特表 2024-522903 空間バーコード分類及びシーケンシングのためのＵＮＩＴ－ＤＮＡ組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-06-21

(54)【発明の名称】空間バーコード分類及びシーケンシングのためのＵＮＩＴ－ＤＮＡ組成物

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/10 20060101AFI20240614BHJP

   C12Q 1/686 20180101ALI20240614BHJP

   C12Q 1/6876 20180101ALN20240614BHJP

【ＦＩ】

C12N15/10 Z

C12Q1/686 Z

C12Q1/6876 Z

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023579848

(86)(22)【出願日】2022-06-30

(85)【翻訳文提出日】2023-12-26

(86)【国際出願番号】 EP2022068213

(87)【国際公開番号】W WO2023275334

(87)【国際公開日】2023-01-05

(31)【優先権主張番号】21183154.0

(32)【優先日】2021-07-01

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】520094891

【氏名又は名称】ミルテニー バイオテック ベー．フェー． ウント コー． カー・ゲー

【氏名又は名称原語表記】Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ Ｂ．Ｖ． ＆ Ｃｏ． ＫＧ

【住所又は居所原語表記】Ｆｒｉｅｄｒｉｃｈ－Ｅｂｅｒｔ－Ｓｔｒａｓｓｅ ６８， ５１４２９ Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ， Ｇｅｒｍａｎｙ

(74)【代理人】

【識別番号】100114890

【弁理士】

【氏名又は名称】アインゼル・フェリックス＝ラインハルト

(74)【代理人】

【識別番号】100098501

【弁理士】

【氏名又は名称】森田 拓

(74)【代理人】

【識別番号】100116403

【弁理士】

【氏名又は名称】前川 純一

(74)【代理人】

【識別番号】100134315

【弁理士】

【氏名又は名称】永島 秀郎

(74)【代理人】

【識別番号】100162880

【弁理士】

【氏名又は名称】上島 類

(72)【発明者】

【氏名】トーマス ロートマン

(72)【発明者】

【氏名】アンドレアス ボズィオ

(72)【発明者】

【氏名】ロバート ピナード

(72)【発明者】

【氏名】ミシェル ペルボス

(72)【発明者】

【氏名】ザンドラ ハルプフェルト

(72)【発明者】

【氏名】マティアス ベアンハート ヴァール

【テーマコード（参考）】

4B063

【Ｆターム（参考）】

4B063QA20

4B063QQ42

4B063QQ52

4B063QR08

4B063QR32

4B063QR35

4B063QR62

4B063QS25

4B063QS34

(57)【要約】

本発明は、バーコードヌクレオチド配列を有する第１の鎖及び第２の鎖を含むポリヌクレオチド分子を提供するための方法であって、第１の鎖が、５’末端で少なくとも１つのユニバーサル塩基のオーバーハングを提供し、少なくとも１つのヌクレオチドを有するポリヌクレオチドの第２の鎖の対応する凹んだ３’末端がブロッキング基を提供することを特徴とし、ブロッキング基が、光の照射によって組み込まれたヌクレオチドから除去される、前記方法に関する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

バーコードヌクレオチド配列を有する第１の鎖及び第２の鎖を含むポリヌクレオチドを提供するための方法であって、第１の鎖が、５’末端で少なくとも１つのユニバーサル塩基のオーバーハングを備え、少なくとも１つのヌクレオチドを有するポリヌクレオチドの第２の鎖の対応する凹んだ３’末端がブロッキング基を備え、ブロッキング基が、光照射によって組み込まれたヌクレオチドから除去されることを特徴とする、前記方法。

【請求項2】

前記ブロッキング基が、切断試薬を提供することによる光照射によって組み込まれたヌクレオチドから除去され、切断試薬が、光を切断試薬の前駆体に照射することによって提供されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記ヌクレオチドが、光照射によって組み込まれたヌクレオチドから除去される光切断可能なブロッキング基を備えることを特徴とする、請求項１に記載の方法。

【請求項4】

前記第１の鎖が、その３’末端にブロッキング基をさらに備えることを特徴とする、請求項１から３までのいずれか１項に記載の方法。

【請求項5】

前記第１の鎖のオーバーハングが、その５’末端に第１のオリゴヌクレオチドを備えることを特徴とする、請求項１から４までのいずれか１項に記載の方法。

【請求項6】

前記第１のオリゴヌクレオチドを、第１の鎖の３’末端に直接又はオリゴヌクレオチド架橋を介して連結させ、それにより環を形成することを特徴とする、請求項５に記載の方法。

【請求項7】

前記第１のオリゴヌクレオチドを、対応するヌクレオチドとハイブリダイズさせ、それにより平滑末端及び少なくとも１つのユニバーサル塩基の位置にギャップを有するポリヌクレオチド鎖を得ることを特徴とする、請求項５に記載の方法。

