特表 2024-522876 アデノ随伴ウイルスパッケージングシステム

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-06-21

(54)【発明の名称】アデノ随伴ウイルスパッケージングシステム

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/864 20060101AFI20240614BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20240614BHJP

   C12N 15/113 20100101ALI20240614BHJP

   C12N 15/55 20060101ALI20240614BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20240614BHJP

【ＦＩ】

C12N15/864 100Z

C12N15/63 Z ZNA

C12N15/113 Z

C12N15/55

C12N5/10

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023579393

(86)(22)【出願日】2022-06-24

(85)【翻訳文提出日】2023-12-21

(86)【国際出願番号】 US2022073138

(87)【国際公開番号】W WO2022272297

(87)【国際公開日】2022-12-29

(31)【優先権主張番号】63/202,817

(32)【優先日】2021-06-25

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/262,218

(32)【優先日】2021-10-07

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/266,646

(32)【優先日】2022-01-11

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】523480783

【氏名又は名称】オックスフォード バイオメディカ ソリューションズ エルエルシー

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本 健策

(72)【発明者】

【氏名】バン リースハウト， ローラ

(72)【発明者】

【氏名】スタンビック， マリッサ

【テーマコード（参考）】

4B065

【Ｆターム（参考）】

4B065AA90X

4B065AA90Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065AC20

4B065BA02

4B065CA44

(57)【要約】

本明細書では、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）の産生のためのデュアルベクタートランスフェクションシステムが提供される。デュアルベクタートランスフェクションシステムは、一般的に：（１）ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、導入遺伝子を含むｒＡＡＶゲノムを含む第２のヌクレオチド配列、及びＡＡＶキャプシドタンパク質をコードする第３のヌクレオチド配列、を含む第１の核酸ベクター；ならびに（２）ヘルパーウイルス遺伝子を含む第２の核酸ベクター、を含む。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列と；
導入遺伝子を含む組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ゲノムを含む第２のヌクレオチド配列と；
ＡＡＶキャプシドタンパク質をコードする第３のヌクレオチド配列と、を含み、
ヘルパーウイルス遺伝子を含まない、第１の核酸ベクター。

【請求項2】

５’から３’方向に：
ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質をコードする前記第１のヌクレオチド配列と；
導入遺伝子を含む組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ゲノムを含む前記第２のヌクレオチド配列と；
ＡＡＶキャプシドタンパク質をコードする前記第３のヌクレオチド配列と、を含み、
ヘルパーウイルス遺伝子を含まない、請求項１に記載の核酸ベクター。

【請求項3】

５’から３’方向に：
ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質をコードする前記第１のヌクレオチド配列と；
導入遺伝子を含む組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ゲノムを含む前記第２のヌクレオチド配列と；
ＡＡＶキャプシドタンパク質をコードする前記第３のヌクレオチド配列と、を含む、請求項１に記載の核酸ベクター。

【請求項4】

前記核酸ベクターが、ＤＮＡプラスミドまたはＤＮＡ最小ベクターである、請求項１～３のいずれか１項に記載の核酸ベクター。

【請求項5】

（ｉ）第１の核酸ベクターであって：
ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列；
導入遺伝子を含む組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ゲノムを含む第２のヌクレオチド配列；及び
ＡＡＶキャプシドタンパク質をコードする第３のヌクレオチド配列、を含む、前記第１の核酸ベクターと；
（ｉｉ）：ヘルパーウイルス遺伝子を含む第２の核酸ベクターと、を含む、
組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）パッケージングシステム。

【請求項6】

前記第１の核酸ベクターが、５’から３’方向に：
ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質をコードする前記第１のヌクレオチド配列と；
導入遺伝子を含む組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ゲノムを含む前記第２のヌクレオチド配列と；
ＡＡＶキャプシドタンパク質をコードする前記第３のヌクレオチド配列と、を含む、請求項５記載のパッケージングシステム。

【請求項7】

前記第１の核酸ベクターが、ＤＮＡプラスミドまたはＤＮＡ最小ベクターである、請求項５または６に記載のパッケージングシステム。

【請求項8】

前記第２の核酸ベクターが、ＤＮＡプラスミドまたはＤＮＡ最小ベクターである、請求項５～７のいずれか１項に記載のパッケージングシステム。

【請求項9】

前記導入遺伝子が、ポリペプチドをコードする、請求項１～８のいずれか１項に記載の核酸ベクターまたはパッケージングシステム。

【請求項10】

前記導入遺伝子が、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ｇＲＮＡ、アンタゴミル（ａｎｔａｇｏｍｉｒ）、ｍｉＲＮＡスポンジ、ＲＮＡアプタザイム、ＲＮＡアプタマー、ｌｎｃＲＮＡ、リボザイム、またはｍＲＮＡをコードする、請求項１～８のいずれか１項に記載の核酸ベクターまたはパッケージングシステム。

【請求項11】

前記導入遺伝子は、グルコース－６－ホスファターゼ（Ｇ６Ｐａｓｅ）またはフラタキシン（ＦＸＮ）をコードする、請求項１～８のいずれか１項に記載の核酸ベクターまたはパッケージングシステム。

【請求項12】

前記ｒＡＡＶゲノムが、前記導入遺伝子に作動可能に連結された転写調節エレメントをさらに含む、先行請求項のいずれかに記載の核酸ベクターまたはパッケージングシステム。

【請求項13】

前記転写調節エレメントが、プロモーターエレメント及び／またはイントロンエレメントを含む、請求項１２記載の核酸ベクターまたはパッケージングシステム。

【請求項14】

前記ｒＡＡＶゲノムが、ポリアデニル化配列をさらに含む、先行請求項のいずれかに記載の核酸ベクターまたはパッケージングシステム。

【請求項15】

前記ポリアデニル化配列が、前記導入遺伝子に対して３’である、請求項１４に記載の核酸ベクターまたはパッケージングシステム。

【請求項16】

前記ｒＡＡＶゲノムが、前記導入遺伝子の５’の５’逆位末端反復（５’ＩＴＲ）ヌクレオチド配列、及び前記導入遺伝子の３’の３’逆位末端反復（３’ＩＴＲ）ヌクレオチド配列をさらに含む、先行請求項のいずれかに記載の核酸ベクターまたはパッケージングシステム。

【請求項17】

前記ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質が、野生型Ｒｅｐタンパク質またはそのバリアントである、先行請求項のいずれかに記載の核酸ベクターまたはパッケージングシステム。

【請求項18】

前記ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質が、ＡＡＶ２ Ｒｅｐタンパク質またはそのバリアントである、先行請求項のいずれかに記載の核酸ベクターまたはパッケージングシステム。

【請求項19】

前記第１のヌクレオチド配列が、前記ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質コード配列に作動可能に連結された転写調節エレメントをさらに含む、先行請求項のいずれかに記載の核酸ベクターまたはパッケージングシステム。

【請求項20】

前記転写調節エレメントが、構成的プロモーター、誘導性プロモーターまたは天然プロモーターからなる群から選択されるプロモーターを含む、請求項１９に記載の核酸ベクターまたはパッケージングシステム。

【請求項21】

前記プロモーターが、Ｐ５プロモーター、Ｐ１９プロモーター、メタロチオニン（ＭＴ）プロモーター、マウス乳腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、Ｔ７プロモーター、エクジソン昆虫プロモーター、テトラサイクリン抑制プロモーター、テトラサイクリン誘導性プロモーター、ＲＵ４８６誘導性プロモーター、及びラパマイシン誘導性プロモーターからなる群から選択される、請求項２０に記載の核酸ベクターまたはパッケージングシステム。

【請求項22】

前記ＡＡＶキャプシドタンパク質が、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶＲｈ３２．３３、ＡＡＶｒｈ７４、ＡＡＶ－ＤＪ、ＡＡＶ－ＬＫ０３、ＮＰ５９、ＶＯＹ１０１、ＶＯＹ２０１、ＶＯＹ７０１、ＶＯＹ８０１、ＶＯＹ１１０１、ＡＡＶＰＨＰ．Ｎ、ＡＡＶＰＨＰ．Ａ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ、ＰＨＰ．Ｂ２、ＰＨＰ．Ｂ３、Ｇ２Ａ３、Ｇ２Ｂ４、Ｇ２Ｂ５、及びＰＨＰ．Ｓ．からなる群から選択される、先行請求項のいずれかに記載の核酸ベクターまたはパッケージングシステム。

【請求項23】

前記第３のヌクレオチド配列が、前記ＡＡＶキャプシドタンパク質コード配列に作動可能に連結された転写調節エレメントをさらに含む、先行請求項のいずれかに記載の核酸ベクターまたはパッケージングシステム。

【請求項24】

前記転写調節エレメントが、構成的プロモーター、誘導性プロモーターまたは天然プロモーターからなる群から選択されるプロモーターを含む、請求項２３に記載の核酸ベクターまたはパッケージングシステム。

【請求項25】

前記プロモーターが、Ｐ４０プロモーター、メタロチオニン（ＭＴ）プロモーター、マウス乳腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、Ｔ７プロモーター、エクジソン昆虫プロモーター、テトラサイクリン抑制プロモーター、テトラサイクリン誘導性プロモーター、ＲＵ４８６誘導性プロモーター、及びラパマイシン誘導性プロモーターからなる群から選択される、請求項２４に記載の核酸ベクターまたはパッケージングシステム。

【請求項26】

前記ヘルパーウイルス遺伝子が、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、サイトメガロウイルス、及びバキュロウイルスからなる群から選択されるヘルパーウイルスに由来する、請求項５～２５のいずれか１項に記載のパッケージングシステム。

【請求項27】

前記ヘルパーウイルス遺伝子が、Ｅｌ、Ｅ２、Ｅ４及びＶＡからなる群から選択されるアデノウイルスに由来するＲＮＡ遺伝子である、請求項５～２６のいずれか１項に記載のパッケージングシステム。

【請求項28】

前記第２の核酸ベクターが、前記ヘルパーウイルス遺伝子に作動可能に連結された転写調節エレメントをさらに含む、請求項５～２７のいずれか１項に記載のパッケージングシステム。

【請求項29】

前記転写調節エレメントが、構成的プロモーター、誘導性プロモーターまたは天然プロモーターからなる群から選択されるプロモーターを含む、請求項２８に記載のパッケージングシステム。

【請求項30】

前記プロモーターが、ＲＳＶ ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶ前初期プロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸還元酵素プロモーター、細胞質β－アクチンプロモーター、ホスホグリセレートキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、メタロチオニン（ＭＴ）プロモーター、マウス乳腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、Ｔ７プロモーター、エクジソン昆虫プロモーター、テトラサイクリン抑制プロモーター、テトラサイクリン誘導性プロモーター、ＲＵ４８６誘導性プロモーター及びラパマイシン誘導性プロモーターからなる群から選択される、請求項２９に記載のパッケージングシステム。

【請求項31】

前記第２の核酸ベクターが、配列番号６０、６１、または６２に記載のヌクレオチド配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項５～３０のいずれか１項に記載のパッケージングシステム。

【請求項32】

前記第２の核酸ベクターが、配列番号６３に記載のヌクレオチド配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項５～３１のいずれか１項に記載のパッケージングシステム。

【請求項33】

前記ヘルパーウイルス遺伝子が、ＵＬ５／８／５２、ＩＣＰ０、ＩＣＰ４、ＩＣＰ２２及びＵＬ３０／ＵＬ４２からなる群から選択されるヘルペスウイルス由来の遺伝子である、請求項５～３２のいずれか１項に記載のパッケージングシステム。

【請求項34】

前記第２の核酸ベクターが、前記ヘルパーウイルス遺伝子に作動可能に連結された転写調節エレメントをさらに含む、請求項３３に記載のパッケージングシステム。

【請求項35】

前記転写調節エレメントが、構成的プロモーター、誘導性プロモーターまたは天然プロモーターからなる群から選択されるプロモーターを含む、請求項３４に記載のパッケージングシステム。

【請求項36】

前記プロモーターが、ＲＳＶ ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶ前初期プロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸還元酵素プロモーター、細胞質β－アクチンプロモーター、ホスホグリセレートキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、メタロチオニン（ＭＴ）プロモーター、マウス乳腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、Ｔ７プロモーター、エクジソン昆虫プロモーター、テトラサイクリン抑制プロモーター、テトラサイクリン誘導性プロモーター、ＲＵ４８６誘導性プロモーター及びラパマイシン誘導性プロモーターからなる群から選択される、請求項３５に記載のパッケージングシステム。

【請求項37】

請求項１～４、もしくは請求項９～２５のいずれか１項に記載の核酸ベクター、または請求項５～３６のいずれか１項に記載のパッケージングシステムを含む、宿主細胞。

【請求項38】

前記宿主細胞が、哺乳動物細胞である、請求項３７に記載の宿主細胞。

【請求項39】

前記哺乳動物細胞が、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞、ＮＳ０細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、ＶＥＲＯ細胞、ＣＲＬ７Ｏ３Ｏ細胞、ＨｓＳ７８Ｂｓｔ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＨｅｐＧ２細胞、ＳＰ２１０細胞、Ｒ１．１細胞、Ｂ－Ｗ細胞、Ｌ－Ｍ細胞、ＢＳＣ１細胞、ＢＳＣ４０細胞、ＹＢ／２０細胞、及びＢＭＴ１０細胞からなる群から選択される、請求項３８に記載の宿主細胞。

【請求項40】

前記哺乳動物細胞が、ＨＥＫ２９３細胞である、請求項３８または３９に記載の宿主細胞。

【請求項41】

ｒＡＡＶの組換え調製のための方法であって、前記ｒＡＡＶを産生する条件下で、請求項５～３６のいずれか１項に記載のパッケージングシステムを哺乳動物細胞に導入することを含む、前記方法。

【請求項42】

前記第１の核酸ベクター対前記第２の核酸ベクターの比、または前記第２の核酸ベクター対前記第１の核酸ベクターの比が、１：０．２、１：０．４、１：０．６、１：０．８、１：１、１：２、１：３、または１：４からなる群から選択される、請求項４１に記載の方法。

【請求項43】

前記第１の核酸ベクター対前記第２の核酸ベクターの比、または前記第２の核酸ベクター対前記第１の核酸ベクターの比が、１：２である、請求項４１または４２に記載の方法。

【請求項44】

前記第１の核酸ベクター対前記第２の核酸ベクターの比、または前記第２の核酸ベクター対前記第１の核酸ベクターの比が、１：０．２～１：１である、請求項４１または４２に記載の方法。

【請求項45】

前記第１の核酸ベクター対前記第２の核酸ベクターの比、または前記第２の核酸ベクター対前記第１の核酸ベクターの比が、１：０．６である、請求項４４に記載の方法。

【請求項46】

前記第１の核酸ベクター対前記第２の核酸ベクターの比、または前記第２の核酸ベクター対前記第１の核酸ベクターの比が、１：０．８である、請求項４４に記載の方法。

【請求項47】

前記第１の核酸ベクター対前記第２の核酸ベクターの比、または前記第２の核酸ベクター対前記第１の核酸ベクターの比が、１：１である、請求項４４に記載の方法。

【請求項48】

前記方法が、前記パッケージングシステムの０．１～４μｇのＤＮＡ／１Ｅ６細胞を導入することを含む、請求項４１～４７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項49】

前記方法が、前記パッケージングシステムの０．５～１μｇのＤＮＡ／１Ｅ６細胞を導入することを含む、請求項４１～４８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項50】

前記方法が、前記パッケージングシステムの０．６、０．７、０．８、０．９または１μｇのＤＮＡ／１Ｅ６細胞を導入することを含む、請求項４１～４９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項51】

前記方法が、前記パッケージングシステムの０．７５μｇのＤＮＡ／１Ｅ６細胞を導入することを含む、請求項４１～４９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項52】

（ｉ）前記ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質及び前記ＡＡＶキャプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む第１のベクター；と
（ｉｉ）前記ｒＡＡＶゲノムを含む第２のベクターと；
（ｉｉｉ）１つ以上の前記ヘルパーウイルス遺伝子を含む第３のベクターと、を含む、哺乳動物細胞を使用してｒＡＡＶを産生することを含む方法と比べて、増大したｒＡＡＶ力価をもたらす、請求項４１～５１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項53】

（ｉ）前記ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質及び前記ＡＡＶキャプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む第１のベクター；と
（ｉｉ）前記ｒＡＡＶゲノムを含む第２のベクター；と
（ｉｉｉ）１つ以上の前記ヘルパーウイルス遺伝子を含む第３のベクターと、を含む、哺乳動物細胞を使用してｒＡＡＶを産生することを含む方法と比べて、インタクトなベクターゲノムのパーセンテージの増大をもたらす、請求項４１～５１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項54】

前記哺乳動物細胞が、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞、ＮＳ０細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、ＶＥＲＯ細胞、ＣＲＬ７Ｏ３Ｏ細胞、ＨｓＳ７８Ｂｓｔ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＨｅｐＧ２細胞、ＳＰ２１０細胞、Ｒ１．１細胞、Ｂ－Ｗ細胞、Ｌ－Ｍ細胞、ＢＳＣ１細胞、ＢＳＣ４０細胞、ＹＢ／２０細胞、及びＢＭＴ１０細胞からなる群から選択される、請求項４１～５３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項55】

前記哺乳動物細胞が、ＨＥＫ２９３細胞である、請求項４１～５４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項56】

前記哺乳動物細胞を、細胞培養物中で提供する、請求項４１～５５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項57】

細胞培養物中に提供される、請求項３７～４０のいずれか１項に記載の宿主細胞の集団。

【請求項58】

前記細胞培養物が、少なくとも２リットル、少なくとも５０リットルまたは少なくとも２０００リットルの容積を有する、請求項５６に記載の方法または請求項５７に記載の宿主細胞の集団。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願
本出願は、２０２１年６月２５日に出願の米国仮特許出願第６３／２０２，８１７号、２０２１年１０月７日に出願の同第６３／２６２，２１８号、及び２０２２年１月１１日に出願の同第６３／２６６，６４６号の優先権を主張しており、これらの開示全体が、参照により本明細書に組み込まれる。

【0002】

配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表を含み、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる（２０２２年６月２１日に作成された上記ＡＳＣＩＩコピーは「ＨＭＷ－０４３＿ＳＬ．ｔｘｔ」という名称で、サイズは３３６，８６６バイトである）。

【背景技術】

【0003】

アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、遺伝子治療の目的で外来ＤＮＡを細胞に送達するベクターとして魅力的なものとなる固有の特徴を有している。ＡＡＶの商業的製造には、一般に哺乳動物細胞系または昆虫細胞系のいずれかを使用している。市販の哺乳動物細胞ベースのＡＡＶ産生システムは、典型的には、３つのプラスミド、すなわちＡＡＶ Ｒｅｐ及びＡＡＶキャプシドタンパク質をコードする配列を含む第１のプラスミド；ＡＡＶベクターゲノムを含む第２のプラスミド；ならびに１つ以上のヘルパーウイルス遺伝子（通常はアデノウイルスまたはヘルペスウイルス遺伝子）を含む第３のプラスミドの細胞へのトランスフェクションを含む。そのような３つのプラスミドＡＡＶ製造システムは、効果的ではあるが、最適化するには複雑であり、商業的なＡＡＶ治療に関連する商品を高コストにさせる。

【0004】

したがって、効率的なＡＡＶ産生をもたらすが、複雑さ及びコストが低減された、改良されたＡＡＶ製造システムが当該技術分野において必要とされている。

【発明の概要】

【0005】

本開示は、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）の産生のためのデュアルベクタートランスフェクションシステムを提供する。本明細書に記載のデュアルベクタートランスフェクションシステムは、一般的に、（１）ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、導入遺伝子を含むｒＡＡＶゲノムを含む第２のヌクレオチド配列、及びＡＡＶキャプシドタンパク質をコードする第３のヌクレオチド配列、を含む第１の核酸ベクター；ならびに（２）ヘルパーウイルス遺伝子を含む第２の核酸ベクター、を含む。このようなデュアルベクタートランスフェクションシステムでは、第１の核酸ベクター及び第２の核酸ベクターは、宿主産生細胞と共に、ＡＡＶ産生に必要な全ての成分を提供する。本明細書に開示されるデュアルベクタートランスフェクションシステムは、従来のトリプルベクタートランスフェクションシステムと比較して、ｒＡＡＶ生産性の増大をもたらすことが判明した。さらに、本明細書に記載のデュアルベクタートランスフェクションシステムにおける成分の特定の組織化は、従来技術のデュアルベクタートランスフェクションシステムよりも優れたｒＡＡＶ生産性をもたらすことが判明した。

【0006】

したがって、一態様では、本開示は、ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列；導入遺伝子を含む組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ゲノムを含む第２のヌクレオチド配列；及びＡＡＶキャプシドタンパク質をコードする第３のヌクレオチド配列、を含む第１の核酸ベクターであって、ヘルパーウイルス遺伝子を含まない、第１の核酸ベクターを提供する。

【0007】

特定の実施形態では、核酸ベクターは、５’から３’方向に：ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列；導入遺伝子を含む組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ゲノムを含む第２のヌクレオチド配列；及びＡＡＶキャプシドタンパク質をコードする第３のヌクレオチド配列を含み、核酸ベクターは、ヘルパーウイルス遺伝子を含まない。

【0008】

特定の実施形態では、核酸ベクターは、５’から３’方向に：ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列；導入遺伝子を含む組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ゲノムを含む第２のヌクレオチド配列；及びＡＡＶキャプシドタンパク質をコードする第３のヌクレオチド配列を含み、この核酸ベクターは、ヘルパーウイルス遺伝子を含まず、この導入遺伝子は、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）、アリールスルファターゼＡ（ＡＲＳＡ）、イズロン酸２－スルファターゼ（Ｉ２Ｓ）、及び抗補体成分５（Ｃ５）抗体からなる群から選択されない。

【0009】

特定の実施形態では、核酸ベクターは、５’から３’方向に：ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列；導入遺伝子を含む組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ゲノムを含む第２のヌクレオチド配列；及びＡＡＶキャプシドタンパク質をコードする第３のヌクレオチド配列を含み、この核酸ベクターは、ヘルパーウイルス遺伝子を含まず、このＡＡＶキャプシドタンパク質は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１５、１６、または１７のアミノ酸２０３～７３６のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％同一であるアミノ酸を含まず、配列番号１６のアミノ酸２０６に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸が、Ｃであり；配列番号１６のアミノ酸２９６に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＨであり；配列番号１６のアミノ酸３１２に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸が、Ｑであり；配列番号１６のアミノ酸３４６に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＡであり；配列番号１６のアミノ酸４６４に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＮであり；配列番号１６のアミノ酸４６８に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＳであり；配列番号１６のアミノ酸５０１に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＩであり；配列番号１６のアミノ酸５０５に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸が、Ｒであり；配列番号１６のアミノ酸５９０に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＲであり；配列番号１６のアミノ酸６２６に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＧまたはＹであり、配列番号１６のアミノ酸６８１に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＭであり；配列番号１６のアミノ酸６８７に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＲであり；配列番号１６のアミノ酸６９０に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＫであり；配列番号１６のアミノ酸７０６に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＣであり、または配列番号１６のアミノ酸７１８に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＧである。

【0010】

特定の実施形態では、核酸ベクターは、５’から３’方向に：ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列；導入遺伝子を含む組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ゲノムを含む第２のヌクレオチド配列；及びＡＡＶキャプシドタンパク質をコードする第３のヌクレオチド配列を含み、この核酸ベクターは、ヘルパーウイルス遺伝子を含まず、（ｉ）この導入遺伝子が、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）、アリールスルファターゼＡ（ＡＲＳＡ）、イズロン酸２－スルファターゼ（Ｉ２Ｓ）、及び抗補体成分５（Ｃ５）抗体からなる群から選択されず、（ｉｉ）このＡＡＶキャプシドタンパク質は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１５、１６または１７のアミノ酸２０３～７３６のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含まず、配列番号１６のアミノ酸２０６に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＣであり；配列番号１６のアミノ酸２９６に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＨであり；配列番号１６のアミノ酸３１２に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＱであり；配列番号１６のアミノ酸３４６に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＡであり；配列番号１６のアミノ酸４６４に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＮであり；配列番号１６のアミノ酸４６８に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＳであり；配列番号１６のアミノ酸５０１に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＩであり；配列番号１６のアミノ酸５０５に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＲであり；配列番号１６のアミノ酸５９０に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＲであり；配列番号１６のアミノ酸６２６に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＧまたはＹであり、配列番号１６のアミノ酸６８１に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＭであり；配列番号１６のアミノ酸６８７に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＲであり；配列番号１６のアミノ酸６９０に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＫであり；配列番号１６のアミノ酸７０６に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＣであり、または配列番号１６のアミノ酸７１８に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＧである。

【0011】

特定の実施形態では、核酸ベクターは、５’から３’方向に：ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列；導入遺伝子を含む組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ゲノムを含む第２のヌクレオチド配列；及びＡＡＶキャプシドタンパク質をコードする第３のヌクレオチド配列を含む。

【0012】

特定の実施形態では、核酸ベクターは、ＤＮＡプラスミドまたはＤＮＡ最小ベクターである。

【0013】

別の態様では、本開示は、（ｉ）ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列；導入遺伝子を含む組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ゲノムを含む第２のヌクレオチド配列；及びＡＡＶキャプシドタンパク質をコードする第３のヌクレオチド配列、を含む第１の核酸ベクターと、（ｉｉ）ヘルパーウイルス遺伝子を含む第２の核酸ベクターと、を含む組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）パッケージングシステムを提供する。

【0014】

特定の実施形態では、第１の核酸ベクターは、５’から３’方向に：ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列；導入遺伝子を含む組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ゲノムを含む第２のヌクレオチド配列；及びＡＡＶキャプシドタンパク質をコードする第３のヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、導入遺伝子は、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）、アリールスルファターゼＡ（ＡＲＳＡ）、イズロン酸２－スルファターゼ（Ｉ２Ｓ）及び抗補体成分５（Ｃ５）抗体からなる群から選択されない。特定の実施形態では、ＡＡＶキャプシドタンパク質は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１５、１６または１７のアミノ酸２０３～７３６のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含まず、配列番号１６のアミノ酸２０６に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＣであり；配列番号１６のアミノ酸２９６に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＨであり；配列番号１６のアミノ酸３１２に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＱであり；配列番号１６のアミノ酸３４６に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＡであり；配列番号１６のアミノ酸４６４に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＮであり；配列番号１６のアミノ酸４６８に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＳであり；配列番号１６のアミノ酸５０１に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＩであり；配列番号１６のアミノ酸５０５に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＲであり；配列番号１６のアミノ酸５９０に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＲであり；配列番号１６のアミノ酸６２６に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＧまたはＹであり；配列番号１６のアミノ酸６８１に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＭであり；配列番号１６のアミノ酸６８７に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＲであり；配列番号１６のアミノ酸６９０に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＫであり；配列番号１６のアミノ酸７０６に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＣであるか；または、配列番号１６のアミノ酸７１８に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸が、Ｇである。特定の実施形態では、導入遺伝子は、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）、アリールスルファターゼＡ（ＡＲＳＡ）、イズロン酸２－スルファターゼ（Ｉ２Ｓ）及び抗補体成分５（Ｃ５）抗体からなる群から選択されず、ＡＡＶキャプシドタンパク質は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１５、１６または１７のアミノ酸２０３～７３６のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含まず、配列番号１６のアミノ酸２０６に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＣであり；配列番号１６のアミノ酸２９６に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＨであり；配列番号１６のアミノ酸３１２に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＱであり；配列番号１６のアミノ酸３４６に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＡであり；配列番号１６のアミノ酸４６４に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＮであり；配列番号１６のアミノ酸４６８に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＳであり；配列番号１６のアミノ酸５０１に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＩであり、配列番号１６のアミノ酸５０５に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＲであり；配列番号１６のアミノ酸５９０に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＲであり；配列番号１６のアミノ酸６２６に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＧまたはＹであり；配列番号１６のアミノ酸６８１に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＭであり；配列番号１６のアミノ酸６８７に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＲであり；配列番号１６のアミノ酸６９０に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＫであり；配列番号１６のアミノ酸７０６に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＣである、または配列番号１６のアミノ酸７１８に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＧである。

【0015】

特定の実施形態では、第１の核酸ベクターは、ＤＮＡプラスミドまたはＤＮＡ最小ベクターである。特定の実施形態では、第２の核酸ベクターは、ＤＮＡプラスミドまたはＤＮＡ最小ベクターである。

【0016】

特定の実施形態では、この導入遺伝子はポリペプチドをコードする。特定の実施形態では、この導入遺伝子は、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ｇＲＮＡ、アンタゴミル（ａｎｔａｇｏｍｉｒ）、ｍｉＲＮＡスポンジ、ＲＮＡアプタザイム、ＲＮＡアプタマー、ｌｎｃＲＮＡ、リボザイムまたはｍＲＮＡをコードする。特定の実施形態では、この導入遺伝子は、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）、グルコース－６－ホスファターゼ（Ｇ６Ｐａｓｅ）、イズロン酸－２－スルファターゼ（Ｉ２Ｓ）、アリールスルファターゼＡ（ＡＲＳＡ）、及びフラタキシン（ＦＸＮ）からなる群から選択されるタンパク質をコードする。特定の実施形態では、この導入遺伝子は、グルコース－６－ホスファターゼ（Ｇ６Ｐａｓｅ）またはフラタキシン（ＦＸＮ）をコードする。

【0017】

特定の実施形態では、ｒＡＡＶゲノムは、導入遺伝子に作動可能に連結されている転写調節エレメントをさらに含む。特定の実施形態では、転写調節エレメントは、プロモーターエレメント及び／またはイントロンエレメントを含む。

【0018】

特定の実施形態では、ｒＡＡＶゲノムは、ポリアデニル化配列をさらに含む。特定の実施形態では、ポリアデニル化配列は、導入遺伝子に対して３’である。

【0019】

特定の実施形態では、ｒＡＡＶゲノムは、配列番号７１、８５、８６、８７、または８８に記載のヌクレオチド配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。

【0020】

特定の実施形態では、ｒＡＡＶゲノムは、導入遺伝子の５’の５’逆位末端反復（５’ＩＴＲ）ヌクレオチド配列及び導入遺伝子の３’の３’逆位末端反復（３’ＩＴＲ）ヌクレオチド配列をさらに含む。特定の実施形態では、５’ＩＴＲヌクレオチド配列は、配列番号３９、４１または４２に記載のヌクレオチド配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であり、及び／または３’ＩＴＲヌクレオチド配列は、配列番号４０、４３または４４に記載のヌクレオチド配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である。

【0021】

特定の実施形態では、ｒＡＡＶゲノムは、配列番号７５、７８、８０、８２または８４に記載のヌクレオチド配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。

【0022】

特定の実施形態では、ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質は、野生型Ｒｅｐタンパク質またはそのバリアントである。特定の実施形態では、ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質は、ＡＡＶ２ Ｒｅｐタンパク質またはそのバリアントである。

【0023】

特定の実施形態では、第１のヌクレオチド配列は、ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質コード配列に作動可能に連結された転写調節エレメントをさらに含む。特定の実施形態では、転写調節エレメントは、構成的プロモーター、誘導性プロモーターまたは天然プロモーターからなる群から選択されるプロモーターを含む。特定の実施形態では、プロモーターは、Ｐ５プロモーター、Ｐ１９プロモーター、メタロチオニン（ＭＴ）プロモーター、マウス乳腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、Ｔ７プロモーター、エクジソン昆虫プロモーター、テトラサイクリン抑制プロモーター、テトラサイクリン誘導性プロモーター、ＲＵ４８６誘導性プロモーター、及びラパマイシン誘導性プロモーターからなる群から選択される。

