特表 2024-522943 結節性硬化症に対する遺伝子療法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-06-21

(54)【発明の名称】結節性硬化症に対する遺伝子療法

(51)【国際特許分類】

   C07K 14/47 20060101AFI20240614BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20240614BHJP

   C12N 15/864 20060101ALI20240614BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20240614BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20240614BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20240614BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20240614BHJP

   C12N 7/01 20060101ALI20240614BHJP

   C12P 19/34 20060101ALI20240614BHJP

   C12N 15/12 20060101ALI20240614BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240614BHJP

   A61K 38/17 20060101ALI20240614BHJP

   A61K 35/76 20150101ALI20240614BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20240614BHJP

   A61K 31/7088 20060101ALI20240614BHJP

【ＦＩ】

C07K14/47 ZNA

C12N15/63 Z

C12N15/864 100Z

C12N5/10

C12N1/21

C12N1/19

C12N1/15

C12N7/01

C12P19/34 A

C12N15/12

A61P35/00

A61K38/17

A61K35/76

A61K48/00

A61K31/7088

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024520657

(86)(22)【出願日】2022-06-14

(85)【翻訳文提出日】2024-01-15

(86)【国際出願番号】 US2022033452

(87)【国際公開番号】W WO2022266113

(87)【国際公開日】2022-12-22

(31)【優先権主張番号】63/210,456

(32)【優先日】2021-06-14

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】523469559

【氏名又は名称】ブリッジバイオ ジーン セラピー リサーチ， インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本 健策

(72)【発明者】

【氏名】スコット， デイビッド ウェイン

【テーマコード（参考）】

4B064

4B065

4C084

4C086

4C087

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B064AF27

4B064CA19

4B064CC24

4B064DA03

4B065AA01X

4B065AA57X

4B065AA72X

4B065AA90X

4B065AA95X

4B065AB01

4B065BA02

4B065CA24

4B065CA44

4C084AA01

4C084AA02

4C084AA07

4C084AA13

4C084BA01

4C084BA08

4C084BA22

4C084BA23

4C084CA18

4C084CA53

4C084NA14

4C084ZB261

4C084ZB262

4C086AA01

4C086AA02

4C086EA16

4C086MA01

4C086MA04

4C086NA14

4C086ZB26

4C087AA01

4C087AA02

4C087BC83

4C087CA12

4C087NA14

4C087ZB26

4H045AA10

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA10

4H045CA40

4H045EA20

4H045FA72

4H045FA74

(57)【要約】

本開示は、結節性硬化症を治療するための遺伝子療法組成物及び方法を提供する。特に、本開示は、ＡＡＶカプシドタンパク質と、短縮されたチュベリン（ｃチュベリン）をコードするＡＡＶ発現カセットと、を含む、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を含む組成物、ならびにそれを使用する方法を提供する。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

（ｉ）ハマルチンに結合することが可能なＮ末端領域と、（ｉｉ）Ｃ末端ＧＴＰａｓｅ活性化タンパク質（ＧＡＰ）領域と、を含む、短縮されたチュベリン（ｃチュベリン）であって、前記ｃチュベリンが、配列番号１のアミノ酸残基４１９～９３２を欠く、前記ｃチュベリン。

【請求項2】

前記ｃチュベリンが、配列番号１のアミノ酸残基９４７～９８８をさらに欠く、請求項１に記載のｃチュベリン。

【請求項3】

前記ｃチュベリンが、配列番号１のアミノ酸残基１２０５～１２７１をさらに欠く、請求項１または２に記載のｃチュベリン。

【請求項4】

前記ｃチュベリンが、配列番号１のアミノ酸残基１３３６～１４９７をさらに欠く、請求項１～３のいずれか１項に記載のｃチュベリン。

【請求項5】

前記Ｃ末端領域が、配列番号１０～１２のうちの１つに対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のｃチュベリン。

【請求項6】

前記ｃチュベリンが、配列番号１のアミノ酸残基９３３～１１０９をさらに欠く、請求項１に記載のｃチュベリン。

【請求項7】

Ｃ末端ドメインが、配列番号８に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項６に記載のｃチュベリン。

【請求項8】

Ｎ末端ドメインが、配列番号５に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１～７のいずれか１項に記載のｃチュベリン。

【請求項9】

（ｉ）ハマルチンに結合することが可能なＮ末端領域と、（ｉｉ）Ｃ末端ＧＴＰａｓｅ活性化タンパク質（ＧＡＰ）領域と、を含む、短縮されたチュベリン（ｃチュベリン）であって、前記Ｃ末端領域が、配列番号７に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記ｃチュベリンが、配列番号１のアミノ酸残基４５１～９３２を欠く、前記ｃチュベリン。

【請求項10】

前記ｃチュベリンが、配列番号１のアミノ酸残基４１９～９３２を欠く、請求項９に記載のｃチュベリン。

【請求項11】

前記Ｃ末端領域が、配列番号８に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項９または１０に記載のｃチュベリン。

【請求項12】

前記Ｃ末端領域が、配列番号９に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項９または１０に記載のｃチュベリン。

【請求項13】

前記Ｎ末端領域が、配列番号４に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項９に記載のｃチュベリン。

【請求項14】

前記Ｎ末端領域が、配列番号５に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項９～１２のいずれか１項に記載のｃチュベリン。

【請求項15】

前記ｃチュベリンが、配列番号１４に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項９に記載のｃチュベリン。

【請求項16】

前記ｃチュベリンが、配列番号１５に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項９に記載のｃチュベリン。

【請求項17】

前記ｃチュベリンが、配列番号１６に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項９に記載のｃチュベリン。

【請求項18】

（ｉ）ハマルチンに結合することが可能なＮ末端領域と、（ｉｉ）Ｃ末端ＧＴＰａｓｅ活性化タンパク質（ＧＡＰ）領域と、を含む、短縮されたチュベリン（ｃチュベリン）であって、前記Ｃ末端領域が、配列番号１０～１２のうちの１つに対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記ｃチュベリンが、配列番号１のアミノ酸残基４５１～９３２を欠く、前記ｃチュベリン。

【請求項19】

前記ｃチュベリンが、配列番号１のアミノ酸残基４１９～９３２を欠く、請求項１８に記載のｃチュベリン。

【請求項20】

前記Ｃ末端領域が、配列番号１０に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１８または１９に記載のｃチュベリン。

【請求項21】

前記Ｃ末端領域が、配列番号１１に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１８または１９に記載のｃチュベリン。

【請求項22】

前記Ｃ末端領域が、配列番号１２に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１８または１９に記載のｃチュベリン。

【請求項23】

前記ｃチュベリンが、配列番号１７に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１８に記載のｃチュベリン。

【請求項24】

前記ｃチュベリンが、配列番号１８に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１８に記載のｃチュベリン。

【請求項25】

前記ｃチュベリンが、配列番号１９に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１８に記載のｃチュベリン。

【請求項26】

前記Ｎ末端領域が、配列番号５に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１８～２５のいずれか１項に記載のｃチュベリン。

【請求項27】

前記ｃチュベリンが、前記Ｎ末端領域と前記Ｃ末端領域との間にスペーサ配列を含む、請求項１～２６のいずれか１項に記載のｃチュベリン。

【請求項28】

前記スペーサ配列が、配列番号２の配列を含む、請求項２７に記載のｃチュベリン。

【請求項29】

前記スペーサ配列が、配列番号３の配列を含む、請求項２８に記載のｃチュベリン。

【請求項30】

請求項１～２９のいずれか１項に記載のｃチュベリンをコードする、核酸分子。

【請求項31】

前記核酸分子が、ヒト標的細胞における発現のためにコドン最適化されている、請求項３０に記載の核酸分子。

【請求項32】

前記ヒト標的細胞が、脳細胞、心臓細胞、腎臓細胞、皮膚細胞、または肺細胞である、請求項３１に記載の核酸分子。

【請求項33】

前記核酸分子が、調節制御配列に操作可能に連結されている、請求項３０～３２のいずれか１項に記載の核酸分子。

【請求項34】

前記調節制御配列が、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモータ、ニワトリβ－アクチン（ＣＢＡ）プロモータ、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモータ／エンハンサ、ＳＶ４０プロモータ、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモータ、ホスホグリセロールキナーゼプロモータ、ＣＭＶ即時／初期遺伝子エンハンサ／ＣＢＡプロモータ、シナプシンプロモータ、またはグリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモータを含む、請求項３３に記載の核酸分子。

【請求項35】

前記調節制御配列が、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）即時／初期遺伝子エンハンサ／ニワトリβ－アクチン（ＣＢＡ）プロモータ、及びウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節要素（ＷＰＲＥ）を含む、請求項３３に記載の核酸分子。

【請求項36】

前記調節制御配列が、ベータ－グルクロニダーゼ（ＧＵＳＢ）プロモータを含む、請求項３３に記載の核酸分子。

【請求項37】

前記核酸分子が、配列番号２１～２６のいずれか１項に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項３０～３６のいずれか１項に記載の核酸分子。

【請求項38】

（ｉ）ハマルチンに結合することが可能なＮ末端領域と、（ｉｉ）Ｃ末端ＧＴＰａｓｅ活性化タンパク質（ＧＡＰ）領域とを含むｃチュベリンをコードする、核酸分子であって、前記ｃチュベリンが、配列番号１のアミノ酸残基４５１～９３２を欠き、前記核酸分子が、ベータ－グルクロニダーゼ（ＧＵＳＢ）プロモータを含む調節制御配列に操作可能に連結されている、前記核酸分子。

【請求項39】

前記ｃチュベリンが、配列番号１のアミノ酸残基４５１～１５１５を欠く、請求項３８に記載の核酸分子。

【請求項40】

前記Ｃ末端領域が、配列番号６に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項３８または３９に記載の核酸分子。

【請求項41】

前記Ｎ末端領域が、配列番号４に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項３８～４０のいずれか１項に記載の核酸分子。

【請求項42】

アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）発現カセットを含む核酸分子であって、前記ＡＡＶ発現カセットが、５’から３’へと、
ｉ）５’ＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）と、
ｉｉ）請求項２５～３５のいずれか１項に記載の核酸分子と、
ｉｉｉ）３’ＡＡＶ ＩＴＲと、を含む、前記核酸分子。

【請求項43】

前記５’ＩＴＲ及び／または前記３’ＩＴＲが、ＡＡＶ２に由来する、請求項４２に記載の核酸分子。

【請求項44】

前記５’ＡＡＶ ＩＴＲ配列が、配列番号２７に対して少なくとも９０％の同一性を有する核酸配列を含む、請求項４２または４３に記載の核酸分子。

【請求項45】

前記３’ＡＡＶ ＩＴＲ配列が、配列番号２８に対して少なくとも９０％の同一性を有する核酸配列を含む、請求項４２～４４のいずれか１項に記載の核酸分子。

【請求項46】

前記ＡＡＶ発現カセットが、ポリアデニル化配列をさらに含む、請求項４２～４５のいずれか１項に記載の核酸分子。

【請求項47】

前記ＡＡＶ発現カセットが、コザック配列をさらに含む、請求項４２～４６のいずれか１項に記載の核酸分子。

【請求項48】

請求項３０～４７のいずれか１項に記載の核酸分子を含む、プラスミド。

【請求項49】

請求項３０～４７のいずれか１項に記載の核酸分子、または請求項４８に記載のプラスミドを含む、宿主細胞。

【請求項50】

請求項３０～４７のいずれか１項に記載の核酸分子、請求項４８に記載のプラスミド、または請求項４９に記載の宿主細胞を含む、組成物。

【請求項51】

組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を産生する方法であって、宿主細胞を、請求項３０～４７のいずれか１項に記載の核酸分子または請求項４８に記載のプラスミドと接触させることを含む、前記方法。

【請求項52】

請求項５１に記載の方法によって産生される、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）。

【請求項53】

ＡＡＶカプシドタンパク質と、請求項３０～４７のいずれか１項に記載の核酸分子と、を含む、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）。

【請求項54】

前記ｒＡＡＶが、ＡＡＶ１カプシドタンパク質、ＡＡＶ２カプシドタンパク質、ＡＡＶ３カプシドタンパク質、ＡＡＶ４カプシドタンパク質、ＡＡＶ５カプシドタンパク質、ＡＡＶ６カプシドタンパク質、ＡＡＶ７カプシドタンパク質、ＡＡＶ８カプシドタンパク質、ＡＡＶ９カプシドタンパク質、ＡＡＶ１０カプシドタンパク質、ＡＡＶｒｈ１０カプシドタンパク質、ＡＡＶ１１カプシドタンパク質、及び／またはＡＡＶ１２カプシドタンパク質を含む、請求項５２または５３に記載のｒＡＡＶ。

【請求項55】

標的細胞においてｃチュベリンを発現させる方法であって、前記標的細胞を、請求項３０～４７のいずれか１項に記載の核酸分子、請求項４８に記載のプラスミド、請求項５０に記載の組成物、または請求項５２～５４のいずれか１項に記載のｒＡＡＶと接触させ、それによって、前記標的細胞においてｃチュベリンを発現させることを含む、前記方法。

【請求項56】

前記接触させるステップが、インビトロ、エクスビボ、またはインビボで実施される、請求項５５に記載の方法。

【請求項57】

前記接触させるステップが、治療を必要とする対象においてインビボで実施される、請求項５６に記載の方法。

【請求項58】

前記接触させるステップが、治療有効量の前記核酸分子、前記プラスミド、前記組成物、または前記ｒＡＡＶを前記対象に投与することを含む、請求項５７に記載の方法。

【請求項59】

結節性硬化症複合体（ＴＳＣ）を有する対象を治療する方法であって、治療有効量の請求項１～２９のいずれか１項に記載のｃチュベリン、請求項３０～４７のいずれか１項に記載の核酸分子、請求項３０～４７のいずれか１項に記載の核酸分子を含む１つ以上の細胞外小胞（ＥＶ）、請求項４８に記載のプラスミド、請求項５０に記載の組成物、または請求項５２～５４のいずれか１項に記載のｒＡＡＶを前記対象に投与し、それによって、前記対象におけるＴＳＣを治療することを含む、前記方法。

【請求項60】

腎癌を有する対象を治療する方法であって、治療有効量の請求項１～２９のいずれか１項に記載のｃチュベリン、請求項３０～４７のいずれか１項に記載の核酸分子、請求項３０～４７のいずれか１項に記載の核酸分子を含む１つ以上の細胞外小胞（ＥＶ）、請求項４８に記載のプラスミド、請求項５０に記載の組成物、または請求項５２～５４のいずれか１項に記載のｒＡＡＶを前記対象に投与し、それによって、前記対象における腎癌を治療することを含む、前記方法。

【請求項61】

前記ｃチュベリン、前記核酸分子、前記プラスミド、前記組成物、または前記ｒＡＡＶが、血管内、腎動脈または静脈内、肺内、大槽内、脳内、髄腔内、静脈内、脳室内、側脳室内、腹腔内、または真皮に投与される、請求項５７～６０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項62】

前記対象が、腎血管筋脂肪腫を有する、請求項５７～６１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項63】

前記ｃチュベリン、前記核酸分子、前記プラスミド、前記組成物、または前記ｒＡＡＶが、前記腎血管筋脂肪腫を標的とする、請求項６２に記載の方法。

【請求項64】

前記対象が、リンパ脈管筋腫症（ＬＡＭ）を呈する、請求項５７～６３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項65】

前記ｃチュベリン、前記核酸分子、前記プラスミド、前記組成物、または前記ｒＡＡＶが、前記ＬＡＭを標的とする、請求項６４に記載の方法。

【請求項66】

前記対象が、脳機能不全を有する、請求項５７～６５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項67】

前記ｃチュベリン、前記核酸分子、前記プラスミド、前記組成物、または前記ｒＡＡＶが、くも膜下腔に提供される、請求項６６に記載の方法。

【請求項68】

前記ｃチュベリン、前記核酸分子、前記プラスミド、前記組成物、または前記ｒＡＡＶが、脳細胞、心臓細胞、腎臓細胞、皮膚細胞、または肺細胞に投与される、請求項５７～６７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項69】

前記対象が、ラパマイシンを投与される、請求項５７～６８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項70】

前記対象が、ヒトである、請求項５７～６９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項71】

前記対象が、１８歳未満である、請求項５７～７０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項72】

前記対象が、乳児である、請求項７１に記載の方法。

【請求項73】

前記対象が、結節性硬化症複合体を有すると診断されている、請求項５７～７２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項74】

前記対象が、ＴＳＣ２遺伝子に変異を有する、請求項５７～７３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項75】

前記対象が、前記ＴＳＣ２遺伝子のエクソン３３、エクソン３７、及び／またはエクソン３８に変異を有する、請求項７４に記載の方法。

【請求項76】

前記対象が、皮質結節、上衣下結節、及び上衣下巨細胞星細胞腫のうちの１つ以上を有する、請求項５７～７５のいずれか１項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０２１年６月１４日出願の米国仮出願第６３／２１０，４５６号に対する優先権の利益を主張する。

【0002】

電子提出されたテキストファイルの説明
ここで電子提出されたテキストファイルの内容：配列表のコンピュータ可読形式コピー（ファイル名：ＢＧＴＲ＿００３＿０１ＷＯ＿ＳｅｑＬｉｓｔ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ、作成日：２０２２年６月１４日、ファイルサイズ約１７０，３３８バイト）は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【背景技術】

【0003】

結節性硬化症複合体（ＴＳＣ）は、結節性硬化症とも称され、脳、ならびに腎臓、心臓、肝臓、眼、肺、及び皮膚などの他の重要な臓器で成長する非がん性腫瘍を生じ得る、多系統の常染色体優性の遺伝性疾患である。脳におけるそのような腫瘍は、発達遅延、自閉症、てんかん、及び水頭症を引き起こし得る。結節性硬化症に関連付けられる生命を脅かす状態としては、内出血を引き起こし得る腎血管筋脂肪腫、及び呼吸を損ない得るリンパ脈管筋腫症（ＬＡＭ）が挙げられる。

【0004】

結節性硬化症は、ＴＳＣ１遺伝子及び／またはＴＳＣ２遺伝子における１つ以上の変異によって引き起こされる。ＴＳＣ２における変異から生じる結節性硬化症は、より重度であり、より一般的である。ＴＳＣ１及びＴＳＣ２は、それぞれ、タンパク質であるハマルチン及びチュベリンをコードする腫瘍成長抑制遺伝子である。チュベリン及びハマルチンは、主にｍＴＯＲＣ１複合体を阻害することによって、ラパマイシンの哺乳類標的（ｍＴＯＲ）シグナル伝達を調節するための複数のシグナルを統合する、タンパク質複合体を形成する。加えて、チュベリンはまた、ｍＴＯＲＣ１活性化因子であるＲｈｅｂを下方調節するＧＴＰａｓｅ活性化ドメイン（ＧＡＰ）ドメインを含有する。

【0005】

結節性硬化症の現在の治療は、ラパマイシン及びその類似体の投与を伴う。しかしながら、これらの薬物は、連続的に投与されなければならず、脳の発達障害及び免疫抑制を含む、顕著な副作用を有する。ラパマイシン及びその類似体の投与はまた、ｍＴＯＲＣ１活性の過剰抑制に起因する有害事象を生じ得る。加えて、一部の患者は、ラパマイシンに応答しないか、または最初に応答し、次いで耐性を得る。

【0006】

したがって、結節性硬化症を治療するために使用することができる組成物及び方法、特に遺伝子療法に基づく組成物及び方法に対する満たされていない必要性が存在する。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0007】

