
【特許文献5】米国特許第７６６２９４３号明細書
【特許文献6】米国特許第１０５８４３３８号明細書
【特許文献7】米国特許第１０２７３４９１号明細書
【非特許文献】
【0005】
【非特許文献1】Ｐｅａｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ（１９８８）［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５］：２４４４
【非特許文献2】Ｒｉｃｅ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．１６：２７６－２７７
【非特許文献3】Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３－４５３
【非特許文献4】Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １２：３８７（１９８４）
【非特許文献5】Ａｔｓｃｈｕｌ，［Ｓ．］［Ｆ．，］［ＥＴ ＡＬ，Ｊ ＭＯＬＥＣ ＢＩＯＬ ２１５］：４０３（１９９０）
【非特許文献6】Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｈｕｇｅ Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ，Ｍａｒｔｉｎ Ｊ．Ｂｉｓｈｏｐ，［ＥＤ．，］Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，１９９４
【非特許文献7】［ＣＡＲＩＬＬＯ ＥＴＡ／．］（１９８８）ＳＩＡＭ Ｊ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ ４８：１０７３
【非特許文献8】Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ（１９８１）２：４８２
【非特許文献9】Ｓｃｈｗａｒｔｚ ａｎｄ Ｄａｙｈｏｆｆ，ｅｄｓ．，Ａｔｌａｓ Ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，ｐｐ．３５３－３５８（１９７９）
【非特許文献10】Ｇｒｉｂｓｋｏｖ ｅｔ ａｌ（１９８６）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４：６７４５
【非特許文献11】Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８９
【非特許文献12】Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ
【非特許文献13】Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，ｓｕｐｒａ、９．５０－９．５１，１１．７－１１．８
【非特許文献14】Ｎａｋａｓｈｉｍａ Ｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｂｙ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ａｎｄ ｇｅｎｅ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ． Ｉｎｔ Ｊ Ｍｏｌ Ｓｃｉ．２０１４；１５（２）：２７７３－２７９３
【非特許文献15】Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２０１２
【非特許文献16】Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ，Ｈ． ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ－ＲＮＡ ａｓ ａ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｒｅｖｉｅｗｓ － Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｖｏｌ．１（１）１９８６
【非特許文献17】Ｓｉｔｎｉｃｋａ ｅｔ ａｌ．Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｇｅｎｅｓ．Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ．２０１０，Ｖｏｌ．２．１－１６
【非特許文献18】Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｔｈｒｉｄ Ｅｄ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（２００１）
【非特許文献19】Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，ＵＳＡ、２０００，９７，６６４０－６６４５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
本出願の解決しようとする課題は、新規なポリ－４－ヒドロキシブチレート及び１，４－ブタンジオール生産方法並びにポリ－４－ヒドロキシブチレート及び／又は１，４－ブタンジオール生産用微生物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【0007】
本出願の一つの目的は、１，４－ブタンジオール生産方法を提供する。
本出願の一つの目的は、ポリ－４－ヒドロキシブチレート及び／又は１，４－ブタンジオール生産用微生物を提供する。
本出願の一つの目的は、ポリ－４－ヒドロキシブチレート生産方法を提供する。
本出願の一つの目的は、ポリ－４－ヒドロキシブチレート及び／又は１，４－ブタンジオール生産用微生物を提供する。
本出願の一つの目的は、ポリ－４－ヒドロキシブチレート生産方法を提供する。
【発明の効果】
【0008】
本出願の方法または微生物を利用する場合、効果的なポリ－４－ヒドロキシブチレート及び１，４－ブタンジオール生産が可能である。
【図面の簡単な説明】
【0009】
【図1】酸化的ＴＣＡ経路を利用したポリ－４－ヒドロキシブチレート及び１，４－ブタンジオール生産経路を示す図である。
【図2】還元型ＴＣＡ経路を利用したポリ－４－ヒドロキシブチレート及び１，４－ブタンジオール生産経路を示す図である。
【図3】グリオキシレート経路を利用したポリ－４－ヒドロキシブチレート及び１，４－ブタンジオール生産経路を示す図である。
【図4】還元型ＴＣＡ経路を利用したポリ－４－ヒドロキシブチレート及び１，４－ブタンジオール生産経路でホスホエノールピルベート－オキサロアセテート経路強化方法を示す図である。
【図5】還元型ＴＣＡ経路を利用したポリ－４－ヒドロキシブチレート及び１，４－ブタンジオール生産経路でホスホエノールピルベート－オキサロアセテート経路強化方法を示す図である。
【図6】還元型ＴＣＡ経路を利用したポリ－４－ヒドロキシブチレート及び１，４－ブタンジオール生産経路でホスホエノールピルベート－オキサロアセテート経路強化方法を示す図である。
【図7】還元型ＴＣＡ経路を利用したポリ－４－ヒドロキシブチレート生産結果を示した図である。
【図8】グリオキシレート経路を利用したポリ－４－ヒドロキシブチレート生産結果を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【0010】
これを具体的に説明すれば、次の通りである。一方、本出願で開示されたそれぞれの説明及び実施形態はそれぞれの異なる説明及び実施形態にも適用できる。即ち、本出願で開示された多様な要素のすべての組合せが本出願の範疇に属する。また、下記の具体的な記述により本出願の範疇が制限されるとは見られない。また、本明細書の全体に亘って多数の論文及び特許文献が参照され、その引用が表示されている。引用された論文及び特許文献の開示内容は、その全体として本明細書に参照に挿入され、本発明が属する技術分野の水準及び本発明の内容がより明確に説明される。
【0011】
本出願の一つの様態は、下記（１）～（５）を含む１，４－ブタンジオール生産方法を提供する：
（１）スクシニル－ｃｏＡ（ｓｕｃｃｉｎｙｌ－ｃｏＡ；ＳｕＣｏＡ）をスクシネートセミアルデヒド（ｓｕｃｃｉｎａｔｅ ｓｅｍｉａｌｄｅｈｙｄｅ；ＳＳＡ）に変換する段階；
（２）スクシネートセミアルデヒド（ｓｕｃｃｉｎａｔｅ ｓｅｍｉａｌｄｅｈｙｄｅ；ＳＳＡ）を４－ヒドロキシブチレート（４－ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒａｔｅ；４ＨＢ）に変換する段階；
（３）４－ヒドロキシブチレート（４－ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒａｔｅ；４ＨＢ）を４－ヒドロキシブチリルｃｏＡ（４－ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒｙｌ ｃｏＡ；４ＨＢＣｏＡ）に変換する段階；
（４）二つ以上の４－ヒドロキシブチリルｃｏＡ（４－ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒｙｌ ｃｏＡ；４ＨＢＣｏＡ）を重合してポリ－４－ヒドロキシブチレート（ｐｏｌｙ－４－ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒａｔｅ；Ｐ４ＨＢ）を生産する段階；及び
（５）ポリ－４－ヒドロキシブチレートを１，４－ブタンジオールに分解させる段階。
（１）スクシニル－ｃｏＡ（ｓｕｃｃｉｎｙｌ－ｃｏＡ；ＳｕＣｏＡ）をスクシネートセミアルデヒド（ｓｕｃｃｉｎａｔｅ ｓｅｍｉａｌｄｅｈｙｄｅ；ＳＳＡ）に変換する段階；
（２）スクシネートセミアルデヒド（ｓｕｃｃｉｎａｔｅ ｓｅｍｉａｌｄｅｈｙｄｅ；ＳＳＡ）を４－ヒドロキシブチレート（４－ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒａｔｅ；４ＨＢ）に変換する段階；
（３）４－ヒドロキシブチレート（４－ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒａｔｅ；４ＨＢ）を４－ヒドロキシブチリルｃｏＡ（４－ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒｙｌ ｃｏＡ；４ＨＢＣｏＡ）に変換する段階；
（４）二つ以上の４－ヒドロキシブチリルｃｏＡ（４－ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒｙｌ ｃｏＡ；４ＨＢＣｏＡ）を重合してポリ－４－ヒドロキシブチレート（ｐｏｌｙ－４－ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒａｔｅ；Ｐ４ＨＢ）を生産する段階；及び
（５）ポリ－４－ヒドロキシブチレートを１，４－ブタンジオールに分解させる段階。
【0012】
上記（１）～（４）は、それぞれスクシネートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ｓｕｃｃｉｎａｔｅ ｓｅｍｉａｌｄｅｈｙｄｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）、４－ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ（４－ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒｉｃ ａｃｉｄ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）、４－ヒドロキシブチリル－ｃｏＡトランスフェラーゼ（４－ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒｙｌ－ＣｏＡ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、及びポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）ポリメラーゼ（Ｐｏｌｙ（３－ｈｙｄｒｏｘｙａｌｋａｎｏａｔｅ） ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）からなる群から選択されるいずれか一つ以上のポリペプチド；上記ポリペプチド、これをコードするポリヌクレオチド、上記ポリヌクレオチドを含むベクター、またはこれらの組合せを含む微生物；及びその培養物で構成される群から選択されるいずれか一つ以上を利用するものであってもよいが、これに制限されない。
【0013】
上記スクシネートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、４－ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ、４－ヒドロキシブチリル－ｃｏＡトランスフェラーゼ、及びポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）ポリメラーゼからなる群から選択されるいずれか一つ以上は、外来ポリペプチド、これをコードするポリヌクレオチド、またはこれを含むベクターを含む微生物により強化されたものであってもよいが、これに制限されない。
【0014】
ブドウ糖発酵で直接１，４－ブタンジオールを生産する場合には、１，４－ブタンジオールの微生物に対する毒性により生産性に制約がある。一方、本出願において細胞親和的なポリ－４－ヒドロキシブチレートを優先的に生産するため、本出願の生産方法は、ポリ－４－ヒドロキシブチレート生産性が増加したものであってもよい。また、本出願は、ポリ－４－ヒドロキシブチレート生産段階で遺伝子を導入し、オキサロアセテートを利用した還元型ＴＣＡ経路を活性化；高生産性発酵工程；及び／又は還元型ＴＣＡ経路を通じて発酵で発生する二酸化炭素を再利用してポリ－４－ヒドロキシブチレート生産能が増加したものであってもよい。また、このようなポリ－４－ヒドロキシブチレート生産性の増加により１，４－ブタンジオールの生産性がさらに増加したものであってもよい。
【0015】
本出願の１，４－ブタンジオール生産方法は、ＴＣＡ経路（ＴＣＡ ｃｙｃｌｅ）、還元型ＴＣＡ経路（ｒｅｄｕｃｔｉｖｅ ＴＣＡ ｃｙｃｌｅ）、及びグリオキシレート経路（ｇｌｙｏｘｙｌａｔｅ ｃｙｃｌｅ）からなる群から選択されるいずれか一つ以上の経路をさらに含むことができる。上記経路は、スクシニル－ｃｏＡに変換するものであってもよい。
【0016】
一具現例として、本出願の１，４－ブタンジオール生産方法は、ＴＣＡ経路を含むものであってもよい。そのとき、ブドウ糖の一分子は、解糖過程（ｇｌｙｃｏｌｙｓｉｓ ｐａｔｈｗａｙ）を通じて生産されたピルベートがＴＣＡ経路を経てスクシニル－ｃｏＡに変換される。
【0017】
上記ＴＣＡ経路は、（ａ１）ピルベートをアセチル－ｃｏＡに変換する段階；（ｂ１）アセチル－ｃｏＡ及びオキサロアセテートをシトレートに変換する段階；（ｃ１）シトレートをイソシトレートに変換する段階；（ｄ１）イソシトレートをα－ケトグルタレートに変換する段階；（ｅ１）α－ケトグルタレートをスクシニル－ｃｏＡに変換する段階；及び（ｆ１）ピルベートをオキサロアセテートに変換する段階で構成される群から選択されるいずれか一つ以上を含むこともできる。
【0018】
上記（ｄ１）は、イソシトレートからα－ケトグルタレート及び二酸化炭素に変換される段階であってもよく、上記（ｅ１）は、α－ケトグルタレートからスクシニル－ｃｏＡ及び二酸化炭素に変換される段階であってもよい。
【0019】
一具現例として、上記（ａ１）～（ｆ１）は、それぞれピルベートデヒドロゲナーゼ（ｐｙｒｕｖａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）、シトレートシンターゼ（ｃｉｔｒａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ）、アコニターゼ（ａｃｏｎｉｔａｓｅ）、イソシトレートデヒドロゲナーゼ（ｉｓｏｃｉｔｒａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）、α－ケトグルタレートデヒドロゲナーゼ（α－ｋｅｔｏｇｌｕｔａｒａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）、及びピルベートカルボキシラーゼ（ｐｙｒｕｖａｔｅ ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ）からなる群から選択されるいずれか一つ以上のポリペプチド；上記ポリペプチド、これをコードするポリヌクレオチド、上記ポリヌクレオチドを含むベクター、またはこれらの組合せを含む微生物；及びその培養物で構成される群から選択されるいずれか一つ以上を利用するものであってもよいが、これに制限されない。
【0020】
上記生産方法は、（ｇ１）ホスホエノールピルベートをオキサロアセテートに変換する段階をさらに含むものであってもよいが、これに制限されない。
【0021】
一具現例として、上記（ｇ１）は、ホスホエノールピルベートカルボキシラーゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｅｎｏｌｐｙｒｕｖａｔｅ ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ）ポリペプチド；上記ポリペプチド、これをコードするポリヌクレオチド、上記ポリヌクレオチドを含むベクター、またはこれらの組合せを含む微生物；及びその培養物で構成される群から選択されるいずれか一つ以上を利用するものであってもよいが、これに制限されない。
【0022】
一具現例として、本出願の生産方法は、窒素、硫黄、リン、及びマグネシウムで構成される群から選択される一つ以上の制限条件においてホスホエノールピルベートカルボキシラーゼ遺伝子（ｐｐｃ）の転写が阻害を受けないものであってもよいが、これに制限されない。
【0023】
一具現例として、本出願の生産方法は、窒素、リン、硫黄、及びマグネシウムで構成される群から選択されるいずれか一つ以上を制限させる段階を含むものであってもよいが、これに制限されない。
【0024】
一具現例として、本出願の生産方法は、窒素、リン、硫黄、及びマグネシウムで構成される群から選択されるいずれか一つ以上が制限させる段階を含めても、上記制限させる段階を含まない方法に比べてポリ－４－ヒドロキシブチレート及び／又は１，４－ブタンジオールが生産が減少しないものであってもよいが、これに制限されない。
【0025】
一具現例として、上記転写は、プロモーターにより阻害を受けないものであってもよいが、これに制限されない。上記プロモーターは、プロモーター活性を有する配列番号４５で示されるポリヌクレオチドであってもよく、上記プロモーター活性を有する配列番号４５で示されるヌクレオチド配列の目的遺伝子は、ホスホエノールピルベートカルボキシラーゼをコードするポリヌクレオチドであってもよい。窒素制限の条件でｐｐｃの転写が阻害を受けないプロモーターを用いる場合、ｒＴＣＡ経路が強化され、ポリ－４－ヒドロキシブチレート及び／又は１，４－ブタンジオールの生産が増加され得る。窒素制限の条件でホスホエノールピルベートカルボキシラーゼ遺伝子（ｐｐｃ）の転写が阻害を受けないながら野生型ｐｐｃプロモーターと同等以上の活性を有するプロモーターを用いる場合、ポリ－４－ヒドロキシブチレート及び／又は１，４－ブタンジオールの生産に効果的である。
【0026】
一具現例として、上記生産方法は、（ｇ１）段階が強化されたものであってもよいが、これに制限されない。
【0027】
一具現例として、本出願の１，４－ブタンジオール生産方法は、還元型ＴＣＡ経路を含むものであってもよい。上記還元型ＴＣＡ経路を通じてオキサロアセテートは、酸化的ＴＣＡ経路に含まれた脱カルボキシル化（ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｔｉｏｎ）過程を経ないため、付加的な二酸化炭素発生なしにマレート（ｍａｌａｔｅ）、フマレート（ｆｕｍａｒａｔｅ）、及びスクシネート（ｓｕｃｃｉｎａｔｅ）を経てスクシニル－ｃｏＡに変換される。
【0028】
上記還元型ＴＣＡ経路は、（ａ２）オキサロアセテートをマレートに変換する段階；（ｂ２）マレートをフマレートに変換する段階；（ｃ２）フマレートをスクシネートに変換する段階；及び（ｄ２）スクシネートをスクシニル－ｃｏＡに変換する段階からなる群から選択されるいずれか一つ以上を含むものであってもよいが、これに制限されない。
【0029】
本出願の生産方法は、上記還元型ＴＣＡ経路に先立ち、（ｅ２）ホスホエノールピルベートをオキサロアセテートに変換する段階がさらに含まれたものであってもよい。上記（ｅ２）は、上記（ｇ１）と同様であってもよい。
【0030】
一具現例として、本出願の生産方法は、還元型ＴＣＡ経路が強化されたものであってもよく、上記還元型ＴＣＡ経路強化は、（ｅ２）ホスホエノールピルベートをオキサロアセテートに変換する段階の強化を含んでもよいが、これに制限されない。
【0031】
一具現例として、上記還元型ＴＣＡ経路は、下記（Ｉ）～（ＸＩＩ）からなる群から選択されるいずれか一つ以上により強化されたものであってもよいが、これに制限されない：