【0024】

特定の実施形態では、ＡＡＶキャプシドタンパク質は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶＲｈ３２．３３、ＡＡＶｒｈ７４、ＡＡＶ－ＤＪ、ＡＡＶ－ＬＫ０３、ＮＰ５９、ＶＯＹ１０１、ＶＯＹ２０１、ＶＯＹ７０１、ＶＯＹ８０１、ＶＯＹ１１０１、ＡＡＶＰＨＰ．Ｎ、ＡＡＶＰＨＰ．Ａ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ、ＰＨＰ．Ｂ２、ＰＨＰ．Ｂ３、Ｇ２Ａ３、Ｇ２Ｂ４、Ｇ２Ｂ５、及びＰＨＰ．Ｓからなる群から選択される。特定の実施形態では、ＡＡＶキャプシドタンパク質は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ１０及びＡＡＶｒｈ７４からなる群から選択される。特定の実施形態では、ＡＡＶキャプシドタンパク質は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８及びＡＡＶｒｈ７４からなる群から選択される。

【0025】

特定の実施形態では、ＡＡＶキャプシドタンパク質は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１５、１６または１７のアミノ酸２０３～７３６のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含む。

【0026】

特定の実施形態では、配列番号１６のアミノ酸２０６に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＣであり；配列番号１６のアミノ酸２９６に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＨであり；配列番号１６のアミノ酸３１２に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＱであり；配列番号１６のアミノ酸３４６に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＡであり；配列番号１６のアミノ酸４６４に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＮであり；配列番号１６のアミノ酸４６８に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＳであり；配列番号１６のアミノ酸５０１に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＩであり；配列番号１６のアミノ酸５０５に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＲであり；配列番号１６のアミノ酸５９０に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＲであり；配列番号１６のアミノ酸６２６に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＧまたはＹであり；配列番号１６のアミノ酸６８１に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＭであり；配列番号１６のアミノ酸６８７に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＲであり；配列番号１６のアミノ酸６９０に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＫであり；配列番号１６のアミノ酸７０６に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＣであるか；または配列番号１６のアミノ酸７１８に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＧである。

【0027】

特定の実施形態では、（ａ）配列番号１６のアミノ酸６２６に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＧであり、配列番号１６のアミノ酸７１８に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＧであり；（ｂ）配列番号１６のアミノ酸２９６に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＨであり、配列番号１６のアミノ酸４６４に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＮであり、配列番号１６のアミノ酸５０５に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＲであり、配列番号１６のアミノ酸６８１に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＭであり；（ｃ）配列番号１６のアミノ酸５０５に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＲであり、かつ配列番号１６のアミノ酸６８７に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＲであり；（ｄ）配列番号１６のアミノ酸３４６に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＡであり、かつ配列番号１６のアミノ酸５０５に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＲであるか；または（ｅ）配列番号１６のアミノ酸５０１に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＩであり、配列番号１６のアミノ酸５０５に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＲであり、かつ配列番号１６のアミノ酸７０６に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＣである。

【0028】

特定の実施形態では、ＡＡＶキャプシドタンパク質は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１５、１６または１７のアミノ酸２０３～７３６のアミノ酸配列を含む。

【0029】

特定の実施形態では、ＡＡＶキャプシドタンパク質は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１５、１６または１７のアミノ酸１３８～７３６のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含む。

【0030】

特定の実施形態では、配列番号１６のアミノ酸１５１に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＲであり；配列番号１６のアミノ酸１６０に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＤであり；配列番号１６のアミノ酸２０６に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＣであり；配列番号１６のアミノ酸２９６に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＨであり；配列番号１６のアミノ酸３１２に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＱであり；配列番号１６のアミノ酸３４６に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＡであり；配列番号１６のアミノ酸４６４に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＮであり；配列番号１６のアミノ酸４６８に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＳであり；配列番号１６のアミノ酸５０１に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＩであり；配列番号１６のアミノ酸５０５に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＲであり；配列番号１６のアミノ酸５９０に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＲであり；配列番号１６のアミノ酸６２６に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＧまたはＹであり；配列番号１６のアミノ酸６８１に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＭであり；配列番号１６のアミノ酸６８７に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＲであり；配列番号１６のアミノ酸６９０に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＫであり；配列番号１６のアミノ酸７０６に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＣであるか；または配列番号１６のアミノ酸７１８に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸が、Ｇである。

【0031】

特定の実施形態では、（ａ）配列番号１６のアミノ酸６２６に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＧであり、かつ配列番号１６のアミノ酸７１８に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＧであり；（ｂ）配列番号１６のアミノ酸２９６に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＨであり、配列番号１６のアミノ酸４６４に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＮであり、配列番号１６のアミノ酸５０５に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＲであり、かつ配列番号１６のアミノ酸６８１に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＭであり；（ｃ）配列番号１６のアミノ酸５０５に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＲであり、かつ配列番号１６のアミノ酸６８７に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＲであり；（ｄ）配列番号１６のアミノ酸３４６に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＡであり、かつ配列番号１６のアミノ酸５０５に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＲであるか；または（ｅ）配列番号１６のアミノ酸５０１に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＩであり、配列番号１６のアミノ酸５０５に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＲであり、かつ配列番号１６のアミノ酸７０６に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＣである。

【0032】

特定の実施形態では、ＡＡＶキャプシドタンパク質は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、９、１０、１１、１２、１３、１５、１６または１７のアミノ酸１３８～７３６のアミノ酸配列を含む。

【0033】

特定の実施形態では、ＡＡＶキャプシドタンパク質は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１５、１６または１７のアミノ酸１～７３６のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含む。

【0034】

特定の実施形態では、配列番号１６のアミノ酸２に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＴであり；配列番号１６のアミノ酸６５に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＩであり；配列番号１６のアミノ酸６８に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＶであり；配列番号１６のアミノ酸７７に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＲであり；配列番号１６のアミノ酸１１９に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＬであり；配列番号１６のアミノ酸１５１に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＲであり；配列番号１６のアミノ酸１６０に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＤであり；配列番号１６のアミノ酸２０６に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＣであり；配列番号１６のアミノ酸２９６に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＨであり；配列番号１６のアミノ酸３１２に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＱであり；配列番号１６のアミノ酸３４６に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＡであり；配列番号１６のアミノ酸４６４に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＮであり；配列番号１６のアミノ酸４６８に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＳであり；配列番号１６のアミノ酸５０１に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＩであり；配列番号１６のアミノ酸５０５に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＲであり；配列番号１６のアミノ酸５９０に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＲであり；配列番号１６のアミノ酸６２６に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＧまたはＹであり；配列番号１６のアミノ酸６８１に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＭであり；配列番号１６のアミノ酸６８７に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＲであり；配列番号１６のアミノ酸６９０に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＫであり；配列番号１６のアミノ酸７０６に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＣであるか；または配列番号１６のアミノ酸７１８に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＧである。

【0035】

特定の実施形態では、（ａ）配列番号１６のアミノ酸２に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＴであり、かつ配列番号１６のアミノ酸３１２に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＱであり；（ｂ）配列番号１６のアミノ酸６５に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＩであり、かつ配列番号１６のアミノ酸６２６に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＹであり；（ｃ）配列番号１６のアミノ酸７７に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＲであり、かつ配列番号１６のアミノ酸６９０に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＫであり；（ｄ）配列番号１６のアミノ酸１１９に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＬであり、かつ配列番号１６のアミノ酸４６８に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＳであり；（ｅ）配列番号１６のアミノ酸６２６に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＧであり、かつ配列番号１６のアミノ酸７１８に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＧであり；（ｆ）配列番号１６のアミノ酸２９６に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＨであり、配列番号１６のアミノ酸４６４に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＮであり、配列番号１６のアミノ酸５０５に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＲであり、かつ配列番号１６のアミノ酸６８１に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＭであり；（ｇ）配列番号１６のアミノ酸５０５に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＲであり、かつ配列番号１６のアミノ酸６８７に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＲであり；（ｈ）配列番号１６のアミノ酸３４６に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＡであり、かつ配列番号１６のアミノ酸５０５に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＲであるか；または配列番号１６のアミノ酸５０１に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＩであり、配列番号１６のアミノ酸５０５に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＲであり、かつ配列番号１６のアミノ酸７０６に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＣである。

【0036】

特定の実施形態では、ＡＡＶキャプシドタンパク質は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１５、１６または１７のアミノ酸１～７３６のアミノ酸配列を含む。

【0037】

特定の実施形態では、第３のヌクレオチド配列は、ＡＡＶキャプシドタンパク質コード配列に作動可能に連結された転写調節エレメントをさらに含む。特定の実施形態では、転写調節エレメントは、構成的プロモーター、誘導性プロモーターまたは天然プロモーターからなる群から選択されるプロモーターを含む。特定の実施形態では、プロモーターは、Ｐ４０プロモーター、メタロチオニン（ＭＴ）プロモーター、マウス乳腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、Ｔ７プロモーター、エクジソン昆虫プロモーター、テトラサイクリン抑制プロモーター、テトラサイクリン誘導性プロモーター、ＲＵ４８６誘導性プロモーター、及びラパマイシン誘導性プロモーターからなる群から選択される。

【0038】

特定の実施形態では、第１の核酸ベクターは、配列番号７３または７７に記載のヌクレオチド配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。

【0039】

特定の実施形態では、第２のヌクレオチド配列は、配列番号７１、７５、７８、８０、８２、８４、８５、８６、８７、または８８に記載のヌクレオチド配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である配列を含む。

【0040】

特定の実施形態では、第１のヌクレオチド配列は、配列番号５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、または５９に記載のヌクレオチド配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一の配列を含み；第２のヌクレオチド配列は、配列番号７１、７５、７８、８０、８２、８４、８５、８６、８７、または８８に記載のヌクレオチド配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である配列を含み；第３のヌクレオチド配列は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１５、１６または１７のアミノ酸２０３～７３６、１３８～７３６及び／または１～７３６のアミノ酸配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一のアミノ酸配列をコードする。

【0041】

特定の実施形態において、第１の核酸ベクターは、５’から３’方向に、第１のヌクレオチド配列；第２のヌクレオチド配列；及び第３のヌクレオチド配列を含む。

【0042】

特定の実施形態では、ヘルパーウイルス遺伝子は、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、サイトメガロウイルス、及びバキュロウイルスからなる群から選択されるヘルパーウイルスに由来する。特定の実施形態では、ヘルパーウイルス遺伝子は、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ４及びＶＡからなる群から選択されるアデノウイルス由来のＲＮＡ遺伝子である。特定の実施形態では、ヘルパーウイルス遺伝子は、ＵＬ５／８／５２、ＩＣＰ０、ＩＣＰ４、ＩＣＰ２２及びＵＬ３０／ＵＬ４２からなる群から選択されるヘルペスウイルス由来の遺伝子である。

【0043】

特定の実施形態では、第２の核酸ベクターは、さらにヘルパーウイルス遺伝子に作動可能に連結された転写調節エレメントを含む。特定の実施形態では、転写調節エレメントは、構成的プロモーター、誘導性プロモーターまたは天然プロモーターからなる群から選択されるプロモーターを含む。特定の実施形態では、プロモーターは、ＲＳＶ ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶ前初期プロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸還元酵素プロモーター、細胞質β－アクチンプロモーター、ホスホグリセレートキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、メタロチオニン（ＭＴ）プロモーター、マウス乳腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、Ｔ７プロモーター、エクジソン昆虫プロモーター、テトラサイクリン抑制プロモーター、テトラサイクリン誘導性プロモーター、ＲＵ４８６誘導性プロモーター及びラパマイシン誘導性プロモーターからなる群から選択される。

【0044】

特定の実施形態では、第２の核酸ベクターは、配列番号６０、６１、または６２に記載のヌクレオチド配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。

【0045】

特定の実施形態では、第２の核酸ベクターは、配列番号６３に記載のヌクレオチド配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。

【0046】

別の態様では、本開示は、本明細書に記載の核酸ベクターまたは本明細書に記載のパッケージングシステムを含む宿主細胞を提供する。本開示はまた、そのような宿主細胞の集団を提供する。特定の実施形態では、宿主細胞の集団は細胞培養物で提供される。特定の実施形態では、細胞培養物は、少なくとも２リットル、少なくとも５０リットルまたは少なくとも２０００リットルの容積を有する。特定の実施形態では、細胞培養物は、約２リットル～約５０００リットルの容積を有する。特定の実施形態では、細胞培養物は、約２リットル～約４０００リットルの容積を有する。特定の実施形態では、細胞培養物は、約２リットル～約３０００リットルの容積を有する。特定の実施形態では、細胞培養物は、約２リットル～約２５００リットルの容積を有する。特定の実施形態では、細胞培養物は、約２リットル～約２０００リットルの容積を有する。特定の実施形態では、細胞培養物は、約２リットル～約１５００リットルの容積を有する。特定の実施形態では、細胞培養物は、約２リットル～約１０００リットルの容積を有する。特定の実施形態では、細胞培養物は、約２リットル～約５００リットルの容積を有する。特定の実施形態では、細胞培養物は、約２リットル～約２５０リットルの容積を有する。特定の実施形態では、細胞培養物は、約２リットル～約１００リットルの容積を有する。特定の実施形態では、細胞培養物は、約２リットル～約５０リットルの容積を有する。特定の実施形態では、細胞培養物は、約２リットル～約２５リットルの容積を有する。

【0047】

特定の実施形態では、宿主細胞は、哺乳動物細胞である。特定の実施形態では、哺乳動物細胞は、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞、ＮＳ０細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、ＶＥＲＯ細胞、ＣＲＬ７Ｏ３Ｏ細胞、ＨｓＳ７８Ｂｓｔ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＨｅｐＧ２細胞、ＳＰ２１０細胞、Ｒ１．１細胞、Ｂ－Ｗ細胞、Ｌ－Ｍ細胞、ＢＳＣ１細胞、ＢＳＣ４０細胞、ＹＢ／２０細胞、及びＢＭＴ１０細胞からなる群から選択される。特定の実施形態では、哺乳動物細胞は、ＨＥＫ２９３細胞である。

【0048】

別の態様では、本開示は、ｒＡＡＶを産生する条件下で哺乳動物細胞に本明細書に記載のパッケージングシステムを導入することを含む、ｒＡＡＶの組換え調製のための方法を提供する。

【0049】

特定の実施形態では、第１の核酸ベクター対第２の核酸ベクターの比、または第２の核酸ベクター対第１の核酸ベクターの比は、１：０．２、１：０．４、１：０．６、１：０．８、１：１、１：２、１：３、または１：４からなる群から選択される。特定の実施形態では、第１の核酸ベクター対第２の核酸ベクターの比、または第２の核酸ベクター対第１の核酸ベクターの比は、１：２である。特定の実施形態では、第１の核酸ベクター対第２の核酸ベクターの比、または第２の核酸ベクター対第１の核酸ベクターの比は、１：０．２～１：１である。特定の実施形態では、第１の核酸ベクター対第２の核酸ベクターの比、または第２の核酸ベクター対第１の核酸ベクターの比は、１：０．６である。特定の実施形態では、第１の核酸ベクター対第２の核酸ベクターの比、または第２の核酸ベクター対第１の核酸ベクターの比は１：０．８である。特定の実施形態では、第１の核酸ベクター対第２の核酸ベクターの比、または第２の核酸ベクター対第１の核酸ベクターの比は、１：１である。

【0050】

特定の実施形態では、この方法は、パッケージングシステムの０．１～４μｇのＤＮＡ／１Ｅ６細胞を導入することを含む。特定の実施形態では、この方法は、パッケージングシステムの０．５～１μｇのＤＮＡ／１Ｅ６細胞を導入することを含む。特定の実施形態では、この方法は、パッケージングシステムの０．６、０．７、０．８、０．９、または１μｇのＤＮＡ／１Ｅ６細胞を導入することを含む。特定の実施形態では、この方法は、パッケージングシステムの０．７５μｇのＤＮＡ／１Ｅ６細胞を導入することを含む。

【0051】

特定の実施形態では、第１の核酸ベクター対第２のベクター核酸の比は、１：２、１：３、または１：４である。特定の実施形態では、第１の核酸ベクター対第２の核酸ベクターの比は、１：２である。

【0052】

特定の実施形態では、この方法は、（ｉ）ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質及びＡＡＶキャプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む第１のベクター、（ｉｉ）ｒＡＡＶゲノムを含む第２のベクター、ならびに（ｉｉｉ）１つ以上のヘルパーウイルス遺伝子を含む第３のベクター、を含む哺乳動物細胞を使用してｒＡＡＶを産生することを含む方法と比較して、ｒＡＡＶ力価の増大を生じる。

【0053】

特定の実施形態では、この方法は、（ｉ）ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質及びＡＡＶキャプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む第１のベクター、（ｉｉ）ｒＡＡＶゲノムを含む第２のベクター、ならびに（ｉｉｉ）１つ以上のヘルパーウイルス遺伝子を含む第３のベクター、を含む哺乳動物細胞を使用してｒＡＡＶを産生することを含む方法と比較して、インタクトなベクターゲノムのパーセンテージの増大を生じる。

【0054】

特定の実施形態では、哺乳動物細胞は、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞、ＮＳ０細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、ＶＥＲＯ細胞、ＣＲＬ７Ｏ３Ｏ細胞、ＨｓＳ７８Ｂｓｔ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＨｅｐＧ２細胞、ＳＰ２１０細胞、Ｒ１．１細胞、Ｂ－Ｗ細胞、Ｌ－Ｍ細胞、ＢＳＣ１細胞、ＢＳＣ４０細胞、ＹＢ／２０細胞、及びＢＭＴ１０細胞からなる群から選択される。特定の実施形態では、哺乳動物細胞は、ＨＥＫ２９３細胞である。

【図面の簡単な説明】

【0055】

【図1A】トリプルベクタートランスフェクションシステム（１）及びデュアルベクタートランスフェクションシステム（２）を用いた小規模ｒＡＡＶ産生から得られた、ウイルスゲノム（ＶＧ）生産性を示すグラフである。

【図1B】トリプルベクタートランスフェクションシステム（１）及びデュアルベクタートランスフェクションシステム（２）を用いた小規模ｒＡＡＶ産生から得られた、キャプシド生産性を示すグラフである。

【図1C】トリプルベクタートランスフェクションシステム（１）及びデュアルベクタートランスフェクションシステム（２）を用いた小規模ｒＡＡＶ産生から得られた、インタクトなベクターゲノムのパーセンテージを示すグラフである。

【0056】

【図2A】トリプルベクタートランスフェクションシステム（１及び３）及びデュアルベクタートランスフェクションシステム（２及び４）を用いた小規模ｒＡＡＶ産生から得られたＶＧ生産性を示すグラフである。ｒＡＡＶ生産性を、２つの異なるｒＡＡＶ遺伝子編集ベクター：ヒト特異的遺伝子編集ベクター（１及び２）及びマウス特異的ベクター（３及び４）について決定した。様々な条件を表３に示す。

【図2B】トリプルベクタートランスフェクションシステム（１及び３）及びデュアルベクタートランスフェクションシステム（２及び４）を用いた小規模ｒＡＡＶ産生から得られたキャプシド生産性を示すグラフである。ｒＡＡＶ生産性を、２つの異なるｒＡＡＶ遺伝子編集ベクター：ヒト特異的遺伝子編集ベクター（１及び２）及びマウス特異的ベクター（３及び４）について決定した。様々な条件を表３に示す。

【図2C】トリプルベクタートランスフェクションシステム（１及び３）及びデュアルベクタートランスフェクションシステム（２及び４）を用いた小規模ｒＡＡＶ産生から得られたインタクトなベクターゲノムのパーセンテージを示すグラフである。ｒＡＡＶ生産性を、２つの異なるｒＡＡＶ遺伝子編集ベクター：ヒト特異的遺伝子編集ベクター（１及び２）及びマウス特異的ベクター（３及び４）について決定した。様々な条件を表３に示す。

【0057】

【図3】Ａ～Ｃは、ｒＡＡＶデュアルベクタートランスフェクションシステムデザイン－１（Ａ）、デザイン－２（Ｂ）及びデザイン－３（Ｃ）を示す概略図である。

【0058】

【図4A】デュアルベクタートランスフェクションシステムデザイン－１（１－３）、デュアルベクタートランスフェクションシステムデザイン－２（４－６）、及びトリプルベクタートランスフェクションシステム（７）を用いた小規模のｒＡＡＶ産生から得られたＶＧ生産性を示すグラフである。試験したデュアルベクタートランスフェクションシステムデザインを図３Ａ及び３Ｂに示す。試験した各デュアルベクタートランスフェクションシステムデザインについて、トランスフェクションを、３つの異なる導入遺伝子ベクター対ヘルパーベクターの比率：１：０．５（１及び４）、１：１（２及び５）、及び１：３（３及び６）で実施した。様々なトランスフェクション条件を表４に記載している。

【図4B】デュアルベクタートランスフェクションシステムデザイン－１（１－３）、デュアルベクタートランスフェクションシステムデザイン－２（４－６）、及びトリプルベクタートランスフェクションシステム（７）を用いた小規模のｒＡＡＶ産生から得られたキャプシド生産性を示すグラフである。試験したデュアルベクタートランスフェクションシステムデザインを図３Ａ及び３Ｂに示す。試験した各デュアルベクタートランスフェクションシステムデザインについて、トランスフェクションを、３つの異なる導入遺伝子ベクター対ヘルパーベクターの比率：１：０．５（１及び４）、１：１（２及び５）、及び１：３（３及び６）で実施した。様々なトランスフェクション条件を表４に記載している。

【図4C】デュアルベクタートランスフェクションシステムデザイン－１（１－３）、デュアルベクタートランスフェクションシステムデザイン－２（４－６）、及びトリプルベクタートランスフェクションシステム（７）を用いた小規模のｒＡＡＶ産生から得られたインタクトなベクターゲノムのパーセンテージを示すグラフである。試験したデュアルベクタートランスフェクションシステムデザインを図３Ａ及び３Ｂに示す。試験した各デュアルベクタートランスフェクションシステムデザインについて、トランスフェクションを、３つの異なる導入遺伝子ベクター対ヘルパーベクターの比率：１：０．５（１及び４）、１：１（２及び５）、及び１：３（３及び６）で実施した。様々なトランスフェクション条件を表４に記載している。

【0059】

【図5A】デュアルベクタートランスフェクションシステムデザイン－１（１）、デュアルベクタートランスフェクションシステムデザイン－２（２）、デュアルベクタートランスフェクションシステムデザイン－３（３）、及びトリプルベクタートランスフェクションシステム（４）を用いた小規模のｒＡＡＶ産生から得られたＶＧ生産性を示すグラフである。試験したデュアルベクタートランスフェクションシステムデザインを図３Ａ～３Ｃに示す。様々なトランスフェクション条件を表５に記載している。

【図5B】デュアルベクタートランスフェクションシステムデザイン－１（１）、デュアルベクタートランスフェクションシステムデザイン－２（２）、デュアルベクタートランスフェクションシステムデザイン－３（３）、及びトリプルベクタートランスフェクションシステム（４）を用いた小規模のｒＡＡＶ産生から得られたキャプシド生産性を示すグラフである。試験したデュアルベクタートランスフェクションシステムデザインを図３Ａ～３Ｃに示す。様々なトランスフェクション条件を表５に記載している。

【図5C】デュアルベクタートランスフェクションシステムデザイン－１（１）、デュアルベクタートランスフェクションシステムデザイン－２（２）、デュアルベクタートランスフェクションシステムデザイン－３（３）、及びトリプルベクタートランスフェクションシステム（４）を用いた小規模のｒＡＡＶ産生から得られたインタクトなベクターゲノムのパーセンテージ（「完全％」）を示すグラフである。試験したデュアルベクタートランスフェクションシステムデザインを図３Ａ～３Ｃに示す。様々なトランスフェクション条件を表５に記載している。

【0060】

【図6A】以下の様々な導入遺伝子ベクター対ヘルパーベクター比：１：２（「デュアル１：２」）、１：３（「デュアル１：３」）及び１：４（「デュアル１：４」）、ならびにトリプルベクタートランスフェクションシステム（トリプル）：で、デュアルベクタートランスフェクションシステムデザイン－１を用いて２Ｌ規模ｒＡＡＶ産生から得られたＶＧ生産性を示すグラフである。６つの異なるｒＡＡＶベクターゲノム（１～６）を試験した。条件１～５はＡＡＶＨＳＣ１５キャプシドを使用し、条件６はＡＡＶＨＳＣ１７キャプシドを使用した。様々なトランスフェクション条件を表６に記載している。

【図6B】以下の様々な導入遺伝子ベクター対ヘルパーベクター比：１：２（「デュアル１：２」）、１：３（「デュアル１：３」）及び１：４（「デュアル１：４」）、ならびにトリプルベクタートランスフェクションシステム（トリプル）：で、デュアルベクタートランスフェクションシステムデザイン－１を用いて２Ｌ規模ｒＡＡＶ産生から得られたキャプシド生産性を示すグラフである。６つの異なるｒＡＡＶベクターゲノム（１～６）を試験した。条件１～５はＡＡＶＨＳＣ１５キャプシドを使用し、条件６はＡＡＶＨＳＣ１７キャプシドを使用した。様々なトランスフェクション条件を表６に記載している。

【図6C】以下の様々な導入遺伝子ベクター対ヘルパーベクター比：１：２（「デュアル１：２」）、１：３（「デュアル１：３」）及び１：４（「デュアル１：４」）、ならびにトリプルベクタートランスフェクションシステム（トリプル）：で、デュアルベクタートランスフェクションシステムデザイン－１を用いて２Ｌ規模ｒＡＡＶ産生から得られたインタクトなベクターゲノムのパーセンテージを示すグラフである。６つの異なるｒＡＡＶベクターゲノム（１～６）を試験した。条件１～５はＡＡＶＨＳＣ１５キャプシドを使用し、条件６はＡＡＶＨＳＣ１７キャプシドを使用した。様々なトランスフェクション条件を表６に記載している。

【0061】

【図7A】ＡＡＶ２キャプシドを利用するデュアルベクタートランスフェクションシステムデザイン－１（２ＴＦＸ）及びトリプルベクタートランスフェクションシステム（３ＴＦＸ）を用いた小規模ｒＡＡＶ産生から得られたＶＧ生産性を示すグラフである。様々なトランスフェクション条件を表６に記載している。

【図7B】ＡＡＶ２キャプシドを利用するデュアルベクタートランスフェクションシステムデザイン－１（２ＴＦＸ）及びトリプルベクタートランスフェクションシステム（３ＴＦＸ）を用いた小規模ｒＡＡＶ産生から得られたキャプシド生産性を示すグラフである。様々なトランスフェクション条件を表６に記載している。

【図7C】ＡＡＶ２キャプシドを利用するデュアルベクタートランスフェクションシステムデザイン－１（２ＴＦＸ）及びトリプルベクタートランスフェクションシステム（３ＴＦＸ）を用いた小規模ｒＡＡＶ産生から得られたインタクトなベクターゲノムのパーセンテージを示すグラフである。様々なトランスフェクション条件を表６に記載している。

【0062】

【図8】デザイン－１のデュアルプラスミドシステムを使用したｒＡＡＶ産生から得られたインタクトなベクターゲノムの数を示すグラフであり、これらはそれぞれ、対応するトリプルプラスミドシステム対照から得られたインタクトなベクターゲノムの数に対する増加のパーセンテージとして表される。４つの異なるｒＡＡＶベクターゲノム（１～４）を試験した。条件１～３は、ＡＡＶＨＳＣ１５キャプシドを使用し、条件４はＡＡＶＨＳＣ１７キャプシドを使用した。様々なトランスフェクション条件を表７に記載している。

【0063】

【図9】デュアルベクタートランスフェクションシステムデザイン－１及びデザイン－２からのキャプシド生成のレベルと、それぞれの各デザインのＲｅｐ／Ｃａｐの配列を含むベクターからのキャプシド産生のレベルとを一緒に示すグラフである。様々なトランスフェクション条件を表８に記載している。

【0064】

【図10A】デュアルベクタートランスフェクションシステムデザイン－１（２ＴＦＸ）及びトリプルベクタートランスフェクションシステム（３ＴＦＸ）を用いた５０ＬのバイオリアクターｒＡＡＶ産生から得られたＶＧ生産性を示すグラフである。トランスフェクション条件を、デザイン－１について１：２のベクター比で、及び関連するトリプルトランスフェクション対照を用いて、表６、条件４に記載する。ｎｓは有意でないことを意味し；＊はｐ＜０．０５で統計的に有意であることを意味し；＊＊＊はｐ＜０．００１で統計的に有意であることを意味する。

【図10B】デュアルベクタートランスフェクションシステムデザイン－１（２ＴＦＸ）及びトリプルベクタートランスフェクションシステム（３ＴＦＸ）を用いた５０ＬのバイオリアクターｒＡＡＶ産生から得られたキャプシド生産性を示すグラフである。トランスフェクション条件を、デザイン－１について１：２のベクター比で、及び関連するトリプルトランスフェクション対照を用いて、表６、条件４に記載する。ｎｓは有意でないことを意味し；＊はｐ＜０．０５で統計的に有意であることを意味し；＊＊＊はｐ＜０．００１で統計的に有意であることを意味する。

【図10C】デュアルベクタートランスフェクションシステムデザイン－１（２ＴＦＸ）及びトリプルベクタートランスフェクションシステム（３ＴＦＸ）を用いた５０ＬのバイオリアクターｒＡＡＶ産生から得られたインタクトなベクターゲノムのパーセンテージを示すグラフである。トランスフェクション条件を、デザイン－１について１：２のベクター比で、及び関連するトリプルトランスフェクション対照を用いて、表６、条件４に記載する。ｎｓは有意でないことを意味し；＊はｐ＜０．０５で統計的に有意であることを意味し；＊＊＊はｐ＜０．００１で統計的に有意であることを意味する。

【図10D】２ＴＦＸ及び３ＴＦＸシステムを用いて得られた精製ＡＡＶベクター中の残存宿主細胞タンパク質の純度パーセントを示すグラフである。ｎｓは有意でないことを意味し；＊はｐ＜０．０５で統計的に有意であることを意味し；＊＊＊はｐ＜０．００１で統計的に有意であることを意味する。

【図10E】２ＴＦＸ及び３ＴＦＸシステムを用いて得られた精製ＡＡＶベクター中の凝集パーセントを示すグラフである。ｎｓは有意でないことを意味し；＊はｐ＜０．０５で統計的に有意であることを意味し；＊＊＊はｐ＜０．００１で統計的に有意であることを意味する。

【図10F】２ＴＦＸ及び３ＴＦＸシステムを用いて得られた精製ＡＡＶベクター中の残存宿主細胞タンパク質のレベルを示すグラフである。試料が定量限界（ＢＬｏＱ）を下回ると判定された場合のアッセイについて、水平の破線は検出限界を示す。ｎｓは有意でないことを意味し；＊はｐ＜０．０５で統計的に有意であることを意味し；＊＊＊はｐ＜０．００１で統計的に有意であることを意味する。