本開示は、結節性硬化症複合体の治療に使用するための組成物及び方法を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、（ｉ）ハマルチンに結合することが可能なＮ末端領域と、（ｉｉ）Ｃ末端ＧＴＰａｓｅ活性化タンパク質（ＧＡＰ）領域と、を含む、短縮されたチュベリンタンパク質（ｃチュベリン）であって、ｃチュベリンが、ヒトチュベリン（配列番号１）のある特定のアミノ酸残基を欠く、ｃチュベリンを提供する。いくつかの実施形態では、本開示のｃチュベリンは、ヒトチュベリン（配列番号１）のアミノ酸残基４５１～９３２を欠く。いくつかの実施形態では、本開示のｃチュベリンは、ヒトチュベリン（配列番号１）のアミノ酸残基４１９～９３２を欠く。いくつかの実施形態では、本開示のｃチュベリンは、（ｉ）ハマルチンに結合することが可能なＮ末端領域と、（ｉｉ）Ｃ末端ＧＴＰａｓｅ活性化タンパク質（ＧＡＰ）領域と、を含み、Ｃ末端領域が、配列番号７に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ配列番号１のアミノ酸残基４５１～９３２を欠く。いくつかの実施形態では、本開示のｃチュベリンは、（ｉ）ハマルチンに結合することが可能なＮ末端領域と、（ｉｉ）Ｃ末端ＧＴＰａｓｅ活性化タンパク質（ＧＡＰ）領域と、を含み、Ｃ末端領域が、配列番号１０～１２のうちの１つに対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ｃチュベリンが、配列番号１のアミノ酸残基４５１～９３２を欠く。

【0008】

ｃチュベリンタンパク質に加えて、本開示は、本明細書に開示のｃチュベリンタンパク質のうちのいずれか１つをコードする核酸分子、ならびに所与の細胞において本明細書に開示のｃチュベリンタンパク質のうちのいずれか１つの発現を引き起こすように構成された組成物を提供する。例えば、本開示は、５’から３’へと、５’ＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）と、本明細書に開示の核酸分子のうちのいずれか１つと、３’ＡＡＶ ＩＴＲと、を含む、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）発現カセットを提供する。本開示はまた、ＡＡＶカプシドタンパク質と、本明細書に開示の核酸分子またはＡＡＶ発現カセットのうちのいずれか１つと、を含む、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）を提供する。さらに、本開示は、本明細書に開示のｃチュベリンタンパク質のうちのいずれか１つ、核酸分子のうちのいずれか１つ、プラスミドのうちのいずれか１つ、宿主細胞のうちのいずれか１つ、またはｒＡＡＶのうちのいずれか１つを含む薬学的組成物を含む、組成物を提供する。

【0009】

別の態様では、本開示は、標的細胞において、本明細書に開示のｃチュベリンのうちのいずれか１つを発現させる方法であって、本明細書に開示の核酸分子のうちのいずれか１つ、本明細書に開示のプラスミドのうちのいずれか１つ、本明細書に開示のｒＡＡＶのうちのいずれか１つ、本明細書に開示の細胞外小胞（ＥＶ）のうちのいずれか１つ、または本明細書に開示の組成物のうちのいずれか１つを標的細胞と接触させ、それによって、標的細胞においてｃチュベリンを発現させることを含む、方法を提供する。

【0010】

さらなる態様では、本開示は、結節性硬化症の治療を必要とする対象においてそれを行う方法であって、治療有効量の本明細書に開示の核酸分子のうちのいずれか１つ、本明細書に開示のプラスミドのうちのいずれか１つ、本明細書に開示のｒＡＡＶのうちのいずれか１つ、本明細書に開示のＥＶのうちのいずれか１つ、または本明細書に開示の組成物のうちのいずれか１つを対象に投与し、それによって、対象における結節性硬化症を治療することを含む、方法を提供する。

【発明を実施するための形態】

【0011】

ＴＳＣ２における変異によって引き起こされる結節性硬化症、すなわちＴＳＣを治療するためのＡＡＶに基づく遺伝子療法を使用することは、５．４ｋｂのｃＤＮＡのヒトチュベリンと比較して比較的小さい、ＡＡＶベクターの挿入容量（約４．７ｋｂ）によって、複雑であった。本開示は、ＡＡＶベクターに組み込まれるように十分に小さく、短縮されたチュベリン（ｃチュベリン）をコードする、短縮された形態のヒトチュベリン遺伝子（ＴＳＣ２）を提供する。特に、本開示は、ＡＡＶカプシドタンパク質と、ｃチュベリンをコードするＡＡＶ発現カセットと、を含む、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を含む組成物、ならびに結節性硬化症の治療を含む、それらを使用する方法を提供する。

【0012】

本明細書で使用される用語は、特定の実施形態について説明することのみを目的とし、制限することを意図しないことを理解されたい。

【0013】

別段に定義されていない限り、本明細書で用いられているすべての技術用語及び科学用語は、本願が属する分野の当業者によって一般に理解される意味と同じ意味を有する。本出願の実施または試験の際には、本明細書に記載のものと同様または同等の任意の方法及び材料を使用できるが、本明細書では代表的な方法及び材料を記載する。

【0014】

「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」という用語は、特許請求の範囲を含む本出願で使用される場合、「１つ以上」を指す。したがって、例えば、「担体」への言及は、１つ以上の担体、２つ以上の担体などの混合物を含み、「方法」への言及は、当業者に既知の等価なステップ及び／または方法への言及を含む、などである。

【0015】

本明細書では、任意濃度範囲、パーセンテージ範囲、比の範囲、または整数範囲は、別段示されない限り、記述された範囲内の任意の整数の値、及び適切な場合には、その分数（整数の１０分の１及び１００分の１など）を含むものと理解されたい。「約」という用語は、数または数字の直前にある場合、その数または数字が、プラスまたはマイナス０％～１０％の範囲であることを意味する。

【0016】

また、本明細書で使用される場合、「及び／または」は、関連する列挙された項目のうちの１つ以上の任意の及びすべての可能な組み合わせ、ならびに数者択一と解釈される（「または」）場合の組み合わせの欠如を指し、かつ網羅する。代替的な手段（例えば、「または」）の使用は、代替的な手段の一方、両方、またはそれらの任意の組み合わせのいずれかを意味すると理解されるべきである。

【0017】

本明細書で使用される場合、「担体」は、任意の及びすべての溶媒、分散媒、ビヒクル、コーティング、希釈剤、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤、緩衝剤、担体溶液、懸濁液、コロイドなどを含む。

【0018】

「薬学的に許容される」という用語は、別段記載されない限り、部分（例えば、塩、剤形、または賦形剤）を、健全な医学的判断に従って使用するのに適切であると特徴付けられるように使用される。一般に、薬学的に許容される部分は、その部分が有し得る任意の有害な影響を上回る、１つ以上の利益を有する。有害な影響としては、例えば、過剰な毒性、刺激、アレルギー応答、ならびに他の問題及び合併症を挙げることができる。

【0019】

本明細書で使用される場合、「治療」または「治療すること」、「緩和すること（ｐａｌｌｉａｔｉｎｇ）」及び「緩和すること（ａｍｅｌｉｏｒａｔｉｎｇ）」は、本明細書では互換的に使用される。これらの用語は、限定されないが、療法的利益及び／または予防的利益を含む、有益なまたは望ましい結果を得るためのアプローチを指す。療法的利益は、治療下の１つ以上の疾患、状態、または症状に対する任意の療法的に関連する改善または効果を指す。一実施形態における「治療すること」という用語は、（１）状態、障害、または状態に罹患し得るか、または罹患する素因があるが、状態、障害、または状態の臨床的または亜臨床的症状を未だ経験していないか、または示していない、患者において発症する状態、障害、または状態の臨床的症状の出現を防止または遅延させること、（２）状態、障害、または状態を阻害すること（例えば、その少なくとも１つの臨床的もしくは亜臨床的症状の疾患の発症、または維持治療の場合にはその再発を、停止、低減、または遅延させること）、及び（３）（例えば、状態、障害、もしくは状態、またはその臨床的もしくは亜臨床的症状のうちの少なくとも１つの退縮を引き起こすこと、またはそれらの重症度を低減させることによって）状態を緩和すること、を含む。例えば、有益な臨床結果としては、限定されないが、腫瘍または過誤腫の侵襲性または成長の遅延または減速、及びそのような腫瘍または過誤腫に関連付けられる症状の緩和が挙げられる。例えば、腎血管筋脂肪腫の場合、腫瘍サイズは、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）によって監視することができ、本明細書に開示の組成物のうちのいずれか１つの投与に起因する細胞サイズの収縮は、ラパマイシンを使用して結節性硬化症の治療を監視するために使用されるものなどの標準的な手順に従って分析することができる。治療はまた、治療を受けていない対象と比較して、対象の死亡率の減少または寿命の増加を含む。

【0020】

「有効量」または「治療有効量」という用語は、転帰を達成するのに、例えば、結節性硬化症またはその症状の治療などの有益なまたは望ましい結果をもたらすのに十分な、薬剤の量を指す。治療有効量は、治療される対象及び疾患状態、対象の体重及び年齢、疾患状態の重症度、投与の様式などのうちの１つ以上に応じて変動し得る。治療有効量は、結節性硬化症を治療する、及び／または結節性硬化症の１つ以上の症状を緩和する、それらの重症度を軽減する、排除する、及び／またはそれらの発症を遅延させるのに十分な量であり得る。いくつかの実施形態では、治療有効量は、対象において、チュベリン（例えば、本明細書に提供される短縮されたチュベリンなどの、１つ以上の変異を欠くチュベリン）を発現するのに十分な量であり得る。

【0021】

「対象」、「個体」、及び「患者」という用語は、哺乳類などの脊椎動物を指すために本明細書では互換的に使用される。哺乳類は、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ネコ、イヌ、ブタ、ヒツジ、ウマ、非ヒト霊長類（例えば、カニクイザル、チンパンジー）、またはヒトであり得る。インビボで得られる、またはインビトロで培養される、対象の組織、細胞、またはその誘導体も包含される。いくつかの実施形態では、対象は、ヒトである。ヒト対象は、成人、ティーンエイジャー（例えば、１２歳～１８歳）、子供（例えば、２歳～１４歳）、乳児（例えば、月齢１ヶ月～２４ヶ月）、または新生児（月齢最大１ヶ月）であり得る。いくつかの実施形態では、成人は、約６５歳以上などの、約６０歳以上の高齢者である。いくつかの実施形態では、対象は、妊娠中の女性、または妊娠する意思がある女性である。いくつかの実施形態では、対象は、１８歳未満である。

【0022】

「アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）発現カセット」は、組換えＡＡＶベクター内にパッケージングされる核酸であり、５’逆位末端反復（ＩＴＲ）及び３’ＩＴＲに隣接する１つ以上の導入遺伝子をコードする配列を含む。

【0023】

本明細書で使用される場合、「ウイルスベクター」、「ウイルス性ベクター」及び「遺伝子送達ベクター」という用語は、核酸送達ビヒクルとして機能し、ビリオン内にパッケージングされた核酸分子（例えば、ＡＡＶ発現カセット）を含む、ウイルス粒子を指す。例示的なウイルスベクターとしては、アデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）が挙げられる。

【0024】

本明細書で使用される場合、「アデノ随伴ウイルス」（ＡＡＶ）という用語は、限定されないが、（例えば、血清型１のＡＡＶ、ＡＡＶ１とも称される）、ＡＡＶ２型（例えば、ＡＡＶ２）、ＡＡＶ３型（例えば、３Ａ及び３Ｂ、ＡＡＶ３Ａ及びＡＡＶ３Ｂ型を含むＡＡＶ３）、ＡＡＶ４型（例えば、ＡＡＶ４）、ＡＡＶ５型（例えば、ＡＡＶ５）、ＡＡＶ６型（例えば、ＡＡＶ６）、ＡＡＶ７型（例えば、ＡＡＶ７）、ＡＡＶ８型（例えば、ＡＡＶ８）、ＡＡＶ９型（例えば、ＡＡＶ９）、ＡＡＶ１０型（例えば、ＡＡＶ１０）、ＡＡＶ１１型（例えば、ＡＡＶ１１）、ＡＡＶ１２型（例えば、ＡＡＶ１２）、ＡＡＶ１３型（例えば、ＡＡＶ１３）、ＡＡＶ ｒｈ３２．３３型（例えば、ＡＡＶｒｈ３２．３３）、ＡＡＶ ｒｈ８型（例えば、ＡＡＶｒｈ８）、ＡＡＶ ｒｈ１０型（例えば、ＡＡＶｒｈ１０）、ＡＡＶ ｒｈ７４型（例えば、ＡＡＶｒｈ７４）、ＡＡＶ ｈｕ．６８型（例えば、ＡＡＶｈｕ．６８）、トリＡＡＶ（例えば、ＡＡＡＶ）、ウシＡＡＶ（例えば、ＢＡＡＶ）、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、ヒツジＡＡＶ、ヘビＡＡＶ、フトアゴヒゲトカゲＡＡＶ、ＡＡＶ２ｉ８、ＡＡＶ２ｇ９、ＡＡＶ－ＬＫ０３、ＡＡＶ７ｍ８、ＡＡＶ Ａｎｃ８０、ＡＡＶ ＰＨＰ．Ｂ、及び現在既知のまたは後日発見された任意の他のＡＡＶが挙げられる。

【0025】

本明細書で使用される場合、「配列同一性」は、２つの最適に整列させたポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列が、構成要素、例えば、ヌクレオチドまたはアミノ酸の整列枠全体にわたり、変動していない程度を指す。試験配列及び参照配列の整列させたセグメントの「小数での同一性」は、２つの整列させた配列によって共有される同一の構成要素の数を、参照配列セグメントの構成要素、すなわち、参照配列全体または参照配列のうちのより小さな定義された部分の総数によって除算したものである。「同一性パーセント」は、小数での同一性の１００倍である。２つの配列間の同一性（相同性）の程度は、コンピュータプログラムと数学的アルゴリズムを使用して確認することができる。同一性割合は、初期設定のパラメーターを使用するｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｍｓａ／ｃｌｕｓｔａｌｏで入手可能なアラインメントプログラムＣｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａを使用して算出することができる。Ｓｉｅｖｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，“Ｆａｓｔ，ｓｃａｌａｂｌｅ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｉｇｈ－ｑｕａｌｉｔｙ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ ｕｓｉｎｇ Ｃｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａ．”（２０１１ Ｏｃｔｏｂｅｒ １１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｙｓｔｅｍｓ ｂｉｏｌｏｇｙ ７：５３９を参照されたい。配列に対する同一性を計算する目的については、タグのような拡張は含まれない。

【0026】

本明細書で使用される場合、核酸配列（例えば、コード配列）及び調節配列は、核酸配列の発現または転写を、調節配列の影響または制御下に置くような方式で共有結合的に連結されている場合、「操作可能に連結されている」と言われる。核酸配列が、機能性タンパク質へと翻訳されることが望ましい場合、５’調節配列におけるプロモータの誘導が、コード配列の転写を生じる場合、及び２つのＤＮＡ配列間の連結の性質が、（１）フレームシフト変異の導入を生じないか、（２）コード配列の転写を指示するプロモータ領域の能力を妨げないか、または（３）タンパク質へと翻訳される対応するＲＮＡ転写物の能力を妨げない場合、２つのＤＮＡ配列は、操作可能に連結されていると言われる。

【0027】

本明細書で使用される場合、「コドン最適化」は、対応するコードされたアミノ酸に変化を生じることなく、個々の核酸を変化させるように核酸配列を修飾することを指す。この方式で修飾された配列は、本明細書では「コドン最適化された」と称される。コドン最適化を実施する方法は、それらの各々の全体が、すべての目的のために参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第７，５６１，９７２号、同第７，５６１，９７３号、及び同第７，８８８，１１２号に記載されている。いくつかの実施形態では、翻訳開始部位を取り囲む配列は、その全体がすべての目的のために参照により本明細書に組み込まれる、Ｋｏｚａｋ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５（２０）：８１２５－８１ ４８（１９８７）に記載のように、コンセンサスコザック配列へと変換され得る。

【0028】

短縮されたチュベリン（ｃチュベリン）
本明細書で使用される場合、短縮されたチュベリンまたはｃチュベリンは、天然のチュベリンタンパク質配列と比較して、１つ以上のアミノ酸残基の欠失を有する、組換えチュベリンタンパク質を指す。いくつかの実施形態では、天然のチュベリンは、ヒトチュベリンである。いくつかの実施形態では、天然のチュベリンタンパク質配列は、配列番号１のアミノ酸配列を有し、この配列は、１８０７個のアミノ酸残基を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるｃチュベリンは、配列番号１の少なくとも１つのアミノ酸残基を欠く。いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるｃチュベリンは、Ｎ末端領域とＣ末端領域との間の領域から、配列番号１の少なくとも１つのアミノ酸残基を欠く。

【0029】

いくつかの実施形態では、ヒトチュベリンのアミノ酸配列及び核酸配列は、それぞれ、ＮＣＢＩ受託番号ＮＰ＿０００５３９．２及びＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｘ７５６２１．１に見出される。いくつかの実施形態では、ヒトチュベリンのアミノ酸配列としては、限定されないが、チュベリンアイソフォーム４（ＮＣＢＩ受託番号ＮＰ＿００１０７０６５１．１）、チュベリンアイソフォーム５（ＮＣＢＩ受託番号ＮＰ＿００１１０７８５４．１）、チュベリンアイソフォーム６（ＮＣＢＩ受託番号ＮＰ＿００１３０５７５６．１）、チュベリンアイソフォーム７（ＮＣＢＩ受託番号ＮＰ＿００１３０５７５８．１）、チュベリンアイソフォーム８（ＮＣＢＩ受託番号ＮＰ＿００１３０５７６０．１）、チュベリンアイソフォーム９（ＮＣＢＩ受託番号ＮＰ＿００１３０５７６１．１）、チュベリンアイソフォームＸ７（ＮＣＢＩ受託番号ＸＰ＿０２４３０６１８１．１）、チュベリンアイソフォームＸ８（ＮＣＢＩ受託番号ＸＰ＿００５２５５５８６．２）、チュベリンアイソフォームＸ９（ＮＣＢＩ受託番号ＸＰ＿０１６８７９１０５．１）、チュベリンアイソフォームＸ１０（ＮＣＢＩ受託番号ＸＰ＿００５２５５５８８．２）、チュベリンアイソフォームＸ１１（ＮＣＢＩ受託番号ＸＰ＿０１６８７９１０６．１）、チュベリンアイソフォームＸ１２（ＮＣＢＩ受託番号ＸＰ＿０１６８７９１０７．１）、及び他が挙げられる。

【0030】

いくつかの実施形態では、ｃチュベリンは、ハマルチンに結合することが可能なＮ末端領域を含む。いくつかの実施形態では、ｃチュベリンは、Ｃ末端ＧＴＰａｓｅ活性化タンパク質（ＧＡＰ）領域を含む。いくつかの実施形態では、ｃチュベリンにおいて欠失している１つ以上のアミノ酸残基は、ハマルチンに結合することが可能なＮ末端領域と、Ｃ末端ＧＴＰａｓｅ活性化タンパク質（ＧＡＰ）領域との間にある。

【0031】

いくつかの実施形態では、ｃチュベリンは、ハマルチンに結合することが可能なＮ末端領域と、Ｃ末端ＧＴＰａｓｅ活性化タンパク質（ＧＡＰ）領域と、を含むか、またはそれらからなる。いくつかの実施形態では、Ｎ末端領域は、配列番号４または５に対して少なくとも約７５％（例えば、少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約１００％などの約９９％以上）の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、Ｎ末端領域は、配列番号４または５に対して少なくとも約９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、Ｎ末端領域は、配列番号４または５のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。

【0032】

いくつかの実施形態では、Ｃ末端領域は、配列番号７～１２のうちのいずれか１つに対して少なくとも約７５％（例えば、少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または１００％などの約９９％以上）の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、Ｃ末端領域は、配列番号７～１２のうちのいずれか１つに対して少なくとも約９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、Ｃ末端領域は、配列番号７～１２のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。

【0033】

いくつかの実施形態では、Ｎ末端領域は、配列番号４に対して少なくとも約７５％（例えば、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または１００％）の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、Ｃ末端領域は、配列番号７に対して少なくとも約７５％（例えば、少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または１００％などの約９９％以上）の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、Ｎ末端領域は、配列番号４に対して少なくとも約９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、Ｃ末端領域は、配列番号７に対して少なくとも約９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、Ｎ末端領域は、配列番号４のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、Ｃ末端領域は、配列番号７のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。

【0034】

いくつかの実施形態では、Ｎ末端領域は、配列番号５に対して少なくとも約７５％（例えば、少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または１００％などの約９９％以上）の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、Ｃ末端領域は、配列番号７に対して少なくとも約７５％（例えば、少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または１００％などの約９９％以上）の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、Ｎ末端領域は、配列番号５に対して少なくとも約９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、Ｃ末端領域は、配列番号７に対して少なくとも約９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、Ｎ末端領域は、配列番号５のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、Ｃ末端領域は、配列番号７のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。