（Ｉ）ピルビン酸キナーゼ（ｐｙｒｕｖａｔｅ ｋｉｎａｓｅ）弱化；（ＩＩ）ホスホエノールピルベートカルボキシラーゼ（ＰＥＰ ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ）強化；（ＩＩＩ）カルボニックアンヒドラーゼ（ｃａｒｂｏｎｉｃ ａｎｈｙｄｒａｓｅ）強化；（ＩＶ）シトレートシンターゼ（ｃｉｔｒａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ）調節；（Ｖ）ピルベートカルボキシラーゼ（ｐｙｒｕｖａｔｅ ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ）強化；（ＶＩ）ＮＡＤ＋依存性マレートデヒドロゲナーゼ（ＮＡＤ＋－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｍａｌａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）弱化；（ＶＩＩ）ＮＡＤＰ＋依存性マレートデヒドロゲナーゼ（ＮＡＤＰ＋－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｍａｌａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）弱化；（ＶＩＩＩ）ホスホグルコン酸デヒドラターゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｕｃｏｎａｔｅ ｄｅｈｙｄｒａｔａｓｅ）弱化；（ＩＸ）２－ケト－４－ヒドロキシグルタレート：２－ケト－３－デオキシグルコネート６－ホスフェートアルドラーゼ（２－ｋｅｔｏ－４－ｈｙｄｒｏｘｙｇｌｕｔａｒａｔｅ：２－ｋｅｔｏ－３－ｄｅｏｘｙｇｌｕｃｏｎａｔｅ ６－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ａｌｄｏｌａｓｅ；ＫＨＧ／ＫＤＰＧ ａｌｄｏｌａｓｅ）弱化；（Ｘ）アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ａｓｐａｒｔａｔｅ ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）弱化；（ＸＩ）グルコース特異的ＰＴＳ酵素ＩＩＢＣコンポーネント（ｇｌｕｃｏｓｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＰＴＳ ｅｎｚｙｍｅ ＩＩＢＣ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）弱化；及び（ＸＩＩ）重炭酸塩トランスポーター（ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ）強化。
（Ｉ）ピルビン酸キナーゼ（ｐｙｒｕｖａｔｅ ｋｉｎａｓｅ）弱化；（ＩＩ）ホスホエノールピルベートカルボキシラーゼ（ＰＥＰ ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ）強化；（ＩＩＩ）カルボニックアンヒドラーゼ（ｃａｒｂｏｎｉｃ ａｎｈｙｄｒａｓｅ）強化；（ＩＶ）シトレートシンターゼ（ｃｉｔｒａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ）調節；（Ｖ）ピルベートカルボキシラーゼ（ｐｙｒｕｖａｔｅ ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ）強化；（ＶＩ）ＮＡＤ＋依存性マレートデヒドロゲナーゼ（ＮＡＤ＋－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｍａｌａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）弱化；（ＶＩＩ）ＮＡＤＰ＋依存性マレートデヒドロゲナーゼ（ＮＡＤＰ＋－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｍａｌａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）弱化；（ＶＩＩＩ）ホスホグルコン酸デヒドラターゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｕｃｏｎａｔｅ ｄｅｈｙｄｒａｔａｓｅ）弱化；（ＩＸ）２－ケト－４－ヒドロキシグルタレート：２－ケト－３－デオキシグルコネート６－ホスフェートアルドラーゼ（２－ｋｅｔｏ－４－ｈｙｄｒｏｘｙｇｌｕｔａｒａｔｅ：２－ｋｅｔｏ－３－ｄｅｏｘｙｇｌｕｃｏｎａｔｅ ６－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ａｌｄｏｌａｓｅ；ＫＨＧ／ＫＤＰＧ ａｌｄｏｌａｓｅ）弱化；（Ｘ）アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ａｓｐａｒｔａｔｅ ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）弱化；（ＸＩ）グルコース特異的ＰＴＳ酵素ＩＩＢＣコンポーネント（ｇｌｕｃｏｓｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＰＴＳ ｅｎｚｙｍｅ ＩＩＢＣ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）弱化；及び（ＸＩＩ）重炭酸塩トランスポーター（ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ）強化。
【0032】
一具現例として、上記ホスホエノールピルベートをオキサロアセテートに変換する段階は、ピルビン酸キナーゼ弱化及びカルボニックアンヒドラーゼ強化；ピルビン酸キナーゼ弱化及びホスホエノールピルベートカルボキシラーゼ強化；シトレートシンターゼ調節及びホスホエノールピルベートカルボキシラーゼ強化；シトレートシンターゼ調節及びカルボニックアンヒドラーゼ強化；及びピルビン酸キナーゼ弱化、ホスホエノールピルベートカルボキシラーゼ強化、及びピルベートカルボキシラーゼ強化により強化されたものであってもよく、選択的に、カルボニックアンヒドラーゼ強化、ＮＡＤ＋依存性マレートデヒドロゲナーゼ弱化、ＮＡＤＰ＋依存性マレートデヒドロゲナーゼ弱化、ホスホグルコン酸デヒドラターゼ弱化、ＫＨＧ／ＫＤＰＧアルドラーゼ弱化、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ弱化、グルコース特異的ＰＴＳ酵素ＩＩＢＣコンポーネント弱化；及び／又は重炭酸塩トランスポーター強化で構成される群から選択されるいずれか一つ以上により強化されたものであってもよいが、これに制限されない。
【0033】
一具現例として、上記還元型ＴＣＡ経路は、（ＩＩ）ホスホエノールピルベートカルボキシラーゼ強化；（ＶＩ）ＮＡＤ＋依存性マレートデヒドロゲナーゼ弱化；
（ＶＩＩ）ＮＡＤＰ＋依存性マレートデヒドロゲナーゼ弱化；及び／又は
（Ｘ）アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ弱化を含むこともできる。
（ＶＩＩ）ＮＡＤＰ＋依存性マレートデヒドロゲナーゼ弱化；及び／又は
（Ｘ）アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ弱化を含むこともできる。
【0034】
一具現例として、上記還元型ＴＣＡ経路は、（ＩＩ）ホスホエノールピルベートカルボキシラーゼが強化されたものであってもよい。
【0035】
一具現例として、上記還元型ＴＣＡ経路は、（ＶＩ）ＮＡＤ＋依存性マレートデヒドロゲナーゼ及び（ＶＩＩ）ＮＡＤＰ＋依存性マレートデヒドロゲナーゼが弱化されたものであってもよい。
【0036】
一具現例として、上記還元型ＴＣＡ経路は、（Ｘ）アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼが弱化されたものであってもよい。
【0037】
一具現例として、本出願のｒＴＣＡ経路を通じて発酵で発生する二酸化炭素を再利用してポリ－４－ヒドロキシブチレート及び／又は１，４－ブタンジオール生産収率を増加させるものであってもよい。
【0038】
一具現例として、本出願の１，４－ブタンジオール生産方法は、グリオキシレート経路を含むものであってもよい。
【0039】
上記グリオキシレート経路は、（ａ３）イソシトレートをグリオキシレート（ｇｌｙｏｘｙｌａｔｅ）及びスクシネート（ｓｕｃｃｉｎａｔｅ）に変換する段階；（ｂ３）グリオキシレート（ｇｌｙｏｘｙｌａｔｅ）及びアセチル－ｃｏＡをマレート及びｃｏＡに変換する段階；（ｃ３）シトレートをイソシトレートに変換する段階；（ｄ３）ピルベートをオキサロアセテートに変換する段階；（ｅ３）ホスホエノールピルベートをオキサロアセテートに変換する段階；（ｆ３）オキサロアセテート及びアセチル－ｃｏＡをシトレートに変換する段階；（ｇ３）マレートをフマレートに変換する段階；（ｈ３）フマレートをスクシネートに変換する段階；及び（ｉ３）スクシネートをスクシニル－ｃｏＡに変換する段階で構成される群からいずれか一つ以上をさらに含むものであってもよいが、これに制限されない。上記（ｆ３）は（ｂ１）と、上記（ｇ３）は（ｂ２）と、上記（ｈ３）は（ｃ２）と、上記（ｉ３）は上記（ｄ２）と同様であってもよい。
【0040】
一具現例として、上記グリオキシレート経路は、（ｉ）シトレートシンターゼ（ｃｉｔｒａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ）強化；（ｉｉ）イソシトレートデヒドロゲナーゼ（ｉｓｏｃｉｔｒａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）弱化；（ｉｉｉ）イソシトレートリアーゼ（ｉｓｏｃｉｔｒａｔｅ ｌｙａｓｅ）強化；（ｉｖ）イソシトレートデヒドロゲナーゼキナーゼ／ホスファターゼ（Ｉｓｏｃｉｔｒａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ｋｉｎａｓｅ／ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）強化；（ｖ）マレートシンターゼＧ（ｍａｌａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ Ｇ）強化；及び（ｖｉ）マレートシンターゼＡ（ｍａｌａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ Ａ）強化からなる群から選択されるいずれか一つ以上によるものであってもよいが、これに制限されない。
【0041】
一具現例として、上記グリオキシレート経路を含む本出願の方法は、（ｊ３）α－ケトグルタレートをスクシニル－ｃｏＡに変換する段階及び／又は（ｋ３）オキサロアセテートをマレートに変換する段階がさらに弱化されたものであってもよいが、これに制限されない。
【0042】
上記グリオキシレート経路の生成物であるスクシネート及びマレートは、いずれも還元型ＴＣＡ経路を利用してスクシニル－ｃｏＡに変換されてもよい。
【0043】
本出願において、「スクシネートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ｓｕｃｃｉｎａｔｅ ｓｅｍｉａｌｄｅｈｙｄｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）」は、スクシニル－ｃｏＡ（ｓｕｃｃｉｎｙｌ－ｃｏＡ；ＳｕＣｏＡ）がスクシネートセミアルデヒド（ｓｕｃｃｉｎａｔｅ ｓｅｍｉａｌｄｅｈｙｄｅ；ＳＳＡ）に変換される反応を触媒できる酵素である。上記スクシネートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼは、ＳｕｃＤと混用され得る。
【0044】
一具現例として、本出願のＳｕｃＤタンパク質は、クロストリジウム・クライベリ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ Ｋｌｕｙｖｅｒｉ）由来であってもよく、これと同一の配列または活性を有する限りＳｕｃＤに含まれる。一具現例として、本出願のＳｕｃＤタンパク質は、配列番号１またはこれと８０％以上の相同性または同一性を有するアミノ酸配列を含んだり、有したり、からなったり、または必須に上記アミノ酸配列から成る（ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）ものであってもよい。
【0045】
本出願において、スクシネートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子は、ｓｕｃＤ、スクシネートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードするポリヌクレオチドなどと混用され得る。上記ｓｕｃＤ遺伝子は、例えば、配列番号２の塩基配列を含んでもよく、これと相同性または同一性が８０％以上である塩基配列からなってもよいが、これに制限されない。
【0046】
本出願において、「４－ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ（４－ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒｉｃ ａｃｉｄ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）」は、スクシネートセミアルデヒド（ｓｕｃｃｉｎａｔｅ ｓｅｍｉａｌｄｅｈｙｄｅ；ＳＳＡ）が４－ヒドロキシブチレート（４－ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒａｔｅ；４ＨＢ）に変換される反応を触媒できる酵素である。上記４－ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼは、スクシネートセミアルデヒドレダクターゼ（ｓｕｃｃｉｎａｔｅ ｓｅｍｉａｌｄｅｈｙｄｅ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）及び４ＨｂＤと混用され得る。
【0047】
一具現例として、本出願の４ＨｂＤタンパク質は、アラビドプシス・サリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）由来であってもよく、これと同一の配列または活性を有する限り４ＨｂＤに含まれる。一具現例として、本出願の４ＨｂＤタンパク質は、配列番号３またはこれと８０％以上の相同性または同一性を有するアミノ酸配列を含んだり、有したり、からなったり、または必須に上記アミノ酸配列から成る（ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）ものであってもよい。
【0048】
本出願において、４－ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ遺伝子は４ｈｂＤ、４－ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼをコードするポリヌクレオチドなどと混用され得る。上記４ｈｂＤ遺伝子は、例えば、配列番号４の塩基配列を含んでもよく、これと相同性または同一性が８０％以上である塩基配列からなってもよいが、これに制限されない。
【0049】
本出願において、「４－ヒドロキシブチリル－ｃｏＡトランスフェラーゼ（４－ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒｙｌ－ＣｏＡ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）」は、４－ヒドロキシブチレート（４－ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒａｔｅ；４ＨＢ）が４－ヒドロキシブチリルｃｏＡ（４－ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒｙｌ ｃｏＡ；４ＨＢＣｏＡ）に変換される反応を触媒できる酵素である。上記４－ヒドロキシブチリル－ｃｏＡトランスフェラーゼはＯｒｆＺと混用され得る。
【0050】
一具現例として、本出願のＯｒｆＺタンパク質は、クロストリジウム・クライベリ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ Ｋｌｕｙｖｅｒｉ）由来であってもよく、これと同一の配列または活性を有する限りＯｒｆＺに含まれる。一具現例として、本出願のＯｒｆＺタンパク質は、配列番号５またはこれと８０％以上の相同性または同一性を有するアミノ酸配列を含んだり、有したり、からなったり、または必須に上記アミノ酸配列から成る（ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）ものであってもよい。
【0051】
本出願において、４－ヒドロキシブチリル－ｃｏＡトランスフェラーゼ遺伝子は、ｏｒｆＺ、４－ヒドロキシブチリル－ｃｏＡトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチドなどと混用され得る。上記ｏｒｆＺ遺伝子は、例えば、配列番号６の塩基配列を含めてもよく、これと相同性または同一性が８０％以上である塩基配列からなってもよいが、これに制限されない。
【0052】
一具現例として、上記ＳｕｃＤ、４ＨｂＤ、及び／又はＯｒｆＺのアミノ酸及び遺伝子配列はＵＳ ９０８４４６７ Ｂ２から得ることができるが、これに制限されない。
【0053】
本出願において、「ポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）ポリメラーゼ（Ｐｏｌｙ（３－ｈｙｄｒｏｘｙａｌｋａｎｏａｔｅ） ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）」は、二つ以上の４－ヒドロキシブチリルｃｏＡ（４－ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒｙｌ ｃｏＡ；４ＨＢＣｏＡ）をポリ－４－ヒドロキシブチレート（ｐｏｌｙ－４－ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒａｔｅ；Ｐ４ＨＢ）で重合する反応を触媒できる酵素である。上記ポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）ポリメラーゼはＰｈａＣと混用され得る。
【0054】
一具現例として、本出願のＰｈａＣタンパク質は多様な微生物由来であってもよく、具体的には、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）またはルストニア・ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ）由来であってもよく、これら由来の融合タンパク質であってもよく、これと同一の配列または活性を有する限りＰｈａＣに含まれる。
【0055】
一具現例として、本出願のＰｈａＣタンパク質は、配列番号７またはこれと８０％以上の相同性または同一性を有するアミノ酸配列を含んだり、有したり、からなったり、または必須に上記アミノ酸配列から成る（ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）ものであってもよい。
【0056】
一具現例として、上記ＰｈａＣのアミノ酸配列及び遺伝子配列は、ＷＯ ２０１４０５８６５５ Ａ１から得ることができるが、これに制限されない。
【0057】
本出願において、ポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）ポリメラーゼ遺伝子は、ｐｈａＣ、ポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）ポリメラーゼをコードするポリヌクレオチドなどと混用され得る。上記ｐｈａＣ遺伝子は、例えば、配列番号８の塩基配列を含めてもよく、これと相同性または同一性が８０％以上である塩基配列からなってもよいが、これに制限されない。
【0058】
本出願において、ピルベートデヒドロゲナーゼ（ｐｙｒｕｖａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）はピルベートがアセチル－ｃｏＡに変換される反応を触媒できる酵素；シトレートシンターゼ（ｃｉｔｒａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ）はオキサロアセテート及びアセチル－ｃｏＡを縮合してシトレートを生成する反応を触媒できる酵素；アコニターゼ（ａｃｏｎｉｔａｓｅ）はシトレートがイソシトレートに変換される反応を触媒できる酵素；イソシトレートデヒドロゲナーゼ（ｉｓｏｃｉｔｒａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）はイソシトレートがα－ケトグルタレートに変換される反応を触媒できる酵素；α－ケトグルタレートデヒドロゲナーゼ（α－ｋｅｔｏｇｌｕｔａｒａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）はα－ケトグルタレートがスクシニル－ｃｏＡに変換される反応を触媒できる酵素；スクシニル－ｃｏＡシンテターゼ（ｓｕｃｃｉｎｙｌ－ｃｏＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ）はスクシニル－ｃｏＡがスクシネートに変換される反応を触媒できる酵素；及びピルベートカルボキシラーゼ（ｐｙｒｕｖａｔｅ ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ）はピルベートがオキサロアセテートに変換される反応を触媒できる酵素を意味する。
【0059】
上記ピルベートデヒドロゲナーゼないしピルベートカルボキシラーゼはＴＣＡ経路に含まれる酵素であってもよく、微生物または生産方法に内在的なものであってもよく、または野生型酵素に比べて強化されたものであってもよい。
【0060】