【請求項8】

前記第１のオリゴヌクレオチドを、対応するヌクレオチドとハイブリダイズさせ、それによって平滑末端及び少なくとも１つのユニバーサル塩基の位置にギャップを有するポリヌクレオチドを得るが、平滑末端を、直接又はオリゴヌクレオチド架橋を介して互いに連結させることを特徴とする、請求項５に記載の方法。

【請求項9】

前記第１のオリゴヌクレオチドを、対応するヌクレオチドとハイブリダイズさせ、それによって平滑末端及び少なくとも１つのユニバーサル塩基の位置にギャップを有するポリヌクレオチドを得るが、第１のオリゴヌクレオチドを、第１の鎖の３’末端に直接又はオリゴヌクレオチド架橋を介して連結させ、それにより環を形成し、かつハイブリダイズした対応するヌクレオチドの３’末端が切断不可能なブロッキング基を含むことを特徴とする、請求項５に記載の方法。

【請求項10】

前記第１のオリゴヌクレオチドは、対応するヌクレオチドとハイブリダイズし、それによって平滑末端及び少なくとも１つのユニバーサル塩基の位置にギャップを有するポリヌクレオチド鎖を得るが、ハイブリダイズした対応するヌクレオチドの３’末端を、直接又はオリゴヌクレオチド架橋を介して第２鎖の５’末端に連結させ、それにより環を形成し、かつ第１鎖の３’末端が切断不可能なブロッキング基を含むことを特徴とする、請求項５に記載の方法。

【請求項11】

以下のステップ：ａ）オリゴｄＴプライミングによるｍＲＮＡの逆転写によって第１の鎖を合成し、捕捉した標的配列に付加した３’末端のＣヌクレオチドをもたらし、続いてｂ）３’末端の対応するＧヌクレオチドによる鋳型スイッチングオリゴのハイブリダイゼーションにより鋳型スイッチしたｃＤＮＡをもたらし、これをｃ）対応する第１の鎖のヌクレオチドにハイブリダイズして、少なくとも１つのユニバーサル塩基の位置に遊離３’ＯＨ及びギャップを生じるステップにより、前記ポリヌクレオチド鎖を、ｍ－ＲＮＡ鎖の鋳型スイッチングによって提供することを特徴とする、請求項１から１０までのいずれか１項に記載の方法。

【請求項12】

以下のステップ：ａ）標的配列を有する環状ｓｓＤＮＡを、パドロックプローブハイブリダイゼーション（ギャップフィルパドロックプローブのためのギャップフィル反応を含む）及びライゲーションにより捕捉し、ｂ）環状ｓｓＤＮＡへのオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションにより、ｄｓＤＮＡ制限を可能にして、線状ｓｓＤＮＡを得て、これをｃ）対応する第１の鎖のヌクレオチドにハイブリダイズして、少なくとも１つのユニバーサル塩基の位置に遊離３’ＯＨ及びギャップを生じるステップにより、前記ＤＮＡ鎖を、環状ｓｓＤＮＡ鋳型をもたらすパドロックワークフローによって提供することを特徴とする、請求項１から１０までのいずれか１項に記載の方法。

【請求項13】

以下のステップ：ａ）ＤＮＡを断片化し、アダプターを連結し、ｂ）遺伝子特異的プライマー（ＰＣＲハンドル付き）及び汎用プライマーでのＰＣＲによって連結した標的配列を濃縮して、直鎖状ｓｓＤＮＡを得て、これをＣ）対応する第１鎖ヌクレオチドにハイブリダイズして、少なくとも１つのユニバーサル塩基の位置に遊離３’ＯＨ及びギャップを生じるステップにより、前記ＤＮＡ鎖を、標的ＤＮＡ増幅によって提供することを特徴とする、請求項１から１０までのいずれか１項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は空間シーケンシング（spatial sequencing）の技術に関する。本発明の目的は、組織領域における又は組織内の個々の細胞におけるｍＲＮＡの分布を決定することである。

【0002】

空間シーケンシングは、組織内で細胞のｍＲＮＡ内容物の直接シーケンシングを可能にする方法の総称である。これらの方法は、一方で一種の高度に多重化された蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）アッセイにおいて細胞のｍＲＮＡ発現プロフィールを分析するために役立つ。