【図10G】２ＴＦＸ及び３ＴＦＸシステムを用いて得られた精製ＡＡＶベクターにパッケージ化された残存宿主細胞ＤＮＡを示すグラフである。ｎｓは有意でないことを意味する。ｎｓは有意でないことを意味し；＊はｐ＜０．０５で統計的に有意であることを意味し；＊＊＊はｐ＜０．００１で統計的に有意であることを意味する。

【図10H】２ＴＦＸ及び３ＴＦＸシステムを用いて得られた精製ＡＡＶベクターにパッケージ化されたＲｅｐ／Ｃａｐの量を示すグラフである。ｎｓは有意でないことを意味する。＊はｐ＜０．０５で統計的に有意であることを意味し；＊＊＊はｐ＜０．００１で統計的に有意であることを意味する。

【図10I】２ＴＦＸ及び３ＴＦＸシステムを用いて得られた精製ＡＡＶベクターにパッケージ化されたＥ１ａの量を示すグラフである。ｎｓは有意でないことを意味する。試料が定量限界（ＢＬｏＱ）を下回ると判定された場合のアッセイについて、水平の破線は検出限界を示す。＊はｐ＜０．０５で統計的に有意であることを意味し；＊＊＊はｐ＜０．００１で統計的に有意であることを意味する。

【図10J】２ＴＦＸ及び３ＴＦＸシステムを用いて得られた精製ＡＡＶベクターにパッケージ化されたヘルパー配列の量を示すグラフである。ｎｓは有意でないことを意味する。＊はｐ＜０．０５で統計的に有意であることを意味し；＊＊＊はｐ＜０．００１で統計的に有意であることを意味する。

【0065】

【図11A】表６の条件５、１：４のベクター比（デザイン１（２ＴＦＸ））及び関連するトリプルトランスフェクション対照（３ＴＦＸ）から得られたＡＡＶベクターを、１Ｅ１２ＶＧ／ｋｇの用量で投与したＰａｈ^ｅｎｕ２マウスの血清中で測定されたフェニルアラニン（Ｐｈｅ）の濃度を示すグラフである。対照としてビヒクルのみの投与を行った（ビヒクル）。

【図11B】表６の条件５、１：４のベクター比（デザイン１（２ＴＦＸ））及び関連するトリプルトランスフェクション対照（３ＴＦＸ）から得られたＡＡＶベクターを、１Ｅ１４ＶＧ／ｋｇの用量で投与したＰａｈ^ｅｎｕ２マウスの血清中で測定されたフェニルアラニン（Ｐｈｅ）の濃度を示すグラフである。対照としてビヒクルのみの投与を行った（ビヒクル）。

【図11C】投与後６週間の時点の処置マウスにおける、肝臓でのベクターゲノムの定量化を示すグラフである。ｎｓは、有意ではないことを意味する。

【図11D】投与後６週間の時点の処置マウスにおける、導入遺伝子発現の定量化を示すグラフである。ｎｓは、有意ではないことを意味する。

【図11E】投与後６週間の時点の処置マウスにおける、オンターゲット組み込みの定量化を示すグラフである。ｎｓは、有意ではないことを意味する。

【0066】

【図12A】トランスフェクトされた総ＤＮＡの様々なレベル（ｘ軸）で、ベクターＶ３とＶ１２との間で示される様々な比率を試験した、デュアルベクタートランスフェクションシステムデザイン－１を使用した小規模ｒＡＡＶ産生から得られたＶＧ生産性を示すグラフである。使用したＰＥＩ：ＤＮＡ比は２：１であった。

【図12B】トランスフェクトされた総ＤＮＡの様々なレベル（ｘ軸）で、ベクターＶ３とＶ１２との間で示される様々な比率を試験した、デュアルベクタートランスフェクションシステムデザイン－１を使用した小規模ｒＡＡＶ産生から得られたキャプシド生産性を示すグラフである。使用したＰＥＩ：ＤＮＡ比は２：１であった。

【図12C】トランスフェクトされた総ＤＮＡの様々なレベル（ｘ軸）で、ベクターＶ３とＶ１２との間で示される様々な比率を試験した、デュアルベクタートランスフェクションシステムデザイン－１を使用した小規模ｒＡＡＶ産生から得られたインタクトなベクターゲノムのパーセンテージを示すグラフである。使用したＰＥＩ：ＤＮＡ比は２：１であった。

【0067】

【図13A】トランスフェクトされた総ＤＮＡの様々なレベル（ｘ軸）において、ベクターＶ３とＶ８との間で示される様々な比率を試験したデュアルベクタートランスフェクションシステムデザイン－１を使用した小規模ｒＡＡＶ産生から得られたＶＧ生産性を示すグラフである。使用したＰＥＩ：ＤＮＡ比は２：１であった。

【図13B】トランスフェクトされた総ＤＮＡの様々なレベル（ｘ軸）において、ベクターＶ３とＶ８との間で示される様々な比率を試験したデュアルベクタートランスフェクションシステムデザイン－１を使用した小規模ｒＡＡＶ産生から得られたキャプシド生産性を示すグラフである。使用したＰＥＩ：ＤＮＡ比は２：１であった。

【図13C】トランスフェクトされた総ＤＮＡの様々なレベル（ｘ軸）において、ベクターＶ３とＶ８との間で示される様々な比率を試験したデュアルベクタートランスフェクションシステムデザイン－１を使用した小規模ｒＡＡＶ産生から得られたインタクトなベクターゲノムのパーセンテージを示すグラフである。使用したＰＥＩ：ＤＮＡ比は２：１であった。

【0068】

【図14A】デュアルベクタートランスフェクションシステムデザイン－１及びＡＡＶキャプシド血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ１０及びＡＡＶｒｈ７４にわたる関連するトリプルトランスフェクション対照を使用した２Ｌ規模のｒＡＡＶ産生から得られたＶＧ生産性を示すグラフである。

【図14B】デュアルベクタートランスフェクションシステムデザイン－１及びＡＡＶキャプシド血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ１０及びＡＡＶｒｈ７４にわたる関連するトリプルトランスフェクション対照を使用した２Ｌ規模のｒＡＡＶ産生から得られたキャプシド生産性を示すグラフである。

【図14C】デュアルベクタートランスフェクションシステムデザイン－１及びＡＡＶキャプシド血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ１０及びＡＡＶｒｈ７４にわたる関連するトリプルトランスフェクション対照を使用した２Ｌ規模のｒＡＡＶ産生から得られたインタクトなベクターゲノムのパーセンテージを示すグラフである。

【0069】

【図15】デュアルベクタートランスフェクションシステムデザイン－１を用いた５０Ｌ及び２０００ＬのバイオリアクターｒＡＡＶ産生から得られたＶＧ生産性を示すグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0070】

本開示は、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）の産生のためのデュアルベクタートランスフェクションシステムを提供する。本開示は、本明細書に記載のデュアルベクタートランスフェクションアプローチを使用したｒＡＡＶ産生が、従来のトリプルベクタートランスフェクションアプローチに比べて優れたＡＡＶ生産性をもたらすという知見に基づく。本明細書に記載されるデュアルベクタートランスフェクションシステムにおける成分の特定の組織化はまた、従来技術のデュアルベクタートランスフェクションアプローチに比べて優れたＡＡＶ生産性をもたらす。

【0071】

Ｉ．定義
本明細書で使用する場合、「組換えアデノ随伴ウイルス」または「ｒＡＡＶ」という用語は、機能的なｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子を欠くゲノムを含むＡＡＶを指す。

【0072】

本明細書で使用する場合、「キャップ遺伝子」という用語は、ＡＡＶキャプシドタンパク質をコードする核酸配列を指す。

【0073】

本明細書で使用される「ｒｅｐ遺伝子」という用語は、ＡＡＶ複製に必要なＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質（例えば、Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２、及びＲｅｐ４０）をコードする核酸配列を指す。

【0074】

本明細書で使用される場合、「Ｒｅｐ－Ｃａｐエレメント」という用語は、ＡＡＶ複製に必要なＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質（例えば、Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２、及びＲｅｐ４０）ならびにＡＡＶキャプシドタンパク質（例えば、ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３）をコードする核酸配列を指す。

【0075】

本明細書で使用する場合、「ヘルパーウイルス遺伝子」という用語は、ＡＡＶ複製を媒介するウイルス遺伝子（例えば、アデノウイルス遺伝子、またはヘルペスウイルス遺伝子）をコードする核酸配列を指す。

【0076】

本明細書で使用される場合、「ｒＡＡＶゲノム」という用語は、ｒＡＡＶのゲノム配列を含む核酸分子を指す。当業者は、ｒＡＡＶゲノムが導入遺伝子を含む場合、ｒＡＡＶゲノムが導入遺伝子の転写の方向に対してセンスまたはアンチセンス配向であり得ることを理解するであろう。

【0077】

本明細書で使用される場合、「編集ゲノム」という用語は、標的遺伝子における遺伝子欠陥を補正するために、標的遺伝子座への相同的組換えによって編集エレメント（例えば、１つ以上のヌクレオチドまたはヌクレオチド間結合）を組み込むことができる組換えＡＡＶゲノムを指す。当業者は、５’相同性アーム、編集エレメント、及び３’相同性アームを含む編集ゲノムの部分が、標的遺伝子座に対してセンスまたはアンチセンス配向であり得ることを理解するであろう。

【0078】

本明細書で使用される場合、「編集エレメント」という用語は、標的遺伝子座で組み込まれた場合にその標的遺伝子座を修飾する編集ゲノムの部分を指す。編集エレメントは、標的遺伝子座における１つ以上のヌクレオチドの挿入、欠失、または置換を媒介し得る。本明細書で使用される場合、「標的遺伝子座」という用語は、編集エレメントによって修飾される染色体またはヌクレオチド間結合の領域（例えば、標的遺伝子の領域またはヌクレオチド間結合）を指す。

【0079】

本明細書で使用される場合、「相同性アーム」という用語は、編集エレメントの５’または３’に位置する編集ゲノムの部分であって、標的遺伝子座に隣接するゲノムと実質的に同一である、部分を指す。

【0080】

本明細書で使用する場合、２つのヌクレオチド配列間または２つのアミノ酸配列間の「同一性パーセンテージ」は、整列した配列の対の間のマッチの数に１００を掛け、これを、内部ギャップを含む整列した領域の長さで割ることによって計算される。同一性のスコアリングでは、完全マッチをカウントするだけであり、アミノ酸同士の類似度は考慮しない。内部ギャップのみが長さに含まれ、配列端部のギャップは含まれないことに留意されたい。

【0081】

本明細書で使用される場合、「コード配列」という用語は、開始コドンから開始して停止コドンで終了するポリペプチドをコードする相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）の部分を指す。遺伝子は、代替スプライシング、代替の翻訳開始、及び母集団内での変動に起因して、１つ以上のコード配列を有し得る。コード配列は、野生型であっても、または天然に存在しないバリアント（例えばコドン最適化されたバリアント）であってもよい。

【0082】

本明細書で使用する場合、「転写調節エレメント」または「ＴＲＥ」という用語は、ＲＮＡ分子を形成するために、ＲＮＡポリメラーゼによって作動可能に連結されたヌクレオチド配列の転写を調節する（例えば、制御、増加、または減少させる）シス作用性ヌクレオチド配列、例えば、ＤＮＡ配列を指す。ＴＲＥは、転写を調節するために、転写因子などの１つ以上のトランス作用性分子に依存する。したがって、１つのＴＲＥは、異なるトランス作用性分子と接触する場合、例えば異なる種類の細胞である場合に、異なる方法で転写を調節し得る。ＴＲＥは、１つ以上のプロモーターエレメント及び／またはエンハンサーエレメントを含み得る。当業者は、遺伝子内のプロモーター及びエンハンサーエレメントが位置的に近い場合があることを理解するであろうし、「プロモーター」という用語は、プロモーターエレメント及びエンハンサーエレメントを含む配列を指し得る。したがって、「プロモーター」という用語は、配列中のエンハンサーエレメントを除外しない。プロモーター及びエンハンサーエレメントは、同じ遺伝子または種から誘導される必要はなく、各プロモーターまたはエンハンサーエレメントの配列は、ゲノム内の対応する内在配列と同一であっても、または実質的に同一であってもよい。

【0083】

本明細書で使用される「作動可能に連結された」という用語は、ＴＲＥと転写されるコード配列との間の連結を説明するために使用される。典型的には、遺伝子発現は、１つ以上のプロモーター及び／またはエンハンサーエレメントを含むＴＲＥの制御下に置かれる。コード配列の転写がＴＲＥによって制御されるか、または影響を受ける場合、そのコード配列は、ＴＲＥに「作動可能に連結されている」。ＴＲＥのプロモーター及びエンハンサーエレメントは、所望の転写活性が得られる限り、コード配列から任意の配向及び／または距離にあってもよい。特定の実施形態では、ＴＲＥはコード配列の上流にある。

【0084】

本明細書で使用する場合、「ポリアデニル化配列」という用語は、ＲＮＡに転写されるときポリアデニル化シグナル配列を構成するＤＮＡ配列を指す。ポリアデニル化配列は、天然型であっても外因性であってもよい。外因性ポリアデニル化配列は、哺乳動物またはウイルスのポリアデニル化配列（例えば、ＳＶ４０ポリアデニル化配列）であってもよい。

【0085】

本明細書で使用する場合、「外因性ポリアデニル化配列」とは、導入遺伝子の内因性ポリアデニル化配列と同一でも実質的に同一でもないポリアデニル化配列を指す。特定の実施形態では、外因性ポリアデニル化配列とは、導入遺伝子とは異なるが同じ種（例えば、ヒト）内の遺伝子のポリアデニル化配列である。特定の実施形態では、外因性ポリアデニル化配列は、異なる生物体（例えば、ウイルス）のポリアデニル化配列である。

【0086】

ＩＩ．第１の核酸ベクター
ｒＡＡＶを産生するための従来のトリプルベクタートランスフェクションシステムは典型的には、ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質及びＡＡＶキャプシドタンパク質をコードする配列を含む第１のベクター；ｒＡＡＶゲノムを含む第２のベクター；ならびに１つ以上のヘルパーウイルス遺伝子を含む第３のベクターを含む。ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質、ＡＡＶキャプシドタンパク質、及び１つ以上のヘルパーウイルス遺伝子をコードする遺伝子を、同じベクター（「Ｒｅｐ－Ｃａｐ－Ｈｅｌｐｅｒベクター」）にクローニングできることは以前に示されている。このような場合、ｒＡＡＶゲノムを含む第２のベクターと一緒にＲｅｐ－Ｃａｐ－Ｈｅｌｐｅｒベクターのダブルトランスフェクション（すなわち、Ｒｅｐ、Ｃａｐ、及びヘルパー遺伝子を、ｒＡＡＶゲノムにトランスで提供する）を用いて、ｒＡＡＶを産生し得る。例えば、Ｇｒｉｍｍ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．９（１８）：２７４５－２７６０（その開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照のこと。

【0087】

以前のデュアルベクタートランスフェクションシステムとは対照的に、本開示のデュアルベクタートランスフェクションシステムは、ｒＡＡＶゲノムとシスでＲｅｐ及びＣａｐ遺伝子を提供する。したがって、本開示は、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）の産生のためのデュアルベクタートランスフェクションシステムを提供し、本明細書に記載されるデュアルベクタートランスフェクションシステムは、一般に、（１）ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、導入遺伝子を含むｒＡＡＶゲノムを含む第２のヌクレオチド配列、及びＡＡＶキャプシドタンパク質をコードする第３のヌクレオチド配列、を含む第１の核酸ベクター；ならびに（２）ヘルパーウイルス遺伝子を含む第２の核酸ベクター、を含む。

【0088】

特定の実施形態では、第１の核酸ベクターは、５’から３’方向に：ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列；導入遺伝子を含むｒＡＡＶゲノムを含む第２のヌクレオチド配列；及びＡＡＶキャプシドタンパク質をコードする第３のヌクレオチド配列を含む。本開示の特定の態様は、第１の核酸ベクターがヘルパーウイルス遺伝子（例えば、ＡＡＶ産生ヘルパー因子をコードする遺伝子）を含まないことを提示する。

【0089】

本明細書に記載のデュアルベクタートランスフェクションシステムは、一般的に、第１の核酸ベクター及び第２の核酸ベクターを、ＡＡＶ（例えば、ｒＡＡＶ）を産生するための適切な宿主細胞にトランスフェクションすることを含む。特定の実施形態では、第１の核酸ベクター及び第２の核酸ベクターは一緒に、ＡＡＶ（例えば、ｒＡＡＶ）産生に必要な全ての構成要素を提供する。特定の実施形態では、第１の核酸ベクター及び第２の核酸ベクター、さらに、宿主細胞は一緒になって、ＡＡＶ（例えば、ｒＡＡＶ）産生に必要な全ての構成要素を提供する。

【0090】

本明細書に開示されるデュアルベクタートランスフェクションシステムは、従来のトリプルベクタートランスフェクションシステム及び前述のデュアルベクタートランスフェクションシステムの両方に比べて、ｒＡＡＶ生産性の増大をもたらすことが見出された。いかなる理論に縛られるものではないが、出願人は、本明細書に記載のデュアルベクタートランスフェクションシステムにおいてｒＡＡＶゲノムとシスでＲｅｐ及びＣａｐ遺伝子を提供により、部分的には、より少ない空のＡＡＶキャプシドしか産生されないおかげで、優れたｒＡＡＶ生産性をもたらすと考えている。

【0091】

ｒＡＡＶゲノム
本明細書に開示のデュアルベクターシステムでは、第１の核酸ベクターは、一般に、ｒＡＡＶゲノムを含むヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、ｒＡＡＶゲノムは導入遺伝子を含む。

【0092】

特定の実施形態では、導入遺伝子は、ＲＮＡ分子をコードする１つ以上の配列を含む。適切なＲＮＡ分子としては、限定するものではないが、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ｇＲＮＡ、アンタゴミル（ａｎｔａｇｏｍｉｒ）、ｍｉＲＮＡスポンジ、ＲＮＡアプタザイム、ＲＮＡアプタマー、ｍＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、リボザイム及び当該技術分野で公知の合成ＲＮＡが挙げられる。

【0093】

特定の実施形態では、この導入遺伝子は、１つ以上のポリペプチドまたはその断片をコードする。そのような導入遺伝子は、ポリペプチドの完全なコード配列を含んでもよく、またはポリペプチドのコード配列の断片のみを含んでもよい。特定の実施形態では、この導入遺伝子は、対象における疾患または障害の処置に有用なポリペプチドをコードする。適切なポリペプチドとしては、限定するものではないが、β－グロビン、ヘモグロビン、組織プラスミノーゲンアクチベーター、及び凝固因子；コロニ－刺激因子（ＣＳＦ）；インターロイキン、例えば、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９など；増殖因子、例えば、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ、例えば、塩基性ＦＧＦ及び酸性ＦＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、増殖分化因子－９（ＧＤＦ－９）、肝癌由来増殖因子（ＨＤＧＦ）、ミオスタチン（ＧＤＦ－８）、神経成長因子（ＮＧＦ）、ニューロトロフィン、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、形質転換増殖因子アルファ（ＴＧＦ－ａ）、形質転換増殖因子ベータ（ＴＧＦ－β）など；可溶性受容体、例えば、可溶性ＴＮＦ－ａ受容体、可溶性インターロイキン受容体（例えば、可溶性ＩＬ－１受容体及び可溶性ＩＩ型ＩＬ－１受容体）、可溶性γ／ΔＴ細胞受容体、可溶性受容体のリガンド結合断片など；酵素、例えば、ａ－グルコシダーゼ、イミグルセラーゼ、β－グルコセレブロシダーゼ、及びアルグルセラーゼ；酵素アクチベーター、例えば、組織プラスミノーゲンアクチベーター；ケモカイン、例えば、ＩＰ－１０、インターフェロンガンマによって誘導されたモノカイン（Ｍｉｇ），Ｇｒｏα／ＩＬ－８、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ－１ａ、ＭＩＰ－１β、ＭＣＰ－１、ＰＦ－４など；血管形成剤、例えば、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ、例えば、ＶＥＧＦ１２１、ＶＥＧＦ１６５、ＶＥＧＦ－Ｃ、ＶＥＧＦ－２）、グリオーマ由来増殖因子、アンギオゲニン、アンギオゲニン－２など；血管新生阻害剤、例えば、可溶性ＶＥＧＦ受容体；タンパクワクチン；向神経活性ペプチド、例えば、神経成長因子（ＮＧＦ）、ブラジキニン、コレシストキニン、ガストリン、セクレチン、オキシトシン、ゴナドトロピン放出ホルモン、ベータ－エンドルフィン、エンケファリン、サブスタンスＰ、ソマトスタチン、プロラクチン、ガラニン、成長ホルモン放出ホルモン、ボンベシン、ダイノルフィン、ワルファリン、ニューロテンシン、モチリン、チロトロピン、神経ペプチドＹ、黄体形成ホルモン、カルシトニン、インスリン、グルカゴン、バソプレシン、アンジオテンシンＩＩ、チロトロピン放出ホルモン、血管作用性小腸ペプチド、睡眠ペプチドなど；血栓溶解剤；心房性ナトリウム利尿ペプチド；リラキシン；グリア線維性酸性タンパク質；毛包刺激ホルモン（ＦＳＨ）；ヒトアルファ－１アンチトリプシン；白血病抑制因子（ＬＩＦ）；組織因子；マクロファージ活性化因子；腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）；好中球走化性因子（ＮＣＦ）；メタロプロテイナーゼ組織阻害剤；血管作動性腸管ペプチド；アンギオゲニン；アンジオトロピン；フィブリン；ヒルジン；ＩＬ－１受容体アンタゴニスト；毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）；脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）；ニューロトロフィン３及び４／５（ＮＴ－３及び－４／５）；グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）；芳香族アミノ酸脱炭酸酵素（ＡＡＤＣ）；第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子；ジストロフィンまたはミニジストロフィン；リソソーム酸性リパーゼ；フェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）；グリコーゲン貯蔵疾患関連酵素、例えば、グルコース－６－ホスファターゼ、酸性マルターゼ、グリコーゲン脱分枝酵素、筋グリコーゲンホスホリラーゼ、肝臓グリコーゲンホスホリラーゼ、筋ホスホフルクトキナーゼ、ホスホリラーゼキナーゼ、グルコーストランスポーター、アルドラーゼＡ、β－エノラーゼ、グリコーゲンシンターゼ；リソソーム酵素、例えば、イズロン酸－２－スルファターゼ（Ｉ２Ｓ）及びアリールスルファターゼＡ；ならびにフラタキシンなどのミトコンドリアタンパク質が挙げられる。

【0094】

特定の実施形態では、この導入遺伝子は、１つ以上のリソソーム蓄積症に欠陥があり得るタンパク質をコードする。適切なタンパク質としては、限定するものではないが、α－シアリダーゼ、カテプシンＡ、α－マンノシダーゼ、β－マンノシダーゼ、グリコシルアスパラギナーゼ、α－フコシダーゼ、α－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ、β－ガラクトシダーゼ、β－ヘキソサミニダーゼα－サブユニット、β－ヘキソサミニダーゼβ－サブユニット、ＧＭ２活性化タンパク質、グルコセレブロシダーゼ、サポシンＣ、アリールスルファターゼＡ、サポシンＢ、ホルミルグリシン生成酵素、β－ガラクトシルセラミダーゼ、α－ガラクトシダーゼＡ、イズロン酸スルファターゼ、α－イズロニダーゼ、ヘパランＮ－スルファターゼ、アセチル－ＣｏＡトランスフェラーゼ、Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ、β－グルクロニダーゼ、Ｎ－アセチルグルコサミン６－スルファターゼ、Ｎ－アセチルガラクトサミン４－スルファターゼ、ガラクトース６－スルファターゼ、ヒアルロニダーゼ、α－グルコシダーゼ、酸性スフィンゴミエリナーゼ、酸性セラミダーゼ、酸性リパーゼ、カテプシンＫ、トリペプチジルペプチダーゼ、パルミトイルタンパク質チオエステラーゼ、シスチノシン、シアリン、ＵＤＰ－Ｎ－アセチルグルコサミン、ホスホトランスフェラーゼγ－サブユニット、ムコリピン－１、ＬＡＭＰ－２、ＮＰＣ１、ＣＬＮ３、ＣＬＮ６、ＣＬＮ８、ＬＹＳＴ、ＭＹＯＶ、ＲＡＢ２７Ａ、メラノフィリン、及びＡＰ３ β－サブユニットが挙げられる。

【0095】

特定の実施形態では、導入遺伝子は、抗体またはその断片（例えば、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、または完全長抗体）をコードする。適切な抗体としては、限定するものではないが、ムロモナブ－ｃｄ３、エファリズマブ、トシツモマブ、ダクリズマブ、ネバクマブ、カツマキソマブ、エドレコロマブ、アブシキシマブ、リツキシマブ、バシリキシマブ、パリビズマブ、インフリキシマブ、トラスツズマブ、アダリムマブ、イブリツモマブチウキセタン、オマリズマブ、セツキシマブ、ベバシズマブ、ナタリズマブ、パニツムマブ、ラニビズマブ、エクリズマブ、セルトリズマブ、ウステキヌマブ、カナキヌマブ、ゴリムマブ、オファツムマブ、トシリズマブ、デノスマブ、ベリムマブ、イピリムマブ、ブレンツキシマブベドチン、ペルツズマブ、ラキシバクマブ、オビヌツズマブ、アレムツズマブ、シルツキシマブ、ラムシルマブ、ベドリズマブ、ブリナツモマブ、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、イダルシズマブ、ネシツムマブ、ジヌツキシマブ、セクキヌマブ、メポリズマブ、アリロクマブ、エボロクマブ、ダラツムマブ、エロツズマブ、イセキズマブ、レスリズマブ、オララツマブ、ベズロトクスマブ、アテゾリズマブ、オビルトキアキシマブ、イノツズマブオゾガマイシン、ブロダルマブ、グセルクマブ、デュピルマブ、サリルマブ、アベルマブ、オクレリズマブ、エミシズマブ、ベンラリズマブ、ゲムツズマブオゾガマイシン、デュルバルマブ、ブロスマブ、エレヌマブ、ガルカネズマブ、ラナデルマブ、モガムリズマブ、チルドラキズマブ、セミプリマブ、フレマネズマブ、ラブリズマブ、エマパルマブ、イバリズマブ、モクセツモマブ、カプラシズマブ、ロモソズマブ、リサンキズマブ、ポラツズマブ、エプチネズマブ、レロンリマブ、サシツズマブ、ブロルシズマブ、イサツキシマブ、及びテプロツムマブが挙げられる。

【0096】

特定の実施形態では、この導入遺伝子はヌクレアーゼをコードする。適切なヌクレアーゼとしては、限定するものではないが、ジンクフィンガ－ヌクレアーゼ（ＺＦＮ）（例えば、Ｐｏｒｔｅｕｓ，ａｎｄ Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ（２００３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３００：７６３；Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２５：７７８－７８５；Ｓａｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ８：６７－６９；及びＷｏｏｄ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３３：３０７（それぞれ参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照のこと）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）（例えば、Ｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３３：３０７；Ｂｏｃｈ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２６：１５０９－１５１２；Ｍｏｓｃｏｕ ａｎｄ Ｂｏｇｄａｎｏｖｅ（２００９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２６：１５０１；Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １８６：７５７－７６１；Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２９：１４３－１４８；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２９：１４９－１５３；及びＲｅｙｏｎ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３０（５）：４６０－４６５（それぞれ参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照のこと）、ホーミングエンドヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ（例えば、米国特許公開第ＵＳ２０１４／０１２１１１５号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照のこと）、及びＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ（例えば、Ｍａｋａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．（２０１８）Ｔｈｅ ＣＲＩＳＰＲ Ｊｏｕｒｎａｌ １（５）：３２５－３３６；及びＡｄｌｉ（２０１８）Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ９：１９１１（その各々は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照のこと）が挙げられる。

【0097】

特定の実施形態では、この導入遺伝子はＲＮＡ誘導ヌクレアーゼをコードする。適切なＲＮＡ誘導ヌクレアーゼとしては、限定するものではないが、クラスＩ及びクラスＩＩのクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）関連ヌクレアーゼが挙げられる。クラスＩは、タイプＩ、ＩＩＩ、及びＩＶに分類され、これらには、限定するものではないが、タイプＩ（Ｃａｓ３）、タイプＩ－Ａ（Ｃａｓ８ａ、Ｃａｓ５）、タイプＩ－Ｂ（Ｃａｓ８ｂ）、タイプＩ－Ｃ（Ｃａｓ８ｃ）、タイプＩ－Ｄ（Ｃａｓ１０ｄ）、タイプＩ－Ｅ（Ｃｓｅｌ、Ｃｓｅ２）、タイプＩ－Ｆ（Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３）、タイプＩ－Ｕ（ＧＳＵ００５４）、タイプＩＩＩ（Ｃａｓ１０）、タイプＩＩＩ－Ａ（Ｃｓｍ２）、タイプＩＩＩ－Ｂ（Ｃｍｒ５）、タイプＩＩＩ－Ｃ（Ｃｓｘ１０またはＣｓｘ１１）、タイプＩＩＩ－Ｄ（Ｃｓｘ１０）、及びタイプＩＶ（Ｃｓｆ１）が挙げられる。クラスＩＩは、タイプＩＩ、Ｖ、及びＶＩに分類され、これらには、限定するものではないが、タイプＩＩ（Ｃａｓ９）、タイプＩＩ－Ａ（Ｃｓｎ２）、タイプＩＩ－Ｂ（Ｃａｓ４）、タイプＶ（Ｃｐｆ１、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ３）、及びタイプＶＩ（Ｃａｓ１３ａ、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃ）が挙げられる。ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼとしてはまた、Ｃａｓ９（タイプＩＩ）またはＣａｓ１２ａ／Ｃｐｆ１（タイプＶ）などの天然に存在するクラスＩＩ ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、ならびにそれらから誘導されるまたは得られるその他のヌクレアーゼも挙げられる。本発明において使用し得る例示的なＣａｓ９ヌクレアーゼとしては、限定するものではないが、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９（ＳａＣａｓ９）、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ Ｃａｓ９（ＮｍＣａｓ９）、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ Ｃａｓ９（ＣｊＣａｓ９）、及びＧｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ Ｃａｓ９（ＧｅｏＣａｓ９）が挙げられる。

【0098】

特定の実施形態では、この導入遺伝子は、発現に際して検出可能なシグナルを生じる１つ以上のレポーター配列をコードする。このようなレポーター配列としては、限定するものではないが、β－ラクタマーゼ、β－ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）、アルカリホスファターゼ、チミジンキナーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ルシフェラーゼ、膜結合タンパク質、例としては、例えばＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ８、インフルエンザヘマグルチニンタンパク質、及び当該分野で周知の他のもの（これらに関する高親和性抗体が存在するか、または従来の手段で産生され得る）、ならびにとりわけ、ヘマグルチニンまたはＭｙｃ由来の抗原タグドメインに適切に融合された膜結合タンパク質を含む融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列が挙げられる。