本出願において、「ピルビン酸キナーゼ（ｐｙｒｕｖａｔｅ ｋｉｎａｓｅ）」は、ホスホエノールピルベート（ｐｈｏｓｐｈｏｅｎｏｌｐｙｒｕｖａｔｅ；ＰＥＰ）がピルベートに変換される反応を触媒できる酵素である。上記ピルビン酸キナーゼはＰｙｋと混用され得る。
【0061】
一具現例として、本出願のＰｙｋタンパク質は、内在的であるか、エシェリキア属、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）由来であってもよく、これと同一の配列または活性を有する限りＰｙｋに含まれる。
【0062】
一具現例として、本出願のＰｙｋタンパク質は、弱化されたものであってもよく、これと同一の配列または活性を有する限りＰｙｋに含まれる。一具現例として、本出願のＰｙｋタンパク質は、配列番号９、配列番号１１またはこれと８０％以上の相同性または同一性を有するアミノ酸配列を含んだり、有したり、からなったり、または必須に上記アミノ酸配列から成る（ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）ものであってもよい。
【0063】
本出願において、ピルビン酸キナーゼ遺伝子は、ｐｙｋＡ、ｐｙｋＦ、及びピルビン酸キナーゼをコードするポリヌクレオチドなどと混用され得る。上記ｐｙｋＡ、ｐｙｋＦ遺伝子は、例えば、配列番号１０または配列番号１２の塩基配列を含んでもよく、これと相同性または同一性が８０％以上である塩基配列からなってもよいが、これに制限されない。
【0064】
本出願において、「ホスホエノールピルベートカルボキシラーゼ（ＰＥＰ ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ）」はホスホエノールピルベートがオキサロアセテートに変換される反応を触媒する酵素である。上記ホスホエノールピルベートカルボキシラーゼはＰＰＣと混用され得る。
【0065】
一具現例として、本出願のＰＰＣタンパク質は、内在的であるか、エシェリキア属、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）由来であってもよく、これと同一の配列または活性を有する限りＰＰＣに含まれる。
【0066】
一具現例として、本出願のＰＰＣタンパク質は、強化されたものであってもよく、これと同一の配列または活性を有する限りＰＰＣに含まれる。一具現例として、本出願のＰＰＣタンパク質は、配列番号１３またはこれと８０％以上の相同性または同一性を有するアミノ酸配列を含んだり、有したり、からなったり、または必須に上記アミノ酸配列から成る（ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）ものであってもよい。
【0067】
本出願において、ホスホエノールピルベートカルボキシラーゼ遺伝子は、ｐｐｃ及びホスホエノールピルベートカルボキシラーゼをコードするポリヌクレオチドなどと混用され得る。上記ｐｐｃ遺伝子は、例えば、配列番号１４の塩基配列を含んでもよく、これと相同性または同一性が８０％以上である塩基配列からなってもよいが、これに制限されない。
【0068】
一具現例として、本出願の微生物は、窒素（ｎｉｔｒｏｇｅｎ）、硫黄（ｓｕｌｆｕｒ）、リン（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｕｓ）、及びマグネシウム（ｍａｇｎｅｓｉｕｍ）で構成される群から選択されるいずれか一つ以上の栄養素制限の条件でもポリ－４－ヒドロキシブチレート生産能があり、特に、その増加した生産能を有するものであってもよいが、これに制限されない。
【0069】
一具現例として、本出願の微生物は、窒素（ｎｉｔｒｏｇｅｎ）、硫黄（ｓｕｌｆｕｒ）、リン（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｕｓ）、及び／又はマグネシウム（ｍａｇｎｅｓｉｕｍ）制限の条件でホスホエノールピルベートカルボキシラーゼ遺伝子（ｐｐｃ）の転写が阻害を受けないプロモーターをさらに含むものであってもよい。上記プロモーターは、プロモーター活性を有する配列番号４５で示されるポリヌクレオチドであってもよく、上記プロモーター活性を有する配列番号４５で示されるヌクレオチド配列の目的遺伝子は、ホスホエノールピルベートカルボキシラーゼをコードするポリヌクレオチドであってもよい。窒素制限の条件でｐｐｃの転写が阻害を受けないプロモーターを用いる場合、ポリ－４－ヒドロキシブチレート及び／又は１，４－ブタンジオールの生産を増加することができる。既存の大腸菌のｐｐｃ発現は、窒素制限の条件で阻害を受けるが、微生物は、窒素制限の条件でホスホエノールピルベートカルボキシラーゼ遺伝子（ｐｐｃ）の転写が阻害を受けないながら野生型ｐｐｃプロモーターと同等以上の活性を有するプロモーターを用いる場合、ポリ－４－ヒドロキシブチレート及び／又は１，４－ブタンジオールの生産に効果的である。
【0070】
本出願において、「カルボニックアンヒドラーゼ（ｃａｒｂｏｎｉｃ ａｎｈｙｄｒａｓｅ）」は、ヒドロゲンカルボネート（ｈｙｄｒｏｇｅｎｃａｒｂｏｎａｔｅ）を二酸化炭素及び水に変換することを触媒できる酵素である。上記カルボニックアンヒドラーゼは、ホスホエノールピルベートカルボキシラーゼの補助役割をする酵素であってもよく、ＰＰＣの円滑な性能発揮のためには、重炭酸塩（Ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ；ＨＣＯ３－）の供給が必要であるが、カルボニックアンヒドラーゼは、二酸化炭素からＨＣＯ３－を生産できる酵素であってもよい。上記カルボニックアンヒドラーゼはＥｃａＡと混用され得る。
【0071】
一具現例として、本出願のＥｃａＡタンパク質は、ノストック属（Ｎｏｓｔｏｃ ｓｐ．）由来であってもよく、これと同一の配列または活性を有する限りＥｃａＡに含まれる。
【0072】
一具現例として、本出願のＥｃａＡタンパク質は、強化されたものであってもよく、これと同一の配列または活性を有する限りＥｃａＡに含まれる。一具現例として、本出願のＥｃａＡタンパク質は、配列番号１５またはこれと８０％以上の相同性または同一性を有するアミノ酸配列を含んだり、有したり、からなったり、または必須に上記アミノ酸配列から成る（ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）ものであってもよい。
【0073】
本出願において、カルボニックアンヒドラーゼ遺伝子は、ｅｃａＡ及びカルボニックアンヒドラーゼをコードするポリヌクレオチドなどと混用され得る。上記ｅｃａＡ遺伝子は、例えば、配列番号１６の塩基配列を含んでもよく、これと相同性または同一性が８０％以上である塩基配列からなってもよいが、これに制限されない。
【0074】
本出願において、「シトレートシンターゼ（ｃｉｔｒａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ）」オキサロアセテート及びアセチル－ｃｏＡを縮合してシトレートを生成する反応を触媒できる酵素である。上記シトレートシンターゼはＧｌｔＡと混用され得る。
【0075】
一具現例として、本出願のＧｌｔＡタンパク質は、内在的であるか、エシェリキア属、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）由来であってもよく、これと同一の配列または活性を有する限りＧｌｔＡに含まれる。
【0076】
一具現例として、本出願のＧｌｔＡタンパク質は調節されたものであってもよく、これと同一の配列または活性を有する限りＧｌｔＡに含まれる。一具現例として、本出願のＧｌｔＡタンパク質は、配列番号１７またはこれと８０％以上の相同性または同一性を有するアミノ酸配列を含んだり、有したり、からなったり、または必須に上記アミノ酸配列から成る（ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）ものであってもよい。
【0077】
本出願において、シトレートシンターゼ遺伝子はｇｌｔＡ及びシトレートシンターゼをコードするポリヌクレオチドなどと混用され得る。上記ｇｌｔＡ遺伝子は、例えば、配列番号１８の塩基配列を含めてもよく、これと相同性または同一性が８０％以上である塩基配列からなってもよいが、これに制限されない。
【0078】
本出願において、「ピルベートカルボキシラーゼ（ｐｙｒｕｖａｔｅ ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ）」は、ピルベートと二酸化炭素がオキサロアセテートに変換される反応を触媒できる酵素である。上記ピルベートカルボキシラーゼはＰｙｃと混用され得る。
【0079】
一具現例として、本出願のＰｙｃタンパク質は、リゾビウム・エトリ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｅｔｌｉ）由来であってもよく、これと同一の配列または活性を有する限りＰｙｃに含まれる。
【0080】
一具現例として、本出願のＰｙｃタンパク質は、強化されたものであってもよく、外来であってもよく、これと同一の配列または活性を有する限りＰｙｃに含まれる。一具現例として、本出願のＰｙｃタンパク質は、配列番号１９またはこれと８０％以上の相同性または同一性を有するアミノ酸配列を含んだり、有したり、からなったり、または必須に上記アミノ酸配列から成る（ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）ものであってもよい。
【0081】
本出願において、ピルベートカルボキシラーゼ遺伝子は、ｐｙｃ及びピルベートカルボキシラーゼをコードするポリヌクレオチドなどと混用され得る。上記ｐｙｃ遺伝子は、例えば、配列番号２０の塩基配列を含めてもよく、これと相同性または同一性が８０％以上である塩基配列からなってもよいが、これに制限されない。
【0082】
本出願において、「ＮＡＤ＋依存性マレートデヒドロゲナーゼ（ＮＡＤ＋－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｍａｌａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）」は、マレートをピルベートに変換する反応を触媒できる酵素である。上記ＮＡＤ＋依存性マレートデヒドロゲナーゼはＭａｅＡと混用され得る。
【0083】
一具現例として、本出願のＭａｅＡタンパク質は、内在的であるか、エシェリキア属、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）由来であってもよく、これと同一の配列または活性を有する限りＭａｅＡに含まれる。
【0084】
一具現例として、本出願のＭａｅＡタンパク質は、弱化されたものであってもよく、これと同一の配列または活性を有する限りＭａｅＡに含まれる。一具現例として、本出願のＭａｅＡタンパク質は、配列番号２１またはこれと８０％以上の相同性または同一性を有するアミノ酸配列を含んだり、有したり、からなったり、または必須に上記アミノ酸配列から成る（ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）ものであってもよい。
【0085】
本出願において、ＮＡＤ＋依存性マレートデヒドロゲナーゼ遺伝子は、ｍａｅＡ及びＮＡＤ＋依存性マレートデヒドロゲナーゼをコードするポリヌクレオチドなどと混用され得る。上記ｍａｅＡ遺伝子は、例えば、配列番号２２の塩基配列を含んでもよく、これと相同性または同一性が８０％以上である塩基配列からなってもよいが、これに制限されない。
【0086】
本出願において、「ＮＡＤＰ＋依存性マレートデヒドロゲナーゼ（ＮＡＤＰ＋－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｍａｌａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）」は、マレートをピルベートに変換する反応を触媒できる酵素である。上記ＮＡＤＰ＋依存性マレートデヒドロゲナーゼはＭａｅＢと混用され得る。
【0087】
一具現例として、本出願のＭａｅＢタンパク質は、内在的であるか、エシェリキア属、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）由来であってもよく、これと同一の配列または活性を有する限りＭａｅＢに含まれる。
【0088】
一具現例として、本出願のＭａｅＢタンパク質は、弱化されたものであってもよく、これと同一の配列または活性を有する限りＭａｅＢに含まれる。一具現例として、本出願のＭａｅＢタンパク質は、配列番号２３またはこれと８０％以上の相同性または同一性を有するアミノ酸配列を含んだり、有したり、からなったり、または必須に上記アミノ酸配列から成る（ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）ものであってもよい。
【0089】
本出願において、ＮＡＤＰ＋依存性マレートデヒドロゲナーゼ遺伝子は、ｍａｅＢ及びＮＡＤＰ＋依存性マレートデヒドロゲナーゼをコードするポリヌクレオチドなどと混用され得る。上記ｍａｅＢ遺伝子は、例えば、配列番号２４の塩基配列を含んでもよく、これと相同性または同一性が８０％以上である塩基配列からなってもよいが、これに制限されない。
【0090】
本出願において、「ホスホグルコン酸デヒドラターゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｕｃｏｎａｔｅ ｄｅｈｙｄｒａｔａｓｅ」は、６－ホスホ－Ｄ－グルコネート（６－ｐｈｏｓｐｈｏ－Ｄ－ｇｌｕｃｏｎａｔｅ）が２－デヒドロ－３－デオキシ－６－ホスホ－Ｄ－グルコネート（２－ｄｅｈｙｄｒｏ－３－ｄｅｏｘｙ－６－ｐｈｏｓｐｈｏ－Ｄ－ｇｌｕｃｏｎａｔｅ）に変換される反応を触媒できる酵素である。上記ホスホグルコン酸デヒドラターゼはＥＤＤと混用され得る。
【0091】
一具現例として、本出願のＥＤＤタンパク質は、内在的であるか、エシェリキア属、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）由来であってもよく、これと同一の配列または活性を有する限りＥＤＤに含まれる。
【0092】
一具現例として、本出願のＥＤＤタンパク質は、弱化されたものであってもよく、これと同一の配列または活性を有する限りＥＤＤに含まれる。一具現例として、本出願のＥＤＤタンパク質は、配列番号２５またはこれと８０％以上の相同性または同一性を有するアミノ酸配列を含んだり、有したり、からなったり、または必須に上記アミノ酸配列から成る（ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）ものであってもよい。
【0093】
本出願において、ホスホグルコン酸デヒドラターゼ遺伝子は、ｅｄｄ及びホスホグルコン酸デヒドラターゼをコードするポリヌクレオチドなどと混用され得る。上記ｅｄｄ遺伝子は、例えば、配列番号２６の塩基配列を含んでもよく、これと相同性または同一性が８０％以上である塩基配列からなってもよいが、これに制限されない。
【0094】
本出願において、「２－ケト－４－ヒドロキシグルタレート：２－ケト－３－デオキシグルコネート６－ホスフェートアルドラーゼ（２－ｋｅｔｏ－４－ｈｙｄｒｏｘｙｇｌｕｔａｒａｔｅ：２－ｋｅｔｏ－３－ｄｅｏｘｙｇｌｕｃｏｎａｔｅ ６－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ａｌｄｏｌａｓｅ；ＫＨＧ／ＫＤＰＧ ａｌｄｏｌａｓｅ）」は、４－ヒドロキシ－２－オキソグルタレートをグリセルアルデヒド－３－ホスフェート及びピルベートへの変換を触媒できる酵素である。上記ホスホグルコン酸デヒドラターゼはＫＨＧ／ＫＤＰＧアルドラーゼ、Ｅｄａと混用され得る。
【0095】
一具現例として、本出願のＥｄａタンパク質は、内在的であるか、エシェリキア属、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）由来であってもよく、これと同一の配列または活性を有する限りＥｄａに含まれる。
【0096】
一具現例として、本出願のＥｄａタンパク質は、弱化されたものであってもよく、これと同一の配列または活性を有する限りＥｄａに含まれる。一具現例として、本出願のＥｄａタンパク質は、配列番号２７またはこれと８０％以上の相同性または同一性を有するアミノ酸配列を含んだり、有したり、からなったり、または必須に上記アミノ酸配列から成る（ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）ものであってもよい。
【0097】
本出願において、ＫＨＧ／ＫＤＰＧアルドラーゼ遺伝子は、ｅｄａ及びＫＨＧ／ＫＤＰＧアルドラーゼをコードするポリヌクレオチドなどと混用され得る。上記ｅｄａ遺伝子は、例えば、配列番号２８の塩基配列を含んでもよく、これと相同性または同一性が８０％以上である塩基配列からなってもよいが、これに制限されない。
【0098】
本出願において、「アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ａｓｐａｒｔａｔｅ ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）」は、２－オキソグルタレート及びアスパラギン酸塩をグルタメート及びオキサロアセテートに変換する反応を触媒できる酵素である。上記アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼはＡｓｐＣと混用され得る。
【0099】
一具現例として、本出願のＡｓｐＣタンパク質は、内在的であるか、エシェリキア属、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）由来であってもよく、これと同一の配列または活性を有する限りＡｓｐＣに含まれる。
【0100】
一具現例として、本出願のＡｓｐＣタンパク質は、弱化されたものであってもよく、これと同一の配列または活性を有する限りＡｓｐＣに含まれる。一具現例として、本出願のＡｓｐＣタンパク質は、配列番号２９またはこれと８０％以上の相同性または同一性を有するアミノ酸配列を含んだり、有したり、からなったり、または必須に上記アミノ酸配列から成る（ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）ものであってもよい。
【0101】
本出願において、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子は、ａｓｐＣ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチドなどと混用され得る。上記ａｓｐＣ遺伝子は、例えば、配列番号３０の塩基配列を含んでもよく、これと相同性または同一性が８０％以上である塩基配列からなってもよいが、これに制限されない。
【0102】
本出願において、「グルコース特異的ＰＴＳ酵素ＩＩＢＣコンポーネント（ｇｌｕｃｏｓｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｈｏｓｐｈｏｅｎｏｌｐｙｒｕｖａｔｅ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｓｕｇａｒ ｐｈｏｓｐｈｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｓｙｓｔｅｍ（ＰＴＳ） ｅｎｚｙｍｅ ＩＩＢＣ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）」は、ブドウ糖の輸送に関与する酵素であるＰＴＳの部分である。一具現例として、上記グルコース特異的ＰＴＳ酵素ＩＩＢＣコンポーネントは、ホスホエノールピルベートｐｏｏｌを増加させ、還元型ＴＣＡ経路を強化させることができる。上記グルコース特異的ＰＴＳ酵素ＩＩＢＣコンポーネントはＩＩＢＣと混用され得る。
【0103】
一具現例として、本出願のＩＩＢＣタンパク質は、内在的であるか、エシェリキア属、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）由来であってもよく、これと同一の配列または活性を有する限りＩＩＢＣに含まれる。
【0104】
一具現例として、本出願のＩＩＢＣタンパク質は、弱化されたものであってもよく、これと同一の配列または活性を有する限りＩＩＢＣに含まれる。一具現例として、本出願のＩＩＢＣタンパク質は、配列番号３１またはこれと８０％以上の相同性または同一性を有するアミノ酸配列を含んだり、有したり、からなったり、または必須に上記アミノ酸配列から成る（ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）ものであってもよい。
【0105】
本出願において、グルコース特異的ＰＴＳ酵素ＩＩＢＣコンポーネント遺伝子は、ｐｔｓＧ、グルコース特異的ＰＴＳ酵素ＩＩＢＣコンポーネントをコードするポリヌクレオチドなどと混用され得る。上記ｐｔｓＧ遺伝子は、例えば、配列番号３２の塩基配列を含めてもよく、これと相同性または同一性が８０％以上である塩基配列からなってもよいが、これに制限されない。
【0106】
本出願において、「重炭酸塩トランスポーター（ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ）」は、重炭酸塩（ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ）を輸送する運搬体であり、二酸化炭素の細胞内流入を増加させる。上記重炭酸塩トランスポーターはＳｂｔＡと混用され得る。
【0107】
一具現例として、本出願のＳｂｔＡタンパク質は、シネコシスティス属（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ．）由来であってもよく、これと同一の配列または活性を有する限りＳｂｔＡに含まれる。