【0003】

一方、ｉｎ ｓｉｔｕシーケンシングは、特定のｍＲＮＡ又はｃＤＮＡ配列の事前定義した部分のコピーを取り込むことができる特定のｍＲＮＡ結合プローブを使用して、ｍＲＮＡ配列情報を読み取ることもできる（「Ｇａｐ－ｆｉｌｌ ｐａｄｌｏｃｋ ｐｒｏｂｅｓ」、Ｋｅら、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０１３，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍｅｔｈ．２５６３）。最近では、ｉｎ ｓｉｔｕゲノムシーケンシング（ＩＧＳ）アプローチも発表された（Ｉｎ ｓｉｔｕ ｇｅｎｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｒｅｓｏｌｖｅｓ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｉｎ ｉｎｔａｃｔ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｓａｍｐｌｅｓ”、Ａ．Ｃ．Ｐａｙｎｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ １０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．ａａｙ３４４６（２０２０））。全てのｉｎ ｓｉｔｕシーケンシング法は、シグナル増幅ステップを必要とし、これはほとんどの場合、ヘアピンライゲーションによるｍＲＮＡもしくはｃＤＮＡ結合プローブ又はｇＤＮＡインサートの環状化及びその後のローリングサークル増幅（ＲＣＡ）によって実施され、プローブ及び／又は標的配列の複数のコピーを含むＤＮＡ分子、いわゆるナノボール、ロロニー（Rolony）又はローリングサークル増幅産物（ＲＣＰ）を作成する。これらはｎｍ又はμｍスケールのサイズを有する大きな分子であるため、１つの細胞内で形成できるロロニーの数はこの細胞のサイズによって厳密に制限される。

【0004】

さらに、細胞内のロロニーの密度が高すぎる場合、シーケンシング手順の光学的検出ステップ中の単一ｍＲＮＡシグナルの識別が大幅に損なわれる。これはこの技術の大きな欠点であるため、これを回避するために、種々の技術、例えば、より小さなロロニーの設計又は組織ヒドロゲル複合体の生成及び除去（Ａｓｐら、ＢｉｏＥｓｓａｙｓ ２０２０、ＤＯＩ：１０．１００２／ｂｉｅｓ．２０１９００２２１）、又は拡張シーケンシングと呼ばれる細胞標的を拡張すること（Ａｌｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３７１、ｅａａｘ２６５６（２０２１））が開発されている。

【0005】

しかしながら、これらの方法は依然としてｉｎ ｓｉｔｕシーケンシングの固有の空間的制限を完全には回避できない。他のアプローチは、ｉｎ ｓｉｔｕでのシグナル増幅を回避する：ｉｎ ｓｉｔｕ捕捉は、バーコードプライマーのスポットでコーティングした表面上への組織からのｍＲＮＡ分子の移動に依存しており、配列決定したｍＲＮＡが抽出された特定の組織領域へのｅｘ ｓｉｔｕで得られた配列情報のバックトラッキングを可能にする。それにもかかわらず、比較的大きいサイズのバーコード化した捕捉スポットにより、ＲＮＡ捕捉効率が制限され、解像度が低い（単一細胞分析ができない）ため、この方法にも限界がある（Ａｓｐら、ＢｉｏＥｓｓａｙｓ ２０２０、Ｄ０１：１０．１００２／ｂｉｅｓ．２０１９００２２１）。

【0006】

発明の要約
本発明は、光学的方法を使用して、ポリヌクレオチド、好ましくはＤＮＡ配列にバーコードを挿入する方法に関する。このコードを使用して、コーディングを実行した位置を取得できる。ここでの目的は、ｉｎ ｓｉｔｕで測定可能なｍＲＮＡ配列の数及び発現ダイナミクスに関する既存のｉｎ ｓｉｔｕシーケンシング法の限界を大幅に克服することである。光学的コーディングは、１μｍの範囲の分解能、及び典型的なサイズの組織切片においてそれぞれの細胞が独自のコードを受信するために十分であるコードの可変性を有しうる。提供したコーディング及びデコーディングのワークフローを図１に示す。

【0007】

本明細書において開示した基本原理は、ユニバーサル鋳型依存的ＤＮＡ合成（universal template directed DNA synthesis）による核酸の空間バーコーディングに基づく。前記方法は、この後ＵＮＩＴ－ＤＮＡ（ＵＮＩｖｅｒｓａｌ Ｔｅｍｐｌａｔｅ ＤＮＡ）という。

【0008】

したがって、本発明の目的は、バーコードヌクレオチド配列を有する第１の鎖及び第２の鎖を含むポリヌクレオチドを提供するための方法であって、第１の鎖が、５’末端で少なくとも１つのユニバーサル塩基のオーバーハングを提供し、少なくとも１つのヌクレオチドを有するポリヌクレオチドの第２の鎖の対応する凹んだ３’末端がブロッキング基を提供することを特徴とし、ブロッキング基が、光の照射によって組み込まれたヌクレオチドから除去される、前記方法である。

【0009】

ブロッキング基の除去は、ブロッキング基に適切な光切断可能な単位を提供するか、又は光照射により活性化されるかもしくはそれらの活性型で提供される切断試薬を添加することによって達成されてよい。