【0035】

いくつかの実施形態では、Ｎ末端領域は、配列番号４に対して少なくとも約７５％（例えば、少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または１００％などの約９９％以上）の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、Ｃ末端領域は、配列番号８に対して少なくとも約７５％（例えば、少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または１００％などの約９９％以上）の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、Ｎ末端領域は、配列番号４に対して少なくとも約９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、Ｃ末端領域は、配列番号８に対して少なくとも約９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、Ｎ末端領域は、配列番号４のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、Ｃ末端領域は、配列番号８のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。

【0036】

いくつかの実施形態では、Ｎ末端領域は、配列番号５に対して少なくとも約７５％（例えば、少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または１００％などの約９９％以上）の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、Ｃ末端領域は、配列番号８に対して少なくとも約７５％（例えば、少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または１００％などの約９９％以上）の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、Ｎ末端領域は、配列番号５に対して少なくとも約９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、Ｃ末端領域は、配列番号８に対して少なくとも約９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、Ｎ末端領域は、配列番号５のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、Ｃ末端領域は、配列番号８のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。

【0037】

いくつかの実施形態では、Ｎ末端領域は、配列番号４に対して少なくとも約７５％（例えば、少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または１００％などの約９９％以上）の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、Ｃ末端領域は、配列番号９に対して少なくとも約７５％（例えば、少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または１００％などの約９９％以上）の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、Ｎ末端領域は、配列番号４に対して少なくとも約９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、Ｃ末端領域は、配列番号９に対して少なくとも約９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、Ｎ末端領域は、配列番号４のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、Ｃ末端領域は、配列番号９のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。

【0038】

いくつかの実施形態では、Ｎ末端領域は、配列番号５に対して少なくとも約７５％（例えば、少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または１００％などの約９９％以上）の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、Ｃ末端領域は、配列番号９に対して少なくとも約７５％（例えば、少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または１００％などの約９９％以上）の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、Ｎ末端領域は、配列番号５に対して少なくとも約９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、Ｃ末端領域は、配列番号９に対して少なくとも約９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、Ｎ末端領域は、配列番号５のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、Ｃ末端領域は、配列番号９のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。

【0039】

いくつかの実施形態では、Ｎ末端領域は、配列番号４に対して少なくとも約７５％（例えば、少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または１００％などの約９９％以上）の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、Ｃ末端領域は、配列番号１０に対して少なくとも約７５％（例えば、少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または１００％などの約９９％以上）の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、Ｎ末端領域は、配列番号４に対して少なくとも約９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、Ｃ末端領域は、配列番号１０に対して少なくとも約９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、Ｎ末端領域は、配列番号４のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、Ｃ末端領域は、配列番号１０のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。

【0040】

いくつかの実施形態では、Ｎ末端領域は、配列番号５に対して少なくとも約７５％（例えば、少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または１００％などの約９９％以上）の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、Ｃ末端領域は、配列番号１０に対して少なくとも約７５％（例えば、少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または１００％などの約９９％以上）の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、Ｎ末端領域は、配列番号５に対して少なくとも約９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、Ｃ末端領域は、配列番号１０に対して少なくとも約９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、Ｎ末端領域は、配列番号５のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、Ｃ末端領域は、配列番号１０のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。

【0041】

いくつかの実施形態では、Ｎ末端領域は、配列番号４に対して少なくとも約７５％（例えば、少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または１００％などの約９９％以上）の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、Ｃ末端領域は、配列番号１１に対して少なくとも約７５％（例えば、少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または１００％などの約９９％以上）の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、Ｎ末端領域は、配列番号４に対して少なくとも約９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、Ｃ末端領域は、配列番号１１に対して少なくとも約９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、Ｎ末端領域は、配列番号４のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、Ｃ末端領域は、配列番号１１のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。

【0042】

いくつかの実施形態では、Ｎ末端領域は、配列番号５に対して少なくとも約７５％（例えば、少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または１００％などの約９９％以上）の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、Ｃ末端領域は、配列番号１１に対して少なくとも約７５％（例えば、少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または１００％などの約９９％以上）の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、Ｎ末端領域は、配列番号５に対して少なくとも約９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、Ｃ末端領域は、配列番号１１に対して少なくとも約９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、Ｎ末端領域は、配列番号５のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、Ｃ末端領域は、配列番号１１のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。

【0043】

いくつかの実施形態では、Ｎ末端領域は、配列番号４に対して少なくとも約７５％（例えば、少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または１００％などの約９９％以上）の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、Ｃ末端領域は、配列番号１２に対して少なくとも約７５％（例えば、少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または１００％などの約９９％以上）の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、Ｎ末端領域は、配列番号４に対して少なくとも約９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、Ｃ末端領域は、配列番号１２に対して少なくとも約９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、Ｎ末端領域は、配列番号４のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、Ｃ末端領域は、配列番号１２のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。

【0044】

いくつかの実施形態では、Ｎ末端領域は、配列番号５に対して少なくとも約７５％（例えば、少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または１００％などの約９９％以上）の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、Ｃ末端領域は、配列番号１２に対して少なくとも約７５％（例えば、少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または１００％などの約９９％以上）の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、Ｎ末端領域は、配列番号５に対して少なくとも約９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、Ｃ末端領域は、配列番号１２に対して少なくとも約９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、Ｎ末端領域は、配列番号５のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、Ｃ末端領域は、配列番号１２のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。

【0045】

本開示は、（ｉ）ハマルチンに結合することが可能なＮ末端領域と、（ｉｉ）Ｃ末端ＧＴＰａｓｅ活性化タンパク質（ＧＡＰ）領域と、を含むか、またはそれらからなるｃチュベリンであって、ｃチュベリンが、配列番号１のアミノ酸残基４５１～９３２を欠く、ｃチュベリンを提供する。本開示はまた、（ｉ）ハマルチンに結合することが可能なＮ末端領域と、（ｉｉ）Ｃ末端ＧＴＰａｓｅ活性化タンパク質（ＧＡＰ）領域と、を含むか、またはそれらからなる、ｃチュベリンであって、ｃチュベリンが、配列番号１のアミノ酸残基４１９～９３２を欠く、ｃチュベリンを提供する。アミノ酸範囲が示される場合、範囲は、包括的である（例えば、アミノ酸残基「４１９～９３２（４１９－９３２）」または「４１９～９３２（４１９ ｔｏ ９３２）」を欠くｃチュベリンは、ｃチュベリンが、配列番号１のアミノ酸４１９及び９３２、ならびにそれらの間に位置するすべてのアミノ酸残基を欠くことを意味する）。

【0046】

いくつかの実施形態では、ｃチュベリンは、配列番号１のアミノ酸残基９４７～９８８をさらに欠く。いくつかの実施形態では、ｃチュベリンは、配列番号１のアミノ酸残基４５１～９３２及び９４７～９８８を欠く。いくつかの実施形態では、ｃチュベリンは、配列番号１のアミノ酸残基４１９～９３２及びアミノ酸残基９４７～９８８を欠く。

【0047】

いくつかの実施形態では、ｃチュベリンは、配列番号１のアミノ酸残基１２０５～１２７１をさらに欠く。いくつかの実施形態では、ｃチュベリンは、配列番号１のアミノ酸残基４５１～９３２及び１２０５～１２７１を欠く。いくつかの実施形態では、ｃチュベリンは、配列番号１のアミノ酸残基４１９～９３２及び１２０５～１２７１を欠く。

【0048】

いくつかの実施形態では、ｃチュベリンは、配列番号１のアミノ酸残基４５１～９３２、９４７～９８８、及び１２０５～１２７１を欠く。いくつかの実施形態では、ｃチュベリンは、配列番号１のアミノ酸残基４１９～９３２、９４７～９８８、及び１２０５～１２７１を欠く。

【0049】

いくつかの実施形態では、ｃチュベリンは、配列番号１のアミノ酸残基１３３６～１４９７をさらに欠く。いくつかの実施形態では、ｃチュベリンは、配列番号１のアミノ酸残基４１９～９３２及び１３３６～１４９７を欠く。いくつかの実施形態では、ｃチュベリンは、配列番号１のアミノ酸残基４５１～９３２及び１３３６～１４９７を欠く。いくつかの実施形態では、ｃチュベリンは、配列番号１のアミノ酸残基４１９～９３２、９４７～９８８、１２０５～１２７１、及び１３３６～１４９７を欠く。いくつかの実施形態では、ｃチュベリンは、配列番号１のアミノ酸残基４５１～９３２、９４７～９８８、１２０５～１２７１、及び１３３６～１４９７を欠く。

【0050】

いくつかの実施形態では、ｃチュベリンは、配列番号１のアミノ酸残基４１９～９３２、１２０５～１２７１、及び１３３６～１４９７を欠く。いくつかの実施形態では、ｃチュベリンは、配列番号１のアミノ酸残基４５１～９３２、１２０５～１２７１、及び１３３６～１４９７を欠く。いくつかの実施形態では、ｃチュベリンは、配列番号１のアミノ酸残基４１９～９３２、９４７～９８８、及び１３３６～１４９７を欠く。いくつかの実施形態では、ｃチュベリンは、配列番号１のアミノ酸残基４５１～９３２、９４７～９８８、及び１３３６～１４９７を欠く。

【0051】

いくつかの実施形態では、ｃチュベリンは、ヒトチュベリン（配列番号１）のアミノ酸残基９３３～１１０９をさらに欠く。いくつかの実施形態では、ｃチュベリンは、ヒトチュベリン（配列番号１）のアミノ酸残基４５１～９３２及び９３３～１１０９を欠く。いくつかの実施形態では、ｃチュベリンは、ヒトチュベリン（配列番号１）のアミノ酸残基４１９～９３２及び９３３～１１０９を欠く。いくつかの実施形態では、ｃチュベリンは、配列番号１のアミノ酸残基４１９～１１０９を欠く。

【0052】

いくつかの実施形態では、ｃチュベリンは、ヒトチュベリン（配列番号１）のアミノ酸残基４５１～９３２を欠く。いくつかの実施形態では、ｃチュベリンは、ヒトチュベリン（配列番号１）のアミノ酸残基４５１～１１０９を欠く。いくつかの実施形態では、ｃチュベリンは、ヒトチュベリン（配列番号１）のアミノ酸残基４５１～１１３９を欠く。いくつかの実施形態では、ｃチュベリンは、ヒトチュベリン（配列番号１）のアミノ酸残基４５１～１５１４を欠く。いくつかの実施形態では、ｃチュベリンは、ヒトチュベリンのアミノ酸残基４１９～９３２を欠く。いくつかの実施形態では、ｃチュベリンは、ヒトチュベリン（配列番号１）のアミノ酸残基４１９～１１０９を欠く。いくつかの実施形態では、ｃチュベリンは、ヒトチュベリン（配列番号１）のアミノ酸残基４１９～１１３９を欠く。いくつかの実施形態では、ｃチュベリンは、ヒトチュベリン（配列番号１）のアミノ酸残基４１９～１５１４を欠く。

【0053】

いくつかの実施形態では、ｃチュベリンは、エクソン２５、３０、及び／または３３などの、ヒトチュベリン（配列番号１）の１つ以上のエクソンのアミノ酸残基を欠く。いくつかの実施形態では、ｃチュベリンは、ヒトチュベリンのエクソン２５のアミノ酸残基（配列番号１）を欠く。いくつかの実施形態では、ｃチュベリンは、ヒトチュベリンのエクソン３０のアミノ酸残基（配列番号１）を欠く。いくつかの実施形態では、ｃチュベリンは、ヒトチュベリンのエクソン３３のアミノ酸残基（配列番号１）を欠く。いくつかの実施形態では、ｃチュベリンは、ヒトチュベリン（配列番号１）のエクソン２５及び３０のアミノ酸残基を欠く。いくつかの実施形態では、ｃチュベリンは、ヒトチュベリン（配列番号１）のエクソン２５、３０、及び３３のアミノ酸残基を欠く。いくつかの実施形態では、ｃチュベリンは、ヒトチュベリン（配列番号１）のアミノ酸残基４５１～９３２、及びエクソン２５のアミノ酸残基を欠く。いくつかの実施形態では、ｃチュベリンは、ヒトチュベリン（配列番号１）のアミノ酸残基４５１～９３２、ならびにエクソン２５及び３０のアミノ酸残基を欠く。いくつかの実施形態では、ｃチュベリンは、ヒトチュベリン（配列番号１）のアミノ酸残基４５１～９３２、ならびにエクソン２５、３０、及び３３のアミノ酸残基を欠く。いくつかの実施形態では、ｃチュベリンは、ヒトチュベリン（配列番号１）のアミノ酸残基４１９～９３２、及びエクソン２５のアミノ酸残基を欠く。いくつかの実施形態では、ｃチュベリンは、ヒトチュベリン（配列番号１）のアミノ酸残基４１９～９３２、ならびにエクソン２５及び３０のアミノ酸残基を欠く。いくつかの実施形態では、ｃチュベリンは、ヒトチュベリン（配列番号１）のアミノ酸残基４１９～９３２、ならびにエクソン２５、３０、及び３３のアミノ酸残基を欠く。

【0054】

本開示は、（ｉ）ハマルチンに結合することが可能なＮ末端領域と、（ｉｉ）Ｃ末端ＧＴＰａｓｅ活性化タンパク質（ＧＡＰ）領域と、を含むか、またはそれらからなる、短縮されたチュベリン（ｃチュベリン）であって、Ｃ末端領域が、配列番号７に対して少なくとも約７５％（例えば、少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または１００％などの約９９％以上）の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、ｃチュベリンが、ヒトチュベリン（配列番号１）のアミノ酸残基４１９～９３２または４５１～９３２を欠く、ｃチュベリンを提供する。本開示はまた、（ｉ）ハマルチンに結合することが可能なＮ末端領域と、（ｉｉ）Ｃ末端ＧＴＰａｓｅ活性化タンパク質（ＧＡＰ）領域と、を含むか、またはそれらからなる、短縮されたチュベリン（ｃチュベリン）であって、Ｃ末端領域が、配列番号７に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、ｃチュベリンが、ヒトチュベリン（配列番号１）のアミノ酸残基４１９～９３２または４５１～９３２を欠く、ｃチュベリンを提供する。本開示は、（ｉ）ハマルチンに結合することが可能なＮ末端領域と、（ｉｉ）Ｃ末端ＧＴＰａｓｅ活性化タンパク質（ＧＡＰ）領域と、を含むか、またはそられからなる、短縮されたチュベリン（ｃチュベリン）であって、Ｃ末端領域が、配列番号７のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、ｃチュベリンが、ヒトチュベリン（配列番号１）のアミノ酸残基４１９～９３２または４５１～９３２を欠く、ｃチュベリンをさらに提供する。

【0055】

いくつかの実施形態では、Ｃ末端領域は、配列番号８に対して少なくとも約７５％（例えば、少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または１００％などの約９９％以上）の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、ｃチュベリンは、ヒトチュベリン（配列番号１）のアミノ酸残基４１９～９３２または４５１～９３２を欠く。いくつかの実施形態では、Ｃ末端領域は、配列番号８に対して少なくとも約９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、ｃチュベリンは、ヒトチュベリン（配列番号１）のアミノ酸残基４１９～９３２または４５１～９３２を欠く。いくつかの実施形態では、Ｃ末端領域は、配列番号８のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、ｃチュベリンは、ヒトチュベリン（配列番号１）のアミノ酸残基４１９～９３２または４５１～９３２を欠く。

【0056】

いくつかの実施形態では、Ｃ末端領域は、配列番号９に対して少なくとも約７５％（例えば、少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または１００％などの約９９％以上）の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、ｃチュベリンは、ヒトチュベリン（配列番号１）のアミノ酸残基４１９～９３２または４５１～９３２を欠く。いくつかの実施形態では、Ｃ末端領域は、配列番号９に対して少なくとも約９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、ｃチュベリンは、ヒトチュベリン（配列番号１）のアミノ酸残基４１９～９３２または４５１～９３２を欠く。いくつかの実施形態では、Ｃ末端領域は、配列番号９のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、ｃチュベリンは、ヒトチュベリン（配列番号１）のアミノ酸残基４１９～９３２または４５１～９３２を欠く。

【0057】

いくつかの実施形態では、Ｃ末端領域は、配列番号７に対して少なくとも約７５％（例えば、少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または１００％などの約９９％以上）の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、ｃチュベリンは、ヒトチュベリン（配列番号１）のアミノ酸残基４５１～９３２を欠き、Ｎ末端領域は、配列番号４に対して少なくとも約７５％（例えば、少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または１００％などの約９９％以上）の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、Ｃ末端領域は、配列番号７に対して少なくとも約９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、ｃチュベリンは、ヒトチュベリン（配列番号１）のアミノ酸残基４５１～９３２を欠き、Ｎ末端領域は、配列番号４に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、Ｃ末端領域は、配列番号７のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、ｃチュベリンは、ヒトチュベリン（配列番号１）のアミノ酸残基４５１～９３２を欠き、Ｎ末端領域は、配列番号４のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。

【0058】

いくつかの実施形態では、Ｃ末端領域は、配列番号７に対して少なくとも約７５％（例えば、少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または１００％などの約９９％以上）の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、ｃチュベリンは、ヒトチュベリン（配列番号１）のアミノ酸残基４１９～９３２または４５１～９３２を欠き、Ｎ末端領域は、配列番号５に対して少なくとも約７５％（例えば、少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または１００％などの約９９％以上）の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、Ｃ末端領域は、配列番号７に対して少なくとも約９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、ｃチュベリンは、ヒトチュベリン（配列番号１）のアミノ酸残基４１９～９３２または４５１～９３２を欠き、Ｎ末端領域は、配列番号５に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、Ｃ末端領域は、配列番号７のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、ｃチュベリンは、ヒトチュベリン（配列番号１）のアミノ酸残基４１９～９３２または４５１～９３２を欠き、Ｎ末端領域は、配列番号５のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。

【0059】

別の態様では、本開示は、（ｉ）ハマルチンに結合することが可能なＮ末端領域と、（ｉｉ）Ｃ末端ＧＴＰａｓｅ活性化タンパク質（ＧＡＰ）領域と、を含むか、またはそれらからなる、短縮されたチュベリン（ｃチュベリン）であって、Ｃ末端領域が、配列番号１０～１２のうちの１つに対して少なくとも約７５％（例えば、少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または１００％などの約９９％以上）の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる、ｃチュベリンを提供する。本開示は、（ｉ）ハマルチンに結合することが可能なＮ末端領域と、（ｉｉ）Ｃ末端ＧＴＰａｓｅ活性化タンパク質（ＧＡＰ）領域と、を含むか、またはそれらからなる、短縮されたチュベリン（ｃチュベリン）であって、Ｃ末端領域が、配列番号１０～１２のうちの１つに対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる、ｃチュベリンを提供する。本開示はまた、（ｉ）ハマルチンに結合することが可能なＮ末端領域と、（ｉｉ）Ｃ末端ＧＴＰａｓｅ活性化タンパク質（ＧＡＰ）領域と、を含むか、またはそれらからなる、短縮されたチュベリン（ｃチュベリン）であって、Ｃ末端領域が、配列番号１０～１２のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる、ｃチュベリンを提供する。

【0060】

いくつかの実施形態では、Ｃ末端領域は、配列番号１０～１２のうちの１つに対して少なくとも約７５％（例えば、少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または１００％などの約９９％以上）の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、ｃチュベリンは、ヒトチュベリン（配列番号１）のアミノ酸残基４１９～９３２または４５１～９３２を欠く。いくつかの実施形態では、Ｃ末端領域は、配列番号１０～１２のうちの１つに対して少なくとも約９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、ｃチュベリンは、ヒトチュベリン（配列番号１）のアミノ酸残基４１９～９３２または４５１～９３２を欠く。いくつかの実施形態では、Ｃ末端領域は、配列番号１０～１２のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、ｃチュベリンは、ヒトチュベリン（配列番号１）のアミノ酸残基４１９～９３２または４５１～９３２を欠く。