【0099】

特定の実施形態では、ｒＡＡＶゲノムは、導入遺伝子に作動可能に連結されている転写調節エレメント（ＴＲＥ）を含み、これによって、この導入遺伝子によりコードされるＲＮＡまたはポリペプチドの発現が制御される。特定の実施形態では、ＴＲＥは構成的プロモーターを含む。特定の実施形態では、ＴＲＥは、任意の哺乳動物細胞（例えば、任意のヒト細胞）において活性であり得る。特定の実施形態では、ＴＲＥは広範囲のヒト細胞において活性である。そのようなＴＲＥは、本明細書に記載されるもののいずれかと、当業者に公知のもののいずれかと、を含む、構成的プロモーター及び／またはエンハンサーエレメントを含んでもよい。特定の実施形態では、ＴＲＥは、誘導性プロモーターを含む。特定の実施形態では、ＴＲＥは組織特異的ＴＲＥであってもよく、すなわち、ＴＲＥは、特定の組織（複数可）及び／または臓器（複数可）において活性である。組織特異的ＴＲＥは、１つ以上の組織特異的プロモーター及び／またはエンハンサーエレメント、ならびに任意選択で１つ以上の構成的プロモーター及び／またはエンハンサーエレメントを含む。当業者は、組織特異的プロモーター及び／またはエンハンサーエレメントを、当該技術分野で周知の方法によって組織で特異的に発現する遺伝子から単離できることを理解するであろう。

【0100】

適切なプロモーターとしては、例えば、サイトメガロウイルスプロモーター（ＣＭＶ）（Ｓｔｉｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５５（２）：４３１－４４１）、ＣＭＶ初期エンハンサー／チキンβ－アクチン（ＣＢＡ）プロモーター／ウサギβ－グロビンイントロン（ＣＡＧ）（Ｍｉｙａｚａｋｉ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｇｅｎｅ ７９（２）：２６９－２７７）、ＣＢ ^ＳＢ（Ｊａｃｏｂｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ １３（６）：１０７４－１０８４）、ヒト伸長因子１αプロモーター（ＥＦ１α）（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｇｅｎｅ ９１（２）：２１７－２２３）、ヒトホスホグリセレートキナーゼプロモーター（ＰＧＫ）（Ｓｉｎｇｅｒ－Ｓａｍ ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｇｅｎｅ ３２（３）：４０９－４１７）、ミトコンドリア重鎖プロモーター（Ｌｏｄｅｉｒｏ ｅｔ ａｌ．（２０１２）ＰＮＡＳ １０９（１７）：６５１３－６５１８）、ユビキチンプロモーター（Ｗｕｌｆｆ ｅｔ ａｌ．（１９９０）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２６１：１０１－１０５）が挙げられる。特定の実施形態では、ＴＲＥは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター／エンハンサー（例えば、配列番号１８または１９と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のヌクレオチド配列を含む）、ＳＶ４０プロモーター、チキンベータアクチン（ＣＢＡ）プロモーター（例えば、配列番号２０または２１と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるヌクレオチド配列を含む）、ｓｍＣＢＡプロモーター（例えば、配列番号２２と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一のヌクレオチド配列を含む）、ヒト伸長因子１アルファ（ＥＦ１α）プロモーター（例えば、配列番号２３と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のヌクレオチド配列を含む）、転写因子結合部位を含むマウス（ＭＶＭ）イントロンの微小ウイルス（例えば、配列番号２４または２５と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一のヌクレオチド配列を含む）、ヒトホスホグリセレートキナーゼ（ＰＧＫ１）プロモーター、ヒトユビキチンＣ（Ｕｂｃ）プロモーター、ヒトベータアクチンプロモーター、ヒトニューロン特異的エノラーゼ（ＥＮＯ２）プロモーター、ヒトベータグルクロニダーゼ（ＧＵＳＢ）プロモーター、ウサギベータ－グロビンエレメント（例えば、配列番号２６または２７と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６、９７％、９８％、９９％または１００％同一のヌクレオチド配列を含む）、ヒトカルモジュリン１（ＣＡＬＭ１）プロモーター（例えば、配列番号２８と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のヌクレオチド配列を含む）、ヒトＡｐｏＥ／Ｃ－Ｉ肝制御領域（ＨＣＲ１）（例えば、配列番号２９と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を含む）、ヒトα１－アンチトリプシン（ｈＡＡＴ）プロモーター（例えば、配列番号３０、３１または３２と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を含む）、伸長されたＨＣＲ１（例えば、配列番号３３と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるヌクレオチド配列を含む）、ｈＡＡＴプロモーターのＨＳ－ＣＲＭ８エレメント（例えば、配列番号３４と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を含む）、ヒトトランスサイレチン（ＴＴＲ）プロモーター（例えば、配列番号３５と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるヌクレオチド配列を含む）、及び／またはヒトのメチル－ＣｐＧ結合タンパク質２（ＭｅＣＰ２）プロモーターを含む。本明細書に記載のＴＲＥのいずれも、効率的な転写を促進するために任意の順序で組み合わせてもよい。例えば、ｒＡＡＶゲノムは、総称的にＣＡＧプロモーターと呼ばれる、ＣＭＶエンハンサー、ＣＢＡプロモーター、及びウサギベータ－グロビン遺伝子のエキソン３からのスプライスアクセプターを含むＴＲＥ（例えば、配列番号３６と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一のヌクレオチド配列を含む）を含んでもよい。例えば、ｒＡＡＶゲノムは、ＣＭＶエンハンサー及びＣＢＡプロモーターのハイブリッド、それに続いて、総称してＣＡＳＩプロモーター領域と呼ばれる、スプライスドナー及びスプライスアクセプターとを含むＴＲＥ（例えば、配列番号３７と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のヌクレオチド配列を含む）を含んでもよい。例えば、ｒＡＡＶゲノムは、ＨＣＲ１及びｈＡＡＴプロモーターを含むＴＲＥを含んでもよい（ＬＰ１プロモーターとも呼ばれ、例えば、配列番号３８と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のヌクレオチド配列を含む）。

【0101】

特定の実施形態では、ＴＲＥは脳特異的である（例えば、ニューロン特異的、グリア細胞特異的、アストロサイト特異的、オリゴデンドロサイト特異的、ミクログリア特異的及び／または中枢神経系特異的）。例示的な脳特異的ＴＲＥは、限定するものではないが、ヒトグリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモーター、ヒトシナプシン１（ＳＹＮ１）プロモーター、ヒトシナプシン２（ＳＹＮ２）プロモーター、ヒトメタロチオネイン３（ＭＴ３）プロモーター、及び／またはヒトプロテオリピドタンパク質１（ＰＬＰ１）プロモーターからの１つ以上のエレメントを含んでもよい。より多くの脳特異的プロモーターエレメントがＷＯ２０１６／１００５７５Ａ１に開示されており、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0102】

特定の実施形態では、導入遺伝子に対する天然プロモーターを使用し得る。天然プロモーターは、導入遺伝子の発現が天然発現を模倣することが望まれる場合に好ましい場合がある。天然プロモーターは、導入遺伝子の発現を時間的もしくは発生的に、または組織特異的な方法で、または特定の転写刺激に応答して調節する必要がある場合に使用してもよい。さらなる実施形態では、エンハンサーエレメント、ポリアデニル化部位、またはコザックコンセンサス配列などの他の天然発現制御エレメントも、天然発現を模倣するために使用してもよい。

【0103】

特定の実施形態では、ｒＡＡＶゲノムは編集ゲノムを含む。編集ゲノムを使用して、細胞内の標的遺伝子座を取り囲むゲノム領域との編集ゲノムの相同組換えにより、細胞のゲノムを編集し得る。特定の実施形態では、編集ゲノムは、相同組換えにより遺伝子の遺伝的欠陥を修正するように設計されている。編集ゲノムは、一般に、（ｉ）標的遺伝子内の標的遺伝子座を編集するための編集エレメントと；（ｉｉ）標的遺伝子座に対して５’である第１のゲノム領域と相同性を有する編集エレメントの５’の５’相同性アームヌクレオチド配列と、（ｉｉｉ）標的遺伝子座に対して３’である第２のゲノム領域と相同性を有する編集エレメントの３’の３’相同性アームヌクレオチド配列とを含み、ここで５’相同性アーム、編集エレメント及び３’相同性アームを含む編集ゲノムの部分は、標的遺伝子座に対してセンス方向であっても、またはアンチセンス方向であってもよい。編集ゲノムを使用する編集に適した標的遺伝子としては、限定するものではないが、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）、嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンス調節因子（ＣＦＴＲ）、ベータヘモグロビン（ＨＢＢ）、眼皮膚白皮症ＩＩ（ＯＣＡ２）、ハンチンチン（ＨＴＴ）、筋強直性ジストロフィープロテインキナーゼ（ＤＭＰＫ）、低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）、アポリポタンパク質Ｂ（ＡＰＯＢ）、ニューロフィブロミン１（ＮＦ１）、多発性嚢胞腎１（ＰＫＤ１）、多発性嚢胞腎２（ＰＫＤ２）、凝固第ＶＩＩＩ因子（Ｆ８）、ジストロフィン（ＤＭＤ）、リン酸制御エンドペプチダーゼ相同体、Ｘ結合型（ＰＨＥＸ）、メチルＣｐＧ結合タンパク質２（ＭＥＣＰ２）、及びユビキチン特異的ペプチダーゼ９Ｙ、Ｙ結合型（ＵＳＰ９Ｙ）が挙げられる。

【0104】

特定の実施形態では、本明細書に開示されるｒＡＡＶゲノムは、転写ターミネーター（例えば、ポリアデニル化配列）をさらに含む。特定の実施形態では、転写ターミネーターは、導入遺伝子に対して３’である。転写ターミネーターは、転写を効果的に終了させる任意の配列であってよく、当業者は、このような配列が、抗体コード配列の少なくとも一部の転写が望まれる細胞で発現される任意の遺伝子から単離され得ることを理解するであろう。特定の実施形態では、転写ターミネーターはポリアデニル化配列を含む。特定の実施形態において、ポリアデニル化配列は、免疫グロブリン遺伝子の内因性ポリアデニル化配列と同一または実質的に同一である。特定の実施形態では、ポリアデニル化配列は外因性ポリアデニル化配列である。特定の実施形態では、ポリアデニル化配列は、ＳＶ４０ポリアデニル化配列（例えば、配列番号６５、６８または６９と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のヌクレオチド配列、あるいはそれと相補的なヌクレオチド配列を含む）である。特定の実施形態では、ポリアデニル化配列は、配列番号６５に記載のヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、ポリアデニル化配列は、配列番号６５に記載のヌクレオチド配列からなる。特定の実施形態では、ポリアデニル化配列は、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化配列（例えば、配列番号６７と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のヌクレオチド配列、あるいはそれと相補的なヌクレオチド配列を含む）である。特定の実施形態では、ポリアデニル化配列は、配列番号６７に記載のヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、ポリアデニル化配列は、配列番号６７に記載のヌクレオチド配列からなる。

【0105】

特定の実施形態では、ｒＡＡＶゲノムは、配列番号７１、８５、８６、８７、または８８に記載の配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、編集エレメントは、配列番号７１、８５、８６、８７または８８に記載のヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、編集エレメントは、配列番号７１、８５、８６、８７または８８に記載のヌクレオチド配列からなる。

【0106】

特定の実施形態では、本明細書に開示されるｒＡＡＶゲノムは、ＴＲＥの５’の５’逆位末端反復（５’ＩＴＲ）ヌクレオチド配列、及び抗体軽鎖コード配列に関連するポリアデニル化配列の３’の３’逆位末端反復（３’ＩＴＲ）ヌクレオチド配列をさらに含む。任意のＡＡＶ血清型またはそのバリアントに由来するＩＴＲ配列は、本明細書に開示されているｒＡＡＶゲノムで使用し得る。５’及び３’のＩＴＲは、同じ血清型のＡＡＶに由来するものであっても、異なる血清型のＡＡＶに由来するものであってもよい。本明細書に開示されているｒＡＡＶゲノムで使用するための例示的なＩＴＲは、本明細書の配列番号３９、４０、４１、４２、４３及び４４に記載されている。

【0107】

特定の実施形態では、５’ＩＴＲまたは３’ＩＴＲは、ＡＡＶ２由来のものである。特定の実施形態では、５’ＩＴＲ及び３’ＩＴＲは両方ともＡＡＶ２由来である。特定の実施形態では、５’ＩＴＲヌクレオチド配列は、配列番号３９に対して少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するか、または３’ＩＴＲヌクレオチド配列は、配列番号４０に対して少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する。特定の実施形態では、５’ＩＴＲヌクレオチド配列は、配列番号３９に対して少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有し、３’ＩＴＲヌクレオチド配列は、配列番号４０に対して少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する。特定の実施形態では、ｒＡＡＶゲノムは、配列番号３９の配列を有する５’ＩＴＲヌクレオチド配列、及び配列番号４０の配列を有する３’ＩＴＲヌクレオチド配列を含む。

【0108】

特定の実施形態では、５’ＩＴＲまたは３’ＩＴＲは、ＡＡＶ５由来のものである。特定の実施形態では、５’ＩＴＲ及び３’ＩＴＲは両方ともＡＡＶ５由来である。特定の実施形態では、５’ＩＴＲヌクレオチド配列は、配列番号４２に対して少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するか、または３’ＩＴＲヌクレオチド配列は、配列番号４３に対して少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する。特定の実施形態では、５’ＩＴＲヌクレオチド配列は、配列番号４２に対して少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有し、３’ＩＴＲヌクレオチド配列は、配列番号４３に対して少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する。特定の実施形態では、ｒＡＡＶゲノムは、配列番号４２の配列を有する５’ＩＴＲヌクレオチド配列、及び配列番号４３の配列を有する３’ＩＴＲヌクレオチド配列を含む。

【0109】

特定の実施形態では、５’ＩＴＲヌクレオチド配列及び３’ＩＴＲヌクレオチド配列は、互いに実質的に相補的である（例えば、５’または３’のＩＴＲにおける１、２、３、４または５個のヌクレオチド位置でのミスマッチを除いて、互いに相補的である）。

【0110】

特定の実施形態では、５’ＩＴＲまたは３’ＩＴＲは、Ｒｅｐタンパク質による分解を軽減または消失させるために改変される（「非分解性ＩＴＲ」）。特定の実施形態では、非分解性ＩＴＲは、最終分解部位のヌクレオチド配列における挿入、欠失または置換を含む。このような改変は、ｒＡＡＶゲノムが感染細胞で複製された後に、ＡＡＶの自己相補的な二本鎖ＤＮＡゲノムの形成を可能にする。例示的な非分解性のＩＴＲ配列は、当該技術分野で公知である（例えば、米国特許第７，７９０，１５４号及び同第９，７８３，８２４号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に示すものを参照のこと）。特定の実施形態では、５’ＩＴＲは、配列番号４１に少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、５’ＩＴＲは、配列番号４１と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列からなる。特定の実施形態では、５’ＩＴＲは、配列番号４１に記載のヌクレオチド配列からなる。特定の実施形態では、３’ＩＴＲは、配列番号４４と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、５’ＩＴＲは、配列番号４４と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列からなる。特定の実施形態では、３’ＩＴＲは、配列番号４４に記載のヌクレオチド配列からなる。特定の実施形態では、５’ＩＴＲは、配列番号４１に記載のヌクレオチド配列からなり、３’ＩＴＲは、配列番号４４に記載のヌクレオチド配列からなる。特定の実施形態では、５’ＩＴＲは、配列番号４１に記載のヌクレオチド配列からなり、３’ＩＴＲは、配列番号４４に記載のヌクレオチド配列からなる。

【0111】

特定の実施形態では、５’ＩＴＲは、野生型ＡＡＶ２ゲノム配列に由来する追加のヌクレオチド配列に隣接している。特定の実施形態では、５’ＩＴＲは、ＡＡＶ２ゲノム内の野生型ＡＡＶ２ ＩＴＲに隣接する野生型ＡＡＶ２配列から誘導されるさらなる４６ｂｐの配列に隣接している。特定の実施形態では、追加の４６ｂｐの配列は、ｒＡＡＶゲノム内の５’ＩＴＲに対して３’である。特定の実施形態では、この４６ｂｐの配列は、配列番号４５に記載のヌクレオチド配列からなる。

【0112】

特定の実施形態では、３’ＩＴＲは、野生型ＡＡＶ２ゲノム配列に由来する追加のヌクレオチド配列に隣接している。特定の実施形態では、３’ＩＴＲは、ＡＡＶ２ゲノム内の野生型ＡＡＶ２ ＩＴＲに隣接する野生型ＡＡＶ２配列に由来するさらなる３７ｂｐの配列に隣接している。例えば、Ｓａｖｙ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ（２０１７）２８（５）：２７７－２８９（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照のこと。特定の実施形態では、追加の３７ｂｐの配列は、ｒＡＡＶゲノム内の３’ＩＴＲに対して５’である。特定の実施形態では、この３７ｂｐの配列は、配列番号４６に記載のヌクレオチド配列からなる。

【0113】

特定の実施形態では、ｒＡＡＶゲノムは、配列番号７５、７８、８０、８２、または８４に記載の配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、編集エレメントは、配列番号７５、７８、８０、８２、または８４に記載のヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、編集エレメントは、配列番号７５、７８、８０、８２、または８４に記載のヌクレオチド配列からなる。

【0114】

ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質
本開示は、Ｒｅｐタンパク質コード配列またはその機能的バリアントのコード配列を含む第１の核酸ベクターを提供する。ＡＡＶ Ｒｅｐ遺伝子の発現は、２つのプロモーターの使用と選択的スプライシングとによって制御され、結果として４つのＲｅｐタンパク質、Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２及びＲｅｐ４０が得られる。Ｒｅｐタンパク質は、ＡＡＶゲノム複製及びウイルスゲノムのパッケージングに関与する。Ｒｅｐタンパク質の発現は、ｐ５及びｐ１９プロモーターによって制御される。ｐ５プロモーターは、選択的スプライスバリアントＲｅｐ７８及びＲｅｐ６８の発現を駆動する。ｐ１９プロモーターは、選択的スプライスバリアントＲｅｐ５２及びＲｅｐ４０の発現を駆動する。したがって、第１の核酸ベクターは、１つ以上のＲｅｐタンパク質またはその機能的バリアントをコードするヌクレオチド配列を含んでもよい。

【0115】

１つ以上のＲｅｐタンパク質は、ＡＡＶ２から誘導され得る。例示的なＡＡＶ２ゲノム配列は、ＮＣＢＩ参照配列ＮＣ＿００１４０１．２を介して見出され得る。ＮＣＢＩの参照配列によれば、Ｒｅｐ６８は、ヌクレオチド３２１～２２５２によってコードされ；Ｒｅｐ７８は、ヌクレオチド３２１～２１８６によってコードされ；Ｒｅｐ４０は、ヌクレオチド９９３～２２５２によってコードされ；かつＲｅｐ５２は、ヌクレオチド９９３～２１８６によってコードされる。

【0116】

特定の実施形態では、本開示は、Ｒｅｐ７８をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を提供し、Ｒｅｐ７８をコードするヌクレオチド配列は、配列番号５０に記載の配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する配列を含む。特定の実施形態では、Ｒｅｐ７８をコードするヌクレオチド配列は、配列番号５０に記載される配列を含むか、またはそれからなる。特定の実施形態では、Ｒｅｐ７８をコードするヌクレオチド配列を含む核酸は、Ｒｅｐ７８をコードするヌクレオチド配列と作動可能に連結される転写調節エレメントを含む。特定の実施形態では、Ｒｅｐ７８をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された転写調節エレメントは、配列番号４７に記載の配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する配列を含む。特定の実施形態では、Ｒｅｐ７８をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された転写調節エレメントは、配列番号４７に記載された配列を含むか、またはそれからなる。特定の実施形態では、Ｒｅｐ７８をコードするヌクレオチド配列を含む核酸は、配列番号５１に記載の配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する配列を含む。特定の実施形態では、Ｒｅｐ７８をコードするヌクレオチド配列を含む核酸は、配列番号５１に記載される配列を含むか、またはそれからなる。特定の実施形態では、本開示は、異なるアデノウイルス血清型において、ＡＡＶ２について記載されているＲｅｐ７８をコードする配列に相当するヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。

【0117】

特定の実施形態では、本開示は、Ｒｅｐ６８をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を提供し、Ｒｅｐ６８をコードするヌクレオチド配列は、配列番号５２に記載の配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する配列を含む。特定の実施形態では、Ｒｅｐ６８をコードするヌクレオチド配列は、配列番号５２に記載される配列を含むか、またはそれからなる。特定の実施形態では、Ｒｅｐ６８をコードするヌクレオチド配列を含む核酸は、Ｒｅｐ６８をコードするヌクレオチド配列と作動可能に連結される転写調節エレメントを含む。特定の実施形態では、Ｒｅｐ６８をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された転写調節エレメントは、配列番号４７に記載の配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する配列を含む。特定の実施形態では、Ｒｅｐ６８をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された転写調節エレメントは、配列番号４７に記載された配列を含むか、またはそれからなる。特定の実施形態では、Ｒｅｐ６８をコードするヌクレオチド配列を含む核酸は、配列番号５３に記載の配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する配列を含む。特定の実施形態では、Ｒｅｐ６８をコードするヌクレオチド配列を含む核酸は、配列番号５３に記載される配列を含むか、またはそれからなる。特定の実施形態では、本開示は、異なるアデノウイルス血清型において、ＡＡＶ２について記載されているＲｅｐ６８をコードする配列に相当するヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。

【0118】

特定の実施形態では、本開示は、Ｒｅｐ４０をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を提供し、Ｒｅｐ４０をコードするヌクレオチド配列は、配列番号５４に記載の配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する配列を含む。特定の実施形態では、Ｒｅｐ４０をコードするヌクレオチド配列は、配列番号５４に記載される配列を含むか、またはそれからなる。特定の実施形態では、Ｒｅｐ４０をコードするヌクレオチド配列を含む核酸は、Ｒｅｐ４０をコードするヌクレオチド配列と作動可能に連結される転写調節エレメントを含む。特定の実施形態では、Ｒｅｐ４０をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された転写調節エレメントは、配列番号４８に記載の配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する配列を含む。特定の実施形態では、Ｒｅｐ４０をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された転写調節エレメントは、配列番号４８に記載された配列を含むか、またはそれからなる。特定の実施形態では、Ｒｅｐ４０をコードするヌクレオチド配列を含む核酸は、配列番号５５に記載の配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する配列を含む。特定の実施形態では、Ｒｅｐ４０をコードするヌクレオチド配列を含む核酸は、配列番号５５に記載される配列を含むか、またはそれからなる。特定の実施形態では、本開示は、異なるアデノウイルス血清型において、ＡＡＶ２について記載されているＲｅｐ４０をコードする配列に相当するヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。

【0119】

特定の実施形態では、本開示は、Ｒｅｐ５２をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を提供し、Ｒｅｐ５２をコードするヌクレオチド配列は、配列番号５６に記載の配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する配列を含む。特定の実施形態では、Ｒｅｐ５２をコードするヌクレオチド配列は、配列番号５６に記載される配列を含むか、またはそれからなる。特定の実施形態では、Ｒｅｐ５２をコードするヌクレオチド配列を含む核酸は、Ｒｅｐ５２をコードするヌクレオチド配列と作動可能に連結される転写調節エレメントを含む。特定の実施形態では、Ｒｅｐ５２をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された転写調節エレメントは、配列番号４８に記載の配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する配列を含む。特定の実施形態では、Ｒｅｐ５２をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された転写調節エレメントは、配列番号４８に記載された配列を含むか、またはそれからなる。特定の実施形態では、Ｒｅｐ５２をコードするヌクレオチド配列を含む核酸は、配列番号５７に記載の配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する配列を含む。特定の実施形態では、Ｒｅｐ５２をコードするヌクレオチド配列を含む核酸は、配列番号５７に記載される配列を含むか、またはそれからなる。特定の実施形態では、本開示は、異なるアデノウイルス血清型において、ＡＡＶ２について記載されているＲｅｐ５２をコードする配列に相当するヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。

【0120】

特定の実施形態では、本開示は、Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ４０及びＲｅｐ５２をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を提供し、Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ４０及びＲｅｐ５２をコードするヌクレオチド配列は、配列番号５８に記載の配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する配列を含む。特定の実施形態では、Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ４０及びＲｅｐ５２をコードするヌクレオチド配列は、配列番号５８に記載される配列を含むか、またはそれからなる。特定の実施形態では、Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ４０及びＲｅｐ５２をコードするヌクレオチド配列を含む核酸は、Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ４０及びＲｅｐ５２をコードするヌクレオチド配列のそれぞれに作動可能に結合され得る、１つ以上の転写調節エレメントを含む。特定の実施形態では、Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ４０及びＲｅｐ５２をコードするヌクレオチド配列を含む核酸は、配列番号５９に記載の配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する配列を含む。特定の実施形態では、Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ４０及びＲｅｐ５２をコードするヌクレオチド配列を含む核酸は、配列番号５９に記載される配列を含むか、またはそれからなる。

【0121】

ＡＡＶキャプシドタンパク質
本開示は、ＡＡＶキャプシドタンパク質コード配列を含むヌクレオチド配列を含む第１の核酸ベクターを提供する。第１の核酸ベクターは、天然のＡＡＶ単離物及びそれらのバリアントを含む、当該技術分野で公知の任意のＡＡＶキャプシド由来のＡＡＶキャプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んでもよい。

【0122】

ＡＡＶキャプシドタンパク質には、ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３キャプシドタンパク質が含まれる。ＶＰ１、ＶＰ２、及び／またはＶＰ３キャプシドタンパク質は、ｒＡＡＶゲノムを取り囲むキャプシドへアセンブルされる。特定の実施形態では、キャプシドタンパク質のアセンブリは、アセンブリ活性化タンパク質（ＡＡＰ）によって促進される。特定のＡＡＶ血清型のキャプシドは、アセンブリのためにキャプシドタンパク質を核小体に輸送する際にＡＡＰの役割を必要とする。例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、及びＡＡＶ１２は、キャプシドを形成するためにＡＡＰを必要とするが、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、及びＡＡＶ１１のキャプシドはＡＡＰなしにアセンブルし得る。例えば、Ｅａｒｌｅｙ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．９１（３）：ｅ０１９８０－１６を参照のこと。

【0123】

異なるＡＡＶ血清型またはそれらのバリアントは、異なるアミノ酸配列を有するＡＡＶキャプシドタンパク質を含む。適切なＡＡＶキャプシドタンパク質としては、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ－ＤＪ、ＡＡＶ－ＬＫ０３、ＮＰ５９、ＶＯＹ１０１、ＶＯＹ２０１、ＶＯＹ７０１、ＶＯＹ８０１、ＶＯＹ１１０１、ＡＡＶＰＨＰ．Ｎ、ＡＡＶＰＨＰ．Ａ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ、ＰＨＰ．Ｂ２、ＰＨＰ．Ｂ３、Ｇ２Ａ３、Ｇ２Ｂ４、Ｇ２Ｂ５、ＰＨＰ．Ｓ、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶＲｈ３２．３３、ＡＡＶｒｈ７４、ＡＡＶＨＳＣ１、ＡＡＶＨＳＣ２、ＡＡＶＨＳＣ３、ＡＡＶＨＳＣ４、ＡＡＶＨＳＣ５、ＡＡＶＨＳＣ６、ＡＡＶＨＳＣ７、ＡＡＶＨＳＣ８、ＡＡＶＨＳＣ９、ＡＡＶＨＳＣ１０、ＡＡＶＨＳＣ１１、ＡＡＶＨＳＣ１２、ＡＡＶＨＳＣ１３、ＡＡＶＨＳＣ１４、ＡＡＶＨＳＣ１５、ＡＡＶＨＳＣ１６、ＡＡＶＨＳＣ１７、及びそれらの任意のバリアント由来のキャプシドタンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、ＡＡＶキャプシドタンパク質は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ１０及びＡＡＶｒｈ７４からなる群から選択される。特定の実施形態では、ＡＡＶキャプシドタンパク質は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８及びＡＡＶｒｈ７４からなる群から選択される。種々のＡＡＶキャプシドタンパク質の配列は、例えば、米国特許公開第ＵＳ２００３０１３８７７２号、同第ＵＳ２０１４０３５９７９９号、同第ＵＳ２０１５０１５９１７３号、同第ＵＳ２０１５０３７６６０７号、同第ＵＳ２０１７００８１６８０号、及び同第ＵＳ２０１７０３６０９６２Ａ１号、ならびにＰＣＴ公開第ＷＯ２０２０２２７５１５号に開示されており、これらは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0124】

例えば、特定の実施形態では、キャプシドタンパク質は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１５、１６または１７のアミノ酸２０３～７３６のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、キャプシドタンパク質は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１５、１６または１７のアミノ酸２０３～７３６のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号１６のアミノ酸２０６に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＣであり；配列番号１６のアミノ酸２９６に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＨであり；配列番号１６のアミノ酸３１２に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＱであり；配列番号１６のアミノ酸３４６に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＡであり；配列番号１６のアミノ酸４６４に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＮであり；配列番号１６のアミノ酸４６８に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＳであり；配列番号１６のアミノ酸５０１に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＩであり；配列番号１６のアミノ酸５０５に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＲであり；配列番号１６のアミノ酸５９０に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＲであり；配列番号１６のアミノ酸６２６に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＧまたはＹであり；配列番号１６のアミノ酸６８１に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＭであり；配列番号１６のアミノ酸６８７に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＲであり；配列番号１６のアミノ酸６９０に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＫであり；配列番号１６のアミノ酸７０６に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＣであるか；または、配列番号１６のアミノ酸７１８に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸が、Ｇである。特定の実施形態では、配列番号１６のアミノ酸６２６に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＧであり；配列番号１６のアミノ酸７１８に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＧである。特定の実施形態では、配列番号１６のアミノ酸２９６に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＨであり；配列番号１６のアミノ酸４６４に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＮであり；配列番号１６のアミノ酸５０５に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＲであり；かつ配列番号１６のアミノ酸６８１に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＭである。特定の実施形態では、配列番号１６のアミノ酸５０５に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＲであり、かつ配列番号１６のアミノ酸６８７に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＲである。特定の実施形態では、配列番号１６のアミノ酸３４６に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＡであり、かつ配列番号１６のアミノ酸５０５に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＲである。特定の実施形態では、配列番号１６のアミノ酸５０１に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＩであり、配列番号１６のアミノ酸５０５に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＲであり、かつ配列番号１６のアミノ酸７０６に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＣである。特定の実施形態では、このキャプシドタンパク質は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１５、１６または１７のアミノ酸２０３～７３６のアミノ酸配列を含む。

【0125】

例えば、特定の実施形態では、キャプシドタンパク質は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１５、１６または１７のアミノ酸１３８～７３６のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、キャプシドタンパク質は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１５、１６または１７のアミノ酸１３８～７３６のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号１６のアミノ酸１５１に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＲであり；配列番号１６のアミノ酸１６０に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＤであり；配列番号１６のアミノ酸２０６に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＣであり；配列番号１６のアミノ酸２９６に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＨであり；配列番号１６のアミノ酸３１２に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＱであり；配列番号１６のアミノ酸３４６に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＡであり；配列番号１６のアミノ酸４６４に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＮであり；配列番号１６のアミノ酸４６８に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＳであり；配列番号１６のアミノ酸５０１に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＩであり；配列番号１６のアミノ酸５０５に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＲであり；配列番号１６のアミノ酸５９０に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＲであり；配列番号１６のアミノ酸６２６に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＧまたはＹであり；配列番号１６のアミノ酸６８１に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＭであり；配列番号１６のアミノ酸６８７に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＲであり；配列番号１６のアミノ酸６９０に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＫであり；配列番号１６のアミノ酸７０６に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＣであるか；または、配列番号１６のアミノ酸７１８に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＧである。特定の実施形態では、配列番号１６のアミノ酸６２６に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＧであり、かつ配列番号１６のアミノ酸７１８に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＧである。特定の実施形態では、配列番号１６のアミノ酸２９６に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＨであり、配列番号１６のアミノ酸４６４に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＮであり、配列番号１６のアミノ酸５０５に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＲであり、かつ配列番号１６のアミノ酸６８１に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＭである。特定の実施形態では、配列番号１６のアミノ酸５０５に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＲであり、かつ配列番号１６のアミノ酸６８７に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＲである。特定の実施形態では、配列番号１６のアミノ酸３４６に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＡであり、かつ配列番号１６のアミノ酸５０５に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＲである。特定の実施形態では、配列番号１６のアミノ酸５０１に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸はＩであり；配列番号１６のアミノ酸５０５に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＲであり、かつ配列番号１６のアミノ酸７０６に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＣである。特定の実施形態では、このキャプシドタンパク質は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１５、１６または１７のアミノ酸１３８～７３６のアミノ酸配列を含む。