【0108】
一具現例として、本出願のＳｂｔＡタンパク質は、強化されたものであってもよく、外来であってもよく、シアノバクテリア（Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）由来であってもよいが、これと同一の配列または活性を有する限りＳｂｔＡに含まれる。一具現例として、本出願のＳｂｔＡタンパク質は、配列番号３３またはこれと８０％以上の相同性または同一性を有するアミノ酸配列を含んだり、有したり、からなったり、または必須に上記アミノ酸配列から成る（ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）ものであってもよい。
【0109】
本出願において、ＳｂｔＡ遺伝子は、ｓｂｔＡ、重炭酸塩トランスポーターをコードするポリヌクレオチドなどと混用され得る。上記ｓｂｔＡ遺伝子は、例えば、配列番号３４の塩基配列を含んでもよく、これと相同性または同一性が８０％以上である塩基配列からなってもよいが、これに制限されない。
【0110】
本出願において、「イソシトレートデヒドロゲナーゼ（ｉｓｏｃｉｔｒａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）」は、イソシトレートを２－オキソグルタレートに変換する反応を触媒できる酵素である。上記イソシトレートデヒドロゲナーゼはＩｃｄと混用され得る。
【0111】
一具現例として、本出願のＩｃｄタンパク質は、内在的であるか、エシェリキア属、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）由来であってもよく、これと同一の配列または活性を有する限りＩｃｄに含まれる。
【0112】
一具現例として、本出願のＩｃｄタンパク質は、弱化されたものであってもよいが、これと同一の配列または活性を有する限りＩｃｄに含まれる。一具現例として、本出願のＩｃｄタンパク質は、配列番号３５またはこれと８０％以上の相同性または同一性を有するアミノ酸配列を含んだり、有したり、からなったり、または必須に上記アミノ酸配列から成る（ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）ものであってもよい。
【0113】
本出願において、Ｉｃｄ遺伝子は、ｉｃｄ、イソシトレートデヒドロゲナーゼをコードするポリヌクレオチドなどと混用され得る。上記ｉｃｄ遺伝子は、例えば、配列番号３６の塩基配列を含んでもよく、これと相同性または同一性が８０％以上である塩基配列からなってもよいが、これに制限されない。
【0114】
本出願において、「イソシトレートリアーゼ（ｉｓｏｃｉｔｒａｔｅ ｌｙａｓｅ）」は、イソシトレートをグリオキシレート及びスクシネートに変換する反応を触媒できる酵素である。上記イソシトレートリアーゼはＡｃｅＡと混用され得る。
【0115】
一具現例として、本出願のＡｃｅＡタンパク質は、内在的であるか、エシェリキア属、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）由来であってもよく、これと同一の配列または活性を有する限りＡｃｅＡに含まれる。
【0116】
一具現例として、本出願のＡｃｅＡタンパク質は、強化されたものであってもよいが、これと同一の配列または活性を有する限りＡｃｅＡに含まれる。一具現例として、本出願のＡｃｅＡタンパク質は、配列番号３７またはこれと８０％以上の相同性または同一性を有するアミノ酸配列を含んだり、有したり、からなったり、または必須に上記アミノ酸配列から成る（ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）ものであってもよい。
【0117】
本出願において、ＡｃｅＡ遺伝子は、ａｃｅＡ、イソシトレートリアーゼをコードするポリヌクレオチドなどと混用され得る。上記ａｃｅＡ遺伝子は、例えば、配列番号３８の塩基配列を含んでもよく、これと相同性または同一性が８０％以上である塩基配列からなってもよいが、これに制限されない。
【0118】
本出願において、「イソシトレートデヒドロゲナーゼキナーゼ／ホスファターゼ（Ｉｓｏｃｉｔｒａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ｋｉｎａｓｅ／ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）」は、イソシトレートデヒドロゲナーゼをリン酸化または脱リン酸化を触媒できる酵素である。一具現例として、上記イソシトレートデヒドロゲナーゼキナーゼ／ホスファターゼはＩｃｄを弱化させることができる、上記イソシトレートデヒドロゲナーゼキナーゼ／ホスファターゼはＡｃｅＫと混用され得る。
【0119】
一具現例として、本出願のＡｃｅＫタンパク質は、内在的であるか、エシェリキア属、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）由来であってもよく、これと同一の配列または活性を有する限りＡｃｅＫに含まれる。
【0120】
一具現例として、本出願のＡｃｅＫタンパク質は、強化されたものであってもよいが、これと同一の配列または活性を有する限りＡｃｅＫに含まれる。一具現例として、本出願のＡｃｅＫタンパク質は、配列番号３９、またはこれと８０％以上の相同性または同一性を有するアミノ酸配列を含んだり、有したり、からなったり、または必須に上記アミノ酸配列から成る（ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）ものであってもよい。
【0121】
本出願において、ＡｃｅＫ遺伝子は、ａｃｅＫ、イソシトレートデヒドロゲナーゼキナーゼ／ホスファターゼをコードするポリヌクレオチドなどと混用され得る。上記ａｃｅＫ遺伝子は、例えば、配列番号４０の塩基配列を含んでもよく、これと相同性または同一性が８０％以上である塩基配列からなってもよいが、これに制限されない。
【0122】
本出願において、「マレートシンターゼＧ（ｍａｌａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ Ｇ）」は、グリオキシレートとアセチル－ｃｏＡをマレートに変換する反応を触媒できる酵素である。上記マレートシンターゼＧはＧｌｃＢと混用され得る。
【0123】
一具現例として、本出願のＧｌｃＢタンパク質は、内在的であるか、エシェリキア属、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）由来であってもよく、これと同一の配列または活性を有する限りＧｌｃＢに含まれる。
【0124】
一具現例として、本出願のＧｌｃＢタンパク質は、強化されたものであってもよいが、これと同一の配列または活性を有する限りＧｌｃＢに含まれる。一具現例として、本出願のＧｌｃＢタンパク質は、配列番号４１またはこれと８０％以上の相同性または同一性を有するアミノ酸配列を含んだり、有したり、からなったり、または必須に上記アミノ酸配列から成る（ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）ものであってもよい。
【0125】
本出願において、ＧｌｃＢ遺伝子は、ｇｌｃＢ、マレートシンターゼＧをコードするポリヌクレオチドなどと混用され得る。上記ｇｌｃＢ遺伝子は、例えば、配列番号４２の塩基配列を含んでもよく、これと相同性または同一性が８０％以上である塩基配列からなってもよいが、これに制限されない。
【0126】
本出願において、「マレートシンターゼＡ（ｍａｌａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ Ａ）」は、グリオキシレートとアセチル－ｃｏＡをマレートに変換する反応を触媒できる酵素である。上記マレートシンターゼＡはＡｃｅＢと混用され得る。
【0127】
一具現例として、本出願のＡｃｅＢタンパク質は、内在的であるか、エシェリキア属、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）由来であってもよく、これと同一の配列または活性を有する限りＡｃｅＢに含まれる。
【0128】
一具現例として、本出願のＡｃｅＢタンパク質は、強化されたものであってもよいが、これと同一の配列または活性を有する限りＡｃｅＢに含まれる。一具現例として、本出願のＡｃｅＢタンパク質は、配列番号４３またはこれと８０％以上の相同性または同一性を有するアミノ酸配列を含んだり、有したり、からなったり、または必須に上記アミノ酸配列から成る（ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）ものであってもよい。
【0129】
本出願において、ＡｃｅＢ遺伝子は、ａｃｅＢ、マレートシンターゼＡをコードするポリヌクレオチドなどと混用され得る。上記ａｃｅＢ遺伝子は、例えば、配列番号４４の塩基配列を含んでもよく、これと相同性または同一性が８０％以上である塩基配列からなってもよいが、これに制限されない。
【0130】
上記酵素（例えば、ＳｕｃＤなど）のアミノ酸配列は、公知のデータベースであるＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋなど多様なデータベースでその配列を得ることができるが、これに制限されない。
【0131】
本出願において「特定配列番号で記載されたアミノ酸配列を含むポリペプチドまたはタンパク質」、「特定配列番号で記載されたアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはタンパク質」または「特定配列番号で記載されたアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはタンパク質」と記載されていても、当該配列番号のアミノ酸配列からなるポリペプチドと同一あるいは対応する活性を有する場合であれば、一部の配列が欠失、変形、置換、保存的置換または付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質も本出願において用いられることは自明である。例えば、上記アミノ酸配列のＮ末端、内部、そして／またはＣ末端にタンパク質の機能を変更しない配列の追加、自然に発生し得る突然変異、そのサイレント突然変異（ｓｉｌｅｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎ）または保存的置換を有する場合である。
【0132】
具体的には、本出願のタンパク質は、特定配列番号のアミノ酸配列を含んだり、または特定配列番号のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の相同性または同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。また、上記相同性または同一性を有し、上記タンパク質に対応する効能を示すアミノ酸配列であれば、一部の配列が欠失、変形、置換または付加されたアミノ酸配列を有しても本出願の範囲内に含まれることは自明である。
【0133】
上記「保存的置換（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）」は、あるアミノ酸を類似した構造的及び／又は化学的性質を有するもう一つのアミノ酸で置換させることを意味する。このようなアミノ酸の置換は、一般に、残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性及び／又は両親媒性（ａｍｐｈｉｐａｔｈｉｃ ｎａｔｕｒｅ）における類似性に基づいて発生する。通常、保存的置換は、ポリペプチドの活性にほとんど影響を及ぼさないか、または影響を及ぼさない。
【0134】
本出願において用語、「相同性（ｈｏｍｏｌｏｇｙ）」または「同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」は、二つの与えられたアミノ酸配列または塩基配列の相互間の同一または類似の程度を意味し、百分率で表示することができる。用語、相同性及び同一性は、しばしば相互交換的に利用され得る。
【0135】
保存された（ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ）ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの配列相同性または同一性は、標準配列アルゴリズムにより決定され、用いられるプログラムにより確立されたデフォルトギャップペナルティが共に利用できる。実質的に、相同性を有したり（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）または同一の（ｉｄｅｎｔｉｃａｌ）配列は、一般に、配列全体または全長の少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％または９０％に該当する一部分と中程度または高いストリンジェントな条件（ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ）でハイブリダイゼーションすることができる。ハイブリダイゼーションには、ポリヌクレオチドで一般のコドンまたはコドン縮退性を考慮したコドンを含有するポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーションも含まれることが自明である。
【0136】
任意の二つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列が相同性、類似性または同一性を有するかどうかは、例えば、Ｐｅａｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ （１９８８） ［Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５］：２４４４でのようなデフォルトパラメータを利用して「ＦＡＳＴＡ」プログラムなどの既知のコンピュータアルゴリズムを利用して決定することができる。または、ＥＭＢＯＳＳパッケージのニードルマンプログラム（ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｏｐｅｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｓｕｉｔｅ，Ｒｉｃｅ ｅｔ ａｌ．、２０００，Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ． １６：２７６－２７７）（バージョン５．０．０または以降のバージョン）で行われるような、ニードルマン－ウンシュ（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈ）アルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ、１９７０，Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４８：４４３－４５３）を使用して決定することができる（ＧＣＧプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １２：３８７ （１９８４））、ＢＬＡＳＴＰ，ＢＬＡＳＴＮ，ＦＡＳＴＡ （Ａｔｓｃｈｕｌ，［Ｓ．］ ［Ｆ．，］ ［ＥＴ ＡＬ，Ｊ ＭＯＬＥＣ ＢＩＯＬ ２１５］：４０３ （１９９０）；Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｈｕｇｅ Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ，Ｍａｒｔｉｎ Ｊ． Ｂｉｓｈｏｐ，［ＥＤ．，］ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、１９９４、及び［ＣＡＲＩＬＬＯ ＥＴＡ／。］（１９８８） ＳＩＡＭ Ｊ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ ４８：１０７３を含む）。例えば、国立生物工学情報データベースセンターのＢＬＡＳＴ、またはＣｌｕｓｔａｌＷを利用して相同性、類似性または同一性を決定することができる。
【0137】
ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの相同性、類似性または同一性は、例えば、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ． Ａｐｐｌ． Ｍａｔｈ （１９８１） ２：４８２において公知となっているように、例えば、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ｅｔ ａｌ． （１９７０）、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． ４８：４４３のようなＧＡＰコンピュータプログラムを利用して配列情報を比較することにより決定することができる。要約すると、ＧＡＰプログラムは、２つの配列中、より短いものにおける記号の総数であり、類似の配列された記号（即ち、ヌクレオチドまたはアミノ酸）の数を除した値と定義することができる。ＧＡＰプログラムのためのデフォルトパラメータは、（１）２進法比較マトリックス（同一性のために１そして非同一性のために０の値を含む）及びＳｃｈｗａｒｔｚ ａｎｄ Ｄａｙｈｏｆｆ，ｅｄｓ．，Ａｔｌａｓ Ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，ｐｐ． ３５３－３５８ （１９７９）により開示された通り、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ ｅｔ ａｌ（１９８６）Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １４：６７４５の加重比較マトリックス（またはＥＤＮＡＦＵＬＬ （ＮＣＢＩ ＮＵＣ４．４のＥＭＢＯＳＳバージョン）置換マトリックス）；（２）各ギャップのための３．０のペナルティ及び各ギャップにおいて各記号のための追加の０．１０ペナルティ（またはギャップ開放ペナルティ１０、ギャップ延長ペナルティ０．５）；及び（３）末端ギャップのための無ペナルティを含むことができる。
【0138】
また、任意の二つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列が相同性、類似性または同一性を有するかどうかは、定義されたストリンジェントな条件下でサザンハイブリダイゼーション実験によって配列を比較することにより確認することができ、定義される適切なハイブリダイゼーション条件は当該技術範囲内であり、当業者によく知られている方法（例えば、Ｊ． Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８９；Ｆ．Ｍ． Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）で決定することができる。
本出願の遺伝子（例えば、ｓｕｃＤ）は、公知のデータベースであるＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋなど多様なデータベースでその配列を得ることができるが、これに制限されない。
本出願の遺伝子（例えば、ｓｕｃＤ）は、公知のデータベースであるＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋなど多様なデータベースでその配列を得ることができるが、これに制限されない。
【0139】
一例として、クロストリジウム・クライベリ由来のｓｕｃＤ遺伝子は配列番号２；アラビドプシス・サリアナ由来の４ｈｂＤ遺伝子は配列番号４；クロストリジウム・クライベリ由来のｏｒｆＺ遺伝子は配列番号６；シュードモナス・プチダ／ルストニア・ユートロファ由来のポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）ポリメラーゼ融合タンパク質ｐｈａＣ３／Ｃ１遺伝子は配列番号８；エシェリキア・コリ由来のｐｙｋＡ、ｐｙｋＦ、ｐｐｃ、ｇｌｔＡ、ｍａｅＡ、ｍａｅＢ． ｅｄｄ、ｅｄａ、ｐｔｓＧ、ｉｃｄ、ａｃｅＡ、ａｃｅＫ、ｇｌｃＢ、及びａｃｅＢ遺伝子は、それぞれ配列番号１０、１２、１４、１８、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３６、３８、４０、４２、及び４４；ノストック属由来のｅｃａＡ遺伝子は配列番号１６；リゾビウム・エトリ由来のｐｙｃ遺伝子は配列番号２０；及びシネコシスティス属由来のｓｂｔＡ遺伝子は配列番号３４の塩基配列を含んだり、有したり、からなるものであってもよいが、これに制限されない。
【0140】
一具現例として、本出願の遺伝子は、エシェリキア属またはコリネバクテリウム属微生物に適するようにコドン最適化したものであってもよいが、これに制限されない。
【0141】
本出願において用語、「ポリヌクレオチド」は、ヌクレオチド単位体（ｍｏｎｏｍｅｒ）が共有結合により長く鎖状につながったヌクレオチドの重合体（ｐｏｌｙｍｅｒ）であり、一定の長さ以上のＤＮＡ鎖である。
【0142】
本出願のポリヌクレオチドまたは遺伝子は、コドンの縮退性（ｄｅｇｅｎｅｒａｃｙ）により、または特定のポリペプチドを発現させようとする生物で好まれるコドンを考慮し、ポリペプチドのアミノ酸配列を変化させない範囲内でコード領域に多様な変形が行われてもよい。上記ポリヌクレオチドまたは遺伝子は、例えば、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、及び／又は４４の塩基配列を含んでもよく、これと相同性または同一性が８０％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、または９９％以上である塩基配列からなってもよいが、これに制限されない。