【0061】

いくつかの実施形態では、Ｃ末端領域は、配列番号１０に対して少なくとも約７５％（例えば、少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または１００％などの約９９％以上）の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、ｃチュベリンは、ヒトチュベリン（配列番号１）のアミノ酸残基４１９～９３２または４５１～９３２を欠く。いくつかの実施形態では、Ｃ末端領域は、配列番号１０に対して少なくとも約９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、ｃチュベリンは、ヒトチュベリン（配列番号１）のアミノ酸残基４１９～９３２または４５１～９３２を欠く。いくつかの実施形態では、Ｃ末端領域は、配列番号１０のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、ｃチュベリンは、ヒトチュベリン（配列番号１）のアミノ酸残基４１９～９３２または４５１～９３２を欠く。

【0062】

いくつかの実施形態では、Ｃ末端領域は、配列番号１１に対して少なくとも約７５％（例えば、少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または１００％などの約９９％以上）の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、ｃチュベリンは、ヒトチュベリン（配列番号１）のアミノ酸残基４１９～９３２または４５１～９３２を欠く。いくつかの実施形態では、Ｃ末端領域は、配列番号１１に対して少なくとも約９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、ｃチュベリンは、ヒトチュベリン（配列番号１）のアミノ酸残基４１９～９３２または４５１～９３２を欠く。いくつかの実施形態では、Ｃ末端領域は、配列番号１１のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、ｃチュベリンは、ヒトチュベリン（配列番号１）のアミノ酸残基４１９～９３２または４５１～９３２を欠く。

【0063】

いくつかの実施形態では、Ｃ末端領域は、配列番号１２に対して少なくとも約７５％（例えば、少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または１００％などの約９９％以上）の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、ｃチュベリンは、ヒトチュベリン（配列番号１）のアミノ酸残基４１９～９３２または４５１～９３２を欠く。いくつかの実施形態では、Ｃ末端領域は、配列番号１２に対して少なくとも約９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、ｃチュベリンは、ヒトチュベリン（配列番号１）のアミノ酸残基４１９～９３２または４５１～９３２を欠く。いくつかの実施形態では、Ｃ末端領域は、配列番号１２のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、ｃチュベリンは、ヒトチュベリン（配列番号１）のアミノ酸残基４１９～９３２または４５１～９３２を欠く。

【0064】

いくつかの実施形態では、Ｃ末端領域は、配列番号１０～１２のうちの１つに対して少なくとも約７５％（例えば、少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または１００％などの約９９％以上）の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、ｃチュベリンは、ヒトチュベリン（配列番号１）のアミノ酸残基４１９～９３２または４５１～９３２を欠き、Ｎ末端領域は、配列番号５に対して少なくとも約７５％（例えば、少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または１００％などの約９９％以上）の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、Ｃ末端領域は、配列番号１０～１２のうちの１つに対して少なくとも約９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、ｃチュベリンは、ヒトチュベリン（配列番号１）のアミノ酸残基４１９～９３２または４５１～９３２を欠き、Ｎ末端領域は、配列番号５に対して少なくとも約９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、Ｃ末端領域は、配列番号１０～１２のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、ｃチュベリンは、ヒトチュベリン（配列番号１）のアミノ酸残基４１９～９３２または４５１～９３２を欠き、Ｎ末端領域は、配列番号５のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。

【0065】

いくつかの実施形態では、Ｃ末端領域は、配列番号１０～１２のうちの１つに対して少なくとも約７５％（例えば、少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または１００％などの約９９％以上）の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、ｃチュベリンは、ヒトチュベリン（配列番号１）のアミノ酸残基４５１～９３２を欠き、Ｎ末端領域は、配列番号４に対して少なくとも約７５％（例えば、少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または１００％などの約９９％以上）の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、Ｃ末端領域は、配列番号１０～１２のうちの１つに対して少なくとも約９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、ｃチュベリンは、ヒトチュベリン（配列番号１）のアミノ酸残基または４５１～９３２を欠き、Ｎ末端領域は、配列番号４に対して少なくとも約９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、Ｃ末端領域は、配列番号１０～１２のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、ｃチュベリンは、ヒトチュベリン（配列番号１）のアミノ酸残基または４５１～９３２を欠き、Ｎ末端領域は、配列番号４のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。

【0066】

いくつかの実施形態では、ｃチュベリンは、Ｎ末端領域とＣ末端領域との間にポリペプチドスペーサを含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドスペーサは、配列番号２（ＳＧＧＧ）の配列を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドスペーサは、配列番号３（ＳＧＧＧＳＧＧＧ ＳＧＧＧＳＧＧＧ）の配列を含むか、またはそれからなる。

【0067】

いくつかの実施形態では、ｃチュベリンは、配列番号１４～１９のうちのいずれか１つに対して少なくとも約７５％（例えば、少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または１００％などの約９９％以上）の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、ｃチュベリンは、配列番号１４～１９のうちのいずれか１つに対して少なくとも約９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、ｃチュベリンは、配列番号１４～１９のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。

【0068】

ｃチュベリンをコードするＡＡＶ発現カセット
本明細書に記載のアミノ酸配列及び対応するｃチュベリンに加えて、本開示は、本明細書に開示のｃチュベリンタンパク質のうちのいずれか１つをコードする核酸分子をさらに提供する。いくつかの実施形態では、核酸分子は、ヒト標的細胞における発現のためにコドン最適化されている。いくつかの実施形態では、ヒト標的細胞は、脳細胞、心臓細胞、腎臓細胞、皮膚細胞、または肺細胞である。

【0069】

いくつかの実施形態では、核酸分子は、調節制御配列に操作可能に連結されている。いくつかの実施形態では、調節制御配列は、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモータ、ニワトリβ－アクチン（ＣＢＡ）プロモータ、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモータ／エンハンサ、ＳＶ４０プロモータ、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモータ、ホスホグリセロールキナーゼプロモータ、ＣＭＶ即時／初期遺伝子エンハンサ／ＣＢＡプロモータ、シナプシンプロモータ、ＣＭＶ－ＩＥプロモータ／エンハンサ、グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモータ、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、調節制御配列は、ＣＭＶ即時／初期遺伝子エンハンサ／ＣＢＡプロモータ、及びウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節要素（ＷＰＲＥ）を含む。いくつかの実施形態では、調節制御配列は、ベータ－グルクロニダーゼ（ＧＵＳＢ）プロモータを含む。ＧＵＳＢプロモータに関するさらなる詳細は、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｓｈｉｐｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ５’ Ｆｌａｎｋｉｎｇ Ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｈｕｍａｎ β－Ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ Ｇｅｎｅ，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ １０，１００９－１０１８（１９９１）に提供されている。

【0070】

いくつかの実施形態では、核酸分子は、配列番号２０～２６のうちのいずれか１つに対して少なくとも約７５％（例えば、少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または１００％などの約９９％以上）の配列同一性を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、核酸分子は、配列番号２０～２６のうちのいずれか１つの配列を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、核酸分子は、配列番号２０の配列を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、核酸分子は、配列番号２１の配列を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、核酸分子は、配列番号２２の配列を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、核酸分子は、配列番号２３の配列を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、核酸分子は、配列番号２４の配列を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、核酸分子は、配列番号２５の配列を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、核酸分子は、配列番号２６の配列を含むか、またはそれからなる。

【0071】

本開示は、（ｉ）ハマルチンに結合することが可能なＮ末端領域と、（ｉｉ）Ｃ末端ＧＴＰａｓｅ活性化タンパク質（ＧＡＰ）領域とを含むかまたはそれらからなるｃチュベリンをコードする、核酸分子であって、ｃチュベリンが、ヒトチュベリン（配列番号１）の少なくともアミノ酸残基４５１～９３２を欠き、核酸分子が、ベータ－グルクロニダーゼ（ＧＵＳＢ）プロモータを含むか、またはそれからなる調節制御配列に操作可能に連結されている、核酸分子を提供する。

【0072】

いくつかの実施形態では、核酸分子は、ヒトチュベリン（配列番号１）のアミノ酸残基４５１～１１０９を欠くｃチュベリンをコードし、核酸分子は、ベータ－グルクロニダーゼ（ＧＵＳＢ）プロモータを含むか、またはそれからなる調節制御配列に操作可能に連結されている。いくつかの実施形態では、核酸分子は、ヒトチュベリン（配列番号１）のアミノ酸残基４５１～１１３９を欠くｃチュベリンをコードし、核酸分子は、ベータ－グルクロニダーゼ（ＧＵＳＢ）プロモータを含むか、またはそれからなる調節制御配列に操作可能に連結されている。いくつかの実施形態では、核酸分子は、ヒトチュベリン（配列番号１）のアミノ酸残基４５１～１５１４を欠くｃチュベリンをコードし、核酸分子は、ベータ－グルクロニダーゼ（ＧＵＳＢ）プロモータを含むか、またはそれからなる調節制御配列に操作可能に連結されている。いくつかの実施形態では、核酸分子は、ヒトチュベリン（配列番号１）のアミノ酸残基４１９～９３２を欠くｃチュベリンをコードし、核酸分子は、ベータ－グルクロニダーゼ（ＧＵＳＢ）プロモータを含むか、またはそれからなる調節制御配列に操作可能に連結されている。いくつかの実施形態では、核酸分子は、ヒトチュベリン（配列番号１）のアミノ酸残基４１９～１１０９を欠くｃチュベリンをコードし、核酸分子は、ベータ－グルクロニダーゼ（ＧＵＳＢ）プロモータを含むか、またはそれからなる調節制御配列に操作可能に連結されている。いくつかの実施形態では、核酸分子は、ヒトチュベリン（配列番号１）のアミノ酸残基４１９～１１３９を欠くｃチュベリンをコードし、核酸分子は、ベータ－グルクロニダーゼ（ＧＵＳＢ）プロモータを含むか、またはそれからなる調節制御配列に操作可能に連結されている。いくつかの実施形態では、核酸分子は、ヒトチュベリン（配列番号１）のアミノ酸残基４１９～１５１４を欠くｃチュベリンをコードし、核酸分子は、ベータ－グルクロニダーゼ（ＧＵＳＢ）プロモータを含むか、またはそれからなる調節制御配列に操作可能に連結されている。いくつかの実施形態では、核酸分子は、ヒトチュベリン（配列番号１）のエクソン２５のアミノ酸残基を欠くｃチュベリンをコードする。いくつかの実施形態では、核酸分子は、ヒトチュベリン（配列番号１）のエクソン３０のアミノ酸残基を欠くｃチュベリンをコードする。いくつかの実施形態では、核酸分子は、ヒトチュベリン（配列番号１）のエクソン３３のアミノ酸残基を欠くｃチュベリンをコードする。いくつかの実施形態では、核酸分子は、ヒトチュベリン（配列番号１）のエクソン２５及び３０のアミノ酸残基を欠くｃチュベリンをコードする。いくつかの実施形態では、核酸分子は、ヒトチュベリン（配列番号１）のエクソン２５、３０、及び３３のアミノ酸残基を欠くｃチュベリンをコードする。

【0073】

いくつかの実施形態では、ｃチュベリンは、ヒトチュベリン（配列番号１）のアミノ酸残基４１９～９３２、４５１～９３２、４１９～１１０９、４１９～１１３９、４５１～１１０９、４５１～１１３９、４１９～１５１４、４５１～１５１４、４１９～１５１５、または４５１～１５１５を欠き、Ｃ末端領域は、配列番号６に対して少なくとも約７５％（例えば、少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または１００％などの約９９％以上）の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、核酸分子は、ベータ－グルクロニダーゼ（ＧＵＳＢ）プロモータを含むか、またはそれからなる調節制御配列に操作可能に連結されている。いくつかの実施形態では、ｃチュベリンは、ヒトチュベリン（配列番号１）のアミノ酸残基４５１～１５１４または４５１～１５１５を欠き、Ｃ末端領域は、配列番号６に対して少なくとも約９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、核酸分子は、ベータ－グルクロニダーゼ（ＧＵＳＢ）プロモータを含むか、またはそれからなる調節制御配列に操作可能に連結されている。いくつかの実施形態では、ｃチュベリンは、ヒトチュベリン（配列番号１）のアミノ酸残基４５１～１５１４または４５１～１５１５を欠き、Ｃ末端領域は、配列番号６のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、核酸分子は、ベータ－グルクロニダーゼ（ＧＵＳＢ）プロモータを含むか、またはそれからなる調節制御配列に操作可能に連結されている。

【0074】

いくつかの実施形態では、ｃチュベリンは、ヒトチュベリン（配列番号１）のアミノ酸残基４１９～９３２、４５１～９３２、４１９～１１０９、４１９～１１３９、４５１～１１０９、または４５１～１１３９を欠き、Ｃ末端領域は、配列番号７に対して少なくとも約７５％（例えば、少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または１００％などの約９９％以上）の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、核酸分子は、ベータ－グルクロニダーゼ（ＧＵＳＢ）プロモータを含むか、またはそれからなる調節制御配列に操作可能に連結されている。いくつかの実施形態では、ｃチュベリンは、ヒトチュベリン（配列番号１）のアミノ酸残基４１９～９３２、４５１～９３２、４１９～１１０９、４１９～１１３９、４５１～１１０９、または４５１～１１３９を欠き、Ｃ末端領域は、配列番号７に対して少なくとも約９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、核酸分子は、ベータ－グルクロニダーゼ（ＧＵＳＢ）プロモータを含むか、またはそれからなる調節制御配列に操作可能に連結されている。いくつかの実施形態では、ｃチュベリンは、ヒトチュベリン（配列番号１）のアミノ酸残基４１９～９３２、４５１～９３２、４１９～１１０９、４１９～１１３９、４５１～１１０９、または４５１～１１３９を欠き、Ｃ末端領域は、配列番号７のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、核酸分子は、ベータ－グルクロニダーゼ（ＧＵＳＢ）プロモータを含むか、またはそれからなる調節制御配列に操作可能に連結されている。

【0075】

いくつかの実施形態では、ｃチュベリンは、ヒトチュベリン（配列番号１）のアミノ酸残基４１９～９３２、４５１～９３２、４１９～１１０９、または４５１～１１０９を欠き、Ｃ末端領域は、配列番号８に対して少なくとも約７５％（例えば、少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または１００％などの約９９％以上）の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、核酸分子は、ベータ－グルクロニダーゼ（ＧＵＳＢ）プロモータを含むか、またはそれからなる調節制御配列に操作可能に連結されている。いくつかの実施形態では、ｃチュベリンは、ヒトチュベリン（配列番号１）のアミノ酸残基４１９～９３２、４５１～９３２、４１９～１１０９、または４５１～１１０９を欠き、Ｃ末端領域は、配列番号８に対して少なくとも約９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、核酸分子は、ベータ－グルクロニダーゼ（ＧＵＳＢ）プロモータを含むか、またはそれからなる調節制御配列に操作可能に連結されている。いくつかの実施形態では、ｃチュベリンは、ヒトチュベリン（配列番号１）のアミノ酸残基４１９～９３２、４５１～９３２、４１９～１１０９、または４５１～１１０９を欠き、Ｃ末端領域は、配列番号８のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、核酸分子は、ベータ－グルクロニダーゼ（ＧＵＳＢ）プロモータを含むか、またはそれからなる調節制御配列に操作可能に連結されている。

【0076】

いくつかの実施形態では、ｃチュベリンは、ヒトチュベリン（配列番号１）のアミノ酸残基４１９～９３２または４５１～９３２を欠き、Ｃ末端領域は、配列番号９に対して少なくとも約７５％（例えば、少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または１００％などの約９９％以上）の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、核酸分子は、ベータ－グルクロニダーゼ（ＧＵＳＢ）プロモータを含むか、またはそれからなる調節制御配列に操作可能に連結されている。いくつかの実施形態では、ｃチュベリンは、ヒトチュベリン（配列番号１）のアミノ酸残基４１９～９３２または４５１～９３２を欠き、Ｃ末端領域は、配列番号９に対して少なくとも約９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、核酸分子は、ベータ－グルクロニダーゼ（ＧＵＳＢ）プロモータを含むか、またはそれからなる調節制御配列に操作可能に連結されている。いくつかの実施形態では、ｃチュベリンは、ヒトチュベリン（配列番号１）のアミノ酸残基４１９～９３２または４５１～９３２を欠き、Ｃ末端領域は、配列番号９のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、核酸分子は、ベータ－グルクロニダーゼ（ＧＵＳＢ）プロモータを含むか、またはそれからなる調節制御配列に操作可能に連結されている。

【0077】

いくつかの実施形態では、ｃチュベリンは、ヒトチュベリン（配列番号１）のアミノ酸残基４１９～９３２または４５１～９３２を欠き、Ｃ末端領域は、配列番号１０～１２のうちの１つに対して少なくとも約７５％（例えば、少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または１００％などの約９９％以上）の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、核酸分子は、ベータ－グルクロニダーゼ（ＧＵＳＢ）プロモータを含むか、またはそれからなる調節制御配列に操作可能に連結されている。いくつかの実施形態では、ｃチュベリンは、ヒトチュベリン（配列番号１）のアミノ酸残基４１９～９３２または４５１～９３２を欠き、Ｃ末端領域は、配列番号１０～１２のうちの１つに対して少なくとも約９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、核酸分子は、ベータ－グルクロニダーゼ（ＧＵＳＢ）プロモータを含むか、またはそれからなる調節制御配列に操作可能に連結されている。いくつかの実施形態では、ｃチュベリンは、ヒトチュベリン（配列番号１）のアミノ酸残基４１９～９３２または４５１～９３２を欠き、Ｃ末端領域は、配列番号１０～１２のうちの１つのアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、核酸分子は、ベータ－グルクロニダーゼ（ＧＵＳＢ）プロモータを含むか、またはそれからなる調節制御配列に操作可能に連結されている。

【0078】

いくつかの実施形態では、ｃチュベリンは、ヒトチュベリン（配列番号１）のアミノ酸残基４５１～９３２、４５１～１１０９、４５１～１１３９、４５１～１５１４、４５１～１５１５を欠き、Ｃ末端領域は、配列番号４に対して少なくとも約７５％（例えば、少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または１００％などの約９９％以上）の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、核酸分子は、ベータ－グルクロニダーゼ（ＧＵＳＢ）プロモータを含むか、またはそれからなる調節制御配列に操作可能に連結されている。いくつかの実施形態では、ｃチュベリンは、ヒトチュベリン（配列番号１）のアミノ酸残基４５１～９３２、４５１～１１０９、４５１～１１３９、４５１～１５１４、４５１～１５１５を欠き、Ｃ末端領域は、配列番号４に対して少なくとも約９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、核酸分子は、ベータ－グルクロニダーゼ（ＧＵＳＢ）プロモータを含むか、またはそれからなる調節制御配列に操作可能に連結されている。いくつかの実施形態では、ｃチュベリンは、ヒトチュベリン（配列番号１）のアミノ酸残基４５１～９３２、４５１～１１０９、４５１～１１３９、４５１～１５１４、または４５１－１５１５を欠き、Ｃ末端領域は、配列番号４のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、核酸分子は、ベータ－グルクロニダーゼ（ＧＵＳＢ）プロモータを含むか、またはそれからなる調節制御配列に操作可能に連結されている。

【0079】

いくつかの実施形態では、ｃチュベリンは、ヒトチュベリン（配列番号１）のアミノ酸残基４１９～９３２、４１９～１１０９、４１９～１１３９、４１９～１５１４、または４１９～１５１５を欠き、Ｃ末端領域は、配列番号５に対して少なくとも約７５％（例えば、少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または１００％などの約９９％以上）の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、核酸分子は、ベータ－グルクロニダーゼ（ＧＵＳＢ）プロモータを含むか、またはそれからなる調節制御配列に操作可能に連結されている。いくつかの実施形態では、ｃチュベリンは、ヒトチュベリン（配列番号１）のアミノ酸残基４１９～９３２、４１９～１１０９、４１９～１１３９、４１９～１５１４、または４１９～１５１５を欠き、Ｃ末端領域は、配列番号５に対して少なくとも約９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、核酸分子は、ベータ－グルクロニダーゼ（ＧＵＳＢ）プロモータを含むか、またはそれからなる調節制御配列に操作可能に連結されている。いくつかの実施形態では、ｃチュベリンは、ヒトチュベリン（配列番号１）のアミノ酸残基４１９～９３２、４１９～１１０９、４１９～１１３９、４１９～１５１４、または４１９～１５１５を欠き、Ｃ末端領域は、配列番号５のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、核酸分子は、ベータ－グルクロニダーゼ（ＧＵＳＢ）プロモータを含むか、またはそれからなる調節制御配列に操作可能に連結されている。