【0126】

例えば、特定の実施形態では、キャプシドタンパク質は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１５、１６または１７のアミノ酸１～７３６のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
特定の実施形態では、キャプシドタンパク質は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１５、１６または１７のアミノ酸１～７３６のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号１６のアミノ酸２に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＴであり；配列番号１６のアミノ酸６５に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＩであり；配列番号１６のアミノ酸６８に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＶであり；配列番号１６のアミノ酸７７に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＲであり；配列番号１６のアミノ酸１１９に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＬであり；配列番号１６のアミノ酸１５１に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＲであり；配列番号１６のアミノ酸１６０に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＤであり；配列番号１６のアミノ酸２０６に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＣであり；配列番号１６のアミノ酸２９６に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＨであり；配列番号１６のアミノ酸３１２に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＱであり；配列番号１６のアミノ酸３４６に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＡであり；配列番号１６のアミノ酸４６４に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＮであり；配列番号１６のアミノ酸４６８に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＳであり；配列番号１６のアミノ酸５０１に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＩであり；配列番号１６のアミノ酸５０５に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＲであり；配列番号１６のアミノ酸５９０に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＲであり；配列番号１６のアミノ酸６２６に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＧまたはＹであり；配列番号１６のアミノ酸６８１に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＭであり；配列番号１６のアミノ酸６８７に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＲであり；配列番号１６のアミノ酸６９０に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＫであり；配列番号１６のアミノ酸７０６に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＣであるか；または、配列番号１６のアミノ酸７１８に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＧである。特定の実施形態では、配列番号１６のアミノ酸２に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＴであり、かつ配列番号１６のアミノ酸３１２に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＱである。特定の実施形態では、配列番号１６のアミノ酸６５に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＩであり、配列番号１６のアミノ酸６２６に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＹである。特定の実施形態では、配列番号１６のアミノ酸７７に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＲであり、かつ配列番号１６のアミノ酸６９０に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＫである。特定の実施形態では、配列番号１６のアミノ酸１１９に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＬであり、かつ配列番号１６のアミノ酸４６８に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＳである。特定の実施形態では、配列番号１６のアミノ酸６２６に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＧであり、かつ配列番号１６のアミノ酸７１８に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＧである。特定の実施形態では、配列番号１６のアミノ酸２９６に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＨであり、配列番号１６のアミノ酸４６４に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＮであり、配列番号１６のアミノ酸５０５に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＲであり、かつ配列番号１６のアミノ酸６８１に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＭである。特定の実施形態では、配列番号１６のアミノ酸５０５に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＲであり、かつ配列番号１６のアミノ酸６８７に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＲである。特定の実施形態では、配列番号１６のアミノ酸３４６に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＡであり、かつ配列番号１６のアミノ酸５０５に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＲである。特定の実施形態では、配列番号１６のアミノ酸５０１に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＩであり、配列番号１６のアミノ酸５０５に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＲであり、かつ配列番号１６のアミノ酸７０６に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＣである。特定の実施形態では、キャプシドタンパク質は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１５、１６または１７のアミノ酸１～７３６のアミノ酸配列を含む。

【0127】

特定の実施形態では、ＡＡＶキャプシドは、（ａ）配列番号１、２、３、４、６、７、１０、１１、１２、１３、１５、１６または１７のアミノ酸２０３～７３６のアミノ酸配列を含むキャプシドタンパク質；（ｂ）配列番号１、２、３、４、５、６、７、９、１０、１１、１２、１３、１５、１６または１７のアミノ酸１３８～７３６のアミノ酸配列を含むキャプシドタンパク質；及び（ｃ）配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１５、１６または１７のアミノ酸１～７３６のアミノ酸配列を含むキャプシドタンパク質のうちの２つ以上を含む。特定の実施形態では、ＡＡＶキャプシドは、（ａ）配列番号１、２、３、４、６、７、１０、１１、１２、１３、１５、１６または１７のアミノ酸２０３～７３６からなるアミノ酸配列を有するキャプシドタンパク質；（ｂ）配列番号１、２、３、４、５、６、７、９、１０、１１、１２、１３、１５、１６または１７のアミノ酸１３８～７３６からなるアミノ酸配列を有するキャプシドタンパク質；及び（ｃ）配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１５、１６または１７のアミノ酸１～７３６からなるアミノ酸配列を有するキャプシドタンパク質を含む。

【0128】

特定の実施形態では、ＡＡＶキャプシドは、（ａ）配列番号８のアミノ酸２０３～７３６の配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むキャプシドタンパク質；（ｂ）配列番号８のアミノ酸１３８～７３６の配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むキャプシドタンパク質；及び（ｃ）配列番号８のアミノ酸１～７３６の配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むキャプシドタンパク質のうちの１つ以上を含む。特定の実施形態では、ＡＡＶキャプシドは、（ａ）配列番号８のアミノ酸２０３～７３６のアミノ酸配列を含むキャプシドタンパク質；（ｂ）配列番号８のアミノ酸１３８～７３６のアミノ酸配列を含むキャプシドタンパク質；及び（ｃ）配列番号８のアミノ酸１～７３６のアミノ酸配列を含むキャプシドタンパク質のうちの１つ以上を含む。特定の実施形態では、ＡＡＶキャプシドは、（ａ）配列番号８のアミノ酸２０３～７３６のアミノ酸配列を含むキャプシドタンパク質；（ｂ）配列番号８のアミノ酸１３８～７３６のアミノ酸配列を含むキャプシドタンパク質；及び（ｃ）配列番号８のアミノ酸１～７３６のアミノ酸配列を含むキャプシドタンパク質のうちの２つ以上を含む。特定の実施形態では、ＡＡＶキャプシドは、（ａ）配列番号８のアミノ酸２０３～７３６からなるアミノ酸配列を有するキャプシドタンパク質；（ｂ）配列番号８のアミノ酸１３８～７３６からなるアミノ酸配列を有するキャプシドタンパク質；及び（ｃ）配列番号８のアミノ酸１～７３６からなるアミノ酸配列を有するキャプシドタンパク質を含む。

【0129】

特定の実施形態では、ＡＡＶキャプシドは、（ａ）配列番号１１のアミノ酸２０３～７３６の配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むキャプシドタンパク質；（ｂ）配列番号１１のアミノ酸１３８～７３６の配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むキャプシドタンパク質；及び（ｃ）配列番号１１のアミノ酸１～７３６の配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むキャプシドタンパク質のうちの１つ以上を含む。特定の実施形態では、ＡＡＶキャプシドは、（ａ）配列番号１１のアミノ酸２０３～７３６のアミノ酸配列を含むキャプシドタンパク質；（ｂ）配列番号１１のアミノ酸１３８～７３６のアミノ酸配列を含むキャプシドタンパク質；及び（ｃ）配列番号１１のアミノ酸１～７３６のアミノ酸配列を含むキャプシドタンパク質のうちの１つ以上を含む。特定の実施形態では、ＡＡＶキャプシドは、（ａ）配列番号１１のアミノ酸２０３～７３６のアミノ酸配列を含むキャプシドタンパク質；（ｂ）配列番号１１のアミノ酸１３８～７３６のアミノ酸配列を含むキャプシドタンパク質；及び（ｃ）配列番号１１のアミノ酸１～７３６のアミノ酸配列を含むキャプシドタンパク質のうちの２つ以上を含む。特定の実施形態では、ＡＡＶキャプシドは、（ａ）配列番号１１のアミノ酸２０３～７３６からなるアミノ酸配列を有するキャプシドタンパク質；（ｂ）配列番号１１のアミノ酸１３８～７３６からなるアミノ酸配列を有するキャプシドタンパク質；及び（ｃ）配列番号１１のアミノ酸１～７３６からなるアミノ酸配列を有するキャプシドタンパク質を含む。

【0130】

特定の実施形態では、ＡＡＶキャプシドは、（ａ）配列番号１３のアミノ酸２０３～７３６の配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むキャプシドタンパク質；（ｂ）配列番号１３のアミノ酸１３８～７３６の配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むキャプシドタンパク質；及び（ｃ）配列番号１３のアミノ酸１～７３６の配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むキャプシドタンパク質のうちの１つ以上を含む。特定の実施形態では、ＡＡＶキャプシドは、（ａ）配列番号１３のアミノ酸２０３～７３６のアミノ酸配列を含むキャプシドタンパク質；（ｂ）配列番号１３のアミノ酸１３８～７３６のアミノ酸配列を含むキャプシドタンパク質；及び（ｃ）配列番号１３のアミノ酸１～７３６のアミノ酸配列を含むキャプシドタンパク質のうちの１つ以上を含む。特定の実施形態では、ＡＡＶキャプシドは、（ａ）配列番号１３のアミノ酸２０３～７３６のアミノ酸配列を含むキャプシドタンパク質；（ｂ）配列番号１３のアミノ酸１３８～７３６のアミノ酸配列を含むキャプシドタンパク質；及び（ｃ）配列番号１３のアミノ酸１～７３６のアミノ酸配列を含むキャプシドタンパク質のうちの２つ以上を含む。特定の実施形態では、ＡＡＶキャプシドは、（ａ）配列番号１３のアミノ酸２０３～７３６からなるアミノ酸配列を有するキャプシドタンパク質；（ｂ）配列番号１３のアミノ酸１３８～７３６からなるアミノ酸配列を有するキャプシドタンパク質；及び（ｃ）配列番号１３のアミノ酸１～７３６からなるアミノ酸配列を有するキャプシドタンパク質を含む。

【0131】

特定の実施形態では、ＡＡＶキャプシドは、（ａ）配列番号１６のアミノ酸２０３～７３６の配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むキャプシドタンパク質；（ｂ）配列番号１６のアミノ酸１３８～７３６の配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むキャプシドタンパク質；及び（ｃ）配列番号１６のアミノ酸１～７３６の配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むキャプシドタンパク質、のうちの１つ以上を含む。特定の実施形態では、ＡＡＶキャプシドは、（ａ）配列番号１６のアミノ酸２０３～７３６のアミノ酸配列を含むキャプシドタンパク質；（ｂ）配列番号１６のアミノ酸１３８～７３６のアミノ酸配列を含むキャプシドタンパク質；及び（ｃ）配列番号１６のアミノ酸１～７３６のアミノ酸配列を含むキャプシドタンパク質のうちの１つ以上を含む。特定の実施形態では、ＡＡＶキャプシドは、（ａ）配列番号１６のアミノ酸２０３～７３６のアミノ酸配列を含むキャプシドタンパク質；（ｂ）配列番号１６のアミノ酸１３８～７３６のアミノ酸配列を含むキャプシドタンパク質；及び（ｃ）配列番号１６のアミノ酸１～７３６のアミノ酸配列を含むキャプシドタンパク質のうちの２つ以上を含む。特定の実施形態では、ＡＡＶキャプシドは、（ａ）配列番号１６のアミノ酸２０３～７３６からなるアミノ酸配列を有するキャプシドタンパク質；（ｂ）配列番号１６のアミノ酸１３８～７３６からなるアミノ酸配列を有するキャプシドタンパク質；及び（ｃ）配列番号１６のアミノ酸１～７３６からなるアミノ酸配列を有するキャプシドタンパク質を含む。

【0132】

特定の実施形態では、ＡＡＶキャプシドタンパク質をコードするヌクレオチドは、ＡＡＶキャプシドタンパク質の発現を制御する転写調節エレメントに作動可能に連結されている。特定の実施形態では、転写調節エレメントは、構成的プロモーター、誘導性プロモーターまたは天然プロモーターからなる群から選択されるプロモーターを含む。ＡＡＶキャプシドタンパク質の発現を制御し得る当該技術分野で公知の任意のプロモーターを使用してもよい。使用に適したプロモーターは、当業者に公知であり、これには、限定するものではないが、ｐ４０プロモーター、メタロチオニン（ＭＴ）プロモーター、マウス乳腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、Ｔ７プロモーター、エクジソン昆虫プロモーター、テトラサイクリン抑制プロモーター、テトラサイクリン誘導性プロモーター、ＲＵ４８６誘導性プロモーター、及びラパマイシン誘導性プロモーターが挙げられる。他の適切なプロモーターとしては、限定するものではないが、ＣＭＶプロモーター、ＣＢＡプロモーター、及びＣＡＧプロモーターが挙げられる。

【0133】

特定の実施形態では、ＡＡＶキャプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された転写調節エレメントは、配列番号４７、４８または４９に記載の配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する配列を含む。特定の実施形態では、ＡＡＶキャプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された転写調節エレメントは、配列番号４７、４８もしくは４９に記載された配列を含むか、またはそれからなる。

【0134】

別の態様では、本開示は、Ｒｅｐ－Ｃａｐエレメントを含む第１のヌクレオチド配列と、導入遺伝子を含むｒＡＡＶゲノムを含む第２のヌクレオチド配列とを含む、第１の核酸ベクターを提供する。特定の実施形態では、Ｒｅｐ－Ｃａｐエレメントは、ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質をコードする核酸配列と、ＡＡＶキャプシドタンパク質をコードする核酸配列とを含む。Ｒｅｐ－Ｃａｐエレメントは、当該技術分野で公知の任意のＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質をコードする核酸配列と、当該技術分野で公知の任意のＡＡＶキャプシドタンパク質をコードする核酸配列とを含み得る。特定の実施形態では、Ｒｅｐ－Ｃａｐエレメントは、配列番号７３または７７に記載の配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。

【0135】

ＩＩＩ．第２の核酸ベクター
本明細書に記載のデュアルベクタートランスフェクションシステムは、一般的に、１つ以上のヘルパーウイルス遺伝子を含む第２の核酸ベクターを含む。当業者には理解されるように、ＡＡＶの複製は、ヘルパーウイルス遺伝子によってコードされるヘルパー因子の存在に依存する。ヘルパー因子は、ヘルパーウイルス、例えば、限定はしないが、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、パピローマウイルス、サイトメガロウイルス、バキュロウイルス及びヒトボカウイルス由来のヘルパーウイルスによる同時感染を介して提供され得る。しかしながら、ヘルパーウイルスの存在下でＡＡＶを成長させると、宿主細胞の溶解及び／またはＡＡＶ産生物の汚染につながり得る。したがって、ＡＡＶ複製に必要なヘルパー因子をコードするヘルパーウイルスの遺伝子を、宿主細胞をトランスフェクトするために使用されるベクターに提供し得る。

【0136】

本明細書に記載のデュアルベクタートランスフェクションシステムは、一般的に、ＡＡＶ（例えば、ｒＡＡＶ）産生のための宿主細胞に、２つの核酸ベクター、すなわち、（１）ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、導入遺伝子を含むｒＡＡＶゲノムを含む第２のヌクレオチド配列、及びＡＡＶキャプシドタンパク質をコードする第３のヌクレオチド配列、を含む第１の核酸ベクター；ならびに（２）ヘルパーウイルス遺伝子を含む第２の核酸ベクターを、トランスフェクションすることを含む。特定の実施形態では、第２の核酸ベクターは、第１の核酸ベクターに見られるＡＡＶ産生のいかなる成分も含まない。特定の実施形態では、第２の核酸ベクターは、導入遺伝子を含むｒＡＡＶゲノムを含まない。特定の実施形態では、第２の核酸ベクターは、ＡＡＶキャプシドタンパク質コード配列を含まない。特定の実施形態では、第２の核酸ベクターは、Ｒｅｐコード配列またはその機能的断片のコード配列を含まない。特定の実施形態では、第２の核酸ベクターは、導入遺伝子を含むｒＡＡＶゲノムを含まず、第２の核酸ベクターは、ＡＡＶキャプシドタンパク質コード配列を含まず、及び／または第２の核酸ベクターは、Ｒｅｐコード配列も、その機能的断片のコード配列も含まない。

【0137】

特定の実施形態では、第２の核酸ベクターは、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、サイトメガロウイルス、及びバキュロウイルスからなる群から選択されるヘルパーウイルスに由来し得る少なくとも１つのヘルパーウイルス遺伝子を含む。ヘルパーウイルス遺伝子は、ヘルパーウイルス遺伝子の発現を制御する転写調節エレメントと作動可能に連結され得る。特定の実施形態では、転写調節エレメントは、構成的プロモーター、誘導性プロモーターまたは天然プロモーターからなる群から選択されるプロモーターを含む。使用に適切なプロモーターは、当業者には公知であり、これには限定するものではないが、ＲＳＶ ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶ前初期プロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸還元酵素プロモーター、細胞質β－アクチンプロモーター、ホスホグリセレートキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、メタロチオニン（ＭＴ）プロモーター、マウス乳腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、Ｔ７プロモーター、エクジソン昆虫プロモーター、テトラサイクリン抑制プロモーター、テトラサイクリン誘導性プロモーター、ＲＵ４８６誘導性プロモーター及びラパマイシン誘導性プロモーターが挙げられる。

【0138】

特定の実施形態では、第２の核酸ベクターは、少なくとも１つのヘルパーウイルス遺伝子を含む。少なくとも１つのヘルパーウイルス遺伝子は、アデノウイルス（ＡｄＶ）由来であってもよい。効率的なＡＡＶ産生に必要であることが公知のＡｄＶヘルパー因子の最小限のセットは、ＡｄＶ分子Ｅｌ、Ｅ２、Ｅ４及びＶＡ ＲＮＡからなる（例えば、Ｍｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０２０）Ｖｉｒｕｓ １２（６）：６６２を参照のこと）。特に、効率的なＡＡＶ産生に必要なＡｄＶヘルパー因子の最小セットは、ＡｄＶ分子Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ４及びＶＡ ＲＮＡを含む。特定の実施形態では、第２の核酸ベクターは、宿主細胞（例えば、宿主ＡＡＶ産生細胞）における効率的なＡＡＶ産生（例えば、ＡＡＶ複製及びパッケージング）を可能にする十分なセットのヘルパーウイルス遺伝子を含む。

【0139】

典型的なＡｄＶゲノムは、初期と後期に分けられる、約４０の密に調節されたタンパク質を発現する。早期相タンパク質としては、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、及びＥ４が挙げられる。簡潔にいえば、Ｅ１Ａ及びＥ２Ａタンパク質は、ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質の発現を制御するＡＡＶプロモーターｐ５及びｐ１９を活性化するように機能する。Ｅ１Ａが媒介するｐ５活性は、ＡＡＶ複製に必要であることが判明している。Ｅ２Ａは、ＡＡＶ複製の様々な態様を促進することが示されている一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質である。Ｅ１Ｂ遺伝子は、Ｅ１Ｂ１９Ｋ及びＥ１Ｂ５５Ｋがんタンパク質をコードする。Ｅ１Ｂ１９Ｋは、Ｅ１Ａ誘導アポトーシスを阻害し、Ｅ１Ｂ５５Ｋは腫瘍抑制タンパク質ｐ５３を阻害する。Ｅ１Ｂ５５Ｋは、Ｅ４ｏｒｆ６と一緒に機能して、ＡＡＶ第２鎖合成及びウイルスＤＮＡ複製を促進する。Ｅ１Ｂ５５Ｋは、ＡＡＶ ｍＲＮＡのエクスポートを容易にし、細胞ｍＲＮＡのエクスポートを阻害すると同時に、ＡＡＶ遺伝子発現を促進することも示されている。Ｅ１Ｂ１９Ｋは、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ５５Ｋ、Ｅ２Ａ、及びＥ４ｏｒｆ６などの他のＡｄＶヘルパー因子と共発現する場合にＡＡＶ力価を増強するのに機能することが見出された。

【0140】

ＶＡ ＲＮＡは、細胞性自然免疫タンパク質二本鎖ＲＮＡ活性化キナーゼ（ＰＫＲ）の阻害において機能することが見出され、このキナーゼの阻害が、効率的なウイルスタンパク質合成を保証する。ＶＡ ＲＮＡは、ＡＡＶ構造タンパク質の合成及びアセンブリを容易にすることも示されている。ＡｄＶゲノム内のＶＡ核酸は、ＶＡ ＲＮＡを生じさせる非翻訳核酸配列であることが当業者に容易に理解される。

【0141】

最も一般的に使用されるヘルパー機能の１つは、ヒトＡｄＶ５型に由来する。アデノウイルスヘルパーウイルス遺伝子は、他の公知のアデノウイルス、例えばＡｄＶ２型由来であってもよい。ＡｄＶ５ゲノムは、約３６キロベースであり、例示的なＡｄＶ５ゲノム配列は、ＮＣＢＩ参照配列ＡＣ＿０００００８．１を介して見出すことができる。ＮＣＢＩの参照配列によれば、Ｅ１Ａは、ヌクレオチド５６０～１５４５によってコードされ；Ｅ１Ｂ１９Ｋは、ヌクレオチド１７１４～２２４４によってコードされ；Ｅ１Ｂ５５Ｋは、ヌクレオチド２０１９～３５０９によってコードされ；Ｅ２Ａは、ヌクレオチド２２４４３～２４０３２によってコードされ；Ｅ４ｏｒｆ６／７は、ヌクレオチド３２９１４～３４０７７によってコードされる。

【0142】

特定の実施形態では、本開示は、ＡｄＶ５ Ｅ２Ａをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。特定の実施形態では、ＡｄＶ５ Ｅ２Ａをコードするヌクレオチド配列を含む核酸は、ＡｄＶ５ Ｅ２Ａをコードするヌクレオチド配列と作動可能に連結される転写調節エレメントを含む。特定の実施形態では、ＡｄＶ５ Ｅ２Ａをコードするヌクレオチド配列を含む核酸は、配列番号６０に記載の配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する配列を含む。特定の実施形態では、ＡｄＶ５ Ｅ２Ａをコードするヌクレオチド配列を含む核酸は、配列番号６０に記載される配列を含むか、またはそれからなる。特定の実施形態では、本開示は、異なるアデノウイルス血清型（例えば、ＡｄＶ２）において、ＡｄＶ５について記載されているＥ２Ａをコードする配列に相当するヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。

【0143】

特定の実施形態では、本開示は、ＡｄＶ５ Ｅ４をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。特定の実施形態では、ＡｄＶ５ Ｅ４をコードするヌクレオチド配列を含む核酸は、ＡｄＶ５ Ｅ４をコードするヌクレオチド配列と作動可能に連結される転写調節エレメントを含む。特定の実施形態では、ＡｄＶ５ Ｅ４をコードするヌクレオチド配列を含む核酸は、配列番号６１に記載の配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する配列を含む。特定の実施形態では、ＡｄＶ５ Ｅ４をコードするヌクレオチド配列を含む核酸は、配列番号６１に記載される配列を含むか、またはそれからなる。特定の実施形態では、本開示は、異なるアデノウイルス血清型（例えば、ＡｄＶ２）において、ＡｄＶ５について記載されているＥ４をコードする配列に相当するヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。

【0144】

特定の実施形態では、本開示は、ＡｄＶ５ ＶＡ ＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。特定の実施形態では、ＡｄＶ５ ＶＡ ＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む核酸は、ＡｄＶ５ ＶＡ ＲＮＡをコードするヌクレオチド配列と作動可能に連結される転写調節エレメントを含む。特定の実施形態では、ＡｄＶ５ ＶＡ ＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む核酸は、配列番号６２に記載の配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する配列を含む。特定の実施形態では、ＡｄＶ５ ＶＡ ＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む核酸は、配列番号６２に記載される配列を含むか、またはそれからなる。ＶＡ ＲＮＡの核酸配列は、ＶＡ ＲＮＡを生じさせる（例えば、「コードする」）非翻訳核酸配列であることが当業者に容易に理解される。特定の実施形態では、本開示は、異なるアデノウイルス血清型（例えば、ＡｄＶ２）において、ＡｄＶ５について記載されているＶＡ ＲＮＡをコードする配列に相当するヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。

【0145】

特定の実施形態では、本開示は、ＡｄＶ５ Ｅ２Ａ、Ｅ４及びＶＡ ＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。特定の実施形態では、ＡｄＶ５ Ｅ２Ａ、Ｅ４及びＶＡ ＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む核酸は、ＡｄＶ５ Ｅ２Ａ、Ｅ４及びＶＡ ＲＮＡをコードするヌクレオチド配列の各々に作動可能に連結され得る１つ以上の転写調節エレメントを含む。特定の実施形態では、ＡｄＶ５ Ｅ２Ａ、Ｅ４及びＶＡ ＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む核酸は、配列番号６３に記載の配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する配列を含む。特定の実施形態では、ＡｄＶ５ Ｅ２Ａ、Ｅ４及びＶＡ ＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む核酸は、配列番号６３に記載される配列を含むか、またはそれからなる。

【0146】

特定の実施形態では、本開示は、効率的なＡＡＶ産生に必要とされるＡｄＶヘルパー因子の最小セットをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。特定の実施形態では、ＡｄＶヘルパー因子の最小セットをコードするヌクレオチドを含む核酸は、ＡｄＶ分子Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ４及びＶＡ ＲＮＡをコードする。

【0147】

ＨＥＫ２９３Ｔ細胞のような特定の宿主細胞は、全てではないが幾つかの必要なヘルパー因子を内因的に提供し、残りのヘルパー因子を、プラスミドトランスフェクションによって外因的に提供し得る。例えば、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、アデノウイルスＥ１Ａ及びＥ１Ｂ遺伝子を内因的に発現し、残りのアデノウイルスヘルパー遺伝子、すなわち、ＡｄＶ５ Ｅ４、Ｅ２Ａ、及びウイルス関連（ＶＡ）ＲＮＡをコードするものを提供する。このようなＡｄＶ５ヘルパー遺伝子は、トランスフェクションを通じて単一のベクターによって提供されてもよい。特定の実施形態では、本開示は、Ｅ２Ａ、Ｅ４及びＶＡ ＲＮＡからなる群から選択されるＡｄＶ５ヘルパーウイルス遺伝子を含む第２の核酸ベクターを提供する。特定の実施形態では、本開示は、異なるアデノウイルス血清型（例えば、ＡｄＶ２）に由来するＡｄＶ５について記載されたＥ２Ａ、Ｅ４及びＶＡ ＲＮＡをコードするヘルパーウイルス遺伝子を含む第２の核酸ベクターを提供する。

【0148】

ヘルパーウイルス遺伝子はまた、ヘルペスウイルス、パピローマウイルス、及びヒトボカウイルスに由来する場合もある。ヘルパーウイルス因子が由来し得るヘルペスウイルスの例としては、ＨＳＶ－１及びＨＳＶ－２が挙げられる。ＡＡＶ産生の支援に関与することが公知のＨＳＶ－１由来のヘルパーウイルス因子としては、限定するものではないが、ＵＬ５、ＵＬ８、ＵＬ５２、ＩＣＰ８、ＩＣＰ０、ＩＣＰ４、ＩＣＰ２２、ＵＬ３０及びＵＬ４２が挙げられる。これらのＨＳＶ－１ヘルパーウイルス因子の様々な機能、及びそれらがＡＡＶ産生を支援する方法は、当業者に公知である。例えば、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質ＩＣＰ８に加えて、ＨＳＶ－１ヘリカーゼ－プライマーゼ複合体ＵＬ５／ＵＬ８／ＵＬ５２も、ＡＡＶ感染モデルにおけるＡＡＶ子孫産生の回復に十分であることが知られており；ＩＣＰ０、ＩＣＰ４及びＩＣＰ２２は、Ｒｅｐタンパク質の発現を促進することに関与しており；及びＨＳＶ－１ ＤＮＡポリメラーゼＵＬ３０／ＵＬ４２は、ＡＡＶ ＤＮＡの複製に関与している。したがって、特定の実施形態では、第２の核酸ベクターは、ＵＬ５、ＵＬ８、ＵＬ５２、ＩＣＰ８、ＩＣＰ０、ＩＣＰ４、ＩＣＰ２２、ＵＬ３０及びＵＬ４２からなる群から選択される少なくとも１つのヘルパーウイルス遺伝子を含む。ヘルパーウイルス因子が由来し得るパピローマウイルスの例は、ＨＰＶ－１６である。特定の実施形態では、ＨＰＶ－１６に由来するヘルパーウイルス因子は、ＡｄＶヘルパー因子の存在下でＡＡＶ産生を増強し得る。ＡＡＶ複製の支援に関与することが公知のそのようなＨＰＶ－１６ヘルパー因子としては、Ｅ１、Ｅ２及びＥ６が挙げられるが、これらに限定されない。ヘルパーウイルス因子が由来し得るヒトボカウイルスの例は、ヒトボカウイルス１（ＨＢｏＶｌ）である。ＡＡＶ産生の支援に関与することが公知のＨＢｏＶ１由来のヘルパーウイルス因子としては、ＮＰ１、ＮＳ２、ＮＳ４及びウイルス長非コードＲＮＡ ＢｏｃａＳＲが含まれるが、これらに限定されない。

【0149】

ＩＶ．ベクター及び細胞
本開示は、ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列と、導入遺伝子を含むｒＡＡＶゲノムを含む第２のヌクレオチド配列と、ＡＡＶキャプシドタンパク質をコードする第３のヌクレオチド配列とを含む第１の核酸ベクター；ならびにヘルパーウイルス遺伝子を含む第２の核酸ベクターを提供する。

【0150】

第１の核酸ベクター及び第２の核酸ベクターは、独立して、任意の形態の核酸ベクターであってもよい。適切なベクターとしては、プラスミド、最小ベクター（例えば、ミニサークル、Ｎａｎｏｐｌａｓｍｉｄｓ（商標）、ドギーボーン（ｄｏｇｇｙｂｏｎｅ）、ＭＩＤＧＥベクター、など）、ウイルス、コスミド、人工染色体、線状ＤＮＡ及びｍＲＮＡが挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、第１の核酸ベクター及び／または第２の核酸ベクターは、ＤＮＡプラスミドまたはＤＮＡ最小ベクターである。必要なベクターエレメントを適合可能な任意のＤＮＡプラスミドまたはＤＮＡ最小ベクターを、第１の核酸ベクター及び第２の核酸ベクターに使用してもよい。適切なＤＮＡ最小ベクターとしては、限定するものではないが、線形共有結合で閉じたＤＮＡ（例えば、ミニストリングＤＮＡ）、線形共有結合で閉じたダンベル形のＤＮＡ（例えば、ドギーボーンＤＮＡ、ダンベルＤＮＡ）、ミニサークル、Ｎａｎｏｐｌａｓｍｉｄｓ（商標）、最小限の免疫学的に定義された遺伝子発現（ｍｉｎｉｍａｌｉｓｔｉｃ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ ｄｅｆｉｎｅｄ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）（ＭＩＤＧＥ）ベクター、及び当業者に公知のものが挙げられる。ＤＮＡ最小ベクター及びそれらの産生方法は、例えば、米国特許出願第２０１００２３３８１４号、同第２０１２０２８２２８３号、同第２０１３０２１６５６２号、同第２０１５０２１８５６５号、同第２０１５０２１８５８６号、同第２０１６０００８４８８号、同第２０１６０２１５２９６号、同第２０１６０３５５８２７号、同第２０１９０１８５９２４号、同第２０２００２７７６２４号、及び同第２０２１００１００２１号に記載されており、これらは全て、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0151】