【0010】

前記方法の第１の変法において、ブロッキング基は、切断試薬を提供することによる光照射によって組み込まれたヌクレオチドから除去され、ここで切断試薬は、切断試薬の前駆体に光を照射することによって提供される。

【0011】

前記方法の第２の変法において、ヌクレオチドには、光照射によって組み込まれたヌクレオチドから除去される光切断可能なブロッキング基が提供される。かかる試薬は公知であり、例えば光の照射により活性切断試薬「Ｃｙ５」に切断される「Ｃｙ５－ＴＥＣＰ」である。

【0012】

以下において、「ポリヌクレオチド」という用語は、二本鎖核酸、例えばＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ－ＲＮＡ、ｃ－ＤＮＡ、ｓｓＤＮＡ及び類似のもの、例えばＰＮＡ又はＬＮＡをいう。

【図面の簡単な説明】

【0013】

【図1】図１は、試料調製、組織染色及びイメージング（透過、蛍光）、分節化又はクラスター分析、並びに構造化照明及び単一細胞シーケンシングのためのマスクの計算を含む、本発明の一般的なワークフローを示す。

【図2】図２は、少なくとも１つのユニバーサル塩基を有する少なくとも１つの５’オーバーハングを有する二本鎖ポリヌクレオチド分子の一般的な構造を示す。

【図3】図３は、本発明のバーコーディングの基本手順を示す。

【図4】光による３つの細胞の構造化照明。

【図5】図５は、Ａ～Ｈで示した本発明の実施形態を示す。

【図6】図６は、鋳型スイッチオリゴヌクレオチド（ＴＳＯ）と実施形態Ｈとの組み合わせを示す。

【図7】図７は、シーケンシングのために直接使用したタグ付け分子によるｉｎ ｖｉｔｒｏシーケンシングでの本発明の実施形態Ｈの一般的なワークフローを示す。

【図8】図８は、環状ｓｓＤＮＡとＵＮＩＴ－ＤＮＡの実施形態Ｈとの組み合わせを示す。

【図9】図９は、標的ＤＮＡ増幅とＵＮＩＴ－ＤＮＡの実施形態Ｈとの組み合わせを示す。

【0014】

詳細な説明
提供されるＵＮＩＴ－ＤＮＡワークフローは、実施形態Ａによるコーディングワークフローについての図１に示されている。試料調製、組織染色及びイメージング（透過、蛍光）の後に、分節化又はクラスター分析、及び構造化照明のためのマスクの計算が続く。ＵＮＩＴ－ＤＮＡでの図１のデコードワークフローについて、構造化照明及びヌクレオチドの周期的取り込みによって誘導される、細胞の空間バーコーディングが組織切片に提供される（細胞放出前のコード化したＵＮＩＴ－ＤＮＡの組織の固定は示されていない）。単一細胞シーケンシングのための組織切片からの細胞の放出及び細胞のカプセル化。

【0015】

ＵＮＩＴ－ＤＮＡでの実施形態Ｈによる図７に示したデコードワークフローについて、構造化照明及びヌクレオチドの周期的取り込みによって誘導される標的分子の空間バーコーディングが組織切片に提供される。標的ｍＲＮＡについて得られた配列及び空間バーコードは、画像に注釈を付ける。生物情報学の分析及び、結果と最初の試料源との関係がワークフローを完了させる。

【0016】

ＵＮＩＴ－ＤＮＡの方法は、少なくとも１つの５’オーバーハングを有するバーコードヌクレオチド配列を有する第１の鎖及び第２の鎖を含む二本鎖ＤＮＡ分子を提供することからなり、５’オーバーハングは少なくとも１つのユニバーサル塩基を含み、凹んだ３’末端は遊離３’－ＯＨを有する。

【0017】

図２は、９ｂｐの二本鎖核酸（Ｎ）及び６つのユニバーサル塩基（Ｂ）５’オーバーハングについての本発明の方法によって得られた組成物の例を示す。二本鎖核酸についてのｂｐの数、又は一本鎖５’オーバーハングについてのユニバーサル塩基の数は、長さで変動する。

【0018】

「ユニバーサル塩基」という用語は、全ての天然ヌクレオチドに結合できるヌクレオチドをいう。かかるユニバーサル塩基の設計は、全ての天然塩基と対になる性質により、主に縮重プライマー又はプローブの一部として文献に記載されている（例えば、Ｌｏａｋｅｓによる、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００１、Ｖｏｌ．２９、Ｎｏ．１２２４３７－２４４７）。