【0143】
また、本出願のポリヌクレオチドまたは遺伝子は、公知の遺伝子配列から製造されてもよいプローブ、例えば、本出願の塩基配列の全体または一部に対する相補配列とストリンジェントな条件下にハイブリダイゼーションし、本出願のアミノ酸配列をコードする配列であれば、制限なく含まれ得る。上記「ストリンジェントな条件（ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）」とは、ポリヌクレオチド間の特異的ハイブリダイゼーションを可能にする条件を意味する。このような条件は、文献（例えば、Ｊ． Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．、同上）に具体的に記載されている。例えば、相同性または同一性が高いポリヌクレオチド同士、４０％以上、具体的には、９０％以上、より具体的には、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、さらに具体的には、９９％以上の相同性または同一性を有するポリヌクレオチド同士ハイブリダイゼーションし、それより相同性または同一性が低いポリヌクレオチド同士ハイブリダイゼーションしない条件、または通常のサザンハイブリダイゼーション（ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）の洗浄条件である６０℃、１ХＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ、具体的には６０℃、０．１ХＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ、より具体的には６８℃、０．１ХＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳに相当する塩濃度及び温度で、１回、具体的には２回～３回洗浄する条件を列挙することができる。
【0144】
ハイブリダイゼーションは、たとえハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに応じて塩基間のミスマッチ（ｍｉｓｍａｔｃｈ）が可能であっても、二つの核酸が相補的配列を有することを要求する。用語、「相補的」は、互いにハイブリダイゼーションが可能なヌクレオチド塩基間の関係を記述するのに用いられる。例えば、ＤＮＡに関し、アデニンはチミンに相補的であり、シトシンはグアニンに相補的である。したがって、本出願のポリヌクレオチドは、また、実質的に類似の核酸配列だけでなく、全体配列に相補的な単離された核酸断片を含むことができる。
【0145】
具体的には、相同性または同一性を有するポリヌクレオチドは、５５℃のＴｍ値でハイブリダイゼーション段階を含むハイブリダイゼーション条件を用いて上述の条件を用いて探知することができる。また、上記Ｔｍ値は６０℃、６３℃または６５℃であってもよいが、これに限定されるものではなく、その目的に応じて当業者により適切に調節することができる。
【0146】
ポリヌクレオチドをハイブリダイズする適切なストリンジェンシーは、ポリヌクレオチドの長さ及び相補性程度に依存し、変数は当該技術分野によく知られている（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，ｓｕｐｒａ、９．５０－９．５１，１１．７－１１．８参照）。
【0147】
本出願において、ポリペプチド、これをコードするポリヌクレオチド、またはこれらの組合せを含む微生物；及びその培養物で構成される群から選択されるいずれか一つ以上を利用することは、上記ポリペプチド、これをコードするポリヌクレオチド、またはこれらの組合せを含む微生物を培養及び／又は上記培養された微生物または培地から特定物質（例えば、スクシネートセミアルデヒド、４－ヒドロキシブチレート、または４－ヒドロキシブチリルｃｏＡなど）を回収することであってもよいが、これに制限されない。
【0148】
本出願の生産方法における「弱化」は、特定の経路または段階の弱化であってもよく、上記経路や段階に関与する酵素の弱化であってもよい。上記弱化は、不活性化（ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）、欠乏（ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ）、下向き調節（ｄｏｗｎ－ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）、減少（ｄｅｃｒｅａｓｅ）、低下（ｒｅｄｕｃｅ）、減衰（ａｔｔｅｎｕａｔｉｏｎ）などの用語と混用され得る。上記酵素の弱化は、上記酵素ポリペプチド；上記ポリペプチド、これをコードするポリヌクレオチド、上記ポリヌクレオチドを含むベクター、またはこれらの組合せを含む微生物；及びその培養物で構成される群から選択されるいずれか一つ以上を減少、欠失、または不活性化させることであってもよい。本出願の生産方法が微生物を利用できるという点から、本出願の生産方法における「弱化」は「ポリペプチド活性の弱化」も含む。
【0149】
本出願の生産方法における「強化」は、特定の経路または段階の強化であってもよく、上記経路や段階に関与する酵素の強化であってもよい。上記強化は、活性化（ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）、上向き調節（ｕｐ－ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）、過発現（ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）、増加（ｉｎｃｒｅａｓｅ）などの用語と混用され得る。上記酵素の強化は、上記酵素ポリペプチド；上記ポリペプチド、これをコードするポリヌクレオチド、上記ポリヌクレオチドを含むベクター、またはこれらの組合せを含む微生物；及びその培養物で構成される群から選択されるいずれか一つ以上を増加、活性化、または過発現させることであってもよい。本出願の生産方法が微生物を利用できるという点から、本出願の生産方法における「強化」は、ポリペプチド活性の「強化」も含む。
【0150】
本出願において用語、「調節」は、上記「強化」及び／又は「弱化」であってもよいが、これに制限されない。
【0151】
本出願において、上記（５）ポリ－４－ヒドロキシブチレートを１，４－ブタンジオールに分解する段階は、化学的方法を利用するものであってもよく、熱分解、水素化、またはこれらの組合せを利用するものであってもよいが、ポリ－４－ヒドロキシブチレートを１，４－ブタンジオールに分解できる限り、これに制限されない。
【0152】
本出願のもう一つの様態は、スクシネートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、４－ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ、４－ヒドロキシブチリル－ｃｏＡトランスフェラーゼ、及びポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）ポリメラーゼポリペプチド、これをコードするポリヌクレオチド、上記ポリヌクレオチドを含むベクター、またはこれらの組合せを含む微生物を提供する。
【0153】
上記スクシネートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、４－ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ、４－ヒドロキシブチリル－ｃｏＡトランスフェラーゼ、ポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）ポリメラーゼポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、下記の１，４－ブタンジオール、ＴＣＡ経路、還元型ＴＣＡ経路、ピルベートデヒドロゲナーゼ、シトレートシンターゼ、アコニターゼ、イソシトレートデヒドロゲナーゼ、α－ケトグルタレートデヒドロゲナーゼ、ピルベートカルボキシラーゼ、（Ｉ）～（ＸＩＩ）、（ｉ）～（ｖｉ）、及びこれと関連した酵素などは、他の様態で説明した通りである。
【0154】
本出願において、上記微生物は、細胞親和的なポリ－４－ヒドロキシブチレートを優先的に生産することであるため、本出願の微生物は、ポリ－４－ヒドロキシブチレート生産能が増加したものであってもよく、これにより、１，４－ブタンジオールの生産能がさらに増加したものであってもよい。また、本出願の微生物は、ポリ－４－ヒドロキシブチレート生産段階で遺伝子を導入してオキサロアセテートを利用した還元型ＴＣＡ経路の活性化；高生産性の発酵工程；及び／又は還元型ＴＣＡ経路を通じて発酵から発生する二酸化炭素を再利用してポリ－４－ヒドロキシブチレート生産能が増加したものであってもよい。
【0155】
一具現例として、上記微生物は、スクシネートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、４－ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ、４－ヒドロキシブチリル－ｃｏＡトランスフェラーゼ、及びポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）ポリメラーゼで構成される群から選択されるいずれか一つ以上のポリペプチドの活性が強化されたものであってもよい：
【0156】
一具現例として、上記スクシネートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、４－ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ、４－ヒドロキシブチリル－ｃｏＡトランスフェラーゼ、及び／又はポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）ポリメラーゼをコードする遺伝子は、外来から導入されたものであってもよいが、これに制限されない。
【0157】
一例として、上記スクシネートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、及び／又は４－ヒドロキシブチリル－ｃｏＡトランスフェラーゼをコードする遺伝子はクルロストリジウム・クライベリ由来であってもよく、４－ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子は、アラビドプシス・サリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）由来であってもよいが、これに制限されない。
【0158】
一例として、上記ポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）ポリメラーゼをコードする遺伝子は、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）またはルストニア・ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ）由来であってもよいが、これに制限されない。
【0159】
一具現例として、上記微生物はＴＣＡ経路を含むものであってもよい。
【0160】
一具現例として、上記微生物は、ピルベートデヒドロゲナーゼ、シトレートシンターゼ、アコニターゼ、イソシトレートデヒドロゲナーゼ、α－ケトグルタレートデヒドロゲナーゼ、及びピルベートカルボキシラーゼからなる群から選択されるいずれか一つ以上のポリペプチド、これをコードするポリヌクレオチド、またはこれらの組合せを含むものであってもよいが、これに制限されない。
【0161】
一具現例として、本出願の微生物は、還元型ＴＣＡ経路を含んでもよく、強化されたものであってもよい。
【0162】
一具現例として、本出願の微生物は、下記（Ｉ）～（ＸＩＩ）からなる群から選択されるいずれか一つ以上を含むものであってもよいが、これに制限されない：
（Ｉ）ピルビン酸キナーゼ弱化；
（ＩＩ）ホスホエノールピルベートカルボキシラーゼ強化；
（ＩＩＩ）カルボニックアンヒドラーゼ強化；
（ＩＶ）シトレートシンターゼ調節；
（Ｖ）ピルベートカルボキシラーゼ強化；
（ＶＩ）ＮＡＤ＋依存性マレートデヒドロゲナーゼ弱化；
（ＶＩＩ）ＮＡＤＰ＋依存性マレートデヒドロゲナーゼ弱化；
（ＶＩＩＩ）ホスホグルコン酸デヒドラターゼ弱化；
（ＩＸ）２－ケト－４－ヒドロキシグルタレートＫＤＰＧ：２－ケト－３－デオキシグルコネート６－ホスフェートアルドラーゼ弱化；
（Ｘ）アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ弱化；
（ＸＩ）グルコース特異的ＰＴＳ酵素ＩＩＢＣコンポーネント弱化；及び
（ＸＩＩ）重炭酸塩トランスポーター強化
（Ｉ）ピルビン酸キナーゼ弱化；
（ＩＩ）ホスホエノールピルベートカルボキシラーゼ強化；
（ＩＩＩ）カルボニックアンヒドラーゼ強化；
（ＩＶ）シトレートシンターゼ調節；
（Ｖ）ピルベートカルボキシラーゼ強化；
（ＶＩ）ＮＡＤ＋依存性マレートデヒドロゲナーゼ弱化；
（ＶＩＩ）ＮＡＤＰ＋依存性マレートデヒドロゲナーゼ弱化；
（ＶＩＩＩ）ホスホグルコン酸デヒドラターゼ弱化；
（ＩＸ）２－ケト－４－ヒドロキシグルタレートＫＤＰＧ：２－ケト－３－デオキシグルコネート６－ホスフェートアルドラーゼ弱化；
（Ｘ）アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ弱化；
（ＸＩ）グルコース特異的ＰＴＳ酵素ＩＩＢＣコンポーネント弱化；及び
（ＸＩＩ）重炭酸塩トランスポーター強化
【0163】
一具現例として、本出願の微生物は、（ＩＩ）ホスホエノールピルベートカルボキシラーゼ強化；
（ＶＩ）ＮＡＤ＋依存性マレートデヒドロゲナーゼ弱化；
（ＶＩＩ）ＮＡＤＰ＋依存性マレートデヒドロゲナーゼ弱化；及び／又は
（Ｘ）アスパラギン酸塩アミノトランストランスフェラーゼ弱化を含んでもよい。
（ＶＩ）ＮＡＤ＋依存性マレートデヒドロゲナーゼ弱化；
（ＶＩＩ）ＮＡＤＰ＋依存性マレートデヒドロゲナーゼ弱化；及び／又は
（Ｘ）アスパラギン酸塩アミノトランストランスフェラーゼ弱化を含んでもよい。
【0164】
一具現例として、本出願の微生物は、（ＩＩ）ホスホエノールピルベートカルボキシラーゼ強化を含めてもよい。
【0165】
一具現例として、本出願の微生物は、（ＶＩ）ＮＡＤ＋依存性マレートデヒドロゲナーゼ弱化及び（ＶＩＩ）ＮＡＤＰ＋依存性マレートデヒドロゲナーゼ弱化を含めてもよい。
【0166】
一具現例として、本出願の微生物は、（Ｘ）アスパラギン酸アミノトランストランスフェラーゼ弱化を含んでもよい。
【0167】
一具現例として、上記ピルベートカルボキシラーゼをコードする遺伝子は外来遺伝子であってもよく、具体的にはリゾビウム・エトリ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｅｔｌｉ）由来であってもよいが、これに制限されない。
【0168】
一具現例として、上記シトレートシンターゼの調節は、遺伝子変異によるものであってもよいが、これに制限されない。
【0169】
一具現例として、本出願の微生物は、グリオキシレート経路を含んでもよく、強化されたものであってもよい。
【0170】
一具現例として、本出願の微生物は、下記（ｉ）～（ｖｉ）からなる群から選択されるいずれか一つ以上を含むものであってもよいが、これに制限されない：
（ｉ）シトレートシンターゼ強化；
（ｉｉ）イソシトレートデヒドロゲナーゼ弱化；
（ｉｉｉ）イソシトレートリアーゼ強化；
（ｉｖ）イソシトレートデヒドロゲナーゼキナーゼ／ホスファターゼ強化；
（ｖ）マレートシンターゼＧ強化；及び
（ｖｉ）マレートシンターゼＡ強化。
（ｉ）シトレートシンターゼ強化；
（ｉｉ）イソシトレートデヒドロゲナーゼ弱化；
（ｉｉｉ）イソシトレートリアーゼ強化；
（ｉｖ）イソシトレートデヒドロゲナーゼキナーゼ／ホスファターゼ強化；
（ｖ）マレートシンターゼＧ強化；及び
（ｖｉ）マレートシンターゼＡ強化。
【0171】
上記スクシネートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼなどは、他の様態で説明した通りである。
【0172】
一具現例として、本出願の微生物は、窒素、硫黄、リン、及びマグネシウムで構成される群から選択されるいずれか一つ以上の栄養素制限の条件でもポリ－４－ヒドロキシブチレート生産能があるものであってもよいが、これに制限されない。
【0173】
一具現例として、本出願の微生物は、窒素、硫黄、リン、及びマグネシウムで構成される群から選択される一つ以上の制限条件でホスホエノールピルベートカルボキシラーゼ遺伝子（ｐｐｃ）の転写が阻害を受けないものであってもよいが、これに制限されない。
【0174】
一具現例として、本出願の微生物は、窒素、リン、硫黄、及びマグネシウムで構成される群から選択されるいずれか一つ以上の栄養素制限の条件でも上記栄養素制限がない条件に比べてポリ－４－ヒドロキシブチレート生産能が維持されたり減少しないものであってもよいが、これに制限されない。
【0175】
一具現例として、本出願において目的とするポリペプチド（例えば、ＳｕｃＤ、ＰｈａＣ、ＯｒｆＺ）が含まれたり強化された微生物は、目的とするポリペプチド、これをコードするポリヌクレオチドまたはこれを含むベクターを含むものであってもよい。
【0176】
本出願のベクターは、適した宿主内で目的ポリペプチドを発現させるように適した発現調節領域（または発現調節配列）に作動可能に連結された上記目的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列を含むＤＮＡ製造物を含むことができる。上記発現調節領域は、転写を開始できるプロモーター、そのような転写を調節するための任意のオペレーター配列、適したｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、及び転写及び解読の終結を調節する配列を含むことができる。ベクターは、適当な宿主細胞内に形質転換された後、宿主ゲノムと関係がなく複製されたり機能することができ、ゲノムそのものに統合することができる。
【0177】
本出願で用いられるベクターは、特に、限定されず、当業界に知られている任意のベクターを利用することができる。通常使用されるベクターの例としては、天然状態または組換え状態のプラスミド、コスミド、ウイルス及びバクテリオファージが挙げられる。例えば、ファージベクターまたはコスミドベクターとしてｐＷＥ１５、Ｍ１３、ＭＢＬ３、ＭＢＬ４、ＩＸＩＩ、ＡＳＨＩＩ、ＡＰＩＩ、ｔ１０、ｔ１１、Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、及びＣｈａｒｏｎ２１Ａなどを使用することができ、プラスミドベクターとしてｐＤＺ系、ｐＢＲ系、ｐＵＣ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ系、ｐＧＥＭ系、ｐＴＺ系、ｐＣＬ系及びｐＥＴ系などを使用することができる。具体的には、ｐＤＺ、ｐＤＣ、ｐＤＣＭ２（大韓民国公開特許公報第１０－２０２０－０１３６８１３号）、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＣＬ、ｐＥＣＣＧ１１７、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＭＷ１１８、ｐＣＣ１ＢＡＣ、ｐＩＭＲ５３ベクターなどを使用することができる。
【0178】
一例として、細胞内染色体挿入用ベクターを通じて目的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを染色体内に挿入することができる。上記ポリヌクレオチドの染色体内への挿入は、当業界に知られている任意の方法、例えば、相同組換え（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）により行われるが、これに限定されない。上記染色体挿入の有無を確認するための選別マーカー（ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｍａｒｋｅｒ）をさらに含むことができる。上記選別マーカーは、ベクターで形質転換された細胞を選別、即ち、目的核酸分子の挿入の有無を確認するためのものであり、薬物耐性、栄養要求性、細胞毒性剤に対する耐性または表面ポリペプチドの発現のような選択可能表現型を付与するマーカーが用いられる。選択剤（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ａｇｅｎｔ）が処理された環境では、選別マーカーを発現する細胞のみが生存したり、他の表現形質を示すため、形質転換された細胞を選別することができる。
【0179】