特定の実施形態では、本明細書に開示されるベクター中の核酸は、例えば、コドン／ＲＮＡの最適化、異種シグナル配列との置換、及び／またはｍＲＮＡ不安定エレメントの除去によって最適化される。コドン変化を導入することにより、及び／またはｍＲＮＡ中の阻害領域を除去することにより、組換え発現のために最適化されたポリヌクレオチドを産生するための方法は、例えば、米国特許第５，９６５，７２６号、同第６，１７４，６６６号、同第６，２９１，６６４号、同第６，４１４，１３２号、及び同第６，７９４，４９８号（これらは全て、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載される最適化方法を適合することにより実施し得る。例えば、ＲＮＡ内の潜在的なスプライス部位及び不安定性エレメント（例えば、Ａ／ＴまたはＡ／Ｕリッチエレメント）は、核酸配列によってコードされたアミノ酸を変更することなく変異され、組換え発現のためのＲＮＡの安定性を高め得る。これらの改変では、例えば、同一アミノ酸の代替のコドンを使用して、遺伝子コードの縮重を利用する。特定の実施形態では、保存的突然変異、例えば、類似の化学構造及び特性を有する類似のアミノ酸をコードするか、及び／または元のアミノ酸として機能するように１つ以上のコドンを変更することが望ましい場合がある。このような方法は、最適化されていないポリヌクレオチドによってコードされたキャプシドの発現と比較して、コードされたキャプシドタンパク質の発現を増大し得る。

【0152】

本明細書に開示されるベクターは、ベクターの増殖のため、及び／またはベクターによってコードされるタンパク質の発現のために、（当該技術分野で公知の任意の技術を使用して）細胞に導入され得る。したがって、別の態様では、本開示は、本明細書に開示されたベクターを含む組換え細胞を提供する。さらに、別の態様では、本開示は、ｒＡＡＶの製造方法を提供し、この方法は、ポリヌクレオチドが発現され、かつｒＡＡＶが産生される条件下で組換え細胞を培養することを含む。

【0153】

様々な宿主細胞及び発現系を利用し得る。このような発現系は、目的のコード配列を産生し、その後に精製し得るビヒクルを表すが、本明細書に記載された適切なヌクレオチドコード配列で形質転換またはトランスフェクトした場合にｒＡＡＶを産生し得る細胞も表す。これらとしては、限定するものではないが、微生物、例えば、本明細書に記載のヌクレオチドコード配列を含む、例えば、組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、またはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ及びＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）；例えば、本明細書に記載のヌクレオチドコード配列を含む組換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ Ｐｉｃｈｉａ）；例えば、本明細書に記載のヌクレオチドコード配列を含む組換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系；例えば、組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）に感染するか、または例えば、本明細書に記載のヌクレオチドコード配列を含む組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）で形質転換された植物細胞系（例えば、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉなどの緑藻類）；あるいは、例えば、哺乳動物細胞のゲノム由来のプロモーター（例えばメタロチオネインプロモーター）または哺乳動物ウイルス由来のプロモーター（例えば、アデノウイルス後期プロモーター；ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）を含む、本明細書に記載のヌクレオチドコード配列を含む組換え発現構築物を保有する哺乳動物細胞系（例えば、ＣＯＳ（例えば、ＣＯＳ１またはＣＯＳ）、ＣＨＯ、ＢＨＫ、ＭＤＣＫ、ＨＥＫ２９３、ＮＳ０、ＰＥＲ．Ｃ６、ＶＥＲＯ、ＣＲＬ７Ｏ３Ｏ、ＨｓＳ７８Ｂｓｔ、ＨｅＬａ、及びＮＩＨ ３Ｔ３、ＨＥＫ２９３Ｔ、ＨＥＫ２９３Ｆ、ＨｅｐＧ２、ＳＰ２１０、Ｒ１．１、Ｂ－Ｗ、Ｌ－Ｍ、ＢＳＣ１、ＢＳＣ４０、ＹＢ／２０及びＢＭＴ１０細胞）が挙げられる。特定の実施形態では、本明細書に記載のヌクレオチドコード配列を発現する細胞は、ヒト細胞、例えば、ヒト細胞株である。特定の実施形態では、哺乳動物発現ベクターは、ｐＯｐｔｉＶＥＣ（商標）またはｐｃＤＮＡ３．３である。特定の実施形態では、細菌細胞、例えばＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、または真核生物細胞（例えば、哺乳動物細胞）が、本明細書に記載されるヌクレオチドコード配列の発現に使用される。例えば、ＣＨＯまたはＨＥＫ２９３細胞などの哺乳動物細胞は、ヒトサイトメガロウイルス由来の主要な中間初期遺伝子プロモーターエレメントなどのベクターエレメントと組み合わせて、本明細書に記載のポリヌクレオチドの効果的な発現系である。

【0154】

細菌系では、発現されるタンパク質に対して意図される用途に応じて、有利には複数の発現ベクターを選択し得る。例えば、大量のタンパク質を産生する場合には、容易に精製される高レベルの融合タンパク質産物の発現を指示するベクターが望ましい場合がある。そのようなベクターとしては、限定するものではないが、タンパク質コード配列を、融合タンパク質が産生されるようにｌａｃ Ｚコード領域を有するフレーム内のベクターに個々にライゲーションされ得るＥ．ｃｏｌｉ発現ベクターｐＵＲ２７８（Ｒｕｅｔｈｅｒ Ｕ ＆ Ｍｕｅｌｌｅｒ－Ｈｉｌｌ Ｂ（１９８３）ＥＭＢＯ Ｊ ２：１７９１－１７９４）；ｐＩＮベクター（Ｉｎｏｕｙｅ Ｓ ＆ Ｉｎｏｕｙｅ Ｍ（１９８５）Ｎｕｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １３：３１０１－３１０９；Ｖａｎ Ｈｅｅｋｅ Ｇ ＆ Ｓｃｈｕｓｔｅｒ ＳＭ（１９８９）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２４：５５０３－５５０９）；などが挙げられ、これらの全てが、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。例えば、ｐＧＥＸベクターは、グルタチオン５ートランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として外来ポリペプチドを発現させるためにも使用され得る。一般的に、このような融合タンパク質は可溶性であり、可溶化細胞から、マトリックスグルタチオンアガロースビーズへ吸着及び結合し、続いて遊離グルタチオンの存在下で溶出することによって容易に精製され得る。ｐＧＥＸベクターは、クローニングされた標的遺伝子産物をＧＳＴ部分から遊離させることができるように、トロンビンまたは第Ｘａ因子プロテアーゼの切断部位を含むように設計される。

【0155】

昆虫系では、例えば、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｈｆｏｒｎｉｃａ核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）を、外来遺伝子を発現するベクターとして使用し得る。このウイルスはＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞で増殖する。このタンパク質コード配列を、ウイルスの非必須領域（例えばポリヘドリン遺伝子）に個々にクローニングし、ＡｃＮＰＶプロモーター（例えばポリヘドリンプロモーター）の制御下に置いてもよい。

【0156】

哺乳動物宿主細胞では、多くのウイルスベースの発現系が利用され得る。アデノウイルスを発現ベクターとして使用する場合、目的のタンパク質コード配列を、アデノウイルス転写／翻訳制御複合体、例えば、後期プロモーター及び３部分（ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ）リーダー配列にライゲーションしてもよい。次いで、このキメラ遺伝子を、インビトロまたはインビボでの組換えによってアデノウイルスゲノム内に挿入してもよい。ウイルスゲノム（例えば、領域ＥｌまたはＥ３）の非必須領域への挿入は、生存可能であり、かつ感染した宿主において本明細書に記載のヌクレオチドコード配列を発現し得る組換えウイルスを生じる（例えば、全体が参照によって本明細書に組み込まれる、Ｌｏｇａｎ Ｊ ＆ Ｓｈｅｎｋ Ｔ（１９８４）ＰＮＡＳ ８１（１２）：３６５５－９を参照のこと）。特異的な開始シグナルは、挿入されたタンパク質コード配列の効率的な翻訳にも必要となり得る。これらのシグナルは、ＡＴＧ開始コドン及び隣接配列を含む。さらに、挿入物全体の翻訳を保証するために、開始コドンは、所望のコード配列の読み取りフレームとインフェーズでなければならない。これらの外因性の翻訳制御シグナル及び開始コドンは、天然及び合成の両方の様々な起源のものであり得る。発現の効率は、適切な転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーターなどを含めることによって高めることができる（例えば、その内容全体を参照により本明細書に組み込む、Ｂｉｔｔｅｒ Ｇｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５３：５１６－５４４を参照のこと）。

【0157】

さらに、挿入された配列の発現を調節するか、または所望の特定の様式で遺伝子産物を修飾及び処理する宿主細胞株を選択してもよい。タンパク質産物のそのような修飾（例えば、グリコシル化）及びプロセシング（例えば、切断）は、タンパク質の機能にとって重要であり得る。異なる宿主細胞は、タンパク質及び遺伝子産物の翻訳後プロセシング及び修飾のための特徴的かつ特異的な機構を有する。発現された外来タンパク質の正しい修飾及びプロセシングを確実にするために適切な細胞株または宿主系を選択し得る。この目的のために、一次転写物の適切なプロセシング、遺伝子産物のグリコシル化、及びリン酸化のための細胞機構を有する真核宿主細胞を使用してもよい。このような哺乳動物宿主細胞としては、限定するものではないが、ＣＨＯ、ＶＥＲＯ、ＢＨＫ、Ｈｅｌａ、ＭＤＣＫ、ＨＥＫ２９３、ＨＥＫ２９３Ｔ、ＨＥＫ２９３Ｆ、ＨＥＫ２９３ＥＢＮＡ、ＮＩＨ３Ｔ３、Ｗ１３８、ＢＴ４８３、Ｈｓ５７８Ｔ、ＨＴＢ２、ＢＴ２Ｏ及びＴ４７Ｄ、ＮＳ０（内因的にいかなる免疫グロブリン鎖も産生しないマウス骨髄腫細胞株）、ＣＡＰ、ＣＡＰ－Ｔ、ＣＲＬ７Ｏ３Ｏ、ＣＯＳ（例えば、ＣＯＳ１またはＣＯＳ）、ＰＥＲ．Ｃ６、ＶＥＲＯ、ＡＧＥ１．ＣＲ、Ａ５４９、ＨｓＳ７８Ｂｓｔ、ＨｅｐＧ２、Ｃ１３９、ＥＢ６６、ＳＰ２１０、Ｒ１．１、Ｂ－Ｗ、Ｌ－Ｍ、ＢＳＣ１、ＢＳＣ４０、ＹＢ／２０、ＢＭＴ１０及びＨｓＳ７８Ｂｓｔ細胞が挙げられる。

【0158】

特定の実施形態では、ウイルス複製起点を含む発現ベクターを使用するのではなく、適切な転写調節エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位など）によって制御されるポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）、及び選択マーカーで宿主細胞を形質転換してもよい。ポリヌクレオチドの導入に続いて、操作された細胞を、富化培地中で１～２日間増殖させてもよく、次いで選択培地に切り替える。組換えプラスミド中の選択マーカーは、選択に対する耐性を付与し、細胞がそのプラスミドをそれらの染色体に安定的に組み込み、増殖して病巣を形成することを可能にし、これは次にクローニングされて細胞株に拡大され得る。この方法は、本明細書に記載されるタンパク質またはその断片を発現する細胞株を操作するのに有利に使用し得る。

【0159】

限定するものではないが、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒ Ｍ ｅｔ ａｌ．（１９７７）Ｃｅｌｌ １１（１）：２２３－３２）、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｓｚｙｂａｌｓｋａ ＥＨ ＆ Ｓｚｙｂａｌｓｋｉ Ｗ（１９６２）ＰＮＡＳ ４８（１２）：２０２６－２０３４）、及びアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｌｏｗｙ Ｉ ｅｔ ａｌ．（１９８０）Ｃｅｌｌ ２２（３）：８１７－２３）遺伝子（その全ては、それらの全体が参照によって本明細書に組み込まれる）を含む多数の選択系を、それぞれｔｋ細胞、ｈｇｐｒｔ細胞またはａｐｒｔ細胞において使用してもよい。また、代謝拮抗薬の耐性を、以下の遺伝子の選択の基礎として用いてもよい：メトトレキセートに対する耐性を付与するｄｈｆｒ（Ｗｉｇｌｅｒ Ｍ ｅｔ ａｌ．（１９８０）ＰＮＡＳ ７７（６）：３５６７－７０；Ｏ’Ｈａｒｅ Ｋ ｅｔ ａｌ．（１９８１）ＰＮＡＳ ７８：１５２７－３１）；ミコフェノール酸に耐性を付与するｇｐｔ（Ｍｕｌｌｉｇａｎ ＲＣ ＆ Ｂｅｒｇ Ｐ（１９８１）ＰＮＡＳ ７８（４）：２０７２－６）；アミノグルコシドＧ－４１８に耐性を付与するｎｅｏ（Ｗｕ ＧＹ ＆ Ｗｕ ＣＨ（１９９１）Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ ３：８７－９５；Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖ Ｐ（１９９３）Ａｎｎ Ｒｅｖ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｔｏｘｉｃｏｌ ３２：５７３－５９６；Ｍｕｌｌｉｇａｎ ＲＣ（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０：９２６－９３２；及びＭｏｒｇａｎ ＲＡ ＆ Ａｎｄｅｒｓｏｎ ＷＦ（１９９３）Ａｎｎ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ ６２：１９１－２１７；Ｎａｂｅｌ ＧＪ ＆ Ｆｅｌｇｎｅｒ ＰＬ（１９９３）Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １１（５）：２１１－５）；及びハイグロマイシンに耐性を付与するｈｙｇｒｏ（Ｓａｎｔｅｒｒｅ ＲＦ ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｇｅｎｅ ３０（１－３）：１４７－５６）（全てが、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる）。組換えＤＮＡ技術の当該分野で一般的に公知の方法は、所望の組換えクローンを選択するために慣用的に適用されており、このような方法は、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ ＦＭ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９９３）；Ｋｒｉｅｇｌｅｒ Ｍ，Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９９０）；及びＣｈａｐｔｅｒｓ １２ ａｎｄ １３，Ｄｒａｃｏｐｏｌｉ ＮＣ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９９４）；Ｃｏｌｂｅｒｅ－Ｇａｒａｐｉｎ Ｆ ｅｔ ａｌ．（１９８１）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １５０：１－１４（その全てが、それらの全体が参照によって本明細書に組み込まれる）に記載される。

【0160】

Ｖ．アデノ随伴ウイルスパッケージングシステム及び方法
別の態様では、本開示は、本明細書に開示されている組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）の組換え調製用のパッケージングシステムを提供する。特に、本開示は、本明細書に記載のデュアルベクタートランスフェクションシステム下でのＡＡＶ産生に有用なパッケージングシステムを提供する（例えば、ＡＡＶ産生は、宿主細胞に送達される第１及び第２の核酸ベクターを含むパッケージングシステムの使用によって媒介される）。このようなパッケージングシステムは、一般的に、（１）ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、導入遺伝子を含むｒＡＡＶゲノムを含む第２のヌクレオチド配列、及びＡＡＶキャプシドタンパク質をコードする第３のヌクレオチド配列を含む第１の核酸ベクター；ならびに（２）ヘルパーウイルス遺伝子を含む第２の核酸ベクターを含むか、またはそれらからなる。第１の核酸ベクターと第２の核酸ベクターとは一緒になって、ｒＡＡＶの産生に必要な全ての成分を提供し得る。特定の実施形態では、ｒＡＡＶの製造に必要な成分は、ｒＡＡＶが産生される宿主細胞によって提供される。このような実施形態では、第１の核酸ベクターと第２の核酸ベクターは、宿主細胞と一緒になって、ｒＡＡＶの産生に必要な全ての成分を提供し得る。本明細書に記載のパッケージングシステムは、ｒＡＡＶゲノムをキャプシドに封入してｒＡＡＶを形成するための細胞内で動作する。

【0161】

特定の実施形態では、本開示は、（１）ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、導入遺伝子を含むｒＡＡＶゲノムを含む第２のヌクレオチド配列、及びＡＡＶキャプシドタンパク質をコードする第３のヌクレオチド配列を含む第１の核酸ベクター；ならびに（２）ヘルパーウイルス遺伝子を含む第２の核酸ベクターを含む、ｒＡＡＶパッケージングシステムを提供する。特定の実施形態では、本開示は、（１）５’から３’方向に、ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、導入遺伝子を含むｒＡＡＶゲノムを含む第２のヌクレオチド配列、及びＡＡＶキャプシドタンパク質をコードする第３のヌクレオチド配列を含む第１の核酸ベクター；ならびに（２）ヘルパーウイルス遺伝子を含む第２の核酸ベクターを含む、ｒＡＡＶパッケージングシステムを提供する。

【0162】

特定の実施形態では、パッケージングシステムの第１の核酸ベクターは、導入遺伝子を含むｒＡＡＶゲノムを含む。本開示のパッケージングシステムの第１の核酸ベクターは、ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質コード配列またはその機能的バリアントのコード配列と、ＡＡＶキャプシドタンパク質コード配列とをさらに含む。したがって、本開示は、ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質またはその機能的バリアントをコードする第１のヌクレオチド配列と、導入遺伝子を含むｒＡＡＶゲノムを含む第２のヌクレオチド配列と、ＡＡＶキャプシドタンパク質をコードする第３のヌクレオチド配列とを含むパッケージングシステムの第１の核酸ベクターを提供する。特定の実施形態では、パッケージングシステムの第１の核酸ベクターは、５’から３’方向に：ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質またはその機能的バリアントをコードする第１のヌクレオチド配列、導入遺伝子を含むｒＡＡＶゲノムを含む第２のヌクレオチド配列、及びＡＡＶキャプシドタンパク質をコードする第３のヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、パッケージングシステムの第１の核酸ベクターは、ヘルパーウイルス遺伝子を含まない。

【0163】

任意のＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質を、本明細書に開示されたパッケージングシステムに使用し得る。パッケージングシステムの特定の実施形態では、Ｒｅｐヌクレオチド配列は、ＡＡＶ２ Ｒｅｐタンパク質をコードする。適切なＡＡＶ２ Ｒｅｐタンパク質には、限定はしないが、Ｒｅｐ７８／６８またはＲｅｐ６８／５２が挙げられ得る。パッケージングシステムの特定の実施形態では、ＡＡＶ２ Ｒｅｐタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、配列番号６４のＡＡＶ２ Ｒｅｐアミノ酸配列に対する最小配列同一性パーセントを有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、最小配列同一性パーセントは、ＡＡＶ２ Ｒｅｐタンパク質のアミノ酸配列の長さにわたって少なくとも７０％（例えば、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）である。パッケージングシステムの特定の実施形態では、ＡＡＶ２ Ｒｅｐタンパク質は、配列番号６４に記載のアミノ酸配列を有する。

【0164】

特定の実施形態では、パッケージングシステムの第２の核酸ベクターは、ヘルパーウイルス遺伝子を含む。本開示のパッケージングシステムの第２の核酸ベクターは、１つ以上のヘルパーウイルス遺伝子を含み得る。本開示の特定の態様は、パッケージングシステムの第２の核酸ベクターが、本明細書に記載された第１の核酸ベクターに見られるＡＡＶ産生のいかなる構成要素も含まないことを示す。特定の実施形態では、パッケージングシステムの第２の核酸ベクターは、導入遺伝子を含むｒＡＡＶゲノムを含まない。特定の実施形態では、パッケージングシステムの第２の核酸ベクターは、ＡＡＶキャプシドタンパク質コード配列を含まない。特定の実施形態では、パッケージングシステムの第２の核酸ベクターは、Ｒｅｐコード配列も、その機能的バリアントのコード配列も含まない。特定の実施形態では、パッケージングシステムの第２の核酸ベクターは、導入遺伝子を含むｒＡＡＶゲノムを含まず、パッケージングシステムの第２の核酸ベクターは、ＡＡＶキャプシドタンパク質コード配列を含まず、及び／またはパッケージングシステムの第２の核酸ベクターは、Ｒｅｐコード配列も、その機能的バリアントのコード配列も含まない。

【0165】

パッケージングシステムの特定の実施形態では、ヘルパーウイルスは、アデノウイルス、ヘルペスウイルス（例としては、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、ポックスウイルス（ワクシニアウイルスなど）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、及びバキュロウイルスからなる群から選択される。ヘルパーウイルスがアデノウイルスであるパッケージングシステムの特定の実施形態では、アデノウイルスゲノムは、Ｅｌ、Ｅ２、Ｅ４及びＶＡからなる群から選択される１つ以上のアデノウイルスＲＮＡ遺伝子を含む。パッケージングシステムの特定の実施形態では、アデノウイルスゲノムは、Ｅ２、Ｅ４及びＶＡからなる群から選択される１つ以上のアデノウイルスＲＮＡ遺伝子を含む。ヘルパーウイルスがＨＳＶである、パッケージングシステムの特定の実施形態では、ＨＳＶゲノムが、ＵＬ５／８／５２、ＩＣＰ０、ＩＣＰ４、ＩＣＰ２２及びＵＬ３０／ＵＬ４２からなる群から選択される１つ以上のＨＳＶ遺伝子を含む。

【0166】

パッケージングシステムの特定の実施形態では、パッケージングシステムの第１及び第２の核酸ベクターは、２つのプラスミド内に含まれる。特定の実施形態では、パッケージングシステムの第１の核酸ベクターは、第１のプラスミド内に含まれる。特定の実施形態では、パッケージングシステムの第２の核酸ベクターは、第２のプラスミド内に含まれる。

【0167】

パッケージングシステムの特定の実施形態では、パッケージングシステムの第１及び第２の核酸ベクターは、２つの組換えヘルパーウイルス内に含まれる。特定の実施形態では、パッケージングシステムの第１の核酸ベクターは、第１の組換えヘルパーウイルス内に含まれる。特定の実施形態では、パッケージングシステムの第２の核酸ベクターは、第２の組換えヘルパーウイルス内に含まれる。特定の実施形態では、パッケージングシステムの第１及び第２の核酸ベクターは、単一組換えヘルパーウイルス内に含まれる。

【0168】

さらなる態様では、本開示は、ｒＡＡＶの組換え調製のための方法であって、ｒＡＡＶゲノムをキャプシド内に封入してｒＡＡＶを形成するために作動可能な条件下で、本明細書に記載されるパッケージングシステムで細胞をトランスフェクションまたは形質導入することを含む方法を提供する。ｒＡＡＶの組換え調製のための例示的な方法としては、一過性トランスフェクション（例えば、１つ以上のトランスフェクションプラスミドを含む）、ウイルス感染（例えば、アデノウイルス、ポックスウイルス（ワクシニアウイルスなど）、ヘルペスウイルス（ＨＳＶ、サイトメガロウイルス、またはバキュロウイルスなど）などの１つ以上の組換えヘルパーウイルスを含む）、及び安定プロデューサー細胞株トランスフェクションまたは感染（例えば、哺乳動物または昆虫細胞などなどの安定プロデューサー細胞による）が挙げられる。

【0169】

したがって、本開示は、ｒＡＡＶの調製のためのパッケージングシステムであって、（１）ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質またはその機能的バリアントをコードする第１のヌクレオチド配列と；ｒＡＡＶゲノムを含む第２のヌクレオチド配列と；ＡＡＶキャプシドタンパク質をコードする第３のヌクレオチド配列と、を含む第１の核酸ベクター、ならびに（２）ヘルパーウイルス遺伝子を含む第２の核酸ベクターを含む、パッケージングシステムを提供する。特定の実施形態では、本開示は、ｒＡＡＶの調製のためのパッケージングシステムであって：（１）５’から３’方向に、ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質またはその機能的バリアントをコードする第１のヌクレオチド配列と；ｒＡＡＶゲノムを含む第２のヌクレオチド配列と；ＡＡＶキャプシドタンパク質をコードする第３のヌクレオチド配列と、を含む第１の核酸ベクター、ならびに（２）ヘルパーウイルス遺伝子を含む第２の核酸ベクターを含む、パッケージングシステムを提供する。

【0170】

したがって、本開示は、ｒＡＡＶの組換え調製のための方法であって、（１）ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質またはその機能的バリアントをコードする第１のヌクレオチド配列と；ｒＡＡＶゲノムを含む第２のヌクレオチド配列と；ＡＡＶキャプシドタンパク質をコードする第３のヌクレオチド配列と、を含む第１の核酸ベクター、ならびに（２）ヘルパーウイルス遺伝子を含む第２の核酸ベクターを含む、パッケージングシステムを用いて細胞をトランスフェクトすること、または形質導入することを含む、方法を提供する。特定の実施形態では、本開示は、ｒＡＡＶの組換え調製のための方法であって、（１）５’から３’方向に、ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質またはその機能的バリアントをコードする第１のヌクレオチド配列と；ｒＡＡＶゲノムを含む第２のヌクレオチド配列と；ＡＡＶキャプシドタンパク質をコードする第３のヌクレオチド配列と、を含む第１の核酸ベクター、ならびに（２）ヘルパーウイルス遺伝子を含む第２の核酸ベクターを含む、パッケージングシステムを用いて細胞をトランスフェクトすること、または形質導入することを含む、方法を提供する。

【0171】

特定の実施形態では、細胞にトランスフェクトされるか、または形質導入される核酸の総量は、（１）ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質またはその機能的バリアントをコードする第１のヌクレオチド配列と；ｒＡＡＶゲノムを含む第２のヌクレオチド配列と；ＡＡＶキャプシドタンパク質をコードする第３のヌクレオチド配列と、を含む第１の核酸ベクター、ならびに（２）ヘルパーウイルス遺伝子を含む第２の核酸ベクターを含んでおり、これは０．１μｇのＤＮＡ／１Ｅ６細胞～４μｇのＤＮＡ／１Ｅ６細胞である。例えば、第１の核酸ベクター及び第２の核酸ベクターを含む、細胞にトランスフェクトまたは形質導入される核酸の総量は、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、または４μｇのＤＮＡ／１Ｅ６細胞である。特定の実施形態では、第１の核酸ベクター及び第２の核酸ベクターを含む、細胞にトランスフェクトまたは形質導入される核酸の総量は、１μｇのＤＮＡ／１Ｅ６細胞である。特定の実施形態では、第１の核酸ベクター及び第２の核酸ベクターを含む、細胞にトランスフェクトまたは形質導入される核酸の総量は、０．６μｇのＤＮＡ／１Ｅ６細胞である。特定の実施形態では、第１の核酸ベクター及び第２の核酸ベクターを含む、細胞にトランスフェクトまたは形質導入される核酸の総量は、０．７μｇのＤＮＡ／１Ｅ６細胞である。特定の実施形態では、第１の核酸ベクター及び第２の核酸ベクターを含む、細胞にトランスフェクトまたは形質導入される核酸の総量は、０．７５μｇのＤＮＡ／１Ｅ６細胞である。特定の実施形態では、第１の核酸ベクター及び第２の核酸ベクターを含む、細胞にトランスフェクトまたは形質導入される核酸の総量は、０．８μｇのＤＮＡ／１Ｅ６細胞である。特定の実施形態では、第１の核酸ベクター及び第２の核酸ベクターを含む、細胞にトランスフェクトまたは形質導入される核酸の総量は、０．９μｇのＤＮＡ／１Ｅ６細胞である。

【0172】

特定の実施形態では、第１の核酸ベクター対第２の核酸ベクターの比、または第２の核酸ベクター対第１の核酸ベクターの比は、１：０．１～１：２０である。例えば、第１の核酸ベクター対第２の核酸ベクターの比、または第２の核酸ベクター対第１の核酸ベクターの比は、１：０．１、１：０．２、１：０．３、１：０．４、１：０．５、１：０．６、１：０．７、１：０．８、１：１、１：１．１、１：１．２、１：１．３、１：１．４、１：１．５、１：１．６、１：１．７、１：１．８、１：１．９、１：２、１：２．１、１：２．２、１：２．３、１：２．４、１：２．５、１：２．６、１：２．７、１：２．８、１：２．９、１：３、１：３．１、１：３．２、１：３．２、１：３．３、１：３．４、１：３．５、１：３．６、１：３．７、１：３．８、１：３．９、１：４、１．４．５、１：５、１：５．５、１：６、１：６．５、１：７、１：７．５、１：８、１：８．５、１：９、１：９．５、１：１０、１：１０．５、１：１１、１：１１．５、１：１２、１：１２．５、１：１３、１：１３．５、１：１４、１：１４．５、１：１５、１：１５．５、１：１６、１：１６．５、１：１７、１：１７．５、１：１８、１：１８．５、１：１９、１：１９．５、または１：２０である。特定の実施形態では、第１の核酸ベクター対第２の核酸ベクターの比、または第２の核酸ベクター対第１の核酸ベクターの比は、１：０．２、１：０．４、１：０．６、１：０．８、１：１、１：２、１：３、または１：４からなる群から選択される。特定の実施形態では、第１の核酸ベクター対第２の核酸ベクターの比、または第２の核酸ベクター対第１の核酸ベクターの比は、１：２である。特定の実施形態では、第１の核酸ベクター対第２の核酸ベクターの比、または第２の核酸ベクター対第１の核酸ベクターの比は、１：０．２～１：１である。特定の実施形態では、第１の核酸ベクター対第２の核酸ベクターの比、または第２の核酸ベクター対第１の核酸ベクターの比は、１：０．６である。特定の実施形態では、第１の核酸ベクター対第２の核酸ベクターの比、または第２の核酸ベクター対第１の核酸ベクターの比は１：０．８である。特定の実施形態では、第１の核酸ベクター対第２の核酸ベクターの比、または第２の核酸ベクター対第１の核酸ベクターの比は、１：１である。

【0173】

特定の実施形態では、本明細書に開示されるｒＡＡＶの組換え調製の方法は、（ｉ）ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質及びＡＡＶキャプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む第１のベクター；（ｉｉ）ｒＡＡＶゲノムを含む第２のベクター；及び（ｉｉｉ）１つ以上のヘルパーウイルス遺伝子を含む第３のベクター、を含む哺乳動物細胞を使用して、ｒＡＡＶを産生することを含む方法と比較して、ｒＡＡＶ力価の増大を生じる。特定の実施形態では、本明細書に開示されるｒＡＡＶの組換え調製の方法は、（ｉ）ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質及びＡＡＶキャプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む第１のベクター；（ｉｉ）ｒＡＡＶゲノムを含む第２のベクター；及び（ｉｉｉ）１つ以上のヘルパーウイルス遺伝子を含む第３のベクター、を含む哺乳動物細胞を使用して、ｒＡＡＶを産生することを含む方法と比較して、ｒＡＡＶ力価の増大を生じる。