【0080】

いくつかの実施形態では、ｃチュベリンは、ヒトチュベリン（配列番号１）のアミノ酸残基４５１～１５１４または４５１～１５１５を欠き、Ｃ末端領域は、配列番号６に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、Ｎ末端領域は、配列番号４に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、核酸分子は、ベータ－グルクロニダーゼ（ＧＵＳＢ）プロモータを含むか、またはそれからなる調節制御配列に操作可能に連結されている。いくつかの実施形態では、ｃチュベリンは、ヒトチュベリン（配列番号１）のアミノ酸残基４５１～１５１４または４５１～１５１５を欠き、Ｃ末端領域は、配列番号６のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、Ｎ末端領域は、配列番号４のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、核酸分子は、ベータ－グルクロニダーゼ（ＧＵＳＢ）プロモータを含むか、またはそれからなる調節制御配列に操作可能に連結されている。

【0081】

いくつかの実施形態では、核酸分子は、配列番号２０～２６のうちのいずれか１つに対して少なくとも約７５％（例えば、少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または１００％などの約９９％以上）の配列同一性を有する核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、核酸分子は、配列番号２０～２６のうちのいずれか１つに対して少なくとも約９０％の配列同一性を有する核酸配列を含む。

【0082】

いくつかの実施形態では、核酸分子は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）発現カセットを含み、ＡＡＶ発現カセットが、５’から３’へと、５’ＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）と、本明細書に開示の核酸分子のうちのいずれか１つと、３’ＡＡＶ ＩＴＲと、を含む。いくつかの実施形態では、５’ＩＴＲ及び／または３’ＩＴＲは、ＡＡＶ２に由来する。

【0083】

いくつかの実施形態では、本明細書に開示のＡＡＶ発現カセットは、その全体がすべての目的のために参照により本明細書に組み込まれる、Ｂ．Ｊ．Ｃａｒｔｅｒの”Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ”，ｅｄ．，Ｐ．Ｔｉｊｓｓｅｒ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ．１５５－１６８（１９９０）にさらに記載のシス－作用性５’及び３’逆位末端反復配列を含む。ＡＡＶ ＩＴＲ配列は、本明細書に開示の現在同定されている哺乳類ＡＡＶ型を含む、任意の既知のＡＡＶから得ることができる。

【0084】

いくつかの実施形態では、ＡＡＶ発現カセットは、ＡＡＶ１型、ＡＡＶ２型、ＡＡＶ３型（３Ａ型及び３Ｂ型が挙げられる）、ＡＡＶ４型、ＡＡＶ５型、ＡＡＶ６型、ＡＡＶ７型、ＡＡＶ８型、ＡＡＶ９型、ＡＡＶ１０型、ＡＡＶ１１型、ＡＡＶ１２型、ＡＡＶ１３型、ＡＡＶ ｒｈ３２．３３型、ＡＡＶ ｒｈ８型、ＡＡＶ ｒｈ１０型、ＡＡＶ ｒｈ７４型、ＡＡＶ ｈｕ．６８型、トリＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、ヒツジＡＡＶ、ヘビＡＡＶ、フトアゴヒゲトカゲＡＡＶ、ＡＡＶ２ｉ８、ＡＡＶ２ｇ９、ＡＡＶ－ＬＫ０３、ＡＡＶ７ｍ８、ＡＡＶ Ａｎｃ８０、ＡＡＶ ＰＨＰ．Ｂからの５’ＩＴＲ及び／または３’ＩＴＲを含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ発現カセットは、ＡＡＶ２からの５’ＩＴＲ、ＡＡＶ２からの３’ＩＴＲ、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ発現カセットは、ＡＡＶ２由来の５’ＩＴＲ、ＡＡＶ２由来の３’ＩＴＲ、またはそれらの組み合わせを含む。

【0085】

いくつかの実施形態では、５’ＡＡＶ ＩＴＲ配列は、配列番号２７の配列に対して少なくとも８０％（例えば、少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または１００％などの約９９．５％以上、その間に存在するすべての値及び部分範囲を含む）の同一性を有する核酸配列を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、５’ＡＡＶ ＩＴＲ配列は、配列番号２７の配列を含むか、またはそれからなる。

【0086】

いくつかの実施形態では、３’ＡＡＶ ＩＴＲ配列は、配列番号２８の配列に対して少なくとも８０％（例えば、少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または１００％などの約９９．５％以上、その間に存在するすべての値及び部分範囲を含む）の同一性を有する核酸配列を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、３’ＡＡＶ ＩＴＲ配列は、配列番号２８の核酸配列を含むか、またはそれからなる。

【0087】

いくつかの実施形態では、本明細書に開示のＡＡＶ発現カセットは、導入遺伝子に操作可能に連結されている追加の発現制御要素を含む。発現制御要素としては、例えば、適切な転写開始配列、終結配列、及びエンハンサ配列；スプライシングシグナル及びポリアデニル化（ポリＡ）シグナルなどの効率的なＲＮＡプロセシングシグナル；細胞質ｍＲＮＡを安定化する配列；翻訳効率を向上する配列；タンパク質安定性を向上する配列；ならびにコードされる産生物の分泌を向上する配列が挙げられる。

【0088】

いくつかの実施形態では、本明細書に開示のＡＡＶ発現カセットは、イントロンを含む。いくつかの実施形態では、イントロンは、プロモータ／エンハンサ配列と導入遺伝子との間に位置する。いくつかの実施形態では、イントロンは、ＳＶ－４０に由来し、ＳＶ－４０Ｔイントロン配列と称される。いくつかの実施形態では、本明細書に開示のＡＡＶ発現カセットは、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示のＡＡＶ発現カセットは、２Ａ自己切断ペプチドをコードする核酸を含む。例示的な２Ａ自己切断ペプチドとしては、Ｐ２Ａ、Ｅ２Ａ、Ｆ２Ａ、及びＴ２Ａが挙げられる。いくつかの実施形態では、本明細書に開示のＡＡＶ発現カセットは、例えば、それらの各々全体がすべての目的のために参照により本明細書に組み込まれる、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ及び３．１８ ３．２６及び１６．１７ １６．２７頁に引用されている参考文献、ならびにＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９に記載の要素を含む。

【0089】

いくつかの実施形態では、本明細書に開示のＡＡＶ発現カセットは、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後要素（ＷＰＲＥ）を含む。（例えば、Ｗａｎｇ ａｎｄ Ｖｅｒｍａ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，９６： ３９０６－３９１０（１９９９）を参照されたい）。いくつかの実施形態では、本明細書に開示のＡＡＶ発現カセットは、Ｂ型肝炎ウイルス転写後調節要素（ＨＢＶＰＲＥ）またはＲＮＡ輸送要素（ＲＴＥ）を含む。いくつかの実施形態では、ＷＰＲＥまたはＨＢＶＰＲＥ配列は、その両方全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第６，１３６，５９７号または同第６，２８７，８１４号に開示のＷＰＲＥまたはＨＢＶＰＲＥ配列のうちのいずれかである。

【0090】

いくつかの実施形態では、本明細書に開示のＡＡＶ発現カセットは、転写及び翻訳の開始にそれぞれ関与する、ＴＡＴＡボックス、キャッピング配列、ＣＡＡＴ配列、エンハンサ要素などの、５’非転写配列及び５’非翻訳配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示のＡＡＶ発現カセットは、エンハンサ配列または上流の活性化因子配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示のＡＡＶ発現カセットは、５’リーダー配列またはシグナル配列を含む。

【0091】

いくつかの実施形態では、本明細書に開示のＡＡＶ発現カセットは、構成的プロモータを含む。構成的プロモータの例としては、限定されないが、レトロウイルスラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモータ（任意選択的に、ＲＳＶエンハンサを有する）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモータ（任意選択的に、ＣＭＶエンハンサを有する）、ＳＶ４０プロモータ、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモータ、β－アクチンプロモータ、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモータ、及びＥＦｌａプロモータが挙げられる。

【0092】

いくつかの実施形態では、本明細書に開示のＡＡＶ発現カセットは、誘導性プロモータを含む。誘導性プロモータの非限定的な例としては、亜鉛誘導性ヒツジメタロチオニン（ＭＴ）プロモータ、デキサメタゾン（Ｄｅｘ）－誘導性マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモータ、Ｔ７ポリメラーゼプロモータ系、エクジソン昆虫プロモータ、テトラサイクリン抑制系、テトラサイクリン誘導系、ＲＵ４８６誘導系、及びラパマイシン誘導系が挙げられる。他のタイプの誘導性プロモータとしては、特定の生理学的状態、例えば、温度、急性期、細胞の特定の分化状態、または特定の細胞周期段階によって調節されるものが挙げられる。

【0093】

いくつかの実施形態では、本明細書に開示のＡＡＶ発現カセットは、ｃチュベリンをコードする導入遺伝子に操作可能に連結された、天然プロモータもしくはその断片、または天然発現制御要素を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示のＡＡＶ発現カセットは、組織特異的遺伝子発現能力を付与する調節配列を含む。いくつかの事例では、組織特異的調節配列は、組織特異的な様式で転写を誘導する組織特異的転写因子に結合する。組織特異的調節配列の例としては、限定されないが、以下の組織特異的プロモータ：ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）プロモータ、ニューロフィラメント軽鎖遺伝子プロモータ、及びニューロン特異的ｖｇｆ遺伝子プロモータなどのニューロンプロモータが挙げられる。

【0094】

いくつかの実施形態では、ＡＡＶ発現カセットは、１つ以上のプロモータを含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ発現カセットは、ニワトリβ－アクチンプロモータを含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ発現カセットは、ＣＢ６プロモータを含む。いくつかの実施形態では、ＣＢ６プロモータは、配列番号３４の配列に対して少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または１００％などの約９９．５％以上、その間に存在するすべての値及び部分範囲を含む）の同一性を有する核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＢ６プロモータは、配列番号３４の核酸配列を含むか、またはそれからなる。

【0095】

いくつかの実施形態では、ＡＡＶ発現カセットは、ＣＭＶ－ＩＥエンハンサを含む。いくつかの実施形態では、エンハンサは、ＣＭＶ－ＩＥエンハンサである。いくつかの実施形態では、ＣＭＶ－ＩＥエンハンサは、配列番号３３の配列に対して少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約１００％などの約９９．５％以上、その間に存在するすべての値及び部分範囲を含む）の同一性を有する核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＭＶ－ＩＥエンハンサは、配列番号３３の核酸配列を含むか、またはそれからなる。

【0096】

いくつかの実施形態では、ＡＡＶ発現カセットは、コザック配列（例えば、ＲＮＡコザック配列へと転写されるＤＮＡ配列）などのコンセンサス配列を含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ発現カセットは、コザック配列を含む。いくつかの実施形態では、コザック配列は、配列番号３５の配列に対して少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または１００％などの約９９．５％以上、その間に存在するすべての値及び部分範囲を含む）の同一性を有する核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、コザック配列は、配列番号３５の核酸配列を含むか、またはそれからなる。

【0097】

いくつかの実施形態では、本明細書に開示のＡＡＶ発現カセットは、１つ以上のマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）のための１つ以上の結合部位を含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ発現カセットは、ｃチュベリン導入遺伝子の組織特異的発現を調節することが可能であるｍｉＲＮＡ結合部位を含む。いくつかの実施形態では、ｃチュベリン導入遺伝子の組織特異的発現を調節することが可能であるｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲ－１２２結合部位、ｍｉＲ－１３３ａ、またはｍｉＲ－１結合部位である。例えば、肝臓におけるｃチュベリン導入遺伝子の発現は、導入遺伝子から発現されるｍＲＮＡが、肝臓においてｍｉＲ－１２２に結合し、ｍｉＲ－１２２によって阻害されるように、ｍｉＲ－１２２のための結合部位を組み込むことによって阻害することができる。心臓におけるｃチュベリン導入遺伝子の発現は、導入遺伝子から発現されるｍＲＮＡが、心臓においてｍｉＲ－１３３ａまたはｍｉＲ－１に結合し、それらによって阻害されるように、ｍｉＲ－１３３ａまたはｍｉＲ－１のための結合部位を組み込むことによって阻害することができる。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡにおけるｍｉＲＮＡ標的部位は、５’非翻訳領域（ＵＴＲ）、３’ＵＴＲ、またはコード領域にある。さらに、ｃチュベリン導入遺伝子は、複数のｍｉＲＮＡが、同じかまたは複数の部位を認識することによってｍＲＮＡを調節するように設計され得る。複数のｍｉＲＮＡ結合部位の存在は、複数のＲＮＡ誘導性サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）の協調作用を生じ得、発現の非常に効率的な阻害を提供し得る。標的部位配列は、合計で、５～１００個、または１０～６０個のヌクレオチドなどの、少なくとも５、１０個、またはそれ以上のヌクレオチドを含み得る。標的部位配列は、少なくとも５つのヌクレオチドの標的遺伝子結合部位の配列を含み得る。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ発現カセットは、ｍｉＲ－１結合部位、ｍｉＲ－１３３ａ結合部位、ｍｉＲ－１２２結合部位、またはそれらの任意の組み合わせを含む。

【0098】

いくつかの実施形態では、ＡＡＶ発現カセットは、ポリアデニル化（ポリＡ）配列を含む。ＰｏｌｙＡシグナルは、限定されないが、ＳＶ－４０、ヒト、及びウシを含む、多くの好適な種に由来し得る。いくつかの実施形態では、ポリＡ配列は、哺乳類β－グロブリンポリＡ配列などの、β－グロブリンポリＡ配列である。いくつかの実施形態では、ポリＡ配列は、ヒトポリＡ配列またはウシβ－グロブリンポリＡ配列である。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ発現カセットは、ウサギβ－グロビンポリＡ配列を含む。いくつかの実施形態では、ウサギβ－グロビンポリＡ配列は、配列番号３６の核酸配列を含むか、またはそれからなる。

【0099】

いくつかの実施形態では、ＡＡＶ発現カセットは、５’から３’へと、（ｉ）５’ＡＡＶ２に基づくＩＴＲ、（ｉｉ）ＣＭＶ－ＩＥエンハンサ、（ｉｉｉ）ＣＢ６プロモータ、（ｉｖ）本明細書に開示のｃチュベリンタンパク質のうちのいずれか１つをコードする導入遺伝子、（ｖ）ポリアデニル化配列、及び（ｖｉ）３’ＡＡＶ２に基づくＩＴＲを含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ発現カセットは、５’から３’へと、（ｉ）配列番号２７の核酸配列を含む５’ＡＡＶ２に基づくＩＴＲ、（ｉｉ）配列番号３３の核酸配列を含むＣＭＶ－ＩＥエンハンサ、（ｉｉｉ）配列番号３４の核酸配列を含むＣＢ６プロモータ、（ｉｖ）本明細書に開示のｃチュベリンタンパク質のうちのいずれか１つをコードする導入遺伝子、（ｖ）ポリアデニル化配列、及び（ｖｉ）配列番号２８の核酸配列を含む３’ＡＡＶ２に基づくＩＴＲを含む。

【0100】

いくつかの実施形態では、ＡＡＶ発現カセットは、５’から３’へと、（ｉ）５’ＡＡＶ２に基づくＩＴＲ、（ｉｉ）ＣＢ６プロモータ、（ｉｉｉ）本明細書に開示のｃチュベリンタンパク質のうちのいずれか１つをコードする導入遺伝子、（ｉｖ）ポリアデニル化配列、及び（ｖ）３’ＡＡＶ２に基づくＩＴＲを含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ発現カセットは、５’から３’へと、（ｉ）配列番号２７の核酸配列を含む５’ＡＡＶ２に基づくＩＴＲ、（ｉｉ）配列番号３４の核酸配列を含むＣＢ６プロモータ、（ｉｉｉ）本明細書に開示のｃチュベリンタンパク質のうちのいずれか１つをコードする導入遺伝子、（ｉｖ）ポリアデニル化配列、及び（ｖ）配列番号２８の核酸配列を含む３’ＡＡＶ２に基づくＩＴＲを含む。

【0101】

いくつかの実施形態では、ＡＡＶ発現カセットは、５’から３’へと、（ｉ）５’ＡＡＶ２に基づくＩＴＲ、（ｉｉ）ＧＵＳＢプロモータ、（ｉｉｉ）本明細書に開示のｃチュベリンタンパク質のうちのいずれか１つをコードする導入遺伝子、（ｉｖ）ポリアデニル化配列、及び（ｖ）３’ＡＡＶ２に基づくＩＴＲを含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ発現カセットは、５’から３’へと、（ｉ）配列番号２７の核酸配列を含む５’ＡＡＶ２に基づくＩＴＲ、（ｉｉ）ＧＵＳＢプロモータ、（ｉｉｉ）本明細書に開示のｃチュベリンタンパク質のうちのいずれか１つをコードする導入遺伝子、（ｉｖ）ポリアデニル化配列、及び（ｖ）配列番号２８の核酸配列を含む３’ＡＡＶ２に基づくＩＴＲを含む。

【0102】

結節性硬化症を治療するための組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）
本開示はまた、本明細書に開示の核酸分子のうちのいずれか１つを含むプラスミド、及び本明細書に開示の核酸分子またはプラスミドのうちのいずれか１つを含む宿主細胞を提供する。

【0103】

本開示は、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を産生する方法をさらに提供する。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶを産生する方法は、宿主細胞を、本明細書に開示の核酸分子またはプラスミドのうちのいずれか１つと接触させることを含む。したがって、本開示は、本明細書に開示のｒＡＡＶを産生する方法によって産生される組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）をさらに提供する。

【0104】

本開示はまた、ｒＡＡＶを提供する。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶカプシドタンパク質と、本明細書に開示の核酸分子またはＡＡＶ発現カセットのうちのいずれか１つと、を含む。本開示はまた、本明細書に開示のｃチュベリンタンパク質のうちのいずれか１つ、核酸分子のうちのいずれか１つ、プラスミドのうちのいずれか１つ、宿主細胞のうちのいずれか１つ、またはｒＡＡＶのうちのいずれか１つを含む、組成物を提供する。

【0105】

いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ１型、ＡＡＶ２型、ＡＡＶ３型（３Ａ型及び３Ｂ型が挙げられる）、ＡＡＶ４型、ＡＡＶ５型、ＡＡＶ６型、ＡＡＶ７型、ＡＡＶ８型、ＡＡＶ９型、ＡＡＶ１０型、ＡＡＶ１１型、ＡＡＶ１２型、ＡＡＶ１３型、ＡＡＶ ｒｈ３２．３３型、ＡＡＶ ｒｈ８型、ＡＡＶ ｒｈ１０型、ＡＡＶ ｒｈ７４型、ＡＡＶ ｈｕ．６８型、トリＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、ヒツジＡＡＶ、ヘビＡＡＶ、フトアゴヒゲトカゲＡＡＶ、ＡＡＶ２ｉ８、ＡＡＶ２ｇ９、ＡＡＶ－ＬＫ０３、ＡＡＶ７ｍ８、ＡＡＶ Ａｎｃ８０、ＡＡＶ ＰＨＰ．Ｂカプシドタンパク質を含む。

【0106】

いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ９カプシドタンパク質、ＡＡＶ８カプシドタンパク質、及び／またはＡＡＶｒｈ１０カプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ９カプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ８カプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶｒｈ１０カプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶは、擬似型のＡＡＶであり、１つの血清型のＡＡＶカプシドタンパク質及び異なる血清型に由来するＡＡＶ ＩＴＲを含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶは、キメラＡＡＶカプシド、またはヒト化ＡＡＶカプシドを含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶは、自己相補的ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）である。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶは、一本鎖ＡＡＶである。