【0019】

本発明の方法によって得られたＵＮＩＴ－ＤＮＡ組成物は、図２に示されており、かつ少なくとも１つの５’オーバーハングを有する二本鎖核酸からなり、ここで５’オーバーハングは、少なくとも１つのユニバーサル塩基を含み、かつ凹んだ３’末端は遊離３’－ＯＨを有する。ここでは一例として、９ｂｐの二本鎖核酸及び５つのユニバーサル塩基５’オーバーハングについてのＵＮＩＴ－ＤＮＡ組成物が示されている。Ｎは天然の塩基（Ｇ又はＣ又はＴ又はＡ）を表し、Ｂはユニバーサル塩基を表す。

【0020】

図３は、ＵＮＩＴ－ＤＮＡ法によるコーディングの基本原理を示す。ポリメラーゼ（図示せず）の支持で、第２の鎖の凹んだ遊離３’－ＯＨに、提供したヌクレオチド（Ｇ）を組み込む。それにより、第２の鎖の凹んだ３’－ＯＨを伸長させ、第１のヌクレオチドによってコードする。第１の鎖の５’オーバーハングがユニバーサル鋳型依存性ＤＮＡ合成を支持するユニバーサル塩基を含む限り、提供したヌクレオチドはいずれも組成物と対合する。凹んだ３’－ＯＨは、ヌクレオチドの３’末端がブロックされているため、１ヌクレオチドだけ伸長する。次のステップとして、ブロックした３’－ＯＨを切断試薬によってブロック解除し、次のコーディングサイクルの発生を可能にする。

【0021】

後で切断試薬によってブロックが解除される、任意に蛍光標識した３’－ＯＨでブロックしたヌクレオチドの組み込みは、Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｂｙ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｃｈｅｎら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ＆Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、Ｖｏｌｕｍｅ １１、Ｉｓｓｕｅ １、Ｆｅｂｒｕａｒｙ ２０１３、Ｐａｇｅｓ ３４－４０）からも公知である。合成によるシーケンシングとは反対に、ＵＮＩＴ－ＤＮＡプロセスはＤＮＡコードを読み取るためではなくＤＮＡコードを書き込むために使用される。

【0022】

空間ポリヌクレオチドバーコードを書き込むために、図１によって既に概念的に導入したコーディングワークフローの一部として構造化照明を使用してよい。光（例えばＵＶ光）による個々の細胞の構造化照明がどのようにして空間的に切断試薬（例えばＴＣＥＰ）を化学的に放出するのかを図４に詳しく示す。Ｃｙ５－ＴＣＥＰ複合体にＵＶ光を照射した後にＴＣＥＰを放出する化学反応は、以前に記載されている（Ｖａｕｇｈａｎら、Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ．、２０１３ Ｊａｎ ３０、１３５（４）、１１９７－１２００）。

【0023】

要約すると、ＵＮＩＴ－ＤＮＡ法によって書き込まれる空間コードの配列は、提供されるヌクレオチドの順序及び光による切断試薬の空間活性化に依存する。ＵＮＩＴ－ＤＮＡによって書き込むことができる空間コードの合計数は、ヌクレオチドの組み込みを可能にする５’オーバーハング内のユニバーサル塩基の数に依存する（例えば１０個のユニバーサル塩基は、～１００万のコード（４¹⁰）に変換される）。コーディング原理の空間分解能は、照明のために使用される光の分解能（ＵＶＢについて～３００ｎｍ）及び放出された切断試薬の局所反応速度に依存し、したがって、細胞（～１０μｍ）又は細胞内（～ｌμｍ）の解像度レベルを容易に達せられる。

【0024】

コーディングが完了した後に、全ての細胞（又は核及び細胞小器官）を組織試料から単離してよく、単一細胞のシーケンシングを受ける。原則として、前記方法は同時に検査する細胞の数に制限はない。同時に個別に検査される細胞の数は、固有の空間バーコードを提供する５’オーバーハング内のユニバーサル塩基の数に依存する。実際の制限は、最終的にはシーケンサーの容量及びスループットのみである。

【0025】

ＵＮＩＴ－ＤＮＡ空間バーコーディングの実施形態
空間バーコーディングのための本発明の方法の実施形態は、図５に要約されており、実施形態Ａ～Ｈと呼ばれる。点線の四角により視覚化されているように、ＵＮＩＴ－ＤＮＡ法のコアとなる機能要素が維持されている。追加の機能を３’末端及び５’末端の修飾によって導入し、空間バーコーディングのためのコアＵＮＩＴ－ＤＮＡ組成物とさらなる核酸操作ワークフローが組み合わせる。