【0174】

特定の実施形態では、哺乳動物細胞は、細胞培養物中で提供される。特定の実施形態では、細胞培養物は、少なくとも２リットル、少なくとも５０リットル、または少なくとも２０００リットルの容積を有する。特定の実施形態では、細胞培養物は、約２リットル～約５０００リットルの容積を有する。特定の実施形態では、細胞培養物は、約２リットル～約４０００リットルの容積を有する。特定の実施形態では、細胞培養物は、約２リットル～約３０００リットルの容積を有する。特定の実施形態では、細胞培養物は、約２リットル～約２５００リットルの容積を有する。特定の実施形態では、細胞培養物は、約２リットル～約２０００リットルの容積を有する。特定の実施形態では、細胞培養物は、約２リットル～約１５００リットルの容積を有する。特定の実施形態では、細胞培養物は、約２リットル～約１０００リットルの容積を有する。特定の実施形態では、細胞培養物は、約２リットル～約５００リットルの容積を有する。特定の実施形態では、細胞培養物は、約２リットル～約２５０リットルの容積を有する。特定の実施形態では、細胞培養物は、約２リットル～約１００リットルの容積を有する。特定の実施形態では、細胞培養物は、約２リットル～約５０リットルの容積を有する。特定の実施形態では、細胞培養物は、約２リットル～約２５リットルの容積を有する。特定の実施形態では、本明細書に記載の方法は、少なくとも２リットル、少なくとも５０リットル、または少なくとも２０００リットルの容積を有するバイオリアクター中で実施される。特定の実施形態では、本明細書に記載される方法は、２０００リットルの容積を有するバイオリアクター中で実施される。

【実施例】

【0175】

下記の実施例は、例示として示されており、限定するために示されているものではない。

【0176】

実施例１：材料及び方法
以下の一般的な材料及び方法を、以下の実施例で使用した。

【0177】

小規模産生：ＨＥＫ２９３細胞を少なくとも１継代で増殖させ、トランスフェクション前に適切な量の細胞培養培地を含有する振盪フラスコに接種した。振盪フラスコを、シェイカー中で、３７℃で、８％のＣＯ_２、及び１３５ｒｐｍでインキュベートした。細胞が１．８Ｅ６～２．４Ｅ６細胞／ｍＬ（実施例１～８の場合）または３．６Ｅ６～５Ｅ６細胞／ｍＬ（実施例９の場合）の密度に達すると、細胞をトランスフェクトした。トランスフェクションミックスを、計算した容積のベクター（複数可）、ＯｐｔｉＰｒｏ媒体、及びポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を全て周囲温度で混合することによって調製した。トランスフェクションミックスを次に振盪フラスコに加え、３７℃、８％のＣＯ_２、及び１３５ｒｐｍで、７２時間にわたってシェイカーでインキュベートした後に採取した。７２時間のインキュベーション後に、１Ｍトリス（ｐＨ９．５）、１０％トリトンＸ－１００、１Ｍ ＭｇＣｌ_２、エンドヌクレアーゼ（例えば、ＢＥＮＺＯＮＡＳＥ（登録商標）、ＤＥＮＡＲＡＳＥ（登録商標））及び５ＭのＮａＣｌを含有する溶解バッファーを用いて細胞を溶解させ、振盪フラスコを３７℃、８％ＣＯ_２、及び１３５ｒｐｍで６０分間インキュベートした。粗溶解物試料を遠心分離により収集した。

【0178】

２Ｌバイオリアクターの製造：ＨＥＫ２９３細胞を少なくとも１継代で増殖させ、トランスフェクション前に適切な量の細胞培養培地を含有する２Ｌのバイオリアクター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｍｏｂｉｕｓ）に接種した。ｐＨを７．１±０．１のプレトランスフェクションに変更し、細胞を１．８Ｅ６～２．４Ｅ６細胞／ｍＬ（実施例４～８の場合）または３．６Ｅ６～５Ｅ６細胞／ｍＬ（実施例９～１１の場合）の密度でトランスフェクトした。トランスフェクションミックスを、計算した容積のベクター（複数可）、ＯｐｔｉＰｒｏ ＳＦＭ媒体、及びポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を全て周囲温度で混合することにより調製し、トランスフェクションミックスを細胞に添加する前に１０分間平衡化させた。細胞を、トランスフェクションの６９～７５時間後に収穫した。採取した細胞を、１Ｍトリス（ｐＨ９．５）、１０％トリトンＸ－１００、１Ｍ ＭｇＣｌ_２、エンドヌクレアーゼ（例えば、ＢＥＮＺＯＮＡＳＥ（登録商標）、ＤＥＮＡＲＡＳＥ（登録商標））及び５ＭのＮａＣｌを含む溶解バッファーを用いて溶解した。適切な容積の溶解バッファーをバイオリアクターに添加し、細胞を３７℃、２８３ｒｐｍで１２０分間インキュベートした。粗溶解物試料を遠心分離の後に収集して、細胞破片を除去した。

【0179】

導入遺伝子を含むベクター（すなわち、導入遺伝子ベクター）の導入遺伝子ペイロードに特異的なプライマー／プローブセットを使用する標準的な方法によって、細胞１つあたりのベクターゲノム数（ｖｇ／細胞）におけるベクターゲノム生産性を液滴化デジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）により決定した。導入遺伝子を含むベクター（すなわち、導入遺伝子ベクター）の導入遺伝子ペイロードに特異的なプライマー／プローブセットを使用する標準的な方法によって、１リットルあたりのベクターゲノム数（ｖｇ／Ｌ）におけるベクターゲノム生産性を液滴化デジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）により決定した。細胞１つあたりのキャプシドの数は、Ｃａｐ配列を含むベクターによりコードされたキャプシドのエピトープに対して指向した固定化抗体を用いた標準的な方法により、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を使用して決定された。インタクトなベクターゲノムのパーセンテージ（すなわち、完全なキャプシドのパーセンテージ）を、ｄｄＰＣＲで測定したベクターゲノム生産性を、ＥＬＩＳＡで測定した細胞１つあたりのキャプシドの数で割ることにより計算するか（実施例２～４）、または分析的超遠心分離沈降速度（ＡＵＣ）分析により決定した（実施例５）。

【0180】

実施例２：デュアルトランスフェクションシステムとトリプルトランスフェクションシステムとの間の比較
最初の小規模の製造での概念証明の試験を行い、デュアルベクタートランスフェクションシステムの有用性を、トリプルトランスフェクションシステムと比較して、得ることができたそのベクターゲノム（ＶＧ）生産性、及びインタクトなベクターゲノムのパーセンテージに関して評価した。トランスフェクション条件を、表１に記載の通りに設定した。

【表1】

【0181】

表１に記載されるように、デュアルベクタートランスフェクションシステムは、第１のＶ４ベクター及び第２のＶ３ベクターを含んでいた。トリプルベクタートランスフェクションシステムは、ベクターＶ１、Ｖ２及びＶ３を含む。表１において、ベクター比は質量を基準とした。種々のベクターに含まれるエレメントを表２に記載する。

【0182】

各トランスフェクション条件についてのトランスフェクション混合物を、適切なサイズの円錐形チューブにおいて、計算された容積のベクター（複数可）、ＯｐｔｉＰｒｏ培地、及びポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を全て周囲温度で添加することにより調製した。トランスフェクション混合物を、１μｇのＤＮＡ／１Ｅ６細胞の濃度で細胞に添加した。振盪フラスコを、採取前に７２時間インキュベートした。採取時に細胞を溶解させ、粗溶解物試料を遠心分離の後に収集して、その後の液滴デジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）及びＥＬＩＳＡによるキャプシド分析のために細胞破片を除去した。

【表2-1】

【表2-2】

【0183】

図１Ａ～１Ｃは、デュアルトランスフェクションシステム及びトリプルトランスフェクションシステムを用いた産生から得られた、ＶＧ生産性（図１Ａ）、キャプシド生産性（図１Ｂ）、及びインタクトなベクターゲノムのパーセンテージ（図１Ｃ）を示す。図１Ａ及び図１Ｃに示されるように、デュアルベクタートランスフェクションシステムを用いた産生から得られたＶＧ生産性及びインタクトなベクターゲノムのパーセンテージが、トリプルベクタートランスフェクションシステムから得られるものよりも高いことが分かった。これらのデータでは、デュアルベクタートランスフェクションシステムを使用すると、対照のトリプルベクタートランスフェクションシステムと比較してｒＡＡＶ力価が増加することが実証される。図１Ａ～図１Ｃに示された様々な条件は、表１に記載されている。

【0184】

デュアルトランスフェクションシステムから取得されたＶＧ生産性の増大及びインタクトなベクターゲノムのパーセンテージの増大を、異なる導入遺伝子ベクターを使用して再現できるか否かを判断するために、付加的なトランスフェクション条件を用いて確認の実験を行った。トランスフェクション条件を表３に記載の通りに設定し、様々なベクターに含まれるエレメントを表２に記載する。表２では、ベクター比は質量に基づいた。

【表3】

【0185】

各トランスフェクション条件についてのトランスフェクション混合物を、適切なサイズの円錐形チューブ中で、計算された容積のベクター（複数可）、ＯｐｔｉＰｒｏ培地、及びポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を全て周囲温度で添加することにより調製した。トランスフェクション混合物を、１μｇのＤＮＡ／１Ｅ６細胞の濃度で細胞に添加した。振盪フラスコを、採取前に７２時間インキュベートした。採取時に細胞を溶解させ、粗溶解物試料を遠心分離の後に収集して、その後の液滴デジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）及びＥＬＩＳＡによるキャプシド分析のために細胞破片を除去した。

【0186】

図２Ａ～図２Ｃは、デュアルトランスフェクションシステム及びトリプルトランスフェクションシステムを用いた産生から得られた、ＶＧ生産性（図２Ａ）、キャプシド生産性（図２Ｂ）、及びインタクトなベクターゲノムのパーセンテージ（図２Ｃ）を示す。図２Ａ及び図２Ｃに示されるように、デュアルベクタートランスフェクションシステムを用いた産生から得られたＶＧ生産性、及びインタクトなベクターゲノムのパーセンテージは、トリプルベクタートランスフェクションシステムから得られるものよりも高いことが分かった。デュアルベクタートランスフェクションシステムの生産性の向上は、ヒトゲノム特異的相同性アームを含む編集ゲノム（条件１及び２）またはマウスゲノム特異的相同性アームを含む編集ゲノム（条件３及び４）のいずれかを含む、少なくとも２つの異なる導入遺伝子ベクターにわたって一致していることが見出された。図２Ａ～図２Ｃに示された様々な条件は、表３に記載されている。

【0187】

まとめると、この実施例に提示されたデータは、トリプルトランスフェクションシステムと比較したデュアルベクタートランスフェクションシステムの有効性を示している。特に、デュアルベクタートランスフェクションシステムにより、粗溶解物力価及びインタクトなベクターゲノムのパーセンテージが増大した。

【0188】

実施例３：デュアルベクタートランスフェクションシステムデザイン間での比較
デュアルベクタートランスフェクションシステムにおけるベクターエレメントの編成が生産性に影響を与えるか否かを調べるために、２つのデュアルベクタートランスフェクションシステムデザインを試験した。ベクターゲノム（ＶＧ）の生産性、及び各デザインに基づく産生から得られたインタクトなベクターゲノムのパーセンテージを評価した。デュアルベクタートランスフェクションシステムデザイン－１（「デザイン－１」）及びデザイン－２（「デザイン－２」）は、Ｒｅｐ／Ｃａｐ配列がベクターゲノム及びヘルパー配列に対してどのベクターに存在するかに関して異なる。図３Ａ～図３Ｂは、デザイン－１（図３Ａ）及びデザイン－２（図３Ｂ）の概略図を示す。図示されているように、デザイン－１は、Ｒｅｐ／Ｃａｐ配列及び導入遺伝子（「ＧＯＩ」）を含む第１のベクターと、ヘルパー配列を含む第２のベクターとを含み（図３Ａ）；デザイン－２は、導入遺伝子（「ＧＯＩ」）を含む第１のベクターと、ヘルパー配列とＲｅｐ／Ｃａｐ配列の両方を含む第２のベクターを含む（図３Ｂ）。トランスフェクション条件は、表４に記載の通りに設定した。

【表4】

【0189】

表４に示すように、デザイン－１は、第１のＶ４ベクター及び第２のＶ３ベクターを含む。デザイン－２は、第１のＶ１ベクター及び第２のＶ７ベクターを含む。トリプルトランスフェクションから得られたＶＧ生産性とインタクトなベクターゲノムのパーセンテージを対照として評価した。種々のベクターに含まれるエレメントを表２に記載する。表４では、ベクター比は、デュアルベクタートランスフェクションシステムデザインを比較する際にベクターの異なるサイズを考慮するためにプラスミドサイズ（すなわちモル比）に基づいた。

【0190】

各トランスフェクション条件についてのトランスフェクション混合物を、適切なサイズの円錐形チューブ中で、計算された容積のベクター（複数可）、ＯｐｔｉＰｒｏ培地、及びポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を全て周囲温度で添加することにより調製した。トランスフェクション混合物を、１μｇのＤＮＡ／１Ｅ６細胞の濃度で細胞に添加した。振盪フラスコを、採取前に７２時間インキュベートした。採取時に細胞を溶解させ、粗溶解物試料を遠心分離の後に収集して、その後の液滴デジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）及びＥＬＩＳＡによるキャプシド分析のために細胞破片を除去した。

【0191】

図４Ａ～図４Ｃは、デュアルトランスフェクションシステム及びトリプルトランスフェクションシステムを用いた産生から得られた、ＶＧ生産性（図４Ａ）、キャプシド生産性（図４Ｂ）、及びインタクトなベクターゲノムのパーセンテージ（図４Ｃ）を示す。図４Ａ及び図４Ｃに示すように、デザイン－１を用いた産生から得られた、ＶＧ生産性と、インタクトなベクターゲノムのパーセンテージは、トリプルトランスフェクションシステムから得られるものよりも高いことが見出された。さらに、図４Ａ及び図４Ｃに示されているように、デザイン－１を用いた産生から得られたＶＧ生産性及びインタクトなベクターゲノムの計算されたパーセンテージが、デザイン－２を用いた産生から得られたものよりも高いことが判明した。これらの結果に基づいて、さらなる研究のためにデザイン－１を選択した。図４Ａ～図４Ｃに示された様々な条件を、表４に記載している。

【0192】

第３のデュアルベクタートランスフェクションシステムデザイン（「デザイン－３」）を試験した。３つの各々のデザインに基づく産生から得られた、ベクターゲノム（ＶＧ）の生産性、及びインタクトなベクターゲノムのパーセンテージを並べて評価した。上述のように、デザイン－１は、Ｒｅｐ／Ｃａｐ配列及び導入遺伝子（「ＧＯＩ」）を含む第１のベクター、ならびにヘルパー配列を含む第２のベクターを含み（図３Ａ）；デザイン－２は、導入遺伝子（「ＧＯＰ」）を含む第１のベクターと、ヘルパー配列及びＲｅｐ／Ｃａｐ配列の両方を含む第２のベクターとを含み（図３Ｂ）；またデザイン３は、導入遺伝子（「ＧＯＩ」）及びヘルパー配列を含む第１のベクターと、Ｒｅｐ／Ｃａｐ配列を含む第２のベクターとを含む（図３Ｃ）。トランスフェクション条件は、表５に記載の通りに設定した。

【表5】

【0193】

表５に示すように、デザイン－１は、第１のＶ２０ベクター及び第２のＶ３ベクターを含む。デザイン－２は、第１のＶ１９ベクター及び第２のＶ７ベクターを含む。デザイン－３は、第１のＶ２１ベクター及び第２のＶ２ベクターを含む。トリプルトランスフェクションから得られたＶＧ生産性、及びインタクトなベクターゲノムのパーセンテージを対照として評価した。種々のベクターに含まれるエレメントを表２に記載している。表５では、ベクター比は、１：１（１：１：１）のモル比から変換した質量ベースの比であった。

【0194】

各トランスフェクション条件についてのトランスフェクション混合物を、適切なサイズの円錐形チューブにおいて、計算された容積のベクター（複数可）、ＯｐｔｉＰｒｏ培地、及びポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を全て周囲温度で添加することにより調製した。トランスフェクション混合物を、１μｇのＤＮＡ／１Ｅ６細胞の濃度で細胞に添加した。振盪フラスコを、採取前に７２時間インキュベートした。採取時に細胞を溶解させ、粗溶解物試料を遠心分離の後に収集して、その後の液滴デジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）及びＥＬＩＳＡによるキャプシド分析のために細胞破片を除去した。

【0195】

図５Ａ～図５Ｃは、デュアルトランスフェクションシステム及びトリプルトランスフェクションシステムを用いた産生から得られた、ＶＧ生産性（図５Ａ）、キャプシド生産性（図５Ｂ）、及びインタクトなベクターゲノムのパーセンテージ（図５Ｃ）を示す。図５Ａ及び図５Ｃに示すように、デザイン－１を用いた産生から得られた、ＶＧ生産性と、インタクトなベクターゲノムのパーセンテージは、トリプルトランスフェクションシステムから得られるものよりも高いことが見出された。さらに、図５Ａ及び図５Ｃに示されているように、デザイン－１を用いた産生から得られたＶＧ生産性及びインタクトなベクターゲノムの算出されたパーセンテージは、デザイン－２及びデザイン－３を用いた産生から得られたものよりも高いことが判明した。これらのデータによって、デザイン－１デュアルベクタートランスフェクションシステムを使用すると、デザイン－２デュアルベクタートランスフェクションシステム、デザイン－３デュアルベクタートランスフェクションシステム及び対照のトリプルベクタートランスフェクションシステムと比較してｒＡＡＶ力価が増大することが実証される。図５Ａ～図５Ｃに示された様々な条件を、表５に記載している。

【0196】

実施例４：デュアルトランスフェクションシステムとトリプルトランスフェクションシステムとの間の比較
実施例３で観察されたトリプルトランスフェクションに対するデザイン－１の生産性の増大を確認するために、トランスフェクション条件を設定して、増大した効率がより大きな規模（２Ｌ規模）で維持されるか否か、またデザイン－１の増加した効率が、異なる導入遺伝子を有するｒＡＡＶゲノムのパッケージングにわたって異なるキャプシドに及ぶか否かを調べた。トランスフェクション条件を、表６に記載の通りに設定した。表６では、ベクター比は質量に基づいた。

【表6-1】

【表6-2】

【0197】

表６に記載されるように、トランスフェクション条件１、２、３、４、５及び６を設定し、デザイン－１の効力の増大が、異なる導入遺伝子を有するｒＡＡＶゲノムのパッケージング全体に及ぶか否かを検討した。条件６及び７では、異なる導入遺伝子を有するｒＡＡＶゲノムのパッケージング全体にわたるデザイン－１の有効性を検討することに加えて、その有効性がｒＡＡＶゲノムのパッケージング全体にわたり異なるキャプシドに及ぶか否かも評価される。条件１から５はそれぞれ、ＡＡＶＨＳＣＳ１５キャプシドを利用し、条件６は、ＡＡＶＨＳＣＳ１７キャプシドを利用し、条件７は、ＡＡＶ２キャプシドを利用した。トリプルトランスフェクションから得られたＶＧ生産性、及びインタクトなベクターゲノムのパーセンテージを対照として評価した。種々のベクターに含まれるエレメントを表２に記載する。

【0198】

各トランスフェクション条件についてのトランスフェクション混合物を、適切なサイズの移入アセンブリ中で、計算された容積のベクター（複数可）、ＯｐｔｉＰｒｏ培地、及びポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を全て周囲温度で添加することにより調製した。トランスフェクション混合物を、１μｇのＤＮＡ／１Ｅ６細胞の濃度で細胞に添加した。採取前に細胞を７２時間インキュベートした。

【0199】

採取時に細胞を溶解させ、粗溶解物試料を遠心分離の後に収集して、その後の液滴デジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）及びＥＬＩＳＡによるキャプシド分析のために細胞破片を除去した。

【0200】

図６Ａ～図６Ｃは、デザイン－１及び対照のトリプルトランスフェクションシステムを用いた産生から得られた、ＶＧ生産性（図６Ａ）、キャプシド生産性（図６Ｂ）、及びインタクトなベクターゲノムのパーセンテージ（図６Ｃ）を示す。図６Ａ及び図６Ｃに示すように、デザイン－１を用いた産生から得られた、ＶＧ生産性及びインタクトなベクターゲノムのパーセンテージは、試験した全ての条件で、トリプルトランスフェクションシステムから得られるものよりも高いことが見出された。これらの結果に基づき、異なる導入遺伝子を有するｒＡＡＶの異なるキャプシドへのパッケージングにわたって、トリプルトランスフェクションを超える、デザイン－１を用いた産生の有効性の増大が観察された。デュアルベクタートランスフェクションシステムの生産性の向上は、５つの異なるｒＡＡＶゲノム全体で一致しており、そのうちの２つは編集ゲノム（条件１及び２）を含んでいることが見出された。これらのデータによって、対照のトリプルベクタートランスフェクションシステムを超える、デザイン－１のデュアルベクタートランスフェクションシステムを使用して得られるｒＡＡＶ力価の増大が、異なる導入遺伝子を有するｒＡＡＶのパッケージにわたって異なるキャプシドに及ぶことが実証されている。図６Ａ～図６Ｃに示された様々な条件を、表６に記載している。

【0201】

図７Ａ～７Ｃは、デザイン－１及び対照のトリプルトランスフェクションシステムを使用してＡＡＶ２キャプシドを利用する産生から得られた、ＶＧ生産性（図７Ａ）、キャプシド生産性（図７Ｂ）、及びインタクトなベクターゲノムのパーセンテージ（図７Ｃ）を示す（条件７）。図７Ａ及び図７Ｃに示すように、デザイン－１を用い、ＡＡＶ２キャプシドを利用する産生から得られた、ＶＧ生産性、及びインタクトなベクターゲノムのパーセンテージは、トリプルトランスフェクションシステムから得られるものよりも高いことが見出された。図７Ａ～７Ｃのデータは、小規模の産生研究から生成された。

【0202】

個別の実験において、デザイン－１はまた、ＡＡＶＨＳＣ１３キャプシドを含むｒＡＡＶを製造し得ることが見出された（その全体が本明細書に組み込まれている米国特許第９，８０３，２１８号を参照のこと）。

【0203】

これらのデータによって、（トリプルプラスミドシステム対照と比較して）デザイン－１のデュアルプラスミドシステムが示すＡＡＶ産生における改善が一般的に適用可能である可能性が高いことが示唆される。

【0204】

実施例５：デュアルトランスフェクションシステムとトリプルトランスフェクションシステムとの間の比較
実施例３及び４では、デザイン－１を用いた製造から得られた粗溶解物において測定されたＶＧ生産性及びインタクトなベクターゲノムのパーセンテージの増大が、対照のトリプルトランスフェクションシステムを用いた製造と比較して実証された。

【0205】

ＶＧ生産性の増大及びインタクトなベクターゲノムのパーセンテージの増大が精製後も維持されたことを確認するために、表７に記載したものに応じて設定したトランスフェクションから得られた粗溶解物を明らかにし、続いてアフィニティー及びアニオン交換クロマトグラフィーによって精製した。表７では、５０Ｌの規模で行った条件３を除いて、条件１、２、及び４を、それぞれ、表６の条件２、３、及び５に従って（すなわち、２Ｌの規模で）行った。異なるベクター比を用いて産生された溶解物を別々に精製した。条件１～３はそれぞれＡＡＶＨＳＣＳ１５キャプシドを利用するが、条件４はＡＡＶＨＳＣＳ１７キャプシドを利用した。デザイン－１のデュアルプラスミドシステムから得られたインタクトなベクターゲノムを、示された対照のトリプルプラスミドシステムから得られたインタクトなベクターゲノムの量に対する増加パーセンテージとして表した（表７及び図８）。表７において、ベクター比は質量を基準とした。種々のベクターに含まれるエレメントを表２に記載する。

【表7】

【0206】

図８に示されたデータは、沈降係数に基づいてマクロ分子を定量化するために使用された方法である、分析的超遠心分離沈降速度（ＡＵＣ）分析に基づいている。ＡＵＣを使用して、各デザイン－１のデュアルプラスミドシステムによって産生されたインタクトなベクターゲノム及びベクターゲノムを欠くキャプシドの、対応するトリプルプラスミドシステム対照に対する割合を決定した。図８において、条件１及び２については、ＡＵＣを、デザイン－１のベクター比（すなわち、表７に示される１：２、１：３、及び１：４の比）のそれぞれから得られた精製ベクターで実施して、インタクトなベクターゲノムの数を決定し、次いで平均し、対応するトリプルプラスミドシステム対照に対する増加パーセントとして提示した。図８に示すように、試験した４つのデザイン－１デュアルプラスミドシステムのそれぞれに対して、インタクトなベクターゲノムの数の増大が得られた（対応するトリプルプラスミドシステム対照から得られたインタクトなベクターゲノムの数に対して）。これらのデータによって、（トリプルプラスミドシステム対照に対して）デザイン－１のデュアルプラスミドシステムが示すＡＡＶ産生における改善が一般的に適用可能かつ拡張可能である可能性が高いことが示唆される。

【0207】

実施例６：デュアルトランスフェクションシステムにおけるキャプシドのバックグラウンド発現
デザイン－１が他のデュアルプラスミドトランスフェクションシステムデザインよりも優れている理由を明らかにするために、バックグラウンドのキャプシド発現のレベルをデザイン－１において決定し、デザイン－２におけるバックグラウンドキャプシド発現のレベルと比較した。トランスフェクション条件を、表８に記載の通りに設定した。表８では、ベクター比は質量に基づいた。

【表8】

【0208】

表８に示されているように、デザイン－１及びデザイン－２を、個々のデュアルデザインごとに、Ｒｅｐ／Ｃａｐ含有ベクターのみと共に試験した。同量のＲｅｐ／Ｃａｐ含有ベクターを、単独で（例えば、条件２及び４）またはデュアルデザインにおけるベクターとして（例えば、条件１及び３）使用した。

【0209】

デザイン－２（ベクターＶ７のみのトランスフェクション；条件２）からのバックグラウンドキャプシドの生成のレベルは、デザイン－２のデュアルトランスフェクション（ベクターＶ１及びＶ７の両方のトランスフェクション；条件１）から生成したバックグラウンドキャプシドのレベルと同じであることが見出された（図９）。図９に示すように、デザイン－１からのバックグラウンドキャプシドの生成は、デザイン－１のデュアルトランスフェクションによって生成されたバックグラウンドキャプシドのレベルの１％未満であった（条件４を条件３と比較）

【0210】

実施例７：デュアルトランスフェクションシステム及びトリプルトランスフェクションシステムからのＡＡＶの大規模産生及び品質評価
デザイン－１の改善された生産性がより大規模な製造で維持されるか否かを検討するために、表６の条件４を、デザイン－１について１：２のベクター比で、５０Ｌのバイオリアクター規模で繰り返した。振盪フラスコ及び２Ｌバイオリアクター規模の傾向と一致して、５０Ｌバイオリアクターの結果は、トリプルトランスフェクションシステムから得られた粗溶解物（「３ＴＦＸ」；トリプルトランスフェクション対照の条件については表６を参照）と比較して、ＶＧ生産性がほぼ２倍向上し、キャプシド生成が同等であり、デザイン－１から得られた粗溶解物（「２ＴＦＸ」）において算出されたインタクトなベクターゲノムが２倍になったことを実証した（図１０Ａ～図１０Ｃ）。これらのデータによって、デザイン－１のデュアルベクタートランスフェクションシステムを使用して得られるｒＡＡＶ力価が、対照のトリプルベクタートランスフェクションシステムに比べて増加したことは、より大規模な産生において維持されることが実証されている。

【0211】

デザイン－１及びトリプルトランスフェクションシステムから得られたＡＡＶベクターの生成物の品質を特徴付けるために様々な分析方法を使用した（図１０Ｄ～１０Ｊ）。示される通り、純度％（図１０Ｄ）、凝集率（図１０Ｅ）、及び残留宿主細胞タンパク質のレベル（図１０Ｆ；ＢＬｏＱは定量限界を下回ることを意味する）は全て、トランスフェクション法に関係なく一定のままであった。デザイン－１から得られた精製ＡＡＶベクターにパッケージングされた残存宿主細胞ＤＮＡ（図１０Ｇ）、Ｒｅｐ／Ｃａｐ（図１０Ｈ）、Ｅｌａ（図１０Ｉ）、及びヘルパー配列（図１０Ｊ）の量に、トリプルトランスフェクションシステムから得られるものと比較して偏差は見出されなかった。

【0212】

実施例８：デュアルトランスフェクションシステム及びトリプルトランスフェクションシステムから得られたＡＡＶベクターの生物活性
デザイン－１から得られたＡＡＶベクターとトリプルトランスフェクションシステムから得られたＡＡＶベクターとの間の製品比較性を確保するために、表６の条件５から、デザイン１の１：４のベクター比で得られたＡＡＶベクター及び関連するトリプルトランスフェクション対照から得られたＡＡＶベクターを精製して、ｉｎ ｖｉｖｏの生物活性について評価した。ｒＡＡＶゲノムは、マウス特異的相同性アームに隣接する肝臓特異的プロモーターの制御下でフェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）を発現する編集ゲノムを含む。デザイン－１及びトリプルトランスフェクションシステムから得られたＡＡＶベクターを、古典的なフェニルケトン尿症の幾つかの特徴を示すモデルであるＰａｈ^ｅｎｕ２マウスに注入した。２つの用量を、ビヒクルのみの対照群と同様に評価した。毎週血清試料を採取し、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）の濃度について分析した。図１１Ａ及び１１Ｂに示されている通り、１Ｅ１２ＶＧ／ｋｇ（図１１Ａ）及び１Ｅ１４ＶＧ／ｋｇ（図１１Ｂ）の両方の用量において、投与後の血清Ｐｈｅ濃度の低下により示される、デザイン－１及びトリプルトランスフェクションシステムから得られたＡＡＶベクターの生物活性は、６週間にわたり区別できなかった。さらに、６週間の時点で、肝臓及びＰＡＨのｍＲＮＡ発現におけるベクターゲノムの定量は、ＶＧ形質導入及び導入遺伝子発現の用量依存的な増加を示したが、各用量でデザイン－１とトリプルトランスフェクション群との間に有意差は見られなかった（図１１Ｃ及び１１Ｄ）。オンターゲット組み込みの定量化は、１Ｅ１４ＶＧ／ｋｇ用量で完了し、デザイン－１またはトリプルトランスフェクションシステムのいずれかから産生されるＡＡＶベクターに対して同等の組み込み効率が実証された（図１１Ｅ）。

【0213】

実施例９：ベクター比の最適化
生産性を向上させる最適なベクター比があるか否かを検討するために、様々なデザイン－１ベクター比を試験した。トランスフェクションを、小規模産生のために、実施例１に記載されるように設定した。

【0214】

図１２Ａ～図１２Ｃは、示されたＶ３：Ｖ１２ベクター比を試験した条件１での生成から得られたＶＧ生産性（図１２Ａ）、キャプシド生産性（図１２Ｂ）、及びインタクトなベクターゲノムのパーセンテージ（図１２Ｃ）を、トランスフェクトされた総ＤＮＡの様々なレベル（ｘ軸）で示す。Ｖ３及びＶ１２に含まれるエレメントを表２に示す。図１２Ａ～図１２Ｃに示される通り、改善されたＶＧ及びキャプシド生産性が、１Ｅ６の細胞あたり０．６～１μｇのトランスフェクトされた総ＤＮＡを用いて、１：０．３～１：１のＶ３：Ｖ１２ベクター比で達成された。