【0107】

いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ粒子の調製は、ＡＡＶカプシドタンパク質またはその断片をコードする核酸配列と、機能的ｒｅｐ遺伝子と、ＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）及び本明細書に開示のｃチュベリンタンパク質のうちのいずれか１つをコードするＡＡＶ発現カセットで構成される組換えＡＡＶベクターと、組換えＡＡＶベクターをＡＡＶカプシドタンパク質内にパッケージングすることを可能にする十分なヘルパー機能と、を含有する、宿主細胞を培養することを含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶカプシド内にｒＡＡＶベクターをパッケージングするために宿主細胞内で培養される構成要素は、トランスで宿主細胞に提供される。いくつかの実施形態では、必要な構成要素（例えば、組換えＡＡＶベクター、ｒｅｐ配列、ｃａｐ配列、及び／またはヘルパー機能）のうちの任意の１つ以上は、必要な構成要素のうちの１つ以上を含有するように操作されている安定な宿主細胞によって提供される。

【0108】

いくつかの実施形態では、安定な宿主細胞は、誘導性プロモータまたは構造的プロモータの制御下で必要な構成要素（複数可）を含有するであろう。いくつかの実施形態では、選択された安定な宿主細胞は、構成的プロモータの制御下にある選択された構成要素（複数可）、及び１つ以上の誘導性プロモータの制御下にある他の選択された構成要素（複数可）を含有する。例えば、（構成的プロモータの制御下にあるＥ１ヘルパー機能を含有する）２９３細胞に由来するが、誘導性プロモータの制御下にあるｒｅｐタンパク質及び／またはｃａｐタンパク質を含有する、安定な宿主細胞が生成され得る。本明細書に開示のｒＡＡＶを産生するために必要な組換えＡＡＶベクター、ｒｅｐ配列、ｃａｐ配列、及びヘルパー機能は、任意の適切な遺伝要素（例えば、ベクター）を使用して、パッケージング宿主細胞に送達され得る。ｒＡＡＶ粒子を調製する方法に関するさらなる詳細は、その各々の内容全体がすべての目的のために本明細書に組み込まれる、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．、Ｋ．Ｆｉｓｈｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７０：５２０－５３２（１９９３）、及び米国特許第５，４７８，７４５号に提供されている。

【0109】

いくつかの実施形態では、組換えＡＡＶは、その内容全体がすべての目的のために本明細書に組み込まれる、米国特許第６，００１，６５０号に記載の三重トランスフェクション法を使用して産生される。いくつかの実施形態では、組換えＡＡＶは、ＡＡＶ粒子、ＡＡＶヘルパー機能ベクター、及びアクセサリー機能ベクター内にパッケージングされる（ｃチュベリンをコードするＡＡＶ発現カセットを含む）組換えＡＡＶベクターで、宿主細胞をトランスフェクションすることによって産生される。ＡＡＶヘルパー機能ベクターは、生産的なＡＡＶ複製及びカプシド化のためにトランスで機能する、「ＡＡＶヘルパー機能」配列（すなわち、ｒｅｐ及びｃａｐ）をコードする。ＡＡＶヘルパー機能ベクターの非限定的な例としては、それらの各々の内容全体がすべての目的のために本明細書に組み込まれる、米国特許第６，００１，６５０号及び同第６，１５６，３０３号にそれぞれ記載されている、ｐＨＬＰ１９及びｐＲｅｐ６ｃａｐ６ベクターが挙げられる。アクセサリー機能ベクターは、ＡＡＶが複製について依存する非ＡＡＶ由来のウイルス機能及び／または細胞機能（すなわち、「アクセサリー機能」）のためのヌクレオチド配列をコードする。アクセサリー機能としては、限定されないが、ＡＡＶ遺伝子転写の活性化、段階特異的ＡＡＶ ｍＲＮＡスプライシング、ＡＡＶ ＤＮＡ複製、ｃａｐ発現産生物の合成、及びＡＡＶカプシドアセンブリに関与する部分を含む、ＡＡＶ複製に必要な機能が挙げられる。ウイルスに基づくアクセサリー機能は、アデノウイルス、ヘルペスウイルス（単純ヘルペスウイルス１型以外）、及びワクシニアウイルスなどの既知のヘルパーウイルスのうちのいずれかに由来し得る。

【0110】

いくつかの実施形態では、組換えＡＡＶは、バキュロウイルスベクターを使用して産生される。バキュロウイルスベクターは、昆虫細胞（例えば、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（Ｓｆ９）細胞）内で組換えＡＡＶを産生するために使用される。ｃチュベリンをコードするＡＡＶの産生に関するさらなる詳細は、その内容全体がすべての目的のために参照により本明細書に組み込まれる、米国特許公開第２０２０／００７９８２４号に見出される。

【0111】

薬学的組成物
本開示は、（ａ）本明細書に開示の核酸分子のうちのいずれか１つ、本明細書に開示のプラスミドのうちのいずれか１つ、本明細書に開示の宿主細胞のうちのいずれか１つ、または本明細書に開示のｒＡＡＶのうちのいずれか１つと、（ｂ）薬学的に許容される担体と、を含む、薬学的組成物をさらに提供する。

【0112】

いくつかの実施形態では、本明細書に開示の組成物は、少なくとも１つの薬学的に許容される担体、賦形剤、及び／またはビヒクル、例えば、溶媒、緩衝液、溶液、分散媒、コーティング、抗菌剤、抗真菌剤、等張剤、及び吸収遅延剤を含む。いくつかの実施形態では、薬学的に許容される担体、賦形剤、及び／またはビヒクルは、生理食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、滅菌等張水性緩衝液、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、薬学的に許容される担体、賦形剤、及び／またはビヒクルは、リン酸緩衝生理食塩水、滅菌生理食塩水、ラクトース、スクロース、リン酸カルシウム、デキストラン、寒天、ペクチン、ピーナッツ油、ゴマ油、薬学的等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなど）、またはそれらの好適な混合物を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示の組成物は、乳化剤もしくは湿潤剤、またはｐＨ緩衝剤をさらに含む。そのような種は、少量（例えば、組成物の５重量％未満、組成物の１重量％未満、組成物の２重量％未満、またはそれ以下などの、組成物の１０重量％未満）で存在し得る。

【0113】

いくつかの実施形態では、本明細書に開示の組成物は、１つ以上の防腐剤または化学安定剤などの、１つ以上の他の薬学的成分をさらに含む。防腐剤及び化学安定剤の例としては、限定されないが、クロロブタノール、ソルビン酸カリウム、ソルビン酸、二酸化硫黄、没食子酸プロピル、パラベン、エチルバニリン、グリセリン、フェノール、パラクロロフェノール、及びアルブミンが挙げられる。いくつかの実施形態では、本明細書に開示の組成物は、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、及びチメロサールなどの抗菌剤及び／または抗真菌剤；糖及びナトリウムクロリドなどの等張剤；及び／またはモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンなどの吸収を遅延させる薬剤をさらに含み得る。いくつかの実施形態では、本明細書に開示の組成物は、ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標） Ｆ６８（Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ１８８、ＬＵＴＲＯＬ（登録商標）Ｆ６８）としても既知である）などの界面活性剤を含む。

【0114】

いくつかの実施形態では、本明細書に開示の組成物は、特に高いｒＡＡＶ濃度（例えば、約１０^１３ＧＣ／ｍｌ以上）が存在する場合、組成物中のＡＡＶ粒子の凝集を低減するように製剤化される。ｒＡＡＶの凝集を低減するための方法としては、その内容全体がすべての目的のために参照により本明細書に組み込まれる、Ｗｒｉｇｈｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ（２００５）１２，１７１－１７８にさらに記載されている、界面活性剤の添加、ｐＨ調整、及び塩濃度調整が挙げられる。

【0115】

いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、水溶液または分散体などの、注射可能な溶液または分散体の形態である。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、滅菌注射溶液または分散体の即時調製のための滅菌粉末である。分散体は、水、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、油、またはそれらの任意の組み合わせ中で調製され得る。リポソーム、ナノカプセル、マイクロ粒子、ミクロスフェア、脂質粒子、小胞などの送達ビヒクルが、本明細書に開示の薬学的組成物の導入に使用され得る。

【0116】

本開示はまた、本明細書に開示のｃチュベリンタンパク質のうちのいずれか１つ、または本明細書に開示の任意の核酸分子を含む、細胞外小胞（ＥＶ）を提供する。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、本明細書に開示のｃチュベリンタンパク質のうちのいずれか１つ、または本明細書に開示の任意の核酸分子を含む、細胞外小胞（ＥＶ）を含む。限定されないが、エクソソーム、マイクロベシクル、マイクロ粒子、循環マイクロベシクル、剥離マイクロベシクル、ナノベシクル、ナノ粒子、アポトーシス体、及び膜小胞を含む、細胞外小胞は、例えば、２０ナノメートル（ｎｍ）～１０マイクロメートル（μｍ）の範囲の形質膜の断片であり、ほぼすべての細胞型から剥離される。いくつかの実施形態では、ＥＶは、濾過、示差遠心分離、超遠心分離、勾配中の小胞の浮遊（スクロース、ＯｐｔｉＰｒｅｐ（商標））、及び膜タンパク質に対する抗体を利用する免疫親和性捕捉を使用して、単離及び精製される。さらなる詳細は、それらの各々の内容全体がすべての目的のために参照により本明細書に組み込まれる、Ｓｉｍｐｓｏｎ Ｒ Ｊ，Ｍａｔｈｉｖａｎａｎ Ｓ（２０１２）Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｖｅｓｉｃｌｅｓ： Ｔｈｅ Ｎｅｅｄ ｆｏｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌｌｙ Ｒｅｃｏｇｎｉｓｅｄ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ ａｎｄ Ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｃｒｉｔｅｒｉａ． Ｊ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ、ｖａｎ ｄｅｒ Ｐｏｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ，ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｒｅｌｅｖａｎｃｅ ｏｆ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅｓ，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｒｅｖ．２０１２ Ｊｕｌｙ；６４（３）：６７６－７０５、Ｒａｐｏｓｏ ａｎｄ Ｓｔｏｏｒｖｏｇｅｌ，Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅｓ：ｅｘｏｓｏｍｅｓ，ｍｉｃｒｏｖｅｓｉｃｌｅｓ，ａｎｄ ｆｒｉｅｎｄｓ，Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２０１ ３ Ｆｅｂ． １８；２００（４）：３７３－８３、及びＷｉｔｗｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔａｎｄａｒｄｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｓａｍｐｌｅ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅ ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｊ Ｅｘｔｒａｃｅｌｌ Ｖｅｓｉｃｌｅｓ．２０１３Ｍａｙ２７；２に提供されている。

【0117】

結節性硬化症を治療する方法
本開示はまた、標的細胞において、本明細書に開示のｃチュベリンのうちのいずれか１つを発現させる方法であって、本明細書に開示の核酸分子のうちのいずれか１つ、本明細書に開示のプラスミドのうちのいずれか１つ、本明細書に開示のｒＡＡＶのうちのいずれか１つ、本明細書に開示のＥＶのうちのいずれか１つ、または本明細書に開示の組成物のうちのいずれか１つを標的細胞と接触させ、それによって、標的細胞においてｃチュベリンを発現させることを含む、方法を提供する。

【0118】

加えて、本開示は、ｍＴＯＲＣ１及び／またはＲｈｅｂ活性を阻害する方法であって、本明細書に開示の核酸分子のうちのいずれか１つ、本明細書に開示のプラスミドのうちのいずれか１つ、本明細書に開示のｒＡＡＶのうちのいずれか１つ、本明細書に開示のＥＶのうちのいずれか１つ、または本明細書に開示の組成物のうちのいずれか１つを標的細胞と接触させ、それによって、標的細胞においてｍＴＯＲＣ１及び／またはＲｈｅｂ活性を阻害することを含む、方法を提供する。

【0119】

いくつかの実施形態では、標的細胞は、脳細胞、心臓細胞、腎臓細胞、皮膚細胞、肺細胞、またはそれらの任意の組み合わせである。いくつかの実施形態では、接触させるステップは、インビトロ、エクスビボ、またはインビボで実施される。いくつかの実施形態では、接触させるステップは、治療を必要とする対象においてインビボで実施される。いくつかの実施形態では、接触させるステップは、治療有効量の核酸分子、プラスミド、ｒＡＡＶ、または組成物を対象に投与することを含む。

【0120】

本開示はまた、結節性硬化症またはその症状の治療を必要とする対象においてそれを行う方法であって、治療有効量の本明細書に開示の核酸分子のうちのいずれか１つ、本明細書に開示のプラスミドのうちのいずれか１つ、本明細書に開示のｒＡＡＶのうちのいずれか１つ、本明細書に開示のＥＶのうちのいずれか１つ、または本明細書に開示の組成物のうちのいずれか１つを対象に投与し、それによって、対象における結節性硬化症を治療することを含む、方法を提供する。関連する態様では、本開示は、対象における結節性硬化症の１つ以上の症状を緩和し、重症度を軽減し、排除し、及び／またはその発症を遅延させることを必要とする対象においてそれを行う方法であって、治療有効量の本明細書に開示の核酸分子のうちのいずれか１つ、本明細書に開示のプラスミドのうちのいずれか１つ、本明細書に開示のｒＡＡＶのうちのいずれか１つ、または本明細書に開示の組成物のうちのいずれか１つを対象に投与し、それによって、対象における結節性硬化症の１つ以上の症状を緩和し、重症度を軽減し、排除し、及び／またはその発症を遅延させることを含む、方法を提供する。

【0121】

本開示は、腎血管筋脂肪腫またはその症状の治療を必要とする対象においてそれを行う方法であって、治療有効量の本明細書に開示の核酸分子のうちのいずれか１つ、本明細書に開示のプラスミドのうちのいずれか１つ、本明細書に開示のｒＡＡＶのうちのいずれか１つ、本明細書に開示のＥＶのうちのいずれか１つ、または本明細書に開示の組成物のうちのいずれか１つを対象に投与し、それによって、対象における腎血管筋脂肪腫を治療することを含む、方法をさらに提供する。いくつかの実施形態では、腎血管筋脂肪腫の治療は、腎血管筋脂肪腫の退縮、収縮、排除、またはその成長の遅延を生じる。

【0122】

加えて、本開示は、リンパ脈管筋腫症（ＬＡＭ）またはその症状の治療を必要とする対象においてそれを行う方法であって、治療有効量の本明細書に開示の核酸分子のうちのいずれか１つ、本明細書に開示のプラスミドのうちのいずれか１つ、本明細書に開示のｒＡＡＶのうちのいずれか１つ、本明細書に開示のＥＶのうちのいずれか１つ、または本明細書に開示の組成物のうちのいずれか１つを対象に投与し、それによって、対象におけるＬＡＭを治療することを含む、方法を提供する。関連する態様では、本開示は、対象におけるリンパ脈管筋腫症（ＬＡＭ）の１つ以上の症状を緩和し、重症度を軽減し、排除し、及び／またはその発症を遅延させることを必要とする対象においてそれを行う方法であって、治療有効量の本明細書に開示の核酸分子のうちのいずれか１つ、本明細書に開示のプラスミドのうちのいずれか１つ、本明細書に開示のｒＡＡＶのうちのいずれか１つ、または本明細書に開示の組成物のうちのいずれか１つを対象に投与し、それによって、対象におけるＬＡＭの１つ以上の症状を緩和し、重症度を軽減し、排除し、及び／またはその発症を遅延させることを含む、方法を提供する。

【0123】

本開示はまた、脳機能不全の治療を必要とする対象においてそれを行う方法であって、治療有効量の本明細書に開示の核酸分子のうちのいずれか１つ、本明細書に開示のプラスミドのうちのいずれか１つ、本明細書に開示のｒＡＡＶのうちのいずれか１つ、本明細書に開示のＥＶのうちのいずれか１つ、または本明細書に開示の組成物のうちのいずれか１つを対象に投与し、それによって、対象における脳機能不全を治療することを含む、方法を提供する。関連する態様では、本開示は、対象における脳機能不全の１つ以上の症状を緩和し、重症度を軽減し、排除し、及び／またはその発症を遅延させることを必要とする対象においてそれを行う方法であって、治療有効量の本明細書に開示の核酸分子のうちのいずれか１つ、本明細書に開示のプラスミドのうちのいずれか１つ、本明細書に開示のｒＡＡＶのうちのいずれか１つ、または本明細書に開示の組成物のうちのいずれか１つを対象に投与し、それによって、対象における脳機能不全の１つ以上の症状を緩和し、重症度を軽減し、排除し、及び／またはその発症を遅延させることを含む、方法を提供する。

【0124】

いくつかの実施形態では、結節性硬化症は、チュベリンの活性の減少と関連付けられるか、相関するか、またはそれによって引き起こされる。いくつかの実施形態では、対象は、結節性硬化症に罹患している。いくつかの実施形態では、対象は、結節性硬化症の少なくとも１つの症状を発症するリスクがある。

【0125】

いくつかの実施形態では、対象は、結節性硬化症を有すると診断されている。いくつかの実施形態では、対象は、発作の存在；発達遅延；皮膚上の白い斑点（白斑）；心臓腫瘍横紋筋腫の同定；脳、心臓、肝臓、または腎臓における腫瘍の同定；多種多様な皮膚特徴についての皮膚の検査；爪線維腫では手の爪及び足の爪；歯の穴及び／または歯肉線維腫では歯及び歯茎；網膜病変では眼；顔面血管線維腫；及び／または白斑の存在などの臨床基準に基づいて、結節性硬化症を有すると診断される。いくつかの実施形態では、対象は、ヒト対象である。いくつかの実施形態では、対象は、１２～１８歳、８～１２歳、６～１２歳、２～１８歳、０～２歳、またはその中の任意の範囲などの１８歳未満である。いくつかの実施形態では、対象は、新生児または乳児である。いくつかの実施形態では、乳児は、出生時の心臓横紋筋腫の存在、または生後最初の６ヶ月以内の乳児けいれんなどの臨床基準に基づいて、結節性硬化症を有すると診断される。

【0126】

いくつかの実施形態では、結節性硬化症は、ＴＳＣ２遺伝子における変異に関連付けられるか、相関するか、またはそれによって引き起こされる。いくつかの実施形態では、対象は、ＴＳＣ２遺伝子に変異を有する。いくつかの実施形態では、対象は、体内の少なくとも１つの細胞において、ＴＳＣ２の一方または両方の対立遺伝子に変異を有する。いくつかの実施形態では、変異は、遺伝性の生殖細胞系列変異である。いくつかの実施形態では、変異は、体細胞変異である。いくつかの実施形態では、ＴＳＣ２の１つの対立遺伝子における変異は、遺伝性変異であり、ＴＳＣ２の第２の対立遺伝子における変異は、体細胞変異である。いくつかの実施形態では、結節性硬化症の少なくとも１つの症状を発症するリスクのある対象は、ＴＳＣ２の１つの対立遺伝子に遺伝性の生殖細胞系列変異を有する対象である。いくつかの実施形態では、結節性硬化症の少なくとも１つの症状を発症するリスクのある対象は、一方または両方の親が１つ以上の変異体チュベリン遺伝子対立遺伝子のキャリアである、対象である。

【0127】

いくつかの実施形態では、対象は、体内の少なくとも１つの細胞において、ＴＳＣ２の両方の対立遺伝子に変異を有する。いくつかの実施形態では、対象は、脳、心臓、腎臓、皮膚、肺、及び／または他の臓器の少なくとも１つの細胞において、ＴＳＣ２の両方の対立遺伝子に変異を有する。いくつかの実施形態では、対象は、ＴＳＣ２における変異がホモ接合性であるか、または化合物ヘテロ接合性である。

【0128】

いくつかの実施形態では、対象は、ＴＳＣ１遺伝子に変異を有する。いくつかの実施形態では、対象は、ＴＳＣ１遺伝子における変異、及びＴＳＣ２遺伝子における変異を有する。