本出願において用語、「形質転換」は、標的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを宿主細胞あるいは微生物内に導入して宿主細胞内で上記ポリヌクレオチドがコードするポリペプチドが発現できるようにすることを意味する。形質転換されたポリヌクレオチドは、宿主細胞内で発現できれば、宿主細胞の染色体内に挿入されて位置したり、染色体外に位置したりに関係なく、これらすべてを含むことができる。また、上記ポリヌクレオチドは、目的ポリペプチドをコードするＤＮＡ及び／又はＲＮＡを含む。上記ポリヌクレオチドは、宿主細胞内に導入されて発現できるものであれば、いかなる形態でも導入することができる。例えば、上記ポリヌクレオチドは、自主的に発現するのに必要なすべての要素を含む遺伝子構造体である発現カセット（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｃａｓｓｅｔｔｅ）の形態で宿主細胞に導入することができる。上記発現カセットは、通常、上記ポリヌクレオチドに作動可能に連結されているプロモーター（ｐｒｏｍｏｔｅｒ）、転写終結信号、リボソーム結合部位及び翻訳終結信号を含むことができる。上記発現カセットは、自己複製が可能な発現ベクター形態であってもよい。また、上記ポリヌクレオチドは、それ自体の形態で宿主細胞に導入されて宿主細胞において発現に必要な配列と作動可能に連結されているものであってもよく、これに制限されない。
【0180】
また、上記において用語「作動可能に連結」されたとは、本出願の目的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの転写を開始及び媒介させるプロモーター配列と上記ポリヌクレオチド配列が機能的に連結されていることを意味する。
【0181】
一具現例として、本出願のスクシネートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、４－ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ、４－ヒドロキシブチリル－ｃｏＡトランスフェラーゼ、及びポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）ポリメラーゼポリペプチド、これをコードするポリヌクレオチド、上記ポリヌクレオチドを含むベクター、またはこれらの組合せを含む微生物は、これらを含まない微生物に比べてスクシネートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、４－ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ、４－ヒドロキシブチリル－ｃｏＡトランスフェラーゼ、及びポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）ポリメラーゼ活性が強化されたものであってもよいが、これに制限されない。
【0182】
本出願において用語「微生物」または「菌株」は、野生型微生物や自然的または人為的に遺伝的変形が起きた微生物をすべて含み、外部遺伝子が挿入されたり内在的遺伝子の活性が強化されるなどの原因により特定の機序が強化された微生物であってもよい。
【0183】
一具現例として、本出願の微生物は、エシェリキア属（Ｇｅｎｕｓ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）またはコリネバクテリウム属（Ｇｅｎｕｓ Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）であってもよく、具体的には、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）またはコリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）であってもよいが、これに制限されない。
【0184】
本出願の微生物は、ポリ－４－ヒドロキシブチレート生産用であってもよく、これから生産されたポリ－４－ヒドロキシブチレートは、化学的工程により１，４－ブタンジオールを生産し、本出願の微生物が１，４－ブタンジオールの生産に用いられるが、これに制限されない。
【0185】
本出願の微生物は、本出願の強化または導入の対象となるポリペプチド（例えば、ＳｕｃＤ、４ＨｂＤ、ＯｒｆＺ、ＰｈａＣ、ＰＰＣ、ＥｃａＡ、Ｇｌｔａ、Ｐｙｃ、ＡｃｅＫ、及び／又はＡｃｅＡなど）、これをコードするポリヌクレオチド、またはポリヌクレオチドを含むベクターのいずれか一つ以上を含む微生物；本出願の強化または導入の対象となるポリペプチドまたは遺伝子を発現するように変形された微生物；本出願の強化または導入の対象となるポリペプチドまたは遺伝子を発現する微生物；本出願のポリペプチドまたは遺伝子を活性を有する微生物；本出願の弱化の対象となるポリペプチド（例えば、Ｐｙｋ、ＧｌｔＡ、ＭａｅＡ、ＭａｅＢ、Ｅｄｄ、Ｅｄａ、及び／又はＡｓｐＣなど）が弱化するように変形された微生物；及び／又は本出願の弱化の対象となるポリペプチドまたは遺伝子またはその活性が弱化された微生物（例えば、組換え菌株）であってもよいが、これに制限されない。
【0186】
本出願の微生物は、自然的に本出願のポリペプチド（例えば、ＳｕｃＤ、ＭａｅＡなど）、１，４－ブタンジオール及び／又はポリ－４－ヒドロキシブチレート生産能を有している微生物；またはポリペプチド、１，４－ブタンジオール及び／又はポリ－４－ヒドロキシブチレート生産能がない親株に本出願の強化または導入の対象となるポリペプチド、遺伝子、ポリヌクレオチド、またはこれを含むベクターが導入されたり、弱化の対象となる遺伝子またはポリヌクレオチドまたはその活性が弱化されてポリペプチドが強化または弱化、または１，４－ブタンジオール及び／又はポリ－４－ヒドロキシブチレート生産能が強化されたり付与された微生物であってもよいが、これに制限されない。
【0187】
一例として、本出願の微生物は、本出願のポリペプチド、遺伝子、ポリヌクレオチド、またはこれを含むベクターで形質転換（これにより、強化、弱化、導入など）され、１，４－ブタンジオール及び／又はポリ－４－ヒドロキシブチレートを生産できたり生産能が増加した微生物をすべて含むことができる。
【0188】
例えば、本出願の微生物は、天然の野生型微生物、１，４－ブタンジオール及び／又はポリ－４－ヒドロキシブチレートを生産する微生物に本出願のポリペプチドが発現または弱化され、１，４－ブタンジオール及び／又はポリ－４－ヒドロキシブチレート生産能が増加した組換え微生物であってもよい。上記１，４－ブタンジオール及び／又はポリ－４－ヒドロキシブチレート生産能が増加した組換え微生物は、天然の野生型微生物または本出願のポリペプチド非変形微生物（即ち、野生型遺伝子を含む微生物、本出願の遺伝子が強化されたり導入されない微生物、または本出願の遺伝子が弱化されていない微生物）に比べて１，４－ブタンジオール及び／又はポリ－４－ヒドロキシブチレート生産能が増加した微生物であってもよいが、これに制限されるものではない。
【0189】
一例として、上記生産能が増加した組換え微生物は、変異前の親株または非変形微生物の１，４－ブタンジオール及び／又はポリ－４－ヒドロキシブチレート生産能に比べて約０．００１％以上または０．０１％以上、１，４－ブタンジオール及び／又はポリ－４－ヒドロキシブチレート生産能が高くなったものであってもよいが、変異前の親株または非変形微生物の生産能に比べて＋値の増加量を有する限り、これに制限されない。上記用語「約（ａｂｏｕｔ）」は、±０．５、±０．４、±０．３、±０．２、±０．１などをすべて含む範囲であり、約という用語の後に出てくる数値と同等または類似の範囲の数値をすべて含むが、これに制限されない。
【0190】
本出願において用語「非変形微生物」は、微生物に自然に発生し得る突然変異を含む微生物を除くものではなく、野生型微生物または天然型微生物自体であるか、自然的または人為的要因による遺伝的変異により形質が変化する前の微生物を意味する。例えば、上記非変形微生物は、本明細書に記載されたポリペプチドが発現していないか、弱化されていないか、導入される前の微生物を意味する。上記「非変形微生物」は、「変形前の菌株」、「変形前の微生物」、「非変異菌株」、「非変形菌株」、「非変異微生物」または「基準微生物」と混用され得る。
【0191】
本出願の微生物において、ポリヌクレオチドの一部または全体の変形は、（ａ）微生物内染色体挿入用ベクターを利用した相同組換えまたは遺伝子はさみ（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｎｕｃｌｅａｓｅ，ｅ．ｇ．，ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９）を利用したゲノム編集及び／又は（ｂ）紫外線及び放射線などのような光及び／又は化学物質処理により誘導されてもよいが、これに制限されない。上記遺伝子の一部または全体の変形方法には、ＤＮＡ組換え技術による方法が含まれ得る。例えば、目的遺伝子と相同性があるヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列またはベクターを上記微生物に注入して相同組換え（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）が起きるようにして遺伝子の一部または全体の欠損が行われる。上記注入されるヌクレオチド配列またはベクターは、優性選別マーカーを含んでもよいが、これに制限されるものではない。
【0192】
本出願において用語、ポリペプチド活性の「弱化」は、内在的活性に比べて活性が減少したりまたは活性がないことをいずれも含む概念である。上記弱化は、不活性化（ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）、欠乏（ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ）、下向き調節（ｄｏｗｎ－ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）、減少（ｄｅｃｒｅａｓｅ）、低下（ｒｅｄｕｃｅ）、減衰（ａｔｔｅｎｕａｔｉｏｎ）などの用語と混用され得る。
【0193】
上記弱化は、上記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの変異などにより、ポリペプチド自らの活性が本来微生物が有するポリペプチドの活性に比べて減少または除去された場合、これをコードするポリヌクレオチドの遺伝子の発現阻害またはポリペプチドへの翻訳（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ）の阻害などにより、細胞内で全体的なポリペプチド活性の程度及び／又は濃度（発現量）が天然型菌株に比べて低い場合、上記ポリヌクレオチドの発現が全く行われていない場合、及び／又はポリヌクレオチドが発現されてもポリペプチドの活性がない場合も含むことができる。上記「内在的活性」は、自然的または人為的要因による遺伝的変異により形質が変化する場合、形質変化前の親株、野生型または非変形微生物が本来有していた特定ポリペプチドの活性を意味する。これは、「変形前の活性」と混用され得る。ポリペプチドの活性が内在的活性に比べて「不活性化、欠乏、減少、下向き調節、低下、減衰」するということは、形質変化前の母菌株または非変形微生物が本来有していた特定ポリペプチドの活性に比べて低くなったことを意味する。
【0194】
このようなポリペプチドの活性の弱化は、当業界に知られている任意の方法により行われるが、これに制限されるものではなく、当該分野によく知られた多様な方法の適用により達成することができる（例えば、Ｎａｋａｓｈｉｍａ Ｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｂｙ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ａｎｄ ｇｅｎｅ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ．Ｉｎｔ Ｊ Ｍｏｌ Ｓｃｉ．２０１４；１５（２）：２７７３－２７９３，Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２０１２など）。
【0195】
具体的には、本出願のポリペプチド活性の弱化は
１）ポリペプチドをコードする遺伝子全体または一部の欠損；
２）ポリペプチドをコードする遺伝子の発現が減少するように発現調節領域（または発現調節配列）の変形；
３）ポリペプチドの活性が除去または弱化するように上記ポリペプチドを構成するアミノ酸配列の変形（例えば、アミノ酸配列上の１以上のアミノ酸の削除／置換／付加）；
４）ポリペプチドの活性が除去または弱化するように上記ポリペプチドをコードする遺伝子配列の変形（例えば、ポリペプチドの活性が除去または弱化するように変形されたポリペプチドをコードするように上記ポリペプチド遺伝子の核酸塩基配列上の１以上の核酸塩基の削除／置換／付加）；
５）ポリペプチドをコードする遺伝子転写体の開始コドンまたは５’－ＵＴＲ領域をコードする塩基配列の変形；
６）ポリペプチドをコードする上記遺伝子の転写体に相補的で結合するアンチセンスオリゴヌクレオチド（例えば、アンチセンスＲＮＡ）の導入；
７）リボソーム（ｒｉｂｏｓｏｍｅ）の付着が不可能な２次構造物を形成させるためにポリペプチドをコードする遺伝子のシャイン・ダルガノ（Ｓｈｉｎｅ－Ｄａｌｇａｒｎｏ）配列の前端にシャイン・ダルガノ配列と相補的な配列の付加；
８）ポリペプチドをコードする遺伝子配列のＯＲＦ（ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ）の３’末端に反対方向に転写するプロモーターの付加（Ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ＲＴＥ）；または
９）上記１）～８）から選択された２以上の組合せであってもよいが、これに、特に制限されるものではない。
１）ポリペプチドをコードする遺伝子全体または一部の欠損；
２）ポリペプチドをコードする遺伝子の発現が減少するように発現調節領域（または発現調節配列）の変形；
３）ポリペプチドの活性が除去または弱化するように上記ポリペプチドを構成するアミノ酸配列の変形（例えば、アミノ酸配列上の１以上のアミノ酸の削除／置換／付加）；
４）ポリペプチドの活性が除去または弱化するように上記ポリペプチドをコードする遺伝子配列の変形（例えば、ポリペプチドの活性が除去または弱化するように変形されたポリペプチドをコードするように上記ポリペプチド遺伝子の核酸塩基配列上の１以上の核酸塩基の削除／置換／付加）；
５）ポリペプチドをコードする遺伝子転写体の開始コドンまたは５’－ＵＴＲ領域をコードする塩基配列の変形；
６）ポリペプチドをコードする上記遺伝子の転写体に相補的で結合するアンチセンスオリゴヌクレオチド（例えば、アンチセンスＲＮＡ）の導入；
７）リボソーム（ｒｉｂｏｓｏｍｅ）の付着が不可能な２次構造物を形成させるためにポリペプチドをコードする遺伝子のシャイン・ダルガノ（Ｓｈｉｎｅ－Ｄａｌｇａｒｎｏ）配列の前端にシャイン・ダルガノ配列と相補的な配列の付加；
８）ポリペプチドをコードする遺伝子配列のＯＲＦ（ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ）の３’末端に反対方向に転写するプロモーターの付加（Ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ＲＴＥ）；または
９）上記１）～８）から選択された２以上の組合せであってもよいが、これに、特に制限されるものではない。
【0196】
例えば、
上記１）ポリペプチドをコードする上記遺伝子の一部または全体の欠損は、染色体内の内在的目的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド全体の除去、一部のヌクレオチドが欠失したポリヌクレオチドへの交換またはマーカー遺伝子での交換であってもよい。
上記１）ポリペプチドをコードする上記遺伝子の一部または全体の欠損は、染色体内の内在的目的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド全体の除去、一部のヌクレオチドが欠失したポリヌクレオチドへの交換またはマーカー遺伝子での交換であってもよい。
【0197】
また、上記２）発現調節領域（または発現調節配列）の変形は、欠失、挿入、非保存的または保存的置換またはこれらの組合せにより発現調節領域（または発現調節配列）上の変異発生、またはさらに弱い活性を有する配列での交換であってもよい。上記発現調節領域には、プロモーター、オペレーター配列、リボソーム結合部位をコードする配列、及び転写と解読の終結を調節する配列を含むが、これに限定されるものではない。
【0198】
また、上記５）ポリペプチドをコードする遺伝子転写体の開始コドンまたは５’－ＵＴＲ領域をコードする塩基配列変形は、例えば、内在的開始コドンに比べてポリペプチド発現率がさらに低い他の開始コドンをコードする塩基配列で置換するものであってもよいが、これに制限されない。
【0199】
また、上記３）及び４）のアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列の変形は、ポリペプチドの活性を弱化するように、上記ポリペプチドのアミノ酸配列または上記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を欠失、挿入、非保存的または保存的置換またはこれらの組合せにより配列上の変異発生、またはさらに弱い活性を有するように改良されたアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列または活性がないように改良されたアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列での交換であってもよいが、これに限定されるものではない。例えば、ポリヌクレオチド配列内の変異を導入して終結コドンを形成させることにより、遺伝子の発現を阻害したり弱化させることができるが、これに制限されない。
【0200】
上記６）ポリペプチドをコードする上記遺伝子の転写体に相補的に結合するアンチセンスオリゴヌクレオチド（例えば、アンチセンスＲＮＡ）の導入は、例えば、文献［Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ，Ｈ． ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ－ＲＮＡ ａｓ ａ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｒｅｖｉｅｗｓ － Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｖｏｌ．１（１） １９８６］を参考にすることができる。
【0201】
上記７）リボソーム（ｒｉｂｏｓｏｍｅ）の付着が不可能な２次構造物を形成させるために、ポリペプチドをコードする遺伝子のシャイン・ダルガノ（Ｓｈｉｎｅ－Ｄａｌｇａｒｎｏ）配列の前端にシャイン・ダルガノ配列と相補的な配列の付加は、ｍＲＮＡ翻訳を不可能にしたり速度を低下させることであってもよい。
【0202】
上記８）ポリペプチドをコードする遺伝子配列のＯＲＦ（ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ）の３’末端に反対方向に転写するプロモーターの付加（Ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ＲＴＥ）は、上記ポリペプチドをコードする遺伝子の転写体に相補的なアンチセンスヌクレオチドを作って活性を弱化することであってもよい。
【0203】
本出願において用語、ポリペプチド活性の「強化」は、ポリペプチドの活性が内在的活性に比べて増加することを意味する。上記強化は、活性化（ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）、上向き調節（ｕｐ－ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）、過発現（ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）、増加（ｉｎｃｒｅａｓｅ）などの用語と混用され得る。ここで、活性化、強化、上向き調節、過発現、増加は、本来有していなかった活性を示すこと、または内在的活性または変形前の活性に比べて向上した活性を示すことをすべて含むことができる。上記「内在的活性」は、自然的または人為的要因による遺伝的変異により形質が変化する場合、形質変化前の親株または非変形微生物が本来有していた特定ポリペプチドの活性を意味する。これは、「変形前の活性」と混用され得る。ポリペプチドの活性が内在的活性に比べて「強化」、「上向き調節」、「過発現」または「増加」するということは、形質変化前の親株または非変形微生物が本来有していた特定ポリペプチドの活性及び／又は濃度（発現量）に比べて向上したことを意味する。
【0204】
上記強化は、外来のポリペプチドを導入したり、内在的なポリペプチドの活性強化及び／又は濃度（発現量）を通じて達成することができる。上記ポリペプチドの活性の強化の有無は、当該ポリペプチドの活性程度、発現量または当該ポリペプチドから排出される産物の量の増加から確認することができる。
【0205】
上記ポリペプチドの活性の強化は、当該分野によく知られた多様な方法の適用が可能であり、目的ポリペプチドの活性を変形前の微生物より強化させることができる限り、制限されない。具体的には、分子生物学の日常的方法である当業界の通常の技術者によく知られた遺伝子工学及び／又はタンパク質工学を利用したことであってもよいが、これで制限されない（例えば、Ｓｉｔｎｉｃｋａ ｅｔ ａｌ．Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｇｅｎｅｓ．Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ．２０１０，Ｖｏｌ．２．１－１６，Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２０１２など）。
【0206】
具体的には、本出願のポリペプチド活性の強化は