【0026】

実施形態を以下でより詳細に記載する。

【0027】

図６は、単一細胞シーケンシングワークフロー（Ｐｉｃｅｌｌｉら、Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０１３ Ｎｏｖ；１０（ｌｌ）：１０９６－８．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍｅｔｈ．２６３９．Ｅｐｕｂ ２０１３ Ｓｅｐ ２２））内の鋳型スイッチオリゴヌクレオチドプロセスの一部として使用されるＵＮＩＴ－ＤＮＡの実施形態Ｈ（図５）の例を示す。ＵＮＩＴ－ＤＮＡによる空間ＤＮＡバーコードの生成後に、得られた核酸を、エラー修正のための固有分子識別子（ＵＭＩ）を使用したシーケンシングによってさらに分析できる。

【0028】

図６において示したＴＳＯは細胞識別子を含まないことに注意する。ＵＮＩＴ－ＤＮＡ組成物は、構造化照明の解像度を細胞解像度レベルと一致するように選択する場合に、細胞識別子として機能する空間バーコードを提供する。

【0029】

図７は、実施形態ＨにおけるＵＮＩＴ－ＤＮＡ誘導体の使用のためのコーディング及びデコーディングのワークフローを更新する図である。コーディング後に、シーケンシングライブラリーを調製し、空間バーコード及び標的核酸を配列決定する。空間バーコードが物理的に標的核酸に結合されているため、標的配列の空間情報は、ｉｎ ｖｉｔｒｏシーケンシングによってもたらされ、結果と最初の試料源との関係を提供する。

【0030】

標的核酸の空間バーコーディングのためのＵＮＩＴ－ＤＮＡ組成物Ｈを、環状化ｓｓＤＮＡを導くパドロックワークフロー内（図８を参照）又は標的ＤＮＡワークフロー内（図９を参照）で使用することもできる。コーディング後に、得られた核酸は、空間バーコード及び結合させた標的核酸を決定するためにシーケンシングを受ける。

【0031】

分子ワークフローに応じて、異なるＵＮＩＴ－ＤＮＡの実施形態を使用して、空間コーディングをシーケンシング及びデコーディングワークフローと組み合わせてよい。図５に示したＵＮＩＴ－ＤＮＡの実施形態を、多峰性の標的化ＲＮＡ及びＤＮＡワークフロー又は固体支持体ワークフロー（図示せず）にも使用してよい。

【0032】

ＵＮＩＴ－ＤＮＡプロセスを、それぞれのサイクルで他の空間的に構造化された光のパターンで組織試料を処理することによって、組織試料の構造化照明によって引き起こされる周期的プロセス内で実施してよい。「構造化照明」及び「空間的に構造化された光のパターン」は、試料の一部又は選択した領域のみを照明することをいう。

【0033】

図４は、光（雷の記号で示される）による３つの細胞の構造化照明を示し、照明された細胞内で切断試薬ＴＣＥＰ（トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン）が放出される。Ｃｙ５－ＴＥＣＰ複合体は、光誘起切断試薬放出のための基質として使用される。

【0034】

さらに、図１において、組織ドナー００１から組織切片００２（任意に染色）がどのように得られ、そして画像化１００を受け、分節化又はクラスター分析、すなわち本発明の方法によってさらに調査されるべき試料の部分の選択が可能になるかを示す。かかる分節化／クラスター化／選択は、構造化照明及び／又は空間的に構造化された光のパターンのためのマスクの計算を可能にする。

【0035】

本発明の方法のさらに下流では、構造化照明及び／又は光の空間的に構造化されたパターンについて得られた情報は、ＵＮＩＴ－ＤＮＡコード生成のための光処理（１０２）中に利用され、これは、後のシーケンシング（１０４）のために細胞ｍＲＮＡ及び単一細胞インデックス試薬（２０２）と一緒にカプセル化される、コード化されたＵＮＩＴ－ＤＮＡをもたらす。構造化照明の助けにより、空間バーコードを備えた試料１０６の選択した領域／細胞のみが、次世代シーケンシング（１０４）及び配列解析（１０６）によって空間的にデコードされる。

【0036】

シーケンシング
本発明の方法における１つのステップは、シーケンシング（１０４）によって読み出されるＵＮＩＴ－ＤＮＡプローブ上でコードしたヌクレオチドの配列を決定することを目的とする。シーケンシングのための１つの方法は、ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｂｙ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（合成によるシーケンシング／ＳＢＳ）である。読み取りシグナルを増加させるために、ＵＮＩＴ－ＤＮＡプローブ配列の増幅を実施できる。クローン増幅の１つの方法は、コード化したＵＮＩＴ－ＤＮＡプローブのローリングサークル増幅（ＲＣＡ）であり、これはロロニーのシーケンシングプロセスを開始する前に実施する。

【0037】

本発明の変法において、ＵＮＩＴ－ＤＮＡコードの配列を標的遺伝子の配列とは別に読み取ってよい。これは、シーケンシング手順を２つの異なるシーケンシングプライマーでの２つの実行に分割することにより実現できる。