【0129】

いくつかの実施形態では、対象は、対象に由来する生物学的試料において、本明細書に記載のＴＳＣ２における変異のうちのいずれか１つ以上の存在を試験することによって、結節性硬化症を有するか、または結節性硬化症を発症するリスクがあると診断される。いくつかの実施形態では、ＴＳＣ２遺伝子における変異は、例えば、アミノ酸挿入、欠失、スプライス部位変異、及び／またはアミノ酸置換などの、任意のアミノ酸修飾であり得る。ＴＳＣ２遺伝子における変異に関する詳細は、それらの各々の内容全体がすべての目的のために本明細書に組み込まれる、Ｒｅｙｎａ－Ｆａｂｉａｎ，Ｍ．Ｅ．，Ｓｃｉ Ｒｅｐ １０，６５８９（２０２０）、Ｇｉｌｂｅｒｔ ＪＲ，ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｇｅｎｅｔｉｃｓ．１９９８ Ａｕｇ；１（４）：２６７－７２；Ａｖｇｅｒｉｓ，Ｓ．，Ｓｃｉ Ｒｅｐ ７，１６６９７（２０１７）、及びＲｏｓｓｅｔ Ｃ，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２０１７；４０（１）：６９－７９にさらに記載されている。いくつかの実施形態では、対象は、ＴＳＣ２遺伝子のエクソン３３、エクソン３７、及び／またはエクソン３８に変異を有する。いくつかの実施形態では、対象は、ＴＳＣ２遺伝子のエクソン３３に変異を有する。

【0130】

いくつかの実施形態では、治療有効量の本明細書に提供される治療薬（例えば、治療有効量の本明細書に開示の核酸分子のうちのいずれか１つ、本明細書に開示のプラスミドのうちのいずれか１つ、本明細書に開示のｒＡＡＶのうちのいずれか１つ、または本明細書に開示の組成物のうちのいずれか１つ）の投与は、本明細書に開示の結節性硬化症の症状のうちのいずれか１つの重症度を軽減する。いくつかの実施形態では、治療有効量の本明細書に提供される治療薬の投与は、本明細書に開示の結節性硬化症の症状のうちのいずれか１つの発症を遅延させる。いくつかの実施形態では、治療有効量の本明細書に提供される治療薬の投与は、本明細書に開示の結節性硬化症の症状のうちのいずれか１つの症状を排除する。いくつかの実施形態では、治療有効量の本明細書に提供される治療薬の投与は、本明細書に開示の結節性硬化症の症状のうちのいずれか１つの症状を緩和する。いくつかの実施形態では、結節性硬化症の症状は、脳、心臓、肝臓、腎臓、眼、もしくは皮膚における腫瘍もしくは過誤腫；上衣下成長もしくは結節；上衣下巨細胞星細胞腫；皮質結節；脳機能不全；発作；発達遅延；白斑；心臓腫瘍横紋筋腫；爪線維腫；歯の穴及び／または歯肉線維腫；網膜病変；顔面血管線維腫；腎血管筋脂肪腫；リンパ脈管筋腫症（ＬＡＭ）；内出血；自閉症；てんかん；水頭症；及び／または白斑の存在のうちのいずれか１つ以上の存在である。いくつかの実施形態では、結節性硬化症の症状は、それらの各々の内容全体がすべての目的のために参照により本明細書に組み込まれる、Ｒａｎｄｌｅ ＳＣ．，Ｐｅｄｉａｔｒ Ａｎｎ．２０１７ Ａｐｒ １；４６（４）：ｅ１６６－ｅ１７１、Ｕｙｓａｌ ＳＰ，Ｔｕｒｋ Ｊ Ｍｅｄ Ｓｃｉ．２０２０Ｎｏｖ ３；５０（ＳＩ－２）：１６６５－１６７６、及びＨｅｎｓｋｅ ＥＰ，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｉｓ Ｐｒｉｍｅｒｓ．２０１６ Ｍａｙ ２６；２：１６０３５に記載のいずれか１つである。

【0131】

いくつかの実施形態では、投与は、対象における腫瘍または過誤腫のサイズの減少に関連付けられるか、相関するか、または減少を生じる。いくつかの実施形態では、投与は、本明細書に開示の組成物を投与されていない結節性硬化症を有する対照対象と比較して、対象における腫瘍または過誤腫のサイズの少なくとも約５％（例えば、少なくとも約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、または１００％などの約９５％以上）の減少に関連付けられるか、相関するか、または減少を生じる。

【0132】

いくつかの実施形態では、投与は、対象における腫瘍または過誤腫の数の減少と関連付けられるか、相関するか、または減少を生じる。いくつかの実施形態では、投与は、本明細書に開示の組成物を投与されていない結節性硬化症を有する対照対象と比較して、対象における腫瘍または過誤腫の数の少なくとも約５％（例えば、少なくとも約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、または１００％などの約９５％以上）の減少に関連付けられるか、相関するか、または減少を生じる。

【0133】

理論に拘束されることなく、結節性硬化症を有する対象へのラパマイシンの投与は、ｍＴＯＲＣ１の過剰阻害に起因する副作用に関連付けられているが、本明細書に開示の組成物及び方法を使用するｃチュベリンの発現は、ｍＴＯＲＣ１の過剰阻害を引き起こさないことができると考えられる。これは、ＴＳＣ２の変異に関連付けられる結節性硬化症を有する対象が、ｍＴＯＲＣ１の正常な阻害を確実にするであろう正常なレベルのハマルチンを有する場合があることが理由である。さらに、ラパマイシン及びその類似体は、ｍＴＯＲＣ１のみを阻害することができるが、開示の組成物を使用するｃチュベリンの発現は、ｍＴＯＲＣ１の阻害に加えて、ｍＴＯＲＣ１非依存性Ｒｈｅｂ依存性の病理学的効果を生じる。したがって、本明細書に開示の組成物及び方法は、結節性硬化症に対するラパマイシンに基づく療法よりも有効であり得る。

【0134】

いくつかの実施形態では、方法は、治療有効量のｒＡＡＶを投与することを含み、治療有効量が、キログラム（ｋｇ）当たり約１０^５ゲノムコピー～１０^２０ゲノムコピー、例えば、約１０^６ゲノムコピー／ｋｇ、約１０^７ゲノムコピー／ｋｇ、約１０^８ゲノムコピー／ｋｇ、約１０^９ゲノムコピー／ｋｇ、約１０^１０ゲノムコピー／ｋｇ、約１０^１１ゲノムコピー／ｋｇ、約１０^１２ゲノムコピー／ｋｇ、約１０^１３ゲノムコピー／ｋｇ、約１０^１４ゲノムコピー／ｋｇ、約１０^１５ゲノムコピー／ｋｇ、約１０^１６ゲノムコピー／ｋｇ、約１０^１７ゲノムコピー／ｋｇ、約１０^１８ゲノムコピー／ｋｇ、または約１０^１９ゲノムコピー／ｋｇの範囲にあり、それらの間に存在するすべての値及び部分範囲を含む。いくつかの実施形態では、方法は、治療有効量のｒＡＡＶを投与することを含み、治療有効量が、キログラム当たり１０^１０ゲノムコピー～１０^１４ゲノムコピーの範囲にある。いくつかの実施形態では、方法は、治療有効量のｒＡＡＶを投与することを含み、治療有効量が、キログラム当たり１０^９ゲノムコピー～１０^１５ゲノムコピーの範囲にある。

【0135】

いくつかの実施形態では、治療有効量は、対象当たり約１０^５～１０^２０ゲノムコピー、例えば、対象当たり約１０^６ゲノムコピー、対象当たり約１０^７ゲノムコピー、対象当たり約１０^８ゲノムコピー、対象当たり約１０^９ゲノムコピー、対象当たり約１０^１０ゲノムコピー、対象当たり約１０^１１ゲノムコピー、対象当たり約１０^１２ゲノムコピー、対象当たり約１０^１３ゲノムコピー、対象当たり約１０^１４ゲノムコピー、対象当たり約１０^１５ゲノムコピー、対象当たり約１０^１６ゲノムコピー、対象当たり約１０^１７ゲノムコピー、対象当たり約１０^１８ゲノムコピー、または対象当たり約１０^１９ゲノムコピーの範囲にあり、それらの間に存在するすべての値及び部分範囲を含む。いくつかの実施形態では、治療有効量は、対象当たり約１０^９～１０^１６ゲノムコピーの範囲にある。

【0136】

いくつかの実施形態では、治療有効量は、約１マイクロリットル（μｌ）～約１００ｍＬの溶液、例えば、約１０μｌ、約５０μｌ、約１００μｌ、約１２５μｌ、約１５０μｌ、約１７５μｌ、約２００μｌ、約２５０μｌ、約３００μｌ、約３５０μｌ、約４００μｌ、約４５０μｌ、約５００μｌ、約５５０μｌ、約６００μｌ、約６５０μｌ、約７００μｌ、約７５０μｌ、約８００μｌ、約８５０μｌ、約９００μｌ、約９５０μｌ、約１ミリリットル（ｍＬ）、約２０ｍＬ、約３０ｍＬ、約４０ｍＬ、約５０ｍＬ、約６０ｍＬ、約７０ｍＬ、約８０ｍＬ、約９０ｍＬ、または約１００ｍＬの体積で投与され、それらの間に存在するすべての値及び部分範囲を含む。使用される体積は、ｒＡＡＶの用量及び投与経路に依存し得る。例えば、髄腔内または脳内投与では、約１μｌ～約１０μｌ、または約１０μｌ～約１００μｌの範囲の体積が使用され得る。静脈内投与では、約１０μｌ～約１００μｌ、または約１００μｌ～１ｍＬ、または約１ｍＬ～約１０ｍＬ、またはそれ以上の範囲の体積が使用され得る。

【0137】

いくつかの実施形態では、様々な間隔の期間、例えば毎日、毎週、１ヶ月ごと、１年ごとなどにわたって、所望されるレベルの遺伝子発現を達成するために、２回以上の投与（例えば２、３、４回、またはそれ以上の投与）が用いられ得る。

【0138】

いくつかの実施形態では、投与は、中枢神経系への注射による。使用され得る他の投与モードとしては、真皮、経口、直腸、経粘膜、鼻腔内、吸入（例えばエアロゾルを経由して）、頬側（例えば舌下）、膣、髄腔内、眼内、経皮、子宮内（または卵内）、非経口（例えば静脈内、皮下、皮内、筋肉内（骨格筋、横隔膜筋、及び／または心筋への投与を包含する）、皮内、胸膜腔内、脳内、及び関節内）、局所（例えば気道表面及び経皮投与を包含する、皮膚及び粘膜表面の両方への）、リンパ管内、及び同種のもの、そして組織または器官の直接的注射（例えば肝臓、骨格筋、心筋、横隔膜筋、または脳への）が挙げられる。いくつかの実施形態では、投与は、側脳室内注射、または頭蓋内注射による。いくつかの実施形態では、ｃチュベリン、核酸分子、プラスミド、組成物、またはｒＡＡＶは、血管内、腎動脈または静脈内、肺内、大槽内、脳内、髄腔内、静脈内、脳室内、側脳室内、腹腔内、または真皮に投与される。

【0139】

いくつかの実施形態では、方法は、治療有効量のｃチュベリン、核酸分子、プラスミド、組成物、またはｒＡＡＶを、例えば、腎動脈または静脈への血管内注射によって、腎血管筋脂肪腫を有する対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、治療有効量のｃチュベリン、核酸分子、プラスミド、組成物、またはｒＡＡＶは、腎血管筋脂肪腫を標的とする。いくつかの実施形態では、方法は、治療有効量のｃチュベリン、核酸分子、プラスミド、組成物、またはｒＡＡＶを、血管内注射によって、リンパ脈管筋腫症（ＬＡＭ）を有する対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、治療有効量のｃチュベリン、核酸分子、プラスミド、組成物、またはｒＡＡＶは、ＬＡＭを標的とする。いくつかの実施形態では、対象は、脳機能不全を有する。いくつかの実施形態では、ｃチュベリン、核酸分子、プラスミド、組成物、またはｒＡＡＶは、くも膜下腔に提供される。

【0140】

いくつかの実施形態では、ｃチュベリン、核酸分子、プラスミド、組成物、またはｒＡＡＶは、脳細胞、心臓細胞、腎臓細胞、皮膚細胞、または肺細胞に提供される（例えば、投与される）。いくつかの実施形態では、核酸分子、プラスミド、宿主細胞、ｒＡＡＶ、または組成物は、対象の血流に投与される。血流への投与は、静脈、動脈、または任意の他の血管導管への注射による場合がある。いくつかの実施形態では、核酸分子、プラスミド、細胞、ｒＡＡＶ、または組成物は、血管内投与される。いくつかの実施形態では、核酸分子、プラスミド、宿主細胞、ｒＡＡＶ、または組成物は、静脈内投与される。

【0141】

いくつかの実施形態では、核酸分子、プラスミド、宿主細胞、ｒＡＡＶ、または組成物は、脳組織、髄膜、神経細胞、グリア細胞、アストロサイト、オリゴデンドロサイト、脳脊髄液（ＣＳＦ）、間質空間などに送達される。いくつかの実施形態では、組換えＡＡＶは、脳室領域への注射によって、ならびに線条体（例えば、線条体の尾状核または被殻）、及び神経筋接合部、または小脳小葉への注射によって、針、カテーテル、または関連するデバイスを用いて、定位注射などの神経外科的技法を使用して、脊髄または脳に直接送達され得る。

【0142】

いくつかの実施形態では、投与は、核酸分子、プラスミド、宿主細胞、ｒＡＡＶ、または組成物を同時または異なる時点で、２つ以上の経路によって投与することを含み得る。

【0143】

いくつかの実施形態では、本明細書に開示の方法は、別の二次療法を対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、二次療法は、抗発作薬の投与を含む。抗発作薬の非限定的な例としては、カルバマゼピン、フェニトイン、バルプロ酸、オキシカルバゼピン、ラモトリジン、ガバペンチン、トピラマート、及びフェノバルビタール、及びゾニサミドが挙げられる。いくつかの実施形態では、二次療法は、ラパマイシンまたはその類似体の投与を含む。二次療法は、連続的にまたは同時に、対象に投与され得る。

【0144】

本開示はまた、１つ以上の薬剤（例えば、本明細書に開示の核酸分子のうちのいずれか１つ、本明細書に開示のプラスミドのうちのいずれか１つ、本明細書に開示のｒＡＡＶのうちのいずれか１つ、または本明細書に開示の組成物のうちのいずれか１つ）を含む、キットを提供する。いくつかの実施形態では、キットは、薬学的、診断、または研究用途において使用されるための、薬学的、または診断、または研究キットである。キットは、本明細書に開示の薬剤及び使用説明書を収容する、１つ以上の容器を含み得る。ある特定の実施形態では、キット内の薬剤は、特定の用途及び薬剤の投与の方法に好適な、薬学的製剤及び投薬量である。いくつかの実施形態では、容器は、シリンジ、バイアル、チューブ、局所適用デバイス、ＩＶニードルチューブ及びバッグ（ｎｅｅｄｌｅ ｔｕｂｉｎｇ ａｎｄ ｂａｇ）、または別の容器である。

【0145】

いくつかの実施形態では、キットは、（例えば、本明細書に記載のｒＡＡＶにおける）ｃチュベリンをコードする核酸分子、またはｃチュベリンを含む第１の薬学的組成物と、ラパマイシン及びその類似体などの結節性硬化症の治療に使用される１つ以上の薬物を含む第２の薬学的組成物と、を収容する。いくつかの実施形態では、キットは、２つの組成物を順次もしくは同時に投与するか、または投与前に２つの薬学的組成物を混合するための説明書を含む。
＊＊＊＊＊＊＊＊

【0146】

本明細書で使用される見出し部分は、単に構成的な目的のためであり、記載の主題を限定するものとして解釈されるべきではない。限定されないが、特許、特許出願、論説、書籍、及び論文を含む、本明細書で引用される文書または文書の一部はすべて、その全体がすべての目的のために参照により本明細書に明確に組み込まれる。組み込まれた文書または文書の一部のうちの１つ以上が、ある用語を定義し、それが本出願でのその用語の定義と矛盾する場合、本出願に記載される定義が優先される。しかしながら、本明細書で引用される任意の参考文献、論説、刊行物、特許、特許公開、及び特許出願の言及は、それらが有効な先行技術を構成するか、または世界の任意の国における一般的な一般知識の一部を形成するという認識、またはそれを示唆する任意の形態として、解釈されるべきではない。

【0147】

文脈が別段指示しない限り、本明細書に記載の様々な特徴は、任意の組み合わせで使用され得ることが特に意図される。

【実施例】

【0148】

実施例１：新しい短縮されたチュベリン（ｃチュベリン）構築物の生成
異なる核酸構築物を好適な発現プラスミド内にクローニングすることによって、特定のアミノ酸残基の欠失を含む様々なｃチュベリンタンパク質を生成する。構築物及びアミノ酸欠失を、以下の表１に列挙する。

【表1-1】

【表1-2】

【0149】

表１に列挙したｃチュベリンの各々をコードする核酸配列を含むＡＡＶ発現カセットを含む、ＡＡＶベクターを生成する。ＡＡＶ発現カセットは、表１に示されるように、ＣＭＶ－ＩＥ上流応答要素（ＵＲＥ）を有するかもしくは有さないＣＢ６プロモータ、またはバリアントの各々をコードする核酸配列に操作可能に連結されたＧＵＳＢプロモータを含む。ＡＡＶベクターを、三重トランスフェクション法を使用してＡＡＶ粒子内にパッケージングする。いくつかの事例では、ＡＡＶは、１型ＡＡＶ（例えば、ＡＡＶ１）または９型ＡＡＶ（例えば、ＡＡＶ９）である。いくつかの事例では、ベクターは、１つ以上のＡＡＶ２ ＩＴＲ要素などの１つ以上のＩＴＲ要素を含む。

【0150】

上述のものなどのＡＡＶベクターは、任意の有用な方法によって調製することができる。いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターは、目的の生成物を生成するために、トランスフェクト（例えば、三重トランスフェクト）した細胞培養物（例えば、ＨＥＫ２９３懸濁培養物）を使用して調製される。その後の処理としては、１つ以上の溶解、イオン交換クロマトグラフィー、濾過（限外濾過を含む）、親和性クロマトグラフィー、及び／または希釈ステップを挙げることができる。ベクターの配列は、様々な配列決定方法を使用して確認することができる。力価（例えば、ｇｃ／ｍＬ）は、ＰＣＲ増幅法または他の方法を使用して決定することができる。

【0151】

実施例２：細胞培養物におけるｃチュベリンの発現
細胞（例えば、ＣＯＳ－７細胞）を、実施例１に記載のｃチュベリンに対応する核酸配列を含むベクタープラスミドでトランスフェクトする。２４時間後、ｃチュベリンの発現は、抗チュベリン／ＴＳＣ２抗体によるイムノブロッティング（例えば、ウエスタンブロッティング）によって検出する。

【0152】

ｃチュベリンの活性を試験するために、細胞（例えば、ＣＯＳ－７細胞）を、例えば、ＧＦＰ、ｐＡＡＶ－ＣＢＡ－ｃＴＳＣ２、ＴＳＣ２－ＦＬＡＧ、ｐＡＡＶ－ＣＢＡ－ｃＴＳＣ２＋ＴＳＣ１－ＦＬＡＧ、ＴＳＣ１－ＦＬＡＧ＋ＴＳＣ２－ＦＬＡＧ、及びＴＳＣ１－ＦＬＡＧベクターを含む様々なＡＡＶ構築物でトランスフェクトする。リン酸化Ｓ６（ｐＳ６）、Ｓ６、及びＧＡＰＤＨの発現レベルは、イムノブロッティング（例えば、ウエスタンブロッティング）によって検出する。ｐＳ６キナーゼレベルは、通常、チュベリン活性の非存在下で上昇するが、本明細書に提供されるプラスミドでトランスフェクトした細胞は、低いｐＳ６レベルを示し得、これは、ｐＳ６キナーゼ活性の減少を示すであろう。

【0153】

実施例３：インビボでのｃチュベリンの発現
本開示のベクターの有効性を、（Ｏｎｄａ ｅｔ ａｌ．（Ｏｎｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０４（６）：６８７－６９５，１９９９）によって記載のＴｃｓ２^ｃ／ｃｆｌｏｘマウスなどの、チュベリンを欠くマウスを使用してさらに評価する。Ｃｒｅリコンビナーゼに応答して、Ｔｓｃ２^ｃ／ｃ対立遺伝子は、ヌル対立遺伝子へと変換され、ｌａｃＺ対立遺伝子は、β－ガラクトシダーゼを発現する。そのようなマウスは、健康かつ正常な寿命を有することが観察されている。