１）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの細胞内コピー数の増加；
２）ポリペプチドをコードする染色体上の遺伝子発現調節領域を活性が強力な配列で交換；
３）ポリペプチドをコードする遺伝子転写体の開始コドンまたは５’－ＵＴＲ領域をコードする塩基配列の変形；
４）ポリペプチド活性が強化されるように上記ポリペプチドのアミノ酸配列の変形；
５）ポリペプチド活性が強化されるように上記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の変形（例えば、ポリペプチドの活性が強化されるように変形されたポリペプチドをコードするように上記ポリペプチド遺伝子のポリヌクレオチド配列の変形）；
６）ポリペプチドの活性を示す外来ポリペプチドまたはこれをコードする外来ポリヌクレオチドの導入；
７）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのコドン最適化；
８）ポリペプチドの三次構造を分析し、露出部位を選択して変形したり化学的に修飾；または
９）上記１）～８）から選択された２以上の組合せであってもよいが、これに、特に制限されるものではない。
１）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの細胞内コピー数の増加；
２）ポリペプチドをコードする染色体上の遺伝子発現調節領域を活性が強力な配列で交換；
３）ポリペプチドをコードする遺伝子転写体の開始コドンまたは５’－ＵＴＲ領域をコードする塩基配列の変形；
４）ポリペプチド活性が強化されるように上記ポリペプチドのアミノ酸配列の変形；
５）ポリペプチド活性が強化されるように上記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の変形（例えば、ポリペプチドの活性が強化されるように変形されたポリペプチドをコードするように上記ポリペプチド遺伝子のポリヌクレオチド配列の変形）；
６）ポリペプチドの活性を示す外来ポリペプチドまたはこれをコードする外来ポリヌクレオチドの導入；
７）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのコドン最適化；
８）ポリペプチドの三次構造を分析し、露出部位を選択して変形したり化学的に修飾；または
９）上記１）～８）から選択された２以上の組合せであってもよいが、これに、特に制限されるものではない。
【0207】
より具体的には、
上記１）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの細胞内コピー数の増加は、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが作動可能に連結された、宿主と無関係に複製され、機能できるベクターの宿主細胞内への導入により達成されることであってもよい。または、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが宿主細胞内の染色体内に１コピーまたは２コピー以上の導入により達成されることであってもよい。上記染色体内への導入は、宿主細胞内の染色体内に上記ポリヌクレオチドを挿入させるベクターが宿主細胞内に導入されることにより行われるが、これに制限されない。上記ベクターは、前述した通りである。
上記１）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの細胞内コピー数の増加は、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが作動可能に連結された、宿主と無関係に複製され、機能できるベクターの宿主細胞内への導入により達成されることであってもよい。または、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが宿主細胞内の染色体内に１コピーまたは２コピー以上の導入により達成されることであってもよい。上記染色体内への導入は、宿主細胞内の染色体内に上記ポリヌクレオチドを挿入させるベクターが宿主細胞内に導入されることにより行われるが、これに制限されない。上記ベクターは、前述した通りである。
【0208】
上記２）ポリペプチドをコードする染色体上の遺伝子発現調節領域（または発現調節配列）を活性が強力な配列での交換は、例えば、上記発現調節領域の活性をさらに強化するように欠失、挿入、非保存的または保存的置換またはこれらの組合せにより配列上の変異発生、またはさらに強い活性を有する配列での交換であってもよい。上記発現調節領域は、特に、これに制限されないが、プロモーター、オペレーター配列、リボソーム結合部位をコードする配列、そして転写及び解読の終結を調節する配列などを含むことができる。一例として、本来のプロモーターを強力なプロモーターで交換させることであってもよいが、これに制限されない。
【0209】
公知となった強力なプロモーターの例としては、ＣＪ１～ＣＪ７プロモーター（米国特許第７６６２９４３号明細書）、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ラムダファージＰＲプロモーター、ＰＬプロモーター、ｔｅｔプロモーター、ｇａｐＡプロモーター、ＳＰＬ７プロモーター、ＳＰＬ１３（ｓｍ３）プロモーター（米国特許第１０５８４３３８号明細書）、Ｏ２プロモーター（米国特許第１０２７３４９１号明細書）、ｔｋｔプロモーター、ｙｃｃＡプロモーターなどがあるが、これに制限されない。
【0210】
上記３）ポリペプチドをコードする遺伝子転写体の開始コドンまたは５’－ＵＴＲ領域をコードする塩基配列の変形は、例えば、内在的開始コドンに比べてポリペプチド発現率がさらに高い他の開始コドンをコードする塩基配列で置換することであってもよいが、これに制限されない。
【0211】
上記４）及び５）のアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列の変形は、ポリペプチドの活性を強化するように、上記ポリペプチドのアミノ酸配列または上記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を欠失、挿入、非保存的または保存的置換またはこれらの組合せにより配列上の変異発生、またはさらに強い活性を有するように改良されたアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列または活性が増加するように改良されたアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列での交換であってもよいが、これに限定されるものではない。上記交換は、具体的に相同組換えによりポリヌクレオチドを染色体内に挿入することにより行われるが、これに制限されない。この時に用いられるベクターは、染色体挿入の有無を確認するための選別マーカー（ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｍａｒｋｅｒ）をさらに含むことができる。上記選別マーカーは、前述した通りである。
【0212】
上記６）ポリペプチドの活性を示す外来ポリヌクレオチドの導入は、上記ポリペプチドと同一／類似の活性を示すポリペプチドをコードする外来ポリヌクレオチドの宿主細胞内導入であってもよい。上記外来ポリヌクレオチドは、上記ポリペプチドと同一／類似の活性を示す限り、その由来や配列に制限がない。上記導入に利用される方法は、公知となった形質転換方法を当業者が適切に選択して行われ、宿主細胞内で上記導入されたポリヌクレオチドが発現することによりポリペプチドが生成され、その活性が増加することができる。
【0213】
上記７）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのコドン最適化は、内在ポリヌクレオチドが宿主細胞内で転写または翻訳が増加するようにコドン最適化したことであるか、または外来ポリヌクレオチドが宿主細胞内で最適化した転写、翻訳が行われるようにそのコドンを最適化したことであってもよい。
【0214】
上記８）ポリペプチドの三次構造を分析し、露出部位を選択して変形したり化学的に修飾することは、例えば、分析しようとするポリペプチドの配列情報を公知のタンパク質の配列情報が貯蔵されたデータベースと比較することにより、配列の類似性程度に応じて鋳型タンパク質の候補を決定し、これに基づいて構造を確認し、変形したり化学的に修飾する露出部位を選択して変形または修飾することであってもよい。
【0215】
このようなポリペプチド活性の強化は、対応するポリペプチドの活性または濃度発現量が野生型や変形前の微生物菌株で発現したポリペプチドの活性または濃度を基準として増加したり、当該ポリペプチドから生産される産物の量の増加されるものであってもよいが、これに制限されるものではない。
【0216】
本出願において用語、ポリペプチド活性の「調節」は、上記ポリペプチド活性の「強化」及び／又はポリペプチド活性の「弱化」であってもよいが、これに制限されない。一具現例として、ＧｌｔＡは、活性が強化または弱化されたものであってもよいが、これに制限されない。
【0217】
本出願のもう一つの態様は、本出願の微生物を培養する段階を含むポリ－４－ヒドロキシブチレート（ｐｏｌｙ－４－ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒａｔｅ，ｐｏｌｙ（４－ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒａｔｅ）；Ｐ４ＨＢ）の生産方法を提供する。
【0218】
本出願において用語、「ポリ－４－ヒドロキシブチレート」は４－ヒドロキシブチレートの重合体であり、ポリエステルに属する化合物である。上記ポリ－４－ヒドロキシブチレートは、ポリ－４－ヒドロキシブタノエート（ｐｏｌｙ－４－ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔａｎｏａｔｅ，Ｐ４ＨＡ）と混用されてもよく、下記の化学式１で示されてもよいが、これに制限されない。
【0219】
【化1】
（上記ｎは１以上の整数）
【0220】
本出願において、用語「培養」とは、本出願の微生物を適当に調節された環境条件で生育させることを意味する。本出願において、培養過程は、当業界に知られている適当な培地と培養条件により行われる。このような培養過程は、選択される菌株により当業者が容易に調整して用いることができる。具体的には、上記培養は、回分式、連続式及び／又は流加式であってもよいが、これに制限されるものではない。
【0221】
本出願の微生物を適当な炭素源、窒素源、リン源、無機化合物、アミノ酸及び／又はビタミンなどを含有した通常の培地内で好気性条件の下で温度、ｐＨなどを調節して培養することができる。
【0222】
本出願の培養において培養温度は２０～３５℃、具体的には２５～３５℃、２８～３５℃を維持してもよく、約１０～１６０時間、約２０時間～１３０時間、約２４時間～１２０時間、約３６時間～１２０時間、約４８時間～１２０時間、約４８時間、約７２時間、または約１２０時間培養してもよいが、これに限定されるものではない。
【0223】
本出願の培養により生産されたポリ－４－ヒドロキシブチレートは、培地中に分泌されたり微生物内に残留することができる。
【0224】
本出願のポリ－４－ヒドロキシブチレート生産方法は、本出願の微生物を準備する段階、上記微生物を培養するための培地を準備する段階、またはこれらの組合せ（手順に無関係、ｉｎ ａｎｙ ｏｒｄｅｒ）を、例えば、上記培養する段階前に、さらに含むことができる。
【0225】
本出願のポリ－４－ヒドロキシブチレート生産方法は、上記微生物の培養による培地（培養が行われた培地）または本出願の微生物からポリ－４－ヒドロキシブチレートを回収する段階をさらに含むことができる。上記回収する段階は、上記培養する段階後にさらに含まれてもよい。
【0226】
上記回収は、本出願の微生物の培養方法、例えば、回分式、連続式または流加式の培養方法などにより当該技術分野に公知となった適切な方法を利用して目的とするポリ－４－ヒドロキシブチレートを収集（ｃｏｌｌｅｃｔ）することであってもよい。例えば、遠心分離、濾過、結晶化タンパク質沈殿剤による処理（塩析法）、抽出、細胞破砕、超音波破砕、限外濾過、透析法、モレキュラーシーブクロマトグラフィー（ゲルろ過）、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、親和度クロマトグラフィーなどの各種クロマトグラフィー、ＨＰＬＣまたはこれらの方法を組み合わせて用いられてもよく、当該分野に公知となった適切な方法を利用して培地または微生物から目的とするポリ－４－ヒドロキシブチレートを回収することができる。
【0227】
また、本出願のポリ－４－ヒドロキシブチレート生産方法は、さらに精製段階を含むことができる。上記精製は、当該技術分野に公知となった適切な方法を利用して行うことができる。一例として、本出願のポリ－４－ヒドロキシブチレート生産方法が回収段階と精製段階をいずれも含む場合、上記回収段階と精製段階は、手順に関係なく異時的（または連続的）で行われたり、同時にまたは一つの段階に統合されて行われるが、これに制限されるものではない。
【0228】
本出願のもう一つの態様は、本出願の微生物を培養する段階；上記微生物または培地からポリ－４－ヒドロキシブチレートを回収する段階；及びポリ－４－ヒドロキシブチレートを１，４－ブタンジオールに分解する段階を含む１，４－ブタンジオール生産方法を提供する。
【0229】
本出願の１，４－ブタンジオール生産方法は、本出願の微生物が生産したポリ－４－ヒドロキシブチレートを１，４－ブタンジオールに分解する段階をさらに含んでもよい。本出願の１，４－ブタンジオール生産方法において、上記分解する段階は、上記培養する段階または上記回収する段階後にさらに含んでもよい。上記分解する段階は、当該技術分野に公知となった適切な方法を利用して行うことができる。一具現例として、上記ポリ－４－ヒドロキシブチレートを１，４－ブタンジオールに分解する段階は、熱分解、水素化、またはこれらの組合せであってもよい。
【0230】
本出願のもう一つの態様は、本出願の微生物またはその培養物を含むポリ－４－ヒドロキシブチレート生産用組成物を提供する。
【0231】
上記微生物、ポリ－４－ヒドロキシブチレートなどは他の様態で説明した通りである。
【0232】
本出願の組成物は、通常使用される任意の適した賦形剤をさらに含むことができ、このような賦形剤は、例えば、保存剤、湿潤剤、分散剤、懸濁化剤、緩衝剤、安定化剤または等張化剤などであってもよいが、これに限定されるものではない。
【0233】
本出願のもう一つの態様は、本出願の微生物またはその培養物のポリ－４－ヒドロキシブチレート生産への使用を提供する。
【0234】
本出願のもう一つの態様は、本出願の微生物またはその培養物の１，４－ブタンジオール生産への使用を提供する。
【0235】
上記微生物、ポリ－４－ヒドロキシブチレートなどは他の様態で説明した通りである。
【0236】
以下、本出願を実施例により、さらに詳しく説明する。しかし、下記実施例は、本出願を例示するための好ましい実施様態に過ぎず、したがって、本出願の権利範囲をこれに限定することには意図されない。一方、本明細書に記載されていない技術的な事項は、本出願の技術分野または類似技術分野において熟練した通常の技術者であれば、十分に理解し、容易に実施することができる。
【0237】
実施例１：ホスホエノールピルベートカルボキシラーゼ発現調節及び酸化的ＴＣＡ（Ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ＴＣＡ）経路を利用したＰ４ＨＢ生産
１－１：酸化的ＴＣＡ（Ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ＴＣＡ；ｏＴＣＡ）経路を利用したＰ４ＨＢ生産経路
大腸菌においてブドウ糖を用いてＰ４ＨＢ生産を評価した。ブドウ糖は、ホスホトランスフェラーゼ（Ｐｈｏｓｐｈｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）システムを通じて一つのホスホエノールピルベート（Ｐｈｏｓｐｈｏｅｎｏｌｐｙｒｕｖａｔｅ；ＰＥＰ）と一つのアセチル－ｃｏＡ及び二酸化炭素で酸化することができる。ＰＥＰは、一つの二酸化炭素を固定し、オキサロアセテート（ｏｘａｌｏａｃｅｔａｔｅ）にホスホエノールピルベートカルボキシラーゼ（ＰＥＰ ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ；ＰＰＣ）により変換することができる。アセチル－ｃｏＡとオキサロアセテートはシトレート（ｃｉｔｒａｔｅ）を経て２個の二酸化炭素と一つのスクシニル－ＣｏＡ（ｓｕｃｃｉｎｙｌ－ｃｏＡ）に酸化されることができる。ポリ－４－ヒドロキシブチレート（Ｐ４ＨＢ）は、このＴＣＡ経路の中間物質であるスクシニル－ＣｏＡから生産が可能であってもよい。スクシニル－ＣｏＡからＰ４ＨＢの生産は、ＮＡＤＨあるいはＮＡＤＰＨ依存的なスクシネートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ｓｕｃｃｉｎａｔｅ ｓｅｍｉａｌｄｅｈｙｄｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ；ＳｕｃＤ）によりスクシニルセミアルデヒド（ｓｕｃｃｉｎｙｌ ｓｅｍｉａｌｄｅｈｙｄｅ）に変換される。スクシニルセミアルデヒドは、ＮＡＤＨ依存的な４－ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ（４－ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒｉｃ ａｃｉｄ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ；４ＨｂＤ）により４－ヒドロキシブチレート（４－ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒａｔｅ；４ＨＢ）に変換され、これは、さらに４－ヒドロキシブチリル－ｃｏＡトランスフェラーゼ（４－ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒｙｌ－ＣｏＡ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ；ＯｒｆＺ）により４－ヒドロキシブチリル－ｃｏＡ（４－ｈｙｄｒｘｙｂｕｔｙｒｉｌ－ＣｏＡ）に変換することができる。最終的に、ポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）ポリメラーゼ（Ｐｏｌｙ（３－ｈｙｄｒｏｘｙａｌｋａｎｏａｔｅ）ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ；ＰｈａＣ）により４－ヒドロキシブチリル－ｃｏＡ（４－ｈｙｄｒｘｙｂｕｔｙｒｉｌ－ＣｏＡ）からポリ－４－ヒドロキシブチレート（ｐｏｌｙ－４－ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒａｔｅ；Ｐ４ＨＢ）が生成されるようにした。
１－１：酸化的ＴＣＡ（Ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ＴＣＡ；ｏＴＣＡ）経路を利用したＰ４ＨＢ生産経路
大腸菌においてブドウ糖を用いてＰ４ＨＢ生産を評価した。ブドウ糖は、ホスホトランスフェラーゼ（Ｐｈｏｓｐｈｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）システムを通じて一つのホスホエノールピルベート（Ｐｈｏｓｐｈｏｅｎｏｌｐｙｒｕｖａｔｅ；ＰＥＰ）と一つのアセチル－ｃｏＡ及び二酸化炭素で酸化することができる。ＰＥＰは、一つの二酸化炭素を固定し、オキサロアセテート（ｏｘａｌｏａｃｅｔａｔｅ）にホスホエノールピルベートカルボキシラーゼ（ＰＥＰ ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ；ＰＰＣ）により変換することができる。アセチル－ｃｏＡとオキサロアセテートはシトレート（ｃｉｔｒａｔｅ）を経て２個の二酸化炭素と一つのスクシニル－ＣｏＡ（ｓｕｃｃｉｎｙｌ－ｃｏＡ）に酸化されることができる。ポリ－４－ヒドロキシブチレート（Ｐ４ＨＢ）は、このＴＣＡ経路の中間物質であるスクシニル－ＣｏＡから生産が可能であってもよい。スクシニル－ＣｏＡからＰ４ＨＢの生産は、ＮＡＤＨあるいはＮＡＤＰＨ依存的なスクシネートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ｓｕｃｃｉｎａｔｅ ｓｅｍｉａｌｄｅｈｙｄｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ；ＳｕｃＤ）によりスクシニルセミアルデヒド（ｓｕｃｃｉｎｙｌ ｓｅｍｉａｌｄｅｈｙｄｅ）に変換される。スクシニルセミアルデヒドは、ＮＡＤＨ依存的な４－ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ（４－ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒｉｃ ａｃｉｄ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ；４ＨｂＤ）により４－ヒドロキシブチレート（４－ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒａｔｅ；４ＨＢ）に変換され、これは、さらに４－ヒドロキシブチリル－ｃｏＡトランスフェラーゼ（４－ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒｙｌ－ＣｏＡ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ；ＯｒｆＺ）により４－ヒドロキシブチリル－ｃｏＡ（４－ｈｙｄｒｘｙｂｕｔｙｒｉｌ－ＣｏＡ）に変換することができる。最終的に、ポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）ポリメラーゼ（Ｐｏｌｙ（３－ｈｙｄｒｏｘｙａｌｋａｎｏａｔｅ）ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ；ＰｈａＣ）により４－ヒドロキシブチリル－ｃｏＡ（４－ｈｙｄｒｘｙｂｕｔｙｒｉｌ－ＣｏＡ）からポリ－４－ヒドロキシブチレート（ｐｏｌｙ－４－ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒａｔｅ；Ｐ４ＨＢ）が生成されるようにした。