【0038】

本発明の実施形態
ＵＮＩＴ－ＤＮＡ法の８つの実施形態（Ａ～Ｈ）を図５に示す。ＵＮＩＴ－ＤＮＡ組成物のコア要素は、全ての実施形態に対して維持される（点線の四角により示す）。ＵＮＩＴ－ＤＮＡの５’末端及び３’末端に追加した追加要素は以下である。

【0039】

（Ａ）オーバーハング内でブロックした３’末端を有する第２の５’オーバーハング。実施形態Ａ及びＢにおいて、第１の鎖は、その３’末端にブロッキング基をさらに備える。

【0040】

（Ｂ）二本鎖の５’末端を二本鎖の３’末端に結合する。

【0041】

（Ｃ）５’ユニバーサル塩基オーバーハングの５’末端を、天然の塩基によって拡張する。実施形態Ｃにおいて、第１の鎖のオーバーハングは、５’末端で第１のオリゴヌクレオチドを備える。

【0042】

（Ｄ）天然の塩基によって伸長した５’ユニバーサル塩基オーバーハングの５’末端を、二本鎖の３’末端に結合する。実施形態Ｄにおいて、第１のオリゴヌクレオチドを、第１の鎖の３’末端に直接又はオリゴヌクレオチド架橋を介して連結させ、それにより環を形成する。オリゴヌクレオチド架橋は、５～１００ヌクレオチドの長さを有してよい。

【0043】

（Ｅ）天然の塩基によって拡張した５’ユニバーサル塩基オーバーハングの５’末端は、天然塩基の二本鎖を形成している。実施形態Ｅにおいて、第１のオリゴヌクレオチドを、対応するヌクレオチドとハイブリダイズさせ、それにより平滑末端及び少なくとも１つのユニバーサル塩基の位置にギャップを有するポリヌクレオチドを得る。

【0044】

（Ｆ）天然の塩基の二本鎖を形成する天然の塩基によって伸長した５’ユニバーサル塩基オーバーハングの５’末端を、隣接する二本鎖の３’末端と結合する。

【0045】

実施形態Ｆにおいて、第１のオリゴヌクレオチドを、対応するヌクレオチドとハイブリダイズさせ、それによって平滑末端及び少なくとも１つのユニバーサル塩基の位置にギャップを有するポリヌクレオチドを得るが、ここでは平滑末端を、直接又はオリゴヌクレオチド架橋を介して互いに連結させる。オリゴヌクレオチド架橋は、５～１００ヌクレオチドの長さを有してよい。

【0046】

（Ｇ）ブロックした３’末端を有する天然の塩基の二本鎖を形成するが一方で５’末端は二本鎖の反対側の３’末端と結合して円を形成している天然の塩基によって伸長させた５’ユニバーサル塩基オーバーハングの５’末端。実施形態Ｇにおいて、第１のオリゴヌクレオチドを、対応するヌクレオチドとハイブリダイズさせ、それによって平滑末端及び少なくとも１つのユニバーサル塩基の位置にギャップを有するポリヌクレオチドを得るが、ここでは第１のオリゴヌクレオチドを、第１の鎖の３’末端に直接又はオリゴヌクレオチド架橋を介して連結させ、それにより環を形成し、ハイブリダイズした対応するヌクレオチドの３’末端は切断不可能なブロッキング基を含む。オリゴヌクレオチド架橋は、５～１００ヌクレオチドの長さを有してよい。

【0047】

（Ｈ）二本鎖の５’末端を、反対側の二本鎖の３’末端に結合させて、二本鎖の３’末端をブロックしたパドロックのような構造を形成する。実施形態Ｇにおいて、第１のオリゴヌクレオチドは、対応するヌクレオチドとハイブリダイズし、それによって平滑末端及び少なくとも１つのユニバーサル塩基の位置にギャップを有するポリヌクレオチドを得るが、ここでは、ハイブリダイズした対応するヌクレオチドの３’末端を、直接又はオリゴヌクレオチド架橋を介して第２鎖の５’末端に連結させ、それにより環を形成し、第１鎖の３’末端は切断不可能なブロッキング基を含む。オリゴヌクレオチド架橋は、５～１００ヌクレオチドの長さを有してよい。