【0154】

側脳室内（ＩＣＶ）及び／または眼窩後（ＲＯ）注射を、実施例１に記載の選択されたベクターを使用して行る。ＩＣＶ注射は、生後日数（ＰＮＤ）０、１、２、３、４、または５日などの、マウスのライフサイクルの早期に実施する。ＲＯ注射は、ＰＮＤ２１などのＰＮＤ７～３５の間などの、マウスのライフサイクルの後期に実施する。注射された力価は、ミリリットル当たり１×１０^１１ゲノムコピー（ｇｃ／ｍＬ）～１×１０^１４ｇｃ／ｍＬの範囲であり得る。生存期間を監視する。ｐＳ６について、ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色及び／または免疫組織化学分析を使用して、チュベリン欠乏マウス及び治療したマウスの脳を研究する。

【0155】

１つの研究では、実施例１に記載のものなどのｃチュベリンベクターの、生存期間に対する影響を評価する。Ｔｃｓ２^ｃ／ｃマウスに、ＡＡＶ１－ＣＢＡ－ＣｒｅなどのＣｒｅ担持ベクターでＰＮＤ０またはＰＮＤ３にＩＣＶ注射するか、実施例１に記載のｃチュベリンベクターでＰ２１にＲＯ注射するか、または注射しない。ＰＮＤ３では、脳脊髄液（ＣＳＦ）関門は、Ｐ０よりも幾分貫通性が低い場合があるので、脳におけるチュベリンの欠乏が少ないことが観察され得る。生存期間を監視する。ｃチュベリンベクターを注射したマウスの生存期間は、Ｃｒｅベクターを注射したマウスの生存期間よりも長いと予想された。ｃチュベリンベクターを注射したマウスの生存期間は、注射しなかったマウスの生存期間（例えば、１７５日超）に匹敵し得る。

【0156】

別の研究では、実施例１に記載のｃチュベリンベクターの有効性を評価する。すべてのマウスに、ＡＡＶ１－ＣＢＡ－ＣｒｅなどのＣｒｅ担持ベクターを、ＰＮＤ０またはＰＮＤ３にＩＣＶ注射する。次いで、マウスの第１の群に、ＰＮＤ２１に実施例１に記載のｃチュベリンベクターをＲＯ注射し、マウスの第２の群には、再び注射しない。ｃチュベリンベクターを注射したマウスの生存期間は、ｃチュベリンベクターを注射しなかったマウスの生存期間よりも長いと予想される。チュベリン欠乏マウス及びｃチュベリン治療マウスの脳を、屠殺後（例えば、ＰＮＤ２７に）、Ｈ＆Ｅ染色またはＩＨＣを使用して、ｐＳ６について研究する。チュベリンが欠乏しているマウスでは、上衣細胞増殖、海馬における錐体細胞の拡大、上衣下結節、及び複数の上衣下結節、ならびに増殖を観察することができる。ｃチュベリン治療マウスでは、脳組織は、正常な注射していない（例えば、対照）脳のものとより同様に思われ得る。

【0157】

別の研究では、実施例１に記載のものなどのｃチュベリンベクターと抗けいれん剤との組み合わせの有効性を評価する。ＴＳＣ２変異は、早期発症及び高頻度の発作と関連付けられる。したがって、ｃチュベリンベクターと抗けいれん剤との組み合わせは、ＴＳＣ２での対象の治療に有効であり得る。すべてのマウスに、ＡＡＶ１－ＣＢＡ－ＣｒｅなどのＣｒｅ担持ベクターを、Ｐ０またはＰ３にＩＣＶ注射する。次いで、マウスの第１の群に、ＰＮＤ３以降に実施例１に記載のｃチュベリンベクターをＲＯ注射し、マウスの第２の群には、再び注射しない。ｃチュベリンベクターを注射したマウスの群を、ビガバトリン（例えば、２００ｍｇ／ｋｇ）などの抗けいれん剤で治療し、別のマウスの群は、抗けいれん剤で治療しない。ｃチュベリンベクターを注射し、抗けいれん剤で治療したマウスの生存期間は、ｃチュベリンベクターを注射せずかつ薬物で治療しなかったマウス、ｃチュベリンベクターを注射せずかつ薬物で治療したマウス、及びｃチュベリンベクターを注射しかつ抗けいれん剤で治療しなかったマウスの生存期間よりも長いことが予想される。

【0158】

さらなる研究では、実施例１に記載のものなどのｃチュベリンベクターの有効性を、ＮＯＤ－ＳＣＩＤ ＩＩ２Ｒガンマ（ＮＳＧ）マウスに皮下注射したリンパ脈管筋腫症（ＬＡＭ）腫瘍に対してインビボで試験する。Ｆｌｕｃを発現しているＴＳＣ２ヌルの不死化した血管筋脂肪腫細胞を血清培地中に懸濁させ、マトリゲルと混合し、ＮＳＧマウスの背中に皮下移植する。数週間（例えば、４週間）後、マウスに、Ｆｌｕｃ基質Ｄ－ルシフェリン（ＬＵＣＮＡ－１Ｇ）を腹腔内注射し、スペクトル及び麻酔システムでシグナルを検出する。生物発光を介して、例えば、１、４、６、９、及び１４週目に、腫瘍体積を監視する。腫瘍に、例えば、４週目及び９週目に、ｃチュベリンベクターを注射するか、または注射しない。１４週目までに、ｃチュベリンベクターを注射した腫瘍は、サイズの増加を停止すると予想されるが、注射しなかった腫瘍は、体積の拡大が継続され得る。

【0159】

追加の実験の詳細及び関連研究は、例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０１８年５月１７日出願の国際特許公開第ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０３３２４７号に記載されている。
番号付けされた実施形態
実施形態１（ｉ）ハマルチンに結合することが可能なＮ末端領域と、（ｉｉ）Ｃ末端ＧＴＰａｓｅ活性化タンパク質（ＧＡＰ）領域と、を含む、短縮されたチュベリン（ｃチュベリン）であって、前記ｃチュベリンが、配列番号１のアミノ酸残基４１９～９３２を欠く、前記ｃチュベリン。
実施形態２前記ｃチュベリンが、配列番号１のアミノ酸残基９４７～９８８をさらに欠く、実施形態１に記載のｃチュベリン。
実施形態３前記ｃチュベリンが、配列番号１のアミノ酸残基１２０５～１２７１をさらに欠く、実施形態１または２に記載のｃチュベリン。
実施形態４前記ｃチュベリンが、配列番号１のアミノ酸残基１３３６～１４９７をさらに欠く、実施形態１～３のいずれか１項に記載のｃチュベリン。
実施形態５前記Ｃ末端領域が、配列番号１０～１２のうちの１つに対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態１に記載のｃチュベリン。
実施形態６前記ｃチュベリンが、配列番号１のアミノ酸残基９３３～１１０９をさらに欠く、実施形態１に記載のｃチュベリン。
実施形態７前記Ｃ末端ドメインが、配列番号８に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態６に記載のｃチュベリン。
実施形態８前記Ｎ末端ドメインが、配列番号５に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態１～７のいずれか１項に記載のｃチュベリン。
実施形態９（ｉ）ハマルチンに結合することが可能なＮ末端領域と、（ｉｉ）Ｃ末端ＧＴＰａｓｅ活性化タンパク質（ＧＡＰ）領域と、を含む、短縮されたチュベリン（ｃチュベリン）であって、前記Ｃ末端領域が、配列番号７に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記ｃチュベリンが、配列番号１のアミノ酸残基４５１～９３２を欠く、前記ｃチュベリン。
実施形態１０前記ｃチュベリンが、配列番号１のアミノ酸残基４１９～９３２を欠く、実施形態９に記載のｃチュベリン。
実施形態１１前記Ｃ末端領域が、配列番号８に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態９または１０に記載のｃチュベリン。
実施形態１２前記Ｃ末端領域が、配列番号９に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態９または１０に記載のｃチュベリン。
実施形態１３前記Ｎ末端領域が、配列番号４に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態９に記載のｃチュベリン。
実施形態１４前記Ｎ末端領域が、配列番号５に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態９～１２のいずれか１項に記載のｃチュベリン。
実施形態１５前記ｃチュベリンが、配列番号１４に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態９に記載のｃチュベリン。
実施形態１６前記ｃチュベリンが、配列番号１５に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態９に記載のｃチュベリン。
実施形態１７前記ｃチュベリンが、配列番号１６に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態９に記載のｃチュベリン。
実施形態１８（ｉ）ハマルチンに結合することが可能なＮ末端領域と、（ｉｉ）Ｃ末端ＧＴＰａｓｅ活性化タンパク質（ＧＡＰ）領域と、を含む、短縮されたチュベリン（ｃチュベリン）であって、前記Ｃ末端領域が、配列番号１０～１２のうちの１つに対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記ｃチュベリンが、配列番号１のアミノ酸残基４５１～９３２を欠く、前記ｃチュベリン。
実施形態１９前記ｃチュベリンが、配列番号１のアミノ酸残基４１９～９３２を欠く、実施形態１８に記載のｃチュベリン。
実施形態２０前記Ｃ末端領域が、配列番号１０に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態１８または１９に記載のｃチュベリン。
実施形態２１前記Ｃ末端領域が、配列番号１１に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態１８または１９に記載のｃチュベリン。
実施形態２２前記Ｃ末端領域が、配列番号１２に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態１８または１９に記載のｃチュベリン。
実施形態２３前記ｃチュベリンが、配列番号１７に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態１８に記載のｃチュベリン。
実施形態２４前記ｃチュベリンが、配列番号１８に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態１８に記載のｃチュベリン。
実施形態２５前記ｃチュベリンが、配列番号１９に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態１８に記載のｃチュベリン。
実施形態２６前記Ｎ末端領域が、配列番号５に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態１８～２５のいずれか１項に記載のｃチュベリン。
実施形態２７前記ｃチュベリンが、前記Ｎ末端領域と前記Ｃ末端領域との間にスペーサ配列を含む、実施形態１～２６のいずれか１項に記載のｃチュベリン。
実施形態２８前記スペーサ配列が、配列番号２の配列を含む、実施形態２７に記載のｃチュベリン。
実施形態２９前記スペーサ配列が、配列番号３の配列を含む、実施形態２８に記載のｃチュベリン。
実施形態３０実施形態１～２９のいずれか１項に記載のｃチュベリンをコードする、核酸分子。
実施形態３１前記核酸分子が、ヒト標的細胞における発現のためにコドン最適化されている、実施形態３０に記載の核酸分子。
実施形態３２前記ヒト標的細胞が、脳細胞、心臓細胞、腎臓細胞、皮膚細胞、または肺細胞である、実施形態３１に記載の核酸分子。
実施形態３３前記核酸分子が、調節制御配列に操作可能に連結されている、実施形態３０～３２のいずれか１項に記載の核酸分子。
実施形態３４前記調節制御配列が、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモータ、ニワトリβ－アクチン（ＣＢＡ）プロモータ、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモータ／エンハンサ、ＳＶ４０プロモータ、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモータ、ホスホグリセロールキナーゼプロモータ、ＣＭＶ即時／初期遺伝子エンハンサ／ＣＢＡプロモータ、シナプシンプロモータ、またはグリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモータを含む、実施形態３３に記載の核酸分子。
実施形態３５前記調節制御配列が、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）即時／初期遺伝子エンハンサ／ニワトリβ－アクチン（ＣＢＡ）プロモータ、及びウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節要素（ＷＰＲＥ）を含む、実施形態３３に記載の核酸分子。
実施形態３６前記調節制御配列が、ベータ－グルクロニダーゼ（ＧＵＳＢ）プロモータを含む、実施形態３３に記載の核酸分子。
実施形態３７前記核酸分子が、配列番号２１～２６のいずれか１項に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する、実施形態３０～３６のいずれか１項に記載の核酸分子。
実施形態３８（ｉ）ハマルチンに結合することが可能なＮ末端領域と、（ｉｉ）Ｃ末端ＧＴＰａｓｅ活性化タンパク質（ＧＡＰ）領域とを含むｃチュベリンをコードする、核酸分子であって、前記ｃチュベリンが、配列番号１のアミノ酸残基４５１～９３２を欠き、前記核酸分子が、ベータ－グルクロニダーゼ（ＧＵＳＢ）プロモータを含む調節制御配列に操作可能に連結されている、前記核酸分子。
実施形態３９前記ｃチュベリンが、配列番号１のアミノ酸残基４５１～１５１５を欠く、実施形態３８に記載の核酸分子。
実施形態４０前記Ｃ末端領域が、配列番号６に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態３８または３９に記載の核酸分子。
実施形態４１前記Ｎ末端領域が、配列番号４に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態３８～４０のいずれか１項に記載の核酸分子。
実施形態４２アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）発現カセットを含む核酸分子であって、前記ＡＡＶ発現カセットが、５’から３’へと、
ｉ）５’ＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）と、
ｉｉ）実施形態２５～３５のいずれか１項に記載の核酸分子と、
ｉｉｉ）３’ＡＡＶ ＩＴＲと、を含む、前記核酸分子。
実施形態４３前記５’ＩＴＲ及び／または前記３’ＩＴＲが、ＡＡＶ２に由来する、実施形態４２に記載の核酸分子。
実施形態４４前記５’ＡＡＶ ＩＴＲ配列が、配列番号２７に対して少なくとも９０％の同一性を有する核酸配列を含む、実施形態４２または４３に記載の核酸分子。
実施形態４５前記３’ＡＡＶ ＩＴＲ配列が、配列番号２８に対して少なくとも９０％の同一性を有する核酸配列を含む、実施形態４２～４４のいずれか１項に記載の核酸分子。
実施形態４６前記ＡＡＶ発現カセットが、ポリアデニル化配列をさらに含む、実施形態４２～４５のいずれか１項に記載の核酸分子。
実施形態４７前記ＡＡＶ発現カセットが、コザック配列をさらに含む、実施形態４２～４６のいずれか１項に記載の核酸分子。
実施形態４８実施形態３０～４７のいずれか１項に記載の核酸分子を含む、プラスミド。
実施形態４９実施形態３０～４７のいずれか１項に記載の核酸分子、または実施形態４８に記載のプラスミドを含む、宿主細胞。
実施形態５０実施形態３０～４７のいずれか１項に記載の核酸分子、実施形態４８に記載のプラスミド、または実施形態４９に記載の宿主細胞を含む、組成物。
実施形態５１組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を産生する方法であって、宿主細胞を、実施形態３０～４７のいずれか１項に記載の核酸分子または実施形態４８に記載のプラスミドと接触させることを含む、前記方法。
実施形態５２実施形態５１に記載の方法によって産生される、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）。
実施形態５３ＡＡＶカプシドタンパク質と、実施形態３０～４７のいずれか１項に記載の核酸分子と、を含む、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）。
実施形態５４前記ｒＡＡＶが、ＡＡＶ１カプシドタンパク質、ＡＡＶ２カプシドタンパク質、ＡＡＶ３カプシドタンパク質、ＡＡＶ４カプシドタンパク質、ＡＡＶ５カプシドタンパク質、ＡＡＶ６カプシドタンパク質、ＡＡＶ７カプシドタンパク質、ＡＡＶ８カプシドタンパク質、ＡＡＶ９カプシドタンパク質、ＡＡＶ１０カプシドタンパク質、ＡＡＶｒｈ１０カプシドタンパク質、ＡＡＶ１１カプシドタンパク質、及び／またはＡＡＶ１２カプシドタンパク質を含む、実施形態５２または５３に記載のｒＡＡＶ。
実施形態５５標的細胞においてｃチュベリンを発現させる方法であって、前記標的細胞を、実施形態３０～４７のいずれか１項に記載の核酸分子、実施形態４８に記載のプラスミド、実施形態５０に記載の組成物、または実施形態５２～５４のいずれか１項に記載のｒＡＡＶと接触させ、それによって、前記標的細胞においてｃチュベリンを発現させることを含む、前記方法。
実施形態５６前記接触させるステップが、インビトロ、エクスビボ、またはインビボで実施される、実施形態５５に記載の方法。
実施形態５７前記接触させるステップが、治療を必要とする対象においてインビボで実施される、実施形態５６に記載の方法。
実施形態５８前記接触させるステップが、治療有効量の前記核酸分子、前記プラスミド、前記組成物、または前記ｒＡＡＶを前記対象に投与することを含む、実施形態５７に記載の方法。
実施形態５９結節性硬化症複合体（ＴＳＣ）を有する対象を治療する方法であって、治療有効量の実施形態１～２９のいずれか１項に記載のｃチュベリン、実施形態３０～４７のいずれか１項に記載の核酸分子、実施形態３０～４７のいずれか１項に記載の核酸分子を含む１つ以上の細胞外小胞（ＥＶ）、実施形態４８に記載のプラスミド、実施形態５０に記載の組成物、または実施形態５２～５４のいずれか１項に記載のｒＡＡＶを前記対象に投与し、それによって、前記対象におけるＴＳＣを治療することを含む、前記方法。
実施形態６０腎癌を有する対象を治療する方法であって、治療有効量の実施形態１～２９のいずれか１項に記載のｃチュベリン、実施形態３０～４７のいずれか１項に記載の核酸分子、実施形態３０～４７のいずれか１項に記載の核酸分子を含む１つ以上の細胞外小胞（ＥＶ）、実施形態４８に記載のプラスミド、実施形態５０に記載の組成物、または実施形態５２～５４のいずれか１項に記載のｒＡＡＶを前記対象に投与し、それによって、前記対象における腎癌を治療することを含む、前記方法。
実施形態６１前記ｃチュベリン、前記核酸分子、前記プラスミド、前記組成物、または前記ｒＡＡＶが、血管内、腎動脈または静脈内、肺内、大槽内、脳内、髄腔内、静脈内、脳室内、側脳室内、腹腔内、または真皮に投与される、実施形態５７～６０のいずれか１項に記載の方法。
実施形態６２前記対象が、腎血管筋脂肪腫を有する、実施形態５７～６１のいずれか１項に記載の方法。
実施形態６３前記ｃチュベリン、前記核酸分子、前記プラスミド、前記組成物、または前記ｒＡＡＶが、前記腎血管筋脂肪腫を標的とする、実施形態６２に記載の方法。
実施形態６４前記対象が、リンパ脈管筋腫症（ＬＡＭ）を呈する、実施形態５７～６３のいずれか１項に記載の方法。
実施形態６５前記ｃチュベリン、前記核酸分子、前記プラスミド、前記組成物、または前記ｒＡＡＶが、前記ＬＡＭを標的とする、実施形態６４に記載の方法。
実施形態６６前記対象が、脳機能不全を有する、実施形態５７～６５のいずれか１項に記載の方法。
実施形態６７前記ｃチュベリン、前記核酸分子、前記プラスミド、前記組成物、または前記ｒＡＡＶが、くも膜下腔に提供される、実施形態６６に記載の方法。
実施形態６８前記ｃチュベリン、前記核酸分子、前記プラスミド、前記組成物、または前記ｒＡＡＶが、脳細胞、心臓細胞、腎臓細胞、皮膚細胞、または肺細胞に投与される、実施形態５７～６７のいずれか１項に記載の方法。
実施形態６９前記対象が、ラパマイシンを投与される、実施形態５７～６８のいずれか１項に記載の方法。
実施形態７０前記対象が、ヒトである、実施形態５７～６９のいずれか１項に記載の方法。
実施形態７１前記対象が、１８歳未満である、実施形態５７～７０のいずれか１項に記載の方法。
実施形態７２前記対象が、乳児である、実施形態７１に記載の方法。
実施形態７３前記対象が、結節性硬化症複合体を有すると診断されている、実施形態５７～７２のいずれか１項に記載の方法。
実施形態７４前記対象が、ＴＳＣ２遺伝子に変異を有する、実施形態５７～７３のいずれか１項に記載の方法。
実施形態７５前記対象が、前記ＴＳＣ２遺伝子のエクソン３３、エクソン３７、及び／またはエクソン３８に変異を有する、実施形態７４に記載の方法。
実施形態７６前記対象が、皮質結節、上衣下結節、及び上衣下巨細胞星細胞腫のうちの１つ以上を有する、実施形態５７～７５のいずれか１項に記載の方法。

【配列表】

2024522943000001.app

【国際調査報告】