【0238】
前述したＳｕｃＤ、４ＨｂＤ、ＯｒｆＺ、ＰｈａＣ、ＰＰＣ及びこれらの遺伝子配列は、配列番号１～配列番号８、配列番号１３、及び配列番号１４に示した。
【0239】
１－２：ホスホエノールピルベートカルボキシラーゼ発現調節用プロモーターの製作
菌体成長に必須の窒素源を制限することにより菌体成長を抑制させ、炭素の流れを目標物質であるＰ４ＨＢに誘導させることにより、その生産性を増加させることにした。ただし、大腸菌のホスホエノールピルベートカルボキシラーゼ（ＰＥＰ ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ）をコードするｐｐｃ遺伝子のプロモーターが窒素制限の条件で調節因子（Ｎａｃ，ＤＮＡ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｄｕａｌ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ）により発現が阻害されるため、これを克服するためのプロモーターを製作することにした。
菌体成長に必須の窒素源を制限することにより菌体成長を抑制させ、炭素の流れを目標物質であるＰ４ＨＢに誘導させることにより、その生産性を増加させることにした。ただし、大腸菌のホスホエノールピルベートカルボキシラーゼ（ＰＥＰ ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ）をコードするｐｐｃ遺伝子のプロモーターが窒素制限の条件で調節因子（Ｎａｃ，ＤＮＡ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｄｕａｌ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ）により発現が阻害されるため、これを克服するためのプロモーターを製作することにした。
【0240】
このために、野生のプロモーター（Ｐｎ）と同等またはそれ以上の発現強度を有し、調節因子Ｎａｃの影響を受けないプロモーターを製作し、Ｐｎプロモーター配列は、次の通りである。
【0241】
５’－ＴＣＧＣＡＧＣＡＴＴＴＧＡＣＧＴＣＡＣＣＧＣＴＴＴＴＡＣＧＴＧＧＣＴＴＴＡＴＡＡＡＡＧＡＣＧＡＣＧＡＡＡＡＧＣＡＡＡＧＣＣＣＧＡＧＣＡＴＡＴＴＣＧＣＧＣＣＡＡＴＧＣＧＡＣＧＴＧＡＡＧＧＡＴＡＣＡＧＧＧＣＴＡＴＣＡＡＡＣＧＡＴＡＡＧＡＴＧＧＧＧＴＧＴＣＴＧＧＧＧＴＡＡＴ－３’（配列番号６０）
【0242】
その結果、下記表１に示されるように、Ｐｎと同一の強度のプロモーター１種（Ｐｓｙｎｋ１）及び約１５倍強いプロモーター１種（ＰｓｙｎＫ２）を確認した。
【0243】
【表1】
【0244】
培地は、ブドウ糖を炭素源とするＭ９－最少培地を用い、４８時間、８００ｒｐｍ、３７℃の条件で９６ウェルプレートで培養後、吸光度を測定した。
【0245】
１－３：Ｐ４ＨＢ生産菌株の製作
実施例１－２で製作したプロモーター３種を実施例１－１のＰ４ＨＢ生合成経路が構築されている微生物菌株に導入し、Ｐ４ＨＢ生産菌株である次のような微生物３種を製作した。下記のＳｕｃＤ、４ＨｂＤ、ＯｒｆＺ、ＰｈａＣ、ＰＰＣ及びこれらの遺伝子配列は、配列番号１～配列番号８、配列番号１３、及び配列番号１４に示した。
実施例１－２で製作したプロモーター３種を実施例１－１のＰ４ＨＢ生合成経路が構築されている微生物菌株に導入し、Ｐ４ＨＢ生産菌株である次のような微生物３種を製作した。下記のＳｕｃＤ、４ＨｂＤ、ＯｒｆＺ、ＰｈａＣ、ＰＰＣ及びこれらの遺伝子配列は、配列番号１～配列番号８、配列番号１３、及び配列番号１４に示した。
【0246】
【表2】
【0247】
目標遺伝子の発現のために用いられたプロモーターはＰｕｓｐＡ、ＰｓｙｎＫ１、及びＰｓｙｎＫ２があり、これらに関する遺伝子情報はｅｃｏｃｙｃ．ｏｒｇとｐａｒｔｓ．ｉｇｅｍ．ｏｒｇで得ることができる。用いられたプロモーター配列は、次の通りである。
【0248】
－ ＰｓｙｎＫ１（５’－ｔｔｔａｃａｇｃｔａｇｃｔｃａｇｔｃｃｔａｇｇｔａｔｔａｔｇｃｔａｇｃ－３’）；配列番号４５
－ ＰｓｙｎＫ２（５’－ｃｔｇａｃａｇｃｔａｇｃｔｃａｇｔｃｃｔａｇｇｔａｔａａｔｇｃｔａｇｃ－３’）；配列番号４６
－ ＰｕｓｐＡ（５’－ＡＡＣＣＡＣＴＡＴＣＡＡＴＡＴＡＴＴＣＡＴＧＴＣＧＡＡＡＡＴＴＴＧＴＴＴＡＴＣＴＡＡＣＧＡＧＴＡＡＧＣＡＡＧＧＣＧＧＡＴＴＧＡＣＧＧＡＴＣＡＴＣＣＧＧＧＴＣＧＣＴＡＴＡＡＧＧＴＡＴＡＧＴＴＣＧＣＡＧＧ ＡＣＧＣＧＧＧＴＧＡＣＧＴＡＡＣＧＧＣＡＣＡＡＧＡＡＡＣＧ－３’）；配列番号４７
－ ＰｓｙｎＫ２（５’－ｃｔｇａｃａｇｃｔａｇｃｔｃａｇｔｃｃｔａｇｇｔａｔａａｔｇｃｔａｇｃ－３’）；配列番号４６
－ ＰｕｓｐＡ（５’－ＡＡＣＣＡＣＴＡＴＣＡＡＴＡＴＡＴＴＣＡＴＧＴＣＧＡＡＡＡＴＴＴＧＴＴＴＡＴＣＴＡＡＣＧＡＧＴＡＡＧＣＡＡＧＧＣＧＧＡＴＴＧＡＣＧＧＡＴＣＡＴＣＣＧＧＧＴＣＧＣＴＡＴＡＡＧＧＴＡＴＡＧＴＴＣＧＣＡＧＧ ＡＣＧＣＧＧＧＴＧＡＣＧＴＡＡＣＧＧＣＡＣＡＡＧＡＡＡＣＧ－３’）；配列番号４７
【0249】
前述したＰ４ＨＢ生合成経路が構築されている微生物の製作には、汎用的に用いられる技術を適用した（代表文献：Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｔｈｒｉｄ Ｅｄ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（２００１））。具体的には、目的遺伝子は、公知のデータベースで遺伝子情報を収得し、遺伝子及びそのためのプライマーを製作し、ＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）を通じて対象遺伝子を増幅することにより、目的とするベクター（ｐＣＬ）にリガーゼを用いて導入した。または、化学的に合成する方法も用い、これは、大腸菌で発現が円滑になされるように、コドン最適化が必要な場合に用いた。目標遺伝子の発現のためには、プロモーターとターミネーターをＰＣＲを通じて対象遺伝子に連結した。このように製作されたベクターを対象菌株に導入するために、一般的な熱衝撃（Ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ）技術を用いた。さらに高い効率が必要な場合は、電気穿孔（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）技術を用いた。
【0250】
遺伝子発現以外に染色体上で特定遺伝子の弱化／欠失はオリゴマーを用い、一般に知られたＲｅｄ／ＥＴ ｒｅｃｏｍｂｉｎｅｅｒｉｎｇを用い、関連技術はＤａｔｓｅｎｋｏ ａｎｄ Ｗａｎｎｅｒ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，ＵＳＡ、２０００，９７，６６４０－６６４５）に報告された技術を用いた。欠失に用いられたオリゴマーは、次の通りである。
【0251】
ｐｙｋＦ－Ｌｅｆｔ（配列番号４８）
ＧＡＡＡＧＣＡＡＧＴＴＴＣＴＣＣＣＡＴＣＣＴＴＣＴＣＡＡＣＴＴＡＡＡＧＡＣＴＡＡＧＡＣＴＧＴＣＡＴＧ
ｐｙｋＦ－ｒｉｇｈｔ（配列番号４９）
ＧＡＴＡＴＡＣＡＡＡＴＴＡＡＴＴＣＡＣＡＡＡＡＧＣＡＡＴＡＴＴＡＣＡＧＧＡＣＧＴＧＡＡＣＡＧＡＴＧＣ
ｐｙｋＡ－Ｌｅｆｔ（配列番号５０）
ＴＴＴＣＡＴＧＴＴＣＡＡＧＣＡＡＣＡＣＣＴＧＧＴＴＧＴＴＴＣＡＧＴＣＡＡＣＧＧＡＧＴＡＴＴＡＣＡＴＧ
ｐｙｋＡ－ｒｉｇｈｔ（配列番号５１）
ＴＧＧＣＧＴＴＴＴＣＧＣＣＧＣＡＴＣＣＧＧＣＡＡＣＧＴＡＣＴＴＡＣＴＣＴＡＣＣＧＴＴＡＡＡＡＴＡＣＧ
ｍａｅＢ－ｌｅｆｔ（配列番号５２）
ＴＴＣＡＧＧＧＴＡＡＧＣＧＴＧＡＧＡＧＴＴＡＡＡＡＡＡＡＡＴＴＡＣＡＧＣＧＧＴＴＧＧＧＴＴＴＧＣＧＣ
ｍａｅＢ－ｒｉｇｈｔ（配列番号５３）
ＴＴＧＣＣＣＡＣＡＣＡＣＴＴＴＡＴＴＴＧＴＧＡＡＣＧＴＴＡＣＧＴＧＡＡＡＧＧＡＡＣＡＡＣＣＡＡＡＴＧ
ｍａｅＡ－ｌｅｆｔ（配列番号５４）
ＣＣＣＧＧＴＡＧＣＣＴＴＣＡＣＴＡＣＣＧＧＧＣＧＣＡＧＧＣＴＴＡＧＡＴＧＧＡＧＧＴＡＣＧＧＣＧＧＴＡ
ｍａｅＡ－ｒｉｇｈｔ（配列番号５５）
ＧＧＣＣＧＡＣＧＣＣＣＴＧＧＣＧＧＴＡＡＡＧＣＡＡＡＧＡＣＧＡＴＡＡＡＡＧＣＣＣＣＣＣＡＧＧＧＡＴＧ
ａｓｐＣ－ｌｅｆｔ（配列番号５６）
ＴＴＴＴＣＡＧＣＧＧＧＣＴＴＣＡＴＴＧＴＴＴＴＴＡＡＴＧＣＴＴＡＣＡＧＣＡＣＴＧＣＣＡＣＡＡＴＣＧＣ
ａｓｐＣ－ｒｉｇｈｔ（配列番号５７）
ＴＡＣＣＣＴＧＡＴＡＧＣＧＧＡＣＴＴＣＣＣＴＴＣＴＧＴＡＡＣＣＡＴＡＡＴＧＧＡＡＣＣＴＣＧＴＣＡＴＧ
Ｉｃｄ－ｌｅｆｔ（配列番号５８）
ＡＡＣＧＴＧＧＴＧＧＣＡＧＡＣＧＡＧＣＡＡＡＣＣＡＧＴＡＧＣＧＣＴＣＧＡＡＧＧＡＧＡＧＧＴＧＡＡＴＧ
Ｉｃｄ－ｒｉｇｈｔ（配列番号５９）
ＣＣＣＧＴＴＡＡＴＡＡＡＴＴＴＡＡＣＡＡＡＣＴＡＣＧＧＣＡＴＴＡＣＡＴＧＴＴＴＴＣＧＡＴＧＡＴＣＧＣ
ＧＡＡＡＧＣＡＡＧＴＴＴＣＴＣＣＣＡＴＣＣＴＴＣＴＣＡＡＣＴＴＡＡＡＧＡＣＴＡＡＧＡＣＴＧＴＣＡＴＧ
ｐｙｋＦ－ｒｉｇｈｔ（配列番号４９）
ＧＡＴＡＴＡＣＡＡＡＴＴＡＡＴＴＣＡＣＡＡＡＡＧＣＡＡＴＡＴＴＡＣＡＧＧＡＣＧＴＧＡＡＣＡＧＡＴＧＣ
ｐｙｋＡ－Ｌｅｆｔ（配列番号５０）
ＴＴＴＣＡＴＧＴＴＣＡＡＧＣＡＡＣＡＣＣＴＧＧＴＴＧＴＴＴＣＡＧＴＣＡＡＣＧＧＡＧＴＡＴＴＡＣＡＴＧ
ｐｙｋＡ－ｒｉｇｈｔ（配列番号５１）
ＴＧＧＣＧＴＴＴＴＣＧＣＣＧＣＡＴＣＣＧＧＣＡＡＣＧＴＡＣＴＴＡＣＴＣＴＡＣＣＧＴＴＡＡＡＡＴＡＣＧ
ｍａｅＢ－ｌｅｆｔ（配列番号５２）
ＴＴＣＡＧＧＧＴＡＡＧＣＧＴＧＡＧＡＧＴＴＡＡＡＡＡＡＡＡＴＴＡＣＡＧＣＧＧＴＴＧＧＧＴＴＴＧＣＧＣ
ｍａｅＢ－ｒｉｇｈｔ（配列番号５３）
ＴＴＧＣＣＣＡＣＡＣＡＣＴＴＴＡＴＴＴＧＴＧＡＡＣＧＴＴＡＣＧＴＧＡＡＡＧＧＡＡＣＡＡＣＣＡＡＡＴＧ
ｍａｅＡ－ｌｅｆｔ（配列番号５４）
ＣＣＣＧＧＴＡＧＣＣＴＴＣＡＣＴＡＣＣＧＧＧＣＧＣＡＧＧＣＴＴＡＧＡＴＧＧＡＧＧＴＡＣＧＧＣＧＧＴＡ
ｍａｅＡ－ｒｉｇｈｔ（配列番号５５）
ＧＧＣＣＧＡＣＧＣＣＣＴＧＧＣＧＧＴＡＡＡＧＣＡＡＡＧＡＣＧＡＴＡＡＡＡＧＣＣＣＣＣＣＡＧＧＧＡＴＧ
ａｓｐＣ－ｌｅｆｔ（配列番号５６）
ＴＴＴＴＣＡＧＣＧＧＧＣＴＴＣＡＴＴＧＴＴＴＴＴＡＡＴＧＣＴＴＡＣＡＧＣＡＣＴＧＣＣＡＣＡＡＴＣＧＣ
ａｓｐＣ－ｒｉｇｈｔ（配列番号５７）
ＴＡＣＣＣＴＧＡＴＡＧＣＧＧＡＣＴＴＣＣＣＴＴＣＴＧＴＡＡＣＣＡＴＡＡＴＧＧＡＡＣＣＴＣＧＴＣＡＴＧ
Ｉｃｄ－ｌｅｆｔ（配列番号５８）
ＡＡＣＧＴＧＧＴＧＧＣＡＧＡＣＧＡＧＣＡＡＡＣＣＡＧＴＡＧＣＧＣＴＣＧＡＡＧＧＡＧＡＧＧＴＧＡＡＴＧ
Ｉｃｄ－ｒｉｇｈｔ（配列番号５９）
ＣＣＣＧＴＴＡＡＴＡＡＡＴＴＴＡＡＣＡＡＡＣＴＡＣＧＧＣＡＴＴＡＣＡＴＧＴＴＴＴＣＧＡＴＧＡＴＣＧＣ
【0252】
１－４：Ｐ４ＨＢ生産菌株のＰ４ＨＢ生産能の評価
実施例１－３で製作した菌株３種のＰ４ＨＢ生産テストを進めるためにフラスコ実験を行った。培養条件は４８時間、２３０ｒｐｍ、及び３０℃であり、培地は、以前に公開された資料を基に製作して用いた（米国特許第９，０８４，４６７号明細書）。具体的には、１ｘＥ２最少培地に１ｘ微量元素（Ｔｒａｃｅ ｓａｌｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を添加して培地を製造し、その炭素：窒素比率（Ｃ／Ｎ ｒａｔｉｏ）を３０：１に調節して用いた。
実施例１－３で製作した菌株３種のＰ４ＨＢ生産テストを進めるためにフラスコ実験を行った。培養条件は４８時間、２３０ｒｐｍ、及び３０℃であり、培地は、以前に公開された資料を基に製作して用いた（米国特許第９，０８４，４６７号明細書）。具体的には、１ｘＥ２最少培地に１ｘ微量元素（Ｔｒａｃｅ ｓａｌｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を添加して培地を製造し、その炭素：窒素比率（Ｃ／Ｎ ｒａｔｉｏ）を３０：１に調節して用いた。
【0253】
Ｐ４ＨＢ分析条件は、公開された文献（米国特許第９，０８４，４６７号明細書）を参照して設定した。簡略に説明すると、前述したように、菌株３種の培養物をそれぞれ１ｍＬ採取して４，０００ｒｐｍで菌体を回収した。回収した菌株を凍結乾燥した後、サンプルのブタノール溶解（Ｂｕｔａｎｏｌｙｓｉｓ）を進めるための製剤（Ｄｉｏｘａｎｅ溶液に９９．９％のブタノール及び４Ｎ ＨＣｌを添加した製剤）を添加し、９３℃で６時間熱処理した。熱処理した溶液を６００ｒｐｍで相分離させ、有機相（Ｏｒｇａｎｉｃ ｐｈａｓｅ）を採取してガスクロマトグラフィー（ＧＣ）分析した。４－ヒドロキシブチレート（４ＨＢ）の標準試薬は１０％のγ－ブチロラクトン（γ－ｂｕｔｙｒｏｌａｃｔｏｎｅ）を用いて製造した。
【0254】
上記のような条件を用いて分析を進めた結果、下記表３に示されるように、窒素制限を受けていないプロモーターであるＰｓｙｎＫ１を含む菌株でＰｎを含む菌株よりＰ４ＨＢ濃度が２２％向上したことを確認した。
【0255】
【表3】
【0256】
一方、表３から過度に強いプロモーターを用いる場合（ＰｓｙｎＫ２）、窒素制限因子に影響を受けなくてもＰ４ＨＢ生産性が向上しないことをさらに確認した。
【0257】
実施例２：還元型ＴＣＡ（ｒＴＣＡ）経路を利用したＰ４ＨＢの生産
ホスホエノールピルベートカルボキシラーゼのカルボキシル化反応により固定された二酸化炭素を還元型ＴＣＡ経路を利用してＰ４ＨＢ生産経路で誘導することにした。還元型ＴＣＡ経路を通じたＰ４ＨＢ生産においてホスホエノールピルベートカルボキシラーゼ酵素を通じてホスホエノールピルベートから生成されたオキサロアセテートは、酸化的（ｏｘｉｄａｔｉｖｅ）ＴＣＡ経路に含まれた脱カルボキシル化（ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｔｉｏｎ）過程を経ないため、二酸化炭素の発生なしにマレート（ｍａｌａｔｅ）、フマレート（ｆｕｍａｒａｔｅ）、及びスクシネート（ｓｕｃｃｉｎａｔｅ）を経てスクシニル－ＣｏＡまで還元することができる。生成されたスクシニル－ＣｏＡは、実施例１－１の経路と同様の方法を経てＰ４ＨＢに変換することができる。
ホスホエノールピルベートカルボキシラーゼのカルボキシル化反応により固定された二酸化炭素を還元型ＴＣＡ経路を利用してＰ４ＨＢ生産経路で誘導することにした。還元型ＴＣＡ経路を通じたＰ４ＨＢ生産においてホスホエノールピルベートカルボキシラーゼ酵素を通じてホスホエノールピルベートから生成されたオキサロアセテートは、酸化的（ｏｘｉｄａｔｉｖｅ）ＴＣＡ経路に含まれた脱カルボキシル化（ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｔｉｏｎ）過程を経ないため、二酸化炭素の発生なしにマレート（ｍａｌａｔｅ）、フマレート（ｆｕｍａｒａｔｅ）、及びスクシネート（ｓｕｃｃｉｎａｔｅ）を経てスクシニル－ＣｏＡまで還元することができる。生成されたスクシニル－ＣｏＡは、実施例１－１の経路と同様の方法を経てＰ４ＨＢに変換することができる。
【0258】
効率的なｒＴＣＡ経路の活性化のために、ピルビン酸キナーゼ（ｐｙｒｕｖａｔｅ ｋｉｎａｓｅ）遺伝子（ｐｙｋＦＡ）が除去された菌株（下記の菌株番号４）を製作した。製作した菌株３種は下記表４に示し、下記の菌株番号３は前述した表２の菌株番号３と同一である。下記のＳｕｃＤ、４ＨｂＤ、ＯｒｆＺ、ＰｈａＣ、ＰＰＣ及びこれらの遺伝子配列は、配列番号１～配列番号８、配列番号１３、及び配列番号１４に示した。また、下記のＭａｅＡＢ、ＡｓｐＣ、ＰｙｋＦＡ、及びこれらの遺伝子配列は、配列番号９～配列番号１２、配列番号２１～配列番号２４、配列番号２９、配列番号３０に示した。
【0259】
【表4】
【0260】
ピルビン酸キナーゼを除去する場合、ＰＥＰからピルベートに向かう炭素の流れを制御し、ＰＥＰの細胞内の濃度を保存し、これに基づいてＰＥＰカルボキシラーゼ経路の活性化を促進することができる。これを通じてｒＴＣＡ経路に必須のオキサロアセテートの細胞内の濃度を高めることを示唆する。
【0261】
追加的に、確保されたオキサロアセテートとマレートなどのｒＴＣＡ経路上の競争経路を除去するために、アミノトランスフェラーゼ（ａｓｐａｒｔａｔｅ ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ；ＡｓｐＣ）とマレートデヒドロゲナーゼ（ｍａｌｉｃ ｅｎｚｙｍｅ；ＭａｅＡＢ）をさらに除去した菌株も製作（上記菌株番号５）し、ｒＴＣＡ基盤のＰ４ＨＢ生産評価を進めた。
【0262】
上記の表４の菌株を対象に、実施例１－４と同様の方法でＰ４ＨＢ生産性評価を行い、ｒＴＣＡ経路が活性化される場合、菌体成長が向上し、図７に示されるように、ｒＴＣＡ経路が導入された菌株（菌株番号４及び５）でｒＴＣＡ経路が導入されていない菌株（菌株番号３）に比べてＰ４ＨＢ収率が約２８％から最大４３％まで向上したことを確認した。ｒＴＣＡ経路を利用する場合、既存の４８ｗｔ％水準のＰ４ＨＢ理論的最大収率を５８ｗｔ％まで向上させることができた。
【0263】
実施例３：グリオキシレート経路を利用したＰ４ＨＢの生産
グリオキシレート経路（Ｇｌｙｏｘｙｌａｔｅ ｃｙｃｌｅ）を利用してＰ４ＨＢ生産を行うことにより、２－オキソグルタレート（２－ｏｘｏｇｌｕｔａｒｔａｔｅ）の脱カルボキシル化（ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｔｉｏｎ）経路を迂回して二酸化炭素への炭素損失を減らし、結果的に、Ｐ４ＨＢの生産収率を増加させることにした。
グリオキシレート経路（Ｇｌｙｏｘｙｌａｔｅ ｃｙｃｌｅ）を利用してＰ４ＨＢ生産を行うことにより、２－オキソグルタレート（２－ｏｘｏｇｌｕｔａｒｔａｔｅ）の脱カルボキシル化（ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｔｉｏｎ）経路を迂回して二酸化炭素への炭素損失を減らし、結果的に、Ｐ４ＨＢの生産収率を増加させることにした。
【0264】
この経路の活性化のために、ＴＣＡ経路上のイソシトレートデヒドロゲナーゼ（ｉｓｏｃｉｔｒａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ；ｉｃｄ）を除去し、炭素の流れを強制的にグリオキシレート経路に誘導させた。グリオキシレート経路の活性化のために、大腸菌由来のイソシトレートリアーゼ（ｉｓｏｃｉｔｒａｔｅ ｌｙａｓｅ；ａｃｅＡ）及びマレートシンターゼ（ｍａｌａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ；ａｃｅＢ）を導入するが、導入される微生物内の既存の野生型プロモーターを合成プロモーターで交換してブドウ糖基盤のカタボリック抑制（Ｃａｔａｂｏｌｉｃ ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ）を受けないようにした。製作した菌株２種は、下記表５に示した。下記のＳｕｃＤ、４ＨｂＤ、ＯｒｆＺ、ＰｈａＣ、ＰＰＣ及びこれらの遺伝子配列は、配列番号１～配列番号８、配列番号１３、及び配列番号１４に示した。また、下記のＩｃｄ、ＡｃｅＢＡ、及びその遺伝子配列は、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号４３、及び配列番号４４に示した。
【0265】
【表5】
【0266】
そのとき、グリオキシレート経路の生成物であるスクシネートとマレートはいずれも還元型ＴＣＡ経路を利用してスクシニル－ＣｏＡに変換することができる。生成されたスクシニル－ＣｏＡは、上記実施例１－１のＰ４ＨＢ生成経路を通じてＰ４ＨＢに変換することができる。このように製作された菌株の発酵時、グルタミン酸（ｇｌｕｔａｍａｔｅ）を外部で補強するために、Ｍｏｎｏｓｏｄｉｕｍ ｇｌｕｔａｍａｔｅ（ＭＳＧ）５０ｍＭを添加した。このように製作された菌株をブドウ糖培地に培養してＰＨＡ生産を確認した結果、図８に示されるように、２．７ｇ／ＬのＰＨＡが生産されること（菌株番号７ ＧＬＵ＋ＭＳＧ）を確認した。グリオキシレート経路が導入されていない菌株（菌株番号６）でＰＨＡ生産は０．９ｇ／Ｌに止まり、グリオキシレート経路が導入されていてもブドウ糖がない場合（菌株番号７ ＭＳＧ）、ＰＨＡの生産は観測されなかった。本方法を通じて既存の理論的最大収率４８ｗｔ％から５８ｗｔ％まで向上させることができた。
【0267】
以上の説明から、本出願が属する技術分野の当業者であれば、本出願がその技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態で実施されうることが理解できるだろう。これに関連し、以上で記述した実施例はあくまで例示的なものであり、限定的なものでないことを理解すべきである。本出願の範囲は上記詳細な説明よりは、後述する特許請求の範囲の意味及び範囲、そしてその等価概念から導かれるあらゆる変更または変形された形態が本出願の範囲に含まれるものと解釈すべきである。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【配列表】
【国際調査報告】