【0048】

実施形態Ｈを、図６に示した第１の変法で実施してよい。ここで、本発明のＵＮＩＴ－ＤＮＡ法は、鋳型スイッチオリゴヌクレオチド（ＴＳＯ）プロセスと組み合わせる。

【0049】

図６に示した変法は、（Ａ）ｍＲＮＡをオリゴｄＴプライマーによって（ｉｎ ｓｉｔｕで）逆転写させ、３’末端にトリプルＣを有するｃＤＮＡを生成することを含む。（Ｂ）５’ＰＣＲハンドル（Ｎとして示す）、固有分子識別子（ＵＭＩ）及び３’末端のトリプルＧを有するＴＳＯ。（Ｃ）ｃＤＮＡ（Ａから）とＴＳＯ（Ｂから）とのｉｎ ｓｉｔｕ鋳型スイッチングの結果、両端にＰＣＲハンドルを有する捕捉ｃＤＮＡを生じる（感度を高めるための任意のｉｎ ｓｉｔｕ ＰＣＲ増幅は示していない）。（Ｄ）ユニバーサル塩基を含むオリゴヌクレオチドとＰＣＲハンドルとのハイブリダイゼーションが、ＵＮＩＴ－ＤＮＡ誘導体Ｈをもたらす（点線の四角で示す）。

【0050】

実施形態Ｈのさらなる変法を図８に示す。ここで本発明のＵＮＩＴ－ＤＮＡ法を環状ｓｓＤＮＡと組み合わせる。

【0051】

図８に示す変法は、（Ａ）環状ｓｓＤＮＡ（捕捉した標的配列、固有分子識別子（ＵＭＩ）及びＰＣＲハンドル（Ｎとして示す）を含む）を含む。ＵＭＩを増幅前に追加し、ＮＧＳワークフロー内でしばしば使用して、増幅によって生じるエラー及び定量的バイアスを低減させる。環状ｓｓＤＮＡを、Ｃｈｅｎら（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２０１８、Ｖｏｌ．４６、Ｎｏ．４ｅ２２）によって記載されているようなＰａｄｌｏｃｋ法（ギャップなし）、Ｐａｄｌｏｃｋ法（ギャップ）又はＤｉｒｅｃｔ法（ＦＩＳＳＥＱ）によってｉｎ ｓｉｔｕで生成してよい。（Ｂ）オリゴハイブリダイゼーションにより二本鎖を生成し、（Ｂ）で示すように制限エンドヌクレアーゼ消化を可能にし、線状ｓｓＤＮＡ（Ｃ）を生成する（感度を高めるための任意のｉｎ ｓｉｔｕ ＰＣＲ増幅は示していない）。（Ｄ）ユニバーサル塩基を含むオリゴヌクレオチドとＰＣＲハンドルとのハイブリダイゼーションが、ＵＮＩＴ－ＤＮＡ誘導体Ｈをもたらす（点線の四角で示す）。

【0052】

実施形態Ｈのさらなる変法を図９に示す。ここでは、本発明のＵＮＩＴ－ＤＮＡ法を、例えば、ＱＩＡｓｅｑ Ｔａｒｇｅｔｅｄ ＤＮＡ Ｐａｎｅｌ Ｈａｎｄｂｏｏｋ０３／２０２１において開示されているＱＩＡＧＥＮによる標的ＤＮＡワークフローによって、標的ＤＮＡ増幅と組み合わせる。図２を、空間（Ｂ）のためにＵＮＩＴ－ＤＮＡ誘導体Ｈと組み合わせるように変更した。アダプターは、固有分子識別子（ＵＭＩ）及びＰＣＲハンドル（Ｎ）を含む。（Ｃ） 濃縮のため、連結させた標的配列は、遺伝子特異的プライマー（ＰＣＲハンドルを有するＧＳＰ）及び汎用プライマー（Ｎとして表示）によるｉｎ ｓｉｔｕでの標的ＰＣＲを数サイクル受ける。（Ｄ）ユニバーサル塩基を含むオリゴヌクレオチドとＰＣＲハンドルとのハイブリダイゼーションは、ＵＮＩＴ－ＤＮＡ誘導体Ｈをもたらす（点線の四角で示す）。

【0053】

図１及び図７の用語解説
００１ 組織ドナー
００２ 染色した組織切片
００３ 細胞
００４ 細胞核
００５ 細胞質内のｍＲＮＡ
００６ ｍＲＮＡ（ＵＮＩＴ－ＤＮＡ組成物に結合）
１００ 画像化
１０１ 分節化又はクラスター分析、構造化照明のマスクの計算
１０２ ＵＮＩＴ－ＤＮＡコード生成のための光処理
１０３ 単一細胞のカプセル化
１０４ シーケンシング
１０５ 環状バーコーディング
１０６ 配列解析
２００ コーディング前のＵＮＩＴ－ＤＮＡ組成物
２０１ コーディング後のＵＮＩＴ－ＤＮＡ組成物
２０２ 単一細胞インデックス試薬
２０３ ＵＮＩＴ－ＤＮＡ組成物Ｈ
２０４ 空間バーコードを有する線形化鋳型スイッチｃＤＮＡ
２０５ ｃＤＮＡ由来のシーケンシングライブラリー

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5A】

【図5B】

【図5C】

【図5D】

【図5E】

【図5F】

【図5G】

【図5H】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【国際調査報告】