【0215】

図１３Ａ～図１３Ｃは、示されたＶ３：Ｖ８比を試験した条件２での生成から得られたＶＧ生産性（図１３Ａ）、キャプシド生産性（図１３Ｂ）、及びインタクトなベクターゲノムのパーセンテージ（図１３Ｃ）を、トランスフェクトされた総ＤＮＡの様々なレベル（ｘ軸）で示す。Ｖ３及びＶ８に含まれるエレメントを表２に示す。図１３Ａ～１３Ｃに示されている通り、改善されたＶＧ及びキャプシド生産性が、１Ｅ６の細胞あたり０．６～１μｇのトランスフェクトされた総ＤＮＡを用いて、１：０．６～１：１のＶ３：Ｖ８ベクター比で達成された。これらのデータは、これらのベクター比及びトランスフェクトされた総ＤＮＡのレベルを使用して、ｒＡＡＶ力価の増大が達成されることを実証している。

【0216】

実施例１０：デュアルプラスミドトランスフェクションを用いた複数のキャプシド血清型の評価
デザイン－１の改善された生産性が他のＡＡＶキャプシド血清型にわたって維持されるか否かを検討するために、デザイン－１またはトリプルトランスフェクションシステムのいずれかから製造されたＡＡＶベクターを、ＡＡＶキャプシド血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ１０及びＡＡＶｒｈ７４を利用して試験した。トランスフェクションを、２Ｌバイオリアクター製造のために実施例１に記載したように設定した。トランスフェクション条件は、表９に記載の通りに設定した。

【表9】

【0217】

図１４Ａ～１４Ｃは、表９に示す条件下での産生から得られたＶＧ生産性（図１４Ａ）、キャプシド生産性（図１４Ｂ）及びインタクトなベクターゲノムのパーセンテージ（図１４Ｃ）を示す。図１４Ａに示す通り、デザイン－１を用いた製造から得られるＶＧ生産性の改善は、対応するトリプルトランスフェクションシステム対照と比較して、試験した全てのＡＡＶキャプシド血清型全体で維持される。図１４Ｂに示す通り、デザイン－１を用いた産生から得られるキャプシド生産性は、対応するトリプルトランスフェクションシステム対照と比べて、改善または維持される。図１４Ｃに示すように、デザイン－１を用いた産生から得られたインタクトなベクターゲノムのパーセンテージは、対応するトリプルトランスフェクションシステム対照と比較して、改善または維持される。これらのデータによって、デザイン－１のデュアルベクタートランスフェクションシステムを使用して得られるｒＡＡＶ力価の増大が、対照のトリプルベクタートランスフェクションシステムと比較して、様々なＡＡＶキャプシド血清型にまたがっていることが実証される。

【0218】

実施例１１：２０００Ｌまでのデュアルプラスミドの拡張可能性
実施例７では、デザイン－１の改善された生産性が５０Ｌのバイオリアクター規模で維持されることが示された。５０Ｌのバイオリアクターからの結果によって、デザイン－１から得られた粗溶解物において、トリプルトランスフェクションシステム対照から得られた粗溶解物と比較して、ＶＧ生産性がほぼ２倍増大することが実証された。

【0219】

デザイン－１の改善されたＶＧ生産性が拡張可能であるか否か検討するために、５０Ｌバイオリアクター規模での生産性を、２０００Ｌバイオリアクター規模での生産性と比較した。細胞を５０Ｌ及び２０００Ｌのバイオリアクターに接種したことを除いて、トランスフェクションを、２Ｌのバイオリアクター製造のために実施例１に記載のように設定した。細胞を３．６Ｅ６～５Ｅ６細胞／ｍＬの密度でトランスフェクトした。５０Ｌバイオリアクター及び２０００Ｌバイオリアクターのトランスフェクション条件を、表１０に記載の条件に従って設定した。

【表10】

【0220】

図１５では、５０Ｌ及び２０００Ｌのバイオリアクター規模が同等のＶＧ生産性を達成することが示される。これらのデータによって、デザイン－１のデュアルプラスミドトランスフェクションシステムの拡張可能性が実証される。

【0221】

本発明のさらなる実施形態は、以下の条項に記載されている。

【0222】

１．ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列と；導入遺伝子を含む組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ゲノムを含む第２のヌクレオチド配列と；ＡＡＶキャプシドタンパク質をコードする第３のヌクレオチド配列と、を含み、ヘルパーウイルス遺伝子を含まない、第１の核酸ベクター。

【0223】

２．５’から３’方向に：ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列；導入遺伝子を含む組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ゲノムを含む第２のヌクレオチド配列；及びＡＡＶキャプシドタンパク質をコードする第３のヌクレオチド配列を含み、ヘルパーウイルス遺伝子を含まない、条項１に記載の核酸ベクター。

【0224】

３．５’から３’方向に：ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列；導入遺伝子を含む組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ゲノムを含む第２のヌクレオチド配列；及びＡＡＶキャプシドタンパク質をコードする第３のヌクレオチド配列を含む、条項１に記載の核酸ベクター。

【0225】

４．前記核酸ベクターが、ＤＮＡプラスミドまたはＤＮＡ最小ベクターである、条項１～３のいずれか１項に記載の核酸ベクター。

【0226】

５．（ｉ）ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列；導入遺伝子を含む組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ゲノムを含む第２のヌクレオチド配列；及びＡＡＶキャプシドタンパク質をコードする第３のヌクレオチド配列、を含む第１の核酸ベクターと、（ｉｉ）ヘルパーウイルス遺伝子を含む第２の核酸ベクターと、を含む、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）パッケージングシステム。

【0227】

６．前記第１の核酸ベクターが、５’から３’方向に、ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列；導入遺伝子を含む組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ゲノムを含む第２のヌクレオチド配列；及びＡＡＶキャプシドタンパク質をコードする第３のヌクレオチド配列を含む、条項５に記載のパッケージングシステム。

【0228】

７．前記第１の核酸ベクターが、ＤＮＡプラスミドまたはＤＮＡ最小ベクターである、条項５または６に記載のパッケージングシステム。

【0229】

８．前記第２の核酸ベクターが、ＤＮＡプラスミドまたはＤＮＡ最小ベクターである、条項５～７のいずれか１項に記載のパッケージングシステム。

【0230】

９．前記導入遺伝子が、ポリペプチドをコードする、条項１～８のいずれか１項に記載の核酸ベクターまたはパッケージングシステム。

【0231】

１０．前記導入遺伝子が、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ｇＲＮＡ、アンタゴミル（ａｎｔａｇｏｍｉｒ）、ｍｉＲＮＡスポンジ、ＲＮＡアプタザイム、ＲＮＡアプタマー、ｌｎｃＲＮＡ、リボザイム、またはｍＲＮＡをコードする、条項１～８のいずれか１項に記載の核酸ベクターまたはパッケージングシステム。

【0232】

１１．前記導入遺伝子が、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）、グルコース－６－ホスファターゼ（Ｇ６Ｐａｓｅ）、イズロン酸－２－スルファターゼ（Ｉ２Ｓ）、アリールスルファターゼＡ（ＡＲＳＡ）、及びフラタキシン（ＦＸＮ）からなる群から選択されるタンパク質をコードする、条項１～８のいずれか１項に記載の核酸ベクターまたはパッケージングシステム。

【0233】

１２．前記ｒＡＡＶゲノムが、前記導入遺伝子に作動可能に連結された転写調節エレメントをさらに含む、先行条項のいずれかに記載の核酸ベクターまたはパッケージングシステム。

【0234】

１３．前記転写調節エレメントが、プロモーターエレメント及び／またはイントロンエレメントを含む、条項１２記載の核酸ベクターまたはパッケージングシステム。

【0235】

１４．前記ｒＡＡＶゲノムが、ポリアデニル化配列をさらに含む、先行条項のいずれかに記載の核酸ベクターまたはパッケージングシステム。

【0236】

１５．前記ポリアデニル化配列が、前記導入遺伝子に対して３’である、条項１４に記載の核酸ベクターまたはパッケージングシステム。

【0237】

１６．前記ｒＡＡＶゲノムが、配列番号７１、８５、８６、８７、または８８に記載のヌクレオチド配列に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を含む、先行条項のいずれかに記載の核酸ベクターまたはパッケージングシステム。

【0238】

１７．前記ｒＡＡＶゲノムが、前記導入遺伝子の５’の５’逆位末端反復（５’ＩＴＲ）ヌクレオチド配列及び前記導入遺伝子の３’の３’逆位末端反復（３’ＩＴＲ）ヌクレオチド配列をさらに含む、先行条項のいずれかに記載の核酸ベクターまたはパッケージングシステム。

【0239】

１８．前記５’ＩＴＲヌクレオチド配列が、配列番号３９、４１または４２に記載のヌクレオチド配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であり、及び／または前記３’ＩＴＲヌクレオチド配列が、配列番号４０、４３または４４に記載のヌクレオチド配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である、条項１７に記載の核酸ベクターまたはパッケージングシステム。

【0240】

１９．前記ｒＡＡＶゲノムが、配列番号７５、７８、８０、８２または８４に記載のヌクレオチド配列に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を含む、先行条項のいずれかに記載の核酸ベクターまたはパッケージングシステム。

【0241】

２０．前記ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質が、野生型Ｒｅｐタンパク質またはそのバリアントである、先行条項のいずれかに記載の核酸ベクターまたはパッケージングシステム。

【0242】

２１．前記ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質が、ＡＡＶ２ Ｒｅｐタンパク質またはそのバリアントである、先行条項のいずれかに記載の核酸ベクターまたはパッケージングシステム。

【0243】

２２．前記第１のヌクレオチド配列が、前記ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質コード配列に作動可能に連結された転写調節エレメントをさらに含む、先行条項のいずれかに記載の核酸ベクターまたはパッケージングシステム。

【0244】

２３．前記転写調節エレメントが、構成的プロモーター、誘導性プロモーターまたは天然プロモーターからなる群から選択されるプロモーターを含む、条項２２記載の核酸ベクターまたはパッケージングシステム。

【0245】

２４．前記プロモーターが、Ｐ５プロモーター、Ｐ１９プロモーター、メタロチオニン（ＭＴ）プロモーター、マウス乳腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、Ｔ７プロモーター、エクジソン昆虫プロモーター、テトラサイクリン抑制プロモーター、テトラサイクリン誘導性プロモーター、ＲＵ４８６誘導性プロモーター、及びラパマイシン誘導性プロモーターからなる群から選択される、条項２３に記載の核酸ベクターまたはパッケージングシステム。

【0246】

２５．前記ＡＡＶキャプシドタンパク質が、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶＲｈ３２．３３、ＡＡＶｒｈ７４、ＡＡＶ－ＤＪ、ＡＡＶ－ＬＫ０３、ＮＰ５９、ＶＯＹ１０１、ＶＯＹ２０１、ＶＯＹ７０１、ＶＯＹ８０１、ＶＯＹ１１０１、ＡＡＶＰＨＰ．Ｎ、ＡＡＶＰＨＰ．Ａ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ、ＰＨＰ．Ｂ２、ＰＨＰ．Ｂ３、Ｇ２Ａ３、Ｇ２Ｂ４、Ｇ２Ｂ５、及びＰＨＰ．Ｓ．からなる群から選択される、先行条項のいずれかに記載の核酸ベクターまたはパッケージングシステム。

【0247】

２６．前記ＡＡＶキャプシドタンパク質が、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１５、１６または１７のアミノ酸２０３～７３６のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含む、先行条項のいずれかに記載の核酸ベクターまたはパッケージングシステム。

【0248】

２７．配列番号１６のアミノ酸２０６に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＣであり；配列番号１６のアミノ酸２９６に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＨであり；配列番号１６のアミノ酸３１２に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＱであり；配列番号１６のアミノ酸３４６に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＡであり；配列番号１６のアミノ酸４６４に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＮであり；配列番号１６のアミノ酸４６８に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＳであり；配列番号１６のアミノ酸５０１に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＩであり；配列番号１６のアミノ酸５０５に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＲであり；配列番号１６のアミノ酸５９０に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＲであり；配列番号１６のアミノ酸６２６に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＧまたはＹであり；配列番号１６のアミノ酸６８１に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＭであり；配列番号１６のアミノ酸６８７に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＲであり；配列番号１６のアミノ酸６９０に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＫであり；配列番号１６のアミノ酸７０６に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＣであるか；または配列番号１６のアミノ酸７１８に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＧである、条項２６に記載の核酸ベクターまたはパッケージングシステム。

【0249】

２８．（ａ）配列番号１６のアミノ酸６２６に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＧであり、かつ配列番号１６のアミノ酸７１８に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＧであり；（ｂ）配列番号１６のアミノ酸２９６に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＨであり、配列番号１６のアミノ酸４６４に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＮであり、配列番号１６のアミノ酸５０５に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＲであり、かつ配列番号１６のアミノ酸６８１に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＭであり；（ｃ）配列番号１６のアミノ酸５０５に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＲであり、かつ配列番号１６のアミノ酸６８７に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＲであり；（ｄ）配列番号１６のアミノ酸３４６に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＡであり、かつ配列番号１６のアミノ酸５０５に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＲであるか；または（ｅ）配列番号１６のアミノ酸５０１に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＩであり、配列番号１６のアミノ酸５０５に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＲであり、かつ配列番号１６のアミノ酸７０６に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＣである、条項２７に記載の核酸ベクターまたはパッケージングシステム。

【0250】

２９．前記ＡＡＶキャプシドタンパク質が、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１５、１６または１７のアミノ酸２０３～７３６のアミノ酸配列を含む、条項２７に記載の核酸ベクターまたはパッケージングシステム。

【0251】

３０．前記ＡＡＶキャプシドタンパク質が、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１５、１６または１７のアミノ酸１３８～７３６のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含む、先行条項のいずれかに記載の核酸ベクターまたはパッケージングシステム。

【0252】

３１．配列番号１６のアミノ酸１５１に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＲであり；配列番号１６のアミノ酸１６０に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＤであり；配列番号１６のアミノ酸２０６に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＣであり；配列番号１６のアミノ酸２９６に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＨであり；配列番号１６のアミノ酸３１２に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＱであり；配列番号１６のアミノ酸３４６に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＡであり；配列番号１６のアミノ酸４６４に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＮであり；配列番号１６のアミノ酸４６８に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＳであり；配列番号１６のアミノ酸５０１に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＩであり；配列番号１６のアミノ酸５０５に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＲであり；配列番号１６のアミノ酸５９０に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＲであり；配列番号１６のアミノ酸６２６に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＧまたはＹであり；配列番号１６のアミノ酸６８１に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＭであり；配列番号１６のアミノ酸６８７に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＲであり；配列番号１６のアミノ酸６９０に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＫであり；配列番号１６のアミノ酸７０６に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＣであるか；または配列番号１６のアミノ酸７１８に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＧである、条項３０に記載の核酸ベクターまたはパッケージングシステム。

【0253】

３２．（ａ）配列番号１６のアミノ酸６２６に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＧであり、かつ配列番号１６のアミノ酸７１８に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＧであり；（ｂ）配列番号１６のアミノ酸２９６に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＨであり、配列番号１６のアミノ酸４６４に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＮであり、配列番号１６のアミノ酸５０５に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＲであり、かつ配列番号１６のアミノ酸６８１に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＭであり；（ｃ）配列番号１６のアミノ酸５０５に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＲであり、かつ配列番号１６のアミノ酸６８７に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＲであり；（ｄ）配列番号１６のアミノ酸３４６に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＡであり、かつ配列番号１６のアミノ酸５０５に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＲであるか；または（ｅ）配列番号１６のアミノ酸５０１に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＩであり、配列番号１６のアミノ酸５０５に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＲであり、かつ配列番号１６のアミノ酸７０６に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＣである、条項３１に記載の核酸ベクターまたはパッケージングシステム。

【0254】

３３．前記ＡＡＶキャプシドタンパク質が、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１５、１６または１７のアミノ酸１３８～７３６のアミノ酸配列を含む、条項３１に記載の核酸ベクターまたはパッケージングシステム。

【0255】

３４．前記ＡＡＶキャプシドタンパク質が、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１５、１６または１７のアミノ酸１～７３６のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含む、先行条項のいずれかに記載の核酸ベクターまたはパッケージングシステム。

【0256】

３５．配列番号１６のアミノ酸２に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＴであり；配列番号１６のアミノ酸６５に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＩであり；配列番号１６のアミノ酸６８に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＶであり；配列番号１６のアミノ酸７７に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＲであり；配列番号１６のアミノ酸１１９に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＬであり；配列番号１６のアミノ酸１５１に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＲであり；配列番号１６のアミノ酸１６０に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＤであり；配列番号１６のアミノ酸２０６に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＣであり；配列番号１６のアミノ酸２９６に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＨであり；配列番号１６のアミノ酸３１２に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＱであり；配列番号１６のアミノ酸３４６に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＡであり；配列番号１６のアミノ酸４６４に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＮであり；配列番号１６のアミノ酸４６８に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＳであり；配列番号１６のアミノ酸５０１に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＩであり；配列番号１６のアミノ酸５０５に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＲであり；配列番号１６のアミノ酸５９０に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＲであり；配列番号１６のアミノ酸６２６に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＧまたはＹであり；配列番号１６のアミノ酸６８１に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＭであり；配列番号１６のアミノ酸６８７に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＲであり；配列番号１６のアミノ酸６９０に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＫであり；配列番号１６のアミノ酸７０６に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＣであるか；または配列番号１６のアミノ酸７１８に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸が、Ｇである、条項３４に記載の核酸ベクターまたはパッケージングシステム。

【0257】

３６．（ａ）配列番号１６のアミノ酸２に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＴであり、かつ配列番号１６のアミノ酸３１２に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＱであり；（ｂ）配列番号１６のアミノ酸６５に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＩであり、かつ配列番号１６のアミノ酸６２６に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＹであり；（ｃ）配列番号１６のアミノ酸７７に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＲであり、かつ配列番号１６のアミノ酸６９０に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＫであり；（ｄ）配列番号１６のアミノ酸１１９に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＬであり、かつ配列番号１６のアミノ酸４６８に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＳであり；（ｅ）配列番号１６のアミノ酸６２６に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＧであり、かつ配列番号１６のアミノ酸７１８に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＧであり；（ｆ）配列番号１６のアミノ酸２９６に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＨであり、配列番号１６のアミノ酸４６４に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＮであり、配列番号１６のアミノ酸５０５に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＲであり、かつ配列番号１６のアミノ酸６８１に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＭであり；（ｇ）配列番号１６のアミノ酸５０５に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＲであり、かつ配列番号１６のアミノ酸６８７に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＲであり；（ｈ）配列番号１６のアミノ酸３４６に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＡであり、かつ配列番号１６のアミノ酸５０５に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＲであるか；または（ｉ）配列番号１６のアミノ酸５０１に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＩであり、配列番号１６のアミノ酸５０５に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＲであり、かつ配列番号１６のアミノ酸７０６に相当するキャプシドタンパク質中のアミノ酸がＣである、条項３５に記載の核酸ベクターまたはパッケージングシステム。

【0258】

３７．前記ＡＡＶキャプシドタンパク質が、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１５、１６または１７のアミノ酸１～７３６のアミノ酸配列を含む、条項３５に記載の核酸ベクターまたはパッケージングシステム。

【0259】

３８．前記第３のヌクレオチド配列が、前記ＡＡＶキャプシドタンパク質コード配列に作動可能に連結された転写調節エレメントをさらに含む、先行条項のいずれかに記載の核酸ベクターまたはパッケージングシステム。

【0260】

３９．前記転写調節エレメントが、構成的プロモーター、誘導性プロモーターまたは天然プロモーターからなる群から選択されるプロモーターを含む、条項３８に記載の核酸ベクターまたはパッケージングシステム。

【0261】

４０．前記プロモーターが、Ｐ４０プロモーター、メタロチオニン（ＭＴ）プロモーター、マウス乳腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、Ｔ７プロモーター、エクジソン昆虫プロモーター、テトラサイクリン抑制プロモーター、テトラサイクリン誘導性プロモーター、ＲＵ４８６誘導性プロモーター、及びラパマイシン誘導性プロモーターからなる群から選択される、条項３９に記載の核酸ベクターまたはパッケージングシステム。

【0262】

４１．前記第１の核酸ベクターが、配列番号７３または７７に記載のヌクレオチド配列に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を含む、先行条項のいずれかに記載の核酸ベクターまたはパッケージングシステム。

【0263】

４２．前記第２のヌクレオチド配列が、配列番号７１、７５、７８、８０、８２、８４、８５、８６、８７、または８８に記載のヌクレオチド配列に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である配列を含む、先行条項のいずれかに記載の核酸ベクターまたはパッケージングシステム。

【0264】

４３．前記第１のヌクレオチド配列が、配列番号５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、または５９に記載のヌクレオチド配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一の配列を含み；前記第２のヌクレオチド配列が、配列番号７１、７５、７８、８０、８２、８４、８５、８６、８７、または８８に記載のヌクレオチド配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である配列を含み；前記第３のヌクレオチド配列が、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１５、１６または１７のアミノ酸２０３～７３６、１３８～７３６及び／または１～７３６のアミノ酸配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一のアミノ酸配列をコードする、先行条項のいずれかに記載の核酸ベクターまたはパッケージングシステム。

【0265】

４４．前記第１の核酸ベクターが、５’から３’方向に：前記第１のヌクレオチド配列、前記第２のヌクレオチド配列；及び前記第３のヌクレオチド配列を含む、条項４３に記載の核酸ベクターまたはパッケージングシステム。

【0266】

４５．前記ヘルパーウイルス遺伝子が、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、サイトメガロウイルス、及びバキュロウイルスからなる群から選択されるヘルパーウイルスに由来する、条項５～４４のいずれか１項に記載のパッケージングシステム。

【0267】

４６．前記ヘルパーウイルス遺伝子が、Ｅｌ、Ｅ２、Ｅ４及びＶＡからなる群から選択されるアデノウイルスに由来するＲＮＡ遺伝子である、条項５～４５のいずれか１項に記載のパッケージングシステム。

【0268】

４７．前記第２の核酸ベクターが、前記ヘルパーウイルス遺伝子に作動可能に連結された転写調節エレメントをさらに含む、条項５～４６のいずれか１項に記載のパッケージングシステム。

【0269】

４８．前記転写調節エレメントが、構成的プロモーター、誘導性プロモーターまたは天然プロモーターからなる群から選択されるプロモーターを含む、条項４７に記載のパッケージングシステム。

【0270】

４９．前記プロモーターが、ＲＳＶ ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶ前初期プロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸還元酵素プロモーター、細胞質β－アクチンプロモーター、ホスホグリセレートキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、メタロチオニン（ＭＴ）プロモーター、マウス乳腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、Ｔ７プロモーター、エクジソン昆虫プロモーター、テトラサイクリン抑制プロモーター、テトラサイクリン誘導性プロモーター、ＲＵ４８６誘導性プロモーター及びラパマイシン誘導性プロモーターからなる群から選択される、条項４８に記載のパッケージングシステム。

【0271】

５０．前記第２の核酸ベクターが、配列番号６０、６１、または６２に記載のヌクレオチド配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を含む、条項５～４９のいずれか１項に記載のパッケージングシステム。

【0272】

５１．前記第２の核酸ベクターが、配列番号６３に記載のヌクレオチド配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を含む、条項５～５０のいずれか１項に記載のパッケージングシステム。

【0273】

５２．前記ヘルパーウイルス遺伝子が、ＵＬ５／８／５２、ＩＣＰ０、ＩＣＰ４、ＩＣＰ２２及びＵＬ３０／ＵＬ４２からなる群から選択されるヘルペスウイルス由来の遺伝子である、条項５～４５のいずれか１項に記載のパッケージングシステム。

【0274】

５３．前記第２の核酸ベクターが、前記ヘルパーウイルス遺伝子に作動可能に連結された転写調節エレメントをさらに含む、条項５２に記載のパッケージングシステム。

【0275】

５４．前記転写調節エレメントが、構成的プロモーター、誘導性プロモーターまたは天然プロモーターからなる群から選択されるプロモーターを含む、条項５３に記載のパッケージングシステム。

【0276】

５５．前記プロモーターが、ＲＳＶ ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶ前初期プロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸還元酵素プロモーター、細胞質β－アクチンプロモーター、ホスホグリセレートキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、メタロチオニン（ＭＴ）プロモーター、マウス乳腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、Ｔ７プロモーター、エクジソン昆虫プロモーター、テトラサイクリン抑制プロモーター、テトラサイクリン誘導性プロモーター、ＲＵ４８６誘導性プロモーター及びラパマイシン誘導性プロモーターからなる群から選択される、条項５４に記載のパッケージングシステム。

【0277】

５６．条項１～４、もしくは条項９～４４のいずれか１項に記載の核酸ベクター、または条項５～５５のいずれか１項に記載のパッケージングシステムを含む、宿主細胞。

【0278】

５７．前記宿主細胞が、哺乳動物細胞である、条項５６に記載の宿主細胞。

【0279】

５８．前記哺乳動物細胞が、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞、ＮＳ０細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、ＶＥＲＯ細胞、ＣＲＬ７Ｏ３Ｏ細胞、ＨｓＳ７８Ｂｓｔ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＨｅｐＧ２細胞、ＳＰ２１０細胞、Ｒ１．１細胞、Ｂ－Ｗ細胞、Ｌ－Ｍ細胞、ＢＳＣ１細胞、ＢＳＣ４０細胞、ＹＢ／２０細胞、及びＢＭＴ１０細胞からなる群から選択される、条項５７に記載の宿主細胞。

【0280】

５９．前記哺乳動物細胞が、ＨＥＫ２９３細胞である、条項５７または５８に記載の宿主細胞。

【0281】

６０．ｒＡＡＶを産生する条件下で、条項５～５５のいずれか１項に記載のパッケージングシステムを哺乳動物細胞に導入することを含む、ｒＡＡＶの組換え調製のための方法。

【0282】

６１．前記第１の核酸ベクター対前記第２の核酸ベクターの比、または前記第２の核酸ベクター対前記第１の核酸ベクターの比は、１：０．２、１：０．４、１：０．６、１：０．８、１：１、１：２、１：３、または１：４からなる群から選択される、条項６０に記載の方法。

【0283】

６２．前記第１の核酸ベクター対前記第２の核酸ベクターの比、または前記第２の核酸ベクター対前記第１の核酸ベクターの比が、１：２である、条項６０または６１に記載の方法。

【0284】

６３．前記第１の核酸ベクター対前記第２の核酸ベクターの比、または前記第２の核酸ベクター対前記第１の核酸ベクターの比が、１：０．２～１：１である、条項６０または６１に記載の方法。

【0285】

６４．前記第１の核酸ベクター対前記第２の核酸ベクターの比、または前記第２の核酸ベクター対前記第１の核酸ベクターの比が、１：０．６である、条項６３に記載の方法。

【0286】

６５．前記第１の核酸ベクター対前記第２の核酸ベクターの比、または前記第２の核酸ベクター対前記第１の核酸ベクターの比が、１：０．８である、条項６３に記載の方法。

【0287】

６６．前記第１の核酸ベクター対前記第２の核酸ベクターの比、または前記第２の核酸ベクター対前記第１の核酸ベクターの比が、１：１である、条項６３に記載の方法。

【0288】

６７．前記方法が、前記パッケージングシステムの０．１～４μｇのＤＮＡ／１Ｅ６細胞を導入することを含む、条項６０～６６のいずれか１項に記載の方法。

【0289】

６８．前記方法が、前記パッケージングシステムの０．５～１μｇのＤＮＡ／１Ｅ６細胞を導入することを含む、条項６０～６７のいずれか１項に記載の方法。

【0290】

６９．前記方法が、前記パッケージングシステムの０．６、０．７、０．８、０．９または１μｇのＤＮＡ／１Ｅ６細胞を導入することを含む、条項６０～６８のいずれか１項に記載の方法。

【0291】

７０．前記方法が、前記パッケージングシステムの０．７５μｇのＤＮＡ／１Ｅ６細胞を導入することを含む、条項６０～６８のいずれか１項に記載の方法。

【0292】

７１．（ｉ）前記ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質及び前記ＡＡＶキャプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む第１のベクター、（ｉｉ）前記ｒＡＡＶゲノムを含む第２のベクター、ならびに（ｉｉｉ）１つ以上の前記ヘルパーウイルス遺伝子を含む第３のベクター、を含む哺乳動物細胞を使用してｒＡＡＶを産生することを含む方法と比較して、ｒＡＡＶ力価の増大を生じる、条項６０～７０のいずれか１項に記載の方法。

【0293】

７２．（ｉ）前記ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質及び前記ＡＡＶキャプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む第１のベクター；（ｉｉ）前記ｒＡＡＶゲノムを含む第２のベクター；及び（ｉｉｉ）１つ以上の前記ヘルパーウイルス遺伝子を含む第３のベクター、を含む哺乳動物細胞を使用してｒＡＡＶを産生することを含む方法と比較して、インタクトなベクターゲノムのパーセンテージの増大を生じる、条項６０～７０のいずれか１項に記載の方法。

【0294】

７３．前記哺乳動物細胞が、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞、ＮＳ０細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、ＶＥＲＯ細胞、ＣＲＬ７Ｏ３Ｏ細胞、ＨｓＳ７８Ｂｓｔ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＨｅｐＧ２細胞、ＳＰ２１０細胞、Ｒ１．１細胞、Ｂ－Ｗ細胞、Ｌ－Ｍ細胞、ＢＳＣ１細胞、ＢＳＣ４０細胞、ＹＢ／２０細胞、及びＢＭＴ１０細胞からなる群から選択される、条項６０～７２のいずれか１項に記載の方法。

【0295】

７４．前記哺乳動物細胞が、ＨＥＫ２９３細胞である、条項６０～７３のいずれか１項に記載の方法。

【0296】

７５．前記哺乳動物細胞を、細胞培養物中でインキュベートする、条項６０～７４のいずれか１項に記載の方法。

【0297】

７６．前記宿主細胞が、細胞培養物で提供される、条項５６～５９のいずれか１項に定義された宿主細胞の集団。

【0298】

７７．前記細胞培養物が、少なくとも２リットル、少なくとも５０リットルまたは少なくとも２０００リットルの容積を有する、条項７５に記載の方法または条項７６記載の宿主細胞の集団。
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本発明は、本明細書に記載の特定の実施形態によって範囲を限定されるものではない。実際に、記載されるものに加えて、本発明の様々な改変が、上記の説明及び添付の図面から当業者に明らかとなるだろう。かかる改変は、添付の特許請求の範囲内に含まれるものとする。
本明細書に引用される、全ての参考文献（例えば、出版物、または特許、または特許出願）は、各個別参考文献（例えば、出版物、または特許もしくは特許出願）が、その全体が参照により、全ての目的のために組み込まれるように具体的かつ個別に示された場合と同程度まで、それらの全体が参照により、全ての目的のために本明細書に組み込まれる。他の実施形態は、以下の特許請求の範囲の範囲内にある。

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図3】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図5A】

【図5B】

【図5C】

【図6A】

【図6B】

【図6C】

【図7A】

【図7B】

【図7C】

【図8】

【図9】

【図10A】

【図10B】

【図10C】

【図10D】

【図10E】

【図10F】

【図10G】

【図10H】

【図10I】

【図10J】

【図11A】

【図11B】

【図11C】

【図11D】

【図11E】

【図12A】

【図12B】

【図12C】

【図13A】

【図13B】

【図13C】

【図14A】

【図14B】

【図14C】

【図15】

【配列表】

2024522876000001.app

【国際調査報告】